(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-05-12
(54)【発明の名称】膣ゲル製剤及びその調製方法
(51)【国際特許分類】
A61K 31/7088 20060101AFI20230502BHJP
A61K 9/06 20060101ALI20230502BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230502BHJP
A61K 47/04 20060101ALI20230502BHJP
A61K 47/30 20060101ALI20230502BHJP
A61K 47/36 20060101ALI20230502BHJP
A61K 47/32 20060101ALI20230502BHJP
A61K 47/44 20170101ALI20230502BHJP
A61K 47/38 20060101ALI20230502BHJP
A61K 47/42 20170101ALI20230502BHJP
A61K 47/10 20170101ALI20230502BHJP
A61K 47/02 20060101ALI20230502BHJP
A61K 47/12 20060101ALI20230502BHJP
A61K 9/14 20060101ALI20230502BHJP
A61K 9/51 20060101ALI20230502BHJP
A61K 47/34 20170101ALI20230502BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20230502BHJP
C12N 15/88 20060101ALN20230502BHJP
【ＦＩ】
A61K31/7088
A61K9/06
A61K48/00
A61K47/04
A61K47/30
A61K47/36
A61K47/32
A61K47/44
A61K47/38
A61K47/42
A61K47/10
A61K47/02
A61K47/12
A61K9/14
A61K9/51
A61K47/34
C12N15/09 110
C12N15/88 Z ZNA
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022560145
(86)(22)【出願日】2020-11-11
(85)【翻訳文提出日】2022-09-29
(86)【国際出願番号】 CN2020128051
(87)【国際公開番号】W WO2021258614
(87)【国際公開日】2021-12-30
(31)【優先権主張番号】202010594395.8
(32)【優先日】2020-06-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522069286
【氏名又は名称】珠海舒桐医療科技有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＺＨＵＨＡＩ ＳＨＵ ＴＯＮＧ ＭＥＤＩＣＡＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＣＯ．， ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】Ｒｏｏｍ ４０４， Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ２， Ｎｏ． ３６， Ｄｏｕｋｏｕ Ｒｏａｄ， Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ－Ｍａｃａｏ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐａｒｋ， Ｈｅｎｇｑｉｎ Ｎｅｗ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｚｈｕｈａｉ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ， Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】110002468
【氏名又は名称】弁理士法人後藤特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】謝紅嫻
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C076AA09
4C076AA31
4C076AA65
4C076AA95
4C076BB30
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4C076FF21
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4C084AA13
4C084MA28
4C084MA41
4C084NA05
4C084NA10
4C084NA13
4C084ZC01
4C084ZC80
4C086AA01
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4C086MA28
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4C086NA05
4C086NA10
4C086NA13
4C086ZC01
4C086ZC80
(57)【要約】
本発明は、膣ゲル製剤及びその調製方法を提供する。当該膣ゲル製剤は、担体及び治療用遺伝子を含む。前記膣ゲル製剤は、親水性ポリマー材料改質モンモリロナイトを更に含み、前記担体は、カチオン性ポリマーを含む。本発明の膣ゲル製剤は、ナノ粒子の構造を十分に安定化することができ、高いトランスフェクション効率を有し、治療効果が良く、安全性が高く、膣局所投与することができる。本発明の膣ゲル製剤は、調製プロセスが簡単であり、試薬処方が柔軟である。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
担体及び治療用遺伝子を含む膣ゲル製剤であって、親水性ポリマー材料改質モンモリロナイトを更に含み、前記担体は、カチオン性ポリマーを含むことを特徴とする膣ゲル製剤。
【請求項2】
前記親水性ポリマー材料改質モンモリロナイトは、キトサン、キトオリゴ糖、キトサン誘導体、セルロース誘導体、デンプン誘導体、ゼラチン、シェラック、トラガカンス、アラビアガム、ペクチン、キサンタンガム、ポビドン、ポリビニルアルコール、ポリオキシエチレンから選択された１つ又は複数の改質剤を用いてモンモリロナイトに対して改質することにより得られることを特徴とする請求項１に記載の膣ゲル製剤。
【請求項3】
前記親水性ポリマー材料改質モンモリロナイトの中の前記親水性ポリマー材料と前記モンモリロナイトの質量比は、０．１～１：１であることを特徴とする請求項１又は２に記載の膣ゲル製剤。
【請求項4】
前記親水性ポリマー材料改質モンモリロナイトは、ナトリウム塩を更に含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の膣ゲル製剤。
【請求項5】
前記ナトリウム塩は、重炭酸ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、クエン酸水素二ナトリウム及び酢酸ナトリウムのうちの１つ又は複数であることを特徴とする請求項４に記載の膣ゲル製剤。
【請求項6】
前記カチオン性ポリマーと前記親水性ポリマー材料改質モンモリロナイトの質量比は、１：１～１０００であることを特徴とする請求項１に記載の膣ゲル製剤。
【請求項7】
前記膣ゲル製剤の調製方法は、前記カチオン性ポリマー及び前記治療用遺伝子を用いてナノ粒子を調製するステップと、前記ナノ粒子、前記親水性ポリマー材料改質モンモリロナイトと水を混合するステップを備えることを特徴とする請求項１に記載の膣ゲル製剤。
【請求項8】
前記担体と治療用遺伝子の質量比は、１０～１５０：１であることを特徴とする請求項１又は７に記載の膣ゲル製剤。
【請求項9】
前記ナノ粒子の表面は、帯電していることを特徴とする請求項７に記載の膣ゲル製剤。
【請求項10】
前記カチオン性ポリマーは、ポリ－β－アミノエステル、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリアミド－アミンのうちの１つ又は複数であることを特徴とする請求項１又は７に記載の膣ゲル製剤。
