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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-05-10
(54)【発明の名称】多重特異性抗体構築のためのプラットフォーム
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20230428BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20230428BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20230428BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230428BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20230428BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230428BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230428BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230428BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20230428BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20230428BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230428BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20230428BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230428BHJP
A61K 38/02 20060101ALI20230428BHJP
C07K 14/005 20060101ALN20230428BHJP
C07K 1/14 20060101ALN20230428BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13
C07K16/46 ZNA
C12N15/62 Z
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P21/08
C07K19/00
A61P35/00
A61P35/02
A61K39/395 N
A61K38/02
A61K39/395 Y
C07K14/005
C07K1/14
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022559869
(86)(22)【出願日】2021-03-30
(85)【翻訳文提出日】2022-11-15
(86)【国際出願番号】 CN2021084198
(87)【国際公開番号】W WO2021197359
(87)【国際公開日】2021-10-07
(31)【優先権主張番号】202010244571.5
(32)【優先日】2020-03-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522384835
【氏名又は名称】バイオテウス インコーポレイティド
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 達則
(72)【発明者】
【氏名】リウ シアオリン
(72)【発明者】
【氏名】ツン アンディー
(72)【発明者】
【氏名】スン ツォーユエ ジョアン
(72)【発明者】
【氏名】ミャオ シアオニウ
(72)【発明者】
【氏名】ワン タオ
(72)【発明者】
【氏名】タイ ショアン
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG27
4B064CA02
4B064CA05
4B064CA06
4B064CA08
4B064CA10
4B064CA19
4B064CC24
4B064CE00
4B064DA01
4B065AA01X
4B065AA01Y
4B065AA57X
4B065AA57Y
4B065AA72X
4B065AA72Y
4B065AA83X
4B065AA83Y
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BD14
4B065CA44
4C084AA01
4C084AA02
4C084AA07
4C084BA02
4C084BA41
4C084MA17
4C084MA66
4C084NA14
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZB271
4C084ZB272
4C085AA13
4C085AA14
4C085BB11
4C085BB31
4C085BB42
4C085CC22
4C085CC23
4C085EE01
4C085GG01
4C085GG02
4C085GG06
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA09
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本発明において、多重特異性抗体を構築する方法が提供される。この方法は、（ｉ）第一のポリヌクレオチド及び第二のポリヌクレオチドを、各々、構築する工程であって、ここで第一のポリヌクレオチド及び第二のポリヌクレオチドは、各々、ＣＬ領域を含む第一のポリペプチド及びＣＨ１領域を含む第二のポリペプチドをコードし、並びにジスルフィド結合が、第一のポリペプチドのＣＬ領域と第二のポリペプチドのＣＨ１領域の間に形成されてよく、その結果この抗体がヘテロ二量体形を有する工程；並びに、（ｉｉ）第一のポリヌクレオチド及び第二のポリヌクレオチドを発現し、第一のポリペプチド及び第二のポリペプチドを得、並びに第一のポリペプチドと第二のポリペプチドを二量体化し、ヘテロ二量体形を伴う多重特異性抗体を形成する工程を含む。本発明の抗体は、異なる標的へ同時に結合し、並びに当初の抗体の結合活性を維持することができ、これは標的が、膜表面受容体又は溶液中の標的である場合に役割を果たし、並びに複数の標的に対する生物活性を有する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
多重特異性抗体の構築方法であって；（ｉ）各々、Ｎ－末端からＣ－末端へ式Ｉにより表された構造を有する第一のポリペプチドをコードしている第一のポリヌクレオチド、及びＮ－末端からＣ－末端へ式ＩＩにより表される構造を有する第二のポリペプチドをコードしている第二のポリヌクレオチドを構築する工程であって、
Ａ１－Ｌ１－Ｂ１－Ｌ２－ＣＬ－Ｌ３－Ａ２ （式Ｉ）
Ａ３－Ｌ４－Ｂ２－Ｌ５－ＣＨ１－Ｌ６－Ａ４ （式ＩＩ）
ここで、Ａ１、Ａ２、Ａ３、及びＡ４は、各々独立して、関心対象の標的を標的化する抗体又はその抗原性断片であり、並びにＡ１、Ａ２、Ａ３、及びＡ４の各々により標的化された標的抗原は、同じ又は異なることができ；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４は、各々独立して、ヌル又はリンカーエレメントであり；
Ｂ１及びＢ２は、両方共ヌルであるか、又はＢ１及びＢ２は、各々、同じ標的を標的化する抗体のＶＬ領域及びＶＨ領域であり；並びに
ジスルフィド結合は、第一のポリペプチドのＣＬ領域と第二のポリペプチドのＣＨ１領域の間に形成されてよく、その結果この抗体がヘテロ二量体形を有する工程；並びに
（ｉｉ）第一のポリヌクレオチド及び第二のポリヌクレオチドを発現し、第一のポリペプチド及び第二のポリペプチドを得、並びに第一のポリペプチド及び第二のポリペプチドを二量体化し、ヘテロ二量体形を伴う多重特異性抗体を形成する工程：を含むことを特徴とする、方法。
【請求項2】
Ｎ－末端からＣ－末端へ式Ｉにより表された第一のポリペプチド、及びＮ－末端からＣ－末端へ式ＩＩにより表された第二のポリペプチドを含むことを特徴とする、多重特異性抗体であって：Ａ１－Ｌ１－Ｂ１－Ｌ２－ＣＬ－Ｌ３－Ａ２ （式Ｉ）
Ａ３－Ｌ４－Ｂ２－Ｌ５－ＣＨ１－Ｌ６－Ａ４ （式ＩＩ）
ここで、
Ａ１、Ａ２、Ａ３、及びＡ４は、各々独立して、関心対象の標的を標的化する抗体又はその抗原性断片であり、並びにＡ１、Ａ２、Ａ３、及びＡ４の各々により標的化された標的抗原は、同じ又は異なることができ；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４は、各々独立して、ヌル又はリンカーエレメントであり；
Ｂ１及びＢ２は、両方共ヌルであるか、又はＢ１及びＢ２は、各々、同じ関心対象の標的を標的化する抗体のＶＬ領域及びＶＨ領域であり；並びに
ジスルフィド結合が、第一のポリペプチドのＣＬ領域と第二のポリペプチドのＣＨ１領域の間に形成されてよく、その結果前記抗体がヘテロ二量体形を有する、前記多重特異性抗体。
【請求項3】
請求項２に記載の多重特異性抗体を含み、及び前記多重特異性抗体の第一のポリペプチドが、Ｎ－末端からＣ－末端へ式ＩＩＩにより表される構造を有することを特徴とする、融合タンパク質であって、Ａ１－Ｌ１－ＣＬ－Ｌ３－Ｆｃ （式ＩＩＩ）
ここで、Ｆｃは、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む、抗体のＦｃ断片であり；並びに
融合タンパク質が、Ｆｃ断片間のジスルフィド結合を介してホモ二量体を形成し得る、前記融合タンパク質。
【請求項4】
第一のヌクレオチド及び第二のヌクレオチドを含むことにより特徴付けられる、単離されたポリヌクレオチドの組合せであって、ここで第一のヌクレオチドは、請求項２に記載の多重特異性抗体のもしくは請求項３に記載の融合タンパク質の第一のポリペプチドをコードし、並びに第二のヌクレオチドは、第二のポリペプチドをコードしている、単離されたポリヌクレオチドの組合せ。
【請求項5】
請求項４に記載のポリヌクレオチドの組合せを含むことにより特徴付けられる、ベクター。
【請求項6】
宿主細胞が、請求項５に記載のベクターを含むか、又は請求項４に記載のポリヌクレオチドの組合せがそのゲノムに組み込まれていること；あるいは、該宿主細胞が、請求項２に記載の多重特異性抗体又は請求項３に記載の融合タンパク質を発現することを特徴とする、宿主細胞。
【請求項7】
抗体の作製方法であって：（ａ）請求項６に記載の宿主細胞を、好適な条件下で培養し、請求項２に記載の多重特異性抗体又は請求項３に記載の融合タンパク質を含む培養物を得る工程；並びに
（ｂ）工程（ａ）において得られた培養物を精製及び／又は単離し、抗体を得る工程：を含むことを特徴とする、方法。
【請求項8】
免疫複合体であって、（ａ）請求項２に記載の多重特異性抗体又は請求項３に記載の融合タンパク質；並びに
（ｂ）検出可能な標識、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、又は酵素、金ナノ粒子／ナノロッド、ナノ磁気粒子、ウイルス外被タンパク質もしくはＶＬＰ、又はそれらの組合せからなる群から選択される、カップリング部分：を含有することを特徴とする、免疫複合体。
【請求項9】
医薬品、試薬、検出プレート、又はキットの製造における、請求項２に記載の多重特異性抗体、請求項３に記載の融合タンパク質、又は請求項８に記載の免疫複合体の使用であって；ここで試薬、検出プレート又はキットが、試料中の関心対象の標的分子の存在又は非存在の検出に使用され；並びに
医薬品が、関心対象の標的分子を発現している腫瘍の治療又は予防に使用される、使用。
【請求項10】
（ｉ）請求項２に記載の多重特異性抗体、請求項３に記載の融合タンパク質、又は請求項８に記載の免疫複合体；並びに、（ｉｉ）医薬として許容し得る担体：を含有することを特徴とする、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
技術分野
本発明は、バイオ医薬又はバイオ医薬品の技術分野に属し、且つ特に多重特異性抗体を構築するためのプラットフォームに関する。
本発明は、バイオ医薬又はバイオ医薬品の技術分野に属し、且つ特に多重特異性抗体を構築するためのプラットフォームに関する。
【背景技術】
【0002】
背景
二重特異性抗体（bispecific antibodies）の原型となる概念は、１９６０年に、Roswell Park Memorial Institute（ニューヨーク）のNisonoff及び彼の同僚により、最初に提唱された。その後の抗体操作及び抗体生物学の分野における画期的進歩により、二重特異性抗体の構築に関する概念及び技術は、継続して革新されている。現在１００種を超える二重特異性抗体構造パターンが存在し、そのおよそ１／４は、技術プラットフォームとして開発され、且つ新規抗体療法のためにバイオテクノロジー会社及び製薬会社により市販されている。今日までに、２０種より多い様々な市販の技術プラットフォームが、二重特異性抗体の開発に関して利用可能であり、且つ８５種を超える二重特異性抗体が、臨床開発中である。
二重特異性抗体（bispecific antibodies）の原型となる概念は、１９６０年に、Roswell Park Memorial Institute（ニューヨーク）のNisonoff及び彼の同僚により、最初に提唱された。その後の抗体操作及び抗体生物学の分野における画期的進歩により、二重特異性抗体の構築に関する概念及び技術は、継続して革新されている。現在１００種を超える二重特異性抗体構造パターンが存在し、そのおよそ１／４は、技術プラットフォームとして開発され、且つ新規抗体療法のためにバイオテクノロジー会社及び製薬会社により市販されている。今日までに、２０種より多い様々な市販の技術プラットフォームが、二重特異性抗体の開発に関して利用可能であり、且つ８５種を超える二重特異性抗体が、臨床開発中である。
【0003】
Ｔ細胞に会合する二重特異性抗体であるブリナツモマブ（ＣＤ３及びＣＤ１９を標的化する、急性Ｂリンパ球性白血病の治療に関して２０１４年にＦＤＡにより承認された）の素晴らしい臨床の転帰は、該産業におけるこの概念の関心と投資に拍車を掛けた。現在、４０種を超えるＴ細胞をリダイレクトする二重特異性抗体が、血液癌及び固形腫瘍の治療のために臨床開発中である。癌に加えて、炎症疾患にも、二重特異性抗体の臨床開発に焦点が当てられている。Roche社のエミシズマブ（凝固因子第Ｘ因子及び第ＩＸａ因子を標的化する）は、２０１７年１１月にＦＤＡにより承認され、血友病を、二重特異性抗体に関する最初の非癌適応症とした。現在多くの研究班が同じく、糖尿病、ＨＩＶ感染症、他のウイルス及び細菌の感染症、アルツハイマー病、骨粗鬆症などの、他の疾患領域における、二重特異性抗体の治療的可能性を探求している。二重特異性抗体のデュアル－標的化の特徴（すなわち、２種の抗原又は１種の抗原の２つの異なるエピトープを同時に特異的に標的化する能力）は、それらを、有望な治療機会のあるものにしているが、二重特異性抗体の臨床療法への転換は、依然課題が多い。
【0004】
治療的二重特異性抗体は、急激に広がっている多様な分子の集団である。モノクローナル抗体と比べ、デュアル－標的化の概念の増大した複雑さは、発見及び開発の様々な段階での更なる困難を示しているが、二重特異性抗体は、新規薬物の設計及び開発に関して刺激的な機会を提供する。疾患分野の視点から、現在のデータは、産業界は、二重特異性抗体による癌治療により期待していることを示している。二重特異性抗体の継続的開発は、癌などの疾患の治療に持続的な影響を持つであろう。
【0005】
従って、低コスト及び高効率の多重特異性抗体を構築する方法を開発することが、当該技術分野において緊急に必要とされている。
【発明の概要】
【0006】
概要
本発明は、低コスト及び高効率の多重特異性抗体を構築する方法を提供することを目的としている。
本発明は、低コスト及び高効率の多重特異性抗体を構築する方法を提供することを目的としている。
【0007】
本発明の第一の態様において、多重特異性抗体の構築方法が提供され、これは：
（ｉ）Ｎ－末端からＣ－末端へ式Ｉにより表された構造を有する第一のポリペプチドをコードしている第一のポリヌクレオチド、及びＮ－末端からＣ－末端へ式ＩＩにより表される構造を有する第二のポリペプチドをコードしている第二のポリヌクレオチドを構築する工程であって、
Ａ１－Ｌ１－Ｂ１－Ｌ２－ＣＬ－Ｌ３－Ａ２ （式Ｉ）
Ａ３－Ｌ４－Ｂ２－Ｌ５－ＣＨ１－Ｌ６－Ａ４ （式ＩＩ）
ここで、
Ａ１、Ａ２、Ａ３、及びＡ４は、各々独立して、関心対象の標的を標的化する抗体又はその抗原性断片であり、並びにＡ１、Ａ２、Ａ３、及びＡ４の各々により標的化された標的抗原は、同じ又は異なることができ；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４は、各々独立して、ヌル(null)又はリンカーエレメントであり；
Ｂ１及びＢ２は、両方共ヌルであるか、又はＢ１及びＢ２は、各々、同じ標的を標的化する抗体のＶＬ領域及びＶＨ領域であり；並びに
ジスルフィド結合は、第一のポリペプチドのＣＬ領域と第二のポリペプチドのＣＨ１領域の間に形成されてよく、その結果この抗体が、ヘテロ二量体形を有する工程；
（ｉｉ）第一のポリヌクレオチド及び第二のポリヌクレオチドを発現し、第一のポリペプチド及び第二のポリペプチドを得、並びに第一のポリペプチド及び第二のポリペプチドを二量体化し、ヘテロ二量体形を伴う多重特異性抗体を形成する工程：を含む。
（ｉ）Ｎ－末端からＣ－末端へ式Ｉにより表された構造を有する第一のポリペプチドをコードしている第一のポリヌクレオチド、及びＮ－末端からＣ－末端へ式ＩＩにより表される構造を有する第二のポリペプチドをコードしている第二のポリヌクレオチドを構築する工程であって、
Ａ１－Ｌ１－Ｂ１－Ｌ２－ＣＬ－Ｌ３－Ａ２ （式Ｉ）
Ａ３－Ｌ４－Ｂ２－Ｌ５－ＣＨ１－Ｌ６－Ａ４ （式ＩＩ）
ここで、
Ａ１、Ａ２、Ａ３、及びＡ４は、各々独立して、関心対象の標的を標的化する抗体又はその抗原性断片であり、並びにＡ１、Ａ２、Ａ３、及びＡ４の各々により標的化された標的抗原は、同じ又は異なることができ；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４は、各々独立して、ヌル(null)又はリンカーエレメントであり；
Ｂ１及びＢ２は、両方共ヌルであるか、又はＢ１及びＢ２は、各々、同じ標的を標的化する抗体のＶＬ領域及びＶＨ領域であり；並びに
ジスルフィド結合は、第一のポリペプチドのＣＬ領域と第二のポリペプチドのＣＨ１領域の間に形成されてよく、その結果この抗体が、ヘテロ二量体形を有する工程；
（ｉｉ）第一のポリヌクレオチド及び第二のポリヌクレオチドを発現し、第一のポリペプチド及び第二のポリペプチドを得、並びに第一のポリペプチド及び第二のポリペプチドを二量体化し、ヘテロ二量体形を伴う多重特異性抗体を形成する工程：を含む。
【0008】
別の好ましい例において、第一のポリペプチドのＣＬ領域は、配列番号：９に明記したアミノ酸配列、又は配列番号：９に明記した配列と８５％より大きいもしくは等しい配列同一性（好ましくは９０％、より好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％）を有するアミノ酸配列を有する。
【0009】
別の好ましい例において、第二のポリペプチドのＣＨ１領域は、配列番号：３に明記したアミノ酸配列、又は配列番号：３に明記した配列と８５％より大きいもしくは等しい配列同一性（好ましくは９０％、より好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％）を有するアミノ酸配列を有する。
【0010】
別の好ましい例において、Ａ１、Ａ２、Ａ３、及びＡ４において関心対象の標的は、抗原、細胞表面受容体、リガンド、又はサイトカインである。
【0011】
別の好ましい例において、Ａ１、Ａ２、Ａ３、及びＡ４において関心対象の標的は、以下を含むが、これらに限定されるものではない：ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ、ヒト血清アルブミン、ＶＥＧＦ、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、又は４１ＢＢ。
【0012】
別の好ましい例において、Ａ１、Ａ２、Ａ３、及びＡ４において関心対象の標的を標的化する抗体又はそれらの抗原性断片は、ナノボディのＶＨＨ鎖、抗体重鎖可変領域、抗体軽鎖可変領域、抗体Ｆｃ断片、又はそれらの組合せである。
【0013】
別の好ましい例において、Ａ１、Ａ２、Ａ３、及びＡ４において関心対象の標的を標的化する抗体又はその抗原性断片は、以下を含むが、これらに限定されるものではない：抗－ＴＩＧＩＴナノボディのＶＨＨ鎖、抗－ＨＳＡナノボディのＶＨＨ鎖、抗－ＰＤ－Ｌ１ナノボディのＶＨＨ鎖、抗－ＰＤ－Ｌ２ナノボディのＶＨＨ鎖、抗－ＶＥＧＦ抗体のＶＨ鎖、抗－ＶＥＧＦ抗体のＶＬ鎖、抗－ＰＤ－１抗体のＶＨ鎖、又は抗－ＰＤ－１抗体のＶＬ鎖。
【0014】
別の好ましい例において、抗－ＴＩＧＩＴナノボディのＶＨＨ鎖は、配列番号：６に明記したアミノ酸配列、又は配列番号：６に明記した配列と８５％より大きいもしくは等しい配列同一性（好ましくは９０％、より好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％）を有するアミノ酸配列を有する。
【0015】
別の好ましい例において、抗－ＨＳＡナノボディのＶＨＨ鎖は、配列番号：５に明記したアミノ酸配列、又は配列番号：５に明記した配列と８５％より大きいもしくは等しい配列同一性（好ましくは９０％、より好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％）を有するアミノ酸配列を有する。
【0016】
別の好ましい例において、抗－ＰＤ－Ｌ１ナノボディのＶＨＨ鎖は、配列番号：１４又は２８に明記したアミノ酸配列、又は配列番号：１４又は２８に明記した配列と８５％より大きいもしくは等しい配列同一性（好ましくは９０％、より好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％）を有するアミノ酸配列を有する。
【0017】
別の好ましい例において、抗－ＰＤ－Ｌ２ナノボディのＶＨＨ鎖は、配列番号：１９に明記したアミノ酸配列、又は配列番号：１９に明記した配列と８５％より大きいもしくは等しい配列同一性（好ましくは９０％、より好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％）を有するアミノ酸配列を有する。
【0018】
別の好ましい例において、Ｂ１及びＢ２において関心対象の同じ標的を標的化する抗体は、以下を含むが、これらに限定されるものではない：抗－ＰＤ－１抗体、抗－ＶＥＧＦ抗体。
【0019】
