(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-05-10
(54)【発明の名称】CRISPR-Cas13 crRNAアレイ
(51)【国際特許分類】
C12N 15/113 20100101AFI20230428BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20230428BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230428BHJP
C12N 15/50 20060101ALI20230428BHJP
C12N 15/44 20060101ALI20230428BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20230428BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20230428BHJP
A61P 31/16 20060101ALI20230428BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20230428BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230428BHJP
C07K 14/165 20060101ALN20230428BHJP
C07K 14/11 20060101ALN20230428BHJP
【FI】
C12N15/113 100Z
C12N15/09 110
C12N15/63 Z ZNA
C12N15/50
C12N15/44
A61P31/12
A61P31/14
A61P31/16
A61K31/7088
A61K48/00
C07K14/165
C07K14/11
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022558251
(86)(22)【出願日】2021-03-26
(85)【翻訳文提出日】2022-10-18
(86)【国際出願番号】 US2021024406
(87)【国際公開番号】W WO2021195525
(87)【国際公開日】2021-09-30
(32)【優先日】2020-03-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】508144129
【氏名又は名称】ユニバーシティ オブ ロチェスター
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【氏名又は名称】池田 達則
(74)【代理人】
【識別番号】100134784
【氏名又は名称】中村 和美
(72)【発明者】
【氏名】ダグラス マシュー アンダーソン
【テーマコード(参考)】
4C084
4C086
4H045
【Fターム(参考)】
4C084AA13
4C084NA13
4C084ZB33
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA13
4C086ZB33
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA01
4H045EA20
(57)【要約】
本開示は、CRISPR RNAのタンデムアレイ及び使用方法を提供する。
【選択図】
図9-2
【特許請求の範囲】
【請求項1】
少なくとも2種のCRISPR RNA(crRNA)を含むタンデムアレイであって、各crRNAがガイド配列及びダイレクトリピート(DR)配列を含む、前記タンデムアレイ。
【請求項2】
前記タンデムアレイにおける各ガイド配列が異なる、請求項1に記載のタンデムアレイ。
【請求項3】
前記タンデムアレイにおける各DR配列が異なる、請求項1または請求項2に記載のタンデムアレイ。
【請求項4】
各DR配列が前記DR配列のループ領域内にヌクレオチド変異を含む、請求項1~3のいずれか1項に記載のタンデムアレイ。
【請求項5】
各DR配列がT17またはT18ヌクレオチド変異を含む、請求項1~4のいずれか1項に記載のタンデムアレイ。
【請求項6】
各crRNAが配列番号265~274から独立して選択されるDR配列を含む、請求項1~5のいずれか1項に記載のタンデムアレイ。
【請求項7】
DR配列がガイド配列の3’に存在する、請求項1~6のいずれか1項に記載のタンデムアレイ。
【請求項8】
各ガイド配列が、独立して、コロナウイルスゲノムmRNA配列またはコロナウイルスサブゲノムmRNA配列に実質的に相補的である、請求項1~7のいずれか1項に記載のタンデムアレイ。
【請求項9】
各ガイド配列が、コロナウイルスリーダー配列、コロナウイルスS配列、コロナウイルスE配列、コロナウイルスM配列、N配列、またはコロナウイルスS2M配列に実質的に相補的である、請求項8に記載のタンデムアレイ。
【請求項10】
各ガイド配列が、独立して、配列番号168~174、176~181、186、及び187から選択される配列と少なくとも80%相同な配列に実質的に相補的である、請求項8または9に記載のタンデムアレイ。
【請求項11】
各ガイド配列が配列番号189~224から選択される配列と少なくとも80%相同な配列を含む、請求項8~10のいずれか1項に記載のタンデムアレイ。
【請求項12】
前記タンデムアレイが配列番号275と少なくとも80%相同な配列を含む、請求項8~11のいずれか1項に記載のタンデムアレイ。
【請求項13】
各ガイド配列が、独立して、インフルエンザウイルスゲノムRNA配列またはインフルエンザウイルスサブゲノムRNA配列に実質的に相補的である、請求項1~7のいずれか1項に記載のタンデムアレイ。
【請求項14】
各ガイド配列が、インフルエンザウイルスPB2配列、インフルエンザウイルスPB1配列、インフルエンザウイルスPA配列、インフルエンザウイルスNP配列、またはインフルエンザウイルスM配列に実質的に相補的である、請求項13に記載のタンデムアレイ。
【請求項15】
各ガイド配列が、独立して、配列番号225~244から選択される配列と少なくとも80%相同な配列に実質的に相補的である、請求項13または14に記載のタンデムアレイ。
【請求項16】
各ガイド配列が、配列番号245~249から選択される配列と少なくとも80%相同な配列を含む、請求項13~15のいずれか1項に記載のタンデムアレイ。
【請求項17】
前記タンデムアレイが配列番号276~279から選択される配列と少なくとも80%相同な配列を含む、請求項8~11のいずれか1項に記載のタンデムアレイ。
【請求項18】
請求項1~17のいずれか1項に記載のタンデムアレイを含む組成物。
【請求項19】
前記組成物がCasタンパク質を更に含む、請求項18に記載の組成物。
【請求項20】
前記Casタンパク質がCas13である、請求項19に記載の組成物。
【請求項21】
前記Casタンパク質が配列番号1~47から選択される配列と少なくとも80%同一な配列を含む、請求項18または請求項19に記載の組成物。
【請求項22】
前記Casタンパク質が局在化シグナルまたは輸送シグナルを更に含む、請求項18~21のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項23】
前記Casタンパク質がNESを含み、前記NESが配列番号58~59と少なくとも80%同一な配列を含む、請求項22に記載の組成物。
【請求項24】
前記Casタンパク質が核局在化シグナル(NLS)を含み、前記NLSが配列番号50~57及び323~935と少なくとも80%同一な配列を含む、請求項22に記載の組成物。
【請求項25】
前記Casタンパク質が局在化シグナルを含み、前記局在化シグナルが配列番号60~66と少なくとも80%同一な配列を含む、請求項22に記載の組成物。
【請求項26】
少なくとも2種のCRISPR RNA(crRNA)を含むタンデムアレイを生成する方法であって、各crRNAが、ガイド配列及びダイレクトリピート(DR)配列を含み、前記方法が、少なくとも2種の前記crRNA配列をライゲーションすることを含み、各crRNA配列が、固有のDR配列を含み、前記ライゲーションにより前記タンデムアレイが生成される、前記方法。
【請求項27】
対象における2種以上の固有の標的RNAの数を減少させる方法であって、前記対象に請求項1~17のいずれか1項に記載のタンデムアレイ及びCasタンパク質もしくはCasタンパク質をコードする核酸を投与すること、または請求項18~25のいずれか1項に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項28】
前記タンデムアレイが前記標的RNA配列に実質的に相補的な少なくとも2種の固有のcrRNA配列を含む、請求項27に記載の方法。
【請求項29】
ウイルス感染症を処置する方法であって、(a)少なくとも2種のCRISPR RNA(crRNA)を含むタンデムアレイであって、各crRNAが、ウイルスRNA配列に実質的に相補的なガイド配列及びダイレクトリピート(DR)配列を含む、前記タンデムアレイ、ならびに(b)Casタンパク質または前記Casタンパク質をコードする核酸を対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項30】
前記Casタンパク質がCas13である、請求項29に記載の方法。
【請求項31】
前記Casタンパク質が配列番号1~47から選択される配列と少なくとも80%同一な配列を含む、請求項29または30に記載の方法。
【請求項32】
前記Casタンパク質が局在化シグナルまたは輸送シグナルを更に含む、請求項29~31のいずれか1項に記載の方法。
【請求項33】
前記Casタンパク質がNESを含み、前記NESが配列番号58~59と少なくとも80%同一な配列を含む、請求項32に記載の方法。
【請求項34】
前記Casタンパク質が核局在化シグナル(NLS)を含み、前記NLSが配列番号50~57及び323~935と少なくとも80%同一な配列を含む、請求項32に記載の方法。
【請求項35】
前記Casタンパク質が局在化シグナルを含み、前記局在化シグナルが配列番号60~66と少なくとも80%同一な配列を含む、請求項32に記載の方法。
【請求項36】
前記Casタンパク質が配列番号68~100と少なくとも80%同一な配列を含む、請求項29~31のいずれか1項に記載の方法。
【請求項37】
前記Casタンパク質をコードする前記核酸が配列番号132~133と少なくとも80%同一な配列を含む、請求項29~36のいずれか1項に記載の方法。
【請求項38】
前記Casタンパク質をコードする前記核酸が配列番号147~166と少なくとも80%同一な配列を含む、請求項29~36のいずれか1項に記載の方法。
【請求項39】
前記ウイルス感染症がコロナウイルス感染症であり、各crRNAが、独立して、コロナウイルスゲノムmRNA配列またはコロナウイルスサブゲノムmRNA配列に実質的に相補的なガイド配列を含む、請求項29~38のいずれか1項に記載の方法。
【請求項40】
各crRNAが、独立して、コロナウイルスリーダー配列、コロナウイルスS配列、コロナウイルスE配列、コロナウイルスM配列、N配列、またはコロナウイルスS2M配列に実質的に相補的なガイド配列を含む、請求項39に記載の方法。
【請求項41】
各crRNAが、独立して、配列番号168~174、176~181、186、及び187から選択される配列と少なくとも80%相同な配列に実質的に相補的なガイド配列を含む、請求項39または請求項40に記載の方法。
【請求項42】
各crRNAが、独立して、配列番号189~224から選択される配列と実質的に少なくとも80%相同なガイド配列を含む、請求項39~41のいずれか1項に記載の方法。
【請求項43】
前記タンデムアレイが配列番号275と少なくとも80%相同な配列を含む、請求項39~42のいずれか1項に記載の方法。
【請求項44】
前記ウイルス感染症がインフルエンザ感染症であり、各crRNAが、独立して、インフルエンザウイルスゲノムRNA配列またはインフルエンザウイルスサブゲノムRNA配列に実質的に相補的なガイド配列を含む、請求項29~38のいずれか1項に記載の方法。
【請求項45】
各crRNAが、独立して、インフルエンザウイルスPB2配列、インフルエンザウイルスPB1配列、インフルエンザウイルスPA配列、インフルエンザウイルスNP配列、またはインフルエンザウイルスM配列に実質的に相補的なガイド配列を含む、請求項44に記載の方法。
【請求項46】
各crRNAが、独立して、配列番号225~244から選択される配列と少なくとも80%相同な配列に実質的に相補的なガイド配列を含む、請求項44または請求項45に記載の方法。
【請求項47】
各crRNAが、独立して、配列番号245~264から選択される配列と実質的に少なくとも80%相同なガイド配列を含む、請求項44~46のいずれか1項に記載の方法。
【請求項48】
前記タンデムアレイが配列番号276~279から選択される配列と少なくとも80%相同な配列を含む、請求項43~47のいずれか1項に記載の方法。
【請求項49】
パッケージングプラスミド、導入プラスミド、及びエンベローププラスミドを含む送達系であって、前記パッケージングプラスミドが、gag-polポリプロテインをコードする核酸配列を含み、前記導入プラスミドが、少なくとも2種のCRISPR RNA(crRNA)を含むタンデムアレイをコードする核酸配列であって、各crRNAが、ガイド配列及びダイレクトリピート(DR)配列を含む、前記核酸配列、ならびにCasタンパク質をコードする核酸配列を含み、前記エンベローププラスミドが、エンベロープタンパク質をコードする核酸配列を含む、前記送達系。
【請求項50】
前記Casタンパク質が配列番号1~47から選択される配列と少なくとも80%同一な配列を含む、請求項49に記載の送達系。
【請求項51】
前記Casタンパク質が局在化シグナルまたは輸送シグナルを更に含む、請求項49または請求項50に記載の送達系。
【請求項52】
前記局在化シグナルまたは輸送シグナルが配列番号50~66及び323~935から選択される配列と80%同一な配列を含む、請求項51に記載の送達系。
【請求項53】
前記エンベロープタンパク質がコロナウイルススパイク糖タンパク質である、請求項49~52のいずれか1項に記載の送達系。
【請求項54】
前記エンベロープタンパク質が配列番号101~129から選択される配列と少なくとも80%同一な配列を含む、請求項49~53のいずれか1項に記載の送達系。
【請求項55】
各crRNAが、独立して、コロナウイルスゲノムmRNA配列またはコロナウイルスサブゲノムmRNA配列に実質的に相補的なガイド配列を含む、請求項49~54のいずれか1項に記載の送達系。
【請求項56】
各crRNAが、独立して、コロナウイルスリーダー配列、コロナウイルスS配列、コロナウイルスE配列、コロナウイルスM配列、N配列、またはコロナウイルスS2M配列に実質的に相補的なガイド配列を含む、請求項49~55のいずれか1項に記載の送達系。
【請求項57】
各crRNAが、独立して、配列番号168~174、176~181、186、及び187から選択される配列と少なくとも80%相同な配列に実質的に相補的なガイド配列を含む、請求項49~56のいずれか1項に記載の送達系。
【請求項58】
各crRNAが、独立して、配列番号189~224から選択される配列と実質的に少なくとも80%相同なガイド配列を含む、請求項49~57のいずれか1項に記載の送達系。
【請求項59】
前記タンデムアレイが配列番号275と少なくとも80%相同な配列を含む、請求項49~58のいずれか1項に記載の送達系。
【請求項60】
各crRNAが、独立して、インフルエンザウイルスゲノムRNA配列またはインフルエンザウイルスサブゲノムRNA配列に実質的に相補的なガイド配列を含む、請求項49~52のいずれか1項に記載の送達系。
【請求項61】
各crRNAが、独立して、インフルエンザウイルスPB2配列、インフルエンザウイルスPB1配列、インフルエンザウイルスPA配列、インフルエンザウイルスNP配列、またはインフルエンザウイルスM配列に実質的に相補的なガイド配列を含む、請求項49~52及び60のいずれか1項に記載の送達系。
【請求項62】
各crRNAが、独立して、配列番号225~244から選択される配列と少なくとも80%相同な配列に実質的に相補的なガイド配列を含む、請求項49~52及び60~61のいずれか1項に記載の送達系。
【請求項63】
各crRNAが、独立して、配列番号245~264から選択される配列と実質的に少なくとも80%相同なガイド配列を含む、請求項49~52及び60~62のいずれか1項に記載の送達系。
【請求項64】
前記タンデムアレイが配列番号276~279から選択される配列と少なくとも80%相同な配列を含む、請求項49~52及び60~63のいずれか1項に記載の送達系。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、2020年3月27日に出願された米国仮出願第63/000,757号の優先権を主張し、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
一般に、哺乳動物ガイドRNA発現カセットは、ガイド配列を含むアニールしたオリゴヌクレオチドを、哺乳動物Pol IIIプロモーター、ダイレクトリピート、及び6つ以上のTのターミネーターからなるカセットにクローニングすることにより作製される。通常、Pol IIIプロモーターカセットを追加することにより複数種のガイドRNAが発現されるが、これは、ベクターの複雑性及びサイズを顕著に増大させ得る。crRNAタンデムアレイの作製は、ベクターのサイズ条件を顕著に緩和するが、長いアレイのヌクレオチド合成は、DR配列のサイズ及び反復性により妨げられる。
【発明の概要】
【0003】
一実施形態では、本開示は、少なくとも2種のCRISPR RNA(crRNA)を含むタンデムアレイを提供し、ここで、各crRNAは、ガイド配列及びダイレクトリピート(DR)配列を含む。
【0004】
一実施形態では、タンデムアレイにおける各ガイド配列は異なる。一実施形態では、タンデムアレイにおける各DR配列は異なる。一実施形態では、各DR配列は、DR配列のループ領域内にヌクレオチド変異を含む。
【0005】
一実施形態では、各DR配列は、T17またはT18ヌクレオチド変異を含む。一実施形態では、各crRNAは、配列番号265~274から独立して選択されるDR配列を含む。一実施形態では、各DR配列は、ガイド配列の3’に存在する。
【0006】
一実施形態では、各ガイド配列は、独立して、コロナウイルスゲノムmRNA配列またはコロナウイルスサブゲノムmRNA配列に実質的に相補的である。一実施形態では、各ガイド配列は、コロナウイルスリーダー配列、コロナウイルスS配列、コロナウイルスE配列、コロナウイルスM配列、N配列、またはコロナウイルスS2M配列に実質的に相補的である。一実施形態では、各ガイド配列は、独立して、配列番号168~174、176~181、186、及び187から選択される配列と少なくとも80%相同な配列に実質的に相補的である。一実施形態では、各ガイド配列は、配列番号189~224から選択される配列と少なくとも80%相同な配列を含む。一実施形態では、タンデムアレイは、配列番号275と少なくとも80%相同な配列を含む。
【0007】
一実施形態では、各ガイド配列は、独立して、インフルエンザウイルスゲノムRNA配列またはインフルエンザウイルスサブゲノムRNA配列に実質的に相補的である。一実施形態では、各ガイド配列は、インフルエンザウイルスPB2配列、インフルエンザウイルスPB1配列、インフルエンザウイルスPA配列、インフルエンザウイルスNP配列、またはインフルエンザウイルスM配列に実質的に相補的である。一実施形態では、各ガイド配列は、独立して配列番号225~244から選択される配列と少なくとも80%相同な配列に実質的に相補的である。一実施形態では、各ガイド配列は、配列番号245~249から選択される配列と少なくとも80%相同な配列を含む。一実施形態では、タンデムアレイは、配列番号276~279から選択される配列と少なくとも80%相同な配列を含む。
【0008】
一実施形態では、本開示は、本開示のタンデムアレイを含む組成物を提供する。一実施形態では、組成物は、Casタンパク質を更に含む。一実施形態では、Casタンパク質は、Cas13である。一実施形態では、Casタンパク質は、配列番号1~47から選択される配列と少なくとも80%同一な配列を含む。一実施形態では、Casタンパク質は、局在化シグナルまたは輸送シグナルを更に含む。一実施形態では、Casタンパク質は、NESを含み、ここで、当該NESは、配列番号58~59と少なくとも80%同一な配列を含む。一実施形態では、Casタンパク質は、核局在化シグナル(NLS)を含み、ここで、当該NLSは、配列番号50~57及び323~935と少なくとも80%同一な配列を含む。一実施形態では、Casタンパク質は、局在化シグナルを含み、ここで、当該局在化シグナルは、配列番号60~66と少なくとも80%同一な配列を含む。
【0009】
一実施形態では、本開示は、少なくとも2種のCRISPR RNA(crRNA)を含むタンデムアレイを作製する方法であって、各crRNAが、ガイド配列及びダイレクトリピート(DR)配列を含む、当該方法を提供する。一実施形態において、本方法は、少なくとも2種のcrRNA配列をライゲーションすることを含み、ここで、各crRNA配列は、固有のDR配列を含み、当該ライゲーションによりタンデムアレイが生成される。
【0010】
一実施形態では、本開示は、対象における2種以上の固有の標的RNAの数を減少させる方法を提供する。一実施形態では、本方法は、本開示のタンデムアレイ及びCasタンパク質もしくはCasタンパク質をコードする核酸を対象に投与すること、または本開示の組成物を投与することを含む。一実施形態では、タンデムアレイは、標的RNA配列に実質的に相補的な少なくとも2種の固有のcrRNA配列を含む。
【0011】
一実施形態では、本開示は、ウイルス感染症を処置する方法を提供する。一実施形態では、本方法は、以下を対象に投与することを含む:(a)少なくとも2種のCRISPR RNA(crRNA)を含むタンデムアレイであって、各crRNAが、ウイルスRNA配列に実質的に相補的なガイド配列及びダイレクトリピート(DR)配列を含む、当該タンデムアレイ;ならびに(b)Casタンパク質またはCasタンパク質をコードする核酸。
【0012】
一実施形態では、Casタンパク質は、Cas13である。一実施形態では、Casタンパク質は、配列番号1~47から選択される配列と少なくとも80%な同一の配列を含む。一実施形態では、Casタンパク質は、局在化シグナルまたは輸送シグナルを更に含む。一実施形態では、Casタンパク質は、NESを含み、ここで、当該NESは、配列番号58~59と少なくとも80%同一な配列を含む。一実施形態では、Casタンパク質は、核局在化シグナル(NLS)を含み、ここで、当該NLSは、配列番号50~57及び323~935と少なくとも80%同一な配列を含む。一実施形態では、Casタンパク質は、局在化シグナルを含み、ここで、当該局在化シグナルは、配列番号60~66と少なくとも80%同一な配列を含む。一実施形態では、Casタンパク質は、配列番号68~100と少なくとも80%同一な配列を含む。
【0013】
一実施形態では、Casタンパク質をコードする核酸は、配列番号132~133と少なくとも80%同一な配列を含む。一実施形態では、Casタンパク質をコードする核酸は、配列番号147~166と少なくとも80%同一な配列を含む。
【0014】
一実施形態では、ウイルス感染症は、コロナウイルス感染症であり、ここで、各crRNAは、独立して、コロナウイルスゲノムmRNA配列またはコロナウイルスサブゲノムmRNA配列に実質的に相補的なガイド配列を含む。
【0015】
一実施形態では、各crRNAは、独立して、コロナウイルスリーダー配列、コロナウイルスS配列、コロナウイルスE配列、コロナウイルスM配列、N配列、またはコロナウイルスS2M配列に実質的に相補的なガイド配列を含む。一実施形態では、各crRNAは、独立して、配列番号168~174、176~181、186、及び187から選択される配列と少なくとも80%相同な配列に実質的に相補的なガイド配列を含む。一実施形態では、各crRNAは、独立して、配列番号189~224から選択される配列と実質的に少なくとも80%相同なガイド配列を含む。一実施形態では、タンデムアレイは、配列番号275と少なくとも80%相同な配列を含む。
【0016】
一実施形態では、ウイルス感染症は、インフルエンザ感染症であり、ここで、各crRNAは、独立して、インフルエンザウイルスゲノムRNA配列またはインフルエンザウイルスサブゲノムRNA配列に実質的に相補的なガイド配列を含む。一実施形態では、各crRNAは、独立して、インフルエンザウイルスPB2配列、インフルエンザウイルスPB1配列、インフルエンザウイルスPA配列、インフルエンザウイルスNP配列、またはインフルエンザウイルスM配列に実質的に相補的なガイド配列を含む。一実施形態では、各crRNAは、独立して、配列番号225~244から選択される配列と少なくとも80%相同な配列に実質的に相補的なガイド配列を含む。一実施形態では、各crRNAは、独立して、配列番号245~264から選択される配列と実質的に少なくとも80%相同なガイド配列を含む。一実施形態では、タンデムアレイは、配列番号276~279から選択される配列と少なくとも80%相同な配列を含む。
【0017】
一実施形態では、本開示は、パッケージングプラスミド、導入プラスミド、及びエンベローププラスミドを含む送達系であって、当該パッケージングプラスミドが、gag-polポリプロテインをコードする核酸配列を含み、当該導入プラスミドが、少なくとも2種のCRISPR RNA(crRNA)を含むタンデムアレイをコードする核酸配列であって、各crRNAが、ガイド配列及びダイレクトリピート(DR)配列を含む、当該核酸配列、ならびにCasタンパク質をコードする核酸配列を含み、当該エンベローププラスミドが、エンベロープタンパク質をコードする核酸配列を含む、当該送達系を提供する。
【0018】
一実施形態では、Casタンパク質は、配列番号1~47から選択される配列と少なくとも80%同一な配列を含む。一実施形態では、Casタンパク質は、局在化シグナルまたは輸送シグナルを更に含む。一実施形態では、局在化シグナルまたは輸送シグナルは、配列番号50~66及び323~935から選択される配列と80%同一な配列を含む。一実施形態では、エンベロープタンパク質は、コロナウイルススパイク糖タンパク質である。一実施形態では、エンベロープタンパク質は、配列番号101~129から選択される配列と少なくとも80%同一な配列を含む。
【0019】
一実施形態では、各crRNAは、独立して、コロナウイルスゲノムmRNA配列またはコロナウイルスサブゲノムmRNA配列に実質的に相補的なガイド配列を含む。一実施形態では、各crRNAは、独立して、コロナウイルスリーダー配列、コロナウイルスS配列、コロナウイルスE配列、コロナウイルスM配列、N配列、またはコロナウイルスS2M配列に実質的に相補的なガイド配列を含む。一実施形態では、各crRNAは、独立して、配列番号168~174、176~181、186、及び187から選択される配列と少なくとも80%相同な配列に実質的に相補的なガイド配列を含む。一実施形態では、crRNAは、独立して、配列番号189~224から選択される配列と実質的に少なくとも80%相同なガイド配列を含む。一実施形態では、タンデムアレイは、配列番号275と少なくとも80%相同な配列を含む。
【0020】
一実施形態では、各crRNAは、独立して、インフルエンザウイルスゲノムRNA配列またはインフルエンザウイルスサブゲノムRNA配列に実質的に相補的なガイド配列を含む。一実施形態では、各crRNAは、独立して、インフルエンザウイルスPB2配列、インフルエンザウイルスPB1配列、インフルエンザウイルスPA配列、インフルエンザウイルスNP配列、またはインフルエンザウイルスM配列に実質的に相補的なガイド配列を含む。一実施形態では、各crRNAは、独立して、配列番号225~244から選択される配列と少なくとも80%相同な配列に実質的に相補的なガイド配列を含む。一実施形態では、各crRNAは、独立して、配列番号245~264から選択される配列と実質的に少なくとも80%相同なガイド配列を含む。一実施形態では、タンデムアレイは、配列番号276~279から選択される配列と少なくとも80%相同な配列を含む。
【0021】
本発明の種々の実施形態の以下の詳細な説明は、添付の図面と共に読まれる場合に、更によく理解される。本発明を例示するために、例示的実施形態を図面に示す。しかしながら、本発明は、図面に示される実施形態の厳密な構成及び手段に限定されないことを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【0022】
【
図1】コロナウイルスゲノムmRNA及びサブゲノムmRNAの概略図を示す。
【
図2】eraseRプラットフォームの概略図を示す。
【
図3】偽型化されたインテグラーゼ欠損型レンチウイルスベクターによる送達の概略図を示す。
【
図4A】
図4(A~C)は、ガイドRNAの試験、レンチウイルス生成、及び細胞標的化の概略図を示す。
図4Aは、5’及び3’CoV標的配列をコードするルシフェラーゼレポーター構築物の設計の概略図を示す。
【
図4B】
図4(A~C)は、ガイドRNAの試験、レンチウイルス生成、及び細胞標的化の概略図を示す。
図4Bは、CRISPR-Cas13構成要素をコードするレンチウイルス構築物が、ウイルスエンベロープタンパク質、例えば、ACE2受容体を発現する細胞への侵入のための特異性を提供するSARS-CoV-2コロナウイルス由来のスパイク糖タンパク質により偽型化された非組み込み型レンチウイルス粒子にパッケージングされ得ることを示す概略図を示す。これは、「コロナウイルスにより標的とされる」細胞種への特異的標的化を可能にする。
【
図4C】
図4(A~C)は、ガイドRNAの試験、レンチウイルス生成、及び細胞標的化の概略図を示す。
図4Cは、形質導入後のプロセシング及び非組み込み型レンチウイルスエピソームの形成により、CoVゲノムウイルスmRNA及びサブゲノムウイルスmRNAの急速な標的分解のためのCRISPR-Cas13構成要素の一過性の発現が可能となることを示す概略図を示す。
【
図5】SARS-CoV-2リーダー配列の保存及び標的部位を示す。
【
図6】タイリングしたSARS-CoV-2リーダーcrRNAを示す。
【
図7A】
図7(A~C)は、SARS-CoV-2リーダー配列を標的とするCRISPR-Cas13ガイドRNAの検証を示す。
図7Aは、SARS-2-CoVリーダー配列及びcrRNAの標的部位を含有するルシフェラーゼレポーターを示す概略図を示す。
【
図7B】
図7(A~C)は、SARS-CoV-2リーダー配列を標的とするCRISPR-Cas13ガイドRNAの検証を示す。
図7Bは、SARS-CoV-2リーダー配列を標的とするタイリングしたcrRNAの配列アラインメントを示す。転写制御配列(TRS)を黄色で強調する。
【
図7C】
図7(A~C)は、SARS-CoV-2リーダー配列を標的とするCRISPR-Cas13ガイドRNAの検証を示す。
図7Cは、細胞におけるCoVリーダーLucレポーター活性の、SARS-CoV-2リーダー配列(crRNA A~G)またはルシフェラーゼをコードする配列(Luc)を標的とするcrRNAによる、非標的化crRNAと比較して強力なノックダウンを実証する細胞ベースのルシフェラーゼアッセイを示す。
【
図8A】
図8(A~C)は、SARS-CoV-2ステムループ様2(S2M)配列を標的とするCRISPR-Cas13ガイドRNAの検証を示す。
図8Aは、SARS-2-CoV S2M配列及びcrRNAの標的部位を含有するルシフェラーゼレポーターを示す概略図を示す。
【
図8B】
図8(A~C)は、SARS-CoV-2ステムループ様2(S2M)配列を標的とするCRISPR-Cas13ガイドRNAの検証を示す。
図8Bは、SARS-CoV-2 S2M配列を標的とするタイリングしたcrRNAの配列アラインメントを示す。
【
図8C】
図8(A~C)は、SARS-CoV-2ステムループ様2(S2M)配列を標的とするCRISPR-Cas13ガイドRNAの検証を示す。
図8Cは、細胞におけるCoV S2M Lucレポーター活性の、SARS-CoV-2 S2M配列(crRNA A~F)またはルシフェラーゼをコードする配列(Luc)を標的とするcrRNAによる、非標的化crRNAと比較して強力なノックダウンを実証する細胞ベースのルシフェラーゼアッセイを示す。
【
図9-1】A~Cは、CRISPR-Cas13 crRNAアレイの指向性ワンステップアセンブリを示す。Aは、通常、単一のCas13タンパク質ならびに複数のスペーサー配列及びダイレクトリピート(DR)配列を含有するCRISPRアレイからなる細菌のCRISPR-Cas13遺伝子座のゲノム構成を示す概略図である。Bは、各機能的CRISPRガイドRNAがスペーサー及びダイレクトリピートを含むようにプロセシングされることを示す概略図である。スペーサー配列は、標的配列に対してアンチセンスであり、標的特異性を提供するが、DR配列は、Cas13タンパク質に結合するためのハンドルとして機能する。Cは、所望のスペーサー配列を含むオリゴヌクレオチドをアニールし、ライゲーションすることにより典型的に哺乳動物crRNA発現カセットが構築されることを示す概略図である。Dは、DRのループ領域内の許容されるヌクレオチド置換を利用することにより、複数種のガイドRNAが順序付けられたアレイが効率的に作製されることを示す概略図である。Eは、アレイアセンブリに利用され得るPspCas13b DRのループ領域内の可能な許容されるヌクレオチド置換を示す。
【
図9-2】D~Eは、CRISPR-Cas13 crRNAアレイの指向性ワンステップアセンブリを示す。Aは、通常、単一のCas13タンパク質ならびに複数のスペーサー配列及びダイレクトリピート(DR)配列を含有するCRISPRアレイからなる細菌のCRISPR-Cas13遺伝子座のゲノム構成を示す概略図である。Bは、各機能的CRISPRガイドRNAがスペーサー及びダイレクトリピートを含むようにプロセシングされることを示す概略図である。スペーサー配列は、標的配列に対してアンチセンスであり、標的特異性を提供するが、DR配列は、Cas13タンパク質に結合するためのハンドルとして機能する。Cは、所望のスペーサー配列を含むオリゴヌクレオチドをアニールし、ライゲーションすることにより典型的に哺乳動物crRNA発現カセットが構築されることを示す概略図である。Dは、DRのループ領域内の許容されるヌクレオチド置換を利用することにより、複数種のガイドRNAが順序付けられたアレイが効率的に作製されることを示す概略図である。Eは、アレイアセンブリに利用され得るPspCas13b DRのループ領域内の可能な許容されるヌクレオチド置換を示す。
【
図10】Cas13bダイレクトリピート(DR)における非必須なループ残基の同定及び検証を示す。Aは、PspCas13bダイレクトリピートのT17及びT18位での全ての可能な変異を示す。Bは、ルシフェラーゼレポーター及びcrRNA標的部位を示す概略図を示す。Cは、別個のDRループ変異を含有する2つの独立したガイドRNAを用いたCRISPR-Cas13bによるルシフェラーゼ活性のノックダウンを実証する実験結果を示す。
【
図11A】
図11(A~C)は、ガイドRNA配列によるSARS-CoV-2ルシフェラーゼレポーターの標的ノックダウンを示す。
図11Aは、単一ガイドRNAまたは3つ組ガイドRNAのアレイのいずれかをコードするCRISPR-Cas13発現カセットをコードするレンチウイルス遺伝子導入プラスミドを示す概略図である。
【
図11B】
図11(A~C)は、ガイドRNA配列によるSARS-CoV-2ルシフェラーゼレポーターの標的ノックダウンを示す。
図11Bは、5’及び3’UTR内に複数のSARS-CoV-2ウイルス配列を含有するルシフェラーゼレポーターの概略図である。
【
図11C】
図11(A~C)は、ガイドRNA配列によるSARS-CoV-2ルシフェラーゼレポーターの標的ノックダウンを示す。
図11Cは、SARS-CoV-2ルシフェラーゼレポーターを標的とする単一(LDR-D)または3つ組のガイドRNA(LDR-D/N-B/S2M-D)により駆動されるCRISPR-Cas13のRNAを標的とする構成要素の発現による、陰性対照の非標的化crRNA(NC)と比較した相対的ルシフェラーゼ活性のノックダウンを実証する実験結果を示す。
【
図12】AAVウイルスベクターにパッケージングされ得る3つ組のガイドRNAをコードするCRISPR-Cas13発現カセットの概略図を示す。
【
図13】インフルエンザウイルスの概略図を示す。Aは、インフルエンザウイルスRNA(vRNA)の概略図を示す。インフルエンザは、8つのvRNAセグメントから構成される包まれたマイナス鎖RNAウイルスである。Aは、インフルエンザウイルス粒子の概略図を示す。8つ全てのvRNAは、宿主細胞への結合及び融合のためにウイルスタンパク質のHA及びNAを利用する外膜ウイルス内にパッケージングされている。
【
図14A】
図14(A及びB)は、インフルエンザを標的とするCRISPR-Cas13によるRNA編集のための構成要素のパッケージング及び送達の概略図である。
図14Aは、CRISPRガイドRNA配列及びCas13タンパク質が含まれる、CRISPR-Cas13による編集のための構成要素が、ウイルス遺伝子治療ベクター、例えば、インテグラーゼ欠損型レンチウイルスベクターにパッケージングされ得ることを示す概略図である。インフルエンザのNA及びHAエンベロープタンパク質でのレンチウイルスベクターの偽型化は、インフルエンザウイルスにより標的とされる宿主細胞への送達のための1つの方法である。
【
図14B】
図14(A及びB)は、インフルエンザを標的とするCRISPR-Cas13によるRNA編集のための構成要素のパッケージング及び送達の概略図である。
図14Aは、ウイルスベクターの融合及び送達時に、CRISPR-Cas13構成要素の発現が、vRNAまたはウイルスmRNAの標的分解をもたらすことを示す概略図である。vRNAへの標的化のために、Cas13タンパク質の強い核局在化が必要であり得る。
【
図15】SARS-CoVスパイクエンベロープタンパク質でのレンチウイルスベクターの偽型化を実証する実験結果を示す。Aは、N及びC末端改変(4LV)が、SARS-Cov-1及びSARS-CoV-2由来のCoVスパイクタンパク質でのレンチウイルスの偽型化に必要とされることを実証する概略図を示す。Bは、野生型(WT)CoVスパイクタンパク質が、HEK293T細胞またはヒトACE2を発現するHEK293T細胞(ACE2-HEK293T)の形質導入のためのレンチウイルスの偽型化に好適でないことを実証する実験結果を示す。HEK293T細胞におけるヒトACE2受容体の発現が、4LV偽型レンチウイルスベクターによる形質導入に必要十分である。ACE2発現とは別に、VSV-Gエンベロープは、インビトロでの多数の細胞種の広範な形質導入のためのレンチウイルスの偽型化を可能にする。
【
図16】インフルエンザA型のプラス鎖及びマイナス鎖の高度に保存されたRNA配列を標的とするCas13b crRNAの活性を実証する実験結果を示す。Aは、インフルエンザA型のセグメント1、2、3、5、及び7における保存されたプラス鎖RNA配列を標的とするガイドRNAでの実験結果を示す。Bは、インフルエンザA型のセグメント1、2、3、5、及び7における保存されたマイナス鎖RNA配列での実験結果を示す。インフルエンザA型を標的とする全てのcrRNAは、対応するインフルエンザA型セグメントに特異的な標的配列を保有するルシフェラーゼレポーターの、非標的化(NT)crRNAと比較して強力なノックダウン効果を示した。
【発明を実施するための形態】
【0023】
幾つかの実施形態では、本開示は、crRNA配列のタンデムアレイを提供する。一実施形態では、タンデムアレイは、1種以上、2種以上、3種以上、4種以上、5種以上、6種以上、7種以上、または8種以上の固有のcrRNA配列を含む。
【0024】
一実施形態では、タンデムアレイのcrRNA配列は、ガイド配列及びダイレクトリピート(DR)配列を含む。一実施形態では、各DR配列は、固有である。一実施形態では、タンデムアレイは、単一のライゲーションステップにより形成され得る。
