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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-05-15
(54)【発明の名称】標的化された配列決定の方法
(51)【国際特許分類】
C40B 40/06 20060101AFI20230508BHJP
C12Q 1/6844 20180101ALI20230508BHJP
C12Q 1/6853 20180101ALI20230508BHJP
C12Q 1/48 20060101ALI20230508BHJP
C12Q 1/34 20060101ALI20230508BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALI20230508BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20230508BHJP
【ＦＩ】
C40B40/06
C12Q1/6844 Z
C12Q1/6853 Z
C12Q1/48
C12Q1/34
C12Q1/6869 Z
C12N15/09 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022542997
(86)(22)【出願日】2021-01-15
(85)【翻訳文提出日】2022-09-12
(86)【国際出願番号】 US2021013598
(87)【国際公開番号】W WO2021146534
(87)【国際公開日】2021-07-22
(31)【優先権主張番号】62/962,777
(32)【優先日】2020-01-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/009,603
(32)【優先日】2020-04-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】518274618
【氏名又は名称】ジャンプコード ゲノミクス，インク．
(74)【復代理人】
【識別番号】110003797
【氏名又は名称】弁理士法人清原国際特許事務所
(74)【代理人】
【識別番号】100082072
【弁理士】
【氏名又は名称】清原 義博
(72)【発明者】
【氏名】ブラウン，キース
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA13
4B063QQ02
4B063QQ06
4B063QQ07
4B063QQ08
4B063QQ10
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR08
4B063QR14
4B063QR62
4B063QS25
4B063QS36
4B063QX02
(57)【要約】
本明細書において、標的核酸を含む配列決定ライブラリーを作製するための方法と組成物が提供される。本明細書の方法は：核酸サンプルをプライマーの第１の集団、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、および標識されたｄｄＮＴＰに接触させる工程；伸長反応を実行する工程であって、それによって標識された伸長生成物を作製する、工程；標的核酸を含む二本鎖伸長生成物を作製するために、伸長生成物をプライマーの第２の集団に接触させる工程；二本鎖伸長生成物の少なくともサブセットの切断を可能にする条件下で、前記二本鎖伸長生成物を標的特異的酵素に接触させる工程であって、それにより、切断された標的核酸を作製する、工程；および、切断された標的核酸を単離する工程を含み得る。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
標的核酸を含む配列決定ライブラリーを作製する方法であって、前記方法は、（ａ）核酸サンプルをプライマーの第１の集団、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、および標識されたｄｄＮＴＰに接触させる工程、
（ｂ）伸長反応を実行する工程であって、それによって標識された伸長生成物を作製する、工程、
（ｃ）標的核酸を含む二本鎖伸長生成物を作製するために、前記伸長生成物をプライマーの第２の集団に接触させる工程
（ｄ）前記二本鎖伸長生成物の少なくともサブセットの切断を可能にする条件で、前記二本鎖伸長生成物を標的特異的酵素に接触させる工程であって、それにより、切断された標的核酸を作製する、工程；および、
（ｅ）前記切断された標的核酸を単離する工程を含む、方法。
【請求項2】
前記核酸サンプルは変性される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
プライマーの前記第１の集団または第２の集団は、ランダムプライマーを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
プライマーの前記第１の集団または第２の集団は、バーコードを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項5】
プライマーの前記第１の集団または第２の集団は、オリゴ－ｄＴプライマーを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項6】
標識されたｄｄＮＴＰは、ビオチンを含む、請求項１から５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項7】
標識された伸長生成物は、ビーズ上で単離される、請求項１から６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項8】
前記ビーズはストレプトアビジン・ビーズである、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記ビーズは磁気ビーズである、前記請求項７に記載の方法。
【請求項10】
標識された伸長生成物は、ポリプロピレンまたはポリカーボネート表面上で単離される、請求項１から６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項11】
標的特異的酵素は、標的特異的なガイドＲＮＡと複合体化される、請求項１から１０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項12】
標的特異的な酵素は、ＣＲＩＳＰＲ酵素である、請求項１から１１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項13】
標的特異的な酵素は、Ｃａｓヌクレアーゼである、請求項１から１２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項14】
標的特異的な酵素は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、請求項１から１３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項15】
標的特異的な酵素は、ヌクレアーゼである、請求項１から１０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項16】
前記ヌクレアーゼは、制限エンドヌクレアーゼである、請求項１から１５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項17】
前記標的核酸は、デオキシリボ核酸である、請求項１から１６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項18】
前記標的核酸は、リボ核酸である、請求項１から１６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項19】
前記ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、またはそれらの組み合わせである、請求項１から１８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項20】
前記標的核酸は、ウイルスの核酸、バクテリアの核酸、病原体の核酸、一塩基多型、疾病関連遺伝子、癌関連遺伝子、ヒト白血球抗原遺伝子、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１から１９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項21】
ウイルスは、インフルエンザウイルス、コロナウイルス、ライノウイルス、ヘルペスウイルス、またはヒト免疫不全ウイルスである、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
前記コロナウイルスは、ＣＯＶＩＤ－１９ウイルスである、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
相互参照
本出願は、２０２０年１月１７日に出願の米国仮特許出願第６２／９６２，７７７号、及び２０２０年４月１４日に出願の米国仮特許出願第６３／００９，６０３号の利益を主張するものであり、これらは各々、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年１月１７日に出願の米国仮特許出願第６２／９６２，７７７号、及び２０２０年４月１４日に出願の米国仮特許出願第６３／００９，６０３号の利益を主張するものであり、これらは各々、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
核酸配列決定の進歩は、ますます手頃な価格で大量のサンプルが配列決定されることを可能にする。しかしながら、ただ１つまたは少量の標的配列を配列決定することが、データ処理の時間とコスト、配列決定のコストを削減するために、または、稀な事象に対する検出感度を増加させるために、望ましい場合がある。
【発明の概要】
【0003】
標的化配列決定パネルは、焦点化された配列決定、ならびに既知の遺伝子配列内の既知および未知の分子事象の様々な発見を可能にする、重要な研究および診断ツールである。応用は、癌ホットスポット配列決定、遺伝病、薬理ゲノム学、感染症、ならびに、ヒトおよび農業に関する生物種の両方における他の応用を含む。標的化または遺伝子座特異的デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）（およびリボ核酸（ＲＮＡ））配列決定の主な正当化理由は、コストを下げ、かつ感度を増大させることである。
【0004】
これらの欠陥を排除することができる標的化配列決定の技術は、従って、非常に魅力的である。そのような方法は、以下の特性を有するに違いない：鋳型分子の断片化がないこと；ＲＮＡとＤＮＡの両方に使えること；各標的セットのための広範囲な最適化を必要としないこと；ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の感度および速度を有すること；ハイブリッド捕捉の規模とコストを有すること；前もって定義された「対照（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）」配列に向けて結果を片寄らせないこと；すべての標的遺伝子座の均等なカバレッジを提供すること；および、微小のサンプル供給源と多様なサンプル品質（すなわち、非常に断片化されている材料か、劣化されている材料か）から作業可能であること。
【0005】
いくつかの実施形態では、本明細書における方法は、実績のあるＲｉｐｔｉｄｅ Ｒａｐｉｄライブラリー調製の性能と、規則的に間が置かれてクラスター化された短い回文反復（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ）（ＣＲＩＳＰＲ）に基づく標的化の特異性と速度とを組み合わせる。サンプルインプットは、ＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。鋳型分子は、熱変性され、５’サンプル・バーコードテール（ｂａｒｃｏｄｅ ｔａｉｌ）を備えたランダムプライマーに接触され得る。高忠実度のポリメラーゼは、テンプレート配列の正確なコピーを作りながら、プライマーを３’端から伸長するために使用することができる。伸長された生成物は、小量のビオチン化デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を使用して終止され得る。この第１の工程は、同時に配列決定に適用可能な断片サイズを生成し、および親和性分子を付加しながら、分子にバーコード付けするために、使用することができる。精製は、端末のビオチン分子を、ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズに結合することにより生じる場合がある。この方法は、バーコード付きの生成物を単離することができる一方、その分子がクロスハイブリダイゼーションや他のテンプレート分子のさらなる３’伸長ができないようにすることを可能にし得る。このことは、また、可能な限り早期の段階における多重化サンプル処理を可能にし得る。複数のサンプルは、この最初のバーコード付けする工程の後に、単一の反応管の中へとプールされ得る。
【0006】
生成物がビーズ上で（またはコーティングされたマイクロウェル上でさえ）固定された後、それらは、ランダムプライミングの工程によって、二本鎖分子に変換され得る。場合によっては、この工程において、高忠実度の鎖置換ポリメラーゼが使用され、つまり、ビーズに最も近く結合したプライマーが、下流のすべての生成物を置換することができる。得られた分子組成物は、二本鎖のバーコード（平滑末端）を片側に、およびテンプレートの二本鎖コピーをビーズに結合させて、含み得る。場合によっては、ランダムプライマーの代わりに、プライマーゼと鎖置換ポリメラーゼを組み合わせて、この生成物を産生する。複数のサンプルは、こうして、このフォーマットにおいて存在することができ、全てが、反応における第１のプライミング工程から生成された固有のサンプルバーコードを備える。すべての過剰な反応物質は、洗い流され得る。標的化された遺伝子座について富化するために、エクソンに隣接した配列を標的とするガイドＲＮＡ分子のプール、単一のヌクレオチド変異体（ＳＮＶ）、または他の対象とする遺伝子標的は、直接またはＤＮＡテンプレートのインビトロの転写を通じて、設計および合成され得る。ガイドＲＮＡ分子のプールは、リボヌクレオプロテイン（ＲＮＰ）複合体の多重化プールを形成するためにＣＡＳ９またはＣＡＳ酵素誘導体と共にインキュベートされ得る。その後、これらのＲＮＰ複合体は、先に記載された捕捉された生成物と共にインキュベートすることができ、標的分子の二本鎖切断を生じ、これがビーズから溶出される。非標的分子は、ビーズに結合されたままであり得る。生じたプール（溶出）は、一端にサンプルバーコード、そして他端にＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ標的に対応する平滑末端標的部位を包含する、多重サンプルライブラリー由来の平滑末端標的配列を包含し得る。その後、これらの平滑末端生成物は、汎用アダプターのライゲーションによって標準ライブラリー構築に供され得る。場合によっては、プレート特異的なバーコードは、サンプルのより大きな多重化とさらなるコスト削減を可能にするために（指標読取位置に）追加される。
【0007】
この方法は：癌ホットスポット／液体生検；遺伝子特異的ＮＩＰＴ；遺伝病／常染色体上の劣性遺伝子標的（Ｔａｙ Ｓａｃｈｓ、Ｃｙｓｔｉｃ Ｆｉｂｒｏｓｉｓなど）；微生物の１６ｓ同定；ゲノム創薬／吸収、分布、代謝、排泄（ＡＤＭＥ）遺伝子標的；感染症標的；法医学マーカーなどの応用に使用することができ、および、任意の標的部位にカスタマイズされ得る。
【0008】
場合によっては、このアプローチは、遺伝子標的の多連試験または遺伝子型の確認を可能にする。例えば、ローパス配列決定およびインピュテーションは、ゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）を行なうために使用される場合があり、および、確認試験は、ライブラリーの第２のセットを調製することを必要とせずに、候補ＳＮＶまたは候補遺伝子配列のより深いカバレッジのためのサンプルライブラリー上で行なわれ得る。同じバーコードを付されたサンプルセットは、新しい発見がなされ、低コストの確認を必要とするとき、様々な遺伝子標的の連続テストのために使用され得る。
【0009】
本明細書において、標的核酸を含む配列決定ライブラリーを作製する方法が提供される。いくつかの場合では、方法は：（ａ）核酸サンプルをプライマーの第１の集団、ポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）、および標識されたｄｄＮＴＰに接触させる工程；（ｂ）伸長反応を実行する工程であって、それによって標識された伸長生成物を作製する、工程；（ｃ）二本鎖伸長生成物を作製するために前記伸長生成物をプライマーの第２の集団に接触させる工程；（ｄ）二本鎖伸長生成物の少なくともサブセットの切断を可能にする条件下で、前記二本鎖伸長生成物を標的特異的酵素に接触させる工程であって、それにより、切断された標的核酸を作製する、工程；および、（ｅ）切断された標的核酸を単離する工程を含む。場合によっては、核酸サンプルライブラリーは、変性される。場合によっては、プライマーの第１の集団または第２の集団は、ランダムプライマーを含む。場合によっては、プライマーの第１の集団または第２の集団は、バーコードを含む。場合によっては、プライマーの第１の集団または第２の集団は、オリゴ－ｄＴプライマーを含む。場合によっては、標識されたｄｄＮＴＰはビオチンを含む。場合によっては、標識された伸長生成物は、ビーズ上で単離される。場合によっては、ビーズはストレプトアビジン・ビーズである。場合によっては、ビーズは磁気ビーズである。場合によっては、標識された伸長生成物は、ポリカーボネート、ポリプロピレン、またはポリカーボネート表面上で単離される。場合によっては、標的特異的酵素は、標的特異的なガイドＲＮＡと複合体化される。場合によっては、標的特異的な酵素はＣＲＩＳＰＲ酵素である。場合によっては、標的特異的な酵素は、Ｃａｓヌクレアーゼである。場合によっては、標的の特異的な酵素は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである。場合によっては、標的特異的な酵素は、ヌクレアーゼである。場合によっては、標的核酸は、デオキシリボ核酸である。場合によっては、標的核酸は、リボ核酸である。場合によっては、ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、またはそれらの組み合わせである。場合によっては、標的核酸は、ウイルスの核酸、バクテリアの核酸、一塩基多型、疾病関連遺伝子、癌関連遺伝子、ヒト白血球抗原遺伝子、またはそれらの組み合わせを含む。場合によっては、ウイルスは、インフルエンザウイルス、コロナウイルス、ライノウイルス、ヘルペスウイルス、またはヒト免疫不全ウイルスである。場合によっては、コロナウイルスは、ＣＯＶＩＤ－１９ウイルスである。場合によっては、標的核酸は、約５ｋｂ～約２０ｋｂである。場合によっては、標的核酸は、約１０ｋｂ～約１５ｋｂである。
【0010】
参照による組み込み
本明細書で言及される刊行物、特許、および特許出願はすべて、あたかも個々の刊行物、特許、または特許出願がそれぞれ参照により引用されるように具体的かつ個々に指示されるのと同じ程度にまで、参照により本明細書に引用される。
本明細書で言及される刊行物、特許、および特許出願はすべて、あたかも個々の刊行物、特許、または特許出願がそれぞれ参照により引用されるように具体的かつ個々に指示されるのと同じ程度にまで、参照により本明細書に引用される。
【図面の簡単な説明】
【0011】
特許または出願ファイルは、カラーで実行された少なくとも１つの図面を包含している。カラーの図面を有するこの特許または特許出願公開のコピーが、必要な料金の請求および支払い後に当該事務局によって提供される。
【0012】
本発明の特徴と利点を良く理解するには、本発明の原理が用いられる例示的実施形態を説明する以下の詳細な説明と添付図面とを参照されたい。
【0013】
【図1】標的化配列決定の方法を図示する。
【図2】単管のＨＣｏＶ２を標的とした配列決定法を図示する。
【図3】大腸菌ゲノムの標的化配列決定を図示する。
【図4】標的化配列決定のロングリードおよびショートリードの応用を図示する。
【図5】標的化配列決定のアダプターおよびバーコードの応用を図示する。
【図6】多重標的分子の生成を図示する。
【図7】配列に対応したライブラリー生成のための小さな断片を図示する。
【発明を実施するための形態】
【0014】
最も一般に使用される標的化配列決定アプローチとして、ＰＣＲまたはＰＣＲ類似の派生、およびハイブリダイゼーションに基づくキャプチャープロトコルが挙げられる。両方の技術は、最初の非常に並列化されたシーケンサーが商業化されるかなり前に開発された。過去２０年間にわたり、これらのアプローチの速度およびコストにおいて劇的な進歩が得られたが、それらは、恐らく革新の限界に達した。従って、両方の技術は高価であり且つ時間を消費する最適化を必要とするため、標的化配列決定へのこれらの時代遅れのアプローチを置き換える新技術が必要とされる。
【0015】
ＰＣＲとＰＣＲの派生は、優れた特異性と感度に加えて、比較的速いサンプル処理時間の利点を有する。しかしながら、これらのアプローチは、多重化するとき、高価であり、大規模な最適化を必要とし、および、煩わしいポスト増幅正規化を必要とする。加えて、これらのアプローチは、２つの反対鎖のプライマーを使用する時、高い中断率を有し、同じ遺伝子座の冗長なサンプリングが可能でなく、および新規な再配列を検出するか発見する能力を欠く。ポリメラーゼエラーのクローン増幅もまた、大きな問題である。これらの制限のうちのいくつかを克服する戦略として、クローンのポリメラーゼエラーを検出するための、固有分子指標（Ｕｎｉｑｕｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｄｉｃｅｓ）（ＵＭＩ）またはバーコードの使用、ならびに再配列を検出するための、半特異的（ｈｅｍｉ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ）もしくは「ネストされた」アプローチが挙げられる。後者は、半特異的アプローチに先立って、フラグメンテーションを使用するライブラリーを作製することを必要とする。これらの方法はまた、多くの最適化を必要とし、ロングリード配列決定システムには向かない。さらに、プライマリー部位の下の一塩基多型（ＳＮＰ）は、しばしば脱落を起こす。加えて、対立遺伝子のバイアスは、カバレッジ（各アンプリコンの表現）の均一性の不足と共に、問題である。
【0016】
