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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-05-11
(54)【発明の名称】疾患の処置のためのアンチセンスオリゴマー
(51)【国際特許分類】
C12N 15/113 20100101AFI20230501BHJP
C12N 15/57 20060101ALI20230501BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20230501BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20230501BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20230501BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20230501BHJP
A61P 9/12 20060101ALI20230501BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20230501BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230501BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230501BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20230501BHJP
【ＦＩ】
C12N15/113 130Z
C12N15/57 ZNA
A61P31/14
A61P11/00
A61P13/12
A61P9/00
A61P9/12
A61P3/10
A61P43/00 111
A61K48/00
A61K31/7088
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022554199
(86)(22)【出願日】2021-03-22
(85)【翻訳文提出日】2022-10-26
(86)【国際出願番号】 AU2021050261
(87)【国際公開番号】W WO2021189104
(87)【国際公開日】2021-09-30
(31)【優先権主張番号】2020900883
(32)【優先日】2020-03-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】AU
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】594202523
【氏名又は名称】モナシュ ユニバーシティ
(71)【出願人】
【識別番号】507192415
【氏名又は名称】マードック ユニバーシティ
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】ウィルトン， スティーブン
(72)【発明者】
【氏名】アン－トゥ， メイ
(72)【発明者】
【氏名】トーマス， マーリン クリストファー
(72)【発明者】
【氏名】ピカリング， レリーン ジェーン
【テーマコード（参考）】
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C084AA13
4C084MA52
4C084MA55
4C084MA56
4C084MA58
4C084MA59
4C084MA63
4C084MA65
4C084MA66
4C084NA14
4C084ZA361
4C084ZA362
4C084ZA421
4C084ZA422
4C084ZA591
4C084ZA592
4C084ZB331
4C084ZB332
4C084ZC351
4C084ZC352
4C084ZC411
4C084ZC412
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA36
4C086ZA42
4C086ZA59
4C086ZA81
4C086ZB33
4C086ZC35
4C086ZC41
(57)【要約】
アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）におけるプレｍＲＮＡのスプライシングを修飾して、ＡＣＥ２遺伝子転写物またはその一部のスプライシングをモジュレートするための単離または精製されたアンチセンスオリゴマーであって、修飾された主鎖構造およびこのようなアンチセンスオリゴマーに対して少なくとも７５％の配列同一性を有し、かつ修飾された主鎖構造を有する配列を有する、アンチセンスオリゴマーが提供される。このアンチセンスオリゴマーは、スプライススイッチングアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）と称され得る。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）におけるプレｍＲＮＡのスプライシングを修飾して、ＡＣＥ２遺伝子転写物またはその一部のスプライシングをモジュレートするための単離または精製されたアンチセンスオリゴマーであって、修飾された主鎖構造およびこのようなアンチセンスオリゴマーに対して少なくとも７５％の配列同一性を有し、かつ修飾された主鎖構造を有する配列を有する、アンチセンスオリゴマー。
【請求項2】
ａ）配列番号１～３１；および／またはｂ）配列番号５、６、９もしくは１１；および／または
ｃ）表３
を含むリストから選択される、請求項１に記載のアンチセンスオリゴマー。
【請求項3】
（ｉ）修飾された糖部分；（ｉｉ）ＲＮａｓｅ Ｈに対する抵抗性；および／または（ｉｉｉ）オリゴマー模倣化学を含むリストから選択される代替化学または修飾を受ける１つまたは複数のヌクレオチド位置を含有する、請求項１に記載のアンチセンスオリゴマー。
【請求項4】
（ｉ）部分への化学的コンジュゲーション；および／または（ｉｉ）細胞透過性ペプチドによるタグ付けによってさらに修飾されている、請求項１に記載のアンチセンスオリゴマー。
【請求項5】
前記アンチセンスオリゴマー中にウラシルが存在する場合、前記アンチセンスオリゴマーの前記ウラシル（Ｕ）が、チミン（Ｔ）によって置き換えられている、請求項１に記載のアンチセンスオリゴマー。
【請求項6】
プレｍＲＮＡスプライシングの前記修飾が、前記ＡＣＥ２プレｍＲＮＡの１つまたは複数のエクソン配列のスキッピングをもたらす、請求項１に記載のアンチセンスオリゴマー。
【請求項7】
対象におけるＡＣＥ２発現に関連する疾患の影響を処置、防止または改善するための医薬、予防用、防止用、または治療用組成物であって、ａ）請求項１から６のいずれか一項に記載の１つまたは複数のアンチセンスオリゴマー、ならびに
ｂ）１つまたは複数の薬学的に許容される担体および／または希釈剤
を含む、組成物。
【請求項8】
ＡＣＥ２遺伝子転写物におけるスプライシングを操作するための方法であって、ａ）請求項１から６のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴマーのうちの１つまたは複数を提供して、前記オリゴマーを標的核酸部位に結合させるステップ
を含む、方法。
【請求項9】
ＡＣＥ２アイソフォームの発現、濃度または活性をモジュレートするための方法であって、ａ）請求項１から６のいずれか一項に記載の１つもしくは複数のアンチセンスオリゴマーまたは１つもしくは複数のアンチセンスオリゴマーを含む医薬組成物の有効量を前記対象に投与するステップ
を含む、方法。
【請求項10】
ＡＣＥ２発現に関連する疾患の影響を処置、防止または改善するための方法であって、ａ）請求項１から６のいずれか一項に記載の１つもしくは複数のアンチセンスオリゴマーまたは１つもしくは複数のアンチセンスオリゴマーを含む医薬組成物の有効量を前記対象に投与するステップ
を含む、方法。
【請求項11】
ＡＣＥ２発現に関連する疾患の影響を処置、防止または改善するための医薬の製造のための、請求項１から６のいずれか一項に記載の精製および単離されたアンチセンスオリゴマーの使用。
【請求項12】
対象におけるＡＣＥ２発現に関連する疾患の影響を処置、防止または改善するためのキットであって、好適な容器内にパッケージングされた、請求項１から６のいずれか一項に記載の少なくともアンチセンスオリゴマーおよびその組合せまたはカクテルを、その使用のための使用説明書と一緒に含む、キット。
【請求項13】
前記ＡＣＥ２発現に関連する疾患が、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルスによって引き起こされる感染症、肺障害、慢性腎疾患、慢性心疾患、高血圧および糖尿病を含むリストから選択される、請求項７に記載の組成物、請求項８から１０のいずれか一項に記載の方法、請求項１１に記載の使用、または請求項１２に記載のキット。
【請求項14】
前記アンチセンスオリゴマーが、可溶性ＡＣＥ２アイソフォーム、ＲＡＡＳをモジュレートすることができる化合物、コロナウイルスを標的とする抗ウイルス療法または受動免疫療法を含むリストから選択される第２の治療剤と組み合わせて投与される、請求項７に記載の組成物、請求項８から１０のいずれか一項に記載の方法、請求項１１に記載の使用、または請求項１２に記載のキット。
【請求項15】
前記アンチセンスオリゴマーが、アンチセンスオリゴマーの組合せである、請求項７に記載の組成物、請求項８から１０のいずれか一項に記載の方法、請求項１１に記載の使用、または請求項１２に記載のキット。
【請求項16】
アンチセンスオリゴマーの前記組合せが、配列番号６と９または配列番号６と１１の組合せから選択される、請求項１５に記載の組成物、方法、使用またはキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の分野
本発明は、アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）またはその一部をコードするプレｍＲＮＡのスプライシングのモジュレーションのための方法であって、スプライススイッチングアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）を使用して、可溶性ＡＣＥ２アイソフォームをコードする新規ＡＣＥ２スプライスバリアントの生成を誘導する方法、および前記モジュレーターを使用するＡＣＥ２関連障害の処置方法に関する。
本発明は、アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）またはその一部をコードするプレｍＲＮＡのスプライシングのモジュレーションのための方法であって、スプライススイッチングアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）を使用して、可溶性ＡＣＥ２アイソフォームをコードする新規ＡＣＥ２スプライスバリアントの生成を誘導する方法、および前記モジュレーターを使用するＡＣＥ２関連障害の処置方法に関する。
【背景技術】
【0002】
背景技術
アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２；ＥＣ ３．４．１７．２３）は、エキソペプチダーゼスーパーファミリーに属する９２ｋＤＡの１型膜内在性糖タンパク質である。ＡＣＥ２は、ほとんどの組織内で発現され、活性である。
アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２；ＥＣ ３．４．１７．２３）は、エキソペプチダーゼスーパーファミリーに属する９２ｋＤＡの１型膜内在性糖タンパク質である。ＡＣＥ２は、ほとんどの組織内で発現され、活性である。
【0003】
ヒトＡＣＥ２遺伝子は、ヒトのＸ染色体のＸｐ２２．２領域に見られる。これは、１８個のエクソンおよび１７個のイントロン、ならびにその転写を調節する５’隣接領域を含む。
【0004】
ヒトＡＣＥ２タンパク質は、球状の細胞外ドメイン（残基１８～７４０）、１回膜貫通ドメイン（残基７４１～７６１）および短い細胞質側末端（残基７６２～８０５）から構成されている。ＡＣＥ２は、Ａｓｎ５３、Ａｓｎ９０、Ａｓｎ１０３、Ａｓｎ３２２、Ａｓｎ４３２、Ａｓｎ５４６、およびＡｓｎ６９０でＮ－グリコシル化されている。
【0005】
重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含む）、ＨＮＬ６３－ＣｏＶ（ＮＬ６３－Ｓ）およびＳＡＲＳ様ＷＩＶ１－ＣｏＶは、その深く凹んだ触媒ドメインとは別個の、それから遠位の部位で、ＡＣＥ２の外部ドメインに結合する。ＡＣＥ２に対するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の親和性は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶを含む他のＣｏＶの親和性よりも高く、おそらく、ヒトでのより高い感染性の一因となっているようである。
【0006】
ＡＣＥ２の外部ドメインは、例えば、Ａｎｇ ＩＩ（１～８）からＣ末端のフェニルアラニンを切断してＡｎｇ（１～７）を生じる、末端カルボキシペプチダーゼとして機能する単一のメタロペプチダーゼドメインを含有する。ＡＣＥ２の遺伝的枯渇によって、Ａｎｇ ＩＩレベルの増加、およびＡｎｇ－（１～７）レベルの低下がもたらされる。このように、ＡＣＥ２は、レニン－アンジオテンシン－アルドステロン系（ＲＡＡＳ）における重要な調節酵素であると考えられる。
【0007】
ＲＡＡＳは、多くの一般的な疾患および疾患プロセスの発生および進行に関与する恒常性維持経路である。アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、またはアンジオテンシンＩＩ受容体１型（ＡＴ１Ｒ）遮断薬（阻害剤）によるＲＡＡＳの阻害は、高血圧、心血管疾患（ＣＶＤ）、心不全、慢性腎疾患（ＣＫＤ）、および糖尿病の合併症を含む多くの疾患および／または状態の管理のために広く使用される。ＲＡＡＳの阻害は、糖尿病の防止、神経保護、ある特定のがんの増殖の修飾、さらにはマウスにおいて長寿をもたらすＡＴ１Ｒの遺伝的枯渇に関する老化において有益であることも示されている。ＲＡＡＳの活性化は、アテローム性動脈硬化、慢性心疾患、慢性腎疾患、高血圧、肺疾患およびコロナウイルス感染症の重要なメディエーターであることが公知である。
【0008】
ＡＣＥ２の非触媒性細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを網羅する残基６１４～８０５を組み込んだＡＣＥ２のＣ末端は、小胞輸送および膜融合のプロセスに関与する酵素活性を有さないタンパク質であるコレクトリンと、４７．８％の配列同一性を示す。結論として、ＡＣＥ２は、ＡＣＥ様である１９～６１３、およびコレクトリン様である６１４～８０５を含む融合タンパク質であると考えられる。
【0009】
ＡＣＥ２の細胞質側末端は、インテグリンおよびカルモジュリン結合部位も含有する。細胞質ドメインは、大型アミノ酸輸送体Ｂ（Ｏ）ＡＴ１の輸送アダプターとしての役割を果たし、それを、腸の上皮細胞の頂端膜に移行させる。コロナウイルスの細胞内への取込みもまた、ＡＣＥ２のサイトゾル側末端に媒介される内在化に依存する。
【0010】
ほとんどのＡＣＥ２は、膜アンカー型である。しかし、外部ドメインの構成的および誘導性の脱落が、シェダーゼの影響下で起こり得る。脱落によって生じた低レベルのＣ末端切断型ＡＣＥ２アイソフォームは、血流、尿、気管支肺胞液および唾液中に自然に見られる。ＡＣＥ２のこの可溶性アイソフォームは、膜アンカーおよび細胞質側末端を欠く。
【0011】
ＡＣＥ２は、肺疾患の発生および進行に関与する。Ａｃｅ２ ＫＯマウスは、肺疾患の様々なモデルに応じて肺傷害の増強を示し、傷害の表現型は、ＡＣＥ２を再導入することによって救済され得る。特に、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）の病態は、ＡＣＥ２の非存在下で増幅され、肺のＡＣＥ２の下降は、臨床成績不良の前兆である。組換え可溶性ＡＣＥ２は、急性および慢性の肺傷害の実験モデルにおいて有益な効果を有し、ＡＲＤＳを有する患者の臨床試験において研究されている。
【0012】
ＡＣＥ２は、アテローム性動脈硬化プラークの発生において重要な役割を果たす。本発明者らは、Ａｃｅ２の遺伝的欠損がアンジオテンシンＩＩ注入後に観察されたものに匹敵する、プラーク蓄積の増加に関連することを以前に示している。ＡＣＥ２発現は、確立されたアテローム性動脈硬化プラークおよび糖尿病などのアテローム性動脈硬化誘発状態において低下する。循環する可溶性ＡＣＥ２を増加させるための方法によって、このモデルにおけるアテローム性動脈硬化が低減する。
【0013】
ＲＡＡＳの活性化は、高血圧の重要なメディエーターであることが公知であり、ＲＡＡＳ活性化を遮断するための介入は、すべての血圧低下剤の中で最も広く使用されているものの１つである。これらの作用剤の降圧剤としての有効性は、Ａｎｇ ＩＩまたはそのシグナル伝達を低下させるそれらの能力によって部分的に媒介される。しかし、従来のＲＡＳ遮断の降圧効果は、Ａｎｇ（１～７）の循環レベルを増加させるＡＣＥ阻害剤とアンジオテンシン受容体遮断薬（ＡＲＢ）の両方の能力によっても、部分的に決定される。血管系におけるＡｎｇ（１～７）の主要な供給源がＡＣＥ２であることを考えると、このデータは、ＡＣＥ２が、高血圧の発生だけでなく、その処置に対する応答にも影響を及ぼす可能性があることを示唆する。ＡＣＥ２とＲＡＡＳは、中枢性高血圧の発病にも関与している。自然発症高血圧のラットでは、ＡＣＥ２発現は延髄吻側腹外側部（ＲＶＬＭ）において低下し、ＲＶＬＭにおけるＡＣＥ２の持続的過剰発現により高血圧の有意な減弱がもたらされる。
【0014】
心臓では、ＡＣＥ２は、Ａｎｇ ＩＩの代謝のための主要な経路を表す。マウスにおけるＡＣＥ２欠損は、初期心臓肥大をもたらし、有害な心筋梗塞後の心室リモデリングを加速させる。一部のモデルでは、ＡＣＥ２欠損は、加齢および／または心圧負荷に伴う進行性の心筋線維化ももたらす。再度、これらの変化は、組換えＡＣＥ２、ＡＣＥ阻害剤またはＡＴ１Ｒ遮断薬による処置後に回復し、心臓におけるＲＡＡＳのバランスが進行性心疾患に関する重要な駆動因子であることを示唆する。
【0015】
ＡＣＥ２欠損マウスが腎損傷を加速させたため、糖尿病性腎臓ならびに腎損傷および腎活性化に関連する他の状態において、ＡＣＥ２は重要な役割を果たす。実験的糖尿病における腎損傷は、循環する可溶性ＡＣＥ２を増加させる発明によって低減される。
【0016】
ＲＡＡＳは、いくつかの代謝機能も有する。ＡＣＥ２欠損は、インスリン抵抗性およびグルコース恒常性障害に関連し、これは、高脂肪食により悪化する。ＡＣＥ２欠損は、骨格筋および肝臓における脂質蓄積の増加に関連する。
【0017】
完全長ＡＣＥ２よりも可溶性ＡＣＥ２の好ましい生成に向けて、ＡＣＥ２スプライシングのモジュレーションのためのエクソン－スキッピングＡＯＮを使用する本方法が説明されるのは、この背景に対してである。
【0018】
背景技術の上記論述は、本発明の理解を容易にすることのみを意図するものである。この論述は、参照した資料のいずれかが、本出願の優先日の時点で、共通の一般的知識の一部であるか、またはその一部であったことの承認でも自認でもない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0019】
発明の要旨
概括的に、本発明の一形態によれば、アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）またはその一部をコードするプレｍＲＮＡ遺伝子転写物の選択的スプライシングをモジュレートするために使用される単離もしくは精製されたＡＯＮまたはＡＯＮの組合せが提供される。精製されたＡＯＮは、好ましくは、修飾された主鎖構造を有する。このようなアンチセンスオリゴマーに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％または少なくとも９５％の配列同一性を有し、かつ修飾された主鎖構造を有する配列も提供される。
概括的に、本発明の一形態によれば、アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）またはその一部をコードするプレｍＲＮＡ遺伝子転写物の選択的スプライシングをモジュレートするために使用される単離もしくは精製されたＡＯＮまたはＡＯＮの組合せが提供される。精製されたＡＯＮは、好ましくは、修飾された主鎖構造を有する。このようなアンチセンスオリゴマーに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％または少なくとも９５％の配列同一性を有し、かつ修飾された主鎖構造を有する配列も提供される。
【0020】
本発明の一態様では、ＡＣＥ２プレｍＲＮＡのイントロン付近またはその中の領域に対して相補的な標的配列を含む、１０～５０ヌクレオチドのＡＯＮが提供される。
【0021】
本発明の一態様では、ＡＣＥ２プレｍＲＮＡのスプライス部位に対して相補的であるかまたはそれに隣接する標的配列を含む、１０～５０ヌクレオチドのＡＯＮが提供される。
【0022】
ＲＮＡ二次構造、ＡＯＮとＳＲタンパク質の間の競合、ヘテロ核リボヌクレオタンパク質（ｈｎＲＮＰ）、および／またはスプライセオソームを構成する他のエレメントなどの因子が、ＡＯＮの作用に影響を及ぼし得るため、重要なアクセプターまたはドナーのスプライス部位に向けられたＡＯＮは、常にスプライシングを変更する訳ではない。結果として、本発明の一態様では、スプライセオソームのエレメント（例えば、タンパク質スプライシング因子、ｕＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ）が結合すると、近くのエクソンのスプライシングをモジュレートするエンハンサーまたはサイレンサーとして作用する、ＡＣＥ２のプレｍＲＮＡにおけるシス作用型ＲＮＡエレメントに対して相補的であるかまたはそれに隣接する標的配列を含む１０～５０ヌクレオチドのＡＯＮが提供される。
