▶ セントアンドルーズ ファーマシューティカル テクノロジー リミテッドの特許一覧
特表2023-519317トランスフェクション効率及び／又はタンパク質発現の向上のための装置並びにその使用方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-05-10
(54)【発明の名称】トランスフェクション効率及び／又はタンパク質発現の向上のための装置並びにその使用方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/88 20060101AFI20230428BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20230428BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20230428BHJP
C12N 15/85 20060101ALI20230428BHJP
C12N 15/87 20060101ALI20230428BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230428BHJP
C12M 1/42 20060101ALI20230428BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20230428BHJP
【ＦＩ】
C12N15/88 Z
C12N15/11 Z
C12N15/113 Z
C12N15/85 Z
C12N15/87 Z
C12N5/10
C12M1/42
C12Q1/02
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022558185
(86)(22)【出願日】2021-03-25
(85)【翻訳文提出日】2022-11-14
(86)【国際出願番号】 GB2021050737
(87)【国際公開番号】W WO2021191624
(87)【国際公開日】2021-09-30
(31)【優先権主張番号】2004412.9
(32)【優先日】2020-03-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(31)【優先権主張番号】2004411.1
(32)【優先日】2020-03-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(31)【優先権主張番号】2009297.9
(32)【優先日】2020-06-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(31)【優先権主張番号】2009296.1
(32)【優先日】2020-06-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＢＬＵＥＴＯＯＴＨ
２．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】522376380
【氏名又は名称】セントアンドルーズ ファーマシューティカル テクノロジー リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110000626
【氏名又は名称】弁理士法人英知国際特許商標事務所
(72)【発明者】
【氏名】ヘンリー、ウィリアム ジェイ
(72)【発明者】
【氏名】モンタリ、アンナ
(72)【発明者】
【氏名】ボードン、ジーン－クリストフ
【テーマコード（参考）】
4B029
4B063
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B029AA07
4B029AA27
4B029BB11
4B029FA12
4B029FA15
4B063QA01
4B063QA18
4B063QQ02
4B063QQ08
4B063QQ36
4B063QS39
4B063QX04
4B065AA91X
4B065AA93X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BA05
4B065CA24
4B065CA44
(57)【要約】
真核細胞におけるトランスフェクション効率を向上させるための方法及び装置が提供される。この方法は、トランスフェクションに好適な少なくとも１つの両親媒性構造体と会合した試薬を含むトランスフェクション混合物を提供するステップを含む。トランスフェクション複合体を形成するために１つ以上の真核細胞にトランスフェクション混合物を加え、１つ以上のトランスフェクトされた細胞を形成するためにトランスフェクション複合体がトランスフェクションプロセスを受けることを許容するステップ。この方法はまた、所与の周波数、所与のパルス率、所与の出力のいずれか又はいずれかの組み合わせで供給されたパルス化電磁信号を、トランスフェクション複合体を生み出す前にステップａ）でトランスフェクション混合物に、ステップｂ）においてトランスフェクション複合体に、ステップｃ）においてトランスフェクション複合体に、及び／又はステップｃ）の後にトランスフェクトされた細胞の複合体に、指向させるステップも含む。
【選択図】図３
【選択図】図３
【特許請求の範囲】
【請求項1】
真核細胞におけるトランスフェクション効率を向上させる方法であって、該方法は、ｄ）トランスフェクションに好適な少なくとも１つの両親媒性構造体と会合した試薬を含むトランスフェクション混合物を提供するステップと；
ｅ）トランスフェクション複合体を形成するために、前記トランスフェクション混合物を１つ以上の真核細胞に導入するステップと；
ｆ）１つ以上のトランスフェクトされた細胞を形成するために、前記トランスフェクション複合体がトランスフェクションプロセスを受けることを許容するステップと
を含み、
前記方法は、所与の周波数、所与のパルス率、又は所与の出力のいずれか又はいずれかの組み合わせで、で供給されたパルス化電磁信号を、前記トランスフェクション複合体を生み出す前に前記ステップａ）で前記トランスフェクション混合物に、前記ステップｂ）において前記トランスフェクション複合体に、前記ステップｃ）において前記トランスフェクション複合体に、及び／又は前記ステップｃ）の後にトランスフェクトされた細胞の複合体に、指向させるステップを含むことを特徴とする、方法。
【請求項2】
前記真核細胞は、溶液中に懸濁されている、及び／又は基質に付着している、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記真核細胞は不死細胞であるか、又は前記細胞は、ヒト及び／又は動物対象の組織から得られたものである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記真核細胞は、ヒト及び／又は動物対象から得られたものであり、Ｔ細胞、リンパ球、顆粒球及び／又はマクロファージを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記トランスフェクション混合物中の前記試薬は、トランスフェクションに好適ないずれかの試薬、及び／又は核酸、医薬品用及び／又は治療用試薬又は化合物、治療的及び／又は医薬品的利益のある試薬、５キロダルトン未満の小分子又は小分子材料、約５キロダルトン以上の大型分子又は大型分子材料、１つ以上のタンパク質、ワクチン、有機剤、又は１つ以上の抗体のいずれか又はいずれかの組み合わせである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記少なくとも１つの両親媒性構造体と会合した前記試薬は、前記両親媒性構造体の中に納められているか、前記試薬は前記両親媒性構造体と複合体を形成しているか、前記試薬は前記両親媒性構造体上に納められているか、又は前記試薬は前記両親媒性構造体に結合している、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記トランスフェクション混合物を形成するために、前記試薬を前記両親媒性構造体と混合するステップを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記両親媒性構造体は、少なくとも１つのリポソーム物質又は媒介体、少なくとも１つのペグ化されたリポソーム物質又は媒介体、ミセル、リン脂質二重層を有する構造体、カチオン重合体、又はポリエチレンイミン（ＰＥＩ）のいずれか又はいずれかの組み合わせを含み得るか、又はそれからなり得る、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記試薬が核酸であるとき、前記核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ＤＮＡとＲＮＡとの組み合わせ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡである、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記試薬は、１つ以上の発現ベクターであるか、又は前記１つ以上の発現ベクターを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記試薬が核酸であるとき、前記トランスフェクションプロセスの結果、一過的発現が得られるか、又は前記試薬が前記核酸である方法であって、該方法は、前記トランスフェクションプロセス後に前記真核細胞の１つ以上を分離するステップと、前記試薬によってコードされる１つ以上のペプチドが１つ以上の分離した真核細胞又はその子孫において発現するレベルを試験するステップと、及び前記発現レベルに基づき前記１つ以上の分離した真核細胞又は子孫を選択するステップとを更に含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
パルス化電磁信号を指向させる前記ステップは、所与の期間にわたって行われる、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記パルス化電磁信号が前記トランスフェクション試薬に指向されるとき、前記所与の期間は約１５分であり；及び／又は前記パルス化電磁信号がトランスフェクションの最中又は前記トランスフェクション後に前記トランスフェクション混合物に指向されるとき、約１～４時間である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記パルス化電磁信号は、１つ以上の電子機器によって生成され、前記１つ以上の電子機器は、使用時に前記パルス化電磁信号を生成し及び／又はそこから伝送する伝送手段又は１個以上の電子伝送チップを含み；各電子機器は単一の伝送手段又は電子チップを含むか、又は各電子機器は複数の伝送手段又は電子チップを含み、任意選択で前記電子機器は複数の伝送手段又は電子伝送チップを含み、前記伝送手段又は電子伝送チップの各々は、互いにある空間距離を離して配設され、ここで前記離される距離は、前記パルス化電磁信号の波長のほぼ半分に等しく；又は前記電子機器は、前記機器の筐体の表面、又は使用時に前記電子機器の上に配置されることになる１つ以上の物品の表面の１０５～１１５ｃｍ2当たり少なくとも１個の伝送手段又は電子伝送チップを含むか、又は前記電子機器は６個の伝送手段又は電子伝送チップを含み、及び前記チップは、使用時にプレートが前記電子機器に、その上に接して、又はそれを基準にして位置するとき、１個の伝送手段又は電子伝送チップが前記２４ウェルプレートの４つのウェルに指向するように、前記機器に互いにある空間距離を離して配設される、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記伝送手段と使用時に前記パルス化電磁信号を受信する１つ以上の物品との間の距離は、約２５ｃｍ以下、約２０ｃｍ以下、約１５ｃｍ以下、約１０ｃｍ以下、約５ｃｍ以下、又は約１ｃｍに等しいか又はそれ未満である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記パルス化電磁信号の前記所与の周波数は約２．４ＧＨｚ±５０ＭＨｚの間であり、約２．２～２．６ＧＨｚの間であり、約２．４ＧＨｚ±５０ＭＨｚであり、又は約２．４５ＧＨｚ±５０ＭＨｚであり、前記パルス化電磁信号の前記所与のパルス率は約５０Ｈｚ以下、約２５Ｈｚ以下、約１５Ｈｚ以下であり、及び／又は２％未満のデューティサイクルを有し、及び／又は前記パルス化電磁信号の各パルスは約１ｍｓ～２０ｍｓの間にわたって持続し、又は約１ｍｓであり、任意選択で前記パルス化電磁信号の各パルス間の休止期間は約６６ｍｓ以下持続し、及び／又は各伝送手段又は電子伝送チップによって供給された前記所与の出力は約＋２ｄＢｍ～＋４ｄＢｍ、約１ｍＷ、約２ｍＷ又は約２．５１１９ｍＷであり；及び／又は前記パルス化電磁信号は、０．４５～０．５５の間のガウス型周波数偏移変調（ＧＦＳＫ）を用いて伝送される、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記パルス化電磁信号の前記所与の周波数は２．４ＧＨｚ±５０ＭＨｚ又は２．４５ＧＨｚ±５０ＭＨｚであり、前記所与のパルス率は１５Ｈｚ以下であり、及び／又は２％未満のデューティサイクルを有し、及び前記所与の出力は＋２ｄＢｍ～＋４ｄＢｍ、約１ｍＷ、約２ｍＷ又は約２．５１１９ｍＷであり、及び任意選択で前記試薬は核酸であるか、又は核酸を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記１つ以上の電子機器は、前記電子機器及び／又は伝送手段の操作及び／又は１つ以上のパラメーターを制御するための制御手段、使用時に前記１つ以上の機器に電力を供給する電力供給手段、１つ以上の回路基板、データを格納する記憶手段、ユーザーが前記機器の前記操作、１つ以上の条件及び／又は前記１つ以上のパラメーターを選択することを許容するユーザー選択手段、又は１つ以上の設定、若しくは設定のオプションを表示する表示手段のいずれか又はいずれかの組み合わせを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項19】
ユーザーが選択することのできる前記機器の前記１つ以上の条件又はパラメーターは、前記パルス化電磁信号の信号周波数、信号強度、信号又は伝送出力、各パルスの時間期間又は信号パルス間の休止期間、信号パルス率のいずれか又はいずれかの組み合わせを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
真核細胞におけるトランスフェクション効率の向上を提供するための装置であって、筐体と、前記筐体に位置する、かつ使用時に所与の周波数、所与のパルス率、所与の出力のいずれか又はいずれかの組み合わせで供給されたパルス化電磁信号を伝送するように配設された伝送手段と、使用時に少なくとも前記伝送手段の操作を制御するための制御手段と、使用時に前記伝送手段及び／又は制御手段に電力を供給するための電力供給手段とを含む、装置。
【請求項21】
１個以上の伝送手段又は電子伝送チップ、又は２個以上の伝送手段又は電子伝送チップを含む、請求項２０に記載の装置。
【請求項22】
前記機器の筐体の表面、又は使用時に前記装置の上に配置されることになる１つ以上の物品の表面の１０５～１１５ｃｍ2当たり少なくとも１個の伝送手段又は電子伝送チップを含む、請求項２０又は２１に記載の装置。
【請求項23】
前記装置は複数の伝送手段又は電子伝送チップを含み、前記伝送手段又は電子伝送チップは、ある空間距離を離して配設され、ここで前記離される距離は、前記パルス化電磁信号の波長の約半分に等しくなるようなものである、請求項２０～２２のいずれか一項に記載の装置。
【請求項24】
前記パルス化電磁信号の前記所与の周波数は約２．２～２．６ＧＨｚの間であり、約２．４ＧＨｚ±５０ＭＨｚであり、又は約２．４５ＧＨｚ±５０ＭＨｚであり、及び／又は前記パルス化電磁信号の前記所与のパルス率は約５０Ｈｚ以下、約２５Ｈｚ以下、約１５Ｈｚ以下であり、及び／又は２％未満のデューティサイクルを有し、及び／又は前記パルス化電磁信号の各パルスは約１ｍｓ～２０ｍｓの間にわたって持続し、又は約１ｍｓであり、及び／又は前記パルス化電磁信号の各パルス間の休止期間は約６６ｍｓ以下持続し、及び／又は前記パルス化電磁信号を伝送する前記伝送手段の各々によって供給された前記所与の出力は、約＋２ｄＢｍ～＋４ｄＢｍ、約１ｍＷ、約２ｍＷ又は約２．５１１９ｍＷであり、及び／又は前記パルス化電磁信号は、０．４５～０．５５の間のガウス型周波数偏移変調（ＧＦＳＫ）を用いて伝送される、請求項２０～２３のいずれか一項に記載の装置。
【請求項25】
前記パルス化電磁信号の前記所与の周波数は２．２～２．６ＧＨｚの間であり、２．４ＧＨｚ±５０ＭＨｚであり、又は２．４５ＧＨｚ±５０ＭＨｚであり、前記所与のパルス率は約１５Ｈｚ以下であり、及び／又は２％未満のデューティサイクルを有し、及び各伝送手段の前記所与の出力は＋２ｄＢｍ～＋４ｄＢｍ、約１ｍＷ、約２ｍＷ又は約２．５１１９ｍＷである、請求項２０～２４のいずれか一項に記載の装置。
【請求項26】
使用時に前記装置をユーザーの上に及び／又はユーザーに隣接して直接又は間接的に着脱可能に取り付けることを許容する取付手段が提供される、請求項２０～２５のいずれか一項に記載の装置。
【請求項27】
前記取付手段は、１つ以上のストラップ、ひも、ネックレス、ペンダント、ベルト、ブレスレット、クリップ、キーリング、ランヤード、ＶＥＬＣＲＯ（登録商標）（面ファスナ）、ホック、ボタン、ボタン穴、接着剤、絆創膏、縫合糸及び／又は生体適合性接着剤のいずれか又はいずれかの組み合わせを含む、請求項２６に記載の装置。
【請求項28】
前記筐体は外装を含み、前記装置の少なくとも前記外装は、使用時に前記装置が身体の中又はユーザーの皮膚の下に埋込み可能であることを許容するための物質で被覆されている、及び／又は前記物質で形成されている、請求項２０～２７のいずれか一項に記載の装置。
【請求項29】
前記装置には、使用時に１つ以上の真核細胞又は人にトランスフェクトされることになるトランスフェクション混合物を保持する又は納めるための少なくとも１つの保持手段又はリザーバーが提供される、請求項２０～２８のいずれか一項に記載の装置。
【請求項30】
前記保持手段又はリザーバーは、使用時にトランスフェクトされることになる人の皮膚又は１つ以上の真核細胞上に及び／又はそれに隣接して位置することが可能であるように前記装置上に配設され、及び前記パルス化電磁信号は、身体の１つ以上の部位及び／又は真核細胞に指向させることが可能であって、使用時に前記試薬の吸収及び／又はトランスフェクションを向上させる助けとなる、請求項２９に記載の装置。
【請求項31】
請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法により作製された細胞又はその子孫。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、トランスフェクション効率及び／又はタンパク質発現の向上を実現するための装置並びにその使用方法に関する。本装置はまた、細胞のタンパク質発現を向上させるためにも使用することができ、及びその使用方法。
【0002】
以下の説明は、細胞のトランスフェクションの向上を許容する装置をどのように遺伝子療法目的で使用することができるかについて言及するが、当業者によれば、ウイルスベクターの作製、遺伝子療法又は修飾、タンパク質発現、自己細胞療法におけるなどの、細胞のトランスフェクションが要求されるいかなる目的又は適用にも本発明を使用し得ることは理解されるであろう。また、本発明の装置及び方法は、インビトロ細胞、エキソビボ細胞及び／又はインビボ細胞に関して行われ得ることも理解されるであろう。
【背景技術】
【0003】
トランスフェクションは、核酸を真核細胞に導入するプロセスである。トランスフェクションは、トランスフェクトされた核酸が発現し続けることができ、娘細胞へと受け継がれる点で、安定したものであり得る。或いは、トランスフェクションは、トランスフェクトされた核酸がトランスフェクション後に短期間のみ発現し、娘細胞に受け継がれない点で、一過性であり得る。遺伝子療法の分野では、いずれのタイプのトランスフェクションの使用も周知であり［１］、疾患の治療用薬剤として作用するような患者細胞への核酸の治療的送達の利用に焦点が置かれている。例えば、治療しなければ、患者が遺伝子に関連した及び遺伝性の病態に罹患することにつながる可能性のある患者の欠陥遺伝子を置き換えることが、目的となり得る。実験室セッティングでは、不死細胞株に外因性遺伝子が、典型的にはプラスミドの形態でトランスフェクトされることが多い。トランスフェクション後、トランスフェクションが成功した細胞は、その外因性遺伝子を発現することになる。
【0004】
一過性トランスフェクションでは、細胞の集団に対して外因性遺伝子（典型的には、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などの担体に封入される）が導入されることになる。これらの細胞の一部についてトランスフェクションが成功することになり、その外因性遺伝子を発現し始めることになる。短期間の後に発現レベルが下がり、その時点で細胞は典型的にはプロセシングされるか、又は他に何らか処分される。
【0005】