【0025】
定義
特に定義しない限り、本明細書において使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解される意味と同じ意味を有する。
【0026】
一般に、本明細書において使用される命名法ならびに細胞培養、分子遺伝学、有機化学、ならびに核酸化学及びハイブリダイゼーションにおける実験手順は、当該技術分野において周知であり、一般的に用いられるものである。
【0027】
標準的な技術が核酸及びペプチド合成に使用される。これらの技術及び手順は、一般に、当該技術分野における従来の方法及び本明細書全体にわたって提供される種々の一般的な参考文献(例えば、Sambrook and Russell,2012,Molecular Cloning,A Laboratory Approach,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY、及びAusubel et al.,2012,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,NY)に従って実行される。
【0028】
本明細書において使用される命名法ならびに以下に記載される分析化学及び有機合成において使用される実験手順は、当該技術分野において周知であり、一般的に用いられるものである。標準的技術またはその改変形態が、化学合成及び化学分析に使用される。
【0029】
本発明の文脈において(特に特許請求の範囲の文脈において)使用される用語「a」、「an」、及び「the」、ならびに同様の用語は、本明細書において特に明記しない限り、または文脈によって明らかに否定されない限り、単数形及び複数形の両方を包含するものと解釈される。
【0030】
量、持続時間などの測定可能な値に言及する場合に本明細書において使用される「約」は、指定の値から±20%、または±10%、または±5%、または±1%、または±0.1%の変動を、かかる変動が本開示の方法を実行するのに適切である場合に、包含することを意図する。
【0031】
「アンチセンス」は、特に、タンパク質をコードする二本鎖DNA分子の非コード鎖の核酸配列、または当該非コード鎖と実質的に相同である配列を指す。本明細書で定義されるように、アンチセンス配列は、タンパク質をコードする二本鎖DNA分子の配列に相補的である。アンチセンス配列がDNA分子のコード鎖のコード部分のみに相補的である必要はない。アンチセンス配列は、タンパク質をコードするDNA分子のコード鎖に定められる調節配列に相補的であり得、この調節配列は、コード配列の発現を制御する。
【0032】
「疾患」は、動物の健康の状態であって、当該動物が恒常性を維持することができず、疾患が改善されない場合、当該動物の健康が悪化し続ける、当該状態である。
【0033】
対照的に、動物における「障害」は、健康の状態であって、当該動物が恒常性を維持することができるが、当該動物の健康状態が、当該障害が存在しない場合よりも良好でない、当該状態である。障害は、処置されないまま放置されると、必ずしも動物の健康状態の更なる悪化を引き起こすわけではない。
【0034】
疾患もしくは障害の徴候もしくは症状の重症度、このような徴候もしくは症状を患者が経験する頻度、またはその両方が低減される場合、当該疾患または障害は「軽減」される。
【0035】
「コードする」とは、遺伝子、cDNA、またはmRNAなどのポリヌクレオチドにおける特定のヌクレオチド配列の固有特性であって、生物学的プロセスにおいて、既定のヌクレオチド配列(すなわち、rRNA、tRNA、及びmRNA)または既定のアミノ酸配列のいずれか、及びそれらによりもたらされる生物学的性質を有する他のポリマー及び高分子の合成のための鋳型として機能する固有特性を指す。従って、遺伝子は、その遺伝子に対応するmRNAの転写及び翻訳が、細胞または他の生物学的系においてタンパク質を生じさせる場合、タンパク質をコードする。ヌクレオチド配列がmRNA配列と同一であり、通常、配列表に示されるコード鎖、及び遺伝子またはcDNAの転写のための鋳型として使用される非コード鎖の両方が、その遺伝子またはcDNAのタンパク質または他の産物をコードすると称され得る。
【0036】
用語「患者」、「対象」、「個体」などは、本明細書において互換的に使用され、インビトロであるかインビボであるかにかかわらず、本明細書に記載される方法に適した任意の動物または細胞を指す。一実施形態では、対象としては、脊椎動物及び無脊椎動物が挙げられる。無脊椎動物としては、限定されるものではないが、Drosophila melanogaster及びCaenorhabditis elegansが挙げられる。脊椎動物としては、限定されるものではないが、霊長類、げっ歯類、飼育動物、または狩猟動物が挙げられる。霊長類としては、限定されるものではないが、チンパンジー、カニクイザル、クモザル、及びマカク(例えば、アカゲザル)が挙げられる。齧歯類としては、限定されるものではないが、マウス、ラット、マーモット、フェレット、ウサギ、及びハムスターが挙げられる。飼育動物及び狩猟動物としては、限定されるものではないが、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、バッファロー、ネコ科の種(例えば、イエネコ)、イヌ科の種(例えば、イヌ、キツネ、オオカミ)、鳥類の種(例えば、ニワトリ、エミュー、ダチョウ)、及び魚類(例えば、ゼブラフィッシュ、マス、ナマズ、及びサケ)が挙げられる。幾つかの実施形態では、対象は、哺乳動物、例えば、霊長類、例えば、ヒトである。ある種の非限定的な実施形態では、患者、対象、または個体は、ヒトである。
【0037】
抗体に関して本明細書で使用される用語「特異的に結合する」は、特異的抗原を認識するが、試料中の他の分子を実質的に認識しないか、またはそれらに結合しない抗体を意味する。例えば、1つの種由来の抗原に特異的に結合する抗体は、1つ以上の種由来のその抗原にも結合し得る。しかし、かかる異種間反応性それ自体は、抗体の特異的抗体への分類を変化させない。別の例では、抗原に特異的に結合する抗体は、当該抗原の異なるアレル型にも結合し得る。しかしながら、かかる交差反応性それ自体は、抗体の特異的抗体への分類を変化させない。
【0038】
場合によっては、用語「特異的結合」または「特異的に結合」は、抗体、タンパク質、またはペプチドと第2の化学種との相互作用に関して、当該相互作用が、当該化学種の特定の構造(例えば、抗原決定基またはエピトープ)の存在に依存することを意味するために使用され得る。例えば、抗体は、タンパク質を広く認識し、それに結合するのではなく、特異的なタンパク質構造を認識し、それに結合する。抗体がエピトープ「A」に特異的である場合、標識された「A」及び抗体を含有する反応物中のエピトープA(または遊離の非標識A)を含有する分子の存在は、抗体に結合する標識されたAの量を低減する。
【0039】
遺伝子の「コード領域」は、当該遺伝子のコード鎖のヌクレオチド残基及び当該遺伝子の非コード鎖のヌクレオチドからなり、これらは、当該遺伝子の転写により生成されるmRNA分子のコード領域にそれぞれ相同または相補的である。
【0040】
またmRNA分子の「コード領域」は、当該mRNA分子の翻訳中に転移RNA分子のアンチコドン領域に適合するか、または終止コドンをコードする、当該mRNA分子のヌクレオチド残基からなる。従って、コード領域は、mRNA分子によりコードされる成熟タンパク質に存在しないアミノ酸残基(例えば、タンパク質輸送シグナル配列のアミノ酸残基)のコドンを含むヌクレオチド残基を含み得る。
【0041】
核酸に言及するために本明細書において使用される「相補的」とは、2本の核酸鎖の領域間、または同じ核酸鎖の2つの領域間の配列相補性という広い概念を指す。第1の核酸領域のアデニン残基は、当該第1の領域に対して逆平行である第2の核酸領域の残基と、この残基がチミンまたはウラシルである場合に特異的な水素結合を形成(「塩基対形成」)できることが知られている。同様に、第1の核酸鎖のシトシン残基は、当該第1の鎖に対して逆平行である第2の核酸鎖の残基と、この残基がグアニンである場合に塩基対形成できることが知られている。2つの領域が逆平行に配置されるときに、第1の領域の少なくとも1つのヌクレオチド残基が第2の領域の残基と塩基対形成できる場合、核酸の当該第1の領域は、同一のまたは異なる核酸の当該第2の領域に相補的である。一実施形態では、第1の領域は第1の部分を含み、第2の領域は第2の部分を含み、よって、当該第1及び第2の部分が逆平行に配置される場合、当該第1の部分のヌクレオチド残基の少なくとも約50%、少なくとも約75%、少なくとも約90%、または少なくとも約95%が、当該第2の部分のヌクレオチド残基と塩基対形成できる。一実施形態では、第1の部分の全てのヌクレオチド残基が、第2の部分のヌクレオチド残基と塩基対形成できる。
【0042】
本明細書で使用する場合、用語「DNA」は、デオキシリボ核酸と定義される。
【0043】
本明細書で使用する場合、用語「発現」は、特定のヌクレオチド配列の、そのプロモーターにより促進される転写及び/または翻訳として定義される。
【0044】
本明細書で使用する場合、用語「発現ベクター」は、転写されることができる遺伝子産物の少なくとも一部をコードする核酸配列を含有するベクターを指す。場合によっては、次いで、RNA分子は、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドに翻訳される。他の場合、例えば、アンチセンス分子、siRNA、リボザイムなどの生成では、これらの配列は翻訳されない。発現ベクターは、種々の制御配列を含有し得、制御配列とは、特定の宿主生物における作動的に連結されたコード配列の転写及びおそらく翻訳に必要な核酸配列を指す。転写及び翻訳を制御する制御配列に加えて、ベクター及び発現ベクターは、他の機能を果たす核酸配列も含有し得る。
【0045】
本明細書で使用する場合、用語「野生型」は、当業者により理解される当該技術分野の用語であり、変異型またはバリアント型とは区別される、自然界に存在する典型的な型の生物、菌株、遺伝子、または特徴を意味する。
【0046】
用語「相同性」は、相補性の程度を指す。部分的な相同性または完全な相同性(すなわち、同一性)が存在し得る。相同性は、多くの場合、配列解析ソフトウェア(例えば、Genetics Computer Group.University of Wisconsin Biotechnology Center.1710 University Avenue.Madison,Wis.53705のSequence Analysis Software Package)を使用して測定される。かかるソフトウェアは、種々の置換、欠失、挿入、及び他の改変に相同性の程度を割り当てることによって、類似配列を比べる。保存的置換は典型的に、以下のグループ内での置換を含む:グリシン、アラニン;バリン、イソロイシン、ロイシン;アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン;セリン、トレオニン;リシン、アルギニン;及びフェニルアラニン、チロシン。
【0047】
「核酸」とは、デオキシリボヌクレオシドから構成されているか、またはリボヌクレオシドから構成されているかにかかわらず、かつホスホジエステル結合から構成されているか、または修飾された結合、例えば、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチルエステル、アセトアミデート、カルバメート、チオエーテル、架橋ホスホロアミデート、架橋メチレンホスホネート、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオエート、架橋ホスホロチオエート、もしくはスルホン結合、及びかかる結合の組み合わせから構成されているかにかかわらず、任意の核酸を意味する。また核酸という用語は、生物学的に存在する5つの塩基(アデニン、グアニン、チミン、シトシン、及びウラシル)以外の塩基から構成される核酸も具体的に包含する。用語「核酸」は、通常、大きなポリヌクレオチドを指す。
【0048】
ポリヌクレオチド配列を表現するための従来の表記法が本明細書において使用される。すなわち、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左端は、5’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左側方向は、5’方向と称される。
【0049】
新生RNA転写物へのヌクレオチドの5’から3’への付加の方向は、転写方向と称される。mRNAと同じ配列を有するDNA鎖は、「コード鎖」と称され、DNA上の基準点に対して5’側に存在するDNA鎖の配列は、「上流配列」と称され、DNA上の基準点に対して3’側にあるDNA鎖の配列は、「下流配列」と称される。
【0050】
本発明の文脈において、一般的に存在する核酸塩基の以下の略号が使用される。「A」はアデノシンを指し、「C」はシトシンを指し、「G」はグアノシンを指し、「T」はチミジンを指し、「U」はウリジンを指す。
【0051】
本明細書で使用する場合、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」は、互換的に使用され、ペプチド結合により共有結合されたアミノ酸残基から構成される化合物を指す。タンパク質またはペプチドは、少なくとも2つのアミノ酸を含有しなければならず、タンパク質またはペプチドの配列を構成し得るアミノ酸の最大数に制限は設けられていない。ポリペプチドとしては、ペプチド結合により互いに連結された2つ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質が挙げられる。本明細書で使用する場合、この用語は、当該技術分野において一般的に例えばペプチド、オリゴペプチド、及びオリゴマーとも称される短い鎖と、当該技術分野において一般にタンパク質と称され、多数の種類が存在するより長い鎖との両方を指す。「ポリペプチド」としては、例えば、とりわけ、生物学的に活性な断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドのバリアント、修飾されたポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が挙げられる。ポリペプチドとしては、天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド、またはそれらの組み合わせが挙げられる。
【0052】
本明細書で使用する場合、用語「RNA」は、リボ核酸と定義される。
【0053】
「バリアント」は、この用語が本明細書で使用される場合、それぞれ参照核酸配列または参照ペプチド配列と配列が異なるが、参照分子の基本的な生物学的性質を保持する、核酸配列またはペプチド配列である。核酸バリアントの配列の変化は、参照核酸によりコードされるペプチドのアミノ酸配列を変化させなくてもよく、アミノ酸置換、付加、欠失、融合、及び短縮化をもたらしてもよい。ペプチドバリアントの配列の変化は、通常、限定的または保存的であるため、参照ペプチド及びバリアントの配列は、全体的に極めて類似しており、多くの領域では同一である。バリアント及び参照ペプチドは、任意の組み合わせでの1つ以上の置換、付加、欠失によりアミノ酸配列が異なり得る。核酸またはペプチドのバリアントは、アレルバリアントなどの天然に存在するものであり得るか、または天然に存在することが公知でないバリアントであり得る。核酸及びペプチドの非天然バリアントは、変異誘発技術または直接合成により作製され得る。
【0054】
「ベクター」は、単離された核酸を含み、当該単離された核酸を細胞の内部に送達するために使用され得る物質の組成物である。限定されるものではないが、直鎖状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物と会合したポリヌクレオチド、プラスミド、及びウイルスが含まれる、多数のベクターが当該技術分野において公知である。従って、用語「ベクター」は、自律的に複製するプラスミドまたはウイルスを包含する。またこの用語は、細胞への核酸の導入を容易にする非プラスミド及び非ウイルスの化合物、例えば、ポリリジン化合物、リポソームなどを包含するようにも解釈されるべきである。ウイルスベクターの例としては、限定されるものではないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが挙げられる。
【0055】
本明細書で使用する場合、用語「ガイド配列」、「スペーサー配列」、「crRNA」、「ガイドRNA」、または「単一のガイドRNA」、または「gRNA」は、標的核酸配列とハイブリダイズし、ガイド配列及びCRISPRエフェクタータンパク質を含むRNAを標的とする複合体の当該標的核酸配列への配列特異的な結合を誘導するのに十分な当該標的核酸配列との相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを指す。幾つかの例示的実施形態では、相補性の程度は、好適なアラインメントアルゴリズムを使用して最適にアラインメントされる場合、約50%もしくは約50%超、約60%もしくは約60%超、約75%もしくは約75%超、約80%もしくは約80%超、約85%もしくは約85%超、約90%もしくは約90%超、約95%もしくは約95%超、約97.5%もしくは約97.5%超、約99%もしくは約99%超、またはそれ以上である。最適なアラインメントは、配列をアラインメントするための任意の好適なアルゴリズムを使用して決定され得、これらの非限定的な例としては、Smith-Watermanアルゴリズム、Needleman-Wunschアルゴリズム、Burrows-Wheeler変換に基づくアルゴリズム(例えば、Burrows Wheeler Aligner)、ClustalW、Clustal X、BLAT、Novoalign(Novocraft Technologies;www.novocraft.comで利用可能)、ELAND(Illumina、San Diego、Calif)、SOAP(soap.genomics.org.cnで利用可能)、及びMaq(maq.sourceforge.netで利用可能)が挙げられる。核酸を標的とする複合体の標的核酸配列への配列特異的な結合を誘導する(核酸を標的とするガイドRNAの)ガイド配列の能力は、任意の好適なアッセイにより評価され得る。例えば、試験されるガイド配列が含まれる、核酸を標的とする複合体を形成するのに十分な核酸を標的とするCRISPR系の構成要素が、核酸を標的とする複合体の構成要素をコードするベクターを用いた形質移入などにより対応する標的核酸配列を有する宿主細胞に提供され得、続いて、標的核酸配列内への選択的な標的化(例えば、切断)が本明細書に記載されるSurveyorアッセイなどにより評価される。同様に、標的核酸配列、試験されるガイド配列及び試験されるガイド配列と異なる対照ガイド配列が含まれる、核酸を標的とする複合体の構成要素を提供し、試験されるガイド配列での反応と対照ガイド配列での反応との間で、標的配列内での結合または切断率を比較することにより、試験管内での標的核酸配列の切断が評価され得る。他のアッセイが利用可能であり、当業者は思いつくであろう。ガイド配列及びこれによる核酸を標的とするガイドは、任意の標的核酸配列を標的とするように選択され得る。標的配列はDNAであり得る。標的配列は任意のRNA配列であり得る。幾つかの実施形態では、標的配列は、メッセンジャーRNA(mRNA)、プレmRNA、リボソームRNA(rRNA)、転移RNA(tRNA)、マイクロRNA(miRNA)、低分子干渉RNA(siRNA)、核内低分子RNA(snRNA)、核小体低分子RNA(snoRNA)、二本鎖RNA(dsRNA)、非コードRNA(ncRNA)、長鎖非コードRNA(lncRNA)、及び細胞質低分子RNA(scRNA)からなる群から選択されるRNA分子内の配列であり得る。幾つかの好ましい実施形態では、標的配列は、mRNA、プレmRNA、及びrRNAからなる群から選択されるRNA分子内の配列であり得る。幾つかの好ましい実施形態では、標的配列は、ncRNA及びlncRNAからなる群から選択されるRNA分子内の配列であり得る。幾つかのより好ましい実施形態では、標的配列は、mRNA分子またはプレmRNA分子内の配列であり得る。
【0056】
範囲:本開示の全体を通して、本発明の種々の態様が範囲形式で提示され得る。範囲形式での記載は、単に便宜及び簡潔さのためのものであり、本開示の範囲に対する融通性のない制限として解釈されるべきではないことを理解すべきである。従って、範囲の記載は、その範囲内の全ての可能な部分範囲及び個々の数値を具体的に開示していると見なされるべきである。例えば、1~6などの範囲の記載は、部分範囲、例えば、1~3、1~4、1~5、2~4、2~6、3~6など、ならびにその範囲内の個々の数、例えば、1、2、2.7、3、4、5、5.3、及び6を具体的に開示していると見なされるべきである。これは、範囲の幅に関係なく適用される。
【0057】
タンパク質
一態様では、本開示は、RNA標的切断をもたらす新規の編集タンパク質の開発に基づく。幾つかの実施形態では、タンパク質は、局在化シグナルを含む。一実施形態では、局在化シグナルは、タンパク質を標的RNAが存在する部位に局在化する。一実施形態では、タンパク質は、核内のRNAを標的とするための核局在化シグナル(NLS)を含む。一実施形態では、タンパク質は、細胞質内のRNAを標的とするための核外移行シグナル(NES)を含む。一実施形態では、融合タンパク質は、精製及び/または検出タグを含む。
【0058】
一態様では、本開示は、RNA標的切断をもたらし、効果的に送達される新規の編集タンパク質の開発に基づく。幾つかの実施形態において、タンパク質は、局在化シグナルを含む。一実施形態では、局在化シグナルは、タンパク質を標的RNAが存在する部位に局在化する。一実施形態では、タンパク質は、精製及び/または検出タグを含む。
【0059】
一態様では、本開示は、核内RNAの切断及び/またはポリアデニル化を調節することができ、核に効果的に送達される新規の編集タンパク質の開発に基づく。幾つかの実施形態では、タンパク質は、切断及び/またはポリアデニル化タンパク質を含む。幾つかの実施形態では、タンパク質は、核局在化シグナルを含む。一実施形態では、タンパク質は、精製及び/または検出タグを含む。
【0060】
編集タンパク質
一実施形態では、編集タンパク質としては、限定されるものではないが、CRISPR関連(Cas)タンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)タンパク質、及びDNAまたはRNA結合ドメインを有するタンパク質が挙げられる。
【0061】
Casタンパク質の非限定的な例としては、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csxl、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、SpCas9、StCas9、NmCas9、SaCas9、CjCas9、CjCas9、AsCpf1、LbCpf1、FnCpf1、VRER SpCas9、VQR SpCas9、xCas9 3.7、それらのホモログ、それらのオーソログ、またはそれらの改変型が挙げられる。幾つかの実施形態では、Casタンパク質は、DNAまたはRNA切断活性を有する。幾つかの実施形態では、Casタンパク質は、標的配列の位置、例えば、標的配列内及び/または標的配列の相補体内の位置での核酸分子の一方または両方の鎖の切断を誘導する。一部の実施形態では、Casタンパク質は、標的配列の最初または最後のヌクレオチドから約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約15、約20、約25、約50、約100、約200、約500塩基対、またはそれ以上の範囲内で一方または両方の鎖の切断を誘導する。一実施形態では、Casタンパク質は、Cas9、Cas13、またはCpf1である。一実施形態では、Casタンパク質は、触媒活性を欠く(dCas)。
【0062】
一実施形態では、Casタンパク質は、RNA結合活性を有する。一実施形態では、Casタンパク質は、Cas13である。一実施形態では、Casタンパク質は、PspCas13b、PspCas13bの短縮型、AdmCas13d、AspCas13b、AspCas13c、BmaCas13a、BzoCas13b、CamCas13a、CcaCas13b、Cga2Cas13a、CgaCas13a、EbaCas13a、EreCas13a、EsCas13d、FbrCas13b、FnbCas13c、FndCas13c、FnfCas13c、FnsCas13c、FpeCas13c、FulCas13c、HheCas13a、LbfCas13a、LbmCas13a、LbnCas13a、LbuCas13a、LseCas13a、LshCas13a、LspCas13a、Lwa2cas13a、LwaCas13a、LweCas13a、PauCas13b、PbuCas13b、PgiCas13b、PguCas13b、Pin2Cas13b、Pin3Cas13b、PinCas13b、Pprcas13a、PsaCas13b、PsmCas13b、RaCas13d、RanCas13b、RcdCas13a、RcrCas13a、RcsCas13a、RfxCas13d、UrCas13d、dPspCas13b、PspCas13b_A133H、PspCas13b_A1058H、dPspCas13bの短縮型、dAdmCas13d、dAspCas13b、dAspCas13c、dBmaCas13a、dBzoCas13b、dCamCas13a、dCcaCas13b、dCga2Cas13a、dCgaCas13a、dEbaCas13a、dEreCas13a、dEsCas13d、dFbrCas13b、dFnbCas13c、dFndCas13c、dFnfCas13c、dFnsCas13c、dFpeCas13c、dFulCas13c、dHheCas13a、dLbfCas13a、dLbmCas13a、dLbnCas13a、dLbuCas13a、dLseCas13a、dLshCas13a、dLspCas13a、dLwa2cas13a、dLwaCas13a、dLweCas13a、dPauCas13b、dPbuCas13b、dPgiCas13b、dPguCas13b、dPin2Cas13b、dPin3Cas13b、dPinCas13b、dPprCas13a、dPsaCas13b、dPsmCas13b、dRaCas13d、dRanCas13b、dRcdCas13a、dRcrCas13a、dRcsCas13a、dRfxCas13d、またはdUrCas13dである。追加のCasタンパク質が当該技術分野において公知である(例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Konermann et al.,Cell,2018,173:665-676 e14,Yan et al.,Mol Cell,2018,7:327-339 e5;Cox,D.B.T.,et al.,Science,2017,358:1019-1027;Abudayyeh et al.,Nature,2017,550:280-284,Gootenberg et al.,Science,2017,356:438-442;及びEast-Seletsky et al.,Mol Cell,2017,66:373-383 e3)。
【0063】
一実施形態では、Casタンパク質は、配列番号1~49のうちの1つと少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一な配列を含む。一実施形態では、Casタンパク質は、配列番号1~47のうちの1つと少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一な配列を含む。一実施形態では、Casタンパク質は、配列番号1~49のうちの1つの配列を含む。一実施形態では、Casタンパク質は、配列番号1~47のうちの1つの配列を含む。
【0064】
局在化シグナル
幾つかの実施形態では、タンパク質は、局在化シグナル、例えば、核局在化シグナル(NLS)、核外移行シグナル(NES)、またはミトコンドリアなどの細胞小器官に局在化するための、もしくは細胞質に局在化するための他の局在化シグナルを含有し得る。一実施形態では、局在化シグナルは、タンパク質を標的RNAが存在する部位に局在化する。
【0065】
核局在化シグナル
一実施形態では、タンパク質は、NLSを含む。一実施形態では、NLSは、レトロトランスポゾンNLSである。一実施形態では、NLSは、Ty1、酵母GAL4、SKI3、L29、またはヒストンH2Bタンパク質、ポリオーマウイルスラージTタンパク質、VP1もしくはVP2カプシドタンパク質、SV40 VP1もしくはVP2カプシドタンパク質、アデノウイルスElaもしくはDBPタンパク質、インフルエンザウイルスNS1タンパク質、肝炎ウイルスコア抗原、または哺乳動物のラミン、c-myc、max、c-myb、p53、c-erbA、jun、Tax、ステロイド受容体、もしくはMxタンパク質、ヌクレオプラスミン(NPM2)、ヌクレオフォスミン(NPM1)、またはシミアンウイルス40(「SV40」)T抗原に由来する。一実施形態では、NLSは、Ty1もしくはTy1由来のNLS、Ty2もしくはTy2由来のNLS、またはMAK11もしくはMAK11由来のNLSである。一実施形態では、Ty1 NLSは、配列番号50のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、Ty2 NLSは、配列番号51のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、MAK11 NLSは、配列番号52のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、NLSは、配列番号50~57及び323~935のうちの1つと少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一な配列を含む。一実施形態では、NLSは、配列番号50~57及び323~935のうちの1つの配列を含む。
【0066】
一実施形態では、NLSは、Ty1様NLSである。例えば、一実施形態では、Ty1様NLSは、KKRXモチーフを含む。一実施形態では、Ty1様NLSは、N末端にKKRXモチーフを含む。一実施形態では、Ty1様NLSは、KKRモチーフを含む。一実施形態では、Ty1様NLSは、C末端にKKRモチーフを含む。一実施形態では、Ty1様NLSは、KKRXモチーフ及びKKRモチーフを含む。一実施形態では、Ty1様NLSは、N末端のKKRX及びC末端のKKRモチーフを含む。一実施形態では、Ty1様NLSは、少なくとも20アミノ酸を含む。一実施形態では、Ty1様NLSは、20~40アミノ酸を含む。一実施形態では、Ty1様NLSは、配列番号323~935のうちの1つと少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一な配列を含む。一実施形態では、NLSは、配列番号323~935のうちの1つの配列を含み、ここで、当該配列は、1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、6つ以上、7つ以上、8つ以上、9つ以上、または10以上の挿入、欠失、または置換を含む。一実施形態では、Ty1様NLSは、配列番号323~935のうちの1つの配列を含む。
【0067】
一実施形態では、NLSは、2コピーの同じNLSを含む。例えば、一実施形態では、NLSは、第1のTy1由来のNLS及び第2のTy1由来のNLSの多量体を含む。
【0068】
核外移行シグナル
一実施形態では、タンパク質は、核外移行シグナル(NES)を含む。一実施形態では、NESは、Casタンパク質のN末端に結合している。一実施形態では、NESは、細胞質RNAを標的とするためにタンパク質を細胞質に局在化する。一実施形態では、NESは、配列番号58または59と少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、NESは、配列番号58または59のアミノ酸配列を含む。
【0069】
細胞小器官局在化シグナル
一実施形態では、タンパク質は、タンパク質を細胞小器官に局在化する局在化シグナルを含む。一実施形態では、局在化シグナルは、タンパク質を核小体、リボソーム、小胞、粗面小胞体、ゴルジ装置、細胞骨格、滑面小胞体、ミトコンドリア、液胞、細胞質ゾル、リソソーム、または中心小体に局在化する。多数の局在化シグナルが当該技術分野において公知である。
【0070】
一実施形態では、タンパク質は、タンパク質を細胞小器官または細胞外に局在化する局在化シグナルを含む。一実施形態では、局在化シグナルは、タンパク質を核小体、リボソーム、小胞、粗面小胞体、ゴルジ装置、細胞骨格、滑面小胞体、ミトコンドリア、液胞、細胞質ゾル、リソソーム、または中心小体に局在化する。
【0071】
多数の局在化シグナルが当該技術分野において公知である。例示的な局在化シグナルとしては、限定されるものではないが、1xミトコンドリア標的化配列、4xミトコンドリア標的化配列、分泌シグナル配列(IL-2)、ミリスチル化配列、カルセケストリンリーダー配列、KDEL保留配列、及びペルオキシソーム標的化配列が挙げられる。
【0072】
一実施形態では、局在化シグナルは、配列番号60~66と少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一な配列を含む。一実施形態では、局在化シグナルは、配列番号60~66の配列を含む。
【0073】
精製及び/または検出タグ
幾つかの実施形態では、タンパク質は、精製及び/または検出タグを含有し得る。一実施形態では、タグは、タンパク質のN末端に存在する。一実施形態では、タグは、3xFLAGタグである。一実施形態では、タグは、配列番号67と少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、タグは、配列番号67のアミノ酸配列を含む。
【0074】
切断及び/またはポリアデニル化タンパク質
一態様では、融合タンパク質は、核に効果的に送達される編集タンパク質ならびに切断及び/またはポリアデニル化タンパク質を含む。一実施形態では、切断及び/またはポリアデニル化タンパク質は、ヒトの3’末端プロセシング機構のRNA結合タンパク質である。一実施形態では、切断及び/またはポリアデニル化タンパク質は、CPSF30、WDR33、またはNUDT21である。一実施形態では、切断及び/またはポリアデニル化タンパク質は、NUDT21である。一実施形態では、切断及び/またはポリアデニル化タンパク質は、NUDT21、NUDT21変異体、NUDT21二量体、NUDT21融合タンパク質、またはそれらの任意の組み合わせである。一実施形態では、切断及び/またはポリアデニル化タンパク質は、ヒトNUDT21、蠕虫NUDT21、ハエNUDT21、ゼブラフィッシュNUDT21、NUDT21_R63S、NUDT21_F103A、またはNUDT21のタンデム二量体である。
【0075】
一実施形態では、切断及び/またはポリアデニル化タンパク質は、配列番号298~307のうちの1つと少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、切断及び/またはポリアデニル化タンパク質は、配列番号298~307のうち1つのアミノ酸配列を含む。
【0076】
融合タンパク質
Casタンパク質及び局在化シグナルを含む融合タンパク質
一実施形態では、本開示のタンパク質は、核、細胞小器官、細胞質、または細胞外に効果的に送達され、RNA標的切断を可能にする。一実施形態では、タンパク質は、配列番号68~100のうちの1つと70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、タンパク質は、配列番号68~100のうちの1つのアミノ酸配列を含む。
【0077】
Casタンパク質ならびに切断及び/またはポリアデニル化タンパク質を含む融合タンパク質
一実施形態では、本開示のタンパク質は、核に効果的に送達され、RNA標的切断及び/またはポリアデニル化を可能にする。一実施形態では、タンパク質は、配列番号308~310のうちの1つと70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、タンパク質は、配列番号308~310のうちの1つのアミノ酸配列を含む。
【0078】
タンパク質、ペプチド、及び融合タンパク質
本開示のタンパク質は、化学的方法を使用して作製され得る。例えば、タンパク質は、固相法(Roberge J Y et al(1995)Science 269:202-204)により合成され得、樹脂から切断され得、分取高速液体クロマトグラフィーにより精製され得る。自動合成は、例えば、製造者より提供される使用説明書に従って、ABI 431A Peptide Synthesizer(Perkin Elmer)を使用して達成され得る。
【0079】
本開示のタンパク質は、組換えタンパク質発現を使用して作製され得る。本開示の組換え発現ベクターは、本発明の核酸を宿主細胞における当該核酸の発現に好適な形態で含み、このことは、組換え発現ベクターが、発現のために使用される宿主細胞に基づいて選択される、発現される核酸配列に作動可能に連結された1つ以上の調節配列を含むことを意味する。組換え発現ベクターにおいて、「作動可能に連結された」とは、関心対象のヌクレオチド配列が、(例えば、インビトロ転写/翻訳系における、またはベクターが宿主細胞に導入される場合、当該宿主細胞における)ヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で調節配列に連結されていることを意味することを意図する。
【0080】
用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサー、及び他の発現調節エレメント(例えば、ポリアデニル化シグナル)を包含することを意図する。かかる調節配列は、例えば、Goeddel,Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,Calif.(1990)に記載されている。調節配列としては、多数の種類の宿主細胞におけるヌクレオチド配列の構成的発現を誘導するもの、及び特定の宿主細胞のみにおけるヌクレオチド配列の発現を誘導するもの(例えば、組織特異的調節配列)が挙げられる。発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどの要因に依存し得ることを当業者は理解するであろう。本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入され、これにより、本明細書に記載される核酸によりコードされる融合タンパク質またはペプチドが含まれる、タンパク質またはペプチドが生成され得る。
【0081】
本発明の組換え発現ベクターは、原核細胞または真核細胞におけるバリアントタンパク質の生成のために設計され得る。例えば、本発明のタンパク質は、Escherichia coliなどの細菌細胞、(バキュロウイルス発現ベクターを使用して)昆虫細胞、酵母細胞、または哺乳動物細胞において発現され得る。好適な宿主細胞は、Goeddel,Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,Calif.(1990)において更に説明されている。あるいは、組換え発現ベクターは、例えば、T7プロモーター調節配列及びT7ポリメラーゼを使用してインビトロで転写及び翻訳され得る。
【0082】
