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特表2023-519261抗ＰＳＭＡ抗体－エキサテカン類似体複合体及びその医薬用途
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-05-10
(54)【発明の名称】抗ＰＳＭＡ抗体－エキサテカン類似体複合体及びその医薬用途
(51)【国際特許分類】
A61K 47/68 20170101AFI20230428BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20230428BHJP
C07K 1/13 20060101ALI20230428BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230428BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20230428BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230428BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20230428BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20230428BHJP
【ＦＩ】
A61K47/68
C07K16/28 ZNA
C07K1/13
A61P35/00
A61P35/02
A61K39/395 L
C07K16/46
C12N15/13
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022557789
(86)(22)【出願日】2021-03-25
(85)【翻訳文提出日】2022-11-17
(86)【国際出願番号】 CN2021082857
(87)【国際公開番号】W WO2021190583
(87)【国際公開日】2021-09-30
(31)【優先権主張番号】202010218297.4
(32)【優先日】2020-03-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】516174219
【氏名又は名称】江蘇恒瑞医薬股▲ふん▼有限公司
(71)【出願人】
【識別番号】516174208
【氏名又は名称】上海恒瑞医薬有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＨＥＮＧＲＵＩ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＣＯ．， ＬＴＤ
【住所又は居所原語表記】ＮＯ． ２７９ ＷＥＮＪＩＮＧ ＲＯＡＤ， ＭＩＮＨＡＮＧ ＤＩＳＴＲＩＣＴ， ＳＨＡＮＧＨＡＩ ２００２４５， ＣＨＩＮＡ
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100156144
【弁理士】
【氏名又は名称】落合 康
(72)【発明者】
【氏名】応 華
(72)【発明者】
【氏名】張 小敏
(72)【発明者】
【氏名】楊 篠瑩
(72)【発明者】
【氏名】陶 維康
【テーマコード（参考）】
4C076
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA95
4C076CC27
4C076CC41
4C076EE41
4C076EE59
4C076FF70
4C085AA27
4C085BB11
4C085BB31
4C085DD35
4C085DD62
4C085EE01
4H045AA11
4H045AA50
4H045BA09
4H045BA50
4H045BA72
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
4H045GA22
(57)【要約】
本開示は、抗ＰＳＭＡ抗体－エキサテカン類似体複合体及びその医薬用途を提供する。具体的には、一般式（Ｐｃ－Ｌ－Ｙ－Ｄ）で示される抗ＰＳＭＡ抗体－薬物複合体を提供し、そのうち、Ｐｃは、抗ＰＳＭＡ抗体又はその抗原結合断片である。
【化１】
【化１】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
一般式（Ｐｃ－Ｌ－Ｙ－Ｄ）で示される抗体－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩であって、【化1】
Ｙは、－Ｏ－（ＣＲａＲｂ）ｍ－ＣＲ１Ｒ２－Ｃ（Ｏ）－、－Ｏ－ＣＲ１Ｒ２－（ＣＲａＲｂ）ｍ－、－Ｏ－ＣＲ１Ｒ２－、－ＮＨ－（ＣＲａＲｂ）ｍ－ＣＲ１Ｒ２－Ｃ（Ｏ）－及び－Ｓ－（ＣＲａＲｂ）ｍ－ＣＲ１Ｒ２－Ｃ（Ｏ）－から選ばれ、
ＲａとＲｂは同一又は異なり、且つそれぞれ独立して水素原子、重水素原子、ハロゲン、アルキル基、ハロアルキル基、重水素化アルキル基、アルコキシ基、ヒドロキシ基、アミノ基、シアノ基、ニトロ基、ヒドロキシアルキル基、シクロアルキル基及びヘテロシクリル基から選ばれ、
或いは、ＲａとＲｂは、それらに連結された炭素原子と共にシクロアルキル基又はヘテロシクリル基を形成し、
Ｒ１は、ハロゲン、ハロアルキル基、重水素化アルキル基、シクロアルキル基、シクロアルキルアルキル基、アルコキシアルキル基、ヘテロシクリル基、アリール基及びヘテロアリール基から選ばれ、
Ｒ２は、水素原子、ハロゲン、ハロアルキル基、重水素化アルキル基、シクロアルキル基、シクロアルキルアルキル基、アルコキシアルキル基、ヘテロシクリル基、アリール基及びヘテロアリール基から選ばれ、
或いは、Ｒ１とＲ２は、それらに連結された炭素原子と共にシクロアルキル基又はヘテロシクリル基を形成し、
或いは、ＲａとＲ２は、それらに連結された炭素原子と共にシクロアルキル基又はヘテロシクリル基を形成し、
ｍは、０～４の整数であり、
ｎは１～１０で、ｎは小数又は整数であり、
Ｌは、リンカーユニットであり、
Ｐｃは抗ＰＳＭＡ抗体又はその抗原結合断片である、
抗体－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
【請求項2】
前記抗ＰＳＭＡ抗体又はその抗原結合断片は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含み、そのうち、前記重鎖可変領域は、それぞれ配列番号３、配列番号４と配列番号５で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号６、配列番号７と配列番号８で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含む、
請求項１に記載の一般式（Ｐｃ－Ｌ－Ｙ－Ｄ）で示される抗体－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
【請求項3】
前記抗ＰＳＭＡ抗体は、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である、請求項１又は２の何れか一項に記載の一般式（Ｐｃ－Ｌ－Ｙ－Ｄ）で示される抗体－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
【請求項4】
前記抗ＰＳＭＡ抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１で示される重鎖可変領域と配列番号２で示される軽鎖可変領域を含む、請求項１～３の何れか一項に記載の一般式（Ｐｃ－Ｌ－Ｙ－Ｄ）で示される抗体－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
【請求項5】
前記抗ＰＳＭＡ抗体は、抗体重鎖定常領域と軽鎖定常領域を含み、好ましくは、前記重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３とＩｇＧ４の定常領域及びその通常の変異体から選ばれ、前記軽鎖定常領域はヒト抗体κとλ鎖の定常領域及びその通常の変異体から選ばれ、より好ましくは、前記抗ＰＳＭＡ抗体は配列番号９で示される重鎖と配列番号１０で示される軽鎖を含む、請求項１～４の何れか一項に記載の一般式（Ｐｃ－Ｌ－Ｙ－Ｄ）で示される抗体－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
【請求項6】
ｎは１～８であり、好ましくは３～８であり、ｎは小数又は整数である、請求項１～５の何れか一項に記載の一般式（Ｐｃ－Ｌ－Ｙ－Ｄ）で示される抗体－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
【請求項7】
Ｙは、－Ｏ－（ＣＲａＲｂ）ｍ－ＣＲ１Ｒ２－Ｃ（Ｏ）－であり、ＲａとＲｂは同一又は異なり、且つそれぞれ独立して水素原子、重水素原子、ハロゲン及びＣ１－６アルキル基から選ばれ、
Ｒ１は、ハロアルキル基又はＣ３－６シクロアルキル基であり、
Ｒ２は、水素原子、ハロアルキル基及びＣ３－６シクロアルキル基から選ばれ、
或いは、Ｒ１とＲ２は、それらに連結された炭素原子と共にＣ３－６シクロアルキル基を形成し、
ｍは、０又は１である、
請求項１～６の何れか一項に記載の一般式（Ｐｃ－Ｌ－Ｙ－Ｄ）で示される抗体－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
【請求項8】
Ｙは、【化2】
そのうち、ＹのＯ末端は、リンカーユニットＬに連結される、請求項１～７の何れか一項に記載の一般式（Ｐｃ－Ｌ－Ｙ－Ｄ）で示される抗体－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
【請求項9】
リンカーユニット－Ｌ－は、－Ｌ１－Ｌ２－Ｌ３－Ｌ４－であり、Ｌ１は、－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－Ｗ－Ｃ（Ｏ）－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－ＮＲ３－Ｗ－Ｃ（Ｏ）－及び－Ｃ（Ｏ）－Ｗ－Ｃ（Ｏ）－から選ばれ、そのうち、Ｗは、Ｃ１－８アルキル基、Ｃ１－８アルキル基－シクロアルキル基及び１～８個の原子の直鎖ヘテロアルキル基から選ばれ、前記ヘテロアルキル基は、Ｎ、Ｏ及びＳから選ばれる１～３個のヘテロ原子を含み、そのうち、前記Ｃ１－８アルキル基、Ｃ１－８アルキル基－シクロアルキル基及び直鎖ヘテロアルキル基は、それぞれ独立的に、任意選択的に更にハロゲン、ヒドロキシ基、シアノ基、アミノ基、アルキル基、クロロアルキル基、重水素化アルキル基、アルコキシ基及びシクロアルキル基から選ばれる１つ又は複数の置換基で置換され、
Ｌ２は－ＮＲ４（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐ１ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）－、－ＮＲ４（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐ１ＣＨ２Ｃ（Ｏ）－、－Ｓ（ＣＨ２）ｐ１Ｃ（Ｏ）－及び化学結合から選ばれ、そのうち、ｐ１は１～２０の整数であり、
Ｌ３は、２～７個のアミノ酸残基からなるペプチド残基であり、そのうち、前記アミノ酸残基はフェニルアラニン、グリシン、バリン、リジン、シトルリン、セリン、グルタミン酸及びアスパラギン酸のうちのアミノ酸からなるアミノ酸残基から選ばれ、且つ任意選択的に更にハロゲン、ヒドロキシ基、シアノ基、アミノ基、アルキル基、クロロアルキル基、重水素化アルキル基、アルコキシ基及びシクロアルキル基から選ばれる１つ又は複数の置換基で置換され、
Ｌ４は、－ＮＲ５（ＣＲ６Ｒ７）ｔ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ５、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ５（ＣＨ２）ｔ－及び化学結合から選ばれ、そのうち、ｔは１～６の整数であり、
Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は同一又は異なり、且つそれぞれ独立して水素原子、アルキル基、ハロアルキル基、重水素化アルキル基及びヒドロキシアルキル基から選ばれ、
Ｒ６とＲ７は同一又は異なり、且つそれぞれ独立して水素原子、ハロゲン、アルキル基、ハロアルキル基、重水素化アルキル基及びヒドロキシアルキル基から選ばれる、
請求項１～８の何れか一項に記載の一般式（Ｐｃ－Ｌ－Ｙ－Ｄ）で示される抗体－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
【請求項10】
リンカーユニット－Ｌ－は、－Ｌ１－Ｌ２－Ｌ３－Ｌ４－であり、Ｌ１は
【化3】
Ｌ２は化学結合であり、
Ｌ３は、テトラペプチド残基であり、好ましくは、Ｌ３はＧＧＦＧのテトラペプチド残基であり、
Ｌ４は、－ＮＲ５（ＣＲ６Ｒ７）ｔ－であり、Ｒ５、Ｒ６又はＲ７は同一又は異なり、且つそれぞれ独立して水素原子又はアルキル基であり、ｔは１又は２であり、
そのうち、前記Ｌ１末端はＰｃに連結され、Ｌ４末端はＹに連結される、
請求項１～９の何れか一項に記載の一般式（Ｐｃ－Ｌ－Ｙ－Ｄ）で示される抗体－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
【請求項11】
－Ｌ－は、【化4】
請求項１～１０の何れか一項に記載の一般式（Ｐｃ－Ｌ－Ｙ－Ｄ）で示される抗体－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
【請求項12】
－Ｌ－Ｙ－は、任意選択的に【化5】
請求項１～１１の何れか一項に記載の一般式（Ｐｃ－Ｌ－Ｙ－Ｄ）で示される抗体－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
【請求項13】
一般式（Ｐｃ－Ｌａ－Ｙ－Ｄ）で示される抗体－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩であり、【化6】
Ｐｃは抗ＰＳＭＡ抗体又はその抗原結合断片であり、
ｍは、０～４の整数であり、
ｎは１～１０で、ｎは小数又は整数であり、
Ｒ１は、ハロゲン、ハロアルキル基、重水素化アルキル基、シクロアルキル基、シクロアルキルアルキル基、アルコキシアルキル基、ヘテロシクリル基、アリール基及びヘテロアリール基から選ばれ、
Ｒ２は、水素原子、ハロゲン、ハロアルキル基、重水素化アルキル基、シクロアルキル基、シクロアルキルアルキル基、アルコキシアルキル基、ヘテロシクリル基、アリール基及びヘテロアリール基から選ばれ、
或いは、Ｒ１とＲ２は、それらに連結された炭素原子と共にシクロアルキル基又はヘテロシクリル基を形成し、
Ｗは、Ｃ１－８アルキル基、Ｃ１－８アルキル基－シクロアルキル基及び１～８個の原子の直鎖ヘテロアルキル基から選ばれ、前記ヘテロアルキル基は、Ｎ、Ｏ及びＳから選ばれる１～３個のヘテロ原子を含み、そのうち、前記Ｃ１－８アルキル基、Ｃ１－８アルキル基－シクロアルキル基及び直鎖ヘテロアルキル基は、それぞれ独立的に、任意選択的に更にハロゲン、ヒドロキシ基、シアノ基、アミノ基、アルキル基、クロロアルキル基、重水素化アルキル基、アルコキシ基及びシクロアルキル基から選ばれる１つ又は複数の置換基で置換され、
Ｌ２は－ＮＲ４（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐ１ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）－、－ＮＲ４（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐ１ＣＨ２Ｃ（Ｏ）－、－Ｓ（ＣＨ２）ｐ１Ｃ（Ｏ）－及び化学結合から選ばれ、そのうち、ｐ１は１～２０の整数であり、
Ｌ３は、２～７個のアミノ酸残基からなるペプチド残基であり、そのうち、前記アミノ酸残基はフェニルアラニン、グリシン、バリン、リジン、シトルリン、セリン、グルタミン酸及びアスパラギン酸のうちのアミノ酸からなるアミノ酸残基から選ばれ、且つ任意選択的に更にハロゲン、ヒドロキシ基、シアノ基、アミノ基、アルキル基、クロロアルキル基、重水素化アルキル基、アルコキシ基及びシクロアルキル基から選ばれる１つ又は複数の置換基で置換され、
Ｒ５は水素原子、アルキル基、ハロアルキル基、重水素化アルキル基及びヒドロキシアルキル基から選ばれ、
Ｒ６とＲ７は同一又は異なり、且つそれぞれ独立して水素原子、ハロゲン、アルキル基、ハロアルキル基、重水素化アルキル基及びヒドロキシアルキル基から選ばれる、
請求項１～１０の何れか一項に記載の一般式（Ｐｃ－Ｌ－Ｙ－Ｄ）で示される抗体－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
【請求項14】
一般式（Ｐｃ－Ｌｂ－Ｙ－Ｄ）で示される抗体－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩であり、【化7】
ｓ１は、２～８の整数であり、
Ｐｃ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７、ｍとｎは請求項１３に定義された通りである、
請求項１～１０、１３の何れか一項に記載の一般式（Ｐｃ－Ｌ－Ｙ－Ｄ）で示される抗体－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
【請求項15】
前記抗体－薬物複合体は、【化8】
Ｐｃは抗ＰＳＭＡ抗体又はその抗原結合断片であり、
ｎは１～１０で、ｎは小数又は整数である、
請求項１～１４の何れか一項に記載の一般式（Ｐｃ－Ｌ－Ｙ－Ｄ）で示される抗体－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
【請求項16】
前記抗体－薬物複合体は、【化9】
ｎは１～８、好ましくは３～８であり、ｎは小数又は整数であり、
ＰＭは抗ＰＳＭＡ抗体であり、それは配列番号９で示される重鎖と配列番号１０で示される軽鎖を含む、
請求項１～１５の何れか一項に記載の一般式（Ｐｃ－Ｌ－Ｙ－Ｄ）で示される抗体－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
【請求項17】
一般式（Ｐｃ－Ｌａ－Ｙ－Ｄ）で示される抗体－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩を調製する方法であって、【化10】
そのうち、
Ｐｃは、抗ＰＳＭＡ抗体又はその抗原結合断片であり、好ましくは、Ｐｃは請求項２～５の何れか一項に記載の抗ＰＳＭＡ抗体又はその抗原結合断片であり、Ｐｃ’は、Ｐｃを還元して得られ、
ｎ、ｍ、Ｗ、Ｌ２、Ｌ３、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は請求項１３に定義された通りである、
方法。
【請求項18】
請求項１～１６の何れか一項に記載の抗体－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩と、１種又は複数種の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又はベクターとを含む、医薬組成物。
【請求項19】
請求項１～１６の何れか一項に記載の抗体－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩、或いは請求項１８に記載の医薬組成物の、ＰＳＭＡにより仲介された疾患又は病状を治療するための薬剤の調製における用途。
【請求項20】
請求項１～１６の何れか一項に記載の抗体－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩、或いは請求項１８に記載の医薬組成物の、腫瘍及びがんを治療及び／又は予防する薬剤の調製における用途であって、前記腫瘍及びがんは、頭頸部扁平上皮がん、頭頸部がん、脳がん、神経膠腫、多形性膠芽腫、神経芽細胞腫、中枢神経系がん、神経内分泌腫瘍、咽頭がん、鼻咽頭がん、食道がん、甲状腺がん、悪性胸膜中皮腫、肺がん、乳がん、肝がん、肝細胞腫、肝胆がん、膵臓がん、胃がん、消化管がん、腸がん、結腸がん、結腸直腸がん、腎がん、透明細胞腎細胞がん、卵巣がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、膀胱がん、前立腺がん、精巣がん、皮膚がん、黒色腫、白血病、リンパ腫、骨がん、軟骨肉腫、骨髄腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、クルッケンベルグ腫瘍、骨髄増殖性腫瘍、扁平上皮がん、ユーイング肉腫、尿路上皮がん及びメルケル細胞がんが好ましく、好ましくは、前記リンパ腫は、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、縦隔原発大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、Ｔ細胞／組織球に富む大細胞型Ｂ細胞リンパ腫及びリンパ形質細胞性リンパ腫から選ばれ、前記肺がんは、非小細胞肺がん及び小細胞肺がんから選ばれ、前記白血病は、慢性骨髄細胞性白血病、急性骨髄細胞性白血病、リンパ球白血病、リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病及び骨髄細胞白血病から選ばれる、用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本願は、２０２０年３月２５日に提出された中国特許出願（出願番号ＣＮ ２０２０１０２１８２９７．４）の優先権を主張する。
【0002】
本開示は抗ＰＳＭＡ抗体、抗ＰＳＭＡ抗体－エキサテカン類似体複合体、その調製方法、それらを含む医薬組成物、及びそのＰＳＭＡにより仲介された疾患又は病状を治療する薬剤の調製における用途、特に、抗がん剤の調製における用途に関する。
【背景技術】
【0003】
ここでの記載は、必ずしも従来技術を構成するものではなく、本開示に関連する背景情報のみを提供する。
【0004】
米国がん協会の２０１９年の統計データによると、米国の男性の新規癌症例数には、前立腺がんが１７４６５０例で、ランキングで１位になっている（ＣＡ ＣＡＮＣＥＲ Ｊ ＣＬＩＮ ２０１９； ６９： ７-３４）。臨床的局所性疾患には、一般的に手術と放射治療が選択される。局所的進行性又は転移性疾患には、一般的に、まず、手術又は化学方式でアンドロゲン（ＡＤＴ）を除去する治療が採用される。去勢抵抗（ＣＲＰＣ）の初期は、Ｓｉｐｕｌｅｕｃｅｌ－Ｔ細胞免疫療法が選択可能であり、転移性去勢抵抗段階（ｍＣＲＰＣ）の患者は、場合に応じてアンドロゲン阻害薬、アンドロゲン受容体拮抗薬、骨転移に対する放射線療法薬及び微小管に作用する化学療法薬などの薬物治療が選択可能である。しかし、何れの治療法も数カ月の生存期間しか延長できず、効果的な治療法を求めなければならない（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｕｒｏｌｏｇｙ， ６６（６）， １１９０-１１９３； Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ５９（２）， １７７-１８２．）。
【0005】
前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）は、前立腺上皮細胞により発現される以外、非前立腺組織、例えば、小腸、腎近位尿細管や唾液腺により発現されてもよいが、そのレベルが前立腺組織よりもはるかに低い。ところで、ＰＳＭＡは、前立腺がん細胞に高発現され、特に転移性疾患、ホルモン抵抗性疾患及び高度病変における発現が最も高い。また、ＰＳＭＡは更に、全ての固形腫瘍の新生血管の内皮細胞に高発現されるが、正常血管には発現されないので、固形腫瘍治療の標的ともされる（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｖｏｌ． ３， ８１－８５， Ｊａｎｕａｒｙ １９９７； Ｕｒｏｌｏｇｉｃ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ： Ｓｅｍｉｎａｒｓ ａｎｄ Ｏｒｉｇｉｎａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ， １（１）， １８-２８．； Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２０１０ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １５； １６（２２）： ５４１４-５４２３．）。アンドロゲンの除去又はアンドロゲン受容体拮抗薬による治療は、何れも前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）の発現を引き上げることができ（Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ ２０１７； ５８：８１-８４）、これにより、標的療法と伝統的なホルモン療法との併用治療のベースが提供される。
【0006】
ＰＳＭＡは、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼＩＩ（Ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ ＩＩ、ＧＣＰＩＩ）に属し、神経系においては、ＮＡＡＬＤａｓｅとして、ＮＡＡＧを酵素分解してグルタミン酸を生成し、グルタミン酸の神経伝達に関連している。小腸においては、ＦＯＬＨ１として、葉酸－ポリ－γ－グルタミン酸（ｆｏｌｙｌ－ｐｏｌｙ－γ－ｇｌｕｔａｍａｔｅ、ＦＰＧｎ）を分解して葉酸を生成し、葉酸の代謝に関連している（Ｃｕｒｒ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ． ２０１２； １９（６）： ８５６-８７０．）。しかし、前立腺においては、ＰＳＭＡとして上皮細胞に発現され、前立腺がんの発生に関連している。ＰＳＭＡは、細胞内における１９個、膜貫通領域における２４個、細胞外における７０７個という７５０個のアミノ酸からなる。結晶の結果によると、細胞外部分は、それぞれプロテアーゼ様ドメイン、先端ドメイン及びＣ末端ドメインという３つのドメインから構成される。三者とも基質との結合に関与し、前の両者は基質と直接結合するが、Ｃ末端ドメインは、ＰＳＭＡの二量体への形成において機能する（Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ （２００６） ２５， １３７５-１３８４）。グルタミン酸カルボキシペプチダーゼＩＩ（ＧＣＰＩＩ）及びそのスプライス変異体、パラログの研究には、限りがある。ＰＳＭ’を代表とするスプライス変異体のほとんどは、正常な前立腺組織細胞の内部に存在する。最も深く研究されたＧＣＰＩＩホモログであるＧＣＰＩＩＩ又はＮＡＡＬＡＤａｓｅ ＩＩは、それ自体が有効である薬物標的として、正常なＧＣＰＩＩ酵素活性の欠乏を補うことができ、ＧＣＰＩＩと６８％の配列類似性を有する（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２０１２， １９， １３１６－１３２２； Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， Ｌａｎｄｍａｒｋ， ２４， ６４８－６８７， Ｍａｒｃｈ １， ２０１９）。
【0007】
抗体－薬物複合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＡＤＣ）は、モノクローナル抗体又は抗体断片をリンカー化合物により生物活性を有する細胞毒素に連結し、抗体の正常細胞及び腫瘍細胞表面抗原に対する結合の特異性及び細胞毒性物質の高効率が活用されると共に、抗体の治療効果が比較的に小さいこと、及び毒性物質の毒性や副作用が大きすぎることといった欠陥が回避される。これはつまり、従来の化学療法薬と比べて、抗体－薬物複合体は腫瘍細胞をより正確に殺し、正常細胞への影響を低減させることができる。
【0008】
現在、臨床又は臨床研究に適用されたＡＤＣ薬物が複数種あり、例えば、Ｋａｄｃｙｌａは、Ｈｅｒ２を標的とするトラスツズマブとＤＭ１からなるＡＤＣ薬剤である。同時に、臨床治療研究に適用された、ＰＳＭＡを標的とするＡＤＣ薬物もある。Ｃｙｔｏｇｅｎ社のＰＳＭＡ－ＡＤＣは、第２相臨床試験段階にあり、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ社のＭＥＤＩ－３７２６及びＢＺＬ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｉｎｃ社のＭＬＮ－２７０４は、第１相臨床試験の終了後、効果不良のために研究を中止した。異なる対策による新規のＡＤＣ薬物の開発は、広い見通しを持っている。
【発明の概要】
【0009】
本開示は、抗ＰＳＭＡ抗体－ＡＤＣ及びその用途に関し、抗ＰＳＭＡ抗体又は抗原結合断片と細胞毒性物質であるエキサテカン類似体とを複合したＡＤＣ薬物を提供する。
【0010】
本開示は、一般式（Ｐｃ－Ｌ－Ｙ－Ｄ）で示される抗体－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩を提供し、
そのうち、
Ｙは、－Ｏ－（ＣＲａＲｂ）ｍ－ＣＲ１Ｒ２－Ｃ（Ｏ）－、－Ｏ－ＣＲ１Ｒ２－（ＣＲａＲｂ）ｍ－、－Ｏ－ＣＲ１Ｒ２－、－ＮＨ－（ＣＲａＲｂ）ｍ－ＣＲ１Ｒ２－Ｃ（Ｏ）－及び－Ｓ－（ＣＲａＲｂ）ｍ－ＣＲ１Ｒ２－Ｃ（Ｏ）－から選ばれ、
ＲａとＲｂは同一又は異なり、且つそれぞれ独立して水素原子、重水素原子、ハロゲン、アルキル基、ハロアルキル基、重水素化アルキル基、アルコキシ基、ヒドロキシ基、アミノ基、シアノ基、ニトロ基、ヒドロキシアルキル基、シクロアルキル基及びヘテロシクリル基から選ばれ、或いは、ＲａとＲｂは、それらに連結された炭素原子と共にシクロアルキル基又はヘテロシクリル基を形成し、
Ｒ１は、ハロゲン、ハロアルキル基、重水素化アルキル基、シクロアルキル基、シクロアルキルアルキル基、アルコキシアルキル基、ヘテロシクリル基、アリール基及びヘテロアリール基から選ばれ、Ｒ２は、水素原子、ハロゲン、ハロアルキル基、重水素化アルキル基、シクロアルキル基、シクロアルキルアルキル基、アルコキシアルキル基、ヘテロシクリル基、アリール基及びヘテロアリール基から選ばれ、或いは、Ｒ１とＲ２は、それらに連結された炭素原子と共にシクロアルキル基又はヘテロシクリル基を形成し、
或いは、ＲａとＲ２は、それらに連結された炭素原子と共にシクロアルキル基又はヘテロシクリル基を形成し、
ｍは０～４の整数であり、非限定的な実例として、例えば、ｍは０、１、２、３及び４から選ばれ、
ｎは１～１０で、ｎは小数又は整数であり、好ましくは、ｎは１～８、より好ましくは３～８、更に好ましくは３～７、最も好ましくは６～７である。
Ｌは、リンカーユニットであり、
Ｐｃは、抗ＰＳＭＡ抗体又はその抗原結合断片であり、好ましくは、上記抗ＰＳＭＡ抗体又はその抗原結合断片は、ＰＳＭＡ細胞外ドメインに特異的に結合する。
【化1】
Ｙは、－Ｏ－（ＣＲａＲｂ）ｍ－ＣＲ１Ｒ２－Ｃ（Ｏ）－、－Ｏ－ＣＲ１Ｒ２－（ＣＲａＲｂ）ｍ－、－Ｏ－ＣＲ１Ｒ２－、－ＮＨ－（ＣＲａＲｂ）ｍ－ＣＲ１Ｒ２－Ｃ（Ｏ）－及び－Ｓ－（ＣＲａＲｂ）ｍ－ＣＲ１Ｒ２－Ｃ（Ｏ）－から選ばれ、
ＲａとＲｂは同一又は異なり、且つそれぞれ独立して水素原子、重水素原子、ハロゲン、アルキル基、ハロアルキル基、重水素化アルキル基、アルコキシ基、ヒドロキシ基、アミノ基、シアノ基、ニトロ基、ヒドロキシアルキル基、シクロアルキル基及びヘテロシクリル基から選ばれ、或いは、ＲａとＲｂは、それらに連結された炭素原子と共にシクロアルキル基又はヘテロシクリル基を形成し、
Ｒ１は、ハロゲン、ハロアルキル基、重水素化アルキル基、シクロアルキル基、シクロアルキルアルキル基、アルコキシアルキル基、ヘテロシクリル基、アリール基及びヘテロアリール基から選ばれ、Ｒ２は、水素原子、ハロゲン、ハロアルキル基、重水素化アルキル基、シクロアルキル基、シクロアルキルアルキル基、アルコキシアルキル基、ヘテロシクリル基、アリール基及びヘテロアリール基から選ばれ、或いは、Ｒ１とＲ２は、それらに連結された炭素原子と共にシクロアルキル基又はヘテロシクリル基を形成し、
或いは、ＲａとＲ２は、それらに連結された炭素原子と共にシクロアルキル基又はヘテロシクリル基を形成し、
ｍは０～４の整数であり、非限定的な実例として、例えば、ｍは０、１、２、３及び４から選ばれ、
ｎは１～１０で、ｎは小数又は整数であり、好ましくは、ｎは１～８、より好ましくは３～８、更に好ましくは３～７、最も好ましくは６～７である。
Ｌは、リンカーユニットであり、
Ｐｃは、抗ＰＳＭＡ抗体又はその抗原結合断片であり、好ましくは、上記抗ＰＳＭＡ抗体又はその抗原結合断片は、ＰＳＭＡ細胞外ドメインに特異的に結合する。
【0011】
幾つかの実施形態において、上記の一般式（Ｐｃ－Ｌ－Ｙ－Ｄ）で示される抗体－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩であって、上記抗ＰＳＭＡ抗体又はその抗原結合断片は重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含み、そのうち、上記重鎖可変領域は配列番号１で示される重鎖可変領域と同じ配列であるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含み、上記軽鎖可変領域は配列番号２で示される軽鎖可変領域と同じ配列であるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含む。
【0012】
幾つかの実施形態において、上記の一般式（Ｐｃ－Ｌ－Ｙ－Ｄ）で示される抗体－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩であって、上記抗ＰＳＭＡ抗体又はその抗原結合断片は重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含み、そのうち、上記重鎖可変領域はそれぞれ配列番号３、配列番号４と配列番号５で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含み、上記軽鎖可変領域はそれぞれ配列番号６、配列番号７と配列番号８で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含む。