【請求項11】
前記治療用遺伝子は、プラスミド、ＤＮＡ及びＲＮＡのうちの１つ又は複数であることを特徴とする請求項１又は７に記載の膣ゲル製剤。
【請求項12】
ＰＨは、４．０～８．０であることを特徴とする請求項１に記載の膣ゲル製剤。
【請求項13】
ナノ粒子が含まれることを特徴とする請求項１に記載の膣ゲル製剤。
【請求項14】
基質及びナノ粒子を含み、前記基質は、親水性ポリマー材料改質モンモリロナイトを含み、前記ナノ粒子は、カチオン性ポリマー及び治療用遺伝子を含み、前記親水性ポリマー材料改質モンモリロナイトは、キトサン、キトオリゴ糖、キトサン誘導体、セルロース誘導体、デンプン誘導体、ゼラチン、シェラック、トラガカンス、アラビアガム、ペクチン、キサンタンガム、ポビドン、ポリビニルアルコール、ポリオキシエチレンから選択された１つ又は複数の改質剤を用いてモンモリロナイトに対して改質することにより得られ、前記カチオン性ポリマーは、ポリ－β－アミノエステルであり、その一般構造式は、【化1】
【請求項15】
酸性緩衝液において前記担体と前記治療用遺伝子がナノ粒子を形成するようにさせることにより、ナノ粒子を含む混合物を得るステップと、前記のナノ粒子を含む混合物は、前記親水性ポリマー材料改質モンモリロナイトと直接に混合することにより、前記膣ゲル製剤を調製する、又は、前記親水性ポリマー材料改質モンモリロナイトを水及び／又は酸性緩衝液に分散させてから、前記のナノ粒子を含む混合物と混合するステップとを備えることを特徴とする請求項１～１４の何れか１つに記載の膣ゲル製剤の調製方法。
【請求項16】
前記親水性ポリマー材料改質モンモリロナイトを調製するステップを更に備え、当該ステップにおいては、モンモリロナイト及び親水性ポリマー材料を水に添加し、ナトリウム塩を選択的に添加し、混合及び撹拌し、その後、ＰＨを４～６に調整し、攪拌して静置した後、コロイド状液体の上層を乾燥及び粉砕することにより、前記親水性ポリマー材料改質モンモリロナイトを得ることを特徴とする請求項１５に記載の膣ゲル製剤の調製方法。
【請求項17】
前記混合及び撹拌の温度は、５０～９０℃であり、時間は、１～１０時間であり、ＰＨが調整された後、５０～９０℃の一定の温度で０．５～２時間撹拌し、その後、冷却し、水を加えて均一に撹拌し、静置することを特徴とする請求項１６に記載の膣ゲル製剤の調製方法。
【請求項18】
請求項１～１４の何れか１つに記載の膣ゲル製剤を膣内に適用することを特徴とする治療用遺伝子の膣デリバリー方法。
【請求項19】
請求項１～１４の何れか１つに記載の膣ゲル製剤を膣局所投与する投与方法を用いることを特徴とする投与方法。
【請求項20】
請求項１～１４の何れか１つに記載の膣ゲル製剤が膣及び／又は子宮頸部疾患の遺伝子治療に用いられることを特徴とする応用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本願は、遺伝子治療分野に関し、特に、膣ゲル製剤及びその調製方法に関する。
【背景技術】
【0002】
ゲノム編集は、遺伝性疾患の治療において既に有望な成功が現れている。しかしながら、遺伝子治療の成功の鍵の１つは、遺伝子工学のデリバリービヒクルである。ポリマーナノ粒子（ＮＰｓ）は、ナノメートルサイズ、低毒性、長いサイクルタイム及び優れた可塑性により、遺伝子治療の効率的な送達が既に実現できている。
【0003】
特定の治療目標及び薬物動態学に基づき、遺伝子治療は、系統的又は局所的に行うことができる。膣は、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質を含む、治療用分子の送達を容易にする幾つかの特徴がある。膣経路は、十分な血液供給、高い接触面積及び幾つかの物質に対する適切な透過性を有し、全身及び局所投与ができる。また、経口投与時に遭遇する肝臓の初回通過効果及び胃腸管の液体を回避することができる。また、パピローマウイルス（ＨＰＶ）感染により引き起こされる病変や子宮頸がん等の一部の局所疾患は、何れも膣局所投与により治療することができる。全身投与に比べ、膣局所投与は、生殖路感染症の治療において独特のメリットを持っている。例えば、ゲノム編集ツールを局所使用してＨＰＶ感染症を治療ことは、治療効果を高め、オフターゲットによる副作用を最小限に抑えることができる。しかしながら、当該テクノロジーを臨床医学に転換する前に、幾つかの重要なハードルを克服する必要がある。膣の遺伝子治療薬を開発する主な困難の１つは、外来の遺伝子物質が局所的な微生物により分解されやすく、膣及び子宮頸部の粘液を通過する際に効率が低いことである故に、分解されないように遺伝子を保護し、その粘液浸透能力を高めることは、膣遺伝子デリバリー体系を開発する重点問題である。また、開放する生殖路からの流出を回避するために、製剤は、生殖路における保持及び長時間放出の目的を達成するために、坐剤、ゲル、錠剤、膣リング等の形態に調製する必要がある。しかし、これらの製剤においては、遺伝子デリバリーナノ粒子の構造を安定に保てるかどうかは、１つの大きなチャレンジである。膣と子宮頸の粘液の組成は、複雑である。ナノ粒子は、製剤において構造安定（例えば、カチオン性ポリマー及び遺伝子に分解する）を維持することができない場合、放出後、粘液の中のタンパク質／酵素、細菌分泌物、無機塩等の影響を受けやすいことにより、高いトランスフェクション効率を有する遺伝子―カチオン性ポリマーナノ粒子構造に自己組織化することができないため、遺伝子のトランスフェクション及びその後の治療効果に影響を与える。よって、ナノ粒子構造を安定に保てる製剤を開発することは、膣遺伝子デリバリーシステムの重要な一環である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
本発明の目的は、膣投与に適しており、外来遺伝子を効果的に送達することができる膣ゲル製剤及びその調製方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0005】
上述した目的を達成するために、本発明に用いられる技術案は、担体及び治療用遺伝子を含む膣ゲル製剤を提供する。前記膣ゲル製剤は、親水性ポリマー材料改質モンモリロナイトを更に含み、前記担体は、カチオン性ポリマーを含む。
【0006】
好ましくは、前記親水性ポリマー材料改質モンモリロナイトは、キトサン、キトオリゴ糖、セルロース誘導体、デンプン誘導体、ゼラチン、シェラック、トラガカンス、アラビアガム、ペクチン、キサンタンガム、ポビドン、ポリビニルアルコール、ポリオキシエチレンから選択された１つ又は複数の改質剤を用いてモンモリロナイトに対して改質することにより得られる。
【0007】
更に、好ましくは、前記親水性ポリマー材料改質モンモリロナイトの中の前記親水性ポリマー材料と前記モンモリロナイトの質量比は、０．１～１：１であり、より好ましくは、０．１～５：１である。
【0008】
本発明に用いられる、改質されていないモンモリロナイト原料は、天然モンモリロナイトであることが好ましく、Ａｌ２Ｏ３１６．５４％、ＭｇＯ４．６５％、ＳｉＯ２５０．９５％を含み、その構造式が（Ａｌ、Ｍｇ）２［ＳｉＯ１０］（ＯＨ）２・ｎＨ２Ｏであり、単斜晶系である。
【0009】
好ましくは、前記親水性ポリマー材料改質モンモリロナイトは、ナトリウム塩を更に含む。
【0010】
より好ましくは、前記ナトリウム塩は、重炭酸ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、クエン酸水素二ナトリウム及び酢酸ナトリウムのうちの１つ又は複数である。
【0011】
より好ましくは、前記ナトリウム塩と前記モンモリロナイトの質量比は、０．００１～０．０５：１であり、好ましくは、０．００５～０．０５：１である。
【0012】
好ましくは、前記カチオン性ポリマーと前記親水性ポリマー材料改質モンモリロナイトの質量比は、１：１～１０００であり、より好ましくは、１：１～１００であり、更により好ましくは、１：１～４０である。
【0013】
好ましくは、前記膣ゲル製剤の調製方法は、前記担体及び前記治療用遺伝子を用いてナノ粒子を調製するステップと、前記ナノ粒子、前記親水性ポリマー材料改質モンモリロナイトと水を混合するステップとを備える。
【0014】
また、好ましくは、前記ナノ粒子の中の担体と治療用遺伝子の質量比は、１０～１５０：１であり、より好ましくは、１０～１００：１であり、更により好ましくは、１０～８０：１である。