原核生物でのタンパク質の発現は、殆どの場合、融合タンパク質または非融合タンパク質の発現を誘導する構成的または誘導性プロモーターを含有するベクターを用いてEscherichia coliで実施される。融合ベクターは、そこにコードされるタンパク質に、組換えタンパク質のアミノ末端またはC末端に多数のアミノ酸を付加する。かかる融合ベクターは、通常、以下の3つの目的に役立つ:(i)組換えタンパク質の発現を増加させる目的;(ii)組換えタンパク質の溶解性を増加させる目的;及び(iii)アフィニティー精製においてリガンドとして作用することにより組換えタンパク質の精製に役立てる目的。融合発現ベクターでは、多くの場合、融合タンパク質の精製後に組換えタンパク質を融合部分から分離するのを可能にするために、融合部分と組換えタンパク質の接合部にタンパク質分解切断部位が導入される。かかる酵素及びそれらの同族認識配列としては、第Xa因子、トロンビン、PreScission、TEV、及びエンテロキナーゼが挙げられる。代表的な融合発現ベクターとしては、それぞれ、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)、マルトースE結合タンパク質、またはプロテインAを標的組換えタンパク質に融合させる、pGEX(Pharmacia Biotech Inc;Smith and Johnson,1988.Gene 67:31-40)、pMAL(New England Biolabs,Beverly,Mass.)、及びpRITS(Pharmacia,Piscataway,N.J.)が挙げられる。
【0083】
好適な誘導性非融合E.coli発現ベクターの例としては、pTrc(Amrann et al.,(1988)Gene 69:301-315)及びpET11d(Studier et al.,Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,Calif.(1990)60-89)が挙げられるが、これは正確ではなく、pET11a~dは、N末端T7タグを有する。
【0084】
E.coliでの組換えタンパク質発現を最大化する1つの戦略は、組換えタンパク質をタンパク質分解により切断する能力が損なわれた宿主細菌でタンパク質を発現させることである。例えば、Gottesman,Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,Calif.(1990)119-128を参照のこと。別の戦略は、各アミノ酸に対する個々のコドンがE.coliで優先的に利用されるものとなるように、発現ベクターに挿入される核酸の核酸配列を改変することである(例えば、Wada,et al.,1992.Nucl.Acids Res.20:2111-2118を参照のこと)。本発明の核酸配列のかかる改変は、標準的なDNA合成技術により実施され得る。コドンバイアスを解決する別の戦略は、BL21コドンプラス菌株(Invitrogen)またはRosetta菌株(Novagen)を使用することであり、これらの菌株は、E.coliの珍しいtRNA遺伝子の余分なコピーを有する。
【0085】
別の実施形態では、本開示のタンパク質をコードする発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母Saccharomyces cerevisiaeにおける発現のためのベクターの例としては、pYepSec1(Baldari,et al.,1987.EMBO J.6:229-234)、pMFa(Kurjan and Herskowitz,1982.Cell 30:933-943)、pJRY88(Schultz et al.,1987.Gene 54:113-123)、pYES2(Invitrogen Corporation,San Diego,Calif.)、及びpicZ(InVitrogen Corp,San Diego,Calif.)が挙げられる。
【0086】
あるいは、本発明のポリペプチドは、バキュロウイルス発現ベクターを使用して昆虫細胞で生成され得る。培養昆虫細胞(例えば、SF9細胞)でのタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターとしては、pAcシリーズ(Smith,et al.,1983.Mol.Cell.Biol.3:2156-2165)及びpVLシリーズ(Lucklow and Summers,1989.Virology 170:31-39)が挙げられる。
【0087】
更に別の実施形態では、本開示の核酸は、哺乳動物発現ベクターを使用して哺乳動物細胞で発現される。異種ポリペプチドの発現のために当該技術分野において利用可能な哺乳動物細胞株としては、限定されるものではないが、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、HeLa細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、NSOマウスメラノーマ細胞、YB2/0ラット骨髄腫細胞、ヒト胎児腎臓細胞、ヒト胎児網膜細胞、及び多数の他の細胞が挙げられる。哺乳動物発現ベクターの例としては、pCDM8(Seed,1987.Nature 329:840)、及びpMT2PC(Kaufman,et al.,1987.EMBO J.6:187-195)、pIRESpuro(Clontech)、pUB6(Invitrogen)、pCEP4(Invitrogen)、pREP4(Invitrogen)、pcDNA3(Invitrogen)が挙げられる。哺乳動物細胞で使用される場合、発現ベクターの制御機能は、多くの場合、ウイルス調節エレメントにより提供される。例えば、一般的に使用されるプロモーターは、ポリオーマウイルス、アデノウイルス2、サイトメガロウイルス、ラウス肉腫ウイルス、及びシミアンウイルス40に由来する。原核細胞及び真核細胞の両方に適した他の発現系については、例えば、Sambrook,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual.2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989の第16章及び第17章を参照のこと。
【0088】
別の実施形態では、哺乳動物組換え発現ベクターは、特定の細胞種で優先的に核酸の発現を誘導することができる(例えば、組織特異的調節エレメントが核酸を発現させるために使用される)。組織特異的調節エレメントは、当該技術分野において公知である。好適な組織特異的プロモーターの非限定的な例としては、アルブミンプロモーター(肝臓特異的;Pinkert,et al.,1987.Genes Dev.1:268-277)、リンパ系特異的プロモーター(Calame and Eaton,1988.Adv.Immunol.43:235-275)、特に、T細胞受容体のプロモーター(Winoto and Baltimore,1989.EMBO J.8:729-733)及び免疫グロブリンのプロモーター(Banerji,et al.,1983.Cell 33:729-740;Queen and Baltimore,1983.Cell 33:741-748)、神経細胞特異的プロモーター(例えば、神経フィラメントプロモーター;Byrne and Ruddle,1989.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:5473-5477)、膵臓特異的プロモーター(Edlund,et al.,1985.Science 230:912-916)、ならびに乳腺特異的プロモーター(例えば、乳清プロモーター;米国特許第4,873,316号及び欧州特許出願公開第264,166号)が挙げられる。発生段階で調節されるプロモーター、例えば、マウスhoxプロモーター(Kessel and Gruss,1990.Science 249:374-379)及びα-フェトプロテインプロモーター(Campes and Tilghman,1989.Genes Dev.3:537-546)も包含される。
【0089】
本発明は、本明細書において開示されるタンパク質との実質的な相同性を有する任意の形態のタンパク質も含むように解釈されるべきである。一実施形態では、「実質的に相同」であるタンパク質は、本明細書に開示される融合タンパク質のアミノ酸配列と約50%相同、約70%相同、約80%相同、約90%相同、約91%相同、約92%相同、約93%相同、約94%相同、約95%相同、約96%相同、約97%相同、約98%相同、または約99%相同である。
【0090】
代替的に、タンパク質は、組換え手段により、またはより長いポリペプチドからの切断により作製され得る。タンパク質の組成は、アミノ酸分析または配列決定により確認され得る。
【0091】
本発明によるタンパク質のバリアントは、(i)アミノ酸残基のうちの1つ以上が保存的もしくは非保存的アミノ酸残基で置換されており、かかる置換されたアミノ酸残基が遺伝暗号によりコードされるものであっても、そうでなくてもよいバリアント、(ii)1つ以上の修飾アミノ酸残基、例えば、置換基の結合により修飾されている残基が存在するバリアント、(iii)ペプチドが本発明のタンパク質の選択的スプライシングバリアントであるバリアント、(iv)ペプチドの断片、及び/または(v)タンパク質が別のペプチド、例えば、リーダー配列もしくは分泌配列、または精製に用いられる配列(例えば、Hisタグ)もしくは検出に用いられる配列(例えば、Sv5エピトープタグ)に融合されているバリアントであり得る。断片としては、元の配列のタンパク質分解性切断(複数部位タンパク質分解が含まれる)により生成されるペプチドが挙げられる。バリアントは、翻訳後修飾または化学修飾され得る。かかるバリアントは、本明細書の教示により当業者の範囲内であるとみなされる。
【0092】
当該技術分野において公知のように、2つの融合タンパク質間の「類似性」は、一方のポリペプチドのアミノ酸配列及びその保存的アミノ酸置換を、もう一方のポリペプチドの配列と比較することにより決定される。バリアントは、元の配列とは異なるペプチド配列を含むと定義される。一実施形態では、バリアントは、関心対象のセグメント当たり40%未満の残基が元の配列と異なるか、関心対象のセグメント当たり25%未満の残基が元の配列と異なるか、関心対象のセグメント当たり10%未満の残基が異なるか、または関心対象のセグメント当たりごく少数の残基が元のタンパク質配列とは異なり、同時に、元の配列の機能及び/または幹細胞の骨芽細胞系への分化を刺激する能力を維持するほど元の配列と十分に相同である。本発明は、元のアミノ酸配列と少なくとも60%、65%、70%、72%、74%、76%、78%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%類似するか、または同一であるアミノ酸配列を含む。2つのペプチド間の同一性の程度は、当業者に広く公知であるコンピュータアルゴリズム及び方法を使用して決定される。2つのアミノ酸配列間の同一性は、BLASTPアルゴリズム[BLAST Manual,Altschul,S.,et al.,NCBI NLM NIH Bethesda,Md.20894,Altschul,S.,et al.,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)]を使用することにより決定され得る。
【0093】
本開示のタンパク質は、翻訳後修飾され得る。例えば、本発明の範囲内にある翻訳後修飾としては、シグナルペプチド切断、グリコシル化、アセチル化、イソプレニル化、タンパク質分解、ミリストイル化、タンパク質フォールディング、及びタンパク質分解プロセシングなどが挙げられる。一部の修飾またはプロセシング事象は、追加の生物学的機構の導入を必要とする。例えば、シグナルペプチド切断及びコアグリコシル化などのプロセシング事象は、イヌミクロソーム膜またはXenopus属の卵抽出物(米国特許第6,103,489号)を標準的な翻訳反応に加えることにより検査される。
【0094】
本開示のタンパク質は、翻訳後修飾により、または翻訳中に非天然アミノ酸を導入することにより形成される非天然アミノ酸を含み得る。タンパク質翻訳中に非天然アミノ酸を導入するための種々の手法が利用可能である。
【0095】
本開示のタンパク質は、Reedijk et al.(The EMBO Journal 11(4):1365,1992)に記載される方法などの従来の方法を使用してリン酸化され得る。
【0096】
本発明の融合タンパク質の環状誘導体も本発明の一部である。環化は、タンパク質が他の分子との会合のために有利な立体構造をとることを可能にし得る。環化は、当該技術分野において公知の技術を使用して達成され得る。例えば、遊離スルフヒドリル基を有する適切に間隔をあけた2つの構成要素の間でジスルフィド結合が形成され得るか、または一方の構成要素のアミノ基と別の構成要素のカルボキシル基との間でアミド結合が形成され得る。環化は、Ulysse,L.,et al.,J.Am.Chem.Soc.1995,117,8466-8467に記載されるようにアゾベンゼン含有アミノ酸を使用して達成されてもよい。結合を形成する構成要素は、アミノ酸の側鎖、非アミノ酸構成要素、またはこれら2つの組み合わせであり得る。本発明の実施形態では、環状ペプチドは、適切な位置にβターンを含み得る。βターンは、アミノ酸Pro-Glyを適切な位置に付加することにより本発明のペプチドに導入され得る。
【0097】
上記のようなペプチド結合による連結を含有する環状ペプチドよりも柔軟である環状タンパク質を作製することが望ましい場合がある。より柔軟なペプチドは、ペプチドの左右の位置にシステインを導入し、2つのシステインの間でジスルフィド架橋を形成させることにより調製され得る。2つのシステインは、βシート及びターンを変形させないように配置される。このペプチドは、ジスルフィド結合の長さ、及びβシート部分の水素結合の数がより少ないことの結果としてより柔軟である。環状ペプチドの相対的な柔軟性は、分子動力学シミュレーションにより決定され得る。
【0098】
また本開示は、Cas13及びRNアーゼタンパク質を含む融合タンパク質を含むペプチドであって、当該融合タンパク質それ自体が、標的タンパク質及び/またはキメラタンパク質を所望の細胞成分または細胞種もしくは組織に誘導することができる標的化ドメインに融合されているか、または組み込まれている、当該ペプチドに関する。キメラタンパク質は、追加のアミノ酸配列またはドメインも含有し得る。キメラタンパク質は、種々の構成要素が異なる供給源由来であり、従って、自然界では一緒に見出されない(すなわち、異種である)という点で組換えである。
【0099】
一実施形態では、標的化ドメインは、膜貫通ドメイン、膜結合ドメイン、または例えば、小胞もしくは核と会合するようにタンパク質を誘導する配列であり得る。一実施形態では、標的化ドメインは、ペプチドを特定の細胞種または組織に標的化することができる。例えば、標的化ドメインは、細胞表面リガンド、または標的組織の細胞表面抗原に対する抗体であり得る。標的化ドメインは、本発明のペプチドを細胞成分に標的化し得る。
【0100】
本発明のペプチドは、従来技術により合成され得る。例えば、ペプチドまたはキメラタンパク質は、固相ペプチド合成を使用した化学合成により合成され得る。これらの方法は、固相合成法または液相合成法のいずれかを用いる(例えば、固相合成法について、J.M.Stewart,and J.D.Young,Solid Phase Peptide Synthesis,2nd Ed.,Pierce Chemical Co.,Rockford Ill.(1984)及びG.Barany and R.B.Merrifield,The Peptides:Analysis Synthesis,Biology editors E.Gross and J.Meienhofer Vol.2 Academic Press,New York,1980,pp.3-254、ならびに古典的な溶液合成について、M Bodansky,Principles of Peptide Synthesis,Springer-Verlag,Berlin 1984、及びE.Gross and J.Meienhofer,Eds.,The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology,suprs,Vol 1を参照のこと)。一例として、本発明のペプチドは、N-フルオレニルメトキシ-カルボニル-O-ベンジル-L-ホスホトレオニン誘導体としてホスホトレオニンを直接組み込む、9-フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)固相化学法を使用して合成され得る。
【0101】
他の分子とコンジュゲートされた本発明のペプチドまたはキメラタンパク質を含むN末端またはC末端融合タンパク質は、当該ペプチドまたはキメラタンパク質のN末端またはC末端と、所望の生物学的機能を有する選択されたタンパク質または選択マーカーの配列とを組換え技術により融合させることにより調製され得る。得られた融合タンパク質は、本明細書に記載される選択されたタンパク質またはマーカータンパク質に融合されたタンパク質を含有する。融合タンパク質を調製するために使用され得るタンパク質の例としては、免疫グロブリン、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)、ヘマグルチニン(HA)、及び短縮型mycが挙げられる。
【0102】
本発明のペプチドは、生物学的発現系を使用して開発され得る。これらの系の使用により、ランダムペプチド配列の大型ライブラリーの生成、及び特定のタンパク質に結合するペプチド配列についてのこれらのライブラリーのスクリーニングが可能となる。ライブラリーは、ランダムペプチド配列をコードする合成DNAを適切な発現ベクターにクローニングすることにより作製され得る(Christian et al 1992,J.Mol.Biol.227:711;Devlin et al,1990 Science 249:404;Cwirla et al 1990,Proc.Natl.Acad,Sci.USA,87:6378を参照のこと)。ライブラリーは、重複ペプチドの同時合成によっても構築され得る(米国特許第4,708,871号を参照のこと)。
【0103】
本発明のペプチド及びキメラタンパク質は、無機酸、例えば、塩酸、硫酸、臭化水素酸、リン酸など、または有機酸、例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、コハク酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、サリチル酸、ベンゼンスルホン酸、及びトルエンスルホン酸と反応させることにより医薬品塩に変換され得る。
【0104】
核酸
一態様では、本開示は、RNA標的切断をもたらす編集タンパク質をコードする新規の核酸分子。幾つかの実施形態では、核酸分子は、局在化シグナルをコードする核酸配列を含む。一実施形態では、局在化シグナルは、タンパク質を標的RNAが存在する部位に局在化する。一実施形態では、核酸分子は、核内のRNAを標的とするための核局在化シグナル(NLS)をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、核酸分子は、細胞質内のRNAを標的とするための核外移行シグナル(NES)をコードする核酸配列を含む。ミトコンドリアなどの細胞小器官内のRNAを標的とするための(当技術分野において公知である)他の局在化シグナルが使用され得る。他の実施形態では、核酸分子は、細胞質内のRNAを標的とするための局在化シグナルをコードする核酸配列を含まない。一実施形態では、核酸分子は、精製及び/または検出タグをコードする核酸配列を含む。
【0105】
本開示は、CRISPR RNA(crRNA)が含まれる、本開示のタンパク質を標的RNAに標的化するための標的化核酸も提供する。
【0106】
一態様では、本開示は、RNA標的切断をもたらす編集タンパク質をコードする新規の核酸分子。幾つかの実施形態では、核酸分子は、局在化シグナルをコードする核酸配列を含む。一実施形態では、局在化シグナルは、タンパク質を標的RNAが存在する部位に局在化する。従って、本開示は、局在化することができるRNA標的切断のためのタンパク質をコードする核酸分子を提供する。
【0107】
編集タンパク質
一実施形態では、核酸分子は、編集タンパク質をコードする配列核酸を含む。一実施形態では、編集タンパク質としては、限定されるものではないが、CRISPR関連(Cas)タンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)タンパク質、及びDNAまたはRNA結合ドメインを有するタンパク質が挙げられる。
【0108】
Casタンパク質の非限定的な例としては、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csxl、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、SpCas9、StCas9、NmCas9、SaCas9、CjCas9、CjCas9、AsCpf1、LbCpf1、FnCpf1、VRER SpCas9、VQR SpCas9、xCas9 3.7、それらのホモログ、それらのオーソログ、またはそれらの改変型が挙げられる。幾つかの実施形態では、Casタンパク質は、DNAまたはRNA切断活性を有する。幾つかの実施形態では、Casタンパク質は、標的配列の位置、例えば、標的配列内及び/または標的配列の相補体内の位置での核酸分子の一方または両方の鎖の切断を誘導する。一部の実施形態では、Casタンパク質は、標的配列の最初または最後のヌクレオチドから約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約15、約20、約25、約50、約100、約200、約500塩基対、またはそれ以上の範囲内で一方または両方の鎖の切断を誘導する。一実施形態では、Casタンパク質は、Cas9、Cas13、またはCpf1である。一実施形態では、Casタンパク質は、触媒活性を欠く(dCas)。
【0109】
一実施形態では、Casタンパク質は、RNA結合活性を有する。一実施形態では、Casタンパク質は、Cas13である。一実施形態では、Casタンパク質は、PspCas13b、PspCas13bの短縮型、AdmCas13d、AspCas13b、AspCas13c、BmaCas13a、BzoCas13b、CamCas13a、CcaCas13b、Cga2Cas13a、CgaCas13a、EbaCas13a、EreCas13a、EsCas13d、FbrCas13b、FnbCas13c、FndCas13c、FnfCas13c、FnsCas13c、FpeCas13c、FulCas13c、HheCas13a、LbfCas13a、LbmCas13a、LbnCas13a、LbuCas13a、LseCas13a、LshCas13a、LspCas13a、Lwa2cas13a、LwaCas13a、LweCas13a、PauCas13b、PbuCas13b、PgiCas13b、PguCas13b、Pin2Cas13b、Pin3Cas13b、PinCas13b、Pprcas13a、PsaCas13b、PsmCas13b、RaCas13d、RanCas13b、RcdCas13a、RcrCas13a、RcsCas13a、RfxCas13d、UrCas13d、dPspCas13b、PspCas13b_A133H、PspCas13b_A1058H、dPspCas13bの短縮型、dAdmCas13d、dAspCas13b、dAspCas13c、dBmaCas13a、dBzoCas13b、dCamCas13a、dCcaCas13b、dCga2Cas13a、dCgaCas13a、dEbaCas13a、dEreCas13a、dEsCas13d、dFbrCas13b、dFnbCas13c、dFndCas13c、dFnfCas13c、dFnsCas13c、dFpeCas13c、dFulCas13c、dHheCas13a、dLbfCas13a、dLbmCas13a、dLbnCas13a、dLbuCas13a、dLseCas13a、dLshCas13a、dLspCas13a、dLwa2cas13a、dLwaCas13a、dLweCas13a、dPauCas13b、dPbuCas13b、dPgiCas13b、dPguCas13b、dPin2Cas13b、dPin3Cas13b、dPinCas13b、dPprCas13a、dPsaCas13b、dPsmCas13b、dRaCas13d、dRanCas13b、dRcdCas13a、dRcrCas13a、dRcsCas13a、dRfxCas13d、またはdUrCas13dである。追加のCasタンパク質が当該技術分野において公知である(例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Konermann et al.,Cell,2018,173:665-676 e14,Yan et al.,Mol Cell,2018,7:327-339 e5;Cox,D.B.T.,et al.,Science,2017,358:1019-1027;Abudayyeh et al.,Nature,2017,550:280-284,Gootenberg et al.,Science,2017,356:438-442;及びEast-Seletsky et al.,Mol Cell,2017,66:373-383 e3)。
【0110】
一実施形態では、Casタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号1~49のうちの1つと少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一なアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、Casタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号1~49のうちの1つのアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、Casタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号1~47のうちの1つのアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。
【0111】
一実施形態では、Casタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号132~135のうちの1つと少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一な核酸配列を含む。一実施形態では、Casタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号132~135のうちの1つの核酸配列を含む。一実施形態では、Casタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号132または133のうちの1つの核酸配列を含む。
【0112】
局在化シグナル
幾つかの実施形態では、核酸分子は、局在化シグナル、例えば、核局在化シグナル(NLS)、核外移行シグナル(NES)、または細胞質もしくはミトコンドリアなどの細胞小器官に局在化するための他の局在化シグナルをコードする核酸配列を含む。一実施形態では、局在化シグナルは、タンパク質を標的RNAが存在する部位に局在化する。
【0113】
核局在化シグナル
一実施形態では、核酸分子は、核局在化シグナル(NLS)をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、NLSは、レトロトランスポゾンNLSである。一実施形態では、NLSは、Ty1、酵母GAL4、SKI3、L29、またはヒストンH2Bタンパク質、ポリオーマウイルスラージTタンパク質、VP1もしくはVP2カプシドタンパク質、SV40 VP1もしくはVP2カプシドタンパク質、アデノウイルスElaもしくはDBPタンパク質、インフルエンザウイルスNS1タンパク質、肝炎ウイルスコア抗原、または哺乳動物のラミン、c-myc、max、c-myb、p53、c-erbA、jun、Tax、ステロイド受容体、もしくはMxタンパク質、ヌクレオプラスミン(NPM2)、ヌクレオフォスミン(NPM1)、またはシミアンウイルス40(「SV40」)T抗原に由来する。
【0114】
一実施形態では、NLSは、Ty1もしくはTy1由来のNLS、Ty2もしくはTy2由来のNLS、またはMAK11もしくはMAK11由来のNLSである。一実施形態では、Ty1 NLSは、配列番号50のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、Ty2 NLSは、配列番号51のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、MAK11 NLSは、配列番号52のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、NLSをコードする核酸配列は、配列番号50~57及び323~935のうちの1つと少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一なアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、NLSをコードする核酸配列は、配列番号50~57及び323~935のうちの1つのアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。
【0115】
一実施形態では、NLSは、Ty1様NLSである。例えば、一実施形態では、Ty1様NLSは、KKRXモチーフを含む。一実施形態では、Ty1様NLSは、N末端にKKRXモチーフを含む。一実施形態では、Ty1様NLSは、KKRモチーフを含む。一実施形態では、Ty1様NLSは、C末端にKKRモチーフを含む。一実施形態では、Ty1様NLSは、KKRXモチーフ及びKKRモチーフを含む。一実施形態では、Ty1様NLSは、N末端のKKRX及びC末端のKKRモチーフを含む。一実施形態では、Ty1様NLSは、少なくとも20アミノ酸を含む。一実施形態では、Ty1様NLSは、20~40アミノ酸を含む。一実施形態では、Ty1様NLSをコードする核酸配列は、配列番号323~935のうちの1つと少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一なアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、Ty1様NLSをコードする核酸配列は、配列番号323~935のうちの1つのアミノ酸配列をコードする核酸配列を含み、ここで、当該配列は、1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、6つ以上、7つ以上、8つ以上、9つ以上、または10以上の挿入、欠失、または置換を含む。一実施形態では、Ty1様NLSをコードする核酸配列は、配列番号323~935のうちの1つのアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。
【0116】
一実施形態では、NLSをコードする核酸配列は、2コピーの同じNLSをコードする。例えば、一実施形態では、核酸配列は、第1のTy1由来のNLS及び第2のTy1由来のNLSの多量体をコードする。
【0117】
一実施形態では、NLSをコードする核酸配列は、配列番号136と少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一な核酸配列を含む。一実施形態では、NLSをコードする核酸配列は、配列番号136の核酸配列を含む。
【0118】
核外移行シグナル
一実施形態では、核酸分子は、核外移行シグナル(NES)をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、NESは、細胞質RNAを標的とするためにタンパク質を細胞質に局在化する。一実施形態では、NESをコードする核酸配列は、配列番号58または59と少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一なアミノ酸配列をコードする配列を含む。一実施形態では、NESをコードする核酸配列は、配列番号58または59のアミノ酸配列をコードする配列を含む。
【0119】
一実施形態では、NESをコードする核酸配列は、配列番号137または138と少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一な配列を含む。一実施形態では、NESをコードする核酸配列は、配列番号137または138の配列を含む。
【0120】
細胞小器官局在化シグナル
一実施形態では、核酸分子は、タンパク質を細胞小器官または細胞外に局在化する局在化シグナルをコードする核酸配列を含む。一実施形態では、局在化シグナルは、タンパク質を核小体、リボソーム、小胞、粗面小胞体、ゴルジ装置、細胞骨格、滑面小胞体、ミトコンドリア、液胞、細胞質ゾル、リソソーム、または中心小体に局在化する。多数の局在化シグナルが当該技術分野において公知である。
【0121】
例示的な局在化シグナルとしては、限定されるものではないが、1xミトコンドリア標的化配列、4xミトコンドリア標的化配列、分泌シグナル配列(IL-2)、ミリスチル化配列、カルセケストリンリーダー配列、KDEL保留配列、及びペルオキシソーム標的化配列が挙げられる。
【0122】
一実施形態では、核酸分子は、局在化シグナルをコードする核酸配列を含む。一実施形態では、局在化シグナルは、タンパク質を細胞小器官または細胞外に局在化する。一実施形態では、局在化シグナルをコードする核酸配列は、少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、アミノ酸配列をコードする配列を含む。一実施形態では、核酸分子は、局在化シグナルをコードする核酸配列を含む。一実施形態では、局在化シグナルは、タンパク質を細胞小器官または細胞外に局在化する。一実施形態では、局在化シグナルをコードする核酸配列は、配列番号60~66のうちの1つと少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一なアミノ酸配列をコードする配列を含む。一実施形態では、局在化シグナルをコードする核酸配列は、配列番号60~66のうちの1つのアミノ酸配列をコードする配列を含む。
【0123】
一実施形態では、局在化シグナルをコードする核酸配列は、配列番号139~145のうちの1つと少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一な配列を含む。一実施形態では、局在化シグナルをコードする核酸配列は、配列番号139~145のうちの1つの配列を含む。
【0124】
精製及び/または検出タグ
一実施形態では、核酸分子は、精製及び/または検出タグをコードする核酸配列を含む。一実施形態では、タグは、タンパク質のN末端に存在する。一実施形態では、タグは、3xFLAGタグである。一実施形態では、精製及び/または検出タグをコードする核酸配列は、配列番号67と少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一なアミノ酸配列をコードする。一実施形態では、精製及び/または検出タグをコードする核酸配列は、配列番号67のアミノ酸配列をコードする。
【0125】
一実施形態では、精製及び/または検出タグをコードする核酸配列は、配列番号146と少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一な配列を含む。一実施形態では、精製及び/または検出タグをコードする核酸配列は、配列番号146の配列を含む。
【0126】
切断及び/またはポリアデニル化タンパク質
一態様では、一実施形態では、核酸分子は、切断及び/またはポリアデニル化タンパク質をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、切断及び/またはポリアデニル化タンパク質は、ヒトの3’末端プロセシング機構のRNA結合タンパク質である。一実施形態では、切断及び/またはポリアデニル化タンパク質は、CPSF30、WDR33、またはNUDT21である。一実施形態では、切断及び/またはポリアデニル化タンパク質は、NUDT21である。一実施形態では、切断及び/またはポリアデニル化タンパク質は、NUDT21、NUDT21変異体、NUDT21二量体、NUDT21融合タンパク質、またはそれらの任意の組み合わせである。一実施形態では、切断及び/またはポリアデニル化タンパク質は、ヒトNUDT21、蠕虫NUDT21、ハエNUDT21、ゼブラフィッシュNUDT21、NUDT21_R63S、NUDT21_F103A、またはNUDT21のタンデム二量体である。
【0127】
一実施形態では、切断及び/またはポリアデニル化タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号298~307のうちの1つと少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一なアミノ酸配列をコードする。一実施形態では、切断及び/またはポリアデニル化タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号298~307のうちの1つのアミノ酸配列をコードする。
【0128】
一実施形態では、切断及び/またはポリアデニル化タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号311~319と少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一な配列を含む。一実施形態では、切断及び/またはポリアデニル化タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号311~319の配列を含む。
【0129】
融合タンパク質
Casタンパク質及び局在化シグナルを含む融合タンパク質
一実施形態では、核酸分子は、核、細胞小器官、細胞質、または細胞外に効果的に送達され、RNA標的切断を可能にする本開示のタンパク質をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号68~100のうちの1つと少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一なアミノ酸配列をコードする。一実施形態では、タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号68~100のうちの1つのアミノ酸配列をコードする。
【0130】
一実施形態では、タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号147~166のうちの1つと少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一な配列を含む。一実施形態では、タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号147~166のうちの1つの配列を含む。
【0131】
Casタンパク質ならびに切断及び/またはポリアデニル化タンパク質を含む融合タンパク質
一実施形態では、核酸分子は、RNA標的切断及び/またはポリアデニル化を可能にする本開示のタンパク質をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号308~310のうちの1つと少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一なアミノ酸配列をコードする。一実施形態では、タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号308~310のうちの1つのアミノ酸配列をコードする。
【0132】
一実施形態では、タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号320~322のうちの1つと少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一な配列を含む。一実施形態では、タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号320~322のうちの1つの配列を含む。
【0133】
標的化核酸及びCRISPR RNA(crRNA)