別の好ましい例において、Ｂ１及びＢ２は、各々、抗－ＰＤ－１抗体のＶＬ領域及びＶＨ領域であり；ここで、抗－ＰＤ－１抗体のＶＬ領域は、配列番号：８に明記したアミノ酸配列、又は配列番号：８に明記した配列と８５％より大きいもしくは等しい配列同一性（好ましくは９０％、より好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％）を有するアミノ酸配列を有し；並びに、抗－ＰＤ－１抗体のＶＨ領域は、配列番号：２に明記したアミノ酸配列、又は配列番号：２に明記した配列と８５％より大きいもしくは等しい配列同一性（好ましくは９０％、より好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％）を有するアミノ酸配列を有する。
【0020】
別の好ましい例において、Ｂ１及びＢ２は、各々、抗－ＶＥＧＦ抗体のＶＬ領域及びＶＨ領域であり；ここで、抗－ＶＥＧＦ抗体のＶＬ領域は、配列番号：１６に明記したアミノ酸配列、又は配列番号：１６に明記した配列と８５％より大きいもしくは等しい配列同一性（好ましくは９０％、より好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％）を有するアミノ酸配列を有し；並びに、抗－ＶＥＧＦ抗体のＶＨ領域は、配列番号：１３に明記したアミノ酸配列、又は配列番号：１３に明記した配列と８５％より大きいもしくは等しい配列同一性（好ましくは９０％、より好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％）を有するアミノ酸配列を有する。
【0021】
別の好ましい例において、リンカーエレメントの配列は、（４ＧＳ）ｎであり、ここでｎは、正の整数（例えば、１、２、３、４、５、又は６）であり、好ましくはｎ＝４である。
【0022】
別の好ましい例において、リンカーエレメントの配列は、配列番号：４又は２１に明記したものであるか、又は配列番号：４又は２１に明記した配列と８５％より大きいもしくは等しい配列同一性（好ましくは９０％、より好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％）を有する。
【0023】
別の好ましい例において、第一のポリペプチドは、配列番号：１に明記したアミノ酸配列、又は配列番号：１に明記した配列と８５％より大きいもしくは等しい配列同一性（好ましくは９０％、より好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％）を有するアミノ酸配列を有し；並びに、第二のポリペプチドは、配列番号：７に明記したアミノ酸配列、又は配列番号：７に明記した配列と８５％より大きいもしくは等しい配列同一性（好ましくは９０％、より好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％）を有するアミノ酸配列を有する。
【0024】
別の好ましい例において、第一のポリペプチドは、配列番号：１０に明記したアミノ酸配列、又は配列番号：１０に明記した配列と８５％より大きいもしくは等しい配列同一性（好ましくは９０％、より好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％）を有するアミノ酸配列を有し；並びに、第二のポリペプチドは、配列番号：１１に明記したアミノ酸配列、又は配列番号：１１に明記した配列と８５％より大きいもしくは等しい配列同一性（好ましくは９０％、より好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％）を有するアミノ酸配列を有する。
【0025】
別の好ましい例において、第一のポリペプチドは、配列番号：１２に明記したアミノ酸配列、又は配列番号：１２に明記した配列と８５％より大きいもしくは等しい配列同一性（好ましくは９０％、より好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％）を有するアミノ酸配列を有し；並びに、第二のポリペプチドは、配列番号：１５に明記したアミノ酸配列、又は配列番号：１５に明記した配列と８５％より大きいもしくは等しい配列同一性（好ましくは９０％、より好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％）を有するアミノ酸配列を有する。
【0026】
別の好ましい例において、第一のポリペプチドは、配列番号：１７に明記したアミノ酸配列、又は配列番号：１７に明記した配列と８５％より大きいもしくは等しい配列同一性（好ましくは９０％、より好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％）を有するアミノ酸配列を有し；並びに、第二のポリペプチドは、配列番号：１８に明記したアミノ酸配列、又は配列番号：１８に明記した配列と８５％より大きいもしくは等しい配列同一性（好ましくは９０％、より好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％）を有するアミノ酸配列を有する。
【0027】
別の好ましい例において、第一のポリペプチドは、配列番号：２０に明記したアミノ酸配列、又は配列番号：２０に明記した配列と８５％より大きいもしくは等しい配列同一性（好ましくは９０％、より好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％）を有するアミノ酸配列を有し；並びに、第二のポリペプチドは、配列番号：１８に明記したアミノ酸配列、又は配列番号：１８に明記した配列と８５％より大きいもしくは等しい配列同一性（好ましくは９０％、より好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％）を有するアミノ酸配列を有する。
【0028】
別の好ましい例において、第一のポリペプチドは、配列番号：２２に明記したアミノ酸配列、又は配列番号：２２に明記した配列と８５％より大きいもしくは等しい配列同一性（好ましくは９０％、より好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％）を有するアミノ酸配列を有し；並びに、第二のポリペプチドは、配列番号：２３に明記したアミノ酸配列、又は配列番号：２３に明記した配列と８５％より大きいもしくは等しい配列同一性（好ましくは９０％、より好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％）を有するアミノ酸配列を有する。
【0029】
別の好ましい例において、第一のポリペプチドは、配列番号：１７に明記したアミノ酸配列、又は配列番号：１７に明記した配列と８５％より大きいもしくは等しい配列同一性（好ましくは９０％、より好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％）を有するアミノ酸配列を有し；並びに、第二のポリペプチドは、配列番号：２４に明記したアミノ酸配列、又は配列番号：２４に明記した配列と８５％より大きいもしくは等しい配列同一性（好ましくは９０％、より好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％）を有するアミノ酸配列を有する。
【0030】
別の好ましい例において、第一のポリペプチドは、配列番号：１７に明記したアミノ酸配列、又は配列番号：１７に明記した配列と８５％より大きいもしくは等しい配列同一性（好ましくは９０％、より好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％）を有するアミノ酸配列を有し；並びに、第二のポリペプチドは、配列番号：２５に明記したアミノ酸配列、又は配列番号：２５に明記した配列と８５％より大きいもしくは等しい配列同一性（好ましくは９０％、より好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％）を有するアミノ酸配列を有する。
【0031】
本発明の第二の態様において、Ｎ－末端からＣ－末端へ式Ｉにより表された第一のポリペプチド、及びＮ－末端からＣ－末端へ式ＩＩにより表された第二のポリペプチドを含む、多重特異性抗体が提供され：
Ａ１－Ｌ１－Ｂ１－Ｌ２－ＣＬ－Ｌ３－Ａ２ （式Ｉ）
Ａ３－Ｌ４－Ｂ２－Ｌ５－ＣＨ１－Ｌ６－Ａ４ （式ＩＩ）
ここで、
Ａ１、Ａ２、Ａ３、及びＡ４は、各々独立して、関心対象の標的を標的化する抗体又はその抗原性断片であり、並びにＡ１、Ａ２、Ａ３、及びＡ４の各々により標的化された標的抗原は、同じ又は異なることができ；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４は、各々独立して、ヌル又はリンカーエレメントであり；
Ｂ１及びＢ２は、両方共ヌルであるか、又はＢ１及びＢ２は、各々、同じ標的を標的化する抗体のＶＬ領域及びＶＨ領域であり；並びに
ジスルフィド結合は、第一のポリペプチドのＣＬ領域と第二のポリペプチドのＣＨ１領域の間に形成されてよく、その結果抗体は、ヘテロ二量体形を有する。
Ａ１－Ｌ１－Ｂ１－Ｌ２－ＣＬ－Ｌ３－Ａ２ （式Ｉ）
Ａ３－Ｌ４－Ｂ２－Ｌ５－ＣＨ１－Ｌ６－Ａ４ （式ＩＩ）
ここで、
Ａ１、Ａ２、Ａ３、及びＡ４は、各々独立して、関心対象の標的を標的化する抗体又はその抗原性断片であり、並びにＡ１、Ａ２、Ａ３、及びＡ４の各々により標的化された標的抗原は、同じ又は異なることができ；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４は、各々独立して、ヌル又はリンカーエレメントであり；
Ｂ１及びＢ２は、両方共ヌルであるか、又はＢ１及びＢ２は、各々、同じ標的を標的化する抗体のＶＬ領域及びＶＨ領域であり；並びに
ジスルフィド結合は、第一のポリペプチドのＣＬ領域と第二のポリペプチドのＣＨ１領域の間に形成されてよく、その結果抗体は、ヘテロ二量体形を有する。
【0032】
本発明の第三の態様において、本発明の第二の態様に従う多重特異性抗体を含む、融合タンパク質が提供され、及びこの多重特異性抗体の第一のポリペプチドは、Ｎ－末端からＣ－末端へ式ＩＩＩにより表される構造を有し、
Ａ１－Ｌ１－ＣＬ－Ｌ３－Ｆｃ （式ＩＩＩ）
ここで、Ｆｃは、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む、抗体のＦｃ断片であり；並びに
融合タンパク質は、Ｆｃ断片間のジスルフィド結合を介してホモ二量体を形成してよい。
Ａ１－Ｌ１－ＣＬ－Ｌ３－Ｆｃ （式ＩＩＩ）
ここで、Ｆｃは、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む、抗体のＦｃ断片であり；並びに
融合タンパク質は、Ｆｃ断片間のジスルフィド結合を介してホモ二量体を形成してよい。
【0033】
別の好ましい例において、第一のポリペプチドは、配列番号：２７に明記したアミノ酸配列、又は配列番号：２７に明記した配列と８５％より大きいもしくは等しい配列同一性（好ましくは９０％、より好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％）を有するアミノ酸配列を有し；並びに、第二のポリペプチドは、配列番号：３０に明記したアミノ酸配列、又は配列番号：３０に明記した配列と８５％より大きいもしくは等しい配列同一性（好ましくは９０％、より好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％）を有するアミノ酸配列を有する。
【0034】
本発明の第四の態様において、第一のヌクレオチド及び第二のヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチド組合せが提供され、ここで第一のヌクレオチドは、本発明の第二の態様に従う多重特異性抗体のもしくは本発明の第三の態様に従う融合タンパク質の第一のポリペプチドをコードし、並びに第二のヌクレオチドは、第二のポリペプチドをコードしている。
【0035】
本発明の第五の態様において、本発明の第四の態様に従うポリヌクレオチド組合せを含むベクターが、提供される。
【0036】
別の好ましい例において、ベクターは、以下からなる群から選択される：ＤＮＡ、ＲＮＡ、ウイルスベクター、プラスミド、トランスポゾン、他の遺伝子導入システム、又はそれらの組合せ；好ましくは、発現ベクターは、レンチウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶウイルス、レトロウイルス、又はそれらの組合せなどの、ウイルスベクターを含む。
【0037】
本発明の第六の態様において、本発明の第五の態様に従うベクターを含むか、又は本発明の第四の態様に従うポリヌクレオチドの組合せをそのゲノムへ組み込んでいる、宿主細胞が提供されるか；
あるいは、宿主細胞は、本発明の第二の態様に従う多重特異性抗体又は本発明の第三の態様に従う融合タンパク質を発現する。
あるいは、宿主細胞は、本発明の第二の態様に従う多重特異性抗体又は本発明の第三の態様に従う融合タンパク質を発現する。
【0038】
別の好ましい例において、宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞を含む。
【0039】
別の好ましい例において、宿主細胞は、大腸菌、酵母細胞、及び哺乳動物細胞からなる群から選択される。
【0040】
本発明の第七の態様において、抗体を作製する方法が提供され、これは：
（ａ）本発明の第六の態様に従う宿主細胞を、好適な条件下で培養し、本発明の第二の態様に従う多重特異性抗体又は本発明の第三の態様に従う融合タンパク質を含む培養物を得る工程；並びに
（ｂ）工程（ａ）において得られた培養物を精製及び／又は単離し、抗体を得る工程：を含む。
（ａ）本発明の第六の態様に従う宿主細胞を、好適な条件下で培養し、本発明の第二の態様に従う多重特異性抗体又は本発明の第三の態様に従う融合タンパク質を含む培養物を得る工程；並びに
（ｂ）工程（ａ）において得られた培養物を精製及び／又は単離し、抗体を得る工程：を含む。
【0041】
別の好ましい例において、精製は、アフィニティクロマトグラフィー精製及び単離により行われ、関心対象の抗体を得ることができる。
【0042】
別の好ましい例において、精製され且つ単離された関心対象の抗体の純度は、９５％より大きい、９６％より大きい、９７％より大きい、９８％より大きい、９９％より大きい、及び好ましくは１００％である。
【0043】
本発明の第八の態様において、免疫複合体が提供され、これは：
（ａ）本発明の第二の態様に従う多重特異性抗体又は本発明の第三の態様に従う融合タンパク質；並びに
（ｂ）検出可能な標識、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、又は酵素、金ナノ粒子／ナノロッド、ナノ磁気粒子、ウイルス外被タンパク質もしくはＶＬＰ、又はそれらの組合せからなる群から選択される、カップリング部分：を含有する。
（ａ）本発明の第二の態様に従う多重特異性抗体又は本発明の第三の態様に従う融合タンパク質；並びに
（ｂ）検出可能な標識、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、又は酵素、金ナノ粒子／ナノロッド、ナノ磁気粒子、ウイルス外被タンパク質もしくはＶＬＰ、又はそれらの組合せからなる群から選択される、カップリング部分：を含有する。
【0044】
別の好ましい例において、放射性核種は、以下を含む：
（ｉ）以下からなる群から選択される診断用同位体：Ｔｃ－９９ｍ、Ｇａ－６８、Ｆ－１８、Ｉ－１２３、Ｉ－１２５、Ｉ－１３１、Ｉｎ－１１１、Ｇａ－６７、Ｃｕ－６４、Ｚｒ－８９、Ｃ－１１、Ｌｕ－１７７、Ｒｅ－１８８、もしくはそれらの組合せ；及び／又は
（ｉｉ）以下からなる群から選択される治療用同位体：Ｌｕ－１７７、Ｙ－９０、Ａｃ－２２５、Ａｓ－２１１、Ｂｉ－２１２、Ｂｉ－２１３、Ｃｓ－１３７、Ｃｒ－５１、Ｃｏ－６０、Ｄｙ－１６５、Ｅｒ－１６９、Ｆｍ－２５５、Ａｕ－１９８、Ｈｏ－１６６、Ｉ－１２５、Ｉ－１３１、Ｉｒ－１９２、Ｆｅ－５９、Ｐｂ－２１２、Ｍｏ－９９、Ｐｄ－１０３、Ｐ－３２、Ｋ－４２、Ｒｅ－１８６、Ｒｅ－１８８、Ｓｍ－１５３、Ｒａ２２３、Ｒｕ－１０６、Ｎａ２４、Ｓｒ８９、Ｔｂ－１４９、Ｔｈ－２２７、Ｘｅ－１３３、Ｙｂ－１６９、Ｙｂ－１７７、もしくはそれらの組合せ。
（ｉ）以下からなる群から選択される診断用同位体：Ｔｃ－９９ｍ、Ｇａ－６８、Ｆ－１８、Ｉ－１２３、Ｉ－１２５、Ｉ－１３１、Ｉｎ－１１１、Ｇａ－６７、Ｃｕ－６４、Ｚｒ－８９、Ｃ－１１、Ｌｕ－１７７、Ｒｅ－１８８、もしくはそれらの組合せ；及び／又は
（ｉｉ）以下からなる群から選択される治療用同位体：Ｌｕ－１７７、Ｙ－９０、Ａｃ－２２５、Ａｓ－２１１、Ｂｉ－２１２、Ｂｉ－２１３、Ｃｓ－１３７、Ｃｒ－５１、Ｃｏ－６０、Ｄｙ－１６５、Ｅｒ－１６９、Ｆｍ－２５５、Ａｕ－１９８、Ｈｏ－１６６、Ｉ－１２５、Ｉ－１３１、Ｉｒ－１９２、Ｆｅ－５９、Ｐｂ－２１２、Ｍｏ－９９、Ｐｄ－１０３、Ｐ－３２、Ｋ－４２、Ｒｅ－１８６、Ｒｅ－１８８、Ｓｍ－１５３、Ｒａ２２３、Ｒｕ－１０６、Ｎａ２４、Ｓｒ８９、Ｔｂ－１４９、Ｔｈ－２２７、Ｘｅ－１３３、Ｙｂ－１６９、Ｙｂ－１７７、もしくはそれらの組合せ。
【0045】
別の好ましい例において、カップリング部分は、薬物又は毒素である。
【0046】
別の好ましい例において、薬物は、細胞毒性薬である。
【0047】
別の好ましい例において、細胞毒性薬は、以下からなる群から選択される：抗－チューブリン薬、ＤＮＡ副溝結合剤、ＤＮＡ複製阻害剤、アルキル化剤、抗生物質、葉酸拮抗薬、代謝拮抗薬、化学療法増感剤、トポイソメラーゼ阻害薬、ビンカアルカロイド、又はそれらの組合せ。
【0048】
特に有用な細胞毒性薬の例は、例えば、ＤＮＡ副溝結合剤、ＤＮＡアルキル化剤、及びチューブリン阻害薬を含み；代表的細胞毒性薬は、例えば、アウリスタチン、カンプトテシン、デュオカルマイシン、エトポシド、メイタンシン及びメイタンシノイド類（例えば、ＤＭ１及びＤＭ４）、タキサン、ベンゾジアゼピン、又はベンゾジアゼピン－含有薬（例えば、ピロロ［１，４］ベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、インドリノベンゾジアゼピン及びオキサゾリジノベンゾジアゼピン）、ビンカアルカロイド、又はそれらの組合せを含む。
【0049】
別の好ましい例において、毒素は、以下からなる群から選択される：アウリスタチン（例えば、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＦ、ＭＭＡＥ、及びＭＭＡＦ）、クロルテトラサイクリン、メイタンシノイド、リシン、リシンＡ鎖、コンブレタスタチン、デュオカルマイシン、ドラスタチン、アドリアマイシン、ダウノルビシン、パクリタキセル、シスプラチン、ｃｃ１０６５、臭化エチジウム、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ジヒドロキシアントラセンジオン、アクチノマイシン、ジフテリア毒素、シュードモナスエキソトキシン（ＰＥ）Ａ、ＰＥ４０、アブリン、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、α－サルシナ、ゲロニン、ミトゲルチン(mitogeltin)、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、クルシン、クロチン、カリケアマイシン、サボンソウ(Sapaonaria offficinalis)阻害剤、糖質コルチコイド、又はそれらの組合せ。別の好ましい例において、この複合部分は、検出可能な標識である。
【0050】
別の好ましい例において、複合体は、以下からなる群から選択される：蛍光又はルミネセンスの標識、放射性標識、ＭＲＩ（磁気共鳴画像法）又はＣＴ（コンピュータ断層撮影法）の造影剤、又は検出可能な生成物を生成可能な酵素、放射性核種、生物毒素、サイトカイン（例えば、ＩＬ－２）、抗体、抗体Ｆｃ断片、抗体ｓｃＦｖ断片、金ナノ粒子／ナノロッド、ウイルス粒子、リポソーム、ナノ磁気粒子、プロドラッグ－活性化酵素（例えば、ＤＴ－ジアホラーゼ（ＤＴＤ）又はビフェニルヒドラーゼ－様タンパク質（ＢＰＨＬ））、化学療法薬（例えば、シスプラチン）。
【0051】
別の好ましい例において、免疫複合体は、本発明の第二の態様に従う多価の（例えば、二価の）多重特異性抗体を含む。
【0052】
別の好ましい例において、多価とは、免疫複合体のアミノ酸が、本発明の第二の態様に従う抗体又は本発明の第三の態様に従う融合タンパク質の複数の反復配列を含むことを指す。
【0053】
本発明の第九の態様において、医薬品、試薬、検出プレート、又はキットの製造における、本発明の第二の態様に従う多重特異性抗体、本発明の第三の態様に従う融合タンパク質、又は本発明の第八の態様に従う免疫複合体の使用が提供され：
ここで、試薬、検出プレート又はキットは、試料中の関心対象の標的分子の存在又は非存在を検出するために使用され；並びに
医薬品は、関心対象の標的分子を発現する腫瘍を治療又は予防するために使用される。
ここで、試薬、検出プレート又はキットは、試料中の関心対象の標的分子の存在又は非存在を検出するために使用され；並びに
医薬品は、関心対象の標的分子を発現する腫瘍を治療又は予防するために使用される。
【0054】
別の好ましい例において、本免疫複合体の複合部分は、診断用同位体である。
【0055】
別の好ましい例において、試薬は、同位体トレーサー、造影剤、フロー検出試薬、細胞免疫蛍光検出試薬、ナノ－磁気粒子及び呈色試薬からなる群から選択される１又は複数の試薬である。
【0056】
別の好ましい例において、試料中の関心対象の標的分子を検出するための薬剤は、関心対象の標的分子の（インビボにおける）検出のための造影剤である。
【0057】
別の好ましい例において、検出は、インビボにおける検出又はインビトロにおける検出である。
【0058】
別の好ましい例において、検出は、フロー検出及び細胞免疫蛍光検出を含む。
【0059】
別の好ましい例において、腫瘍は、以下を含むが、これらに限定されるものではない：急性骨髄性白血病、慢性顆粒球性白血病、多発性ミエロパチー、非ホジキンリンパ腫、結腸直腸癌、乳癌、大腸癌、胃癌、肝臓癌、白血病、腎臓腫瘍、肺癌、小腸癌、骨癌、前立腺癌、前立腺癌、子宮頸癌、リンパ腫、副腎腫瘍、及び膀胱腫瘍。
【0060】
本発明の第十の態様において、（ｉ）本発明の第二の態様に従う多重特異性抗体、本発明の第三の態様に従う融合タンパク質、又は本発明の第八の態様に従う免疫複合体；並びに、（ｉｉ）医薬として許容し得る担体を含有する、医薬組成物が提供される。
【0061】
別の好ましい例において、本免疫複合体の複合部分は、薬物、毒素、及び／又は治療的同位体である。
【0062】
別の好ましい例において、本医薬組成物は更に、細胞毒性薬などの、腫瘍治療のための他の薬物を含有する。
【0063】
別の好ましい例において、腫瘍治療のための他の薬物は、パクリタキセル、ドキソルビシン、シクロホスファミド、アクシチニブ、レンバチニブ、又はペムブロリズマブを含む。
【0064】
別の好ましい例において、本医薬組成物は、関心対象の標的分子を発現する（すなわち、関心対象の標的分子について陽性）腫瘍の治療のために使用される。
【0065】
別の好ましい例において、本医薬組成物は、注射用剤形である。
【0066】
別の好ましい例において、本医薬組成物は、腫瘍を予防及び治療するための医薬品を調製するために使用される。
【0067】
本発明の第十一の態様において、疾患を治療する方法が提供され、この方法は：本発明の第二の態様に従う多重特異性抗体、本発明の第三の態様に従う融合タンパク質、本発明の第八の態様に従う免疫複合体、又は本発明の第十の態様に従う医薬組成物を、それを必要とする対象へ投与することを含む。