【0023】
本発明の一態様では、スプライス部位の選択に影響を与える前記ｍＲＮＡの二次構造をモジュレートするＡＣＥ２プレｍＲＮＡに対して相補的な標的配列を含む１０～５０ヌクレオチドのＡＯＮが提供される。
【0024】
本発明の一形態では、ＡＣＥ２遺伝子転写物またはその一部における１つまたは複数のエクソン配列の排除（スキッピングとしても公知）を誘導する単離または精製されたＡＯＮが提供される。
【0025】
本発明の一形態では、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）、チオモルホリノオリゴヌクレオチド（ＴＭＯ）、２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）ホスホロチオエート（ＰＴＯ）オリゴヌクレオチドおよび２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）ＰＴＯオリゴヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）修飾ＡＯＮ、熱安定性のねじれ挿入核酸（ｔｗｉｓｔｅｄ ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）（ＴＩＮＡ）およびペプチド核酸（ＰＮＡ）を含むがこれらに限定されないＡＯＮが、プレｍＲＮＡ－ＡＯＮ複合体の分解を妨げるために化学修飾される。
【0026】
本発明の一形態では、ＡＯＮは、それらの送達を増加させる部分にコンジュゲートされる。この部分には、以下に限定されないが、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）、ｖｉｖｏ－モルホリノ（ＶＭＯ）またはペプチドホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＰＭＯ）が含まれる。
【0027】
好ましくは、ＡＯＮは、表３に示される配列、およびそれらの組合せ、誘導体またはカクテルを含む群から選択される。好ましくは、ＡＯＮは、配列番号１～３１、より好ましくは配列番号５、６、９または１１を含むリストから選択される。より好ましくは、ＡＯＮは、配列番号６および９または配列番号６および１１である。
【0028】
本発明のＡＯＮは、スプライスドナー部位、スプライスアクセプター部位、スプライスエンハンサー配列、スプライスサイレンサー配列またはプレｍＲＮＡの二次構造をモジュレートする部位から選択される推定ｍＲＮＡスプライシング部位標的部位に結合することが可能なＡＯＮであってもよい。ドナーまたはアクセプターのスプライス部位が標的とされる場合、標的部位には、いくつかの隣接するイントロン配列が含まれてもよい。
【0029】
より詳細には、ＡＯＮは、配列番号１～３１、より好ましくは配列番号５、６、９もしくは１１、ならびに／または表３のいずれかに示される配列、およびそれらの組合せ、誘導体またはカクテルのうちのいずれか１つまたは複数を含む群から選択されてもよい。より好ましくは、ＡＯＮは、ＡＯＮの組合せ；好ましくは配列番号６と９または配列番号６と１１の組合せである。これには、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でこのような配列にハイブリダイズすることができる配列、それに対して相補的な配列、ＡＣＥ２遺伝子転写物におけるプレｍＲＮＡプロセシング活性をモジュレートする修飾された塩基、修飾された主鎖、およびその機能的切断または伸長を含有する配列にハイブリダイズすることができる配列が含まれる。
【0030】
ある特定の実施形態では、ＡＯＮは、オリゴヌクレオチドと標的配列の間に形成されるヘテロ二重鎖が、細胞ヌクレアーゼの作用およびｉｎ ｖｉｖｏで起こり得る他の分解様式に耐えるのに十分安定である限り、標的配列に対して１００％相補的であってもよく、または例えば、バリアントを収容するように、ミスマッチを含んでもよい。したがって、ある特定のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドと標的配列の間に、約または少なくとも約７０％の配列相補性、例えば７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列相補性を有してもよい。
【0031】
本発明は、ＡＣＥ２プレｍＲＮＡの選択的スプライシングをモジュレートするために選択された標的に結合することが可能な２つまたはそれより多いＡＯＮの組合せにも及び、２つまたはそれより多いこのようなＡＯＮを含む構築物も含む。構築物は、組み合わされたＡＯＮベースの治療として一緒に使用されてもよい。ＡＯＮの組合せは、好ましくは、配列番号６と９または配列番号６と１１の組合せである。
【0032】
本発明は、そのまたさらなる態様によれば、本発明のＡＯＮ配列のｃＤＮＡまたはクローニングされたコピー、および本発明のＡＯＮ配列を含有するベクターに及ぶ。本発明は、このような配列および／またはベクターを含有する細胞にもさらに及ぶ。
【0033】
ＡＣＥ２遺伝子転写物のスプライシングを操作するための方法であって、
ａ）本明細書に記載されたＡＯＮのうちの１つまたは複数を提供して、オリゴマーを標的核酸部位に結合させるステップ
を含む、方法も提供される。
ａ）本明細書に記載されたＡＯＮのうちの１つまたは複数を提供して、オリゴマーを標的核酸部位に結合させるステップ
を含む、方法も提供される。
【0034】
対象におけるＡＣＥ２発現に関連する疾患の影響を処置、防止または改善するための医薬、予防用、または治療用組成物であって、
ａ）本明細書に記載された１つまたは複数のＡＯＮ；ならびに
ｂ）１つまたは複数の薬学的に許容される担体および／または希釈剤
を含む、組成物も提供される。
ａ）本明細書に記載された１つまたは複数のＡＯＮ；ならびに
ｂ）１つまたは複数の薬学的に許容される担体および／または希釈剤
を含む、組成物も提供される。
【0035】
組成物は、本発明の所望のＡＯＮのそれぞれを、約１ｎＭ～１０００ｎＭ含んでもよい。好ましくは、組成物は、本発明のＡＯＮのそれぞれを、約１ｎＭ～５００ｎＭ、最も好ましくは１ｎＭ～１０ｎＭの間で含んでもよい。
【0036】
ＡＣＥ２発現に関連する疾患の影響を処置、防止または改善するための方法であって、
本明細書に記載された１つもしくは複数のＡＯＮまたは１つもしくは複数のＡＯＮを含む医薬組成物の有効量を、対象に投与するステップ
を含む、方法も提供される。
本明細書に記載された１つもしくは複数のＡＯＮまたは１つもしくは複数のＡＯＮを含む医薬組成物の有効量を、対象に投与するステップ
を含む、方法も提供される。
【0037】
本発明の一形態では、ＡＯＮは、アンジオテンシン受容体遮断薬およびＡＣＥ阻害剤および組換えＡＣＥ２を含むレニン－アンジオテンシン－アルドステロン系（ＲＡＡＳ）をモジュレートする他の作用剤と同時投与される。
【0038】
本発明の一形態では、ＡＯＮは、受動免疫、能動免疫または抗ウイルス療法を含む、コロナウイルス感染力をモジュレートする他の作用剤と同時投与される。
【0039】
ＡＣＥ２発現および／または活性に関連する疾患の影響を処置、防止または改善するための医薬の製造のための、本明細書に記載された精製および単離されたＡＯＮの使用も提供される。
【0040】
対象におけるＡＣＥ２発現に関連する疾患の影響を処置、防止または改善するためのキットであって、好適な容器内にパッケージングされた、本明細書に記載された少なくともＡＯＮおよびその組合せまたはカクテルを、その使用のための使用説明書と一緒に含む、キットも提供される。
【0041】
好ましくは、対象におけるＡＣＥ２発現に関連する疾患は、コロナウイルス感染症、肺疾患、アテローム性動脈硬化、慢性心疾患、慢性腎疾患または糖尿病である。
【0042】
ＡＣＥ２発現に関連する疾患を有する対象は、ヒトを含む哺乳動物であってもよい。
【0043】
本発明のさらなる態様は、添付の非限定的な例および図面を参照してここに記載される。
本発明のさらなる特徴は、いくつかのその非限定的な実施形態についての以下の記載においてより十分に説明される。この記載は、本発明を例示するためにのみ含まれる。これは、上に示されるような本発明の広範な概要、開示または記載に関する制限として理解されるべきではない。この記載は、添付の図面を参照してなされる。
本発明のさらなる特徴は、いくつかのその非限定的な実施形態についての以下の記載においてより十分に説明される。この記載は、本発明を例示するためにのみ含まれる。これは、上に示されるような本発明の広範な概要、開示または記載に関する制限として理解されるべきではない。この記載は、添付の図面を参照してなされる。
【図面の簡単な説明】
【0044】
【図1a】ポリクローナル抗ＡＣＥ２抗体（図１ａ－ｉ）またはモノクローナル抗Ｈｉｓ抗体（図１ａ－ｉｉ）によって検出された、ウエスタンブロッティングで選択されたＣ末端切断型ＡＣＥ２構築物でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞由来の細胞培養培地中の可溶性ＡＣＥ２タンパク質の発現。
【図1b】抗ＡＣＥ２ ＥＬＩＳＡによって検出された、選択されたＣ末端切断型ｍＡＣＥ２構築物でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞由来の細胞培養培地中の可溶性ＡＣＥ２タンパク質の発現。バーは、平均±ＳＥＭを示す。構築物当たりｎ＝６。
【図1c】消光蛍光ＡＣＥ２活性アッセイによって検出された、選択されたＣ末端切断型ｍＡＣＥ２構築物でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞由来の培養培地中のＡＣＥ２の触媒活性。バーは平均を示し、エラーバーはＳＥＭを示す。構築物当たりｎ＝６。
【図1d】ポリクローナル抗ＡＣＥ２抗体を使用するウエスタンブロッティングによって検出された、選択されたＣ末端切断型ｍＡＣＥ２構築物を含有するＤＮＡミニサークルでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞由来の培養培地中の可溶性ｍＡＣＥ２タンパク質の発現。
【図1e】抗ＡＣＥ２ ＥＬＩＳＡによって検出された、ｍＡＣＥ２（１９～６１５）をコードするＤＮＡミニサークルでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞由来の培養培地中の可溶性ｍＡＣＥ２タンパク質の発現。バーは平均を示し、エラーバーはＳＥＭを示す。構築物当たりｎ＝６。
【図1f】ＨＡＥＣ細胞における炎症性サイトカイン、ＭＣＰ－１のＡｎｇ ＩＩに誘導される発現は、ｍＡＣＥ２（１９～６１５）を過剰発現するＣＨＯ細胞由来の培地とのプレインキュベーションによってアンタゴナイズされ、この保護は、選択的ＡＣＥ２阻害剤、ＭＬＮ４７６０によってアンタゴナイズされた。データは、平均±ＳＥＭとして表した。各カラムはｎ＝８の群である。
【図1g】ＨＡＥＣ細胞における接着分子、ＩＣＡＭ－１のＡｎｇ ＩＩに誘導される発現は、ｍＡＣＥ２（１９～６１５）を過剰発現するＣＨＯ細胞由来の培地とのプレインキュベーションによってアンタゴナイズされ、この保護は、選択的ＡＣＥ２阻害剤、ＭＬＮ４７６０によってアンタゴナイズされた。
【図1h】ｍＡＣＥ２（１９～６１５）をコードするＤＮＡミニサークルによる筋肉内注射の４週間後の、マウスの血清中の循環するＡＣＥ２タンパク質の増加。
【図1i】ｍＡＣＥ２（１９～６１５）をコードするＤＮＡミニサークルによる筋肉内注射の４週間後の、マウスの血清中の循環するＡＣＥ２活性の増加。
【図1j】ベクターによってトランスフェクトされた細胞と比較した、ウエスタンブロッティングによって検出された、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞由来の１５μＬの細胞培地中のヒトＹ６１３Ｌ－ｈＡＣＥ２（１９～６１３）タンパク質の発現。
【図1k】ＡＣＥ２活性アッセイによって検出された、Ｙ６１３Ｌ－ｈＡＣＥ２（１９～６１３）でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞由来の培養培地中のＡＣＥ２の触媒活性。組換えＡｃｅ２（１～７４０）を陽性対照として示し、トランスフェクトされていないＣＨＯ細胞由来の培地を陰性対照として示す。
【図1l】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によるＶｅｒｏＥ６細胞の感染後のプラーク蓄積は、Ｙ６１３Ｌ－ＡＣＥ２による処置後に用量依存的に低減する。
【図2a】ＡＣＥ２の構成的スプライシングによって、エクソン１３－１４－１５の融合が創出される。エクソン１４のドナーおよびアクセプターのスプライス部位を標的とするＡＯＮを使用することによって、このスプライシングパターンが変更され、エクソン１４スキッピングを引き起こすことができれば、Ｙ６１３Ｌ－ＡＣＥ２（１９～６１３）をコードする新規ｍＲＮＡスプライスバリアント（Δ１４スプライスバリアント）を生じることになる。
【図2b】ヒトＣａｃｏ－２細胞の（ｉｉ）Ｈ１４Ａ［－１７＋８］（１００ｎＭ）または（ｉｉｉ）Ｈ１４Ａ［－１７＋８］とＨ１４Ｄ［＋１３－１２］（５０＋５０ｎＭ）の組合せによる処置の４８時間後に誘導された、Δ１４スプライスバリアント（矢印、緑色）のｄｅ ｎｏｖｏ発現を示すＲＴ－ＰＣＲ増幅プロット。非標的ＡＯＮ（１００ｎＭ、ｉ）でトランスフェクトされた細胞では、Δ１４スプライスバリアントの発現は観察されていない。１８Ｓは、発現対照（青色）として示される。
【図2c】用量対照非標的ＡＯＮと比較した、ＡＯＮの組合せ、具体的には、Ｈ１４Ｄ［＋９－１６］とＨ１４Ａ［－１７＋８］およびＨ１４Ｄ［＋１３－１２］とＨ１４Ａ［－１７＋８］によるヒトＣａｃｏ－２細胞の処置後の、エクソン１４を含有する従来の方法でスプライシングされたＡＣＥ２ ｍＲＮＡの発現。データは、平均±ＳＥＭを示す。＊ｐ＜０．０１対用量対照。
【図2d】ＡＣＥ２標的ＡＯＮまたは非標的対照ＡＯＮによるヒトＣａｃｏ－２細胞のトランスフェクション後のすべてのＡＣＥ２ ｍＲＮＡスプライスバリアント（すなわち、エクソン１３とエクソン１５の両方を含有するＡＣＥ２ ｍＲＮＡ）の発現。データは、平均±ＳＥＭを示す。＊ｐ＜０．０１対用量対照。データは、平均±ＳＥＭを示す。
【図2e】ＡＯＮ、具体的には、Ｈ１４Ｄ［＋９－１６］とＨ１４Ａ［－１７＋８］、Ｈ１４Ｄ［＋１３－１２］とＨ１４Ａ［－１７＋８］、または非標的対照ＡＯＮによるヒトＣａｃｏ－２細胞のトランスフェクション後の、エクソン１４を保持する従来の方法でスプライシングされたＡＣＥ２ ｍＲＮＡおよびすべてのＡＣＥ２ ｍＲＮＡスプライスバリアント（すなわち、エクソン１３とエクソン１５の両方を含有する）の発現。データは、平均±ＳＥＭを示す。＊ｐ＜０．０１対用量対照。
【図2f】ＡＯＮの組合せ（ｉ）Ｈ１４Ｄ［＋９－１６］とＨ１４Ａ［－１７＋８］；５０＋５０ｎＭによるヒトＣａｃｏ－２細胞の処置の２４時間後のΔ１４スプライスバリアントのｄｅ ｎｏｖｏ発現（緑色）を示すＲＴ－ＰＣＲ増幅プロット。非標的ＡＯＮ（１００ｎＭ、ｉｉ）でトランスフェクトされた細胞では、Δ１４スプライスバリアントの発現は観察されていない。１８Ｓは、発現対照（紫色／青色）として示される。
【図3a】ＡＣＥ２標的ＡＯＮ、具体的には、Ｈ１４Ａ［－１７＋８］とＨ１４Ｄ［＋１３－１２］、または非標的対照ＡＯＮによるＶｅｒｏＥ６細胞のトランスフェクション後の、エクソン１４を含有する従来の方法でスプライシングされたＡＣＥ２ ｍＲＮＡの発現およびエクソン１３とエクソン１５の両方を含有するすべてのＡＣＥ２ ｍＲＮＡスプライスバリアントの発現。データは、平均±ＳＥＭを示す。＊ｐ＜０．０１対用量対照。
【図3b】プールした培地試料におけるＡＣＥ２活性によって測定した、ＡＣＥ２標的ＡＯＮ、具体的には、Ｈ１４Ａ［－１７＋８］とＨ１４Ｄ［＋１３－１２］、Ｈ１４Ａ［－１７＋８］とＨ１４Ｄ［＋９－１６］、Ｈ１４Ａ［－６＋１９］とＨ１４Ｄ［＋１３－１２］または非標的対照ＡＯＮによるＶｅｒｏＥ６細胞のトランスフェクション後の細胞培地中の触媒活性可溶性ＡＣＥ２の発現。
【図3c】ＥＬＩＳＡによって測定した、ＡＣＥ２標的ＡＯＮ、具体的には、Ｈ１４Ａ［－１７＋８］とＨ１４Ｄ［＋１３－１２］または非標的対照ＡＯＮによるＶｅｒｏＥ６細胞のトランスフェクション後の細胞培地中の可溶性ＡＣＥ２タンパク質の発現。データは、平均±ＳＥＭを示す。＊ｐ＜０．０１対用量対照。
【図3d】ＡＣＥ標的ＡＯＮ、具体的には、Ｈ１４Ａ［－１７＋８］とＨ１４Ｄ［＋１３－１２］または非標的対照ＡＯＮによるトランスフェクション後のＶｅｒｏＥ６細胞の表面へのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質（Ｓ１－サブユニット）の吸着。ＧＦＰの吸着は、陰性対照として示される。代表的なイメージを左側に示す。右側のデータは、平均±ＳＥＭを示す。＊ｐ＜０．０１対非標的対照。
【図4a】エクソン１３（フォワード）およびエクソン１５（リバース）内に位置するプライマーを使用するワンステップＰＣＲによって検出された、２’－Ｏ－Ｍｅ ＰＴＯ ＡＯＮ（５０μＭ）によるトランスフェクション後のＣａｃｏ－２細胞におけるＡＣＥ２ ｍＲＮＡスプライスバリアントの発現。
【図4b】エクソン１３（フォワード）およびエクソン１５（リバース）内に位置するプライマーを使用するワンステップＰＣＲによって検出された、２’－Ｏ－Ｍｅ ＰＴＯ ＡＯＮ（５０ｎＭ）による７２時間のトランスフェクション後のＣａｌｕ－３細胞におけるＡＣＥ２ ｍＲＮＡスプライスバリアントの発現。
【図4c】Ｈ１４Ａ［－２２＋３］（配列番号６；１ｕＭ）のｖｉｖｏ－モルホリノ製剤で７２時間前処置し、それに続いて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｖｉｃ０１）とインキュベーションしたＣａｌｕ－３細胞の培地中の組織培養感染量の中央値（ＴＣＩＤ５０）。
【図5a】エクソン１７（最後から２番目のエクソン）を含む場合と含まない場合の、エクソン９～１８のＡＣＥ２転写物のリーディングフレーム。エクソン１７はインフレームエクソンであるため、エクソン１７を除去すると、エクソン１８の読取りにおいてフレームシフトはもたらされない。
【図5b】エクソン１３（フォワード）およびエクソン１８（リバース）内に位置するプライマーを使用するワンステップＰＣＲによって測定した、５０～２００μＭのエクソン１７を標的とする２’－Ｏ－Ｍｅ ＰＴＯ ＡＯＮによるヒト線維芽細胞のトランスフェクションの２４時間後の、様々なＡＣＥ２ ｍＲＮＡスプライスバリアントの誘導。
【図5c】エクソン１３（フォワード）およびエクソン１８（リバース）内に位置するプライマーを使用するワンステップＰＣＲによって測定した、５０～２００μＭのエクソン１７を標的とする２’－Ｏ－Ｍｅ ＰＴＯ ＡＯＮによるヒト角化細胞の細胞株ＨａＣａＴのトランスフェクションの２４時間後の、様々なＡＣＥ２ ｍＲＮＡスプライスバリアントの誘導。
【図5d】エクソン１３（フォワード）およびエクソン１８（リバース）内に位置するプライマーを使用するワンステップＰＣＲによって測定した、エクソン１７を標的とする２’－Ｏ－Ｍｅ ＰＴＯ ＡＯＮを含む上位３つの候補ＡＯＮ ５０～２００μＭによるＨａＣａＴ細胞のトランスフェクション後のエクソン１７スキッピングの経時的分析。
【図5e】エクソン１３（フォワード）およびエクソン１８（リバース）内に位置するプライマーを使用するワンステップＰＣＲを使用する、Ｍ１７Ａ［＋２１＋４５］（配列番号９）のｖｉｖｏモルホリノ製剤による処置（１～３μＭ）の４８時間後の、Ｃａｃｏ－２細胞内でのＡＣＥ２ ｍＲＮＡスプライスバリアントの発現。
【図5f】リアルタイムＲＴ－ＰＣＲによって測定した、ＤＩ水中で気管支内に送達された３ｍｇ／ｋｇの用量のＭ１７Ａ［＋２１＋４５］（配列番号９）、対照ＡＯＮまたはビヒクルによる処置の７日後のマウスの肺におけるＡＣＥ２ ｍＲＮＡの発現。
【図5g】ＥＬＩＳＡによって測定した、ＤＩ水中で気管支内に送達された３ｍｇ／ｋｇの用量のＭ１７Ａ［＋２１＋４５］（配列番号３２）、対照ＡＯＮまたはビヒクルによる処置の７日後のマウスの気管支肺胞液中の可溶性ＡＣＥ２タンパク質の発現。
【図5h】Ｈ１７Ａ［＋２１＋４５］（配列番号９；１ｕＭ）のｖｉｖｏ－モルホリノ製剤で７２時間前処置し、それに続いて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｖｉｃ０１）とインキュベーションしたＣａｌｕ－３細胞の培地中の組織培養感染量の中央値（ＴＣＩＤ５０）。
【図6a】エクソン１３（フォワード）およびエクソン１５（リバース）内に位置するプライマーを使用するワンステップＰＣＲによって検出された、ｖｉｖｏ－モルホリノＡＯＮ、Ｈ１７Ａ［＋２１＋４５］またはＨ１４Ａ［－２２＋３］またはその両方（それぞれ１μＭ）による処置後のＣａｌｕ－３細胞におけるＡＣＥ２ ｍＲＮＡスプライスバリアントの発現。
【図6b】エクソン１３（フォワード）およびエクソン１５（リバース）内に位置するプライマーを使用するワンステップＰＣＲによって検出された、ｖｉｖｏ－モルホリノＡＯＮ、Ｈ１７Ａ［＋２１＋４５］、Ｈ１４Ａ［－２２＋３］、Ｈ１７Ａ［＋２１＋４５］とＨ１４Ａ［－２２＋３］の両方、または対照オリゴヌクレオチド（それぞれ１μＭ）による処置後のＣａｃｏ－２細胞におけるＡＣＥ２ ｍＲＮＡスプライスバリアントの発現。
【図6c】エクソン１３（フォワード）およびエクソン１８（リバース）内に位置するプライマーを使用するワンステップＰＣＲによって検出された、ｖｉｖｏ－モルホリノＡＯＮ、Ｈ１７Ａ［＋２１＋４５］またはＨ１４Ａ［－２２＋３］またはその両方（それぞれ１μＭ）による処置後のＣａｃｏ－２細胞におけるＡＣＥ２ ｍＲＮＡスプライスバリアントの発現。
【図6d】Ｈ１７Ａ［＋２１＋４５］とＨ１４Ａ［－２２＋３］（それぞれ０．５μＭ）のｖｉｖｏ－モルホリノ製剤の組合せで７２時間前処置し、それに続いて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｖｉｃ０１）とインキュベーションしたＣａｌｕ－３細胞の培地中の組織培養感染量の中央値（ＴＣＩＤ５０）。
