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▶ イーエムベーアー−インスティテュート フュール モレクラレ バイオテクロノジー ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツングの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-05-15
(54)【発明の名称】ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡの内部標準
(51)【国際特許分類】
C12N 15/11 20060101AFI20230508BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20230508BHJP
C12N 15/54 20060101ALI20230508BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20230508BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230508BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230508BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230508BHJP
【ＦＩ】
C12N15/11 Z ZNA
C12N15/09 110
C12N15/54
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022548213
(86)(22)【出願日】2021-03-30
(85)【翻訳文提出日】2022-08-08
(86)【国際出願番号】 EP2021058255
(87)【国際公開番号】W WO2021198233
(87)【国際公開日】2021-10-07
(31)【優先権主張番号】20166567.6
(32)【優先日】2020-03-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】513048519
【氏名又は名称】イーエムベーアー－インスティテュート フュール モレクラレ バイオテクノロジー ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 達則
(72)【発明者】
【氏名】ウルリヒ エリング
(72)【発明者】
【氏名】アンニカ セル
(72)【発明者】
【氏名】エスタ セー．ホー．ウイデボール
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA91X
4B065AB01
4B065AC12
4B065AC20
4B065BA02
4B065CA46
(57)【要約】
本発明は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をコードする配列を含む核酸と、このようなｓｇＲＮＡの使用方法、トランスジェニック細胞、及びキットを提供する。ｓｇＲＮＡ配列は、リコンビナーゼ認識部位の第１の対によってフランキングされたガイド破壊配列によって中断され、ｓｇＲＮＡ配列は、リコンビナーゼ認識部位の第１の対とは異なるリコンビナーゼ認識配列を有するリコンビナーゼ認識部位の第２の対をさらに含み、ガイド破壊配列は、リコンビナーゼ認識部位の第２の対によってフランキングされておらず、及び第１及び第２のリコンビナーゼ認識部位によってフランキングされた配列は重複している。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をコードする配列を含む核酸であって、ｓｇＲＮＡ配列は、リコンビナーゼ認識部位の第１の対によってフランキングされたガイド破壊配列によって中断され、及びｓｇＲＮＡ配列は、リコンビナーゼ認識部位の第１の対とは異なるリコンビナーゼ認識配列を有するリコンビナーゼ認識部位の第２の対をさらに含み、ガイド破壊配列は、リコンビナーゼ認識部位の第２の対によってフランキングされておらず、及び／又はリコンビナーゼ認識部位の第２の対は、活性ｓｇＲＮＡを形成するために必要なｓｇＲＮＡの一部をフランキングしており、そして第１及び第２のリコンビナーゼ認識部位によってフランキングされた配列は重複している、上記核酸。
【請求項2】
前記第２のリコンビナーゼ認識部位の対の１つのリコンビナーゼ認識部位が、リコンビナーゼ認識部位の第１の対の間に位置し、好ましくはガイド破壊配列の下流に位置し、及び第２のリコンビナーゼ認識部位の対の別のリコンビナーゼ認識部位が、リコンビナーゼ認識部位の第１の対の下流に位置する、請求項１に記載の核酸。
【請求項3】
前記第１のリコンビナーゼ認識部位の１つが、ｓｇＲＮＡ配列のループ領域内に位置し、好ましくはｓｇＲＮＡ配列がｃｒＲＮＡ部分及びｔｒａｃｒＲＮＡ部分を含み、及び第１のリコンビナーゼ認識部位の１つが、ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡリンカーループ内に位置する、請求項１又は２に記載の核酸。
【請求項4】
前記ガイド破壊配列が転写破壊配列を含むか、又は活性ｓｇＲＮＡ折り畳みへの折り畳みを防止するのに十分な長さを有する、請求項１～３のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項5】
リコンビナーゼ認識部位の前記第１及び第２の対が同じリコンビナーゼ酵素によって活性化され、好ましくはこれらがｌｏｘ部位から、さらに好ましくはｌｏｘＰ、ｌｏｘ５１１、ｌｏｘ５１７１、ｌｏｘ２２７２、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ７、Ｍ１１、ｌｏｘ７１、ｌｏｘ６６から独立して選択される、請求項１～４のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項6】
好ましくはリコンビナーゼ認識部位の対の間、特に好ましくはリコンビナーゼ認識部位の第１及び第２の対の両方の間に位置する選択マーカー配列、好ましくは抗生物質選択マーカー配列をさらに含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項7】
リコンビナーゼ刺激時にＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのｓｇＲＮＡを発現させる方法であって、この方法は、Ａ）複数の細胞に請求項１～６のいずれか１項に記載の複数の核酸を提供すること、
Ｂ）第１及び第２のリコンビナーゼ認識部位の対を活性化することができる細胞内で、１種以上のリコンビナーゼを導入するか又は活性化すること、を含み、
Ｃ）ここで、第１のリコンビナーゼ認識部位の対及び第２のリコンビナーゼ認識部位の対の活性化は競合反応であり、第１のリコンビナーゼ認識部位の対の活性化は活性ｓｇＲＮＡの発現をもたらし、及び第２のリコンビナーゼ認識部位の対の活性化はｓｇＲＮＡ配列を不活性化する、上記方法。
【請求項8】
前記複数の細胞が、細胞毎に、請求項１～６に記載の核酸の単一のコピーを有する、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記細胞が工程Ａ）の後でかつ工程Ｂ）の前に増殖される請求項７又は８に記載の方法であって、好ましくは前記細胞は、請求項１～６のいずれか１項に記載の複数の核酸中の異なるｓｇＲＮＡ配列の数当たり少なくとも２５０個の細胞の数まで増殖される、上記方法。
【請求項10】
前記ｓｇＲＮＡ配列の存在を検出するためにｓｇＲＮＡ配列の不活性部分を有する細胞が同定される、請求項７～９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
前記細胞が、トランスジェニック癌遺伝子をさらに発現するか、又は抑制された腫瘍抑制遺伝子を有する請求項７～１０のいずれか１項に記載の方法であって、前記方法は、工程Ｃ）における活性化のない細胞と比較して、工程Ｃ）における活性化後の腫瘍形成の差異を過剰に提供し、これにより腫瘍形成中にｓｇＲＮＡが標的とする遺伝子の役割についてスクリーニングするか、又は前記細胞が候補化合物を用いてさらに処理されることをさらに含み、
前記方法は、工程Ｃ）における活性化のない細胞と比較して、工程Ｃ）における活性化後の細胞活性又は形態の差異を過剰に提供し、これにより候補化合物の影響下にあるｓｇＲＮＡが標的とする遺伝子の活性についてスクリーニングすることをさらに含む、上記方法。
【請求項12】
請求項１～６のいずれか１項に記載の核酸が、固有の分子識別子（ＵＭＩ）配列を含み、前記ＵＭＩは異なる細胞中の同じｓｇＲＮＡを同定するために使用される、請求項７～１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項13】
前記細胞が、リコンビナーゼ、好ましくはＣｒｅの発現のための核酸配列を含み、リコンビナーゼの発現のための前記核酸が好ましくは選択マーカーも含む、請求項７～１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項14】
請求項１～６のいずれか１項に記載の核酸を含む細胞。
【請求項15】
ｉ）請求項１～６のいずれか１項に記載の核酸、及びｉｉ）請求項１～６のいずれか１項に記載の核酸の両方のリコンビナーゼ認識部位の対を活性化することができる１種以上のリコンビナーゼの発現のための１種以上の核酸、を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムとその手段を使用するＤＮＡ編集の分野に関する。
【背景技術】
【0002】
ＣＲＩＳＰＲスクリーニングは、様々なアッセイでゲノムを機能的に調べるための主要な方法になっている。ポジティブ選択スクリーンでは、細胞集団におけるｓｇＲＮＡの濃縮を調べて、ノックアウト時に細胞の生存を促進する遺伝子を特定する。一方ネガティブ選択スクリーニングでは、対応する遺伝子のノックアウトにより細胞死が生じるため、特定のｓｇＲＮＡは細胞集団から欠失させる（Miles et al. FEBS J. 283, 2016: 3170-3180）。これらのスクリーンは、必須遺伝子群（essentialome）スクリーンとも呼ばれる。そうするために、細菌のエンドヌクレアーゼＣａｓ９を発現する細胞株はｓｇＲＮＡライブラリーを形質導入されて、遺伝子の機能変異の喪失を誘導する。ｓｇＲＮＡは、２０ｂｐの遺伝子特異的ストレッチとＣａｓ酵素をｓｇＲＮＡ配列に相補的なゲノム遺伝子座に導く３’足場とからなる短いＲＮＡである。結合すると、Ｃａｓは遺伝的又は調節的変化を引き起こす。
【0003】
遺伝子機能の優れた評価のためには、複数の独立した細胞に特定のｓｇＲＮＡを形質導入して、細胞の不均一性と様々な編集結果を説明する必要がある。プールされた遺伝子スクリーンでは、独立して標的とされる細胞の数は、通常３００～１，０００細胞／ｓｇＲＮＡ以上に維持される。従って、各遺伝子がゲノム全体（２０，０００遺伝子）のスクリーニングアプローチで５つのｓｇＲＮＡを用いて標的にされる場合、これは実験全体で最小スクリーンサイズが３００×５×２０，０００＝３，０００万個の細胞になる。例えば、Wang et al. (Science 343, 2014: 80-84) は、７３，０００のｓｇＲＮＡを使用して９，０００万個の標的細胞を形質導入する、すなわち１，２３３細胞／ｓｇＲＮＡの大規模なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓスクリーンを記載している。５～１０ｓｇＲＮＡ／遺伝子が推奨される。このようなスクリーンでは本質的に、多数の生存活性の高い不死化細胞を用いて作業する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
多数の細胞というこの要件は、不均一な増殖を有する初代細胞株、限られたサイズのオルガノイド、及びインビボスクリーンなどのいくつかの実験では、対応することが難しい。従って、スクリーンにおいて必要な細胞の数を減らし、かつ細胞増殖のボトルネックを克服することができる堅牢な方法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明の要約
本発明は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をコードする配列を含む核酸を提供し、ｓｇＲＮＡ配列は、リコンビナーゼ認識部位の第１の対によってフランキングされたガイド破壊配列によって中断され、及びｓｇＲＮＡ配列は、リコンビナーゼ認識部位の第１の対とは異なるリコンビナーゼ認識配列を有するリコンビナーゼ認識部位の第２の対をさらに含み、ガイド破壊配列は、リコンビナーゼ認識部位の第２の対によってフランキングされておらず、及び／又はリコンビナーゼ認識部位の第２の対は、活性ｓｇＲＮＡを形成するために必要なｓｇＲＮＡの一部をフランキングしており、そして、第１及び第２のリコンビナーゼ認識部位によってフランキングされた配列は重複している。
本発明は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をコードする配列を含む核酸を提供し、ｓｇＲＮＡ配列は、リコンビナーゼ認識部位の第１の対によってフランキングされたガイド破壊配列によって中断され、及びｓｇＲＮＡ配列は、リコンビナーゼ認識部位の第１の対とは異なるリコンビナーゼ認識配列を有するリコンビナーゼ認識部位の第２の対をさらに含み、ガイド破壊配列は、リコンビナーゼ認識部位の第２の対によってフランキングされておらず、及び／又はリコンビナーゼ認識部位の第２の対は、活性ｓｇＲＮＡを形成するために必要なｓｇＲＮＡの一部をフランキングしており、そして、第１及び第２のリコンビナーゼ認識部位によってフランキングされた配列は重複している。
【0006】
これに関連して、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をコードする配列を含む核酸を提供し、ここで、ｓｇＲＮＡ配列は、リコンビナーゼ認識部位の第１の対によってフランキングされたガイド破壊配列によって中断され、及びｓｇＲＮＡ配列は、リコンビナーゼ認識部位の第１の対とは異なるリコンビナーゼ認識配列を有するリコンビナーゼ認識部位の第２の対をさらに含み、第２のリコンビナーゼ認識部位の対の１つのリコンビナーゼ認識部位は、リコンビナーゼ認識部位の第１の対の間に位置し、及び任意選択的にガイド破壊配列の下流に位置し、及び第２のリコンビナーゼ認識部位の対の別のリコンビナーゼ認識部位は、リコンビナーゼ認識部位の第１の対の下流に位置する。
【0007】
本発明はさらに、リコンビナーゼ刺激時にＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのｓｇＲＮＡを発現させる方法を提供し、この方法は、Ａ）複数の細胞に本発明の複数のｓｇＲＮＡコード核酸を提供し、Ｂ）第１及び第２のリコンビナーゼ認識部位の対を活性化することができる細胞内で、１種以上のリコンビナーゼを導入するか又は活性化すること、を含み、Ｃ）ここで、第１のリコンビナーゼ認識部位の対及び第２のリコンビナーゼ認識部位の対の活性化は競合反応であり、第１のリコンビナーゼ認識部位の対の活性化は活性ｓｇＲＮＡの発現をもたらし、及び第２のリコンビナーゼ認識部位の対の活性化はｓｇＲＮＡ配列を不活性化する。
【0008】
さらに、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をコードする配列を含む核酸を含む細胞が提供される。さらに、ｉ）ｓｇＲＮＡをコードする核酸と、ｉｉ）ｓｇＲＮＡコード核酸のリコンビナーゼ認識部位の対を活性化するリコンビナーゼの発現のための核酸とを、含むキットが提供される。
【0009】
本発明の全ての実施態様は、以下の詳細な説明に一緒に記載され、全ての好適な実施態様は、全ての実施態様、態様、核酸、方法、細胞、及びキットに同様に関連する。例えば核酸、細胞、及びキット自体の記載は、本発明の方法で使用される核酸及び手段にも適用される。本発明の方法の好適かつ詳細な説明は、本発明の核酸、細胞、キット、又は発現されたｓｇＲＮＡのような生成物一般の適合性及び要件に同様に適用される。特に他に明記しない限り、全ての実施態様を互いに組み合わせることができる。
【発明を実施するための形態】
【0010】
発明の詳細な説明
高分解能のインビボＣＲＩＳＰＲ法の主な課題は、複数の独立した細胞における各ｓｇＲＮＡの表示である（Miles et al.、前出）。理想的には、遺伝子は複数のｓｇＲＮＡ、５～１０のｓｇＲＮＡ／遺伝子によって標的化され、各ｓｇＲＮＡは３００～１，０００個の細胞に表示される。このいわゆるライブラリーの複雑さは、インビトロで不死化された細胞株では簡単に達成及び維持できる。しかし、この複雑さを初代細胞又はインビボで実現することははるかに困難であり、従ってゲノム全体のライブラリーではこれまでのところ不可能である。さらに、システムから多数の細胞を除去する選択工程などの増殖のボトルネックは、複雑さの損失を引き起こし、従ってｓｇＲＮＡの表示の減少又は喪失によりスクリーン品質が低下する。表示のさらなるボトルネックには、次のものが含まれる：ｉ）感染効率：どれだけのｓｇＲＮＡが独立した細胞に正常に形質導入されるか。他の細胞よりも感染が困難な細胞がある。非効率的なｓｇＲＮＡ感染は、スクリーニングが開始される前に、クローンの増殖とライブラリーの多くのｓｇＲＮＡの喪失につながる。ｉｉ）細胞の利用可用性：ライブラリーの複雑さを高めるために拡張できる細胞の量。一部の細胞株は増殖能力が限られているため、実際のスクリーニングの前に十分なｓｇＲＮＡを表示すること、及びスクリーニング中に維持することは困難である。ｉｉｉ）生着：インビボで注入後に生存する形質導入された（例えば腫瘍）細胞の量は細胞注入の場所にも依存する。どの細胞が生着するかに依存して、限られた量のｓｇＲＮＡのみが表示される。ｉｖ）分化：集団内の他の細胞の代わりに特定の細胞が分化する偏り。これらの要因はまとめて、生物活性とは無関係に、インビボ実験でｓｇＲＮＡ表示の非常に広く確率的な広がりに寄与する。従って、絶対的表示は、特定のｓｇＲＮＡによって誘導される表現型の有用な予測因子ではなく、スクリーン結果の検証が不十分になる。
高分解能のインビボＣＲＩＳＰＲ法の主な課題は、複数の独立した細胞における各ｓｇＲＮＡの表示である（Miles et al.、前出）。理想的には、遺伝子は複数のｓｇＲＮＡ、５～１０のｓｇＲＮＡ／遺伝子によって標的化され、各ｓｇＲＮＡは３００～１，０００個の細胞に表示される。このいわゆるライブラリーの複雑さは、インビトロで不死化された細胞株では簡単に達成及び維持できる。しかし、この複雑さを初代細胞又はインビボで実現することははるかに困難であり、従ってゲノム全体のライブラリーではこれまでのところ不可能である。さらに、システムから多数の細胞を除去する選択工程などの増殖のボトルネックは、複雑さの損失を引き起こし、従ってｓｇＲＮＡの表示の減少又は喪失によりスクリーン品質が低下する。表示のさらなるボトルネックには、次のものが含まれる：ｉ）感染効率：どれだけのｓｇＲＮＡが独立した細胞に正常に形質導入されるか。他の細胞よりも感染が困難な細胞がある。非効率的なｓｇＲＮＡ感染は、スクリーニングが開始される前に、クローンの増殖とライブラリーの多くのｓｇＲＮＡの喪失につながる。ｉｉ）細胞の利用可用性：ライブラリーの複雑さを高めるために拡張できる細胞の量。一部の細胞株は増殖能力が限られているため、実際のスクリーニングの前に十分なｓｇＲＮＡを表示すること、及びスクリーニング中に維持することは困難である。ｉｉｉ）生着：インビボで注入後に生存する形質導入された（例えば腫瘍）細胞の量は細胞注入の場所にも依存する。どの細胞が生着するかに依存して、限られた量のｓｇＲＮＡのみが表示される。ｉｖ）分化：集団内の他の細胞の代わりに特定の細胞が分化する偏り。これらの要因はまとめて、生物活性とは無関係に、インビボ実験でｓｇＲＮＡ表示の非常に広く確率的な広がりに寄与する。従って、絶対的表示は、特定のｓｇＲＮＡによって誘導される表現型の有用な予測因子ではなく、スクリーン結果の検証が不十分になる。
