▶ バイオ − テラ ソリューションズ、リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-05-11
(54)【発明の名称】免疫細胞活性化剤の開発及び応用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20230501BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20230501BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20230501BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230501BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230501BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230501BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230501BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20230501BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20230501BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230501BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13
C07K16/28 ZNA
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A61P35/00
A61P35/02
A61K45/00
A61K39/395 D
A61K39/395 N
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022558138
(86)(22)【出願日】2021-03-22
(85)【翻訳文提出日】2022-09-26
(86)【国際出願番号】 CN2021081993
(87)【国際公開番号】W WO2021190431
(87)【国際公開日】2021-09-30
(31)【優先権主張番号】202010208900.0
(32)【優先日】2020-03-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】519102107
【氏名又は名称】バイオ － テラ ソリューションズ、リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】梁世中
(72)【発明者】
【氏名】鄭丹丹
(72)【発明者】
【氏名】ユ，ジン－チェン
(72)【発明者】
【氏名】リ，シェンフェン
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA87X
4B065AA92Y
4B065AA94Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA25
4B065CA44
4C084AA19
4C084NA05
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZB271
4C084ZB272
4C085AA13
4C085AA14
4C085BB11
4H045AA11
4H045AA30
4H045DA76
4H045EA28
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、抗ＯＸ４０抗体及び免疫細胞活性化剤の開発及び応用を提供し、本発明の抗ＯＸ４０抗体又はその断片は、ヒトＯＸ４０又はアカゲザルＯＸ４０に対する比較的強い結合を保持する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗体又はその断片は、ＯＸ４０に特異的に結合し、前記抗体又はその断片は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、４、１０、１６、１０４又は２２に示されるＶＨ ＣＤＲ１、
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、５、７、８、１１、１３、１４、１７、２０、２３又は２６に示されるＶＨ ＣＤＲ２、
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４又は２７に示されるＶＨ ＣＤＲ３、
（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８、３１、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５、５８又は６１に示されるＶＬ ＣＤＲ１、
（ｅ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、２５、２９、３２、３５、３８、４４、４７、５０、５６、５９又は６２に示されるＶＬ ＣＤＲ２、
（ｆ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、３３、３４、３６、３９、４１、４２、４５、４８、５１、５３、５４、５７、６０又は６３に示されるＶＬ ＣＤＲ３のうちの１種又は複数種のアミノ酸配列を含む、ことを特徴とする抗体又はその抗原結合断片。
【請求項2】
前記抗体又はその断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示されるＶＨ ＣＤＲ１、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、１１、１３又は２６に示されるＶＨ ＣＤＲ２、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２又は２７に示されるＶＨ ＣＤＲ３、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、４３又は６１に示されるＶＬ ＣＤＲ１、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、２５、３８、４４又は６２に示されるＶＬ ＣＤＲ２、及び
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４、３９、４１、４５、５３又は６３に示されるＶＬ ＣＤＲ３を含む、ことを特徴とする請求項１に記載の抗体又はその断片。
【請求項3】
前記抗体又はその断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示されるＶＨ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示されるＶＨ ＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示されるＶＨ ＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１に示されるＶＬ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示されるＶＬ ＣＤＲ２、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示されるＶＬ ＣＤＲ３を含む、ことを特徴とする請求項１に記載の抗体又はその断片。
【請求項4】
抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗体又はその断片は、重鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４～７２に示されるいずれか１つのアミノ酸配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４～７２に示されるいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するペプチドを含み、及び／又は前記抗体又はその断片は、軽鎖可変領域をさらに含み、前記軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３～８４に示されるいずれか１つのアミノ酸配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３～８４に示されるいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するペプチドを含む、ことを特徴とする抗体又はその抗原結合断片。
【請求項5】
抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗体又はその断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２に示される重鎖可変領域と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４に示される軽鎖可変領域とを含む、ことを特徴とする抗体又はその抗原結合断片。
【請求項6】
前記抗体又はその断片は、重鎖定常領域及び／又は軽鎖定常領域を含み、前記重鎖定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８、８９又は９０に示される重鎖定常領域であり、及び／又は前記軽鎖定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１に示される軽鎖定常領域である、ことを特徴とする請求項１～５のいずれか１項に記載の抗体又はその断片。
【請求項7】
抗体であって、前記抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６に示される重鎖、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７に示される軽鎖を含む、ことを特徴とする抗体。
【請求項8】
前記抗体又はその断片のＯＸ４０に対する親和性数値ＫＤ≦５ｎＭである、ことを特徴とする請求項１～７に記載の抗体又はその断片。
【請求項9】
前記抗体のフコース含有量は、１０％を超えない、ことを特徴とする請求項１～８のいずれか１項に記載の抗体又はその断片。
【請求項10】
前記抗体は、ｆｕｔ８遺伝子がノックアウトされたＣＨＯ細胞により発現される、ことを特徴とする請求項１～８のいずれか１項に記載の抗体又はその断片。
【請求項11】
前記抗体のフコース含有量は、０％である、ことを特徴とする請求項１０に記載の抗体又はその断片。
【請求項12】
ポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドは、請求項１～１１のいずれか１項に記載の抗体又はその断片をコードする、ことを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項13】
細胞であって、前記細胞は、請求項１～１１のいずれか１項に記載の抗体又はその断片をコードする１種又は複数種のポリヌクレオチドを含む、ことを特徴とする細胞。
【請求項14】
組成物であって、前記組成物は、請求項１～１１のいずれか１項に記載の抗体又はその断片、請求項１２に記載のポリヌクレオチド又は請求項１３に記載の細胞、及び薬学的に許容しうる担体を含む、ことを特徴とする組成物。
【請求項15】
必要とされる患者において、がん又は感染を治療する方法であって、前記方法は、前記患者に有効量の請求項１～１１のいずれか１項に記載の抗体又はその断片を投与することを含む、ことを特徴とする方法。
【請求項16】
前記がんは、非ホジキンリンパ腫、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、乳がん、卵巣がん、頭頸部がん、膀胱がん、黒色腫、結腸直腸がん、膵臓がん、肺がん、平滑筋腫、平滑筋肉腫、神経膠腫、神経膠芽腫、前立腺がん、食道がん、肝臓がんと腎臓がんから選択される、ことを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記方法は、前記患者に第２のがん治療剤を投与することをさらに含む、ことを特徴とする請求項１５に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、生物免疫技術の分野に関し、特にＯＸ４０に特異的に結合する新規な抗体及び抗体断片に関する。
【背景技術】
【0002】
免疫系の検査ポイントには２種類があり、１つは、ＰＤ－１のような抑制性であり、もう１つは、ＯＸ４０のような活性化性である。免疫系におけるＴ細胞の十分な活性化は、２段階のシグナルが必要である。第１のシグナルは、抗原を認識するＴ細胞抗原受容体によって産生され、ＣＤ３分子を介して活性化シグナルを細胞内に伝達し、第２のシグナルは、共刺激シグナルと呼ばれ、抗原提示細胞又はターゲット細胞表面の共刺激分子と活性化Ｔ細胞表面の共刺激分子受容体との相互作用によって産生される。共刺激シグナルは、抗原特異性Ｔ細胞の増殖及びエフェクターＴ細胞への分化を促進する。（Ｌｉｎｄｓａｙ ＫらＩｍｍｕｎｉｔｙ２０１６，４４（５）：１００５－１０１９）。
【0003】
ＯＸ４０は、ＴＮＦＲＳＦ４、ＡＣＴ３５、ＣＤ１３４などと呼ばれる場合もあり、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）に属し、１つのＩ型膜貫通糖タンパク質でもある。ＯＸ４０は、休止Ｔ細胞上に発現されず、活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞とＮＫＴ細胞上に発現される（Ｐａｔｅｒｓｏｎ ＤＪらＭｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８７；２４：１２８１－１２９０）。Ｔ細胞は、抗原により活性化された後、１～３日内でＯＸ４０分子を高発現することができる。ＯＸ４０シグナルの活性化は、更にＴ細胞の活性化シグナルを増強し、免疫系の反応を増強させる（ＧｒａｍａｇｌｉａＩら Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００；１６５：３０４３－３０５０）。
【0004】
ＯＸ４０Ｌは、ＴＮＦＳＦ４、ＴＸＧＰ１、ｇｐ３４とＣＤ２５２と呼ばれる場合もあり、ＩＩ型膜貫通糖タンパク質であり、ＯＸ４０の天然リガンドであり、活性化された抗原提示細胞（ＡＰＣ）上、例えばＤＣ細胞とＢ細胞上に三量体の形態で存在し、かつＣＤ４０、ｔｏｌｌ様の受容体（ＴＬＲ）及び炎症性因子の媒介によって発現される。ＯＸ４０Ｌは、また非造血細胞、例えば平滑筋と血管内皮細胞において広く存在している（Ｍｕｒａｔａ ＫらＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２；１６９：４６２８－４６３６）。
【0005】
ＯＸ４０Ｌによって活性化されたＯＸ４０の細胞内シグナル経路は、Ｔ細胞内の複数のシグナル経路に関連する。分子内のジスルフィド結合によって形成された三量体ＯＸ４０ＬがＴ細胞膜上のＯＸ４０と結合した後（Ｃｏｍｐａａｎ ＤＭら．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．２００６；１４：１３２１－３０）、ＯＸ４０の細胞内シグナル経路を最初に活性化することができる。ＯＸ４０細胞内シグナルをさらに又は十分に活性化するためには、受容体の更なるオリゴ化が必要であり、六量体又はそれ以上を形成する（Ｈ Ｗａｊａｎｔ．Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（２０１５）２２，１７２７－１７４１）。ＯＸ４０が活性化された後、その細胞内領域を介してＴＮＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｆａｃｔｏｒ（ＴＲＡＦ）２と５を募集することにより、ＮＦκＢシグナル経路を活性化し、抗アポトーシス効果を発揮し、細胞のアポトーシスを抑制する（Ｓｏｎｇ Ｊら Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８；１８０：７２４０－８）。
【0006】
なお、ＯＸ４０の細胞内シグナル経路は、Ｔ細胞のＴＣＲ細胞内シグナル経路、主にＰＫＢ／ＰＩ３Ｋとカルシウムイオンに関連するＮＦＡＴシグナル経路を特異的に補助する。前者は、活性化されたＴ細胞の生存と細胞周期の進行を促進することができる（Ｓｏｎｇ ＪらＮａｔＩｍｍｕｎｏｌ．２００４；５：１５０－８）。後者は、主に活性化されたＴ細胞の増殖及び該当するサイトカインの分泌を促進する（Ｓｏ ＴらＰｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００６；１０３：３７４０－５）。
【0007】
ある研究者は、腫瘍に浸潤したＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞（制御性Ｔ細胞）上に、ＯＸ４０を高発現することもできることを見出した。Ｔｒｅｇは、エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）を抑制することができる。現在、Ｔｒｅｇ細胞の機能に対するＯＸ４０シグナル経路の調節作用について、統一的な明確な観点はない。ＯＸ４０シグナル経路がＴｒｅｇ細胞の免疫抑制機能を抑制できることが幾つかの研究で示唆されている（Ｐｉｃｏｎｅｓｅ ＳらＪ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００８；２０５：８２５－３９；Ｖｏｏ ＫＳらＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１３；１９１：３６４１－５０）。ＯＸ４０はＴｒｅｇ細胞に対してその免疫抑制機能を十分に発揮することが必要であることを見出した（Ｐｉｃｏｎｅｓｅ ＳらＥｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１０；４０：２９０２－１３；Ｇｒｉｓｅｒｉ ＴらＪ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０１０；２０７：６９９－７０９）。ＯＸ４０細胞内シグナル経路のＴｒｅｇ細胞の増殖とアポトーシスに対する影響は、細胞が所在する微小環境によって変化する。また、ＩＦＮ－γとＩＬ－４が存在しない場合やＦｏｘＰ３が発現している場合、ＯＸ４０の活性化は、Ｔｒｅｇ細胞の増殖を強力に促進できることも見出した（Ｒｕｂｙ ＣＥらＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９；１８３：４８５３－７）。他の微小環境において、ＯＸ４０の活性化は、Ｔｒｅｇ細胞の増殖に全く影響しないことが観察された（Ｖｕ ＭＤらＢｌｏｏｄ．２００７；１１０：２５０１－１０）。
【0008】
現在、抗ＯＸ４０抗体は、主に以下の３つの細胞生理学的機序によって、免疫系のＴ細胞の活性化と腫瘍抑制の効果を達成すると考えられる。１つは、ＣＤ４＋とＣＤ８＋のエフェクターＴ細胞を直接活性化することにより、それらの増殖と生存、及び関連する炎症性因子を分泌することを促進することである。２つは、Ｔｒｅｇのシグナルと活性を抑制することによって、その免疫系に対する抑制効果を弱くすることである。３つは、ＡＤＣＣ又はＡＤＣＰなどによって、Ｔｒｅｇ細胞を枯渇し、そのエフェクターＴ細胞に対する抑制を減少させることである（Ｊ．ＷｉｌｌｏｕｇｈｂｙらＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ８３，２０１７，１３－２２）。
抗ＯＸ４０抗体又はＯＸ４０のシグナル経路を利用して腫瘍を治療する概念は、すでに大量のマウス腫瘍モデルから有力な検証を得た。ＯＸ４０が腫瘍免疫療法における非常に潜在力のある活性化標的であり、腫瘍免疫療法のために新たな手段を提供できることが従来の研究で強く示唆されている。
抗ＯＸ４０抗体又はＯＸ４０のシグナル経路を利用して腫瘍を治療する概念は、すでに大量のマウス腫瘍モデルから有力な検証を得た。ＯＸ４０が腫瘍免疫療法における非常に潜在力のある活性化標的であり、腫瘍免疫療法のために新たな手段を提供できることが従来の研究で強く示唆されている。
【発明の概要】
【0009】
本発明は、ＯＸ４０（特にヒトＯＸ４０（ｈＯＸ４０））を特異的に認識かつ結合することができる新規な抗体又はその断片を提供する。ここで、前記抗体又はその断片は、より高い親和性でｈＯＸ４０に結合することができるとともに、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）と競争することなく、Ｔ細胞をより効果的に活性化し、より強い免疫応答を産生し、抗腫瘍活性を高めることができる。
【0010】
本発明は、抗体又はその抗原結合断片を開示し、前記抗体又はその断片は、ＯＸ４０に特異的に結合し、前記抗体又はその断片は、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、４、１０、１６、１０４又は２２に示されるＶＨ ＣＤＲ１、
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、５、７、８、１１、１３、１４、１７、２０、２３又は２６に示されるＶＨ ＣＤＲ２、
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４又は２７に示されるＶＨ ＣＤＲ３、
（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８、３１、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５、５８又は６１に示されるＶＬ ＣＤＲ１、
（ｅ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、２５、２９、３２、３５、３８、４４、４７、５０、５６、５９又は６２に示されるＶＬ ＣＤＲ２、
（ｆ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、３３、３４、３６、３９、４１、４２、４５、４８、５１、５３、５４、５７、６０又は６３に示されるＶＬ ＣＤＲ３のうちの１種又は複数種のアミノ酸配列を含む。
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、４、１０、１６、１０４又は２２に示されるＶＨ ＣＤＲ１、
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、５、７、８、１１、１３、１４、１７、２０、２３又は２６に示されるＶＨ ＣＤＲ２、
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４又は２７に示されるＶＨ ＣＤＲ３、
（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８、３１、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５、５８又は６１に示されるＶＬ ＣＤＲ１、