安定トランスフェクションでは、細胞が上記のとおりトランスフェクトされる。細胞の一部が、外因性遺伝子を安定的に組み込んでしまうことになる。安定にトランスフェクトされた細胞は、外因性遺伝子の発現に基づき細胞集団から分離し、選択することができ、これらの細胞を増殖させると、外因性遺伝子をより長期間にわたって発現する不死細胞株が作り出される。
【0006】
トランスフェクション効率（即ち、細胞への外因性遺伝子のトランスフェクションが成功する比率）は、先行技術の方法では典型的には低い。細胞株のトランスフェクション効率を高めようと試みて、複数の戦略が採用されている（例えば、電気穿孔、特殊化したトランスフェクション用試薬など）。必要とされているのは、いずれの所与のトランスフェクションプロトコルのトランスフェクション効率も向上させるための、トランスフェクションプロトコルを更に向上させる装置及び方法である。
【0007】
最近の展開は、患者自身の免疫細胞の遺伝子配列を操作して、患者の体内にある特定の癌性細胞を認識して攻撃するであろう細胞へとそれを形質転換するというものになっている［２］。患者の細胞が遺伝子操作される手法は、「遺伝子療法」として知られる。癌の治療に向けた遺伝子療法の一つの有望な手段は、Ｔ細胞が癌性組織の成長をより有効に標的化することを許容するキメラ抗原受容体を発現するようにＴ細胞を遺伝子操作することである。かかる細胞は、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（「ＣＡＲ－Ｔ」細胞）として公知であり、この療法は、「ＣＡＲ－Ｔ細胞療法」として公知である。初めに患者の体から免疫細胞が取り出され、次にそれがエキソビボでトランスフェクションプロセスを受けると、その細胞が、癌を探し出すキラー細胞に変換される。トランスフェクトされた細胞は、次に患者に再投与され、その癌を治療する。こうした細胞のトランスフェクションは、典型的には、外因性遺伝子物質をナノ粒子又はリポソーム担体などの担体分子と会合させることが関わる手法を用いて実現される。
【0008】
従来のトランスフェクションプロセスの一例では、標的ＤＮＡをリン脂質二重層小胞又はリポソームに封入し、次にそれを真核細胞に投与するステップが含まれる［３］。リポソームはリン脂質で形成されているため、リポソームは、同様にリン脂質二重層を有する真核細胞膜に親和性を有し、そのためこれらの系の融合がある。したがって外部のＤＮＡがこの融合機構を経て真核細胞の中へと移行し、細胞にとっての染色体外遺伝情報となることができる。単純な従来のトランスフェクションプロセスには、外因性核酸（例えば目的の遺伝子を納めるＤＮＡプラスミド）をカチオン重合体（ＰＥＩ）に封入することが関わる［６］。かかるプロセスには潜在的に大きな利点がある一方で、こうした従来プロセスは遅く、トランスフェクション効率が悪い。これらの方法は、そのトランスフェクション効率の低さのために無駄が多く、時間がかかり、ひいては高価なものとなっている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
従って、上述の問題を克服する真核細胞におけるトランスフェクション効率及び／又はタンパク質発現を向上させる装置を提供することが、本発明の目的である。
【0010】
真核細胞におけるトランスフェクション効率及び／又はタンパク質発現を向上させる方法を提供することが、本発明の更なる目的である。
【0011】
トランスフェクションを亢進させる装置及び／又はその使用方法を提供することが、本発明の更なる目的である。
【0012】
動物又はヒトにおける遺伝子療法及び／又は治療的処置の有効性を向上させる装置を提供することが、本発明のなおも更なる目的である。
【0013】
動物又はヒトにおける遺伝子療法及び／又は治療的処置の有効性を向上させる方法を提供することが、本発明のなおも更なる目的である。
【0014】
ウイルスベクターの作製を向上させる装置及び／又はその使用方法を提供することが、本発明のなおも更なる目的である。
【0015】
ヒト及び／又は動物細胞のタンパク質発現を向上させる装置及び／又はその使用方法を提供することが、本発明のなおも更なる目的である。
【0016】
本発明の更なる目的は、トランスフェクション物質の調製及び／又は適用速度の向上を許容することであり、なおも更なる目的は、トランスフェクトされた細胞の収率増加を許容することである。
【0017】
より低コストで、より標的を絞った効率的な方式による患者の皮膚を通じた試薬、薬剤及び／又は治療的処置の送達を許容する装置及び／又は使用方法を提供することが、本発明のなおも更なる目的である。
【0018】
患者への試薬、薬剤及び／又は治療的処置の送達を提供するために使用することのできる、携帯及び／又は患者の自宅での使用が容易な装置を許容する装置及び／又は使用方法を提供することが、本発明の更なる目的である。
【課題を解決するための手段】
【0019】
本発明の第１の態様によれば、真核細胞におけるトランスフェクション効率を向上させる方法が提供され、該方法は、
ａ）トランスフェクションに好適な少なくとも１つの両親媒性構造体と会合した試薬を含むトランスフェクション混合物を提供するステップと；
ｂ）トランスフェクション複合体を形成するために、前記トランスフェクション混合物を１つ以上の真核細胞に導入するステップと；
ｃ）１つ以上のトランスフェクトされた細胞を形成するために、前記トランスフェクション複合体がトランスフェクションプロセスを受けることを許容するステップと
を含み、
前記方法は、所与の周波数、所与のパルス率、及び所与の出力のいずれか又はいずれかの組み合わせで供給されたパルス化電磁信号を、トランスフェクション複合体を生み出す前に前記ステップａ）で前記トランスフェクション混合物に、前記ステップｂ）において前記トランスフェクション複合体に、前記ステップｃ）においてトランスフェクション複合体に、及び／又はトランスフェクションステップｃ）の後にトランスフェクトされた細胞の複合体に、指向させるステップを含むことを特徴とする、方法。
ａ）トランスフェクションに好適な少なくとも１つの両親媒性構造体と会合した試薬を含むトランスフェクション混合物を提供するステップと；
ｂ）トランスフェクション複合体を形成するために、前記トランスフェクション混合物を１つ以上の真核細胞に導入するステップと；
ｃ）１つ以上のトランスフェクトされた細胞を形成するために、前記トランスフェクション複合体がトランスフェクションプロセスを受けることを許容するステップと
を含み、
前記方法は、所与の周波数、所与のパルス率、及び所与の出力のいずれか又はいずれかの組み合わせで供給されたパルス化電磁信号を、トランスフェクション複合体を生み出す前に前記ステップａ）で前記トランスフェクション混合物に、前記ステップｂ）において前記トランスフェクション複合体に、前記ステップｃ）においてトランスフェクション複合体に、及び／又はトランスフェクションステップｃ）の後にトランスフェクトされた細胞の複合体に、指向させるステップを含むことを特徴とする、方法。
【0020】
本出願人らは、意外にも、トランスフェクション前、トランスフェクションの最中及び／又はトランスフェクションの後にパルス化電磁（ＰＥＭ）信号を投与すると、トランスフェクション効率及び／又はトランスフェクションプロセスによって生み出されるタンパク質発現収率が有意に増加することを見出した。トランスフェクション率が有意に向上し、試薬及び／又は外因性核酸を納めるトランスフェクトされた細胞の出現頻度の亢進を許容する。したがって、本発明は、細胞生存度、遺伝子導入、トランスフェクション率及び／又はタンパク質産生を向上させる非侵襲性の非化学的な手法を提供する。本発明は、細胞にとって外部の環境から細胞の内側にある内部環境への細胞外物質又は試薬の輸送を亢進させる。
【0021】
本明細書で使用される用語「パルス化電磁信号」は、好ましくは、電磁スペクトル範囲でベースラインからより高い値又は低い値へと振幅が変化し、続いてベースラインに戻る又は実質的にベースラインに戻る信号の系列又はパターンとして定義される。更に好ましくは、信号振幅の変化は速く、過渡的であり、繰り返しの系列として現れる。一例において、ベースラインは、電磁信号源又は伝送手段が発する電磁信号がない状態に相当する。好ましくはベースラインは、細胞及び／又はパルス化電磁信号にとっての休止又は緩和期間と見なされる。
【0022】
好ましくは、本方法は、完全にインビトロで、又は完全にインビボで、又は部分的にインビトロで及び部分的にインビボで行われ得る。例えば、真核細胞はインビトロでトランスフェクトされ、１つ以上の目的又は適用にインビトロで使用される可能性がある。更なる例では、真核細胞は患者から抽出され、インビトロでトランスフェクトされ、次に患者に再導入して戻される可能性がある（これは、同義的に「エキソビボ」方法と称される。或いは、トランスフェクション複合体は患者に注入されるか、又は他の方法で運び込まれる可能性があり、患者の細胞がインビボでトランスフェクトされる可能性がある。
【0023】
好ましくはトランスフェクション混合物中の試薬は、トランスフェクションに好適ないずれかの試薬及び／又は核酸、医薬品用及び／又は治療用試薬又は化合物、治療的及び／又は医薬品的利益のある試薬、５キロダルトン未満の小分子又は小分子材料、約５キロダルトン以上の大型分子又は大型分子材料、１つ以上のタンパク質、ワクチン、１つ以上の抗体、有機剤などのいずれか又はいずれかの組み合わせである。
【0024】
用語「医薬品用及び／又は治療用試薬又は化合物」は、好ましくは、臨床に展開されている又は展開するために開発中の化合物であって、確かな薬効のあるものを指す。
【0025】
用語「治療的及び／又は医薬品的利益のある試薬」は、好ましくは、研究及び／又は臨床での使用のために開発された、及び／又はそこでの使用に向けて調査中である化合物を指す。これらの試薬又は化合物は、公知の作用機序を有し得るが、臨床的適合性及び関連性については実証又は調査が行われていないものであり得る。一部の実施形態において、これらの試薬又は化合物の作用機序は、まだ明らかになっていないものであり得る。それにも関わらず、本発明の根底にある機序は、これらの試薬又は化合物の優れた細胞内送達を許容する。
【0026】
一態様において、細胞内送達方法が提供され、前記方法は、
ａ）細胞内送達に好適な少なくとも１つの両親媒性構造体と会合した試薬を含む第１の混合物を提供するステップと；
ｂ）前記第１の混合物と１つ以上の真核細胞とを含む第２の混合物を形成するために、前記第１の混合物を前記１つ以上の真核細胞に導入するステップと；
ｃ）少なくとも１つの両親媒性構造体と会合した前記試薬が前記１つ以上の真核細胞へと送達されるプロセスを受けることを前記第２の混合物に許容するステップと
を含み、
前記方法は、所与の周波数、所与のパルス率、又は所与の出力のいずれか又はいずれかの組み合わせで供給されたパルス化電磁信号を、
前記第２の混合物を生み出す前の前記ステップａ）での第１の混合物に；
前記ステップｂ）における前記第２の混合物に；
前記ステップｃ）における前記第２の混合物に；及び／又は
前記ステップｃ）の後の前記１つ以上の真核細胞に
指向させるステップを更に含むことを特徴とする。
ａ）細胞内送達に好適な少なくとも１つの両親媒性構造体と会合した試薬を含む第１の混合物を提供するステップと；
ｂ）前記第１の混合物と１つ以上の真核細胞とを含む第２の混合物を形成するために、前記第１の混合物を前記１つ以上の真核細胞に導入するステップと；
ｃ）少なくとも１つの両親媒性構造体と会合した前記試薬が前記１つ以上の真核細胞へと送達されるプロセスを受けることを前記第２の混合物に許容するステップと
を含み、
前記方法は、所与の周波数、所与のパルス率、又は所与の出力のいずれか又はいずれかの組み合わせで供給されたパルス化電磁信号を、
前記第２の混合物を生み出す前の前記ステップａ）での第１の混合物に；
前記ステップｂ）における前記第２の混合物に；
前記ステップｃ）における前記第２の混合物に；及び／又は
前記ステップｃ）の後の前記１つ以上の真核細胞に
指向させるステップを更に含むことを特徴とする。
【0027】
一部の実施形態において、試薬は核酸であるか、又はそれを含み、及びトランスフェクションとは、核酸が１つ以上の真核細胞に導入され、ひいては１つ又は複数の細胞による外因性核酸（例えば、外因性ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド又は前記核酸によってコードされる遺伝子、若しくはそれから発現するタンパク質）の発現を引き起こすプロセスを指す。他の実施形態において、試薬が核酸を含まない場合、語句トランスフェクションは用語「細胞内送達」と同義的に使用され、この文脈では、試薬が１つ以上の真核細胞の細胞膜を越えて細胞質へと送達されることを意味する。一部の実施形態において、したがって本方法は、特に試薬が核酸を含まないとき、膜貫通送達方法であると見なすことができる。
【0028】
本明細書に記載されるいずれかの態様又は実施形態において、特に明らかでない限り、本方法は、トランスフェクション、細胞内送達又は膜貫通送達方法であると見なされてもよい。
【0029】
本明細書に記載されるいずれかの態様又は実施形態において、特に明らかでない限り、トランスフェクション混合物は第１の混合物と記載することができ、及び／又はトランスフェクション複合体は第２の混合物と記載することができる。細胞への送達は、膜貫通、細胞内又は細胞質内送達であると見なされてもよい。
【0030】
好ましくは試薬は、それが両親媒性構造体の中に納められている点、それが両親媒性構造体と複合体を形成している点、それが両親媒性構造体上に納められている点、それが両親媒性構造体に結合している点などから、少なくとも両親媒性構造体と会合している。
【0031】
一実施形態において、真核細胞には、付着細胞、懸濁細胞、血液細胞、リンパ球、顆粒球、Ｔ細胞などのいずれか又はいずれかの組み合わせが含まれる可能性がある。
【0032】
一部の実施形態において、真核細胞は、溶液中に懸濁されているか、基質に付着しているか、又は懸濁細胞と付着細胞との両方の混合物である。
【0033】
一部の実施形態において、真核細胞は、不死細胞又は不死細胞株から得られた細胞である。例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞、ヒト結腸腫瘍（ＨＣＴ）１１６細胞、又はジャーカットＥ６細胞。
【0034】
一部の実施形態において、真核細胞は、ヒト又は動物対象（被検体）の組織にあるか、又はそこから得られた細胞である。例えば、細胞は対象から抽出されたものであってよく、トランスフェクトされ、次に対象に再導入されることになる。一部の実施形態において、真核細胞は、対象の血液から得られる。一部の実施形態において、真核細胞は、Ｔ細胞、リンパ球、顆粒球、マクロファージ及び／又は他の白血球細胞である。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞又は細胞傷害性Ｔ細胞のいずれか又はいずれかの組み合わせである。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋細胞傷害性Ｔリンパ球及び／又はＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球を含む。
【0035】
本発明の装置及び方法の一つの例示的な使用は、いわゆる「ＣＡＲ－Ｔ」細胞の作成が関わる養子Ｔ細胞療法（ＡＣＴ）である。かかる技法では、対象から得られたＴ細胞に対して本装置及び／又は方法が使用される。この細胞が培養され、インビトロでトランスフェクトされるとキメラ抗原受容体を発現し、次にインビトロで拡大された後、患者に再導入される。本装置及び／又は方法はトランスフェクション効率を向上させるため、ひいてはＣＡＲ－Ｔ細胞のより高い収率をもたらす。
【0036】
一部の実施形態において、本方法は、ヒト又は動物の身体に実施される処置又は手術方法でなくてもよい。一部の実施形態において、本方法は、ヒトの生殖細胞系列の遺伝子アイデンティティを修飾するための方法でなくてもよい。
【0037】
好ましくは、本方法は、トランスフェクション混合物を形成するために、核酸又は試薬を少なくとも１つの両親媒性構造体と混合するステップを含む。核酸又は試薬が両親媒性構造体と会合すると、それがトランスフェクション混合物を形成する。
【0038】
一実施形態において、少なくとも１つの両親媒性構造体は、少なくとも１つのリポソーム物質又は媒介体、少なくとも１つのペグ化されたリポソーム物質又は媒介体、ミセル、リン脂質二重層を有する構造体、カチオン重合体、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などのいずれか又はいずれかの組み合わせを含み得るか、又はそれからなり得る。
【0039】
例えば、カチオン重合体は、Ｔｕｒｂｏｆｅｃｔ（商標）であり得る。
【0040】
好ましくは、核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）であるか、又はＤＮＡとＲＮＡとの組み合わせ（例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドオリゴヌクレオチド）を含む。核酸がＲＮＡであるとき、それは、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどであり得る。
【0041】
一実施形態において、核酸は、１つ以上の発現ベクターであるか、又は１つ以上の発現ベクターを含む。例えば、１つ以上の発現ベクターは、１つ以上の真核細胞での発現が意図される１つ以上の外因性遺伝子を含む１つ以上のＤＮＡプラスミドである可能性がある。
【0042】
一実施形態において、試薬が核酸であるとき、トランスフェクションプロセスの結果、トランスフェクトされた細胞内のトランスフェクトされた核酸が発現し続け、娘細胞に受け継がれる点で、安定発現が得られる。
【0043】
一実施形態において、試薬が核酸であるとき、トランスフェクションプロセスの結果、一過的発現が得られ、トランスフェクトされた核酸が比較的短期間しか発現せず、娘細胞に受け継がれない。
【0044】
好ましくは、パルス化電磁信号を指向させるステップは、室温（例えば２０℃など）で行われるか、又は室温を上回る温度に設定することができるインキュベーター（培養器）において若しくは患者の体温（例えば３７℃など）で行われる。
【0045】
一実施形態において、パルス化電磁信号を指向させるステップは、所与の期間にわたって行われる。一例において、細胞がパルス化電磁信号を受信する時間は、トランスフェクション複合体を生み出す前にステップａ）においてトランスフェクション混合物に指向させるとき、約１５分又は最長１５分である。しかしながら、必要に応じてより長時間又はより短時間の期間が用いられる可能性があることは理解されるであろう。
【0046】
一実施形態において、細胞がパルス化電磁信号を受信する所与の期間は、ステップｃ）においてトランスフェクトされた細胞を形成するためトランスフェクション複合体に指向させるとき、及び／又はトランスフェクションステップ後、約１～４時間又はその間であり、更に好ましくは約３～４時間である。しかしながら、必要に応じてより長時間又はより短時間の期間が用いられる可能性があることは理解されるであろう。例えば、一実施形態において所与の期間は、最長１６時間、又は最長２４時間であり得る。
【0047】
一実施形態において、トランスフェクションはリバーストランスフェクションである（即ち、真核細胞がトランスフェクション混合物に導入される）。
【0048】
一実施形態において、トランスフェクションはフォワードトランスフェクションである（即ち、トランスフェクション混合物が真核細胞に導入される）。
【0049】
好ましくは、パルス化電磁信号は、１つ以上の電子機器によって生成される。
【0050】
好ましくは、１つ以上の電子機器は、使用時にパルス化電磁信号を生成し及び／又はそこから伝送する伝送手段を含む。
【0051】
好ましくは、伝送手段は、１個以上の電子伝送チップであって、使用時に１つ以上のパルス化電磁信号を生成する、発する、及び／又は伝送するように配設された１個以上の電子伝送チップを含む。
【0052】
一実施形態において、伝送手段又は１個以上の電子伝送チップへの言及には、１個以上の伝送機、１個以上の伝送機及び少なくとも１個の受信機、又は１個以上の送受信機が含まれる可能性がある。したがって、一例において、パルス化電磁信号は、中心位置又はマスター伝送機から伝送される可能性があり、１個以上の遠隔及び／又はスレーブ受信機及び／又は送受信機によって受信され、続いてそこから再伝送され又は発せられる可能性がある。
【0053】
一実施形態において、電子機器は、単一の伝送手段又は電子伝送チップを有する。かかる単一の伝送手段又は電子伝送チップは、パルス化電磁信号を一例では組織培養プレートに提供するのに十分である。一例示的実施形態において、単一の伝送手段又は電子伝送チップは、１つ以上の懸濁細胞を納めるバイオリアクターに提供され、取り付けられ、又は組み込まれる。かかるバイオリアクターは、懸濁液をスターラーで撹拌することによって動作し、そのため、典型的には培地中にある、懸濁されている細胞が伝送手段又は電子伝送チップのそばを通過し、したがって本発明のパルス化電磁信号に曝されることになる。
【0054】
一実施形態において、電子機器は２個以上の伝送手段又は電子伝送チップを有する。好ましくは、２個以上の伝送手段又は電子伝送チップは、電子機器において互いに所与の空間距離だけ離して配設される。
