▶ パル・バイオテクノロジー・（ホーペイ）・カンパニー・リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-05-10
(54)【発明の名称】免疫調節機能を有するＣｐＧ ＯＤＮ及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/117 20100101AFI20230428BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230428BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20230428BHJP
A61P 37/08 20060101ALI20230428BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20230428BHJP
A61K 31/7115 20060101ALI20230428BHJP
A61K 31/712 20060101ALI20230428BHJP
A61K 31/7125 20060101ALI20230428BHJP
A61K 39/39 20060101ALI20230428BHJP
A61K 39/205 20060101ALI20230428BHJP
【ＦＩ】
C12N15/117 Z ZNA
A61P35/00
A61P31/00
A61P37/08
A61P37/02
A61K31/7115
A61K31/712
A61K31/7125
A61K39/39
A61K39/205
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022559536
(86)(22)【出願日】2021-03-31
(85)【翻訳文提出日】2022-11-28
(86)【国際出願番号】 CN2021084467
(87)【国際公開番号】W WO2021197381
(87)【国際公開日】2021-10-07
(31)【優先権主張番号】202010253089.8
(32)【優先日】2020-04-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522383115
【氏名又は名称】パル・バイオテクノロジー・（ホーペイ）・カンパニー・リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＰＡＲＲ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ （ＨＥＢＥＩ） ＣＯ．， ＬＴＤ．
(74)【代理人】
【識別番号】110001508
【氏名又は名称】弁理士法人 津国
(72)【発明者】
【氏名】ワン，リーゴン
(72)【発明者】
【氏名】シャオ，ヤン
【テーマコード（参考）】
4C085
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C085AA03
4C085AA38
4C085BA64
4C085EE06
4C085FF14
4C085GG02
4C085GG03
4C086AA01
4C086AA02
4C086AA03
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086MA66
4C086NA14
4C086ZB05
4C086ZB09
4C086ZB13
4C086ZB26
4C086ZB32
4C086ZC61
(57)【要約】
一般式Ｉに示される構造で化学修飾された免疫調節性ＣｐＧ ＯＤＮ及びその使用を提供する。前記ＣｐＧ ＯＤＮは、免疫刺激活性を有し、Ｂ細胞の増殖を刺激でき、特異的サイトカインを産生できる。上記ＣｐＧ ＯＤＮは、ワクチンアジュバントとして単独で使用してもよく、他のアジュバントと組み合わせて相乗作用を発揮してもよく、腫瘍、感染、アレルギーを予防又は治療するための薬物の調製にも使用することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１～６から選択されるヌクレオチド配列を含むか又は配列番号１～６から選択されるヌクレオチド配列からなる免疫調節性ＣｐＧ ＯＤＮであって、前記ヌクレオチド配列中の少なくとも１つのヌクレオチドは、一般式Ｉに示される構造を有する化学修飾されたヌクレオチドである、免疫調節性ＣｐＧ ＯＤＮ：【化1】
（式中、Ｙは、Ｓ又はＯであり、Ｒは、Ｈ又は正に帯電した対イオンであり、Ｂは、独立して未修飾の又は修飾された核酸塩基であり、Ｒ１は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、ＯＨ、ＯＭｅ、Ｍｅ、Ｏ－エチルオキシメチルである）。
【請求項2】
Ｙは、Ｓである、請求項１に記載の免疫調節性ＣｐＧ ＯＤＮ。
【請求項3】
前記ＣｐＧ ＯＤＮのヌクレオチド配列中の全てのヌクレオチドは、一般式Ｉに示される構造を有する化学修飾されたヌクレオチドである、請求項１又は２に記載の免疫調節性ＣｐＧ ＯＤＮ。
【請求項4】
前記免疫調節性ＣｐＧ ＯＤＮの配列は、配列番号１～６であり、好ましくは、全てホスホロチオエート化された配列番号１～６であり、より好ましくは、全てホスホロチオエート化された配列番号３又は６である、請求項３に記載の免疫調節性ＣｐＧ ＯＤＮ。
【請求項5】
請求項１～４のいずれか一項に記載の免疫調節性ＣｐＧ ＯＤＮと薬学的に許容可能な担体とを含む、医薬組成物。
【請求項6】
ワクチンアジュバントの調製における、請求項１～４のいずれか一項に記載の免疫調節性ＣｐＧ ＯＤＮの使用。
【請求項7】
前記ワクチンは、狂犬病ワクチンであり、好ましくは、ＣｐＧ ＯＤＮの量は、０．０１μｇ～１０００μｇ／ｍｌであり、より好ましくは１～１０μｇ／ｍｌであり、例えば、１、３、又は１０μｇ／ｍｌである、請求項６に記載の使用。
【請求項8】
前記ワクチンは、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ワクチンであり、好ましくは、不活化ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ワクチンであり、ＣｐＧ ＯＤＮの量は、０．０１μｇ～１０００μｇ／ｍｌである、請求項６に記載の使用。
【請求項9】
前記ワクチンアジュバントは、前記免疫調節性ＣｐＧ ＯＤＮと共同で作用する１つ又は複数の他のアジュバント、例えば不溶性アルミニウム塩コロイド、油水エマルジョン、微生物及び代謝産物、核酸及びその類似体、サイトカイン、免疫刺激複合体、プロポリス、及びリポソームをさらに含む、請求項６～８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項10】
対象の腫瘍、微生物感染又はアレルギーを予防又は治療するための医薬の調製における、請求項１～４のいずれか一項に記載の免疫調節性ＣｐＧ ＯＤＮ又は請求項５に記載の医薬組成物の使用。
【請求項11】
前記対象は、人、又は動物、例えばマウス、ラット、飼育動物、例えば犬、豚、牛、馬、家禽、例えば鶏、アヒル、ガチョウである、請求項９に記載の使用。
【請求項12】
請求項１～４のいずれか一項に記載の免疫調節性ＣｐＧ ＯＤＮ及び抗原を含むワクチンであって、前記抗原は、狂犬病抗原又はＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２抗原である、ワクチン。
【請求項13】
前記ワクチンは、ヒト用又は動物用のワクチンであり、前記免疫調節性ＣｐＧ ＯＤＮは、全てホスホロチオエート化された配列番号３に示される免疫調節性ＣｐＧ ＯＤＮであり、前記ＣｐＧ ＯＤＮの量は、０．０１μｇ～１０００μｇ／ｍｌであり、より好ましくは１～１０μｇ／ｍｌであり、例えば、１、３、又は１０μｇ／ｍｌである、請求項１２に記載のワクチン。
【請求項14】
前記ワクチンは、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ワクチンであり、好ましくは不活化ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ワクチンであり、前記ワクチンは、アルミニウムアジュバント、例えば水酸化アルミニウムアジュバントをさらに含む、請求項１２に記載のワクチン。
【請求項15】
前記免疫調節性ＣｐＧ ＯＤＮは、全てホスホロチオエート化された配列番号６に示される免疫調節性ＣｐＧ ＯＤＮである、請求項１４に記載のワクチン。
【請求項16】
前記抗原の含有量は、１～１０μｇ／ｍＬであり、例えば２、４又は８μｇ／ｍＬであり、前記水酸化アルミニウムの含有量は、１～１０００μｇ／ｍＬであり、好ましくは３００～５００μｇ／ｍＬであり、前記免疫調節性ＣｐＧ ＯＤＮの含有量は、１～１０００μｇ／ｍＬであり、好ましくは２～５００μｇ／ｍＬであり、例えば５μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬ、８０μｇ／ｍＬ、又は４００μｇ／ｍＬである、請求項１５に記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、免疫調節機能を有するＣｐＧ ＯＤＮ及びその使用に関する。前記ＣｐＧ ＯＤＮは、良好な免疫刺激活性を有し、Ｂ細胞の増殖を刺激でき、サイトカインを産生できる。それは、ワクチンアジュバントとして単独で使用することも、他のアジュバントと組み合わせて使用して相乗効果を発揮することもでき、また、腫瘍、感染、及びアレルギーを予防又は治療するための薬物の調製に使用することもできる。
【背景技術】
【0002】