【発明を実施するための形態】
【0045】
発明の説明
発明の詳細な説明
アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）は、ワトソン－クリック塩基対合によって、プレＲＮＡ／ｍＲＮＡに選択的にハイブリダイズし、標的ＲＮＡの機能を選択的にモジュレートすることができるＤＮＡまたはＲＮＡの短い、合成の、アンチセンスの修飾された鎖である。
発明の詳細な説明
アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）は、ワトソン－クリック塩基対合によって、プレＲＮＡ／ｍＲＮＡに選択的にハイブリダイズし、標的ＲＮＡの機能を選択的にモジュレートすることができるＤＮＡまたはＲＮＡの短い、合成の、アンチセンスの修飾された鎖である。
【0046】
ＡＯＮを使用して、ｍＲＮＡの選択的スプライシングをモジュレートする場合、これらは、スプライス－スイッチングオリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）と称されることが多い。本発明では、ＡＯＮおよびＳＳＯという用語は交換可能に使用されてもよい。ＡＯＮは、プレｍＲＮＡと塩基対合し、スプライシング機構の構成成分とプレｍＲＮＡの間に生じるＲＮＡ－ＲＮＡ塩基対合またはタンパク質－ＲＮＡ結合の相互作用を遮断することによって、転写物の正常なスプライシングレパートリーを破壊する。ＡＯＮは、選択されたエクソンの「スキッピング」および／またはイントロン配列の保持を誘導し、翻訳産物をモジュレートすることができる。これは、スプライス部位を直接標的とするか、または特異的タンパク質の結合をモジュレートするか、もしくはプレｍＲＮＡの二次構造を変更することによって、スプライシングを増強またはサイレンシングすることに関与するシス作用配列を標的とすることによって達成することができる。
【0047】
治療用ＡＯＮは、遺伝性障害の処置のために使用され、不完全であるかまたは誤ってアライメントされたセクションをスキップして、内部に欠失があるが、治療として依然として機能的なタンパク質の生成を可能にし得る。
【0048】
選択的スプライシングは、ＡＣＥ２の転写後遺伝子調節の重要な層として現在は認識されていない。転写は、自然に選択的にスプライシングされたバリアントを生じることがあり、大多数は、エクソン１の５’伸長によって異なる。しかし、これらの配列は非コードＲＮＡであるため、機能的な意義は不明である。注目すべきは、エクソン１４は、自然には選択的スプライシングを受けないことである。
【0049】
本発明は、ＡＣＥ２プレｍＲＮＡのスプライシングパターンを操作するためにＡＯＮを使用し、酵素的に機能性である、および／またはコロナウイルスの内因性ＡＣＥ２への結合をアンタゴナイズするデコイ受容体として作用する可溶性ＡＣＥ２アイソフォームをコードする新規スプライスバリアントの生成をもたらす。
【0050】
注目すべきは、今日までに、これらのスプライス部位に共通のＡＣＥ２多型が見つかっていないことである。ＡＣＥ２配列は、種間であっても、高度に保存されている。したがって、エクソンスキッピング技術による遺伝性障害の管理とは異なり、個人化または個別化された配列修飾は必要とされない。
【0051】
本発明は、ＡＣＥ２プレｍＲＮＡまたはその一部のスプライシングをモジュレートするＡＯＮを開発することによって、コロナウイルス感染症、肺障害、高血圧、心臓障害、腎臓障害、および糖尿病を含むがこれらに限定されない、ＡＣＥ２が発生または進行に関与する疾患の影響の処置、防止または改善のための代替方法を提供する。
【0052】
概括的に、本発明の一態様によれば、ＡＣＥ２遺伝子転写物またはその一部におけるプレｍＲＮＡスプライシングをモジュレートするための単離または精製されたＡＯＮが提供される。好ましくは、ＡＣＥ２プレｍＲＮＡまたはその一部において、エクソンの排除および／またはイントロンの保持を誘導するための単離または精製されたＡＯＮが提供される。精製されたＡＯＮは、好ましくは、修飾された主鎖構造を有する。このようなアンチセンスオリゴマーに対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、かつ修飾された主鎖構造を有する配列も提供される。
【0053】
本発明は、ＡＣＥ２遺伝子転写物またはその一部におけるプレｍＲＮＡスプライシングをモジュレートするために、ＡＣＥ２遺伝子転写物上の選択された標的に結合することが可能なＡＯＮを提供する。例えば、本発明の一態様では、ｍＲＮＡのスプライシングの調節に関与するタンパク質の結合に関連するＡＣＥ２プレｍＲＮＡまたはその一部の領域に対して相補的な標的配列を含む１０～５０ヌクレオチドのＡＯＮが提供される。
【表1a】
【表1b-1】
【表1b-2】
【表2】
【0054】
他のＡＯＮベースの治療とは対照的に、本発明は、ＡＣＥ２遺伝子のＤＮＡに二重結合したＲＮＡに優先的に結合し、それを分解するＲＮａｓｅ Ｈの動員によるＲＮＡ分解の増加を誘導しない。これは、ＡＯＮのＡＣＥ２ゲノムＤＮＡへのハイブリダイゼーションまたはＡＯＮのｍＲＮＡへの結合に依拠して、複製、転写、転位および翻訳などの正常な機能を妨害することによって生じるＡＣＥ２タンパク質の量をモジュレートするものでもない。むしろ、ＡＯＮを使用して、ＡＣＥ２遺伝子転写物またはその一部のプレｍＲＮＡスプライシングを選択的にモジュレートし、エクソンの「スキッピング」を誘導する。この戦略は、好ましくは、完全長膜関連ＡＣＥ２の発現を低減する、および／または膜貫通ドメインもしくは細胞質ドメインを欠く切断型可溶性ＡＣＥ２アイソフォームの生成を増加させる。
【0055】
本発明の第一の態様によれば、ＡＣＥ２遺伝子転写物上の選択された標的に結合し、ＡＣＥ２遺伝子転写物またはその一部におけるプレｍＲＮＡスプライシングをモジュレートすることが可能なＡＯＮが提供される。概括的に、ＡＣＥ２遺伝子転写物またはその一部において、標的とされるエクソンの排除／イントロンの保持を誘導するための単離または精製されたＡＯＮが提供される。
【0056】
「単離された」は、そのネイティブの状態で通常伴う構成成分を実質的または本質的に含まない物質を意味する。例えば、「単離されたポリヌクレオチド」または「単離されたオリゴヌクレオチド」は、本明細書で使用される場合、天然に存在する状態でそれに隣接する配列から精製または取り除かれたポリヌクレオチド、例えば、ゲノムにおいて断片に隣接する配列から取り除かれたＤＮＡ断片を指し得る。「単離する（ｉｓｏｌａｔｉｎｇ）」という用語は、細胞に関する場合、供給源となる対象（例えば、ポリヌクレオチド反復疾患を有する対象）からの細胞（例えば、線維芽細胞、リンパ芽球）の精製を指す。ＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはタンパク質の文脈において、「単離する」は、供給源、例えば細胞からのＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはタンパク質の回収を指す。
【0057】
ＡＯＮは、それがハイブリダイズする標的配列を「対象とする」かまたは「標的とする」と言うことができる。ある特定の実施形態では、標的配列は、プレプロセシングされたｍＲＮＡの３’もしくは５’スプライス部位、分岐点、またはスプライスエンハンサーおよびスプライスサイレンサーおよびスプライシングに影響を与えるＲＮＡの二次構造を決定する部位を含むスプライシングの調節に関与する他の配列を含む領域を含む。標的配列は、エクソン内もしくはイントロン内、またはイントロン／エクソン接合部にまたがる配列であってもよい。
【0058】
ある特定の実施形態では、ＡＯＮは、標的ＲＮＡ（例えば、プレｍＲＮＡ）の領域を効果的に遮断するために、標的ＲＮＡ（すなわち、スプライス部位の選択がモジュレートされるＲＮＡ）に対して十分な配列相補性を有する。例示的な実施形態では、ＡＣＥ２プレｍＲＮＡのこのような遮断は、そうでなければスプライシングをモジュレートするであろうスプライセオソームタンパク質に関する結合部位をマスキングする、および／または標的ＲＮＡの構造を変更することのいずれかによって、スプライシングをモジュレートする役割を果たす。一部の実施形態では、標的ＲＮＡは、標的プレｍＲＮＡ（例えば、ＡＣＥ２遺伝子のプレｍＲＮＡ）である。
【0059】
標的ＲＮＡのスプライシングをモジュレートする標的ＲＮＡ配列に対して十分な配列相補性を有するＡＯＮは、ＡＯＮが、そうでなければスプライシングをモジュレートするであろうネイティブタンパク質に関する結合部位のマスキングを誘発する、および／または標的ＲＮＡの三次元構造を変更するのに十分な配列を有することを意味する。
【0060】
選択されたＡＯＮは、配列が、標的配列へのハイブリダイゼーションの際にスプライスモジュレーションをもたらすのに十分に相補的であり、必要に応じて４５℃またはそれより高いＴｍを有するヘテロ二重鎖をＲＮＡと共に形成する限り、より短く、例えば約１２塩基にされても、またはより長く、例えば約５０塩基にされてもよく、少数のミスマッチを含んでもよい。
【0061】
好ましくは、ＡＯＮは、配列番号１～３１、より好ましくは配列番号５、６、９もしくは１１、および／または表３に示される配列を含む群から選択される。より好ましくは、ＡＯＮは、配列番号６と９または配列番号６と１１である。
【0062】
ある特定の実施形態では、標的配列とＡＯＮの間の相補性の程度は、安定な二重鎖を形成するのに十分である。ＡＯＮの標的ＲＮＡ配列との相補性の領域は、８～１１塩基と同程度に短くてもよいが、１２～１５塩基またはそれより多い塩基数、例えば１０～５０塩基、１０～４０塩基、１２～３０塩基、１２～２５塩基、１５～２５塩基、１２～２０塩基、または１５～２０塩基（これらの範囲の間のすべての整数を含む）であり得る。約１６～１７塩基のＡＯＮは、一般に、固有の相補配列を有するのに十分長い。ある特定の実施形態では、本明細書において論じられるように、必要な結合Ｔｍを達成するために、相補塩基の最小限の長さが必要とされ得る。
【0063】
ある特定の実施形態では、少なくとも最小数の塩基、例えば１０～１２塩基が標的配列に対して相補的である、５０塩基程度の長さのオリゴヌクレオチドが好適であり得る。しかし、一般に、細胞内への取込みの促進または活性は、約３０塩基未満のオリゴヌクレオチド長で最適化される。本明細書にさらに説明されるホスホロージアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）ＡＯＮについては、結合安定性および取込みの最適なバランスは、一般に、１８～２５塩基の長さで生じる。約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０塩基からなるＡＯＮ（例えば、ＰＭＯ、ＰＭＯ－Ｘ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＴＩＮＡ、２’－Ｏ－Ｍｅ）が含まれる。
【0064】
ある特定の実施形態では、ＡＯＮは、オリゴヌクレオチドと標的配列の間に形成されたヘテロ二重鎖が、細胞ヌクレアーゼの作用およびｉｎ ｖｉｖｏで起こり得る他の分解様式に耐えるのに十分安定である限り、標的配列に対して１００％相補的であってもよく、または例えば、バリアントを収容するように、ミスマッチを含んでもよい。したがって、ある特定のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドと標的配列の間に、約または少なくとも約７０％の配列相補性、例えば７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列相補性を有してもよい。
【0065】
ミスマッチは、存在する場合、典型的には、ハイブリッド二重鎖の末端領域に向かって、中間領域におけるよりも不安定化の程度が低い。許容されるミスマッチの数は、二重鎖安定性の十分に理解された原理に従って、オリゴヌクレオチドの長さ、二重鎖中のＧ：Ｃ塩基対のパーセンテージ、および二重鎖中のミスマッチの位置に依存することになる。このようなＡＯＮは、標的配列に対して必ずしも１００％相補的ではないが、標的プレＲＮＡのスプライシングがモジュレートされるように、標的配列に安定かつ特異的に結合するのに有効である。
【0066】
ＡＯＮと標的配列の間に形成される二重鎖の安定性は、結合Ｔｍおよび細胞酵素切断に対する二重鎖の感受性の関数である。相補的配列ＲＮＡに関するオリゴヌクレオチドのＴｍは、例えばHames et al., Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, 1985, pp. 107-108により記載されているか、またはMiyada C. G. and Wallace R. B., 1987, Oligonucleotide Hybridization Techniques, Methods Enzymol. Vol. 154 pp. 94-107に記載されているものなどの従来の方法によって、測定することができる。ある特定の実施形態では、ＡＯＮは、相補的配列ＲＮＡに関して、体温よりも高く、好ましくは約４５℃または５０℃よりも高い結合Ｔｍを有してもよい。６０～８０℃の範囲またはそれよりも高いＴｍも含まれる。
【0067】
バリアントの追加の例は、配列番号１～３１、より好ましくは配列番号５、６、９もしくは１１および／または表３に示される配列のいずれかの全長にわたり、約または少なくとも約７０％の配列同一性または相同性、例えば７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性または相同性を有するＡＯＮを含む。より好ましくは、ＡＯＮは、配列番号６と９または配列番号６と１１である。
【0068】
より詳細には、ＡＣＥ２遺伝子転写物またはその一部におけるプレｍＲＮＡスプライシングを修飾するために選択された標的部位に結合することが可能なＡＯＮが提供される。ＡＯＮは、好ましくは、配列番号１～３１、より好ましくは配列番号５、６、９もしくは１１、および／または表３のいずれかに示される配列から選択される。より好ましくは、ＡＯＮは、配列番号６と９または配列番号６と１１である。
【0069】
プレｍＲＮＡスプライシングの修飾は、好ましくは、「スキッピング」、あるいはｍＲＮＡの１つもしくは複数のエクソンの除去またはイントロンの保持を誘導する。得られたタンパク質は、内部切断または未熟終結のいずれかによって、親の完全長ＡＣＥ２タンパク質と比較した場合に、より短い長さのものであることが好ましい。これらのＣ末端切断型ＡＣＥ２タンパク質は、完全長ＡＣＥ２タンパク質のアイソフォームと称され得る。
【0070】
生成されたｍＲＮＡの残りのエクソンは、インフレームであってもよく、それが、元の３’末端と５’末端の間の領域において内部切断を有することを除いて、親の完全長タンパク質の配列と類似する配列を有するより短いタンパク質を生じ得る。別の可能性では、エクソンスキッピングは、タンパク質の第１の部分が親の完全長タンパク質と実質的に同一であるが、タンパク質の第２の部分がフレームシフトによって異なる配列（例えば、ナンセンス配列）を有するタンパク質をもたらすフレームシフトを誘導し得る。あるいは、エクソンスキッピングは、リーディングフレームの破壊および翻訳の未熟終結の存在によって、未熟に終結したタンパク質の産生を誘導し得る。未熟に終結したタンパク質は、未熟に終結したｍＲＮＡ（例えば、エクソン１４のスキッピング）、またはエクソン１４ｍＲＮＡを含有するｍＲＮＡを提供するが、これらのエクソンによってコードされたタンパク質の発現を提供しないミスセンススキップの結果であり得る。
【0071】
個々のエクソンのスキッピングは、好ましくは、ＡＣＥ２転写物のリーディングフレームを破壊し得る。これによって、タンパク質の機能不全または分解をもたらすミスセンスコード配列、またはＣ末端切断型タンパク質の翻訳またはナンセンスに媒介される崩壊によるｍＲＮＡ分解の増加を生じる未熟終結コドンをもたらすナンセンスコード配列が導入され得る。
【0072】
個々のエクソンのスキッピングは、好ましくは、リーディングフレームをインタクトに保ち得る。これによって、好ましくは、内部切断型タンパク質の翻訳がもたらされることになる。切断型タンパク質またはＡＣＥ２アイソフォームは、完全に切除された機能を有する場合もあり、低減した機能を有するかまたはデコイ受容体として作用する場合もある。
【0073】
好ましくは、これらの切断型、または未熟に終結したタンパク質は、膜保持および受容体内在化に関与する１つまたは複数の機能的ドメインを欠いている。
【0074】
例えば、エクソン１４は、ＡＣＥ２の非触媒的コレクトリン様ドメインの開始をコードし、このエクソンを除去することによって、可溶性ＡＣＥ２タンパク質が生成され、これが、ＡＣＥ２によって媒介されるコロナウイルス内在化の可溶性デコイまたは競合的アンタゴニストとして作用し得る可能性がある。切断型の、ナンセンスまたは未熟に終結したタンパク質は、他の因子への結合またはそれに対する結合部位をさらに欠く場合があり、その除去によって、ＡＣＥ２タンパク質の、関連するシグナル伝達経路との相互作用の低下がもたらされる可能性がある。
【0075】
内部切断型タンパク質（すなわち、１つまたは複数のエクソンによってコードされたアミノ酸を欠くタンパク質）の存在が好ましい。ＡＣＥ２触媒活性が阻害されると、身体がＡＣＥ２タンパク質の全量の低下を補おうとするため、ＡＣＥ２転写の増加に関して問題となり得る。対照的に、内部切断型タンパク質（好ましくは、完全なＡＣＥ２タンパク質の特徴のうちの１つまたは複数を欠く）の存在は、転写の増加を妨げるのに十分であるはずだが、可溶性ＡＣＥ２の増加および膜に結合したＡＣＥ２タンパク質総量の低下によって、依然として治療的利益をもたらす。
【0076】
ＡＯＮを使用する本発明のスキッピングプロセスは、個々のエクソンを排除（スキップ）することができるか、または２つもしくはそれより多いエクソンのスキッピングを一度でもたらすことができる。
【0077】
ＡＯＮを使用する本発明のスキッピングプロセスは、１つまたは複数のエクソンを直接スキッピングするかまたはしないイントロン配列の保持を含み得る。
【0078】
本発明のＡＯＮは、ＡＣＥ２遺伝子転写物におけるエクソン排除を誘導するために、選択された標的に結合することが可能な２つまたはそれより多いＡＯＮの組合せであってもよい。この組合せは、２つもしくはそれより多いＡＯＮのカクテルおよび／あるいは２つもしくはそれより多いＡＯＮまたは一緒に接合した２つもしくはそれより多いＡＯＮを含む構築物であってもよい。
【表3】
【0079】
本発明は、ＡＣＥ２遺伝子転写物における選択的スプライシングをモジュレートするための方法であって、
本明細書に記載されたＡＯＮの１つまたは複数を提供して、オリゴマーを標的核酸部位に結合させるステップ
を含む、方法をさらに提供する。
本明細書に記載されたＡＯＮの１つまたは複数を提供して、オリゴマーを標的核酸部位に結合させるステップ
を含む、方法をさらに提供する。
【0080】
本発明のさらに別の態様によれば、配列番号１～３１、より好ましくは配列番号５、６、９もしくは１１、および／または表３のいずれかに示される配列およびそれらに相補的な配列からなる群から選択される核酸配列のＤＮＡ等価物を含むＡＣＥ２プレｍＲＮＡの選択的スプライシングをモジュレートするための核酸配列標的が提供される。より好ましくは、ＡＯＮの組合せは、好ましくは、配列番号６と９、または配列番号６と１１の組合せである。
【0081】
コンセンサススプライス部位を完全にマスクするようＡＯＮを設計することによって、標的エクソンのスプライシングの変化は必ずしも生じ得ない。さらに、本発明者らは、ＡＯＮを設計する場合に、ＡＯＮ自体のサイズまたは長さが、常に主要な要因である訳ではないことを発見した。いくつかの標的に関して、２０塩基程度の短いＡＯＮは、いくつかのエクソンの包含を誘導することができ、ある特定の場合には、同じエクソンを対象とする他のより長い（例えば、２５塩基）オリゴマーよりも効率的に誘導することができた。
【0082】
本発明者らは、スプライシングを再指示するために、ＡＯＮによって遮断またはマスクされ得る標準的モチーフは何ら存在しないようであることも発見した。各遺伝子標的に対して、ＡＯＮが設計され、それらの個々の有効性が経験的に評価されなければならないことが見出された。
【0083】
より詳細には、ＡＯＮは、表３に示されるものから選択されてもよい。配列は、好ましくは、配列番号１～３１、より好ましくは配列番号５、６、９または１１、およびその組合せまたはカクテルのうちのいずれか１つまたは複数からなる群から選択される。ＡＯＮの組合せは、好ましくは、配列番号６と９、または配列番号６と１１の組合せである。これには、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でこのような配列にハイブリダイズすることができる配列、それに対して相補的な配列、ＡＣＥ２遺伝子転写物におけるプレｍＲＮＡプロセシングを有するかまたはモジュレートする修飾された塩基、修飾された主鎖、およびその機能的切断または伸長を含有する配列にハイブリダイズすることができる配列が含まれる。
【0084】
オリゴマーとＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡとは、各分子における十分な数の対応する位置が、互いに水素結合し得るヌクレオチドによって占有されている場合に、互いに相補的である。よって、「特異的にハイブリダイズ可能な」および「相補的な」は、オリゴマーとＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡ標的との間に安定かつ特異的な結合が生じるような十分な程度の相補性または対合を示すために使用される用語である。ＡＯＮの配列が、特異的にハイブリダイズ可能であるべきその標的配列の配列に対して１００％相補的である必要がないことは、当技術分野において理解されている。化合物の標的ＤＮＡまたはＲＮＡ分子への結合が標的ＤＮＡまたはＲＮＡの産物の正常な機能を妨害し、かつ特異的結合が望ましい条件下、すなわちｉｎ ｖｉｖｏアッセイまたは治療処置の場合には生理学的条件下、およびｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの場合にはアッセイが実施される条件下で、ＡＯＮの非標的配列への非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性が存在する場合に、ＡＯＮは特異的にハイブリダイズ可能である。
