ホーム > 特許ランキング > スキャンセル リミテッド
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-05-12
(54)【発明の名称】ＳＳＥＡ－４結合メンバー
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20230502BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20230502BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20230502BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20230502BHJP
C12Q 1/04 20060101ALI20230502BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230502BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230502BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20230502BHJP
A61K 39/00 20060101ALI20230502BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13
C07K16/28 ZNA
C12P21/08
C12N5/0783
C12Q1/04
A61K39/395 T
A61K39/395 N
A61P35/00
A61P37/04
A61K39/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】有
(21)【出願番号】P 2022514814
(86)(22)【出願日】2020-09-04
(85)【翻訳文提出日】2022-05-02
(86)【国際出願番号】 EP2020074878
(87)【国際公開番号】W WO2021044039
(87)【国際公開日】2021-03-11
(31)【優先権主張番号】1912882.6
(32)【優先日】2019-09-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】520104123
【氏名又は名称】スキャンセル リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】デュラント，リンダ ジリアン
(72)【発明者】
【氏名】チュア，チアシン
【テーマコード（参考）】
4B063
4B064
4B065
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA14
4B063QA18
4B063QQ08
4B063QQ79
4B063QR48
4B063QS10
4B063QS12
4B063QS33
4B064AG27
4B064CA10
4B064CA19
4B064CC15
4B064CC24
4B064DA05
4B064DA14
4B065AA90X
4B065BA25
4B065BB19
4B065BB34
4B065BD14
4B065CA44
4C085AA03
4C085AA13
4C085AA14
4C085AA16
4C085BA01
4C085BB41
4C085BB43
4C085BB44
4C085CC23
4C085DD62
4C085EE01
4C085GG01
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA20
4H045EA50
4H045FA74
(57)【要約】
本開示は、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏの両方でステムメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）のサブセットを単離、活性化、および増殖させるための標的としてその後使用され得る、ステムメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）上の発生段階に特異的な胚性抗原４（ＳＳＥＡ－４）の発現に関連する。またこれは、ＳＳＥＡ－４に結合し、ＴＳＣＭを標的とする医薬抗体組成物およびその使用のための方法に関する。本開示の抗体は、ＳＳＥＡ－４糖脂質を認識し、ＴＳＣＭの増殖を誘導し、血液由来のこの固有の集団を選別するために使用されて、形質導入Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、形質導入キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）－Ｔの養子Ｔ細胞移入のためまたは造血幹細胞移植用の細胞のための臨床的な増殖を行うことができる。使用方法として、限定するものではないが、がんの治療および診断における使用方法が挙げられる。例は、表記Ｆ２８１１．７２を有する抗体に関連していた。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＳＳＥＡ－４（Ｎｅｕ５Ａｃ（α２－３）Ｇａｌ（β１－３）ＧａｌＮＡｃ（β１－３）Ｇａｌ（α１－４）Ｇａｌ（β１－４）Ｇｌｃ）に特異的に結合することができ、ステムメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）を標的とすることができる、単離された特異的な結合メンバー。
【請求項2】
糖脂質上でＳＳＥＡ－４に結合できる、請求項１に記載の結合メンバー。
【請求項3】
ステムメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の増殖を誘導できる、先行する請求項のいずれかに記載の結合メンバー。
【請求項4】
ＳＳＥＡ－３に結合しない、先行する請求項のいずれかに記載の結合メンバー。
【請求項5】
ｍＡｂ ＦＧ２８１１．７２またはキメラのＦＧ２８１１．７２（ＣＨ２８１１／ＣＨ２８１１．７２）、またはそれらのフラグメントである、先行する請求項のいずれかに記載の結合メンバー。
【請求項6】
二重特異性である、先行する請求項のいずれかに記載の結合メンバー。
【請求項7】
二重特異性の結合メンバーが、さらにＣＤ３に対して特異的である、請求項７に記載の結合メンバー。
【請求項8】
図２ａの残基２７～３８（ＣＤＲＨ１）、５６～６５（ＣＤＲＨ２）、および１０５～１１３（ＣＤＲＨ３）のアミノ酸配列から選択される１つ以上の結合ドメインを含む、先行する請求項のいずれかに記載の結合メンバー。
【請求項9】
図２ｂの残基２７～３８（ＣＤＲＬ１）、５６～６５（ＣＤＲＬ２）、および１０５～１１３（ＣＤＲＬ３）のアミノ酸配列から選択される１つ以上の結合ドメインを含む、先行する請求項のいずれかに記載の結合メンバー。
【請求項10】
前記結合メンバーが、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３のうちの１つ以上を含む軽鎖可変配列であって、ＬＣＤＲ１が、ＳＳＶＮＹを含み、
ＬＣＤＲ２が、ＤＴＳを含み
ＬＣＤＲ３が、ＦＱＡＳＧＹＰＬＴを含む、
軽鎖可変配列と、
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３のうちの１つ以上を含む重鎖可変配列であって、
ＨＣＤＲ１が、ＧＦＳＬＮＳＹＧを含み、
ＨＣＤＲ２が、ＩＷＧＤＧＳＴを含み、
ＨＣＤＲ３が、ＴＫＰＧＳＧＹＡＦを含む、
重鎖可変配列と
を含む、先行する請求項のいずれかに記載の結合メンバー。
【請求項11】
前記結合ドメインが、ヒト抗体フレームワークにより担持されている、先行する請求項のいずれかに記載の結合メンバー。
【請求項12】
前記結合メンバーが、図２ａのアミノ酸配列の残基１～１２６を含むＶＨドメイン、および／または図２ｂのアミノ酸配列の残基１～１２３を含むＶＬドメインを含む、先行する請求項のいずれかに記載の結合メンバー。
【請求項13】
前記結合メンバーが、抗体、抗体フラグメント、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄ、またはジアボディである、先行する請求項のいずれかに記載の結合メンバー。
【請求項14】
前記結合メンバーが、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはベニヤ化抗体である、先行する請求項のいずれかに記載の結合メンバー。
【請求項15】
治療に使用するための、先行する請求項のいずれかに記載の結合メンバー。
【請求項16】
がんを予防、処置、または診断する方法に使用するための、請求項１～１４のいずれかに記載の結合メンバー。
【請求項17】
がんに対する防御免疫応答を亢進する方法であって、請求項１～１４のいずれかに記載の結合メンバーを、それを必要とする対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項18】
前記結合メンバーが、任意選択でがんワクチンであるさらなる免疫原性作用物質と共に投与するように調製されている、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
請求項１～１４のいずれかに記載の結合メンバーをコードする配列を含む核酸。
【請求項20】
がんの診断のための方法であって、個体由来のサンプル中の糖脂質に結合したグリカンＳＳＥＡ－４（Ｎｅｕ５Ａｃ（α２－３）Ｇａｌ（β１－３）ＧａｌＮＡｃ（β１－３）Ｇａｌ（α１－４）Ｇａｌ（β１－４）Ｇｌｃ）を検出するために請求項１～１４のいずれかに記載の結合メンバーを使用するステップを含む、方法。
【請求項21】
請求項１～１４のいずれかに記載の結合メンバーと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項22】
ｅｘ ｖｉｖｏでステムメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の増殖を誘導する方法であって、ステムメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）を請求項１～１４のいずれかに記載の結合メンバーと接触させるステップを含む、方法。
【請求項23】
請求項１～１４のいずれかに記載の結合メンバーを含む、ステムメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の増殖を誘導するための細胞培養培地。
【請求項24】
請求項１～１４のいずれかに記載の結合メンバーでステムメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）上のＳＳＥＡ－４（Ｎｅｕ５Ａｃ（α２－３）Ｇａｌ（β１－３）ＧａｌＮＡｃ（β１－３）Ｇａｌ（α１－４）Ｇａｌ（β１－４）Ｇｌｃ）の存在を検出することにより、前記細胞を同定する方法。
【請求項25】
請求項１～１４のいずれかに記載の結合メンバーでステムメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）上のＳＳＥＡ－４（Ｎｅｕ５Ａｃ（α２－３）Ｇａｌ（β１－３）ＧａｌＮＡｃ（β１－３）Ｇａｌ（α１－４）Ｇａｌ（β１－４）Ｇｌｃ）の存在を検出することにより、前記細胞を精製する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏの両方でステムメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）のサブセットを単離、活性化、および増殖させるための標的としてその後使用され得る、ステムメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）上の発生段階に特異的な胚性抗原４（ＳＳＥＡ－４）の発現に関連する。またこれは、ＳＳＥＡ－４に結合し、ＴＳＣＭを標的とする医薬抗体組成物およびその使用のための方法に関する。本開示の抗体は、ＳＳＥＡ－４糖脂質を認識し、ＴＳＣＭの増殖を誘導し、血液由来のこの固有の集団を選別するために使用されて、形質導入Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、形質導入キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）－Ｔの養子Ｔ細胞移入のためまたは造血幹細胞移植用の細胞のための臨床的な増殖を行うことができる。使用方法として、限定するものではないが、がんもしくは長期間ウイルスに感染した患者におけるかまたは化学療法後におけるＴＳＣＭのｉｎ ｖｉｖｏでの刺激のためのアゴニスト（ＩｇＧ２）キメラモノクローナル抗体（ｍＡｂ）としてのがんの治療および診断における使用方法が挙げられる。
【背景技術】
【0002】
ＳＳＥＡは、グロボ系列の糖脂質であり、３種：ＳＳＥＡ－１、ＳＳＥＡ－３、およびＳＳＥＡ－４から構成されている（Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ． ２０１３）。シアリルガラクトシルグロボシド（シアリルＧｂ５Ｃｅｒ、ＳＧＧ、ＭＳＧＧ）またはＳＳＥＡ－４は、酵素ＳＴ３ β－ガラクトシドα－２，３－シアリルトランスフェラーゼ２（ＳＴ３ＧＡＬ２）によりＳＳＥＡ－３から合成されるグロボ系列のガングリオシドである（Ｓａｉｔｏ ｅｔ ａｌ． ２００３）。これらグロボシドの発現は、精製の複雑さおよびこれらの合成に関与する遺伝子の数のために、主にｍＡｂにより定義されている。この手法の主な限定は、これらｍＡｂの大部分は特異性が低く、個別のグロボシドの発現の解釈を困難なものにしているという点である。この注意事項により、ＳＳＥＡ－４の発現は、以下のように定義されている：ＳＳＥＡ－４は、細胞膜のグリコシナプスの成分である。ヒトの着床前発生の間、ＳＳＥＡ－４は、最初に、内部細胞塊の多能性細胞で観察され、その後、分化後に消失する（Ｔｏｎｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ． ２００８）。出生後、ヒトの精巣および卵巣における生殖幹細胞（Ｈａｒｉｃｈａｎｄａｎ， Ｓｉｖａｓｕｂｒａｍａｎｉｙａｎ， ａｎｄ Ｂｕｈｒｉｎｇ ２０１３）ならびに間葉系幹細胞（Ｇａｎｇ ｅｔ ａｌ． ２００７）ならびに心筋幹細胞（Ｓａｎｄｓｔｅｄｔ ｅｔ ａｌ． ２０１４）は、ＳＳＥＡ－４を発現する（Ｇａｎｇ ｅｔ ａｌ． ２００７）。これは、ヒト胚性癌細胞（ヒト奇形癌腫細胞；３つ全ての胚葉の組織誘導体を含む腫瘍）での動物の免疫処置を介して同定されており（Ｓｈｅｖｉｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ． １９８２； Ｋａｎｎａｇｉ ｅｔ ａｌ． １９８３； Ｗｒｉｇｈｔ ａｎｄ Ａｎｄｒｅｗｓ ２００９）、ヒト胚性幹細胞およびそれらの悪性対応物、胚性癌細胞を定義するための細胞表面マーカーとして広く使用されている（Ｋａｎｎａｇｉ ｅｔ ａｌ． １９８３； Ｌｏｕ ｅｔ ａｌ． ２０１４； Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ． ２００２）。固形腫瘍では、ＳＳＥＡ－４の過剰発現は、神経膠芽腫（グレードＩの約５５％、グレードＩＩの約５５％、グレードＩＩＩの約６０％、およびグレードＩＶの星状細胞腫の約６９％）（Ｌｏｕ ｅｔ ａｌ． ２０１４）、腎細胞癌（Ｓａｉｔｏ ｅｔ ａｌ． １９９７）、乳がん細胞および乳がん幹細胞（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ． ２０１３）、類基底細胞肺がん（Ｇｏｔｔｓｃｈｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ． ２０１３）、卵巣上皮癌（Ｙｅ ｅｔ ａｌ． ２０１０）、ならびに口腔がん（Ｎｏｔｏ ｅｔ ａｌ． ２０１３）で見出されている。がんに関連し、かつ／またはがんを予測する超特異的なグリカンマーカーを同定し、幅広いスペクトラムのがんの診断および処置に使用するためのマーカーに対する抗体を開発することに多くの関心が集まっている。ＳＳＥＡ－４は、胚性幹細胞で発現し、成年幹細胞でダウンレギュレートされるグリカンである。しかしながら、予想外なことに本発明者らは、この発現がヒトおよびマウスのＴＳＣＭで保持されることを示した。ＴＳＣＭに固有のマーカーの記載がなされたのは、今回が初めてである。
【0003】
メモリーＴ細胞（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋メモリーＴ細胞を含む）は、いくつかのサブセット：ＴＳＣＭ、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）、トランジショナルメモリーＴ細胞（ＴＴＭ）（ＣＤ４＋メモリーＴ細胞でのみ記載）、エフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ）、およびターミナルエフェクターＴ細胞（ＴＴＥ）を含む（Ｍａｔｅｕｓ ｅｔ ａｌ． ２０１５； Ｔａｋｅｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ． ２０１５）。ヒトの臨床試験でより強力な抗腫瘍細胞をもたらすために、ナイーブなセントラルメモリーリンパ球または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）由来のＴＳＣＭ細胞の産生を誘導するためにどの方法を使用すべきかに関しては、議論が続いている（Ｋｌｅｂａｎｏｆｆ， Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ， ａｎｄ Ｒｅｓｔｉｆｏ ２０１２）。
【0004】
ヒトＴＳＣＭ細胞は、長期間生存するメモリーＴ細胞集団として記載されており、ナイーブＴ細胞と表現型の類似性を共有しており（ＣＤ４５ＲＯ－、ＣＣＲ７＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ２８＋、およびＩＬ－７Ｒα＋）、またＣＤ９５、ＩＬ－２Ｒβ（ＣＤ１２２）、およびＣＸＣＲ３を著しく発現している（Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ ｅｔ ａｌ． ２０１１）。ＴＳＣＭ細胞は、抗原刺激により生じ、有意に高い増殖能および再構成能を呈する、クローンにより増殖した始原的なメモリーＴのサブセットである（Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ ｅｔ ａｌ． ２０１１）。
【0005】
長期間持続する免疫の維持はＴＳＣＭ細胞に依存すると考えられており、これは、小さな集団を構成し、最も分化度が低いメモリーＴ細胞のサブセットであり、血液におけるＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞集団の合計の約２～４％である（Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ ｅｔ ａｌ． ２０１１； Ｌｕｇｌｉ， Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ， ｅｔ ａｌ． ２０１３）。ＴＳＣＭ細胞は、Ｓｃａ－１（幹細胞抗原１）、ＣＤ１２２、およびＢｃｌ－２を発現する有糸分裂後のＣＤ４４ｌｏｗＣＤ６２ｈｉｇｈＣＤ８＋Ｔ細胞の新規のサブセットを報告したＺｈａｎｇら（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． ２００５）により、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）のマウスモデルで最初に観察された。このＴ細胞集団は、ＧＶＨＤ反応において全てのアロジェニックなＴ細胞のサブセットを産生および維持することができた。これらアロ反応性のＣＤ８＋Ｔ細胞は、高い自己再生能および多分化能を有することが示されており、ＴＣＭ、ＴＥＭ、およびＴＴＥ細胞へ分化することができた（Ｃｈａｈｒｏｕｄｉ， Ｓｉｌｖｅｓｔｒｉ， ａｎｄ Ｌｉｃｈｔｅｒｆｅｌｄ ２０１５； Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． ２００５）。ヒトにおいては、一例は、ワクチン接種後のナイーブな黄熱（ＹＦ）に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞集団の同定に由来しており、これは、２５年超の間安定して維持されており、ｅｘ ｖｉｖｏで自己再生することができた（Ｆｕｅｒｔｅｓ Ｍａｒｒａｃｏ ｅｔ ａｌ． ２０１５）。ＴＳＣＭ細胞は、マーカーＣＤ９５と共にいくつかのナイーブなマーカーの同時発現に基づきフローサイトメトリーにより同定することができる（Ｍａｈｎｋｅ ｅｔ ａｌ． ２０１３）。これら細胞の頻度の低さが詳細な性質決定を限定しているため、抗原に特異的なＴＳＣＭ細胞に関する報告は限定されている。たとえば、総ヒトＴ細胞の１％未満が、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ１２７＋ＣＤ９５＋のウイルスに特異的なＴＳＣＭ細胞と定義されている。ヒトＣＭＶに特異的なＴＳＣＭ細胞は、約１／１０，０００個のＴ細胞の頻度の、他のサブセットで観察される頻度と同様の頻度で検出され得る（Ｓｃｈｍｕｅｃｋ－Ｈｅｎｎｅｒｅｓｓｅ ｅｔ ａｌ． ２０１５； Ｄｉ Ｂｅｎｅｄｅｔｔｏ ｅｔ ａｌ． ２０１５）。抗原に特異的なＴＳＣＭ細胞が、リンパ節に優先的に存在し、脾臓および骨髄では少なく存在することが示されている（Ｌｕｇｌｉ， Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ， ｅｔ ａｌ． ２０１３）。
【0006】
ＴＳＣＭ細胞は、特異的な抗腫瘍応答および腫瘍に対する長期間の免疫監視に主要な役割を果たし得る（Ｄａｒｌａｋ ｅｔ ａｌ． ２０１４； Ｃｏｕｌｉｅ ｅｔ ａｌ． ２０１４； Ｍａｒｔｉｎ ２０１４）。また、優れた持続能を有するＴＳＣＭ細胞は、長命のＴ細胞のメモリーの維持における重要なプレイヤーとして注目を浴びつつあり、よって、がんの養子移入ベースの免疫療法で使用するための魅力的な集団とみなされている。しかしながら、これらの産生を調節する分子シグナルは、依然として定義が不十分である。養子免疫療法の状況で行われる実験は、Ｔ細胞の分化を管理する２つの鍵となる転写因子、Ｔボックス転写因子（Ｔ－ｂｅｔ）およびＥｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ（ｅｏｍｅｓ：エオメス）を欠いているＴ細胞が、抗腫瘍応答を誘発できず、発現したマーカーがＴＳＣＭと一致したことを明らかにした。よって、ＴＳＣＭの抗腫瘍の可能性は、それらの内因的な活性よりも、エフェクターメモリー細胞へのさらなる分化により依存していると思われる（Ｌｉ ｅｔ ａｌ． ２０１３）。
【0007】
養子Ｔ細胞療法は、がん免疫療法に有効な戦略ではあるが、注入したＴ細胞は、高頻度で、機能的に消耗され、結果として、患者へ移植した後に不十分な予後を提供する。腫瘍抗原に特異的なＴＳＣＭ細胞の養子移入は、この欠点を克服している。これは、ＴＳＣＭ細胞がナイーブＴ細胞に近いが、著しく増殖性であり、長期間生存し、抗原の刺激に応答して多数のエフェクターＴ細胞を産生するためである。天然のＴＣＲまたは人工的なＣＡＲに由来する腫瘍特異性を有するＴ細胞を使用する養子細胞療法は、後期の臨床試験に達している。ＣＡＲを発現するＴ細胞を使用したがんの免疫療法による処置は、養子細胞療法において比較的新規の手法である。ＣＡＲ－Ｔ細胞は、特定のＢ細胞の悪性化において顕著な成功を示しているが、固形がんに対する奏効率は、今日まであまり成功してはいない。この戦略は、抗体様認識細胞外ドメインおよびＴ細胞シグナリング細胞内ドメインからなる新規の合成受容体をＴ細胞に遺伝的に装備することに基づく。この受容体の抗体由来の結合ドメインにより提供されるインタクトな抗原の直接的な同定により、Ｔ細胞は、主要組織適合抗原（ＭＨＣ）が介在する抗原認識の制限を迂回することができ、これにより、所定のＣＡＲが、そのＭＨＣのハプロタイプに関わらず、全ての患者で使用できる。ＭＨＣからの独立性はＣＡＲ－Ｔ細胞に基本的な抗腫瘍性の利点をもたらす。何故ならば、一部の腫瘍細胞はＴＣＲが介在する免疫応答を回避するためにＭＨＣ発現をダウンレギュレートするためである（Ｇａｒｒｉｄｏ ｅｔ ａｌ． １９９３）。しかしながら、目的のＣＡＲを発現するように操作されたＴ細胞は、依然として腫瘍細胞を認識および根絶できる。さらに、ＣＡＲ－Ｔ細胞を使用することにより、潜在的な腫瘍標的の範囲をＴＣＲベースの認識の範囲を超えるエピトープまで広げることができ、たとえば、腫瘍の標的化でタンパク質だけではなく炭水化物（Ｍｅｚｚａｎｚａｎｉｃａ ｅｔ ａｌ． １９９８）および糖脂質（Ｙｖｏｎ ｅｔ ａｌ． ２００９）をも含めることが可能である。
【0008】
増殖および養子移入のために選択されるＴ細胞の性質決定は、移入された細胞の持続の決定に重要である。感染症またはがんの存在下で抗原に特異的なＴ細胞は、増殖でき、病原体を迅速に排除することに特化したエフェクターＴ細胞、および長期間持続でき、疾患の再発を防御し得るメモリーＴ細胞に分化できる。メモリーＴ細胞の区画は、不均一であり、特有の性質を有する複数のサブセットを包有する。免疫学的なメモリーのスペクトラムは、ナイーブＴ細胞のようにＣＤ４５ＲＡ、ＣＣＲ７、およびＣＤ６２Ｌを発現し、同様にＣＤ９５を発現するＴＳＣＭ細胞を含む。ＴＳＣＭ細胞は、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）およびエフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ細胞）、およびターミナルエフェクターＴ細胞（ＴＴＥ）に分化し得、またこれらは、段階的な移植実験により示されるように、自己再生に関して顕著な可能性を有している（Ｃｉｅｒｉ ｅｔ ａｌ． ２０１３）。抗原に特異的なＴ細胞の総合的なメモリー区画の維持に対する異なるメモリーサブセットの寄与は、ＴＳＣＭ細胞が低頻度であることから完全には解明されてはおらず、これらの詳細な性質決定は限定されている（Ｓｃｈｍｕｅｃｋ－Ｈｅｎｎｅｒｅｓｓｅ ｅｔ ａｌ． ２０１５）。ＴＳＣＭ細胞を産生、増殖し、がん細胞に対するＴＳＣＭ細胞の再支持を可能にする戦略が、完全に定義される必要がある。Ｃｉｅｒｉおよびその同僚は、ナイーブＴ細胞を抗ＣＤ３／ＣＤ２８および低用量のＩＬ－７およびＩＬ－１５でプライミングすることにより多数のＴＳＣＭ細胞が産生することを記載しており、ナイーブな前駆体からｉｎ ｖｉｔｒｏでＴＳＣＭ細胞を産生、増殖、および遺伝子操作することが可能であることを示唆している。しかしながら、増殖した細胞は、もはやＣＤ４５ＲＡを発現していないがＣＤ４５ＲＯを発現しており、よってこれらはＴＣＭであり得る。さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏで産生されたＴＳＣＭ細胞は、免疫欠損マウスへの養子移入の後に高い増殖能を呈し、この知見は天然に存在するＴＳＣＭ細胞と一致している（Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ ａｎｄ Ｒｅｓｔｉｆｏ ２０１３； Ｃｉｅｒｉ ｅｔ ａｌ． ２０１３）。既知のメモリーＴ細胞集団の中で、ＴＳＣＭ細胞のサブセットは、有効なワクチンの設計および開発ならびにＴ細胞ベースの治療に深く関係している（Ｒｅｓｔｉｆｏ ａｎｄ Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ ２０１３； Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ ｅｔ ａｌ． ２０１１； Ｌｕｇｌｉ， Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ， ｅｔ ａｌ． ２０１３）。ＴＳＣＭ細胞は、細胞性（ＣＡＲ－Ｔ）免疫療法の臨床的な開発を促進し得る（Ｈａｎ ｅｔ ａｌ． ２０１３； Ａｋｉｎｌｅｙｅ， Ａｖｖａｒｕ， ｅｔ ａｌ． ２０１３； Ｂｒｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ． ２０１４； Ａｋｉｎｌｅｙｅ， Ｃｈｅｎ， ｅｔ ａｌ． ２０１３； Ｎｏｖｅｒｏ ｅｔ ａｌ． ２０１４； Ｓｕｒｅｓｈ ｅｔ ａｌ． ２０１４）が、循環するリンパ球におけるＴＳＣＭ細胞の数の少なさが、これらの手法を限定している（Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ ａｎｄ Ｒｅｓｔｉｆｏ ２０１３）。
【0009】
グリコシル化の変化は、がん細胞の特性であり、いくつかのグリカン構造は、よく知られている腫瘍マーカーである（Ｍｅｅｚａｎ ｅｔ ａｌ． １９６９； Ｈａｋｏｍｏｒｉ ２００２）。これらの異常な変化は、Ｎ結合したグリカンの分枝の全体的な増大（Ｌａｕ ａｎｄ Ｄｅｎｎｉｓ ２００８）およびシアル酸含有量の全体的な増大（ｖａｎ Ｂｅｅｋ， Ｓｍｅｔｓ， ａｎｄ Ｅｍｍｅｌｏｔ １９７３）、特定のグリカンエピトープの喪失または過剰発現（Ｓｅｌｌ １９９０； Ｈａｋｏｍｏｒｉ ａｎｄ Ｚｈａｎｇ １９９７； Ｔａｙｌｏｒ－Ｐａｐａｄｉｍｉｔｒｉｏｕ ａｎｄ Ｅｐｅｎｅｔｏｓ １９９４）、トランケートされたグリカンの持続または新規グリカンの出現（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ． ２０１３）を含み得る。実際に、多くの腫瘍が、特定の糖脂質、特にガングリオシド、スフィンゴ糖脂質（ＧＳＬ）、およびグリカン鎖に結合したシアル酸の発現を増大させている。多くの試験は、異常なグリコシル化が、最初の発がん性の形質転換に寄与しており、腫瘍の侵襲および転移の誘導に重要な役割を果たしていることを表している（Ｈａｋｏｍｏｒｉ ２００２）。幅広い範囲のＧＳＬの過剰発現が、様々な種類のヒト悪性腫瘍で同定されている：メラノーマにおけるＧＤ４（Ｎｕｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ． １９８２）、神経外胚葉性腫瘍におけるＧＤ２（Ｃａｈａｎ ｅｔ ａｌ． １９８２）、小細胞肺癌におけるフコシル－ＧＭ１（Ｎｉｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ． １９８６）、乳癌および卵巣癌におけるＧｌｏｂｏ－Ｈ（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． ２００８）、ならびに乳がんおよび乳がん幹細胞における発生段階に特異的な胚性抗原（ＳＳＥＡ）－３およびＳＳＥＡ－４（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． ２００８）。
【0010】
がん免疫療法の成功は、良好な特異性および強力な殺滅を有するｍＡｂの作製に依存している。グライコームの複雑さおよび悪性の形質転換に関連するグリコシルトランスフェラーゼの発現の変化は、がん細胞に関連する炭水化物を優れた標的にする（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ． ２０１４； Ｄａｌｚｉｅｌ ｅｔ ａｌ． ２０１４； Ｄａｎｉｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ． ２０１３； Ｈａｋｏｍｏｒｉ ２００２）。特に糖脂質は、それらの密な細胞表面分布、移動度、および膜のマイクロドメインとの関連（これらは全て、幅広い範囲の細胞シグナリングおよび接着特性におけるそれらの関与に寄与している）により魅力的である（Ｆｕｓｔｅｒ ａｎｄ Ｅｓｋｏ ２００５； Ｈａｋｏｍｏｒｉ ２００２； Ｈａｋｏｍｏｒｉ ２００８）。しかしながら、抗糖脂質抗体を作製することは、糖脂質はＴ細胞の支援を提供せず、ｍＡｂは通常低い親和性のＩｇＭであるため、困難なタスクである。
【発明の概要】
【0011】
ＦＧ２８１１．７２（またＦＧ２８１１とも略される）ｍＡｂは、グリコシルを操作したマウス線維芽細胞株のＳＳＥＡ－３／４－ＬＭＴＫで免疫処置したマウスから作製したマウスＩｇＧ３ ｍＡｂである。興味深いことに、ＦＧ２８１１ ｍＡｂは、ＳＳＥＡ－４を特異的に認識した。ＳＳＥＡ－４は、さらなる末端のシアル酸残基を有することを除き、構造の観点からＳＳＥＡ－３と類似している。α－２，３－シアリルトランスフェラーゼは、ＳＴ３ＧＡＬ２遺伝子によりコードされており、ＳＳＥＡ－３のＳＳＥＡ－４へのシアリル化に寄与する主要な酵素であることが示唆されている。ＦＧ２８１１ ｍＡｂは、ＳＳＥＡ－４に特異的に結合し、ＳＳＥＡ－３と交差反応しない。これは、以前に派生した、本発明者らがＳＳＥＡ－３およびフォルスマンとも結合することを見出したｍＡｂ ＭＣ８１３、ならびにＳＳＥＡ－３およびＧｌｏｂｏ－Ｈと結合したＭＣ６１３とは対照的である。ＭＣ８１３とは対照的に、ＦＧ２８１１は、赤血球に結合せず、これら細胞がＳＳＥＡ－４を発現せず、ＭＣ８１３の結合がＳＳＥＡ－３／フォルスマンの発現に関連し得ることが示唆される（Ｃｏｏｌｉｎｇ ａｎｄ Ｈｗａｎｇ ２００５）。米国特許公開公報第２０１０／００４７８２７号は、ＳＳＥＡ－４に結合するｍＡｂを記載しているが、出願人らはこれが、他のグロボシドのある範囲により発現され得る末端の二糖Ｎｅｕ５Ａｃ（α２－３）Ｇａｌのみに結合するだけでなく、ＳＳＥＡ－３およびＧｌｏｂｏ－Ｈにも結合することもまた示している。米国特許公開公報第２０１６／０２８９３４０号は、いくつかの新規の抗ＳＳＥＡ４結合ｍＡｂを開示しており、これらは特異的と思われるが、それらのアッセイにおいて、ＭＣ８１３もまた本発明者らの結果とは対照的にＳＳＥＡ－４に特異的である。正常な血液の結合のスクリーニングは、ＭＣ８１３ではなくＦＧ２８１１が、小さな集団のリンパ球を認識したことを明らかにした。これは、ＴＳＣＭとしてさらに特徴づけられた。以前の、ＳＳＥＡ－３およびフォルスマンの抗原と交差反応するＳＳＥＡ－４ ｍＡｂ（ＭＣ８１３）とは対照的に、本開示は、ＴＳＣＭの増殖および維持を刺激し得る、著しくＳＳＥＡ－４に特異的なｍＡｂのＦＧ２８１１を記載している。
【0012】
一態様では、本発明は、ＳＳＥＡ－４ Ｎｅｕ５Ａｃ（α２－３）Ｇａｌ（β１－３）ＧａｌＮＡｃ（β１－３）Ｇａｌ（α１－４）Ｇａｌ（β１－４）Ｇｌｃに特異的に結合する特異的な結合メンバーを提供する。
【0013】
さらなる態様では、本発明は、本発明の特異的な結合メンバーを使用してステムメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）上のＳＳＥＡ－４ Ｎｅｕ５Ａｃ（α２－３）Ｇａｌ（β１－３）ＧａｌＮＡｃ（β１－３）Ｇａｌ（α１－４）Ｇａｌ（β１－４）Ｇｌｃの存在を検出することにより、上記細胞を同定する方法を提供する。
【0014】
さらなる態様では、本発明は、本発明の特異的な結合メンバーを使用してステムメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）上のＳＳＥＡ－４ Ｎｅｕ５Ａｃ（α２－３）Ｇａｌ（β１－３）ＧａｌＮＡｃ（β１－３）Ｇａｌ（α１－４）Ｇａｌ（β１－４）Ｇｌｃの存在を検出することにより、上記細胞を精製する方法を提供する。
【0015】
さらなる態様では、本発明は、ステムメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）を標的化できる特異的な結合メンバーを提供する。さらなる態様では、本発明は、ステムメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）に特異的に結合できる特異的な結合メンバーを提供する。本発明の一部の態様では、特異的な結合メンバーは、ステムメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の増殖を誘導できる。
【0016】
さらなる態様では、本発明は、ＳＳＥＡ－４ Ｎｅｕ５Ａｃ（α２－３）Ｇａｌ（β１－３）ＧａｌＮＡｃ（β１－３）Ｇａｌ（α１－４）Ｇａｌ（β１－４）Ｇｌｃに結合する特異的な結合メンバーであって、単離された抗体またはその結合フラグメントもしくはメンバーが、超特異的（ｕｌｔｒａ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ）である、特異的な結合メンバーを提供する。
【0017】
さらなる態様では、本発明は、ＳＳＥＡ－４ Ｎｅｕ５Ａｃ（α２－３）Ｇａｌ（β１－３）ＧａｌＮＡｃ（β１－３）Ｇａｌ（α１－４）Ｇａｌ（β１－４）Ｇｌｃに結合する特異的な結合メンバーであって、ステムメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の増殖を刺激できる、特異的な結合メンバーを提供する。
【0018】
さらなる態様では、本発明は、ＳＳＥＡ－４ Ｎｅｕ５Ａｃ（α２－３）Ｇａｌ（β１－３）ＧａｌＮＡｃ（β１－３）Ｇａｌ（α１－４）Ｇａｌ（β１－４）Ｇｌｃに結合する特異的な結合メンバーであって、ステムメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）を活性化できる、特異的な結合メンバーを提供する。
【0019】
本発明の一部の態様では、本発明の特異的な結合メンバーは、特異的な結合メンバーの非存在下でのステムメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％、ステムメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の増殖を刺激できる。
【0020】
本発明の一部の態様では、ステムメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の活性化は、特異的なマーカーの産生によるか、または細胞の機能的な作用の増大により、測定され得る。本発明の一部の態様では、本発明の特異的な結合メンバーは、特異的な結合メンバーの非存在下でのステムメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％、ステムメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）を活性化できる。
【0021】
本発明の一部の態様では、特異的な結合メンバーは、約１０－８Ｍ未満の親和性（Ｋｄ）で、糖脂質により提示されるＮｅｕ５Ａｃ（α２－３）Ｇａｌ（β１－３）ＧａｌＮＡｃ（β１－３）Ｇａｌ（α１－４）Ｇａｌ（β１－４）Ｇｌｃに結合できてよい。特異的な結合メンバーは、約１０－９Ｍの親和性（Ｋｄ）で糖脂質により提示されたものに結合できてもよい。特異的な結合メンバーは、約１０－８Ｍ、１０－９Ｍ、１０－１０Ｍ、１０－１１Ｍ、または１０－１２Ｍ未満の親和性（Ｋｄ）で糖脂質により提示されたものに結合できてもよい。
【0022】
本発明のさらなる態様は、重鎖結合ドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と、軽鎖結合ドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３とを含む特異的な結合メンバーを提供する。本発明は、図２ａおよび２ｂの残基２７～３８（ＣＤＲＨ１）、５６～６５（ＣＤＲＨ２）、および１０５～１１３（ＣＤＲＨ３）のアミノ酸配列から選択される１つ以上の結合ドメインを含む特異的な結合メンバーを提供し得る。
【0023】
本発明の特異的な結合メンバーは、図２ａの１～１２６（ＶＨ）として実質的に提示されるアミノ酸配列を含み得る。本発明の一実施形態では、本発明の特異的な結合メンバーは、図２ａのアミノ酸配列の残基１０５～１１３（ＣＤＲＨ３）として実質的に提示されるアミノ酸配列を含む、結合ドメインを含む。本発明のこの実施形態では、特異的な結合メンバーは、図２ａに示されるアミノ酸配列の残基２７～３８（ＣＤＲＨ１）および残基５６～６５（ＣＤＲＨ２）として実質的に提示される結合ドメインのうちの１つまたは両方、好ましくは両方をさらに含み得る。
【0024】
別の態様では、本発明は、図２ｂの残基２７～３８（ＣＤＲＬ１）、５６～６５（ＣＤＲＬ２）、および１０５～１１３（ＣＤＲＬ３）のアミノ酸配列から選択される１つ以上の結合ドメインを含む特異的な結合メンバーを提供する。
【0025】
本発明の一態様では、結合ドメインは、図２ｂのアミノ酸配列の残基１０５～１１３（ＣＤＲＬ３）として実質的に提示されるアミノ酸配列を含み得る。この実施形態では、特異的な結合メンバーは、図２ｂに示されるアミノ酸配列の残基２７～３８（ＣＤＲＬ１）および残基５６～６５（ＣＤＲＬ２）として実質的に提示される結合ドメインのうちの１つまたは両方、好ましくは両方をさらに含み得る。
【0026】
本発明の一部の実施形態では、可変重鎖および／または軽鎖は、抗体ＦＧ２８１１のＨＣＤＲ１～３およびＬＣＤＲ１～３を含み得る。本発明の一部の実施形態では、可変重鎖および／または軽鎖は、抗体ＦＧ２８１１のＨＣＤＲ１～３およびＬＣＤＲ１～３と、ＦＧ２８１１のフレームワーク領域とを含み得る。
【0027】
同じまたは異なる配列の複数の結合ドメイン、またはそれらの組み合わせを含む特異的な結合メンバーは、本発明の範囲内に含まれる。各結合ドメインは、ヒト抗体フレームワークにより担持され得る。たとえば、１つ以上のフレームワーク領域は、ヒト全抗体またはその可変領域のフレームワーク領域で代用され得る。
【0028】
本発明の１つの単離された特異的な結合メンバーは、図２ｂに示されるアミノ酸配列の残基１～１２３（ＶＬ）として実質的に提示される配列を含む。
【0029】
【0030】
一実施形態では、特異的な結合メンバーは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３のうちの１つ以上（すなわち１、２、または３つ）を含む軽鎖可変配列であって、
ＬＣＤＲ１が、ＳＳＶＮＹを含み、
ＬＣＤＲ２が、ＤＴＳを含み
ＬＣＤＲ３が、ＦＱＡＳＧＹＰＬＴを含む、
軽鎖可変配列と、
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３のうちの１つ以上（すなわち１、２、または３つ）を含む重鎖可変配列であって、
ＨＣＤＲ１が、ＧＦＳＬＮＳＹＧを含み、
ＨＣＤＲ２が、ＩＷＧＤＧＳＴを含み、
ＨＣＤＲ３が、ＴＫＰＧＳＧＹＡＦを含む、
重鎖可変配列と
を含み得る。
ＬＣＤＲ１が、ＳＳＶＮＹを含み、
ＬＣＤＲ２が、ＤＴＳを含み
ＬＣＤＲ３が、ＦＱＡＳＧＹＰＬＴを含む、
軽鎖可変配列と、
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３のうちの１つ以上（すなわち１、２、または３つ）を含む重鎖可変配列であって、
ＨＣＤＲ１が、ＧＦＳＬＮＳＹＧを含み、
ＨＣＤＲ２が、ＩＷＧＤＧＳＴを含み、
ＨＣＤＲ３が、ＴＫＰＧＳＧＹＡＦを含む、
重鎖可変配列と
を含み得る。
【0031】
【0032】
特定の実施形態では、特異的な結合メンバーは、ヒト抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体である。本発明の一部の態様では、特異的な結合メンバーは、モノクローナル抗体である。本発明の一部の態様では、特異的な結合メンバーは、ポリクローナル抗体である。
【0033】
また本発明は、結合ドメインの配列が図２に実質的に提示される通りである、上述の特異的な結合メンバーを包有する。よって、１つ以上の結合ドメインが、１～５、１～４、１～３、２、または１つのアミノ酸置換により、図２に記載される結合ドメインと異なる、上述の特異的な結合メンバーが提供される。
【0034】
また本発明は、図２に記載のＶＨ配列およびＶＬ配列と同じエピトープに結合する特性を有する特異的な結合メンバーを包有する。単離された抗体またはその結合フラグメントもしくはメンバーのエピトープは、単離された抗体またはその結合フラグメントもしくはメンバーが結合する抗原の領域である。２つの抗体またはその結合フラグメントもしくはメンバーは、それぞれが抗原に対する他の結合を競合的に阻害（遮断）する場合、同じまたは重複するエピトープに結合する。すなわち、１×、５×、１０×、２０×、または１００×過剰な１つの単離された抗体またはその結合フラグメントもしくはメンバーは、競合する抗体を欠いている対照と比較して、競合結合アッセイで測定される場合に、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％、９０％、またはさらには９９％、他の結合を阻害する（たとえば本明細書中参照により組み込まれている（Ｊｕｎｇｈａｎｓ ｅｔ ａｌ． １９９０）を参照されたい）。
【0035】
本発明の好ましい実施形態では、競合する特異的な結合メンバーは、図２ａの残基１～１２６のアミノ酸配列を有するＶＨ鎖と、図２ｂの残基１～１２３のアミノ酸配列を有するＶＬ鎖とを含む抗体と、糖脂質にのみ結合したＳＳＥＡ－４、Ｎｅｕ５Ａｃ（α２－３）Ｇａｌ（β１－３）ＧａｌＮＡｃ（β１－３）Ｇａｌ（α１－４）Ｇａｌ（β１－４）Ｇｌｃに対する結合に関して競合する。
【0036】
好ましくは、競合する特異的な結合メンバーは、抗体、たとえばｍＡｂ、または本文書を通して記載される抗体フラグメントのいずれかである。
【0037】
本明細書中記載される望ましい特性を有する単一の原型ｍＡｂ、たとえばＦＧ２８１１ ｍＡｂが単離された後、当該分野で知られている方法を使用することにより、同様の特性を有する他のｍＡｂを作製することは容易である。たとえば、例として参照により本明細書に組み込まれている（Ｊｅｓｐｅｒｓ ｅｔ ａｌ． １９９４）の方法を使用して同じエピトープ、よって、原型ｍＡｂと同様の特性を有するｍＡｂの選択が導かれ得る。ファージディスプレイを使用して、まず原型抗体の重鎖を、グリカンに結合するｍＡｂを選択するため（好ましくはヒトの）軽鎖のレパートリーと対形成し、次に、新規の軽鎖を、原型ｍＡｂと同じエピトープを有する（好ましくはヒトの）グリカンに結合するｍＡｂを選択するため（好ましくはヒトの）重鎖のレパートリーと対形成する。
【0038】
糖脂質にのみ結合したＳＳＥＡ－４に結合でき、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣを誘導し、ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインにおいて図２のＶＨドメインまたはＶＬドメインと少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるｍＡｂは、本発明に含まれる。９０％、９５％、または９９％の同一性に対する言及は、ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインのフレームワーク領域のみに対してであり得る。特に、ＣＤＲ領域は同一であり得るが、フレームワーク領域は、最大１％、５％、または１０％変動し得る。好ましくは、このような抗体は、少数の機能的に重要ではないアミノ酸の置換（たとえば保存的置換）、欠失、または挿入により、図２の配列と異なる。本発明の全ての実施形態では、特異的な結合対は、抗体、または抗体フラグメント、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄ、またはジアボディであり得る。一部の実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体である。他の実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。本発明の抗体は、ヒト化抗体、キメラ抗体、もしくはベニヤ化抗体（veneered antibody）であり得、またはいずれかの種の非ヒト抗体であり得る。一実施形態では、本発明の特異的な結合パートナーは、図２ａに記載の重鎖と図２ｂに記載の軽鎖とを含むマウス抗体ＦＧ２８１１である。
【0039】
本発明の特異的な結合メンバーは、検出可能または機能的な標識を担持し得る。
【0040】
さらなる態様では、本発明は、本発明の特異的な結合メンバーをコードする単離された核酸、および本発明の特異的な結合メンバーを調製する方法であって、上記結合メンバーの発現をもたらす条件下で上記核酸を発現させるステップと、上記結合メンバーを回収するステップとを含む、方法を提供する。ＳＳＥＡ－４に特異的に結合でき、本明細書中提供される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一である特異的な結合メンバーをコードする単離された核酸は、本発明に含まれる。
【0041】
本発明の特異的な結合メンバーは、ヒトまたは動物の身体の処置または診断の方法、たとえば、患者（好ましくはヒト）の腫瘍を処置する方法であって、本発明の特異的な結合メンバーの有効量を上記患者に投与するステップを含む方法に、使用され得る。また本発明は、医薬で使用するため、好ましくは腫瘍の処置に使用するための本発明の特異的な結合メンバー、および腫瘍の診断または処置のための薬剤の製造における本発明の特異的な結合メンバーの使用を提供する。この腫瘍は、胃、結腸直腸、膵臓、肺、卵巣、または乳房の腫瘍であり得る。
【0042】
本明細書において、本発明の特異的な結合メンバーが結合する抗原が開示される。本発明の特異的な結合メンバーにより、好ましくは特異的に、結合できるＳＳＥＡ－４が提供され得る。ＳＳＥＡ－４は、単離された形態で提供されてもよく、それに対するさらなる特異的な結合メンバーを開発するためのスクリーニングに使用され得る。たとえば、化合物のライブラリーは、ＳＳＥＡ－４に特異的に結合するライブラリーのメンバーに関してスクリーニングされ得る。
【0043】
さらなる態様では、本発明は、胃、結腸直腸、膵臓、肺、卵巣、および乳房の腫瘍の診断または予後診断に使用するための、好ましくは本発明の第１の態様の、ＳＳＥＡ－４含有グリカン（すなわちＮｅｕ５Ａｃ（α２ ３）Ｇａｌ（β１ ３）ＧａｌＮＡｃ（β１ ３）Ｇａｌ（α１ ４）Ｇａｌ（β１ ４）Ｇｌｃ）に結合できる単離された特異的な結合メンバーを提供する。
【0044】
本発明のさらなる態様では、ｅｘ ｖｉｖｏでステムメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の増殖を誘導する方法であって、ステムメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）を本明細書の特異的な結合メンバーと接触させるステップを含む、方法が提供される。
【0045】
本発明のさらなる態様では、本発明の特異的な結合メンバーを含む、ステムメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の増殖を誘導するための細胞培養培地が提供される。
【0046】
本発明のさらなる態様では、ｉｎ ｖｉｖｏでステムメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の増殖を誘導する方法であって、本発明の特異的な結合メンバーを対象に投与するステップを含む、方法が提供される。
【0047】
本発明のさらなる態様では、治療に使用するための本発明の結合メンバーが提供される。本発明のさらなる態様では、患者を処置する方法であって、それを必要とする患者に本発明の特異的な結合メンバーを投与するステップを含む、方法が提供される。
【0048】
本発明のさらなる態様では、自己免疫疾患、ＨＩＶ、成人Ｔ細胞白血病、または移植片対宿主病を処置する方法に使用するための本発明の特異的な結合メンバーが提供される。
【0049】
本発明のさらなる態様では、がんを処置または予防する方法であって、本発明の特異的な結合メンバーを、それを必要とする対象に投与するステップを含む、方法が提供される。
【0050】
本発明のさらなる態様では、長期間ウイルスに感染した患者を処置または予防する方法であって、本発明の特異的な結合メンバーを、それを必要とする対象に投与するステップを含む、方法が提供される。
【0051】
本発明のさらなる態様では、自己免疫疾患、ＨＩＶ、成人Ｔ細胞白血病、または移植片対宿主病を処置または予防する方法であって、本発明の特異的な結合メンバーを、それを必要とする対象に投与するステップを含む、方法が提供される。
【0052】
本発明のさらなる態様では、ステムメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）および本発明の特異的な結合メンバーを含む細胞培養物であって、増殖速度が、本発明の特異的な結合メンバーを伴わないステムメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）を含む対応する細胞培養物と比較する場合に、少なくとも１０％速い、細胞培養物が提供される。
【0053】
本発明の一部の態様では、ステムメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）および本発明の特異的な結合メンバーを含む細胞培養物の増殖速度は、本発明の特異的な結合メンバーを伴わないステムメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）を含む対応する細胞培養物と比較する場合に、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％速い。
【0054】
本発明のさらなる態様では、本発明の特異的な結合メンバーを使用してステムメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）を精製する方法であって、細胞集団におけるステムメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の比率が、本発明の特異的な結合メンバーを使用して精製されていない対応する細胞集団と比較する場合に少なくとも約１０％高い、方法が提供される。
【0055】
本発明の一部の態様では、精製した細胞集団におけるステムメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の比率は、本発明の特異的な結合メンバーを使用して精製されていない対応する細胞集団と比較する場合に少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％高い。
【0056】
本発明の一部の態様では、本発明の特異的な結合メンバーは、単離された抗体またはその結合フラグメントもしくはメンバーである。
【0057】
さらに本発明は、がんの診断のための方法であって、個体由来のサンプルにおけるＳＳＥＡ４含有グリカンを検出するために本発明の特異的な結合メンバーを使用するステップを含む、方法を提供する。本発明の一部の診断方法では、結合メンバーにより検出されるグリカンのパターンは、個体の治療の選択肢を層別化するために使用され得る。
【0058】
本発明のこれらおよび他の態様を、以下でさらに詳述する。
【0059】
本明細書中使用される場合、「特異的な結合メンバー」は、互いに対して結合特異性を有する、分子の対のメンバーである。特異的な結合対のメンバーは、自然由来であり得るか、または全体的もしくは部分的に合成により作製され得る。分子対の１つのメンバーは、その表面上に、突起またはキャビティであり得る領域であって、分子対の他のメンバーの特定の空間的かつ正反対の構成に特異的に結合し、よってこれに相補的である領域を有する。よって、対のメンバーは、互いに特異的に結合する特性を有する。特異的な結合対の種類の例として、抗原－抗体、ビオチン－アビジン、ホルモン－ホルモン受容体、５受容体－リガンド、酵素－基質がある。本発明は、全般的に抗原－抗体の種類の反応に関するが、本明細書中定義される抗原に結合する小分子にも関連する。
【0060】
本明細書中使用される場合、「処置」は、ヒトまたは非ヒトの動物、好ましくは哺乳類に利益を与え得る全てのレジームを含む。処置は、既存の病態に関するものであってもよく、または防止的（予防的な処置）であり得る。
【0061】
本明細書中使用される場合、「腫瘍」は、組織の異常な増殖である。これは、局在化されていてもよく（良性）、または近くの組織を浸潤してもよく（悪性）、または遠くの組織を浸潤してもよい（転移性）。腫瘍は、がんを引き起こす新生物の増殖を含み、ならびに食道、結腸直腸、胃、乳房、卵巣、および子宮内膜の腫瘍、ならびに限定するものではないが白血球細胞を含むがん性組織または細胞株を含む。本明細書中使用される場合、「腫瘍」はまた、その範囲内に子宮内膜症を含む。
【0062】
用語「抗体」は、本明細書中使用される場合、天然であるかまたは部分的もしくは全体的に合成により作製されるかどうかに関わらず、イムノグロブリン分子およびイムノグロブリン分子の免疫学的に活性の部分、すなわち抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含む分子を表す。この用語はまた、抗体結合ドメインであるかまたは抗体結合ドメインと相同である結合ドメインを有する全てのポリペプチドまたはタンパク質を包有する。これらは、天然の供給源に由来してもよく、またはこれらは部分的もしくは全体的に合成により作製されてもよい。本発明の抗体の例として、イムノグロブリンのアイソタイプ（たとえばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＡ）、ならびにそれらのアイソタイプのサブクラス；抗原結合ドメインを含むフラグメント、たとえばＦａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄ；ならびにジアボディがある。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得る。モノクローナル抗体は、「ｍＡｂ」と表され得る。
【0063】
モノクローナル抗体および他の抗体を採取し、組み換えＤＮＡ技術を使用して元の抗体の特異性を保持する他の抗体またはキメラ分子を産生させることが可能である。このような技術は、抗体の、イムノグロブリン可変領域またはＣＤＲをコードするＤＮＡを、異なるイムノグロブリンの定常領域または定常領域＋フレームワーク領域に導入することを含み得る。たとえば、欧州特許公開公報第１８４１８７号、イギリス特許公開公報第２１８８６３８号、または欧州特許公開公報第２３９４００号を参照されたい。抗体を産生するハイブリドーマまたは他の細胞は、遺伝的変異または他の変化に供されてよく、これにより産生される抗体の結合特異性を変えてもよくまたは変えなくてもよい。
【0064】