【0015】
また、好ましくは、前記ナノ粒子の粒子サイズの範囲は、１０～１０００ｎｍであり、より好ましくは、２００～４００ｎｍである。
【0016】
また、好ましくは、前記ナノ粒子の表面は、帯電している。
【0017】
好ましくは、前記カチオン性ポリマーは、ポリ－β－アミノエステル（ＰＢＡＥ）、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリアミド－アミン（ＰＡＭＡＭ）のうちの１つ又は複数である。
【0018】
また、好ましくは、前記ポリ－β－アミノエステルは、１，４－ブタンジオールジアクリレートモノマー、５－アミノ－１－ペンタノールモノマー及び１－（３－アミノプロピル）－４－メチルピペラジンモノマーから構成されている。
【0019】
また、好ましくは、前記ポリ－β－アミノエステルの一般構造式は、次の通りである。
なお、ｍは、５～２００の間の数であり、好ましくは、１５～３０の間の数である。
【化2】
【0020】
また、好ましくは、前記ポリ－β－アミノエステルの数平均分子量は、１５００～６００００であり、より好ましくは、５０００～８０００である。
【0021】
また、好ましくは、前記ポリ－β－アミノエステルの調製方法は、まず、１，４－ブタンジオールジアクリレートと５－アミノ－１－ペンタノールを８０～１００℃で３０～４０時間反応させ、その後、後処理により中間体が得られ、次に、中間体を１－（３－アミノプロピル）－４－メチルピペラジンと１０～４０℃で２０～３０時間反応させ、後処理により前記ポリ－β－アミノエステルが得られる。
【0022】
より好ましくは、前記１，４－ブタンジオールジアクリレートと前記５－アミノ－１－ペンタノールの原料投入のモル比は、１：０．８～１．２であり、前記中間体と前記１－（３－アミノプロピル）－４－メチルピペラジンの原料投入のモル比は、１：４～６である。
【0023】
好ましくは、前記治療用遺伝子は、プラスミド、ＤＮＡ及びＲＮＡのうちの１つ又は複数である。
【0024】
また、好ましくは、前記治療用遺伝子は、ターゲットＰＥＲＶ－Ｐｏｌ遺伝子の、ｓｇＲＮＡに転写されることが可能なＤＮＡとＳｐＣａｓ９から構成されるプラスミドである。
【0025】
より好ましくは、前記のｓｇＲＮＡに転写されることができるＤＮＡの配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１及び／又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されている。
【0026】
より好ましくは、前記ＳｐＣａｓ９は、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ１及び／又はｅＳｐＣａｓ９である。
【0027】
１つの具体的な好ましい実施形態によれば、前記治療用遺伝子は、ＳｐＣａｓ９－ｓｇＲＮＡ－１及び／又はＳｐＣａｓ９－ｓｇＲＮＡ－３であり、なお、前記ＳｐＣａｓ９－ｓｇＲＮＡ－１の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に示され、前記ＳｐＣａｓ９－ｓｇＲＮＡ－１の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に示されている。
【0028】
好ましくは、前記膣ゲル製剤のｐＨは、４～８であり、より好ましくは、４．５～５．５である。
【0029】
本発明においては、前記膣ゲル製剤は、ナノ粒子を含む。
【0030】
本発明における膣ゲル製剤は、酸性緩衝液を更に含み、前記酸性緩衝液は、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液及びリン酸緩衝液のうちの１つ又は複数である。
【0031】
より好ましくは、前記酸性緩衝液のｐＨは、４～６である。
【0032】
本発明においては、前記酸性緩衝液の濃度及び使用量並びに前記水の使用量は、ゲル製剤の必要な粘度に基づいて調整することができる。
【0033】
本発明の第二の側面は、基質及びナノ粒子を含む膣ゲル製剤を提供する。前記基質は、親水性ポリマー材料改質モンモリロナイトを含み、前記ナノ粒子は、カチオン性ポリマー及び治療用遺伝子を含む。
【0034】
当該技術案における、親水性ポリマー材料改質モンモリロナイト、カチオン性ポリマー及び治療用遺伝子は、本発明の第一の側面で提供される膣ゲル製剤の原料と同じであり、ここでは、繰り返して説明しない。
【0035】
１つの具体的な好ましい実施形態によれば、前記親水性ポリマー材料改質モンモリロナイトは、キトサン、キトオリゴ糖、キトサン誘導体、セルロース誘導体、デンプン誘導体、ゼラチン、シェラック、トラガカンス、アラビアガム、ペクチン、キサンタンガム、ポビドン、ポリビニルアルコール、ポリオキシエチレンから選択された１つ又は複数の改質剤を用いてモンモリロナイトに対して改質することにより得られる。
【0036】
前記カチオン性ポリマーは、ポリ－β－アミノエステルであり、その一般構造式は、次の通りである。
なお、ｍは、５～２００の間の数であり、前記治療用遺伝子は、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ１及び／又はｅＳｐＣａｓ９とｓｇＲＮＡ－１に転写することができるＤＮＡ及び／又はｓｇＲＮＡ－３に転写することができるＤＮＡにより形成されるプラスミドであり、ｓｇＲＮＡ－１に転写することができるＤＮＡの配列は、ＴＴＣＧＡＡＴＧＧＡＧＡＧＡＴＣＣＡＧＧであり、ｓｇＲＮＡ－３に転写することができるＤＮＡの配列は、ＧＧＴＧＡＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＧＴＡＣＧである。
なお、ｍは、５～２００の間の数であり、前記治療用遺伝子は、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ１及び／又はｅＳｐＣａｓ９とｓｇＲＮＡ－１に転写することができるＤＮＡ及び／又はｓｇＲＮＡ－３に転写することができるＤＮＡにより形成されるプラスミドであり、ｓｇＲＮＡ－１に転写することができるＤＮＡの配列は、ＴＴＣＧＡＡＴＧＧＡＧＡＧＡＴＣＣＡＧＧであり、ｓｇＲＮＡ－３に転写することができるＤＮＡの配列は、ＧＧＴＧＡＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＧＴＡＣＧである。
【0037】
本発明の第三の側面は、前記膣ゲル製剤の調製方法を提供する。当該調製方法は、酸性緩衝液において前記担体と前記治療用遺伝子がナノ粒子を形成するようにさせることにより、ナノ粒子を含む混合物を得るステップと、前記のナノ粒子を含む混合物は、前記親水性ポリマー材料改質モンモリロナイトと直接に混合することにより、前記膣ゲル製剤を調製する、又は、親水性ポリマー材料改質モンモリロナイトを水及び／又は酸性緩衝液に分散させてから、前記のナノ粒子を含む混合物と混合するステップとを備える。
【0038】
好ましくは、前記調製方法は、親水性ポリマー材料改質モンモリロナイトを調製するステップを更に備える。当該ステップにおいては、モンモリロナイト及び親水性ポリマー材料を水に添加し、ナトリウム塩を選択的に添加し、混合及び撹拌し、その後、ｐＨを４～６に調整し、攪拌して静置した後、コロイド状液体の上層を乾燥及び粉砕することにより、前記の親水性ポリマー材料改質モンモリロナイトを得る。
【0039】
また、好ましくは、前記混合及び撹拌の温度は、５０～９０℃であり、時間は、１～１０時間である。
【0040】
また、好ましくは、ｐＨが調整された後、５０～９０℃の一定の温度で０．５～２時間撹拌し、その後、冷却し、水を加えて均一に撹拌し、静置する。
【0041】
また、好ましくは、酸を用いて前記ｐＨを調整し、前記酸は、リン酸、クエン酸及び酢酸のうちの１つ又は複数である。
【0042】
１つの具体的な好ましい実施形態によれば、前記親水性ポリマー材料改質モンモリロナイトの調製方法においては、前記モンモリロナイト及び前記ナトリウム塩を水に加え、均一に混合した後、前記親水性ポリマー材料を加え、撹拌を続け、密封撹拌しながら、５０～９０℃まで温度を上昇させ、１～１０時間保持し、酸でｐＨを４～６に調整し、一定の温度で０．５～２時間撹拌し、室温まで冷却し、水を加えて均一に撹拌し、３０～６０分間静置した後、コロイド状液体の上層を取って乾燥及び粉砕することにより、前記親水性ポリマー材料改質モンモリロナイトを得る。
