(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-05-10
(54)【発明の名称】ヘムペルオキシダーゼを生産するための方法
(51)【国際特許分類】
C12N 9/08 20060101AFI20230428BHJP
C12N 15/53 20060101ALN20230428BHJP
【ＦＩ】
C12N9/08 ZNA
C12N15/53
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022558377
(86)(22)【出願日】2021-03-24
(85)【翻訳文提出日】2022-11-28
(86)【国際出願番号】 EP2021057532
(87)【国際公開番号】W WO2021191253
(87)【国際公開日】2021-09-30
(31)【優先権主張番号】20165131.2
(32)【優先日】2020-03-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】20167716.8
(32)【優先日】2020-04-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】20177549.1
(32)【優先日】2020-05-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．Ｌｉｎｕｘ
２．ＵＮＩＸ
(71)【出願人】
【識別番号】517047651
【氏名又は名称】テヒニッシュ・ウニベルズィテート・ウイーン
【氏名又は名称原語表記】Ｔｅｃｈｎｉｓｃｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔ Ｗｉｅｎ
【住所又は居所原語表記】Ｋａｒｌｓｐｌａｔｚ １３， １０４０ Ｗｉｅｎ， Ａｕｓｔｒｉａ
(74)【代理人】
【識別番号】110001519
【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】フーマー、ディアナ
(72)【発明者】
【氏名】スパディウト、オリヴァー
(72)【発明者】
【氏名】エブナー、ユリアン
【テーマコード（参考）】
4B050
【Ｆターム（参考）】
4B050CC03
4B050DD13
4B050FF01
4B050GG10
4B050KK03
4B050LL05
(57)【要約】
本発明は、封入体（ＩＢ）からヘムペルオキシダーゼを生産するための方法であって：前記ヘムペルオキシダーゼをＩＢの形態で提供する工程、前記ＩＢを可溶化する工程、前記可溶化されたＩＢをリフォールディング緩衝液中に移してリフォールディングミックスを得る工程、前記リフォールディングミックスにヘム補因子を添加する工程を含み、前記リフォールディングミックスへの前記ヘム補因子の添加が、少なくとも１時間の期間にわたって配分される、前記方法を提供する。本発明は、ヘムペルオキシダーゼ製品を生産するための方法をさらに提供する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
封入体（ＩＢ）からヘムペルオキシダーゼを生産するための方法であって：－前記ヘムペルオキシダーゼをＩＢの形態で提供する工程；
－前記ＩＢを可溶化する工程；
－前記可溶化されたＩＢをリフォールディング緩衝液中に移してリフォールディングミックスを得る工程；
－前記リフォールディングミックスにヘム補因子を添加する工程、
を含み、
前記リフォールディングミックスへの前記ヘム補因子の添加が、少なくとも１時間、好ましくは少なくとも２時間、より好ましくは少なくとも３時間、なおより好ましくは少なくとも６時間、特に少なくとも１０時間の期間にわたって配分される、前記方法。
【請求項2】
前記ヘム補因子が、連続フィードとして前記リフォールディングミックスに添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記リフォールディングミックスが、前記ヘム補因子の添加の前に少なくとも１時間、好ましくは少なくとも２時間、なおより好ましくは少なくとも４時間、特に少なくとも８時間インキュベートされる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記ヘムペルオキシダーゼが、クラスＩＩ又はクラスＩＩＩのヘムペルオキシダーゼ、好ましくはクラスＩＩＩのヘムペルオキシダーゼ、特にセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）である、請求項１～請求項３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
前記ヘムペルオキシダーゼが、配列番号３と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、なおより好ましくは少なくとも９０％、なおより好ましくは少なくとも９５％、さらになおより好ましくは少なくとも９８％、さらになおより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、特に、前記ヘムペルオキシダーゼが、配列番号３に記載されているアミノ酸配列を含み、最も好ましくは、前記ヘムペルオキシダーゼが、配列番号４に記載されているアミノ酸配列からなる、請求項１～請求項４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項6】
前記ヘム補因子が、ヘミンである、請求項１～請求項５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
前記のＩＢの形態のヘムペルオキシダーゼが：－前記ヘムペルオキシダーゼをコードする遺伝子を発現する宿主細胞を培養する工程；及び
－前記宿主細胞からＩＢを得る工程、
によって提供され、好ましくは、前記宿主細胞が、原核細胞、好ましくは大腸菌細胞である、請求項１～請求項６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
前記可溶化が、可溶化緩衝液において前記ＩＢをインキュベートすることを含み、好ましくは、前記可溶化緩衝液が、８～１２．５、好ましくは８．５～１１．５、より好ましくは９～１１、なおより好ましくは９．５～１０．５のｐＨを有する、請求項１～請求項７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
前記可溶化緩衝液が、１～５０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは２～２５ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは４～１５ｍｍｏｌ／Ｌ、特に６～８ｍｍｏｌ／Ｌのジチオスレイトール（ＤＴＴ）濃度に相当する還元状態を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記ヘム補因子が前記リフォールディングミックスに添加された後に、リフォールディングされたヘムペルオキシダーゼを精製する工程をさらに含み、好ましくは、前記方法が、リフォールディングされたヘムペルオキシダーゼから不純物を除去するための遠心分離工程をさらに含み、及び／又は、前記ヘムペルオキシダーゼが、疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）によって精製される、請求項１～請求項９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
請求項１～請求項１０のいずれか１項に記載の方法によってヘムペルオキシダーゼを生産することを含む、ヘムペルオキシダーゼ製品を生産するための方法。
【請求項12】
ヘムペルオキシダーゼコンジュゲートを得るためのコンジュゲーション反応をさらに含み、好ましくは、前記ヘムペルオキシダーゼが、結合物質にコンジュゲートされ、好ましくは、前記ヘムペルオキシダーゼが、抗体、抗体断片、抗体模倣体、抗体結合タンパク質、又はストレプトアビジンにコンジュゲートされる、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記ヘムペルオキシダーゼ又は前記ヘムペルオキシダーゼコンジュゲートを精製する、凍結する、及び／又は凍結乾燥する工程をさらに含む、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項14】
前記ヘムペルオキシダーゼ又はヘムペルオキシダーゼコンジュゲートを固体担体に固定化する工程をさらに含み、好ましくは、前記固体担体が、ナノ粒子、カーボン／ポリビニル材料、又は膜である、請求項１１～請求項１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項15】
前記ヘムペルオキシダーゼ又は前記ヘムペルオキシダーゼコンジュゲートをキットにパッケージングする工程をさらに含む、請求項１１～請求項１４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ヘムペルオキシダーゼを生産するための方法に関する。
【背景技術】
【0002】
ヘムペルオキシダーゼは、免疫アッセイ、診断キット、ＥＬＩＳＡ、ＥＭＳＡ、ウエスタンブロッティング及びサザンブロッティングなどのプローブベースのアッセイ技術、廃液処理、有機合成における試薬として、並びに潜在的な治療用途を含め、広範な用途を有する産業的に重要なクラスの酵素である。このクラスのヘムペルオキシダーゼのよく知られたメンバーとして、研究及び産業において一般的に使用されているセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）がある。
【0003】
これまで、ヘムペルオキシダーゼはしばしば植物から生産されており、例えば、ＨＲＰは、セイヨウワサビ（Ａｒｍｏｒａｃｉａ ｒｕｓｔｉｃａｎａ）の毛状根培養物からの抽出により主に生産されている。しかし、これは非効率で時間のかかるプロセスである。欠点として、低い収率、長い培養時間、季節的にしか利用可能でないこと、不均質なイソ酵素組成（調製物ごとに生化学的特性が異なる）、根の成長中の条件への依存、及び、ヒトに対して免疫原性で結果として医療用に非適格となり得る植物グリコシル化パターンが挙げられる。
【0004】
ヘムペルオキシダーゼの組換え生産は、規定された酵素調製物の安定供給を高品質で保障するより有望な製造方式であるため、望ましい代替案である。特に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における組換え生産は、グリコシル化及びこれによる免疫原性を欠きながら、安定な生化学的特性を有する単一のアイソフォームの規定された調製物を得ることを可能にし得る。
【0005】
しかしながら、天然のヘムペルオキシダーゼの組換え生産は難易度が高い。例えば、ＨＲＰは８つのアスパラギン残基におけるグリコシル化を含んでおり、組換え生産を困難にしている。大腸菌から生産される野生型ＨＲＰは、植物由来酵素と比較して低い安定性を示す。
【0006】
様々な宿主（哺乳類細胞、昆虫細胞、酵母（ピキア・パストリス及びサッカロマイセス・セレビシエ）、他の植物（ニコチアナ・タバカム、ニコチアナ・ベンサミアナ、アルモラシア・ラファチフォリア）、並びに大腸菌）においてヘムペルオキシダーゼを組換え生産するための数多くの試みがなされている。しかし、これらの生産戦略は、結果として、非常に低い収率、並びに／又は酵素活性及び安定性の減少に終わっている。大腸菌における生産では、これは、大腸菌細胞質内の還元条件による封入体形成を引き起こす、タンパク質の細胞内生産に起因して生じる。したがって、この下流のプロセスは、例えば酵母におけるよりも複雑である。上記の酵素はシグナル配列を付加することによってペリプラズムに移行させることもできるが、この場合、収率はさらに低く、移行タグの付加によって酵素の活性及び安定性が損なわれる可能性がある。また、大腸菌は翻訳後修飾を行えないため、酵素がグリコシルされず、結果としてタンパク質の安定性の低減を引き起こす。
【0007】
組換え生産されたＨＲＰの特性を改良する目的で過去にいくつかの研究が実施されている。変異によってＨＲＰ特性を改良するための試みの概要は、Humer and Spadiut ("Improving the performance of horseradish peroxidase by site-directed mutagenesis." International Journal of Molecular Sciences 20.4 (2019): 916)に提供されており、安定性及び／又は酵素活性に対する多数の変異の影響が開示されている。
【発明の概要】
【0008】
しかしながら、これらの努力の全てにかかわらず、ヘムペルオキシダーゼを生産する新しい改良された方法がまだ存在しない。特に、好適な宿主、特に大腸菌においてヘムペルオキシダーゼを組換え生産し精製するための方法が必要とされる。本発明の目的は、かかる方法を提供することである。
【0009】
したがって、本発明は、封入体（ＩＢ；inclusion body）からヘムペルオキシダーゼを生産するための方法であって：
－前記ヘムペルオキシダーゼをＩＢの形態で提供する工程；
－前記ＩＢを可溶化する工程；
－前記可溶化されたＩＢをリフォールディング緩衝液中に移してリフォールディングミックスを得る工程；
－前記リフォールディングミックスにヘム補因子を添加する工程
を含み、前記リフォールディングミックスへの前記ヘム補因子の添加が、少なくとも１時間、好ましくは少なくとも２時間、より好ましくは少なくとも３時間、なおより好ましくは少なくとも６時間、特に少なくとも１０時間の期間にわたって配分される、前記方法を提供する。
－前記ヘムペルオキシダーゼをＩＢの形態で提供する工程；
－前記ＩＢを可溶化する工程；
－前記可溶化されたＩＢをリフォールディング緩衝液中に移してリフォールディングミックスを得る工程；
－前記リフォールディングミックスにヘム補因子を添加する工程
を含み、前記リフォールディングミックスへの前記ヘム補因子の添加が、少なくとも１時間、好ましくは少なくとも２時間、より好ましくは少なくとも３時間、なおより好ましくは少なくとも６時間、特に少なくとも１０時間の期間にわたって配分される、前記方法を提供する。
【0010】
加えて、本発明は、本発明によるヘムペルオキシダーゼを生産することを含む、ヘムペルオキシダーゼ製品を生産するための方法を提供する。
【0011】
本発明に関して、驚くべきことに、ヘムペルオキシダーゼのリフォールディングプロセスは、前記リフォールディングミックスへの前記ヘム補因子の添加がある特定の期間にわたって配分されるときに、強力に改良され得ることが見出された（実施例３、特に、表５及び表６の比較を参照されたい）。特定の理論に拘束されないが、本発明者らは、この有益な効果は前記ヘム補因子の疎水性の性質に起因すると推測する。この補因子はホロ酵素を形成する必要があるため、リフォールディング収率はリフォールディング後の正確にフォールディングされたヘムペルオキシダーゼへの組み込みに利用可能な遊離ヘム補因子に左右される。前記補因子の疎水性の性質に起因して、１回の工程で添加されると組み込みに利用可能でない凝集体を形成する可能性がある。
【0012】
本明細書においてより詳細に以下に記載されているように、前記リフォールディングミックスが、前記ヘム補因子を添加する前のある特定の期間にわたってインキュベートされるとき（特に、図１を参照されたい）、ある特定のレドックス特性及びｐＨ値を有する可溶化緩衝液及びリフォールディング緩衝液が使用されるとき（実施例２～５を参照されたい）、リフォールディング後にある特定の塩濃度を用いた析出工程が含まれているとき（実施例４、表９を参照されたい）、並びに、タンパク質が、疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ；hydrophobic interaction chromatography）によってさらに精製されるとき（実施例４を参照されたい）、さらに有利な効果が観察された。重要なことに、これらの個々の特徴の全てが互いに独立に有利な効果を有し得る。また、これらのいくつか、又は、特にこれらの全てが組み合わされるときに、高度に最適化された効率的なプロセスが得られる（特に実施例５を参照されたい）。
【0013】
この新しい改良された生産プロセスに加えて、本明細書では、野生型ＨＲＰ及び公知のＨＲＰ変異体を超えて改良された熱安定性及び反応速度パラメータを提供するだけでなく、特に本発明による方法を用いた、細菌における組換え生産に特によく適している新しいＨＲＰ変異体を開示する。これにより、強力に改良されたヘムペルオキシダーゼ及び高度に効率的な生産プロセスの組み合わせが可能になる。
【0014】
タンパク質発現及びＩＢからのリフォールディングのための技術は確立されており、当該分野において一般的に使用されている。かかる技術の概説は、例えば、Cabrita and Bottomley ("Protein expression and refolding - A practical guide to getting the most out of inclusion bodies." Biotechnology Annual Review 10 (2004): 31-50)、及び、Yamaguchi and Miyazaki ("Refolding techniques for recovering biologically active recombinant proteins from inclusion bodies. " Biomolecules 4.1 (2014): 235-251)に提供されている。大腸菌などの細菌における組換えタンパク質の過剰発現は、多くの場合、結果として、非天然コンホメーションを有するタンパク質凝集体であるＩＢの形成を引き起こす。用語「封入体」（ＩＢ）は、形質転換した宿主細胞の細胞質に存在する異種ポリペプチド（例えば、前記ヘムペルオキシダーゼ）を含有する不溶性凝集体を指す。これらは、典型的には顕微鏡下で明るいスポットとして現れ、細胞質の分離により回収できる。かかる封入体は、通常は比較的純粋且つ無傷のタンパク質を含有する；しかしながら、前記封入体は可溶化する必要があり、前記タンパク質はこれらの天然の構造にリフォールディングされる必要がある。
【0015】
典型的には、ＩＢは、尿素、塩化グアニジニウム（ＧｄｎＨＣｌ）などの変性剤、又はＮ－ラウロイルサルコシンなどのイオン性界面活性剤を含有する可溶化緩衝液中で可溶化される。多くの場合、非天然の分子内及び分子間ジスルフィド結合を還元し、システインを還元状態で保つために、２－メルカプトエタノール（β－ＭＥ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）又は１－モノチオグリセロール（ＭＴＧ）などの還元剤が添加される。用語「可溶化」又は「可溶化すること」は、最小の分子内及び分子間相互作用によるポリペプチドの単分子分散を結果として引き起こすことを目的として、前記ＩＢを溶解するために必要なプロセスを指す。「可溶化緩衝液」は、前記ＩＢを可溶化する目的で好適である緩衝液、すなわち、典型的には、可溶化されるＩＢにとって十分に変性的である状態の緩衝液である。
【0016】
変性タンパク質（可溶化されたＩＢ）から活性タンパク質（フォールディングされた形態）へのリフォールディングは、典型的には、変性剤の除去によって起こり、かかるタンパク質の効率的な回収において重要な工程である。用語「リフォールディング」は、変性タンパク質がその天然の又は活性なコンホメーションを得る際の機構を指す。リフォールディングのためのいくつかのアプローチが当該分野において知られている。希釈によるリフォールディングは、その簡潔さにより、特に生産スケールにおいて、１つの好ましい方法である。タンパク質濃度及び変性剤濃度が単一の工程で減少され、分子間相互作用による凝集が防止される。本明細書で使用される場合、「リフォールディング緩衝液」は、リフォールディングの目的で好適である緩衝液、すなわち、変性タンパク質がその天然の又は活性なコンホメーションを得ることを可能にする状態を提供する緩衝液を指す。リフォールディングされたタンパク質のリフォールディング効率（収率）は、酵素活性などの生物学的活性によって見積もることができる。
【0017】
封入体からヘムペルオキシダーゼを生産及び精製するための多くの方法が、当該分野において説明されている。かかる技術の概説は、Eggenreich et al. (“Production strategies for active heme-containing peroxidases from E. coli inclusion bodies - a review.” Biotechnology Reports 10 (2016): 75-83)に提供されている。このようなプロセスは、広範なヘムペルオキシダーゼの生産について説明されており、これらの全てについて、上記で概説されているものと同様の基本的なプロセスが使用され得る（ＩＢ生産、可溶化、リフォールディング）。例として、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（Smith et al. “Expression of a synthetic gene for horseradish peroxidase C in Escherichia coli and folding and activation of the recombinant enzyme with Ca2+and heme.” Journal of Biological Chemistry 265.22 (1990): 13335-13343）、真菌の染料脱色ペルオキシダーゼ（Linde et al. “Heterologous expression and physicochemical characterization of a fungal dye-decolorizing peroxidase from Auricularia auricula-judae.” Protein Expression and Purification 103 (2014): 28-37）、カチオン性細胞壁ペルオキシダーゼ（Kim et al. “Optimized refolding and characterization of S-peroxidase (CWPO_C of Populus alba) expressed in E. coli.” Protein Expression and Purification 80.2 (2011): 268-273）、シロイヌナズナペルオキシダーゼ（Shigeto et al. “Catalytic profile of Arabidopsis peroxidases, AtPrx-2, 25 and 71, contributing to stem lignification.” PLoS One 9.8 (2014)）、アニオン性タバコペルオキシダーゼ（Zakharova et al. “High-yield reactivation of anionic tobacco peroxidase overexpressed in Escherichia coli.” Protein Expression and Purification 113 (2015): 85-93）などが挙げられる。
【0018】
ＷＯ２０１４／１２８７２６Ａ２は、ＩＢから組換えタンパク質をリフォールディングするプロセスを記載している；しかしながら、これは、ペルオキシダーゼ又はヘム補因子と無関係である。
【0019】
Lin et al. (“High yield production of fungal manganese peroxidases by E. coli through soluble expression, and examination of the activities.” Protein expression and purification 145 (2018): 45-52)は、大腸菌における可溶性形態での真菌マンガンペルオキシダーゼの発現を記載している。ＩＢからのリフォールディングとは完全に無関係に、細胞へのヘミンの取り込みを増加させるため、及びタンパク質発現の間の適当な細胞活性の妨害を回避するために、ヘミンが細菌細胞培養物に連続的に添加される方法が記載されている。
【0020】
ヘムペルオキシダーゼは、過酸化水素を電子受容体として使用して酸化反応を触媒することができるヘム含有酵素である。本発明に関して、前記ヘムペルオキシダーゼは、好ましくはＥＣ１．１１．１．７（酵素番号）の酵素である。本発明に関してまた好ましい、ヘムペルオキシダーゼの主なスーパーファミリーは、植物、菌類及び細菌類ペルオキシダーゼのスーパーファミリーである（Welinder “Superfamily of plant, fungal and bacterial peroxidases.” Current Opinion in Structural Biology 2.3 (1992): 388-393を参照されたい）。このスーパーファミリーは、多くの場合、３の主なクラスからなると見られている：クラスＩは、細胞内ペルオキシダーゼであり、クラスＩＩは、分泌性の真菌ペルオキシダーゼからなり、クラスＩＩＩは、分泌性の植物ペルオキシダーゼからなる。クラスＩＩ及びＩＩＩは、これらのメンバーが、典型的には、ヘム基、４つのジスルフィド架橋を有し、２のＣａ２＋イオンを結合することにおいて類似している。また、両クラスのメンバーは、通常は天然の状態でグリコシル化されており、大腸菌において発現するには難易度が高い。本発明の方法に関して、ある特定の期間にわたって前記ヘム補因子の添加を配分する有利な効果は、とりわけ、この補因子の性質の結果であるため、本発明の方法は、全てのヘムペルオキシダーゼのリフォールディングに有利に使用され得る。しかしながら、クラスＩＩ及びクラスＩＩＩのヘムペルオキシダーゼは、組換え発現するのに特に難易度が高いため、これらのクラスは特に好ましい。したがって、好ましい実施形態において、前記ヘムペルオキシダーゼはクラスＩＩ又はクラスＩＩＩのヘムペルオキシダーゼ、特にクラスＩＩＩのヘムペルオキシダーゼである。
【0021】
本発明に関して使用されるヘム補因子は、ヘム自体、又はアポペルオキシダーゼに組み込まれている任意のヘム前駆体若しくは誘導体であり得る。例えば、ヘミン（ヘムの塩化第二鉄種；ＣＡＳ［１６００９－１３－５］）は、ヘム補因子として頻繁に使用される（上記で本明細書において列挙している、封入体からヘムペルオキシダーゼを生産及び精製するための方法に関連する文献を参照されたい）。本発明の好ましい実施形態において、前記ヘム補因子は、したがってヘミンである。
【0022】
本発明に関して、前記ヘムペルオキシダーゼがセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）であるとき特に好ましい。前記ＨＲＰが、大腸菌における組換え発現について最適化されていて、並びに／又は、改良された熱安定性及び／若しくは改良された触媒特性などの改良された特性を有する変異体ＨＲＰであるとき特に好ましい。
【0023】
ＨＲＰの特性は、野生型ＨＲＰのプロリン－１４６位（Ｐ１４６）及び／又はアスパラギン－２７５位（Ｎ２７５）において変異を導入することによって改良され得ることが、驚くべきことに見出された。特に、かかるＨＲＰ変異体は、高い収率（特に本発明による方法を使用して）及び良好な純度で大腸菌において組換え生産され得、驚くほど良好な熱安定性（実施例７を参照されたい）及び驚くほど高い酵素活性（実施例８を参照されたい）を示すことが見出された。ＨＲＰの多くの変異が研究されているが（Humer and Spadiut, “Improving the performance of horseradish peroxidase by site-directed mutagenesis.” International Journal of Molecular Sciences 20.4 (2019): 916を参照されたい）、上記のアミノ酸Ｐ１４６及び／又はＮ２７５の置換は、従来技術には記載されていない。
【0024】
野生型ＨＲＰの配列は、例えば、Gajhede et al (“Crystal structure of horseradish peroxidase C at 2.15 Å resolution.” Nature Structural Biology 4.12 (1997): 1032-1038, Protein Data Bank PDB ID 1ATJ)又はＵｎｉＰｒｏｔエントリーＰ００４３３により、当該分野において知られている。別途特定されない限り、本明細書において使用されている残基ナンバリングは、配列番号１に記載されている野生型ＨＲＰの配列を参照する（Ｐ１４６位及びＮ２７５位が太字で以下に示されている）。
【0025】
（野生型ＨＲＰ（配列番号１）：）
【化1】
【0026】
植物由来酵素は、翻訳後修飾を経て、結果として、とりわけ、付加されたメチオニンを有さない遊離Ｎ末端を生じさせる。しかしながら、例えば、大腸菌において組換え生産されるときには、開始コドンから得られるＮ末端メチオニン残基を伴って典型的には生産される。したがって、組換え生産された野生型ＨＲＰは典型的には以下の配列を有する：
【0027】
（組換え生産された野生型ＨＲＰ（配列番号２）：）
【化2】
【0028】
本発明の実施形態において、前記ヘムペルオキシダーゼは、配列番号１に記載されているアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。なおより好ましくは、前記ヘムペルオキシダーゼは、配列番号２に記載されているアミノ酸配列からなるポリペプチドである。前記ヘムペルオキシダーゼが、配列番号１と比較して少なくとも２つのアミノ酸交換を含むアミノ酸配列を含むポリペプチドであるとき、特に良好な結果が得られ、前記少なくとも２つのアミノ酸交換は、配列番号１のアミノ酸Ｐ１４６及びＮ２７５の交換である。実施例７に提供されている実験結果から分かるように、（ＨＲＰ Ｎ１３Ｄ／Ｎ５７Ｓ／Ｐ１４６Ｑ／Ｎ１７５Ｓ／Ｎ２５５Ｄ／Ｎ２６８Ｄ／Ｎ２７５Ｋにおける）Ｐ１４６及びＮ２７５の両方のアミノ酸交換の組み合わせは、単一の位置の交換（ＨＲＰ Ｎ１３Ｄ／Ｎ５７Ｓ／Ｐ１４６Ｑ／Ｎ１７５Ｓ／Ｎ２５５Ｄ／Ｎ２６８Ｄ又はＨＲＰ Ｎ１３Ｄ／Ｎ５７Ｓ／Ｎ１７５Ｓ／Ｎ２５５Ｄ／Ｎ２６８Ｄ／Ｎ２７５Ｋ）よりも予想外に高い熱安定性につながり得る。
【0029】
本発明に関して、前記ヘムペルオキシダーゼが、配列番号１と比較して少なくとも１つのアミノ酸交換を含むアミノ酸配列を含むとき、特に好ましく、前記少なくとも１つのアミノ酸交換は、Ｐ１４６Ｑ、Ｐ１４６Ａ、Ｐ１４６Ｒ、Ｐ１４６Ｖ、Ｐ１４６Ｅ、Ｎ２７５Ｋ、Ｎ２７５Ｒ、Ｎ２７５Ｄ、Ｎ２７５Ｓ、Ｎ２７５Ｑ、Ｎ２７５Ａ及びＮ２７５Ｅからなる群より選択される。Ｐ１４６Ｑ及びＮ２７５Ｋが特に好ましい。
【0030】
前記アミノ酸配列が、配列番号１と比較して、Ｐ１４６Ｑ、Ｐ１４６Ａ、Ｐ１４６Ｒ、Ｐ１４６Ｖ及びＰ１４６Ｅからなる群より選択されるアミノ酸交換、特にＰ１４６Ｑを含むとき、さらに好ましい。前記アミノ酸配列が、配列番号１と比較して、Ｎ２７５Ｋ、Ｎ２７５Ｒ、Ｎ２７５Ｄ、Ｎ２７５Ｓ、Ｎ２７５Ｑ、Ｎ２７５Ａ及びＮ２７５Ｅからなる群より選択されるアミノ酸交換、好ましくはＮ２７５Ｋを含むとき、さらに好ましい。Ｐ１４６について好ましい前記のアミノ酸交換の１つ（特にＰ１４６Ｑ）及びＮ２７５について好ましい前記アミノ酸交換の１つ（特にＮ２７５Ｋ）が組み合わされるとき、最も好ましい。実施例７及び８に提供されている実験結果から分かるように、かかる組み合わせは、高い熱安定性（ＨＲＰ Ｎ１３Ｄ／Ｎ５７Ｓ／Ｐ１４６Ｑ／Ｎ１７５Ｓ／Ｎ２５５Ｄ／Ｎ２６８Ｄ又はＨＲＰ Ｎ１３Ｄ／Ｎ５７Ｓ／Ｎ１７５Ｓ／Ｎ２５５Ｄ／Ｎ２６８Ｄ／Ｎ２７５Ｋと比較したとき、ＨＲＰ Ｎ１３Ｄ／Ｎ５７Ｓ／Ｐ１４６Ｑ／Ｎ１７５Ｓ／Ｎ２５５Ｄ／Ｎ２６８Ｄ／Ｎ２７５において）、及び高い酵素活性（ＨＲＰ Ｎ１３Ｄ／Ｎ５７Ｓ／Ｎ１７５Ｓ／Ｎ２５５Ｄ／Ｎ２６８Ｄと比較したとき、ＨＲＰ Ｎ１３Ｄ／Ｎ５７Ｓ／Ｐ１４６Ｑ／Ｎ１７５Ｓ／Ｎ２５５Ｄ／Ｎ２６８Ｄ／Ｎ２７５において）の両方につながり得る。本発明に関して、特に良好な結果は、ポリペプチドが配列番号３に記載されているアミノ酸配列を含むときに観察された。前記配列は、配列番号１に対して、アミノ酸交換Ｐ１４６Ｑ及びＮ２７５Ｋ、並びにアミノ酸交換Ｎ１３Ｄ、Ｎ５７Ｓ、Ｎ１７５Ｓ、Ｎ２５５Ｄ及びＮ２６８Ｄ（全て以下において太字でマークされている）を含む。