（ｅ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、２５、２９、３２、３５、３８、４４、４７、５０、５６、５９又は６２に示されるＶＬ ＣＤＲ２、
（ｆ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、３３、３４、３６、３９、４１、４２、４５、４８、５１、５３、５４、５７、６０又は６３に示されるＶＬ ＣＤＲ３のうちの１種又は複数種のアミノ酸配列を含む。
【0011】
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、４、１０、１６、１０４又は２２に示されるＶＨ ＣＤＲ１を含む。いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、５、７、８、１１、１３、１４、１７、２０、２３又は２６に示されるＶＨ ＣＤＲ２を含む。いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４又は２７に示されるＶＨ ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８、３１、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５、５８又は６１に示されるＶＬ ＣＤＲ１を含む。いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、２５、２９、３２、３５、３８、４４、４７、５０、５６、５９又は６２に示されるＶＬ ＣＤＲ２を含む。いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、３３、３４、３６、３９、４１、４２、４５、４８、５１、５３、５４、５７、６０又は６３に示されるＶＬ ＣＤＲ３を含む。
【0012】
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示されるＶＨ ＣＤＲ１を含む。いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、１１、１３又は２６に示されるＶＨ ＣＤＲ２を含む。いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２又は２７に示されるＶＨ ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、４３又は６１に示されるＶＬ ＣＤＲ１を含む。いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、２５、３８、４４又は６２に示されるＶＬ ＣＤＲ２を含む。いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４、３９、４１、４５、５３又は６３に示されるＶＬ ＣＤＲ３を含む。
【0013】
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、４、１０、１６、１０４又は２２に示されるＶＨ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、５、７、８、１１、１３、１４、１７、２０、２３又は２６に示されるＶＨ ＣＤＲ２、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４又は２７に示されるＶＨ ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８、３１、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５、５８又は６１に示されるＶＬ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、２５、２９、３２、３５、３８、４４、４７、５０、５６、５９又は６２に示されるＶＬ ＣＤＲ２、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、３３、３４、３６、３９、４１、４２、４５、４８、５１、５３、５４、５７、６０又は６３に示されるＶＬ ＣＤＲ３を含む。
【0014】
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、４、１０、１６、１０４又は２２に示されるＶＨ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、５、７、８、１１、１３、１４、１７、２０、２３又は２６に示されるＶＨ ＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４又は２７に示されるＶＨ ＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８、３１、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５、５８又は６１に示されるＶＬ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、２５、２９、３２、３５、３８、４４、４７、５０、５６、５９又は６２に示されるＶＬ ＣＤＲ２、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、３３、３４、３６、３９、４１、４２、４５、４８、５１、５３、５４、５７、６０又は６３に示されるＶＬ ＣＤＲ３を含む。
【0015】
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示されるＶＨ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、１１、１３又は２６に示されるＶＨ ＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２又は２７に示されるＶＨ ＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、４３又は６１に示されるＶＬ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、２５、３８、４４又は６２に示されるＶＬ ＣＤＲ２、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４、３９、４１、４５、５３又は６３に示されるＶＬ ＣＤＲ３を含む。
【0016】
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＶＨ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるＶＨ ＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるＶＨ ＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示されるＶＬ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に示されるＶＬ ＣＤＲ２、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるＶＬ ＣＤＲ３を含む。
【0017】
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるＶＨ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるＶＨ ＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されるＶＨ ＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に示されるＶＬ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に示されるＶＬ ＣＤＲ２、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３に示されるＶＬ ＣＤＲ３を含む。
【0018】
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＶＨ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるＶＨ ＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示されるＶＨ ＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に示されるＶＬ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５に示されるＶＬ ＣＤＲ２、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６に示されるＶＬ ＣＤＲ３を含む。
【0019】
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示されるＶＨ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示されるＶＨ ＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるＶＨ ＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７に示されるＶＬ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるＶＬ ＣＤＲ２、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示されるＶＬ ＣＤＲ３を含む。
【0020】
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示されるＶＨ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示されるＶＨ ＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるＶＨ ＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるＶＬ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に示されるＶＬ ＣＤＲ２、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示されるＶＬ ＣＤＲ３を含む。
【0021】
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示されるＶＨ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示されるＶＨ ＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるＶＨ ＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３に示されるＶＬ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されるＶＬ ＣＤＲ２、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示されるＶＬ ＣＤＲ３を含む。
【0022】
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示されるＶＨ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示されるＶＨ ＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示されるＶＨ ＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１に示されるＶＬ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示されるＶＬ ＣＤＲ２、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示されるＶＬ ＣＤＲ３を含む。
【0023】
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示されるＶＨ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示されるＶＨ ＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示されるＶＨ ＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６に示されるＶＬ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に示されるＶＬ ＣＤＲ２、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８に示されるＶＬ ＣＤＲ３を含む。
【0024】
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示されるＶＨ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されるＶＨ ＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されるＶＨ ＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９に示されるＶＬ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示されるＶＬ ＣＤＲ２、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１に示されるＶＬ ＣＤＲ３を含む。
【0025】
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示されるＶＨ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されるＶＨ ＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されるＶＨ ＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２に示されるＶＬ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に示されるＶＬ ＣＤＲ２、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４に示されるＶＬ ＣＤＲ３を含む。
【0026】
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＶＨ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示されるＶＨ ＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示されるＶＨ ＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５に示されるＶＬ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６に示されるＶＬ ＣＤＲ２、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７に示されるＶＬ ＣＤＲ３を含む。
【0027】
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示されるＶＨ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３に示されるＶＨ ＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示されるＶＨ ＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８に示されるＶＬ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９に示されるＶＬ ＣＤＲ２、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０に示されるＶＬ ＣＤＲ３を含む。
【0028】
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示されるＶＨ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示されるＶＨ ＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示されるＶＨ ＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１に示されるＶＬ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２に示されるＶＬ ＣＤＲ２、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３に示されるＶＬ ＣＤＲ３を含む。
【0029】
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示されるＶＨ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示されるＶＨ ＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示されるＶＨ ＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１に示されるＶＬ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２に示されるＶＬ ＣＤＲ２、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示されるＶＬ ＣＤＲ３を含む。
【0030】
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示されるＶＨ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示されるＶＨ ＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示されるＶＨ ＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１に示されるＶＬ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されるＶＬ ＣＤＲ２、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示されるＶＬ ＣＤＲ３を含む。
【0031】
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示されるＶＨ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示されるＶＨ ＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるＶＨ ＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１に示されるＶＬ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示されるＶＬ ＣＤＲ２、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示されるＶＬ ＣＤＲ３を含む。
【0032】
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示されるＶＨ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示されるＶＨ ＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示されるＶＨ ＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１に示されるＶＬ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示されるＶＬ ＣＤＲ２、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示されるＶＬ ＣＤＲ３を含む。
【0033】
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示されるＶＨ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示されるＶＨ ＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示されるＶＨ ＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１に示されるＶＬ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されるＶＬ ＣＤＲ２、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示されるＶＬ ＣＤＲ３を含む。
【0034】
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示されるＶＨ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示されるＶＨ ＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示されるＶＨ ＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１に示されるＶＬ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示されるＶＬ ＣＤＲ２、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示されるＶＬ ＣＤＲ３を含む。
【0035】
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示されるＶＨ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示されるＶＨ ＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示されるＶＨ ＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１に示されるＶＬ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されるＶＬ ＣＤＲ２、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示されるＶＬ ＣＤＲ３を含む。
