特表 2023-519868 Ｔ細胞受容体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-05-15

(54)【発明の名称】Ｔ細胞受容体

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20230508BHJP

   C07K 14/725 20060101ALI20230508BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20230508BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230508BHJP

   A61K 38/17 20060101ALI20230508BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20230508BHJP

   A61K 35/15 20150101ALI20230508BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230508BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20230508BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALN20230508BHJP

【ＦＩ】

C12N15/62 Z

C07K14/725 ZNA

C12N15/867 Z

C12N5/10

A61K38/17

A61K48/00

A61K35/15

A61P35/00

C12N15/12

C12N5/0783

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022558271

(86)(22)【出願日】2021-03-26

(85)【翻訳文提出日】2022-11-08

(86)【国際出願番号】 US2021024370

(87)【国際公開番号】W WO2021195503

(87)【国際公開日】2021-09-30

(31)【優先権主張番号】63/000,800

(32)【優先日】2020-03-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521438515

【氏名又は名称】２セブンティ バイオ インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】マン， ジャスディープ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA44

4C084AA02

4C084AA07

4C084AA13

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA22

4C084BA23

4C084BA41

4C084DA45

4C084NA14

4C084ZB26

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB37

4C087BB64

4C087CA04

4C087NA14

4C087ZB26

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA50

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本開示は、改善されたＴ細胞受容体、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ベクター、細胞、およびそれらの使用方法を提供する。本開示の一部は概して、発現、安定性、および機能的アビディティが増加するよう改変された（操作された）単離されたＴ細胞受容体、そのポリヌクレオチド、組成物、医薬品および使用に関するものである。様々な実施形態において、最小限にマウス化されたＴＣＲα鎖と、最小限にマウス化されたＴＣＲβ鎖を含む単離されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が提供され、この場合において当該ＴＣＲα鎖の膜貫通ドメインは、疎水性アミノ酸置換を含む。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

最小限にマウス化されたＴＣＲα鎖、および最小限にマウス化されたＴＣＲβ鎖を含む単離されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）であって、前記ＴＣＲα鎖の膜貫通ドメインは、疎水性アミノ酸置換を含み、前記ＴＣＲは、ＭＡＧＥＡ４に結合しない、単離されたＴＣＲ。

【請求項2】

単離されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）であって、
（ａ）９０位、９１位、９２位、および９３位で最小マウス化アミノ酸置換、ならびに１１５位、１１８位、および１１９位で疎水性アミノ酸置換を含む定常ドメインを含むＴＣＲα鎖、ならびに
（ｂ）１８位、２２位、１３３位、１３６位、および１３９位で最小マウス化アミノ酸置換を含む定常ドメインを含むＴＣＲβ鎖、を含む、単離されたＴＣＲ。

【請求項3】

単離されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）であって、
（ａ）Ｐ９０Ｓ、Ｅ９１Ｄ、Ｓ９２Ｖ、Ｓ９３Ｐ、Ｓ１１５Ｌ、Ｇ１１８Ｖ、およびＦ１１９Ｌのアミノ酸置換を含む定常ドメインを含むＴＣＲα鎖、ならびに
ｂ）Ｅ１８Ｋ、Ｓ２２Ａ、Ｆ１３３Ｉ、Ｅ／Ｖ１３６Ａ、およびＱ１３９Ｈのアミノ酸置換を含む定常ドメインを含むＴＣＲβ鎖、を含む、単離されたＴＣＲ。

【請求項4】

単離されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）であって、
（ａ）少なくとも４個の最小マウス化アミノ酸置換、およびＴＣＲα鎖膜貫通ドメインに少なくとも３個の疎水性アミノ酸置換を含む定常ドメインを含むＴＣＲα鎖であって、前記ＴＣＲα鎖定常ドメインは、配列番号４に記載されるアミノ酸配列に対し、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＴＣＲα鎖、ならびに
（ｂ）少なくとも５個の最小マウス化アミノ酸置換を含む定常ドメインを含むＴＣＲβ鎖であって、前記ＴＣＲβ鎖定常ドメインは、配列番号５または配列番号６に記載されるアミノ酸配列に対し、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＴＣＲβ鎖、を含む、単離されたＴＣＲ。

【請求項5】

単離されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）であって、
（ａ）配列番号４に記載されるアミノ酸配列を含む定常ドメインを含むＴＣＲα鎖、ならびに
（ｂ）配列番号５または配列番号６に記載されるアミノ酸配列を含む定常ドメインを含むＴＣＲβ鎖、を含む、単離されたＴＣＲ。

【請求項6】

前記ＴＣＲが、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ：α－ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）、Ｂ Ｍｅｌａｎｏｍａ Ａｎｔｉｇｅｎ（ＢＡＧＥ）ファミリー類、Ｂｒｏｔｈｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ ｓｉｔｅｓ（ＢＯＲＩＳ）、癌－精巣抗原、癌－精巣抗原８３（ＣＴ－８３）、Ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ ＩＸ（ＣＡ１Ｘ）、癌胎児抗原（ＣＥＡ：Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）抗原、メラノーマ上の細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）認識抗原（ＣＡＭＥＬ：Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ（ＣＴＬ）－ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ ｏｎ ｍｅｌａｎｏｍａ）、エプスタイン－バールウイルス（ＥＢＶ：Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ）抗原、Ｇ ａｎｔｉｇｅｎ １（ＧＡＧＥ－１）、ＧＡＧＥ－２、ＧＡＧＥ－３、ＧＡＧＥ－４、ＧＡＧＥ－５、ＧＡＧＥ－６、ＧＡＧＥ－７Ｂ、ＧＡＧＥ－８、糖タンパク質１００（ＧＰ１００：Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ １００）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）抗原、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）非構造タンパク質３（ＮＳ３）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ－２）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）－Ｅ６、ＨＰＶ－Ｅ７、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、潜在膜タンパク質２（ＬＭＰ２：Ｌａｔｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）、Ｍｅｌａｎｏｍａ ａｎｔｉｇｅｎ ｆａｍｉｌｙ Ａ，１（ＭＡＧＥ－Ａ１）、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ１２、Ｍｅｌａｎｏｍａ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ（ＭＡＲＴ－１）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ムチン１（ＭＵＣ１）、ムチン１６（ＭＵＣ１６）、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ－１（ＮＹＥＳＯ－１）、Ｐ５３、Ｐ抗原（ＰＡＧＥ：Ｐ ａｎｔｉｇｅｎ）ファミリー類、Ｐｌａｃｅｎｔａ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ １（ＰＬＡＣ１）、Ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎ ｍｅｌａｎｏｍａ（ＰＲＡＭＥ）、サバイビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）、Ｓｙｎｏｖｉａｌ ｓａｒｃｏｍａ Ｘ １（ＳＳＸ１）、Ｓｙｎｏｖｉａｌ ｓａｒｃｏｍａ Ｘ ２（ＳＳＸ２）、Ｓｙｎｏｖｉａｌ ｓａｒｃｏｍａ Ｘ ３（ＳＳＸ３）、Ｓｙｎｏｖｉａｌ ｓａｒｃｏｍａ Ｘ ４（ＳＳＸ４）、Ｓｙｎｏｖｉａｌ ｓａｒｃｏｍａ Ｘ ５（ＳＳＸ５）、Ｓｙｎｏｖｉａｌ ｓａｒｃｏｍａ Ｘ ８（ＳＳＸ８）、サイログロブリン、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質（ＴＲＰ：Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）１、ＴＲＰ２、Ｗｉｌｍｓ ｔｕｍｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＷＴ－１）、Ｘ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｆａｍｉｌｙ Ｍｅｍｂｅｒ １（ＸＡＧＥ１）、およびＸ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｆａｍｉｌｙ Ｍｅｍｂｅｒ ２（ＸＡＧＥ２）からなる群から選択される標的抗原に結合する、請求項１～５のいずれか一項に記載の単離されたＴＣＲ。

【請求項7】

最小限にマウス化されたＴＣＲα鎖、および最小限にマウス化されたＴＣＲβ鎖を含むが、前記ＴＣＲα鎖の膜貫通ドメインは疎水性アミノ酸置換を含まないＴＣＲと比較して、前記ＴＣＲの発現およびアビディティは増加している、請求項１～６のいずれか一項に記載の単離されたＴＣＲ。

【請求項8】

最小限にマウス化されたＴＣＲα鎖、および最小限にマウス化されたＴＣＲβ鎖を含まないが、前記ＴＣＲα鎖の膜貫通ドメインは疎水性アミノ酸置換を含むＴＣＲと比較して、前記ＴＣＲの発現およびアビディティは増加している、請求項１～６のいずれか一項に記載の単離されたＴＣＲ。

【請求項9】

請求項１～８のいずれか一項に記載のＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を含む、融合タンパク質。

【請求項10】

前記ＴＣＲα鎖の膜貫通ドメインは疎水性アミノ酸置換を含む、最小限にマウス化されたＴＣＲα鎖、ポリペプチド切断シグナル、および最小限にマウス化されたＴＣＲβ鎖を含む融合タンパク質であって、ＭＡＧＥＡ４に結合しない、融合タンパク質。

【請求項11】

融合タンパク質であって、
（ａ）９０位、９１位、９２位、および９３位で最小マウス化アミノ酸置換、ならびに１１５位、１１８位、および１１９位で疎水性アミノ酸置換を含む定常ドメインを含むＴＣＲα鎖、
（ｂ）ポリペプチド切断シグナル、ならびに
（ｃ）１８位、２２位、１３３位、１３６位、および１３９位で最小マウス化アミノ酸置換を含む定常ドメインを含むＴＣＲβ鎖、を含み、
前記融合タンパク質は、ＭＡＧＥＡ４に結合しない、融合タンパク質。

【請求項12】

融合タンパク質であって、
（ａ）Ｐ９０Ｓ、Ｅ９１Ｄ、Ｓ９２Ｖ、Ｓ９３Ｐ、Ｓ１１５Ｌ、Ｇ１１８Ｖ、およびＦ１１９Ｌのアミノ酸置換を含む定常ドメインを含むＴＣＲα鎖、
（ｂ）ポリペプチド切断シグナル、ならびに
（ｃ）Ｅ１８Ｋ、Ｓ２２Ａ、Ｆ１３３Ｉ、Ｅ／Ｖ１３６Ａ、およびＱ１３９Ｈのアミノ酸置換を含む定常ドメインを含むＴＣＲβ鎖、を含み、
前記融合タンパク質は、ＭＡＧＥＡ４に結合しない、融合タンパク質。

【請求項13】

融合タンパク質であって、
（ａ）少なくとも４個の最小マウス化アミノ酸置換、およびＴＣＲα鎖膜貫通ドメインに少なくとも３個の疎水性アミノ酸置換を含む定常ドメインを含むＴＣＲα鎖であって、前記ＴＣＲα鎖定常ドメインは、配列番号４に記載されるアミノ酸配列に対し、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＴＣＲα鎖、
（ｂ）ポリペプチド切断シグナル、ならびに
（ｃ）少なくとも５個の最小マウス化アミノ酸置換を含む定常ドメインを含むＴＣＲβ鎖であって、前記ＴＣＲβ鎖定常ドメインは、配列番号５または配列番号６に記載されるアミノ酸配列に対し、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＴＣＲβ鎖、を含み、
前記融合タンパク質は、ＭＡＧＥＡ４に結合しない、融合タンパク質。

【請求項14】

融合タンパク質であって、
（ａ）配列番号４に記載されるアミノ酸配列を含む定常ドメインを含むＴＣＲα鎖、
（ｂ）ポリペプチド切断シグナル、ならびに
（ｃ）配列番号５または配列番号６に記載されるアミノ酸配列を含む定常ドメインを含むＴＣＲβ鎖、を含み、
前記融合タンパク質は、ＭＡＧＥＡ４に結合しない、融合タンパク質。

【請求項15】

前記ポリペプチド切断シグナルが、ウイルス自己切断ペプチドまたはリボソームスキッピング配列である、請求項９～１４のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項16】

前記ポリペプチド切断シグナルが、ウイルス２Ａペプチドである、請求項９～１５のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項17】

前記ポリペプチド切断シグナルは、アフトウイルス２Ａペプチド、ポティウイルス２Ａペプチド、またはカルジオウイルス２Ａペプチドである、請求項９～１６のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項18】

前記ポリペプチド切断シグナルは、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａペプチド、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａペプチド、Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルス（ＴａＶ）２Ａペプチド、ブタテッショウウイルス－１（ＰＴＶ－１）２Ａペプチド、タイロウイルス２Ａペプチド、および脳心筋炎ウイルス２Ａペプチドからなる群から選択されるウイルス２Ａペプチドである、請求項９～１７のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項19】

請求項１～８のいずれか一項に記載のＴＣＲ、または請求項９～１８のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸。

【請求項20】

最小限にマウス化されたＴＣＲα鎖をコードする第一のポリヌクレオチドであって、前記ＴＣＲα鎖の膜貫通ドメインは疎水性アミノ酸置換を含む、第一のポリヌクレオチド、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、および最小限にマウス化されたＴＣＲβ鎖をコードする第二のポリヌクレオチド、を含む核酸であって、前記融合タンパク質は、ＭＡＧＥＡ４に結合しない、核酸。

【請求項21】

核酸であって、
（ａ）９０位、９１位、９２位、および９３位で最小マウス化アミノ酸置換、ならびに１１５位、１１８位、および１１９位で疎水性アミノ酸置換を含む定常ドメインを含むＴＣＲα鎖をコードする第一のポリヌクレオチド、
（ｂ）ＩＲＥＳ、ならびに
（ｃ）１８位、２２位、１３３位、１３６位、および１３９位で最小マウス化アミノ酸置換を含む定常ドメインを含むＴＣＲβ鎖をコードする第二のポリヌクレオチド、を含み、
前記融合タンパク質は、ＭＡＧＥＡ４に結合しない、核酸。