【0031】
（ＨＲＰ Ｎ１３Ｄ／Ｎ５７Ｓ／Ｐ１４６Ｑ／Ｎ１７５Ｓ／Ｎ２５５Ｄ／Ｎ２６８Ｄ／Ｎ２７５Ｋ（配列番号３）：）
【化3】
【0032】
野生型ＨＲＰについて上記に記載されているように、例えば大腸菌において、組換え生産されるときには、変異体ＨＲＰは、開始コドンから得られるＮ末端メチオニン残基を伴って典型的には生産される。したがって、上記に記載されているＨＲＰ変異体は以下の配列を有するタンパク質として典型的には組換え生産される：
【0033】
（組換え生産されたＨＲＰ Ｎ１３Ｄ／Ｎ５７Ｓ／Ｐ１４６Ｑ／Ｎ１７５Ｓ／Ｎ２５５Ｄ／Ｎ２６８Ｄ／Ｎ２７５Ｋ（配列番号４）：）
【0034】
【化4】
【0035】
上記で言及されているように、典型的には、本発明に関して使用される変異体はＮ末端メチオニンを含む。しかしながら、全ての場合において、本発明によって使用されるアミノ酸ナンバリングは、Ｎ末端メチオニンを欠く野生型配列（配列番号１）に従って適用され、すなわち、このナンバリングは、対応してＮ末端メチオニンを含む変異体に適用される。つまり、例えば配列番号４において、変異Ｎ１３Ｄが（絶対）第１４位などにあることを意味する。このことは、欠失又は挿入を持つさらなる変異体の実施形態にも適用可能である。
【0036】
本発明に関して、前記ヘムペルオキシダーゼは、好ましくは、ペルオキシダーゼ活性を有し、且つ配列番号３と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、前記アミノ酸配列が、配列番号１と比較して少なくとも１つのアミノ酸交換を含み、前記少なくとも１つのアミノ酸交換が、配列番号１のアミノ酸Ｐ１４６又はアミノ酸Ｎ２７５の交換である。
【0037】
好ましい実施形態において、前記ヘムペルオキシダーゼは、配列番号３と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、なおより好ましくは少なくとも９０％、さらになおより好ましくは少なくとも９５％、特に少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。好ましさを増加させる順に、前記アミノ酸配列は、配列番号３と少なくとも７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％の配列同一性を有する。前記アミノ酸配列が配列番号３に記載されている配列であるとき、特に好ましい。前記ヘムペルオキシダーゼが配列番号４に記載されているアミノ酸配列からなるとき、最も好ましい。
【0038】
前記アミノ酸配列が、配列番号１と比較して、Ｎ１３Ｄ、Ｎ５７Ｓ、Ｎ１７５Ｓ、Ｎ２５５Ｄ、及びＮ２６８Ｄからなる群より選択される少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つ、なおより好ましくは少なくとも４つ、特に５つのアミノ酸交換をさらに含むとき、さらに好ましい。
【0039】
変異Ｎ１３Ｄ、Ｎ５７Ｓ、Ｎ２５５Ｄ及びＮ２６８Ｄは、Capone et al. (“Glyco-variant library of the versatile enzyme horseradish peroxidase.” Glycobiology 24.9 (2014): 852-863)、及びHumer and Spadiut (“Improving the performance of horseradish peroxidase by site-directed mutagenesis.” International Journal of Molecular Sciences 20.4 (2019): 916)に開示されている。これとは関係なく、酵母における発現にのみ関して、変異Ｎ１７５Ｓが、Morawski et al. (“Functional expression and stabilization of horseradish peroxidase by directed evolution in Saccharomyces cerevisiae.” Biotechnology and Bioengineering 76.2 (2001): 99-107)に開示されている。
【0040】
配列番号１に関する全ての上記変異Ｎ１３Ｄ、Ｎ５７Ｓ、Ｐ１４６Ｑ、Ｎ１７５Ｓ、Ｎ２５５Ｄ、Ｎ２６８Ｄ及びＮ２７５Ｋが、本発明に関して、個々及び互いとの組み合わせの両方において好ましい。５つの変異Ｎ１３Ｄ、Ｎ５７Ｓ、Ｎ１７５Ｓ、Ｎ２５５Ｄ及びＮ２６８Ｄの組み合わせが、特に高い熱安定性につながることが驚くべきことに見出された（実施例６を参照されたい））。また、これまで完全に未知であった変異Ｐ１４６Ｑ及びＮ２７５Ｋのさらなる組み合わせが、酵素活性の顕著な向上につながった（実施例３；配列番号４を参照されたい）。
【0041】
天然のＨＲＰのいくつかのさらなる変異が、当該分野において知られており、これらも、本発明に関して好ましい。例えば、Ryan et al. (“Effects of single mutations on the stability of horseradish peroxidase to hydrogen peroxide.” Biochimie 89.8 (2007): 1029-1032)は、変異Ｋ２３２Ｎ及びＴ１１０Ｖの有益な効果を記載している。好ましい実施形態において、前記アミノ酸配列は、したがって、配列番号１と比較して、アミノ酸交換Ｔ１１０Ｖ又はＫ２３２Ｎをさらに含む。
【0042】
本発明に関して、「ペルオキシダーゼ活性」は、基質３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、２，２’－アジノ－ビス（３－エチルベンゾチアゾリン－６－スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、又は過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）のうちの少なくとも１つに対する活性を好ましくは意味する。好ましくは、ｐＨ５及び３０℃において１ｍＭのＨ２Ｏ２を含有する５０ｍＭのリン酸－クエン酸緩衝液中で測定されるとき、前記ヘムペルオキシダーゼは、少なくとも０．０１ｍＭ－１ｓ－１、好ましくは少なくとも０．１ｍＭ－１ｓ－１、より好ましくは少なくとも１ｍＭ－１ｓ－１、なおより好ましくは少なくとも１０ｍＭ－１ｓ－１、なおより好ましくは少なくとも２０ｍＭ－１ｓ－１、なおより好ましくは少なくとも１００ｍＭ－１ｓ－１、さらになおより好ましくは少なくとも１０００ｍＭ－１ｓ－１、さらになおより好ましくは少なくとも１００００ｍＭ－１ｓ－１、特に少なくとも２００００ｍＭ－１ｓ－１の基質ＴＭＢのｋｃａｔ／Ｋｍ値に相当するペルオキシダーゼ活性を有する。別の好ましい実施形態において、ｐＨ５及び３０℃において１ｍＭのＨ２Ｏ２を含有する５０ｍＭのリン酸－クエン酸緩衝液中で測定されるとき、前記ヘムペルオキシダーゼは、前記基質ＡＢＴＳのｋｃａｔ／Ｋｍ値に相当するペルオキシダーゼ活性が、少なくとも０．１ｍＭ－１ｓ－１、好ましくは少なくとも１ｍＭ－１ｓ－１、より好ましくは少なくとも１０ｍＭ－１ｓ－１、なおより好ましくは少なくとも１００ｍＭ－１ｓ－１、最も好ましくは少なくとも２５０ｍＭ－１ｓ－１である。さらに別の好ましい実施形態において、ｐＨ５及び３０℃において１０ｍＭのＡＢＴＳを含有する５０ｍＭのリン酸－クエン酸緩衝液中で測定されるとき、前記ヘムペルオキシダーゼは、前記基質Ｈ２Ｏ２のｋｃａｔ／Ｋｍ値に相当するペルオキシダーゼ活性が、少なくとも１ｍＭ－１ｓ－１、好ましくは少なくとも１０ｍＭ－１ｓ－１、より好ましくは少なくとも１００ｍＭ－１ｓ－１、なおより好ましくは少なくとも１０００ｍＭ－１ｓ－１、最も好ましくは少なくとも２５００ｍＭ－１ｓ－１である。好ましくは、前記ペルオキシダーゼ活性は、実施例６に記載されているように測定される。５０ｍＭのリン酸－クエン酸緩衝液は、２５．７ｍｌの０．２Ｍ二塩基性リン酸ナトリウム及び２４．３ｍｌの０．１Ｍクエン酸を５０ｍＬの脱イオン水に添加することによって得ることができる。
【0043】
特に同じ条件下で生産及び測定される場合、前記ヘムペルオキシダーゼのペルオキシダーゼ活性は、野生型ＨＲＰの、特に、配列番号１又は配列番号２、好ましくは配列番号２に記載されているアミノ酸配列からなるポリペプチドのペルオキシダーゼ活性の、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも５０％であることがさらに好ましい。
【0044】
前記ヘムペルオキシダーゼが、野生型ＨＲＰに対して増加した熱安定性を有するとき、さらに好ましい。上記に定義されているように配列番号３とある特定の配列同一性（％）を有する前記アミノ酸配列について、かかるアミノ酸配列からなるポリペプチドが、配列番号１又は配列番号２、好ましくは配列番号２に記載されているアミノ酸配列からなるポリペプチドに対して増加した熱安定性を有するとき、好ましい。大腸菌において組換え生産され得るように、配列番号３とある特定の配列同一性（％）を有する前記アミノ酸配列のＮ末端にメチオニン残基が付加され得る。すなわち、Ｎ末端メチオニンと引き続く上述のアミノ酸配列からなるポリペプチドが、配列番号２に記載されているアミノ酸配列からなるポリペプチドに対して増加した熱安定性を有するとき、好ましい。このような２つのポリペプチドの熱安定性を比較するために、前記ポリペプチドは同じ条件下で生産及び測定されてよい。「増加した熱安定性」は、２０ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７）、７％のグリセロール及び５００ｍＭのＮａＣｌからなる緩衝液中６０℃でインキュベートされるとき、半減期がより長いことを好ましくは意味する。上述のアミノ酸配列からなるポリペプチドの（及び／又は前記アミノ酸配列を含む前記ヘムペルオキシダーゼの）半減期は、配列番号１又は配列番号２、好ましくは配列番号２に記載されているアミノ酸配列からなるポリペプチドに対して、少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも３倍、より好ましくは少なくとも６倍、なおより好ましくは少なくとも１２倍高いことが好ましい。好ましくは、前記半減期は、異なる時点において、ｐＨ５及び３０℃において１ｍＭのＨ２Ｏ２を含有する５０ｍＭのリン酸－クエン酸緩衝液中７ｍＭのＡＢＴＳを用いて残存ペルオキシダーゼ活性を測定することによって求められる。半減期測定では、前記ポリペプチドの濃度が２．８６μＭであることが好ましい。好ましくは、前記半減期は、実施例６に記載されているように求められる。
【0045】
好ましい実施形態において、上記に定義されているように配列番号３とある特定の配列同一性（％）を有する前記アミノ酸配列からなる前記ヘムペルオキシダーゼ及び／又はポリペプチドは、ｐＨ５及び３０℃において１ｍＭのＨ２Ｏ２を含有する５０ｍＭのリン酸－クエン酸緩衝液中７ｍＭのＡＢＴＳを用いて残存ペルオキシダーゼ活性によって測定される、２０ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７）、７％のグリセロール及び５００ｍＭのＮａＣｌからなる緩衝液中の６０℃における半減期が、少なくとも０．５時間、好ましくは少なくとも１時間、より好ましくは少なくとも２時間、なおより好ましくは少なくとも４時間、最も好ましくは少なくとも６時間である。
【0046】
前記ヘムペルオキシダーゼを生産するための本発明の方法に関して、驚くべきことに、ある特定の期間にわたって前記リフォールディングミックスへの前記ヘム補因子の添加を配分することが、１つのバッチで一度に全ての前記補因子を添加することと比較して優れた結果につながることが見出された（実施例３；表５及び６の比較を参照されたい）。概して、前記ヘム補因子をゆっくり添加するほど好ましい。前記リフォールディングミックスへの前記ヘム補因子の添加は、好ましくは、少なくとも１時間の期間にわたって配分されるが、さらに長い期間がさらにより好ましい。より好ましくなる順序では、前記期間は、少なくとも２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、特に少なくとも１０時間である。これに関して、「少なくとも１時間の期間にわたって配分され（distributed)」は、前記ヘム補因子の一定（constant）のフィードが少なくとも１時間の期間で適用されること、又は、ヘム補因子の合計量が、数個のより少ない用量、例えば、数時間の期間において、１０分毎又は１時間毎に１用量となるように分割されることを意味し得る。同じことが、対応して他の期間に適用される（例えば、前記添加が、少なくとも１０時間の期間にわたって配分される好ましい実施形態において、前記補因子の一部が、少なくとも１０時間の期間にわたって１時間に１回、又は少なくとも１０時間にわたって一定のフィードとして、添加され得る）。前記ヘム補因子の添加は、少なくとも２回（しかし、好ましくは少なくとも３回、より好ましくは少なくとも４回、なおより好ましくは少なくとも６回、最も好ましくは少なくとも１０回）の、ヘム補因子濃度の増加を含むことが好ましく、最初及び最後の増加が、上記で指定されている期間分少なくとも離れている（例えば、少なくとも１時間分、好ましくは少なくとも４時間分、特に少なくとも１０時間分離れている、少なくとも２回のヘム補因子濃度の増加）。これは、複数の別々のヘム補因子濃度増加工程（ヘム補因子の合計添加量が、複数のより少ない用量に分割される）若しくはヘム補因子の連続供給のいずれによっても、又はこれらの２つの組み合わせによって、達成され得る。前記リフォールディングミックスに添加されるヘム補因子の合計量が均等に配分されているとき、特に有利である。したがって、１時間未満の期間に添加されるのが、前記リフォールディングミックスに添加されるヘム補因子の合計量の８０％以下、好ましくは７０％以下、より好ましくは６０％以下、なおより好ましくは５０％以下、なおより好ましくは４０％以下、なおより好ましくは３０％以下、さらになおより好ましくは２０％以下、最も好ましくは１０％以下であるとき、好ましい。
【0047】
前記ヘム補因子が連続フィードとして前記リフォールディングミックスに添加されるとき、特に好ましい、なぜなら、これにより、前記ヘム補因子の特にゆっくりで且つよく配分された添加が可能になるからである。前記ヘム補因子フィードとして供給される前記ヘム補因子の濃度が経時的に一定であるとき、特に有利である。
【0048】
本発明の方法の好ましい実施形態において、前記ヘム補因子は、０．１～１０μｍｏｌ／Ｌ／時間、好ましくは０．２～５μｍｏｌ／Ｌ／時間、なおより好ましくは０．５～３μｍｏｌ／Ｌ／時間、さらになおより好ましくは１～２．５μｍｏｌ／Ｌ／時間、特に１．４～１．８μｍｏｌ／Ｌ／時間の速度で前記リフォールディングミックスに添加される。前記リフォールディングミックスに存在する前記ヘムペルオキシダーゼに対して、前記ヘム補因子が、０．０１～１モル当量／時間、好ましくは０．０２～０．５モル当量／時間、より好ましくは０．０５～０．２モル当量／時間の速度で添加されることが好ましい。前記速度は、好ましくは平均速度であり、すなわち、前記ヘム補因子が、ある特定の期間にわたって別々の工程において適用されるとき、前記平均速度は、ヘム補因子の合計量を最初の工程と最後の工程との間の期間によって除算することによって算出できる。
【0049】
本発明に関して、結果は、前記ヘム補因子が前記リフォールディングミックスに直ちに添加されないとき、特に、前記リフォールディング緩衝液中に既に存在していないとき、なおさらに改良され得ることが見出された。そのかわりに、前記ヘム補因子が、前記リフォールディングミックスをある特定の期間インキュベートした後に初めて添加されるときに有利であることが見出された（特に、実施例２、ＤｏＥ４及び図１を参照されたい）。したがって、前記リフォールディングは、前記ヘム補因子の非存在下で少なくともある特定の期間進行し得るときに有利であることが見出された。本発明の好ましい実施形態において、前記リフォールディングミックスは、したがって、前記ヘム補因子の添加の前に少なくとも１時間、好ましくは少なくとも２時間、なおより好ましくは少なくとも４時間、特に少なくとも８時間インキュベートされる。このことは、しかしながら、このインキュベーション時間の間にヘム補因子が全く存在し得ないことを意味しているのではない；この実施形態に関して、単に、ヘム補因子が、指定されている期間の後に前記リフォールディングミックスに添加されることが必要とされるに過ぎない。好ましくは、しかし、前記期間の間に、リフォールディングミックスに存在する前記ヘム補因子は、１０μＭ未満、好ましくは２μＭ未満、なおより好ましくは０．５μＭ未満、最も好ましくは０．１μＭ未満である。
【0050】
好ましい実施形態において、少なくとも１μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは少なくとも４μｍｏｌ／Ｌ、なおより好ましくは少なくとも１０μｍｏｌ／Ｌ、特に少なくとも２０μｍｏｌ／Ｌの前記ヘム補因子が、前記リフォールディングミックスに添加される。好ましくは、１μｍｏｌ／Ｌ～２００μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは４μｍｏｌ／Ｌ～１００μｍｏｌ／Ｌ、なおより好ましくは１０μｍｏｌ／Ｌ～５０μｍｏｌ／Ｌ、特に１５μｍｏｌ／Ｌ～２５μｍｏｌ／Ｌの前記ヘム補因子が、前記リフォールディングミックスに添加される。前記ヘムペルオキシダーゼに対して少なくとも０．２５モル当量、好ましくは少なくとも０．５モル当量、なおより好ましくは少なくとも１モル当量、特に少なくとも２モル当量の前記ヘム補因子が前記リフォールディングミックスに添加されるとき、特に好ましい。特に、前記ヘムペルオキシダーゼに対して０．２５～１０モル当量、好ましくは０．５～５モル当量、なおより好ましくは１～４モル当量、特に１～２モル当量の前記ヘム補因子が、前記リフォールディングミックスに添加されてよい。
【0051】
本発明による方法に使用される前記ＩＢを得るために、当該分野において知られている標準技術が使用され得る。当業者は、好適な宿主細胞、例えば、大腸菌において、ある特定のヘムペルオキシダーゼを組換え発現させて、前記ヘムペルオキシダーゼを含有するＩＢを得る方法を熟知している。好ましくは、ＩＢの形態の前記ヘムペルオキシダーゼは：前記ヘムペルオキシダーゼをコードする遺伝子を発現する宿主細胞を培養する工程；及び前記宿主細胞からＩＢを得る工程；によって提供される。前記宿主細胞は、原核細胞、好ましくは大腸菌細胞であることが好ましい。
【0052】
本発明による方法は、その有利な特性に起因して、ヘムペルオキシダーゼを大量に生産するのによく適している。本明細書に記載されている実施例において実証されているように、本発明の方法は、より大きな培養体積、故に、より多量のヘムペルオキシダーゼ生産に拡大可能である。好ましい実施形態において、前記の細胞は、したがって、少なくとも２Ｌ、好ましくは少なくとも５Ｌ、より好ましくは少なくとも２０Ｌ、なおより好ましくは少なくとも５０Ｌ、特に少なくとも１００Ｌの体積で培養される。
【0053】
本発明の過程において、前記ヘムペルオキシダーゼを生産するための方法が、可溶化緩衝液及びリフォールディング緩衝液の特定の組成を使用することによってなおさらに改良され得るという結果となった（実施例２～５を参照されたい）。好ましくは、前記ＩＢを可溶化することは、前記ＩＢを可溶化緩衝液においてインキュベートすることを含む。実施例に記載されているように、前記可溶化緩衝液のある特定のｐＨが、特に有利な結果につながることが見出された（特に実施例２、表３、並びに図２及び３を参照されたい）。特に、前記可溶化緩衝液が、少なくとも８、好ましくは少なくとも８．５、より好ましくは少なくとも９．０、なおより好ましくは少なくとも９．５のｐＨを有するとき、好ましい。前記可溶化緩衝液が、８～１２．５、好ましくは８．５～１１．５、より好ましくは９～１１、なおより好ましくは９．５～１０．５のｐＨを有するとき、さらに好ましい。
【0054】
好ましくは、前記ＩＢを可溶化するのに使用される前記可溶化緩衝液は、還元剤を含有する。本発明に関して、ある特定の還元剤濃度が、特に有利な結果につながることが見出された（特に、実施例２、ＤｏＥ１～３；実施例３、リアクターラン１～４を参照されたい）。好ましくは、前記還元剤は、ＤＴＴである。しかし、他の還元剤も同じく使用され得る。当業者は、ＩＢ可溶化に一般的に使用される他の還元剤、例えば、β－ＭＥ、ＴＣＥＰ（トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン）、システインなどを熟知している。これらの還元剤の全てもまた、本発明の方法に関して好ましい。前記可溶化緩衝液におけるレドックス状態が、１～５０ｍｍｏｌ／ＬのＤＴＴ、好ましくは２～２５ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは４～１５ｍｍｏｌ／Ｌ、特に６～８ｍｍｏｌ／ＬのＤＴＴ濃度に相当することが好ましい。これに関して、用語「レドックス状態」は、還元電位を指し、「に相当する」は、ＤＴＴが、示されている量で存在すること、又は、別の還元剤（例えば、β－ＭＥ、ＴＣＥＰ又はシステインなど）が、水中の５０ｍＭのグリシン、６Ｍの尿素の溶液（ｐＨ１０）において２５℃で測定されるとき、同じ還元電位となる濃度で存在することのいずれかを意味する。好ましくは、前記可溶化緩衝液の還元電位は、－１５０ｍＶ～－５００ｍＶ、好ましくは－２００ｍＶ～－４５０ｍＶ、より好ましくは－２５０ｍＶ～－４００ｍＶ、なおより好ましくは－２８０ｍＶ～－３７０ｍＶ、さらになおより好ましくは－３００ｍＶ～－３４０ｍＶ、最も好ましくは－３１０ｍＶ～－３３０ｍＶである。前記還元電位は、２５℃の温度及び１０１．３００Ｐａの圧力で好ましくは測定される。当業者は、前記還元電位を測定する方法を熟知している。好ましくは、前記還元電位の測定は、好ましくは実施例３に記載されているように、Ｌｕｃｕｌｌｕｓプロセスシステムに接続されたＥａｓｙＦｅｒｍ Ｐｌｕｓ ＯＲＰ Ａｒｃ４２５を用いて実施される。代替的には、当該測定は、標準ＡＳＴＭ Ｄ１４９８－１４に記載されているように実施され得る（“Standard Test Method for Oxidation-Reduction Potential of Water”, ASTM International, West Conshohocken, PA, 2014, www.astm.org）。
【0055】
別の好ましい実施形態において、前記還元剤は、チオール基を含有する。好ましくは、前記可溶化緩衝液におけるチオール基の濃度は、２～１００ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは４～５０ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは８～３０ｍｍｏｌ／Ｌ、特に１２～１６ｍｍｏｌ／Ｌである。前記可溶化緩衝液におけるチオール基の濃度は、好ましくは、前記可溶化緩衝液に添加されるチオール含有物質の濃度に基づいて求められる（例えば、ＤＴＴは、１分子当たり２のチオール基を含有する；１ｍｍｏｌ／ＬのＤＴＴの濃度は、したがって、２ｍｍｏｌ／Ｌのチオール基の濃度に相当する）。代替的には、チオール基の濃度はまた、実験的に求められてもよい。好ましくは、前記可溶化緩衝液におけるチオール基の濃度は、エルマン試薬を使用して測定される。エルマン試薬（５，５’－ジチオビス－（２－ニトロ安息香酸）、又はＤＴＮＢ）は、サンプルにおけるチオール基の数又は濃度を定量化するのに使用される化学物質である。当業者は、エルマン試薬を使用して測定を実施する方法を熟知している。好ましくは、当該測定は、Simpson (“Estimation of Free Thiols and Disulfide Bonds Using Ellman’s Reagent.” CSH Protocols 2008 (2008): pdb-prot4699)に記載されているように実施される。
【0056】
前記還元剤に加えて、前記可溶化緩衝液は、変性剤を典型的には含有する。当業者は、好適な変性剤、例えば、尿素又はＧｄｎＨＣｌを熟知している。好ましくは、前記可溶化緩衝液は、好ましくは少なくとも４ｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは少なくとも５ｍｏｌ／Ｌ、なおより好ましくは少なくとも６ｍｏｌ／Ｌの濃度で尿素を含有する。好ましくは、前記可溶化緩衝液は、４ｍｏｌ／Ｌ～８ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは５ｍｏｌ／Ｌ～７ｍｏｌ／Ｌ、特に５．５～６．５ｍｏｌ／Ｌの尿素を含有する。
【0057】
前記ＩＢを可溶化するために、前記ＩＢが、前記可溶化緩衝液において、少なくとも５分、好ましくは少なくとも１０分、より好ましくは少なくとも１５分、特に少なくとも３０分インキュベートされるとき、好ましい。好ましくは、前記ＩＢは、４℃～４０℃、好ましくは１０℃～３５℃、なおより好ましくは２０℃～２５℃の温度で前記可溶化緩衝液においてインキュベートされる。
【0058】
前記可溶化されたＩＢが、前記リフォールディング緩衝液と、１：５ｖ／ｖ～１：２５０（可溶化されたＩＢ：リフォールディング緩衝液）、好ましくは１：１０～１：１００、なおより好ましくは１：２０～１：８０、特に１：３０～１：６０の比率で混合されるとき、有利な結果が得られ得る。上記のように、本発明の方法は、前記ヘムペルオキシダーゼを多量に生産するのに特によく適している。したがって、前記リフォールディングは、好ましくは少なくとも５Ｌ、好ましくは少なくとも１０Ｌ、より好ましくは少なくとも２５Ｌ、なおより好ましくは少なくとも１００Ｌの体積で実施される。このことは、前記リフォールディングミックスが、好ましくは少なくとも５Ｌ、好ましくは少なくとも１０Ｌ、より好ましくは少なくとも２５Ｌ、なおより好ましくは少なくとも１００Ｌの体積を有することを意味する。
【0059】
前記可溶化緩衝液の場合と同様に、前記リフォールディング緩衝液のある特定のｐＨ範囲について有利な効果が見出された（特に、表３、７及び１４、並びに図２及び３を参照されたい）。したがって、前記リフォールディング緩衝液が、少なくとも８、好ましくは少なくとも８．５、より好ましくは少なくとも９、なおより好ましくは少なくとも９．５のｐＨを有するとき、好ましい。特に、前記リフォールディング緩衝液が、８～１２．５、好ましくは８．５～１１．５、より好ましくは９～１１、なおより好ましくは９．５～１０．５のｐＨを有するとき、好ましい。前記可溶化緩衝液と前記リフォールディング緩衝液との間のｐＨの差が、２未満のｐＨ増分、好ましくは１未満のｐＨ増分、より好ましくは０．５未満のｐＨ増分、なおより好ましくは０．２未満のｐＨ増分、特に０．１未満のｐＨ増分であるとき、特に好ましい。このことは、例えば、前記可溶化緩衝液のｐＨが１０であるとき、前記リフォールディング緩衝液のｐＨが、好ましくは９～１１（すなわち、前記差が１未満のｐＨ増分である）、より好ましくは９．５～１０．５（前記差が０．５未満のｐＨ増分である）などであることを意味する。
【0060】
好ましくは、本発明方法に関して使用される前記リフォールディング緩衝液は、酸化剤を含有する。当業者は、リフォールディング緩衝液において一般的に使用されている酸化剤、例えば、グルタチオンジスルフィド（ＧＳＳＧ）又はシスチンを熟知しており、これらは、全てが本発明の方法に関して好ましい。実施例において本明細書において実証されているように（例えば、表１、３及び７、並びに図２及び３を参照されたい）、有利な効果が、ある特定の酸化剤濃度によって観察された。好ましくは、前記リフォールディング緩衝液が、０．２～６ｍＭのＧＳＳＧ、好ましくは０．４～４ｍＭのＧＳＳＧ、より好ましくは０．８～２．５ｍＭのＧＳＳＧ、特に１．１～１．６ｍＭのＧＳＳＧのＧＳＳＧ濃度に相当するレドックス状態を有する。これに関連して、用語「レドックス状態」は、還元電位を指し、「に相当する」は、ＧＳＳＧが、示されている量で存在すること、又は、別の酸化剤（シスチンなど）が、２０ｍＭのグリシン、２ｍＭのＣａＣｌ２、２Ｍの尿素、７％ｖ／ｖのグリセロール（ｐＨ１０）の溶液において２５℃で測定されるとき、同じ還元電位となる濃度で存在することのいずれかを意味する。好ましくは、前記リフォールディング緩衝液は、５０ｍＶ～１１０ｍＶ、好ましくは６０ｍＶ～１００ｍＶ、より好ましくは６５ｍＶ～９５ｍＶ、最も好ましくは７０ｍＶ～９０ｍＶの還元電位を有する。好ましくは、前記還元電位は、前記可溶化緩衝液に関して上記で記載されているように測定される。
【0061】
前記リフォールディング緩衝液は、変性剤を含有することがさらに好ましい。濃度はより低いものの、前記可溶化緩衝液のためのものと同じ変性剤が好ましい。好ましくは、前記リフォールディング緩衝液は、０．５～３ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１ｍｏｌ／Ｌ～２．７ｍｏｌ／Ｌ、なおより好ましくは１．５ｍｏｌ／Ｌ～２．４ｍｏｌ／Ｌ、特に１．８～２．２ｍｏｌ／Ｌの尿素を含有する。
【0062】
前記リフォールディングミックスがＤＴＴ及びＧＳＳＧの両方を含有するとき、特に好ましい。好ましくは、前記リフォールディングミックスにおけるＤＴＴとＧＳＳＧとの間のモル比は、１：２（ＤＴＴ：ＧＳＳＧ）～１：３０、好ましくは１：３～１：２０、なおより好ましくは１：４～１：１５、特に１：６～１：８である。これらの比は、前記可溶化緩衝液及び前記リフォールディング緩衝液に添加されるＤＴＴ及びＧＳＳＧの初期量に基づいて算出され、ＤＴＴ及び／又はＧＳＳＧの消費は、考慮されるべきではないことは理解されるべきである。
【0063】
好ましくは、前記リフォールディングミックスは、－１０５ｍＶ～１３５ｍＶ、好ましくは－９０ｍＶ～１０５ｍＶ、なおより好ましくは－８０ｍＶ～８０ｍＶ、さらになおより好ましくは－７０ｍＶ～６０ｍＶ、最も好ましくは－６０ｍＶ～５０ｍＶの還元電位を有する。好ましくは、前記還元電位は、前記可溶化緩衝液に関して上記に記載されているように測定される。好ましくは、前記還元電位は、前記ヘム補因子の添加の前に、前記可溶化緩衝液及び前記リフォールディング緩衝液を混合次第直ちに測定される。
【0064】
本発明に関して、リフォールディング後に高い塩濃度を伴う析出工程が含まれるときに有利であることが見出された（実施例４、表９を参照されたい）。驚くべきことに、この方法により、相当量の前記ヘムペルオキシダーゼが析出することなく、不純物が有効に除去され得ることが見出された。したがって、本発明の方法は、塩を前記リフォールディングミックスに添加する工程を好ましくはさらに含む。好ましい実施形態において、前記塩が、２ｍｏｌ／Ｌ～１２ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは４ｍｏｌ／Ｌ～１０ｍｏｌ／Ｌ、なおより好ましくは４．５ｍｏｌ／Ｌ～８ｍｏｌ／Ｌである。前記塩が、好ましくは０．５～６ｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは１．５～５．５ｍｏｌ／Ｌ、なおより好ましくは２．５～５ｍｏｌ／Ｌ、特に３．５～４．５ｍｏｌ／Ｌの濃度の塩化ナトリウムであるとき、特に良好な結果が得られた。良好な結果が得られた別の好ましい実施形態において、前記塩は、好ましくは０．２５～１．５ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．５～１．４ｍｏｌ／Ｌ、なおより好ましくは０．８～１．２ｍｏｌ／Ｌの濃度の硫酸アンモニウムである。タンパク質を塩析するのに一般的に使用される任意の塩が、本発明方法に関して使用され得る。当業者は、かかる塩、例えば、ＫＣｌ、Ｋ２ＣＯ３、ＣａＣｌ２、ＮＨ４Ｃｌ、Ｎａ２ＳＯ４、又はＮａＯＡｃを熟知している。かかる代替の塩の最適濃度は、得られる溶液のイオン強度を基準にし得る（Ｉ＝０．５＊Σ（ｃｉ