一態様では、本開示は、Casを標的RNAに標的化するためのCRISPR RNA(crRNA)を提供する。一実施形態では、crRNAは、ガイド配列を含む。一実施形態では、crRNAは、ダイレクトリピート(DR)配列を含む。一実施形態では、crRNAは、ガイド配列またはスペーサー配列に融合または連結されたダイレクトリピート配列及びガイド配列を含む。一実施形態では、ダイレクトリピート配列は、ガイド配列またはスペーサー配列の上流(すなわち、5’)に存在し得る。他の実施形態では、ダイレクトリピート配列は、ガイド配列またはスペーサー配列の下流(すなわち、3’)に存在し得る。
【0134】
幾つかの実施形態では、crRNAは、ステムループを含む。一実施形態では、crRNAは、単一のステムループを含む。一実施形態では、ダイレクトリピート配列は、ステムループを形成する。一実施形態では、ダイレクトリピート配列は、単一のステムループを形成する。
【0135】
一実施形態では、ガイドRNAのスペーサーの長さは、15~35ヌクレオチドである。一実施形態では、ガイドRNAのスペーサーの長さは、少なくとも15ヌクレオチドである。一実施形態では、スペーサーの長さは、15~17ヌクレオチド、例えば、15、16、もしくは17ヌクレオチド、17~20ヌクレオチド、例えば、17、18、19、もしくは20ヌクレオチド、20~24ヌクレオチド、例えば、20、21、22、23、もしくは24ヌクレオチド、23~25ヌクレオチド、例えば、23、24、もしくは25ヌクレオチド、24~27ヌクレオチド、例えば、24、25、26、もしくは27ヌクレオチド、27~30ヌクレオチド、例えば、27、28、29、もしくは30ヌクレオチド、30~35ヌクレオチド、例えば、30、31、32、33、34、もしくは35ヌクレオチド、または35ヌクレオチドもしくはそれ以上である。
【0136】
一般に、ガイド配列は、標的配列とハイブリダイズし、CRISPR複合体の当該標的配列への配列特異的な結合を誘導するのに十分な当該標的ポリヌクレオチド配列との相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列である。幾つかの実施形態では、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、好適なアラインメントアルゴリズムを使用して最適にアラインメントされる場合、約50%もしくは約50%超、約60%もしくは約60%超、約75%もしくは約75%超、約80%もしくは約80%超、約85%もしくは約85%超、約90%もしくは約90%超、約95%もしくは約95%超、約97.5%もしくは約97.5%超、約99%もしくは約99%超、またはそれ以上である。最適なアラインメントは、配列をアラインメントするための任意の好適なアルゴリズムを使用して決定され得、これらの非限定的な例としては、Smith-Watermanアルゴリズム、Needleman-Wunschアルゴリズム、Burrows-Wheeler変換に基づくアルゴリズム(例えば、Burrows Wheeler Aligner)、ClustalW、Clustal X、BLAT、Novoalign(Novocraft Technologies;www.novocraft.comで利用可能)、ELAND(Illumina、San Diego、Calif.)、SOAP(soap.genomics.org.cnで利用可能)、及びMaq(maq.sourceforge.netで利用可能)が挙げられる。幾つかの実施形態では、ガイド配列は、約5もしくは約5超、約10もしくは約10超、約11もしくは約11超、約12もしくは約12超、約13もしくは約13超、約14もしくは約14超、約15もしくは約15超、約16もしくは約16超、約17もしくは約17超、約18もしくは約18超、約19もしくは約19超、約20もしくは約20超、約21もしくは約21超、約22もしくは約22超、約23もしくは約23超、約24もしくは約24超、約25もしくは約25超、約26もしくは約26超、約27もしくは約27超、約28もしくは約28超、約29もしくは約29超、約30もしくは約30超、約35もしくは約35超、約40もしくは約40超、約45もしくは約45超、約50もしくは約50超、約75もしくは約75超、またはそれ以上のヌクレオチド長である。幾つかの実施形態では、ガイド配列は、約75未満、50未満、45未満、40未満、35未満、30未満、25未満、20未満、15未満、12未満、またはそれ以下のヌクレオチド長である。好ましくは、ガイド配列は、10~30ヌクレオチド長である。CRISPR複合体の標的配列への配列特異的な結合を誘導するガイド配列の能力は、任意の好適なアッセイにより評価され得る。例えば、試験されるガイド配列が含まれる、CRISPR複合体を形成するのに十分なCRISPR系の構成要素が、CRISPR配列の構成要素をコードするベクターを用いた形質移入などにより対応する標的配列を有する宿主細胞に提供され得、続いて、標的配列内での選択的な切断が本明細書に記載されるSurveyorアッセイなどにより評価される。同様に、標的配列、試験されるガイド配列及び試験されるガイド配列と異なる対照ガイド配列が含まれる、CRISPR複合体の構成要素を提供し、試験されるガイド配列での反応と対照ガイド配列での反応との間で、標的配列内での結合または切断率を比較することにより、試験管内での標的ポリヌクレオチド配列の切断が評価され得る。他のアッセイが利用可能であり、当業者は思いつくであろう。
【0137】
CRISPR-Cas系の幾つかの実施形態では、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、約50%もしくは約50%超、約60%もしくは約60%超、約75%もしくは約75%超、約80%もしくは約80%超、約85%もしくは約85%超、約90%もしくは約90%超、約95%もしくは約95%超、約97.5%もしくは約97.5%超、約99%もしくは約99%超、または100%であり得、ガイドまたはRNAまたはsgRNAは、約5もしくは約5超、約10もしくは約10超、約11もしくは約11超、約12もしくは約12超、約13もしくは約13超、約14もしくは約14超、約15もしくは約15超、約16もしくは約16超、約17もしくは約17超、約18もしくは約18超、約19もしくは約19超、約20もしくは約20超、約21もしくは約21超、約22もしくは約22超、約23もしくは約23超、約24もしくは約24超、約25もしくは約25超、約26もしくは約26超、約27もしくは約27超、約28もしくは約28超、約29もしくは約29超、約30もしくは約30超、約35もしくは約35超、約40もしくは約40超、約45もしくは約45超、約50もしくは約50超、約75もしくは約75超、またはそれ以上のヌクレオチド長であり得るか、あるいはガイドまたはRNAまたはsgRNAは、約75未満、50未満、45未満、40未満、35未満、30未満、25未満、20未満、15未満、12未満、またはそれ以下のヌクレオチド長であり得、有利には、tracrRNAは、30または50ヌクレオチド長である。しかしながら、本開示の態様は、オフターゲット相互作用を低減すること、例えば、低い相補性を有する標的配列と相互作用するガイド配列を低減することである。実際、実施例において、標的配列と、80%超~約95%の相補性、例えば、83%~84%または88~89%または94~95%の相補性を有するオフターゲット配列とを区別することができる(例えば、18ヌクレオチドを有する標的と、1、2、または3つのミスマッチを有する18ヌクレオチドのオフターゲットとを区別する)CRISPR-Cas系をもたらす変異を本開示が含むことが示される。従って、本開示の文脈において、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、94.5%超または95%超または95.5%超または96%超または96.5%超または97%超または97.5%超または98%超または98.5%超または99%超または99.5%超または99.9%超または100%である。オフターゲットは、その配列とガイドとの間の相補性が100%未満または99.9%未満または99.5%未満または99%未満または99%未満または98.5%未満または98%未満または97.5%未満または97%未満または96.5%未満または96%未満または95.5%未満または95%未満または94.5%未満または94%未満または93%未満または92%未満または91%未満または90%未満または89%未満または88%未満または87%未満または86%未満または85%未満または84%未満または83%未満または82%未満または81%未満または80%未満であり、有利には、オフターゲットは、その配列とガイドとの間の相補性が100%または99.9%または99.5%または99%または99%または98.5%または98%または97.5%または97%または96.5%または96%または95.5%または95%または94.5%である。
【0138】
一実施形態では、crRNAは、ウイルスRNA配列に実質的に相補的な配列を含む。一実施形態では、crRNAは、コロナウイルスゲノムmRNA配列またはコロナウイルスサブゲノムmRNA配列に実質的に相補的な配列を含む。例えば、一実施形態では、crRNAは、コロナウイルスのリーダー配列、S配列、E配列、M配列、N配列、またはS2M配列に実質的に相補的な配列を含む。一実施形態では、crRNAは、コロナウイルスのリーダー配列、N配列、またはS2M配列に実質的に相補的な配列を含む。
【0139】
一実施形態では、crRNAは、配列番号167~187から選択される配列またはその断片と少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%相同な配列に実質的に相補的な配列を含む。一実施形態では、crRNAは、配列番号167~187から選択される配列またはその断片に実質的に相補的な配列を含む。
【0140】
一実施形態では、crRNAは、配列番号167、175、または182~185から選択される配列の断片と少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%相同な配列に実質的に相補的な配列を含む。一実施形態では、crRNAは、配列番号167、175、または182~185から選択される配列の断片に実質的に相補的な配列を含む。
【0141】
一実施形態では、crRNAは、配列番号168~174、176~181、186、及び187から選択される配列と少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%相同な配列に実質的に相補的な配列を含む。一実施形態では、crRNAは、配列番号168~174、176~181、186、及び187から選択される配列と実質的に相補的な配列を含む。
【0142】
一実施形態では、crRNAは、配列番号189~224から選択される配列と少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%相同な配列を含む。一実施形態では、crRNAは、配列番号189~224から選択される配列を含む。
【0143】
一実施形態では、本開示は、インフルエンザウイルス配列に実質的に相補的な配列を有するcrRNAを提供する。一実施形態では、crRNAは、インフルエンザウイルスのゲノムmRNA配列またはサブゲノムmRNA配列に実質的に相補的な配列を含む。例えば、一実施形態では、crRNAは、インフルエンザウイルスのPB2配列、PB1配列、PA配列、HA配列、NP配列、NA配列、M配列、またはNS配列に実質的に相補的な配列を含む。一実施形態では、crRNAは、インフルエンザウイルスのPB2配列、PB1配列、PA配列、NP配列、またはM配列に実質的に相補的な配列を含む。
【0144】
一実施形態では、crRNAは、配列番号225~244から選択される配列またはその断片と少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%相同な配列に実質的に相補的な配列を含む。一実施形態では、crRNAは、配列番号225~244から選択される配列またはその断片に実質的に相補的な配列を含む。
【0145】
一実施形態では、crRNAは、ウイルスRNA配列に実質的に相補的な配列を含む。一実施形態では、crRNAは、プラス鎖ウイルスRNA配列に実質的に相補的な配列を含む。一実施形態では、crRNAは、マイナス鎖ウイルスRNA配列に実質的に相補的な配列を含む。一実施形態では、crRNAは、配列番号245~264から選択される配列と少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%相同な配列を含む。一実施形態では、crRNAは、配列番号245~264から選択される配列を含む。
【0146】
一実施形態では、crRNAは、ダイレクトリピート(DR)配列を含む。一実施形態では、DR配列は、標的配列に実質的に相補的な配列の5’に存在する。例えば、一実施形態では、DR配列は、コロナウイルスゲノムmRNA配列またはコロナウイルスサブゲノムmRNA配列に実質的に相補的な配列の5’に存在する。一実施形態では、DR配列は、インフルエンザウイルスゲノムRNA配列またはインフルエンザウイルスサブゲノムRNA配列に実質的に相補的な配列の5’に存在する。一実施形態では、DR配列は、伸長RNAリピート配列に実質的に相補的な配列の5’に存在する。一実施形態では、DR配列は、Cas13の標的配列への標的化活性、Cas13触媒活性、または両方を増強する。例えば、一実施形態では、DR配列は変異を含む。例えば、一実施形態では、DR配列はT17C点変異を含む。一実施形態では、DR配列はT18C点変異を含む。一実施形態では、DR配列は、配列番号189~224及び245~264から選択される配列と少なくとも80%相同な配列の5’に存在する。
【0147】
一実施形態では、DR配列は、標的配列に実質的に相補的な配列の3’に存在する。例えば、一実施形態では、DR配列は、コロナウイルスゲノムmRNA配列またはコロナウイルスサブゲノムmRNA配列に実質的に相補的な配列の3’に存在する。一実施形態では、DR配列は、インフルエンザウイルスゲノムmRNA配列またはインフルエンザウイルスサブゲノムmRNA配列に実質的に相補的な配列の3’に存在する。一実施形態では、DR配列は、配列番号189~224及び245~264から選択される配列と少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%相同な配列の3’に存在する。
【0148】
一実施形態では、5’または3’DR配列の選択は、使用されるCasタンパク質オーソログに依存する。一実施形態では、DR配列は、配列番号265~274から選択される配列を含む。
【0149】
タンデムアレイ
一実施形態では、本発明は、タンデムCRISPR RNA(crRNA)配列を提供する。一実施形態では、タンデムcrRNAアレイは、単一のプロモーターが複数のcrRNAの発現を駆動することを可能にする。一実施形態では、タンデムアレイは、1種以上、2種以上、3種以上、4種以上、5種以上、6種以上、7種以上、または8種以上のcrRNA配列を含む。
【0150】
一実施形態では、タンデムcrRNAアレイの各crRNAは、ダイレクトリピート(DR)配列及びスペーサー配列を含む。一実施形態では、ダイレクトリピート配列は、ガイド配列またはスペーサー配列の上流(すなわち、5’)に存在し得る。他の実施形態では、ダイレクトリピート配列は、ガイド配列またはスペーサー配列の下流(すなわち、3’)に存在し得る。
【0151】
一実施形態では、DR配列は、関連するCasタンパク質に特異的である。例えば、一実施形態では、Casタンパク質はCas13であり、ダイレクトリピート配列は配列番号265~274のうちの1つの配列を含む。一実施形態では、ダイレクトリピート配列は、ポリTストレッチに単一変異を含む。例えば、一実施形態では、ダイレクトリピート配列は、配列番号268~274から選択される配列を含む。
【0152】
一実施形態では、タンデムcrRNAアレイの各crRNAは、異なるダイレクトリピート配列を含む。例えば、一実施形態では、ダイレクトリピートのループ領域内のヌクレオチド置換、複数のガイドRNAにより、crRNAの順序付けられたアレイの効率的な生成がもたらされる。
【0153】
一実施形態では、タンデムアレイは、少なくとも2種以上のcrRNAを含み、ここで、各crRNAは、標的RNAに実質的に相補的な配列を含む。例えば、一実施形態では、各crRNAは、単一の標的RNA内の異なる配列に実質的に相補的な異なる配列を含む。一実施形態では、各crRNAは、異なる標的RNA内の異なる配列に実質的に相補的な異なる配列を含む。一実施形態では、異なる標的RNAは、単一の疾患、障害、または感染症に関連する。例えば、一実施形態では、異なる標的RNAは、ウイルスの各ウイルスRNA配列である。
【0154】
例えば、一実施形態では、各crRNAは、コロナウイルスゲノムRNA配列及び/またはコロナウイルスサブゲノムRNA配列内の異なる配列に実質的に相補的な異なる配列を含む。一実施形態では、crRNAは、コロナウイルスゲノムmRNA配列またはコロナウイルスサブゲノムmRNA配列に実質的に相補的な配列を含む。例えば、一実施形態では、crRNAは、コロナウイルスのリーダー配列、S配列、E配列、M配列、N配列、またはS2M配列に実質的に相補的な配列を含む。一実施形態では、crRNAは、コロナウイルスのリーダー配列、N配列、またはS2M配列に実質的に相補的な配列を含む。
【0155】
一実施形態では、タンデムアレイは、コロナウイルスゲノムRNA配列及び/またはコロナウイルスサブゲノムRNA配列に実質的に相補的な配列を含む少なくとも2種以上のcrRNAを含む。一実施形態では、タンデムアレイは、配列番号167~188から選択される配列またはその断片と少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%相同な配列に実質的に相補的な配列を含む少なくとも2種以上のcrRNAを含む。一実施形態では、タンデムアレイは、配列番号167~188から選択される配列またはその断片に実質的に相補的な配列を含む少なくとも2種以上のcrRNAを含む。
【0156】
一実施形態では、タンデムアレイは、配列番号168~174、176~181、186、及び187から選択される配列と少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%相同な配列に実質的に相補的な配列を含む少なくとも2種以上のcrRNAを含む。一実施形態では、タンデムアレイは、配列番号168~174、176~181、186、及び187から選択される配列に実質的に相補的な配列を含む少なくとも2種以上のcrRNAを含む。
【0157】
一実施形態では、タンデムアレイは、配列番号189~224から選択される配列と少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%相同な配列を含む少なくとも2種以上のcrRNAを含む。一実施形態では、タンデムアレイは、配列番号189~224から選択される配列を含む少なくとも2種以上のcrRNAを含む。
【0158】
一実施形態では、タンデムアレイは、配列番号275と少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%相同な配列を含む。一実施形態では、タンデムアレイは、配列番号275の配列を含む。
【0159】
一実施形態では、タンデムアレイは、各々が独立してインフルエンザウイルス配列に実質的に相補的な配列を含む少なくとも2種以上のcrRNAを含む。一実施形態では、タンデムアレイは、各々がインフルエンザウイルスのゲノムmRNA配列またはサブゲノムmRNA配列に実質的に相補的な配列を含む少なくとも2種以上のcrRNAを含む。一実施形態では、タンデムアレイは、各々がインフルエンザウイルスのPB2配列、PB1配列、PA配列、HA配列、NP配列、NA配列、M配列、またはNS配列に実質的に相補的な配列を含む少なくとも2種以上のcrRNAを含む。
【0160】
一実施形態では、タンデムアレイは、配列番号225~244から選択される配列またはその断片と少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%相同な配列に実質的に相補的な配列を含む少なくとも2種以上のcrRNAを含む。一実施形態では、タンデムアレイは、配列番号225~244から選択される配列またはその断片に実質的に相補的な配列を含む少なくとも2種以上のcrRNAを含む。
【0161】
一実施形態では、タンデムアレイは、各々が異なるプラス鎖vRNAセグメント1、2、3、5、または7を標的とする配列を含む少なくとも2種以上のcrRNAを含む。一実施形態では、タンデムアレイは、配列番号216~225から選択される配列と少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%相同な配列を含む少なくとも2種以上のcrRNAを含む。一実施形態では、タンデムアレイは、配列番号245~264から選択される配列を含む少なくとも2種以上のcrRNAを含む。一実施形態では、タンデムアレイは、配列番号255~259から選択される配列と少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%相同な配列を含む少なくとも2種以上のcrRNAを含む。一実施形態では、タンデムアレイは、配列番号255~259から選択される配列を含む少なくとも2種以上のcrRNAを含む。
【0162】
一実施形態では、タンデムアレイは、各々が異なるマイナス鎖vRNAセグメント1、2、3、5、または7を標的とする配列を含む少なくとも2種以上のcrRNAを含む。一実施形態では、タンデムアレイは、配列番号245~249から選択される配列と少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%相同な配列を含む少なくとも2種以上のcrRNAを含む。一実施形態では、タンデムアレイは、配列番号245~249から選択される配列を含む少なくとも2種以上のcrRNAを含む。一実施形態では、タンデムアレイは、配列番号260~264から選択される配列と少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%相同な配列を含む少なくとも2種以上のcrRNAを含む。一実施形態では、タンデムアレイは、配列番号260~264から選択される配列を含む少なくとも2種以上のcrRNAを含む。
【0163】
一実施形態では、タンデムアレイは、配列番号250~254から選択される配列と少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%相同な配列を含む少なくとも2種以上のcrRNAを含む。一実施形態では、タンデムアレイは、配列番号250~254から選択される配列を含む少なくとも2種以上のcrRNAを含む。
【0164】
一実施形態では、タンデムアレイは、配列番号276~279のうちの1つと少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%相同な配列を含む。一実施形態では、タンデムアレイは、配列番号276~279の配列を含む。
【0165】
一実施形態では、タンデムアレイは、各々が独立して細胞経路内のmRNA配列に実質的に相補的な配列を含む、少なくとも2種以上のcrRNAを含む。幾つかの実施形態では、細胞経路は、例えば、制御されない増殖及び細胞生存の増強を伴う細胞プロセスの制御異常をもたらす。例えば、一実施形態では、各crRNAは、独立して、細胞内のRAS、JAK-STAT、PI3K/AKT ErbB、p53媒介アポトーシス、GSK3、Hippo、Wnt、エストロゲン、インスリン、mTOR、NF-kB、Notch、TGF-β、Toll様受容体、VEGF、AMPK、またはMAPKシグナル伝達経路内のmRNA配列に実質的に相補的な配列を含む。
【0166】
一実施形態では、タンデムアレイは、各々が独立して、微生物または植物での生物燃料生成、生物工学技術でのCAR-T細胞の製造、ストレス応答経路のサイレンシング、免疫細胞の炎症経路のサイレンシング、複数の異なる型または亜型の感染性ウイルスへの標的化に使用するためのmRNA配列に実質的に相補的な配列を含む少なくとも2種以上のcrRNAを含む。
【0167】
一実施形態では、crRNAは、ダイレクトリピート(DR)配列を含む。一実施形態では、DR配列は、標的配列に実質的に相補的な配列の5’に存在する。例えば、一実施形態では、DR配列は、コロナウイルスゲノムmRNA配列またはコロナウイルスサブゲノムmRNA配列に実質的に相補的な配列の5’に存在する。一実施形態では、DR配列は、Cas13の標的配列への標的化活性、Cas13触媒活性、または両方を増強する。例えば、一実施形態では、DR配列は変異を含む。例えば、一実施形態では、DR配列はT17C点変異を含む。一実施形態では、DR配列はT18C点変異を含む。一実施形態では、DR配列は、T17A点変異を含む。一実施形態では、DR配列は、T18A点変異を含む。一実施形態では、DR配列は、T17G点変異を含む。一実施形態では、DR配列は、T18G点変異を含む。一実施形態では、DR配列は、配列番号189~224から選択される配列と少なくとも80%相同な配列の5’に存在する。一実施形態では、DR配列は、標的配列に実質的に相補的な配列の3’に存在する。例えば、一実施形態では、DR配列は、コロナウイルスゲノムmRNA配列またはコロナウイルスサブゲノムmRNA配列に実質的に相補的な配列の3’に存在する。一実施形態では、DR配列は、配列番号189~224から選択される配列と少なくとも80%相同な配列の3’に存在する。一実施形態では、5’または3’DR配列の選択は、使用されるCasタンパク質オーソログに依存する。一実施形態では、DR配列は、配列番号265~274から選択される配列を含む。
【0168】
一実施形態では、ガイドRNAのスペーサーの長さは、15~35ヌクレオチドである。一実施形態では、ガイドRNAのスペーサーの長さは、少なくとも15ヌクレオチドである。一実施形態では、スペーサーの長さは、15~17ヌクレオチド、例えば、15、16、もしくは17ヌクレオチド、17~20ヌクレオチド、例えば、17、18、19、もしくは20ヌクレオチド、20~24ヌクレオチド、例えば、20、21、22、23、もしくは24ヌクレオチド、23~25ヌクレオチド、例えば、23、24、もしくは25ヌクレオチド、24~27ヌクレオチド、例えば、24、25、26、もしくは27ヌクレオチド、27~30ヌクレオチド、例えば、27、28、29、もしくは30ヌクレオチド、30~35ヌクレオチド、例えば、30、31、32、33、34、もしくは35ヌクレオチド、または35ヌクレオチドもしくはそれ以上である。
【0169】
一般に、用語「スペーサー配列」と互換的に使用される「ガイド配列」は、標的配列とハイブリダイズし、CRISPR複合体の当該標的配列への配列特異的な結合を誘導するのに十分な当該標的ポリヌクレオチド配列との相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列である。幾つかの実施形態では、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、好適なアラインメントアルゴリズムを使用して最適にアラインメントされる場合、約50%もしくは約50%超、約60%もしくは約60%超、約75%もしくは約75%超、約80%もしくは約80%超、約85%もしくは約85%超、約90%もしくは約90%超、約95%もしくは約95%超、約97.5%もしくは約97.5%超、約99%もしくは約99%超、またはそれ以上である。最適なアラインメントは、配列をアラインメントするための任意の好適なアルゴリズムを使用して決定され得、これらの非限定的な例としては、Smith-Watermanアルゴリズム、Needleman-Wunschアルゴリズム、Burrows-Wheeler変換に基づくアルゴリズム(例えば、Burrows Wheeler Aligner)、ClustalW、Clustal X、BLAT、Novoalign(Novocraft Technologies;www.novocraft.comで利用可能)、ELAND(Illumina、San Diego、Calif.)、SOAP(soap.genomics.org.cnで利用可能)、及びMaq(maq.sourceforge.netで利用可能)が挙げられる。幾つかの実施形態では、ガイド配列は、約5もしくは約5超、約10もしくは約10超、約11もしくは約11超、約12もしくは約12超、約13もしくは約13超、約14もしくは約14超、約15もしくは約15超、約16もしくは約16超、約17もしくは約17超、約18もしくは約18超、約19もしくは約19超、約20もしくは約20超、約21もしくは約21超、約22もしくは約22超、約23もしくは約23超、約24もしくは約24超、約25もしくは約25超、約26もしくは約26超、約27もしくは約27超、約28もしくは約28超、約29もしくは約29超、約30もしくは約30超、約35もしくは約35超、約40もしくは約40超、約45もしくは約45超、約50もしくは約50超、約75もしくは約75超、またはそれ以上のヌクレオチド長である。幾つかの実施形態では、ガイド配列は、約75未満、50未満、45未満、40未満、35未満、30未満、25未満、20未満、15未満、12未満、またはそれ以下のヌクレオチド長である。好ましくは、ガイド配列は、10~30ヌクレオチド長である。CRISPR複合体の標的配列への配列特異的な結合を誘導するガイド配列の能力は、任意の好適なアッセイにより評価され得る。例えば、試験されるガイド配列が含まれる、CRISPR複合体を形成するのに十分なCRISPR系の構成要素が、CRISPR配列の構成要素をコードするベクターを用いた形質移入などにより対応する標的配列を有する宿主細胞に提供され得、続いて、標的配列内での選択的な切断が本明細書に記載されるSurveyorアッセイなどにより評価される。同様に、標的配列、試験されるガイド配列及び試験されるガイド配列と異なる対照ガイド配列が含まれる、CRISPR複合体の構成要素を提供し、試験されるガイド配列での反応と対照ガイド配列での反応との間で、標的配列内での結合または切断率を比較することにより、試験管内での標的ポリヌクレオチド配列の切断が評価され得る。他のアッセイが利用可能であり、当業者は思いつくであろう。
【0170】
CRISPR-Cas系の幾つかの実施形態では、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、約50%もしくは約50%超、約60%もしくは約60%超、約75%もしくは約75%超、約80%もしくは約80%超、約85%もしくは約85%超、約90%もしくは約90%超、約95%もしくは約95%超、約97.5%もしくは約97.5%超、約99%もしくは約99%超、または100%であり得、ガイドRNAまたはsgRNAは、約5もしくは約5超、約10もしくは約10超、約11もしくは約11超、約12もしくは約12超、約13もしくは約13超、約14もしくは約14超、約15もしくは約15超、約16もしくは約16超、約17もしくは約17超、約18もしくは約18超、約19もしくは約19超、約20もしくは約20超、約21もしくは約21超、約22もしくは約22超、約23もしくは約23超、約24もしくは約24超、約25もしくは約25超、約26もしくは約26超、約27もしくは約27超、約28もしくは約28超、約29もしくは約29超、約30もしくは約30超、約35もしくは約35超、約40もしくは約40超、約45もしくは約45超、約50もしくは約50超、約75もしくは約75超、またはそれ以上のヌクレオチド長であり得るか、あるいはガイドRNAまたはsgRNAは、約75未満、50未満、45未満、40未満、35未満、30未満、25未満、20未満、15未満、12未満、またはそれ以下のヌクレオチド長であり得、有利には、tracrRNAは、30または50ヌクレオチド長である。しかしながら、本発明の態様は、オフターゲット相互作用を低減すること、例えば、低い相補性を有する標的配列と相互作用するガイド配列を低減することである。実際、実施例において、標的配列と、80%超~約95%の相補性、例えば、83%~84%または88~89%または94~95%の相補性を有するオフターゲット配列とを区別することができる(例えば、18ヌクレオチドを有する標的と、1、2、または3つのミスマッチを有する18ヌクレオチドのオフターゲットとを区別する)CRISPR-Cas系をもたらす変異を本発明が含むことが示される。従って、本発明の文脈において、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、94.5%超または95%超または95.5%超または96%超または96.5%超または97%超または97.5%超または98%超または98.5%超または99%超または99.5%超または99.9%超または100%である。オフターゲットは、その配列とガイドとの間の相補性が100%未満または99.9%未満または99.5%未満または99%未満または99%未満または98.5%未満または98%未満または97.5%未満または97%未満または96.5%未満または96%未満または95.5%未満または95%未満または94.5%未満または94%未満または93%未満または92%未満または91%未満または90%未満または89%未満または88%未満または87%未満または86%未満または85%未満または84%未満または83%未満または82%未満または81%未満または80%未満であり、有利には、オフターゲットは、その配列とガイドとの間の相補性が100%または99.9%または99.5%または99%または99%または98.5%または98%または97.5%または97%または96.5%または96%または95.5%または95%または94.5%である。
【0171】
核酸
本開示の単離核酸配列は、当該技術分野において公知の多数の組換え方法のうちのいずれかを使用して、例えば、標準的な技術を使用して、遺伝子を発現する細胞由来のスクリーニングライブラリーによって、遺伝子を含むことが公知のベクターから遺伝子を取り出すことによって、または遺伝子を含有する細胞及び組織から直接単離することによって得られ得る。代替的に、関心対象の遺伝子は、クローニングではなく合成により生成され得る。
【0172】
単離核酸は、限定されるものではないが、DNA及びRNAが含まれる、任意の種類の核酸を含み得る。例えば、一実施形態では、組成物は、本開示のタンパク質をコードする、例えば、単離cDNA分子が含まれる、単離DNA分子を含む。一実施形態では、組成物は、本開示のタンパク質またはその機能断片をコードする単離RNA分子を含む。
【0173】
本発明の核酸分子は、血清中または細胞培養用の増殖培地中での安定性を改善するために修飾され得る。修飾は、本発明の核酸分子の安定性、機能性、及び/または特異性を増強し、免疫賦活作用を最小限にするために付加され得る。例えば、安定性を増強するために、3’残基が分解に対して安定化され得る。例えば、それらがプリンヌクレオチド、特にアデノシンまたはグアノシンヌクレオチドからなるようにそれらが選択され得る。代替的に、修飾された類似体によるピリミジンヌクレオチドの置換、例えば、2’-デオキシチミジンによるウリジンの置換が許容され、分子の機能に影響を及ぼさない。
【0174】
本発明の一実施形態では、核酸分子は、少なくとも1つの修飾ヌクレオチド類似体を含有し得る。例えば、末端は、修飾ヌクレオチド類似体を組み込むことによって安定化され得る。
ヌクレオチド類似体の非限定的な例としては、糖及び/または骨格が修飾されたリボヌクレオチドが挙げられる(すなわち、リン酸-糖骨格への修飾が挙げられる)。例えば、天然RNAのホスホジエステル結合は、窒素または硫黄ヘテロ原子のうちの少なくとも1つを含むように修飾され得る。例示的な骨格が修飾されたリボヌクレオチドでは、隣接するリボヌクレオチドに結合しているリン酸エステル基が、修飾基、例えば、ホスホロチオエート基で置き換えられている。例示的な糖が修飾されたリボヌクレオチドでは、2’OH基が、H、OR、R、ハロ、SH、SR、NH2、NHR、NR2、またはONから選択される基で置き換えられており、ここで、Rは、C1~C6アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、ハロは、F、Cl、Br、またはIである。
【0175】
修飾の他の例は、核酸塩基が修飾されたリボヌクレオチド、すなわち、天然に存在する核酸塩基の代わりに少なくとも1つの非天然核酸塩基を含有するリボヌクレオチドである。アデノシンデアミナーゼの活性を阻害するように塩基が修飾され得る。例示的な修飾核酸塩基としては、限定されるものではないが、5位で修飾されたウリジン及び/またはシチジン、例えば、5-(2-アミノ)プロピルウリジン、5-ブロモウリジン;8位で修飾されたアデノシン及び/またはグアノシン、例えば、8-ブロモグアノシン;デアザヌクレオチド、例えば、7-デアザ-アデノシン;O-アルキル化ヌクレオチド及びN-アルキル化ヌクレオチド、例えば、N6-メチルアデノシンが挙げられ、好適である。上記の修飾が組み合わされ得ることに留意されたい。
【0176】
場合によっては、核酸分子は、以下の化学修飾のうちの少なくとも1つを含む:1つ以上のヌクレオチドの2’-H、2’-O-メチル、または2’-OH修飾。ある種の実施形態では、本発明の核酸分子は、ヌクレアーゼに対する増強された耐性を有し得る。ヌクレアーゼ耐性の増加のために、核酸分子は、例えば、2’-修飾されたリボース単位及び/またはホスホロチオエート結合を含み得る。例えば、2’ヒドロキシル基(OH)が、多数の異なる「オキシ」または「デオキシ」置換基で修飾され得るか、または置き換えられ得る。ヌクレアーゼ耐性の増加のために、本発明の核酸分子は、2’-O-メチル、2’-フッ素、2’-O-メトキシエチル、2’-O-アミノプロピル、2’-アミノ、及び/またはホスホロチオエート結合を含み得る。ロックド核酸(LNA)、エチレン核酸(ENA)、例えば、2’-4’-エチレン架橋核酸を含有させること、及び特定の核酸塩基修飾、例えば、2-アミノ-A修飾、2-チオ(例えば、2-チオ-U)修飾、G-クランプ修飾も標的に対する結合親和性を増加させ得る。
【0177】
一実施形態では、核酸分子は、2’-修飾されたヌクレオチド、例えば、2’-デオキシ、2’-デオキシ-2’-フルオロ、2’-O-メチル、2’-O-メトキシエチル(2’-O-MOE)、2’-O-アミノプロピル(2’-O-AP)、2’-O-ジメチルアミノエチル(2’-O-DMAOE)、2’-O-ジメチルアミノプロピル(2’-O-DMAP)、2’-O-ジメチルアミノエチルオキシエチル(2’-O-DMAEOE)、または2’-O-N-メチルアセトアミド(2’-O-NMA)を含む。一実施形態では、核酸分子は、少なくとも1つの2’-O-メチル修飾されたヌクレオチドを含み、幾つかの実施形態では、核酸分子のヌクレオチドの全てが、2’-O-メチル修飾を含む。
【0178】
ある種の実施形態では、本発明の核酸分子は、以下の特性のうちの1つ以上を有する。
【0179】
本明細書に述べる核酸薬剤は、他の点では未修飾のRNA及びDNA、ならびに例えば、有効性を改善するために修飾されたRNA及びDNA、ならびにヌクレオシド代用物のポリマーを含む。未修飾RNAとは、核酸の構成要素、すなわち糖、塩基、及びリン酸部分が、天然に存在するものまたは人体に天然に存在するものと同じであるか、または本質的に同じである分子を指す。当該技術分野において、稀であるか、または通常と異なるが天然に存在するRNAは、修飾RNAとみなされている。例えば、Limbach et al.(Nucleic Acids Res.,1994,22:2183-2196)を参照のこと。しばしば修飾RNAと称されるかかる稀であるか、または通常と異なるRNAは、典型的には、転写後修飾の結果であり、本明細書で使用する場合、未修飾RNAという用語の範囲内である。本明細書で使用する場合、修飾RNAとは、核酸の構成要素、すなわち糖、塩基、及びリン酸部分のうちの1つ以上が、天然に存在するものと異なるか、または人体に天然に存在するものと異なる分子を指す。それらは「修飾RNA」と称されるが、修飾に起因して、厳密に言えばRNAではない分子も当然ながら含む。ヌクレオシド代用物とは、ハイブリダイゼーションがリボースリン酸骨格で見られるものと実質的に類似するように、塩基が正しい空間関係で提示されることを可能にする非リボースリン酸構造、例えば、リボースリン酸骨格の非荷電模倣物でリボースリン酸骨格が置き換えられている分子である。