１９８４年に、カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）の核酸成分がマウス腫瘍保持モデルにおいて抗腫瘍作用を有することが発見され、それをヒト腫瘍の治療に使用することに成功した（Ｔｏｋｕｎａｇａ Ｔ、Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｈ、Ｓｈｉｍａｄａ Ｓ、ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｆｒａｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ ＢＣＧ．Ｉ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ、１９８４、７２（４）：９５５－９６２）。リボヌクレアーゼとデオキシリボヌクレアーゼを用いて分解分析後、本当に作用する成分は細菌中のデオキシリボ核酸であることが証明された（Ｔｏｋｕｎａｇａ Ｔ、Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｓ、Ｎａｍｂａ Ｋ．Ａ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ，Ｐｏｌｙ（ｄＧ、ｄＣ），ｉｎｄｕｃｅｓ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ａｌｐｈａ／ｂｅｔａ ａｎｄ ｇａｍｍａ，ａｕｇｍｅｎｔｓ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ，ａｎｄ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ．Ｊｐｎ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、１９８８、７９（６）：６８２－６８６；Ｔｏｋｕｎａｇａ Ｔ、Ｙａｎｏ Ｏ、Ｋｕｒａｍｏｔｏ Ｅ、ｅｔ ａ１．Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈ ｐａｒｔｉｃｕｌａｒ ｂａｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃＤＮＡ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ ＢＣＧ ｉｎｄｕｃｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｅ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９２、３６（１）：５５－６６）。配列分析により、免疫活性を有するオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）が配列中に少なくとも１つ又は複数のＣＧジヌクレオチドを含み、ＣＧはリン（ｐ）でつながっていることが示された。したがって、オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）は、免疫活性化配列（ＩＳＳ）としても知られているＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ ＯＤＮ）と総称された。
【0003】
ＣｐＧ ＯＤＮの免疫刺激活性は、それ自体の構造に影響を受ける。細菌などの病原性微生物のゲノムにはＣＧジヌクレオチドが多く存在する。しかしながら、ヒトや脊椎動物のゲノムには、ＣＧジヌクレオチドがほとんど見出されず、たとえヒトや脊椎動物のゲノムにＣＧジヌクレオチドが存在しても、その中のシトシンやグアニンのヌクレオチドは、通常メチル化されている。ＣｐＧジヌクレオチドの欠失、逆転及びメチル化は、その活性の喪失を招く可能性があり、これは、ＣｐＧ ＯＤＮ中の非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドの存在が免疫刺激活性の基礎であることを示している（凌世淦．免疫活性オリゴデオキシヌクレオチドＣｐＧの研究進捗［Ｊ］．Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２００８、２８（６）：５７１－５７６）。ＣｐＧ ＯＤＮでは、複数のデオキシヌクレオチドは、多様な組み合わせで規則的に配列されている。しかしながら、異なる配列構造特徴のＣｐＧ ＯＤＮの免疫活性は顕著に異なっており、配列中の１つ又はいくつかのヌクレオチドの改変は、その免疫活性に大きな影響を与える可能性がある。そのため、構造と活性との関係を理解し、把握することは、我々が免疫活性を有するより多くの配列を設計することに役立つ。
【0004】
マウスにおいてＢリンパ球を刺激する活性を有するＣｐＧ ＯＤＮについては、その塩基配列は一般に以下のルールを有する：ＣｐＧジヌクレオチドの５’末端に近い２つの塩基は一般的にプリン、好ましくはＧｐＡであり、３’末端に近い２つの塩基は一般的にピリミジン、好ましくはＴｐＣ又はＴｐＴである（Ｋｒｉｅｇ Ａ Ｍ、Ｙｉ ＡＫ、Ｍａｔｓｏｎ Ｓ、ｅｔ ａ１．ＣｐＧ ｍｏｔｉｆｓ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ＤＮＡ ｔｒｉｇｇｅｒ ｄｉｒｅｃｔ Ｂ－ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ、１９９５、３７４（６５２２）：５４６－５４９）。ＣｐＧジヌクレオチドの５’末端近くのＣ又はＧは、マウスにおけるＮＫリンパ球の刺激におけるＣｐＧ ＯＤＮの活性を顕著に阻害し得るが、３’末端近くのＣは、活性に対する影響がほとんどない。５’末端にＧＡを有するＧＡＣＧＴＴ／Ｃは、マウスに対して強い作用を有するＣｐＧモチーフであるが、５’末端のＧＡをＧＣやＧＧに置き換えることによって得られるＧＣＣＧＴＴ／Ｃ又はＧＧＣＧＴＴ／Ｃモチーフの免疫活性は低下することが分かり得る。ヒト末梢血単核細胞は、「ＧＴＣＧＴＴ」、「ＴＴＣＧＴＴ」、又は「ＡＡＣＧＴＴ」を含むモチーフで活性化することができ、作用が最も強いモチーフはＧＴＣＧＴＴである（Ｂａｌｌａｓ ＺＫ、Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ Ｗ Ｌ、Ｋｒｉｅｇ ＡＭ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＮＫ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｍｕｒｉｎｅ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ＣｐＧ ｍｏｔｉｆｓ ｉｎ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ＤＮＡ［Ｊ］．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９６、１５７（５）：１８４０－１８４５）。複数のＴＣＧ反復配列は、ヒトＢ細胞とＮＫ細胞に対するＣｐＧ ＯＤＮの刺激作用を増強するのに役立つ（Ｈａｒｔｍａｎｎ Ｇ、Ｋｒｉｅｇ ＡＭ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｅｗｌｙ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ＣｐＧ ＤＮＡ ｍｏｔｉｆ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｒｙ Ｂ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２０００、１６４（２）：９４４－９５３）。複数のＴＣＧ反復配列を含むＴ７とＴ８は、ヒトＰＢＭＣに対しても良好な免疫刺激活性を有する。複数のＴＣＧ反復配列は、ＧＴＣＧＴＣモチーフを形成し、これは、ＣｐＧジヌクレオチドの３’末端がＴｐＣである時に形成されたＧＴＣＧＴＣモチーフも、ヒトに対して強い免疫刺激活性を有することを示している（許洪林、王四清、王世峰．２つのＣｐＧモチーフはヒト免疫細胞を高度に活性化する［Ｊ］．Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２００１、２１（５）：４７１－４７５）。ＣｐＧ ＯＤＮ配列には５’－ＮＴＣＧＴＴ－３’モチーフの２つ以上のコピーが存在し、これは長さが１５～３５個のヌクレオチドであり、ここで、ＮはＡ又はＧを表さない。そのようなＣｐＧ ＯＤＮは、インビトロでヒト及びマウスの免疫細胞に対して良好な免疫刺激活性を有する（許洪林．免疫刺激活性を有するチオリゴデオキシヌクレオチド及びその使用、ＣＮ １０１４９２６７２ Ａ）。ＣｐＧ ＯＤＮのコア配列は、一般式：５’－Ｘ１－Ｘ２－ＣＧ－Ｙ１－Ｙ２－３’を有する６－ヌクレチシドモチーフであり、ここで、Ｘ１は、プリン塩基ヌクレオチドであり、Ｘ２もプリン又はチミン（Ｔ）であり、Ｙ１及びＹ２はいずれもピリミジンである。さらに、この６－ヌクレオチドモチーフに加えて、周辺配列や複数のＣｐＧ間の配列もＣｐＧ ＯＤＮの活性に影響を持つ（Ｋｒｉｅｇ ＡＭ、Ｈａｒｔｍａｎｎ Ｇ、Ｙｉ ＡＫ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ＣｐＧ ＤＮ Ａ．Ｃｕｒｔ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２０００．２４７（１）：１－２１）。ＣｐＧの２つの側面に隣接する塩基の配列は、ほとんど５’ＰｕｒＰｕｒＣＧＰｙｒＰｙｒ３’のルール、すなわち５’末端が２つのプリン、３’末端が２つのピリミジンに従うことが、他の研究により見出された（Ｇ．Ｍｕｔｗｉｒｉ、Ｒ．Ｐｏｎｔａｒｏｌｌｏ、Ｓ．ＢａＢＩＵＫ．Ｂｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ＣｐＧ ＯＤＮ ｍｏｔｉｆ ｉｎ ｄｏｍｅｓｔｉｃ ａｎｉｍａｌｓ．Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ、２００３、９１：８９－１０３）。
【0005】