＊ｚｉ
２）として定義され、ｃｉは、各イオンのモル濃度であり、ｚｉは、当該イオンの電荷数である；前記塩に含有される全てのイオンで総計を取る；例えば、１ｍｏｌ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４では、前記イオン強度は、Ｉ＝０．５＊（２ｍｏｌ／Ｌ＊１２＋１ｍｏｌ／Ｌ＊２２）＝３ｍｏｌ／Ｌとなる）。好ましくは、前記塩は、０．５～６ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１．５～５ｍｏｌ／Ｌ、なおより好ましくは２．５～４．５ｍｏｌ／Ｌ、特に３．５～４．５ｍｏｌ／Ｌのイオン強度となるまで、前記リフォールディングミックスに添加される。
【0065】
具体的な塩の塩析強度はまた、いわゆるホフマイスターシリーズ（「離液順列」とも呼ばれる）における位置によって求めることもできる。ホフマイスターシリーズは、イオンがタンパク質を塩析する又はこれに塩を加える能力の順での分類である（塩析強度が減少する順での例示的なアニオンは、ＳＯ４
２－＞ＨＰＯ４
２－＞ＯＡｃ－＞Ｃｌ－＞ＮＯ３
－＞Ｉ－＞ＳＣＮ－であり；カチオンでも同じように：ＮＨ４
＋＞Ｋ＋＞Ｎａ＋＞Ｌｉ＋＞Ｍｇ２＋＞Ｃａ２＋＞グアニジニウムである）。本発明に関して、前記塩が、ホフマイスターシリーズにおけるその位置によって求められる、硫酸アンモニウムと塩化ナトリウムとの間の塩析強度を有するとき好ましく、好ましくは、前記塩の濃度が、１．２５～６ｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．５～５ｍｏｌ／Ｌ、なおより好ましくは１．０～４．５ｍｏｌ／Ｌ、最も好ましくは１．５～４ｍｏｌ／Ｌである。さらに好ましい実施形態において、前記塩は、ホフマイスターシリーズにおけるその位置によって求められる、塩化ナトリウムよりも弱い塩析強度を有し、好ましくは、前記塩の濃度が、少なくとも２ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは少なくとも４ｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは少なくとも４．５ｍｏｌ／Ｌである。本明細書において使用されているとき、第１の塩のカチオン及びアニオンの両方が、ホフマイスターシリーズによって求められる第２の塩のカチオン及びアニオンよりも高い／低い塩析濃度を有するとき、第１の塩は第２の塩よりも高い／低い塩析濃度を有するとみなされる。
【0066】
好ましくは、本発明方法は、リフォールディングされたヘムペルオキシダーゼから不純物を除去するための遠心分離工程をさらに含む。代替的には又はこれに加えて、本発明方法は、リフォールディングされたヘムペルオキシダーゼから不純物を除去するためのろ過工程をさらに含んでいてよい。これらの実施形態は、不純物が析出されるが前記ヘムペルオキシダーゼ（の大部分）が溶液中に残存するように塩が前記リフォールディングミックスに添加されるとき、特に有利である。
【0067】
好ましくは、本発明による方法は、リフォールディングされたヘムペルオキシダーゼを精製する工程をさらに含む。前記ヘムペルオキシダーゼが精製の際にホロ型であるとき、特に有利であることが見出され、好ましくは、前記ヘムペルオキシダーゼは、したがって、前記ヘム補因子が前記リフォールディングミックスに添加された後に精製される。
【0068】
精製の目的で、ポリヒスチジンタグなどの精製タグ（典型的には、多くの場合、タンパク質Ｎ又はＣ末端に付加される、いくつかの、例えば、６～１０のヒスチジン残基からなる）が、当該分野において頻繁に使用される。かかるタグもまた、本発明に関して使用され得る。しかし、前記ヘムペルオキシダーゼは、精製タグを含まないとき、好ましい。特に、前記ヘムペルオキシダーゼは、ポリヒスチジンタグを含まないとき、好ましい。
【0069】
本発明の方法に関して、前記ヘムペルオキシダーゼが、クロマトグラフィによって、特に疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）によって精製されることが好ましい。実施例によって実証されているように、このタイプの精製は、驚くべきことに良好な結果、特に、高い最終濃度、優れた純度及び高い活性につながる（実施例４を参照されたい）。ＨＩＣは典型的に高い塩濃度による結合条件を伴うため、ＨＩＣは、上記で本明細書に記載されているように、不純物を除去するための塩析工程との組み合わせに特によく適している。したがって、かかる高い塩濃度は不純物及び過剰のヘム補因子を析出させ得るが、正確にフォールディングされたヘムペルオキシダーゼは溶液に残存し、ＨＩＣ用のロード（ｌｏａｄ）として直接使用され得る。当業者は、ＨＩＣを実施する方法を熟知している。好ましくは、実施例４に記載されているように実施される。固定相がブチルセファロース樹脂であるとき、特に好ましい。
【0070】
本明細書において使用されているとき、「ヘムペルオキシダーゼ製品」は、本発明による方法によって生産されるヘムペルオキシダーゼから得られる任意の製品、例えば、前記ヘムペルオキシダーゼの別の分子（例えば、タンパク質）とのコンジュゲート、又はその他の方法で修飾若しくは誘導体化されたヘムペルオキシダーゼ（例えば、固体担体に連結したヘムペルオキシダーゼ）であり得る。「ヘムペルオキシダーゼ製品」はまた、ヘムペルオキシダーゼ（又は修飾された／誘導体化された／コンジュゲートされたヘムペルオキシダーゼ）を含有する任意のタイプの市販の製品、例えば、かかるヘムペルオキシダーゼを（例えば、溶液において若しくは凍結乾燥された形態で）含有する組成物、又はかかる組成物を含有する容器、又はかかる容器を含有するキットなどの任意のタイプのパッケージングされた製品であることもできる。
【0071】
多くの用途において、ＨＲＰなどのヘムペルオキシダーゼは、他の分子とのコンジュゲートとして使用される。かかるコンジュゲートは、例えば、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ及び免疫組織化学などの技術において有用である。広く使用されているコンジュゲートの１つの種類は、抗体又は別の結合タンパク質とのコンジュゲートである。この場合、ＨＲＰの基質を添加することによって、結合タンパク質がその標的に結合する部位において、検出可能なシグナルを発生させることができる。頻繁に使用される他のＨＲＰコンジュゲートには、ＨＲＰ－ストレプトアビジンコンジュゲート（例えば、ビオチン化抗体を検出するためのサンドイッチＥＬＩＳＡ用途における使用のため）、又はＨＲＰ－タンパク質Ａ、Ｇ若しくはＬコンジュゲート（タンパク質Ａ、Ｇ及びＬは、免疫グロブリンに結合するため、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、ＩＨＣ、又はウエスタンブロッティングにおいて、一次抗体を検出するのに有用である）が含まれる。
【0072】
多くの商業的供給者が、ＨＲＰなどのヘムペルオキシダーゼを対象のタンパク質にコンジュゲートするためのキット（例えば、Ａｂｃａｍ社からのＨＲＰ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ／ＨＲＰ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ ａｂ１０２８９０、Ｂｉｏ－Ｒａｄ社からのＬＹＮＸ Ｒａｐｉｄ ＨＲＰ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（製品コードＬＮＫ００１Ｐ）、又はＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社からのＥＺ－Ｌｉｎｋ Ｐｌｕｓ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｋｉｔ（カタログ番号３１４８９））を提供している。かかるキットの目的は、典型的には、ユーザが、前記ペルオキシダーゼを対象の任意のタンパク質、例えば、抗体にコンジュゲートすることを可能にすることである。かかるキットは、前記ヘムペルオキシダーゼを活性化形態（別のタンパク質との直接反応のため）で含んでいてよく、又は、当該キットは、前記ヘムペルオキシダーゼ、及びユーザによるコンジュゲーションに好適な架橋剤を含んでいてよい。
【0073】
そのため、好ましい実施形態において、本発明の方法は、前記ヘムペルオキシダーゼをコンジュゲーション反応用に活性化する工程をさらに含む。好ましくは、前記ヘムペルオキシダーゼを、前記ヘムペルオキシダーゼを別の分子、好ましくは別のタンパク質にコンジュゲートするのに好適な架橋剤と反応させる。コンジュゲーションに好適な技術、及び好適な架橋剤は、当業者に公知であり、例えば、書籍Hermanson, Greg T. Bioconjugate Techniques. Academic press, 2013に見出され得る。好ましくは、前記架橋剤は、前記ヘムペルオキシダーゼとの共有結合を形成する。好ましくは、前記架橋剤は、ＮＨＳエステル、スクシンイミジルエステル、イミドエステル、ジフルオロ、ハロアセチル、マレイミド、ピリジルジチオール及びヒドラジドからなる群より選択される１つ、特に２つの反応性基を含む。例えば、前記架橋剤は、マレイミド基及び活性エステル基を有する二官能性ＰＥＧリンカー、例えば、マレイミド－ＰＥＧ８－スクシンイミジルエステル（ＣＡＳ番号７５６５２５－９３－６、例えば、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから市販されており、カタログ番号７４６２０７）であってよい。
【0074】
好ましくは、前記ヘムペルオキシダーゼが、「コンジュゲーションのために活性化される」とき、このことは、前記ヘムペルオキシダーゼが、別のタンパク質との、好ましくは結合タンパク質との、特に抗体との、共有結合を形成することができる反応性基を含むことを意味する。前記ヘムペルオキシダーゼは、上記に記載されているように化学架橋剤に共有結合的に連結していて、特に、当該架橋剤の少なくとも１つの反応性基が、別の分子、好ましくは別のタンパク質との反応に利用可能であることが特に好ましい。このことは、前記の共有結合的連結を形成するために、例えば、前記架橋剤のさらなる反応性基を前記ヘムペルオキシダーゼと反応させることによって達成され得る。
【0075】
前記ヘムペルオキシダーゼ製品は、凍結乾燥された形態で又は溶液で、好適な容器、例えば、バイアルにパッケージングされた、コンジュゲーションのために活性化されたヘムペルオキシダーゼからなっていてよい。しかし、前記ヘムペルオキシダーゼ及び前記架橋剤はまた、別々に提供されてもよい。前記ヘムペルオキシダーゼ製品は、したがって、前記ヘムペルオキシダーゼ及び前記架橋剤を含むキットであってよい。前記ヘムペルオキシダーゼ製品を生産するための方法は、したがって、前記ヘムペルオキシダーゼや上記で言及されている架橋剤をキットにパッケージングすることをさらに含んでいてよい。好ましくは、前記架橋剤は、ポリペプチドを別のタンパク質、好ましくは結合タンパク質にコンジュゲートするのに好適である。
【0076】
本発明の方法によって生産されるヘムペルオキシダーゼは、配列番号４に記載されているアミノ酸配列からなるポリペプチドであってよい。しかし、前記ヘムペルオキシダーゼは、上記で本明細書において定義されているペルオキシダーゼ活性を有し、且つ、さらなるタンパク質のアミノ酸配列をさらに含むポリペプチドであってもよい。融合タンパク質は、公知の方法によって、例えば、遺伝子融合を作製する（前記ヘムペルオキシダーゼをコードする核酸配列を、前記さらなるタンパク質をコードする核酸配列に、好ましくはかかる２つのタンパク質間のリンカー配列を含ませることによって、接続させる）ことによって得られ得る。前記さらなるタンパク質は、ストレプトアビジンであってよい。別の好ましい実施形態において、前記さらなるタンパク質は、抗体結合タンパク質、好ましくはタンパク質Ａ、タンパク質Ｇ又はタンパク質Ｌである。特に好ましい実施形態において、本発明の方法によって生産されるヘムペルオキシダーゼは、結合タンパク質のアミノ酸配列を含む。前記結合タンパク質は、（例えば、特定のタンパク質又は別の分子を検出するために）対象の分子に結合するための物質として作用し得る任意のタンパク質であってよい。好ましくは、前記結合タンパク質は、抗体である。さらに好ましい実施形態において、前記結合タンパク質は、抗体断片、好ましくは一本鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）又は抗原結合断片（Ｆａｂ）である。さらに好ましい実施形態において、前記結合タンパク質は、好ましくは、アドネクチン、アフィボディ、アンティカリン、ＤＡＲＰｉｎ、改変Ｋｕｎｉｔｚ型阻害剤、及びモノボディからなる群より選択される抗体模倣体である。多くのかかる好適な結合タンパク質が、当該分野から、例えば、Gebauer and Skerra (“Engineered protein scaffolds as next-generation antibody therapeutics.” Current opinion in chemical biology 13.3 (2009): 245-255)から公知である。
【0077】
本発明のヘムペルオキシダーゼ製品を生産するための方法の好ましい実施形態において、前記方法は、ヘムペルオキシダーゼコンジュゲートを得るためのコンジュゲーション反応をさらに含む。好ましくは、前記ヘムペルオキシダーゼは、結合物質、好ましくは抗体、にコンジュゲートされる。さらに好ましい実施形態において、前記結合物質は、結合タンパク質、好ましくは、上記に列挙されているいずれかの結合タンパク質である。前記ヘムペルオキシダーゼが抗体断片、好ましくは一本鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）又は抗原結合断片（Ｆａｂ）にコンジュゲートされるとき、特に好ましい。前記ヘムペルオキシダーゼは、好ましくは、アドネクチン、アフィボディ、アンティカリン、ＤＡＲＰｉｎ、改変Ｋｕｎｉｔｚ型阻害剤、及びモノボディからなる群より選択される抗体模倣体にコンジュゲートされるとき、さらに好ましい。別の好ましい実施形態において、前記ヘムペルオキシダーゼは、抗体結合タンパク質、好ましくはタンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、又はタンパク質Ｌにコンジュゲートされる。さらに別の好ましい実施形態において、前記ヘムペルオキシダーゼは、さらなるタンパク質、好ましくはストレプトアビジンにコンジュゲートされる。
【0078】
ヘムペルオキシダーゼと他のタンパク質との間のコンジュゲートは、当業者に公知であるコンジュゲーション反応によって、例えば、化学架橋によって得られ得る。この目的のために、前記ヘムペルオキシダーゼ及び前記他のタンパク質は、かかる２分子間の安定な、好ましくは共有結合的な連結を形成する化学架橋剤によって共に連結され得る。かかる方法は、多くの場合、バイオコンジュゲーションと称され、当該分野において知られている。多くの好適な方法が、例えば、書籍Hermanson, Greg T. Bioconjugate Techniques. Academic press, 2013に見出され得る。
【0079】
前記ヘムペルオキシダーゼ製品を生産するための本発明方法は、前記ヘムペルオキシダーゼの精製、濃縮、又は他の加工をさらに含んでいてよい。好ましくは、前記方法は、前記ヘムペルオキシダーゼ又は前記ヘムペルオキシダーゼコンジュゲートを精製する工程をさらに含む。前記ヘムペルオキシダーゼは、これに関して、既に誘導体化又はその他の方法で修飾されていてよい。好ましい実施形態において、前記方法は、前記ヘムペルオキシダーゼ又は前記ヘムペルオキシダーゼコンジュゲートを凍結する工程をさらに含む。上記実施形態の代替的には又はこれと組み合わせて、前記方法は、前記ヘムペルオキシダーゼ又は前記ヘムペルオキシダーゼコンジュゲートを凍結乾燥する工程を好ましくはさらに含む。
【0080】
前記ヘムペルオキシダーゼ製品はまた、本発明による方法によって生産されたヘムペルオキシダーゼを含む組成物、又は前記組成物を含む製品（例えば、容器）であってもよい。好ましくは、１又は複数の添加剤が、前記組成物に添加される。かかる添加剤は、例えば、貯蔵時の前記ヘムペルオキシダーゼの安定性をさらに増加させたり、さらに長い保存期間及び安定な生物学的活性レベルを確保したりすることができる。好ましい添加剤として、ｐＨ緩衝剤、安定剤、増量剤、張度調整剤などが挙げられる。凍結乾燥に関しての使用に好適である添加剤が特に好ましい。
【0081】
好適な添加剤は、当業者に公知である。例えば、前記組成物は、グリシン、ヒスチジン、グルタメート、スクシネート、ホスフェート、アセテート、及びアスパルテートからなる群より好ましくは選択されるｐＨ緩衝剤を好ましくは含有する。前記組成物は、マンニトール、グリシン、スクロース、デキストラン、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、ラクトース、ソルビトール、トレハロース、又はキシリトールからなる群より好ましくは選択される増量剤を含むことがさらに好ましい。前記組成物は、スクロース、トレハロース、マンノース、マルトース、ラクトース、グルコース、ラフィノース、セロビオース、ゲンチオビオース、イソマルトース、アラビノース、グルコサミン、フルクトース、マンニトール、ソルビトール、グリシン、アルギニンＨＣＬ、並びに、デキストラン、デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、シクロデキストリン、Ｎ－メチルピロリデン、セルロース及びヒアルロン酸などの多糖類を含めたポリヒドロキシ化合物、並びに、塩化ナトリウムからなる群より選択される安定剤を好ましくは含む。前記組成物は、ラウリル硫酸ナトリウム、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム、ジオクチルスルホン酸ナトリウム、ケノデオキシコール酸、Ｎ－ラウロイルサルコシンナトリウム塩、硫酸ドデシルリチウム、１－オクタンスルホン酸ナトリウム塩、コール酸ナトリウム水和物、デオキシコール酸ナトリウム、グリコデオキシコール酸ナトリウム塩、塩化ベンザルコニウム又は塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム一水和物、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、ＳＢ３－１０、ＳＢ３－１２、ジギトニン、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、ＴｒｉｔｏｎＸ－１１４、ラウロマクロゴール４００、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン硬化ひまし油１０、４０、５０及び６０、モノステアリン酸グリセロール、ポリソルベート２０、４０、６０、６５及び８０、ダイズレシチン、ＤＯＰＣ、ＤＭＰＧ、ＤＭＰＣ、及びＤＯＰＧ；スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロース及びカルボキシメチルセルロースからなる群より好ましくは選択される界面活性剤をさらに含んでいてよい。
【0082】
有利には、前記組成物は、少なくとも０．０１ｍｇ、好ましくは少なくとも０．１ｍｇ、より好ましくは少なくとも１ｍｇ、なおより好ましくは少なくとも５ｍｇ、特に少なくとも１０ｍｇの、本発明によって生産されるヘムペルオキシダーゼを含む。前記組成物が、前記ヘムペルオキシダーゼを、少なくとも０．０００１％（重量／重量、ｗ／ｗ）、好ましくは少なくとも０．００１％ｗ／ｗ、より好ましくは少なくとも０．０１％ｗ／ｗ、なおより好ましくは少なくとも０．１％ｗ／ｗ、さらになおより好ましくは少なくとも１％ｗ／ｗ、特に少なくとも１０％ｗ／ｗの濃度で含有するとき、さらに好ましい。
【0083】
有利には、前記組成物は、固体組成物（２５℃で及び大気圧で）、好ましくは凍結乾燥された組成物である。別の好ましい実施形態において、前記組成物は、液体組成物（２５℃で及び大気圧で）である。有利には、前記組成物は、本発明によって生産されるヘムペルオキシダーゼを、少なくとも０．００１ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも０．０１ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは少なくとも０．１ｍｇ／ｍＬ、さらになおより好ましくは少なくとも０．５ｍｇ／ｍＬ、最も好ましくは少なくとも２ｍｇ／ｍＬの濃度で含有する。
【0084】
前記組成物は、ＤＮＡ、特にｄｓＤＮＡを実質的に含まないことがさらに好ましい。好ましくは、前記組成物が含有するＤＮＡは１μｇ／ｇ未満、好ましくは１００ｎｇ／ｇ未満、より好ましくは１０ｎｇ／ｇ未満、最も好ましくは１ｎｇ／ｇ未満である。このＤＮＡ濃度は、染料ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩ（Ｎ’，Ｎ’－ジメチル－Ｎ－［４－［（Ｅ）－（３－メチル－１，３－ベンゾチアゾール－２－イリデン）メチル］－１－フェニルキノリン－１－イウム－２－イル］－Ｎ－プロピルプロパン－１，３－ジアミン）を使用してフローメトリーによって求められ得る。当業者は、フローメトリーを使用したＤＮＡ濃度の測定を熟知している。当該測定は、Rengarajan, Kalpana, et al. (“Technical Brief Quantifying DNA concentrations using fluorometry: A comparison of fluorophores.” Molecular Vision 8 (2002): 416-421)に記載されているように実施され得る。
【0085】
前記ヘムペルオキシダーゼ製品は、様々な治療用途における、例えば、標的化したがん治療における、使用を見出すことができる。好ましい実施形態において、前記ヘムペルオキシダーゼ製品は、したがって、個体、特に哺乳類、特にヒトへの投与に薬学的に許容可能である１又は複数の添加剤を好ましくは含む医薬組成物である。好適な添加剤は、当業者に公知であり、例えば、水（特に注射用水）、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、緩衝液、ハンクス液、ベシクル形成化合物（例えば、脂質）、固定油、オレイン酸エチル、生理食塩水中５％のデキストロース、等張性及び化学的安定性を向上させる物質、緩衝液、並びに保存料である。他の好適な添加剤として、患者に投与されたときに当該患者に有害である抗体の生産を誘発しない任意の化合物が挙げられる。例は、良好に耐容性のタンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸及びアミノ酸コポリマーである。この医薬組成物は、好ましくは非経口投与、特に、静脈内投与に好適である。当該医薬組成物は、上記で定義されている薬学的に許容可能な添加剤と併せて製剤化された、注射可能な単位剤形、例えば、溶液、懸濁液又はエマルジョンとして提供されてよい。概して前記組成物について上記に列挙されている全ての好ましい実施形態（特に、前記ヘムペルオキシダーゼの濃度及び量に関係する）は、前記ヘムペルオキシダーゼ製品が医薬組成物であるときもまた好ましい。
【0086】
治療用途に関して、前記ヘムペルオキシダーゼは、酵素－プロドラッグシステムの一部であってよい。ＨＲＰなどのヘムペルオキシダーゼを含む酵素－プロドラッグシステムが、特にがんの処置について、当該分野において知られている（例えば、Tupper et al. “In vivo characterization of horseradish peroxidase with indole-3-acetic acid and 5-bromoindole-3-acetic acid for gene therapy of cancer.” Cancer Gene Therapy 17.6 (2010): 420-428を参照されたい）。例えば、標的化したがん処置は、ＨＲＰをインドール酢酸（ＩＡＡ）と共に含む酵素－プロドラッグシステムを含み得、ＨＲＰはインドール酢酸（ＩＡＡ）を酸化して、がん細胞の生存能力を減少させる。上記のプロドラッグＩＡＡもＨＲＰも単独で細胞毒性でなく、これらの２つの物質を純粋な形態で、並びにヒトに調和可能及び非免疫原性な形態で組み合わせて所望の細胞毒性効果を得ることが必要であることを示している。別の研究では、ＨＲＰがパラセタモールを強力な細胞毒素に転換し得ることを示している（Tupper et al. “Use of horseradish peroxidase for gene-directed enzyme prodrug therapy with paracetamol.” British Journal of Cancer 90.9 (2004): 1858-1862）。しかし、この著者らは、植物からの市販のＨＲＰ調製物が、かかる転換反応においてあまり有効でなかったことを見出し、故にこの研究をさらに追及しなかった。
【0087】
本発明によって生産されるヘムペルオキシダーゼ製品は、抗体指向性酵素プロドラッグ療法（ＡＤＥＰＴ；antibody directed enzyme prodrug therapy）における使用を特に見出すことができる（例えば、Bagshawe “Antibody-directed enzyme prodrug therapy (ADEPT) for cancer.” Expert Review of Anticancer Therapy 6.10 (2006): 1421-1431を参照されたい）。ＡＤＥＰＴの原理は、典型的には、腫瘍関連抗原を指向する抗体を使用して酵素（例えば、ＨＲＰなど）を腫瘍部位に局在化させることである。部位特位的に活性種に転換されるプロドラッグを患者に与えることができる。前記ヘムペルオキシダーゼをコードする核酸分子もまた、療法、特に遺伝子指向性酵素プロドラッグ療法（ＧＤＥＰＴ；gene-directed enzyme prodrug therapy）などの遺伝子療法における使用を見出すことができる。
【0088】
多くの用途、特に排水処理などの産業用途（例えば、クロロフェノールの除去）では、前記ヘムペルオキシダーゼが、固体担体に固定化されているとき、有利であり得る。したがって、前記ヘムペルオキシダーゼ製品が、固体担体に固定化されているヘムペルオキシダーゼを含むとき、好ましい。したがって、本発明の方法は、前記ヘムペルオキシダーゼ又はヘムペルオキシダーゼコンジュゲートを固体担体に固定化する工程を好ましくはさらに含む。
【0089】
他の利点の中でも、酵素固定化は、特に高い貯蔵安定性、再利用性の向上、操作プロセスコストの低減などを可能にする。固体担体に固定化されたヘムペルオキシダーゼ及びこれらの産業用途は、当該分野において知られており、例えば、Tatsumi, et al. (“Removal of chlorophenols from wastewater by immobilized horseradish peroxidase.” Biotechnology and Bioengineering 51.1 (1996): 126-130)、及びSarno and Iuliano ("Immobilization of Horseradish Peroxidase on Fe3O4/Au_GO Nanoparticles to Remove 4-chlorophenols from Waste Water." Chemical Engineering Transactions 73 (2019): 217-222)を参照されたい。当業者は、例えば、Andreescu, et al.(“Chapter 7 - Nanostructured materials for enzyme immobilization and biosensors.” The New Frontiers of Organic and Composite Nanotechnology. Elsevier, 2008, 355-394）に記載されているように、酵素を固体担体に固定化する方法を熟知している。
【0090】
ナノ材料は、その比表面積及び有効酵素負荷に起因して、固体担体として特に好適である。この実施形態に関して、したがって、前記固体担体がナノ粒子であるとき、好ましい。「ナノ粒子」は、本明細書において使用されているとき、好ましくは、全ての三次元寸法が１×１０－１２～１×１０－６ｍの範囲、なおより好ましくは１×１０－９～１×１０－７ｍの範囲内の任意の形状の粒子である。前記ナノ粒子は、例えば、マグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）ナノ粒子又は金ナノ粒子であってよい。磁界を印加することによって分離を容易にするというさらなる利点を提供することから、磁性ナノ粒子が特に好ましい。固体担体のさらに好ましい例は、ナノファイバ、カーボン／ポリビニル材料、カーボンナノチューブ、ナノワイヤ、ナノロッド、ナノ結晶、メソ多孔性シリカ及び複合材料である。
【0091】
さらに好ましい実施形態において、前記固体担体は、膜、特に、ポリマー性膜などの合成膜である。固定化されたヘムペルオキシダーゼを含む膜、かかる膜を製造する方法、及びかかる膜の用途（例えば、廃液処理における）は、例えば、Vasileva et al. (“Application of immobilized horseradish peroxidase onto modified acrylonitrile copolymer membrane in removing of phenol from water.” International journal of biological macromolecules 44.2 (2009): 190-194)から、当該分野において知られている。
【0092】
さらに好ましい実施形態において、前記ヘムペルオキシダーゼ製品は、キットである。本発明方法は、したがって、前記ヘムペルオキシダーゼ又は前記ヘムペルオキシダーゼコンジュゲートをキットにパッケージングする工程を好ましくはさらに含む。緩衝液、試薬、指示マニュアルから選択されるさらなる構成要素がキットに追加されるとき、好ましい。前記ヘムペルオキシダーゼ又は前記ヘムペルオキシダーゼコンジュゲートは、凍結乾燥された形態で前記キットにおいて提供されてよい。代替の好ましい実施形態において、前記ヘムペルオキシダーゼ又は前記ヘムペルオキシダーゼコンジュゲートは、溶液中で提供される。
【0093】