【0013】
幾つかの実施形態において、上記の一般式（Ｐｃ－Ｌ－Ｙ－Ｄ）で示される抗体－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩であって、上記抗ＰＳＭＡ抗体はマウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である。
【0014】
幾つかの実施形態において、上記の一般式（Ｐｃ－Ｌ－Ｙ－Ｄ）で示される抗体－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩であって、上記抗ＰＳＭＡ抗体又はその抗原結合断片は重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含み、そのうち、上記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１で示され、又はそれと少なくとも９０％～１００％の配列同一性を有し、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は少なくとも１００％の配列同一性を含むが、これらに限定されず、及び上記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号２で示され、又はそれと少なくとも９０％～１００％の配列同一性を有し、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は少なくとも１００％の配列同一性を含むが、これらに限定されない。
【0015】
幾つかの実施形態において、上記の一般式（Ｐｃ－Ｌ－Ｙ－Ｄ）で示される抗体－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩であって、上記抗ＰＳＭＡ抗体又はその抗原結合断片は、配列が配列番号１で示される重鎖可変領域と配列が配列番号２で示される軽鎖可変領域を含む。
【0016】
幾つかの実施形態において、上記の一般式（Ｐｃ－Ｌ－Ｙ－Ｄ）で示される抗体－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩であって、上記抗ＰＳＭＡ抗体は、抗体重鎖定常領域と軽鎖定常領域を含み、好ましくは、上記重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３とＩｇＧ４の定常領域及びその通常の変異体から選ばれ、上記軽鎖定常領域はヒト抗体κとλ鎖の定常領域及びその通常の変異体から選ばれる。
【0017】
幾つかの実施形態において、上記の一般式（Ｐｃ－Ｌ－Ｙ－Ｄ）で示される抗体－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩であって、上記抗ＰＳＭＡ抗体は配列番号９で示される重鎖と配列番号１０で示される軽鎖を含む。
【0018】
幾つかの実施形態において、上記の一般式（Ｐｃ－Ｌ－Ｙ－Ｄ）で示される抗体－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩であって、ｎは１～８、好ましくは３～８、より好ましくは３～７であり、ｎは小数又は整数である。
【0019】
幾つかの実施形態において、上記の一般式（Ｐｃ－Ｌ－Ｙ－Ｄ）で示される抗体－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩であって、
そのうち、
Ｙは、－Ｏ－（ＣＲａＲｂ）ｍ－ＣＲ１Ｒ２－Ｃ（Ｏ）－であり、
ＲａとＲｂは同一又は異なり、且つそれぞれ独立して水素原子、重水素原子、ハロゲン及びＣ１－６アルキル基から選ばれ、
Ｒ１は、ハロアルキル基又はＣ３－６シクロアルキル基であり、
Ｒ２は、水素原子、ハロアルキル基及びＣ３－６シクロアルキル基から選ばれ、
或いは、Ｒ１とＲ２は、それらに連結された炭素原子と共にＣ３－６シクロアルキル基を形成し、
ｍは、０又は１である。
そのうち、
Ｙは、－Ｏ－（ＣＲａＲｂ）ｍ－ＣＲ１Ｒ２－Ｃ（Ｏ）－であり、
ＲａとＲｂは同一又は異なり、且つそれぞれ独立して水素原子、重水素原子、ハロゲン及びＣ１－６アルキル基から選ばれ、
Ｒ１は、ハロアルキル基又はＣ３－６シクロアルキル基であり、
Ｒ２は、水素原子、ハロアルキル基及びＣ３－６シクロアルキル基から選ばれ、
或いは、Ｒ１とＲ２は、それらに連結された炭素原子と共にＣ３－６シクロアルキル基を形成し、
ｍは、０又は１である。
【0020】
幾つかの実施形態において、上記の一般式（Ｐｃ－Ｌ－Ｙ－Ｄ）で示される抗体－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩であって、Ｙは、
から選ばれ、
そのうち、ＹのＯ末端は、リンカーユニットＬに連結される。
【化2】
そのうち、ＹのＯ末端は、リンカーユニットＬに連結される。
【0021】
幾つかの実施形態において、上記の一般式（Ｐｃ－Ｌ－Ｙ－Ｄ）で示される抗体－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩であって、リンカーユニット－Ｌ－は－Ｌ１－Ｌ２－Ｌ３－Ｌ４－であり、
Ｌ１は－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－Ｗ－Ｃ（Ｏ）－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－ＮＲ３－Ｗ－Ｃ（Ｏ）－又は－Ｃ（Ｏ）－Ｗ－Ｃ（Ｏ）－から選ばれ、そのうち、ＷはＣ１－８アルキル基、Ｃ１－８アルキル基－シクロアルキル基及び１～８個の原子の直鎖ヘテロアルキル基から選ばれ、上記ヘテロアルキル基はＮ、Ｏ及びＳから選ばれる１～３個のヘテロ原子を含み、そのうち、上記Ｃ１－８アルキレン基、Ｃ１－８アルキル基－シクロアルキル基及び直鎖ヘテロアルキル基は、それぞれ独立的に、任意選択的に更にハロゲン、ヒドロキシ基、シアノ基、アミノ基、アルキル基、クロロアルキル基、重水素化アルキル基、アルコキシ基及びシクロアルキル基から選ばれる１つ又は複数の置換基で置換され、
Ｌ２は－ＮＲ４（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐ１ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）－、－ＮＲ４（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐ１ＣＨ２Ｃ（Ｏ）－、－Ｓ（ＣＨ２）ｐ１Ｃ（Ｏ）－及び化学結合から選ばれ、そのうち、ｐ１は１～２０の整数であり、
Ｌ３は、２～７個のアミノ酸残基からなるペプチド残基であり、そのうち、上記アミノ酸はフェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、リジン（Ｋ）、シトルリン、セリン（Ｓ）、グルタミン酸（Ｅ）及びアスパラギン酸（Ｄ）のうちのアミノ酸からなるアミノ酸残基から選ばれ、且つ任意選択的に更にハロゲン、ヒドロキシ基、シアノ基、アミノ基、アルキル基、クロロアルキル基、重水素化アルキル基、アルコキシ基及びシクロアルキル基から選ばれる１つ又は複数の置換基で置換され、
Ｌ４は、－ＮＲ５（ＣＲ６Ｒ７）ｔ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ５、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ５（ＣＨ２）ｔ－及び化学結合から選ばれ、そのうち、ｔは１～６の整数であり、
Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は同一又は異なり、且つそれぞれ独立して水素原子、アルキル基、ハロアルキル基、重水素化アルキル基及びヒドロキシアルキル基から選ばれ、
Ｒ６とＲ７は同一又は異なり、且つそれぞれ独立して水素原子、ハロゲン、アルキル基、ハロアルキル基、重水素化アルキル基及びヒドロキシアルキル基から選ばれる。
Ｌ１は－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－Ｗ－Ｃ（Ｏ）－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－ＮＲ３－Ｗ－Ｃ（Ｏ）－又は－Ｃ（Ｏ）－Ｗ－Ｃ（Ｏ）－から選ばれ、そのうち、ＷはＣ１－８アルキル基、Ｃ１－８アルキル基－シクロアルキル基及び１～８個の原子の直鎖ヘテロアルキル基から選ばれ、上記ヘテロアルキル基はＮ、Ｏ及びＳから選ばれる１～３個のヘテロ原子を含み、そのうち、上記Ｃ１－８アルキレン基、Ｃ１－８アルキル基－シクロアルキル基及び直鎖ヘテロアルキル基は、それぞれ独立的に、任意選択的に更にハロゲン、ヒドロキシ基、シアノ基、アミノ基、アルキル基、クロロアルキル基、重水素化アルキル基、アルコキシ基及びシクロアルキル基から選ばれる１つ又は複数の置換基で置換され、
Ｌ２は－ＮＲ４（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐ１ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）－、－ＮＲ４（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐ１ＣＨ２Ｃ（Ｏ）－、－Ｓ（ＣＨ２）ｐ１Ｃ（Ｏ）－及び化学結合から選ばれ、そのうち、ｐ１は１～２０の整数であり、
Ｌ３は、２～７個のアミノ酸残基からなるペプチド残基であり、そのうち、上記アミノ酸はフェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、リジン（Ｋ）、シトルリン、セリン（Ｓ）、グルタミン酸（Ｅ）及びアスパラギン酸（Ｄ）のうちのアミノ酸からなるアミノ酸残基から選ばれ、且つ任意選択的に更にハロゲン、ヒドロキシ基、シアノ基、アミノ基、アルキル基、クロロアルキル基、重水素化アルキル基、アルコキシ基及びシクロアルキル基から選ばれる１つ又は複数の置換基で置換され、
Ｌ４は、－ＮＲ５（ＣＲ６Ｒ７）ｔ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ５、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ５（ＣＨ２）ｔ－及び化学結合から選ばれ、そのうち、ｔは１～６の整数であり、
Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は同一又は異なり、且つそれぞれ独立して水素原子、アルキル基、ハロアルキル基、重水素化アルキル基及びヒドロキシアルキル基から選ばれ、
Ｒ６とＲ７は同一又は異なり、且つそれぞれ独立して水素原子、ハロゲン、アルキル基、ハロアルキル基、重水素化アルキル基及びヒドロキシアルキル基から選ばれる。
【0022】
幾つかの実施形態において、上記の一般式（Ｐｃ－Ｌ－Ｙ－Ｄ）で示される抗体－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩であって、リンカーユニット－Ｌ－は－Ｌ１－Ｌ２－Ｌ３－Ｌ４－であり、
Ｌ１は
であり、ｓ１は２～８の整数であり、
Ｌ２は化学結合であり、
Ｌ３はテトラペプチド残基であり、好ましくは、Ｌ３はＧＧＦＧ（配列番号１３）（グリシン－グリシン－フェニルアラニン－グリシン）のテトラペプチド残基であり、
Ｌ４は、－ＮＲ５（ＣＲ６Ｒ７）ｔ－であり、Ｒ５、Ｒ６又はＲ７は同一又は異なり、且つそれぞれ独立して水素原子又はアルキル基であり、ｔは１又は２であり、
そのうち、上記Ｌ１末端はＰｃに連結され、Ｌ４末端はＹに連結される。
Ｌ１は
【化3】
Ｌ２は化学結合であり、
Ｌ３はテトラペプチド残基であり、好ましくは、Ｌ３はＧＧＦＧ（配列番号１３）（グリシン－グリシン－フェニルアラニン－グリシン）のテトラペプチド残基であり、
Ｌ４は、－ＮＲ５（ＣＲ６Ｒ７）ｔ－であり、Ｒ５、Ｒ６又はＲ７は同一又は異なり、且つそれぞれ独立して水素原子又はアルキル基であり、ｔは１又は２であり、
そのうち、上記Ｌ１末端はＰｃに連結され、Ｌ４末端はＹに連結される。
【0023】
幾つかの実施形態において、上記の一般式（Ｐｃ－Ｌ－Ｙ－Ｄ）で示される抗体－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩であって、－Ｌ－は、
である。
【化4】
【0024】
幾つかの実施形態において、上記の一般式（Ｐｃ－Ｌ－Ｙ－Ｄ）で示される抗体－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩であって、－Ｌ－Ｙ－は、任意選択的に
から選ばれる。
【化5】
【0025】
幾つかの実施形態において、上記の一般式（Ｐｃ－Ｌ－Ｙ－Ｄ）で示される抗体－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩であって、それは、一般式（Ｐｃ－Ｌａ－Ｙ－Ｄ）で示される抗体－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩であり、
そのうち、
Ｗ、Ｌ２、Ｌ３、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７は、上記のリンカーユニット－Ｌ－に定義された通りであり、
Ｐｃ、ｎ、Ｒ１、Ｒ２、ｍは、一般式（Ｐｃ－Ｌ－Ｙ－Ｄ）に定義された通りであり、
具体的に、Ｐｃは抗ＰＳＭＡ抗体又はその抗原結合断片であり、
ｍは０～４の整数であり、非限定的な実例として、例えば、ｍは０、１、２、３及び４から選ばれ、
ｎは１～１０で、ｎは小数又は整数であり、好ましくは、ｎは１～８、より好ましくは３～８、更に好ましくは３～７、最も好ましくは６～７であり、
Ｒ１は、ハロゲン、ハロアルキル基、重水素化アルキル基、シクロアルキル基、シクロアルキルアルキル基、アルコキシアルキル基、ヘテロシクリル基、アリール基及びヘテロアリール基から選ばれ、Ｒ２は、水素原子、ハロゲン、ハロアルキル基、重水素化アルキル基、シクロアルキル基、シクロアルキルアルキル基、アルコキシアルキル基、ヘテロシクリル基、アリール基及びヘテロアリール基から選ばれ、或いは、Ｒ１とＲ２は、それらに連結された炭素原子と共にシクロアルキル基又はヘテロシクリル基を形成し、
Ｗは、Ｃ１－８アルキル基、Ｃ１－８アルキル基－シクロアルキル基又は１～８個の原子の直鎖ヘテロアルキル基から選ばれ、上記ヘテロアルキル基は、Ｎ、Ｏ及びＳから選ばれる１～３個のヘテロ原子を含み、そのうち、上記Ｃ１－８アルキル基、シクロアルキル基及び直鎖ヘテロアルキル基は、それぞれ独立的に、任意選択的に更にハロゲン、ヒドロキシ基、シアノ基、アミノ基、アルキル基、クロロアルキル基、重水素化アルキル基、アルコキシ基及びシクロアルキル基から選ばれる１つ又は複数の置換基で置換され、
Ｌ２は－ＮＲ４（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐ１ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）－、－ＮＲ４（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐ１ＣＨ２Ｃ（Ｏ）－、－Ｓ（ＣＨ２）ｐ１Ｃ（Ｏ）－及び化学結合から選ばれ、そのうち、ｐ１は１～２０の整数であり、
Ｌ３は、２～７個のアミノ酸残基からなるペプチド残基であり、そのうち、上記アミノ酸残基はフェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、リジン（Ｋ）、シトルリン、セリン（Ｓ）、グルタミン酸（Ｅ）及びアスパラギン酸（Ｄ）のうちのアミノ酸からなるアミノ酸残基から選ばれ、且つ任意選択的に更にハロゲン、ヒドロキシ基、シアノ基、アミノ基、アルキル基、クロロアルキル基、重水素化アルキル基、アルコキシ基及びシクロアルキル基から選ばれる１つ又は複数の置換基で置換され、
Ｒ５は水素原子、アルキル基、ハロアルキル基、重水素化アルキル基及びヒドロキシアルキル基から選ばれ、
Ｒ６とＲ７は同一又は異なり、且つそれぞれ独立して水素原子、ハロゲン、アルキル基、ハロアルキル基、重水素化アルキル基及びヒドロキシアルキル基から選ばれる。
【化6】
Ｗ、Ｌ２、Ｌ３、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７は、上記のリンカーユニット－Ｌ－に定義された通りであり、
Ｐｃ、ｎ、Ｒ１、Ｒ２、ｍは、一般式（Ｐｃ－Ｌ－Ｙ－Ｄ）に定義された通りであり、
具体的に、Ｐｃは抗ＰＳＭＡ抗体又はその抗原結合断片であり、
ｍは０～４の整数であり、非限定的な実例として、例えば、ｍは０、１、２、３及び４から選ばれ、
ｎは１～１０で、ｎは小数又は整数であり、好ましくは、ｎは１～８、より好ましくは３～８、更に好ましくは３～７、最も好ましくは６～７であり、
Ｒ１は、ハロゲン、ハロアルキル基、重水素化アルキル基、シクロアルキル基、シクロアルキルアルキル基、アルコキシアルキル基、ヘテロシクリル基、アリール基及びヘテロアリール基から選ばれ、Ｒ２は、水素原子、ハロゲン、ハロアルキル基、重水素化アルキル基、シクロアルキル基、シクロアルキルアルキル基、アルコキシアルキル基、ヘテロシクリル基、アリール基及びヘテロアリール基から選ばれ、或いは、Ｒ１とＲ２は、それらに連結された炭素原子と共にシクロアルキル基又はヘテロシクリル基を形成し、
Ｗは、Ｃ１－８アルキル基、Ｃ１－８アルキル基－シクロアルキル基又は１～８個の原子の直鎖ヘテロアルキル基から選ばれ、上記ヘテロアルキル基は、Ｎ、Ｏ及びＳから選ばれる１～３個のヘテロ原子を含み、そのうち、上記Ｃ１－８アルキル基、シクロアルキル基及び直鎖ヘテロアルキル基は、それぞれ独立的に、任意選択的に更にハロゲン、ヒドロキシ基、シアノ基、アミノ基、アルキル基、クロロアルキル基、重水素化アルキル基、アルコキシ基及びシクロアルキル基から選ばれる１つ又は複数の置換基で置換され、
Ｌ２は－ＮＲ４（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐ１ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）－、－ＮＲ４（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐ１ＣＨ２Ｃ（Ｏ）－、－Ｓ（ＣＨ２）ｐ１Ｃ（Ｏ）－及び化学結合から選ばれ、そのうち、ｐ１は１～２０の整数であり、
Ｌ３は、２～７個のアミノ酸残基からなるペプチド残基であり、そのうち、上記アミノ酸残基はフェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、リジン（Ｋ）、シトルリン、セリン（Ｓ）、グルタミン酸（Ｅ）及びアスパラギン酸（Ｄ）のうちのアミノ酸からなるアミノ酸残基から選ばれ、且つ任意選択的に更にハロゲン、ヒドロキシ基、シアノ基、アミノ基、アルキル基、クロロアルキル基、重水素化アルキル基、アルコキシ基及びシクロアルキル基から選ばれる１つ又は複数の置換基で置換され、
Ｒ５は水素原子、アルキル基、ハロアルキル基、重水素化アルキル基及びヒドロキシアルキル基から選ばれ、
Ｒ６とＲ７は同一又は異なり、且つそれぞれ独立して水素原子、ハロゲン、アルキル基、ハロアルキル基、重水素化アルキル基及びヒドロキシアルキル基から選ばれる。
【0026】
幾つかの実施形態において、上記の何れか一項に記載の一般式（Ｐｃ－Ｌ－Ｙ－Ｄ）で示される抗体－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩であって、それは、一般式（Ｐｃ－Ｌｂ－Ｙ－Ｄ）で示される抗体－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩であり、
そのうち、
ｓ１は、２～８の整数であり、
Ｐｃ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、ｍ及びｎは、一般式（Ｐｃ－Ｌａ－Ｙ－Ｄ）に定義された通りである。
【化7】
ｓ１は、２～８の整数であり、
Ｐｃ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、ｍ及びｎは、一般式（Ｐｃ－Ｌａ－Ｙ－Ｄ）に定義された通りである。
【0027】
幾つかの実施形態において、上記の何れか一項に記載の一般式（Ｐｃ－Ｌ－Ｙ－Ｄ）で示される抗体－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩であって、上記抗体－薬物複合体は、
から選ばれ、そのうち、Ｐｃとｎは、一般式（Ｐｃ－Ｌ－Ｙ－Ｄ）に定義された通りであリ、具体的に、Ｐｃは抗ＰＳＭＡ抗体又はその抗原結合断片、又は上記の何れか一項に記載の抗ＰＳＭＡ抗体であり、
ｎは１～１０で、ｎは小数又は整数であり、好ましくは、ｎは１～８、より好ましくは３～８、最も好ましくは３～７、最も好ましくは６～７である。
【化8】
ｎは１～１０で、ｎは小数又は整数であり、好ましくは、ｎは１～８、より好ましくは３～８、最も好ましくは３～７、最も好ましくは６～７である。
【0028】
幾つかの実施形態において、上記の何れか一項に記載の一般式（Ｐｃ－Ｌ－Ｙ－Ｄ）で示される抗体－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩であって、上記抗体－薬物複合体は、
であり、そのうち、
ｎは１～８、好ましくは３～８であり、ｎは小数又は整数であり、
ＰＭは抗ＰＳＭＡ抗体であり、それは配列番号９で示される重鎖と配列番号１０で示される軽鎖を含む。
【化9】
ｎは１～８、好ましくは３～８であり、ｎは小数又は整数であり、
ＰＭは抗ＰＳＭＡ抗体であり、それは配列番号９で示される重鎖と配列番号１０で示される軽鎖を含む。
【0029】
本開示は、一般式（Ｐｃ－Ｌａ－Ｙ－Ｄ）で示される抗体－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩を調製する方法を更に提供し、それは、
還元されたＰｃであるＰｃ’を、一般式（Ｌａ－Ｙ－Ｄ）で示される化合物とカップリング反応させ、一般式（Ｐｃ－Ｌａ－Ｙ－Ｄ）で示される化合物を得るステップを含み、
そのうち、
Ｐｃは抗ＰＳＭＡ抗体又はその抗原結合断片であり、
ｎ、ｍ、Ｗ、Ｌ２、Ｌ３、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、上記の一般式（Ｐｃ－Ｌａ－Ｙ－Ｄ）に定義された通りである。
【化10】
そのうち、
Ｐｃは抗ＰＳＭＡ抗体又はその抗原結合断片であり、
ｎ、ｍ、Ｗ、Ｌ２、Ｌ３、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、上記の一般式（Ｐｃ－Ｌａ－Ｙ－Ｄ）に定義された通りである。
【0030】
本開示は、一般式（Ｐｃ－Ｌ’－Ｄ）で示される抗体薬物複合体を調製する方法を更に提供し、それは、
上記の反応において、Ｐｃ’を式（Ｌ’－Ｄ）で示される化合物とカップリング反応させ、一般式（Ｐｃ－Ｌ’－Ｄ）で示される化合物を得るステップを含み、そのうち、
Ｐｃは、上記の抗ＰＳＭＡ抗体又はその抗原結合断片であり、Ｐｃ’は還元されたＰｃであり、
ｎは、一般式（Ｐｃ－Ｌ－Ｙ－Ｄ）に定義された通りである。
【化11】
Ｐｃは、上記の抗ＰＳＭＡ抗体又はその抗原結合断片であり、Ｐｃ’は還元されたＰｃであり、
ｎは、一般式（Ｐｃ－Ｌ－Ｙ－Ｄ）に定義された通りである。
【0031】
本開示は、ＰＭ－９－Ａで示される抗体薬物複合体を調製する方法を更に提供し、それは、
ＰＭ’を式９－Ａで示される化合物とカップリング反応させ、一般式（ＰＭ－９－Ａ）で示される化合物を得るステップを含み、そのうち、
ｎは１～８、好ましくは３～８であり、ｎは小数又は整数であり、
ＰＭは抗ＰＳＭＡ抗体であり、それは配列番号９で示される重鎖と配列番号１０で示される軽鎖を含み、
ＰＭ’は、ＰＭを還元して得られる。
【化12】
ｎは１～８、好ましくは３～８であり、ｎは小数又は整数であり、
ＰＭは抗ＰＳＭＡ抗体であり、それは配列番号９で示される重鎖と配列番号１０で示される軽鎖を含み、
ＰＭ’は、ＰＭを還元して得られる。
【0032】
幾つかの実施形態において、ｎは抗体－薬物複合体の薬物負荷量を示し、ＤＡＲ値と呼ばれてもよく、通常の方法、例えば、ＵＶ／可視分光法、質量分析、ＥＬＩＳＡ試験とＨＰＬＣにより測定可能であり、幾つかの実施形態において、ｎは０～１０、好ましくは１～１０、より好ましくは１～８、又は２～８、又は２～７、又は２～４、又は３～８、又は３～７、又は３～６、又は４～７、又は４～６、又は４～５の平均値であり、幾つかの実施形態において、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０の平均値である。
【0033】
別の態様において、本開示は、本開示に係る抗体－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩と、１種又は複数種の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又はベクターとを含む医薬組成物を提供する。幾つかの実施形態において、上記単位用量の医薬組成物は、０．１ ｍｇ～３０００ ｍｇ又は１ ｍｇ～１０００ ｍｇの上記抗ＰＳＭＡ抗体又は上記抗体薬物複合体を含む。
【0034】
別の態様において、本開示は、本開示に係る抗体－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩、或いはそれらを含む医薬組成物の薬剤としての用途を提供する。
【0035】
別の態様において、本開示は、本開示に係る抗体－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩或いはそれらを含む医薬組成物の、ＰＳＭＡにより仲介された疾患又は病状を治療するための薬剤の調製における用途を提供し、上記ＰＳＭＡにより仲介された疾患又は病状は、ＰＳＭＡ高発現がん、ＰＳＭＡ中等発現がん又はＰＳＭＡ低発現がんが好ましい。
【0036】
別の態様において、本開示は、本開示に係る抗体－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩、或いはそれらを含む医薬組成物の、がんを治療又は予防するための薬剤の調製における用途を提供し、上記がんは、頭頸部扁平上皮がん、頭頸部がん、脳がん、神経膠腫、多形性膠芽腫、神経芽細胞腫、中枢神経系がん、神経内分泌腫瘍、咽頭がん、鼻咽頭がん、食道がん、甲状腺がん、悪性胸膜中皮腫、肺がん、乳がん、肝がん、肝細胞腫、肝細胞がん、肝胆がん、膵臓がん、胃がん、消化管がん、腸がん、結腸がん、結腸直腸がん、腎がん、透明細胞腎細胞がん、卵巣がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、膀胱がん、前立腺がん、精巣がん、皮膚がん、黒色腫、白血病、リンパ腫、骨がん、軟骨肉腫、骨髄腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、クルッケンベルグ腫瘍、骨髄増殖性腫瘍、扁平上皮がん、ユーイング肉腫、尿路上皮がん及びメルケル細胞がんが好ましく、好ましくは前立腺がんであり、より好ましくは、上記リンパ腫は、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、縦隔原発大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、Ｔ細胞／組織球に富む大細胞型Ｂ細胞リンパ腫及びリンパ形質細胞性リンパ腫から選ばれ、上記肺がんは、非小細胞肺がんと小細胞肺がんから選ばれ、上記白血病は、慢性骨髄細胞性白血病、急性骨髄細胞性白血病、リンパ球白血病、リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病及び骨髄細胞白血病から選ばれる。
【0037】
別の態様において、本開示は更に、腫瘍を治療及び／又は予防するための方法に関し、当該方法は、それを必要とする被験者に治療有効量の本開示に係る抗体－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩或いはそれらを含む医薬組成物を投与することを含み、好ましくは、上記腫瘍は、ＰＳＭＡの高発現に関連するがん、ＰＳＭＡ中等発現がん又はＰＳＭＡ低発現がんである。
【0038】
別の態様において、本開示は更に、腫瘍又はがんを治療又は予防するための方法に関し、当該方法は、それを必要とする被験者に治療有効量の本開示に係る抗体薬物複合体又はその薬学的に許容される塩或いはそれらを含む医薬組成物を投与することを含み、上記腫瘍及びがんは、頭頸部扁平上皮がん、頭頸部がん、脳がん、神経膠腫、多形性膠芽腫、神経芽細胞腫、中枢神経系がん、神経内分泌腫瘍、咽頭がん、鼻咽頭がん、食道がん、甲状腺がん、悪性胸膜中皮腫、肺がん、乳がん、肝がん、肝細胞腫、肝細胞がん、肝胆がん、膵臓がん、胃がん、消化管がん、腸がん、結腸がん、結腸直腸がん、腎がん、透明細胞腎細胞がん、卵巣がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、膀胱がん、前立腺がん、精巣がん、皮膚がん、黒色腫、白血病、リンパ腫、骨がん、軟骨肉腫、骨髄腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、クルッケンベルグ腫瘍、骨髄増殖性腫瘍、扁平上皮がん、ユーイング肉腫、尿路上皮がん及びメルケル細胞がんが好ましく、好ましくは前立腺がんであり、より好ましくは、上記リンパ腫は、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、縦隔原発大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、Ｔ細胞／組織球に富む大細胞型Ｂ細胞リンパ腫及びリンパ形質細胞性リンパ腫から選ばれ、上記肺がんは、非小細胞肺がん及び小細胞肺がんから選ばれ、上記白血病は、慢性骨髄細胞性白血病、急性骨髄細胞性白血病、リンパ球白血病、リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病及び骨髄細胞白血病から選ばれる。
【0039】
別の態様において、本開示は、上記抗ＰＳＭＡ抗体又はその抗体－薬物複合体を薬剤、好ましくは、がん又は腫瘍を治療する薬剤、より好ましくは、ＰＳＭＡにより仲介されたがんを治療する薬剤とすることを更に提供する。
【0040】
活性化合物（例えば、本開示に係るリガンド－薬物複合体、又はその薬学的に許容される塩）を任意の適切な経路による投与に適する形態にすることができ、活性化合物は単位用量の形態、又は被験者が単剤で自己投与可能な形態であることが好ましい。本開示に係る活性化合物又は組成物の単位用量の形態はトローチ剤、カプセル、カシェ剤、瓶詰めの薬液、ドラッグパウダー、顆粒剤、錠剤、坐剤、再生粉末又は液体製剤であってもよい。
【0041】
本開示に係る治療方法に使用される活性化合物又は組成物の投与量は、一般的に、疾患の重症度、被験者の体重及び活性化合物の相対効能によって変化される。一般的な目安として、好適な単位用量は０．１ ｍｇ～１０００ ｍｇであってもよい。
【0042】
本開示に係る医薬組成物は、活性化合物の他に、１種又は複数種の添加物を含んでもよく、上記添加物は充填剤、希釈剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤又は賦形剤などの成分から選ばれる。組成物は、投与方法によって、０．１～９９重量％の活性化合物を含んでもよい。
【0043】
本開示により提供されるＰＳＭＡ抗体及び抗体薬物複合体は、細胞表面抗原との良好な親和性、良好な細胞によるエンドサイトーシス効率及び強力な腫瘍阻害効率を有する共に、薬物応用範囲がより広く、腫瘍阻害効果と治療活性がより強く、安全性、薬物動態特性と創薬可能性（例えば、安定性）もより優れておりより、薬剤の臨床応用にはより適する。
【図面の簡単な説明】
【0044】
【図1A】本開示に係るＡＤＣ又は抗体の細胞ＭＤＡＰＣａとの体外結合能力である。
【図1B】本開示に係るＡＤＣ又は抗体の細胞ＬＮＣａＰとの体外結合能力である。
【図1C】本開示に係るＡＤＣ又は抗体の細胞２２Ｒｖ１との体外結合能力である。
【図1D】本開示に係るＡＤＣ又は抗体の細胞ＰＣ－３との体外結合能力である。
【図1E】本開示に係るＡＤＣ又は抗体の細胞ＤＵ １４５との体外結合能力である。
【図2A】抗体ＰＭのＬＮＣａＰ細胞における体外エンドサイトーシス実験であり、２ Ｋの細胞、１０％Ｕ－Ｌ ＩｇＧ ＦＢＳである。
【図2B】抗体ＰＭの２２Ｒｖ１細胞における体外エンドサイトーシス実験であり、２ Ｋの細胞、１０％Ｕ－Ｌ ＩｇＧ ＦＢＳである。
【図3A】本開示に係る異なるＡＤＣによるＬＮＣａＰ細胞に対する傷害作用であり、２ Ｋの細胞、４．５％のＦＢＳが用いられた。
【図3B】本開示における毒素（化合物２－Ｂ）によるＬＮＣａＰ細胞に対する傷害作用であり、２ Ｋの細胞、４．５％のＦＢＳが用いられた。
【図3C】本開示に係る異なるＡＤＣによる２２Ｒｖ１細胞に対する傷害作用であり、４ Ｋの細胞、４．５％のＦＢＳが用いられた。
【図3D】本開示における毒素（化合物２－Ｂ）による２２Ｒｖ１細胞に対する傷害作用であり、４ Ｋの細胞、４．５％のＦＢＳが用いられた。
【図3E】本開示に係る異なるＡＤＣによるＰＣ－３細胞に対する傷害作用であり、４ Ｋの細胞、４．５％のＦＢＳが用いられた。
【図3F】本開示における毒素（化合物２－Ｂ）によるＰＣ－３細胞に対する傷害作用であり、２ Ｋの細胞、４．５％のＦＢＳが用いられた。
【図4A】本開示に係る異なる用量のＡＤＣによるヒト前立腺がん細胞２２Ｒｖ１ヌードマウス移植腫瘍への阻害活性である。
【図4B】本開示に係る異なる用量のＡＤＣによるヒト前立腺がん細胞２２Ｒｖ１ヌードマウス移植腫瘍への阻害活性試験でのマウスの体重変化である。
【図5A】本開示に係る異なる用量のＡＤＣによるヒト前立腺がん細胞２２Ｒｖ１ヌードマウス移植腫瘍への阻害活性である。
【図5B】本開示に係る異なる用量のＡＤＣによるヒト前立腺がん細胞２２Ｒｖ１ヌードマウス移植腫瘍への阻害活性試験でのマウスの体重変化である。
【図6A】本開示に係る異なる用量のＡＤＣによるヒト前立腺がん細胞ＬＮＣａｐのＳＣＩＤ Ｂｅｉｇｈｅマウスにおける移植腫瘍への阻害活性である。
【図6B】本開示に係る異なる用量のＡＤＣによるヒト前立腺がん細胞ＬＮＣａｐのＳＣＩＤ Ｂｅｉｇｈｅマウスにおける移植腫瘍への阻害活性試験でのマウスの体重変化である。