抗体は多くの方法で修飾され得るため、用語「抗体」は、必要とされる特異性を有する結合ドメインを有する全ての特異的な結合メンバーまたは物質を包有すると解釈されるべきである。よってこの用語は、天然であるかまたは全体的もしくは部分的に合成であるかどうかにかかわらず、イムノグロブリン結合ドメインを含む全てのポリペプチドを含む、抗体、ヒト化抗体の抗体フラグメント、誘導体、機能的な均等物、および相同体を含む。よって、別のポリペプチドに融合した、イムノグロブリン結合ドメインを含むキメラ分子または均等物が含まれる。キメラ抗体のクローニングおよび発現は、欧州特許公開公報第０１２０６９４号および同第０１２５０２３号に記載されている。ヒト化抗体は、非ヒト、たとえばマウスの抗体の可変領域と、ヒト抗体の定常領域とを有する修飾された抗体であり得る。ヒト化抗体を作製するための方法は、たとえば米国特許第５２２５５３９号に記載されている。
【0065】
全抗体のフラグメントが、抗原に結合する機能を行うことができることが示されている。結合フラグメントの例は、（ｉ）ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメイン、およびＣＨ１ドメインからなるＦａｂフラグメント；（ｉｉ）ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｉｉ）単一の抗体のＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；（ｉｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ． １９８９）；（ｖ）単離されたＣＤＲ領域；（ｖｉ）２つの結合したＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントである、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント；（ｖｉｉ）一本鎖のＦｖ分子（ｓｃＦｖ）（ここでＶＨドメインおよびＶＬドメインは、２つのドメインを結合させるペプチドリンカーにより結合することにより抗原結合部位を形成する）（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ． １９８８； Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ． １９８８）；（ｖｉｉｉ）二重特異性一本鎖Ｆｖ二量体（国際特許公開公報第９２／０９９６５号）；ならびに（ｉｘ）「ジアボディ」、遺伝子融合により構築される多価または多重特異性フラグメント（国際特許公開公報第９４／１３８０４号；（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ， Ｐｒｏｓｐｅｒｏ， ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ １９９３））がある。
【0066】
ジアボディは、ポリペプチドの多量体であり、ここで各ポリペプチドは、イムノグロブリン軽鎖の結合領域を含む第１のドメインとイムノグロブリン重鎖の結合領域を含む第２のドメインとを含み、２つのドメインは（たとえばペプチドリンカーにより）結合しているが、抗原結合部位を形成するために互いに結合することはできない：抗原結合部位は、多量体の中の１つのポリペプチドの第１のドメインと多量体の中の別のポリペプチドの第２のドメインとの結合により形成される（国際特許公開公報第９４／１３８０４号）。
【0067】
二重特異性抗体が使用される場合、これらは、様々な方法（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ １９９３）で製造され得る従来の二重特異性抗体であってよく、たとえば化学的にもしくはハイブリッドハイブリドーマから調製されてもよく、または上述の二重特異性抗体フラグメントのいずれかであってもよい。全抗体よりもｓｃＦｖ二量体またはジアボディを使用することが好ましい場合があり得る。ジアボディおよびｓｃＦｖは、可変ドメインのみを使用してＦｃ領域を伴わずに構築でき、恐らくは抗イディオタイプ反応の作用を低減する。二重特異性抗体の他の形態として、（Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ， Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ， ａｎｄ Ｋａｒｊａｌａｉｎｅｎ １９９１）に記載される一本鎖「Ｊａｎｕｓｉｎｓ」が挙げられる。
【0068】
また二重特異性ジアボディは、二重特異性全抗体とは対照的に、大腸菌で容易に構築および発現できるため有用であり得る。適切な結合特異性のジアボディ（および多くの他のポリペプチド、たとえば抗体フラグメント）は、ライブラリーからファージディスプレイ（国際特許公開公報第９４／１３８０４号）を使用して容易に選択され得る。ジアボディの１つのアームが、たとえば抗原Ｘに対する特異性を伴い一定であり続ける場合、これにより他のアームが変動するライブラリーを作製し、適切な特異性の抗体が選択され得る。
【0069】
「結合ドメイン」は、抗原の一部または全てに特異的に結合しこれに対し相補的である領域を含む特異的な結合メンバーの一部である。結合メンバーが抗体またはその抗原結合フラグメントである場合、結合ドメインはＣＤＲであり得る。抗原が大きい場合、抗体は、抗原の特定の一部にのみ結合し得、この一部はエピトープと称される。抗原結合ドメインは、１つ以上の抗体可変ドメインにより提供され得る。抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）および抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含み得る。
【0070】
「特異的な」は、全般的に、特異的な結合対の１つのメンバーがその特異的な結合パートナー以外の分子に対し有意な結合を全く示さず、たとえば他のいずれかの分子と約３０％未満、好ましくは２０％未満、１０％未満、または１％未満の交差反応性を有する状況を表すために使用される。またこの用語は、たとえば抗原結合ドメインが多くの抗原により担持される特定のエピトープに特異的である場合に適用可能であり、この場合抗原結合ドメインを担持する特異的な結合メンバーは、このエピトープを担持する様々な抗原に結合できる。本発明の特異的な結合メンバーは、結合が本明細書中の実施例における「グライコーム分析」で提示されるプロトコルにより試験される場合、他のいずれの抗原（たとえば他のいずれのグリカン）に対する検出可能な結合がない状況で、Ｌｅｙに特異的に結合できる場合がある。
【0071】
「単離された」は、本発明の特異的な結合メンバーまたは当該結合メンバーをコードする核酸が、好ましくは本発明に係るものである状況を表す。全般的に、メンバーおよび核酸は、それらの天然の環境または調製される（当該調製がｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで行われる組み換えＤＮＡ技術によるものである場合の）環境（たとえば細胞培養）で見出される他のポリペプチドまたは核酸などの本来関連する物質を含まないかまたは実質的に含まない。特異的な結合メンバーおよび核酸は、希釈剤またはアジュバントと共に製剤化されてよく、さらには実務的な目的のため単離され得る－たとえば、メンバーは、通常、イムノアッセイでの使用のためマイクロタイタープレートをコーティングするために使用される場合ゼラチンもしくは他の担体と混合され、または診断または治療に使用される場合は薬学的に許容される担体もしくは希釈剤と混合される。特異的な結合メンバーは、天然にもしくは異種性真核細胞の系によりグリコシル化されてよく、またはこれらは、（たとえば原核細胞での発現により産生される場合）非グリコシル化され得る。
【0072】
「実質的に提示される（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ａｓ ｓｅｔ ｏｕｔ）」は、本発明のアミノ酸配列が、記載されるアミノ酸配列と同一であるかまたは著しく相同性であることを意味する。「著しく相同性」により、１～５、１～４、１～３、２または１のアミノ酸置換が配列でなされ得ることが企図される。
【0073】
また本発明は、図２に提示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、図２に提示される核酸配列を有するポリヌクレオチド、それらと実質的な同一性、たとえばそれらと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を、その範囲内に含む。２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列のパーセント同一性は、全般的に、最適な比較のため配列をアライメントし（たとえばギャップが、第２の配列との最良のアライメントで第１の配列に導入され得る）、対応する位置でアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較することにより決定される。「最良のアライメント」は、最も高いパーセント同一性をもたらす２つの配列のアライメントである。パーセント同一性は、配列の中の同一であるアミノ酸残基またはヌクレオチドの数を比較することにより決定される（すなわち％同一性＝同一な位置の数／位置の総数×１００）。
【0074】
２つの配列間のパーセント同一性の決定は、当業者に知られている数学的なアルゴリズムを使用して達成され得る。２つの配列を比較するための数学的なアルゴリズムの一例は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ， １９９３（Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ １９９３）のように改変した、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ， １９９０（Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ １９９０）のアルゴリズムである。Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， １９９０（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ． １９９０）のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴのプログラムは、このようなアルゴリズムを組み込んでいる。ＢＬＡＳＴのヌクレオチドの検索は、本発明の核酸分子に相同的なヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラムで行われ得る（スコア＝１００、ワード長＝１２）。ＢＬＡＳＴのタンパク質の検索は、本発明のタンパク質分子に相同的なアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラムで行われ得る（スコア＝５０、ワード長＝３）。比較のためギャップのあるアライメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴが、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， １９９７（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ． １９９７）に記載されるように利用され得る。あるいは、ＰＳＩ－Ｂｌａｓｔが、分子間の遠い関係を検出する反復探索（ｉｔｅｒａｔｅｄ ｓｅａｒｃｈ）を行うために使用され得る（Ｉｄ．）。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ－Ｂｌａｓｔのプログラムを利用する場合、各プログラムのデフォルトのパラメータ（たとえばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）が使用され得る。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい。配列の比較のために利用される数学的なアルゴリズムの別の例は、Ｍｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ， １９８９（Ｍｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ １９８９）のアルゴリズムである。ＧＣＧ配列アライメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）は、このようなアルゴリズムを組み込んでいる。当該分野で知られている配列分析のための他のアルゴリズムとして、Ｔｏｒｅｌｌｉｓ ａｎｄ Ｒｏｂｏｔｔｉ， １９９４（Ｔｏｒｅｌｌｉ ａｎｄ Ｒｏｂｏｔｔｉ １９９４）に記載されるＡＤＶＡＮＣＥおよびＡＤＡＭ；ならびにＰｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ， １９８８（Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ １９８８）に記載されるＦＡＳＴＡが挙げられる。ＦＡＳＴＡの中で、ｋｔｕｐは、検索の感度および速度を設定する制御オプションである。
【0075】
本発明の単離された特異的な結合メンバーは、ＳＳＥＡ－４セラミドであり得るかまたはタンパク質部分上にあり得るＳＳＥＡ－４炭水化物に結合できる。図２の残基１０５～１１６（ＣＤＲＨ３）および図２の１０５～１１３として実質的に提示されるアミノ酸配列を含む結合ドメインは、ＳＳＥＡ－４炭水化物に対するこれら領域の結合を可能にする構造で担持され得る。
【0076】
本発明の結合ドメインを担持するための構造は、全般的に、結合ドメインが、再配置されたイムノグロブリン遺伝子によりコードされる天然に存在するＶＨおよびＶＬの抗体可変ドメインのＣＤＲ３領域に対応する位置に位置している、抗体の重鎖もしくは軽鎖配列またはそれらの実質的な一部であり得る。イムノグロブリン可変ドメインの構造および位置は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／を参照することにより決定され得る。図１ａおよび１ｂの残基１０５～１１６として実質的に提示されるアミノ酸配列は、ヒト重鎖可変ドメインまたはその実質的な一部のＣＤＲ３として担持されてもよく、図１ｃの残基１０５～１１３として実質的に提示されるアミノ酸配列は、ヒト軽鎖可変ドメインまたはその実質的な一部のＣＤＲ３として担持され得る。
【0077】
可変ドメインは、いずれかの生殖系列もしくは再配置されたヒト可変ドメインに由来してもよく、または既知のヒト可変ドメインのコンセンサス配列に基づく合成可変ドメインであってもよい。本発明のＣＤＲ３由来の配列は、組み換えＤＮＡ技術を使用してＣＤＲ３領域を欠いている可変ドメインのレパートリーに導入され得る。たとえば、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．， １９９２（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ． １９９２）は、可変ドメイン領域の５’末端を対象とするかまたは５’末端に隣接するコンセンサスなプライマーがＣＤＲ３を欠いているＶＨ可変ドメインのレパートリーを提供するためにヒトＶＨ遺伝子の第３のフレームワーク領域に対しコンセンサスなプライマーと併せて使用される抗体可変ドメインのレパートリーを産生する方法を記載している。さらにＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．， １９９２（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ． １９９２）は、どのようにこのレパートリーが特定の抗体のＣＤＲ３と組み合わせられ得るかを記載している。同様の技術を使用して、本発明のＣＤＲ３由来の配列は、ＣＤＲ３を欠いているＶＨドメインまたはＶＬドメインのレパートリーとシャッフリングされてよく、シャッフリングされた完全なＶＨまたはＶＬドメインを同族のＶＬまたはＶＨドメインと組み合わせて、本発明の特異的な結合メンバーを提供することが可能である。次に、このレパートリーは、国際特許公開公報第９２／０１０４７号のファージディスプレイシステムなどの適切な宿主系で提示され得、これにより適切な特異的な結合メンバーが選択され得る。レパートリーは、１０４以上の個別のメンバー、たとえば１０６～１０８または１０１０のメンバーからなり得る。
【0078】
類似のシャッフリングまたはコンビナトリアルな技術もまた、Ｓｔｅｍｍｅｒ， １９９４（Ｓｔｅｍｍｅｒ １９９４）により開示されており、Ｓｔｅｍｍｅｒはβ－ラクタマーゼ遺伝子に関連する技術を記載しているが、この手法が抗体の作製に使用され得ることを観察している。さらなる代替案は、全可変ドメインの中に変異を作製するために、たとえばＦＧ２８１１ＶＨまたはＶＬ遺伝子の、ランダムな変異誘発を使用して本発明のＣＤＲ３由来の配列を担持する新規のＶＨまたはＶＬ領域を作製することである。このような技術は、ｅｒｒｏｒ－ｐｒｏｎｅ ＰＣＲを使用したＧｒａｍ ｅｔ ａｌ．， １９９２（Ｇｒａｍ ｅｔ ａｌ． １９９２）により記載されている。
【0079】
使用され得る別の方法は、ＶＨまたはＶＬ遺伝子のＣＤＲ領域に対する変異誘発を生じさせることである。このような技術は、Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．， １９９４（Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ． １９９４）およびＳｃｈｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９６（Ｓｃｈｉｅｒ ｅｔ ａｌ． １９９６）により開示されている。イムノグロブリン可変ドメインの実質的な一部は、全般的に、それらに介入するフレームワーク領域と共に、少なくとも３つのＣＤＲ領域を含む。この部分はまた、第１および第４のフレームワーク領域のいずれかまたは両方の少なくとも約５０％を含み得、この５０％は、第１のフレームワーク領域のＣ末端側の５０％および第４のフレームワーク領域のＮ末端側の５０％である。可変ドメインの実質的な部分のＮ末端またはＣ末端のさらなる残基は、天然に存在する可変ドメイン領域と通常関連しなくてもよい。たとえば、組み換えＤＮＡ技術によりなされる本発明の特異的な結合メンバーの構築は、以下により詳細に論述されるように、イムノグロブリンの重鎖、（たとえばジアボディの産生における）他の可変ドメインまたはタンパク質標識を含むさらなるタンパク質配列に本発明の可変ドメインを結合するためのリンカーの導入を含む、クローニングまたは他の操作ステップを容易にするために導入されるリンカーによりコードされたＮ末端またはＣ末端の残基の導入をもたらし得る。
【0080】
本発明は、図２に実質的に提示されるＶＬ領域およびＶＨ領域のアミノ酸配列、すなわち図２のアミノ酸１～１２７（ＶＨ）および図２のアミノ酸１～１２４（ＶＬ）に基づく結合ドメインの対を含む特異的な結合メンバーを提供する。これら配列のいずれかに基づく単一の結合ドメインは、本発明のさらなる態様を形成する。図２に実質的に提示されるＶＨ領域のアミノ酸配列に基づく結合ドメインの場合、このような結合ドメインは、イムノグロブリンＶＨドメインが特定の方法で標的の抗原に結合できることが知られているため、標的化作用物質として使用され得る。一本鎖の特異的な結合ドメインのいずれかの場合、これらドメインは、本明細書中開示されるＦＧ２８１１抗体と同じ程度良好であるかまたは同等のｉｎ ｖｉｖｏでの特性を有する２ドメインの特異的な結合メンバーを形成できる相補的なドメインに関してスクリーニングするために使用され得る。
【0081】
これは、国際特許公開公報第９２／０１０４７号に開示されるいわゆる階層的なデュアルコンビナトリアルな手法（ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ｄｕａｌ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ）を使用するファージディスプレイスクリーニング法（ここでＨ鎖またはＬ鎖のクローンのいずれかを含む個々のコロニーが、他の鎖（ＬまたはＨ）をコードするクローンの完全なライブラリーに感染させるために使用され、結果得られる二本鎖の特異的な結合メンバーが、この参照文献に開示されるものなどのファージディスプレイ技術により選択される）により、達成され得る。この技術はまた、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．， １９９２（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ． １９９２）に開示されている。
【0082】
本発明の特異的な結合メンバーは、抗体の定常領域またはその一部をさらに含み得る。たとえば、図２ａに示されるＶＬ領域に基づく特異的な結合メンバーは、それらのＣ末端で抗体の軽鎖定常ドメインに結合し得る。同様に、図２に示されるＶＨ領域に基づく特異的な結合メンバーは、それらのＣ末端で、いずれかの抗体のアイソタイプ、たとえば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、およびＩｇＭ、ならびにアイソタイプのサブクラス、特にＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４に由来するイムノグロブリン重鎖の全てまたは一部に結合し得る。
【0083】
本発明の特異的な結合メンバーは、ヒトまたは動物の対象における腫瘍の診断および処置の方法に使用され得る。
【0084】
診断に使用される場合、本発明の特異的な結合メンバーは、検出可能な標識、たとえば１３１Ｉまたは９９Ｔｃなどの放射性標識で標識されてよく、これは、抗体イメージングの分野で知られている従来の化学技術を使用して本発明の特異的な結合メンバーに結合され得る。また標識は、西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素標識を含む。さらに標識は、特定の同族の検出可能な部分、たとえば標識したアビジンへの結合を介して検出され得るビオチンなどの化学的な部分を含む。
【0085】
さらに、本発明の特異的な結合メンバーは、処置される病態に応じて、単独でか、または他の処置と同時もしくは連続的に併用して投与され得る。よって、さらに本発明は、腫瘍の処置における同時使用、別々の使用、または逐次使用のための配合剤としての、本発明の特異的な結合メンバーと有効な作用物質とを含む製品をさらに提供する。有効な作用物質は、本発明の結合メンバーと相乗的に作用し得る、５－フルオロウラシル、シスプラチン、マイトマイシンＣ、オキサリプラチン、およびタモキシフェンを含む化学療法剤または細胞毒性剤を含み得る。他の有効な作用物質は、適切な用量の鎮痛剤、たとえば非ステロイド系抗炎症薬物（たとえばアスピリン、パラセタモール、イブプロフェン、もしくはケトプロフェン）もしくはオピエート（ｏｐｉｔａｔｅ）、たとえばモルヒネ、または鎮吐剤を含み得る。
【0086】
理論により拘束されることを望むものではないが、腫瘍の殺滅を高めるために有効な作用物質と相乗的に作用する本発明の結合メンバーの特性は、免疫エフェクター機構によるものでなくてよく、むしろ細胞表面に結合したＳＳＥＡ－４グリカンに対する結合メンバーの結合の直接的な結果であり得る。免疫チェックポイント分子に対する抗体を含むがん免疫療法は、様々な悪性腫瘍（ｍａｌｉｇｎａｎｃｅ）に対して、異なる免疫－腫瘍学の処置形式と組み合わせて有効であることを示している。
【0087】
本発明の特異的な結合メンバーは、通常医薬組成物の形態で投与され、これは、当該特異的な結合メンバーに加えて少なくとも１つの成分を含み得る。医薬組成物は、有効成分に加え、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、担体、バッファー、安定化剤、または当業者によく知られている他の物質を含み得る。このような物質は、非毒性であるべきであり、有効成分の効力を妨げるべきではない。担体または他の物質の精確な性質は、経口であり得るかまたは注射、たとえば静脈内注射といった注射によるものであり得る投与経路に応じて変化する。注射は、組成物の治療上の投与のための主要な経路であるが、カテーテルまたは他の外科的なチューブを介した送達もまた使用されることが想定されている。一部の適切な投与経路として、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、および筋肉内投与が挙げられる。液体製剤は、散剤の製剤から再構成した後に利用され得る。
【0088】
静脈内注射または罹患部位での注射では、有効成分は、パイロジェンフリーであり、適切なｐＨ、等張性、および安定性を有する非経口的に許容される水溶液の形態である。当業者は、たとえば塩化ナトリウム注射液、リンゲル液、乳酸加リンゲル液などの等張性ビヒクルを使用して適切な液剤を良好に調製できる。保存剤、安定化剤、バッファー、抗酸化剤、および／または他の添加剤が、必要に応じて含まれ得る。
【0089】
経口投与のための医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、散剤、または液体の形態であり得る。錠剤は、ゼラチンなどの固体の担体またはアジュバントを含み得る。液体の医薬組成物は、全般的に、水、石油、動物性または植物性油、鉱油、または合成油などの液体の担体を含む。生理食塩水、デキストロース、または他の糖溶液またはグリコール、たとえばエチレングリコール、プロピレングリコール、もしくはポリエチレングリコールが含まれ得る。製剤が液体である場合、これは、たとえば、ｐＨ６．８～７．６の非リン酸バッファーを含む生理的な塩の溶液または凍結乾燥した粉末であってもよい。
【0090】
また本組成物は、血液を含む特定の組織に置かれるミクロスフィア、リポソーム、他のマイクロ粒子送達システムまたは徐放製剤を介して投与され得る。徐放担体の適切な例として、たとえば坐薬またはマイクロカプセルといった共通の物品の形態における半透過性のポリマーマトリックスが挙げられる。埋め込み可能またはマイクロカプセル状の徐放マトリックスとして、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号；欧州特許公開公報第００５８４８１号）、Ｌ－グルタミン酸およびγエチル－Ｌ－グルタマートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ ｅｔ ａｌ． １９８３）、ポリ（２－ヒドロキシエチル－メタクリラート）が挙げられる。ポリペプチドを含むリポソームは、よく知られている方法：ＤＥ ３，２１８， １２１Ａ；（Ｅｐｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ． １９８５）；（Ｈｗａｎｇ， Ｌｕｋ， ａｎｄ Ｂｅａｕｍｉｅｒ １９８０）；欧州特許公開公報第００５２５２２号；欧州特許公開公報第００３６６７６号；欧州特許公開公報第００８８０４６号；欧州特許公開公報第０１４３９４９号；欧州特許公開公報第０１４２５４１号；特許公開公報第８３－１１８０８号；米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号により調製される。基本的に、リポソームは、小さな（約２００～８００オングストローム）の単層型であり、ここでの脂質の含有量は、約３０ｍｏｌ％超のコレステロールであり、選択された比率が、ポリペプチド漏出の最適な比率のため調節されている。本組成物は、腫瘍部位もしくは他の望ましい部位へ局在化した方法で投与されてもよく、または腫瘍もしくは他の細胞を標的とする方法で送達されてもよい。
【0091】
本組成物は、好ましくは「治療上有効量」で個体に投与され、これは、個体に利点を示すために十分な量である。投与される実際の量、ならびに投与の速度および時間過程は、処置されるものの性質および重症度に応じて変化する。処置の処方、たとえば用量の決定などは、一般開業医および他の医師の責任の範囲内にあり、通常、処置される障害、個別の患者の状態、送達部位、投与方法、および実務者に知られている他の要因を考慮する。本発明の組成物は、特に、既存の腫瘍、特にがんの処置、および最初の処置または外科手術の後の当該病態の再発の予防に関連している。上述の技術およびプロトコルの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｏｓｌｏ， Ａ． （ｅｄ）， １９８０ （Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ １９８０）で見出され得る。
【0092】
最適な用量は、たとえば年齢、性別、体重、処置される病態の重症度、投与される有効成分、および投与経路を含む多くのパラメータに基づき医師により決定され得る。一般的に、受容体の飽和を許容するポリペプチドおよび抗体の血清中濃度が望ましい。通常、約０．１ｎＭを超える濃度が十分である。たとえば、１００ｍｇ／ｍ２の用量の抗体は、約８日間約２０ｎＭの血清中濃度を提供する。
【0093】
おおよそのガイドラインとして、抗体の用量は、１０～３００ｍｇ／ｍ２の量で毎週投与され得る。等しい用量の抗体フラグメントは、ＳＳＥＡ４炭水化物の飽和を可能にする濃度を超える血清レベルを維持するためにより頻繁な間隔で使用される。本組成物の用量は、結合メンバーの特性、たとえばその結合活性およびｉｎ ｖｉｖｏでの血漿中半減期、製剤中のポリペプチドの濃度、投与経路、投与部位および速度、関与する患者の臨床的耐性、患者を苦しめる病態などに応じて変化し、これは医師の技能の範囲内にある。たとえば、投与あたり、患者あたり３００μｇの抗体の用量が好ましいが、用量は、投与あたり約１０μｇ～６ｍｇの範囲にあり得る。異なる用量が、一連の逐次接種の間利用される。実務者は、最初の接種を行い、次に、相対的により低い用量の抗体を用いてブーストを行い得る。
【0094】
また本発明は、がんに対する防御免疫応答を高めるために最適化された免疫処置スケジュールを対象とする。本発明は、がんに対する防御免疫応答を高めるための免疫処置スケジュールを提供する。
【0095】
本発明の結合メンバーは、全体的または部分的に化学的な合成により作製され得る。結合メンバーは、良好に確立されている標準的な液相または好ましくは固相ペプチド合成法により容易に調製でき（この一般的な記載は、広く利用可能である（たとえばＪ．Ｍ． Ｓｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｊ．Ｄ． Ｙｏｕｎｇ， １９８４（Ｓｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ １９８４）、Ｍ． Ｂｏｄａｎｚｓｋｙ ａｎｄ Ａ． Ｂｏｄａｎｚｓｋｙ， １９８４（Ｂｏｄａｎｚｓｋｙ ａｎｄ Ｂｏｄａｎｚｓｋｙ １９８４）を参照）、またはこれらは、溶液において、液相法もしくは固相、液相、および溶液の化学技術のいずれかの組み合わせにより、たとえば最初に各ペプチド部分を完成させ、次に望ましくかつ適切である場合、存在する保護基を全て除去した後、各炭酸もしくはスルホン酸もしくはそれらの反応性の誘導体の反応により残基Ｘを導入することにより、調製され得る。
【0096】
本発明に係る結合メンバーを生産する別の簡便な方法は、発現系において核酸を使用することにより、それをコードする核酸を発現することである。
【0097】
さらに本発明は、本発明の特異的な結合メンバーをコードする単離された核酸を提供する。核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。好ましい態様では、本発明は、上記に定義される本発明の特異的な結合メンバーをコードする核酸を提供する。このような核酸の例は、図２に示されている。当業者は、本発明の特異的な結合メンバーを依然として提供する、当該核酸に対する置換、欠失、および／または付加を決定することができる。
【0098】
また本発明は、上述の少なくとも１つの核酸を含むプラスミド、ベクター、転写または発現カセットの形態のコンストラクトを提供する。また本発明は、上記の１つ以上のコンストラクトを含む組み換え宿主細胞を提供する。言及されるように、本発明の特異的な結合メンバーをコードする核酸は、コードした核酸からの発現を含む、特異的な結合メンバーの産生方法と同様に、本発明の一態様を形成する。発現は、この核酸を含む組み換え宿主細胞を適切な条件下で培養することにより、簡便に達成され得る。発現による産生の後に、特異的な結合メンバーは、いずれかの適切な技術を使用して単離および／または精製されてよく、次に適宜使用され得る。
【0099】
様々な異なる宿主細胞におけるポリペプチドのクローニングおよび発現のためのシステムは、よく知られている。適切な宿主細胞として、細菌、哺乳類細胞、酵母、およびバキュロウイルスの系が挙げられる。異種性ポリペプチドの発現のため当該分野で利用可能な哺乳類細胞株として、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ヒーラ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＮＳ０マウスメラノーマ細胞、および多くの他の細胞が挙げられる。一般的な好ましい細菌宿主は、大腸菌である。大腸菌などの原核細胞での抗体および抗体フラグメントの発現は、当該分野で良好に確立されている。レビューとして、たとえばＰｌｕｃｋｔｈｕｎ， １９９１（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ １９９１）を参照されたい。培養物における真核細胞の発現はまた、特異的な結合メンバーの産生のための選択肢として当業者に利用可能である。近年のレビューとして、たとえばＲｅｆｆ， １９９３（Ｒｅｆｆ １９９３）； Ｔｒｉｌｌ ｅｔ ａｌ．， １９９５（Ｔｒｉｌｌ， Ｓｈａｔｚｍａｎ， ａｎｄ Ｇａｎｇｕｌｙ １９９５）を参照されたい。
【0100】
プロモーター配列、転写終結配列、ポリアデニル化配列、エンハーサー配列、マーカー遺伝子、および他の配列を含む適切な制御配列を適宜含む適切なベクターが、選択または構築され得る。ベクターは、適宜、プラスミド、ウイルス、たとえば「ファージ」またはファージミドであり得る。さらなる詳細に関しては、たとえばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９（Ｓａｍｂｒｏｏｋ １９８９）を参照されたい。たとえば核酸コンストラクトの調製における核酸の操作、変異誘発、シーケンシング、ＤＮＡの細胞への導入、および遺伝子発現、ならびにタンパク質の分析のための多くの知られている技術およびプロトコルは、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９９２（Ａｕｓｕｂｅｌ １９９２）に詳述されている。
【0101】
よって、本発明のさらなる態様は、本明細書中開示される核酸を含む宿主細胞を提供する。さらなる態様は、当該核酸を宿主細胞に導入することを含む方法を提供する。この導入は、いずれかの利用可能な技術を使用し得る。真核細胞では、適切な技術は、リン酸カルシウムのトランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン、エレクトロポレーション、リポソームが介在するトランスフェクション、およびレトロウイルスまたは他のウイルス、たとえばワクシニアウイルス、もしくは昆虫細胞ではバキュロウイルスを使用する形質導入を含み得る。細菌細胞では、適切な技術は、塩化カルシウムによる形質転換、エレクトロポレーション、およびバクテリオファージを使用するトランスフェクションを含み得る。この導入を行った後に、たとえば宿主細胞を遺伝子発現のための条件下で培養することにより、核酸からの発現が引き起こされてもよくまたはこれが可能となり得る。
【0102】
本発明の核酸は、宿主細胞のゲノム（たとえば染色体）に統合され得る。統合は、標準的な技術によるゲノムでの組み換えを促進する配列の包含により、促進され得る。
【0103】
また本発明は、上述の特異的な結合メンバーまたはポリペプチドを発現するための発現系において上述のコンストラクトを使用することを含む方法を提供する。
【0104】
本発明の各態様の好ましい特性は、必要な変更を加えた他の各態様と同様である。本明細書中言及される従来技術の文献は、法律により許容される最も完全な度合いまで組み込まれている。
【0105】
特定の態様では、本開示は、本明細書中記載のｍＡｂまたはその結合フラグメントと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
【0106】
免疫調節性ｍＡｂは、エフェクターＴ細胞（チェックポイントブロッカー）を抑制する鍵となる阻害性経路を遮断するか、または共刺激免疫受容体（免疫賦活性）をアゴニスティックに必要とするように設計されている。この特許で、本発明者らは、２８１１ ｍＡｂがｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでＴ細胞の増殖を刺激し得ることを示した。アイソタイプに依存するＦｃγＲＩＩＢの関与は、免疫アゴニスティックなｍＡｂの活性に不可欠であることが示されている。これら作用物質は、それらの標的受容体、通常は、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーのメンバーを介してシグナリングを刺激し、受容体のクラスタリングおよびそれに続く下流のシグナリングは、ＦｃγＲＩＩＢとｍＡｂ Ｆｃの相互作用により促進される。癌治療として、これらは、ＡＰＣもしくはＴエフェクター細胞上のＣＤ４０、４－１ＢＢ、もしくはＯＸ４０などの共刺激受容体を必要とすることにより腫瘍免疫を高めるように、またはがん細胞上のＤＲ４、ＤＲ５、もしくはＦａｓ（ＣＤ９５）などの細胞死受容体（ＤＲ）を刺激することによりアポトーシスを促進させるように設計されている。直接的な標的化作用物質とは対照的に、これらｍＡｂのアゴニスティックな活性は、阻害性ＦｃγＲＩＩＢを必要とするそれらの特性に依存しており、阻害性受容体よりも活性化受容体に対する結合の比（Ａ：Ｉ）が高いｍＡｂ（たとえばマウスＩｇＧ２ａ、ヒトＩｇＧ１）は、前臨床モデルにおいて大部分が不活性であり、低いＡ：Ｉ比を有するもの（たとえばマウスＩｇＧ１およびｈＩｇＧ２）は、著しくアゴニスティックである。ＦｃγＲＩＩＢを介したシグナリングは、活性を提供することを必要とされておらず；むしろＦｃγＲＩＩＢは、ＴＮＦＲのクラスタリングおよび活性化を促進するためｍＡｂに架橋スキャフォールドを提供するものである（Ｂｅｅｒｓ， Ｇｌｅｎｎｉｅ， ａｎｄ Ｗｈｉｔｅ ２０１６）。そのため、ＦＧ２８１１ ｍＩｇＧ１は、ＴＳＣＭを刺激するためにｉｎ ｖｉｖｏで使用され、プレートに結合した２８１１ ｈＩｇＧ１またはｍＩｇＧ３は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで使用され得る。別の手法は、ｈＩｇＧ２アイソタイプの使用を構成する。このヒトのアイソタイプは、ＦｃγＲＩＩＢに対して限定した結合親和性を有しており、その固有のヒンジジスルフィド構成を介して、受容体のクラスタリングを駆動する内因性の特性を有する（Ｗｈｉｔｅ ２０１５； Ｌｉｕ ２０１９； Ｙｕ ２０２０）。合成時に、ｈＩｇＧ２は、そのヒンジドメインおよびＣＨ１ドメインのジスルフィド結合の再配置を介してある範囲のアイソフォームに転換し、よりコンパクトで強固な形態が、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで強力なＦｃγＲＩＩＢに依存しない受容体のクラスタリングを呈している。よって、本発明者らは、ＴＳＣＭの２８１１ ｈＩｇＧ２により誘導される刺激を示している。
【0107】
一部の態様では、本発明は、ＳＳＥＡ－４抗原に対する本発明の単離された特異的な結合メンバーの結合を介して、ｅｘ ｖｉｖｏでステムメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）を単離する方法を提供する。一部の態様では、本発明は、ＳＳＥＡ－４抗原に対する本発明の単離された特異的な結合メンバーの結合を介して、ｅｘ ｖｉｖｏでステムメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）を増殖する方法を提供する。一部の態様では、本発明は、ＳＳＥＡ－４抗原に対する本発明の単離された特異的な結合メンバーの結合を介して、ｅｘ ｖｉｖｏでステムメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）を単離および増殖する方法を提供する。
【0108】
特定の態様では、本発明は、いずれかのマウスまたはヒトのアイソタイプのｍＡｂ ２８１１を使用して、ｅｘ ｖｉｖｏでステムメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）を単離および／または増殖する方法を提供する。特定の態様では、本発明は、いずれかのマウスまたはヒト抗体のアイソタイプ由来のｍＡｂ ２８１１の結合ドメインおよびいずれかのフレームワーク領域を含む単離された抗体またはその結合フラグメントもしくはメンバーを使用して、ｅｘ ｖｉｖｏでステムメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）を単離および／または増殖する方法を提供する。
【0109】
一部の態様では、本発明は、ＳＳＥＡ－４抗原に対する本発明の単離された特異的な結合メンバーの結合を介して、ｉｎ ｖｉｖｏでステムメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）を単離する方法を提供する。一部の態様では、本発明は、ＳＳＥＡ－４抗原に対する本発明の単離された特異的な結合メンバーの結合を介して、ｉｎ ｖｉｖｏでステムメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）を増殖する方法を提供する。一部の態様では、本発明は、ＳＳＥＡ－４抗原に対する本発明の単離された特異的な結合メンバーの結合を介して、ｉｎ ｖｉｖｏでステムメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）を単離および増殖する方法を提供する。
【0110】
一部の態様では、本発明は、ＳＳＥＡ－４抗原に対する結合を介して、ｉｎ ｖｉｖｏでステムメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）を単離する方法に使用するための本発明の単離された特異的な結合メンバーを提供する。一部の態様では、本発明は、ＳＳＥＡ－４抗原に対する結合を介して、ｉｎ ｖｉｖｏでステムメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）を増殖する方法に使用するための本発明の単離された特異的な結合メンバーを提供する。一部の態様では、本発明は、ＳＳＥＡ－４抗原に対する結合を介して、ｉｎ ｖｉｖｏでステムメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）を単離および増殖する方法に使用するための本発明の単離された特異的な結合メンバーを提供する。
【0111】
特定の態様では、本発明は、いずれかのマウスまたはヒトのアイソタイプのｍＡｂ ２８１１を使用して、ｉｎ ｖｉｖｏでステムメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）を単離および／または増殖する方法を提供する。特定の態様では、本発明は、いずれかのマウスまたはヒトの抗体のアイソタイプ由来のｍＡｂ ２８１１の結合ドメインおよびいずれかのフレームワーク領域を含む単離された抗体またはその結合フラグメントもしくはメンバーを使用して、ｉｎ ｖｉｖｏでステムメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）を単離および／または増殖する方法を提供する。
【0112】
本発明の一部の態様では、ステムメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）を増殖することは、細胞の増殖を増大させることおよび／または細胞分裂を促進させることを表す。
【0113】
本発明の一部の態様では、細胞は、細胞を標的化または標識するため本発明の結合メンバーを使用し次にセルソーティングまたは細胞分離方法を適用することにより、同定または精製される。本発明の一部の態様では、本発明の結合メンバーは、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）、フローサイトメトリー、免疫磁気細胞分離、免疫密度細胞分離（Ｉｍｍｕｎｏｄｅｎｓｉｔｙ Ｃｅｌｌ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）、免疫誘導型レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（ＬＣＭ：Ｉｍｍｕｎｏｇｕｉｄｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ）などのセルソーティングまたは細胞分離方法で使用され得る。好ましい実施形態では、本発明の結合メンバーは、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）で使用され得る。好ましい実施形態では、本発明の結合メンバーは、フローサイトメトリー法で使用され得る。
【0114】
特定の態様では、本発明は、それを必要とする対象のがんを処置する方法であって、本発明の単離された特異的な結合メンバーを含む医薬組成物の治療上有効量を対象に投与するステップを含む、方法を提供する。本発明の一部の方法では、投与された結合メンバーは、対象において本発明の単離された特異的な結合メンバーの増殖を刺激する。
【0115】
特定の実施形態では、本方法は、脳がん、肺がん、乳がん、口腔がん、食道がん、胃がん、肝臓がん、胆管がん、膵臓がん、結腸がん、腎臓がん、骨がん、皮膚がん、子宮頸がん、卵巣がん、および前立腺がんからなる群から選択されるがんの処置を提供する。
【0116】
特定の態様では、本発明は、それを必要とする対象のがんを処置する方法であって、本医薬組成物の治療上有効量を対象に投与するステップを含む方法に使用するための、本発明の単離された特異的な結合メンバーを含む医薬組成物を提供する。本発明の一部の方法では、投与された結合メンバーは、対象において本発明の単離された特異的な結合メンバーの増殖を刺激する。
【0117】
特定の実施形態では、本発明の方法に係る使用のための医薬組成物は、脳がん、肺がん、乳がん、口腔がん、食道がん、胃がん、肝臓がん、胆管がん、膵臓がん、結腸がん、腎臓がん、骨がん、皮膚がん、子宮頸がん、卵巣がん、および前立腺がんからなる群から選択されるがんを処置する。
【0118】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細を、以下の説明に記載する。本発明の他の特性または利点は、以下の図面およびいくつかの実施形態の詳細な説明から、また添付の特許請求の範囲から明らかである。
【0119】
本明細書中使用される場合、たとえばＡｊｉｔ Ｖａｒｋｉら（Ｖａｒｋｉ ｅｔ ａｌ． ２００９）による「Ｓｙｍｂｏｌｓ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｇｌｙｃａｎ Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ」を含むグリカンおよび関連する構造を説明するための記号、図画、およびテキストの術語体系は、当該分野で良好に確立および理解されている。
【図面の簡単な説明】
【0120】
【図1】ラクトシルセラミド（ＬＣ）由来のＳＳＥＡ－３およびＳＳＥＡ－４グリカンの産生の模式図。ＬＭＴＫマウス線維芽細胞株に、Ａ４ＧＡＬＴ、Ｂ３ＧＡＬＮＴ１、およびＢ３ＧＡＬＴ５遺伝子を形質導入し、それぞれα－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼ、β－１，３－Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼおよびβ－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼを作製し、グリカンを順次ＬＣに添加してＳＳＥＡ－３およびＳＳＥＡ－４グリカンを産生させた。
【図2】ＦＧ２８１１ ＩｇＧ３重鎖およびκ軽鎖の可変領域ならびにｍＩｇＧ１、ｈＩｇＧ１、およびｈＩｇＧ２の定常領域のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列。 （Ａ）フレームワーク領域（ＦＲ）１～３および相補性決定領域（ＣＤＲ）１～３を示す、成熟ＦＧ２８１１重鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列。 （Ｂ）フレームワーク領域（ＦＲ）１～３および相補性決定領域（ＣＤＲ）１～３を示す、成熟ＦＧ２８１１κ鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列。 （Ｃ）生殖系列でアライメントされたｍＩｇＧ１のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列。 （Ｄ）生殖系列でアライメントされたｈＩｇＧ２のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列。 （Ｅ）生殖系列でアライメントされたｈＩｇＧ１のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列。
【図3】ＳＳＥＡ－３／４－ＬＭＴＫ細胞に対する２８１１マウスＩｇＧ（ＩｇＧ１およびＩｇＧ３）アイソタイプ対キメラＩｇＧ（ＩｇＧ１およびＩｇＧ２）アイソタイプの結合パターン。 ＦＧ２８１１ｍＧ３、ＦＧ２８１１ｍＧ１、ＣＨ２８１１ｈＧ１、ＣＨ２８１１ｈＧ２、ＭＣ８１３（抗ＳＳＥＡ－４ ｍＡｂ；マウスＩｇＧ１）、ＭＣ６３１（抗ＳＳＥＡ－３ ｍＡｂ；ラットＩｇＭ）、ＦＧ８８．７（抗Ｌｅｗｉｓａ／ｃ／ｘ ｍＡｂ；マウスＩｇＧ３）、抗マウス二次抗体および三次抗体単独、抗ヒト二次抗体および三次抗体単独、ならびに培地単独のＳＳＥＡ－３／４－ＬＭＴＫ細胞に対する結合を、フローサイトメトリーにより評価した。この結果は、幾何平均（Ｇｍ）の値として提示されている。
【図4】ＳＳＥＡ－４に対するＦＧ２８１１ｍＧ３の特異性の評価 （Ａ）ＨＰＴＬＣにより評価されるＦＧ２８１１ｍＧ３ ｍＡｂの脂質抗原に対する結合。５μｇ／ｍｌのｉ）ＦＧ２８１１ｍＧ３ ｍＡｂ、ｉｉ）ＭＣ６３１ ｍＡｂ、およびｉｉｉ）ＭＣ８１３ ｍＡｂを使用した、１）野生型ＬＭＴＫおよび２）ＳＳＥＡ－３／４－ＬＭＴＫ細胞膜脂質抽出物の薄層クロマトグラフィー分析。 （Ｂ）ＳＳＥＡ－３／４－ＬＭＴＫ細胞表面抗原に結合したＦＧ２８１１ｍＧ３ ｍＡｂ。５μｇ／ｍｌのｉ）二次抗体単独、ｉｉ）ＭＣ８１３、ｉｉｉ）ＦＧ２８１１ｍＧ３、およびｉｖ）ＭＣ６３１のＳＳＥＡ－３／４－ＬＭＴＫ細胞に対する結合を、直接的な免疫蛍光染色およびフローサイトメトリー分析により評価した。結果は、Ｇｍ値として表されている。 （Ｃ）ＨＳＡとカップリングしたグリカン抗原（ＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、Ｇｌｏｂｏ－Ｈ、およびフォルスマン）とＦＧ２８１１ｍＧ３ ｍＡｂの反応性。５μｇ／ｍｌのｉ）ＦＧ２８１１ｍＧ３、ｉｉ）ＭＣ８１３、ｉｉｉ）ＭＣ６３１、ｉｖ）Ｍ１／８７、およびｖ）ＫＭ９３ ｍＡｂのＨＳＡとカップリングしたグリカンに対する結合を、ＥＬＩＳＡにより評価した。ＭＣ６３１（抗ＳＳＥＡ－３およびＳＳＥＡ－４）、ＭＣ８１３（抗ＳＳＥＡ－４）、Ｍ１／８７（抗フォルスマン）、およびＫＭ９３（抗シアリル－Ｌｅｗｉｓｘ）が、陽性対照ｍＡｂとして含まれていた。抗体活性は、４５０ｎｍの吸光度により測定した。エラーバーは、四連のウェルの平均値±標準偏差を表している（＊＊＊ｐ＜０．０００１；＊ｐ＜０．０５対対照、ＡＮＯＶＡ、続いてボンフェローニの多重比較検定、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６）。 （Ｄ）Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｌｙｃｏｍｉｃｓアレイ（ＣＦＧ， ｃｏｒｅ Ｈ， ｖｅｒｓｉｏｎ ５．１）に対するＦＧ２８１１ｍＧ３ ｍＡｂの結合。Ｓｐは、スライド上のグリカン間のスペーサーの長さを意味する。
【図5】抗原に対するＦＧ２８１１ｍＧ３親和性の評価 （Ａ）ＦＧ２８１１ｍＧ３ ｍＡｂのＳＳＥＡ－３／４－ＬＭＴＫ細胞膜脂質抗原の結合動態を、ＳＰＲ（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｘ）を使用して試験した。 （Ｂ）ＳＳＥＡ－３／４－ＬＭＴＫ細胞膜脂質のＥＬＩＳＡ。ある濃度範囲のＦＧ２８１１ｍＧ３ ｍＡｂを、ＳＳＥＡ－３／４－ＬＭＴＫ細胞膜脂質でコーティングしたマイクロウェルでインキュベートした。ＥＣ５０値（６．８×１０－１０Ｍ）は、対数変換したデータ上の非線形回帰を介して得た（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６）。 （Ｃ）ＳＳＥＡ－３／４－ＬＭＴＫ細胞表面結合。ＳＳＥＡ－３／４－ＬＭＴＫ細胞を、ある濃度範囲のＦＧ２８１１ｍＧ３ ｍＡｂとインキュベートし、フローサイトメトリーにより細胞結合を分析した。バックグラウンド減算したデータを１つの部位特異的な結合モデルに適合することにより（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６）、Ｋｄ値がもたらされた。３つの独立した実験からの代表的な結合曲線が示されている。
【図6】ヒトがん細胞株のパネルに対するＦＧ２８１１ｍＧ３抗体の結合 （Ａ）脳がん細胞株（Ｕ２５１、ＫＮＳ４２、ＤＡＯＹ、ＳＦ１８８、Ｕ８７、およびＵＷ２２８３）に対する抗体結合。５μｇ／ｍｌの脳がん細胞株に対する抗体ＦＧ２８１１ｍＧ３、ＭＣ８１３、マウスＩｇＧ３κアイソタイプ対照および二次抗体単独（一次抗体なし）の結合を、フローサイトメトリーにより評価し、結果は、Ｇｍ値として提示された。 （Ｂ）卵巣（ＳＫＯＶ３、ＩＧＲＯＶ１、およびＯＶＣＡＲ－５）、乳房（Ｔ４７Ｄ、ＭＣＦ７、ＤＵ４４７５、およびＨＣＣ１１８７）、ならびに結腸直腸（Ｃｏｌｏ２０５およびＨＣＴ１５）に対する抗体結合。５μｇ／ｍｌでのがん細胞株のパネルに対する抗体ＦＧ２８１１ｍＧ３、抗ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ（Ｗ６／３２）、および二次抗体単独（一次抗体なし）の結合は、フローサイトメトリーにより評価されており、結果は、Ｇｍ値として提示された。
【図7】ＦＧ２８１１ｍＧ３抗体の細胞傷害性活性 （Ａ）ＦＧ２８１１ｍＧ３ ｍＡｂによるがん細胞のＡＤＣＣ殺滅。ＳＫＯＶ３細胞およびＴ４７Ｄ細胞上のＦＧ２８１１ｍＧ３ ｍＡｂの用量依存的なＡＤＣＣ活性。５１Ｃｒで標識したがん標的細胞を、増大する濃度のＦＧ２８１１ｍＧ３ ｍＡｂ（０．００３～１０μｇ／ｍｌ）およびヒトＰＢＭＣ（標的細胞：ＰＢＭＣ；１００：１）と共インキュベートした。上清内へ放出された５１Ｃｒを測定し、１０％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘで放出された総５１Ｃｒのパーセンテージとして表した。抗ＣＤ５５ ｍＡｂ（７９１Ｔ／３６）を、陰性対照ｍＡｂとして使用した。ＰＢＭＣ対照と比較した有意性を、ＡＮＯＶＡ、次いでボンフェローニの多重比較検定をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６で行うことにより確立した（＊＊＊、Ｐ＜０．００１対対照）。 （Ｂ）ＦＧ２８１１ｍＧ３ ｍＡｂによるがん細胞のＣＤＣ殺滅。ＳＫＯＶ３細胞およびＴ４７Ｄ細胞上のＦＧ２８１１ｍＧ３ ｍＡｂの用量依存的なＣＤＣ活性。５１Ｃｒで標識したがん標的細胞を、増大する濃度のＦＧ２８１１ｍＧ３ ｍＡｂ（０．００３～１０μｇ／ｍｌ）およびヒト血清と共インキュベートした。上清内へ放出された５１Ｃｒを測定し、１０％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘで放出された総５１Ｃｒのパーセンテージとして表した。抗ＣＤ５５ ｍＡｂ（７９１Ｔ／３６）を、陰性対照ｍＡｂとして使用した。ＰＢＭＣ対照と比較した有意性を、ＡＮＯＶＡ、次いでボンフェローニの多重比較検定をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６で行うことにより確立した（＊、Ｐ＜０．００５；＊＊＊、Ｐ＜０．００１対対照）。 （Ｃ）ＦＧ２８１１ｍＧ３は、３７℃でがん細胞の直接的な細胞死を誘導した。ｍＡｂで曝露した後のヨウ化プロピジウム（ＰＩ）の取り込みを、フローサイトメトリー分析により評価した。ＳＳＥＡ－３／４－ＬＭＴＫ細胞を、３０μｇ／ｍｌのＦＧ２８１１ｍＧ３ ｍＡｂと３７℃でインキュベートした。過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）および培地単独を、それぞれ陽性対照および陰性対照として含めた。 （Ｄ）ＦＧ２８１１ｍＧ３で処置したがん細胞の位相差像。画像（倍率×１０）は、７２時間、３０μｇ／ｍｌのＦＧ２８１１ｍＧ３ ｍＡｂおよび培地単独とインキュベートした後のＳＳＥＡ－３／４－ＬＭＴＫ細胞、ＳＫＯＶ３細胞、およびＬＭＴＫ細胞を示す。
【図8】正常な赤血球結合 （Ａ）フローサイトメトリーによる健常なドナーの赤血球に対するＦＧ２８１１ｍＧ３ ｍＡｂの結合の評価。ＦＧ２８１１ｍＧ３ ｍＡｂによる赤血球の結合を、フローサイトメトリーにより７９１Ｔ／３６陽性対照ｍＡｂ（抗ＣＤ５５ ｍＡｂ）と比較した。両方のｍＡｂは、１０μｇ／ｍｌで使用した。アイソタイプ対照ｍＡｂおよび培地単独は、陰性対照として使用した。結果は、５名のドナーを代表する。 （Ｂ）赤血球凝集アッセイ。様々な濃度（０．６２５～１０μｇ／ｍｌ）のＦＧ２８１１ｍＧ３ ｍＡｂによる赤血球の凝集を、７９１Ｔ／３６および抗血液グループの陽性対照抗体と比較した。ＰＢＳを陰性対照として使用した。結果は、５名のドナーを代表する。