【0036】
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、重鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１又は７２に示されるアミノ酸配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１又は７２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0037】
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、重鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７又は７２に示されるアミノ酸配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７又は７２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0038】
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、軽鎖可変領域をさらに含み、前記軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３又は８４に示されるアミノ酸配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３又は８４に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0039】
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、軽鎖可変領域をさらに含み、前記軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６、７８又は８４に示されるアミノ酸配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６、７８又は８４に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0040】
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２に示される重鎖可変領域と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４に示される軽鎖可変領域とを含む。
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ又はＩｇＤのうちの１つのアイソタイプである。
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ又はＩｇＤのうちの１つのアイソタイプである。
【0041】
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、ＩｇＧアイソタイプであり、いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、ＩｇＧ１アイソタイプ、ＩｇＧ２アイソタイプ、ＩｇＧ３アイソタイプ又はＩｇＧ４アイソタイプである。限定的でなく、抗体又はその断片は、キメラ抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト化抗体である。ある態様では、抗体又はその断片は、ヒト化抗体である。
【0042】
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、重鎖定常領域、軽鎖定常領域、Ｆｃ領域又はその結合をさらに含む。
【0043】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載された抗体は、ＩｇＧアイソタイプである。いくつかの実施形態では、抗体の定常領域は、ヒトＩｇＧ１アイソタイプであり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０に示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域とを有する。
いくつかの実施形態では、抗体の定常領域は、ヒトＩｇＧ２アイソタイプであり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９２に示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域とを有する。
いくつかの実施形態では、抗体の定常領域は、ヒトＩｇＧ２アイソタイプであり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９２に示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域とを有する。
【0044】
いくつかの実施形態では、抗体の定常領域は、ヒトＩｇＧ４アイソタイプであり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４に示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９５に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域とを有する。
【0045】
いくつかの実施形態では、前記Ｆｃ領域は、ヒト抗体のＦｃ領域である。いくつかの実施形態では、前記ヒトＦｃ領域重鎖の３４５位（Ｅｕ番号）のアミノ酸は、Ｒ（Ｅ３４５Ｒ）である。いくつかの実施例では、前記ヒトＦｃ領域重鎖の４４０位（Ｅｕ番号）のアミノ酸は、Ｙ（Ｓ４４０Ｙ）である。いくつかの実施例では、前記ヒトＦｃ領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９に示されるアミノ酸配列を含む。
【0046】
いくつかの実施形態では、前記重鎖定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８、８９又は９０に示されるアミノ酸配列を含み、及び／又は前記軽鎖定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記重鎖定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０に示されるアミノ酸配列を含み、及び／又は前記軽鎖定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１に示されるアミノ酸配列を含む。
【0047】
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、キメラ抗体又はその断片、又はヒト化抗体又はその断片、又は完全ヒト化抗体又はその断片である。
【0048】
いくつかの実施形態では、前記抗体は、重鎖と、軽鎖とを含み、前記重鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６に示されるアミノ酸配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７に示されるアミノ酸配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0049】
いくつかの実施形態では、前記抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６に示される重鎖及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７に示される軽鎖を含む。
【0050】
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、ヒトＯＸ４０又はアカゲザルＯＸ４０を特異的に認識かつ結合することができる。
【0051】
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、ＯＸ４０の活性を活性化、増強又は誘導する。
【0052】
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、Ｔ細胞を活性化することができる。
【0053】
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその抗原結合断片は、活性化されたＴ細胞の更なる活性化を促進し、より多くの炎症性因子を分泌する。
【0054】
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその抗原結合断片は、前記ＯＸ４０の細胞内シグナル経路を活性化することができる。
【0055】
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片のＯＸ４０に対する親和性数値ＫＤ≦５ｎＭである。いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片のＯＸ４０に対する親和性数値ＫＤ≦３．５ｎＭである。いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片のＯＸ４０に対する親和性数値ＫＤ≦２ｎＭである。いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片のＯＸ４０に対する親和性数値ＫＤ≦１ｎＭである。いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片のＯＸ４０に対する親和性数値ＫＤ≦０．２ｎＭである。
【0056】
いくつかの実施形態では、前記抗体又は断片は、モノクローナル抗体又は断片である。
【0057】
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、ＣＨＯ細胞において発現される。
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、ゲノムが編集されたＣＨＯ細胞において発現され、前記ＣＨＯ細胞は、フコース含有量が低いか又はフコースを含まない抗体又はその断片を発現する。いくつかの実施形態では、前記ゲノムが編集されたＣＨＯ細胞は、α－１，６－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子（ｆｕｔ８遺伝子）、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼ（ＧＭＤ）遺伝子、ＧＤＰ－４－ケト－６－デオキシマンノース－３，５－エピメラーゼ－４－レダクターゼ（ＧＭＥＲ）遺伝子、ＧＤＰ－フコーストランスポーター（ＧＦＴ）遺伝子（例えばＳｌｃ３５ｃ１遺伝子）のうちの１つ又は複数が減少又はノックアウトされたＣＨＯ細胞である。いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、ｆｕｔ８遺伝子をノックアウトしたＣＨＯ細胞において発現される。
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、ゲノムが編集されたＣＨＯ細胞において発現され、前記ＣＨＯ細胞は、フコース含有量が低いか又はフコースを含まない抗体又はその断片を発現する。いくつかの実施形態では、前記ゲノムが編集されたＣＨＯ細胞は、α－１，６－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子（ｆｕｔ８遺伝子）、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼ（ＧＭＤ）遺伝子、ＧＤＰ－４－ケト－６－デオキシマンノース－３，５－エピメラーゼ－４－レダクターゼ（ＧＭＥＲ）遺伝子、ＧＤＰ－フコーストランスポーター（ＧＦＴ）遺伝子（例えばＳｌｃ３５ｃ１遺伝子）のうちの１つ又は複数が減少又はノックアウトされたＣＨＯ細胞である。いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、ｆｕｔ８遺伝子をノックアウトしたＣＨＯ細胞において発現される。
【0058】
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片のうちの１つ、２つ又は３つのアミノ酸残基は、フコース修飾される。
【0059】
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片において、フコース含有量は、１０％を超えない。いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片において、フコース含有量は、５％を超えない。いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片において、フコース含有量は、１％を超えない。いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片において、フコース含有量は、０．５％を超えない。いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、フコースに結合していない。
【0060】
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、単離された抗体又はその抗原結合断片である。
【0061】
いくつかの実施形態では、本発明は、ポリヌクレオチドをさらに提供し、前記ポリヌクレオチドは、前記抗体又はその断片をコードする。いくつかの実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、単離されたポリヌクレオチドである。
【0062】
いくつかの実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６～１０１に示される１種又は複数種のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６、９７と９８に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９９、１００と１０１に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０２に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０３に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０２に示されるヌクレオチド配列、及び／又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０３に示されるヌクレオチド配列を含む。
【0063】
いくつかの実施形態では、本発明は、前記抗体又はその断片をコードする１種又は複数種のポリヌクレオチドを含む担体をさらに提供する。いくつかの実施形態では、前記担体は、単離された担体である。いくつかの実施形態では、前記担体は、プラスミド又はウイルスを含む発現ベクターである。
【0064】
いくつかの実施形態では、本発明は、前記抗体又はその断片をコードする１種又は複数種のポリヌクレオチドを含む細胞をさらに提供する。いくつかの実施形態では、前記細胞は、単離された細胞である。いくつかの実施形態では、前記細胞は、ＣＨＯ細胞である。いくつかの実施形態では、前記細胞は、前記担体を含む。いくつかの実施形態では、前記細胞のうちの１種又は複数種のゲノムが編集され、さらに前記ＣＨＯ細胞は、フコース含有量が低い又はフコースを含まない抗体又はその断片を発現する。いくつかの実施形態では、前記ゲノムが編集されたＣＨＯ細胞は、Ｓｌｃ３５ｃ１遺伝子、ｆｕｔ８遺伝子、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼ（ＧＭＤ）遺伝子、ＧＤＰ－４－ケト－６－デオキシマンノース－３，５－エピメラーゼ－４－レダクターゼ（ＧＭＥＲ）遺伝子、ＧＤＰ－フコーストランスポーター（ＧＦＴ）遺伝子のうちの１つ又は複数が減少又はノックアウトされたＣＨＯ細胞である。
【0065】
いくつかの実施形態では、本発明は、前記抗体又はその断片、前記ポリヌクレオチド又は上記細胞、及び薬学的に許容しうる担体を含む組成物をさらに提供する。
【0066】
いくつかの実施形態では、本発明は、前記患者に有効量の前記抗体又はその断片を投与することを含む、必要とされる患者においてがん又は感染を治療する方法をさらに提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、がん又は感染の治療における本明細書に記載された抗体又はその断片の使用をさらに提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、がん又は感染を治療するための薬物の調製における本明細書に記載された抗体又はその断片の使用をさらに提供する。
【0067】
いくつかの実施形態では、前記がんは、固形がんである。
【0068】
いくつかの実施形態では、前記がんは、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、乳がん、卵巣がん、頭頸部がん、膀胱がん、黒色腫、結腸直腸がん、膵臓がん、肺がん、平滑筋腫、平滑筋肉腫、神経膠腫、神経膠芽腫などから選択される。固形がんは、例えば乳がん、卵巣がん、肺がん、前立腺がん、黒色腫、結腸直腸がん、頭頸部がん、膀胱がん、食道がん、肝臓がんと腎臓がんを含む。
【0069】
いくつかの実施形態では、前記方法は、前記患者に第２のがん治療剤を投与することをさらに含む。
【0070】
いくつかの実施形態では、前記感染は、ウイルス感染、細菌感染、真菌感染又は寄生虫感染である。
【0071】
いくつかの実施形態では、本発明は、（ａ）体外で、本明細書に記載された抗体又はその断片を用いて細胞を処理するステップと、（ｂ）処理後の細胞を患者体内に投与するステップとを含む必要とされる患者においてがん又は感染を治療する方法をさらに提供する。いくつかの実施形態では、前記方法は、ステップ（ａ）の前に、個体から前記細胞を単離することをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記細胞は、前記患者体内から単離されたものである。いくつかの実施形態では、前記細胞は、前記患者とは異なるドナー個体から単離されたものである。
【0072】
いくつかの実施形態では、前記細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、前記Ｔ細胞は、腫瘍浸潤性Ｔリンパ球、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞又はその組み合わせである。
【0073】
いくつかの実施形態では、本発明は、検体を本明細書に記載された抗体又はその断片抗体と接触させ、前記抗体又はその断片をＯＸ４０に結合し、検体中のＯＸ４０の発現量を反映する前記結合を検出する検体中のＯＸ４０発現を検出する方法をさらに提供する。いくつかの実施形態では、前記検体は、腫瘍細胞、腫瘍組織、感染組織又は血液検体を含む。
【0074】
いくつかの実施形態では、本発明は、前記患者に有効量の前記抗体又はその断片を投与することを含むことを特徴とする必要とされる患者において免疫機能を増強する必要がある疾病を治療する方法をさらに提供する。
【0075】
本発明は、ヒトＯＸ４０又はアカゲザルＯＸ４０に結合する抗体又はその断片を提供し、ここで、本発明の抗ＯＸ４０抗体又はその断片は、ヒトＯＸ４０又はアカゲザルＯＸ４０に対して比較的強い結合を保持する。
【図面の簡単な説明】
【0076】
【図1】候補抗体と高発現ＯＸ４０のＪｕｒｋａｔｘ細胞結合のフロー図検証である。Ｘ軸は、５０ｎＭのｈＯＸ４０－ＦＣ結合の蛍光強度を示す。
【図2】抗体－Ｆ２３－３２ｋがＪｕｒｋａｔ－ＴＩＭ３、Ｊｕｒｋａｔ－ＣＴＬＡ４、Ｊｕｒｋａｔ－ＴＩＧＩＴ、ＣＨＯ及びｒａｊｉ細胞に結合しないことを示す。
【図3】ＮＦκＢレポーター遺伝子系を用いて、候補抗体の体外活性化活性を検出することを示す。
【図5】ＳＥＢ活性化後のＰＢＭＣの検出、本発明の抗体の刺激下で、ＩＬ－２炎症性因子の分泌レベルを示す。
【図6】ＮＦκＢレポーター遺伝子系を用いて、実験抗体のＦｃ突然変異体３２ｋ－ＲＹと３２ｋ－Ｒの体外活性化活性、及びｐｒｏｔｅｉｎ Ａ又はｒａｊｉが存在するとき、その活性化活性の変化を検出することを示す。
【図7】体内での腫瘍（ＭＣ３８）成長に対する候補抗体の抑制効果を示す。
【図10】ＮＦκＢレポーター遺伝子系を用いて、ｒａｊｉ細胞が存在するとき、親和性成熟後の抗体の体外活性化活性を検出することを示す。
【図11】体内での腫瘍（ＭＣ３８）成長に対する候補抗体の抑制効果を示す。
【図12】体内での腫瘍（ＭＣ３８）成長に対する親和性成熟後の抗体の２１日目の抑制効果を示す。
【図13】抗体のＡＤＣＣエフェクターの検出を示し、ここで、横座標は濃度を示し、縦座標は細胞毒性を示す。
【図14】活性化されたＰＢＭＣのＩＬ－２の分泌に対する抗体の影響を示す。
【図15】非活性化条件下でのＰＢＭＣサイトカイン放出に対する抗体の影響を示す。
【発明を実施するための形態】
【0077】
（定義）
特に定義されない限り、本明細書で使用される科学的および技術的用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。一般的には、本明細書に記載された細胞培養、分子生物学及びタンパク質精製で使用される命名と技術は、当該分野では既知で、一般的に使用されるものである。組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成と細胞培養及び形質転換（例えば電気穿孔、リポフェクション）について、標準技術を用いた。酵素反応と精製技術は、製造業者の説明書又は当該分野で一般的に使用されるか、又は本明細書に記載された方法に従って行われる。上述した技術と方法は、一般的には、当該分野で既知であり、かつ本明細書で参照及び説明される複数の総合と比較的具体的な文献に記載されるように使用される。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（『分子クローニング：実験マニュアル』）（第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版社、ニューヨークコールドスプリング（１９８９））を参照されたい。
特に定義されない限り、本明細書で使用される科学的および技術的用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。一般的には、本明細書に記載された細胞培養、分子生物学及びタンパク質精製で使用される命名と技術は、当該分野では既知で、一般的に使用されるものである。組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成と細胞培養及び形質転換（例えば電気穿孔、リポフェクション）について、標準技術を用いた。酵素反応と精製技術は、製造業者の説明書又は当該分野で一般的に使用されるか、又は本明細書に記載された方法に従って行われる。上述した技術と方法は、一般的には、当該分野で既知であり、かつ本明細書で参照及び説明される複数の総合と比較的具体的な文献に記載されるように使用される。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（『分子クローニング：実験マニュアル』）（第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版社、ニューヨークコールドスプリング（１９８９））を参照されたい。