【0011】
これらのボトルネックに加えて、細胞の不均一性も、混乱を招き、時には矛盾するスクリーニング結果をもたらす上で極めて重要な役割を果たす。細胞集団内には、生存能力の利点を獲得した細胞がしばしば存在するが、リポーターの追加又は免疫蛍光アッセイにより、遺伝子編集後にも発生する可能性もある。
【0012】
本発明は、トランスフェクションの時点での必要な細胞の数、又はボトルネックでの生き残っている細胞の数を減らすことができるＣＲＩＳＰＲシステムを提供する。本発明の方法は、ｓｇＲＮＡの確率的活性化又は不活性化に基づいており、それにより、細胞集団において活性化及び不活性化の両方のｓｇＲＮＡを作成する。不活化されたｓｇＲＮＡは、活性化されたｓｇＲＮＡの対照として機能することができ、その逆も真である。重要なのは、活性化と不活性化の時間を制御することができ（通常はそのようなボトルネックの後に行われる）、それにより、例えば細胞数が増殖段階で回復された時のように、試験ｓｇＲＮＡ種と同じ時点で対照の作成が可能になり、こうしてボトルネック又は細胞の不均一性の影響を回避する。
【0013】
確率的活性に基づいて、本発明の方法はまた、ＣＲＩＳＰＲ－ＳｔＡＲ（組換えによる確率的活性化）とも呼ばれる。組換えシステムを使用することにより、ｓｇＲＮＡを活性又は不活性状態で発現させることが可能である。リコンビナーゼ認識部位の２つの異なる対又はセットでの代替的組換えにより、活性化又は不活性化のいずれかが起こり、細胞集団内で内部対照（例えば、通常は不活性ｓｇＲＮＡ）が生成される（図３）。
【0014】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）のそのような条件付き発現のために、本発明は、ｓｇＲＮＡ配列をコードする配列を含む、発現カセットなどの核酸を提供する。ｓｇＲＮＡ内には、本発明の活性化又は不活性化を可能にするリコンビナーゼ認識部位が配置されている。ｓｇＲＮＡのリコンビナーゼ認識部位は、すでにＷＯ２０１７／１５８１５３Ａ１及びChylinski et al, Nature Communications 10, 2019: 5454に開示されており、ＣＲＩＳＰＲ－スイッチと呼ばれている。両方の参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明は、ｓｇＲＮＡ修飾におけるリコンビナーゼ使用の基本原理を利用し、この原理をさらに数段階進めて、リコンビナーゼ認識の少なくとも２つの異なる対又はセットを使用して、条件付き活性化／不活性化システムを提供し、細胞数が少ない状況における不充分な表示の問題を克服している。
【0015】
ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲｉやＣＲＩＳＰＲａなどのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ法で、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ９、ｄＣａｓ９、Ｃａｓ１０、又はＣａｓ１２ａなどのＣａｓ酵素と組み合わせて使用されるＲＮＡである。単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、ｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）とｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒａｎｓ－活性化ｃｒＲＮＡ）の両方を単一の構築物として含む。ｃｒＲＮＡはまた、ＤＮＡガイド配列を含むためのガイドＲＮＡとも呼ばれる。ｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡを結合させて、単一の分子、すなわち単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を形成することができる。ｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡは相補的な領域でハイブリダイズする。この相補的領域は結合に使用することができ、結合とともに、本明細書ではｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡステムループと呼ばれるステムループを形成することができる。この領域は、ほとんどの場合Ｃａｓタンパク質への結合を仲介するため、Ｃａｓ結合要素と呼ばれることもある。部位特異的切断は、ｃｒＲＮＡと標的プロトスペーサーＤＮＡ間の塩基対の相補性と、標的ＤＮＡの相補領域に並置された短いモチーフ［プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる］の両方によって決定される位置で起きる。標的ＤＮＡは、修飾が必要な任意のＤＮＡ分子にあってもよい。それは改変されるべき遺伝子であるかもしれない。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの典型的な使用法は、ＤＮＡに変異や修飾を導入したり、遺伝子発現を変化させたりすることである。ｓｇＲＮＡのデザインは、例えば次のようにレビューされているように、現在は従来型である：Ciu et al. (Interdisciplinary Sciences Computational Life Sci-ences 2018, DOI: 10.1007/s12539-018-0298-z) 又は Hwang et al. (BMC Bioinformatics 19, 2018:542)。本発明に従って使用して、目的の活性（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの作用による遺伝子の活性化又は阻害）を有する、目的の遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡ配列を生成することができる、多くのツールが存在する。
【0016】
本発明によれば、ｓｇＲＮＡ配列はガイド破壊配列によって中断される。このガイド破壊配列は、Ｃａｓ酵素が使用できる活性ｓｇＲＮＡの形成を妨害する。ガイド破壊配列は、リコンビナーゼ認識部位の第１の対によってフランキングされており、これらの部位でのリコンビナーゼ作用によってガイド破壊配列が欠失されることを可能にする。ｓｇＲＮＡ配列は、リコンビナーゼ認識部位の第１の対とは異なるリコンビナーゼ認識配列を有するリコンビナーゼ認識部位の第２の対を含む。リコンビナーゼ認識部位の第１の対との違いは、２つのタイプのリコンビナーゼ認識部位間に組換え混合物又は接続が発生しないことを意味する。この効果のために異なるリコンビナーゼを使用することができるが、Ｃｒｅなどの一部のリコンビナーゼは、組換え中にそのような異なる部位を接続せずに多くの部位を認識するため、第１と第２の部位に同じリコンビナーゼを使用することもできる。
【0017】
注目すべきことに、第１及び第２のリコンビナーゼ認識部位は両方とも、組換え時に欠失をもたらし、すなわち、これらは同じ方向にある（配列の反転につながる反対の方向ではない）。
【0018】
第１と第２のリコンビナーゼ認識部位の主な違いは、部位の第１の対のみがガイド破壊配列をフランキングし、第２の対はガイド破壊配列をフランキングしないことである。これは、第１の対での組換えがガイド破壊配列を除去する（ｓｇＲＮＡを活性にする）のに対し、第２の対での組換えはこれを除去しない（ｓｇＲＮＡは不活性のまま）ことを意味する。本明細書において、「ｓｇＲＮＡ配列を不活性化する」への言及は、ｓｇＲＮＡが不活性にされ、それにより、もはや活性ｓｇＲＮＡを生じさせることができず、すなわち第２のリコンビナーゼ認識部位の対で組換えが起きないことを意味する。さらに、第１の対と第２の対によりフランキングされる配列は重複し、第１の対での組換え（これによりそのフランキングされた配列が欠失される）により、第２の対の必要な必要なリコンビナーゼ認識部位が除去され、そして別の場合には、第２の対での組換え（これによりそのフランキングされた配列が欠失される）により、第１の対の必要なリコンビナーゼ認識部位が除去されるため、第１の対と第２の対の組換えは相互に排他的になる。従って、本発明のｓｇＲＮＡでは、第２のリコンビナーゼ認識部位の対の１つのリコンビナーゼ認識部位は、リコンビナーゼ認識部位の第１の対の間（及び好ましくはガイド破壊配列の下流）に位置し、第２のリコンビナーゼ認識部位の対の別のリコンビナーゼ認識部位は、リコンビナーゼ認識部位の第１の対の下流に位置する。「下流」とは、ｓｇＲＮＡの配列上の５’から３’への方向を意味する。言い換えれば、本発明の核酸は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をコードする配列を含む核酸として定義することもでき、ここで、ｓｇＲＮＡ配列は、リコンビナーゼ認識部位の第１の対によってフランキングされたガイド破壊配列によって中断され、及びここで、ｓｇＲＮＡ配列は、リコンビナーゼ認識部位の第１の対とは異なるリコンビナーゼ認識配列を有するリコンビナーゼ認識部位の第２の対をさらに含み、ここで、ガイド破壊配列は、リコンビナーゼ認識の第２の対によってフランキングされておらず、及びここで、第１及び第２のリコンビナーゼ認識部位によってフランキングされた配列は重複している。リコンビナーゼ認識部位の第１の対の間に位置する言及された第２のリコンビナーゼ認識部位は、任意選択的に及び好ましくは、ガイド破壊配列の下流にもある。これは、第２のリコンビナーゼ認識部位の対によってフランキングされた領域の外側にガイド破壊配列を残し、従って、不活性化の際に、ガイド破壊配列を有効のまま残す。これにより、不活化されたｓｇＲＮＡが効率的に生成される。しかし、活性ｓｇＲＮＡを形成するために必要なｔｒａｃｒＲＮＡの一部を除去するなど、他の選択肢も存在する。このような除去はまた、ｓｇＲＮＡを不活性化するであろう。もちろんｔｒａｃｒＲＮＡの一部のこの除去は、第２のリコンビナーゼ認識部位の対によってフランキングされた領域の外側にガイド破壊配列を配置することと組み合わせることができる。従って、「ガイド破壊配列がリコンビナーゼ認識部位の第２の対によってフランキングされていない」の代わりに、リコンビナーゼ認識部位の第２の対が、上記のように必須のｔｒａｃｒＲＮＡ部分などの活性ｓｇＲＮＡを形成するのに必要とされるｓｇＲＮＡの一部をフランキングする核酸を提供することも可能である。ｔｒａｃｒＲＮＡのそのような必須の部分は、Ｃａｓ結合要素、又は本明細書に記載されるようにｔｒａｃｒＲＮＡの任意の機能のために必要とされるｔｒａｃｒＲＮＡの一部であり得る。第２のリコンビナーゼ認識部位が、ガイド破壊配列及びリコンビナーゼ認識部位の第１の対の１つの下流にあるこの選択肢は、ガイドの５’から３’構造の後にｔｒａｃｒ部分が続くｓｇＲＮＡに特に適用される。一部のＣａｓ酵素は、ガイドがｔｒａｃｒの下流（３’側）にある場合などの、異なる順序を認識する。これらのＣａｓ酵素の場合、ｓｇＲＮＡ内の順序が逆になり、第２のリコンビナーゼ認識部位がガイド破壊配列の上流（すなわち、３’から５’の方向）にある必要がある。従って、本発明はまた、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をコードする配列を含む核酸を提供し、ここで、ｓｇＲＮＡ配列は、リコンビナーゼ認識部位の第１の対によってフランキングされたガイド破壊配列によって中断され、及びここで、ｓｇＲＮＡ配列はさらに、リコンビナーゼ認識部位の第１の対とは異なるリコンビナーゼ認識配列を有するリコンビナーゼ認識部位の第２の対を含み、ここで、第２のリコンビナーゼ認識部位の対の１つのリコンビナーゼ認識部位は、リコンビナーゼ認識部位の第１の対の間（及び好ましくはガイド破壊配列の上流）に位置し、及び第２のリコンビナーゼ認識部位の対の別のリコンビナーゼ認識部位は、リコンビナーゼ認識部位の第１の対の上流に位置する。
【0019】
この配列構造に基づいて、前記第１又は第２のリコンビナーゼ認識部位の１つの対のみが組換え反応を引き起こし、リコンビナーゼ認識部位間の配列の欠失をもたらすことができる。部位の対のどちらか、すなわち第１の対と第２の対のどちらが組換え（「選択」）をもたらすかは、本質的に確率的である。他のものよりも好ましい組換え配列を選択することは可能であるが、本質的に、リコンビナーゼによる部位選択は確率的なままである。簡単に言えば、以下で他の選択肢と共により詳細に説明されるように、通常、より短いフランキング配列での組換えがより長いフランキング配列よりもリコンビナーゼ酵素にとって好適である。本発明のｓｇＲＮＡ配列を有する集団又は複数の細胞を使用する場合、リコンビナーゼ酵素による確率的リコンビナーゼ部位選択は、細胞の（第１の）群が第１のリコンビナーゼ認識部位組換え（ｓｇＲＮＡの活性化）を、及び別の細胞の（第２の）群が第２のリコンビナーゼ認識部位の組換え（ｓｇＲＮＡの不活性化）を有することを意味する。細胞の第１の群と細胞の第２の群の比率は、リコンビナーゼ認識部位の第１の対と第２の対の間の組換えの選択の優先度に依存する。
【0020】
これらの原理によれば、本発明は、リコンビナーゼ刺激時にＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのｓｇＲＮＡを発現する方法を提供し、この方法は、以下を含む：
Ａ）複数の細胞に、本発明のｓｇＲＮＡをコードする複数の核酸を提供すること、
Ｂ）第１及び第２のリコンビナーゼ認識部位の対を活性化することができる細胞に、１種以上のリコンビナーゼを導入又は活性化することを含み、
Ｃ）ここで、第１のリコンビナーゼ認識部位の対と第２のリコンビナーゼ認識部位の対の活性化は競合反応であり、ここで、第１のリコンビナーゼ認識部位の対の活性化は活性ｓｇＲＮＡの発現をもたらし、及び第２のリコンビナーゼ認識部位の対の活性化はｓｇＲＮＡ配列を不活性化する。
Ａ）複数の細胞に、本発明のｓｇＲＮＡをコードする複数の核酸を提供すること、
Ｂ）第１及び第２のリコンビナーゼ認識部位の対を活性化することができる細胞に、１種以上のリコンビナーゼを導入又は活性化することを含み、
Ｃ）ここで、第１のリコンビナーゼ認識部位の対と第２のリコンビナーゼ認識部位の対の活性化は競合反応であり、ここで、第１のリコンビナーゼ認識部位の対の活性化は活性ｓｇＲＮＡの発現をもたらし、及び第２のリコンビナーゼ認識部位の対の活性化はｓｇＲＮＡ配列を不活性化する。
【0021】
本発明の１つの利点は、リコンビナーゼの導入又は活性化の時間を実施者が選択できることである。従って、考慮されるアッセイ又はスクリーニング方法に最適な所望の数まで、細胞を増殖させることが可能である。これにより、例えば全能性、多能性（pluripotent）、又は多能性（multipotent）（幹）細胞から開始する場合の、分化パラダイムにおける望ましい分化段階（例えば、最終分化又は終末分化）などの組換えに有益な時点を選択することが可能になる。一方、活性ｓｇＲＮＡと不活性ｓｇＲＮＡの両方が存在すると、細胞集団内の内部対照が提供されるため、細胞数が少なく最適ではない場合でも、改善が達成される。
【0022】
本発明のＣＲＩＳＰＲ－ＳｔＡＲ法は、ｓｇＲＮＡの存在量を、ボトルネック前のｓｇＲＮＡの存在量ではなく、内部の不活性な対照と比較することにより、確率的な表示ドリフトを回避することができる。特にｓｇＲＮＡ表現のボトルネックを通過するスクリーンの場合、この制御方法は、スクリーニングの前後にｓｇＲＮＡを制御する従来の方法よりも堅牢である（図８～１３）。ＣＲＩＳＰＲ－ＳｔＡＲは、細胞数が少ない場合でも、ノイズを低減し、必須のｓｇＲＮＡと対照ｓｇＲＮＡの集団の分離を可能にする。
【0023】
活性ｓｇＲＮＡと不活性ｓｇＲＮＡの比較可能性を維持するには、両方が、すなわち不活性ｓｇＲＮＡもガイド配列の少なくとも一部（ｃｒＲＮＡに対応、上記を参照）を維持して、不活性ｓｇＲＮＡが活性ｓｇＲＮＡに割り当てられるようにすることが不可欠である。もちろん、前記配列が両方の組換えイベントで保存され、ｓｇＲＮＡに固有であるため、他の遺伝子標的を有する他のｓｇＲＮＡ配列と混同されない場合、他の配列を使用して、両方が同じ核酸に由来する不活性及び活性のｓｇＲＮＡを互いに割り当てることができる。
【0024】
本発明の好適な実施態様において、ｓｇＲＮＡ配列の不活性部分を有する細胞は、ｓｇＲＮＡ配列の存在を検出することが特定される。実験でｓｇＲＮＡの存在を検出する手段として不活性ｓｇＲＮＡを使用すると、ボトルネックよる消失又はその他の欠如理由に関係なく、存在していたために実験で試験されたｓｇＲＮＡ（特にそのガイド配列）を特定することができる。細胞集団中に活性ｓｇＲＮＡが存在しない場合、その欠如がｓｇＲＮＡ自体の活性（例えば細胞の生存に対して有害）によって引き起こされる可能性もあるため、通常そのような結論は得られない。これは、活性ｓｇＲＮＡの欠如（従来技術のように）は、ｓｇＲＮＡが細胞の生存（従ってｓｇＲＮＡの検出）を妨害するか、又はそれが実験中に失われたことを意味し得ることを意味する。本発明の不活性ｓｇＲＮＡが存在しないことは、おそらくこれが実験で失われたことを意味するが、ｓｇＲＮＡは不活性のままであるため、細胞の生存に影響を与えなかったであろうから、この理由は除外できる。これは、本発明のシステムが、結果（細胞生存）がないことの証拠を提供することを意味する。
【0025】
本発明のシステムは、大規模なスクリーニングに最初に必要とされるよりも低い表示でのスクリーニングを可能にし、従って、ボトルネックを克服するであろう。これは、インビボでの遺伝子スクリーン、特に大規模な遺伝子スクリーンに特に有益である。
【0026】
細胞生存又は増殖のボトルネックにおける低細胞数の細胞の影響を克服するために、本発明の核酸を有する細胞を望ましい数まで増殖させた後に、リコンビナーゼを（能動的に）導入又は活性化することが好ましい。例えば、本発明の好適な実施態様において、工程Ａ）の後でかつ工程Ｂ）の前に、細胞は増殖（クローン化）され、好ましくは、ここで細胞は、実験で使用される異なるｓｇＲＮＡ配列の数当たり、少なくとも２５０、好ましくは少なくとも３００、少なくとも３５０、又は少なくとも４００個の細胞数まで増殖される。また場合によっては、より大きな数が可能かつ好適であり、本発明の異なるｓｇＲＮＡ配列の数当たり、少なくとも５００、又は少なくとも８００、例えば５００～５０００、又は８００～２０００、又はそれ以上の細胞数である。細胞の不均一性のため、ＣＲＩＳＰＲ実験では多くの細胞が並行して試験される。本発明の方法及びそのための手段は、本発明の核酸を含むこれらの細胞を作成すること（トランスフェクション、移植などの細胞数を減少させる可能性のある任意の工程の後）を可能にし、次にリコンビナーゼを活性化すると、第１又は第２のリコンビナーゼ認識部位で組み換えが起き、それによりｓｇＲＮＡを活性化又は不活性化する。この活性化／リコンビナーゼ作用の後、細胞又は生物におけるｓｇＲＮＡの遺伝的又は生理学的効果を観察することができる。「第１及び第２のリコンビナーゼ認識部位の対を活性化することができる」という表現は、第１及び第２のリコンビナーゼ認識部位で組換えを引き起こすことができるリコンビナーゼを指す。「リコンビナーゼを活性化する」とは、リコンビナーゼが組み換えを行うことを意味する。リコンビナーゼは不活性型で存在することができ、補因子又は他の活性化因子が存在すると活性化され得る。
【0027】
好適な実施態様において、リコンビナーゼは誘導性リコンビナーゼである。これにより、リコンビナーゼが存在するトランスジェニック細胞の調製が容易になり、これは次に、上記の工程Ｂ）に記載したようにリコンビナーゼを活性化することができる。誘導性リコンビナーゼは、誘導性プロモーター又は転写エンハンサーを使用することによって誘導され得る。プロモーター又はエンハンサーを活性化すると、リコンビナーゼの発現と活性が高まる。別の例は、（タンパク質として）不活性であり、活性化因子の作用によって活性化されるリコンビナーゼである。そのようなリコンビナーゼは遺伝子操作され得る。一例は、エストロゲン受容体（ＥＲ）に、又はＥＲの（変異した）リガンド結合ドメインに融合したＣｒｅリコンビナーゼ、ＣｒｅＥＲである。エストロゲン受容体又はドメイン（例えば、４ＯＨ－タモキシフェン又はタモキシフェン）にリガンドを提供することにより、Ｃｒｅ酵素が活性化される。