【0085】
選択的ハイブリダイゼーションは、低、中または高ストリンジェンシー下にあってもよいが、好ましくは高ストリンジェンシー条件下にある。当業者は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーが、塩基組成、相補鎖の長さおよびハイブリダイズする核酸間のヌクレオチド塩基のミスマッチ数に加えて、塩濃度、温度、または有機溶媒などの条件によって影響を受けることを認識するであろう。ストリンジェントな温度条件は、一般に、３０℃を超える温度、典型的には３７℃を超える温度、好ましくは４５℃を超える温度、好ましくは少なくとも５０℃、典型的には６０℃～８０℃またはそれより高い温度を含むことになる。ストリンジェントな塩の条件は、通常１０００ｍＭ未満、典型的には５００ｍＭ未満、好ましくは２００ｍＭ未満となる。しかし、パラメーターの組合せは、いずれの単一のパラメーターの尺度よりもはるかにより重要である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、６５℃で０．１×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム ｐＨ７．０）である。よって、本発明のＡＯＮは、表３、または配列番号１～３１、より好ましくは配列番号５、６、９または１１に与えられる配列と選択的にハイブリダイズするオリゴマーを含んでもよい。より好ましくは、ＡＯＮの組合せは、好ましくは、配列番号６と９、または配列番号６と１１の組合せである。
【0086】
構造タンパク質におけるエクソンの末端でのコドンの配置はコドンの末端で必ずしも切れると限らなくてもよく、その結果、プレｍＲＮＡから１を超えるエクソンを欠失させて、ｍＲＮＡのインフレームでの読取りを確保する必要性があってもよいことが認識されるであろう。このような状況では、それぞれが所望のエクソンおよび／またはイントロンの包含を誘導するのを担う様々な領域に向けられる複数のＡＯＮが、本発明の方法によって選択される必要があってもよい。所与のイオン強度およびｐＨでは、Ｔｍは、標的配列の５０％が相補的ポリヌクレオチドとハイブリダイズする温度である。このようなハイブリダイゼーションは、ＡＯＮの標的配列に対する正確な相補性で生じるのと同様に、「おおよその（ｎｅａｒ）」または「実質的な」相補性で生じてもよい。
【0087】
典型的には、少なくとも約１４ヌクレオチドのストレッチにわたって、ＡＯＮのヌクレオチドとの、少なくとも約５５％の同一性、好ましくは少なくとも約６５％、より好ましくは少なくとも約７５％および最も好ましくは少なくとも約９０％、９５％、９８％または９９％の同一性が存在する場合に、選択的ハイブリダイゼーションが生じることになる。記載されているような相同性比較の長さは、さらに長いストレッチにわたってもよく、ある特定の実施形態では、少なくとも約９ヌクレオチド、通常少なくとも約１２ヌクレオチド、より通常には少なくとも約２０、多くの場合少なくとも約２１、２２、２３または２４ヌクレオチド、少なくとも約２５、２６、２７または２８ヌクレオチド、少なくとも約２９、３０、３１または３２ヌクレオチド、少なくとも約３６またはそれより多いヌクレオチドのストレッチにわたることが多い。
【0088】
よって、本発明のＡＯＮ配列は、好ましくは、本明細書の配列表に示される配列に対して少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６、８７、８８、８９または９０％の相同性を有する。より好ましくは、少なくとも９１、９２、９３、９４、または９５％、より好ましくは少なくとも９６、９７、９８％、または９９％の相同性が存在する。一般に、ＡＯＮの長さが短いほど、選択的ハイブリダイゼーションを得るのに要する相同性は大きい。その結果、本発明のＡＯＮが約３０未満のヌクレオチドからなる場合、同一性のパーセンテージは、本明細書の配列表で設定されるＡＯＮと比較して、７５％を超える、好ましくは８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５％、９６、９７、９８％または９９％を超えることが好ましい。ヌクレオチド相同性の比較は、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ＢｅｓｔｆｉｔプログラムまたはＧＡＰ（Deveraux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12, 387-395）などの配列比較プログラムによって行われてもよい。このようにして、本明細書で引用されるものに類似するかまたは実質的に異なる長さの配列は、アライメント中にギャップを挿入することによって比較されてもよく、このようなギャップは、例えば、ＧＡＰによって使用される比較アルゴリズムによって決定される。
【0089】
本発明のＡＯＮは、標的配列との低下した相同性の領域、および正確な相同性の領域を有してもよい。オリゴマーが、その全長に対して正確な相同性を有することは必要ではない。例えば、オリゴマーは、標的配列と同一である少なくとも４または５塩基の連続ストレッチ、好ましくは標的配列と同一である少なくとも６または７塩基の連続ストレッチ、より好ましくは標的配列と同一である少なくとも８または９塩基の連続ストレッチを有してもよい。オリゴマーは、標的配列と同一である少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６塩基のストレッチを有してもよい。オリゴマー配列の残りのストレッチは、標的配列と断続的に同一であってもよく、例えば、残りの配列は、同一の塩基、それに続いて同一ではない塩基、それに続いて同一の塩基を有してもよい。あるいは（または同様に）、オリゴマー配列は、完全な相同性に満たないストレッチが散在したいくつかの同一配列のストレッチ（例えば、３、４、５または６塩基）を有してもよい。このような配列ミスマッチは、好ましくは、スプライススイッチング活性を全く喪失しないかまたはほとんど喪失しない。
【0090】
「モジュレートする（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」または「モジュレートする（ｍｏｄｕｌａｔｅｓ）」という用語は、必要に応じて、定義された量および／または統計的に有意な量によって、１つまたは複数の定量可能なパラメーターを「増加させる」または「減少させる」ことを含む。「増加させる（ｉｎｃｒｅａｓｅ）」もしくは「増加させること（ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ）」、「増強する（ｅｎｈａｎｃｅ）」もしくは「増強すること（ｅｎｈａｎｃｉｎｇ）」、または「刺激する（ｓｔｉｍｕｌａｔｅ）」もしくは「刺激すること（ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ）」という用語は、一般に、ＡＯＮがないことまたは対照化合物のいずれかによって引き起こされる応答に対して、細胞または対象においてより大きな生理的応答（すなわち、下流効果）を生じるかもしくは引き起こすものまたはＡＯＮまたは組成物の能力を指す。「減少させること（ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ）」または「減少させる（ｄｅｃｒｅａｓｅ）」という用語は、一般に、ＡＯＮがないことまたは対照化合物のいずれかによって引き起こされる応答に対して、細胞または対象において低下した生理的応答（すなわち、下流効果）を生じるかもしくは引き起こすものまたはＡＯＮまたは組成物の能力を指す。
【0091】
関連する生理的なまたは細胞性の応答（ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ）は当業者にとって明らかであり、それには、それを必要とする細胞、組織または対象における、ＡＣＥ２をコードするプレｍＲＮＡにおける特定のエクソンの排除の増加、可溶性ＡＣＥ２の増加または完全長ＡＣＥ２タンパク質の発現の低下が含まれてもよい。「増加した（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ）」または「増強された（ｅｎｈａｎｃｅｄ）」量は、典型的には、統計的に有意な量であり、ＡＯＮがないこと（作用剤の非存在）または対照化合物によって産生される量の１．１、１．２、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０倍またはそれより多い倍数（例えば、５００倍、１０００倍）（１との間の、および１を上回るあらゆる整数および小数点、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８を含む）である増加を含んでもよい。「低減する（ｒｅｄｕｃｅ）」または「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」という用語は、一般に、診断の技術分野における日常的技法によって測定される場合、本明細書に記載の疾患または状態の症状などの関連する生理的なまたは細胞性の応答を「低下させる（ｄｅｃｒｅａｓｅ）」１つまたは複数のＡＯＮまたは組成物の能力に関してもよい。関連する生理的なまたは細胞性の応答（ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ）は当業者にとって明らかであり、それには、コロナウイルス感染症、肺障害、慢性腎疾患、慢性心疾患、高血圧および糖尿病のなどの疾患の症状または病態の低減が含まれてもよい。応答における「低下」は、ＡＯＮがないことまたは対照組成物によって生じる応答と比較して、統計的に有意であってもよく、それには、その間のすべての整数をふくむ、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の低下が含まれてもよい。
【0092】
ＡＯＮの長さは、それがプレｍＲＮＡ分子内での意図された位置に選択的に結合することが可能である限り、変化してもよい。このような配列の長さは、本明細書に記載の選択手順に従って決定することができる。一般に、ＡＯＮは、長さ約１０ヌクレオチドから長さ約５０ヌクレオチドまでとなる。しかし、この範囲内の任意の長さのヌクレオチドが、本方法において使用され得ることが認識されるであろう。好ましくは、ＡＯＮの長さは、１０～４０、１０～３５、１５～３０ヌクレオチド長、または２０～３０ヌクレオチド長、最も好ましくは約２５～３０ヌクレオチド長の間である。例えば、オリゴマーは、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチド長であってもよい。
【0093】
本明細書で使用される場合、「ＡＯＮ」は、ワトソン－クリックの塩基対合によって、ＲＮＡにおいて核酸塩基を標的配列にハイブリダイズさせて、標的配列内にオリゴヌクレオチド：ＲＮＡのヘテロ二重鎖を形成するヌクレオチド、またはヌクレオチドアナログの線状配列を指す。「ＡＯＮ」、「ＡＯＮ」、「オリゴマー」および「アンチセンス化合物」という用語は、オリゴヌクレオチドを指すのに交換可能に使用することができる。環状サブユニットは、リボース糖もしくは別のペントース糖、またはある特定の実施形態では、モルホリノ基（以下のモルホリノオリゴヌクレオチドの説明を参照されたい）に基づいてもよい。企図されるのはまた、当技術分野で公知の他のアンチセンス作用剤の中でも、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、および２’－Ｏ－Ｍｅ ＰＴＯオリゴヌクレオチドである。
【0094】
含まれるのは、（ｉ）修飾された主鎖構造、例えば、天然に存在するオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドに見られる標準的ホスホジエステル連結以外の主鎖、ならびに／または（ｉｉ）修飾された糖部分、例えば、リボース部分もしくはデオキシリボース部分ではなくモルホリノ部分を有するＡＯＮまたはオリゴヌクレオチドを含む、天然に存在しないＡＯＮまたは「オリゴヌクレオチドアナログ」である。オリゴヌクレオチドアナログは、標準的ポリヌクレオチド塩基に対するワトソン－クリック塩基対合による水素結合が可能な塩基をサポートし、ここで、アナログの主鎖は、オリゴヌクレオチドアナログ分子と標準的ポリヌクレオチド（例えば、一本鎖ＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡ）における塩基との間で配列特異的な方式でこのような水素結合を許容する様式で塩基を提示する。好ましいアナログは、実質的に非荷電性のリン含有主鎖を有するものである。
【0095】
本発明の当業者は本発明の目的で使用可能であり得る好適な主鎖の他の形態に気付くであろうが、ＡＯＮを生成するための１つの方法は、２’ヒドロキシリボース位のメチル化であり、ホスホロチオエート主鎖の組込みは一見ＲＮＡに類似するが、ヌクレアーゼ分解にはるかに抵抗性である分子を生じる。
【0096】
ＡＯＮとの二重鎖形成中のプレｍＲＮＡの分解を回避するために、本方法で使用されるＡＯＮは、内因性ＲＮａｓｅ Ｈによる切断を最小限にするかまたは防ぐように適合させてもよい。ＲＮａｓｅ Ｈを含有する細胞内または粗抽出物のいずれかにおけるメチル化されていないオリゴマーによるＲＮＡの処置は、プレｍＲＮＡ：ＡＯＮ二重鎖の分解をもたらすので、この特性は非常に好ましい。このような分解を迂回するかまたは誘導しないことが可能である任意の形態の修飾されたＡＯＮを本発明の方法において使用することができる。ヌクレアーゼ抵抗性は、それが、部分的に不飽和の脂肪族炭化水素鎖と、カルボン酸基、エステル基、およびアルコール基を含む１つまたは複数の極性基または荷電基とを含むように、本発明のＡＯＮを修飾することによって達成されてもよい。
【0097】
ＲＮＡと二重鎖を形成する場合、細胞のＲＮａｓｅ Ｈによって切断されないＡＯＮの例は、２’－Ｏ－Ｍｅ誘導体である。このような２’－Ｏ－Ｍｅオリゴリボヌクレオチドは、細胞環境および動物組織において安定であり、ＲＮＡとのそれらの二重鎖はリボ－またはデオキシリボ－対応物よりも高いＴｍ値を有する。あるいは、本発明のヌクレアーゼ抵抗性ＡＯＮは、フッ素化された最後の３’末端ヌクレオチドの少なくとも１つを有してもよい。またあるいは、本発明のヌクレアーゼ抵抗性ＡＯＮは、最後の３’末端ヌクレオチド塩基の少なくとも２つの間を連結するホスホロチオエート結合を有し、好ましくは最後の４つの３’末端ヌクレオチド塩基間を連結するホスホロチオエート結合を有する。
【0098】
スプライススイッチングの増加は、代替のオリゴヌクレオチド化学を用いて達成されてもよい。例えば、ＡＯＮは、ホスホロアミデートまたはホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）；ＰＭＯ－Ｘ；ＰＰＭＯ；ペプチド核酸（ＰＮＡ）；ロックド核酸（ＬＮＡ）、チオモルホリノ（ＴＭＯ）；およびアルファ－Ｌ－ＬＮＡ、２’－アミノＬＮＡ、４’－メチルＬＮＡおよび４’－Ｏ－メチルＬＮＡを含む誘導体；エチレン架橋した核酸（ＥＮＡ）およびそれらの誘導体；ホスホロチオエートオリゴマー；トリシクロ－ＤＮＡオリゴマー（ｔｃＤＮＡ）；トリシクロホスホロチオエートオリゴマー；２’－Ｏ－Ｍｅ修飾オリゴマー（２’－Ｏ－Ｍｅ）；２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）；２’－フルオロ，２’－フルオロアラビノ（ＦＡＮＡ）；非ロックド核酸（ＵＮＡ）；熱安定性のねじれ挿入核酸（ＴＩＮＡ）、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）；シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）；２’－アミノ（２’－ＮＨ２）；２’－Ｏ－エチレンアミンまたはミックスマーとしてのもしくはギャップマーとしての前述のものの任意の組合せを含むリストから選択されてもよい。送達有効性をさらに改善するために、上述の修飾ヌクレオチドは、糖部分または核酸塩基部分に対して、脂肪酸／脂質／コレステロール／アミノ酸／炭水化物／多糖類／ナノ粒子などによりコンジュゲートされることが多い。これらのコンジュゲートされたヌクレオチド誘導体を使用して、エクソンスキッピング用のＡＯＮを構築することもできる。ヒトＡＣＥ２遺伝子転写物のアンチセンスオリゴヌクレオチドに誘導されるスプライス修飾は、一般に、ホスホロチオエート主鎖においてオリゴリボヌクレオチド、ＰＮＡ、２’－Ｏ－Ｍｅまたは２’－ＭＯＥのいずれかで修飾された塩基を使用している。２’－Ｏ－Ｍｅ ＰＴＯ ＡＯＮは、カチオン性リポプレックスとして送達される場合にそれらのｉｎ ｖｉｔｒｏでの効率的取込みに起因して、一般に、オリゴの設計に使用される。代替の化学構造を使用して、本発明のＡＯＮを生成する場合、本明細書において提供される配列のウラシル（Ｕ）はチミン（Ｔ）によって置き換えられてもよく、またはリボヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチドで置き換えられてもよい。
【0099】
本発明のＡＯＮの範囲内に含まれるのは、（ｉ）修飾された主鎖構造、例えば、天然に存在するオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドにおいて見られる標準的なホスホジエステル連結以外の主鎖、ならびに／または（ｉｉ）修飾された糖部分、例えば、リボース部分もしくはデオキシリボース部分ではなくモルホリノ部分を有するオリゴマーを含む天然に存在しないオリゴマー、または「オリゴヌクレオチドアナログ」である。オリゴマーアナログは、標準的ポリヌクレオチド塩基に対するワトソン－クリック塩基対合による水素結合が可能な塩基をサポートし、ここで、アナログの主鎖は、オリゴマーアナログ分子と標準的ポリヌクレオチド（例えば、一本鎖ＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡ）における塩基との間で配列特異的な方式でこのような水素結合を許容する様式で塩基を提示する。好ましいアナログは、実質的に非荷電性のリン含有主鎖を有するものである。
【0100】
ＲＮａｓｅ Ｈを活性化しないアンチセンスオリゴヌクレオチドは、公知の技法（例えば、米国特許第５，１４９，７９７号を参照されたい）に従って作製することができる。デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの配列であり得る、このようなＡＯＮは、その１つのメンバーとしてオリゴマーを含有する二重鎖分子へのＲＮａｓｅ Ｈの結合を立体的に妨害するかまたは防止するいずれかの構造的修飾を単に含有し、その構造的修飾は二重鎖形成を実質的に妨害も破壊もしない。二重鎖形成に関与するオリゴマーの部分が、それへのＲＮａｓｅ Ｈの結合に関与するこれらの部分と実質的に異なるため、ＲＮａｓｅ Ｈを活性化しない多数のＡＯＮが利用可能である。例えば、このようなＡＯＮは、ヌクレオチド間を架橋するリン酸残基の少なくとも１つ、またはすべてが、ホスホン酸メチル、メチルホスホロチオエート、ホスホロモルホリデート、ホスホロピペラジデート、ボラノホスフェート、アミド連結およびホスホロアミデートなどの修飾されたリン酸であるオリゴマーであってもよい。例えば、ヌクレオチド間を架橋するリン酸残基が１つおきに、記載されているように修飾されてもよい。別の非限定的な例では、このようなＡＯＮは、ヌクレオチドの少なくとも１つ、またはすべてが、２’低級アルキル部分（例えば、Ｃ１～Ｃ４の線状または分枝状の、飽和または不飽和のアルキル、例えばメチル、エチル、エテニル、プロピル、１－プロペニル、２－プロペニル、およびイソプロピルなど）を含有する分子である。例えば、ヌクレオチドが１つおきに、記載されているように修飾されてもよい。
【0101】
上記ＡＯＮは本発明のＡＯＮの好ましい形態である一方で、本発明は、以下に記載されているようなオリゴマー模倣体を含むが、これらに限定されない他のオリゴマーアンチセンス分子を含む。
【0102】
本発明において有用な好ましいＡＯＮの具体例には、修飾された主鎖または非天然のヌクレオシド間連結を含有するオリゴマーが含まれる。本明細書で定義されているように、修飾された主鎖を有するオリゴマーには、主鎖中にリン原子を保持するもの、および主鎖中にリン原子を有さないものが含まれる。本明細書の目的として、および当技術分野で参照されることがあるように、それらのヌクレオシド間の主鎖中にリン原子を有さない修飾されたオリゴマーもＡＯＮであると考えることができる。
【0103】
他の好ましいオリゴマー模倣体では、ヌクレオチド単位の糖とヌクレオシド間連結の両方、すなわち主鎖が、新規の基で置き換えられる。適当な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために塩基単位が維持される。優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているオリゴマー模倣体であるこのようなオリゴマー化合物の１つは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡ化合物では、オリゴマーの糖主鎖は、アミド含有主鎖、特にアミノエチルグリシン主鎖で置き換えられる。核酸塩基は保持され、主鎖のアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合される。