【図7】本開示に係るＡＤＣ－２の薬物動態安定性であり、ここで、ＡＤＣの濃度は１００ μｇ／ｍＬである。
【図8】本開示に係るＡＤＣ－５の血漿安定性であり、ここで、ＡＤＣの濃度は１００ μｇ／ｍＬである。
【図9】ＡＤＣの投与による担腫瘍ヌードマウスの２２Ｒｖ１移植腫瘍への治療効果である。
【発明を実施するための形態】
【0045】
用語
別途に制限のない限り、本願に使用される技術と科学用語の全ては、当業者により一般的に理解されているものと一致している。本願中の記載と類似又は同等の任意の方法と材料により本開示を実施又は試験することができるが、本願には、好ましい方法と材料が記載されている。本開示の記載及び特許請求の時に、次の定義に従って下記用語が使用されている。
別途に制限のない限り、本願に使用される技術と科学用語の全ては、当業者により一般的に理解されているものと一致している。本願中の記載と類似又は同等の任意の方法と材料により本開示を実施又は試験することができるが、本願には、好ましい方法と材料が記載されている。本開示の記載及び特許請求の時に、次の定義に従って下記用語が使用されている。
【0046】
本開示において商品名が使用される場合は、当該商品名の製品の製剤、当該商品名の製品の薬剤及び活性薬物部分を含むことが意図されている。
【0047】
特に逆の説明がない限り、明細書及び特許請求の範囲で使用される用語は、下記の意味を有する。
【0048】
「薬剤」又は「毒素」という用語は、腫瘍細胞内にその正常な増殖を比較的強く破壊する化学分子を有することができる細胞毒性薬剤を指す。細胞毒性薬剤は、原則的に、十分に高い濃度であれば、細胞を死滅させることができるが、特異性が欠けているため、腫瘍細胞を傷害すると同時に、正常細胞のアポトーシスも招き、重篤な副作用を引き起こす。当該用語は細菌、真菌、植物又は動物由来の小分子毒素又は酵素活性毒素、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２及びＬｕの放射性同位体）、化学療法薬、抗生物質及び核酸分解酵素を含む。
【0049】
「リンカーユニット」、「リンカー」、「連結ユニット」又は「連結断片」という用語は、一端がリガンド（本開示では抗体）に連結され、他端が薬物に連結される化学構造断片又は結合であり、その他のリンカーに連結されてからリガンド又は薬物に連結されてもよい。
【0050】
リンカーは、１種又は複数種のリンカー要素を含んでもよい。例示的なリンカー要素は、６－マレイミドカプロイル（「ＭＣ」）、マレイミドプロピオニル（「ＭＰ」）、バリン－シトルリン（「ｖａｌ－ｃｉｔ」又は「ｖｃ」）、アラニン－フェニルアラニン（「ａｌａ－ｐｈｅ」）、ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル（「ＰＡＢ」）、Ｎ－スクシンイミジル４－（２－ピリジルチオ）ペンタノエート（「ＳＰＰ」）、Ｎ－スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１カルボキシレート（「ＳＭＣＣ」、本明細書では、「ＭＣＣ」とも呼ばれる）及びＮ－スクシンイミジル（４－ヨード－アセチル）アミノベンゾエート（「ＳＩＡＢ」）を含む。リンカーは、伸長体、スペーサー及びアミノ酸ユニットという要素のうちの１つ又は複数或いはそれらの組み合わせを含んでもよく、例えば、ＵＳ２００５－０２３８６４９Ａ１に記載された方法のようなこの分野での既知の方法により合成することができる。リンカーは、細胞において薬物を放出しやすくする「切断可能リンカー」であってもよい。例えば、酸不安定性リンカー（例えば、ヒドラゾン）、プロテアーゼ感受性（例えば、ペプチダーゼ感受性）リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー、又はジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２：１２７－１３１（１９９２）、米国特許Ｎｏ．５，２０８，０２０）を使用してもよい。
【0051】
リンカー要素は、下記のものを含むが、これらに限定されない：
次のような構造を持つ、ＭＣ＝６－マレイミドカプロイル：
Ｖａｌ－Ｃｉｔ又は「ｖｃ」＝バリン－シトルリン（プロテアーゼ切断可能リンカーにおける例示的なジペプチド）、
シトルリン＝２－アミノ－５－ウレイドペンタン酸、
ＰＡＢ＝ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル（「自己犠牲」リンカー要素の例）、
Ｍｅ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ＝Ｎ－メチル－バリン－シトルリン（そのうち、リンカーペプチド結合は、カテプシンＢにより切断されないように修飾された）、
ＭＣ（ＰＥＧ）６－ＯＨ＝マレイミドカプロイル－ポリエチレングリコール（抗体システインに付着可能）、
ＳＰＰ＝Ｎ－スクシンイミジル４－（２－ピリジルチオ）ペンタノエ一卜、
ＳＰＤＰ＝Ｎ－スクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート、
ＳＭＣＣ＝スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート、
ＩＴ＝イミノチオラン。
ＩＴ＝イミノチオラン。
次のような構造を持つ、ＭＣ＝６－マレイミドカプロイル：
【化13】
シトルリン＝２－アミノ－５－ウレイドペンタン酸、
ＰＡＢ＝ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル（「自己犠牲」リンカー要素の例）、
Ｍｅ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ＝Ｎ－メチル－バリン－シトルリン（そのうち、リンカーペプチド結合は、カテプシンＢにより切断されないように修飾された）、
ＭＣ（ＰＥＧ）６－ＯＨ＝マレイミドカプロイル－ポリエチレングリコール（抗体システインに付着可能）、
ＳＰＰ＝Ｎ－スクシンイミジル４－（２－ピリジルチオ）ペンタノエ一卜、
ＳＰＤＰ＝Ｎ－スクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート、
ＳＭＣＣ＝スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート、
ＩＴ＝イミノチオラン。
ＩＴ＝イミノチオラン。
【0052】
「抗体薬物複合体」という用語は、抗体が連結ユニットにより生物活性を有する薬物に連結されたものを指す。本開示における「抗体薬物複合体」（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＡＤＣ）は、モノクローナル抗体又は抗体断片を連結ユニットにより生物活性を有する毒性薬物に連結したものを指す。抗体は、直接的に、又はリンカーを介して薬物に複合されてもよい。ｎは各抗体の平均薬物モジュール数であり、整数でも小数でもよく、その範囲として、例えば、各抗体に対して約０～約２０個の薬物モジュールであってもよく、幾つかの実施形態において、各抗体に対して１個～約１０個の薬物モジュールであり、幾つかの実施形態において、各抗体に対して１個～約８個の薬物モジュールであり、例えば、２、３、４、５、６、７、８個の薬物モジュールである。本開示に係る抗体－薬物複合体の混合物の組成物において、各抗体の平均薬物負荷は約１個～約１０個であり、約３個～約７個、約３個～約６個、約３個～約５個、約１個～約９個、約７個又は約４個を含むが、これらに限定されない。
【0053】
本開示に使用されるアミノ酸の３文字コードと１文字コードは、Ｊ． ｂｉｏｌ． ｃｈｅｍ， ２４３， ｐ３５５８（１９６８）に記載された通りである。
【0054】
「抗体」という用語は、免疫グロブリンを指し、完全な抗体は、２本の同じ重鎖と２本の同じ軽鎖が鎖間ジスルフィド結合で連結してなるテトラペプチド鎖構造である。免疫グロブリンは、免疫グロブリン重鎖定常領域のアミノ酸組成と配列順序によって、５種類、つまりＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥという免疫グロブリンの５つのアイソタイプに分けられ、その対応する重鎖は、それぞれμ鎖、δ鎖、γ鎖、α鎖及びε鎖である。同一種類のＩｇは、そのヒンジ領域のアミノ酸組成及び重鎖ジスルフィド結合の数と位置の差によって、更に異なるサブクラスに分けることができ、例えば、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４に分けられてもよい。軽鎖は、定常領域によって、κ鎖又はλ鎖に分けられる。５種類のＩｇのそれぞれは、κ鎖又はλ鎖を有してもよい。
【0055】
全長抗体重鎖及び軽鎖は、Ｎ末端に近い約１１０個のアミノ酸の配列の変化が大きくて、可変領域（Ｆｖ領域）となり、Ｃ末端に近い残りのアミノ酸配列が比較的に安定的で、定常領域となる。可変領域は、３つの超可変領域（ＨＶＲ）と、４つの配列が比較的に保存的なフレームワーク領域（ＦＲ）とを含む。３つの超可変領域は、抗体の特異性を決定し、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも称される。それぞれの軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）及び重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）は、３つのＣＤＲ領域と、４つのＦＲ領域とからなり、アミノ基末端からカルボキシ基末端へ、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に配列されている。軽鎖の３つのＣＤＲ領域は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３であり、重鎖の３つのＣＤＲ領域は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３である。
【0056】
「完全ヒト化抗体」、「完全ヒト抗体」、「ヒト抗体」又は「全ヒト抗体」という用語は、「全ヒト化モノクローナル抗体」とも称され、その抗体の可変領域と定常領域は何れも免疫原性及び毒性や副作用が除去されたヒト由来のものである。全ヒト抗体の調製に関連する技術は、主に、ヒトハイブリドーマ技術、ＥＢＶ形質転換Ｂリンパ球技術、ファージディスプレイ技術（ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ）、トランスジェニックマウス抗体調製技術（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｏｕｓｅ）及び単一Ｂ細胞抗体調製技術などがある。
【0057】
「抗原結合断片」という用語は、抗原に特異的結合する能力を保持する抗体の１つ又は複数の断片を指す。全長抗体の断片により抗体の抗原結合機能を果たすことができる。「抗原結合断片」に含まれる結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量化のＶ領域（二重抗体）、ジスルフィド結合安定化のＶ領域（ｄｓＦｖ）及びＣＤＲを含むペプチドの抗原結合断片から選ばれ、例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる１価断片であるＦａｂ断片、（ｉｉ）ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む２価断片であるＦ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）ＶＨとＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体のシングルアームのＶＨとＶＬドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなる単一ドメイン又はｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．， （１９８９）Ｎａｔｕｒｅ３４１：５４４－５４６）、及び（ｖｉ）分離した相補性決定領域（ＣＤＲ）又は（ｖｉｉ）合成されたリンカーにより任意選択的に連結された２つ以上の分離したＣＤＲの組合せ、を含む。なお、Ｆｖ断片の２つのドメインＶＬ及びＶＨは、分離した遺伝子でコードされるが、その中のＶＬ及びＶＨ領域がペアになって１価分子を形成する単一のタンパク質鎖（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）と呼ばれ、例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ． （１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２： ４２３－４２６、及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９８８）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ８５： ５８７９－５８８３を参照）を生成することができるように、組換え法により、合成されたリンカーでそれらを連結することができる。このような単鎖抗体も、抗体の「抗原結合断片」という用語に含まれることが意図される。このような抗体断片は、当業者に知られている通常の技術により得られ、また、完全な抗体と同じように、断片が機能性によってスクリーニングされる。抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技術により、又は、完全な免疫グロブリンを酵素的若しくは化学的に切断することにより産生することができる。抗体は、例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４アイソフォーム）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭ抗体のような異なるアイソタイプの抗体であってもよい。
【0058】
通常、Ｆａｂは、プロテアーゼであるパパインプロテアーゼ（例えば、Ｈ鎖を切断する２２４位のアミノ酸残基）でＩｇＧ抗体分子を処理することにより得られた断片における、約５０，０００の分子量を有して抗原結合活性を有する抗体断片であり、そのうち、Ｈ鎖のＮ末端側の部分とＬ鎖は、ジスルフィド結合により一緒に結合される。
【0059】
通常、Ｆ（ａｂ’）２は、酵素であるペプシンでＩｇＧヒンジ領域におけるジスルフィド結合の下方部分を消化することにより得られた、分子量が約１００，０００で、抗原結合活性を有し、ヒンジ部位にて連結された２つのＦａｂ領域を含む抗体断片である。
【0060】
通常、Ｆａｂ’は、上記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することで得られた、分子量が約５０，０００で抗原結合活性を有する抗体断片である。
【0061】
また、Ｆａｂ’断片をコードするＤＮＡを、原核生物発現ベクター又は真核生物発現ベクターに挿入し、そしてベクターを原核生物又は真核生物に導入することにより、Ｆａｂ’を発現して上記Ｆａｂ’を産生することができる。
【0062】
「単鎖抗体」、「単鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」という用語は、リンカーにより連結された抗体重鎖可変ドメイン（又はＶＨ）と抗体軽鎖可変ドメイン（又はＶＬ）を含む分子である。このようなｓｃＦｖ分子は、ＮＨ２－ＶＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＯＯＨ又はＮＨ２－ＶＨ－リンカー－ＶＬ－ＣＯＯＨという一般的な構造を有してもよい。好適な従来技術のリンカーは、反復のＧＧＧＧＳアミノ酸配列又はその変異体からなり、例えば、１～４個の反復変異体が用いられる（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９３）， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ９０： ６４４４－６４４８）。本開示に使用可能な他のリンカーは、Ａｌｆｔｈａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． ８：７２５－７３１、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．（２００１）， Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ ｌ． ３１：９４－１０６、Ｈｕ ｅｔ ａｌ．（１９９６）， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５６：３０５５－３０６１、Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．（１９９９）， Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２９３：４１－５６及びＲｏｏｖｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（２００１）， Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．により記載されている。
【0063】
「ＣＤＲ」という用語は、抗体の可変ドメインにおいて抗原結合を促進する６つの主な超可変領域の１つである。通常、それぞれの重鎖可変領域には３つのＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）があり、それぞれの軽鎖可変領域には３つのＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）がある。ＣＤＲのアミノ酸配列境界は、「Ｋａｂａｔ」番号付け規則（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ． （１９９１）， 「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」， 第５版， Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤを参照）、「Ｃｈｏｔｈｉａ」番号付け規則（Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ． ， （１９９７）ＪＭＢ ２７３：９２７－９４８を参照）及びＩｍＭｕｎｏＧｅｎＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）番号付け規則（Ｌｅｆｒａｎｃ Ｍ． Ｐ． ， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ， ７， １３２－１３６（１９９９）、Ｌｅｆｒａｎｃ、Ｍ． Ｐ． ｅｔ ａｌ． ， Ｄｅｖ． Ｃｏｍｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ， ２７， ５５－７７（２００３）などを含む種々の公知方案の何れか１つによって決定することができる。例えば、典型的な書式では、Ｋａｂａｔ規則によれば、上記重鎖可変領域（ＶＨ）におけるＣＤＲアミノ酸残基の番号は３１～３５（ＨＣＤＲ１）、５０～６５（ＨＣＤＲ２）及び９５～１０２（ＨＣＤＲ３）で、軽鎖可変領域（ＶＬ）におけるＣＤＲアミノ酸残基の番号は２４～３４（ＬＣＤＲ１）、５０～５６（ＬＣＤＲ２）及び８９～９７（ＬＣＤＲ３）である。Ｃｈｏｔｈｉａ規則によれば、ＶＨにおけるＣＤＲアミノ酸の番号は２６～３２（ＨＣＤＲ１）、５２～５６（ＨＣＤＲ２）及び９５～１０２（ＨＣＤＲ３）で、ＶＬにおけるアミノ酸残基の番号は２６～３２（ＬＣＤＲ１）、５０～５２（ＬＣＤＲ２）及び９１～９６（ＬＣＤＲ３）である。ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａの両方を組み合わせたＣＤＲ定義によって、ＣＤＲは、ヒトＶＨにおけるアミノ酸残基である２６～３５（ＨＣＤＲ１）、５０～６５（ＨＣＤＲ２）と９５～１０２（ＨＣＤＲ３）及びヒトＶＬにおけるアミノ酸残基である２４～３４（ＬＣＤＲ１）、５０～５６（ＬＣＤＲ２）と８９～９７（ＬＣＤＲ３）により構成される。ＩＭＧＴ規則によれば、ＶＨにおけるＣＤＲアミノ酸残基の番号は大体、２６～３５（ＣＤＲ１）、５１～５７（ＣＤＲ２）及び９３～１０２（ＣＤＲ３）で、ＶＬにおけるＣＤＲアミノ酸残基の番号は大体、２７～３２（ＣＤＲ１）、５０～５２（ＣＤＲ２）及び８９～９７（ＣＤＲ３）である。ＩＭＧＴ規則によれば、抗体のＣＤＲ領域は、プログラムＩＭＧＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐ Ａｌｉｇｎによって決定することができる。特に説明のない限り、本開示に記載の６つのＣＤＲは何れも、Ｋａｂａｔ番号付け規則によって得られる。（（Ｋａｂａｔ Ｅ．Ａ． ｅｔ ａｌ．，（１９９１） Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ． ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２））。例えば、Ｋａｂａｔ規則によれば、上記重鎖可変領域（ＶＨ）におけるＣＤＲアミノ酸残基の番号は３１～３５（ＨＣＤＲ１）、５０～６５（ＨＣＤＲ２）及び９５～１０２（ＨＣＤＲ３）で、軽鎖可変領域（ＶＬ）におけるＣＤＲアミノ酸残基の番号は２４～３４（ＬＣＤＲ１）、５０～５６（ＬＣＤＲ２）及び８９～９７（ＬＣＤＲ３）である。この分野における他の番号付け規則はＣｈｏｔｈｉａ、ＩＭＧＴなどである。
【0064】
「抗体フレームワーク領域」という用語は、可変ドメインＶＬ又はＶＨの一部を指し、当該可変ドメインの抗原結合ループ（ＣＤＲ）のステントとして用いられる。実質的に、それは、ＣＤＲを有しない可変ドメインである。
【0065】
「エピトープ」又は「抗原決定基」という用語は、抗原上の免疫グロブリン又は抗体によって結合される部位である。エピトープは通常、独特な空間配座で少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個の連続的又は非連続的なアミノ酸を含む。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ ｉｏｌｏｇｙ， 第６６巻， Ｇ．Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ， Ｅｄ． （１９９６）を参照する。
【0066】
「特異的結合」、「選択的結合」、「選択的に結合」及び「特異的に結合」という用語は、抗体又は抗原結合断片の、予め決定された抗原におけるエピトープに対する結合を指す。通常、抗体又は抗原結合断片は、約１０－７ Ｍ未満、例えば、約１０－８ Ｍ、１０－９ Ｍ若しくは１０－１０ Ｍ未満又はそれ以下の親和性（ＫＤ）で結合される。
【0067】
「ＫＤ」という用語は、抗体ー抗原が互いに作用する解離平衡定数を指す。一般的に、本開示の抗体又は抗原結合断片は、約１０－７ Ｍ未満、例えば、約１０－８ Ｍ又は１０－９ Ｍ未満の解離平衡定数（ＫＤ）でＰＳＭＡ又はそのエピトープと結合し、例えば、本開示において、抗体と細胞表面抗原との親和性は、ＦＡＣＳ法でＫＤ値を測定することで得られる。
【0068】
「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子を指す。核酸分子は、単鎖又は二重鎖であってもよいが、好ましくは二重鎖ＤＮＡである。核酸が別の核酸配列と共に機能的関係に置かれる場合、核酸は「効果的に連結されている」。例えば、プロモーター又はエンハンサーがコード配列の転写に影響を与えると、プロモーター又はエンハンサーは、上記コード配列に効果的に連結されている。
【0069】
アミノ酸配列の「配列同一性」は、アミノ酸配列のアラインメント過程において、最も大きい配列同一性の百分率が達成されるように、必要に応じてギャップを導入し、且つ、何れの保存的置換も配列同一性の一部とは見なさない、第１配列における第２配列中のアミノ酸残基と同様のアミノ酸残基の百分率を指す。アミノ酸の配列同一性の百分率を測定するために、アラインメントは、この分野の技術的範囲における種々の方法、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ－２又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に取得可能なコンピュータソフトウェアにより、実現することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大アラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、測定アラインメントに適用されるパラメータを決定することができる。
【0070】
「発現ベクター」という用語は、それに連結された別の核酸を輸送可能な核酸分子を指す。一実施形態において、ベクターは、他のＤＮＡセグメントをそれに連結可能な環状二本鎖ＤＮＡ環を指す「プラスミド」である。別の実施形態において、ベクターは、他のＤＮＡセグメントをウイルスゲノムに連結可能なウイルスベクターである。本願に開示されるベクターは、それらを導入した宿主細胞において自己複製することができ（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム性哺乳動物ベクター）、又は、宿主細胞に導入された後、宿主細胞のゲノムに整合されることで、宿主ゲノムと共に複製することができる（例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター）。
【0071】
「宿主細胞」という用語は、その中に発現ベクターが導入された細胞を指す。宿主細胞は、微生物（例えば、細菌）、植物又は動物細胞を含んでもよい。形質転換しやすい細菌は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）やサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の菌株などの腸内細菌科（ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）のメンバー、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などのバシラス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）及びインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）を含む。好適な微生物は、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及びピキア酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）を含む。好適な動物宿主細胞系は、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞系）及びＮＳ０細胞を含む。
【0072】
本開示の工学的な抗体又は抗原結合断片は、通常の方法により調製及び精製することができる。例えば、重鎖及び軽鎖をコードするｃＤＮＡ配列は、クローンニングしてＧＳ発現ベクターに組換えることができる。組換えた免疫グロブリン発現ベクターは、ＣＨＯ細胞を安定してトランスフェクションすることができる。更に好ましい従来技術の一つとして、哺乳動物発現系は、特にＦｃ領域の高度に保存的なＮ末端部位において、抗体のグリコシル化を引き起こすことになる。陽性クローンは、バイオリアクターの無血清培地において培養を拡大することで、抗体を産生する。抗体が分泌された培養液は、通常の技術により精製することができる。例えば、調整された緩衝液を含むＡ又はＧ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラムで精製が行われる。非特異的に結合した成分を洗い流す。更に、ｐＨ勾配法により結合した抗体を溶離し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで抗体断片を検出し、収集する。抗体は、通常の方法によりろ過濃縮することができる。可溶性の混合物及び多量体は、分子ふるい、イオン交換などの通常の方法により除去されてもよい。得られた生成物は、直ちに例えば、－７０℃で冷凍し、又は凍結乾燥しなければならない。
【0073】
「ペプチド」という用語は、２個以上のアミノ酸分子がペプチド結合により互いに連結されてなる分子を指し、タンパク質の構造及び機能的断片である。
【0074】
「アルキル基」という用語は、飽和脂肪族炭化水素基であり、１～２０個の炭素原子を含む直鎖又は分岐鎖基であり、１～１２個（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１及び１２個）の炭素原子を含むアルキル基が好ましく、１～１０個の炭素原子を含むアルキル基がより好ましく、１～６個の炭素原子を含む（１個、２個、３個、４個、５個又は６個の炭素原子を含む）アルキル基が最も好ましい。その非限定的な例は、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、１，１－ジメチルプロピル基、１，２－ジメチルプロピル基、２，２－ジメチルプロピル基、１－エチルプロピル基、２－メチルブチル基、３－メチルブチル基、ｎ－ヘキシル基、１－エチル－２－メチルプロピル基、１，１，２－トリメチルプロピル基、１，１－ジメチルブチル基、１，２－ジメチルブチル基、２，２－ジメチルブチル基、１，３－ジメチルブチル基、２－エチルブチル基、２－メチルペンチル基、３－メチルペンチル基、４－メチルペンチル基、２，３－ジメチルブチル基、ｎ－ヘプチル基、２－メチルヘキシル基、３－メチルヘキシル基、４－メチルヘキシル基、５－メチルヘキシル基、２，３－ジメチルペンチル基、２，４－ジメチルペンチル基、２，２－ジメチルペンチル基、３，３－ジメチルペンチル基、２－エチルペンチル基、３－エチルペンチル基、ｎ－オクチル基、２，３－ジメチルヘキシル基、２，４－ジメチルヘキシル基、２，５－ジメチルヘキシル基、２，２－ジメチルヘキシル基、３，３－ジメチルヘキシル基、４，４－ジメチルヘキシル基、２－エチルヘキシル基、３－エチルヘキシル基、４－エチルヘキシル基、２－メチル－２－エチルペンチル基、２－メチル－３－エチルペンチル基、ｎ－ノニル基、２－メチル－２－エチルヘキシル基、２－メチル－３－エチルヘキシル基、２，２－ジエチルペンチル基、ｎ－デシル基、３，３－ジエチルヘキシル基、２，２－ジエチルヘキシル基、及びその種々の分岐鎖異性体などを含む。より好ましくは１～６個の炭素原子を含む低級アルキル基であり、その非限定的な実施例はメチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、１，１－ジメチルプロピル基、１，２－ジメチルプロピル基、２，２－ジメチルプロピル基、１－エチルプロピル基、２－メチルブチル基、３－メチルブチル基、ｎ－ヘキシル基、１－エチル－２－メチルプロピル基、１，１，２－トリメチルプロピル基、１，１－ジメチルブチル基、１，２－ジメチルブチル基、２，２－ジメチルブチル基、１，３－ジメチルブチル基、２－エチルブチル基、２－メチルペンチル基、３－メチルペンチル基、４－メチルペンチル基、２，３－ジメチルブチル基などを含む。アルキル基は、置換されても、置換されなくてもよく、置換される場合に、置換基は任意の利用可能な連結部位で置換されてもよく、上記置換基は、独立的に、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルアミノ基、ハロゲン、メルカプト基、ヒドロキシ基、ニトロ基、シアノ基、シクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、シクロアルコキシ基、ヘテロシクロアルコキシ基、シクロアルキルチオ基、ヘテロシクロアルキルチオ基及びオキソ基から選ばれる１つ又は複数の基であることが好ましい。
【0075】
「ヘテロアルキル基」という用語は、Ｎ、Ｏ又はＳから選ばれる１つ又は複数のヘテロ原子を含むアルキル基であり、そのうち、アルキル基は、上記に定義された通りである。
【0076】
「アルキレン基」という用語は、アルカン母体の同じ炭素原子又は２つの異なる炭素原子から２つの水素原子を除去して誘導された２つの残基を有する飽和の直鎖又は分岐鎖の脂肪族炭化水素基を指し、１～２０個の炭素原子を含む直鎖又は分岐鎖基であり、好ましくは１～１２個（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１及び１２個）の炭素原子を含み、より好ましくは１～６個の炭素原子を含む（１個、２個、３個、４個、５個又は６個の炭素原子を含む）アルキレン基である。アルキレン基の非限定的な例は、メチレン（－ＣＨ２－）、１，１－エチリデン（－ＣＨ（ＣＨ３）－）、１，２－エチリデン（－ＣＨ２ＣＨ２）－、１，１－プロピリデン（－ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）－）、１，２－プロピリデン（－ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）－）、１，３－プロピリデン（－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－）、１，４－ブチリデン（－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－）及び１，５－ブチリデン（－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－）などを含むが、これらに限定されない。アルキレン基は、置換されても、置換されなくてもよく、置換される場合に、置換基は任意の利用可能な連結部位で置換されてもよく、上記置換基は、独立的に、任意選択的にアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルアミノ基、ハロゲン、メルカプト基、ヒドロキシ基、ニトロ基、シアノ基、シクロアルキル基、ヘテロシクリル基、アリール基、ヘテロアリール基、シクロアルコキシ基、ヘテロシクロアルコキシ基、シクロアルキルチオ基、ヘテロシクロアルキルチオ基及びオキソ基から選ばれる１つ又は複数の基で置換されることが好ましい。