ハイブリッド捕捉と呼ばれるハイブリダイゼーションに基づくアプローチは、新規な構造の再配列を発見する能力を与え、および、同時に配列決定することができる標的の数の点で規模の増加を与える。しかしながら、ハイブリッド捕捉アプローチには、まだ多数の欠陥がある。現在まで、すべてのハイブリッド捕捉アプローチは、断片化工程で始まる。この工程は、鋳型分子が化学的または物理的な断片化によって引き起こされる損傷のために失われることになるため、情報消失を生じる。最も効率的な断片化プロトコルの後、最もよい場合で、個々の核酸分子の６０％が保持される。加えて、ハイブリッド捕捉アプローチについては、ハイブリダイゼーションプローブが最初に設計されている配列に対する対照対立遺伝子バイアスが報告されている。キャプチャー効率は、配列の内容の違いのために幅広くばらつきがあり、そのため、臨床グレード配列決定に必要とされる最小のカバレッジに達するためには、サンプルの過剰配列決定（ｏｖｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を必要とする。
【0017】
実際、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎの研究者による２０２０年１月の刊行物は、主要な商用エクソーム配列決定提供者のうちの３つが重要な遺伝子をカバーしないことを明かした。「３つの主な米国の研究所の臨床試験の調査は、全エクソーム配列決定が、ＤＮＡの大きなセグメントを十分に解析することに常習的に失敗すること、医師が癲癇から癌におよぶ潜在的な遺伝障害を正確に診断することを妨害し得る潜在的に重要な欠陥を示した。」ＵＴ Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎによる再分析は、各研究室が、平均的で、遺伝子の４分の３未満－－３４、６６、および６９パーセントのカバレッジ－－を適切に検査し、および特定の障害を検出するそれらの能力において、驚くほどに広いギャップを有していた、と説明する。研究者は、試験品質における広範な差異は臨床遺伝学の配列決定において特有であるが、十分報告されてこなかった、あるいは臨床医の間で共有されてこなかったと信じ、当該研究を行なったと述べる。（出典：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｃｉｅｎｃｅｄａｉｌｙ．ｃｏｍ／ｒｅｌｅａｓｅｓ／２０２０／０１／２００１０６１０３４５１．ｈｔｍ）
【0018】
ハイブリッド・キャプチャー戦略は、多重化の増加（多数の標的）を可能にし、クローンの増幅エラーを回避する。しかしながら、ワークフローは長く、煩わしく、および、キャプチャーはあまり特異的ではない。この方法は、また対立遺伝子バイアスと脱落の影響を受け、ロングリード配列決定のために理想的ではない。
【0019】
理想的な標的化配列決定戦略は無制限の多重化、サンプル中のすべての標的カバレッジ／表現の均一性を可能にし、およびロングリードとショートリードの配列決定技術において機能するだろう。また、それは初期設計において高転換率を有するだろう。
【0020】
現在、標的化配列決定技術は、主としてアンプリコンベース、またはハイブリダイゼーションベースのいずれかである。アンプリコンベースの戦略は、一般にＰＣＲまたはＰＣＲの派生を使用する。これらは高感度で、相対的に速いプロトコルであり得る。しかし、プライマー設計の制約（すなわち、アンプリコンの重複がない）のため、多重化能力に限界がある場合が多い。それはまた、一般に多くの最適化を必要とし、ロングリード配列決定システムには向かない。さらに、プライマー部位の下のＳＮＰは脱落を起こす場合がある。加えて、クローンのポリメラーゼエラーと対立遺伝子のバイアスは問題となり得る。増幅ベースの標的化配列決定における別の問題は、カバレッジ（すなわち、各アンプリコンの表現）の均一性である。
【0021】
ハイブリダイゼーション捕捉戦略は、増加された多重化（多数の標的）を可能にし、クローンの増幅エラーを回避する。しかしながら、ワークフローは長く煩わしいものになり得る。具体的に、この方法では、特異性、対立遺伝子バイアス、および脱落、さらにポーズが問題となる。ハイブリダイゼーション法も、ロングリード配列決定のために理想ではない。
【0022】
理想的な標的化配列決定戦略は、無制限の多重化を可能にし、サンプル中のすべての標的のカバレッジと表現の均一性を提供し、およびロングリードとショートリードの配列決定技術において機能し、および初期設計上で高転換率を有するだろう。
【0023】
定義
関連する定義の部分的なリストは以下の通りである。
関連する定義の部分的なリストは以下の通りである。
【0024】
本明細書で使用される「増幅された核酸」または「増幅されたポリヌクレオチド」は、その量が、その開始量と比較して、インビトロで実行される任意の核酸増幅または複製方法の少なくとも２倍増加された、任意の核酸またはポリヌクレオチド分子である。例えば、増幅された核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）から得られ、いくつかの事例では、ＤＮＡを指数関数的に増幅することができる（例えば、ｎサイクルで２ｎコピーに増幅）。増幅された核酸は、線形の増幅から得ることもできる。
【0025】
本明細書に使用される「増幅産物」は、ポリメラーゼ連鎖反応などの増幅反応によって生じる生成物を指し得る。
【0026】
本明細書で使用される「アンプリコン」は、天然または人工の増幅または複製事象の源および／または産物であるポリヌクレオチドまたは核酸である。
【0027】
本明細書で使用される用語「生体サンプル」または「サンプル」は、一般に、生物学的存在から分離されたサンプルまたは部分を指す。生体試料は、全体の性質を示す場合があり、例としては、体液、解離した腫瘍標本、培養細胞、およびそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。生体試料は１つ以上の個体由来であり得る。１つ以上の生体試料が同じ個体由来であり得る。１つの限定しない例において、第１のサンプルは個体の血液由来であり、第２のサンプルは個体の腫瘍生検標本由来であり得る。生体サンプルの例はとしては、限定されないが、血液、血清、血漿、鼻スワブ（ｎａｓａｌ ｓｗａｂ）または鼻咽頭洗浄液、唾液、尿、胃液、髄液、涙、便、粘液、汗、耳垢、油、腺分泌物、脳脊髄液、組織、精液、膣液、腫瘍組織由来の間質液を含む間質液、眼液、髄液、咽頭スワブ、息、毛、指の爪、皮膚、生検標本、胎盤液、羊水、臍帯血、強調液（ｅｍｐｈａｔｉｃ ｆｌｕｉｄｓ）、腔液、痰、膿、細菌叢、胎便、母乳および／または他の分泌物が挙げられる。サンプルは、鼻咽頭洗浄液を含み得る。被験体の組織サンプルの例としては、限定されないが、結合組織、筋組織、神経組織、上皮組織、軟骨、癌または腫瘍のサンプル、あるいは骨が挙げられる。サンプルはヒトまたは動物から提供され得る。サンプルは、ネズミ、サル、ヒト、家畜、スポーツ動物、またはペットなどの脊椎動物を含む哺乳動物から提供され得る。サンプルは、生きているか又は死んでいる被験体から収集され得る。サンプルは、被験体から新鮮に得られるか、あるいは前処理、保存、または輸送の何らかの形態を経ている場合がある。
【0028】
本明細書で使用される「体液」は、一般に被験体の身体から生じる流体または分泌物を記載し得る。いくつかの事例では、体液は、一緒に混合された１つを超えるタイプの体液の混合物である。体液の幾つかの限定しない例としては、血液、尿、骨髄、髄液、胸膜液、リンパ液、羊水、腹水、痰、またはそれらの組み合わせが挙げられる。
【0029】
「相補的」または本明細書に使用されるような「相補性」は、塩基対合によって関連づけられる核酸分子を指すことができる。相補的なヌクレオチドは、一般に、ＡおよびＴ（またはＡおよびＵ）、あるいはＣおよびＧ（またはＧおよびＵ）である。最適にアラインメントされた、および適切なヌクレオチドの挿入または欠失が伴う、１つの鎖のヌクレオチドが、少なくとも約９０％から約９５％またはそれ以上の相補性、およびより好ましくは約９８％から約１００％の相補性、およびさらにより好ましくは１００％の相補性を有して対になるときに、２つの一本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ分子は、実質的に相補的であると言われる。代替的に、ＲＮＡまたはＤＮＡの鎖が選択的なハイブリダイゼーション条件下でその補体にハイブリダイズするときに、相当な相補性が存在する。選択的なハイブリダイゼーション条件は、限定されないが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を含む。ハイブリダイゼーション温度は、一般に、少なくとも約２℃から約６℃融解温度（Ｔｍ）より低い。
【0030】
「バーコード」または「分子バーコード」は、本明細書では、標識化のための物質である。バーコードは、核酸またはポリペプチドなどの分子を標識することができる。標識化のための材料は、情報に関連づけられる。バーコードは、配列識別子（例えば、配列ベースの バーコードまたは配列指標）と呼ばれる。バーコードは、特定のヌクレオチド配列であり得る。バーコードは、識別子として使用することができる。バーコードは、異なるサイズの分子、または同じ分子の異なる終了点であり得る。バーコードは、分子内の特異的な配列および異なる終了配列を含み得る。例えば、同じプライマーから増幅され且つ２５ヌクレオチド位置を有する分子は、増幅され且つ２７ヌクレオチド位置を有する分子とは異なる。２７ｍｅｒ配列の付加位置はバーコードとみなし得る。バーコードは、ポリヌクレオチドに組み込まれ得る。バーコードは、多くの方法によってポリヌクレオチドに組み込まれる。バーコードを組み込むためのいくつかの非限定的な法は、分子生物学的方法を含み得る。バーコードを組み込むための分子生物学的方法のいくつかの非限定的な例は、プライマー（例えば、テールのプライマー伸長）、プローブ（即ち、ライゲーションによるプローブへの伸長）、またはライゲーション（即ち、分子への既知の配列のライゲーション）による方法である。
【0031】
バーコードは、ポリヌクレオチドの任意の領域の中に組み込まれ得る。前記領域は、既知であり得る。あるいは、前記領域は、未知であり得る。バーコードは、ポリヌクレオチドにわたって任意の位置に付加され得る。場合によっては、バーコードは、ポリヌクレオチドの５’端に付加され得る。あるいは、バーコードは、ポリヌクレオチドの３’端に付加され得る。バーコードは、ポリヌクレオチドの５’端と３’端との間に付加され得る。場合によっては、バーコードは、１つ以上の他の既知の配列を用いて付加され得る。１つの非限定的な例として、配列アダプターを用いたバーコードの付加がある。
【0032】
バーコードは、情報に関連づけられ得る。バーコードが情報に関連付けられる情報のタイプのいくつかの限定しない例は、次のものを含む：サンプルの供給源；サンプルの配向；サンプルが処理された領域または容器；隣接したポリヌクレオチド；またはそれらの任意の組み合わせ。
【0033】
場合によって、バーコードは、（コンビナトリアルバーコードとは異なる）配列の組み合わせから作られ、サンプルまたはゲノム座標および鎖の分子標識およびコピーが得られる異なる鋳型分子または一本鎖を同定するために使用される。場合によって、各生体分子に対するサンプル識別子、ゲノム座標、および特異的標識が、一緒に増幅され得る。バーコード、合成コード、または標識情報はまた、（エラーまたはエラー訂正を可能にする）コードの配列構成、コードの長さ、コードの方位、分子内のコードの位置から、および他の天然または合成のコードと組み合わせて、入手され得る。
【0034】
バーコードは、サンプルのプーリング（ｐｏｏｌｉｎｇ）前に付加され得る。プールされたサンプルの配列が決定される時、バーコードは、ポリヌクレオチドの残りと共に配列決定され得る。場合によっては、バーコードは、配列決定された断片をサンプルの供給源に関連づけるために使用される。
【0035】
バーコードは、代替的に、撚り（ｓｔｒａｎｄｅｄｎｅｓｓ）のサンプルを同定するために使用され得る。１つ以上のバーコードが一緒に使用され得る。２つ以上のバーコードは、互いに隣接しているか、隣接していないか、またはその組み合わせであり得る。
【0036】
場合によっては、バーコードはコンビナトリアル標識化のために使用される。
【0037】
本明細書で使用される「コンビナトリアル標識化（Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｌａｂｅｌｉｎｇ）」は、２以上のバーコードが使用される方法である。２つ以上のバーコードがポリヌクレオチドを標識し得る。バーコードは、それぞれ、単独で情報に関連づけられる。バーコードの組み合わせは、一緒に情報に関連づけられ得る。場合により、バーコードの組み合わせは、増幅が、サンプル鋳型の合成コピーからではなく、元のサンプル鋳型から生じたことをランダムに増幅された分子において判定するために、一緒に使用される。場合により、別のバーコードの配列と組み合わせた１つのバーコードの長さは、ポリヌクレオチドを標識するために使用される。場合により、別のバーコードの配向と組み合わせた１つのバーコードの長さは、ポリヌクレオチドを標識するために使用される。他の場合では、１つのバーコードの配列は、ポリヌクレオチドを標識するために別のバーコードの配向とともに使用される。場合により、第１および第２のバーコードの配列は、それらの間のヌクレオチドの距離との組み合わせにおいて、ポリヌクレオチドを標識または同定するために使用される。
【0038】
本明細書に使用される「二本鎖」は、逆相補的な配向などで、相補的塩基対合によってアニールされた２つのポリヌクレオチド鎖を指す。
【0039】
本明細書に使用される「既知のオリゴヌクレオチド配列」または「既知のオリゴヌクレオチド」あるいは「既知の配列」は、知られているポリヌクレオチド配列を指す。既知のオリゴヌクレオチド配列は、設計されたオリゴヌクレオチド、例えば、次世代型配列決定プラットフォームのためのユニバーサルプライマー（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、４５４）、プローブ、アダプター、タグ、プライマー、分子バーコード配列、識別子に対応し得る。既知の配列は、プライマーの部分を含み得る。既知のオリゴヌクレオチド配列は、特定のユーザーに実際には知られていないが、例えば、コンピューターによって利用可能なデータとして保存されることによって構造的に知られている。既知の配列は、また、実際に知られていない通商上の秘密または１人以上のユーザーにとって秘密であるが、ユーザーが使用している実験の特定のコンポーネント、キット、装置、またはソフトウェアを設計した実体に知られている場合がある。
【0040】
本明細書で使用される「ライブラリー」は、核酸のコレクションを指し得る。ライブラリーは１つ以上の標的断片を含み得る。いくつかの例では、標的断片は増幅された核酸である。他の例では、標的断片は増幅されていない核酸である。ライブラリーは、３’末端、５’末端、または３’末端と５’末端の両方に加えられた１つ以上の既知のオリゴヌクレオチド配列を有する核酸を含有し得る。ライブラリーは、断片が、ライブラリーの供給源を特定する既知のオリゴヌクレオチド配列を含有するように調製され得る（例えば、患者またはＤＮＡ源を同定する分子同定バーコード）。いくつかの例では、２つ以上のライブラリーが、ライブラリープール（ｌｉｂｒａｒｙ ｐｏｏｌ）を作製するためにプールされる。ライブラリーはまた、当該技術分野で知られているような、トランスポゾン媒介性の標識化、または「タグ付け（ｔａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）」などの、他のキットおよび技術を用いて生成され得る。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮＥＸＴＥＲＡキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）などのキットは、市販で入手可能である。
【0041】
本明細書で使用される「遺伝子座特異的な（Ｌｏｃｕｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ）」または「遺伝子座特異的な（ｌｏｃｉ ｓｐｅｃｉｆｉｃ）」は、核酸分子中の位置（例えば、染色体またはゲノム内の位置）に対応する１つ以上の遺伝子座を指し得る。いくつかの例では、遺伝子座は遺伝子型に関連づけられる。いくつかの例では、遺伝子座は、例えば、ハイブリダイゼーションおよび／または他の配列ベースの技術に基づいて、サンプルから直接単離され、富化されるか、あるいは、配列の検出前に鋳型としてサンプルを使用して選択的に増幅される。いくつかの例では、遺伝子座は個体間のＤＮＡレベルの変異に基づいて、特定の染色体に対する特異性に基づいて、選択された遺伝子座のＣＧ内容および／または必要とされる増幅条件に基づいて、または当業者にとって本開示を読むことで明白となる他の特徴に基づいて、選択される場合がある。遺伝子座はまた、特異的なゲノム座標またはそのゲノムの対照配列によって明示されるようなゲノムにおける位置を指す場合がある。
【0042】
本明細書で使用される「長い核酸」は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０キロベースより長いポリヌクレオチドを指す。
【0043】
本明細書で使用される用語「融解温度」または「Ｔｍ」は、通常、二本鎖核酸分子の集団が一本鎖へと半分に解離される温度を指す。核酸のＴｍを計算する等式は、当該技術分野において周知である。Ｔｍ値の単純な概算を与える１つの方程式は次のとおりであり：Ｔｍ＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ １０［Ｎａ＋］）０．４１（％［Ｇ＋Ｃ］）－６７５／ｎ－１．０ｍ、この時、核酸は０．５Ｍ未満のカチオン濃度を有する水溶液中にあり、（Ｇ＋Ｃ）の内容は、３０％～７０％の間にあり、ｎは塩基の数であり、および、ｍは不適正塩基対のパーセンテージである（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｒｄ Ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （２００１）を参照されたい）。他の参考文献は、より精巧な計算を含んでもよく、それらは構造ならびに配列の特徴をＴｍの計算のために考慮に入れる。
【0044】
本明細書で使用される「ヌクレオチド」は、塩基－糖－リン酸の組み合わせを指し得る。ヌクレオチドは、核酸配列（例えば、ＤＮＡとＲＮＡ）の単量体単位である。用語ヌクレオチドは、例えば、自然発生および非自然発生のリボヌクレオシド三リン酸ＡＴＰ、ＴＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＧ、ＧＴＰ、およびＩＴＰ、およびｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、またはそれらの誘導体などのデオキシリボヌクレオシド三リン酸を含む。そのような誘導体は、例えば、［ａＳ］ｄＡＴＰ、７－デアザ－ｄＧＴＰおよび７－デアザ－ｄＡＴＰ、および例えば、それらを含有している核酸分子に対するヌクレアーゼ耐性を与えるヌクレオチド誘導体を含む。本明細書に使用される用語ヌクレオチドはまた、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）およびそれらの誘導体を指す。ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸の実例は、例えば、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ、ｄｄＵＴＰ、およびｄｄＴＴＰを含む。ｄｄ（２－６ジアミノ）プリンなど、他のｄｄＮＴＰは企図され、および、本明細書の開示に矛盾しない。
【0045】
本明細書で使用される「ポリメラーゼ」は、別の鎖を鋳型として使用して、個別のヌクレオチドを一緒に鎖へと連結する酵素を指す。
【0046】
「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」は、過剰な非特異的ＤＮＡの存在下でさえ、選択されたＤＮＡの特定の断片をインビトロで複製するための技術を指す。選択されたＤＮＡにプライマーが加えられ、そこでプライマーは、ヌクレオチドおよび典型的にＴａｑポリメラーゼなどを使用して、選択されたＤＮＡのコピーを開始する。温度を周期させることによって、選択されたＤＮＡは、反復して変性させられ、およびコピーされる。選択されたＤＮＡの単一のコピーは、他のランダムなＤＮＡと混合されたとしても、何千、何百万、または何十億もの複製を得るために増幅される。ポリメラーゼ連鎖反応は、非常に少量のＤＮＡを検出および測定するために、ならびにＤＮＡのカスタマイズされた断片を作製するために、使用される。
【0047】
本明細書で使用される用語「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、限定されないが、様々なＤＮＡ、ＲＮＡ分子、それらの誘導体または組み合わせを含み得る。これらは、ｄＮＴＰｓ、ｄｄＮＴＰ、２メチルＮＴＰ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸、ｃＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、コスミドＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、細菌ＤＮＡ、ｍｔＤＮＡ（ミトコンドリアＤＮＡ）、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｎＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、リボザイム、リボスイッチ、およびウイルスＲＮＡなどの種を含み得る。「オリゴヌクレオチド」は、一般に、プライマーとして使用するために適している長さのポリヌクレオチドであり、一般に約６～５０塩基であるが、特により長い例外も稀ではない。
【0048】
本明細書で使用される「プライマー」は、ポリメラーゼ連鎖反応の合成工程、または一定の配列決定反応で使用されるプライマー伸長技術などにおいて、例えば、ヌクレオチドの伸長、ライゲーション、および／または合成をプライミングするために使用されるオリゴヌクレオチドを一般的に指す。プライマーは、代替的に、特異的な核酸領域の検出のための捕捉オリゴヌクレオチド（ｃａｐｔｕｒｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）に対する遺伝子座の相補性を提供する手段としてハイブリダイゼーション技術に使用される。
【0049】
本明細書で使用される「プライマー伸長産物」は、鋳型として連続したポリヌクレオチドを使用するプライマー伸長反応から生じる産物、および連続した配列に対する相補的な又は部分的に相補的なプライマーを一般的に指す。
【0050】
本明細書で使用される「配列決定（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）」、「配列決定（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）」などは、核酸中のヌクレオチド塩基の順序を決定するために使用され得る全ての生化学的方法を一般的に指す。
【0051】