【0180】
本発明の核酸の修飾は、リン酸基、糖基、骨格、N末端、C末端、または核酸塩基のうちの1つ以上に存在し得る。
【0181】
本発明は、本発明の単離核酸が挿入されるベクターも含む。当該技術分野には、本発明において有用である好適なベクターが豊富に存在する。
【0182】
簡潔に要約すると、本開示のタンパク質をコードする天然または合成核酸の発現は、典型的には、本開示のタンパク質またはその一部をコードする核酸をプロモーターに作動可能に連結し、構築物を発現ベクターに組み込むことにより達成される。使用されるベクターは、真核細胞における複製及び任意により、組込みに好適である。典型的なベクターは、転写及び翻訳ターミネーター、開始配列、ならびに所望の核酸配列の発現の調節に有用なプロモーターを含有する。
【0183】
本発明のベクターは、標準的な遺伝子送達プロトコールを使用した核酸免疫法及び遺伝子治療にも使用され得る。遺伝子送達のための方法は、当該技術分野において公知である。例えば、米国特許第5,399,346号、同第5,580,859号、同第5,589,466号(参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる)を参照のこと。別の実施形態では、本発明は、遺伝子治療ベクターを提供する。
【0184】
本発明の単離核酸は、多数の種類のベクターにクローニングされ得る。例えば、核酸は、限定されるものではないが、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス、及びコスミドが含まれるベクターにクローニングされ得る。特に関心対象となるベクターとしては、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、及び配列決定ベクターが挙げられる。
【0185】
更にベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に提供され得る。ウイルスベクター技術は、当該技術分野において周知であり、例えば、Sambrook et al.(2012,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)、ならびに他のウイルス学及び分子生物学のマニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスとしては、限定されるものではないが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、及びレンチウイルスが挙げられる。一般に、好適なベクターは、少なくとも1種の生物において機能する複製開始点、プロモーター配列、有用な制限エンドヌクレアーゼ部位、及び1つ以上の選択マーカーを含有する(例えば、WO01/96584;WO01/29058;及び米国特許第6,326,193号)。
【0186】
送達系及び送達方法
一態様では、本開示は、新規のレンチウイルスパッケージング系及び送達系の開発に関する。レンチウイルス粒子は、ウイルス酵素をタンパク質として送達する。この様式では、レンチウイルス酵素が短命であるため、細胞の生涯にわたる長期的発現に起因するオフターゲット編集の可能性が制限される。従って、一実施形態では、本開示は、遺伝子または遺伝物質を送達するための新規の送達系を提供する。
【0187】
編集構成要素または従来のCRISPR-Cas編集構成要素をタンパク質としてレンチウイルス粒子に組み込むことは、必要とされるそれらの活性が短期間のみ必要とされることを考慮すると、有利である。従って、一実施形態では、本開示は、レンチウイルス送達系、ならびにレンチウイルス送達系を使用した本発明の組成物を送達する方法、遺伝物質を編集する方法、及び核酸送達の方法を提供する。
【0188】
一実施形態では、送達系は、(1)パッケージングプラスミド、(2)導入プラスミド、及び(3)エンベローププラスミドを含む。一実施形態では、送達系は、(1)パッケージングプラスミド、(2)エンベローププラスミド、及び(3)VPRプラスミドを含む。一実施形態では、パッケージングプラスミドは、gag-polポリプロテインをコードする核酸配列を含む。一実施形態では、gag-polポリプロテインは、触媒活性を失った(catalytically dead)インテグラーゼを含む。一実施形態では、gag-polポリプロテインは、D116N、D116A、D116E、D64V、D64E、及びD64Aから選択される変異を含む。
【0189】
一実施形態では、導入プラスミドは、本開示のcrRNA配列及びCasタンパク質をコードする核酸配列を含む。例えば、一実施形態では、導入プラスミドは、crRNA配列及びCasタンパク質を含む本開示のタンパク質をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、導入プラスミドは、crRNA配列ならびにCasタンパク質及び局在化シグナルを含む本開示のタンパク質をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、導入プラスミドは、crRNA配列ならびにCasタンパク質及びNLS、NES、または他の局在化シグナルを含む本開示のタンパク質をコードする核酸配列を含む。
【0190】
例えば、一実施形態では、導入プラスミドは、本開示のタンデムcrRNAアレイをコードする核酸配列を含む。一実施形態では、タンデムアレイは、1種以上、2種以上、3種以上、4種以上、5種以上、6種以上、7種以上、または8種以上のcrRNA配列を含む。一実施形態では、タンデムcrRNAアレイの各crRNAは、ダイレクトリピート(DR)配列及びスペーサー配列を含む。一実施形態では、ダイレクトリピート配列は、ガイド配列またはスペーサー配列の上流(すなわち、5’)に存在し得る。他の実施形態では、ダイレクトリピート配列は、ガイド配列またはスペーサー配列の下流(すなわち、3’)に存在し得る。
【0191】
一実施形態では、タンデムcrRNAアレイの各crRNAは、異なるダイレクトリピート配列を含む。例えば、一実施形態では、ダイレクトリピートのループ領域内のヌクレオチド置換、複数のガイドRNAにより、crRNAの順序付けられたアレイの効率的な生成がもたらされる。
【0192】
一実施形態では、タンデムアレイは、少なくとも2種以上のcrRNAを含み、ここで、各crRNAは、標的RNAに実質的に相補的な配列を含む。例えば、一実施形態では、各crRNAは、単一の標的RNA内の異なる配列に実質的に相補的な異なる配列を含む。一実施形態では、各crRNAは、異なる標的RNA内の異なる配列に実質的に相補的な異なる配列を含む。一実施形態では、異なる標的RNAは、単一の疾患、障害、または感染症に関連する。例えば、一実施形態では、異なる標的RNAは、ウイルスの各ウイルスRNA配列である。
【0193】
一実施形態では、タンデムアレイは、コロナウイルスゲノムRNA配列及び/またはコロナウイルスサブゲノムRNA配列に実質的に相補的な配列を含む少なくとも2種以上のcrRNAを含む。一実施形態では、タンデムアレイは、配列番号167~188から選択される配列またはその断片と少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%相同な配列に実質的に相補的な配列を含む少なくとも2種以上のcrRNAを含む。一実施形態では、タンデムアレイは、配列番号167~188から選択される配列またはその断片に実質的に相補的な配列を含む少なくとも2種以上のcrRNAを含む。
【0194】
一実施形態では、タンデムアレイは、配列番号189~224から選択される配列と少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%相同な配列を含む少なくとも2種以上のcrRNAを含む。一実施形態では、タンデムアレイは、配列番号189~22から選択される配列を含む少なくとも2種以上のcrRNAを含む。
【0195】
一実施形態では、タンデムアレイは、配列番号275と少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%相同な配列を含む。一実施形態では、タンデムアレイは、配列番号275の配列を含む。
【0196】
一実施形態では、タンデムアレイは、各々が独立してインフルエンザウイルス配列に実質的に相補的な配列を含む少なくとも2種以上のcrRNAを含む。一実施形態では、タンデムアレイは、各々がインフルエンザウイルスのゲノムmRNA配列またはサブゲノムmRNA配列に実質的に相補的な配列を含む少なくとも2種以上のcrRNAを含む。一実施形態では、タンデムアレイは、各々がインフルエンザウイルスのPB2配列、PB1配列、PA配列、HA配列、NP配列、NA配列、M配列、またはNS配列に実質的に相補的な配列を含む少なくとも2種以上のcrRNAを含む。
【0197】
一実施形態では、タンデムアレイは、配列番号225~244から選択される配列またはその断片と少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%相同な配列に実質的に相補的な配列を含む少なくとも2種以上のcrRNAを含む。一実施形態では、タンデムアレイは、配列番号225~244から選択される配列またはその断片に実質的に相補的な配列を含む少なくとも2種以上のcrRNAを含む。
【0198】
一実施形態では、タンデムアレイは、配列番号245~249から選択される配列と少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%相同な配列を含む少なくとも2種以上のcrRNAを含む。一実施形態では、タンデムアレイは、配列番号245~249から選択される配列を含む少なくとも2種以上のcrRNAを含む。
【0199】
一実施形態では、タンデムアレイは、配列番号276~279のうちの1つと少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%相同な配列を含む。一実施形態では、タンデムアレイは、配列番号276~279のうちの1つの配列を含む。
【0200】
一実施形態では、タンデムアレイは、各々が独立して細胞経路内のmRNA配列に実質的に相補的な配列を含む、少なくとも2種以上のcrRNAを含む。幾つかの実施形態では、細胞経路は、例えば、制御されない増殖及び細胞生存の増強を伴う細胞プロセスの制御異常をもたらす。例えば、一実施形態では、各crRNAは、独立して、RAS、JAK-STAT、PI3K/AKT、またはMAPK細胞経路内のmRNA配列に実質的に相補的な配列を含む。
【0201】
一実施形態では、Casタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号1~47または68~100のうちの1つと少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%相同なアミノ酸配列をコードする配列を含む。一実施形態では、Casタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号132~133または14~166のうちの1つと少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%相同な配列を含む。
【0202】
一実施形態では、導入プラスミドは、配列番号283の配列を含む。
【0203】
一実施形態では、エンベローププラスミドは、エンベロープタンパク質をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、エンベロープタンパク質は、所望の細胞種に基づいて選択され得る。一実施形態では、エンベローププラスミドは、HIVエンベロープタンパク質をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、エンベローププラスミドは、水疱性口炎ウイルスgタンパク質(VSV-g)エンベロープタンパク質をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、エンベローププラスミドは、配列番号130と少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%相同なアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、エンベローププラスミドは、配列番号130のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。
【0204】
一実施形態では、エンベローププラスミドは、コロナウイルススパイクタンパク質またはコロナウイルススパイクタンパク質由来のタンパク質をコードする核酸配列を含む。例えば、一実施形態では、エンベローププラスミドは、配列番号101~129のうちの1つと少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%相同なアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、エンベローププラスミドは、配列番号101~129のうちの1つのアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。
【0205】
一実施形態では、コロナウイルス由来のウイルスエンベロープタンパク質は、レンチウイルスベクターを偽型化するのに効率的でない。従って、一実施形態では、本開示は、レンチウイルスベクターを偽型化するのに使用するための新規のコロナウイルスエンベロープタンパク質も提供する。一実施形態では、コロナウイルスエンベロープタンパク質は、配列番号101~129のうちの1つと少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%相同なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、コロナウイルスエンベロープタンパク質は、配列番号101~129のうちの1つのアミノ酸配列を含む。
【0206】
一実施形態では、VPRプラスミドは、VPR及び本開示のCasタンパク質を含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含む。
【0207】
一実施形態では、パッケージングプラスミド、導入プラスミド、及びエンベローププラスミドが細胞に導入される。一実施形態では、細胞は、パッケージングプラスミドによりコードされるgag-polタンパク質をコードする核酸配列を転写し、翻訳して、gag-polポリプロテインを生成する。一実施形態では、細胞は、エンベローププラスミドのエンベロープタンパク質をコードする核酸配列を転写し、翻訳して、エンベロープタンパク質を生成する。一実施形態では、細胞は、導入プラスミドのcrRNA配列またはcrRNAアレイをコードする核酸配列を転写して、crRNAまたはcrRNAアレイを生成する。一実施形態では、細胞は、導入プラスミドのCasタンパク質をコードする核酸配列を転写し、翻訳して、Casタンパク質またはCas融合タンパク質を生成する。
【0208】
一実施形態では、転写された導入プラスミド及びgag-polタンパク質が、レンチウイルスベクターにパッケージングされる。一実施形態では、レンチウイルスベクターは、細胞培地から収集される。一実施形態では、ウイルス粒子は、標的細胞に形質導入し、ここで、転写されたcrRNA及びCasタンパク質が切断され、翻訳され、これにより、Casタンパク質及びcrRNAが生成され、crRNAは、Casタンパク質に結合し、これをcrRNA配列に実質的に相補的な配列を有するRNAに誘導する。
【0209】
一実施形態では、パッケージングプラスミド、導入プラスミド、及びエンベローププラスミドが細胞に導入される。一実施形態では、細胞は、パッケージングプラスミドによりコードされるgag-polタンパク質をコードする核酸配列を転写し、翻訳して、gag-polポリプロテインを生成する。一実施形態では、細胞は、エンベローププラスミドのエンベロープタンパク質をコードする核酸配列を転写し、翻訳して、エンベロープタンパク質を生成する。一実施形態では、細胞は、遺伝子をコードする核酸配列を転写して、遺伝子を生成する。一実施形態では、細胞は、導入プラスミドの遺伝子をコードする核酸配列を転写し、翻訳して、タンパク質を生成する。
【0210】
一実施形態では、転写された導入プラスミド及びgag-polタンパク質が、レンチウイルスベクターにパッケージングされる。一実施形態では、レンチウイルスベクターは、細胞培地から収集される。一実施形態では、ウイルス粒子は、標的細胞に形質導入し、ここで、転写された遺伝子は、細胞に送達されており、ゲノムに挿入されている。
【0211】
一実施形態では、転写された導入プラスミド及びgag-polタンパク質が、レンチウイルスベクターにパッケージングされる。一実施形態では、レンチウイルスベクターは、細胞培地から収集される。一実施形態では、ウイルス粒子は、標的細胞に形質導入し、ここで、転写及び翻訳された遺伝子が細胞に送達されている。
【0212】
一実施形態では、遺伝子またはタンパク質は、呼吸器細胞種、血管細胞種、腎臓細胞種、または心血管細胞種に送達される。従って、一実施形態では、エンベロープタンパク質は、コロナウイルスに由来する。一実施形態では、コロナウイルスエンベロープタンパク質は、配列番号101~129のうちの1つと少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%相同なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、コロナウイルスエンベロープタンパク質は、配列番号101~129のうちの1つのアミノ酸配列を含む。
【0213】
更に多数の追加のウイルスベースの系が、哺乳動物細胞への遺伝子導入のために開発されてきた。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達システムに便利なプラットフォームを提供する。選択された遺伝子は、当該技術分野において公知の技術を使用してベクターに挿入され得、レトロウイルス粒子にパッケージングされ得る。次いで、組換えウイルスが単離され得、インビボまたはエクスビボのいずれかで対象の細胞に送達され得る。多数のレトロウイルス系が当該技術分野において公知である。幾つかの実施形態では、アデノウイルスベクターが使用される。多数のアデノウイルスベクターが当該技術分野において公知である。一実施形態では、レンチウイルスベクターが使用される。
【0214】
例えば、レンチウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクターは、それらが導入遺伝子の長期の安定した組込み及び娘細胞におけるその伝播を可能にするため、長期の遺伝子導入を達成するのに好適なツールである。レンチウイルスベクターは、マウス白血病ウイルスなどの腫瘍レトロウイルスに由来するベクターと比較して、肝実質細胞などの非増殖細胞に形質導入することができるという点で更なる利点を有する。それらは、免疫原性が低いという更なる利点も有する。
【0215】
一実施形態では、組成物は、アデノ随伴ウイルス(AAV)に由来するベクターを含む。用語「AAVベクター」は、限定されるものではないが、AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、及びAAV-9が含まれる、アデノ随伴ウイルス血清型に由来するベクターを意味する。AAVベクターは、種々の障害の処置のための強力な遺伝子送達ツールとなっている。AAVベクターは、病原性がないこと、最小限の免疫原性、及び安定的かつ効率的に分裂終了細胞に形質導入する能力が含まれる、AAVベクターを遺伝子治療に理想的に適したものにする幾つかの特徴を有する。AAVベクター内に含まれる特定の遺伝子の発現は、AAV血清型、プロモーター、及び送達方法の適切な組み合わせを選択することにより、1つ以上の種類の細胞に特異的に標的化され得る。
【0216】
例えば、一実施形態では、AAVベクターは、コロナウイルスゲノムmRNA配列またはコロナウイルスサブゲノムmRNA配列に実質的に相補的な配列を有するcrRNAを含む。一実施形態では、AAVベクターは、コロナウイルスゲノムmRNA配列またはコロナウイルスサブゲノムmRNA配列に実質的に相補的な配列を有する2種以上のcrRNAを含むcrRNAアレイを含む。一実施形態では、AAVベクターは、配列番号284と少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%相同な配列を含む。一実施形態では、導入プラスミドは、配列番号284の配列を含む。
【0217】
一実施形態では、AAVベクターは、インフルエンザウイルスゲノムRNA配列またはインフルエンザウイルスサブゲノムRNA配列に実質的に相補的な配列を有するcrRNAを含む。一実施形態では、導入プラスミドは、インフルエンザウイルスゲノムRNA配列またはインフルエンザウイルスサブゲノムRNA配列に実質的に相補的な配列を有する2種以上のcrRNAを含むcrRNAアレイを含む。
【0218】
AAVベクターは、AAV野生型遺伝子のうちの1つ以上、好ましくは、rep及び/またはcap遺伝子の全体または一部の欠失を有し得るが、機能的な隣接するITR配列を保持し得る。高度な相同性にもかかわらず、異なる血清型は異なる組織に対する指向性を有する。AAV1の受容体は知られていないが、AAV1は、AAV2よりも効率的に骨格筋及び心筋に形質導入することが公知である。ほとんどの研究が、AAV2 ITRに挟まれたベクターDNAが代替の血清型のカプシドにパッケージングされている偽型ベクターを用いて行われてきたため、生物学的相違がゲノムではなくカプシドに関連することは明らかである。最近の証拠は、AAV1カプシドにパッケージングされたDNA発現カセットが、心筋細胞の形質導入において、AAV2カプシドにパッケージングされたものよりも少なくとも1log10効率的であることを示している。一実施形態では、ウイルス送達系は、アデノ随伴ウイルス送達系である。アデノ随伴ウイルスは、血清型1(AAV1)、血清型2(AAV2)、血清型3(AAV3)、血清型4(AAV4)、血清型5(AAV5)、血清型6(AAV6)、血清型7(AAV7)、血清型8(AAV8)、または血清型9(AAV9)のものであり得る。
【0219】
ベクターへのアセンブリに望ましいAAV断片としては、vp1、vp2、vp3、及び超可変領域が含まれるcapタンパク質、rep78、rep68、rep52、及びrep40が含まれるrepタンパク質、ならびにこれらのタンパク質をコードする配列が挙げられる。これらの断片は、種々のベクター系及び宿主細胞で容易に利用され得る。かかる断片は、単独で、他のAAV血清型の配列もしくは断片と組み合わせて、または他のAAVもしくは非AAVウイルス配列由来のエレメントと組み合わせて使用され得る。本明細書で使用する場合、人工AAV血清型としては、限定されるものではないが、非天然カプシドタンパク質を有するAAVが挙げられる。かかる人工カプシドは、選択されたAAV配列(例えば、vp1カプシドタンパク質の断片)を、選択された異なるAAV血清型、同じAAV血清型の非隣接部分、非AAVウイルス源、または非ウイルス源から得られ得る異種配列と組み合わせて使用して、任意の好適な技術により生成され得る。人工AAV血清型は、限定されるものではないが、キメラAAVカプシド、組換えAAVカプシド、または「ヒト化」AAVカプシドであり得る。従って、1種以上のタンパク質の発現に好適な例示的なAAVまたは人工AAVとしては、とりわけ、AAV2/8(米国特許第7,282,199号を参照のこと)、AAV2/5(National Institutes of Healthから入手可能)、AAV2/9(国際特許公開第WO2005/033321号)、AAV2/6(米国特許第6,156,303号)、及びAAVrh8(国際特許公開第WO2003/042397号)が挙げられる。
【0220】
ある種の実施形態では、ベクターは、本発明により生成されたプラスミドベクターでトランスフェクトされた細胞、または本発明により生成されたウイルスに感染した細胞における導入遺伝子の転写、翻訳、及び/または発現を可能にする様式で導入遺伝子に作動可能に連結された従来の制御エレメントも含む。本明細書で使用する場合、「作動可能に連結された」配列には、関心対象の遺伝子と隣接する発現制御配列、及び関心対象の遺伝子を制御するようにトランスでまたは一定距離を置いて作用する発現制御配列の両方が含まれる。発現制御配列としては、適切な転写開始配列、転写終結配列、プロモーター配列、及びエンハンサー配列;スプライシングシグナル及びポリアデニル化(ポリA)シグナルなどの効率的なRNAプロセシングシグナル;細胞質mRNAを安定化する配列;翻訳効率を増強する配列(すなわち、コザックコンセンサス配列);タンパク質安定性を増強する配列;ならびに必要に応じて、コードされる生成物の分泌を増強する配列が挙げられる。天然プロモーター、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、及び/または組織特異的プロモーターが含まれる、多数の発現制御配列が当該技術分野において公知であり、利用され得る。
【0221】
追加のプロモーターエレメント、例えば、エンハンサーは、転写開始の頻度を調節する。典型的には、これらは開始部位の30~110bp上流の領域に存在するが、近年、多数のプロモーターが、開始部位の下流にも機能的エレメントを含むことが示されている。しばしば、プロモーターエレメント間の間隔には柔軟性があり、その結果、エレメントが互いに対して逆位になったり移動したりしてもプロモーター機能は保持される。チミジンキナーゼ(tk)プロモーターでは、活性の減衰を起こすことなく、プロモーターエレメント間の間隔が50bpまで隔てられ得る。プロモーターによっては、個々のエレメントが協調的に、または独立して、転写を活性化することができるように見える。
【0222】
好適なプロモーターの1つの例は、サイトメガロウイルス(CMV)最初期プロモーター配列である。このプロモーター配列は、機能的に連結された任意のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を作動させることができる強力な構成的プロモーター配列である。好適なプロモーターの別の例は、伸長成長因子-1α(EF-1α)である。しかしながら、シミアンウイルス40(SV40)初期プロモーター、マウス乳癌ウイルス(MMTV)、ヒト免疫不全症ウイルス(HIV)末端反復配列(LTR)プロモーター、MoMuLVプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン・バーウイルス最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならびに限定されるものではないが、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、及びクレアチンキナーゼプロモーターなどのヒト遺伝子プロモーターが含まれるが、これらに限定されない、他の構成的プロモーター配列も使用され得る。更に本発明は、構成的プロモーターの使用に限定されるべきではない。誘導性プロモーターも本発明の一部として意図される。誘導性プロモーターの使用は、機能的に連結されているポリヌクレオチド配列の発現を、かかる発現が所望される場合にはオンにすることができ、または発現が所望されない場合には発現をオフにすることができる分子スイッチを提供する。誘導性プロモーターの例としては、限定されるものではないが、メタロチオネインプロモーター、糖質コルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、及びテトラサイクリンプロモーターが挙げられる。
【0223】
ベクター上に見出されるエンハンサー配列も、ベクターに含まれる遺伝子の発現を調節する。典型的には、エンハンサーは、タンパク質因子と結合して、遺伝子の転写を増強する。エンハンサーは、それが調節する遺伝子の上流または下流に存在し得る。エンハンサーはまた、特定の細胞種または組織種における転写を増強するように組織特異的であり得る。一実施形態では、本発明のベクターは、ベクター内に存在する遺伝子の転写を促進するための1つ以上のエンハンサーを含む。
【0224】
本発明の融合タンパク質の発現を評価するために、細胞に導入される発現ベクターは、ウイルスベクターによってトランスフェクトまたは感染させようとする細胞集団からの発現細胞の同定及び選択を容易にするための選択マーカー遺伝子もしくはレポーター遺伝子のいずれか、またはその両方も含有し得る。他の態様では、選択マーカーは、別個のDNA断片に保有され得、同時トランスフェクションの手順に使用され得る。選択マーカー遺伝子及びレポーター遺伝子の両方が、宿主細胞における発現を可能にするための適切な調節配列と隣接していてもよい。有用な選択マーカーとしては、例えば、neoなどの抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。
【0225】
レポーター遺伝子は、遺伝子導入された可能性のある細胞を同定するため、及び調節配列の機能を評価するために使用される。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物または組織に存在しないか、またはそれらによって発現されない遺伝子であり、幾つかの容易に検出可能な特性、例えば、酵素活性によってその発現が明らかとなるポリペプチドをコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、DNAがレシピエント細胞に導入された後の好適な時点で試験される。好適なレポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子、または緑色蛍光タンパク質遺伝子が挙げられ得る(例えば、Ui-Tei et al.,2000 FEBS Letters 479:79-82)。好適な発現系は周知であり、既知の技法を使用して調製され得るか、または商業的に入手され得る。一般に、レポーター遺伝子の最も高い発現レベルを示す最小限の5’隣接領域を有する構築物が、プロモーターとして同定される。かかるプロモーター領域は、レポーター遺伝子に連結され得、プロモーターにより駆動される転写を調節する能力について作用物質を評価するために使用され得る。
【0226】
遺伝子を細胞に導入し、発現させる方法は、当該技術分野において公知である。発現ベクターに関連して、ベクターは、当該技術分野における任意の方法によって、宿主細胞、例えば、哺乳動物細胞、細菌細胞、酵母細胞、または昆虫細胞に容易に導入され得る。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的、または生物学的手段によって宿主細胞に導入され得る。
【0227】
宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための物理的方法としては、リン酸カルシウム沈殿法、リポフェクション、微粒子銃法、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどが挙げられる。ベクター及び/または外来性核酸を含む細胞を作製するための方法は、当該技術分野において周知である。例えば、Sambrook et al.(2012,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)を参照のこと。ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための例示的な方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションである。
【0228】
関心対象のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための生物学的方法としては、DNA及びRNAベクターの使用が挙げられる。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、哺乳動物、例えば、ヒト細胞に遺伝子を挿入するための最も広く使用されている方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスI型、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルスなどに由来し得る。例えば、米国特許第5,350,674号及び第5,585,362号を参照のこと。
【0229】
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための化学的手段としては、コロイド分散系、例えば、高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油型エマルション、ミセル、混合ミセル、及びリポソームが含まれる脂質ベースの系が挙げられる。インビトロ及びインビボで送達媒体として使用するための例示的なコロイド系は、リポソーム(例えば、人工膜小胞)である。
【0230】
非ウイルス送達系が利用される場合には、例示的な送達媒体は、リポソームである。宿主細胞への核酸の(インビトロ、エクスビボ、またはインビボ)導入のための脂質製剤の使用が意図される。別の態様では、核酸は脂質と会合していてもよい。脂質と会合した核酸は、リポソームの水性内部に封入され得るか、リポソームの脂質二重層内に分散され得るか、リポソーム及びオリゴヌクレオチドの両方と会合している連結分子を介してリポソームに付着され得るか、リポソーム内に封じ込められ得るか、リポソームと複合体化され得るか、脂質を含有する溶液中に分散され得るか、脂質と混合され得るか、脂質と組み合わされ得るか、懸濁物として脂質に含有され得るか、ミセル中に含有され得るか、もしくはこれと複合体化され得るか、または別様に脂質と会合し得る。脂質、脂質/DNA、または脂質/発現ベクターが会合した組成物は、溶液中でのいかなる特定の構造にも限定されない。例えば、それらは二重層構造中に、ミセルとして、または「崩壊した」構造として存在し得る。またそれらは単純に溶液中に散在していてもよく、おそらくサイズまたは形状が均一でない凝集物を形成している。脂質とは、天然に存在する脂質または合成脂質であり得る脂肪性物質のことである。例えば、脂質としては、細胞質中に天然に存在する脂肪小滴、ならびに長鎖脂肪族炭化水素及びそれらの誘導体を含む化合物のクラス、例えば、脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、及びアルデヒドが挙げられる。
【0231】
使用に好適な脂質は、民間の供給元から入手され得る。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン(「DMPC」)は、Sigma,St.Louis,Mo.から入手され得、ジセチルホスファート(「DCP」)は、K&K Laboratories(Plainview,N.Y.)から入手され得、コレステロール(「Choi」)は、Calbiochem-Behringから入手され得、ジミリスチルホスファチジルグリセロール(「DMPG」)及び他の脂質は、Avanti Polar Lipids,Inc.(Birmingham,AL)から入手され得る。クロロホルムまたはクロロホルム/メタノール中の脂質の貯蔵溶液は、約-20℃で保存され得る。クロロホルムは、メタノールよりも容易に蒸発するため、唯一の溶媒として使用される。「リポソーム」とは、閉じた脂質二重層または凝集物の生成によって形成される、種々の単層及び多重層の脂質媒体を包含する総称である。リポソームは、リン脂質二重層膜及び内部の水性媒質を有する小胞構造を有することを特徴とし得る。多重膜リポソームは、水性媒質によって隔てられた複数の脂質層を有する。それらはリン脂質を過剰量の水性溶液中に懸濁させると自発的に形成される。脂質成分は自己再配列を起こし、その後に閉鎖構造の形成が起こり、水及び溶解溶質を脂質二重層の間に封じ込める(Ghosh et al.,1991 Glycobiology 5:505-10)。しかしながら、溶液中で通常の小胞構造とは異なる構造を有する組成物も包含される。例えば、脂質は、ミセル構造をとり得るか、または単に脂質分子の不均一な凝集物として存在し得る。また、リポフェクタミン-核酸複合体も意図される。
【0232】
外来性核酸を宿主細胞に導入するために使用される方法に関係なく、種々のアッセイが宿主細胞における組換えDNA配列の存在を確認するために実施され得る。かかるアッセイとしては、例えば、当業者に周知の「分子生物学的」アッセイ、例えば、サザンブロッティング及びノーザンブロッティング、RT-PCR、及びPCR;「生化学的」アッセイ、例えば、免疫学的手段(ELISA及びウェスタンブロット)による、または本発明の範囲内に含まれる作用物質を同定するための本明細書に記載されるアッセイによる、特定のペプチドの存在または非存在の検出が挙げられる。
【0233】
系
一態様では、本発明は、対象における1種以上のRNA転写物の数を減少させるための系を提供する。一実施形態では、系は、タンパク質をコードする核酸配列であって、当該タンパク質が、CRISPR関連(Cas)タンパク質及び任意に局在化配列、例えば、NLS、NES、または細胞小器官局在化シグナルを含む、当該核酸配列;ならびにタンデムcrRNAアレイをコードする核酸配列を1種以上のベクターに含む。
【0234】
一実施形態では、タンデムアレイは、1種以上、2種以上、3種以上、4種以上、5種以上、6種以上、7種以上、または8種以上のcrRNA配列を含む。一実施形態では、各crRNAは、単一の標的RNA内の異なる配列に実質的に相補的な異なる配列を含む。一実施形態では、各crRNAは、異なる標的RNA内の異なる配列に実質的に相補的な異なる配列を含む。一実施形態では、異なる標的RNAは、単一の疾患、障害、または感染症に関連する。例えば、一実施形態では、異なる標的RNAは、ウイルスの各ウイルスRNA配列である。
【0235】
一実施形態では、Casをコードする核酸配列及びcrRNAをコードする核酸配列は、同じベクターに存在する。一実施形態では、タンパク質をコードする核酸配列及びcrRNAをコードする核酸配列は、異なるベクター存在する。
【0236】
一実施形態では、タンパク質をコードする核酸配列は、(1)配列番号1~47のうちの1つと少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一なアミノ酸配列をコードする核酸配列;ならびに任意に(2)配列番号50~66及び323~935のうちの1つと少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一なアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、タンパク質をコードする核酸配列は、(1)配列番号1~47のうちの1つのアミノ酸をコードする核酸配列;ならびに任意に(2)配列番号50~66及び323~935のうちの1つのアミノ酸をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号68~100のうちの1つと少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一なアミノ酸をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号68~100のうちの1つのアミノ酸をコードする核酸配列を含む。
【0237】
一実施形態では、タンデムアレイは、1種以上、2種以上、3種以上、4種以上、5種以上、6種以上、7種以上、または8種以上のcrRNA配列を含む。一実施形態では、タンデムcrRNAアレイの各crRNAは、ダイレクトリピート(DR)配列及びスペーサー配列を含む。一実施形態では、ダイレクトリピート配列は、ガイド配列またはスペーサー配列の上流(すなわち、5’)に存在し得る。他の実施形態では、ダイレクトリピート配列は、ガイド配列またはスペーサー配列の下流(すなわち、3’)に存在し得る。
【0238】