【図9】ヒト血液細胞に対するＦＧ２８１１ｍＧ１の結合 （Ａ）ＦＧ２８１１ｍＧ１は健常なドナー由来の全血のＰＢＭＣに結合した。ＦＧ２８１１ｍＧ１、ＭＣ８１３、マウスＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体（アイソタイプｃｔｒｌ）、ＯＫＴ３（抗ＣＤ３）、１９８（抗ＣＥＡＣＡＭ６）、および抗マウスＩｇＧ Ｆｃに特異的なＦＩＴＣ二次抗体単独（一次抗体なし）と健常なドナーの全血の結合を、間接的な免疫蛍光染色およびフローサイトメトリー分析により評価した。全てのｍＡｂは、５μｇ／ｍｌで使用した。示された結果は、７名の異なる健常なドナーの全血を代表する。結果は、ドットプロットおよびヒストグラムで示されている。 （Ｂ）ＰＢＭＣの表現型決定。ＣＤ３＋ＦＧ２８１１ｍＧ３＋ＰＢＭＣを表現型決定するために使用されるフローサイトメトリーのゲート戦略を記載する連続的なパネル；ゲートは、ＣＤ３＋ＦＧ２８１１ｍＧ３＋細胞での分析のために描かれており；ＣＤ３＋ＦＧ２８１１ｍＧ３＋細胞を、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ４５ＲＯの発現に関して確認した。さらにＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ４５ＲＡ＋ＲＯ＋、およびＣＤ４５ＲＯ＋細胞を、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ９５、およびＣＣＲ－７マーカーの発現について確認した。
【図10】４名の健常なドナー（ＢＤ３、ＢＤ１３、ＢＤ６１、ＢＤ９６）由来のＣＨ２８１１ｈＧ１を多く含むナイーブＴ細胞およびＣＤ１２２／ＣＤ９５を多く含むナイーブＴ細胞を、バルクＲＮＡｓｅｑを使用して転写的にプロファイリングした。 （Ａ）ナイーブなＣＤ８Ｔ細胞（ＧＳＥ８３８０８）を、ＣＨ２８１１ｈＧ１を多く含むナイーブＴ細胞およびＣＤ１２２／ＣＤ９５を多く含むナイーブＴ細胞とそれぞれ比較することにより得た差次的に発現した（ＤＥ）遺伝子の２つのセットの間で共通する遺伝子を示すベン図。同定した２２２７の共通する遺伝子を、ＳｔｅｍＣｈｅｃｋｅｒ（Ｐｉｎｔｏ ｅｔ ａｌ． ２０１５）を使用して幹細胞性シグネチャーについて分析した。幹細胞のサブセットに関連する遺伝子の統計的に有意なエンリッチメントおよび幹細胞性に関連する転写因子の有意に多い標的が、表に示されている。 （Ｂ）ＥＳＣ由来の２５７の重複する遺伝子およびＨＳＣに由来する１１３の重複する遺伝子（両方ともＡの表由来）それぞれに基づく、ＣＨ２８１１ｈＧ１を多く含むトランスクリプトームプロファイルおよびＣＤ１２２／ＣＤ９５を多く含むトランスクリプトームプロファイルのヒートマップおよび階層クラスタリング（ユークリッド距離）。２つの多く含まれる集団の明確な分離はなく、これらの幹細胞性プロファイルにおける共通性が示唆される。 （Ｃ）（ｉ）Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１１（Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ ｅｔ ａｌ． ２０１１）からのＣＤ８＋ＴＳＣＭおよびＴＮの間のＤＥ遺伝子に基づき、かつ、（ｉｉ）Ｐｉｌｉｐｏｗ ｅｔ ａｌ．， ２０１８（Ｐｉｌｉｐｏｗ ｅｔ ａｌ． ２０１８）からのエフェクターの分化に関連することが示されている転写因子、エフェクター機能、消耗、およびホーミング接着の遺伝子のサブセットに基づく、ヒートマップ（２倍超、ｐ＜０．００１）。ドナー１～６は、ＧＳＥ１１４７６５、ＣＤ８／ＣＤ４ナイーブに由来しており、メモリーのデータセットは、ＧＳＥ２３３２１由来であった。
【図11】ＣＨ２８１１ｈＧ１抗体はＰＢＭＣ増殖を誘導した。 （Ａ）ＰＢＭＣは、２名の健常なドナー（ＢＤ３およびＢＤ１８）の全血から単離し、ＣＳＦＥ色素で標識した。健常なドナー由来のＣＳＦＥで標識したＴ細胞を、プレートに結合したｉ）ＰＨＡ、ｉｉ）ＣＨ２８１１ｈＧ１ ｍＡｂ、およびｉｉｉ）培地で刺激し、１１日目に細胞を回収してＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞の増殖を確認した。特異的なＴ細胞集団の増殖のパーセンテージを、ＣＳＦＥ色素希釈分析を介して評価した。結果は、２名のドナーを代表する。 （Ｂ）ＣＤ４およびＣＤ８のＰＢＭＣ増殖の概要。
【図12】ＣＨ２８１１ｈＧ１抗体はＴ細胞増殖を誘導した。 （Ａ）Ｔ細胞の純度およびＣＳＦＥ標識の確認。純粋なＴ細胞を、４名の健常なドナー（ＢＤ６１、ＢＤ２、ＢＤ３、ＢＤ２６）の全血から単離し、ＣＳＦＥ色素で標識した。Ｔ細胞の純度を、抗ＣＤ３抗体でＴ細胞を染色することにより確認し、ＣＳＦＥ標識を、ＦＩＴＣチャネルで確認した。 （Ｂ）プレートに結合したＣＨ２８１１ｈＧ１抗体は、５μｇ／ｍｌでＴ細胞の増殖を誘導した。健常なドナー由来のＣＳＦＥで標識したＴ細胞を、プレートに結合したｉ）ＣＨ２８１１ｈＧ１、ｉｉ）抗ＣＤ３抗体、およびｉｉｉ）培地で刺激し、７、１１、および１４日目に細胞を回収して、ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞の増殖を確認した。特異的なＴ細胞集団の増殖のパーセンテージを、ＣＳＦＥ色素希釈分析を介して評価した。結果は、４名のドナーを代表する。 （Ｃ）ＣＳＦＥ色素希釈分析により評価される４名の健常なドナー（ＢＤ６１、ＢＤ２、ＢＤ３、ＢＤ２６）由来のｉ）総Ｔ細胞の増殖、ｉｉ）ＣＤ４Ｔ細胞の増殖、およびｉｉｉ）ＣＤ８Ｔ細胞の増殖の概要。 （Ｄ）ｉｎ ｖｉｔｒｏで１１日後の特定の数の分裂でのＣＨ２８１１ｈＧ１で刺激したＣＤ４Ｔ細胞のパーセンテージ。Ｔ細胞に、ＣＳＦＥ色素を充填し、０日目にｉ）抗ＣＤ３、ｉｉ）ＣＨ２８１１ｈＧ１、またはｉｉｉ）培地で刺激した。１１日目に、ＣＳＦＥプロファイルを、フローサイトメトリーにより分析した。細胞分裂回数は、四角のボックスで表されており、特定の回数分裂した細胞のパーセンテージは、四角のボックスの上に表されている。
【図13】ＣＨ２８１１ｈＧ１で刺激したＴ細胞におけるＴＣＲレパートリーのクローン型の評価 Ｔ細胞のレパートリーを、２名のドナー由来のＣＳＦＥｈｉｇｈおよびｌｏｗのＣＨ２８１１ｈＧ１で刺激したＴ細胞の抽出したＲＮＡから、それぞれ１９日目（ＢＤ３）および１４日目（ＢＤ２６）に検出した。ＴＣＲのレパートリーの多様性は、ｔｒｅｅ ｍａｐで示されている（ここで、それぞれの角丸長方形は固有のエントリー：Ｖ－Ｊ－ｕＣＤＲ３を表し、スポットの大きさは、相対的な頻度を意味する）。 （Ａ）ＣＨ２８１１で刺激したＴ細胞のＣＦＳＥｈｉｇｈ（Ｂ）およびＣＦＳＥｌｏｗ（Ｃ）ＴＲＡ鎖、ＣＦＳＥｈｉｇｈ（Ｄ）およびＣＦＳＥｌｏｗ（Ｅ）ＴＲＢ鎖の多様性のプロット。サンプルの多様性が高いほど、実線は破線に近づく。この線は、サンプルの総合的な多様性を記載する曲線に構築しており、ここで「完全な」多様性は、黒色の破線である（各固有のクローン型は、同等の読み取りを受領し、すなわちクローン的な増殖または優性のクローンはない）。
【図14】個別のサイトカイン／ケモカイン応答の動態 ４名の健常なドナー（ＢＤ６１、ＢＤ２、ＢＤ３、ＢＤ２６）から単離した純粋なＴ細胞を、０日目にＣＨ２８１１ｈＧ１（５μｇ／ｍｌ）で刺激した。刺激していない細胞（培地）を、陰性対照として含めた。上清を７、１１、および１４日目に回収し、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－２、ＩＬ－５、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－７、およびＩＬ－２１の濃度（ｐｇ／ｍｌ）について評価した。個別のドットは、異なるドナーを表す。ＣＨ２８１１ｈＧ１で刺激したＴ細胞と刺激していない細胞との間のサイトカイン／ケモカインの結果の比較分析を、独立スチューデントｔ検定を適用することにより行い、これによりＰ値を計算した（＊＊＊、Ｐ＜０．０００１、＊＊、Ｐ＜０．０１、＊、Ｐ＜０．０５；ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６）。
【図15】ＣＨ２８１１ｈＧ１で刺激したＴ細胞は、２カ月超の間ｉｎ ｖｉｔｒｏで生存可能であり続けた。 （Ａ）Ｔ細胞を、プレートに結合したＣＨ２８１１ｈＧ１（５μｇ／ｍｌ）または抗ＣＤ３抗体（０．００５μｇ／ｍｌ）または培地で、０日目に刺激した。３５日目に、光学顕微鏡下で、ｉ）抗ＣＤ３抗体およびｉｉ）培地で刺激した細胞は、ｉｉｉ）ＣＨ２８１１ｈＧ１で刺激した細胞を除き、全て死亡していた（倍率×２０）。 （Ｂ）３５日目での生存可能なＣＨ２８１１ｈＧ１で刺激したＴ細胞の表現型の分析。ＦＧ２８１１ｍＧ３＋細胞を表現型決定するために使用されるフローサイトメトリーのゲート戦略を表す連続パネル。ゲートは、ｉ）ＦＧ２８１１ｍＧ３＋およびｉｉ）ＦＧ２８１１ｍＧ３－細胞での分析のために描かれており；これらは、ＣＤ３およびＣＤ１２２の発現に関して確認された。さらにＣＤ３＋細胞を、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、およびＣＤ９５マーカーの発現について確認した（結果は、１名のドナーの代表である）。 （Ｃ）ＣＨ２８１１ｈＧ１で刺激したＴ細胞は、３５日目に、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて依然として生存可能であり、増殖能を維持した。３３日目に、生存可能なＣＨ２８１１ｈＧ１で刺激したＴ細胞を、プレートに結合したＣＨ２８１１ｈＧ１（５μｇ／ｍｌ）またはプレートに結合した抗ＣＤ３（０．００５μｇ／ｍｌ）および抗ＣＤ２８（５μｇ／ｍｌ）抗体の組み合わせで再刺激した。光学顕微鏡下で、ｉ）抗ＣＤ３／ＣＤ２８で再刺激したＴ細胞は、大量のＴ細胞の増殖を経て、３９日目にＴ細胞の芽細胞を形成し、ｉｉ）７０日目に、ＣＨ２８１１ｈＧ１で刺激した細胞は、依然として生存可能であり、有意なＴ細胞増殖を示した（倍率×１０および×２０）。 （Ｄ）ＩＬ－７およびＩＬ－２１は、ＣＨ２８１１ｈＧ１で刺激したＴ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの長期間の生存にとって重要な自立したサイトカインであり得る。ｉ）ＣＨ２８１１ｈＧ１およびｉｉ）抗ＣＤ３／ＣＤ２８で再刺激したＴ細胞における代表的なサイトカイン／ケモカイン発現レベル（ｐｇ／ｍｌ）。Ｔ細胞は、０日目にＣＨ２８１１で刺激し、次に、３３日目および６４日目にＣＨ２８１１ｈＧ１で再刺激するか、または３３日目に抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体で再刺激した。上清を、７、１１、１４、３９、５４、および７０日目に回収し、ＩＦＮγ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＩＬ－５、ＩＬ－７、ＩＬ－８、およびＴＮＦ－αの濃度（ｐｇ／ｍｌ）に関して評価した。三角形および矢印は、それぞれ２８１１およびＣＤ３／ＣＤ２８抗体で再刺激した日を表した。
【図16】マウス免疫細胞でのＳＳＥＡ－４の発現 ＨＨＤＩＩ／ＤＰ４マウスを安楽死させ、脾臓、腸間膜リンパ節および鼠径リンパ節を回収した。ｉ）脾細胞、ｉｉ）腸間膜リンパ節細胞、およびｉｉｉ）鼠径リンパ節細胞を、ＦＩＴＣで標識したＣＨ２８１１ｈＧ１抗体で染色し、フローサイトメトリー分析を使用して評価した。
【図17】ＦＧ２８１１ｍＧ１は、Ｃ５７／Ｂ６マウスにおいて表現型のＴＳＣＭ細胞を誘導した。 （Ａ）１６日目に、グループＡおよびＢに由来する脾細胞の細胞の総数を、トリパンブルー排除分析を使用して計算した。 （Ｂ）１６日目に、グループＡおよびＢに由来する個別のマウス由来の脾細胞を、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４４、ＣＤ６２Ｌ、ＳＣＡ－１、およびＣＨ２８１１ｈＧ１抗体で染色し、フローサイトメトリー分析を使用して評価した。 （Ｃ）１６日目に、グループＡおよびグループＢの脾細胞を、プレートに結合したＦＧ２８１１ｍＧ１（５μｇ／ｍｌ）と共に（Ａ＋２８１１およびＢ＋２８１１）、または伴わずに（Ａ－２８１１およびＢ－２８１１）培養し、２４日目に回収した。２４日目に、脾細胞を、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４４、ＣＤ６２Ｌ、ＳＣＡ－１、およびＣＨ２８１１ｈＧ１抗体で染色し、フローサイトメトリー分析を使用して評価した。 （Ｄ）２４、２７、および３０日目に、Ａ＋２８１１脾細胞を回収し、抗ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４４、ＣＤ６２Ｌ、ＳＣＡ－１、およびＣＨ２８１１ｈＧ１で染色し、フローサイトメトリー分析を使用して評価した。
【図18】ＨＨＤＩＩマウスおよびＨＨＤＩＩ／ＤＰ４マウスから直接ｅｘ ｖｉｖｏで表現型決定したＴｓｃｍ細胞。 ナイーブなＨＨＤＩＩマウスおよびＨＨＤＩＩ／ＤＰ４マウスを選別し、脾細胞を回収し、ＣＤ３、ＣＤ４４、ＣＤ６２Ｌ、ＳＣＡ－１、およびＣＨ２８１１ｈＧ２－ＰｅＣｙ７抗体で染色して、フローサイトメトリー分析を使用して評価した。 （Ａ）ＨＨＤＩＩマウス由来のｅｘ ｖｉｖｏで直接染色された脾細胞の代表的なフローサイトメトリープロット。 （Ｂ）ＨＨＤＩＩマウスから単離した脾細胞に対する表現型決定の結果の概要。 （Ｃ）ＨＨＤＩＩ／ＤＰ４マウス由来のｅｘ ｖｉｖｏで直接染色された脾細胞の代表的なフローサイトメトリープロット。 （Ｄ）ＨＨＤＩＩ／ＤＰ４マウスから単離した脾細胞に対する表現型決定の結果の概要。 （Ｅ）ＨＨＤＩＩ／ＤＰ４マウスから単離したＣＤ４Ｔ細胞およびＣＤ８Ｔ細胞に対する表現型決定の結果の概要。
【図19】マウス脾細胞は、プレートに結合したＦＧ２８１１ｍＧ１およびＦＧ２８１１ｈＧ１に応答して増殖する。 ナイーブなＨＨＤＩＩマウスを選別し、脾細胞を回収し、ｐａｎＴ細胞を多く含むように処理し、ＣＦＳＥで標識した。次に、ＣＦＳＥで標識したＴ細胞を、プレートに結合した２８１１マウスＩｇＧ１（５μｇ／ｍＬ）またはヒトＩｇＧ１（５μｇ／ｍｌ）または抗ＣＤ３（１μｇ／ｍｌ）を含むウェルにプレーティングし、３７℃でインキュベートした。７、１２、および１４日目に、細胞を、サンプルとして採取し、抗ＣＤ４および抗ＣＤ８で染色し、フローサイトメトリーにより分析した。 （Ａ）１２日目の、ＦＧ２８１１ｍＧ１およびＦＧ２８１１ｈＧ１に応答して増殖したＴ細胞の代表的なフローサイトメトリープロット。 （Ｂ）１２日目の、プレートに結合したＦＧ２８１１ｍＧ１、ＦＧ２８１１ｈＧ１、または抗ＣＤ３に応答して増殖した細胞の総パーセンテージ。 （Ｃ）１２日目の、プレートに結合したＦＧ２８１１ｍＧ１、ＦＧ２８１１ｈＧ１、または抗ＣＤ３に応答して増殖したＣＤ８Ｔ細胞の総パーセンテージ。 （Ｄ）１２日目の、プレートに結合したＦＧ２８１１ｍＧ１、ＦＧ２８１１ｈＧ１、または抗ＣＤ３に応答して増殖したＣＤ４Ｔ細胞の総パーセンテージ。
【図20】抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８は、エフェクターメモリー細胞の増殖を駆動するナイーブなＨＨＤＩＩマウス由来の幹細胞様の特性を有する細胞のｅｘ ｖｉｖｏでの増殖を誘導する。 ナイーブなＨＨＤＩＩマウスを選別し、脾細胞を回収し、ｐａｎＴ細胞を多く含むように処理し、ＣＦＳＥで標識した。次に、ＣＦＳＥで標識したＴ細胞を、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８（それぞれ１μｇ／ｍｌ）を含むウェルにプレーティングし、３７℃でインキュベートした。７、１２、および１４日目に、細胞を、サンプルとして採取し、抗ＣＤ４および抗ＣＤ８で染色し、フローサイトメトリーにより分析した。 （Ａ）１１、１５、および２０日目に、細胞を採取し、ＣＨ２８１１ｈＧ２－ＰｅＣｙ７および／または抗ＣＤ３で染色した。（ｉ）ＣＤ３＋細胞の２８１１＋細胞のパーセンテージ、（ｉｉ）ＣＤ３＋細胞のＣＦＳＥｌｏｗのパーセンテージ、（ｉｉｉ）２８１１＋細胞の数（１ｍＬあたり×１０４）、（ｉｖ）ＣＤ３＋Ｔ細胞の数（１ｍＬあたり×１０５）、（ｎ＝２つのウェル）。 （Ｂ）ＣＤ３／ＣＤ２８で刺激してから１１日後に染色した脾細胞の代表的なフローサイトメトリーのプロット。細胞は、抗ＣＤ３、ＣＤ４４、ＣＤ６２Ｌ、およびＣＨ２８１１ｈＧ２－ＰｅＣｙ７で染色し、フローサイトメトリー分析を使用して評価した。 （Ｃ）ＣＤ３／ＣＤ２８で刺激してから１１日後に、２８１１＋エフェクターメモリーＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターＴ細胞、およびナイーブＴ細胞の総数を決定した（ｎ＝２つのウェル）。 （Ｄ）ＣＤ３／ＣＤ２８で刺激してから１１日後に、２８１１＋エフェクターメモリーＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターＴ細胞、およびナイーブＴ細胞のパーセンテージを決定した（ｎ＝２つのウェル）。
【図21】ヒト２８１１ｈＧ２およびマウス２８１１ｍＧ１は、エフェクターメモリー細胞の増殖を駆動するナイーブなＨＨＤＩＩ／ＤＰ４マウス由来の幹細胞様の特性を有する細胞のｅｘ ｖｉｖｏでの増殖を誘導する。 ナイーブなＨＨＤＩＩ／ＤＰ４マウスを選別し、脾細胞を回収し、ｐａｎＴ細胞を多く含むように処理し、ＣＦＳＥで標識した。次に、ＣＦＳＥで標識したＴ細胞を、ＡＫＴｉを伴うかまたは伴うことなく、可溶性ヒトＩｇＧ２（５μｇ／ｍＬ）またはマウスＩｇＧ１ ２８１１ Ａｂ（５μｇ／ｍＬ）または抗ＣＤ３（１μｇ／ｍｌ）およびＣＤ２８を含むウェルにプレーティングし、これにより刺激し、細胞を３７℃でインキュベートした。１１および１５日目に、細胞をサンプルとして採取し、抗ＣＤ３、ＣＤ４４、ＣＤ６２Ｌ、ＳＣＡ １、およびＣＨ２８１１ｈＧ２－ＰｅＣｙ７で染色し、フローサイトメトリー分析を使用して評価した。 （Ａ）１１日目の、ＦＧ２８１１ｍＧ１および２８１１ｈＧ２に応答して増殖したＴ細胞の代表的なフローサイトメトリープロット（ｎ＝２つのウェル）。 （Ｂ）ＣＤ３／ＣＤ２８、ＦＧ２８１１ｍＧ１、または２８１１ｈＧ２で刺激してから１１日後に、２８１１＋エフェクターメモリーＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターＴ細胞、およびナイーブＴ細胞の総数を決定した（ｎ＝２つのウェル）。 （Ｃ）ＣＤ３／ＣＤ２８、ＦＧ２８１１ｍＧ１、または２８１１ｈＧ２で刺激してから１１日後に、２８１１＋エフェクターメモリーＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、およびエフェクターＴ細胞のパーセンテージを決定した（ｎ＝２つのウェル）。
【図22】抗ＣＤ３およびＣＤ２８は、健常なドナーから単離した２８１１＋細胞のｅｘ ｖｉｖｏでの増殖を誘導する。 ＰＢＭＣを、バフィーコートから単離し、ＰａｎＴ細胞を多く含むように処理し、２４ウェルプレートのウェルあたり約２×１０６個の細胞を、さらなるサイトカイン（ＩＬ－７またはＩＬ－２１）を伴うかまたは伴わずに、抗ＣＤ３／ＣＤ２８の存在下で２０日間インキュベートした。１５日目および２０日目に、細胞をサンプルとして採取し、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２２、ＣＤ９５、ＣＤ３、ＣＣＲ７、および２８１１ｈＧ Ｐｅ－Ｃｙ７で染色した。 （Ａ）２０日目の、抗ＣＤ３／ＣＤ２８での刺激に応答して増殖したＴ細胞を表現型決定した代表的なフローサイトメトリーのプロット（ｎ＝２つのウェル）。 （Ｂ）抗ＣＤ３／ＣＤ２８で刺激してから１５日目および２０日目後の、（ｉ）２８１１＋ＣＤ３＋Ｔ細胞のパーセンテージ、（ｉｉ）２８１１＋細胞の総数（×１０４／ｍＬ、ｎ＝２つのウェル）。
【図23】Ｔｓｃｍ細胞の頻度は、抗ＣＤ３／ＣＤ２８での刺激により増大する。 ＰＢＭＣを、バフィーコートから単離し、ＰａｎＴ細胞を多く含むように処理し、２４ウェルプレートのウェルあたり約２×１０６個の細胞を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８の存在下で２０日間インキュベートした。１５日目および２０日目に、細胞を採取し、ＴｓｃｍをＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ９５＋ＣＤ１２２ｌｏｗの発現により染色した。ＣＤ３Ｔ細胞集団におけるＴｓｃｍ細胞のパーセンテージ（ｉ）、２８１１＋でもあるＴｓｃｍ細胞のパーセンテージ（ｉｉ）、Ｔｓｃｍ ２８１１＋ＣＤ３＋細胞のパーセンテージ（ｉｉｉ）。
【図24】可溶性ＦＧ２８１１ｍＧ１は、Ｆｃ架橋を介してマウスＴ細胞を刺激し得る。 脾細胞を、ＨＨＤＩＩおよびＨＨＤＩＩ／ＦＤＰ４マウスから単離し、ＨＨＤＩＩマウスから回収した脾細胞からｐａｎＴ細胞を多く含むように処理した。ＨＨＤＩＩｐａｎＴ細胞およびＨＨＤＩＩ／ＤＰ４脾細胞をＣＦＳＥ標識した。ＣＦＳＥ標識したＴ細胞を、可溶性ＦＧ２８１１ｍＧ１、培地単独（陰性対照）およびＬＰＳ（陽性対照）を含む対照の存在下で、単独で培養するか、またはＨＨＤＩＩ／ＤＰ４脾細胞と１：１の比率で混合した。 （Ａ）（ｉ）１５日目の、ＦＧ２８１１ｍＧ１、ＬＰＳ、または培地単独の存在下で培養したＴ細胞の代表的なフローサイトメトリープロット。増殖した（ＣＦＳＥｌｏｗ）細胞および増殖しなかった（ＣＦＳＥｈｉｇｈ）細胞のＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞集団が示されている。 （ｉｉ）１５日目の、ＦＧ２８１１ｍＧ１、ＬＰＳ、または培地単独の存在下で脾細胞と培養したＴ細胞の代表的なフローサイトメトリープロット。増殖した（ＣＦＳＥｌｏｗ）細胞および増殖しなかった（ＣＦＳＥｈｉｇｈ）細胞のＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞集団が示されている。 （Ｂ）ＦＧ２８１１ｍＧ１、ＬＰＳ、または培地単独と、脾細胞を伴うかまたは伴わずに培養した場合のＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞の増殖性応答の概要。
【発明を実施するための形態】
【0121】
方法
細胞膜糖脂質の抽出
ＳＳＥＡ－３／４－ＬＭＴＫ細胞のペレット（５×１０７個の細胞）を、５００μｌのマンニトール／ＨＥＰＥＳバッファー（５０ｍＭのマンニトール、５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２、両方ともＳｉｇｍａ）に再懸濁し、それぞれ３０回３つの針（２３Ｇ、２５Ｇ、２７Ｇ）に通した。５μｌの１ＭのＣａＣｌ２を細胞に添加し、上記のようにそれぞれ３０回３つの針に通した。剪断された細胞を氷上で２０分間インキュベートした後、３，０００ｇで１５分間、室温にて回転させた。上清を回収し、４８，０００ｇで３０分間、４℃で回転させ、上清を廃棄した。ペレットを１ｍｌのメタノールに再懸濁した後、１ｍｌのクロロホルムに再懸濁し、回転させながら室温で３０分間インキュベートした。次に、このサンプルを、１，２００ｇで１０分間回転させて沈殿したタンパク質を除去した。細胞膜糖脂質を含む上清を回収し、－２０℃で保存した。
細胞膜糖脂質の抽出
ＳＳＥＡ－３／４－ＬＭＴＫ細胞のペレット（５×１０７個の細胞）を、５００μｌのマンニトール／ＨＥＰＥＳバッファー（５０ｍＭのマンニトール、５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２、両方ともＳｉｇｍａ）に再懸濁し、それぞれ３０回３つの針（２３Ｇ、２５Ｇ、２７Ｇ）に通した。５μｌの１ＭのＣａＣｌ２を細胞に添加し、上記のようにそれぞれ３０回３つの針に通した。剪断された細胞を氷上で２０分間インキュベートした後、３，０００ｇで１５分間、室温にて回転させた。上清を回収し、４８，０００ｇで３０分間、４℃で回転させ、上清を廃棄した。ペレットを１ｍｌのメタノールに再懸濁した後、１ｍｌのクロロホルムに再懸濁し、回転させながら室温で３０分間インキュベートした。次に、このサンプルを、１，２００ｇで１０分間回転させて沈殿したタンパク質を除去した。細胞膜糖脂質を含む上清を回収し、－２０℃で保存した。
【0122】
リポソームの調製
ＳＳＥＡ－３／４－ＬＭＴＫ細胞膜（ｐｍ）糖脂質抽出物（５×１０７個の細胞に相当）を、丸底フラスコにおいて総濃度１０ｍｇの脂質［コレステロール、ジセチルホスフェート（ＤＣＰ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）およびα－ＧａｌＣｅｒ］と、様々な比率で混合した（表２）。次に、脂質混合物を、ロータリーエバポレーターを使用して、溶媒が蒸発しフラスコの壁に均一な脂質の薄い膜を残すまで、６０℃で乾燥させた。フラスコを室温に冷却した後、１００μｌの無菌性ＰＢＳを添加した。フラスコの開口部をパラフィルムで覆い、次に、超音波槽に１０分間浸漬してリポソームを産生させた（クロロホルムおよびメタノールを用いる全ての作業は、ヒュームフードで行った）。
ＳＳＥＡ－３／４－ＬＭＴＫ細胞膜（ｐｍ）糖脂質抽出物（５×１０７個の細胞に相当）を、丸底フラスコにおいて総濃度１０ｍｇの脂質［コレステロール、ジセチルホスフェート（ＤＣＰ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）およびα－ＧａｌＣｅｒ］と、様々な比率で混合した（表２）。次に、脂質混合物を、ロータリーエバポレーターを使用して、溶媒が蒸発しフラスコの壁に均一な脂質の薄い膜を残すまで、６０℃で乾燥させた。フラスコを室温に冷却した後、１００μｌの無菌性ＰＢＳを添加した。フラスコの開口部をパラフィルムで覆い、次に、超音波槽に１０分間浸漬してリポソームを産生させた（クロロホルムおよびメタノールを用いる全ての作業は、ヒュームフードで行った）。
【0123】
免疫処置プロトコル
ＢＡＬＢ／ｃマウスは、６～８週齢であった（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ， ＵＫ）。免疫処置の前に、正常マウス血清（ＮＭＳ）を、陰性対照として使用するため、尾からの出血の抽出を介して回収し、－２０℃で保存した。マウスを、１ｍｌのインスリンシリンジ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， Ｓｐａｉｎ）を使用して、２週間間隔で、ＳＳＥＡ－３／４－ＬＭＴＫ細胞（１×１０６個の細胞／免疫処置／マウス）で腹腔内（ｉ．ｐ．）にて免疫処置した。第２の免疫処置から７日後に、さらにその後７日ごとに、抗血清を尾からの出血の抽出を介して回収し、ＩｇＧおよびＩｇＭの抗体応答に関してスクリーニングした。高い力価のＩｇＧ応答を得た後、動物を、ＳＳＥＡ－３／４－ＬＭＴＫ細胞（１×１０５個の細胞／免疫処置／マウス）を用いて静脈内（ｉ．ｖ．）にブーストし、５日後に屠殺した。
ＢＡＬＢ／ｃマウスは、６～８週齢であった（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ， ＵＫ）。免疫処置の前に、正常マウス血清（ＮＭＳ）を、陰性対照として使用するため、尾からの出血の抽出を介して回収し、－２０℃で保存した。マウスを、１ｍｌのインスリンシリンジ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， Ｓｐａｉｎ）を使用して、２週間間隔で、ＳＳＥＡ－３／４－ＬＭＴＫ細胞（１×１０６個の細胞／免疫処置／マウス）で腹腔内（ｉ．ｐ．）にて免疫処置した。第２の免疫処置から７日後に、さらにその後７日ごとに、抗血清を尾からの出血の抽出を介して回収し、ＩｇＧおよびＩｇＭの抗体応答に関してスクリーニングした。高い力価のＩｇＧ応答を得た後、動物を、ＳＳＥＡ－３／４－ＬＭＴＫ細胞（１×１０５個の細胞／免疫処置／マウス）を用いて静脈内（ｉ．ｖ．）にブーストし、５日後に屠殺した。
【0124】
ｍＡｂの作製
脾細胞の単離－マウスを安楽死させ、脾臓を取り出した。２５ゲージの針を使用して５ｍｌの血清フリー培地（ＲＰＭＩ １６４０）で洗浄した後、脾臓を無菌性の鉗子で優しく撹拌して、脾細胞を回収した。５ｍｌの脾細胞を無菌性の２５ｍｌの一般的なチューブ内に回収し、過剰な脂肪および結合組織を廃棄した。脾細胞を含む液量の合計を、血清フリー培地（ＲＰＭＩ １６４０）で２５ｍｌまで増大させ、１００ｇで１０分間遠心分離した。この上清を除去し、１ｍｌの培地および脾細胞を残し、次に５ｍｌの血清フリー培地（ＲＰＭＩ １６４０）に再懸濁し、バイアビリティの評価のため、トリパンブルー染色を用いて血球計算器を使用して計測した。
脾細胞の単離－マウスを安楽死させ、脾臓を取り出した。２５ゲージの針を使用して５ｍｌの血清フリー培地（ＲＰＭＩ １６４０）で洗浄した後、脾臓を無菌性の鉗子で優しく撹拌して、脾細胞を回収した。５ｍｌの脾細胞を無菌性の２５ｍｌの一般的なチューブ内に回収し、過剰な脂肪および結合組織を廃棄した。脾細胞を含む液量の合計を、血清フリー培地（ＲＰＭＩ １６４０）で２５ｍｌまで増大させ、１００ｇで１０分間遠心分離した。この上清を除去し、１ｍｌの培地および脾細胞を残し、次に５ｍｌの血清フリー培地（ＲＰＭＩ １６４０）に再懸濁し、バイアビリティの評価のため、トリパンブルー染色を用いて血球計算器を使用して計測した。
【0125】
ＮＳ０ミエローマ細胞と脾細胞の融合－洗浄した脾細胞を、２５ｍｌの一般的なチューブにおいて、健常なＮＳ０ミエローマ細胞と１：１０の比率（ＮＳ０：脾細胞；１×１０７：１×１０８個の細胞）で組み合わせ、３１７ｇで５分間遠心分離した。この上清を吸引し、組み合わせた細胞ペレットを、８００μｌのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に１分間にわたり穏やかかつ徐々に再懸濁した。細胞混合物を１分間優しく撹拌した後、１ｍｌの血清フリー培地（ＲＰＭＩ １６４０）を、撹拌し続けながら１分間にわたり添加した。さらに２０ｍｌの血清フリー培地（ＲＰＭＩ １６４０）を、撹拌し続けながら１分間にわたり添加した。次に、細胞混合物を３１７ｇで５分間遠心分離し、上清を除去し、細胞混合物を、１５ｍｌのハイブリドーマ培地［５００ｍｌのハイブリドーマ血清フリー培地（Ｇｉｂｃｏ）：１０ｍｌのＨＴ（ヒポキサンチンチミジン）上清（５０×Ｈｙｂｒｉ－Ｍａｘ；Ｓｉｇｍａ）：３１μｌ（３１μｇ）のメトトレキサート（１ｍｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）：２５ｍｌのハイブリドーマクローニング因子（Ｏｐｔｉ－Ｃｌｏｎｅ ＩＩ；ＭＰ）：５０ｍｌの濾過したＮＳ０ ｓｐｅｎｔ培地）に再懸濁した。細胞懸濁物を、９６ウェルの平底プレートを通して均等に播種し、細胞培養インキュベーター（５％のＣＯ２）において３７℃でインキュベートした。
【0126】
ＣＨ２８１１ｈＧ１の作製
総ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｐａｉｓｌｅｙ， ＵＫ）を製造社のプロトコルにしたがい使用して、５×１０６個のＦＧ２８１１ハイブリドーマ細胞から調製した。第１の鎖のｃＤＮＡを、第１の鎖のｃＤＮＡ合成キットおよびＡＭＶ逆転写酵素を製造社のプロトコルにしたがい使用して（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）、３μｇの総ＲＮＡから調製した。重鎖および軽鎖の可変領域のＰＣＲおよびシーケンシングは、Ｓｙｄ Ｌａｂｓ， Ｉｎｃ（Ｎａｔｉｃｋ， ＭＡ ０１７６０， ＵＳＡ）により行い、可変領域ファミリーの使用は、ＩＭＧＴデータベース（Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ． ２０１８）を使用して分析した。その後、ＦＧ２８１１可変領域を、ｈＩｇＧ１／κ二重発現ベクターｐＤＣＯｒｉｇ－ｈＩｇＧ１（Ｍｅｔｈｅｒｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ． ２００９）にクローニングし、配列をシーケンシングにより確認した。
総ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｐａｉｓｌｅｙ， ＵＫ）を製造社のプロトコルにしたがい使用して、５×１０６個のＦＧ２８１１ハイブリドーマ細胞から調製した。第１の鎖のｃＤＮＡを、第１の鎖のｃＤＮＡ合成キットおよびＡＭＶ逆転写酵素を製造社のプロトコルにしたがい使用して（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）、３μｇの総ＲＮＡから調製した。重鎖および軽鎖の可変領域のＰＣＲおよびシーケンシングは、Ｓｙｄ Ｌａｂｓ， Ｉｎｃ（Ｎａｔｉｃｋ， ＭＡ ０１７６０， ＵＳＡ）により行い、可変領域ファミリーの使用は、ＩＭＧＴデータベース（Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ． ２０１８）を使用して分析した。その後、ＦＧ２８１１可変領域を、ｈＩｇＧ１／κ二重発現ベクターｐＤＣＯｒｉｇ－ｈＩｇＧ１（Ｍｅｔｈｅｒｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ． ２００９）にクローニングし、配列をシーケンシングにより確認した。
【0127】
ｍＡｂの性質決定
ｍＡｂのアイソタイプ決定－Ｓｐｅｎｔハイブリドーマ血清フリー培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｓｃｏｔｌａｎｄ， ＵＫ）を回収し、１５０μｌをＰＢＳ １（ｗ／ｖ）％のＢＳＡにおいて１／１０に希釈し、次に、ｍｏｕｓｅ ｍＡｂ ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ ｔｅｓｔ ｋｉｔ（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ， Ｋｉｄｌｉｎｇｔｏｎ， ＵＫ）の展開チューブ（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｔｕｂｅ）の中へとピペッティングし、室温で３０秒間インキュベートした。このチューブを、短い時間ボルテックスにかけ、着色したマイクロ粒子溶液が完全に再懸濁したことを確保した。このチューブに、１つのアイソタイピング切片を、切片の無地の赤色の端部がチューブの底になるようにして５～１０分間入れた。この結果は、ｍＡｂの重鎖および軽鎖の組成を表す、切片のクラスまたはサブクラスのウインドウおよびκまたはλのウインドウの１つの文字の上に現れた青色のバンドを確認することにより解釈された。
ｍＡｂのアイソタイプ決定－Ｓｐｅｎｔハイブリドーマ血清フリー培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｓｃｏｔｌａｎｄ， ＵＫ）を回収し、１５０μｌをＰＢＳ １（ｗ／ｖ）％のＢＳＡにおいて１／１０に希釈し、次に、ｍｏｕｓｅ ｍＡｂ ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ ｔｅｓｔ ｋｉｔ（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ， Ｋｉｄｌｉｎｇｔｏｎ， ＵＫ）の展開チューブ（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｔｕｂｅ）の中へとピペッティングし、室温で３０秒間インキュベートした。このチューブを、短い時間ボルテックスにかけ、着色したマイクロ粒子溶液が完全に再懸濁したことを確保した。このチューブに、１つのアイソタイピング切片を、切片の無地の赤色の端部がチューブの底になるようにして５～１０分間入れた。この結果は、ｍＡｂの重鎖および軽鎖の組成を表す、切片のクラスまたはサブクラスのウインドウおよびκまたはλのウインドウの１つの文字の上に現れた青色のバンドを確認することにより解釈された。
【0128】
マウスｍＡｂの精製－２リットルのＳｐｅｎｔハイブリドーマ血清フリー培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｓｃｏｔｌａｎｄ， ＵＫ）を回収し、０．２％のアジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）を添加した。その後、ｓｐｅｎｔ培地を、Ｗｈａｔｍａｎろ紙を介して濾過し、次に０．２μｍのステリトップ（ｓｔｅｒｉｔｏｐ）フィルター（Ｓｉｇｍａ）を使用して濾過した。ＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ＨＰ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、製造社の推奨により、精製に使用した。ｍＡｂ結合バッファーは、ＰＢＳ－Ｔｒｉｓ ｐＨ７．０からなり、ｍＡｂは、Ｔｒｉｓ－Ｇｌｙｃｉｎｅ ｐＨ１２．０を使用して溶出した。ＩｇＧ ｍＡｂを含むフラクションを集め、１０ＭのＨＣｌを使用してｐＨを中性化し、ＰＢＳに対して一晩透析した後、アリコートし、－８０℃で保存した。
【0129】
一過性ｍＡｂの産生－ＦＧ２８１１ｍＧ１、ＣＨ２８１１ｈＧ１、およびＣＨ２８１１ｈＧ２ ｍＡｂを、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｇｉｂｃｏ， Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、Ｅｘｐｉ２９３（商標）細胞の一過性トランスフェクションにより入手した。懸濁液におけるＨＥＫ２９３細胞（１００ｍｌ、２×１０６個の細胞／ｍｌ）を、１００μｇのプラスミドＤＮＡでトランスフェクトし、トランスフェクションの後７日目に、条件付け培地を回収した。
【0130】
腫瘍細胞株
細胞株は、完全培養培地の定期的な交換および対数期増殖を維持するための分裂により、維持した。全ての細胞株は、定期的に、マイコプラズマの濃度に関して確認され、ショートタンデムリピート（ＳＴＲ）のプロファイリングを使用して立証された（表１）。
表１：がん細胞株。ＧＢＭ：多形神経膠芽腫
細胞株は、完全培養培地の定期的な交換および対数期増殖を維持するための分裂により、維持した。全ての細胞株は、定期的に、マイコプラズマの濃度に関して確認され、ショートタンデムリピート（ＳＴＲ）のプロファイリングを使用して立証された（表１）。
【表1】
【0131】
がん細胞株およびマウス線維芽細胞に対する抗体の結合
１×１０５個の細胞を、５０μｌの一次抗体（様々な濃度）と４℃で１時間インキュベートした。細胞を、２００μｌのＲＰＭＩ １０％のＦＣＳで洗浄し、１００ｇで５分間回転させた。上清を廃棄し、ＲＰＭＩ １０％のＦＣＳで１／１００に希釈した５０μｌのＦＩＴＣにコンジュゲートした抗マウス／抗ヒトまたはビオチンにコンジュゲートした抗マウス／抗ヒトのＩｇＧ／ＩｇＭ Ｆｃに特異的な抗体（Ｓｉｇｍａ）を、二次抗体として使用した。細胞を、暗室において４℃で１時間インキュベートした。細胞を、２００μｌのＲＰＭＩ １０％のＦＣＳで洗浄し、１００ｇで５分間回転させた。ＲＰＭＩ １０％のＦＣＳで１／１００に希釈した５０μｌのストレプトアビジン－ＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ）またはＳｔｒｅｐ－ＰｅＣｙ７（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、ビオチン化二次抗体を検出した。細胞を、２００μｌのＲＰＭＩ １０％のＦＣＳで洗浄し、１００ｇで５分間回転させた。細胞を、０．４％のホルムアルデヒドで固定し、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｆｃ－５００フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ， Ｈｉｇｈ Ｗｙｃｏｍｂｅ， ＵＫ）またはＭＡＣＳＱフローサイトメーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｂｉｓｌｅｙ， ＵＫ）で分析した。
１×１０５個の細胞を、５０μｌの一次抗体（様々な濃度）と４℃で１時間インキュベートした。細胞を、２００μｌのＲＰＭＩ １０％のＦＣＳで洗浄し、１００ｇで５分間回転させた。上清を廃棄し、ＲＰＭＩ １０％のＦＣＳで１／１００に希釈した５０μｌのＦＩＴＣにコンジュゲートした抗マウス／抗ヒトまたはビオチンにコンジュゲートした抗マウス／抗ヒトのＩｇＧ／ＩｇＭ Ｆｃに特異的な抗体（Ｓｉｇｍａ）を、二次抗体として使用した。細胞を、暗室において４℃で１時間インキュベートした。細胞を、２００μｌのＲＰＭＩ １０％のＦＣＳで洗浄し、１００ｇで５分間回転させた。ＲＰＭＩ １０％のＦＣＳで１／１００に希釈した５０μｌのストレプトアビジン－ＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ）またはＳｔｒｅｐ－ＰｅＣｙ７（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、ビオチン化二次抗体を検出した。細胞を、２００μｌのＲＰＭＩ １０％のＦＣＳで洗浄し、１００ｇで５分間回転させた。細胞を、０．４％のホルムアルデヒドで固定し、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｆｃ－５００フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ， Ｈｉｇｈ Ｗｙｃｏｍｂｅ， ＵＫ）またはＭＡＣＳＱフローサイトメーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｂｉｓｌｅｙ， ＵＫ）で分析した。
【0132】
全血に対する抗体結合
５０μｌの健常なドナーの全血を、５０μｌの一次抗体と４℃で１時間インキュベートした。血液を、１５０μｌのＲＰＭＩ １０％のＮＢＣＳで洗浄し、１００ｇで５分間回転させた。上清を廃棄し、５０μｌのＦＩＴＣにコンジュゲートした抗マウス／抗ヒトまたはビオチンにコンジュゲートした抗マウス／抗ヒトのＩｇＧ Ｆｃに特異的な抗体（Ｓｉｇｍａ；ＲＰＭＩ １０％のＮＢＣＳにおいて１／１００）を、二次抗体として使用して、細胞を、暗室において４℃で１時間インキュベートし、その後、１５０μｌのＲＰＭＩ １０％のＮＢＣＳで洗浄し、１００ｇで５分間回転させた。５０μｌのストレプトアビジン－ＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ；ＲＰＭＩ １０％のＮＢＣＳにおいて１／１００）またはストレプトアビジン－ＰＥ－Ｃｙ７（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；ＲＰＭＩ １０％のＮＢＣＳにおいて１／１００）を使用して、ビオチン化二次抗体を検出した。細胞を、暗室において４℃で１時間インキュベートし、その後２００μｌのＲＰＭＩ １０％のＮＢＣＳで洗浄し、１００ｇで５分間回転させた。上清を廃棄した後、５０μｌ／ウェルのＣａｌ－Ｌｙｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｐａｉｓｌｅｙ， ＵＫ）を使用し、次に、５００μｌ／ウェルの蒸留水を使用して、赤血球を溶解した。その後、血液を１００ｇで５分間回転させ、上清を廃棄し、細胞を５００μｌのＰＢＳに再懸濁した。サンプルは、ＦＣ－５００フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で分析した。生のデータを分析およびプロットするために、ＷｉｎＭＤＩ ２．９ソフトウェアを使用した。
５０μｌの健常なドナーの全血を、５０μｌの一次抗体と４℃で１時間インキュベートした。血液を、１５０μｌのＲＰＭＩ １０％のＮＢＣＳで洗浄し、１００ｇで５分間回転させた。上清を廃棄し、５０μｌのＦＩＴＣにコンジュゲートした抗マウス／抗ヒトまたはビオチンにコンジュゲートした抗マウス／抗ヒトのＩｇＧ Ｆｃに特異的な抗体（Ｓｉｇｍａ；ＲＰＭＩ １０％のＮＢＣＳにおいて１／１００）を、二次抗体として使用して、細胞を、暗室において４℃で１時間インキュベートし、その後、１５０μｌのＲＰＭＩ １０％のＮＢＣＳで洗浄し、１００ｇで５分間回転させた。５０μｌのストレプトアビジン－ＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ；ＲＰＭＩ １０％のＮＢＣＳにおいて１／１００）またはストレプトアビジン－ＰＥ－Ｃｙ７（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；ＲＰＭＩ １０％のＮＢＣＳにおいて１／１００）を使用して、ビオチン化二次抗体を検出した。細胞を、暗室において４℃で１時間インキュベートし、その後２００μｌのＲＰＭＩ １０％のＮＢＣＳで洗浄し、１００ｇで５分間回転させた。上清を廃棄した後、５０μｌ／ウェルのＣａｌ－Ｌｙｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｐａｉｓｌｅｙ， ＵＫ）を使用し、次に、５００μｌ／ウェルの蒸留水を使用して、赤血球を溶解した。その後、血液を１００ｇで５分間回転させ、上清を廃棄し、細胞を５００μｌのＰＢＳに再懸濁した。サンプルは、ＦＣ－５００フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で分析した。生のデータを分析およびプロットするために、ＷｉｎＭＤＩ ２．９ソフトウェアを使用した。
【0133】
糖脂質の結合のＴＬＣ分析
ＬＭＴＫおよびＳＳＥＡ－３／４－ＬＭＴＫ細胞膜脂質サンプルを、シリカプレート上にブロッティングし、クロロホルム（Ｓｉｇｍａ）／メタノール（Ｓｉｇｍａ）／蒸留水（体積により６０：３０：５）に２回展開し、その後、ヘキサン（Ｓｉｇｍａ）：ジエチルエーテル（Ｓｉｇｍａ）：酢酸（Ｓｉｇｍａ）（体積により８０：２０：１．５）に２回展開した。乾燥したプレートに、アセトンにおいて０．１％のポリイソブチルメタクリレート（Ｓｉｇｍａ）を噴霧した。空気乾燥させた後、プレートを、室温で１時間、ＰＢＳ ２（ｗ／ｖ）％のＢＳＡでブロッキングし、ＰＢＳ ２（ｗ／ｖ）％のＢＳＡに希釈した一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。次に、プレートをＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ ２（ｗ／ｖ）％のＢＳＡで１／１０００に希釈したビオチンにコンジュゲートした抗マウスＩｇＧ Ｆｃに特異的な二次抗体（Ｓｉｇｍａ）と、室温で１時間インキュベートした。その後、プレートを再度ＰＢＳで洗浄した後、ＰＢＳ ２（ｗ／ｖ）％のＢＳＡで１／１０００に希釈したＩＲＤｙｅ ８００ＣＷストレプトアビジン（ＬＩＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＵＫ）と、暗室において室温で１時間インキュベートした。その後、プレートをＰＢＳでさらに３回洗浄し、暗室において空気乾燥させた。脂質のバンドは、ＬＩＣＯＲ Ｏｄｙｓｓｅｙ ｓｃａｎｎｅｒを使用して可視化した。
ＬＭＴＫおよびＳＳＥＡ－３／４－ＬＭＴＫ細胞膜脂質サンプルを、シリカプレート上にブロッティングし、クロロホルム（Ｓｉｇｍａ）／メタノール（Ｓｉｇｍａ）／蒸留水（体積により６０：３０：５）に２回展開し、その後、ヘキサン（Ｓｉｇｍａ）：ジエチルエーテル（Ｓｉｇｍａ）：酢酸（Ｓｉｇｍａ）（体積により８０：２０：１．５）に２回展開した。乾燥したプレートに、アセトンにおいて０．１％のポリイソブチルメタクリレート（Ｓｉｇｍａ）を噴霧した。空気乾燥させた後、プレートを、室温で１時間、ＰＢＳ ２（ｗ／ｖ）％のＢＳＡでブロッキングし、ＰＢＳ ２（ｗ／ｖ）％のＢＳＡに希釈した一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。次に、プレートをＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ ２（ｗ／ｖ）％のＢＳＡで１／１０００に希釈したビオチンにコンジュゲートした抗マウスＩｇＧ Ｆｃに特異的な二次抗体（Ｓｉｇｍａ）と、室温で１時間インキュベートした。その後、プレートを再度ＰＢＳで洗浄した後、ＰＢＳ ２（ｗ／ｖ）％のＢＳＡで１／１０００に希釈したＩＲＤｙｅ ８００ＣＷストレプトアビジン（ＬＩＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＵＫ）と、暗室において室温で１時間インキュベートした。その後、プレートをＰＢＳでさらに３回洗浄し、暗室において空気乾燥させた。脂質のバンドは、ＬＩＣＯＲ Ｏｄｙｓｓｅｙ ｓｃａｎｎｅｒを使用して可視化した。
【0134】
（ＨＳＡとカップリングした）グリカンのＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡプレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｏｘｆｏｒｄ， ＵＫ）を、１００ｎｇ／ウェルのＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、フォルスマン、Ｇｌｏｂｏ－Ｈ、およびシアリル－Ｌｅｗｉｓｘ（ＳＬｅｘ）グリカン－ＨＳＡコンジュゲートで、４℃で一晩コーティングし、ＰＢＳ（Ｅｌｉｃｉｔｙｌ、Ｃｒｏｌｌｅｓ， Ｆｒａｎｃｅ）に再懸濁し、２００μｌ／ウェルのＰＢＳ ５（ｗ／ｖ）％のＢＳＡを用いて、室温で１時間ブロッキングし、次に、５０μｌ／ウェルの一次抗体（５μｇ／ｍｌ）とインキュベートした。一次抗体を、ＰＢＳ １（ｗ／ｖ）％のＢＳＡで１／５０００に希釈したビオチン化抗マウスＩｇＧまたは抗ラットＩｇＭ二次抗体（Ｓｉｇｍａ）を使用して検出した。ＰＢＳ １（ｗ／ｖ）％のＢＳＡで１／５０００に希釈したストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）コンジュゲート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とインキュベートし、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ；Ｓｉｇｍａ）で展開した後、プレートを、Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｆ５０を使用して４５０ｎｍで読み取った。
ＥＬＩＳＡプレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｏｘｆｏｒｄ， ＵＫ）を、１００ｎｇ／ウェルのＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、フォルスマン、Ｇｌｏｂｏ－Ｈ、およびシアリル－Ｌｅｗｉｓｘ（ＳＬｅｘ）グリカン－ＨＳＡコンジュゲートで、４℃で一晩コーティングし、ＰＢＳ（Ｅｌｉｃｉｔｙｌ、Ｃｒｏｌｌｅｓ， Ｆｒａｎｃｅ）に再懸濁し、２００μｌ／ウェルのＰＢＳ ５（ｗ／ｖ）％のＢＳＡを用いて、室温で１時間ブロッキングし、次に、５０μｌ／ウェルの一次抗体（５μｇ／ｍｌ）とインキュベートした。一次抗体を、ＰＢＳ １（ｗ／ｖ）％のＢＳＡで１／５０００に希釈したビオチン化抗マウスＩｇＧまたは抗ラットＩｇＭ二次抗体（Ｓｉｇｍａ）を使用して検出した。ＰＢＳ １（ｗ／ｖ）％のＢＳＡで１／５０００に希釈したストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）コンジュゲート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とインキュベートし、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ；Ｓｉｇｍａ）で展開した後、プレートを、Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｆ５０を使用して４５０ｎｍで読み取った。
【0135】
赤血球結合アッセイ
健常なドナーの赤血球を、ＰＢＳで３回洗浄し、充填された細胞容量の１０倍のＰＢＳに再懸濁した。次に、５０μｌの洗浄した赤血球を、５０μｌの一次抗体と３７℃で１時間インキュベートした。細胞を、１５０μｌのＰＢＳで洗浄し、１００ｇで５分間回転させた。上清を廃棄し、細胞を、ＰＢＳ １（ｗ／ｖ）％のＢＳＡで１／１００に希釈した５０μｌのＦＩＴＣにコンジュゲートした抗マウスＩｇＧ Ｆｃに特異的な二次抗体（Ｓｉｇｍａ）に再懸濁した。細胞を、暗室において３７℃で１時間インキュベートし、次に、１５０μｌのＰＢＳで洗浄し、１００ｇで５分間回転させた。上清を廃棄し、細胞を５００μｌのＰＢＳに再懸濁した。サンプルは、ＦＣ－５００フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）により分析した。生のデータを分析およびプロットするために、ＷｉｎＭＤＩ ２．９ソフトウェアを使用した。
健常なドナーの赤血球を、ＰＢＳで３回洗浄し、充填された細胞容量の１０倍のＰＢＳに再懸濁した。次に、５０μｌの洗浄した赤血球を、５０μｌの一次抗体と３７℃で１時間インキュベートした。細胞を、１５０μｌのＰＢＳで洗浄し、１００ｇで５分間回転させた。上清を廃棄し、細胞を、ＰＢＳ １（ｗ／ｖ）％のＢＳＡで１／１００に希釈した５０μｌのＦＩＴＣにコンジュゲートした抗マウスＩｇＧ Ｆｃに特異的な二次抗体（Ｓｉｇｍａ）に再懸濁した。細胞を、暗室において３７℃で１時間インキュベートし、次に、１５０μｌのＰＢＳで洗浄し、１００ｇで５分間回転させた。上清を廃棄し、細胞を５００μｌのＰＢＳに再懸濁した。サンプルは、ＦＣ－５００フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）により分析した。生のデータを分析およびプロットするために、ＷｉｎＭＤＩ ２．９ソフトウェアを使用した。
【0136】
赤血球の血球凝集アッセイ
４ｍｌの正常なドナーの全血を、ヘパリンチューブ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に回収した。全血を、無菌性の１５ｍｌのコニカルチューブに移し、無菌性ＰＢＳで洗浄した。洗浄した血液を、１００ｇで５分間遠心分離した。上清を吸引した。洗浄ステップは、２回反復した。最後の洗浄の後、血液細胞のペレットを無菌性ＰＢＳで希釈し、最終的な作業濃度の０．５％の赤血球を作製した。０．５％の赤血球５０μｌを９６ウェルのＵ底プレートの各ウェルに添加した。赤血球の上部に、一次抗体を５０μｌ／ウェルで添加し、室温で１時間か、または赤血球が凝集するまでインキュベートした。
４ｍｌの正常なドナーの全血を、ヘパリンチューブ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に回収した。全血を、無菌性の１５ｍｌのコニカルチューブに移し、無菌性ＰＢＳで洗浄した。洗浄した血液を、１００ｇで５分間遠心分離した。上清を吸引した。洗浄ステップは、２回反復した。最後の洗浄の後、血液細胞のペレットを無菌性ＰＢＳで希釈し、最終的な作業濃度の０．５％の赤血球を作製した。０．５％の赤血球５０μｌを９６ウェルのＵ底プレートの各ウェルに添加した。赤血球の上部に、一次抗体を５０μｌ／ウェルで添加し、室温で１時間か、または赤血球が凝集するまでインキュベートした。
【0137】
モノクローナル抗体の親和性分析
ＳＳＥＡ－４含有リポソームに対するＦＧ２８１１ｍＧ３ ｍＡｂの結合の動態パラメータを、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ， Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００， ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により決定した。Ｌ１センサーチップ（ＧＥ－ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、４０ｍＭのオクチルＤ－グルコシドであらかじめ条件付けし、次に、ＳＳＥＡ４含有リポソーム（６０００ＲＵ）でコーティングし、短いパルス（ｓｈｏｒｔ ｐｕｌｓｅ）のＮａＯＨ（１０ｍＭ）でゆるく結合したリポソームを除去した。参照フローセルは、ＳＳＥＡ－４を欠いたリポソームを使用したこと以外は同じ方法で処置した。両方のフローセルで、カバー度の度合いは、ＨＳＡ（０．１ｍｇ／ｍｌ）の注射がＲＵのわずかな増大（５０～６０ＲＵ）しか誘導しなかったためほぼ完全であった。両方のフローセルからのシグナルの安定化の後、増大する濃度（０．３ｎｍｏｌ／Ｌ～２００ｎｍｏｌ／Ｌ）のＦＧ２８１１ｍＧ３ ｍＡｂを注射し、その後、サイクル後に再生（１０ｍＭのグリシン、ｐＨ１．５）を行った。結合曲線を、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ４．１を使用して１：１（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）結合モデルに適合した。
ＳＳＥＡ－４含有リポソームに対するＦＧ２８１１ｍＧ３ ｍＡｂの結合の動態パラメータを、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ， Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００， ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により決定した。Ｌ１センサーチップ（ＧＥ－ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、４０ｍＭのオクチルＤ－グルコシドであらかじめ条件付けし、次に、ＳＳＥＡ４含有リポソーム（６０００ＲＵ）でコーティングし、短いパルス（ｓｈｏｒｔ ｐｕｌｓｅ）のＮａＯＨ（１０ｍＭ）でゆるく結合したリポソームを除去した。参照フローセルは、ＳＳＥＡ－４を欠いたリポソームを使用したこと以外は同じ方法で処置した。両方のフローセルで、カバー度の度合いは、ＨＳＡ（０．１ｍｇ／ｍｌ）の注射がＲＵのわずかな増大（５０～６０ＲＵ）しか誘導しなかったためほぼ完全であった。両方のフローセルからのシグナルの安定化の後、増大する濃度（０．３ｎｍｏｌ／Ｌ～２００ｎｍｏｌ／Ｌ）のＦＧ２８１１ｍＧ３ ｍＡｂを注射し、その後、サイクル後に再生（１０ｍＭのグリシン、ｐＨ１．５）を行った。結合曲線を、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ４．１を使用して１：１（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）結合モデルに適合した。
【0138】
ＦＧ２８１１ｍＧ３のグライコーム分析（Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｌｙｃｏｍｉｃｓ）
ＦＧ２８１１ｍＧ３抗体の微細な特異性を決定するために、抗体をＦＩＴＣで標識し、Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｌｙｃｏｍｉｃｓに送付した。ここでこれらを、６００以上の天然および合成のグリカンに対してスクリーニングした（ｃｏｒｅ Ｈ ｇｒｏｕｐ， ｖｅｒｓｉｏｎ ５．１）。アミノリンカーを含む合成および哺乳類のグリカンを、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）により活性化した顕微鏡のスライドガラス上にプリントし、アミド結合を形成した。プリントされたスライドを、５μｇ／ｍｌの抗体と室温で１時間インキュベートした後、結合を、Ａｌｅｘａ４８８にコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧで検出した。次に、スライドを乾燥させ、スキャンし、スクリーニングデータを、Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｌｙｃｏｍｉｃｓデータベースと比較した。