【請求項22】

核酸であって、
（ａ）Ｐ９０Ｓ、Ｅ９１Ｄ、Ｓ９２Ｖ、Ｓ９３Ｐ、Ｓ１１５Ｌ、Ｇ１１８Ｖ、およびＦ１１９Ｌのアミノ酸置換を含む定常ドメインを含むＴＣＲα鎖をコードする第一のポリヌクレオチド、
（ｂ）ＩＲＥＳ、ならびに
（ｃ）Ｅ１８Ｋ、Ｓ２２Ａ、Ｆ１３３Ｉ、Ｅ／Ｖ１３６Ａ、およびＱ１３９Ｈのアミノ酸置換を含む定常ドメインを含むＴＣＲβ鎖をコードする第二のポリヌクレオチド、を含み、
前記融合タンパク質は、ＭＡＧＥＡ４に結合しない、核酸。

【請求項23】

核酸であって、
（ａ）少なくとも４個の最小マウス化アミノ酸置換、およびＴＣＲα鎖膜貫通ドメインに少なくとも３個の疎水性アミノ酸置換を含む定常ドメインを含むＴＣＲα鎖であって、前記ＴＣＲα鎖定常ドメインは、配列番号４に記載されるアミノ酸配列に対し、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＴＣＲα鎖、をコードする第一のポリヌクレオチド、
（ｂ）ＩＲＥＳ、ならびに
（ｃ）少なくとも５個の最小マウス化アミノ酸置換を含む定常ドメインを含むＴＣＲβ鎖であって、前記ＴＣＲβ鎖定常ドメインは、配列番号５または配列番号６に記載されるアミノ酸配列に対し、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＴＣＲβ鎖、をコードする第二のポリヌクレオチド、を含み、
前記融合タンパク質は、ＭＡＧＥＡ４に結合しない、核酸。

【請求項24】

核酸であって、
（ａ）配列番号４に記載されるアミノ酸配列を含む定常ドメインを含むＴＣＲα鎖をコードする第一のポリヌクレオチド、
（ｂ）ＩＲＥＳ、ならびに
（ｃ）配列番号５または配列番号６に記載されるアミノ酸配列を含む定常ドメインを含むＴＣＲβ鎖をコードする第二のポリヌクレオチド、を含み、
前記融合タンパク質は、ＭＡＧＥＡ４に結合しない、核酸。

【請求項25】

請求項１～８のいずれか一項に記載のＴＣＲ、または請求項９～１８のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸を含む、ベクター。

【請求項26】

前記ベクターが、好ましくは発現ベクター、より好ましくはレトロウイルスベクター、またはさらに好ましくはレンチウイルスベクターである、請求項１９～２４のいずれか一項に記載の核酸を含むベクター。

【請求項27】

請求項１～８のいずれか一項に記載のＴＣＲを発現する細胞。

【請求項28】

請求項９～１８のいずれか一項に記載の融合タンパク質を発現する細胞。

【請求項29】

請求項１９～２４のいずれか一項に記載の核酸を含む細胞。

【請求項30】

請求項２５または請求項２６に記載のベクターを含む細胞。

【請求項31】

前記細胞が、免疫エフェクター細胞である、請求項２７～３０のいずれか一項に記載の細胞。

【請求項32】

前記細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、またはナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞からなる群から選択される免疫エフェクター細胞である、請求項２７～３１のいずれか一項に記載の細胞。

【請求項33】

請求項１～８のいずれか一項に記載のＴＣＲ、請求項９～１８のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項１９～２４のいずれか一項に記載の核酸、請求項２５もしくは請求項２６に記載のベクター、または請求項２７～３２のいずれか一項に記載の細胞を含む、組成物。

【請求項34】

薬学的に許容可能な担体、および請求項１～８のいずれか一項に記載のＴＣＲ、請求項９～１８のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項１９～２４のいずれか一項に記載の核酸、請求項２５もしくは請求項２６に記載のベクター、または請求項２７～３２のいずれか一項に記載の細胞を含む、医薬組成物。

【請求項35】

医薬品としての使用のための、請求項１～８のいずれか一項に記載のＴＣＲ、請求項９～１８のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項１９～２４のいずれか一項に記載の核酸、請求項２５もしくは請求項２６に記載のベクター、または請求項２７～３２のいずれか一項に記載の細胞、請求項３３に記載の組成物、または請求項３４に記載の医薬組成物。

【請求項36】

癌の治療における使用のためであり、前記癌は、好ましくは血液の癌または固形腫瘍であり、より好ましくは前記癌は、肉腫、前立腺癌、子宮癌、甲状腺癌、精巣癌、腎臓癌、膵臓癌、卵巣癌、食道癌、非小細胞肺癌、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、メラノーマ、肝細胞癌腫、頭頚部癌、胃癌、子宮内膜癌、大腸癌、胆管癌、乳癌、膀胱癌、骨髄性白血病および急性リンパ芽球性白血病からなる群から選択され、最も好ましくは、前記癌は、ＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、乳癌、卵巣癌、または大腸癌、肉腫、または骨肉腫からなる群から選択される、請求項１～８のいずれか一項に記載のＴＣＲ、請求項９～１８のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項１９～２４のいずれか一項に記載の核酸、請求項２５もしくは請求項２６に記載のベクター、または請求項２７～３２のいずれか一項に記載の細胞、請求項３３に記載の組成物、または請求項３４に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年３月２７日に出願された米国仮特許出願第６３／０００，８００号の３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づく優先権を主張し、当該仮特許出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

配列表に関する記載
本出願に関する配列表は紙媒体の代わりにテキストフォーマットで提出され、参照により本明細書に援用される。配列表を含むテキストファイルの名前は、ＢＬＵＥ－１３０＿ＰＣ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは７０ＫＢであり、２０２１年３月２５日に作成され、本明細書の出願と同時にＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出される。

【0003】

本発明は、発現および機能的アビディティが改善されるように操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ：Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）に関する。より具体的には、本発明は、発現および機能的アビディティを改善するアミノ酸置換を有するＴＣＲ、同ＴＣＲをコードするヌクレオチド、ベクター、細胞、組成物、薬剤、およびそれらを使用する方法に関する。

【背景技術】

【0004】

関連分野に関する記載
癌の診断および治療における技術的進歩はあるが、いまだに多くの癌患者は予後不良の状態である。

【0005】

養子細胞療法（ＡＣＴ：Ａｄｏｐｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ）は、悪性腫瘍およびウイルス感染の治療に対する有望なアプローチである。抗原特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ：ａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）で遺伝子改変されたＴリンパ球の養子移入は、患者自身のＴ細胞の腫瘍除去能力を活用し、増幅させる試みであり、健康な組織を傷つけることなく腫瘍を除去する。理論上、免疫系のＴ細胞には腫瘍細胞に特異的なタンパク質パターンを認識する能力があり、様々なエフェクター機構を介して腫瘍細胞の破壊を介在する。

【0006】

しかしこのアプローチは腫瘍免疫学の分野にとって新しいものではなく、多くの欠点によって、養子Ｔ細胞療法を癌および他の疾患の治療に幅広く使用することができない。ＴＣＲ遺伝子治療が直面する重大な障害は、ＴＣＲのミスペアリングである。ＴＣＲのミスペアリングは、導入されたＴＣＲα鎖またはＴＣＲβ鎖と、内因性のＴＣＲβ鎖またはＴＣＲα鎖との間の不正確なペア形成であり、これによって、治療用αβＴＣＲの表面発現が少なくなり、さらには特異性と毒性が不明なＴ細胞が生成されてしまう可能性がある。ＴＣＲ遺伝子療法のもう一つの重大な制限事項は、ＴＣＲの発現が予測不能なことである。これによって、ＴＣＲの不安定性がもたらされ、機能的アビディティが低下する可能性がある。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0007】

本開示の一部は概して、発現、安定性、および機能的アビディティが増加するよう改変された（操作された）単離されたＴ細胞受容体、そのポリヌクレオチド、組成物、医薬品および使用に関するものである。

【0008】

様々な実施形態において、最小限にマウス化されたＴＣＲα鎖と、最小限にマウス化されたＴＣＲβ鎖を含む単離されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が提供され、この場合において当該ＴＣＲα鎖の膜貫通ドメインは、疎水性アミノ酸置換を含む。

【0009】

様々な実施形態において、最小限にマウス化されたＴＣＲα鎖と、最小限にマウス化されたＴＣＲβ鎖を含む単離されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が提供され、この場合において当該ＴＣＲα鎖の膜貫通ドメインは、疎水性アミノ酸置換を含み、当該ＴＣＲは、ＭＡＧＥＡ４に結合しない。

【0010】

特定の実施形態では、単離されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）は、９０位、９１位、９２位、および９３位で最小マウス化アミノ酸置換、ならびに１１５位、１１８位、および１１９位で疎水性アミノ酸置換を含む定常ドメインを含むＴＣＲα鎖、ならびに１８位、２２位、１３３位、１３６位、および１３９位で最小マウス化アミノ酸置換を含む定常ドメインを含むＴＣＲβ鎖、を含む。

【0011】

特定の実施形態では、単離されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）は、Ｐ９０Ｓ、Ｅ９１Ｄ、Ｓ９２Ｖ、Ｓ９３Ｐ、Ｓ１１５Ｌ、Ｇ１１８Ｖ、およびＦ１１９Ｌのアミノ酸置換を含む定常ドメインを含むＴＣＲα鎖、ならびにＥ１８Ｋ、Ｓ２２Ａ、Ｆ１３３Ｉ、Ｅ／Ｖ１３６Ａ、およびＱ１３９Ｈのアミノ酸置換を含む定常ドメインを含むＴＣＲβ鎖、を含む。

【0012】

特定の実施形態では、単離されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）は、少なくとも４個の最小マウス化アミノ酸置換、およびＴＣＲα鎖膜貫通ドメインに少なくとも３個の疎水性アミノ酸置換を含む定常ドメインを含むＴＣＲα鎖であって、当該ＴＣＲα鎖定常ドメインは、配列番号４に記載されるアミノ酸配列に対し、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むもの、ならびに少なくとも５個の最小マウス化アミノ酸置換を含む定常ドメインを含むＴＣＲβ鎖であって、当該ＴＣＲβ鎖定常ドメインは、配列番号５または配列番号６に記載されるアミノ酸配列に対し、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むもの、を含む。

【0013】

一部の実施形態では、単離されたＴＣＲは、定常領域の９０位、９１位、９２位および９３位で最小マウス化アミノ酸置換、ならびに１１５位、１１８位および１１９位で疎水性アミノ酸置換を含む定常ドメインを含むＴＣＲα鎖であって、当該ＴＣＲα定常領域のアミノ酸配列は、配列番号４に記載されるアミノ酸配列に対し、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるもの、ならびに１８位、２２位、１３３位、１３６位、および１３９位で最小マウス化アミノ酸置換を含む定常領域を含むＴＣＲβ鎖であって、当該ＴＣＲβ定常領域のアミノ酸配列は、配列番号５または配列番号６に記載されるアミノ酸配列に対し、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるもの、を含む。

【0014】

特定の実施形態では、単離されたＴＣＲは、定常ドメインに以下の最小マウス化アミノ酸置換であるＰ９０Ｓ、Ｅ９１Ｄ、Ｓ９２Ｖ、およびＳ９３Ｐ、ならびに定常ドメインの膜貫通ドメインに以下の疎水性アミノ酸置換であるＳ１１５Ｌ、Ｇ１１８Ｖ、およびＦ１１９Ｌ、を含む定常ドメインを含むＴＣＲα鎖であって、この場合において当該ＴＣＲα定常ドメインのアミノ酸配列は、配列番号４に記載されるアミノ酸配列に対し、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるもの、ならびに以下の最小マウス化アミノ酸置換であるＥ１８Ｋ、Ｓ２２Ａ、Ｆ１３３Ｉ、Ｅ／Ｖ１３６Ａ、およびＱ１３９Ｈを含む定常ドメインを含むＴＣＲβ鎖であって、当該ＴＣＲβ定常ドメインのアミノ酸配列は、配列番号５または配列番号６に記載されるアミノ酸配列に対し、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるもの、を含む。

【0015】

特定の実施形態では、単離されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）は、配列番号４に記載されるアミノ酸配列を含む定常ドメインを含むＴＣＲα鎖、および配列番号５または配列番号６に記載されるアミノ酸配列を含む定常ドメインを含むＴＣＲβ鎖、を含む。

【0016】

特定の実施形態では、ＴＣＲは、以下からなる群から選択される標的抗原に結合する：α－フェトプロテイン（ＡＦＰ：α－ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）、Ｂ Ｍｅｌａｎｏｍａ Ａｎｔｉｇｅｎ（ＢＡＧＥ）ファミリー類、Ｂｒｏｔｈｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ ｓｉｔｅｓ（ＢＯＲＩＳ）、癌－精巣抗原、癌－精巣抗原８３（ＣＴ－８３）、Ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ ＩＸ（ＣＡ１Ｘ）、癌胎児抗原（ＣＥＡ：Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）抗原、メラノーマ上の細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）認識抗原（ＣＡＭＥＬ：Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ（ＣＴＬ）－ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ ｏｎ ｍｅｌａｎｏｍａ）、エプスタイン－バールウイルス（ＥＢＶ：Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ）抗原、Ｇ ａｎｔｉｇｅｎ １（ＧＡＧＥ－１）、ＧＡＧＥ－２、ＧＡＧＥ－３、ＧＡＧＥ－４、ＧＡＧＥ－５、ＧＡＧＥ－６、ＧＡＧＥ－７Ｂ、ＧＡＧＥ－８、糖タンパク質１００（ＧＰ１００：Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ １００）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）抗原、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）非構造タンパク質３（ＮＳ３）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ－２）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）－Ｅ６、ＨＰＶ－Ｅ７、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、潜在膜タンパク質２（ＬＭＰ２：Ｌａｔｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）、Ｍｅｌａｎｏｍａ ａｎｔｉｇｅｎ ｆａｍｉｌｙ Ａ，１（ＭＡＧＥ－Ａ１）、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ１２、Ｍｅｌａｎｏｍａ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ（ＭＡＲＴ－１）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ムチン１（ＭＵＣ１）、ムチン１６（ＭＵＣ１６）、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ－１（ＮＹＥＳＯ－１）、Ｐ５３、Ｐ抗原（ＰＡＧＥ：Ｐ ａｎｔｉｇｅｎ）ファミリー類、Ｐｌａｃｅｎｔａ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ １（ＰＬＡＣ１）、Ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎ ｍｅｌａｎｏｍａ（ＰＲＡＭＥ）、サバイビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）、Ｓｙｎｏｖｉａｌ ｓａｒｃｏｍａ Ｘ １（ＳＳＸ１）、Ｓｙｎｏｖｉａｌ ｓａｒｃｏｍａ Ｘ ２（ＳＳＸ２）、Ｓｙｎｏｖｉａｌ ｓａｒｃｏｍａ Ｘ ３（ＳＳＸ３）、Ｓｙｎｏｖｉａｌ ｓａｒｃｏｍａ Ｘ ４（ＳＳＸ４）、Ｓｙｎｏｖｉａｌ ｓａｒｃｏｍａ Ｘ ５（ＳＳＸ５）、Ｓｙｎｏｖｉａｌ ｓａｒｃｏｍａ Ｘ ８（ＳＳＸ８）、サイログロブリン、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質（ＴＲＰ：Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）１、ＴＲＰ２、Ｗｉｌｍｓ ｔｕｍｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＷＴ－１）、Ｘ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｆａｍｉｌｙ Ｍｅｍｂｅｒ １（ＸＡＧＥ１）、およびＸ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｆａｍｉｌｙ Ｍｅｍｂｅｒ ２（ＸＡＧＥ２）。