ＴＬＲ９は、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）ファミリーのメンバーの１つであり、これは主に細菌ＤＮＡ中のＣｐＧモチーフを認識する。ＣｐＧ ＯＤＮは、ＴＬＲ９依存の方式で個体の先天的免疫応答を刺激することができる。ウイルスや細菌のゲノムにおけるＣｐＧ ＯＤＮは、ＴＬＲ９の天然のアゴニストである。したがって、細胞が細菌に感染するか又は細菌が細胞中に摂取されると、ＴＬＲ９は、Ｔｈ１ドミナント免疫応答を開始する（ＡＨＬＥＲＳ Ｊ Ｄ、ＢＥＬＹＡＫＯＶ Ｉ Ｍ．Ｍｅｍｏｒｉｅｓ ｔｈａｔ ｌａｓｔ ｆｏｒｅｖｅｒ： Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｖａｃｃｉｎｅ Ｔ－ｃｅｌｌ ｍｅｍｏｒｙ［Ｊ］Ｂｌｏｏｄ、２０１０、１１５（９）；１６７８－１６８９）。
【0006】
ＣｐＧ ＯＤＮは、ＴＬＲ９分子を発現する細胞を刺激し、免疫調節カスケードを引き起こし、最終的に炎症促進性のサイトカインとケモカインを産生するだけでなく、また樹状細胞、単球及びマクロファージの抗原提示機能を改善し、Ｂ細胞の増殖を誘導し、ＮＫ細胞の免疫保護活性を刺激し、生体内免疫応答反応を誘導する。したがって、ＣｐＧ ＯＤＮは、高効率及び低毒性の免疫アジュバントであり、疾患の治療に高い価値がある（ＳＵＮ Ｓ Ｑ、ＺＨＡＮＧ Ｘ Ｈ、ＴＯＵＧＨ Ｄ Ｆ．Ｔｙｐｅ Ｉ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ＣｐＧ ＤＮＡ［Ｊ］Ｊ．Ｅｘｐ Ｍｅｄ、１９９８、１８８（１２）：２３３５－２３４２）。
【0007】
ＣｐＧ ＯＤＮのワクチンアジュバント活性は、予防的及び治療的ワクチンについての大量の動物実験で実証されている。マウスモデルにおいて、ＣｐＧ ＯＤＮは、パピローマウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ブルセラ菌、クラミジア、ＨＩＶ、アスペルギルス、マイコバクテリア、トリパノソーマ、ミクソウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、サイトメガロウイルス、デングウイルス、狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルスなどの各種のワクチンと併用される。２０００年以来、２０種類以上のＣｐＧ ＯＤＮをアジュバントとして有するワクチンが臨床的に研究されている（ＫＲＩＥＧ ＡＭ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ９ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ、２００６、５（６）：４７１－４８４； Ｄｅｎｎｉｓ Ｍ Ｋｌｉｎｍａｎ．ＣｐＧ ＤＮＡ ａｓ ａ ｖａｃｃｉｎｅ ａｄｊｕｖａｎｔ［Ｊ］．Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ、２００３、２（２）：３０５－３１５； ＫＲＩＥＧ ＡＭ．ＣｐＧ ｓｔｉｌｌ ｒｏｃｋｓ！ Ｕｐｄａｔｅ ｏｎ ａｎ ａｃｃｉｄｅｎｔａｌ ｄｒｕｇ［Ｊ］．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｈｅｒ．２０１２、２２（２）：７７－８９）。Ｂ型ＣｐＧ ＯＤＮは、実験の主な研究対象であり、それはワクチンアジュバントとして感染性疾患の予防及び治療に用いられている。ＤｙｎａｖａｘによるＨＥＰＬＩＳＡＶ－Ｂ Ｂ型肝炎ワクチンは、２０１７年１１月にＦＤＡに承認されている。
【0008】
ウイルスに対するＣｐＧ ＯＤＮの阻害作用は、呼吸器合胞体ウイルス、肝炎ウイルス、ＨＩＶなどでの実験で実証されている（Ｌｉｕ Ｓ、Ｓｕｎ Ｗ、Ｃａｏ Ｙ． Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ａｎｔｉ－ＨＢＶ ｅｆｆｅｃｔｓ ｂｙ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｃｈｉｎａ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２００１、３５（５）、３３８－３４０； Ｌｕｎｄ ＯＳ、Ｈａｎｓｅｎ ＪＥ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＨＩＶ－１ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｐｐｌｉｅｄ ｉｎ ｆｒｅｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９９８、４１（２－３）、６３－６８）。
【0009】
ＣｐＧ ＯＤＮは、多くのマウスモデルで抗腫瘍活性を有し、腫瘍が相対的に小さい場合には、ＣｐＧ ＯＤＮ単独で、Ｔ細胞が媒介する腫瘍拒絶反応を効果的に誘導することができる。しかし、大きい腫瘍に対しては、ＣｐＧ ＯＤＮは、他の処置、例えばモノクローナル抗体、放射線療法、手術、化学療法と組み合わせる必要があり、強い相乗効果を有する。ＣｐＧ ＯＤＮが媒介する腫瘍消退は、Ｔ細胞依存性及びＮＫ細胞非依存性であってもよいし、又はＮＫ細胞依存性及びＴ細胞非依存性であってもよい。メラノーマポリペプチド抗原ワクチンのアジュバントとして、ＣｐＧ ７９０９は、腫瘍を有する患者の生存を顕著に改善することができ、強いメラノーマタンパク質抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞反応を誘導することができる（ｖａｎ Ｏｊｉｋ，Ｈ．ｅｔ ａｌ Ｐｈａｓｅ Ｉ／ＩＩ ｓｔｕｄｙ ｗｉｔｈ ＣＰＧ ７９０９ ａｓ ａｄｊｕｖａｎｔ ｔｏ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＭＡＧＡ－３ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＭＡＧＡ－３ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｔｕｍｏｒｓ．Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ ２００２、１３、１５７； Ｓｐｅｉｓｅｒ、Ｄ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｔｒｏｎｇ ｈｕｍａｎ ＣＤ８（＋） Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｐｅｐｔｉｄｅ，ＩＦＡ，ａｎｄ ＣＰＧ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ７９０９．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ、２００５、１１５、７３９－７４６）。
【0010】
単独で又は抗腫瘍抗体と組み合わせてＣｐＧ ＯＤＮはいずれも、Ｔｈ１サイトカイン分泌を誘導し、ＡＤＣＣ作用を増強することができる（Ｈａｒｔｍａｎｎ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｕｍｏｒ－ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００３：６３、６４７８－６４８７）。Ｂ型１０１８ ＩＳＳとリツキシマブとの組み合わせは、非ホジキンリンパ腫の治療において非常に効果があり、臨床試験に入っている（Ｆｒｉｅｄｂｅｒｇ，Ｊ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ａ ＣＰＧ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（１０１８ ＩＳＳ） ａｎｄ ｒｉｔｕｘｉｍａｂ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｎｏｎ－Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ－Ｈｏｄｇｋｉｎ ｌｙｍｐｈｏｍａ： ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－α／β－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， ｗｉｔｈｏｕｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｔｏｘｉｃｉｔｙ．Ｂｌｏｏｄ ２００５：１０５、４８９－４９５）。
【0011】