本発明方法によって生産されるヘムペルオキシダーゼは、結合酵素アッセイ用の反応物としての使用をさらに見出すことができる。かかるアッセイにおいて、対象の酵素（例えば、グルコースオキシダーゼ）はＨ２Ｏ２を生産し、次いでこれが前記ヘムペルオキシダーゼによって利用され得る（例えば、Aumiller et al. “Coupled enzyme reactions performed in heterogeneous reaction media: experiments and modeling for glucose oxidase and horseradish peroxidase in a PEG/citrate aqueous two-phase system.” The Journal of Physical Chemistry B 118.9 (2014): 2506-2517を参照されたい）。したがって、好ましい実施形態において、Ｈ２Ｏ２を生産する酵素がキットに追加される。
【0094】
本発明によって生産されるヘムペルオキシダーゼは、さらに、ポリマー架橋のための反応物として使用されてよい。例えば、ＨＲＰは、ヒドロゲルの調製のためのデキストラン－チラミンコンジュゲートの酵素的架橋のために、例えば軟骨組織エンジニアリング用途のための３Ｄ足場として、当分野において成功裏に使用されてきた（Jin et al. “Enzymatically crosslinked dextran-tyramine hydrogels as injectable scaffolds for cartilage tissue engineering.” Tissue Engineering Part A 16.8 (2010): 2429-2440）。
【0095】
本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語を以下に定義する。本明細書において定義されている用語は、本発明に関しての当業者によって一般的に理解されている意味を有する。「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」などの用語は、単数の存在のみを指すことは意図されておらず、説明目的のためにその特定の例が使用されうる一般的なクラスを含む。本明細書における用語は、本発明の具体的な実施形態を記載するのに使用されているが、これらの使用は、特許請求の範囲において概説されているものを除き、本発明の境界を定めるものではない。
【0096】
参照のポリペプチド又はタンパク質配列に関しての「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」、「Ｘ％の配列同一性」又は「Ｘ％同一の」（「７０％の配列同一性」又は「７０％同一の」など）は、配列をアラインメントして必要に応じてギャップを導入し、最大のパーセント配列同一性を達成した後、且つ、いずれの保存的置換も当該配列同一性の一部として見なさずに、上記の参照のポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である、候補の配列におけるアミノ酸残基の百分率として定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を求める目的でのアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ－２、Ｍｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）、又は、ＥＭＢＯＳＳソフトウエアパッケージの「ｎｅｅｄｌｅ」 ｐａｉｒｗｉｓｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔアプリケーションなどの公的に入手可能コンピュータソフトウエアを使用して、当該分野における能力の範囲内にある様々な方式で達成され得る。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大アラインメントを達成するのに必要とされる任意のアルゴリズムを含めた、配列をアラインメントするのに適切なパラメータを決定することができる。しかし、本明細書における目的のために、アミノ酸配列同一性（％）値は、ＥＭＢＯＳＳソフトウエアパッケージのコンピュータプログラム「ｎｅｅｄｌｅ」の配列アラインメントを使用して算出される（European Molecular Biology Laboratoryから公的に入手可能；Rice et al., EMBOSS: the European Molecular Biology Open Software Suite, Trends Genet. 2000 Jun;16(6):276-7, PMID: 10827456）。
【0097】
前記ｎｅｅｄｌｅプログラムは、ウエブサイトhttp://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/でアクセス可能であり、又はhttp://emboss.sourceforge.net/からＥＭＢＯＳＳパッケージの一部としてローカルインストールによりダウンロードできる。これは、Ｌｉｎｕｘなどの、多くの広く使用されているＵＮＩＸオペレーティングシステムで動作する。
【0098】
２のタンパク質配列をアラインメントするために、前記ｎｅｅｄｌｅプログラムを以下のパラメータによって好ましくは実行する：
コマンドライン：needle -auto -stdout -asequence SEQUENCE_FILE_A-bsequence SEQUENCE_FILE_B -datafile EBLOSUM62 -gapopen 10.0 -gapextend 0.5 -endopen 10.0 -endextend 0.5 -aformat3 pair -sprotein1 -sprotein2(Align_format: pair Report_file:stdout)
コマンドライン：needle -auto -stdout -asequence SEQUENCE_FILE_A-bsequence SEQUENCE_FILE_B -datafile EBLOSUM62 -gapopen 10.0 -gapextend 0.5 -endopen 10.0 -endextend 0.5 -aformat3 pair -sprotein1 -sprotein2(Align_format: pair Report_file:stdout)
【0099】
所与のアミノ酸配列Ｂに対する（ｔｏ）、これとの（ｗｉｔｈ）、又はこれに対抗する（ａｇａｉｎｓｔ）、所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性（％）（代替的に、所与のアミノ酸配列Ｂに対する、これとの、又はこれに対抗する、ある特定のアミノ酸配列同一性（％）を有する又は含む所与のアミノ酸配列Ａと表現され得る）は、以下のように算出される：
【0100】
割合（Ｘ／Ｙ）×１００、
ここで、Ｘは、配列アラインメントプログラム「ｎｅｅｄｌｅ」によって、そのプログラムのＡとＢのアラインメントにおいて完全一致としてスコアリングされたアミノ酸残基数であり、Ｙは、Ｂにおける合計アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合には、Ｂに対するＡのアミノ酸配列同一性（％）が、Ａに対するＢのアミノ酸配列同一性（％）と等しくならないことが理解されよう。「Ａの配列がＢの全配列とＮ％を超えて同一である」場合には、Ｙは、Ｂの全配列長さ（すなわち、Ｂにおける全アミノ酸残基数）である。別途特に記述されていない限り、本明細書において使用される全てのアミノ酸配列同一性（％）値は、ｎｅｅｄｌｅコンピュータプログラムを使用して、直前の項に記載されるように得られる。
ここで、Ｘは、配列アラインメントプログラム「ｎｅｅｄｌｅ」によって、そのプログラムのＡとＢのアラインメントにおいて完全一致としてスコアリングされたアミノ酸残基数であり、Ｙは、Ｂにおける合計アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合には、Ｂに対するＡのアミノ酸配列同一性（％）が、Ａに対するＢのアミノ酸配列同一性（％）と等しくならないことが理解されよう。「Ａの配列がＢの全配列とＮ％を超えて同一である」場合には、Ｙは、Ｂの全配列長さ（すなわち、Ｂにおける全アミノ酸残基数）である。別途特に記述されていない限り、本明細書において使用される全てのアミノ酸配列同一性（％）値は、ｎｅｅｄｌｅコンピュータプログラムを使用して、直前の項に記載されるように得られる。
【0101】
別途特定されない限り、本明細書において使用されている全てのパラメータは、ＩＵＰＡＣ ＳＡＴＰ条件（Standard Ambient Temperature and Pressure;「標準環境温度と圧力」）、特に、２５℃の温度及び１０１．３００Ｐａの圧力におけるパラメータに相当する。
【0102】
本明細書において使用されている百分率（％）は、重量／重量（ｗ／ｗ）又は別の方法で特定されない限り、重量／体積（ｗ／ｖ）に相当する。
【0103】
本発明は、以下の好ましい実施形態に関する：
実施形態１．封入体（ＩＢ）からヘムペルオキシダーゼを生産するための方法であって：
－前記ヘムペルオキシダーゼをＩＢの形態で提供する工程；
－前記ＩＢを可溶化する工程；
－前記可溶化されたＩＢをリフォールディング緩衝液中に移してリフォールディングミックスを得る工程；
－前記リフォールディングミックスにヘム補因子を添加する工程、
を含み、
前記リフォールディングミックスへの前記ヘム補因子の添加が、少なくとも１時間の期間にわたって配分される、前記方法。
実施形態１．封入体（ＩＢ）からヘムペルオキシダーゼを生産するための方法であって：
－前記ヘムペルオキシダーゼをＩＢの形態で提供する工程；
－前記ＩＢを可溶化する工程；
－前記可溶化されたＩＢをリフォールディング緩衝液中に移してリフォールディングミックスを得る工程；
－前記リフォールディングミックスにヘム補因子を添加する工程、
を含み、
前記リフォールディングミックスへの前記ヘム補因子の添加が、少なくとも１時間の期間にわたって配分される、前記方法。
【0104】
実施形態２．前記リフォールディングミックスへの前記ヘム補因子の添加が、少なくとも２時間、好ましくは少なくとも３時間、より好ましくは少なくとも６時間、なおより好ましくは少なくとも８時間、特に少なくとも１０時間の期間にわたって配分される、実施形態１に記載の方法。
【0105】
実施形態３．前記ヘム補因子が、連続フィードとして前記リフォールディングミックスに添加される、実施形態１又は実施形態２に記載の方法。
【0106】
実施形態４．前記ヘム補因子が、０．１～１０μｍｏｌ／Ｌ／時間、好ましくは０．２～５μｍｏｌ／Ｌ／時間、なおより好ましくは０．５～３μｍｏｌ／Ｌ／時間、さらになおより好ましくは１～２．５μｍｏｌ／Ｌ／時間、特に１．４～１．８μｍｏｌ／Ｌ／時間の速度で前記リフォールディングミックスに添加される、実施形態１～実施形態３のいずれか１つに記載の方法。
【0107】
実施形態５．前記リフォールディングミックスが、前記ヘム補因子の添加の前に少なくとも１時間、好ましくは少なくとも２時間、なおより好ましくは少なくとも４時間、特に少なくとも８時間インキュベートされる、実施形態１～実施形態４のいずれか１つに記載の方法。
【0108】
実施形態６．少なくとも１μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは少なくとも４μｍｏｌ／Ｌ、なおより好ましくは少なくとも１０μｍｏｌ／Ｌ、特に少なくとも２０μｍｏｌ／Ｌの前記ヘム補因子が、前記リフォールディングミックスに添加される、実施形態１～実施形態５のいずれか１つに記載の方法。
【0109】
実施形態７．１μｍｏｌ／Ｌ～２００μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは４μｍｏｌ／Ｌ～１００μｍｏｌ／Ｌ、なおより好ましくは１０μｍｏｌ／Ｌ～５０μｍｏｌ／Ｌ、特に１５μｍｏｌ／Ｌ～２５μｍｏｌ／Ｌの前記ヘム補因子が、前記リフォールディングミックスに添加される、実施形態１～実施形態６のいずれか１つに記載の方法。
【0110】
実施形態８．前記ヘムペルオキシダーゼに対して少なくとも０．２５モル当量、好ましくは少なくとも０．５モル当量、なおより好ましくは少なくとも１モル当量、特に少なくとも２モル当量の前記ヘム補因子が前記リフォールディングミックスに添加される、実施形態１～実施形態７のいずれか１つに記載の方法。
【0111】
実施形態９．前記ヘムペルオキシダーゼに対して０．２５～１０モル当量、好ましくは０．５～５モル当量、なおより好ましくは１～４モル当量、特に１～２モル当量の前記ヘム補因子が前記リフォールディングミックスに添加される、実施形態１～実施形態８のいずれか１つに記載の方法。
【0112】
実施形態１０．前記ヘムペルオキシダーゼが、クラスＩＩ又はクラスＩＩＩのヘムペルオキシダーゼ、好ましくはクラスＩＩＩのヘムペルオキシダーゼである、実施形態１～実施形態９のいずれか１つに記載の方法。
【0113】
実施形態１１．前記ヘムペルオキシダーゼが、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）である、実施形態１～実施形態１０のいずれか１つに記載の方法。
【0114】
実施形態１２．前記ヘムペルオキシダーゼが、精製タグ、特にポリヒスチジンタグを含まない、実施形態１～実施形態１１のいずれか１つに記載の方法。
【0115】
実施形態１３．前記ヘムペルオキシダーゼが、配列番号３と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、なおより好ましくは少なくとも９０％、なおより好ましくは少なくとも９５％、さらになおより好ましくは少なくとも９８％、特に少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１～実施形態１２のいずれか１つに記載の方法。
【0116】
実施形態１４．前記ヘムペルオキシダーゼが、配列番号３に記載されているアミノ酸配列を含む、実施形態１～実施形態１３のいずれか１つに記載の方法。
【0117】
実施形態１５．前記ヘムペルオキシダーゼが、配列番号４に記載されているアミノ酸配列からなる、実施形態１～実施形態１４のいずれか１つに記載の方法。
【0118】
実施形態１６．前記ヘム補因子が、ヘミンである、実施形態１～実施形態１５のいずれか１つに記載の方法。
【0119】
実施形態１７．前記のＩＢの形態のヘムペルオキシダーゼが：
－前記ヘムペルオキシダーゼをコードする遺伝子を発現する宿主細胞を培養する工程；及び
－前記宿主細胞からＩＢを得る工程
によって提供される、実施形態１～実施形態１６のいずれか１つに記載の方法。
－前記ヘムペルオキシダーゼをコードする遺伝子を発現する宿主細胞を培養する工程；及び
－前記宿主細胞からＩＢを得る工程
によって提供される、実施形態１～実施形態１６のいずれか１つに記載の方法。
【0120】
実施形態１８．前記宿主細胞が、原核細胞、好ましくは大腸菌細胞である、実施形態１７に記載の方法。
【0121】
実施形態１９．前記宿主細胞が、少なくとも２Ｌ、好ましくは少なくとも５Ｌ、より好ましくは少なくとも２０Ｌ、さらには５０Ｌ、特に少なくとも１００Ｌの体積で培養される、実施形態１７又は実施形態１８に記載の方法。
【0122】
実施形態２０．前記可溶化が、可溶化緩衝液において前記ＩＢをインキュベートすることを含む、実施形態１～実施形態１９のいずれか１つに記載の方法。
【0123】
実施形態２１．前記可溶化緩衝液が、少なくとも８、好ましくは少なくとも８．５、より好ましくは少なくとも９．０、なおより好ましくは少なくとも９．５のｐＨを有する、実施形態２０に記載の方法。
【0124】
実施形態２２．前記可溶化緩衝液が、８～１２．５、好ましくは８．５～１１．５、より好ましくは９～１１、なおより好ましくは９．５～１０．５のｐＨを有する、実施形態２０又は実施形態２１に記載の方法。
【0125】
実施形態２３．前記可溶化緩衝液が、還元剤を含有する、実施形態２０～実施形態２２のいずれか１つに記載の方法。
【0126】
実施形態２４．前記可溶化緩衝液が、１～５０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは２～２５ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは４～１５ｍｍｏｌ／Ｌ、特に６～８ｍｍｏｌ／Ｌのジチオスレイトール（ＤＴＴ）濃度に相当するレドックス状態を有する、実施形態２０～実施形態２３のいずれか１つに記載の方法。
【0127】
実施形態２５．前記可溶化緩衝液が、好ましくは少なくとも４ｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは少なくとも５ｍｏｌ／Ｌ、なおより好ましくは少なくとも６ｍｏｌ／Ｌの濃度で尿素を含有する、実施形態２０～実施形態２４のいずれか１つに記載の方法。
【0128】
実施形態２６．前記可溶化緩衝液が、４ｍｏｌ／Ｌ～８ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは５ｍｏｌ／Ｌ～７ｍｏｌ／Ｌ、特に５．５～６．５ｍｏｌ／Ｌの尿素を含有する、実施形態２０～実施形態２５のいずれか１つに記載の方法。
【0129】
実施形態２７．前記ＩＢが、前記可溶化緩衝液において、少なくとも５分、好ましくは少なくとも１０分、より好ましくは少なくとも１５分、特に少なくとも３０分間インキュベートされる、実施形態２０～実施形態２６のいずれか１つに記載の方法。
【0130】
実施形態２８．前記ＩＢが、４℃～４０℃、好ましくは１０℃～３５℃、なおより好ましくは２０℃～２５℃の温度で前記可溶化緩衝液においてインキュベートされる、実施形態２０～実施形態２７のいずれか１つに記載の方法。
【0131】
実施形態２９．前記可溶化されたＩＢが、前記リフォールディング緩衝液と、１：５ｖ／ｖ～１：２５０（可溶化されたＩＢ：リフォールディング緩衝液）、好ましくは１：１０～１：１００、なおより好ましくは１：２０～１：８０、特に１：２５～１：６０、最も好ましくは１：３０～１：５０の比率で混合される、実施形態１～実施形態２８のいずれか１つに記載の方法。
【0132】
実施形態３０．前記リフォールディングが、少なくとも５Ｌ、好ましくは少なくとも１０Ｌ、より好ましくは少なくとも２５Ｌ、なおより好ましくは少なくとも１００Ｌの体積で実施される、実施形態１～実施形態２９のいずれか１つに記載の方法。
【0133】
実施形態３１．前記リフォールディング緩衝液が、少なくとも８、好ましくは少なくとも８．５、より好ましくは少なくとも９、なおより好ましくは少なくとも９．５のｐＨを有する、実施形態１～実施形態３０のいずれか１つに記載の方法。
【0134】
実施形態３２．前記リフォールディング緩衝液が、８～１２．５、好ましくは８．５～１１．５、より好ましくは９～１１、なおより好ましくは９．５～１０．５のｐＨを有する、実施形態１～実施形態３１のいずれか１つに記載の方法。
【0135】
実施形態３３．前記可溶化緩衝液と前記リフォールディング緩衝液との間のｐＨの差が、２未満のｐＨ増分、好ましくは１未満のｐＨ増分、より好ましくは０．５未満のｐＨ増分、なおより好ましくは０．２未満のｐＨ増分、特に０．１未満のｐＨ増分である、実施形態１～実施形態３２のいずれか１つに記載の方法。
【0136】
実施形態３４．前記リフォールディング緩衝液が、酸化剤を含有する、実施形態１～実施形態３３のいずれか１つに記載の方法。
【0137】
実施形態３５．前記リフォールディング緩衝液が、０．２～６ｍＭのＧＳＳＧ、好ましくは０．４～４ｍＭのＧＳＳＧ、より好ましくは０．８～２．５ｍＭのＧＳＳＧ、特に１．１～１．６ｍＭのＧＳＳＧのグルタチオンジスルフィド（ＧＳＳＧ）濃度に相当するレドックス状態を有する、実施形態１～実施形態３４のいずれか１つに記載の方法。
【0138】
実施形態３６．前記リフォールディング緩衝液が、０．５～３ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１ｍｏｌ／Ｌ～２．７ｍｏｌ／Ｌ、なおより好ましくは１．５ｍｏｌ／Ｌ～２．４ｍｏｌ／Ｌ、特に１．８～２．２ｍｏｌ／Ｌの尿素を含有する、実施形態１～実施形態３５のいずれか１つに記載の方法。
【0139】
実施形態３７．前記リフォールディングミックスにおけるＤＴＴとＧＳＳＧとの間のモル比が、１：２（ＤＴＴ：ＧＳＳＧ）～１：３０、好ましくは１：３～１：２０、なおより好ましくは１：４～１：１５、特に１：６～１：８である、実施形態１～実施形態３６のいずれか１つに記載の方法。
【0140】
実施形態３８．前記リフォールディングミックスが、－１０５ｍＶ～１３５ｍＶ、好ましくは－９０ｍＶ～１０５ｍＶ、なおより好ましくは－８０ｍＶ～８０ｍＶ、さらになおより好ましくは－７０ｍＶ～６０ｍＶ、最も好ましくは－６０ｍＶ～５０ｍＶの還元電位を有する、実施形態１～実施形態３７のいずれか１つに記載の方法。
【0141】
実施形態３９．前記リフォールディングミックスに塩を添加する工程をさらに含む、実施形態１～実施形態３８のいずれか１つに記載の方法。
【0142】
実施形態４０．前記塩が、０．５～６ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１．５～５ｍｏｌ／Ｌ、なおより好ましくは２．５～４．５ｍｏｌ／Ｌ、特に３．５～４．５ｍｏｌ／Ｌのイオン強度となるまで前記リフォールディングミックスに添加される、実施形態３９に記載の方法。
【0143】
実施形態４１．前記塩が、好ましくは０．５～６ｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは１．５～５．５ｍｏｌ／Ｌ、なおより好ましくは２．５～５ｍｏｌ／Ｌ、特に３．５～４．５ｍｏｌ／Ｌの濃度の塩化ナトリウムである、実施形態３９又は実施形態４０に記載の方法。
【0144】
実施形態４２．前記塩が、好ましくは０．２５～１．５ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．５～１．４ｍｏｌ／Ｌ、なおより好ましくは０．８～１．２ｍｏｌ／Ｌの濃度の硫酸アンモニウムである、実施形態３９～実施形態４１のいずれか１つに記載の方法。
【0145】
実施形態４３．前記塩が、ホフマイスターシリーズにおけるその位置によって求められる、硫酸アンモニウムと塩化ナトリウムとの間の塩析強度を有し、好ましくは、前記塩の濃度が、１．２５～６ｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．５～５ｍｏｌ／Ｌ、なおより好ましくは１．０～４．５ｍｏｌ／Ｌ、最も好ましくは１．５～４ｍｏｌ／Ｌである、実施形態３９～実施形態４２のいずれか１つに記載の方法。
【0146】
実施形態４４．前記塩が、ホフマイスターシリーズにおけるその位置によって求められる、塩化ナトリウムよりも弱い塩析強度を有し、好ましくは前記塩の濃度が、少なくとも２ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは少なくとも４ｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは少なくとも４．５ｍｏｌ／Ｌである、実施形態３９～実施形態４３のいずれか１つに記載の方法。
【0147】
実施形態４５．前記塩の濃度が、２ｍｏｌ／Ｌ～１２ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは４ｍｏｌ／Ｌ～１０ｍｏｌ／Ｌ、なおより好ましくは４．５ｍｏｌ／Ｌ～８ｍｏｌ／Ｌである、実施形態４４に記載の方法。
【0148】
実施形態４６．リフォールディングされたヘムペルオキシダーゼから不純物を除去するための遠心分離工程をさらに含む、実施形態１～実施形態４５のいずれか１つに記載の方法。
【0149】
実施形態４７．リフォールディングされたヘムペルオキシダーゼから不純物を除去するためのろ過工程をさらに含む、実施形態１～実施形態４６のいずれか１つに記載の方法。
【0150】
実施形態４８．リフォールディングされたヘムペルオキシダーゼを精製する工程をさらに含む、実施形態１～実施形態４７のいずれか１つに記載の方法。
【0151】
実施形態４９．前記ヘム補因子が前記リフォールディングミックスに添加された後に前記ヘムペルオキシダーゼが精製される、実施形態４８に記載の方法。
【0152】
実施形態５０．前記ヘムペルオキシダーゼが、クロマトグラフィによって精製される、実施形態４８又は実施形態４９に記載の方法。
【0153】
実施形態５１．前記ヘムペルオキシダーゼが、疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）によって精製される、実施形態４８～実施形態５０のいずれか１つに記載の方法。
【0154】
実施形態５２．固定相がブチルセファロース樹脂である、実施形態５１に記載の方法。
【0155】
実施形態５３．実施形態１～実施形態５２のいずれか１つに記載の方法によってヘムペルオキシダーゼを生産することを含む、ヘムペルオキシダーゼ製品を生産するための方法。
【0156】
実施形態５４．前記ヘムペルオキシダーゼをコンジュゲーション反応用に活性化する工程をさらに含む、実施形態５３に記載の方法。
【0157】
実施形態５５．ヘムペルオキシダーゼコンジュゲートを得るためのコンジュゲーション反応をさらに含む、実施形態５３又は実施形態５４に記載の方法。
【0158】
実施形態５６．前記ヘムペルオキシダーゼが、結合物質（binding agent）、好ましくは抗体にコンジュゲートされる、実施形態５５に記載の方法。
【0159】
実施形態５７．前記ヘムペルオキシダーゼが、抗体断片、好ましくは一本鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）又は抗原結合断片（Ｆａｂ）にコンジュゲートされる、実施形態５５に記載の方法。
【0160】
実施形態５８．前記ヘムペルオキシダーゼが、抗体模倣体、好ましくは、アドネクチン、アフィボディ、アンティカリン、ＤＡＲＰｉｎ、改変Ｋｕｎｉｔｚ型阻害剤、及びモノボディからなる群より選択される抗体模倣体にコンジュゲートされる、実施形態５５に記載の方法。
【0161】
実施形態５９．前記ヘムペルオキシダーゼが、抗体結合タンパク質、好ましくはタンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、又はタンパク質Ｌにコンジュゲートされる、実施形態５５に記載の方法。
【0162】
実施形態６０．前記ヘムペルオキシダーゼが、さらなるタンパク質、好ましくはストレプトアビジンにコンジュゲートされる、実施形態５５に記載の方法。
【0163】
実施形態６１．前記ヘムペルオキシダーゼ又は前記ヘムペルオキシダーゼコンジュゲートを精製する工程をさらに含む、実施形態５３～実施形態６０のいずれか１つに記載の方法。
【0164】
実施形態６２．前記ヘムペルオキシダーゼ又は前記ヘムペルオキシダーゼコンジュゲートを凍結する工程をさらに含む、実施形態５３～実施形態６１のいずれか１つに記載の方法。
【0165】
実施形態６３．前記ヘムペルオキシダーゼ又は前記ヘムペルオキシダーゼコンジュゲートを凍結乾燥する工程をさらに含む、実施形態５３～実施形態６２のいずれか１つに記載の方法。
【0166】
実施形態６４．前記ヘムペルオキシダーゼ又はヘムペルオキシダーゼコンジュゲートを固体担体に固定化する工程をさらに含む、実施形態５３～実施形態６３のいずれか１つに記載の方法。
【0167】
実施形態６５．前記固体担体が、ナノ粒子、好ましくは磁性ナノ粒子又はナノファイバである、実施形態６４に記載の方法。
【0168】
実施形態６６．前記固体担体が、カーボン／ポリビニル材料である、実施形態６４に記載の方法。
【0169】
実施形態６７．前記固体担体が、膜である、実施形態６４に記載の方法。
【0170】
実施形態６８．前記ヘムペルオキシダーゼ又は前記ヘムペルオキシダーゼコンジュゲートをキットにパッケージングする工程をさらに含む、実施形態５３～実施形態６７のいずれか１つに記載の方法。
【0171】
実施形態６９．緩衝液、試薬、指示マニュアルから選択されるさらなる構成要素がキットに追加される、実施形態６８に記載の方法。
【0172】
実施形態７０．Ｈ２Ｏ２を生産する酵素がキットに追加される、実施形態６９に記載の方法。
【0173】
本発明は、以下の図及び例によってさらに説明されるが、これらに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【0174】
【図1A】異なるヘム補因子濃度、及びリフォールディングミックスへの異なる添加時間の、体積活性への影響、それぞれリフォールディング収率。
【図1B】異なるヘム補因子添加時間及びヘム補因子濃度をファクターとして、体積活性［Ｕ／ｍＬ］をレスポンスとした、レスポンス等高線プロット（ＤｏＥ４）。
【図2】可溶化ミックス中のＤＴＴ濃度及びリフォールディング緩衝液中のＧＳＳＧ濃度に依存する体積活性［Ｕ／ｍＬ］についてのレスポンス等高線プロット（ＤｏＥ１）。
【図3】ＤｏＥ３についての、異なるＤＴＴ及びＧＳＳＧ濃度（両方ともｍＭ）でのｐＨ８．５、ｐＨ９．２５及びｐＨ１０でのレスポンス等高線プロット。
【図4】リアクター実験２でのレドックス電位及び体積活性（アットライン（ａｔ－ｌｉｎｅ）サンプリング）。リフォールディング開始２０時間後に２０μＭのヘミンを添加し、この時点でレドックスシグナルが急激な上昇を示す。
【図5】リアクター実験５でのレドックス電位及び体積活性。ヘミンフィードの終了の前に、サンプルを２時間毎に抜き出し、測定前に２０μＭの最終ヘミン濃度でインキュベートした（丸）。前記ヘミンフィードの開始後、サンプルを２時間毎に抜き出し、体積活性を直ちに測定した（四角）。
【図6】段階勾配を使用するＨＩＣ１での活性ＨＲＰ及び不純物の溶出。活性ＨＲＰは、１２０から１２５ｍＬの間で溶出するが（７５％の緩衝液Ｂ）、疎水性不純物は、１３１ｍＬから開始して溶出する（１００％の緩衝液Ｂ）。
【図7】線形勾配を使用するＨＩＣ２での活性ＨＲＰ及び不純物の溶出。活性ＨＲＰは、１２５ｍＬから１３５ｍＬの間で溶出するが、疎水性不純物は、１４５ｍＬから開始して溶出する。
【図8】線形勾配を使用するＨＩＣ３での活性ＨＲＰ及び不純物の溶出。活性ＨＲＰは、当該勾配において遅くに溶出して（９０％の緩衝液Ｂ付近）、１００％の緩衝液Ｂで溶出する疎水性不純物の溶出と重なる。
【図9】段階勾配を使用するＨＩＣ４での活性ＨＲＰ及び不純物の溶出。９０％の緩衝液Ｂを使用して疎水性不純物からの活性ＨＲＰの分離が可能であるが、これは活性ＨＲＰピークの強いテーリング（ｔａｉｌｉｎｇ）につながり、結果として、活性ＨＲＰのより低い濃度とより乏しい回収との間の判断となる。
【図10】段階勾配を使用するＨＩＣ５での活性ＨＲＰ及び不純物の溶出。活性ＨＲＰは、１２５０から１４００ｍＬの間で溶出するが（７５％の緩衝液Ｂ）、疎水性不純物は、１４００ｍＬ出しはじめる（１００％の緩衝液Ｂ）。
【図11】ｐＨ８．５におけるリフォールディングによるＨＩＣランのクロマトグラム。純粋なＨＲＰは７５％の緩衝液Ｂで溶出する一方で、疎水性不純物は１００％の緩衝液Ｂで溶出する。
【図12】ｐＨ１０におけるリフォールディングによるＨＩＣランのクロマトグラム。純粋なＨＲＰは７５％の緩衝液Ｂで溶出する一方で、疎水性不純物は１００％の緩衝液Ｂで溶出する。
【図13】組換え野生型ＨＲＰ（ｒＨＲＰ、配列番号２）及び植物由来ＨＲＰ（ｐＨＲＰ）と比較したＨＲＰ Ｎ１３Ｄ／Ｎ５７Ｓ／Ｐ１４６Ｑ／Ｎ１７５Ｓ／Ｎ２５５Ｄ／Ｎ２６８Ｄ／Ｎ２７５Ｋ（ｍＨＲＰ、配列番号４）の残存活性。２．９μＭの濃度を有する１５０μｌのｐＨＲＰ（三角）、ｍＨＲＰ（四角）及びｒＨＲＰ（丸）を、５０ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７）、０．５ＭのＮａＣｌ、７％のグリセロール中で、６０℃で最大１０時間インキュベートした。実施例１に記載されているように初期酵素活性及び残存酵素活性をＡＢＴＳによって測定し、インキュベーション時間に対しての％でプロットする。ｍＨＲＰは、ｒＨＲＰよりも１３倍を超えて向上した熱安定性、及び、前記植物由来（すなわち、グリコシル化された）ｐＨＲＰに対しても１．７倍向上した熱安定性を示した。