ＦＧ２８１１ｍＧ３抗体の微細な特異性を決定するために、抗体をＦＩＴＣで標識し、Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｌｙｃｏｍｉｃｓに送付した。ここでこれらを、６００以上の天然および合成のグリカンに対してスクリーニングした（ｃｏｒｅ Ｈ ｇｒｏｕｐ， ｖｅｒｓｉｏｎ ５．１）。アミノリンカーを含む合成および哺乳類のグリカンを、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）により活性化した顕微鏡のスライドガラス上にプリントし、アミド結合を形成した。プリントされたスライドを、５μｇ／ｍｌの抗体と室温で１時間インキュベートした後、結合を、Ａｌｅｘａ４８８にコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧで検出した。次に、スライドを乾燥させ、スキャンし、スクリーニングデータを、Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｌｙｃｏｍｉｃｓデータベースと比較した。
【0139】
ＣＳＦＥ Ｔ細胞増殖アッセイ
ＰＢＭＣの分離
全血（バフィーコート）を、国立血液サービス（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ）から入手するか、または健常なドナーからヘパリンリチウム（１０００単位／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ Ｈ０８７８）を含むシリンジに回収した。全血は、ＲＰＭＩ １６４０を用いて１：１の比率で希釈し、リンパ球分離培地（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ－１０７７；Ｓｉｇｍａ）上に層状化し、次に８００ｇで２５分間ブレーキをかけずに遠心分離した。遠心分離した後、血漿を上層の、バフィーコート層由来のＰＢＭＣから回収した。ＰＢＭＣをＲＰＭＩ １６４０で２回洗浄し、３１７ｇで５分間回転させた。ＰＢＭＣの数を計測し、細胞の、Ｔ細胞の単離に関する準備を完了させた。
ＰＢＭＣの分離
全血（バフィーコート）を、国立血液サービス（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ）から入手するか、または健常なドナーからヘパリンリチウム（１０００単位／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ Ｈ０８７８）を含むシリンジに回収した。全血は、ＲＰＭＩ １６４０を用いて１：１の比率で希釈し、リンパ球分離培地（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ－１０７７；Ｓｉｇｍａ）上に層状化し、次に８００ｇで２５分間ブレーキをかけずに遠心分離した。遠心分離した後、血漿を上層の、バフィーコート層由来のＰＢＭＣから回収した。ＰＢＭＣをＲＰＭＩ １６４０で２回洗浄し、３１７ｇで５分間回転させた。ＰＢＭＣの数を計測し、細胞の、Ｔ細胞の単離に関する準備を完了させた。
【0140】
純粋なＴ細胞の単離
全ての１×１０７個のＰＢＭＣを、４０μｌの冷却したＭＡＣＳバッファー［ＰＢＳ １（ｖ／ｖ）％のＦＣＳ １（ｖ／ｖ）％のＥＤＴＡ］（ＰＢＳ：Ｓｉｇｍａ Ｄ８５３７；ＦＣＳ：Ｓｉｇｍａ Ｆ９６６５および０．５Ｍ ｐＨ８ ＥＤＴＡ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に再懸濁した。次に、１０μｌのＰａｎＴ細胞ビオチン抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を、全ての１×１０７個の細胞に添加し、暗室において４℃で５分間インキュベートした。３０μｌの冷却したＭＡＣＳバッファーを全ての１×１０７個の細胞に添加した後、２０μｌのＰａｎＴ細胞のマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を全ての１×１０７個の細胞に添加し、暗室において４℃で１０分間インキュベートした。細胞をＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）に添加し、ＣＤ３の精製したＴ細胞を含む素通り画分を回収した。カラムに保持された細胞は、非Ｔ細胞であった。
全ての１×１０７個のＰＢＭＣを、４０μｌの冷却したＭＡＣＳバッファー［ＰＢＳ １（ｖ／ｖ）％のＦＣＳ １（ｖ／ｖ）％のＥＤＴＡ］（ＰＢＳ：Ｓｉｇｍａ Ｄ８５３７；ＦＣＳ：Ｓｉｇｍａ Ｆ９６６５および０．５Ｍ ｐＨ８ ＥＤＴＡ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に再懸濁した。次に、１０μｌのＰａｎＴ細胞ビオチン抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を、全ての１×１０７個の細胞に添加し、暗室において４℃で５分間インキュベートした。３０μｌの冷却したＭＡＣＳバッファーを全ての１×１０７個の細胞に添加した後、２０μｌのＰａｎＴ細胞のマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を全ての１×１０７個の細胞に添加し、暗室において４℃で１０分間インキュベートした。細胞をＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）に添加し、ＣＤ３の精製したＴ細胞を含む素通り画分を回収した。カラムに保持された細胞は、非Ｔ細胞であった。
【0141】
ＣＳＦＥの充填
精製したＴ細胞を、ＲＰＭＩ １６４０で洗浄し、細胞の数を計測した。細胞を、３１７ｇで５分間回転させ、上清を除去した。全ての１×１０７個の精製したＴ細胞を、１ｍｌのＰＢＳ １０％のＦＣＳに再懸濁した。ＣＳＦＥを、１８μｌのＤＭＳＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、次に、１．８ｍｌのＰＢＳ １０％のＦＣＳに溶解させた。次に、１１０μｌの希釈したＣＳＦＥを、全ての１×１０７個のＴ細胞に添加し、暗室において室温で５分間インキュベートした。ＣＳＦＥを充填した細胞を、ＰＢＳ １０％のＦＣＳで洗浄し、次に、１×１０６個の細胞／ｍｌで完全培地（ＲＰＭ１６４０ ２（ｖ／ｖ）％のＨｅｐｅｓ １（ｖ／ｖ）％のＬグルタミン １（ｖ／ｖ）％のペニシリン・ストレプトマイシン）１０％のドナーの血漿に再懸濁した。細胞（２ｍｌにおいて２×１０６個）を、ＣＨ２８１１ｈＧ１抗体（５μｇ／ｍｌ）、ＦＧ２８１１ｍＧ１（５μｇ／ｍｌ）、ＣＨ２８１１ｈＧ２抗体（５μｇ／ｍｌ）であらかじめコーティングされているか、または抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ ３；０．００５μｇ／ｍｌ）、抗ＣＤ３ｅ Ａｂ（１μｇ／ｍＬ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， １６－００３１－８５）、および抗ＣＤ２８ Ａｂ（１μｇ／ｍｌ ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ １６－０２８１－８５）、または培地単独を含む２４ウェルプレートの各ウェルに添加した。７、１１、および１４日目に細胞を回収し、ＣＤ３に対する関連する抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， １７－００３１）、ＳＣＡ－１に対する関連する抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ， １３０－１０２－３４３）、ＣＤ６２Ｌに対する関連する抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ， １３０－１０２－５４３）、ＣＤ４４に対する関連する抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ， １３０－１１６－４９５）、抗ＣＤ４－ＡＰＣ－７８０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ４７－００４９）、抗ＣＤ８－ＶｉｏＧｒｅｅｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ， １３０－１０２－８０５）、Ｔｉｍ３－ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， １３０－１１８－５６３）、またはＣＨ２８１１ｈＧ２－ＰｅＣｙ７（組織内、１：５０希釈）で染色し、次に、ＭＡＣＳＱフローサイトメーター（ＭＡＣＳＱＵＡＮＴ ａｎａｌｙｓｅｒ １０）を使用して分析した。
精製したＴ細胞を、ＲＰＭＩ １６４０で洗浄し、細胞の数を計測した。細胞を、３１７ｇで５分間回転させ、上清を除去した。全ての１×１０７個の精製したＴ細胞を、１ｍｌのＰＢＳ １０％のＦＣＳに再懸濁した。ＣＳＦＥを、１８μｌのＤＭＳＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、次に、１．８ｍｌのＰＢＳ １０％のＦＣＳに溶解させた。次に、１１０μｌの希釈したＣＳＦＥを、全ての１×１０７個のＴ細胞に添加し、暗室において室温で５分間インキュベートした。ＣＳＦＥを充填した細胞を、ＰＢＳ １０％のＦＣＳで洗浄し、次に、１×１０６個の細胞／ｍｌで完全培地（ＲＰＭ１６４０ ２（ｖ／ｖ）％のＨｅｐｅｓ １（ｖ／ｖ）％のＬグルタミン １（ｖ／ｖ）％のペニシリン・ストレプトマイシン）１０％のドナーの血漿に再懸濁した。細胞（２ｍｌにおいて２×１０６個）を、ＣＨ２８１１ｈＧ１抗体（５μｇ／ｍｌ）、ＦＧ２８１１ｍＧ１（５μｇ／ｍｌ）、ＣＨ２８１１ｈＧ２抗体（５μｇ／ｍｌ）であらかじめコーティングされているか、または抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ ３；０．００５μｇ／ｍｌ）、抗ＣＤ３ｅ Ａｂ（１μｇ／ｍＬ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， １６－００３１－８５）、および抗ＣＤ２８ Ａｂ（１μｇ／ｍｌ ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ １６－０２８１－８５）、または培地単独を含む２４ウェルプレートの各ウェルに添加した。７、１１、および１４日目に細胞を回収し、ＣＤ３に対する関連する抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， １７－００３１）、ＳＣＡ－１に対する関連する抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ， １３０－１０２－３４３）、ＣＤ６２Ｌに対する関連する抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ， １３０－１０２－５４３）、ＣＤ４４に対する関連する抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ， １３０－１１６－４９５）、抗ＣＤ４－ＡＰＣ－７８０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ４７－００４９）、抗ＣＤ８－ＶｉｏＧｒｅｅｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ， １３０－１０２－８０５）、Ｔｉｍ３－ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， １３０－１１８－５６３）、またはＣＨ２８１１ｈＧ２－ＰｅＣｙ７（組織内、１：５０希釈）で染色し、次に、ＭＡＣＳＱフローサイトメーター（ＭＡＣＳＱＵＡＮＴ ａｎａｌｙｓｅｒ １０）を使用して分析した。
【0142】
Ｌｕｍｉｎｅｘ［Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘ Ｍａｐ Ｋｉｔ－ヒト高感受性Ｔ細胞磁性ビーズパネル（９６ウェルプレートアッセイ）］
９ウェルの形式のアッセイを、製造社の推奨に基づきフィルタープレートで行った。合計で２００μｌのウォッシュバッファーを９６ウェルのフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の各ウェルに添加した。このプレートを密閉し、プレートシェーカー上にて室温で１０分間混合した。プレートを反転させ、ペーパータオル上でタッピングすることによりウォッシュバッファーを除去した。次に、各標準物質、対照、およびサンプル（ＣＳＦＥ増殖アッセイ由来の培養上清）２５μｌを各ウェルに添加し、２５μｌの血清マトリックスを、各標準物質および対照のウェルに添加し、２５μｌのアッセイバッファーを、各サンプルウェルに添加した。作業ビーズの混合物を、使用の直前にボルテックスした。次に、２５μｌの混合したビーズを各ウェルに添加した。次に、プレートを密閉し、アルミホイルで覆い、プレートシェーカー上で撹拌しながら（５００～８００ｒｐｍ）４℃で１６～１８時間インキュベートした。インキュベートの後、プレートを、６０秒間ハンドヘルドの磁石上で休ませ、次に、プレートを反転しペーパータオル上でタッピングすることにより、プレートから液体を除去した。毎回、プレートを、２００μｌのウォッシュバッファーで２回洗浄した。第２の洗浄の後、プレートの底を、ペーパータオル上でタッピングすることにより乾燥させ、２５μｌの検出抗体を各ウェルに添加した。次に、プレートを密閉し、アルミホイルで覆い、プレートシェーカー上で撹拌しながら室温で１時間インキュベートした。次に、２５μｌのストレプトアビジン－フィコエリトリンを、２５μｌの検出抗体を含む各ウェルに添加した。プレートを、室温でさらに３０分間振とうさせた。インキュベートの後、プレートを、ハンドヘルド磁石上で６０秒間休ませた後、プレートを反転させペーパータオル上でタッピングすることにより、プレートから液体を除去した。毎回、プレートを、２００μｌのウォッシュバッファーで２回洗浄した。次に、１５０μｌのｓｈｅａｔｈ ｆｌｕｉｄ（Ｌｕｍｉｎｅｘ）を各ウェルに添加した。ビーズを、プレートシェーカー上で５分間再懸濁させ、Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘ ３Ｄ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ， Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ）で読み取った。この器具は、分析物あたり少なくとも５０のビーズを回収するように設定した。生のデータは、平均蛍光強度（ＭＦＩ）として測定した。
９ウェルの形式のアッセイを、製造社の推奨に基づきフィルタープレートで行った。合計で２００μｌのウォッシュバッファーを９６ウェルのフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の各ウェルに添加した。このプレートを密閉し、プレートシェーカー上にて室温で１０分間混合した。プレートを反転させ、ペーパータオル上でタッピングすることによりウォッシュバッファーを除去した。次に、各標準物質、対照、およびサンプル（ＣＳＦＥ増殖アッセイ由来の培養上清）２５μｌを各ウェルに添加し、２５μｌの血清マトリックスを、各標準物質および対照のウェルに添加し、２５μｌのアッセイバッファーを、各サンプルウェルに添加した。作業ビーズの混合物を、使用の直前にボルテックスした。次に、２５μｌの混合したビーズを各ウェルに添加した。次に、プレートを密閉し、アルミホイルで覆い、プレートシェーカー上で撹拌しながら（５００～８００ｒｐｍ）４℃で１６～１８時間インキュベートした。インキュベートの後、プレートを、６０秒間ハンドヘルドの磁石上で休ませ、次に、プレートを反転しペーパータオル上でタッピングすることにより、プレートから液体を除去した。毎回、プレートを、２００μｌのウォッシュバッファーで２回洗浄した。第２の洗浄の後、プレートの底を、ペーパータオル上でタッピングすることにより乾燥させ、２５μｌの検出抗体を各ウェルに添加した。次に、プレートを密閉し、アルミホイルで覆い、プレートシェーカー上で撹拌しながら室温で１時間インキュベートした。次に、２５μｌのストレプトアビジン－フィコエリトリンを、２５μｌの検出抗体を含む各ウェルに添加した。プレートを、室温でさらに３０分間振とうさせた。インキュベートの後、プレートを、ハンドヘルド磁石上で６０秒間休ませた後、プレートを反転させペーパータオル上でタッピングすることにより、プレートから液体を除去した。毎回、プレートを、２００μｌのウォッシュバッファーで２回洗浄した。次に、１５０μｌのｓｈｅａｔｈ ｆｌｕｉｄ（Ｌｕｍｉｎｅｘ）を各ウェルに添加した。ビーズを、プレートシェーカー上で５分間再懸濁させ、Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘ ３Ｄ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ， Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ）で読み取った。この器具は、分析物あたり少なくとも５０のビーズを回収するように設定した。生のデータは、平均蛍光強度（ＭＦＩ）として測定した。
【0143】
ナイーブＴ細胞の単離
全血を、正常なドナーからヘパリンリチウム（１０００単位／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ Ｈ０８７８）を含むシリンジに回収した。全血は、ＲＰＭＩ １６４０を用いて１：１の比率で希釈し、リンパ球分離培地（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ－１０７７；Ｓｉｇｍａ）上に層状化した後、ブレーキをかけずに、８００ｇで２５分間遠心分離した。遠心分離の後、血漿を、バフィーコート層由来の上層のＰＢＭＣから回収した。ＰＢＭＣを、ＲＰＭＩ １６４０で２回洗浄し、３１７ｇで５分間回転させた。ＰＢＭＣの数を計測し、細胞の、ナイーブＴ細胞の単離の準備が完了した。全ての１×１０７個のＰＢＭＣを、４０μｌの冷却したＭＡＣＳバッファー［ＰＢＳ １（ｖ／ｖ）％のＦＣＳ １（ｖ／ｖ）％のＥＤＴＡ］（ＰＢＳ：Ｓｉｇｍａ Ｄ８５３７；ＦＣＳ：Ｓｉｇｍａ Ｆ９６６５および０．５Ｍ ｐＨ８ ＥＤＴＡ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に再懸濁した。次に、１０μｌのナイーブなＰａｎＴ細胞ビオチン抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を、全ての１×１０７個の細胞に添加し、暗室において４℃で５分間インキュベートした。３０μｌの冷却したＭＡＣＳバッファーを全ての１×１０７個の細胞に添加し、次に、２０μｌのナイーブなＰａｎＴ細胞のマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を、全ての１×１０７個の細胞に添加し、暗室において４℃で１０分間インキュベートした。細胞を、ＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）に添加し、ＣＤ３の精製したＴ細胞を含む素通り画分を回収した。カラムに保持された細胞は、非Ｔ細胞であった。ナイーブＴ細胞は、ＣＨ２８１１ｈＧ１、またはＣＤ９５／ＣＤ１２２抗体の組み合わせで３０分間染色した。細胞を、ＭＡＣＳバッファーで洗浄し、セルソーティングに進ませた。ＣＨ２８１１ｈＧ１＋およびＣＤ９５／ＣＤ１２２＋細胞を、ＲＮＡ ｐｒｏｔｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ）に選別し、－８０℃に保存した。
全血を、正常なドナーからヘパリンリチウム（１０００単位／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ Ｈ０８７８）を含むシリンジに回収した。全血は、ＲＰＭＩ １６４０を用いて１：１の比率で希釈し、リンパ球分離培地（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ－１０７７；Ｓｉｇｍａ）上に層状化した後、ブレーキをかけずに、８００ｇで２５分間遠心分離した。遠心分離の後、血漿を、バフィーコート層由来の上層のＰＢＭＣから回収した。ＰＢＭＣを、ＲＰＭＩ １６４０で２回洗浄し、３１７ｇで５分間回転させた。ＰＢＭＣの数を計測し、細胞の、ナイーブＴ細胞の単離の準備が完了した。全ての１×１０７個のＰＢＭＣを、４０μｌの冷却したＭＡＣＳバッファー［ＰＢＳ １（ｖ／ｖ）％のＦＣＳ １（ｖ／ｖ）％のＥＤＴＡ］（ＰＢＳ：Ｓｉｇｍａ Ｄ８５３７；ＦＣＳ：Ｓｉｇｍａ Ｆ９６６５および０．５Ｍ ｐＨ８ ＥＤＴＡ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に再懸濁した。次に、１０μｌのナイーブなＰａｎＴ細胞ビオチン抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を、全ての１×１０７個の細胞に添加し、暗室において４℃で５分間インキュベートした。３０μｌの冷却したＭＡＣＳバッファーを全ての１×１０７個の細胞に添加し、次に、２０μｌのナイーブなＰａｎＴ細胞のマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を、全ての１×１０７個の細胞に添加し、暗室において４℃で１０分間インキュベートした。細胞を、ＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）に添加し、ＣＤ３の精製したＴ細胞を含む素通り画分を回収した。カラムに保持された細胞は、非Ｔ細胞であった。ナイーブＴ細胞は、ＣＨ２８１１ｈＧ１、またはＣＤ９５／ＣＤ１２２抗体の組み合わせで３０分間染色した。細胞を、ＭＡＣＳバッファーで洗浄し、セルソーティングに進ませた。ＣＨ２８１１ｈＧ１＋およびＣＤ９５／ＣＤ１２２＋細胞を、ＲＮＡ ｐｒｏｔｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ）に選別し、－８０℃に保存した。
【0144】
サンプルの抽出およびクオリティコントロール
８つのＴ細胞のサンプルを、ＲＮＡ保護試薬に入れた。サンプル容量全体を、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ， Ｈｉｌｄｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して抽出した。抽出したＲＮＡサンプルは、量および完全性について、それぞれＮａｎｏＤｒｏｐ ８０００ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ Ｖ２．０（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ＵＳＡ）およびＥｕｋａｒｙｏｔｅ ＲＮＡ Ｐｉｃｏ Ｂｉｏａｎａｌｙｓｅｒ ｃｈｉｐと組み合わせたＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｓｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、評価した。サンプルは、７．４～１０のＲＩＮ（ＲＮＡ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ｎｕｍｂｅｒｓ）を伴う低レベルの分解、および平均１１０ｎｇの収率を呈した。
８つのＴ細胞のサンプルを、ＲＮＡ保護試薬に入れた。サンプル容量全体を、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ， Ｈｉｌｄｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して抽出した。抽出したＲＮＡサンプルは、量および完全性について、それぞれＮａｎｏＤｒｏｐ ８０００ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ Ｖ２．０（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ＵＳＡ）およびＥｕｋａｒｙｏｔｅ ＲＮＡ Ｐｉｃｏ Ｂｉｏａｎａｌｙｓｅｒ ｃｈｉｐと組み合わせたＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｓｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、評価した。サンプルは、７．４～１０のＲＩＮ（ＲＮＡ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ｎｕｍｂｅｒｓ）を伴う低レベルの分解、および平均１１０ｎｇの収率を呈した。
【0145】
ｃＤＮＡ合成
完全長のｃＤＮＡ分子を、ＳＭＡＲＴ－Ｓｅｑ（登録商標）ｖ４ Ｕｌｔｒａ（登録商標）Ｌｏｗ Ｉｎｐｕｔ ＲＮＡ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， ＣＡ， ＵＳＡ）を使用して、サンプルあたり１ｎｇの総ＲＮＡから作製した。ｃＤＮＡの量は、Ｑｕｂｉｔ（登録商標）２．０ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ， ＵＳＡ）を使用して測定し、質については、Ａｇｉｌｅｎｔ ２２００ Ｔａｐｅｓｔａｔｉｏｎおよびｈｉｇｈ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｄ５０００ ｓｃｒｅｅｎｔａｐｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して確認した。全てのサンプルは、十分な量のｃＤＮＡを呈し、分子の大きさは、４００～１０，０００ｂｐの範囲であった。
完全長のｃＤＮＡ分子を、ＳＭＡＲＴ－Ｓｅｑ（登録商標）ｖ４ Ｕｌｔｒａ（登録商標）Ｌｏｗ Ｉｎｐｕｔ ＲＮＡ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， ＣＡ， ＵＳＡ）を使用して、サンプルあたり１ｎｇの総ＲＮＡから作製した。ｃＤＮＡの量は、Ｑｕｂｉｔ（登録商標）２．０ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ， ＵＳＡ）を使用して測定し、質については、Ａｇｉｌｅｎｔ ２２００ Ｔａｐｅｓｔａｔｉｏｎおよびｈｉｇｈ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｄ５０００ ｓｃｒｅｅｎｔａｐｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して確認した。全てのサンプルは、十分な量のｃＤＮＡを呈し、分子の大きさは、４００～１０，０００ｂｐの範囲であった。
【0146】
ライブラリーの作製およびＲＮＡシーケンシング
シーケンシングライブラリーを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｎｅｘｔｅｒａ ＸＴ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＵＫ）を使用して調製し、ここではサンプルあたり１５０ｐｇのｃＤＮＡを投入した。１１サイクルの最終的なＰＣＲ増幅を行った。最終的なライブラリーは、Ｑｕｂｉｔ（登録商標）２．０ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ， ＵＳＡ）、およびｈｉｇｈ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｄ１０００ ｓｃｒｅｅｎｔａｐｅを伴うＡｇｉｌｅｎｔ ２２００ Ｔａｐｅｓｔａｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して定量化および定性化した。等モル量の各サンプルライブラリーを、ｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）５００ Ｍｉｄ－ｏｕｔｐｕｔ ｋｉｔを使用して行うシーケンシングのためにまとめて集め、７５ｂｐのペアエンドリードを作製した。
シーケンシングライブラリーを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｎｅｘｔｅｒａ ＸＴ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＵＫ）を使用して調製し、ここではサンプルあたり１５０ｐｇのｃＤＮＡを投入した。１１サイクルの最終的なＰＣＲ増幅を行った。最終的なライブラリーは、Ｑｕｂｉｔ（登録商標）２．０ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ， ＵＳＡ）、およびｈｉｇｈ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｄ１０００ ｓｃｒｅｅｎｔａｐｅを伴うＡｇｉｌｅｎｔ ２２００ Ｔａｐｅｓｔａｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して定量化および定性化した。等モル量の各サンプルライブラリーを、ｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）５００ Ｍｉｄ－ｏｕｔｐｕｔ ｋｉｔを使用して行うシーケンシングのためにまとめて集め、７５ｂｐのペアエンドリードを作製した。
【0147】
差次的な発現分析
ＦａｓｔＱＣ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂａｂｒａｈａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｆａｓｔｑｃ）を使用してクオリティの確認を行った後、７５ｂｐのペアエンドリードを、ＳＴＡＲ（ｖｅｒｓｉｏｎ ２．６．１ｄ）を使用してホモサピエンス参照ゲノムｈｇ１９に対してアライメントした。マッピングは、デフォルトパラメータを用いて行い、読み取りは、ＧｅｎｅＣｏｕｎｔｓで計測した。２８１１および同様にＣＤ９５／ＣＤ１２２を多く含むＴ細胞の差次的な発現分析（ＤＥ）を、ｅｄｇｅＲ ｐａｃｋａｇｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ ３．２２）、次にＢｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ多重検定の訂正を使用して、ＧＳＥ１１４７６５由来のＣＤ４およびＣＤ８のナイーブＴ細胞由来のデータセットを使用して行い（Ｐｉｌｉｐｏｗ ｅｔ ａｌ． ＪＣＩ ｉｎｓｉｇｈｔ ２０１８）、ＦＤＲ（ＦＤＲ＜０．０５）を確立した。Ｔ細胞のＤＥセット（ＣＤ８で２つ、ＣＤ４で２つ）の間に共通する遺伝子を、Ｖｅｎｎｙ ２．１を使用して同定し、ＳｔｅｍＣｈｅｃｋｅｒデータベースの入力として使用して、「幹細胞性」シグネチャーを同定した（Ｐｉｎｔｏ ｅｔ ａｌ． ２０１５）。
ＦａｓｔＱＣ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂａｂｒａｈａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｆａｓｔｑｃ）を使用してクオリティの確認を行った後、７５ｂｐのペアエンドリードを、ＳＴＡＲ（ｖｅｒｓｉｏｎ ２．６．１ｄ）を使用してホモサピエンス参照ゲノムｈｇ１９に対してアライメントした。マッピングは、デフォルトパラメータを用いて行い、読み取りは、ＧｅｎｅＣｏｕｎｔｓで計測した。２８１１および同様にＣＤ９５／ＣＤ１２２を多く含むＴ細胞の差次的な発現分析（ＤＥ）を、ｅｄｇｅＲ ｐａｃｋａｇｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ ３．２２）、次にＢｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ多重検定の訂正を使用して、ＧＳＥ１１４７６５由来のＣＤ４およびＣＤ８のナイーブＴ細胞由来のデータセットを使用して行い（Ｐｉｌｉｐｏｗ ｅｔ ａｌ． ＪＣＩ ｉｎｓｉｇｈｔ ２０１８）、ＦＤＲ（ＦＤＲ＜０．０５）を確立した。Ｔ細胞のＤＥセット（ＣＤ８で２つ、ＣＤ４で２つ）の間に共通する遺伝子を、Ｖｅｎｎｙ ２．１を使用して同定し、ＳｔｅｍＣｈｅｃｋｅｒデータベースの入力として使用して、「幹細胞性」シグネチャーを同定した（Ｐｉｎｔｏ ｅｔ ａｌ． ２０１５）。
【0148】
ＲＮＡｓｅｑを使用した転写のプロファイリング
８つのＴ細胞のサンプル（４つのＣＨ２８１１＋、４つのＣＤ１２２／ＣＤ９５＋）を、ＲＮＡ保護試薬で選別した。サンプル容量全体を、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ， Ｈｉｌｄｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して抽出した。抽出したＲＮＡサンプルは、量および完全性について、それぞれＮａｎｏＤｒｏｐ ８０００ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ Ｖ２．０（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ＵＳＡ）およびＥｕｋａｒｙｏｔｅ ＲＮＡ Ｐｉｃｏ Ｂｉｏａｎａｌｙｓｅｒ ｃｈｉｐと組み合わせたＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｓｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、評価した。サンプルは、７．４～１０のＲＩＮ（ＲＮＡ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ｎｕｍｂｅｒｓ）を伴う低レベルの分解および平均１１０ｎｇの収率を呈した。完全長のｃＤＮＡ分子を、ＳＭＡＲＴ－Ｓｅｑ（登録商標）ｖ４ Ｕｌｔｒａ（登録商標）Ｌｏｗ Ｉｎｐｕｔ ＲＮＡ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， ＣＡ， ＵＳＡ）を使用して、サンプルあたり１ｎｇの総ＲＮＡから作製した。ｃＤＮＡの量は、Ｑｕｂｉｔ（登録商標）２．０ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ， ＵＳＡ）を使用して測定し、質については、Ａｇｉｌｅｎｔ ２２００ Ｔａｐｅｓｔａｔｉｏｎおよびｈｉｇｈ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｄ５０００ ｓｃｒｅｅｎｔａｐｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して確認した。全てのサンプルは、十分な量のｃＤＮＡを呈し、分子の大きさは、４００～１０，０００ｂｐの範囲であった。シーケンシングライブラリーを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｎｅｘｔｅｒａ ＸＴ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＵＫ）を使用して調製し、ここではサンプルあたり１５０ｐｇのｃＤＮＡを投入した。１１サイクルの最終的なＰＣＲ増幅を行った。最終的なライブラリーは、Ｑｕｂｉｔ（登録商標）２．０ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ， ＵＳＡ）、およびｈｉｇｈ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｄ１０００ ｓｃｒｅｅｎｔａｐｅを伴うＡｇｉｌｅｎｔ ２２００ Ｔａｐｅｓｔａｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して定量化および定性化した。等モル量の各サンプルライブラリーを、ｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）５００ Ｍｉｄ－ｏｕｔｐｕｔ ｋｉｔを使用して行うシーケンシングのためにまとめて集め、７５ｂｐのペアエンドリードを作製した。ＦａｓｔＱＣ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂａｂｒａｈａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｆａｓｔｑｃ）を使用してクオリティの確認を行った後、７５ｂｐのペアエンドリードを、ＳＴＡＲ（ｖｅｒｓｉｏｎ ２．５．１ｂ）を使用してホモサピエンス参照ゲノム（Ｅｓｅｍｂｌ ａｓｓｅｍｂｌｙ ＧＲＣｈ３７（ｈｇ１９））に対してアライメントした。マッピングは、デフォルトパラメータを用いて行い、読み取りは、ＧｅｎｅＣｏｕｎｔｓで計測した。
８つのＴ細胞のサンプル（４つのＣＨ２８１１＋、４つのＣＤ１２２／ＣＤ９５＋）を、ＲＮＡ保護試薬で選別した。サンプル容量全体を、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ， Ｈｉｌｄｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して抽出した。抽出したＲＮＡサンプルは、量および完全性について、それぞれＮａｎｏＤｒｏｐ ８０００ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ Ｖ２．０（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ＵＳＡ）およびＥｕｋａｒｙｏｔｅ ＲＮＡ Ｐｉｃｏ Ｂｉｏａｎａｌｙｓｅｒ ｃｈｉｐと組み合わせたＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｓｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、評価した。サンプルは、７．４～１０のＲＩＮ（ＲＮＡ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ｎｕｍｂｅｒｓ）を伴う低レベルの分解および平均１１０ｎｇの収率を呈した。完全長のｃＤＮＡ分子を、ＳＭＡＲＴ－Ｓｅｑ（登録商標）ｖ４ Ｕｌｔｒａ（登録商標）Ｌｏｗ Ｉｎｐｕｔ ＲＮＡ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， ＣＡ， ＵＳＡ）を使用して、サンプルあたり１ｎｇの総ＲＮＡから作製した。ｃＤＮＡの量は、Ｑｕｂｉｔ（登録商標）２．０ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ， ＵＳＡ）を使用して測定し、質については、Ａｇｉｌｅｎｔ ２２００ Ｔａｐｅｓｔａｔｉｏｎおよびｈｉｇｈ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｄ５０００ ｓｃｒｅｅｎｔａｐｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して確認した。全てのサンプルは、十分な量のｃＤＮＡを呈し、分子の大きさは、４００～１０，０００ｂｐの範囲であった。シーケンシングライブラリーを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｎｅｘｔｅｒａ ＸＴ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＵＫ）を使用して調製し、ここではサンプルあたり１５０ｐｇのｃＤＮＡを投入した。１１サイクルの最終的なＰＣＲ増幅を行った。最終的なライブラリーは、Ｑｕｂｉｔ（登録商標）２．０ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ， ＵＳＡ）、およびｈｉｇｈ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｄ１０００ ｓｃｒｅｅｎｔａｐｅを伴うＡｇｉｌｅｎｔ ２２００ Ｔａｐｅｓｔａｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して定量化および定性化した。等モル量の各サンプルライブラリーを、ｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）５００ Ｍｉｄ－ｏｕｔｐｕｔ ｋｉｔを使用して行うシーケンシングのためにまとめて集め、７５ｂｐのペアエンドリードを作製した。ＦａｓｔＱＣ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂａｂｒａｈａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｆａｓｔｑｃ）を使用してクオリティの確認を行った後、７５ｂｐのペアエンドリードを、ＳＴＡＲ（ｖｅｒｓｉｏｎ ２．５．１ｂ）を使用してホモサピエンス参照ゲノム（Ｅｓｅｍｂｌ ａｓｓｅｍｂｌｙ ＧＲＣｈ３７（ｈｇ１９））に対してアライメントした。マッピングは、デフォルトパラメータを用いて行い、読み取りは、ＧｅｎｅＣｏｕｎｔｓで計測した。
【0149】
ＣＨ２８１１および同様にＣＤ９５／ＣＤ１２２を多く含む転写プロファイルの差次的な発現分析（ＤＥ）を、ｅｄｇｅＲ ｐａｃｋａｇｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ ３．２２）、次にＢｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ多重検定の訂正を使用して、ＧＳＥ８３８０８由来のＣＤ４およびＣＤ８のナイーブＴ細胞由来のデータセットを使用して行い（Ｈｏｓｏｋａｗａ ｅｔ ａｌ． ２０１７）、ＦＤＲ（ＦＤＲ＜０．０５）を確立した。Ｔ細胞のＤＥセット（ＣＤ８で２つ、ＣＤ４で２つ）の間に共通する遺伝子を、Ｖｅｎｎｙ ２．１を使用して同定し、ＳｔｅｍＣｈｅｃｋｅｒデータベースの入力として使用して、「幹細胞性」シグネチャーならびに造血幹細胞（ｈａｅｍａｔｏｐｏｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）（ＨＳＣ）および胚性幹細胞（ＥＳＣ）に関連する遺伝子セットとの重複を同定した（Ｐｉｎｔｏ ｅｔ ａｌ． ２０１５）。有意に多く含まれる遺伝子の分布は、ヒートマップ分析（ｈｔｔｐｓ：／／ｓｏｆｔｗａｒｅ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｍｏｒｐｈｅｕｓ／）を介して提示される。同時に、公開されているナイーブなＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞ならびにメモリーＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞（ＧＳＥ２３３２１）ならびに活性化したナイーブなＣＤ８Ｔ細胞（ＧＳＥ１１４７６５）と比較したＣＨ２８１１およびＣＤ９５／ＣＤ１２２を多く含むプロファイルでの、ＴｓｃｍおよびエフェクターＴの分化に関連する遺伝子の分布は、ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｓｄｓｔａｔｅ．ｅｄｕ／ｉｄｅｐ／を使用して可視化した。
【0150】
マウス試験
８～１２週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）、ＨＨＤＩＩ／ＨＬＡ－ＤＰ４（ＤＰ＊０４０１）マウス（ＥＭ：０２２２１， Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｕｓｅ Ｍｕｔａｎｔ Ａｒｃｈｉｖｅ）、ＨＨＤＩＩマウス（Ｐａｓｔｅｕｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を使用した。全ての作業は、内務省により承認されたプロジェクトライセンスの下行われた。６匹のマウスを、無作為に２つのグループ（グループＡおよびＢ）に分け、調査者に対し盲検は行わなかった。０日目に、エンドトキシンフリーのＦＧ２８１１ｍＧ１ ｍＡｂをグループＡのマウスに腹腔内経路（ｉ．ｐ．）を介して免疫処置した（２５０μｇ／マウス）。グループＢのマウスは、免疫処置を行わない対照グループとして使用した。１６日目に分析のため脾臓を回収し、次に、サンプルグループ内で脾細胞をまとめて集め、プレートに結合したＦＧ２８１１ｍＧ１抗体（５μｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下で再刺激した。２４、２７、および３０日目に、抗ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４４、ＣＤ６２Ｌ、ＳＣＡ－１、およびＣＨ２８１１ｈＧ１抗体を使用して、分析のため脾細胞を、培養物から回収した。
８～１２週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）、ＨＨＤＩＩ／ＨＬＡ－ＤＰ４（ＤＰ＊０４０１）マウス（ＥＭ：０２２２１， Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｕｓｅ Ｍｕｔａｎｔ Ａｒｃｈｉｖｅ）、ＨＨＤＩＩマウス（Ｐａｓｔｅｕｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を使用した。全ての作業は、内務省により承認されたプロジェクトライセンスの下行われた。６匹のマウスを、無作為に２つのグループ（グループＡおよびＢ）に分け、調査者に対し盲検は行わなかった。０日目に、エンドトキシンフリーのＦＧ２８１１ｍＧ１ ｍＡｂをグループＡのマウスに腹腔内経路（ｉ．ｐ．）を介して免疫処置した（２５０μｇ／マウス）。グループＢのマウスは、免疫処置を行わない対照グループとして使用した。１６日目に分析のため脾臓を回収し、次に、サンプルグループ内で脾細胞をまとめて集め、プレートに結合したＦＧ２８１１ｍＧ１抗体（５μｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下で再刺激した。２４、２７、および３０日目に、抗ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４４、ＣＤ６２Ｌ、ＳＣＡ－１、およびＣＨ２８１１ｈＧ１抗体を使用して、分析のため脾細胞を、培養物から回収した。
【0151】
染色マウス試験
ナイーブなＨＨＤＩＩ ＤＰ４マウスを使用した。全ての作業は、内務省により承認されたプロジェクトライセンスの下行われた。ナイーブなマウスから脾臓、腸間膜リンパ節、鼠径リンパ節、骨髄、および血液のサンプルを、分析のため回収した。組織は、ＣＨ２８１１ｈＧ２－ＰｅＣｙ７（組織内、１：５０希釈）、抗ＣＤ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， １７－００３１）、ＳＣＡ－１（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ， １３０－１０２－３４３）、ＣＤ６２Ｌ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ， １３０－１０２－５４３）、ＣＤ４４（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ， １３０－１１６－４９５）、抗ＣＤ４－ＡＰＣ－７８０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ４７－００４９）、抗ＣＤ８－ＶｉｏＧｒｅｅｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ， １３０－１０２－８０５）、およびＴｉｍ３－ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， １３０－１１８－５６３）とインキュベートした。
ナイーブなＨＨＤＩＩ ＤＰ４マウスを使用した。全ての作業は、内務省により承認されたプロジェクトライセンスの下行われた。ナイーブなマウスから脾臓、腸間膜リンパ節、鼠径リンパ節、骨髄、および血液のサンプルを、分析のため回収した。組織は、ＣＨ２８１１ｈＧ２－ＰｅＣｙ７（組織内、１：５０希釈）、抗ＣＤ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， １７－００３１）、ＳＣＡ－１（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ， １３０－１０２－３４３）、ＣＤ６２Ｌ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ， １３０－１０２－５４３）、ＣＤ４４（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ， １３０－１１６－４９５）、抗ＣＤ４－ＡＰＣ－７８０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ４７－００４９）、抗ＣＤ８－ＶｉｏＧｒｅｅｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ， １３０－１０２－８０５）、およびＴｉｍ３－ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， １３０－１１８－５６３）とインキュベートした。
【0152】
実施例
ここで本発明を、以下の実施例および添付の図面を参照してさらに記載する。
ここで本発明を、以下の実施例および添付の図面を参照してさらに記載する。
【0153】
実施例１．ＦＧ２８１１．７２の作製
ＦＧ２８１１ ｍＡｂの作製および性質決定
ＢＡＬＢ／ｃマウスを、３カ月間にわたり、ＳＳＥＡ－３／４発現細胞株（ＳＳＥＡ－３／４－ＬＭＴＫ）を用いて腹腔内（ｉ．ｐ．）に免疫処置し、静脈内（ｉ．ｖ．）にてブーストした。この細胞株は、野生型ＬＭＴＫマウス線維芽細胞にα－１－４－ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ａ４ＧＡＬＴ）、β－１－３－Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Ｂ３ＧＡＬＮＴ１）、およびβ－１－３－ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｂ３ＧＡＬＴ５）の遺伝子（Ｃｉｄ ｅｔ ａｌ． ２０１３）を形質導入することにより、産生させた。この細胞株は、ＳＳＥＡ－３グリカンの末端にシアル酸を付加し、ＳＳＥＡ－４を産生させる内因性シアリルトランスフェラーゼを有する（図１）。
ＦＧ２８１１ ｍＡｂの作製および性質決定
ＢＡＬＢ／ｃマウスを、３カ月間にわたり、ＳＳＥＡ－３／４発現細胞株（ＳＳＥＡ－３／４－ＬＭＴＫ）を用いて腹腔内（ｉ．ｐ．）に免疫処置し、静脈内（ｉ．ｖ．）にてブーストした。この細胞株は、野生型ＬＭＴＫマウス線維芽細胞にα－１－４－ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ａ４ＧＡＬＴ）、β－１－３－Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Ｂ３ＧＡＬＮＴ１）、およびβ－１－３－ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｂ３ＧＡＬＴ５）の遺伝子（Ｃｉｄ ｅｔ ａｌ． ２０１３）を形質導入することにより、産生させた。この細胞株は、ＳＳＥＡ－３グリカンの末端にシアル酸を付加し、ＳＳＥＡ－４を産生させる内因性シアリルトランスフェラーゼを有する（図１）。
【0154】
抗ＳＳＥＡ－４特異的ｍＡｂを作製するために、免疫処置したマウスの脾細胞を、ミエローマＮＳ０細胞と融合させた。スクリーニングおよび限界希釈のクローニングを数ラウンド反復した後、抗ＳＳＥＡ－４ ｍＡｂ、ＦＧ２８１１ｍＧ３を得た。
【0155】
ＳＳＥＡ－３およびＳＳＥＡ－４は、グロボ系列の糖脂質であることが知られている。ＦＧ２８１１ｍＧ３ ｍＡｂがＳＳＥＡ－３／４－ＬＭＴＫ細胞上で細胞表面糖脂質抗原を認識することを確認するために、ＳＳＥＡ－３／４－ＬＭＴＫ細胞膜脂質抽出物の高速薄層クロマトグラフィー（ＨＰＴＬＣ）分析およびＦＧ２８１１ｍＧ３ ｍＡｂでの免疫染色を行った（図４Ａ）。ＭＣ６３１ ｍＡｂ（市販の抗ＳＳＥＡ－３ ｍＡｂ）およびＭＣ８１３ ｍＡｂ（市販の抗ＳＳＥＡ－４ ｍＡｂ）を、比較として含め、野生型のＬＭＴＫ細胞を、陰性対照細胞株として使用した。ＦＧ２８１１ｍＧ３およびＭＣ６３１ ｍＡｂは、ＳＳＥＡ－３／４－ＬＭＴＫ細胞で発現した糖脂質を染色したが、野生型ＬＭＴＫ細胞を染色しなかった。ＦＧ２８１１ｍＧ３ ｍＡｂは非常に特異的な糖脂質染色を示したが、ＭＣ６３１は、３つの異なる糖脂質抗原を染色し、ＭＣ６３１ ｍＡｂはＳＳＥＡ－３／４－ＬＭＴＫ細胞で発現した他の２つの糖脂質抗原と交差反応することが示唆された。ＭＣ８１３は、ＳＳＥＡ－３／４－ＬＭＴＫ細胞およびＬＭＴＫ細胞の両方に由来する糖脂質を染色することができず、これは恐らくＳＳＥＡ－４抗原に対する自身の低い親和性によるものであり得る。その後の細胞表面抗原結合により、ＳＳＥＡ－３／４－ＬＭＴＫ細胞表面抗原に対する結合は、ＭＣ６３１（ラットＩｇＭ；Ｇｍ：５５．９３）が最も強く、次いでＦＧ２８１１ｍＧ３（マウスＩｇＧ３；Ｇｍ：２０．７７）およびＭＣ８１３（マウスＩｇＧ１；８．７７）のｍＡｂであることが示された（図４Ｂ）。二次抗体単独（Ｇｍ：０．３４）は、陰性対照として使用した。次に、ＥＬＩＳＡアッセイを行い、ＨＳＡとカップリングしたＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、Ｇｌｏｂｏ－Ｈ、フォルスマン、およびシアリル－Ｌｅｗｉｓｘグリカンに対しＦＧ２８１１ｍＧ３ ｍＡｂをスクリーニングした（図４Ｃ）。ＥＬＩＳＡからの結果は、ＦＧ２８１１ｍＧ３ ｍＡｂがＳＳＥＡ－４グリカンに特異的（１．２ＯＤ単位）であり、Ｍ１／８７ ｍＡｂがフォルスマングリカンに特異的（１．１ＯＤ単位）であることを示した。対照的に、ＭＣ６３１およびＭＣ８１３は両方とも、他のグリカンと交差反応した。ＭＣ６３１ ｍＡｂは、ＳＳＥＡ－３（１．０ＯＤ単位）、ＳＳＥＡ－４（１．０ＯＤ単位）およびＧｌｏｂｏ－Ｈ（０．５ＯＤ単位）のグリカンを認識した。ＭＣ８１３ ｍＡｂは、ＳＳＥＡ－３（０．８ＯＤ単位）、ＳＳＥＡ－４（１．２ＯＤ単位）およびフォルスマン（０．７ＯＤ単位）に結合した。ＦＧ２８１１ｍＧ３は、微細な特異性を決定するために、６００以上の天然および合成のグリカンに対して、Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｌｙｃｏｍｉｃｓ（ＣＦＧ）によりスクリーニングがなされ、ＦＧ２８１１ｍＧ３のみがＳＳＥＡ－４グリカンに結合し、ＳＳＥＡ－４に対するその特異性が確認された（図４Ｄ）。
【0156】
ＦＧ２８１１ｍＧ３ ｍＡｂのＳＳＥＡ－３／４－ＬＭＴＫ細胞膜脂質抗原結合動態を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ；Ｂｉａｃｏｒｅ Ｘ）を使用して試験した。結合曲線の適合は、２８１１ ｍＡｂに関する速い結合速度（約１０５ １／Ｍｓ）および遅い解離速度（約１０－４ １／ｓ）を有する強力で明確な機能的な親和性（Ｋｄ 約２×１０－９Ｍ）を明らかにした（図５Ａ）。これは、ＳＳＥＡ－３／４－ＬＭＴＫ細胞膜脂質のＥＬＩＳＡ由来のＥＣ５０値（ＥＣ５０＝６．８×１０－１０Ｍ）（図５Ｂ）および細胞の機能的な結合活性（Ｋｄ＝５×１０－９Ｍ）（図５Ｃ）と一致していた。
【0157】
実施例２．ＦＧ２８１１抗体配列
ＤＮＡシーケンシングは、ＦＧ２８１１ｍＧ３ ｍＡｂがＩＧＨＶ２－３＊０１重鎖およびＩＧＫＶ４－６３＊０１軽鎖の遺伝子ファミリーに属していることを明らかにした（図２ＡおよびＢ）。変異の評価は、ＦＧ２８１１重鎖と生殖系列配列との間に９ヌクレオチドの差異を示し、ここでアミノ酸残基では５つ変化があった。同様に、ＦＧ２８１１κ鎖と生殖系列配列との間に７ヌクレオチドの差異があり、アミノ酸残基においては結果として５つの変化があった。変異の性質およびパターンは、体細胞の高頻度変異および親和性の変異を示唆している。
ＤＮＡシーケンシングは、ＦＧ２８１１ｍＧ３ ｍＡｂがＩＧＨＶ２－３＊０１重鎖およびＩＧＫＶ４－６３＊０１軽鎖の遺伝子ファミリーに属していることを明らかにした（図２ＡおよびＢ）。変異の評価は、ＦＧ２８１１重鎖と生殖系列配列との間に９ヌクレオチドの差異を示し、ここでアミノ酸残基では５つ変化があった。同様に、ＦＧ２８１１κ鎖と生殖系列配列との間に７ヌクレオチドの差異があり、アミノ酸残基においては結果として５つの変化があった。変異の性質およびパターンは、体細胞の高頻度変異および親和性の変異を示唆している。
【0158】
ＦＧ２８１１の重鎖および軽鎖の可変領域を、マウスＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２およびＩｇＧ１の発現ベクターにクローニングした（図２Ｃ～Ｅ）。これを、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、抗体をプロテインＧで精製した。ｍＩｇＧ３、ｍＩｇＧ１、ｈＩｇＧ１、およびｈＩｇＧ２ ｍａｂは、ＳＳＥＡ３／４ ＬＭＴＫ細胞株に結合した（図３）。
【0159】
実施例３．ヒトがん細胞株のパネルに対する２８１１の結合
ＳＳＥＡ－４の過剰発現が、ＭＣ８１３ ｍＡｂにより定義されるように、神経膠芽腫がん細胞株で報告されている。よって、脳がん細胞株のパネルを、５μｇ／ｍｌのＦＧ２８１１ｍＧ３およびＭＣ８１３ ｍＡｂの両方を使用して、ＳＳＥＡ－４の発現に関してフローサイトメトリー分析により評価した（図６Ａ）。マウスＩｇＧ３κアイソタイプ対照および培地単独（一次抗体なし）を、陰性対照として使用した。がん細胞株Ｕ２５１およびＵ８７は、成年ＧＢＭ細胞であり、ＳＦ１８８およびＫＮＳ４２は、小児ＧＢＭ細胞であり、ＵＷ２２８３およびＤＡＯＹは、髄質芽細胞腫がん細胞である。ＦＧ２８１１ｍＧ３は、ＤＡＯＹ（Ｇｍ：５０）およびＵＷ２２８３（Ｇｍ：３６）に弱く結合するが、他のがん細胞株と結合しなかった。対照的に、ＭＣ８１３は、Ｕ２５１（Ｇｍ：２７）およびＵ８７（Ｇｍ：３８）に弱く結合し、ＤＡＯＹ（Ｇｍ：１６９）およびＵＷ２２８３（Ｇｍ：１５２）に強く結合し、ＫＮＳ４２およびＳＦ１８８に結合しなかった。ＭＣ８１３抗体の低い特異性により、この結果は、ＳＳＥＡ－４の発現がＤＡＯＹ細胞株およびＵ２５１細胞株でみ見出され得、この発現レベルは低いことを示唆している。卵巣細胞、乳房細胞、および結腸直腸細胞から構成されるがん細胞株のパネルに対するＦＧ２８１１ｍＧ３抗体の結合を、ＦＡＣＳによりさらに評価した（図６Ｂ）。ＦＧ２８１１ｍＧ３は、ＳＫＯＶ３（Ｇｍ：２０３）に強く結合し、Ｔ４７Ｄ（Ｇｍ：９５）およびＭＣＦ７（Ｇｍ：７６）に中程度に結合し、ＩＧＲＯＶ１（Ｇｍ：４１）およびＯＶＣＡＲ－５（Ｇｍ：８７）に弱く結合し、ＤＵ４４７５（Ｇｍ：２６）、ＨＣＣ１１８７（Ｇｍ：２２）、Ｃｏｌｏ２０５（Ｇｍ：１３）、およびＨＣＴ１５（Ｇｍ：２２）に結合しなかった。