【0068】
別の好ましい例において、この対象は、哺乳動物、好ましくはヒトを含む。
【0069】
本発明の第十二の態様において、第二の態様に従う多重特異性抗体、本発明の第三の態様に従う融合タンパク質、本発明の第八の態様に従う免疫複合体、又は本発明の第十の態様に従う医薬組成物、並びに使用説明書を含むキットが、提供される。
【0070】
別の好ましい例において、使用説明書は、本キットは、検出のために対象における、関心対象の標的分子の発現を非侵襲的に検出するために使用されることを説明している。
【0071】
別の好ましい例において、使用説明書は、本キットは、関心対象の標的分子を発現する（すなわち、関心対象の標的分子について陽性）腫瘍を検出するために使用されることを説明している。
【0072】
本発明の範囲内において、本発明の先に説明した特徴及び以下に（例えば実施例において）具体的に説明するものは、新規の又は好ましい実施態様を形成するために互いに組み合わされてよいことは、理解されるべきである。これらは、本明細書の長さのために、繰り返されることはないであろう。
【図面の簡単な説明】
【0073】
図面の簡単な説明
【図12】図１２は、３種のＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体のＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ１細胞及びＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ２細胞への結合活性のアッセイの結果、並びに抗－ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２／ＴＩＧＩＴ／ヒト血清アルブミン四重特異性抗体の、ＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ１細胞、ＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ２細胞、及びＣＨＯ－ｈＴＩＧＩＴ細胞への結合活性のアッセイの結果を示す；
【図13】図１３は、ＥＬＩＳＡにより決定された、３種の抗－ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体及び抗－ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２／ＴＩＧＩＴ／ヒト血清アルブミン四重特異性抗体の、ヒト血清アルブミンへの結合活性を示す；
【図14】図１４は、３種の抗－ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体及び抗－ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２／ＴＩＧＩＴ／ヒト血清アルブミン四重特異性抗体の、ヒトＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２のヒトＰＤ－１への結合に対するブロック作用を示す；
【発明を実施するための形態】
【0074】
詳細な説明
本発明者らは、大規模且つ集中的な研究を行い、結果的に、膨大な数のスクリーニングを通じ、初めて多重特異性抗体の構築方法を開発した。実験は、安定したヘテロ二量体は、抗原－結合断片（抗体可変領域、単一ドメイン抗体又はＦｃなど）を、未変性の抗体のＣＬ断片及びＣＨ１断片に連結することにより形成され得ることを明らかにしている。本出願の方法により構築された多重特異性抗体は、異なる標的に同時に結合し、当初の抗体の結合活性を維持することができ；標的が、膜表面受容体又は溶液中の標的である場合に、有効であり；複数の標的に対する生物活性を有し；並びに、単一ドメイン抗体又は正常抗体又はＦｃ断片を連結することができる。従って本発明の方法及び提供されたプラットフォームは、巨大な適用の見込みを有する。本発明、この知見を基に企図されている。
本発明者らは、大規模且つ集中的な研究を行い、結果的に、膨大な数のスクリーニングを通じ、初めて多重特異性抗体の構築方法を開発した。実験は、安定したヘテロ二量体は、抗原－結合断片（抗体可変領域、単一ドメイン抗体又はＦｃなど）を、未変性の抗体のＣＬ断片及びＣＨ１断片に連結することにより形成され得ることを明らかにしている。本出願の方法により構築された多重特異性抗体は、異なる標的に同時に結合し、当初の抗体の結合活性を維持することができ；標的が、膜表面受容体又は溶液中の標的である場合に、有効であり；複数の標的に対する生物活性を有し；並びに、単一ドメイン抗体又は正常抗体又はＦｃ断片を連結することができる。従って本発明の方法及び提供されたプラットフォームは、巨大な適用の見込みを有する。本発明、この知見を基に企図されている。
【0075】
用語
本開示をより容易に理解するために、いくつかの用語が最初に定義される。本出願において使用される以下の用語の各々は、本明細書において別に明確に特定されない限りは、以下に提示した意味を有するものとする。追加の定義は、本出願を通じて明記される。
本開示をより容易に理解するために、いくつかの用語が最初に定義される。本出願において使用される以下の用語の各々は、本明細書において別に明確に特定されない限りは、以下に提示した意味を有するものとする。追加の定義は、本出願を通じて明記される。
【0076】
本明細書において使用される用語「多重特異性抗体を構築するためのプラットフォーム」及び「本発明の構築方法」は、互換的に使用され、本発明の第一の態様に従う多重特異性抗体の構築方法を指し、ここでジスルフィド結合を介してＣＬとＣＨ１の間に形成されるヘテロ二量体は、コア構造であり、並びに関心対象の異なる標的部位を標的化する抗体又はそれらの抗原性断片と融合される。
【0077】
多重特異性抗体
二重特異性／多重特異性抗体（ＢｓＡｂ、ＭｓＡｂ）は、２種又はそれよりも多い異なるモノクローナル抗体の断片で構成される人工のタンパク質であり、従って２種又はそれよりも多い異なる型の抗原に結合することができる。例えば、癌免疫療法において、操作されたＢｓＡｂは、細胞傷害性細胞及び死滅されるべき標的（例えば、腫瘍細胞）の両方へ結合する。三機能性抗体、化学連結されたＦａｂ、及び二重特異性Ｔ細胞アダプターを含む、二重特異性抗体の少なくとも３種の型が、提唱又は試験される。製造上の難点を克服するために、三機能性抗体と称される第一世代のＢｓＭＡｂが開発され、これは各々異なる抗体由来の２本の重鎖及び２本の軽鎖からなり；２つのＦａｂ領域は、２種の抗原に対し方向付けられ；このＦｃ領域は、２本の重鎖からなり、且つ第三の結合部位を形成し、従ってそのように称される。
二重特異性／多重特異性抗体（ＢｓＡｂ、ＭｓＡｂ）は、２種又はそれよりも多い異なるモノクローナル抗体の断片で構成される人工のタンパク質であり、従って２種又はそれよりも多い異なる型の抗原に結合することができる。例えば、癌免疫療法において、操作されたＢｓＡｂは、細胞傷害性細胞及び死滅されるべき標的（例えば、腫瘍細胞）の両方へ結合する。三機能性抗体、化学連結されたＦａｂ、及び二重特異性Ｔ細胞アダプターを含む、二重特異性抗体の少なくとも３種の型が、提唱又は試験される。製造上の難点を克服するために、三機能性抗体と称される第一世代のＢｓＭＡｂが開発され、これは各々異なる抗体由来の２本の重鎖及び２本の軽鎖からなり；２つのＦａｂ領域は、２種の抗原に対し方向付けられ；このＦｃ領域は、２本の重鎖からなり、且つ第三の結合部位を形成し、従ってそのように称される。
【0078】
別の型の二重特異性抗体は、短い半減期、免疫原性、及びサイトカイン放出により引きおこされる副作用などの、いくつかの問題に対処するように設計されている。これらは：Ｆａｂ領域からのみなる、化学的に連結されたＦａｂ、及び様々な型の二価及び三価の単一鎖可変領域（ｓｃＦｖ）（これは、２種の抗体可変ドメインの融合タンパク質を模倣している）を含む。最も最近に開発されたフォーマットは、二重特異性Ｔ細胞アダプター（ＢｉＴＥ）及び四機能性抗体である。
【0079】
抗体は、抗原へ特異的に結合し、且つ重鎖（Ｈ鎖）と称されるより大きい分子量の２本鎖、及び軽鎖（Ｌ鎖）と称されるより小さい分子量の２本鎖の４本のポリペプチド鎖から構成される、免疫グロブリンのクラスとして周知である。モノクローナル抗体において、２本のＨ－鎖及び２本のＬ－鎖のアミノ酸組成は同一であるのに対し、二重特異性抗体は、２本の異なるＨ－鎖及び２本の異なるＬ－鎖を同時発現することにより開発された。Ｈ２Ｌ２の１０種の可能性のある組換え混合物から機能性の二重特異性抗体を得ることは、二重特異性抗体の開発における最初の挑戦の一つであり、これは通常鎖－関連問題と称される。過去数十年にわたり、研究者らは、この問題に対処するために数多くの戦略を開発してきた。
【0080】
断片－ベースのフォーマット
Ｆｃ領域を伴わない断片－ベースの二重特異性抗体は、１個の分子内の複数の抗体断片へ、単純に結合し、これは鎖－関連問題を回避し、且つ高収率及び低コストの利点、並びに比較的短い半減期の欠点を有する。加えて、断片－ベースの二重特異性抗体は、安定性及び重合の問題点を提示し得る。
Ｆｃ領域を伴わない断片－ベースの二重特異性抗体は、１個の分子内の複数の抗体断片へ、単純に結合し、これは鎖－関連問題を回避し、且つ高収率及び低コストの利点、並びに比較的短い半減期の欠点を有する。加えて、断片－ベースの二重特異性抗体は、安定性及び重合の問題点を提示し得る。
【0081】
対称フォーマット
二重特異性抗体の対称フォーマットは、未変性の抗体に近いが、サイズ及び構造が異なる、Ｆｃ領域を保持している。これらの差異は、未変性の抗体に関連した有益な特性（例えば、安定性及び溶解性）に負の影響を及ぼすことがあり、このことはこれらの二重特異性抗体の物理化学特性及び／又は薬物動態特性を損ない得る。
二重特異性抗体の対称フォーマットは、未変性の抗体に近いが、サイズ及び構造が異なる、Ｆｃ領域を保持している。これらの差異は、未変性の抗体に関連した有益な特性（例えば、安定性及び溶解性）に負の影響を及ぼすことがあり、このことはこれらの二重特異性抗体の物理化学特性及び／又は薬物動態特性を損ない得る。
【0082】
非対称フォーマット
非対称フォーマットを伴うほとんどの二重特異性抗体は、天然の抗体に非常に類似しており、且つ最小の免疫原性の可能性を有すると考えられる。しかし、鎖－関連問題を解決するために関与し得る複合体操作は、一部の非対称フォーマット二重特異性抗体のこの利点を相殺し得る。
非対称フォーマットを伴うほとんどの二重特異性抗体は、天然の抗体に非常に類似しており、且つ最小の免疫原性の可能性を有すると考えられる。しかし、鎖－関連問題を解決するために関与し得る複合体操作は、一部の非対称フォーマット二重特異性抗体のこの利点を相殺し得る。
【0083】
しかし本発明においては、ヘテロ二量体形を基にした多重特異性抗体のクラスが、提供される。
【0084】
本明細書において使用される用語「本発明の多重特異性抗体」、「本発明のマルチ－抗体」、及び「本発明の抗体」は、互換的に使用され、且つ全て、本発明により提供された多重特異性抗体の構築方法を用いて構築された多重特異性抗体を指す。
【0085】
好ましくは、本発明により提供される抗体は、Ｎ－末端からＣ－末端へ式Ｉに明記した第一のポリペプチド、及びＮ－末端からＣ－末端へ式ＩＩに明記した第二のポリペプチドを含み、
Ａ１－Ｌ１－Ｂ１－Ｌ２－ＣＬ－Ｌ３－Ａ２ （式Ｉ）
Ａ３－Ｌ４－Ｂ２－Ｌ５－ＣＨ１－Ｌ６－Ａ４ （式ＩＩ）
ここで、
Ａ１、Ａ２、Ａ３、及びＡ４は、各々独立して、関心対象の標的を標的化する抗体又はその抗原性断片であり、並びにＡ１、Ａ２、Ａ３、及びＡ４の各々により標的化された標的抗原は、同じ又は異なることができ；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４は、各々独立して、ヌル又はリンカーエレメントであり；
Ｂ１及びＢ２は、両方共ヌルであるか、又はＢ１及びＢ２は、各々、関心対象の同じ標的を標的化する抗体のＶＬ領域及びＶＨ領域であり；並びに
ジスルフィド結合は、第一のポリペプチドのＣＬ領域と第二のポリペプチドのＣＨ１領域の間に形成されてよく、その結果この抗体は、ヘテロ二量体形を有する。
Ａ１－Ｌ１－Ｂ１－Ｌ２－ＣＬ－Ｌ３－Ａ２ （式Ｉ）
Ａ３－Ｌ４－Ｂ２－Ｌ５－ＣＨ１－Ｌ６－Ａ４ （式ＩＩ）
ここで、
Ａ１、Ａ２、Ａ３、及びＡ４は、各々独立して、関心対象の標的を標的化する抗体又はその抗原性断片であり、並びにＡ１、Ａ２、Ａ３、及びＡ４の各々により標的化された標的抗原は、同じ又は異なることができ；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４は、各々独立して、ヌル又はリンカーエレメントであり；
Ｂ１及びＢ２は、両方共ヌルであるか、又はＢ１及びＢ２は、各々、関心対象の同じ標的を標的化する抗体のＶＬ領域及びＶＨ領域であり；並びに
ジスルフィド結合は、第一のポリペプチドのＣＬ領域と第二のポリペプチドのＣＨ１領域の間に形成されてよく、その結果この抗体は、ヘテロ二量体形を有する。
【0086】
好ましい実施態様において、式ＩのＣＬ領域は、配列番号：９に明記したアミノ酸配列を有し、及び式ＩＩのＣＨ１領域は、配列番号：３に明記したアミノ酸配列を有する。
【0087】
一実施態様において、本多重特異性抗体は、抗－ＰＤ－１／ＴＩＧＩＴ／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体であり、ここで第一のポリペプチドは、配列番号：１に明記したアミノ酸配列を有し、且つ第二のポリペプチドは、配列番号：７に明記したアミノ酸配列を有する。
【0088】
一実施態様において、本多重特異性抗体は、抗－ＰＤ－１／ＴＩＧＩＴ／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体であり、ここで第一のポリペプチドは、配列番号：１０に明記したアミノ酸配列を有し、且つ第二のポリペプチドは、配列番号：１１に明記したアミノ酸配列を有する。
【0089】
一実施態様において、本多重特異性抗体は、抗－ＶＥＧＦ／ＰＤ－Ｌ１／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体であり、ここで第一のポリペプチドは、配列番号：１２に明記したアミノ酸配列を有し、且つ第二のポリペプチドは、配列番号：１５に明記したアミノ酸配列を有する。
【0090】
一実施態様において、本多重特異性抗体は、抗－ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体であり、ここで第一のポリペプチドは、配列番号：１７に明記したアミノ酸配列を有し、且つ第二のポリペプチドは、配列番号：１８に明記したアミノ酸配列を有する。
【0091】
一実施態様において、本多重特異性抗体は、抗－ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体であり、ここで第一のポリペプチドは、配列番号：２０に明記したアミノ酸配列を有し、且つ第二のポリペプチドは、配列番号：１８に明記したアミノ酸配列を有する。
【0092】
一実施態様において、本多重特異性抗体は、抗－ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体であり、ここで第一のポリペプチドは、配列番号：２２に明記したアミノ酸配列を有し、且つ第二のポリペプチドは、配列番号：２３に明記したアミノ酸配列を有する。
【0093】
一実施態様において、本多重特異性抗体は、抗－ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２／ＴＩＧＩＴ／ヒト血清アルブミン四重特異性抗体であり、ここで第一のポリペプチドは、配列番号：１７に明記したアミノ酸配列を有し、且つ第二のポリペプチドは、配列番号：２４に明記したアミノ酸配列を有する。
【0094】
一実施態様において、本多重特異性抗体は、抗－ＰＤ－Ｌ１／４１ＢＢ／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体であり、ここで第一のポリペプチドは、配列番号：１７に明記したアミノ酸配列を有し、且つ第二のポリペプチドは、配列番号：２５に明記したアミノ酸配列を有する。
【0095】
別の実施態様において、本発明は、Ｆｃ断片が、本発明の多重特異性抗体の第一のポリペプチドのＣ－末端に融合された融合タンパク質を提供し、その結果この多重特異性抗体は、Ｆｃ断片間のジスルフィド結合のために、ホモ二量体化が可能であり、より安定したホモ二量体を形成する。
【0096】
好ましくは、この融合タンパク質は、抗－ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２二重特異性抗体であり、ここで第一のポリペプチドは、配列番号：２７に明記したアミノ酸配列を有し、且つ第二のポリペプチドは、配列番号：３０に明記したアミノ酸配列を有する。
【0097】
本明細書において使用される用語「単一ドメイン抗体」、「ナノボディＶＨＨ」、及び「ナノボディ」は、同じ意味を有し、完全な機能を伴う最小の抗原－結合断片である、抗体の重鎖の可変領域をクローニングすることにより構築されるただ１個の重鎖可変領域からなるナノボディ（ＶＨＨ）を指す。ただ１個の重鎖可変領域からなるナノボディ（ＶＨＨ）は、典型的には、軽鎖及び重鎖定常領域１（ＣＨ１）を天然に欠いている抗体を入手し、次にこの抗体重鎖の可変領域をクローニングすることにより、構築される。
【0098】
本明細書において使用される用語「可変」とは、抗体の可変領域のある部分は、配列が異なり、このことは特定の抗体の各々の、その特定の抗原に対する結合及び特異性を生じることを意味する。しかし可変性は、抗体可変領域を通じて均等に分布されてはいない。これは、軽鎖及び重鎖の可変領域内の相補性決定領域（ＣＤＲ）又は超可変領域と称される、３つの断片に集中されている。これらの可変領域のより保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される。未変性の重鎖及び軽鎖の可変領域は、各々、４つのＦＲ領域を含み、これらは実質的に、連結ループを形成し、並びに場合によってはベータ－シート構造の一部を形成することがある３つのＣＤＲにより連結された、ベータ－シート構造である。各鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域を介して一緒に近傍に位置し、且つ他方の鎖のＣＤＲと抗体の抗原結合部位を形成する(Kabat et al, NIH Publ. No. 91-3242, Vol. I, 647-669頁 (1991)参照)。これらの定常領域は、抗体の抗原への結合には直接関与しないが、これらは、抗体の抗体-依存した細胞傷害性における参画など、異なるエフェクター機能を発揮する。
【0099】
本明細書において使用される用語「フレームワーク領域」（ＦＲ）は、ＣＤＲ間に挿入されたアミノ酸配列を指し、すなわち単独種の異なる免疫グロブリン間で比較的保存されている免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖可変領域のその部分を指す。免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖は、各々、４つのＦＲを有し、それぞれ、ＦＲ１－Ｌ、ＦＲ２－Ｌ、ＦＲ３－Ｌ、ＦＲ４－Ｌ及びＦＲ１－Ｈ、ＦＲ２－Ｈ、ＦＲ３－Ｈ、ＦＲ４－Ｈと指定される。従って軽鎖可変ドメインは、結果的に、（ＦＲ１－Ｌ）－（ＣＤＲ１－Ｌ）－（ＦＲ２－Ｌ）－（ＣＤＲ２－Ｌ）－（ＦＲ３－Ｌ）－（ＣＤＲ３－Ｌ）－（ＦＲ４－Ｌ）と称されてよく、並びに重鎖可変ドメインは、結果的に、（ＦＲ１－Ｈ）－（ＣＤＲ１－Ｈ）－（ＦＲ２－Ｈ）－（ＣＤＲ２－Ｈ）－（ＦＲ３－Ｈ）－（ＣＤＲ３－Ｈ）－（ＦＲ４－Ｈ）と称されてよい。好ましくは、本発明のＦＲは、天然のヒト抗体ＦＲと実質的に同一である、すなわち８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する、ヒト抗体ＦＲ又はその誘導体である。
【0100】
ＣＤＲのアミノ酸配列がわかると、当業者は、フレームワーク領域ＦＲ１－Ｌ、ＦＲ２－Ｌ、ＦＲ３－Ｌ、ＦＲ４－Ｌ及び／又はＦＲ１－Ｈ、ＦＲ２－Ｈ、ＦＲ３－Ｈ、ＦＲ４－Ｈを容易に決定することができる。
【0101】
本明細書において使用される用語「ヒトフレームワーク領域」は、天然のヒト抗体のフレームワーク領域に対し、実質的に（約８５％又はそれよりも大きい、具体的には９０％、９５％、９７％、９９％、もしくは１００％）同一であるフレームワーク領域である。
【0102】
本明細書において使用される用語「親和性」は、無傷の抗体と抗原の間の釣り合った会合により理論的に規定される。本発明の二重特異性抗体の親和性は、FortebioRed96装置を使用するバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）などの、ＫＤ値（解離定数）（又は他の決定手段）により、評価又は決定されてよい。
【0103】
本明細書において使用される用語「リンカー」は、各ドメイン又は領域に十分な可動性を提供する、本発明の抗体に挿入された、１又は複数個のアミノ酸残基を指す。
【0104】
当業者に公知のように、免疫複合体及び融合発現産物は、以下を含む：薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、酵素、及び本発明の抗体又はその断片への他の診断的又は治療的分子の結合により形成された複合体。本発明はまた、多重特異性抗体又はその断片へ結合する、細胞表面マーカー又は抗原も含む。
【0105】
本発明において用語「本発明の抗体」、「本発明のタンパク質」、又は「本発明のポリペプチド」は、互換的に使用され、且つ最初のメチオニンを含むか又は含まなくてよい、本発明により提供された多重特異性抗体を指す。
【0106】
本発明はまた、本発明の抗体を有する、他のタンパク質又は融合発現産物も提供する。特に本発明は、可変領域が、本発明の抗体の重鎖可変領域に対し、同一であるか又は少なくとも９０％相同、好ましくは少なくとも９５％相同であることを条件として、この可変領域を含む重鎖を有する任意のタンパク質又はタンパク質複合体及び融合発現産物（すなわち、免疫複合体及び融合発現産物）を含む。
【0107】
本発明は、無傷の抗体のみではなく、免疫学的に活性のある抗体の断片又は他の配列とこの抗体により形成された融合タンパク質も含む。従って本発明は、本抗体の断片、誘導体、及びアナログも含む。
【0108】
本明細書において使用される用語「断片」、「誘導体」、及び「アナログ」は、本発明の抗体と実質的に同じ生物学的機能又は活性を保持しているポリペプチドを指す。本発明のポリペプチド断片、誘導体、又はアナログは、（ｉ）１もしくは複数の保存されたもしくは保存されないアミノ酸残基（好ましくは保存されたアミノ酸残基）が置換されており、且つそのような置換されたアミノ酸残基が、遺伝暗号によりコードされるかもしくはコードされない、ポリペプチド、又は（ｉｉ）１もしくは複数のアミノ酸残基中に置換基を有する、ポリペプチド、又は（ｉｉｉ）この成熟ポリペプチドを別の化合物（例えば、ポリペプチドの半減期を増加する化合物、例えばポリエチレングリコールなど）と融合することにより形成された、ポリペプチド、又は（ｉｖ）追加のアミノ酸配列（例えば、リーダー配列もしくは分泌配列又はこのポリペプチドもしくはプロタンパク質の配列を精製するために使用される配列、又は６Ｈｉｓタグとの融合タンパク質など）を、このポリペプチドの配列へ融合することにより形成された、ポリペプチドであってよい。そのような断片、誘導体、及びアナログは、本明細書の技術を考慮し、当業者に周知である。