【0028】
さらなる方法には、Ｃｒｅ又はＦｌｐリコンビナーゼのドキシサイクリン依存性又は光誘導性発現などの条件付き遺伝子発現システムが含まれる。同様に、細胞型又はステージ特異的プロモーターを使用して、特定の時間又は場所で遺伝子発現を誘導することができる。さらに別の例は、前記リコンビナーゼ活性の化学的安定化（シールド）又は不安定化（デグロン）であり得る。
【0029】
例えば、リコンビナーゼは、細胞又は細胞培養物において、又は本発明の核酸を有する細胞を含む動物において、細胞／ｓｇＲＮＡ表示のボトルネックの後に、例えば細胞が、例えば少なくとも５００又は少なくとも１，０００細胞／ｓｇＲＮＡに回復したとき、（例えば、４ＯＨ－タモキシフェンを投与することによって）誘導又は活性化され得る。
【0030】
好ましくは、本発明の核酸は細胞内で使用され、すなわち、本発明の方法において細胞に提供されるか又は提供されてきた。細胞はまた、細胞の増殖とともに核酸を安定して増殖させることができるはずである。これは、例えば核酸又はｓｇＲＮＡ配列を細胞のゲノムに組み込むことによって行われる。
【0031】
好ましくは、細胞は、細胞ごとに本発明のｓｇＲＮＡをコードする核酸の１つのコピーを有する。これにより、所定の細胞で１つのタイプのみのリコンビナーゼ反応（活性化又は不活性化のいずれか、両方ではない）が発生することが保証される。もちろん、異なる細胞は上記の確率的原理に従って、異なるリコンビナーゼ反応を示す可能性があり、細胞内に不活性又は活性ｓｇＲＮＡ集団を提供する。細胞にｓｇＲＮＡコピーが１つしかないことを確認するために、Wang et al.（2014、上記）に開示されているＡＡＳＶ１遺伝子座のような１つの特定のゲノム遺伝子座を標的にすることができるが、もちろん他のユニークな遺伝子座も可能である。細胞ごとにゲノムへの挿入は１つだけ可能である。
【0032】
本発明の核酸は、好ましくはｓｇＲＮＡ配列を含み、また好ましくは、ｓｇＲＮＡ配列の発現のためにｓｇＲＮＡ配列に作動可能に連結されたプロモーターも含む。プロモーターは、構成性プロモーター又は誘導性プロモーターであり得る。ｓｇＲＮＡの活性は本発明のｓｇＲＮＡ配列構築物（ガイド破壊配列又は不活性化リコンビナーゼ産物）自体によって調節されるため、構成性プロモーターが特に好ましい。プロモーターの例は、特にMa et al. (Molecular Therapy-Nucleic Acids 3, 2014: e161) に開示されている。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩ）又はＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩＩ）プロモーターであり得る（ＷＯ２０１５／０９９８５０を参照）。好ましくはそれは、Ｕ６、７ＳＫ、又はＨ１プロモーターなどのＰｏｌＩＩＩプロモーターである。Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの構造は、Ma et al. 2014に開示されている。Ｈ１プロモーターの使用は、例えばＷＯ２０１５／１９５６２１（参照により本明細書に組み込まれる）に示され、この方法及び構築物の設計は、本発明の任意の態様に従って使用することができる。好ましいプロモーターはＵ６プロモーターである。
【0033】
Ｐｏｌ ＩＩプロモーターは、レトロウイルス性ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意選択的にＲＳＶエンハンサーを含む）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（任意選択的にＣＭＶエンハンサーを含む）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、β－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ＥＦｌａプロモーターから、及びさらにＣＡＧ、ＥＦ１Ａ、ＣＡＧＧＳ、ＰＧＫ、ＵｂｉＣ、ＣＭＶ、Ｂ２９、デスミン（Desmin）、エンドグリン（Endoglin）、ＦＬＴ－１、ＧＦＰＡ、及びＳＹＮ１プロモーターの任意の１つからなる群から選択することができる。Ｐｏｌ ＩＩプロモーターは、ＷＯ２０１５／０９９８５０に開示されているように、ガイドＲＮＡ配列をフランキングしているＣｓｙ４切断部位と又は自己切断リボザイムと、組み合わせて使用することができる。ガイド発現におけるｐｏｌ ＩＩの使用は、ＷＯ２０１５／１５３９４０にさらに記載されている。
【0034】
核酸はまた、好ましくは選択マーカーを含む。選択マーカーを使用して、本発明の核酸を含む細胞を同定し、好ましくは選択又は単離することができる。従って、本発明の核酸を有する細胞のそのような形質転換の成功を確認及び制御することができる。次に、選択マーカーを有する細胞、及び結果として本発明のｓｇＲＮＡは、本発明の方法の工程Ａ）などに進めることができる。
【0035】
そのような選択マーカーは、当技術分野で知られている任意のマーカーであり得る。それは、細胞生存マーカー、例えば抗生物質耐性遺伝子、又は光学マーカー、例えばＧＦＰ、ＢＦＧ、若しくはＲＦＧなどの蛍光タンパク質をコードする遺伝子であり得る。
【0036】
好ましくは、マーカーは、第１及び／又は第２のリコンビナーゼ活性によって切除される位置に配置され、すなわち、これはリコンビナーゼ認識部位の第１及び／又は第２の対によってフランキングされる。この除去は、活性ｓｇＲＮＡの形成における選択マーカー配列の妨害を防ぎ、又は不活性ｓｇＲＮＡの場合、不活性ｓｇＲＮＡは好ましくは配列決定によって同定されため、これはサイズを小さくするのに役立つ。配列決定サイズを小さくすると、配列決定の労力とコストが削減され、これは、多くのｓｇＲＮＡ配列が配列決定される大規模なスクリーンで特に重要である。第１及び第２のリコンビナーゼ認識部位の対のそれぞれの間に、すなわち重複して、選択マーカーを配置することのさらなる利点は、ここでは、これが活性化及び不活性化の両方によって除去されることであり、これにより、本発明の核酸を使用する前の時期尚早の組み換えに対する逆選択が可能になることである。従って、選択肢「及び」が最も好ましく、すなわちマーカーは、好ましくはリコンビナーゼ認識部位の第１と第２の対の両方にフランキングされ、すなわち、第１と第２のリコンビナーゼ認識部位の対の重複部分内にある。
【0037】
好ましくは本発明の核酸は、１つ以上のプライマー又はプローブ結合部位を含み、その結果、核酸プライマー又はプローブは、その非リコンビナーゼ形質転換（元の）状態又は不活性のｓｇＲＮＡ若しくは活性ｓｇＲＮＡの状態のいずれかで、本発明のｓｇＲＮＡの検出のために核酸に結合し得る。プライマーを使用して、ｓｇＲＮＡ配列を増幅又は配列決定して、その検出及び好ましくは同定も行うことができる。プローブを使用して核酸を結合することができ、さらにプローブを使用してｓｇＲＮＡ配列を結合させて、その配列同定をすることができる。
【0038】
好ましくは、プライマー又はプローブ結合部位は、リコンビナーゼ認識部位の第１及び第２の対の外側にあり、従ってリコンビナーゼの作用の間及びその後にも維持される。そのようなプローブ又はプライマー結合部位は、例えば、ガイド配列又はｓｇＲＮＡ配列全体をフランキングしてもよい。好ましくは、２つのプローブ又はプライマー結合部位が使用され、１つはガイド配列又はｓｇＲＮＡ配列の５’であり、１つはガイド配列又はｓｇＲＮＡ配列の３’である。１つ以上のプローブ又はプライマー結合部位は、好ましくはｓｇＲＮＡ配列の近くにあり、好ましくはｓｇＲＮＡ配列のいずれかの末端から２０，０００ｎｔ（ヌクレオチド）以内、好ましくはｓｇＲＮＡ配列のいずれかの末端から１５，０００ｎｔ以内、又は１０，０００ｎｔ以内、５，０００ｎｔ以内、又は１，０００ｎｔ以内にある。
【0039】
ｓｇＲＮＡの構造は、例えばJiang and Doudna (Annu. Rev. Biophys. 46, 2017:505-29), Swarts et al. (Molecular Cell 66, 2017: 221-233)、ＷＯ２０１５／０８９３６４、ＷＯ２０１４／１９１５２１、ＷＯ２０１５／０６５９６４、及びＷＯ２０１７／１５８１５３Ａ１に開示されている。ｓｇＲＮＡ分子は、標的の特異性を媒介する長さが通常１５～３０ｎｔ、ほとんどの場合１７～２１ｎｔのガイドを含むｃｒＲＮＡに対応する部分を含む。ｃｒＲＮＡは、シュードノット構造及び／又はシード領域を含み得る。このｃｒＲＮＡ部分は、ｔｒａｃｒＲＮＡに対応する部分に接続されている。ｓｇＲＮＡでは、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの部分が、通常（ｃｒＲＮＡ）リピート、ループ、及び（ｔｒａｃｒＲＮＡ）アンチリピートを含み得るステムループ領域中で融合している。ステムには、パリンドローム配列に加えて、ミスマッチヌクレオチドも含まれ得る。ｔｒａｃｒＲＮＡに対応するｓｇＲＮＡの部分は、さらにループ領域を有し、一般にＣａｓ酵素への結合を仲介する３Ｄ折り畳み構造を有している可能性がある。リコンビナーゼ認識部位の第２の対に対するリコンビナーゼの作用によるｓｇＲＮＡの不活性化は、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ９、ｄＣａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、又はＣａｓ１２ｃ、好ましくはＣａｓ９、及び／又はその変種、例えばｄＣａｓ９の、選択されたＣａｓ酵素への結合を妨害して、例えばＣａｓ結合に必要な折り畳み構造を妨害することにより、欠失を引き起こすことが好ましい。欠失された領域は、リコンビナーゼ認識部位の対によってフランキングされる領域である。好ましくは、欠失は、１つ以上のループ又はループの一部を欠失させる。
【0040】
活性ｓｇＲＮＡの場合、リコンビナーゼ認識部位の第１の対上のリコンビナーゼ作用による欠失は、活性なｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ構造を維持し、ｓｇＲＮＡのＣａｓ結合能力を確立するはずである。従って、第１のリコンビナーゼ認識部位（リコンビナーゼ作用後にそのうちの１つのリコンビナーゼ認識部位が残る）は、ループなどの不活性領域に配置されることが好ましい。従って、本発明の好適な実施態様において、第１のリコンビナーゼ認識部位のうちの１つ、好ましくは２つは、ｓｇＲＮＡ配列のループ領域内に位置する。好ましくは、ｓｇＲＮＡ配列はｃｒＲＮＡ部分及びｔｒａｃｒＲＮＡ部分を含み、第１のリコンビナーゼ認識部位の１つは、ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡリンカーループ、すなわちｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡ部分を接続するループ内に位置する。
【0041】
好ましくはｓｇＲＮＡは、１つ以上のループ、例えば１、２、３、４、又はそれ以上のループを含む。１つのループは、好ましくはｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ部分を接続する。１つのループは、シュードノット構造などのｃｒＲＮＡ部分に含まれていてもよい。好ましくはｔｒａｃｒＲＮＡ部分は、完全にｔｒａｃｒＲＮＡ部分にある１、２、３、又はそれ以上のループを含む（ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡリンカーループを数えない）。通常、Ｃａｓ結合には、ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡリンカーループの後の最初の２つのループが必要であり、そしてリコンビナーゼ作用でｓｇＲＮＡを不活性化するために、これらの１つ、好ましくは両方が、欠失されるか又は部分的に欠失される（例えば、リコンビナーゼ認識部位をループ内に配置してステムの片方の脚を欠失させることにより）。ループは、長さが３～２０ｎｔのステムなどに接続でき、ここで、ステムの片方の脚の長さがカウントされ、すなわちステムは、塩基対をカウントするとその数の２倍になる場合があるが、もちろん塩基のミスマッチも含まれる。好ましくは、これらのループのいずれか１つのステム、特に完全にｔｒａｃｒＲＮＡ部分の完全なステムループは、３～２０塩基対、例えば４～１５又は５～１０塩基対、例えば３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０塩基対、好ましくは４～７塩基対を含む。好ましくは、ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡリンカーループは、ステム内に６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０塩基対の長さを有するステムループである。
【0042】
リコンビナーゼ作用の前にｓｇＲＮＡ中の活性ガイドの形成を妨害するガイド破壊配列は、ポリＡ配列などの転写終結配列を含み得、その結果、ｓｇＲＮＡの残りは転写されない。これはまた、Ｃａｓ酵素と相互作用して活性なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体を形成することができる活性ガイドＲＮＡ折り畳み又はｓｇＲＮＡ折り畳みを妨害する配列を含み得る。例えばこれは、Ｃａｓ酵素に結合しない折り畳み要素の十分な長さ又はそれを含めることによって達成できる。ガイド破壊配列は、ｓｇＲＮＡのループのいずれか、特に好ましくはｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡリンカーループのループ形成を妨害する可能性がある。そのような配列は、活性なガイドＲＮＡの折り畳みを妨害するのに十分な長さがある場合は、例えば選択マーカー配列であり得る。特に好適な実施態様において、転写終結配列と、活性なガイドＲＮＡの折り畳みを妨害する（長さの）配列との両方が使用される。好適な実施態様において、転写終結配列は、ループ内、特に好ましくはｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡリンカーループ内に配置される。好ましくは、そのフランキングする第１のリコンビナーゼ認識部位の両方が同じループに配置され、その結果、そのループの一部のみが活性化リコンビナーゼ反応で欠失される。このような場合、上記で説明したように、第１及び第２のフランキング配列が重複しているため、第２のリコンビナーゼ認識部位の１つも同じループ内に配置される。第２のリコンビナーゼ認識部位の別の１つは、好ましくは下流に配置され、その結果、ｓｇＲＮＡの必須部分、特にそのｔｒａｃｒＲＮＡは、リコンビナーゼ認識部位の第２の対上のリコンビナーゼの作用時に欠失される。好ましくは、第２のリコンビナーゼ認識部位は、全体に、ｔｒａｃｒＲＮＡ内、又はｓｇＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ部分の下流、例えばまたｓｇＲＮＡの下流の、ループ内に配置される。これは、転写された領域又はさらに下流に、例えば転写末端の後にある可能性がある。例えば、これは、ｓｇＲＮＡの５’末端の１０，０００ｎｔ以内、好ましくはｓｇＲＮＡの５’末端の５，０００ｎｔ以内にあり得る。
【0043】
好適な実施態様において、リコンビナーゼ認識部位の第１及び第２の対は、同じリコンビナーゼ酵素によって活性化される。従ってリコンビナーゼは、リコンビナーゼ反応において互いに相互作用しない異なる認識部位を有し得る。そのようなリコンビナーゼは、例えばＣｒｅである。リコンビナーゼ認識部位の第１及び第２の対は、ｌｏｘ部位、例えばｌｏｘＰ、ｌｏｘ５１１、ｌｏｘ５１７１、ｌｏｘ２２７２、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ７、Ｍ１１、ｌｏｘ７１、ｌｏｘ６６から、独立して選択することができる。
【0044】
１つのリコンビナーゼをリコンビナーゼ認識部位の両方の対に使用することは、細胞に提供する必要があるのは１つのリコンビナーゼのみであるという利点がある。他の実施態様において、リコンビナーゼ認識部位の第１及び第２の対は、異なるリコンビナーゼ酵素によって活性化される。この場合、実験で使用される細胞の集団は、両方のリコンビナーゼ酵素を備えている必要があり、その集団の個々の細胞は、両方のリコンビナーゼ酵素の一方、好ましくは両方のリコンビナーゼ酵素を有し得る。両方の選択肢（すなわち、同じ又は異なるリコンビナーゼ）のリコンビナーゼの例は、Ｃｒｅ、Ｈｉｎ、Ｔｒｅ、ＦＬＰなどの部位特異的リコンビナーゼである。
【0045】
リコンビナーゼの反応性と、リコンビナーゼ認識配列の第１及び第２の対の間の選択の優先順位（従って、確率的分布－上記を参照）は、構造要素と配列によって制御することができる。リコンビナーゼ認識部位によってフランキングされるより短い配列は、リコンビナーゼ認識部位によってフランキングされるより長い配列よりも優先され、従って、そのフランキングされた領域のより多くの欠失事象をもたらすであろう。従って、リコンビナーゼ作用時の活性及び不活性ｓｇＲＮＡの分布又は比率は、それに応じてフランキングされる領域の長さを選択することによって操作することができる。リコンビナーゼ作用時に活性及び不活性ｓｇＲＮＡの分布又は比率を制御する別の選択肢は、リコンビナーゼ認識部位をさらに追加することであり、これにより、リコンビナーゼ反応を引き起こす可能性も高まる。３つ以上のリコンビナーゼ認識部位を使用すると、もしリコンビナーゼ作用が、内部のリコンビナーゼ認識配列によりフランキングされる領域を欠失させても、少なくとも２つのリコンビナーゼ認識配列が残り、これがさらなる欠失をもたらすことが、残りのリコンビナーゼ認識部位が１つになるまで続くため、最も外側のリコンビナーゼ認識部位の間の配列部分全体が欠失されると予想される。従って、同じタイプ（第１及び／又は第２の部位として）の３つ以上のリコンビナーゼ認識部位の「セット」が本発明の核酸配列において使用される場合でも、フランキングされる部分及び重複部分は、例えば最も外側のリコンビナーゼ認識部位を本明細書に記載のリコンビナーゼ認識部位の「対」と見なすことによって選択されるべきである、
【0046】
好ましくは、核酸は、活性ｓｇＲＮＡと不活性ｓｇＲＮＡの平均比率９：１～１：９、好ましくは５：１～１：５、特に好ましくは２：１～１：２を提供するように改変される。そのような比率はまた、本発明の方法で達成され得る。
【0047】
リコンビナーゼ作用は長さに依存するため、リコンビナーゼの適切な作用のために、リコンビナーゼ認識部位の対は、最大１００，０００ｎｔ離れ、好ましくは最大５０，０００ｎｔ離れ、特に好ましくは最大１０，０００ｎｔ離れ、又は最大５，０００ｎｔ離れていることが好ましい。これは、第１及び／又は第２の対、好ましくは両方に適用される。
【0048】