【0043】
好ましくは、前記ステップ（３）の具体的な方法においては、前記親水性ポリマー材料改質モンモリロナイトを水と混合し、その後、酸性緩衝液を加え、前記ナノ粒子を加え、均一に攪拌すれば良い。
【0044】
本発明の第四の側面は、治療用遺伝子の膣デリバリー方法を提供する。当該方法においては、まず、治療用遺伝子及び担体をナノ粒子に調製し、その後、前記ナノ粒子を親水性ポリマー材料改質モンモリロナイトと混合してゲル製剤を調製し、前記ゲル製剤を膣内に投与すれば良い。
【0045】
本発明の第五の側面は、投与方法を提供する。当該投与方法は、前記膣ゲル製剤を膣局所投与する。
【0046】
本発明の第六の側面は、膣／子宮頸部疾患の遺伝子治療における前記膣ゲル製剤の応用を提供する。
【0047】
具体的には、前記疾患は、ＨＰＶ感染に関連する子宮頸部病変、子宮頸がん又は単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）感染等を含む。
【0048】
本発明の膣ゲル製剤は、約１８～２５℃で保存する必要があるだけであり、当該製剤は、自分で使用することができ、患者及び医者にとって便利である。
【発明の効果】
【0049】
前記技術案の適用により、本発明は、従来技術に比べて以下のメリットを有する。即ち、
本発明の膣ゲル製剤は、ナノ粒子の構造を十分に安定化することができ、高いトランスフェクション効率を有し、治療効果が良く、安全性が高く、膣局所投与することができる。本発明の膣ゲル製剤は、調製プロセスが簡単であり、試薬処方が柔軟である。
本発明の膣ゲル製剤は、ナノ粒子の構造を十分に安定化することができ、高いトランスフェクション効率を有し、治療効果が良く、安全性が高く、膣局所投与することができる。本発明の膣ゲル製剤は、調製プロセスが簡単であり、試薬処方が柔軟である。
【図面の簡単な説明】
【0050】
【発明を実施するための形態】
【0051】
以下、図面に示される実施形態を参照しながら、本発明を更に説明する。しかしながら、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではない。実施形態において用いられている実施条件は、具体的な用途の異なる要求に基づいて更に調整することができ、記載されていない実施条件は、当業界の通常の条件である。
【0052】
以下の実施形態に用いられる主な原材料は、次の通りである。
【0053】
１，４－ブタンジオールジアクリレート（ＢＤＤ）及び５－アミノ－１－ペンタノール（ＡＰ）は、ＴＣＩ（中国上海）から購入した。
【0054】
１－（３－アミノプロピル）－４－メチルピペラジン（ＡＭＰ）は、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ（Ｌ０４８７６、米国）から購入した。
【0055】
ポリエチレンイミン２５ｋＤ（ＰＥＩ ２５ｋＤ）（Ｃａｔ、２８９６８）は、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ（４００Ｖａｌｌｅｙ Ｒｏａｄ、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ）から購入した。
【0056】
ポリリジンは、アラジン試薬から購入した。
【0057】
ＰＡＭＡＭは、Ｗｅｉｈａｉ Ｃｈｅｎ Ｙｕａｎ、山東から購入した。
【0058】
ｐＭＡＸ－ＧＦＰ（ＣＡＳ：８６０３１６８）は、Ｂｉｏ Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＣＣ（中国北京）から購入した。
【0059】
コードがＣａｓ９及びｓｇＲＮＡであるプラスミド（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラスミド）は、Ａｄｄｇｅｎｅ（＃５８７７８）から購入した。
【0060】
Ｍａｌｉら（Ｍａｌｉ Ｐ， Ｙａｎｇ Ｌ， Ｅｓｖｅｌｔ ＫＭ， Ａａｃｈ Ｊ， Ｇｕｅｌｌ Ｍ， ＤｉＣａｒｌｏ ＪＥ， ｅｔ ａｌ． ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｖｉａ Ｃａｓ９． Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２０１３；３３９（６１２１）：８２３－６） の方法に従ってターゲットＰＥＲＶ－ｐｏｌ遺伝子（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＪ２７９０５６．１）に対する３つのｓｇＲＮＡを設計し、ＧＥＮＥＷＩＺ（中国江蘇）により合成された。
【0061】
二本鎖オリゴヌクレオチドタグ（Ｔｓａｉ ＳＱ， Ｚｈｅｎｇ Ｚ， Ｎｇｕｙｅｎ ＮＴ， Ｌｉｅｂｅｒｓ Ｍ， Ｔｏｐｋａｒ ＶＶ， Ｔｈａｐａｒ Ｖ， ｅｔ ａｌ． ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ ｅｎａｂｌｅｓ ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｃｌｅａｖａｇｅ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ． Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． ２０１５；３３（２）：１８７－９７）の具体的な配列は、次の通りである。順方向、５’Ｇ＊Ｔ＊ＴＴＡＡＴＴＧＡＧＴＴＧＴＣＡＴＡＴＧＴＴＡＡＴＡＡＣＧＧＴ＊Ａ＊Ｔ ３’、逆方向、５’Ａ＊Ｔ＊ＡＣＣＧＴＴＡＴＴＡＡＣＡＴＡＴＧＡＣＡＡＣＴＣＡＡＴＴＡＡ＊Ａ＊Ｃ ３’（＊は、リン酸化を示す）。「オリゴヌクレオチドタグ」の作成方法は、次の通りである。２つのオリゴヌクレオチドをＳＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解し、濃度が２ＯＤ／１００ｕＬであり、等モルで混合し、９４℃で５分間インキュベートし、室温まで冷却する。本発明に用いられる全てのｓｇＲＮＡｓは、何れも表１に示されている。
【0062】
（第一の実施形態）ゲル製剤の調製
一、ＰＢＡＥポリマーの合成
ＢＤＤ、ＡＰ及びＡＭＰは、以下の方法によりＰＢＡＥポリマーを調製する。まず、ＢＤＤ（ｐ－ヒドロキシアニソールＭＥＨＱで安定化する）とＡＰを、１：１のモル比で混合し、磁気撹拌板でＮ２雰囲気において９０℃で３６時間撹拌した後、前記反応後、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で希釈し、沈殿後、冷エーテルで洗浄する。真空乾燥によりエーテルを除去した後、中間生成物（ｉ－ＰＢＡＥ）を室温で乾燥させる。次に、ｉ－ＰＢＡＥを無水ＤＭＦに溶解し、５倍のモル量のＡＭＰと室温で２４時間撹拌して反応させた後、反応生成物を冷たい無水ジエチルエーテルで沈殿させる。最後に、最終ポリマー（ＰＢＡＥ）をジエチルエーテルで３回洗浄し、真空で４８時間乾燥させ、使用するまで室温で保存する。
ＰＢＡＥポリマーの合成式は、図１Ａに示されている。
一、ＰＢＡＥポリマーの合成
ＢＤＤ、ＡＰ及びＡＭＰは、以下の方法によりＰＢＡＥポリマーを調製する。まず、ＢＤＤ（ｐ－ヒドロキシアニソールＭＥＨＱで安定化する）とＡＰを、１：１のモル比で混合し、磁気撹拌板でＮ２雰囲気において９０℃で３６時間撹拌した後、前記反応後、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で希釈し、沈殿後、冷エーテルで洗浄する。真空乾燥によりエーテルを除去した後、中間生成物（ｉ－ＰＢＡＥ）を室温で乾燥させる。次に、ｉ－ＰＢＡＥを無水ＤＭＦに溶解し、５倍のモル量のＡＭＰと室温で２４時間撹拌して反応させた後、反応生成物を冷たい無水ジエチルエーテルで沈殿させる。最後に、最終ポリマー（ＰＢＡＥ）をジエチルエーテルで３回洗浄し、真空で４８時間乾燥させ、使用するまで室温で保存する。
ＰＢＡＥポリマーの合成式は、図１Ａに示されている。
【0063】