【0077】
「アルコキシ基」という用語は、－Ｏ－（アルキル基）及び－Ｏ－（非置換のシクロアルキル基）であり、そのうち、アルキル基又はシクロアルキル基の定義は上記の通りである。アルコキシ基の非限定的な例は、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基、シクロプロポキシ基、シクロブトキシ基、シクロペンチルオキシ基、シクロヘキシルオキシ基を含む。アルコキシ基は、任意選択的に置換されても、置換されなくてもよく、置換される場合に、置換基は、独立的に、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルアミノ基、ハロゲン、メルカプト基、ヒドロキシ基、ニトロ基、シアノ基、シクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、シクロアルコキシ基、ヘテロシクロアルコキシ基、シクロアルキルチオ基及びヘテロシクロアルキルチオ基から選ばれる１つ又は複数の基であることが好ましい。
【0078】
「シクロアルキル基」という用語は、飽和又は部分的に不飽和の単環式又は多環式の環状炭化水素置換基を指し、シクロアルキル環は３～２０個の炭素原子を含み、好ましくは３～１２個の炭素原子を含み、より好ましくは３～８個の炭素原子を含み、さらに好ましくは３～６個の炭素原子を含む。単環式シクロアルキル基の非限定的な例は、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロペンテニル基、シクロヘキシル基、シクロヘキセニル基、シクロヘキサジエニル基、シクロヘプチル基、シクロヘプタトリエニル基、シクロオクチル基などを含み、多環式シクロアルキル基は、スピロ環、縮合環及び架橋環のシクロアルキル基を含む。
【0079】
上記シクロアルキル環は、上記のシクロアルキル基（単環式環、スピロ環、縮合環及び架橋環を含む）がアリール基、ヘテロアリール基又はヘテロシクロアルキル環に縮合されており、そのうち、母体構造に連結された環がシクロアルキル基であるものを含み、その非限定的な実例は、インダニル基、テトラヒドロナフチル基及びベンゾシクロヘプタニル基などを含み、好ましくはベンゾシクロペンチル基及びテトラヒドロナフチル基である。
【0080】
シクロアルキル基は置換されても、置換されなくてもよく、置換される場合、置換基は任意の利用可能な連結部位で置換されてもよく、上記置換基は、独立的に、任意選択的に水素原子、ハロゲン、アルキル基、アルコキシ基、ハロアルキル基、ヒドロキシ基、ヒドロキシアルキル基、シアノ基、アミノ基、ニトロ基、シクロアルキル基、ヘテロシクリル基、アリール基及びヘテロアリール基から選ばれる１つ又は複数の置換基で置換されることが好ましい。
【0081】
「ヘテロシクリル基」という用語は、３～２０個の環原子を含む飽和又は部分的に不飽和の単環式又は多環式環状炭化水素置換基を指し、そのうち、１つ又は複数の環原子は、窒素、酸素又はＳ（Ｏ）Ｐ（そのうち、ｐは０～２の整数である）から選ばれるヘテロ原子であるが、－Ｏ－Ｏ－、－Ｏ－Ｓ－又は－Ｓ－Ｓ－の環部分を含まず、残りの環原子は炭素である。好ましくは、１～４個がヘテロ原子である３～１２個の環原子を含み、より好ましくは、１～３個がヘテロ原子である３～８個の環原子を含み、更に好ましくは、１～３個がヘテロ原子である３～６個の環原子を含み、最も好ましくは、１～３個がヘテロ原子である５又は６個の環原子を含む。単環式ヘテロシクリル基の非限定的な例は、ピロリジニル基、テトラヒドロピラニル基、１，２，３，６－テトラヒドロピリジル基、ピペリジニル基、ピペラジニル基、モルホリニル基、チオモルホリニル基及びホモピペラジニル基などを含む。多環式ヘテロシクリル基は、スピロ環、縮合環及び架橋環のヘテロシクリル基を含む。
【0082】
上記ヘテロシクリル環は、上記のヘテロシクリル基（単環、スピロヘテロ環、縮合ヘテロ環及び架橋ヘテロ環を含む）がアリール基、ヘテロアリール基又はシクロアルキル環に縮合されており、そのうち、母体構造に連結された環がヘテロシクリル基であるものを含み、その非限定的な例は、
を含む。
【化14】
【0083】
ヘテロシクリル基は置換されても、置換されなくてもよく、置換される場合、置換基は任意の利用可能な連結部位で置換されてもよく、上記置換基は、独立的に、任意選択的に水素原子、ハロゲン、アルキル基、アルコキシ基、ハロアルキル基、ヒドロキシ基、ヒドロキシアルキル基、シアノ基、アミノ基、ニトロ基、シクロアルキル基、ヘテロシクリル基、アリール基及びヘテロアリール基から選ばれる１つ又は複数の置換基で置換されることが好ましい。
【0084】
「アリール基」という用語は、共役したπ電子系を有する６～１４員の全炭素単環式又は縮合多環式（つまり、隣接する炭素原子対を共有する環）の基であり、好ましくは６～１０員であり、例えば、フェニル基及びナフチル基である。上記アリール環は、上記のアリール環がヘテロアリール基、ヘテロシクリル基又はシクロアルキル環に縮合されており、そのうち、母体構造に連結された環がアリール環であるものを含み、その非限定的な例は、
を含む。
【化15】
【0085】
アリール基は置換されても、置換されなくてもよく、置換される場合、置換基は任意の利用可能な連結部位で置換されてもよく、上記置換基は、独立的に、任意選択的に水素原子、ハロゲン、アルキル基、アルコキシ基、ハロアルキル基、ヒドロキシ基、ヒドロキシアルキル基、シアノ基、アミノ基、ニトロ基、シクロアルキル基、ヘテロシクリル基、アリール基及びヘテロアリール基から選ばれる１つ又は複数の置換基で置換されることが好ましい。
【0086】
「ヘテロアリール基」という用語は、１～４個のヘテロ原子、５～１４個の環原子を含む複素芳香族系を指し、そのうち、ヘテロ原子は酸素、硫黄及び窒素から選ばれる。ヘテロアリール基は、５～１０員であることが好ましく、５員又は６員であることがより好ましく、例えば、フラニル基、チエニル基、ピリジル基、ピロリル基、Ｎ－アルキルピロリル基、ピリミジニル基、ピラジニル基、ピリダジニル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、トリアゾリル基、テトラゾリル基などである。上記ヘテロアリール環は、上記のヘテロアリール基がアリール基、ヘテロシクリル基又はシクロアルキル環に縮合されており、そのうち、母体構造に連結された環がヘテロアリール環であるものを含み、その非限定的な例は、
を含む。
【化16】
【0087】
ヘテロアリール基は置換されても、置換されなくてもよく、置換される場合、置換基は任意の利用可能な連結部位で置換されてもよく、上記置換基は、独立的に、任意選択的に水素原子、ハロゲン、アルキル基、アルコキシ基、ハロアルキル基、ヒドロキシ基、ヒドロキシアルキル基、シアノ基、アミノ基、ニトロ基、シクロアルキル基、ヘテロシクリル基、アリール基及びヘテロアリール基から選ばれる１つ又は複数の置換基で置換されることが好ましい。
【0088】
「ハロアルキル基」という用語は、アルキル基上の水素が１つ又は複数のハロゲンで置換されたものを指し、そのうち、アルキル基は、上記に定義された通りである。
【0089】
「重水素化アルキル基」という用語は、アルキル基上の水素が１つ又は複数の重水素原子で置換されたものを指し、そのうち、アルキル基は、上記に定義された通りである。
【0090】
「ヒドロキシアルキル基」という用語は、アルキル基上の水素が１つ又は複数のヒドロキシ基で置換されたものを指し、そのうち、アルキル基は、上記に定義された通りである。
【0091】
「ヒドロキシ基」という用語は、－ＯＨ基を指す。
【0092】
「ハロゲン」という用語は、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素を指す。
【0093】
「アミノ基」という用語は、－ＮＨ２を指す。
【0094】
「ニトロ基」という用語は、－ＮＯ２を指す。
【0095】
「シアノ基」という用語は、－ＣＮを指す。
【0096】
「任意選択的」又は「任意選択的に」は、その後に説明される事象又は状況が生じてもよいが、生じなくてもよいことを意味し、この説明は、当該事象又は状況が生じる場合と生じない場合を含む。例えば、「任意選択的にアルキル基で置換されたヘテロシクリル基」とは、アルキル基が存在してもよいが、必ずしもそうとは限らないことを意味し、この説明は、ヘテロシクリル基がアルキル基で置換された場合と、ヘテロシクリル基がアルキル基で置換されていない場合とを含む。
【0097】
「置換される」とは、基における１つ又は複数の水素原子、好ましくは多くとも５個、より好ましくは１個、２個又は３個の水素原子が、互いに独立的に置換基で置換されることを指す。置換基は、それらの化学的に可能な位置にしか位置せず、当業者は、過度の努力をすることなく（実験又は理論により）可能又は不可能な置換を決定することができる。例えば、遊離水素を有するアミノ基又はヒドロキシ基は不飽和（例えば、オレフィン）結合を有する炭素原子と結合する場合、不安定になる可能性がある。
【0098】
「医薬組成物」という用語は、１種又は複数種の本願に記載の化合物又はその生理学的に／薬学的に許容される塩又はプロドラッグと他の化学成分の混合物と、例えば生理学的に／薬学的に許容されるベクター及び賦形剤などの他の成分とを含むものを示す。医薬組成物は、生体への投与を促進し、活性成分の吸収に寄与して更に生物活性を発揮するためである。
【0099】
「薬学的に許容される塩」又は「薬学的に利用可能な塩」という用語は、本開示に係る抗体薬物複合体の塩を指し、このような塩は、被験者の体内に用いられる場合、安全性と有效性を有すると共に、所望の生物活性を有し、本開示に係る抗体薬物複合体は、少なくとも１つのアミノ基を含むため、酸と一緒に塩を形成することができ、薬学的に許容される塩の非限定的な例は、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、クエン酸塩、酢酸塩、コハク酸塩、アスコルビン酸塩、シュウ酸塩、硝酸塩、ソルビン酸塩、リン酸水素塩、リン酸二水素塩、サリチル酸塩、クエン酸水素塩、酒石酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩及びｐ－トルエンスルホン酸塩を含む。
【0100】
「薬物負荷量」又は「平均薬物負荷」は、薬物抗体比（Ｄｒｕｇ－ｔｏ－Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｒａｔｉｏ、ＤＡＲ）とも呼ばれ、即ち、ＡＤＣ中のそれぞれの抗体に複合された薬物の平均数量である。それは、例えば、それぞれの抗体が約１～約１０個の薬物に複合される範囲内であってもよく、また、ある実施例において、それぞれの抗体が約１～約８個の薬物に複合される範囲内であり、好ましくは２～８、２～７、２～６、２～５、２～４、３～４、３～５、５～６、５～７、５～８と６～８の範囲から選ばれる。例示的に、薬物負荷量は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０の平均値であってもよい。本開示に係るＡＤＣの一般式は、上記一定の薬物負荷量の範囲内での抗体薬物複合体の集合を含む。本開示の実施形態において、薬物負荷量はｎで示され、ＤＡＲ値と称されてもよく、例示的に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０の平均値である。ＵＶ／可視分光法、質量分析、ＥＬＩＳＡ試験とＨＰＬＣなどの通常の方法により、薬物負荷量を測定することができる。
【0101】
リガンド薬物複合体の負荷量は、
（１）連結試薬とモノクローナル抗体とのモル比を制御することと、
（２）反応時間と温度を制御することと、
（３）異なる反応試薬を選択することと、
を含む非限定的な方法で制御することができる。
（１）連結試薬とモノクローナル抗体とのモル比を制御することと、
（２）反応時間と温度を制御することと、
（３）異なる反応試薬を選択することと、
を含む非限定的な方法で制御することができる。
【0102】
通常の医薬組成物の調製は、中国薬典に示されている。
【0103】
「ベクター」という用語は、本開示の薬物に利用されるものとして、薬物の人体への入り方と体内での分布を変更し、薬物の放出速度を制御し、薬物を標的器官に輸送することができる系である。薬物ベクターの放出と標的系により、薬物の分解と損失を低減し、副作用を低下させ、生物学的利用能を向上させることができる。例えば、ベクターとしての高分子界面活性剤は、その独特な両親媒性構造のため、自己集合して様々な形態の凝集体を形成することができ、好ましい例は、例えば、ミセル、マイクロエマルジョン、ゲル、液晶、ベシクルなどである。これらの凝集体は、薬物分子を封入する能力を有すると共に、膜に対して良好な透過性を有し、良い薬物ベクターとすることができる。
【0104】
「賦形剤」という用語は、薬物製剤における主薬以外の付加物であり、添加物と呼ばれてもよい。例えば、トローチ剤中の結合剤、充填剤、崩壊剤、潤滑剤、半固体製剤である軟膏剤やクリーム剤中の基質部分、液体製剤中の防腐剤、酸化防止剤、矯味剤、芳香剤、共溶剤、乳化剤、可溶化剤、浸透圧調整剤、着色剤などは何れも、賦形剤と呼ぶことができる。
【0105】
「希釈剤」という用語は充填剤とも呼ばれ、トローチ剤の重量及び体積を増加させることがその主な用途である。希釈剤の加入により、一定の体積の大きさが確保されるだけでなく、主成分の用量偏差が低減され、薬剤の圧縮成形性などが改善される。トローチ剤の薬物に油性成分が含まれる場合、「乾燥」状態を維持してトローチ剤の調製に寄与するために、吸収剤を加えて油性物質を吸収する必要がある。例えば、澱粉、乳糖、カルシウムの無機塩、微結晶セルロースなどである。
【0106】
医薬組成物は、滅菌注射用水溶液の形態であってもよい。使用される許容可能な溶媒と溶剤には、水、リンゲル液及び等張塩化ナトリウム溶液があってもよい。滅菌注射用製剤は、その中の活性成分が油相に溶解された滅菌注射用水中油型マイクロエマルジョンであってもよい。例えば、活性成分を大豆油とレシチンの混合物に溶解する。次に、油溶液を水とグリセリンの混合物に入れて処理してマイクロエマルジョンを形成する。局所で大量に注射することにより、注射液又はマイクロエマルジョンを被験者の血流に注入することができる。又は、本開示に係る化合物の一定のサイクル濃度を維持可能な方式で、溶液及びマイクロエマルジョンを投与することが好ましい。このような一定の濃度を維持するために、連続静脈内投与装置を使用することができる。このような装置の例は、Ｄｅｌｔｅｃ ＣＡＤＤ－ＰＬＵＳ． ＴＭ． ５４００型の静脈注射ポンプである。
【0107】
医薬組成物は、筋肉内及び皮下投与に使用される滅菌注射水又は油懸濁液の形態であってもよい。当該懸濁液は、既知の技術に従って、上記の適切な分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤を用いて調製することができる。滅菌注射用製剤は、無毒の胃腸外に許容可能な希釈剤又は溶剤において調製された滅菌注射溶液又は懸濁液、例えば、１，３－ブタンジオールにおいて調製された溶液であってもよい。また、滅菌固定油を溶剤又は懸濁媒体として便利に用いることができる。このために、合成されたモノグリセリド又はジグリセリドを含む任意の配合用固定油を用いることができる。また、油酸などの脂肪酸も、注射剤を調製することができる。
【0108】
合成方法
合成の目的を達成するために、以下の合成技術案を採用する。
一般式（ＰＭ－９－Ａ）で示される化合物の調製方法であって、それは、
ＰＭを還元した後にＰＭ’を得て、ＰＭ’を一般式（９－Ａ）とカップリング反応させ、一般式（ＰＭ－９－Ａ）で示される化合物を得るステップを含み、還元剤はＴＣＥＰが好ましく、特に、抗体におけるジスルフィド結合を還元することが好ましく、
そのうち、
ＰＭは抗ＰＳＭＡ抗体又はその抗原結合断片であり、
ｎは１～１０で、ｎは小数又は整数である。
合成の目的を達成するために、以下の合成技術案を採用する。
一般式（ＰＭ－９－Ａ）で示される化合物の調製方法であって、それは、
【化17】
そのうち、
ＰＭは抗ＰＳＭＡ抗体又はその抗原結合断片であり、
ｎは１～１０で、ｎは小数又は整数である。
【0109】
上記の明細書には、本開示の１つ又は複数種の実施形態の詳細が提出されている。本願の記載と類似又は同様の任意の方法と材料により本開示を実施又は試験することができるが、以下、好ましい方法と材料を説明する。明細書と特許請求の範囲により、本開示の他の特徴、目的及び利点は明らかになる。明細書と特許請求の範囲において、文脈で特に明記しない限り、単数形は複数の指示対象のことをも含む。特に定義しない限り、本願に使用される技術と科学用語の全ては、当業者により理解されている一般的な意味を持っている。明細書に引用される特許と出版物の全ては、引用により組み込まれている。以下の実施例は、本開示の好ましい実施形態を更に全面的に説明するために提出される。これらの実施例は、何れかの方式で、本開示の範囲を限定するものと理解すべきではなく、本開示の範囲は、特許請求の範囲により限定される。
【0110】
本開示の実施例又は試験例において具体的な条件が明記されていない実験方法は、一般的に通常の条件、又は原料や商品のメーカーにより推奨された条件に従う。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング、実験室マニュアル、冷泉港実験室、及び現代分子生物学方法、Ａｕｓｕｂｅｌら著、Ｇｒｅｅｎｅ出版協会、Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＹを参照する。具体的な供給源が明記されていない試薬は、市販される通常の試薬である。
実施例１． 抗体の調製
（一）ＰＳＭＡ抗体の調製
実施例１． 抗体の調製
（一）ＰＳＭＡ抗体の調製
【0111】
１．１ 抗体配列
本開示の抗体は、ＷＯ２００３０３４９０３Ａ２を参照して調製され、ここで、ＡＢ－ＰＧ１－ＸＧ１－００６可変領域のアミノ酸配列は下記の通りである。
本開示の抗体は、ＷＯ２００３０３４９０３Ａ２を参照して調製され、ここで、ＡＢ－ＰＧ１－ＸＧ１－００６可変領域のアミノ酸配列は下記の通りである。
【0112】
ＡＢ－ＰＧ１－ＸＧ１－００６重鎖可変領域：
ＡＢ－ＰＧ１－ＸＧ１－００６軽鎖可変領域：
注：下線部分はＫａｂａｔ番号付け規則に従って決められたＣＤＲ領域である。
【化18】
ＡＢ－ＰＧ１－ＸＧ１－００６軽鎖可変領域：
【化19】
【0113】
【表1】
【0114】
１．２ 全長抗体の構築
以上の配列に従って、プライマーＰＣＲを設計してＶＨ／ＶＫ遺伝子断片を構築して取得し、可変領域を得た。
以上の配列に従って、プライマーＰＣＲを設計してＶＨ／ＶＫ遺伝子断片を構築して取得し、可変領域を得た。
【0115】
抗体可変領域は更に、定常領域遺伝子（ＣＨ１－Ｆｃ／ＣＬ）断片と相同組換えを行い、完全な抗体ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ／ＶＫ－ＣＬを構築した。
【0116】
構築された完全な全長抗体ＰＭ配列は下記の通りである。
【0117】
重鎖（ＩｇＧ１）アミノ酸配列：
軽鎖（Ｋａｐｐａ）アミノ酸配列：
【化20】
軽鎖（Ｋａｐｐａ）アミノ酸配列：
【化21】
【0118】
１．３ 全長抗体の発現と精製
抗体の軽・重鎖をそれぞれ発現したプラスミドをＨＥＫ２９３Ｅ細胞にトランスフェクションし、６日後に発現上清を収集し、高速遠心分離により不純物を除去し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａカラムで精製した。Ａ２８０読取値が基線に低減されるまで、ＰＢＳでカラムを洗い流した。ｐＨ３．０～ｐＨ３．５の酸性溶離液で目的タンパク質を溶離し、１ ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌで、ｐＨ８．０～９．０に中和した。溶離試料を適当に濃縮した後、ＰＢＳで平衡されたゲルクロマトグラフィーＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（ＧＥ）により更に精製することで、量体を除去し、単体ピークを収集し、分注して使用に備えた。
（二）対照抗体Ｌｍａｂの調製
抗体の軽・重鎖をそれぞれ発現したプラスミドをＨＥＫ２９３Ｅ細胞にトランスフェクションし、６日後に発現上清を収集し、高速遠心分離により不純物を除去し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａカラムで精製した。Ａ２８０読取値が基線に低減されるまで、ＰＢＳでカラムを洗い流した。ｐＨ３．０～ｐＨ３．５の酸性溶離液で目的タンパク質を溶離し、１ ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌで、ｐＨ８．０～９．０に中和した。溶離試料を適当に濃縮した後、ＰＢＳで平衡されたゲルクロマトグラフィーＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（ＧＥ）により更に精製することで、量体を除去し、単体ピークを収集し、分注して使用に備えた。
（二）対照抗体Ｌｍａｂの調製
【0119】
対照抗体ｌａｂｅｔｕｚｕｍａｂ（Ｌｍａｂと略称）は、ＷＨＯ Ｄｒｕｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｖｏｌ． ３０， Ｎｏ． １， ２０１６を参照して調製され、そのうち、重鎖と軽鎖アミノ酸配列は下記の通りである。
【0120】
＞抗体重鎖配列Ｌｍａｂ－ＨＣ
＞抗体軽鎖配列Ｌｍａｂ－ＬＣ
実施例２． 化合物の調製
【化22】
＞抗体軽鎖配列Ｌｍａｂ－ＬＣ
【化23】
実施例２． 化合物の調製
【0121】
本開示の実施例において具体的な条件が明記されていない実験方法は、一般的に、通常の条件に従い、又は原料や商品のメーカーにより勧められた条件に従う。具体的な供給源が明記されていない試薬は、市販される通常の試薬である。
【0122】
化合物の構造は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）又は質量分析（ＭＳ）によって決定された。ＮＭＲの測定には、核磁気装置Ｂｒｕｋｅｒ ＡＶＡＮＣＥ－４００が利用され、測定溶剤が重水素化ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ－ｄ６）、重水素化クロロホルム（ＣＤＣｌ３）、重水素化メタノール（ＣＤ３ＯＤ）であり、内部標準がテトラメチルシラン（ＴＭＳ）であり、化学シフトが１０－６（ｐｐｍ）単位で示された。
【0123】
ＭＳの測定には、質量分析計ＦＩＮＮＩＧＡＮ ＬＣＱＡｄ（ＥＳＩ）（メーカー：Ｔｈｅｒｍｏ、型番：Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＬＣＱ ａｄｖａｎｔａｇｅ ＭＡＸ）が使用された。
【0124】
ＵＰＬＣの測定には、液体クロマトグラフ質量分析計Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＳＱＤが利用された。
【0125】
ＨＰＬＣの測定には、高速液体クロマトグラフＡｇｉｌｅｎｔ １２００ＤＡＤ（Ｓｕｎｆｉｒｅ Ｃ１８ １５０×４．６ ｍｍカラム）及び高速液体クロマトグラフＷａｔｅｒｓ ２６９５－２９９６（Ｇｉｍｉｎｉ Ｃ１８ １５０×４．６ ｍｍカラム）が利用された。
【0126】
ＵＶ－ＨＰＬＣの測定には、紫外線分光光度計Ｔｈｅｒｍｏ ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００が利用された。
【0127】
増殖阻害率及びＩＣ５０値の測定には、マイクロプレートリーダーＰＨＥＲＡ ｓｔａｒＦＳ（独ＢＭＧ社）が利用された。
【0128】
薄層クロマトグラフィー用シリカゲルプレートとしては、煙台黄海ＨＳＧＦ２５４又は青島ＧＦ２５４シリカゲルプレートが使用され、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）に使用されたシリカゲルプレートの仕様は０．１５ ｍｍ～０．２ ｍｍであり、薄層クロマトグラフィーによる製品の分離精製用のシリカゲルプレートの仕様は、０．４ ｍｍ～０．５ ｍｍである。
【0129】
カラムクロマトグラフィーは、一般的に、煙台黄海２００～３００メッシュのシリカゲルをベクターとして利用した。
【0130】
本開示に係る既知の出発原料は、この分野での既知の方法を採用して又はそれに従って合成してもよく、又はＡＢＣＲ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ．ＫＧ、Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｎｉｃｓ、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、韶遠化学科技（Ａｃｃｅｌａ ＣｈｅｍＢｉｏ Ｉｎｃ）、達瑞化学品などの会社から購入してもよい。
【0131】
実施例において、特に断りのない限り、反応は、何れもアルゴン雰囲気又は窒素雰囲気で行われた。
【0132】
アルゴン雰囲気又は窒素雰囲気は、反応フラスコに容量が約１ Ｌのアルゴン又は窒素バルーンが連結されていることを指す。
【0133】
水素雰囲気は、反応フラスコに容量が約１ Ｌの水素バルーンが連結されていることを指す。
【0134】
加圧水素化反応には、Ｐａｒｒ ３９１６ＥＫＸ型水素化装置及び清藍ＱＬ－５００型水素発生器又はＨＣ２－ＳＳ型水素化装置が使用された。
【0135】
水素化反応は、一般的に、真空引きして水素を充填する操作を３回繰り返した。
【0136】
マイクロ波反応には、ＣＥＭ Ｄｉｓｃｏｖｅｒ－Ｓ ９０８８６０型マイクロ波反応器が使用された。
【0137】
実施例において、特に断りのない限り、反応中の溶液は、水溶液を指す。
【0138】
実施例において、特に断りのない限り、反応の温度は、室温である。
【0139】
室温は最適な反応温度であり、温度範囲が２０℃～３０℃である。
【0140】
実施例におけるｐＨ＝６．５のＰＢＳ緩衝液の調製：８．５ ｇのＫＨ２ＰＯ４、８．５６ ｇのＫ２ＨＰＯ４．３Ｈ２Ｏ、５．８５ ｇのＮａＣｌ、１．５ ｇのＥＤＴＡを取ってフラスコに入れ、２ Ｌに定容し、超音波でそれを完全に溶解させ、振り混ぜると得た。
【0141】
化合物の精製に利用されたカラムクロマトグラフィーの溶離剤の系及び薄層クロマトグラフィーの展開溶媒の系は、Ａ：ジクロロメタンとイソプロピルアルコール系、Ｂ：ジクロロメタンとメタノール系、及びＣ：石油エーテルと酢酸エチル系を含み、溶剤の体積比は、化合物の極性によって調整してもよく、少量のトリエチルアミンと酸性又は塩基性試薬などを加えて調整してもよい。
【0142】
本開示の化合物の一部は、Ｑ－ＴＯＦ ＬＣ／ＭＳによって特徴付けられている。Ｑ－ＴＯＦ ＬＣ／ＭＳは、精密質量数四重極－飛行時間型質量分析計Ａｇｉｌｅｎｔ ６５３０及び超高速液体クロマトグラフＡｇｉｌｅｎｔ １２９０－Ｉｎｆｉｎｉｔｙ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ ３００ＳＢ－Ｃ８ ５ μｍ、２．１×７５ ｍｍカラム）が利用された。
【0143】
本開示に係る抗体薬物複合体のＹ－Ｄ薬物部分については、ＰＣＴ／ＣＮ２０１９／１０７８７３が参照され、関連する化合物の合成及び試験は本特許に引用されている。その中の非限定的な実施例の合成は、以下のように引用されている。
【0144】
実施例２－１
Ｎ－（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）－１－ヒドロキシシクロプロパン－１－カルボキサミド １
エキサテカンメシル酸塩１ｂ（２．０ ｍｇ、３．７６ μｍｏｌ、特許出願「ＥＰ０７３７６８６Ａ１」に開示された方法で調製された）に１ ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドを加え、氷水浴で０～５℃に冷却し、１滴のトリエチルアミンを滴下し、反応液が清澄になるまで撹拌した。反応液に１－ヒドロキシシクロプロピルギ酸１ａ（１．４ ｍｇ、３．７ μｍｏｌ、「Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ， ２５（１２）， １２６９－７２； １９８４」という公知の方法で調製された）及び４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（３．８ ｍｇ、１３．７ μｍｏｌ）を順に加え、加入完了後、０～５℃で２時間撹拌しながら反応させた。反応液に水５ ｍＬを加えて反応をクエンチし、反応液を酢酸エチル（８ ｍＬ×３）で抽出し、有機相を合わせ、飽和塩化ナトリウム溶液（５ ｍＬ×２）で洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、ろ液を減圧濃縮し、得られた残留物を薄層クロマトグラフィーにより展開溶媒系Ｂで精製し、表題生成物１（１．６ ｍｇ、収率：８２．１％）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ５２０．２ ［Ｍ＋１］
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ ７．９０－７．８４ （ｍ， １Ｈ）， ７．８０－７．６８（ｍ， １Ｈ）， ５．８０－５．７０ （ｍ， １Ｈ）， ５．６２－５．５４（ｍ， ２Ｈ）， ５．４４－５．３２ （ｍ， ２Ｈ）， ５．２８－５．１０（ｍ， ２Ｈ）， ３．４０－３．１５ （ｍ， ３Ｈ）， ２．４４ （ｓ， ３Ｈ）， ２．２３（ｔ， １Ｈ）， ２．０６－１．７５ （ｍ， ２Ｈ）， １．６８－１．５６ （ｍ， １Ｈ）， １．２２－１．１８ （ｍ， ２Ｈ）， １．０４－０．９８ （ｍ， ２Ｈ）， ０．８９ （ｔ， ３Ｈ）．
Ｎ－（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）－１－ヒドロキシシクロプロパン－１－カルボキサミド １
【化24】
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ５２０．２ ［Ｍ＋１］
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ ７．９０－７．８４ （ｍ， １Ｈ）， ７．８０－７．６８（ｍ， １Ｈ）， ５．８０－５．７０ （ｍ， １Ｈ）， ５．６２－５．５４（ｍ， ２Ｈ）， ５．４４－５．３２ （ｍ， ２Ｈ）， ５．２８－５．１０（ｍ， ２Ｈ）， ３．４０－３．１５ （ｍ， ３Ｈ）， ２．４４ （ｓ， ３Ｈ）， ２．２３（ｔ， １Ｈ）， ２．０６－１．７５ （ｍ， ２Ｈ）， １．６８－１．５６ （ｍ， １Ｈ）， １．２２－１．１８ （ｍ， ２Ｈ）， １．０４－０．９８ （ｍ， ２Ｈ）， ０．８９ （ｔ， ３Ｈ）．
【0145】
実施例２－２
（Ｓ）－２－シクロプロピル－Ｎ－（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）－２－ヒドロキシアセトアミド ２－Ａ
（Ｒ）－２－シクロプロピル－Ｎ－（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）－２－ヒドロキシアセトアミド ２－Ｂ
１ｂ（４ ｍｇ、７．５３ μｍｏｌ）に２ ｍＬのエタノール及び０．４ ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドを加え、アルゴンガスで３回置換し、氷水浴で０～５℃に冷却し、０．３ ｍＬのＮ－メチルモルホリンを滴下し、清澄になるまで反応液を撹拌した。反応液に２－シクロプロピル－２－ヒドロキシ酢酸２ａ（２．３ ｍｇ、１９．８ μｍｏｌ、特許出願「ＷＯ２０１３１０６７１７」に開示された方法で調製された）、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（３ ｍｇ、２２．４ μｍｏｌ）及び１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（４．３ ｍｇ、２２．４ μｍｏｌ）を順に加え、加入完了後、０～５℃で１時間撹拌しながら反応させた。氷水浴を撤去し、３０℃に加熱して２時間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、得られた粗製品である化合物２を高速液体クロマトグラフィーで精製し（分離条件：カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤ ５ μｍ １９＊２５０ ｍｍ、移動相：Ａ－水（１０ ｍｍｏｌ ＮＨ４ＯＡｃ）、Ｂ－アセトニトリル、勾配溶離、流速：１８ ｍＬ／分）、その対応する成分を収集し、減圧濃縮して表題生成物（２－Ａ：１．５ ｍｇ、２－Ｂ：１．５ ｍｇ）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ５３４．０ ［Ｍ＋１］。
単一配置の化合物２－Ｂ（比較的短い保持時間）
ＵＰＬＣ分析：保持時間：１．０６分間、純度：８８％（カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨＣ１８ １．７ μｍ ２．１＊５０ ｍｍ、移動相：Ａ－水（５ ｍｍｏｌ ＮＨ４ＯＡｃ）、Ｂ－アセトニトリル）。
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６）： δ ８．３７ （ｄ， １Ｈ）， ７．７６ （ｄ， １Ｈ）， ７．３０ （ｓ， １Ｈ）， ６．５１ （ｓ， １Ｈ）， ５．５８－５．５６ （ｍ， １Ｈ）， ５．４８ （ｄ， １Ｈ）， ５．４１ （ｓ， ２Ｈ）， ５．３２－５．２９ （ｍ， ２Ｈ）， ３．６０ （ｔ， １Ｈ）， ３．１９－３．１３ （ｍ， １Ｈ）， ２．３８ （ｓ， ３Ｈ）， ２．２０－２．１４ （ｍ， １Ｈ）， １．９８ （ｑ， ２Ｈ）， １．８７－１．８３ （ｍ， １Ｈ）， １．５０－１．４０ （ｍ， １Ｈ）， １．３４－１．２８ （ｍ， １Ｈ）， ０．８６ （ｔ， ３Ｈ）， ０．５０－０．３９ （ｍ， ４Ｈ）。
単一配置の化合物２－Ａ（比較的長い保持時間）