好ましくは、本発明の核酸は、固有の分子識別子（ＵＭＩ）又はバーコードを含む。ＵＭＩ又はバーコードは、特定のｓｇＲＮＡ分子の識別を可能にする配列であり、同じ遺伝子標的（同じガイド配列）を標的にしている場合でも、分子ごとに異なる。ＵＭＩの例はランダム配列である。このようなＵＭＩは、使用される全ての核酸分子を区別できる十分な長さを有する必要がある。好ましくはＵＭＩの長さは、少なくとも６ｎｔ、好ましくは少なくとも８ｎｔである。例えば、これは６～４０ｎｔ、好ましくは８～２０ｎｔの長さでもよい。好ましくは、これはｓｇＲＮＡ配列の下流に配置される。また好ましくは、これは、リコンビナーゼの作用時に削除されず、活性ｓｇＲＮＡと不活性ｓｇＲＮＡの両方で保持されるように、リコンビナーゼ認識部位の第１と第２の（又は任意の）対の両方の外側に位置する。他のＵＭＩを、第１及び第２のリコンビナーゼ認識部位の一方（他方ではない）に配置して、活性ｓｇＲＮＡのみ又は不活性ｓｇＲＮＡのみの追跡を可能にすることもできる（すなわち、これは、リコンビナーゼ作用時に保持される）。しかし、活性ｓｇＲＮＡと不活性ｓｇＲＮＡの両方に存在するＵＭＩの使用が推奨される。ＵＭＩを使用すると、ボトルネックを通過する独立したイベントを独立した複製として分析できるため（Michlits et al., Nature Methods 14, 2017: 1191-1197）、クローンの増殖を説明できる。異なるＵＭＩを有する細胞は、生物学的複製物として使用でき、これは、オルガノイド培養やインビボ応用などの、アッセイで不均一性の高い構成のための優れた利点である。従って本発明の方法では、ＵＭＩを使用して、異なる細胞において同じｓｇＲＮＡが同定される。これは、これらの細胞が、１つの特定のｓｇＲＮＡをコードする核酸分子を含むように形質転換された１つの元の細胞のクローンであることを意味する。リコンビナーゼ活性化後に生成物で検出されたＵＭＩも、増殖のボトルネックの程度を示している可能性がある。ボトルネックの前後の細胞集団におけるガイドごとのＵＭＩの数が少ないことは、細胞が失われたこと及びその程度を示している。
【0049】
本発明はまた、本発明のｓｇＲＮＡをコードする核酸を含む細胞を提供する。これらの細胞は、本発明の方法で使用することができる。細胞は、哺乳動物細胞、好ましくはヒト又は非ヒト細胞であり得る。全能性細胞が使用される場合、これらは好ましくは非ヒトである。これらは霊長類、ネズミ、ウシ、齧歯類の細胞であり得る。細胞は、単離された細胞、又は細胞の集合体、例えば培養物、オルガノイド、又はインビボ細胞であり得る。本発明のインビボ細胞は、好ましくはヒトには存在しない。細胞は、細胞株及び／又は多能性細胞のものであり得る。しかし、細胞は、多能性を維持する必要はなく、分化してもよい。リコンビナーゼ作用（従って、確率的原理に従って、ｓｇＲＮＡの一部を活性化すること）は、増殖又は成長の任意の時点で行われる。本発明はまた、このような活性化されたｓｇＲＮＡ又は不活性化されたｓｇＲＮＡを有する細胞に関する。
【0050】
細胞は、好ましくは、Ｃｒｅなどの１種以上のリコンビナーゼの発現のための、発現構築物のような１種以上の核酸を含む。リコンビナーゼは、上記のように、第１及び／又は第２のリコンビナーゼ認識部位を活性化するものでなければならない。発現核酸は、選択マーカーを含み得る。選択マーカーは、活性なリコンビナーゼを有する細胞を同定及び／又は単離するために使用され得る。選択マーカーは、長さマーカーなどの特定の配列であるか、バーコードを有するか、又は抗生物質耐性遺伝子などの細胞生存マーカーを含み得る。長さマーカーは、例えば、配列決定中に同定することができる。マーカーは、代替的又は追加的に、ウイルスにおけるリコンビナーゼタンパク質をコードする核酸の産生における対照として機能し得る。後でリコンビナーゼを発現する（そして本発明の方法で使用される）細胞を形質転換するために、トランスフェクション物質としてウイルスを使用することが可能である。マーカーを有する適切なウイルスを選択することができる。上記のように、リコンビナーゼの発現のための核酸、例えば発現構築物は、好ましくは、誘導性又は代替的に構成性プロモーターを含む。しかしながらリコンビナーゼは、プロモーターの選択によって、又は発現されたときに制御可能な活性化を必要とするリコンビナーゼ（例えば、上記に開示されたＣｒｅＥＲ）を使用することによって、好ましくは誘導可能である。光活性化可能なＣａｓ９も可能である（Nihongaki et al., Nature, 2015, 33(7): 755-760）。次に本発明の方法は、Ｃａｓを光活性化する工程も含むであろう。場合によっては、リコンビナーゼが全ての細胞で活性であるとは限らない（「未反応」）。非リコンビナーゼ活性化ｓｇＲＮＡは、活性化後の不活性及び活性ｓｇＲＮＡとは異なる配列を有し、従って特定び検討できるため、これは通常問題ではない。細胞型特異的プロモーター（例えばＣｒｅＥＲ）下でリコンビナーゼを使用する場合、組換えは実際には細胞型特異性も選択し、追加の細胞型がｓｇＲＮＡで形質導入された場合でも、目的の細胞型のみを測定することを可能にする。
【0051】
本発明の好適な実施態様において、活性／不活性／未反応ｓｇＲＮＡの配列は、工程Ｂ）でのリコンビナーゼの活性化／導入後、及び好ましくは、工程Ｃ）後の細胞でその効果が観察された後に、決定される。ｓｇＲＮＡの配列を決定するために、好ましくは本発明の核酸は、上記のようなプライマー結合部位を含む。プライマー結合部位は、ｓｇＲＮＡ（その活性／不活性組換え産物を含む）及び存在する場合は任意のＵＭＩの配列決定を可能にし、ここで、プライマー結合部位はｓｇＲＮＡ配列とＵＭＩ配列とをフランキングしている。
【0052】
細胞は、好ましくは、Ｃａｓ９などのＣａｓ、又は上記のＣａｓ酵素のいずれかを発現させるための、発現構築物のような核酸を含む。また、この核酸、例えばＣａｓの発現のための発現構築物は、誘導性又は代替的に構成性プロモーターを含み得る。Ｃａｓ酵素の活性を制御できるように、誘導性プロモーターが好ましい。またＣａｓ核酸は上記のように、同様にしかし独立して選択される選択マーカーを含み得る。
【0053】
リコンビナーゼ及び／又はＣａｓ酵素、好ましくは両方が、細胞内に提供される。例えば、これらがゲノムに組み込まれている市販の細胞が利用可能である。従って、核酸の説明は細胞のゲノムにまで及ぶ。
【0054】
通常、大規模なスクリーニングなどの実験では多くの細胞が使用される。好ましくは、本発明の細胞は、本発明の少なくとも１０，０００個の細胞、より好ましくは少なくとも１００，０００個の細胞、又は少なくとも１００万個の細胞集団で提供される。好ましくは、細胞は、上記のｓｇＲＮＡ（すなわち、異なるガイドを有するｓｇＲＮＡ）当たりの細胞に従い、異なるｓｇＲＮＡを有する。
【0055】
細胞は、活性ｓｇＲＮＡのない細胞、特に不活性ｓｇＲＮＡを有する細胞と比較して、活性ｓｇＲＮＡによって変化され得るそれらの増殖形態又は活性に対するｓｇＲＮＡの任意の作用について研究することができる。そのような研究された細胞は、野生型細胞であるか、又は突然変異を有し得る。そのような場合、変異の効果に対する活性化ｓｇＲＮＡの影響が観察されることがある。そのような突然変異は、発癌性突然変異、例えば癌遺伝子の活性化又はアップレギュレーション、あるいは腫瘍抑制遺伝子の抑制又は不活性化であり得る。
【0056】
従って、本発明の好適な実施態様において、細胞は、トランスジェニック癌遺伝子をさらに発現するか、又は抑制された腫瘍抑制遺伝子を有する。本発明の方法は、工程Ｃ）で活性化されていない細胞と比較して、工程Ｃ）で活性化された後の腫瘍形成の違いを観察する工程をさらに含み、それにより、腫瘍形成中にｓｇＲＮＡによって標的とされる遺伝子の役割をスクリーニングする。腫瘍の一部は増殖し、すなわちリコンビナーゼ作用後に不活性ｓｇＲＮＡを含む細胞が増殖する。不活性ｓｇＲＮＡに対応する活性ｓｇＲＮＡが腫瘍内に見つからない場合、これらの不活性ｓｇＲＮＡの存在は、活性ｓｇＲＮＡが最初は活性化されて存在したが、腫瘍内で増殖できなかったことの証拠である。従って、腫瘍増殖又はその抑制のための必須の遺伝的標的が見出された。上記したように、不活性ｓｇＲＮＡの存在は、活性ｓｇＲＮＡが存在しないことの証拠を提供する。
【0057】
別の実施態様において、ＣＲＩＳＰＲ－ＳｔＡＲカセットは、動物モデルの生殖細胞系列又は細胞株に組み込まれて、まばらな遺伝子の欠失を可能にし、例えば、腫瘍抑制因子のまれな再現性のある喪失を伴う腫瘍モデルを生成する。本発明はまた、ｓｇＲＮＡ活性化と組み合わせた候補化合物の作用を試験することを含む。従って、細胞をさらに候補化合物で処理することができ、この方法は、工程Ｃ）で活性化されていない細胞と比較して、工程Ｃ）で活性化された後の細胞活性又は形態の違いを観察することをさらに含み、それにより、候補化合物の影響下でｓｇＲＮＡの標的となる遺伝子の活性についてスクリーニングされる。このような方法は、例えば、毒性スクリーンで使用することができる。候補化合物は毒素であり得、そしてｓｇＲＮＡは、活性である時に毒性の改善について観察することができる。
【0058】
本発明の方法は、前述のように、細胞数が少ないというボトルネックを克服するのに特に適している。このような状況は、インビボ移植、オルガノイド、又は異種細胞培養で発生する。従って、これらは本発明の好ましい適用である。従って、好ましくは細胞は、オルガノイドなどの組織凝集体まで又はその中で増殖される。凝集体の組織（例えば、オルガノイドの組織）は、肝臓、脾臓、大脳、筋肉、心臓、腎臓、結腸直腸、膀胱、血管、卵巣、精巣、膵臓組織であり得る。また、好ましくは細胞は、好ましくは同種移植片又は異種移植片を形成するために、非ヒト動物に移される。好ましくは動物は、げっ歯類、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、マウス、ハムスター、ラットなどである。リコンビナーゼの導入又は活性化は、組織凝集体、オルガノイド、又は非ヒト動物で、すなわち、移植又は生着のボトルネックが過ぎ去り、本発明の細胞が好ましくは所望の数まで増殖された後に起きる。他の実施態様において、細胞は、２Ｄ又は３Ｄ細胞培養などの細胞培養で増殖される。リコンビナーゼの活性化は、所望の細胞数に及び／又は細胞分化段階に達したときに起きる。望ましい細胞数は、特定の細胞／ｓｇＲＮＡ比で上記に記載されている。
【0059】
本発明はさらに、核酸及び／又は細胞のような、本発明の方法で使用される任意の手段を含むキットを提供する。特にキットは、ｉ）本発明のｓｇＲＮＡをコードする核酸と、ｉｉ）ｓｇＲＮＡのリコンビナーゼ認識部位の対を活性化する１種以上のリコンビナーゼの発現のための核酸とを含む。キットは、好ましくはｉｉｉ）Ｃａｓ遺伝子をコードする核酸をさらに含む。任意のそのような核酸は、上記のようにさらに定義することができ、例えばｓｇＲＮＡ、リコンビナーゼ、Ｃａｓタンパク質に作動可能に連結されたプロモーターを有する。遺伝子は通常、プロモーターとコード領域を含むと考えられている。
【0060】
本発明は、本発明のこれらの実施態様に限定されることなく、以下の図及び実施例によってさらに説明される。
【図面の簡単な説明】
【0061】
【図1】ライブラリー内のガイドごとのバーコード数を減らした場合の、プールされたＣＲＩＳＰＲスクリーンの前後のバーコード間のｌｏｇ2倍数の変化の分布。
【図2】Ａ）ボトルネックのない２Ｄインビトロ遺伝子スクリーンの概略図。細胞集団の各分割で、細胞／ｓｇＲＮＡの表示は５００～１，０００細胞／ｓｇＲＮＡより高く維持されて、スクリーンの複雑さが維持される。Ｂ）遺伝子スクリーンにおける複雑さのボトルネックの概略図。感染効率によって引き起こされたボトルネックの後、限られた細胞、生着効率、及び／又は分化細胞は示差的に回復し、細胞／ｓｇＲＮＡの表示が減少する。細胞の不均一性のクローンサイズとは関係なく、単細胞由来のクローンは実験集団と対照集団に確率的に分割され、上部の緑色の二重矢印（活性ｓｇＲＮＡ）と下部の赤色の二重矢印（不活性ｓｇＲＮＡ）として示される。
【図3】（Ａ、Ｂ）ｓｇＲＮＡ、ストップカセット、選択カセット、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及びＵＭＩをコードするＣＲＩＳＰＲ－ＳｔＡＲベクターの概略図。組換えにより、活性（Ａ）ｓｇＲＮＡ又は不活性（Ｂ）ｓｇＲＮＡが得られる。
【図4】ＣＲＩＳＰＲ－ＳｔＡＲ構築物シリーズの概略図。ＳｔＡＲ１は、２セットの異なるｌｏｘ部位を含む。ＳｔＡＲ１と比較して、ＳｔＡＲ３は余分なｌｏｘＰ部位を含み、Ｌｏｘ５１７１部位とストップカセットの間の距離が長くなり、ｔｒａｃｒと２番目のＬｏｘ５１７１部位の間の距離が短くなっている。余分なｌｏｘＰ部位を除去すると、構築物ＳｔＡＲ４が得られた。
【図5】ＣＲＩＳＰＲ ＳｔＡＲ構築物における活性組み換えから不活性組換えへの頻度を決定するための実験概要。
【図6】実証実験の概略図。
【図7】ＣＲＩＳＰＲ ＳｔＡＲ分析のベンチマーク検査。従来の０日目の基準との比較。
【図8-1】従来法（活性対０日目）及びＣＲＩＳＰＲ－ＳｔＡＲ分析（活性対不活性）を使用した、複雑度の高い２つの生物学的複製物の相関。各ドットは１つのｓｇＲＮＡを表す。密度プロットと積み上げヒストグラムは、各複製物のガイド分布を示している。必須物は赤で、非必須物は青で表示される。
【図8-2】上記の説明に同じ。
【図8-3】上記の説明に同じ。
【図9-1】従来法（活性対０日目）及びＣＲＩＳＰＲ－ＳｔＡＲ分析（活性対不活性）を使用した、複雑度の低い２つの生物学的複製物の相関。各ドットは１つのｓｇＲＮＡを表す。密度プロットと積み上げヒストグラムは、各複製物のガイド分布を示している。必須物は赤で、非必須物は青で表示される。中性（青色）ｓｇＲＮＡの広がりが劇的に増加することに加えて、非常に低い表示で追加の完全なドロップアウトが観察される。これは、ボトルネックでｓｇＲＮＡが完全に失われたという事実による。対照的に、ＣＲＩＳＰＲ－ＳｔＡＲは、不活性なコンフォメーションで検出され活性コンフォメーションで失われたｓｇＲＮＡのみをスコア化する。
【図9-2】上記の説明に同じ。
【図9-3】上記の説明に同じ。
【図10-1】ライブラリー内のガイドごとの細胞数の減少における、２つの生物学的複製物の非必須物（青）と比較した必須物（赤）の曲線下面積分析。
【図10-2】上記の説明に同じ。
【図10-3】上記の説明に同じ。
【図10-4】上記の説明に同じ。
【図11-1】ライブラリーと比較した細胞数の複雑さの減少における受信者動作特性曲線下面積（ＡＵＲＯＣ）分析。ＣＲＩＳＰＲ ＳｔＡＲ分析（活性対不活性）は緑、従来の分析（活性対０日目）は黒。
【図11-2】上記の説明に同じ。
【図12】ピアソン相関、ライブラリーと比較した細胞数の複雑さの減少の曲線下のデルタ面積（ｄＡＵＣ）分析と受信者動作特性曲線下面積（ＡＵＲＯＣ）分析。黒い点は個々の複製物の値を示し、バーは２つの複製物の平均を示す。
【図13-1】オルガノイドスクリーニングの堅牢性の改良。ａ）ＵＭＩによって決定された２つの生物学的複製物の相関。密度プロットと積み上げヒストグラムは、各複製物のガイド分布を示す。ｂ）ランクで分類された上位のｓｇＲＮＡと相関する遺伝子（ｘ軸）について、同じ遺伝子を標的とするガイドの平均数（ｙ軸）。ｃ）ＵＭＩによって決定された２つの生物学的複製物における従来法（活性対０日目）とＣＲＩＳＰＲ－ＳｔＡＲ分析（活性対不活性）のボルケーノプロット（Volcano Plot）。上位の遺伝子は青色で表示される。他の複製物でスコア化された遺伝子は緑色で表示される。
【図13-2】上記の説明に同じ。
【図13-3】上記の説明に同じ。
【図14】インビトロ及びインビボのＣＲＩＳＰＲ－ＳｔＡＲスクリーニング結果の相関プロット。各ドットは１つの遺伝子の全てのｓｇＲＮＡを表し、ドットサイズはインビボ試料中の遺伝子当たりのＵＭＩの数を表す。積み上げヒストグラムは、各試料中のガイド分布を示している。インビボ試料は、２つの組み合わされた複製物である。必須遺伝子は赤で、非必須遺伝子は黒で示されている。必須遺伝子の大部分は、インビトロとインビボの両方で表示の低下を示している。
【図15】ＣＲＩＳＰＲ－ＳｔＡＲ構築物を有するＥＦ１ａプロモーターの制御下にあるＥＧＦＰ－Ｐ２Ａ－ＦＡＨ発現カセットを有する眠れる森の美女トランスポゾン（Sleeping beauty transposon）。（左）食塩水のみを注射し、ＮＴＢＣで維持し、注射の１４日後に採取したＦＡＨ－／－マウスの肝臓。（右）トランスポゾンとトランスポザーゼを注射し、注射の２５日後に採取したＦＡＨ－／－マウスの肝臓。核をＤＡＰＩ（青）で対比染色し、ＣＲＩＳＰＲ－ＳｔＡＲ構築物を含む増殖細胞をＥＧＦＰ（緑）で視覚化した。
【図16】ＣＲＩＳＰＲ－ＳｔＡＲ構築物を有するＥＦ１ａプロモーターの制御下にあるＫｒａｓＧ１２Ｄ－Ｐ２Ａ－ＦＡＨ発現カセットを有する眠れる森の美女トランスポゾン。（左）トランスポザーゼのみを注射し、注射の５０日後に採取したＷＴマウスの肝臓。（右）トランスポザーゼとトランスポザーゼを注射し、注射の５０日後に採取したＷＴマウスの肝臓。核をＤＡＰＩ（青）で対比染色し、ＣＲＩＳＰＲ－ＳｔＡＲ構築物を含む増殖細胞をＥＧＦＰ（緑）で視覚化した。
【実施例】
【0062】
実施例１：材料と方法
１．１ 材料
１．１ 材料
【0063】
１．１．１ 細胞株
タモキシフェン誘導性Ｃｒｅ－ＥＲＴマウス胚幹細胞ＡＮ３－１２（ＥＳＣ）
白金Ｅ細胞（Platinum-E cell）（Cell Biolabs RV-101）
Ｖｉｌ－ＣｒｅＥＲＴ２；Ｒｏｓａ－ＬＳＬ－Ｃａｓ９－２Ａ－ｅＧＦＰマウス小腸オルガノイド
タモキシフェン誘導性Ｃｒｅ－ＥＲＴマウス胚幹細胞ＡＮ３－１２（ＥＳＣ）
白金Ｅ細胞（Platinum-E cell）（Cell Biolabs RV-101）
Ｖｉｌ－ＣｒｅＥＲＴ２；Ｒｏｓａ－ＬＳＬ－Ｃａｓ９－２Ａ－ｅＧＦＰマウス小腸オルガノイド
【0064】
１．１．２ 細胞培養培地
マウス胚幹細胞培地（ＥＳＣＭ）：
４５０ｍｌのＤＭＥＭ、７５ｍｌのＦＣＳ（Sigma、025M3347）、５．５ｍｌのペニシリン－ストレプトマイシン（Sigma）、５．５ｍｌのＮＥＡＡ（Gibco）、５．５ｍｌのＬ－グルタミン（Gibco）、５．５ｍｌのピルビン酸ナトリウム（Sigma）、０．５５ｍｌのβ－メルカプトエタノール（Merck）、７．５μｌのＬＩＦ（２ｍｇ／ｍｌ）
マウス胚幹細胞培地（ＥＳＣＭ）：
４５０ｍｌのＤＭＥＭ、７５ｍｌのＦＣＳ（Sigma、025M3347）、５．５ｍｌのペニシリン－ストレプトマイシン（Sigma）、５．５ｍｌのＮＥＡＡ（Gibco）、５．５ｍｌのＬ－グルタミン（Gibco）、５．５ｍｌのピルビン酸ナトリウム（Sigma）、０．５５ｍｌのβ－メルカプトエタノール（Merck）、７．５μｌのＬＩＦ（２ｍｇ／ｍｌ）
【0065】
オルガノイド完全培地：
高度なＤＭＥＭ／Ｆ１２、ペニシリン／ストレプトマイシン、１０ｍｍｏｌ／Ｌヘペス、グルタマックス、１ｘＮ２、１ｘＢ２７（全てInvitrogenから）、及び１ｍｍｏｌ／Ｌ Ｎ－アセチルシステイン（Sigma）、組換えヒトＷｎｔ－３Ａ、マウスＥＧＦ、マウスノギン（noggin）、ヒトＲ－スポンジン－１、ニコチンアミド
高度なＤＭＥＭ／Ｆ１２、ペニシリン／ストレプトマイシン、１０ｍｍｏｌ／Ｌヘペス、グルタマックス、１ｘＮ２、１ｘＢ２７（全てInvitrogenから）、及び１ｍｍｏｌ／Ｌ Ｎ－アセチルシステイン（Sigma）、組換えヒトＷｎｔ－３Ａ、マウスＥＧＦ、マウスノギン（noggin）、ヒトＲ－スポンジン－１、ニコチンアミド
【0066】
１．１．３ 緩衝液
ラウリルサルコシン溶解緩衝液：
１０ｍＭトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．５（Sigma Aldrich）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ（Sigma Ａｌ－ｄｒｉｃｈ）、１０ｍＭ ＮａＣｌ（Sigma Aldrich）、０．５％Ｎ－ラウリルサルコシン（Sigma Aldrich）、１ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（Thermo Fisher Scientific）、０．１ｍｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅＡ（Qiagen）
ラウリルサルコシン溶解緩衝液：
１０ｍＭトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．５（Sigma Aldrich）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ（Sigma Ａｌ－ｄｒｉｃｈ）、１０ｍＭ ＮａＣｌ（Sigma Aldrich）、０．５％Ｎ－ラウリルサルコシン（Sigma Aldrich）、１ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（Thermo Fisher Scientific）、０．１ｍｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅＡ（Qiagen）