【0109】
本発明の抗体はまた、本発明の抗体と同じ機能を有し、且つその第一又は第二のポリペプチドは変動（複数可）を有する、形も含む。これらの変動（複数可）の形は、以下を含む（しかし限定されない）：１個又は複数（通常１～５０個、好ましくは１～３０個、より好ましくは１～２０個、最も好ましくは１～１０個）のアミノ酸の欠失、挿入、及び／又は置換、並びにＣ－末端及び／又はＮ－末端での１もしくは数個の（通常最大２０個、好ましくは最大１０個、より好ましくは最大５個）のアミノ酸の付加。例えば、当該技術分野において、性能が同様又は類似しているアミノ酸との置換は、典型的にはそのタンパク質の機能を変更しない。同じく例えば、Ｃ－末端及び／又はＮ－末端での１個又は数個のアミノ酸の付加は、一般にそのタンパク質の機能を変更しない。この用語はまた、本発明の抗体の活性断片及び活性誘導体も含む。
【0110】
このポリペプチドの変種は、以下を含む：相同配列、保存的変種、アレル変種、天然の変異体、誘導された変異体、高もしくは低ストリンジェンシー条件下で本発明の抗体をコードしているＤＮＡへハイブリダイズすることが可能なＤＮＡによりコードされたタンパク質、並びに本発明の抗体に対し生じた抗血清を用いて得られたポリペプチド又はタンパク質。
【0111】
本発明はまた、他のポリペプチド、例えば単一ドメイン抗体又はその断片を含む融合タンパク質なども提供する。実質的完全長ポリペプチドに加え、本発明はまた、本発明の単一ドメイン抗体の断片も包含している。典型的には、この断片は、本発明の抗体の少なくとも約５０個の近接アミノ酸、好ましくは少なくとも約５０個の近接アミノ酸、より好ましくは少なくとも約８０個の近接アミノ酸、及び最も好ましくは少なくとも約１００個の近接アミノ酸を有する。
【0112】
本発明において、「本発明の抗体の保存的変種」とは、本発明の抗体のアミノ酸配列と比べ、性質が同様又は類似しているアミノ酸と、最大１０個、好ましくは最大８個、より好ましくは最大５個、及び最も好ましくは最大３個のアミノ酸が置換されているポリペプチドを指す。これらの保存的変種ポリペプチドは、好ましくは、表Ａに従うアミノ酸置換により生成される。
【表1】
【0113】
本発明はまた、前記抗体又はその断片もしくは融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチド分子も提供する。本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡの形状であってよい。ＤＮＡの形状は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又は人工的に合成されたＤＮＡを含む。このＤＮＡは、一本鎖又は二本鎖であってよい。このＤＮＡは、コード鎖又は非コード鎖であってよい。
【0114】
本発明の成熟ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドは、以下を含む：成熟ポリペプチドのみをコードしているコード配列；成熟ポリペプチドのコード配列及び様々な追加のコード配列；成熟ポリペプチドのコード配列（及び任意に追加のコード配列）並びに非コード配列。
【0115】
用語「ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド」は、ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含んでよく、且つ同じく追加のコード配列及び／又は非コード配列のポリヌクレオチドも含む。
【0116】
本発明はまた、先に説明された配列にハイブリダイズし、且つこれらの２種の配列間で少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、及びより好ましくは少なくとも８０％の同一性を有する、ポリヌクレオチドにも関する。本発明は特に、ストリンジェント条件下で、本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドに関する。本発明において、「ストリンジェント条件」とは、以下を意味する：（１）０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃などの、比較的低いイオン強度及び比較的高い温度でのハイブリダイゼーション及び溶出；又は、（２）５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％ウシ血清／０．１％フィコール、４２℃でなどの、ハイブリダイゼーション時の変性剤の添加；又は、（３）２種の配列の間の同一性が、少なくとも９０％もしくはそれよりも多い、好ましくは９５％もしくはそれよりも多い場合にのみ起こる、ハイブリダイゼーション。ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドもまた、成熟ポリペプチドと同じ生物学的機能及び活性を有する。
【0117】
本発明の抗体又はその断片の完全長ヌクレオチド配列は、一般に、ＰＣＲ増幅法、組換え法、又は人工的合成法により得ることができる。一つの可能性のある方法は、特に断片が短い場合に、人工合成により、関連のある配列（複数可）を合成することである。典型的には、長い断片は、複数の小型断片の最初の合成、その後それらを一緒にライゲーションすることにより得られる。加えて、重鎖のコード配列及び発現タグ（例えば、６Ｈｉｓ）を、一緒に融合し、融合タンパク質を形成することができる。
【0118】
関連配列は、配列が得られた後の組換え法により、大量に得ることができ、これは一般に、関連配列をベクターへクローニングする工程、ベクターを細胞へ導入する工程、並びに従来型の方法により増殖された宿主細胞から関連配列を単離及び入手する工程を含む。それに本発明が関連する生体分子（核酸、タンパク質など）は、単離された形で存在した生体分子を含む。
【0119】
現時点で、本発明のタンパク質（又はその断片もしくは誘導体）をコードしているＤＮＡ配列は、化学合成により完全に入手することができる。その後このＤＮＡ配列は、様々な存在するＤＮＡ分子（又は例えばベクター）及び当該技術分野において公知の細胞へ導入することができる。更に、変異も、化学合成により、本発明のタンパク質配列へ導入することができる。
【0120】
本発明はまた、先に説明された好適なＤＮＡ配列及び好適なプロモーター又は制御配列を含むベクターにも関する。これらのベクターは、そのタンパク質を発現することができるよう、好適な宿主細胞を形質転換するために使用され得る。
【0121】
この宿主細胞は、細菌細胞などの原核細胞；又は、酵母細胞などの比較的下等の真核細胞；又は、哺乳動物細胞などの比較的高等の真核細胞であってよい。代表例は、大腸菌、ストレプトマイセス；例えば、サルモネラ・ティフィムリウスなどの細菌細胞；例えば酵母などの真菌細胞；例えばドロソフィアＳ２もしくはＳｆ９などの昆虫細胞；例えばＣＨＯ、ＣＯＳ７、２９３細胞などの動物細胞を含む。
【0122】
宿主細胞の組換えＤＮＡによる形質転換は、当業者に周知の従来型の技術により実行され得る。宿主が大腸菌など原核細胞である場合、ＤＮＡの取込みが可能であるコンピテント細胞は、指数増殖期の後収集され、且つ当該技術分野において周知の手順を使用するＣａＣｌ２アプローチにより処理されることができる。別のアプローチは、ＭｇＣｌ２を使用する。望ましいならば、形質転換はまた、電気穿孔法により実行されることもできる。宿主が真核細胞である場合、以下のＤＮＡトランスフェクション法が、使用されてよい：リン酸カルシウム共沈殿法、微量注入、電気穿孔法、リポソームパッケージングなどの、従来型の機械的方法。
【0123】
得られた形質転換体は、本発明の遺伝子によりコードされたポリペプチドを発現するために、従来型の方法により培養されることができる。培養において使用される培地は、使用される宿主細胞に応じて、様々な従来型の培地から選択されてよい。培養は、宿主細胞の成長に適した条件下で実行される。宿主細胞が適切な細胞密度に成長した後、選択プロモーターが適切な方法（例えば、温度シフト又は化学誘導）により導入され、並びにこれらの細胞は、更なる期間培養される。
【0124】
前記方法における組換えポリペプチドは、細胞内でもしくは細胞膜上に発現されるか、又は細胞の外側に分泌されてよい。必要ならば、組換えタンパク質の物理的特徴、化学的特徴及び他の特徴を、様々な単離法による、組換えタンパク質の単離及び精製に利用することができる。これらの方法は、当業者に周知である。そのような方法の例は、以下を含むが、これらに限定されるものではない：従来型の再構成処理、タンパク質沈殿剤による処理（塩析など）、遠心分離、浸透圧による細胞溶解、音波処理、超遠心分離、分子篩クロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、及び他の様々な液体クロマトグラフィー技術及びそれらの組合せ。
【0125】
本発明の抗体は、単独で、又は検出可能な標識（診断目的のため）、治療薬、ＰＫ（プロテインキナーゼ）修飾部分、もしくは前述のいずれかの組合せと組合せるかもしくは複合して、使用されてよい。
【0126】
診断目的のための検出可能な標識は、蛍光もしくはルミネセンスの標識、放射性標識、ＭＲＩ（磁気共鳴画像法）もしくはＣＴ（コンピュータ断層撮影法）の造影剤、又は検出可能な生成物を生成することが可能な酵素を含むが、これらに限定されるものではない。
【0127】
本発明の抗体に結合又は複合されてよい治療薬は、以下を含むが、これらに限定されるものではない：１．放射性核種；２．生物毒素；３．ＩＬ－２などの、サイトカイン；４．金ナノ粒子／ナノロッド；５．ウイルス粒子；６．リポソーム；７．ナノ磁気粒子；８．プロドラッグ活性化酵素（例えば、ＤＴ－ジアホラーゼ（ＤＴＤ）又はビフェニルヒドロラーゼ－様タンパク質（ＢＰＨＬ））；１０．化学療法薬（例えば、シスプラチン）又はナノ粒子の任意の形状など。
【0128】
発明の構築方法
本発明において、多重特異性抗体を構築する方法が提供され、これは：
（ｉ）各々、Ｎ－末端からＣ－末端へ式Ｉにより表された構造を有する第一のポリペプチドをコードしている第一のポリヌクレオチド、及びＮ－末端からＣ－末端へ式ＩＩにより表される構造を有する第二のポリペプチドをコードしている第二のポリヌクレオチドを構築する工程であって、
Ａ１－Ｌ１－Ｂ１－Ｌ２－ＣＬ－Ｌ３－Ａ２ （式Ｉ）
Ａ３－Ｌ４－Ｂ２－Ｌ５－ＣＨ１－Ｌ６－Ａ４ （式ＩＩ）
ここで、Ａ１、Ａ２、Ａ３、及びＡ４は、各々独立して、関心対象の標的を標的化する抗体又はその抗原性断片であり、並びにＡ１、Ａ２、Ａ３、及びＡ４の各々により標的化された標的抗原は、同じ又は異なることができ；Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４は、各々独立して、ヌル又はリンカーエレメントであり；Ｂ１及びＢ２は、両方共ヌルであるか、又はＢ１及びＢ２は、各々、同じ標的を標的化する抗体のＶＬ領域及びＶＨ領域であり；並びに、ジスルフィド結合は、第一のポリペプチドのＣＬ領域と第二のポリペプチドのＣＨ１領域の間に形成されてよく、その結果抗体は、ヘテロ二量体形を有する工程；並びに
（ｉｉ）第一のポリヌクレオチド及び第二のポリヌクレオチドを発現し、第一のポリペプチド及び第二のポリペプチドを得、並びに第一のポリペプチド及び第二のポリペプチドを二量体化し、ヘテロ二量体形を伴う多重特異性抗体を形成する工程：を含む。
本発明において、多重特異性抗体を構築する方法が提供され、これは：
（ｉ）各々、Ｎ－末端からＣ－末端へ式Ｉにより表された構造を有する第一のポリペプチドをコードしている第一のポリヌクレオチド、及びＮ－末端からＣ－末端へ式ＩＩにより表される構造を有する第二のポリペプチドをコードしている第二のポリヌクレオチドを構築する工程であって、
Ａ１－Ｌ１－Ｂ１－Ｌ２－ＣＬ－Ｌ３－Ａ２ （式Ｉ）
Ａ３－Ｌ４－Ｂ２－Ｌ５－ＣＨ１－Ｌ６－Ａ４ （式ＩＩ）
ここで、Ａ１、Ａ２、Ａ３、及びＡ４は、各々独立して、関心対象の標的を標的化する抗体又はその抗原性断片であり、並びにＡ１、Ａ２、Ａ３、及びＡ４の各々により標的化された標的抗原は、同じ又は異なることができ；Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４は、各々独立して、ヌル又はリンカーエレメントであり；Ｂ１及びＢ２は、両方共ヌルであるか、又はＢ１及びＢ２は、各々、同じ標的を標的化する抗体のＶＬ領域及びＶＨ領域であり；並びに、ジスルフィド結合は、第一のポリペプチドのＣＬ領域と第二のポリペプチドのＣＨ１領域の間に形成されてよく、その結果抗体は、ヘテロ二量体形を有する工程；並びに
（ｉｉ）第一のポリヌクレオチド及び第二のポリヌクレオチドを発現し、第一のポリペプチド及び第二のポリペプチドを得、並びに第一のポリペプチド及び第二のポリペプチドを二量体化し、ヘテロ二量体形を伴う多重特異性抗体を形成する工程：を含む。
【0129】
好ましくは、第一のポリペプチドのＣＬ領域は、配列番号：９に明記したアミノ酸配列を有し、及び第二のポリペプチドのＣＨ１領域は、配列番号：３に明記したアミノ酸配列を有し、ここでジスルフィド結合は、これら２つの領域間に形成されてよい。
【0130】
医薬組成物
本発明はまた、組成物も提供する。好ましくは、本組成物は、上記抗体又はその活性断片又はその融合タンパク質、及び医薬として許容し得る担体を含有する医薬組成物である。一般にこれらの物質は、典型的には約５～約８のｐＨ、好ましくは約６～約８のｐＨを有する、無毒の、不活性の、及び医薬として許容し得る水性担体媒体中に製剤化されるが、このｐＨは、製剤化される物質の性質及び治療される状態に応じて変動するであろう。製剤化された医薬組成物は、非限定的に、以下を含む、通常の経路により、投与されてよい：腫瘍内投与、腹腔内投与、静脈内投与、又は局所投与。
本発明はまた、組成物も提供する。好ましくは、本組成物は、上記抗体又はその活性断片又はその融合タンパク質、及び医薬として許容し得る担体を含有する医薬組成物である。一般にこれらの物質は、典型的には約５～約８のｐＨ、好ましくは約６～約８のｐＨを有する、無毒の、不活性の、及び医薬として許容し得る水性担体媒体中に製剤化されるが、このｐＨは、製剤化される物質の性質及び治療される状態に応じて変動するであろう。製剤化された医薬組成物は、非限定的に、以下を含む、通常の経路により、投与されてよい：腫瘍内投与、腹腔内投与、静脈内投与、又は局所投与。
【0131】
本発明の医薬組成物は、関心対象の標的分子を結合するために、直接使用されることができ、従って、対応する疾患を治療するために使用されることができる。加えて他の治療薬を、同時に使用してよい。
【0132】
本発明の医薬組成物は、前述の本発明の抗体（又はその複合体）の安全且つ有効な量（例えば、０．００１～９９ｗｔ％、好ましくは０．０１～９０ｗｔ％、より好ましくは０．１～８０ｗｔ％）、及び医薬として許容し得る担体又は賦形剤を含有する。そのような媒介物(vector)は、以下を含む（しかしこれに限定されない）：食塩水、緩衝液、グルコース、水、グリセロール、エタノール、及びそれらの組合せ。この医薬製剤は、投与様式に、適合しなければならない。本発明の医薬組成物は、例えば、生理食塩水又はグルコース及び他のアジュバントを含有する水性溶液を使用する通常の方法により、注射剤の形状で調製されることができる。注射剤、液剤などの医薬組成物は、好ましくは無菌条件下で調製される。活性成分の投与量は、治療的有効量、例えば、約１０μｇ／ｋｇ体重～約５０ｍｇ／ｋｇ体重である。加えて、本発明のポリペプチドはまた、他の治療薬と共に使用されてよい。
【0133】
医薬組成物を使用する場合、免疫複合体の安全且つ有効な量が、哺乳動物へ投与され、ここで安全且つ有効な量は、典型的には少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体重であり、ほとんどの症例において、約５０ｍｇ／ｋｇ体重を超えず、好ましくは投与量は、約１０μｇ／ｋｇ体重～約１０ｍｇ／ｋｇ体重である。当然、特定の用量はまた、投与経路、患者の健康状態などの要因も考慮され、これは熟練した医師の技術の範囲内である。
【0134】
本発明の主な利点は、以下である：
１）本発明の二重／多重特異性抗体構造は、異なる標的へ同時に結合し、且つ当初の抗体の結合活性を維持することができる；
２）本発明の二重／多重特異性抗体構造は、標的が、膜表面受容体又は溶液中の標的である場合に、有効である；
３）本発明の二重／多重特異性抗体構造は、複数の標的に対する生物活性を有する；
４）本発明の二重／多重特異性抗体構造は、単一ドメイン抗体又は正常抗体又はＦｃ断片へ連結されてよい；
５）本発明の二重／多重特異性抗体は、ＣＨ１－ＣＬ二量体を中心とすることにより構築された、抗体又は融合タンパク質であり、並びにそれを基に、本発明はまた、Ｆｃ断片を含む多重特異性抗体を提供し、このことはタンパク質の半減期を有意に改善し、且つ精製プロセスを簡略化する。
１）本発明の二重／多重特異性抗体構造は、異なる標的へ同時に結合し、且つ当初の抗体の結合活性を維持することができる；
２）本発明の二重／多重特異性抗体構造は、標的が、膜表面受容体又は溶液中の標的である場合に、有効である；
３）本発明の二重／多重特異性抗体構造は、複数の標的に対する生物活性を有する；
４）本発明の二重／多重特異性抗体構造は、単一ドメイン抗体又は正常抗体又はＦｃ断片へ連結されてよい；
５）本発明の二重／多重特異性抗体は、ＣＨ１－ＣＬ二量体を中心とすることにより構築された、抗体又は融合タンパク質であり、並びにそれを基に、本発明はまた、Ｆｃ断片を含む多重特異性抗体を提供し、このことはタンパク質の半減期を有意に改善し、且つ精製プロセスを簡略化する。
【0135】
本発明は、下記の具体的実施例を参照し、更に例示されるであろう。これらの実施例は、単に例示を目的とし、本発明の範囲を限定することは意図しないことは、理解されなければならない。下記実施例に注記した具体的条件を伴わない実験手順は、一般に、例えば、Sambrookらの「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載された、又は製造業者の推奨に従う従来型の条件に従い実行される。別に指示しない限りは、百分率及び部は、重量による。
【表2-1】
【表2-2】
【実施例】
【0136】
実施例１：抗－ＰＤ－１／ＴＩＧＩＴ／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体
１．１ 抗－ＰＤ－１／ＴＩＧＩＴ／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体の構築
Ｍ－ボディ技術を明らかにするために、この実験において、２種の抗－ＰＤ－１／ＴＩＧＩＴ／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体を構築した：
１．１ 抗－ＰＤ－１／ＴＩＧＩＴ／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体の構築
Ｍ－ボディ技術を明らかにするために、この実験において、２種の抗－ＰＤ－１／ＴＩＧＩＴ／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体を構築した：
【0137】
２本のポリペプチド鎖からなるＢｉ－７０－７１は、図１Ａに示した構造を有し、ここでペプチド鎖＃１は、配列番号：１に明記したアミノ酸配列を有し、これは抗－ＰＤ－１抗体ペムブロリズマブ（特許番号ＵＳ８３５４５０９）由来のＶＨアミノ酸配列（配列番号：２）を含み、このＶＨアミノ酸配列のＣ－末端は、ヒトＩｇＧ１由来のＣＨ１アミノ酸配列（配列番号：３）へ直接連結しており；並びに、ペプチド鎖＃１は、抗－ヒト血清アルブミン配列番号：５を有するナノボディＡＬＢ８（特許番号：ＷＯ２００４／０４１８６５）のＣ－末端の、ペムブロリズマブの重鎖可変領域のＮ－末端への、１１個のアミノ酸残基（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ）の可動性ペプチド（配列番号：４）を介した連結、並びに、抗－ＴＩＧＩＴナノボディＥ－Ｙｅ－１１（配列番号：６）のＮ－末端の、ＣＨ１のＣ－末端への、１１個のアミノ酸残基（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ）の可動性ペプチドを介した連結により得られ；ペプチド鎖＃２は、配列番号：７に明記したアミノ酸配列を有し、これは、抗－ＰＤ－１抗体ペムブロリズマブ由来のＶＬアミノ酸配列（配列番号：８）を含み；並びに、ペプチド鎖＃２は、ＶＬアミノ酸配列のＣ－末端の、ヒトκ軽鎖定常領域（ＣＬ）アミノ酸配列（配列番号：９）への直接連結により、得られた。
【0138】
同じく２本のポリペプチド鎖からなるＢｉ－７２－７３は、図１Ｂに示した構造を有し、ここでペプチド鎖＃１は、配列番号：１０に明記したアミノ酸配列を有し、これは抗－ＰＤ－１抗体ペムブロリズマブ由来のＶＨアミノ酸配列（配列番号：２）を含み、このＶＨアミノ酸配列のＣ－末端は、ヒトＩｇＧ１由来のＣＨ１アミノ酸配列（配列番号：３）へ直接連結しており；ペプチド鎖＃２は、配列番号：１１に明記したアミノ酸配列を有し、これは、抗－ＰＤ－１抗体ペムブロリズマブ由来のＶＬアミノ酸配列（配列番号：８）を含み、このＶＬアミノ酸配列のＣ－末端は、ヒトκ軽鎖定常領域（ＣＬ）アミノ酸配列（配列番号：９）へ直接連結され；並びに、ペプチド鎖＃２は、抗－ヒト血清アルブミンナノボディＡＬＢ８（配列番号：５）のＣ－末端の、ペムブロリズマブの軽鎖可変領域のＮ－末端への、１１個のアミノ酸残基（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ）の可動性ペプチド（配列番号：４）を介した連結、並びに、抗－ＴＩＧＩＴナノボディＥ－Ｙｅ－１１（配列番号：６）のＮ－末端の、ＣＬのＣ－末端への、１１個のアミノ酸残基ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧの可動性ペプチド（配列番号：４）を介した連結により、得られた。
【0139】
１．２ 抗－ＰＤ－１／ＴＩＧＩＴ／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体の発現及び精製
この実施例において、下記のような具体的手順により、実施例１．１において構築した抗－ＰＤ－１／ＴＩＧＩＴ／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体Ｂｉ－７０－７１及びＢｉ－７２－７３の２本の鎖の各々をコードしているヌクレオチド配列を、市販の真核細胞発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１（＋）へ、マルチクローニングサイトを介してライゲーションし、並びに真核細胞において発現し及び精製し、三重特異性抗体Ｂｉ－７０－７１及びＢｉ－７２－７３を得た。