【0017】

さらなる実施形態において、最小限にマウス化されたＴＣＲα鎖、および最小限にマウス化されたＴＣＲβ鎖を含むが、ＴＣＲα鎖の膜貫通ドメインは疎水性アミノ酸置換を含まないＴＣＲと比較して、当該ＴＣＲの発現およびアビディティは増加している。

【0018】

さらなる実施形態において、最小限にマウス化されたＴＣＲα鎖、および最小限にマウス化されたＴＣＲβ鎖を含まないが、ＴＣＲα鎖の膜貫通ドメインは疎水性アミノ酸置換を含むＴＣＲと比較して、当該ＴＣＲの発現およびアビディティは増加している。

【0019】

特定の好ましい実施形態では、本明細書において予期される単離されたＴＣＲは、ＭＡＧＥＡ４に結合しない。

【0020】

特定の実施形態において、本明細書において予期されるＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を含む融合タンパク質が提供される。

【0021】

特定の実施形態では、融合タンパク質は、最小限にマウス化されたＴＣＲα鎖であって、当該ＴＣＲα鎖の膜貫通ドメインは、疎水性アミノ酸置換を含むもの、ポリペプチド切断シグナル、および最小限にマウス化されたＴＣＲβ鎖、を含む。

【0022】

特定の実施形態では、融合タンパク質は、９０位、９１位、９２位、および９３位で最小マウス化アミノ酸置換、ならびに１１５位、１１８位、および１１９位で疎水性アミノ酸置換を含む定常ドメインを含むＴＣＲα鎖、ポリペプチド切断シグナル、ならびに１８位、２２位、１３３位、１３６位、および１３９位で最小マウス化アミノ酸置換を含む定常ドメインを含むＴＣＲβ鎖、を含む。

【0023】

特定の実施形態では、融合タンパク質は、Ｐ９０Ｓ、Ｅ９１Ｄ、Ｓ９２Ｖ、Ｓ９３Ｐ、Ｓ１１５Ｌ、Ｇ１１８Ｖ、およびＦ１１９Ｌのアミノ酸置換を含む定常ドメインを含むＴＣＲα鎖、ポリペプチド切断シグナル、ならびにＥ１８Ｋ、Ｓ２２Ａ、Ｆ１３３Ｉ、Ｅ／Ｖ１３６Ａ、およびＱ１３９Ｈのアミノ酸置換を含む定常ドメインを含むＴＣＲβ鎖、を含む。

【0024】

特定の実施形態では、融合タンパク質は、少なくとも４個の最小マウス化アミノ酸置換、およびＴＣＲα鎖膜貫通ドメインに少なくとも３個の疎水性アミノ酸置換を含む定常ドメインを含むＴＣＲα鎖であって、当該ＴＣＲα鎖定常ドメインは、配列番号４に記載されるアミノ酸配列に対し、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むもの、ポリペプチド切断シグナル、ならびに少なくとも５個の最小マウス化アミノ酸置換を含む定常ドメインを含むＴＣＲβ鎖であって、当該ＴＣＲβ鎖定常ドメインは、配列番号５または配列番号６に記載されるアミノ酸配列に対し、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むもの、を含む。

【0025】

特定の実施形態では、融合タンパク質は、定常領域の９０位、９１位、９２位および９３位で最小マウス化アミノ酸置換、ならびに１１５位、１１８位および１１９位で疎水性アミノ酸置換を含む定常ドメインを含むＴＣＲα鎖であって、当該ＴＣＲα定常領域のアミノ酸配列は、配列番号４に記載されるアミノ酸配列に対し、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるもの、ポリペプチド切断シグナル、ならびに１８位、２２位、１３３位、１３６位、および１３９位で最小マウス化アミノ酸置換を含む定常領域を含むＴＣＲβ鎖であって、当該ＴＣＲβ定常領域のアミノ酸配列は、配列番号５または配列番号６に記載されるアミノ酸配列に対し、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるもの、を含む。

【0026】

特定の実施形態では、融合タンパク質は、定常ドメインに以下の最小マウス化アミノ酸置換であるＰ９０Ｓ、Ｅ９１Ｄ、Ｓ９２Ｖ、およびＳ９３Ｐ、ならびに定常ドメインの膜貫通ドメインに以下の疎水性アミノ酸置換であるＳ１１５Ｌ、Ｇ１１８Ｖ、およびＦ１１９Ｌ、を含む定常ドメインを含むＴＣＲα鎖であって、この場合において当該ＴＣＲα定常ドメインのアミノ酸配列は、配列番号４に記載されるアミノ酸配列に対し、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるもの、ポリペプチド切断シグナル、ならびに以下の最小マウス化アミノ酸置換であるＥ１８Ｋ、Ｓ２２Ａ、Ｆ１３３Ｉ、Ｅ／Ｖ１３６Ａ、およびＱ１３９Ｈを含む定常ドメインを含むＴＣＲβ鎖であって、当該ＴＣＲβ定常ドメインのアミノ酸配列は、配列番号５または配列番号６に記載されるアミノ酸配列に対し、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるもの、を含む。

【0027】

特定の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号４に記載されるアミノ酸配列を含む定常ドメインを含むＴＣＲα鎖、ポリペプチド切断シグナル、および配列番号５または配列番号６に記載されるアミノ酸配列を含む定常ドメインを含むＴＣＲβ鎖、を含む。

【0028】

一部の実施形態では、ポリペプチド切断シグナルは、ウイルス自己切断ペプチドまたはリボソームスキッピング配列である。

【0029】

特定の実施形態では、ポリペプチド切断シグナルは、ウイルス２Ａペプチドである。

【0030】

さらなる実施形態では、ポリペプチド切断シグナルは、アフトウイルス２Ａペプチド、ポティウイルス２Ａペプチド、またはカルジオウイルス２Ａペプチドである。

【0031】

追加的な実施形態では、ポリペプチド切断シグナルは、ウイルス２Ａペプチドであり、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａペプチド、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａペプチド、ゾセアアシグナウイルス（ＴａＶ）２Ａペプチド、ブタテスコウイルス－１（ＰＴＶ－１）２Ａペプチド、タイロウイルス２Ａペプチド、および脳心筋炎ウイルス２Ａペプチドからなる群から選択される。

【0032】

特定の好ましい実施形態では、本明細書において予期される融合タンパク質は、ＭＡＧＥＡ４に結合しない。

【0033】

他の実施形態では、核酸は、本明細書に予期されるＴＣＲまたは融合タンパク質をコードする。

【0034】

一部の実施形態では、核酸は、最小限にマウス化されたＴＣＲα鎖をコードする第一のポリヌクレオチドであって、この場合において当該ＴＣＲα鎖膜貫通ドメインは、疎水性アミノ酸置換を含むもの、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、および最小限にマウス化されたＴＣＲβ鎖をコードする第二のポリヌクレオチド、を含む。

【0035】

特定の実施形態では、核酸は、９０位、９１位、９２位、および９３位で最小マウス化アミノ酸置換、ならびに１１５位、１１８位、および１１９位で疎水性アミノ酸置換を含む定常ドメインを含むＴＣＲα鎖をコードする第一のポリヌクレオチド、ＩＲＥＳ、ならびに１８位、２２位、１３３位、１３６位、および１３９位で最小マウス化アミノ酸置換を含む定常ドメインを含むＴＣＲβ鎖をコードする第二のポリヌクレオチド、を含む。

【0036】

特定の実施形態では、核酸は、Ｐ９０Ｓ、Ｅ９１Ｄ、Ｓ９２Ｖ、Ｓ９３Ｐ、Ｓ１１５Ｌ、Ｇ１１８Ｖ、およびＦ１１９Ｌのアミノ酸置換を含む定常ドメインを含むＴＣＲα鎖をコードする第一のポリヌクレオチド、ＩＲＥＳ、ならびにＥ１８Ｋ、Ｓ２２Ａ、Ｆ１３３Ｉ、Ｅ／Ｖ１３６Ａ、およびＱ１３９Ｈのアミノ酸置換を含む定常ドメインを含むＴＣＲβ鎖をコードする第二のポリヌクレオチド、を含む。

【0037】

一部の実施形態では、核酸は、少なくとも４個の最小マウス化アミノ酸置換、およびＴＣＲα鎖膜貫通ドメインに少なくとも３個の疎水性アミノ酸置換を含む定常ドメインを含むＴＣＲα鎖をコードする第一のポリヌクレオチドであって、当該ＴＣＲα鎖定常ドメインは、配列番号４に記載されるアミノ酸配列に対し、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むもの、ＩＲＥＳ、ならびに少なくとも５個の最小マウス化アミノ酸置換を含む定常ドメインを含むＴＣＲβ鎖をコードする第二のポリヌクレオチドであって、当該ＴＣＲβ鎖定常ドメインは、配列番号５または配列番号６に記載されるアミノ酸配列に対し、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むもの、を含む。

【0038】

好ましい実施形態では、核酸は、定常領域の９０位、９１位、９２位および９３位で最小マウス化アミノ酸置換、ならびに１１５位、１１８位および１１９位で疎水性アミノ酸置換を含む定常ドメインを含むＴＣＲα鎖をコードする第一のポリヌクレオチドであって、当該ＴＣＲα定常領域のアミノ酸配列は、配列番号４に記載されるアミノ酸配列に対し、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるもの、ＩＲＥＳ、ならびに１８位、２２位、１３３位、１３６位、および１３９位で最小マウス化アミノ酸置換を含む定常領域を含むＴＣＲβ鎖をコードする第二のポリヌクレオチドであって、当該ＴＣＲβ定常領域のアミノ酸配列は、配列番号５または配列番号６に記載されるアミノ酸配列に対し、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるもの、を含む。

【0039】

特定の実施形態では、核酸は、定常ドメインに以下の最小マウス化アミノ酸置換であるＰ９０Ｓ、Ｅ９１Ｄ、Ｓ９２Ｖ、およびＳ９３Ｐ、ならびに定常ドメインの膜貫通ドメインに以下の疎水性アミノ酸置換であるＳ１１５Ｌ、Ｇ１１８Ｖ、およびＦ１１９Ｌ、を含む定常ドメインを含むＴＣＲα鎖をコードする第一のポリヌクレオチドであって、この場合において当該ＴＣＲα定常ドメインのアミノ酸配列は、配列番号４に記載されるアミノ酸配列に対し、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるもの、ＩＲＥＳ、ならびに以下の最小マウス化アミノ酸置換であるＥ１８Ｋ、Ｓ２２Ａ、Ｆ１３３Ｉ、Ｅ／Ｖ１３６Ａ、およびＱ１３９Ｈを含む定常ドメインを含むＴＣＲβ鎖をコードする第二のポリヌクレオチドであって、当該ＴＣＲβ定常ドメインのアミノ酸配列は、配列番号５または配列番号６に記載されるアミノ酸配列に対し、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるもの、を含む。

【0040】

特定の実施形態では、核酸は、配列番号４に記載されるアミノ酸配列を含む定常ドメインを含むＴＣＲα鎖をコードする第一のポリヌクレオチド、ＩＲＥＳ、および配列番号５または配列番号６に記載されるアミノ酸配列を含む定常ドメインを含むＴＣＲβ鎖をコードする第二のポリヌクレオチド、を含む。

【0041】

特定の好ましい実施形態では、本明細書で予期される核酸は、ＭＡＧＥＡ４に結合する単離されたＴＣＲまたは融合タンパク質をコードしない。

【0042】

一部の実施形態では、ベクターは、本明細書で予期されるＴＣＲまたは融合タンパク質をコードする核酸を含む。

【0043】

特定の実施形態では、ベクターは、本明細書で予期される核酸を含む。

【0044】

一部の実施形態において、ベクターは、発現ベクターである。

【0045】

他の実施形態において、ベクターは、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである。

【0046】

特定の実施形態では、細胞は、本明細書で予期されるＴＣＲを発現するように改変される。

【0047】

特定の実施形態では、細胞は、予期される融合タンパク質を発現するように改変される。

【0048】

特定の実施形態では、細胞は、本明細書で予期される核酸を発現するように改変される。

【0049】

特定の実施形態では、細胞は、本明細書で予期されるベクターを含む。

【0050】

特定の実施形態では、細胞は、免疫エフェクター細胞である。

【0051】

さらなる実施形態では、細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、またはナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞からなる群から選択される免疫エフェクター細胞である。

【0052】

様々な実施形態では、組成物は、本明細書で予期されるＴＣＲ、融合タンパク質、核酸、ベクター、または細胞を含む。

【0053】

様々な実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体と、本明細書で予期されるＴＣＲ、融合タンパク質、核酸、ベクターまたは細胞を含む。