臨床試験では、腫瘍周囲にＣｐＧ ＯＤＮを注射した後に放射線治療を行った再発性膠芽腫の一部の患者において、癌細胞の増殖と転移が一定の程度まで阻害された（Ｓｅｎｔｉ Ｇ、Ｊｏｈａｎｓｅｎ Ｐ、Ｈａｕｇ Ｓ、ｅｔ ａｌ．Ｕｓｅ ｏｆ Ａ－ｔｙｐｅ ＣｐＧ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ ａｎ ａｄｊｕｖａｎｔ ｉｎ ａｌｌｅｒｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ： ａ ｐｈａｓｅ Ｉ／ＩＩａ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌ［Ｊ］．Ｃｌｉｎｉｃ Ｅｘｐｅｒｉｍ Ａｌｌｅｒｇｙ、２００９、３９（４）：５６２－５７０；Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ Ａ、Ｌａｉｇｌｅ－Ｄｏｎａｄｅｙ Ｆ、Ｚｏｈａｒ Ｓ、ｅｔ ａｌ．Ｐｈａｓｅ １ ｔｒｉａｌ ｏｆ ａ ＣｐＧ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｆｏｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ［Ｊ］．Ｎｅｕｒｏ－Ｏｎｃｏｌ、２００６，８（１）：６０－６６）。他の臨床試験により、腫瘍内にＣｐＧ ７９０９を注射することでメラノーマ腫瘍の完全消退が達成されたが、５例の転移性メラノーマ患者の遠隔部の腫瘍を阻止できなかったことが示された（Ｐａｓｈｅｎｋｏｖ Ｍ、Ｇｏｅｓｓ Ｇ、Ｗａｇｎｅｒ Ｃ、ｅｔ ａｌ．Ｐｈａｓｅ ＩＩ ｔｒｉａｌ ｏｆ ａ ｔｏｌｌ-ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ９－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｍｅｌａｎｏｍａ［Ｊ］．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌ Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｊ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｃｌｉｎｉｃ Ｏｎｃｏｌ、２００６．２４（３６）：５７１６－５７２４）。ＣｐＧ ７９０９の２つの第３相臨床試験のデータは、単独の化学療法と比較して臨床結果を改善できなかったことを示した。本分野では、新規な免疫調節性ポリヌクレオチドの発見を継続する必要がある。
【0012】
ＣｐＧ ＯＤＮは、高効率及び低毒性の免疫アジュバントであり、感染性疾患、免疫不全性疾患、腫瘍、及びアレルギー性疾患の治療に強大な潜在的価値がある。しかし、現在の実際の使用は限られており、より多くの深い研究が、より多くの効果的な配列構造を設計し、それらが、その潜在能力をより広く発揮でき、より安全で効率的に臨床で使用できるようにする必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0013】
本発明は、免疫調節機能を有する一連のＣｐＧ ＯＤＮを提供する。これらのＣｐＧ ＯＤＮの構造は新規で、それらはマウスとヒトの両方に対して免疫刺激作用があるため、大きな臨床上の価値がある。具体的には、本発明は、以下の技術的解決手段によって本分野における課題を解決する：
【課題を解決するための手段】
【0014】
１．配列番号１～６から選択されるヌクレオチド配列を含むか又は配列番号１～６から選択されるヌクレオチド配列からなる免疫調節性ＣｐＧ ＯＤＮであって、前記ヌクレオチド配列中の少なくとも１つのヌクレオチドは、一般式Ｉに示される構造を有する化学修飾されたヌクレオチドである、免疫調節性ＣｐＧ ＯＤＮ：
（式中、Ｙは、Ｓ又はＯであり、Ｒは、Ｈ又は正に帯電した対イオンであり、Ｂは、独立して未修飾の又は修飾された核酸塩基であり、Ｒ１は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、ＯＨ、ＯＭｅ、Ｍｅ、Ｏ－エチルオキシメチルである）。
【化1】
（式中、Ｙは、Ｓ又はＯであり、Ｒは、Ｈ又は正に帯電した対イオンであり、Ｂは、独立して未修飾の又は修飾された核酸塩基であり、Ｒ１は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、ＯＨ、ＯＭｅ、Ｍｅ、Ｏ－エチルオキシメチルである）。
【0015】
２．Ｙは、Ｓである、項目１に記載の免疫調節性ＣｐＧ ＯＤＮ。
【0016】
３．前記ＣｐＧ ＯＤＮのヌクレオチド配列中の全てのヌクレオチドは、一般式Ｉに示される構造を有する化学修飾されたヌクレオチドである、項目１又は２に記載の免疫調節性ＣｐＧ ＯＤＮ。
【0017】
４．免疫調節性ＣｐＧ ＯＤＮの配列は、配列番号１～６から選択され、好ましくは、全てホスホロチオエート化された配列番号１～６であり、より好ましくは、全てホスホロチオエート化された配列番号３又は６である、項目３に記載の免疫調節性ＣｐＧ ＯＤＮ。
【0018】
５．項目１～４のいずれか一項に記載の免疫調節性ＣｐＧ ＯＤＮと薬学的に許容可能な担体とを含む、医薬組成物。
【0019】
６．ワクチンアジュバントの調製における、項目１～４のいずれか一項に記載の免疫調節性ＣｐＧ ＯＤＮの使用。
【0020】
７．前記ワクチンは、狂犬病ワクチンであり、好ましくは、ＣｐＧ ＯＤＮの量は、０．０１μｇ～１０００μｇ／ｍｌであり、より好ましくは１～１０μｇ／ｍｌであり、例えば、１、３、又は１０μｇ／ｍｌである、項目６に記載の使用。
【0021】
８．前記ワクチンは、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ワクチンであり、好ましくは、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２不活化ワクチンであり、ＣｐＧ ＯＤＮの量は、０．０１μｇ～１０００μｇ／ｍｌである、項目６に記載の使用。
【0022】
９．前記ワクチンアジュバントは、前記免疫調節性ＣｐＧ ＯＤＮと共同で作用する１つ又は複数の他のアジュバント、例えば不溶性アルミニウム塩コロイド、油水エマルジョン、微生物及び代謝産物、核酸及びその類似体、サイトカイン、免疫刺激複合体、プロポリス、及びリポソームをさらに含む、項目６～８のいずれか一項に記載の使用。
【0023】
１０．対象の腫瘍、微生物感染又はアレルギーを予防又は治療するための医薬の調製における、項目１～４のいずれか一項に記載の免疫調節性ＣｐＧ ＯＤＮ又は項目５に記載の医薬組成物の使用。
【0024】
１１．前記対象は、人、又は動物、例えばマウス、ラット、飼育動物、例えば犬、豚、牛、馬、家禽、例えば鶏、アヒル、ガチョウである、項目９に記載の使用。
【0025】
１２．項目１～４のいずれか一項に記載の免疫調節性ＣｐＧ ＯＤＮ及び抗原を含むワクチンであって、前記抗原は、狂犬病抗原又はＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２抗原である、ワクチン。
【0026】
１３．前記ワクチンは、ヒト用又は動物用のワクチンであり、前記免疫調節性ＣｐＧ ＯＤＮは、全てホスホロチオエート化された配列番号３に示される免疫調節性ＣｐＧ ＯＤＮであり、前記ＣｐＧ ＯＤＮの量は、０．０１μｇ～１０００μｇ／ｍｌであり、より好ましくは１～１０μｇ／ｍｌであり、例えば、１、３、又は１０μｇ／ｍｌである、項目１２に記載のワクチン。
【0027】
１４．前記ワクチンは、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ワクチンであり、好ましくはＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２不活化ワクチンであり、前記ワクチンは、アルミニウムアジュバント、例えば水酸化アルミニウムアジュバントをさらに含む、項目１２に記載のワクチン。
【0028】
１５．前記免疫調節性ＣｐＧ ＯＤＮは、全てホスホロチオエート化された配列番号６に示される免疫調節性ＣｐＧ ＯＤＮである、項目１４に記載のワクチン。
【0029】
１６．前記抗原の含有量は、１～１０μｇ／ｍＬであり、例えば２、４又は８μｇ／ｍＬであり、前記水酸化アルミニウムの含有量は、１～１０００μｇ／ｍＬであり、好ましくは３００～５００μｇ／ｍＬであり、前記免疫調節性ＣｐＧ ＯＤＮの含有量は、１～１０００μｇ／ｍＬであり、好ましくは２～５００μｇ／ｍＬであり、例えば５μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬ、８０μｇ／ｍＬ、又は４００μｇ／ｍＬである、項目１５に記載のワクチン。
【図面の簡単な説明】
【0030】
【発明を実施するための形態】
【0031】
定義
ＣｐＧ ＯＤＮ
ＣｐＧ ＯＤＮ
【0032】
本発明におけるＣｐＧ ＯＤＮは、ホスホジエステル結合で連結された非メチル化ジヌクレオチドであり、免疫刺激作用を有する。ＣｐＧ ＯＤＮは、Ｂ細胞の増殖及び分化並びにＩＬ－６の分泌を促進することができ、それにより、抗体の分泌を誘導し、単球、マクロファージ及び樹状細胞等の提示細胞を活性化して種々のサイトカイン（例えば、ＩＬ－１２、ＩＬ－６、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－α及びＩＦＮ－β等）を分泌する。サイトカインは、キラーＴ細胞（ＣＴＬ）とナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）の活性を間接的に促進し、細胞内病原体による細胞性免疫を誘導し、ＮＫ細胞とＴ細胞からＩＦＮ－γの分泌を誘導する。天然免疫反応の誘導に加えて、ＣｐＧ ＯＤＮは、抗原特異的反応を以下の理由により増強することもできる：（１）Ｂ細胞抗原受容体により開始される信号伝達経路とＣｐＧにより開始されるＢ細胞信号伝達経路との間に強い相乗効果が存在し、（２）ＣｐＧ ＯＤＮは、抗原特異的ＴヘルパーＴｈ１様サイトカインを増加させることができ、それにより、Ｂ細胞とＴ細胞の抗原特異的反応を増強し、（３）細胞反応は、補助的刺激分子によるポジティブな制御を必要とする。
【0033】
早くも１８９０年代に、癌患者に細菌抽出物を注射することが病状を顕著に軽減できたことが発見された。その後の研究により、細菌ＤＮＡは直接的な免疫刺激作用と抗腫瘍作用を持っていたことが示された。合成オリゴデオキシヌクレオチドでの実験研究により、細菌ＤＮＡの免疫刺激作用がその中の非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドに関連することが発見された。
【0034】
免疫刺激活性を有するＣｐＧ ＯＤＮは、以下の基本的な構造特徴を有する：
【0035】
ａ．ＣｐＧモチーフは、ＣｐＧ ＯＤＮが免疫刺激作用を産生する基本的な構造であり、ＣｐＧジヌクレオチド及びその５’末端と３’末端の２つの塩基から構成される。
【0036】