本明細書に使用される「配列」は、核酸分子における隣接した核酸塩基の相対順序を反映し、および、必ずしもその核酸分子に固有にではないが、容易に特異的に同定され得る、一連の順序付けられた核酸塩基を指す。一般に、すべての場合ではないが、１つの配列は、情報を与えるために、５以上などの、複数の核酸塩基を必要とするが、この数はコンテキストによって変化し得る。従って、制限エンドヌクレアーゼは、たとえその配列がわずか４つの塩基でも、それが同定し、特異的に切断するならば「配列」を有すると言及される場合がある。配列は、サンプルの断片に対して「固有にマッピングする」必要はない。しかしながら、ほとんどの場合、配列は、その分子の出所に関して情報を与えるために十分な情報を含んでいると考えてよい。
【0052】
本明細書に使用されるように、あるサンプルの全配列においてその配列が隣接して現れない場合、配列は「生じない」。あるサンプルにおいて生じない配列は、そのサンプルにおける自然発生の配列ではない。
【0053】
本明細書に使用されるように、ライブラリーがサンプルの情報を与える配列を含む場合、ライブラリーは「サンプルの代表」として説明される。場合によっては、情報を与える配列は、サンプル配列の約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％を含む。場合によっては、情報を与える配列は、サンプル配列の約９０％、９０％、または９０％以上を含む。
【0054】
本明細書に使用されるように、配列または配列長は、配列または配列長が第２の配列または配列長により、決定されるのではない、または第２の配列または配列長の関数ではない場合、「独立して判定される」と説明される。終止ｄｄＮＴＰ塩基の取り込み、またはオリゴの鋳型に対する非特異的または正確でないアニーリングなどのランダムな事象は、一般に、そのような事象から生じる分子のライブラリーが配列または配列長に本質的な変異を含むように独立して判定される事象である。
【0055】
本明細書に使用されるように、配列は、鋳型で媒介される合成によって判定されない場合、「不確定の」ものとして説明される。従って、ランダムなオリゴマーの鋳型へのアニーリングによってプライミングされた鋳型からの合成を起源とする核酸分子は、鋳型で駆動された核酸伸長から生じる、鋳型に方向づけられた配列の領域と、鋳型に駆動された伸長反応が構築される場所である３’ＯＨ基を提供するオリゴマー配列に対応する「不確定の配列」とを含む場合がある。場合によっては、オリゴヌクレオチド・アニーリングは、当該オリゴマー配列が結合する分子の正確な逆相補ではないように、不完全である。
【0056】
本明細書に使用される「細分化」は、サンプル配列の文脈において、部分配列へと配列を分解することであり、ここで分解後の各々が依然として本明細書に定義される配列であるように、分解することを指す。
【0057】
本明細書で使用される「コンティグ」は、配列相同性の共通の又は重複する領域を共有する２つ以上の構成ヌクレオチド配列から構築されるヌクレオチド配列を指す。例えば、２つ以上の核酸断片のヌクレオチド配列が比較され、共通の又は重複する配列を同定するために整列される。共通の又は重複する配列が、２つ以上の核酸断片間に存在する場合、配列（およびそれ故それらの対応する核酸断片）は、単一の連続したヌクレオチド配列へと構築される。
【0058】
用語「ビオチン」は、本明細書に使用されるように、ビオチン（５－［（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）－２－オキソヘキサヒドロ－１Ｈ－チエノ［３，４－ｄ］イミダゾール－４－イル］ペンタン酸）およびあらゆるビオチン誘導体およびアナログを指すように意図されている。そのような誘導体およびアナログは、ネイティブな又は修飾されたストレプトアビジンまたはアビジンのビオチン結合ポケットとの複合体を形成する物質である。そのような化合物は、例えば、イミノビオチン、デスチオビオチンおよびストレプトアビジンの親和性ペプチドを含み、ビオチン－．イプシロン．－Ｎ－リシン、ビオシチンヒドラジド、２－イミノビオチンおよびビオチニル－ε－アミノカプロン酸－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルのアミノまたはスルフヒドリルの誘導体、スルフォ－スクシンイミド－イミノビオチン、ビオチンブロモアセチルヒドラジド、ｐ－ジアゾベンゾイルビオシチン、３－（Ｎ－マレイミドプロピオニル）ビオシチンも含む。「ストレプトアビジン」は、ビオチンに結合することができるタンパク質またはペプチドを指し：天然の卵白アビジン、組み換えのアビジン、非糖鎖形成された形態のアビジン、バクテリアのストレプトアビジン、組み換えのストレプトアビジン、切り縮められたストレプトアビジン、および／またはそれらの任意の誘導体を含む。
【0059】
本明細書に使用される「被験体」は、、複製することができるゲノムを有する、現在生存している生物またはかつて生きていた又は実体であった生物を一般的に指す。本開示の方法、キット、および／または組成物は、限定されないが、細菌および酵母などの微生物；ハエ、甲虫、およびハチを含み、これらに限定されない昆虫；トウモロコシ、コムギ、海藻、または藻類を含み、これらに限定されない植物；および、限定されないが、ヒト；マウス、ラット、サル、およびチンパンジーなどの、実験動物；イヌおよびネコなどの飼育哺乳動物；ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなどの農業動物；および、パンダ、ライオン、トラ、クマ、ヒョウ、ゾウ、シマウマ、キリン、ゴリラ、イルカ、およびクジラなどの野生動物を含む、動物を含む、１以上の単細胞または多細胞の被験体に適用される。本開示の方法は、ウイルスまたはウイルス粒子、あるいは１つ以上のウイルスによって感染された１つ以上の細胞などの、病原菌または感染病原体にも適用される。
【0060】
本明細書で使用される「支持体（ｓｕｐｐｏｒｔ）」は、固形物、半固形物、ビーズ、表面である。支持体は、溶液中で可動であるか又は非可動である。
【0061】
本明細書で使用される用語「一意の識別子（ｕｎｉｑｕｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）」は、限定されないが、分子バーコード、またはｄＵＴＰなどの、混合物中の核酸のパーセンテージを含み得る。
【0062】
本明細書に使用される「反復配列」は、核酸配列データセットにおいて単一の位置に一意にマッピングされない配列を指す。一部の反復配列は、所与のサイズの、および正確な又はおよその配列の、反復単位の整数または分数倍数として概念化される。
【0063】
本明細書に使用される「プライマー」は、鋳型分子にアニール化されて、その場所で鋳型に方向づけられた核酸合成が生じることができる３’ＯＨ基を提供する、オリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、多くの場合、修飾されないデオキシ核酸を含むが、場合により、リボ核酸または２’メチルリボ核酸などの修飾された核酸などの、代替の核酸を含む。
【0064】
本明細書に使用されるように、核酸は、水素結合した塩基対合を含む場合、二本鎖である。二本鎖と呼ぶには、分子内のすべての塩基が対になっている必要はない。
【0065】
本明細書で数字に関連して使用される用語「約」は、１０％までの数を指す。範囲に関して使用される用語は、明示された下限の１０％程度下の下限を有し、および明示された限界の１０％以内で上の上限数を有する範囲を指す。
【0066】
標的化配列決定法が本明細書に提供される。簡潔には、ある場合において、二本鎖ＤＮＡまたはｃＤＮＡの生成物は固体基質に結合される。ＣＲＩＳＰＲ ＣＡＳシステムは、標的分子を「切る」ために使用することができ、その後、物理的に固体基質に対して結合されたままであるバックグラウンド分子から分離することができる。その後、標的分子は、配列決定ライブラリーに変換されて配列決定され得る。
【0067】
いくつかのＲＮＡに標的化配列決定法において、ＲＮＡの合計はサンプルから得ることができる。場合によっては、ランダムプライマーがサンプルＲＮＡ鋳型に結合される。逆転写酵素はＲＮＡ鋳型のｃＤＮＡ（コピーＤＮＡ）を作製するために使用され得る。場合により、ｄＮＴＰとビオチンｄｄＮＴＰの混合物が伸長反応に使用され、場合により、ｃＤＮＡ生成物をビオチンｄｄＮＴＰで終止させる。場合によっては、その後、生成物はストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズ上でキャプチャーされ、および、過剰反応物質が洗い流される。場合によっては、第２鎖は、ランダムプライマーと鎖置換ポリメラーゼを使用して、捕捉された分子上で合成される。ビーズに最も近く結合したプライマーは、下流の生成物を置換することができ、二本鎖ｃＤＮＡ生成物は、ビーズに結合したまま残る。ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡは、関心の標的配列を認識するように設計することができ、および、ビーズに結合された生成物は、ＲＮＡでガイドされる切断に供される。いくつかの場合では、ＣＲＩＳＰＲ切断生成物はビーズに結合されたバックグラウンドから磁気分離および溶出まで分離される。二本鎖ｃＤＮＡ生成物は、ビーズから溶出されて配列決定ライブラリーに変換され得る。
【0068】
いくつかのＤＮＡ標的化配列決定法では、上記されたものと同じ方法が使用される。場合によっては、二本鎖ＤＮＡ生成物は変性され、およびＤＮＡポリメラーゼは鋳型を調製するために使用される。
【0069】
場合によっては、ＲＮＡとＤＮＡは、ＲＮＡとＤＮＡの鋳型を使用することができるポリメラーゼ酵素と同時に調製され得る。
【0070】
標的化配列決定法
付加的な態様では、標準のＲＩＰＴＩＤＥ ＡおよびＢの反応を使用する標的化配列決定法が提供される。この方法では、ＤＮＡサンプル（またはｃＤＮＡ）は、バーコード付きランダムプライマーを使用してポリメラーゼと共にコピーされ、ビオチン－ｄｄＮＴＰで終止される。場合によっては、サンプルは、ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズ上にプールされ（９６以上）およびキャプチャーされる。場合によっては、第２鎖は、ポリメラーゼを置換する鎖を介して形成される。場合によっては、活性のあるＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳは、ｓｇＲＮＡによって標的化されて、標的化分子をビーズから切り離す。場合によっては、分子は、溶出され、そして、ライブラリーは、標準ライゲーションに基づくプロトコルを用いて生成される。
付加的な態様では、標準のＲＩＰＴＩＤＥ ＡおよびＢの反応を使用する標的化配列決定法が提供される。この方法では、ＤＮＡサンプル（またはｃＤＮＡ）は、バーコード付きランダムプライマーを使用してポリメラーゼと共にコピーされ、ビオチン－ｄｄＮＴＰで終止される。場合によっては、サンプルは、ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズ上にプールされ（９６以上）およびキャプチャーされる。場合によっては、第２鎖は、ポリメラーゼを置換する鎖を介して形成される。場合によっては、活性のあるＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳは、ｓｇＲＮＡによって標的化されて、標的化分子をビーズから切り離す。場合によっては、分子は、溶出され、そして、ライブラリーは、標準ライゲーションに基づくプロトコルを用いて生成される。
【0071】
図１に図示されるのは、本明細書に提供される、別の標的化配列決定法である。図１では、プライマー伸長が、バーコード付きランダムプライマーを用いて行なわれる（これらの「Ａ」プライマーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプター配列などのアダプター配列を包含していない）。プライマー伸長生成物は、ビオチンｄｄＮＴＰで終止され、ストレプトアビジン・ビーズに結合される。その後、ランダムプライマーである「Ｂ」プライマーは、二本鎖ＤＮＡを形成する相補鎖を生成するために使用される。関心の特異的な遺伝子座を標的とするように設計されたＣａｓ９－ガイドＲＮＡ複合体は、ストレプトアビジン・ビーズに結合されたＤＮＡに付加される。Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ複合体は、標的部位にてＤＮＡを切断する。その後、放出されたＤＮＡは、新しい管に移される。その後、アダプターライゲーションを伴う任意の適切なＮＧＳライブラリー調製プロトコルが、配列決定のためのＤＮＡを調製するために使用され得る。
【0072】
本明細書で提供される標的化配列決定のいくつかの方法では、ニッカーゼなどの酵素は、最初の工程で分子の３’端を露出させるために使用することができ、次に、鎖置換ポリメラーゼなどのポリメラーゼは、酵素に切断された部位およびビオチンなどの組み込みアフィニティー分子から伸長し得る。場合によっては、ＲＮＡ分子は、ビオチンｄＡＴＰｓを使用してポリアデニル化され、および、同様にストレプトアビジン・ビーズ上でキャプチャーされ得るか、または、オリゴｄＴキャプチャー・オリゴが第２鎖合成のためのプライマーとして使用され得る場所で、またはオリゴｄＴキャプチャーされる得る。二本鎖分子を（好適には端末にて）キャプチャーするあらゆる適切な方法が、中間構成物を作るために使用されることが企図される。鍵となるのは、ＣＲＩＳＰＲを使用して標的分子を切断すること、および物理的に固体基質に結合した分子からそれらを分離することである。
【0073】
場合によっては、ｄｓＤＮＡは断片化され、末端修復され、Ａテーリングされ、およびビオチン化されたアダプターにライゲーションされる。場合によっては、ビオチン化されたプライマーは、ＲＮＡ分子の３’端にライゲーションされる。場合によっては、ｄｓＤＮＡは、ビオチン化されたＤＮＡでタグメント化される（ｔａｇｍｅｎｔｅｄ）。場合によっては、単鎖または、ｄｓＤＮＡは、ターミナルトランスフェラーゼとビオチン標識されたｄＮＴＰｓまたはｄｄＮＴＰでビオチン化される。場合によっては、オリゴヌクレオチド合成の間における５’端組み込みには、例えば、プライマー伸長のために使用されるプライマー、Ｎｅｘｔｅｒａトランスポゾン端、ＴＳＯ、その他のものがある。場合によっては、キナーゼ処理によってリン酸にコンジュゲートされたビオチンの５’端組み込みが使用される。場合によっては、３’端組み込みは、クレノー（Ｋｌｅｎｏｗ）などの、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を備えたポリメラーゼによって行われ、ここで酵素は、ｄｓＤＮＡ分子の最後のいくらかの３’ヌクレオチドを除去し、およびビオチン・コンジュゲートされたヌクレオチドを足し込むことになる。場合によっては、３’端組み込みは、Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅを用いた処理によってビオチン・コンジュゲートされたデオキシヌクレオチドを使用する。場合によっては、３’端組み込は、プライマー伸長する間にビオチン・コンジュゲートされたデオキシヌクレオチドヌクレオチドを使用する。場合によっては、５’端または３’端は、ビオチン・ヌクレオチドを備えたダプターのライゲーションによる組み込みを使用する。場合によっては、５’端または３’端組み込みは、ＣＬＩＣＫ化学などの、コンジュゲーション化学によってビオチン・オリゴを使用する。
【0074】
本明細書で提供される標的化配列決定のいくつかの方法では、分子の中間の中へのビオチン組み込みは、以下の方法の１つで行なわれ得る：プライマー伸長する間における、アニールされたプライマーからの、ヌクレオチドの組み込み；または、ニッキング、次にＳｅｑｕｅｎａｓｅなどの鎖置換ポリメラーゼを用いたニックの３’端からのプライマー伸長による、既存のｄｓＤＮＡ鋳型の中へのヌクレオチドの組み込み。
【0075】
本明細書で提供される標的化配列決定のいくつかの方法では、バーコード付きランダムプライマーおよびアダプターがテールされたバーコード付きランダムプライマーは、サンプルを多重化するまたはライブラリー調製ワークフローを効率化するために、使用され得る。
【0076】
本明細書で提供される標的化配列決定のいくつかの方法では、ＣＲＩＳＰＲで切断された生成物からのライブラリー調製は、任意の適切な調製を使用し、限定されないが、タグ付け、断片化、Ａテーリング、およびライゲーション、または他の適切な方法が含まれる。例えば、二本鎖ゲノムＤＮＡは、ビオチン化されたトランスポゾンでタグ付され得る。このことは、捕捉されたとき、すべての分子が比較的等しい長さであることを確証し得る。
【0077】
本明細書における標的化配列決定法の例示的な実施形態では、プライマー５’－Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプター－８ｂｐサンプルバーコード－ランダムプライマー－３’（５’－Ｉｌｌｕｍｉｎａ ａｄａｐｔｅｒ－８ｂｐ ｓａｍｐｌｅ ｂａｒｃｏｄｅ－ｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒ－３’）を含む、核酸分子が使用される。複数のサンプル（微小滴定プレートの個別のウェルなど）が第１の工程（伸長およびビオチンｄｄＮＴＰ伸長停止）で処理され、次に、キャプチャーのためにまとめてプールされ、そして洗浄される場合がある。第２鎖合成とＣＲＩＳＰＲ標的化が、すべてのサンプルに同時に生じる場合がある。この場合、アダプターは、Ａテーリングやライゲーションなどによって、ＣＲＩＳＰＲに切断された生成物のもう１つの端部に付加されなければならない。両端部におけるライゲーションは、ＣＲＩＳＰＲ切断に先立ってビーズ／固体基質上の生成物をブロックするなどの任意の適切な方法を使用して防止される。生成物がビーズから切り離されるとき、アダプターはＣＲＩＳＰＲに切断された位置の平滑末端だけにライゲーションすることができる。ＰＣＲ濃縮は、配列決定のために２つのアダプターを有する生成物が富化されることを確証するために使用される。
【0078】
本明細書でされる標的化配列決定法の付加的な実施形態では、プライミングは、ランダムプライミングまたはプライマーゼに基づくイニシエーション、そしてポリメラーゼ伸長によって行うことができる。ランダムプライマーは、サンプルバーコードテール（）またはアダプターテール、またはバーコードを付されたアダプターテールを有し得る。アフィニティー分子は、ポリアデニル化などのビオチンまたは他の適切なアフィニティータグであり得る。固体基質は、磁気ビーズ、ストレプトアビジンでコーティングされたプレート、他の適切な基質であり得る。固体基質は、カラムの中、マイクロ流体デバイスの中、ピペットチップの中、または他の適切な基質面上にあり得る。
【0079】
本明細書における標的化配列決定法のさらなる実施形態では、サンプル中のすべての分子の二本鎖の、基質に結合された変換を作製することができ、そして、標的配列の、ＲＮＡでガイドされるエンドヌクレアーゼ切断によって物理的に分離することができる、あらゆる適切な方法が企図される。
【0080】
本明細書でされる標的化配列決定法の付加的な実施形態では、ＲＮＡでガイドされるエンドヌクレアーゼは、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重螺旋、ＤＮＡ／ＤＮＡ二重螺旋を標的とするために使用され、ＰＡＭ配列があるもの、またはＰＡＭ配列がないものを含む（ＰＡＭ配列を必要としないＣＲＩＳＰＥＲ／Ｃａｓ９酵素利用する）。
【0081】
本明細書における標的化配列決定法のさらなる実施形態では、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡはビーズ上にキャプチャーされ、特異性を改良するために標的とされるオリゴヌクレオチド（標的部位を唯一の二本鎖にする）にハイブリダイズされる。
【0082】
本明細書における標的化配列決定法の応用は、限定されないが、コロナウイルス、呼吸系ウイルスなどの既知のウイルスゲノムの全ゲノム配列決定を含む。ＲＮＡ全体は、Ｒｉｐｔｉｄｅ（登録商標）ライブラリーを用いて（例えば、ｉ）第１のランダムプライマーとバーコードを付されたアダプターを含むオリゴヌクレオチドを核酸にアニーリングすること、ｉｉ）第１のランダムプライマーを伸長し、そして伸長生成物を生成するために伸長を終止させること、ｉｉｉ）アダプターを有する第２のランダムプライマーを伸長生成物にアニーリングし、そして第２のランダムプライマーを使用して、二本鎖伸長生成物を生成することを含む、ライブラリー構築技術）で準備し、キャプチャーすることができる。ガイドＲＮＡは、５００ｂｐ毎、１ｋｂ毎、３ｋｂ毎、またはそれ以上毎に設計され得、分離され配列決定されるウイルスｃＤＮＡ配列を切り離し得る。場合によっては、このことは、サンプルからのＲＮＡ全体の複合的なバックグラウンドからウイルスの配列についてＲＮＡを富化する。このことは、ハイスループット設定またはフィールド展開可能なＯｘｆｏｒｄナノポア配列決定において行うことができる。
【0083】
標的化配列決定の付加的な応用は、ＢＲＣＡ遺伝子などのＡＣＭＧ遺伝子リストの配列決定を含む。付加的な実施形態では、標的化配列決定は、キャリアスクリーニングパネル（ｃａｒｒｉｅｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｐａｎｅｌ）（すべての既知の劣性の障害）を含む。
【0084】
場合によっては、ＣＲＩＳＰＲ切断は対立遺伝子特異的である。例えば、特異的対立遺伝子が切り取られ、および、ＨＬＡなど、標的化遺伝子座について層化された情報が得られる。あるいは、低頻度癌変異が標的とされ得る。本明細書の方法は、低存在量核転写を標的とするために使用され得る。
【0085】
本明細書における標的化配列決定法の別の例では、標準Ｒｉｐｔｉｄｅ（登録商標）ライブラリー（例えば、ｉ）第１のランダムプライマーとバーコード付きアダプターを含むオリゴヌクレオチドを核酸にアニーリングすること、ｉｉ）第１のランダムプライマーを伸長し、そして伸長生成物を生成するために伸長を終止させること、ｉｉｉ）アダプターを有する第２のランダムプライマーを伸長生成物にアニーリングし、そして第２のランダムプライマーを使用して、二本鎖伸長生成物を生成することを含む、ライブラリー構築技術）は、ローパス配列決定と遺伝子型判定のために生成される。オリジナルのライブラリーは、研究における関心のＳＮＰを切り取るために、および各サンプルにおけるそれらの変異体の高カバレッジの確認を得るために、使用することができる。
【0086】
