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特表2023-519277伝染性ＲＮＡウイルス感染症の予防又は治療するための医薬組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-05-10
(54)【発明の名称】伝染性ＲＮＡウイルス感染症の予防又は治療するための医薬組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 31/4745 20060101AFI20230428BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20230428BHJP
A61K 31/366 20060101ALI20230428BHJP
A61K 31/357 20060101ALI20230428BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20230428BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230428BHJP
A61P 31/16 20060101ALI20230428BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20230428BHJP
A61K 31/7056 20060101ALI20230428BHJP
A61K 38/21 20060101ALI20230428BHJP
A61K 31/166 20060101ALI20230428BHJP
【ＦＩ】
A61K31/4745
A61P31/14
A61K31/366
A61K31/357
A61K45/00
A61P43/00 121
A61P43/00 111
A61P31/16
A61P11/00
A61K31/7056
A61K38/21
A61K31/166
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022557949
(86)(22)【出願日】2021-03-25
(85)【翻訳文提出日】2022-11-04
(86)【国際出願番号】 KR2021003742
(87)【国際公開番号】W WO2021194290
(87)【国際公開日】2021-09-30
(31)【優先権主張番号】10-2020-0037135
(32)【優先日】2020-03-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
２．ＳＰＡＮ
３．ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ
４．ＬＡＢＲＡＳＯＬ
(71)【出願人】
【識別番号】518073240
【氏名又は名称】シンプン・ファーマシューティカル・カンパニー・リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＳＨＩＮ ＰＯＯＮＧ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＣＯ．， ＬＴＤ．
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100150500
【弁理士】
【氏名又は名称】森本 靖
(74)【代理人】
【識別番号】100176474
【弁理士】
【氏名又は名称】秋山 信彦
(72)【発明者】
【氏名】リュ，ジェマン
(72)【発明者】
【氏名】チュ，チョン
(72)【発明者】
【氏名】チョン，ヒョンギュ
(72)【発明者】
【氏名】チョ，グムシル
【テーマコード（参考）】
4C084
4C086
4C206
【Ｆターム（参考）】
4C084AA02
4C084AA22
4C084BA44
4C084DA21
4C084MA02
4C084NA05
4C084ZA591
4C084ZA592
4C084ZB331
4C084ZB332
4C084ZC412
4C084ZC75
4C086AA01
4C086AA02
4C086BA16
4C086BA17
4C086CB09
4C086EA11
4C086GA13
4C086MA01
4C086MA02
4C086MA04
4C086NA05
4C086NA14
4C086ZA59
4C086ZB33
4C086ZC75
4C206AA01
4C206GA07
4C206GA31
4C206MA02
4C206MA03
4C206NA05
4C206ZA59
4C206ZB33
4C206ZC41
4C206ZC75
(57)【要約】
本発明は、ピロナリジン（pyronaridine）又はその薬学的に許容される塩、及び／又はアルテミシニン（artemisinin）又はその誘導体を伝染性ＲＮＡウイルス感染症の予防又は治療に使用するための使用に関し、より詳細には、治療有効量のピロナリジン又はその薬学的に許容される塩、及び／又は、治療有効量のアルテミシニン又はその誘導体を、薬学的に許容される担体と共に含む、伝染性ＲＮＡウイルス感染症、特にコロナウイルス感染症－１９（ＣＯＶＩＤ－１９）の予防又は治療に使用するための医薬組成物に関する。
【選択図】図４
【選択図】図４
【特許請求の範囲】
【請求項1】
治療有効量のピロナリジン（pyronaridine）又はその薬学的に許容される塩を、薬学的に許容される担体と共に含む、伝染性ＲＮＡウイルス感染症の予防又は治療するための医薬組成物。
【請求項2】
治療有効量のアルテミシニン（artemisinin）又はその誘導体を、薬学的に許容される担体と共に含む、伝染性ＲＮＡウイルス感染症の予防又は治療するための医薬組成物。
【請求項3】
治療有効量のピロナリジン（pyronaridine）又はその薬学的に許容される塩、及び治療有効量のアルテミシニン（artemisinin）又はその誘導体を、薬学的に許容される担体と共に含む、伝染性ＲＮＡウイルス感染症の予防又は治療するための医薬組成物。
【請求項4】
前記ピロナリジンの薬学的に許容される塩が、リン酸塩、硫酸塩、塩酸塩、酢塩酸、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、マレイン酸塩及びフマル酸塩からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１又は３に記載の医薬組成物。
【請求項5】
前記ピロナリジンの薬学的に許容される塩が、リン酸塩であることを特徴とする、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項6】
前記ピロナリジン又はその薬学的に許容される塩と、アルテミシニン又はその誘導体との重量比が、１０：１～１：１０であることを特徴とする、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項7】
前記ピロナリジン又はその薬学的に許容される塩と、アルテミシニン又はその誘導体との重量比が、１：１～６：１であることを特徴とする、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項8】
前記ピロナリジン又はその薬学的に許容される塩と、アルテミシニン又はその誘導体との重量比が、３：１であることを特徴とする、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項9】
前記アルテミシニンの誘導体が、ジヒドロアルテミシニン（dihydroartemisinin）、アルテスナート（artesunate）、アルテメテル（artemether）及びアルテエテル（arteether）からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項２又は３に記載の医薬組成物。
【請求項10】
前記アルテミシニンの誘導体が、アルテスナートであることを特徴とする、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項11】
少なくとも一つの他の抗ウイルス剤をさらに含むことを特徴とする、請求項１～３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項12】
前記他の抗ウイルス剤が、ウイルス複製阻害剤、ヘリカーゼ阻害剤、ウイルスプロテアーゼ阻害剤及びウイルス細胞進入阻害剤からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項13】
前記他の抗ウイルス剤が、リバビリン（ribavirin）、インターフェロン（interferon）、ニクロサミド（niclosamide）及びそれらの組み合わせから選ばれることを特徴とする、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項14】
前記伝染性ＲＮＡウイルス感染症が、ジカウイルス感染症、エボラウイルス感染症、新型インフルエンザウイルス感染症及びコロナウイルス感染症によって引き起こされる呼吸器疾患からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１～３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項15】
前記コロナウイルス感染症によって引き起こされる呼吸器疾患が、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）及びコロナウイルス感染症－１９（ＣＯＶＩＤ－１９）からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項16】
前記コロナウイルス感染症によって引き起こされる呼吸器疾患が、コロナウイルス感染症－１９（ＣＯＶＩＤ－１９）であることを特徴とする、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項17】
治療有効量のピロナリジン（pyronaridine）又はその薬学的に許容される塩の、伝染性ＲＮＡウイルス感染症の予防又は治療用薬剤の製造における使用。
【請求項18】
治療有効量のアルテミシニン（artemisinin）又はその誘導体の、伝染性ＲＮＡウイルス感染症の予防又は治療用薬剤の製造における使用。
【請求項19】
治療有効量のピロナリジン（pyronaridine）又はその薬学的に許容される塩、及び治療有効量のアルテミシニン（artemisinin）又はその誘導体の、伝染性ＲＮＡウイルス感染症の予防又は治療用薬剤の製造における使用。
【請求項20】
前記ピロナリジンの薬学的に許容される塩が、リン酸塩、硫酸塩、塩酸塩、酢酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、マレイン酸塩及びフマル酸塩からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１７又は１９に記載の使用。
【請求項21】
前記ピロナリジンの薬学的に許容される塩が、リン酸塩であることを特徴とする、請求項２０に記載の使用。