【図14】３の異なるリフォールディング実験から得られた酵素活性。「バッチ添加」：ヘム補因子を２０時間のリフォールディング時間の後にバッチで添加した（第１カラム）。「ヘミンフィード１０時間」：ヘム補因子をリフォールディング開始後８時間で１０時間のフィードとして添加した（第２カラム）。「ヘミンフィード１時間」：ヘム補因子をリフォールディング開始後８時間で１時間のフィードとして添加した；測定は、フィードの終了後（最終カラム）、及び１０時間のさらなるインキュベーション後（第３カラム）すぐに行った。
【発明を実施するための形態】
【0175】
実施例１．材料及び方法
（化学物質）
酸化型Ｌ－グルタチオン（ＧＳＳＧ）及び２，２’－アジノ－ビス（３－エチルベンゾチアゾリン－６－スルホン酸）（ＡＢＴＳ）は、ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ社からのものであった。ヘミンはＳｉｇｍａ社から購入した（ウシ由来のヘミン、≧９０％）。ジチオスレイトール（ＤＴＴ）及び全ての他の化学物質はＲｏｔｈ社から購入した。
（化学物質）
酸化型Ｌ－グルタチオン（ＧＳＳＧ）及び２，２’－アジノ－ビス（３－エチルベンゾチアゾリン－６－スルホン酸）（ＡＢＴＳ）は、ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ社からのものであった。ヘミンはＳｉｇｍａ社から購入した（ウシ由来のヘミン、≧９０％）。ジチオスレイトール（ＤＴＴ）及び全ての他の化学物質はＲｏｔｈ社から購入した。
【0176】
（細菌株及び増殖条件）
ＨＲＰバリアントＣ１ａをコードするｈｒｐ遺伝子を大腸菌についてコドン最適化し、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ ＵＳＡ社（米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）から得た。プラスミドｐＥＴ２１ｄ＋を細胞質におけるＨＲＰ封入体生産に使用した。タンパク質がいずれのタグも伴わずに生産されるように停止コドンを導入した。ＨＲＰを、１０ＬのＢｉｏｓｔａｔ Ｃｐｌｕｓステンレス鋼バイオリアクター（ドイツ、Ｓａｔｏｒｉｕｓ社）中で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）において生産させた。ＤｅＬｉｓａ培地を使用してフィードバッチ培養において１２時間、０．５ｍＭのイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を用いてＨＲＰ生産を誘導した。バイオマスを遠心分離によって採取し、湿潤バイオマスをさらなる処理まで－２０℃で保存した。
ＨＲＰバリアントＣ１ａをコードするｈｒｐ遺伝子を大腸菌についてコドン最適化し、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ ＵＳＡ社（米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）から得た。プラスミドｐＥＴ２１ｄ＋を細胞質におけるＨＲＰ封入体生産に使用した。タンパク質がいずれのタグも伴わずに生産されるように停止コドンを導入した。ＨＲＰを、１０ＬのＢｉｏｓｔａｔ Ｃｐｌｕｓステンレス鋼バイオリアクター（ドイツ、Ｓａｔｏｒｉｕｓ社）中で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）において生産させた。ＤｅＬｉｓａ培地を使用してフィードバッチ培養において１２時間、０．５ｍＭのイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を用いてＨＲＰ生産を誘導した。バイオマスを遠心分離によって採取し、湿潤バイオマスをさらなる処理まで－２０℃で保存した。
【0177】
（ホモジナイズ及び洗浄）
ＩＫＡ Ｔ１０ベーシックＵＬＴＲＡ－ＴＵＲＲＡＸを使用して、３～５ｍＬの緩衝液Ａ／ｇ湿潤バイオマス（緩衝液Ａ：５０ｍＭのＴＲＩＳ／ＨＣｌ；ｐＨ８；５００ｍＭのＮａＣｌ；１．５ｍＭのＥＤＴＡ）でバイオマスを再懸濁し、（ＧＥＡ Ｎｉｒｏ Ｓｏａｖｉ Ｐａｎｄａ ＰＬＵＳを使用して）ホモジナイズした（＞１３００バール、３通路、冷却）。当該ホモジナイズした懸濁液を遠心分離し（１５６５０ｇ；２０分、４℃）、上清を廃棄して細胞残屑を１０ｍＬの緩衝液Ｂ／ｇ湿潤細胞残屑（緩衝液Ｂ：５０ｍＭのＴＲＩＳ／ＨＣｌ；ｐＨ８；５００ｍＭのＮａＣｌ；２Ｍの尿素）で再懸濁し、再び遠心分離した（１５６５０ｇ；２０分、４℃）。緩衝液Ｂを使用した洗浄工程を１回繰り返した。その後、ＩＢ／細胞残屑を水（５ｍＬの水／ｇ湿潤細胞残屑）に再懸濁し、当該懸濁液を、予め秤量した５０ｍＬの反応管に分配し（aliquoted）、遠心分離し（１５６５０ｇ；２０分、４℃）、ペレットをさらなる使用まで－２０℃で保存した。
ＩＫＡ Ｔ１０ベーシックＵＬＴＲＡ－ＴＵＲＲＡＸを使用して、３～５ｍＬの緩衝液Ａ／ｇ湿潤バイオマス（緩衝液Ａ：５０ｍＭのＴＲＩＳ／ＨＣｌ；ｐＨ８；５００ｍＭのＮａＣｌ；１．５ｍＭのＥＤＴＡ）でバイオマスを再懸濁し、（ＧＥＡ Ｎｉｒｏ Ｓｏａｖｉ Ｐａｎｄａ ＰＬＵＳを使用して）ホモジナイズした（＞１３００バール、３通路、冷却）。当該ホモジナイズした懸濁液を遠心分離し（１５６５０ｇ；２０分、４℃）、上清を廃棄して細胞残屑を１０ｍＬの緩衝液Ｂ／ｇ湿潤細胞残屑（緩衝液Ｂ：５０ｍＭのＴＲＩＳ／ＨＣｌ；ｐＨ８；５００ｍＭのＮａＣｌ；２Ｍの尿素）で再懸濁し、再び遠心分離した（１５６５０ｇ；２０分、４℃）。緩衝液Ｂを使用した洗浄工程を１回繰り返した。その後、ＩＢ／細胞残屑を水（５ｍＬの水／ｇ湿潤細胞残屑）に再懸濁し、当該懸濁液を、予め秤量した５０ｍＬの反応管に分配し（aliquoted）、遠心分離し（１５６５０ｇ；２０分、４℃）、ペレットをさらなる使用まで－２０℃で保存した。
【0178】
（可溶化）
可溶化のために、凍結したＩＢのアリコートを解凍し、湿潤封入体（ｗＩＢ）重量を算出するために秤量し、適切な可溶化緩衝液（可溶化緩衝液１：５０ｍＭのＴＲＩＳ／ＨＣｌ；ｐＨ８；６Ｍの尿素／可溶化緩衝液２：５０ｍＭのグリシン；ｐＨ１０；６Ｍの尿素）に再懸濁して、１００ｇ／ＬのｗＩＢ濃度とした。再懸濁後、ＤＴＴを添加し（１ＭのＤＴＴ原液を使用）、可溶化ミックス中の１ｍＭ～２８．４４ｍＭのＤＴＴの間で振った最終濃度とし、当該可溶化ミックスをインキュベートし（室温；０．５時間；弱く攪拌）、続いて遠心分離した（２０３７９ｇ；２０分；４℃）。上清を直ちにリフォールディングに使用し、ペレットは廃棄した。
可溶化のために、凍結したＩＢのアリコートを解凍し、湿潤封入体（ｗＩＢ）重量を算出するために秤量し、適切な可溶化緩衝液（可溶化緩衝液１：５０ｍＭのＴＲＩＳ／ＨＣｌ；ｐＨ８；６Ｍの尿素／可溶化緩衝液２：５０ｍＭのグリシン；ｐＨ１０；６Ｍの尿素）に再懸濁して、１００ｇ／ＬのｗＩＢ濃度とした。再懸濁後、ＤＴＴを添加し（１ＭのＤＴＴ原液を使用）、可溶化ミックス中の１ｍＭ～２８．４４ｍＭのＤＴＴの間で振った最終濃度とし、当該可溶化ミックスをインキュベートし（室温；０．５時間；弱く攪拌）、続いて遠心分離した（２０３７９ｇ；２０分；４℃）。上清を直ちにリフォールディングに使用し、ペレットは廃棄した。
【0179】
実施例２．小スケールのリフォールディング実験
（分析方法）
（ブラッドフォード）：タンパク質濃度は、室温での１０分間のインキュベーション後に、Ｇｅｎｅｓｙｓ２０ Ｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用して５９５ｎｍで吸光を測定し、ブラッドフォードアッセイを用いて求めた。スタンダードとしてウシ血清アルブミンを使用した。
（分析方法）
（ブラッドフォード）：タンパク質濃度は、室温での１０分間のインキュベーション後に、Ｇｅｎｅｓｙｓ２０ Ｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用して５９５ｎｍで吸光を測定し、ブラッドフォードアッセイを用いて求めた。スタンダードとしてウシ血清アルブミンを使用した。
【0180】
（酵素活性測定）：平底ポリスチレン９６ウエルプレートを使用してＴｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ＰＲＯによってＨＲＰ酵素活性を測定した。正確にフォールディングされたＨＲＰの濃度に応じて、サンプルを希釈緩衝液（希釈緩衝液：２０ｍＭのＢｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ７）；７％ｖ／ｖのグリセロール）において１：５０～１：２００に希釈した。上記のウエルにおいて１７０μＬのＡＢＴＳ溶液（５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ５）中５ｍＭのＡＢＴＳ）を１０μＬの希釈サンプルと混合し、その後、２０μＬのＨ２Ｏ２（１０ｍＭのＨ２Ｏ２）を添加して反応を開始した。直後に、２分にわたって４２０ｎｍにおける吸光の変化を（３０℃で）記録した。体積酵素活性を、以下の式を使用して算出した：
【0181】
【数1】
【0182】
Ｖｔｏｔａｌ ・・・キュベットにおける総体積［μｌ］
ΔＡ／ｍｉｎ ・・・吸光の変化［Δ吸収（４２０ｎｍ）／分］
ｄｉｌｕｔｉｏｎ・・・サンプルの希釈
Ｖｓａｍｐｌｅ ・・・サンプルの体積［μｌ］
ｄ・・・反応を通してのビーム路の長さ（ｄ＝０．５８ｃｍ）
ε・・・吸光係数（ε４２０＝３６ｍＭ－１ｃｍ－１）。
ΔＡ／ｍｉｎ ・・・吸光の変化［Δ吸収（４２０ｎｍ）／分］
ｄｉｌｕｔｉｏｎ・・・サンプルの希釈
Ｖｓａｍｐｌｅ ・・・サンプルの体積［μｌ］
ｄ・・・反応を通してのビーム路の長さ（ｄ＝０．５８ｃｍ）
ε・・・吸光係数（ε４２０＝３６ｍＭ－１ｃｍ－１）。
【0183】
（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）：ＨＩＣによる捕捉工程の後の活性ＨＲＰ画分の純度を、ＳＥＣ－ＨＰＬＣを使用して測定した。このために、ＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ ＳＥＣ カラム、２００Å、３．５μｍ、７．８ｍｍ×１５０ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ）を使用した。この方法を１００％の緩衝液Ａ（緩衝液Ａ：８０ｍＭのリン酸塩（ｐＨ６．８）；２５０ｍＭのＫＣｌ）を用いて０．５ｍＬ／分で１８分間行った。前記カラムを２５℃の一定温度で保ち、２１４ｎｍ、２８０ｎｍ及び４０４ｎｍを測定した。
【0184】
（Ｒｅｉｎｈｅｉｔｓｚａｈｌ（ＲＺ））：Ｒｅｉｎｈｅｉｔｓｚａｈｌを２８０ｎｍに対する４０４ｎｍの吸光度比として測定した。吸光度測定は、Ｈｉｔａｃｈｉ Ｄｏｕｂｌｅ Ｂｅａｍ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ Ｕ－２９００を使用して行った。
【0185】
（ＭＯＤＤＥ１０）：実験計画法（ＤｏＥ）の計画及び分析は、Ｕｍｅｔｒｉｃｓ ＭＯＤＤＥ１０を使用して行った。
【0186】
（実験の設定）
全般的な材料及び方法は、実施例１に記載されている通りとした。小スケールのリフォールディング実験は全て２ｍＬの反応管を使用して行った。溶解物（solubilizate）を適切なリフォールディング緩衝液で１：４０で希釈し（リフォールディング緩衝液１：２０ｍＭのＴＲＩＳ／ＨＣｌ；ｐＨ８．５；２Ｍの尿素；２ｍＭのＣａＣｌ２；７％ｖ／ｖのグリセロール；変化させたＧＳＳＧ濃度／リフォールディング緩衝液２：２０ｍＭのグリシン；ｐＨ１０；２Ｍの尿素；２ｍＭのＣａＣｌ２；７％ｖ／ｖのグリセロール；変化させたＧＳＳＧ濃度）、続いて、４℃で４８時間、弱く攪拌しながらインキュベートした。全ての実験に使用した１ｍＭのヘミン原液溶液は、１００ｍＭのＫＯＨ中で調製した。
全般的な材料及び方法は、実施例１に記載されている通りとした。小スケールのリフォールディング実験は全て２ｍＬの反応管を使用して行った。溶解物（solubilizate）を適切なリフォールディング緩衝液で１：４０で希釈し（リフォールディング緩衝液１：２０ｍＭのＴＲＩＳ／ＨＣｌ；ｐＨ８．５；２Ｍの尿素；２ｍＭのＣａＣｌ２；７％ｖ／ｖのグリセロール；変化させたＧＳＳＧ濃度／リフォールディング緩衝液２：２０ｍＭのグリシン；ｐＨ１０；２Ｍの尿素；２ｍＭのＣａＣｌ２；７％ｖ／ｖのグリセロール；変化させたＧＳＳＧ濃度）、続いて、４℃で４８時間、弱く攪拌しながらインキュベートした。全ての実験に使用した１ｍＭのヘミン原液溶液は、１００ｍＭのＫＯＨ中で調製した。
【0187】
（ＤｏＥ１）：第１のＤｏＥ（実験計画法）では、可溶化のためのＤＴＴ濃度（可溶化緩衝液１；ｐＨ８）及びリフォールディング緩衝液（リフォールディング緩衝液１；ｐＨ８．５）中のＧＳＳＧ濃度を変動させ（表１を参照されたい）、ヘミン添加は２０時間後２０μＭで一定に保った。リフォールディング後の体積活性をレスポンスとして用いるＣＣＦ（central composite face-centered design；中心複合計画）を使用した。
【0188】
【表1】
【0189】
（ＤｏＥ２）：第２のＤｏＥでは、可溶化のためのＤＴＴ濃度（可溶化緩衝液１；ｐＨ８）、リフォールディング緩衝液（リフォールディング緩衝液１；ｐＨ８．５）中のＧＳＳＧ濃度、及びリフォールディングミックスにおけるタンパク質濃度を変動させ（表２を参照されたい）、ヘミン添加は、２０時間後２０μＭで一定に保った。リフォールディング後の体積活性及び比活性をレスポンスとして用いるＣＣＦ（中心複合計画）を使用した。
【0190】
【表2】
【0191】
（ＤｏＥ３）：第３のＤｏＥでは、可溶化のためのＤＴＴ濃度、リフォールディング緩衝液におけるＧＳＳＧ濃度、並びに可溶化緩衝液及びリフォールディング緩衝液のｐＨを変動させた（表３を参照されたい）。ｐＨ８．５では、可溶化及びリフォールディング緩衝液１を使用し、ｐＨ１０では、可溶化及びリフォールディング緩衝液２を使用した。ヘミン添加は、２０時間後２０μＭで一定に保った。リフォールディング後の体積活性をレスポンスとして用いるＣＣＦ（中心複合計画）を使用した。
【0192】
【表3】
【0193】
（ＤｏＥ４）：このＤｏＥでは、ヘミン添加の時間及び濃度を、それぞれ、リフォールディング開始後０時間～２４時間、及び６μＭ～８０μＭのヘミンの間で変動させた。使用した正確なファクターを表４に示す。全ての実験で可溶化緩衝液１（ｐＨ８）及びリフォールディング緩衝液１（ｐＨ８．５）を使用した。両ファクターを最適化するために、体積活性をレスポンスとして使用した。
【0194】
【表4】
【0195】
（結果：ヘミン添加）
リフォールディング開始後のヘミンの最適濃度及び最適な添加時間を評価するために、体積活性をレスポンスとして用いた小スケール実験で、いくつかの異なる条件をスクリーニングした。結果を図１に提示する。リフォールディング開始後０時間でのヘミン添加では、リフォールディング収率はヘミン濃度に強い依存性を示し、より高いヘミン濃度は、最適化された条件と比較して、１０倍を超える低減につながった。さらに、前記リフォールディング収率は、最低のヘミン濃度（６μＭ）であっても６０％まで低減する。この影響は、ヘミン添加時間がより遅いと低減され、２４時間後の添加ではヘミン濃度の影響は殆どみられなかった。さらなる実験のために、２０μＭを選択した。
リフォールディング開始後のヘミンの最適濃度及び最適な添加時間を評価するために、体積活性をレスポンスとして用いた小スケール実験で、いくつかの異なる条件をスクリーニングした。結果を図１に提示する。リフォールディング開始後０時間でのヘミン添加では、リフォールディング収率はヘミン濃度に強い依存性を示し、より高いヘミン濃度は、最適化された条件と比較して、１０倍を超える低減につながった。さらに、前記リフォールディング収率は、最低のヘミン濃度（６μＭ）であっても６０％まで低減する。この影響は、ヘミン添加時間がより遅いと低減され、２４時間後の添加ではヘミン濃度の影響は殆どみられなかった。さらなる実験のために、２０μＭを選択した。
【0196】
（結果：レドックスシステム）
第１工程において、可溶化及びリフォールディングの際の最適なレドックスシステムを得るために、ＤＴＴ及びＧＳＳＧ濃度を使用する実験計画法を実施した（ＤｏＥ１）。このアプローチは、２の単位操作である可溶化及びリフォールディングに及んでおり、且つリフォールディング収率（体積活性）をレスポンスとして使用するという利点を有する。これにより、例えば単一の単位操作を最適化するために可溶化収率をレスポンスとして使用する場合と比べて、このプロセスの最終収率が最大化される。図２は、実施したＤｏＥ１についての等高線プロットを示し、ＭＯＤＤＥ最適化機能を使用した算出により、可溶化の際の７．１１ｍＭのＤＴＴ（緩衝液１；ｐＨ８）及び１．２７ｍＭのＧＳＳＧ（緩衝液１；ｐＨ８．５）で最大のリフォールディング収率が得られている。使用した１：４０の希釈では（リフォールディング緩衝液中の可溶化ミックス）、これは７：１のＧＳＳＧ：ＤＴＴ比に等しい。
第１工程において、可溶化及びリフォールディングの際の最適なレドックスシステムを得るために、ＤＴＴ及びＧＳＳＧ濃度を使用する実験計画法を実施した（ＤｏＥ１）。このアプローチは、２の単位操作である可溶化及びリフォールディングに及んでおり、且つリフォールディング収率（体積活性）をレスポンスとして使用するという利点を有する。これにより、例えば単一の単位操作を最適化するために可溶化収率をレスポンスとして使用する場合と比べて、このプロセスの最終収率が最大化される。図２は、実施したＤｏＥ１についての等高線プロットを示し、ＭＯＤＤＥ最適化機能を使用した算出により、可溶化の際の７．１１ｍＭのＤＴＴ（緩衝液１；ｐＨ８）及び１．２７ｍＭのＧＳＳＧ（緩衝液１；ｐＨ８．５）で最大のリフォールディング収率が得られている。使用した１：４０の希釈では（リフォールディング緩衝液中の可溶化ミックス）、これは７：１のＧＳＳＧ：ＤＴＴ比に等しい。
【0197】
レドックス対ＤＴＴ／ＧＳＳＧのｐＨ依存性をカバーするために、ｐＨ（７；８．５；１０）をさらなるファクターとしたことを除き、ＤｏＥ１と同様のＤｏＥを実施した。ｐＨ７におけるリフォールディングでは、ＤＴＴ及びＧＳＳＧの全ての組み合わせで、より低い結果が得られ、このことはモデルに大きく影響する。これは、ｐＨ８．５及び１０でのＤＴＴ及びＧＳＳＧについての悪い予測につながる。したがって、ｐＨ７をモデルから除外した。図３は、体積活性をレスポンスとして用いる最終モデルについての４Ｄ等高線プロットを示す。ｐＨ１０では、最高収率は、６．７ｍＭのＤＴＴ及び１．２６ｍＭのＧＳＳＧで達成される。
【0198】
実施例３．リフォールディングリアクター実験
全般的な材料及び方法は、別途特定されない限り、実施例１に記載されている通りであった。分析方法は実施例２に記載されているように使用した。
全般的な材料及び方法は、別途特定されない限り、実施例１に記載されている通りであった。分析方法は実施例２に記載されているように使用した。
【0199】
（リアクターの設定）
より大スケールでのリフォールディングでは、３．６Ｌの容器体積を有するＩｎｆｏｒｓ Ｌａｂｆｏｒｓ５を使用した。全てのデータ収集及びプロセス制御は、Ｌｕｃｕｌｌｕｓ ＰＩＭＳを使用して行った。温度は、ガラス容器の二重ジャケットに接続されたＬａｕｄａ Ａｌｐｈａ Ｒ８サーモスタットを使用して、リフォールディング中１０℃で一定に保った。温度は、前記Ｉｎｆｏｒｓ Ｌａｂｆｏｒｓ５に接続させた温度センサを使用してモニタリングした。加えて、ｐＨ、ｄＯ２及びレドックス電位をモニタリングした。前記ｐＨ及びｄＯ２を、前記Ｉｎｆｏｒｓ Ｌａｂｆｏｒｓ５に接続したそれぞれのプローブによって測定した。前記レドックス電位を、Ｌｕｃｕｌｌｕｓプロセスシステムに接続されたＨａｍｉｌｔｏｎ ＥａｓｙＦｅｒｍ Ｐｌｕｓ ＯＲＰ Ａｒｃ４２５を使用してモニタリングした。ヘミンフィードは、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｅｎｔｒｉｓスケールと組み合わせたＬＡＭＢＤＡ ＰＲＥＣＩＦＬＯＷ蠕動液体ポンプを使用して適用し、Ｌｕｃｕｌｌｕｓを使用したＰＩＤ－フィードフォワード制御を可能にした。
より大スケールでのリフォールディングでは、３．６Ｌの容器体積を有するＩｎｆｏｒｓ Ｌａｂｆｏｒｓ５を使用した。全てのデータ収集及びプロセス制御は、Ｌｕｃｕｌｌｕｓ ＰＩＭＳを使用して行った。温度は、ガラス容器の二重ジャケットに接続されたＬａｕｄａ Ａｌｐｈａ Ｒ８サーモスタットを使用して、リフォールディング中１０℃で一定に保った。温度は、前記Ｉｎｆｏｒｓ Ｌａｂｆｏｒｓ５に接続させた温度センサを使用してモニタリングした。加えて、ｐＨ、ｄＯ２及びレドックス電位をモニタリングした。前記ｐＨ及びｄＯ２を、前記Ｉｎｆｏｒｓ Ｌａｂｆｏｒｓ５に接続したそれぞれのプローブによって測定した。前記レドックス電位を、Ｌｕｃｕｌｌｕｓプロセスシステムに接続されたＨａｍｉｌｔｏｎ ＥａｓｙＦｅｒｍ Ｐｌｕｓ ＯＲＰ Ａｒｃ４２５を使用してモニタリングした。ヘミンフィードは、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｅｎｔｒｉｓスケールと組み合わせたＬＡＭＢＤＡ ＰＲＥＣＩＦＬＯＷ蠕動液体ポンプを使用して適用し、Ｌｕｃｕｌｌｕｓを使用したＰＩＤ－フィードフォワード制御を可能にした。
【0200】
前記容器の最終リフォールディング体積を１．２Ｌで一定に保った（３０ｍＬの溶解物の使用及び１：４０の希釈において生じる）。前記小スケール実験について言及したものと同じ緩衝液組成物（実施例２；リフォールディング緩衝液１又はリフォールディング緩衝液２）を使用した。
【0201】
（リアクターラン）
（リアクター実験１）：この実験では、可溶化ミックスは１ｍＭのＤＴＴを含有し、リフォールディング緩衝液は０．３５ｍＭのＧＳＳＧを含有した。可溶化緩衝液１（ｐＨ８）及びリフォールディング緩衝液１（ｐＨ８．５）を使用した。ヘミンをリフォールディング開始２０時間後に添加して最終濃度を２０μＭとした。
（リアクター実験１）：この実験では、可溶化ミックスは１ｍＭのＤＴＴを含有し、リフォールディング緩衝液は０．３５ｍＭのＧＳＳＧを含有した。可溶化緩衝液１（ｐＨ８）及びリフォールディング緩衝液１（ｐＨ８．５）を使用した。ヘミンをリフォールディング開始２０時間後に添加して最終濃度を２０μＭとした。
【0202】
（リアクター実験２）：この実験では、可溶化ミックスは７．１１ｍＭのＤＴＴを含有し、リフォールディング緩衝液は１．２７ｍＭのＧＳＳＧを含有した。可溶化緩衝液１（ｐＨ８）及びリフォールディング緩衝液１（ｐＨ８．５）を使用した。ヘミンをリフォールディング開始２０時間後に添加して最終濃度を２０μＭとした。サンプル（反応管において２ｍＬ）を２時間毎に採取し、ヘミンを添加して２０μＭの最終濃度とし（ヘミン添加前に採取したサンプルについてのみ；ヘミン添加後のサンプルは既に２０μＭを含有していた）、インキュベートし（２時間；４℃、弱く攪拌）、次いで酵素活性を測定した。
【0203】
（リアクター実験３）：この実験では、可溶化ミックスは１ｍＭのＤＴＴを含有し、リフォールディング緩衝液は０．３５ｍＭのＧＳＳＧを含有した。可溶化緩衝液２（ｐＨ１０）及びリフォールディング緩衝液２（ｐＨ１０）を使用した。ヘミンをリフォールディング開始２０時間後に添加して最終濃度を２０μＭとした。
【0204】
（リアクター実験４）：この実験では、可溶化ミックスは７．１１ｍＭのＤＴＴを含有し、リフォールディング緩衝液は１．２７ｍＭのＧＳＳＧを含有した。可溶化緩衝液２（ｐＨ１０）及びリフォールディング緩衝液２（ｐＨ１０）を使用した。ヘミンをリフォールディング開始２０時間後に添加して最終濃度を２０μＭとした。
【0205】
（リアクター実験５）：この実験では、可溶化ミックスは７．１１ｍＭのＤＴＴを含有し、リフォールディング緩衝液は１．２７ｍＭのＧＳＳＧを含有した。可溶化緩衝液１（ｐＨ８）及びリフォールディング緩衝液１（ｐＨ８．５）を使用した。一定のフィード（２ｍＬ、１ｍＭのヘミン／時；最終濃度：２０μＭのヘミン）を、リフォールディング開始８時間後から２０時間後まで（１２時間のフィード時間）適用した。リアクター２については、サンプルを２時間毎に抜き出し、活性を測定した。上記のヘミンフィードの開始後、サンプルを、直接（当該ヘミンフィードの開始時に低ヘミン濃度で）、並びに２０μＭのヘミン最終濃度となるまでのヘミン添加及び２時間のインキュベーションの後に加えての両方で測定した。
【0206】
（結果：ヘミン添加時間）
小スケールの最適化（実施例２）に基づいて、リフォールディング開始から２０時間後の最終濃度２０μＭのヘミン添加をリアクター実験２に使用した。ヘミンの添加の前（すなわち、最初の２０時間）、サンプルを２時間毎に採取して活性をａｔ－ｌｉｎｅで測定した（図４）。リフォールディングの成功と相関する体積活性を測定するために、サンプリング直後に２０μＭのヘミンを各サンプルに添加し、２時間のインキュベーション後に前記活性を測定した。リアクターへのヘミンの添加後（すなわち、２０時間後）は、サンプルを２時間毎にさらに採取したが、さらなるヘミンは添加しなかった。さらに、前記サンプルを前述と同じ条件下でインキュベートした（測定前２時間）。ａｔ－ｌｉｎｅ活性測定について分かるように、リフォールディングは、およそ１０時間後に完了し、その後、前記活性は、ヘミンが添加されるまで停滞している。リアクターへのヘミン添加後の活性上昇は、恐らく、より良好な表面対体積比及びより良好な混合などの、リアクターでの良好な条件に起因するものである。
小スケールの最適化（実施例２）に基づいて、リフォールディング開始から２０時間後の最終濃度２０μＭのヘミン添加をリアクター実験２に使用した。ヘミンの添加の前（すなわち、最初の２０時間）、サンプルを２時間毎に採取して活性をａｔ－ｌｉｎｅで測定した（図４）。リフォールディングの成功と相関する体積活性を測定するために、サンプリング直後に２０μＭのヘミンを各サンプルに添加し、２時間のインキュベーション後に前記活性を測定した。リアクターへのヘミンの添加後（すなわち、２０時間後）は、サンプルを２時間毎にさらに採取したが、さらなるヘミンは添加しなかった。さらに、前記サンプルを前述と同じ条件下でインキュベートした（測定前２時間）。ａｔ－ｌｉｎｅ活性測定について分かるように、リフォールディングは、およそ１０時間後に完了し、その後、前記活性は、ヘミンが添加されるまで停滞している。リアクターへのヘミン添加後の活性上昇は、恐らく、より良好な表面対体積比及びより良好な混合などの、リアクターでの良好な条件に起因するものである。
【0207】
【表5】
【0208】
これらの実験は、驚くべきことに、リフォールディングミックスをヘム補因子の添加の前の期間でインキュベートすることが有利であることを実証している。ヘミンの疎水性の性質が、リフォールディングプロセスの際に凝集を促進したと見られる。小スケールの実験を使用して示されるように、より高濃度のヘミンは早期に添加されるとリフォールディング収率を顕著に低減させ、これは添加が遅い場合には存在しない効果である。反応において疎水性物質（この場合、ヘミン）を早期に添加することにより、タンパク質凝集を促進して、より低いリフォールディング収率につながっている可能性がある。しかし、フォールディング反応が完了した後では（ＨＲＰでは使用した条件で約１０時間）、ヘミンの添加は、ヘミンの取り込みがホロ酵素形成における最後の工程であるため、（試験した全ての濃度について）凝集につながらない。
【0209】
（結果：線形ヘミンフィード）
リアクター実験５では、リフォールディングの開始８時間後に、１２時間の合計フィード継続時間で線形ヘミンフィードを適用した。サンプルはリアクター実験２について記載されているサンプリング手順にしたがって（２時間毎）抜き出した。前記ヘミンフィードの開始後、サンプルを、さらなるヘミン添加をすることなく１回（すなわち、ヘミンフィードの開始時における低いヘミン濃度で；表６におけるサンプルｂ１～ｂ１０）、及び２０μＭのヘミン最終濃度となるようにヘミンを添加してさらに２時間インキュベーションした後に１回（表６におけるサンプルａ１～ａ９）の両方で測定した。
リアクター実験５では、リフォールディングの開始８時間後に、１２時間の合計フィード継続時間で線形ヘミンフィードを適用した。サンプルはリアクター実験２について記載されているサンプリング手順にしたがって（２時間毎）抜き出した。前記ヘミンフィードの開始後、サンプルを、さらなるヘミン添加をすることなく１回（すなわち、ヘミンフィードの開始時における低いヘミン濃度で；表６におけるサンプルｂ１～ｂ１０）、及び２０μＭのヘミン最終濃度となるようにヘミンを添加してさらに２時間インキュベーションした後に１回（表６におけるサンプルａ１～ａ９）の両方で測定した。
【0210】
【表6】
【0211】
１回のバッチ添加に対する、ある特定の期間にわたって配分されるヘミン添加の有益な効果は、リアクター実験２及び５の比較から明らかである。実験２、サンプル４及び実験５、サンプルａ４はいずれも、リフォールディングの開始６時間後の２０μＭのヘミンのバッチ添加、及びさらに２時間後の測定に基づいている。結果として、観察された体積活性は、非常に類似している（３１．９７±０．５２対３３．１０±１．４９）。このことは、サンプルの結果がこれらの実験間で比較され得ることを実証している。バッチ添加とより長い期間にわたる添加との間の差は、実験２、サンプル１０（１８時間後の２０μＭのヘミンのバッチ添加、２０時間後に測定：３５．４４±０．８６）及び実験５、サンプルｂ６（リフォールディング後８時間～２０時間で線形フィードとして２０μＭのヘミンを添加、２０．５時間後に測定：６２．４０±２．１０）の比較から明らかである。これらの２のサンプル間の差はヘミン添加の継続時間のみであり（バッチとして一度に又は１２時間にわたって配分）、より長期間にわたってのヘミン添加の配分が、優れた結果につながることを明らかに実証している。
【0212】
図５は、レドックス電位、及び測定した体積活性を示す。リアクター実験２と比較して（図４）、リフォールディングの最初は、両方の実験で非常に類似しており、８時間後に達成された体積活性は、実験２で３２．０、実験５で３３．１である。しかし、実験５に適用した線形ヘミンフィードは、ヘミン添加後の実験２と比較してリフォールディング収率の２５％の増加につながる。
【0213】
（結果：レドックスシステム）
小スケールの実験（実施例２）を使用して得られた結果を確認するために、４つのリアクター実験を実施した。条件及び最終比活性を表７に列挙する。概して、これらの結果は、前記小スケールの実験を使用して得られた結果とよく一致しており、ｐＨ１０での最適化されたＤＴＴ／ＧＳＳＧ濃度が最も高いリフォールディング収率を示している。
小スケールの実験（実施例２）を使用して得られた結果を確認するために、４つのリアクター実験を実施した。条件及び最終比活性を表７に列挙する。概して、これらの結果は、前記小スケールの実験を使用して得られた結果とよく一致しており、ｐＨ１０での最適化されたＤＴＴ／ＧＳＳＧ濃度が最も高いリフォールディング収率を示している。
【0214】
【表7】
【0215】
実施例４．リフォールディング後の捕捉
全般的な材料及び方法は、実施例１において記載されている通りとした。分析方法は、実施例２に記載されているように使用した。
全般的な材料及び方法は、実施例１において記載されている通りとした。分析方法は、実施例２に記載されているように使用した。
【0216】
この例において、リフォールディング後の捕捉工程として疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）を使用した。これは、結合条件が、過剰のヘミン、凝集体及び不純物などの不純物を析出させる高い塩濃度を必要とする一方、正確にフォールディングされたＨＲＰが高い塩濃度まで安定である、という利点を有する。このことは、捕捉工程に使用されるロードからこれらの不純物が分離されて、より高い結合能をもたらし、クロマトグラフィ樹脂のより容易な洗浄及び再生をもたらすという利点を有する。