【0054】

医薬品としての使用のための、本明細書で予期されるＴＣＲ、融合タンパク質、核酸、ベクター、細胞、組成物、または医薬組成物。

【0055】

癌の治療における使用のための本明細書に予期されるＴＣＲ、融合タンパク質、核酸、ベクター、細胞、組成物または医薬組成物であって、当該癌は、好ましくは血液の癌または固形腫瘍であり、より好ましくは当該癌は、肉腫、前立腺癌、子宮癌、甲状腺癌、精巣癌、腎臓癌、膵臓癌、卵巣癌、食道癌、非小細胞肺癌、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、メラノーマ、肝細胞癌腫、頭頚部癌、胃癌、子宮内膜癌、大腸癌、胆管癌、乳癌、膀胱癌、骨髄性白血病および急性リンパ芽球性白血病からなる群から選択され、最も好ましくは、当該癌は、ＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、乳癌、卵巣癌、または大腸癌、肉腫、または骨肉腫からなる群から選択される。

【図面の簡単な説明】

【0056】

【図1】図１は、ＭＡＧＥＡ４ ＴＣＲ発現に対する様々なアミノ酸置換の影響を示す。ドナー細胞（ｎ＝２）を、ＴＣＲ^ＴＭ（膜貫通ドメインにおける疎水性変異）、ＴＣＲ^ＭＭ（最小マウス変異）、ＴＣＲ^{ＴＭ／ＭＭ}（両方の変異セット）、またはＴＣＲ^ＷＴ（ヒトＴＣＲ）をコードするレンチウイルス構築物で形質導入し、１０日間培養した。非形質導入（ＵＴＤ：ｕｎｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ）Ｔ細胞は、対照として使用した。１０日目にＭＡＧＥＡ４ペプチド（五量体構造）で標識することによって発現を検証した。

【図2】図２Ａは、二つの異なる形質導入（Ｔｄｘｎ）条件下で、ＴＣＲ^ＷＴをコードするレンチウイルスベクターで形質導入されたＴ細胞と比較し、ＴＣＲ^{ＴＭ／ＭＭ}をコードするレンチウイルスベクターで形質導入されたＴ細胞において、ＴＣＲの発現が増加していたことを示す（左パネル）。 図２Ｂは、二つの異なるＴｄｘｎ条件下で、レンチウイルスＴＣＲ構築物のＴＣＲ^{ＴＭ／ＭＭ}およびＴＣＲ^ＷＴを用いたドナー細胞（ｎ＝２）の形質導入効率は同等であったことを示す（右パネル）。

【図3】図３Ａは、ＴＣＲ^ＷＴを発現するＴ細胞におけるＴＣＲミスペアリングを示す。ペアリングは、ｖ－ベータ染色および四量体抗原染色によって検出された陽性細胞の割合として表される。ｖ－ベータ染色および四量体抗原染色によって検出された陽性細胞の割合が等しい場合は、特異的なＴＣＲペアリングが示唆される。 図３Ｂは、ＴＣＲ^{ＴＭ／ＭＭ}を発現するＴ細胞におけるＴＣＲミスペアリングを示す（右パネル）。ペアリングは、ｖ－ベータ染色および四量体抗原染色によって検出された陽性細胞の割合として表される。ｖ－ベータ染色および四量体抗原染色によって検出された陽性細胞の割合が等しい場合は、特異的なＴＣＲペアリングが示唆される。

【図4】図４Ａは、ＴＣＲ^ＷＴおよびＴＣＲ^{ＴＭ／ＭＭ}をコードするレンチウイルスベクターで形質導入されたドナーＴ細胞からのＩＦＮγ産生を示す。ＵＴＤ Ｔ細胞、ＴＣＲ^ＷＴまたはＴＣＲ^{ＴＭ／ＭＭ} Ｔ細胞を、１：１のＥ：Ｔ比で、ＭＡＧＥＡ４発現腫瘍細胞と一緒に共培養し、ＩＦＮγ発現を２４時間後に測定した（左パネル）。 図４Ｂは、ＴＣＲ^ＷＴおよびＴＣＲ^{ＴＭ／ＭＭ}をコードするレンチウイルスベクターで形質導入されたドナーＴ細胞の細胞傷害活性を示す。ＵＴＤ Ｔ細胞、ＴＣＲ^ＷＴまたはＴＣＲ^{ＴＭ／ＭＭ} Ｔ細胞を、１：１のＥ：Ｔ比で、ＭＡＧＥＡ４発現腫瘍細胞と一緒に共培養し、細胞障害活性を３日間にわたり測定した（右パネル）。

【図5A】図５Ａおよび５Ｂは、ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ発現に対する様々な変異の作用を示す。ドナー細胞（ｎ＝２）を、ＴＣＲ^ＷＴ（ヒトＴＣＲ）、ＴＣＲ^ＭＭ（最小マウス変異）、またはＴＣＲ^{ＴＭ／ＭＭ}（膜貫通ドメインにおける疎水性変異、および最小マウス変異）をコードするレンチウイルス構築物で形質導入し、１０日間培養した。非形質導入（ＵＴＤ：ｕｎｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ）Ｔ細胞は、対照として使用した。図５Ａは、１０日目にＮＹ－ＥＳＯペプチド（五量体構造）で標識することにより検証されたＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ発現を示す。

【図5B】図５Ｂは、各ドナーについて、ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ発現の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。

【図6】図６は、ＵＴＤ Ｔ細胞、ＴＣＲ^ＷＴ Ｔ細胞、およびＴＣＲ^{ＴＭ／ＭＭ} Ｔ細胞におけるＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲのミスペアリングを示す。ペアリングは、ｖ－ベータ染色および四量体抗原染色によって検出された陽性細胞の割合として表される。

【発明を実施するための形態】

【0057】

配列番号に関する簡単な説明
配列番号１は、ヒトＴＣＲα定常領域のアミノ酸配列を記載する。
配列番号２は、ヒトＴＣＲβ定常領域１のアミノ酸配列を記載する。
配列番号３は、ヒトＴＣＲβ定常領域２のアミノ酸配列を記載する。
配列番号４は、最小マウスアミノ酸置換、および膜貫通ドメインにおいて疎水性アミノ酸置換と、を含むヒトＴＣＲα定常領域のアミノ酸配列を記載する。
配列番号５は、最小マウスアミノ酸置換を含むヒトＴＣＲβ定常領域１のアミノ酸配列を記載する。
配列番号６は、最小マウスアミノ酸置換を含むヒトＴＣＲβ定常領域２のアミノ酸配列を記載する。
配列番号７は、最小マウスアミノ酸置換、および膜貫通ドメインにおいて疎水性アミノ酸置換と、含む定常領域を含むヒトＭＡＲＴ－１ ＴＣＲα鎖のアミノ酸配列を記載する。
配列番号８は、最小マウスアミノ酸置換を含む定常領域を含むヒトＭＡＲＴ－１ ＴＣＲβ鎖のアミノ酸配列を記載する。
配列番号９は、最小マウスアミノ酸置換、および膜貫通ドメインにおいて疎水性アミノ酸置換と、を含む定常領域を含むヒトＭＡＲＴ－１ ＴＣＲα鎖のアミノ酸配列を記載する。
配列番号１０は、最小マウスアミノ酸置換を含む定常領域を含むヒトＭＡＲＴ－１ ＴＣＲβ鎖のアミノ酸配列を記載する。
配列番号１１は、最小マウスアミノ酸置換、および膜貫通ドメインにおいて疎水性アミノ酸置換と、を含む定常領域を含むヒトＷＴ－１ ＴＣＲα鎖のアミノ酸配列を記載する。
配列番号１２は、最小マウスアミノ酸置換を含む定常領域を含むヒトＷＴ－１ ＴＣＲβ鎖のアミノ酸配列を記載する。
配列番号１３は、最小マウスアミノ酸置換、および膜貫通ドメインにおいて疎水性アミノ酸置換と、を含む定常領域を含むヒトＨＰＶ１６ Ｅ６ ＴＣＲα鎖のアミノ酸配列を記載する。
配列番号１４は、最小マウスアミノ酸置換を含む定常領域を含むヒトＨＰＶ１６ Ｅ６ ＴＣＲβ鎖のアミノ酸配列を記載する。
配列番号１５は、最小マウスアミノ酸置換、および膜貫通ドメインにおいて疎水性アミノ酸置換と、を含む定常領域を含むヒトＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲα鎖のアミノ酸配列を記載する。
配列番号１６は、最小マウスアミノ酸置換を含む定常領域を含むヒトＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲβ鎖のアミノ酸配列を記載する。
配列番号１７は、最小マウスアミノ酸置換、および膜貫通ドメインにおいて疎水性アミノ酸置換と、を含む定常領域を含むヒトＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲα鎖のアミノ酸配列を記載する。
配列番号１８は、最小マウスアミノ酸置換を含む定常領域を含むヒトＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲβ鎖のアミノ酸配列を記載する。
配列番号１９は、最小マウスアミノ酸置換、および膜貫通ドメインにおいて疎水性アミノ酸置換と、を含む定常領域を含むヒトＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲα鎖のアミノ酸配列を記載する。
配列番号２０は、最小マウスアミノ酸置換を含む定常領域を含むヒトＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲβ鎖のアミノ酸配列を記載する。
配列番号２１は、最小マウスアミノ酸置換、および膜貫通ドメインにおいて疎水性アミノ酸置換と、を含む定常領域を含むヒトＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲα鎖のアミノ酸配列を記載する。
配列番号２２は、最小マウスアミノ酸置換を含む定常領域を含むヒトＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲβ鎖のアミノ酸配列を記載する。
配列番号２３は、最小マウスアミノ酸置換、および膜貫通ドメインにおいて疎水性アミノ酸置換と、を含む定常領域を含むヒトＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲα鎖のアミノ酸配列を記載する。
配列番号２４は、最小マウスアミノ酸置換を含む定常領域を含むヒトＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲβ鎖のアミノ酸配列を記載する。
配列番号２５は、最小マウスアミノ酸置換、および膜貫通ドメインにおいて疎水性アミノ酸置換と、を含む定常領域を含むヒトＧＰ１００ ＴＣＲα鎖のアミノ酸配列を記載する。
配列番号２６は、最小マウスアミノ酸置換を含む定常領域を含むヒトＧＰ１００ ＴＣＲβ鎖のアミノ酸配列を記載する。
配列番号２７～３７は、様々なリンカーのアミノ酸配列を記載する。
配列番号３８～６２は、プロテアーゼ切断部位および自己切断型ポリペプチドの切断部位のアミノ酸配列を記載する。
配列番号６３は、コンセンサスＫｏｚａｋ配列のポリヌクレオチド配列を記載する。
本開示全体を通して、ＴＣＲαおよびＴＣＲβの定常領域を用いて、アミノ酸の位置についての参照がなされる。アミノ酸の位置は、ＴＣＲαについては配列番号１および４、ＴＣＲβについては配列番号２、３、５、および６を参照して番号が付けられている。

【0058】

前述の配列において、Ｘは、存在する場合には任意のアミノ酸を指し、またはアミノ酸の非存在を指す。

【0059】

Ａ．概要
本開示の一部は概して、発現、安定性、および機能的アビディティが増加するよう改変されたＴ細胞受容体に関するものである。ＴＣＲのアビディティは、その標的ペプチドに対するＴＣＲのアフィニティと、ＴＣＲの発現によって決定される。標的ペプチドに対するＴＣＲのアフィニティは概して、１μＭ～１０μＭの範囲内である。しかし、ＴＣＲのアフィニティが高すぎる場合、胸腺拒絶反応や、望ましくないオフターゲット活性のいずれかが生じてしまう可能性がある。ＴＣＲのアビディティは、細胞表面上に発現されるＴＣＲ分子の数を増加させることによって向上させることもでき、可能性としては、コドン最適化や、鎖の方向性の最適化を行い、バランスのとれた発現を実現することによってアビディティ向上を実現することができる。ＴＣＲの安定性も、ＴＣＲ発現において役割を果たし得る。

【0060】

ＴＣＲ膜貫通領域中の正電荷残基は、ＴＣＲの不安定化と、発現減少の原因となり得る。膜貫通ドメインの組成を変化させることで不安定化を低下させ、発現が増加する場合もあるが、一部の電荷残基はＣＤ３複合体との相互作用に必須であるため、当該鎖を劇的に変化させることはできない。

【0061】

ＴＣＲ鎖の不安定性に加えて、内因性ＴＣＲ鎖との競合も低発現の原因となる。トランスジェニック（外因性）鎖と内因性鎖とのミスペアリングによって、ＴＣＲ発現の低下が生じ、ＴＣＲの機能的アビディティが減少して、さらにオフターゲット毒性の可能性も生じる。当分野では、内因性ＴＣＲ座位のノックアウトや、トランスジェニック定常ドメイン（例えば、ヒト）を異なる種由来の定常ドメイン（例えば、マウス）で置換することにより、この問題に対処してきた。しかしこれらの戦略では、内因性ＴＣＲ座位の不完全な不活化、および外来性定常ドメインの存在による免疫原性のリスク増加の恐れがある。

【0062】

本発明者らは、最小マウスアミノ酸置換、およびＴＣＲαの膜貫通ドメインにおける疎水性アミノ酸置換の組み合わせを用いて操作されたＴＣＲが、ＴＣＲの安定性、発現、特異的ペアリング、および機能的アビディティを相乗的に増加させるという予想外の発見をした。さらに本発明者らは驚くべきことに、ＴＣＲ定常ドメインを操作することにより、多くのＴＣＲ（高アフィニティおよび低アフィニティの両方とも）が、前述の特性を保有し得ること、それに伴い、取り扱いやすい免疫療法戦略となることを見出した。さらに、本明細書で予期される操作されたＴＣＲは、シンプルな製造工程、用量を満たすためのＴＣＲ Ｔ細胞数の減少、およびＴＣＲ発現を低下させることなくさらに操作できる可能性をはじめとする、当分野の操作されたＴＣＲ Ｔ細胞を超える他の利点を提供する。

【0063】

様々な実施形態では、安定性、発現、および機能的アビディティを増加させるよう操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が提供される。本明細書に予期されるＴＣＲは、ＴＣＲを最小限にマウス化するための一つ以上のアミノ酸置換、および膜貫通ドメインに一つ以上のアミノ酸疎水性アミノ酸置換を含む。特定の実施形態では、ＴＣＲは、最小限にマウス化され、および膜貫通ドメインに疎水性アミノ酸置換を含む定常領域を伴うＴＣＲα鎖、ならびに最小限にマウス化された定常領域を伴うＴＣＲα鎖を含む。