ｂ．ＣｐＧの両側のプリンとピリミジン及びＣｐＧの間隔は、ＣｐＧ ＯＤＮの免疫刺激活性及び作用の特徴に影響を与え得る。
【0037】
ｃ．ＯＤＮに含まれるＣｐＧモチーフの数に関して、２～４つのＣｐＧモチーフが通常最適であり、ＣｐＧモチーフ間の間隔は、通常少なくとも２つの塩基（好ましくはチミン）である。
【0038】
ｄ．ｐｏｌｙ－Ｇ配列（３つ以上のグアニンから構成される）を含むＣｐＧ ＯＤＮは、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）を刺激してインターフェロン－αを産生させることに対して強い作用を有する。全てチオ修飾されたＣｐＧ ＯＤＮが、最も安定的で、Ｂ細胞に対して最も良好な刺激作用を有するが、全てチオ修飾されたＣｐＧ ＯＤＮがｐＤＣを刺激してＩＦＮ－αを産生させる作用は、部分的にチオ修飾されたＣｐＧ ＯＤＮよりも弱い。
【0039】
機能的特徴に基づき、ＣｐＧ ＯＤＮは、３つのタイプに分けることができる（Ｔｏｍｏｋｉ Ｉｔｏ、ｅｔ ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ、２００６、Ｖｏｌ １０７、Ｎｕｍ ６：２４２３－２４３１）：
【0040】
（１）Ａ型ＣｐＧ ＯＤＮ。これは、骨格の５’末端と３’末端がホスホロチオエートであり、中間ＣｐＧ領域がリン酸ジエステルであるキメラ骨格によって合成される。これらのＯＤＮは、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）と形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ細胞）をよく活性化してＩＦＮ－αを大量に産生させることができるが、Ｂ細胞を限定的な程度まで活性化できるのみである。
【0041】
（２）Ｂ型ＣｐＧ ＯＤＮ。これは、ヌクレアーゼ耐性のホスホロチオエート骨格を介して合成され、Ｂ細胞とｐＤＣ細胞をよく活性化し、ＩＬ－１２を産生させて抗体分泌を誘導するが、ＮＫ細胞を限定的な程度まで活性化できるのみである。Ｂ型ＣｐＧ ＯＤＮは、通常、ワクチンアジュバントとして有効である。
【0042】
（３）Ｃ型ＣｐＧ ＯＤＮ。これは、ホスホロチオエート骨格を介して合成され、Ａ型ＣｐＧ ＯＤＮの刺激活性とＢ型ＣｐＧ ＯＤＮの刺激活性との間の刺激活性を有し、例えば、それは、Ｂ細胞をよく活性化することができるが、ＮＫ細胞及びｐＤＣ細胞もよく活性化することができる。
【0043】
本発明で使用される免疫調節性ＣｐＧ ＯＤＮは、配列番号１～６から選択されるヌクレオチド配列を含むか又は配列番号１～６から選択されるヌクレオチド配列からなり、前記ヌクレオチド配列中の少なくとも１つのヌクレオチドは、一般式Ｉに示される構造を有する化学修飾されたヌクレオチドである：
（式中、Ｙは、Ｓ又はＯであり、特にＳであり、Ｒは、Ｈ又は正に帯電した対イオンであり、Ｂは、独立して未修飾の又は修飾された核酸塩基であり、Ｒ１は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、ＯＨ、ＯＭｅ、Ｍｅ、Ｏ－エチルオキシメチルである。ここでＭｅは、メチルを表す）。
【化2】
（式中、Ｙは、Ｓ又はＯであり、特にＳであり、Ｒは、Ｈ又は正に帯電した対イオンであり、Ｂは、独立して未修飾の又は修飾された核酸塩基であり、Ｒ１は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、ＯＨ、ＯＭｅ、Ｍｅ、Ｏ－エチルオキシメチルである。ここでＭｅは、メチルを表す）。
【0044】
本発明のＣｐＧ ＯＤＮにおける塩基は、未修飾であってもよく、又は部分的に修飾されていてもよく、又は完全に修飾された核酸塩基であってもよい（ここで、天然の核酸塩基は、アデニン、グアニン、シトシン及びチミンを含む）。ＣｐＧ ＯＤＮ骨格の修飾は、本発明のＣｐＧ ＯＤＮ中の塩基の部分的又は完全なホスホロチオエート化修飾を含み得る。前記修飾は、オリゴヌクレオチドの合成中又は合成後に行うことができ、前記修飾は、ヌクレオシドの間のホスホジエステル架橋上、リボース単位上及び／又は天然核酸塩基（すなわち、アデニン、グアニン、シトシン及びチミン）上で生じ得る。オリゴヌクレオチドの合成中に修飾する時、修飾された塩基は、オリゴヌクレオチド中に又はオリゴヌクレオチドの末端に組み込むことができる。オリゴヌクレオチドの合成後に修飾する時、修飾は、活性基を用いることによって、例えば、アミノ基修飾部分によって、３’又は５’ヒドロキシル基によって、又はリン酸基によって、行うことができる。
【0045】
本発明における化学修飾は、核酸分子の安定な糖リン酸骨格であり、該骨格において、ヌクレオチド間の少なくとも１つの結合上に、非架橋のリン酸の酸素を硫黄が置換するか、又は、それぞれ又は１つおきのヌクレオチド間の結合上に、非架橋のリン酸の酸素を硫黄が置換する、本発明のＣｐＧ ＯＤＮ中の骨格の修飾を含んでもよく、これは、ホスホロチオエートで骨格を修飾してホスホロチオエート化骨格を得ることを含むが、それに限定されない。オリゴヌクレオチド骨格に対して他の修飾を行うこともでき、例えば、非イオン性ＤＮＡ類似体、例えば、リン酸アルキル及びリン酸アリールを用いることによってオリゴヌクレオチド骨格を修飾することができ、ここで、電荷を持つリン酸中の酸素はアルキル基又はアリール基で置換されているか、又は、ホスホジエステル及びアルキルホスホトリエステルを用いて骨格を修飾し、ここで、電荷を持つ酸素がアルキル化される。
【0046】
本発明の免疫調節性ＣｐＧ ＯＤＮは、新規な配列構造を有し、それはマウス及びヒトの両方に対して免疫刺激作用があるため、大きな臨床上の価値がある。
【0047】
ある特定の実施形態では、本発明の免疫調節性ＣｐＧ ＯＤＮの配列は、ＯＤＮ３又はＯＤＮ６であり、それは、一般式Ｉに示される構造を有する化学修飾された少なくとも１つのヌクレオチドを含み、ここで一般式Ｉ中の置換基は、上で定義したとおりである。
【0048】
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載の免疫調節性ＣｐＧ ＯＤＮと薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物も提供する。「薬学的に許容可能な担体」は、対象に毒性のない、医薬製剤中の活性成分以外の成分を指す。薬学的に許容可能な担体は、緩衝剤、賦形剤、安定剤又は保存剤を含むが、それらに限定されない。
【0049】
対象
【0050】
本発明で使用される用語「対象」は、霊長類（例えば、ヒト）、牛、ヒツジ、ヤギ、馬、犬、豚、猫、ウサギ、ラット、マウス、魚、鳥、家禽、例えば鶏、アヒル、ガチョウ等を含むが、それらに限定されない動物を指す。好ましくは、動物は、哺乳動物である。好ましい実施形態では、対象は、ヒトである。
【0051】
免疫細胞
【0052】
本発明における免疫細胞は、免疫応答に関与し、免疫応答に関連する全ての細胞及びその前駆細胞を指す。免疫細胞は、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞及び様々な他のＴ細胞サブタイプ）、Ｂ細胞（例えばＣＤ１９）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、マクロファージ、単球、樹状細胞及び好中球を含む。
【0053】
特異的抗原受容体を発現する特異的Ｔリンパ球と特異的Ｂリンパ球は、獲得免疫応の媒介に関与する。抗原特異的刺激後、Ｂリンパ球は、活性化し、増殖し、形質細胞に分化し、特異的抗体を産生し、体液性免疫応答を媒介することができる。抗原特異的刺激後、Ｔリンパ球は、活性化し、増殖し、エフェクターＴ細胞に分化し、細胞性免疫応答を媒介し、体液性免疫応答を補助することができる。加えて、獲得性免疫応答の開始段階で、樹状細胞や単核マクロファージ等の専任ＡＰＣが関与して、抗原を提示してＴ細胞を活性化する。獲得性免疫応答のエフェクター段階で、単核マクロファージ、ＮＫ細胞等が関与して、Ｔ細胞、抗体等と協同して抗原を除去する役割を果たす。
【0054】
先天性免疫応答に関与する細胞は、主に、単核マクロファージ、顆粒球、樹状細胞、ＮＫ細胞、内皮細胞、肥満細胞、赤血球、血小板等、及び少数のＴ及びＢリンパ球サブグループを含む。ＮＫ細胞は、３番目のタイプのリンパ球であり、これは、非特異的細胞毒活性を有し、ウイルス感染及び腫瘍に対する先天性免疫応答で重要な役割を果たす。単核マクロファージ、顆粒球等は、強い食作用及び殺機能を有し、多数の活性産物を放出することによって炎症反応に関与する。
【0055】
抗原と本発明のＣｐＧ ＯＤＮとの相乗効果は、体液性免疫応答と細胞性免疫応答の両方を誘導し、Ｔｈ１型Ｔ細胞の免疫機能を増強し、Ｔ細胞の免疫反応を大幅に増強する。
【0056】
ワクチン
【0057】
本発明における「ワクチン」は、当業者に周知のワクチンであり、一般的には、注射又は粘膜経路で接種した後に、個体において特定の病原体に対する特異的抗体及び／又は細胞性免疫の産生を誘導することにより、個体に該病原体を保護又は消滅する能力を与えることができる任意の生物学的調製物を指し、タンパク質、多糖類、核酸、生きたベクター又は感染剤などを含む。ワクチンは、人工的に弱毒化し、不活化し又は遺伝子工学及びその他の方法によって、病原性微生物（例えば細菌、リケッチア、ウイルス等）及びその代謝産物から調製される感染性疾患の予防のための自己免疫型の調製物である。ワクチンは、動物体の免疫系を刺激する病原性細菌の特性を保持している。動物がこのような無害の病原体に曝露されると、免疫系は、いくらかの保護物質、例えば免疫ホルモン、活性生理物質、特別な抗体などを産生し、動物が再びそのような病原体に曝露された時に、動物の免疫系は、その元の記憶に従い、病原性細菌の傷害を阻止するためにより多くの保護物質を産生する。
【0058】