【0217】
（小スケール析出実験）
ＨＩＣ（疎水性相互作用クロマトグラフィ）を使用した捕捉工程での最も良好な塩濃度を見出すために、異なる濃度の（ＮＨ４）２ＳＯ４及びＮａＣｌを２ｍＬの反応管で試験した。適切な量の塩（表８を参照されたい）を２ｍＬの反応管において秤量し、（リフォールディングが完了した後）１ｍＬのリフォールディングミックスを添加した。前記塩を溶解するために前記反応管を混ぜ、室温で弱く攪拌しながら３０分間インキュベートした。遠心分離（２０３７９ｇ；２０分；４℃）後、上清をブラッドフォード及び活性測定に使用した。次いで最も良好な条件を使用して、より大きい体積を使用して、様々なＨＩＣ実験のロードを調製した。そのため、前記塩を１０分以内に連続攪拌下でゆっくり添加し、次いで溶液を室温で２０分間攪拌しながらインキュベートし、次いで遠心分離した（２０３７９ｇ；２０分；２２℃）。
ＨＩＣ（疎水性相互作用クロマトグラフィ）を使用した捕捉工程での最も良好な塩濃度を見出すために、異なる濃度の（ＮＨ４）２ＳＯ４及びＮａＣｌを２ｍＬの反応管で試験した。適切な量の塩（表８を参照されたい）を２ｍＬの反応管において秤量し、（リフォールディングが完了した後）１ｍＬのリフォールディングミックスを添加した。前記塩を溶解するために前記反応管を混ぜ、室温で弱く攪拌しながら３０分間インキュベートした。遠心分離（２０３７９ｇ；２０分；４℃）後、上清をブラッドフォード及び活性測定に使用した。次いで最も良好な条件を使用して、より大きい体積を使用して、様々なＨＩＣ実験のロードを調製した。そのため、前記塩を１０分以内に連続攪拌下でゆっくり添加し、次いで溶液を室温で２０分間攪拌しながらインキュベートし、次いで遠心分離した（２０３７９ｇ；２０分；２２℃）。
【0218】
【表8】
【0219】
ＡＫＴＡ Ｐｕｒｅシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を記載されているクロマトグラフィ工程の全てに使用した。３波長（２１４ｎｍ、２８０ｎｍ及び４０４ｎｍ）及び伝導率をモニタリングした。
【0220】
２つの異なる塩、すなわち（ＮＨ４）２ＳＯ４及びＮａＣｌを析出工程について試験した。最適な塩濃度を見出すために、いくつかの塩濃度の両方の塩を２ｍＬの反応管において試験した。結果を表９及び表１０に列挙する。通常は、ＨＩＣ樹脂において結合する標的タンパク質に必要とされる最も低い塩濃度をロードの調製に使用する。これは、この濃度で不純物の結合が最も低い量となるからである。しかし、ここでは、活性ＨＲＰが析出しない最も高い量を選択した。１つには、これにより、確実に、多量の不純物が析出することになった（表９における精製係数（purification factor）を参照されたい）。他方で、これらの条件において前記樹脂に結合したほとんど全ての不純物が、より疎水性であり、したがって、より低い塩濃度においても結合し得た。加えて、結合強度の差が、これらの不純物から活性ＨＲＰを分離することを容易にした。この理由で、１Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４又は４ＭのＮａＣｌをロードの調製に選択した。
【0221】
【表9】
【0222】
【表10】
【0223】
小スケールの実験について得られた結果を、表１１に列挙する、１５０ｍＬの体積によるベンチスケールの実験を使用して検証した。選択した塩濃度についての体積活性の回収は、それぞれ、（ＮＨ４）２ＳＯ４及びＮａＣｌについて９６％及び９５％であった。比活性は、（ＮＨ４）２ＳＯ４では２．５倍、ＮａＣｌでは４．５倍増加し、引き続くＨＩＣ工程でのロードとして有利な条件をもたらした。
【0224】
【表11】
【0225】
（ＨＩＣ実験１（ＨＩＣ１））
２６７ｇのＮａＣｌ／１Ｌのリフォールディングミックスを添加することによって、上記に記載されているようにロードを調製した。１ｍＬのＨｉＴｒａｐ Ｂｕｔｙｌ ＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を０．５ｍＬ／分の流量で使用した（７５ｃｍ／時間；０．５ＣＶ／分；ＣＶ＝カラム体積）。このカラムを緩衝液Ａ（緩衝液Ａ：２０ｍＭのＢｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ７）；７％のグリセロール；４ＭのＮａＣｌ）によって平衡化し、平衡化の際に全てのシグナルが一定になった後に４９ｍＬのロードをアプライした。これらのロードの後、緩衝液Ａによる洗浄工程（８ｍＬ；８ＣＶ）を実施した。その後、段階溶出を２５％の緩衝液Ｂ（緩衝液Ｂ：２０ｍＭのＢｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ７）；７％のグリセロール／８ｍＬ；８ＣＶ）、７５％の緩衝液Ｂ（１０ｍＬ；１０ＣＶ）及び１００％（１７ｍＬ；１７ＣＶ）緩衝液Ｂによって実施し、活性ＨＲＰが７５％の緩衝液Ｂにおいて溶出した。体積酵素活性［Ｕ／ｍＬ］及びタンパク質濃度を全ての画分について測定した。活性プールの純度を、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ及びＲｅｉｎｈｅｉｔｓｚａｈｌを使用して求めた。
２６７ｇのＮａＣｌ／１Ｌのリフォールディングミックスを添加することによって、上記に記載されているようにロードを調製した。１ｍＬのＨｉＴｒａｐ Ｂｕｔｙｌ ＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を０．５ｍＬ／分の流量で使用した（７５ｃｍ／時間；０．５ＣＶ／分；ＣＶ＝カラム体積）。このカラムを緩衝液Ａ（緩衝液Ａ：２０ｍＭのＢｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ７）；７％のグリセロール；４ＭのＮａＣｌ）によって平衡化し、平衡化の際に全てのシグナルが一定になった後に４９ｍＬのロードをアプライした。これらのロードの後、緩衝液Ａによる洗浄工程（８ｍＬ；８ＣＶ）を実施した。その後、段階溶出を２５％の緩衝液Ｂ（緩衝液Ｂ：２０ｍＭのＢｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ７）；７％のグリセロール／８ｍＬ；８ＣＶ）、７５％の緩衝液Ｂ（１０ｍＬ；１０ＣＶ）及び１００％（１７ｍＬ；１７ＣＶ）緩衝液Ｂによって実施し、活性ＨＲＰが７５％の緩衝液Ｂにおいて溶出した。体積酵素活性［Ｕ／ｍＬ］及びタンパク質濃度を全ての画分について測定した。活性プールの純度を、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ及びＲｅｉｎｈｅｉｔｓｚａｈｌを使用して求めた。
【0226】
この捕捉工程は、リフォールディング後のＨＲＰの精製及び捕捉のための最適化された方法を提示する。図６は、この実験で使用した段階溶出を示し、表１２は、対応する分析結果を示す。活性ＨＲＰをクロマトグラフィ工程のため約９倍に濃縮して０．５ｇ／Ｌとし、これは、スケールアップの際にさらに改良することが期待される。より疎水性の不純物は１００％の緩衝液Ｂで溶出し、この方法に関する良好な分離能につながる。２８０ｎｍシグナルに対する４０４ｎｍシグナルの比は、活性画分についての高い純度を示唆する。このことは、ＳＥＣ－ＨＰＬＣによってさらに確認された（純度≧９８％）。したがって、これは、大腸菌封入体から生産される、純粋な、正確にフォールディングされた、且つ、完全に活性なＨＲＰを得る方法を提示している。
【0227】
【表12】
【0228】
（ＨＩＣ実験２（ＨＩＣ２））
１３２ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４／１Ｌのリフォールディングミックスを添加することによって、上記に記載されているようにロードを調製した。１ｍＬのＨｉＴｒａｐ Ｏｃｔｙｌ ＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を１ｍＬ／分の流量で使用した（１５０ｃｍ／時間；１ＣＶ／分）。このカラムを緩衝液Ａによって平衡化し（緩衝液Ａ：２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．５）；７％のグリセロール；１Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４）、平衡化の際に全てのシグナルが一定になった後に５０ｍＬのロードをアプライした。これらのロードの後、緩衝液Ａによる洗浄工程（１６ｍＬ；１６ＣＶ）を実施した。その後、線形勾配溶出を０～１００％Ｂによって（緩衝液Ｂ：２０ｍＭのＢｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ７）；７％のグリセロール）３０ｍＬで実施した（３０分；３０ＣＶ）。体積酵素活性［Ｕ／ｍＬ］を全ての画分について測定した。ここまでで、活性ＨＲＰの最も高い割合がフロースルーに見出されたため、さらなる分析は適用しなかった。
１３２ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４／１Ｌのリフォールディングミックスを添加することによって、上記に記載されているようにロードを調製した。１ｍＬのＨｉＴｒａｐ Ｏｃｔｙｌ ＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を１ｍＬ／分の流量で使用した（１５０ｃｍ／時間；１ＣＶ／分）。このカラムを緩衝液Ａによって平衡化し（緩衝液Ａ：２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．５）；７％のグリセロール；１Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４）、平衡化の際に全てのシグナルが一定になった後に５０ｍＬのロードをアプライした。これらのロードの後、緩衝液Ａによる洗浄工程（１６ｍＬ；１６ＣＶ）を実施した。その後、線形勾配溶出を０～１００％Ｂによって（緩衝液Ｂ：２０ｍＭのＢｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ７）；７％のグリセロール）３０ｍＬで実施した（３０分；３０ＣＶ）。体積酵素活性［Ｕ／ｍＬ］を全ての画分について測定した。ここまでで、活性ＨＲＰの最も高い割合がフロースルーに見出されたため、さらなる分析は適用しなかった。
【0229】
この捕捉工程では、疎水性が低い樹脂であるＨｉＴｒａｐ Ｏｃｔｙｌ ＦＦ（１ｍＬ）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を使用した。選択した塩濃度（１Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４）では、活性ＨＲＰの７５％が前記カラムに結合せず、フロースルーに見られた（図７及び表１３を参照されたい）。これは、より高い塩濃度を使用して改良され得たが、小スケールの実験では、１Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４よりも高い塩濃度では回収が減少することが示された。したがって、上記の樹脂は、リフォールディング後の活性ＨＲＰの捕捉工程にはあまり有利でないことが結論付けられた。前記カラムの疎水性は結合リガンドの密度に依存するため、これは、より高いリガンド密度を有するオクチル樹脂が使用されれば改良される可能性がある。Octyl Sepharose 4 Fast Flow（５μｍｏｌ／ｍＬ樹脂）についてのリガンド密度は、ＨＩＣ１で使用したＢｕｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（５０μｍｏｌ／ｍＬ樹脂）よりも約１０倍低い。
【0230】
【表13】
【0231】
（ＨＩＣ実験３及び４（ＨＩＣ３及びＨＩＣ４））
ＨＩＣ実験３では、２６７ｇのＮａＣｌ／１Ｌのリフォールディングミックスを添加することによって、上記に記載されているようにロードを調製した。ＨｉＴｒａｐ Ｐｈｅｎｙｌ ＦＦ（Ｈｉｇｈ Ｓｕｂ）１ｍＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を１ｍＬ／分の流量で使用した（１５０ｃｍ／時間；１ＣＶ／分）。このカラムを緩衝液Ａによって平衡化し（緩衝液Ａ：２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．５）；７％のグリセロール；４ＭのＮａＣｌ）、平衡化の際に全てのシグナルが一定になった後に５０ｍＬのロードをアプライした。これらのロードの後、緩衝液Ａによる洗浄工程（９ｍＬ；９ＣＶ）を実施した。その後、線形勾配溶出を３０ｍＬ中０～１００％Ｂによって（緩衝液Ｂ：２０ｍＭのＢｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ７）；７％のグリセロール）実施した（３０分；３０ＣＶ）。体積酵素活性［Ｕ／ｍＬ］を全ての画分について測定した。活性ＨＲＰを含有する画分はより低い濃度を示し、不純物からの良好な分離が示されなかったため、さらなる分析は適用しなかった。
ＨＩＣ実験３では、２６７ｇのＮａＣｌ／１Ｌのリフォールディングミックスを添加することによって、上記に記載されているようにロードを調製した。ＨｉＴｒａｐ Ｐｈｅｎｙｌ ＦＦ（Ｈｉｇｈ Ｓｕｂ）１ｍＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を１ｍＬ／分の流量で使用した（１５０ｃｍ／時間；１ＣＶ／分）。このカラムを緩衝液Ａによって平衡化し（緩衝液Ａ：２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．５）；７％のグリセロール；４ＭのＮａＣｌ）、平衡化の際に全てのシグナルが一定になった後に５０ｍＬのロードをアプライした。これらのロードの後、緩衝液Ａによる洗浄工程（９ｍＬ；９ＣＶ）を実施した。その後、線形勾配溶出を３０ｍＬ中０～１００％Ｂによって（緩衝液Ｂ：２０ｍＭのＢｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ７）；７％のグリセロール）実施した（３０分；３０ＣＶ）。体積酵素活性［Ｕ／ｍＬ］を全ての画分について測定した。活性ＨＲＰを含有する画分はより低い濃度を示し、不純物からの良好な分離が示されなかったため、さらなる分析は適用しなかった。
【0232】
ＨＩＣ実験４では、２６７ｇのＮａＣｌ／１Ｌのリフォールディングミックスを添加することによって、上記に記載されているようにロードを調製した。１ｍＬのＨｉＴｒａｐ Ｐｈｅｎｙｌ ＦＦ（Ｈｉｇｈ Ｓｕｂ）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を０．５ｍＬ／分の流量で使用した（７５ｃｍ／時間；０．５ＣＶ／分）。このカラムを緩衝液Ａによって平衡化し（緩衝液Ａ：２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．５）；７％のグリセロール；４ＭのＮａＣｌ）、平衡化の際に全てのシグナルが一定になった後に５０ｍＬのロードをアプライした。これらのロードの後、緩衝液Ａによる洗浄工程（１０ｍＬ；１０ＣＶ）を実施した。その後、段階溶出を６０％の緩衝液Ｂ（緩衝液Ｂ：２０ｍＭのＢｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ７）；７％のグリセロール／９ｍＬ；９ＣＶ）、９０％の緩衝液Ｂ（２６ｍＬ；２６ＣＶ）及び１００％（３２ｍＬ；３２ＣＶ）緩衝液Ｂによって実施し、活性ＨＲＰが９０％の緩衝液Ｂで溶出した。体積酵素活性［Ｕ／ｍＬ］を全ての画分について測定した。活性ＨＲＰを含有する画分はより低い濃度を示し、不純物からの良好な分離が示されなかったため、さらなる分析は適用しなかった。
【0233】
ＨＩＣ３及びＨＩＣ４では、ＨＩＣ１より高い疎水性を有する樹脂を使用した（ＨｉＴｒａｐ Ｐｈｅｎｙｌ ＦＦ（Ｈｉｇｈ Ｓｕｂ））。ＨＩＣ３では、勾配溶出を使用したが、図８に示すように、活性ＨＲＰとより疎水性の不純物との分離により乏しかった。前記樹脂の高い疎水性に起因して、両方の画分が互いに非常に近くで溶出し、活性ＨＲＰは９０％の緩衝液Ｂ付近で、不純物は１００％の緩衝液Ｂで溶出した。したがって、図９に示すＨＩＣ４で段階溶出を試験した。分離は改善した一方、強いテーリングが示されたことから、９０％の緩衝液Ｂで溶出する活性ＨＲＰ画分についての溶出体積も増加した。
【0234】
（ＨＩＣ実験５（ＨＩＣ５））
リアクター実験４（実施例３）で仕上がったリフォールディングミックスを、この捕捉工程の材料として使用した。ｐＨを２ＭのＨＣｌによって攪拌下で８．５に調整した。その後、２６７ｇのＮａＣｌ／１Ｌのリフォールディングミックスを添加することによって、上記に記載されているようにロードを調製した。Ｂｕｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）で充填され、８０ｍｌの体積を有するカラムを８ｍＬ／分（９０ｃｍ／時間）の流量で使用した。このカラムを緩衝液Ａによって平衡化し（緩衝液Ａ：２０ｍＭのＢｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ７）；４ＭのＮａＣｌ）、平衡化の際に全てのシグナルが一定になった後に７５１ｍＬのロードをアプライした。このロードの後、２０％の緩衝液Ｂによる洗浄工程（緩衝液Ｂ：２０ｍＭのＢｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ７）／１．５ＣＶ）を実施した。その後、７５％の緩衝液Ｂ（３ＣＶ）及び１００％（３ＣＶ）緩衝液Ｂによって段階溶出を実施し、活性ＨＲＰが７５％の緩衝液Ｂにおいて溶出した。体積酵素活性［Ｕ／ｍＬ］及びタンパク質濃度を全ての画分について測定した。活性プールの純度を、Ｒｅｉｎｈｅｉｔｓｚａｈｌを使用して求めた。
リアクター実験４（実施例３）で仕上がったリフォールディングミックスを、この捕捉工程の材料として使用した。ｐＨを２ＭのＨＣｌによって攪拌下で８．５に調整した。その後、２６７ｇのＮａＣｌ／１Ｌのリフォールディングミックスを添加することによって、上記に記載されているようにロードを調製した。Ｂｕｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）で充填され、８０ｍｌの体積を有するカラムを８ｍＬ／分（９０ｃｍ／時間）の流量で使用した。このカラムを緩衝液Ａによって平衡化し（緩衝液Ａ：２０ｍＭのＢｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ７）；４ＭのＮａＣｌ）、平衡化の際に全てのシグナルが一定になった後に７５１ｍＬのロードをアプライした。このロードの後、２０％の緩衝液Ｂによる洗浄工程（緩衝液Ｂ：２０ｍＭのＢｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ７）／１．５ＣＶ）を実施した。その後、７５％の緩衝液Ｂ（３ＣＶ）及び１００％（３ＣＶ）緩衝液Ｂによって段階溶出を実施し、活性ＨＲＰが７５％の緩衝液Ｂにおいて溶出した。体積酵素活性［Ｕ／ｍＬ］及びタンパク質濃度を全ての画分について測定した。活性プールの純度を、Ｒｅｉｎｈｅｉｔｓｚａｈｌを使用して求めた。
【0235】
後の捕捉工程によるｐＨ１０におけるリフォールディングの適合性を確認するために、リアクター実験４のリフォールディングミックスを当該ＨＩＣのロードとして使用した。結合挙動の変化を防止するために、前記リフォールディングミックスのｐＨを塩析の前に８．５に調整した。図１０は、活性ＨＲＰ画分、及び不純物の溶出を示す。活性ＨＲＰは最終濃度０．９５ｇ／Ｌ及び最終体積活性１５００Ｕ／ｍＬにまで濃縮され、Ｒｅｉｎｈｅｉｔｓｚａｈｌは植物ＨＲＰのそれに匹敵した（２．７２）。これらの結果は、１ｍＬのカラム体積からのスケールアップが、ＨＩＣ１で議論されているように、より高い濃度につながるという予測を裏付けた。さらに、ＨＩＣ１で議論されている捕捉工程は、スケールアップ可能であり、ｐＨ１０におけるリフォールディングプロセスに適用可能であることが示された。これは前記ｐＨを、活性ＨＲＰを損失することなく８．５に調整可能であるからである。したがって、塩析に４ＭのＮａＣｌを使用する捕捉工程、及び引き続く疎水性相互作用クロマトグラフィは特に有利であることが証明された。
【0236】
実施例５．全プロセス
（分析方法）
以下の差異点／追加点以外は実施例２に記載されているように分析方法を使用した。
（タンパク質濃度）：タンパク質濃度をブラッドフォードによる方法を使用して求めた（Bradford, M.M., A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical biochemistry, 1976. 72(1-2): p. 248-254）。２００μｌのブラッドフォード溶液を５μｌのサンプルと混合し、５９５ｎｍにおける吸光度の変化を、Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ ＰＲＯ機器を使用して１０分にわたって測定した。
（分析方法）
以下の差異点／追加点以外は実施例２に記載されているように分析方法を使用した。
（タンパク質濃度）：タンパク質濃度をブラッドフォードによる方法を使用して求めた（Bradford, M.M., A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical biochemistry, 1976. 72(1-2): p. 248-254）。２００μｌのブラッドフォード溶液を５μｌのサンプルと混合し、５９５ｎｍにおける吸光度の変化を、Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ ＰＲＯ機器を使用して１０分にわたって測定した。
【0237】
（逆相ＨＰＬＣ）：ＰｏｌｙＰｈｅｎｙｌ ＢｉｏＲｅｓｏｌｖｅ－ＲＰ－ｍＡｂ（２．７μｍ、３．０×１００ｍｍ）カラムを使用したＲＰ ＨＰＬＣによってサンプル中のＨＲＰ濃度を測定した。この方法を、１０分間、以下のプログラムで実行した：
１．２ｍｌ／分の流量で、２５％のＢを０．５分間、５５％のＢを線形勾配において８分間、５５％のＢを０．５分間、及び次いで２５％のＢを１分間（Ａ＝０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含むＭｉｌｌｉＱ水；Ｂ＝０．１％のＴＦＡを含むアセトニトリル）。前記カラムを７５℃の一定温度で保ち、２１４ｎｍ、２８０ｎｍ及び４０４ｎｍを測定した。
１．２ｍｌ／分の流量で、２５％のＢを０．５分間、５５％のＢを線形勾配において８分間、５５％のＢを０．５分間、及び次いで２５％のＢを１分間（Ａ＝０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含むＭｉｌｌｉＱ水；Ｂ＝０．１％のＴＦＡを含むアセトニトリル）。前記カラムを７５℃の一定温度で保ち、２１４ｎｍ、２８０ｎｍ及び４０４ｎｍを測定した。
【0238】
（サイズ排除ＨＰＬＣ）：ＨＩＣによる捕捉工程の後の活性ＨＲＰ画分の純度を、ＳＥＣ－ＨＰＬＣを使用して測定した。このために、ＢＥＨ２００Ａ ＳＥＣ１．７μｍ、４．６×３００ｍｍ、３．５μｍ（Ｗａｔｅｒｓ社）カラムを使用した。この方法を１００％の緩衝液Ａ（緩衝液Ａ：８０ｍＭのリン酸塩（ｐＨ６．８）；２５０ｍＭのＫＣｌ）によって０．３ｍＬ／分で１８分間実行した。前記カラムを３０℃の一定温度で保ち、２１４ｎｍ、２８０ｎｍ及び４０４ｎｍを測定した。
【0239】
（プロセスラン）
細胞株及び増殖条件、並びにホモジナイズ及び封入体洗浄を、実施例１に記載されているように実施した。リフォールディングリアクターを、実施例３に記載されているように使用した。
細胞株及び増殖条件、並びにホモジナイズ及び封入体洗浄を、実施例１に記載されているように実施した。リフォールディングリアクターを、実施例３に記載されているように使用した。
【0240】
可溶化のために、凍結したＩＢのアリコートを解凍し、湿潤封入体（ｗＩＢ）重量を算出するために秤量し、適切な可溶化緩衝液（可溶化緩衝液１：５０ｍＭのＴＲＩＳ／ＨＣｌ；ｐＨ８．５；６Ｍの尿素／可溶化緩衝液２：５０ｍＭのグリシン；ｐＨ１０；６Ｍの尿素）に再懸濁して、１００ｇ／Ｌ（３．５ｇのＩＢ＝３５ｍｌの可溶化ミックス（遠心分離後に３０ｍｌの可溶化ミックスを結果として生じさせる）のｗＩＢ濃度とした。再懸濁後、可溶化ミックス中７．１１ｍＭのＤＴＴの最終濃度となるようにＤＴＴを添加し（１ＭのＤＴＴ原液を使用）、当該可溶化ミックスをインキュベートし（４℃；０．５時間；弱く攪拌）、続いて遠心分離した（２０３７９ｇ；２０分；４℃）。上清をリフォールディング用に直ちに使用し、ペレットを廃棄した。
【0241】
リアクターランをｐＨ８．５及びｐＨ１０において以下のように実施した。
【0242】
ｐＨ８．５では、容器の最終リフォールディング体積は１．２Ｌであった（３０ｍＬの溶解物の使用及び１：４０の希釈において生じる）。リフォールディング緩衝液は、２０ｍＭのＴＲＩＳ／ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、２Ｍの尿素、７％のグリセロール、２ｍＭのＣａＣｌ２、１．２７ｍＭのＧＳＳＧを含有した。一定のフィード（２．４ｍＬ、１ｍＭのヘミン／時間；最終濃度２０μＭのヘミン）をリフォールディング開始８時間後から１８時間後まで適用し（１０時間のフィード時間）、前記リアクターランを１９時間後に終了させた。塩析では、０．２７ｇのＮａＣｌ／ｍｌリフォールディングミックスを室温で攪拌しながら３０分にわたって添加した。その後、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＬＹＮＸ Ｓｏｒｖａｌｌ ６０００遠心分離機で前記リフォールディングミックスを１７，５６８ｇ、４℃で３０分間遠心分離した。上清をＨＩＣのロードとして使用し（塩添加後約１２５０～１３００ｍｌ）、ペレットを廃棄した。
【0243】
ｐＨ１０では、容器の最終リフォールディング体積は１．２Ｌであった（３０ｍＬの溶解物の使用及び１：４０の希釈において生じる）。リフォールディング緩衝液は、２０ｍＭのグリシン（ｐＨ１０）（ＨＣｌで調整）、２Ｍの尿素、７％のグリセロール、２ｍＭのＣａＣｌ２、１．２７ｍＭのＧＳＳＧを含有した。一定のフィード（２．４ｍＬ、１ｍＭのヘミン／時；最終濃度２０μＭのヘミン）をリフォールディング開始８時間後から１８時間後まで適用し（１０時間のフィード時間）、前記リアクターランを１９時間後に終了させた。塩析の前に、ｐＨをＨＣｌによってｐＨ１０からｐＨ８．５に低下させた。次いで、０．２７ｇのＮａＣｌ／ｍｌリフォールディングミックスを室温で攪拌しながら３０分にわたって添加した。その後、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＬＹＮＸ Ｓｏｒｖａｌｌ ６０００遠心分離機で前記リフォールディングミックスを１７，５６８ｇ、４℃で３０分間遠心分離した。上清をＨＩＣのロードとして使用し（塩添加後約１２５０～１３００ｍｌ）、ペレットを廃棄した。
【0244】
ＨＩＣでは、Ｂｕｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）で充填したベッドボリューム８０ｍｌのカラムを使用した。前記カラムを、全てのシグナルが一定になるまで１１３ｃｍ／時間の流量で緩衝液Ａ（緩衝液Ａ：２０ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓ（ｐＨ７）；４ＭのＮａＣｌ）によって平衡化した。次いで、１２５０～１３００ｍＬのロードを、９０ｃｍ／時間の流量でアプライした。これらのロードの後、２０％の緩衝液Ｂ（緩衝液Ｂ：２０ｍＭのＢｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ７））による洗浄工程を２ＣＶについて９０ｃｍ／時間の流量で実施した。その後、段階溶出を７５％の緩衝液Ｂ（７９ｃｍ／時間）及び１００％（９０ｃｍ／時間）緩衝液Ｂによって実施し、活性ＨＲＰが７５％の緩衝液Ｂにおいて溶出した。体積酵素活性［Ｕ／ｍＬ］及びタンパク質濃度を全ての画分について測定した。活性プールの純度を、Ｒｅｉｎｈｅｉｔｓｚａｈｌを使用して求めた。
【0245】
（結果）
小スケールで実施した方法開発実験により、ｐＨ８．５よりもｐＨ１０がリフォールディングにより好適であることが見出された（実施例２を参照されたい）。したがって、同量のＨＲＰ湿潤封入体を用いて、ｐＨ８．５でリフォールディングを行うもの及びｐＨ１０でリフォールディングを行うものの２つのリアクターランを実施した。結果の概説を表１４に見ることができる。ｐＨ８．５でのリフォールディング収率（４４％）と比較すると、ｐＨ１０でのリフォールディングは大きく増加したリフォールディング収率（７４％）につながった。また、Ｒｅｉｎｈｅｉｔｓｚａｈｌはより高く、純粋なＨＲＰの合計収率はｐＨ１０において１．７倍増加する。このことは、小スケールＤｏＥの結果を再確認するものである（実施例２）。図１１及び１２は、ＨＩＣランのクロマトグラムを示す。ここで、ｐＨ１０におけるリフォールディングが、疎水性不純物の顕著な低減及び７５％の緩衝液Ｂでの大きくシャープなＨＲＰピークにつながることが分かる。
小スケールで実施した方法開発実験により、ｐＨ８．５よりもｐＨ１０がリフォールディングにより好適であることが見出された（実施例２を参照されたい）。したがって、同量のＨＲＰ湿潤封入体を用いて、ｐＨ８．５でリフォールディングを行うもの及びｐＨ１０でリフォールディングを行うものの２つのリアクターランを実施した。結果の概説を表１４に見ることができる。ｐＨ８．５でのリフォールディング収率（４４％）と比較すると、ｐＨ１０でのリフォールディングは大きく増加したリフォールディング収率（７４％）につながった。また、Ｒｅｉｎｈｅｉｔｓｚａｈｌはより高く、純粋なＨＲＰの合計収率はｐＨ１０において１．７倍増加する。このことは、小スケールＤｏＥの結果を再確認するものである（実施例２）。図１１及び１２は、ＨＩＣランのクロマトグラムを示す。ここで、ｐＨ１０におけるリフォールディングが、疎水性不純物の顕著な低減及び７５％の緩衝液Ｂでの大きくシャープなＨＲＰピークにつながることが分かる。
【0246】
【表14】
【0247】
実施例６．ＨＲＰ変異研究の材料及び方法
（ＨＲＰ変異体の発現及び精製）
植物ＨＲＰタイプＶＩ－Ａ（カタログ番号：Ｐ６７８２）をＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社（米国ミズーリ州セントルイス）から得た。大腸菌で生産された全てのＨＲＰバリアントは、別途特定されない限り、示されている変異を有する配列番号２に記載されている配列からなった。
（ＨＲＰ変異体の発現及び精製）
植物ＨＲＰタイプＶＩ－Ａ（カタログ番号：Ｐ６７８２）をＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社（米国ミズーリ州セントルイス）から得た。大腸菌で生産された全てのＨＲＰバリアントは、別途特定されない限り、示されている変異を有する配列番号２に記載されている配列からなった。
【0248】
発現宿主及びプラスミド