【0055】
好ましくは、離される所与の空間距離は、電磁パルス化信号でパルスされる１つ以上の物品又は物質に、所望の効果（即ち、トランスフェクション効率を増加させるという効果）を実現するのに十分な、及び／又は使用時に電磁放射線／信号の均等な若しくは実質的に均等な分布を提供するのに十分な信号強度を提供するようなものである。
【0056】
好ましくは、電子機器は、所与のパターン及び／又はアレイで配設された複数の伝送手段又は電子伝送チップを有する。
【0057】
単一の伝送手段又は電子伝送チップが本発明の有利な特性を提供するのに十分ではあるものの、複数の伝送手段又は電子伝送チップを有すると、最大限の効果をなおも維持しながら、より広い範囲の表面積にわたるパルス化電磁信号の送達を許容することが分かっている。本出願人らは、１８．５ｃｍ2当たりに少なくとも１個のチップがあるような、均等に分布した伝送手段又は電子伝送チップを有することにより、最適な効果に十分な有効範囲が提供されることを見出した。
【0058】
一部の実施形態において、本装置は、１個以上の伝送手段又は電子伝送チップを含む。一部の実施形態において、本装置は、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個又はそれ以上の伝送手段又は電子伝送チップを含む。
【0059】
一部の実施形態において、装置の筐体の表面又は本明細書に定義するとおりの物品の表面の約１０５～１１５ｃｍ2当たり、及び好ましくは装置の筐体の表面又は本明細書に定義するとおりの物品の表面の約１１０ｃｍ2当たりに１個の伝送手段又は電子伝送チップがある。
【0060】
一部の実施形態において、装置の筐体の表面又は本明細書に定義するとおりの物品の表面の約５０～６０ｃｍ2当たり、及び好ましくは装置の筐体の表面又は本明細書に定義するとおりの物品の表面の約５５ｃｍ2当たりに１個の伝送手段又は電子伝送チップがある。
【0061】
一部の実施形態において、装置の筐体の表面又は本明細書に定義するとおりの物品の表面の約２５～３０ｃｍ2当たり、及び好ましくは装置の筐体の表面又は本明細書に定義するとおりの物品の表面の約２７．５ｃｍ2当たりに１個の伝送手段又は電子伝送チップがある。
【0062】
一部の実施形態において、装置の筐体の表面又は本明細書に定義するとおりの物品の表面の約１５～２０ｃｍ2当たり、及び好ましくは装置の筐体の表面又は本明細書に定義するとおりの物品の表面の約１８．５ｃｍ2当たりに１個の伝送手段又は電子伝送チップがある。
【0063】
一部の実施形態において、装置の筐体の表面又は本明細書に定義するとおりの物品の表面の約１０～１５ｃｍ2当たり、及び好ましくは装置の筐体の表面又は本明細書に定義するとおりの物品の表面の約１２．２ｃｍ2当たりに１個の伝送手段又は電子伝送チップがある。
【0064】
本明細書に定義するとおりの物品は、好ましくは、細胞培養プレート、フラスコ、ローラーボトル、及び当業者に公知の他の容器を含む。例えば、以下に定義するとおりの標準的な実験用マイクロプレート、Ｔ２５、Ｔ７５、Ｔ１２５、Ｔ１７５、Ｔ２２５、及びそれより大きい細胞培養プレート。１個以上の伝送手段又は電子伝送チップは、使用時に機器上に配置されるかかる容器の表面積に応じた、及び／又は装置の筐体の表面に基づく所与の間隔だけ離してセットされる。
【0065】
例示的実施形態において、本装置には６個の伝送手段又は電子伝送チップが提供され、装置の上には標準的な実験用マイクロプレートが位置する。これらの標準的な実験用マイクロプレートは、６ウェル、１２ウェル、２４ウェル、４８ウェル、９６ウェル、３８４ウェル、及び１５３６ウェルプレート（及びそれ以上）として提供される。これらのマイクロプレートは、概して標準化されたサイズであって、寸法が約１２８ｍｍ長さ×８５ｍｍ幅であり、したがってプレートは約１１０ｃｍ2の表面積を与える。したがって、例示的実施形態において、６個の伝送手段又は電子伝送チップは、これらのプレートタイプのいずれかに本発明に係るパルス化電磁信号を提供するのに最適な所与の間隔を提供するように均等な間隔で置かれ得る。一例において、電子機器は６個の伝送手段又は電子伝送チップを含む。好ましくは、６個の伝送手段又は電子伝送チップは、使用時に電子機器に、その上に、又はそれに対して２４ウェルプレートが位置するとき、各伝送手段又はチップがプレートの４つのウェルに十分な強度の電磁信号を発することが可能であるような、及び／又はそれを指向させるような所与の距離だけ互いに離して配設される。
【0066】
更に好ましくは、伝送手段又は伝送チップは、２４ウェルプレートの４つのウェルの中心位置又は実質的に中心位置に隣接して位置する。
【0067】
一実施形態において、２個の以上の伝送手段又は電子伝送チップが必要となる場合、複数の伝送手段又は電子伝送チップの間隔が最適化されなければならない。各伝送手段又は電子伝送チップの間に最適な所与の間隔を実現するためには、伝送手段又は電子伝送チップは、用いられる電磁放射線周波数の波長の半分に等しい又は実質的に半分に等しい距離に位置しなければならない。好ましくは、この距離は、あらゆる向きの平面との関係で、又は２個以上の伝送手段又は電子伝送チップが装置の一部として共に使用されるものと考えなければならない。例えば、波長が１２．４ｃｍである場合、伝送チップは、使用時にあるとき最適な電磁場を生じるために約６．２ｃｍ離して配置されなければならない。
【0068】
一例において、所与の空間距離＝波長／２。
【0069】
一例において、Ｘ軸及び／又はＹ軸の所与の空間距離は、均等な間隔の格子状にある各伝送手段又は電子伝送チップ間において波長の半分である。かかる配設により、破壊的干渉リスクが最小限となる。
【0070】
一実施形態において、電子機器は筐体を含み、１個以上の伝送手段又は伝送チップは前記筐体に位置する。
【0071】
好ましくは、筐体は、使用時にパルス化電磁信号を受信するもう１つの物品に対して筐体が安定して位置することを許容する少なくとも１つの平らな又は平面的な表面を含む。或いは、筐体は、使用時にパルス化電磁信号を受信する１つ以上の物品に対して筐体が安定して位置することを許容する１つ以上の湾曲した又は非平面的な表面を含むことができる。
【0072】
一例において、筐体の少なくとも１つの表面は、使用時にパルス化電磁信号を受信する１つ以上の物品が位置するための１つ以上の凹部を含む。
【0073】
一例において、電子機器は、実験室での使用向けのトランスフェクションプレートと称される。
【0074】
一実施形態において、筐体は、使用時に筐体が表面上に直接又は間接的に支持されることを許容する基面を含む。更に好ましくは、筐体は、基面の反対側の上面を含む。好ましくは、上面は、パルス化電磁信号を受信する１つ以上の物品が使用時にその上に位置し得る表面である。
【0075】
一例において、１つ以上の物品は、そこで真核細胞を培養し得る当業者に公知の細胞培養プレート又はフラスコであり得る。
【0076】
一実施形態において、電子機器及び／又は筐体は、容器、反応容器などの外面に取付可能である。例えば、電子機器及び／又は筐体は、１つ以上のねじ、ナット及びボルト、磁石、ひも、クリップ、ストラップ、相互係合部材、接着（粘着）剤、溶接などのいずれか又はいずれかの組み合わせを含めた、１つ以上の取付手段又は装置によって取付可能であり得る。
【0077】
好ましくは、筐体の上面及び／又は使用時に筐体又は電子機器の上に、そこに又はそれに対して位置するときのパルス化電磁信号を受信する１つ以上の物品と伝送手段との間の距離は、約２５ｃｍ以下、２０ｃｍ以下、１５ｃｍ以下、１０ｃｍ以下又は５ｃｍ以下である。更に好ましくは、距離は約１ｃｍである。
【0078】
好ましくは、パルス化電磁信号は、所与のパルス系列で提供される。
【0079】
一実施形態において、電子機器は、パルス化電磁信号を約２．２～２．６ＧＨｚの範囲の周波数で伝送するように配設され、更に好ましくは、パルス化電磁信号は、約２．４ＧＨｚ±５０ＭＨｚ又はより好ましくは２．４５ＧＨｚ±５０ＭＨｚの周波数で伝送される。
【0080】
一実施形態において、電子機器は、パルス化電磁信号を２．４～２．４８３５ＧＨｚ、好ましくは２．４５ＧＨｚ±５０ＭＨｚの工業、科学及び医療用無線周波数帯域幅（ＩＳＭバンド）の範囲内の周波数で伝送するように配設される。
【0081】
好ましくは、パルス化電磁信号は、約５０Ｈｚ以下、更に好ましくは約２５Ｈｚ以下、及びなおも更に好ましくは約１５Ｈｚ以下の周波数でパルス化される。
【0082】
好ましくは、パルス化電磁信号の各パルスは約１ｍｓ～２０ｍｓの間にわたって持続する。更に好ましくは、各パルスは約１ｍｓ持続する。
【0083】
好ましくは、パルス間の時間期間（「休止期間」又は「緩和期間」とも称される）は約６６ｍｓ以下である。
【0084】
好ましくは、パルス化電磁信号のデューティサイクルは２％未満である。
【0085】
一実施形態において、電子機器の各伝送手段又はチップによって供給された伝送出力は、２ｄＢｍ～＋４ｄＢｍ、約１ｍＷ、約２ｍＷ又は約２．５１１９ｍＷである。
【0086】
一実施形態において、パルス化電磁信号の所与の周波数は約２．２～２．６ＧＨｚ、２．４ＧＨｚ±５０ＭＨｚ又は２．４５ＧＨｚ±５０ＭＨｚであり、所与のパルス率は約１５Ｈｚであるか、又は２％未満のデューティサイクルを有し、及び所与の出力は＋２ｄＢｍ～＋４ｄＢｍ、１ｍＷ、２ｍＷ又は２．５１１９ｍＷである。
【0087】
理論によって拘束されることを望むものではないが、本発明の装置又は方法において使用される電磁波又は電磁信号の使用は、比較的長い休止又は緩和期間でＨ2Ｏをその双極子の周りに周期的に回転させるのに十分であると考えられる。Ｈ2Ｏの周期的回転は、リン脂質二重層及び／又は両親媒性構造体の水素結合を遮断すると考えられる。したがって、細胞膜のこの周期的又は断続的な低エネルギーの摂動が、一部の分子、細胞膜及び／又は両親媒性構造体並びにそれらの環境、例えば、両親媒性構造体と会合した核酸又は試薬などとの相互作用の増加を刺激すると考えられる。これが、細胞膜を越える試薬の輸送を亢進させて、１つ以上の真核細胞による核酸、ペプチド、小分子及び他の試薬などの１つ以上の試薬の取込みの増加につながると考えられる。したがって、本発明に係るトランスフェクション及び／又は細胞内送達プロセスは、超低エネルギー電磁波又は信号を使用して大きく向上し得ることが見て分かる。パルス化電磁信号のパルス間の比較的長い休止又は緩和期間は、細胞の完全性を維持するのに十分であると考えられる。したがって、本発明との関連において、パルス化電磁信号、電磁波又は電磁場の使用は、細胞膜を越える分子の輸送の向上を提供し、上記に定義したとおりの試薬のより効率的なトランスフェクション及び／又は細胞内送達につながると考えられる。
【0088】
好ましくは、パルス化電磁信号は、０．４５～０．５５の間のガウス型周波数偏移変調（ＧＦＳＫ）を用いて伝送される。
好ましくは、パルス化電磁信号は、無線周波数（ＲＦ）データ信号である。
好ましくは、パルス化電磁信号は、パルス化電磁信号のデジタル系列である。
好ましくは、パルス化電磁信号は、無線周波数（ＲＦ）データ信号である。
好ましくは、パルス化電磁信号は、パルス化電磁信号のデジタル系列である。
【0089】
好ましくは、無線周波数信号は、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ ＬＥ（ＢＬＥ）プロトコルのアドバタイズ機能を利用する。好ましくは、アドバタイズＲＦ信号は、それぞれ、周波数２４０２ＭＨｚ、２４２６ＭＨｚ、２４８０ＭＨｚに対応するチャンネル３７、３８及び３９上にある。
【0090】
好ましくは、パルス化電磁信号は、トランスフェクション混合物、トランスフェクション複合体及び／又はトランスフェクション後の複合体からなる、又はそれを含む水性媒体に指向される。
【0091】
一実施形態において、電子機器は、使用時に機器に電力を供給する電力供給手段を含む。好ましくは、電力供給手段には、主電源、１つ以上のバッテリー、電力セル、１つ以上の充電式バッテリー、発電機手段などが含まれる。
【0092】
一実施形態において、電子機器は、使用時に電子機器及び／又は伝送手段の操作を制御するための制御手段を含む。
【0093】
一実施形態において、電子機器は、１つ以上の回路基板を含む。好ましくは、典型的には集積回路の形態の１つ以上の回路基板上には伝送手段が提供されてもよく、及び／又は例えば記憶手段など、他の構成要素が位置する。
【0094】
一実施形態において、電子機器は、記憶装置、データ格納装置など記憶手段を含む。
【0095】
好ましくは、電子機器の他の構成要素には、パルス化電磁信号を発生させるための装置の選択的な操作、及び作動時におけるその制御された操作に必要な１つ以上の構成要素が含まれる。例えば、使用時に機器の１つ以上の条件、操作及び／又は１つ以上のパラメーターのユーザー選択を許容するユーザー選択手段；１つ以上の設定、選択オプションなどを表示する表示手段が機器上に提供されてもよい。
【0096】
一実施形態において、前記更なる構成要素又は電力供給手段は１つ以上の電力セルを含み、それらは全てが筐体内に納められてもよい。
【0097】
一実施形態において、電子機器の筐体は、使用時に電磁信号に曝されることになる物質及び／又は１つ以上の物品が位置する容器とそれが係合する、及び／又はそれに基づき位置することを許容する形態で提供される。
【0098】
一実施形態において、制御手段は、ユーザーが前記パルス化電磁信号の信号周波数、信号強度、信号出力、信号パルス率、信号のパルス発生時間期間などのいずれか又はいずれかの組み合わせを選択することを許容するオプションを含む。一実施形態において、周波数、強度、出力、パルス率、パルス発生時間期間、他のパラメーターなどの選択は、使用時にパルス化電磁信号に曝されることになる物質及び／又は１つ以上の物品の詳細な形態、前記物質の分量、使用に際して装置が位置する基準となる容器の寸法及び／又は他のパラメーターに基づき行われてもよい。
【0099】
本発明のもののようなパルス化信号に曝される細胞は、インビトロでのトランスフェクション時に、細胞の一様な又は実質的に一様な分布又は分散を提供することが分かっており、これは、パルス化されない技術が用いられる、細胞の凝集が観察されているトランスフェクションと対照的である。
【0100】
本発明のある態様によれば、真核細胞におけるトランスフェクション効率を向上させることを提供する装置が提供され、前記装置は、筐体と、前記筐体に位置する、かつ使用時に所与の周波数、所与のパルス率、又は所与の出力のいずれか又はいずれかの組み合わせで供給されたパルス化電磁信号を伝送するように配設された伝送手段と、使用時に少なくとも前記伝送手段の操作を制御するための制御手段と、使用時に前記伝送手段及び／又は制御手段に電力を供給するための電力供給手段とを含む。
【0101】
好ましくは、本装置の１つ以上の所与のパラメーターは、装置の製造者によって事前に設定されてもよく、及び／又はユーザーの要求に応じてユーザー選択可能なものであってもよい。
【0102】
好ましくは、制御手段を使用して、ユーザー選択可能な所与のパラメーターのうちの１つ以上のユーザー選択が許容される。
【0103】
一実施形態において、本装置は、身体におけるトランスフェクションプロセスを向上させるために使用時に身体の一範囲へとパルス化電磁信号を指向させるのを許容するため、人の皮膚上に又はそれに隣接して直接又は間接的に装着されるように配設される。この実施形態において、本装置は好ましくは、ウェアラブル機器である。
【0104】
一実施形態において、身体で行われるトランスフェクションプロセスを向上させるため、ユーザーの皮膚又は身体の外部、使用時にユーザーが身に着ける衣服又は物品の内部及び／又は外部などへの、又はそれに対する着脱可能な取付けを許容する、装置上にある、及び／又は装置に付随する取付手段が提供されてもよい。
【0105】
例示的実施形態において、本装置はウェアラブル機器、例えばアームバンドであり、アームバンドは、患者に投与される例えばＤＮＡ又はＲＮＡワクチンの注入（インジェクション）部位に直接配置される。
【0106】
例示的実施形態において、ワクチンの投与方法であって、対象にワクチンを注入するステップ、及び次に本発明の装置を注入部位に配置するステップ、及び本発明に係るパルス化電磁信号を注入部位に提供するステップを含む方法がある。
【0107】
好ましくは、装置及び／又は伝送手段若しくは１個以上の電子伝送チップは、使用時にパルス化電磁信号がユーザーの皮膚又は身体に指向されるように装置に配設される。例えば、パルス化電磁信号は、筐体の第１の表面を通して指向させることができ、前記第１の表面は、ユーザーの皮膚と直接又は間接的に接触した状態となるように配設される。
【0108】
一実施形態において、本装置は、身体に埋込み可能であるように配設される。例えば、本装置は、治療を必要とする身体の部位に埋め込まれる可能性がある。この実施形態において、本装置は、好ましくはインプラント（埋込み）である。
【0109】
好ましくは本装置の少なくとも外装は、身体への埋込みに好適な物質で被覆されている、及び／又はそれで形成されている。
【0110】
好ましくは、取付手段は、１つ以上のストラップ、ひも、ネックレス、ペンダント、ベルト、ブレスレット、クリップ、キーリング、ランヤード、ＶＥＬＣＲＯ（登録商標）（面ファスナ）、ホック、ボタン、ボタン穴、接着剤、絆創膏、縫合糸、クリップ、生体適合性接着剤などのいずれか又はいずれかの組み合わせを含む。
【0111】
一実施形態において、本装置には、使用時に人にトランスフェクトされることになるトランスフェクション混合物を、それぞれ保持する又は納めるための少なくとも１つの保持手段又はリザーバーが提供される。
【0112】
好ましくは、保持手段又はリザーバーは、本装置上に、使用時にそれが人の皮膚上に、及び／又はそれに隣接して位置することが可能であるように配設される。パルス化電磁信号を身体の１つ以上の部位に指向させることにより、人の皮膚を通じた、及び人の１つ以上の細胞への試薬の吸収及び／又はトランスフェクションの向上を助けることができる。
【0113】
一実施形態において、パルス化電磁信号をユーザーの皮膚に指向させると、ユーザーの皮膚の透過性が改良され、使用時にトランスフェクション混合物の取込みの増加及び／又は向上が許容されると考えられる。典型的には、皮膚の透過性の改良は、少なくともパルス化電磁信号がユーザーの皮膚に指向されている時間期間にわたって起こる。典型的には、パルス化電磁信号の発信が止まった後にもユーザーの皮膚の透過性の改良は続くが、時間が経つと減弱する。
【0114】
一実施形態において、パルス化電磁信号の強度及び範囲は、電子機器の筐体がユーザーの皮膚の一部分に基づいて位置するとき、パルス化電磁信号が皮膚を通過してユーザーの体内に入り、好ましくは、前記ユーザーの皮膚の一部分に直接隣接する内部範囲に少なくとも隣接するのに十分である。
【0115】
本発明の一態様によれば、真核細胞におけるトランスフェクション効率を増加させる方法及び／又は真核細胞におけるトランスフェクション効率を増加させるための装置が提供される。
【0116】
本発明の更なる態様によれば、トランスフェクトされた真核細胞のタンパク質発現を増加させる方法及び／又はトランスフェクトされた真核細胞のタンパク質発現を増加させるための装置が提供される。
【0117】
本発明の一態様によれば、インビボで遺伝子療法を提供する方法が提供され、該方法は、
ａ）トランスフェクションに好適な少なくとも１つの両親媒性構造体と会合した試薬を含むトランスフェクション混合物を提供するステップと；
ｂ）インビボで前記トランスフェクション混合物で患者の１つ以上の細胞のトランスフェクションを許容するために、前記トランスフェクション混合物を患者に導入又は注入するステップと
を含み、
前記方法は、所与の周波数、所与のパルス率、及び所与の出力のいずれか又はいずれかの組み合わせで、供給されたパルス化電磁信号を、前記トランスフェクション混合物を指向させる又は注入する前に前記ステップａ）でトランスフェクション試薬に、前記ステップｂ）において前記トランスフェクション混合物を患者に指向させる又は注入する間に患者に、及び／又はトランスフェクションステップｂ）の後に患者に、指向させるステップを含むことを特徴とする、方法。
ａ）トランスフェクションに好適な少なくとも１つの両親媒性構造体と会合した試薬を含むトランスフェクション混合物を提供するステップと；
ｂ）インビボで前記トランスフェクション混合物で患者の１つ以上の細胞のトランスフェクションを許容するために、前記トランスフェクション混合物を患者に導入又は注入するステップと
を含み、
前記方法は、所与の周波数、所与のパルス率、及び所与の出力のいずれか又はいずれかの組み合わせで、供給されたパルス化電磁信号を、前記トランスフェクション混合物を指向させる又は注入する前に前記ステップａ）でトランスフェクション試薬に、前記ステップｂ）において前記トランスフェクション混合物を患者に指向させる又は注入する間に患者に、及び／又はトランスフェクションステップｂ）の後に患者に、指向させるステップを含むことを特徴とする、方法。
【0118】
好ましくは、トランスフェクション混合物を患者に導入する方法は、経口的に、経皮的に、皮下になどを含む。
【0119】
本発明の一態様によれば、インビトロで遺伝子療法を提供する方法が提供され、該方法は、