【請求項22】
前記ピロナリジン又はその薬学的に許容される塩と、アルテミシニン又はその誘導体との重量比が、１０：１～１：１０であることを特徴とする、請求項１９に記載の使用。
【請求項23】
前記ピロナリジン又はその薬学的に許容される塩と、アルテミシニン又はその誘導体との重量比が、１：１～６：１であることを特徴とする、請求項２２に記載の使用。
【請求項24】
前記ピロナリジン又はその薬学的に許容される塩と、アルテミシニン又はその誘導体との重量比が、３：１であることを特徴とする、請求項２３に記載の使用。
【請求項25】
前記アルテミシニンの誘導体が、ジヒドロアルテミシニン（dihydroartemisinin）、アルテスナート（artesunate）、アルテメテル（artemether）及びアルテエテル（arteether）からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１８又は１９に記載の使用。
【請求項26】
前記アルテミシニンの誘導体が、アルテスナートであることを特徴とする、請求項２５に記載の使用。
【請求項27】
前記薬剤が、少なくとも一つの他の抗ウイルス剤をさらに含むことを特徴とする、請求項１７～１９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項28】
前記他の抗ウイルス剤が、ウイルス複製阻害剤、ヘリカーゼ阻害剤、ウイルスプロテアーゼ阻害剤及びウイルス細胞進入阻害剤からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項２７に記載の使用。
【請求項29】
前記他の抗ウイルス剤がリバビリン（ribavirin）、インターフェロン（interferon）、ニクロサミド（niclosamide）及びそれらの組み合わせから選ばれることを特徴とする、請求項２８に記載の使用。
【請求項30】
前記伝染性ＲＮＡウイルス感染症が、ジカウイルス感染症、エボラウイルス感染症、新型インフルエンザウイルス感染症及びコロナウイルス感染症によって引き起こされる呼吸器疾患からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１７～１９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項31】
前記コロナウイルス感染症によって引き起こされる呼吸器疾患が、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）及びコロナウイルス感染症－１９（ＣＯＶＩＤ－１９）からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項３０に記載の使用。
【請求項32】
前記コロナウイルス感染症によって引き起こされる呼吸器疾患が、コロナウイルス感染症－１９（ＣＯＶＩＤ－１９）であることを特徴とする、請求項３１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ピロナリジン（pyronaridine）又はその薬学的に許容される塩、及び／又はアルテミシニン（artemisinin）又はその誘導体を伝染性ＲＮＡウイルス感染症の予防又は治療に使用するための使用に関し、より詳細には、治療有効量のピロナリジン又はその薬学的に許容される塩、及び／又はアルテミシニン又はその誘導体を、薬学的に許容される担体と共に含む、伝染性ＲＮＡウイルス感染症、特にコロナウイルス感染症－１９（ＣＯＶＩＤ－１９）の予防又は治療に使用するための医薬組成物に関するものである。
【背景技術】
【0002】
ＲＮＡゲノムを有するＲＮＡウイルスは、ＤＮＡウイルスよりも突然変異率が高く、宿主や環境の変化に適応した変異体が簡単に発生する。この性質のため、ＲＮＡウイルスは、抗ウイルス剤や予防ワクチンによる制御が困難である。さらに、ＲＮＡウイルスは、ウイルスゲノムのテンプレートとしてＲＮＡを使用して、ＲＮＡを合成するＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）をコードし、ＤＮＡをテンプレートとしてＲＮＡを合成する宿主細胞のＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡウイルスの複製には作用しない。ＲＮＡウイルスは、ゲノムの極性、及びゲノムＲＮＡがｍＲＮＡと同じ極性であるかどうかによって、プラスセンス一本鎖、マイナスセンス一本鎖及び二本鎖ｄｓＲＮＡウイルスに分けられる。
【0003】
昨今、世界中に広がり、グローバルな公衆衛生上の危機を引き起こしている急性ウイルス性感染症は、ウイルスの発生国から他国への移動や交易を通じて急速に拡大しており、世界的に治療薬の開発が強く求められている。特に、２００９年の新型インフルエンザ、２０１４年の西アフリカ及び２０１９年のコンゴ民主共和国のエボラ（Ebola）ウイルス、２０１６年のジカ（Zika）による流行はすべてＲＮＡウイルス感染症である。
【0004】
コロナウイルスは、ジカウイルスのような一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルスに属するウイルスであり、２５－３２ｋｂサイズのプラスセンス一本鎖ＲＮＡゲノムを有し、鳥類、哺乳類などの動物とヒトの両方の細胞を感染できる人畜共通ウイルスである。コロナウイルスは、特徴的な突起型スパイク（spike）タンパク質が外皮から突き出た構造を有している。コロナウイルスは、様々な構成員を有するウイルス系であり、２００３年重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、２０１２年サウジアラビアで新たに出現した中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）、最近、世界保健機構（ＷＨＯ）により国際的公衆衛生上の緊急事態（ＰＨＥＩＣ）が宣言したコロナウイルス感染症－１９（ＣｏｖＩＤ－１９、２０１９－ｎＣｏＶ感染症）を誘発するＳＡＲＳ－ＣｏＶウイルス、ＭＥＲＳ－ＣｏＶウイルス、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ）ウイルスを含む。
【0005】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶは、２００２年に中国で発生し、世界中に広がった重症急性呼吸器症候群を誘発し、８，０９６人の患者で約１０％の死亡率を記録した。主に、高熱と筋肉痛を伴い、２～７日後には痰のない乾いた咳が出現し、患者の１０～２０％で呼吸不全が発生した。適切な治療法が確立されていないため、非定型肺炎に対する抗菌剤を投与し、オセルタミビル（oseltamivir）又はリバビリン（ribavirin）などの抗ウイルス剤を投与するか、ステロイドを併用して投与したことがあった。
【0006】
ＭＥＳＲ－ＣｏＶは、ラクダなどの動物宿主からヒトに感染されたウイルスと推定されており、重症の急性呼吸器症候群と腎不全を引き起こし、中東を含む２６カ国で約２０００件の感染を引き起こし、死亡率は３５．６％に達した（ＷＨＯ、２０１６）。潜伏期間は約５日で、発熱、咳、息切れ、肺炎などを伴い、家族や医療機関のメンバー間で限定的に感染が広がり、糖尿病などの基礎疾患のある人では重症化することが多かった。
【0007】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ）は、ＣＯＶＩＤ－１９の原因となるウイルスであり、２０１９年に中国の武漢で最初の症例が確認された。１～１４日の潜伏期間の後、咳、発熱、倦怠感、息切れ、肺炎、急性呼吸窮迫症候群など、軽度から重度までの様々な呼吸器症状が現れ、まれに痰、喉の痛み、下痢などが現れた。それに対する選択的な抗ウイルス剤がないため、対症療法単独で、又は以前の他のウイルスに適応された抗ウイルス剤による治療と既存疾患に使用した抗ウイルス剤を併用して治療した。
【0008】
特に、ＣＯＶＩＤ－１９は、その中で最も最近の大流行であり、現在利用可能な治療法やワクチンがない状態で非常に急速に広がっている（非特許文献１）、この疾患に対する適切な細胞又は動物試験モデルはまだ確立されていない状態である。現在、中国及び韓国などで臨床的に使用され報告されたか、専門家勧告案で提案される薬剤には、クロロキン（Chloroquine）とレムデシビル（Remdesivir）（非特許文献２）、ロピナビル（Lopinavir）、ファビピラビル（Favipiravir）、リバビリン（Ribavirin）、インターフェロンなどがあり、８０以上の臨床試験が進行中である（非特許文献３）。特に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、コロナウイルス科に属しているため、同じ系のＭＥＲＳウイルス又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスと塩基配列が約７９．５％一致するＳＡＲＳ－ＣｏＶで抗ウイルス効果があることが既に知られていた物質が注目されており（非特許文献４）、その中にはニクロサミド（Niclosamide）のような薬物がある（非特許文献５）。
【0009】
ＳＡＲＳやＣＯＶＩＤ－１９のケースを考えると、患者と濃密に接触すると、感染のリスクは非常に高くなり、ウイルスは、エアロゾル化した呼吸飛沫によって、人口密度の高い環境で多くの人々にかなり高い感染性を有している。しかしながら、また、これらのコロナウイルスによる急性ウイルス感染症は、ウイルスの発生国から他国への移動や交易を通じて急速に広がり、成果的な公衆衛生上の危機を引き起こしていた。
【0010】
それにもかかわらず、今日まで、伝染病を引き起こすこのような呼吸器ウイルス病原体を効率的に阻害、治療又は予防するための適切な解決策の開発が不十分であった。このように、世界中の人々の健康と福祉のために、これらの病気に対向するための薬を開発することが緊急に必要とされている。
【0011】
また、呼吸器感染症の臨床症状はやや似ており、同じＲＮＡウイルス科に属しているが、ウイルスには遺伝子レベルや構造レベルの違いがあり、この違いが抗ウイルス薬剤の感受性や効果に影響を与えることが報告されている。さらに、これらのウイルスの分子遺伝学的違いは、感染経路、ウイルスが結合する宿主の受容体、感染率、潜伏期間及び／又は感染部位の違いを引き起こし、臨床症状及び治療効果の違いにつながり、したがって、適切な標的ウイルスに対する試薬は非常に重要である。
【0012】
また、その呼吸器感染症による急速な感染、高い死亡率、世界的な保健及び経済的リスクを考慮すると、少なくとも１年から数年かかる新薬と新規ワクチンの開発に加えて、過去の臨床試験と実用化によって安全性が保証された薬物のドラッグリポジショニング（drug repositioning）を通じて、ＲＮＡウイルス感染症、特に、コロナウイルス呼吸器疾患の予防、改善、又は治療の可能性を探ることは、非常に有効で費用対比の効果の高い戦略となる可能性がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0013】