ＳＳＥＡ－４の過剰発現が、ＭＣ８１３ ｍＡｂにより定義されるように、神経膠芽腫がん細胞株で報告されている。よって、脳がん細胞株のパネルを、５μｇ／ｍｌのＦＧ２８１１ｍＧ３およびＭＣ８１３ ｍＡｂの両方を使用して、ＳＳＥＡ－４の発現に関してフローサイトメトリー分析により評価した（図６Ａ）。マウスＩｇＧ３κアイソタイプ対照および培地単独（一次抗体なし）を、陰性対照として使用した。がん細胞株Ｕ２５１およびＵ８７は、成年ＧＢＭ細胞であり、ＳＦ１８８およびＫＮＳ４２は、小児ＧＢＭ細胞であり、ＵＷ２２８３およびＤＡＯＹは、髄質芽細胞腫がん細胞である。ＦＧ２８１１ｍＧ３は、ＤＡＯＹ（Ｇｍ：５０）およびＵＷ２２８３（Ｇｍ：３６）に弱く結合するが、他のがん細胞株と結合しなかった。対照的に、ＭＣ８１３は、Ｕ２５１（Ｇｍ：２７）およびＵ８７（Ｇｍ：３８）に弱く結合し、ＤＡＯＹ（Ｇｍ：１６９）およびＵＷ２２８３（Ｇｍ：１５２）に強く結合し、ＫＮＳ４２およびＳＦ１８８に結合しなかった。ＭＣ８１３抗体の低い特異性により、この結果は、ＳＳＥＡ－４の発現がＤＡＯＹ細胞株およびＵ２５１細胞株でみ見出され得、この発現レベルは低いことを示唆している。卵巣細胞、乳房細胞、および結腸直腸細胞から構成されるがん細胞株のパネルに対するＦＧ２８１１ｍＧ３抗体の結合を、ＦＡＣＳによりさらに評価した（図６Ｂ）。ＦＧ２８１１ｍＧ３は、ＳＫＯＶ３（Ｇｍ：２０３）に強く結合し、Ｔ４７Ｄ（Ｇｍ：９５）およびＭＣＦ７（Ｇｍ：７６）に中程度に結合し、ＩＧＲＯＶ１（Ｇｍ：４１）およびＯＶＣＡＲ－５（Ｇｍ：８７）に弱く結合し、ＤＵ４４７５（Ｇｍ：２６）、ＨＣＣ１１８７（Ｇｍ：２２）、Ｃｏｌｏ２０５（Ｇｍ：１３）、およびＨＣＴ１５（Ｇｍ：２２）に結合しなかった。
【0160】
実施例４．２８１１ ｍＡｂの細胞傷害性
ＡＤＣＣを介して腫瘍細胞死を誘導するＦＧ２８１１ｍＧ３ ｍＡｂの特性を調査した（図７Ａ）。ヒトＰＢＭＣを、エフェクター細胞の供給源として使用し、ＳＫＯＶ３細胞およびＴ４７Ｄ細胞を、標的細胞として扱った。ＦＧ２８１１ｍＧ３ ｍＡｂにより殺滅された細胞の数を、３７℃で１８時間のインキュベーションの後に測定した。卵巣がん細胞のＳＫＯＶ３（ＥＣ５０：１０－１０Ｍ）は、濃度依存的な方法でＦＧ２８１１ｍＧ３ ｍＡｂの殺滅の影響を受けやすく、最大６６％の細胞溶解を示した。ＦＧ２８１１ｍＧ３ ｍＡｂはＴ４７Ｄに結合したにも関わらず、このｍＡｂはＡＤＣＣを介してＴ４７Ｄ細胞の殺滅を誘導できず、この殺滅効果がＳＳＥＡ－４の発現レベルに依存していることが示唆された。ＣＤＣは、ｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍細胞の排除に関与する重要な機構であることが知られている。補体の供給源としてのヒト血清の存在下または非存在下でＦＧ２８１１ｍＧ３ ｍＡｂにより誘導されるＣＤＣにより殺滅されるＳＫＯＶ３細胞およびＴ４７Ｄ細胞の特性をアッセイした（図７Ｂ）。ＦＧ２８１１ｍＧ３ ｍＡｂは、ＳＫＯＶ３（ＥＣ５０：１０－９Ｍ）細胞の最大４８％の細胞溶解を示した。ＦＧ２８１１ｍＧ３は、ＣＤＣを介してもまたＴ４７Ｄ細胞の殺滅を誘導しなかった。ＦＧ２８１１ｍＧ３ ｍＡｂが腫瘍細胞に直接的な殺滅を誘導し得るかどうかを調査するために、ＰＩの取り込みアッセイを、ＳＳＥＡ－３／４－ＬＭＴＫ細胞およびＳＫＯＶ３細胞を用いて３０μｇ／ｍｌのＦＧ２８１１ｍＧ３ ｍＡｂを使用することにより行った（図７Ｃ）。過酸化水素および培地単独は、それぞれ陽性対照および陰性対照として含めた。ＦＧ２８１１ｍＧ３ ｍＡｂは、ＳＳＥＡ－３／４－ＬＭＴＫで、７４．７％のＰＩの取り込みを誘導し、ＳＫＯＶ－３細胞で２８．６％と弱く誘導した。ＰＩアッセイが真に増殖する細胞の細胞死を反映していることを確認するために、３０μｇ／ｍｌのＦＧ２８１１ｍＧ３ ｍＡｂで処置したＳＳＥＡ－３／４－ＬＭＴＫ細胞およびＳＫＯＶ３細胞の細胞バイアビリティを、光学顕微鏡下で評価した（図７Ｄ）。ＬＭＴＫの野生型の細胞および培地単独（ＲＰＭＩ）で処置した細胞を、陰性対照として使用した。ＳＳＥＡ－３／４－ＬＭＴＫ細胞は、ＦＧ２８１１ｍＧ３ ｍＡｂを添加してから数秒以内に凝集することが観察された。しかしながら、この現象は、ＳＫＯＶ３細胞およびＬＭＴＫ細胞をＦＧ２８１１ｍＧ３ ｍＡｂとインキュベートした場合には発達しなかった。ＦＧ２８１１ｍＧ３で処置したＳＳＥＡ－３／４－ＬＭＴＫ細胞およびＳＫＯＶ３細胞は、７２時間のｍＡｂの添加の後に増殖阻害のエビデンスを示した。ＦＧ２８１１ｍＧ３ ｍＡｂは、ＬＭＴＫ細胞に関する作用を示さなかった。培地単独とインキュベートした細胞は、増殖阻害を示さず、７２時間のインキュベーション期間にわたりいくつかの細胞死を伴い１００％のコンフルエントを達成した。
ＡＤＣＣを介して腫瘍細胞死を誘導するＦＧ２８１１ｍＧ３ ｍＡｂの特性を調査した（図７Ａ）。ヒトＰＢＭＣを、エフェクター細胞の供給源として使用し、ＳＫＯＶ３細胞およびＴ４７Ｄ細胞を、標的細胞として扱った。ＦＧ２８１１ｍＧ３ ｍＡｂにより殺滅された細胞の数を、３７℃で１８時間のインキュベーションの後に測定した。卵巣がん細胞のＳＫＯＶ３（ＥＣ５０：１０－１０Ｍ）は、濃度依存的な方法でＦＧ２８１１ｍＧ３ ｍＡｂの殺滅の影響を受けやすく、最大６６％の細胞溶解を示した。ＦＧ２８１１ｍＧ３ ｍＡｂはＴ４７Ｄに結合したにも関わらず、このｍＡｂはＡＤＣＣを介してＴ４７Ｄ細胞の殺滅を誘導できず、この殺滅効果がＳＳＥＡ－４の発現レベルに依存していることが示唆された。ＣＤＣは、ｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍細胞の排除に関与する重要な機構であることが知られている。補体の供給源としてのヒト血清の存在下または非存在下でＦＧ２８１１ｍＧ３ ｍＡｂにより誘導されるＣＤＣにより殺滅されるＳＫＯＶ３細胞およびＴ４７Ｄ細胞の特性をアッセイした（図７Ｂ）。ＦＧ２８１１ｍＧ３ ｍＡｂは、ＳＫＯＶ３（ＥＣ５０：１０－９Ｍ）細胞の最大４８％の細胞溶解を示した。ＦＧ２８１１ｍＧ３は、ＣＤＣを介してもまたＴ４７Ｄ細胞の殺滅を誘導しなかった。ＦＧ２８１１ｍＧ３ ｍＡｂが腫瘍細胞に直接的な殺滅を誘導し得るかどうかを調査するために、ＰＩの取り込みアッセイを、ＳＳＥＡ－３／４－ＬＭＴＫ細胞およびＳＫＯＶ３細胞を用いて３０μｇ／ｍｌのＦＧ２８１１ｍＧ３ ｍＡｂを使用することにより行った（図７Ｃ）。過酸化水素および培地単独は、それぞれ陽性対照および陰性対照として含めた。ＦＧ２８１１ｍＧ３ ｍＡｂは、ＳＳＥＡ－３／４－ＬＭＴＫで、７４．７％のＰＩの取り込みを誘導し、ＳＫＯＶ－３細胞で２８．６％と弱く誘導した。ＰＩアッセイが真に増殖する細胞の細胞死を反映していることを確認するために、３０μｇ／ｍｌのＦＧ２８１１ｍＧ３ ｍＡｂで処置したＳＳＥＡ－３／４－ＬＭＴＫ細胞およびＳＫＯＶ３細胞の細胞バイアビリティを、光学顕微鏡下で評価した（図７Ｄ）。ＬＭＴＫの野生型の細胞および培地単独（ＲＰＭＩ）で処置した細胞を、陰性対照として使用した。ＳＳＥＡ－３／４－ＬＭＴＫ細胞は、ＦＧ２８１１ｍＧ３ ｍＡｂを添加してから数秒以内に凝集することが観察された。しかしながら、この現象は、ＳＫＯＶ３細胞およびＬＭＴＫ細胞をＦＧ２８１１ｍＧ３ ｍＡｂとインキュベートした場合には発達しなかった。ＦＧ２８１１ｍＧ３で処置したＳＳＥＡ－３／４－ＬＭＴＫ細胞およびＳＫＯＶ３細胞は、７２時間のｍＡｂの添加の後に増殖阻害のエビデンスを示した。ＦＧ２８１１ｍＧ３ ｍＡｂは、ＬＭＴＫ細胞に関する作用を示さなかった。培地単独とインキュベートした細胞は、増殖阻害を示さず、７２時間のインキュベーション期間にわたりいくつかの細胞死を伴い１００％のコンフルエントを達成した。
【0161】
実施例５．赤血球の２８１１の染色
ＳＳＥＡ－３およびＳＳＥＡ－４は両方とも、大部分の人々の赤血球で発現することが報告されていた。よって、ある濃度範囲（１０μｇ／ｍｌ）のＦＧ２８１１ｍＧ３ ｍＡｂの、５名のドナー由来の赤血球に対する結合を、フローサイトメトリーにより評価した（図８Ａ）。抗ＣＤ５５ ｍＡｂ（７９１Ｔ／３６；１０μｇ／ｍｌ；Ｇｍ：２０２）を陽性対照として含め、ＩｇＧアイソタイプ対照およびＰＢＳを陰性対照として使用した。ＦＧ２８１１ｍＧ３（Ｇｍ：１０）は、全ての５名のドナー由来の赤血球と結合しなかった。さらに赤血球凝集アッセイから、ＦＧ２８１１ｍＧ３ ｍＡｂ（０．６２５～１０μｇ／ｍｌ）が５名のドナー由来の赤血球を凝集しなかったことが確認された。対照的に、７９１Ｔ／３６ ｍＡｂおよび抗血液血清抗体は、全てのドナー由来の赤血球を凝集した。ＰＢＳを陰性対照として使用した（図８Ｂ）。
ＳＳＥＡ－３およびＳＳＥＡ－４は両方とも、大部分の人々の赤血球で発現することが報告されていた。よって、ある濃度範囲（１０μｇ／ｍｌ）のＦＧ２８１１ｍＧ３ ｍＡｂの、５名のドナー由来の赤血球に対する結合を、フローサイトメトリーにより評価した（図８Ａ）。抗ＣＤ５５ ｍＡｂ（７９１Ｔ／３６；１０μｇ／ｍｌ；Ｇｍ：２０２）を陽性対照として含め、ＩｇＧアイソタイプ対照およびＰＢＳを陰性対照として使用した。ＦＧ２８１１ｍＧ３（Ｇｍ：１０）は、全ての５名のドナー由来の赤血球と結合しなかった。さらに赤血球凝集アッセイから、ＦＧ２８１１ｍＧ３ ｍＡｂ（０．６２５～１０μｇ／ｍｌ）が５名のドナー由来の赤血球を凝集しなかったことが確認された。対照的に、７９１Ｔ／３６ ｍＡｂおよび抗血液血清抗体は、全てのドナー由来の赤血球を凝集した。ＰＢＳを陰性対照として使用した（図８Ｂ）。
【0162】
実施例６．ステムメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）に対する２８１１の結合
ＴＳＣＭ細胞の発見およびＳＳＥＡ－４が幹細胞マーカーであるとの事実により、２８１１ ｍＡｂがＴＳＣＭ細胞を認識し得るとの仮説がもたらされた。全血サンプルを、７名の健常なドナー（ＢＤ３、ＢＤ１３、ＢＤ１８、ＢＤ２７、ＢＤ３８、ＢＤ９６、ＢＤ３１）から回収し、ＦＧ２８１１ｍＧ１ ｍＡｂで染色した（図９Ａ）。ＭＣ８１３ ｍＡｂを比較として含め；マウスＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体および二次抗体単独（一次抗体なし）を、本発明者らは、陰性対照として使用し；１９８抗体（抗ＣＥＡＣＡＭ６）およびＯＫＴ３抗体（抗ＣＤ３）を、それぞれ顆粒球およびＰＢＭＣの陽性対照抗体として使用した。ＦＧ２８１１ｍＧ１ ｍＡｂは、７名の健常なドナーの中の、０．８～２．３％の範囲の小さな集団の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を染色した。ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、およびフォルスマンの抗原を認識するＭＣ８１３ ｍＡｂは、７名のドナーを通していずれの血液細胞も染色しなかった。１９８ ｍＡｂは、顆粒球を染色し、ＯＫＴ３ ｍＡｂは、ＣＤ３＋Ｔ細胞を染色した。二次抗体および培地単独は、細胞染色を示さなかった。次に、これら２８１１＋ＰＢＭＣがＴＳＣＭ細胞であるかどうかを調査するために、ＰＢＭＣを、２名の健常なドナーから回収し、ＦＧ２８１１、ＣＤ３、ＣＤ１２２、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、およびＣＤ９５の抗体と共染色し、マルチパラメーターフローサイトメトリーにより分析した（図９Ｂ、表２）。ＣＤ３＋のＴ細胞全てを最初に同定し、次に、２８１１＋集団を同定した。２８１１＋細胞の頻度は、２名のドナーを通して０．３２～０．４１％であった。その後、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ４５ＲＯのマーカーの発現を、ＣＤ３＋２８１１＋集団から分析した。ＣＤ３＋２８１１＋Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ＋細胞（３７．５～３８．６％）、ＣＤ４５ＲＯ＋細胞（３８～４７．８％）およびＣＤ４５ＲＡ＋ＲＯ＋細胞（１２．７～２３．１％）のサブセットから構成されていた。最終的に、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ９５、およびＣＣＲ－７の発現を、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ４５ＲＯ＋、およびＣＤ４５ＲＡ＋ＲＯ＋の集団から評価した。大部分のＣＤ４５ＲＡ＋（８８．７～９０％）、ＣＤ４５ＲＡ＋ＲＯ＋（７９．５～８９．６％）、およびＣＤ４５ＲＯ＋（６４．５～６７．１％）は、ＣＤ６２Ｌ＋であり、ＣＤ４５ＲＡ＋細胞の２７．６～５９．７％、ＣＤ４５ＲＡ＋ＲＯ＋細胞の２９．５～８５．７％、およびＣＤ４５ＲＯ＋細胞の８１．２～８６．１％は、ＣＤ９５＋であり、ＣＤ４５ＲＡ＋細胞の５６．１～７８．９％、ＣＤ４５ＲＡ＋ＲＯ＋細胞の５１．４～７８．１％、およびＣＤ４５ＲＯ＋細胞の５３．７～６１．２％は、ＣＣＲ－７＋であった。これら結果は、２８１１／ＣＤ４５ＲＡ＋細胞がＴＳＣＭ細胞であり、２８１１／ＣＤ４５ＲＡ＋ＲＯ＋細胞が活性化されたＴＳＣＭであり得、２８１１／ＣＤ４５ＲＯ＋細胞が活性化されたＴＳＣＭ細胞またはＴＣＭ細胞であり得ることを示唆していた。
ＴＳＣＭ細胞の発見およびＳＳＥＡ－４が幹細胞マーカーであるとの事実により、２８１１ ｍＡｂがＴＳＣＭ細胞を認識し得るとの仮説がもたらされた。全血サンプルを、７名の健常なドナー（ＢＤ３、ＢＤ１３、ＢＤ１８、ＢＤ２７、ＢＤ３８、ＢＤ９６、ＢＤ３１）から回収し、ＦＧ２８１１ｍＧ１ ｍＡｂで染色した（図９Ａ）。ＭＣ８１３ ｍＡｂを比較として含め；マウスＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体および二次抗体単独（一次抗体なし）を、本発明者らは、陰性対照として使用し；１９８抗体（抗ＣＥＡＣＡＭ６）およびＯＫＴ３抗体（抗ＣＤ３）を、それぞれ顆粒球およびＰＢＭＣの陽性対照抗体として使用した。ＦＧ２８１１ｍＧ１ ｍＡｂは、７名の健常なドナーの中の、０．８～２．３％の範囲の小さな集団の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を染色した。ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、およびフォルスマンの抗原を認識するＭＣ８１３ ｍＡｂは、７名のドナーを通していずれの血液細胞も染色しなかった。１９８ ｍＡｂは、顆粒球を染色し、ＯＫＴ３ ｍＡｂは、ＣＤ３＋Ｔ細胞を染色した。二次抗体および培地単独は、細胞染色を示さなかった。次に、これら２８１１＋ＰＢＭＣがＴＳＣＭ細胞であるかどうかを調査するために、ＰＢＭＣを、２名の健常なドナーから回収し、ＦＧ２８１１、ＣＤ３、ＣＤ１２２、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、およびＣＤ９５の抗体と共染色し、マルチパラメーターフローサイトメトリーにより分析した（図９Ｂ、表２）。ＣＤ３＋のＴ細胞全てを最初に同定し、次に、２８１１＋集団を同定した。２８１１＋細胞の頻度は、２名のドナーを通して０．３２～０．４１％であった。その後、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ４５ＲＯのマーカーの発現を、ＣＤ３＋２８１１＋集団から分析した。ＣＤ３＋２８１１＋Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ＋細胞（３７．５～３８．６％）、ＣＤ４５ＲＯ＋細胞（３８～４７．８％）およびＣＤ４５ＲＡ＋ＲＯ＋細胞（１２．７～２３．１％）のサブセットから構成されていた。最終的に、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ９５、およびＣＣＲ－７の発現を、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ４５ＲＯ＋、およびＣＤ４５ＲＡ＋ＲＯ＋の集団から評価した。大部分のＣＤ４５ＲＡ＋（８８．７～９０％）、ＣＤ４５ＲＡ＋ＲＯ＋（７９．５～８９．６％）、およびＣＤ４５ＲＯ＋（６４．５～６７．１％）は、ＣＤ６２Ｌ＋であり、ＣＤ４５ＲＡ＋細胞の２７．６～５９．７％、ＣＤ４５ＲＡ＋ＲＯ＋細胞の２９．５～８５．７％、およびＣＤ４５ＲＯ＋細胞の８１．２～８６．１％は、ＣＤ９５＋であり、ＣＤ４５ＲＡ＋細胞の５６．１～７８．９％、ＣＤ４５ＲＡ＋ＲＯ＋細胞の５１．４～７８．１％、およびＣＤ４５ＲＯ＋細胞の５３．７～６１．２％は、ＣＣＲ－７＋であった。これら結果は、２８１１／ＣＤ４５ＲＡ＋細胞がＴＳＣＭ細胞であり、２８１１／ＣＤ４５ＲＡ＋ＲＯ＋細胞が活性化されたＴＳＣＭであり得、２８１１／ＣＤ４５ＲＯ＋細胞が活性化されたＴＳＣＭ細胞またはＴＣＭ細胞であり得ることを示唆していた。
【0163】
【表2】
【0164】
ヒトＴ細胞の分化の階層的なモデルにおいて、抗原のプライミングの後、ナイーブＴ細胞（ＴＮ）は、ステムメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）、エフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ）、および最終的に分化したエフェクターＴ細胞（ＴＴＥ／ＴＥＭＲＡ）に漸進的に分化する。これらＴ細胞のサブセットは、異なるマーカーのコンビナトリアルな発現により区別される（表３）（Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ ｅｔ ａｌ． ２０１７）。
【0165】
【表3】
【0166】
実施例７．２８１１陽性Ｔ細胞のＲＮＡシーケンシング
トランスクリプトーム解析により、本発明者らは、推定上のＴＳＣＭ細胞（Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ ｅｔ ａｌ． ２０１７）と２８１１＋Ｔ細胞との間の関連性の度合いを調査した。ＣＤ９５およびＣＤ１２２（ＩＬ－２Ｒβ）のマーカーは、ＴＮ細胞とＴＳＣＭ細胞を識別し；ＣＤ４５ＲＯマーカーは、他のメモリーＴ細胞のサブタイプをＴＳＣＭ細胞と区別する。よって、ナイーブＴ細胞を、メモリーＴ細胞および非Ｔ細胞の欠乏に関するビオチン化抗体のカクテルを含むＰａｎ ｎａｉｖｅ ｈｕｍａｎ Ｔ－ｃｅｌｌ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して、４名の健常なドナーから単離した。その後、精製したナイーブＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋）を、ＣＨ２８１１ｈＧ１またはＣＤ９５／ＣＤ１２２の組み合わせで染色して、２８１１＋細胞および推定上のＴＳＣＭ細胞をそれぞれ単離した。ＣＨ２８１１ｈＧ１およびＣＤ９５／ＣＤ１２２を多く含むＴ細胞のＲＮＡシーケンシングならびにＣＤ８の天然のＴ細胞からのデータセットを使用した差次的な遺伝子発現（ＤＥ）分析は、ＳＳＥＡ－４陽性（ＣＨ２８１１）細胞で有意にアップレギュレートまたはダウンレギュレートした５，０３６の遺伝子のうちの２２２７（４４％）が、ＣＤ９５／ＣＤ１２２陽性Ｔ細胞でアップレギュレートまたはダウンレギュレートされたＤＥ遺伝子と共通することを示しており、これら２つの集団の間に実質的な重複遺伝子が存在することが示唆される（図１０Ａ）。共通する遺伝子のうち有意に、２５７は胚性幹細胞遺伝子のセットと重複し、１０３は造血幹細胞と重複し、７８は胚性癌と重複し（図１０Ａ）、ＳＳＥＡ－４が実際に、幹細胞様の挙動を有するＴ細胞のサブセットに関連することを暗示していた。本発明者らのデータセットにおける前者の２つの重複した遺伝子セットの分布プロファイルが、ヒートマップ分析を使用して示されている。さらにまた、本発明者らのＣＨ２８１１ｈＧ１およびＣＤ９５／ＣＤ１２２を多く含むＴ細胞プロファイルの中のＴＳＣＭおよびエフェクターの分化の遺伝子の分布、ならびにＣＤ８／ＣＤ４ナイーブＴ細胞およびメモリーＴ細胞および活性化したＣＤ８の天然のＴ細胞（「ドナー」との比較も示されている（図１０Ｂ）。階層クラスタリングは、ＣＨ２８１１ｈＧ１およびＣＤ９５／ＣＤ１２２のサンプルの明らかな分離を示しており、これらが、真のナイーブＴ細胞／メモリーＴ細胞または活性化ナイーブＴ細胞と比較して互いに類似しており、幹細胞様挙動を有する明確に異なるＴ細胞のサブセットを表し得ることを示唆している（図１０Ｃ）。
トランスクリプトーム解析により、本発明者らは、推定上のＴＳＣＭ細胞（Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ ｅｔ ａｌ． ２０１７）と２８１１＋Ｔ細胞との間の関連性の度合いを調査した。ＣＤ９５およびＣＤ１２２（ＩＬ－２Ｒβ）のマーカーは、ＴＮ細胞とＴＳＣＭ細胞を識別し；ＣＤ４５ＲＯマーカーは、他のメモリーＴ細胞のサブタイプをＴＳＣＭ細胞と区別する。よって、ナイーブＴ細胞を、メモリーＴ細胞および非Ｔ細胞の欠乏に関するビオチン化抗体のカクテルを含むＰａｎ ｎａｉｖｅ ｈｕｍａｎ Ｔ－ｃｅｌｌ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して、４名の健常なドナーから単離した。その後、精製したナイーブＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋）を、ＣＨ２８１１ｈＧ１またはＣＤ９５／ＣＤ１２２の組み合わせで染色して、２８１１＋細胞および推定上のＴＳＣＭ細胞をそれぞれ単離した。ＣＨ２８１１ｈＧ１およびＣＤ９５／ＣＤ１２２を多く含むＴ細胞のＲＮＡシーケンシングならびにＣＤ８の天然のＴ細胞からのデータセットを使用した差次的な遺伝子発現（ＤＥ）分析は、ＳＳＥＡ－４陽性（ＣＨ２８１１）細胞で有意にアップレギュレートまたはダウンレギュレートした５，０３６の遺伝子のうちの２２２７（４４％）が、ＣＤ９５／ＣＤ１２２陽性Ｔ細胞でアップレギュレートまたはダウンレギュレートされたＤＥ遺伝子と共通することを示しており、これら２つの集団の間に実質的な重複遺伝子が存在することが示唆される（図１０Ａ）。共通する遺伝子のうち有意に、２５７は胚性幹細胞遺伝子のセットと重複し、１０３は造血幹細胞と重複し、７８は胚性癌と重複し（図１０Ａ）、ＳＳＥＡ－４が実際に、幹細胞様の挙動を有するＴ細胞のサブセットに関連することを暗示していた。本発明者らのデータセットにおける前者の２つの重複した遺伝子セットの分布プロファイルが、ヒートマップ分析を使用して示されている。さらにまた、本発明者らのＣＨ２８１１ｈＧ１およびＣＤ９５／ＣＤ１２２を多く含むＴ細胞プロファイルの中のＴＳＣＭおよびエフェクターの分化の遺伝子の分布、ならびにＣＤ８／ＣＤ４ナイーブＴ細胞およびメモリーＴ細胞および活性化したＣＤ８の天然のＴ細胞（「ドナー」との比較も示されている（図１０Ｂ）。階層クラスタリングは、ＣＨ２８１１ｈＧ１およびＣＤ９５／ＣＤ１２２のサンプルの明らかな分離を示しており、これらが、真のナイーブＴ細胞／メモリーＴ細胞または活性化ナイーブＴ細胞と比較して互いに類似しており、幹細胞様挙動を有する明確に異なるＴ細胞のサブセットを表し得ることを示唆している（図１０Ｃ）。
【0167】
実施例８．Ｔ細胞の増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）
共刺激のパラダイムにより、ＴＮ細胞は、増殖および分化をもたらす完全な活性化のためＴ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル１および共刺激シグナル２の両方の関与を必要とする。しかしながら、ＣＤ２８スーパーアゴニストとして知られているＣＤ２８に特異的な抗体のサブクラスは、従来のＣＤ２８抗体とは異なり、ＴＣＲをさらに刺激することなくＴ細胞を完全に活性化できる。本発明者らは、ＣＨ２８１１ｈＧ１ ｍＡｂが、ＣＤ４およびＣＤ８のＴ細胞の増殖を誘導できるかどうかを調査した。最初に、ＰＢＭＣを、２名の健常なドナー（ＢＤ３およびＢＤ１８）から単離し、ＣＳＦＥを標識し、次に、５μｇ／ｍｌのプレートに結合したＣＨ２８１１ｈＧ１ ｍＡｂを使用して抗体により刺激し、これにより、１１日目にＣＤ４Ｔ細胞の増殖（１３～２０％）およびＣＤ８Ｔ細胞の増殖（２～３１％）が示された（図１１Ａ～Ｂ）。ＰＨＡおよび培地単独で刺激されたＰＢＭＣは、陽性対照および陰性対照であった。
共刺激のパラダイムにより、ＴＮ細胞は、増殖および分化をもたらす完全な活性化のためＴ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル１および共刺激シグナル２の両方の関与を必要とする。しかしながら、ＣＤ２８スーパーアゴニストとして知られているＣＤ２８に特異的な抗体のサブクラスは、従来のＣＤ２８抗体とは異なり、ＴＣＲをさらに刺激することなくＴ細胞を完全に活性化できる。本発明者らは、ＣＨ２８１１ｈＧ１ ｍＡｂが、ＣＤ４およびＣＤ８のＴ細胞の増殖を誘導できるかどうかを調査した。最初に、ＰＢＭＣを、２名の健常なドナー（ＢＤ３およびＢＤ１８）から単離し、ＣＳＦＥを標識し、次に、５μｇ／ｍｌのプレートに結合したＣＨ２８１１ｈＧ１ ｍＡｂを使用して抗体により刺激し、これにより、１１日目にＣＤ４Ｔ細胞の増殖（１３～２０％）およびＣＤ８Ｔ細胞の増殖（２～３１％）が示された（図１１Ａ～Ｂ）。ＰＨＡおよび培地単独で刺激されたＰＢＭＣは、陽性対照および陰性対照であった。
【0168】
これが、抗原提示細胞のＦｃの活性化によるものであったことを未然に防ぐために、精製したＴ細胞（９６％の純度；図１２Ａ）を、４名の健常なドナーから単離し、ＣＳＦＥで標識し、次に、５μｇ／ｍｌのプレートに結合したＣＨ２８１１ｈＧ１ ｍＡｂで刺激した。１４日目に、ＣＤ４＋Ｔ細胞の８～１８％およびＣＤ８＋Ｔ細胞の３～７％が増殖し、この増殖は、Ｆｃの相互作用により媒介されなかったことが示唆された（図１２Ｂ～Ｃ）。抗ＣＤ３ ｍＡｂ（０．００５μｇ／ｍｌ）および培地単独で刺激した細胞は、それぞれ陽性対照および陰性対照として使用した。細胞分裂を経た細胞のパーセンテージは、ＳＳＥＡ４陽性細胞の大部分が１４日以内に少なくとも４回の細胞分裂を経た（９６％）のに対してＣＤ３で刺激した細胞のうちの５５％しか４回の細胞分裂を経ていないため、異なるものであった（図１２Ｄ）。
【0169】
実施例１０．ＴＣＲレパートリーのクローン型の評価
ＣＨ２８１１ＩｇＧ１で刺激したＴ細胞のクローン性を、２名のドナー（ＢＤ３およびＢＤ２６）から評価し、ＴＣＲレパートリーを決定し、完全に自動化されたマルチプレックスＰＣＲを行い、固有のＣＤＲ３（ｕＣＤＲ３）の次世代シーケンシング（ＮＧＳ）分析のためのＴＣＲα（ＴＲＡ）およびＴＣＲβ（ＴＲＢ）鎖ライブラリーを作製した。ツリープロット分析（図１３）は、両ドナーのＣＳＦＥｌｏｗ集団においていくつかの比較的優性なクローン型の存在を明らかにした。非増殖集団の多様性は、ＴＲＡ鎖およびＴＲＢ鎖それぞれで、それぞれ１８．９および１２．８であった。予想されるように、２８１１で刺激した集団の多様性は、ＴＲＡ鎖およびＴＲＢ鎖それぞれで、３および３．３であった。この多様性は少なく、これら細胞が抗原を経験した細胞を表すことが示唆された。
ＣＨ２８１１ＩｇＧ１で刺激したＴ細胞のクローン性を、２名のドナー（ＢＤ３およびＢＤ２６）から評価し、ＴＣＲレパートリーを決定し、完全に自動化されたマルチプレックスＰＣＲを行い、固有のＣＤＲ３（ｕＣＤＲ３）の次世代シーケンシング（ＮＧＳ）分析のためのＴＣＲα（ＴＲＡ）およびＴＣＲβ（ＴＲＢ）鎖ライブラリーを作製した。ツリープロット分析（図１３）は、両ドナーのＣＳＦＥｌｏｗ集団においていくつかの比較的優性なクローン型の存在を明らかにした。非増殖集団の多様性は、ＴＲＡ鎖およびＴＲＢ鎖それぞれで、それぞれ１８．９および１２．８であった。予想されるように、２８１１で刺激した集団の多様性は、ＴＲＡ鎖およびＴＲＢ鎖それぞれで、３および３．３であった。この多様性は少なく、これら細胞が抗原を経験した細胞を表すことが示唆された。
【0170】
実施例１１．個別のサイトカイン／ケモカイン応答の動態
ＴＳＣＭ細胞は、高い増殖能を有することが示されており、自己再生し多能性であり、さらにこれらは、他のＴ細胞のサブセットへ分化し得る。本発明者らは、ＦＧ２８１１＋ＴＳＣＭ細胞が、いずれの補足されるサイトカインもない状態でｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖および自己再生し得るとの仮説を立てた。最初に、本発明者らは、ＣＨ２８１１ｈＧ１抗体での刺激によりＦＧ２８１１＋ＴＳＣＭ細胞により放出されるサイトカインを同定し、次に、推定上のＦＧ２８１１＋ＴＳＣＭ細胞を増殖させこの幹細胞性を維持するのに使用できる方法を設計することを目的とした。Ｔ細胞は、４名の健常なドナーから精製し、プレートに結合したＣＨ２８１１ｈＧ１ ｍＡｂで刺激し、７、１１、および１４日目に上清を回収し、サイトカインまたはケモカインの放出について評価した。刺激していない細胞（培地のみ）を、陰性対照として使用した。９個のサイトカイン／ケモカイン（ＩＦＮγ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＩＬ－５、ＩＬ－７、ＩＬ－８、およびＴＮＦα）の分泌を、マルチプレックスサイトカインアッセイ（Ｌｕｍｉｎｅｘ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用してアッセイした（図１４）。ＣＨ２８１１ｈＧ１ ｍＡｂの刺激により、ケモカインＩＬ－８は強力にアップレギュレートされ、対してより控えめなレベルのＴＮＦα、ＩＬ－１０、およびＩＬ－５が、７～１４日目から検出可能であった。
ＴＳＣＭ細胞は、高い増殖能を有することが示されており、自己再生し多能性であり、さらにこれらは、他のＴ細胞のサブセットへ分化し得る。本発明者らは、ＦＧ２８１１＋ＴＳＣＭ細胞が、いずれの補足されるサイトカインもない状態でｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖および自己再生し得るとの仮説を立てた。最初に、本発明者らは、ＣＨ２８１１ｈＧ１抗体での刺激によりＦＧ２８１１＋ＴＳＣＭ細胞により放出されるサイトカインを同定し、次に、推定上のＦＧ２８１１＋ＴＳＣＭ細胞を増殖させこの幹細胞性を維持するのに使用できる方法を設計することを目的とした。Ｔ細胞は、４名の健常なドナーから精製し、プレートに結合したＣＨ２８１１ｈＧ１ ｍＡｂで刺激し、７、１１、および１４日目に上清を回収し、サイトカインまたはケモカインの放出について評価した。刺激していない細胞（培地のみ）を、陰性対照として使用した。９個のサイトカイン／ケモカイン（ＩＦＮγ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＩＬ－５、ＩＬ－７、ＩＬ－８、およびＴＮＦα）の分泌を、マルチプレックスサイトカインアッセイ（Ｌｕｍｉｎｅｘ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用してアッセイした（図１４）。ＣＨ２８１１ｈＧ１ ｍＡｂの刺激により、ケモカインＩＬ－８は強力にアップレギュレートされ、対してより控えめなレベルのＴＮＦα、ＩＬ－１０、およびＩＬ－５が、７～１４日目から検出可能であった。
【0171】
トリパンブルー排除により示されるように、刺激しなかったＴ細胞および抗ＣＤ３で刺激したＴ細胞は、１４日を超えて培養物で生存せず、ＣＨ２８１１ｈＧ１で刺激したＴ細胞のみが１４日を超えて生存した（図１５Ａ）。３５日目に、生存可能な、ＣＨ２８１１ｈＧ１で刺激したＴ細胞を回収し、抗体のパネル（ＦＧ２８１１、ＣＤ３、ＣＤ１２２、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、およびＣＤ９５）で細胞を染色することにより性質決定し、マルチパラメーターフローサイトメトリーを使用して分析した（図１５Ｂ）。３２．４７％の生細胞のうち、３％がＦＧ２８１１＋であり、残りの９７％はＦＧ２８１１－であった。ＦＧ２８１１＋細胞（図１５Ｂ（ｉ））は、９９％がＣＤ３＋およびＣＤ１２２＋であり、このうちの６０％がＣＤ４５ＲＡ／ＲＯ二重陽性（ＣＤ４５ＲＡ／ＲＯ＋）であり、３０％がＣＤ４５ＲＡ＋であった。ＣＤ４５ＲＡ／ＲＯ＋およびＣＤ４５ＲＡ＋細胞は両方ともＣＤ６２Ｌ＋およびＣＤ９５＋であり、これらがＴＳＣＭ細胞であることを示唆していた。ＣＤ４５ＲＡ／ＲＯ＋集団は、活性化したＴＳＣＭ細胞であり得、対してＣＤ４５ＲＡ＋は、よりナイーブ様のＴＳＣＭ細胞であり得る。ＦＧ２８１１－集団（図１５Ｂ（ｉｉ））は、９９％がＣＤ３＋であるが、３４％のみがＣＤ１２２＋であった。ＦＧ２８１１－ＣＤ３＋集団は、６２％がＣＤ４５ＲＯ＋であり、１７％がＣＤ４５ＲＡ＋であった。ＣＤ６２Ｌは、４９％のＦＧ２８１１－ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＯ＋細胞で発現し、ＣＤ９５は、ＦＧ２８１１－ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＯ＋細胞の７９％で発現した。ＣＤ４５ＲＯ／ＣＤ６２Ｌ／ＣＤ９５トリプル陽性細胞（ＣＤ４５ＲＯ／ＣＤ６２Ｌ／ＣＤ９５＋）は、活性化したＴＳＣＭ細胞またはＴＣＭ細胞であり得、ＣＤ４５ＲＯ／ＣＤ９５＋細胞は、ＴＥＭまたはＴＥＭＲＡであり得る。ＣＤ４５ＲＡ＋集団は、より多くのＣＤ６２Ｌ＋細胞（約７６％）を含んでいたが、ＣＤ９５＋細胞は少なかった（約２８％）。ＣＤ４５ＲＡ／ＣＤ６２Ｌ／ＣＤ９５＋細胞は、ＴＳＣＭ細胞であり得る。この結果は、ＣＨ２８１１ｈＧ１の刺激が、長期間培養液において「幹細胞様」およびメモリーの特徴を有するＴ細胞を維持すること、ならびにこれらが他のＴ細胞種に分化し得ることを示唆している。これら生細胞の増殖の可能性を、これらを３３日目に抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体で再刺激するか、または３３および６４日目にＣＨ２８１１ｈＧ１ ｍＡｂで再刺激することにより評価した。光学顕微鏡下で、３９日目に、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体で再刺激した細胞は、Ｔ細胞の芽細胞を形成しており（図１５Ｃ（ｉ））、ＣＤ３／ＣＤ２８で再刺激したＴ細胞の大部分は死亡しており、いくつかの生細胞のみが残存していた。対照的に、ＣＨ２８１１抗体で２回再刺激した細胞は、７０日目に依然として生存可能であり、多くにおいて明らかな増殖を示した（図１５Ｃ（ｉｉ））。これら２つの培養物由来の上清を、３９、５４、および７０日目に回収し、サイトカインおよびケモカインについてスクリーニングした（図１５Ｄ）。ＣＨ２８１１ｈＧ１で再刺激した培養物では、他のサイトカイン／ケモカインのレベルは、１４日目から徐々に７０日目まで検出不能なレベルに至るまで減少し、ＩＬ－７およびＩＬ－２１のレベルは徐々に増大した（図１５Ｄ（ｉ））。この結果は、ＩＬ－７およびＩＬ－２１が、培養物でのＦＧ２８１１＋ＴＳＣＭ細胞の自立に重要な役割を果たし得ることを示唆しており、ＩＬ－７は、ＴＳＣＭの形成にとって重要な指令的なシグナルを提供することが知られており（Ｃｉｅｒｉ ｅｔ ａｌ． ２０１３）、ＩＬ－２１は、エフェクターＴ細胞の分化の阻害に重要な役割を果たしている（Ｌｕｇｌｉ， Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ， ｅｔ ａｌ． ２０１３）。抗ＣＤ３／２８抗体で再刺激した培養物では、全てのサイトカインおよびケモカインが増大し、異なるＴ細胞のサブセットのバリエーションの活性化が存在することが示唆される（図１５Ｄ（ｉｉ））。たとえば、Ｔｈ１細胞は、ＩＬ－２、ＩＦＮｙ、およびＴＮＦαの分泌を特徴とし、Ｔｈ２は、ＩＬ－５を分泌し、Ｔｈ１７は、ＩＬ－１７ＡおよびＩＬ－２１を分泌し、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、ＩＬ－１０を分泌する（Ｒａｐｈａｅｌ ｅｔ ａｌ． ２０１５）。
【0172】
実施例１２．マウスにおけるＦＧ２８１１＋ＴＳＣＭ細胞の同定
次に、本発明者らは、ＣＨ２８１１ｈＧ１抗体を使用して、マウスの脾細胞、腸間膜リンパ節細胞、および鼠径リンパ節細胞でのＳＳＥＡ－４の発現を調査した（図１６）。これら結果は、ＣＨ２８１１ｈＧ１抗体が、脾細胞の０．５％、腸間膜リンパ節細胞の０．３７％、および鼠径リンパ節細胞の０．５２％を染色したことを示した。
次に、本発明者らは、ＣＨ２８１１ｈＧ１抗体を使用して、マウスの脾細胞、腸間膜リンパ節細胞、および鼠径リンパ節細胞でのＳＳＥＡ－４の発現を調査した（図１６）。これら結果は、ＣＨ２８１１ｈＧ１抗体が、脾細胞の０．５％、腸間膜リンパ節細胞の０．３７％、および鼠径リンパ節細胞の０．５２％を染色したことを示した。
【0173】
実施例１３．ＦＧ２８１１（マウスＩｇＧ１）は、Ｃ５７Ｂ／６Ｊマウスにおいて表現型ＴＳＣＭ細胞を誘導する。
ｉｎ ｖｉｖｏでのＦＧ２８１１ｍＧ１のＴ細胞へのアゴニスティックな作用を決定するために、３匹のマウスのグループ（グループＡ）を、０日目に、２５０μｇのＦＧ２８１１でｉ．ｐ．により免疫処置した。３匹の免疫処置しなかったマウスを対照グループとして含めた（グループＢ）。１６日目に、両方のグループ由来のマウスを安楽死させ、脾臓を回収した。グループＡ由来の脾細胞の総数は、グループＢのマウスと比較して多く、それぞれ７×１０７～１×１０８個の細胞および３．９×１０７～６．２×１０７個の細胞の範囲であった（図１７Ａ）。各グループの中の個別のマウスに由来する脾細胞を、ＣＨ２８１１ｈＧ１、抗ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＳＣＡ－１、ＣＤ４４、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１１ｂ、およびＦ４／８０抗体で染色し、マルチパラメーターフローサイトメトリーにより分析した（図１７Ｂ）。ＣＨ２８１１ｈＧ１ ｍＡｂを使用して、Ｔ細胞では抗ＣＤ４およびＣＤ８、ＴおよびＢ細胞のサブセットではＣＤ４４およびＣＤ６２Ｌ、幹細胞様細胞ではＳＣＡ－１（他のマーカーに加えて造血幹細胞およびマウスＴＳＣＭ細胞を同定するために使用されるマーカー）、ならびにマクロファージではＣＤ１１ｂおよびＦ４／８０のＳＳＥＡ－４＋脾細胞を同定した。グループＡのマウスにおける２８１１＋（０．９７～１．２％）、ＣＤ６２Ｌ＋（５．５１～１０．８３％）、およびＣＤ６２＋ＣＤ４４＋（８．７４～１５．０３％）の細胞の頻度は、グループＢ（それぞれ１．６２～１．７４％、１７．３９～１９．２％、および１８．４～２７．３４％）と比較して低かった。両グループ間のＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ１９＋、ＣＤ１１ｂ＋、Ｆ４／８０＋、およびＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０＋細胞のパーセンテージの差異は、マウスＡ３が少ないＣＤ８＋Ｔ細胞集団を含んでいたことを除き、最小限であった（表４）。これら結果は、ＦＧ２８１１ｍＧ１抗体の免疫処置が２８１１＋細胞の増殖および分化を誘導し、ｉｎ ｖｉｖｏでナイーブ様の細胞（２８１１＋、ＳＣＡ－１＋、およびＣＤ６２Ｌ＋）の低減をもたらすことを示唆している。
ｉｎ ｖｉｖｏでのＦＧ２８１１ｍＧ１のＴ細胞へのアゴニスティックな作用を決定するために、３匹のマウスのグループ（グループＡ）を、０日目に、２５０μｇのＦＧ２８１１でｉ．ｐ．により免疫処置した。３匹の免疫処置しなかったマウスを対照グループとして含めた（グループＢ）。１６日目に、両方のグループ由来のマウスを安楽死させ、脾臓を回収した。グループＡ由来の脾細胞の総数は、グループＢのマウスと比較して多く、それぞれ７×１０７～１×１０８個の細胞および３．９×１０７～６．２×１０７個の細胞の範囲であった（図１７Ａ）。各グループの中の個別のマウスに由来する脾細胞を、ＣＨ２８１１ｈＧ１、抗ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＳＣＡ－１、ＣＤ４４、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１１ｂ、およびＦ４／８０抗体で染色し、マルチパラメーターフローサイトメトリーにより分析した（図１７Ｂ）。ＣＨ２８１１ｈＧ１ ｍＡｂを使用して、Ｔ細胞では抗ＣＤ４およびＣＤ８、ＴおよびＢ細胞のサブセットではＣＤ４４およびＣＤ６２Ｌ、幹細胞様細胞ではＳＣＡ－１（他のマーカーに加えて造血幹細胞およびマウスＴＳＣＭ細胞を同定するために使用されるマーカー）、ならびにマクロファージではＣＤ１１ｂおよびＦ４／８０のＳＳＥＡ－４＋脾細胞を同定した。グループＡのマウスにおける２８１１＋（０．９７～１．２％）、ＣＤ６２Ｌ＋（５．５１～１０．８３％）、およびＣＤ６２＋ＣＤ４４＋（８．７４～１５．０３％）の細胞の頻度は、グループＢ（それぞれ１．６２～１．７４％、１７．３９～１９．２％、および１８．４～２７．３４％）と比較して低かった。両グループ間のＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ１９＋、ＣＤ１１ｂ＋、Ｆ４／８０＋、およびＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０＋細胞のパーセンテージの差異は、マウスＡ３が少ないＣＤ８＋Ｔ細胞集団を含んでいたことを除き、最小限であった（表４）。これら結果は、ＦＧ２８１１ｍＧ１抗体の免疫処置が２８１１＋細胞の増殖および分化を誘導し、ｉｎ ｖｉｖｏでナイーブ様の細胞（２８１１＋、ＳＣＡ－１＋、およびＣＤ６２Ｌ＋）の低減をもたらすことを示唆している。
【0174】
【表4】
【0175】
各グループ由来の脾細胞を共にまとめ、次に、５μｇ／ｍｌのプレートに結合したＦＧ２８１１ｍＧ１ ｍＡｂの存在下（Ａ＋２８１１およびＢ＋２８１１）または非存在下（Ａ－２８１１およびＢ－２８１１）で培養した。その後、２４、２７、および３０日目に、これら細胞を回収し、ＦＧ２８１１、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４４、ＣＤ６２Ｌ、ＳＣＡ－１、ＣＤ１１ｂ、Ｆ４／８０、およびＣＤ１９抗体で染色し、マルチパラメーターフローサイトメトリーにより分析した（図１７Ｃ～Ｄ）。２４日目に、グループＡの脾細胞を、ＦＧ２８１１ｍＧ１ ｍＡｂを伴い（Ａ＋２８１１）または伴わずに（Ａ－２８１１）再刺激し、ＦＳＣ／ＳＳＣ（ｆｏｒｗａｒｄ ａｎｄ ｓｉｄｅ ｓｃａｔｔｅｒ）プロファイルにより示されるように小さい細胞集団および大きな細胞集団を形成した。対照的に、ＦＧ２８１１ｍＧ１ ｍＡｂを伴い（Ｂ＋２８１１）または伴わずに（Ｂ－２８１１）再刺激したグループＢの脾細胞は、大きな集団をもたらさなかった（図１７Ｃ）。大きな集団は、３０日目までＡ＋２８１１およびＡ－２８１１脾細胞の培養物において持続し続けた（図１７Ｄ）。大きな細胞集団は主にＣＤ３ｍｏｄｅｒａｔｅ－ｈｉｇｈ（ＣＤ３ｍｏ－ｈｉ）ＣＤ４ｈｉｇｈ（ＣＤ４ｈｉ）およびＣＤ８ｈｉｇｈ（ＣＤ８ｈｉ）Ｔ細胞からなり、小さな細胞集団は、ＣＤ３ｌｏｗ－ｍｏｄｅｒａｔｅ（ＣＤ３ｌｏ－ｍｏ）ＣＤ４ｌｏｗ（ＣＤ４ｌｏ）およびＣＤ８ｌｏｗ（ＣＤ８ｌｏ）のＴ細胞からなる。
【0176】
マウスＴ細胞の分化の階層的なモデルにおいて、抗原プライミングの後、ナイーブＴ細胞（ＴＮ）は、ステムメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）、エフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ）に漸進的に分化する。これらＴ細胞のサブセットは、異なるマーカーのコンビナトリアルな発現により区別される（表５）。
【0177】
【表5】
【0178】
表現型の分析は、Ａ＋／－２８１１培養物におけるＣＤ３ｍｏ－ｈｉ集団が、主にＣＤ４４－ＣＤ６２Ｌ＋の表現型を有するＴ細胞（ＴＮおよび／またはＴＳＣＭ；２８．８～３２．４９％）およびＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ＋の表現型を有するＴ細胞（ＴＣＭ；３７．９２～４１．０８％）、次にＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ－の表現型を有するＴ細胞（ＴＥＦ／ＴＥＭ；約２７．８％）、ならびにＣＤ４４－ＣＤ６２Ｌ－表現型を有する細胞の小さなフラクション（１．７２～２．２６％）からなることを明らかにした。対照的に、全ての培養物におけるＣＤ３ｌｏ－ｍｏ集団は、主にＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ－の表現型（ＴＥＦ／ＴＥＭ；６６．０９～７０．８３％）、次にＣＤ４４－ＣＤ６２Ｌ－の表現型（２６．７７～３２．１７％）からなる。ＴＮおよび／またはＴＳＣＭ細胞、およびＴＣＭ細胞のパーセンテージは、それぞれ０．０８～０．２４％および１．５～２．２９％であった。Ｔ細胞に加え、大きな細胞集団はまた、ＣＤ１９ｈｉ、ＣＤ６２Ｌ＋、およびＣＤ６２Ｌ＋ＳＣＡ－１＋細胞を含み、これらは全て、小さな細胞集団では存在しなかった。ＣＤ１９ｌｏ細胞のみが小さな細胞集団で検出された。興味深いことに、ＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０＋マクロファージ集団のパーセンテージは、Ａ＋／－２８１１グループで有意に低下した。免疫処置を行わなかったマウスの脾細胞Ｂ＋２８１１培養物由来の脾細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでのＦＧ２８１１ｍＧ１抗体での刺激は、３０日目までであっても、これら大きな集団を形成せず、この細胞集団の産生がｉｎ ｖｉｖｏでのＦＧ２８１１抗体の免疫処置作用であることを表している。
【0179】
実施例１４．ＨＨＤＩＩマウスおよびＨＨＤＩＩトランスジェニックマウスにおけるＴｓｃｍ細胞の同定
ＨＨＤＩＩマウス（図１８ＡおよびＢ）ならびにＨＨＤＩＩ／ＤＰ４マウス（図１８Ｃ－Ｅ）におけるＴｓｃｍ細胞の頻度を決定するために、脾細胞を、ナイーブなマウスから回収し、ＣＨ２８１１ｈＧ２－ＰｅＣｙ７、抗ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４４、ＣＤ６２Ｌ、およびＳＣＡ－１で染色し、次に、マルチパラメーターフローサイトメトリーにより分析した。ＣＨ２８１１ｈＧ２ ｍＡｂを使用して、Ｔ細胞では抗ＣＤ４およびＣＤ８、Ｔ細胞のサブセットではＣＤ４４およびＣＤ６２Ｌ、幹細胞様細胞ではＳＣＡ－１（他のマーカーに加えて造血幹細胞およびマウスＴＳＣＭ細胞を同定するために使用されるマーカー）のＳＳＥＡ－４＋脾細胞を同定した。ＨＨＤＩＩマウスでは、細胞の１０．８８％が、２８１１＋ＣＤ３＋細胞であり、これは１ｍｌあたり１．８５×１０５個の細胞に翻訳され、さらに、ＣＤ３＋集団の２４．６１％がＴｓｃｍ細胞であった（図１８Ｂ）。ＨＨＤＩＩマウスにおける２８１１＋集団（１０．８８％）は、Ｃ５７／Ｂ６マウスで以前に観察された頻度（２．４２～３．６０％）よりも高かった。さらに、ＨＨＤＩＩマウスにおける２８１１＋集団の表現型の分析（図１８Ｂ）は、３３．３８％のＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ－および４７．９８％がＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ＋であることを示した。また、幹細胞マーカーのＳＣＡ－１を発現した２８１１＋細胞のパーセンテージを決定し、このマーカーは、他のマーカー（ＣＤ４４－ＣＤ６２Ｌ＋）と併用して使用される場合に、これらマウスにおけるＴｓｃｍ細胞を定義し得る。また、２８１１＋ＳＣＡ－１＋細胞の大部分は、ＣＤ４４を発現しており、これらが抗原を経験していることが示唆される。
ＨＨＤＩＩマウス（図１８ＡおよびＢ）ならびにＨＨＤＩＩ／ＤＰ４マウス（図１８Ｃ－Ｅ）におけるＴｓｃｍ細胞の頻度を決定するために、脾細胞を、ナイーブなマウスから回収し、ＣＨ２８１１ｈＧ２－ＰｅＣｙ７、抗ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４４、ＣＤ６２Ｌ、およびＳＣＡ－１で染色し、次に、マルチパラメーターフローサイトメトリーにより分析した。ＣＨ２８１１ｈＧ２ ｍＡｂを使用して、Ｔ細胞では抗ＣＤ４およびＣＤ８、Ｔ細胞のサブセットではＣＤ４４およびＣＤ６２Ｌ、幹細胞様細胞ではＳＣＡ－１（他のマーカーに加えて造血幹細胞およびマウスＴＳＣＭ細胞を同定するために使用されるマーカー）のＳＳＥＡ－４＋脾細胞を同定した。ＨＨＤＩＩマウスでは、細胞の１０．８８％が、２８１１＋ＣＤ３＋細胞であり、これは１ｍｌあたり１．８５×１０５個の細胞に翻訳され、さらに、ＣＤ３＋集団の２４．６１％がＴｓｃｍ細胞であった（図１８Ｂ）。ＨＨＤＩＩマウスにおける２８１１＋集団（１０．８８％）は、Ｃ５７／Ｂ６マウスで以前に観察された頻度（２．４２～３．６０％）よりも高かった。さらに、ＨＨＤＩＩマウスにおける２８１１＋集団の表現型の分析（図１８Ｂ）は、３３．３８％のＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ－および４７．９８％がＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ＋であることを示した。また、幹細胞マーカーのＳＣＡ－１を発現した２８１１＋細胞のパーセンテージを決定し、このマーカーは、他のマーカー（ＣＤ４４－ＣＤ６２Ｌ＋）と併用して使用される場合に、これらマウスにおけるＴｓｃｍ細胞を定義し得る。また、２８１１＋ＳＣＡ－１＋細胞の大部分は、ＣＤ４４を発現しており、これらが抗原を経験していることが示唆される。
【0180】
ＨＨＤＩＩ／ＤＰ４マウスでは、細胞の１２．０１％が、２８１１＋ＣＤ３＋細胞であり、これは１ｍｌあたり０．９１×１０５個の細胞に翻訳され、さらにＣＤ３＋集団の６．９８％が同様に２８１１＋であった（図１８ＣおよびＤ）。ＨＨＤＩＩ／ＤＰ４マウスにおける２８１１＋集団（１２．０１％）は、ＨＨＤＩＩマウスの頻度に類似しており、同様に、Ｃ５７／Ｂ６マウスで以前に観察された頻度（２．４２～３．６０％）よりも高かった。さらに、ＨＨＤＩＩ／ＤＰ４マウスにおける２８１１＋集団の表現型の分析（図１８Ｄ）は、１２．０９％がＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ－であり、７７．１５％がＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ＋であることを示した。また、幹細胞マーカーのＳＣＡ－１を発現した２８１１＋細胞のパーセンテージを決定した。また、２８１１＋ＳＣＡ－１＋細胞の大部分はＣＤ４４を発現する（７５．５１％のＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ＋、３０．０３％のＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ－）。
【0181】
より詳細な表現型の分析を、ＨＨＤＩＩ／ＤＰ４マウス由来のＴ細胞集団で行い、この分析は、ＣＤ４およびＣＤ８のＴ細胞のサブセットにおける２８１１の発現を見るが、同様に消耗マーカー（ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ）のＴｉｍ３の発現も見た。ＨＨＤＩＩ／ＤＰ４マウスにおけるＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージは、１４．３０％であったが、ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、非常に低く、わずか０．５０％のＣＤ８＋細胞であり（図１８Ｅ）、ＣＤ４Ｔ細胞のうち９．４７％が２８１１＋であり、ＣＤ８Ｔ細胞のうち１０．１４％が２８１１＋であった。消耗マーカー、Ｔｉｍ３の発現は、ＣＤ４＋２８１１＋（０．４２％）細胞およびＣＤ８＋２８１１＋（０．３４％）細胞において、これらの幹細胞特性と一致して、低かった。
【0182】
実施例１５．プレートに結合したヒト（ＩｇＧ１）およびマウス（ＩｇＧ１）２８１１は、マウス脾細胞のｅｘ ｖｉｖｏでの増殖を誘導した。
本発明者らは、プレートに結合したＣＨ２８１１ｈＧ１およびＦＧ２８１１ｍＧ１ ｍＡｂが、ＣＤ４およびＣＤ８のＴ細胞の増殖を誘導できるかどうかを調査した。脾細胞を、ナイーブなＨＨＤＩＩマウスから回収し、ｐａｎＴ細胞を多く含むように処理し（ＣＤ３＋）、ＣＦＳＥで標識し、次に、プレートに結合したＣＨ２８１１ｈＧ１ ｍＡｂまたはＦＧ２８１１ｍＧ１を使用して抗体刺激を行い、抗ＣＤ３を陽性対照として使用し、培地を陰性対照として使用した（図１９Ａ）。ＣＤ３、ＣＤ４、およびＣＤ８のＴ細胞集団の増殖性応答を、７、１２、および１４日目に決定した（図１９Ｂ～Ｄ）。これら結果は、ＣＤ３、ＣＤ４、およびＣＤ８のＴ細胞が、プレートに結合したＣＨ２８１１ｈＧ１およびＦＧ２８１１ｍＧ１ ｍＡｂでの刺激に応答して増殖し、これは、培地対照と同等またはわずかにこれを上回るものであったことを示した。７日目に、ＣＤ３Ｔ細胞では、２．７２％がＦＧ２８１１ｍＧ１に応答して増殖し、２．２４％がＣＨ２８１１ｈＧ１に応答して増殖し、ＣＤ８Ｔ細胞では、２．４７％がＦＧ２８１１ｍＧ１に応答して増殖し、１．４６％がＣＨ２８１１ｈＧ１に応答して増殖し、ＣＤ４Ｔ細胞では、１．３２％がＦＧ２８１１ｍＧ１に応答して増殖し、０．９６％がＣＨ２８１１ｈＧ１に応答して増殖した。１２日目に、プレートに結合したＣＨ２８１１ｈＧ１およびＦＧ２８１１ｍＧ１に対する増殖性応答は増大し、ＣＤ３Ｔ細胞では、６．４６％がＦＧ２８１１ｍＧ１に応答して増殖し、６．２７％がＣＨ２８１１ｈＧ１に応答して増殖し、ＣＤ８Ｔ細胞では、６．２１％がＦＧ２８１１ｍＧ１に応答して増殖し、３．３３％がＣＨ２８１１ｈＧ１に応答して増殖し、ＣＤ４Ｔ細胞では、５．７９％がＦＧ２８１１ｍＧ１に応答して増殖し、２．８２％がＣＨ２８１１ｈＧ１に応答して増殖した。１４日目では、プレートに結合したＣＨ２８１１ｈＧ１およびＦＧ２８１１ｍＧ１に対する増殖性応答はさらに増大し、ＣＤ３Ｔ細胞では、１０．０７％がＦＧ２８１１ｍＧ１に応答して増殖し、８．７％がＣＨ２８１１ｈＧ１に応答して増殖し、ＣＤ８Ｔ細胞では、７．８７％がＦＧ２８１１ｍＧ１に応答して増殖し、６．６１％がＣＨ２８１１ｈＧ１に応答して増殖し、ＣＤ４Ｔ細胞では、７．２９％がＦＧ２８１１ｍＧ１に応答して増殖し、５．１５％がＣＨ２８１１ｈＧ１に応答して増殖した。これら結果は、マウス脾細胞が、プレートに結合したＣＨ２８１１ｈＧ１およびＦＧ２８１１ｍＧ１ ｍＡｂに応答してｅｘ ｖｉｖｏで増殖することを示している。
本発明者らは、プレートに結合したＣＨ２８１１ｈＧ１およびＦＧ２８１１ｍＧ１ ｍＡｂが、ＣＤ４およびＣＤ８のＴ細胞の増殖を誘導できるかどうかを調査した。脾細胞を、ナイーブなＨＨＤＩＩマウスから回収し、ｐａｎＴ細胞を多く含むように処理し（ＣＤ３＋）、ＣＦＳＥで標識し、次に、プレートに結合したＣＨ２８１１ｈＧ１ ｍＡｂまたはＦＧ２８１１ｍＧ１を使用して抗体刺激を行い、抗ＣＤ３を陽性対照として使用し、培地を陰性対照として使用した（図１９Ａ）。ＣＤ３、ＣＤ４、およびＣＤ８のＴ細胞集団の増殖性応答を、７、１２、および１４日目に決定した（図１９Ｂ～Ｄ）。これら結果は、ＣＤ３、ＣＤ４、およびＣＤ８のＴ細胞が、プレートに結合したＣＨ２８１１ｈＧ１およびＦＧ２８１１ｍＧ１ ｍＡｂでの刺激に応答して増殖し、これは、培地対照と同等またはわずかにこれを上回るものであったことを示した。７日目に、ＣＤ３Ｔ細胞では、２．７２％がＦＧ２８１１ｍＧ１に応答して増殖し、２．２４％がＣＨ２８１１ｈＧ１に応答して増殖し、ＣＤ８Ｔ細胞では、２．４７％がＦＧ２８１１ｍＧ１に応答して増殖し、１．４６％がＣＨ２８１１ｈＧ１に応答して増殖し、ＣＤ４Ｔ細胞では、１．３２％がＦＧ２８１１ｍＧ１に応答して増殖し、０．９６％がＣＨ２８１１ｈＧ１に応答して増殖した。１２日目に、プレートに結合したＣＨ２８１１ｈＧ１およびＦＧ２８１１ｍＧ１に対する増殖性応答は増大し、ＣＤ３Ｔ細胞では、６．４６％がＦＧ２８１１ｍＧ１に応答して増殖し、６．２７％がＣＨ２８１１ｈＧ１に応答して増殖し、ＣＤ８Ｔ細胞では、６．２１％がＦＧ２８１１ｍＧ１に応答して増殖し、３．３３％がＣＨ２８１１ｈＧ１に応答して増殖し、ＣＤ４Ｔ細胞では、５．７９％がＦＧ２８１１ｍＧ１に応答して増殖し、２．８２％がＣＨ２８１１ｈＧ１に応答して増殖した。１４日目では、プレートに結合したＣＨ２８１１ｈＧ１およびＦＧ２８１１ｍＧ１に対する増殖性応答はさらに増大し、ＣＤ３Ｔ細胞では、１０．０７％がＦＧ２８１１ｍＧ１に応答して増殖し、８．７％がＣＨ２８１１ｈＧ１に応答して増殖し、ＣＤ８Ｔ細胞では、７．８７％がＦＧ２８１１ｍＧ１に応答して増殖し、６．６１％がＣＨ２８１１ｈＧ１に応答して増殖し、ＣＤ４Ｔ細胞では、７．２９％がＦＧ２８１１ｍＧ１に応答して増殖し、５．１５％がＣＨ２８１１ｈＧ１に応答して増殖した。これら結果は、マウス脾細胞が、プレートに結合したＣＨ２８１１ｈＧ１およびＦＧ２８１１ｍＧ１ ｍＡｂに応答してｅｘ ｖｉｖｏで増殖することを示している。
【0183】
実施例１６．抗ＣＤ３およびＣＤ２８は、ＨＨＤＩＩマウス由来の２８１１＋細胞のｅｘ ｖｉｖｏでの増殖を誘導する。
本発明者らは、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８がＨＨＤＩＩマウスから単離した２８１１＋細胞の増殖を誘導し得るかどうかを調査した。脾細胞を、ナイーブなＨＨＤＩＩマウスから回収し、ｐａｎＴ細胞を多く含むように処理し（ＣＤ３＋）、ＣＦＳＥで標識し、次に、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８（１μｇ／ｍＬ）で刺激した。２８１１＋集団の増殖性応答を、ＣＨ２８１１ｈＧ２－ＰｅＣｙ７ ｍＡｂを使用して、１１、１５、および２０日目に決定した（図２０Ａ）。２８１１＋ＣＤ３＋Ｔ細胞のパーセンテージは、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８での刺激により、１１日目まで増大し、Ｔ細胞の６１．２％が２８１１＋であり、１５日目までに、これはさらに６９．８４％まで増大したが、２０日目までには、２８１１＋Ｔ細胞のパーセンテージは、５７．５８％に低下した。また、２０日目に観察される２８１１＋細胞のパーセンテージの減少は、Ｔ細胞および２８１１＋Ｔ細胞の総数の低下を伴う細胞のバイアビリティの減少と相関した（図２０Ａｉｉｉおよびｉｖ）。培地のみの対照における２８１１＋細胞のパーセンテージは、ｅｘ ｖｉｖｏでは直接１０％であり、これは、１１および１５日目に２０～３０％に増大したが、同様に２０日目に減少した。