ａ）トランスフェクションに好適な少なくとも１つの両親媒性構造体と会合した試薬を含むトランスフェクション混合物を提供するステップと；
ｂ）前記トランスフェクション複合体を形成するために、前記方法より前に患者から採取した１つ以上の真核細胞に前記トランスフェクション混合物を加えるステップと；
ｃ）１つ以上のトランスフェクトされた細胞を形成するために、前記トランスフェクション複合体をトランスフェクトするステップと
を含み、
前記方法は、所与の周波数、所与のパルス率、及び所与の出力のいずれか又はいずれかの組み合わせで供給されたパルス化電磁信号を、前記トランスフェクション複合体を生み出す前に前記ステップａ）で前記トランスフェクション混合物に、前記ステップｂ）において前記トランスフェクション複合体に、前記ステップｃ）において前記トランスフェクション複合体に、及び／又はトランスフェクションステップｃ）の後に前記トランスフェクトされた細胞の複合体に、指向させるステップを含むことを特徴とする。
ａ）トランスフェクションに好適な少なくとも１つの両親媒性構造体と会合した試薬を含むトランスフェクション混合物を提供するステップと；
ｂ）前記トランスフェクション複合体を形成するために、前記方法より前に患者から採取した１つ以上の真核細胞に前記トランスフェクション混合物を加えるステップと；
ｃ）１つ以上のトランスフェクトされた細胞を形成するために、前記トランスフェクション複合体をトランスフェクトするステップと
を含み、
前記方法は、所与の周波数、所与のパルス率、及び所与の出力のいずれか又はいずれかの組み合わせで供給されたパルス化電磁信号を、前記トランスフェクション複合体を生み出す前に前記ステップａ）で前記トランスフェクション混合物に、前記ステップｂ）において前記トランスフェクション複合体に、前記ステップｃ）において前記トランスフェクション複合体に、及び／又はトランスフェクションステップｃ）の後に前記トランスフェクトされた細胞の複合体に、指向させるステップを含むことを特徴とする。
【0120】
本発明の更なる態様によれば、真核細胞におけるトランスフェクション効率を向上させる方法が提供され、該方法は、
ａ）トランスフェクションに好適な少なくとも１つの両親媒性構造体と会合した核酸を含むトランスフェクション混合物を提供するステップと；
ｂ）トランスフェクション複合体を形成するために、１つ以上の真核細胞に前記トランスフェクション混合物を加えるステップと；
ｃ）１つ以上のトランスフェクトされた細胞を形成するために、前記トランスフェクション複合体がトランスフェクションプロセスを受けることを許容するステップと
を含み、
前記方法は、所与の周波数、所与のパルス率、及び所与の出力のいずれか又はいずれかの組み合わせで供給されたパルス化電磁信号を、前記トランスフェクション複合体を生み出す前に前記ステップａ）で前記トランスフェクション混合物に、前記ステップｂ）において前記トランスフェクション複合体に、前記ステップｃ）において前記トランスフェクション複合体に、及び／又はトランスフェクションステップｃ）の後にトランスフェクトされた細胞の複合体に、指向させるステップを含む。
ａ）トランスフェクションに好適な少なくとも１つの両親媒性構造体と会合した核酸を含むトランスフェクション混合物を提供するステップと；
ｂ）トランスフェクション複合体を形成するために、１つ以上の真核細胞に前記トランスフェクション混合物を加えるステップと；
ｃ）１つ以上のトランスフェクトされた細胞を形成するために、前記トランスフェクション複合体がトランスフェクションプロセスを受けることを許容するステップと
を含み、
前記方法は、所与の周波数、所与のパルス率、及び所与の出力のいずれか又はいずれかの組み合わせで供給されたパルス化電磁信号を、前記トランスフェクション複合体を生み出す前に前記ステップａ）で前記トランスフェクション混合物に、前記ステップｂ）において前記トランスフェクション複合体に、前記ステップｃ）において前記トランスフェクション複合体に、及び／又はトランスフェクションステップｃ）の後にトランスフェクトされた細胞の複合体に、指向させるステップを含む。
【0121】
本方法により患者の細胞がトランスフェクトされた後、次に細胞は、任意選択で、必要に応じてその患者又は別の患者に再導入して戻すことができる。
【0122】
本発明のある態様によれば、真核細胞における遺伝子療法の提供を支援するための装置が提供され、前記装置は、筐体と、前記筐体に位置する、かつ使用時に所与の周波数、所与のパルス率、又は所与の出力のいずれか又はいずれかの組み合わせで供給されたパルス化電磁信号を伝送するように配設された伝送手段と、使用時に少なくとも前記伝送手段の操作を制御するための制御手段と、使用時に前記伝送手段及び／又は制御手段に電力を供給するための電力供給手段とを含む。
【0123】
本発明の更なる態様によれば、遺伝子発現及び／又はタンパク質発現を変化させる方法が提供され、該方法は、
－ １つ以上の真核細胞を提供するステップを含み、
前記方法は、所与の周波数、所与のパルス率、及び所与の出力のいずれか又はいずれかの組み合わせで供給されたパルス化電磁信号を、前記１つ以上の真核細胞における前記遺伝子発現及び／又はタンパク質発現を変化させるために、前記真核細胞に指向させるステップを含むことを特徴とする。
－ １つ以上の真核細胞を提供するステップを含み、
前記方法は、所与の周波数、所与のパルス率、及び所与の出力のいずれか又はいずれかの組み合わせで供給されたパルス化電磁信号を、前記１つ以上の真核細胞における前記遺伝子発現及び／又はタンパク質発現を変化させるために、前記真核細胞に指向させるステップを含むことを特徴とする。
【0124】
一実施形態において、本方法は癌細胞を死滅させて、健全な細胞及び組織におけるＤＮＡ修復を増加させる。
【0125】
一実施形態において、本装置は、例えば、癌性組織における又はそれに隣接する一領域など、患者に埋込み可能であり、それにより癌性組織を治療する。この方法は、癌性組織が患者の皮膚から一層遠く離れている場合に有用であり得る。
【0126】
一実施形態において、本装置は、患者によって患者の皮膚に又はそれに隣接して装着され、例えば、黒色腫など、皮下腫瘍の近くに位置するなどの癌性組織に１つ以上の医薬品用試薬又は薬剤を送達するために、及び／又はウイルスを治療するために使用される可能性がある。
【0127】
したがって、一実施形態では、本装置を使用して患者の皮膚を通じてパルス化電磁信号を送達することにより、細胞のＤＮＡとの直接的な相互作用によって癌性細胞のアポトーシス、細胞を促進し、及び／又はＤＮＡ損傷が修復されるように健全な細胞を生み出すのを支援することができる。
【0128】
一実施形態では、本装置を使用して患者の皮膚を通じてパルス化電磁信号を送達することにより、抗ウイルス効果が提供される。
【0129】
本発明の一態様において、本明細書に定義される方法のいずれか１つを用いて作製された細胞又はその子孫が提供される。
【0130】
本明細書においてトランスフェクション効率の向上と言うとき、それは、トランスフェクトされた細胞の数の増加及びトランスフェクションプロセス後の細胞生存度の増加又は維持を指すことに留意すべきである。
【0131】
本発明は実験室ベースの環境で使用することができ、又は産業レベルの環境で使用されるようにスケールアップできることは理解されるであろう。
【0132】
以下に、本発明の具体的な実施形態を添付の図面を参照しながら説明する。
【図面の簡単な説明】
【0133】
【図1a】本発明の一実施形態に係る装置を示し、ここで電子機器は、１個の伝送機チップを含む。
【図1b】本発明の一実施形態に係る装置を示し、ここで電子機器は、１個の伝送機チップを含む。
【図3】一例において電子機器と共に使用され得る２４ウェルプレートの例と併せて、本発明の一実施形態における装置を示し、ここで電子機器は、６個の伝送機チップのアレイを含む。
【図4a】Ｔｕｒｂｏｆｅｃｔ両親媒性構造体と会合したＤＮＡプラスミドを使用した付着ＣＨＯ Ｋ１細胞のトランスフェクションの結果を示し、ここでは本発明のある実施形態により、単一の電子伝送機チップを含むパルス化技術が使用された。
【図4b】Ｔｕｒｂｏｆｅｃｔ両親媒性構造体と会合したＤＮＡプラスミドを使用した付着ＣＨＯ Ｋ１細胞のトランスフェクションの結果を示し、ここでは本発明のある実施形態により、６個の電子伝送機チップを含むパルス化技術が使用された。
【図4c】Ｔｕｒｂｏｆｅｃｔ両親媒性構造体と会合したＤＮＡプラスミドを使用した付着ＨＣＴ １１６細胞のトランスフェクションの結果を示し、ここでは本発明のある実施形態により、パルス化技術が使用された。
【図5a】本発明のパルス化技術を用いた、ＩＧＦＢＰ３プロモーターを含む、かつＰＥＩ両親媒性構造体と会合したＤＮＡプラスミドを使用したＨＣＴ １１６細胞におけるトランスフェクションの結果を示す。
【図5b】本発明のパルス化技術を用いた、ＳＶ４０プロモーターを含む、かつＰＥＩ両親媒性構造体と会合したＤＮＡプラスミドを使用したＨＣＴ １１６細胞のトランスフェクションの結果を示す。
【図6】本発明のパルス化技術を用いた、ＰＥＩ両親媒性構造体と会合した緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）含有プラスミドを使用した懸濁ＨＥＫ ２９３ Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞におけるトランスフェクションの結果を示すグラフである。
【図7】本発明のパルス化技術を用いた、ＰＥＩ両親媒性構造体と会合した緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）含有プラスミドを使用した懸濁ＨＥＫ ２９３ Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞におけるトランスフェクションの更なる結果を示すグラフである。
【図8】本発明のパルス化技術を用いた、ＴｒａｎｓＩＴ２０２０両親媒性構造体と会合したＤＮＡプラスミドを使用した懸濁ジャーカットＥ６細胞におけるトランスフェクションの結果を示すグラフである。
【図9a】本発明の実施形態に係る装置の図を示す。
【図9b】本発明の実施形態に係る装置の図を示す。
【図10a】本発明の更なる実施形態に係る装置の図を示す。
【図10b】本発明の更なる実施形態に係る装置の図を示す。
【図11】本発明の更なる実施形態を示す。
【図12a】本発明のなおも更なる実施形態の立面図を示す。
【図12b】本発明のなおも更なる実施形態の立面図を示す。
【図13】本発明の特許請求の範囲のサポートを提供する本出願人の同時係属中の特許出願における実験からのウエスタンブロットを示す。
【図14】本発明の特許請求の範囲のサポートを提供する本出願人の同時係属中の特許出願における実験からの更なるウエスタンブロットを示す。
【発明を実施するための形態】
【0134】
【0135】
装置２は、所与の周波数で、所与のパルス率で、所与の出力レベルで、及び所与の期間の時間にわたってパルス化電磁信号を発する能力を有する電子機器の形態である。所与のパラメーターは、製造者によって事前に設定されてもよく、又は要求に応じてユーザー選択可能なものであってもよい。本装置に用いられる技術は、以下では「本発明に係るパルス化技術」と称する。
【0136】
装置２は筐体４を含む。この特定の例では、筐体４は実験用トランスフェクションプレートの形態であり、基面５と、基面５の反対側の上面７と、上面５と基面７との間に位置する１つ以上の側壁９とを含む。
【0137】
筐体４の内部の範囲内に、動作時にパルス化電磁信号を発生するように上に集積回路８が構成され、かつ相互接続されている回路基板６が提供される。装置２の選択的な操作を許容するため、制御ユニット１０の形態の制御手段が提供される。データ、１つ以上の操作パラメーター、ソフトウェアなどを格納して必要なときに検索を許容するため、記憶装置１２が提供される。制御ユニットは、好ましくは、データの処理などを許容する超小型演算処理手段を含む。
【0138】
装置２はまた、典型的には、装置に電力を供給する１つ以上の電力セル１４も含む。任意選択で、電力セル１４を交換しなければならないのでなく、むしろ遠隔電源から充電することが許容されるように、充電可能設備もまた提供することができる。
【0139】
筐体４は、その使用目的に好適な任意の形態で提供されてよく、例えば処理される細胞が位置する容器の内部又は外部と共にそれが位置することを許容する係合手段が提供され得ることが理解されるであろう。或いは、筐体は、処理される細胞が位置する容器の一部として形成されてもよい。或いは更に、上面７が平面的な又は平らな表面を提供してもよく、その上に、細胞が処理される又は位置することになる容器を配置することができる。まだなおも更には、筐体の上面７に、例えば、培養フラスコ、ペトリ皿又は他の培養容器の形態の容器１６の配置を安定に支持するための凹部１７が画成されて、筐体４が容器１６の下に位置し、かつ容器１６が凹部１７に支持されるようになる可能性もある。
【0140】
集積回路８は、使用時に装置２からパルス化電磁信号を発するように配設される電子伝送チップを含む。より詳細には、本発明の一実施形態において、電子伝送チップは、使用時に凹部１７に位置する容器１６からの間隔が５ｃｍ未満、好ましくは約１ｃｍとなるように配設される。これは、使用時にチップが発する電磁信号を容器１６内に位置する細胞へと指向させることを許容する。
【0141】
本発明の装置は、室温（即ち約２０℃）で、例えば冷蔵ユニット内など、室温よりも低い温度の中で使用されるように設計され、及び／又は例えばインキュベーターユニット内など、室温を上回る温度で使用することができる。
【0142】
一実施形態において、制御ユニット１０は、伝送チップがパルス化電磁信号を２．４５ＧＨｚ±５０ＭＨｚの周波数で、１５Ｈｚのパルス化周波数で、かつ約２ｍＷの出力で発することを許容するために伝送チップを制御するようにプログラムされる。パルス化電磁信号に関連するパラメーターは、必要に応じて調整されてもよく、及び／又はユーザー選択可能なものであってもよいことは理解されるであろう。例えば、必要であれば、パルス化電磁信号を発する時間をユーザーが選択することができる。加えて、出力を調整することができ、但しこれは、使用時に容器１６内に納められた細胞に過剰なエネルギーが供給されるのを回避するため、典型的にはミリワット範囲に保たれる。一例において、パルス化信号は１ｍｓ間持続し、信号間の休止期間は６６ｍｓである。これは、２％未満のデューティサイクルを提供する。
【0143】
一例において、電磁信号は、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ ＬＥプロトコルのアドバタイズ機能を使用したＲＦ信号であり、０．４５～０．５５の間のＧＦＳＫを用いて伝送される。
【0144】
しかしながら、使用時に電子装置により、工業、医療及び科学用周波数帯域幅（即ち、２．４～２．４８３５ＧＨｚ、好ましくは２．４５ＧＨｚ±５０ＭＨｚ）の任意の周波数伝送が可能であり得ることに留意しなければならない。
【0145】
図３を参照すると、更なる実施形態に係るパルス化電磁信号を提供するための装置１０２の更なる例が示されている。図１ａ～図１ｂが、パルス化電磁信号を伝送するために単一の電子チップを含む装置を示しているのに対し、図３は、パルス化電磁信号を伝送するために６個の電子チップ１０４のアレイを有する装置１０２を示している。図１ａ～図１ｂと同じ特徴を説明するために、同じ参照符号が用いられる。図３は、電子チップ１０４を装置１０２の上にあるものとして示すが、これは単に明確にするためにこのように示されるに過ぎず、チップ１０４は実際には装置１０２の範囲内に納まっている。
【0146】
６個の電子チップ１０４は、ある空間距離を離して装置１０２に提供される。チップ間の間隔は任意の所要の距離であり得るが、一例では、チップは、使用時に２４ウェルセルプレート１０６が装置の上面７に位置するとき、１個の伝送チップ１０４がウェルのうち４つの中心に位置するような間隔を離して置かれる。したがって、２４ウェルセルプレートにつき各電子チップ１０２が４つのウェルにパルス化電磁信号を指向させる。装置１０２上にはオン／オフ操作スイッチ１０８が提供され、使用時に装置をオン状態とオフ状態との間で動かす。
【0147】
本発明において、上記に記載したとおりの装置を使用することにより、トランスフェクションプロセスの１つ以上の異なる段階で関わる試薬及び／又は細胞を指向したパルス化電磁信号を提供することができる。また本装置を使用することにより、パルス化電磁信号をトランスフェクトされた細胞又はトランスフェクトされていない細胞に指向させて細胞タンパク質発現を亢進させることもできる。本発明のパルス化技術には、先述のとおり、遺伝子療法、細胞トランスフェクションなど、幅広い種々の適用用途がある。
【0148】
本出願人らは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡプラスミドなど、核酸の形態の試薬が、リポソーム媒介体など、両親媒性構造体と会合して提供され、異なる種類の真核細胞にトランスフェクトされるとき、トランスフェクションプロセスの種々の段階で本発明のパルス化技術を使用すると、トランスフェクション効率プロセス及びタンパク質発現収率が大幅に増加し得ることを示す実験に着手した。
【0149】
簡単な概要として、一例では、真核細胞と核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ又はいずれかの小断片）のリポソーム製剤とを合わせた分散体を含む物質が、一実施形態では装置２、１０２上に位置する培養容器、フラスコ又はディッシュなどの好適な容器に納められ、装置からパルス化電磁信号が発せられ、容器１６の壁を通じて物質２０内へと指向する。
【0150】
本発明のパルス化技術は、例えば核酸及び／又は両親媒性構造体に対するなど、トランスフェクションを行う前のトランスフェクション混合物に対して用いることができる。本発明のパルス化技術は、トランスフェクション混合物と真核細胞とを含むトランスフェクション複合体に対してもまた用いることができ、又は代わりにそれに対して用いることができる。加えて、又は代わりになおも、本発明のパルス化技術は、トランスフェクションが行われた後の細胞に対し、及び／又はトランスフェクションを受けていない真核細胞に対し、そうした細胞のタンパク質発現を増加させるために用いることができる。
【0151】
本発明を例示するために用いられる以下の実験では、種々の真核細胞株と混合する前のトランスフェクション混合物に対して、及び／又はトランスフェクションプロセス中にトランスフェクション混合物と混合した真核細胞株に対して、本発明の同じパルス化技術が用いられた。
【0152】
実験で使用した核酸は、アルギニンバソプレシン（ＡＶＰ）プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、又はインスリン様成長因子結合保護（ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）３（ＩＧＦＢＰ３）プロモーターを含むＤＮＡプラスミド物質を含んだ。サイトメガロウイルス（Ａｄｌｕｃ）プラスミド、ルシフェラーゼ対照（コントロール）ベクター（Ｒｅｎｉｌｌａ）プラスミド又は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）プラスミドもまた使用した。
【0153】
実験で使用した両親媒性構造体は、カチオン重合体（Ｔｕｒｂｏｆｅｃｔ（登録商標））（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、米国）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）、又はＴｒａｎｓＩＴ２０２０（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ、米国）を含有するいずれかのトランスフェクション試薬であった。
【0154】
実験で使用した細胞株は、チャイニーズハムスター卵巣－Ｋ１（ＣＨＯ）細胞（付着細胞）（ＡＴＣＣ、米国－ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－６１（商標））、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３ ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞（懸濁細胞）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、米国）、ヒト結腸腫瘍（ＨＣＴ）１１６細胞（付着細胞）（ＡＴＣＣ、米国－ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－２４７（商標））又はジャーカットＥ６（懸濁Ｔ細胞）（ＥＣＡＣＣ）、英国）であった。
【0155】
上記の構成要素を用いて細胞トランスフェクションプロセス効率を決定するため、好適な装置を使用してルシフェラーゼ活性又は緑色蛍光タンパク質の量を測定した。
【0156】