１Ｈ－ＮＭＲ分光法（Ｂｒｕｋｅｒ ＡＶＡＮＣＥ ＩＩＩ ４００ＭＨｚ ＮＭＲ分光計、溶媒：ＣＤＣｌ３）により、ｉ－ＰＢＡＥ及びＰＢＡＥの構造が特徴付けられ、図１Ｂは、スペクトルを示している。化学シフト値が４．０６２ｐｐｍであるピークは、ＰＡＢＥ及びｉ－ＰＡＢＥのＢＤＤユニットの－ＣＯＯＣＨ２－の水素シグナルピークに属し、１．３２－１．５３ｐｐｍ領域は、ＡＰのメチレン－ＣＨ２－の水素シグナルピークであるが、２．４２、２．６５及び２．８５ｐｐｍのピークは、－Ｎ（ＣＨ２）２－、－ＮＣＨ２ＣＨ２ＯＣＯ及び－ＮＣＨ２ＣＨ２ＯＣＯ－の水素シグナルピークであり、ｉ－ＰＡＢＥスペクトルの５．８０－６．４０ｐｐｍ領域は、アリル末端基の水素シグナルピークであり、合成されたＰＡＢＥスペクトルからが検出されておらず、Ｃ－Ｃ二重結合とＡＭＰの間の反応が成功したことが示されている。
【0064】
本実施形態で調製されたＰＢＡＥの数平均分子量（Ｍｎ）は、６９８０Ｄａであり、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ、Ｗａｔｅｒｓ－２４１０システム）、Ｗａｔｅｒｓ ２４１４屈折率検出器（移動相：ＤＭＦ、標準品：狭分散ポリスチレン）によりテストされ、そのサンプルを濃度が０．３ｗｔ％であるジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、図１Ｃは、テスト結果を示している。
【0065】
フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｔｗｏ、３２回の繰り返しスキャン設定）により、ｉ－ＰＢＡＥ及びＰＢＡＥの構造が特徴づけられ、図１Ｄは、スペクトルを示し、１７３０ｃｍ－１のピークは、特に、ｉ－ＰＡＢＥ及びＰＢＡＥのＢＤＤ鎖の脂肪エステル－ＣＨ２－ＣＯＯ－ＣＨ２－に由来する。また、３２００～３５００ｃｍ－１の間の広いピークは、主鎖に－ＯＨが存在することを示しているが、ｉ－ＰＢＡＥの固有の１６３９及び１６２０ｃｍ－１ピークは、Ｃ－Ｃ二重結合の炭化水素伸縮振動ピークであり、ＰＢＡＥスペクトルにおいても消えている。前記結果は、１Ｈ－ＮＭＲの結果と一致しており、ＰＢＡＥが正常に合成されたことを示している。
【0066】
二、ＰＢＡＥ－プラスミドポリマーＮＰｓの調製と特性評価
ＰＢＡＥ－プラスミドポリマーＮＰｓを調製するために、ＰＢＡＥをｐＨが５．０であるクエン酸緩衝液に溶解し、超音波処理により溶解してポリマー溶液（濃度が２０ｍｇ／ｍＬである）を得る。 ポリマー溶液とプラスミドを、７５：１であるＰＢＡＥとプラスミドの重量比に従って均一に混合し、ボルテックスし、室温で３０分間インキュベートし、ＰＢＡＥ－プラスミドポリマーＮＰｓを得る。
ＰＢＡＥ－プラスミドポリマーＮＰｓを調製するために、ＰＢＡＥをｐＨが５．０であるクエン酸緩衝液に溶解し、超音波処理により溶解してポリマー溶液（濃度が２０ｍｇ／ｍＬである）を得る。 ポリマー溶液とプラスミドを、７５：１であるＰＢＡＥとプラスミドの重量比に従って均一に混合し、ボルテックスし、室温で３０分間インキュベートし、ＰＢＡＥ－プラスミドポリマーＮＰｓを得る。
【0067】
ＰＢＡＥ―プラスミドポリマーＮＰｓの特性評価は、動的光散乱（ＤＬＳ、Ｚｅｔａｐｌｕｓ、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ、米国）及び透過型電子顕微鏡（Ｈｉｔａｃｈｉ ＨＴ７７００、Ｊａｐａｎ）を用いて行われる。図１Ｅ及び図１Ｆは、テスト結果を示し、図１Ｇは、走査型電子顕微鏡（ＴＥＭ）の検出結果を示している。
【0068】
研究から分かるように、ＰＢＡＥとｐＤＮＡの最適な比率は、７５：１である。この時、図１Ｅ及び図１Ｆから分かるように、平均粒子サイズは、３１７．１±５．３ｎｍであり、ＰＤＩは、０．２６７（図１Ｅ）であり、表面電荷は、３４．９±６．５ｍＶである（図１Ｆ）。
【0069】
担体材料のＰＢＡＥとｐＤＮＡは、静電相互作用により圧縮されるので、ＮＰｓは、圧縮されて高密度に帯電する。透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）により、図１Ｇに示すように、複合ＮＰｓの形態が観察できる。電子顕微鏡の写真から分かるように、ＰＢＡＥにより形成された複合ＮＰｓは、全て球状粒子であり、サイズが約２４０ｎｍ前後に分布し、ＤＬＳテストの結果よりも小さい優れた分散特性を有する。この現象は、ポリ複合物ＮＰｓの脱水及び収縮により引き起こされている。
【0070】
ＰＥＩ－プラスミドポリマーＮＰｓ、ポリリジン－プラスミドポリマーＮＰｓ、ＰＡＭＡＭ－プラスミドポリマーＮＰｓ等の場合、ＰＢＡＥの代わりに、ＰＥＩ、ポリリジン、ＰＡＭＡＭ等を用いてプラスミドと混合すれば良く、なお、プラスミドＤＮＡと２５ｋｄａ ｌｉｎｅｒ ＰＥＩは、１０：１の質量比に従って混合され、残りのカチオン性ポリマーとプラスミドの質量比は、依然として７５：１である。
【0071】
三、膣ゲル製剤の調製
ＮＰｓ－ＨＴＴゲルの調製では、６６．６５ｍｇのヘクトライト（ＨＴＴ）と１ｍＬの水とを、磁気攪拌機において１０００～１５００ｒｐｍで混合し、２０～３０分間分散させた後、０．１１ｍＬ１０×クエン酸緩衝液（クエン酸：１ｍｏｌ／Ｌ、クエン酸ナトリウム：１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ値：４．７）に加えられ、その後、均一に混合するまで、１ｍＬ ＰＢＡＥ－プラスミドポリマーＮＰｓ（２５０μｇのプラスミドＤＮＡと１００μｇのオリゴヌクレオチドタグを含む）が加えられ、当該ゲルのｐＨが５．０である。
ＮＰｓ－ＨＴＴゲルの調製では、６６．６５ｍｇのヘクトライト（ＨＴＴ）と１ｍＬの水とを、磁気攪拌機において１０００～１５００ｒｐｍで混合し、２０～３０分間分散させた後、０．１１ｍＬ１０×クエン酸緩衝液（クエン酸：１ｍｏｌ／Ｌ、クエン酸ナトリウム：１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ値：４．７）に加えられ、その後、均一に混合するまで、１ｍＬ ＰＢＡＥ－プラスミドポリマーＮＰｓ（２５０μｇのプラスミドＤＮＡと１００μｇのオリゴヌクレオチドタグを含む）が加えられ、当該ゲルのｐＨが５．０である。
【0072】
ＮＰｓ－ｍＭＭＴゲルの調製：
１、改質モンモリロナイトｍＭＭＴの調製
１００ｍｇの薬用天然モンモリロナイトを、１ｍｇのクエン酸水素二ナトリウム及び２０ｍｇの水と混合し、均一に攪拌し、１０ｍｇのメチルセルロース改質剤を加えて攪拌を続け、密封攪拌しながら、ゆっくりと７０°Ｃまで温度を上昇させ、５時間維持し、クエン酸を用いてｐＨが５になるように調整し、一定の温度で１時間撹拌し、室温に冷却し、２５０ｍｇの水を加え、均一に撹拌し、４０分間静置した後に、コロイド液体の上層を乾燥及び粉砕することにより、ｍＭＭＴを得る。
１、改質モンモリロナイトｍＭＭＴの調製
１００ｍｇの薬用天然モンモリロナイトを、１ｍｇのクエン酸水素二ナトリウム及び２０ｍｇの水と混合し、均一に攪拌し、１０ｍｇのメチルセルロース改質剤を加えて攪拌を続け、密封攪拌しながら、ゆっくりと７０°Ｃまで温度を上昇させ、５時間維持し、クエン酸を用いてｐＨが５になるように調整し、一定の温度で１時間撹拌し、室温に冷却し、２５０ｍｇの水を加え、均一に撹拌し、４０分間静置した後に、コロイド液体の上層を乾燥及び粉砕することにより、ｍＭＭＴを得る。
【0073】
２、ＮＰｓ－ｍＭＭＴゲルの調製
６０ｍｇのｍＭＭＴと１ｍＬの水を、磁気撹拌機において１０００～１５００ｒｐｍで混合し、２０～３０分間分散させる。０．１１ｍＬ１０×クエン酸緩衝液（クエン酸：１ｍｏｌ／Ｌ、クエン酸ナトリウム：１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ値：４．７）を加え、１ｍＬ ＰＢＡＥ－プラスミドポリマーＮＰｓ（２５０マイクログラムのプラスミドＤＮＡ及び１００μｇのオリゴヌクレオチドタグを含む）を加え、均一に攪拌することで得られ、当該ゲルのｐＨは、５．０である。
６０ｍｇのｍＭＭＴと１ｍＬの水を、磁気撹拌機において１０００～１５００ｒｐｍで混合し、２０～３０分間分散させる。０．１１ｍＬ１０×クエン酸緩衝液（クエン酸：１ｍｏｌ／Ｌ、クエン酸ナトリウム：１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ値：４．７）を加え、１ｍＬ ＰＢＡＥ－プラスミドポリマーＮＰｓ（２５０マイクログラムのプラスミドＤＮＡ及び１００μｇのオリゴヌクレオチドタグを含む）を加え、均一に攪拌することで得られ、当該ゲルのｐＨは、５．０である。
【0074】