一実施形態では、タンデムcrRNAアレイの各crRNAは、異なるダイレクトリピート配列を含む。例えば、一実施形態では、ダイレクトリピートのループ領域内のヌクレオチド置換、複数のガイドRNAにより、crRNAの順序付けられたアレイの効率的な生成がもたらされる。
【0239】
一実施形態では、タンデムアレイは、少なくとも2種以上のcrRNAを含み、ここで、各crRNAは、標的RNAに実質的に相補的な配列を含む。例えば、一実施形態では、各crRNAは、単一の標的RNA内の異なる配列に実質的に相補的な異なる配列を含む。一実施形態では、各crRNAは、異なる標的RNA内の異なる配列に実質的に相補的な異なる配列を含む。一実施形態では、異なる標的RNAは、単一の疾患、障害、または感染症に関連する。例えば、一実施形態では、異なる標的RNAは、ウイルスの各ウイルスRNA配列である。
【0240】
一実施形態では、タンデムアレイは、コロナウイルスゲノムRNA配列及び/またはコロナウイルスサブゲノムRNA配列に実質的に相補的な配列を含む少なくとも2種以上のcrRNAを含む。一実施形態では、タンデムアレイは、配列番号167~188から選択される配列またはその断片と少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%相同な配列に実質的に相補的な配列を含む少なくとも2種以上のcrRNAを含む。一実施形態では、タンデムアレイは、配列番号167~188から選択される配列またはその断片に実質的に相補的な配列を含む少なくとも2種以上のcrRNAを含む。
【0241】
一実施形態では、タンデムアレイは、配列番号189~224から選択される配列と少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%相同な配列を含む少なくとも2種以上のcrRNAを含む。一実施形態では、タンデムアレイは、配列番号189~224から選択される配列を含む少なくとも2種以上のcrRNAを含む。
【0242】
一実施形態では、タンデムアレイは、配列番号275と少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%相同な配列を含む。一実施形態では、タンデムアレイは、配列番号275の配列を含む。
【0243】
一実施形態では、タンデムアレイは、各々が独立してインフルエンザウイルス配列に実質的に相補的な配列を含む少なくとも2種以上のcrRNAを含む。一実施形態では、タンデムアレイは、各々がインフルエンザウイルスのゲノムmRNA配列またはサブゲノムmRNA配列に実質的に相補的な配列を含む少なくとも2種以上のcrRNAを含む。一実施形態では、タンデムアレイは、各々がインフルエンザウイルスのPB2配列、PB1配列、PA配列、HA配列、NP配列、NA配列、M配列、またはNS配列に実質的に相補的な配列を含む少なくとも2種以上のcrRNAを含む。
【0244】
一実施形態では、タンデムアレイは、配列番号225~244から選択される配列またはその断片と少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%相同な配列に実質的に相補的な配列を含む少なくとも2種以上のcrRNAを含む。一実施形態では、タンデムアレイは、配列番号225~244から選択される配列またはその断片に実質的に相補的な配列を含む少なくとも2種以上のcrRNAを含む。
【0245】
一実施形態では、タンデムアレイは、配列番号245~264から選択される配列と少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%相同な配列を含む少なくとも2種以上のcrRNAを含む。一実施形態では、タンデムアレイは、配列番号245~264から選択される配列を含む少なくとも2種以上のcrRNAを含む。
【0246】
一実施形態では、タンデムアレイは、配列番号276~279のうちの1つと少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%相同な配列を含む。一実施形態では、タンデムアレイは、配列番号276~279のうちの1つの配列を含む。
【0247】
一実施形態では、タンデムアレイは、各々が独立して細胞経路内のmRNA配列に実質的に相補的な配列を含む、少なくとも2種以上のcrRNAを含む。幾つかの実施形態では、細胞経路は、例えば、制御されない増殖及び細胞生存の増強を伴う細胞プロセスの制御異常をもたらす。例えば、一実施形態では、各crRNAは、独立して、RAS、JAK-STAT、PI3K/AKT、またはMAPK細胞経路内のmRNA配列に実質的に相補的な配列を含む。
【0248】
組成物及び製剤
一態様では、本発明は、対象におけるRNA転写物の数を減少させるための組成物を提供する。一実施形態では、組成物は、融合タンパク質を含み、ここで、当該融合タンパク質は、CRISPR関連(Cas)タンパク質、及び任意に局在化配列、例えば、NLS、NES、または細胞小器官局在化シグナルを含む。一実施形態では、組成物は、タンデムcrRNAアレイを含む。一実施形態では、タンデムcrRNAアレイは、各々が1種以上のRNA転写物の標的RNA配列に実質的にハイブリダイズする2種以上のcrRNAを含む。
【0249】
一実施形態では、組成物は、(1)配列番号1~47のうちの1つと少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一なアミノ酸配列;ならびに任意に(2)配列番号50~66及び323~935のうちの1つと少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一なアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。一実施形態では、組成物は、(1)配列番号1~47のうちの1つのアミノ酸;ならびに任意に(2)配列番号50~66及び323~935のうちの1つのアミノ酸を含むタンパク質を含む。
【0250】
一実施形態では、組成物は、配列番号68~100のうちの1つと少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一なアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。一実施形態では、タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号68~100のうちの1つのアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。
【0251】
一実施形態では、組成物は、タンデムcrRNAアレイを含み、ここで、当該アレイは、1種以上、2種以上、3種以上、4種以上、5種以上、6種以上、7種以上、または8種以上のcrRNA配列を含む。一実施形態では、タンデムcrRNAアレイの各crRNAは、ダイレクトリピート(DR)配列及びスペーサー配列を含む。一実施形態では、ダイレクトリピート配列は、ガイド配列またはスペーサー配列の上流(すなわち、5’)に存在し得る。他の実施形態では、ダイレクトリピート配列は、ガイド配列またはスペーサー配列の下流(すなわち、3’)に存在し得る。
【0252】
一実施形態では、タンデムcrRNAアレイの各crRNAは、異なるダイレクトリピート配列を含む。例えば、一実施形態では、ダイレクトリピートのループ領域内のヌクレオチド置換、複数のガイドRNAにより、crRNAの順序付けられたアレイの効率的な生成がもたらされる。
【0253】
一実施形態では、組成物は、タンデムアレイを含み、ここで、当該タンデムアレイは、少なくとも2種以上のcrRNAを含み、各crRNAは、標的RNAに実質的に相補的な配列を含む。例えば、一実施形態では、各crRNAは、単一の標的RNA内の異なる配列に実質的に相補的な異なる配列を含む。一実施形態では、各crRNAは、異なる標的RNA内の異なる配列に実質的に相補的な異なる配列を含む。一実施形態では、異なる標的RNAは、単一の疾患、障害、または感染症に関連する。例えば、一実施形態では、異なる標的RNAは、ウイルスの各ウイルスRNA配列である。
【0254】
一実施形態では、タンデムアレイは、コロナウイルスゲノムRNA配列及び/またはコロナウイルスサブゲノムRNA配列に実質的に相補的な配列を含む少なくとも2種以上のcrRNAを含む。一実施形態では、タンデムアレイは、配列番号167~188から選択される配列またはその断片と少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%相同な配列に実質的に相補的な配列を含む少なくとも2種以上のcrRNAを含む。一実施形態では、タンデムアレイは、配列番号167~188から選択される配列またはその断片に実質的に相補的な配列を含む少なくとも2種以上のcrRNAを含む。
【0255】
一実施形態では、タンデムアレイは、配列番号189~224から選択される配列と少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%相同な配列を含む少なくとも2種以上のcrRNAを含む。一実施形態では、タンデムアレイは、配列番号189~224から選択される配列を含む少なくとも2種以上のcrRNAを含む。
【0256】
一実施形態では、タンデムアレイは、配列番号275と少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%相同な配列を含む。一実施形態では、タンデムアレイは、配列番号275の配列を含む。
【0257】
一実施形態では、タンデムアレイは、各々が独立してインフルエンザウイルス配列に実質的に相補的な配列を含む少なくとも2種以上のcrRNAを含む。一実施形態では、タンデムアレイは、各々がインフルエンザウイルスのゲノムmRNA配列またはサブゲノムmRNA配列に実質的に相補的な配列を含む少なくとも2種以上のcrRNAを含む。一実施形態では、タンデムアレイは、各々がインフルエンザウイルスのPB2配列、PB1配列、PA配列、HA配列、NP配列、NA配列、M配列、またはNS配列に実質的に相補的な配列を含む少なくとも2種以上のcrRNAを含む。
【0258】
一実施形態では、タンデムアレイは、配列番号225~244から選択される配列またはその断片と少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%相同な配列に実質的に相補的な配列を含む少なくとも2種以上のcrRNAを含む。一実施形態では、タンデムアレイは、配列番号225~244から選択される配列またはその断片に実質的に相補的な配列を含む少なくとも2種以上のcrRNAを含む。
【0259】
一実施形態では、タンデムアレイは、配列番号245~264から選択される配列と少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%相同な配列を含む少なくとも2種以上のcrRNAを含む。一実施形態では、タンデムアレイは、配列番号245~264から選択される配列を含む少なくとも2種以上のcrRNAを含む。
【0260】
一実施形態では、タンデムアレイは、配列番号276~279のうちの1つと少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%相同な配列を含む。一実施形態では、タンデムアレイは、配列番号276~279のうちの1つの配列を含む。
【0261】
一実施形態では、タンデムアレイは、各々が独立して細胞経路内のmRNA配列に実質的に相補的な配列を含む、少なくとも2種以上のcrRNAを含む。幾つかの実施形態では、細胞経路は、例えば、制御されない増殖及び細胞生存の増強を伴う細胞プロセスの制御異常をもたらす。例えば、一実施形態では、各crRNAは、独立して、RAS、JAK-STAT、PI3K/AKT、またはMAPK細胞経路内のmRNA配列に実質的に相補的な配列を含む。
【0262】
本開示は、本開示の方法を実施するための本開示の医薬組成物の使用も包含する。このような医薬組成物は、対象への投与に好適な形態の本発明の少なくとも1種の調節(例えば、阻害または活性化)組成物もしくはその塩からなってもよく、または医薬組成物は、本発明の少なくとも1種の調節(例えば、阻害または活性化)組成物もしくはその塩、及び1種以上の薬学的に許容される担体、1種以上の追加の成分、またはこれらの幾つかの組み合わせを含んでもよい。本発明の化合物は、当該技術分野において周知のように、生理学的に許容される塩の形態で、例えば、生理学的に許容されるカチオンまたはアニオンとの組み合わせで医薬組成物中に存在し得る。
【0263】
一実施形態では、本発明の方法を実施するのに有用な医薬組成物は、1ng/kg/日~100mg/kg/日の用量を送達するように投与され得る。別の実施形態では、本発明の方法を実施するのに有用な医薬組成物は、1ng/kg/日~500mg/kg/日の用量を送達するように投与され得る。
【0264】
本発明の医薬組成物中の活性成分、薬学的に許容される担体、及び任意の追加の成分の相対量は、処置される対象の個性、サイズ、及び状態に応じて、ならびに更に組成物が投与される経路に応じて異なるであろう。一例として、組成物は、0.1%~100%(w/w)の活性成分を含み得る。
【0265】
本発明の方法において有用である医薬組成物は、経口、直腸、膣内、非経口、局所、肺内、鼻腔内、口腔内、点眼、または別の投与経路用に好適に開発され得る。本発明の方法に有用な組成物は、哺乳動物の皮膚または任意の他の組織に直接投与され得る。他の意図される製剤としては、リポソーム製剤、活性成分を含有する再封入赤血球、及び免疫学に基づく製剤が挙げられる。投与経路(複数可)は、当業者には容易に明白であり、処置される疾患の種類及び重症度、処置される動物対象またはヒト対象の種類及び年齢などが含まれる、いくつもの要因に依存するであろう。
【0266】
本明細書に記載される医薬組成物の製剤は、薬理学の分野において公知の、または今後開発される任意の方法により調製され得る。一般に、かかる調製方法は、活性成分を担体または1種以上の他の補助的成分と混合し、次いで、必要とされるか、または望ましい場合、製品を所望の単回または複数回投与単位に成形または包装するステップを含む。
【0267】
本明細書で使用する場合、「単位用量」は、所定量の活性成分を含む個別の量の医薬組成物である。活性成分の量は、一般に、対象に投与されるであろう活性成分の投与量、またはこのような投与量の好都合な分数、例えば、このような投与量の2分の1もしくは3分の1に等しい。単位剤形は、1日1回用量用、または1日複数回用量用(例えば、1日当たり約1~4回以上)のうちの1つであり得る。1日複数回用量が使用される場合、単位剤形は、各用量について同じであっても異なってもよい。
【0268】
一実施形態では、本発明の組成物は、1種以上の薬学的に許容される賦形剤または担体を使用して製剤化される。一実施形態では、本発明の医薬組成物は、治療上有効量の本発明の化合物またはコンジュゲート及び薬学的に許容される担体を含む。有用である薬学的に許容される担体としては、限定されるものではないが、グリセロール、水、生理食塩水、エタノール、及び他の薬学的に許容される塩溶液、例えば、リン酸塩及び有機酸の塩が挙げられる。これら及び他の薬学的に許容される担体の例は、Remington’s Pharmaceutical Sciences(1991,Mack Publication Co.,New Jersey)に記載されている。
【0269】
担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど)、それらの好適な混合物、及び植物油を含有する溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、分散体の場合に必要な粒子サイズを維持することによって、及び界面活性剤を使用することによって維持され得る。微生物の活動の防止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより達成され得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウム、または多価アルコール、例えば、マンニトール及びソルビトールが組成物に含まれる。注射可能な組成物の吸収の延長は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチンを組成物に入れることにより引き起こされ得る。一実施形態では、薬学的に許容される担体は、DMSOのみではない。
【0270】
製剤は、従来の賦形剤、すなわち、経口、膣内、非経口、経鼻、静脈内、皮下、経腸、または当業者に公知の任意の他の好適な投与様式に好適な薬学的に許容される有機または無機担体物質との混合物で用いられ得る。医薬製剤は滅菌され得、必要に応じて、補助剤、例えば、滑沢剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧緩衝剤に影響を与えるための塩、着色剤、矯味剤、及び/または芳香剤などと混合され得る。それらは、所望の場合、他の活性薬剤、例えば、他の鎮痛剤と組み合わされてもよい。
【0271】
本明細書で使用する場合、「追加の成分」としては、限定されるものではないが、以下のうちの1つ以上が挙げられる:賦形剤;表面活性剤;分散剤;不活性希釈剤;造粒剤及び崩壊剤;結合剤;滑沢剤;甘味剤;香味剤;着色剤;防腐剤;ゼラチンなどの生理学的に分解性の組成物;水性ビヒクル及び溶媒;油性ビヒクル及び溶媒;懸濁剤;分散剤または湿潤剤;乳化剤、粘滑剤;緩衝剤;塩;増粘剤;充填剤;乳化剤;抗酸化剤;抗生物質;抗真菌剤;安定化剤;ならびに薬学的に許容されるポリマー材料または疎水性材料。本発明の医薬組成物に含まれ得る他の「追加の成分」は、当該技術分野において公知であり、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Genaro,ed.(1985,Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,PA)に記載されている。
【0272】
本発明の組成物は、組成物の総重量に対して約0.005%~2.0%の防腐剤を含み得る。防腐剤は、環境中の夾雑物に曝露される場合に腐敗を防止するために使用される。本発明に従って有用な防腐剤の例としては、限定されるものではないが、ベンジルアルコール、ソルビン酸、パラベン、イミド尿素、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるものが挙げられる。例示的な防腐剤は、約0.5%~2.0%のベンジルアルコール及び0.05%~0.5%のソルビン酸の組み合わせである。
【0273】
一実施形態では、組成物は、化合物の分解を阻害する抗酸化剤及びキレート剤を含む。一部の化合物での例示的な抗酸化剤は、組成物の総重量に対して約0.01%~0.3%の範囲のBHT、BHA、α-トコフェロール、及びアスコルビン酸、ならびに0.03重量%~0.1重量%の範囲のBHTである。一実施形態では、キレート剤は、組成物の総重量に基づいて0.01重量%~0.5重量%の量で存在する。例示的なキレート剤としては、約0.01%~0.20%の重量範囲のエデト酸塩(例えば、エデト酸二ナトリウム)及びクエン酸が挙げられる。幾つかの実施形態では、キレート剤は、組成物の総重量に対して0.02重量%~0.10重量%の範囲である。キレート剤は、製剤の貯蔵寿命に有害であり得る組成物中の金属イオンをキレートするのに有用である。BHT及びエデト酸二ナトリウムは、それぞれ、一部の化合物での例示的な抗酸化剤及びキレート剤であるが、当業者に公知であろう他の好適かつ同等な抗酸化剤及びキレート剤がそれらの代用とされ得る。
【0274】
液体懸濁液は、水性または油性ビヒクル中の活性成分の懸濁を達成するための従来の方法を使用して調製され得る。水性ビヒクルとしては、例えば、水、及び等張食塩水が挙げられる。油性ビヒクルとしては、例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、植物油、例えば、落花生油、オリーブ油、ゴマ油、またはヤシ油、分画された植物油、及び流動パラフィンなどの鉱油が挙げられる。液体懸濁液は、限定されるものではないが、懸濁剤、分散剤または湿潤剤、乳化剤、粘滑剤、防腐剤、緩衝剤、塩、香味剤、着色剤、及び甘味剤が含まれる、1種以上の追加の成分を更に含み得る。油性懸濁液は、増粘剤を更に含み得る。既知の懸濁剤としては、限定されるものではないが、ソルビトールシロップ、硬化食用脂、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム、アラビアゴム、及びセルロース誘導体、例えば、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースが挙げられる。既知の分散剤または湿潤剤としては、限定されるものではないが、レシチンなどの天然に存在するリン脂質、アルキレンオキシドの、脂肪酸、長鎖脂肪族アルコール、脂肪酸及びヘキシトールに由来する部分エステル、または脂肪酸及びヘキシトール無水物に由来する部分エステルとの縮合物(例えば、それぞれ、ステアリン酸ポリオキシエチレン、ヘプタデカエチレンオキシセタノール、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート、及びポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート)が挙げられる。既知の乳化剤としては、限定されるものではないが、レシチン及びアカシアが挙げられる。既知の防腐剤としては、限定されるものではないが、パラヒドロキシ安息香酸メチル、パラヒドロキシ安息香酸エチル、またはパラヒドロキシ安息香酸n-プロピル、アスコルビン酸、及びソルビン酸が挙げられる。既知の甘味剤としては、例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、スクロース、及びサッカリンが挙げられる。油性懸濁液での既知の増粘剤としては、例えば、蜜蝋、固形パラフィン、及びセチルアルコールが挙げられる。
【0275】
水性または油性溶媒中の活性成分の液体溶液は、液体懸濁液と実質的に同じ方法で調製され得、主要な相違点は、活性成分が溶媒中に懸濁されるのではなく溶解されることである。本明細書で使用する場合、「油性」液体は、炭素を含む液体分子を含み、水よりも低い極性を示すものである。本発明の医薬組成物の液体溶液は、液体懸濁液に関して記載される成分の各々を含んでいてもよいが、必ずしも懸濁剤が活性成分の溶媒中への溶解を補助するわけではないことが理解されよう。水性溶媒としては、例えば、水及び等張食塩水が挙げられる。油性溶媒としては、例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、植物油、例えば、落花生油、オリーブ油、ゴマ油、またはヤシ油、分画された植物油、及び流動パラフィンなどの鉱油が挙げられる。
【0276】
本発明の医薬調製物の粉末製剤及び顆粒製剤は、既知の方法を使用して調製され得る。かかる製剤は、対象に直接投与され得るか、例えば、錠剤を形成するため、カプセルを充填するため、または水性もしくは油性ビヒクルをそれに添加することによって水性もしくは油性懸濁液もしくは溶液を調製するために使用され得る。これらの製剤の各々は、分散剤または湿潤剤、懸濁剤、及び防腐剤のうちの1つ以上を更に含み得る。追加の賦形剤、例えば、充填剤及び甘味料、香味料、または着色剤などもこれらの製剤中に含まれ得る。
【0277】
また本発明の医薬組成物は、水中油型エマルションまたは油中水型エマルションの形態で調製、包装、または販売されてもよい。油相は、オリーブ油もしくは落花生油などの植物油、流動パラフィンなどの鉱油、またはこれらの組み合わせであり得る。かかる組成物は、1種以上の乳化剤、例えば、天然に存在するガム、例えば、アラビアゴムまたはトラガカントゴム、天然に存在するホスファチド、例えば、ダイズまたはレシチンホスファチド、脂肪酸及びヘキシトール無水物の組み合わせに由来するエステルまたは部分エステル、例えば、ソルビタンモノオレエート、ならびにかかる部分エステルのエチレンオキシドとの縮合物、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートを更に含み得る。これらのエマルションは、例えば、甘味剤または香味剤が含まれる、追加の成分も含有し得る。
【0278】
材料を化学組成物で含浸またはコーティングするための方法は、当該技術分野において公知であり、限定されるものではないが、化学組成物を表面上に堆積または結合させる方法、材料の合成(すなわち、生理学的に分解性の材料などを用いた合成)中に化学組成物を当該材料の構造に組み込む方法、及び水性または油性の溶液または懸濁液を吸収材料に吸収させ、その後に乾燥を行うか、または乾燥を行わない方法が挙げられる。
【0279】
投与計画は、有効量を構成するものに影響を及ぼし得る。治療製剤は、疾患の診断前または後のいずれかで対象に投与され得る。更に、幾つかの分割された用量及び時差用量が連日もしくは逐次的に投与され得るか、または用量が継続的に注入され得るか、もしくはボーラス注射であり得る。更に、治療製剤の投与量は、治療または予防状況の緊急性が示される場合、相応じて増加または減少され得る。
【0280】
哺乳動物、例えば、ヒトが含まれる、対象への本発明の組成物の投与は、公知の手順を使用して、疾患を予防または処置するのに有効な投与量及び期間で実施され得る。治療効果を達成するのに必要な治療用化合物の有効量は、用いられる特定の化合物の活性;投与時間;化合物の排出速度;処置期間;化合物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物、または材料、疾患または障害の状態、処置される対象の年齢、性別、体重、病態、健康状態、及び既往歴、ならびに医療分野において周知の同様の要因などの要因に応じて異なり得る。投与計画は、最適な治療応答を得られるように調整され得る。例えば、幾つかの分割用量が連日投与され得るか、または用量が、治療状況の緊急性が示される場合に、相応じて低減され得る。本発明の治療用化合物の有効な用量範囲の非限定的な例は、1日当たり約1~5,000mg/体重kgである。当業者は、関連する要因を研究し、過度な実験をすることなく、治療用化合物の有効量に関して決定を下すことができるであろう。
【0281】
化合物は、毎日数回の頻度で対象に投与され得るか、またはより低い頻度で、例えば、1日1回、週1回、2週間に1回、月1回、または更に低い頻度で、例えば、数ヶ月毎に1回もしくは更には年1回以下で投与され得る。投与される1日当たりの化合物の量が、非限定的な例では、連日、1日おき、2日毎、3日毎、4日毎、または5日毎に投与され得ることが理解されよう。例えば、1日おきの投与では、5mg/日の用量が月曜日に開始され得、第1の後続の5mg/日の用量が水曜日に投与され、第2の後続の5mg/日の用量が金曜日に投与され、以下同様に続く。投与頻度は、当業者には容易に明らかであり、いくつもの要因、例えば、限定されるものではないが、処置される疾患の種類及び重症度、動物の種類及び年齢などに依存するであろう。
【0282】
本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、特定の対象、組成物、及び投与様式について、当該対象に有毒とならずに望ましい治療応答を達成するのに有効な活性成分の量を得られるように異なってもよい。
【0283】
当該技術分野において通常の技量を有する医師、例えば、医者または獣医は、必要とされる医薬組成物の有効量を容易に決定し、処方し得る。例えば、医師または獣医師は、医薬組成物に用いられる本発明の化合物の用量を、所望の治療効果を達成するために必要とされるレベルよりも低いレベルで開始し得、所望の効果が達成されるまで投与量を徐々に増加させ得る。
【0284】
特定の実施形態では、投与の容易さ及び投与量の均一性のために、化合物を単位剤形で製剤化することが特に有利である。本明細書で使用する場合、単位剤形は、処置される対象のための単位投与量として好適な物理的に分離した単位を指し、各単位が、必要とされる賦形薬と共同して所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の治療用化合物を含有する。本発明の単位剤形は、(a)治療用化合物に固有の特徴及び達成されるべき特定の治療効果、ならびに(b)対象における疾患を処置するためのこのような治療用化合物を調合/製剤化する技術に固有の制限事項によって決定され、それらに直接的に依存する。
【0285】
一実施形態では、本発明の組成物は、1日当たり1~5回以上の範囲の投与量で対象に投与される。別の実施形態では、本発明の組成物は、限定されるものではないが、毎日1回、2日に1回、3日に1回~週1回、及び2週間に1回が含まれる、投与量の範囲で対象に投与される。本発明の種々の組み合わせの組成物の投与頻度が、限定されるものではないが、年齢、処置されるべき疾患または障害、性別、全体的な健康状態、及び他の要因が含まれる、多数の要因に応じて対象毎に異なるであろうことは、当業者には容易に明白であろう。従って、本発明は、いずれの特定の投与計画にも限定されるように解釈されるべきでなく、任意の対象に投与されるべき正確な投与量及び組成物は、対象に関する全ての他の要因を考慮に入れて担当医師により決定されるであろう。
【0286】
投与用の本発明の化合物は、約1mg~約10,000mg、約20mg~約9,500mg、約40mg~約9,000mg、約75mg~約8,500mg、約150mg~約7,500mg、約200mg~約7,000mg、約3050mg~約6,000mg、約500mg~約5,000mg、約750mg~約4,000mg、約1mg~約3,000mg、約10mg~約2,500mg、約20mg~約2,000mg、約25mg~約1,500mg、約50mg~約1,000mg、約75mg~約900mg、約100mg~約800mg、約250mg~約750mg、約300mg~約600mg、約400mg~約500mgの範囲、及びそれらの間のあらゆる増分の全体または一部であり得る。
【0287】
幾つかの実施形態では、本発明の化合物の用量は、約1mg~約2,500mgである。幾つかの実施形態では、本明細書に記載の組成物に使用される本発明の化合物の用量は、約10,000mg未満、または約8,000mg未満、または約6,000mg未満、または約5,000mg未満、または約3,000mg未満、または約2,000mg未満、または約1,000mg未満、または約500mg未満、または約200mg未満、または約50mg未満である。同様に、幾つかの実施形態では、本明細書に記載される第2の化合物(すなわち、本発明の組成物により処置される疾患と同じ疾患または別の疾患を処置するために使用される薬物)の用量は、約1,000mg未満、約800mg未満、または約600mg未満、または約500mg未満、または約400mg未満、または約300mg未満、または約200mg未満、または約100mg未満、または約50mg未満、または約40mg未満、または約30mg未満、または約25mg未満、または約20mg未満、または約15mg未満、または約10mg未満、または約5mg未満、または約2mg未満、または約1mg未満、または約0.5mg未満、及びそれらのあらゆる増分の全体または一部である。
【0288】
一実施形態では、本発明は、単独でまたは第2の医薬品との組み合わせでの治療上有効量の本発明の化合物またはコンジュゲートを収容する容器、及び当該化合物またはコンジュゲートを使用して、対象における疾患の1つ以上の症状を処置、予防、または低減するための使用説明書を含む包装された医薬組成物を対象とする。
【0289】
用語「容器」には、医薬組成物を収容するための任意の入れ物が含まれる。例えば、一実施形態では、容器は、医薬組成物を収容する包装である。他の実施形態では、容器は、医薬組成物を収容する包装ではなく、すなわち、容器は、包装された医薬組成物または包装されていない医薬組成物及び医薬組成物の使用説明書を収容する箱またはバイアルなどの入れ物である。更に、包装技術は、当該技術分野において周知である。医薬組成物の使用説明書が医薬組成物を収容する包装に含まれてもよく、従って、使用説明書は、包装された製品との強い機能的関係を形成することを理解すべきである。しかしながら、使用説明書は、その意図される機能、例えば、対象における疾患の処置もしくは予防、またはイメージング剤もしくは診断用薬の対象への送達を果たす化合物の能力に関する情報を含み得ることを理解すべきである。
【0290】
本発明の組成物のいずれかの投与経路としては、経口、経鼻、非経口、舌下、経皮、経粘膜(例えば、舌下、舌、(経)口腔、及び鼻腔(内))、膀胱内、十二指腸内、胃内、直腸、腹腔内、皮下、筋肉内、皮内、動脈内、静脈内、または投与が挙げられる。
【0291】
好適な組成物及び剤形としては、例えば、錠剤、カプセル、カプレット、丸剤、ジェルカプセル、トローチ、分散剤、懸濁液、溶液、シロップ剤、顆粒、ビーズ、経皮パッチ、ゲル、粉末、ペレット、マグマ、舐剤、クリーム、ペースト、硬膏剤、ローション、ディスク、座剤、経鼻または経口投与用の液体スプレー、吸入用の乾燥粉末またはエアロゾル化製剤、膀胱内投与用の組成物及び製剤などが挙げられる。本発明において有用であろう製剤及び組成物は、本明細書に記載される特定の製剤及び組成物に限定されないことを理解すべきである。
【0292】
タンデムアレイを作製する方法
本発明は、本発明のタンデムアレイを作製する方法を提供する。例えば、一実施形態では、タンデムアレイは、単一ステップで作製され得る。一実施形態では、タンデムアレイの作製は、アレイ全長の転写を可能にする。
【0293】
一実施形態では、本方法は、少なくとも2種のcrRNA配列をライゲーションすることを含み、ここで、各crRNA配列は、固有のダイレクトリピート配列(DR)を含み、当該ライゲーションによりタンデムアレイが生成される。一実施形態では、各DR配列は、配列番号267のポリTストレッチに固有の変異を含む。例えば、一実施形態では、各DR配列は、配列番号267のT17またはT18での固有の変異を含む。一実施形態では、1つのcrRNA配列は、野生型DR配列を含み、各追加のcrRNA配列は、配列番号267のポリTストレッチに固有の変異を有するDR配列を含む。一実施形態では、各DR配列は、配列番号268~274から独立して選択される。
【0294】
RNAを減少させる方法及び処置方法
一態様では、本開示は、対象における1種以上のRNA転写物の数を減少させる方法を提供する。一実施形態では、本方法は、対象における2種以上のRNA転写物の数を減少させる。一実施形態では、対象における2種以上のRNA転写物は関連する。例えば、一実施形態では、2種以上のRNA転写物は、同じウイルスの各ウイルス転写物である。一実施形態では、2種以上のRNA転写物は、それぞれ同じ細胞経路に関与する。
【0295】
一実施形態では、RNAは、細胞質に局在する。一実施形態では、RNAは、核に局在する。一実施形態では、RNAは、細胞小器官に局在する。例えば、一実施形態では、本方法は、核小体、リボソーム、小胞、粗面小胞体、ゴルジ装置、細胞骨格、滑面小胞体、ミトコンドリア、液胞、細胞質ゾル、リソソーム、または中心小体に局在するRNAを減少させる。一実施形態では、本方法は、細胞膜に会合したRNAを減少させる。一実施形態では、本方法は、細胞外RNAを減少させる。
【0296】
一実施形態では、本方法は、(1)Casタンパク質及び任意に局在化配列、例えば、NLS、NES、もしくは細胞小器官局在化シグナルを含む本開示の融合タンパク質をコードする核酸分子、またはCasタンパク質及び任意に局在化配列、例えば、NLS、NES、もしくは細胞小器官局在化シグナルを含む本開示の融合タンパク質;ならびに(2)2種以上のcrRNAを含むcrRNAアレイをコードする核酸分子を対象に投与することを含む。
【0297】
幾つかの実施形態では、細胞質RNA。かかる実施形態では、本方法は、(1)Casタンパク質及びNESを含む本開示のタンパク質またはCasタンパク質及びNESを含む本開示のタンパク質をコードする核酸分子;ならびに(2)2種以上のcrRNAを含むcrRNAアレイをコードする核酸分子を対象に投与することを含む。
【0298】
幾つかの実施形態では、核内RNA。かかる実施形態で、本方法は、(1)Casタンパク質及びNLSを含む本開示のタンパク質またはCasタンパク質及びNLSを含む本開示のタンパク質をコードする核酸分子;ならびに(2)2種以上のcrRNAを含むcrRNAアレイをコードする核酸分子を対象に投与することを含む。
【0299】
一実施形態では、対象は、細胞である。一実施形態では、細胞は、原核細胞または真核細胞である。一実施形態では、細胞は、真核細胞である。一実施形態では、細胞は、植物細胞、動物細胞、または真菌細胞である。一実施形態では、細胞は、植物細胞である。一実施形態では、細胞は、動物細胞である。一実施形態では、細胞は、酵母細胞である。
【0300】
一実施形態では、対象は、哺乳動物である。例えば、一実施形態では、対象は、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、ブタ、ラット、またはマウスである。一実施形態では、対象は、非哺乳動物対象である。例えば、一実施形態では、対象は、ゼブラフィッシュ、ショウジョウバエ、またはカイチュウである。
【0301】
一実施形態では、ウイルスRNAの量は、インビトロで低減される。一実施形態では、ウイルスRNAの量は、インビボで低減される。
【0302】
一態様では、本発明は、対象における1種以上の標的ウイルスRNAを切断する方法を提供する。一実施形態では、本方法は、(1)Casタンパク質及び任意に局在化配列、例えば、NLS、NES、もしくは細胞小器官局在化シグナルを含む本開示のタンパク質をコードする核酸分子、またはCasタンパク質及び任意に局在化配列、例えば、NLS、NES、もしくは細胞小器官局在化シグナルを含む本開示のタンパク質;ならびに(2)2種以上のcrRNAを含むcrRNAアレイをコードする核酸分子を対象に投与することを含み、ここで、各crRNAは、独立して、標的ウイルスRNAのRNA配列に実質的に相補的な配列を含む。
【0303】
処置方法及び使用方法
本発明は、対象における疾患または障害を処置する方法、それらの症状を低減する方法、及び/またはそれらを発症するリスクを低減する方法を提供する。例えば、一実施形態では、本発明の方法は、哺乳動物における疾患または障害を処置し、それらの症状を低減し、及び/またはそれらを発症するリスクを低減する。一実施形態では、本発明の方法は、植物における疾患または障害を処置し、それらの症状を低減し、及び/またはそれらを発症するリスクを低減する。一実施形態では、本発明の方法は、酵母菌における疾患または障害を処置し、それらの症状を低減し、及び/またはそれらを発症するリスクを低減する。
【0304】
一実施形態では、対象は、細胞である。一実施形態では、細胞は、原核細胞または真核細胞である。一実施形態では、細胞は、真核細胞である。一実施形態では、細胞は、植物細胞、動物細胞、または真菌細胞である。一実施形態では、細胞は、植物細胞である。一実施形態では、細胞は、動物細胞である。一実施形態では、細胞は、酵母細胞である。
【0305】
一実施形態では、対象は、哺乳動物である。例えば、一実施形態では、対象は、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、ブタ、ラット、またはマウスである。一実施形態では、対象は、非哺乳動物対象である。例えば、一実施形態では、対象は、ゼブラフィッシュ、ショウジョウバエ、またはカイチュウである。
【0306】
一実施形態では、疾患または障害は、細胞経路の活性化により引き起こされる。幾つかの実施形態では、細胞経路は、例えば、制御されない増殖及び細胞生存の増強を伴う細胞プロセスの制御異常をもたらす。例えば、一実施形態では、各crRNAは、独立して、RAS、JAK-STAT、PI3K/AKT、またはMAPK細胞経路内のmRNA配列に実質的に相補的な配列を含む。
【0307】
一実施形態では、本方法は、(1)本開示のタンパク質または本開示のタンパク質をコードする核酸分子、及び(2)2種以上のcrRNAを含むcrRNAアレイをコードする核酸分子を対象に投与することを含み、ここで、各crRNAは、独立して、経路のRNA転写物のヌクレオチド配列に実質的に相補的な配列を含む。一実施形態では、crRNAアレイは、2種以上のcrRNAを含み、ここで、各crRNAは、独立して、RAS、JAK-STAT、PI3K/AKT、またはMAPK細胞経路内のmRNA配列のヌクレオチド配列に実質的に相補的な配列を含む。一実施形態では、Casタンパク質は、RNA転写物(複数可)を切断する。