本発明者らは、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８がＨＨＤＩＩマウスから単離した２８１１＋細胞の増殖を誘導し得るかどうかを調査した。脾細胞を、ナイーブなＨＨＤＩＩマウスから回収し、ｐａｎＴ細胞を多く含むように処理し（ＣＤ３＋）、ＣＦＳＥで標識し、次に、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８（１μｇ／ｍＬ）で刺激した。２８１１＋集団の増殖性応答を、ＣＨ２８１１ｈＧ２－ＰｅＣｙ７ ｍＡｂを使用して、１１、１５、および２０日目に決定した（図２０Ａ）。２８１１＋ＣＤ３＋Ｔ細胞のパーセンテージは、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８での刺激により、１１日目まで増大し、Ｔ細胞の６１．２％が２８１１＋であり、１５日目までに、これはさらに６９．８４％まで増大したが、２０日目までには、２８１１＋Ｔ細胞のパーセンテージは、５７．５８％に低下した。また、２０日目に観察される２８１１＋細胞のパーセンテージの減少は、Ｔ細胞および２８１１＋Ｔ細胞の総数の低下を伴う細胞のバイアビリティの減少と相関した（図２０Ａｉｉｉおよびｉｖ）。培地のみの対照における２８１１＋細胞のパーセンテージは、ｅｘ ｖｉｖｏでは直接１０％であり、これは、１１および１５日目に２０～３０％に増大したが、同様に２０日目に減少した。
【0184】
表現型の分析を、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８での刺激により増殖した２８１１＋細胞で行った。１１日目に、染色を、ＣＨ２８１１ｈＧ２－ＰｅＣｙ７、抗ＣＤ３、ＣＤ４４、およびＣＤ６２Ｌを使用して行った（図２０Ｂ）。同定したＴ細胞のサブセットは、ＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ－により定義されるエフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ）、ＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ＋により定義されるセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）、ＣＤ４４－ＣＤ６２Ｌ－により定義されるエフェクターＴ細胞（ＴＥＦＦ）、およびＣＤ４４－ＣＤ６２Ｌ＋により定義されるナイーブＴ細胞（ＴＮ）であった。１１日目の表現型決定の結果（図２０Ｃ）は、抗ＣＤ３およびＣＤ２８での刺激が２８１１＋ＴＥＭ（平均値６７．３５×１０３）、ＴＣＭ（平均値６１．１５×１０３）、ＴＥＦＦ（平均値１４１×１０３）、およびＴＮ（平均値１６．４５×１０３）の総数を増大させたことを示している。抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８での刺激は、２８１１＋細胞の表現型をよりエフェクターＴ細胞の表現型へと押し進めていた（図２０Ｄ）。２８１１＋、ＴＥＦＦ細胞のパーセンテージは、４７．７％（平均値）であり、対してＴＣＭ細胞およびＴＥＭ細胞のパーセンテージは、刺激していない細胞（培地単独）よりも低いパーセンテージに低下していた。
【0185】
これら結果は、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８が、ＨＨＤＩＩマウス由来の２８１１＋細胞のｅｘ ｖｉｖｏでの増殖を誘導することを示している。抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８での刺激は、刺激から１１～１５日後に２８１１＋細胞の数およびパーセンテージの増大をもたらした。各サブセットの中の２８１１＋Ｔ細胞（ＴＣＭ、ＴＮ、ＴＥＭ、ＴＥＦＦ）の総数は増大したが、この刺激は、Ｔ細胞をよりエフェクターＴ細胞の表現型へと押し進めた。
【0186】
実施例１７．ヒト（ＩｇＧ２）およびマウス（ＩｇＧ１）２８１１は、ＨＨＤＩＩ／ＤＰ４マウス由来の脾細胞のｅｘ ｖｉｖｏでの増殖を誘導した。
本発明者らは、プレートに結合したＣＨ２８１１ｈＧ２およびＦＧ２８１１ｍＧ１ ｍＡｂが、ＣＤ４およびＣＤ８のＴ細胞の増殖を誘導できるかどうかを調査した。脾細胞を、ナイーブなＨＨＤＩＩマウスから回収し、ｐａｎＴ細胞を多く含むように処理し（ＣＤ３＋）、ＣＦＳＥで標識し、次に、プレートに結合したＣＨ２８１１ｈＧ２、ＦＧ２８１１ｍＧ１で抗体刺激し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８（＋／－ＡＫＴｉ）を陽性対照として使用し、培地を陰性対照として使用した。ＣＤ３Ｔ細胞集団の増殖性応答を、１１、１５、および２０日目に決定した（図２１Ａ）。これら結果は、２８１１＋ＣＤ３Ｔ細胞が、プレートに結合したＣＨ２８１１ｈＧ２およびＦＧ２８１１ｍＧ１ ｍＡｂでの刺激に応答して増殖したことを示した。１１日目に、８．７３％の２８１１＋ＣＤ３＋Ｔ細胞がＦＧ２８１１ｍＧ１に応答して増殖し、５０．４７％がＣＨ２８１１ｈＧ２に応答して増殖し、１５日目には、２０．４８％の２８１１＋ＣＤ３＋Ｔ細胞がＦＧ２８１１ｍＧ１に応答して増殖し、４０．５５％がＣＨ２８１１ｈＧ２に応答して増殖し、２０日目までに、パーセンテージは、わずかに減少し、２１．４１％の２８１１＋ＣＤ３＋Ｔ細胞がＦＧ２８１１ｍＧ１に応答して増殖し、３５．１３％がＣＨ２８１１ｈＧ２に応答して増殖した。同じ２８１１＋細胞の増加が、２８１１＋細胞のパーセンテージ、２８１１＋ＣＤ３＋細胞および２８１１＋細胞の総数を見る際にも見られた。ＡＫＴｉを伴うかまたは伴わない抗ＣＤ３／ＣＤ２８での刺激もまた、２８１１＋細胞の増殖を誘導し、ここで８０％の２８１１＋ＣＤ３＋Ｔ細胞が、各時点でＣＤ３／ＣＤ２８での刺激により増殖し、このパーセンテージは、細胞に対してわずかに毒性であるＡＫＴｉの添加により、６０％に低下した。これら結果は、ＣＨ２８１１ｈＧ２が、刺激により全ての時点で２８１１＋細胞の増殖を誘導し、また同じことが、より少ない度合いではあるが、ＦＧ２８１１ｍＧ１でも見られたことを示している。
本発明者らは、プレートに結合したＣＨ２８１１ｈＧ２およびＦＧ２８１１ｍＧ１ ｍＡｂが、ＣＤ４およびＣＤ８のＴ細胞の増殖を誘導できるかどうかを調査した。脾細胞を、ナイーブなＨＨＤＩＩマウスから回収し、ｐａｎＴ細胞を多く含むように処理し（ＣＤ３＋）、ＣＦＳＥで標識し、次に、プレートに結合したＣＨ２８１１ｈＧ２、ＦＧ２８１１ｍＧ１で抗体刺激し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８（＋／－ＡＫＴｉ）を陽性対照として使用し、培地を陰性対照として使用した。ＣＤ３Ｔ細胞集団の増殖性応答を、１１、１５、および２０日目に決定した（図２１Ａ）。これら結果は、２８１１＋ＣＤ３Ｔ細胞が、プレートに結合したＣＨ２８１１ｈＧ２およびＦＧ２８１１ｍＧ１ ｍＡｂでの刺激に応答して増殖したことを示した。１１日目に、８．７３％の２８１１＋ＣＤ３＋Ｔ細胞がＦＧ２８１１ｍＧ１に応答して増殖し、５０．４７％がＣＨ２８１１ｈＧ２に応答して増殖し、１５日目には、２０．４８％の２８１１＋ＣＤ３＋Ｔ細胞がＦＧ２８１１ｍＧ１に応答して増殖し、４０．５５％がＣＨ２８１１ｈＧ２に応答して増殖し、２０日目までに、パーセンテージは、わずかに減少し、２１．４１％の２８１１＋ＣＤ３＋Ｔ細胞がＦＧ２８１１ｍＧ１に応答して増殖し、３５．１３％がＣＨ２８１１ｈＧ２に応答して増殖した。同じ２８１１＋細胞の増加が、２８１１＋細胞のパーセンテージ、２８１１＋ＣＤ３＋細胞および２８１１＋細胞の総数を見る際にも見られた。ＡＫＴｉを伴うかまたは伴わない抗ＣＤ３／ＣＤ２８での刺激もまた、２８１１＋細胞の増殖を誘導し、ここで８０％の２８１１＋ＣＤ３＋Ｔ細胞が、各時点でＣＤ３／ＣＤ２８での刺激により増殖し、このパーセンテージは、細胞に対してわずかに毒性であるＡＫＴｉの添加により、６０％に低下した。これら結果は、ＣＨ２８１１ｈＧ２が、刺激により全ての時点で２８１１＋細胞の増殖を誘導し、また同じことが、より少ない度合いではあるが、ＦＧ２８１１ｍＧ１でも見られたことを示している。
【0187】
次に、表現型の分析を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８（＋／－ＡＫＴｉ）、ＣＨ２８１１ｈＧ２、およびＦＧ２８１１ｍＧ１ ｍＡｂでの刺激により増殖した２８１１＋細胞で行った。１１日目に、染色を、ＣＨ２８１１ｈＧ２－ＰｅＣｙ７、抗ＣＤ３、ＣＤ４４、およびＣＤ６２Ｌを使用して行った（図２０Ｂ）。同定したＴ細胞のサブセットは、ＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ－により定義されるエフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ）、ＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ＋により定義されるセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）、ＣＤ４４－ＣＤ６２Ｌ－により定義されるエフェクターＴ細胞（ＴＥＦＦ）、およびＣＤ４４－ＣＤ６２Ｌ＋により定義されるナイーブＴ細胞（ＴＮ）であった。１１日目の表現型決定の結果（図２１Ｂ）は、ＣＨ２８１１ｈＧ２またはＦＧ２８１１ｍＧ１ ｍＡｂでの刺激が、２８１１＋ＴＥＭの総数をＣＨ２８１１ｈＧ２での刺激により６２．８×１０３個の細胞に、ＦＧ２８１１ｍＧ１での刺激により５．２４×１０３個の細胞に増大させたことを示した。２８１１＋ＴＣＭの総数は、ＣＨ２８１１ｈＧ２での刺激により６．９５×１０３個の細胞に、ＦＧ２８１１ｍＧ１での刺激により１．８×１０３個の細胞に増大した。２８１１＋ＴＥＦＦの総数は、ＣＨ２８１１ｈＧ２での刺激により２９．０５×１０３個の細胞に、ＦＧ２８１１ｍＧ１での刺激により７．０２×１０３個の細胞に増大し、２８１１＋ＴＮ細胞の総数はわずかにのみ増大し、ＣＨ２８１１ｈＧ２での刺激により０．６１×１０３個に（培地のみ０．０７×１０３）増大し、ＦＧ２８１１ｍＧ１での刺激では増大しなかった。また本発明者らは、抗ＣＤ３／ＣＤ２８、ＦＧ２８１１ｍＧ１、およびＣＨ２８１１ｈＧ２での刺激による２８１１＋Ｔ細胞のパーセンテージを観察し（図２１Ｃ）、２８１１＋ＴＥＦＦ細胞のパーセンテージが、ＦＧ２８１１ｍＧ１での刺激では３４．８２％であり、ＣＨ２８１１ｈＧ２での刺激では５７．５９％であり、抗ＣＤ３／ＣＤ２８での刺激では４７．３６％であった。これら結果は、ＨＨＤＩＩ／ＤＰ４マウス由来のＴ細胞において、ＨＨＤＩＩマウスから得た結果（図２０Ｄ）と比較した場合に、Ｔ細胞のエフェクターの表現型への偏りが少ないことを示している。また、ＨＨＤＩＩ／ＤＰ４マウスにおけるＴＣＭおよびＴＥＭのサブセットのパーセンテージは、ＨＨＤＩＩマウスと比較して高かった。
【0188】
これら結果は、ＨＨＤＩＩ／ＤＰ４マウス由来の脾細胞が、プレートに結合したＣＨ２８１１ｈＧ２およびＦＧ２８１１ｍＧ１ ｍＡｂに応答してｅｘ ｖｉｖｏで増殖することを示しており、これは、２８１１＋エフェクターメモリーＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターＴ細胞、およびナイーブＴ細胞の数の増大に加え、２８１１＋ＣＤ３＋Ｔ細胞の総数の増大をもたらす。ＣＨ２８１１ｈＧ２に対するｅｘ ｖｉｖｏでの増殖性応答の大きさは、ＦＧ２８１１ｍＧ１に対する応答と比較して大きく、よってより多数の２８１１＋細胞をもたらす。
【0189】
実施例１８．抗ＣＤ３およびＣＤ２８は、健常なドナー由来の２８１１＋細胞のｅｘ ｖｉｖｏでの増殖を誘導する。
ＴＳＣＭ細胞は、高い増殖能を有することが示されており、自己再生しかつ多能性であり、さらにこれらは他のＴ細胞のサブセットへと分化し得る。本発明者らは、抗ＣＤ３／ＣＤ２８での刺激または異なるサイトカインの添加が、健常なドナーから単離されたＴｓｃｍ細胞のｅｘ ｖｉｖｏでの増殖を誘導し得るかどうかを調査した。ＰＢＭＣを、４名の健常なドナー（バフィーコート）から単離し、ｐａｎＴ細胞を多く含むように処理し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、またはＩＬ－２１の存在下でＴ細胞を培養した。１５および２０日目に、表現型の分析を、抗ＣＤ３、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ９５、ＣＤ１２２、およびＣＣＲ７を使用して行い、Ｔ細胞集団を同定するために使用した異なるマーカーの発現を、表６に列挙する。
ＴＳＣＭ細胞は、高い増殖能を有することが示されており、自己再生しかつ多能性であり、さらにこれらは他のＴ細胞のサブセットへと分化し得る。本発明者らは、抗ＣＤ３／ＣＤ２８での刺激または異なるサイトカインの添加が、健常なドナーから単離されたＴｓｃｍ細胞のｅｘ ｖｉｖｏでの増殖を誘導し得るかどうかを調査した。ＰＢＭＣを、４名の健常なドナー（バフィーコート）から単離し、ｐａｎＴ細胞を多く含むように処理し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、またはＩＬ－２１の存在下でＴ細胞を培養した。１５および２０日目に、表現型の分析を、抗ＣＤ３、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ９５、ＣＤ１２２、およびＣＣＲ７を使用して行い、Ｔ細胞集団を同定するために使用した異なるマーカーの発現を、表６に列挙する。
【0190】
【表6】
【0191】
表現型の分析を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８での刺激によるか、またはある範囲の組み合わせで添加されるＩＬ－７、ＩＬ－１５、およびＩＬ－２１の添加で増殖したＣＤ３＋Ｔ細胞で行った。１５および２０日目に、染色を行った（図２２Ａ）。１５日目の表現型決定の結果（図２２Ｂ）は、ＣＤ３／ＣＤ２８単独、またはＩＬ－７、ＩＬ－１５、およびＩＬ－２１と組み合わせたＣＤ３／ＣＤ２８での刺激は、２８１１＋ＣＤ３＋細胞のパーセンテージを増大させることを示しており、またこれは、２８１１＋細胞およびＣＤ３＋細胞の総数の増大と相関している。１５日目に、抗ＣＤ３／ＣＤ２８での刺激による２８１１＋ＣＤ３＋Ｔ細胞のパーセンテージは、１９．６４％および２３．９４％であり、これは、サイトカインのみ（ＣＤ３／ＣＤ２８での刺激なし）の存在下で培養したＴ細胞よりも多かった。抗ＣＤ３／ＣＤ２８での刺激と組み合わせたＩＬ－７／ＩＬ－２１またはＩＬ－７／ＩＬ－１５／ＩＬ－２１の添加は、２８１１＋ＣＤ３＋細胞のパーセンテージをわずかに向上させた。２８１１＋ＣＤ３＋Ｔ細胞のパーセンテージは、細胞をＣＤ３／ＣＤ２８、ＩＬ－７／ＩＬ－２１の存在下で培養した場合に２３．８％および２７．４％まで増大し、ＩＬ－１５の添加では、パーセンテージは３１．５３％に増大した。また、２８１１＋ＣＤ３＋Ｔ細胞のパーセンテージの増大は、総細胞数の増大と相関しており、１５日目には、８０×１０４個の２８１１＋ＣＤ３＋が存在していた。２０日目には、２８１１＋ＣＤ３＋のパーセンテージは、ＣＤ３／ＣＤ８、ＩＬ－７／ＩＬ－２１／ＩＬ－１５と培養した場合に１６．４５％および１７．５６％に低下し、これは、１５日目の３１．５３％から減少している。また、２８１１＋ＣＤ３＋Ｔ細胞のパーセンテージの減少は、２８１１＋Ｔ細胞の総数の減少と相関していた。
【0192】
さらにより詳細な表現型の分析を、２名のドナー由来のＴ細胞で行い、ＣＤ３／ＣＤ２８単独またはＩＬ－７、ＩＬ－１５、およびＩＬ－２１と組み合わせたＣＤ３／ＣＤ２８の存在下で培養したＴ細胞におけるＴｓｃｍ細胞を同定した。ヒトにおけるＴｓｃｍ細胞の頻度は低く、４名の健常なドナーのＴｓｃｍのパーセンテージは、０．６４％～３．４８％の範囲にあった。本発明者らは、Ｔｓｃｍが、ＣＤ３／ＣＤ２８単独またはＩＬ－７、ＩＬ－１５、およびＩＬ－２１と組み合わせたＣＤ３／ＣＤ２８の存在下で増殖し得るかどうかを調査した（図２３）。Ｔｓｃｍ細胞の最大増殖が、Ｔ細胞を抗ＣＤ３／ＣＤ２８の存在下にて、ＩＬ－７／ＩＬ－２１の存在下（３．５１％および６．３２％のＴｓｃｍ）またはＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１を伴い（３．６２％のＴｓｃｍ）培養した場合に観察され、１名のドナーでは、これは５倍のＴｓｃｍ細胞増殖であり、第２のドナーでは８倍の増殖であった。２０日目に、Ｔ細胞を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８の存在下にて、ＩＬ－７／ＩＬ－２１の存在下（１４．８４％および１１．３３％のＴｓｃｍ）またはＩＬ－７／ＩＬ－１５／ＩＬ－２１を伴い（１３．６７％）培養した場合に、Ｔｓｃｍ細胞のパーセンテージはさらに増殖し、１名のドナーでは、これは３倍のＴｓｃｍ細胞増殖であり、第２のドナーでは９倍の増殖であった（２０日目の培地対照と比較）。次に、本発明者らは、Ｔｓｃｍ細胞の何パーセントが２８１１でも陽性であるかを決定した（図２３ｉｉ）。０日目に、２８１１＋であるＴｓｃｍ細胞のパーセンテージは４６．８９％および６３．６０％であった。１５日目に、Ｔｓｃｍ ２８１１＋細胞のパーセンテージは、全ての条件の間で依然として類似しており、これらは３１．５１～５３．５２％の範囲にあった。２０日目に、Ｔｓｃｍ ２８１１＋細胞のパーセンテージは、大部分の条件で低下し、培地単独またはＣＤ３／ＣＤ２８単独の存在下で培養したＴ細胞のみが１５日目の結果と同様のパーセンテージを維持していた。次に、本発明者らは、Ｔｓｃｍ細胞の何パーセントがＣＤ３および２８１１でも陽性であるかを決定した（図２３ｉｉｉ）。１５日目で、ＣＤ３／ＣＤ２８の存在下またはＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１との組み合わせたＣＤ３／ＣＤ２８の存在下で、Ｔｓｃｍ細胞のパーセンテージは、培地のみの対照または０日目の結果と比較して増大しなかった。２０日目では、ＣＤ３／ＣＤ２８の存在下またはＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１との組み合わせたＣＤ３／ＣＤ２８の存在下で、Ｔｓｃｍ細胞のパーセンテージは、培地のみの対照または０日目の結果と比較して増大しなかった。
【0193】
これら結果は、ＣＤ３／ＣＤ２８での刺激が、健常なヒトドナーから単離した２８１１＋細胞のｅｘ ｖｉｖｏでの増大を誘導したことを示している。抗ＣＤ３／ＣＤ２８でのＴ細胞の刺激は、２８１１＋細胞の頻度を増大させたが、この増殖は、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、およびＩＬ－２１全てを培養物に添加する場合にさらに増大し、この増殖は、刺激から１５日後にピークを迎えた。組み合わせた抗ＣＤ３／ＣＤ２８でのＴ細胞の刺激は、Ｔｓｃｍ集団を増殖させ、この増殖は、これら細胞の３～９倍の増殖をもたらした。
【0194】
実施例１９．可溶性ＦＧ２８１１ｍＧ１で刺激したＴ細胞は、Ｆｃ架橋を介してＣＤ４およびＣＤ８のＴ細胞の増殖を刺激する。
次に、本発明者らは、可溶性ＦＧ２８１１ｍＧ１が、脾細胞の存在下または非存在下で培養される場合にＣＤ４およびＣＤ８のＴ細胞を刺激し得るかどうかを調査した。脾細胞の添加は、Ｆｃの架橋を可能にし、Ｔ細胞応答を刺激する。脾細胞を、ＨＨＤＩＩマウスおよびＨＨＤＩＩ／ＤＰ４マウスから単離し、ＨＨＤＩＩ脾細胞からｐａｎＴ細胞を多く含むように処理し（ＣＤ３＋）、ＨＨＤＩＩ Ｔ細胞およびＨＨＤＩＩ／ＤＰ４脾細胞を、ＣＦＳＥで標識した。次に、ＨＨＤＩＩＴ細胞を、ＦＧ２８１１ｍＧ１、ＬＰＳ、または培地単独に加えて、ＨＨＤＩＩ／ＤＰ４脾細胞を伴うかまたは伴わずに培養した。１５日目に、ＣＤ４およびＣＤ８の増殖性応答を決定した。脾細胞との共培養の非存在下では、０．１４％のＣＤ４Ｔのみが可溶性ＦＧ２８１１ｍＧ１の存在下で増殖した（ＣＦＳＥｌｏｗ）が、これは、培地のみの対照（０．１６％のＣＦＳＥｌｏｗ）を上回るものではなく、よって単なるバックグラウンドレベルであった。脾細胞との共培養の非存在下で、０．０２％のＣＤ８Ｔのみが、可溶性ＦＧ２８１１ｍＧ１の存在下で増殖し（ＣＦＳＥｌｏｗ）、これは、培地のみの対照（０％のＣＦＳＥｌｏｗ）と非常に類似しており、よって単なるバックグラウンドレベルであった。ＣＤ４およびＣＤ８のＴ細胞は、両方とも、ＬＰＳに対して良好な増殖性応答を示した（それぞれ３．３４％、３９．５６％）。脾細胞との共培養の存在下では、１５．２％のＣＤ４Ｔ細胞が可溶性ＦＧ２８１１ｍＧ１の存在下で増殖し（ＣＦＳＥｌｏｗ）、２．３３％のＣＤ８Ｔが可溶性ＦＧ２８１１ｍＧ１の存在下で増殖し（ＣＦＳＥｌｏｗ）、ＣＤ４およびＣＤ８のＴ細胞は、両方とも、ＰＢＭＣの存在を亢進させるＬＰＳに対する良好な増殖性応答を示した（それぞれ５９．８８％、５４．１０％）。
次に、本発明者らは、可溶性ＦＧ２８１１ｍＧ１が、脾細胞の存在下または非存在下で培養される場合にＣＤ４およびＣＤ８のＴ細胞を刺激し得るかどうかを調査した。脾細胞の添加は、Ｆｃの架橋を可能にし、Ｔ細胞応答を刺激する。脾細胞を、ＨＨＤＩＩマウスおよびＨＨＤＩＩ／ＤＰ４マウスから単離し、ＨＨＤＩＩ脾細胞からｐａｎＴ細胞を多く含むように処理し（ＣＤ３＋）、ＨＨＤＩＩ Ｔ細胞およびＨＨＤＩＩ／ＤＰ４脾細胞を、ＣＦＳＥで標識した。次に、ＨＨＤＩＩＴ細胞を、ＦＧ２８１１ｍＧ１、ＬＰＳ、または培地単独に加えて、ＨＨＤＩＩ／ＤＰ４脾細胞を伴うかまたは伴わずに培養した。１５日目に、ＣＤ４およびＣＤ８の増殖性応答を決定した。脾細胞との共培養の非存在下では、０．１４％のＣＤ４Ｔのみが可溶性ＦＧ２８１１ｍＧ１の存在下で増殖した（ＣＦＳＥｌｏｗ）が、これは、培地のみの対照（０．１６％のＣＦＳＥｌｏｗ）を上回るものではなく、よって単なるバックグラウンドレベルであった。脾細胞との共培養の非存在下で、０．０２％のＣＤ８Ｔのみが、可溶性ＦＧ２８１１ｍＧ１の存在下で増殖し（ＣＦＳＥｌｏｗ）、これは、培地のみの対照（０％のＣＦＳＥｌｏｗ）と非常に類似しており、よって単なるバックグラウンドレベルであった。ＣＤ４およびＣＤ８のＴ細胞は、両方とも、ＬＰＳに対して良好な増殖性応答を示した（それぞれ３．３４％、３９．５６％）。脾細胞との共培養の存在下では、１５．２％のＣＤ４Ｔ細胞が可溶性ＦＧ２８１１ｍＧ１の存在下で増殖し（ＣＦＳＥｌｏｗ）、２．３３％のＣＤ８Ｔが可溶性ＦＧ２８１１ｍＧ１の存在下で増殖し（ＣＦＳＥｌｏｗ）、ＣＤ４およびＣＤ８のＴ細胞は、両方とも、ＰＢＭＣの存在を亢進させるＬＰＳに対する良好な増殖性応答を示した（それぞれ５９．８８％、５４．１０％）。
【0195】
これら結果は、可溶性ＦＧ２８１１ｍＧ１が、脾細胞の存在下で共培養される場合に、ＣＤ４およびＣＤ８の増殖性応答を刺激し得ることを示している（図２４）。培養物に脾細胞を添加しない場合、Ｔ細胞は増殖せず、これは、Ｆｃ架橋が２８１１ ｍＡｂの作用様式であることを示している。ＣＤ４Ｔ細胞集団において、脾細胞およびＦＧ２８１１ｍＧ１と共培養した場合のＴ細胞の増殖は、ＣＤ８Ｔ細胞と比較して多かった（１５．２％ｖｓ２．３３％）。これら結果は、ｅｘ ｖｉｖｏでＴ細胞を増殖させる２８１１ ｍＡｂの潜在性およびその作用様式が、Ｆｃ架橋を介していることを示している。
【0196】
実施形態
本発明のさらなる実施形態を以下に記載する。
本発明のさらなる実施形態を以下に記載する。
【0197】
１．ＳＳＥＡ－４（Ｎｅｕ５Ａｃ（α２－３）Ｇａｌ（β１－３）ＧａｌＮＡｃ（β１－３）Ｇａｌ（α１－４）Ｇａｌ（β１－４）Ｇｌｃ）に結合できる単離された特異的な結合メンバー。
【0198】
２．糖脂質上でＳＳＥＡ－４に結合できる、実施形態１に記載の結合メンバー。
【0199】
３．ステムメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）を標的とすることができる、先行する実施形態のいずれかに記載の結合メンバー。
【0200】
４．ステムメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の増殖を誘導できる、先行する実施形態のいずれかに記載の結合メンバー。
【0201】
５．ＳＳＥＡ－３に結合しない、先行する実施形態のいずれかに記載の結合メンバー。
【0202】
６．ｍＡｂ ＦＧ２８１１．７２またはキメラのＦＧ２８１１．７２（ＣＨ２８１１／ＣＨ２８１１．７２）、またはそれらのフラグメントである、先行する実施形態のいずれかに記載の結合メンバー。
【0203】
７．二重特異性である、先行する実施形態のいずれかに記載の結合メンバー。
【0204】
８．前記二重特異性結合メンバーが、さらにＣＤ３に対して特異的である、実施形態７に記載の結合メンバー。
【0205】
９．図２ａの残基２７～３８（ＣＤＲＨ１）、５６～６５（ＣＤＲＨ２）、および１０５～１１３（ＣＤＲＨ３）のアミノ酸配列から選択される１つ以上の結合ドメインを含む、先行する実施形態のいずれかに記載の結合メンバー。
【0206】
１０．図２ｂの残基２７～３８（ＣＤＲＬ１）、５６～６５（ＣＤＲＬ２）、および１０５～１１３（ＣＤＲＬ３）のアミノ酸配列から選択される１つ以上の結合ドメインを含む、先行する実施形態のいずれかに記載の結合メンバー。
【0207】
１１．前記結合メンバーが、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３のうちの１つ以上を含む軽鎖可変配列であって、
ＬＣＤＲ１が、ＳＳＶＮＹを含み、
ＬＣＤＲ２が、ＤＴＳを含み
ＬＣＤＲ３が、ＦＱＡＳＧＹＰＬＴを含む、
軽鎖可変配列と、
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３のうちの１つ以上を含む重鎖可変配列であって、
ＨＣＤＲ１が、ＧＦＳＬＮＳＹＧを含み、
ＨＣＤＲ２が、ＩＷＧＤＧＳＴを含み、
ＨＣＤＲ３が、ＴＫＰＧＳＧＹＡＦを含む、
重鎖可変配列と
を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の結合メンバー。
ＬＣＤＲ１が、ＳＳＶＮＹを含み、
ＬＣＤＲ２が、ＤＴＳを含み
ＬＣＤＲ３が、ＦＱＡＳＧＹＰＬＴを含む、
軽鎖可変配列と、
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３のうちの１つ以上を含む重鎖可変配列であって、
ＨＣＤＲ１が、ＧＦＳＬＮＳＹＧを含み、
ＨＣＤＲ２が、ＩＷＧＤＧＳＴを含み、
ＨＣＤＲ３が、ＴＫＰＧＳＧＹＡＦを含む、
重鎖可変配列と
を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の結合メンバー。
【0208】
１２．前記結合ドメインが、ヒト抗体フレームワークにより担持されている、先行する実施形態のいずれかに記載の結合メンバー。
【0209】
１３．前記結合メンバーが、図２ａのアミノ酸配列の残基１～１２６を含むＶＨドメイン、および／または図２ｂのアミノ酸配列の残基１～１２３を含むＶＬドメインを含む、先行する実施形態のいずれかに記載の結合メンバー。
【0210】
１４．前記結合メンバーが、ヒト抗体定常領域を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の結合メンバー。
【0211】
１５．前記結合メンバーが、抗体、抗体フラグメント、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄ、またはジアボディである、先行する実施形態のいずれかに記載の結合メンバー。
【0212】
１６．前記結合メンバーが、以下の順で、１）リーダー配列、２）重鎖可変領域、３）３ｘＧＧＧＧＳスペーサー、４）軽鎖可変領域、および５）精製のためのポリ－Ａｌａおよび６×Ｈｉｓタグを含むｓｃＦｖである、先行する実施形態のいずれかに記載の結合メンバー。
【0213】
１７．前記結合メンバーが、以下の順で、１）リーダー配列、２）軽鎖可変領域、３）３ｘＧＧＧＧＳスペーサー、および４）重鎖可変領域を含み、任意選択で５’または３’精製タグをさらに含むｓｃＦｖである、実施形態１～１５のいずれかに記載の結合メンバー。
【0214】
１８．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の形態で提供されている、先行する実施形態のいずれかに記載の結合メンバー。
【0215】
１９．前記結合メンバーが、重鎖－軽鎖の配向または軽鎖－重鎖の配向のいずれかのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の形態で提供されているｓｃＦｖである、実施形態１８に記載の結合メンバー。
【0216】
２０．アゴニスト（ＩｇＧ２）モノクローナル抗体の形態で提供されている、実施形態１～１７のいずれかに記載の結合メンバー。
【0217】
２１．アンタゴニストモノクローナル抗体の形態で提供されている、実施形態１～１７のいずれかに記載の結合メンバー。
【0218】
２２．前記結合メンバーが、モノクローナル、たとえばモノクローナル抗体である、先行する実施形態のいずれかに記載の結合メンバー。
【0219】
２３．前記結合メンバーが、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはベニヤ化抗体である、先行する実施形態のいずれかに記載の結合メンバー。
【0220】
２４．ＳＳＥＡ－４（Ｎｅｕ５Ａｃ（α２－３）Ｇａｌ（β１－３）ＧａｌＮＡｃ（β１－３）Ｇａｌ（α１－４）Ｇａｌ（β１－４）Ｇｌｃ）に特異的に結合でき、実施形態１～２３のいずれか１項で具現化されている単離された特異的な結合メンバーと競合する、単離された特異的な結合メンバー。
【0221】
２５．治療に使用するための、先行する実施形態のいずれかに記載の結合メンバー。
【0222】
２６．がんを予防、処置、または診断する方法に使用するための、実施形態１～２４のいずれかに記載の結合メンバー。
【0223】
２７．長期間ウイルスに感染した患者を処置する方法に使用するための、実施形態１～２４のいずれかに記載の結合メンバー。
【0224】
２８．自己免疫疾患、ＨＩＶ、成人Ｔ細胞白血病、または移植片対宿主病を処置する方法に使用するための、実施形態１～２４のいずれかに記載の結合メンバー。
【0225】
２９．がんを処置または予防する方法であって、実施形態１～２４のいずれかに記載の結合メンバーを、それを必要とする対象に投与するステップを含む、方法。
【0226】
３０．長期間ウイルスに感染した患者を処置または予防する方法であって、実施形態１～２４のいずれかに記載の結合メンバーを、それを必要とする対象に投与するステップを含む、方法。
【0227】
３１．自己免疫疾患、ＨＩＶ、成人Ｔ細胞白血病、または移植片対宿主病を処置または予防する方法であって、実施形態１～２４のいずれかに記載の結合メンバーを、それを必要とする対象に投与するステップを含む、方法。
【0228】
３２．がんに対する防御免疫応答を亢進する方法であって、実施形態１～２４のいずれかに記載の結合メンバーを、それを必要とする対象に投与するステップを含む、方法。
【0229】
３３．前記結合メンバーが、任意選択でがんワクチンであるさらなる免疫原性作用物質と共に投与するように調製されている、実施形態３２に記載の方法。
【0230】
３４．前記結合メンバーおよびさらなる免疫原性作用物質が、同時または連続的に投与するように調製されている、実施形態３３に記載の方法。
【0231】
３５．前記がんが、膵臓がん、胃がん、結腸直腸がん、卵巣がん、または肺がんである、実施形態２５もしくは２６に記載の使用のための結合メンバーまたは実施形態２９に記載の方法。
【0232】
３６．前記結合メンバーが、単独でかもしくは他の処置と組み合わせて投与または投与するように調製される、実施形態２５、２６、もしくは３５に記載の使用のための結合メンバーまたは実施形態２８もしくは実施形態３１に記載の方法。
【0233】
３７．実施形態１～２４のいずれかに記載の結合メンバーをコードする配列を含む核酸。
【0234】
３８．プラスミド、ベクター、転写カセット、または発現カセットの形態のコンストラクトである、実施形態３７に記載の核酸。
【0235】
３９．実施形態３７または３８に記載の核酸を含む組み換え宿主細胞。
【0236】
４０．がんの診断のための方法であって、個体由来のサンプル中の糖脂質に結合したグリカンＳＳＥＡ－４（Ｎｅｕ５Ａｃ（α２－３）Ｇａｌ（β１－３）ＧａｌＮＡｃ（β１－３）Ｇａｌ（α１－４）Ｇａｌ（β１－４）Ｇｌｃ）を検出するために実施形態１～２４のいずれかで具現化された結合メンバーを使用するステップを含む、方法。
【0237】
４１．前記結合メンバーにより検出されるグリカンのパターンを、個体の治療の選択肢を層別化するために使用する、実施形態４０に記載の方法。
【0238】
４２．実施形態１～２４のいずれかに記載の結合メンバーと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【0239】
４３．少なくとも１つまたは他の薬学的に有効な（作用物質）をさらに含む、請求項４２に記載の医薬組成物。
【0240】
４４．がんの処置に使用するための実施形態４２または実施形態４３に記載の医薬組成物。
【0241】
４５．長期間ウイルスに感染した患者の処置に使用するための、実施形態４２または４３に記載の医薬組成物。
【0242】
４６．自己免疫疾患、ＨＩＶ、成人Ｔ細胞白血病、または移植片対宿主病の処置に使用するための、実施形態４２または実施形態４３に記載の医薬組成物。
【0243】
４７．ｅｘ ｖｉｖｏでステムメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の増殖を誘導する方法であって、ステムメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）を実施形態１～２４のいずれかに記載の結合メンバーと接触させるステップを含む、方法。
【0244】
４８．実施形態１～２４のいずれかに記載の結合メンバーを含む、ステムメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の増殖を誘導するための細胞培養培地。
【0245】
４９．ｉｎ ｖｉｖｏでステムメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の増殖を誘導する方法であって、実施形態１～２４のいずれかに記載の結合メンバーを、対象に投与するステップを含む、方法。
【0246】
５０．実施形態１～２４のいずれかに記載の結合メンバーでステムメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）上のＳＳＥＡ－４（Ｎｅｕ５Ａｃ（α２－３）Ｇａｌ（β１－３）ＧａｌＮＡｃ（β１－３）Ｇａｌ（α１－４）Ｇａｌ（β１－４）Ｇｌｃ）の存在を検出することにより、前記細胞を同定する方法。
【0247】
５１．実施形態１～２４のいずれかに記載の結合メンバーでステムメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）上のＳＳＥＡ－４（Ｎｅｕ５Ａｃ（α２－３）Ｇａｌ（β１－３）ＧａｌＮＡｃ（β１－３）Ｇａｌ（α１－４）Ｇａｌ（β１－４）Ｇｌｃ）の存在を検出することにより前記細胞を精製する方法。
【0248】
５２．前記同定または精製を、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで行う、実施形態５０または５１に記載の方法。
【0249】
５３．前記結合メンバーを使用して、精製のためステムメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）を標識する、実施形態５１または５２に記載の方法。
【0250】
５４．任意選択で添付の図面に準拠した、本明細書中実質的に記載される結合メンバー。
【0251】
参照文献
Ａｋｉｎｌｅｙｅ， Ａ．， Ｐ． Ａｖｖａｒｕ， Ｍ． Ｆｕｒｑａｎ， Ｙ． Ｓｏｎｇ， ａｎｄ Ｄ． Ｌｉｕ． ２０１３． ’Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ ３－ｋｉｎａｓｅ （ＰＩ３Ｋ） ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ａｓ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ’， Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ， ６： ８８．
Ａｋｉｎｌｅｙｅ， Ａ．， Ｙ． Ｃｈｅｎ， Ｎ． Ｍｕｋｈｉ， Ｙ． Ｓｏｎｇ， ａｎｄ Ｄ． Ｌｉｕ． ２０１３． ’Ｉｂｒｕｔｉｎｉｂ ａｎｄ ｎｏｖｅｌ ＢＴＫ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ’， Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ， ６： ５９．
Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ． Ｆ．， Ｗ． Ｇｉｓｈ， Ｗ． Ｍｉｌｌｅｒ， Ｅ． Ｗ． Ｍｙｅｒｓ， ａｎｄ Ｄ． Ｊ． Ｌｉｐｍａｎ． １９９０． ’Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ’， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ， ２１５： ４０３－１０．
Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ． Ｆ．， Ｔ． Ｌ． Ｍａｄｄｅｎ， Ａ． Ａ． Ｓｃｈａｆｆｅｒ， Ｊ． Ｚｈａｎｇ， Ｚ． Ｚｈａｎｇ， Ｗ． Ｍｉｌｌｅｒ， ａｎｄ Ｄ． Ｊ． Ｌｉｐｍａｎ． １９９７． ’Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ： ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ’， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ， ２５： ３３８９－４０２．
Ａｕｓｕｂｅｌ， ＦＭ． １９９２． Ｓｈｏｒｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）．
Ｂａｒｂａｓ， Ｃ． Ｆ．， ３ｒｄ， Ｄ． Ｈｕ， Ｎ． Ｄｕｎｌｏｐ， Ｌ． Ｓａｗｙｅｒ， Ｄ． Ｃａｂａｂａ， Ｒ． Ｍ． Ｈｅｎｄｒｙ， Ｐ． Ｌ． Ｎａｒａ， ａｎｄ Ｄ． Ｒ． Ｂｕｒｔｏｎ． １９９４． ’Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｔｏ ｅｎｈａｎｃｅ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ ｂｒｏａｄｅｎ ｓｔｒａｉｎ ｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ’， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ， ９１： ３８０９－１３．
Ｂｅｅｒｓ， Ｓ． Ａ．， Ｍ． Ｊ． Ｇｌｅｎｎｉｅ， ａｎｄ Ａ． Ｌ． Ｗｈｉｔｅ． ２０１６． ’Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｉｓｏｔｙｐｅ ｏｎ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎ’， Ｂｌｏｏｄ， １２７： １０９７－１０１．
Ｂｉｒｄ， Ｒ． Ｅ．， Ｋ． Ｄ． Ｈａｒｄｍａｎ， Ｊ． Ｗ． Ｊａｃｏｂｓｏｎ， Ｓ． Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｂ． Ｍ． Ｋａｕｆｍａｎ， Ｓ． Ｍ． Ｌｅｅ， Ｔ． Ｌｅｅ， Ｓ． Ｈ． Ｐｏｐｅ， Ｇ． Ｓ． Ｒｉｏｒｄａｎ， ａｎｄ Ｍ． Ｗｈｉｔｌｏｗ． １９８８． ’Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｇｅｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ’， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４２： ４２３－６．
Ｂｏｄａｎｚｓｋｙ， Ｍ．， ａｎｄ Ａ． Ｂｏｄａｎｚｓｋｙ． １９８４． Ｔｈｅ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ （Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ： Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）．
Ｂｒｅｔｏｎ， Ｃ． Ｓ．， Ａ． Ｎａｈｉｍａｎａ， Ｄ． Ａｕｂｒｙ， Ｊ． Ｍａｃｏｉｎ， Ｐ． Ｍｏｒｅｔｔｉ， Ｍ． Ｂｅｒｔｓｃｈｉｎｇｅｒ， Ｓ． Ｈｏｕ， Ｍ． Ａ． Ｄｕｃｈｏｓａｌ， ａｎｄ Ｊ． Ｂａｃｋ． ２０１４． ’Ａ ｎｏｖｅｌ ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ （ＧＢＲ ４０１） ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｋｉｌｌｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ Ｂ ｃｅｌｌ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ’， Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ， ７： ３３．
Ｃａｈａｎ， Ｌ． Ｄ．， Ｒ． Ｆ． Ｉｒｉｅ， Ｒ． Ｓｉｎｇｈ， Ａ． Ｃａｓｓｉｄｅｎｔｉ， ａｎｄ Ｊ． Ｃ． Ｐａｕｌｓｏｎ． １９８２． ’Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｒｏｅｃｔｏｄｅｒｍａｌ ｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ （ＯＦＡ－Ｉ－２） ａｓ ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ ＧＤ２’， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ， ７９： ７６２９－３３．
Ｃｈａｈｒｏｕｄｉ， Ａ．， Ｇ． Ｓｉｌｖｅｓｔｒｉ， ａｎｄ Ｍ． Ｌｉｃｈｔｅｒｆｅｌｄ． ２０１５． ’Ｔ ｍｅｍｏｒｙ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ＨＩＶ： ａ ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ’， Ｃｕｒｒ ＨＩＶ／ＡＩＤＳ Ｒｅｐ， １２： ３３－４０．
Ｃｈａｎｇ， Ｗ． Ｗ．， Ｃ． Ｈ． Ｌｅｅ， Ｐ． Ｌｅｅ， Ｊ． Ｌｉｎ， Ｃ． Ｗ． Ｈｓｕ， Ｊ． Ｔ． Ｈｕｎｇ， Ｊ． Ｊ． Ｌｉｎ， Ｊ． Ｃ． Ｙｕ， Ｌ． Ｅ． Ｓｈａｏ， Ｊ． Ｙｕ， Ｃ． Ｈ． Ｗｏｎｇ， ａｎｄ Ａ． Ｌ． Ｙｕ． ２００８． ’Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｇｌｏｂｏ Ｈ ａｎｄ ＳＳＥＡ３ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｆｕｃｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ １ ａｎｄ ２ ｉｎ Ｇｌｏｂｏ Ｈ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ’， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ， １０５： １１６６７－７２．
Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ， Ｍ． Ｎ．， Ｊ． Ｃｈｉｋ， Ｌ． Ｌｅｅ， Ｍ． Ａｎｕｇｒａｈａｍ， Ｊ． Ｌ． Ａｂｒａｈａｍｓ， ａｎｄ Ｎ． Ｈ． Ｐａｃｋｅｒ． ２０１４． ’Ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ’， Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ， １４： ５２５－４６．
Ｃｉｄ， Ｅ．， Ｍ． Ｙａｍａｍｏｔｏ， Ｍ． Ｂｕｓｃｈｂｅｃｋ， ａｎｄ Ｆ． Ｙａｍａｍｏｔｏ． ２０１３． ’Ｍｕｒｉｎｅ ｃｅｌｌ ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄｓ ｃｕｓｔｏｍｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ｍｏｄｕｌａｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ’， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ， ８： ｅ６４７２８．
Ｃｉｅｒｉ， Ｎ．， Ｂ． Ｃａｍｉｓａ， Ｆ． Ｃｏｃｃｈｉａｒｅｌｌａ， Ｍ． Ｆｏｒｃａｔｏ， Ｇ． Ｏｌｉｖｅｉｒａ， Ｅ． Ｐｒｏｖａｓｉ， Ａ． Ｂｏｎｄａｎｚａ， Ｃ． Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎ， Ｊ． Ｐｅｃｃａｔｏｒｉ， Ｆ． Ｃｉｃｅｒｉ， Ｍ． Ｔ． Ｌｕｐｏ－Ｓｔａｎｇｈｅｌｌｉｎｉ， Ｆ． Ｍａｖｉｌｉｏ， Ａ． Ｍｏｎｄｉｎｏ， Ｓ． Ｂｉｃｃｉａｔｏ， Ａ． Ｒｅｃｃｈｉａ， ａｎｄ Ｃ． Ｂｏｎｉｎｉ． ２０１３． ’ＩＬ－７ ａｎｄ ＩＬ－１５ ｉｎｓｔｒｕｃｔ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｅｍｏｒｙ ｓｔｅｍ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｎａｉｖｅ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ’， Ｂｌｏｏｄ， １２１： ５７３－８４．
Ｃｏｏｌｉｎｇ， Ｌ．， ａｎｄ Ｄ． Ｈｗａｎｇ． ２００５． ’Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｂ２， ａ ｍａｒｋｅｒ ｏｆ ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｓｙｍｐａｔｈｏａｄｒｅｎａｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ， ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｓ ｔｈｅ Ｌｕｋｅ （ＬＫＥ） ａｎｔｉｇｅｎ’， Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ， ４５： ７０９－１６．
Ｃｏｕｌｉｅ， Ｐ． Ｇ．， Ｂ． Ｊ． Ｖａｎ ｄｅｎ Ｅｙｎｄｅ， Ｐ． ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｒｕｇｇｅｎ， ａｎｄ Ｔ． Ｂｏｏｎ． ２０１４． ’Ｔｕｍｏｕｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ： ａｔ ｔｈｅ ｃｏｒｅ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ’， Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ， １４： １３５－４６．
Ｄａｌｚｉｅｌ， Ｍ．， Ｍ． Ｃｒｉｓｐｉｎ， Ｃ． Ｎ． Ｓｃａｎｌａｎ， Ｎ． Ｚｉｔｚｍａｎｎ， ａｎｄ Ｒ． Ａ． Ｄｗｅｋ． ２０１４． ’Ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｘｐｌｏｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ’， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３４３： １２３５６８１．
Ｄａｎｉｏｔｔｉ， Ｊ． Ｌ．， Ａ． Ａ． Ｖｉｌｃａｅｓ， Ｖ． Ｔｏｒｒｅｓ Ｄｅｍｉｃｈｅｌｉｓ， Ｆ． Ｍ． Ｒｕｇｇｉｅｒｏ， ａｎｄ Ｍ． Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ－Ｗａｌｋｅｒ． ２０１３． ’Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ： ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ’， Ｆｒｏｎｔ Ｏｎｃｏｌ， ３： ３０６．
Ｄａｒｌａｋ， Ｋ． Ａ．， Ｙ． Ｗａｎｇ， Ｊ． Ｍ． Ｌｉ， Ｗ． Ａ． Ｈａｒｒｉｓ， Ｃ． Ｒ． Ｇｉｖｅｒ， Ｃ． Ｈｕａｎｇ， ａｎｄ Ｅ． Ｋ． Ｗａｌｌｅｒ． ２０１４． ’Ｈｏｓｔ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ－ｄｅｒｉｖｅｄ ＩＬ－１２ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｄｏｎｏｒ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ’， Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ， ７： １６．
Ｄｉ Ｂｅｎｅｄｅｔｔｏ， Ｓ．， Ｅ． Ｄｅｒｈｏｖａｎｅｓｓｉａｎ， Ｅ． Ｓｔｅｉｎｈａｇｅｎ－Ｔｈｉｅｓｓｅｎ， Ｄ． Ｇｏｌｄｅｃｋ， Ｌ． Ｍｕｌｌｅｒ， ａｎｄ Ｇ． Ｐａｗｅｌｅｃ． ２０１５． ’Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ａｇｅ， ｓｅｘ ａｎｄ ＣＭＶ－ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｔ ｃｅｌｌ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ： ｒｅｓｕｌｔｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｂｅｒｌｉｎ ＢＡＳＥ－ＩＩ Ｓｔｕｄｙ’， Ｂｉｏｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ， １６： ６３１－４３．
Ｅｐｐｓｔｅｉｎ， Ｄ． Ａ．， Ｙ． Ｖ． Ｍａｒｓｈ， Ｍ． ｖａｎ ｄｅｒ Ｐａｓ， Ｐ． Ｌ． Ｆｅｌｇｎｅｒ， ａｎｄ Ａ． Ｂ． Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ． １９８５． ’Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｌｉｐｏｓｏｍｅ－ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｍｕｒｉｎｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｇａｍｍａ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ａ ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ’， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ， ８２： ３６８８－９２．
Ｆｕｅｒｔｅｓ Ｍａｒｒａｃｏ， Ｓ． Ａ．， Ｃ． Ｓｏｎｅｓｏｎ， Ｌ． Ｃａｇｎｏｎ， Ｐ． Ｏ． Ｇａｎｎｏｎ， Ｍ． Ａｌｌａｒｄ， Ｓ． Ａｂｅｄ Ｍａｉｌｌａｒｄ， Ｎ． Ｍｏｎｔａｎｄｏｎ， Ｎ． Ｒｕｆｅｒ， Ｓ． Ｗａｌｄｖｏｇｅｌ， Ｍ． Ｄｅｌｏｒｅｎｚｉ， ａｎｄ Ｄ． Ｅ． Ｓｐｅｉｓｅｒ． ２０１５． ’Ｌｏｎｇ－ｌａｓｔｉｎｇ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ－ｌｉｋｅ ｍｅｍｏｒｙ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ａ ｎａｉｖｅ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｆｉｌｅ ｕｐｏｎ ｙｅｌｌｏｗ ｆｅｖｅｒ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ’， Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ， ７： ２８２ｒａ４８．
Ｆｕｓｔｅｒ， Ｍ． Ｍ．， ａｎｄ Ｊ． Ｄ． Ｅｓｋｏ． ２００５． ’Ｔｈｅ ｓｗｅｅｔ ａｎｄ ｓｏｕｒ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ： ｇｌｙｃａｎｓ ａｓ ｎｏｖｅｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔｓ’， Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ， ５： ５２６－４２．
Ｇａｎｇ， Ｅ． Ｊ．， Ｄ． Ｂｏｓｎａｋｏｖｓｋｉ， Ｃ． Ａ． Ｆｉｇｕｅｉｒｅｄｏ， Ｊ． Ｗ． Ｖｉｓｓｅｒ， ａｎｄ Ｒ． Ｃ． Ｐｅｒｌｉｎｇｅｉｒｏ． ２００７． ’ＳＳＥＡ－４ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ’， Ｂｌｏｏｄ， １０９： １７４３－５１．
Ｇａｒｒｉｄｏ， Ｆ．， Ｔ． Ｃａｂｒｅｒａ， Ａ． Ｃｏｎｃｈａ， Ｓ． Ｇｌｅｗ， Ｆ． Ｒｕｉｚ－Ｃａｂｅｌｌｏ， ａｎｄ Ｐ． Ｌ． Ｓｔｅｒｎ． １９９３． ’Ｎａｔｕｒａｌ ｈｉｓｔｏｒｙ ｏｆ ＨＬＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｔｕｍｏｕｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ’， Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ， １４： ４９１－９．
Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ， Ｌ．， Ｅ． Ｌｕｇｌｉ， Ｙ． Ｊｉ， Ｚ． Ｐｏｓ， Ｃ． Ｍ． Ｐａｕｌｏｓ， Ｍ． Ｆ． Ｑｕｉｇｌｅｙ， Ｊ． Ｒ． Ａｌｍｅｉｄａ， Ｅ． Ｇｏｓｔｉｃｋ， Ｚ． Ｙｕ， Ｃ． Ｃａｒｐｅｎｉｔｏ， Ｅ． Ｗａｎｇ， Ｄ． Ｃ． Ｄｏｕｅｋ， Ｄ． Ａ． Ｐｒｉｃｅ， Ｃ． Ｈ． Ｊｕｎｅ， Ｆ． Ｍ． Ｍａｒｉｎｃｏｌａ， Ｍ． Ｒｏｅｄｅｒｅｒ， ａｎｄ Ｎ． Ｐ． Ｒｅｓｔｉｆｏ． ２０１１． ’Ａ ｈｕｍａｎ ｍｅｍｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌ ｓｕｂｓｅｔ ｗｉｔｈ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ’， Ｎａｔ Ｍｅｄ， １７： １２９０－７．
Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ， Ｌ．， ａｎｄ Ｎ． Ｐ． Ｒｅｓｔｉｆｏ． ２０１３． ’Ｍｏｖｉｎｇ Ｔ ｍｅｍｏｒｙ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃ’， Ｂｌｏｏｄ， １２１： ５６７－８．
Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ， Ｌ．， Ｄ． Ｅ． Ｓｐｅｉｓｅｒ， Ｍ． Ｌｉｃｈｔｅｒｆｅｌｄ， ａｎｄ Ｃ． Ｂｏｎｉｎｉ． ２０１７． ’Ｔ ｍｅｍｏｒｙ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ’， Ｎａｔ Ｍｅｄ， ２３： １８－２７．
Ｇｏｔｔｓｃｈｌｉｎｇ， Ｓ．， Ｋ． Ｊｅｎｓｅｎ， Ａ． Ｗａｒｔｈ， Ｆ． Ｊ． Ｈｅｒｔｈ， Ｍ． Ｔｈｏｍａｓ， Ｐ． Ａ． Ｓｃｈｎａｂｅｌ， ａｎｄ Ｅ． Ｈｅｒｐｅｌ． ２０１３． ’Ｓｔａｇｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ－４ ｉｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｂａｓａｌｏｉｄ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｏｏｒ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ’， Ｅｕｒ Ｒｅｓｐｉｒ Ｊ， ４１： ６５６－６３．
Ｇｒａｍ， Ｈ．， Ｌ． Ａ． Ｍａｒｃｏｎｉ， Ｃ． Ｆ． Ｂａｒｂａｓ， ３ｒｄ， Ｔ． Ａ． Ｃｏｌｌｅｔ， Ｒ． Ａ． Ｌｅｒｎｅｒ， ａｎｄ Ａ． Ｓ． Ｋａｎｇ． １９９２． ’Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ａ ｎａｉｖｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｌｉｂｒａｒｙ’， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ， ８９： ３５７６－８０．
Ｈａｋｏｍｏｒｉ， Ｓ． ２００２． ’Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｄｅｆｉｎｉｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ： ｎｅｗ ｗｉｎｅ ｉｎ ａｎ ｏｌｄ ｂｏｔｔｌｅ’， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ， ９９： １０２３１－３．
Ｈａｋｏｍｏｒｉ， Ｓ． Ｉ． ２００８． ’Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｏｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄｓ ａｎｄ ｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄｓ： ｒｅｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｔｒｅｎｄｓ’， Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ， １７８０： ３２５－４６．