ＮＰｓ－Ｆ１２７ゲルの調製は、上述した２つのゲルの調製方法と同じであり、ＨＴＴ又はｍＭＭＴの代わり、感熱性ゲルＰｌｕｒｏｎｉｃＦ１２７を用いるという点が違い、当該ゲルのｐＨが５．０である。
【0075】
他のカチオン性ポリマーゲルは、ＰＢＡＥ－プラスミド複合ナノ粒子の代わりに、相応するポリマー－プラスミド複合ナノ粒子を用いれば良く、例えば、ＰＢＡＥ－プラスミド複合ナノ粒子の代わりに、ＰＥＩ－プラスミド複合ナノ粒子、ポリリジン－プラスミド複合ナノ粒子、ＰＡＭＡＭ－プラスミド複合ナノ粒子複合ナノ粒子等を用いれば良い。以下、ＮＰｓ又は複合ナノ粒子と略称する。
【0076】
走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ、日本日立ＳＵ８０１０）を用い、ＰＢＡＥ－プラスミド複合ナノ粒子（即ち、図２の複合ナノ粒子）、改質モンモリロナイトゲル基質（即ち、前記ＮＰｓ－ｍＭＭＴゲルの調製時、１ｍＬのＰＢＡＥ－プラスミドマルチマーＮＰを加えずに調製された基質）、ＮＰｓ－ｍＭＭＴゲル（即ち、図２の複合ナノ粒子－改質モンモリロナイトゲル）、ヘクトライトゲル基質（即ち、前記ＮＰｓ－ＨＴＴゲルの調製時、１ｍＬのＰＢＡＥ－プラスミドポリマーＮＰｓを加えずに調製された基質）、ＮＰｓ－ＨＴＴゲル（即ち、図２の複合ナノ粒子－ヘクトライトゲル）、Ｆ１２７ゲル基質（即ち、前記ＮＰｓ－Ｆ１２７の調製時、１ｍＬのＰＢＡＥ－プラスミドポリマーＮＰｓを加えずに調製された基質）及びＮＰｓ－Ｆ１２７ゲル（即ち、図２の複合ナノ粒子―Ｆ１２７ゲル基質）を２ｋＶで観察し、図２は、テスト結果を示している。試験前に、サンプルをコーティングの形でシリコンウエハーに固定し、金を噴霧した。配合の安定性を観察するために、ゲルを室温で３日間保存した後、ＳＥＭで観察した。
【0077】
ＮＰｓ－ｍＭＭＴゲルを４倍量のクエン酸緩衝液で希釈し、０．４５μｍのフィルターで濾過し、ゲルの中のＮＰｓの放出状況をテストした。当該溶液をＤＬＳでテストし、ゲルから放出されたＮＰｓの直径をテストし、室温で異なる保存時間（１日と３日間）を経た後、同じ方法でＮＰｓの大きさをテストし、図３は、テスト結果を示している。
【0078】
図２及び図３から分かるように、ｍＭＭＴゲルの中のＮＰｓは、変化せず、ＮＰ構造の安定性を維持することができ、希釈後にゲル基質からナノ粒子の形で直接に放出することができ、良好な保存安定性を有し、室温で３日間保存した後に放出されたナノ粒子の直径が変わらない。一方、ＨＴＴゲル及び感熱ゲルＰｌｕｒｏｎｉｃＦ１２７においては、ＮＰｓは、基質から受ける影響が比較的大きく、ナノ粒子の構造を維持することができない。
【0079】
（第二の実施形態）マウス生体実験
私達は、生体画像技術により、昆明マウスモデルにおけるＮＰｓ－ｍＭＭＴゲルの膣内保持能力を評価した。複合ナノ粒子の調製時に、蛍光色素Ｃｅ－６を、複合ナノ粒子の総質量の１％の質量比で複合ナノ粒子に混合してＣｅ－６標識のＮＰｓを得た後、第一の実施形態の技術案に基づいてＣｅ－６標識のＰＢＡＥ－プラスミド複合ナノ粒子ゲル（ＮＰｓ－ｍＭＭＴ ｇｅｌ）を調製した。次に、遊離する蛍光色素Ｃｅ－６及びＣｅ－６標識のＰＢＡＥ－プラスミド複合ナノ粒子ゲルは、それぞれマウスの膣に入れた。図４は、テスト結果示しており、遊離する蛍光色素（Ｃｅ－６）のシグナルは、一日以内で消えた。ｍＭＭＴゲルの場合、３日目に強い蛍光が見られる。これらの結果から分かるように、ｍＭＭＴゲルは、良好な膣内保持能力を有しており、膣内の遺伝子薬物の作用時間を改善することができる。
私達は、生体画像技術により、昆明マウスモデルにおけるＮＰｓ－ｍＭＭＴゲルの膣内保持能力を評価した。複合ナノ粒子の調製時に、蛍光色素Ｃｅ－６を、複合ナノ粒子の総質量の１％の質量比で複合ナノ粒子に混合してＣｅ－６標識のＮＰｓを得た後、第一の実施形態の技術案に基づいてＣｅ－６標識のＰＢＡＥ－プラスミド複合ナノ粒子ゲル（ＮＰｓ－ｍＭＭＴ ｇｅｌ）を調製した。次に、遊離する蛍光色素Ｃｅ－６及びＣｅ－６標識のＰＢＡＥ－プラスミド複合ナノ粒子ゲルは、それぞれマウスの膣に入れた。図４は、テスト結果示しており、遊離する蛍光色素（Ｃｅ－６）のシグナルは、一日以内で消えた。ｍＭＭＴゲルの場合、３日目に強い蛍光が見られる。これらの結果から分かるように、ｍＭＭＴゲルは、良好な膣内保持能力を有しており、膣内の遺伝子薬物の作用時間を改善することができる。
【0080】
（第三の実施形態）豚実験
（一）、異なるカチオン性ポリマーのトランスフェクション効果の比較
膣ゲル製剤のトランスフェクション効率を評価するために、第一の実施形態のＰＢＡＥ－プラスミド複合ナノ粒子、ＰＥＩ－プラスミド複合ナノ粒子、ＰＡＭＡＭ－プラスミド複合ナノ粒子の調製プロセスにおいては、第二の実施形態の方法で複合ナノ粒子を調製する際に、前記プラスミド（レポーター遺伝子）は、緑色蛍光タンパク質粒子（ＧＦＰ）である。
（一）、異なるカチオン性ポリマーのトランスフェクション効果の比較
膣ゲル製剤のトランスフェクション効率を評価するために、第一の実施形態のＰＢＡＥ－プラスミド複合ナノ粒子、ＰＥＩ－プラスミド複合ナノ粒子、ＰＡＭＡＭ－プラスミド複合ナノ粒子の調製プロセスにおいては、第二の実施形態の方法で複合ナノ粒子を調製する際に、前記プラスミド（レポーター遺伝子）は、緑色蛍光タンパク質粒子（ＧＦＰ）である。
【0081】
豚のゲノムは、人のゲノムに非常に近いため、私達は、大型哺乳類の豚を実験対象として選択し、豚は、生後１ヶ月の普通の家畜豚である。
【0082】
投与時、各豚には、ＧＦＰ標識のＰＢＡＥ－プラスミド複合ナノ粒子、ＰＥＩ－プラスミド複合ナノ粒子、ＰＡＭＡＭ－プラスミド複合ナノ粒子の何れか１つを投与し、投与量が２ｍＬであり、膣ゲルを豚の膣表面、子宮頸部表面及び後膣円蓋に均一に広げる。私達は、１日目及び４日目に投与し、７日目にブラシ（パパニコロウ塗抹標本に類似する）で子宮頸部細胞を収集し、サンプリングした子宮頸部細胞を子宮頸部細胞保存液に保存し、７１５ｇで５分間遠心分離して収集した。次に、私達は、同じ体積のＰＢＳに細胞を再懸濁し、ＤＡＰＩで染色した後、直接に分析し、サイトメーターで一定体積の細胞数をカウントすることにより、収集された細胞の総数を計算する。各グループについては、私達は、約２．５×１０４個の細胞を採取し、蛍光顕微鏡及びフローサイトメトリーに適用して検出を行い、その後、蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＤＭＩ８）及びフローサイトメトリー（Ｃ６、ＢＤ、米国）により各グループのトランスフェクション効果を検出し、図５は、テスト結果を示している。空白グループの細胞は、緑色蛍光が殆どなく、カチオン性ポリマーを含まないＧＦＰ－ｍＭＭＴも、ＧＦＰ表現が殆どないが、ＧＦＰ－ＰＢＡＥ ｍＭＭＴ、ＧＦＰ－ＰＥＩ ｍＭＭＴ及びＧＦＰ－ＰＡＭＡＭｍＭＭＴグループは、明らかなＧＦＰ表現が現れ、それぞれは、５７．０％、４１．５％及び２４．９％である。明らかに、ｍＭＭＴ＋カチオン性材料ＰＢＡＥを用いて膣ゲルを調製する際に、より高い割合のＧＦＰ陽性細胞を得ることができ、効率的な膣内遺伝子デリバリーを実現することができる。
【0083】
（二）、ｍＭＭＴとＨＴＴのトランスフェクション効果の比較
第一の実施形態のＰＢＡＥ－プラスミドポリマーＮＰｓの調製プロセスにおいては、第二の実施例の方法で複合ナノ粒子を調製する際に、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を、複合ナノ粒子の総質量の１％の質量比で複合ナノ粒子に混合し、第一の実施形態の技術案に基づき、ｍＭＭＴとＨＴＴのそれぞれを基質としてＰＢＡＥ－ＧＦＰ ＮＰｓ－ｍＭＭＴ及びＰＢＡＥ－ＧＦＰ ＮＰｓ－ＨＴＴを調製する。
第一の実施形態のＰＢＡＥ－プラスミドポリマーＮＰｓの調製プロセスにおいては、第二の実施例の方法で複合ナノ粒子を調製する際に、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を、複合ナノ粒子の総質量の１％の質量比で複合ナノ粒子に混合し、第一の実施形態の技術案に基づき、ｍＭＭＴとＨＴＴのそれぞれを基質としてＰＢＡＥ－ＧＦＰ ＮＰｓ－ｍＭＭＴ及びＰＢＡＥ－ＧＦＰ ＮＰｓ－ＨＴＴを調製する。
【0084】
ＧＦＰ－ＨＴＴ及びＧＦＰ－ｍＭＭＴの調製は、ＰＢＡＥが省略されたことを除き、前記ＰＢＡＥ－ＧＦＰ ＮＰｓ－ｍＭＭＴ及びＰＢＡＥ－ＧＦＰ ＮＰｓ－ＨＴＴの調製とほぼ同じである。
【0085】