本明細書に記載の「ワクチン」は、抗原に対する免疫反応を誘導するように設計された製剤を指す。ワクチンは、免疫反応を増強するか又は特定方向の反応を駆動するように処置中に投与される治療的なものであってもよく、又は疾患を発症する前又は発症した直後に投与される予防的なものであってもよい。ワクチンは、すでに発症した疾患を治療し、将来再発する疾患を予防することにおいて、同時に治療的及び予防的の両方なものであってもよい。ワクチンは、本分野における従来の投与方法によって対象に投与できる。本明細書で使用される用語「投与」又は「投与する」は、患者に物質を提供するすべての適切な手段を含む。従来の経路は、経口、舌下、経粘膜、経皮、直腸、膣、皮下、筋肉内、静脈内、動脈内、髄腔内、カテーテルを介した投与、インプラントを介した投与などを含む。
【0059】
本発明の抗原は、対象において抗原に対する免疫反応を誘導するための医薬を調製するために用いることができる。一実施形態では、本発明の抗原は、狂犬病ワクチンを調製するために用いることができる。本発明の好ましい実施形態では、本発明の抗原は、動物及びヒト用の狂犬病ワクチンを調製するために用いることができる。動物用の狂犬病ワクチンは、不活化ワクチン、弱毒化ワクチン及び遺伝子操作されたワクチンを含む。ヒト用の狂犬病ワクチンは、神経組織由来ワクチン、トリ胚培養ワクチン、細胞培養ワクチン、サブユニット及び精製ワクチン、遺伝子操作されたワクチンを含む。一実施形態では、本発明の抗原は、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ワクチンを調製するために用いることができる。
【0060】
ワクチンアジュバント
【0061】
本発明における「ワクチンアジュバント」又は「アジュバント」は、当業者に周知のワクチンアジュバントを指す。「アジュバント」という語は、ラテン語の「Ａｄｕｖａｒｅ」に由来し、これは、補助又は増強の意味である。ワクチンアジュバントは、ワクチンの添加剤である。それが抗原注入より先に又は抗原と混合された後に体に注入されると、それは、抗原に対する免疫応答を増強するか又は免疫反応のタイプを変化させることができ、それは、非特異的免疫増強剤であり、それ自体は抗原性がない。
【0062】
現在では、国際的にアジュバントの分類には統一基準がなく、一般に使用されるアジュバントは、主に、不溶性アルミニウム塩コロイド、油水エマルジョン、微生物及びそれらの代謝物、核酸及びそれらの類似体、サイトカイン、免疫刺激複合体、プロポリス、リポソームなどを含む。本発明の免疫調節性ＣｐＧ ＯＤＮは、ワクチンアジュバントとして使用することもでき、優れたアジュバント機能を発揮することができる。本発明の免疫調節性ＣｐＧ ＯＤＮは、ワクチン（例えば狂犬病ワクチン又はＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ワクチン）のアジュバントとして単独で使用することもできるし、又はワクチン（例えば狂犬病ワクチン又はＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ワクチン）のアジュバントとして他の一般に使用されるアジュバントと組み合わせて使用することもできる。免疫調節性ＣｐＧ ＯＤＮ及びこれらの一般的に使用されるアジュバントは、付加的効果又は相乗的効果を発揮して、抗原の免疫原性を向上させることにより、ワクチンの用量を減少し又はワクチン効果を向上させることができる（例えばワクチンの用量の減少又はワクチン投与回数の減少）。そのため、一実施形態では、本発明はまた、ワクチンアジュバントの調製における、免疫調節性ＣｐＧ ＯＤＮの使用を提供し、好ましくは、ワクチンは、狂犬病ワクチン又はＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ワクチンである。一実施形態では、本明細書におけるワクチンアジュバントは、免疫調節性ＣｐＧ ＯＤＮと相乗的に機能する１つ又は複数の他の物質をさらに含む。狂犬病ワクチン又はＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ワクチンのアジュバントとして使用する場合、本明細書に記載の免疫調節性ＣｐＧ ＯＤＮの有効量は、慣用の実験を通して当業者により決定でき、例えば、有効量は、０．０１μｇ～１０００μｇ／ｍｌワクチンであってもよく、これには、０．０１μｇ～１０００μｇ／ｍｌの範囲内の任意の値、例えば、０．１μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ、０．３μｇ／ｍｌ、０．４μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、０．６μｇ／ｍｌ、０．７μｇ／ｍｌ、０．８μｇ／ｍｌ、０．９μｇ／ｍｌ、１．０μｇ／ｍｌ、１．１μｇ／ｍｌ、１．２μｇ／ｍｌ、１．３μｇ／ｍｌ、１．４μｇ／ｍｌ、１．５μｇ／ｍｌ、１．６μｇ／ｍｌ、１．７μｇ／ｍｌ、１．８μｇ／ｍｌ、１．９μｇ／ｍｌ、２．０μｇ／ｍｌ、３．０μｇ／ｍｌ、４．０μｇ／ｍｌ、５．０μｇ／ｍｌ、６．０μｇ／ｍｌ、７．０μｇ／ｍｌ、８．０μｇ／ｍｌ、９．０μｇ／ｍｌ、１０．０μｇ／ｍｌ、２０．０μｇ／ｍｌ、３０．０μｇ／ｍｌ、４０．０μｇ／ｍｌ、５０．０μｇ／ｍｌ、６０．０μｇ／ｍｌ、７０．０μｇ／ｍｌ、８０．０μｇ／ｍｌ、９０．０μｇ／ｍｌ、１００．０μｇ／ｍｌ、２００．０μｇ／ｍｌ、３００．０μｇ／ｍｌ、４００．０μｇ／ｍｌ、５００．０μｇ／ｍｌ、６００．０μｇ／ｍｌ、７００．０μｇ／ｍｌ、８００．０μｇ／ｍｌ、９００．０μｇ／ｍｌ、１０００．０μｇ／ｍｌワクチンが含まれる。
【0063】
医薬
【0064】
用語「医薬」又は「医薬製剤」は、それに含まれる活性成分の生物学的活性が有効であることを可能にするような形態の製剤を指し、それは、製剤が投与される対象に対して許容できない毒性がある追加の成分を含まない。一実施形態では、本発明は、対象における腫瘍、微生物感染又はアレルギーを予防又は治療するための医薬の調製における、免疫調節性ＣｐＧ ＯＤＮ又は医薬組成物の使用に関する。対象は、人、又は動物、例えばマウス、ラット、飼育動物、例えば犬、豚、牛、馬、家禽、例えば鶏、アヒル、ガチョウである。当業者は、通常の方法にしたがって、医薬又は医薬製剤における免疫調節性ＣｐＧ ＯＤＮの有効量を決定でき、通常の方法にしたがって、医薬の投与方法を決定できる。
【0065】
［発明の詳細な説明］
本発明の目的、技術的解決手段及び利点をより明確にするために、具体的な実施例及び図面を参照しながら、本発明を以下に詳細にさらに説明する。以下の実施例は、説明の目的のためだけのものであり、本発明の保護範囲は、添付の特許請求の範囲に基づくものである。
本発明の目的、技術的解決手段及び利点をより明確にするために、具体的な実施例及び図面を参照しながら、本発明を以下に詳細にさらに説明する。以下の実施例は、説明の目的のためだけのものであり、本発明の保護範囲は、添付の特許請求の範囲に基づくものである。
【実施例】
【0066】
材料と方法
【0067】
全てのＣｐＧ ＯＤＮは、蘇州瑞博生物科学技術有限公司、中国により合成され、これらには、ＯＤＮ１（５’－ｔｃｇｃｇａｃｇｔｔｃｇｃｇｇｇａｃｇｔｔｃｃｃｔａ－３’、配列番号１）、ＯＤＮ２（５’－ｔｃｇｃｇａｃｇｔｔｃｇｃｇｃｇａｃｇｔｔｃｇｃｔａ－３’、配列番号２）、ＯＤＮ３（５’－ｔｃｇｃｇａｃｇｔｔｃｇｃｃｇａｃｇｔｔｃｇｔａ－３’、配列番号３）、ＯＤＮ４（５’－ｔｇｇａｃｇｔｔｃｇｔｃｇｔｔｃｇｔｃｃｔｔｃ－３’、配列番号４）、ＯＤＮ５（５’－ｔｃｇｔｃｇｔｔｃｇｔｃｇｔｔｃｇａｃｇｔｔｃ－３’、配列番号５）、ＯＤＮ６（５’－ｔｃｇａｇｇｔｔｃｇｔｃｇｔｔｃｃｔｃｇｔｔｃ－３’、配列番号６）等が含まれ、ここでＯＤＮ１、ＯＤＮ２、ＯＤＮ３、ＯＤＮ４、ＯＤＮ５、ＯＤＮ６は、いずれも全てホスホロチオエート化された配列である。ＨＰ３００４は、陽性対照ＣｐＧ ＯＤＮ（５’－ｔｇａｃｔｇｔｇａａｃｇｔｔｃｇａｇａｔｇａ－３’、配列番号７、全てホスホロチオエート化された）であり、ＨＰ００００は、陰性対照ＣｐＧ ＯＤＮ（５’－ｔｇｇｃｃａａｇｃｔｔｇｇｇｃｃｃｃｔｔｇｃａａｇｇｇｃｃ－３’、配列番号８、全てホスホロチオエート化された）であった。全てのＣｐＧ ＯＤＮを無菌／エンドトキシンフリー水（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、米国）に溶解し、使用用に－４０℃で保存した。狂犬病ワクチンは、長春生物製品所、中国（Ｖｅｒｏ細胞狂犬病ワクチン）／成都康華生物製品有限公司、中国（ヒト二倍体細胞狂犬病ワクチン）から得た。不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンは、浙江天元生物薬業有限公司、中国により提供された。
【0068】
ヒト末梢血濃縮白血球と実験動物：
【0069】
ヒト末梢血濃縮白血球を、長春市中心血液ステーション、中国から購入した。６～８週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを、長春生物製品研究所有限責任公司、中国から購入した。
【0070】
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の単離と培養：
【0071】
ヒト末梢血由来の濃縮白血球を、２倍体積の生理食塩水で希釈して、プラスチック遠心管中のＦｉｃｏｌｌ分離液（Ｃｏｒｎｉｎｇ、米国）の表面に１：１で添加し、２８００ｒｐｍで２０分間遠心し（８増加、０減少）、単核細胞層の懸濁液を収集した。懸濁液を、１×ＰＢＳで３回洗浄し、１５００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を廃棄し、１０％のウシ胎児血清（Ｃｌａｒｋ、米国）、１％のＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、米国）及び１％のＨＥＰＥＳ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、米国）を添加したＲＰＭＩ－１６４０（Ｃｏｒｎｉｎｇ、米国）完全培地により細胞を懸濁し、２×１０５／ウェルにて９６ウェルＵ型プレートに播種し、異なる濃度（０．０３、０．１、０．３、１及び３μＭ）のＣｐＧをそれぞれ添加し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベーター中で培養した。