【非特許文献1】Li et al., 2020
【非特許文献2】Wang et al., 2020
【非特許文献3】Maxmen et al., 2020
【非特許文献4】Zhou et al., 2020
【非特許文献5】Xu et al., 2020
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0014】
本発明の目的は、ピロナリジン（pyronaridine）又はその薬学的に許容される塩、及び／又はアルテミシニン（artemisinin）又はその誘導体の伝染性ＲＮＡウイルス感染症の予防又は治療における使用を提供することである。
【0015】
本発明の別の目的は、治療有効量のピロナリジン又はその薬学的に許容される塩、及び／又はアルテミシニン又はその誘導体を、薬学的に許容される担体と共に含む、伝染性ＲＮＡウイルス感染症の予防又は治療に使用するための医薬組成物を提供することである。
【0016】
本発明のさらに別の目的は、ピロナリジン又はその薬学的に許容される塩、及び／又はアルテミシニン又はその誘導体を用いて、伝染性ＲＮＡウイルス感染症を予防又は治療する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0017】
前記目的を達成するために、本発明は、治療有効量のピロナリジン又はその薬学的に許容される塩、及び／又はアルテミシニン又はその誘導体を、薬学的に許容される担体と共に含む、伝染性ＲＮＡウイルス感染症の予防又は治療するための医薬組成物を提供する。
【0018】
また、本発明は、ピロナリジン又はその薬学的に許容される塩、及び／又はアルテミシニン又はその誘導体の、伝染性ＲＮＡウイルス感染症を予防又は治療するための使用を提供する。
【0019】
さらに、本発明は、治療有効量のピロナリジン又はその薬学的に許容される塩、及び／又はアルテミシニン又はその誘導体を、それを必要とする対象に投与することを含む、伝染性ＲＮＡウイルス感染症を予防又は治療する方法を提供する。
【0020】
以下、本発明を詳細に説明する。
【0021】
本発明の一態様によれば、治療有効量の下記式（１）のピロナリジン（pyronaridine）又はその薬学的に許容される塩を、薬学的に許容される担体と共に含む、伝染性ＲＮＡウイルス感染症の予防又は治療するための医薬組成物が提供される。
【0022】
【化1】
（１）
【0023】
本発明の別の態様によれば、治療有効量の下記式（２）のアルテミシニン（artemisinin）又はその誘導体を、薬学的に許容される担体と共に含む、ＲＮＡウイルス感染症の予防又は治療するための医薬組成物が提供される。
【0024】
【化2】
【0025】
本発明の別の態様によれば、治療有効量の前記式（１）のピロナリジン（pyronaridine）又はその薬学的に許容される塩及び前記式（２）のアルテミシニン（artemisinin）又はその誘導体を、薬学的に許容される担体と共に含む、ＲＮＡウイルス感染症の予防又は治療するための医薬組成物が提供される。
【0026】
本発明の一実施形態において、前記ピロナリジンの薬学的に許容される塩は、例えば、リン酸、硫酸、塩酸、酢酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、マレイン酸又はフマル酸との酸付加塩を含むが、それらに限定されない。本発明の別の実施形態では、前記ピロナリジンの薬学的に許容される塩は、ピロナリジンリン酸塩であってもよい。
【0027】
本発明の別の実施形態において、前記アルテミシニンの誘導体は、例えば、ジヒドロアルテミシニン（dihydroartemisinin）、アルテスナート（artesunate）、アルテメテル（artemether）及びアルテエテル（arteether）を含むが、それらに限定されない。本発明の他の実施形態で、前記アルテミシニンの誘導体はアルテスナートである。
【0028】
本発明の別の実施形態において、前記治療有効量のピロナリジン又はその薬学的に許容される塩及びアルテミシニン又はその誘導体を、薬学的に許容される担体と共に含む医薬組成物において、ピロナリジン又はその薬学的に許容される塩とアルテミシニン又はその誘導体との重量比は、１０：１～１：１０である。本発明の別の実施形態において、ピロナリジン又はその薬学的に許容される塩とアルテミシニン又はその誘導体との重量比は、１：１～６：１である。本発明の別の実施形態において、ピロナリジン又はその薬学的に許容される塩とアルテミシニン又はその誘導体との重量比は、１：１～４：１である。本発明の別の実施形態において、ピロナリジン又はその薬学的に許容される塩とアルテミシニン又はその誘導体との重量比は、３：１である。
【0029】
本明細書において、「薬学的に許容される」とは、生理学的に許容され、ヒトに投与した際に有効成分の作用を阻害せず、通常、胃腸障害、めまいなどのアレルギー反応を引き起こさない毒性をいう。本発明の医薬組成物は、投与経路に応じて、薬学的に許容される担体と共に、当技術分野で公知の方法により様々な方法で製剤化することができる。投与経路では、これに限定されず、経口又は非経口で投与することができる。非経口投与経路には、例えば、経皮、鼻腔、腹腔内、筋肉内、皮下、静脈内などの様々な経路が含まれる。
【0030】
本発明の医薬組成物を経口投与する場合、本発明の医薬組成物は、適切な経口投与用担体と共に当技術分野で公知方法に従って、粉末、顆粒、錠剤、丸剤、糖衣錠剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、懸濁液、ウエハース、注射剤、坐剤などを投与することができる。適切な担体の例には、ラクトース、グルコース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール及びマルチトールなどを含む糖類と、コーンスターチ、コムギデンプン、米デンプン及びジャガイモデンプンなどを含むデンプン類、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム及びヒドロキシプロピルメチルセルロース、低置換度ヒドロキシメチルセルロースなどを含むセルロース類、ゼラチン、ポリビニルピロリドンなどの充填剤が含まれる。また、必要に応じて、クロスポビドン、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、寒天、アルギン酸又はアルギン酸ナトリウムなどを崩壊剤として添加してもよい。さらに、前記医薬組成物は、流動促進剤、抗凝集剤、可塑剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤及び防腐剤などをさらに含むことができる。
【0031】
また、非経口的に投与する場合、本発明の医薬組成物は、適切な非経口担体と共に当技術分野で公知の方法に従って、注射剤、坐剤、経皮投与剤及び鼻腔吸入剤の形態で製剤化することができる。注射剤の場合に、必ず滅菌し、細菌や真菌などの微生物の汚染から保護する必要がある。注射剤の場合、適切な担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコールなど）、それらの混合物及び／又は植物油を含む溶媒又は分散媒質であってもよいが、それらに限定されない。より好ましくは、適切な担体には、ハンクス液、リンゲル液、トリエタノールアミンが含まれたリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）又は注射用滅菌水、１０％エタノール、４０％プロピレングリコール及び５％グルコースなどの等張液などを使用することができる。前記注射剤を微生物汚染から保護するためには、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどの様々な抗菌剤及び抗真菌剤をさらに含むことができる。また、殆どの場合、前記注射剤は、糖又は塩化ナトリウムなどの等張化剤をさらに含むことができる。
【0032】
これらの製剤は、薬化学において、一般に知られている文書である文献（Remington’s Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania）に記述されている。
【0033】
吸入による投与の場合、本発明に従って使用するための化合物は、適切な噴霧推進剤、例えば、ジクロロフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又は他の適切な気体を使用することにより、加圧パック又はネブライザーからエアロゾルスプレー形で便利に送達することができる。加圧エアロゾルの場合、投薬単位は、計量された量を送達するためのバルブを提供することによって決定することができる。例えば、吸入器又は吹送器で使用するためのカプセル及びカートリッジは、適切な粉末基剤の粉末混合物を含有するように製剤化することができる。
【0034】
その他の薬学的に許容される担体として、以下の文書に記載されているものを参照することができる（Remington’s Pharmaceutical Sciences, 19th Edition, 1995 Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania）。
【0035】
本発明の別の実施形態において、ピロナリジン（pyronaridine）又はその薬学的に許容される塩を、薬学的に許容される担体と共に製剤化した。
【0036】
前述したように、本発明で使用できる「薬学的に許容される担体」は、製薬分野で従来から使用されているものであればいずれでもよい。代表的な例としては、ラクトース、デキストリン、デンプン、アルファ化デンプン、微結晶セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、エチルセルロース、メチルセルロース、ポリエチレングリコール、二酸化ケイ素、ハイドロタルサイト、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、水酸化アルミニウム、ケイ酸アルミニウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、ベントナイト及びそれらの混合物などが挙げられる。本発明の医薬組成物は、担体に加えて、インビボで投与される場合に水性媒質と接触して急速に崩壊及び溶出するための崩壊剤、溶出や吸収を増加させるための可溶化剤又は界面活性剤、流動性や潤滑性を増加させる流動促進剤又は潤滑剤をさらに含むことができる。崩壊剤としては、クロスポビドン、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、寒天、アルギン酸又はアルギン酸ナトリウムなどが挙げられる。流動促進剤又は潤滑剤としては、コロイド状二酸化ケイ素、二酸化ケイ素、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリンフマル酸ナトリウム、ステアリン酸、二酸化ケイ素などが挙げられる。しかし、それらは列挙された例に限定されない。本発明の別の実施形態によれば、ピロナリジン又はその薬学的に許容される塩４０～８０重量％、微結晶セルロース１～３０重量％、二酸化ケイ素０．１～５重量％、ヒドロキシプロピルセルロース１～１０重量％、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース１～１０重量％、デンプングリコール酸ナトリウム２～２０重量％及びステアリン酸マグネシウム１～１０重量％を含む医薬組成物が提供される。