ＵＰＬＣ分析：保持時間：１．１０分間、純度：８６％（カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨＣ１８ １．７ μｍ ２．１＊５０ ｍｍ、移動相：Ａ－水（５ ｍｍｏｌ ＮＨ４ＯＡｃ）、Ｂ－アセトニトリル）。
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６）： δ ８．３５ （ｄ， １Ｈ）， ７．７８ （ｄ， １Ｈ）， ７．３１ （ｓ， １Ｈ）， ６．５２ （ｓ， １Ｈ）， ５．５８－５．５３ （ｍ， １Ｈ）， ５．４２ （ｓ， ２Ｈ）， ５．３７ （ｄ， １Ｈ）， ５．３２ （ｔ， １Ｈ）， ３．６２ （ｔ， １Ｈ）， ３．２０－３．１５ （ｍ， ２Ｈ）， ２．４０ （ｓ， ３Ｈ）， ２．２５－２．１６ （ｍ， １Ｈ）， １．９８ （ｑ， ２Ｈ）， １．８７－１．８２ （ｍ， １Ｈ）， １．５０－１．４０ （ｍ， １Ｈ）， １．２１－１．１４ （ｍ， １Ｈ）， ０．８７ （ｔ， ３Ｈ）， ０．４７－０．３５ （ｍ， ４Ｈ）。
（Ｓ）－２－シクロプロピル－Ｎ－（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）－２－ヒドロキシアセトアミド ２－Ａ
（Ｒ）－２－シクロプロピル－Ｎ－（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）－２－ヒドロキシアセトアミド ２－Ｂ
【化25】
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ５３４．０ ［Ｍ＋１］。
単一配置の化合物２－Ｂ（比較的短い保持時間）
ＵＰＬＣ分析：保持時間：１．０６分間、純度：８８％（カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨＣ１８ １．７ μｍ ２．１＊５０ ｍｍ、移動相：Ａ－水（５ ｍｍｏｌ ＮＨ４ＯＡｃ）、Ｂ－アセトニトリル）。
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６）： δ ８．３７ （ｄ， １Ｈ）， ７．７６ （ｄ， １Ｈ）， ７．３０ （ｓ， １Ｈ）， ６．５１ （ｓ， １Ｈ）， ５．５８－５．５６ （ｍ， １Ｈ）， ５．４８ （ｄ， １Ｈ）， ５．４１ （ｓ， ２Ｈ）， ５．３２－５．２９ （ｍ， ２Ｈ）， ３．６０ （ｔ， １Ｈ）， ３．１９－３．１３ （ｍ， １Ｈ）， ２．３８ （ｓ， ３Ｈ）， ２．２０－２．１４ （ｍ， １Ｈ）， １．９８ （ｑ， ２Ｈ）， １．８７－１．８３ （ｍ， １Ｈ）， １．５０－１．４０ （ｍ， １Ｈ）， １．３４－１．２８ （ｍ， １Ｈ）， ０．８６ （ｔ， ３Ｈ）， ０．５０－０．３９ （ｍ， ４Ｈ）。
単一配置の化合物２－Ａ（比較的長い保持時間）
ＵＰＬＣ分析：保持時間：１．１０分間、純度：８６％（カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨＣ１８ １．７ μｍ ２．１＊５０ ｍｍ、移動相：Ａ－水（５ ｍｍｏｌ ＮＨ４ＯＡｃ）、Ｂ－アセトニトリル）。
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６）： δ ８．３５ （ｄ， １Ｈ）， ７．７８ （ｄ， １Ｈ）， ７．３１ （ｓ， １Ｈ）， ６．５２ （ｓ， １Ｈ）， ５．５８－５．５３ （ｍ， １Ｈ）， ５．４２ （ｓ， ２Ｈ）， ５．３７ （ｄ， １Ｈ）， ５．３２ （ｔ， １Ｈ）， ３．６２ （ｔ， １Ｈ）， ３．２０－３．１５ （ｍ， ２Ｈ）， ２．４０ （ｓ， ３Ｈ）， ２．２５－２．１６ （ｍ， １Ｈ）， １．９８ （ｑ， ２Ｈ）， １．８７－１．８２ （ｍ， １Ｈ）， １．５０－１．４０ （ｍ， １Ｈ）， １．２１－１．１４ （ｍ， １Ｈ）， ０．８７ （ｔ， ３Ｈ）， ０．４７－０．３５ （ｍ， ４Ｈ）。
【0146】
実施例２－３
（Ｓ）－Ｎ－（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）－３，３，３－トリフルオロ－２－ヒドロキシプロパンアミド ３－Ａ
（Ｒ）－Ｎ－（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）－３，３，３－トリフルオロ－２－ヒドロキシプロパンアミド ３－Ｂ
１ｂ（５．０ ｍｇ、９．４１ μｍｏｌ）に２ ｍＬのエタノール及び０．４ ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドを加え、氷水浴で０～５℃に冷却し、０．３ ｍＬのＮ－メチルモルホリンを滴下し、反応液が清澄になるまで撹拌した。反応液に３，３，３－トリフルオロ－２－ヒドロキシプロピオン酸３ａ（４．１ ｍｇ、２８．４ μｍｏｌ、供給元：Ａｌｆａ）、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（３．８ ｍｇ、２８．１ μｍｏｌ）及び１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（５．４ ｍｇ、２８．２ μｍｏｌ）を順に加え、加入完了後、０～５℃で１０分間撹拌しながら反応させた。氷水浴を撤去し、３０℃に加熱して８時間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、得られた粗製品である化合物３を高速液体クロマトグラフィーで精製し（分離条件：カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤ ５ μｍ １９＊２５０ ｍｍ、移動相：Ａ－水（１０ ｍｍｏｌ ＮＨ４ＯＡｃ）、Ｂ－アセトニトリル、勾配溶離、流速：１８ ｍＬ／分）、その対応する成分を収集し、減圧濃縮して表題生成物（１．５ ｍｇ、１．５ ｍｇ）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ５６１．９ ［Ｍ＋１］。
単一配置の化合物（比較的短い保持時間）
ＵＰＬＣ分析：保持時間：１．１１分間、純度：８８％（カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨＣ１８ １．７ μｍ ２．１＊５０ ｍｍ、移動相：Ａ－水（５ ｍｍｏｌ ＮＨ４ＯＡｃ）、Ｂ－アセトニトリル）。
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６）： δ ８．９４ （ｄ， １Ｈ）， ７．８０ （ｄ， １Ｈ）， ７．３２ （ｓ， １Ｈ）， ７．２０ （ｄ， １Ｈ）， ６．５３ （ｓ， １Ｈ）， ５．６１－５．５５ （ｍ， １Ｈ）， ５．４５－５．２３ （ｍ， ３Ｈ）， ５．１５－５．０６ （ｍ， １Ｈ）， ４．６６－４．５７ （ｍ， １Ｈ）， ３．１８－３．１２ （ｍ， １Ｈ）， ２．４０ （ｓ， ３Ｈ）， ２．２６－２．２０ （ｍ， １Ｈ）， ２．１６－２．０８ （ｍ， １Ｈ）， ２．０２－１．９４ （ｍ， １Ｈ）， １．８９－１．８２ （ｍ， １Ｈ）， １．５０－１．４０ （ｍ， １Ｈ）， ０．８７ （ｔ， ３Ｈ）。
単一配置の化合物（比較的長い保持時間）
ＵＰＬＣ分析：保持時間：１．１９分間、純度：９０％（カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨＣ１８ １．７ μｍ ２．１＊５０ ｍｍ、移動相：Ａ－水（５ ｍｍｏｌ ＮＨ４ＯＡｃ）、Ｂ－アセトニトリル）。
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６）： δ ８．９７ （ｄ， １Ｈ）， ７．８０ （ｄ， １Ｈ）， ７．３１ （ｓ， １Ｈ）， ７．１６ （ｄ， １Ｈ）， ６．５３ （ｓ， １Ｈ）， ５．６３－５．５５ （ｍ， １Ｈ）， ５．４５－５．２０ （ｍ， ３Ｈ）， ５．１６－５．０７ （ｍ， １Ｈ）， ４．６６－４．５７ （ｍ， １Ｈ）， ３．１８－３．１２ （ｍ， １Ｈ）， ２．４０ （ｓ， ３Ｈ）， ２．２２－２．１４ （ｍ， １Ｈ）， ２．０４－１．９５ （ｍ， ２Ｈ）， １．８９－１．８２ （ｍ， １Ｈ）， １．５０－１．４０ （ｍ， １Ｈ）， ０．８７ （ｔ， ３Ｈ）。
（Ｓ）－Ｎ－（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）－３，３，３－トリフルオロ－２－ヒドロキシプロパンアミド ３－Ａ
（Ｒ）－Ｎ－（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）－３，３，３－トリフルオロ－２－ヒドロキシプロパンアミド ３－Ｂ
【化26】
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ５６１．９ ［Ｍ＋１］。
単一配置の化合物（比較的短い保持時間）
ＵＰＬＣ分析：保持時間：１．１１分間、純度：８８％（カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨＣ１８ １．７ μｍ ２．１＊５０ ｍｍ、移動相：Ａ－水（５ ｍｍｏｌ ＮＨ４ＯＡｃ）、Ｂ－アセトニトリル）。
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６）： δ ８．９４ （ｄ， １Ｈ）， ７．８０ （ｄ， １Ｈ）， ７．３２ （ｓ， １Ｈ）， ７．２０ （ｄ， １Ｈ）， ６．５３ （ｓ， １Ｈ）， ５．６１－５．５５ （ｍ， １Ｈ）， ５．４５－５．２３ （ｍ， ３Ｈ）， ５．１５－５．０６ （ｍ， １Ｈ）， ４．６６－４．５７ （ｍ， １Ｈ）， ３．１８－３．１２ （ｍ， １Ｈ）， ２．４０ （ｓ， ３Ｈ）， ２．２６－２．２０ （ｍ， １Ｈ）， ２．１６－２．０８ （ｍ， １Ｈ）， ２．０２－１．９４ （ｍ， １Ｈ）， １．８９－１．８２ （ｍ， １Ｈ）， １．５０－１．４０ （ｍ， １Ｈ）， ０．８７ （ｔ， ３Ｈ）。
単一配置の化合物（比較的長い保持時間）
ＵＰＬＣ分析：保持時間：１．１９分間、純度：９０％（カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨＣ１８ １．７ μｍ ２．１＊５０ ｍｍ、移動相：Ａ－水（５ ｍｍｏｌ ＮＨ４ＯＡｃ）、Ｂ－アセトニトリル）。
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６）： δ ８．９７ （ｄ， １Ｈ）， ７．８０ （ｄ， １Ｈ）， ７．３１ （ｓ， １Ｈ）， ７．１６ （ｄ， １Ｈ）， ６．５３ （ｓ， １Ｈ）， ５．６３－５．５５ （ｍ， １Ｈ）， ５．４５－５．２０ （ｍ， ３Ｈ）， ５．１６－５．０７ （ｍ， １Ｈ）， ４．６６－４．５７ （ｍ， １Ｈ）， ３．１８－３．１２ （ｍ， １Ｈ）， ２．４０ （ｓ， ３Ｈ）， ２．２２－２．１４ （ｍ， １Ｈ）， ２．０４－１．９５ （ｍ， ２Ｈ）， １．８９－１．８２ （ｍ， １Ｈ）， １．５０－１．４０ （ｍ， １Ｈ）， ０．８７ （ｔ， ３Ｈ）。
【0147】
実施例２－４
Ｎ－（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）－１－ヒドロキシシクロペンタン－１－カルボキサミド ４
１ｂ（３．０ ｍｇ、５．６４ μｍｏｌ）に１ ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドを加え、氷水浴で０～５℃に冷却し、１滴のトリエチルアミンを滴下し、反応液が清澄になるまで撹拌した。反応液に１－ヒドロキシ－シクロペンタンギ酸４ａ（２．２ ｍｇ、１６．９ μｍｏｌ、特許出願「ＷＯ２０１３１０６７１７」に開示された方法で調製された）及び４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（４．７ ｍｇ、１６．９ μｍｏｌ）を順に加え、加入完了後、０～５℃で１時間撹拌しながら反応させた。反応液に水５ ｍＬを加えて反応をクエンチし、反応液を酢酸エチル（１０ ｍＬ×３）で抽出し、有機相を合わせ、飽和塩化ナトリウム溶液（５ ｍＬ×２）で洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、ろ液を減圧濃縮し、得られた残留物を薄層クロマトグラフィーにより展開溶媒系Ｂで精製し、表題生成物４（２．５ ｍｇ、収率：８０．９％）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ５４８．０ ［Ｍ＋１］。
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ ７．７３－７．６２ （ｍ， ２Ｈ）， ５．７５－５．６２ （ｍ， １Ｈ）， ５．４６－５．３２ （ｍ， ２Ｈ）， ５．２６－５．１０ （ｍ， １Ｈ）， ３．３０－３．１０ （ｍ， １Ｈ）， ２．４３ （ｓ， ３Ｈ）， ２．２８－２．２０ （ｍ， ２Ｈ）， ２．０８－１．８４ （ｍ， ８Ｈ）， １．６９－１．５８ （ｍ， ２Ｈ）， １．０４－１．００ （ｍ， ２Ｈ）， ０．８９ （ｔ， ３Ｈ）。
Ｎ－（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）－１－ヒドロキシシクロペンタン－１－カルボキサミド ４
【化27】
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ５４８．０ ［Ｍ＋１］。
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ ７．７３－７．６２ （ｍ， ２Ｈ）， ５．７５－５．６２ （ｍ， １Ｈ）， ５．４６－５．３２ （ｍ， ２Ｈ）， ５．２６－５．１０ （ｍ， １Ｈ）， ３．３０－３．１０ （ｍ， １Ｈ）， ２．４３ （ｓ， ３Ｈ）， ２．２８－２．２０ （ｍ， ２Ｈ）， ２．０８－１．８４ （ｍ， ８Ｈ）， １．６９－１．５８ （ｍ， ２Ｈ）， １．０４－１．００ （ｍ， ２Ｈ）， ０．８９ （ｔ， ３Ｈ）。
【0148】
実施例２－５
Ｎ－（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）－１－（ヒドロキシメチル）シクロプロパン－１－カルボキサミド ５
１ｂ（２．０ ｍｇ、３．７６ μｍｏｌ）に１ ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドを加え、氷水浴で０～５℃に冷却し、１滴のトリエチルアミンを滴下し、反応液が清澄になるまで撹拌した。反応液に１－（ヒドロキシメチル）－シクロペンタンギ酸５ａ（０．８７ ｍｇ、７．５ μｍｏｌ、特許出願「ＷＯ２０１３９６７７１」に開示された方法で調製された）及び４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（２ ｍｇ、７．２４ μｍｏｌ）を順に加え、加入完了後、０～５℃で２時間撹拌しながら反応させた。反応液に水５ ｍＬを加えて反応をクエンチし、反応液を酢酸エチル（８ ｍＬ×３）で抽出し、有機相を合わせ、飽和塩化ナトリウム溶液（５ ｍＬ×２）で洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、ろ液を減圧濃縮し、得られた残留物を薄層クロマトグラフィーにより展開溶媒系Ｂで精製し、表題生成物５（１．０ ｍｇ、収率：５０％）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ５３３．９ ［Ｍ＋１］。
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ ８．０７ （ｓ， １Ｈ）， ７．２３－７．１８ （ｍ， ２Ｈ）， ６．７１－６．６４ （ｍ， １Ｈ）， ６．５５－６．５１ （ｍ， １Ｈ）， ５．３６－５．２７ （ｍ， ２Ｈ）， ４．６７－４．６１ （ｍ， ２Ｈ）， ３．５３－３．４８ （ｍ， １Ｈ）， ３．３０－３．２２ （ｍ， ２Ｈ）， ３．１８－３．１３ （ｍ， １Ｈ）， ２．７１－２．６１ （ｍ， ２Ｈ）， ２．３５－２．２８ （ｍ， １Ｈ）， ２．０４－１．９１ （ｍ， ４Ｈ）， １．５３－１．４０ （ｍ， ３Ｈ）， ０．９１－０．７５ （ｍ， ４Ｈ）。
Ｎ－（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）－１－（ヒドロキシメチル）シクロプロパン－１－カルボキサミド ５
【化28】
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ５３３．９ ［Ｍ＋１］。
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ ８．０７ （ｓ， １Ｈ）， ７．２３－７．１８ （ｍ， ２Ｈ）， ６．７１－６．６４ （ｍ， １Ｈ）， ６．５５－６．５１ （ｍ， １Ｈ）， ５．３６－５．２７ （ｍ， ２Ｈ）， ４．６７－４．６１ （ｍ， ２Ｈ）， ３．５３－３．４８ （ｍ， １Ｈ）， ３．３０－３．２２ （ｍ， ２Ｈ）， ３．１８－３．１３ （ｍ， １Ｈ）， ２．７１－２．６１ （ｍ， ２Ｈ）， ２．３５－２．２８ （ｍ， １Ｈ）， ２．０４－１．９１ （ｍ， ４Ｈ）， １．５３－１．４０ （ｍ， ３Ｈ）， ０．９１－０．７５ （ｍ， ４Ｈ）。
【0149】
実施例２－６
Ｎ－（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）－１－（ヒドロキシメチル）シクロブタン－１－カルボキサミド ６
１ｂ（３．０ ｍｇ、５．６４ μｍｏｌ）に１ ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドを加え、氷水浴で０～５℃に冷却し、１滴のトリエチルアミンを滴下し、反応液が清澄になるまで撹拌した。反応液に１－（ヒドロキシメチル）シクロブタン－１－ギ酸６ａ（２．２ ｍｇ、１６．９ μｍｏｌ、「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ， ２０１４， ｖｏｌ．１３６， ＃２２， ｐ．８１３８－８１４２」という文献に開示された方法で調製された）及び４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（４．７ ｍｇ、１６．９ μｍｏｌ）を順に加え、加入完了後、０～５℃で１時間撹拌しながら反応させた。反応液に水５ ｍＬを加えて反応をクエンチし、反応液を酢酸エチル（１０ ｍＬ×３）で抽出し、有機相を合わせ、飽和塩化ナトリウム溶液（５ ｍＬ×２）で洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、ろ液を減圧濃縮し、得られた残留物を薄層クロマトグラフィーにより展開溶媒系Ｂで精製し、表題生成物６（２．１ ｍｇ、収率：６７．９％）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ５４８．０ ［Ｍ＋１］。
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６）： δ ７．８５－７．６２ （ｍ， １Ｈ）， ６．８８ （ｂｒ，１Ｈ）， ５．８７－５．４８ （ｍ，２Ｈ）， ５．４７－５．３３ （ｍ，１Ｈ）， ５．３１－５．０６ （ｍ，１Ｈ）， ４．２５－３．９１ （ｍ， ２Ｈ）， ３．２５ （ｂｒ， １Ｈ）， ２．６０－２．３２ （ｍ， ３Ｈ）， ２．２３ （ｔ， １Ｈ）， ２．１５－１．９５ （ｍ， ３Ｈ）， １．７０－１．５６ （ｍ， ２Ｈ）， １．４１－１．１７ （ｍ， ９Ｈ）， １．０３ （ｓ， １Ｈ）， ０．９５－０．８０ （ｍ， ２Ｈ）。
Ｎ－（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）－１－（ヒドロキシメチル）シクロブタン－１－カルボキサミド ６
【化29】
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ５４８．０ ［Ｍ＋１］。
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６）： δ ７．８５－７．６２ （ｍ， １Ｈ）， ６．８８ （ｂｒ，１Ｈ）， ５．８７－５．４８ （ｍ，２Ｈ）， ５．４７－５．３３ （ｍ，１Ｈ）， ５．３１－５．０６ （ｍ，１Ｈ）， ４．２５－３．９１ （ｍ， ２Ｈ）， ３．２５ （ｂｒ， １Ｈ）， ２．６０－２．３２ （ｍ， ３Ｈ）， ２．２３ （ｔ， １Ｈ）， ２．１５－１．９５ （ｍ， ３Ｈ）， １．７０－１．５６ （ｍ， ２Ｈ）， １．４１－１．１７ （ｍ， ９Ｈ）， １．０３ （ｓ， １Ｈ）， ０．９５－０．８０ （ｍ， ２Ｈ）。
【0150】
実施例２－７
Ｎ－（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）－１－ヒドロキシシクロブタン－１－カルボキサミド ７
１ｂ（３．０ ｍｇ、５．６４ μｍｏｌ）に２ ｍＬのエタノール及び０．４ ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドを加え、氷水浴で０～５℃に冷却し、０．３ ｍＬのＮ－メチルモルホリンを滴下し、反応液が清澄になるまで撹拌した。反応液に１－ヒドロキシシクロブタンギ酸７ａ（２．０ ｍｇ、１７．２２ μｍｏｌ、供給元：薬石）、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（２．３ ｍｇ、１７．０ μｍｏｌ）及び１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（３．２ ｍｇ、１６．７ μｍｏｌ）を順に加え、加入完了後、０～５℃で１０分間撹拌しながら反応させた。氷水浴を撤去し、室温で２時間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、得られた残留物を薄層クロマトグラフィーにより展開溶媒系Ｂで精製し、表題生成物７（２．５ ｍｇ、収率：８３．１％）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ５３４．０ ［Ｍ＋１］。
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６）： δ ８．２８ （ｄ， １Ｈ）， ７．７５ （ｄ， １Ｈ）， ７．２９ （ｓ， １Ｈ）， ６．５１ （ｓ， １Ｈ）， ６．１２ （ｓ， １Ｈ）， ５．５９－５．５１ （ｍ， １Ｈ）， ５．４１ （ｓ， ２Ｈ）， ５．２０－５．０１ （ｍ， ２Ｈ）， ３．２７－３．１７ （ｍ， １Ｈ）， ３．１５－３．０５ （ｍ， １Ｈ）， ２．７１－２．６３ （ｍ， １Ｈ）， ２．３７ （ｓ， ３Ｈ）， ２．１２－２．０５ （ｍ， １Ｈ）， ２．０３－１．９４ （ｍ， ２Ｈ）， １．９２－１．７８ （ｍ， ４Ｈ）， １．５０－１．４２ （ｍ， １Ｈ）， ０．９０－０．８３ （ｍ， ４Ｈ）。
Ｎ－（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）－１－ヒドロキシシクロブタン－１－カルボキサミド ７
【化30】
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ５３４．０ ［Ｍ＋１］。
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６）： δ ８．２８ （ｄ， １Ｈ）， ７．７５ （ｄ， １Ｈ）， ７．２９ （ｓ， １Ｈ）， ６．５１ （ｓ， １Ｈ）， ６．１２ （ｓ， １Ｈ）， ５．５９－５．５１ （ｍ， １Ｈ）， ５．４１ （ｓ， ２Ｈ）， ５．２０－５．０１ （ｍ， ２Ｈ）， ３．２７－３．１７ （ｍ， １Ｈ）， ３．１５－３．０５ （ｍ， １Ｈ）， ２．７１－２．６３ （ｍ， １Ｈ）， ２．３７ （ｓ， ３Ｈ）， ２．１２－２．０５ （ｍ， １Ｈ）， ２．０３－１．９４ （ｍ， ２Ｈ）， １．９２－１．７８ （ｍ， ４Ｈ）， １．５０－１．４２ （ｍ， １Ｈ）， ０．９０－０．８３ （ｍ， ４Ｈ）。
【0151】
実施例２－８
１－（（（Ｓ）－７－ベンジル－２０－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）－３，６，９，１２，１５－ペンタオキソ－２，５，８，１１，１４－ペンタアザイコシル）オキシ）－Ｎ－（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）シクロプロパン－１－カルボキサミド ８
ステップ１
１－（（２－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）アセチルアミノ）メトキシ）シクロプロパン－１－カルボン酸ベンジル ８ｃ
１－ヒドロキシシクロプロパン－１－カルボン酸ベンジル８ａ（１０４ ｍｇ、０．５４ ｍｍｏｌ、特許出願「ＵＳ２００５／２０６４５」に開示された方法で調製された）及び（２－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）アセチルアミノ）メチル酢酸エステル８ｂ（１００ ｍｇ、０．２７ ｍｍｏｌ、特許出願「ＣＮ１０５８２９３４６Ａ」に開示された方法で調製された）を反応フラスコに加え、５ ｍＬのテトラヒドロフランを加え、アルゴンガスで３回置換し、氷水浴で０～５℃に降温し、カリウムｔｅｒｔ－ブトキシド（６１ ｍｇ、０．５４ ｍｍｏｌ）を加え、氷浴を撤去し、室温まで昇温して１０分間撹拌し、氷水２０ ｍＬを加え、酢酸エチル（５ ｍＬ×２）及びクロロホルム（５ ｍＬ×５）で抽出し、有機相を合わせて濃縮した。得られた残留物を３ ｍＬの１，４－ジオキサンに溶解し、水０．６ ｍＬを加え、炭酸水素ナトリウム（２７ ｍｇ、０．３２ ｍｍｏｌ）及びクロロギ酸－９－フルオレニルメチル（７０ ｍｇ、０．２７ ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌した。水２０ ｍＬを加え、酢酸エチル（８ ｍＬ×３）で抽出し、有機相を飽和塩化ナトリウム溶液（２０ ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、ろ液を減圧濃縮し、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより展開溶媒系Ｂで精製し、表題生成物８ｃ（１００ ｍｇ、収率：７３．６％）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ５０１．０ ［Ｍ＋１］。
１－（（（Ｓ）－７－ベンジル－２０－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）－３，６，９，１２，１５－ペンタオキソ－２，５，８，１１，１４－ペンタアザイコシル）オキシ）－Ｎ－（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）シクロプロパン－１－カルボキサミド ８
【化31】
ステップ１
１－（（２－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）アセチルアミノ）メトキシ）シクロプロパン－１－カルボン酸ベンジル ８ｃ
１－ヒドロキシシクロプロパン－１－カルボン酸ベンジル８ａ（１０４ ｍｇ、０．５４ ｍｍｏｌ、特許出願「ＵＳ２００５／２０６４５」に開示された方法で調製された）及び（２－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）アセチルアミノ）メチル酢酸エステル８ｂ（１００ ｍｇ、０．２７ ｍｍｏｌ、特許出願「ＣＮ１０５８２９３４６Ａ」に開示された方法で調製された）を反応フラスコに加え、５ ｍＬのテトラヒドロフランを加え、アルゴンガスで３回置換し、氷水浴で０～５℃に降温し、カリウムｔｅｒｔ－ブトキシド（６１ ｍｇ、０．５４ ｍｍｏｌ）を加え、氷浴を撤去し、室温まで昇温して１０分間撹拌し、氷水２０ ｍＬを加え、酢酸エチル（５ ｍＬ×２）及びクロロホルム（５ ｍＬ×５）で抽出し、有機相を合わせて濃縮した。得られた残留物を３ ｍＬの１，４－ジオキサンに溶解し、水０．６ ｍＬを加え、炭酸水素ナトリウム（２７ ｍｇ、０．３２ ｍｍｏｌ）及びクロロギ酸－９－フルオレニルメチル（７０ ｍｇ、０．２７ ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌した。水２０ ｍＬを加え、酢酸エチル（８ ｍＬ×３）で抽出し、有機相を飽和塩化ナトリウム溶液（２０ ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、ろ液を減圧濃縮し、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより展開溶媒系Ｂで精製し、表題生成物８ｃ（１００ ｍｇ、収率：７３．６％）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ５０１．０ ［Ｍ＋１］。
【0152】
ステップ２
１－（（２－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）アセチルアミノ）メトキシ）シクロプロパン－１－カルボン酸 ８ｄ
８ｃ（５０ ｍｇ、０．１０ ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフランと酢酸エチル（Ｖ：Ｖ＝２：１）の混合溶媒３ ｍＬに溶解し、パラジウム炭素（２５ ｍｇ、含有量１０％）を加え、水素ガスで３回置換し、室温で１時間撹拌しながら反応させた。反応液を珪藻土でろ過し、ろ過ケーキをテトラヒドロフランですすぎ、ろ液を濃縮して表題生成物８ｄ（４１ ｍｇ、収率：１００％）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ４１１．０ ［Ｍ＋１］。
１－（（２－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）アセチルアミノ）メトキシ）シクロプロパン－１－カルボン酸 ８ｄ
８ｃ（５０ ｍｇ、０．１０ ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフランと酢酸エチル（Ｖ：Ｖ＝２：１）の混合溶媒３ ｍＬに溶解し、パラジウム炭素（２５ ｍｇ、含有量１０％）を加え、水素ガスで３回置換し、室温で１時間撹拌しながら反応させた。反応液を珪藻土でろ過し、ろ過ケーキをテトラヒドロフランですすぎ、ろ液を濃縮して表題生成物８ｄ（４１ ｍｇ、収率：１００％）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ４１１．０ ［Ｍ＋１］。
【0153】
ステップ３
（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチル（２－（（（１－（（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）アミノカルボニル）シクロプロポキシ）メチル）アミノ）－２－オキソエチル）カルバメート ８ｅ
１ｂ（７ ｍｇ、０．０１３ ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加え、１ ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドを加え、アルゴンガスで３回置換し、氷水浴で０～５℃に降温し、１滴のトリエチルアミンを滴下し、８ｄ（７ ｍｇ、０．０１７ ｍｍｏｌ）の０．５ ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド溶液を加え、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（７ ｍｇ、０．０２６ ｍｍｏｌ）を加え、氷浴で３５分間撹拌しながら反応させた。１０ ｍＬの水を加え、酢酸エチル（５ ｍＬ×３）で抽出し、有機相を飽和塩化ナトリウム溶液（１０ ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、ろ液を減圧濃縮し、得られた残留物を薄層クロマトグラフィーにより展開溶媒系Ｂで精製し、表題生成物８ｅ（８．５ ｍｇ、収率：７８．０％）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ８２８．０ ［Ｍ＋１］。
（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチル（２－（（（１－（（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）アミノカルボニル）シクロプロポキシ）メチル）アミノ）－２－オキソエチル）カルバメート ８ｅ
１ｂ（７ ｍｇ、０．０１３ ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加え、１ ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドを加え、アルゴンガスで３回置換し、氷水浴で０～５℃に降温し、１滴のトリエチルアミンを滴下し、８ｄ（７ ｍｇ、０．０１７ ｍｍｏｌ）の０．５ ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド溶液を加え、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（７ ｍｇ、０．０２６ ｍｍｏｌ）を加え、氷浴で３５分間撹拌しながら反応させた。１０ ｍＬの水を加え、酢酸エチル（５ ｍＬ×３）で抽出し、有機相を飽和塩化ナトリウム溶液（１０ ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、ろ液を減圧濃縮し、得られた残留物を薄層クロマトグラフィーにより展開溶媒系Ｂで精製し、表題生成物８ｅ（８．５ ｍｇ、収率：７８．０％）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ８２８．０ ［Ｍ＋１］。
【0154】
ステップ４
１－（（２－アミノアセチルアミノ）メトキシ）－Ｎ－（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）シクロプロパン－１－カルボキサミド ８ｆ