【0072】
サイトカイン分泌アッセイ：
【0073】
ヒトＰＢＭＣｓ（２×１０５／ウェル）及びマウス脾臓細胞（１×１０６／ウェル）を９６ウェルＵ型プレートに播種し、異なる濃度のＣｐＧ（０．０３、０．１、０．３、１及び３μＭ）をそれぞれ添加し、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター中で１６時間培養した後、上清を収集し、次いで、ＥＬＩＳＡキットの説明書に従って、上清中のヒトＩＦＮ－α（Ｍａｂｔｅｃｈ、スウェーデン）、マウスＩＦＮ－α（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、オーストラリア）、マウスＩＬ－６（Ｍａｂｔｅｃｈ、スウェーデン）及びマウスＴＮＦ－α（Ｍａｂｔｅｃｈ、スウェーデン）のレベルを検出した。
【0074】
実施例１ ＣｐＧ ＯＤＮの調製
【0075】
脱保護、活性化、チオ化、及びキャッピングの工程による固相ホスホロアミダイトトリエステル法を介して、自動化ＤＮＡ合成装置によって、ＣｐＧ ＯＤＮを合成した。合成したオリゴヌクレオチドを濃縮アンモニアで脱保護し、次いで、精製し、脱塩した。精製したオリゴヌクレオチドを、使用前に、ナトリウム塩の形態で凍結乾燥し、ＭＳにより定性化した。その後、純度が＞９０％のＣｐＧ ＯＤＮ配列を得た。ＯＤＮ１、ＯＤＮ２、ＯＤＮ３、ＯＤＮ４、ＯＤＮ５及びＯＤＮ６で示されるＣｐＧ ＯＤＮを、その後の実験に用いた。
【0076】
５’－ＤＭＴ ｄＡ、ｄＧ、ｄＣ、ｄＴ及びその他のホスホロアミダイトモノマーは、上海兆維科学技術発展有限公司から購入した。対応するベクターは、Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）から購入した。２’－置換リボヌクレオシドホスホロアミダイトは、上海兆維科学技術発展有限公司、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｏｂｉｓｐｏ、ＣＡ）から購入した。
【0077】
実施例２ マウス脾臓Ｔ及びＢ細胞の増殖に対するＣｐＧ ＯＤＮの作用
【0078】
マウス脾臓細胞の単離と培養：
【0079】
無菌条件下でマウス脾臓を単離し、研磨及び濾過後にＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞懸濁液を調製した。ＲＰＭＩ－１６４０完全培地中に細胞を懸濁し、５×１０５又は１×１０６細胞／ウェルにて９６ウェルＵ型プレートに播種し、異なる濃度のＣｐＧ（０．０３、０．１、０．３、１及び３μＭ）をそれぞれ添加し、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター中で培養した。
【0080】
１６時間培養した後、細胞を収集し、１×ＰＢＳで２回洗浄し、１５００ｒｐｍで５分間遠心した。１×ＰＢＳで細胞を再懸濁し、細胞懸濁液に、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８及び抗ＣＤ１９抗体（ＢＤ、米国）を添加し、次いで、暗所で４℃で３０分間インキュベートした。細胞を、１×ＰＢＳで２回洗浄し、１５００ｒｐｍで５分間遠心し、１×ＰＢＳに再懸濁し、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（商標）フローサイトメーター（ＢＤ、米国）を用いて、フローサイトメトリーにより分析した。
【0081】
ＥＬＩＳＡ分析のために、上清を収集した。サンドイッチＥＬＩＳＡによって、上清中のＣＤ４、ＣＤ８及びＣＤ１９のレベルを測定し、マウス脾臓Ｔ及びＢ細胞の増殖に対するＣｐＧ ＯＤＮの作用を得た。結果を図１に示す。
【0082】
結論：ＣｐＧ ＯＤＮは、マウス脾臓Ｂ細胞の活性化を大きく刺激し（ＣＤ１９レベルにより示される）、マウス脾臓Ｂ細胞の増殖を誘導し、次いで、共刺激分子の発現とサイトカイン（例えばＩＬ－６、ＴＮＦ－α）の分泌をアップレギュレートできる。
【0083】
実施例３ マウス脾細胞培養物におけるサイトカイン誘導
【0084】
４～８週齢のＣ５７ＢＬ／６由来の脾細胞を調製し、ＲＰＭＩ完全培地で培養した。マウス脾細胞を５×１０６細胞／ｍｌにて２４ウェルペトリ皿に播種した。細胞培養物にＰＢＳ緩衝液中のＣｐＧ ＯＤＮを最終濃度がそれぞれ０．０３、０．１、０．３、１及び３μＭになるまで添加した。その後に、細胞を３７℃で２４時間インキュベートし、ＥＬＩＳＡ分析のために上清を収集した。サンドイッチＥＬＩＳＡによって、上清中のＩＦＮ－α、ＩＬ－６及びＴＮＦ－αのレベルを決定した。サイトカイン、抗体及び標準品を含む実施例で使用した試薬は、ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎから購入した。結果を図２、３、及び４に示した。図２は、異なるＣｐＧ ＯＤＮがｐＤＣによるＩＦＮ－αｎｏ分泌を効果的に刺激したことを示し、ここでＨＰ３００４は、陽性対照であった。図３は、異なるＣｐＧ ＯＤＮがＢ細胞によるＩＬ－６の分泌を刺激したことを示し、ここでＨＰ３００４は、陽性対照であった。図４は、異なるＣｐＧ ＯＤＮがＢ細胞によるＴＮＦ－αの産生を刺激したことを示し、ここでＨＰ３００４は、陽性対照であった。
【0085】
結論：異なるＣｐＧ ＯＤＮ配列は、サイトカインＩＬ－６及びＴＮＦ－αの分泌をアップレギュレートし、刺激した。
【0086】
実施例４ ヒトＰＢＭＣにより誘導されるＴ及びＢ細胞の増殖に対するＣｐＧ ＯＤＮの作用
【0087】
分析に使用した培地は、１．５ｍＭのグルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、５０μＭの２－メルカプトエタノール、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン－ストレプトマイシン混合物及び１０％の熱不活化ウシ胎児血清を補充した、ＲＰＭＩ１６４０培地であった。合計１ｍｌ当たり０．５×１０６個のＢ細胞（すなわち０．１×１０６／２００μｌ／ウェル）を、９６ウェル平底プレートで三連で、異なる濃度の試験すべきＣｐＧ ＯＤＮ（０．０３、０．１、０．３、１及び３μＭ）で、７２時間刺激した。６６時間後、１ウェルあたり２０μｌのＲＰＭＩ１６４０培地（無血清）中の０．７５μＣｉの［３Ｈ］－チミジン（１Ｃｉ＝３７ＧＢｑ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）で、細胞をパルスし、次いで、８時間後に回収した。セルハーベスターを使用してプレートを回収し、標準的な液体シンチレーション技術を使用して、放射活性の導入を決定した。結果を、平均ｃｐｍ＋／－ＳＤ又は増殖指数（ｃｐｍ処理群／ｃｐｍ培地対照）として示した。結果を図５に示し、ここでＨＰ３００４は、陽性対照であった。
【0088】
結論：ＣｐＧ ＯＤＮは、ヒトＰＢＭＣ細胞を活性化させ、Ｂ細胞の増殖を誘導し、次いで、共刺激分子の発現及びサイトカイン（例えばＩＬ－６、ＴＮＦ－α）の分泌をアップレギュレートできる。
【0089】
実施例５ ＰＢＭＣ培養物におけるＣｐＧ ＯＤＮによるサイトカイン誘導
【0090】
ヒトＰＢＭＣを５×１０６細胞／ｍｌにて９６ウェルプレートに播種した。細胞培養物にリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）中のＣｐＧ ＯＤＮを最終濃度が１０．０μｇ／ｍｌになるまで添加した。その後、細胞を３７℃で２４時間インキュベートし、ＥＬＩＳＡ分析のために上清を収集した。各実験は、三連で行った。サンドイッチＥＬＩＳＡによって、ＩＦＮ－α、ＩＬ－６及びＴＮＦ－αのレベルを決定した。サイトカイン、抗体及び標準品を含む実施例で使用した試薬は、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎから購入した。結果を図６～８に示した。
【0091】
結論：ＣｐＧ ＯＤＮ配列は、ＩＬ－６及びＴＮＦ－αのレベルを顕著に向上できる。
【0092】
実施例６：ＨＥＫ－ＢＬＵＥ検出
【0093】
細胞継代
【0094】
１０μｇ／ｍｌのＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ及び１００μｇ／ｍｌのＺｅｏｃｉｎ（商標）が補充した増殖培地で、細胞を維持し継代培養した。
【0095】
増殖培地：ＤＭＥＭ、４．５ｇ／Ｌのブドウ糖、１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清、５０Ｕ／ｍｌのペニシリン、５０Ｕ／ｍｌのストレプトマイシン、１００μｇ／ｍｌのＮｏｒｍｏｃｉｎ（商標）、２ｍＭのグルタミン。
【0096】
継代培地
【表1】
【0097】
７０～８０％の密度に達した後、細胞を、継代し、元の培地をＰＢＳで置換した後、アンプルをタッピングするか又はセルスクレーパーを用いることによって、分離すべきである。分離した細胞を収集し、５分間遠心した。細胞をカウントし、９６ウェルプレートに２～４×１０４個の細胞を播種し、次いで、２～３日間後に処理した。
【0098】