【0037】
本発明の別の実施形態において、アルテミシニン又はその誘導体を、薬学的に許容される担体と共に製剤化した。本発明の医薬組成物は、担体に加えて、インビボで投与された場合に水性媒質と接触して急速に崩壊及び溶出するための崩壊剤、溶出や吸収を増加させるための可溶化剤又は界面活性剤、及び流動性や潤滑性を増加させるための流動促進剤又は潤滑剤をさらに含むことができる。担体としては、微結晶セルロース、ラクトース水和物、マンニトール、デンプン、アルファ化デンプン、低置換度ヒドロキシセルロース、ヒドロキシセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどが挙げられる。崩壊剤としては、クロスポビドン、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、寒天、アルギン酸又はアルギン酸ナトリウムなどが挙げられる。流動促進剤又は潤滑剤としては、コロイド状二酸化ケイ素、二酸化ケイ素、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリンフマル酸ナトリウム、ステアリン酸、二酸化ケイ素などが挙げられる。界面活性剤の代表的な例は、ラウリル硫酸ナトリウム及びその誘導体、ポロキサーマ（poloxamer）及びその誘導体、飽和ポリグリコール化グリセリド（別名：ｇｅｌｕｃｉｒｅ）、ｌａｂｒａｓｏｌ、各種のポリソルベート（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（以下、Ｔｗｅｅｎ２０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート（以下、Ｔｗｅｅｎ４０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（以下、Ｔｗｅｅｎ６０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（以下、Ｔｗｅｅｎ８０）、ソルビタンエステル（例えば、ソルビタンモノラウレート（以下、Ｓｐａｎ２０）、ソルビタンモノパルミテート（以下、Ｓｐａｎ４０）、ソルビタンモノステアレート（以下、Ｓｐａｎ６０）、ソルビタンモノオレエート（以下、Ｓｐａｎ８０）、ソルビタントリラウレート（以下、Ｓｐａｎ２５）、ソルビタントリオレエート（以下、Ｓｐａｎ８５）、ソルビタントリステアレート（以下、Ｓｐａｎ６５）、クレモフォール（cremophor）、ＰＥＧ－６０水添ヒマシ油、ＰＥＧ－４０水添ヒマシ油、ラウリルグルタミン酸ナトリウム、コカンフォ二酢酸二ナトリウムなどが挙げられる。しかし、それらは列挙された例に限定されない。本発明の別の実施形態によれば、アルテミシニン又はその誘導体１０～５０重量％、微結晶セルロース３０～７０重量％、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース２～２０重量％、デンプングリコール酸ナトリウム２～２０重量％、二酸化ケイ素０．１～５重量％、ラウリル硫酸ナトリウム０．５～１５重量％及びステアリン酸マグネシウム０．１～５重量％を含む医薬組成物が提供される。
【0038】
本発明の別の実施形態において、ピロナリジン（pyronaridine）又はその薬学的に許容される塩及びアルテミシニン（artemisinin）又はその誘導体は、薬学的に許容される担体と共に製剤化した。本発明の医薬組成物は、担体に加えて、インビボで投与された場合に水溶媒質と接触して急速に崩壊及び溶出するための界面活性剤又は崩壊剤、流動性や潤滑性を増加させる流動促進剤又は潤滑剤をさらに含むことができる。担体としては、ラクトース、デキストリン、デンプン、アルファ化デンプン、微結晶セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、エチルセルロース、メチルセルロース、ポリエチレングリコール、二酸化ケイ素、ハイドロタルサイト、アルミニウムケイ酸マグネシウム、水酸化アルミニウム、ケイ酸アルミニウム、メタケイ酸マグネシウムアルミニウム、ベントナイト、ブチルヒドロキシトルエン及びそれらの混合物などが挙げられる。界面活性剤の代表としては、ラウリル硫酸ナトリウム及びその誘導体、ポロキサーマ及びその誘導体、飽和ポリグリコール化グリセリド（別名、ｇｅｌｕｃｉｒｅ）、ｌａｂｒａｓｏｌ、各種のポリソルベート（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（以下、Ｔｗｅｅｎ２０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート（以下、Ｔｗｅｅｎ４０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（以下、Ｔｗｅｅｎ６０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（以下、Ｔｗｅｅｎ８０）、ソルビタンエステル（例えば、ソルビタンモノラウレート（以下、Ｓｐａｎ２０）、ソルビタンモノパルミテート（以下、Ｓｐａｎ４０）、ソルビタンモノステアレート（以下、Ｓｐａｎ６０）、ソルビタンモノオレエート（以下、Ｓｐａｎ８０）、ソルビタントリラウレート（以下、Ｓｐａｎ２５）、ソルビタントリオレエート（以下、Ｓｐａｎ８５）、ソルビタントリステアレート（以下、Ｓｐａｎ６５）、クレモフォール（cremophor）、ＰＥＧ－６０水添ヒマシ油、ＰＥＧ－４０水添ヒマシ油、ラウリルグルタミン酸ナトリウム、コカンフォ二酢酸二ナトリウムなどが挙げられるが、それらに限定されない。崩壊剤としては、クロスポビドン、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、寒天、アルギン酸又はアルギン酸ナトリウムなどが挙げられる。流動促進剤又は潤滑剤としては、コロイド状二酸化ケイ素、二酸化ケイ素、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリンフマル酸ナトリウム、ステアリン酸、二酸化ケイ素などが挙げられる。しかし、それらはその列挙された例に限定されない。本発明の別の実施形態によれば、ピロナリジン又はその薬学的に許容される塩１５～６０重量％、アルテミシニン又はその誘導体５～２０重量％、微結晶セルロース５～３０重量％、クロスポビドン１０～４０重量％、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース２～１５重量％、ラウリル硫酸ナトリウム１～１０重量％、ポリエチレングリコール５～３０重量％、ヒドロキシプロピルセルロース０．１～５重量％、ブチルヒドロキシトルエン０．００１～１重量％、二酸化ケイ素０．１～５重量％及びステアリン酸マグネシウム０．５～１０重量％を含む医薬組成物が提供される。
【0039】
本発明の医薬組成物は、粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、乾燥シロップ剤、コーティング製剤、注射剤、坐剤、経皮投与剤及び吸入投与剤などに製剤化することができる。
本発明の別の実施形態において、本発明の医薬組成物は、伝染性ＲＮＡウイルス性感染疾患を予防及び治療するために抗ウイルス効果を有する一つ又はそれ以上の追加の薬物と組み合わせて投与することができる。
本発明の別の実施形態において、本発明の医薬組成物は、伝染性ＲＮＡウイルス性感染疾患を予防及び治療するために抗ウイルス効果を有する一つ又はそれ以上の追加の薬物と組み合わせて投与することができる。
【0040】
本発明の別の実施形態において、前記他の抗ウイルス剤としては、例えば、ウイルス複製阻害剤、ヘリカーゼ阻害剤、ウイルスプロテアーゼ阻害剤及びウイルス細胞進入阻害剤を含むが、それらに限定されない。本発明の別の実施形態において、前記他の抗ウイルス剤は、例えば、リバビリン（ribavirin）、インターフェロン（interferon）、ニクロサミド（niclosamide）又はそれらの組み合わせであってもよいが、それらに限定されない。
【0041】
本発明の別の実施形態において、前記伝染性ＲＮＡウイルス疾患は、例えば、ジカウイルス感染症、エボラウイルス感染症、新型インフルエンザウイルス感染症、コロナウイルス感染症によって引き起こされる呼吸器疾患を含むが、それらに限定されない。本発明の別の実施形態において、前記コロナウイルス感染症によって引き起こされる呼吸器疾患は、例えば、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）又はコロナウイルス感染症－１９（ＣＯＶＩＤ－１９）を含むが、それらに限定されない。本発明の別の実施形態において、前記コロナウイルス感染症によって引き起こされる呼吸器疾患は、コロナウイルス感染症－１９（ＣＯＶＩＤ－１９）である。
【0042】
本発明において、用語「予防」とは、本発明の医薬組成物を投与することにより、伝染性ＲＮＡウイルス感染症の発生、拡散及び再発を阻害又は遅延させる任意の行為を意味し、前記用語「治療」とは、本発明の医薬組成物を投与することにより、前記疾患の症状が改善又は有益に変化する任意の行為を意味する。
【0043】
また、本明細書で使用される場合、前記「治療有効量」という用語は、陰性対照よりも高い反応を示す量を指し、好ましくは伝染性ＲＮＡウイルス性感染疾患を治療又は予防するのに十分な量をいう。患者の治療用量は、一般に状態の重症度及び前記化合物内での単独、組み合わせ又は他の薬物と組み合わせて投与するかに応じて、５０ｍｇ～２，０００ｍｇ／日、好ましくは１００ｍｇ～１，０００ｍｇ／日である。経口又は非経口経路で、１日１回又は数回に分けて投与することができる。しかし、前記治療有効量は、疾患の種類及び重症度、患者の年齢、体重、健康状態、性別、投与経路、治療期間などの様々な要因によって適宜変更することができる。
【0044】
本発明は、ヒトにおける伝染性ＲＮＡウイルス性感染、好ましくはヒトにおけるコロナウイルス感染症によって引き起こされる呼吸器疾患、より好ましくはヒトにおけるロナウイルス感染症－１９を引き起こすウイルスの予防及び治療について記載するが、本発明は、感染性ＲＮＡウイルス、具体的には呼吸器疾患を誘発するコロナウイルス科（Coronaviridae）、より具体的にはコロナウイルス感染症－１９を誘発する動物及びヒト菌株治療に有用である。
【0045】
本発明の課題は、前述した技術的課題に限定されず、記載されていない他の技術的課題は、以下の説明から当業者によって明確に理解されるであろう。また、前記の説明は、特許請求された発明を決して限定するものではなく、さらに、議論された特徴の組み合わせは、本発明の解決方法に絶対的に必要というわけではない。
【発明の効果】
【0046】