８ｅ（４ ｍｇ、４．８４ μｍｏｌ）を０．２ ｍＬのジクロロメタンに溶解し、０．１ ｍＬのジエチルアミンを加え、室温で２時間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、２ ｍＬのトルエンを加えて減圧濃縮することを２回繰り返し、３ ｍＬのｎ－ヘキサンを加えてスラリー化し、上層のｎ－ヘキサンを注ぎ出すことを３回繰り返し、減圧濃縮して粗製品である表題生成物８ｆ（２．９ ｍｇ）を得て、生成物を精製せずにそのまま次のステップの反応に使用した。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ６０６．０ ［Ｍ＋１］。
１－（（２－アミノアセチルアミノ）メトキシ）－Ｎ－（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）シクロプロパン－１－カルボキサミド ８ｆ
８ｅ（４ ｍｇ、４．８４ μｍｏｌ）を０．２ ｍＬのジクロロメタンに溶解し、０．１ ｍＬのジエチルアミンを加え、室温で２時間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、２ ｍＬのトルエンを加えて減圧濃縮することを２回繰り返し、３ ｍＬのｎ－ヘキサンを加えてスラリー化し、上層のｎ－ヘキサンを注ぎ出すことを３回繰り返し、減圧濃縮して粗製品である表題生成物８ｆ（２．９ ｍｇ）を得て、生成物を精製せずにそのまま次のステップの反応に使用した。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ６０６．０ ［Ｍ＋１］。
【0155】
ステップ５
１－（（（Ｓ）－７－ベンジル－２０－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）－３，６，９，１２，１５－ペンタオキソ－２，５，８，１１，１４－ペンタアザイコシル）オキシ）－Ｎ－（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）シクロプロパン－１－カルボキサミド ８
粗製品８ｆ（２．９ ｍｇ、４．８４ μｍｏｌ）を０．５ ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドに溶解し、アルゴンガスで３回置換し、氷水浴で０～５℃に降温し、（Ｓ）－２－（－２－（－２－（６－（－２，５－ジオキソ－１Ｈ－ピロール－１－イル）ヘキサンアミノ）アセチルアミノ）アセチルアミノ）－３－フェニルプロピオン酸８ｇ（２．７ ｍｇ、５．８０ μｍｏｌ、特許出願「ＥＰ２９０７８２４」に開示された方法で調製された）の０．３ ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド溶液を加え、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（２．７ ｍｇ、９．６７ μｍｏｌ）を加え、氷浴で３０分間撹拌しながら反応させ、氷浴を撤去し、室温まで昇温して１５分間撹拌した。反応液を高速液体クロマトグラフィーで精製し（分離条件：カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤ ５ μｍ １９＊２５０ ｍｍ、移動相：Ａ－水（１０ ｍｍｏｌ ＮＨ４ＯＡｃ）、Ｂ－アセトニトリル、勾配溶離、流速：１８ ｍＬ／ｍｉｎ）、その対応する成分を収集し、減圧濃縮して表題生成物８（２ ｍｇ、収率：３９．０％）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： １０６０．０ ［Ｍ＋１］。
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６）： δ ９．０１ （ｄ， １Ｈ）， ８．７７ （ｔ， １Ｈ）， ８．２１ （ｔ， １Ｈ）， ８．０８－７．９２ （ｍ， ２Ｈ）， ７．７３ （ｄ， １Ｈ）， ７．２８ （ｓ， １Ｈ）， ７．２４－７．０７ （ｍ， ４Ｈ）， ６．９８ （ｓ， １Ｈ）， ６．５０ （ｓ， １Ｈ）， ５．６１ （ｑ， １Ｈ）， ５．４０ （ｓ， ２Ｈ）， ５．３２ （ｔ， １Ｈ）， ５．１２ （ｑ， ２Ｈ）， ４．６２ （ｔ， １Ｈ）， ４．５２ （ｔ， １Ｈ）， ４．４０－４．３２ （ｍ， １Ｈ）， ３．７３－３．４７ （ｍ， ８Ｈ）， ３．１６－３．０４ （ｍ， ２Ｈ）， ２．８９ （ｄｄ， １Ｈ）， ２．６９－２．５５ （ｍ， ２Ｈ）， ２．３７－２．２３ （ｍ， ４Ｈ）， ２．１２－１．９３ （ｍ， ４Ｈ）， １．９０－１．７４ （ｍ， ２Ｈ）， １．５２－１．３８ （ｍ， ４Ｈ）， １．３３－１．１１ （ｍ， ５Ｈ）， ０．９１－０．８１ （ｍ， ４Ｈ）。
１－（（（Ｓ）－７－ベンジル－２０－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）－３，６，９，１２，１５－ペンタオキソ－２，５，８，１１，１４－ペンタアザイコシル）オキシ）－Ｎ－（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）シクロプロパン－１－カルボキサミド ８
粗製品８ｆ（２．９ ｍｇ、４．８４ μｍｏｌ）を０．５ ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドに溶解し、アルゴンガスで３回置換し、氷水浴で０～５℃に降温し、（Ｓ）－２－（－２－（－２－（６－（－２，５－ジオキソ－１Ｈ－ピロール－１－イル）ヘキサンアミノ）アセチルアミノ）アセチルアミノ）－３－フェニルプロピオン酸８ｇ（２．７ ｍｇ、５．８０ μｍｏｌ、特許出願「ＥＰ２９０７８２４」に開示された方法で調製された）の０．３ ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド溶液を加え、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（２．７ ｍｇ、９．６７ μｍｏｌ）を加え、氷浴で３０分間撹拌しながら反応させ、氷浴を撤去し、室温まで昇温して１５分間撹拌した。反応液を高速液体クロマトグラフィーで精製し（分離条件：カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤ ５ μｍ １９＊２５０ ｍｍ、移動相：Ａ－水（１０ ｍｍｏｌ ＮＨ４ＯＡｃ）、Ｂ－アセトニトリル、勾配溶離、流速：１８ ｍＬ／ｍｉｎ）、その対応する成分を収集し、減圧濃縮して表題生成物８（２ ｍｇ、収率：３９．０％）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： １０６０．０ ［Ｍ＋１］。
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６）： δ ９．０１ （ｄ， １Ｈ）， ８．７７ （ｔ， １Ｈ）， ８．２１ （ｔ， １Ｈ）， ８．０８－７．９２ （ｍ， ２Ｈ）， ７．７３ （ｄ， １Ｈ）， ７．２８ （ｓ， １Ｈ）， ７．２４－７．０７ （ｍ， ４Ｈ）， ６．９８ （ｓ， １Ｈ）， ６．５０ （ｓ， １Ｈ）， ５．６１ （ｑ， １Ｈ）， ５．４０ （ｓ， ２Ｈ）， ５．３２ （ｔ， １Ｈ）， ５．１２ （ｑ， ２Ｈ）， ４．６２ （ｔ， １Ｈ）， ４．５２ （ｔ， １Ｈ）， ４．４０－４．３２ （ｍ， １Ｈ）， ３．７３－３．４７ （ｍ， ８Ｈ）， ３．１６－３．０４ （ｍ， ２Ｈ）， ２．８９ （ｄｄ， １Ｈ）， ２．６９－２．５５ （ｍ， ２Ｈ）， ２．３７－２．２３ （ｍ， ４Ｈ）， ２．１２－１．９３ （ｍ， ４Ｈ）， １．９０－１．７４ （ｍ， ２Ｈ）， １．５２－１．３８ （ｍ， ４Ｈ）， １．３３－１．１１ （ｍ， ５Ｈ）， ０．９１－０．８１ （ｍ， ４Ｈ）。
【0156】
実施例２－９
Ｎ－（（２Ｒ，１０Ｓ）－１０－ベンジル－２－シクロプロピル－１－（（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）アミノ）－１，６，９，１２，１５－ペンタオキソ－３－オキサ－５，８，１１，１４－テトラアザヘキサデカン－１６－イル）－６－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）ヘキサンアミド ９－Ａ
Ｎ－（（２Ｓ，１０Ｓ）－１０－ベンジル－２－シクロプロピル－１－（（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）アミノ）－１，６，９，１２，１５－ペンタオキソ－３－オキサ－５，８，１１，１４－テトラアザヘキサデカン－１６－イル）－６－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）ヘキサンアミド ９－Ｂ
ステップ１
２－シクロプロピル－２－ヒドロキシ酢酸ベンジル ９ａ
２ａ（１．３ ｇ、１１．２ ｍｍｏｌ、特許出願「ＷＯ２０１３／１０６７１７」に開示された方法で調製された）を５０ ｍＬのアセトニトリルに溶解し、炭酸カリウム（６．１８ ｇ、４４．８ ｍｍｏｌ）、臭化ベンジル（１．３３ ｍＬ、１１．２ ｍｍｏｌ）及びテトラブチルヨウ化アンモニウム（４１３ ｍｇ、１．１ ｍｍｏｌ）を順に加えた。反応液を室温で４８時間撹拌し、珪藻土でろ過し、ろ過ケーキを酢酸エチル（１０ ｍＬ）ですすぎ、ろ液を合わせて減圧濃縮し、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより展開溶媒系Ｃで精製し、表題生成物９ａ（２ ｇ、収率：８６．９％）を得た。
Ｎ－（（２Ｒ，１０Ｓ）－１０－ベンジル－２－シクロプロピル－１－（（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）アミノ）－１，６，９，１２，１５－ペンタオキソ－３－オキサ－５，８，１１，１４－テトラアザヘキサデカン－１６－イル）－６－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）ヘキサンアミド ９－Ａ
Ｎ－（（２Ｓ，１０Ｓ）－１０－ベンジル－２－シクロプロピル－１－（（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）アミノ）－１，６，９，１２，１５－ペンタオキソ－３－オキサ－５，８，１１，１４－テトラアザヘキサデカン－１６－イル）－６－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）ヘキサンアミド ９－Ｂ
【化32】
ステップ１
２－シクロプロピル－２－ヒドロキシ酢酸ベンジル ９ａ
２ａ（１．３ ｇ、１１．２ ｍｍｏｌ、特許出願「ＷＯ２０１３／１０６７１７」に開示された方法で調製された）を５０ ｍＬのアセトニトリルに溶解し、炭酸カリウム（６．１８ ｇ、４４．８ ｍｍｏｌ）、臭化ベンジル（１．３３ ｍＬ、１１．２ ｍｍｏｌ）及びテトラブチルヨウ化アンモニウム（４１３ ｍｇ、１．１ ｍｍｏｌ）を順に加えた。反応液を室温で４８時間撹拌し、珪藻土でろ過し、ろ過ケーキを酢酸エチル（１０ ｍＬ）ですすぎ、ろ液を合わせて減圧濃縮し、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより展開溶媒系Ｃで精製し、表題生成物９ａ（２ ｇ、収率：８６．９％）を得た。
【0157】
ステップ２
１０－シクロプロピル－１－（９Ｈ－フルオレン－９－イル）－３，６－ジオキソ－２，９－ジオキサ－４，７－ジアザウンデカン－１１－酸ベンジル ９ｂ
９ａ（１２０．９ ｍｇ、０．５８６ ｍｍｏｌ）及び８ｂ（１８０ ｍｇ、０．４８９ ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加え、４ ｍＬのテトラヒドロフランを加え、アルゴンガスで３回置換し、氷水浴で０～５℃に降温し、カリウムｔｅｒｔ－ブトキシド（１０９ ｍｇ、０．９８ ｍｍｏｌ）を加え、氷水浴を撤去し、室温まで昇温して４０分間撹拌し、１０ ｍＬの氷水を加え、酢酸エチル（２０ ｍＬ×２）及びクロロホルム（１０ ｍＬ×５）で抽出し、有機相を合わせて濃縮した。得られた残留物を４ ｍＬのジオキサンに溶解し、水２ ｍＬを加え、炭酸水素ナトリウム（４９．２ ｍｇ、０．５８６ ｍｍｏｌ）及びクロロギ酸－９－フルオレニルメチル（１２６ ｍｇ、０．４９ ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間撹拌した。水２０ ｍＬを加え、酢酸エチル（１０ ｍＬ×３）で抽出し、有機相を飽和塩化ナトリウム溶液（２０ ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、ろ液を減圧濃縮した。得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより展開溶媒系Ｃで精製し、表題生成物９ｂ（４８ ｍｇ、収率：１９％）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ５１５．０ ［Ｍ＋１］。
１０－シクロプロピル－１－（９Ｈ－フルオレン－９－イル）－３，６－ジオキソ－２，９－ジオキサ－４，７－ジアザウンデカン－１１－酸ベンジル ９ｂ
９ａ（１２０．９ ｍｇ、０．５８６ ｍｍｏｌ）及び８ｂ（１８０ ｍｇ、０．４８９ ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加え、４ ｍＬのテトラヒドロフランを加え、アルゴンガスで３回置換し、氷水浴で０～５℃に降温し、カリウムｔｅｒｔ－ブトキシド（１０９ ｍｇ、０．９８ ｍｍｏｌ）を加え、氷水浴を撤去し、室温まで昇温して４０分間撹拌し、１０ ｍＬの氷水を加え、酢酸エチル（２０ ｍＬ×２）及びクロロホルム（１０ ｍＬ×５）で抽出し、有機相を合わせて濃縮した。得られた残留物を４ ｍＬのジオキサンに溶解し、水２ ｍＬを加え、炭酸水素ナトリウム（４９．２ ｍｇ、０．５８６ ｍｍｏｌ）及びクロロギ酸－９－フルオレニルメチル（１２６ ｍｇ、０．４９ ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間撹拌した。水２０ ｍＬを加え、酢酸エチル（１０ ｍＬ×３）で抽出し、有機相を飽和塩化ナトリウム溶液（２０ ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、ろ液を減圧濃縮した。得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより展開溶媒系Ｃで精製し、表題生成物９ｂ（４８ ｍｇ、収率：１９％）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ５１５．０ ［Ｍ＋１］。
【0158】
ステップ３
１０－シクロプロピル－１－（９Ｈ－フルオレン－９－イル）－３，６－ジオキソ－２，９－ジオキサ－４，７－ジアザウンデカン－１１－酸 ９ｃ
９ｂ（２０ ｍｇ、０．０３８ ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフランと酢酸エチル（Ｖ：Ｖ＝２：１）の混合溶媒４．５ ｍＬに溶解し、パラジウム炭素（１２ ｍｇ、含有量１０％、乾燥型）を加え、水素ガスで３回置換し、室温で１時間撹拌しながら反応させた。反応液を珪藻土でろ過し、ろ過ケーキを酢酸エチルですすぎ、ろ液を濃縮して粗製品である表題生成物９ｃ（１３ ｍｇ）を得て、生成物を精製せずにそのまま次のステップの反応を行った。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ４２４．９ ［Ｍ＋１］。
１０－シクロプロピル－１－（９Ｈ－フルオレン－９－イル）－３，６－ジオキソ－２，９－ジオキサ－４，７－ジアザウンデカン－１１－酸 ９ｃ
９ｂ（２０ ｍｇ、０．０３８ ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフランと酢酸エチル（Ｖ：Ｖ＝２：１）の混合溶媒４．５ ｍＬに溶解し、パラジウム炭素（１２ ｍｇ、含有量１０％、乾燥型）を加え、水素ガスで３回置換し、室温で１時間撹拌しながら反応させた。反応液を珪藻土でろ過し、ろ過ケーキを酢酸エチルですすぎ、ろ液を濃縮して粗製品である表題生成物９ｃ（１３ ｍｇ）を得て、生成物を精製せずにそのまま次のステップの反応を行った。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ４２４．９ ［Ｍ＋１］。
【0159】
ステップ４
（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチル（２－（（（１－シクロプロピル－２－（（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）アミノ）－２－オキソエトキシ）メチル）アミノ）－２－オキソエチル）カルバメート ９ｄ
１ｂ（１０ ｍｇ、１８．８ μｍｏｌ）を反応フラスコに入れ、１ ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドを加え、アルゴンガスで３回置換し、氷水浴で０～５℃に降温し、１滴のトリエチルアミンを滴下し、粗製品９ｃ（１３ ｍｇ、３０．６ μｍｏｌ）を加え、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（１６．９ ｍｇ、６１．２ μｍｏｌ）を加え、氷浴で４０分間撹拌しながら反応させた。１０ ｍＬの水を加え、酢酸エチル（１０ ｍＬ×３）で抽出し、有機相を合わせた。有機相を飽和塩化ナトリウム溶液（１０ ｍＬ×２）で洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、ろ液を減圧濃縮した。得られた残留物を薄層クロマトグラフィーにより展開溶媒系Ｂで精製し、表題生成物９ｄ（１９ ｍｇ、収率：７３．６％）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ８４２．１［Ｍ＋１］。
（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチル（２－（（（１－シクロプロピル－２－（（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）アミノ）－２－オキソエトキシ）メチル）アミノ）－２－オキソエチル）カルバメート ９ｄ
１ｂ（１０ ｍｇ、１８．８ μｍｏｌ）を反応フラスコに入れ、１ ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドを加え、アルゴンガスで３回置換し、氷水浴で０～５℃に降温し、１滴のトリエチルアミンを滴下し、粗製品９ｃ（１３ ｍｇ、３０．６ μｍｏｌ）を加え、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（１６．９ ｍｇ、６１．２ μｍｏｌ）を加え、氷浴で４０分間撹拌しながら反応させた。１０ ｍＬの水を加え、酢酸エチル（１０ ｍＬ×３）で抽出し、有機相を合わせた。有機相を飽和塩化ナトリウム溶液（１０ ｍＬ×２）で洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、ろ液を減圧濃縮した。得られた残留物を薄層クロマトグラフィーにより展開溶媒系Ｂで精製し、表題生成物９ｄ（１９ ｍｇ、収率：７３．６％）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ８４２．１［Ｍ＋１］。
【0160】
ステップ５
２－（（２－アミノアセチルアミノ）メトキシ）－２－シクロプロピル－Ｎ－（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）アセトアミド ９ｅ
９ｄ（１９ ｍｇ、２２．６ μｍｏｌ）を２ ｍＬのジクロロメタンに溶解し、１ ｍＬのジエチルアミンを加え、室温で２時間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、１ ｍＬのトルエンを加えて減圧濃縮することを２回繰り返した。残留物に３ ｍＬのｎ－ヘキサンを加えてスラリー化し、静置後に上清液を注ぎ出し、固体を保留した。固体残留物を減圧濃縮し、オイルポンプにより乾燥させて粗製品である表題生成物９ｅ（１７ ｍｇ）を得て、生成物を精製せずにそのまま次のステップの反応に使用した。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ６３８．０［Ｍ＋１８］。
２－（（２－アミノアセチルアミノ）メトキシ）－２－シクロプロピル－Ｎ－（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）アセトアミド ９ｅ
９ｄ（１９ ｍｇ、２２．６ μｍｏｌ）を２ ｍＬのジクロロメタンに溶解し、１ ｍＬのジエチルアミンを加え、室温で２時間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、１ ｍＬのトルエンを加えて減圧濃縮することを２回繰り返した。残留物に３ ｍＬのｎ－ヘキサンを加えてスラリー化し、静置後に上清液を注ぎ出し、固体を保留した。固体残留物を減圧濃縮し、オイルポンプにより乾燥させて粗製品である表題生成物９ｅ（１７ ｍｇ）を得て、生成物を精製せずにそのまま次のステップの反応に使用した。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ６３８．０［Ｍ＋１８］。
【0161】
ステップ６
Ｎ－（（２Ｒ，１０Ｓ）－１０－ベンジル－２－シクロプロピル－１－（（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）アミノ）－１，６，９，１２，１５－ペンタオキソ－３－オキサ－５，８，１１，１４－テトラアザヘキサデカン－１６－イル）－６－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）ヘキサンアミド ９－Ａ
Ｎ－（（２Ｓ，１０Ｓ）－１０－ベンジル－２－シクロプロピル－１－（（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）アミノ）－１，６，９，１２，１５－ペンタオキソ－３－オキサ－５，８，１１，１４－テトラアザヘキサデカン－１６－イル）－６－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）ヘキサンアミド ９－Ｂ
粗製品９ｅ（１３．９ ｍｇ、２２．４ μｍｏｌ）を０．６ ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドに溶解し、アルゴンガスで３回置換し、氷水浴で０～５℃に降温し、８ｇ（２１．２ ｍｇ、４４．８ μｍｏｌ）の０．３ ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド溶液を加え、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（１８．５ ｍｇ、６７．３ μｍｏｌ）を加え、氷浴で１０分間撹拌しながら反応させ、氷浴を撤去し、室温まで昇温して１時間撹拌し、反応させて化合物９を生成した。反応液を高速液体クロマトグラフィーで精製し（分離条件：カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤ ５ μｍ １９＊２５０ ｍｍ、移動相：Ａ－水（１０ ｍｍｏｌ ＮＨ４ＯＡｃ）、Ｂ－アセトニトリル、勾配溶離、流速：１８ ｍＬ／ｍｉｎ）、その対応する成分を収集し、減圧濃縮して表題生成物（９－Ａ：２．４ ｍｇ、９－Ｂ：１．７ ｍｇ）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： １０７４．４ ［Ｍ＋１］。
単一配置の化合物９－Ａ（比較的短い保持時間）
ＵＰＬＣ分析：保持時間：１．１４分間、純度：８５％（カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨＣ１８ １．７ μｍ ２．１＊５０ ｍｍ、移動相：Ａ－水（５ ｍｍｏｌ ＮＨ４ＯＡｃ）、Ｂ－アセトニトリル）。
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６）： δ ８．６０ （ｔ， １Ｈ）， ８．５１－８．４９ （ｄ， １Ｈ）， ８．３２－８．２４ （ｍ， １Ｈ）， ８．１３－８．０２ （ｍ， ２Ｈ）， ８．０２－７．９６ （ｍ， １Ｈ）， ７．８２－７．７５ （ｍ， １Ｈ）， ７．３１ （ｓ， １Ｈ）， ７．２６－７．１５ （ｍ， ４Ｈ）， ６．９９ （ｓ， １Ｈ）， ６．５５－６．４８ （ｍ， １Ｈ）， ５．６５－５．５４ （ｍ， １Ｈ）， ５．４１ （ｓ， ２Ｈ）， ５．３５－５．１５ （ｍ， ３Ｈ）， ４．７４－４．６２ （ｍ， １Ｈ）， ４．５４－４．４０ （ｍ， ２Ｈ）， ３．７６－３．６４ （ｍ，４Ｈ）， ３．６２－３．４８ （ｍ， ２Ｈ）， ３．２０－３．０７ （ｍ， ２Ｈ）， ３．０４－２．９４ （ｍ， １Ｈ）， ２．８０－２．６２ （ｍ， １Ｈ）， ２．４５－２．３０ （ｍ， ３Ｈ）， ２．２５－２．１５ （ｍ， ２Ｈ）， ２．１５－２．０４ （ｍ， ２Ｈ）， １．９３－１．７８ （ｍ， ２Ｈ）， １．５２－１．３９ （ｍ， ３Ｈ）， １．３４－１．１２ （ｍ， ５Ｈ）， ０．８７ （ｔ， ３Ｈ）， ０．６４－０．３８ （ｍ， ４Ｈ）。
単一配置の化合物９－Ｂ（比較的長い保持時間）
ＵＰＬＣ分析：保持時間：１．１６分間、純度：８９％（カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨＣ１８ １．７ μｍ ２．１＊５０ ｍｍ、移動相：Ａ－水（５ ｍｍｏｌ ＮＨ４ＯＡｃ）、Ｂ－アセトニトリル）。
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６）： δ ８．６８－８．６０ （ｍ， １Ｈ）， ８．５８－８．５０ （ｍ， １Ｈ）， ８．３２－８．２４ （ｍ， １Ｈ）， ８．１３－８．０２ （ｍ， ２Ｈ）， ８．０２－７．９４ （ｍ， １Ｈ）， ７．８２－７．７５ （ｍ， １Ｈ）， ７．３１ （ｓ， １Ｈ）， ７．２６－７．１３ （ｍ， ３Ｈ）， ６．９９ （ｓ， １Ｈ）， ６．５５－６．４８ （ｍ， １Ｈ）， ５．６０－５．５０ （ｍ， １Ｈ）， ５．４１ （ｓ， ２Ｈ）， ５．３５－５．１５ （ｍ， ２Ｈ）， ４．７８－４．６８ （ｍ， １Ｈ）， ４．６０－４．４０ （ｍ， ２Ｈ）， ３．７６－３．５８ （ｍ， ４Ｈ）， ３．５８－３．４８ （ｍ， １Ｈ）， ３．２０－３．１０ （ｍ， ２Ｈ）， ３．０８－２．９７ （ｍ， ２Ｈ）， ２．８０－２．７２ （ｍ， ２Ｈ）， ２．４５－２．３０ （ｍ， ３Ｈ）， ２．２５－２．１３ （ｍ， ２Ｈ）， ２．１３－２．０４ （ｍ， ２Ｈ）， ２．０３－１．９４ （ｍ， ２Ｈ）， １．９１－１．７８ （ｍ， ２Ｈ）， １．５２－１．３９ （ｍ， ３Ｈ）， １．３４－１．１２ （ｍ， ４Ｈ）， ０．９１－０．７９ （ｍ， ３Ｈ）， ０．５３－０．３４ （ｍ， ４Ｈ）。
Ｎ－（（２Ｒ，１０Ｓ）－１０－ベンジル－２－シクロプロピル－１－（（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）アミノ）－１，６，９，１２，１５－ペンタオキソ－３－オキサ－５，８，１１，１４－テトラアザヘキサデカン－１６－イル）－６－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）ヘキサンアミド ９－Ａ
Ｎ－（（２Ｓ，１０Ｓ）－１０－ベンジル－２－シクロプロピル－１－（（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）アミノ）－１，６，９，１２，１５－ペンタオキソ－３－オキサ－５，８，１１，１４－テトラアザヘキサデカン－１６－イル）－６－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）ヘキサンアミド ９－Ｂ
粗製品９ｅ（１３．９ ｍｇ、２２．４ μｍｏｌ）を０．６ ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドに溶解し、アルゴンガスで３回置換し、氷水浴で０～５℃に降温し、８ｇ（２１．２ ｍｇ、４４．８ μｍｏｌ）の０．３ ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド溶液を加え、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（１８．５ ｍｇ、６７．３ μｍｏｌ）を加え、氷浴で１０分間撹拌しながら反応させ、氷浴を撤去し、室温まで昇温して１時間撹拌し、反応させて化合物９を生成した。反応液を高速液体クロマトグラフィーで精製し（分離条件：カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤ ５ μｍ １９＊２５０ ｍｍ、移動相：Ａ－水（１０ ｍｍｏｌ ＮＨ４ＯＡｃ）、Ｂ－アセトニトリル、勾配溶離、流速：１８ ｍＬ／ｍｉｎ）、その対応する成分を収集し、減圧濃縮して表題生成物（９－Ａ：２．４ ｍｇ、９－Ｂ：１．７ ｍｇ）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： １０７４．４ ［Ｍ＋１］。
単一配置の化合物９－Ａ（比較的短い保持時間）
ＵＰＬＣ分析：保持時間：１．１４分間、純度：８５％（カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨＣ１８ １．７ μｍ ２．１＊５０ ｍｍ、移動相：Ａ－水（５ ｍｍｏｌ ＮＨ４ＯＡｃ）、Ｂ－アセトニトリル）。
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６）： δ ８．６０ （ｔ， １Ｈ）， ８．５１－８．４９ （ｄ， １Ｈ）， ８．３２－８．２４ （ｍ， １Ｈ）， ８．１３－８．０２ （ｍ， ２Ｈ）， ８．０２－７．９６ （ｍ， １Ｈ）， ７．８２－７．７５ （ｍ， １Ｈ）， ７．３１ （ｓ， １Ｈ）， ７．２６－７．１５ （ｍ， ４Ｈ）， ６．９９ （ｓ， １Ｈ）， ６．５５－６．４８ （ｍ， １Ｈ）， ５．６５－５．５４ （ｍ， １Ｈ）， ５．４１ （ｓ， ２Ｈ）， ５．３５－５．１５ （ｍ， ３Ｈ）， ４．７４－４．６２ （ｍ， １Ｈ）， ４．５４－４．４０ （ｍ， ２Ｈ）， ３．７６－３．６４ （ｍ，４Ｈ）， ３．６２－３．４８ （ｍ， ２Ｈ）， ３．２０－３．０７ （ｍ， ２Ｈ）， ３．０４－２．９４ （ｍ， １Ｈ）， ２．８０－２．６２ （ｍ， １Ｈ）， ２．４５－２．３０ （ｍ， ３Ｈ）， ２．２５－２．１５ （ｍ， ２Ｈ）， ２．１５－２．０４ （ｍ， ２Ｈ）， １．９３－１．７８ （ｍ， ２Ｈ）， １．５２－１．３９ （ｍ， ３Ｈ）， １．３４－１．１２ （ｍ， ５Ｈ）， ０．８７ （ｔ， ３Ｈ）， ０．６４－０．３８ （ｍ， ４Ｈ）。
単一配置の化合物９－Ｂ（比較的長い保持時間）
ＵＰＬＣ分析：保持時間：１．１６分間、純度：８９％（カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨＣ１８ １．７ μｍ ２．１＊５０ ｍｍ、移動相：Ａ－水（５ ｍｍｏｌ ＮＨ４ＯＡｃ）、Ｂ－アセトニトリル）。
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６）： δ ８．６８－８．６０ （ｍ， １Ｈ）， ８．５８－８．５０ （ｍ， １Ｈ）， ８．３２－８．２４ （ｍ， １Ｈ）， ８．１３－８．０２ （ｍ， ２Ｈ）， ８．０２－７．９４ （ｍ， １Ｈ）， ７．８２－７．７５ （ｍ， １Ｈ）， ７．３１ （ｓ， １Ｈ）， ７．２６－７．１３ （ｍ， ３Ｈ）， ６．９９ （ｓ， １Ｈ）， ６．５５－６．４８ （ｍ， １Ｈ）， ５．６０－５．５０ （ｍ， １Ｈ）， ５．４１ （ｓ， ２Ｈ）， ５．３５－５．１５ （ｍ， ２Ｈ）， ４．７８－４．６８ （ｍ， １Ｈ）， ４．６０－４．４０ （ｍ， ２Ｈ）， ３．７６－３．５８ （ｍ， ４Ｈ）， ３．５８－３．４８ （ｍ， １Ｈ）， ３．２０－３．１０ （ｍ， ２Ｈ）， ３．０８－２．９７ （ｍ， ２Ｈ）， ２．８０－２．７２ （ｍ， ２Ｈ）， ２．４５－２．３０ （ｍ， ３Ｈ）， ２．２５－２．１３ （ｍ， ２Ｈ）， ２．１３－２．０４ （ｍ， ２Ｈ）， ２．０３－１．９４ （ｍ， ２Ｈ）， １．９１－１．７８ （ｍ， ２Ｈ）， １．５２－１．３９ （ｍ， ３Ｈ）， １．３４－１．１２ （ｍ， ４Ｈ）， ０．９１－０．７９ （ｍ， ３Ｈ）， ０．５３－０．３４ （ｍ， ４Ｈ）。
【0162】
実施例３． ＡＤＣの調製
ＡＤＣ薬物負荷量の分析
実験の目的及び原理
紫外線分光光度法（ＵＶ－Ｖｉｓ）によりＡＤＣ負荷量を測定した。機器：紫外線分光光度計Ｔｈｅｒｍｏ ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００。その原理は、ある波長でのＡＤＣの全吸光値が、薬物とモノクローナル抗体の当該波長での吸光値の累積に等しいことである。
ＡＤＣ薬物負荷量の分析
実験の目的及び原理
紫外線分光光度法（ＵＶ－Ｖｉｓ）によりＡＤＣ負荷量を測定した。機器：紫外線分光光度計Ｔｈｅｒｍｏ ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００。その原理は、ある波長でのＡＤＣの全吸光値が、薬物とモノクローナル抗体の当該波長での吸光値の累積に等しいことである。
【0163】
実験の方法
コハク酸ナトリウム緩衝液が入ったキュベットを、参照吸収セル及び試料測定吸収セルにそれぞれ置いてから、溶媒ブランクを差し引いた後、供試品溶液が入ったキュベットを試料測定吸収セルに置き、２８０ ｎｍ及び３７０ ｎｍでの吸光度を測定した。
コハク酸ナトリウム緩衝液が入ったキュベットを、参照吸収セル及び試料測定吸収セルにそれぞれ置いてから、溶媒ブランクを差し引いた後、供試品溶液が入ったキュベットを試料測定吸収セルに置き、２８０ ｎｍ及び３７０ ｎｍでの吸光度を測定した。
【0164】
結果の算出：
（１） Ａ２８０ｎｍ＝εｍａｂ－２８０ｂＣｍａｂ＋εＤｒｕｇ－２８０ｂＣＤｒｕｇ
εＤｒｕｇ－２８０：薬物の２８０ ｎｍでの平均モル吸光係数が５１００であり、