【0104】
別の好ましい化学構造は、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）オリゴマー化合物であり、これは任意の公知のヌクレアーゼまたはプロテアーゼによって分解されない。これらの化合物は非荷電性であり、ＲＮＡ鎖に結合した場合にＲＮａｓｅ Ｈ活性を活性化せず、ｉｎ ｖｉｖｏ投与の後に持続したスプライスモジュレーションを発揮することが示されている（Summerton and Weller, Antisense Nucleic Acid Drug Development, 7, 187-197）。
【0105】
修飾されたオリゴマーは、１つまたは複数の置換された糖部分を含有してもよい。オリゴマーは、核酸塩基（当技術分野では、単に「塩基」と呼ばれることが多い）の修飾または置換を含んでもよい。ある特定の核酸塩基は、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を高めるのに特に有用である。これらには、５－置換されたピリミジン、６－アザピリミジン、ならびに２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシルおよび５－プロピニルシトシンを含むＮ－２、Ｎ－６およびＯ－６置換されたプリンが含まれる。５－メチルシトシン置換は、さらにより詳細には２’－ＭＯＥ修飾と組み合わせた場合に、０．６～１．２℃で核酸二重鎖の安定性を高めることが示されている。
【0106】
本発明のオリゴマーの別の修飾は、オリゴマーの活性、細胞分布または細胞への取込みを増強する１つもしくは複数の部分またはコンジュゲートをオリゴマーに化学的に連結させることに関与する。このような部分としては、コレステロール部分、コール酸などの脂質部分、チオエーテル、例えばヘキシル－Ｓ－トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基、リン脂質、例えばジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－Ｈ－ホスホネート、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖、またはアダマンタン酢酸、パルミチル部分、ミリスチル、またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ－カルボニル－オキシコレステロール部分が挙げられるが、これらに限定されない。
【0107】
細胞透過性ペプチドをホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーに添加して、細胞の取込みおよび核局在化を増強した。Jearawiriyapaisarn et al. (2008), Mol. Ther. 16 9, 1624-1629において示されるように、様々なペプチドタグが取込みの効率および標的組織の特異性に影響を与えることが示されている。
【0108】
所与の化合物におけるすべての位置について均一に修飾される必要はなく、実際に、１を超える前述の修飾は、単一の化合物に、またはオリゴマー内の単一ヌクレオシドにさえも、組み込まれてもよい。本発明は、キメラ化合物であるＡＯＮも含む。本発明の文脈における「キメラ」ＡＯＮまたは「キメラ」は、それぞれ少なくとも１つのモノマー単位、すなわち、オリゴマー化合物の場合にはヌクレオチドで構成される２つまたはそれより多い化学的に別個の領域を含有するＡＯＮ、特にオリゴマーである。これらのオリゴマーは、典型的には、オリゴマーまたはＡＯＮにヌクレアーゼ分解に対する増加した抵抗性、増加した細胞取込み、および標的核酸に対する増加した結合親和性のための追加の領域を付与するようにオリゴマーが修飾される少なくとも１つの領域を含有する。
【0109】
当技術分野における日常的技法に従って、ＡＯＮおよびそのバリアントの活性をアッセイすることができる。例えば、調査されるＲＮＡおよびタンパク質のスプライス形態および発現レベルは、転写された核酸またはタンパク質のスプライス形態および／または発現を検出するための多種多様な周知の方法のいずれかによって評価されてもよい。このような方法の非限定的な例としては、ＲＮＡのスプライス形態のＲＴ－ＰＣＲとその後のＰＣＲ産物のサイズ分離、核酸のハイブリダイゼーション方法、例えば、ノーザンブロットおよび／または核酸アレイの使用；核酸増幅方法；タンパク質の検出のための免疫学的方法；タンパク質の精製方法；ならびにタンパク質の機能または活性のアッセイが挙げられる。
【0110】
ＲＮＡの発現レベルは、細胞、組織または生物からｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ（すなわち、転写されたポリヌクレオチド）を調製することによって、およびアッセイされる核酸、またはその断片の相補鎖である参照ポリヌクレオチドとｍＲＮＡ／ｃＤＮＡをハイブリダイズさせることによって評価するこができる。相補的ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに先立って、種々のポリメラーゼ連鎖反応またはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写方法のいずれかを使用して、ｃＤＮＡを必要に応じて増幅することができ、好ましくは、これは増幅されない。転写物の発現レベルを評価するために、１つまたは複数の転写物の発現を、定量ＰＣＲを使用して検出することもできる。
【0111】
本発明は、ＡＣＥ２遺伝子転写物のＡＯＮに誘導されるスプライススイッチング、臨床的に関連するオリゴマー化学構造および送達系を提供して、ＡＣＥ２のスプライス操作を治療レベルの対象とする。ＡＣＥ２遺伝子の転写からの完全長ＡＣＥ２ ｍＲＮＡ、ひいては完全長ＡＣＥ２タンパク質の量の実質的な低下は、
ａ）（ｉ）イントロン－エンハンサー標的モチーフ、（ｉｉ）ＡＯＮの長さとオリゴマーカクテルの開発、（ｉｉｉ）化学構造の選択、および（ｉｖ）オリゴマー送達を増強するための細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）の添加という実験的な評価による、線維芽細胞の細胞株を使用するｉｎ ｖｉｔｒｏでのオリゴマーの洗練；ならびに
ｂ）１つまたは複数のエクソンが欠けているＡＣＥ２転写物を生成するための新規のアプローチの詳細な評価
によって達成される。
ａ）（ｉ）イントロン－エンハンサー標的モチーフ、（ｉｉ）ＡＯＮの長さとオリゴマーカクテルの開発、（ｉｉｉ）化学構造の選択、および（ｉｖ）オリゴマー送達を増強するための細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）の添加という実験的な評価による、線維芽細胞の細胞株を使用するｉｎ ｖｉｔｒｏでのオリゴマーの洗練；ならびに
ｂ）１つまたは複数のエクソンが欠けているＡＣＥ２転写物を生成するための新規のアプローチの詳細な評価
によって達成される。
【0112】
このように、本明細書では、ＡＣＥ２プレｍＲＮＡの選択的スプライシングが、特定のＡＯＮによりモジュレートされ得ることが実証される。このようにして、完全長（ウイルスの内在化を可能にする）ＡＣＥ２タンパク質の量の機能的に有意な低下を得ることができ、および／または可溶性デコイ－受容体ＡＣＥ２アイソフォームまたは他のデコイ受容体の増加を達成することができ、それによって、コロナウイルス感染症、肺疾患、慢性心疾患、慢性腎疾患、高血圧および糖尿病などの疾患に関連する重度の病態を低減することができる。
【0113】
本発明に従って使用されるＡＯＮは、固相合成の周知の技法によって好都合に作製されてもよい。このような合成のための機器は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．）を含むいくつかの供給業者によって販売されている。修飾された固形支持体上でオリゴマーを合成する１つの方法は、米国特許第４，４５８，０６６号に記載されている。
【0114】
当技術分野で公知のこのような合成のためのいずれかの他の手段が、追加的にまたは代替として用いられてもよい。類似の技法を使用して、ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体などのオリゴマーを調製することは周知である。このような自動化された一実施形態では、ジエチル－ホスホルアミダイトが出発材料として使用され、Beaucage, et al., (1981) Tetrahedron Letters, 22:1859-1862に記載されたように合成されてもよい。
【0115】
本発明のＡＯＮは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成され、生物起源のアンチセンス組成物、またはＡＯＮのｉｎ ｖｉｖｏ合成を対象とするように設計された遺伝子ベクター構築物を含まない。本発明の分子は、取り込み、分布および／または吸収を補助する他の分子、分子構造または化合物の混合物、例としては、リポソーム、受容体が標的とする分子、経口製剤、直腸製剤、局所製剤または他の製剤と混合されても、封入されても、コンジュゲートされてもよく、またはそうでなければそれに関連してもよい。
【0116】
本発明のＡＯＮは、予防薬または治療薬として使用することもでき、これは、疾患の処置の目的で利用されてもよい。したがって、一実施形態では、本発明は、ＡＣＥ２プレｍＲＮＡにおける選択された標的に結合し、本明細書に記載されている効率的かつ一貫したエクソンスキッピングを誘導し、治療有効量で、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と混合される、ＡＯＮを提供する。
【0117】
したがって、本発明は、対象におけるＡＣＥ２発現に関連する疾患の影響を処置、防止または改善するための医薬、予防用または治療用組成物であって、
ａ）本明細書に記載されているような１つまたは複数のＡＯＮ、ならびに
ｂ）１つまたは複数の薬学的に許容される担体および／または希釈剤
を含む、組成物を提供する。
ａ）本明細書に記載されているような１つまたは複数のＡＯＮ、ならびに
ｂ）１つまたは複数の薬学的に許容される担体および／または希釈剤
を含む、組成物を提供する。
【0118】
好ましくは、ＡＣＥ２発現に関連する疾患は、コロナウイルス感染症；心血管障害；呼吸器障害、筋骨格、腎臓障害、および内分泌障害を含むリストから選択される。
【0119】
本発明の一形態では、ＡＣＥ２関連障害は、以下の群：重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス、ＳＡＲＳ、ＳＡＲＳ－２、ＨＮＬ６３－ＣｏＶ（ＮＬ６３－Ｓ）およびＷＩＶ１－ＣｏＶから選択されるコロナウイルス感染症である。
【0120】
本発明の一形態では、ＡＣＥ２関連障害は、以下の群：アテローム性動脈硬化、虚血性心疾患、心筋炎、心内膜炎、心筋症、急性リウマチ熱、慢性リウマチ性心疾患（chronic rhematic heart disease）、脳血管疾患／卒中、心不全、血管石灰化、末梢血管疾患、およびリンパ管炎から選択される心血管障害である。
【0121】
本発明の一形態では、ＡＣＥ２関連障害は、呼吸器（肺）障害であり、以下の群：急性上気道感染症、鼻炎、上咽頭炎、副鼻腔炎、喉頭炎、インフルエンザおよび肺炎、急性気管支炎、急性細気管支炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、気管支拡張症、肺気腫、外部因子による慢性肺疾患、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、肺好酸球増多症、および胸膜炎、肺の外傷および肺の傷害、外傷または手術からの回復から選択される。
【0122】
本発明の一形態では、ＡＣＥ２関連障害は、腎臓障害であり、以下の群：糸球体腎炎、腎炎、糖尿病性腎疾患、間質性腎炎、閉塞性および逆流性腎症、急性腎不全、および慢性腎疾患から選択される。
【0123】
本発明の一形態では、ＡＣＥ２関連障害は、以下の群：真性糖尿病、インスリン抵抗性、耐糖能障害および甲状腺炎から選択される内分泌障害である。
【0124】
組成物は、本発明の所望のＡＯＮのそれぞれを、約１ｎＭ～１０００ｎＭ含んでもよい。好ましくは、組成物は、本発明のＡＯＮのそれぞれを、約１ｎＭ～５００ｎＭ、１０ｎＭ～５００ｎＭ、５０ｎＭ～７５０ｎＭ、１０ｎＭ～５００ｎＭ、１ｎＭ～１００ｎＭ、１ｎＭ～５０ｎＭ、１ｎＭ～４０ｎＭ、１ｎＭ～３０ｎＭ、１ｎＭ～２０ｎＭ、最も好ましくは１ｎＭ～１０ｎＭの間含んでもよい。
【0125】
組成物は、本発明の所望のＡＯＮのそれぞれを、約１ｎｍ、２ｎｍ、３ｎｍ、４ｎｍ、５ｎｍ、６ｎｍ、７ｎｍ、８ｎｍ、９ｎｍ、１０ｎｍ、２０ｎｍ、５０ｎｍ、７５ｎｍ、１００ｎｍ、１５０ｎｍ、２００ｎｍ、２５０ｎｍ、３００ｎｍ、３５０ｎｍ、４００ｎｍ、４５０ｎｍ、５００ｎｍ、５５０ｎｍ、６００ｎｍ、６５０ｎｍ、７００ｎｍ、７５０ｎｍ、８００ｎｍ、８５０ｎｍ、９００ｎｍ、９５０ｎｍまたは１０００ｎｍ含んでもよい。
【0126】
本発明は、ＡＣＥ２発現に関連する疾患または病態などの疾患の症状の予防または治療処置、防止または改善を補助するように適合させた１つまたは複数のＡＯＮを、対象への送達に好適な形態でさらに提供する。
【0127】
「薬学的に許容される」という語句は、生理的に忍容性であり、かつ対象に投与された場合に、急性胃蠕動などのようなアレルギー反応または類似する有害反応を典型的には生じない分子実体および組成物を指す。「担体」という用語は、化合物が共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。このような医薬担体は、水、および石油、動物、植物または合成起源のものを含む油、例えばピーナッツ油、ダイズ油、鉱物油、ゴマ油などの無菌の液体であり得る。水または生理食塩水溶液ならびに水性デキストロースおよびグリセロールの溶液は、好ましくは、特に注射溶液のための担体として用いられる。好適な医薬担体はMartin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, (1990)において記載されている。
【0128】
本発明のより特別な形態では、薬学的に許容される希釈剤、防腐剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバントおよび／または担体と一緒に、治療有効量の本発明の１つまたは複数のＡＯＮを含む医薬組成物が提供される。このような組成物は、様々な緩衝剤内容物（例えば、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨおよびイオン強度の希釈剤、ならびに界面活性剤および可溶化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ８０、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、防腐剤（例えば、Ｔｈｉｍｅｒｓｏｌ、ベンジルアルコール）および増量物質（例えば、ラクトース、マンニトール）などの添加剤を含む。材料は、ポリ乳酸、ポリグリコール酸などのようなポリマー化合物の微粒子調製物中、またはリポソーム中に組み込まれてもよい。ヒアルロン酸も使用されてもよい。このような組成物は、本発明のタンパク質および誘導体の物理的状態、安定性、ｉｎ ｖｉｖｏ放出の速度、およびｉｎ ｖｉｖｏクリアランスの速度に影響を与え得る。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) pages 1435-1712を参照されたい。組成物は、液体形態で調製されてもよく、または凍結乾燥形態などの乾燥粉末であってもよい。
【0129】
本発明に従って提供される医薬組成物が、当技術分野で公知の任意の手段によって投与されてもよいことが認識されるであろう。好ましくは、投与のための医薬組成物は、注射によって、経口的に、局所的にまたは肺もしくは鼻の経路によって投与される。適当な経路は、処置下の対象の状態に対して適宜、当業者によって決定されてもよい。
【0130】
ある特定の実施形態では、本開示のＡＯＮは、肺または鼻の経路（例えば、ＡＯＮを組み込んだ霧状化生理食塩水によって）で送達されてもよい。ＡＣＥ２ ｍＲＮＡの高レベルの内因性発現は、肺において見られ、気道を介してアクセス可能である。吸入されたオリゴヌクレオチドは、呼吸器疾患に対して出現した治療モダリティである。気道は、独特に、双性イオン脂質から主に構成される肺サーファクタントで裏打ちされている。これらのサーファクタント脂質は、呼吸器のｐＨにおいてカチオン性を有する。アニオン性オリゴヌクレオチドが吸入される場合、これらは、サーファクタントによって吸着される傾向があり、気管上皮細胞および肺胞上皮細胞によって肺細胞中に効率的に取り込まれることが仮定された再製剤化された粒子をもたらす。注目すべきことに、ＡＯＮは、噴霧化プロセスに耐えることができることが示されている。
【0131】
ある特定の実施形態では、ＡＯＮは、より好ましくは、投与の静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内または皮下の経路によって送達される。血管循環または血管外循環、血液系またはリンパ系、および脳脊髄液は、ＡＯＮが導入されてもよい一部の非限定的な部位である。
【0132】
ある特定の実施形態では、直接的なＣＮＳへの送達が用いられてもよく、例えば、脳内、心室または髄腔内投与が、投与経路として使用されてもよい。
【0133】
局所投与用の製剤としては、本開示のオリゴマーが、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤および表面活性物質などの局所送達剤との混合物中にあるものが挙げられる。脂質およびリポソームには、中性（例えば、ジオレオイルホスファチジルＤＯＰＥエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロイルホスファチジルコリン）、陰性（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロールＤＭＰＧ）およびカチオン性（例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰおよびジオレオイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ）が含まれる。局所投与または他の投与については、本開示のオリゴマーはリポソーム内に封入されてもよく、またはそれとの、特にカチオン性リポソームとの複合体を形成してもよい。あるいは、オリゴマーは、脂質、特にカチオン性脂質と複合体形成されてもよい。脂肪酸およびエステル、その薬学的に許容される塩、ならびにそれらの使用は、米国特許第６，２８７，８６０号および／または１９９９年５月２０日に出願された米国特許出願第０９／３１５，２９８号においてさらに記載されている。
【0134】
ある特定の実施形態では、本開示のＡＯＮは、経皮法（例えば、必要に応じてリポソーム内にパッケージングされたこのようなＡＯＮによる、ＡＯＮの、例えば、エマルションへの組込みによる）によって送達することができる。送達のこのような経皮法およびエマルション／リポソームに媒介される方法は、当技術分野におけるＡＯＮの送達について、例えば、米国特許第６，９６５，０２５号において記載されている。
【0135】
本明細書に記載のＡＯＮは、埋め込み可能なデバイスを介して送達されてもよい。このようなデバイスの設計は、当技術分野で認識されたプロセスであり、例えば合成インプラントの設計は、例えば米国特許第６，９６９，４００号において記載されている。
【0136】
経口投与用の組成物および製剤としては、粉末または顆粒、微粒子、ナノ粒子、水または非水性媒体における懸濁液または溶液、カプセル剤、ゲルカプセル剤、サシェ、錠剤またはミニ錠剤が挙げられる。増粘剤、風味剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤または結合剤が望ましい場合もある。経口製剤は、本開示のオリゴマーが、１つまたは複数の浸透増強剤、表面活性物質およびキレート剤と併せて投与されるものである。表面活性物質としては、脂肪酸および／またはそのエステルもしくは塩、胆汁酸および／またはその塩が挙げられる。胆汁酸／塩および脂肪酸ならびにそれらの使用は、米国特許第６，２８７，８６０号においてさらに記載されている。一部の実施形態では、本開示は、浸透増強剤の組合せ、例えば胆汁酸／塩と組み合わせた脂肪酸／塩を提供する。例示的な組合せは、ラウリン酸のナトリウム塩、カプリン酸およびＵＤＣＡである。さらなる浸透増強剤としては、ポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン－２０－セチルエーテルが挙げられる。本開示のオリゴマーは、噴霧される乾燥粒子を含む顆粒形態で経口的に送達されてもよく、または複合体化されて微粒子またはナノ粒子を形成してもよい。オリゴマー複合体形成剤およびそれらの使用は、米国特許第６，２８７，８６０号においてさらに記載されている。オリゴマーのための経口製剤およびそれらの調製物は、ＵＳ６，８８７，９０６、１９９９年５月２０日に出願された０９／３１５，２９８および／またはＵＳ２００３００２７７８０において詳細に記載されている。
【0137】
非経口、髄腔内または脳室内投与のための組成物および製剤は、緩衝液、希釈剤ならびに以下に限定されないが、浸透増強剤、担体化合物および他の薬学的に許容される担体または賦形剤などの他の好適な添加剤を含有してもよい無菌の水溶液を含んでもよい。
【0138】