本発明は、治療有効量のピロナリジン又はその薬学的に許容される塩、及び／又はアルテミシニン又はその誘導体を有効成分として含む伝染性ＲＮＡウイルス感染症の予防及び治療するための医薬組成物を提供する。本発明による医薬組成物は、伝染性ＲＮＡウイルス感染症、例えば、コロナ感染症－１９などのコロナウイルスによって引き起こされる呼吸器疾患を効果的に阻害することにより、予防及び治療に効果的に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【0047】
【図1】本発明の有効成分の一つのピロナリジンリン酸塩による前処理によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する感染阻害効果と細胞毒性を、感染後２４時間に測定し、その結果を濃度－反応曲線で示す図である。
【図2】ピロナリジンリン酸塩の同時処理によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する感染阻害効果と細胞毒性を、感染後２４時間に測定し、その結果を濃度－反応曲線で示す図である。
【図3】本発明の有効成分の一つのアルテスナートの同時処理によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する感染阻害効果を、感染後２４時間と４８時間に測定し、対照群であるクロロキンと比較した結果である。
【図4】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を細胞に感染させ、ピロナリジンリン酸塩とアルテスナートの様々な比率で組み合わせて処理した後、ウイルス感染阻害効果を比較し、最適比率で感染後２４時間と４８時間のウイルス阻害率を比較した結果である。
【図5】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２をヒトの肺細胞株であるＣａｌｕ－３細胞に感染させ、ピロナリジンリン酸塩又はアルテスナートを同時処理した後、ウイルス感染阻害効果と細胞毒性を感染後２４時間と４８時間に測定し、その結果を濃度－反応曲線で示し、対照群であるヒドロキシクロロキンと比較した結果である。
【図6】ヒト肺細胞株であるＣａｌｕ－３におけるピロナリジンリン酸塩又はアルテスナートのウイルス感染後、治療によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染阻害効果を薬物処理後４８時間に測定し、その結果を時間－反応曲線で示す図である。
【図7】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２をハムスターに感染させ、低用量又は高用量のピロナリジンリン酸塩とアルテスナートを３：１の比率で組み合わせて、感染後１時間から１日１回３日間経口投与するか、感染後２５時間に高用量のピロナリジンリン酸塩のみを投与した後、４日目に肺のウイルス力価を分析し、薬物を投与しなかったウイルス接種対照群と比較した結果である。
【発明を実施するための最良の形態】
【0048】
（実施例）
以下、実施例により本発明の構成及び効果をより詳細に説明する。ただし、これらの例は例示にすぎず、本発明の範囲はこれに限定されない。
以下、実施例により本発明の構成及び効果をより詳細に説明する。ただし、これらの例は例示にすぎず、本発明の範囲はこれに限定されない。
【0049】
実施例１：ピロナリジンリン酸塩単独錠剤の製造
ヒドロキシプロピルセルロースをエタノールに溶解して結合溶液を製造した。製造された結合溶液を用いてピロナリジンリン酸塩を湿式顆粒した後、得られた生成物を乾燥、造粒した。低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、デンプングリコール酸ナトリウム、微結晶セルロース、二酸化ケイ素を混合した。ステアリン酸マグネシウムを加えて、潤滑した後、打錠して錠剤を製造した。
ヒドロキシプロピルセルロースをエタノールに溶解して結合溶液を製造した。製造された結合溶液を用いてピロナリジンリン酸塩を湿式顆粒した後、得られた生成物を乾燥、造粒した。低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、デンプングリコール酸ナトリウム、微結晶セルロース、二酸化ケイ素を混合した。ステアリン酸マグネシウムを加えて、潤滑した後、打錠して錠剤を製造した。
【0050】
【表1】
【0051】
実施例２：アルテスナート単独錠剤の製造
二酸化ケイ素とラウリル硫酸ナトリウムを、ふるいを用いて篩過した。ふるいにかけた二酸化ケイ素とラウリル硫酸ナトリウムをアルテスナート、微結晶セルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、デンプングリコール酸ナトリウムと混合し、ステアリン酸マグネシウムを加えて、潤滑し、打錠して錠剤を製造した。フィルムコーティング基剤でコーティングした。
二酸化ケイ素とラウリル硫酸ナトリウムを、ふるいを用いて篩過した。ふるいにかけた二酸化ケイ素とラウリル硫酸ナトリウムをアルテスナート、微結晶セルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、デンプングリコール酸ナトリウムと混合し、ステアリン酸マグネシウムを加えて、潤滑し、打錠して錠剤を製造した。フィルムコーティング基剤でコーティングした。
【0052】
【表2】
【0053】
実施例３：ピロナリジンリン酸塩／アルテスナート配合錠の製造
溶融分散担体としてポリエチレングリコール、ブチルヒドロキシトルエン、有効成分としてアルテスナートを混合し、加熱溶融後、急冷し粉砕した。次に、微結晶セルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、クロスポビドン、ステアリン酸マグネシウムを混合し、混合物１を製造した。ヒドロキシプロピルセルロースをエタノールに溶解後、ピロナリジンリン酸塩を湿式顆粒し、乾燥し、造粒して混合物２を製造した。混合物１、混合物２、ラウリル硫酸ナトリウム、二酸化ケイ素、クロスポビドンと混合し、ステアリン酸マグネシウムを加えて、潤滑し、打錠して錠剤を製造した。フィルムコーティング基剤でコーティングした。
溶融分散担体としてポリエチレングリコール、ブチルヒドロキシトルエン、有効成分としてアルテスナートを混合し、加熱溶融後、急冷し粉砕した。次に、微結晶セルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、クロスポビドン、ステアリン酸マグネシウムを混合し、混合物１を製造した。ヒドロキシプロピルセルロースをエタノールに溶解後、ピロナリジンリン酸塩を湿式顆粒し、乾燥し、造粒して混合物２を製造した。混合物１、混合物２、ラウリル硫酸ナトリウム、二酸化ケイ素、クロスポビドンと混合し、ステアリン酸マグネシウムを加えて、潤滑し、打錠して錠剤を製造した。フィルムコーティング基剤でコーティングした。
【0054】
【表3】
【0055】
本発明のピロナリジン（pyronaridine）又はその塩、アルテミシニン（artemisinin）又はその誘導体がコロナウイルスに対する抗ウイルス活性を有するかどうかを調べるために、以下の実験例のように薬物を単独及び併用処理し、ウイルス感染に対する阻害率を評価した。
【0056】
実験例１：ピロナリジンリン酸塩の抗ウイルス効果測定（前処理）
実験例１では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス（韓国の分離株）を細胞に感染させる前に、ピロナリジンリン酸塩を１時間前処理し、ウイルス感染に対する阻害効果を評価した。
実験例１では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス（韓国の分離株）を細胞に感染させる前に、ピロナリジンリン酸塩を１時間前処理し、ウイルス感染に対する阻害効果を評価した。
【0057】
１）ウイルスと宿主細胞の準備
Ｖｅｒｏ細胞は、米国ＡＴＣＣから購入、３７℃、５％ＣＯ2の培養条件で、１０％熱不活性１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）と抗生剤を加えたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、韓国疾病管理本部（ＫＣＤＣ）から提供された。ウイルス増殖後、ウイルス増殖に利用した細胞にウイルスを感染させ、ウイルスプラークを測定するプラークアッセイによりウイルス力価を決定した。
Ｖｅｒｏ細胞は、米国ＡＴＣＣから購入、３７℃、５％ＣＯ2の培養条件で、１０％熱不活性１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）と抗生剤を加えたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、韓国疾病管理本部（ＫＣＤＣ）から提供された。ウイルス増殖後、ウイルス増殖に利用した細胞にウイルスを感染させ、ウイルスプラークを測定するプラークアッセイによりウイルス力価を決定した。
【0058】
２）免疫蛍光染色法を使用した抗ウイルス効果の測定
試験２４時間前に、μＣｌｅａｒプレートに１ウェル当たり１．２×１０4細胞の密度でＶｅｒｏ細胞を付着し、細胞を０．０５～５０μＭの濃度範囲で１０個の濃度で希釈し、希釈された薬物を含む培養液で１時間前処理し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を接種した（ウイルス接種力価約値Ｍ＝０．０１２５）。感染２４時間後、４％ホルムアルデヒドで細胞を固定し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのスタンパク質を標識する抗体を用いて感染した細胞を免疫蛍光染色法で分析した。感染率は、画像分析プログラムを介して陽性及び陰性対照群と比較して細胞総数と感染細胞数の割合として計算した。薬物の抗ウイルス効果は用量－反応－曲線で表され、Ｇｒａｐｈ Ｐｒｉｓｍ（ｍ（ｖ．８）解析プログラムを使用して、下記数式（１）に示すように５０％有効濃度（ＥＣ50、ウイルス感染による細胞毒性を５０％阻害する濃度）と５０％細胞毒性濃度（ＣＣ50、正常細胞の５０％の損傷を加える化合物の濃度）を計算した。
試験２４時間前に、μＣｌｅａｒプレートに１ウェル当たり１．２×１０4細胞の密度でＶｅｒｏ細胞を付着し、細胞を０．０５～５０μＭの濃度範囲で１０個の濃度で希釈し、希釈された薬物を含む培養液で１時間前処理し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を接種した（ウイルス接種力価約値Ｍ＝０．０１２５）。感染２４時間後、４％ホルムアルデヒドで細胞を固定し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのスタンパク質を標識する抗体を用いて感染した細胞を免疫蛍光染色法で分析した。感染率は、画像分析プログラムを介して陽性及び陰性対照群と比較して細胞総数と感染細胞数の割合として計算した。薬物の抗ウイルス効果は用量－反応－曲線で表され、Ｇｒａｐｈ Ｐｒｉｓｍ（ｍ（ｖ．８）解析プログラムを使用して、下記数式（１）に示すように５０％有効濃度（ＥＣ50、ウイルス感染による細胞毒性を５０％阻害する濃度）と５０％細胞毒性濃度（ＣＣ50、正常細胞の５０％の損傷を加える化合物の濃度）を計算した。