【0078】
本発明では、「ポリペプチド」という用語は、単数の「ポリペプチド」及び複数の「ポリペプチド」を包含することを意図しており、また、アミド結合（ペプチド結合と呼ばれる場合もある）によって線形的に結合したモノマー（アミノ酸）からなる分子を意味する。「ポリペプチド」という用語は、２つ以上のアミノ酸の任意の単鎖又は複数の鎖を意味し、また、生成物の特定の長さに関与しない。そのため、「ポリペプチド」の定義には、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」又は２つ以上のアミノ酸鎖を意味するための任意の他の用語が含まれており、また、「ポリペプチド」という用語は、上記任意の１つの用語の代わりに使用されてもよく、又は上記任意の１つの用語と交互に使用されてもよい。「ポリペプチド」という用語は、ポリペプチドの発現後に修飾された生成物を意味することも意図され、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護／閉鎖基による誘導体化、タンパク質加水分解切断又は非天然発生のアミノ酸修飾を含むが、これらに限らない。ポリペプチドは、天然生物から由来するか、又は組換え技術によって産生されてもよいが、必ずしも指定された核酸配列から翻訳して得られるとは限らない。それは化学合成などを含む任意の方式で産生されてもよい。
【0079】
「アミノ酸」とは、アミノ基とカルボキシル基の２つの官能基を含有する化合物、例えばα－アミノ酸を意味する。２つ以上のアミノ酸は、アミド結合（ペプチド結合と呼ばれる場合もある）によってポリペプチドを構成することができる。単一のアミノ酸は、３つのヌクレオチド（いわゆるコドン又は塩基トリプレット）からなる核酸によってコードされる。各々のアミノ酸は、少なくとも１つのコドンによってコードされる。同じアミノ酸を異なるコドンによってコードすることは、「遺伝子コードの縮重性」と呼ばれる。アミノ酸は、天然アミノ酸と非天然アミノ酸とを含む。天然アミノ酸は、アラニン（３文字表記：Ａｌａ、１文字表記：Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）とバリン（Ｖａｌ、Ｖ）を含む。
【0080】
本発明において細胞、核酸、ポリペプチド、抗体などに関して使用される用語「単離された」、例えば「単離された」ＤＮＡ又はＲＮＡは、天然由来における他の成分、例えば天然ＤＮＡ又はＲＮＡからそれぞれ単離された分子を意味する。本発明で使用される用語「単離された」はまた、組換えＤＮＡ技術によって産生される場合に細胞材料、ウイルス材料又は細胞培地の核酸又はポリペプチド、又は化学合成場合の化学前駆体又は他の化学物質を基本的に含まないことを意味する。なお、「単離された核酸」は、天然状態で存在しない核酸断片を含むことが意図される。本発明では、用語「単離された」は、他の細胞タンパク質又は組織から単離された細胞又はポリペプチドを意味するためにも用いられる。単離されたポリペプチドは、精製された及び組換えられたポリペプチドを含むことが意図される。単離されたポリペプチド、抗体などは、一般的には、少なくとも１つの精製ステップによって調製される。いくつかの実施形態では、単離された核酸、ポリペプチド、抗体などの純度は、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％である。
【0081】
本発明では、用語「組換え」は、ポリペプチド又はポリヌクレオチドに関し、天然で存在しないポリペプチド又はポリヌクレオチドの形態を意味し、組み合わせによって通常存在しないポリヌクレオチド又はポリペプチドを産生することができる。
【0082】
「相同性」又は「同一性」又は「類似性」は、２つのポリペプチドの間又は２つの核酸分子の間の配列類似性を意味する。相同性は、各配列におけるアライメント可能な位置を比較することによって決定される。比較された配列における位置が同じ塩基又はアミノ酸で占められている場合、分子は、この位置上で相同である。配列間の相同性の程度は、配列の共有するマッチング位置又は相同位置の数からなる関数である。
【0083】
ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド領域（又はポリペプチド又はポリペプチド領域）が、別の配列と一定百分率（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％）の「配列同一性」又は「配列相同性」を有することは、配列のアラインメントの時、比較される２つの配列において、この百分率の塩基（又はアミノ酸）が同じであることを意味する。当該分野で既知のソフトウェアプログラム、例えばＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． ｅｄｓ．（２００７）のＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙに記載されているソフトウェアプログラムを用いて、当該アラインメントと相同性の百分率又は配列同一性を決定することができる。いくつかの実施形態では、デフォルトパラメータを用いてアラインメントを行う。ここで１つのアラインメントプログラムは、デフォルトパラメータを用いるＢＬＡＳＴである。生物学的に同等のポリヌクレオチドは、上記に指定された百分率の相同性を有し、同様又は類似の生物学活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。
【0084】
用語「ポリヌクレオチド」は、「オリゴヌクレオチド」と相互に交換して使用可能であり、デオキシリボヌクレオチドであるかリボヌクレオチド又はその同種物であるかに関わらず、任意の長さのヌクレオチドの重合形態を意味する。ポリヌクレオチドは、任意の３次元構造を有してもよく、また、既知又は未知の任意の機能を実行することができる。例えば、遺伝子又は遺伝子断片（例えばプローブ、プライマー、ＥＳＴ又はＳＡＧＥタグ）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡと任意の配列の単離されたＲＮＡが挙げられる。ポリヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチド、例えばメチル化されたヌクレオチド及びヌクレオチド類似体を含んでもよい。ヌクレオチドに対する構造修飾は、ポリヌクレオチドを組み立てる前又は後に行われてもよい。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断されることができる。重合後、ポリヌクレオチドをさらに修飾することができる。この用語は、二本鎖と一本鎖分子も指す。特に説明又は要求されていない限り、本開示の任意のポリヌクレオチドは、二本鎖形態と既知の又は予測された、二本鎖形態を構成する２つの相補可能性な一本鎖形態の各々を含む。
【0085】
用語「コードする」をポリヌクレオチドに用いる場合、ポリペプチドを「コードする」ことができるポリヌクレオチドを指し、その天然状態にあると、又は当業者に知られている既知の方法によって操作される場合、ポリペプチド及び／又はその断片のｍＲＮＡを産生するために、転写及び／又は翻訳されることができる。アンチセンス鎖は、このような核酸の相補的配列であり、そのコード配列は、それから導出されることができる。
【0086】
本発明では、「抗体」又は「抗原結合断片」は、抗原を特異的に認識及び結合するポリペプチド又はポリペプチド複合体を意味する。抗体は、完全な抗体又はその任意の抗原結合断片又はその一本鎖であってもよい。そのため、用語「抗体」は、抗原に結合する生物学活性を有する免疫グロブリン分子を分子に含む一部又は全部のタンパク質又はペプチドを含む。重鎖又は軽鎖又はそのリガンド結合部分の相補性決定領域（ＣＤＲ）、重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）、重鎖定常領域（ＣＨ）、軽鎖定常領域（ＣＬ）、フレームワーク領域（ＦＲ）又はその任意の部分を含むが、これらに限らない。ＣＤＲは、軽鎖のＣＤＲ（ＶＬ ＣＤＲ）と重鎖のＣＤＲ（ＶＨ ＣＤＲ）とを含む。抗体重鎖のクラスは、γ、μ、α、δ、εを含み、ここで、いくつかのサブクラス（例えばγ１～γ４）がある。この鎖の性質は、抗体の「種類」がそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ又はＩｇＥであることを決定している。ここでいくつかは、さらに例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４などの免疫グロブリンサブクラス（アイソタイプ）に分類されてもよい。軽鎖のクラスはκ、λを含む。各重鎖は、κ又はλ軽鎖に結合することができる。一般に、ハイブリドーマ、Ｂ細胞又は遺伝子工学宿主細胞から免疫グロブリンを産生する場合、その軽鎖と重鎖は、共有結合を介して結合し、２本の重鎖の「尾」部分は、共有ジスルフィド結合又は非共有結合を介して結合する。重鎖では、アミノ酸配列は、Ｙ配置の叉状末端のＮ末端から各本の鎖の底部のＣ末端まで延びている。免疫グロブリンのκ軽鎖可変領域はＶκであり、免疫グロブリンのλ軽鎖可変領域はＶλである。本発明で一般的に用いられるＶＬはＶκである。いくつかの議論は、免疫グロブリン分子のＩｇＧ種類に関するが、全ての免疫グロブリンの種類は、本発明に開示された請求範囲内に含まれるものとする。ＩｇＧについては、標準的な免疫グロブリン分子は、分子量が約２３，０００ダルトンである２本の同じ軽鎖ポリペプチドと、分子量が約５３，０００～７０，０００の２本の同じ重鎖ポリペプチドとを含む。軽鎖と重鎖は、いずれも構造と機能相同性の領域に分類されてもよい。用語「定常の」と「可変の」は、機能に応じて使用される。この点から、ＶＬとＶＨは、抗原認識と特異性を決定すると理解すべきである。ＶＬとＶＨ上の抗原結合部位は、抗原決定基を認識するとともに、抗原に特異的に結合することができる。抗原結合部位は、ＶＨとＶＬにおけるそれぞれの３つのＣＤＲ（即ちＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２とＶＬ ＣＤＲ３）によって定義される。ＣＬとＣＨ（ＣＨ１、ＣＨ２又はＣＨ３）は、例えば分泌、胎盤を介した移動、Ｆｃ受容体結合、補体結合などの重要な生物学性質を付与する。慣例に従って、定常領域の番号は、抗体の抗原結合部位又はアミノ基末端からより遠くなるにつれて増加する。Ｎ末端部分は、可変領域であり、Ｃ末端部分は、定常領域であり、ＣＨ３とＣＬ構造ドメインは、実際には、それぞれ重鎖と軽鎖を含むカルボキシル末端である。
【0087】
本発明では、抗体の重鎖定常領域は、異なる免疫グロブリン分子に由来してもよい。例えば、抗体の重鎖定常領域は、ＩｇＧ１分子由来のＣＨ１構造ドメインとＩｇＧ３分子由来のヒンジ領域とを含んでもよい。別の実施例では、重鎖定常領域は、部分的にＩｇＧ１分子に由来するヒンジ領域と部分的にＩｇＧ３分子に由来するヒンジ領域を含んでもよい。別の実施例では、重鎖の一部は、部分的にＩｇＧ１分子に由来するキメラヒンジ領域と部分的にＩｇＧ４分子に由来するキメラヒンジ領域を含んでもよい。
本発明では、用語「ヒンジ領域」は、ＣＨ１構造ドメインとＣＨ２構造ドメインとを結合する一部の重鎖構造を含む。前記ヒンジ領域は、約２５個の残基を含み、かつ柔軟であることで、２つのＮ末端抗原結合領域を単独に移動させることができる。
本発明では、用語「ジスルフィド結合」は、２つの硫黄原子の間で形成された共有結合を含む。システインは、第２のチオール基とジスルフィド結合を形成し、又は架橋可能なチオール基を含む。多くの天然に存在するＩｇＧ分子では、ＣＨ１とＣＬ領域は、ジスルフィド結合を介して結合し、２本の重鎖は、２つのジスルフィド結合を介して結合する。
本発明では、用語「ヒンジ領域」は、ＣＨ１構造ドメインとＣＨ２構造ドメインとを結合する一部の重鎖構造を含む。前記ヒンジ領域は、約２５個の残基を含み、かつ柔軟であることで、２つのＮ末端抗原結合領域を単独に移動させることができる。
本発明では、用語「ジスルフィド結合」は、２つの硫黄原子の間で形成された共有結合を含む。システインは、第２のチオール基とジスルフィド結合を形成し、又は架橋可能なチオール基を含む。多くの天然に存在するＩｇＧ分子では、ＣＨ１とＣＬ領域は、ジスルフィド結合を介して結合し、２本の重鎖は、２つのジスルフィド結合を介して結合する。
【0088】
本発明では、用語「断片」、「抗体断片」又は「抗原結合断片」は、例えばＦ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖなど、抗体の一部である。その構造に関わらず、抗体断片は、完全抗体で認識された同一の抗原に結合する。用語「抗原結合断片」は、アプタマーと、鏡像異性体と、二価抗体とを含み、特定の抗原に結合することによって複合体を形成して、抗体として用いられる任意の合成された又は遺伝子工学によってなされたタンパク質をさらに含む。
「ｓｃＦｖ」は、免疫グロブリンのＶＨとＶＬの融合タンパク質を意味する。いくつかの態様では、これらの領域は、約１０個～約２５個のアミノ酸の短いリンカーペプチドに結合している。リンカーは、柔軟性を増加させるためにグリシンを豊富に含んでもよく、溶解性を増加させるためにセリン又はスレオニンを豊富に含んでもよく、かつ、ＶＨのＮ末端とＶＬのＣ末端に結合してもよく、その逆でもよい。このタンパク質は、定常領域が除去され、リンカーが導入されたにも関わらず、原始免疫グロブリンの特異性を保持している。
「ｓｃＦｖ」は、免疫グロブリンのＶＨとＶＬの融合タンパク質を意味する。いくつかの態様では、これらの領域は、約１０個～約２５個のアミノ酸の短いリンカーペプチドに結合している。リンカーは、柔軟性を増加させるためにグリシンを豊富に含んでもよく、溶解性を増加させるためにセリン又はスレオニンを豊富に含んでもよく、かつ、ＶＨのＮ末端とＶＬのＣ末端に結合してもよく、その逆でもよい。このタンパク質は、定常領域が除去され、リンカーが導入されたにも関わらず、原始免疫グロブリンの特異性を保持している。
【0089】
本発明に開示される抗体、抗原結合断片、変種又は誘導体は、ポリクローナル、モノクローナル、多重特異性、完全ヒト化、ヒト化、霊長類化、又はキメラ抗体、一本鎖抗体、エピトープ結合断片を含むが、これらに限らない。
【0090】
本明細書で使用される用語「エピトープ」は、免疫グロブリン又はその断片又はＴ細胞受容体に特異的に結合することができる任意のタンパク質決定領域を含む。エピトープ決定領域は、一般的には、分子の化学活性表面基（例えばアミノ酸又は糖側鎖）からなり、かつ一般的には、特定の３次元構造特性及び特定の電荷特性を有する。解離定数が１μＭ以下（例えば１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下又は１ｎＭ以下）である場合、抗体特異的結合抗原と呼ぶことができる。
【0091】
当該技術分野で使用及び／又は許容される用語が２つ以上の定義を有する場合、明示的に対立して指摘されない限り、本明細書で使用された用語の定義は、これらの全ての意味を含む。
【0092】
特に説明されていない限り、抗体の各構造ドメインにおける残基の番号は、ＥＵ番号システムに従って、ＥＵインデックスとも呼ばれ、例えばＫａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ Ｅｄ．， Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ， １９９１で記載されている。
【0093】
本発明に開示された抗体は、鳥類と哺乳動物とを含む任意の動物に由来してもよい。好ましくは、抗体は、ヒト、マウス、ロバ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ラマ、ウマ又はニワトリ由来の抗体である。別の実施例では、可変領域は、軟骨魚綱由来のもの（例えばサメ由来）であってもよい。
【0094】
本発明では、用語「キメラ抗体」は、抗体の可変領域が第１の種から得られるか、又は誘導され、その定常領域（本発明では、完全な、一部の又は修飾されたものであってもよい）が第２の種から由来する任意の抗体を指すと考えられる。いくつかの実施例では、可変領域は、非ヒト（例えばマウス又は霊長類動物）に由来し、定常領域は、ヒト由来である。
【0095】
「特異的に結合」又は「．．．に対して、特異性を有する」は、一般的には、抗体がその抗原結合構造ドメインを介してエピトープに結合することを意味し、この結合は、抗原結合構造ドメインとエピトープとの間の相補性を必要とする。この定義によれば、抗体がその抗原結合構造ドメインを介してこのエピトープに結合する場合、それがランダムで無関係なエピトープに結合するよりも容易であり、このエピトープに「特異的に結合」すると呼ばれる。用語「特異性」は、本発明において、特定のエピトープに結合する特定の抗体の相対親和性を限定するために用いられる。免疫学的結合相互作用の強度又は親和性は、相互作用の平衡解離定数（ＫＤ）で表されてもよく、ここで、比較的小さいＫＤは、親和性が比較的強いことを表す。選択されたポリペプチドの免疫結合特性は、当該分野でよく知られている方法で定量されてもよい。一方法では、抗原結合部位／抗原複合体の形成と解離の速度を測定する必要があり、ここで、それらの速度は、複合体パートナーの濃度、相互作用の親和性と２つの方向においてこの速度に等しく影響する幾何学的パラメータに依存する。そのため、「結合速度定数」（Ｋｏｎ）と「解離速度定数」（Ｋｏｆｆ）の両方は、濃度と実際の会合と解離速度とを計算することによって測定することができる（Ｎａｔｕｒｅ３６１：１８６－８７（１９９３）参照）。Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎ比率は、親和性とは無関係なパラメータを除去することができ、平衡解離定数ＫＤに等しく、親和性数値である。（一般的には、Ｄａｖｉｅｓら（１９９０）Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ５９：４３９－４７３を参照）。ＯＸ４０との平衡結合定数（ＫＤ）が≦１μＭである場合、本開示の抗体は、ＯＸ４０に特異的に結合すると考えられる。
【0096】
本発明では、抗体のフコースの「含有量」は、抗体において、フコースを含有するグリコフォーム部分が抗体の全てのグリコフォーム部分に占めるモル比を意味する。いくつかの実施形態では、抗体のフコース含有量は、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％以上である。いくつかの実施形態では、抗体のフコース含有量は約９６％である。いくつかの実施形態では、抗体のフコース含有量は、約１０％、約９％、約８％、約７％、約６％、約５％、約４％、約３％、約２％、約１％又は約０．５％を超えない。いくつかの実施形態では、抗体のフコース含有量は約０である。
【0097】
本発明では、用語「治療」は、予防的措置及び／又は治療的措置を意味し、有害の生理的改変又は障害（例えばがん）の進行を予防、緩和及び／又は解消することを目的とする。有益又は所望の臨床結果は、例えば症状の緩和、疾患の程度の低減、疾患状態の安定（即ち悪化しない）、疾患進行の遅延又は緩和、疾患状態の改善又は緩和などを含むが、これらに限らない。「治療」とは、延長された生存期限（治療を受けない場合に所望の生存期限と比較して）を意味する。治療を必要とするのは、すでに病状又は障害に罹患しているヒト、及び病状又は障害に罹患しやすいヒト、又は当該病状又は障害を予防する必要があるヒトを含む。
【0098】
「患者」は、一般的には、診断、予後又は治療を必要とする任意の患者、特に哺乳動物患者を意味する。哺乳動物患者は、ヒト、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、乳牛などを含み、特にヒトである。
本発明では、例えば「治療を必要とする患者」は、検出、診断プロセス、予防及び／又は治療に用いられる本発明に開示された抗体又は組成物を投与することから利益を受けた患者、例えば哺乳動物患者を含む。
本発明では、例えば「治療を必要とする患者」は、検出、診断プロセス、予防及び／又は治療に用いられる本発明に開示された抗体又は組成物を投与することから利益を受けた患者、例えば哺乳動物患者を含む。
【0099】
特に説明されていない限り、用語「ＯＸ４０」は、任意の脊椎動物由来の（哺乳動物、例えば霊長類（例えばヒト、アカゲザル）と、齧歯類（例えばマウスとラット）とを含む）任意の天然ＯＸ４０を意味する。この用語は、「全長」の、未加工のＯＸ４０及び細胞における加工による任意の形態のＯＸ４０を含む。
【0100】
「ＯＸ４０活性化」は、ＯＸ４０受容体の活性化を意味する。一般的には、ＯＸ４０活性化は、シグナル形質導入を引き起こす。
【0101】
「活性化Ｔ細胞」は、エフェクター又は記憶Ｔ細胞が再生、持続、または増幅された生物学機能を有するように誘導、誘発又は刺激することを意味する。Ｔ細胞機能を増強する例は、介入前と比較して、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞由来のγ－インターフェロン（例えばＩＦＮｇ）又はインターロイキン（例えばＩＬ－２）の分泌が増加すること、ＣＤ４＋記憶及び／又はエフェクターＴ細胞由来のγ－インターフェロン（例えばＩＦＮｇ）又はインターロイキン（例えばＩＬ－２）の分泌が増加すること、ＣＤ４＋エフェクター及び／又は記憶Ｔ細胞の増殖が増加すること、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の増殖が増加すること、抗原応答性（例えば除去）が増強することを含む。関連する測定方法は、当業者の既知のものである。
【0102】
用語「サイトカイン」は、１つの細胞群によって放出されたものであり、細胞間媒質として別の細胞に作用するタンパク質の総称である。このようなサイトカインの例としては、リンホカイン、モノカイン、インターロイキン（ＩＬ）（例えばＩＬ－１、ＩＬ－１α、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５）、腫瘍壊死因子（例えばＴＮＦ－α又はＴＮＦ－β）及び他のポリペプチド因子（ＬＩＦとｋｉｔリガンド（ＫＬ）とγ－インターフェロンを含む）が挙げられる。例えば、本明細書で使用されるように、サイトカインという用語は、天然由来の、又は組換え細胞培養物由来のタンパク質及び天然配列サイトカインの生物活性等価物を含む。生物活性等価物は、人工合成により産生される小分子実体、及びその薬学的に許容しうる誘導体と塩を含む。
【0103】