選択したＤＮＡプラスミド物質を公知の技法を用いて両親媒性構造体と複合体化することにより、トランスフェクション混合物を形成した。一部の実験では、このトランスフェクション混合物を本発明のパルス化技術に供した。次にトランスフェクション混合物（パルス化技術への曝露有り又は無し）を好適な細胞培養容器内にある哺乳類細胞株のうちの１つの分散液中に混合し、トランスフェクション複合体を形成した。次にこの細胞培養容器を本発明の装置筐体に配置し、所与の期間の時間にわたって先述のとおりのパルス化技術に供した。次にパルス化電磁信号の発信を停止させて、物質を平衡に至らせた。加えて、同じ物質及び混合要件を用いて全く同様に、但し本発明のパルス化技術の非存在下で、対照実験もまた行った。
【0157】
実験に用いた方法論の更に詳細な説明、結果及び知見を以下に提供する。
【実施例】
【0158】
＜＜方法論＞＞
＜＜実験１－Ａｄｌｕｃ及びＲｅｎｉｌｌａプラスミドを使用した、及びＰＥＩ又はＴｕｒｂｏｆｅｃｔのいずれかを両親媒性構造体として使用した付着ＣＨＯ Ｋ１及びＨＣＴ１１６細胞のトランスフェクション＞＞
この実験は、ＰＥＩ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）又はＴｕｒｂｏｆｅｃｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、米国）のいずれかの両親媒性構造体中のＡｄｌｕｃ及びＲｅｎｉｌｌａプラスミドを使用した付着チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ、米国）及びＨＣＴ１１６（ヒト結腸癌細胞株）（ＡＴＣＣ、米国）におけるトランスフェクションのプロセスに本発明のパルス化技術が及ぼす効果を調べるために行った。パルス化技術は、ａ）トランスフェクションプロセス中の細胞及びトランスフェクション混合物（トランスフェクション複合体）のみ；及びｂ）細胞とのトランスフェクション複合体を形成する前のトランスフェクション混合物及び次にトランスフェクションプロセス中のトランスフェクション複合体に適用した。
＜＜実験１－Ａｄｌｕｃ及びＲｅｎｉｌｌａプラスミドを使用した、及びＰＥＩ又はＴｕｒｂｏｆｅｃｔのいずれかを両親媒性構造体として使用した付着ＣＨＯ Ｋ１及びＨＣＴ１１６細胞のトランスフェクション＞＞
この実験は、ＰＥＩ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）又はＴｕｒｂｏｆｅｃｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、米国）のいずれかの両親媒性構造体中のＡｄｌｕｃ及びＲｅｎｉｌｌａプラスミドを使用した付着チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ、米国）及びＨＣＴ１１６（ヒト結腸癌細胞株）（ＡＴＣＣ、米国）におけるトランスフェクションのプロセスに本発明のパルス化技術が及ぼす効果を調べるために行った。パルス化技術は、ａ）トランスフェクションプロセス中の細胞及びトランスフェクション混合物（トランスフェクション複合体）のみ；及びｂ）細胞とのトランスフェクション複合体を形成する前のトランスフェクション混合物及び次にトランスフェクションプロセス中のトランスフェクション複合体に適用した。
【0159】
＜消耗品＞
Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）Ｉ低血清培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、米国）
ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、米国）
ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ、米国）
２×２４ウェルプレートＮｕｎｃ（１．９ｃｍ2／ウェル）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、米国）
２００ｎｇのＡｄＬｕｃプラスミド／ウェル（ルシフェラーゼ発現プラスミド／ＤＮＡ）（英国ダンディー大学が作製）
２ｎｇ Ｒｅｎｉｌｌａプラスミド／ウェル（ルシフェラーゼ発現プラスミド／ＤＮＡ）（英国ダンディー大学が作製）
Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ（商標）ポリエチレンイミン、線状、分子量２５，００（ＰＥＩ）（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）
Ｔｕｒｂｏｆｅｃｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、米国）
Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）Ｉ低血清培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、米国）
ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、米国）
ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ、米国）
２×２４ウェルプレートＮｕｎｃ（１．９ｃｍ2／ウェル）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、米国）
２００ｎｇのＡｄＬｕｃプラスミド／ウェル（ルシフェラーゼ発現プラスミド／ＤＮＡ）（英国ダンディー大学が作製）
２ｎｇ Ｒｅｎｉｌｌａプラスミド／ウェル（ルシフェラーゼ発現プラスミド／ＤＮＡ）（英国ダンディー大学が作製）
Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ（商標）ポリエチレンイミン、線状、分子量２５，００（ＰＥＩ）（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）
Ｔｕｒｂｏｆｅｃｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、米国）
【0160】
＜方法ステップ＞
＜対照－ＰＥＩを使用＞
１．６５０μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地を第１のチューブ内で２．６μｇのＡｄＬｕｃプラスミド及び２６ｎｇのＲｅｎｉｌｌａプラスミドと混合した；
２．６５０μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地を第２のチューブ内で７．８８μｇのＰＥＩと混合した；
３．Ｖｏｒｔｅｘ－Ｇｅｎｉｅ２、モデルＧ５６０Ｅ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、米国）を使用して第２のチューブの内容物を第１のチューブに滴下する方式で穏やかにボルテックスしながら（渦を作りながら）混合し、１．３ｍＬの最終容積の混合物を実現させた；
４．トランスフェクション混合物を室温（約２０℃）で１５分間培養した；
５．次に１００μＬのこの培養したトランスフェクション混合物を、２つの２４ウェルプレート（プレート１及び２）の各々のＡ１～Ａ６と名付けたウェルに分注した。これがトランスフェクション混合物を形成した。
＜対照－ＰＥＩを使用＞
１．６５０μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地を第１のチューブ内で２．６μｇのＡｄＬｕｃプラスミド及び２６ｎｇのＲｅｎｉｌｌａプラスミドと混合した；
２．６５０μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地を第２のチューブ内で７．８８μｇのＰＥＩと混合した；
３．Ｖｏｒｔｅｘ－Ｇｅｎｉｅ２、モデルＧ５６０Ｅ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、米国）を使用して第２のチューブの内容物を第１のチューブに滴下する方式で穏やかにボルテックスしながら（渦を作りながら）混合し、１．３ｍＬの最終容積の混合物を実現させた；
４．トランスフェクション混合物を室温（約２０℃）で１５分間培養した；
５．次に１００μＬのこの培養したトランスフェクション混合物を、２つの２４ウェルプレート（プレート１及び２）の各々のＡ１～Ａ６と名付けたウェルに分注した。これがトランスフェクション混合物を形成した。
【0161】
＜発明－トランスフェクション複合体が生み出される前のトランスフェクション混合物に対するパルス化技術有り、ＰＥＩを使用＞
１．次に、上記のステップ１～３を繰り返し、但し、ステップ４において－トランスフェクション混合物を形成する混合物は、第１のチューブを本発明に係るパルス化電磁信号機器上に位置させることにより、室温（約２０℃）で１５分間培養した。パルス化機器は、上記に記載したとおり動作する（即ち、パルス化機器は、２．４５ＧＨｚ±５０ＭＨｚで、出力２ｍＷで、１５Ｈｚのパルス化周波数を用いて動作させた）。
２．１００μＬのこの培養したパルス化トランスフェクション混合物を、２つの２４ウェルプレート（プレート１及び２）の各々のＢ１～Ｂ６と名付けたウェルに分注した。
１．次に、上記のステップ１～３を繰り返し、但し、ステップ４において－トランスフェクション混合物を形成する混合物は、第１のチューブを本発明に係るパルス化電磁信号機器上に位置させることにより、室温（約２０℃）で１５分間培養した。パルス化機器は、上記に記載したとおり動作する（即ち、パルス化機器は、２．４５ＧＨｚ±５０ＭＨｚで、出力２ｍＷで、１５Ｈｚのパルス化周波数を用いて動作させた）。
２．１００μＬのこの培養したパルス化トランスフェクション混合物を、２つの２４ウェルプレート（プレート１及び２）の各々のＢ１～Ｂ６と名付けたウェルに分注した。
【0162】
＜対照－Ｔｕｒｂｏｆｅｃｔを使用＞
１．６５０μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地を第１のチューブ内で２．６μｇのＡｄＬｕｃプラスミド及び２６ｎｇのＲｅｎｉｌｌａプラスミドと混合した；
２．１３μＬのＴｕｒｂｏｆｅｃｔを加え、Ｖｏｒｔｅｘ－Ｇｅｎｉｅ ２、モデルＧ５６０Ｅ、（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、米国）を使用してボルテックスすることにより混合した；
３．トランスフェクション混合物を室温（約２０℃）で１５分間培養した
４．１００μＬのこの培養したトランスフェクション混合物を、２つの２４ウェルプレート（プレート１及び２）の各々のＣ１～Ｃ６と名付けたウェルに分注した。
１．６５０μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地を第１のチューブ内で２．６μｇのＡｄＬｕｃプラスミド及び２６ｎｇのＲｅｎｉｌｌａプラスミドと混合した；
２．１３μＬのＴｕｒｂｏｆｅｃｔを加え、Ｖｏｒｔｅｘ－Ｇｅｎｉｅ ２、モデルＧ５６０Ｅ、（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、米国）を使用してボルテックスすることにより混合した；
３．トランスフェクション混合物を室温（約２０℃）で１５分間培養した
４．１００μＬのこの培養したトランスフェクション混合物を、２つの２４ウェルプレート（プレート１及び２）の各々のＣ１～Ｃ６と名付けたウェルに分注した。
【0163】
＜発明－トランスフェクション複合体が生み出される前のトランスフェクション混合物に対するパルス化技術有り、Ｔｕｒｂｏｆｅｃｔを使用＞
１．Ｔｕｒｂｏｆｅｃｔ対照についての上記のステップ１～２を繰り返した。ステップ３において－トランスフェクション混合物は、第１のチューブを本発明に係るパルス化電磁信号機器上に位置させることにより、室温（約２０℃）で１５分間培養した。パルス化機器は、２．４５ＧＨｚ±５０ＭＨｚで、出力２ｍＷで、１５Ｈｚのパルス化周波数を用いて動作させた。
２．１００μＬのこの培養したパルス化トランスフェクション混合物を、２つの２４ウェルプレート（プレート１及び２）の各々のＤ１～Ｄ６と名付けたウェルに分注した。
１．Ｔｕｒｂｏｆｅｃｔ対照についての上記のステップ１～２を繰り返した。ステップ３において－トランスフェクション混合物は、第１のチューブを本発明に係るパルス化電磁信号機器上に位置させることにより、室温（約２０℃）で１５分間培養した。パルス化機器は、２．４５ＧＨｚ±５０ＭＨｚで、出力２ｍＷで、１５Ｈｚのパルス化周波数を用いて動作させた。
２．１００μＬのこの培養したパルス化トランスフェクション混合物を、２つの２４ウェルプレート（プレート１及び２）の各々のＤ１～Ｄ６と名付けたウェルに分注した。
【0164】
＜細胞株をプレート１及び２に加えた＞
－ プレート１及び２について、ＣＨＯ Ｋ１細胞又はＨＣＴ１１６細胞のいずれかを２つの２４ウェルプレートの各ウェルに２×１０4細胞／ウェルで加えることによりトランスフェクション複合体を生み出し、次に最終容積が６００μＬのダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）となるように構成した。詳細には、Ａ１～Ａ３，Ｂ１～Ｂ３、Ｃ１～Ｃ３及びＤ１～Ｄ３にＣＨＯ Ｋ１細胞が加えられた；Ａ４～Ａ６、Ｂ４～Ｂ６、Ｃ４～Ｃ６及びＤ４～Ｄ６にＨＣＴ １１６細胞が加えられた；
－ プレート１及び２をインキュベーターにおいて３７℃、５％ＣＯ2で３時間培養した；
－ プレート１では、３時間の培養段階にある間、トランスフェクション複合体にパルス化技術は与えられなかったが、一方、プレート２は、培養段階にある間、本発明に係るパルス化技術に３時間供された。
－ ４時間後、Ｔｕｒｂｏｆｅｃｔトランスフェクション試薬を含有するＤＭＥＭをウェルにいっぱいになるまでつぎ足した。
－ 各実験条件について３つのウェルの平均値を測定し、記録した。
－ プレート１及び２について、ＣＨＯ Ｋ１細胞又はＨＣＴ１１６細胞のいずれかを２つの２４ウェルプレートの各ウェルに２×１０4細胞／ウェルで加えることによりトランスフェクション複合体を生み出し、次に最終容積が６００μＬのダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）となるように構成した。詳細には、Ａ１～Ａ３，Ｂ１～Ｂ３、Ｃ１～Ｃ３及びＤ１～Ｄ３にＣＨＯ Ｋ１細胞が加えられた；Ａ４～Ａ６、Ｂ４～Ｂ６、Ｃ４～Ｃ６及びＤ４～Ｄ６にＨＣＴ １１６細胞が加えられた；
－ プレート１及び２をインキュベーターにおいて３７℃、５％ＣＯ2で３時間培養した；
－ プレート１では、３時間の培養段階にある間、トランスフェクション複合体にパルス化技術は与えられなかったが、一方、プレート２は、培養段階にある間、本発明に係るパルス化技術に３時間供された。
－ ４時間後、Ｔｕｒｂｏｆｅｃｔトランスフェクション試薬を含有するＤＭＥＭをウェルにいっぱいになるまでつぎ足した。
－ 各実験条件について３つのウェルの平均値を測定し、記録した。
【0165】
場合によっては、上記の実験は、パルス化機器に単一の伝送機のみが提供される第１のタイプのパルス化技術を用いて行った（テクニック１パルス化技術）。場合によっては、上記の実験は、パルス化機器に複数の伝送機のアレイが使用される第２のタイプのパルス化技術を用いて行った（テクニック２パルス化技術）。詳細には、タイプ２のパルス化技術を用いた実験では、６個の伝送機が提供され、プレートがパルス化機器上に位置するときに各伝送機が２４ウェルプレートの４つのウェルの中心に又は実質的に中心に配設された。
【0166】
＜＜ルシフェラーゼアッセイプロトコル － デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）を使用＞＞
使用したプロトコルについては下記のリンクに示されるが、以下にプロトコルの概要を示す。ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｍｅｇａ．ｃｏ．ｕｋ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ－ａｓｓａｙｓ／ｒｅｐｏｒｔｅｒ－ａｓｓａｙｓ／ｄｕａｌ＿ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ－ｒｅｐｏｒｔｅｒ－ａｓｓａｙ－ｓｙｓｔｅｍ／？ｃａｔＮｕｍ＝Ｅ１９１０＃ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
使用したプロトコルについては下記のリンクに示されるが、以下にプロトコルの概要を示す。ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｍｅｇａ．ｃｏ．ｕｋ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ－ａｓｓａｙｓ／ｒｅｐｏｒｔｅｒ－ａｓｓａｙｓ／ｄｕａｌ＿ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ－ｒｅｐｏｒｔｅｒ－ａｓｓａｙ－ｓｙｓｔｅｍ／？ｃａｔＮｕｍ＝Ｅ１９１０＃ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
【0167】
＜方法ステップ＞
１．トランスフェクション実験を行った２４時間後、細胞から培地を取り除いた。
２．細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄した。
３．１００μＬの１×受動的溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）を細胞に加えた。
４．細胞をＢｅｌｌｙ Ｄａｎｃｅｒ（登録商標）オービタルシェーカー（Ｓｉｇｍａ、Ａｌｄｒｉｃｈ）において穏やかに揺らしながら３７℃で１５分間培養した。
５．各ウェルから１０μＬの細胞を取り、白色９６ウェルプレートに配置した。
６．細胞をマイクロプレートルミノメーターＬＢ ９６Ｖ（ＥＧ ＆ Ｇ Ｂｅｒｔｈｏｌｄ、独国）でデュアルルシフェラーゼアッセイシステムプロトコル（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）を用いて分析した。
７．分析は、３０μＬルシフェラーゼアッセイ試薬ＩＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）を注入してホタルルシフェラーゼ活性を測定し、次に３０μＬ Ｓｔｏｐ＆Ｇｌｏ（商標）試薬を注入してホタルルシフェラーゼをブロックし、ウミシイタケルシフェラーゼ活性を測定することにより行った。
８．次に、必要であればウエスタンブロットにかけるため、溶解させた抽出物を－２０℃に保った。
９．細胞におけるトランスフェクション効率は、細胞をＩｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）生細胞分析システム（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、独国）に７２～９６時間配置することにより行ったとともに、その蛍光を毎時測定する。データはＥｘｃｅｌ（登録商標）に収集し、分析した。
１．トランスフェクション実験を行った２４時間後、細胞から培地を取り除いた。
２．細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄した。
３．１００μＬの１×受動的溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）を細胞に加えた。
４．細胞をＢｅｌｌｙ Ｄａｎｃｅｒ（登録商標）オービタルシェーカー（Ｓｉｇｍａ、Ａｌｄｒｉｃｈ）において穏やかに揺らしながら３７℃で１５分間培養した。
５．各ウェルから１０μＬの細胞を取り、白色９６ウェルプレートに配置した。
６．細胞をマイクロプレートルミノメーターＬＢ ９６Ｖ（ＥＧ ＆ Ｇ Ｂｅｒｔｈｏｌｄ、独国）でデュアルルシフェラーゼアッセイシステムプロトコル（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）を用いて分析した。
７．分析は、３０μＬルシフェラーゼアッセイ試薬ＩＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）を注入してホタルルシフェラーゼ活性を測定し、次に３０μＬ Ｓｔｏｐ＆Ｇｌｏ（商標）試薬を注入してホタルルシフェラーゼをブロックし、ウミシイタケルシフェラーゼ活性を測定することにより行った。
８．次に、必要であればウエスタンブロットにかけるため、溶解させた抽出物を－２０℃に保った。
９．細胞におけるトランスフェクション効率は、細胞をＩｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）生細胞分析システム（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、独国）に７２～９６時間配置することにより行ったとともに、その蛍光を毎時測定する。データはＥｘｃｅｌ（登録商標）に収集し、分析した。
【0168】
＜＜実験の結果１＞＞
表１は、テクニック１パルス化技術をＴｕｒｂｏｆｅｃｔ両親媒性構造体及び関連する方法論と共に用いたＣＨＯ Ｋ１細胞実験の結果を示す。
＜表１（テクニック１パルス化技術）＞
対照と比較したパルス化技術における％増加率－１７８％
対照と比較したパルス化技術における平均増加倍数－１．８
ｔ検定－０．０２４