標準の分子クリーニング技術を、過去に記載されているように実施した（Humer and Spadiut. “Improving the performance of horseradish peroxidase by site-directed mutagenesis.” International Journal of Molecular Sciences 20.4 (2019): 916）。ＨＲＰバリアントＣ１Ａ（野生型ＨＲＰ；配列番号２）をコードするｈｒｐ遺伝子を大腸菌についてコドン最適化し、ＧｅｎＳｒｉｐｔ ＵＳＡ Ｉｎｃ．（米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）から得た。大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｌｕｃｉｇｅｎ社、米国ウィスコンシン州ミドルトン）において、ＨＲＰを、ｐＳＦ－Ｔ７－ＬａｃＯ－ＮＨ２－ｄｓｂＡ（ＯＧ４５９１）（Ｏｘｆｏｒｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｌｔｄ．、英国オクスフォード）又はｐＥＴ２１ｄ＋（Ｎｏｖａｇｅｎ、米国カリフォルニア州サンディエゴ）から生産した。プラスミドｐＳＦＴ７は、ペリプラズム内へのエクスポートのためのＤｓｂタグをコードし、これは移行後に切断される。プラスミドｐＥＴ２１ｄ＋は細胞質内でのＨＲＰ封入体生産に使用した。タンパク質がいずれのタグも伴わずに生産されるように停止コドンを導入した。
標準の分子クリーニング技術を、過去に記載されているように実施した（Humer and Spadiut. “Improving the performance of horseradish peroxidase by site-directed mutagenesis.” International Journal of Molecular Sciences 20.4 (2019): 916）。ＨＲＰバリアントＣ１Ａ（野生型ＨＲＰ；配列番号２）をコードするｈｒｐ遺伝子を大腸菌についてコドン最適化し、ＧｅｎＳｒｉｐｔ ＵＳＡ Ｉｎｃ．（米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）から得た。大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｌｕｃｉｇｅｎ社、米国ウィスコンシン州ミドルトン）において、ＨＲＰを、ｐＳＦ－Ｔ７－ＬａｃＯ－ＮＨ２－ｄｓｂＡ（ＯＧ４５９１）（Ｏｘｆｏｒｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｌｔｄ．、英国オクスフォード）又はｐＥＴ２１ｄ＋（Ｎｏｖａｇｅｎ、米国カリフォルニア州サンディエゴ）から生産した。プラスミドｐＳＦＴ７は、ペリプラズム内へのエクスポートのためのＤｓｂタグをコードし、これは移行後に切断される。プラスミドｐＥＴ２１ｄ＋は細胞質内でのＨＲＰ封入体生産に使用した。タンパク質がいずれのタグも伴わずに生産されるように停止コドンを導入した。
【0249】
タンパク質発現及び封入体（ＩＢ）からの精製
いずれのＮ末端又はＣ末端タグも有さず、ｈｒｐ遺伝子（若しくはそのバリアント）を有するベクターｐＥＴ２１ｄ＋を保有するＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の培養に、ＳＢ培地（３２ｇＬ－１トリプトン；２０ｇＬ－１酵母抽出物；５ｇＬ－１ＮａＣｌ；５ｍＭのＮａＯＨ）を使用した。アンピシリンを１００ｍｇＬ－１の最終濃度となるように添加した。前培養物を５０ｍＬのＳＢＡｍｐ培地において振とうしながら（２５０ｒｐｍ）３７℃で一晩増殖させ、２．５ＬのＵｌｔｒａ Ｙｉｅｌｄ Ｆｌａｓｋｓ（ＵＹＦ）に接種して最終体積５００ｍＬのＳＢＡｍｐ培地において０．３の光学密度（ＯＤ６００）となるようにした。細胞を０．５のＯＤ６００まで振とうしながら（２５０ｒｐｍ）３７℃で増殖させ、その後、０．１ｍＭのイソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することによりｈｒｐ発現を誘導した。２５℃及び２５０ｒｐｍで２０時間の増殖の後、細胞を遠心分離により収集した（５０００ｇ、２０分、４℃）。
いずれのＮ末端又はＣ末端タグも有さず、ｈｒｐ遺伝子（若しくはそのバリアント）を有するベクターｐＥＴ２１ｄ＋を保有するＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の培養に、ＳＢ培地（３２ｇＬ－１トリプトン；２０ｇＬ－１酵母抽出物；５ｇＬ－１ＮａＣｌ；５ｍＭのＮａＯＨ）を使用した。アンピシリンを１００ｍｇＬ－１の最終濃度となるように添加した。前培養物を５０ｍＬのＳＢＡｍｐ培地において振とうしながら（２５０ｒｐｍ）３７℃で一晩増殖させ、２．５ＬのＵｌｔｒａ Ｙｉｅｌｄ Ｆｌａｓｋｓ（ＵＹＦ）に接種して最終体積５００ｍＬのＳＢＡｍｐ培地において０．３の光学密度（ＯＤ６００）となるようにした。細胞を０．５のＯＤ６００まで振とうしながら（２５０ｒｐｍ）３７℃で増殖させ、その後、０．１ｍＭのイソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することによりｈｒｐ発現を誘導した。２５℃及び２５０ｒｐｍで２０時間の増殖の後、細胞を遠心分離により収集した（５０００ｇ、２０分、４℃）。
【0250】
ＩＫＡ Ｔ１０ベーシックＵＬＴＲＡ－ＴＵＲＲＡＸを使用して、３～５ｍＬの緩衝液Ａ／ｇ湿潤バイオマス（緩衝液Ａ：５０ｍＭのＴＲＩＳ／ＨＣｌ；ｐＨ８；５００ｍＭのＮａＣｌ；１．５ｍＭのＥＤＴＡ）でバイオマスを再懸濁し、（ＧＥＡ Ｎｉｒｏ Ｓｏａｖｉ Ｐａｎｄａ ＰＬＵＳを使用して）ホモジナイズした（＞１３００バール、３通路、冷却）。当該ホモジナイズされた懸濁液を遠心分離し（１５６５０ｇ；２０分、４℃）、上清を廃棄して細胞残屑を１０ｍＬの緩衝液Ｂ／ｇ湿潤細胞残屑（緩衝液Ｂ：５０ｍＭのＴＲＩＳ／ＨＣｌ；ｐＨ８；５００ｍＭのＮａＣｌ；２Ｍの尿素）で再懸濁し、再び遠心分離した（１５６５０ｇ；２０分、４℃）。緩衝液Ｂを使用した洗浄工程を１回繰り返した。その後、ＩＢ／細胞残屑を水（５ｍＬの水／ｇ湿潤細胞残屑）に再懸濁し、当該懸濁液を、予め秤量した５０ｍＬの反応管に分配し（aliquoted）、遠心分離し（１５６５０ｇ；２０分、４℃）、ペレットをさらなる使用まで－２０℃で保存した。
【0251】
可溶化のために、凍結したＩＢのアリコートを解凍し、湿潤封入体（ｗＩＢ）重量を算出するために秤量し、適切な可溶化緩衝液（５０ｍＭのＴＲＩＳ／ＨＣｌ；ｐＨ８．５；６Ｍの尿素）に再懸濁して、１００ｇ／ＬのｗＩＢ濃度とした。再懸濁後、可溶化ミックス中７．１１ｍＭのＤＴＴの最終濃度となるようにＤＴＴを添加し（１ＭのＤＴＴ原液を使用）、当該可溶化ミックスをインキュベートし（４℃；０．５時間；弱く攪拌）、続いて遠心分離した（２０３７９ｇ；２０分；４℃）。上清をリフォールディング用に直ちに使用し、ペレットを廃棄した。
【0252】
溶解物を適切なリフォールディング緩衝液（例えば、２０ｍＭのＴＲＩＳ／ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、２Ｍの尿素、７％のグリセロール、２ｍＭのＣａＣｌ２、１．２７ｍＭのＧＳＳＧ）において１：４０に希釈し、これにヘミンを２０μＭの最終濃度で添加して、リフォールディングを１０℃で１９時間実施した。
【0253】
タンパク質を疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）によってさらに精製した。Ｂｕｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）で充填したベッドボリューム８０ｍｌのカラムを使用した。８ｍＬ／分（９０ｃｍ／時間）。前記カラムを、全てのシグナルが一定になるまで１１３ｃｍ／時間の流量で緩衝液Ａによって（緩衝液Ａ：２０ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓ（ｐＨ７）；４ＭのＮａＣｌ）平衡化した。次いで、１２５０～１３００ｍＬのロードを、９０ｃｍ／時間の流量でアプライした。これらのロードの後、２０％の緩衝液Ｂ（緩衝液Ｂ：２０ｍＭのＢｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ７））による洗浄工程を２ＣＶについて９０ｃｍ／時間の流量で実施した。その後、段階溶出を７５％の緩衝液Ｂ（７９ｃｍ／時間）及び１００％（９０ｃｍ／時間）緩衝液Ｂによって実施し、活性ＨＲＰが７５％の緩衝液Ｂにおいて溶出した。
【0254】
いくつかの変異体については、代わりに、タンパク質生産及び精製を、実施例５に記載されている最も好ましい方法を使用して実施した（ｐＨ１０）。
【0255】
（反応速度パラメータ）
酵素の反応速度パラメータを、Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ ＰＲＯ機器（Ｔｅｃａｎ社、スイス、マンドルフ）を使用して９６ウエルプレートアッセイで基質ＡＢＴＳ、ＴＭＢ及び過酸化水素について求めた。
酵素の反応速度パラメータを、Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ ＰＲＯ機器（Ｔｅｃａｎ社、スイス、マンドルフ）を使用して９６ウエルプレートアッセイで基質ＡＢＴＳ、ＴＭＢ及び過酸化水素について求めた。
【0256】
３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を基質として用いる測定では、９６ウエルプレートの各ウエルにおける反応混合物は、最終体積２００μＬの５０ｍＭのリン酸－クエン酸緩衝液（ｐＨ５）中、１ｍＭという飽和性（saturating）の過酸化水素濃度、及び変動させたＴＭＢ濃度（２０～５５０μＭ）を含有した。タンパク質サンプル（５μＬ）を１７５μｌのＴＭＢ－緩衝液混合物と混合し、反応を２０μｌの過酸化水素溶液（１０ｍＭ）によって開始した。吸光の増加を、Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ＰＲＯ機器において３０℃で６０秒間、６５２ｎｍで追跡した。反応速度パラメータを、Ｓｉｇｍａ Ｐｌｏｔソフトウエア（Ｓｙｓｔａｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＩＮＣ．、米国カリフォルニア州サンノゼ）及びε６５２の吸光係数＝３９ｍＭ－１ｃｍ－１（Josephy, et al. “The horseradish peroxidase-catalyzed oxidation of 3, 5, 3’, 5’-tetramethylbenzidine. Free radical and charge-transfer complex intermediates.” Journal of Biological Chemistry 257.7 (1982): 3669-3675を参照されたい）を使用して算出した。
【0257】
ＡＢＴＳを基質として用いる測定では、９６ウエルプレートの各ウエルにおける反応混合物は、最終体積２００μＬの５０ｍＭのリン酸－クエン酸緩衝液（ｐＨ５）中、１ｍＭという飽和性（saturating）の過酸化水素濃度、及び変動させたＡＢＴＳ濃度（０．１～７ｍＭ）を含有した。タンパク質サンプル（５μＬ）を１７５μｌのＡＢＴＳ－緩衝液混合物と混合し、反応を２０μｌの過酸化水素溶液（１０ｍＭ）によって開始した。吸光の増加を、Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ＰＲＯ機器において３０℃で１２０秒間、４２０ｎｍで追跡した。反応速度パラメータを、Ｓｉｇｍａ Ｐｌｏｔソフトウエア（Ｓｙｓｔａｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＩＮＣ．、米国カリフォルニア州サンノゼ）及びε４２０の吸光係数＝３６ｍＭ－１ｃｍ－１（Childs and Bardsley. “The steady-state kinetics of peroxidase with 2, 2′-azino-di-(3-ethyl-benzthiazoline-6-sulphonic acid) as chromogen.” Biochemical Journal 145.1 (1975): 93-103を参照されたい）を使用して算出した。
【0258】
過酸化水素を基質として用いる測定では、９６ウエルプレートの各ウエルにおける反応混合物は、最終体積２００μＬの５０ｍＭのリン酸－クエン酸緩衝液（ｐＨ５）中、１０ｍＭという飽和性（saturating）のＡＢＴＳ、及び変動させた過酸化水素濃度（０．００１～１ｍＭ）を含有した。タンパク質サンプル（５μＬ）を１４５μｌの過酸化水素－緩衝液混合物と混合し、反応を５０μｌのＡＢＴＳ溶液（４０ｍＭ）によって開始した。吸光の増加を、Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ＰＲＯ機器において３０℃で１２０秒間、４２０ｎｍで追跡した。反応速度パラメータを、Ｓｉｇｍａ Ｐｌｏｔソフトウエア（Ｓｙｓｔａｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＩＮＣ．、米国カリフォルニア州サンノゼ）及びε４２０の吸光係数＝３６ｍＭ－１ｃｍ－１（Childs and Bardsley. “The steady-state kinetics of peroxidase with 2, 2′-azino-di-(3-ethyl-benzthiazoline-6-sulphonic acid) as chromogen.” Biochemical Journal 145.1 (1975): 93-103を参照されたい）を使用して算出した。
【0259】
（熱安定性）
酵素バリアントの熱安定性を５０ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７）、７％のグリセロール、５００ｍＭのＮａＣｌにおいて６０℃で評価した。ＡＢＴＳによる酵素活性を、０、３０、６０、９０及び１２０分後にＨＲＰ野生型（配列番号２）及びＨＲＰ Ｎ１３Ｄ／Ｎ５７Ｓ／Ｎ２５５Ｄ／Ｎ２６８Ｄについて測定し；０、９０、１８０、３００、４２０及び５８８分後にバリアントＨＲＰ Ｎ１３Ｄ／Ｎ５７Ｓ／Ｎ１７５Ｓ／Ｎ２５５Ｄ／Ｎ２６８Ｄ、ＨＲＰ Ｎ１３Ｄ／Ｎ５７Ｓ／Ｐ１４６Ｑ／Ｎ１７５Ｓ／Ｎ２５５Ｄ／Ｎ２６８Ｄ、ＨＲＰ Ｎ１３Ｄ／Ｎ５７Ｓ／Ｎ１７５Ｓ／Ｎ２５５Ｄ／Ｎ２６８Ｄ／Ｎ２７５Ｋ、及びＨＲＰ Ｎ１３Ｄ／Ｎ５７Ｓ／Ｐ１４６Ｑ／Ｎ１７５Ｓ／Ｎ２５５Ｄ／Ｎ２６８Ｄ／Ｎ２７５Ｋについて測定し；並びに、０、９０、１８０、３００及び４２０分後に植物ＨＲＰについて測定した。植物ＨＲＰを含めた全てのバリアントの酵素濃度は、熱処理の際に２．８６μＭであった。その後、これらのサンプルを氷上で５分間冷却し、その後、１６１６２ｇで４℃で１５分間遠心分離した。その後、残存活性を、Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ＰＲＯ機器を用いて７ｍＭのＡＢＴＳによって測定した。反応混合物は、総体積２００μｌの５０ｍＭのリン酸－クエン酸緩衝液（ｐＨ５）中、５μＬのタンパク質、１ｍＭという飽和性（saturating）の過酸化水素濃度、及び７ｍＭのＡＢＴＳを含有した。吸光の増加を３０℃で１２０秒間、４２０ｎｍで追跡した。残存酵素活性をインキュベーション時間に対してプロットし、以下の式における不活性速度を使用して６０℃における半減期を算出した：
酵素バリアントの熱安定性を５０ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７）、７％のグリセロール、５００ｍＭのＮａＣｌにおいて６０℃で評価した。ＡＢＴＳによる酵素活性を、０、３０、６０、９０及び１２０分後にＨＲＰ野生型（配列番号２）及びＨＲＰ Ｎ１３Ｄ／Ｎ５７Ｓ／Ｎ２５５Ｄ／Ｎ２６８Ｄについて測定し；０、９０、１８０、３００、４２０及び５８８分後にバリアントＨＲＰ Ｎ１３Ｄ／Ｎ５７Ｓ／Ｎ１７５Ｓ／Ｎ２５５Ｄ／Ｎ２６８Ｄ、ＨＲＰ Ｎ１３Ｄ／Ｎ５７Ｓ／Ｐ１４６Ｑ／Ｎ１７５Ｓ／Ｎ２５５Ｄ／Ｎ２６８Ｄ、ＨＲＰ Ｎ１３Ｄ／Ｎ５７Ｓ／Ｎ１７５Ｓ／Ｎ２５５Ｄ／Ｎ２６８Ｄ／Ｎ２７５Ｋ、及びＨＲＰ Ｎ１３Ｄ／Ｎ５７Ｓ／Ｐ１４６Ｑ／Ｎ１７５Ｓ／Ｎ２５５Ｄ／Ｎ２６８Ｄ／Ｎ２７５Ｋについて測定し；並びに、０、９０、１８０、３００及び４２０分後に植物ＨＲＰについて測定した。植物ＨＲＰを含めた全てのバリアントの酵素濃度は、熱処理の際に２．８６μＭであった。その後、これらのサンプルを氷上で５分間冷却し、その後、１６１６２ｇで４℃で１５分間遠心分離した。その後、残存活性を、Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ＰＲＯ機器を用いて７ｍＭのＡＢＴＳによって測定した。反応混合物は、総体積２００μｌの５０ｍＭのリン酸－クエン酸緩衝液（ｐＨ５）中、５μＬのタンパク質、１ｍＭという飽和性（saturating）の過酸化水素濃度、及び７ｍＭのＡＢＴＳを含有した。吸光の増加を３０℃で１２０秒間、４２０ｎｍで追跡した。残存酵素活性をインキュベーション時間に対してプロットし、以下の式における不活性速度を使用して６０℃における半減期を算出した：
【0260】
ｔ１／２＝ｌｎ（２）／ｋｉｎ
式中、ｔ１／２は半減期であり、ｋｉｎは、対数残存活性の傾きである。
式中、ｔ１／２は半減期であり、ｋｉｎは、対数残存活性の傾きである。
【0261】
実施例７．ＨＲＰ変異体の熱安定性
ＨＲＰのいくつかの変異体を発現させて精製し、実施例６に記載されているように熱安定性を測定した。多くの変異が熱安定性を増加させたことが見出された。最も好ましい変異体ＨＲＰ Ｎ１３Ｄ／Ｎ５７Ｓ／Ｐ１４６Ｑ／Ｎ１７５Ｓ／Ｎ２５５Ｄ／Ｎ２６８Ｄ／Ｎ２７５Ｋ（配列番号４）は、野生型ＨＲＰ（配列番号２）よりも１３倍を超えて向上した熱安定性、及び、植物由来（すなわち、グリコシル化された）酵素に対してさえもこれより１．７倍向上した熱安定性を示した。重要なことに、変異Ｐ１４６Ｑ及びＮ２７５Ｋの組み合わせ（ＨＲＰ Ｎ１３Ｄ／Ｎ５７Ｓ／Ｐ１４６Ｑ／Ｎ１７５Ｓ／Ｎ２５５Ｄ／Ｎ２６８Ｄ／Ｎ２７５Ｋ）では、変異Ｐ１４６Ｑ（ＨＲＰ Ｎ１３Ｄ／Ｎ５７Ｓ／Ｐ１４６Ｑ／Ｎ１７５Ｓ／Ｎ２５５Ｄ／Ｎ２６８Ｄ）又はＮ２７５Ｋ（ＨＲＰ Ｎ１３Ｄ／Ｎ５７Ｓ／Ｎ１７５Ｓ／Ｎ２５５Ｄ／Ｎ２６８Ｄ／Ｎ２７５Ｋ）単独のいずれかよりも、有意に高い熱安定性が観察された。
ＨＲＰのいくつかの変異体を発現させて精製し、実施例６に記載されているように熱安定性を測定した。多くの変異が熱安定性を増加させたことが見出された。最も好ましい変異体ＨＲＰ Ｎ１３Ｄ／Ｎ５７Ｓ／Ｐ１４６Ｑ／Ｎ１７５Ｓ／Ｎ２５５Ｄ／Ｎ２６８Ｄ／Ｎ２７５Ｋ（配列番号４）は、野生型ＨＲＰ（配列番号２）よりも１３倍を超えて向上した熱安定性、及び、植物由来（すなわち、グリコシル化された）酵素に対してさえもこれより１．７倍向上した熱安定性を示した。重要なことに、変異Ｐ１４６Ｑ及びＮ２７５Ｋの組み合わせ（ＨＲＰ Ｎ１３Ｄ／Ｎ５７Ｓ／Ｐ１４６Ｑ／Ｎ１７５Ｓ／Ｎ２５５Ｄ／Ｎ２６８Ｄ／Ｎ２７５Ｋ）では、変異Ｐ１４６Ｑ（ＨＲＰ Ｎ１３Ｄ／Ｎ５７Ｓ／Ｐ１４６Ｑ／Ｎ１７５Ｓ／Ｎ２５５Ｄ／Ｎ２６８Ｄ）又はＮ２７５Ｋ（ＨＲＰ Ｎ１３Ｄ／Ｎ５７Ｓ／Ｎ１７５Ｓ／Ｎ２５５Ｄ／Ｎ２６８Ｄ／Ｎ２７５Ｋ）単独のいずれかよりも、有意に高い熱安定性が観察された。
【0262】
【表15】
【0263】
実施例８．ＨＲＰ変異体の反応速度パラメータ
ＨＲＰのいくつかの変異体を発現させて精製し、実施例６に記載されているように基質ＡＢＴＳ、ＴＭＢ及び過酸化水素についての反応速度パラメータを求めた。ＨＲＰ Ｎ１３Ｄ／Ｎ５７Ｓ／Ｐ１４６Ｑ／Ｎ１７５Ｓ／Ｎ２５５Ｄ／Ｎ２６８Ｄ／Ｎ２７５Ｋ（配列番号４）は、基質ＴＭＢ及び過酸化水素ではＨＲＰ Ｎ１３Ｄ／Ｎ５７Ｓ／Ｎ１７５Ｓ／Ｎ２５５Ｄ／Ｎ２６８Ｄより顕著に活性が高いことが見出された。変異Ｐ１４６Ｑ及びＮ２７５Ｋは、酵素活性に対して強力な有益な効果を及ぼすことが見出された。
ＨＲＰのいくつかの変異体を発現させて精製し、実施例６に記載されているように基質ＡＢＴＳ、ＴＭＢ及び過酸化水素についての反応速度パラメータを求めた。ＨＲＰ Ｎ１３Ｄ／Ｎ５７Ｓ／Ｐ１４６Ｑ／Ｎ１７５Ｓ／Ｎ２５５Ｄ／Ｎ２６８Ｄ／Ｎ２７５Ｋ（配列番号４）は、基質ＴＭＢ及び過酸化水素ではＨＲＰ Ｎ１３Ｄ／Ｎ５７Ｓ／Ｎ１７５Ｓ／Ｎ２５５Ｄ／Ｎ２６８Ｄより顕著に活性が高いことが見出された。変異Ｐ１４６Ｑ及びＮ２７５Ｋは、酵素活性に対して強力な有益な効果を及ぼすことが見出された。
【0264】
【表16】
【0265】
【表17】
【0266】
【表18】
【0267】
実施例９．植物由来ＨＲＰ及び野生型ＨＲＰとの比較
ＨＲＰ Ｎ１３Ｄ／Ｎ５７Ｓ／Ｐ１４６Ｑ／Ｎ１７５Ｓ／Ｎ２５５Ｄ／Ｎ２６８Ｄ／Ｎ２７５Ｋ（配列番号４）の反応速度パラメータ及び熱安定性を、野生型ＨＲＰ（配列番号２）並びに植物由来ＨＲＰ（ｐＨＲＰ）のものと比較した。反応速度パラメータ及び熱安定性を実施例６に記載されているように求めた。
ＨＲＰ Ｎ１３Ｄ／Ｎ５７Ｓ／Ｐ１４６Ｑ／Ｎ１７５Ｓ／Ｎ２５５Ｄ／Ｎ２６８Ｄ／Ｎ２７５Ｋ（配列番号４）の反応速度パラメータ及び熱安定性を、野生型ＨＲＰ（配列番号２）並びに植物由来ＨＲＰ（ｐＨＲＰ）のものと比較した。反応速度パラメータ及び熱安定性を実施例６に記載されているように求めた。
【0268】
熱安定性の測定を図１３に示す。本明細書において上記の実施例７に既に記載されているように、最も好ましい変異体ＨＲＰ Ｎ１３Ｄ／Ｎ５７Ｓ／Ｐ１４６Ｑ／Ｎ１７５Ｓ／Ｎ２５５Ｄ／Ｎ２６８Ｄ／Ｎ２７５Ｋ（ｍＨＲＰ、配列番号４）は、野生型ＨＲＰ（ｒＨＲＰ、配列番号２）よりも１３倍を超えて向上した熱安定性、及び植物由来（すなわち、グリコシル化された）ｐＨＲＰよりもさらに１．７倍向上した熱安定性を示した（表１５を参照されたい）。また、この強力に改良された熱安定性を有しながら、野生型ＨＲＰ（ｒＨＲＰ、配列番号２）及び植物由来ＨＲＰのいずれとも類似の触媒効果が観察されたことが見出された（以下の表１９及び２０を参照されたい）。
【0269】
【表19】
【0270】
【表20】
【0271】
実施例１０．１４６位及び２７５位の部位飽和変異誘発
Ｐ１４６位及びＮ２７５位の全ての可能性のあるアミノ酸交換の効果を試験するために、これらの位置の部位飽和変異誘発（site-saturation mutagenesis）を実施した。前記部位飽和変異誘発の開始点として、好ましい変異体ＨＲＰ Ｎ１３Ｄ／Ｎ５７Ｓ／Ｐ１４６Ｑ／Ｎ１７５Ｓ／Ｎ２５５Ｄ／Ｎ２６８Ｄ／Ｎ２７５Ｋ（配列番号３）を選択した。１４６位及び２７５位におけるアミノ酸交換の効果を個々に調べた。
Ｐ１４６位及びＮ２７５位の全ての可能性のあるアミノ酸交換の効果を試験するために、これらの位置の部位飽和変異誘発（site-saturation mutagenesis）を実施した。前記部位飽和変異誘発の開始点として、好ましい変異体ＨＲＰ Ｎ１３Ｄ／Ｎ５７Ｓ／Ｐ１４６Ｑ／Ｎ１７５Ｓ／Ｎ２５５Ｄ／Ｎ２６８Ｄ／Ｎ２７５Ｋ（配列番号３）を選択した。１４６位及び２７５位におけるアミノ酸交換の効果を個々に調べた。
【0272】
（ライブラリ生成）
以下のプラスミドを標準の分子クローニング技術によって構築した。部位飽和変異誘発によって１４６位及び２７５位でｈｒｐ遺伝子に変異を導入するために、ｐＳＦ－Ｔ７におけるＨＲＰ Ｎ１３Ｄ／Ｎ５７Ｓ／Ｐ１４６Ｑ／Ｎ１７５Ｓ／Ｎ２５５Ｄ／Ｎ２６８Ｄ／Ｎ２７５Ｋ（配列番号３）の全プラスミドＰＣＲ（whole-plasmid PCR）を使用した。６．３ｋｂ断片をそれぞれのオリゴヌクレオチドを用いて増幅して、部位飽和ライブラリを生成した（表２１）。全てのオリゴヌクレオチドはＭｉｃｒｏｓｙｎｔｈ社（スイス、バルガッハ）から購入した。前記オリゴヌクレオチドを、以下のプロトコルによってリン酸化した：３００ｐｍｏｌのプライマーＤＮＡ、１×Ｔ４ＰＮＫ緩衝液（ＮＥＢ）、１ｍＭのＡＴＰ、５％のＰＥＧ、１０単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ、ＮＥＢ）。反応を３７℃で４５分間インキュベートした後、６５℃で２０分間熱不活化した。各ＰＣＲ反応は、１×Ｑ５反応緩衝液、２００μＭのｄＮＴＰ Ｍｉｘ、２００ｎＭのフォワード及びリバースの両方のリン酸化されたプライマー、１００ｎｇのテンプレートベクターＤＮＡ、並びに１Ｕ Ｑ５ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼを含有した。Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社（ＮＥＢ、米国マサチューセッツ州イプスウィッチ）からのＭｏｎａｒｃｈ ＰＣＲ ＆ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎｕｐ ＫｉｔによってＰＣＲ産物を精製し、ＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ ＤｐｎＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）、米国マサチューセッツ州ウォルサム）消化によってテンプレートプラスミドＤＮＡを除去した。２ＦＤＵ（ＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ単位）のＤｐｎＩをクローニングされたＰＣＲ産物に添加し、３７℃で４時間インキュベートした。８０℃で２０分間の熱不活化後、プラスミドを平滑末端ライゲーションした：５０ｎｇのプラスミドＤＮＡ、１×Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ）、４００の付着端単位Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）、１６℃で一晩。６５℃で２０分間の熱不活化後に、前記プラスミドでＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した。
以下のプラスミドを標準の分子クローニング技術によって構築した。部位飽和変異誘発によって１４６位及び２７５位でｈｒｐ遺伝子に変異を導入するために、ｐＳＦ－Ｔ７におけるＨＲＰ Ｎ１３Ｄ／Ｎ５７Ｓ／Ｐ１４６Ｑ／Ｎ１７５Ｓ／Ｎ２５５Ｄ／Ｎ２６８Ｄ／Ｎ２７５Ｋ（配列番号３）の全プラスミドＰＣＲ（whole-plasmid PCR）を使用した。６．３ｋｂ断片をそれぞれのオリゴヌクレオチドを用いて増幅して、部位飽和ライブラリを生成した（表２１）。全てのオリゴヌクレオチドはＭｉｃｒｏｓｙｎｔｈ社（スイス、バルガッハ）から購入した。前記オリゴヌクレオチドを、以下のプロトコルによってリン酸化した：３００ｐｍｏｌのプライマーＤＮＡ、１×Ｔ４ＰＮＫ緩衝液（ＮＥＢ）、１ｍＭのＡＴＰ、５％のＰＥＧ、１０単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ、ＮＥＢ）。反応を３７℃で４５分間インキュベートした後、６５℃で２０分間熱不活化した。各ＰＣＲ反応は、１×Ｑ５反応緩衝液、２００μＭのｄＮＴＰ Ｍｉｘ、２００ｎＭのフォワード及びリバースの両方のリン酸化されたプライマー、１００ｎｇのテンプレートベクターＤＮＡ、並びに１Ｕ Ｑ５ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼを含有した。Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社（ＮＥＢ、米国マサチューセッツ州イプスウィッチ）からのＭｏｎａｒｃｈ ＰＣＲ ＆ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎｕｐ ＫｉｔによってＰＣＲ産物を精製し、ＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ ＤｐｎＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）、米国マサチューセッツ州ウォルサム）消化によってテンプレートプラスミドＤＮＡを除去した。２ＦＤＵ（ＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ単位）のＤｐｎＩをクローニングされたＰＣＲ産物に添加し、３７℃で４時間インキュベートした。８０℃で２０分間の熱不活化後、プラスミドを平滑末端ライゲーションした：５０ｎｇのプラスミドＤＮＡ、１×Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ）、４００の付着端単位Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）、１６℃で一晩。６５℃で２０分間の熱不活化後に、前記プラスミドでＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した。
【0273】
【表21】
【0274】
（スクリーニング）
形質転換陽性細胞を選択プレートから採集し、乾燥を防止するためのプラスチック箱内で、９６ウエルプレートで２００μｌのＳＢ培地（３２ｇＬ－１トリプトン；２０ｇＬ－１酵母抽出物；５ｇＬ－１のＮａＣｌ；５ｍＭのＮａＯＨ；５０ｍｇＬ－１のカナマイシン）とともに１６時間、３７℃、２５０ｒｐｍで増殖させた。その後、９０μｌの７５％のグリセロールをマスタープレートに添加した後、これらを－８０℃で保存した。１９０μｌのＳＢ培地を含むスレーブプレートに１０μｌのマスタープレートを接種した。ここで、前記培地は、２００μｌの最終体積で、２ｍＭのＣａＣｌ２；６μＭのヘミン、及び０．１ｍＭのＩＰＴＧを含有した。前記細胞をプラスチック箱において２５℃、２５０ｒｐｍで１６時間増殖させ、Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ＰＲＯ（Ｔｅｃａｎ社、スイス、マンドルフ）プレートリーダで５９５ｎｍでの吸光を測定することにより細胞密度を求めた。次いで、上記プレートを、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｌｙｎｘ Ｓｏｒｖａｌｌ遠心分離機で、５０００ｇ、４℃で６分間遠心分離し、前記細胞を、５Ｕｍｌ－１のＤＮａｓｅＩ及び１／２プロテアーゼインヒビターカクテル錠（コンプリート錠、ＥＤＴＡフリー；Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、ドイツ、マンハイム）並びに２００ｍＭのＭｇＣｌ２を用いて、２００μｌ／ウエルのＢ－ＰＥＲ細菌タンパク質抽出試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国マサチューセッツ州ウォルサム）で完全に再懸濁させた。細胞溶解を室温で１５分間実施した後、５０００ｇ、４℃で２０分間遠心分離した。その後、総タンパク質含量をブラッドフォード法によって測定した。各ウエルの９０μｌを新たなプレートに移し、８０℃で２０分間（１４６位）又は８０℃で１５分間（２７５位）インキュベートし、その後、加熱したプレート及び対照プレートの両方を５０００ｇ、４℃で２０分間遠心分離した。その後、２００μｌの総体積の、５０ｍＭのリン酸－クエン酸緩衝液（ｐＨ５）中の３９５μＭのＴＭＢ（１４６位）又は４０６μＭのＴＭＢ（２７５位）、１ｍＭのＨ２Ｏ２、及び１０μｌの細胞溶解液によって、酵素活性を測定した。測定を３０℃で実施し、６５２ｎｍにおける吸光度の増加（青色のＴＭＢラジカルではε＝３．９×１０４Ｍ－１ｃｍ－１）をＴｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ ＰＲＯプレートリーダによって１２０秒間モニタリングした。総タンパク質濃度を用いて初期活性と残存活性を正規化し、熱安定性を初期活性に対する残存活性の割合として表示した。手順は上記に記載されているものと同じとした。予期される９９％超のライブラリ完全性に相当する１８０コロニーを各位置についてスクリーニングした。各プレートは、陽性対照として、ＨＲＰ Ｎ１３Ｄ／Ｎ５７Ｓ／Ｐ１４６Ｑ／Ｎ１７５Ｓ／Ｎ２５５Ｄ／Ｎ２６８Ｄ／Ｎ２７５Ｋ（配列番号３に相当）の６つのコロニーを含んだ。