Ｈａｋｏｍｏｒｉ， Ｓ．， ａｎｄ Ｙ． Ｚｈａｎｇ． １９９７． ’Ｇｌｙｃｏｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄ ａｎｔｉｇｅｎｓ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ’， Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ， ４： ９７－１０４．
Ｈａｎ， Ｅ． Ｑ．， Ｘ． Ｌ． Ｌｉ， Ｃ． Ｒ． Ｗａｎｇ， Ｔ． Ｆ． Ｌｉ， ａｎｄ Ｓ． Ｙ． Ｈａｎ． ２０１３． ’Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ： ｐｒｏｇｒｅｓｓ ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ’， Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ， ６： ４７．
Ｈａｒｉｃｈａｎｄａｎ， Ａ．， Ｋ． Ｓｉｖａｓｕｂｒａｍａｎｉｙａｎ， ａｎｄ Ｈ． Ｊ． Ｂｕｈｒｉｎｇ． ２０１３． ’Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ－ｄｅｒｉｖｅｄ ＭＳＣｓ’， Ａｄｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｅｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， １２９： １－１７．
Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ， Ｊ． Ｋ．， Ｊ． Ｓ． Ｄｒａｐｅｒ， Ｈ． Ｓ． Ｂａｉｌｌｉｅ， Ｓ． Ｆｉｓｈｅｌ， Ｊ． Ａ． Ｔｈｏｍｓｏｎ， Ｈ． Ｍｏｏｒｅ， ａｎｄ Ｐ． Ｗ． Ａｎｄｒｅｗｓ． ２００２． ’Ｐｒｅｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｓ ａｎｄ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｓｈｏｗ ｃｏｍｐａｒａｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｓｔａｇｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎｓ’， Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ， ２０： ３２９－３７．
Ｈｏｌｌｉｇｅｒ， Ｐ．， Ｔ． Ｐｒｏｓｐｅｒｏ， ａｎｄ Ｇ． Ｗｉｎｔｅｒ． １９９３． ’”Ｄｉａｂｏｄｉｅｓ”： ｓｍａｌｌ ｂｉｖａｌｅｎｔ ａｎｄ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ’， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ， ９０： ６４４４－８．
Ｈｏｌｌｉｇｅｒ， Ｐ．， ａｎｄ Ｇ． Ｗｉｎｔｅｒ． １９９３． ’Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ’， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， ４： ４４６－９．
Ｈｏｓｏｋａｗａ， Ｔ．， Ｔ． Ｋｉｍｕｒａ， Ｓ． Ｎａｄａ， Ｔ． Ｏｋｕｎｏ， Ｄ． Ｉｔｏ， Ｓ． Ｋａｎｇ， Ｓ． Ｎｏｊｉｍａ， Ｋ． Ｙａｍａｓｈｉｔａ， Ｔ． Ｎａｋａｔａｎｉ， Ｙ． Ｈａｙａｍａ， Ｙ． Ｋａｔｏ， Ｙ． Ｋｉｎｅｈａｒａ， Ｍ． Ｎｉｓｈｉｄｅ， Ｎ． Ｍｉｋａｍｉ， Ｓ． Ｋｏｙａｍａ， Ｈ． Ｔａｋａｍａｔｓｕ， Ｄ． Ｏｋｕｚａｋｉ， Ｎ． Ｏｈｋｕｒａ， Ｓ． Ｓａｋａｇｕｃｈｉ， Ｍ． Ｏｋａｄａ， ａｎｄ Ａ． Ｋｕｍａｎｏｇｏｈ． ２０１７． ’Ｌａｍｔｏｒ１ Ｉｓ Ｃｒｉｔｉｃａｌｌｙ Ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ＣＤ４（＋） Ｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ’， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ， １９９： ２００８－１９．
Ｈｕａｎｇ， Ｙ． Ｌ．， Ｊ． Ｔ． Ｈｕｎｇ， Ｓ． Ｋ． Ｃｈｅｕｎｇ， Ｈ． Ｙ． Ｌｅｅ， Ｋ． Ｃ． Ｃｈｕ， Ｓ． Ｔ． Ｌｉ， Ｙ． Ｃ． Ｌｉｎ， Ｃ． Ｔ． Ｒｅｎ， Ｔ． Ｊ． Ｃｈｅｎｇ， Ｔ． Ｌ． Ｈｓｕ， Ａ． Ｌ． Ｙｕ， Ｃ． Ｙ． Ｗｕ， ａｎｄ Ｃ． Ｈ． Ｗｏｎｇ． ２０１３． ’Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ－ｂａｓｅｄ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｗｉｔｈ ａ ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄ ａｄｊｕｖａｎｔ ｆｏｒ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ’， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ， １１０： ２５１７－２２．
Ｈｕｓｔｏｎ， Ｊ． Ｓ．， Ｄ． Ｌｅｖｉｎｓｏｎ， Ｍ． Ｍｕｄｇｅｔｔ－Ｈｕｎｔｅｒ， Ｍ． Ｓ． Ｔａｉ， Ｊ． Ｎｏｖｏｔｎｙ， Ｍ． Ｎ． Ｍａｒｇｏｌｉｅｓ， Ｒ． Ｊ． Ｒｉｄｇｅ， Ｒ． Ｅ． Ｂｒｕｃｃｏｌｅｒｉ， Ｅ． Ｈａｂｅｒ， Ｒ． Ｃｒｅａ， ａｎｄ ｅｔ ａｌ． １９８８． ’Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ： ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ａｎ ａｎｔｉ－ｄｉｇｏｘｉｎ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ ａｎａｌｏｇｕｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ’， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ， ８５： ５８７９－８３．
Ｈｗａｎｇ， Ｋ． Ｊ．， Ｋ． Ｆ． Ｌｕｋ， ａｎｄ Ｐ． Ｌ． Ｂｅａｕｍｉｅｒ． １９８０． ’Ｈｅｐａｔｉｃ ｕｐｔａｋｅ ａｎｄ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ／ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ： ａ ｋｉｎｅｔｉｃ ｓｔｕｄｙ’， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ， ７７： ４０３０－４．
Ｊｅｓｐｅｒｓ， Ｌ． Ｓ．， Ａ． Ｒｏｂｅｒｔｓ， Ｓ． Ｍ． Ｍａｈｌｅｒ， Ｇ． Ｗｉｎｔｅｒ， ａｎｄ Ｈ． Ｒ． Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ． １９９４． ’Ｇｕｉｄｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ ｔｏ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｅｐｉｔｏｐｅ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉｇｅｎ’， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （Ｎ Ｙ）， １２： ８９９－９０３．
Ｊｕｎｇｈａｎｓ， Ｒ． Ｐ．， Ｔ． Ａ． Ｗａｌｄｍａｎｎ， Ｎ． Ｆ． Ｌａｎｄｏｌｆｉ， Ｎ． Ｍ． Ａｖｄａｌｏｖｉｃ， Ｗ． Ｐ． Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ， ａｎｄ Ｃ． Ｑｕｅｅｎ． １９９０． ’Ａｎｔｉ－Ｔａｃ－Ｈ， ａ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｗｉｔｈ ｎｅｗ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ’， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ５０： １４９５－５０２．
Ｋａｎｎａｇｉ， Ｒ．， Ｎ． Ａ． Ｃｏｃｈｒａｎ， Ｆ． Ｉｓｈｉｇａｍｉ， Ｓ． Ｈａｋｏｍｏｒｉ， Ｐ． Ｗ． Ａｎｄｒｅｗｓ， Ｂ． Ｂ． Ｋｎｏｗｌｅｓ， ａｎｄ Ｄ． Ｓｏｌｔｅｒ． １９８３． ’Ｓｔａｇｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎｓ （ＳＳＥＡ－３ ａｎｄ －４） ａｒｅ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｏｆ ａ ｕｎｉｑｕｅ ｇｌｏｂｏ－ｓｅｒｉｅｓ ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ’， ＥＭＢＯ Ｊ， ２： ２３５５－６１．
Ｋａｒｌｉｎ， Ｓ．， ａｎｄ Ｓ． Ｆ． Ａｌｔｓｃｈｕｌ． １９９０． ’Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ａｓｓｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｇｅｎｅｒａｌ ｓｃｏｒｉｎｇ ｓｃｈｅｍｅｓ’， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ， ８７： ２２６４－８．
－－－． １９９３． ’Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｈｉｇｈ－ｓｃｏｒｉｎｇ ｓｅｇｍｅｎｔｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ’， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ， ９０： ５８７３－７．
Ｋｌｅｂａｎｏｆｆ， Ｃ． Ａ．， Ｌ． Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ， ａｎｄ Ｎ． Ｐ． Ｒｅｓｔｉｆｏ． ２０１２． ’Ｓｏｒｔｉｎｇ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｕｂｓｅｔｓ： ｗｈｉｃｈ Ｔ－ｃｅｌｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｍｅｄｉａｔｅ ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｄｏｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ？’， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ， ３５： ６５１－６０．
Ｌａｕ， Ｋ． Ｓ．， ａｎｄ Ｊ． Ｗ． Ｄｅｎｎｉｓ． ２００８． ’Ｎ－Ｇｌｙｃａｎｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ’， Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ， １８： ７５０－６０．
Ｌｅｆｒａｎｃ， Ｍ． Ｐ．， Ｆ． Ｅｈｒｅｎｍａｎｎ， Ｓ． Ｋｏｓｓｉｄａ， Ｖ． Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉ， ａｎｄ Ｐ． Ｄｕｒｏｕｘ． ２０１８． ’Ｕｓｅ ｏｆ ＩＭＧＴ（（Ｒ）） Ｄａｔａｂａｓｅｓ ａｎｄ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ’， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ， １８２７： ３５－６９．
Ｌｉ， Ｇ．， Ｑ． Ｙａｎｇ， Ｙ． Ｚｈｕ， Ｈ． Ｒ． Ｗａｎｇ， Ｘ． Ｃｈｅｎ， Ｘ． Ｚｈａｎｇ， ａｎｄ Ｂ． Ｌｕ． ２０１３． ’Ｔ－Ｂｅｔ ａｎｄ Ｅｏｍｅｓ Ｒｅｇｕｌａｔｅ ｔｈｅ Ｂａｌａｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ／Ｃｅｎｔｒａｌ Ｍｅｍｏｒｙ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｖｅｒｓｕｓ Ｍｅｍｏｒｙ Ｓｔｅｍ Ｌｉｋｅ Ｔ Ｃｅｌｌｓ’， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ， ８： ｅ６７４０１．
Ｌｏｕ， Ｙ． Ｗ．， Ｐ． Ｙ． Ｗａｎｇ， Ｓ． Ｃ． Ｙｅｈ， Ｐ． Ｋ． Ｃｈｕａｎｇ， Ｓ． Ｔ． Ｌｉ， Ｃ． Ｙ． Ｗｕ， Ｋ． Ｈ． Ｋｈｏｏ， Ｍ． Ｈｓｉａｏ， Ｔ． Ｌ． Ｈｓｕ， ａｎｄ Ｃ． Ｈ． Ｗｏｎｇ． ２０１４． ’Ｓｔａｇｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ－４ ａｓ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔ ｉｎ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｃａｎｃｅｒｓ’， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ， １１１： ２４８２－７．
Ｌｕｇｌｉ， Ｅ．， Ｍ． Ｈ． Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ， Ｌ． Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ， Ｐ． Ｋ． Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙ， Ｄ． Ｌ． Ｂｏｌｔｏｎ， Ｋ． Ｓｏｎｇ， Ｎ． Ｒ． Ｋｌａｔｔ， Ｊ． Ｍ． Ｂｒｅｎｃｈｌｅｙ， Ｍ． Ｖａｃｃａｒｉ， Ｅ． Ｇｏｓｔｉｃｋ， Ｄ． Ａ． Ｐｒｉｃｅ， Ｔ． Ａ． Ｗａｌｄｍａｎｎ， Ｎ． Ｐ． Ｒｅｓｔｉｆｏ， Ｇ． Ｆｒａｎｃｈｉｎｉ， ａｎｄ Ｍ． Ｒｏｅｄｅｒｅｒ． ２０１３． ’Ｓｕｐｅｒｉｏｒ Ｔ ｍｅｍｏｒｙ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ ｓｕｐｐｏｒｔｓ ｌｏｎｇ－ｌｉｖｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｍｅｍｏｒｙ’， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ， １２３： ５９４－９．
Ｌｕｇｌｉ， Ｅ．， Ｌ． Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ， Ａ． Ｒｏｂｅｒｔｏ， Ｄ． Ｍａｖｉｌｉｏ， Ｄ． Ａ． Ｐｒｉｃｅ， Ｎ． Ｐ． Ｒｅｓｔｉｆｏ， ａｎｄ Ｍ． Ｒｏｅｄｅｒｅｒ． ２０１３． ’Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｎｏｎｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅ Ｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｍｅｍｏｒｙ ｃｅｌｌｓ’， Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ， ８： ３３－４２．
Ｍａｈｎｋｅ， Ｙ． Ｄ．， Ｔ． Ｍ． Ｂｒｏｄｉｅ， Ｆ． Ｓａｌｌｕｓｔｏ， Ｍ． Ｒｏｅｄｅｒｅｒ， ａｎｄ Ｅ． Ｌｕｇｌｉ． ２０１３． ’Ｔｈｅ ｗｈｏ’ｓ ｗｈｏ ｏｆ Ｔ－ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ： ｈｕｍａｎ ｍｅｍｏｒｙ Ｔ－ｃｅｌｌ ｓｕｂｓｅｔｓ’， Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ， ４３： ２７９７－８０９．
Ｍａｒｋｓ， Ｊ． Ｄ．， Ａ． Ｄ． Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ， Ｍ． Ｍａｌｍｑｖｉｓｔ， Ｔ． Ｐ． Ｃｌａｃｋｓｏｎ， Ｊ． Ｍ． Ｂｙｅ， ａｎｄ Ｇ． Ｗｉｎｔｅｒ． １９９２． ’Ｂｙ－ｐａｓｓｉｎｇ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ： ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｈｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ ｃｈａｉｎ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ’， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （Ｎ Ｙ）， １０： ７７９－８３．
Ｍａｒｔｉｎ， Ｐ． Ｊ． ２０１４． ’Ｒｅｖｅｒｓｉｎｇ ＣＤ８＋ Ｔ－ｃｅｌｌ ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＤＬＩ’， Ｂｌｏｏｄ， １２３： １２８９－９０．
Ｍａｔｅｕｓ， Ｊ．， Ｐ． Ｌａｓｓｏ， Ｐ． Ｐａｖｉａ， Ｆ． Ｒｏｓａｓ， Ｎ． Ｒｏａ， Ｃ． Ａ． Ｖａｌｅｎｃｉａ－Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ， Ｊ． Ｍ． Ｇｏｎｚａｌｅｚ， Ｃ． Ｊ． Ｐｕｅｒｔａ， ａｎｄ Ａ． Ｃｕｅｌｌａｒ． ２０１５． ’Ｌｏｗ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ＣＤ８＋ Ｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｍｅｍｏｒｙ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｃｈａｇａｓｉｃ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｓｅｖｅｒｅ ｆｏｒｍｓ ｏｆ ｔｈｅ ｄｉｓｅａｓｅ’， ＰＬｏＳ Ｎｅｇｌ Ｔｒｏｐ Ｄｉｓ， ９： ｅ３４３２．
Ｍｅｅｚａｎ， Ｅ．， Ｈ． Ｃ． Ｗｕ， Ｐ． Ｈ． Ｂｌａｃｋ， ａｎｄ Ｐ． Ｗ． Ｒｏｂｂｉｎｓ． １９６９． ’Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ ｖｉｒｕｓ－ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｍｏｕｓｅ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ． ＩＩ． Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅｓ ｂｙ ｓｅｐｈａｄｅｘ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ’， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ８： ２５１８－２４．
Ｍｅｔｈｅｒｉｎｇｈａｍ， Ｒ． Ｌ．， Ｖ． Ａ． Ｐｕｄｎｅｙ， Ｂ． Ｇｕｎｎ， Ｍ． Ｔｏｗｅｙ， Ｉ． Ｓｐｅｎｄｌｏｖｅ， ａｎｄ Ｌ． Ｇ． Ｄｕｒｒａｎｔ． ２００９． ’Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｓ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｃａｎｃｅｒ ｖａｃｃｉｎｅｓ’， ＭＡｂｓ， １： ７１－８５．
Ｍｅｚｚａｎｚａｎｉｃａ， Ｄ．， Ｓ． Ｃａｎｅｖａｒｉ， Ａ． Ｍａｚｚｏｎｉ， Ｍ． Ｆｉｇｉｎｉ， Ｍ． Ｉ． Ｃｏｌｎａｇｈｉ， Ｔ． Ｗａｋｓ， Ｄ． Ｇ． Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ， ａｎｄ Ｚ． Ｅｓｈｈａｒ． １９９８． ’Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇｅｎｅ ｍａｄｅ ｏｆ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｔｕｍｏｒ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｎｆｅｒｓ ａｎｔｉｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ’， Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ， ５： ４０１－７．
Ｍｙｅｒｓ， Ｅ． Ｗ．， ａｎｄ Ｗ． Ｍｉｌｌｅｒ． １９８９． ’Ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅ ｍａｔｃｈｉｎｇ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ’， Ｂｕｌｌ Ｍａｔｈ Ｂｉｏｌ， ５１： ５－３７．
Ｎｉｌｓｓｏｎ， Ｏ．， Ｆ． Ｔ． Ｂｒｅｚｉｃｋａ， Ｊ． Ｈｏｌｍｇｒｅｎ， Ｓ． Ｓｏｒｅｎｓｏｎ， Ｌ． Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ， Ｆ． Ｙｎｇｖａｓｏｎ， ａｎｄ Ｌ． Ｌｉｎｄｈｏｌｍ． １９８６． ’Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ ａｎｔｉｇｅｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ｕｓｉｎｇ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ａｇａｉｎｓｔ ｆｕｃｏｓｙｌ－ＧＭ１’， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ４６： １４０３－７．
Ｎｏｔｏ， Ｚ．， Ｔ． Ｙｏｓｈｉｄａ， Ｍ． Ｏｋａｂｅ， Ｃ． Ｋｏｉｋｅ， Ｍ． Ｆａｔｈｙ， Ｈ． Ｔｓｕｎｏ， Ｋ． Ｔｏｍｉｈａｒａ， Ｎ． Ａｒａｉ， Ｍ． Ｎｏｇｕｃｈｉ， ａｎｄ Ｔ． Ｎｉｋａｉｄｏ． ２０１３． ’ＣＤ４４ ａｎｄ ＳＳＥＡ－４ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ａｎ ｏｒａｌ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ＨＳＣ－４ ｐｏｓｓｅｓｓ ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ－ｌｉｋｅ ｃｅｌｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ’， Ｏｒａｌ Ｏｎｃｏｌ， ４９： ７８７－９５．
Ｎｏｖｅｒｏ， Ａ．， Ｐ． Ｍ． Ｒａｖｅｌｌａ， Ｙ． Ｃｈｅｎ， Ｇ． Ｄｏｕｓ， ａｎｄ Ｄ． Ｌｉｕ． ２０１４． ’Ｉｂｒｕｔｉｎｉｂ ｆｏｒ Ｂ ｃｅｌｌ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ’， Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ， ３： ４．
Ｎｕｄｅｌｍａｎ， Ｅ．， Ｓ． Ｈａｋｏｍｏｒｉ， Ｒ． Ｋａｎｎａｇｉ， Ｓ． Ｌｅｖｅｒｙ， Ｍ． Ｙ． Ｙｅｈ， Ｋ． Ｅ． Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ， ａｎｄ Ｉ． Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ． １９８２． ’Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ ｍｅｌａｎｏｍａ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｄｅｆｉｎｅｄ ｂｙ ａ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ， ４．２’， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ２５７： １２７５２－６．
Ｐｅａｒｓｏｎ， Ｗ． Ｒ．， ａｎｄ Ｄ． Ｊ． Ｌｉｐｍａｎ． １９８８． ’Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ’， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ， ８５： ２４４４－８．
Ｐｉｌｉｐｏｗ， Ｋ．， Ｅ． Ｓｃａｍａｒｄｅｌｌａ， Ｓ． Ｐｕｃｃｉｏ， Ｓ． Ｇａｕｔａｍ， Ｆ． Ｄｅ Ｐａｏｌｉ， Ｅ． Ｍ． Ｍａｚｚａ， Ｇ． Ｄｅ Ｓｉｍｏｎｅ， Ｓ． Ｐｏｌｌｅｔｔｉ， Ｍ． Ｂｕｃｃｉｌｌｉ， Ｖ． Ｚａｎｏｎ， Ｐ． Ｄｉ Ｌｕｃｉａ， Ｍ． Ｉａｎｎａｃｏｎｅ， Ｌ． Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ， ａｎｄ Ｅ． Ｌｕｇｌｉ． ２０１８． ’Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ＣＤ８＋ Ｔ ｍｅｍｏｒｙ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ’， ＪＣＩ Ｉｎｓｉｇｈｔ， ３．
Ｐｉｎｔｏ， Ｊ． Ｐ．， Ｒ． Ｋ． Ｋａｌａｔｈｕｒ， Ｄ． Ｖ． Ｏｌｉｖｅｉｒａ， Ｔ． Ｂａｒａｔａ， Ｒ． Ｓ． Ｍａｃｈａｄｏ， Ｓ． Ｍａｃｈａｄｏ， Ｉ． Ｐａｃｈｅｃｏ－Ｌｅｙｖａ， Ｉ． Ｄｕａｒｔｅ， ａｎｄ Ｍ． Ｅ． Ｆｕｔｓｃｈｉｋ． ２０１５． ’ＳｔｅｍＣｈｅｃｋｅｒ： ａ ｗｅｂ－ｂａｓｅｄ ｔｏｏｌ ｔｏ ｄｉｓｃｏｖｅｒ ａｎｄ ｅｘｐｌｏｒｅ ｓｔｅｍｎｅｓｓ ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ ｉｎ ｇｅｎｅ ｓｅｔｓ’， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ， ４３： Ｗ７２－７．
Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ， Ａ． １９９１． ’Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ： ａｄｖａｎｃｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍｓ’， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （Ｎ Ｙ）， ９： ５４５－５１．
Ｒａｐｈａｅｌ， Ｉ．， Ｓ． Ｎａｌａｗａｄｅ， Ｔ． Ｎ． Ｅａｇａｒ， ａｎｄ Ｔ． Ｇ． Ｆｏｒｓｔｈｕｂｅｒ． ２０１５． ’Ｔ ｃｅｌｌ ｓｕｂｓｅｔｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｉｎ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ａｎｄ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｉｓｅａｓｅｓ’， Ｃｙｔｏｋｉｎｅ， ７４： ５－１７．
Ｒｅｆｆ， Ｍ． Ｅ． １９９３． ’Ｈｉｇｈ－ｌｅｖｅｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ’， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， ４： ５７３－６．
Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ， ＲＰ． １９８０． Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｓｃｉｅｎｃｅｓ （Ｍａｃｋ Ｐｕｂ． Ｃｏ．）．
Ｒｅｓｔｉｆｏ， Ｎ． Ｐ．， ａｎｄ Ｌ． Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ． ２０１３． ’Ｌｉｎｅａｇｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｏｆ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ａｎｄ ｍｅｍｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ’， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ， ２５： ５５６－６３．
Ｓａｉｔｏ， Ｓ．， Ｈ． Ａｏｋｉ， Ａ． Ｉｔｏ， Ｓ． Ｕｅｎｏ， Ｔ． Ｗａｄａ， Ｋ． Ｍｉｔｓｕｚｕｋａ， Ｍ． Ｓａｔｏｈ， Ｙ． Ａｒａｉ， ａｎｄ Ｔ． Ｍｉｙａｇｉ． ２００３． ’Ｈｕｍａｎ ａｌｐｈａ２，３－ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ （ＳＴ３Ｇａｌ ＩＩ） ｉｓ ａ ｓｔａｇｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ－４ ｓｙｎｔｈａｓｅ’， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ２７８： ２６４７４－９．
Ｓａｉｔｏ， Ｓ．， Ｓ． Ｏｒｉｋａｓａ， Ｍ． Ｓａｔｏｈ， Ｃ． Ｏｈｙａｍａ， Ａ． Ｉｔｏ， ａｎｄ Ｔ． Ｔａｋａｈａｓｈｉ． １９９７． ’Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｇｌｏｂｏ－ｓｅｒｉｅｓ ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｒｅｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ’， Ｊｐｎ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ８８： ６５２－９．
Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． １９８９． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）．
Ｓａｎｄｓｔｅｄｔ， Ｊ．， Ｍ． Ｊｏｎｓｓｏｎ， Ｋ． Ｖｕｋｕｓｉｃ， Ｇ． Ｄｅｌｌｇｒｅｎ， Ａ． Ｌｉｎｄａｈｌ， Ａ． Ｊｅｐｐｓｓｏｎ， ａｎｄ Ｊ． Ａｓｐ． ２０１４． ’ＳＳＥＡ－４＋ ＣＤ３４－ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｄｕｌｔ ｈｕｍａｎ ｈｅａｒｔ ｓｈｏｗ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ’， Ｃｅｌｌｓ Ｔｉｓｓｕｅｓ Ｏｒｇａｎｓ， １９９： １０３－１６．
Ｓｃｈｉｅｒ， Ｒ．， Ａ． ＭｃＣａｌｌ， Ｇ． Ｐ． Ａｄａｍｓ， Ｋ． Ｗ． Ｍａｒｓｈａｌｌ， Ｈ． Ｍｅｒｒｉｔｔ， Ｍ． Ｙｉｍ， Ｒ． Ｓ． Ｃｒａｗｆｏｒｄ， Ｌ． Ｍ． Ｗｅｉｎｅｒ， Ｃ． Ｍａｒｋｓ， ａｎｄ Ｊ． Ｄ． Ｍａｒｋｓ． １９９６． ’Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｉｃｏｍｏｌａｒ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｔｉ－ｃ－ｅｒｂＢ－２ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ ｂｙ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ’， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ， ２６３： ５５１－６７．
Ｓｃｈｍｕｅｃｋ－Ｈｅｎｎｅｒｅｓｓｅ， Ｍ．， Ｒ． Ｓｈａｒａｆ， Ｋ． Ｖｏｇｔ， Ｂ． Ｊ． Ｗｅｉｓｔ， Ｓ． Ｌａｎｄｗｅｈｒ－Ｋｅｎｚｅｌ， Ｈ． Ｆｕｅｈｒｅｒ， Ａ． Ｊｕｒｉｓｃｈ， Ｎ． Ｂａｂｅｌ， Ｃ． Ｍ． Ｒｏｏｎｅｙ， Ｐ． Ｒｅｉｎｋｅ， ａｎｄ Ｈ． Ｄ． Ｖｏｌｋ． ２０１５． ’Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｖｉｒｕｓ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｅｍｏｒｙ ｓｔｅｍ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｍａｔｕｒｅ ｔｏ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｍｅｍｏｒｙ ｓｕｂｓｅｔｓ ｗｉｔｈ ｓｅｌｆ－ｒｅｎｅｗａｌ ｐｏｔｅｎｃｙ’， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ， １９４： ５５５９－６７．
Ｓｅｌｌ， Ｓ． １９９０． ’Ｃａｎｃｅｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ’， Ｈｕｍ Ｐａｔｈｏｌ， ２１： １００３－１９．
Ｓｈｅｖｉｎｓｋｙ， Ｌ． Ｈ．， Ｂ． Ｂ． Ｋｎｏｗｌｅｓ， Ｉ． Ｄａｍｊａｎｏｖ， ａｎｄ Ｄ． Ｓｏｌｔｅｒ． １９８２． ’Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｍｕｒｉｎｅ ｅｍｂｒｙｏｓ ｄｅｆｉｎｅｓ ａ ｓｔａｇｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｏｎ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｓ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ’， Ｃｅｌｌ， ３０： ６９７－７０５．
Ｓｉｄｍａｎ， Ｋ． Ｒ．， Ｗ． Ｄ． Ｓｔｅｂｅｒ， Ａ． Ｄ． Ｓｃｈｗｏｐｅ， ａｎｄ Ｇ． Ｒ． Ｓｃｈｎａｐｅｒ． １９８３． ’Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ｆｒｏｍ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ’， Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ， ２２： ５４７－５６．
Ｓｔｅｍｍｅｒ， Ｗ． Ｐ． １９９４． ’Ｒａｐｉｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｙ ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ’， Ｎａｔｕｒｅ， ３７０： ３８９－９１．
Ｓｔｅｗａｒｔ， ＪＭ．， ａｎｄ ＪＤ． Ｙｏｕｎｇ． １９８４． Ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ （Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ： Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）．
Ｓｕｒｅｓｈ， Ｔ．， Ｌ． Ｘ． Ｌｅｅ， Ｊ． Ｊｏｓｈｉ， ａｎｄ Ｓ． Ｋ． Ｂａｒｔａ． ２０１４． ’Ｎｅｗ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｔｈｅｒａｐｙ’， Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ， ７： ５８．
Ｓｕｚｕｋｉ， Ｙ．， Ｎ． Ｈａｒａｇｕｃｈｉ， Ｈ． Ｔａｋａｈａｓｈｉ， Ｍ． Ｕｅｍｕｒａ， Ｊ． Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ， Ｔ． Ｈａｔａ， Ｉ． Ｔａｋｅｍａｓａ， Ｔ． Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ， Ｈ． Ｉｓｈｉｉ， Ｙ． Ｄｏｋｉ， Ｍ． Ｍｏｒｉ， ａｎｄ Ｈ． Ｙａｍａｍｏｔｏ． ２０１３． ’ＳＳＥＡ－３ ａｓ ａ ｎｏｖｅｌ ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｍａｒｋｅｒ ｉｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒｓ’， Ｉｎｔ Ｊ Ｏｎｃｏｌ， ４２： １６１－７．
Ｔａｋｅｓｈｉｔａ， Ｍ．， Ｋ． Ｓｕｚｕｋｉ， Ｙ． Ｋａｓｓａｉ， Ｍ． Ｔａｋｉｇｕｃｈｉ， Ｙ． Ｎａｋａｙａｍａ， Ｙ． Ｏｔｏｍｏ， Ｒ． Ｍｏｒｉｔａ， Ｔ． Ｍｉｙａｚａｋｉ， Ａ． Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ， ａｎｄ Ｔ． Ｔａｋｅｕｃｈｉ． ２０１５． ’Ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＣＤ４＋ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｍｅｍｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ’， Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ， １５９： １０７－１７．
Ｔａｙｌｏｒ－Ｐａｐａｄｉｍｉｔｒｉｏｕ， Ｊ．， ａｎｄ Ａ． Ａ． Ｅｐｅｎｅｔｏｓ． １９９４． ’Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ ａｌｔｅｒｅｄ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ： ｐｒｏｇｒｅｓｓ ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｉｎ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｙ’， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， １２： ２２７－３３．
Ｔｏｎｄｅｕｒ， Ｓ．， Ｓ． Ａｓｓｏｕ， Ｌ． Ｎａｄａｌ， Ｓ． Ｈａｍａｍａｈ， ａｎｄ Ｊ． Ｄｅ Ｖｏｓ． ２００８． ’［Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ］’， Ａｎｎ Ｂｉｏｌ Ｃｌｉｎ （Ｐａｒｉｓ）， ６６： ２４１－７．
Ｔｏｒｅｌｌｉ， Ａ．， ａｎｄ Ｃ． Ａ． Ｒｏｂｏｔｔｉ． １９９４． ’ＡＤＶＡＮＣＥ ａｎｄ ＡＤＡＭ： ｔｗｏ ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｌｏｂａｌ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｂｅｔｗｅｅｎ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ’， Ｃｏｍｐｕｔ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｓｃｉ， １０： ３－５．
Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ， Ａ．， Ａ． Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ， ａｎｄ Ｋ． Ｋａｒｊａｌａｉｎｅｎ． １９９１． ’Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ （Ｊａｎｕｓｉｎｓ） ｔａｒｇｅｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｏｎ ＨＩＶ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｃｅｌｌｓ’， ＥＭＢＯ Ｊ， １０： ３６５５－９．
Ｔｒｉｌｌ， Ｊ． Ｊ．， Ａ． Ｒ． Ｓｈａｔｚｍａｎ， ａｎｄ Ｓ． Ｇａｎｇｕｌｙ． １９９５． ’Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ＣＯＳ ａｎｄ ＣＨＯ ｃｅｌｌｓ’， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， ６： ５５３－６０．
ｖａｎ Ｂｅｅｋ， Ｗ． Ｐ．， Ｌ． Ａ． Ｓｍｅｔｓ， ａｎｄ Ｐ． Ｅｍｍｅｌｏｔ． １９７３． ’Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｓｉａｌｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｎｓｉｔｙ ｉｎ ｓｕｒｆａｃｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ａｎｄ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｃｅｌｌｓ－－ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ？’， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ３３： ２９１３－２２．
Ｖａｒｋｉ， Ａ．， Ｒ． Ｄ． Ｃｕｍｍｉｎｇｓ， Ｊ． Ｄ． Ｅｓｋｏ， Ｈ． Ｈ． Ｆｒｅｅｚｅ， Ｐ． Ｓｔａｎｌｅｙ， Ｊ． Ｄ． Ｍａｒｔｈ， Ｃ． Ｒ． Ｂｅｒｔｏｚｚｉ， Ｇ． Ｗ． Ｈａｒｔ， ａｎｄ Ｍ． Ｅ． Ｅｔｚｌｅｒ． ２００９． ’Ｓｙｍｂｏｌ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｆｏｒ ｇｌｙｃａｎ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ’， Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ， ９： ５３９８－９．
Ｗａｒｄ， Ｅ． Ｓ．， Ｄ． Ｇｕｓｓｏｗ， Ａ． Ｄ． Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ， Ｐ． Ｔ． Ｊｏｎｅｓ， ａｎｄ Ｇ． Ｗｉｎｔｅｒ． １９８９． ’Ｂｉｎｄｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ａ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ’， Ｎａｔｕｒｅ， ３４１： ５４４－６．
Ｗｒｉｇｈｔ， Ａ． Ｊ．， ａｎｄ Ｐ． Ｗ． Ａｎｄｒｅｗｓ． ２００９． ’Ｓｕｒｆａｃｅ ｍａｒｋｅｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ’， Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ， ３： ３－１１．
Ｙｅ， Ｆ．， Ｙ． Ｌｉ， Ｙ． Ｈｕ， Ｃ． Ｚｈｏｕ， Ｙ． Ｈｕ， ａｎｄ Ｈ． Ｃｈｅｎ． ２０１０． ’Ｓｔａｇｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ４ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ’， Ｉｎｔ Ｊ Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｃａｎｃｅｒ， ２０： ９５８－６４．
Ｙｖｏｎ， Ｅ．， Ｍ． Ｄｅｌ Ｖｅｃｃｈｉｏ， Ｂ． Ｓａｖｏｌｄｏ， Ｖ． Ｈｏｙｏｓ， Ａ． Ｄｕｔｏｕｒ， Ａ． Ａｎｉｃｈｉｎｉ， Ｇ． Ｄｏｔｔｉ， ａｎｄ Ｍ． Ｋ． Ｂｒｅｎｎｅｒ． ２００９． ’Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｍｅｌａｎｏｍａ ｕｓｉｎｇ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＧＤ２－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌｓ’， Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， １５： ５８５２－６０．
Ｚｈａｎｇ， Ｙ．， Ｇ． Ｊｏｅ， Ｅ． Ｈｅｘｎｅｒ， Ｊ． Ｚｈｕ， ａｎｄ Ｓ． Ｇ． Ｅｍｅｒｓｏｎ． ２００５． ’Ｈｏｓｔ－ｒｅａｃｔｉｖｅ ＣＤ８＋ ｍｅｍｏｒｙ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｇｒａｆｔ－ｖｅｒｓｕｓ－ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ’， Ｎａｔ Ｍｅｄ， １１： １２９９－３０５．
Ａｋｉｎｌｅｙｅ， Ａ．， Ｐ． Ａｖｖａｒｕ， Ｍ． Ｆｕｒｑａｎ， Ｙ． Ｓｏｎｇ， ａｎｄ Ｄ． Ｌｉｕ． ２０１３． ’Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ ３－ｋｉｎａｓｅ （ＰＩ３Ｋ） ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ａｓ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ’， Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ， ６： ８８．
Ａｋｉｎｌｅｙｅ， Ａ．， Ｙ． Ｃｈｅｎ， Ｎ． Ｍｕｋｈｉ， Ｙ． Ｓｏｎｇ， ａｎｄ Ｄ． Ｌｉｕ． ２０１３． ’Ｉｂｒｕｔｉｎｉｂ ａｎｄ ｎｏｖｅｌ ＢＴＫ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ’， Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ， ６： ５９．
Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ． Ｆ．， Ｗ． Ｇｉｓｈ， Ｗ． Ｍｉｌｌｅｒ， Ｅ． Ｗ． Ｍｙｅｒｓ， ａｎｄ Ｄ． Ｊ． Ｌｉｐｍａｎ． １９９０． ’Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ’， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ， ２１５： ４０３－１０．
Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ． Ｆ．， Ｔ． Ｌ． Ｍａｄｄｅｎ， Ａ． Ａ． Ｓｃｈａｆｆｅｒ， Ｊ． Ｚｈａｎｇ， Ｚ． Ｚｈａｎｇ， Ｗ． Ｍｉｌｌｅｒ， ａｎｄ Ｄ． Ｊ． Ｌｉｐｍａｎ． １９９７． ’Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ： ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ’， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ， ２５： ３３８９－４０２．
Ａｕｓｕｂｅｌ， ＦＭ． １９９２． Ｓｈｏｒｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）．
Ｂａｒｂａｓ， Ｃ． Ｆ．， ３ｒｄ， Ｄ． Ｈｕ， Ｎ． Ｄｕｎｌｏｐ， Ｌ． Ｓａｗｙｅｒ， Ｄ． Ｃａｂａｂａ， Ｒ． Ｍ． Ｈｅｎｄｒｙ， Ｐ． Ｌ． Ｎａｒａ， ａｎｄ Ｄ． Ｒ． Ｂｕｒｔｏｎ． １９９４． ’Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｔｏ ｅｎｈａｎｃｅ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ ｂｒｏａｄｅｎ ｓｔｒａｉｎ ｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ’， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ， ９１： ３８０９－１３．
Ｂｅｅｒｓ， Ｓ． Ａ．， Ｍ． Ｊ． Ｇｌｅｎｎｉｅ， ａｎｄ Ａ． Ｌ． Ｗｈｉｔｅ． ２０１６． ’Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｉｓｏｔｙｐｅ ｏｎ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎ’， Ｂｌｏｏｄ， １２７： １０９７－１０１．
Ｂｉｒｄ， Ｒ． Ｅ．， Ｋ． Ｄ． Ｈａｒｄｍａｎ， Ｊ． Ｗ． Ｊａｃｏｂｓｏｎ， Ｓ． Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｂ． Ｍ． Ｋａｕｆｍａｎ， Ｓ． Ｍ． Ｌｅｅ， Ｔ． Ｌｅｅ， Ｓ． Ｈ． Ｐｏｐｅ， Ｇ． Ｓ． Ｒｉｏｒｄａｎ， ａｎｄ Ｍ． Ｗｈｉｔｌｏｗ． １９８８． ’Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｇｅｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ’， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４２： ４２３－６．
Ｂｏｄａｎｚｓｋｙ， Ｍ．， ａｎｄ Ａ． Ｂｏｄａｎｚｓｋｙ． １９８４． Ｔｈｅ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ （Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ： Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）．
Ｂｒｅｔｏｎ， Ｃ． Ｓ．， Ａ． Ｎａｈｉｍａｎａ， Ｄ． Ａｕｂｒｙ， Ｊ． Ｍａｃｏｉｎ， Ｐ． Ｍｏｒｅｔｔｉ， Ｍ． Ｂｅｒｔｓｃｈｉｎｇｅｒ， Ｓ． Ｈｏｕ， Ｍ． Ａ． Ｄｕｃｈｏｓａｌ， ａｎｄ Ｊ． Ｂａｃｋ． ２０１４． ’Ａ ｎｏｖｅｌ ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ （ＧＢＲ ４０１） ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｋｉｌｌｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ Ｂ ｃｅｌｌ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ’， Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ， ７： ３３．
Ｃａｈａｎ， Ｌ． Ｄ．， Ｒ． Ｆ． Ｉｒｉｅ， Ｒ． Ｓｉｎｇｈ， Ａ． Ｃａｓｓｉｄｅｎｔｉ， ａｎｄ Ｊ． Ｃ． Ｐａｕｌｓｏｎ． １９８２． ’Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｒｏｅｃｔｏｄｅｒｍａｌ ｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ （ＯＦＡ－Ｉ－２） ａｓ ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ ＧＤ２’， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ， ７９： ７６２９－３３．
Ｃｈａｈｒｏｕｄｉ， Ａ．， Ｇ． Ｓｉｌｖｅｓｔｒｉ， ａｎｄ Ｍ． Ｌｉｃｈｔｅｒｆｅｌｄ． ２０１５． ’Ｔ ｍｅｍｏｒｙ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ＨＩＶ： ａ ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ’， Ｃｕｒｒ ＨＩＶ／ＡＩＤＳ Ｒｅｐ， １２： ３３－４０．
Ｃｈａｎｇ， Ｗ． Ｗ．， Ｃ． Ｈ． Ｌｅｅ， Ｐ． Ｌｅｅ， Ｊ． Ｌｉｎ， Ｃ． Ｗ． Ｈｓｕ， Ｊ． Ｔ． Ｈｕｎｇ， Ｊ． Ｊ． Ｌｉｎ， Ｊ． Ｃ． Ｙｕ， Ｌ． Ｅ． Ｓｈａｏ， Ｊ． Ｙｕ， Ｃ． Ｈ． Ｗｏｎｇ， ａｎｄ Ａ． Ｌ． Ｙｕ． ２００８． ’Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｇｌｏｂｏ Ｈ ａｎｄ ＳＳＥＡ３ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｆｕｃｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ １ ａｎｄ ２ ｉｎ Ｇｌｏｂｏ Ｈ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ’， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ， １０５： １１６６７－７２．
Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ， Ｍ． Ｎ．， Ｊ． Ｃｈｉｋ， Ｌ． Ｌｅｅ， Ｍ． Ａｎｕｇｒａｈａｍ， Ｊ． Ｌ． Ａｂｒａｈａｍｓ， ａｎｄ Ｎ． Ｈ． Ｐａｃｋｅｒ． ２０１４． ’Ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ’， Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ， １４： ５２５－４６．
Ｃｉｄ， Ｅ．， Ｍ． Ｙａｍａｍｏｔｏ， Ｍ． Ｂｕｓｃｈｂｅｃｋ， ａｎｄ Ｆ． Ｙａｍａｍｏｔｏ． ２０１３． ’Ｍｕｒｉｎｅ ｃｅｌｌ ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄｓ ｃｕｓｔｏｍｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ｍｏｄｕｌａｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ’， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ， ８： ｅ６４７２８．
Ｃｉｅｒｉ， Ｎ．， Ｂ． Ｃａｍｉｓａ， Ｆ． Ｃｏｃｃｈｉａｒｅｌｌａ， Ｍ． Ｆｏｒｃａｔｏ， Ｇ． Ｏｌｉｖｅｉｒａ， Ｅ． Ｐｒｏｖａｓｉ， Ａ． Ｂｏｎｄａｎｚａ， Ｃ． Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎ， Ｊ． Ｐｅｃｃａｔｏｒｉ， Ｆ． Ｃｉｃｅｒｉ， Ｍ． Ｔ． Ｌｕｐｏ－Ｓｔａｎｇｈｅｌｌｉｎｉ， Ｆ． Ｍａｖｉｌｉｏ， Ａ． Ｍｏｎｄｉｎｏ， Ｓ． Ｂｉｃｃｉａｔｏ， Ａ． Ｒｅｃｃｈｉａ， ａｎｄ Ｃ． Ｂｏｎｉｎｉ． ２０１３． ’ＩＬ－７ ａｎｄ ＩＬ－１５ ｉｎｓｔｒｕｃｔ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｅｍｏｒｙ ｓｔｅｍ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｎａｉｖｅ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ’， Ｂｌｏｏｄ， １２１： ５７３－８４．
Ｃｏｏｌｉｎｇ， Ｌ．， ａｎｄ Ｄ． Ｈｗａｎｇ． ２００５． ’Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｂ２， ａ ｍａｒｋｅｒ ｏｆ ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｓｙｍｐａｔｈｏａｄｒｅｎａｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ， ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｓ ｔｈｅ Ｌｕｋｅ （ＬＫＥ） ａｎｔｉｇｅｎ’， Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ， ４５： ７０９－１６．
Ｃｏｕｌｉｅ， Ｐ． Ｇ．， Ｂ． Ｊ． Ｖａｎ ｄｅｎ Ｅｙｎｄｅ， Ｐ． ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｒｕｇｇｅｎ， ａｎｄ Ｔ． Ｂｏｏｎ． ２０１４． ’Ｔｕｍｏｕｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ： ａｔ ｔｈｅ ｃｏｒｅ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ’， Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ， １４： １３５－４６．