表１は、テクニック１パルス化技術をＴｕｒｂｏｆｅｃｔ両親媒性構造体及び関連する方法論と共に用いたＣＨＯ Ｋ１細胞実験の結果を示す。
＜表１（テクニック１パルス化技術）＞
【表1】
対照と比較したパルス化技術における平均増加倍数－１．８
ｔ検定－０．０２４
【0169】
表２は、テクニック２パルス化技術をＴｕｒｂｏｆｅｃｔ両親媒性構造体及び関連する方法論と共に用いたＣＨＯ Ｋ１細胞実験の結果を示す。
＜表２（テクニック２パルス化技術）＞
対照と比較したパルス化技術における％増加率 － ２３２．７％
対照と比較したパルス化技術における平均増加倍数 － ２．３
ｔ検定 － ０．０４４
＜表２（テクニック２パルス化技術）＞
【表2】
対照と比較したパルス化技術における平均増加倍数 － ２．３
ｔ検定 － ０．０４４
【0170】
表３は、パルス化技術をＴｕｒｂｏｆｅｃｔ両親媒性構造体及び関連する方法論と共に用いたＨＣＴ １１６細胞実験の結果を示す。
＜表３＞
対照と比較したパルス化技術における％増加率 － １３８．５％
対照と比較したパルス化技術における平均増加倍数 － １．４
ｔ検定 － ０．０４４
＜表３＞
【表3】
対照と比較したパルス化技術における平均増加倍数 － １．４
ｔ検定 － ０．０４４
【0171】
表１及び表２並びに図４ａ及び図４ｂを参照すると、対照及び本発明に係るパルス化技術（Ｐｕｌｚａｒ）について、Ｔｕｒｂｏｆｅｃｔ両親媒性構造体と会合したＣＨＯ Ｋ１細胞におけるトランスフェクション効率が示される。各条件につき３レプリケートが含まれる。全ての細胞について、ルシフェラーゼ活性（即ちトランスフェクション）の尺度として発光量を測定した。
【0172】
テクニック１パルス化技術を用いたＣＨＯ Ｋ１細胞におけるトランスフェクション効率は、対照細胞と比較して有意に向上したことが見て分かり、ｔ検定値は０．０２４、平均増加倍数は１．８、そして％増加率は１７８．０であった。
【0173】
また、テクニック２パルス化技術を用いたＣＨＯ Ｋ１細胞におけるトランスフェクション効率が対照細胞と比較して有意に向上したことも見て分かり、ｔ検定値は０．０４４、平均増加倍数は２．３、そして％増加率は２３２．７であった。
【0174】
更に、テクニック２パルス化技術（即ち６個の電子伝送機チップアレイ）で行われた実験では、テクニック１パルス化技術を用いて行われた実験よりも有意に良好な結果が生じたことが見て分かる。
【0175】
表３及び図４ｃを参照すると、対照及び本発明に係るパルス化技術（Ｐｕｌｚａｒ）について、Ｔｕｒｂｏｆｅｃｔ両親媒性構造体と会合したＨＣＴ １１６細胞におけるトランスフェクション効率が示される。各条件につき３レプリケートが含まれる。全ての細胞について、ルシフェラーゼ活性の尺度として発光量を測定した。
【0176】
パルス化技術を用いたＨＣＴ １１６細胞におけるトランスフェクション効率は、対照細胞と比較して有意に向上したことが見て分かり、ｔ検定値は０．０４４、増加倍数は１．４、そして％増加率は１３８．５であった。
【0177】
したがって、本発明のパルス化技術により、パルス化技術を用いない場合と比較して、付着ＣＨＯ Ｋ１細胞及びＨＣＴ １１６細胞におけるトランスフェクション効率が有意に増加したと結論付けることができる。更に、６個の電子伝送機により、単一の電子伝送機のみを使用した場合と比較して、トランスフェクション効率の更なる増加が生じた。
【0178】
＜＜実験２－ＩＧＦＢＰ３プロモーターを納めるプラスミド又はＳＶ４０プロモーターを納めるプラスミドのいずれか、及び両親媒性構造体としてＰＥＩを使用した付着ＨＣＴ細胞のトランスフェクション＞＞
実験２は、ＰＥＩ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）両親媒性構造体にＩＧＦＢＰ３プロモーター又はＳＶ４０プロモーターのいずれかを納めるＡｄｌｕｃ及びＲｅｎｉｌｌａプラスミドを使用した付着ＨＣＴ１１６（ヒト結腸癌細胞株）（ＡＴＣＣ、米国）のトランスフェクションのプロセスに本発明のパルス化技術が及ぼす効果を調べるために行った。実験２については、実験１の方法論に従った。
実験２は、ＰＥＩ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）両親媒性構造体にＩＧＦＢＰ３プロモーター又はＳＶ４０プロモーターのいずれかを納めるＡｄｌｕｃ及びＲｅｎｉｌｌａプラスミドを使用した付着ＨＣＴ１１６（ヒト結腸癌細胞株）（ＡＴＣＣ、米国）のトランスフェクションのプロセスに本発明のパルス化技術が及ぼす効果を調べるために行った。実験２については、実験１の方法論に従った。
【0179】
＜＜実験２の結果＞＞
＜表４＞
表４は、ＰＥＩ両親媒性構造体及び関連する方法論を使用したＩＧＦＢＰ３プロモーターについてのＨＣＴ １１６細胞実験の結果を示す。
％増加倍数＝１６８．４９９１９７４
ｔ検定 ｐ＜０．００４１５４２７４
＜表４＞
表４は、ＰＥＩ両親媒性構造体及び関連する方法論を使用したＩＧＦＢＰ３プロモーターについてのＨＣＴ １１６細胞実験の結果を示す。
【表4】
ｔ検定 ｐ＜０．００４１５４２７４
【0180】
＜表５＞
表５は、ＰＥＩ両親媒性構造体及び関連する方法論を使用したＳＶ４０プロモーターについてのＨＣＴ １１６細胞実験の結果を示す。
％増加倍数＝１５５．２３７１０１６
ｔ検定 ｐ＜０．０２６９５３８８４
表５は、ＰＥＩ両親媒性構造体及び関連する方法論を使用したＳＶ４０プロモーターについてのＨＣＴ １１６細胞実験の結果を示す。
【表5】
ｔ検定 ｐ＜０．０２６９５３８８４
【0181】
表４及び表５並びに図５ａ及び図５ｂを参照すると、対照及び本発明に係るパルス化技術（Ｐｕｌｚａｒ）について、ＩＧＦＢＰ３プロモーター又はＳＶ４０プロモーターのいずれかを納める、かつＰＥＩ両親媒性構造体と会合したＤＮＡプラスミドのＨＣＴ １１６細胞におけるトランスフェクション効率が示される。各グラフに、３レプリケートの実験が２つ含まれる。全ての細胞について、ルシフェラーゼ活性の尺度として発光量を測定した。
【0182】
パルス化技術を用いたＨＣＴ １１６細胞におけるトランスフェクション効率（ＩＧＦＢＰ３プロモーターによって示される）は、対照細胞と比較して有意に向上したことが見て分かり、ｔ検定値は０．００４、及び％増加率は１６８．５であった。
【0183】
パルス化技術を用いたＨＣＴ １１６細胞におけるトランスフェクション効率（ＳＶ４０プロモーターによって示される）は、対照細胞と比較して有意に向上したことが見て分かり、ｔ検定値は０．０２７、そして％増加率は１５５．２であった。
【0184】
したがって、本発明のパルス化技術により、パルス化技術を用いない場合と比較して、付着ＨＣＴ １１６細胞におけるトランスフェクション効率が有意に増加したと結論付けることができる。
【0185】
＜＜実験３－ＧＦＰプラスミド及び両親媒性構造体としてＰＥＩを使用した懸濁ＨＥＫ ２９３Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞のトランスフェクション＞＞
この実験は、ＰＥＩ両親媒性構造体中の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）プラスミドを使用したヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）懸濁細胞２９３Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅのトランスフェクションのプロセスに本発明のパルス化技術が及ぼす効果を調べるために行った。パルス化技術は、トランスフェクションプロセスの間の細胞及びトランスフェクション試薬のみに適用した。
この実験は、ＰＥＩ両親媒性構造体中の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）プラスミドを使用したヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）懸濁細胞２９３Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅのトランスフェクションのプロセスに本発明のパルス化技術が及ぼす効果を調べるために行った。パルス化技術は、トランスフェクションプロセスの間の細胞及びトランスフェクション試薬のみに適用した。
【0186】
＜消耗品＞
Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）Ｉ低血清培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、米国）
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）プラスミド（英国ダンディー大学が作製）
２９３－Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ懸濁細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、米国）
２９３－Ｆｒｅｅ発現培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）
Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ（商標）ポリエチレンイミン、線状、分子量２５，００（ＰＥＩ）（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）
Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）Ｉ低血清培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、米国）
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）プラスミド（英国ダンディー大学が作製）
２９３－Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ懸濁細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、米国）
２９３－Ｆｒｅｅ発現培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）
Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ（商標）ポリエチレンイミン、線状、分子量２５，００（ＰＥＩ）（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）
【0187】
＜パルス化技術が試薬及び細胞混合物に対してのみ使用される場合の方法ステップ＞
１．トランスフェクション前日に６×１０5～７×１０5個の２９３－Ｆ細胞／ｍＬを播種する。
２．トランスフェクション当日に細胞数をカウントし、必要であれば密度が１×１０6細胞／ｍＬとなるように細胞を希釈する。
３．１５μｇの緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）プラスミド／フラスコを３０μＬの２９３－Ｆｒｅｅ発現培地／フラスコでトランスフェクトする。
４．１：２のＤＮＡ：ＰＥＩ比を用いる。
５．製造者の指示に従い２９３－Ｆｒｅｅ発現培地を用いる（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｄａｍ／ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈ／ｄｏｃｓ／ＳＡＪ／Ｂｒｏｃｈｕｒｅ／２ＴＢ５５１５．ｐｄｆ）－ユーザープロトコルＴＢ５１５ Ｒｅｖ．Ｂ ０４１１ＪＮ［４］
６．ＤＮＡ－トランスフェクション混合物を調製するため：
－ フラスコに２．４ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭを加える。
－ フラスコに３０μｇのＧＦＰプラスミドを加える。
６０μＬの２９３－Ｆｒｅｅ発現培地を加える。
－ 得られた混合物容積を２つの１２５ｍＬエルレンマイヤー（Ｅｒｌｅｎｎｍｅｙｅｒ）フラスコに分割し、各々に２８．８ｍＬの２９３発現培地中１×１０6細胞／ｍＬを納める；
－ ２つのフラスコを２つの別個のインキュベーターにおいてＢｅｌｌｙｄａｎｃｅｒオービタルシェーカー（Ｓｉｇｍａ、Ａｌｄｒｉｃｈ）上１２５ｒｐｍで８％ＣＯ2、３７℃にて培養する。フラスコのうちの一方は、インキュベーターのうちの一方において本発明に係るパルス化技術を用いて３時間パルスし、他方のフラスコは、第２のインキュベーターにおいていかなるパルス化技術もなしに培養する。３時間後、両方のフラスコとも、いかなるパルス化技術もない同じインキュベーターに配置することにより、必要に応じた長さの時間（この実験の場合は１２０時間）にわたって時間の経過に伴うトランスフェクション効率の測定を許容する。
１．トランスフェクション前日に６×１０5～７×１０5個の２９３－Ｆ細胞／ｍＬを播種する。
２．トランスフェクション当日に細胞数をカウントし、必要であれば密度が１×１０6細胞／ｍＬとなるように細胞を希釈する。
３．１５μｇの緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）プラスミド／フラスコを３０μＬの２９３－Ｆｒｅｅ発現培地／フラスコでトランスフェクトする。
４．１：２のＤＮＡ：ＰＥＩ比を用いる。
５．製造者の指示に従い２９３－Ｆｒｅｅ発現培地を用いる（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｄａｍ／ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈ／ｄｏｃｓ／ＳＡＪ／Ｂｒｏｃｈｕｒｅ／２ＴＢ５５１５．ｐｄｆ）－ユーザープロトコルＴＢ５１５ Ｒｅｖ．Ｂ ０４１１ＪＮ［４］
６．ＤＮＡ－トランスフェクション混合物を調製するため：
－ フラスコに２．４ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭを加える。
－ フラスコに３０μｇのＧＦＰプラスミドを加える。
６０μＬの２９３－Ｆｒｅｅ発現培地を加える。
－ 得られた混合物容積を２つの１２５ｍＬエルレンマイヤー（Ｅｒｌｅｎｎｍｅｙｅｒ）フラスコに分割し、各々に２８．８ｍＬの２９３発現培地中１×１０6細胞／ｍＬを納める；
－ ２つのフラスコを２つの別個のインキュベーターにおいてＢｅｌｌｙｄａｎｃｅｒオービタルシェーカー（Ｓｉｇｍａ、Ａｌｄｒｉｃｈ）上１２５ｒｐｍで８％ＣＯ2、３７℃にて培養する。フラスコのうちの一方は、インキュベーターのうちの一方において本発明に係るパルス化技術を用いて３時間パルスし、他方のフラスコは、第２のインキュベーターにおいていかなるパルス化技術もなしに培養する。３時間後、両方のフラスコとも、いかなるパルス化技術もない同じインキュベーターに配置することにより、必要に応じた長さの時間（この実験の場合は１２０時間）にわたって時間の経過に伴うトランスフェクション効率の測定を許容する。
【0188】
＜実験３ 結果＞
図６は、本明細書に説明するパルス化技術方法論を用いてこれらの実験で達成されたトランスフェクション効率の向上の最大値を示す。
図６は、本明細書に説明するパルス化技術方法論を用いてこれらの実験で達成されたトランスフェクション効率の向上の最大値を示す。
【0189】
図７は、本発明のパルス化技術を用いたトランスフェクション効率の向上の平均値を示す。
【0190】
図６及び図７を参照すると、対照及び本発明に係るパルス化技術（Ｐｕｌｚａｒ）について、ＨＥＫ ２９３ Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ懸濁細胞におけるＰＥＩ両親媒性構造体と会合したＧＦＰプラスミドのトランスフェクション効率が示される。Ｐｕｌｚａｒ曝露及びＰｕｌｚａｒ曝露なし（対照）を実施した後、成長曲線を図６及び図７のグラフに可視化した。
【0191】
パルス化技術を用いたＨＥＫ ２９３ Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ懸濁細胞におけるトランスフェクション効率（平均緑色蛍光量の測定値によって示される）は、対照細胞と比較して有意に向上したことが見て分かり、図６に示されるとおり、０．０５未満のｔ検定値及び２．３倍高いＧＦＰ発現のピーク増加が認められた。
【0192】
パルス化技術を用いたＨＥＫ ２９３ Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ懸濁細胞におけるトランスフェクション効率（平均緑色蛍光量の測定値によって示される）は、対照細胞と比較して有意に向上したことが見て分かり、図７に示されるとおり、０．０５未満のｔ検定値及び５０％を超えるＧＦＰ発現の増加が認められた。実験期間全体を通じてデルタを計算してＧＦＰ発現の％増加率をマークした。
【0193】
したがって、本発明のパルス化技術により、パルス化技術を用いない場合と比較して、ＨＥＫ ２９３ Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ懸濁細胞におけるトランスフェクション効率が有意に増加したと結論付けることができる。
【0194】
＜実験４－Ａｄｌｕｃ及びＲｅｎｉｌｌａプラスミドを使用した、かつＰＥＩ又はＴｒａｎｓＩＴ２０２０のいずれかを両親媒性構造体として使用した懸濁ジャーカットＥ６細胞のトランスフェクション＞
この実験は、ＰＥＩ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）又はＴｒａｎｓＩＴ２０２０（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ、米国）のいずれかの両親媒性構造体中のＡｄｌｕｃ及びＲｅｎｉｌｌａプラスミドを用いたジャーカットＥ６細胞（ヒト白血病Ｔ細胞リンパ芽球細胞）（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）、英国）におけるトランスフェクションのプロセスに本発明のパルス化技術が及ぼす効果を調べるために行った。パルス化技術は、ａ）トランスフェクションプロセス中の細胞及びトランスフェクション混合物（トランスフェクション複合体）のみ；及びｂ）細胞とのトランスフェクション複合体を形成する前のトランスフェクション混合物及び次にトランスフェクションプロセス中のトランスフェクション複合体に適用した。
この実験は、ＰＥＩ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）又はＴｒａｎｓＩＴ２０２０（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ、米国）のいずれかの両親媒性構造体中のＡｄｌｕｃ及びＲｅｎｉｌｌａプラスミドを用いたジャーカットＥ６細胞（ヒト白血病Ｔ細胞リンパ芽球細胞）（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）、英国）におけるトランスフェクションのプロセスに本発明のパルス化技術が及ぼす効果を調べるために行った。パルス化技術は、ａ）トランスフェクションプロセス中の細胞及びトランスフェクション混合物（トランスフェクション複合体）のみ；及びｂ）細胞とのトランスフェクション複合体を形成する前のトランスフェクション混合物及び次にトランスフェクションプロセス中のトランスフェクション複合体に適用した。
【0195】
＜消耗品＞
Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）Ｉ低血清培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、米国）
ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ、米国）
ＲＰＭＩ培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、英国）
２×２４ウェルプレートＮｕｎｃ（１．９ｃｍ2／ウェル）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、米国）
１μｇのＡｄＬｕｃプラスミド／ウェル（ルシフェラーゼ発現プラスミド／ＤＮＡ）（英国ダンディー大学が作製）
８０ｎｇ Ｒｅｎｉｌｌａプラスミド／ウェル（ルシフェラーゼ発現プラスミド／ＤＮＡ）（英国ダンディー大学が作製）
Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ（商標）ポリエチレンイミン、線状、分子量２５，００（ＰＥＩ）（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）
ＴｒａｎｓＩＴ２０２０（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ、米国）
Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）Ｉ低血清培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、米国）
ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ、米国）