陽性対照（ＨＰ３００４）、陰性対照（ＨＰ００００）及びＣｐＧ ＯＤＮの所定の最終濃度は、いずれも０．００３、０．０１、０．０３、０．１、０．３、１、３、１０、３０、及び１００μｇ／ｍｌであり、培地の濃度は、９０％超である。対応のウェルに、１０μｌの陰性対照、陽性対照及び試験物質を加えた。５％ＣＯ２のインキュベーターで２４時間、細胞をインキュベートした。培地を２５０ｍｌの細首フラスコに注入し、１００ｍｌの水を加え、均一に撹拌し、３７℃で３０分間加熱した。細胞上清５０μｌを取り、５分間遠心した。２０μｌのサンプルを上清に添加し、１８０μｌのＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅを９６ウェルプレートの各ウェルに加え、３７℃で６時間インキュベートした。波長６５５ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。図９～１１を参照のこと。
【0099】
結果：図９～１１から理解できるように、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ｈＴＬＲ９細胞、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ｍＴＬＲ９細胞及びＲａｍｏｓ－Ｂｌｕｅ細胞の活性に対して、ＣｐＧ ＯＤＮは良好な効果があった。
【0100】
実施例７ マウスにおける抗狂犬病ウイルス中和抗体価に対する、ＯＤＮ３と狂犬病ワクチンとの組み合わせの効果
【0101】
マウスを各群８匹ずつ８群に分けた。免疫の２日間前に、各群のマウスのバックグラウンド血清を収集した。ワクチンを、０日目、３日目、及び７日目に注射（筋肉内注射）した。４日目、６日目、８日目、１０日目、１４日目、２８日目、及び５６日目に、眼球を取り出し、血液を収集し、血清を分離した。ＲＦＦＩＴ法を用いて、マウス血清中の抗狂犬病ウイルス中和抗体の力価を１匹ずつ決定した。結果を図１２に示した。
【0102】
具体的な群分けは、以下の通りであった：
【表2】
【0103】
結果：図１２から理解できるように、狂犬病ワクチンと異なる用量のＯＤＮ３との組み合わせの群では、産生された抗体レベルは、経時変化したが、全体的なトレンドは増加傾向を呈した。狂犬病ワクチン＋１μｇ ＯＤＮ３群（ＲＶ＋１）、狂犬病ワクチン＋３μｇ ＯＤＮ３群（ＲＶ＋３）、及び狂犬病ワクチン＋１０μｇ ＯＤＮ３群（ＲＶ＋１０）における抗体レベルは、アジュバントなしのワクチン群（ＲＶ）におけるものより高かった。免疫１４日後、４群（狂犬病ワクチン、狂犬病ワクチン＋１μｇ ＯＤＮ３、狂犬病ワクチン＋３μｇ ＯＤＮ３、及び狂犬病ワクチン＋１０μｇ ＯＤＮ３）の抗体レベルはピークに達し、その後、反落した。これらのなかでも、狂犬病ワクチン＋１０μｇ ＯＤＮ３群は、全ての検出時間内で、最も高い抗体レベルを有した。中和抗体産生時間、ピーク及び中和抗体の継続性に基づけば、１０μｇ ＯＤＮ３群の実験結果は、その他の用量群よりも優れていた。
【0104】
実施例８ 狂犬病ワクチンが抗体産生を誘導する効果を増強する、異なる用量のＯＤＮ３の比較
【0105】
マウス１１２匹（５６匹雌性及び５６匹雄性、体重１８～２２グラム／マウス）、狂犬病ワクチン（１ｍｌ／用量）（２．５ＩＵを含む）、及びＯＤＮ３を実施例で使用した。マウスを各群８匹（４匹雄性及び４匹雌性）に分けた。ワクチン群：狂犬病ワクチン、狂犬病ワクチン＋０．３μｇ ＯＤＮ３、狂犬病ワクチン＋１μｇ ＯＤＮ３、狂犬病ワクチン＋３μｇ ＯＤＮ３、及び狂犬病ワクチン＋１０μｇ ＯＤＮ３。狂犬病ワクチン及びＣｐＧ ＯＤＮを、いずれもＰＢＳに溶解した。０日目、３日目、７日目、１４日目、及び２８日目に、異なる群に従い、それぞれマウスを免疫した。免疫は、腹腔内注射により行った。免疫４、６、及び８日間後、マウスの尾静脈から血液を収集し、血清を分離した。狂犬病ワクチン用の迅速蛍光フォーカス抑制試験（ＲＦＦＩＴ）により、マウスの血清中の狂犬病ワクチン抗体価を検出した。免疫２日間前に、マウスの尾静脈から血液を集め、得られた血清を陰性対照として使用した。
【0106】
結果：各群における狂犬病ワクチンの免疫効果は、経時的に増強された。ＯＤＮ３の増加に伴い、狂犬病ワクチンの免疫効果は増強された。結果を図１３に示した。
【0107】
結論：ＯＤＮ３は、狂犬病ワクチンの免疫効果を顕著に増強できる。
【0108】
実施例９ 狂犬病ワクチンの投薬量を低減するための狂犬病ワクチンアジュバントとして、ＯＤＮ３を使用する
【0109】
マウス１２８匹（６４匹雌性及び６４匹雄性、体重１８～２２グラム／マウス）、狂犬病ワクチン（１ｍｌ／用量）（２．５ＩＵを含む）を用いた。マウスを各群８匹（４匹雄性及び４匹雌性）に分けた。ワクチン群：狂犬病ワクチン、狂犬病ワクチン＋１μｇ ＯＤＮ３、１／２狂犬病ワクチン＋１μｇ ＯＤＮ３、１／４狂犬病ワクチン１μｇ ＯＤＮ３、及び１／８狂犬病ワクチン＋１μｇ ＯＤＮ３。
【0110】
狂犬病ワクチン及びＯＤＮ３を、いずれもＰＢＳに溶解した。マウスの免疫：０日目、３日目、７日目、１４日目、及び２１日目に、異なる群に従いそれぞれマウスを免疫した。免疫は、腹腔内注射により行った。２８日目にマウスの尾静脈から血液を収集し、血清を分離した。狂犬病ワクチン用の迅速蛍光フォーカス抑制試験（ＲＦＦＩＴ）により、マウスの血清中の狂犬病ワクチン抗体価を検出した。免疫２日間前に、マウスの尾静脈から血液を収集し、得られた血清を陰性対照として使用した。
【0111】
結果：減量した投薬量の狂犬病ワクチンとＯＤＮ３との組み合わせは、依然としてマウスを刺激して高いレベルの狂犬病ウイルス特異的抗体を産生させることができる、狂犬病ワクチン＋１μｇ ＯＤＮ３、１／２狂犬病ワクチン＋１μｇ ＯＤＮ３、１／４狂犬病ワクチン１μｇ ＯＤＮ３、１／８狂犬病ワクチン＋１μｇ ＯＤＮ３の群における抗体価（ＧＭＴ）は、いずれも狂犬病ワクチンを単独で使用した場合のものよりも高いレベルを達成でき、これは、ＣｐＧ ＯＤＮが狂犬病ワクチンの投薬量を低減できることを示している。結果を図１４に示す。
【0112】
結論：ＯＤＮ３は、狂犬病ワクチンの投薬量を低減できる。
【0113】
実施例１０ 狂犬病ワクチンアジュバントとして使用される異なるＣｐＧ ＯＤＮ配列
【0114】
ＢＡＬＢ／ｃマウスを８つの群にランダムに分けた：ヒト狂犬病ワクチン群、ヒト狂犬病ワクチン＋ＯＤＮ１（１０μｇ／マウス）群、ヒト狂犬病ワクチン＋ＯＤＮ２（１０μｇ／マウス）群、ヒト狂犬病ワクチン＋ＯＤＮ３（１０μｇ／マウス）群、ヒト狂犬病ワクチン＋ＯＤＮ４（１０μｇ／マウス）群、ヒト狂犬病ワクチン＋ＯＤＮ５（１０μｇ／マウス）群、ヒト狂犬病ワクチン＋ＯＤＮ６（１０μｇ／マウス）群、ヒト狂犬病ワクチン＋ＨＰ００００（１０μｇ／マウス）群。後肢筋肉を経てそれぞれ０、７、２１日目に３回、各群を免疫し、各免疫の投薬量は、０．２ｍｌ／マウスであった。免疫後１４日目、２８日目、及び５６日目に眼球を取り出し、血液を収集し、血清を分離し、血清中の抗狂犬病ウイルス抗体の含有量を検出し、中和抗体価を図１５に示した。
【0115】
結論：ＣｐＧ ＯＤＮは、抗体価のレベルを向上できる。
【0116】
実施例１１：マウスにおける抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質特異的ＩｇＧ及びウイルス中和抗体の抗体価に対する、不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンと組み合わせたＯＤＮ６の効果
【0117】
１８～２０ｇのＢＡＬＢ／ｃマウスを選び、各群９又は１０匹（雌雄半分ずつ）のマウスに分けた。各群を、設計された免疫プログラムに従って、Ｄ０とＤ１４に、各注射０．５ｍｌで腹腔内注射により免疫した。設計時間に従って、Ｄ０、Ｄ６、Ｄ１３、Ｄ２１及びＤ２８に血液を収集して、血清を分離し、全ての血清を、Ｓタンパク質特異的ＩｇＧ及びウイルス中和抗体について試験した。各群の血清ＩｇＧ及びウイルス中和抗体の幾何学的平均力価を、統計学的に計算した。結果を図１６～１８に示した。
【0118】
具体的な群分けは、以下の通りであった：
【表3】
【0119】
結果：図１６～１８から理解できるように、抗原特異的Ｓ１抗体は、Ｄ２８のダブルアジュバント対照群ではほとんど検出されなかった。２μｇ／ｍＬ抗原＋４５０μｇ／ｍＬ水酸化アルミニウムアジュバント群、及び２μｇ／ｍＬ抗原＋４５０μｇ／ｍＬ水酸化アルミニウムアジュバント＋４００μｇ／ｍＬ ＣｐＧ群においてＳ１抗体レベルが相対的に低かった以外、他の群は、より高いＳ１抗体価を誘導した。各群におけるマウスの血清中の中和抗体価の結果から理解できるように、２μｇ／ｍＬ抗原＋４５０μｇ／ｍＬ水酸化アルミニウムアジュバント群、２μｇ／ｍＬ抗原＋４５０μｇ／ｍＬ水酸化アルミニウムアジュバント＋４００μｇ／ｍＬ ＣｐＧ群、及び４μｇ／ｍＬ抗原＋４５０μｇ／ｍＬ水酸化アルミニウムアジュバント＋８０μｇ／ｍＬ ＣｐＧ群において中和抗体レベルが相対的に低かった以外、他の群は、より高い中和抗体価を誘導した。
【0120】
結論：不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンとＯＤＮ６及びアルミニウムアジュバントとの組み合わせは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質特異的ＩｇＧ及びウイルス中和抗体のより高い抗体価を誘導できる。Ｄ２８には、４μｇ／ｍＬ抗原＋４５０μｇ／ｍＬ水酸化アルミニウムアジュバント＋４０μｇ／ｍＬ ＣｐＧ群は、最も高いＳ１抗体価を誘導した。８μｇ／ｍＬ抗原＋４５０μｇ／ｍＬ水酸化アルミニウムアジュバント＋４００μｇ／ｍＬ ＣｐＧ群は、最も高い中和抗体価を誘導した。
【0121】
等価の技術的解決手段
【0122】
上に記載した具体的な実施例は、本発明の目的、技術的解決手段及び有益な効果について、詳細にさらに記載するものであるが、これらは、発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。発明の精神及び範囲内で当業者によりなされる任意の修正、等価的置換、及び改良は、本発明の保護範囲内に含まれるべきものであることに留意すべきである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【配列表】
【国際調査報告】