【0064】

特定の実施形態では、本明細書に予期されるＴＣＲは、ＴＣＲα定常領域にＴＣＲα鎖を最小限にマウス化するための１個、２個、３個、または４個のアミノ酸置換、ＴＣＲα膜貫通ドメインに１個、２個または３個の疎水性アミノ酸置換、およびＴＣＲβ定常領域にＴＣＲβ鎖を最小限にマウス化するための１個、２個、３個、４個、または５個のアミノ酸置換、を含む。好ましい実施形態では、本明細書に予期されるＴＣＲは、ＴＣＲα定常領域にＴＣＲα鎖を最小限にマウス化するための４個のアミノ酸置換、ＴＣＲα膜貫通ドメインに３個の疎水性アミノ酸置換、およびＴＣＲβ定常領域にＴＣＲβ鎖を最小限にマウス化するための５個のアミノ酸置換、を含む。

【0065】

本明細書で予期されるＴＣＲは、典型的には、主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子によって提示される標的抗原に結合する。特定の実施形態では、本明細書で予期されるＴＣＲは、癌細胞上に発現される標的抗原、すなわち限定されないが、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ：ｔｕｍｏｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ）および腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ：ｔｕｍｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）をはじめとする腫瘍抗原に結合する。

【0066】

特定の実施形態では、操作されたＴＣＲをコードする一つ以上のポリヌクレオチドが、予期される。ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖は、異なるポリヌクレオチドによってコードされてもよく、またはポリシストロニックタンパク質として、もしくは融合ポリペプチドとして単一のポリヌクレオチドによってコードされてもよく、この場合において当該鎖は、任意で自己切断型ポリペプチドなどのリンカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによって分離される。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＴＣＲα鎖、自己切断型ポリペプチド、およびＴＣＲβポリペプチドをコードする。他の特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＴＣＲβ鎖、自己切断型ポリペプチド、およびＴＣＲαポリペプチドをコードする。

【0067】

特定の実施形態では、ＴＣＲポリヌクレオチドは、免疫エフェクター細胞に導入されることがさらに予期される。本明細書で予期されるＴＣＲを発現する免疫エフェクター細胞は、組成物または医薬組成物として製剤化されてもよく、癌の治療のための医薬品の製造において使用されてもよく、および／または癌の治療方法において使用されてもよい。

【0068】

好ましい実施形態では、本明細書に予期されるＴＣＲは、限定されないが、霊長類またはヒトのＭＡＧＥＡ４をはじめとするＭＡＧＥＡ４に結合しない。

【0069】

組み換え（すなわち、操作された）ＤＮＡ、ペプチドおよびオリゴヌクレオチド合成、免疫アッセイ、組織培養、形質変換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）、酵素反応、精製ならびに関連する技術および手法は、本明細書を通じて引用され、考察される、微生物学、分子生物学、生化学、分子遺伝学、細胞生物学、ウイルス学および免疫学における様々な一般的およびより具体的な参考文献に記載されるように一般的に行われてもよい。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、２００８年７月に更新）、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｇｌｏｖｅｒ，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ ＵＳＡ，１９８５）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ：Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａｄａ Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄａｖｉｄ Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅｔｈａｎ Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗａｒｒｅｎ Ｓｔｒｏｂｅｒ ２００１ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ，ＮＹ）、Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｊｕｌｉｅ Ｌｏｇａｎ，Ｋｉｒｓｔｉｎ Ｅｄｗａｒｄｓ ａｎｄ Ｎｉｃｋ Ｓａｕｎｄｅｒｓ，２００９，Ｃａｉｓｔｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｏｒｆｏｌｋ，ＵＫ、Ａｎａｎｄ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｇｅｎｏｍｅｓ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２）、Ｇｕｔｈｒｉｅ ａｎｄ Ｆｉｎｋ，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ，Ｅｄ．，１９８４）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｈｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．，１９８５）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．，１９８４）、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｅｄ．，１９８６）、Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）、Ｎｅｘｔ－Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｊａｎｉｔｚ，２００８ Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ）、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｐａｒｋ，Ｅｄ．，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１０ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）、ｔｈｅ ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ ｅｄｓ．，１９８７，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９８）、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄＣＣ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６）、Ｒｏｉｔｔ，Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｑ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ ａｎｄ Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ，ｅｄｓ．，１９９１）、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ならびにＡｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙなどの専門誌の研究論文を参照されたい。

【0070】

Ｂ．定義
本開示をより詳細に記載する前に、本明細書で使用されるべきある特定の用語の定義を提供することは、その理解に役立ち得る。

【0071】

別段の規定がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって普遍的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似した、または均等の方法および材料を、特定の実施形態の実施または検証に使用することができるが、本明細書においては好ましい組成物、方法および材料の実施形態を開示している。本開示の目的に対し、以下の用語を、以下に規定する。

【0072】

「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」といった冠詞は、本明細書において、当該冠詞の文法上の対象の一つまたは複数（すなわち少なくとも一つ、または一つもしくは複数）を指すために使用される。例示として、「ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ」とは、一つの要素、または一つもしくは複数の要素を意味する。

【0073】

選択肢（例えば「または」）の使用は、いずれか一つ、両方、またはその選択肢の任意の組み合わせを意味すると理解されたい。

【0074】

「および／または」という用語は、いずれか一つ、またはその選択肢の両方を意味すると理解されたい。

【0075】

本明細書において使用される場合、「約」または「およそ」という用語は、基準の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重さ、または長さに対し、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％までも変化する数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重さ、または長さを指す。一つの実施形態では、「約」または「およそ」という用語は、基準の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重さ、または長さに関し、±１５％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％または±１％の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重さ、または長さの範囲を指す。

【0076】

一つの実施形態では、例えば１～５、約１～５、または約１～約５といった範囲は、当該範囲に包含される各数値を指す。例えば、一つの非限定的かつ単なる例示としての実施形態では、「１～５」という範囲は、１、２、３、４、５という表現、または１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、もしくは５．０という表現、または１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、もしくは５．０という表現と同等である。

【0077】

本明細書において使用される場合、「実質的に」という用語は、基準の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重さ、または長さと比較して、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上である数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重さ、または長さを指す。一実施形態では、「実質的に同じ」は、参照の量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さとほぼ同じである効果、例えば、生理学的効果を生じる量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さを指す。

【0078】

本明細書全体を通じて、文脈が別段要求しない限り、語句「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含むこと」は、規定される工程もしくは構成要素または工程もしくは構成要素の群を含むことを暗示するが、任意の他の工程もしくは構成要素または工程もしくは構成要素の群を除外することを暗示しないことは理解されるだろう。「～からなる」とは、語句「からなる」に続くもの全てを含み、それらに限定されることを意味する。ゆえに、「～からなる」という文言は、列記される要素が必要または義務であり、他の要素は存在し得ないことを示す。「本質的に～からなる」とは、当該文言の後に列記される任意の要素、および列記される要素に関して本開示中に特定される活性もしくは作用に干渉しない、または寄与しない他の要素に限定される任意の要素を含むことを意味する。ゆえに、「本質的に～からなる」という文言は、列記される要素が必須または義務であり、しかし列記される要素の活性または作用に実質的に影響を与える他の要素は存在しないことを示す。

【0079】

本明細書全体を通じて「一つの実施形態」、「実施形態」、「特定の実施形態」、「関連する実施形態」、「ある実施形態」、「追加的な実施形態」、もしくは「さらなる実施形態」、またはそれらの組み合わせに対する参照は、当該実施形態と関連付けて記載される特定の性質、構造または特徴が、少なくとも一つの実施形態に含まれることを意味する。ゆえに本明細書全体の様々な箇所での前述の文言の出現は、必ずしもすべてが同じ実施形態を指しているわけではない。さらに特定の性質、構造または特徴は、一つ以上の実施形態において任意の適切な様式で組み合わされ得る。さらに、一つの実施形態でのある性質の肯定的な列挙は、特定の実施形態では当該性質の除外の根拠として機能することを理解されたい。

【0080】

「外来」分子は、細胞に通常存在しないが、一つまたは複数の遺伝子、生化学的または他の方法によって細胞に導入される分子である。例示的な外来分子としては、小有機分子、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖類、上記分子の任意の改変された誘導体、または上記分子の一つまたは複数を含む任意の複合体が挙げられるが、これらに限定されない。細胞への外来分子の導入方法は、当業者に公知であり、脂質により仲介される伝達（すなわち、中性脂質およびカチオン性脂質を含むリポソーム）、エレクトロポレーション、直接注入、細胞融合、微粒子銃、バイオポリマーナノ粒子、リン酸カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ－デキストランにより仲介される伝達、およびウイルスベクターにより仲介される伝達が挙げられるが、これらに限定されない。

【0081】

「内在」分子は、特定の環境条件下での特定の発生段階で、特定の細胞に通常存在する分子である。追加の内在分子には、タンパク質が含まれ得る。

【0082】

追加の定義は、本開示全体を通じて記載されている。

【0083】

Ｃ．Ｔ細胞受容体
主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子によって標的抗原のペプチド断片が提示されるとき、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は標的抗原ペプチド断片を認識する。ＭＨＣ分子には、二つの異なるクラスのＭＨＣ ＩとＭＨＣ ＩＩがあり、異なる細胞区画から細胞表面にペプチドを送達する。ＴＣＲと抗原およびＭＨＣとの関与は、関連する酵素、共受容体、および特殊なアクセサリ分子によって媒介される一連の生化学的事象を通して免疫エフェクター細胞の活性化をもたらす。

【0084】

本明細書で予期されるＴＣＲは、ＴＣＲアルファ（ＴＣＲα）鎖およびＴＣＲベータ（ＴＣＲβ）鎖を含むヘテロ二量体複合体である。ヒトＴＣＲα座位は、１４番染色体（１４ｑ１１．２）上に位置する。成熟ＴＣＲα鎖は、可変（Ｖ）セグメントと結合（Ｊ）セグメントとの組み換えに由来する可変ドメインと、定常（Ｃ）ドメインとを含む。「可変ＴＣＲα領域」または「ＴＣＲα可変鎖」または「ＴＣＲα可変ドメイン」という用語は、ＴＣＲα鎖の可変領域を指す。ヒトＴＣＲβ座位は、７番染色体（７ｑ３４）上に位置する。成熟ＴＣＲβ鎖は、可変（Ｖ）セグメント、多様性（Ｄ）セグメント、および結合（Ｊ）セグメントの組み換えに由来する可変ドメインと、二つの定常（Ｃ）ドメインのうちの一つとを含む。「可変ＴＣＲβ領域」または「ＴＣＲβ可変鎖」または「ＴＣＲβ可変ドメイン」という用語は、ＴＣＲβ鎖の可変領域を指す。

【0085】

ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の両鎖の再構成されたＶ（Ｄ）Ｊ領域は、それぞれが相補性決定領域（ＣＤＲ：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）として知られる三つの超可変領域を含有する。ＣＤＲ３が、処理された抗原を認識するメインのＣＤＲであるが、アルファ鎖のＣＤＲ１は、抗原ペプチドのＮ末端部分と相互作用すること、一方でベータ鎖のＣＤＲ１は、抗原ペプチドのＣ末端部分と相互作用することが示されている。ＣＤＲ２は、ＭＨＣ分子を認識すると考えられている。フレームワーク領域（ＦＲ）は、ＣＤＲの間に配置されている。これらの領域によって、ＴＣＲ可変領域の構造が形成される。

【0086】

ＴＣＲ鎖の定常ドメインまたは定常領域は、ＴＣＲ構造にも寄与しており、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および短い細胞質ドメインからなる。

【0087】

ＴＣＲ構造によって、ＴＣＲ複合体が形成される。ＴＣＲ複合体は、ＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ならびにアクセサリ分子のＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、およびＣＤ３ζを含む。Ｔ細胞複合体からのシグナルは、特定の共受容体によるＭＨＣ分子への同時結合によって増強される。ＣＤ４はヘルパーＴ細胞上に発現されるＭＨＣ ＩＩ分子の共受容体であり、ＣＤ８は細胞傷害性Ｔ細胞上に発現されるＭＨＣ Ｉ分子の共受容体である。共受容体によって、抗原に対するＴＣＲの特異性が確保されるだけではなく、抗原提示細胞とＴ細胞との間の長期間の係合も可能となり、活性化Ｔリンパ球のシグナル伝達に関与する細胞内の必須分子（例えばＬＣＫ）もリクルートされる。

【0088】

本明細書で予期されるＴＣＲを使用して、免疫エフェクター細胞を標的細胞へとリダイレクトさせることができる。本明細書で予期されるＴＣＲは、ＴＣＲの安定性、ＴＣＲの発現、特異的なＴＣＲペアリング、および機能的アビディティを高めるように操作される。

【0089】

特定の実施形態では、ＴＣＲαおよびＴＣＲβ鎖の定常ドメインは、ＴＣＲの安定性、ＴＣＲの発現、特異的なＴＣＲペアリング、および機能的アビディティを高めるように操作され、または改変される。

【0090】

操作されたＴＣＲ配列の正しいペアリングを効率的に強化し、内因性ＴＣＲ鎖とのミスペアリングを回避するために、操作されたＴＣＲ配列は、ＴＣＲαおよびＴＣＲβの定常ドメインが最小限にマウス化するように改変される。ＴＣＲのマウス化とは、ヒトのＴＣＲα定常ドメインおよびＴＣＲβ定常ドメインを、それぞれのマウスでのカウンターパートと置き換えることを指す。九つのアミノ酸が、マウス化ＴＣＲの発現改善に寄与すると特定されている。「最小マウス化」を行うことによって、細胞表面発現が強化されると同時にアミノ酸配列内の「外来性」アミノ酸残基の数も減少するため、免疫原性のリスクも低下するという利点がもたらされる。最小マウス化とは、ＴＣＲαの定常ドメインにおける、１、２、３、または４個のアミノ酸の置換、好ましくは４個すべてのアミノ酸の置換、およびＴＣＲβ定常ドメインにおける、１、２、３、４、または５個のアミノ酸の置換、好ましくは５個すべてのアミノ酸の置換を指し、それらアミノ酸は、マウス化ＴＣＲの発現の改善に寄与するアミノ酸である。好ましい実施形態では、最小マウス化とは、ヒトＴＣＲαの定常ドメイン中の４個のアミノ酸の置換、およびヒトＴＣＲβ定常ドメイン中の５個のアミノ酸の置換を指し、それらアミノ酸は、マウス化ＴＣＲの発現の改善に寄与するアミノ酸である。