ＲＰＭＩ培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、英国）
２×２４ウェルプレートＮｕｎｃ（１．９ｃｍ2／ウェル）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、米国）
１μｇのＡｄＬｕｃプラスミド／ウェル（ルシフェラーゼ発現プラスミド／ＤＮＡ）（英国ダンディー大学が作製）
８０ｎｇ Ｒｅｎｉｌｌａプラスミド／ウェル（ルシフェラーゼ発現プラスミド／ＤＮＡ）（英国ダンディー大学が作製）
Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ（商標）ポリエチレンイミン、線状、分子量２５，００（ＰＥＩ）（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）
ＴｒａｎｓＩＴ２０２０（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ、米国）
【0196】
＜方法ステップ＞
＜対照 － ＰＥＩを使用＞
１．６５０μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地を第１のチューブ内で１３μｇのＡｄＬｕｃプラスミド及び１μｇのＲｅｎｉｌｌａプラスミドと混合した；
２．６５０μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地を第２のチューブ内で４２μｇのＰＥＩと混合した；
３．Ｖｏｒｔｅｘ－Ｇｅｎｉｅ２、モデルＧ５６０Ｅ、（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、米国）を使用して第２のチューブの内容物を第１のチューブに滴下する方式で穏やかにボルテックスしながら混合し、１．３ｍＬの最終容積の混合物を実現させた；
４．トランスフェクション混合物を室温（約２０℃）で１５分間培養した；
５．次に１００μＬのこの培養したトランスフェクション混合物を、２つの２４ウェルプレート（プレート１及び２）の各々のＡ１～Ａ６と名付けたウェルに分注した。これがトランスフェクション混合物を形成した。
＜対照 － ＰＥＩを使用＞
１．６５０μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地を第１のチューブ内で１３μｇのＡｄＬｕｃプラスミド及び１μｇのＲｅｎｉｌｌａプラスミドと混合した；
２．６５０μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地を第２のチューブ内で４２μｇのＰＥＩと混合した；
３．Ｖｏｒｔｅｘ－Ｇｅｎｉｅ２、モデルＧ５６０Ｅ、（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、米国）を使用して第２のチューブの内容物を第１のチューブに滴下する方式で穏やかにボルテックスしながら混合し、１．３ｍＬの最終容積の混合物を実現させた；
４．トランスフェクション混合物を室温（約２０℃）で１５分間培養した；
５．次に１００μＬのこの培養したトランスフェクション混合物を、２つの２４ウェルプレート（プレート１及び２）の各々のＡ１～Ａ６と名付けたウェルに分注した。これがトランスフェクション混合物を形成した。
【0197】
＜発明 － トランスフェクション複合体が生み出される前のトランスフェクション混合物に対するパルス化技術有り、ＰＥＩを使用＞
１．次に、上記のステップ１～３を繰り返し、但しステップ４において－トランスフェクション混合物を形成する混合物は、第１のチューブを本発明に係るパルス化電磁信号機器上に位置させることにより、室温（約２０℃）で１５分間培養した。パルス化機器は、上記に記載したとおり動作する（即ち、パルス化機器は、２．４５ＧＨｚ±５０ＭＨｚで、出力２ｍＷで、１５Ｈｚのパルス化周波数を用いて動作させた）。
２．１００μＬのこの培養したパルス化トランスフェクション混合物を、２つの２４ウェルプレート（プレート１及び２）の各々のＢ１～Ｂ６と名付けたウェルに分注した。
１．次に、上記のステップ１～３を繰り返し、但しステップ４において－トランスフェクション混合物を形成する混合物は、第１のチューブを本発明に係るパルス化電磁信号機器上に位置させることにより、室温（約２０℃）で１５分間培養した。パルス化機器は、上記に記載したとおり動作する（即ち、パルス化機器は、２．４５ＧＨｚ±５０ＭＨｚで、出力２ｍＷで、１５Ｈｚのパルス化周波数を用いて動作させた）。
２．１００μＬのこの培養したパルス化トランスフェクション混合物を、２つの２４ウェルプレート（プレート１及び２）の各々のＢ１～Ｂ６と名付けたウェルに分注した。
【0198】
＜対照 － ＴｒａｎｓＩＴ２０２０を使用＞
５．７００μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地を第１のチューブ内で１３μｇのＡｄＬｕｃプラスミド及び１μｇのＲｅｎｉｌｌａプラスミドと混合した；
６．４２μＬのＴｒａｎｓＩＴ２０２０を加え、Ｖｏｒｔｅｘ－Ｇｅｎｉｅ ２、モデルＧ５６０Ｅ、（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、米国）を使用してボルテックスすることにより混合した；
７．トランスフェクション混合物を室温（約２０℃）で１５分間培養した
８．５０μＬのこの培養したトランスフェクション混合物を、２つの２４ウェルプレート（プレート１及び２）の各々のＣ１～Ｃ６と名付けたウェルに分注した。
５．７００μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地を第１のチューブ内で１３μｇのＡｄＬｕｃプラスミド及び１μｇのＲｅｎｉｌｌａプラスミドと混合した；
６．４２μＬのＴｒａｎｓＩＴ２０２０を加え、Ｖｏｒｔｅｘ－Ｇｅｎｉｅ ２、モデルＧ５６０Ｅ、（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、米国）を使用してボルテックスすることにより混合した；
７．トランスフェクション混合物を室温（約２０℃）で１５分間培養した
８．５０μＬのこの培養したトランスフェクション混合物を、２つの２４ウェルプレート（プレート１及び２）の各々のＣ１～Ｃ６と名付けたウェルに分注した。
【0199】
＜発明 － トランスフェクション複合体が生み出される前のトランスフェクション混合物に対するパルス化技術有り、ＴｒａｎｓＩＴ２０２０を使用＞
３．ＴｒａｎｓＩＴ２０２０対照についての上記のステップ１～２を繰り返した。ステップ３において－トランスフェクション混合物は、第１のチューブを本発明に係るパルス化電磁信号機器上に位置させることにより、室温（約２０℃）で１５分間培養した。パルス化機器は、２．４５ＧＨｚ±５０ＭＨｚで、出力２ｍＷで、１５Ｈｚのパルス化周波数を用いて動作させた。
４．５０μＬのこの培養したパルス化トランスフェクション混合物を、２つの２４ウェルプレート（プレート１及び２）の各々のＤ１～Ｄ６と名付けたウェルに分注した。
３．ＴｒａｎｓＩＴ２０２０対照についての上記のステップ１～２を繰り返した。ステップ３において－トランスフェクション混合物は、第１のチューブを本発明に係るパルス化電磁信号機器上に位置させることにより、室温（約２０℃）で１５分間培養した。パルス化機器は、２．４５ＧＨｚ±５０ＭＨｚで、出力２ｍＷで、１５Ｈｚのパルス化周波数を用いて動作させた。
４．５０μＬのこの培養したパルス化トランスフェクション混合物を、２つの２４ウェルプレート（プレート１及び２）の各々のＤ１～Ｄ６と名付けたウェルに分注した。
【0200】
＜細胞株をプレート１及び２に加えた＞
－ プレート１及び２について、ＲＰＭＩ及び１０％ＦＣＳ中のジャーカットＥ６細胞を２つの２４ウェルプレートの各ウェルに２×１０5細胞／ウェルで加えることによりトランスフェクション複合体を生み出し、次に最終容積が６００μＬとなるように構成した。
－ プレート１及び２をインキュベーターにおいて３７℃、５％ＣＯ2で一晩培養した；
－ プレート１では、一晩の培養段階にある間、トランスフェクション複合体にパルス化技術は与えられなかったが、一方、プレート２は、一晩の培養段階にある間、本発明に係るパルス化技術に３時間供された。
－ 各実験条件について３つのウェルの平均値を測定し、記録した。
－ プレート１及び２について、ＲＰＭＩ及び１０％ＦＣＳ中のジャーカットＥ６細胞を２つの２４ウェルプレートの各ウェルに２×１０5細胞／ウェルで加えることによりトランスフェクション複合体を生み出し、次に最終容積が６００μＬとなるように構成した。
－ プレート１及び２をインキュベーターにおいて３７℃、５％ＣＯ2で一晩培養した；
－ プレート１では、一晩の培養段階にある間、トランスフェクション複合体にパルス化技術は与えられなかったが、一方、プレート２は、一晩の培養段階にある間、本発明に係るパルス化技術に３時間供された。
－ 各実験条件について３つのウェルの平均値を測定し、記録した。
【0201】
＜＜ルシフェラーゼアッセイプロトコル－デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）を使用＞＞
＜方法ステップ － 上記に説明したとおり＞
＜方法ステップ － 上記に説明したとおり＞
【0202】
＜＜実験４の結果＞＞
＜＜表６＞＞
表６は、ＰＥＩ又はＴｒａｎｓＩＴ２０２０両親媒性構造体及び関連する方法論を使用したＡｄＬｕｃ及びＲｅｎｉｌｌａプラスミドについてのジャーカットＥ６細胞実験の結果を示す。
実験Ａ － ここでは、パルス化技術がトランスフェクション複合体に対してのみ（即ち、トランスフェクション混合物を細胞に加え終えた後、培養中に）適用された。
実験Ｂ － ここでは、パルス化技術が（ジャーカットＥ６細胞を加える前の）トランスフェクション混合物に対してのみ適用された。
実験Ｃ － ここでは、パルス化技術が、ジャーカットＥ６細胞を加える前の）トランスフェクション混合物に対して適用され、次にトランスフェクション複合体に対してもまた（即ちトランスフェクション混合物を細胞に加え終えた後、培養中に）適用された。
＜＜表６＞＞
表６は、ＰＥＩ又はＴｒａｎｓＩＴ２０２０両親媒性構造体及び関連する方法論を使用したＡｄＬｕｃ及びＲｅｎｉｌｌａプラスミドについてのジャーカットＥ６細胞実験の結果を示す。
【表6】
実験Ｂ － ここでは、パルス化技術が（ジャーカットＥ６細胞を加える前の）トランスフェクション混合物に対してのみ適用された。
実験Ｃ － ここでは、パルス化技術が、ジャーカットＥ６細胞を加える前の）トランスフェクション混合物に対して適用され、次にトランスフェクション複合体に対してもまた（即ちトランスフェクション混合物を細胞に加え終えた後、培養中に）適用された。
【0203】
実験４の結果
表６及び図８を参照すると、グラフの各棒が、３レプリケートの平均を表している。トランスフェクション複合体のみがパルス化技術を受けたとき、トランスフェクション効率の１．７倍の増加が認められた。トランスフェクション混合物のみがパルス化技術を受けたとき、トランスフェクション効率の２．０倍の増加が認められた。トランスフェクション混合物及びトランスフェクション複合体の両方がパルス化技術を受けたとき、トランスフェクション効率の２．３倍の増加が認められた。したがって、本発明に係るパルス化技術を用いると、トランスフェクション混合物又はトランスフェクション複合体単独に対して使用したときのいずれも、トランスフェクション効率が有意に増加したが、パルス化技術をトランスフェクション混合物及びトランスフェクション複合体の両方に適用したとき、トランスフェクション効率の更なる増加が認められたと結論付けることができる。
表６及び図８を参照すると、グラフの各棒が、３レプリケートの平均を表している。トランスフェクション複合体のみがパルス化技術を受けたとき、トランスフェクション効率の１．７倍の増加が認められた。トランスフェクション混合物のみがパルス化技術を受けたとき、トランスフェクション効率の２．０倍の増加が認められた。トランスフェクション混合物及びトランスフェクション複合体の両方がパルス化技術を受けたとき、トランスフェクション効率の２．３倍の増加が認められた。したがって、本発明に係るパルス化技術を用いると、トランスフェクション混合物又はトランスフェクション複合体単独に対して使用したときのいずれも、トランスフェクション効率が有意に増加したが、パルス化技術をトランスフェクション混合物及びトランスフェクション複合体の両方に適用したとき、トランスフェクション効率の更なる増加が認められたと結論付けることができる。
【0204】
本発明の一実施形態において、図９ａ及び図９ｂに示されるとおり、１つ以上の試薬のトランスフェクション効率及び／又は細胞内送達を向上させるため、患者に１つ以上の治療的処置方法を提供するため、患者への医薬品用及び／又は治療用試薬の送達を増加させるため、遺伝子発現、タンパク質発現を増加及び／又は減少させるためなどに使用することのできる電子機器の形態の装置３０１が提供される。
【0205】
装置３０１は、先述のとおり、所与の周波数で、所与のパルス率で、所与の出力レベルで、及び所与の期間の時間にわたってパルス化電磁信号を発する能力を有する。しかしながら、この装置３０１は、患者の身体に隣接して装着されることにより、使用時にパルス化電磁信号を患者の身体に指向させることを許容し得る。所与のパラメーターは、製造者によって事前に設定されてもよく、又は要求に応じてユーザー選択可能なものであってもよい。
【0206】
装置３０１は筐体３０２を含み、これはパルス化信号伝送システムを含んでいる。詳細には、この例では、パルス化信号伝送システムは、典型的には集積回路の一部として提供される、電子伝送チップ３０４の形態の伝送手段を含む回路基板３０７を含み、伝送手段は、使用時に機器が操作可能な状態にあるときパルス化電磁信号の伝送を許容する。
【0207】
一例において、筐体は、それぞれ、基面３０３と、基面の反対側の上面３１１と、上面３１１と基面３０３との間に位置する１つ以上の側壁３１３とを含む。
【0208】
装置３０１の選択的な操作を許容するため、制御ユニット３１０の形態の制御手段が提供され得る。データ、１つ以上の操作パラメーター、ソフトウェアなどを格納して必要なときに検索を許容するため、記憶装置３０６が提供される。制御ユニットは、好ましくは、データの処理などを許容する超小型演算処理手段を含む。
【0209】
装置３０１はまた、装置に電力を供給する１つ以上の電力セル３１０も含む可能性がある。任意選択で、電力セルを交換しなければならないのでなく、むしろ遠隔電源から充電することが許容されるように、充電可能設備もまた提供することができる。
【0210】
電子伝送チップ３０４は、使用時に装置３０１からパルス化電磁信号を１つ又は複数の特定の方向に発するように筐体３０２に配設される。パルス化電磁信号の伝送方向は、典型的には、装置１がどのような目的で使用されるものなのかに依存することになる。装置がユーザーによる装着用に使用されるものである場合、信号は典型的には、基面３０３を通ってユーザーに向かうように指向される。
【0211】
本発明の一実施形態において、電子伝送チップは、使用時にユーザーの皮膚と接触することになる筐体３０２の表面からの間隔が５ｃｍ未満、好ましくは約１ｃｍとなるように筐体３０２に配設される。これは、使用時にチップが発する電磁信号を患者へと指向させることを許容する。
【0212】
本発明の装置は、室温（即ち約２０℃）で、室温よりも低い温度の中で使用されるように設計され、及び／又は例えば患者の体温など、室温を上回る温度で使用することができる。
【0213】
一実施形態において、制御ユニット３１０は、伝送チップがパルス化電磁信号を２．４５ＧＨｚ±５０ＭＨｚの周波数で、１５Ｈｚのパルス化周波数で、及び約２ｍＷの出力で発することを許容するために伝送チップを制御するようにプログラムされる。パルス化電磁信号に関連するパラメーターは、必要に応じて調整されてもよく、及び／又はユーザー選択可能なものであってもよいことは理解されるであろう。例えば、必要であれば、パルス化電磁信号を発する時間をユーザーが選択することができる。加えて、出力を調整することができ、但しこれは、使用時に容器１６内に納められた細胞に過剰な電流が流れるのを回避するため、典型的にはミリワット範囲に保たれる。一例において、パルス化信号は１ｍｓ間持続し、信号間の休止期間は６６ｍｓである。これは、２％未満のデューティサイクルを提供する。
【0214】
しかしながら、使用時に電子装置により、工業、医療及び科学用周波数帯域幅（即ち、２．４～２．４８３５ＧＨｚ、好ましくは２．４５ＧＨｚ±５０ＭＨｚ）の任意の周波数伝送が可能であり得ることに留意しなければならない。
【0215】
一例において、電磁信号は、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ ＬＥプロトコルのアドバタイズ機能を使用したＲＦ信号であり、０．４５～０．５５の間のＧＦＳＫを用いて伝送される。しかしながら、使用時に電子装置により、工業、医療及び科学用周波数帯域幅の任意の周波数伝送が可能であり得ることに留意しなければならない。
【0216】
図９ａに示される例では、装置がユーザーの要求に従い構成されることを許容するため、パルスの特定のパルス系列、周波数、タイミング、及び／又は強度の選択を許容する選択手段３０５が提供される。
【0217】
図９ａ及び図９ｂに示される実施形態において、装置３０１は、患者の皮膚３１２の表面に直接位置させるように例示される。この例では、装置３０１をユーザーの身体に着脱可能に取り付けるためのバンド３１４の形態の取付手段が提供される。より詳細には、バンド３１４が患者の腕又は肢に巻き付けられ、それにより筐体３０２が患者の皮膚の一部分に対して所要の位置に固定される。或いは、皮膚と接触することになる筐体の基面３０３には、それを患者の皮膚に所要の位置で付着させることを許容するように、その上に接着剤が提供されてもよい。使用時に装置３０１が操作されると、筐体３０２から発せられるパルス化電磁信号３２２が患者の皮膚の少なくとも一部分に入り込み、恐らくは患者の身体の組織３２４及び細胞に更に入り込む。
【0218】
本発明の別の実施形態において、図１０ａ及び図１０ｂに示されるとおり、装置筐体３０２は薬剤送達「パッチ」３２５（「経皮パッチ」と称されることもある）の上に位置し、次にはそれが、ユーザーの皮膚３１２の一部分に付着される。この実施形態において、パルス化電磁信号３２２は筐体３０２から発せられ、パッチ３２５に指向されてそこに入り、パッチのうち試薬又は薬剤３２６を含む部分を通って皮膚３１２に至る。薬剤は、ユーザーの皮膚を通過することによってユーザーの組織及び細胞３２４へと送達される。パルス化電磁信号を使用すると、ユーザーの皮膚を通じた薬剤の吸収及び取込みが亢進する。「薬剤」と言うとき、それは必要に応じて任意の試薬、医薬品用及び／又は治療用試薬を意味し得る。
【0219】
本発明の別の実施形態において、図１１に示されるとおり、本装置は、埋込み可能な機器として提供される。より詳細には、本装置の筐体３０２は、ユーザーの皮膚３１２の下及び／又はユーザーの組織３２４に皮下埋込みされる無菌外装を提供する。埋め込まれると、本装置はそこからパルス化電磁信号３２２を発する。このインプラントは、信号３２２を所望の方向に、例えば癌性腫瘍３２８に向かって発するように位置する。
【0220】
本発明のなおも更なる実施形態において、図１２ａ及び図１２ｂに示されるとおり、本装置はペンダント３３６の形態で提供される。この図では、ペンダントはチェーン３３７に装着され、ペンダントが患者又は人３３９の咽喉／胸郭上部３３８の高さに位置するように配設される。次にはパルス化電磁信号３２２が、図１２ａの矢印３４１によって指示されるとおり、ペンダントから着用者の身体へと指向される。ペンダント３３６の表面３４３は、ペンダントが所要の位置で装着されたときに人の最も近くに位置することが可能であるように配設される。
【0221】
一例において、本発明の装置は、ウイルス増殖を最小限に抑えるために、及び着用者に一層高い免疫学的防御を提供する手段として装着される可能性がある。したがって、この実施形態において、ペンダント３３６が咽喉／胸郭上部の高さに装着されるとき、着用者のこの決定的に重要な呼吸領域の免疫が高められる。
【0222】
典型的には、いずれの実施形態においても、本発明の装置は、所与の位置に局所的及び集中的な治療を提供するように選択されたユーザーの皮膚の一部分に、又はそれに隣接して提供される。
【0223】
例えば、本装置の目的が患者の癌性腫瘍に対する治療を提供することである場合、本装置は、例えば肝臓、腎臓、乳房又は骨に存在し得るなどの、認識されている癌性腫瘍に近接して位置するか、又はそこに埋め込まれる。或いは、本装置が、治療的利益を実現するため、又は感染症の可能性を制限若しくは防止するために提供されることになる場合、本装置は、患者の体外に、患者又は人の咽喉領域など、治療的又は予防的効果が最も有益になると考えられる患者の身体の一部分に隣接して位置してもよい。
【0224】