本明細書の方法のワークフローの１つの例は、以下のとおりである。アダプターライゲーションを伴う現在の方法。Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプターを含まないバーコード付きランダムプライマーを用いて標準Ａ反応（プライマー伸長反応）を行なう。ストレプトアビジン磁気ビーズでプライマー伸長分子をキャプチャーする。非特異的に結合されたＤＮＡ分子を除去するために、ビーズを３回洗浄する。Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプターを含まないバーコード付きランダムプライマーを用いてプライマー伸長反応（標準Ｂ反応）を行なって、相補鎖を作製する。非特異的に結合されたＤＮＡ分子を除去するために、ビーズを３回洗浄する。ビーズを１Ｘ Ｃａｓ９緩衝液に再懸濁する。ストレプトアビジン・ビーズにＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ を添加する（ｓｇＲＮＡプールは、関心の遺伝子座すべてを標的とするガイドＲＮＡを含む）。Ｃａｓ９に媒介された部位特異的切断が起こるまで、３７℃で３０～６０分インキュベートする。切り取られた分子は、もはやビーズに結合されないであろう。管を磁気スタンドに置く。上澄みを新しい管に移す。管を磁気スタンドに置く。上澄みを新しい管に移す（これは、残余のビーズを取り除くためである）。ＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＩＩ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ の試薬を用いて、標準的なエンドリペア、リン酸化、Ａテーリング反応を行う（ＮＥＢ のプロトコルを使用）。ＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＩＩ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔの試薬を用いて、Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプターライゲーションを行う（ＮＥＢのプロトコルを使用）。０．９Ｘ Ａｍｐｕｒｅビーズクリーンアップ、またはその他のビーズによるサイズセレクションを行う（ＮＥＢのプロトコルを使用）。全長Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｐ５およびＰ７プライマーを用いてＰＣＲ増幅を行う（ＮＥＢのプロトコルを使用）。Ａｍｐｕｒｅビーズの最終的なクリーンアップを行う（ＮＥＢのプロトコルを使用）。
【0087】
標的外事象を減少させ、およびＡプライマー・バーコードを含んでいる分子について富化することにより、プロトコルを改善するためのワークフローの別の例は、以下のとおりである。部分的なＰ５ Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプターと５’アミン基（ＤＮＡの５’リン酸化をブロックするため）を持つバーコード付きランダムプライマーで標準Ａ反応（プライマー伸長反応）を行う。ストレプトアビジン磁気ビーズでプライマー伸長分子を捕捉する。ビーズを３回洗浄し、非特異的に結合したＤＮＡ分子を除去する。 Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプターを含まないが５’アミンを含むバーコード付きランダムプライマーを用いてプライマー伸長反応（標準Ｂ反応）を行い、相補鎖を作製する。相補鎖は、５’末端でリン酸化がブロックされることになる。非特異的に結合されたＤＮＡ分子を除去するために、ビーズを２回洗浄する。Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ酵素とデオキシヌクレオチドで処置することにより、ＤＮＡ分子の利用可能な３’端をブロックする。ビーズをさらに２回洗浄する。ビーズを１Ｘ Ｃａｓ９緩衝液に再懸濁する。ストレプトアビジン・ビーズにＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ を添加する（ｓｇＲＮＡプールは、関心の遺伝子座すべてを標的とするガイドＲＮＡを含む）。Ｃａｓ９に媒介された部位特異的切断が起こるまで、３７℃で３０～６０分インキュベートする。管を磁気スタンドに置く。上澄みを新しい管に移す。管を磁気スタンドに置く。上澄みを再度ピペットで吸い上げ、新しい管に移す（これは、残留ビーズを取り除くためである）。ＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＩＩ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ の試薬を用いて、標準的なエンドリペア、リン酸化、Ａテーリング反応を行う（ＮＥＢまたは別のプロトコルを使用）。Ｐ７アダプターのみでＩｌｌｕｍｉｎａアダプターライゲーションを行なう。アダプターは、分子のＡプライマー端に、または存在するあらゆるＢにプライマー端にライゲーションしないだろう。０．９Ｘ Ａｍｐｕｒｅビーズクリーンアップ、またはその他のビーズによるサイズセレクションを行う（ＮＥＢのプロトコルを使用）。全長Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｐ５およびＰ７プライマーでＰＣＲ増幅を行なう。最終のＡｍｐｕｒｅビーズクリーンアップを行なう。
【0088】
ワークフローのさらなる例は、Ｃａｓ９切断（先のプロトコルにおける工程１～５、部分的なＰ５ Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプターを含むＡプライマーと、いかなるＩｌｌｕｍｉｎａアダプター配列も含まないＢプライマーを除く）まで正常なＲｉｐＴｉｄｅライブラリー調製の工程を行なうことを含み、Ｃａｓ９切断を行ない、次に、Ｐ７アダプター置換可能な末端を有する切断された生成物の転移を実行し、そして、全長Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｐ５およびＰ７プライマーを使用して、Ｐ５－Ｐ７生成物をＰＣＲ増幅する。このプロトコルでは、アダプターライゲーションの必要はない。転移に基づくプロトコルは、以下のように詳述される：部分的なイルミナＰ５アダプターを持つバーコード付きランダムプライマーで標準Ａ反応（プライマー伸長反応）を行う。ストレプトアビジン磁気ビーズでプライマー伸長分子を捕捉する。非特異的に結合されたＤＮＡ分子を除去するために、ビーズを３回洗浄する。Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプターを含まないバーコード付きランダムプライマーを用いてプライマー伸長反応（標準Ｂ反応）を行なって、相補鎖を作製する。非特異的に結合されたＤＮＡ分子を除去するために、ビーズを３回洗浄する。ビーズを１Ｘ Ｃａｓ９緩衝液に再懸濁する。ストレプトアビジン・ビーズにＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ を添加する（ｓｇＲＮＡプールは、関心の遺伝子座すべてを標的とするガイドＲＮＡを含む）。Ｃａｓ９に媒介された部位特異的切断が起こるまで、３７℃で３０～６０分インキュベートする。切り取られた分子は、もはやビーズに結合されないであろう。管を磁気スタンドに置く。上澄みを新しい管に移す。管を磁気スタンドに置く。上澄みを新しい管に移す（これは、残余のビーズを取り除くためである）。Ｎｅｘｔｅｒａのようなシステムで転移を行なう。Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｐ７アダプター（Ｐ５アダプターは必要ない）は、ＣＲＩＳＰＲに切断された分子に挿入されることになる。Ａｍｐｕｒｅビーズ・サイズ選択を行なう（必要な場合も、必要でない場合もある）。Ｐ５－Ｐ７分子を増幅するために、全長Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｐ５およびＰ７プライマーを用いてＰＣＲ増幅を行なう。最終のＡｍｐｕｒｅビーズクリーンアップを行なう。
【0089】
代替のワークフローは、トランスポサーゼへのｄＣａｓ９の融合を利用することにより、標的特異的なトランスポジションを行なうことを含み、前記トランスポサーゼは、関心の標的部位にてＩｌｌｕｍｉｎａアダプターでトランスポゾン末端を挿入することになる。トランスポジション後、アダプターライゲーションの必要も、Ｃａｓ９消化とトランスポジション事象とを分ける必要も、ないだろう。
【0090】
ワークフローの別の例は、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）を含み、５’オーバーハングを有するスタガードカットを作製するために、以下のように、ｄｓＤＮＡを切断する。部分的なＰ５ Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプター（ライゲーションをブロックするための５’アミン基を含み得る）を含むバーコード付きランダムプライマーを用いて標準Ａ反応（プライマー伸長反応）を行なう。ストレプトアビジン磁気ビーズでプライマー伸長分子を捕捉する。非特異的に結合されたＤＮＡ分子を除去するために、ビーズを３回洗浄する。 Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプターを含まないバーコード付きランダムプライマーを用いてプライマー伸長反応（標準Ｂ反応）を行い、相補鎖を作製する。（プライマーは、ライゲーションをブロックするための５’アミン基を含む場合がある）。非特異的に結合されたＤＮＡ分子を除去するために、前記ビーズを３回洗浄する。ビーズを１Ｘ Ｃａｓ１２ａ緩衝液に再懸濁する。ストレプトアビジン・ビーズにＣａｓ１２ａ：ｇＲＮＡ を添加する（ｇＲＮＡプールは、関心の遺伝子座すべてを標的とするガイドＲＮＡを含む）。Ｃａｓ１２ａで媒介された部位特異的切断が起こるまで、３７℃でインキュベートする。切り取られた分子は、もはやビーズに結合されないであろう。管を磁気スタンドに置く。上澄みを新しい管に移す。管を磁気スタンドに置く。上澄みを新しい管に移す（これは、残余のビーズを取り除くためである）。３’単一ヌクレオチド・オーバーハング（Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴオーバーハングの混合物）があるＩｌｌｕｍｉｎａ Ｐ７アダプターを加える。ギャップを埋めるためにＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで処置し、次に、ニックをふさぐためにＴ４ＤＮＡリガーゼを加える。０．９Ｘ Ａｍｐｕｒｅビーズクリーンアップ、またはその他のビーズによるサイズセレクションを行う（ＮＥＢのプロトコルを使用）。全長Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｐ５およびＰ７プライマーでＰＣＲ増幅を行なう。最終のＡｍｐｕｒｅビーズクリーンアップを行なう。
【0091】
さらなる実施形態
本開示の態様は、標的とされる、同一ではない、標的核酸配列由来の配列のサブセットを各々含む、タグ付けされた核酸分子の集団を生成するための、方法と組成物とを記載する。標的核酸サンプルは、植物、動物（ヒトを含む）、細菌、菌類、または藻類を含む、任意の生物学的もしくは環境的供給源から得られ得る。任意の適切な生体試料が標的核酸として使用される。便利な適切なサンプルは、全血、組織、精液、唾液、涙、尿、糞便物質、汗、バッカル、皮膚、および毛髪を含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は、５０～５００の細胞から得られる。いくつかの実施形態では、標的核酸は、５０～４００、５０～３５０の、５０～３００、１００～３００、１５０～３００、２００～３００、または２００～２５０の細胞から得られる。
本開示の態様は、標的とされる、同一ではない、標的核酸配列由来の配列のサブセットを各々含む、タグ付けされた核酸分子の集団を生成するための、方法と組成物とを記載する。標的核酸サンプルは、植物、動物（ヒトを含む）、細菌、菌類、または藻類を含む、任意の生物学的もしくは環境的供給源から得られ得る。任意の適切な生体試料が標的核酸として使用される。便利な適切なサンプルは、全血、組織、精液、唾液、涙、尿、糞便物質、汗、バッカル、皮膚、および毛髪を含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は、５０～５００の細胞から得られる。いくつかの実施形態では、標的核酸は、５０～４００、５０～３５０の、５０～３００、１００～３００、１５０～３００、２００～３００、または２００～２５０の細胞から得られる。
【0092】
一実施形態では、標的化配列決定法は、第１の分子のタグ配列を含む第１の核酸分子と、標的核酸サンプルから第１の長さを有している第１の標的配列とを得る工程を含む場合がある。第１の核酸分子は、様々な長さのものであり得る。いくつかの実施形態では、第１の核酸分子の長さは、特定の配列決定プラットフォームのための最適の長さに相当する。特定の配列決定プラットフォームのための最適の長さは、イオン半導体のための４００以内のヌクレオチド塩基（例えば、ＩＯＮ ＴＯＲＲＥＮＴ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）、パイロシーケンシング（ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）のための７００のヌクレオチド塩基（例えば、ＧＳ ＪＵＮＩＯＲ＋， ４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｂｒａｎｆｏｒｄ， ＣＴ）、および合成による配列決定のための５０～３００のヌクレオチド塩基 （ＳＢＳ） （ｅ．ｇ．， ＭＩＳＥＱ， Ｉｌｌｕｍｉｎａ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）を含む場合がある。いくつかの実施形態では、第１の核酸分子は、５０～１０００、１００～１０００、２００～１０００、３００～１０００、３００～９００、３００～８００、３００～７００、３００～６００、３００～５００または４００～５００のヌクレオチド塩基であり得る。いくつかの実施形態では、第１の核酸分子は、５０、６２．５、１２５、２５０、５００、または１０００ヌクレオチド塩基であり得る。
【0093】
いくつかの実施形態では、第１の核酸分子は分子リガンドを含む。いくつかの実施形態では、この分子のリガンドは、ビオチンまたは任意のビオチン誘導体またはアナログを含む。
【0094】
いくつかの実施形態では、分子タグ配列は、６、７、８、９、または１０ヌクレオチド塩基長であり得る。いくつかの実施形態では、分子タグは、８ヌクレオチド塩基長である。一実施形態では、分子タグは、ランダムなヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ランダムな塩基配列は、標的核酸サンプルの含有量の変化を考慮して半ランダム的に合成される。ランダムなヌクレオチド配列は、代表的な「ランダムさ（ｒａｎｄｏｍｎｅｓｓ）」を反映するように選択され得、ゲノム中１％ＧＣから１００％ＧＣグアニン－シトシン（ＧＣ）含量率のウィンドウに対して順序づけられ得、および、各ＧＣ％におけるゲノムの含有率に相対する比率で合成されてプールされ得る。
【0095】
いくつかの実施形態では、第１の核酸分子は、第１のランダムなオリゴヌクレオチド配列を含む第１のプライマーを標的核酸サンプルに接触させることによって得られる場合がある。いくつかの実施形態では、第１のプライマーを接触させることは、第１のプライマーを前記標的核酸サンプルの核酸にアニーリングすることを含む。アニーリングは、完全なハイブリダイゼーションまたは不完全なハイブリダイゼーションを生じ得る。さらなる実施形態では、第２の核酸は、第２のランダム・オリゴヌクレオチド配列を含む第２のプライマーを第１の核酸分子に接触させることによって生成される。この方法は、第１の核酸分子に第２の分子のタグ配列を含むオリゴヌクレオチドをアニールする工程、および、第１の分子のタグ配列、第１の長さを有する第１の標的配列、および第２の分子のタグ配列を含む第１の二本鎖核酸分子を得るために、前記オリゴヌクレオチドを伸長する工程を含む場合がある。
【0096】
本明細書に記載の標的化配列決定法は、第３の分子のタグ配列、第２の長さを有している第２の標的配列、および第４の分子のタグ配列を含む、第２の二本鎖核酸分子を得る工程、および、第３の分子のタグ配列が第１の分子のタグ配列と同一の場合に、第２の二本鎖核酸分子を切り捨てる工程をさらに含み、第４の分子のタグ配列は第２の分子のタグ配列と同一であり、第２の標的配列は第１の標的配列と同一であり、および、第２の標的配列の長さは第１の標的配列の長さと同一である。いくつかの実施形態では、第３の分子のタグ配列が第１の分子のタグ配列とは異なる場合、第２の二本鎖分子が保持されてもよく、第４の分子のタグ配列は第２の分子のタグ配列とは異なり、第２の標的配列は第１の標的配列とは異なるか；または、第２の標的配列長さは第１の標的配列長さとは異なり、結果は、非同一で、標的核酸サンプル由来の配列のサブセットを各々含む、タグ付き核酸分子の集団を生成する。
【0097】
いくつかの実施形態では、第１の核酸は、前記第１のランダムなオリゴヌクレオチド配列に対して５’側に位置するアダプター配列を含む。いくつかの実施形態では、このアダプター配列は、特定の配列決定プラットフォームのために増幅および／または配列決定を容易にするために付加される。配列決定プラットフォームは、イオン半導体（例えば、，ＩＯＮ ＴＯＲＲＥＮＴ， Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）、パイロシーケンシング（例えば、ＧＳ ＪＵＮＩＯＲ＋， ４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｂｒａｎｆｏｒｄ， ＣＴ）、および、合成による配列決定（ＳＢＳ） （例えば、ＭＩＳＥＱ， Ｉｌｌｕｍｉｎａ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）を含む。例示的なアダプター配列は、配列番号１と２を含む。
【0098】
場合によっては、標的化配列決定ライブラリー分子は、配列決定に先立って環状化される。ライブラリー分子の環状化は、例えば、アダプター配列配列番号１および配列番号２に逆の相補的な配列、または他のアダプター配列を含む「架橋オリゴ」または「スプリン・トオリゴ」の提供により達成され、その結果、単鎖のライブラリー生成物分子の５’末端と３’末端が、架橋オリゴによって同時に結合される。場合によっては、架橋オリゴは、塩基対水素結合相互作用により、一本鎖ライブラリー分子の５’末端と３’末端を近接させ、その結果、リガーゼの添加により、分子の５’末端と３’末端が結合し、環状化されたライブラリー分子が形成され得る。分子は、ライゲーション、ｃｒｅ－ｌｏｘ ベースの融合、ニック－リペアベース（ｎｉｃｋ－ｒｅｐａｉｒ－ｂａｓｅｄ）の技術、さもなければ単一の環状分子を形成することなどの、数ある分子の技術のいずれかによって環状化され得る。場合によっては、その後、ライブラリーは、架橋オリゴを除去するためにエキソヌクレアーゼで処置される。
【0099】
その後、環状化された分子は、配列情報を得るために、ローリングサークル増幅／配列決定などの、当該技術分野で既知の、多くの配列決定技術のうちの１つによって配列決定される。
【0100】
場合によっては、第１の核酸および第１のプライマーは、核酸ポリメラーゼとヌクレオチド三リン酸に接触され得る。核酸ポリメラーゼは、ファミリーＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｘ、Ｙ、およびＲＴ由来のＤＮＡポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態では、核酸ポリメラーゼは、鎖転移活性を有する。いくつかの実施形態では、核酸ポリメラーゼは、鎖転移活性を欠く。ヌクレオチド三リン酸塩は、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰなどのデオキシリボヌクレオシド３リン酸、ならびに、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ、およびｄｄＴＴＰなどの、ジデオキシリボヌクレオシド三燐酸（ｄｄＮＴＰ）を含み得る。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド三リン酸は、デオキシリボヌクレオチド三リン酸塩およびデオキシヌクレオチド三リン酸塩を含むプールから核酸ポリメラーゼによって選択される。いくつかの実施形態では、このプールは、０．０１％～５．０％、０．０１％～４．０％、０．０１％～３．０％、０．０１％～２．０％、０．０２％～２．０％、０．０３％～２．０％、０．０４％～２．０％、０．０５％～２．０％、０．０６％～２．０％、０．０７％～２．０％ ０．０８％～２．０％ ０．０９％～２．０％、または０．１％～２．０％に及ぶ量でデオキシヌクレオチド三リン酸塩を含み得る。いくつかの実施形態では、プールは、０．０５、０．１％、０．２％、０．４％、０．８％、または１．０％の量でデオキシヌクレオチド三リン酸塩を含み得る。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド三リン酸は、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰを含むプールから核酸ポリメラーゼによって選択され、ここで４つのデオキシリボヌクレオチド三リン酸のうちの１つは他の３つよりも著しく低い濃度であり、または４つのデオキシリボヌクレオチド三リン酸うちの２つが他の２つよりも著しく濃度が低い。場合によっては、ヌクレオチド三リン酸は、デオキシリボヌクレオチド三リン酸、ならびに、２，６ジアミノプリン（２，６Ｄｉａｍｉｎｏｐｕｒｉｎｅ）および２－チオチミジン （２－ｔｈｉｏｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）（または５位置にメチル基がないウラシル）などの修飾ヌクレオチドのプールから核酸ポリメラーゼによって選択される。場合によっては、修飾ヌクレオチドは「半適合性の（ｓｅｍｉ－ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）」ヌクレオチド塩基対を含む。場合によっては、半適合性のヌクレオチド塩基対は、自然発生のヌクレオチド塩基、またはそれらの自然発生の類縁と対になる塩基と塩基対になることができるが、それらの自然発生の塩基対相手のアナログとは塩基対にならないように、選択された、修飾ヌクレオチドを含む。例えば、アデニン（Ａｄｅｎｉｎｅ） ・アナログである２，６－ジアミノプリンは、チミジン（Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）と塩基対になることができ、および、チミジンアナログである２－チオチミジンはアデニンと塩基対になることができるが、しかし半適合性の対の２，６－ジアミノプリンと２－チオチミジンは互いに塩基対になることができない。このように、アデニンアナログである２，６－ジアミノプリンとチミジンアナログである２－チオチミジンは、半適合性の塩基対を構成する。ヌクレオチド三リン酸ｄＧＴＰとｄＣＴＰ（相補的か自然な対）を含む組成物、および半相補的な対であるデオキシ－２，６－ジアミノプリンＴＰとデオキシ－２－チオチミジンＴＰは、従って、鋳型に方向づけられた核酸合成の３’ＯＨ位置からの伸長を支持する。
【0101】