【数1】
【0059】
その結果、図１に示すように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染したＶｅｒｏ細胞の場合、ピロナリジン５０μＭ濃度で７０％のウイルス阻害率が観察されたが、薬物前処理によって細胞毒性もまた、１７％増加した。Ｖｅｒｏ細胞は、アフリカミドリザルの腎臓上皮細胞から分離された、１型ＩＦＮ欠乏細胞として知られている。以前の研究では、ピロナリジンのエボラウイルスに対するインビトロ抗ウイルス性効果測定するとき、Ｖｅｒｏ細胞株に接種させた場合には、ＣＣ50以下の濃度で抗ウイルス活性が観察されなかったが（ＣＣ50＝１．３μＭ）、ヒト由来のＨｅｌａ細胞に接種させた場合には、ＣＣ50がより高く、抗ウイルス活性は無毒性濃度（ＥＣ50＝０．４２－１．１２μＭ、ＣＣ50＝３．１μＭ）で示されることが報告されている。また、ピロナリジンは、エボラウイルスに接種したマウスモデルの死亡率とウイルス感染率を有意に阻害した（Lane et al., 2015）。このように抗ウイルス剤の効果は、実験宿主細胞の特性とその細胞内免疫シグナル伝達経路の違いに応じて、インビトロ又はインビボアッセイ系で異なる可能性があることが良く知られており（Lane et al., 2015）、ヒト由来宿主細胞ベースのアッセイがさらに確立され、様々な細胞株及び動物試験でピロナリジンの抗ウイルス効果を確認した。
【0060】
実験例２：ピロナリジンリン酸塩のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２阻害効果（同時処理）
実験例２では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（韓国の分離株）を細胞に接種時に、ピロナリジンリン酸塩を処理してウイルス感染を阻害する効果があるのか評価した。クロロキンは、エンドソームのｐＨを上昇させ、ウイルスと細胞の結合と、宿主細胞のＳＡＲＳ－ＣｏＶウイルス受容体の糖化を阻害することにより、抗ウイルス効果を示すことが知られている（Vincent et al., 2005）。クロロキンと構造が似ているピロナリジンも同様の機序で作用すると予想されることから、薬物とウイルスを同時に処理し、その抗ウイルス効果を測定した。実験例１で使用したいくつかの試験条件を最適化することにより、細胞毒性が比較的に低い試験条件で試験を行った。
実験例２では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（韓国の分離株）を細胞に接種時に、ピロナリジンリン酸塩を処理してウイルス感染を阻害する効果があるのか評価した。クロロキンは、エンドソームのｐＨを上昇させ、ウイルスと細胞の結合と、宿主細胞のＳＡＲＳ－ＣｏＶウイルス受容体の糖化を阻害することにより、抗ウイルス効果を示すことが知られている（Vincent et al., 2005）。クロロキンと構造が似ているピロナリジンも同様の機序で作用すると予想されることから、薬物とウイルスを同時に処理し、その抗ウイルス効果を測定した。実験例１で使用したいくつかの試験条件を最適化することにより、細胞毒性が比較的に低い試験条件で試験を行った。
【0061】
１）ウイルスと宿主細胞の準備
Ｖｅｒｏ細胞は、米国ＡＴＣＣから購入、３７℃、５％ＣＯ2の培養条件で、１０％熱不活性１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）と抗生剤を加えたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスは、韓国疾病管理本部（ＫＣＤＣ）から提供された。ウイルス増殖後、ＲＮＡコピー数を測定するｑＲＴ－ＰＣＲによってウイルス力価を決定した。
Ｖｅｒｏ細胞は、米国ＡＴＣＣから購入、３７℃、５％ＣＯ2の培養条件で、１０％熱不活性１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）と抗生剤を加えたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスは、韓国疾病管理本部（ＫＣＤＣ）から提供された。ウイルス増殖後、ＲＮＡコピー数を測定するｑＲＴ－ＰＣＲによってウイルス力価を決定した。
【0062】
２）ＲＮＡコピー数を使用した抗ウイルス効果の測定
ピロナリジンリン酸塩をＤＭＳＯに溶解した後、培地を使用して０．０３３－１００μＭ濃度に希釈した。試験２４時間前に、２×１０4細胞／ウェルの密度でＶｅｒｏ細胞株を付着させた９６－ウェルプレートにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を接種（ＭＯＩ＝０．１）し、様々な濃度で希釈された薬物を含有する培養液を各ウェルに加えた。感染２４時間後に、細胞上清を回収し、ＲＮＡを抽出し、ＲｄＲｐ遺伝子に対するｑＲＴ－ＰＣＲを行った。薬物の抗ウイルス効果は、薬物のＲＮＡウイルスのコピー数を対照群と比較することによって分析された。ＲＮＡコピー数から逆算したウイルス力価からウイルス感染阻害率（%cytotoxicity）を薬物用量－反応－曲線で示し、Ｇｒａｐｈ Ｐｒｉｓｍ（ｖｅｒ．８）解析プログラムを使用して、実験例１のように５０％有効濃度（ＥＣ50、ウイルス力価を５０％阻害する濃度）を計算した。
ピロナリジンリン酸塩をＤＭＳＯに溶解した後、培地を使用して０．０３３－１００μＭ濃度に希釈した。試験２４時間前に、２×１０4細胞／ウェルの密度でＶｅｒｏ細胞株を付着させた９６－ウェルプレートにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を接種（ＭＯＩ＝０．１）し、様々な濃度で希釈された薬物を含有する培養液を各ウェルに加えた。感染２４時間後に、細胞上清を回収し、ＲＮＡを抽出し、ＲｄＲｐ遺伝子に対するｑＲＴ－ＰＣＲを行った。薬物の抗ウイルス効果は、薬物のＲＮＡウイルスのコピー数を対照群と比較することによって分析された。ＲＮＡコピー数から逆算したウイルス力価からウイルス感染阻害率（%cytotoxicity）を薬物用量－反応－曲線で示し、Ｇｒａｐｈ Ｐｒｉｓｍ（ｖｅｒ．８）解析プログラムを使用して、実験例１のように５０％有効濃度（ＥＣ50、ウイルス力価を５０％阻害する濃度）を計算した。
【0063】
３）細胞毒性（%cytotoxicity）測定
細胞毒性は、テトラゾリウム塩（ＷＳＴ－１）ベースのアッセイを使用して測定した。ＷＳＴ－１は、生きている細胞内にのみ存在するミトコンドリア脱水素酵素によってホルマザンと呼ばれる発色物質に変換される。各ウェルに１０μＬのＷＳＴ－１プレミックスを加えた後、細胞をさらに１時間培養し、ホルマザンの生成量をＥＬＩＳＡで吸光度を測定、計算した。５０％細胞毒性濃度（ＣＣ50、正常細胞の５０％の損傷を加える化合物の濃度）を計算した。
細胞毒性は、テトラゾリウム塩（ＷＳＴ－１）ベースのアッセイを使用して測定した。ＷＳＴ－１は、生きている細胞内にのみ存在するミトコンドリア脱水素酵素によってホルマザンと呼ばれる発色物質に変換される。各ウェルに１０μＬのＷＳＴ－１プレミックスを加えた後、細胞をさらに１時間培養し、ホルマザンの生成量をＥＬＩＳＡで吸光度を測定、計算した。５０％細胞毒性濃度（ＣＣ50、正常細胞の５０％の損傷を加える化合物の濃度）を計算した。
【0064】
その結果、図２に示すように、同時処理条件でピロナリジンは濃度依存的に抗ウイルス効果を示し、一部の高濃度では細胞毒性が観察されたが、無毒性濃度でも９０％以上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗ウイルス活性を示した（ＥＣ50＝８．２７μＭ、ＣＣ50＝１１．５４μＭ；選択指数ＳＩ＞１．４０）。
【0065】
実験例３：アルテスナートのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２阻害効果（同時処理）
実験例３では、実験例２と同じ試験条件でアルテスナートの抗ウイルス効果を測定した。
実験例３では、実験例２と同じ試験条件でアルテスナートの抗ウイルス効果を測定した。
【0066】
１）ウイルスと宿主細胞の準備
Ｖｅｒｏ細胞株及びウイルスは、実験例２と同様に準備した。
Ｖｅｒｏ細胞株及びウイルスは、実験例２と同様に準備した。
【0067】
２）ＲＮＡコピー数を使用した抗ウイルス効果の測定
アルテスナートは、ＤＭＳＯに溶解し、培地を使用して３．１３、１２．５、５０μＭ濃度に希釈した。試験２４時間前に、２×１０4細胞／ウェルの密度でＶｅｒｏ細胞株を付着させた９６－ウェルプレートにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を接種（ＭＯＩ＝０．１）し、それぞれの濃度に希釈された薬物を含有する培養液を各ウェルに加えた。感染２４時間及び４８時間後、細胞上清を回収し、実験例２に示すように、ＲｄＲｐ遺伝子に対するｑＲＴ－ＰＣＲを行い、ウイルス力価を計算し、ウイルス感染阻害率（％inhibition）を算出した。対照群はクロロキンを用いた。
アルテスナートは、ＤＭＳＯに溶解し、培地を使用して３．１３、１２．５、５０μＭ濃度に希釈した。試験２４時間前に、２×１０4細胞／ウェルの密度でＶｅｒｏ細胞株を付着させた９６－ウェルプレートにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を接種（ＭＯＩ＝０．１）し、それぞれの濃度に希釈された薬物を含有する培養液を各ウェルに加えた。感染２４時間及び４８時間後、細胞上清を回収し、実験例２に示すように、ＲｄＲｐ遺伝子に対するｑＲＴ－ＰＣＲを行い、ウイルス力価を計算し、ウイルス感染阻害率（％inhibition）を算出した。対照群はクロロキンを用いた。
【0068】
３）細胞毒性（%cytotoxicity）測定
細胞毒性は、実験例２と同様に測定した。
その結果、図３に示すように、アルテスナートは、実験濃度内で濃度依存的に抗ウイルス活性を示し、５０μＭの濃度で８３％のウイルス阻害率を示した。１２．５μＭでは、阻害率は、感染２４時間後（２４ｈｉｐ）と４８時間後（４８ｈｐｉ）にそれぞれ４０％と５１％の阻害率を示しており、３．１３μＭでは処理後４８時間で３９％のウイルス感染阻害効果を示した。すべての試験条件で有意な細胞毒性を示さなかった。アルテスナートは、ピロナリジンと対照群としてクロロキンと比較して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するＥＣ50が低く、発症時間が遅く、抗ウイルス効果が長く持続して、ウイルス阻害率が時間経過とともにウイルス阻害率がゆっくりと増加するパターンを示した。
細胞毒性は、実験例２と同様に測定した。