例えば、本明細書で使用されるように、用語「標識」又は「標識された」は、例えば、放射性標識アミノ酸、又は標識可能なアビジン（例えば、蛍光標識を含有するか、又は光学的方法又は熱量測定法によって検出した酵素活性を有するストレプトアビジン）により検出されたビオチン基部分に付着したポリペプチドを組み込むことにより、検出可能な標識を組み込むことを意味する。場合によっては、マーカー又は標識は、治療的なものであってもよい。ポリペプチドと糖タンパク質を標識する様々な方法は、当該分野で既知かつ使用可能なものである。ポリペプチド用のマーカーの例としては、放射性同位体又は放射性核種（例えば３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光マーカー（例えばＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニドリン光体）、酵素マーカー（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光標識、ビオチニル基、二次レポーター遺伝子によって認識された所定のポリペプチドエピトープ（例えばロイシンジッパーペア配列、二次抗体結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）を含むが、これらに限らない。いくつかの実施形態では、標識は、可能な立体障害を低減するために、様々な長さのスペーサーアームを介して結合される。
【0104】
（抗ＯＸ４０抗体）
本発明の抗体は、ＯＸ４０に結合する能力を有し、ＯＸ４０の細胞内シグナル経路を活性化することができ、特にＦｃ受容体又はＦｃ受容体を発現する細胞が関与する場合に、それによってＴ細胞の活性化を促進し、腫瘍の成長又は転移を抑制する。例えば、本明細書の実施例に記載のＮＦκＢレポーター遺伝子系を用いて、そのＴ細胞を活性化する機能を検証することができる。
本発明の抗体は、ＯＸ４０に結合する能力を有し、ＯＸ４０の細胞内シグナル経路を活性化することができ、特にＦｃ受容体又はＦｃ受容体を発現する細胞が関与する場合に、それによってＴ細胞の活性化を促進し、腫瘍の成長又は転移を抑制する。例えば、本明細書の実施例に記載のＮＦκＢレポーター遺伝子系を用いて、そのＴ細胞を活性化する機能を検証することができる。
【0105】
いくつかの実施形態では、本発明は、ヒトＯＸ４０又はアカゲザルＯＸ４０に結合する抗体又はその抗原結合断片を提供する。いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片は、ヒトＯＸ４０又はアカゲザルＯＸ４０に対する強い結合（例えば、ＯＸ４０ｍＡｂ２４と１１Ｄ４などの既知の抗ＯＸ４０抗体に相当又はそれより強い）を保持する。
【0106】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、ヒトＯＸ４０又はアカゲザルＯＸ４０に結合する。本発明の抗体又はその抗原結合断片は、結合しないか、又はヒトＯＸ４０又はアカゲザルＯＸ４０の結合と比較して、ネズミＯＸ４０、例えばマウスＯＸ４０に比較的低く結合する。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片がヒトＯＸ４０に結合するＫＤは、約２０ｎＭ、約１９ｎＭ、約１２ｎＭ、約６ｎＭ、約５ｎＭ、約４ｎＭ又は約２ｎＭ以下である。いくつかの実施形態では、ＫＤは、約１ｎＭ、約０．８ｎＭ、約０．６ｎＭ、約０．４ｎＭ又は約０．２ｎＭ以下である。いくつかの実施形態では、ＫＤは約０．１６ｎＭである。いくつかの実施形態では、抗体結合親和性は、生物光学干渉による測定法（例えばＦｏｒｔｅｂｉｏ親和性測定）を用いて測定したものである。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片がヒトＯＸ４０に結合するＫＤは、約２０ｎＭ、約１９ｎＭ、約１２ｎＭ、約６ｎＭ、約５ｎＭ、約４ｎＭ又は約２ｎＭ以下である。いくつかの実施形態では、ＫＤは、約１ｎＭ、約０．８ｎＭ、約０．６ｎＭ、約０．４ｎＭ又は約０．２ｎＭ以下である。いくつかの実施形態では、ＫＤは約０．１６ｎＭである。いくつかの実施形態では、抗体結合親和性は、生物光学干渉による測定法（例えばＦｏｒｔｅｂｉｏ親和性測定）を用いて測定したものである。
【0107】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合断片のヒトＯＸ４０に対する結合は、フローサイトメトリー測定法を用いて測定したものである。いくつかの実施形態では、ヒトＯＸ４０に対する結合は、約１．５ｎＭ以下のＥＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、ヒトＯＸ４０に対する結合は、約１．３３ｎＭ又は約１．０ｎＭ以下のＥＣ５０を有する。
【0108】
いくつかの実施形態では、抗ＯＸ４０抗体のアゴニスト活性は、ＯＸ４０シグナルの伝達によって評価される。主に、ＯＸ４０とＮＦκＢレポーター遺伝子をトランスフェクションしたＪｕｒｋａｔ細胞を用いて検出する。本発明は、ＩｇＧ対照抗体と比較して、ＮＦκＢ媒介の転写活性レベルを高める抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片を提供する。いくつかの実施形態では、抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片は、該当する対照ＩｇＧと比較して、ｒａｊｉ細胞が関与した場合、ＮＦκＢ媒介の転写活性レベルを約９倍以上増加させることができる。いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体又はその断片は、該当する対照ＩｇＧと比較して、ＮＦκＢ媒介の転写活性レベルを約５倍又はそれ以上増加させることができる。
【0109】
いくつかの実施形態では、抗ＯＸ４０抗体のＦｃがＲＹ（Ｅ３４５ＲとＳ４４０Ｙ）とＲ（Ｅ３４５Ｒ）突然変異を経た後、ＯＸ４０とＮＦκＢレポーター遺伝子をトランスフェクションしたＪｕｒｋａｔ細胞を用いてそれらの活性を検出する。ＲＹ突然変異を経た後の抗体の活性は、突然変異しない抗体より１２倍高いが、Ｒ突然変異を経た抗体の活性は、突然変異しない抗体より１０倍高い。
【0110】
いくつかの実施形態では、抗ＯＸ４０抗体のアゴニスト活性は、ＰＢＭＣ細胞活性化後に放出されたサイトカイン（ＩＬ－２）のレベルによって評価される。本発明の抗ＯＸ４０抗体又はその断片は、該当する対照ＩｇＧと比較して、ＰＢＭＣ細胞により分泌されたＩＬ－２のレベルを約１倍、約２倍、約３倍又はそれより増加させることができる。
【0111】
いくつかの実施形態では、抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片は、親和性成熟を経た後、その親和性が約５倍、約１０倍、約２０倍又は約７０倍向上する。
【0112】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片は、重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、ここで、前記ＶＨは、相補性決定領域ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２とＶＨ ＣＤＲ３を含み、ここで、ＶＨ ＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、４、１０、１６、１０４又は２２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなり、ＶＨ ＣＤＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、５、７、８、１１、１３、１４、１７、２０、２３又は２６から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなり、かつＶＨ ＣＤＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４又は２７から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。
【0113】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片は、軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ここで、前記ＶＬは、相補性決定領域（ＣＤＲ）ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２とＶＬ ＣＤＲ３を含み、ここで、ＶＬ ＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８、３１、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５、５８又は６１から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなり、ＶＬ ＣＤＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、２５、２９、３２、３５、３８、４４、４７、５０、５６、５９又は６２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなり、ＶＬ ＣＤＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、３３、３４、３６、３９、４１、４２、４５、４８、５１、５３、５４、５７、６０又は６３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。本発明の抗体又はその抗原結合断片において、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２とＶＬ ＣＤＲ３は、表１における各ＣＤＲに対応するいずれか１つのアミノ酸配列の例示的な組み合わせであってもよい。
【0114】
【表1】
【0115】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体又はその断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４～７２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、重鎖可変領域ＶＨを含む。
【0116】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３～８４から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、軽鎖可変領域ＶＬを含む。
【0117】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合断片における重鎖可変領域ＶＨと軽鎖可変領域ＶＬは、表３の例示的な組み合わせである。
【0118】
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、重鎖定常領域、軽鎖定常領域、Ｆｃ領域又はその結合をさらに含む。
【0119】
いくつかの実施形態では、前記抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６に示される重鎖及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７に示される軽鎖を含む。
【0120】
本発明に開示された抗体、抗原結合断片、変種又は誘導体である。変種は、抗体又はその抗原結合断片における１つ又は複数のアミノ酸残基に対して欠失及び／又は置換を行うか、又は１つ又は複数のアミノ酸残基を挿入して得られる抗体又はその抗原結合断片である。誘導体は、修飾された誘導体を含み、即ち、任意のタイプの分子と抗体の共有結合によって修飾を行い、ここで、共有結合は、抗体のエピトープへの結合を阻止しない。下記の実例を含むが、これらに限定されず、抗体は、、例えばグリコシル化、アセチル化、ポリエチレングリコール化、リン酸化、アミド化、既知の保護／封鎖基による誘導体化、タンパク質加水分解切断、細胞リガンド又は他のタンパク質への接続などによって修飾されてもよい。多くの化学修飾のうちのいずれか１つの修飾は、従来技術によって行われてもよく、特異性化学分解、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含むが、これらに限らない。なお、抗体は、１つ又は複数の非自然のアミノ酸を含有してもよい。
【0121】
いくつかの実施例では、抗体は、治療剤、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生物学的応答調節剤、薬剤又はＰＥＧ複合することができる。
抗体は、治療剤に複合又は融合することができ、前記治療剤は、検出可能な標識、例えば放射性標識、免疫調節剤、ホルモン、酵素、オリゴヌクレオチド、光感受性治療剤又は診断剤を含んでもよく、薬物又は毒素の細胞毒性剤、超音波増強剤、非放射性標識及びその組成物及び当該分野で既知の他のこのような試薬であってもよい。
抗体は、治療剤に複合又は融合することができ、前記治療剤は、検出可能な標識、例えば放射性標識、免疫調節剤、ホルモン、酵素、オリゴヌクレオチド、光感受性治療剤又は診断剤を含んでもよく、薬物又は毒素の細胞毒性剤、超音波増強剤、非放射性標識及びその組成物及び当該分野で既知の他のこのような試薬であってもよい。
【0122】
抗体は、化学発光化合物にカップリングすることによって、検出可能に標識されることができる。そして化学反応中に出現した発光を検出することによって、化学発光標識された抗原結合断片の存在を決定する。特に有用な化学発光標識化合物の実例としては、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩とシュウ酸エステルを含む。
【0123】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体又はその断片の重鎖及び／又は軽鎖は、例えばＭＥＦＧＬＳＷＶＦＬＶＡＩＬＫＧＶＱＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５）などのシグナルペプチド配列をさらに含む。
【0124】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、抗ＯＸ４０抗体のアミノ酸配列の変種及び上述した任意の抗体と同じエピトープに結合する抗体をさらに含む。
【0125】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体は、その抗体断片をさらに含み、いくつかの実施形態では、Ｆａｂ、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ又は（Ｆａｂ’）２断片という抗体断から選択される。
【0126】
本発明の抗ＯＸ４０抗体は、従来の組換えＤＮＡ技術によって調製することができ、例えば、当業者で既知の組換えＤＮＡ技術を使用することによって、抗体をコードするＤＮＡ、抗体を生産するベクター及び細胞系を選択、構築と培養することができる。これらの技術は、様々な実験室マニュアルと主要な出版物に記載されている。この点で、以下で記述される本発明に適用する技術は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）を参照し、その内容の全ては、追補を含めて、ここに参照として組み込まれる。
【0127】
いくつかの実施形態では、従来の方法に従って、本明細書に記載された抗体アミノ酸配列に基づいて、抗体をコードするＤＮＡを設計合成し、それを発現ベクターに入れ、宿主細胞をトランスフェクションし、トランスフェクションされた宿主細胞を培地にて培養し、モノクローナル抗体を産生することができる。いくつかの実施形態では、発現抗体ベクターは、少なくとも１つのプロモータエレメント、抗体コード配列、転写終了シグナルとｐｏｌｙＡ尾部を含む。他のエレメントは、エンハンサー、Ｋｏｚａｋ配列及び挿入配列の両側のＲＮＡスプライシングのドナーと受容体部位を含む。ＳＶ４０の前期と後期プロモーター、レトロウイルス由来の長い末端反復配列、例えばＲＳＶ、ＨＴＬＶ１、ＨＩＶＩ及びサイトメガロウイルスの早期プロモーターによって、高効率な転写を得ることができ、アクチンプロモーターのような他のいくつかの細胞のプロモーターを適用することもできる。適切な発現ベクターは、ｐＩＲＥＳ１ｎｅｏ、ｐＲｅｔｒｏ－Ｏｆｆ、ｐＲｅｔｒｏ－Ｏｎ、ＰＬＸＳＮ、又はＰｌｎｃｘ、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／－）、ｐｃＤＮＡ／Ｚｅｏ（＋／－）、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ（＋／－）、ＰＳＶＬ、ＰＭＳＧ、ｐＲＳＶｃａｔ、ｐＳＶ２ｄｈｆｒ、ｐＢＣ１２ＭＩとｐＣＳ２などを含んでもよい。一般的に用いられる哺乳動物細胞は、２９３細胞、Ｃｏｓ１細胞、Ｃｏｓ７細胞、ＣＶ１細胞、マウスＬ細胞とＣＨＯ細胞などを含む。
【0128】
いくつかの実施形態では、挿入遺伝子断片は、スクリーニング標識を含有する必要があり、よく見られるスクリーニング標識は、トランスフェクションに成功した細胞のスクリーニング単離を容易にするように、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、グルタミン合成酵素、ネオマイシン耐性、ハイグロマイシン耐性などのスクリーニング遺伝子を含む。構築したプラスミドを宿主細胞にトランスフェクションし、選択的に培地で培養し、トランスフェクションに成功した細胞が大量に成長し、所望の目標タンパク質を産生する。
【0129】
いくつかの実施形態では、本発明は、上記任意の抗ＯＸ４０抗体又はその断片をコードする核酸を提供する。一実施形態では、前記核酸を含むベクターを提供する。一実施形態では、ベクターは、発現ベクターである。発現ベクターは、プラスミド、レトロウイルス、ＹＡＣ、ＥＢＶ誘導の付加体などを含む。一実施形態では、前記ベクターを含む宿主細胞を提供する。一実施形態では、前記宿主細胞は真核である。別の実施形態では、宿主細胞は、酵母細胞、哺乳動物細胞（例えばＣＨＯ細胞又は２９３Ｆ細胞）又は抗体又はその抗原結合断片の調製に適用する他の細胞から選択される。
【0130】
いくつかの実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６～１０１に示される１種又は複数種のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６、９７と９８に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９９、１００と１０１に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０２に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０３に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０２に示されるヌクレオチド配列、及び／又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０３に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６、９７、９８、９９、１００又は１０１に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、２６、２７、６１、６２又は６３に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをそれぞれコードして産生することができる。いくつかの実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０２に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードして産生することができ、いくつかの実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０３に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードして産生することができる。いくつかの実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードして産生することができ、いくつかの実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０６に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードして産生することができる。ここで、各ヌクレオチド配列を下記表２に示す。
【0131】
【表2】
【0132】
本発明の薬物組成物は、本発明の抗体又はその抗原結合断片を含んでもよい。これらの薬物組成物は、試薬キット、例えば診断試薬キットに含まれてもよい。
本発明は、必要とされる患者に、１種又は複数種の本明細書に記載された抗体又は断片を投与することによって、がん又は他の腫瘍症状又は感染症状を緩和する方法を提供する。前記抗体の投与用量は、患者におけるがん又は他の腫瘍症状又は感染症状を緩和するのに十分でなければならない。いくつかの実施形態では、前記患者はヒトである。いくつかの実施形態では、前記抗体は、キメラ、ヒト化又は完全ヒト化のものである。いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、Ｔ細胞を活性化し、その増殖又は炎症性因子の分泌を促進することができる。いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、ＩｇＧアイソタイプであり、前記ＩｇＧアイソタイプは、ＩｇＧ１アイソタイプ、ＩｇＧ２アイソタイプ、ＩｇＧ３アイソタイプ及び／又はＩｇＧ４アイソタイプからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、前記抗体又はその抗原結合断片は、ＩｇＧ４ＰとＩｇＧ４ＰＥから選択されるＩｇＧアイソタイプである。いくつかの実施形態では、前記抗体又はその抗原結合断片は、ＲＹ（Ｅ３４５ＲとＳ４４０Ｙ）とＲ（Ｅ３４５Ｒ）を含むものから選択されるＩｇＧアイソタイプである。
本発明は、必要とされる患者に、１種又は複数種の本明細書に記載された抗体又は断片を投与することによって、がん又は他の腫瘍症状又は感染症状を緩和する方法を提供する。前記抗体の投与用量は、患者におけるがん又は他の腫瘍症状又は感染症状を緩和するのに十分でなければならない。いくつかの実施形態では、前記患者はヒトである。いくつかの実施形態では、前記抗体は、キメラ、ヒト化又は完全ヒト化のものである。いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、Ｔ細胞を活性化し、その増殖又は炎症性因子の分泌を促進することができる。いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、ＩｇＧアイソタイプであり、前記ＩｇＧアイソタイプは、ＩｇＧ１アイソタイプ、ＩｇＧ２アイソタイプ、ＩｇＧ３アイソタイプ及び／又はＩｇＧ４アイソタイプからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、前記抗体又はその抗原結合断片は、ＩｇＧ４ＰとＩｇＧ４ＰＥから選択されるＩｇＧアイソタイプである。いくつかの実施形態では、前記抗体又はその抗原結合断片は、ＲＹ（Ｅ３４５ＲとＳ４４０Ｙ）とＲ（Ｅ３４５Ｒ）を含むものから選択されるＩｇＧアイソタイプである。