代替Ａ：Ｔ対および代替Ｇ：Ｃ対などの、他の修飾塩基対合が企図される。
【0102】
そのような半適合性の修飾塩基の利点は、核酸が取り出されるｄＮＴＰプールが十分な濃度のこれらの塩基を含んでいる場合、これらの修飾塩基を組み込む核酸鋳型は、合成のための鋳型として働かないことである。従って、これらの塩基を組み込む核酸は、他の合成された核酸によって鋳型とされるのではなく、むしろ元の核酸サンプルによって確実に鋳型とされる。この特徴は、核酸合成反応の初期における塩基組み込みミスマッチエラーが後の鋳型において広められるというリスクを伴わずに、サンプル核酸の複数コピーの合成を可能にする。しかしながら、ｄＮＴＰプールを、アナログが置換である塩基の型の自然発生のｄＮＴＰから成る、または含む、プールに置換することによって、４つの自然発生の塩基をすべて含む核酸が、塩基対アナログを組み込む鋳型から生成される。
【0103】
場合によっては、修飾ヌクレオチドの少なくとも１つは、標識されている。場合によっては、修飾ヌクレオチドの少なくとも１つは、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）―、ビオチン、フルオレセイン－、またはテトラメチルローダミン－（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ－）で標識されている。場合によっては、鋳型は、第１の核酸と第１のプライマーを接触させる前に、特定の長さの断片へと断片化される。場合によっては、鎖伸長終止を達成するために、エンドヌクレアーゼ処置に敏感なヌクレオチドなどの、１つ以上のヌクレオチドアナログがエンドヌクレアーゼとの組み合わせで使用される。場合によっては、鎖伸長終止は、ｄＮＴＰ濃度の操作によって達成される。
【0104】
一実施形態では、デオキシリボヌクレオチド三リン酸とデオキシヌクレオチド三リン酸を含むプールは、分子のリガンドに結合された少なくとも１つのデオキシヌクレオチド三リン酸を含む。いくつかの実施形態では、この分子のリガンドは、ビオチンを含む。いくつかの実施形態では、方法は、前記第１の核酸分子にアニールされた第２の分子のタグ配列を含むオリゴヌクレオチドを含む分子を、リガンド結合剤に接触させる工程を含む。いくつかの実施形態では、このリガンド結合剤は、アビジンまたはストレプトアビジンである。場合によっては、リガンド結合剤は、ＤＩＧ、ビオチン、フルオレセイン、またはテトラメチルローダミンに対する高度親和性抗体である。
【0105】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸の少なくとも１つは、デオキシリボ核酸である。実施形態では、デオキシリボ核酸は、１０キロベースを超える断片へと断片化される。断片化は、機械的分断または酵素の消化を含む、多くの方法で遂行され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載された核酸の少なくとも１つは、リボ核酸である。いくつかの実施形態では、標的核酸サンプルは、リボ核酸である。実施形態では、第１の核酸分子は、リボ核酸から生成された相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）分子である。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡを生成した核酸ポリメラーゼは、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡは、標的核酸サンプルにオリゴ（ｄＴ）配列を含む第１のプライマーを接触させることによって生成される。
【0106】
さらなる実施形態では、同じ分子タグを有する所与のコンティグ由来の配列は、すべて、特定の相同染色体に割り当てられる。
【0107】
また、本明細書において、第１の分子のタグ配列と第１の長さを有する第１の標的配列とを含む第１の核酸分子、および第２の分子タグ配列を含むオリゴヌクレオチドを含む、標的化配列決定組成物が記載される。いくつかの実施形態では、第１の核酸分子は、３’デオキシリボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、３’デオキシリボヌクレオチドは、デオキシヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、第１の核酸は、第１の分子タグ配列に対して５’側に位置するアダプター配列を含む。このアダプター配列は、イオン半導体（例えば、，ＩＯＮ ＴＯＲＲＥＮＴ， Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、パイロシーケンシング（例えば、ＧＳ ＪＵＮＩＯＲ＋， ４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｂｒａｎｆｏｒｄ，ＣＴ）、または、合成による配列決定（ＳＢＳ）（例えば、ＭＩＳＥＱ，Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）などの特定の配列決定プラットフォームのために増幅および／または配列決定を容易にするために付加され得る。例示的なアダプター配列は、５’ ＡＡＴ ＧＡＴ ＡＣＧ ＧＣＧ ＡＣＣ ＡＣＣ ＧＡ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）、および５’ＣＡＡ ＧＣＡ ＧＡＡ ＧＡＣ ＧＧＣ ＡＴＡ ＣＧＡ ＧＡＴ ３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２）を含む。Ｉｌｌｕｍｉｎａ，４５４，Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔおよび他の既知の配列決定技術と適合性のあるアダプターは、本明細書において企図される。
【0108】
いくつかの実施形態では、第１の核酸分子を含む標的化配列決定組成物は、分子リガンドを含む。いくつかの実施形態では、この分子のリガンドは、ビオチンを含む。いくつかの実施形態では、組成物はリガンド結合剤を含む。いくつかの実施形態では、このリガンド結合剤は、アビジンまたはストレプトアビジンである。本明細書に記載の組成物はまた、リガンド－リガンド結合剤洗浄緩衝剤を含む場合がある。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、ビオチン洗浄緩衝剤を含む。
【0109】
本明細書に記載の標的化配列決定組成物はまた、組み込まれていないヌクレオチドを含む場合がある。いくつかの実施形態では、組み込まれていないヌクレオチドは組み込まれていないデオキシリボヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、組み込まれていないヌクレオチドはデオキシヌクレオチドである。
【0110】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、第２の分子のタグ配列を含むオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされた第１の核酸分子を含む。第１の核酸分子は、オリゴヌクレオチドの第２分子のタグ配列に完全にハイブリダイズされるか、または、第１の核酸分子は、オリゴヌクレオチドの第２の分子タグ配列に不完全にハイブリダイズされる場合がある。
【0111】
さらに本明細書で記載されるのは、核酸分子の集団を含む標的化配列決定組成物であり、ここで分子は各々、第１のアダプター配列を含む第１鎖、分子タグ配列、および独立した標的配列を個別に含み、および、ここで独立した標的配列は各々、サンプル核酸配列のサブセットを含み、および、ここで集団の少なくとも第１の分子は、サンプル核酸配列の第１のサブセットを含む独立した標的配列を含み、および、ここで集団の少なくとも第２の分子は、サンプル核酸配列の第２のサブセットを含む独立した標的配列を含む。いくつかの実施形態では、集団の各第１鎖のアダプターは、同一である。いくつかの実施形態では、集団の各分子の分子タグ配列は、少なくとも６つのヌクレオチド塩基を含む。いくつかの実施形態では、集団の第１のメンバおよび集団の第２のメンバは、異非同一の分子タグ配列を含む。いくつかの実施形態では、各第１鎖は、その３’端末に３’－デオキシヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、各第１鎖は、その５’端末に分子リガンドを含み得るか、または、各第１鎖は、非終止位置にて付着された分子リガンドを含み得る。付加的には、各第１鎖は、その３’端末にて分子リガンドを含み得る。いくつかの実施形態では、前記分子リガンドは、ビオチンである。
【0112】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、核酸分子の集団を含み、ここで集団の各分子は、第２のアダプター配列および第２の分子タグ配列を含む第２鎖を含む。さらなる実施形態において、集団の少なくとも１つの分子の第２鎖は、第２鎖の第２の分子タグ配列の、第１鎖の独立した標的配列に対する、少なくとも部分的な塩基対合を介して、第１鎖にアニールされる場合がある。いくつかの実施形態では、集団の各第２鎖のアダプターは、同一であり得る。いくつかの実施形態では、集団の少なくとも１つの分子は、分子リガンド結合剤に結合される。いくつかの実施形態では、分子リガンド結合剤は、アビジンまたはストレプトアビジンを含む。
【0113】
本明細書に記載の標的化配列決定組成物はまた、組み込まれていない核酸三リン酸を含む場合がある。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、分子リガンド結合剤洗浄緩衝剤、および／またはポリメラーゼ伸長緩衝剤、および／または核酸ポリメラーゼを含み得る。いくつかの実施形態では、核酸ポリメラーゼは、核酸ヘリカーゼ活性を持つ。いくつかの実施形態では、本明細書に記載された組成物は、核酸鎖転移活性を持つ核酸ポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｉｏｎ ｔｏｒｒｅｎｔまたは４５４配列決定技術に適合する配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、配列番号１および配列番号２で詳述される配列を含む。
【0114】
ここで得られた標的化配列情報は、場合により、核酸蓄積レベルを定量するために使用される。ライブラリーは、本明細書に開示されるとおり、生成され、および配列決定される。固有にタグ付けされたリードだけが含まれるように、複製のリード（ｒｅａｄ）は除外される。固有のリード配列は、ゲノムの配列またはｃＤＮＡライブラリー、または、所与の細胞型または処理についてのトランスクリプトーム、または生物体についての、トランスクリプトームセット全体までの又はトランスクリプトームセット全体を含むより大きなトランスクリプトームセットなどの、トランスクリプトームの配列にマッピングされる。標的領域にマッピングする固有のライブラリー配列リードの数は、数えられ、サンプルにおけるその配列の存在量を表わすために使用される。いくつかの実施形態では、固有にタグ付けされた配列リードはそれぞれ、サンプル配列における単一の部位に対してマッピングする。場合によっては、固有にタグ付けされた配列リードは、トランスポゾン挿入部位または循環要素部位などのゲノムの全体にわたる複数の部位に対してマッピングする。従って、場合により、トランスクリプトーム「遺伝子座」または転写にマッピングするライブラリー分子の数は、ライブラリーが生成されるもととなるサンプルにおけるその転写の蓄積のレベルに対応する。循環要素にマッピングするライブラリー分子の数は、ゲノムの所与の固有の領域にマッピングするライブラリー分子の数に比べて、サンプルにおける循環要素の相対存在量をよく示す。このように、本明細書で開示されるのは、ライブラリーを生成するもととなったサンプル中の核酸分子配列の存在量に対応する核酸分子配列の出現頻度などの、サンプル中の核酸分子配列の相対存在量を定量する方法であり、前記方法は、固有にタグ付けされたライブラリー断片を有する配列ライブラリーを生成する工程、およびライブラリー上に核酸分子配列をマッピングする工程を含む。場合によっては、ライブラリーにおける核酸分子配列の出現頻度は、ライブラリーにおける第２の核酸分子配列の出現頻度、トランスクリプトームにおける既知の存在量の遺伝子座または転写に対応する前記第２の核酸配列、またはゲノムサンプルの１つのゲノムごとの既知のコピー数との比較で評価される。
【0115】
前記組成物のいずれかを使用する標的化配列決定のためにサンプル中の核酸を調製する方法が、本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、サンプルは、細胞、組織、または生物体の部分から得られる。生物体の非限定的な例は、ヒト、植物、細菌、ウイルス、原生動物、真核生物、および原核生物を含み得る。一例として、サンプルは、ヒトゲノム核酸を含むヒトゲノムである。サンプルは、核酸ライブラリーを調製するために使用される。ライブラリーは、配列決定される。
【0116】
標的化配列決定の核酸ライブラリーの調製は、本明細書に記載されている、あるいは当該技術分野において周知の方法を用いて行われる。いくつかの実施形態において、核酸はヒトゲノムから得られる。ヒトゲノムの核酸を反応混合物Ｘにおいて増幅させる。いくつかの実施形態において、反応混合物ＸはＤＮＡ、少なくとも１つのプライマー、バッファー、デオキシヌクレオチド混合物、酵素、ヌクレアーゼフリー水を含み得る。反応混合物Ｘをエッペンドルフ管の中で調製する。反応混合物Ｘは、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＤＮＡ ＬｏＢｉｎｄ微量遠心分離管の中で調整することが好ましい。場合によっては、ＤＮＡはヒトのＤＮＡである。反応混合物Ｘにおける最終的なＤＮＡ濃度は約０．１ｎｇ、０．２ｎｇ、０．３ｎｇ、０．４ｎｇ、０．５ｎｇ、０．６ｎｇ、０．７ｎｇ、０．８ｎｇ、０．９ｎｇ、１．０ｎｇ、１．２ｎｇ、１．４ｎｇ、１．５ｎｇ、１．８ｎｇ、２．０ｎｇあるいはそれ以上である。反応混合物Ｘにおける最終的なＤＮＡ濃度は約０．１ｎｇ、０．２ｎｇ、０．３ｎｇ、０．４ｎｇ、０．５ｎｇ、０．６ｎｇ、０．７ｎｇ、０．８ｎｇ、０．９ｎｇ、１．０ｎｇ、１．２ｎｇ、１．４ｎｇ、１．５ｎｇ、１．８ｎｇ、２．０ｎｇあるいはそれ以下である。反応混合物Ｘにおける最終的なＤＮＡ濃度は０．１から約２．０ｎｇの間、約０．２ｎｇから約１．２ｎｇの間、約０．５ｎｇから約０．８ｎｇの間、あるいは約１．０ｎｇから約１．５ｎｇの間である。
【0117】
場合によっては、反応混合物Ｘは１つのプライマーのみ、例えば、プライマーＡを含む。全反応混合物におけるプライマーＡの最終濃度は、約１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ，４０μＭ、約５０μＭ、約１００μＭ、約１５０μＭ、約２００μＭ、あるいはそれ以上である。全反応混合物ＸにおけるプライマーＡの最終濃度は、約１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、約５０μＭ、約１００μＭ、約１５０μＭ、約２００μＭ、あるいはそれ以下である。全反応混合物ＸにおけるプライマーＡの最終濃度は、約１０μＭから約２００μＭの間、約３０μＭから約８０μＭの間、約５０μＭから約１００μＭの間、または約４０μＭから約１５０μＭの間である。
【0118】
場合によっては、反応混合物ＸはＴｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ Ｂｕｆｆｅｒのようなバッファーを含む。典型的に、反応混合物Ｘにおけるバッファーの最終濃度は元のバッファー濃度の約１０％である。例えば、反応混合物Ｘの最終体積に応じて、加えるバッファーの量は、約１μｌ、約２μｌ、約２．５μｌ、約３μｌ、約４μｌ、約５μｌ、約１０μｌか、あるいはそれらの量以下、それらの量以上である。
【0119】
場合によっては、反応混合物Ｘは複数のデオキシリボヌクレオチドを含む。デオキシリボヌクレオチドは、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＧＴＰ、およびｄｄＣＴＰのうち１つ以上である。反応混合物Ｘにおけるデオキシリボヌクレオチドの最終濃度は約０．１μＭ、約０．２μＭ、約０．３μＭ、、約０．４μＭ、約０．５μＭ、約０．６μＭ、約０．７μＭ、約０．８μＭ、約０．９μＭ、約１．０μＭ、約１．２μＭ、約１．５μＭ、約１．８μＭ、約２．０μＭ、あるいはそれ以上である。反応混合物Ｘにおけるデオキシリボヌクレオチドの最終濃度は約０．１μＭ、約０．２μＭ、約０．３μＭ、、約０．４μＭ、約０．５μＭ、約０．６μＭ、約０．７μＭ、約０．８μＭ、約０．９μＭ、約１．０μＭ、約１．２μＭ、約１．５μＭ、約１．８μＭ、約２．０μＭ、あるいはそれ以下である。
【0120】
場合によっては、反応混合物Ｘはポリメラーゼなどの酵素を含む。例えば、場合によっては、酵素はＴｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅである。ポリメラーゼの最終濃度は約０．０１μＭ、約０．１μＭ、約０．２μＭ、約０．３μＭ、約０．４μＭ、約０．５μＭ、約０．６μＭ、約０．７μＭ、約０．８μＭ、約０．９μＭ、約１．０μＭ、約１．２μＭ、約１．５μＭ、約１．８μＭ、約２．０μＭ、あるいはそれ以上である。ポリメラーゼの最終濃度は約０．０１μＭ、約０．１μＭ、約０．２μＭ、約０．３μＭ、約０．４μＭ、約０．５μＭ、約０．６μＭ、約０．７μＭ、約０．８μＭ、約０．９μＭ、約１．０μＭ、約１．２μＭ、約１．５μＭ、約１．８μＭ、約２．０μＭ、あるいはそれ以下である。ポリメラーゼの最終濃度は、約２．０μＭまでの間、約０．１μＭから約１．０μＭの間、約０．５μＭから約１．５μＭの間、あるいは約０．８μＭから約１．８μＭの間である。
【0121】
典型的に、所望の最終体積にするために反応混合物Ｘに多量のヌクレアーゼフリー水を追加する。反応混合物の最終体積は約１０μｌ、約２０μｌ、約２５μｌ、約３０μｌ、約４０μｌ、約５０μｌ、あるいは１００μｌである。反応混合物Ｘの最終体積に応じて、ヌクレアーゼフリー水の量は約０．１μｌ、約０．５μｌ、約０．８μｌ、約１．０μｌ、約２μｌ、約５μｌ、約１０μｌ、約１５μｌ、約２０μｌ、約２５μｌ、約３０μｌ、約４０μｌ、約５０μｌ、約８０μｌ、約９０μｌ、約９５μｌ、あるいはそれ以上である。ヌクレアーゼフリー水の量は約０．１μｌ、約０．５μｌ、約０．８μｌ、約１．０μｌ、約２μｌ、約５μｌ、約１０μｌ、約１５μｌ、約２０μｌ、約２５μｌ、約３０μｌ、約４０μｌ、約５０μｌ、約８０μｌ、約９０μｌ、約９５μｌ、あるいはそれ以下である。ヌクレアーゼフリー水の量は、約０．１μｌから約９５μｌの間、約１．０μｌから約１０μｌの間、約５μｌから約５０μｌの間、あるいは約２０μｌから約８０μｌの間である。
【0122】
一般に、反応混合物Ｘは、ＤＮＡが変性するまで十分長くある温度（Ｔｍ）でインキュベートされる。Ｔｍは約８０℃、約８５℃、約９０℃、約９１℃、約９２℃、約９３℃、約９４℃、約９５℃、約９６℃、約９７℃、約９８℃、約９９℃、あるいはそれ以上である。反応混合物Ｘは約５秒間、約１０秒間、約１５秒間、約２０秒間、約３０秒間、約１分間、約２分間、約３分間、約４分間、約５分間、約６分間、約７分間、約８分間、約９分間、約１０分間、あるいはそれら以上、それら以下の時間Ｔｍでインキュベートされる。例えば、反応混合物Ｘは９５℃で約３分間インキュベートされる。変性後、管を氷の上に置くことにより反応混合物Ｘの温度は低下する。例えば、管は約５秒間、約１０秒間、約１５秒間、約２０秒間、約３０秒間、約５秒間、約１０秒間、約１５秒間、約２０秒間、約３０秒間、約１分間、約２分間、約３分間、約４分間、約５分間、約６分間、約７分間、約８分間、約９分間、約１０分間、あるいはそれら以上、それら以下の時間氷の上に配置される。ポリメラーゼ、例えばＴｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ、を反応に追加し、丁寧に混ぜることが好ましい。一般的に、反応混合物Ｘはサーマルサイクラーへ移され、本明細書に記載のとおり、機器上での処理に進む。
【0123】
サーマルサイクラーは、（１）ある期間低温度を維持すること、（２）温度をＤＮＡアニーリング温度へと上昇させること、（３）ある期間アニーリング温度を維持すること、（４）ある期間温度を変性温度へと上昇させること、（１）から（４）を少なくとも９回繰り返し行うことを含むプログラムの実行、そして保管のため８℃、４℃、それ以下、あるいは－２０℃での冷凍を保つ。（１）における低温は約１０℃、約１２℃、約１４℃、約１６℃、約１８℃、あるいは約２０℃で維持される。（１）において低温は約５秒間、約１０秒間、約１５秒間、約２０秒間、約３０秒間、約１分間、約２分間、約３分間、約４分間、約５分間、約６分間、約７分間、約８分間、約９分間、約１０分間、約１５分間、あるいは約２０分間維持される。代替として、サーマルサイクラーは約３分間約１６℃で温度を維持することができる。いくつかの実施形態では、温度は（１）から（２）まで徐序に上昇され、温度は約０．１℃／秒の小さな増分で上昇される。（２）における温度は約４５℃、約５０℃、約５５℃、約６０℃、約６５℃、約６８℃、約７０℃、あるいはそれ以上である。場合によっては、（２）の温度は０．１℃／秒で約６０℃まで徐々に上昇される。場合によっては、（２）の温度は（３）の温度に等しい。場合によっては、（２）の温度は（３）の温度に達するためさらに大きく上昇される。（３）の温度は、約５秒間、約１０秒間、約１５秒間、約２０秒間、約３０秒間、約１分間、約２分間、約３分間、約４分間、約５分間、約６分間、約７分間、約８分間、約９分間、約１０分間、約１５分間、あるいは約２０分間維持される。いくつかの実施形態では、（３）の温度は約１０分間維持される。実施例として、（４）の温度は約９５℃で、約１０秒間、２０秒間、３０秒間、４５秒間、６０秒間、１分間、２分間、あるいはそれより長く維持される。
【0124】
いくつかの実施形態では、反応混合物Ｘ中の反応成分はすべて、プライマーを除き、適切な分離装置上に組み合わせられロードされる。反応物が分離され、およびバーコード付きのプライマーと結合された後、反応混合物をサーマルサイクラーへと移し、９５℃で２分間熱変性させ、その後本明細書に記載されたプログラムに従ってサーモサイクルされる。いくつかの実施形態において、生成物は、長期間保管のため、４℃、あるいは氷の上で保存、あるいは－２０℃で冷凍される。いくつかの実施形態において、次の工程へと進む直前に、保存された生成物は約９８℃で約３分間加熱され、その後氷の上で一時的に保存するため移される。
【0125】