【0091】

本明細書で予期される操作されたＴＣＲまたは改変されたＴＣＲは、ＴＣＲの安定性、ＴＣＲの発現および機能的アビディティを高めるために、最小限にマウス化されたＴＣＲα定常ドメインおよびＴＣＲβ定常ドメインを含み、さらにＴＣＲα膜貫通ドメインには疎水性アミノ酸置換を含む。ＴＣＲα鎖の膜貫通ドメインは、鎖の全体的な安定性の欠如の原因となること、ゆえにＴＣＲ－ＣＤ３複合体全体の形成と表面発現に影響を及ぼすことが示されている。特定の実施形態では、ＴＣＲαの膜貫通ドメインにおいて、１、２、または３個のアミノ酸、好ましくは３個すべてのアミノ酸を、疎水性アミノ酸と置換することによって、ＴＣＲの安定性、発現、およびアビディティが改善される。好ましい実施形態では、ＴＣＲαの膜貫通ドメインには、３個の疎水性アミノ酸置換が含まれ、それによって、ＴＣＲの安定性、発現、およびアビディティが改善される。

【0092】

特定の実施形態での使用に適した疎水性アミノ酸の例としては、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、およびトリプトファン（Ｗ）が挙げられる。好ましい実施形態では、疎水性アミノ酸は、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）およびロイシン（Ｌ）からなる群から選択される。より好ましい実施形態では、疎水性アミノ酸は、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）およびロイシン（Ｌ）からなる群から選択される。さらにより好ましい実施形態では、疎水性アミノ酸は、バリン（Ｖ）およびロイシン（Ｌ）である。

【0093】

特定の実施形態では、操作されたＴＣＲは、最小限にマウス化されたＴＣＲα鎖と、最小限にマウス化されたＴＣＲβ鎖を含み、この場合において当該ＴＣＲα鎖の膜貫通ドメインは、疎水性アミノ酸置換を含む。

【0094】

好ましい実施形態では、操作されたＴＣＲは、ＴＣＲα定常領域に４個のアミノ酸置換を含む最小限にマウス化されたＴＣＲα鎖と、ＴＣＲβ定常領域に５個のアミノ酸置換を含む最小限にマウス化されたＴＣＲβ鎖とを含み、この場合において当該ＴＣＲα鎖の膜貫通ドメインは、３個の疎水性アミノ酸置換をさらに含む。

【0095】

好ましい実施形態では、操作されたＴＣＲは、定常領域の９０位、９１位、９２位、および９３位で最小マウス化アミノ酸置換、ならびに１１５位、１１８位、および１１９位で疎水性アミノ酸置換を含む定常ドメインを含むＴＣＲα鎖、ならびに１８位、２２位、１３３位、１３６位、および１３９位で最小マウス化アミノ酸置換を含む定常ドメインを含むＴＣＲβ鎖、を含む。

【0096】

好ましい実施形態では、操作されたＴＣＲは、以下の最小マウス化アミノ酸置換であるＰ９０Ｓ、Ｅ９１Ｄ、Ｓ９２Ｖ、およびＳ９３Ｐと、定常領域の膜貫通ドメインにおいて以下の疎水性アミノ酸置換であるＳ１１５Ｌ、Ｇ１１８Ｖ、およびＦ１１９Ｌとを含む定常ドメインを含むＴＣＲα鎖、ならびに以下の最小マウス化アミノ酸置換であるＥ１８Ｋ、Ｓ２２Ａ、Ｆ１３３Ｉ、Ｅ／Ｖ１３６Ａ、およびＱ１３９Ｈを含む定常ドメインを含むＴＣＲβ鎖、を含む。

【0097】

好ましい実施形態では、操作されたＴＣＲは、定常領域の９０位、９１位、９２位および９３位で最小マウス化アミノ酸置換、ならびに１１５位、１１８位および１１９位で疎水性アミノ酸置換を含む定常ドメインを含むＴＣＲα鎖であって、当該ＴＣＲα定常領域のアミノ酸配列は、配列番号４に記載されるアミノ酸配列に対し、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるもの、ならびに１８位、２２位、１３３位、１３６位、および１３９位で最小マウス化アミノ酸置換を含む定常領域を含むＴＣＲβ鎖であって、当該ＴＣＲβ定常領域のアミノ酸配列は、配列番号５または配列番号６に記載されるアミノ酸配列に対し、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるもの、を含む。

【0098】

特定の実施形態では、操作されたＴＣＲは、定常ドメインに以下の最小マウス化アミノ酸置換であるＰ９０Ｓ、Ｅ９１Ｄ、Ｓ９２Ｖ、およびＳ９３Ｐ、ならびに定常ドメインの膜貫通ドメインに以下の疎水性アミノ酸置換であるＳ１１５Ｌ、Ｇ１１８Ｖ、およびＦ１１９Ｌ、を含む定常ドメインを含むＴＣＲα鎖であって、この場合において当該ＴＣＲα定常ドメインのアミノ酸配列は、配列番号４に記載されるアミノ酸配列に対し、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるもの、ならびに以下の最小マウス化アミノ酸置換であるＥ１８Ｋ、Ｓ２２Ａ、Ｆ１３３Ｉ、Ｅ／Ｖ１３６Ａ、およびＱ１３９Ｈを含む定常ドメインを含むＴＣＲβ鎖であって、当該ＴＣＲβ定常ドメインのアミノ酸配列は、配列番号５または配列番号６に記載されるアミノ酸配列に対し、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるもの、を含む。

【0099】

特定の好ましい実施形態では、操作されたＴＣＲは、配列番号４に記載されるアミノ酸配列を含む定常ドメインを含むＴＣＲα鎖、および配列番号５または配列番号６に記載されるアミノ酸配列を含む定常ドメインを含むＴＣＲβ鎖、を含む。

【0100】

特定の実施形態では、操作されたＴＣＲは、抗原に結合する可変ドメインを含む。好ましい実施形態では、抗原は、ＭＡＧＥＡ４ではない。

【0101】

Ｄ．標的抗原
本明細書で予期される操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）は、主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）のクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示されるポリペプチド抗原に結合し、好ましくはＭＨＣクラスＩ分子によって提示されるポリペプチド抗原に結合する。

【0102】

「主要組織適合性遺伝子複合体」（ＭＨＣ）とは、ペプチド抗原を細胞表面に送達する糖タンパク質を指す。ＭＨＣクラスＩ分子は、膜にまで及ぶα鎖（三つのαドメインを含む）と、非共有結合的に関連付けられたβ２マイクログロブリンとを有するヘテロ二量体である。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、αとβの二つの膜貫通型糖タンパク質から構成され、それら糖タンパク質は両方とも膜にまで及んでいる。各鎖は二つのドメインを有する。ＭＨＣクラスＩ分子は、細胞質を起源とするペプチドを細胞表面へと送達し、ペプチド：ＭＨＣ複合体は細胞表面でＣＤ８^＋Ｔ細胞によって認識される。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、小胞系を起源とするペプチドを細胞表面へと送達し、細胞表面でペプチド：ＭＨＣ複合体はＣＤ４^＋Ｔ細胞によって認識される。ヒトＭＨＣは、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）とも呼ばれる。

【0103】

好ましい実施形態では、「抗原（Ａｇ）」、「標的抗原」、および「ポリペプチド抗原」は相互交換可能に使用され、集合的に、自然に処理された抗原性タンパク質部分、または合成的に作製された抗原性タンパク質部分を指す。例えば、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）または腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）があり、約７アミノ酸～約１５アミノ酸の長さの範囲で、ＭＨＣ（例えば、ＨＬＡ）と複合体を形成して、標的抗原：ＭＨＣ（例えば、ＨＬＡ）複合体を形成することができる。

【0104】

抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞、マクロファージ、リンパ球または他の細胞型）による抗原処理の原理、およびＡＰＣによるＴ細胞への抗原提示の原理はしっかりと確立されており、免疫適合性のある（例えば、抗原提示に適したＭＨＣ遺伝子のアレル型を少なくとも一つ共有すること、など）ＡＰＣとＴ細胞の間の主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）拘束性の提示などが挙げられる（例えば、Ｍｕｒｐｈｙ，Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（８ｔｈ Ｅｄ．）２０１１ Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹのチャプター６、９および１６を参照のこと）。例えば、細胞質を起源とし、処理された抗原ペプチド（例えば、腫瘍抗原、細胞内病原体など）は多くの場合、約７アミノ酸～約１１アミノ酸の長さであり、クラスＩ ＭＨＣ分子と関連付けられる。一方で小胞系で処理されたペプチド（例えば、細菌性ペプチド、ウイルス性ペプチド）は多くの場合、約１０アミノ酸～約２５アミノ酸の長さで変化し、クラスＩＩ ＭＨＣ分子と関連付けられる。

【0105】

特定の実施形態では、本明細書で予期される操作されたＴＣＲは、例えばＴＡＡやＴＳＡなどの腫瘍抗原に結合する。「腫瘍関連抗原」または「ＴＡＡ」としては限定されないが、腫瘍胎児抗原、過剰発現抗原、系統限定抗原、および癌－精巣抗原が挙げられる。ＴＡＡは、相対的に腫瘍細胞に限定される。ＴＡＡは、腫瘍細胞で発現レベルが上昇しているが、健康な細胞でも低レベルで発現する。「腫瘍特異的抗原」または「ＴＳＡ」としては限定されないが、新抗原（ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ）や腫瘍ウイルス抗原（ｏｎｃｏｖｉｒａｌ ａｎｔｉｇｅｎ）が挙げられる。ＴＳＡは、腫瘍細胞に固有のものである。ＴＳＡは、癌細胞で発現され、正常細胞では発現されない。

【0106】

特定の実施形態では、本明細書で予期される操作されたＴＣＲは、以下からなる群から選択されるポリペプチドの抗原性部分に結合する：α－フェトプロテイン（ＡＦＰ：α－ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）、Ｂ Ｍｅｌａｎｏｍａ Ａｎｔｉｇｅｎ（ＢＡＧＥ）ファミリー類、Ｂｒｏｔｈｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ ｓｉｔｅｓ（ＢＯＲＩＳ）、癌－精巣抗原、癌－精巣抗原８３（ＣＴ－８３）、Ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ ＩＸ（ＣＡ１Ｘ）、癌胎児抗原（ＣＥＡ：Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）抗原、メラノーマ上の細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）認識抗原（ＣＡＭＥＬ：Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ（ＣＴＬ）－ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ ｏｎ ｍｅｌａｎｏｍａ）、エプスタイン－バールウイルス（ＥＢＶ：Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ）抗原、Ｇ ａｎｔｉｇｅｎ １（ＧＡＧＥ－１）、ＧＡＧＥ－２、ＧＡＧＥ－３、ＧＡＧＥ－４、ＧＡＧＥ－５、ＧＡＧＥ－６、ＧＡＧＥ－７Ｂ、ＧＡＧＥ－８、糖タンパク質１００（ＧＰ１００：Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ １００）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）抗原、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）非構造タンパク質３（ＮＳ３）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ－２）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）－Ｅ６、ＨＰＶ－Ｅ７、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、潜在膜タンパク質２（ＬＭＰ２：Ｌａｔｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）、Ｍｅｌａｎｏｍａ ａｎｔｉｇｅｎ ｆａｍｉｌｙ Ａ，１（ＭＡＧＥ－Ａ１）、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ１２、Ｍｅｌａｎｏｍａ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ（ＭＡＲＴ－１）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ムチン１（ＭＵＣ１）、ムチン１６（ＭＵＣ１６）、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ－１（ＮＹＥＳＯ－１）、Ｐ５３、Ｐ抗原（ＰＡＧＥ：Ｐ ａｎｔｉｇｅｎ）ファミリー類、Ｐｌａｃｅｎｔａ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ １（ＰＬＡＣ１）、Ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎ ｍｅｌａｎｏｍａ（ＰＲＡＭＥ）、サバイビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）、Ｓｙｎｏｖｉａｌ ｓａｒｃｏｍａ Ｘ １（ＳＳＸ１）、Ｓｙｎｏｖｉａｌ ｓａｒｃｏｍａ Ｘ ２（ＳＳＸ２）、Ｓｙｎｏｖｉａｌ ｓａｒｃｏｍａ Ｘ ３（ＳＳＸ３）、Ｓｙｎｏｖｉａｌ ｓａｒｃｏｍａ Ｘ ４（ＳＳＸ４）、Ｓｙｎｏｖｉａｌ ｓａｒｃｏｍａ Ｘ ５（ＳＳＸ５）、Ｓｙｎｏｖｉａｌ ｓａｒｃｏｍａ Ｘ ８（ＳＳＸ８）、サイログロブリン、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質（ＴＲＰ：Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）１、ＴＲＰ２、Ｗｉｌｍｓ ｔｕｍｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＷＴ－１）、Ｘ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｆａｍｉｌｙ Ｍｅｍｂｅｒ １（ＸＡＧＥ１）、およびＸ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｆａｍｉｌｙ Ｍｅｍｂｅｒ ２（ＸＡＧＥ２）。

【0107】

特定の実施形態では、本明細書で予期される操作されたＴＣＲは、ＣＴ－８３、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＲＴ－１、ＭＵＣ１６、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＬＡＣ－１、ＰＲＡＭＥ、ＳＳＸ２、サバイビン、およびＷＴ－１からなる群から選択されるポリペプチドの抗原性部分に結合する。

【0108】

特定の実施形態では、本明細書で予期される操作されたＴＣＲは、ＮＹ－ＥＳＯ－１の抗原性部分に結合する。

【0109】

Ｅ．ポリペプチド
様々なポリペプチド、融合ポリペプチド、およびポリペプチドバリアントが本明細書で予期され、限定されないが、ＴＣＲポリペプチド、ＴＣＲα鎖ポリペプチド、ＴＣＲβ鎖ポリペプチド、ＴＣＲ融合ポリペプチド、およびそれらの断片が挙げられる。特定の実施形態では、本明細書で予期されるポリペプチドの例としては、配列番号４～２６のいずれか一つに記載されるアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。