【0133】
いくつかの実施形態では、前記抗ＯＸ４０抗体と他の治療剤は、単一の治療組成物として調製され、また前記抗ＯＸ４０抗体と他の治療剤を同時に投与する。又は、前記抗ＯＸ４０抗体と他の治療剤は、互いに独立して、例えば、それぞれ、独立した治療組成物として調製され、また、前記抗ＯＸ４０抗体と他の治療剤を同時に投与するか、又は治療レジメンの間で前記抗ＯＸ４０抗体と他の治療剤を異なる時間点で投与する。例えば、他の治療剤を投与する前に、前記抗ＯＸ４０抗体を投与するか、他の治療剤を投与した後に、前記抗ＯＸ４０抗体を投与するか、又は交互のレジメンで前記抗ＯＸ４０抗体と他の治療剤を投与する。本明細書では、前記抗ＯＸ４０抗体と他の治療剤は、単一用量又は複数の用量で投与される。
【0134】
本発明の抗体が様々な用途を有することを、当業者は理解するであろう。例えば、本発明の抗体は、治療剤として、診断試薬キットにおける試薬又は診断ツールとして、又は治療剤を生成するために競合実験における試薬として用いることができる。
本発明は、表３に記載されている抗体及びその配列を提供する。本明細書では、これらの抗体は、抗ＯＸ４０抗体と総称される。
本発明は、表３に記載されている抗体及びその配列を提供する。本明細書では、これらの抗体は、抗ＯＸ４０抗体と総称される。
【0135】
本明細書に記載された抗体のいくつかの特性は、ヒトＯＸ４０とアカゲザルＯＸ４０に特異的に結合することと、ＯＸ４０の細胞内シグナル経路を活性化することができることと、Ｔ細胞の活性化を促進することができることと、がんに対して強力な腫瘍抑制活性を示すこととを含む。
【0136】
本発明の抗体及びその断片のヒトＯＸ４０のエピトープに結合する平衡解離定数（ＫＤ）は、生物光学干渉による測定法とＢＩＡＣＯＲＥを用いて測定したものであり、約２０ｎＭ、約１９ｎＭ、約１２ｎＭ、約６ｎＭ、約５ｎＭ、約４ｎＭ、約２ｎＭ以下である。いくつかの実施形態では、前記ＫＤは、約１ｎＭ又は０．１６ｎＭ以下である。
【0137】
本発明の抗体又はその断片のヒトＯＸ４０のエピトープに結合する平衡結合定数（ＫＤ）は、フローサイトメトリー測定法を用いて測定したものである。いくつかの実施形態では、ヒトＯＸ４０に対する結合は、約１．５ｎＭ以下のＥＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、ヒトＯＸ４０に対する結合は、約１．３３ｎＭ又は１．０ｎＭ以下のＥＣ５０を有する。その測定したＫＤは、既知の対照抗体以下である。
【0138】
本発明の抗ＯＸ４０抗体のＯＸ４０を活性化する活性は、ＮＦκＢレポーター遺伝子系を用いて同定したものであり、ｐｒｏｔｅｉｎ Ａが存在する場合、ＥＣ５０は約０．１４μｇ／ｍｌであるが、Ｒａｊｉ細胞が存在する場合、ＥＣ５０は、約０．０６０２μｇ／ｍｌと０．０７２２μｇ／ｍｌである。
【0139】
本発明の例示的な抗体は、抗体－Ｆ１０、抗体－Ｆ１５－１Ｌ、抗体－Ａ２、抗体－Ｘ３５－６Ｌ、抗体－Ａ６－１ｋ、抗体－Ｍ５－５ｋ、抗体－Ｍ５－７ｋ、抗体－Ｆ２３－４ｋ、抗体－Ｆ２３－７ｋ、抗体－Ｆ２３－３２ｋ、抗体－ＦＥ－１６Ｈと抗体Ｍを含む。本発明の例示的な抗体は、配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４～７２から選択される可変重鎖と、配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３～８４から選択される可変軽鎖（ＶＬ）とを含有する抗体を含む。特に、例示的な抗体は、表３に提供された抗体を含む。
【0140】
【表3-1】
【0141】
【表3-2】
【0142】
本発明は、本明細書に記載された抗ＯＸ４０抗体と同じエピトープに結合する抗体をさらに含む。例えば、本発明の抗体特異的結合は、ヒトＯＸ４０上の１つ又は複数のアミノ酸残基のエピトープ（例えばＵｎｉｐｒｏｔ上のＰ４３４４８９を参照）を含む。
【0143】
過度の実験を行うことなく、被検抗体が既知の抗体のＯＸ４０への結合を抑制するか否かを究明するだけで抗体が本明細書に記載された抗体（例えば表３に示す抗体、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４～７２から選択される可変重鎖と、配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３～８４から選択される可変軽鎖を有する抗体のうちの１つ）と同じエピトープに結合するか否かを決定することができることを、当業者は認識するだろう。本明細書に記載された抗体の結合減少に示されるように、被験抗体が本開示の抗体と競争すると、２種類の抗体は、同じ又は類似するエピトープに結合する可能性がある。
【0144】
抗体が本明細書に記載された抗体の特異性を有するか否かを決定するための代替方法は、本明細書に記載された抗体を、通常、この抗体に対する反応のある可溶性ＯＸ４０タンパク質と共に予備インキュベートし、その後試験される抗体を添加して、試験される抗体のＯＸ４０と結合する能力が抑制されているか否かを決定することである。試験される抗体が抑制されると、それは、本開示の抗体と同じ、又は機能が同じエピトープ特異性を有する。
【0145】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、例えば、以下に提供される実施例に説明される方法を用いて調製することができる。いくつかの実施形態では、Ｔｒｉｏｍａ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら，１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ ４：７２を参照）、及びＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら，１９８５，Ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，第７７－９６ページを参照）などを用いて調製して産生することもできる。
【0146】
抗体は、既知の技術により精製することができ、例えばタンパク質Ａ又はタンパク質Ｇを用いて親和性クロマトグラフィー、免疫親和性クロマトグラフィーなどを行うことができる。例えばＤ．Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ（Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ，Ｉｎｃ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ Ｐａ．出版、第１４巻、第８期（２０００）、第２５－２８ページ）で免疫グロブリンの精製を検討した。
本発明のモノクローナル抗ＯＸ４０抗体は、調節、促進、活性化、起動と他の方式でＯＸ４０細胞内シグナルを活性化させた能力を有する。いくつかの実施形態では、ＷＯ２００９０３６３７９とＷＯ２０１０１０５２５６特許を参照して、例えば酵母表面ディスプレイ方法によって抗ＯＸ４０抗体（例えば完全ヒト化抗体又はヒト化抗体）を産生することができる。この方法では、天然又は組換えＯＸ４０由来又はその断片を用いて、ランダムな軽鎖と重鎖対を持つ酵母組み合わせライブラリをスクリーニングする。
本発明のモノクローナル抗ＯＸ４０抗体は、調節、促進、活性化、起動と他の方式でＯＸ４０細胞内シグナルを活性化させた能力を有する。いくつかの実施形態では、ＷＯ２００９０３６３７９とＷＯ２０１０１０５２５６特許を参照して、例えば酵母表面ディスプレイ方法によって抗ＯＸ４０抗体（例えば完全ヒト化抗体又はヒト化抗体）を産生することができる。この方法では、天然又は組換えＯＸ４０由来又はその断片を用いて、ランダムな軽鎖と重鎖対を持つ酵母組み合わせライブラリをスクリーニングする。
【0147】
（Ｆｃ修飾）
本明細書に記載された抗体の関連するエフェクター機能は、修飾によって、例えばＯＸ４０シグナル伝達に関連する疾病と障害の治療における抗体の有効性を向上させることができる。例えば、腫瘍に浸潤した制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、遍在的に発現するものであるため、１つ又は複数の突然変異を抗体のＦｃ領域に導入することにより、ＡＤＣＣの機能を向上させ、それにより、より一層効果的にＴｒｅｇを死滅させることができる。また例えば、ＯＸ４０の細胞内シグナルの十分な活性化は、複数のＯＸ４０受容体の凝集を必要とし、さらにオリゴ化する必要があるため、１つ又は複数の突然変異を抗体のＦｃ領域に導入することによって、抗体自体の凝集能力又はＦｃ受容体との結合能力を向上させることで抗体の凝集を促進し、それによってＯＸ４０の細胞内シグナルをより十分に活性化することができる。
本明細書に記載された抗体の関連するエフェクター機能は、修飾によって、例えばＯＸ４０シグナル伝達に関連する疾病と障害の治療における抗体の有効性を向上させることができる。例えば、腫瘍に浸潤した制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、遍在的に発現するものであるため、１つ又は複数の突然変異を抗体のＦｃ領域に導入することにより、ＡＤＣＣの機能を向上させ、それにより、より一層効果的にＴｒｅｇを死滅させることができる。また例えば、ＯＸ４０の細胞内シグナルの十分な活性化は、複数のＯＸ４０受容体の凝集を必要とし、さらにオリゴ化する必要があるため、１つ又は複数の突然変異を抗体のＦｃ領域に導入することによって、抗体自体の凝集能力又はＦｃ受容体との結合能力を向上させることで抗体の凝集を促進し、それによってＯＸ４０の細胞内シグナルをより十分に活性化することができる。
【0148】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載された抗体は、ＩｇＧアイソタイプである。いくつかの実施形態では、抗体の定常領域は、ヒトＩｇＧ１アイソタイプであり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、例えばＮ２９７の脱フコシル化など、抗体のグリコシル化を変更するために、ヒトＩｇＧ１定常領域上の特定のアミノ酸に対して修飾を行う。いくつかの実施形態では、前記抗体又はその抗原結合断片は、少量のフコース修飾を含有するか、又はフコース修飾をほとんど含有しないか、又はフコース修飾を含有せず、ＡＤＣＣ効果が著しく向上する。いくつかの実施例では、前記抗体又はその断片は、最大１つ（又は最大２つ、又は３つ）のアミノ酸残基がフコース修飾を有する。いくつかの実施例では、前記抗体又はその断片は、フコースによって修飾される最大で０．０１％、０．１％、１％、２％、３％、４％、又は５％未満のタンパク質分子を含む。いくつかの実施形態では、フコース修飾を低減又は除去した抗体は、より強いＡＤＣＣを有し、いくつかの治療用途に適している。いくつかの実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、改造されたＣＨＯ細胞で発現される。いくつかの実施形態では、改造されたＣＨＯ細胞は、Ｓｌｃ３５ｃ１遺伝子、ｆｕｔ８遺伝子、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼ（ＧＭＤ）遺伝子、ＧＤＰ－４－ケト－６－デオキシマンノース－３，５－エピメラーゼ－４－レダクターゼ（ＧＭＥＲ）遺伝子、ＧＤＰ－フコーストランスポーター（ＧＦＴ）遺伝子のうちの１つ又は複数が減少又はノックアウトされたＣＨＯ細胞である。いくつかの実施形態では、改造されたＣＨＯ細胞は、ｆｕｔ８遺伝子がノックアウトされたＣＨＯ細胞である。
【0149】
いくつかの実施形態では、抗体定常領域上の特定のアミノ酸に対して修飾を行って、Ｆｃ受容体相互作用、例えばＳ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆの突然変異を改変させる。
【0150】
いくつかの実施形態では、抗体の定常領域は、ヒトＩｇＧ２アイソタイプであり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９２と９３のアミノ酸配列を有する。ここで、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９２のアミノ酸配列は以下のとおりである：
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK；
ここで、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３のアミノ酸配列は以下のとおりである：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC。
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK；
ここで、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３のアミノ酸配列は以下のとおりである：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC。
【0151】
いくつかの実施形態では、抗体の定常領域は、ヒトＩｇＧ４アイソタイプであり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４と９５のアミノ酸配列を有する。ここで、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４のアミノ酸配列は以下のとおりである：
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK；
ここで、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９５のアミノ酸配列は以下のとおりである：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC。
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK；
ここで、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９５のアミノ酸配列は以下のとおりである：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC。
【0152】
いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ４定常領域内のヒンジ領域に対して修飾を行うことで、鎖交換を回避又は減少させる。他の実施形態では、ヒトＩｇＧ４定常領域上のアミノ酸２３５に対して修飾を行うことで、Ｆｃ受容体相互作用を改変させる。
【0153】
（抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片に対する使用）
本明細書に記載された抗ＯＸ４０抗体が治療可能な疾患又は病状は、血液がん及び／又は固形がんを含む。血液がんは、例えば白血病、リンパ腫と骨髄腫を含む。いくつかの実施形態では、白血病は、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、骨髄増殖性疾患／腫瘍（ＭＰＤＳ）を含む。リンパ腫は、ホジキンリンパ腫、無痛性と侵襲性非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫と濾胞性リンパ腫（小細胞と大細胞）を含む。骨髄腫は、多発性骨髄腫（ＭＭ）、巨細胞骨髄腫、重鎖骨髄腫と軽鎖又はベンス－ジョーンズ骨髄腫を含む。固形がんは、例えば乳がん、卵巣がん、肺がん、膵臓がん、前立腺がん、黒色腫、結腸直腸がん、肺がん、頭頸部がん、膀胱がん、食道がん、肝臓がんと腎臓がんを含む。
本明細書に記載された抗ＯＸ４０抗体が治療可能な疾患又は病状は、血液がん及び／又は固形がんを含む。血液がんは、例えば白血病、リンパ腫と骨髄腫を含む。いくつかの実施形態では、白血病は、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、骨髄増殖性疾患／腫瘍（ＭＰＤＳ）を含む。リンパ腫は、ホジキンリンパ腫、無痛性と侵襲性非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫と濾胞性リンパ腫（小細胞と大細胞）を含む。骨髄腫は、多発性骨髄腫（ＭＭ）、巨細胞骨髄腫、重鎖骨髄腫と軽鎖又はベンス－ジョーンズ骨髄腫を含む。固形がんは、例えば乳がん、卵巣がん、肺がん、膵臓がん、前立腺がん、黒色腫、結腸直腸がん、肺がん、頭頸部がん、膀胱がん、食道がん、肝臓がんと腎臓がんを含む。
【0154】
本発明の抗体の治療有効量は、治療目標を達成するために必要な量に関する。投与に必要な量は、その特異的抗原に対する抗体の結合親和性、疾患、障害又は症状の重篤程度、投与経路、投与された抗体がそれを投与されたフリー体積の他対から枯渇する速度などに依存する。いくつかの実施形態では、本発明の抗体又は抗体断片の治療有効量の範囲は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、本発明の抗体又は抗体断片の治療有効量の範囲は、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約３０ｍｇ／ｋｇである。用量頻度は、例えば２週ごとに１回又は３週ごとに１回であってもよい。
【0155】
別のいくつかの実施形態では、ＯＸ４０に対する抗体は、当該分野で既知のＯＸ４０局在及び／又は定量に関連する方法（例えば、適当な生理検体におけるＯＸ４０及び／又はＯＸ４０とＯＸ４０Ｌの両者のレベルを測定するために用いられ、診断方法に用いられ、アミロイドイメージングなどに用いられる）に用いられることができる。
いくつかの実施形態では、抗ＯＸ４０抗体を、診断を経て、上記疾患（がん又は他の腫瘍症状を含むが、これらに限らない）に関連する１種又は複数種の臨床症状を有する患者に投与する。診断後、抗ＯＸ４０抗体を投与して、上記疾患に関連する１種又は複数種の臨床症状の効果を軽減又は反転させる。
いくつかの実施形態では、抗ＯＸ４０抗体を、診断を経て、上記疾患（がん又は他の腫瘍症状を含むが、これらに限らない）に関連する１種又は複数種の臨床症状を有する患者に投与する。診断後、抗ＯＸ４０抗体を投与して、上記疾患に関連する１種又は複数種の臨床症状の効果を軽減又は反転させる。
【0156】
いくつかの腫瘍検体において、ＯＸ４０の過剰発現が観察され、かつＯＸ４０過剰発現の細胞を有する患者は、本発明の抗ＯＸ４０抗体を用いた治療に対して応答する可能性がある。そのため、本発明の抗体は、診断と予後にも用いられることができる。
いくつかの実施形態では、細胞を含む検体は、患者体内から採取されてもよく、この患者は、がん患者又は診断対象の患者であってもよい。細胞は、腫瘍組織又は腫瘍塊、血液検体、尿液検体又は患者の任意の検体からの細胞である。検体を選択的に前処理した後、検体に存在する可能性のあるＯＸ４０タンパク質と抗体との相互作用が許容される条件下で、検体を本発明の抗体と共にインキュベートし、抗ＯＸ４０抗体を用いて検体中のＯＸ４０タンパク質の存在を検出することができる。
いくつかの実施形態では、細胞を含む検体は、患者体内から採取されてもよく、この患者は、がん患者又は診断対象の患者であってもよい。細胞は、腫瘍組織又は腫瘍塊、血液検体、尿液検体又は患者の任意の検体からの細胞である。検体を選択的に前処理した後、検体に存在する可能性のあるＯＸ４０タンパク質と抗体との相互作用が許容される条件下で、検体を本発明の抗体と共にインキュベートし、抗ＯＸ４０抗体を用いて検体中のＯＸ４０タンパク質の存在を検出することができる。
【0157】
本発明の抗体は、患者検体中のＯＸ４０を検出するためにも用いられ、そのため診断に用いられることができる。例えば、本発明の抗ＯＸ４０抗体は、患者検体中のＯＸ４０レベルを検出するために、体外試験（例えばＥＬＩＳＡ）に用いられる。
【0158】
一実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体は、固体支持体（例えば微量滴定プレートのウェル）上に固定されている。固定された抗体を捕捉抗体として、試験検体に存在可能な任意のＯＸ４０を捕捉する。固定された抗体を患者検体に接触させる前に、固相担体を洗浄し、分析物の非特異的吸着を回避するために、ブロッキング試薬（例えば牛乳タンパク質又はアルブミン）を用いて処理する。その後、抗原を含む可能性のある試験検体又は標準量の抗原を含む溶液を用いて前記ウェルを処理する。このような検体は、例えば対象からの血清検体であり、ある病変を診断できると考えられる循環抗原レベルを有する可能性がある。試験検体又は標準品を洗浄した後、検出可能な標識の二次抗体を用いて固相支持体を処理する。標識の二次抗体は検出抗体として用いられる。検出可能な標識のレベルを測定し、標準検体によって構築された標準曲線と比較することによって、試験検体におけるＯＸ４０の濃度を決定する。
【0159】
本発明の抗ＯＸ４０抗体を用いて体外での診断試験から得られた結果に基づき、ＯＸ４０及び／又はＯＸ４０Ｌの発現レベルに基づき、対象の疾患（例えば虚血、自己免疫性又は炎症疾病に関連する臨床症状）を分級することができる。特定の疾患については、疾患が進行中の複数の段階及び／又は疾患治療の複数の点にあると診断された対象から血液検体を採取する。進行又は療法の各段階に統計的に有意な結果を提供した検体群を用いて、各段階の特徴と考えられる抗原濃度範囲を決定する。
【0160】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載された抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片を使用する時、抗体又はその断片は、薬物組成物の形態で存在する。ここで、薬物組成物は、抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片と薬学的に許容しうる担体とからなることができる。本明細書で使用されるように、用語「薬学的に許容しうる担体」は、薬物の投与に適合する任意の全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌剤と抗真菌剤、等張化剤と吸収遅延剤などを含むことが意図されている。適切な担体は、最新版のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓに記述されている。このような担体又は希釈剤は、水、塩水、リンガー溶液、グルコース溶液及び／又は５％のヒト血清アルブミンを含むが、これらに限らない。
【0161】
薬物組成物の調合は、その所望の投与経路に適合しなければならない。投与経路の例としては、非経口、例えば静脈内、皮内、皮下、経口（例えば吸入）、経皮（即ち局所）、経粘膜と直腸投与が挙げられる。非経口、皮内又は皮下投与用の溶液又は懸濁液は、例えば水、塩溶液、固定油、ポリエチレングリコール類、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒などの注射用無菌希釈剤、、例えばベンジルアルコール又はパラヒドロキシ安息香酸メチルなどの抗細菌剤、例えばアスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムなどの酸化防止剤、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート剤、例えば酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩などの緩衝剤、及び例えば塩化ナトリウム又は右旋性グルコースなどの浸透圧調節用の試薬の成分を含んでもよい。ｐＨは、酸又は塩基、例えば塩酸又は水酸化ナトリウムで調節することができる。非経口製剤をアンプル、ディスポーザブルシリンジ又はガラス又はプラスチック製の多投与量瓶に包装することができる。