この実施例において、下記のような具体的手順により、実施例１．１において構築した抗－ＰＤ－１／ＴＩＧＩＴ／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体Ｂｉ－７０－７１及びＢｉ－７２－７３の２本の鎖の各々をコードしているヌクレオチド配列を、市販の真核細胞発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１（＋）へ、マルチクローニングサイトを介してライゲーションし、並びに真核細胞において発現し及び精製し、三重特異性抗体Ｂｉ－７０－７１及びＢｉ－７２－７３を得た。
【0140】
抗体遺伝子のｐＣＤＮＡ３．１発現ベクターへの構築
Ｂｉ－７０－７１及びＢｉ－７２－７３の２本鎖の各々をコードしている遺伝子配列を、GENEWIZ,Inc.により合成し、その後、市販の指示書中の手順に従い、線状化したｐＣＤＮＡ３．１ベクターへ、相同組換え酵素(Vazymeから購入)及びＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ二重消化によりライゲーションした。この相同組換え産物を、Ｔｏｐ１０コンピテント細胞へ形質転換し、アンピシリン耐性プレートに播種し、３７℃で一晩培養し、単一クローンを配列決定のために採取した。
Ｂｉ－７０－７１及びＢｉ－７２－７３の２本鎖の各々をコードしている遺伝子配列を、GENEWIZ,Inc.により合成し、その後、市販の指示書中の手順に従い、線状化したｐＣＤＮＡ３．１ベクターへ、相同組換え酵素(Vazymeから購入)及びＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ二重消化によりライゲーションした。この相同組換え産物を、Ｔｏｐ１０コンピテント細胞へ形質転換し、アンピシリン耐性プレートに播種し、３７℃で一晩培養し、単一クローンを配列決定のために採取した。
【0141】
タンパク質発現及び精製
前記プラスミドを、Ｅｘｐｉ－ＣＨＯ細胞へ、ＥｘｐｉＣＨＯ(商標)発現系キット(Thermo)を用い、市販の指示書に従うトランスフェクション法により導入し、及びその上清を５日間細胞培養後に収集し、KappaSelect(GE)アフィニティクロマトグラフィーカラムを用いて精製した。具体的方法は、以下に従う：試料は、０．２μｍ滅菌針フィルターＰＥＳを通し、シリンジにより濾過し；クロマトグラフィーカラムは、溶出液の電導度及びｐＨが変化しなくなるまで、５カラム容積の平衡緩衝液（２０ｍＭ ＰＢ＋０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）により平衡化し；流量は、０．５ｍｌ／分であった。並びに、試料負荷の終了後、クロマトグラフィーカラムを、浸透が完了し且つＵＶ値がそれ以上は減少しなくなるまで、平衡(balance)緩衝液により、連続して洗浄した。溶出緩衝液（０．１Ｍグリシン－ＨＣｌ、ｐＨ３．０）による溶出後、溶出液を収集した。溶出直後に、収集した抗体溶液は、抗体が安定しているｐＨまで、アルカリ緩衝液（例えば、１Ｍトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．０）により中和すべきであった。
前記プラスミドを、Ｅｘｐｉ－ＣＨＯ細胞へ、ＥｘｐｉＣＨＯ(商標)発現系キット(Thermo)を用い、市販の指示書に従うトランスフェクション法により導入し、及びその上清を５日間細胞培養後に収集し、KappaSelect(GE)アフィニティクロマトグラフィーカラムを用いて精製した。具体的方法は、以下に従う：試料は、０．２μｍ滅菌針フィルターＰＥＳを通し、シリンジにより濾過し；クロマトグラフィーカラムは、溶出液の電導度及びｐＨが変化しなくなるまで、５カラム容積の平衡緩衝液（２０ｍＭ ＰＢ＋０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）により平衡化し；流量は、０．５ｍｌ／分であった。並びに、試料負荷の終了後、クロマトグラフィーカラムを、浸透が完了し且つＵＶ値がそれ以上は減少しなくなるまで、平衡(balance)緩衝液により、連続して洗浄した。溶出緩衝液（０．１Ｍグリシン－ＨＣｌ、ｐＨ３．０）による溶出後、溶出液を収集した。溶出直後に、収集した抗体溶液は、抗体が安定しているｐＨまで、アルカリ緩衝液（例えば、１Ｍトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．０）により中和すべきであった。
【0142】
このタンパク質の純度は、ＨＰＬＣにより決定した。ＨＰＬＣ法は、以下のようであった：移動相：１５０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、ｐＨ７．０。クロマトグラフィー条件は、以下のようであった：検出波長：２８０ｎｍ、カラム温度：２５℃、流量：０．３５ｍｌ／分、検出時間：２０分間、Ｚｅｎｉｘ－Ｃ ＳＥＣ－３００カラム（ＳＥＰＡＸ ４．６×３００ｍｍ、３μｍ）。ＳＥＣ結果は、二重特異性抗体Ｂｉ－７０－７１は、純度９９．１４％であり、及びＢｉ－７２－７３は、純度９８．２７％であることを示した。
【0143】
１．３ 抗－ＰＤ－１／ＴＩＧＩＴ／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体の抗原共－結合能の決定
先に説明した本発明の２種の例証的抗－ＰＤ－１／ＴＩＧＩＴ／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体Ｂｉ－７０－７１及びＢｉ－７２－７３は、ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ、及びヒト血清アルブミンへ同時に結合することができるかどうかを、Ｏｃｔｅｔシステム(ForteBio Inc.により製造)を用いる、速度論的結合アッセイにより決定した。本実験開始の３０分前に、ＳＡセンサー（Ｐａｌｌ）を、ＳＤ緩衝液（ＰＢＳ １×、ＢＳＡ ０．１％、ツイーン２０ ０．０５％）に浸漬することにより、室温で平衡化した。９６－ウェル黒色ポリスチレン製ハーフ－マイクロプレート(Greiner)のウェルへ、ブランク対照（バックグラウンド減算のため）としてのＳＤ緩衝液１００μＬ、１００ｎＭ精製した双特異性抗体Ｂｉ－７０－７１及びＢｉ－７２－７３の１００μＬ、並びにＳＤ緩衝液中に希釈した抗原としてビオチン化－標識したヒトＰＤ－１（１００ｎＭ）(ACROBiosystems)、ヒトＴＩＧＩＴ（１００ｎＭ）(ACROBiosystems)、及びヒト血清アルブミン(ACROBiosystems)の各々１００μＬ溶液を、添加した。ＳＡセンサーを、ビオチン化－標識したヒトＰＤ－１溶液を含有するウェルに、６０秒間、室温で含浸させ、その後負荷した。その後このセンサーを、ベースラインに達するまで、ＳＤ緩衝液中で洗浄し、次に１００μＬ抗体溶液を含有するウェル中に含浸させ、抗体の抗原への会合をモニタリングし、引き続きセンサーを、１００μＬのＳＤ緩衝液を含有するウェルへ移動させ、抗体解離をモニタリングし；その後、このセンサーを、１００ｎＭヒトＴＩＧＩＴ溶液を含有するウェルへ移動させ、抗体のヒトＴＩＧＩＴへの結合を検出し、次にセンサーを、１００μＬのＳＤ緩衝液を含有するウェルへ移動させ、抗原解離をモニタリングし；その後このセンサーを、１００ｎＭヒト血清アルブミン溶液を含有するウェルへ移動させ、抗体のヒト血清アルブミンへの結合を検出し、引き続きセンサーを、１００μｌのＳＤ緩衝液を含有するウェルへ移動させることにより、抗原解離をモニタリングした。回転速度は１０００ｒｐｍであり、及び温度は３０℃であった。
先に説明した本発明の２種の例証的抗－ＰＤ－１／ＴＩＧＩＴ／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体Ｂｉ－７０－７１及びＢｉ－７２－７３は、ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ、及びヒト血清アルブミンへ同時に結合することができるかどうかを、Ｏｃｔｅｔシステム(ForteBio Inc.により製造)を用いる、速度論的結合アッセイにより決定した。本実験開始の３０分前に、ＳＡセンサー（Ｐａｌｌ）を、ＳＤ緩衝液（ＰＢＳ １×、ＢＳＡ ０．１％、ツイーン２０ ０．０５％）に浸漬することにより、室温で平衡化した。９６－ウェル黒色ポリスチレン製ハーフ－マイクロプレート(Greiner)のウェルへ、ブランク対照（バックグラウンド減算のため）としてのＳＤ緩衝液１００μＬ、１００ｎＭ精製した双特異性抗体Ｂｉ－７０－７１及びＢｉ－７２－７３の１００μＬ、並びにＳＤ緩衝液中に希釈した抗原としてビオチン化－標識したヒトＰＤ－１（１００ｎＭ）(ACROBiosystems)、ヒトＴＩＧＩＴ（１００ｎＭ）(ACROBiosystems)、及びヒト血清アルブミン(ACROBiosystems)の各々１００μＬ溶液を、添加した。ＳＡセンサーを、ビオチン化－標識したヒトＰＤ－１溶液を含有するウェルに、６０秒間、室温で含浸させ、その後負荷した。その後このセンサーを、ベースラインに達するまで、ＳＤ緩衝液中で洗浄し、次に１００μＬ抗体溶液を含有するウェル中に含浸させ、抗体の抗原への会合をモニタリングし、引き続きセンサーを、１００μＬのＳＤ緩衝液を含有するウェルへ移動させ、抗体解離をモニタリングし；その後、このセンサーを、１００ｎＭヒトＴＩＧＩＴ溶液を含有するウェルへ移動させ、抗体のヒトＴＩＧＩＴへの結合を検出し、次にセンサーを、１００μＬのＳＤ緩衝液を含有するウェルへ移動させ、抗原解離をモニタリングし；その後このセンサーを、１００ｎＭヒト血清アルブミン溶液を含有するウェルへ移動させ、抗体のヒト血清アルブミンへの結合を検出し、引き続きセンサーを、１００μｌのＳＤ緩衝液を含有するウェルへ移動させることにより、抗原解離をモニタリングした。回転速度は１０００ｒｐｍであり、及び温度は３０℃であった。
【0144】
先に説明した方法によるアッセイ実験において、本発明の抗－ＰＤ－１／ＴＩＧＩＴ／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体Ｂｉ－７０－７１（図２Ａに示す）及びＢｉ－７２－７３（図２Ｂに示す）は、ヒトＰＤ－１、ヒトＴＩＧＩＴ、及びヒト血清アルブミンタンパク質へ、同時に結合することができる。
【0145】
１．４ 抗－ＰＤ－１／ＴＩＧＩＴ／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体の抗原の結合能の決定
ヒトＰＤ－Ｌ１又はヒトＴＩＧＩＴを過剰発現しているＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ１細胞、ＣＨＯ－ｈＴＩＧＩＩＴ細胞）を、ｐＣＨＯ１．０ベクター(Invitrogenから購入)の、ＭＣＳへクローニングした、ヒトＰＤ－１又はヒトＴＩＧＩＴ ｃＤＮＡ(Nano Biologicalから購入)によるトランスフェクションにより、作製した。増幅したＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ１細胞／ＣＨＯ－ｈＴＩＧＩＩＴ細胞を、細胞密度２×１０６個細胞／ｍｌに調節し、並びにこれらの細胞１００μＬを、９６－ウェルフロープレートの各ウェルへ添加し、引き続きその後の使用のために遠心分離した。精製した三重特異性抗体を、ＰＢＳによる３－倍連続希釈（４００ｎＭで出発し、合計１２の濃度）により希釈し、希釈した試料１００μＬを、細胞を含有する９６－ウェルフロープレートの各ウェルへ添加し、このプレートを、４℃で３０分間インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗浄した。精製した抗体試料ウェルの各ウェルへ、ＰＢＳで希釈したマウス抗－ヒトＩｇＧ－Ｆａｂ（ＰＥ）(Abcamから購入)１００μＬを添加し、このプレートを、４℃で３０分間インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗浄した。１ウェルにつき１００μＬのＰＢＳを添加し、細胞を再浮遊させ、これをＣｙｔｏＦｌｅｘフローサイトメーター(Bechman)上で検出し、対応するMFIを算出した。
ヒトＰＤ－Ｌ１又はヒトＴＩＧＩＴを過剰発現しているＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ１細胞、ＣＨＯ－ｈＴＩＧＩＩＴ細胞）を、ｐＣＨＯ１．０ベクター(Invitrogenから購入)の、ＭＣＳへクローニングした、ヒトＰＤ－１又はヒトＴＩＧＩＴ ｃＤＮＡ(Nano Biologicalから購入)によるトランスフェクションにより、作製した。増幅したＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ１細胞／ＣＨＯ－ｈＴＩＧＩＩＴ細胞を、細胞密度２×１０６個細胞／ｍｌに調節し、並びにこれらの細胞１００μＬを、９６－ウェルフロープレートの各ウェルへ添加し、引き続きその後の使用のために遠心分離した。精製した三重特異性抗体を、ＰＢＳによる３－倍連続希釈（４００ｎＭで出発し、合計１２の濃度）により希釈し、希釈した試料１００μＬを、細胞を含有する９６－ウェルフロープレートの各ウェルへ添加し、このプレートを、４℃で３０分間インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗浄した。精製した抗体試料ウェルの各ウェルへ、ＰＢＳで希釈したマウス抗－ヒトＩｇＧ－Ｆａｂ（ＰＥ）(Abcamから購入)１００μＬを添加し、このプレートを、４℃で３０分間インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗浄した。１ウェルにつき１００μＬのＰＢＳを添加し、細胞を再浮遊させ、これをＣｙｔｏＦｌｅｘフローサイトメーター(Bechman)上で検出し、対応するMFIを算出した。
【0146】
先に説明した方法によるアッセイ実験において、図３に示したように、結果は、本発明の抗－ＰＤ－１／ＴＩＧＩＴ／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体は、ＣＨＯ－ｈＰＤ－１細胞及びＣＨＯ－ｈＴＩＧＩＩＴ細胞の両方に対する結合活性を有することを示した。
【0147】
１．５ ＥＬＩＳＡレベルでの抗－ＰＤ－１／ＴＩＧＩＴ／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体のヒト血清アルブミンへの結合
ヒト血清アルブミン(ACROBiosystems)を、ＥＬＩＳＡコーティング溶液により希釈し、その後ＥＬＩＳＡプレートへ添加し、４℃で一晩コーティングした。コーティング溶液を廃棄し、２５０μＬのＰＢＳＴを、各ウェルへ添加し、３回洗浄し、ＥＬＩＳＡプレートを、後で使用するために、５％ＢＳＡにより、室温で１ｈブロックした。精製した抗体及び対照抗体を、勾配希釈し、その後ブロックしたＥＬＩＳＡプレートへ添加し、このプレートを、室温で２ｈインキュベーションし、ＰＢＳＴで３回洗浄し；精製した抗体試料ウェルへ、ヤギ抗－ヒトＦａｂ－ＨＲＰ(Abcam)を添加し、このプレートを、室温で１ｈインキュベーションし、ＰＢＳＴで３回洗浄し、引き続きＥＬＩＳＡ呈色溶液を添加し、室温で３分間静置し、ＥＬＩＳＡ停止溶液を添加し、４５０ｎｍで吸光度の値を測定した。
ヒト血清アルブミン(ACROBiosystems)を、ＥＬＩＳＡコーティング溶液により希釈し、その後ＥＬＩＳＡプレートへ添加し、４℃で一晩コーティングした。コーティング溶液を廃棄し、２５０μＬのＰＢＳＴを、各ウェルへ添加し、３回洗浄し、ＥＬＩＳＡプレートを、後で使用するために、５％ＢＳＡにより、室温で１ｈブロックした。精製した抗体及び対照抗体を、勾配希釈し、その後ブロックしたＥＬＩＳＡプレートへ添加し、このプレートを、室温で２ｈインキュベーションし、ＰＢＳＴで３回洗浄し；精製した抗体試料ウェルへ、ヤギ抗－ヒトＦａｂ－ＨＲＰ(Abcam)を添加し、このプレートを、室温で１ｈインキュベーションし、ＰＢＳＴで３回洗浄し、引き続きＥＬＩＳＡ呈色溶液を添加し、室温で３分間静置し、ＥＬＩＳＡ停止溶液を添加し、４５０ｎｍで吸光度の値を測定した。
【0148】
先に説明した方法によるアッセイ実験において、図４に示したように、実験結果は、ＥＬＩＳＡレベルでの、本発明の抗－ＰＤ－１／ＴＩＧＩＴ／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体のヒト血清アルブミンへの結合を示した。
【0149】
１．６ 抗－ＰＤ－１／ＴＩＧＩＴ／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体によるヒトＰＤ－Ｌ１のヒトＰＤ－１への結合のブロック
ＣＨＯ－ｈＰＤ－１細胞を、細胞密度２×１０６個細胞／ｍＬに調節し、１００μＬの細胞を、９６－ウェルフロープレートの各ウェルに添加し、引き続きその後の使用のために遠心分離した。精製した抗体及び対照抗体の試料を、ＰＢＳによる３－倍連続希釈（４００ｎＭで出発し、合計１２の濃度）により希釈し、希釈した試料６０μＬを、９６－ウェル試料希釈プレートの各ウェルに添加する一方で、６０μＬのビオチン化－標識したヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質(ACROBiosystemsから購入)を、各ウェルへ、最終濃度５００ｎｇ／ｍＬで添加し、この混合物を、試料と共に、４℃で３０分間インキュベーションした。１００μＬの同時－インキュベーションした試料を、細胞を含有する先の９６－ウェルフロープレートの各ウェルに添加し、このプレートを、４℃で３０分間インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗浄した。ＰＢＳにより１００－倍希釈したストレプトアビジン、Ｒ－フィトエリスリン複合体（Thermo fisherから入手)の１ウェルに１００μＬを添加し、このプレートを、４℃で３０分間インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗浄した。１ウェルにつき１００μＬのＰＢＳを添加し、細胞を再浮遊させ、これをＣｙｔｏＦｌｅｘフローサイトメーター(Bechman)上で検出し、対応するＭＦＩを算出した。
ＣＨＯ－ｈＰＤ－１細胞を、細胞密度２×１０６個細胞／ｍＬに調節し、１００μＬの細胞を、９６－ウェルフロープレートの各ウェルに添加し、引き続きその後の使用のために遠心分離した。精製した抗体及び対照抗体の試料を、ＰＢＳによる３－倍連続希釈（４００ｎＭで出発し、合計１２の濃度）により希釈し、希釈した試料６０μＬを、９６－ウェル試料希釈プレートの各ウェルに添加する一方で、６０μＬのビオチン化－標識したヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質(ACROBiosystemsから購入)を、各ウェルへ、最終濃度５００ｎｇ／ｍＬで添加し、この混合物を、試料と共に、４℃で３０分間インキュベーションした。１００μＬの同時－インキュベーションした試料を、細胞を含有する先の９６－ウェルフロープレートの各ウェルに添加し、このプレートを、４℃で３０分間インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗浄した。ＰＢＳにより１００－倍希釈したストレプトアビジン、Ｒ－フィトエリスリン複合体（Thermo fisherから入手)の１ウェルに１００μＬを添加し、このプレートを、４℃で３０分間インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗浄した。１ウェルにつき１００μＬのＰＢＳを添加し、細胞を再浮遊させ、これをＣｙｔｏＦｌｅｘフローサイトメーター(Bechman)上で検出し、対応するＭＦＩを算出した。
【0150】
先に説明した方法によるアッセイ実験において、図５に示したように、実験結果は、本発明の抗－ＰＤ－１／ＴＩＧＩＴ／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体は、ＰＤ－Ｌ１のＰＤ－１への結合をブロックすることができることを示した。
【0151】
１．７ 抗－ＰＤ－１／ＴＩＧＩＴ／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体によるヒトＣＤ１５５のヒトＴＩＧＩＴへの結合のブロック
ＣＨＯ－ｈＴＩＧＩＴ細胞を、細胞密度２×１０６個細胞／ｍＬに調節し、１００μＬの細胞を、９６－ウェルフロープレートの各ウェルに添加し、引き続きその後の使用のために遠心分離した。精製した抗体及び対照抗体の試料を、ＰＢＳによる３－倍連続希釈（４００ｎＭで出発し、合計１２の濃度）により希釈し、希釈した試料６０μＬを、９６－ウェル試料希釈プレートの各ウェルに添加する一方で、１ウェルに６０μＬのヒトＣＤ１５５－ｍＦｃタンパク質(ACROBiosystemsから購入)を、最終濃度２μｇ／ｍＬで添加し、この混合物を、試料と共に、４℃で３０分間インキュベーションした。１００μＬの同時－インキュベーションした試料を、細胞を含有する先の９６－ウェルフロープレートの各ウェルに添加し、このプレートを、４℃で３０分間インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗浄した。ＰＢＳで１００－倍希釈した１００μＬのヤギ抗－マウスＩｇＧ Ｆｃ－ＡＰＣ(Biolegendから購入)を１ウェルにつき添加し、プレートを、４℃で３０分間インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗浄した。１ウェルにつき１００μＬのＰＢＳを添加し、細胞を再浮遊させ、これをＣｙｔｏＦｌｅｘフローサイトメーター(Bechman)上で検出し、対応するＭＦＩを算出した。
ＣＨＯ－ｈＴＩＧＩＴ細胞を、細胞密度２×１０６個細胞／ｍＬに調節し、１００μＬの細胞を、９６－ウェルフロープレートの各ウェルに添加し、引き続きその後の使用のために遠心分離した。精製した抗体及び対照抗体の試料を、ＰＢＳによる３－倍連続希釈（４００ｎＭで出発し、合計１２の濃度）により希釈し、希釈した試料６０μＬを、９６－ウェル試料希釈プレートの各ウェルに添加する一方で、１ウェルに６０μＬのヒトＣＤ１５５－ｍＦｃタンパク質(ACROBiosystemsから購入)を、最終濃度２μｇ／ｍＬで添加し、この混合物を、試料と共に、４℃で３０分間インキュベーションした。１００μＬの同時－インキュベーションした試料を、細胞を含有する先の９６－ウェルフロープレートの各ウェルに添加し、このプレートを、４℃で３０分間インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗浄した。ＰＢＳで１００－倍希釈した１００μＬのヤギ抗－マウスＩｇＧ Ｆｃ－ＡＰＣ(Biolegendから購入)を１ウェルにつき添加し、プレートを、４℃で３０分間インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗浄した。１ウェルにつき１００μＬのＰＢＳを添加し、細胞を再浮遊させ、これをＣｙｔｏＦｌｅｘフローサイトメーター(Bechman)上で検出し、対応するＭＦＩを算出した。
【0152】
先に説明した方法によるアッセイ実験において、図６に示したように、実験結果は、本発明の抗－ＰＤ－１／ＴＩＧＩＴ／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体は、ＣＤ１５５のＴＩＧＩＴへの結合をブロックすることができることを示した。