【0067】
２ＸＳＤＳ溶解緩衝液：
１０ｍＭトリス－ＨＣｌ、ｐＨ８（Sigma Aldrich）、１％ＳＤＳ（社内）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ（Sigma Aldrich）、１００ｍＭ ＮａＣｌ（Sigma Aldrich）、０．１ｍｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅＡ（Qiagen）
１０ｍＭトリス－ＨＣｌ、ｐＨ８（Sigma Aldrich）、１％ＳＤＳ（社内）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ（Sigma Aldrich）、１００ｍＭ ＮａＣｌ（Sigma Aldrich）、０．１ｍｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅＡ（Qiagen）
【0068】
１．１．４ プライマー
FW_G_CrSc_5: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAGATAACGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTC (配列番号1)
FW_G_CrSc_6: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAGCTTGCGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTC (配列番号2)
FW_G_CrSc_7: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAGGACACGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTC (配列番号3)
FW_G_CrSc_10: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACATCACTCGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTC (配列番号4)
FW_G_CrSc_12: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCAACACCGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTC (配列番号5)
FW_G_CrSc_13: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCACGCCCGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTC (配列番号6)
FW_G_CrSc_15: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCATTACCGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTC (配列番号7)
FW_G_CrSc_19: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCCCCAACGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTC (配列番号8)
FW_G_CrSc_20: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCGTCATCGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTC (配列番号9)
FW_G_CrSc_21: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCTATGCCGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTC (配列番号10)
FW_G_CrSc_22: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCTCCGCCGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTC (配列番号11)
FW_G_CrSc_39: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTGCCGACGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTC (配列番号12)
FW_G_CrSc_41: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTGTAGACGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTC (配列番号13)
FW_G_CrSc_42: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTTGCCACGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTC (配列番号14)
RV_G_CrSc: CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACCGTTGATGAGTAG (配列番号15)
NGS_U6: CGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCG (配列番号16)
FW_G_CrSc_5: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAGATAACGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTC (配列番号1)
FW_G_CrSc_6: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAGCTTGCGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTC (配列番号2)
FW_G_CrSc_7: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAGGACACGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTC (配列番号3)
FW_G_CrSc_10: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACATCACTCGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTC (配列番号4)
FW_G_CrSc_12: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCAACACCGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTC (配列番号5)
FW_G_CrSc_13: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCACGCCCGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTC (配列番号6)
FW_G_CrSc_15: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCATTACCGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTC (配列番号7)
FW_G_CrSc_19: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCCCCAACGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTC (配列番号8)
FW_G_CrSc_20: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCGTCATCGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTC (配列番号9)
FW_G_CrSc_21: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCTATGCCGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTC (配列番号10)
FW_G_CrSc_22: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCTCCGCCGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTC (配列番号11)
FW_G_CrSc_39: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTGCCGACGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTC (配列番号12)
FW_G_CrSc_41: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTGTAGACGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTC (配列番号13)
FW_G_CrSc_42: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTTGCCACGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTC (配列番号14)
RV_G_CrSc: CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACCGTTGATGAGTAG (配列番号15)
NGS_U6: CGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCG (配列番号16)
【0069】
１．２ 方法
１．２．１ マウス胚幹細胞培養
細胞はＥＳＣＭで培養され、これは毎日交換された。コンフルエントになった時、細胞をトリプシン処理し、１：１０に分割した。４－ヒドロキシタモキシフェン（４ＯＨ）処理のために、培地に０．５μＭ ４ＯＨ（Sigma）を毎日補足した。
１．２．１ マウス胚幹細胞培養
細胞はＥＳＣＭで培養され、これは毎日交換された。コンフルエントになった時、細胞をトリプシン処理し、１：１０に分割した。４－ヒドロキシタモキシフェン（４ＯＨ）処理のために、培地に０．５μＭ ４ＯＨ（Sigma）を毎日補足した。
【0070】
１．２．２ 小腸オルガノイド培養
小腸のオルガノイドはＶｉｌ－ＣｒｅＥＲＴ２から確立された；Ｒｏｓａ－ＬＳＬ－Ｃａｓ９－２Ａ－ｅＧＦＰ（ホモ接合性）マウス。オルガノイドの樹立のために、洗浄及び分離後、陰窩をマウス小腸上皮から単離した。単離された陰窩は、２０μｌの液滴当たり１５０～２００の陰窩密度でマトリゲル（Corning）に再懸濁された。液滴を４８ウェルプレート（Corning）に接種し、各ウェルで２５０μｌの培地を使用した。最初の２つの継代では、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤（Ｙ－２７６３２、R&D Systems）を補足した完全オルガノイド培地で細胞を培養した。オルガノイドは、機械的ピペッティングにより５～７日ごとに１：５～１：６の比率で分割された。
小腸のオルガノイドはＶｉｌ－ＣｒｅＥＲＴ２から確立された；Ｒｏｓａ－ＬＳＬ－Ｃａｓ９－２Ａ－ｅＧＦＰ（ホモ接合性）マウス。オルガノイドの樹立のために、洗浄及び分離後、陰窩をマウス小腸上皮から単離した。単離された陰窩は、２０μｌの液滴当たり１５０～２００の陰窩密度でマトリゲル（Corning）に再懸濁された。液滴を４８ウェルプレート（Corning）に接種し、各ウェルで２５０μｌの培地を使用した。最初の２つの継代では、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤（Ｙ－２７６３２、R&D Systems）を補足した完全オルガノイド培地で細胞を培養した。オルガノイドは、機械的ピペッティングにより５～７日ごとに１：５～１：６の比率で分割された。
【0071】
１．２．３ 単細胞由来クローン
ＥＳＣをトリプシン処理し、カウントした。５００個の細胞を１５ｃｍディッシュ（Sigma Aldrich）に接種した。ＥＳＣＭは２日ごとに交換した。コロニーを１０日間増殖させた後、９６Ｕウェルプレート（Thermo Fisher）に採取し、トリプシン処理し、９６Ｆウェルプレート（Thermo Fisher）に分割した。細胞をコンフルエントになるまで培養し、７５μｌのラウリルサルコシン溶解緩衝液で３７℃で一晩溶解した。増幅には、１μｌの溶解物を２５μｌのＰＣＲ反応で使用した（９５℃で３分、［９５℃で２０秒、６５℃（－０．３℃／サイクル）で２０秒、７２℃で３０秒］×２３、［９５℃で２０秒、５８℃で２０秒、７２℃で３０秒］×３０、７２℃で３分、１２℃で∞）。
ＥＳＣをトリプシン処理し、カウントした。５００個の細胞を１５ｃｍディッシュ（Sigma Aldrich）に接種した。ＥＳＣＭは２日ごとに交換した。コロニーを１０日間増殖させた後、９６Ｕウェルプレート（Thermo Fisher）に採取し、トリプシン処理し、９６Ｆウェルプレート（Thermo Fisher）に分割した。細胞をコンフルエントになるまで培養し、７５μｌのラウリルサルコシン溶解緩衝液で３７℃で一晩溶解した。増幅には、１μｌの溶解物を２５μｌのＰＣＲ反応で使用した（９５℃で３分、［９５℃で２０秒、６５℃（－０．３℃／サイクル）で２０秒、７２℃で３０秒］×２３、［９５℃で２０秒、５８℃で２０秒、７２℃で３０秒］×３０、７２℃で３分、１２℃で∞）。
【0072】
１．２．４ レトロウイルスベクターとＥＳＣ感染
ＣＲＩＳＰＲ－ＳｔＡＲライブラリーを、製造業者の推奨に従って、白金Ｅ細胞にパッケージ化した。３億個のＥＳＣを、２μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下でウイルス含有上清の１：１０希釈液で感染させた。感染の２４時間後、それぞれ１μｇ／ｍｌのブラストサイジンとピューロマイシンを用いて、感染細胞の選択を開始した。感染多重度を推定するために、１０，０００個の細胞を１５ｃｍの皿にプレーティングし、Ｇ４１８で選択した。比較のために、さらに１，０００個の細胞をプレーティングし、Ｇ４１８選択は行なわなかった。１０日目にコロニーをカウントした。
ＣＲＩＳＰＲ－ＳｔＡＲライブラリーを、製造業者の推奨に従って、白金Ｅ細胞にパッケージ化した。３億個のＥＳＣを、２μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下でウイルス含有上清の１：１０希釈液で感染させた。感染の２４時間後、それぞれ１μｇ／ｍｌのブラストサイジンとピューロマイシンを用いて、感染細胞の選択を開始した。感染多重度を推定するために、１０，０００個の細胞を１５ｃｍの皿にプレーティングし、Ｇ４１８で選択した。比較のために、さらに１，０００個の細胞をプレーティングし、Ｇ４１８選択は行なわなかった。１０日目にコロニーをカウントした。
【0073】
１．２．５ 細胞培養スクリーン
ＥＳＣにレトロウイルスＣＲＩＳＰＲ－ＳｔＡＲベクターを感染させ、ブラストサイジン及びピューロマイシン耐性について３日間選択した。ボトルネックを模倣するために、細胞を完全にカウントし、ライブラリー中で１細胞／ｓｇＲＮＡ（５８７０細胞）、４細胞／ｓｇＲＮＡ、１６細胞／ｓｇＲＮＡ、６４細胞／ｓｇＲＮＡ、２５６細胞／ｓｇＲＮＡ、１０２４細胞／ｓｇＲＮＡの密度で接種した。７日間にわたって、細胞を等密度まで増殖させた。組換えを誘導するために、ＥＳＣを５μＭの４ＯＨで３日間処理した。これらをさらに１４日間維持した。
ＥＳＣにレトロウイルスＣＲＩＳＰＲ－ＳｔＡＲベクターを感染させ、ブラストサイジン及びピューロマイシン耐性について３日間選択した。ボトルネックを模倣するために、細胞を完全にカウントし、ライブラリー中で１細胞／ｓｇＲＮＡ（５８７０細胞）、４細胞／ｓｇＲＮＡ、１６細胞／ｓｇＲＮＡ、６４細胞／ｓｇＲＮＡ、２５６細胞／ｓｇＲＮＡ、１０２４細胞／ｓｇＲＮＡの密度で接種した。７日間にわたって、細胞を等密度まで増殖させた。組換えを誘導するために、ＥＳＣを５μＭの４ＯＨで３日間処理した。これらをさらに１４日間維持した。
【0074】
１．２．６ オルガノイドスクリーン
スクリーンの調製のために、オルガノイドを１０ｃｍディッシュの形態（コーニング）で拡張した。各１０ｃｍディッシュに５０～５５滴を接種し、各液滴は約１００個のオルガノイドを含み、そして合計１０個の１０ｃｍディッシュをスクリーンに使用した。各ディッシュに１０ｍｌの完全培地を補足し、２日ごとに新しいものに交換した。ウイルス感染用のオルガノイドを調製するために、オルガノイドをまず機械的に小さな断片に分解した。遠心分離（５００ｇ×５分）して上清（古いマトリゲルを含む）を除去した後、細胞をＴｒｙｐＬＥ（Gibco）に再懸濁し、３７℃で５～８細胞の凝集塊に分離させた。細胞を３００ｇで３分間遠心分離した。上清を除去した後、細胞ペレットをウイルス含有培地に再懸濁し、４８ウェルプレートに分注した。プレートをパラフィルムで密封し、３７℃で１時間スピノキュレーション（spinoculation）を行った。スピノキュレーション後、パラフィルムを取り除き、プレートを３７℃で６時間インキュベートした。その後、細胞をエッペンドルフチューブに移し、遠心分離した（３００ｇｘ３分）。細胞ペレットをマトリゲルに再懸濁し、１０ｃｍディッシュに接種した。３日間の回復後、感染したオルガノイドを、ブラストサイジン耐性について１μｇ／ｍｌで８日間選択した。続いて、オルガノイドを分離させ、完全培地を４ＯＨで６時間置換した。その後、オルガノイドを分割することなく完全培地で１２日間培養した。培地は３日ごとに新しいものに交換した。
スクリーンの調製のために、オルガノイドを１０ｃｍディッシュの形態（コーニング）で拡張した。各１０ｃｍディッシュに５０～５５滴を接種し、各液滴は約１００個のオルガノイドを含み、そして合計１０個の１０ｃｍディッシュをスクリーンに使用した。各ディッシュに１０ｍｌの完全培地を補足し、２日ごとに新しいものに交換した。ウイルス感染用のオルガノイドを調製するために、オルガノイドをまず機械的に小さな断片に分解した。遠心分離（５００ｇ×５分）して上清（古いマトリゲルを含む）を除去した後、細胞をＴｒｙｐＬＥ（Gibco）に再懸濁し、３７℃で５～８細胞の凝集塊に分離させた。細胞を３００ｇで３分間遠心分離した。上清を除去した後、細胞ペレットをウイルス含有培地に再懸濁し、４８ウェルプレートに分注した。プレートをパラフィルムで密封し、３７℃で１時間スピノキュレーション（spinoculation）を行った。スピノキュレーション後、パラフィルムを取り除き、プレートを３７℃で６時間インキュベートした。その後、細胞をエッペンドルフチューブに移し、遠心分離した（３００ｇｘ３分）。細胞ペレットをマトリゲルに再懸濁し、１０ｃｍディッシュに接種した。３日間の回復後、感染したオルガノイドを、ブラストサイジン耐性について１μｇ／ｍｌで８日間選択した。続いて、オルガノイドを分離させ、完全培地を４ＯＨで６時間置換した。その後、オルガノイドを分割することなく完全培地で１２日間培養した。培地は３日ごとに新しいものに交換した。