【0110】

「ポリペプチド」「ペプチド」、および「タンパク質」は、相互交換可能に使用され、反対であることが明記されない限り、従来的な意味に従う。すなわちアミノ酸配列として使用される。ポリペプチドは特定の長さに限定されず、例えばポリペプチドは、全長ポチペプチドまたはポリペプチド断片を含有してもよく、ポリペプチドは、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化などのポリペプチドの翻訳後修飾を一つ以上含んでもよく、ならびに当分野に公知の天然および非天然の他の修飾を含んでもよい。

【0111】

本明細書において使用される場合、「単離されたポリペプチド」などは、細胞環境からの、および細胞の他の構成要素との会合からの、ペプチド分子またはポリペプチド分子のインビトロでの合成、単離および／または精製を指し、すなわち、インビボでの物質と実質的に関連づけられていない。特定の実施形態では、単離されたポリペプチドは、合成ポリペプチド、組み換えポリペプチド、または半合成ポリペプチド、または組み換え源から取得された、もしくは誘導されたポリペプチドである。

【0112】

ポリペプチドには、「ポリペプチドバリアント」が含まれる。ポリペプチドバリアントは、一つまたは複数のアミノ酸置換、欠失、付加および／または挿入において天然に存在するポリペプチドとは異なってもよい。そうしたバリアントは、天然であってもよく、または本明細書で予期されるポリペプチド配列の一つ以上を改変することによって合成的に作製されてもよい。例えば特定の実施形態では、ＴＣＲα鎖および／またはＴＣＲβ鎖内に、一つ以上の置換、欠失、付加および／または挿入を導入することによって、ＴＣＲの結合アフィニティ、安定性、発現、特異的ペアリング、機能的アビディティ、および／または生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。特定の実施形態では、ポリペプチドは、本明細書において予期されるポリペプチド配列のいずれかに対し、少なくとも約６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、８６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含み、典型的には、当該バリアントは、参照配列の生物学的活性を少なくとも一つ維持している。

【0113】

ポリペプチドには「ポリペプチド断片」が含まれる。ポリペプチド断片は、単量体または多量体であってもよく、アミノ末端欠失、カルボキシル末端欠失、および／または自然発生的または組み換えにより産生されたポリペプチドの内部欠失または置換を有する、生物学的に活性なポリペプチドを指す。本明細書で使用される、用語「生物学的に活性な断片」または「最小限の生物学的に活性な断片」は、天然に存在するポリペプチド活性の少なくとも１００％、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、少なくとも３０％、少なくとも２０％、少なくとも１０％、または少なくとも５％を保持するポリペプチド断片を指す。ある実施形態では、ポリペプチド断片は、少なくとも５～約５００アミノ酸の長さのアミノ酸鎖を含有し得る。ある実施形態では、断片は、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、または４５０のアミノ酸長である。

【0114】

上述のように、特定の実施形態では、ポリペプチドは、アミノ酸の置換、欠失、切断および挿入を含む、様々な方法で改変されてもよい。そうした操作のための方法は、当分野において一般的に公知である。例えば、参照ポリペプチドのアミノ酸配列バリアントは、ＤＮＡ中の変異により作製され得る。変異誘導およびヌクレオチド配列改変のための方法は、当分野に公知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８２：４８８－４９２）、Ｋｕｎｋｅｌら、（１９８７、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ、１５４：３６７－３８２）、米国特許第 ４，８７３，１９２号、Ｗａｔｓｏｎ、Ｊ．Ｄ．ら、（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ、Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、Ｃａｌｉｆ．、１９８７）、およびそれらにおいて引用される参照文献を参照のこと。対象となるタンパク質の生物活性に影響を与えない適切なアミノ酸置換に関するガイダンスは、Ｄａｙｈｏｆｆら、（１９７８）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．）のモデルに見出され得る。

【0115】

好ましい実施形態では、融合ポリペプチドが本明細書で予期される。融合ポリペプチドおよび融合タンパク質とは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０個以上のポリペプチドセグメントを有するポリペプチドを指す。融合ポリペプチドは、典型的にはＣ末端～Ｎ末端で連結されるが、Ｃ末端～Ｃ末端、Ｎ末端～Ｎ末端、またはＭ末端～Ｃ末端で連結されることもできる。特定の実施形態では、融合タンパク質のポリペプチドは、任意の順序であってもよく、または指定される順序であってもよい。

【0116】

特定の実施形態では、本明細書で予期されるＴＣＲは、ＴＣＲα鎖、ポリペプチドリンカー、およびＴＣＲβ鎖を含む融合ポリペプチドとして発現される。一部の実施形態では、ＴＣＲは、融合タンパク質として発現され、融合タンパク質は、５’から３’に向かって、ＴＣＲα鎖、ポリペプチドリンカー、およびＴＣＲβ鎖を含む。一部の実施形態では、ＴＣＲは、融合タンパク質として発現され、融合タンパク質は、５’から３’に向かって、ＴＣＲβ鎖、ポリペプチドリンカー、およびＴＣＲα鎖を含む。

【0117】

「リンカー」は、ポリペプチドまたは融合ポリペプチドの隣接するドメインを接続するアミノ酸配列である。リンカーの例としては、グリシンポリマー（Ｇ）_ｎ、グリシン－セリンポリマー（Ｇ_１－５Ｓ_１－５）_ｎ（式中、ｎは、少なくとも１、２、３、４または５の整数である）、グリシン－アラニンポリマー、アラニン－セリンポリマー、および当分野で公知の他の柔軟性のあるリンカーが挙げられる。グリシンは、アラニンよりも非常に多くのｐｈｉ－ｐｓｉ空間にアクセスし、より長い側鎖を有する残基よりもはるかに制限が少ない（Ｓｃｈｅｒａｇａ，Ｒｅｖ．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍ．１１１７３－１４２（１９９２）を参照のこと）。リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５個またはそれ以上のアミノ酸長であってもよい。他の例示的なリンカーとしては限定されないが、以下のアミノ酸配列が挙げられる：ＤＧＧＧＳ（配列番号２７）；ＴＧＥＫＰ（配列番号２８）（例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ５５２５－５５３０（１９９７）を参照されたい）、ＧＧＲＲ（配列番号２９）（Ｐｏｍｅｒａｎｔｚ ｅｔ ａｌ．１９９５、上記）、（ＧＧＧＧＳ）_ｎ（式中、ｎ＝１、２、３、４または５である）（配列番号３０）（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９３，１１５６－１１６０（１９９６．）、ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＶＤ（配列番号３１）（Ｃｈａｕｄｈａｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：１０６６－１０７０）、ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号３２）（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６）、ＧＧＲＲＧＧＧＳ（配列番号３３）、ＬＲＱＲＤＧＥＲＰ（配列番号３４）、ＬＲＱＫＤＧＧＧＳＥＲＰ（配列番号３５）、ＬＲＱＫＤ（ＧＧＧＳ）_２ ＥＲＰ（配列番号３６）。あるいは柔軟性のあるリンカーは、ＤＮＡ結合部位とペプチドそれ自体の両方をモデリングすることができるコンピュータープログラム（Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ ＆ Ｂｅｒｇ，ＰＮＡＳ ９０：２２５６－２２６０（１９９３），ＰＮＡＳ ９１：１１０９９－１１１０３（１９９４））またはファージディスプレイ法を使用して合理的に設計することもできる。特定の実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列：ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号３７）（Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０１（４）：１６３７－１６４４（２００３））を含む。

【0118】

特定の実施形態では、融合ポリペプチドは、最小限にマウス化されたＴＣＲα鎖、ポリペプチドリンカー、および最小限にマウス化されたＴＣＲβ鎖を含み、この場合において当該ＴＣＲα鎖の膜貫通ドメインは、疎水性アミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、５’から３’に向かって、最小限にマウス化されたＴＣＲα鎖、ポリペプチドリンカー、および最小限にマウス化されたＴＣＲβ鎖を含む融合タンパク質であって、この場合において当該ＴＣＲα鎖の膜貫通ドメインは、疎水性アミノ酸置換を含むもの。一部の実施形態では、５’から３’に向かって、最小限にマウス化されたＴＣＲβ鎖、ポリペプチドリンカー、および最小限にマウス化されたＴＣＲα鎖を含む融合タンパク質であって、この場合において当該ＴＣＲα鎖の膜貫通ドメインは、疎水性アミノ酸置換を含むもの。

【0119】

特定の実施形態では、融合ポリペプチドは、ＴＣＲα定常領域に４個のアミノ酸置換を含む最小限にマウス化されたＴＣＲα鎖、ポリペプチドリンカー、およびＴＣＲβ定常領域に５個のアミノ酸置換を含む最小限にマウス化されたＴＣＲβ鎖を含み、この場合において当該ＴＣＲα鎖の膜貫通ドメインは、３個の疎水性アミノ酸置換をさらに含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、５’から３’に向かって、ＴＣＲα定常領域に４個のアミノ酸置換を含む最小限にマウス化されたＴＣＲα鎖、ポリペプチドリンカー、およびＴＣＲβ定常領域に５個のアミノ酸置換を含む最小限にマウス化されたＴＣＲβ鎖を含み、この場合において当該ＴＣＲα鎖の膜貫通ドメインは、３個の疎水性アミノ酸置換をさらに含む。一部の実施形態では、５’から３’に向かって、ＴＣＲβ定常領域に５個のアミノ酸置換を含む最小限にマウス化されたＴＣＲβ鎖、ポリペプチドリンカー、およびＴＣＲα定常領域に４個のアミノ酸置換を含む最小限にマウス化されたＴＣＲα鎖を含む融合タンパク質であって、当該ＴＣＲα鎖の膜貫通ドメインは、３個の疎水性アミノ酸置換をさらに含むもの。

【0120】

特定の実施形態では、融合ポリペプチドは、ＴＣＲα定常ドメインに以下の最小マウス化アミノ酸置換であるＰ９０Ｓ、Ｅ９１Ｄ、Ｓ９２Ｖ、およびＳ９３Ｐ、ならびにＴＣＲα定常ドメインの膜貫通ドメインに以下の疎水性アミノ酸置換であるＳ１１５Ｌ、Ｇ１１８Ｖ、およびＦ１１９Ｌを含む、最小限にマウス化されたＴＣＲα鎖（例えば、配列番号７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、および２５）、ポリペプチドリンカー、ならびに以下の最小マウス化アミノ酸置換であるＥ１８Ｋ、Ｓ２２Ａ、Ｆ１３３Ｉ、Ｅ／Ｖ１３６Ａ、およびＱ１３９Ｈを含む定常ドメインを含むＴＣＲβ鎖（例えば、配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、および２６）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、５’から３’に向かって、ＴＣＲα定常ドメインに以下の最小マウス化アミノ酸置換であるＰ９０Ｓ、Ｅ９１Ｄ、Ｓ９２Ｖ、およびＳ９３Ｐ、ならびにＴＣＲα定常ドメインの膜貫通ドメインに以下の疎水性アミノ酸置換であるＳ１１５Ｌ、Ｇ１１８Ｖ、およびＦ１１９Ｌを含む定常ドメインを含むＴＣＲα鎖、ポリペプチドリンカー、ならびに以下の最小マウス化アミノ酸置換であるＥ１８Ｋ、Ｓ２２Ａ、Ｆ１３３Ｉ、Ｅ／Ｖ１３６Ａ、およびＱ１３９Ｈを含む定常ドメインを含むＴＣＲβ鎖、を含む。一部の実施形態では、５’から３’に向かって、以下の最小マウス化アミノ酸置換であるＥ１８Ｋ、Ｓ２２Ａ、Ｆ１３３Ｉ、Ｅ／Ｖ１３６Ａ、およびＱ１３９Ｈを含む定常ドメインを含むＴＣＲβ鎖、ポリペプチドリンカー、ならびにＴＣＲα定常ドメインに以下の最小マウス化アミノ酸置換であるＰ９０Ｓ、Ｅ９１Ｄ、Ｓ９２Ｖ、およびＳ９３Ｐ、ならびにＴＣＲα定常ドメインの膜貫通ドメインに以下の疎水性アミノ酸置換であるＳ１１５Ｌ、Ｇ１１８Ｖ、およびＦ１１９Ｌを含む定常ドメインを含むＴＣＲα鎖、を含む融合タンパク質。

【0121】

特定の実施形態では、融合ポリペプチドは、ＴＣＲα定常ドメインの９０位、９１位、９２位、および９３位に最小マウス化アミノ酸置換、ならびに１１５位、１１８位、および１１９位に疎水性アミノ酸置換とを含む定常ドメインを含むＴＣＲα鎖であって、当該ＴＣＲα定常ドメインのアミノ酸配列は、配列番号４に記載されるアミノ酸配列に対し、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるもの、ポリペプチドリンカー、ならびに１８位、２２位、１３３位、１３６位、および１３９位で最小マウス化アミノ酸置換を含む定常ドメインを含むＴＣＲβ鎖であって、当該ＴＣＲβ定常ドメインのアミノ酸配列は、配列番号５または配列番号６に記載されるアミノ酸配列に対し、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるもの、を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、５’から３’に向かって、ＴＣＲα定常ドメインの９０位、９１位、９２位、および９３位に最小マウス化アミノ酸置換、ならびに１１５位、１１８位、および１１９位に疎水性アミノ酸置換とを含む定常ドメインを含むＴＣＲα鎖であって、当該ＴＣＲα定常ドメインのアミノ酸配列は、配列番号４に記載されるアミノ酸配列に対し、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるもの、ポリペプチドリンカー、ならびに１８位、２２位、１３３位、１３６位、および１３９位で最小マウス化アミノ酸置換を含む定常ドメインを含むＴＣＲβ鎖であって、当該ＴＣＲβ定常ドメインのアミノ酸配列は、配列番号５または配列番号６に記載されるアミノ酸配列に対し、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるもの、を含む。一部の実施形態では、５’から３’に向かって、１８位、２２位、１３３位、１３６位、および１３９位で最小マウス化アミノ酸置換を含む定常ドメインを含むＴＣＲβ鎖であって、当該ＴＣＲβ定常ドメインのアミノ酸配列は、配列番号５または配列番号６に記載されるアミノ酸配列に対し、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるもの、ポリペプチドリンカー、ならびにＴＣＲα定常ドメインの９０位、９１位、９２位、および９３位に最小マウス化アミノ酸置換、ならびに１１５位、１１８位、および１１９位に疎水性アミノ酸置換とを含む定常ドメインを含むＴＣＲα鎖であって、当該ＴＣＲα定常ドメインのアミノ酸配列は、配列番号４に記載されるアミノ酸配列に対し、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるもの、を含む融合タンパク質。