【0308】
一実施形態では、疾患または障害としては、限定されるものではないが、がん、心疾患、アテローム硬化症、心臓線維症、心不整脈、高血圧、呼吸器疾患、脳卒中、アルツハイマー病、糖尿病、腎炎、肝疾患が挙げられる。
【0309】
一実施形態では、疾患または障害は、ウイルス感染症である。一実施形態では、疾患または障害は、ウイルス感染症により引き起こされる。一実施形態では、ウイルス感染症は、RNAウイルス感染症である。例えば、一実施形態では、ウイルス感染症は、プラス鎖ssRNAウイルス感染症、マイナス鎖ssRNAウイルス感染症、dsRNAウイルス感染症、またはssRNA-RTウイルス感染症である。一実施形態では、ウイルス感染症は、DNAウイルス感染症である。例えば、一実施形態では、ウイルス感染症は、dsDNAウイルス感染症、ssDNAウイルス感染症、またはdsDNA-RTウイルス感染症である。従って、一実施形態では、疾患または障害は、ウイルスRNA転写物を妨害または低減する構成要素により処置され得るか、低減され得るか、またはリスクが低減され得る。従って、一実施形態では、疾患または障害は、ウイルスmRNA転写物を妨害もしくは低減するか、またはウイルスタンパク質の翻訳を防止もしくは低減する構成要素により処置され得るか、低減され得るか、またはリスクが低減され得る。
【0310】
一実施形態では、本方法は、(1)本開示のタンパク質または本開示のタンパク質をコードする核酸分子、及び(2)2種以上のcrRNAを含むcrRNAアレイをコードする核酸分子を対象に投与することを含み、ここで、各crRNAは、独立して、ウイルスRNA転写物に相補的なヌクレオチド配列に実質的に相補的な配列を含む。一実施形態では、Casタンパク質は、ウイルスRNA転写物を切断する。
【0311】
一実施形態では、ウイルスは、RNAウイルスである。一実施形態では、ウイルスは、その生活環の間にRNAを生成する。一実施形態では、ウイルスは、ヒトウイルス、植物ウイルス、または動物ウイルスである。例示的なウイルスとしては、限定されるものではないが、Adenoviridae科、Adenoviridae科、Alphaflexiviridae科、Anelloviridae科、Arenavirus科、Arteriviridae科、Asfarviridae科、Astroviridae科、Benyviridae科、Betaflexiviridae科、Birnaviridae科、Bornaviridae科、Bromoviridae科、Caliciviridae科、Caulimoviridae科、Circoviridae科、Closteroviridae科、Coronaviridae科、Filoviridae科、Flaviviridae科、Geminiviridae科、Hantaviridae科、Hepadnaviridae科、Hepeviridae科、Herpesviridae科、Kitaviridae科、Luteoviridae科、Nairoviridae科、Nanoviridae科、Nimaviridae科、Orthomyxoviridae科、Paramyxoviridae科、Phenuiviridae科、Picornaviridae科、Polyomaviridae科、Pospiviridae科、Potyviridae科、Poxviridae科、Reoviridae科、Retroviridae科、Retrovirus科、Rhabdoviridae科、Secoviridae科、Togaviridae科、Tombusviridae科、Tospoviridae科、Tymoviridae科、及びVirgaviridae科のウイルスが挙げられる。例えば、例示的なウイルスとしては、限定されるものではないが、アフリカ豚コレラウイルス、トリE型肝炎ウイルス、トリ伝染性喉頭気管炎ウイルス、ニワトリ腎炎ウイルス、タケモザイクウイルス、バナナバンチートップウイルス、ムギ斑葉モザイクウイルス、オオムギ黄萎ウイルス、ジャガイモ葉巻ウイルス、ボルナ病ウイルス、ブロムモザイクウイルス、コムギ、カリフラワーモザイクウイルス、チクングンヤウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、Citrus leprosis virus、Citrus sudden death associated virus、カンキツトリステザウイルス、Coconut cadang-cadang viroid、カーリートップウイルス、African cassava mosaic virus、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、西ナイルウイルス、ジカウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、ウマ動脈炎ウイルス、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス、ウマ伝染性貧血ウイルス、口蹄疫ウイルス、口蹄疫ウイルス、エンテロウイルス、ライノウイルス、B型肝炎ウイルス、E型肝炎ウイルス、HIV、HIV-1、HIV-2、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス(家禽)、伝染性膵臓壊死症ウイルス(サケ)、イヌ伝染性肝炎ウイルス、家禽アビアデノウイルス、インフルエンザウイルス、ラッサ熱ウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、サル痘ウイルス、ナイロビヒツジ病ウイルス、ニューキャッスル病ウイルス(家禽)、ノーウォークウイルス、ジャガイモYウイルスが含まれる作物に害を与えるウイルスの多数の例、Porcine circovirus 2、嘴羽毛病ウイルス(家禽)、ジャガイモMウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器系及び消化器系アデノウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、Rice stripe necrosis virus、リフトバレー熱ウイルス、ロタウイルス、SARS-CoV-2、MERSウイルス、ヒツジ痘ウイルス、ランピースキン病ウイルス、シンノンブルウイルス、アンデスウイルス、SV40、タバコ輪点ウイルス、トマトブッシースタントウイルス、トマトスポッテドウイルトウイルス、トルクテノウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、水疱性口内炎インディアナウイルス、ウイルス性出血性敗血症ウイルス(マス)、ならびにホワイトスポット病ウイルス(エビ)が挙げられる。
【0312】
一実施形態では、例示的なウイルスとしては、限定されるものではないが、霊長類Tリンパ球向性ウイルス1、霊長類Tリンパ球向性ウイルス2、霊長類Tリンパ球向性ウイルス3、ヒト免疫不全ウイルス1、ヒト免疫不全ウイルス2、サル泡沫状ウイルス、ヒトピコビルナウイルス、コロラドダニ熱ウイルス、チャンギノラウイルス、グレートアイランドウイルス、Lebombo virus、Orungo virus、ロタウイルスA、ロタウイルスB、ロタウイルスC、バンナウイルス、ボルナ病ウイルス、レイクビクトリアマールブルグウイルス、レストンエボラウイルス、スーダンエボラウイルス、タイフォレストエボラウイルス、ザイールウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス2、ヒトパラインフルエンザウイルス4、ムンプスウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス1、ヒトパラインフルエンザウイルス3、ヘンドラウイルス、ニパウイルス、麻疹ウイルス、ヒト呼吸器合胞体ウイルス、ヒトメタニューモウイルス、チャンディプラウイルス、イスファハンウイルス、ピリウイルス、水疱性口内炎アラゴアスウイルス、水疱性口内炎インディアナウイルス、水胞性口内炎ニュージャージウイルス、オーストラリアコウモリリッサウイルス、デュベンヘイジウイルス、ヨーロッパコウモリリッサウイルス1、ヨーロッパコウモリリッサウイルス2、モコラウイルス、狂犬病ウイルス、グアナリトウイルス、フニンウイルス、ラッサ熱ウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、マチュポウイルス、ピチンデウイルス、サビアウイルス、ホワイトウォーターアロヨウイルス、ブニヤンベラウイルス、ブワンバウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス、カラパルウイルス、カツウイルス、グアマウイルス、グアロアウイルス、Kairi virus、マリツバウイルス、オリボカウイルス、口嚢ウイルス、シュニウイルス、Tacaiuma virus、ウェオミヤウイルス、アンデスウイルス、バヨウウイルス、ブラッククリークカナルウイルス、ドブラバ-ベルグレドウイルス、ハンターンウイルス、ラグナネグラウイルス、ニューヨークウイルス、プーマラウイルス、ソウルウイルス、シンノンブルウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ジュグベウイルス、カンディルウイルス、Punta Toro virus、リフトバレー熱ウイルス、サシチョウバエ熱ナポリウイルス、インフルエンザAウイルス、インフルエンザBウイルス、インフルエンザCウイルス、ドーリウイルス、トゴトウイルス、デルタ肝炎ウイルス、ヒトコロナウイルス229E、ヒトコロナウイルスNL63、ヒトコロナウイルスHKU1、ヒトコロナウイルスOC43、SARSコロナウイルス、ヒトトロウイルス、ヒトエンテロウイルスA、ヒトエンテロウイルスB、ヒトエンテロウイルスC、ヒトエンテロウイルスD、ヒトライノウイルスA、ヒトライノウイルスB、ヒトライノウイルスC、脳心筋炎ウイルス、タイロウイルス、ウマ鼻炎Aウイルス、口蹄疫ウイルス、A型肝炎ウイルス、ヒトパレコウイルス、ユンガンウイルス、アイチウイルス、ヒトアストロウイルス、ヒトアストロウイルス2、ヒトアストロウイルス3、ヒトアストロウイルス4、ヒトアストロウイルス5、ヒトアストロウイルス6、ヒトアストロウイルス7、ヒトアストロウイルス8、ノーウォークウイルス、サッポロウイルス、Aroa virus、バンジウイルス、デング熱ウイルス、イルヘウスウイルス、日本脳炎ウイルス、ココベラウイルス、キャサヌール森林病ウイルス、跳躍病ウイルス、マレー渓谷脳炎ウイルス、ウンタヤウイルス、オムスク出血熱ウイルス、ポワッサンウイルス、リオブラボーウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、ウスツウイルス、ウェッセルスブロンウイルス、西ナイルウイルス、黄熱病ウイルス、ジカウイルス、C型肝炎ウイルス、E型肝炎ウイルス、バーマ森林ウイルス、チクングンヤウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、エバーグレーズウイルス、ゲタウイルス、マヤロウイルス、ムカンボウイルス、オニョンニョンウイルス、ピクスナウイルス、ロス川ウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、ワタロアウイルス、風疹ウイルスが挙げられる。
一実施形態では、例示的なウイルスとしては、限定されるものではないが、アカガエルヘルペスウイルス1、アカガエルヘルペスウイルス2、アカガエルヘルペスウイルス3、ウナギヘルペスウイルス1、コイヘルペスウイルス1、コイヘルペスウイルス2、コイヘルペスウイルス3、チョウザメヘルペスウイルス2、アメリカナマズヘルペスウイルス1、アメリカナマズヘルペスウイルス2、サケ科魚類ヘルペスウイルス1、サケ科魚類ヘルペスウイルス2、サケ科魚類ヘルペスウイルス3、トリアルファヘルペスウイルス1、オウムアルファヘルペスウイルス1、カモアルファヘルペスウイルス1、ハトアルファヘルペスウイルス1、トリアルファヘルペスウイルス2、トリアルファヘルペスウイルス3、シチメンチョウアルファヘルペスウイルス1、ペンギンアルファヘルペスウイルス1、ウミガメアルファヘルペスウイルス5、リクガメアルファヘルペスウイルス3、クモザルアルファヘルペスウイルス1、ウシアルファヘルペスウイルス2、オナガザルアルファヘルペスウイルス2、ヒトアルファヘルペスウイルス1、ヒトアルファヘルペスウイルス2、ウサギアルファヘルペスウイルス4、マカクアルファヘルペスウイルス1、カンガルーアルファヘルペスウイルス1、カンガルーアルファヘルペスウイルス2、チンパンジーアルファヘルペスウイルス3、ヒヒアルファヘルペスウイルス2、オオコウモリアルファヘルペスウイルス1、リスザルアルファヘルペスウイルス1、ウシアルファヘルペスウイルス1、ウシアルファヘルペスウイルス5、スイギュウアルファヘルペスウイルス1、イヌアルファヘルペスウイルス1、ヤギアルファヘルペスウイルス1、オナガザルアルファヘルペスウイルス9、シカアルファヘルペスウイルス1、シカアルファヘルペスウイルス2、ウマアルファヘルペスウイルス1、ウマアルファヘルペスウイルス3、ウマアルファヘルペスウイルス4、ウマアルファヘルペスウイルス8、ウマアルファヘルペスウイルス9、ネコアルファヘルペスウイルス1、ヒトアルファヘルペスウイルス3、イッカクアルファヘルペスウイルス1、アザラシアルファヘルペスウイルス1、ブタアルファヘルペスウイルス1、ウミガメアルファヘルペスウイルス6、ヨザルベータヘルペスウイルス1、オマキザルベータヘルペスウイルス1、オナガザルベータヘルペスウイルス5、ヒトベータヘルペスウイルス5、マカクベータヘルペスウイルス3、マカクベータヘルペスウイルス8、Mandrilline betaherpesvirus 1、チンパンジーベータヘルペスウイルス2、ヒヒベータヘルペスウイルス3、ヒヒベータヘルペスウイルス4、リスザルヘルペスウイルス4、ネズミベータヘルペスウイルス1、ネズミベータヘルペスウイルス2、ネズミベータヘルペスウイルス8、ゾウベータヘルペスウイルス1、ゾウベータヘルペスウイルス4、ゾウベータヘルペスウイルス5、ヒトベータヘルペスウイルス7、ヒトベータヘルペスウイルス6A、ヒトベータヘルペスウイルス6B、マカクベータヘルペスウイルス9、ネズミベータヘルペスウイルス3、ブタベータヘルペスウイルス2、モルモットベータヘルペスウイルス2、ツパイベータヘルペスウイルス1、キヌザルガンマヘルペスウイルス3、オナガザルガンマヘルペスウイルス14、ゴリラガンマヘルペスウイルス1、ヒトガンマヘルペスウイルス4、マカクガンマヘルペスウイルス4、マカクガンマヘルペスウイルス10、チンパンジーガンマヘルペスウイルス1、ヒヒガンマヘルペスウイルス1、ショウジョウガンマヘルペスウイルス2、ウシカモシカガンマヘルペスウイルス1、ウシカモシカガンマヘルペスウイルス2、ウシガンマヘルペスウイルス6、ヤギガンマヘルペスウイルス2、ブルーバックガンマヘルペスウイルス1、ヒツジガンマヘルペスウイルス2、ブタガンマヘルペスウイルス3、ブタガンマヘルペスウイルス4、ブタガンマヘルペスウイルス5、ウマガンマヘルペスウイルス2、ウマガンマヘルペスウイルス5、ネコガンマヘルペスウイルス1、イタチガンマヘルペスウイルス1、アザラシガンマヘルペスウイルス3、ヒナコウモリガンマヘルペスウイルス1、クモザルガンマヘルペスウイルス2、クモザルガンマヘルペスウイルス3、ウシガンマヘルペスウイルス4、キヌゲネズミガンマヘルペスウイルス2、ヒトガンマヘルペスウイルス8、マカクガンマヘルペスウイルス5、マカクガンマヘルペスウイルス8、マカクガンマヘルペスウイルス11、マカクガンマヘルペスウイルス12、ネズミガンマヘルペスウイルス4、ネズミガンマヘルペスウイルス7、リスザルガンマヘルペスウイルス2、ウマガンマヘルペスウイルス7、アザラシガンマヘルペスウイルス2、Saguinine gammaherpesvirus 1、イグアナヘルペスウイルス2、アワビヘルペスウイルス1、カキヘルペスウイルス1、Salmonella virus SKML39、Shigella virus AG3、Dickeya virus Limestone、Dickeya virus RC2014、Escherichia virus CBA120、Escherichia virus PhaxI、Salmonella virus 38、Salmonella virus Det7、Salmonella virus GG32、Salmonella virus PM10、Salmonella virus SFP10、Salmonella virus SH19、Salmonella virus SJ3、Escherichia virus KWBSE43-6、Klebsiella virus 0507KN21、Klebsiella virus KpS110、Klebsiella virus May、Klebsiella virus Menlow、Serratia virus IME250、Erwinia virus Ea2809、Serratia virus MAM1、Acinetobacter virus Acibel007、Acinetobacter virus AB3、Acinetobacter virus AbKT21III、Acinetobacter virus Abp1、Acinetobacter virus Aci07、Acinetobacter virus Aci08、Acinetobacter virus AS11、Acinetobacter virus AS12、Acinetobacter virus Fri1、Acinetobacter virus IME200、Acinetobacter virus PD6A3、Acinetobacter virus PDAB9、Acinetobacter virus phiAB1、Acinetobacter virus SH-Ab 15519、Acinetobacter virus SWHAb1、Acinetobacter virus SWHAb3、Acinetobacter virus WCHABP5、Acinetobacter virus B1、Acinetobacter virus B2、Acinetobacter virus B5、Acinetobacter virus D2、Acinetobacter virus P1、Acinetobacter virus P2、Acinetobacter virus phiAB6、Acinetobacter virus Petty、Vibrio virus Vc1、Vibrio virus A318、Vibrio virus AS51、Vibrio virus Vp670、Marinomonas virus CB5A、Marinomonas virus CPP1m、Vibrio virus VEN、Pseudomonas virus Achelous、Pseudomonas virus Alpheus、Pseudomonas virus Nerthus、Pseudomonas virus Njord、Pseudomonas virus uligo、Pseudomonas virus C171、Pectobacterium virus PP16、Pectobacterium virus PPWS1、Pectobacterium virus PPWS2、Pectobacterium virus CB5、Pectobacterium virus Clickz、Pectobacterium virus fM1、Pectobacterium virus Gaspode、Pectobacterium virus Khlen、Pectobacterium virus Koot、Pectobacterium virus Lelidair、Pectobacterium virus Nobby、Pectobacterium virus Peat1、Pectobacterium virus Phoria、Pectobacterium virus PP90、Pectobacterium virus Zenivior、Dickeya virus BF25-12、Pseudomonas virus NV3、Pseudomonas virus 130-113、Pseudomonas virus 15pyo、Pseudomonas virus Ab05、Pseudomonas virus ABTNL、Pseudomonas virus DL62、Pseudomonas virus kF77、Pseudomonas virus LKD16、Pseudomonas virus LUZ19、Pseudomonas virus MPK6、Pseudomonas virus MPK7、Pseudomonas virus NFS、Pseudomonas virus PAXYB1、Pseudomonas virus phiKMV、Pseudomonas virus PT2、Pseudomonas virus PT5、Pseudomonas virus RLP、Pseudomonas virus LKA1、Pseudomonas virus f2、Aeromonas virus 25AhydR2PP、Aeromonas virus AS7、Aeromonas virus ZPAH7、Yersinia virus ISAO8、Aeromonas virus Ahp1、Aeromonas virus CF7、Cronobacter virus DevCD23823、Cronobacter virus GAP227、Salmonella virus Spp16、Yersinia virus R8-01、Yersinia virus fHeYen301、Yersinia virus Phi80-18、Pectobacterium virus Arno160、Pectobacterium virus PP2、Proteus virus PM85、Proteus virus PM93、Proteus virus PM116、Proteus virus Pm5460、Pectobacterium virus PP1、Erwinia virus Era103、Erwinia virus S2、Lelliottia virus phD2B、Citrobacter CrRp3、Escherichia virus LL11、Escherichia virus AAPEc6、Escherichia virus ACGC91、Escherichia virus B、Escherichia virus C、Escherichia virus K、Escherichia virus K1-5、Escherichia virus K1E、Escherichia virus mutPK1A2、Escherichia virus VEc3、Escherichia virus UAB78、Salmonella virus BP12B、Sa
lmonella virus SP6、Burkholderia virus BpAMP1、Ralstonia virus RSPI1、Ralstonia virus RSB1、Ralstonia virus RsoP1IDN、Burkholderia virus JG068、Ralstonia virus RSJ2、Ralstonia virus RSJ5、Ralstonia virus RSPII1、Shigella virus Buco、Escherichia virus Minorna、Klebsiella virus AltoGao、Klebsiella virus BO1E、Klebsiella virus F19、Klebsiella virus K244、Klebsiella virus Kp2、Klebsiella virus KP34、Klebsiella virus KPRio2015、Klebsiella virus KpS2、Klebsiella virus KpV41、Klebsiella virus KpV48、Klebsiella virus KpV71、Klebsiella virus KpV74、Klebsiella virus KpV475、Klebsiella virus KPV811、Klebsiella virus myPSH1235、Klebsiella virus SU503、Klebsiella virus SU552A、Shigella virus SFN6B、Enterobacter virus KDA1、Proteus virus PM16、Proteus virus PM75、Dickeya virus Dagda、Dickeya virus Katbat、Dickeya virus Luksen、Dickeya virus Mysterion、Yersinia virus AP10、Erwinia virus FE44、Escherichia virus 285P、Escherichia virus BA14、Escherichia virus P483、Escherichia virus P694、Escherichia virus S523、Kluyvera virus Kvp1、Pectobacterium virus PP74、Salmonella virus BP12A、Salmonella virus BSP161、Shigella virus A7、Yersinia virus Berlin、Yersinia virus PYPS50、Yersinia virus Yepe2、Yersinia virus Yepf、Citrobacter virus CR8、Vibrio virus ICP3、Vibrio virus N4、Vibrio virus VP4、Enterobacter virus Eap1、Erwinia virus L1、Escherichia virus SRT7、Pseudomonas virus 17A、Pseudomonas virus gh1、Pseudomonas virus Henninger、Pseudomonas virus KNP、Pseudomonas virus Pf1ERZ2017、Pseudomonas virus PhiPSA2、Pseudomonas virus PhiPsa17、Pseudomonas virus PPPL1、Pseudomonas virus shl2、Pseudomonas virus WRT、Yersinia virus fPS9、Yersinia virus fPS53、Yersinia virus fPS59、Yersinia virus fPS54ocr、Pectobacterium virus Jarilo、Citrobacter virus CR44b、Citrobacter virus SH3、Citrobacter virus SH4、Cronobacter virus Dev2、Cronobacter virus GW1、Enterobacter virus EcpYZU01、Escherichia virus EcoDS1、Escherichia virus F、Escherichia virus GA2A、Escherichia virus IMM002、Escherichia virus K1F、Escherichia virus LM33P1、Escherichia virus PE3-1、Escherichia virus Ro45lw、Escherichia virus ST31、Escherichia virus Vec13、Escherichia virus YZ1、Escherichia virus ZG49、Shigella virus SFPH2、Morganella virus MmP1、Morganella virus MP2、Dickeya virus JA10、Dickeya virus Ninurta、Pectobacterium virus PP47、Pectobacterium virus PP81、Pectobacterium virus PPWS4、Pseudomonas virus PPpW4、Pseudomonas virus 22PfluR64PP、Pseudomonas virus IBBPF7A、Pseudomonas virus Pf10、Pseudomonas virus PFP1、Pseudomonas virus PhiS1、Pseudomonas virus UNOSLW1、Pseudomonas virus PspYZU08、Escherichia virus K30、Klebsiella virus 2044-307w、Klebsiella virus BIS33、Klebsiella virus Henu1、Klebsiella virus IL33、Klebsiella virus IME205、Klebsiella virus IME321、Klebsiella virus K5、Klebsiella virus K11、Klebsiella virus K5-2、Klebsiella virus K5-4、Klebsiella virus KN1-1、Klebsiella virus KN3-1、Klebsiella virus KN4-1、Klebsiella virus Kp1、Klebsiella virus KP32、Klebsiella virus KP32i192、Klebsiella virus KP32i194、Klebsiella virus KP32i195、Klebsiella virus KP32i196、Klebsiella virus kpssk3、Klebsiella virus KpV289、Klebsiella virus KpV763、Klebsiella virus KpV766、Klebsiella virus KpV767、Klebsiella virus Pharr、Klebsiella virus PRA33、Klebsiella virus SHKp152234、Klebsiella virus SHKp152410、Citrobacter virus CFP1、Citrobacter virus SH1、Citrobacter virus SH2、Enterobacter virus E2、Enterobacter virus E3、Enterobacter virus KPN3、Enterobacteria virus T7M、Escherichia virus ECA2、Escherichia virus LL2、Escherichia virus T3、Escherichia virus T3Luria、Leclercia virus 10164-302、Salmonella virus SG-JL2、Serratia virus 2050H2、Serratia virus SM9-3Y、Yersinia virus AP5、Yersinia virus YeF10、Yersinia virus YeO3-12、Enterobacteria virus IME390、Escherichia virus 13a、Escherichia virus 64795ec1、Escherichia virus C5、Escherichia virus CICC80001、Escherichia virus Ebrios、Escherichia virus EG1、Escherichia virus HZ2R8、Escherichia virus HZP2、Escherichia virus N30、Escherichia virus NCA、Escherichia virus T7、Salmonella virus 3A8767、Salmonella virus Vi06、Stenotrophomonas virus IME15、Yersinia virus YpPY、Yersinia virus YpsPG、Pseudomonas virus Phi15、Pectobacterium virus DUPPII、Synechococcus virus SCBP42、Aquamicrobium virus P14、Ashivirus S45C4、Agrobacterium virus Atuph02、Agrobacterium virus Atuph03、Ralstonia virus Ap1、Ayaqvirus S45C18、Prochlorococcus virus SS120-1、Pseudomonas virus Andromeda、Pseudomonas virus Bf7、Escherichia virus J8-65、Escherichia virus Lidtsur、Prochlorococcus virus NATL1A7、Chosvirus KM23C739、Rhizobium virus RHEph02、Rhizobium virus RHEph08、Rhizobium virus RHEph09、Vibrio virus Cyclit、Escherichia virus PGT2、Escherichia virus PhiKT、Alteromonas virus H4-4、Foussvirus S46C10、Fussvirus S30C28、Escherichia virus ECBP5、Pectobacterium virus PP99、Ralstonia virus DURPI、Ralstonia virus RsoP1EGY、Synechococcus STIP37、Jalkavirus S08C159、Ralstonia virus RSB3、Kawavirus SWcelC56、Synechococcus virus SRIP1、Providencia virus PS3、Curvibacter virus P26059B、Ralstonia virus RSB2、Synechococcus virus SCBP2、Krakvirus S39C11、Podovirus Lau218、Pantoea virus LIMElight、Prochlorococcus virus PGSP1、Synechococcus virus SCBP3、Caulobacter virus Lullwater、Vibrio virus KF1、Vibrio virus KF2、Vibrio virus OWB、Vibrio virus VP93、Pseudomonas virus VSW3、Nohivirus S31C1、Oinezvirus S37C6、Rhi