【0153】
要約すると、本抗体の結合活性は、１又は複数のナノボディドメインを連結する一方での、ＣＨ１－ＣＬドメイン上のＶＨドメイン及びＶＬドメインを連結することにより、効果的に維持され、二重特異性又は多重特異性抗体を形成することができる。ペムブロリズマブ由来のこの実験において使用されたＶＨ－ＶＬ組合せは、細胞表面抗原ヒトＰＤ－１へ結合するドメインであった。
【0154】
実施例２：抗－ＶＥＧＦ／ＰＤ－Ｌ１／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体
２．１． 抗－ＶＥＧＦ／ＰＤ－Ｌ１／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体の構築
この実験において、連結されたＶＨ－ＶＬドメインが、血液中の遊離抗原に標的化される場合に、Ｍ－ボディが適用可能であるかどうかを確認するために、Ｂｉ－７４－７６と指定された、２種のポリペプチド鎖からなる１種の抗－ＶＥＧＦ／ＰＤ－Ｌ１／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体を構築し、その概略構造を、図１Ｃに示し、ここでペプチド鎖＃１は、配列番号：１２に明記したアミノ酸配列を有し、これは抗－ＶＥＧＦ抗体ベバシズマブ（特許番号：ＷＯ１９９８０４５３３２）由来のＶＨアミノ酸配列（配列番号：１３）を含み、このＶＨアミノ酸配列のＣ－末端は、ヒトＩｇＧ１由来のＣＨ１アミノ酸配列（配列番号：３）へ直接連結され；並びに、ペプチド鎖＃１は、抗－ヒト血清アルブミンナノボディＡＬＢ８（配列番号：５）のＣ－末端を、ベバシズマブ重鎖可変領域のＮ－末端へ、１１個のアミノ酸残基（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ）の可動性ペプチド（配列番号：４）を介して連結すること、並びに抗－ヒトＰＤ－Ｌ１ナノボディＣ－Ｙｅ－８－５（特許出願番号：２０１９１０８６３１０９０）（配列番号：１４）のＮ－末端を、ＣＨ１のＣ－末端へ、１１個のアミノ酸残基（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ）の可動性ペプチド（配列番号：４）を介して連結することにより得られ；ペプチド鎖＃２は、配列番号：１５に明記したアミノ酸配列を有し、これは抗－ＶＥＧＦ抗体ベバシズマブ由来のＶＬアミノ酸配列（配列番号：１６）を含み、このＶＬアミノ酸配列のＣ－末端は、ヒトκ軽鎖定常領域（ＣＬ）由来のアミノ酸配列（配列番号：９）へ直接連結され；並びに、ペプチド鎖＃２は、抗－ヒトＰＤ－Ｌ１ナノボディＣ－Ｙｅ－８－５（配列番号：１４）のＮ－末端を、ＣＬのＣ－末端へ、１１個のアミノ酸残基（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ）の可動性ペプチド（配列番号：４）を介して連結することにより得られた。
２．１． 抗－ＶＥＧＦ／ＰＤ－Ｌ１／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体の構築
この実験において、連結されたＶＨ－ＶＬドメインが、血液中の遊離抗原に標的化される場合に、Ｍ－ボディが適用可能であるかどうかを確認するために、Ｂｉ－７４－７６と指定された、２種のポリペプチド鎖からなる１種の抗－ＶＥＧＦ／ＰＤ－Ｌ１／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体を構築し、その概略構造を、図１Ｃに示し、ここでペプチド鎖＃１は、配列番号：１２に明記したアミノ酸配列を有し、これは抗－ＶＥＧＦ抗体ベバシズマブ（特許番号：ＷＯ１９９８０４５３３２）由来のＶＨアミノ酸配列（配列番号：１３）を含み、このＶＨアミノ酸配列のＣ－末端は、ヒトＩｇＧ１由来のＣＨ１アミノ酸配列（配列番号：３）へ直接連結され；並びに、ペプチド鎖＃１は、抗－ヒト血清アルブミンナノボディＡＬＢ８（配列番号：５）のＣ－末端を、ベバシズマブ重鎖可変領域のＮ－末端へ、１１個のアミノ酸残基（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ）の可動性ペプチド（配列番号：４）を介して連結すること、並びに抗－ヒトＰＤ－Ｌ１ナノボディＣ－Ｙｅ－８－５（特許出願番号：２０１９１０８６３１０９０）（配列番号：１４）のＮ－末端を、ＣＨ１のＣ－末端へ、１１個のアミノ酸残基（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ）の可動性ペプチド（配列番号：４）を介して連結することにより得られ；ペプチド鎖＃２は、配列番号：１５に明記したアミノ酸配列を有し、これは抗－ＶＥＧＦ抗体ベバシズマブ由来のＶＬアミノ酸配列（配列番号：１６）を含み、このＶＬアミノ酸配列のＣ－末端は、ヒトκ軽鎖定常領域（ＣＬ）由来のアミノ酸配列（配列番号：９）へ直接連結され；並びに、ペプチド鎖＃２は、抗－ヒトＰＤ－Ｌ１ナノボディＣ－Ｙｅ－８－５（配列番号：１４）のＮ－末端を、ＣＬのＣ－末端へ、１１個のアミノ酸残基（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ）の可動性ペプチド（配列番号：４）を介して連結することにより得られた。
【0155】
２．２ 抗－ＶＥＧＦ／ＰＤ－Ｌ１／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体の発現及び精製
この実施例において、実施例２．１において構築した抗－ＶＥＧＦ／ＰＤ－Ｌ１／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体Ｂｉ－７４－７６をコードしている２種のヌクレオチド配列を、市販の真核細胞発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１（＋）へ、マルチクローニングサイトを介してライゲーションし、並びに真核細胞において発現し及び精製し、三重特異性抗体Ｂｉ－７４－７６を得た。発現プラスミド構築、細胞トランスフェクション、タンパク質精製及びＨＰＬＣ純度検出の方法は、実施例１．２と同じであった。ＳＥＣ結果は、二重特異性抗体Ｂｉ－７４－７６は、純度９５．８９％であることを示した。
この実施例において、実施例２．１において構築した抗－ＶＥＧＦ／ＰＤ－Ｌ１／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体Ｂｉ－７４－７６をコードしている２種のヌクレオチド配列を、市販の真核細胞発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１（＋）へ、マルチクローニングサイトを介してライゲーションし、並びに真核細胞において発現し及び精製し、三重特異性抗体Ｂｉ－７４－７６を得た。発現プラスミド構築、細胞トランスフェクション、タンパク質精製及びＨＰＬＣ純度検出の方法は、実施例１．２と同じであった。ＳＥＣ結果は、二重特異性抗体Ｂｉ－７４－７６は、純度９５．８９％であることを示した。
【0156】
２．３ 抗－ＶＥＧＦ／ＰＤ－Ｌ１／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体の抗原共－結合能の決定
先に説明した本発明の２種の例証的抗－ＶＥＧＦ／ＰＤ－Ｌ１／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体Ｂｉ－７４－７６は、ヒトＰＤ－Ｌ１、ＶＥＧＦ、及びヒト血清アルブミンへ同時に結合することができるかどうかを、Ｏｃｔｅｔシステム(ForteBio Inc.)を用いる、速度論的結合アッセイにより決定した。本実験開始の３０分前に、ＳＡセンサー(Pall)を、ＳＤ緩衝液（ＰＢＳ １×、ＢＳＡ ０．１％、ツイーン２０ ０．０５％）に浸漬することにより、室温で平衡化した。９６－ウェル黒色ポリスチレン製ハーフ－マイクロプレート(Greiner)のウェルへ、ブランク対照（バックグラウンド減算のため）としてのＳＤ緩衝液１００μＬ、１００ｎＭ精製した三重特異性抗体Ｂｉ－７４－７６の１００μＬ、並びに抗原としてＳＤ緩衝液中に希釈したビオチン化－標識したヒトＶＥＧＦ（１００ｎＭ）(ACROBiosystems)、ヒトＰＤ－Ｌ１（１００ｎＭ）(ACROBiosystems)、及びヒト血清アルブミンの溶液(ACROBiosystems)の各々１００μＬ溶液を、添加した。ＳＡセンサーを、ビオチン化－標識したＶＥＧＦ溶液を含有するウェルに、６０秒間、室温で含浸させ、その後負荷した。その後このセンサーを、ベースラインに達するまで、ＳＤ緩衝液中で洗浄し、次に１００μＬ抗体溶液を含有するウェル中に含浸させ、抗体の抗原への会合をモニタリングし、引き続きセンサーを、１００μＬのＳＤ緩衝液を含有するウェルへ移動させ、抗体解離をモニタリングし；その後、このセンサーを、１００ｎＭヒトＰＤ－Ｌ１溶液を含有するウェルへ移動させ、抗体のヒトＰＤ－Ｌ１への結合を検出し、引き続きセンサーを、１００μＬＳＤ緩衝液を含有するウェルへ移動させ、抗原解離をモニタリングし；その後このセンサーを、１００ｎＭヒト血清アルブミン溶液を含有するウェルへ移動させ、抗体のヒト血清アルブミンへの結合を検出し、引き続きセンサーを、１００μｌのＳＤ緩衝液を含有するウェルへ移動させることにより、抗原解離をモニタリングした。回転速度は１０００ｒｐｍであり、及び温度は３０℃であった。
先に説明した本発明の２種の例証的抗－ＶＥＧＦ／ＰＤ－Ｌ１／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体Ｂｉ－７４－７６は、ヒトＰＤ－Ｌ１、ＶＥＧＦ、及びヒト血清アルブミンへ同時に結合することができるかどうかを、Ｏｃｔｅｔシステム(ForteBio Inc.)を用いる、速度論的結合アッセイにより決定した。本実験開始の３０分前に、ＳＡセンサー(Pall)を、ＳＤ緩衝液（ＰＢＳ １×、ＢＳＡ ０．１％、ツイーン２０ ０．０５％）に浸漬することにより、室温で平衡化した。９６－ウェル黒色ポリスチレン製ハーフ－マイクロプレート(Greiner)のウェルへ、ブランク対照（バックグラウンド減算のため）としてのＳＤ緩衝液１００μＬ、１００ｎＭ精製した三重特異性抗体Ｂｉ－７４－７６の１００μＬ、並びに抗原としてＳＤ緩衝液中に希釈したビオチン化－標識したヒトＶＥＧＦ（１００ｎＭ）(ACROBiosystems)、ヒトＰＤ－Ｌ１（１００ｎＭ）(ACROBiosystems)、及びヒト血清アルブミンの溶液(ACROBiosystems)の各々１００μＬ溶液を、添加した。ＳＡセンサーを、ビオチン化－標識したＶＥＧＦ溶液を含有するウェルに、６０秒間、室温で含浸させ、その後負荷した。その後このセンサーを、ベースラインに達するまで、ＳＤ緩衝液中で洗浄し、次に１００μＬ抗体溶液を含有するウェル中に含浸させ、抗体の抗原への会合をモニタリングし、引き続きセンサーを、１００μＬのＳＤ緩衝液を含有するウェルへ移動させ、抗体解離をモニタリングし；その後、このセンサーを、１００ｎＭヒトＰＤ－Ｌ１溶液を含有するウェルへ移動させ、抗体のヒトＰＤ－Ｌ１への結合を検出し、引き続きセンサーを、１００μＬＳＤ緩衝液を含有するウェルへ移動させ、抗原解離をモニタリングし；その後このセンサーを、１００ｎＭヒト血清アルブミン溶液を含有するウェルへ移動させ、抗体のヒト血清アルブミンへの結合を検出し、引き続きセンサーを、１００μｌのＳＤ緩衝液を含有するウェルへ移動させることにより、抗原解離をモニタリングした。回転速度は１０００ｒｐｍであり、及び温度は３０℃であった。
【0157】
先に説明した方法によるアッセイ実験において、図７に示したように、実験結果は、抗－ＶＥＧＦ／ＰＤ－Ｌ１／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体Ｂｉ－７４－７６は、ヒトＰＤ－Ｌ１、ヒトＶＥＧＦ、及びヒト血清アルブミンへ同時に結合することができることを示した。
【0158】
２．４ 抗－ＶＥＧＦ／ＰＤ－Ｌ１／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体の抗原結合能の決定
ヒトＰＤ－Ｌ１を過剰発現しているＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ１細胞、ＣＨＯ－ｈＴＩＧＩＩＴ細胞）を、ｐＣＨＯ１．０ベクター(Invitrogenから購入)の、ＭＣＳへクローニングした、ヒトＰＤ－１ ｃＤＮＡ(Nano Biologicalから購入)によるトランスフェクションにより、作製した。抗－ＶＥＧＦ／ＰＤ－Ｌ１／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体のＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ１細胞への結合活性は、実施例１．４のように検出した。
ヒトＰＤ－Ｌ１を過剰発現しているＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ１細胞、ＣＨＯ－ｈＴＩＧＩＩＴ細胞）を、ｐＣＨＯ１．０ベクター(Invitrogenから購入)の、ＭＣＳへクローニングした、ヒトＰＤ－１ ｃＤＮＡ(Nano Biologicalから購入)によるトランスフェクションにより、作製した。抗－ＶＥＧＦ／ＰＤ－Ｌ１／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体のＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ１細胞への結合活性は、実施例１．４のように検出した。
【0159】
先に説明した方法によるアッセイ実験において、図８に示したように、結果は、本発明の抗－ＶＥＧＦ／ＰＤ－Ｌ１／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体は、ＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ１細胞へ結合することができることを示した。
【0160】
２．５ ＥＬＩＳＡレベルでの抗－ＶＥＧＦ／ＰＤ－Ｌ１／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体のヒト血清アルブミンへの結合の決定
抗－ＶＥＧＦ／ＰＤ－Ｌ１／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体のヒト血清アルブミンへの結合能を、この実験においてＥＬＩＳＡ反応の方法により検出し、且つ実験方法は、実施例１．５と同じであった。先に説明した方法によるアッセイ実験において、本発明の精製した抗体は、ヒト血清アルブミンへ、ＥＬＩＳＡレベルで結合することができる（図９参照）。
抗－ＶＥＧＦ／ＰＤ－Ｌ１／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体のヒト血清アルブミンへの結合能を、この実験においてＥＬＩＳＡ反応の方法により検出し、且つ実験方法は、実施例１．５と同じであった。先に説明した方法によるアッセイ実験において、本発明の精製した抗体は、ヒト血清アルブミンへ、ＥＬＩＳＡレベルで結合することができる（図９参照）。
【0161】
２．６ ＥＬＩＳＡレベルでの抗－ＶＥＧＦ／ＰＤ－Ｌ１／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体のヒトＶＥＧＦへの結合
ヒトＶＥＧＦ(ACROBiosystems)タンパク質を、ＥＬＩＳＡコーティング溶液で希釈し、その後ＥＬＩＳＡプレートへ添加し、４℃で一晩コーティングした。コーティング溶液を廃棄し、２５０μＬのＰＢＳＴを、各ウェルへ添加し、３回洗浄し、且つこのＥＬＩＳＡプレートを、５％ＢＳＡにより、室温で１ｈブロックした。精製した抗体Ｂｉ－０７４－０７６抗体を、勾配希釈し、その後ブロックしたＥＬＩＳＡプレートへ添加し、このプレートを、室温で２ｈインキュベーションし、ＰＢＳＴで３回洗浄し；精製した抗体試料ウェルへ、ヤギ抗－ヒトＦａｂ－ＨＲＰ(Abcam)を添加し、対照抗体試料ウェルへ、ヤギ抗－ヒトＦｃ－ＨＲＰ(Abcam)を添加し、このプレートを、室温で１ｈインキュベーションし、ＰＢＳＴで３回洗浄し、引き続きＥＬＩＳＡ呈色溶液を添加し、室温で３分間静置し、ＥＬＩＳＡ停止溶液を添加し、４５０ｎｍで吸光度値を測定した。
ヒトＶＥＧＦ(ACROBiosystems)タンパク質を、ＥＬＩＳＡコーティング溶液で希釈し、その後ＥＬＩＳＡプレートへ添加し、４℃で一晩コーティングした。コーティング溶液を廃棄し、２５０μＬのＰＢＳＴを、各ウェルへ添加し、３回洗浄し、且つこのＥＬＩＳＡプレートを、５％ＢＳＡにより、室温で１ｈブロックした。精製した抗体Ｂｉ－０７４－０７６抗体を、勾配希釈し、その後ブロックしたＥＬＩＳＡプレートへ添加し、このプレートを、室温で２ｈインキュベーションし、ＰＢＳＴで３回洗浄し；精製した抗体試料ウェルへ、ヤギ抗－ヒトＦａｂ－ＨＲＰ(Abcam)を添加し、対照抗体試料ウェルへ、ヤギ抗－ヒトＦｃ－ＨＲＰ(Abcam)を添加し、このプレートを、室温で１ｈインキュベーションし、ＰＢＳＴで３回洗浄し、引き続きＥＬＩＳＡ呈色溶液を添加し、室温で３分間静置し、ＥＬＩＳＡ停止溶液を添加し、４５０ｎｍで吸光度値を測定した。
【0162】
先に説明した方法によるアッセイ実験において、本発明の精製した抗体Ｂｉ－７４－７６は、ＥＬＩＳＡレベルで、ヒトＶＥＧＦタンパク質へ結合することができた（図１０参照）。
【0163】
要約すると、本抗体の結合活性は、１又は複数のナノボディドメインを連結する一方での、ＣＨ１－ＣＬ構造上のＶＨドメイン及びＶＬドメインを連結することにより、効果的に維持され、二重特異性又は多重特異性抗体を形成することができる。ベバシズマブ由来のこの実験において使用されたＶＨ－ＶＬ組合せは、血液中の遊離抗原ＶＥＧＦへ結合するドメインであった。
【0164】
実施例３：抗－ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体又は抗－ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２／ＴＩＧＩＴ／ヒト血清アルブミン四重特異性抗体
３．１ 抗－ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体又は抗－ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２／ＴＩＧＩＴ／ヒト血清アルブミン四重特異性抗体の構築
同じ細胞の異なる標的を標的化する２種のナノ－抗体に結合する場合に、Ｍ－ボディは、適用可能であるかどうか確認するために、本発明者らは、抗－ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体又は抗－ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２／ＴＩＧＩＴ／ヒト血清アルブミン四重特異性抗体の群を構築した。
３．１ 抗－ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体又は抗－ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２／ＴＩＧＩＴ／ヒト血清アルブミン四重特異性抗体の構築
同じ細胞の異なる標的を標的化する２種のナノ－抗体に結合する場合に、Ｍ－ボディは、適用可能であるかどうか確認するために、本発明者らは、抗－ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体又は抗－ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２／ＴＩＧＩＴ／ヒト血清アルブミン四重特異性抗体の群を構築した。
【0165】
この実施例において、３種の抗－ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体を構築し：
２本のポリペプチド鎖からなるＢｉ－７８－７９は、図１１Ａに示した概略構造を有し、ここでペプチド鎖＃１は、配列番号：１７に明記したアミノ酸配列を有し、これは抗－ＰＤ－Ｌ１ナノボディＣ－Ｙｅ－１８－５（配列番号：１４）を含み、このナノボディアミノ酸配列のＣ－末端は、ヒトＩｇＧ１由来のＣＨ１アミノ酸配列（配列番号：３）へ直接連結され；並びに、ペプチド鎖＃１は、抗－ヒト血清アルブミンナノボディＡＬＢ８（配列番号：５）のＣ－末端を、ＣＨ１領域のＣ－末端へ、１１個のアミノ酸残基（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ）の可動性ペプチド（配列番号：４）を介して連結することにより得られ；ペプチド鎖＃２は、配列番号：１８に明記したアミノ酸配列を有し、これは抗－ＰＤ－Ｌ２ナノボディＤ－Ｙｅ－２２アミノ酸配列（配列番号：１９）を含み、並びにペプチド鎖＃２は、このナノボディアミノ酸配列のＣ－末端を、ヒトκ軽鎖定常領域（ＣＬ）アミノ酸配列（配列番号：９）に直接連結することにより得られた。
２本のポリペプチド鎖からなるＢｉ－７８－７９は、図１１Ａに示した概略構造を有し、ここでペプチド鎖＃１は、配列番号：１７に明記したアミノ酸配列を有し、これは抗－ＰＤ－Ｌ１ナノボディＣ－Ｙｅ－１８－５（配列番号：１４）を含み、このナノボディアミノ酸配列のＣ－末端は、ヒトＩｇＧ１由来のＣＨ１アミノ酸配列（配列番号：３）へ直接連結され；並びに、ペプチド鎖＃１は、抗－ヒト血清アルブミンナノボディＡＬＢ８（配列番号：５）のＣ－末端を、ＣＨ１領域のＣ－末端へ、１１個のアミノ酸残基（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ）の可動性ペプチド（配列番号：４）を介して連結することにより得られ；ペプチド鎖＃２は、配列番号：１８に明記したアミノ酸配列を有し、これは抗－ＰＤ－Ｌ２ナノボディＤ－Ｙｅ－２２アミノ酸配列（配列番号：１９）を含み、並びにペプチド鎖＃２は、このナノボディアミノ酸配列のＣ－末端を、ヒトκ軽鎖定常領域（ＣＬ）アミノ酸配列（配列番号：９）に直接連結することにより得られた。
【0166】
２本のポリペプチド鎖からなるＢｉ－７８－８０は、図１Ａに示した概略構造を有し、ここでペプチド鎖＃１は、配列番号：２０に明記したアミノ酸配列を有し、これは抗－ＰＤ－Ｌ１ナノボディの配列番号：２を含み、このナノボディアミノ酸配列のＣ－末端は、ヒトＩｇＧ１由来のＣＨ１アミノ酸配列の配列番号：６へ直接連結され；これは、抗－ＰＤ－Ｌ１ナノボディＣ－Ｙｅ－１８－５（配列番号：１４）を含み、このナノボディアミノ酸配列のＣ－末端は、ヒトＩｇＧ１由来のＣＨ１アミノ酸配列（配列番号：３）へ直接連結され；並びに、ペプチド鎖＃１は、抗－ヒト血清アルブミンナノボディＡＬＢ８（配列番号：５）のＣ－末端を、ＣＨ１領域のＣ－末端へ、５個のアミノ酸残基（ＤＫＴＨＴ）の可動性ペプチド（配列番号：２１）を介して連結することにより得られ；ペプチド鎖＃２は、配列番号：１８に明記したアミノ酸配列を有した。
【0167】