ＣＤｒｕｇ：薬物の濃度、
εｍａｂ－２８０：モノクローナル抗体の２８０ ｎｍでの平均モル吸光係数は２１４６００であり、
Ｃｍａｂ：モノクローナル抗体の濃度、
ｂ：光路長は１ ｃｍである。
同様に、試料の３７０ ｎｍでの全吸光値方程式を得ることができる：
（２） Ａ３７０ｎｍ＝εｍａｂ－３７０ｂＣｍａｂ＋εＤｒｕｇ－３７０ｂＣＤｒｕｇ
εＤｒｕｇ－３７０：薬物の３７０ ｎｍでの平均モル吸光係数が１９０００であり、
ＣＤｒｕｇ：薬物の濃度、
εｍａｂ－３７０：モノクローナル抗体の３７０ ｎｍでの吸光係数は０であり、
Ｃｍａｂ：モノクローナル抗体の濃度、
ｂ：光路長は１ ｃｍである。
（１） Ａ２８０ｎｍ＝εｍａｂ－２８０ｂＣｍａｂ＋εＤｒｕｇ－２８０ｂＣＤｒｕｇ
εＤｒｕｇ－２８０：薬物の２８０ ｎｍでの平均モル吸光係数が５１００であり、
ＣＤｒｕｇ：薬物の濃度、
εｍａｂ－２８０：モノクローナル抗体の２８０ ｎｍでの平均モル吸光係数は２１４６００であり、
Ｃｍａｂ：モノクローナル抗体の濃度、
ｂ：光路長は１ ｃｍである。
同様に、試料の３７０ ｎｍでの全吸光値方程式を得ることができる：
（２） Ａ３７０ｎｍ＝εｍａｂ－３７０ｂＣｍａｂ＋εＤｒｕｇ－３７０ｂＣＤｒｕｇ
εＤｒｕｇ－３７０：薬物の３７０ ｎｍでの平均モル吸光係数が１９０００であり、
ＣＤｒｕｇ：薬物の濃度、
εｍａｂ－３７０：モノクローナル抗体の３７０ ｎｍでの吸光係数は０であり、
Ｃｍａｂ：モノクローナル抗体の濃度、
ｂ：光路長は１ ｃｍである。
【0165】
（１）と（２）の２つの方程式により、モノクローナル抗体及び薬物の２つの検出波長での吸光係数及び濃度のデータと合わせてＡＤＣにおける薬物の負荷量を算出することができる。
薬物負荷量＝ＣＤｒｕｇ／Ｃｍａｂ。
薬物負荷量＝ＣＤｒｕｇ／Ｃｍａｂ。
【0166】
異なるＤＡＲ値であるＰＳＭＡ抗体－薬物複合体ＰＭ－９－Ａの調製の実施例
下記の実施例は、本開示に係るＡＤＣの調製プロセスである。そのうち、実施例３－４、実施例３－５、実施例３－７、実施例３－１１では、抗体ＰＭは、システインにおけるメルカプト基を介して連結ユニットを持つ薬物９－Ａに複合して反応し、抗体薬物複合ＰＭ－９－Ａ （ＤＡＲ＝約３～４）を調製し、実施例３－１～実施例３－３及び実施例３－６では、抗体ＰＭは、システインにおけるメルカプト基を介して連結ユニットを持つ薬物９－Ａに複合して反応し、ＰＳＭＡ ＡＤＣ分子ＰＭ－９－Ａ（ＤＡＲ＝約６－７）を調製し、実施例３－８～実施例３－１０では、抗体ＰＭは、システインにおけるメルカプト基を介して連結ユニットを持つ薬物ＶｃＭＭＡＥ（瀚香生物科技、ＣＡＳ ６４６５０２－５３－６）と反応して複合体分子ＰＭ－ＶｃＭＭＡＥを対照として調製した。
下記の実施例は、本開示に係るＡＤＣの調製プロセスである。そのうち、実施例３－４、実施例３－５、実施例３－７、実施例３－１１では、抗体ＰＭは、システインにおけるメルカプト基を介して連結ユニットを持つ薬物９－Ａに複合して反応し、抗体薬物複合ＰＭ－９－Ａ （ＤＡＲ＝約３～４）を調製し、実施例３－１～実施例３－３及び実施例３－６では、抗体ＰＭは、システインにおけるメルカプト基を介して連結ユニットを持つ薬物９－Ａに複合して反応し、ＰＳＭＡ ＡＤＣ分子ＰＭ－９－Ａ（ＤＡＲ＝約６－７）を調製し、実施例３－８～実施例３－１０では、抗体ＰＭは、システインにおけるメルカプト基を介して連結ユニットを持つ薬物ＶｃＭＭＡＥ（瀚香生物科技、ＣＡＳ ６４６５０２－５３－６）と反応して複合体分子ＰＭ－ＶｃＭＭＡＥを対照として調製した。
【0167】
抗体と薬物の割合、反応量の規模、及びその他の条件の調整により、異なるＤＡＲ値（ｎ）である抗体薬物複合体を得ることができ、好ましいＤＡＲ値は１～８、より好ましくは３～８、最も好ましくは３～７である。
【0168】
（一）異なるＤＡＲ値である抗体薬物複合ＰＭ－９－Ａの調製
【化33】
【0169】
実施例３－１ ＡＤＣ－１
３７℃の条件下で、抗体ＰＭのＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５の０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、１０．０ ｍｇ／ｍＬ、０．２７ ｍＬ、１８ ｎｍｏｌ）に、調製されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の水溶液（１０ ｍＭ、９．８ μＬ、９８ ｎｍｏｌ）を加え、水浴振とう機に置き、３７℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液を水浴で２５℃に降温した。
３７℃の条件下で、抗体ＰＭのＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５の０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、１０．０ ｍｇ／ｍＬ、０．２７ ｍＬ、１８ ｎｍｏｌ）に、調製されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の水溶液（１０ ｍＭ、９．８ μＬ、９８ ｎｍｏｌ）を加え、水浴振とう機に置き、３７℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液を水浴で２５℃に降温した。
【0170】
化合物９－Ａ（０．３ ｍｇ、２７７ ｎｍｏｌ）を２０ μＬのジメチルスルホキシドに溶解し、上記反応液に加え、水浴振とう機に置き、２５℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：ｐＨが６．５である０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、０．００１ ＭのＥＤＴＡ含有）、式ＰＭ－９－Ａで示される複合体の例示的な生成物ＡＤＣ－１のＰＢＳ緩衝液（０．１８ ｍｇ／ｍＬ、１１ ｍＬ）を得て、４℃で貯蔵した。
ＵＶ－Ｖｉｓにより平均値を算出した：ｎ＝６．３１。
ＵＶ－Ｖｉｓにより平均値を算出した：ｎ＝６．３１。
【0171】
実施例３－２ ＡＤＣ－２
３７℃の条件下で、抗体ＰＭのＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５の０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、１０．０ ｍｇ／ｍＬ、３．６ ｍＬ、２４３ ｎｍｏｌ）に、調製されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の水溶液（１０ ｍＭ、１２８．９ μＬ、１２８９ ｎｍｏｌ）を加え、水浴振とう機に置き、３７℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液を水浴で２５℃に降温した。
３７℃の条件下で、抗体ＰＭのＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５の０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、１０．０ ｍｇ／ｍＬ、３．６ ｍＬ、２４３ ｎｍｏｌ）に、調製されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の水溶液（１０ ｍＭ、１２８．９ μＬ、１２８９ ｎｍｏｌ）を加え、水浴振とう機に置き、３７℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液を水浴で２５℃に降温した。
【0172】
化合物９－Ａ（３．９３ ｍｇ、３６４９ ｎｍｏｌ）を２００ μＬのジメチルスルホキシドに溶解し、上記反応液に加え、水浴振とう機に置き、２５℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：ｐＨが６．５である０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、０．００１ ＭのＥＤＴＡ含有）、式ＰＭ－９－Ａで示される複合体の例示的な生成物ＡＤＣ－２のＰＢＳ緩衝液（１．９３ ｍｇ／ｍＬ、１５．４ ｍＬ）を得て、４℃で貯蔵した。
ＵＶ－Ｖｉｓにより平均値を算出した：ｎ＝６．６３。
ＵＶ－Ｖｉｓにより平均値を算出した：ｎ＝６．６３。
【0173】
実施例３－３ ＡＤＣ－３
３７℃の条件下で、抗体ＰＭのＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５の０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、１０．０ ｍｇ／ｍＬ、１０ ｍＬ、６７６ ｎｍｏｌ）に、調製されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の水溶液（１０ ｍＭ、３５８．１ μＬ、３５８１ ｎｍｏｌ）を加え、水浴振とう機に置き、３７℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液を水浴で２５℃に降温した。
３７℃の条件下で、抗体ＰＭのＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５の０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、１０．０ ｍｇ／ｍＬ、１０ ｍＬ、６７６ ｎｍｏｌ）に、調製されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の水溶液（１０ ｍＭ、３５８．１ μＬ、３５８１ ｎｍｏｌ）を加え、水浴振とう機に置き、３７℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液を水浴で２５℃に降温した。
【0174】
化合物９－Ａ（１０．９１ ｍｇ、１０１３５ ｎｍｏｌ）を４８０ μＬのジメチルスルホキシドに溶解し、上記反応液に加え、水浴振とう機に置き、２５℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：ｐＨが６．５である０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、０．００１ ＭのＥＤＴＡ含有）、式ＰＭ－９－Ａで示される複合体の例示的な生成物ＡＤＣ－３のＰＢＳ緩衝液（３．４７ ｍｇ／ｍＬ、２５ ｍＬ）を得て、４℃で貯蔵した。
ＵＶ－Ｖｉｓにより平均値を算出した：ｎ＝６．９。
ＵＶ－Ｖｉｓにより平均値を算出した：ｎ＝６．９。
【0175】
実施例３－４ ＡＤＣ－４
３７℃の条件下で、抗体ＰＭのＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５の０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、１０．０ ｍｇ／ｍＬ、０．２１ ｍＬ、１４ ｎｍｏｌ）に、調製されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の水溶液（１０ ｍＭ、３．５ μＬ、３５ ｎｍｏｌ）を加え、水浴振とう機に置き、３７℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液を水浴で２５℃に降温した。
３７℃の条件下で、抗体ＰＭのＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５の０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、１０．０ ｍｇ／ｍＬ、０．２１ ｍＬ、１４ ｎｍｏｌ）に、調製されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の水溶液（１０ ｍＭ、３．５ μＬ、３５ ｎｍｏｌ）を加え、水浴振とう機に置き、３７℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液を水浴で２５℃に降温した。
【0176】
化合物９－Ａ（０．１５ｍｇ、１３９ ｎｍｏｌ）を２０ μＬのジメチルスルホキシドに溶解し、上記反応液に加え、水浴振とう機に置き、２５℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：ｐＨが６．５である０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、０．００１ ＭのＥＤＴＡ含有）、式ＰＭ－９－Ａで示される複合体の例示的な生成物ＡＤＣ－４のＰＢＳ緩衝液（０．２８ ｍｇ／ｍＬ、４．６ ｍＬ）を得て、４℃で貯蔵した。
ＵＶ－Ｖｉｓにより平均値を算出した：ｎ＝３．６８。
ＵＶ－Ｖｉｓにより平均値を算出した：ｎ＝３．６８。
【0177】
実施例３－５ ＡＤＣ－５
３７℃の条件下で、抗体ＰＭのＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５の０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、１０．０ ｍｇ／ｍＬ、５．２３ ｍＬ、３５３ ｎｍｏｌ）に、調製されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の水溶液（１０ ｍＭ、８４．８ μＬ、８４８ ｎｍｏｌ）を加え、水浴振とう機に置き、３７℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液を水浴で２５℃に降温した。
３７℃の条件下で、抗体ＰＭのＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５の０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、１０．０ ｍｇ／ｍＬ、５．２３ ｍＬ、３５３ ｎｍｏｌ）に、調製されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の水溶液（１０ ｍＭ、８４．８ μＬ、８４８ ｎｍｏｌ）を加え、水浴振とう機に置き、３７℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液を水浴で２５℃に降温した。
【0178】
化合物９－Ａ（３．８ ｍｇ、３５３４ ｎｍｏｌ）を２６０ μＬのジメチルスルホキシドに溶解し、上記反応液に加え、水浴振とう機に置き、２５℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：ｐＨが６．５である０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、０．００１ ＭのＥＤＴＡ含有）、式ＰＭ－９－Ａで示される複合体の例示的な生成物ＡＤＣ－５のＰＢＳ緩衝液（２．４８ ｍｇ／ｍＬ、１８．２ ｍＬ）を得て、４℃で貯蔵した。
ＵＶ－Ｖｉｓにより平均値を算出した：ｎ＝３．８９。
ＵＶ－Ｖｉｓにより平均値を算出した：ｎ＝３．８９。
【0179】
実施例３－６ ＡＤＣ－６
３７℃の条件下で、抗体ＰＭのＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５の０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、１０．０ ｍｇ／ｍＬ、３．５ ｍＬ、２３６ ｎｍｏｌ）に、調製されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の水溶液（１０ ｍＭ、１２５．３ μＬ、１２５３ ｎｍｏｌ）を加え、水浴振とう機に置き、３７℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液を水浴で２５℃に降温した。
３７℃の条件下で、抗体ＰＭのＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５の０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、１０．０ ｍｇ／ｍＬ、３．５ ｍＬ、２３６ ｎｍｏｌ）に、調製されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の水溶液（１０ ｍＭ、１２５．３ μＬ、１２５３ ｎｍｏｌ）を加え、水浴振とう機に置き、３７℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液を水浴で２５℃に降温した。
【0180】
化合物９－Ａ（３．８２ ｍｇ、３５４７ ｎｍｏｌ）を１５０ μＬのジメチルスルホキシドに溶解し、上記反応液に加え、水浴振とう機に置き、２５℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：ｐＨが６．５である０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、０．００１ ＭのＥＤＴＡ含有）、式ＰＭ－９－Ａで示される複合体の例示的な生成物ＡＤＣ－６のＰＢＳ緩衝液（１．８３ ｍｇ／ｍＬ、１４ ｍＬ）を得て、４℃で貯蔵した。
ＵＶ－Ｖｉｓにより平均値を算出した：ｎ＝６．６１。
ＵＶ－Ｖｉｓにより平均値を算出した：ｎ＝６．６１。
【0181】
実施例３－７ ＡＤＣ－７
３７℃の条件下で、抗体ＰＭのＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５の０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、１０．０ ｍｇ／ｍＬ、１４．６８ ｍＬ、９９２ ｎｍｏｌ）に、調製されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の水溶液（１０ ｍＭ、２３８．１ μＬ、２３８１ ｎｍｏｌ）を加え、水浴振とう機に置き、３７℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液を水浴で２５℃に降温した。
３７℃の条件下で、抗体ＰＭのＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５の０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、１０．０ ｍｇ／ｍＬ、１４．６８ ｍＬ、９９２ ｎｍｏｌ）に、調製されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の水溶液（１０ ｍＭ、２３８．１ μＬ、２３８１ ｎｍｏｌ）を加え、水浴振とう機に置き、３７℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液を水浴で２５℃に降温した。
【0182】
化合物９－Ａ（１０．６７ ｍｇ、９９１９ ｎｍｏｌ）を４２０ μＬのジメチルスルホキシドに溶解し、上記反応液に加え、水浴振とう機に置き、２５℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：ｐＨが６．５である０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、０．００１ ＭのＥＤＴＡ含有）、式ＰＭ－９－Ａで示される複合体の例示的な生成物ＡＤＣ－７のＰＢＳ緩衝液（３．６１ ｍｇ／ｍＬ、３７ ｍＬ）を得て、４℃で貯蔵した。
ＵＶ－Ｖｉｓにより平均値を算出した：ｎ＝３．９３。
ＵＶ－Ｖｉｓにより平均値を算出した：ｎ＝３．９３。
【0183】
（二）対照抗体薬物複合ＰＭ－ＶｃＭＭＡＥの調製（特許ＷＯ２００７００２２２２Ａ２を参照）
実施例３－８ ＡＤＣ－８
３７℃の条件下で、抗体ＰＭのＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５の０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、１０．０ ｍｇ／ｍＬ、２．５ ｍＬ、１６９ ｎｍｏｌ）に、調製されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の水溶液（１０ ｍＭ、４２．２ μＬ、４２２ ｎｍｏｌ）を加え、水浴振とう機に置き、３７℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液を水浴で２５℃に降温した。
【化34】
実施例３－８ ＡＤＣ－８
３７℃の条件下で、抗体ＰＭのＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５の０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、１０．０ ｍｇ／ｍＬ、２．５ ｍＬ、１６９ ｎｍｏｌ）に、調製されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の水溶液（１０ ｍＭ、４２．２ μＬ、４２２ ｎｍｏｌ）を加え、水浴振とう機に置き、３７℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液を水浴で２５℃に降温した。
【0184】
化合物ＶｃＭＭＡＥ（２．２２ ｍｇ、１６８９ ｎｍｏｌ）を１００ μＬのジメチルスルホキシドに溶解し、上記反応液に加え、水浴振とう機に置き、２５℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：ｐＨが６．５である０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、０．００１ ＭのＥＤＴＡ含有）、式ＰＭ－ＶｃＭＭＡＥで示される複合体の例示的な生成物ＡＤＣ－８のＰＢＳ緩衝液（１．７６ ｍｇ／ｍＬ、１２ ｍＬ）を得て、４℃で貯蔵した。
ＣＥ－ＳＤＳにより平均値を算出した：ｎ＝４．４７。
ＣＥ－ＳＤＳにより平均値を算出した：ｎ＝４．４７。
【0185】
実施例３－９ ＡＤＣ－９
３７℃の条件下で、抗体ＰＭのＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５の０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、１０．０ ｍｇ／ｍＬ、３．３ ｍＬ、２２３ ｎｍｏｌ）に、調製されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の水溶液（１０ ｍＭ、５５．７ μＬ、５５７ ｎｍｏｌ）を加え、水浴振とう機に置き、３７℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液を水浴で２５℃に降温した。
３７℃の条件下で、抗体ＰＭのＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５の０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、１０．０ ｍｇ／ｍＬ、３．３ ｍＬ、２２３ ｎｍｏｌ）に、調製されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の水溶液（１０ ｍＭ、５５．７ μＬ、５５７ ｎｍｏｌ）を加え、水浴振とう機に置き、３７℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液を水浴で２５℃に降温した。
【0186】
化合物ＶｃＭＭＡＥ（２．９３ ｍｇ、２２３０ ｎｍｏｌ）を２００ μＬのジメチルスルホキシドに溶解し、上記反応液に加え、水浴振とう機に置き、２５℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：ｐＨが６．５である０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、０．００１ ＭのＥＤＴＡ含有）、式ＰＭ－ＶｃＭＭＡＥで示される複合体の例示的な生成物ＡＤＣ－９のＰＢＳ緩衝液（２．０５ ｍｇ／ｍＬ、１７ ｍＬ）を得て、４℃で貯蔵した。
ＣＥ－ＳＤＳにより平均値を算出した：ｎ＝４．２３。
ＣＥ－ＳＤＳにより平均値を算出した：ｎ＝４．２３。
【0187】
実施例３－１０ ＡＤＣ－１０
３７℃の条件下で、抗体ＰＭのＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５の０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、１０．０ ｍｇ／ｍＬ、２．５ ｍＬ、１６９ ｎｍｏｌ）に、調製されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の水溶液（１０ ｍＭ、４２．２ μＬ、４２２ ｎｍｏｌ）を加え、水浴振とう機に置き、３７℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液を水浴で２５℃に降温した。
３７℃の条件下で、抗体ＰＭのＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５の０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、１０．０ ｍｇ／ｍＬ、２．５ ｍＬ、１６９ ｎｍｏｌ）に、調製されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の水溶液（１０ ｍＭ、４２．２ μＬ、４２２ ｎｍｏｌ）を加え、水浴振とう機に置き、３７℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液を水浴で２５℃に降温した。
【0188】
化合物ＶｃＭＭＡＥ（２．２２ ｍｇ、１６８９ ｎｍｏｌ）を１５０ μＬのジメチルスルホキシドに溶解し、上記反応液に加え、水浴振とう機に置き、２５℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：ｐＨが６．５である０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、０．００１ ＭのＥＤＴＡ含有）、式ＰＭ－ＶｃＭＭＡＥで示される複合体の例示的な生成物ＡＤＣ－１０のＰＢＳ緩衝液（２．２ ｍｇ／ｍＬ、１３ ｍＬ）を得て、４℃で貯蔵した。
ＣＥ－ＳＤＳにより平均値を算出した：ｎ＝３．９２。
ＣＥ－ＳＤＳにより平均値を算出した：ｎ＝３．９２。
【0189】
実施例３－１１ ＡＤＣ－１１
３７℃の条件下で、抗体ＰＭのＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５の０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、１０．０ ｍｇ／ｍＬ、２．４ ｍＬ、１６０ ｎｍｏｌ）に、調製されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の水溶液（１０ ｍＭ、４２．２ μＬ、４２２ ｎｍｏｌ）を加え、水浴振とう機に置き、３７℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液を水浴で２５℃に降温した。
３７℃の条件下で、抗体ＰＭのＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５の０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、１０．０ ｍｇ／ｍＬ、２．４ ｍＬ、１６０ ｎｍｏｌ）に、調製されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の水溶液（１０ ｍＭ、４２．２ μＬ、４２２ ｎｍｏｌ）を加え、水浴振とう機に置き、３７℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液を水浴で２５℃に降温した。
【0190】
化合物９－Ａ（１．７５ ｍｇ、１６２９ ｎｍｏｌ）を１００ μＬのジメチルスルホキシドに溶解し、上記反応液に加え、水浴振とう機に置き、２５℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：ｐＨが６．５である０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、０．００１ ＭのＥＤＴＡ含有）、式ＰＭ－９－Ａで示される複合体の例示的な生成物ＡＤＣ－１１のＰＢＳ緩衝液（１．３４ ｍｇ／ｍＬ、１５．５ ｍＬ）を得て、４℃で貯蔵した。
ＵＶ－Ｖｉｓにより平均値を算出した：ｎ＝４．１９。
ＵＶ－Ｖｉｓにより平均値を算出した：ｎ＝４．１９。
【0191】
実施例３－１２ ＡＤＣ－１２
３７℃の条件下で、抗体ＰＭのＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５の０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、１０．０ ｍｇ／ｍＬ、２．４ ｍＬ、１６０ ｎｍｏｌ）に、調製されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の水溶液（１０ ｍＭ、４２．２ μＬ、４２２ ｎｍｏｌ）を加え、水浴振とう機に置き、３７℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液を水浴で２５℃に降温した。
【化35】
３７℃の条件下で、抗体ＰＭのＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５の０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、１０．０ ｍｇ／ｍＬ、２．４ ｍＬ、１６０ ｎｍｏｌ）に、調製されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の水溶液（１０ ｍＭ、４２．２ μＬ、４２２ ｎｍｏｌ）を加え、水浴振とう機に置き、３７℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液を水浴で２５℃に降温した。
【0192】
化合物５８（特許「ＣＮ１０４７５５４９４Ａの第１６３ページの実施例５８を参照して調製され、１．６８ ｍｇ、１６２４ ｎｍｏｌ）を１００ μＬのジメチルスルホキシドに溶解し、上記反応液に加え、水浴振とう機に置き、２５℃で３時間発振反応させて、反応を停止させた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：ｐＨが６．５である０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、０．００１ ＭのＥＤＴＡ含有）、式ＰＭ－５８で示される複合体の例示的な生成物ＡＤＣ－１２のＰＢＳ緩衝液（１．４５ ｍｇ／ｍＬ、１４．８ ｍＬ）を得て、４℃で貯蔵した。
ＵＶ－Ｖｉｓにより平均値を算出した：ｎ＝４．１６。
ＵＶ－Ｖｉｓにより平均値を算出した：ｎ＝４．１６。
【0193】
（三）対照抗体薬物複合Ｌｍａｂ－９－Ａの調製
３７℃の条件下で、抗体ＬｍａｂのＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５の０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、１０．０ ｍｇ／ｍＬ、２．１５ ｍＬ、１４５ ｎｍｏｌ）に、調製されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の水溶液（１０ ｍＭ、７４．１ μＬ、７４１ ｎｍｏｌ）を加え、水浴振とう機に置き、３７℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液を水浴で２５℃に降温した。
【化36】
【0194】
化合物９－Ａ（３．２０ ｍｇ、２１７９ ｎｍｏｌ）を１５５ μＬのジメチルスルホキシドに溶解し、上記反応液に加え、水浴振とう機に置き、２５℃で３時間振とう反応させ、反応を止めた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：ｐＨが６．５である０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、０．００１ ＭのＥＤＴＡ含有）、表題生成物Ｌｍａｂ－９－ＡのＰＢＳ緩衝液（０．９９ ｍｇ／ｍＬ、１５ ｍＬ）を得て、４℃で貯蔵した。
ＵＶ－Ｖｉｓにより平均値を算出した：ｎ＝７．０７。
ＵＶ－Ｖｉｓにより平均値を算出した：ｎ＝７．０７。
【0195】
以下、生化学試験方法により本開示の抗体の活性を検証した
試験例１：体外細胞結合実験
本実験は、細胞表面抗体の蛍光シグナルを検出することで、蛍光シグナルの強さによって抗体の結合を評価した。調製されたＡＤＣ－２、ＡＤＣ－１０、対照ＡＤＣ Ｌｍａｂ－９－Ａ及び抗体ＰＭは、一緒に体外結合検出に用いられた。
試験例１：体外細胞結合実験
本実験は、細胞表面抗体の蛍光シグナルを検出することで、蛍光シグナルの強さによって抗体の結合を評価した。調製されたＡＤＣ－２、ＡＤＣ－１０、対照ＡＤＣ Ｌｍａｂ－９－Ａ及び抗体ＰＭは、一緒に体外結合検出に用いられた。
【0196】
勾配希釈されたＡＤＣ－２、ＡＤＣ－１０及び抗体ＰＭと１×１０５個の細胞（ＡＴＣＣ、ＭＤＡ ＰＣａ ２ｂ／ＣＲＬ－２４２２、ＬＮＣａＰ／ＣＲＬ－１７４０、２２Ｒｖ１／ＣＲＬ－２５０５、ＰＣ－３／ＣＲＬ－１４３５、ＤＵ １４５／ＨＴＢ－８１）を４℃で６０分間インキュベートした後に、不要のＡＤＣ又は抗体を洗い流した。細胞及びＦＩＴＣで標識されたヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１０９－０９５－００３）を４℃で３０分間インキュベートし、不要の抗体を洗い流した後、ＢＤ ＣａｎｔｏＩＩにより細胞表面の蛍光シグナルを読み出した（結果は、表２、図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ、図１Ｄ、図１Ｅに示される通りである）。
【0197】
【表2】
【0198】
検出用細胞の抗原ＰＳＭＡの発現レベルは、ＭＤＡ ＰＣａ ２ｂ＞ＬＮＣａＰ＞２２Ｒｖ１で、ＰＣ－３とＤＵ １４５はＰＳＭＡを発現しない。
【0199】