【0162】
注射用途に適した薬物組成物は、無菌水性溶液（ここでは水溶性）又は分散体及び無菌注射液又は分散体を即時に調製するための無菌粉末を含む。静脈内投与については、適切な担体は、生理食塩水、静菌水又はリン酸塩緩衝塩水（ＰＢＳ）を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、無菌で注射しやすいものでなければならない。それは、製造及び保管条件下で安定でなければならず、例えば細菌や真菌などの微生物の汚染作用を防止することができなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセリン、プロピレングリコールと液体ポリエチレングリコールなど）を含む溶媒又は分散媒体、及びその適切な混合物であってもよい。いくつかの実施形態では、薬学的に許容しうる担体は、抗細菌剤及び／又は抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどを含んで実現されてもよい。いくつかの実施形態では、薬学的に許容しうる担体は、等張化剤、例えば糖、ポリオール（例えばエリトリトール、ソルビトール）、塩化ナトリウムを含んでもよい。
【0163】
必要に応じて、抗体を所望の量で、上記の成分における１種又は複数種の組み合わせ（必要に応じて）を有する適切な溶媒に混ぜ込むことによって、無菌注射溶液を調製し、その後、濾過消毒することができる。上記の無菌溶液を凍結乾燥することにより粉末を得て、投与時に無菌注射溶液を調製するためにも用いることがもできる。
【0164】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、免疫応答を活性化することができ、それによって感染の治療に用いられる。
【0165】
感染は、病原性因子が生体組織に侵入し、それらの増殖及び宿主組織のこれらの生体及びそれらから産生する毒素に対する反応である。感染は、例えばウイルス、ウイロイド、プリオン、細菌、例えば寄生性回虫と蟯虫などの線虫、例えばマダニ、ダニ、ノミとシラミなどの節足動物、例えば癬などの真菌及び例えばサナダムシと他の蠕虫などの他の大寄生生物などの感染源によって誘発される可能性がある。ある態様では、感染源は、細菌、例えばグラム陰性菌である。ある態様では、感染源は、ウイルス、例えばＤＮＡウイルス、ＲＮＡウイルスとレトロウイルスである。ウイルスは、特に限定されず、アデノウイルス、コクサッキーウイルス、ＥＢウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス１型、単純ヘルペスウイルス２型、巨細胞ウイルス、ヒトヘルペスウイルス８型、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、耳下腺炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、パラインフルエンザウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器合胞体ウィルス、風疹ウイルス、水痘－帯状疱疹ウイルス含む。
【0166】
本発明の抗体は、微生物によって誘発される感染症の治療に用いられ、又は微生物と免疫細胞に標的結合して微生物を死滅させることにより、微生物を除去する目的を達成することもできる。ある態様では、微生物は、ＲＮＡとＤＮＡウイルスを含むウイルス、グラム陽性菌、グラム陰性菌、原生動物又は真菌である。
【実施例】
【0167】
〔実施例１：ＯＸ４０抗原及び対照抗体の生産と精製〕
（１．１ ヒト化ＯＸ４０抗原の調製）
タンパク質データベースＵｎｉｐｒｏｔから、ヒトＯＸ４０のアミノ酸配列（Ｐ４３４８９）を見つけ、ここでヒトＯＸ４０の細胞外領域のアミノ酸配列は、１～２１６残基であった。タンパク質データベースＵｎｉｐｒｏｔから、ヒトのＩｇＧ１－Ｆｃのアミノ酸配列（Ｐ０１８５７）が１０４～３３０残基であることを見つけた。その後、人工合成（ゼネラルモーターズ社）により、ＯＸ４０とＦｃに対応するヌクレオチド配列を得て、酵素切断によって結合し、それをｐＣＤＮＡ３．０担体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入）に挿入した。組み換えプラスミドｐＣＤＮＡ－ＯＸ４０－ｈｉｓとｐＣＤＮＡ－ＯＸ４０－Ｆｃを得た。さらに、上記プラスミドをＰＥＩによってＨＥＫ２９３を一過性トランスフェクシしョンし、７日培養した後、上澄み液を収集し、最後に、精製によりｈＯＸ４０－ＦＣとｈＯＸ４０－ｈｉｓタンパク質検体を得て、以下の様々な実施例に用いた。
（１．１ ヒト化ＯＸ４０抗原の調製）
タンパク質データベースＵｎｉｐｒｏｔから、ヒトＯＸ４０のアミノ酸配列（Ｐ４３４８９）を見つけ、ここでヒトＯＸ４０の細胞外領域のアミノ酸配列は、１～２１６残基であった。タンパク質データベースＵｎｉｐｒｏｔから、ヒトのＩｇＧ１－Ｆｃのアミノ酸配列（Ｐ０１８５７）が１０４～３３０残基であることを見つけた。その後、人工合成（ゼネラルモーターズ社）により、ＯＸ４０とＦｃに対応するヌクレオチド配列を得て、酵素切断によって結合し、それをｐＣＤＮＡ３．０担体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入）に挿入した。組み換えプラスミドｐＣＤＮＡ－ＯＸ４０－ｈｉｓとｐＣＤＮＡ－ＯＸ４０－Ｆｃを得た。さらに、上記プラスミドをＰＥＩによってＨＥＫ２９３を一過性トランスフェクシしョンし、７日培養した後、上澄み液を収集し、最後に、精製によりｈＯＸ４０－ＦＣとｈＯＸ４０－ｈｉｓタンパク質検体を得て、以下の様々な実施例に用いた。
【0168】
（１．２ 陽性対照抗体１１Ｄ４とＯＸ４０ｍＡｂ２４の調製）
１１Ｄ４の重鎖と軽鎖の配列は、米国特許ＵＳ８２３６９３０に由来する。ＯＸ４０ｍＡｂ２４の重鎖と軽鎖の配列は、米国特許ＵＳ２０１６／０１３７７４０に由来する。人工合成により、上記対応するヌクレオチド配列を得て、そして、酵素切断によって結合し、重鎖のヌクレオチドと軽鎖のヌクレオチドをｐＣＨＯ１．０プラスミドに（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）にそれぞれ結合し、完全抗体を発現するための組み換えプラスミドを得た。メーカーの説明書に基づいて、Ｆｒｅｅｄｏｍ ＣＨＯ－Ｓ試薬キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）を用いて、上記組み換えプラスミドをＣＨＯ－Ｓ細胞系に形質転換し、１１日培養した後、上澄み液を収集し、最後に、精製により１１Ｄ４とＯＸ４０ｍＡｂ２４抗体タンパク質検体を得て、以下の様々な実施例に用いた。
１１Ｄ４の重鎖と軽鎖の配列は、米国特許ＵＳ８２３６９３０に由来する。ＯＸ４０ｍＡｂ２４の重鎖と軽鎖の配列は、米国特許ＵＳ２０１６／０１３７７４０に由来する。人工合成により、上記対応するヌクレオチド配列を得て、そして、酵素切断によって結合し、重鎖のヌクレオチドと軽鎖のヌクレオチドをｐＣＨＯ１．０プラスミドに（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）にそれぞれ結合し、完全抗体を発現するための組み換えプラスミドを得た。メーカーの説明書に基づいて、Ｆｒｅｅｄｏｍ ＣＨＯ－Ｓ試薬キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）を用いて、上記組み換えプラスミドをＣＨＯ－Ｓ細胞系に形質転換し、１１日培養した後、上澄み液を収集し、最後に、精製により１１Ｄ４とＯＸ４０ｍＡｂ２４抗体タンパク質検体を得て、以下の様々な実施例に用いた。
【0169】
〔実施例２：抗ＯＸ４０抗体の調製〕
表３に示される第１～１１号の各抗体の可変領域、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０に示される重鎖定常領域、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１に示される軽鎖定常領域に従って、分子クローニング技術により、その対応する核酸配列をｐＣＨＯ１．０プラスミドに（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）に挿入し、完全抗体を発現するための組み換えプラスミドを得た。メーカーの説明書に基づいて、Ｆｒｅｅｄｏｍ ＣＨＯ－Ｓ試薬キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）を用いて、上記組み換えプラスミドをＣＨＯ－Ｓ細胞系に形質転換し、１１日培養した後、上澄み液を収集し、最後に、精製により、１１株の抗体のタンパク質検体を得て、シーケンシングにより配列を確認し、以下の様々な実施例に用いた。
表３に示される第１～１１号の各抗体の可変領域、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０に示される重鎖定常領域、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１に示される軽鎖定常領域に従って、分子クローニング技術により、その対応する核酸配列をｐＣＨＯ１．０プラスミドに（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）に挿入し、完全抗体を発現するための組み換えプラスミドを得た。メーカーの説明書に基づいて、Ｆｒｅｅｄｏｍ ＣＨＯ－Ｓ試薬キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）を用いて、上記組み換えプラスミドをＣＨＯ－Ｓ細胞系に形質転換し、１１日培養した後、上澄み液を収集し、最後に、精製により、１１株の抗体のタンパク質検体を得て、シーケンシングにより配列を確認し、以下の様々な実施例に用いた。
【0170】
ここで、重鎖定常領域の配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０は、以下のとおりである：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
軽鎖定常領域の配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１は、以下のとおりである：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
〔実施例３：抗ヒトＯＸ４０抗体の結合能力測定〕
（３．１ 生物光学干渉により抗ヒトＯＸ４０抗体の親和性の測定）
ＦｏｒｔｅＢｉｏ親和性測定は、従来の一般的な方法（Ｅｓｔｅｐ，ＰらＭＡｂｓ，２０１３，５（２）：２７０－８）に従う。概略プロセスは、以下のとおりであり、センサを例えばＰＢＳなどの分析緩衝液で、、オフラインで２０分間平衡化し、その後オンラインで６０秒検出し、シグナルベースラインを確立し、オンラインで前述したように得られた精製後の抗体を該当するセンサ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）上にロードし、最後に、ＦｏｒｔｅＢｉｏ親和性測定を行った。ビオチン化された候補抗体をＳＡセンサで吸着し、ｈＯＸ４０－ＦＣの結合及び解離を検出し、それぞれ約５ｍｉｎであり、結果を表４に示し、表４において、Ｎ．Ｄは、未検出を表す。最後に、いずれも１：１結合モデルを用いて、動態分析を行った。結果から、一部の本発明の抗体の親和性は、対照抗体の親和性よりも優れているか、又はそれに近いことが分かった。
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
軽鎖定常領域の配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１は、以下のとおりである：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
〔実施例３：抗ヒトＯＸ４０抗体の結合能力測定〕
（３．１ 生物光学干渉により抗ヒトＯＸ４０抗体の親和性の測定）
ＦｏｒｔｅＢｉｏ親和性測定は、従来の一般的な方法（Ｅｓｔｅｐ，ＰらＭＡｂｓ，２０１３，５（２）：２７０－８）に従う。概略プロセスは、以下のとおりであり、センサを例えばＰＢＳなどの分析緩衝液で、、オフラインで２０分間平衡化し、その後オンラインで６０秒検出し、シグナルベースラインを確立し、オンラインで前述したように得られた精製後の抗体を該当するセンサ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）上にロードし、最後に、ＦｏｒｔｅＢｉｏ親和性測定を行った。ビオチン化された候補抗体をＳＡセンサで吸着し、ｈＯＸ４０－ＦＣの結合及び解離を検出し、それぞれ約５ｍｉｎであり、結果を表４に示し、表４において、Ｎ．Ｄは、未検出を表す。最後に、いずれも１：１結合モデルを用いて、動態分析を行った。結果から、一部の本発明の抗体の親和性は、対照抗体の親和性よりも優れているか、又はそれに近いことが分かった。
【0171】
【表4】
【0172】
（３．２抗ヒトＯＸ４０抗体の細胞表面抗原の結合能力）
ヒトＯＸ４０ ｃＤＮＡを有するｐＣＭＶ担体をトランスフェクションすることにより、ヒトＯＸ４０を過剰発現するＪｕｒｋａｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ－ｈＯＸ４０細胞）を産生した。Ｊｕｒｋａｔ－ｈＯＸ４０細胞（０．５×１０６個の細胞）と１００ｎＭの実験抗体を０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳにて氷上で４０分間インキュベートした。その後、細胞を２回洗浄し、二次抗体と０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳにて氷上で２５分間インキュベートした。細胞を２回洗浄し、Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６系（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上でフローサイトメトリー分析を行い、その結果を図１に示す。
抗体－Ｆ２３－４ｋと抗体－Ｆ２３－３２ｋ、及び２つの対照抗体１１Ｄ４とＯＸ４０ｍＡｂ２４など、異なる濃度の抗体でＪｕｒｋａｔ－ｈＯＸ４０細胞をインキュベートした。抗体濃度は、５０ｎＭから３倍下方希釈し、合計９つの濃度点であり、ＭＦＩを集計し、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏを用いてデータを処理し、測定により、ＥＣ５０値がそれぞれ、１．５ｎＭ、１．０ｎＭ、１．５ｎＭと５ｎＭであった。
ヒトＯＸ４０ ｃＤＮＡを有するｐＣＭＶ担体をトランスフェクションすることにより、ヒトＯＸ４０を過剰発現するＪｕｒｋａｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ－ｈＯＸ４０細胞）を産生した。Ｊｕｒｋａｔ－ｈＯＸ４０細胞（０．５×１０６個の細胞）と１００ｎＭの実験抗体を０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳにて氷上で４０分間インキュベートした。その後、細胞を２回洗浄し、二次抗体と０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳにて氷上で２５分間インキュベートした。細胞を２回洗浄し、Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６系（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上でフローサイトメトリー分析を行い、その結果を図１に示す。
抗体－Ｆ２３－４ｋと抗体－Ｆ２３－３２ｋ、及び２つの対照抗体１１Ｄ４とＯＸ４０ｍＡｂ２４など、異なる濃度の抗体でＪｕｒｋａｔ－ｈＯＸ４０細胞をインキュベートした。抗体濃度は、５０ｎＭから３倍下方希釈し、合計９つの濃度点であり、ＭＦＩを集計し、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏを用いてデータを処理し、測定により、ＥＣ５０値がそれぞれ、１．５ｎＭ、１．０ｎＭ、１．５ｎＭと５ｎＭであった。
【0173】
抗－ＣＤ３／ＣＤ２８電磁ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）を用いて、健常人由来のＰＢＭＣ細胞（雷徳生物から購入）を４８時間活性化し、０．５ｘ１０６個の細胞をＰＢＳにて、５０ｎＭの実験抗体と共にインキュベートし、４０分間インキュベートした。そしてその後、細胞を２回洗浄し、ａｎｔｉ－ＦＣ－ＰＥ二次抗体（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入）とＰＢＳにて氷上で３０分間インキュベートした。細胞を２回洗浄し、フローサイトメトリーにより分析し、ＭＦＩを算出した。結果を表５に示す。
【0174】
【表5】
【0175】
〔実施例４：抗ヒトＯＸ４０抗体の特異性〕
例３．２の方法と同様に、１００ｎＭの実験抗体と異なる抗原を過剰発現するＪｕｒｋａｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ－ＴＩＭ３、Ｊｕｒｋａｔ－ＣＴＬＡ４、Ｊｕｒｋａｔ－ＴＩＧＩＴ）、ＣＨＯ及びｒａｊｉをインキュベートし、その後、フローサイトメトリーで測定し、結果を図２に示す。結果から、抗体－Ｆ２３－３２ｋは、これらの抗原又は細胞株と有意に結合しておらず、特異性が良いことが示唆されることが分かった。
ＥＬＩＳＡの方法を用いて、まず、１０ｎｇのマウスのＯＸ４０－ｈｉｓ（ｍＯＸ４０－ｈｉｓ）、ｈＣＤ２７－ＦＣ及びｈＯＸ４０－ｈｉｓをコーティングし、４℃で一晩し、洗浄後、さらに抗体－Ｆ２３－３２Ｋと対照抗体をインキュベートし、最後に、ＨＲＰ標識二次抗体によって標識及び発色を行う。検出して得られたＯＤ値を表６に示す。例３．２の方法と同様に、ｐｒｏｔｅｉｎ Ａセンサ－－－Ａｎｔｉｂｏｄｙ－－－ＯＸ４０－ｈｉｓ（１００ｎＭ）のプロセスグラムに従って設定し、Ｆｏｒｔｅｂｉｏを用いて、抗体－Ｆ２３－３２Ｋと対照抗体及びアカゲザルＯＸ４０（Ｒｈ－ＯＸ４０）との親和性を検出し、結果を表６に示す。上記結果から、抗体－Ｆ２３－３２Ｋは、ｈＣＤ２７（ｈＯＸ４０の同ファミリータンパク質）に結合せず、マウスのＯＸ４０にも結合しないが、アカゲザルのＯＸ４０に有意に結合していることが分かった。
例３．２の方法と同様に、１００ｎＭの実験抗体と異なる抗原を過剰発現するＪｕｒｋａｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ－ＴＩＭ３、Ｊｕｒｋａｔ－ＣＴＬＡ４、Ｊｕｒｋａｔ－ＴＩＧＩＴ）、ＣＨＯ及びｒａｊｉをインキュベートし、その後、フローサイトメトリーで測定し、結果を図２に示す。結果から、抗体－Ｆ２３－３２ｋは、これらの抗原又は細胞株と有意に結合しておらず、特異性が良いことが示唆されることが分かった。
ＥＬＩＳＡの方法を用いて、まず、１０ｎｇのマウスのＯＸ４０－ｈｉｓ（ｍＯＸ４０－ｈｉｓ）、ｈＣＤ２７－ＦＣ及びｈＯＸ４０－ｈｉｓをコーティングし、４℃で一晩し、洗浄後、さらに抗体－Ｆ２３－３２Ｋと対照抗体をインキュベートし、最後に、ＨＲＰ標識二次抗体によって標識及び発色を行う。検出して得られたＯＤ値を表６に示す。例３．２の方法と同様に、ｐｒｏｔｅｉｎ Ａセンサ－－－Ａｎｔｉｂｏｄｙ－－－ＯＸ４０－ｈｉｓ（１００ｎＭ）のプロセスグラムに従って設定し、Ｆｏｒｔｅｂｉｏを用いて、抗体－Ｆ２３－３２Ｋと対照抗体及びアカゲザルＯＸ４０（Ｒｈ－ＯＸ４０）との親和性を検出し、結果を表６に示す。上記結果から、抗体－Ｆ２３－３２Ｋは、ｈＣＤ２７（ｈＯＸ４０の同ファミリータンパク質）に結合せず、マウスのＯＸ４０にも結合しないが、アカゲザルのＯＸ４０に有意に結合していることが分かった。
【0176】
【表6】
【0177】
〔実施例５：抗ＯＸ４０抗体の生物活性の検出〕
（５．１ ＮＦκＢレポーター遺伝子系を用いて候補抗体の体外活性化活性の検出）
例３．２のＪｕｒｋａｔ－ｈＯＸ４０を基礎として、ｐＧＬ６－ＮＦｋＢ－ｌｕｆｉｆｅｒａｓ－ｒｅｐｏｒｔｅｒプラスミド（碧雲天から購入）を細胞に電気的に形質転換し、最後に、抗生物質の加圧スクリーニングにより、安定したモノクローナル株を得て、Ｊｕｒｋａｔ－ｈＯＸ４０－ＮＦκＢと命名した。細胞を蘇生させ、３回継代、その後２０ｘ１０４細胞／ウェルに従ってプレートに塗布し、１ウェルあたりに６０μｌの培地であり、該当する１μｇ／ｍｌの実験抗体と２．５μｇ／ｍｌのａｎｔｉ－ＦＣ抗体（ヤギ抗ヒト、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）を加え、５時間インキュベートし、その後５０μｌの蛍光反応物（ＯＮＥ－ＧｌｏＴＭ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ、ｐｒｏｍｅｇａ社から購入）をウェルごとに加え、結果を図３に示す。データから分かるように、１μｇ／ｍｌの濃度下で実験抗体の活性化シグナルは、いずれも対照抗体より強い。
（５．１ ＮＦκＢレポーター遺伝子系を用いて候補抗体の体外活性化活性の検出）
例３．２のＪｕｒｋａｔ－ｈＯＸ４０を基礎として、ｐＧＬ６－ＮＦｋＢ－ｌｕｆｉｆｅｒａｓ－ｒｅｐｏｒｔｅｒプラスミド（碧雲天から購入）を細胞に電気的に形質転換し、最後に、抗生物質の加圧スクリーニングにより、安定したモノクローナル株を得て、Ｊｕｒｋａｔ－ｈＯＸ４０－ＮＦκＢと命名した。細胞を蘇生させ、３回継代、その後２０ｘ１０４細胞／ウェルに従ってプレートに塗布し、１ウェルあたりに６０μｌの培地であり、該当する１μｇ／ｍｌの実験抗体と２．５μｇ／ｍｌのａｎｔｉ－ＦＣ抗体（ヤギ抗ヒト、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）を加え、５時間インキュベートし、その後５０μｌの蛍光反応物（ＯＮＥ－ＧｌｏＴＭ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ、ｐｒｏｍｅｇａ社から購入）をウェルごとに加え、結果を図３に示す。データから分かるように、１μｇ／ｍｌの濃度下で実験抗体の活性化シグナルは、いずれも対照抗体より強い。
【0178】
上記で述べた方法に従って、１つのウィンドウ値がより大きなＪｕｒｋａｔ－ｈＯＸ４０－ＮＦκＢ－２細胞を再構築し、抗体の活性化活性を検証するために用いられる。活性化標的受容体に対する抗体は、活性化活性を強力に発揮しようとすると、Ｆｃ－Ｒの関与が必要であることがある研究で示唆されている。上記方法と同様に、Ｊｕｒｋａｔ－ｈＯＸ４０－ＮＦκＢ－２細胞を蘇生させ、３回継代し、その後４ｘ１０４細胞／ウェルに従ってプレートに塗布し、１ウェルあたりに６０μｌの培地であり、該当する実験抗体と４万個のｒａｊｉ細胞（その表面に一定のＦｃ－受容体（即ちＦｃ－Ｒ）を天然に有する）をウェルごとに加え、４．５時間インキュベートした後、５０μｌの蛍光反応物をウェルごとに加え、結果を表７に示す。データから、ｒａｊｉ細胞が存在する場合、候補抗体の活性化活性を有意に向上させることができることが示唆された。