Ｄａｌｚｉｅｌ， Ｍ．， Ｍ． Ｃｒｉｓｐｉｎ， Ｃ． Ｎ． Ｓｃａｎｌａｎ， Ｎ． Ｚｉｔｚｍａｎｎ， ａｎｄ Ｒ． Ａ． Ｄｗｅｋ． ２０１４． ’Ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｘｐｌｏｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ’， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３４３： １２３５６８１．
Ｄａｎｉｏｔｔｉ， Ｊ． Ｌ．， Ａ． Ａ． Ｖｉｌｃａｅｓ， Ｖ． Ｔｏｒｒｅｓ Ｄｅｍｉｃｈｅｌｉｓ， Ｆ． Ｍ． Ｒｕｇｇｉｅｒｏ， ａｎｄ Ｍ． Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ－Ｗａｌｋｅｒ． ２０１３． ’Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ： ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ’， Ｆｒｏｎｔ Ｏｎｃｏｌ， ３： ３０６．
Ｄａｒｌａｋ， Ｋ． Ａ．， Ｙ． Ｗａｎｇ， Ｊ． Ｍ． Ｌｉ， Ｗ． Ａ． Ｈａｒｒｉｓ， Ｃ． Ｒ． Ｇｉｖｅｒ， Ｃ． Ｈｕａｎｇ， ａｎｄ Ｅ． Ｋ． Ｗａｌｌｅｒ． ２０１４． ’Ｈｏｓｔ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ－ｄｅｒｉｖｅｄ ＩＬ－１２ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｄｏｎｏｒ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ’， Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ， ７： １６．
Ｄｉ Ｂｅｎｅｄｅｔｔｏ， Ｓ．， Ｅ． Ｄｅｒｈｏｖａｎｅｓｓｉａｎ， Ｅ． Ｓｔｅｉｎｈａｇｅｎ－Ｔｈｉｅｓｓｅｎ， Ｄ． Ｇｏｌｄｅｃｋ， Ｌ． Ｍｕｌｌｅｒ， ａｎｄ Ｇ． Ｐａｗｅｌｅｃ． ２０１５． ’Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ａｇｅ， ｓｅｘ ａｎｄ ＣＭＶ－ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｔ ｃｅｌｌ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ： ｒｅｓｕｌｔｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｂｅｒｌｉｎ ＢＡＳＥ－ＩＩ Ｓｔｕｄｙ’， Ｂｉｏｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ， １６： ６３１－４３．
Ｅｐｐｓｔｅｉｎ， Ｄ． Ａ．， Ｙ． Ｖ． Ｍａｒｓｈ， Ｍ． ｖａｎ ｄｅｒ Ｐａｓ， Ｐ． Ｌ． Ｆｅｌｇｎｅｒ， ａｎｄ Ａ． Ｂ． Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ． １９８５． ’Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｌｉｐｏｓｏｍｅ－ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｍｕｒｉｎｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｇａｍｍａ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ａ ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ’， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ， ８２： ３６８８－９２．
Ｆｕｅｒｔｅｓ Ｍａｒｒａｃｏ， Ｓ． Ａ．， Ｃ． Ｓｏｎｅｓｏｎ， Ｌ． Ｃａｇｎｏｎ， Ｐ． Ｏ． Ｇａｎｎｏｎ， Ｍ． Ａｌｌａｒｄ， Ｓ． Ａｂｅｄ Ｍａｉｌｌａｒｄ， Ｎ． Ｍｏｎｔａｎｄｏｎ， Ｎ． Ｒｕｆｅｒ， Ｓ． Ｗａｌｄｖｏｇｅｌ， Ｍ． Ｄｅｌｏｒｅｎｚｉ， ａｎｄ Ｄ． Ｅ． Ｓｐｅｉｓｅｒ． ２０１５． ’Ｌｏｎｇ－ｌａｓｔｉｎｇ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ－ｌｉｋｅ ｍｅｍｏｒｙ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ａ ｎａｉｖｅ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｆｉｌｅ ｕｐｏｎ ｙｅｌｌｏｗ ｆｅｖｅｒ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ’， Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ， ７： ２８２ｒａ４８．
Ｆｕｓｔｅｒ， Ｍ． Ｍ．， ａｎｄ Ｊ． Ｄ． Ｅｓｋｏ． ２００５． ’Ｔｈｅ ｓｗｅｅｔ ａｎｄ ｓｏｕｒ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ： ｇｌｙｃａｎｓ ａｓ ｎｏｖｅｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔｓ’， Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ， ５： ５２６－４２．
Ｇａｎｇ， Ｅ． Ｊ．， Ｄ． Ｂｏｓｎａｋｏｖｓｋｉ， Ｃ． Ａ． Ｆｉｇｕｅｉｒｅｄｏ， Ｊ． Ｗ． Ｖｉｓｓｅｒ， ａｎｄ Ｒ． Ｃ． Ｐｅｒｌｉｎｇｅｉｒｏ． ２００７． ’ＳＳＥＡ－４ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ’， Ｂｌｏｏｄ， １０９： １７４３－５１．
Ｇａｒｒｉｄｏ， Ｆ．， Ｔ． Ｃａｂｒｅｒａ， Ａ． Ｃｏｎｃｈａ， Ｓ． Ｇｌｅｗ， Ｆ． Ｒｕｉｚ－Ｃａｂｅｌｌｏ， ａｎｄ Ｐ． Ｌ． Ｓｔｅｒｎ． １９９３． ’Ｎａｔｕｒａｌ ｈｉｓｔｏｒｙ ｏｆ ＨＬＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｔｕｍｏｕｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ’， Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ， １４： ４９１－９．
Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ， Ｌ．， Ｅ． Ｌｕｇｌｉ， Ｙ． Ｊｉ， Ｚ． Ｐｏｓ， Ｃ． Ｍ． Ｐａｕｌｏｓ， Ｍ． Ｆ． Ｑｕｉｇｌｅｙ， Ｊ． Ｒ． Ａｌｍｅｉｄａ， Ｅ． Ｇｏｓｔｉｃｋ， Ｚ． Ｙｕ， Ｃ． Ｃａｒｐｅｎｉｔｏ， Ｅ． Ｗａｎｇ， Ｄ． Ｃ． Ｄｏｕｅｋ， Ｄ． Ａ． Ｐｒｉｃｅ， Ｃ． Ｈ． Ｊｕｎｅ， Ｆ． Ｍ． Ｍａｒｉｎｃｏｌａ， Ｍ． Ｒｏｅｄｅｒｅｒ， ａｎｄ Ｎ． Ｐ． Ｒｅｓｔｉｆｏ． ２０１１． ’Ａ ｈｕｍａｎ ｍｅｍｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌ ｓｕｂｓｅｔ ｗｉｔｈ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ’， Ｎａｔ Ｍｅｄ， １７： １２９０－７．
Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ， Ｌ．， ａｎｄ Ｎ． Ｐ． Ｒｅｓｔｉｆｏ． ２０１３． ’Ｍｏｖｉｎｇ Ｔ ｍｅｍｏｒｙ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃ’， Ｂｌｏｏｄ， １２１： ５６７－８．
Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ， Ｌ．， Ｄ． Ｅ． Ｓｐｅｉｓｅｒ， Ｍ． Ｌｉｃｈｔｅｒｆｅｌｄ， ａｎｄ Ｃ． Ｂｏｎｉｎｉ． ２０１７． ’Ｔ ｍｅｍｏｒｙ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ’， Ｎａｔ Ｍｅｄ， ２３： １８－２７．
Ｇｏｔｔｓｃｈｌｉｎｇ， Ｓ．， Ｋ． Ｊｅｎｓｅｎ， Ａ． Ｗａｒｔｈ， Ｆ． Ｊ． Ｈｅｒｔｈ， Ｍ． Ｔｈｏｍａｓ， Ｐ． Ａ． Ｓｃｈｎａｂｅｌ， ａｎｄ Ｅ． Ｈｅｒｐｅｌ． ２０１３． ’Ｓｔａｇｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ－４ ｉｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｂａｓａｌｏｉｄ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｏｏｒ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ’， Ｅｕｒ Ｒｅｓｐｉｒ Ｊ， ４１： ６５６－６３．
Ｇｒａｍ， Ｈ．， Ｌ． Ａ． Ｍａｒｃｏｎｉ， Ｃ． Ｆ． Ｂａｒｂａｓ， ３ｒｄ， Ｔ． Ａ． Ｃｏｌｌｅｔ， Ｒ． Ａ． Ｌｅｒｎｅｒ， ａｎｄ Ａ． Ｓ． Ｋａｎｇ． １９９２． ’Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ａ ｎａｉｖｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｌｉｂｒａｒｙ’， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ， ８９： ３５７６－８０．
Ｈａｋｏｍｏｒｉ， Ｓ． ２００２． ’Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｄｅｆｉｎｉｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ： ｎｅｗ ｗｉｎｅ ｉｎ ａｎ ｏｌｄ ｂｏｔｔｌｅ’， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ， ９９： １０２３１－３．
Ｈａｋｏｍｏｒｉ， Ｓ． Ｉ． ２００８． ’Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｏｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄｓ ａｎｄ ｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄｓ： ｒｅｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｔｒｅｎｄｓ’， Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ， １７８０： ３２５－４６．
Ｈａｋｏｍｏｒｉ， Ｓ．， ａｎｄ Ｙ． Ｚｈａｎｇ． １９９７． ’Ｇｌｙｃｏｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄ ａｎｔｉｇｅｎｓ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ’， Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ， ４： ９７－１０４．
Ｈａｎ， Ｅ． Ｑ．， Ｘ． Ｌ． Ｌｉ， Ｃ． Ｒ． Ｗａｎｇ， Ｔ． Ｆ． Ｌｉ， ａｎｄ Ｓ． Ｙ． Ｈａｎ． ２０１３． ’Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ： ｐｒｏｇｒｅｓｓ ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ’， Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ， ６： ４７．
Ｈａｒｉｃｈａｎｄａｎ， Ａ．， Ｋ． Ｓｉｖａｓｕｂｒａｍａｎｉｙａｎ， ａｎｄ Ｈ． Ｊ． Ｂｕｈｒｉｎｇ． ２０１３． ’Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ－ｄｅｒｉｖｅｄ ＭＳＣｓ’， Ａｄｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｅｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， １２９： １－１７．
Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ， Ｊ． Ｋ．， Ｊ． Ｓ． Ｄｒａｐｅｒ， Ｈ． Ｓ． Ｂａｉｌｌｉｅ， Ｓ． Ｆｉｓｈｅｌ， Ｊ． Ａ． Ｔｈｏｍｓｏｎ， Ｈ． Ｍｏｏｒｅ， ａｎｄ Ｐ． Ｗ． Ａｎｄｒｅｗｓ． ２００２． ’Ｐｒｅｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｓ ａｎｄ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｓｈｏｗ ｃｏｍｐａｒａｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｓｔａｇｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎｓ’， Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ， ２０： ３２９－３７．
Ｈｏｌｌｉｇｅｒ， Ｐ．， Ｔ． Ｐｒｏｓｐｅｒｏ， ａｎｄ Ｇ． Ｗｉｎｔｅｒ． １９９３． ’”Ｄｉａｂｏｄｉｅｓ”： ｓｍａｌｌ ｂｉｖａｌｅｎｔ ａｎｄ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ’， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ， ９０： ６４４４－８．
Ｈｏｌｌｉｇｅｒ， Ｐ．， ａｎｄ Ｇ． Ｗｉｎｔｅｒ． １９９３． ’Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ’， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， ４： ４４６－９．
Ｈｏｓｏｋａｗａ， Ｔ．， Ｔ． Ｋｉｍｕｒａ， Ｓ． Ｎａｄａ， Ｔ． Ｏｋｕｎｏ， Ｄ． Ｉｔｏ， Ｓ． Ｋａｎｇ， Ｓ． Ｎｏｊｉｍａ， Ｋ． Ｙａｍａｓｈｉｔａ， Ｔ． Ｎａｋａｔａｎｉ， Ｙ． Ｈａｙａｍａ， Ｙ． Ｋａｔｏ， Ｙ． Ｋｉｎｅｈａｒａ， Ｍ． Ｎｉｓｈｉｄｅ， Ｎ． Ｍｉｋａｍｉ， Ｓ． Ｋｏｙａｍａ， Ｈ． Ｔａｋａｍａｔｓｕ， Ｄ． Ｏｋｕｚａｋｉ， Ｎ． Ｏｈｋｕｒａ， Ｓ． Ｓａｋａｇｕｃｈｉ， Ｍ． Ｏｋａｄａ， ａｎｄ Ａ． Ｋｕｍａｎｏｇｏｈ． ２０１７． ’Ｌａｍｔｏｒ１ Ｉｓ Ｃｒｉｔｉｃａｌｌｙ Ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ＣＤ４（＋） Ｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ’， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ， １９９： ２００８－１９．
Ｈｕａｎｇ， Ｙ． Ｌ．， Ｊ． Ｔ． Ｈｕｎｇ， Ｓ． Ｋ． Ｃｈｅｕｎｇ， Ｈ． Ｙ． Ｌｅｅ， Ｋ． Ｃ． Ｃｈｕ， Ｓ． Ｔ． Ｌｉ， Ｙ． Ｃ． Ｌｉｎ， Ｃ． Ｔ． Ｒｅｎ， Ｔ． Ｊ． Ｃｈｅｎｇ， Ｔ． Ｌ． Ｈｓｕ， Ａ． Ｌ． Ｙｕ， Ｃ． Ｙ． Ｗｕ， ａｎｄ Ｃ． Ｈ． Ｗｏｎｇ． ２０１３． ’Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ－ｂａｓｅｄ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｗｉｔｈ ａ ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄ ａｄｊｕｖａｎｔ ｆｏｒ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ’， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ， １１０： ２５１７－２２．
Ｈｕｓｔｏｎ， Ｊ． Ｓ．， Ｄ． Ｌｅｖｉｎｓｏｎ， Ｍ． Ｍｕｄｇｅｔｔ－Ｈｕｎｔｅｒ， Ｍ． Ｓ． Ｔａｉ， Ｊ． Ｎｏｖｏｔｎｙ， Ｍ． Ｎ． Ｍａｒｇｏｌｉｅｓ， Ｒ． Ｊ． Ｒｉｄｇｅ， Ｒ． Ｅ． Ｂｒｕｃｃｏｌｅｒｉ， Ｅ． Ｈａｂｅｒ， Ｒ． Ｃｒｅａ， ａｎｄ ｅｔ ａｌ． １９８８． ’Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ： ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ａｎ ａｎｔｉ－ｄｉｇｏｘｉｎ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ ａｎａｌｏｇｕｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ’， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ， ８５： ５８７９－８３．
Ｈｗａｎｇ， Ｋ． Ｊ．， Ｋ． Ｆ． Ｌｕｋ， ａｎｄ Ｐ． Ｌ． Ｂｅａｕｍｉｅｒ． １９８０． ’Ｈｅｐａｔｉｃ ｕｐｔａｋｅ ａｎｄ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ／ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ： ａ ｋｉｎｅｔｉｃ ｓｔｕｄｙ’， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ， ７７： ４０３０－４．
Ｊｅｓｐｅｒｓ， Ｌ． Ｓ．， Ａ． Ｒｏｂｅｒｔｓ， Ｓ． Ｍ． Ｍａｈｌｅｒ， Ｇ． Ｗｉｎｔｅｒ， ａｎｄ Ｈ． Ｒ． Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ． １９９４． ’Ｇｕｉｄｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ ｔｏ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｅｐｉｔｏｐｅ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉｇｅｎ’， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （Ｎ Ｙ）， １２： ８９９－９０３．
Ｊｕｎｇｈａｎｓ， Ｒ． Ｐ．， Ｔ． Ａ． Ｗａｌｄｍａｎｎ， Ｎ． Ｆ． Ｌａｎｄｏｌｆｉ， Ｎ． Ｍ． Ａｖｄａｌｏｖｉｃ， Ｗ． Ｐ． Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ， ａｎｄ Ｃ． Ｑｕｅｅｎ． １９９０． ’Ａｎｔｉ－Ｔａｃ－Ｈ， ａ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｗｉｔｈ ｎｅｗ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ’， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ５０： １４９５－５０２．
Ｋａｎｎａｇｉ， Ｒ．， Ｎ． Ａ． Ｃｏｃｈｒａｎ， Ｆ． Ｉｓｈｉｇａｍｉ， Ｓ． Ｈａｋｏｍｏｒｉ， Ｐ． Ｗ． Ａｎｄｒｅｗｓ， Ｂ． Ｂ． Ｋｎｏｗｌｅｓ， ａｎｄ Ｄ． Ｓｏｌｔｅｒ． １９８３． ’Ｓｔａｇｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎｓ （ＳＳＥＡ－３ ａｎｄ －４） ａｒｅ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｏｆ ａ ｕｎｉｑｕｅ ｇｌｏｂｏ－ｓｅｒｉｅｓ ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ’， ＥＭＢＯ Ｊ， ２： ２３５５－６１．
Ｋａｒｌｉｎ， Ｓ．， ａｎｄ Ｓ． Ｆ． Ａｌｔｓｃｈｕｌ． １９９０． ’Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ａｓｓｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｇｅｎｅｒａｌ ｓｃｏｒｉｎｇ ｓｃｈｅｍｅｓ’， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ， ８７： ２２６４－８．
－－－． １９９３． ’Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｈｉｇｈ－ｓｃｏｒｉｎｇ ｓｅｇｍｅｎｔｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ’， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ， ９０： ５８７３－７．
Ｋｌｅｂａｎｏｆｆ， Ｃ． Ａ．， Ｌ． Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ， ａｎｄ Ｎ． Ｐ． Ｒｅｓｔｉｆｏ． ２０１２． ’Ｓｏｒｔｉｎｇ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｕｂｓｅｔｓ： ｗｈｉｃｈ Ｔ－ｃｅｌｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｍｅｄｉａｔｅ ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｄｏｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ？’， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ， ３５： ６５１－６０．
Ｌａｕ， Ｋ． Ｓ．， ａｎｄ Ｊ． Ｗ． Ｄｅｎｎｉｓ． ２００８． ’Ｎ－Ｇｌｙｃａｎｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ’， Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ， １８： ７５０－６０．
Ｌｅｆｒａｎｃ， Ｍ． Ｐ．， Ｆ． Ｅｈｒｅｎｍａｎｎ， Ｓ． Ｋｏｓｓｉｄａ， Ｖ． Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉ， ａｎｄ Ｐ． Ｄｕｒｏｕｘ． ２０１８． ’Ｕｓｅ ｏｆ ＩＭＧＴ（（Ｒ）） Ｄａｔａｂａｓｅｓ ａｎｄ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ’， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ， １８２７： ３５－６９．
Ｌｉ， Ｇ．， Ｑ． Ｙａｎｇ， Ｙ． Ｚｈｕ， Ｈ． Ｒ． Ｗａｎｇ， Ｘ． Ｃｈｅｎ， Ｘ． Ｚｈａｎｇ， ａｎｄ Ｂ． Ｌｕ． ２０１３． ’Ｔ－Ｂｅｔ ａｎｄ Ｅｏｍｅｓ Ｒｅｇｕｌａｔｅ ｔｈｅ Ｂａｌａｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ／Ｃｅｎｔｒａｌ Ｍｅｍｏｒｙ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｖｅｒｓｕｓ Ｍｅｍｏｒｙ Ｓｔｅｍ Ｌｉｋｅ Ｔ Ｃｅｌｌｓ’， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ， ８： ｅ６７４０１．
Ｌｏｕ， Ｙ． Ｗ．， Ｐ． Ｙ． Ｗａｎｇ， Ｓ． Ｃ． Ｙｅｈ， Ｐ． Ｋ． Ｃｈｕａｎｇ， Ｓ． Ｔ． Ｌｉ， Ｃ． Ｙ． Ｗｕ， Ｋ． Ｈ． Ｋｈｏｏ， Ｍ． Ｈｓｉａｏ， Ｔ． Ｌ． Ｈｓｕ， ａｎｄ Ｃ． Ｈ． Ｗｏｎｇ． ２０１４． ’Ｓｔａｇｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ－４ ａｓ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔ ｉｎ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｃａｎｃｅｒｓ’， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ， １１１： ２４８２－７．
Ｌｕｇｌｉ， Ｅ．， Ｍ． Ｈ． Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ， Ｌ． Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ， Ｐ． Ｋ． Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙ， Ｄ． Ｌ． Ｂｏｌｔｏｎ， Ｋ． Ｓｏｎｇ， Ｎ． Ｒ． Ｋｌａｔｔ， Ｊ． Ｍ． Ｂｒｅｎｃｈｌｅｙ， Ｍ． Ｖａｃｃａｒｉ， Ｅ． Ｇｏｓｔｉｃｋ， Ｄ． Ａ． Ｐｒｉｃｅ， Ｔ． Ａ． Ｗａｌｄｍａｎｎ， Ｎ． Ｐ． Ｒｅｓｔｉｆｏ， Ｇ． Ｆｒａｎｃｈｉｎｉ， ａｎｄ Ｍ． Ｒｏｅｄｅｒｅｒ． ２０１３． ’Ｓｕｐｅｒｉｏｒ Ｔ ｍｅｍｏｒｙ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ ｓｕｐｐｏｒｔｓ ｌｏｎｇ－ｌｉｖｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｍｅｍｏｒｙ’， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ， １２３： ５９４－９．
Ｌｕｇｌｉ， Ｅ．， Ｌ． Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ， Ａ． Ｒｏｂｅｒｔｏ， Ｄ． Ｍａｖｉｌｉｏ， Ｄ． Ａ． Ｐｒｉｃｅ， Ｎ． Ｐ． Ｒｅｓｔｉｆｏ， ａｎｄ Ｍ． Ｒｏｅｄｅｒｅｒ． ２０１３． ’Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｎｏｎｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅ Ｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｍｅｍｏｒｙ ｃｅｌｌｓ’， Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ， ８： ３３－４２．
Ｍａｈｎｋｅ， Ｙ． Ｄ．， Ｔ． Ｍ． Ｂｒｏｄｉｅ， Ｆ． Ｓａｌｌｕｓｔｏ， Ｍ． Ｒｏｅｄｅｒｅｒ， ａｎｄ Ｅ． Ｌｕｇｌｉ． ２０１３． ’Ｔｈｅ ｗｈｏ’ｓ ｗｈｏ ｏｆ Ｔ－ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ： ｈｕｍａｎ ｍｅｍｏｒｙ Ｔ－ｃｅｌｌ ｓｕｂｓｅｔｓ’， Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ， ４３： ２７９７－８０９．
Ｍａｒｋｓ， Ｊ． Ｄ．， Ａ． Ｄ． Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ， Ｍ． Ｍａｌｍｑｖｉｓｔ， Ｔ． Ｐ． Ｃｌａｃｋｓｏｎ， Ｊ． Ｍ． Ｂｙｅ， ａｎｄ Ｇ． Ｗｉｎｔｅｒ． １９９２． ’Ｂｙ－ｐａｓｓｉｎｇ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ： ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｈｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ ｃｈａｉｎ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ’， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （Ｎ Ｙ）， １０： ７７９－８３．
Ｍａｒｔｉｎ， Ｐ． Ｊ． ２０１４． ’Ｒｅｖｅｒｓｉｎｇ ＣＤ８＋ Ｔ－ｃｅｌｌ ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＤＬＩ’， Ｂｌｏｏｄ， １２３： １２８９－９０．
Ｍａｔｅｕｓ， Ｊ．， Ｐ． Ｌａｓｓｏ， Ｐ． Ｐａｖｉａ， Ｆ． Ｒｏｓａｓ， Ｎ． Ｒｏａ， Ｃ． Ａ． Ｖａｌｅｎｃｉａ－Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ， Ｊ． Ｍ． Ｇｏｎｚａｌｅｚ， Ｃ． Ｊ． Ｐｕｅｒｔａ， ａｎｄ Ａ． Ｃｕｅｌｌａｒ． ２０１５． ’Ｌｏｗ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ＣＤ８＋ Ｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｍｅｍｏｒｙ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｃｈａｇａｓｉｃ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｓｅｖｅｒｅ ｆｏｒｍｓ ｏｆ ｔｈｅ ｄｉｓｅａｓｅ’， ＰＬｏＳ Ｎｅｇｌ Ｔｒｏｐ Ｄｉｓ， ９： ｅ３４３２．
Ｍｅｅｚａｎ， Ｅ．， Ｈ． Ｃ． Ｗｕ， Ｐ． Ｈ． Ｂｌａｃｋ， ａｎｄ Ｐ． Ｗ． Ｒｏｂｂｉｎｓ． １９６９． ’Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ ｖｉｒｕｓ－ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｍｏｕｓｅ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ． ＩＩ． Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅｓ ｂｙ ｓｅｐｈａｄｅｘ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ’， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ８： ２５１８－２４．
Ｍｅｔｈｅｒｉｎｇｈａｍ， Ｒ． Ｌ．， Ｖ． Ａ． Ｐｕｄｎｅｙ， Ｂ． Ｇｕｎｎ， Ｍ． Ｔｏｗｅｙ， Ｉ． Ｓｐｅｎｄｌｏｖｅ， ａｎｄ Ｌ． Ｇ． Ｄｕｒｒａｎｔ． ２００９． ’Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｓ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｃａｎｃｅｒ ｖａｃｃｉｎｅｓ’， ＭＡｂｓ， １： ７１－８５．
Ｍｅｚｚａｎｚａｎｉｃａ， Ｄ．， Ｓ． Ｃａｎｅｖａｒｉ， Ａ． Ｍａｚｚｏｎｉ， Ｍ． Ｆｉｇｉｎｉ， Ｍ． Ｉ． Ｃｏｌｎａｇｈｉ， Ｔ． Ｗａｋｓ， Ｄ． Ｇ． Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ， ａｎｄ Ｚ． Ｅｓｈｈａｒ． １９９８． ’Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇｅｎｅ ｍａｄｅ ｏｆ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｔｕｍｏｒ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｎｆｅｒｓ ａｎｔｉｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ’， Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ， ５： ４０１－７．
Ｍｙｅｒｓ， Ｅ． Ｗ．， ａｎｄ Ｗ． Ｍｉｌｌｅｒ． １９８９． ’Ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅ ｍａｔｃｈｉｎｇ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ’， Ｂｕｌｌ Ｍａｔｈ Ｂｉｏｌ， ５１： ５－３７．
Ｎｉｌｓｓｏｎ， Ｏ．， Ｆ． Ｔ． Ｂｒｅｚｉｃｋａ， Ｊ． Ｈｏｌｍｇｒｅｎ， Ｓ． Ｓｏｒｅｎｓｏｎ， Ｌ． Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ， Ｆ． Ｙｎｇｖａｓｏｎ， ａｎｄ Ｌ． Ｌｉｎｄｈｏｌｍ． １９８６． ’Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ ａｎｔｉｇｅｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ｕｓｉｎｇ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ａｇａｉｎｓｔ ｆｕｃｏｓｙｌ－ＧＭ１’， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ４６： １４０３－７．
Ｎｏｔｏ， Ｚ．， Ｔ． Ｙｏｓｈｉｄａ， Ｍ． Ｏｋａｂｅ， Ｃ． Ｋｏｉｋｅ， Ｍ． Ｆａｔｈｙ， Ｈ． Ｔｓｕｎｏ， Ｋ． Ｔｏｍｉｈａｒａ， Ｎ． Ａｒａｉ， Ｍ． Ｎｏｇｕｃｈｉ， ａｎｄ Ｔ． Ｎｉｋａｉｄｏ． ２０１３． ’ＣＤ４４ ａｎｄ ＳＳＥＡ－４ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ａｎ ｏｒａｌ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ＨＳＣ－４ ｐｏｓｓｅｓｓ ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ－ｌｉｋｅ ｃｅｌｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ’， Ｏｒａｌ Ｏｎｃｏｌ， ４９： ７８７－９５．
Ｎｏｖｅｒｏ， Ａ．， Ｐ． Ｍ． Ｒａｖｅｌｌａ， Ｙ． Ｃｈｅｎ， Ｇ． Ｄｏｕｓ， ａｎｄ Ｄ． Ｌｉｕ． ２０１４． ’Ｉｂｒｕｔｉｎｉｂ ｆｏｒ Ｂ ｃｅｌｌ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ’， Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ， ３： ４．
Ｎｕｄｅｌｍａｎ， Ｅ．， Ｓ． Ｈａｋｏｍｏｒｉ， Ｒ． Ｋａｎｎａｇｉ， Ｓ． Ｌｅｖｅｒｙ， Ｍ． Ｙ． Ｙｅｈ， Ｋ． Ｅ． Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ， ａｎｄ Ｉ． Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ． １９８２． ’Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ ｍｅｌａｎｏｍａ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｄｅｆｉｎｅｄ ｂｙ ａ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ， ４．２’， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ２５７： １２７５２－６．
Ｐｅａｒｓｏｎ， Ｗ． Ｒ．， ａｎｄ Ｄ． Ｊ． Ｌｉｐｍａｎ． １９８８． ’Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ’， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ， ８５： ２４４４－８．
Ｐｉｌｉｐｏｗ， Ｋ．， Ｅ． Ｓｃａｍａｒｄｅｌｌａ， Ｓ． Ｐｕｃｃｉｏ， Ｓ． Ｇａｕｔａｍ， Ｆ． Ｄｅ Ｐａｏｌｉ， Ｅ． Ｍ． Ｍａｚｚａ， Ｇ． Ｄｅ Ｓｉｍｏｎｅ， Ｓ． Ｐｏｌｌｅｔｔｉ， Ｍ． Ｂｕｃｃｉｌｌｉ， Ｖ． Ｚａｎｏｎ， Ｐ． Ｄｉ Ｌｕｃｉａ， Ｍ． Ｉａｎｎａｃｏｎｅ， Ｌ． Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ， ａｎｄ Ｅ． Ｌｕｇｌｉ． ２０１８． ’Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ＣＤ８＋ Ｔ ｍｅｍｏｒｙ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ’， ＪＣＩ Ｉｎｓｉｇｈｔ， ３．
Ｐｉｎｔｏ， Ｊ． Ｐ．， Ｒ． Ｋ． Ｋａｌａｔｈｕｒ， Ｄ． Ｖ． Ｏｌｉｖｅｉｒａ， Ｔ． Ｂａｒａｔａ， Ｒ． Ｓ． Ｍａｃｈａｄｏ， Ｓ． Ｍａｃｈａｄｏ， Ｉ． Ｐａｃｈｅｃｏ－Ｌｅｙｖａ， Ｉ． Ｄｕａｒｔｅ， ａｎｄ Ｍ． Ｅ． Ｆｕｔｓｃｈｉｋ． ２０１５． ’ＳｔｅｍＣｈｅｃｋｅｒ： ａ ｗｅｂ－ｂａｓｅｄ ｔｏｏｌ ｔｏ ｄｉｓｃｏｖｅｒ ａｎｄ ｅｘｐｌｏｒｅ ｓｔｅｍｎｅｓｓ ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ ｉｎ ｇｅｎｅ ｓｅｔｓ’， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ， ４３： Ｗ７２－７．
Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ， Ａ． １９９１． ’Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ： ａｄｖａｎｃｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍｓ’， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （Ｎ Ｙ）， ９： ５４５－５１．
Ｒａｐｈａｅｌ， Ｉ．， Ｓ． Ｎａｌａｗａｄｅ， Ｔ． Ｎ． Ｅａｇａｒ， ａｎｄ Ｔ． Ｇ． Ｆｏｒｓｔｈｕｂｅｒ． ２０１５． ’Ｔ ｃｅｌｌ ｓｕｂｓｅｔｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｉｎ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ａｎｄ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｉｓｅａｓｅｓ’， Ｃｙｔｏｋｉｎｅ， ７４： ５－１７．
Ｒｅｆｆ， Ｍ． Ｅ． １９９３． ’Ｈｉｇｈ－ｌｅｖｅｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ’， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， ４： ５７３－６．
Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ， ＲＰ． １９８０． Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｓｃｉｅｎｃｅｓ （Ｍａｃｋ Ｐｕｂ． Ｃｏ．）．
Ｒｅｓｔｉｆｏ， Ｎ． Ｐ．， ａｎｄ Ｌ． Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ． ２０１３． ’Ｌｉｎｅａｇｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｏｆ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ａｎｄ ｍｅｍｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ’， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ， ２５： ５５６－６３．
Ｓａｉｔｏ， Ｓ．， Ｈ． Ａｏｋｉ， Ａ． Ｉｔｏ， Ｓ． Ｕｅｎｏ， Ｔ． Ｗａｄａ， Ｋ． Ｍｉｔｓｕｚｕｋａ， Ｍ． Ｓａｔｏｈ， Ｙ． Ａｒａｉ， ａｎｄ Ｔ． Ｍｉｙａｇｉ． ２００３． ’Ｈｕｍａｎ ａｌｐｈａ２，３－ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ （ＳＴ３Ｇａｌ ＩＩ） ｉｓ ａ ｓｔａｇｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ－４ ｓｙｎｔｈａｓｅ’， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ２７８： ２６４７４－９．
Ｓａｉｔｏ， Ｓ．， Ｓ． Ｏｒｉｋａｓａ， Ｍ． Ｓａｔｏｈ， Ｃ． Ｏｈｙａｍａ， Ａ． Ｉｔｏ， ａｎｄ Ｔ． Ｔａｋａｈａｓｈｉ． １９９７． ’Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｇｌｏｂｏ－ｓｅｒｉｅｓ ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｒｅｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ’， Ｊｐｎ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ８８： ６５２－９．
Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． １９８９． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）．
Ｓａｎｄｓｔｅｄｔ， Ｊ．， Ｍ． Ｊｏｎｓｓｏｎ， Ｋ． Ｖｕｋｕｓｉｃ， Ｇ． Ｄｅｌｌｇｒｅｎ， Ａ． Ｌｉｎｄａｈｌ， Ａ． Ｊｅｐｐｓｓｏｎ， ａｎｄ Ｊ． Ａｓｐ． ２０１４． ’ＳＳＥＡ－４＋ ＣＤ３４－ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｄｕｌｔ ｈｕｍａｎ ｈｅａｒｔ ｓｈｏｗ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ’， Ｃｅｌｌｓ Ｔｉｓｓｕｅｓ Ｏｒｇａｎｓ， １９９： １０３－１６．
Ｓｃｈｉｅｒ， Ｒ．， Ａ． ＭｃＣａｌｌ， Ｇ． Ｐ． Ａｄａｍｓ， Ｋ． Ｗ． Ｍａｒｓｈａｌｌ， Ｈ． Ｍｅｒｒｉｔｔ， Ｍ． Ｙｉｍ， Ｒ． Ｓ． Ｃｒａｗｆｏｒｄ， Ｌ． Ｍ． Ｗｅｉｎｅｒ， Ｃ． Ｍａｒｋｓ， ａｎｄ Ｊ． Ｄ． Ｍａｒｋｓ． １９９６． ’Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｉｃｏｍｏｌａｒ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｔｉ－ｃ－ｅｒｂＢ－２ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ ｂｙ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ’， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ， ２６３： ５５１－６７．
Ｓｃｈｍｕｅｃｋ－Ｈｅｎｎｅｒｅｓｓｅ， Ｍ．， Ｒ． Ｓｈａｒａｆ， Ｋ． Ｖｏｇｔ， Ｂ． Ｊ． Ｗｅｉｓｔ， Ｓ． Ｌａｎｄｗｅｈｒ－Ｋｅｎｚｅｌ， Ｈ． Ｆｕｅｈｒｅｒ， Ａ． Ｊｕｒｉｓｃｈ， Ｎ． Ｂａｂｅｌ， Ｃ． Ｍ． Ｒｏｏｎｅｙ， Ｐ． Ｒｅｉｎｋｅ， ａｎｄ Ｈ． Ｄ． Ｖｏｌｋ． ２０１５． ’Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｖｉｒｕｓ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｅｍｏｒｙ ｓｔｅｍ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｍａｔｕｒｅ ｔｏ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｍｅｍｏｒｙ ｓｕｂｓｅｔｓ ｗｉｔｈ ｓｅｌｆ－ｒｅｎｅｗａｌ ｐｏｔｅｎｃｙ’， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ， １９４： ５５５９－６７．
Ｓｅｌｌ， Ｓ． １９９０． ’Ｃａｎｃｅｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ’， Ｈｕｍ Ｐａｔｈｏｌ， ２１： １００３－１９．
Ｓｈｅｖｉｎｓｋｙ， Ｌ． Ｈ．， Ｂ． Ｂ． Ｋｎｏｗｌｅｓ， Ｉ． Ｄａｍｊａｎｏｖ， ａｎｄ Ｄ． Ｓｏｌｔｅｒ． １９８２． ’Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｍｕｒｉｎｅ ｅｍｂｒｙｏｓ ｄｅｆｉｎｅｓ ａ ｓｔａｇｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｏｎ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｓ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ’， Ｃｅｌｌ， ３０： ６９７－７０５．
Ｓｉｄｍａｎ， Ｋ． Ｒ．， Ｗ． Ｄ． Ｓｔｅｂｅｒ， Ａ． Ｄ． Ｓｃｈｗｏｐｅ， ａｎｄ Ｇ． Ｒ． Ｓｃｈｎａｐｅｒ． １９８３． ’Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ｆｒｏｍ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ’， Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ， ２２： ５４７－５６．
Ｓｔｅｍｍｅｒ， Ｗ． Ｐ． １９９４． ’Ｒａｐｉｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｙ ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ’， Ｎａｔｕｒｅ， ３７０： ３８９－９１．
Ｓｔｅｗａｒｔ， ＪＭ．， ａｎｄ ＪＤ． Ｙｏｕｎｇ． １９８４． Ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ （Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ： Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）．
Ｓｕｒｅｓｈ， Ｔ．， Ｌ． Ｘ． Ｌｅｅ， Ｊ． Ｊｏｓｈｉ， ａｎｄ Ｓ． Ｋ． Ｂａｒｔａ． ２０１４． ’Ｎｅｗ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｔｈｅｒａｐｙ’， Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ， ７： ５８．
Ｓｕｚｕｋｉ， Ｙ．， Ｎ． Ｈａｒａｇｕｃｈｉ， Ｈ． Ｔａｋａｈａｓｈｉ， Ｍ． Ｕｅｍｕｒａ， Ｊ． Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ， Ｔ． Ｈａｔａ， Ｉ． Ｔａｋｅｍａｓａ， Ｔ． Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ， Ｈ． Ｉｓｈｉｉ， Ｙ． Ｄｏｋｉ， Ｍ． Ｍｏｒｉ， ａｎｄ Ｈ． Ｙａｍａｍｏｔｏ． ２０１３． ’ＳＳＥＡ－３ ａｓ ａ ｎｏｖｅｌ ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｍａｒｋｅｒ ｉｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒｓ’， Ｉｎｔ Ｊ Ｏｎｃｏｌ， ４２： １６１－７．
Ｔａｋｅｓｈｉｔａ， Ｍ．， Ｋ． Ｓｕｚｕｋｉ， Ｙ． Ｋａｓｓａｉ， Ｍ． Ｔａｋｉｇｕｃｈｉ， Ｙ． Ｎａｋａｙａｍａ， Ｙ． Ｏｔｏｍｏ， Ｒ． Ｍｏｒｉｔａ， Ｔ． Ｍｉｙａｚａｋｉ， Ａ． Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ， ａｎｄ Ｔ． Ｔａｋｅｕｃｈｉ． ２０１５． ’Ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＣＤ４＋ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｍｅｍｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ’， Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ， １５９： １０７－１７．
Ｔａｙｌｏｒ－Ｐａｐａｄｉｍｉｔｒｉｏｕ， Ｊ．， ａｎｄ Ａ． Ａ． Ｅｐｅｎｅｔｏｓ． １９９４． ’Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ ａｌｔｅｒｅｄ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ： ｐｒｏｇｒｅｓｓ ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｉｎ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｙ’， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， １２： ２２７－３３．
Ｔｏｎｄｅｕｒ， Ｓ．， Ｓ． Ａｓｓｏｕ， Ｌ． Ｎａｄａｌ， Ｓ． Ｈａｍａｍａｈ， ａｎｄ Ｊ． Ｄｅ Ｖｏｓ． ２００８． ’［Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ］’， Ａｎｎ Ｂｉｏｌ Ｃｌｉｎ （Ｐａｒｉｓ）， ６６： ２４１－７．
Ｔｏｒｅｌｌｉ， Ａ．， ａｎｄ Ｃ． Ａ． Ｒｏｂｏｔｔｉ． １９９４． ’ＡＤＶＡＮＣＥ ａｎｄ ＡＤＡＭ： ｔｗｏ ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｌｏｂａｌ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｂｅｔｗｅｅｎ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ’， Ｃｏｍｐｕｔ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｓｃｉ， １０： ３－５．
Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ， Ａ．， Ａ． Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ， ａｎｄ Ｋ． Ｋａｒｊａｌａｉｎｅｎ． １９９１． ’Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ （Ｊａｎｕｓｉｎｓ） ｔａｒｇｅｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｏｎ ＨＩＶ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｃｅｌｌｓ’， ＥＭＢＯ Ｊ， １０： ３６５５－９．
Ｔｒｉｌｌ， Ｊ． Ｊ．， Ａ． Ｒ． Ｓｈａｔｚｍａｎ， ａｎｄ Ｓ． Ｇａｎｇｕｌｙ． １９９５． ’Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ＣＯＳ ａｎｄ ＣＨＯ ｃｅｌｌｓ’， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， ６： ５５３－６０．
ｖａｎ Ｂｅｅｋ， Ｗ． Ｐ．， Ｌ． Ａ． Ｓｍｅｔｓ， ａｎｄ Ｐ． Ｅｍｍｅｌｏｔ． １９７３． ’Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｓｉａｌｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｎｓｉｔｙ ｉｎ ｓｕｒｆａｃｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ａｎｄ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｃｅｌｌｓ－－ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ？’， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ３３： ２９１３－２２．
Ｖａｒｋｉ， Ａ．， Ｒ． Ｄ． Ｃｕｍｍｉｎｇｓ， Ｊ． Ｄ． Ｅｓｋｏ， Ｈ． Ｈ． Ｆｒｅｅｚｅ， Ｐ． Ｓｔａｎｌｅｙ， Ｊ． Ｄ． Ｍａｒｔｈ， Ｃ． Ｒ． Ｂｅｒｔｏｚｚｉ， Ｇ． Ｗ． Ｈａｒｔ， ａｎｄ Ｍ． Ｅ． Ｅｔｚｌｅｒ． ２００９． ’Ｓｙｍｂｏｌ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｆｏｒ ｇｌｙｃａｎ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ’， Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ， ９： ５３９８－９．
Ｗａｒｄ， Ｅ． Ｓ．， Ｄ． Ｇｕｓｓｏｗ， Ａ． Ｄ． Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ， Ｐ． Ｔ． Ｊｏｎｅｓ， ａｎｄ Ｇ． Ｗｉｎｔｅｒ． １９８９． ’Ｂｉｎｄｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ａ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ’， Ｎａｔｕｒｅ， ３４１： ５４４－６．
Ｗｒｉｇｈｔ， Ａ． Ｊ．， ａｎｄ Ｐ． Ｗ． Ａｎｄｒｅｗｓ． ２００９． ’Ｓｕｒｆａｃｅ ｍａｒｋｅｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ’， Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ， ３： ３－１１．
Ｙｅ， Ｆ．， Ｙ． Ｌｉ， Ｙ． Ｈｕ， Ｃ． Ｚｈｏｕ， Ｙ． Ｈｕ， ａｎｄ Ｈ． Ｃｈｅｎ． ２０１０． ’Ｓｔａｇｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ４ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ’， Ｉｎｔ Ｊ Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｃａｎｃｅｒ， ２０： ９５８－６４．
Ｙｖｏｎ， Ｅ．， Ｍ． Ｄｅｌ Ｖｅｃｃｈｉｏ， Ｂ． Ｓａｖｏｌｄｏ， Ｖ． Ｈｏｙｏｓ， Ａ． Ｄｕｔｏｕｒ， Ａ． Ａｎｉｃｈｉｎｉ， Ｇ． Ｄｏｔｔｉ， ａｎｄ Ｍ． Ｋ． Ｂｒｅｎｎｅｒ． ２００９． ’Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｍｅｌａｎｏｍａ ｕｓｉｎｇ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＧＤ２－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌｓ’， Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， １５： ５８５２－６０．
Ｚｈａｎｇ， Ｙ．， Ｇ． Ｊｏｅ， Ｅ． Ｈｅｘｎｅｒ， Ｊ． Ｚｈｕ， ａｎｄ Ｓ． Ｇ． Ｅｍｅｒｓｏｎ． ２００５． ’Ｈｏｓｔ－ｒｅａｃｔｉｖｅ ＣＤ８＋ ｍｅｍｏｒｙ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｇｒａｆｔ－ｖｅｒｓｕｓ－ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ’， Ｎａｔ Ｍｅｄ， １１： １２９９－３０５．
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C-1】
【図2C-2】
【図2D-1】
【図2D-2】
【図2E-1】
【図2E-2】
【図2F】
【図2G】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6A-1】
【図6A-2】
【図6B-1】
【図6B-2】
【図6B-3】
【図7A-C】
【図7D】
【図8A】
【図8B】
【図9A】
【図9B】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図11】
【図12A】
【図12B】
【図12C-D】
【図13A】
【図13B】
【図13C】
【図13D】
【図13E】
【図14】
【図15A-B】
【図15C-D】
【図16】
【図17A-B】
【図17C】
【図17D】
【図18A】
【図18B】
【図18C】
【図18D-E】
【図19A】
【図19B】
【図19C-D】
【図20A】
【図20B-1】
【図20B-2】
【図20C-D】
【図21A】
【図21B】
【図21C】
【図22A-1】
【図22A-2】
【図22B】
【図23】
【図24A-1】
【図24A-2】
【図24B】
【国際調査報告】