形質転換陽性細胞を選択プレートから採集し、乾燥を防止するためのプラスチック箱内で、９６ウエルプレートで２００μｌのＳＢ培地（３２ｇＬ－１トリプトン；２０ｇＬ－１酵母抽出物；５ｇＬ－１のＮａＣｌ；５ｍＭのＮａＯＨ；５０ｍｇＬ－１のカナマイシン）とともに１６時間、３７℃、２５０ｒｐｍで増殖させた。その後、９０μｌの７５％のグリセロールをマスタープレートに添加した後、これらを－８０℃で保存した。１９０μｌのＳＢ培地を含むスレーブプレートに１０μｌのマスタープレートを接種した。ここで、前記培地は、２００μｌの最終体積で、２ｍＭのＣａＣｌ２；６μＭのヘミン、及び０．１ｍＭのＩＰＴＧを含有した。前記細胞をプラスチック箱において２５℃、２５０ｒｐｍで１６時間増殖させ、Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ＰＲＯ（Ｔｅｃａｎ社、スイス、マンドルフ）プレートリーダで５９５ｎｍでの吸光を測定することにより細胞密度を求めた。次いで、上記プレートを、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｌｙｎｘ Ｓｏｒｖａｌｌ遠心分離機で、５０００ｇ、４℃で６分間遠心分離し、前記細胞を、５Ｕｍｌ－１のＤＮａｓｅＩ及び１／２プロテアーゼインヒビターカクテル錠（コンプリート錠、ＥＤＴＡフリー；Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、ドイツ、マンハイム）並びに２００ｍＭのＭｇＣｌ２を用いて、２００μｌ／ウエルのＢ－ＰＥＲ細菌タンパク質抽出試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国マサチューセッツ州ウォルサム）で完全に再懸濁させた。細胞溶解を室温で１５分間実施した後、５０００ｇ、４℃で２０分間遠心分離した。その後、総タンパク質含量をブラッドフォード法によって測定した。各ウエルの９０μｌを新たなプレートに移し、８０℃で２０分間（１４６位）又は８０℃で１５分間（２７５位）インキュベートし、その後、加熱したプレート及び対照プレートの両方を５０００ｇ、４℃で２０分間遠心分離した。その後、２００μｌの総体積の、５０ｍＭのリン酸－クエン酸緩衝液（ｐＨ５）中の３９５μＭのＴＭＢ（１４６位）又は４０６μＭのＴＭＢ（２７５位）、１ｍＭのＨ２Ｏ２、及び１０μｌの細胞溶解液によって、酵素活性を測定した。測定を３０℃で実施し、６５２ｎｍにおける吸光度の増加（青色のＴＭＢラジカルではε＝３．９×１０４Ｍ－１ｃｍ－１）をＴｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ ＰＲＯプレートリーダによって１２０秒間モニタリングした。総タンパク質濃度を用いて初期活性と残存活性を正規化し、熱安定性を初期活性に対する残存活性の割合として表示した。手順は上記に記載されているものと同じとした。予期される９９％超のライブラリ完全性に相当する１８０コロニーを各位置についてスクリーニングした。各プレートは、陽性対照として、ＨＲＰ Ｎ１３Ｄ／Ｎ５７Ｓ／Ｐ１４６Ｑ／Ｎ１７５Ｓ／Ｎ２５５Ｄ／Ｎ２６８Ｄ／Ｎ２７５Ｋ（配列番号３に相当）の６つのコロニーを含んだ。
【0275】
（結果）
選択した変異体の結果を以下の表２２（Ｐ１４６位）及び表２３（Ｎ２７５位）に示す。本実施例は９６ウエルプレートベースのスクリーニングアッセイを使用するため、ばらつき（標準偏差）は、本明細書において報告されている他のアッセイによるものよりも高い。したがって、各変異体についての結果は、測定した各プレート内でのみ比較されるべきである。
選択した変異体の結果を以下の表２２（Ｐ１４６位）及び表２３（Ｎ２７５位）に示す。本実施例は９６ウエルプレートベースのスクリーニングアッセイを使用するため、ばらつき（標準偏差）は、本明細書において報告されている他のアッセイによるものよりも高い。したがって、各変異体についての結果は、測定した各プレート内でのみ比較されるべきである。
【0276】
表２２及び２３から分かるように、１４６位及び２７５位における複数の異なるアミノ酸交換が優れた熱安定性につながることが見出された。各位置におけるいくつかのアミノ酸交換が有利な結果を与えた。１４６位の場合、１４６Ａ、１４６Ｒ、１４６Ｖ、１４６Ｅ、及び特に１４６Ｑが特に有利であることが見出された（いずれも、最も好ましい変異体１４６Ｑの標準偏差の範囲内）。２７５位の場合、２７５Ｒ、２７５Ｄ、２７５Ｓ、２７５Ｑ、２７５Ａ、２７５Ｅ及び特に２７５Ｋについて最も良好な結果が観察された（いずれも最も好ましい変異体２７５Ｋの標準偏差の範囲内）。
【0277】
【表22】
【0278】
【表23】
【0279】
実施例１１．様々な期間にわたるヘム補因子添加の配分
（方法）
以下に示す違いを除き実施例５に記載されているようにプロセスランを実施した。細胞株及び増殖条件、並びにホモジナイゼーション及び封入体洗浄は実施例１に記載されているように実施した。リフォールディングリアクターは実施例３に記載されているように使用した。
（方法）
以下に示す違いを除き実施例５に記載されているようにプロセスランを実施した。細胞株及び増殖条件、並びにホモジナイゼーション及び封入体洗浄は実施例１に記載されているように実施した。リフォールディングリアクターは実施例３に記載されているように使用した。
【0280】
可溶化のために、凍結したＩＢのアリコートを解凍し、湿潤封入体（ｗＩＢ）重量を算出するために秤量し、適切な可溶化緩衝液（可溶化緩衝液２：５０ｍＭのグリシン；ｐＨ１０；６Ｍの尿素）に再懸濁して、１００ｇ／Ｌ（３．５ｇのＩＢ＝３５ｍｌの可溶化ミックス（遠心分離後に３０ｍｌの可溶化ミックスを結果として生じさせる））のｗＩＢ濃度とした。再懸濁後、可溶化ミックス中７．１１ｍＭのＤＴＴの最終濃度となるようにＤＴＴを添加し、当該可溶化ミックスをインキュベートし（４℃；０．５時間；弱く攪拌）、続いて遠心分離した（２０３７９ｇ；２０分；４℃）。上清をリフォールディング用に直ちに使用し、ペレットを廃棄した。容器の最終リフォールディング体積は１．２Ｌであった（３０ｍＬの溶解物の使用及び１：４０の希釈において生じる）。リフォールディング緩衝液は、２０ｍＭのグリシン（ｐＨ１０）（ＨＣｌで調整）、２Ｍの尿素、７％のグリセロール、２ｍＭのＣａＣｌ２、１．２７ｍＭのＧＳＳＧを含有した。
【0281】
３の異なるヘミン添加方式を比較した：（Ａ）２０時間のリフォールディング、引き続く２０μＭの最終濃度までヘミンのバッチ添加、及び測定前のさらなる５時間のインキュベーション；（Ｂ）８時間のリフォールディング、引き続く１０時間のヘミンフィード添加（２．４ｍｌの１ｍＭのヘミン／時間；最終濃度２０μＭのヘミン）、及び測定前のさらなる１時間のインキュベーション；並びに、（Ｃ）８時間のリフォールディング、引き続く１時間のヘミンフィード添加（２４ｍｌの１ｍＭのヘミン／時間；最終濃度２０μＭのヘミン）、及びさらなる１０時間のインキュベーション。実験（Ｃ）では、上記のフィードの終了後すぐにサンプルを採取及び測定し、さらに１０時間のインキュベーション後にさらなる測定を行った。
【0282】
タンパク質濃度及び酵素活性を、実施例２に記載されているように求めた。
【0283】
（結果）
得られた結果を図１４に示す。１時間の期間にわたってヘム補因子添加を配分させる明らかな利益が見出された。１時間ヘミンフィードの終了後（すなわち、９時間の合計リフォールディング時間の後）すぐに測定したときでも、バッチ添加実験（合計リフォールディング時間は２５時間であった）の場合よりも比活性が１．４倍高いことが見出された。１時間のフィード実験からのサンプルを、１０時間のさらなるインキュベーション後（すなわち、１９時間の合計リフォールディング時間の後）に測定したとき、バッチ添加からのもの場合よりも比活性は１．７倍も高かった。１０時間のより長期間にわたる（実験（Ｂ）；１９時間の合計リフォールディング時間）ヘミン添加の配分は、バッチ添加に対して２倍もの比活性の増加につながった。
得られた結果を図１４に示す。１時間の期間にわたってヘム補因子添加を配分させる明らかな利益が見出された。１時間ヘミンフィードの終了後（すなわち、９時間の合計リフォールディング時間の後）すぐに測定したときでも、バッチ添加実験（合計リフォールディング時間は２５時間であった）の場合よりも比活性が１．４倍高いことが見出された。１時間のフィード実験からのサンプルを、１０時間のさらなるインキュベーション後（すなわち、１９時間の合計リフォールディング時間の後）に測定したとき、バッチ添加からのもの場合よりも比活性は１．７倍も高かった。１０時間のより長期間にわたる（実験（Ｂ）；１９時間の合計リフォールディング時間）ヘミン添加の配分は、バッチ添加に対して２倍もの比活性の増加につながった。
【0284】
実施例１２．さらなるＨＲＰ変異体の反応速度パラメータ及び熱安定性
Ｐ１４６及びＮ２７５位における変異の有利な効果を、野生型ＨＲＰ（配列番号２）、ＨＲＰ Ｎ１７５Ｓ及びＨＲＰ Ｎ１３Ｄ／Ｎ５７Ｓ／Ｎ１７５Ｓ／Ｎ２５５Ｄ／Ｎ２６８Ｄに関して調査した。さらに、単一変異体及びこれらの組み合わせの有益な効果を調べた。これに関して、生化学的特性に対するＰ１４６及びＮ２７５位における変異の役割を６０℃における比酵素活性及び熱安定性の測定によって決定した。
Ｐ１４６及びＮ２７５位における変異の有利な効果を、野生型ＨＲＰ（配列番号２）、ＨＲＰ Ｎ１７５Ｓ及びＨＲＰ Ｎ１３Ｄ／Ｎ５７Ｓ／Ｎ１７５Ｓ／Ｎ２５５Ｄ／Ｎ２６８Ｄに関して調査した。さらに、単一変異体及びこれらの組み合わせの有益な効果を調べた。これに関して、生化学的特性に対するＰ１４６及びＮ２７５位における変異の役割を６０℃における比酵素活性及び熱安定性の測定によって決定した。
【0285】
（材料及び方法）
野生型ＨＲＰ（配列番号２）の以下の変異体を作り出し、サンガーシーケンシングによって検証した：ＨＲＰ Ｐ１４６Ｑ、ＨＲＰ Ｎ１７５Ｓ、ＨＲＰ Ｎ２７５Ｋ、ＨＲＰ Ｐ１４６Ｑ／Ｎ２７５Ｋ、ＨＲＰ Ｐ１４６Ｑ／Ｎ１７５Ｓ、ＨＲＰ Ｎ１７５Ｓ／Ｎ２７５Ｋ、ＨＲＰ Ｐ１４６Ｑ／Ｎ１７５Ｓ／Ｎ２７５Ｋ。実施例６に記載されているように精製を実施した。反応速度パラメータ及び熱安定性もまた実施例６に記載されているように求めた。
野生型ＨＲＰ（配列番号２）の以下の変異体を作り出し、サンガーシーケンシングによって検証した：ＨＲＰ Ｐ１４６Ｑ、ＨＲＰ Ｎ１７５Ｓ、ＨＲＰ Ｎ２７５Ｋ、ＨＲＰ Ｐ１４６Ｑ／Ｎ２７５Ｋ、ＨＲＰ Ｐ１４６Ｑ／Ｎ１７５Ｓ、ＨＲＰ Ｎ１７５Ｓ／Ｎ２７５Ｋ、ＨＲＰ Ｐ１４６Ｑ／Ｎ１７５Ｓ／Ｎ２７５Ｋ。実施例６に記載されているように精製を実施した。反応速度パラメータ及び熱安定性もまた実施例６に記載されているように求めた。
【0286】
（比酵素活性（ＡＢＴＳ））
全てのＨＲＰバリアントの比活性（ユニット／ｍｇタンパク質）を、Ｔｅｃａｎプレートリーダにおいて基質ＡＢＴＳによって試験した（表２４）。ＨＲＰ Ｐ１４６Ｑは、ＨＲＰ野生型に対して１．４倍のより高い比活性を示した。興味深いことに、ＨＲＰ Ｎ１７５Ｓは、より低い比活性を示した；しかし、ＨＲＰ Ｎ１３Ｄ／Ｎ５７Ｓ／Ｐ１４６Ｑ／Ｎ１７５Ｓ／Ｎ２５５Ｄ／Ｎ２６８Ｄ／Ｎ２７５Ｋ（配列番号４）は、この活性低減を弱めることができ、ＨＲＰ野生型の値に戻した。
全てのＨＲＰバリアントの比活性（ユニット／ｍｇタンパク質）を、Ｔｅｃａｎプレートリーダにおいて基質ＡＢＴＳによって試験した（表２４）。ＨＲＰ Ｐ１４６Ｑは、ＨＲＰ野生型に対して１．４倍のより高い比活性を示した。興味深いことに、ＨＲＰ Ｎ１７５Ｓは、より低い比活性を示した；しかし、ＨＲＰ Ｎ１３Ｄ／Ｎ５７Ｓ／Ｐ１４６Ｑ／Ｎ１７５Ｓ／Ｎ２５５Ｄ／Ｎ２６８Ｄ／Ｎ２７５Ｋ（配列番号４）は、この活性低減を弱めることができ、ＨＲＰ野生型の値に戻した。
【0287】
【表24】
【0288】
（比酵素活性（Ｈ２Ｏ２））
さらに、過酸化水素基質を用いて比活性（ユニット／ｍｇタンパク質）を求めた。ここでは、ＡＢＴＳについてのデータで観察されたとの同じ傾向があり、バリアントＰ１４６Ｑは比活性の増加につながり、Ｎ１７５Ｓの導入はより低い値につながった。これは、二重変異体Ｐ１４６Ｑ／Ｎ１７５Ｓ及びＮ１７５Ｓ／Ｎ２７５Ｋ、並びに三重変異体Ｐ１４６Ｑ／Ｎ１７５Ｓ／Ｎ２７５Ｋの場合にもそうであった。Ｎ１７５Ｓを欠いたとき又は配列番号４のさらなる変異が存在したとき、比活性は配列番号２と同様又はこれよりもさらに良好であった。
さらに、過酸化水素基質を用いて比活性（ユニット／ｍｇタンパク質）を求めた。ここでは、ＡＢＴＳについてのデータで観察されたとの同じ傾向があり、バリアントＰ１４６Ｑは比活性の増加につながり、Ｎ１７５Ｓの導入はより低い値につながった。これは、二重変異体Ｐ１４６Ｑ／Ｎ１７５Ｓ及びＮ１７５Ｓ／Ｎ２７５Ｋ、並びに三重変異体Ｐ１４６Ｑ／Ｎ１７５Ｓ／Ｎ２７５Ｋの場合にもそうであった。Ｎ１７５Ｓを欠いたとき又は配列番号４のさらなる変異が存在したとき、比活性は配列番号２と同様又はこれよりもさらに良好であった。
【0289】
【表25】
【0290】
（比酵素活性（ＴＭＢ））
基質ＴＭＢに関しては、ＨＲＰバリアント間の比活性の差があまり顕著ではなかった。しかし、Ｐ１４６Ｑはここでも比酵素活性の顕著な増加を示した一方で、Ｎ１７５Ｓは、野生型と比較して最も低いＵ／ｍｇを示した。
基質ＴＭＢに関しては、ＨＲＰバリアント間の比活性の差があまり顕著ではなかった。しかし、Ｐ１４６Ｑはここでも比酵素活性の顕著な増加を示した一方で、Ｎ１７５Ｓは、野生型と比較して最も低いＵ／ｍｇを示した。
【0291】
【表26】
【0292】
（熱安定性）
６０℃における酵素安定性を全てのＨＲＰ変異体について調査したところ、驚くべきことに、Ｎ１７５Ｓだけが高温での安定性の増加の原因ではなかった。ＨＲＰ Ｎ１３Ｄ／Ｎ５７Ｓ／Ｎ２５５Ｄ／Ｎ２６８Ｄが酵素半減期を１．５倍増加させた一方で、ＨＲＰ Ｎ１７５Ｓは安定性を７．７倍向上させ、これらを組み合わせると前記安定性がＨＲＰ野生型と比較して１３倍上昇し、このことは相乗効果を示唆している（表２７）。ＨＲＰ Ｎ１３Ｄ／Ｎ５７Ｓ／Ｎ１７５Ｓ／Ｎ２５５Ｄ／Ｎ２６８Ｄ及びＨＲＰ Ｎ１３Ｄ／Ｎ５７Ｓ／Ｐ１４６Ｑ／Ｎ１７５Ｓ／Ｎ２５５Ｄ／Ｎ２６８Ｄ／Ｎ２７５Ｋ（配列番号４）が同様の安定性を示したという事実から、Ｎ１７５Ｓと組み合わせた四重変異体がこの向上の原因となっていると推測できる可能性がある。
６０℃における酵素安定性を全てのＨＲＰ変異体について調査したところ、驚くべきことに、Ｎ１７５Ｓだけが高温での安定性の増加の原因ではなかった。ＨＲＰ Ｎ１３Ｄ／Ｎ５７Ｓ／Ｎ２５５Ｄ／Ｎ２６８Ｄが酵素半減期を１．５倍増加させた一方で、ＨＲＰ Ｎ１７５Ｓは安定性を７．７倍向上させ、これらを組み合わせると前記安定性がＨＲＰ野生型と比較して１３倍上昇し、このことは相乗効果を示唆している（表２７）。ＨＲＰ Ｎ１３Ｄ／Ｎ５７Ｓ／Ｎ１７５Ｓ／Ｎ２５５Ｄ／Ｎ２６８Ｄ及びＨＲＰ Ｎ１３Ｄ／Ｎ５７Ｓ／Ｐ１４６Ｑ／Ｎ１７５Ｓ／Ｎ２５５Ｄ／Ｎ２６８Ｄ／Ｎ２７５Ｋ（配列番号４）が同様の安定性を示したという事実から、Ｎ１７５Ｓと組み合わせた四重変異体がこの向上の原因となっていると推測できる可能性がある。
【0293】
Ｐ１４６Ｑ及びＮ２７５Ｋでは、単一変異体及び二重変異体Ｐ１４６Ｑ／Ｎ２７５Ｋの安定性は、ＨＲＰ野生型と比較して僅かに低減した。しかし、三重変異体Ｐ１４６Ｑ／Ｎ１７５Ｓ／Ｎ２７５ＫはＮ１７５Ｓ単独と同じ安定性を示した一方で、二重変異体Ｐ１４６Ｑ／Ｎ１７５Ｓ及びＮ１７５Ｓ／Ｎ２７５Ｋは、より不安定であった。このことは、前記変異体のうちの１つだけがＮ１７５Ｓと組み合わされると安定性に好ましくない効果を示すが、これは、組み合わせれば軽減され、Ｐ１４６Ｑ、Ｎ２７５Ｋ、及びＮ１７５Ｓ間の相乗効果を示唆している。ＨＲＰ Ｎ１３Ｄ／Ｎ５７Ｓ／Ｐ１４６Ｑ／Ｎ１７５Ｓ／Ｎ２５５Ｄ／Ｎ２６８Ｄ／Ｎ２７５Ｋ（配列番号４）と比較したときのＨＲＰ Ｎ１３Ｄ／Ｎ５７Ｓ／Ｐ１４６Ｑ／Ｎ１７５Ｓ／Ｎ２５５Ｄ／Ｎ２６８Ｄ及びＨＲＰ Ｎ１３Ｄ／Ｎ５７Ｓ／Ｎ１７５Ｓ／Ｎ２５５Ｄ／Ｎ２６８Ｄ／Ｎ２７５Ｋについても同じ効果が見出される。
【0294】
【表27】
【0295】
（結論）
置換Ｐ１４６Ｑは自体は、試験した全ての基質についてＨＲＰ酵素活性の強力な増加につながったことが見出された。例えば、基質ＡＢＴＳでは、当該増加は、野生型酵素（配列番号２）に対して１．４倍の増加に達し、ＨＲＰ Ｎ１７５Ｓと比較すると２倍高い比活性に達した。
置換Ｐ１４６Ｑは自体は、試験した全ての基質についてＨＲＰ酵素活性の強力な増加につながったことが見出された。例えば、基質ＡＢＴＳでは、当該増加は、野生型酵素（配列番号２）に対して１．４倍の増加に達し、ＨＲＰ Ｎ１７５Ｓと比較すると２倍高い比活性に達した。
【0296】
置換Ｎ１７５Ｓは、ＨＲＰの熱安定性を強力に増加させることが見出された。この効果は、Ｎ１７５Ｓ自身において、さらにより強力には、変異したＮ－グリコシル化部位アミノ酸Ｎ１３Ｄ／Ｎ５７Ｓ／Ｎ２５５Ｄ／Ｎ２６８Ｄとの組み合わせにおいて観察され、相乗効果が観察された。単一変異Ｐ１４６Ｑ又は単一変異Ｎ２７５ＫとＮ１７５Ｓとの組み合わせは、僅かな安定性の低減につながった。しかし、Ｐ１４６Ｑ及びＮ２７５Ｋの両方をＮ１７５Ｓと組み合わせたときには当該低減が軽減され、Ｐ１４６Ｑ、Ｎ２７５Ｋ、及びＮ１７５Ｓ間の相乗効果を示唆した。
【0297】
Ｎ１７５Ｓはいくつかの基質において酵素活性を低減させることが見出された。この効果は、しかし、Ｎ１３Ｄ／Ｎ５７Ｓ／Ｐ１４６Ｑ／Ｎ１７５Ｓ／Ｎ２５５Ｄ／Ｎ２６８Ｄ／Ｎ２７５Ｋ（配列番号４）によって弱められた。そのため、この変異体が、高い熱安定性と最適な反応速度性能の組み合わせを提供する。
【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-01-11
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
封入体（ＩＢ）からヘムペルオキシダーゼを生産するための方法であって：－前記ヘムペルオキシダーゼをＩＢの形態で提供する工程；
－前記ＩＢを可溶化する工程；
－前記可溶化されたＩＢをリフォールディング緩衝液中に移してリフォールディングミックスを得る工程；
－前記リフォールディングミックスにヘム補因子を添加する工程、
を含み、
前記リフォールディングミックスへの前記ヘム補因子の添加が、少なくとも１時間の期間にわたって配分される、前記方法。
【請求項2】
前記ヘム補因子が、連続フィードとして前記リフォールディングミックスに添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記リフォールディングミックスが、前記ヘム補因子の添加の前に少なくとも１時間インキュベートされる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記ヘムペルオキシダーゼが、クラスＩＩ又はクラスＩＩＩのヘムペルオキシダーゼである、請求項１～請求項３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
前記ヘムペルオキシダーゼが、配列番号３と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～請求項４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項6】
前記ヘム補因子が、ヘミンである、請求項１～請求項５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
前記のＩＢの形態のヘムペルオキシダーゼが：－前記ヘムペルオキシダーゼをコードする遺伝子を発現する宿主細胞を培養する工程；及び
－前記宿主細胞からＩＢを得る工程、
によって提供される、請求項１～請求項６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
前記可溶化が、可溶化緩衝液において前記ＩＢをインキュベートすることを含む、請求項１～請求項７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
前記可溶化緩衝液が、１～５０ｍｍｏｌ／Ｌのジチオスレイトール（ＤＴＴ）濃度に相当する還元状態を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記ヘム補因子が前記リフォールディングミックスに添加された後に、リフォールディングされたヘムペルオキシダーゼを精製する工程をさらに含む、請求項１～請求項９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
請求項１～請求項１０のいずれか１項に記載の方法によってヘムペルオキシダーゼを生産することを含む、ヘムペルオキシダーゼ製品を生産するための方法。
【請求項12】
ヘムペルオキシダーゼコンジュゲートを得るためのコンジュゲーション反応をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記ヘムペルオキシダーゼ、又は前記ヘムペルオキシダーゼのコンジュゲーション反応により得られたヘムペルオキシダーゼコンジュゲートを精製する、凍結する、及び／又は凍結乾燥する工程をさらに含む、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項14】
前記ヘムペルオキシダーゼ、又は前記ヘムペルオキシダーゼのコンジュゲーション反応により得られたヘムペルオキシダーゼコンジュゲートを固体担体に固定化する工程をさらに含む、請求項１１～請求項１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項15】
前記ヘムペルオキシダーゼ、又は前記ヘムペルオキシダーゼのコンジュゲーション反応により得られたヘムペルオキシダーゼコンジュゲートをキットにパッケージングする工程をさらに含む、請求項１１～請求項１４のいずれか１項に記載の方法。【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0297】
Ｎ１７５Ｓはいくつかの基質において酵素活性を低減させることが見出された。この効果は、しかし、Ｎ１３Ｄ／Ｎ５７Ｓ／Ｐ１４６Ｑ／Ｎ１７５Ｓ／Ｎ２５５Ｄ／Ｎ２６８Ｄ／Ｎ２７５Ｋ（配列番号４）によって弱められた。そのため、この変異体が、高い熱安定性と最適な反応速度性能の組み合わせを提供する。
（付記）
本開示は以下の態様を含む。
項１：
封入体（ＩＢ）からヘムペルオキシダーゼを生産するための方法であって：
－前記ヘムペルオキシダーゼをＩＢの形態で提供する工程；
－前記ＩＢを可溶化する工程；
－前記可溶化されたＩＢをリフォールディング緩衝液中に移してリフォールディングミックスを得る工程；
－前記リフォールディングミックスにヘム補因子を添加する工程、
を含み、
前記リフォールディングミックスへの前記ヘム補因子の添加が、少なくとも１時間、好ましくは少なくとも２時間、より好ましくは少なくとも３時間、なおより好ましくは少なくとも６時間、特に少なくとも１０時間の期間にわたって配分される、前記方法。
項２：
前記ヘム補因子が、連続フィードとして前記リフォールディングミックスに添加される、項１に記載の方法。
項３：
前記リフォールディングミックスが、前記ヘム補因子の添加の前に少なくとも１時間、好ましくは少なくとも２時間、なおより好ましくは少なくとも４時間、特に少なくとも８時間インキュベートされる、項１又は２に記載の方法。
項４：
前記ヘムペルオキシダーゼが、クラスＩＩ又はクラスＩＩＩのヘムペルオキシダーゼ、好ましくはクラスＩＩＩのヘムペルオキシダーゼ、特にセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）である、項１～項３のいずれか１項に記載の方法。
項５：
前記ヘムペルオキシダーゼが、配列番号３と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、なおより好ましくは少なくとも９０％、なおより好ましくは少なくとも９５％、さらになおより好ましくは少なくとも９８％、さらになおより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、特に、前記ヘムペルオキシダーゼが、配列番号３に記載されているアミノ酸配列を含み、最も好ましくは、前記ヘムペルオキシダーゼが、配列番号４に記載されているアミノ酸配列からなる、項１～項４のいずれか１項に記載の方法。
項６：
前記ヘム補因子が、ヘミンである、項１～項５のいずれか１項に記載の方法。
項７：
前記のＩＢの形態のヘムペルオキシダーゼが：
－前記ヘムペルオキシダーゼをコードする遺伝子を発現する宿主細胞を培養する工程；及び
－前記宿主細胞からＩＢを得る工程、
によって提供され、好ましくは、前記宿主細胞が、原核細胞、好ましくは大腸菌細胞である、項１～項６のいずれか１項に記載の方法。
項８：
前記可溶化が、可溶化緩衝液において前記ＩＢをインキュベートすることを含み、好ましくは、前記可溶化緩衝液が、８～１２．５、好ましくは８．５～１１．５、より好ましくは９～１１、なおより好ましくは９．５～１０．５のｐＨを有する、項１～項７のいずれか１項に記載の方法。
項９：
前記可溶化緩衝液が、１～５０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは２～２５ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは４～１５ｍｍｏｌ／Ｌ、特に６～８ｍｍｏｌ／Ｌのジチオスレイトール（ＤＴＴ）濃度に相当する還元状態を有する、項８に記載の方法。
項１０：
前記ヘム補因子が前記リフォールディングミックスに添加された後に、リフォールディングされたヘムペルオキシダーゼを精製する工程をさらに含み、好ましくは、前記方法が、リフォールディングされたヘムペルオキシダーゼから不純物を除去するための遠心分離工程をさらに含み、及び／又は、前記ヘムペルオキシダーゼが、疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）によって精製される、項１～項９のいずれか１項に記載の方法。
項１１：
項１～項１０のいずれか１項に記載の方法によってヘムペルオキシダーゼを生産することを含む、ヘムペルオキシダーゼ製品を生産するための方法。
項１２：
ヘムペルオキシダーゼコンジュゲートを得るためのコンジュゲーション反応をさらに含み、好ましくは、前記ヘムペルオキシダーゼが、結合物質にコンジュゲートされ、好ましくは、前記ヘムペルオキシダーゼが、抗体、抗体断片、抗体模倣体、抗体結合タンパク質、又はストレプトアビジンにコンジュゲートされる、項１１に記載の方法。
項１３：
前記ヘムペルオキシダーゼ又は前記ヘムペルオキシダーゼコンジュゲートを精製する、凍結する、及び／又は凍結乾燥する工程をさらに含む、項１１又は１２に記載の方法。
項１４：
前記ヘムペルオキシダーゼ又はヘムペルオキシダーゼコンジュゲートを固体担体に固定化する工程をさらに含み、好ましくは、前記固体担体が、ナノ粒子、カーボン／ポリビニル材料、又は膜である、項１１～項１３のいずれか１項に記載の方法。
項１５：
前記ヘムペルオキシダーゼ又は前記ヘムペルオキシダーゼコンジュゲートをキットにパッケージングする工程をさらに含む、項１１～項１４のいずれか１項に記載の方法。
（付記）
本開示は以下の態様を含む。
項１：
封入体（ＩＢ）からヘムペルオキシダーゼを生産するための方法であって：
－前記ヘムペルオキシダーゼをＩＢの形態で提供する工程；
－前記ＩＢを可溶化する工程；
－前記可溶化されたＩＢをリフォールディング緩衝液中に移してリフォールディングミックスを得る工程；
－前記リフォールディングミックスにヘム補因子を添加する工程、
を含み、
前記リフォールディングミックスへの前記ヘム補因子の添加が、少なくとも１時間、好ましくは少なくとも２時間、より好ましくは少なくとも３時間、なおより好ましくは少なくとも６時間、特に少なくとも１０時間の期間にわたって配分される、前記方法。
項２：
前記ヘム補因子が、連続フィードとして前記リフォールディングミックスに添加される、項１に記載の方法。
項３：
前記リフォールディングミックスが、前記ヘム補因子の添加の前に少なくとも１時間、好ましくは少なくとも２時間、なおより好ましくは少なくとも４時間、特に少なくとも８時間インキュベートされる、項１又は２に記載の方法。
項４：
前記ヘムペルオキシダーゼが、クラスＩＩ又はクラスＩＩＩのヘムペルオキシダーゼ、好ましくはクラスＩＩＩのヘムペルオキシダーゼ、特にセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）である、項１～項３のいずれか１項に記載の方法。
項５：
前記ヘムペルオキシダーゼが、配列番号３と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、なおより好ましくは少なくとも９０％、なおより好ましくは少なくとも９５％、さらになおより好ましくは少なくとも９８％、さらになおより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、特に、前記ヘムペルオキシダーゼが、配列番号３に記載されているアミノ酸配列を含み、最も好ましくは、前記ヘムペルオキシダーゼが、配列番号４に記載されているアミノ酸配列からなる、項１～項４のいずれか１項に記載の方法。
項６：
前記ヘム補因子が、ヘミンである、項１～項５のいずれか１項に記載の方法。
項７：
前記のＩＢの形態のヘムペルオキシダーゼが：
－前記ヘムペルオキシダーゼをコードする遺伝子を発現する宿主細胞を培養する工程；及び
－前記宿主細胞からＩＢを得る工程、
によって提供され、好ましくは、前記宿主細胞が、原核細胞、好ましくは大腸菌細胞である、項１～項６のいずれか１項に記載の方法。
項８：
前記可溶化が、可溶化緩衝液において前記ＩＢをインキュベートすることを含み、好ましくは、前記可溶化緩衝液が、８～１２．５、好ましくは８．５～１１．５、より好ましくは９～１１、なおより好ましくは９．５～１０．５のｐＨを有する、項１～項７のいずれか１項に記載の方法。
項９：
前記可溶化緩衝液が、１～５０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは２～２５ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは４～１５ｍｍｏｌ／Ｌ、特に６～８ｍｍｏｌ／Ｌのジチオスレイトール（ＤＴＴ）濃度に相当する還元状態を有する、項８に記載の方法。
項１０：
前記ヘム補因子が前記リフォールディングミックスに添加された後に、リフォールディングされたヘムペルオキシダーゼを精製する工程をさらに含み、好ましくは、前記方法が、リフォールディングされたヘムペルオキシダーゼから不純物を除去するための遠心分離工程をさらに含み、及び／又は、前記ヘムペルオキシダーゼが、疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）によって精製される、項１～項９のいずれか１項に記載の方法。
項１１：
項１～項１０のいずれか１項に記載の方法によってヘムペルオキシダーゼを生産することを含む、ヘムペルオキシダーゼ製品を生産するための方法。
項１２：
ヘムペルオキシダーゼコンジュゲートを得るためのコンジュゲーション反応をさらに含み、好ましくは、前記ヘムペルオキシダーゼが、結合物質にコンジュゲートされ、好ましくは、前記ヘムペルオキシダーゼが、抗体、抗体断片、抗体模倣体、抗体結合タンパク質、又はストレプトアビジンにコンジュゲートされる、項１１に記載の方法。
項１３：
前記ヘムペルオキシダーゼ又は前記ヘムペルオキシダーゼコンジュゲートを精製する、凍結する、及び／又は凍結乾燥する工程をさらに含む、項１１又は１２に記載の方法。
項１４：
前記ヘムペルオキシダーゼ又はヘムペルオキシダーゼコンジュゲートを固体担体に固定化する工程をさらに含み、好ましくは、前記固体担体が、ナノ粒子、カーボン／ポリビニル材料、又は膜である、項１１～項１３のいずれか１項に記載の方法。
項１５：
前記ヘムペルオキシダーゼ又は前記ヘムペルオキシダーゼコンジュゲートをキットにパッケージングする工程をさらに含む、項１１～項１４のいずれか１項に記載の方法。
【国際調査報告】