【0179】
【表7】
【0180】
上記方法と同様に、Ｊｕｒｋａｔ－ｈＯＸ４０－ＮＦκＢ－２細胞を蘇生させ、３回継代し、その後４ｘ１０４細胞／ウェルに従ってプレートに塗布し、１ウェルあたりに６０μｌの培地であった。まず、実験抗体とｐｒｏｔｅｉｎ Ａ／Ｇを１：１に従って２ｍｉｎインキュベートし、開始濃度を１．５μｇ／ｍｌとし、その後勾配希釈し、結果を図４に示す。抗体－Ｆ２３－３２ｋと１１Ｄ４のＥＣ５０は、それぞれ０．１４０５μｇ／ｍｌと０．２２６１μｇ／ｍｌであった。
【0181】
（５．２ 活性化されたＰＢＭＣのＩＬ－２の分泌に対する抗体の影響の検出）
本発明の抗ＯＸ４０抗体のアゴニスト活性は、Ｔ細胞活性化後にＴ細胞から放出される炎症性サイトカインを測定することによって評価される。ＰＢＭＣ取得後、２０万個／ウェルに従ってプレートに塗布し、２００μｌの培地を９６ウェルプレートに塗布し、８０μｇ／ｍｌのＳＥＢを加えてＰＢＭＣを活性化させ、２日後、ＰＢＭＣを収集した。洗浄後、２０万個／ウェルに従ってプレートに塗布し、２００μｌの培地であり、さらに１μｇ／ｍｌの候補抗体又は対照抗体と２μｇ／ｍｌのａｎｔｉ－ＦＣ抗体（ヤギ抗ヒト、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）を加えた。３日後、ＥＬＩＳＡ試薬キットにより培地中のＩＬ－２分泌レベルを検出し、結果を図５に示す。上記操作と同様に、まず、１μｇ／ｍｌの候補抗体又は対照抗体を４℃でプレートに一晩コーティングし、プレートを３回洗浄した後、活性化されたＰＢＭＣをプレートに塗布し、２０万個／ウェルに従ってプレートに塗布し、２００μｌの培地であった。３日後、ＥＬＩＳＡ試薬キット（欣博盛から購入）により培地中のＩＬ－２分泌レベルを測定し、結果を図５に示す。データから、本発明の抗体－Ｆ２３－３２ｋが陽性対照に相当することが示唆された。
本発明の抗ＯＸ４０抗体のアゴニスト活性は、Ｔ細胞活性化後にＴ細胞から放出される炎症性サイトカインを測定することによって評価される。ＰＢＭＣ取得後、２０万個／ウェルに従ってプレートに塗布し、２００μｌの培地を９６ウェルプレートに塗布し、８０μｇ／ｍｌのＳＥＢを加えてＰＢＭＣを活性化させ、２日後、ＰＢＭＣを収集した。洗浄後、２０万個／ウェルに従ってプレートに塗布し、２００μｌの培地であり、さらに１μｇ／ｍｌの候補抗体又は対照抗体と２μｇ／ｍｌのａｎｔｉ－ＦＣ抗体（ヤギ抗ヒト、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）を加えた。３日後、ＥＬＩＳＡ試薬キットにより培地中のＩＬ－２分泌レベルを検出し、結果を図５に示す。上記操作と同様に、まず、１μｇ／ｍｌの候補抗体又は対照抗体を４℃でプレートに一晩コーティングし、プレートを３回洗浄した後、活性化されたＰＢＭＣをプレートに塗布し、２０万個／ウェルに従ってプレートに塗布し、２００μｌの培地であった。３日後、ＥＬＩＳＡ試薬キット（欣博盛から購入）により培地中のＩＬ－２分泌レベルを測定し、結果を図５に示す。データから、本発明の抗体－Ｆ２３－３２ｋが陽性対照に相当することが示唆された。
【0182】
〔実施例６：抗ＯＸ４０抗体生物活性に対するＦｃ突然変異の増強〕
人工合成によって、２つのＩｇＧ１－Ｆｃ突然変異配列を得て、それぞれＲＹ（Ｅ３４５ＲとＳ４４０Ｙ）とＲ（Ｅ３４５Ｒ）で、ＩｇＧ１－ＦＣ－ＲＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８）とＩｇＧ１－ＦＣ－Ｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９）とそれぞれ命名され、配列を表８に示す（下線は、突然変異位置を表す）。抗体－Ｆ２３－３２ｋに対してＲＹ又はＲ突然変異を行い、得られた抗体を３２ｋ－ＲＹと３２ｋ－Ｒとそれぞれ命名した。また、ＨＰＬＣ検証を経て、遊離状態で、主にモノマーとして存在した。Ｊｕｒｋａｔ－ｈＯＸ４０－ＮＦκＢ－２とＪｕｒｋａｔ－ｈＯＸ４０－ＮＦκＢ細胞を蘇生させ、それぞれ以下の実験に用いた。例５．１の操作と同様に、細胞を３回継代し、その後４ｘ１０４又は２０万細胞／ウェルに従ってプレートに塗布し、該当する抗体（１μｇ／ｍｌ）、抗体突然変異体（１μｇ／ｍｌ）、ｒａｊｉ細胞（１ウェルあたり１万個の細胞）又はｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（１μｇ／ｍｌ、生工生物工程（Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）から購入）を加えた。９６ウェルに添加した検体レジメンと組み合わせを具体的に図６に示し、結果も図６に示す。ＲＹ又はＲ突然変異を含む抗体は、ｐｒｏｔｅｉｎ Ａが存在しない場合もＯＸ４０のシグナルを有意に活性化することができ、かつ野生型の抗体よりも１０倍前後強い。
人工合成によって、２つのＩｇＧ１－Ｆｃ突然変異配列を得て、それぞれＲＹ（Ｅ３４５ＲとＳ４４０Ｙ）とＲ（Ｅ３４５Ｒ）で、ＩｇＧ１－ＦＣ－ＲＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８）とＩｇＧ１－ＦＣ－Ｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９）とそれぞれ命名され、配列を表８に示す（下線は、突然変異位置を表す）。抗体－Ｆ２３－３２ｋに対してＲＹ又はＲ突然変異を行い、得られた抗体を３２ｋ－ＲＹと３２ｋ－Ｒとそれぞれ命名した。また、ＨＰＬＣ検証を経て、遊離状態で、主にモノマーとして存在した。Ｊｕｒｋａｔ－ｈＯＸ４０－ＮＦκＢ－２とＪｕｒｋａｔ－ｈＯＸ４０－ＮＦκＢ細胞を蘇生させ、それぞれ以下の実験に用いた。例５．１の操作と同様に、細胞を３回継代し、その後４ｘ１０４又は２０万細胞／ウェルに従ってプレートに塗布し、該当する抗体（１μｇ／ｍｌ）、抗体突然変異体（１μｇ／ｍｌ）、ｒａｊｉ細胞（１ウェルあたり１万個の細胞）又はｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（１μｇ／ｍｌ、生工生物工程（Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）から購入）を加えた。９６ウェルに添加した検体レジメンと組み合わせを具体的に図６に示し、結果も図６に示す。ＲＹ又はＲ突然変異を含む抗体は、ｐｒｏｔｅｉｎ Ａが存在しない場合もＯＸ４０のシグナルを有意に活性化することができ、かつ野生型の抗体よりも１０倍前後強い。
【0183】
【表8】
【0184】
〔実施例７：ヒト化マウスにＭＣ３８腫瘍を接種したモデルにより、腫瘍抑制に対するａｎｔｉ－抗ＯＸ４０抗体の能力の検証〕
ＯＸ４０ヒト化マウスモデル（百奥賽図から購入）において、本発明の抗ＯＸ４０抗体の抗腫瘍効果を検証した。ＭＣ３８腫瘍細胞を５×１０５個／０．１ｍＬの濃度でＢ－ｈＯＸ４０のヒト化雌性マウスの右側皮下に接種し、腫瘍が１１９ｍｍ３まで成長する時に、腫瘍体積に従ってランダムに群分けし、１群あたりに６匹であった。抗体を腹腔内投与し、Ｑ３Ｄ（３日ごとに１回）の頻度に従って投与し、３ｍｇ／ｋｇであり、合計６回投与し、ＰＢＳを陰性対照とした。
ＯＸ４０ヒト化マウスモデル（百奥賽図から購入）において、本発明の抗ＯＸ４０抗体の抗腫瘍効果を検証した。ＭＣ３８腫瘍細胞を５×１０５個／０．１ｍＬの濃度でＢ－ｈＯＸ４０のヒト化雌性マウスの右側皮下に接種し、腫瘍が１１９ｍｍ３まで成長する時に、腫瘍体積に従ってランダムに群分けし、１群あたりに６匹であった。抗体を腹腔内投与し、Ｑ３Ｄ（３日ごとに１回）の頻度に従って投与し、３ｍｇ／ｋｇであり、合計６回投与し、ＰＢＳを陰性対照とした。
【0185】
全研究期間にわたって腫瘍と体重を週に２回測り、腫瘍が終点に達した時、又はマウスが２０％体重減少した時、マウスを安楽死させた。各群に対して、デジタルノギスを用いて平均腫瘍体積を推定し、以下の式によって腫瘍体積（ｍｍ３）を算出し、各群の（幅）２×長さ／２は約５０ｍｍ３であった。結果を図７に示す。図７において、ＴＧＩ％は、腫瘍体積に対する抑制率であり、その計算式は、：ＴＧＩ％＝（１－（ｍｅａｎ ＲＴＶ投与群）／（ｍｅａｎ ＲＴＶ対照群））×１００％であり、ｍｅａｎ ＲＴＶ投与群は、投与群のＲＴＶ平均値であり、ｍｅａｎ ＲＴＶ対照群は、対照群のＲＴＶ平均値であり、ＲＴＶｎ＝Ｖｎｔ／Ｖｎ０であり、Ｖｎｔは、番号がｎであるマウスのｔ日目の腫瘍体積でり、Ｖｎ０は、番号がｎであるマウスの０日目の腫瘍体積であり、ＲＴＶｎは、番号がｎであるマウスのｔ日目の腫瘍相対体積であり、抗体４Ｋ－ＲＹの重鎖は、抗体－Ｆ２３－４ｋのＦＣ突然変異（Ｅ３４５ＲとＳ４４０Ｙ）から得られた。
【0186】
実験抗体の投与後、腫瘍に浸潤したＴ細胞（ＴＩＬ）に対する影響をさらに了解するためである。上記実験が終了した後、適切なマウスを選択し、１群あたりに４匹であった。従来の解剖手段により、腫瘍に浸潤したリンパＴ細胞、及び血液中のリンパＴ細胞を取得した。さらに異なるマーカーを用いて細胞に対して蛍光標識を行い、最後に、フローセルソーターを用いて蛍光検出を行った。結果から、本発明の実験抗体が腫瘍内部ＣＤ４＋とＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を増加させることが分かった。一方、血液中のＣＤ４＋とＣＤ８＋Ｔ細胞の割合に影響を与えなかった。
【0187】
〔実施例８〕
１）候補抗体の親和性成熟及び親和性測定
表９に抗体－Ｆ２３－３２ＫのＣＤＲのいくつかの突然変異を示し、ここで、下線のアミノ酸は、変異部位とした。表１０には、これらのアミノ酸の変異の８つの完全抗体のＣＤＲが挙げられ、残りの配列は、抗体－Ｆ２３－３２Ｋと同じであった。ＢＩＡＣＯＲＥを用いて、それらの親和性を測定し、具体的なプローは、まずプローブを用いて抗体に結合し、２０ｎＭのＯＸ４０－ｈｉｓの結合と解離を検出した。結果を表１１に示し、ここで抗体Ｍの親和性は、約７０倍向上し、０．１６ｎＭに達し、ＯＸ４０ｍＡｂ２４の親和性より約２１倍高く、１１Ｄ４の抗体より約９倍高かった。上記方法と同様に、異なる濃度のＷＥＳＴ＋ＶＧＴＤとＳＴ＋ＶＧＴＤ抗体を用いて、ＯＸ４０を過剰発現するｊｕｒｋａｔ細胞をインキュベートし、得られたＥＣ５０値は、それぞれ、１．２ｎＭと１．３ｎＭであり、結果を図８に示す。抗ＯＸ４０抗体（抗体Ｍ）の配列は、表１２に示すとおりであり、ここで、上記抗体（抗体Ｍを含む）に用いられる発現細胞は、ＣＨＯ－Ｓ細胞であり、抗体Ｍ－ＫＦの調製方法は、抗体Ｍ－ＫＦと抗体Ｍのアミノ酸配列が同じであり、ｆｕｔ８遺伝子がノックアウトされたＣＨＯ細胞株を用いて発現した（抗体Ｍ－ＫＦのフコース含有量は約０％であった）。
１）候補抗体の親和性成熟及び親和性測定
表９に抗体－Ｆ２３－３２ＫのＣＤＲのいくつかの突然変異を示し、ここで、下線のアミノ酸は、変異部位とした。表１０には、これらのアミノ酸の変異の８つの完全抗体のＣＤＲが挙げられ、残りの配列は、抗体－Ｆ２３－３２Ｋと同じであった。ＢＩＡＣＯＲＥを用いて、それらの親和性を測定し、具体的なプローは、まずプローブを用いて抗体に結合し、２０ｎＭのＯＸ４０－ｈｉｓの結合と解離を検出した。結果を表１１に示し、ここで抗体Ｍの親和性は、約７０倍向上し、０．１６ｎＭに達し、ＯＸ４０ｍＡｂ２４の親和性より約２１倍高く、１１Ｄ４の抗体より約９倍高かった。上記方法と同様に、異なる濃度のＷＥＳＴ＋ＶＧＴＤとＳＴ＋ＶＧＴＤ抗体を用いて、ＯＸ４０を過剰発現するｊｕｒｋａｔ細胞をインキュベートし、得られたＥＣ５０値は、それぞれ、１．２ｎＭと１．３ｎＭであり、結果を図８に示す。抗ＯＸ４０抗体（抗体Ｍ）の配列は、表１２に示すとおりであり、ここで、上記抗体（抗体Ｍを含む）に用いられる発現細胞は、ＣＨＯ－Ｓ細胞であり、抗体Ｍ－ＫＦの調製方法は、抗体Ｍ－ＫＦと抗体Ｍのアミノ酸配列が同じであり、ｆｕｔ８遺伝子がノックアウトされたＣＨＯ細胞株を用いて発現した（抗体Ｍ－ＫＦのフコース含有量は約０％であった）。
【0188】
【表9】
【0189】
【表10】
【0190】
【表11】
【0191】
【表12】
【0192】
２）抗体の抗原結合特異性の検出
ＥＬＩＳＡ方法を用いて抗体Ｍ－ＫＦとヒト及びカニクイザルのＯＸ４０との結合能力を測定した。試験方法は、まず、ヒト又はカニクイザルのＯＸ４０を４℃で一晩コーティングし、その濃度を２ｕｇ／ｍｌとし、異なる濃度の抗体Ｍ－ＫＦをインキュベートして検出した。抗体Ｍ－ＫＦの開始濃度は、１μｇ／ｍｌ又は２μｇ／ｍｌであり、２倍の勾配で希釈した。
ＥＬＩＳＡ方法を用いて抗体Ｍ－ＫＦとヒト及びカニクイザルのＯＸ４０との結合能力を測定した。試験方法は、まず、ヒト又はカニクイザルのＯＸ４０を４℃で一晩コーティングし、その濃度を２ｕｇ／ｍｌとし、異なる濃度の抗体Ｍ－ＫＦをインキュベートして検出した。抗体Ｍ－ＫＦの開始濃度は、１μｇ／ｍｌ又は２μｇ／ｍｌであり、２倍の勾配で希釈した。
【0193】
結果から分かるように、抗体Ｍ－ＫＦは、ヒト及びカニクイザルのＯＸ４０に結合することができ、結合したＥＣ５０値がそれぞれ、約０．０３４０ｎｇ／ｍｌと０．０３５２ｎｇ／ｍｌであった。
【0194】
〔実施例９：抗体のＡＤＣＣエフェクターと体外活性化活性〕
抗体Ｍのフコース含有量は、約９６％であった。抗体Ｍ－ＫＦのフコース含有量は、約０％であった。ｊｕｒｋａｔ細胞上にＦＣ－ＲＩＩＩＡとＮＦ－ＡＴレポーター遺伝子を形質転換し、Ｊｕｒｋａｔ－ＡＤＣＣ細胞を得た。Ｊｕｒｋａｔ－ｈＯＸ４０細胞とｊｕｒｋａｔ－ＡＤＣＣ細胞を１：１に従って混合し、該当する濃度勾配の抗体Ｍと抗体Ｍ－ＫＦを加え、結果を図９に示す。上述した方法（実施例５）のように、ＮＦκＢレポーター遺伝子系を用いて、候補抗体の体外活性化活性を検出した。Ｊｕｒｋａｔ－ｈＯＸ４０－ＮＦκＢ－２細胞を蘇生させ、３回継代し、その後４ｘ１０４個の細胞／ウェルに従ってプレートに塗布し、１ウェルあたりに６０μｌの培地であり、該当する実験抗体と４万個のｒａｊｉ細胞を加え、結果を図１０に示す。抗体Ｍ、抗体Ｍ－ＫＦのＥＣ５０値は、１１Ｄ４よりも少し良く、しかし、前両者の活性化ピーク値は、後者の約２．５倍であった。
抗体Ｍのフコース含有量は、約９６％であった。抗体Ｍ－ＫＦのフコース含有量は、約０％であった。ｊｕｒｋａｔ細胞上にＦＣ－ＲＩＩＩＡとＮＦ－ＡＴレポーター遺伝子を形質転換し、Ｊｕｒｋａｔ－ＡＤＣＣ細胞を得た。Ｊｕｒｋａｔ－ｈＯＸ４０細胞とｊｕｒｋａｔ－ＡＤＣＣ細胞を１：１に従って混合し、該当する濃度勾配の抗体Ｍと抗体Ｍ－ＫＦを加え、結果を図９に示す。上述した方法（実施例５）のように、ＮＦκＢレポーター遺伝子系を用いて、候補抗体の体外活性化活性を検出した。Ｊｕｒｋａｔ－ｈＯＸ４０－ＮＦκＢ－２細胞を蘇生させ、３回継代し、その後４ｘ１０４個の細胞／ウェルに従ってプレートに塗布し、１ウェルあたりに６０μｌの培地であり、該当する実験抗体と４万個のｒａｊｉ細胞を加え、結果を図１０に示す。抗体Ｍ、抗体Ｍ－ＫＦのＥＣ５０値は、１１Ｄ４よりも少し良く、しかし、前両者の活性化ピーク値は、後者の約２．５倍であった。
【0195】
〔実施例１０：抗体の体外薬力学試験〕
前述したように、ＯＸ４０ヒト化マウスモデル（百奥賽図から購入）において、本発明の抗ＯＸ４０抗体の抗腫瘍効果を検証した。ＭＣ３８腫瘍細胞を５×１０５個／０．１ｍＬの濃度でＢ－ｈＯＸ４０のヒト化雌性マウスの右側皮下に接種し、腫瘍成長が１１９ｍｍ３まで成長する時に、腫瘍体積に従ってランダムに群分けし、１群あたりに６匹であった。発現及び精製により一連のエンドトキシンを含まない抗体、抗体Ｍと抗体Ｍ－ＫＦを得て、腹腔内投与し、Ｑ３Ｄの頻度に従って、３つの用量群１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇに分けられ、合計６回投与した。
前述したように、ＯＸ４０ヒト化マウスモデル（百奥賽図から購入）において、本発明の抗ＯＸ４０抗体の抗腫瘍効果を検証した。ＭＣ３８腫瘍細胞を５×１０５個／０．１ｍＬの濃度でＢ－ｈＯＸ４０のヒト化雌性マウスの右側皮下に接種し、腫瘍成長が１１９ｍｍ３まで成長する時に、腫瘍体積に従ってランダムに群分けし、１群あたりに６匹であった。発現及び精製により一連のエンドトキシンを含まない抗体、抗体Ｍと抗体Ｍ－ＫＦを得て、腹腔内投与し、Ｑ３Ｄの頻度に従って、３つの用量群１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇに分けられ、合計６回投与した。
【0196】
全研究期間にわたって腫瘍と体重を週に２回測り、腫瘍が終点に達した時、又はマウスが２０％体重減少した時、マウスを安楽死させた。各群に対して、デジタルノギスを用いて平均腫瘍体積を推定し、以下の式によって腫瘍体積（ｍｍ３）を算出し、各群の（幅）２×長さ／２は、約５０ｍｍ３であり、結果を図１１に示し、ここで、２１日目の結果を図１２に示す。抗体Ｍと抗体Ｍ－ＫＦの高用量群は、腫瘍の成長を顕著に抑制することができ（Ｐ＜０．０５）、かつ効果も１１Ｄ４の高用量群より明らかに良かった。抗体Ｍ－ＫＦの中用量群は、腫瘍の成長を顕著に抑制することもできる（Ｐ＜０．０５）。
【0197】
〔実施例１１：抗体のＡＤＣＣエフェクター（ＰＢＭＣ法）〕
Ｊｕｒｋａｔ－ｈＯＸ４０細胞をターゲット細胞とし、健常人由来のＰＢＭＣをエフェクター細胞とした。ＰＢＭＣとＪｕｒｋａｔ－ＯＸ４０細胞を２５：１の量比で混合し、抗体Ｍ－ＫＦ又は抗体Ｍ（開始濃度を１μｇ／ｍｌとし、４倍の勾配で希釈したもの）を加え、３７℃下で４ｈインキュベートし、その後試薬キットＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標） Ｎｏｎ－Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて該当するシグナルを測定し、この系により抗体のＡＤＣＣ媒介の生細胞傷害作用を検出した。
Ｊｕｒｋａｔ－ｈＯＸ４０細胞をターゲット細胞とし、健常人由来のＰＢＭＣをエフェクター細胞とした。ＰＢＭＣとＪｕｒｋａｔ－ＯＸ４０細胞を２５：１の量比で混合し、抗体Ｍ－ＫＦ又は抗体Ｍ（開始濃度を１μｇ／ｍｌとし、４倍の勾配で希釈したもの）を加え、３７℃下で４ｈインキュベートし、その後試薬キットＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標） Ｎｏｎ－Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて該当するシグナルを測定し、この系により抗体のＡＤＣＣ媒介の生細胞傷害作用を検出した。
【0198】
結果を図１３に示し、抗体Ｍ－ＫＦは、明らかなＡＤＣＣ作用を持ち、ＥＣ５０は、約１．８９１ｎｇ／ｍｌであり、抗体Ｍより２倍強であった。
【0199】
〔実施例１２：活性化されたＰＢＭＣのＩＬ－２の分泌に対する抗体の影響の検出〕
ＥＬＩＳＡの方法を用いて、ＩＬ－２サイトカインの放出を検出することによって、抗体Ｍ－ＫＦの外来刺激下のヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に対する活性化エフェクターを検出した。まず、ＳＥＢ（ブドウ球菌エンテロトキシンＢ）でＰＢＭＣを２４ｈ刺激し、異なる濃度の抗体Ｍ－ＫＦ又は参照抗体１１Ｄ４を加え、３日続けてインキュベートし、最後に、Ｈｕｍａｎ ＩＬ－２ ＥＬＩＳＡ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｋｉｔ（ＨＲＰ）試薬キット（Ｍａｂｔｅｃｈ、品番３４４５－１Ｈ－２０）を用いて、ＰＢＭＣから分泌されたＩＬ－２を検出した。
ＥＬＩＳＡの方法を用いて、ＩＬ－２サイトカインの放出を検出することによって、抗体Ｍ－ＫＦの外来刺激下のヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に対する活性化エフェクターを検出した。まず、ＳＥＢ（ブドウ球菌エンテロトキシンＢ）でＰＢＭＣを２４ｈ刺激し、異なる濃度の抗体Ｍ－ＫＦ又は参照抗体１１Ｄ４を加え、３日続けてインキュベートし、最後に、Ｈｕｍａｎ ＩＬ－２ ＥＬＩＳＡ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｋｉｔ（ＨＲＰ）試薬キット（Ｍａｂｔｅｃｈ、品番３４４５－１Ｈ－２０）を用いて、ＰＢＭＣから分泌されたＩＬ－２を検出した。
【0200】
結果を図１４に示し、０．３２μｇ／ｍｌ又はそれ以上の濃度下で、抗体Ｍ－ＫＦによってＰＢＭＣを刺激してＩＬ－２を分泌する量は、陰性対照ＩｇＧ１の約４倍であった。
【0201】
〔実施例１３：非活性化条件下でのＰＢＭＣサイトカイン放出に対する抗体の影響の検出〕
ＥＬＩＳＡの方法を用いて、ＩＬ－２、ＩＮＦ－γ、ＩＬ－６、ＴＮＦ－αサイトカインの放出を検出することによって、外来刺激無しのヒトＰＢＭＣに対する抗体Ｍ－ＫＦの活性化エフェクターを検出し、その安全性を考察した。抗体Ｍ－ＫＦ作用機序の最終目的は、Ｔ細胞を活性化することにより、免疫系を刺激し、免疫機能を増強させることである。安全性の観点から考えると、このような抗体は、生体免疫系の過度活性化を招き、それによってサイトカインストームを誘発するおそれがある。ＩＬ－２、ＩＮＦ－γ、ＩＬ－６、ＴＮＦ－αは、いずれもサイトカインストームの発生時に、よく見られる大量産生する因子の１つであり、これらの因子を選択して検出を行った。
ＥＬＩＳＡの方法を用いて、ＩＬ－２、ＩＮＦ－γ、ＩＬ－６、ＴＮＦ－αサイトカインの放出を検出することによって、外来刺激無しのヒトＰＢＭＣに対する抗体Ｍ－ＫＦの活性化エフェクターを検出し、その安全性を考察した。抗体Ｍ－ＫＦ作用機序の最終目的は、Ｔ細胞を活性化することにより、免疫系を刺激し、免疫機能を増強させることである。安全性の観点から考えると、このような抗体は、生体免疫系の過度活性化を招き、それによってサイトカインストームを誘発するおそれがある。ＩＬ－２、ＩＮＦ－γ、ＩＬ－６、ＴＮＦ－αは、いずれもサイトカインストームの発生時に、よく見られる大量産生する因子の１つであり、これらの因子を選択して検出を行った。
【0202】
活性化処理されていないヒトＰＢＭＣと異なる濃度の抗体Ｍ－ＫＦ又はＣＤ２８抗体を共にインキュベートし、抗体の開始濃度を２００μｇ／ｍｌとし、３倍勾配に従って希釈した。最後に、Ｍａｂｔｅｃｈ社の該当するサイトカイン検出試薬キットを用いて、ＰＢＭＣから分泌されたＩＬ－２、ＩＮＦ－γ、ＩＬ－６、ＴＮＦ－αを検出した。
【0203】
図１５に示すように、陽性対照ＣＤ２８抗体と比較して、抗体Ｍ－ＫＦは、２００μｇ／ｍＬ及びそれ以下の濃度で、いずれも外来刺激無しのＰＢＭＣからＩＬ－２、ＩＮＦ－γ、ＩＬ－６、ＴＮＦ－αを産生させることができず、抗体Ｍ－ＫＦは、一定の安全性を持つと予想される。
【0204】
本明細書で引用された全ての出版物と特許文献は、あたかも、各出版物又は文献が具体的かつ個々に参照により本明細書に組み込まれるように、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。上記出版物と特許文献についての引用は、上述したいかなる内容が関連する先行技術であることを認めることを示すものではなく、その内容又は日付を認めることを示すものではない。ここで、本発明を明細書の方式で説明したが、当業者であれば、本発明を様々な実施形態で実施することができ、上記した明細書と実施例は、本発明の特許請求の範囲を限定するものではなく、説明するものが意図されていることを、認識するであろう。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【配列表】
【国際調査報告】