その結果、図３に示すように、アルテスナートは、実験濃度内で濃度依存的に抗ウイルス活性を示し、５０μＭの濃度で８３％のウイルス阻害率を示した。１２．５μＭでは、阻害率は、感染２４時間後（２４ｈｉｐ）と４８時間後（４８ｈｐｉ）にそれぞれ４０％と５１％の阻害率を示しており、３．１３μＭでは処理後４８時間で３９％のウイルス感染阻害効果を示した。すべての試験条件で有意な細胞毒性を示さなかった。アルテスナートは、ピロナリジンと対照群としてクロロキンと比較して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するＥＣ50が低く、発症時間が遅く、抗ウイルス効果が長く持続して、ウイルス阻害率が時間経過とともにウイルス阻害率がゆっくりと増加するパターンを示した。
【0069】
実験例４：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するピロナリジンリン酸塩とアルテスナート組み合わせの阻害効果
エボラウイルスを感染させたモルモットモデルで抗ウイルス効果を示さなかったクロロキンとは異なり、ピロナリジンは、エボラウイルスを接種したマウス動物モデルのウイルス力価と生存率を大幅に改善した。そのため、クロロキンはさらに異なる作用機序がある可能性があると推定されており、その中で、１型ＩＦＮ－１経路などの免疫調節機序が提示されたことがある（Lane et al., 2019）。アルテスナートはまた、インビトロ試験でエボラウイルスに対するピロナリジンよりも弱い抗ウイルス効果を示しており）、クロロキン誘導体であるアモジアキン（amodiaquine）と併用した患者でエボラウイルスに関連する死亡率が３１％減少されたと報告されたことがある（Gignox et al., 2016）。したがって、実験例４では、２つの薬物の併用処理と組み合わせ比率による抗ウイルス効果の変化を測定した。
エボラウイルスを感染させたモルモットモデルで抗ウイルス効果を示さなかったクロロキンとは異なり、ピロナリジンは、エボラウイルスを接種したマウス動物モデルのウイルス力価と生存率を大幅に改善した。そのため、クロロキンはさらに異なる作用機序がある可能性があると推定されており、その中で、１型ＩＦＮ－１経路などの免疫調節機序が提示されたことがある（Lane et al., 2019）。アルテスナートはまた、インビトロ試験でエボラウイルスに対するピロナリジンよりも弱い抗ウイルス効果を示しており）、クロロキン誘導体であるアモジアキン（amodiaquine）と併用した患者でエボラウイルスに関連する死亡率が３１％減少されたと報告されたことがある（Gignox et al., 2016）。したがって、実験例４では、２つの薬物の併用処理と組み合わせ比率による抗ウイルス効果の変化を測定した。
【0070】
１）ウイルスと宿主細胞の準備
Ｖｅｒｏ細胞株とウイルスは、実験例２と同様に準備した。
Ｖｅｒｏ細胞株とウイルスは、実験例２と同様に準備した。
【0071】
２）ＲＮＡコピー数を使用した抗ウイルス効果の測定
ピロナリジンリン酸塩とアルテスナートをＤＭＳＯに溶解し、１：１、３：１、１０：１などの様々な組み合わせ比率で培地を使用し、様々な濃度に希釈した。試験の２４時間前に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を、２×１０4細胞／ウェル（ＭＯＩ＝０．１）の密度で９６－ウェルプレートに接種したＶｅｒｏ細胞に付着させ、それぞれの濃度に希釈された薬物を含有する培養液を各ウェルに加えた。感染２４時間後、細胞上清を回収し、実験例２に示すように、ＲｄＲｐ遺伝子に対してｑＲＴ－ＰＣＲを行、ウイルス力価を計算し、ウイルス感染阻害率を算出した。ピロナリジンリン酸塩１０μＭとアルテスナート３．３μＭを組み合わせて処理した場合、それぞれ感染後２４時間と４８時間でウイルス力価を測定し、対照群であるクロロキン及びロピナビルと比較した。
ピロナリジンリン酸塩とアルテスナートをＤＭＳＯに溶解し、１：１、３：１、１０：１などの様々な組み合わせ比率で培地を使用し、様々な濃度に希釈した。試験の２４時間前に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を、２×１０4細胞／ウェル（ＭＯＩ＝０．１）の密度で９６－ウェルプレートに接種したＶｅｒｏ細胞に付着させ、それぞれの濃度に希釈された薬物を含有する培養液を各ウェルに加えた。感染２４時間後、細胞上清を回収し、実験例２に示すように、ＲｄＲｐ遺伝子に対してｑＲＴ－ＰＣＲを行、ウイルス力価を計算し、ウイルス感染阻害率を算出した。ピロナリジンリン酸塩１０μＭとアルテスナート３．３μＭを組み合わせて処理した場合、それぞれ感染後２４時間と４８時間でウイルス力価を測定し、対照群であるクロロキン及びロピナビルと比較した。
【0072】
３）細胞毒性（%cytotoxicity）測定
細胞毒性は、実験例２と同様に測定した。
その結果、図４に示すように、アルテスナート単独処理よりも併用処理した場合、また、併用されるピロナリジンの比率が高いほど抗ウイルス効果が増加した。特に、ピロナリジンリン酸塩１０μＭとアルテスナート３．３μＭの併用処理時（比率３：１）、９０～１００％の抗ウイルス感染率阻害効果を示し、対照群として用いたクロロキンやロピナビルよりも高い抗ウイルス効果を示した。この場合、４８時間まで抗ウイルス阻害率が維持された。図４に示すべての組み合わせ条件で有意な細胞毒性が認められず、ピロナリジンリン酸塩１０μＭとアルテスナート３．３μＭを併用処理した場合、ピロナリジンリン酸塩１０μＭ単独処理に比べて、低い細胞毒性が認められた（４９．５％減少）。
細胞毒性は、実験例２と同様に測定した。
その結果、図４に示すように、アルテスナート単独処理よりも併用処理した場合、また、併用されるピロナリジンの比率が高いほど抗ウイルス効果が増加した。特に、ピロナリジンリン酸塩１０μＭとアルテスナート３．３μＭの併用処理時（比率３：１）、９０～１００％の抗ウイルス感染率阻害効果を示し、対照群として用いたクロロキンやロピナビルよりも高い抗ウイルス効果を示した。この場合、４８時間まで抗ウイルス阻害率が維持された。図４に示すべての組み合わせ条件で有意な細胞毒性が認められず、ピロナリジンリン酸塩１０μＭとアルテスナート３．３μＭを併用処理した場合、ピロナリジンリン酸塩１０μＭ単独処理に比べて、低い細胞毒性が認められた（４９．５％減少）。
【0073】
実験例５：ヒト肺細胞株におけるピロナリジンリン酸塩とアルテスナートのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２阻害効果（同時処理）
抗ウイルス作用は、受容体構造など、ヒトと他の動物の抗ウイルス作用に種差がある可能性が報告されている。したがって、ヒトの肺細胞株での有効性を確認するために、実験例５では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（韓国の分離株）をヒトの肺細胞株であるＣａｌｕ－３細胞に接種する際に、ピロナリジンリン酸塩又はアルテスナートを処理し、ウイルス感染を阻害する効果があるかどうかを評価した。ウイルス感染に対するピロナリジンリン酸塩又はアルテスネートの阻害効果は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ (韓国の分離株) 感染時に細胞を同時処理した場合のヒト肺細胞株、Ｃａｌｕ－３ 細胞で評価された。
抗ウイルス作用は、受容体構造など、ヒトと他の動物の抗ウイルス作用に種差がある可能性が報告されている。したがって、ヒトの肺細胞株での有効性を確認するために、実験例５では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（韓国の分離株）をヒトの肺細胞株であるＣａｌｕ－３細胞に接種する際に、ピロナリジンリン酸塩又はアルテスナートを処理し、ウイルス感染を阻害する効果があるかどうかを評価した。ウイルス感染に対するピロナリジンリン酸塩又はアルテスネートの阻害効果は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ (韓国の分離株) 感染時に細胞を同時処理した場合のヒト肺細胞株、Ｃａｌｕ－３ 細胞で評価された。
【0074】
１）ウイルスと宿主細胞の準備
Ｃａｌｕ－３細胞は、３７℃、５％ＣＯ2培養条件で１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）と抗生剤を含有するダルベッコ変法イーグル培地 (ＤＭＥＭ)を使用して培養した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、韓国疾病管理本部（ＫＣＤＣ）から提供された。
Ｃａｌｕ－３細胞は、３７℃、５％ＣＯ2培養条件で１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）と抗生剤を含有するダルベッコ変法イーグル培地 (ＤＭＥＭ)を使用して培養した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、韓国疾病管理本部（ＫＣＤＣ）から提供された。
【0075】
２）ＲＮＡコピー数を使用した抗ウイルス効果の測定
ピロナリジンリン酸塩は、ＤＭＳＯに溶解し、培地を使用して０．０３３～１００μＭ濃度で希釈した。試験の２４時間前に、２×１０4細胞／ウェルの密度でＣａｌｕ－３細胞を付着させた９６－ウェルプレートにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を接種（ＭＯＩ＝０．１）し、様々な濃度で希釈された薬物を含有する培養液を各ウェルに添加した。感染２４時間及び４８時間後、実験例２に示すように、ＲｄＲｐ遺伝子に対するｑＲＴ－ＰＣＲを行い、ＲＮＡコピー数をウイルス力価から逆算して、ウイルス感染阻害率（%inhibition）を薬物用量－反応－曲線で示し、５０％有効濃度（ＩＣ50、ウイルス力価を５０％阻害する濃度）を計算した。
ピロナリジンリン酸塩は、ＤＭＳＯに溶解し、培地を使用して０．０３３～１００μＭ濃度で希釈した。試験の２４時間前に、２×１０4細胞／ウェルの密度でＣａｌｕ－３細胞を付着させた９６－ウェルプレートにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を接種（ＭＯＩ＝０．１）し、様々な濃度で希釈された薬物を含有する培養液を各ウェルに添加した。感染２４時間及び４８時間後、実験例２に示すように、ＲｄＲｐ遺伝子に対するｑＲＴ－ＰＣＲを行い、ＲＮＡコピー数をウイルス力価から逆算して、ウイルス感染阻害率（%inhibition）を薬物用量－反応－曲線で示し、５０％有効濃度（ＩＣ50、ウイルス力価を５０％阻害する濃度）を計算した。
【0076】
３）細胞毒性（%cytotoxicity）測定
細胞毒性は、実験例２と同様に測定した。