２本のポリペプチド鎖からなるＢｉ－８１－８２は、図１Ａに示した概略構造を有し、ここで、ペプチド鎖＃１は、配列番号：２２に明記したアミノ酸配列を有し、これは抗－ＰＤ－Ｌ１ナノボディＣ－Ｙｅ－１８－５（配列番号：１４）を含み、このナノボディアミノ酸配列のＣ－末端は、ヒトＩｇＧ１由来のＣＨ１アミノ酸配列（配列番号：３）へ、１１個のアミノ酸鎖（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ）の可動性ペプチド（配列番号：４）を介して連結され；並びに、ペプチド鎖＃１は、抗－ヒト血清アルブミンナノボディＡＬＢ８（配列番号：５）のＣ－末端を、ＣＨ１領域のＣ－末端へ、１１個のアミノ酸残基（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ）の可動性ペプチド（配列番号：４）を介して連結することにより得られ；ペプチド鎖＃２は、配列番号：２３に明記したアミノ酸配列を有し、これは、抗－ＰＤ－Ｌ２ナノボディＤ－Ｙｅ－２２アミノ酸配列（配列番号：１９）を含み、且つペプチド鎖＃２は、このナノボディアミノ酸配列のＣ－末端を、ヒトκ軽鎖定常領域（ＣＬ）アミノ酸配列（配列番号：９）へ、１１個のアミノ酸（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ）の可動性ペプチド鎖（配列番号：４）を介して連結することにより得られた。
【0168】
この実施例において、Ｂｉ－７９－８３と指定され、図１Ａに示された概略構造を伴う、２本のポリペプチド鎖からなる１種の抗－ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２／ＴＩＧＩＴ／ヒト血清アルブミン四重特異性抗体が構築され、ここで、ペプチド鎖＃１は、配列番号：１７に明記したアミノ酸配列を有し；ペプチド鎖＃２は、配列番号：２４に明記したアミノ酸配列を有し、これは、抗－ＰＤ－Ｌ２ナノボディＤ－Ｙｅ－２２アミノ酸配列（配列番号：１９）を含み、このナノボディアミノ酸配列のＣ－末端で、ヒトκ軽鎖定常領域（ＣＬ）アミノ酸配列（配列番号：９）へ直接連結され；並びに、ペプチド鎖＃２は、抗－ＴＩＧＩＴナノボディＥ－Ｙｅ－１１のＮ－末端を、ＣＬ領域のＣ－末端へ、１１個のアミノ酸残基（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ）の可動性ペプチド（配列番号：４）を介して連結することにより得られた。
【0169】
３．２ ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体又は抗－ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２／ＴＩＧＩＴ／ヒト血清アルブミン四重特異性抗体の発現及び精製
この実施例において、実施例３．１において構築した抗－ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体Ｂｉ－７８－７９、Ｂｉ－７８－８０、及びＢｉ－８１－８２並びに抗－ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２／ＴＩＧＩＴ／ヒト血清アルブミン四重特異性抗体Ｂｉ－７９－８３の２本鎖をコードしているヌクレオチド配列を、市販の真核細胞発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１（＋）へ、マルチクローニングサイトを介してライゲーションし、並びに真核細胞において発現し及び精製した。発現プラスミド構築、タンパク質発現及び精製の方法は、実施例１．２と同じであった。
この実施例において、実施例３．１において構築した抗－ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体Ｂｉ－７８－７９、Ｂｉ－７８－８０、及びＢｉ－８１－８２並びに抗－ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２／ＴＩＧＩＴ／ヒト血清アルブミン四重特異性抗体Ｂｉ－７９－８３の２本鎖をコードしているヌクレオチド配列を、市販の真核細胞発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１（＋）へ、マルチクローニングサイトを介してライゲーションし、並びに真核細胞において発現し及び精製した。発現プラスミド構築、タンパク質発現及び精製の方法は、実施例１．２と同じであった。
【0170】
この試験は、ＳＥＣアッセイを用い、精製した生成物の純度を試験し、これは、実施例１．２と同じであった。実験結果は、４種全ての多重特性抗体は、比較的高い純度を有したことを示した（Ｂｉ－７８－７９：９８．０７％；Ｂｉ－７８－８０：９８．６２％；Ｂｉ－８１－８２：９６．３１％；Ｂｉ－７９－８３：９９．１４％）。
【0171】
３．３ 抗－ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体又は抗－ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２／ＴＩＧＩＴ／ヒト血清アルブミン四重特異性抗体の抗原結合能の決定
ヒトＰＤ－Ｌ１又はヒトＰＤ－Ｌ２又はヒトＴＩＧＩＴを過剰発現しているＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ１細胞、ＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ２細胞、ＣＨＯ－ｈＴＩＧＩＩＴ細胞）を、ｐＣＨＯ１．０ベクター(Invitrogenから購入)を、ＭＣＳへクローニングした、ヒトＰＤ－Ｌ１又はヒトＰＤ－Ｌ２又はヒトＴＩＧＩＴ ｃＤＮＡ(Nano Biologicalから購入)によるトランスフェクションにより、作製した。増幅したＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ１細胞／ＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ２細胞／ＣＨＯ－ｈＴＩＧＩＩＴ細胞を、細胞密度２×１０６個細胞／ｍｌに調節し、並びにこの細胞１００μＬを、９６－ウェルフロープレートの各ウェルへ添加し、引き続きその後の使用のために遠心分離した。精製した三重特異性抗体を、ＰＢＳによる３－倍連続希釈（４００ｎＭで出発し、合計１２の濃度）により希釈し、希釈した試料１００μＬを、細胞を含有する９６－ウェルフロープレートの各ウェルへ添加し、このプレートを、４℃で３０分間インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗浄した。精製した抗体試料ウェルの各ウェルへ、ＰＢＳで希釈したマウス抗－ヒトＩｇＧ－Ｆａｂ（ＰＥ）(Abcamから購入)１００μＬを添加し、及び対照抗体試料ウェルには、ＰＢＳで希釈したヤギＦ（ａｂ’）２抗－ヒトＩｇＧ－Ｆｃ（ＰＥ）(Abcamから購入)を添加し、このプレートを、４℃で３０分間インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗浄した。１ウェルにつき１００μＬのＰＢＳを添加し、細胞を再浮遊させ、これをＣｙｔｏＦｌｅｘフローサイトメーター(Bechman)上で検出し、対応するＭＦＩを算出した。
ヒトＰＤ－Ｌ１又はヒトＰＤ－Ｌ２又はヒトＴＩＧＩＴを過剰発現しているＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ１細胞、ＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ２細胞、ＣＨＯ－ｈＴＩＧＩＩＴ細胞）を、ｐＣＨＯ１．０ベクター(Invitrogenから購入)を、ＭＣＳへクローニングした、ヒトＰＤ－Ｌ１又はヒトＰＤ－Ｌ２又はヒトＴＩＧＩＴ ｃＤＮＡ(Nano Biologicalから購入)によるトランスフェクションにより、作製した。増幅したＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ１細胞／ＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ２細胞／ＣＨＯ－ｈＴＩＧＩＩＴ細胞を、細胞密度２×１０６個細胞／ｍｌに調節し、並びにこの細胞１００μＬを、９６－ウェルフロープレートの各ウェルへ添加し、引き続きその後の使用のために遠心分離した。精製した三重特異性抗体を、ＰＢＳによる３－倍連続希釈（４００ｎＭで出発し、合計１２の濃度）により希釈し、希釈した試料１００μＬを、細胞を含有する９６－ウェルフロープレートの各ウェルへ添加し、このプレートを、４℃で３０分間インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗浄した。精製した抗体試料ウェルの各ウェルへ、ＰＢＳで希釈したマウス抗－ヒトＩｇＧ－Ｆａｂ（ＰＥ）(Abcamから購入)１００μＬを添加し、及び対照抗体試料ウェルには、ＰＢＳで希釈したヤギＦ（ａｂ’）２抗－ヒトＩｇＧ－Ｆｃ（ＰＥ）(Abcamから購入)を添加し、このプレートを、４℃で３０分間インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗浄した。１ウェルにつき１００μＬのＰＢＳを添加し、細胞を再浮遊させ、これをＣｙｔｏＦｌｅｘフローサイトメーター(Bechman)上で検出し、対応するＭＦＩを算出した。
【0172】
先に説明した方法によるアッセイ実験において、図１２に示したように、結果は、本発明の精製した試料Ｂｉ－７８－７９、Ｂｉ－７８－８０及びＢｉ－８１－８２は、ＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ１細胞及びＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ２細胞の両方への結合活性を有し；本発明の精製した試料Ｂｉ－７９－８３は、ＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ１細胞、ＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ２細胞及びＣＨＯ－ｈＴＩＧＩＴ細胞の全てに対する結合活性を有したことを示した。
【0173】
３．４ ＥＬＩＳＡレベルでの抗－ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体又は抗－ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２／ＴＩＧＩＴ／ヒト血清アルブミン四重特異性抗体とヒト血清アルブミンの結合の決定
抗－ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体又は抗－ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２／ＴＩＧＩＴ／ヒト血清アルブミン四重特異性抗体とヒト血清アルブミンの結合能を、この実験においてＥＬＩＳＡ反応の方法により検出し、実験方法は、実施例１．３の方法と同じであった。
抗－ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体又は抗－ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２／ＴＩＧＩＴ／ヒト血清アルブミン四重特異性抗体とヒト血清アルブミンの結合能を、この実験においてＥＬＩＳＡ反応の方法により検出し、実験方法は、実施例１．３の方法と同じであった。
【0174】
先に説明した方法によるアッセイ実験において、図１３に示したように、実験結果は、本発明の抗－ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体又は抗－ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２／ＴＩＧＩＴ／ヒト血清アルブミン四重特異性抗体は全て、ＥＬＩＳＡレベルで、ヒト血清アルブミンへ結合することができることを示した。
【0175】
３．５ 抗－ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体又は抗－ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２／ＴＩＧＩＴ／ヒト血清アルブミン四重特異性抗体の決定によるヒトＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２のＰＤ－１への結合活性のブロック
ＣＨＯ－ｈＰＤ－１細胞を、細胞密度２×１０６個細胞／ｍＬに調節し、１００μＬの細胞を、９６－ウェルフロープレートの各ウェルに添加し、引き続きその後の使用のために遠心分離した。精製した抗体Ｂｉ－７８－７９、Ｂｉ－７８－８０、Ｂｉ－８１－８２、及びＢｉ－７９－８３並びに対照抗体の試料を、ＰＢＳによる３－倍連続希釈（４００ｎＭで出発し、合計１２の濃度）により希釈し、希釈した試料６０μＬを、９６－ウェル試料希釈プレートの各ウェルに添加する一方で、６０μＬのビオチン化－標識したヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質又はビオチン化－標識したヒトＰＤ－Ｌ２タンパク質(ACROBiosystemsから購入)を、各ウェルへ、最終濃度５００ｎｇ／ｍｌで添加し、この混合物を、試料と共に、４℃で３０分間インキュベーションした。１００μＬの同時－インキュベーションした試料を、細胞を含有する先の９６－ウェルフロープレートの各ウェルに添加し、このプレートを、４℃で３０分間インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗浄した。ＰＢＳで１００－倍希釈した１００μＬのストレプトアビジン、Ｒ－フィトエリスリン複合体(Thermo fisherから購入)を、各ウェルへ添加し、プレートを、４℃で３０分間インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗浄した。１ウェルにつき１００μＬのＰＢＳを添加し、細胞を再浮遊させ、これをＣｙｔｏＦｌｅｘフローサイトメーター(Bechman)上で検出し、対応するＭＦＩを算出した。
ＣＨＯ－ｈＰＤ－１細胞を、細胞密度２×１０６個細胞／ｍＬに調節し、１００μＬの細胞を、９６－ウェルフロープレートの各ウェルに添加し、引き続きその後の使用のために遠心分離した。精製した抗体Ｂｉ－７８－７９、Ｂｉ－７８－８０、Ｂｉ－８１－８２、及びＢｉ－７９－８３並びに対照抗体の試料を、ＰＢＳによる３－倍連続希釈（４００ｎＭで出発し、合計１２の濃度）により希釈し、希釈した試料６０μＬを、９６－ウェル試料希釈プレートの各ウェルに添加する一方で、６０μＬのビオチン化－標識したヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質又はビオチン化－標識したヒトＰＤ－Ｌ２タンパク質(ACROBiosystemsから購入)を、各ウェルへ、最終濃度５００ｎｇ／ｍｌで添加し、この混合物を、試料と共に、４℃で３０分間インキュベーションした。１００μＬの同時－インキュベーションした試料を、細胞を含有する先の９６－ウェルフロープレートの各ウェルに添加し、このプレートを、４℃で３０分間インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗浄した。ＰＢＳで１００－倍希釈した１００μＬのストレプトアビジン、Ｒ－フィトエリスリン複合体(Thermo fisherから購入)を、各ウェルへ添加し、プレートを、４℃で３０分間インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗浄した。１ウェルにつき１００μＬのＰＢＳを添加し、細胞を再浮遊させ、これをＣｙｔｏＦｌｅｘフローサイトメーター(Bechman)上で検出し、対応するＭＦＩを算出した。
【0176】
先に説明した方法によるアッセイ実験において、図１４に示したように、実験結果は、抗－ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体又は抗－ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２／ＴＩＧＩＴ／ヒト血清アルブミン四重特異性抗体は全て、ヒトＰＤ－Ｌ１及びヒトＰＤ－Ｌ２の細胞表面上のヒトＰＤ－１への結合をブロックすることができることを示した。
【0177】
３．６ 抗－ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体又は抗－ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２／ＴＩＧＩＴ／ヒト血清アルブミン四重特異性抗体によるＰＤＬ１／ＰＤＬ２／ＰＤ１／ｌｕｃシグナル伝達経路をブロックする実験
ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２は、腫瘍細胞又は免疫細胞上で同時－発現されることができ、並びに精製された抗体Ｂｉ－７８－７９、Ｂｉ－７８－８０、Ｂｉ－８１－８２、及びＢｉ－７９－８３のＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１経路及びＰＤ－Ｌ２／ＰＤ－１経路に対する同時ブロック作用は、ヒトＰＤ－Ｌ１及びヒトＰＤ－Ｌ２を同時－発現しているＣＨＯ細胞並びにヒトＰＤ－１を過剰発現し且つＮＦＡＴ－ルシフェラーゼレポーター遺伝子を含むＪｕｒｋａｔ細胞を、同時－インキュベーションする方法により検出され、具体的手順は、以下のようであった。
ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２は、腫瘍細胞又は免疫細胞上で同時－発現されることができ、並びに精製された抗体Ｂｉ－７８－７９、Ｂｉ－７８－８０、Ｂｉ－８１－８２、及びＢｉ－７９－８３のＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１経路及びＰＤ－Ｌ２／ＰＤ－１経路に対する同時ブロック作用は、ヒトＰＤ－Ｌ１及びヒトＰＤ－Ｌ２を同時－発現しているＣＨＯ細胞並びにヒトＰＤ－１を過剰発現し且つＮＦＡＴ－ルシフェラーゼレポーター遺伝子を含むＪｕｒｋａｔ細胞を、同時－インキュベーションする方法により検出され、具体的手順は、以下のようであった。
【0178】
ヒトＰＤ－Ｌ１及びヒトＰＤ－Ｌ２を同時－発現している機能性細胞（ＣＨＯ－Ｋ１－ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２）を、密度５×１０５個細胞／ｍｌに調節し、１００μＬの細胞を、９６－ウェル細胞培養白色底プレートの各ウェルに播種し、５％ＣＯ２のインキュベーター内で、３７℃で一晩培養した。精製した抗体及び対照抗体１６４０を、完全培地中に、その後の使用のために、勾配希釈した。ヒトＰＤ－１を過剰発現し且つＮＦＡＴ－ルシフェラーゼレポーター遺伝子を含むＪｕｒｋａｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ－ＰＤ－１－ＮＦＡＴ）を、１６４０完全培地により、その後の使用のために、細胞密度２．５×１０５個細胞／ｍＬに調節した。白色底プレートを取りだし、培養物上清をピペッティングし、希釈した試料４０μＬを添加し、白色底プレートへ、１個のウェルにつき添加し、Ｊｕｒｋａｔ－ＰＤ－１－ＮＦＡＴエフェクター細胞浮遊液４０μＬを同時に添加し、並びにこの白色底プレートを、接着培養のために６ｈ、５％ＣＯ２のインキュベーター内に、３７℃で配置した。Ｂｉｏ－Ｇｌｏ（商標）試薬(Promega)を、各ウェルへ添加し、蛍光シグナルを、多機能マイクロプレートリーダーを使用し測定した。
【0179】
先に説明した方法によるアッセイ実験において、図１５に示したように、実験結果は、抗－ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体又は抗－ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２／ＴＩＧＩＴ／ヒト血清アルブミン四重特異性抗体は、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ２／ＰＤ－１シグナル伝達経路を、インビトロにおいて同時にブロックすることができ、且つこのブロック作用は、抗－ＰＤ－１モノクローナル抗体ペムブロリズマブの作用に類似していることを示した。
【0180】
要約すると、親抗体の結合活性は、２種の異なるナノボディドメインの、ＣＨ１－ＣＬ構造のＮ－末端への連結により、及び三重特異性抗体を形成するための、１種のナノボディドメインの、ＣＨ１のＣ－末端への連結によるか、あるいは、四重特異性抗体を形成するための、２種の異なるナノボディドメインの、ＣＨ１－ＣＬ構造のＣ－末端への連結により、効果的に維持することができる。このナノボディは、ＣＨ１又はＣＬのＮ－末端へ、可動性ペプチド鎖を介して又は直接連結することにより、抗原結合能を維持することができる。このナノボディは、ＣＨ１のＣ－末端へ、１１個のアミノ酸（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ）の可動性ペプチド鎖又は５個のアミノ酸（ＤＫＴＨＴ）の短いペプチド鎖を介して連結することにより、抗原結合能を維持することができる。
【0181】
この実施例において、抗－ＰＤ－Ｌ１及び抗－ＰＤ－Ｌ２ナノボディの組合せが、同じ細胞上の２種の抗原に結合するために使用され、且つこれらの結果は、全ての多重特異性抗体は、ＰＤ－Ｌ１をＰＤ－Ｌ２へ同時に結合し、且つＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２のＰＤ－１への結合をブロックし、下流のシグナル伝達経路を活性化することを指摘した。
【0182】
実施例４：抗－ＰＤ－Ｌ１／４１ＢＢ／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体
４．１ 抗－ＰＤ－Ｌ１／４１ＢＢ／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体の構築
Ｍ－ボディが、異なる細胞上に位置した異なる標的を標的化する２種のナノ－抗体を連結するために適用可能であるかどうかを確認するために、本発明者らは、Ｂｉ－７９－８６と指定される抗－ＰＤ－Ｌ１／４１ＢＢ／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体を構築し、これは図１６に示されたような概略構造である、２種の異なるポリペプチドを含む。ペプチド鎖＃１は、配列番号：１７に明記したアミノ酸配列を有した。ペプチド鎖＃２は、配列番号：２５に明記したアミノ酸配列を有し、これは抗－４１ＢＢナノボディアミノ酸配列（配列番号：２６、特許番号）を含み、及びペプチド鎖＃２は、このナノボディアミノ酸配列のＣ－末端を、ヒトκ軽鎖定常領域（ＣＬ）アミノ酸配列の配列番号：９へ直接連結することにより得た。
４．１ 抗－ＰＤ－Ｌ１／４１ＢＢ／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体の構築