結果から明らかなように、ＡＤＣ－２、ＡＤＣ－１０、対照ＡＤＣＬｍａｂ－９－Ａ及び抗体ＰＭは、異なるＰＳＭＡ抗原発現レベルの細胞と、相応する強い又は弱い結合能力を持っている。ＥＣ５０が小さいほど、結合能力は強くなる。
【0200】
試験例２：体外細胞エンドサイトーシス実験
ＤＴ３Ｃ、７０ ｋｄは、組換え発現の融合タンパク質であり、ジフテリア毒素のＦｒａｇｍｅｎｔ Ａ（毒素部分のみ）とＧ群連鎖球菌の３Ｃ断片（ＩｇＧ結合部分）が融合してなるものであり、当該タンパク質は、抗体のＩｇＧ部分と高度に親和でき、抗体においてエンドサイトーシスが発生した時に一緒に細胞に侵入し、細胞内フーリンの作用下で、毒性を有するＤＴを放出し、ＤＴはＥＦ２－ＡＤＰリボシル化の活性を阻害し、タンパク質の翻訳プロセスを遮断して、最終的に細胞の死亡を引き起こすことができる。細胞に侵入していないＤＴ３Ｃは、細胞を傷害する活性を有しない。細胞傷害状況によって抗体のエンドサイトーシス活性を評価した。
ＤＴ３Ｃ、７０ ｋｄは、組換え発現の融合タンパク質であり、ジフテリア毒素のＦｒａｇｍｅｎｔ Ａ（毒素部分のみ）とＧ群連鎖球菌の３Ｃ断片（ＩｇＧ結合部分）が融合してなるものであり、当該タンパク質は、抗体のＩｇＧ部分と高度に親和でき、抗体においてエンドサイトーシスが発生した時に一緒に細胞に侵入し、細胞内フーリンの作用下で、毒性を有するＤＴを放出し、ＤＴはＥＦ２－ＡＤＰリボシル化の活性を阻害し、タンパク質の翻訳プロセスを遮断して、最終的に細胞の死亡を引き起こすことができる。細胞に侵入していないＤＴ３Ｃは、細胞を傷害する活性を有しない。細胞傷害状況によって抗体のエンドサイトーシス活性を評価した。
【0201】
滅菌ろ過されたＤＴ３Ｃ（７０ＫＤ、ＳＢ ＨＲＳ３Ａ、ＭＥＩ３ＡＵ０８０３）と抗体ＰＭ抗体（ＤＴ３Ｃモル濃度が抗体モル濃度の６倍である）を１：１の体積で均一に混合し、室温で静置して３０分間インキュベートした後、無血清培地で勾配希釈し、前日に用意した、２０％のｌｏｗ ＩｇＧ ＦＢＳ含有の培地で培養された細胞（ＡＴＣＣ、ＬＮＣａＰ／ＣＲＬ－１７４０、２２Ｒｖ１／ＣＲＬ－２５０５）の中（２０００個の細胞／ウェル）に入れ、５％の二酸化炭素インキュベーターにおいて３７℃で３日間インキュベートした。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ７５７３）を加え、室温で暗所で１０分間インキュベートし、Ｖｉｃｔｏｒ３で化学発光を読み出した（結果は、表３、図２Ａ、図２Ｂに示される通りである）。
【0202】
【表3】
【0203】
結果から明らかなように、抗体ＰＭは、ＰＳＭＡ抗原を陽性発現した細胞においてエンドサイトーシス能力を持っている。
【0204】
試験例３：細胞増殖阻害実験
本実験は、細胞内ＡＴＰ含有量を検出することで、ＩＣ５０の大きさによってＰＳＭＡ ＡＤＣの細胞（ＡＴＣＣ、ＬＮＣａＰ／ＣＲＬ－１７４０、２２Ｒｖ１／ＣＲＬ－２５０５、ＰＣ－３／ＣＲＬ－１４３５）増殖に対する阻害効果を評価した。
本実験は、細胞内ＡＴＰ含有量を検出することで、ＩＣ５０の大きさによってＰＳＭＡ ＡＤＣの細胞（ＡＴＣＣ、ＬＮＣａＰ／ＣＲＬ－１７４０、２２Ｒｖ１／ＣＲＬ－２５０５、ＰＣ－３／ＣＲＬ－１４３５）増殖に対する阻害効果を評価した。
【0205】
検出待ちの試料：ＡＤＣ－２、ＡＤＣ－４、対照ＡＤＣ Ｌｍａｂ－９－Ａ
１、ＬＮＣａＰ細胞増殖への阻害効果
ＬＮＣａＰ細胞を１０％ＦＢＳ含有のＲＰＭＩ－１６４０培地において培養し、週に２～３回継代し、継代割合が１：３又は１：６であった。継代時に、培地を吸引除去し、５ ｍＬの０．２５％のトリプシンで細胞層をすすいだ後、トリプシンを吸引除去し、細胞をインキュベーターに入れて３～５分間消化し、新鮮な培地を加えて細胞を再懸濁した。９６ウェルの細胞培養プレートに２×１０３細胞／ウェルで１８０ μＬの細胞懸濁液を加え、培地が４．５％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０培地であり、９６ウェルプレートの外周に培地のみを加えた。培養プレートをインキュベーターで２４時間培養した（３７℃、５％のＣＯ２）。
１、ＬＮＣａＰ細胞増殖への阻害効果
ＬＮＣａＰ細胞を１０％ＦＢＳ含有のＲＰＭＩ－１６４０培地において培養し、週に２～３回継代し、継代割合が１：３又は１：６であった。継代時に、培地を吸引除去し、５ ｍＬの０．２５％のトリプシンで細胞層をすすいだ後、トリプシンを吸引除去し、細胞をインキュベーターに入れて３～５分間消化し、新鮮な培地を加えて細胞を再懸濁した。９６ウェルの細胞培養プレートに２×１０３細胞／ウェルで１８０ μＬの細胞懸濁液を加え、培地が４．５％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０培地であり、９６ウェルプレートの外周に培地のみを加えた。培養プレートをインキュベーターで２４時間培養した（３７℃、５％のＣＯ２）。
【0206】
検出待ちのＡＤＣ（ＡＤＣ－２、ＡＤＣ－４、Ｌｍａｂ－９－Ａ）を初期濃度に配合し、ＰＢＳにより１：６で９つのポイントにて勾配希釈し、更に０濃度ポイントを加えた。２０ μＬを取って上記細胞プレートに入れ、インキュベーターにおいて５日間インキュベートした（３７℃、５％のＣＯ２）。化合物２－Ｂ（即ち、９－Ａの遊離毒素）に対して、まず、ＤＳＭＯで母液に希釈し、且つＰＢＳで２００ μＭが初期濃度になるように配合し、そしてＰＢＳで１：６で９つのポイントにて勾配希釈し、更に０濃度ポイントを加え、１ μＬを取って２０ μＬのＲＰＭＩ－１６４０に入れて９６ウェル細胞培養プレートに転移し、インキュベーターにおいて５日間インキュベートした（３７℃、５％のＣＯ２）。９６ウェル細胞培養プレートにおいて、各ウェルに８０ μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ試薬を入れ、室温で暗所で１０～１５分間放置し、Ｖｉｃｔｏｒ３で化学発光シグナル値を読み取り、データをＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアで処理した。（結果は表４、図３Ａ、図３Ｂに示される通りである）。
【0207】
２、２２Ｒｖ１細胞増殖への阻害効果
２２Ｒｖ１細胞を１０％ＦＢＳ含有のＲＰＭＩ－１６４０培地において培養し、週に２回継代し、継代割合が１：３又は１：６であった。継代時に、培地を吸引除去し、５ ｍＬの０．２５％のトリプシンで細胞層をすすいだ後、トリプシンを吸引除去し、細胞をインキュベーターに入れて３～５分間消化し、新鮮な培地を加えて細胞を再懸濁した。９６ウェルの細胞培養プレートに４×１０３細胞／ウェルで１８０ μＬの細胞懸濁液を加え、培地が４．５％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０であり、９６ウェルプレートの外周に培地のみを加えた。培養プレートをインキュベーターで２４時間培養した（３７℃、５％のＣＯ２）。検出待ちのＡＤＣと化合物２－Ｂの調製及び実験の方法は、上記と同様である。（結果は表４、図３Ｃ、図３Ｄに示される通りである）。
２２Ｒｖ１細胞を１０％ＦＢＳ含有のＲＰＭＩ－１６４０培地において培養し、週に２回継代し、継代割合が１：３又は１：６であった。継代時に、培地を吸引除去し、５ ｍＬの０．２５％のトリプシンで細胞層をすすいだ後、トリプシンを吸引除去し、細胞をインキュベーターに入れて３～５分間消化し、新鮮な培地を加えて細胞を再懸濁した。９６ウェルの細胞培養プレートに４×１０３細胞／ウェルで１８０ μＬの細胞懸濁液を加え、培地が４．５％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０であり、９６ウェルプレートの外周に培地のみを加えた。培養プレートをインキュベーターで２４時間培養した（３７℃、５％のＣＯ２）。検出待ちのＡＤＣと化合物２－Ｂの調製及び実験の方法は、上記と同様である。（結果は表４、図３Ｃ、図３Ｄに示される通りである）。
【0208】
３、ＰＣ－３細胞増殖への阻害効果
ＰＣ－３細胞を１０％ＦＢＳ含有のＦ－１２Ｋ培地において培養し、週に２～３回継代し、継代割合が１：３又は１：６であった。継代時に、培地を吸引除去し、５ ｍＬの０．２５％のトリプシンで細胞層をすすいだ後、トリプシンを吸引除去し、細胞をインキュベーターに入れて３～５分間消化し、新鮮な培地を加えて細胞を再懸濁した。９６ウェルの細胞培養プレートに４×１０３細胞／ウェルで１８０ μＬの細胞懸濁液を加え、培地が４．５％のＦＢＳを含むＦ－１２Ｋであり、９６ウェルプレートの外周に培地のみを加えた。培養プレートをインキュベーターで２４時間培養した（３７℃、５％のＣＯ２）。検出待ちのＡＤＣと化合物２－Ｂの調製及び実験の方法は、上記と同様である。（結果は、表４、図３Ｅ、図３Ｆに示される通りでる。）
ＰＣ－３細胞を１０％ＦＢＳ含有のＦ－１２Ｋ培地において培養し、週に２～３回継代し、継代割合が１：３又は１：６であった。継代時に、培地を吸引除去し、５ ｍＬの０．２５％のトリプシンで細胞層をすすいだ後、トリプシンを吸引除去し、細胞をインキュベーターに入れて３～５分間消化し、新鮮な培地を加えて細胞を再懸濁した。９６ウェルの細胞培養プレートに４×１０３細胞／ウェルで１８０ μＬの細胞懸濁液を加え、培地が４．５％のＦＢＳを含むＦ－１２Ｋであり、９６ウェルプレートの外周に培地のみを加えた。培養プレートをインキュベーターで２４時間培養した（３７℃、５％のＣＯ２）。検出待ちのＡＤＣと化合物２－Ｂの調製及び実験の方法は、上記と同様である。（結果は、表４、図３Ｅ、図３Ｆに示される通りでる。）
【0209】
【表4】
【0210】
結論：ＰＳＭＡ ＡＤＣは、ＬＮＣａＰ及び２２ＲＶ１細胞において傷害作用を有する。化合物２－Ｂ（即ち、９－Ａの遊離毒素）は、膜透過傷害作用を有する。
【0211】
試験例４：ＡＤＣ薬物によるヒト前立腺がん細胞２２Ｒｖ１ヌードマウス移植腫瘍への治療効果の評価
一、試験の方法
雄で６～８週齢の実験用ｎｕ／ｎｕヌードマウスは、北京維通利華実験動物技術有限公司から購入された（合格証明書番号：１９０８１２００８２）。飼育環境：ＳＰＦ級。ヌードマウスの皮下にヒト前立腺がん細胞２２Ｒｖ１（中国科学院）を接種し、腫瘍平均体積が２２０ ｍｍ３になると、動物をランダムに群分けし（Ｄ０）、１群当たり６匹であり、腹腔内に２回／週で注射投与し始め、合計５回投与し、腫瘍体積と体重を週に２回検出し、データを記録した。
一、試験の方法
雄で６～８週齢の実験用ｎｕ／ｎｕヌードマウスは、北京維通利華実験動物技術有限公司から購入された（合格証明書番号：１９０８１２００８２）。飼育環境：ＳＰＦ級。ヌードマウスの皮下にヒト前立腺がん細胞２２Ｒｖ１（中国科学院）を接種し、腫瘍平均体積が２２０ ｍｍ３になると、動物をランダムに群分けし（Ｄ０）、１群当たり６匹であり、腹腔内に２回／週で注射投与し始め、合計５回投与し、腫瘍体積と体重を週に２回検出し、データを記録した。
【0212】
腫瘍体積Ｖ＝１／２×ａ×ｂ２で、そのうち、ａ、ｂはそれぞれ長さ、幅を示す。
【0213】
相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）＝（Ｔ－Ｔ０）／（Ｃ－Ｃ０）×１００で、そのうち、Ｔ、Ｃは、実験終了時の治療群と対照群の腫瘍体積であり、Ｔ０、Ｃ０は実験開始時の腫瘍体積である。
【0214】
腫瘍阻害率ＴＧＩ（％）＝１－Ｔ／Ｃ（％）。
【0215】
二、試験の対象
ＡＤＣ－１０：３ ｍｐｋ、１０ ｍｐｋ、
ＡＤＣ－２：３ ｍｐｋ、１０ ｍｐｋ、
ブランク対照群：ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液。
ＡＤＣ－１０：３ ｍｐｋ、１０ ｍｐｋ、
ＡＤＣ－２：３ ｍｐｋ、１０ ｍｐｋ、
ブランク対照群：ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液。
【0216】
三、抗体ＡＤＣの腫瘍阻害効果
投与開始後の１７日目（Ｄ１７）に観察した時、陽性ＡＤＣ－１０の１０ ｍｐｋと３ ｍｐｋの腫瘍阻害率はそれぞれ４８．９％と１０．０％であり、ＡＤＣ－２の１０ ｍｐｋと３ ｍｐｋの腫瘍阻害率はそれぞれ＞１００％と９１．５％で、ブランク対照群と陽性ＡＤＣ群より顕著に優れ、且つ良好な用量依存関係を示している（表５、図４Ａ）。
投与開始後の１７日目（Ｄ１７）に観察した時、陽性ＡＤＣ－１０の１０ ｍｐｋと３ ｍｐｋの腫瘍阻害率はそれぞれ４８．９％と１０．０％であり、ＡＤＣ－２の１０ ｍｐｋと３ ｍｐｋの腫瘍阻害率はそれぞれ＞１００％と９１．５％で、ブランク対照群と陽性ＡＤＣ群より顕著に優れ、且つ良好な用量依存関係を示している（表５、図４Ａ）。
【0217】
投与中に、マウスの体重は安定しており、ＡＤＣ－２の各投与量に明らかな毒性や副作用がないことが示されている（図４Ｂ）。
【0218】
【表5】
【0219】
試験例５：ＡＤＣ薬物によるヒト前立腺がん細胞２２Ｒｖ１ヌードマウス移植腫瘍への治療効果の評価
一、試験の方法
雄で６～８週齢の実験用ｎｕ／ｎｕヌードマウスは、北京維通利華実験動物技術有限公司から購入された（合格証明書番号：１９０８１２００８２）。飼育環境：ＳＰＦ級。ヌードマウスの皮下にヒト前立腺がん細胞２２Ｒｖ１（中国科学院）を接種し、腫瘍平均体積が２１０ ｍｍ３になると、動物をランダムに群分けし（Ｄ０）、１群当たり８匹であり、腹腔内に２回／週で注射投与し始め、合計６回投与し、腫瘍体積と体重を週に２回検出し、データを記録した。
一、試験の方法
雄で６～８週齢の実験用ｎｕ／ｎｕヌードマウスは、北京維通利華実験動物技術有限公司から購入された（合格証明書番号：１９０８１２００８２）。飼育環境：ＳＰＦ級。ヌードマウスの皮下にヒト前立腺がん細胞２２Ｒｖ１（中国科学院）を接種し、腫瘍平均体積が２１０ ｍｍ３になると、動物をランダムに群分けし（Ｄ０）、１群当たり８匹であり、腹腔内に２回／週で注射投与し始め、合計６回投与し、腫瘍体積と体重を週に２回検出し、データを記録した。
【0220】
腫瘍体積Ｖ＝１／２×ａ×ｂ２で、そのうち、ａ、ｂはそれぞれ長さ、幅を示す。
【0221】
相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）＝（Ｔ－Ｔ０）／（Ｃ－Ｃ０）×１００で、そのうち、Ｔ、Ｃは、実験終了時の治療群と対照群の腫瘍体積であり、Ｔ０、Ｃ０は実験開始時の腫瘍体積である。
【0222】
腫瘍阻害率ＴＧＩ（％）＝１－Ｔ／Ｃ（％）。
【0223】
二、試験の対象
ＡＤＣ－８：１０ ｍｐｋ、
ＡＤＣ－６：３ ｍｐｋ、６ ｍｐｋ、
ＡＤＣ－７：３ ｍｐｋ、６ ｍｐｋ、１０ ｍｐｋ、
ブランク対照群：ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液。
ＡＤＣ－８：１０ ｍｐｋ、
ＡＤＣ－６：３ ｍｐｋ、６ ｍｐｋ、
ＡＤＣ－７：３ ｍｐｋ、６ ｍｐｋ、１０ ｍｐｋ、
ブランク対照群：ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液。
【0224】
三、抗体ＡＤＣの腫瘍阻害効果
投与開始後の１４日目（Ｄ１４）に観察した時、陽性ＡＤＣ－８の１０ ｍｐｋの腫瘍阻害率は８１．６％であり、被験ＡＤＣ－６の６ ｍｐｋと３ ｍｐｋの腫瘍阻害率はそれぞれ＞１００％と９７．８％で、もう１つの被験ＡＤＣ－７の１０ ｍｐｋ、６ ｍｐｋと３ ｍｐｋの腫瘍阻害率はそれぞれ＞１００％、８８．４％と８０．５％であり、投与群は何れも対照群より顕著に優れ、被験ＡＤＣ－６は同等な用量で被験ＡＤＣ－７より顕著に優れ、２つの被験ＡＤＣは共に良好な用量依存関係を示している（表６、図５Ａ）。
投与開始後の１４日目（Ｄ１４）に観察した時、陽性ＡＤＣ－８の１０ ｍｐｋの腫瘍阻害率は８１．６％であり、被験ＡＤＣ－６の６ ｍｐｋと３ ｍｐｋの腫瘍阻害率はそれぞれ＞１００％と９７．８％で、もう１つの被験ＡＤＣ－７の１０ ｍｐｋ、６ ｍｐｋと３ ｍｐｋの腫瘍阻害率はそれぞれ＞１００％、８８．４％と８０．５％であり、投与群は何れも対照群より顕著に優れ、被験ＡＤＣ－６は同等な用量で被験ＡＤＣ－７より顕著に優れ、２つの被験ＡＤＣは共に良好な用量依存関係を示している（表６、図５Ａ）。
【0225】
投与中に、マウスの体重は安定しており、各被験抗体の各投与量に明らかな毒性や副作用がないことが示されている（図５Ｂ）。
【0226】
【表6】
【0227】
試験例６：ＡＤＣ薬物によるヒト前立腺がん細胞ＬＮＣａｐのＳＣＩＤ Ｂｅｉｇｈｅマウスにおける移植腫瘍への治療効果の評価
一、試験の方法
雄で６～８週齢の実験用ＳＣＩＤ Ｂｅｉｇｅマウスは、北京維通利華実験動物技術有限公司から購入された（合格証明書番号：１９０８１２００８２）。飼育環境：ＳＰＦ級。マウスの皮下にヒト前立腺がん細胞ＬＮＣａｐ（ＡＴＣＣ）を接種し、腫瘍平均体積が１６０ ｍｍ３になると、動物をランダムに群分けし（Ｄ０）、１群当たり７匹であり、Ｄ０とＤ４に腹腔内に２回注射投与し、腫瘍体積と体重を週に２回検出し、データを記録した。
一、試験の方法
雄で６～８週齢の実験用ＳＣＩＤ Ｂｅｉｇｅマウスは、北京維通利華実験動物技術有限公司から購入された（合格証明書番号：１９０８１２００８２）。飼育環境：ＳＰＦ級。マウスの皮下にヒト前立腺がん細胞ＬＮＣａｐ（ＡＴＣＣ）を接種し、腫瘍平均体積が１６０ ｍｍ３になると、動物をランダムに群分けし（Ｄ０）、１群当たり７匹であり、Ｄ０とＤ４に腹腔内に２回注射投与し、腫瘍体積と体重を週に２回検出し、データを記録した。
【0228】
腫瘍体積Ｖ＝１／２×ａ×ｂ２で、そのうち、ａ、ｂはそれぞれ長さ、幅を示す。
【0229】
相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）＝（Ｔ－Ｔ０）／（Ｃ－Ｃ０）×１００で、そのうち、Ｔ、Ｃは、実験終了時の治療群と対照群の腫瘍体積であり、Ｔ０、Ｃ０は実験開始時の腫瘍体積である。
【0230】
腫瘍阻害率ＴＧＩ（％）＝１－Ｔ／Ｃ（％）。
【0231】
二、試験の対象
ＡＤＣ－９：１０ ｍｐｋ、
ＡＤＣ－３：３ ｍｐｋ、１０ ｍｐｋ、
ＡＤＣ－５：３ ｍｐｋ、６ ｍｐｋ、１０ ｍｐｋ、
ブランク対照群：ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液。
ＡＤＣ－９：１０ ｍｐｋ、
ＡＤＣ－３：３ ｍｐｋ、１０ ｍｐｋ、
ＡＤＣ－５：３ ｍｐｋ、６ ｍｐｋ、１０ ｍｐｋ、
ブランク対照群：ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液。
【0232】
三、抗体ＡＤＣの腫瘍阻害効果
全ての投与群腫瘍は、Ｄ０とＤ４の２回投与後に直ちに退縮され始め、且つその薬効が実験のエンドポイントであるＤ１８まで維持された。被験ＡＤＣ－３とＡＤＣ－５は共に一定の用量依存関係を示しているが、それらの間に有意差がなかった（表７、図６Ａ）。
全ての投与群腫瘍は、Ｄ０とＤ４の２回投与後に直ちに退縮され始め、且つその薬効が実験のエンドポイントであるＤ１８まで維持された。被験ＡＤＣ－３とＡＤＣ－５は共に一定の用量依存関係を示しているが、それらの間に有意差がなかった（表７、図６Ａ）。
【0233】
投与中に、マウスの体重は安定しており、各被験抗体の各投与量に明らかな毒性や副作用がないことが示されている（図６Ｂ）。
【0234】
【表7】
【0235】
試験例７：ＰＭＳＡ ＡＤＣ ＳＤラットＴ１／２評価
雄のＳＤラット９匹を３群に分け、１群当たり３匹で、１２／１２時間の明／暗周期で調節し、温度を２０～２６℃のままにし、湿度４０～７０％で、水や餌を自由に摂取させた。浙江維通利華実験動物技術有限公司から購入した。実験当日に、雄の各ＳＤラットの尾静脈に被験薬ＡＤＣ－２、ＡＤＣ－５、ＡＤＣ－１０を注射し、投与用量が３ ｍｇ／ｋｇで、注射体積が５ ｍＬ／ｋｇである。
雄のＳＤラット９匹を３群に分け、１群当たり３匹で、１２／１２時間の明／暗周期で調節し、温度を２０～２６℃のままにし、湿度４０～７０％で、水や餌を自由に摂取させた。浙江維通利華実験動物技術有限公司から購入した。実験当日に、雄の各ＳＤラットの尾静脈に被験薬ＡＤＣ－２、ＡＤＣ－５、ＡＤＣ－１０を注射し、投与用量が３ ｍｇ／ｋｇで、注射体積が５ ｍＬ／ｋｇである。
【0236】
採血時点は、初日投与後の５分間、８時間、２４時間（２日目）、３日目、５日目、８日目、１１日目、１５日目、２２日目と２９日目であり、ラットの眼底静脈から採血し、毎回３００ μＬ（血清１５０ μＬの採取に相当する）で、収集された血液試料を凝集になるまで室温で３０分間放置し、そして４℃で１０００×ｇを１５分間遠心分離し、上清（血清）をＥＰ管に転移してから、直ちに－８０℃で貯蔵した。ＥＬＩＳＡ法によりＳＤラット血清中のＰＳＭＡ抗体ＡＤＣの濃度を検出した。
【0237】
試験の方法：
全抗体（Ｔｏｔａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）の検出：
１．ＥＬＩＳＡプレート（ｃｏｒｎｎｉｎｇ）において１ウェルごとに１ μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒトｌｇＧ ＦＣ（ａｂｃａｍ）１００ μＬを入れ、４℃で一晩インキュベートした。
２． プレート洗浄液ＰＢＳＴで３回洗浄した（１×ＰＢＳ、０．５％のｔｗｅｅｎ－２０（生工）。
３． １ウェルごとに２００ μＬのブロッキング液（５％のミルク、碧雲天）を入れ、３７℃で１～３時間インキュベートした。
４． プレート洗浄液ＰＢＳＴで３回洗浄した。
５． １００ μＬの標準試料、品質管理試料及び検出試料を加え、３７℃で１～３時間インキュベートした。
６． プレート洗浄液で３回洗浄した。
７． マウスに予備吸着されたヤギ抗ヒトｌｇＧ軽／重鎖ＨＲＰ（１：５０００、ａｂｃａｍ）１００ μＬを加え、３７℃で１～１．５時間インキュベートした。
８． プレート洗浄液で３回洗浄した。
９． １００ μＬのＴＭＢ（ＫＰＬ）を加え、常温で暗所で１０分間インキュベートした。
１０． １ Ｍの希硫酸（国薬グループ）１００ μＬを加えて中止し、４５０ ｎｍの波長でプレートの読み取りを行った（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅ、ｆｌｅｘｓｔａｔｉｏｎ ３）。
全抗体（Ｔｏｔａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）の検出：
１．ＥＬＩＳＡプレート（ｃｏｒｎｎｉｎｇ）において１ウェルごとに１ μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒトｌｇＧ ＦＣ（ａｂｃａｍ）１００ μＬを入れ、４℃で一晩インキュベートした。
２． プレート洗浄液ＰＢＳＴで３回洗浄した（１×ＰＢＳ、０．５％のｔｗｅｅｎ－２０（生工）。
３． １ウェルごとに２００ μＬのブロッキング液（５％のミルク、碧雲天）を入れ、３７℃で１～３時間インキュベートした。
４． プレート洗浄液ＰＢＳＴで３回洗浄した。
５． １００ μＬの標準試料、品質管理試料及び検出試料を加え、３７℃で１～３時間インキュベートした。
６． プレート洗浄液で３回洗浄した。
７． マウスに予備吸着されたヤギ抗ヒトｌｇＧ軽／重鎖ＨＲＰ（１：５０００、ａｂｃａｍ）１００ μＬを加え、３７℃で１～１．５時間インキュベートした。
８． プレート洗浄液で３回洗浄した。
９． １００ μＬのＴＭＢ（ＫＰＬ）を加え、常温で暗所で１０分間インキュベートした。
１０． １ Ｍの希硫酸（国薬グループ）１００ μＬを加えて中止し、４５０ ｎｍの波長でプレートの読み取りを行った（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅ、ｆｌｅｘｓｔａｔｉｏｎ ３）。
【0238】
完全なＡＤＣ（Ｉｎｔａｃｔ ＡＤＣ）の検出：
１．ＥＬＩＳＡプレート（ｃｏｒｎｎｉｎｇ）において１ウェルごとに１ μｇ／ｍＬのヤギ抗マウスｌｇＧ Ｆｃ １００ μＬを入れ、４℃で一晩インキュベートした。
２．プレート洗浄液ＰＢＳＴで３回洗浄した。
３．１ウェルごとに２００ μＬのブロッキング液を入れ、３７℃で１～３時間インキュベートした。
４．プレート洗浄液で３回洗浄した。
５．１ウェルごとに０．２ μｇ／ｍＬ抗毒素抗体又はａｎｔｉ－ｐａｂ－ｍｍａｅ（中科英沐、ｓ－４９７－８）１００ μＬを入れ、３７℃で１～１．５時間インキュベートした。
６．プレート洗浄液で３回洗浄した。
７．１００ μＬの標準試料、品質管理試料及び検出試料を加え、３７℃で１～３時間インキュベートした。
８．プレート洗浄液で３回洗浄した。
９．マウスに予備吸着されたヤギ抗ヒトｌｇＧ軽／重鎖ＨＲＰ（１：５０００）１００ μＬを加え、３７℃で１～１．５時間インキュベートした。
１０．プレート洗浄液で３回洗浄した。
１１．１００ μＬのＴＭＢを加え、常温で暗所で１０分間インキュベートした。
１２．１ Ｍの希硫酸１００ μＬを加えて中止し、４５０ ｎｍの波長でプレートの読み取りを行った。
１．ＥＬＩＳＡプレート（ｃｏｒｎｎｉｎｇ）において１ウェルごとに１ μｇ／ｍＬのヤギ抗マウスｌｇＧ Ｆｃ １００ μＬを入れ、４℃で一晩インキュベートした。
２．プレート洗浄液ＰＢＳＴで３回洗浄した。
３．１ウェルごとに２００ μＬのブロッキング液を入れ、３７℃で１～３時間インキュベートした。
４．プレート洗浄液で３回洗浄した。
５．１ウェルごとに０．２ μｇ／ｍＬ抗毒素抗体又はａｎｔｉ－ｐａｂ－ｍｍａｅ（中科英沐、ｓ－４９７－８）１００ μＬを入れ、３７℃で１～１．５時間インキュベートした。
６．プレート洗浄液で３回洗浄した。
７．１００ μＬの標準試料、品質管理試料及び検出試料を加え、３７℃で１～３時間インキュベートした。
８．プレート洗浄液で３回洗浄した。
９．マウスに予備吸着されたヤギ抗ヒトｌｇＧ軽／重鎖ＨＲＰ（１：５０００）１００ μＬを加え、３７℃で１～１．５時間インキュベートした。
１０．プレート洗浄液で３回洗浄した。
１１．１００ μＬのＴＭＢを加え、常温で暗所で１０分間インキュベートした。
１２．１ Ｍの希硫酸１００ μＬを加えて中止し、４５０ ｎｍの波長でプレートの読み取りを行った。
【0239】
検出と分析結果：
ＥＬＩＳＡにより血清中のＰＳＭＡ抗体ＡＤＣの濃度を検出し、ＰＫ分析を行った（結果は表８に示されている）。
ＥＬＩＳＡにより血清中のＰＳＭＡ抗体ＡＤＣの濃度を検出し、ＰＫ分析を行った（結果は表８に示されている）。
【0240】
【表8】
【0241】
結果から明らかなように、ラットの静脈に３ ｍｇ／ｋｇの被験抗体複合体ＡＤＣ－１０、ＡＤＣ－２、ＡＤＣ－５を投与した後、全抗体（ＡＤＣにおける複合した抗体と血清における遊離した抗体）のラット体内での半減期が約２１９．８時間（９．２日）、１７１．２時間（７．１日）、１７２．５時間（７．２日）で、完全なＡＤＣのラット体内での半衰期が約７６．７時間（３．２日）、１５３．９時間（６．４日）、１３７．９時間（５．７日）である。ＡＤＣ－２及びＡＤＣ－５のＴ１／２はＡＤＣ－１０よりも優れている。
【0242】
試験例８：ＰＳＭＡ ＡＤＣの安定性研究（遊離毒素検出）
１． ラット薬物動態試料におけるＡＤＣ－２の安定性
特定の濃度条件下での試料の安定性を反映するために、液体クロマトグラフ質量分析技術により、試料の静脈投与による雄のラット体内での２８日間の化合物２－Ｂ（９－Ａの遊離毒素）の経時的な放出量をモニターした。２８日間の異なる時点（５分間、８時間、１日間、２日間、４日間、７日間、１０日間、１４日間、２１日間、２８日間）でのラット血漿中の化合物２－Ｂの含有量を測定したところ、ＡＤＣ－２は良好な安定性を示し、結果は表９に示される通りである。
１． ラット薬物動態試料におけるＡＤＣ－２の安定性
特定の濃度条件下での試料の安定性を反映するために、液体クロマトグラフ質量分析技術により、試料の静脈投与による雄のラット体内での２８日間の化合物２－Ｂ（９－Ａの遊離毒素）の経時的な放出量をモニターした。２８日間の異なる時点（５分間、８時間、１日間、２日間、４日間、７日間、１０日間、１４日間、２１日間、２８日間）でのラット血漿中の化合物２－Ｂの含有量を測定したところ、ＡＤＣ－２は良好な安定性を示し、結果は表９に示される通りである。
【0243】
結果から明らかなように、ＡＤＣ－２は、雄のラットの体内で２８日間にわたって全て良好な安定性を示していた。
【0244】
【表9】
【0245】
２． ＰＳＭＡ ＡＤＣの血漿安定性研究
特定の濃度（１００ μｇ／ｍＬ）条件下での試料の安定性を反映するために、液体クロマトグラフ質量分析技術により、試料ＡＤＣ－２（１００ μｇ／ｍＬ）のそれぞれ（ヒト、サル、イヌ、ラット、マウスという５つの種の血漿（ヘパリンで抗凝固した）及び対照としての１％のＢＳＡ－ＰＢＳ）における、それぞれ（３７℃ ＆ ５％のＣＯ２のインキュベーターにおいて、０日、７日、１４日、２１日間置いた）異なる時間での化合物２－Ｂの経時的な放出量をモニターした。異なる時点での化合物２－Ｂの含有量を測定することにより、ＡＤＣ－２は、良好な安定性を示し、結果は図７と表１０に示される通りである。
特定の濃度（１００ μｇ／ｍＬ）条件下での試料の安定性を反映するために、液体クロマトグラフ質量分析技術により、試料ＡＤＣ－２（１００ μｇ／ｍＬ）のそれぞれ（ヒト、サル、イヌ、ラット、マウスという５つの種の血漿（ヘパリンで抗凝固した）及び対照としての１％のＢＳＡ－ＰＢＳ）における、それぞれ（３７℃ ＆ ５％のＣＯ２のインキュベーターにおいて、０日、７日、１４日、２１日間置いた）異なる時間での化合物２－Ｂの経時的な放出量をモニターした。異なる時点での化合物２－Ｂの含有量を測定することにより、ＡＤＣ－２は、良好な安定性を示し、結果は図７と表１０に示される通りである。
【0246】
結果から明らかなように、ＡＤＣ－２は異なる種の血漿において、一定の温度、一定の時間で良好な安定性を示している。
【0247】
注：試験操作は滅菌実験室において行われ、ブランク血漿は０．２２ μｍのマイクロウェルろ過膜でろ過除菌された。
【表10】
【0248】
３． ＰＳＭＡ ＡＤＣの血漿安定性研究
特定の濃度（１００ μｇ／ｍＬ）条件下での試料の安定性を反映するために、液体クロマトグラフ質量分析技術により、試料ＡＤＣ－５のそれぞれ（ヒト、サル、イヌ、ラット、マウスという５つの種の血漿（ヘパリンで抗凝固した）及び対照としての１％のＢＳＡ－ＰＢＳ）における、それぞれ（３７℃ ＆ ５％のＣＯ２のインキュベーターにおいて、０日、７日、１４日、２３日間置いた）異なる時間での化合物２－Ｂの経時的な低下量をモニターした。異なる時点での化合物２－Ｂの含有量を測定することにより、ＡＤＣ－５は、良好な安定性を示し、結果は表１１と図８に示される通りである。
特定の濃度（１００ μｇ／ｍＬ）条件下での試料の安定性を反映するために、液体クロマトグラフ質量分析技術により、試料ＡＤＣ－５のそれぞれ（ヒト、サル、イヌ、ラット、マウスという５つの種の血漿（ヘパリンで抗凝固した）及び対照としての１％のＢＳＡ－ＰＢＳ）における、それぞれ（３７℃ ＆ ５％のＣＯ２のインキュベーターにおいて、０日、７日、１４日、２３日間置いた）異なる時間での化合物２－Ｂの経時的な低下量をモニターした。異なる時点での化合物２－Ｂの含有量を測定することにより、ＡＤＣ－５は、良好な安定性を示し、結果は表１１と図８に示される通りである。
【0249】
結果から明らかなように、ＡＤＣ－５は異なる種の血漿において、一定の温度、一定の時間で良好な安定性を示している。
【0250】
注：試験操作は滅菌実験室において行われ、ブランク血漿は０．２２ μｍのマイクロウェルろ過膜でろ過除菌された。
【0251】
【表11】
【0252】
試験例９：ＡＤＣ薬物によるヒト前立腺がん細胞２２Ｒｖ１ヌードマウス移植腫瘍への治療効果の評価
一、試験の方法
雄で６～８週齢の実験用ｎｕ／ｎｕヌードマウスは、北京維通利華実験動物技術有限公司から購入された（合格証明書番号：１９０８１２００８２）。飼育環境：ＳＰＦ級。ヌードマウスの皮下にヒト前立腺がん細胞２２Ｒｖ１（中国科学院）を接種し、腫瘍平均体積が１９０ ｍｍ３になると、動物をランダムに群分けし（Ｄ０）、１群当たり８匹であり、腹腔内に２回／週で注射投与し始め、合計４回投与し、腫瘍体積と体重を週に２回検出し、データを記録した。
一、試験の方法
雄で６～８週齢の実験用ｎｕ／ｎｕヌードマウスは、北京維通利華実験動物技術有限公司から購入された（合格証明書番号：１９０８１２００８２）。飼育環境：ＳＰＦ級。ヌードマウスの皮下にヒト前立腺がん細胞２２Ｒｖ１（中国科学院）を接種し、腫瘍平均体積が１９０ ｍｍ３になると、動物をランダムに群分けし（Ｄ０）、１群当たり８匹であり、腹腔内に２回／週で注射投与し始め、合計４回投与し、腫瘍体積と体重を週に２回検出し、データを記録した。
【0253】
腫瘍体積（Ｖ）の計算式は、Ｖ＝１／２×ａ×ｂ２で、そのうち、ａ、ｂはそれぞれ長さ、幅を示す。
【0254】
相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）＝（Ｔ－Ｔ０）／（Ｃ－Ｃ０）×１００で、そのうち、Ｔ、Ｃは実験終了時の治療群及び対照群の腫瘍体積であり、Ｔ０、Ｃ０は実験開始時の腫瘍体積である。
【0255】
腫瘍阻害率ＴＧＩ（％）＝１－Ｔ／Ｃ（％）。
【0256】
二、試験の対象
ＡＤＣ－１１：５ ｍｐｋ
ＡＤＣ－１２：５ ｍｐｋ
ブランク対照群：ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液
ＡＤＣ－１１：５ ｍｐｋ
ＡＤＣ－１２：５ ｍｐｋ
ブランク対照群：ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液
【0257】
三、抗体ＡＤＣの腫瘍阻害効果
投与開始後の１３日目（Ｄ１３）に観察した時に、ＡＤＣ－１１とＡＤＣ－１２は、５ ｍｐｋの用量での腫瘍阻害率がそれぞれ８７．６３％と７９．８２％であり、何れも対照群より顕著に優れている。ＡＤＣ－１１とＡＤＣ－１２の間に有意差がない（表１２、図９）。
投与開始後の１３日目（Ｄ１３）に観察した時に、ＡＤＣ－１１とＡＤＣ－１２は、５ ｍｐｋの用量での腫瘍阻害率がそれぞれ８７．６３％と７９．８２％であり、何れも対照群より顕著に優れている。ＡＤＣ－１１とＡＤＣ－１２の間に有意差がない（表１２、図９）。
【0258】
投与中に、マウスの体重は安定しており、各被験抗体に明らかな毒性や副作用がないことが示されている。
【0259】
【表12】
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図3F】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【図7】
【図8】
【図9】
【配列表】
【国際調査報告】