zobium virus RHEph01、Pagavirus S05C849、Mesorhizobium virus Lo5R7ANS、Pedosvirus S28C3、Pekhitvirus S04C24、Pelagibacter virus HTVC019P、Pelagivirus S35C6、Caulobacter virus Percy、Delftia virus IMEDE1、Podivirus S05C243、Pseudomonas virus PollyC、Synechococcus virus SCBP4、Powvirus S08C41、Xanthomonas virus f20、Xanthomonas virus f30、Xanthomonas virus XAJ24、Xanthomonas virus Xc10、Xylella virus Prado、Synechococcus virus SB28、Sphingomonas virus Scott、Synechococcus virus SRIP2、Ralstonia virus ITL1、Sieqvirus S42C7、Ralstonia virus RPSC1、Stopalavirus S38C3、Pelagibacter virus HTVC011P、Stupnyavirus KM16C193、Prochlorococcus virus 951510a、Prochlorococcus virus NATL2A133、Prochlorococcus virus PSSP10、Vibrio virus JSF7、Prochlorococcus virus PSSP7、Synechococcus virus P60、Prochlorococcus virus PSSP3、Synechococcus virus PSSP2、Synechococcus virus Syn5、Votkovvirus S28C10、Pantoea virus LIMEzero、Pasteurella virus PHB01、Pasteurella virus PHB02、Escherichia virus GJ1、Escherichia virus ST32、Erwinia virus Faunus、Erwinia virus Y2、Aeromonas virus pAh6C、Pectobacterium virus PM1、Pectobacterium virus PP101、Shewanella virus Spp001、Shewanella virus SppYZU05、Vibrio virus Ceto、Vibrio virus Thalassa、Vibrio virus JSF10、Vibrio virus JSF12、Vibrio virus phi3、Vibrio virus pVp1、Escherichia virus EPS7、Escherichia virus mar003J3、Escherichia virus saus132、Salmonella virus 123、Salmonella virus 329、Salmonella virus 118970sal2、Salmonella virus LVR16A、Salmonella virus S113、Salmonella virus S114、Salmonella virus S116、Salmonella virus S124、Salmonella virus S126、Salmonella virus S132、Salmonella virus S133、Salmonella virus S147、Salmonella virus Seafire、Salmonella virus SH9、Salmonella virus STG2、Salmonella virus Stitch、Salmonella virus Sw2、Yersinia virus phiR201、Escherichia virus AKFV33、Escherichia virus BF23、Escherichia virus chee24、Escherichia virus DT5712、Escherichia virus DT57C、Escherichia virus FFH1、Escherichia virus Gostya9、Escherichia virus H8、Escherichia virus mar004NP2、Escherichia virus OSYSP、Escherichia virus phiAPCEc03、Escherichia virus phiLLS、Escherichia virus slur09、Escherichia virus T5、Salmonella virus NR01、Salmonella virus S131、Salmonella virus Shivani、Salmonella virus SP01、Salmonella virus SP3、Salmonella virus SPC35、Shigella virus SHSML45、Shigella virus SSP1、Pectobacterium virus DUPPV、Pectobacterium virus My1、Proteus virus PM135、Proteus virus Stubb、Vibrio virus PG07、Vibrio virus VspSw1、Aeromonas virus AhSzq1、Aeromonas virus AhSzw1、Klebsiella virus IME260、Klebsiella virus Sugarland、Escherichia virus IME542、Escherichia virus ACGM12、Escherichia virus EC3a、Escherichia virus DTL、Escherichia virus IME253、Escherichia virus Rtp、Shigella virus Sf12、Escherichia virus phiEB49、Escherichia virus AHP42、Escherichia virus AHS24、Escherichia virus AKS96、Escherichia virus C119、Escherichia virus E41c、Escherichia virus Eb49、Escherichia virus Jk06、Escherichia virus KP26、Escherichia virus phiJLA23、Escherichia virus Rogue1、Shigella virus Sd1、Shigella virus pSf1、Citrobacter virus DK2017、Citrobacter virus Sazh、Citrobacter virus Stevie、Escherichia virus LL5、Escherichia virus TLS、Salmonella virus 36、Salmonella virus PHB07、Salmonella virus phSE2、Salmonella virus SP126、Salmonella virus YSP2、Escherichia virus 95、Escherichia virus mar001J1、Escherichia virus mar002J2、Escherichia virus SECphi27、Escherichia virus swan01、Escherichia virus IME347、Escherichia virus SRT8、Escherichia virus ADB2、Escherichia virus BIFF、Escherichia virus IME18、Escherichia virus JMPW1、Escherichia virus JMPW2、Escherichia virus SH2、Escherichia virus T1、Shigella virus 008、Shigella virus ISF001、Shigella virus PSf2、Shigella virus Sfin1、Shigella virus SH6、Shigella virus Shfl1、Shigella virus ISF002、Cronobacter virus Esp2949-1、Enterobacter virus EcL1、Cronobacter virus PhiCS01、Escherichia virus ESCO41、Pantoea virus AAS23、Escherichia virus NBD2、Enterobacter virus F20、Klebsiella virus 1513、Klebsiella virus GHK3、Klebsiella virus KLPN1、Klebsiella virus KOX1、Klebsiella virus KP36、Klebsiella virus KpCol1、Klebsiella virus KpKT21phi1、Klebsiella virus KPN N141、Klebsiella virus KpV522、Klebsiella virus MezzoGao、Klebsiella virus NJR15、Klebsiella virus NJS1、Klebsiella virus NJS2、Klebsiella virus PKP126、Klebsiella virus Sushi、Klebsiella virus TAH8、Klebsiella virus TSK1、Bacillus virus Agate、Bacillus virus Bobb、Bacillus virus Bp8pC、Bacillus virus Bastille、Bacillus virus CAM003、Bacillus virus Evoli、Bacillus virus HoodyT、Bacillus virus AvesoBmore、Bacillus virus B4、Bacillus virus Bigbertha、Bacillus virus Riley、Bacillus virus Spock、Bacillus virus Troll、Bacillus virus Bc431、Bacillus virus Bcp1、Bacillus virus BCP82、Bacillus virus BM15、Bacillus virus Deepblue、Bacillus virus JBP901、Bacillus virus Grass、Bacillus virus NIT1、Bacillus virus SPG24、Bacillus virus BCP78、Bacillus virus TsarBomba、Bacillus virus BPS13、Bacillus virus BPS10C、Bacillus virus Hakuna、Bacillus virus Megatron、Bacillus virus WPh、Bacillus virus Mater、Bacillus virus Moonbeam、Bacillus virus SIOphi、Enterococcus virus ECP3、Enterococcus virus EF24C、Enterococcus 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、Listeria virus LMSP25、Listeria virus LMTA34、Listeria virus LMTA148、Listeria virus LP048、Listeria virus LP064、Listeria virus LP083-2、Listeria virus P100、Listeria virus WIL1、Bacillus virus Camphawk、Bacillus virus SPO1、Bacillus virus CP51、Bacillus virus JL、Bacillus virus Shanette、Staphylococcus virus BS1、Staphylococcus virus BS2、Lactobacillus virus Bacchae、Lactobacillus virus Bromius、Lactobacillus virus Iacchus、Lactobacillus virus Lpa804、Lactobacillus virus Semele、Staphylococcus virus G1、Staphylococcus virus G15、Staphylococcus virus JD7、Staphylococcus virus K、Staphylococcus virus MCE2014、Staphylococcus virus P108、Staphylococcus virus Rodi、Staphylococcus virus S253、Staphylococcus virus S25-4、Staphylococcus virus SA12、Staphylococcus virus Sb1、Staphylococcus virus SscM1、Staphylococcus virus IPLAC1C、Staphylococcus virus SEP1、Staphylococcus virus Remus、Staphylococcus virus SA11、Staphylococcus virus Stau2、Staphylococcus virus Twort、Brochothrix virus A9、Lactobacillus virus Lb338-1、Lactobacillus 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B、Maruca vitrata nucleopolyhedrovirus、Mythimna unipuncta nucleopolyhedrovirus A、Mythimna unipuncta nucleopolyhedrovirus B、Operophtera brumata nucleopolyhedrovirus、Orgyia leucostigma nucleopolyhedrovirus、Orgyia pseudotsugata multiple nucleopolyhedrovirus、Oxyplax ochracea nucleopolyhedrovirus、Peridroma saucia nucleopolyhedrovirus、Perigonia lusca nucleopolyhedrovirus、Spodoptera eridania nucleopolyhedrovirus、Spodoptera exempta nucleopolyhedrovirus、Spodoptera exigua multiple nucleopolyhedrovirus、Spodoptera frugiperda multiple nucleopolyhedrovirus、Spodoptera littoralis nucleopolyhedrovirus、Spodoptera litura nucleopolyhedrovirus、Sucra jujuba nucleopolyhedrovirus、Thysanoplusia orichalcea nucleopolyhedrovirus、Trichoplusia ni single nucleopolyhedrovirus、Urbanus proteus nucleopolyhedrovirus、Wiseana signata nucleopolyhedrovirus、Adoxophyes orana granulovirus、Agrotis segetum granulovirus、Artogeia rapae granulovirus、Choristoneura fumiferana granulovirus、Clostera anachoreta granulovirus、Clostera anastomosis granulovirus A、Clostera anastomosis granulovirus B、Cnaphalocrocis medinalis granulovirus、Cryptophlebia leucotreta granulovirus、Cydia pomonella granulovirus、Diatraea saccharalis granulovirus、Epinotia aporema granulovirus、Erinnyis ello granulovirus、Harrisina brillians granulovirus、Helicoverpa armigera granulovirus、Lacanobia oleracea granulovirus、Mocis latipes granulovirus、Mythimna unipuncta granulovirus A、Mythimna unipuncta granulovirus B、Phthorimaea operculella granulovirus、Plodia interpunctella granulovirus、Plutella xylostella granulovirus、Spodoptera frugiperda granulovirus、Spodoptera litura granulovirus、Trichoplusia ni granulovirus、Xestia c-nigrum granulovirus、Culex nigripalpus nucleopolyhedrovirus、Neodiprion lecontei nucleopolyhedrovirus、Neodiprion sertifer nucleopolyhedrovirus、Acidianus two-tailed virus、Aeropyrum pernix bacilliform virus 1、Flavobacterium virus FLiP、Sulfolobus spindle-shaped virus 1、Sulfolobus spindle-shaped virus 2、Sulfolobus spindle-shaped virus 4、Sulfolobus spindle-shaped virus 5、Sulfolobus spindle-shaped virus 7、Sulfolobus spindle-shaped virus 8、Sulfolobus spindle-shaped virus 9、Acidianus spindle-shaped virus 1、Sulfolobus spindle-shaped virus 6、Pyrobaculum spherical virus、Thermoproteus tenax spherical virus 1、Sulfolobus newzealandicus droplet-shaped virus、Aeropyrum pernix ovoid virus 1、Salterprovirus His1、Glossina hytrosavirus、Musca hytrosavirus、ホワイトスポット病ウイルス、Gryllus bimaculatus nudivirus、Oryctes rhinoceros nudivirus、Heliothis zea nudivirus、Sulfolobus ellipsoid virus 1、Acholeplasma virus L2、Apanteles crassicornis bracovirus、Apanteles fumiferanae bracovirus、Ascogaster argentifrons bracovirus、Ascogaster quadridentata bracovirus、Cardiochiles nigriceps bracovirus、Chelonus altitudinis bracovirus、Chelonus blackburni bracovirus、Chelonus inanitus bracovirus、Chelonus insularis bracovirus、Chelonus near curvimaculatus bracovirus、Chelonus texanus bracovirus、Cotesia congregata bracovirus、Cotesia flavipes bracovirus、Cotesia glomerata 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sia rubecula bracovirus、Cotesia schaeferi bracovirus、Diolcogaster facetosa bracovirus、Glyptapanteles flavicoxis bracovirus、Glyptapanteles indiensis bracovirus、Glyptapanteles liparidis bracovirus、Hypomicrogaster canadensis bracovirus、Hypomicrogaster ectdytolophae bracovirus、Microplitis croceipes bracovirus、Microplitis demolitor bracovirus、Phanerotoma flavitestacea bracovirus、Pholetesor ornigis bracovirus、Protapanteles paleacritae bracovirus、Tranosema rostrale bracovirus、Campoletis aprilis ichnovirus、Campoletis flavicincta ichnovirus、Campoletis sonorensis ichnovirus、Casinaria arjuna ichnovirus、Casinaria forcipata ichnovirus、Casinaria infesta ichnovirus、Diadegma acronyctae ichnovirus、Diadegma interruptum ichnovirus、Diadegma terebrans ichnovirus、Enytus montanus ichnovirus、Eriborus terebrans ichnovirus、Glypta fumiferanae ichnovirus、Hyposoter annulipes ichnovirus、Hyposoter exiguae ichnovirus、Hyposoter fugitivus ichnovirus、Hyposoter lymantriae ichnovirus、Hyposoter pilosulus ichnovirus、Hyposoter rivalis ichnovirus、Olesicampe benefactor ichnovirus、Olesicampe geniculatae ichnovirus、Synetaeris tenuifemur ichnovirus、Alphaportoglobovirus SPV2、Sulfolobus alphaportoglobovirus 1、リンゴくぼみ果ウイロイド、リンゴさび果ウイロイド、ブドウオーストラリアウイロイド、カンキツベントリーフウイロイド、カンキツ矮化ウイロイド、カンキツウイロイドV、カンキツウイロイドVI、ブドウ黄色斑点ウイロイド1、ブドウ黄色斑点ウイロイド2、ナシブリスタキャンカーウイロイド、カンキツバーククラッキングウイロイド、Coconut cadang-cadang viroid、Coconut tinangaja viroid、ホップ潜在ウイロイド、コリウスウイロイド1、コリウスウイロイド2、コリウスウイロイド3、ダリア潜在ウイロイド、ホップ矮化ウイロイド、キク矮化ウイロイド、カンキツエクソコーティスウイロイド、Columnea latent viroid、Iresine viroid 1、Pepper chat fruit viroid、ジャガイモやせいもウイロイド、Tomato apical stunt viroid、トマト退緑萎縮ウイロイド、Tomato planta macho viroid、Aeropyrum coil-shaped virus、Nitmarvirus NSV1、Ageratum leaf curl Buea betasatellite、Ageratum leaf curl Cameroon betasatellite、Ageratum yellow leaf curl betasatellite、カッコウアザミ葉脈黄化ベータサテライト、Ageratum yellow vein India betasatellite、Ageratum yellow vein Sri Lanka betasatellite、Alternanthera yellow vein betasatellite、Andrographis yellow vein leaf curl betasatellite、Bhendi yellow vein mosaic betasatellite、Cardiospermum yellow leaf curl betasatellite、Chili leaf curl betasatellite、Chili leaf curl Jaunpur betasatellite、Chili leaf curl Sri Lanka betasatellite、Cotton leaf curl Gezira betasatellite、Cotton leaf curl Multan betasatellite、Croton yellow vein mosaic betasatellite、ヒヨドリバナ葉脈黄化ベータサテライト、Eupatorium yellow vein mosaic betasatellite、French bean leaf curl betasatellite、Hedyotis yellow mosaic betasatellite、スイカズラ葉脈黄化ベータサテライト、スイカズラ葉脈黄化モザイクベータサテライト、Malvastrum leaf curl betasatellite、Malvastrum leaf curl Guangdong betasatellite、Mirabilis leaf curl betasatellite、Momordica yellow mosaic betasatellite、Mungbean yellow mosaic betasatellite、Okra leaf curl Oman betasatellite、Papaya leaf curl betasatellite、Papaya leaf curl China betasatellite、Papaya leaf curl India betasatellite、Rhynchosia yellow mosaic betasatellite、Rose leaf curl betasatellite、Siegesbeckia yellow vein betasatellite、Tobacco curly shoot betasatellite、Tobacco leaf curl betasatellite、タバコ巻葉日本ベータサテライト、Tobacco leaf curl Patna betasatellite、Tomato leaf curl Bangalore betasatellite、Tomato leaf curl Bangladesh betasatellite、Tomato leaf curl betasatellite、Tomato leaf curl China betasatellite、Tomato leaf curl Gandhinagar betasatellite、Tomato leaf curl Java betasatellite、Tomato leaf curl Joydebpur betasatellite、Tomato leaf curl Laguna betasatellite、Tomato leaf curl Laos betasatellite、Tomato leaf curl Malaysia betasatellite、Tomato leaf curl Nepal betasatellite、Tomato leaf curl Patna betasatellite、Tomato leaf curl Philippine betasatellite、Tomato leaf curl Sri Lanka betasatellite、Tomato leaf curl Yemen betasatellite、Tomato yellow leaf curl China betasatellite、Tomato yellow leaf curl Rajasthan betasatellite、Tomato yellow leaf curl Shandong betasatellite、Tomato yellow leaf curl Thailand betasatellite、Tomato yellow leaf curl Vietnam betasatellite、Tomato yellow leaf curl Yunnan betasatellite、Vernonia yellow vein betasatellite、Vernonia yellow vein Fujian betasatellite、Croton yellow vein deltasatellite、Malvastrum leaf curl deltasatellite、Sida golden yellow vein deltasatellite 1、Sida golden yellow vein deltasatellite 2、Sida golden yellow vein deltasatellite 3、Sweet potato leaf curl deltasatellite 1、Sweet potato leaf curl deltasatellite 2、Sweet potato leaf curl deltasatellite 3、Tomato leaf curl deltasatellite、Tomato yellow leaf distortion deltasatellite 1、Tomato yellow leaf distortion deltasatellite 2、Pyrobaculum filamentous virus 1、Thermoproteus tenax virus 1、デルタ肝炎ウイルス、Heterocapsa circularisquama DNA virus 01、及びRhizidiomyces virusが挙げられる。他のウイルスとしては、参照により本明細書に組み込まれる、ICTV Master Speices List(https://talk.ictvonline.org/files/master-species-lists/m/msl/9601)が挙げられる。
【0313】
一実施形態では、ウイルスは、コロナウイルスである。一実施形態では、ウイルスは、SARS-CoV-2である。一実施形態では、ウイルスは、インフルエンザウイルスである。一実施形態では、一実施形態では、ウイルスは、インフルエンザAウイルス、インフルエンザBウイルス、インフルエンザCウイルス、またはインフルエンザDウイルスである。
【0314】
アミノ酸配列及び核酸配列
表1は、アミノ酸配列及び核酸配列の概要を提供する。
【0315】
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【表1-4】
【表1-5】
【表1-6】
【表1-7】
【表1-8】
【表1-9】
【表1-10】
【表1-11】
【表1-12】
【表1-13】
【表1-14】
【表1-15】
【表1-16】
【表1-17】
【表1-18】
【表1-19】
【表1-20】
【表1-21】
【表1-22】
【表1-23】
【表1-24】
【表1-25】
【表1-26】
【表1-27】
【表1-28】
【表1-29】
【表1-30】
【表1-31】
【実施例】
【0316】
本発明は、以下の実施例を参照することにより更に詳述される。これらの実施例は、説明のみを目的として提供され、特に明記しない限り、限定することを意図しない。従って、本発明は、以下の実施例に限定されるものと決して解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書において提供される教示の結果として明らかとなる、あらゆる変形形態を包含すると解釈されるべきである。
【0317】
当業者は、更なる説明なしに上記の説明及び以下の実例を使用して、本発明を作製及び利用することができ、特許請求される方法を実施することができると考えられる。従って、以下の実施例は、本発明の特定の実施形態を具体的に示すものであり、本開示のその他を如何様にも限定するものと解釈されるべきではない。
【0318】
実施例1:インテグラーゼ欠損型レンチウイルスベクターにより送達されたCRISPR-Cas13によるコロナウイルスRNA標的破壊
本明細書において示されるデータは、1)必須かつ保存的なコロナウイルスRNA配列を標的とする効果的なCRISPR-ガイドRNAを同定するため、2)強力なコロナウイルスRNA切断のための最も強力なガイドRNA及びCRISPR-Cas13プラットフォームを同定するため、ならびに3)コロナウイルススパイクタンパク質により偽型化された非組み込み型レンチウイルスベクターを利用するためのアプローチとしてRNAを標的とするCRISPR-Cas13プラットフォームを使用する有効性を実証する。これらの実験は、コロナウイルス感染症を処置する新規の標的治療薬の開発に向けた大きな最初のステップとなる。注目すべきことに、このアプローチの迅速なプログラム可能性及びこのアプローチによる迅速な供給は、多様なコロナウイルス株またはインフルエンザなどの他の感染性RNAウイルスを標的とするのに適している可能性がある。
【0319】
コロナウイルスの生活環
コロナウイルスゲノムは、大きな(約30kb)の一本鎖mRNAによりコードされ、キャッピング及びポリアデニル化されており、これにより、宿主タンパク質による翻訳が可能となる。コロナウイルスゲノムは、全てRNA中間体から複製され、これにより、全長ゲノムmRNA及び入れ子状態のサブゲノムmRNAの両方が生成され、多数のウイルスタンパク質の発現が可能となる。
【0320】
標的化
コロナウイルスの複製及び転写の結果として、5’配列(リーダー)及び3’配列(S2MまたはヌクレオカプシドORF)は、ゲノムRNA及び全てのサブゲノムRNAで共通である(
図1)。これらの配列は、広範な有効性を有するガイドRNAを設計する機会を提供する。5’UTRまたは3’UTR領域にコロナウイルス標的配列を含有するルシフェラーゼレポーターmRNAを使用した細胞ベースのルシフェラーゼレポーターアッセイで、タイリングしたCRISPR RNA(crRNA)を試験する。
【0321】
切断
コロナウイルス標的配列のRNA切断の有効性及び特異性は、改良されたガイドRNA発現構築物及び/またはCRISPR配列を有する新規のCRISPR-Cas13系(eraseRプラットフォーム)を利用する上記のアッセイで決定される(
図2)。
【0322】
送達
レンチウイルスベクターは、ウイルスの指向性を変化させるために、異なるウイルスエンベロープタンパク質を用いて包まれ、偽型化され得る(
図3)。ACE2を発現する細胞種に形質導入するためにコロナウイルスエンベロープスパイクタンパク質で偽型化されたレンチウイルスベクターの有効性及び安定性が決定される。触媒活性のないインテグラーゼを使用して作製された非組み込み型の第3世代レンチウイルスベクターは、永続的に発現させることなくウイルスRNAが除去されるための、安全かつ一過性に発現させる方法を提供する。
【0323】
CRISPR-Cas13構成要素をコードするレンチウイルス構築物は、ウイルスエンベロープタンパク質で偽型化された非組み込み型レンチウイルス粒子にパッケージングされ得る。例えば、レンチウイルス粒子は、ACE2受容体を発現する細胞に侵入させるための特異性を提供するSARS-CoV-2コロナウイルス由来のスパイク糖タンパク質で偽型化され得る(
図4B)。これにより、「コロナウイルスにより標的とされる」細胞種への特異的な標的化が可能となる。形質導入後、プロセシング及び非組み込み型レンチウイルスのエピソームの形成により、CoVのウイルスゲノム及びサブゲノムmRNAの急速な標的分解のためのCRISPR-Cas13構成要素の一過性の発現が可能となる(
図4C)。
【0324】
SARS-2-CoV S2M配列を含有するルシフェラーゼレポーターを使用した。(
図7A)。CoVリーダー配列を標的とする7つのcrRNAを設計した(
図7B)。細胞ベースのルシフェラーゼアッセイは、細胞におけるCoVリーダーLucレポーター活性の、SARS-CoV-2リーダー配列(crRNA A~G)またはルシフェラーゼをコードする配列(Luc)を標的とするcrRNAによる、非標的化crRNAと比較して強力なノックダウンを実証する(
図7C)。
【0325】
更に、SARS-2-CoV S2M配列を含有するルシフェラーゼレポーターを使用した(
図8A)。SARS-2-CoV S2M配列を標的とする6つのcrRNAを設計した(
図8B)。細胞ベースのルシフェラーゼアッセイは、細胞におけるCoV S2M Lucレポーター活性の、SARS-CoV-2 S2M配列(crRNA A~F)またはルシフェラーゼをコードする配列(Luc)を標的とするcrRNAによる、非標的化crRNAと比較して強力なノックダウンを実証する(
図8C)。
【0326】
実施例2:CRISPR-Cas13 crRNAアレイの指向性ワンステップアセンブリ
本明細書において提供されるデータは、DR配列内にヌクレオチド置換を含有する複数のアニールされたオリゴ対の直接的ライゲーションによりcrRNAアレイを作製するためのアプローチの設計及び検証を示す(
図9D)。3つのスペーサー配列の順序付けられたタンデムアレイを効率的に作製するために、この迅速なアセンブリアプローチを使用した。注目すべきことに、これらのタンデムアレイは、DR配列内にポリTストレッチを含有せず、これにより、アレイ全長の転写が促進される。これらの位置における他の可能なヌクレオチド置換を考慮すると、DRのTストレッチを欠く最高7つのcrRNAのアレイ、またはDRのTストレッチが含まれる場合、最高8つのcrRNAのアレイが単一ステップでアセンブルされ得る(
図9E)。
【0327】
CRISPR-Cas13ガイドRNAは、細菌種においてタンデムアレイで天然に生じ、これらはその後にCas13により媒介される切断により単一のガイドにプロセシングされる(
図9A)。この切断活性は、標的RNA切断活性から分離可能であり、従って、「触媒活性を失った(catalytically dead)」Cas13(dCas13)は、このcrRNAプロセシング能力を保持する。多数のCRISPR-Cas13ダイレクトリピートが、4~5ヌクレオチドのポリT配列を含有し、これは哺乳動物細胞における一般的に使用されるhU6などのPol IIIプロモーターからの全長の単一またはタンデムcrRNAの発現を阻害する能力を有する(
図9B)。結晶構造解析研究により、ポリTストレッチがダイレクトリピート(DR)のループ領域に生じ、少なくとも1つのTヌクレオチドが空間に突き出ており、これがCRISPR-Cas13の結合または切断において重要な役割を果たさないことを示唆することが明らかとなった。本明細書において示すように、このTストレッチ内の2つの位置の変異であるT17CまたはT18Cは、dCas13またはCas13により媒介される活性を阻害しない。従って、これらの変化は、DR配列内に多様性を生じさせて、指向性のマルチプレックスクローニングを可能にするために利用され得る。
【0328】
一般に、哺乳動物ガイドRNA発現カセットは、スペーサー配列を含むアニールしたオリゴヌクレオチドを、哺乳動物Pol IIIプロモーター、ダイレクトリピート、及び6つ以上のTのターミネーターからなるカセットにクローニングすることにより作製される(
図9C)。通常、Pol IIIプロモーターカセットを追加することにより複数種のガイドRNAが発現されるが、これは、ベクターの複雑性及びサイズを顕著に増大させ得る。crRNAタンデムアレイの作製は、ベクターのサイズ条件を顕著に緩和するが、長いアレイのヌクレオチド合成は、DR配列のサイズ及び反復性により妨げられる。
【0329】
実施例3:CRISPR crRNAアレイによるSARS-CoV-2ウイルス配列のノックダウンの増強
実施例4は、SARS-CoV-2ウイルス配列をコードするルシフェラーゼレポーターの強力なノックダウンが可能なCRISPRガイドRNAの設計及び検証を示す。実施例5は、Cas13bダイレクトリピートのループ領域内の必須ではない残基の塩基置換を利用するcrRNAタンデムアレイの指向性アセンブリのためのクローニング戦略の開発を実証する(
図9E及び
図10A)。本明細書において示されるデータは、これらの2つのループ残基(T17及びT18)の全ての可能な塩基変異は、ルシフェラーゼをコードする配列を標的とする2つの独立したガイドRNA(Luc-a及びLuc-b)において、ガイドRNAによる標的化及びルシフェラーゼレポーターmRNAのノックダウンに悪影響を及ぼさないことを実証する(
図10B)。
【0330】
SARS-CoV-2ウイルス配列を標的とする単一crRNAまたは3つ組crRNAのアレイを有するCRISPR-Cas13をコードするレンチウイルス遺伝子導入ベクターを開発した(
図11A)。ルシフェラーゼレポーターmRNAの5’及び3’UTR領域の両方にコードされる、標的となるSARS-CoV-2ウイルスリーダー配列及びNタンパク質配列を含有するルシフェラーゼレポーターを構築した(
図11B)。本明細書において示されるデータは、レンチウイルス導入ベクターにコードされる複数種のガイドRNAの単一プロモーターからの発現が、単一のガイドRNAの発現と比較してルシフェラーゼ活性のより強いノックダウンをもたらすことを示す(
図11C)。これらの結果は、単一のウイルスゲノムを標的とする複数種のガイドRNAを使用することのより高い有効性と共に、複数種のガイドRNAにより、ランダム変異誘発または治療による選択により発生し得るウイルス「エスケープ」が更に予防され得るという更なる利点を実証する。
【0331】
加えて、3つ組のガイドアレイをコードするCRISPR-Cas13発現カセットは、ウイルス遺伝子治療の有用な代替的送達方法であり得るAAVベクター内にパッケージングされるのに十分小さい(
図12)。
【0332】
実施例4:CRISPR-Cas13によるインフルエンザウイルス亜型の標的化
実施例4及び6は、CRISPR-Cas13が、SARS-CoV-2コロナウイルスのウイルス配列をコードするルシフェラーゼレポーターの発現を効率的にノックダウンすることができることを実証する。複製の特徴に基づいて、全てのコロナウイルスゲノムRNA及びサブゲノムRNAを標的とする単一のガイドRNAが設計され得る。加えて、単一プロモーターから発現されるアレイ内の複数種のガイドRNAの発現は、ウイルスレポーターのノックダウンの増強をもたらした。
【0333】
コロナウイルスと同様に、インフルエンザウイルスは、動物及びヒトの両方に感染し、世界的大流行になる大きな可能性がある包まれたRNAウイルスである。コロナウイルスとは対照的に、インフルエンザウイルスは、脊椎動物の核内に局在し、複製する8つの独立したウイルスRNAセグメントから構成される(
図13A)。ウイルスRNA(vRNA)セグメントは、少なくとも10種のタンパク質をコードし、ウイルス複製酵素、構造タンパク質、ならびに宿主細胞への結合及び融合に必要とされるエンベロープ糖タンパク質をコードする。複数セグメントのRNAウイルスゲノムであることにより、感染細胞内でウイルスセグメントがウイルス亜型間で容易に取り替えられ得るため、急速な変異及びウイルス選択が可能となる。これにより、エンベロープタンパク質ヘマグルチニン(HA)及びノイラミニダーゼ(NA)により分類される多様なインフルエンザ亜型がもたらされた。CRISPR-Cas13によるインフルエンザウイルスRNAの標的分解においてこれらの特徴が固有の課題をもたらしている。
【0334】
本明細書において示されるデータは、近年において重大なヒト疾患を引き起こしており、世界的大流行となる大きな可能性を含んでいる4つの主要なインフルエンザウイルスA型の亜型(H1N1、H2N2、H3N2、及びH7N9)を標的とし得るcrRNAの設計を示す。これらの4つの亜型間のウイルスタンパク質をコードする配列の多重配列アラインメントを使用して、8つのウイルスセグメントのうちの5つで保存されるセグメントを同定した(表2)。HA及びNA遺伝子では、宿主免疫からの回避を可能にするそれらの急速な進化と一致して、サブタイプ間で大きな保存されるウイルス配列は、同定されなかった。これらの5つの領域について、マイナス鎖ウイルスRNA(vRNA)またはウイルスタンパク質をコードするプラス鎖mRNAを標的とするガイドRNAを設計した。単一のPol IIIプロモーターから5種全てのcrRNAを発現するようにガイドRNA配列を設計した。
【0335】
レンチウイルス遺伝子導入ベクター(またはAAVなどの代替的な遺伝子治療ベクター)内にCRISPRガイドアレイ及びCas13発現カセットをコードすることにより、脊椎動物細胞へのCRISPR-Cas13構成要素の送達及び発現のための単一粒子の作製が可能となる(
図14)。NA及びHAエンベロープタンパク質によるレンチウイルスベクターの偽型化が、気道上皮などのインフルエンザウイルスにより感染される特異的な細胞種を標的とするために利用され得る。
【0336】
【0337】
本明細書において引用されるいずれの特許、特許出願、及び刊行物の開示も参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。本発明が特定の実施形態を参照して開示されたが、本発明の他の実施形態及び変形形態が、本発明の本来の趣旨及び範囲を逸脱しない範囲で他の当業者により考案され得ることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、全てのかかる実施形態及び等価な変形形態を含むものと解釈されることを意図する。
【配列表】
【国際調査報告】