【0075】
１．２．７ ＤＮＡ採取とＮＧＳ試料調製
試料当たり６０００万個の細胞を採取し、１ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ及び０．１ｍｇ／ｍｌ ＲＮＡｓｅＡを含むＳＤＳ溶解緩衝液で溶解した。ゲノムＤＮＡをフェノールとクロロフォルムで抽出し、１容量のイソプロパノールで沈殿させた。組み込まれたｓｇＲＮＡ構築物はＰａｃＩ制限部位によりフランキングされている。試料をＰａｃＩで４８時間消化し、最後の１２時間ＢｂｓＩで同時消化した。各試料は、１反応当たり１μｇのＤＮＡを含む９６回の個別の５０μｌの反応でＰＣＲ増幅された（９５℃で３分、［９５℃で１０秒、５９℃で２０秒、７２℃で３０秒］×３６、７２℃で３分、４℃で∞）。前進プライマーは各試料に固有であり、ＮＧＳ後の逆多重化のための６ｂｐ実験インデックスを含有した（AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-NNNNNN-CGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTC（配列番号17）、ここで６ｂｐのＮＮＮＮＮＮ配列は、ＮＧＳ後に試料を逆多重化するために使用される特定の実験インデックスを表す）。逆進プライマーは各試料で同じであった。ＰＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動によって精製及びサイズ分離された。２つの組換え産物を別々に切り出し、ミニ溶出カラムで精製し、等量で混合した。この試料は、イルミナ（Illumina）HiSeqV4 SR100二重インデックス配列決定実験で配列決定された。ｓｇＲＮＡは、カスタムリードプライマーを使用して配列決定された。活性ガイドと不活性ガイドを区別するために、第１のｌｏｘ部位の下流の配列（活性の場合はＴＣＡＧＣＡＴＡＧＣ、不活性の場合はＴＴＴＴＴＴＴ）が選択された。
試料当たり６０００万個の細胞を採取し、１ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ及び０．１ｍｇ／ｍｌ ＲＮＡｓｅＡを含むＳＤＳ溶解緩衝液で溶解した。ゲノムＤＮＡをフェノールとクロロフォルムで抽出し、１容量のイソプロパノールで沈殿させた。組み込まれたｓｇＲＮＡ構築物はＰａｃＩ制限部位によりフランキングされている。試料をＰａｃＩで４８時間消化し、最後の１２時間ＢｂｓＩで同時消化した。各試料は、１反応当たり１μｇのＤＮＡを含む９６回の個別の５０μｌの反応でＰＣＲ増幅された（９５℃で３分、［９５℃で１０秒、５９℃で２０秒、７２℃で３０秒］×３６、７２℃で３分、４℃で∞）。前進プライマーは各試料に固有であり、ＮＧＳ後の逆多重化のための６ｂｐ実験インデックスを含有した（AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-NNNNNN-CGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTC（配列番号17）、ここで６ｂｐのＮＮＮＮＮＮ配列は、ＮＧＳ後に試料を逆多重化するために使用される特定の実験インデックスを表す）。逆進プライマーは各試料で同じであった。ＰＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動によって精製及びサイズ分離された。２つの組換え産物を別々に切り出し、ミニ溶出カラムで精製し、等量で混合した。この試料は、イルミナ（Illumina）HiSeqV4 SR100二重インデックス配列決定実験で配列決定された。ｓｇＲＮＡは、カスタムリードプライマーを使用して配列決定された。活性ガイドと不活性ガイドを区別するために、第１のｌｏｘ部位の下流の配列（活性の場合はＴＣＡＧＣＡＴＡＧＣ、不活性の場合はＴＴＴＴＴＴＴ）が選択された。
【0076】
実施例２：概念の概要
遺伝子スクリーンでは、ゲノム編集は３つの大きな効果をもたらす可能性がある：それは、特定のｓｇＲＮＡを標的とする細胞に、増殖の利益をもたらすか、増殖の不利益をもたらすか、又は影響を与えない。増殖のいい点は集団内の濃縮につながる。増殖の悪い点は欠失につながる。
遺伝子スクリーンでは、ゲノム編集は３つの大きな効果をもたらす可能性がある：それは、特定のｓｇＲＮＡを標的とする細胞に、増殖の利益をもたらすか、増殖の不利益をもたらすか、又は影響を与えない。増殖のいい点は集団内の濃縮につながる。増殖の悪い点は欠失につながる。
【0077】
プールされたＣＲＩＳＰＲスクリーンは、通常ｓｇＲＮＡごとに３００～１，０００の個別に標的化された細胞の複雑さで維持される。これにより、十分な数の固有の編集イベントが、集団の大幅な変化を呼び出すことを可能にする。しかし、この高レベルの複雑さをいつも維持できるとは限らない。非効率的な感染又は限定された細胞数又は分化によって引き起こされるボトルネックにシステムが遭遇した場合、又は細胞が異なる速度で回復し、ライブラリー表示が減少する場合である。これを説明するために、ＣＲＩＳＰＲスクリーンの前後のバーコードの読み取り数の間のｌｏｇ2倍数の変化（ＬＦＣ）を計算した。バーコードの数は、異なって形質転換された細胞の数を表し、すなわちガイドごとのバーコードの数は細胞／ｓｇＲＮＡの数を表す。
【0078】
複雑さが減少するにつれて、存在するバーコードが少なくなり、集団の変化がより大きな影響を与えるため、ＬＦＣの分布はより広くなる。複雑さがさらに低下すると分布は二峰性になり、強いＬＦＣを有する２番目のピークが現れる（図１）。このピークは、リード０のガイドが欠落しているためである。分析では、これらのガイドは、強い欠失表示型を引き起こすガイドと間違えられ、従ってスクリーニング結果を歪める。これは、複雑さが不十分なため、スクリーン前のガイドの読み取り数がスクリーン後の読み取り数と匹敵しなくなり、従来法の分析が失敗することを意味する。
【0079】
ＣＲＩＳＰＲスクリーンにおけるボトルネックでの不十分なライブラリー表示によって引き起こされる問題は、本発明によって克服することができる（図２に示されている）。
【0080】
実施例３：ｓｇＲＮＡ構築物
２セットの織り混ざったｌｏｘ部位により、ＣＲＩＳＰＲ ＳｔＡＲシステムが、２つの異なる組換え産物を生じさせる可能性がある：不活性ｓｇＲＮＡ又は活性ｓｇＲＮＡ。ベクターはｓｇＲＮＡ（ライブラリー）を含み、その後にｔｒａｃｒ領域に２対のｌｏｘ部位が続く。ｌｏｘ部位の間には、ブラストサイジン選択カセットがあり、例えばウイルスパッケージング中のＣｒｅ活性又は組換えイベントによる早すぎる活性化を防ぐ。最後に、これは、固有の分子識別子（ＵＭＩ）として機能する一連のランダムヌクレオチドを含む。ｌｏｘＰ部位の組換えは活性ｓｇＲＮＡをもたらす（図３Ａ）が、ｌｏｘ５１７１部位の組換えはｔｒａｃｒの終結と排除をもたらす。結果として、ｓｇＲＮＡは不活性になる（図３Ｂ）。２つの組換えイベントは相互に排他的である。
２セットの織り混ざったｌｏｘ部位により、ＣＲＩＳＰＲ ＳｔＡＲシステムが、２つの異なる組換え産物を生じさせる可能性がある：不活性ｓｇＲＮＡ又は活性ｓｇＲＮＡ。ベクターはｓｇＲＮＡ（ライブラリー）を含み、その後にｔｒａｃｒ領域に２対のｌｏｘ部位が続く。ｌｏｘ部位の間には、ブラストサイジン選択カセットがあり、例えばウイルスパッケージング中のＣｒｅ活性又は組換えイベントによる早すぎる活性化を防ぐ。最後に、これは、固有の分子識別子（ＵＭＩ）として機能する一連のランダムヌクレオチドを含む。ｌｏｘＰ部位の組換えは活性ｓｇＲＮＡをもたらす（図３Ａ）が、ｌｏｘ５１７１部位の組換えはｔｒａｃｒの終結と排除をもたらす。結果として、ｓｇＲＮＡは不活性になる（図３Ｂ）。２つの組換えイベントは相互に排他的である。
【0081】
このシステムでは、ＣＲＩＳＰＲスクリーンの最終的な集団内で、活性なガイドを不活性な内部対照と比較することができる。しかし、活性な組換えと不活性な組換えの比率がかなり類似している場合は、２つの組換え産物の読み取り数を比較することが有益である。ほとんどの場合、ｌｏｘＰ（活性）とｌｏｘ５１７１（不活性）組み換えの比率は、１０：９０～９０：１０の間でなければならない。
【0082】
一方のｌｏｘＰと他方のｌｏｘＰ対間の組換え確率は、遺伝子座での距離やＤＮＡ構造（１次、２次、３次）などのいくつかの要因に依存する。従って、予測することは困難である。組換え確率の単一細胞定量により、元の構築物（ＳｔＡＲ１）が３３％の活性ｓｇＲＮＡと６６％の不活性ｓｇＲＮＡの組換え比をもたらすことが明らかになった。このような比率は、理想的なダイナミックレンジを提供するため、スクリーンが不活性ｓｇＲＮＡよりも活性ｓｇＲＮＡの相対的な濃縮を追跡することを望む場合には、理想的である。しかし、必須遺伝子の分析では、活性ｓｇＲＮＡと不活性ｓｇＲＮＡの等しい比率で始めるか、又は活性ｓｇＲＮＡへのバイアスで始めても望ましい。従って、ＳｔＡＲ３及びＳｔＡＲ４は、相対距離、１次配列の変更、及び１つの追加のｌｏｘＰ部位の導入によって開発された（図４）。そうすることで、様々な組換え比をもたらす一連の構築物を生成することに成功した。
活性 不活性
ＳｔＡＲ１（配列番号１８）： ３３％ ６６％
ＳｔＡＲ３（配列番号１９）： ９０％ １０％
ＳｔＡＲ４（配列番号２０）： ５０％ ５０％
活性 不活性
ＳｔＡＲ１（配列番号１８）： ３３％ ６６％
ＳｔＡＲ３（配列番号１９）： ９０％ １０％
ＳｔＡＲ４（配列番号２０）： ５０％ ５０％
【0083】
目的の実験に応じて、理想的設定は異なる。
【0084】
ｌｏｘ部位のいずれかの対がいかに効率的に組み換えするかを決定するために、ｓｇＲＮＡ感染細胞を４ＯＨで３日間処理し、続いてクローン密度で接種した（図５）。この時点で、組換えが起こり、これらのクローンは活性又は不活性なガイドを発現した。これらを同定するために、ガイド構築物をフランキングするプライマーを使用してＰＣＲを行った。組換え産物は、活性の場合は５８０ｂｐ、不活性の場合は５４２ｂｐである。各バンドサイズの頻度をカウントした。最も重要なことは、組み換えられていないクローンが見つからなかったことであり、これにより、細胞株での安定したＣｒｅ発現が確認される。上記の組換え頻度が分かった。ＳｔＡＲ１の場合、２８８個の全クローンのうち、組換えにより９７個の活性ｓｇＲＮＡと１７２個の不活性ｓｇＲＮＡが生成された。汚染された混合クローン又は二重感染のいずれかが原因である２１の二重バンドが見つかった。これらは両方のイベントでカウントされた。
【0085】
実施例４：細胞培養
【0086】
４．１ 実験計画
ＣＲＩＳＰＲ－ＳｔＡＲがボトルネックスクリーンにおけるノイズを克服することを確認するために、制御されたボトルネックを細胞培養実験で導入した。従って、Ｃａｓ９発現カセットとＣｒｅＥＲＴ２発現構築物を安定して組み込んだマウス胚幹細胞に、１，２４５個の遺伝子を標的とする５，８７０個のｓｇＲＮＡのレトロウイルスｓｇＲＮＡ ＳｔＡＲ１タイプライブラリーを感染させた（表１）。
ＣＲＩＳＰＲ－ＳｔＡＲがボトルネックスクリーンにおけるノイズを克服することを確認するために、制御されたボトルネックを細胞培養実験で導入した。従って、Ｃａｓ９発現カセットとＣｒｅＥＲＴ２発現構築物を安定して組み込んだマウス胚幹細胞に、１，２４５個の遺伝子を標的とする５，８７０個のｓｇＲＮＡのレトロウイルスｓｇＲＮＡ ＳｔＡＲ１タイプライブラリーを感染させた（表１）。
【0087】
【表1】
【0088】
細胞の１５％を感染させて、単一感染を確実にした。ウイルス組み込みについて選択後、細胞をカウント及び希釈して、制御されたボトルネックを導入した。複雑さは、１細胞／ｓｇＲＮＡ（５，８７０細胞）、４細胞／ｓｇＲＮＡ、１６細胞／ｓｇＲＮＡ、６４細胞／ｓｇＲＮＡ、２５６細胞／ｓｇＲＮＡ、１，０２４細胞／ｓｇＲＮＡに低下した。細胞は、７日間で１，０００細胞／ｓｇＲＮＡを超える等密度まで増殖された。続いて、細胞を４ＯＨで処理してＣｒｅ組換えを誘導し、細胞をさらに１４日間維持した。実験は２つの独立した複製物で実施された（図６）。
【0089】
１４日間後、ゲノムＤＮＡを抽出し、構築物をフランキングする切断部位を使用してＰａｃＩで消化した。次に、各試料について実験インデックスとイルミナアダプターを含むプライマーを使用して、断片化されたゲノムからＰＣＲを介してガイド構築物を増幅し、こうしてＰＣＲ産物の直接配列決定が可能になった。両方の組換え産物を別々にゲル抽出し、１：１の比率で混合した。次に、このプールを配列決定した。
【0090】
４．２ バイオインフォマティックパイプライン
ＮＧＳリードをマッピングした後、第１のｌｏｘＰ部位のすぐ下流にある１０ｂｐのストレッチを使用して、活性ガイドを不活性ガイド（活性はＴＣＡＧＣＡＴＡＧＣ、不活性はＴＴＴＴＴＴＴ）から生物情報学的に区別した。活性及び不活性の組換え産物を１：１の比率で混合した後、配列決定をし、不活性からのリードが活性ガイドからのリードよりも２倍多いことがわかり、これは、不活性な構築物の配列決定がより良好であることを示している。それにもかかわらず、この状況が分析に不利益であることはない。
ＮＧＳリードをマッピングした後、第１のｌｏｘＰ部位のすぐ下流にある１０ｂｐのストレッチを使用して、活性ガイドを不活性ガイド（活性はＴＣＡＧＣＡＴＡＧＣ、不活性はＴＴＴＴＴＴＴ）から生物情報学的に区別した。活性及び不活性の組換え産物を１：１の比率で混合した後、配列決定をし、不活性からのリードが活性ガイドからのリードよりも２倍多いことがわかり、これは、不活性な構築物の配列決定がより良好であることを示している。それにもかかわらず、この状況が分析に不利益であることはない。
【0091】
各細胞が単一のガイド構築物で感染された。すなわち、全てのＵＭＩは１つのクローンを表し、ガイドごとのＵＭＩの数は、ガイドごとの細胞の数に等しくなり、これは、ガイドごとの感染した細胞の数の直接的な尺度である。実証実験での細胞希釈が十分であったかどうかを確認するために、最も複雑度の低い試料（ガイドごと１つの細胞）の不活性ガイドごとのＵＭＩ数の中央値を計算した。しかし、ガイドごとに理論上の１ ＵＭＩの代わりに、はるかに大きい数が見つかった。これには２つの理由があると我々は仮定した：まず、これらのＵＭＩのほとんどは１つ又は２つのリードしかなく、これは、配列決定における塩基置換エラーが原因である可能性がある；第２に、ＵＭＩごとのリード数の分布を計算すると、二峰性の分布が見つかった。この分布の低いリード率からｓｇＲＮＡ－ＵＭＩの組み合わせを見ると、異なる試料で高いリード数を有する同じｓｇＲＮＡ－ＵＭＩの組み合わせを見つけることができた。これは、イルミナベースの配列決定における既知の問題であるインデックスホッピングを示唆しており、ここで、隣接するクラスター間のインデックスが間違った試料に割り当てられている。より複雑性の高い試料では、ガイドごとに真のＵＭＩが多数存在するため、これらの問題は無視でき、従って、全体としてこれらのエラーによる影響はごくわずかである。従って、これは複雑度の低い試料（ｓｇＲＮＡ当たり１～１６個の細胞）にのみ関連する。ここで、真のリードはリード数が多い明確な分布を有しているが、エラーはリードが少ない分布を有する。
【0092】
真のリードをエラーから分離するために、複雑度の低い各試料のこの二峰性のリード分布の局所的最小値を閾値として定義して、それ以下の全てのリードを破棄した。活性ガイドのＵＭＩのリード数は表現型を表すことができるため、不活性ガイドにカットオフのみを設定し、活性ガイドのｓｇＲＮＡ－ＵＭＩの組み合わせをマッピングし、これにより、存在しないＵＭＩのデータセットがさらに除去された。
【0093】
最後に、ＣＲＩＳＰＲ ＳｔＡＲの性能を従来のＣＲＩＳＰＲスクリーン分析に対してベンチマーク検査するために、両方の方法のＬＦＣを計算した：活性ガイド対従来の分析の０日目、及びＣＲＩＳＰＲ－ＳｔＡＲ分析の活性ガイド対不活性ガイド（図７）。
【0094】
４．３ ベンチマーク検査
従来のスクリーニング方法と比較したＣＲＩＳＰＲ－ＳｔＡＲの性能をベンチマーク検査するために、複製物間のピアソン係数、デルタ曲線下面積（ｄＡＵＣ）、及び受信者動作特性曲線下面積（ＡＵＲＯＣ）を計算した。
従来のスクリーニング方法と比較したＣＲＩＳＰＲ－ＳｔＡＲの性能をベンチマーク検査するために、複製物間のピアソン係数、デルタ曲線下面積（ｄＡＵＣ）、及び受信者動作特性曲線下面積（ＡＵＲＯＣ）を計算した。
【0095】
４．３．１ 複製物相関
我々の結果の再現性を試験するために、必須ガイドと非必須ガイドの２つの生物学的複製物間の相関係数を計算した。これを行うために、同じ細胞株で実行された２つの独立したスクリーンのデータを使用して、高い複雑性の同じライブラリーを用いて、必須遺伝子（赤）を定義した。各ガイドの欠失中央値を計算し、ＬＦＣが－３未満のガイドを必須物として定義した。一方、非必須物（青）は、同じデータセットからの最も欠失の少ないガイドの必須物と同じ数として定義した。次に、２つの独立した複製物でガイドのＬＦＣを相関させ、必須物及び非必須物に基づいてピアソン係数を決定した。データ分布をよりよく理解するために、各複製物の必須データと残りのデータの密度と比率を計算した（図８及び９、サイド密度プロット）。最後に、各複製物に存在するｓｇＲＮＡの数と、両方の複製物間の重複をカウントした。
我々の結果の再現性を試験するために、必須ガイドと非必須ガイドの２つの生物学的複製物間の相関係数を計算した。これを行うために、同じ細胞株で実行された２つの独立したスクリーンのデータを使用して、高い複雑性の同じライブラリーを用いて、必須遺伝子（赤）を定義した。各ガイドの欠失中央値を計算し、ＬＦＣが－３未満のガイドを必須物として定義した。一方、非必須物（青）は、同じデータセットからの最も欠失の少ないガイドの必須物と同じ数として定義した。次に、２つの独立した複製物でガイドのＬＦＣを相関させ、必須物及び非必須物に基づいてピアソン係数を決定した。データ分布をよりよく理解するために、各複製物の必須データと残りのデータの密度と比率を計算した（図８及び９、サイド密度プロット）。最後に、各複製物に存在するｓｇＲＮＡの数と、両方の複製物間の重複をカウントした。
【0096】
ｓｇＲＮＡ当たり６４～１，０２４細胞という高い複雑さで、従来の分析とＣＲＩＳＰＲ ＳｔＡＲ分析の両方で、複製物間の良好な相関関係が見つかった。データの分布は、ＣＲＩＳＰＲ ＳｔＡＲを使用するよりも従来の分析を使用する方がわずかに広いが、必須物は非必須物から明確に区別できる。相関係数の範囲は、従来の分析では０．７２～０．７５、そしてＣＲＩＳＰＲ－ＳｔＡＲでは０．８０～０．８４の範囲である（図８）。この均一なシステムでは、ｓｇＲＮＡ当たり６４細胞は、従来の分析を使用するＣＲＩＳＰＲスクリーンには十分な複雑さのようである。
【0097】
ｓｇＲＮＡ当たり１～１６個の細胞の複雑度の低い従来の分析を使用して、必須ガイドと非必須ガイドの両方の広がりが増加していることが分かった。ｓｇＲＮＡ試料当たり４個と１個の細胞では、データの分布は二峰性になる。これは、０日目と比較して強い欠失を引き起こす片方又は両方の複製物におけるリードが０のｓｇＲＮＡが原因である。この欠失は、ガイドによって引き起こされた表現型が原因であるか、又は最終的な集団中のガイドの不在が原因であり得る。特にボトルネックに遭遇するシステムでは、ガイドが失われる可能性がある。従来の分析では、欠落しているガイドと表現型とを区別することはできない。対照的に、ＣＲＩＳＰＲ ＳｔＡＲ分析を使用すると、活性なガイドの存在量は、最終的な集団内の不活性な対照ガイドの存在量と比較される。従って、ボトルネックの影響で失われたガイドは分析から除外される。結果として得られるガイドの集団は小さくなり、ＬＦＣはガイドによって引き起こされる表現型によるものである。その結果、最も複雑度の低い試料（ｓｇＲＮＡ当たり１個の細胞）では、従来の分析を使用すると、相関は０．１６に減少するが、ＣＲＩＳＰＲ ＳｔＡＲ分析では０．８３で、最も複雑な試料と同じくらい高くなる（図９）。
【0098】