いくつかの実施形態において、上記記載の反応混合物ＸのＤＮＡ生成物は磁気ビーズを用いて捕捉される。このことは、上記記載の生成物を加える前にＣａｐｔｕｒｅ Ｂｅａｄｓを調製することにより達成される。まず、ビーズを再懸濁させるために、Ｃａｐｔｕｒｅ Ｂｅａｄｓの管を徹底的に振動させ約４０μｌのビーズを０．５ｍＬの新しいＥｐｐｅｎｄｏｒｆ ＤＮＡ ＬｏＢｉｎｄ管へと移す。場合によっては、ビーズの体積は約１０μｌ、２０μｌ、約３０μｌ、約５０μｌ、約１００μｌ、あるいはそれ以上である。溶液が透明になるまで、管を約０．５～１分間磁気スタンドに配置する。上澄みはピペットで移し廃棄する。管を磁気スタンドから取り外す。約２００μｌの量のＨＳ Ｂｕｆｆｅｒをビーズに加える。磁気スタンドへ戻す前に、サンプルをピペットで上下に移すことで構成要素を丁寧に混合する。溶液が透明になるまで、サンプルを約０．５～１分間磁気スタンドに設置した状態にする。上澄みはピペットで管の外へ丁寧に移すことで取り除き、および廃棄する。その後、管を磁気スタンドから取り外し、ビーズは４０μｌのＨＳ Ｂｕｆｆｅｒ中で再懸濁する。管を一時的に常温で実験台に置いた状態にする。上記記載の反応混合物のＤＮＡ生成物を、本明細書に記載されているように調製したＣａｐｔｕｒｅ Ｂｅａｄｓに加え、約２０分間常温でインキュベートした。場合によっては、ＤＮＡおよびＣａｐｔｕｒｅ Ｂｅａｄｓを含むサンプルを常温で約１０分間、約１５分間、約２０分間、約３０分間、あるいはそれより長くインキュベートする。ＤＮＡ生成物およびＣａｐｔｕｒｅ Ｂｅａｄｓを約５分間、約１０分間、約１５分間、約２０分間、約３０分間、あるいはそれより長くピペットで上下に移すことで混合する。ＤＮＡ生成物の混合物を含んだ管およびＣａｐｔｕｒｅ Ｂｅａｄｓを磁気スタンドに設置し、溶液が透明になるまで待つ。上澄みを管からピペットで慎重に移すことにより取り除く。その後、管は磁気スタンドから取り外されビーズを２００μｌのＢｅａｄ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒに再懸濁し、溶液が透明になるまでの一定時間磁気スタンドへ戻され得る。上澄みは廃棄する。洗浄を少なくともさらに２回繰り返し、最終洗浄後に残った液体を慎重に取り除く。
【0126】
洗浄後のＣａｐｔｕｒｅ Ｂｅａｄｓおよび上記記載のＤＮＡ生成物を、反応混合物Ｙを生成するために試薬の混合物に加える。試薬はＳｅｑｕｅｎａｓｅ Ｂｕｆｆｅｒ、複数のデオキシリボヌクレオチド、少なくとも１つプライマー、酵素およびヌクレアーゼフリー水を含み得る。
【0127】
場合によっては、反応混合物Ｙは１つのプライマーのみ、例えば、プライマーＢを含む。全反応混合物ＹにおけるプライマーＡの最終濃度は、約１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、約１００μＭ、約１５０μＭ、約２００μＭ、あるいはそれ以上である。全反応混合物ＹにおけるプライマーＢの最終濃度は、約１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、約１００μＭ、約１５０μＭ、約２００μＭ、あるいはそれ以下である。全反応混合物ＹにおけるプライマーＢの最終濃度は、約１０μＭから約２００μＭの間、約３０μＭから約８０μＭの間、約５０μＭから約１００μＭの間、あるいは約４０μＭから約１５０μＭの間である。
【0128】
場合によっては、反応混合物ＹはＳｅｑｕｅｎａｓｅ Ｂｕｆｆｅｒを含む。典型的に、反応混合物Ｙにおけるバッファーの最終濃度は元のバッファーの濃度の約１０％である。場合によっては、反応混合物Ｙにおけるバッファーの最終濃度は元のバッファーの濃度の約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約３０％、あるいはそれ以下である。例えば、反応混合物Ｙの最終体積に応じて、加えるバッファーの量は、約１μｌ、約２μｌ、約２．５μｌ、約３μｌ、約４μｌ、約５μｌ、約１０μｌ、あるいはそれらの量以下、それらの量以上である。
【0129】
場合によっては、反応混合物Ｙは複数のデオキシリボヌクレオチドを含む。デオキシリボヌクレオチドはｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＧＴＰ、およびｄｄＣＴＰである。反応混合物におけるデオキシリボヌクレオチドの最終濃度は約０．１μＭ、約０．２μＭ、約０．３μＭ、、約０．４μＭ、約０．５μＭ、約０．６μＭ、約０．７μＭ、約０．８μＭ、約０．９μＭ、約１．０μＭ、約１．２μＭ、約１．５μＭ、約１．８μＭ、約２．０μＭ、あるいはそれ以上である。反応混合物におけるデオキシリボヌクレオチドの最終濃度は約０．１μＭ、約０．２μＭ、約０．３μＭ、、約０．４μＭ、約０．５μＭ、約０．６μＭ、約０．７μＭ、約０．８μＭ、約０．９μＭ、約１．０μＭ、約１．２μＭ、約１．５μＭ、約１．８μＭ、約２．０μＭ、あるいはそれ以下である。
【0130】
場合によっては、反応混合物Ｙは酵素を含む。酵素はポリメラーゼである。例えば、酵素はＳｅｑｕｅｎａｓｅである。場合によっては、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅｓは、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅおよび無機ピロホスファターゼを１：１の割合で含む。ポリメラーゼの最終濃度は約０．０１μＭ、約０．１μＭ、約０．２μＭ、約０．３μＭ、約０．４μＭ、約０．５μＭ、約０．６μＭ、約０．７μＭ、約０．８μＭ、約０．９μＭ、約１．０μＭ、約１．２μＭ、約１．５μＭ、約１．８μＭ、約２．０μＭ、あるいはそれ以上である。ポリメラーゼの最終濃度は約０．０１μＭ、約０．１μＭ、約０．２μＭ、約０．３μＭ、約０．４μＭ、約０．５μＭ、約０．６μＭ、約０．７μＭ、約０．８μＭ、約０．９μＭ、約１．０μＭ、約１．２μＭ、約１．５μＭ、約１．８μＭ、約２．０μＭ、あるいはそれ以下である。ポリメラーゼの最終濃度は約２．０μＭまでの間、約０．１μＭから約１．０μＭの間、約０．５μＭから約１．５μＭの間、あるいは約０．８μＭから約１．８μＭの間である。
【0131】
典型的に、所望の最終体積にするために反応混合物に多量のヌクレアーゼフリー水を加える。反応混合物Ｙの最終体積は約１０μｌ、約２０μｌ、約２５μｌ、約３０μｌ、約４０μｌ、約５０μｌ、あるいは約１００μｌである。最終反応液体積に応じて、ヌクレアーゼフリー水の量は約０．１μｌ、約０．５μｌ、約０．８μｌ、約１．０μｌ、約２μｌ、約５μｌ、約１０μｌ、約１５μｌ、約２０μｌ、約２５μｌ、約３０μｌ、約４０μｌ、約５０μｌ、約８０μｌ、約９０μｌ、約９５μｌ、あるいはそれ以上である。ヌクレアーゼフリー水の量は約０．１μｌ、約０．５μｌ、約０．８μｌ、約１．０μｌ、約２μｌ、約５μｌ、約１０μｌ、約１５μｌ、約２０μｌ、約２５μｌ、約３０μｌ、約４０μｌ、約５０μｌ、約８０μｌ、約９０μｌ、約９５μｌ、あるいはそれ以下である。ヌクレアーゼフリー水の量は約０．１μｌから約９５μｌの間、約１．０μｌから約１０μｌの間、約５μｌから約５０μｌの間、あるいは約２０μｌから約８０μｌの間である。
【0132】
いくつかの実施形態において、反応混合物Ｙは２４℃で約２０分間インキュベートされる。混合物はより長い時間、あるいはより短い時間インキュベートされる。例えば、反応混合物Ｙは約１０分間、約１５分間、約２０分間、約３０分間、あるいはそれより長くインキュベートされる。温度は約１８℃、約２０℃、約２５℃、約２８℃、あるいはそれら以上、それら以下である。サーマルサイクラーあるいはヒートブロックにおいてインキュベーションを行なうことが好ましい。溶液が透明になるまで、その後管は一定時間磁気スタンドに設置され得る。上澄みを取り除き、および廃棄する。その後、管を磁気スタンドから取り外しビーズを約２００μｌのＢｅａｄ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ中で再懸濁して、磁気スタンドへ戻す前に、溶液が透明になるまでそのままにしておく。上澄みを慎重に取り除く。典型的に、洗浄の工程を少なくともさらに２回繰り返す。最終洗浄後に残った液体を慎重に取り除く。
【0133】
いくつかの実施形態において、反応混合物Ｚを生成するために、反応混合物Ｙを反応混合物に加える。一般に、反応混合物Ｙは、ＰＣＲユニバーサルプライマーＩ、バーコード付きのＰＣＲプライマーＩＩ、ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＰＣＲ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｉｘおよびヌクレアーゼフリー水を含むＰＣＲ管における反応混合物Ｚに加えられる。
【0134】
場合によっては、全反応混合物Ｚ’におけるＰＣＲユニバーサルプライマーＩの最終濃度は約１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、約５０μＭ、約１００μＭ、約１５０μＭ、約２００μＭ、あるいはそれ以上である。全反応混合物Ｚ’におけるＰＣＲユニバーサルプライマーＩの最終濃度は約１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、約５０μＭ、約１００μＭ、約１５０μＭ、約２００μＭ、あるいはそれ以下である。全反応混合物Ｚ’におけるＰＣＲユニバーサルプライマーＩの最終濃度は約１０μＭから約２００μＭの間、約３０μＭから約８０μＭの間、約５０μＭから約１００μＭの間、あるいは約４０μＭから約１５０μＭの間である。
【0135】
場合によっては、全反応混合物Ｚ’におけるＰＣＲプライマーＩＩの最終濃度は約１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、約５０μＭ、約１００μＭ、約１５０μＭ、約２００μＭ、あるいはそれ以上である。全反応混合物Ｚ’におけるＰＣＲプライマーＩＩの最終濃度は約１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、約５０μＭ、約１００μＭ、約１５０μＭ、約２００μＭ、あるいはそれ以下である。全反応混合物Ｚ’におけるＰＣＲプライマーＩＩの最終濃度は約１０μＭから約２００μＭの間、約３０μＭから約８０μＭの間、約５０μＭから約１００μＭの間、あるいは約４０μＭから約１５０μＭの間である。
【0136】
場合によっては、反応混合物はＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＰＣＲ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｉｘを含む。典型的に、反応混合物Ｚ’におけるＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＰＣＲ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｉｘの最終濃度は元のミックスの濃度の約１０％である。場合によっては、反応混合物Ｚ’におけるＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＰＣＲ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｉｘの最終濃度は元のミックスの約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約３０％、あるいはそれ以下である。例えば、反応混合物Ｚ’の最終体積に応じて、加えるＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＰＣＲ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｉｘの量は約１μｌ、約２μｌ、約２．５μｌ、約３μｌ、約４μｌ、約５μｌ、約１０μｌ、あるいはそれら以下、それら以上である。
【0137】
典型的に、所望の最終体積にするために反応混合物Ｚ’に多量のヌクレアーゼフリー水を加える。反応混合物Ｚ’の最終体積は約１０μｌ、約２０μｌ、約２５μｌ、約３０μｌ、約４０μｌ、約５０μｌ、あるいは約１００μｌである。最終反応液体積に応じて、ヌクレアーゼフリー水の量は約０．１μｌ、約０．５μｌ、約０．８μｌ、約１．０μｌ、約２μｌ、約５μｌ、約１０μｌ、約１５μｌ、約２０μｌ、約２５μｌ、約３０μｌ、約４０μｌ、約５０μｌ、約８０μｌ、約９０μｌ、約９５μｌ、あるいはそれ以上である。ヌクレアーゼフリー水の量は約０．１μｌ、約０．５μｌ、約０．８μｌ、約１．０μｌ、約２μｌ、約５μｌ、約１０μｌ、約１５μｌ、約２０μｌ、約２５μｌ、約３０μｌ、約４０μｌ、約５０μｌ、約８０μｌ、約９０μｌ、約９５μｌ、あるいはそれ以下である。ヌクレアーゼフリー水の量は約０．１μｌから約９５μｌの間、約１．０μｌから約１０μｌの間、約５μｌから約５０μｌの間、あるいは約２０μｌから約８０μｌの間である。
【0138】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行ない、かつ生成物ＸＸを生成するために、反応混合物Ｚをサーマルサイクラーに置く。ＰＣＲプログラムはＤＮＡを変性させるために約９８℃で２分間の少なくとも１サイクル、変性させるために約９８℃で２０秒間の少なくとも１５サイクル、プライマーのアニーリングのために約６０℃まで３０秒間温度を低下させること、伸長のために約７０℃まで３０秒間温度を上昇させること、最終伸長のために７２℃で５分間の少なくとも１サイクル、４℃のまま保つことを含んでいる。場合によっては、ＤＮＡ変性温度は約９２℃、約９５℃、約９７℃、あるいは約９９℃である。場合によっては、プライマーアニーリング温度は約４５℃、約５０℃、約５５℃、約６０℃、約６５℃、あるいは約７０℃である。場合によっては、伸長温度は約６５℃、約７０℃、約７２℃、あるいは約７５℃である。
【0139】
生成物ＸＸをＡｍｐｕｒｅＸＰ Ｂｅａｄｓで浄化する。一般に、生成物ＸＸを含むＰＣＲ管は、磁気スタンドに置かれ、および溶液が透明になるように静止状態に維持され、その後、上澄みがピペット操作によって除去される。上澄みを、新しい０．５ｍＬ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＤＮＡ ＬｏＢｉｎｄ管に移す。Ｃａｐｔｕｒｅ Ｂｅａｄｓを包含しているＰＣＲ管を廃棄する。典型的には、ＡｍｐｕｒｅＸＰ Ｂｅａｄｓの約１００μｌを上澄みに添加し、そして、混合物を上下ピペット操作により混合し、その後、約１０分間、室温でインキュベートする。場合によっては、インキュベーションの時間は、約５分、約１５分、約２０分、約３０分、またはそれ以上など、１０分より長いかまたは短い。溶液が透明になるまで、チューブを約０．５～１分間磁気スタンドに配置する。上澄みを廃棄する。約２００μｌの８０％エタノールを管に加え、および約３０秒間おき、その後エタノールを除去および廃棄する。この手順の間、磁気スタンドから管を取り除くことが必要ではない場合がある。管は、少なくともさらに１回、２００μｌの８０％エタノールで洗浄される。管のキャップを開き、そして約１０～１５分間、ビーズを大気乾燥にさらす。約２０μｌ～約３０μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｃ－ＨＣｌ（ｐＨ７．８）をビーズに添加する。生じた混合物を上下ピペット操作で混合し、その後、約２分間、室温に置く。溶液が透明になるまで、チューブを約０．５～１分間磁気スタンドに配置する。溶出されたＤＮＡを包含している上澄みを、新しいＥｐｐｅｎｄｏｒｆ ＤＮＡ ＬｏＢｉｎｄ管に移す。その後、生成物は、ライブラリーを生成するために使用することができ、および、配列決定に先立って高感度ＤＮＡチップを使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ上で量を計られる。
【0140】
いくつかの実施形態では、この時点までのライブラリー調製のすべての工程が、単一ボリューム中で行なわれることが見られる。場合によっては、単一ボリュームは単一チューブである。ある場合には、単一ボリュームは、プレート中の単一ウェルである。任意選択的に、ライブラリー生成の後に、ＤＮＡは、ビーズに基づく方法またはアガロースゲルに基づく方法を使用して、選択されたサイズであり、および、ライブラリーの量は、配列決定に先立ち、高感度ＤＮＡチップを使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ上で定量される。
【0141】
核酸の標的化切断のためのエンドヌクレアーゼ
本明細書に開示される標的化配列決定法は、部位特異的な、標的化可能な、および／または操作されたヌクレアーゼもしくはヌクレアーゼ・システムを使用して核酸の切断を標的化する工程を含む。そのようなヌクレアーゼは、ゲノムの、ｃＤＮＡまたは他の核酸分子の中の所望の位置に二本鎖切断（ＤＳＢ）を生じ得る。他の例では、ヌクレアーゼは、一本鎖切断を生じ得る。場合によっては、２つのヌクレアーゼが使用され、その各々は一本鎖切断を生成する。本明細書の開示と調和する多くの切断酵素は、一本鎖か二本鎖のエキソヌクレアーゼ活性のためのアクセス可能な末端を有する分子を産出する形質を共有する。
本明細書に開示される標的化配列決定法は、部位特異的な、標的化可能な、および／または操作されたヌクレアーゼもしくはヌクレアーゼ・システムを使用して核酸の切断を標的化する工程を含む。そのようなヌクレアーゼは、ゲノムの、ｃＤＮＡまたは他の核酸分子の中の所望の位置に二本鎖切断（ＤＳＢ）を生じ得る。他の例では、ヌクレアーゼは、一本鎖切断を生じ得る。場合によっては、２つのヌクレアーゼが使用され、その各々は一本鎖切断を生成する。本明細書の開示と調和する多くの切断酵素は、一本鎖か二本鎖のエキソヌクレアーゼ活性のためのアクセス可能な末端を有する分子を産出する形質を共有する。
【0142】
本明細書の開示と調和するエンドヌクレアーゼは、クラスター化された短い回文反復（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓシステム・タンパク質－ｇＲＮＡ複合体、ジンクフィンガー・ヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ）から選択される少なくとも１つを多様に含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、標的核酸における少なくとも１つの部位に相補的である。また、他のプログラム可能な、核酸配列特異的エンドヌクレアーゼもまた、本明細書の開示に調和する。
【0143】
ジンクフィンガー・ヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、操作されたホーミングエンドヌクレアーゼなどの、操作されたヌクレアーゼ、および、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＣＰＦ１などの、ＲＮＡでガイドされる、またはＤＮＡでガイドされるエンドヌクレアーゼ、および／またはアルゴノートシステム（Ａｒｇｏｎａｕｔｅ ｓｙｓｔｅｍｓ）は、本開示の方法のうちのいくつかを実行するのに特に適切である。付加的に、または代替的に、ｃ２ｃ２ヌクレアーゼを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムなどの、ＲＮＡを標的とするシステムが使用されてもよい。
【0144】
本明細書で開示される方法は、タイプＩ、タイプＩＩ、タイプＩＩＩ、タイプＩＶ、タイプＶ、またはタイプＶＩ ＣＲＩＳＰＲシステムなどの、ＣＲＩＳＰＲシステムを使用して、標的核酸を切断する工程を含む場合がある。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、多タンパク質のシステムまたは単一のエフェクタータンパク質システムであり得る。多タンパク質の、またはＣｌａｓｓ１の、ＣＲＩＳＰＲシステムは、タイプＩ、タイプＩＩＩ、およびタイプＩＶシステムを含む。代替的に、クラス２システムは、単一のエフェクター分子を含み、およびタイプＩＩ、タイプＶ、およびタイプＶＩを含む。
【0145】
本明細書に開示されるいくつかの標的化配列決定法において使用されるＣＲＩＳＰＲシステムは、単一または複数のエフェクタータンパク質を含む場合がある。エフェクタータンパク質は、１つまたは複数のヌクレアーゼドメインを含む場合がある。エフェクタータンパク質は、ＤＮＡまたはＲＮＡを標的とする場合があり、およびＤＮＡまたはＲＮＡは、単鎖の場合も二本鎖場合もある。ＣＲＩＳＰＲシステムは、単一または複数のガイドＲＮＡを含む場合がある。ｇＲＮＡはｃｒＲＮＡを含み得る。ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの配列を有するキメラＲＮＡを含む場合がある。ｇＲＮＡは、別個のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む場合がある。ターゲット核酸配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ ａｄｊａｃｅｎｔ ｍｏｔｉｆ）（ＰＡＭ）またはプロトスペーサー側方部位（ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ ｆｌａｎｋｉｎｇ ｓｉｔｅ）（ＰＦＳ）を含む場合がある。ＰＡＭまたはＰＦＳは、標的またはプロトスペーサー部位の３’または５’であり得る。標的配列の切断は、平滑末端、３’オーバーハング、または５’オーバーハングを生成する場合がある。
【0146】
ｇＲＮＡは、スペーサー配列を含む場合がある。スペーサー配列は、標的配列またはプロトスペーサー配列に相補的な場合がある。スペーサー配列は、長さが１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６ヌクレオチドであり得る。いくつかの例では、スペーサー配列は、長さが１０ヌクレオチド未満または３６ヌクレオチド超であり得る。
【0147】
ｇＲＮＡは、反復配列を含む場合がある。場合によっては、反復配列は、ｇＲＮＡの二本鎖部分の一部である。反復配列は、長さが１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０ヌクレオチドであり得る。いくつかの例では、スペーサー配列は、長さ１０ヌクレオチド未満、または５０ヌクレオチド超であり得る。
【0148】
ｇＲＮＡは、１つ以上の合成ヌクレオチド、非自然発生のヌクレオチド、修飾があるヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。付加的に、または代替的に、ｇＲＮＡは、ヘアピン、リンカー領域、一本鎖領域、二本鎖領域、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。付加的に、または代替的に、ｇＲＮＡは、シグナル分子またはリポーター分子を含み得る。
【0149】
ｇＲＮＡｓは遺伝学的かエピゾームのＤＮＡによってコードされる場合がある。ｇＲＮＡｓには、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに付随して、または連続して、提供あるいは送達され得る。ガイドＲＮＡは、化学的に合成されるか、あるいはインビトロで転写されるか、さもなければ当該技術分野において既知の標準的なＲＮＡ生成技術を使用して生成され得る。
【0150】