治療上有用な量のＡＯＮの送達は、以前公開された方法によって達成されてもよい。例えば、ＡＯＮの細胞内送達は、ＡＯＮと有効量のブロックコポリマーの混合物を含む組成物を介してもよい。この方法の例は、米国特許出願ＵＳ２００４０２４８８３３において記載されている。ＡＯＮの核への送達の他の方法は、Mann CJ et al. (2001) Proc, Natl. Acad. Science, 98(1) 42-47、およびGebski et al. (2003) Human Molecular Genetics, 12(15): 1801-1811において記載されている。発現ベクターによって、ネイキッドＤＮＡまたは脂質担体と複合体形成したＤＮＡのいずれかとして、核酸分子を細胞内に導入する方法は、ＵＳ６，８０６，０８４において記載されている。
【0139】
コロイド分散系においてＡＯＮを送達することが望ましい場合がある。コロイド分散系には、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、および水中油エマルションを含む脂質ベースの系、ミセル、混合ミセル、およびリポソームまたはリポソーム製剤が含まれる。これらのコロイド分散系は、治療用医薬組成物の製造において使用することができる。
【0140】
リポソームは人工膜小胞であり、これは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの送達ビヒクルとして有用である。これらの製剤は、正味のカチオン性、アニオン性、または中性の電荷特性を有してもよく、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏの送達法について有用な特徴を有してもよい。大きな単層小胞が大きな高分子を含有する水性緩衝剤の実質的なパーセンテージを封入できることが示されている。ＲＮＡおよびＤＮＡは、水性内部中に封入することができ、生物学的に活性な形態で細胞に送達することができる（Fraley, et al., Trends Biochem. Sci. 6:77, 1981）。
【0141】
リポソームが効率的な遺伝子移入ビヒクルであるために、以下の特徴が存在するべきである：（１）それらの生物活性を損なわないようにしながら高効率で目的のＡＯＮを封入すること；（２）非標的細胞と比較して、優先的かつ実質的な標的細胞への結合；（３）標的細胞の細胞質への小胞の水性内容物の高効率での送達；および（４）遺伝情報の正確かつ効果的な発現（Mannino, et al., Biotechniques, 6:682, 1988）。通常、リポソームの組成は、通常ステロイド、特にコレステロールと組み合わせた、リン脂質、特に相転移温度の高いリン脂質の組合せである。他のリン脂質または他の脂質が使用されてもよい。リポソームの物理的特徴は、ｐＨ、イオン強度、および二価のカチオンの存在に左右される。カチオン性リポソームは、負に荷電したＤＮＡ分子と相互作用して安定な複合体を形成すると考えられている正に荷電したリポソームである。ｐＨに感受性であるか、または負に荷電しているリポソームは、それと複合体形成するのではなく、ＤＮＡを捕捉すると考えられる。カチオン性リポソームと非カチオン性リポソームの両方が、ＤＮＡを細胞に送達するために使用されている。
【0142】
リポソームには、本明細書で使用される場合、リポソーム中に組み込まれた場合に、特殊化された脂質を欠いているリポソームに対して増強された循環寿命を生じる１つまたは複数のこのように特殊化された脂質を含むリポソームを指す用語である「立体的に安定化された」リポソームも含まれる。立体的に安定化されたリポソームの例は、リポソームの小胞形成脂質部分の一部が、１つまたは複数の糖脂質を含むか、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分などの１つまたは複数の親水性ポリマーとの誘導体であるものである。リポソームおよびそれらの使用は、ＵＳ６，２８７，８６０においてさらに記載されている。
【0143】
本明細書に記載のＡＯＮは、埋め込み可能なデバイスを介して送達されてもよい。このようなデバイスの設計は、例えば、その内容が参照によりその全体として本明細書に組み込まれる米国特許第６，９６９，４００号に記載された、例えば、合成インプラント設計に関する当技術分野で認識されたプロセスである。
【0144】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、当技術分野で認識された技法（例えば、トランスフェクション、電気穿孔、融合、リポソーム、コロイド状ポリマー粒子ならびにウイルスベクターおよび非ウイルスベクターならびに当技術分野で公知の他の手段）を使用して細胞内に導入することができる。選択される送達方法は、処置される細胞および細胞の位置に少なくとも左右され、当業者にとって明らかであろう。例えば、局在化は、表面にリポソームを対象とする特異的マーカーを有するリポソーム、標的細胞を含有する組織への直接注射、特異的な受容体に媒介される取込みなどによって達成され得る。
【0145】
当技術分野で公知のように、ＡＯＮは、例えば、リポソームに媒介される取込み、脂質コンジュゲート、ポリリシンに媒介される取込み、ナノ粒子に媒介される取込み、および受容体に媒介されるエンドサイトーシス、ならびに送達の追加の非エンドサイトーシス方式、例えば微量注入、透過処理（例えば、ストレプトリジン－Ｏ透過処理、アニオン性ペプチド透過処理）、電気穿孔、および当技術分野で公知である様々な非侵襲性非エンドサイトーシスの送達方法（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるDokka and Rojanasakul, Advanced Drug Delivery Reviews 44, 35-49を参照のこと）に関与する方法を使用して送達されてもよい。
【0146】
ＡＯＮを他の薬学的に許容される担体または希釈剤と組み合わせて、医薬組成物を生成してもよい。好適な担体および希釈剤としては、等張生理食塩水溶液、例えばリン酸緩衝生理食塩水が挙げられる。組成物は、非経口、筋肉内、静脈内、皮下、眼内、経口、または経皮の投与のために製剤化されてもよい。
【0147】
熟練した開業医は、最適な投与経路ならびにいずれかの特定の動物および状態に対するいずれかの投与量を容易に決定することができるため、記載された投与経路はガイドとして意図されるにすぎない。
【0148】
ｉｎ ｖｉｔｒｏとｉｎ ｖｉｖｏの両方で、機能的な新しい遺伝物質を細胞内に導入するための複数のアプローチが試みられている（Friedmann (1989) Science, 244:1275-1280）。これらのアプローチには、発現される遺伝子の修飾レトロウイルスへの組込み（Friedmann (1989) 上掲；Rosenberg (1991) Cancer Research 51(18), suppl.: 5074S-5079S）；非レトロウイルスベクターへの組込み（Rosenfeld, et al. (1992) Cell, 68:143-155；Rosenfeld, et al. (1991) Science, 252:431-434）；またはリポソームを介した異種のプロモーター／エンハンサーエレメントに連結された導入遺伝子の送達（Friedmann (1989)、上掲；Brigham, et al. (1989) Am. J. Med. Sci., 298:278-281；Nabel, et al. (1990) Science, 249:1285-1288；Hazinski, et al. (1991) Am. J. Resp. Cell Molec. Biol., 4:206-209；およびWang and Huang (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 84:7851-7855）；リガンド特異的なカチオン系輸送システムへの接続（Wu and Wu (1988) J. Biol. Chem., 263:14621-14624）またはネイキッドＤＮＡ、発現ベクターの使用（Nabel et al. (1990)、上掲）；Wolff et al. (1990) Science, 247:1465-1468）が含まれる。組織への導入遺伝子の直接注入は局在化された発現のみを生じる（Rosenfeld (1992) 上掲）；Rosenfeld et al. (1991) 上掲；Brigham et al. (1989) 上掲；Nabel (1990) 上掲；およびHazinski et al. (1991) 上掲）。Ｂｒｉｇｈａｍらのグループ（Am. J. Med. Sci. (1989) 298:278-281およびClinical Research (1991) 39 (abstract)）は、ＤＮＡリポソーム複合体の静脈内または気管内の投与のいずれかに続くマウスの肺のみのｉｎ ｖｉｖｏトランスフェクションを報告している。ヒトの遺伝子療法の手順の総説の例は：Anderson, Science (1992) 256:808-813；Barteau et al. (2008), Curr Gene Ther; 8(5):313-23；Mueller et al. (2008). Clin Rev Allergy Immunol; 35(3):164-78；Li et al. (2006) Gene Ther., 13(18):1313-9；Simoes et al. (2005) Expert Opin Drug Deliv; 2(2):237-54である。
【0149】
本発明のＡＯＮは、ヒトを含む動物への投与の際、生物学的に活性なその代謝物または残基を（直接的または間接的に）提供することが可能である、任意の薬学的に許容される塩、エステル、またはこのようなエステルの塩、または任意の他の化合物を包含する。従って、例として、本開示はまた、本発明の化合物のプロドラッグおよび薬学的に許容される塩、このようなプロドラッグの薬学的に許容される塩、および他の生物学的等価物にも向けられる。
【0150】
「薬学的に許容される塩」という用語は、本発明の化合物の生理学的かつ薬学的に許容される塩、すなわち、親化合物の所望の生物活性を保持し、かつ望ましくない毒性効果をそれに付与しない塩を指す。オリゴマーについては、薬学的に許容される塩の好ましい例としては、以下に限定されないが、（ａ）ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウムなどのカチオン、スペルミンおよびスペルミジンなどのポリアミンなどと共に形成される塩；（ｂ）無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸などと共に形成される酸付加塩；（ｃ）有機酸、例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸などのような有機酸と共に形成される塩、ならびに（ｄ）塩素、臭素およびヨウ素などの元素アニオンから形成される塩が挙げられる。本発明の医薬組成物は、局所的または全身的な処置が望ましいかどうかに応じて、および処置される領域に応じて、いくつかの方法で投与されてもよい。投与は、局所（眼膜および粘膜、ならびに直腸への送達を含む）、例えば粉末もしくはエアロゾルの吸入もしくは吹き込み（ネブライザー、気管内、鼻内、表皮および経皮によるものを含む）による肺、経口または非経口であってもよい。非経口投与には、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内もしくは筋肉内の注射もしくは点滴；または頭蓋内、例えばクモ膜下もしくは脳室内の投与が含まれる。少なくとも１つの２’－ＭＯＥ修飾を伴うオリゴマーは、経口投与に特に有用であると考えられる。好ましくは、ＡＯＮは、肺経路を介して送達される。
【0151】
単位剤形で好都合に提示され得る本発明の医薬製剤は、製薬業界で周知の従来の技法に従って調製することができる。このような技法には、有効成分を医薬担体または医薬賦形剤と結び付けるステップが含まれる。一般に、製剤は、有効成分を液体担体または微細に分割した固体担体またはその両方と均一にかつ密接に結び付け、次いで必要に応じて、生成物を成形することによって調製される。
【0152】
一実施形態では、ＡＯＮは、少なくとも２００～４００ｎＭのＡＯＮのピーク血中濃度をもたらすのに有効な量および方法で投与される。典型的には、１回または複数回用量のＡＯＮが、一般に、一定の間隔で約１～２週間の期間投与される。経口投与に好ましい用量は、７０ｋｇ当たり約１ｍｇ～１０００ｍｇのオリゴマーである。一部の場合には、対象当たり１０００ｍｇを超えるオリゴマーの用量が必要であり得る。ｉ．ｖ．投与では、好ましい用量は、７０ｋｇ当たり約０．５ｍｇ～１０００ｍｇのオリゴマーである。静脈内または皮下の投与では、ＡＯＮは、約１２０ｍｇ／ｋｇの投薬量で毎日または毎週投与されてもよい。
【0153】
ＡＯＮは、一定の間隔で、短い期間、例えば２週間またはそれより短い期間、毎日投与されてもよい。しかし、一部の場合には、オリゴマーは、より長い期間にわたって断続的に投与される。投与は、抗生剤の投与または他の治療処置が続いてもよく、またはそれと同時であってもよい。処理レジメンは、処置下の対象のイムノアッセイ、他の生化学検査および生理的検査の結果に基づいて、示されるように調整されてもよい（用量、頻度、経路など）。
【0154】
投薬は、処置される疾患状態の重症度および応答性に依存し、処置の経過は、数日から数カ月まで、または治癒が達成されるまで、または疾患状態の縮小が達成されるまで続く。最適な投薬スケジュールは、対象の体内での薬物蓄積の測定から算出することができる。当業者は、最適な投薬量、投薬方法および繰り返し率を容易に決定することができる。最適な投薬量は、個々のオリゴマーの相対的効力に応じて変化してもよく、一般に、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの動物モデルにおいて有効であることが判明したＥＣ５０に基づいて推定することができる。一般に、投薬量は、体重１ｋｇ当たり０．０１μｇ～１００ｇであり、１日ごと、１週間ごと、１カ月ごともしくは１年ごとに１回もしくは複数回、またはさらには２～２０年ごとに１回与えられてもよい。当業者は、体液または組織における薬物の測定された滞留時間および濃度に基づいて、投薬のための繰り返し率を容易に推定することができる。処置の成功に続いて、疾患状態の再発を防ぐために対象に維持療法を受けさせることが望ましい場合があり、その際、オリゴマーは、体重１ｋｇ当たり０．０１μｇ～１００ｇの範囲に及ぶ維持用量で、１日１回または複数回から２０年ごとに１回までで投与される。
【0155】
本発明のＡＯＮを使用する有効なｉｎ ｖｉｖｏでの処置レジメンは、投与の持続時間、用量、頻度および経路、ならびに処置下の対象の状態に従って変化してもよい（すなわち、局在化したかまたは全身性の感染に応じた投与に対する予防的投与）。したがって、このようなｉｎ ｖｉｖｏでの治療は、最適な治療結果を達成するために、処置下の特定の種類の障害に適する検査によるモニタリング、および用量または処置レジメンにおいて対応する調整を必要とすることが多くなる。
【0156】
処置は、例えば、当技術分野で公知の疾患の一般的指標によってモニターされてもよい。ｉｎ ｖｉｖｏで投与された本発明のＡＯＮの有効性は、ＡＯＮの投与に先立って、その間におよびその後で、対象から採取された生体試料（組織、血液、尿など）から決定されてもよい。このような試料のアッセイとしては、（１）当業者に公知の手順、例えば電気泳動ゲル移動アッセイを使用する標的配列および非標的配列とのヘテロ二重鎖形成の有無のモニタリング；（２）ＲＴ－ＰＣＲ、ノーザンブロッティング、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロッティングなどの標準的技法によって決定される参照の正常ｍＲＮＡまたはタンパク質と比較した突然変異体のｍＲＮＡの量のモニタリングが挙げられる。
【0157】
核内のオリゴマー送達は、ＡＯＮにとって主要な課題である。異なる細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）は異なる条件および細胞系において種々の程度にＰＭＯを局在化させ、新規のＣＰＰは標的細胞にＰＭＯを送達するそれらの能力について、本発明者らによって評価されている。ＣＰＰまたは「細胞の取込みを増強するペプチド部分」という用語は、交換可能に使用され、「輸送ペプチド」、「担体ペプチド」、または「ペプチド形質導入ドメイン」とも呼ばれるカチオン性細胞透過性ペプチドを指す。本明細書で示されているペプチドは、所与の細胞培養集団の細胞の約または少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の範囲内で細胞透過を誘導する能力を有し、全身性投与の際に、ｉｎ ｖｉｖｏの複数の組織内での高分子の転位を可能にする。ＣＰＰは、当該技術で周知であり、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願第２０１０／００１６２１５号において開示されている。
【0158】
したがって、本発明は、治療用医薬組成物を製造するために細胞透過性ペプチドと組み合わせた本発明のＡＯＮを提供する。
【0159】
本発明のまたさらなる態様によれば、ＡＯＮベースの治療における使用のための、本明細書に記載されている１つまたは複数のＡＯＮが提供される。好ましくは、治療は、ＡＣＥ２発現に関連する状態のためのものである。より好ましくは、ＡＣＥ２発現に関連する状態のための治療は、コロナウイルス感染症、肺障害、慢性腎疾患、慢性心疾患、高血圧および糖尿病から選択される疾患に関する治療である。
【0160】
より詳細には、ＡＯＮは、表３に列挙されたＡＯＮおよび／または配列番号１～３１、より好ましくは配列番号５、６、９もしくは１１およびその組合せまたはカクテルのうちのいずれか１つまたは複数からなる群から選択されてもよい。より好ましくは、ＡＯＮは、配列番号６および９または配列番号６および１１である。これには、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、このような配列とハイブリダイズすることができる配列、それに対して相補的な配列、ＡＣＥ２遺伝子転写物におけるプレｍＲＮＡのプロセッシング活性を有するかまたはそれをモジュレートする修飾された塩基、修飾された主鎖、およびその機能的な切断または伸長を含有する配列が含まれる。
【0161】
本発明は、選択された標的に結合してＡＣＥ２遺伝子転写物におけるエクソンの排除を誘導することが可能な２つまたはそれより多いＡＯＮの組合せにまでも及ぶ。組合せは、ＡＯＮベースの治療における使用のための、２つもしくはそれより多いＡＯＮのカクテル、２つもしくはそれより多いＡＯＮを含む構築物または一緒に接合した２つもしくはそれより多いＡＯＮであってもよい。ＡＯＮの組合せは、好ましくは、配列番号６と９の組合せ、または配列番号６と１１の組合せである。
【0162】
本発明は、ＡＣＥ２発現に関連する疾患の影響を処置、防止または改善するための方法であって、
ａ）本明細書に記載された１つもしくは複数のＡＯＮまたは１つもしくは複数のＡＯＮを含む医薬組成物の有効量を対象に投与するステップ
を含む、方法を提供する。
ａ）本明細書に記載された１つもしくは複数のＡＯＮまたは１つもしくは複数のＡＯＮを含む医薬組成物の有効量を対象に投与するステップ
を含む、方法を提供する。
【0163】
さらに、本発明は、コロナウイルス感染症、肺障害、慢性腎疾患、慢性心疾患、高血圧および糖尿病の影響を処置、防止または改善するための方法であって、
ａ）本明細書に記載された１つもしくは複数のＡＯＮまたは１つもしくは複数のＡＯＮを含む医薬組成物の有効量を対象に投与するステップ
を含む、方法を提供する。
ａ）本明細書に記載された１つもしくは複数のＡＯＮまたは１つもしくは複数のＡＯＮを含む医薬組成物の有効量を対象に投与するステップ
を含む、方法を提供する。
【0164】
好ましくは、治療法を使用して、エクソンスキッピング戦略を介してＡＣＥ２タンパク質の可溶性レベルを増加させる。ＡＣＥ２のレベルの増加は、好ましくは、ＡＣＥ２遺伝子転写物またはその一部においてプレｍＲＮＡのスプライシングを修飾することにより転写物のレベルをモジュレートすることによって達成される。
【0165】
可溶性ＡＣＥ２の増加は、好ましくは、コロナウイルス感染症、肺障害、慢性腎疾患、慢性心疾患、高血圧および糖尿病などのＡＣＥ２関連状態または病態の症状の量、持続期間または重症度の低下をもたらす。
【0166】
本明細書で使用される場合、対象（例えば、ヒトなどの哺乳動物）または細胞の「処置」は、個体または細胞の自然経過を変更する試みにおいて使用される任意の種の医療介入である。処置は、医薬組成物の投与を含むがこれに限定されず、予防的に、または病的事象の開始もしくは病原因子との接触に続いてのいずれかで実施されてもよい。含まれるのはまた、処置される疾患もしくは状態の進行速度を低下させること、その疾患もしくは状態の発症を遅らせること、またはその発症の重症度を低減することを対象とし得る「予防的」処置である。「処置」または「予防」は、必ずしも疾患または状態、またはそれらの関連する症状の完全な撲滅、治癒または予防を示さない。
【0167】
本発明の別の態様によれば、ＡＣＥ２発現に関連する疾患のモジュレーションまたは制御のための医薬の製造における、本明細書に記載された１つまたは複数のＡＯＮの使用が提供される。
【0168】
本発明は、ＡＣＥ２発現に関連する疾患の処置のための医薬の製造のための、本明細書に記載された精製および単離されたＡＯＮの使用も提供する。
【0169】
ＡＣＥ２発現に関連する疾患の影響を処置、防止または改善する医薬の製造のための、本明細書に記載された精製および単離されたＡＯＮの使用が提供される。
【0170】
好ましくは、ＡＣＥ２関連病態または疾患は、コロナウイルス感染症、肺障害、慢性腎疾患、慢性心疾患、高血圧および糖尿病である。
【0171】