結論として、従来の分析を使用して、複雑さが減少すると再現性が低いことがわかった。これは、欠落したガイドにより引き起こされたデータの拡散が広がりが原因である。ＣＲＩＳＰＲ ＳｔＡＲを使用すると、欠落しているガイドが除去され、現在のガイドのみが考慮される。従って、結果は、複雑さが低くても再現性が高くなる。
【0099】
４．３．２ ｄＡＵＣ
集団内で定義されたカテゴリーのｄＡＵＣを計算すると、各カテゴリーのメンバーを互いにどれだけうまく分離できるかがわかる。これを使用して、必須物と非必須物との分離について、ＣＲＩＳＰＲ ＳｔＡＲの性能を従来の分析と比較してベンチマーク検査した。このために、上記で定義したように、必須ガイドと非必須ガイドを新しいリストにサブセット化し、ＬＦＣによって、最も欠失したものから最も豊富なものへとランク付けした。次に、ランク付けされたリスト全体のカテゴリー内の各ガイドの存在の累積率を計算した。言い換えれば、必須ガイドがスコア化されると、必須カーブが上がる。非必須ガイドについても同じことが言える。ガイドが効果を発揮する場合は、必須物をリストの一番上にランク付けする必要があり、これにより、急激に増加し、次にプラトーがあり、ここで非必須物はスコア化されない。一方、非必須物はリストの最後にランク付けされ、これはプラトーとそれに続く急激な増加によって表される。理想的には、両方のカテゴリーが互いに明確に分離されていることを期待されるであろう。従って、より良い方法はより良い分離を示す。同等の尺度を得るために、非必須物のＡＵＣから必須物のＡＵＣを差し引いてｄＡＵＣを計算した。全ての必須要素が非必須要素から分離された場合の理想的なスコアは０．５になるであろう。ランダム試料は対角線になり、ｄＡＵＣスコアは０になる。
集団内で定義されたカテゴリーのｄＡＵＣを計算すると、各カテゴリーのメンバーを互いにどれだけうまく分離できるかがわかる。これを使用して、必須物と非必須物との分離について、ＣＲＩＳＰＲ ＳｔＡＲの性能を従来の分析と比較してベンチマーク検査した。このために、上記で定義したように、必須ガイドと非必須ガイドを新しいリストにサブセット化し、ＬＦＣによって、最も欠失したものから最も豊富なものへとランク付けした。次に、ランク付けされたリスト全体のカテゴリー内の各ガイドの存在の累積率を計算した。言い換えれば、必須ガイドがスコア化されると、必須カーブが上がる。非必須ガイドについても同じことが言える。ガイドが効果を発揮する場合は、必須物をリストの一番上にランク付けする必要があり、これにより、急激に増加し、次にプラトーがあり、ここで非必須物はスコア化されない。一方、非必須物はリストの最後にランク付けされ、これはプラトーとそれに続く急激な増加によって表される。理想的には、両方のカテゴリーが互いに明確に分離されていることを期待されるであろう。従って、より良い方法はより良い分離を示す。同等の尺度を得るために、非必須物のＡＵＣから必須物のＡＵＣを差し引いてｄＡＵＣを計算した。全ての必須要素が非必須要素から分離された場合の理想的なスコアは０．５になるであろう。ランダム試料は対角線になり、ｄＡＵＣスコアは０になる。
【0100】
ＣＲＩＳＰＲ－ＳｔＡＲ分析のｄＡＵＣは、０．４５～０．４７の範囲で安定している。最も複雑度の低い試料でも、ｄＡＵＣはそれぞれ０．４６と０．４５である。対照的に、従来の分析を使用すると、複雑さが低下し、必須物と非必須物を明確に分離できなくなる。上記のように、これは必須物と非必須物の両方の広範な広がりによって引き起こされる（図９）。ｄＡＵＣは、最も複雑度の低い試料でそれぞれ０．１４と０．０９に低下する（図１０）。従って、ＣＲＩＳＰＲ ＳｔＡＲ分析は、必須物を必須として明確に識別し、これらを非必須物から分離することにより、従来の分析よりも優れている。
【0101】
４．３．３ ＡＵＲＯＣ
受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線では、真陽性率が偽陽性率と比較される。それらは、方法がデータ（この場合はガイド）を必須又は非必須にどれだけうまく分類できるかを定量化する。必須を上記のように定義し、真の陽性として分類した。同様に、必須ではないものを偽陽性として分類した。真のＣＲＩＳＰＲ ＳｔＡＲと従来の分析について、ＲのｐＲＯＣパッケージを使用して、ＬＦＣによるガイドのランク付けされたリストでＡＵＲＯＣスコアを計算した。理想的なスコアは１で、ランダムなスコアは０．５であろう。
受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線では、真陽性率が偽陽性率と比較される。それらは、方法がデータ（この場合はガイド）を必須又は非必須にどれだけうまく分類できるかを定量化する。必須を上記のように定義し、真の陽性として分類した。同様に、必須ではないものを偽陽性として分類した。真のＣＲＩＳＰＲ ＳｔＡＲと従来の分析について、ＲのｐＲＯＣパッケージを使用して、ＬＦＣによるガイドのランク付けされたリストでＡＵＲＯＣスコアを計算した。理想的なスコアは１で、ランダムなスコアは０．５であろう。
【0102】
従来の分析では、複雑さが減少するにつれて、ＡＵＲＯＣは０．９４から０．４４に低下すし、これはランダムスコアと同じである（図１１）。欠失している非必須物は分析に含まれていない。これによりＬＦＣが大きくなり、これが非必須物を誤って必須物としてスコア化する。対照的に、ＣＲＩＳＰＲ ＳｔＡＲ分析では、ＡＵ－ＲＯＣは０．９１～０．９５の間に留まる。従って、最も複雑度が低い場合でも、真陽性は明確に偽陽性から区別することができる。
【0103】
４．４ 要約
ピアソン係数、ｄＡＵＣ、及びＡＵＲＯＣを計算して、従来のＣＲＩＳＰＲスクリーン分析に対するＣＲＩＳＰＲ ＳｔＡＲの性能をベンチマーク検査した。３つの方法全てを使用すると、複雑さが減少するにつれて、ＣＲＩＳＰＲ ＳｔＡＲは、特に最も複雑度の低い試料で、従来の分析よりも明らかに優れていることがわかった（図１２）。
ピアソン係数、ｄＡＵＣ、及びＡＵＲＯＣを計算して、従来のＣＲＩＳＰＲスクリーン分析に対するＣＲＩＳＰＲ ＳｔＡＲの性能をベンチマーク検査した。３つの方法全てを使用すると、複雑さが減少するにつれて、ＣＲＩＳＰＲ ＳｔＡＲは、特に最も複雑度の低い試料で、従来の分析よりも明らかに優れていることがわかった（図１２）。
【0104】
まとめると提示されたデータは、集団のスクリーニングにおけるボトルネック後の複雑度の喪失によって導入される遺伝子スクリーンのノイズを、ＣＲＩＳＰＲ－ＳｔＡＲが実際に克服することを確認している。
【0105】
実施例５：オルガノイドスクリーン
均一な細胞集団では、高分解能のＣＲＩＳＰＲスクリーニングを支持する条件を容易に制御することができる。オルガノイドなどのより不均一なシステムでは、これは大きな問題である。モデルにおけるクローンの不均一性の影響を具体的に試験するために、腸のオルガノイドでＣＲＩＳＰＲ－ＳｔＡＲを試験した。まず、我々のレトロウイルスライブラリーの送達は、細胞集団全体の小さなサブセットである陰窩の幹細胞にのみ感染する。従って、オルガノイドの感染は非常に非効率的であり、通常、克服する必要のある第１のボトルネックになる。第２に、クローンの増殖は非常に不均一である。
均一な細胞集団では、高分解能のＣＲＩＳＰＲスクリーニングを支持する条件を容易に制御することができる。オルガノイドなどのより不均一なシステムでは、これは大きな問題である。モデルにおけるクローンの不均一性の影響を具体的に試験するために、腸のオルガノイドでＣＲＩＳＰＲ－ＳｔＡＲを試験した。まず、我々のレトロウイルスライブラリーの送達は、細胞集団全体の小さなサブセットである陰窩の幹細胞にのみ感染する。従って、オルガノイドの感染は非常に非効率的であり、通常、克服する必要のある第１のボトルネックになる。第２に、クローンの増殖は非常に不均一である。
【0106】
ＣｒｅＥＲＴ２及びＣａｓ９トランス遺伝子を有するオルガノイドに々のｓｇＲＮＡライブラリーを形質導入した。これらはブラストサイジン耐性について８日間選択され、４ＯＨ－タモキシフェンで処理されてＣｒｅ組換えを誘導し、さらに１２日間培養で維持された。
【0107】
感染の複雑さを推定するために、ガイドごとのＵＭＩ数の中央値を計算した。細胞培養スクリーンと同様に、インデックススワッピングによって引き起こされる二峰性のリード分布が見られた。これは、細胞培養スクリーンで行ったのと同じ方法で処理された：すなわち、真のリードをエラーから分離するために、この二峰性のリード分布の局所的最小値を閾値として定義して、それ以下の全てのリードを破棄した。活性ガイドのＵＭＩのリード数は表現型を表すことができるため不活性ガイドにカットオフのみを設定し、活性ガイドのｓｇＲＮＡ－ＵＭＩの組み合わせをマッピングし、これにより、存在しないＵＭＩのデータセットがさらに除去された。カットオフ後、ｓｇＲＮＡ当たり３０個の細胞の複雑度で感染が発生することがわかった。
【0108】
ガイド構築物上のＵＭＩにより、個別にマークされた細胞のクローン増殖を追跡できるため、同じガイド内の全てのＵＭＩは生物学的複製物を表す。従って、ＵＭＩの最初の文字に従ってデータセットを２つの群に分割することでデータセットを変更した：１つの群はＡ又はＴで始まるＵＭＩで、別の群はＣとＧで始まるＵＭＩ。次に、これら２つの群を生物学的複製物として使用した。
【0109】
５．１ ベンチマーク検査
従来のスクリーニング方法と比較して、オルガノイドにおけるＣＲＩＳＰＲ－ＳｔＡＲの性能をベンチマーク検査するために、ＵＭＩに基づいて複製物間のピアソン係数を計算した。次に、ガイドの数と比較した遺伝子の数を計算することにより、ガイドのランク付けされたリスト内のガイドの再現性を分析し、ＵＭＩによって決定された２つの生物学的複製物の相関をスコア化した。最後に、同じ２つの複製物内の両方のタイプの分析でヒットリストを比較した。
従来のスクリーニング方法と比較して、オルガノイドにおけるＣＲＩＳＰＲ－ＳｔＡＲの性能をベンチマーク検査するために、ＵＭＩに基づいて複製物間のピアソン係数を計算した。次に、ガイドの数と比較した遺伝子の数を計算することにより、ガイドのランク付けされたリスト内のガイドの再現性を分析し、ＵＭＩによって決定された２つの生物学的複製物の相関をスコア化した。最後に、同じ２つの複製物内の両方のタイプの分析でヒットリストを比較した。
【0110】
５．２ 相関
ＣＲＩＳＰＲ ＳｔＡＲの再現性を従来の分析と比較するために、これらのＵＭＩベースの生物学的複製物間のピアソン係数を計算した。従来の分析用に０日目の試料を生成するために、実証スクリーンで０日目の試料の複製物を取得し、各ガイドの平均リード数を計算した。オルガノイドの完全な必須遺伝子群がわからないため、細胞培養スクリーンと同じベンチマーク検査手順を適用できなかった（実施例２．２）。代わりに、全ての細胞タイプで欠失するはずのHart（Hart et al., Cell 163(6), 2015: 1515-1526）によって定義されたコア必須物を使用した。
ＣＲＩＳＰＲ ＳｔＡＲの再現性を従来の分析と比較するために、これらのＵＭＩベースの生物学的複製物間のピアソン係数を計算した。従来の分析用に０日目の試料を生成するために、実証スクリーンで０日目の試料の複製物を取得し、各ガイドの平均リード数を計算した。オルガノイドの完全な必須遺伝子群がわからないため、細胞培養スクリーンと同じベンチマーク検査手順を適用できなかった（実施例２．２）。代わりに、全ての細胞タイプで欠失するはずのHart（Hart et al., Cell 163(6), 2015: 1515-1526）によって定義されたコア必須物を使用した。
【0111】
従来の分析を使用したスクリーニング結果の再現性が低いこと（Ｒ＝０．２７）がわかったが、同じデータセットのＣＲＩＳＰＲ－ＳｔＡＲ分析では、より再現性の高いヒットリストが生成された（Ｒ＝０．５３）。全体として、従来の分析を使用すると、データの広がりが大きくなる。対照的に、ボトルネックで失われたＣＲＩＳＰＲ ＳｔＡＲ分析から除外された５５７の欠落ガイドを特定した後、ＣＲＩＳＰＲ ＳｔＡＲ分析では非常に鋭い信号がある（図１３ａ）。
【0112】
５．３ ガイドの再現性
ガイドの再現性を試験するために、ＭＡＧｅＣＫアルゴリズムを使用して、ガイドのランク付けされたリストを作成した。このリストから、ランク別に分類されたガイドのそれぞれの群によってヒットされた全ての遺伝子について、遺伝子ごとに存在するｓｇＲＮＡの平均数を計算した。例えば、上位３０のｓｇＲＮＡ内で１５の遺伝子がヒットした場合、値は２でした。ランダムデータセットの場合、値１が期待される。従来の分析ではほぼランダムな結果が得られるが、ＣＲＩＳＰＲ－ＳｔＡＲはスコア化された遺伝子の再現性が高いことを示している（図１３ｂ）。
ガイドの再現性を試験するために、ＭＡＧｅＣＫアルゴリズムを使用して、ガイドのランク付けされたリストを作成した。このリストから、ランク別に分類されたガイドのそれぞれの群によってヒットされた全ての遺伝子について、遺伝子ごとに存在するｓｇＲＮＡの平均数を計算した。例えば、上位３０のｓｇＲＮＡ内で１５の遺伝子がヒットした場合、値は２でした。ランダムデータセットの場合、値１が期待される。従来の分析ではほぼランダムな結果が得られるが、ＣＲＩＳＰＲ－ＳｔＡＲはスコア化された遺伝子の再現性が高いことを示している（図１３ｂ）。
【0113】
５．４ 遺伝子の再現性
最後に、遺伝子レベルでの比較のために、両方の分析方法にＭＡＧｅＣＫを使用して、ガイドを組み合わせて遺伝子のランク付けされたリストを作成した。従来の分析と比較して高いｐ値を有する上位のヒットを呼び出すことができただけでなく、スコア化された遺伝子は複製物間でより再現性があった。さらに、ＣＲＩＳＰＲ－ＳｔＡＲ分析を使用して、両方の複製物の上位１０個の欠失遺伝子のうち４個を呼び出し、これは、従来の分析を使用した１つのみの一般的な欠失遺伝子とは対照的である。これらは、オルガノイドの増殖に不可欠又は特異的であるため、私たちが見つけることを期待しているヒットである（Ｅｇｆｒ、Ｉｔｇｂ１、Ｔｏｐ２ａ、Ｒｐｌ１４）。上位５つの濃縮遺伝子の下で、複製物間で共通の２つ（Ｎｆ２、Ｃｄｋｎ２ａ）が見つかったが、従来の分析では共通の遺伝子は見つからなかった（図１３ｃ）。さらに、それぞれの他の複製物でスコア化された遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲ－ＳｔＡＲ分析では高いスコア化を示しているが、従来の分析ではかなり分布している。
最後に、遺伝子レベルでの比較のために、両方の分析方法にＭＡＧｅＣＫを使用して、ガイドを組み合わせて遺伝子のランク付けされたリストを作成した。従来の分析と比較して高いｐ値を有する上位のヒットを呼び出すことができただけでなく、スコア化された遺伝子は複製物間でより再現性があった。さらに、ＣＲＩＳＰＲ－ＳｔＡＲ分析を使用して、両方の複製物の上位１０個の欠失遺伝子のうち４個を呼び出し、これは、従来の分析を使用した１つのみの一般的な欠失遺伝子とは対照的である。これらは、オルガノイドの増殖に不可欠又は特異的であるため、私たちが見つけることを期待しているヒットである（Ｅｇｆｒ、Ｉｔｇｂ１、Ｔｏｐ２ａ、Ｒｐｌ１４）。上位５つの濃縮遺伝子の下で、複製物間で共通の２つ（Ｎｆ２、Ｃｄｋｎ２ａ）が見つかったが、従来の分析では共通の遺伝子は見つからなかった（図１３ｃ）。さらに、それぞれの他の複製物でスコア化された遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲ－ＳｔＡＲ分析では高いスコア化を示しているが、従来の分析ではかなり分布している。
【0114】
ＣＲＩＳＰＲ－ＳｔＡＲはスクリーンヒットを確実に同定できるため、従来の分析よりも優れており、腸内オルガノイドなどの不均一系でも再現性のある結果が得られると結論できる。
【0115】
実施例６：インビトロとインビボのスクリーニング
６．１ 材料
６．１ 材料
【0116】
細胞株
Ｙｕｍｍ１．７ ４５０Ｒ黒色腫細胞（IMP, ViennaのObenauf Labから受領）。
Ｌｅｎｔｉ－Ｘ（Clontech ６３２１８０）
Ｙｕｍｍ１．７ ４５０Ｒ黒色腫細胞（IMP, ViennaのObenauf Labから受領）。
Ｌｅｎｔｉ－Ｘ（Clontech ６３２１８０）
【0117】
細胞培養培地
Ｙｕｍｍ１．７ ４５０Ｒ黒色腫細胞：１０％ＦＣＳ（Gibco）、１％Ｌ－グルタミン（Gibco）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Sigma）を補足したＤＭＥＭ／Ｆ１２。ＹＵＭＭ１．７ ４５０Ｒ（Ｃａｓ９－ＣｒｅERT2）の培地には、ピューロマイシン（１μｇ／ｍｌ、Invivogen）が追加で含まれている。
Ｙｕｍｍ１．７ ４５０Ｒ黒色腫細胞：１０％ＦＣＳ（Gibco）、１％Ｌ－グルタミン（Gibco）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Sigma）を補足したＤＭＥＭ／Ｆ１２。ＹＵＭＭ１．７ ４５０Ｒ（Ｃａｓ９－ＣｒｅERT2）の培地には、ピューロマイシン（１μｇ／ｍｌ、Invivogen）が追加で含まれている。
【0118】
Ｌｅｎｔｉ－Ｘ細胞：１０％ＦＣＳ（Gibco）、１％Ｌ－グルタミン（Gibco）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Sigma）、１％非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、Gibco）、１％ピルビン酸ナトリウム（Sigma）を補足したＤＭＥＭ。
【0119】
緩衝液
２Ｘ ＳＤＳ溶解緩衝液：
１０ｍＭトリス－ＨＣｌ、ｐＨ８（Sigma Aldrich）、１％ＳＤＳ（社内）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ（Sigma Aldrich）、１００ｍＭ ＮａＣｌ（Sigma Aldrich）、新たに添加した１ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（New England Biolabs）。
２Ｘ ＳＤＳ溶解緩衝液：
１０ｍＭトリス－ＨＣｌ、ｐＨ８（Sigma Aldrich）、１％ＳＤＳ（社内）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ（Sigma Aldrich）、１００ｍＭ ＮａＣｌ（Sigma Aldrich）、新たに添加した１ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（New England Biolabs）。
【0120】
プライマー
FW_G_CrSc_2: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACCGAACGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTC (配列番号21)
FW_G_CrSc_15: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCATTACCGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTC (配列番号22)
FW_G_CrSc_20: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCGTCATCGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTC (配列番号23)
RV_G_CrSc: CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACCGTTGATGAGTAG (配列番号24)
NGS_U6: CGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCG (配列番号25)
NGS_customNextSeq_i2_primer: GAAGGAATCATGGGAAATAGGCCCTCG (配列番号26)