したがって、装置が患者の皮膚３１２上に直接位置する場合、パルス化電磁信号は皮膚を通じて腫瘍の中へと発せられ、腫瘍細胞の状態の変化を提供する。本装置が、例えば図１０ａ及び図１０ｂに示されるとおりのものなど、パッチ又は他の薬剤担持物品と併せて使用されることになる場合、そのとき薬剤は、従来可能であろうよりも容易に患者の皮膚を通過することが可能になる。パルス化電磁信号は、皮膚の細孔の孔径を増加させて、薬剤がそこを通過するためのより大きな空間を許容すると考えられる。したがって、医薬品用薬剤又は他の試薬は、本発明を用いると、一層効率的かつ有効に送達することができる。加えて、現在は経皮的に提供することができない医薬品用薬剤又は他の試薬も、本発明の方法を用いると、ここでは身体内へと供給することができる。本発明の装置が提供されることにより、皮膚透過性の増加によって薬剤の送達が亢進するとともに、直接処理する利益が提供される。
【0225】
上記の例は、様々な種類の真核細胞における両親媒性構造体と会合した核酸の形態の試薬のトランスフェクションが、トランスフェクションプロセスの様々な段階で本発明のパルス化技術に曝された後に有意に向上することを示しているが、本出願人らは、両親媒性構造体と会合したときの１つ以上の医薬品用及び／又は治療用試薬又は化合物、５キロダルトン未満の小分子又は小分子材料、約５キロダルトン以上の大型分子又は大型分子材料、１つ以上のタンパク質、ワクチン、有機剤、及び／又は１つ以上の抗体のトランスフェクション及び／又は細胞内送達が、それを本発明のパルス化技術に曝すと、１つ以上の真核細胞において有意に向上することを全面的に期待し、予想している。このような予想及び期待は、英国特許出願第ＧＢ２００４４１１．１号明細書、同第ＧＢ２００９２９７．９号明細書、同第ＧＢ２００４４１１２．９号明細書及び同第ＧＢ２００９２９６．１号明細書（これらの内容は参照により本明細書に援用される）からの優先権を主張する本出願人らの同時係属出願において本出願人らが既に収集したデータに基づいており、これらの特許出願は、本発明のパルス化技術に曝したとき、ドキソルビシンの形態の「ネイキッド試薬」（両親媒性構造体と会合していない）の真核細胞における細胞内送達が有意に向上することを示すものである。本願の特許請求の範囲の広さについてサポートを示すため、これらの実験のデータを以下に再掲する。本出願人は、試薬を両親媒性構造体と会合したときのトランスフェクション効率及び／又は細胞内送達の向上について、「ネイキッド試薬」（即ち両親媒性構造体と会合していない）が使用されるときと同じ又は類似の機序を予想する。これは、本発明に係るパルス化した電磁波又は電磁信号が、比較的長い休止又は緩和期間でＨ2Ｏをその双極子の周りに周期的に回転させるのに十分であると考えられることが理由である。Ｈ2Ｏの周期的回転は、真核細胞のリン脂質二重層又は細胞膜の水素結合を遮断すると考えられる。したがって、細胞膜のこの周期的又は断続的な低エネルギーの摂動が、例えば、核酸又は試薬と細胞膜など、試薬、一部の分子及び／又は細胞膜及びそれらの環境との相互作用の増加を刺激すると考えられる。パルス化電磁信号のパルス間の比較的長い休止又は緩和期間は、細胞の完全性を維持するのに十分であると考えられる。
【0226】
本出願人の同時係属中の特許出願から引用する以下の実験では、真核細胞株に加えたときのドキソルビシンの形態の「ネイキッド試薬」に対して、本発明の同じパルス化技術が用いられた。
【0227】
処理の２４時間前に、２つのＣＥＬＬＳＴＡＲ（登録商標）６ウェルプレート（９．６ｃｍ2）にある５ｍＬの最終容積のダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、米国）＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ、米国）にヒト結腸腫瘍（ＨＣＴ）１１６細胞（付着細胞）（ＡＴＣＣ、米国－ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－２４７（商標））を各ウェルにつき３×１０5細胞の密度で播種した。
【0228】
使用したネイキッド試薬は、無水エタノール中のドキソルビシン（０．２５μＭ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）であり、これを１時間の処理期間にわたって細胞に与え、５％ＣＯ2にて３７℃で培養した。
【0229】
処理後、培地を除去し、細胞に新鮮培地を加えた。プレートの一方は、５％ＣＯ2にて３７℃で直接培養し、第２のプレートは別のインキュベーターに配置し、本発明のパルス化技術を用いて５％ＣＯ2にて３７℃でパルス処理した。
【0230】
３時間、６時間、９時間、１６時間又は２４時間処理した時点でタンパク質抽出物を回収し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分析にかけた。
【0231】
参考文献［５］に、以下のウエスタンブロットプロトコルが提示される。
【0232】
＜ウエスタンブロット用のタンパク質抽出物の調製＞
１．タンパク質抽出のため、細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、次に、１×Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）プロテアーゼ阻害薬カクテル（Ｒｏｃｈｅ、スイス）を補足したＮＰ－４０抽出緩衝液（５０ｍＭトリス ｐｈ７．５；１０％グリセロール；０．１％「ＮＰ－４０ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ」（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国）；１００ｍＭ ＮａＣｌ；０．２ｍＭ ＥＤＴＡ）で溶解させた。抽出物を超音波処理し（２０秒、２０％振幅）、ＢＣＡ（商標）タンパク質アッセイキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）を製造者の推奨に従い使用してタンパク質濃度を決定した。
１．タンパク質抽出のため、細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、次に、１×Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）プロテアーゼ阻害薬カクテル（Ｒｏｃｈｅ、スイス）を補足したＮＰ－４０抽出緩衝液（５０ｍＭトリス ｐｈ７．５；１０％グリセロール；０．１％「ＮＰ－４０ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ」（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国）；１００ｍＭ ＮａＣｌ；０．２ｍＭ ＥＤＴＡ）で溶解させた。抽出物を超音波処理し（２０秒、２０％振幅）、ＢＣＡ（商標）タンパク質アッセイキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）を製造者の推奨に従い使用してタンパク質濃度を決定した。
【0233】
＜ウエスタンブロットプロトコル＞
１．タンパク質抽出物（実験に応じて１５／２０μｇ）に、０．１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）及び１×ＬＤＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）を補足し、９５℃で１０分間加熱した後、ＮｕＰＡＧＥ １０％ビス－トリスポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）にロードした。
２．１×ＭＯＰＳランニング緩衝液を用いた電気泳動法（１００Ｖ）によってタンパク質試料を分離した。２０％メタノールを補足した１×転写緩衝液中でニトロセルロース膜（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、米国からのＰｒｏｔｒａｎ ０．１μｍ）へのタンパク質の転写を１２Ｖで一晩実施した。１×転写緩衝液は、１４４ｇのグリシン及び３０ｇトリス塩基を含有する１０×ウエスタンブロット溶液から１ＬミリＱ水の最終容積で調製する。
３．ＰＢＳ－０．１％Ｔｗｅｅｎ２０中に希釈した５％ＢＳＡで膜を３０分間ブロックした後、一次抗体（マウスモノクローナル抗体ＤＯ１）と共に一晩培養した。ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０で１５分間洗浄した後、対応する二次抗体（ＨＲＰコンジュゲートロバ抗マウス）と共に膜を１時間培養した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）がコンジュゲートされた二次抗体は全て、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ ｌａｂから購入し、５％ＢＳＡ－ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０中１：１００００／１：１５０００希釈（抗体に応じて）で使用した。
１．タンパク質抽出物（実験に応じて１５／２０μｇ）に、０．１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）及び１×ＬＤＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）を補足し、９５℃で１０分間加熱した後、ＮｕＰＡＧＥ １０％ビス－トリスポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）にロードした。
２．１×ＭＯＰＳランニング緩衝液を用いた電気泳動法（１００Ｖ）によってタンパク質試料を分離した。２０％メタノールを補足した１×転写緩衝液中でニトロセルロース膜（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、米国からのＰｒｏｔｒａｎ ０．１μｍ）へのタンパク質の転写を１２Ｖで一晩実施した。１×転写緩衝液は、１４４ｇのグリシン及び３０ｇトリス塩基を含有する１０×ウエスタンブロット溶液から１ＬミリＱ水の最終容積で調製する。
３．ＰＢＳ－０．１％Ｔｗｅｅｎ２０中に希釈した５％ＢＳＡで膜を３０分間ブロックした後、一次抗体（マウスモノクローナル抗体ＤＯ１）と共に一晩培養した。ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０で１５分間洗浄した後、対応する二次抗体（ＨＲＰコンジュゲートロバ抗マウス）と共に膜を１時間培養した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）がコンジュゲートされた二次抗体は全て、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ ｌａｂから購入し、５％ＢＳＡ－ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０中１：１００００／１：１５０００希釈（抗体に応じて）で使用した。
【0234】
培養終了時に膜をＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０で１５分間、２回洗浄し、続いてＰＢＳで１０分間、最終洗浄した。Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ（商標）ＥＣＬ（Ｃｙｔｉｖａ、米国）でＡｍｅｒｓｈａｍ ＥＣＬウエスタンブロッティング検出システム（Ｃｙｔｉｖａ、米国）を用いて化学発光シグナルを検出した。
【0235】
結果
図１３を参照すると、ウエスタンブロットから、本発明のパルス化技術による処理後にｐ５３α － ｐ５３タンパク質の主要なアイソフォーム － が上方制御されたことが見て分かる。この効果は、薬剤を加えて３時間経つと間もなく認められ、処理の２４時間後に最も明らかであった。ｐ５３の他のアイソフォーム、即ち、ｄ１３３ｐ５３α、ｄ１３３ｐ５３β及びｄ１６０ｐ５３βもまた、ドキソルビシン処理後に本発明に係るパルス化技術の効果を受けて更に上方制御された。
ウエスタンブロットでは、γＨ２ＡＸをマーカーとして使用することにより、何らかの効果が認められた場合に、それが電離放射線に起因して生じたのではないことを確実にした。γＨ２ＡＸの発現は電離放射線が存在するとき変化し、本発明に係るパルス化技術と対照とのアーム間に認められる変化はないため、本発明のパルス化技術は電離放射線を発しなかったと結論付けた。
図１３を参照すると、ウエスタンブロットから、本発明のパルス化技術による処理後にｐ５３α － ｐ５３タンパク質の主要なアイソフォーム － が上方制御されたことが見て分かる。この効果は、薬剤を加えて３時間経つと間もなく認められ、処理の２４時間後に最も明らかであった。ｐ５３の他のアイソフォーム、即ち、ｄ１３３ｐ５３α、ｄ１３３ｐ５３β及びｄ１６０ｐ５３βもまた、ドキソルビシン処理後に本発明に係るパルス化技術の効果を受けて更に上方制御された。
ウエスタンブロットでは、γＨ２ＡＸをマーカーとして使用することにより、何らかの効果が認められた場合に、それが電離放射線に起因して生じたのではないことを確実にした。γＨ２ＡＸの発現は電離放射線が存在するとき変化し、本発明に係るパルス化技術と対照とのアーム間に認められる変化はないため、本発明のパルス化技術は電離放射線を発しなかったと結論付けた。
【0236】
Ｋｕ８０をローディング対照として使用することにより、各ウェルに等濃度の各試料がロードされたことを確実にした。Ｋｕ８０の濃度が等しいと、ウエスタンブロットで残りのバンドが同等になる。
【0237】
図１４を参照すると、別の実験では、一部の細胞を本発明のパルス化技術によって処理し、一部の細胞は対照として本発明のパルス化技術を受けず、５日間ドキソルビシンを加えなかった。ｐ５３α発現の変化は認められなかった。細胞に０．２５μＭドキソルビシンを１時間加えたとき、本発明に係るパルス化技術の効果を受けている細胞は、１６時間後に対照と比較してｐ５３αの有意な過剰産生を示した。
【0238】
結論として、対照アームと比較してパルス化技術アームで様々なｐ５３アイソフォームが一層上方制御されたとおり、本発明に係るパルス化技術で細胞を処理すると、細胞が培地からドキソルビシンを取り込む能力が増加するという明らかなエビデンスがある。パルス化技術アームと対照アームとの間で放射線マーカーｇＨ２ＡＸが変化しないままであったとおり、この効果は電離放射線によって生じるのではないと結論付けることができる。
【0239】
したがって、抗癌薬の送達亢進と、本発明に係るパルス化技術の直接的な処理との組み合わせ効果により、ｐ５３癌遺伝子を介した複製の調節が有益な影響を受け、癌の治療が向上する。更に、本発明のパルス化技術が健全な細胞の非突然変異型ｐ５３に及ぼす効果により、それらの細胞の修復が増加することになる。
【0240】
＜＜参考文献＞＞
［１］－ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ａｎ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｃｏｍｉｎｇ Ｏｆ Ａｇｅ－Ｔｈｅ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｄｉｓｈ Ｉｎｃ．２０２０ ｐａｇｅｓ １－４９
［２］－ Ｇｌｏｂａｌ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｏｆ ＣＡＲ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｂｒｕｃｅ Ｌｅｖｉｎｅ ｅｔ ａｌ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｖｏｌ．４，Ｍａｒｃｈ ２０７；９２－１０１；２０１７ Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐ．
［３］ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｌｉｐｉｄ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｏｆ ＤＮＡ Ｉｎｔｏ Ｐｒｉｍａｒｙ ＲａｔＨｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ－Ｓｈｅｒｉ Ｌ．Ｈｏｌｍｅｓ ｅｔ ａｌ；Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３０；３４７－３５１－Ｍａｙ １９９５－１９９５ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｂｉｏｌｏｇｙ．
［４］ Ｎｏｖａｇｅｎ－Ｕｓｅｒ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ＴＢ５１５ Ｒｅｖ．Ｂ０４１１ＪＮ－ｐａｇｅｓ １－４－２９３－Ｆｒｅｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（２０１１（著作権）ＥＭ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ）．
［５］ Ｂｏｕｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２００５，ＰＭＩＤ １６１３１６１１．
［６］ Ｌｏｎｇｏ ＰＡ，Ｋａｖｒａｎ ＪＭ，Ｋｉｍ ＭＳ，Ｌｅａｈｙ ＤＪ．“Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ（ＰＥＩ）．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０１３；５２９－２２７－２４０．Ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｂ９７８－０－１２－４１８６８７－３．０００１８－５．
［１］－ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ａｎ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｃｏｍｉｎｇ Ｏｆ Ａｇｅ－Ｔｈｅ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｄｉｓｈ Ｉｎｃ．２０２０ ｐａｇｅｓ １－４９
［２］－ Ｇｌｏｂａｌ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｏｆ ＣＡＲ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｂｒｕｃｅ Ｌｅｖｉｎｅ ｅｔ ａｌ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｖｏｌ．４，Ｍａｒｃｈ ２０７；９２－１０１；２０１７ Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐ．
［３］ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｌｉｐｉｄ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｏｆ ＤＮＡ Ｉｎｔｏ Ｐｒｉｍａｒｙ ＲａｔＨｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ－Ｓｈｅｒｉ Ｌ．Ｈｏｌｍｅｓ ｅｔ ａｌ；Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３０；３４７－３５１－Ｍａｙ １９９５－１９９５ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｂｉｏｌｏｇｙ．
［４］ Ｎｏｖａｇｅｎ－Ｕｓｅｒ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ＴＢ５１５ Ｒｅｖ．Ｂ０４１１ＪＮ－ｐａｇｅｓ １－４－２９３－Ｆｒｅｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（２０１１（著作権）ＥＭ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ）．
［５］ Ｂｏｕｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２００５，ＰＭＩＤ １６１３１６１１．
［６］ Ｌｏｎｇｏ ＰＡ，Ｋａｖｒａｎ ＪＭ，Ｋｉｍ ＭＳ，Ｌｅａｈｙ ＤＪ．“Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ（ＰＥＩ）．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０１３；５２９－２２７－２４０．Ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｂ９７８－０－１２－４１８６８７－３．０００１８－５．
【図1a】
【図1b】
【図2】
【図3】
【図4a】
【図4b】
【図4c】
【図5a】
【図5b】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9a】
【図9b】
【図10a】
【図10b】
【図11】
【図12a】
【図12b】
【図13】
【図14】
【国際調査報告】