本発明は、そのまたさらなる態様によれば、本発明のＡＯＮ配列のｃＤＮＡまたはそのＡＯＮ配列のクローニングされたコピー、および本発明のＡＯＮ配列を含有するベクターに及ぶ。本発明は、このような配列および／またはベクターを含有する細胞にもさらに及ぶ。
【0172】
本発明のＡＯＮは、別の治療用分子と同時投与されてもよい。例えば、ＡＯＮは、ＡＣＥ阻害剤またはアンジオテンシン受容体遮断薬などのレニンアンジオテンシン系の遮断薬などの化合物である第２の治療剤と共に投与されてもよい。抗炎症剤が、本発明のＡＯＮと組み合わされて提供されてもよい。
【0173】
本発明の一形態では、ＡＯＮは、受動免疫化および抗ウイルス治療を含む、コロナウイルス感染症をモジュレートする他の作用剤と同時投与される。ＡＣＥ２関連病態または疾患は、コロナウイルス感染症であり、本発明のＡＯＮは、以下を含むリストから選択される別の抗ウイルス治療用分子と同時投与されてもよい：オセルタミビル（Ｔａｍｉｆｌｕ（登録商標））、ザナミビル（Ｒｅｌｅｎｚａ（登録商標））、リバビリン、レムデシビル、ペンシクロビル、ｆａｖｉｐａｒｖｉｒ、ナファモスタット、ニタゾキサニド、メシル酸カモスタット、インターフェロンα（例えば、インターフェロンαＢ２）、リトナビル、ロピナビル、ＡＳＣ０９、アズブジン、バロキサビル マルボキシル、ダルナビル、コビシスタット、アジスロマイシン、クロロキンおよびヒドロキシクロロキン。このような追加の治療剤は、コロナウイルスがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である場合に特に助けとなるものであり得る。
【0174】
本発明はまた、対象におけるＡＣＥ２発現に関連する疾患または状態を処置、防止または改善するためのキットであって、好適な容器内にパッケージングされた、ＡＣＥ２遺伝子転写物またはその一部においてプレｍＲＮＡのスプライシングを修飾するための少なくとも単離または精製されたＡＯＮを、その使用のための使用説明書と一緒に含む、キットも提供する。
【0175】
好ましい実施形態では、キットは、本明細書に記載された少なくとも１つのＡＯＮ、すなわち、本明細書に記載された配列番号１～３１、より好ましくは配列番号５、６、９もしくは１１、および／または表３のいずれかに示される配列、またはＡＯＮのカクテルのうちのいずれか１つまたは複数を含有する。キットは、緩衝剤、安定剤などのような周辺試薬を含有してもよい。より好ましくは、ＡＯＮは、配列番号６および９、または配列番号６および１１である。
【0176】
したがって、対象におけるＡＣＥ２発現に関連する疾患または状態を処置、防止または改善するためのキットであって、好適な容器内にパッケージングされた、本明細書に記載の少なくともＡＯＮ、すなわち、配列番号１～３１、より好ましくは配列番号５、６、９もしくは１１、および／または表３に示される配列、その組合せ、もしくはカクテルのうちのいずれか１つまたは複数を、その使用のための使用説明書と一緒に含む、キットが提供される。より好ましくは、ＡＯＮの組合せは、好ましくは、配列番号６と９、または配列番号６と１１の組合せである。
【0177】
好ましくは、疾患または状態は、以下を含むリストから選択される：コロナウイルス感染症、肺障害、慢性腎疾患、慢性心疾患、高血圧および糖尿病。
【0178】
キットの内容物は凍結乾燥されてもよく、キットは、凍結乾燥された構成成分の再構成のための好適な溶媒をさらに含有してもよい。キットの個々の構成成分は、別々の容器内にパッケージングされ、このような容器に関連付けられ、通知は、医薬品または生物製剤の製造、使用または販売を規制する政府機関によって指示された形態であってもよく、その通知はヒトへの投与のための製造、使用または販売の当局による認可を反映する。
【0179】
キットの構成成分は、１つまたは複数の液体溶液中で提供され、液体溶液は、水性溶液、例えば滅菌水溶液であってもよい。ｉｎ ｖｉｖｏでの使用では、発現構築物は、薬学的に許容される注入可能な組成物へと製剤化されてもよい。この場合には、容器手段はそれ自体、そこから製剤が肺などの動物の罹患した領域に適用されてもよいか、動物に注射されてもよいか、またはさらに、キットの他の構成成分と共に適用されて、かつそれと混合されてもよい吸入器、注射器、ピペット、点眼器、または他のこのような装置であってもよい。
【0180】
キットの構成成分はまた、乾燥形態または凍結乾燥形態で提供されてもよい。試薬または構成成分が乾燥形態で提供される場合、再構成は一般に、好適な溶媒の添加による。溶媒も別の容器手段で提供されてもよいことが想定される。容器の数または種類に関わりなく、本発明のキットは、動物の体内での最終的な複合体組成物の注射／投与または配置を補助する器具を含んでもよくまたはそれと共にパッケージングされてもよい。そのような器具は、吸入器、注射器、ピペット、鉗子、計量スプーン、点眼器または任意のこのような医療上認可された送達媒体であってもよい。
【0181】
当業者は、上記方法の適用が、多数の他の疾患の処置における使用に好適であるＡＯＮを特定するための広い適用を有することを認識すべきである。
【0182】
本発明のＡＯＮは、例えば、薬物療法などの代替療法と併せて使用されてもよい。
【0183】
したがって、本発明は、ＡＣＥ２発現に関連する疾患または状態の影響を処置、防止または改善する方法を提供し、本発明のＡＯＮは、ＡＣＥ２発現に関連する疾患または状態の影響を処置、防止または改善することに関連する別の代替療法と連続して、または同時に投与される。好ましくは、疾患または状態は、以下を含むリストから選択される：コロナウイルス感染症、肺傷害、慢性腎疾患、慢性心疾患、高血圧および糖尿病。
一般
一般
【0184】
当業者は、本明細書に記載の本発明が具体的に記載されているもの以外の変形および修飾の影響を受け易いことを認識するであろう。本発明は、このような変形および修飾のすべてを含むことが理解されるべきである。本発明はまた、本明細書で言及または示されているステップ、特徴、組成物および化合物のすべてを、個々にまたはまとめて、ならびにステップまたは特徴のうちのいずれか２つまたはそれより多くのありとあらゆる組合せを含む。
【0185】
本発明は、本明細書に記載の具体的な実施形態によって範囲を限定されることはなく、これは例示のみを目的とすることを意図する。機能的に均等な生成物、組成物および方法は明確に、本明細書に記載されている本発明の範囲内にある。
【0186】
本明細書で引用されるすべての刊行物（特許、特許出願、雑誌の論文、実験室マニュアル、書籍、または他の文書を含む）の開示全体は、これにより参照により本明細書に組み込まれる。参考文献のいずれかが、従来技術を構成する、または本発明が関係する分野で働く者の共通の常識の一部であるという自認はなされない。
【0187】
この本文で引用される各文書、参考文献、特許出願または特許は、参照によりその全体が明確に本明細書に組み込まれ、これは、それがこの本文の一部として読み手に読み取られ、考慮されるべきであることを意味する。この本文で引用されている文書、参考文献、特許出願または特許がこの本文で反復されないということは、単に簡潔さの理由のためである。
【0188】
本明細書で言及される、または参照により本明細書に組み込まれる任意の文書における任意の製品についての製造元の使用説明書、説明、製品仕様、および製品シートは、参照により本明細書に組み込まれ、本発明の実践において用いられてもよい。
【0189】
本明細書で使用される場合、「誘導される（ｄｅｒｉｖｅｄ）」および「由来する（ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ）」という用語は、特定の整数が、必ずしも特定の供給源に直接由来しないにもかかわらず、その供給源から得られてもよいことを示すように解釈されるべきである。
【0190】
本明細書で使用される場合、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が別段に明確に指示しない限り、複数の参照を含む。
【0191】
本明細書の全体を通して、文脈が別段に必要としていなければ、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、記述された整数または整数の群の包含を示すが、任意の他の整数または整数の群の排除を示さないことが理解されるであろう。
【0192】
操作例における、または別段に示される場合以外で、本明細書および特許請求の範囲において使用される成分、反応条件などの量を表す数はすべて、あらゆる場合に、「約（ａｂｏｕｔ）」という用語によって修飾されていると理解されるべきである。したがって、反対に示されない限り、本明細書および特許請求の範囲において示される数値パラメーターは、本発明によって得られるように求められる所望の特性に応じて変化してもよい近似値である。よって、「約８０％」は、「約８０％」と「８０％」も意味する。少なくとも、各数値パラメーターは、有意な数字の数および普通の四捨五入法という観点で解釈されるべきである。
【0193】
本発明の広い範囲を示す数値範囲およびパラメーターが近似値であることにもかかわらず、特定の例において示される数値は、可能な限り正確に報告される。しかし、いずれの数値も、それらの各試験測定で見出される標準偏差から必然的に生じる特定の誤差を固有に含有する。
【0194】
本明細書で使用される選択された用語についての他の定義は、本発明の詳細な説明の中で見出されてもよく、全体にわたって適用されてもよい。別段に定義されていなければ、本明細書で使用されているすべての他の科学用語および専門用語はすべて、本発明が属する技術分野における当業者に一般に理解されるのと同じ意味を有する。
【0195】
本明細書に含まれるヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の情報を含有する配列識別番号（「配列番号」）は、説明の最後にまとめられ、プログラムＰａｔｅｎｔＩｎバージョン３．０を使用して作成されている。各ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列は、数的識別子＜２１０＞に続く配列識別子（例えば、＜２１０＞１、＜２１０＞２など）によって、配列表において特定される。各ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列についての配列の長さ、種類および起源となる生物は、それぞれ、数的指標の領域＜２１１＞、＜２１２＞および＜２１３＞において提供される情報によって示される。
【0196】
様々なアンチセンスオリゴマー間で識別するために、アンチセンスオリゴマーの命名システムが提案され、公開された（Mann et al., (2002) J Gen Med 4, 644-654を参照されたい）。この命名法は、以下に示されているように、すべて同じ標的領域に向けられた、いくつかのやや異なるアンチセンスオリゴマーを試験する場合に特に意味を持つようになる。
Ｈ ＃ Ａ／Ｄ（ｘ：ｙ）
最初の文字は種を指定する（例えば、Ｈ：ヒト、Ｍ：マウス）
「＃」は標的のエクソン番号を指定する。
「Ａ／Ｄ」は、それぞれ、エクソンの始まり／終わりでのアクセプターまたはドナーのスプライス部位を示す。
（ｘ ｙ）は、「－」または「＋」がそれぞれイントロンまたはエクソンの配列を示すアニーリング座標を表す。一例として、Ａ［－６＋１８］は、標的エクソンの前のイントロンの最後の６塩基と、標的エクソンの最初の１８塩基を示すことになる。最も近接するスプライス部位は、アクセプターであるため、これら座標の前に「Ａ」と記載することになる。ドナースプライス部位におけるアニーリング座標の記載は、Ｄ［＋２－１８］となり得、ここで、最後の２つのエクソン塩基および最初の１８個のイントロン塩基はアンチセンスオリゴマーのアニーリング部位に対応する。Ａ［＋６５＋８５］によって表される全体がエクソンであるアニーリング座標は、すなわち、そのエクソンの最初から６５番目のヌクレオチドと８５番目のヌクレオチドとの間の部位である。
Ｈ ＃ Ａ／Ｄ（ｘ：ｙ）
最初の文字は種を指定する（例えば、Ｈ：ヒト、Ｍ：マウス）
「＃」は標的のエクソン番号を指定する。
「Ａ／Ｄ」は、それぞれ、エクソンの始まり／終わりでのアクセプターまたはドナーのスプライス部位を示す。
（ｘ ｙ）は、「－」または「＋」がそれぞれイントロンまたはエクソンの配列を示すアニーリング座標を表す。一例として、Ａ［－６＋１８］は、標的エクソンの前のイントロンの最後の６塩基と、標的エクソンの最初の１８塩基を示すことになる。最も近接するスプライス部位は、アクセプターであるため、これら座標の前に「Ａ」と記載することになる。ドナースプライス部位におけるアニーリング座標の記載は、Ｄ［＋２－１８］となり得、ここで、最後の２つのエクソン塩基および最初の１８個のイントロン塩基はアンチセンスオリゴマーのアニーリング部位に対応する。Ａ［＋６５＋８５］によって表される全体がエクソンであるアニーリング座標は、すなわち、そのエクソンの最初から６５番目のヌクレオチドと８５番目のヌクレオチドとの間の部位である。
【0197】
以下の実施例は、上記の本発明を使用する方法をさらに十分に説明すると共に、本発明の様々な態様を実行するための最良の方法を示す。これらの方法は本発明の範囲を限定するものではなく、むしろ例示目的で提示されることが理解される。
【実施例】
【0198】
以下の実施例のそれぞれにおいて、文脈が別段に要求していなければ、以下の一般的な材料および方法を適用する。
【0199】
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は組換えタンパク質を高レベルで発現し、切断型ＡＣＥ２の発現、活性および分泌への、ＡＣＥ２のＣ末端切断の影響を調べるのに理想的な系となる。実験では、ＣＨＯ細胞をＦ１２培地（１０％ＦＢＳを補充した）中で増殖させた。次いで、ＣＨＯ細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を使用して切断型ＡＣＥ２構築物をコードするプラスミドでトランスフェクトした。２日後に、培地を回収し、分子量カットオフフィルターを使用して濃縮し、抗ｈＡＣＥ２抗体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用するウエスタンブロットおよびＡＣＥ２触媒活性によって調査した。
【0200】
実験では、Ｃａｃｏ－２細胞を、ＭＣＤＢ１３１培地（１０ｍＭのグルタミン、ＥＧＦおよびヒドロコルチゾンを含む１０％ＦＣＳ）中で培養した。Ｃａｌｕ－３細胞を、ＥＭＥＭ（１０％ＦＣＳ）中で培養した。ＨｅＣＡＴ細胞を、１０％ＦＢＳ ＤＭＥＭ中で培養した。初代正常ヒト皮膚線維芽細胞を、１０％ＦＢＳ ＤＭＥＭを補充したＤＭＥＭ、および１０ｎｇ／ｍｌの上皮増殖因子、１μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン、１０％のＦＢＳ ＤＭＥＭおよび１×のグルタミンを補充したＭＣＤＢ１３１中のＨＭＥＣ中で増殖させた。アフリカミドリザル（Chlorocebus sp）由来のＶｅｒｏＥ６細胞を、αＭＥＭ培地中で培養した。
【0201】
ＡＯＮのトランスフェクションのために、細胞を、６または２４ウェルプレート中に播種し、次いで、ヒトＡＣＥ２を標的とするＡＯＮまたは用量等価非標的対照（ＲＡＧＥスプライシングを変更せずにヒトＲＡＧＥのエクソン９に対してアニーリングする）のいずれかでＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００試薬（リポフェクタミン３０００を０．１５ｕｌ／ウェル；０．４ｕｌ／ウェル Ｐ３０００／ウェル）を使用してトランスフェクトした。次いで、細胞を、５０～２００μＭのＡＯＮ／カチオン性リポプレックスと共に３７℃で２４～７２時間インキュベートした後、細胞を溶解させ、ＲＮＡを抽出し、Ｃｙｃｌｅ Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ法またはＴｒｉｚｏｌ法のいずれかを使用して、ｃＤＮＡを生成した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ［Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ：Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ］および約５０ｎｇの総ＲＮＡを鋳型として使用して、ワンステップＲＴ－ＰＣＲを実施した。ＡＣＥ２テール領域に対するフォワードプライマーおよびリバースプライマーを使用するＰＣＲ産物を、Ｔｒｉｓ－Ａｃｅｔａｔｅ－ＥＤＴＡ緩衝剤中２％のアガロースゲルで分画化し、ゲル記録システム［Ｖｉｌｂｅｒ Ｌｏｕｒｍａｔ、Ｅｂｅｒｈａｒｄｚｅｌｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ］で画像を撮影した。
【0202】
次いで、ＡＣＥ２のスプライシングに関するＡＯＮの定量的効果を測定するために、ＡＣＥ２ ｍＲＮＡのエクソン境界に対するプローブを使用する定量的リアルタイムＲＴ－ＰＣＲを使用して、遺伝子発現を決定した。
【0203】
また、分子量カットオフフィルターを使用して、培地を回収し、濃縮した。次いで、可溶性ＡＣＥ２の存在を、ＥＬＩＳＡおよびＡＣＥ２触媒活性の存在によって決定した。
【0204】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来のＳ１のＶｅｒｏＥ６細胞の細胞表面への吸着を決定するために、トランスフェクトした細胞を、無血清Ｏｐｔｉｍｕｍ培地中でＧＦＰ標識Ｓ１と共に３０分間インキュベートし、その後、それらを培地で洗浄し、蛍光プレートリーダーを使用して緑色蛍光を検出した。
【0205】
ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２による感染を決定するために、プラークアッセイを使用した。このアッセイでは、Ｙ６１３Ｌ－ＡＣＥ２（１９－６１３）をＶｅｒｏＥ６細胞（０．００２～２ｕｇ／ｍｌ）に添加し、その後、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（５０ＰＦＵ）を各ウェルに添加した。３０分後、２Ｘ Ｌ１５培地およびアガロース（０．９％ｗ／ｖ）でウェルを覆い、次いで３７℃で１～３日間インキュベートした後、プラークをカウントし、ＴＣＩＤ５０を推定した。
【0206】
ｉｎ ｖｉｖｏ実験では、雄のＣ５７ｂｌ６マウスを、全身麻酔（ケタミン）下で、ＡＯＮ（３０ｕＬのＤＩ水中で３ｍｇ／ｋｇ）の単回気管内用量で処置し、次いで、７日間追跡し、その後、ＣＯ２ナルコーシスを使用して人道的に死亡させた。死後、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を行い、市販のＥＬＩＳＡを使用して、液体をＡＣＥ２について測定した。次いで、肺を摘出し、Ｔｒｉｚｏｌ抽出後にＡＣＥ２ ｍＲＮＡの発現を推定した。
（実施例１）
Ｃ末端切断型ＡＣＥ２突然変異体の構築および検証
（実施例１）
Ｃ末端切断型ＡＣＥ２突然変異体の構築および検証
【0207】
この実施例は、Ｃ末端切断型ＡＣＥ２アイソフォームが、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで発現した場合に、可溶性、安定性、分泌性、触媒活性であり、かつ抗ウイルス活性を保持できることを実証する。
【0208】
ＡＣＥ２の分泌、安定性および酵素活性へのＣ末端切断の効果をｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで確立するために、一連のＣ末端切断型マウスＡＣＥ２（ｍＡｃｅ２）突然変異体を最初に生成し、発現させた。内因性のＮ末端シグナルペプチド（１～１８）をすべての構築物から省き、６－Ｈｉｓタグおよび短いリンカー（－ＧＫＴ）－を、精製するためにすべての構築物のＣ末端に付加した。６１５部位はコレクトリン相同性ドメインとの推定上の境界を表し（表１）、選択的スプライシングによりエクソン１４がスキップされた場合の産物であるため選択された。膜貫通ドメインとの境界を表しているため、７４０部位を選択した。ＡＣＥ２に関する推定誘導性切断部位を表しているため、６９７部位を選択した。非マウスＡＣＥ２の発現が、中和抗体の開発をもたらし、ｉｎ ｖｉｖｏでの長期試験を不可能にするため、マウスＡＣＥ２を特に使用した。
【0209】
ウエスタンブロット（図１ａ）およびＥＬＩＳＡ（図１ｂ）によって、培地中に分泌された活性ＡＣＥ２の最高量は、ｍＡｃｅ２（１９～６１５）を含有するプラスミドによるＣＨＯ細胞のトランスフェクションの４８時間後に観察され、ｍＡｃｅ２（１９～７４０）ではより少ない量しか観察されなかった。さらに、両方の構築物は、酵素的に活性なタンパク質を産生した（図１ｃ）。注目すべきことに、誘導性ＡＣＥ２脱落の推定産物であるにもかかわらず、ｍＡｃｅ２（１９～６９７）では乏しい発現しか観察されなかった（図１ａ）。
【0210】
より短いＡＣＥ２構築物であるｍＡｃｅ２（１９～６１５）はまた、ＣＨＯ細胞をＣ末端切断型ＡＣＥ２を含有するＤＮＡミニサークルでトランスフェクトした場合にも、ウエスタンブロッティングで実証されたように、ｍＡｃｅ２（１９～７４０）より多量に分泌した（図１ｄ）。ｍＡｃｅ２（１９～６１５）をコードするＤＮＡミニサークルによるＣＨＯ細胞のトランスフェクションにより、ＥＬＩＳＡで実証されたように、培地中でＡＣＥ２タンパク質も生成された（図１ｅ）。
【0211】
ｍＡｃｅ２（１９～６１５）でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞からの培地はまた、機能的に関連するアンジオテンシナーゼ活性の存在と一致して、ヒト大動脈内皮細胞におけるＩＣＡＭ－１およびＭＣＰ－１遺伝子発現のＡｎｇ ＩＩ（１μＭ）に依存する誘導をアンタゴナイズした（図１ｆおよび１ｇ）。注目すべきことに、この保護は、選択的ＡＣＥ２阻害剤であるＭＬＮ－４７６０によって遮断され、培地中のＡＣＥ２触媒活性のみによって保護がもたらされることと一致した。
【0212】