Ｍ－ボディが、異なる細胞上に位置した異なる標的を標的化する２種のナノ－抗体を連結するために適用可能であるかどうかを確認するために、本発明者らは、Ｂｉ－７９－８６と指定される抗－ＰＤ－Ｌ１／４１ＢＢ／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体を構築し、これは図１６に示されたような概略構造である、２種の異なるポリペプチドを含む。ペプチド鎖＃１は、配列番号：１７に明記したアミノ酸配列を有した。ペプチド鎖＃２は、配列番号：２５に明記したアミノ酸配列を有し、これは抗－４１ＢＢナノボディアミノ酸配列（配列番号：２６、特許番号）を含み、及びペプチド鎖＃２は、このナノボディアミノ酸配列のＣ－末端を、ヒトκ軽鎖定常領域（ＣＬ）アミノ酸配列の配列番号：９へ直接連結することにより得た。
【0183】
４．２ 抗－ＰＤ－Ｌ１／４１ＢＢ／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体の発現及び精製
この実施例において、実施例４．１において構築した抗－ＰＤ－Ｌ１／４１ＢＢ／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体Ｂｉ－７９－８６の２本鎖をコードしているヌクレオチド配列を、市販の真核細胞発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１（＋）へ、マルチクローニングサイトを介して全てライゲーションし、並びに真核細胞において発現し及び精製した。発現プラスミド構築、並びにタンパク質発現及び精製の方法は、実施例１．２と同じであった。
この実施例において、実施例４．１において構築した抗－ＰＤ－Ｌ１／４１ＢＢ／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体Ｂｉ－７９－８６の２本鎖をコードしているヌクレオチド配列を、市販の真核細胞発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１（＋）へ、マルチクローニングサイトを介して全てライゲーションし、並びに真核細胞において発現し及び精製した。発現プラスミド構築、並びにタンパク質発現及び精製の方法は、実施例１．２と同じであった。
【0184】
この試験は、ＳＥＣアッセイを用い、精製した生成物の純度を試験し、これは実施例１．２と同じであった。実験結果は、本研究において得られた抗－ＰＤ－Ｌ１／４１ＢＢ／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体は、純度９５．０８％であることを示した。
【0185】
４．３ 抗－ＰＤ－Ｌ１／４１ＢＢ／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体の抗原結合能の決定
ヒトＰＤ－Ｌ１又はヒト４１ＢＢを過剰発現するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ１細胞、ＣＨＯ－４１ＢＢ細胞）を、ｐＣＨＯ１．０ベクター(Invitrogenから購入)の、ＭＣＳへクローニングした、ヒトＰＤ－Ｌ１又はヒト４１ＢＢ ｃＤＮＡ(Nano Biologicalから購入)によるトランスフェクションにより、作製した。増幅したＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ１／ＣＨＯ－４１ＢＢ細胞を、細胞密度２×１０６個細胞／ｍｌに調節し、並びにこの細胞１００μＬを、９６－ウェルフロープレートの各ウェルへ添加し、引き続きその後の使用のために遠心分離した。精製した三重特異性抗体を、ＰＢＳによる３－倍連続希釈（４００ｎＭで出発し、合計１２の濃度）により希釈し、希釈した試料１００μＬを、細胞を含有する９６－ウェルフロープレートの各ウェルへ添加し、このプレートを、４℃で３０分間インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗浄した。精製した抗体試料ウェルの各ウェルへ、ＰＢＳで希釈したマウス抗－ヒトＩｇＧ－Ｆａｂ（ＰＥ）(Abcamから購入)１００μＬを、対照抗体試料ウェルへ、ＰＢＳで希釈したヤギＦ（ａｂ’）２抗－ヒトＩｇＧ－Ｆｃ（ＰＥ）(Abcamから購入)を添加し、このプレートを、４℃で３０分間インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗浄した。１ウェルにつき１００μＬのＰＢＳを添加し、細胞を再浮遊させ、これをＣｙｔｏＦｌｅｘフローサイトメーター(Bechman)上で検出し、対応するＭＦＩを算出した。
ヒトＰＤ－Ｌ１又はヒト４１ＢＢを過剰発現するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ１細胞、ＣＨＯ－４１ＢＢ細胞）を、ｐＣＨＯ１．０ベクター(Invitrogenから購入)の、ＭＣＳへクローニングした、ヒトＰＤ－Ｌ１又はヒト４１ＢＢ ｃＤＮＡ(Nano Biologicalから購入)によるトランスフェクションにより、作製した。増幅したＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ１／ＣＨＯ－４１ＢＢ細胞を、細胞密度２×１０６個細胞／ｍｌに調節し、並びにこの細胞１００μＬを、９６－ウェルフロープレートの各ウェルへ添加し、引き続きその後の使用のために遠心分離した。精製した三重特異性抗体を、ＰＢＳによる３－倍連続希釈（４００ｎＭで出発し、合計１２の濃度）により希釈し、希釈した試料１００μＬを、細胞を含有する９６－ウェルフロープレートの各ウェルへ添加し、このプレートを、４℃で３０分間インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗浄した。精製した抗体試料ウェルの各ウェルへ、ＰＢＳで希釈したマウス抗－ヒトＩｇＧ－Ｆａｂ（ＰＥ）(Abcamから購入)１００μＬを、対照抗体試料ウェルへ、ＰＢＳで希釈したヤギＦ（ａｂ’）２抗－ヒトＩｇＧ－Ｆｃ（ＰＥ）(Abcamから購入)を添加し、このプレートを、４℃で３０分間インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗浄した。１ウェルにつき１００μＬのＰＢＳを添加し、細胞を再浮遊させ、これをＣｙｔｏＦｌｅｘフローサイトメーター(Bechman)上で検出し、対応するＭＦＩを算出した。
【0186】
先に説明した方法によるアッセイ実験において、図１７に示したように、結果は、本発明の抗－ＰＤ－Ｌ１／４１ＢＢ／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体Ｂｉ－７９－８６は、ＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ１細胞及びＣＨＯ－４１ＢＢ細胞の両方への結合活性を有したことを示した。
【0187】
４．４ ＥＬＩＳＡレベルでの抗－ＰＤ－Ｌ１／４１ＢＢ／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体のヒト血清アルブミンへの結合の決定
この実験において、抗－ＰＤ－Ｌ１／４１ＢＢ／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体Ｂｉ－７９－８６のヒト血清アルブミンへの結合能を、ＥＬＩＳＡ反応の方法により検出し、且つこの実験方法は、実施例１．３における方法と同じであった。
この実験において、抗－ＰＤ－Ｌ１／４１ＢＢ／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体Ｂｉ－７９－８６のヒト血清アルブミンへの結合能を、ＥＬＩＳＡ反応の方法により検出し、且つこの実験方法は、実施例１．３における方法と同じであった。
【0188】
先に説明した方法によるアッセイ実験において、結果は図１８に示し、並びに本発明の抗－ＰＤ－Ｌ１／４１ＢＢ／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体は、ＥＬＩＳＡレベルで、ヒト血清アルブミンへ結合することができる。
【0189】
４．５ 抗－ＰＤ－Ｌ１／４１ＢＢ／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体のＰＤ－Ｌ１／４１ＢＢを発現している細胞へ架橋する能力の決定
ヒトＰＤ－Ｌ１及びヒト４１ＢＢを、各々、腫瘍細胞及び免疫細胞の表面上に発現させ、並びに細胞架橋実験は、三重特異性抗体Ｂｉ－７９－８６の、ヒトＰＤ－Ｌ１を過剰発現している細胞（ＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ１）及びヒト４１ＢＢを過剰発現している細胞（ＣＨＯ－ｈ４１ＢＢ）へ同時に結合することにより、２種の細胞をより近くに引き寄せる能力を証明し、具体的手順は、以下のようであった。
ヒトＰＤ－Ｌ１及びヒト４１ＢＢを、各々、腫瘍細胞及び免疫細胞の表面上に発現させ、並びに細胞架橋実験は、三重特異性抗体Ｂｉ－７９－８６の、ヒトＰＤ－Ｌ１を過剰発現している細胞（ＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ１）及びヒト４１ＢＢを過剰発現している細胞（ＣＨＯ－ｈ４１ＢＢ）へ同時に結合することにより、２種の細胞をより近くに引き寄せる能力を証明し、具体的手順は、以下のようであった。
【0190】
２×１０７個のＣＨＯ－ｈＰＤＬ１細胞及びＣＨＯ－ｈ４１ＢＢ細胞を、各々、採取し、遠心分離し、CellTrace(商標)CFSE及びCellTracer(商標)Violet BMQC色素である２種の色素により再浮遊させ、暗所において３７℃で１２分間インキュベーションし；Ｂｉ－０７９－Ａｓａ ０８６、Ａ－Ｎａ－１９、ａｌｐｈａ ＨＳＡ(Ablynx benchmark)を、ＰＢＳによる２－倍連続希釈（４００ｎＭで出発し、合計１２の濃度）により希釈した。ＣＨＯ－ｈＰＤＬ１細胞及びＣＨＯ－ｈ４１ＢＢ細胞を、遠心分離し、その後ＰＢＳで再浮遊させ、細胞比１：１で混合した。この混合物１００μＬ／ウェルを、９６－ウェルプレートへ添加し、上清を遠心分離により廃棄した。ヒト血清アルブミンを、ＰＢＳにより２μｇ／ｍＬに希釈し、その後１ウェルにつき５０μＬで細胞プレートへ添加し、先に調製した抗体５０μＬ／ウェルを添加した。この混合物を混ぜ合わせ、暗所において３７℃で２ｈインキュベーションし、ＣｙｔｏＦｌｅｘフローサイトメーター(Bechman)上で検出した。
【0191】
先に説明した方法によるアッセイ実験において、図１９に示したように、実験結果は、本発明の抗－ＰＤ－Ｌ１／４１ＢＢ／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体Ｂｉ－７９－８６は、システムが高濃度のヒト血清アルブミンを含む条件下で、ＣＨＯ－ｈＰＤＬ１細胞及びＣＨＯ－ｈ４１ＢＢ細胞を近くに引き寄せることができることを示し、このことは、Ｂｉ－７９－８６は、異なる細胞表面上に発現された異なる抗原に同時に結合することができ、且つその結合活性は、そのシステム中のヒト血清アルブミンにより影響を受けないことを証明した。
【0192】
４．６ 抗－ＰＤ－Ｌ１／４１ＢＢ／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体によるヒトＰＤ－Ｌ１のヒトＰＤ－１への結合のブロック
精製された抗－ＰＤ－Ｌ１／４１ＢＢ／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体Ｂｉ－７９－８６により、ＰＤ－Ｌ１タンパク質のＰＤ－１細胞への結合活性をブロックすることを検出する方法は、実施例１．６の方法と同じであった。先に説明した方法によるアッセイ実験において、図２０に示したように、実験結果は、抗－ＰＤ－Ｌ１／４１ＢＢ／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体Ｂｉ－７９－８６分子は、ＰＤ－Ｌ１タンパク質のＰＤ－１細胞への結合をブロックすることができることを示した。
精製された抗－ＰＤ－Ｌ１／４１ＢＢ／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体Ｂｉ－７９－８６により、ＰＤ－Ｌ１タンパク質のＰＤ－１細胞への結合活性をブロックすることを検出する方法は、実施例１．６の方法と同じであった。先に説明した方法によるアッセイ実験において、図２０に示したように、実験結果は、抗－ＰＤ－Ｌ１／４１ＢＢ／ヒト血清アルブミン三重特異性抗体Ｂｉ－７９－８６分子は、ＰＤ－Ｌ１タンパク質のＰＤ－１細胞への結合をブロックすることができることを示した。
【0193】
要約すると、親抗体の結合活性は、２種の異なるナノボディドメインの、ＣＨ１－ＣＬ構造のＮ－末端への連結により、及び三重特異性抗体を形成するための、１種のナノボディドメインの、ＣＨ１のＣ－末端への連結により、効果的に維持することができる。この実施例において、抗－ＰＤ－Ｌ１及び抗－４１ＢＢナノボディの組合せを、異なる細胞上の２種の抗原に結合するために使用し、この結果は、本発明の三重特異性抗体構造は、細胞レベルでＰＤ－Ｌ１及び４１ＢＢへ同時に結合し、且つ各々、ＰＤ－Ｌ１及び４１ＢＢを発現している細胞に架橋することができ、並びにこの結合及び架橋の活性は、そのシステム中のヒト血清アルブミンにより左右されないことを指摘した。
【0194】
実施例５：抗－ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２二重特異性抗体Ｆｃ融合タンパク質
５．１ 抗－ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２二重特異性抗体Ｆｃ融合タンパク質の構築
本抗体のＦｃドメインは、薬物の物理的半減期を延長するために、ＦｃＲｎへ結合することができ；このＦｃドメインは、他のＦｃ受容体へ結合し、ＡＤＣＣ／ＣＤＣなどの下流反応を引きおこすことができ；Ｆｃドメインは、プロテインＡに特異的に結合することができ、これはタンパク質精製を促進することができる。
５．１ 抗－ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２二重特異性抗体Ｆｃ融合タンパク質の構築
本抗体のＦｃドメインは、薬物の物理的半減期を延長するために、ＦｃＲｎへ結合することができ；このＦｃドメインは、他のＦｃ受容体へ結合し、ＡＤＣＣ／ＣＤＣなどの下流反応を引きおこすことができ；Ｆｃドメインは、プロテインＡに特異的に結合することができ、これはタンパク質精製を促進することができる。
【0195】
Ｍ－ボディ技術を、Ｆｃと融合する場合において適用できるかどうかを確認するために、本発明者らは、Ｂｉ－２０３－２０４と指定される、抗－ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２二重特異性抗体を構築し、これは、図２１に示した概略構造を伴う、２種の異なるポリペプチドを含んだ。ここで、ペプチド鎖＃１は、配列番号：２７に明記したアミノ酸配列を有し、これは、抗－ＰＤ－Ｌ１ナノボディの配列番号：２８を含み、ナノボディアミノ酸配列のＣ－末端は、ヒトＩｇＧ１由来の配列番号：３に明記したＣＨ１アミノ酸配列へ直接連結され；並びに、ペプチド鎖＃１は、ヒトＩｇＧ１（ＬＡＬＡ変異型）Ｆｃ（配列番号：２９）ドメインを、ＣＨ１領域のＣ－末端へ直接連結することにより得られ；ペプチド鎖＃２は、配列番号：３０に明記したアミノ酸配列を有し、これは、抗－ＰＤ－Ｌ２ナノボディＨＺ－Ｄ－ＮＡ－９６－０１アミノ酸配列の配列番号：３１を有し、且つペプチド鎖＃２は、このアミノ酸配列のＣ－末端を、ヒトκ軽鎖定常領域（ＣＬ）へ直接連結することにより得た。
【0196】
５．２ 抗－ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２二重特異性抗体Ｆｃ融合タンパク質の発現及び精製
この実施例において、実施例５．１において構築された抗－ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２二重特異性抗体Ｂｉ－２０３－２０４の２本鎖の各々をコードしているヌクレオチド配列を、市販の真核細胞発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１（＋）へ、マルチクローニングサイトを介してライゲーションし、並びに真核細胞において発現し及び精製し、二重特異性抗体Ｂｉ－２０３－２０４を得、具体的手順は、以下のようであった。
この実施例において、実施例５．１において構築された抗－ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２二重特異性抗体Ｂｉ－２０３－２０４の２本鎖の各々をコードしているヌクレオチド配列を、市販の真核細胞発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１（＋）へ、マルチクローニングサイトを介してライゲーションし、並びに真核細胞において発現し及び精製し、二重特異性抗体Ｂｉ－２０３－２０４を得、具体的手順は、以下のようであった。
【0197】
このプラスミドを、Ｅｘｐｉｃ(商標)発現系キット(Thermoから購入)を用い、製品の使用説明書に記載されたトランスフェクション方法に従い、Ｅｘｐｉ－ＣＨＯ細胞へ導入した。５日間の細胞培養後、上清を収集し、標的タンパク質を、プロテインＡ磁気ビーズ(GenScriptから購入)選別法により精製した。磁気ビーズを、好適な容積の結合緩衝液（ＰＢＳ＋０．１％ツイーン２０、ｐＨ７．４）（ビーズ容積の１～４倍）中に再浮遊させ、その後精製されるべき試料に添加し、この混合物を、穏やかに振動させながら、室温で１ｈインキュベーションした。この試料を、磁気スタンド(Beaverから購入)上に配置し、上清を廃棄し、ビーズを、結合緩衝液により３回洗浄した。溶出緩衝液（０．１Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．２）を、磁気ビーズの３～５倍の容積で添加し、室温で、５～１０分間振盪させた。試料を、磁気スタンド上に配置し、溶出緩衝液を収集し、中和緩衝液（１Ｍトリス、ｐＨ８．５４）を添加した収集パイプに移し、この混合物を混ぜ合わせた。
【0198】
このタンパク質の純度は、ＨＰＬＣにより決定した。ＨＰＬＣ法は、以下のようであった：移動相：１５０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、ｐＨ７．０。クロマトグラフィー条件は、以下のようであった：検出波長：２８０ｎｍ、カラム温度：２５℃、流量：０．３５ｍｌ／分、検出時間：２０分間、Ｚｅｎｉｘ－Ｃ ＳＥＣ－３００カラム（ＳＥＰＡＸ ４．６×３００ｍｍ、３μｍ）。
【0199】
実験結果は、抗－ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２二重特異性抗体Ｆｃ融合タンパク質Ｂｉ－２０３－２０４は、比較的良い純度（＞９９％）を有し、且つＢｉ－２０３－２０４の精製した分子は、４種のペプチド鎖を含み、精製により得られたタンパク質分子のサイズに従い、正確に対を形成したことを示した。
【0200】
５．３ 抗－ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２二重特異性抗体Ｆｃ融合タンパク質の抗原結合能の決定
増幅したＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ１細胞／ＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ２細胞を、細胞密度２×１０６個細胞／ｍｌに調節し、並びにこの細胞１００μＬを、９６－ウェルフロープレートの各ウェルへ添加し、引き続きその後の使用のために遠心分離した。精製した二重特異性抗体を、ＰＢＳによる３－倍連続希釈（４００ｎＭで出発し、合計１２の濃度）により希釈し、希釈した試料１００μＬを、細胞を含有する９６－ウェルフロープレートの各ウェルへ添加し、このプレートを、４℃で３０分間インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗浄した。精製した抗体試料ウェルの各ウェルへ、ＰＢＳで希釈したヤギＦ（ａｂ’）２抗－ヒトＩｇＧ－Ｆｃ（ＰＥ）(Abcamから購入)１００μＬを添加し、このプレートを、４℃で３０分間インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗浄した。１ウェルにつき１００μＬのＰＢＳを添加し、細胞を再浮遊させ、これをＣｙｔｏＦｌｅｘフローサイトメーター(Bechman)上で検出し、対応するＭＦＩを算出した。
増幅したＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ１細胞／ＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ２細胞を、細胞密度２×１０６個細胞／ｍｌに調節し、並びにこの細胞１００μＬを、９６－ウェルフロープレートの各ウェルへ添加し、引き続きその後の使用のために遠心分離した。精製した二重特異性抗体を、ＰＢＳによる３－倍連続希釈（４００ｎＭで出発し、合計１２の濃度）により希釈し、希釈した試料１００μＬを、細胞を含有する９６－ウェルフロープレートの各ウェルへ添加し、このプレートを、４℃で３０分間インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗浄した。精製した抗体試料ウェルの各ウェルへ、ＰＢＳで希釈したヤギＦ（ａｂ’）２抗－ヒトＩｇＧ－Ｆｃ（ＰＥ）(Abcamから購入)１００μＬを添加し、このプレートを、４℃で３０分間インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗浄した。１ウェルにつき１００μＬのＰＢＳを添加し、細胞を再浮遊させ、これをＣｙｔｏＦｌｅｘフローサイトメーター(Bechman)上で検出し、対応するＭＦＩを算出した。
【0201】
先に説明した方法によるアッセイ実験において、図２２に示したように、結果は、本発明の抗－ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２二重特異性抗体Ｆｃ融合タンパク質Ｂｉ－２０３－２０４は、ＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ１細胞及びＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ２細胞の両方に対し結合活性を有することを示した。
【0202】
要約すると、親抗体の結合活性は、２種の異なるナノボディドメインの、ＣＨ１－ＣＬ構造のＮ－末端での連結により、及び二重特異性の特異的抗体Ｆｃ融合タンパク質を形成するための、ヒト抗体ＦｃドメインのＣＨ１のＣ－末端での連結により、効果的に維持されることとができる。同時に、Ｆｃドメインは、この抗体の精製及び安定した四量体構造の形成を促進することができる。
【0203】
本出願において言及された全ての文献は、各々が個別に引用により組み込まれているように、引用により本出願中に組み込まれている。更に、本発明の様々な変更又は修飾は、先の本発明の教示を分かった後、当業者により行われることができ、並びにこれらの同等物もまた、本出願の添付された請求の範囲内に収まることは理解されるべきである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【配列表】
【国際調査報告】