FW_G_CrSc_2: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACCGAACGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTC (配列番号21)
FW_G_CrSc_15: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCATTACCGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTC (配列番号22)
FW_G_CrSc_20: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCGTCATCGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTC (配列番号23)
RV_G_CrSc: CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACCGTTGATGAGTAG (配列番号24)
NGS_U6: CGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCG (配列番号25)
NGS_customNextSeq_i2_primer: GAAGGAATCATGGGAAATAGGCCCTCG (配列番号26)
【0121】
６．２．方法
６．２．１ Ｃａｓ９及びＣｒｅＥＲＴ２を発現する単細胞由来クローンの作成
６．２．１ Ｃａｓ９及びＣｒｅＥＲＴ２を発現する単細胞由来クローンの作成
【0122】
インビボ及びインビトロスクリーニングで、Ｃａｓ９及びＣｒｅＥＲＴ２を使用してＹｕｍｍ１．７ ４５０Ｒ細胞を作成した。まず、細胞にＰＸ４５９ ｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）－２Ａ－Ｐｕｒｏ及びｐＭＳＣＶ－ＧＦＰ－ｍｉｒ３０－ＰＧＫ－ＣｒｅＥＲＴ２を順次形質導入した。ピューロマイシン耐性についてバルク細胞集団を選択し、単一細胞クローンを単一蛍光活性化細胞ソーター解析（ＦＡＣＳ）によって誘導した。続いて、ＧＦＰ用のｓｇＲＮＡを有するＣＲＩＳＰＲ－Ｓｗｉｔｃｈを使用して、Ｃａｓ９機能と漏出性ｃｒｅＥＲＴ２発現についてクローンを試験した（Chylinski et al, Nature Communications 10, 2019）。
【0123】
６．２．２ プールされたライブラリーのクローニング
薬剤を加えたｓｇＲＮＡライブラリープールを用いてＳｔＡＲ構築物を含むレンチウイルスライブラリーを作成するために、１５，７２３個のｓｇＲＮＡをＰＣＲ増幅し、ゴールデンゲート（Golden Gate）クローニングによってＳｔＡＲベクターにクローニングした。続いて、プラスミドを細菌（Enduraエレクトロコンピテント細胞、Lucigen）に電気穿孔した。形質転換後、細菌をＬＢ培地で３７℃で１時間回収し、アンピシリンを含むＬＢ寒天プレートにプレーティングし、３７℃で一晩インキュベートした。ライブラリー内の各ｓｇＲＮＡの３，０００倍のカバー範囲を確認した。プラスミドＤＮＡを単離し、レンチウイルス粒子の作成に使用した。
薬剤を加えたｓｇＲＮＡライブラリープールを用いてＳｔＡＲ構築物を含むレンチウイルスライブラリーを作成するために、１５，７２３個のｓｇＲＮＡをＰＣＲ増幅し、ゴールデンゲート（Golden Gate）クローニングによってＳｔＡＲベクターにクローニングした。続いて、プラスミドを細菌（Enduraエレクトロコンピテント細胞、Lucigen）に電気穿孔した。形質転換後、細菌をＬＢ培地で３７℃で１時間回収し、アンピシリンを含むＬＢ寒天プレートにプレーティングし、３７℃で一晩インキュベートした。ライブラリー内の各ｓｇＲＮＡの３，０００倍のカバー範囲を確認した。プラスミドＤＮＡを単離し、レンチウイルス粒子の作成に使用した。
【0124】
６．２．３ インビトロスクリーニング
薬剤を加えたｓｇＲＮＡライブラリープール（１５７，２３個のｓｇＲＮＡ）を含むＳｔＡＲ構築物を、製造元の推奨に従ってＬｅｎｔｉ－Ｘ細胞にパッケージ化した。モノクローナルＹＵＭＭ１．７４５０Ｒ（Ｃａｓ９－ＣｒｅERT2）にレンチウイルス粒子を形質導入した後、ネオマイシン選択（ゲネチシンＧ－４１８、５００μｇ／ｍｌ、Gibco）を４日間行った。細胞は、インビトロ及びインビボスクリーニングの２群に分けられた。インビトロの細胞を培養し、ｃｒｅＥＲＴ２組換えを４ＯＨ（０．５μＭ）で３日間誘導した。誘導後２１日間細胞を維持した。
薬剤を加えたｓｇＲＮＡライブラリープール（１５７，２３個のｓｇＲＮＡ）を含むＳｔＡＲ構築物を、製造元の推奨に従ってＬｅｎｔｉ－Ｘ細胞にパッケージ化した。モノクローナルＹＵＭＭ１．７４５０Ｒ（Ｃａｓ９－ＣｒｅERT2）にレンチウイルス粒子を形質導入した後、ネオマイシン選択（ゲネチシンＧ－４１８、５００μｇ／ｍｌ、Gibco）を４日間行った。細胞は、インビトロ及びインビボスクリーニングの２群に分けられた。インビトロの細胞を培養し、ｃｒｅＥＲＴ２組換えを４ＯＨ（０．５μＭ）で３日間誘導した。誘導後２１日間細胞を維持した。
【0125】
６．２．４ インビボスクリーニング
５０μｌ（ＰＢＳ：マトリゲル）の１×１０6細胞を、６～１２週齢の雌マウスの脇腹に皮下注射した。細胞の注射の７日後、３０ｇ当たり５ｍｇのタモキシフェンを腹腔内注射することにより、ｃｒｅＥＲＴ２組換えを誘導した。毎週、腫瘍サイズを測定し、腫瘍サイズが２ｃｍ3に達したときにマウスを殺処分した（タモキシフェン注射の６～１３日後）。
５０μｌ（ＰＢＳ：マトリゲル）の１×１０6細胞を、６～１２週齢の雌マウスの脇腹に皮下注射した。細胞の注射の７日後、３０ｇ当たり５ｍｇのタモキシフェンを腹腔内注射することにより、ｃｒｅＥＲＴ２組換えを誘導した。毎週、腫瘍サイズを測定し、腫瘍サイズが２ｃｍ3に達したときにマウスを殺処分した（タモキシフェン注射の６～１３日後）。
【0126】
６．２．５ ゲノムＤＮＡ抽出とＮＧＳライブラリー調製
インビトロでスクリーニングされ２１日目に採取された細胞を、溶解緩衝液を用いて５５℃で２４時間溶解した。マウスから採取した腫瘍を１５～２０ｍｌの溶解緩衝液で５５℃で４８～７２時間溶解した。溶解した細胞と腫瘍の両方を、０．１ｍｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅＡ（Qiagen）で３７℃で１時間処理した。ｇＤＮＡをフェノールとクロロホルムで抽出し、続いてイソプロパノールとＥｔＯＨで沈殿させた。ＤＮＡを断片化するために、試料をＢｓｍＢＩで４８時間消化し、各試料を４８回の個別の５０μｌ反応で１反応当たり１μｇのＤＮＡでＰＣＲ増幅した（９５℃で３分、［９５℃で２０秒、５９℃で２０秒、７２℃で４０秒］×３３、７２℃で３分、４℃で∞）。前進プライマーは試料ごとに固有であり、ＮＧＳ後の逆多重化のための６ｂｐの実験的インデックスが含まれていた（材料中のＦＷ＿Ｇ＿ＣｒＳｃ＿２、ＦＷ＿Ｇ＿ＣｒＳｃ＿１５、又はＦＷ＿Ｇ＿ＣｒＳｃ＿２０プライマー）。逆進プライマーは各試料で同じであった（ＲＶ＿Ｇ＿ＣｒＳｃ）。ＰＣＲ産物を精製し、アガロースゲル電気泳動でサイズ分離をした。２つの組換え産物を一緒に切り出し、ミニ溶出カラムで精製した。この試料は、イルミナNextSeq2000でＰ２ ＳＲ１００配列決定実験で配列決定された。ｓｇＲＮＡは、カスタムリードプライマー（リード１、ＮＧＳ＿Ｕ６）で配列決定された。活性ｓｇＲＮＡ構築物と不活性ｓｇＲＮＡ構築物は、ｓｇＲＮＡ後の５５ｂｐベクターの配列を分析することで区別することができる。インデックスを決定するために、別のカスタムプライマーが使用された（Ｉｎｄｅｘ２、ＮＧＳ＿ｃｕｓｔｏｍＮｅｘｔＳｅｑ＿ｉ２＿ｐｒｉｍｅｒ）。
インビトロでスクリーニングされ２１日目に採取された細胞を、溶解緩衝液を用いて５５℃で２４時間溶解した。マウスから採取した腫瘍を１５～２０ｍｌの溶解緩衝液で５５℃で４８～７２時間溶解した。溶解した細胞と腫瘍の両方を、０．１ｍｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅＡ（Qiagen）で３７℃で１時間処理した。ｇＤＮＡをフェノールとクロロホルムで抽出し、続いてイソプロパノールとＥｔＯＨで沈殿させた。ＤＮＡを断片化するために、試料をＢｓｍＢＩで４８時間消化し、各試料を４８回の個別の５０μｌ反応で１反応当たり１μｇのＤＮＡでＰＣＲ増幅した（９５℃で３分、［９５℃で２０秒、５９℃で２０秒、７２℃で４０秒］×３３、７２℃で３分、４℃で∞）。前進プライマーは試料ごとに固有であり、ＮＧＳ後の逆多重化のための６ｂｐの実験的インデックスが含まれていた（材料中のＦＷ＿Ｇ＿ＣｒＳｃ＿２、ＦＷ＿Ｇ＿ＣｒＳｃ＿１５、又はＦＷ＿Ｇ＿ＣｒＳｃ＿２０プライマー）。逆進プライマーは各試料で同じであった（ＲＶ＿Ｇ＿ＣｒＳｃ）。ＰＣＲ産物を精製し、アガロースゲル電気泳動でサイズ分離をした。２つの組換え産物を一緒に切り出し、ミニ溶出カラムで精製した。この試料は、イルミナNextSeq2000でＰ２ ＳＲ１００配列決定実験で配列決定された。ｓｇＲＮＡは、カスタムリードプライマー（リード１、ＮＧＳ＿Ｕ６）で配列決定された。活性ｓｇＲＮＡ構築物と不活性ｓｇＲＮＡ構築物は、ｓｇＲＮＡ後の５５ｂｐベクターの配列を分析することで区別することができる。インデックスを決定するために、別のカスタムプライマーが使用された（Ｉｎｄｅｘ２、ＮＧＳ＿ｃｕｓｔｏｍＮｅｘｔＳｅｑ＿ｉ２＿ｐｒｉｍｅｒ）。
【0127】
６．３． 結果と考察
インビボスクリーンを実施する場合、大きな課題を克服する必要がある。同種移植片スクリーニングには、感染や生着効率を含むいくつかの技術的なボトルネックがある。さらに、不均一性は、細胞（系統）に依存する内因性の要因により、及び生体内の細胞の位置（例えば、血管に近いか、腫瘍の真ん中か）に依存して外因性に生じる。これらの問題は、ｓｇＲＮＡの表示が等しくないことにつながり、従来のスクリーニング分析を混乱させ、ここで、スクリーン分析の初日と最終日のｓｇＲＮＡを比較するのは適切ではない。この１つの例は、これらのｓｇＲＮＡを含む細胞がマウスに生着できなかったため、一部のｓｇＲＮＡが失われたことである。もしスクリーンの初日と最終日のｓｇＲＮＡを比較すると、これらのｓｇＲＮＡは欠失していると識別されるため、標的遺伝子は腫瘍の増殖に不可欠であると定義され、これは偽陽性の結果である。ＣＲＩＳＰＲ－ＳｔＡＲは、スクリーンの最後に生着した細胞に存在する活性ｓｇＲＮＡと不活性ｓｇＲＮＡを比較することにより、このような課題を克服する。この例では、インビトロとインビボの条件で異なる遺伝的依存性をさらに解明することができる。
インビボスクリーンを実施する場合、大きな課題を克服する必要がある。同種移植片スクリーニングには、感染や生着効率を含むいくつかの技術的なボトルネックがある。さらに、不均一性は、細胞（系統）に依存する内因性の要因により、及び生体内の細胞の位置（例えば、血管に近いか、腫瘍の真ん中か）に依存して外因性に生じる。これらの問題は、ｓｇＲＮＡの表示が等しくないことにつながり、従来のスクリーニング分析を混乱させ、ここで、スクリーン分析の初日と最終日のｓｇＲＮＡを比較するのは適切ではない。この１つの例は、これらのｓｇＲＮＡを含む細胞がマウスに生着できなかったため、一部のｓｇＲＮＡが失われたことである。もしスクリーンの初日と最終日のｓｇＲＮＡを比較すると、これらのｓｇＲＮＡは欠失していると識別されるため、標的遺伝子は腫瘍の増殖に不可欠であると定義され、これは偽陽性の結果である。ＣＲＩＳＰＲ－ＳｔＡＲは、スクリーンの最後に生着した細胞に存在する活性ｓｇＲＮＡと不活性ｓｇＲＮＡを比較することにより、このような課題を克服する。この例では、インビトロとインビボの条件で異なる遺伝的依存性をさらに解明することができる。
【0128】
この例では、インビボスクリーンとインビトロスクリーンの比較について説明する。Ｃａｓ９とＣｒｅERT2を含むモノクローナル黒色腫細胞株ＹＵＭＭ１．７ ４５０Ｒを使用した。薬剤を加えたｓｇＲＮＡライブラリープール（１５，７２３個のｓｇＲＮＡ）を含むＳｔＡＲ構築物によるウイルス形質導入時に、選択された細胞をインビトロ又はインビボでスクリーニングした。スクリーンの開始時にインビトロでＣｒｅ組換えを誘発するために４ＯＨを使用し、一方、細胞の注射の１０日後のタモキシフェンの腹腔内注射によりインビボで組換えを誘発した。インビボで６～１３日間の短いスクリーニング時間（腫瘍増殖速度に依存する）の後、腫瘍及びインビトロでスクリーニングされた細胞からＤＮＡを抽出し、次世代配列決定に供し、そして生物情報学的に分析した。
【0129】
このインビボスクリーンから、不活性及び活性ｓｇＲＮＡ構築物からリードを取得することができ、これは、ＳｔＡＲベクターでインビボのＣｒｅ組換えが成功したことを示している。必須遺伝子を標的とする活性ｓｇＲＮＡは、対応する不活性ｓｇＲＮＡと比較して欠失していた。同じｓｇＲＮＡのＵＭＩのリードを合計し、各ＵＭＩのＬｏｇ2倍数の変化（ＬＦＣ）を計算し、次に同じ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡの合計ＬＦＣの中央値を計算することによって、インビトロ及びインビボでのｓｇＲＮＡの効果が計算される（図１４）。陰性対照遺伝子（黒で示されている）は、インビトロでもインビボでも効果を示さない。必須遺伝子の大部分（赤で示されている）は、インビトロ及びインビボで欠失している。ドットサイズは、インビボ試料中の遺伝子当たりのＵＭＩの数を表す。
【0130】
実施例７：マウス肝臓におけるＣＲＩＳＰＲスクリーン
内因性組織でインビボＣＲＩＳＰＲスクリーニングを行うには、抗生物質を用いる細胞のインビトロ選択と同様に、インビボでライブラリー担持細胞を選択的に拡大する必要がある。この例では、肝臓の損傷後に肝細胞が増殖して肝臓を再生することができる、肝臓でのこの拡大を示す。この場合、ＳｔＡＲライブラリーを担持している少数の細胞のみが肝臓で再増殖し、結果として、ライブラリーを取得し、活性ｓｇＲＮＡと不活性ｓｇＲＮＡの比率を比較してスクリーンを実行するのに十分な細胞が得られる。健康な肝細胞を用いるフマリルアセト酢酸ヒドロキシラーゼ（ＦＡＨ）ホモ接合性ノックアウト（ＦＡＨ－／－）マウスにおける肝臓の再増殖は、肝臓の再生を研究するための確立された方法である（Montini et al. (2002) Molecular Therapy, 6(6), 759-769; Wuestefeld et al. (2013) Cell, 153(2), 389-401; Zhu et al. (2019) Cell, 177(3), 608-621.e12）。ＦＡＨは、有毒なフマリルアセト酢酸（ＦＡＡ）を代謝してフマル酸とアセト酢酸にする。機能的なＦＡＨ酵素を欠くマウスは肝不全で死亡する。しかし、ＦＡＨ－／－マウスは、ニチシノン（ＮＴＢＣ）治療によって維持することができる。ＮＴＢＣは、この代謝経路の上流酵素である４－ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＤ）を阻害し、ＦＡＡの蓄積を妨害する。機能的なＦＡＨ遺伝子を担持する肝細胞は、ＮＴＢＣが中止されると、ＦＡＨ－／－肝臓に再増殖することができる。
内因性組織でインビボＣＲＩＳＰＲスクリーニングを行うには、抗生物質を用いる細胞のインビトロ選択と同様に、インビボでライブラリー担持細胞を選択的に拡大する必要がある。この例では、肝臓の損傷後に肝細胞が増殖して肝臓を再生することができる、肝臓でのこの拡大を示す。この場合、ＳｔＡＲライブラリーを担持している少数の細胞のみが肝臓で再増殖し、結果として、ライブラリーを取得し、活性ｓｇＲＮＡと不活性ｓｇＲＮＡの比率を比較してスクリーンを実行するのに十分な細胞が得られる。健康な肝細胞を用いるフマリルアセト酢酸ヒドロキシラーゼ（ＦＡＨ）ホモ接合性ノックアウト（ＦＡＨ－／－）マウスにおける肝臓の再増殖は、肝臓の再生を研究するための確立された方法である（Montini et al. (2002) Molecular Therapy, 6(6), 759-769; Wuestefeld et al. (2013) Cell, 153(2), 389-401; Zhu et al. (2019) Cell, 177(3), 608-621.e12）。ＦＡＨは、有毒なフマリルアセト酢酸（ＦＡＡ）を代謝してフマル酸とアセト酢酸にする。機能的なＦＡＨ酵素を欠くマウスは肝不全で死亡する。しかし、ＦＡＨ－／－マウスは、ニチシノン（ＮＴＢＣ）治療によって維持することができる。ＮＴＢＣは、この代謝経路の上流酵素である４－ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＤ）を阻害し、ＦＡＡの蓄積を妨害する。機能的なＦＡＨ遺伝子を担持する肝細胞は、ＮＴＢＣが中止されると、ＦＡＨ－／－肝臓に再増殖することができる。
【0131】
図１５は、ＣＲＩＳＰＲ－ＳｔＡＲ構築物を有するＥＦ１ａプロモーターの制御下にある、ＥＧＦＰ－Ｐ２Ａ－ＦＡＨ発現カセットを有する眠れる森の美女トランスポゾンを示す。０．９％ＮａＣｌ食塩水中の２５μｇのトランスポゾンプラスミドと５μｇの眠れる森の美女トランスポザーゼＳＢ１００ＸプラスミドをＦＡＨ－／－マウスに注入し、これを２５０ｍＬの飲料水中の１．８ｍｇのＮＴＢＣで維持した。総体重の１０％に相当する容量を５秒で尾静脈に注射した。ＮＴＢＣ濃度は、注射の１日後に元の濃度の２０％に減少した。注射の７日後、ＮＴＢＣは飲料水から完全に除去された。ＳｔＡＲ構築物は、ＦＡＨ発現カセットを含む眠れる森の美女トランスポゾンでクローン化されている。このようにして、肝臓にＳｔＡＲ構築物を担持する細胞を再増殖させることができる。眠れる森の美女トランスポゾンとトランスポザーゼは、流体力学的尾静脈注射によって肝臓に送達され（Bell et al. (2007) Nature Protocols, 2(12), 3153-3165; Liu et al. (1999) Gene Therapy, 6(7), 1258-1266）、そして、ＳｔＡＲ構築物を担持する細胞が、ＮＴＢＣ中止後に肝臓に再増殖することを確認した。従って、肝臓に健康なＳｔＡＲ含有細胞を再増殖させて、ＣＲＩＳＰＲ－ＳｔＡＲスクリーンを実施することができる。
【0132】
肝臓でＳｔＡＲを含む細胞を増殖させる別の例は、肝臓癌を誘発することである。ここで、ＳｔＡＲ構築物は、よく知られている癌ドライバーであるＫｒａｓＧ１２Ｄ発現カセットを有する眠れる森の美女トランスポゾンでクローン化されている。我々は、ＳｔＡＲを含む細胞が健康な肝臓で増殖することを確認した。図１６は、ＣＲＩＳＰＲ－ＳｔＡＲ構築物を有するＥＦ１ａプロモーターの制御下にある、ＫｒａｓＧ１２Ｄ－Ｐ２Ａ－ＦＡＨ発現カセットを有する眠れる森の美女トランスポゾンを示す。０．９％ＮａＣｌ食塩水中の１５μｇのトランスポゾンプラスミッド及び３μｇの眠れる森の美女トランスポザーゼＳＢ１００ＸプラスミドをＷＴマウスに注射した。総体重の１０％に相当する容量を５秒で尾静脈に注射した。この拡大を加速するために、トランスポゾンは、ｐ５３が条件付きで欠失した肝臓（これは、ｐ５３ｆｌ／ｆｌマウスでＡｌｂ－ＣｒｅERT2を活性化することによって達成される）に注入される（Ju et al. (2016) International Journal of Cancer, 138(7), 1601-1608）。
【0133】
インビボ肝臓スクリーニングは、Ｃａｓ９とＦＡＨ－／－のＡｌｂ－ＣｒｅＥＲＴ２マウス、又はｐ５３ｆｌ／ｆｌマウスで行われる。これらの例は、組換えを誘発してスクリーンを実行する前に、インビボでＣＲＩＳＰＲ－ＳｔＡＲライブラリーを拡張する２つの方法を示している。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8-1】
【図8-2】
【図8-3】
【図9-1】
【図9-2】
【図9-3】
【図10-1】
【図10-2】
【図10-3】
【図10-4】
【図11-1】
【図11-2】
【図12】
【図13-1】
【図13-2】
【図13-3】
【図14】
【図15】
【図16】
【配列表】
【国際調査報告】