次いで、ｍＡｃｅ２（１９～６１５）をコードするＤＮＡミニサークルをＣ５７ｂｌ６マウスの腓腹に注射し（４０μｇ／ＩＭ）、注射の４週間後に循環ＡＣＥ２タンパク質および活性の検出可能な増加を誘導し（それぞれ、図１ｈおよび１ｉ）、Ｃ末端切断型産物ｍＡｃｅ２（１９～６１５）がいずれも、そのコンフォメーションの完全性と一致して、ｉｎ ｖｉｖｏで発現、分泌され、かつ酵素機能を保持できることを確認した。
【0213】
次いで、最適なｍＡｃｅ２（１９～６１５）構築物のヒトアナログである、Ｙ６１３Ｌ－ＡＣＥ２（１９～６１３）を開発し、ＣＨＯ細胞へとトランスフェクトし、そこで、これがまた高レベルで発現し、培地中に効率的に分泌されるＡＣＥ２タンパク質を生成し（図１ｊ）、触媒的ＡＣＥ２活性は市販の組換えＡＣＥ２をスパイクした培地と同等であった（１～７４０；図１ｋ）。
【0214】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によるＶｅｒｏＥ６細胞の感染後のプラーク蓄積は、用量依存的にトランスフェクト－ＣＨＯ細胞培地から濃縮したＹ６１３Ｌ－ＡＣＥ２タンパク質による処置後にも阻害され（図１ｌ）、その抗ウイルス活性が確認された。
【0215】
まとめると、この例は、触媒（ＡＣＥ様）ドメインおよびコレクトリン様ドメインの推定境界で優先的にＣ末端を切断されたＡＣＥ２アイソフォームが、コンフォメーションの完全性と一致して、十分に発現し、分泌され、酵素活性および抗ウイルス性であることを実証する。
（実施例２）
Ｃａｃｏ－２細胞においてＡＯＮを使用してＡＣＥ２のエクソン１４のスプライシングをモジュレートする
（実施例２）
Ｃａｃｏ－２細胞においてＡＯＮを使用してＡＣＥ２のエクソン１４のスプライシングをモジュレートする
【0216】
この実施例は、ヒトＡＣＥ２プレｍＲＮＡ中のエクソン１４をスキップするためにＡＯＮを設計し利用して、ＡＣＥ様ドメインとコレクトリン様ドメインの推定上の境界で切断される可溶性ＡＣＥ２アイソフォームをコードする新規ＡＣＥ２ ｍＲＮＡスプライスバリアント（Δ１４スプライスバリアント）を生成し、同時にエクソン１４を保持して膜結合した完全長のＡＣＥ２アイソフォームをコードする従来の方法でスプライスされたＡＣＥ２ ｍＲＮＡの発現を低下させる方法について詳述する。
【0217】
ヒトＡＣＥ２のエクソン１４は、アミノ酸６１３～６３３をコードする（図２ａ）。これは、２つの大きなイントロン（１ｋｂを超える；表１ｂ）の間に位置する短いコード化配列（５９ｂｐ）である。エクソン１３および１５の位相が異なるため、エクソン１４をスキップすると、最も近い下流のエクソン－エクソン接合部から５５ヌクレオチドを超えるインフレーム停止コドンが導入されることになる。このような異常なスプライシングによって導入される早期終止コドン（ＰＴＣ）は、通常、非効率的な転写産物を排除するために、ナンセンス媒介性崩壊（ＮＭＤ）の標的である。しかし、５５ｂｐのヒューリスティックは、ほとんどの場合、ＮＭＤの感受性を予測するが、いくつかの例外が報告されている。本発明者らは、エクソン１４をスキップすると、機能的な切断型アイソフォームであるＹ６１３Ｌ－ＡＣＥ２（１９～６１３）をコードするスプライスバリアントが生じ（図２ａ）、この切断は、思わぬことにＡＣＥ２の外部ＡＣＥ様アンジオテンシナーゼドメインとコレクトリン様内部ドメインの間のキメラ境界で正確に起こり、このスプライスバリアントはＮＭＤから逃れる可能性があると仮定している。
【0218】
エクソンスキッピングを誘導するために、ヒト大腸上皮細胞（Ｃａｃｏ－２）を、エクソン１４の５’および／または３’スプライス部位を標的とする２’Ｏ－Ｍｅ ＰＴＯアンチセンスオリゴヌクレオチド（５０～１００μＭ）でトランスフェクトした。Ｃａｃｏ－２は内因性にＡＣＥ２を高レベルで発現し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を取り込むことが公知である。ベクター処理した細胞では、ＡＣＥ２ ｍＲＮＡのスプライスバリアントは存在せず、ここではエクソン１４がスキップされている（図２ｂ、パネルｉ）。しかし、Ｈ１４Ａ［－１７＋８］（１００ｎＭ；パネルｉｉ）またはＡＯＮのＨ１４Ａ［－１７＋８］とＨ１４Ｄ［＋１３－１２］の組合せ（各５０ｎｍ；パネルｉｉｉ）によるトランスフェクションの４８時間後には、ＲＴ－ＰＣＲ増幅曲線によって実証されたように、エクソン１４がスキップされ、エクソン１３および１５が一緒にスプライシングされたΔ１４スプライスバリアントのｄｅ ｎｏｖｏ生成が生じた（図２ｂ）。
【0219】
Ｈ１４Ａ［－１７＋８］またはＨ１４Ａ［－１７＋８］を含む組合せによるＣａｃｏ－２細胞の処置後のΔ１４スプライスバリアントの発現の増加は、エクソン１４の配列を保持する従来の方法でスプライスされたＡＣＥ２ ｍＲＮＡスプライスバリアントの付随する減少と関連していたが（図２ｃ）、一方、総ＡＣＥ２ ｍＲＮＡ発現は、有意に変化しなかった（図２ｄ）。
【0220】
同様の結果が、より大きなｍＲＮＡコピー数を達成するために、ＲＮＡ精製にＴｒｉｚｏｌ法を使用して、Ｈ１４Ｄ［＋１３－１２］と共にＨ１４Ａ［－１７＋８］およびＨ１４Ｄ［＋９－１６］と共にＨ１４Ａ［－１７＋８］を含むＡＣＥ２を標的とするＡＯＮでトランスフェクトしたＣａｃｏ－２細胞において観察され、ここで、エクソン１４を含有するＡＣＥ２スプライスバリアントは、総ＡＣＥ２を全く減らすことなく８０％を超えて減少した（すなわち、エクソン１３および１５の両方を含有するＡＣＥ２スプライスバリアント；図２ｅ）。
【0221】
経時的研究では、Δ１４スプライスバリアントのｄｅ ｎｏｖｏ生成が、ＲＴ－ＰＣＲ増幅曲線によって実証されたように、トランスフェクションのわずか２４時間後に観察された（図２ｆ）。特に、Ｈ１４Ａ［－１７＋８］とＨ１４Ｄ［＋１３－１２］の組合せ（パネルｉ）は、Δ１４スプライスバリアントのｄｅ ｎｏｖｏ生成をもたらした。再度、対照のＡＯＮによるトランスフェクション後に、新規スプライスバリアントは観察されなかった（パネルｉｉ）。
【0222】
まとめると、このデータは、エクソン１４がスキップされた新規ＡＣＥ２ ｍＲＮＡスプライスバリアント（Δ１４スプライスバリアント）が、予想外に実質的なＮＭＤを回避し、ある特定のＡＯＮによる処置後に誘導され得ることを実証する。
（実施例３）
ＶｅｒｏＥ６細胞においてＡＯＮを使用してＡＣＥ２のエクソン１４のスプライシングをモジュレートする
（実施例３）
ＶｅｒｏＥ６細胞においてＡＯＮを使用してＡＣＥ２のエクソン１４のスプライシングをモジュレートする
【0223】
この実施例は、ヒトＡＣＥ２のエクソン１４をスキップするように設計されたＡＯＮが、ＶｅｒｏＥ６細胞におけるＡＣＥ２のスプライシングをモジュレートすることもでき、そこでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の細胞表面への吸着を阻害する方法を詳述している。
【0224】
ヒトＥｘｏｎ１４の５’および３’スプライス部位を標的とする２’－Ｏ－Ｍｅ ＰＴＯ ＡＯＮによるＶｅｒｏＥ６細胞のトランスフェクションによっても、サル由来のＶｅｒｏＥ６細胞におけるＡＣＥ２スプライシングがモジュレートされる。特に、Ｈ１４Ａ［－１７＋８］とＨ１４Ｄ［＋１３－１２］の組合せ（各５０ｎｍ）によるトランスフェクションの４８時間後に、Ｅｘｏｎ １４を含有する従来の方法でスプライシングされたＡＣＥ２ ｍＲＮＡスプライスバリアントが有意に減少した（９５％を超える）（図３ａ）。同時に、全ＡＣＥ２発現（エクソン１３とエクソン１５の両方を含有するＡＣＥ２ ｍＲＮＡスプライスバリアントによって示される）は、有意に変化しなかった。このことは、エクソン１４のスキップも起こったはずであることを意味する。
【0225】
ヒトＥｘｏｎ１４の５’および３’スプライス部位を標的とする２’－Ｏ－Ｍｅ ＰＴＯ ＡＯＮ、具体的にはＨ１４Ａ［－１７＋８］およびＨ１４Ｄ［＋１３－１２］によるＶｅｒｏＥ６細胞のトランスフェクションはまた、濃縮細胞培地のＡｃｅ２活性の増加をもたらし（図３ｂ）、非標的ＡＯＮでトランスフェクトした細胞と比較した場合、ＥＬＩＳＡによって測定した培地中の可溶性ＡＣＥ２タンパク質の増加（図３ｃ）は、新規可溶性ＡＣＥ２タンパク質アイソフォームの遊離と一致した。
【0226】
スパイク糖タンパク質（Ｓ１）のＶｅｒｏＥ６細胞上への吸着は、ＡＣＥ２の表面発現に依存している。ヒトＥｘｏｎ１４の５’および３’スプライス部位を標的とする２’－Ｏ－Ｍｅ ＰＴＯ ＡＯＮ、具体的にはＨ１４Ａ［－１７＋８］およびＨ１４Ｄ［＋１３－１２］によるＶｅｒｏＥ６細胞のトランスフェクションはまた、緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）で標識したＳ１のＶｅｒｏＥ６細胞上への吸着を低減させ（図３ｄ）、ＡＣＥ２のＥｘｏｎ１４を標的とするＡＯＮによるトランスフェクションの抗ウイルス活性を実証した。
（実施例４）
ＡＣＥ２のエクソン１４のスプライシングをモジュレートするオリゴヌクレオチドの最適化
（実施例４）
ＡＣＥ２のエクソン１４のスプライシングをモジュレートするオリゴヌクレオチドの最適化
【0227】
この実施例は、ヒトＡＣＥ２のエクソン１４をスキップするように設計されたＡＯＮが、その有効性を改善するためにその標的配列を少量移動させることによって修飾された方法を詳細に説明する。
【0228】
それ自体で、特定のＡＯＮ、特にＨ１４Ａ［－１７＋８］が、ＡＣＥ２のエクソン１４のスプライシングをモジュレートする適度な能力を有することが示され（図２ｂおよび２ｃ）、隣接領域を標的とする追加の２’－Ｏ－Ｍｅ ＰＴＯ ＡＯＮを設計し（配列番号５～８）、ヒト大腸上皮（Ｃａｃｏ－２）細胞において試験した。これらの構築物のうち、Ｈ１４Ａ［－２５－１］およびＨ１４Ａ［－２２＋３］（それぞれ配列番号５および６）によるトランスフェクションは、エクソン１３とエクソン１５の間の配列に対するプライマーを使用するワンステップＰＣＲでのより小さいバンド（白色の矢印）によって示されたように、４８時間後にエクソン１４のスキッピングの誘導に最大の個々の効果を有しており、Ｈ１４Ａ［－１７＋７］（配列番号４）単独による応答を上回った（図４ａ）。
【0229】
２’－Ｏ－ＭｅホスホロチオエートＡＯＮ、Ｈ１４Ａ［－２５－１］およびＨ１４Ａ［－２２＋３］（それぞれ配列番号５および６）によるＣａｌｕ－３細胞のトランスフェクションも、エクソン１３とエクソン１５の間の配列に対するプライマーを使用するワンステップＰＣＲでのより小さいバンド（白色の矢印）によって示されたように、４８時間後にエクソン１４のスキッピングを誘導した（図４ｂ）。
【0230】
Ｈ１４Ａ［－２２＋３］（配列番号６）のｖｉｖｏ－モルホリノ製剤によるＣａｌｕ－３細胞のトランスフェクションも、エクソン１３とエクソン１５の間の配列に対するプライマーを使用するワンステップＰＣＲでのより小さいバンド（白色の矢印）によって示されたように、７２時間後にエクソン１４のスキッピングを誘導した（図６ａ）。Ｈ１４Ａ［－２２＋３］（配列番号６）のｖｉｖｏ－モルホリノ製剤によるＣａｌｕ－３細胞の７２時間の前処理も、細胞をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｖｉｃ０１）にｉｎ ｖｉｔｒｏで曝露させた後に、培地中のウイルスのＴＣＩＤ５０を低下させ（図４ｃ）、エクソン１４のスキッピングから生じるコロナウイルスの感染活性の有意な阻害を示した。
（実施例５）
ＡＯＮを使用してＡＣＥ２のエクソン１７のスプライシングをモジュレートする
（実施例５）
ＡＯＮを使用してＡＣＥ２のエクソン１７のスプライシングをモジュレートする
【0231】
この実施例は、ＡＣＥ２プレｍＲＮＡの最後から２番目のエクソンである、エクソン１７をスキップし、それによって、残基７０６～７６２のコード配列を除去し、膜貫通ドメインをコードしない新規ＡＣＥ２スプライスバリアントを生成し、同時に、膜保持されて、コロナウイルス吸着を媒介することが可能であるＡＣＥ２アイソフォームをコードするエクソン１７を保持している従来の方法でスプライスされたＡＣＥ２ ｍＲＮＡの発現を低下させるように、ＡＯＮを設計および利用する方法を詳述する。
【0232】
ＡＣＥ２のエクソン１７の５’および３’スプライス部位、またはエクソン１７のスプライシングをモジュレートするシス作用配列として機能する可能性を有する隣接領域を標的とする２５マーの２’－Ｏ－Ｍｅ ＰＴＯ ＡＯＮで１５，０００個のヒト線維芽細胞をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００を使用してトランスフェクトした。対照処置細胞および未処置（ＵＴ）細胞では、エクソン１７がスキップされるＡＣＥ２ ｍＲＮＡの選択的スプライシングは見られない。しかし、Ｈ１７Ａ［－１５＋１０］、Ｈ１７Ａ［－５＋２０］、Ｈ１７Ａ［－１０＋１５］、Ｈ１７Ａ［＋２１＋４５］によるトランスフェクションの２４時間後には、エクソン１３（フォワード）およびエクソン１８（リバース）に位置するプライマーを使用するワンステップＰＣＲでの新しい低いバンドによって実証されたように、エクソン１７がスキップされた新規ＡＣＥ２ ｍＲＮＡスプライスバリアント（Δ１７スプライスバリアント）の発現が観察された（図５ｂ）。
【0233】
エクソン１７の５’および３’スプライス部位の一方、またはスプライシングをモジュレートするシス作用配列として機能する可能性を有する隣接領域を標的とする２０マーの２’－Ｏ－Ｍｅ ＰＴＯ ＡＯＮによる３万個のヒト角化細胞系（ＨａＣａｔ）のトランスフェクションも、エクソン１３（フォワード）およびエクソン１８（リバース）に位置するプライマーを使用するワンステップＰＣＲでの新しい低いバンドによって実証されたように、新規Δ１７スプライスバリアントを生じた（図５ｃ）。
【0234】
エクソン１７のスプライシングを変更することが示された３つの最良の２’－Ｏ－Ｍｅ ＰＴＯ ＡＯＮである、Ｈ１７Ａ［－２＋１８］、Ｈ１７Ａ［＋２６＋４５］およびＨ１７Ａ［＋２１＋４５］によるＨａＣａｔ細胞のトランスフェクションはすべて、新規Δ１７スプライスバリアントの生成をもたらし、ワンステップＰＣＲでの新しい低いバンドによって実証されたように、エクソン１７が保持される従来の方法でスプライスされた形態の発現を低減させた（図５ｄ）。このことは、好ましい２５マーの、Ｈ１７Ａ［＋２１＋４５］（配列番号９）またはＨ１７Ａ［－５＋２０］（配列番号１１）の短縮された誘導体が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで同様の有効性を達成することができることを実証する。
【0235】
Ｈ１７Ａ［＋２１＋４５］のｖｉｖｏ－モルホリノ製剤によるＣａｃｏ－２細胞の処置（１μＭ）により、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲによって検出されたように、４８時間後にエクソン１７をコードする従来の方法でスプライスされたＡＣＥ２ ｍＲＮＡの顕著な抑制ももたらされた（図５ｅ）。
【0236】
次いで、雄のＣ５７ｂｌ６マウスを、マウスＡＣＥ２ ｍＲＮＡ配列（配列番号３２）に特異的な２’－Ｏ－Ｍｅ ＰＴＯ ＡＯＮ構築物であるＭ１７Ａ［＋２１＋４５］で、ＤＩ水中で気管内送達される３．０ｍｇ／ｋｇの用量で処置した。その７日後に、総ＡＣＥ２においては有意な変化がないが、エクソン１７をコードする従来の方法でスプライスされたＡＣＥ２ ｍＲＮＡについては肺における有意な低減が見られ、ＡＣＥ２の選択的スプライシングの誘導を示した（図５ｆ）。さらに、非標的ＡＯＮ対照で処置したマウスと比較した場合、ＥＬＩＳＡ法で測定した気管支肺胞液中の可溶性ＡＣＥ２タンパク質が増加しており（図５ｇ）、可溶性タンパク質アイソフォームを生成するＡＣＥ２プレｍＲＮＡスプライシングのモジュレーションと一致した。
【0237】
Ｈ１７Ａ［＋２１＋４５］（２ｕＭ）単独のｖｉｖｏ－モルホリノ製剤による７２時間のＣａｌｕ－３細胞の前処置は、次いで、細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｖｉｃ０１）に曝露させた後に、培地中のウイルスのＴＣＩＤ５０を有意に低下させなかった（図５ｈ）。これは、図４ｂに詳述したＨ１４Ａ［－２２＋３］とは対照的である。これは、可溶性ＡＣＥ２が生成され、完全長ＡＣＥ２ ｍＲＮＡがＨ１７Ａ［＋２１＋４５］による処置によって減るが、抗ウイルス活性もコンフォメーションの完全性を必要とすることを例証する。
（実施例６）
ヒトＡＣＥ２のエクソン１４および１７を標的とするＡＯＮの組合せを使用してＡＣＥ２のスプライシングをモジュレートする
（実施例６）
ヒトＡＣＥ２のエクソン１４および１７を標的とするＡＯＮの組合せを使用してＡＣＥ２のスプライシングをモジュレートする
【0238】
この実施例は、好ましい可溶性ＡＣＥ２アイソフォームをコードし、生成する新規ＡＣＥ２ ｍＲＮＡスプライスバリアントの生成を増強し、同時に、いずれもが膜保持され、ウイルス吸着および取込みを媒介することが可能な完全長ＡＣＥ２をコードする従来の方法でスプライスされたＡＣＥ２ ｍＲＮＡの発現を低減するために、ある特定のＡＯＮを組み合わせ得る方法を詳述する。
【0239】
エクソン１７をスキップすることにより（例えば、Ｈ１７Ａ［＋２１＋４５］またはＨ１７Ａ［－５＋２０］により）、残基１９～７０５を含有するＡＣＥ２タンパク質アイソフォームが生じ、膜貫通ドメインをスキップし、ＡＣＥ２の短い（４３ａａ）サイトゾル側末端に続くことが予測される。この新規Δ１７スプライスバリアントからのタンパク質の発現は、本発明者らが、ＡＣＥ２（１９～６９７）を含むより長いＡＣＥ２外部ドメイン構築物よりも活性であり、より良好に発現することを示すＹ６１３Ｌ－ＡＣＥ２（１９～６１３）を生成するΔ１４スプライスバリアントよりも低い可能性がある（図１ａ）。Δ１７スプライスバリアントによって生成された可溶性タンパク質は、その活性、保持または安定性を妨害する可能性を有するサイトゾル側末端の保持に起因して、ネイティブＡＣＥ２とは異なるコンフォメーションを有する可能性もある。これは、触媒活性であり、抗ウイルス作用が実証されている好ましいアイソフォームであるＹ６１３Ｌ－ＡＣＥ２（１９～６１３）とは異なる（図１ｌ）。本発明者らは、エクソン１４と１７の両方が、ＡＣＥ２ ｍＲＮＡにおいてスキップできれば（例えば、Ｈ１４Ａ［－２２＋３］をＨ１７Ａ［＋２１＋４５］と組み合わせて使用した）、より望ましい高発現Ｙ６１３Ｌ－ＡＣＥ２（１９～６１３）アイソフォームの生成を増加させることができると仮定した。加えて、１つの標的部位でプレｍＲＮＡのスプライシングを変更するために１つのＡＯＮを使用することにより、プレｍＲＮＡのコンフォメーションを変えることによって（例えば、標的配列へのＳＳＯのアクセスを増加させ、新規スプライスバリアントの安定性や崩壊を変更する）、別の場所で選択的スプライシングを誘導する異なるＡＯＮの能力をモジュレートする可能性もある。しかし、このような相互作用は予測不可能であり、各プレｍＲＮＡおよび各ターゲットに固有のものである。
【0240】
この実施例では、２つのｖｉｖｏ－モルホリノＡＯＮ、すなわち、Ｈ１７Ａ［＋２１＋４５］およびＨ１４Ａ［－２２＋３］（各１μＭ）の組合せによるＣａｌｕ－３細胞の処置により、この細胞系で７２時間後にわずかな効果しかなかったＨ１４Ａ［－２２＋３］単独と比較した場合に、エクソン１４がスキップされた新規ＡＣＥ２ ｍＲＮＡスプライスバリアントの発現が有意に増加したことを、本発明者らが示している（白色の矢印；図６ａ）。Ｈ１７Ａ［＋２１＋４５］単独では、それ自体ではエクソン１４スプライシングに影響を及ぼさなかった（エクソン１７を標的とするため）。エクソン１４を保持するＡＣＥ２ ｍＲＮＡスプライスバリアントの発現も、エクソン１３（フォワード）およびエクソン１５（リバース）に位置するプライマーを使用するワンステップＰＣＲによって検出されたように、Ｈ１７Ａ［＋２１＋４５］およびＨ１４Ａ［－２２＋３］の組合せによる処置の７２時間後に減少した（赤色の矢印）。
【0241】
２つのｖｉｖｏ－モルホリノＡＯＮである、Ｈ１７Ａ［＋２１＋４５］およびＨ１４Ａ［－２２＋３］の組合せに対する同様の相乗応答は、Ｃａｃｏ－２細胞においても観察され、エクソン１４がスキップされた新規ＡＣＥ２ ｍＲＮＡスプライスバリアントの発現が有意に増加した（白色の矢印；図６ｂ）。注目すべきことに、Ｈ１７Ａ［＋２１＋４５］を単独で使用する場合に観察されたΔ１７スプライスバリアントは、Ｈ１４Ａ［－２２＋３］と組み合わせて使用した場合にも低減したことであり（図６ｃ）、エクソン１３（フォワード）およびエクソン１８（リバース）に位置するプライマーを使用するワンステップＰＣＲで測定した場合に、組合せによって生じた主要なスプライスバリアントが、エクソン１７と１４の両方をスキップした（緑色の矢印）ことが確認される。この新規スプライスバリアント（Δ １４、１７）は、好ましいタンパク質産物であるＹ６１３Ｌ－ＡＣＥ２（１９～６１３）をコードしていることになる。加えて、完全長スプライスバリアント（赤色の矢印）の低減は、併用処置で明らかに最大となる。
【0242】
Ｈ１７Ａ［＋２１＋４５］およびＨ１４Ａ［－２２＋３］（各１μＭ）のｖｉｖｏ－モルホリノ製剤の組合せによりＣａｌｕ－３細胞を７２時間前処置する場合、いずれかのＡＯＮ単独による応答を超えて、細胞をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｖｉｃ０１）に曝露させた後に、培地中のウイルスのＴＣＩＤ５０の低下によって実証したように（図６ｄ）、強力な抗ウイルス応答が観察された。
【図1a】
【図1b】
【図1c】
【図1d】
【図1e】
【図1f】
【図1g】
【図1h】
【図1i】
【図1j】
【図1k】
【図1l】
【図2b】
【図2c】
【図2d】
【図2e】
【図2f】
【図3a】
【図3b】
【図3c】
【図3d】
【図4a】
【図4b】
【図4c】
【図5a】
【図5b】
【図5c】
【図5d】
【図5e】
【図5f】
【図5g】
【図5h】
【図6a】
【図6b】
【図6c】
【図6d】
【図7a】
【図7b】
【図7c】
【配列表】
【国際調査報告】