次に、当該実施形態の第一の部分と同じ方法でトランスフェクション効率をテストした。図６は、テスト結果を示している。
【0086】
また、子宮頸部と臓器（卵巣、尿道、膣及び子宮）を収集し、任意の付着脂肪又は任意の他の余分の組織を除去するために、ＰＢＳで洗い流し、その後、４％のパラホルムアルデヒドで固定し、厚さが３～５μｍであるスライスに切り、Ｈ＆Ｅ染色とＩＨＣ染色に用いられ、図７は、テスト結果を示している。また、３つのグループの繰り返しを行い、膣塗抹標本の中のＧＦＰ＋細胞の割合をカウントし、結果は、空白グループが０．３０％±０．０５％であり、ＧＦＰ－ＨＴＴグループが１．４１％±０．２８％であり、ＧＦＰ－ｍＭＭＴグループが１．８０％±０．２４％であり、ＰＢＡＥ－ＧＦＰ ＮＰｓ－ＨＴＴグループが２５．７９％±１．５６％であり、ＰＢＡＥ－ＧＦＰ ＮＰｓ－ｍＭＭＴグループがそれぞれ５１．１２％±１．２３％である。
【0087】
明らかに、ｍＭＭＴ材料を用いて膣ゲルを調製した場合、ＧＦＰ陽性細胞の割合が遥かに高くなる（ｐ値＜０．０００１）。また、ＰＢＡＥを含まないデリバリーは、トランスフェクション効率が低く、カチオン性ポリマーＰＢＡＥが遺伝子デリバリー担体として必要であることを意味する。総括すると、データから分かるように、ＰＢＡＥ－ＧＦＰ ＮＰｓ－ｍＭＭＴゲルは、ＰＢＡＥ－ＧＦＰ ＮＰ－ＨＴＴゲルに比べ、体内膣内のＤＮＡデリバリーをより効率的に行うことができる。
【0088】
（第四の実施形態）ゲルシステムによる膣ウイルスの除去
豚の内在性レトロウイルス（ＰＥＲＶｓ）は、全ての豚のゲノムに組み込まれ、感染性粒子として放出される。幾つかの条件では、それらは、人の細胞に感染し、人の性感染症ウイルスと類似点を有する可能性がある。よって、この研究では、ＰＥＲＶｓを治療ターゲットとして選択し、大型哺乳類の豚のウイルス統合フラグメントを除去するゲルシステムの能力をテストする。
豚の内在性レトロウイルス（ＰＥＲＶｓ）は、全ての豚のゲノムに組み込まれ、感染性粒子として放出される。幾つかの条件では、それらは、人の細胞に感染し、人の性感染症ウイルスと類似点を有する可能性がある。よって、この研究では、ＰＥＲＶｓを治療ターゲットとして選択し、大型哺乳類の豚のウイルス統合フラグメントを除去するゲルシステムの能力をテストする。
【0089】
ＰＥＲＶは、そのＤＮＡを豚のゲノムに組み込んでプロウイルスを形成することができるレトロウイルスである。そのゲノムは、主に、ＰＥＲＶ－ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖの３つの遺伝子により構成されており、宿主ゲノムと一緒に複製することができる。
【0090】
以前の研究では、組織内のｐｏｌ遺伝子のコピー数がｇａｇ及びｅｎｖ遺伝子のコピー数より高いことが証明されているため、私達は、ＰＥＲＶ－ｐｏｌ遺伝子をターゲットにしたｓｇＲＮＡｓを設計した。ＺＨＡＮＧ実験室のウェブサイト（Ｄｏｅｎｃｈ ＪＧ、Ｆｕｓｉ Ｎ、Ｓｕｌｌｅｎｄｅｒ Ｍ、Ｈｅｇｄｅ Ｍ、Ｖａｉｍｂｅｒｇ ＥＷ、Ｄｏｎｏｖａｎ ＫＦ、ｅｔ ａｌ． Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｓｇＲＮＡ ｄｅｓｉｇｎ ｔｏ ｍａｘｉｍｉｚｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｍｉｎｉｍｉｚｅ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． ２０１６；３４（２）：１８４－９１）に基づき、私達は、スコアが最も高い３つのｓｇＲＮＡを選択し、ＳｐＣａｓ９－ｓｇＲＮＡプラスミド（ＳｐＣａｓ９－ｓｇＲＮＡ－１、ＳｐＣａｓ９－ｓｇＲＮＡ－２、ＳｐＣａｓ９－ｓｇＲＮＡ－３）を構築した。その後、相応するＰＢＡＥプラスミドＮＰｓを含む膣ＭＭＭＴゲルを調製する（調製方法は、第一の実施形態と同じである）。私達の以前の実験では、ターゲットが突然変異している場合、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの編集効率が影響を受けることが示されているからである。よって、動物実験の前に、私達は、慣例に従ってＰＥＲＶ ＤＮＡに対してＳａｎｇｅｒシークエンシングを行うことにより、ＰＥＲＶシーケンスが突然変異しているかどうかを確認する（図８Ａは、テスト結果を示している）。結果から分かるように、ｓｇＲＮＡ－２のターゲットＤＮＡが１つの塩基突然変異を有し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの編集効率に影響を与える可能性がある（図８Ｂは、テスト結果を示している）。故に、私達は、ｓｇＲＮＡ－１及びｓｇＲＮＡ－３を選択して更なる実験を行う。
【0091】
投与時、各豚には、２ｍＬのＰＢＡＥ－ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラスミドｍＭＭＴゲル（２５０ｕｇのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集システムプラスミドを含む）（即ち、第一の実施形態で調製して得られたＮＰｓ－ｍＭＭＴゲル）を投与し、それを生後１か月の豚の膣表面、子宮頸部表面及び後膣円蓋に均一に分布させる。１日目と４日目には、投与し、７日目には、細胞を収集した。その後、ブラシを雌豚の子宮頸の入口の周りで３回回転させて細胞を取得した（これは、人である患者のパパニコロウ塗抹標本収集法に非常に類似している）。子宮頸部細胞を採取して子宮頸部細胞保存溶液に入れ、７１５ｇで５分間遠心分離する。次に、同じ体積のＰＢＳで細胞を再懸濁し、セルカウンターで一定体積の細胞数をカウントし、収集された細胞の総数を計算する。各グループから約２．５×１０４個の細胞を採取して分析を行う。
【0092】
ＤＮＡ抽出及びＰＣＲ
ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ ６９５０６、Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ試薬テストキットを用いてＤＮＡを抽出する。ＰＣＲ反応は、Ｑ５で高精度２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ （Ｍ０４９４Ｓ， ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢｉｏＬａｂｓ， 米国）をウォームスタートすることで行われる。表１は、用いられたプライマーを示している。ｑＰＣＲは、ＰｏｗｅｒＵｐＳＹＢＲＧｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａ２５７４２、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国）を用いてＢｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ９６機器で行われる。実験は、３回の生物学的反復を行い、豚のＧＡＰＤＨ遺伝子を内部参照遺伝子として用いられ、２－ΔΔＣＴ法でＰＥＲＶコピー数の相対的な表現変化を計算する。表１は、用いられたプライマーを示している。
私達は、ＰＢＡＥ ＮＰｓに基づくｍＭＭＴゲルがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを豚の膣上皮に効率的に導入し、当該部位のＰＥＲＶをターゲットとし、ウイルスのコピー数を大幅に減らしたことを証明することができた。ＰＢＡＥ－ＳｐＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ－１ ＮＰｓ－ｍＭＭＴ膣ゲルを豚の膣に適用された後、ＰＥＲＶのウイルスのコピー数を減らすことができた（図８Ｅ）。
ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ ６９５０６、Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ試薬テストキットを用いてＤＮＡを抽出する。ＰＣＲ反応は、Ｑ５で高精度２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ （Ｍ０４９４Ｓ， ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢｉｏＬａｂｓ， 米国）をウォームスタートすることで行われる。表１は、用いられたプライマーを示している。ｑＰＣＲは、ＰｏｗｅｒＵｐＳＹＢＲＧｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａ２５７４２、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国）を用いてＢｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ９６機器で行われる。実験は、３回の生物学的反復を行い、豚のＧＡＰＤＨ遺伝子を内部参照遺伝子として用いられ、２－ΔΔＣＴ法でＰＥＲＶコピー数の相対的な表現変化を計算する。表１は、用いられたプライマーを示している。
【表1】
【0093】
ＳｐＣａｓ９が体内で膣内のＰＥＲＶ ＤＮＡを切断する場合、ｏｌｉｇｏは、切断部位に挿入される。挿入部位ゲノムとｏｌｉｇｏ ＤＮＡに対してＰＣＲ反応（１つのプライマーは、ｏｌｉｇｏにあり、もう１つのプライマーは、ターゲットに近いゲノム部位にある）を行うことにより、約２００ｂｐの正しいサイズが得られる（図８Ｃは、テスト結果を示している）。予想通り、Ｓａｎｇｅｒ－Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｓは、ＳｐＣａｓ９－ＰＥＲＶ ｓｇＲＮＡプラスミドが体内で豚の子宮頸部の上皮細胞のＰＥＲＶ ＤＮＡ配列を効率的に切断し、ｏｌｉｇｏが正しく挿入されたことを示している（図８Ｃ）。更なるｑＰＣＲも、ＰＢＡＥ－ＳｐＣａｓ９ ＮＰｓゲル処理グループでＰＥＲＶのコピー数の減少を示している。治療の前に比べ、ｓｇＲＮＡ－１グループのＰＥＲＶのコピー数は、３４％減少し、ｓｇＲＮＡ－３グループのＰＥＲＶのコピー数は、１７％減少するので、ｓｇＲＮＡ－１の切断効率は、ｓｇＲＮＡ－３より優れることが分かる（図８Ｅ）。
【0094】
ゲノム編集の効率を損なうことなくオフターゲットサイトを減らすために、ＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼの特異性は、ｅＳｐＣａｓ９とＳｐＣａｓ９－ＨＦ１の２つのバリアントにより高めることができる。よって、当該研究では、ｍＭＭＴゲルにおけるｅＳｐＣａｓ９及びｅＳｐＣａｓ９－ＨＦ１並びにｓｇＲＮＡ－１の有効性を更にテストした。対照グループに比べ、ＰＥＲＶコピー数はＳｐＣａｓ９－ＨＦ１グループのＰＥＲＶが約４２％減少し、ｅＳｐＣａｓ９グループが３４％減少したので、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ１ベースの膣ゲルがより効果的であることを示している（Ｐ＜０．０５、図８Ｆ）。プラスミド送達は、ＰＢＡＥのコピー数に影響を与える炎症反応を引き起こす可能性があるため、私達は、実験グループＰＢＡＥ－ＳｐＣａｓ９－ＨＦ１（ｓｇＲＮＡなし）ＮＰｓ－ｍＭＭＴゲルを別の対照グループとして追加してこの現象を観察した。私達は、ｓｇＲＮＡ処理なしのＳｐＣａｓ９－ＨＦ１グループのＰＥＲＶのコピー数は、処理前に比べて変化しなかったことが分かり（図８Ｆ）、これは、プラスミド送達がＰＥＲＶのコピー数に影響を与える免疫応答を誘発しなかったことを意味する。
【0095】
総括すれば、これらのデータは、ＰＢＡＥ－Ｃａｓ９ ＮＰｓ－ｍＭＭＴ膣ゲルに基づく体内ＤＮＡ送達が効率的な局所ゲノム編集を実現したことを示している。
【0096】
（第五の実施形態）ゲルの安全性評価
豚を安楽死させた後、その子宮頸部、卵巣、尿道、膣及び子宮を分離して固定する（４％のパラホルムアルデヒド）。パラフィン包埋切片（５ ｍｍ）は、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈプロトコル（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｔｇｃｎ．ｃｏｍ／ｓｕｐｐｏｒｔ／ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）に基づいてＩＨＣ染色を行った。
豚を安楽死させた後、その子宮頸部、卵巣、尿道、膣及び子宮を分離して固定する（４％のパラホルムアルデヒド）。パラフィン包埋切片（５ ｍｍ）は、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈプロトコル（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｔｇｃｎ．ｃｏｍ／ｓｕｐｐｏｒｔ／ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）に基づいてＩＨＣ染色を行った。
【0097】
私達は、まず、デリバリーシステムの生体内分布を評価した。私達のシステムのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラスミドは、Ｆｌａｇタグを含んでいるため、プラスミドが豚の臓器のある場所に送達され、トランスフェクトに成功すると、Ｆｌａｇが表現される。私達は、免疫組織化（ＩＨＣ）方法を用いて膣、尿道、子宮頸部、卵巣及び子宮等の異なる臓器におけるＦｌａｇ標識の表現を染色した。膣及び子宮頸部の組織だけは、Ｆｌａｇの表現があり、膣が最も強いことが分かった。標識は、他の臓器組織において表現がない。これは、私達のシステムが膣と子宮頸部で局所的に機能し、近くの臓器に広がっていないことを意味している（図９Ａ）。次に、ＮＰｓ－ｍＭＭＴゲル処理の豚に対して血液一般検査及び血液の生化学的検査を行い、その毒性を評価した。血液検査は、造血系や免疫系等を含む全身の複数のシステムの正常な代謝を反映している。血液生化学的指標の中では、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）及びアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）は、肝機能に関連しているが、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＢＵＮ）は、腎臓の重要な指標である。１日目及び４日目には、一般的なｍＭＭＴゲルを投与し、血液と血清を採取し、治療の前日及び７日目には、血液検査と血液生化学的検査を行った。血液一般検査のＷＢＣ、ＲＢＣ等の指標は、投与前に比べて顕著な差異がない（Ｐ＜０．０５、図９Ｂ）。血液生化学的検査でも類似する結果が得られた（図９Ｃ）。また、子宮頸部、卵巣、尿道、膣、子宮に対してヘマトキシリン－エオジン染色（Ｈ＆Ｅ）を行い、薬物の毒性を評価した。その結果、異常な形態、病的浮腫、炎症性壊死及びアポトーシス小体が見られなかった（図９Ｄ）。
【0098】
私達は、結果を証明するために、ＰＢＡＥ－ＳｐＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ ＮＰｓ－ｍＭＭＴ治療グループと対照グループの膣、子宮頸部及び尿道内腔の炎症性サイトカインＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－αに対して免疫化学的検査も行った。明らかな炎症性サイトカイン染色が観察されなかった（図１０）。データは、私達の投与処方が比較的安全であり、局所的な膣の生物分布及び低毒性の特徴を有し、これも、臨床試験におけるゲルシステムの将来の応用に有利である。
【0099】
上述した統計分析の全ての定量的データは、少なくとも３回の並列測定の平均値±ＳＤとして表される。統計分析は、単一要因分散分析を用い、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８）で事後検定及びＴ検定を行うことにより計算し、なお、Ｐ＜０．０５は、顕著な差異とされる。
【0100】
上述した実施形態は、本願の技術的概念及び特徴を説明するものであり、その目的は、当該技術分野に精通している者が本発明の内容を理解し、本願の内容に基づいて実施することができるようにすることであり、本願の特許権利の範囲を制限しない。本願の精神に基づいて行われた全ての等価の変更又は修飾は、何れも本発明の特許保護の範囲に属する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【配列表】
【国際調査報告】