その結果、図５に示すように、同時処理条件でピロナリジンとアルテスナートの両方が、ヒトの肺細胞株でも濃度依存的に抗ウイルス効果を示した。さらに、感染後２４時間（２４ｈｐｉ）及び４８時間（４８ｈｐｉ）の両方で、非毒性濃度でも９０％以上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する抗ウイルス活性を示した（ピロナリジンの４８時間ＩＣ50＝８．５８μＭ、ＣＣ50＞１００μＭ；選択指数、ＳＩ＞１１．６６；アルテスナートの４８時間ＩＣ50＝０．４５μＭ、ＣＣ50＞１００μＭ；選択指数、ＳＩ＞２２０．８）。特に、アルテスナートの場合、サルの腎臓細胞株であるＶｅｒｏ細胞と比較して、ヒトの肺細胞株で効果が有意に増加した。これらとは対照的に、ヒドロキシクロロキンは、ヒトの肺細胞株では５０μＭ以下で抗ウイルス効果を示さなかったのに対し、サル細胞株で抗ウイルス効果を示した。
細胞毒性は、実験例２と同様に測定した。
その結果、図５に示すように、同時処理条件でピロナリジンとアルテスナートの両方が、ヒトの肺細胞株でも濃度依存的に抗ウイルス効果を示した。さらに、感染後２４時間（２４ｈｐｉ）及び４８時間（４８ｈｐｉ）の両方で、非毒性濃度でも９０％以上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する抗ウイルス活性を示した（ピロナリジンの４８時間ＩＣ50＝８．５８μＭ、ＣＣ50＞１００μＭ；選択指数、ＳＩ＞１１．６６；アルテスナートの４８時間ＩＣ50＝０．４５μＭ、ＣＣ50＞１００μＭ；選択指数、ＳＩ＞２２０．８）。特に、アルテスナートの場合、サルの腎臓細胞株であるＶｅｒｏ細胞と比較して、ヒトの肺細胞株で効果が有意に増加した。これらとは対照的に、ヒドロキシクロロキンは、ヒトの肺細胞株では５０μＭ以下で抗ウイルス効果を示さなかったのに対し、サル細胞株で抗ウイルス効果を示した。
【0077】
実験例６：ピロナリジンリン酸塩とアルテスナートのヒト肺細胞株における感染後処理のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２阻害効果
実験例６では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（韓国の分離株）の接種後、０、２、４、６、８、１０、１２、２４及び３６時間後にピロナリジンリン酸塩又はアルテスナートをそれぞれＣａｌｕ－３細胞に処理し、ウイルス感染に対して各薬物の阻害効果がどのくらいの時間保持されるか評価した。
実験例６では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（韓国の分離株）の接種後、０、２、４、６、８、１０、１２、２４及び３６時間後にピロナリジンリン酸塩又はアルテスナートをそれぞれＣａｌｕ－３細胞に処理し、ウイルス感染に対して各薬物の阻害効果がどのくらいの時間保持されるか評価した。
【0078】
１）ウイルスと宿主細胞の準備
Ｃａｌｕ－３細胞株とウイルスは、実験例５と同様に準備した。
Ｃａｌｕ－３細胞株とウイルスは、実験例５と同様に準備した。
【0079】
２）ウイルスプラークアッセイ（plaque assay）を用いた抗ウイルス効果の測定
ピロナリジンリン酸塩とアルテスナートをそれぞれＤＭＳＯに溶解後、培地を使用して１２．５μＭに希釈した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＭＯＩ＝０．１）の接種から１時間後に上清を除去し、Ｃａｌｕ－３細胞を洗浄した後、２％ウシ血清を含有したＤＭＥＭ培地を添加した。薬物を含む培地は、それぞれ０、２、４、６、８、１０、１２、２４及び３６時間で添加した。感染４８時間後に細胞上清を回収し、ウイルス増殖に使用したＶｅｒｏ細胞にウイルスを感染させて生成されたプラークを計数するプラークアッセイを行った。感染したＶｅｒｏ細胞株の上に２％アガロースを含むＤＭＥＭ－Ｆ１２培地層を置き、７２時間培養後、クリスタルバイオレットで対比染色してプラーク数を計数した。薬物の抗ウイルス効果は、形成されたプラーク数から逆算したウイルス力価からウイルス感染阻害率（%inhibition）で解析し、対照群と比較した。
ピロナリジンリン酸塩とアルテスナートをそれぞれＤＭＳＯに溶解後、培地を使用して１２．５μＭに希釈した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＭＯＩ＝０．１）の接種から１時間後に上清を除去し、Ｃａｌｕ－３細胞を洗浄した後、２％ウシ血清を含有したＤＭＥＭ培地を添加した。薬物を含む培地は、それぞれ０、２、４、６、８、１０、１２、２４及び３６時間で添加した。感染４８時間後に細胞上清を回収し、ウイルス増殖に使用したＶｅｒｏ細胞にウイルスを感染させて生成されたプラークを計数するプラークアッセイを行った。感染したＶｅｒｏ細胞株の上に２％アガロースを含むＤＭＥＭ－Ｆ１２培地層を置き、７２時間培養後、クリスタルバイオレットで対比染色してプラーク数を計数した。薬物の抗ウイルス効果は、形成されたプラーク数から逆算したウイルス力価からウイルス感染阻害率（%inhibition）で解析し、対照群と比較した。
【0080】
その結果、図６に示すように、ピロナリジン１２．５μＭ処理した場合に最大の抗ウイルス効果が示された（感染後６時間まで添加した場合は＞９９％の阻害、感染後１２時間までに添加した場合は＞９４％の阻害、感染後２４時間まで添加した場合は９０％の阻害）。一方、アルテスナート１２．５μＭ処理は、感染後６時間までに添加すると９２～９６％の阻害を示し、感染後１２時間までに添加すると＞９０％を超える阻害を示し、感染後２４時間までに添加すると４８％の阻害が示された。
【0081】
実験例７：コロナ１９動物モデルにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するピロナリジンリン酸塩とアルテスナートの組み合わせの阻害効果
実験例７では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（韓国の分離株）を接種したハムスターにピロナリジンリン酸塩とアルテスナート（３：１の比率で組み合わせたもの）を経口投与し、動物おけるインビボ抗ウイルス効果を評価した。
実験例７では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（韓国の分離株）を接種したハムスターにピロナリジンリン酸塩とアルテスナート（３：１の比率で組み合わせたもの）を経口投与し、動物おけるインビボ抗ウイルス効果を評価した。
【0082】
１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２接種のためのウイルスとハムスターの準備
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、韓国疾病管理本部（ＫＣＤＣ）から適用された。実験動物モデルとして、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する感受性が高く、供給制限の少ないゴールデンハムスターを使用し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（１×１０6ＰＦＵ／１００μＬ）をハムスターの両鼻腔に５０μＬずつ接種した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、韓国疾病管理本部（ＫＣＤＣ）から適用された。実験動物モデルとして、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する感受性が高く、供給制限の少ないゴールデンハムスターを使用し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（１×１０6ＰＦＵ／１００μＬ）をハムスターの両鼻腔に５０μＬずつ接種した。
【0083】
２）プラークアッセイを使用したインビボ抗ウイルス効果の測定
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の鼻腔接種の１時間後に、ピロナリジンリン酸塩（１８０ｍｇ／ｋｇ又は３６０ｍｇ／ｋｇ）とアルテスナート（６０ｍｇ／ｋｇ又は１２０ｍｇ／ｋｇ）を３：１の比率で組み合わせて１日１回３日間経口投与し、２つの薬物の併用投与時、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するインビボ抗ウイルス効果を評価した。比較試験群として、ピロナリジン３６０ｍｇ／ｋｇのみを感染後２５時間に１回経口投与し、ピロナリジンのみの感染後の有効時間を評価した。ピロナリジンリン酸塩、アルテスナートともに使用直前に調製し、５％重炭酸ナトリウムに完全溶解して経口投与した。対照群として、ウイルスを接種しない正常対照群（Ｍｏｃｋ）と溶媒のみを同時投与したビヒクル対照群を使用した。ウイルス接種後４日目に、肺の左葉及び右葉の両方を切除してウイルスを抽出し、肺組織のウイルス力価を実験例６に記載のプラークアッセイで分析した。プラークアッセイによって定量化された肺のウイルス力価は、肺組織の総体重さ（ｇ）対して正規化され、ログ値に換算されて、最終的な力価を算定して比較した（Ｌｏｇ10プラーク形成単位／ｇ、Ｌｏｇ10ＰＦＵ／ｇ）。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の鼻腔接種の１時間後に、ピロナリジンリン酸塩（１８０ｍｇ／ｋｇ又は３６０ｍｇ／ｋｇ）とアルテスナート（６０ｍｇ／ｋｇ又は１２０ｍｇ／ｋｇ）を３：１の比率で組み合わせて１日１回３日間経口投与し、２つの薬物の併用投与時、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するインビボ抗ウイルス効果を評価した。比較試験群として、ピロナリジン３６０ｍｇ／ｋｇのみを感染後２５時間に１回経口投与し、ピロナリジンのみの感染後の有効時間を評価した。ピロナリジンリン酸塩、アルテスナートともに使用直前に調製し、５％重炭酸ナトリウムに完全溶解して経口投与した。対照群として、ウイルスを接種しない正常対照群（Ｍｏｃｋ）と溶媒のみを同時投与したビヒクル対照群を使用した。ウイルス接種後４日目に、肺の左葉及び右葉の両方を切除してウイルスを抽出し、肺組織のウイルス力価を実験例６に記載のプラークアッセイで分析した。プラークアッセイによって定量化された肺のウイルス力価は、肺組織の総体重さ（ｇ）対して正規化され、ログ値に換算されて、最終的な力価を算定して比較した（Ｌｏｇ10プラーク形成単位／ｇ、Ｌｏｇ10ＰＦＵ／ｇ）。
【0084】
その結果、図７に示すように、感染後４日目に、ピロナリジンリン酸塩（Ｐ）－アルテスナート（Ａ）１８０／６０及び３６０／１２０ｍｇ／ｋｇ併用投与群の両方で肺組織内感染性ウイルスの力価が統計的に有意に減少された［Ｌｏｇ10ＰＦＵの中央値（median）：ウイルス接種群８．３０対比併用投与群ＰＡ１８０／６０ｍｇ／ｋｇ７．２２（ｐ＜０．００１）；ＰＡ３６０／１２０ｍｇ／ｋｇ投与群７．６１（ｐ＝０．０４６）］。一方、ピロナリジンリン酸塩を単独経で口投与した場合、高容量３６０ｍｇ／ｋｇの投与時、肺組織における感染性ウイルス力価の有意な減少が観察され、感染後２５時間に１回投与した場合でも、有意な阻害効果が観察された［ウイルス接種群Ｌｏｇ10ＰＦＵの中央値８．３０対単独高容量２５ｈｐｉ投与群７．２２（ｐ＜０．００１）]。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【国際調査報告】