ＣＲＩＳＰＲシステムは、タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲシステム、例えば、Ｃａｓ９システムであり得る。タイプＩＩヌクレアーゼは、場合によりＲｕｖＣおよびＨＮＨヌクレアーゼドメインを含む単一のエフェクタータンパク質を含む場合がある。場合によっては、機能的タイプＩＩヌクレアーゼは２つ以上のポリペプチドを含む場合があり、それぞれはヌクレアーゼドメインまたはその断片を含む。ターゲット核酸配列は、３’プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む場合がある。いくつかの例では、ＰＡＭは、標的核酸の５’であり得る。ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は単一のキメラｇＲＮＡを含む場合があり、それはｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡ配列の両方を含んでいる。あるいは、ｇＲＮＡは、一組の２つのＲＮＡ、例えばｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡを含む場合がある。タイプＩＩヌクレアーゼは、二本鎖切断を生成する場合があり、それは場合により２つの平滑末端を作る。場合によっては、タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ヌクレアーゼが一本鎖切断だけを生成するように、ニッカーゼであるように操作される。そのような場合、２つの一本鎖切断がニッカーゼによって生成されるように、２つの異なる核酸配列がｇＲＮＡによって標的とされ得る。いくつかの例では、２つの一本鎖切断は、効果的に二本鎖切断を生じる。場合によっては、タイプＩＩニッカーゼが２つの一本鎖切断を生成するために使用される場合、生じる核酸遊離末端は平滑であるか、３’オーバーハングを有するか、または５’オーバーハングを有するかのいずれかであり得る。いくつかの例では、タイプＩＩヌクレアーゼは、標的配列に結合するが切断しないように、触媒現象的に無効な場合がある。例えば、タイプＩＩヌクレアーゼは、ＲｕｖＣとＨＮＨの両方のドメインにおいて変異を有している場合があり、それによって、両方のヌクレアーゼドメインが機能を果たさなくなる。タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲシステムは、３つのサブタイプ、具体的には、タイプＩＩ－Ａ、タイプＩＩ－Ｂ、タイプＩＩ－Ｃのうちの１つであり得る。
【0151】
ＣＲＩＳＰＲシステムは、タイプＶ ＣＲＩＳＰＲシステム、例えば、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ３システムであり得る。タイプＶヌクレアーゼは、単一のエフェクタータンパク質を含む場合があり、それは場合により単一のＲｕｖＣヌクレアーゼドメインを含む。他の場合では、機能タイプＶヌクレアーゼは、２つ以上のポリペプチド間で分割されたＲｕｖＣドメインを含む。そのような場合、標的核酸配列は、５’ＰＡＭまたは３’ＰＡＭを含み得る。ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、Ｃｐｆ１である場合などの、単一のｇＲＮＡまたは単一のｃｒＲＮＡを含み得る。場合によっては、ｔｒａｃｒＲＮＡは必要とされない。他の例では、Ｃ２ｃ１が使用されるときなど、ｇＲＮＡは単一のキメラｇＲＮＡを含む場合があり、そのときｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの両方の配列を含むか、またはｇＲＮＡは一組の２つのＲＮＡ、例えば、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡを含み得る。タイプＶ ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、二本鎖切断を生成する場合があり、それは場合により５’オーバーハングを生成する。場合よっては、タイプＶ ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ヌクレアーゼが一本鎖切断だけを生成するように、ニッカーゼであるように操作される。そのような場合、２つの一本鎖切断がニッカーゼによって生成されるように、２つの異なる核酸配列がｇＲＮＡによって標的とされ得る。いくつかの例では、２つの一本鎖切断は効果的に二本鎖切断を生じる。場合によっては、タイプＶニッカーゼが２つの一本鎖切断を生成するために使用される場合、生じる核酸遊離末端は平滑であるか、３’オーバーハングを有するか、または５’オーバーハングを有するかのいずれかであり得る。いくつかの例では、タイプＶヌクレアーゼは、標的配列に結合するが切断しないように、触媒現象的に無効な場合がある。例えば、タイプＶヌクレアーゼは、ＲｕｖＣドメインにおいて変異を有している場合があり、それによって、ヌクレアーゼドメインが機能を果たさなくなる。
【0152】
ＣＲＩＳＰＲシステムはタイプＶＩ ＣＲＩＳＰＲシステム、例えば、Ｃ２ｃ２システムであり得る。タイプＶＩヌクレアーゼは、ＨＥＰＮドメインを含む場合がある。いくつかの例では、タイプＶＩヌクレアーゼは２つ以上のポリペプチドを含む場合があり、それぞれはＨＥＰＮヌクレアーゼドメインまたはその断片を含む。そのような場合、ターゲット核酸配列は一本鎖ＲＮＡなどのＲＮＡであり得る。タイプＶＩ ＣＲＩＳＰＲシステムを使用する時、標的核酸はプロトスペーサー側方部位（ＰＦＳ）を含み得る。ＰＦＳは、３’または５’、あるいは標的またはプロトスペーサー配列であり得る。ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、単一のｇＲＮＡまたは単一のｃｒＲＮＡを含む場合がある。場合によっては、ｔｒａｃｒＲＮＡは必要とされない。他の例では、ｇＲＮＡは単一のキメラｇＲＮＡを含む場合があり、そのときｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの両方の配列を含むか、またはｇＲＮＡは一組の２つのＲＮＡ、例えば、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡを含み得る。いくつかの例では、タイプＶＩヌクレアーゼは、標的配列に結合するが切断しないように、触媒現象的に無効な場合がある。例えば、タイプＶＩヌクレアーゼは、ＨＥＰＮドメインにおいて変異を有している場合があり、それによって、ヌクレアーゼドメインが機能を果たさなくなる。
【0153】
核酸にガイドされるヌクレアーゼを含む、本開示における使用のための適切なヌクレアーゼの非限定的な例は、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９ （Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１０、Ｃｐｆ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１００、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、それらの相同体、それらのオーソログ、またはそれらの修飾版を含む。
【0154】
本明細書に開示されたいくつかの方法では、アルゴノート（Ａｒｇｏｎａｕｔｅ）（Ａｇｏ）システムが、ターゲット核酸配列を切断するために使用されてもよい。Ａｇｏタンパク質は、原核生物、真核生物、または古細菌に由来する場合がある。標的核酸は、ＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。ＤＮＡ標的は、単鎖または二本鎖であり得る。いくつかの例では、標的核酸は、プロトスペーサー隣接モチーフまたはプロトスペーサー側方配列に等価の配列などの、特定の標的側方配列を必要としない。Ａｇｏタンパク質は、二本鎖切断または一本鎖切断を生じる場合がある。いくつかの例では、Ａｇｏタンパク質が一本鎖切断を形成する時、２つのＡｇｏタンパク質は、二重鎖切断を生成するために組み合わせて使用されてもよい。いくつかの例では、Ａｇｏタンパク質は１、２、またはそれ以上のヌクレアーゼドメインを含む。いくつかの例では、Ａｇｏタンパク質は１、２、またはそれ以上の触媒ドメインを含む。１つ以上のヌクレアーゼまたは触媒ドメインはＡｇｏタンパク質において変異させられる場合があり、それによって、一本鎖切断を生成することができるニッカーゼタンパク質が生成される。他の例では、１つ以上のヌクレアーゼまたはＡｇｏタンパク質の触媒ドメインにおける変異は、結合するが標的核酸を切断しない場合があるような、触媒現象的に無効なＡｇｏタンパク質を生成する。
【0155】
Ａｇｏタンパク質は、ガイドする核酸によって標的核酸配列に向けられる。多くの例では、ガイドする核酸は、ガイドＤＮＡ（ｇＤＮＡ）である。ｇＤＮＡは、５’にリン酸化された端末を有し得る。ｇＤＮＡは、単鎖または二本鎖であり得る。単鎖ｇＤＮＡは、長さが１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０ヌクレオチドであり得る。いくつかの例では、ｇＤＮＡは、長さが１０ヌクレオチド未満であり得る。いくつかの例では、ｇＤＮＡは、長さが５０ヌクレオチド超であり得る。
【0156】
アルゴノートに媒介された切断は、平滑末端、５’オーバーハング、または３’オーバーハングを生成する場合がある。いくつかの例では、１つ以上のヌクレオチドが、切断の間または後に、標的部位から除去される。
【0157】
アルゴノートタンパク質は、内発的にまたは組み換え的に発現される場合がある。アルゴノートは、染色体上に、染色体外に、またはプラスミド、合成染色体、または人工染色体上に、コードされる場合がある。付加的に、または代替的に、アルゴノートタンパク質は、ポリペプチドをコードするポリペプチドまたはｍＲＮＡとして提供される場合がある。そのような例では、ポリペプチドまたはｍＲＮＡは、ペプチド、ナノ粒子、またはウイルス粒子の使用によるなどの、当該技術分野において既知の標準的な手段によって送達される場合がある。
【0158】
ガイドＤＮＡは、遺伝子の、またはエピゾームのＤＮＡによって提供される場合がある。いくつかの例では、ｇＤＮＡは、ＲＮＡまたはｍＲＮＡから逆転写される。いくつかの例では、ガイドＤＮＡは、Ａｇｏタンパク質に付随して、または連続して、提供あるいは送達され得る。ガイドＤＮＡは、化学的に合成、構築される場合があり、さもなければ当該技術分野において既知の標準的なＤＮＡ生成技術を使用して、生成される。ガイドＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ、エピゾームのＤＮＡ分子、単離された核酸分子、または核酸分子の他の任意の供給源から、切断されるか、放出されるか、さもなければ取り出され得る。
【0159】
ヌクレアーゼ融合蛋白質は、組み換え的に発現される場合がある。ヌクレアーゼ融合蛋白質は、染色体上に、染色体外に、またはプラスミド、合成染色体、または人工染色体上に、コードされる場合がある。ヌクレアーゼとクロマチンリモデリング酵素は、別々に操作され、その後共有結合でリンクされる場合がある。ヌクレアーゼ融合蛋白質は、ポリペプチドをコードするポリペプチドまたはｍＲＮＡとして提供される場合がある。そのような例では、ポリペプチドまたはｍＲＮＡは、ペプチド、ナノ粒子、またはウイルス粒子の使用によるなどの、当該技術分野において既知の標準的な手段によって送達される場合がある。
【0160】
ガイド核酸は、適合する核酸でガイドされるヌクレアーゼと複合体化し、および標的配列とハイブリダイズするする場合があり、それによって、標的配列にヌクレアーゼを向ける。ガイド核酸と複合体化することができる、対象の核酸でガイドされるヌクレアーゼは、ガイド核酸と適合する核酸でガイドされるヌクレアーゼとして言及され得る。同様に、核酸でガイドされるヌクレアーゼと複合体化することができるガイド核酸は、核酸でガイドされるヌクレアーゼと適合するガイド核酸として言及され得る。
【0161】
ガイド核酸はＤＮＡであり得る。ガイド核酸はＲＮＡであり得る。ガイド核酸は、ＤＮＡとＲＮＡの両方を含む場合がある。ガイド核酸は、修飾された非自然発生のヌクレオチドを含んでもよい。ガイド核酸がＲＮＡを含む場合、ＲＮＡガイド核酸は、本明細書に開示されるように、プラスミド、線状構築物、または編集カセットなどのポリヌクレオチド分子におけるＤＮＡ塩基配列によってコードされてもよい。
【0162】
ガイド核酸はガイド配列を含む場合がある。ガイド配列は、標的配列とハイブリダイズして、複合体化された核酸でガイドされるヌクレアーゼの配列特異的結合を標的配列に向けるために、標的ポリヌクレオチド配列と十分な相補性があるポリヌクレオチド配列である。ガイド配列とその対応する標的配列の間の相補性の程度は、適切なアラインメント・アルゴリズムを使用して、最適にアラインメントしたとき、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％、またはそれらの値以上である。最適なアラインメントは、配列をアラインメントするための任意の適切なアルゴリズムを使用して求められ得る。いくつかの態様において、ガイド配列は、長さが約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５ヌクレオチド、またはそれ以上である。いくつかの態様において、ガイド配列は、長さが約７５ヌクレオチド未満、５０ヌクレオチド未満、４５ヌクレオチド未満、４０ヌクレオチド未満、３５ヌクレオチド未満、３０ヌクレオチド未満、２５ヌクレオチド未満、２０ヌクレオチド未満である。好適には、ガイド配列は、長さが１０～３０ヌクレオチドである。ガイド配列は、長さが１０～２５ヌクレオチドであり得る。ガイド配列は、長さが１０～２０ヌクレオチドであり得る。ガイド配列は、長さが１５～３０ヌクレオチドであり得る。ガイド配列は、長さが２０～３０ヌクレオチドであり得る。ガイド配列は、長さが１５～２５ヌクレオチドであり得る。ガイド配列は、長さが１５～２０ヌクレオチドであり得る。ガイド配列は、長さが２０～２５ヌクレオチドであり得る。ガイド配列は、長さが２２～２５ヌクレオチドであり得る。ガイド配列は、長さが１５ヌクレオチドであり得る。ガイド配列は、長さが１６ヌクレオチドであり得る。ガイド配列は、長さが１７ヌクレオチドであり得る。ガイド配列は、長さが１８ヌクレオチドであり得る。ガイド配列は、長さが１９ヌクレオチドであり得る。ガイド配列は、長さが２０ヌクレオチドであり得る。ガイド配列は、長さが２１ヌクレオチドであり得る。ガイド配列は、長さが２２ヌクレオチドであり得る。ガイド配列は、長さが２３ヌクレオチドであり得る。ガイド配列は、長さが２４ヌクレオチドであり得る。ガイド配列は、長さが２５ヌクレオチドであり得る。
【0163】
ガイド核酸は、スキャフォールド配列を含む場合がある。一般に、「スキャフォールド配列」は、標的化可能なヌクレアーゼ複合体の生成を促進するために十分な配列を有している任意の配列を含み、ここで標的化可能なヌクレアーゼ複合体は核酸でガイドされるヌクレアーゼとガイド核酸を含み、ガイド核酸はスキャフォールド配列とガイド配列を含む。標的化可能なヌクレアーゼ複合体の生成を促進するためのスキャフォールド配列内の十分な配列は、２次構造の形成するに関与する１つまたは２つの配列領域などの、スキャフォールド配列内の２つの配列領域の長さに沿った相補性の程度を含む場合がある。場合によっては、前記１つまたは２つの配列領域は、同じポリヌクレオチド上に含まれるか、またはコードされる。場合によっては、前記１つまたは２つの配列領域は、別個のポリヌクレオチド上に含まれるか、またはコードされる。最適なアラインメントは、任意の適切なアラインメント・アルゴリズムによって求められる場合があり、１つか２つの配列領域内の自己相補性などの、２次構造をさらに説明し得る。いくつかの態様では、最適にアラインメントされたとき２つのうちより短いものの長さに沿った、１つまたは２つの配列領域間の、相補性の程度は、約２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７．５％、９９％、またはそれら以上である。いくつかの態様では、２つの配列領域の少なくとも１つは、長さが約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、４０、５０ヌクレオチド、またはそれらの値以上である。いくつかの態様では、２つの配列領域の少なくとも１つは、長さが約１０～３０ヌクレオチドである。２つの配列領域の少なくとも１つは、長さが１０～２５ヌクレオチドであり得る。２つの配列領域の少なくとも１つは、長さが１０～２０ヌクレオチドであり得る。２つの配列領域の少なくとも１つは、長さが１５～３０ヌクレオチドであり得る。２つの配列領域の少なくとも１つは、長さが２０～３０ヌクレオチドであり得る。２つの配列領域の少なくとも１つは、長さが１５～２５ヌクレオチドであり得る。２つの配列領域の少なくとも１つは、長さが１５～２０ヌクレオチドであり得る。２つの配列領域の少なくとも１つは、長さが２０～２５ヌクレオチドであり得る。２つの配列領域の少なくとも１つは、長さが２２～２５ヌクレオチドであり得る。２つの配列領域の少なくとも１つは、長さが１５ヌクレオチドであり得る。２つの配列領域の少なくとも１つは、長さが１６ヌクレオチドであり得る。２つの配列領域の少なくとも１つは、長さが１７ヌクレオチドであり得る。２つの配列領域の少なくとも１つは、長さが１８ヌクレオチドであり得る。２つの配列領域の少なくとも１つは、長さが１９ヌクレオチドであり得る。２つの配列領域の少なくとも１つは、長さが２０ヌクレオチドであり得る。２つの配列領域の少なくとも１つは、長さが２１ヌクレオチドであり得る。２つの配列領域の少なくとも１つは、長さが２２ヌクレオチドであり得る。２つの配列領域の少なくとも１つは、長さが２３ヌクレオチドであり得る。２つの配列領域の少なくとも１つは、長さが２４ヌクレオチドであり得る。２つの配列領域の少なくとも１つは、長さが２５ヌクレオチドであり得る。
【0164】
対象ガイド核酸のスキャフォールド配列は、２次構造を含む場合がある。２次構造はシュードノット領域を含む場合がある。いくつかの例では、ガイド核酸と核酸でガイドされるヌクレアーゼの適合性は、ガイドＲＮＡのシュードノット領域に内在または隣接する配列によって、少なくとも部分的に求められる。場合によっては、核酸でガイドされるヌクレアーゼに対する、ガイド核酸の結合キネティクスは、ひとつには、スキャフォールド配列内の２次構造によって求められる。場合によっては、核酸でガイドされるヌクレアーゼに対する、ガイド核酸の結合キネティクスは、ひとつには、スキャフォールド配列を有する核酸配列によって求められる。
【0165】
本開示の態様において、用語「ガイド核酸」は、１）標的配列にハイブリダイズすることができるガイド配列、および、２）本明細書に記載されるような核酸でガイドされるヌクレアーゼと相互作用することができるか、または複合体化することができる、スキャフォールド配列を含む、ポリヌクレオチドを指す。
【0166】
ガイド核酸は、２つの要素が、１つの、標的配列を切断することができる機能的な標的化可能なヌクレアーゼ複合体を形成し得るとき、核酸でガイドされるヌクレアーゼと適合し得る。多くの場合、適合するガイド核酸に適合するスキャフォールド配列は、天然の核酸でガイドされるヌクレアーゼ遺伝子座に隣接している配列を走査することによって見つけられ得る。言いかえれば、天然の核酸でガイドされるヌクレアーゼは、対応している適合のガイド核酸またはスキャフォールド配列の近傍内のゲノム上にコードされ得る。
【0167】
核酸でガイドされるヌクレアーゼは、ヌクレアーゼの内在性ホスト内に存在しないガイド核酸に適合する場合がある。このような直交するガイド核酸は、経験的なテストによって判定することができる。直交するガイド核酸は、異なる細菌種に由来するものであっても、合成されたものであっても、あるいは、自然界に存在しないように操作されたものであってもよい。
【0168】
共通の核酸ガイドヌクレアーゼに適合する直交ガイド核酸は、１つまたは複数の共通の特徴を含んでいてもよい。共通の特徴は、シュードノット領域の外側の配列を含む場合がある。共通の特徴は、シュードノット領域を含む場合がある。共通の特徴は、一次配列または２次構造を含む場合がある。
【0169】
ガイド核酸は、ガイド配列を、ガイド配列が標的配列に相補的であるように変更することにより、所望の標的配列を標的にするように操作される場合があり、それによってガイド配列と標的配列の間のハイブリダイゼーションが可能になる。操作されたガイド核酸を有するガイド配列は、操作されたガイド核酸と呼ばれることがある。操作されたガイド核酸は、多くの場合、非自然発生で、自然界では見出されない。
【0170】
ガイドＲＮＡ分子は、配列決定するために単離するべき標的配列と塩基対となる配列を含む。いくつかの実施形態では、塩基対合は完全であり、一方、いくつかの実施形態では、塩基対合は部分的か、または対がない塩基を、非標的配列に対になる塩基と共に、含む。
【0171】
ガイドＲＮＡは、ＲＮＡ「ヘアピン」構造を形成する領域または複数の領域を含む場合がある。そのような領域または複数の領域は、回文配列を部分的にまたは完全に含み、その結果、領域の５’末端と３’端末は、二本鎖「ステム」構造を形成するように互いにハイブリダイズする場合があり、それは、いくつかの実施形態では、互いに二重鎖環の中の一本鎖の各々をテザーする非回文の環によってキャップされる。
【0172】
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡステムループなどの、ステムループを含む。ｔｒａｃｒＲＮＡステムループなどのステムループは、Ｃａｓ９ ＤＮＡエンドヌクレアーゼなどの核酸エンドヌクレアーゼと複合体化または結合し得る。代替的に、ステムループは、Ｃａｓ９以外のエンドヌクレアーゼ、または塩基除去酵素、メチルトランスフェラーゼ、または１つ以上のＤＮＡポリメラーゼ酵素を妨害する他の核酸修飾活性を有する酵素など、エンドヌクレアーゼ以外の核酸修飾酵素と複合化してもよい。
【0173】
ｔｒａｃｒＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲ／Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅシステムは、真正細菌や古細菌の原核生物が、既知の配列のウイルスに繰り返し感染することで細胞が耐性を獲得する適応免疫システムとして特定された。例えば、Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ Ｅ， Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ Ｋ， Ｓｈａｒｍａ ＣＭ， Ｇｏｎｚａｌｅｓ Ｋ， Ｃｈａｏ Ｙ， Ｐｉｒｚａｄａ ＺＡ ｅｔ ａｌ．（２０１１）”ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｒａｎｓ－ｅｎｃｏｄｅｄ ｓｍａｌｌ ＲＮＡ ａｎｄ ｈｏｓｔ ｆａｃｔｏｒ ＲＮａｓｅ ＩＩＩ” Ｎａｔｕｒｅ ４７１ （７３４０）：６０２－７．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０９８８６．ＰＭＣ ３０７０２３９．ＰＭＩＤ ２１４５５１７４；Ｔｅｒｎｓ ＭＰ， Ｔｅｒｎｓ ＲＭ （２０１１）”ＣＲＩＳＰＲ－ｂａｓｅｄ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍｓ” Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １４ （３）：３２１－７．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍｉｂ．２０１１．０３．００５．ＰＭＣ ３１１９７４７．ＰＭＩＤ ２１５３１６０７；Ｊｉｎｅｋ Ｍ， Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ Ｋ， Ｆｏｎｆａｒａ Ｉ， Ｈａｕｅｒ Ｍ， Ｄｏｕｄｎａ ＪＡ， Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ Ｅ （２０１２）”Ａ Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ｄｕａｌ－ＲＮＡ－Ｇｕｉｄｅｄ ＤＮＡ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎ Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ” Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７ （６０９６）： ８１６－２１． ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２２５８２９．ＰＭＩＤ ２２７４５２４９；および、Ｂｒｏｕｎｓ ＳＪ （２０１２）”Ａ ｓｗｉｓｓ ａｒｍｙ ｋｎｉｆｅ ｏｆ ｉｍｍｕｎｉｔｙ” Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７ （６０９６）： ８０８－９． ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２２７２５３． ＰＭＩＤ ２２９０４００２を参照されたい。当該システムは、真核細胞における標的化遺伝子突然変異誘発を導くために、順応してきた。Ｗｅｎｚｈｉ Ｊｉａｎｇ， Ｈｕａｎｂｉｎ Ｚｈｏｕ， Ｈｏｎｇｈａｏ Ｂｉ， Ｍｉｃｈａｅｌ Ｆｒｏｍｍ， Ｂｉｎｇ Ｙａｎｇ， ａｎｄ Ｄｏｎａｌｄ Ｐ． Ｗｅｅｋｓ （２０１３）”Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ， ｔｏｂａｃｃｏ， ｓｏｒｇｈｕｍ ａｎｄ ｒｉｃｅ” Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． Ｎｏｖ ２０１３； ４１（２０）： ｅ１８８， Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ （Ａｕｇ ３１， ２０１３）． ｄｏｉ： １０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｔ７８０、およびその中の参考文献を参照されたい。
【0174】
本明細書に企図されたように、ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼなどのＤＮＡエンドヌクレアーゼに配列特異性を提供するために、いくつかの実施形態において、使用される。これらの実施形態では、ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９などのエンドヌクレアーゼに結合するか、またはエンドヌクレアーゼによって結合されるヘアピン構造を含み（他のエンドヌクレアーゼは、いくつかの実施形態において、代替または追加として企図される）、および、ガイドＲＮＡは、配列決定ライブラリーまたは配列決定反応から取り除かれることになっている配列に結合するか、特異的に結合するか、排他的に結合する、認識配列をさらに含む。ガイドＲＮＡの中の認識配列の長さは、配列排除プロセスにおける所望の特異性の程度によって変化し得る。サンプル中で頻繁に生じる配列を含むか、または差動的に豊富な配列（ＡＴリッチなゲノムサンプル中でのＡＴの存在量またはＧＣリッチなゲノムサンプル中でＧＣの存在量）を含む、短い認識配列は、相対的に大きな数の部位を同定する可能性が高く、従って、エンドヌクレアーゼ活性、塩基切除、メチル化、または少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼ活性に干渉する他の活性などの、頻繁な核酸修飾を導く可能性が高い。サンプル中で希に生じる配列を含むか、または不十分に代表された塩基の組み合わせ（ＡＴリッチなゲノムサンプル中でのＧＣの存在量またはＧＣリッチなゲノムサンプル中でＡＴの存在量）を含む、長い認識配列は、相対的に小さな数の部位を同定する可能性が高く、従って、エンドヌクレアーゼ活性、塩基切除、メチル化、または少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼ活性に干渉する他の活性などの、希な核酸修飾を導く可能性が高い。従って、本明細書に開示されるように、いくつかの実施形態では、配列反応から認識配列の長さまたは内容への修飾を介して、配列除去の頻度を加減してもよい。
【0175】
ガイドＲＮＡは、本明細書に記載される開示と一致する多くの方法によって合成される。標準的な合成技術は、大きな分量のガイドＲＮＡを産生するために、および／または非常に反復的な標的領域のために、使用されてもよく、そのことは、多くの不要な遺伝子座を標的とするほんの少数のガイドＲＮＡ分子だけを必要とし得る。二本鎖ＤＮＡ分子は、ＲＮＡ部位特異的結合配列、Ｃａｓ９タンパク質のガイドＲＮＡ配列、およびＴ７プロモーター部位を含み得る。場合によっては、二本鎖ＤＮＡ分子は、約１００ｂｐ以下の長さであり得る。Ｔ７ポリメラーゼは、Ｃａｓ９タンパク質のための標的ＲＮＡ配列とガイドＲＮＡ配列を含み得る、一本鎖ＲＮＡ分子を作製するために使用することができる。
【0176】
ガイドＲＮＡ配列は、数多くの方法によって設計され得る。例えば、いくつかの実施形態では、ヒトゲノムの非遺伝的な繰り返し配列は、例えば、１００ｂｐのスライディングウィンドウに分割される。二本鎖ＤＮＡ分子は、フォトリソグラフィーを使用して、マイクロアレイ上で並列に合成することができる。
【0177】
ウィンドウは、サイズにおいて変化する場合がある。３０量体の標的配列は、標的設計配列の５’端末側方Ｎ－Ｇ－Ｇの短いトリヌクレオチド・プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を用いて設計することができ、それは場合により、切断を容易にする。とりわけ、全体が参照によって本明細書に組み込まれる、Ｇｉｅｄｒｉｕｓ Ｇａｓｉｕｎａｓ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）“Ｃａｓ９－ｃｒＲＮＡ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ ｆｏｒ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａ” Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． Ｓｅｐ ２５， １０９（３９）： Ｅ２５７９－Ｅ２５８６、を参照されたい。冗長な配列は除去することができ、および、残りの配列は、ｒｅｆｓｅｑ、ＥＮＳＥＭＢＬに対するハイブリダイゼーションを回避するために、ヒトゲノムに対してサーチエンジン（例えば、ＢＬＡＳＴ）を使用して、およびこれらの部位でヌクレアーゼ活性を回避するために、他の遺伝子データベースを使用して、解析することができる。ガイドＲＮＡ標的配列にユニバーサルＣａｓ９トレーサーＲＮＡ配列を付加し、Ｔ７プロモーターでフランキングすることができる。Ｔ７プロモーター部位上流の配列は、合成することができる。ヒトゲノムの標的領域は繰り返しが多いため、多くの実施形態では、相対的に少数のガイドＲＮＡ分子が、ＮＧＳライブラリー分子のより大きな割合を消化することになる。
【0178】
タンパク質のコードする遺伝子のわずか約５０％がＮＧＧ ＰＡＭ（フォトスペーサ隣接モチーフ）配列を含むエクソンを有すると推定されるが、Ｃａｓ９切断システムで標的とすることができるゲノムの割合を増加させるために、複数の戦略が本明細書に提供される。例えば、ＤＮＡ領域でＰＡＭ配列が利用可能でない場合、ＰＡＭ配列からなるヘルパーＤＮＡと結合したガイドＲＮＡを用いた組み合わせ戦略により、ＰＡＭ配列を導入することができる。ヘルパーＤＮＡは、合成のもの、および／または単鎖のものであり得る。ヘルパーＤＮＡのＰＡＭ配列は、ＮＧＳライブラリーのｇＤＮＡノックアウトターゲットと相補的ではないと考えられ、従って、標的ＮＧＳライブラリーテンプレートには結合しないかもしれないが、ガイドＲＮＡには結合し得る。ガイドＲＮＡは、ターゲット配列とＰＡＭ配列からなるヘルパーＤＮＡの両方にハイブリダイズして、Ｃａｓ９システムによって認識されるハイブリッドＤＮＡ：ＲＮＡ：ＤＮＡ複合体を形成するように設計することができる。
【0179】
ＰＡＭ配列は、単鎖のオーバーハングまたはヘアピンとして表現される場合がある。ヘアピンは、場合により、任意選択的に劣化される場合がある、修飾されたヌクレオチドを含み得る。例えば、ヘアピンはウラシルを含むことができ、これはウラシルＤＮＡグリコシラーゼによって分解され得る。
【0180】
ＰＡＭ配列を含むＤＮＡの使用の代替として、ＰＡＭ配列の必要のない修飾されたＣａｓ９タンパク質またはＰＡＭ配列へのより低い感度を有する修飾されたＣａｓ９は、ヘルパーＤＮＡ塩基配列を必要とせずに、使用されてもよい。
【0181】
さらなる場合では、Ｃａｓ９の認識に用いるガイドＲＮＡの配列は、複数の部位を緊密に切断するためのデュアルカッティングシステムとして機能させるために、１つの末端で長くされ得、および反転され得る。ガイドＲＮＡ配列は、ＮＧＳ ＤＮＡライブラリー標的上で２つの切断を作り出すことができる。このことは、制限された距離内の鎖を交互にするための単一のガイドＲＮＡを設計することにより、達成され得る。ガイドＲＮＡの一端は二本鎖ＤＮＡライブラリーの順鎖に結合し得、および他端は逆鎖に結合し得る。ガイドＲＮＡの各末端は、ＰＡＭ配列とＣａｓ９結合ドメインを含み得る。このことは、所定の距離だけ離れた同じＤＮＡ塩基配列由来のＮＧＳライブラリー分子の２重の二本鎖切断をもたらし得る。いくつかの実施形態は、ガイドＲＮＡ分子の生成に関する。ガイドＲＮＡ分子は、場合によっては、ＤＮＡ鋳型から転写される。Ｔ７ポリメラーゼ、ＲＮＡ ＰｏｌＩ、ＲＮＡ ＰｏｌＩＩ、ＲＮＡ ＰｏｌＩＩＩ、オルガネラＲＮＡポリメラーゼ、ウイルスＲＮＡポリメラーゼ、真正細菌、または古細菌ポリメラーゼなど、多くのＲＮＡポリメラーゼが使用され得る。場合によっては、ポリメラーゼはＴ７である。
【0182】
ガイドＲＮＡ生成テンプレートは、Ｔ７ポリメラーゼ、ＲＮＡ ＰｏｌＩ、ＲＮＡ ＰｏｌＩＩ、ＲＮＡ ＰｏｌＩＩＩ、オルガネラＲＮＡポリメラーゼ、ウイルス性ＲＮＡポリメラーゼ、真正細菌、または古細菌ポリメラーゼによって方向づけられる転写に適合したプロモーターなどの、プロモーターを含む。場合によっては、プロモーターはＴ７プロモーターである。
【0183】
ガイドＲＮＡ鋳型は、場合により、タグ配列をコードする。タグ配列は、メチラーゼ、塩基除去酵素、エンドヌクレアーゼなどの核酸修飾酵素に結合する。非標的部位に結合されたより大きなガイドＲＮＡ分子のコンテキストにおいて、タグ配列は、核酸の非標的領域に酵素を結びつけ（ｔｅｔｈｅｒ）、非標的部位に活性を向ける。例示的な、結びつけられる酵素（ｔｅｔｈｅｒｅｄ ｅｎｚｙｍｅ）は、Ｃａｓ９などのエンドヌクレアーゼである。
【0184】
ガイドＲＮＡテンプレートは、リボソームＲＮＡ配列、グロビン蛋白質をコードする配列、トランスポゾンをコードする配列、レトロウイルス配列をコードする配列、テロメア配列を含む配列、サブテロメア反復を含む配列、セントロメア配列を含む配列、イントロン配列を含む配列、Ａｌｕ反復を含む配列、ＳＩＮＥ反復を含む配列、ＬＩＮＥ反復を含む配列、二核酸反復を含む配列、三核酸反復を含む配列、四核酸反復を含む配列、ポリＡ反復を含む配列、ポリＴ反復を含む配列、ポリＣ反復を含む配列、ポリＧ反復を含む配列、ＡＴリッチな配列を含む配列、またはＧＣリッチな配列を含む配列に対応する核酸と相補的である。
【0185】
多くの場合において、タグ配列は、部分的または全体のステムループ構造などの、ステムループを含む。ステムループ構造の「ステム」は、場合によっては回文配列でコードされ、完全なものか、ステムに少なくとも１つの「キンク（ｋｉｎｋ）」またはターンを導入するために中断されたものかのいずれかである。ステムループ構造の「ループ」は、ほとんどの場合、ステム塩基のペアリングには関与しない。場合によっては、ステムループは、本明細書に組み込まれた参考文献に開示されたｔｒａｃｒ配列などの、ｔｒａｃｒ配列によってコードされる。いくつかのステムループは、例えば、Ｃａｓ９または他のエンドヌクレアーゼを結合する。
【0186】
ガイドＲＮＡ分子は、認識配列をさらに含む。認識配列は、核酸ライブラリー配列セットから除去されるべき非標的配列に対して、完全または不完全に逆相補的である。ＲＮＡは、ＤＮＡ－ＤＮＡハイブリッドでは生じない塩基対の組み合わせ（例えば、Ｇ：Ｕの塩基対）でハイブリッドすることができるため、結合するために、認識配列が非標的配列の正確な逆相補配列である必要はない。加えて、完全な塩基対合からの微小摂動は、場合により、許容される。
【実施例】
【0187】
以下の例は、本発明の様々な実施形態を例証する目的で与えられ、いかなるやり方でも本発明を制限することを意図していない。本実施例は、本明細書に記載される方法と共に、好ましい実施形態を現時点において代表するものであり、典型的なものであるが、本発明の範囲を制限する意図はない。それらにおける変更、および特許請求の範囲により定義されるような本発明の趣旨に含まれる他の用途を、当業者は見出すだろう。
【0188】
実施例１：Ｂ反応におけるＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９を用いた標的化配列決定
アダプター配列を持たないバーコード付きランダムプライマーを用いて、プライマー伸長反応を行なう。プライマー伸長生成物は、ビオチンｄｄＮＴＰで終止され、ストレプトアビジン・ビーズに結合される。ランダムＢプライマーは、相補鎖を生成するために使用される。関心の特異的な遺伝子座を標的とするように設計されたＣａｓ９－ガイドＲＮＡ複合体を、前記ストレプトアビジン・ビーズに結合されたＤＮＡに付加する。Ｃａｓ９－ガイドＲＮＡ複合体は、標的部位にてＤＮＡを切断する。放出されたＤＮＡを、新しい管に移す。アダプターライゲーションを伴う任意のＮＧＳライブラリー調製プロトコルを、配列決定のためのＤＮＡを調製するために使用する。この例は、図１に例示される。
アダプター配列を持たないバーコード付きランダムプライマーを用いて、プライマー伸長反応を行なう。プライマー伸長生成物は、ビオチンｄｄＮＴＰで終止され、ストレプトアビジン・ビーズに結合される。ランダムＢプライマーは、相補鎖を生成するために使用される。関心の特異的な遺伝子座を標的とするように設計されたＣａｓ９－ガイドＲＮＡ複合体を、前記ストレプトアビジン・ビーズに結合されたＤＮＡに付加する。Ｃａｓ９－ガイドＲＮＡ複合体は、標的部位にてＤＮＡを切断する。放出されたＤＮＡを、新しい管に移す。アダプターライゲーションを伴う任意のＮＧＳライブラリー調製プロトコルを、配列決定のためのＤＮＡを調製するために使用する。この例は、図１に例示される。
【0189】
ロングリード配列決定が使用される場合、アダプターは、精製された生成物上に直接ライゲーションされる。ショートリード配列決定が使用される場合、サンプルは、断片化され、ポリアデニル化され、ライゲーションされ、または、タグ付けが使用される。これらの３つの選択肢は、図４に示される。
【0190】
まだビーズに結合されている間に（つまり、ＣＲＩＳＰＲ反応が起こる前）、サンプルにアダプター／バーコードをライゲーションする。タグ付けやライゲーションによる切断の後、２つ目のアダプター／バーコードを付加する。このことは、図５に例示される。
【0191】
【0192】
実施例２：ＣＯＶＩＤ－１９の標的化配列決定
患者サンプルから全ＲＮＡを取得し、逆転写酵素を用いて逆転写し、ビオチン化ジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）で終止されたｃＤＮＡを作り、ストレプトアビジン磁気ビーズで捕捉する。第２鎖はビーズ上に合成される。ＨＣｏＶ－２ゲノムに特異的なＣＲＩＳＰＲ複合体は、サンプル中でＣＯＶＩＤ－１９核酸を標的とする。バックグラウンド核酸は、磁石を使ってサンプルから除去され、精製されたＨＣｏＶ２核酸分子は、Ｎｅｘｔｅｒｒａを使って配列決定のために調製される。この例は、図２に例示される。
患者サンプルから全ＲＮＡを取得し、逆転写酵素を用いて逆転写し、ビオチン化ジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）で終止されたｃＤＮＡを作り、ストレプトアビジン磁気ビーズで捕捉する。第２鎖はビーズ上に合成される。ＨＣｏＶ－２ゲノムに特異的なＣＲＩＳＰＲ複合体は、サンプル中でＣＯＶＩＤ－１９核酸を標的とする。バックグラウンド核酸は、磁石を使ってサンプルから除去され、精製されたＨＣｏＶ２核酸分子は、Ｎｅｘｔｅｒｒａを使って配列決定のために調製される。この例は、図２に例示される。
【0193】
実施例３：大腸菌ゲノムの標的化配列決定
大腸菌ゲノムＤＮＡを含む生体試料を得た。Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプターを含まないバーコード付きランダムプライマーを用いてＡプライマー伸長反応を行なった。ストレプトアビジン磁気ビーズでプライマー伸長分子を捕捉した。非特異的に結合されたＤＮＡ分子を除去するために、ビーズを３回洗浄した。相補鎖を作製するために、Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプターを含まないバーコード付きランダムプライマーを用いてプライマー伸長反応を行なった。非特異的に結合されたＤＮＡ分子を除去するために、前記ビーズを３回洗浄した。ビーズを、１ＸＣａｓ９緩衝剤において再懸濁した。事前に複合体化されたＣａｓ９：ｓｇＲＮＡをストレプトアビジン・ビーズに加えた（ｓｇＲＮＡプールは、関心の大腸菌遺伝子座すべてを標的とするガイドＲＮＡを含む）。Ｃａｓ９に媒介された部位特異的切断が起こるまで、反応物を３７℃で３０～６０分インキュベートした。切り取られた分子は、もはやビーズに結合されない。チューブを磁気スタンドに置き、上澄みを新しいチューブに移した。新しいチューブを磁気スタンドに戻し、上澄みを新しいチューブに移し、残留ビーズを取り除いた。ＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＩＩ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔの試薬を用いて、標準的なエンドリペア、リン酸化、Ａテーリング反応を行なった（ＮＥＢのプロトコルを使用）。ＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＩＩ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔの試薬を用いて、Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプターライゲーションを行なった（ＮＥＢのプロトコルを使用）。０．９Ｘ Ａｍｐｕｒｅビーズのクリーンアップを行った（ＮＥＢのプロトコルを使用）。ＰＣＲ増幅は全長のＩｌｌｕｍｉｎａ Ｐ５およびＰ７プライマーを用いて行った（ＮＥＢのプロトコルを使用）。最終的なＡｍｐｕｒｅビーズのクリーンアップを行った（ＮＥＢのプロトコルを使用）。精製した増幅産物の塩基配列を決定した。この実験からのデータを図３に示す。
大腸菌ゲノムＤＮＡを含む生体試料を得た。Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプターを含まないバーコード付きランダムプライマーを用いてＡプライマー伸長反応を行なった。ストレプトアビジン磁気ビーズでプライマー伸長分子を捕捉した。非特異的に結合されたＤＮＡ分子を除去するために、ビーズを３回洗浄した。相補鎖を作製するために、Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプターを含まないバーコード付きランダムプライマーを用いてプライマー伸長反応を行なった。非特異的に結合されたＤＮＡ分子を除去するために、前記ビーズを３回洗浄した。ビーズを、１ＸＣａｓ９緩衝剤において再懸濁した。事前に複合体化されたＣａｓ９：ｓｇＲＮＡをストレプトアビジン・ビーズに加えた（ｓｇＲＮＡプールは、関心の大腸菌遺伝子座すべてを標的とするガイドＲＮＡを含む）。Ｃａｓ９に媒介された部位特異的切断が起こるまで、反応物を３７℃で３０～６０分インキュベートした。切り取られた分子は、もはやビーズに結合されない。チューブを磁気スタンドに置き、上澄みを新しいチューブに移した。新しいチューブを磁気スタンドに戻し、上澄みを新しいチューブに移し、残留ビーズを取り除いた。ＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＩＩ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔの試薬を用いて、標準的なエンドリペア、リン酸化、Ａテーリング反応を行なった（ＮＥＢのプロトコルを使用）。ＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＩＩ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔの試薬を用いて、Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプターライゲーションを行なった（ＮＥＢのプロトコルを使用）。０．９Ｘ Ａｍｐｕｒｅビーズのクリーンアップを行った（ＮＥＢのプロトコルを使用）。ＰＣＲ増幅は全長のＩｌｌｕｍｉｎａ Ｐ５およびＰ７プライマーを用いて行った（ＮＥＢのプロトコルを使用）。最終的なＡｍｐｕｒｅビーズのクリーンアップを行った（ＮＥＢのプロトコルを使用）。精製した増幅産物の塩基配列を決定した。この実験からのデータを図３に示す。
【0194】
本発明の好ましい実施形態が本明細書において示され、かつ記載されているが、こうした実施形態はほんの一例として提供されているに過ぎないということが当業者にとって明白である。多くの変更、変化、および置換が、本発明から逸脱することなく、当業者の心に思い浮かぶであろう。本明細書に記載されるの実施形態の様々な代案が、利用され得ることを理解されたい。以下の請求項は本発明の範囲を定義するものであり、この請求項とその均等物の範囲内の方法、および構造体がそれによって包含されるものであるということが意図されている。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【国際調査報告】