【0122】

特定の実施形態では、融合ポリペプチドは、定常ドメインに以下の最小マウス化アミノ酸置換であるＰ９０Ｓ、Ｅ９１Ｄ、Ｓ９２ＶおよびＳ９３Ｐ、ならびに定常ドメインの膜貫通ドメインに以下の疎水性アミノ酸置換であるＳ１１５Ｌ、Ｇ１１８Ｖ、およびＦ１１９Ｌとを含む定常ドメインを含むＴＣＲα鎖であって、当該ＴＣＲα定常ドメインのアミノ酸配列は、配列番号４に記載されるアミノ酸配列に対し、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるもの、ポリペプチドリンカー、ならびに以下の最小マウス化アミノ酸置換であるＥ１８Ｋ、Ｓ２２Ａ、Ｆ１３３Ｉ、Ｅ／Ｖ１３６Ａ、およびＱ１３９Ｈを含む定常ドメインを含むＴＣＲβ鎖であって、当該ＴＣＲβ定常ドメインのアミノ酸配列は、配列番号５または配列番号６に記載されるアミノ酸配列に対し、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるもの、を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、５’から３’に向かって、定常ドメインに以下の最小マウス化アミノ酸置換であるＰ９０Ｓ、Ｅ９１Ｄ、Ｓ９２ＶおよびＳ９３Ｐ、ならびに定常ドメインの膜貫通ドメインに以下の疎水性アミノ酸置換であるＳ１１５Ｌ、Ｇ１１８Ｖ、およびＦ１１９Ｌとを含む定常ドメインを含むＴＣＲα鎖であって、当該ＴＣＲα定常ドメインのアミノ酸配列は、配列番号４に記載されるアミノ酸配列に対し、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるもの、ポリペプチドリンカー、ならびに以下の最小マウス化アミノ酸置換であるＥ１８Ｋ、Ｓ２２Ａ、Ｆ１３３Ｉ、Ｅ／Ｖ１３６Ａ、およびＱ１３９Ｈを含む定常ドメインを含むＴＣＲβ鎖であって、当該ＴＣＲβ定常ドメインのアミノ酸配列は、配列番号５または配列番号６に記載されるアミノ酸配列に対し、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるもの、を含む。一部の実施形態では、５’から３’に向かって、以下の最小マウス化アミノ酸置換であるＥ１８Ｋ、Ｓ２２Ａ、Ｆ１３３Ｉ、Ｅ／Ｖ１３６Ａ、およびＱ１３９Ｈを含む定常ドメインを含むＴＣＲβ鎖であって、当該ＴＣＲβ定常ドメインのアミノ酸配列は、配列番号５または配列番号６に記載されるアミノ酸配列に対し、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるもの、ポリペプチドリンカー、ならびに定常ドメインに以下の最小マウス化アミノ酸置換であるＰ９０Ｓ、Ｅ９１Ｄ、Ｓ９２ＶおよびＳ９３Ｐ、ならびに定常ドメインの膜貫通ドメインに以下の疎水性アミノ酸置換であるＳ１１５Ｌ、Ｇ１１８Ｖ、およびＦ１１９Ｌとを含む定常ドメインを含むＴＣＲα鎖であって、当該ＴＣＲα定常ドメインのアミノ酸配列は、配列番号４に記載されるアミノ酸配列に対し、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるもの、を含む。

【0123】

好ましい実施形態では、ポリペプチドリンカーは、ポリペプチド切断シグナルである。ポリペプチド切断シグナルの例としては、例えばプロテアーゼ切断部位、ヌクレアーゼ切断部位（例えば、稀な制限酵素認識部位、自己切断リボザイム認識部位）、および自己切断ウイルスオリゴペプチド（ｄｅＦｅｌｉｐｅ ａｎｄ Ｒｙａｎ，２００４．Ｔｒａｆｆｉｃ，５（８）；６１６－２６を参照のこと）といったポリペプチド切断認識部位が挙げられる。

【0124】

適切なプロテアーゼ切断部位および自己切断ペプチドは、当業者に公知である（例えば、Ｒｙａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７．Ｊ．Ｇｅｎｅｒ．Ｖｉｒｏｌ．７８，６９９－７２２；Ｓｃｙｍｃｚａｋ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．５，５８９－５９４を参照のこと）。プロテアーゼ切断部位の例としては限定されないが、ポティウイルスＮＩａプロテアーゼ（例えばタバコエッチ病ウイルスプロテアーゼ）、ポティウイルスＨＣプロテアーゼ、ポティウイルスＰ１（Ｐ３５）プロテアーゼ、ビオウイルス（ｂｙｏｖｉｒｕｓ）ＮＩａプロテアーゼ、ビオウイルスＲＮＡ－２－コードプロテアーゼ、アフトウイルスＬプロテアーゼ、エンテロウイルス２Ａプロテアーゼ、ライノウイルス２Ａプロテアーゼ、ピコルナ３Ｃプロテアーゼ、コモウイルス２４Ｋプロテアーゼ、ネポウイルス２４Ｋプロテアーゼ、ＲＴＳＶ（ワイカウイルス）３Ｃ様プロテアーゼ、ＰＹＶＦ（パースニップ黄斑ウイルス）３Ｃ様プロテアーゼ、ヘパリン、トロンビン、第Ｘａ因子、およびエンテロキナーゼの切断部位が挙げられる。切断ストリンジェンシーが高いために、一つの実施形態ではＴＥＶ（タバコエッチ病ウイルス）プロテアーゼ切断部位、例えばＥＸＸＹＸＱ（Ｇ／Ｓ）（配列番号３８）、例えばＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号３９）およびＥＮＬＹＦＱＳ（配列番号４０）が好ましく、式中、Ｘは、任意のアミノ酸を表している（ＴＥＶによる切断は、ＱとＧの間、またはＱとＳの間で発生する）。

【0125】

特定の実施形態において、ポリペプチド切断シグナルは、ウイルス自己切断ペプチドまたはリボソームスキッピング配列である。

【0126】

リボソームスキッピング配列の実例には、２Ａもしくは２Ａ様部位、配列またはドメインが挙げられるが、これらに限定されない（Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、２００１年、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：１０２７～１０４１を参照）。特定の実施形態では、ウイルス２Ａペプチドは、アフトウイルス２Ａペプチド、ポティウイルス２Ａペプチド、またはカルジオウイルス２Ａペプチドである。

【0127】

一実施形態では、ウイルス２Ａペプチドは、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａペプチド、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａペプチド、ゾセアアシグナウイルス（ＴａＶ）２Ａペプチド、ブタテスコウイルス－１（ＰＴＶ－１）２Ａペプチド、タイロウイルス２Ａペプチド、および脳心筋炎ウイルス２Ａペプチドからなる群から選択される。

【0128】

２Ａ部位の例示を表１に提示する。

【表1】

【0129】

特定の実施形態では、融合ポリペプチドは、最小限にマウス化されたＴＣＲα鎖、ポリペプチド切断シグナル、および最小限にマウス化されたＴＣＲβ鎖を含み、この場合において当該ＴＣＲα鎖の膜貫通ドメインは、疎水性アミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、５’から３’に向かって、最小限にマウス化されたＴＣＲα鎖、ポリペプチド切断シグナル、および最小限にマウス化されたＴＣＲβ鎖を含む融合タンパク質であって、この場合において当該ＴＣＲα鎖の膜貫通ドメインは、疎水性アミノ酸置換を含むもの。一部の実施形態では、５’から３’に向かって、最小限にマウス化されたＴＣＲβ鎖、ポリペプチド切断シグナル、および最小限にマウス化されたＴＣＲα鎖を含む融合タンパク質であって、この場合において当該ＴＣＲα鎖の膜貫通ドメインは、疎水性アミノ酸置換を含むもの。

【0130】

特定の実施形態では、融合ポリペプチドは、ＴＣＲα定常領域に４個のアミノ酸置換を含む最小限にマウス化されたＴＣＲα鎖、ポリペプチド切断シグナル、およびＴＣＲβ定常領域に５個のアミノ酸置換を含む最小限にマウス化されたＴＣＲβ鎖を含み、この場合において当該ＴＣＲα鎖の膜貫通ドメインは、３個の疎水性アミノ酸置換をさらに含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、５’から３’に向かって、ＴＣＲα定常領域に４個のアミノ酸置換を含む最小限にマウス化されたＴＣＲα鎖、ポリペプチド切断シグナル、およびＴＣＲβ定常領域に５個のアミノ酸置換を含む最小限にマウス化されたＴＣＲβ鎖を含み、この場合において当該ＴＣＲα鎖の膜貫通ドメインは、３個の疎水性アミノ酸置換をさらに含む。一部の実施形態では、５’から３’に向かって、ＴＣＲβ定常領域に５個のアミノ酸置換を含む最小限にマウス化されたＴＣＲβ鎖、ポリペプチド切断シグナル、およびＴＣＲα定常領域に４個のアミノ酸置換を含む最小限にマウス化されたＴＣＲα鎖を含む融合タンパク質であって、当該ＴＣＲα鎖の膜貫通ドメインは、３個の疎水性アミノ酸置換をさらに含むもの。

【0131】

特定の実施形態では、融合ポリペプチドは、ＴＣＲα定常ドメインに以下の最小マウス化アミノ酸置換であるＰ９０Ｓ、Ｅ９１Ｄ、Ｓ９２Ｖ、およびＳ９３Ｐ、ならびにＴＣＲα定常ドメインの膜貫通ドメインに以下の疎水性アミノ酸置換であるＳ１１５Ｌ、Ｇ１１８Ｖ、およびＦ１１９Ｌを含む最小限にマウス化されたＴＣＲα鎖、ポリペプチド切断シグナル、ならびに以下の最小マウス化アミノ酸置換であるＥ１８Ｋ、Ｓ２２Ａ、Ｆ１３３Ｉ、Ｅ／Ｖ１３６Ａ、およびＱ１３９Ｈを含む定常ドメインを含むＴＣＲβ鎖、を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、５’から３’に向かって、ＴＣＲα定常ドメインに以下の最小マウス化アミノ酸置換であるＰ９０Ｓ、Ｅ９１Ｄ、Ｓ９２Ｖ、およびＳ９３Ｐ、ならびにＴＣＲα定常ドメインの膜貫通ドメインに以下の疎水性アミノ酸置換であるＳ１１５Ｌ、Ｇ１１８Ｖ、およびＦ１１９Ｌを含む定常ドメインを含むＴＣＲα鎖、ポリペプチド切断シグナル、ならびに以下の最小マウス化アミノ酸置換であるＥ１８Ｋ、Ｓ２２Ａ、Ｆ１３３Ｉ、Ｅ／Ｖ１３６Ａ、およびＱ１３９Ｈを含む定常ドメインを含むＴＣＲβ鎖、を含む。一部の実施形態では、５’から３’に向かって、以下の最小マウス化アミノ酸置換であるＥ１８Ｋ、Ｓ２２Ａ、Ｆ１３３Ｉ、Ｅ／Ｖ１３６Ａ、およびＱ１３９Ｈを含む定常ドメインを含むＴＣＲβ鎖、ポリペプチド切断シグナル、ならびにＴＣＲα定常ドメインに以下の最小マウス化アミノ酸置換であるＰ９０Ｓ、Ｅ９１Ｄ、Ｓ９２Ｖ、およびＳ９３Ｐ、ならびにＴＣＲα定常ドメインの膜貫通ドメインに以下の疎水性アミノ酸置換であるＳ１１５Ｌ、Ｇ１１８Ｖ、およびＦ１１９Ｌを含む定常ドメインを含むＴＣＲα鎖、を含む融合タンパク質。

【0132】

特定の実施形態では、融合ポリペプチドは、ＴＣＲα定常ドメインの９０位、９１位、９２位、および９３位に最小マウス化アミノ酸置換、ならびにＴＣＲα定常ドメインの１１５位、１１８位、および１１９位に疎水性アミノ酸置換とを含む定常ドメインを含むＴＣＲα鎖であって、当該ＴＣＲα定常ドメインのアミノ酸配列は、配列番号４に記載されるアミノ酸配列に対し、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるもの、ポリペプチド切断シグナル、ならびに１８位、２２位、１３３位、１３６位、および１３９位で最小マウス化アミノ酸置換を含む定常ドメインを含むＴＣＲβ鎖であって、当該ＴＣＲβ定常ドメインのアミノ酸配列は、配列番号５または配列番号６に記載されるアミノ酸配列に対し、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるもの、を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、５’から３’に向かって、ＴＣＲα定常ドメインの９０位、９１位、９２位、および９３位に最小マウス化アミノ酸置換、ならびにＴＣＲα定常ドメインの１１５位、１１８位、および１１９位に疎水性アミノ酸置換とを含む定常ドメインを含むＴＣＲα鎖であって、当該ＴＣＲα定常ドメインのアミノ酸配列は、配列番号４に記載されるアミノ酸配列に対し、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるもの、ポリペプチド切断シグナル、ならびに１８位、２２位、１３３位、１３６位、および１３９位で最小マウス化アミノ酸置換を含む定常ドメインを含むＴＣＲβ鎖であって、当該ＴＣＲβ定常ドメインのアミノ酸配列は、配列番号５または配列番号６に記載されるアミノ酸配列に対し、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるもの、を含む。一部の実施形態では、５’から３’に向かって、１８位、２２位、１３３位、１３６位、および１３９位で最小マウス化アミノ酸置換を含む定常ドメインを含むＴＣＲβ鎖であって、当該ＴＣＲβ定常ドメインのアミノ酸配列は、配列番号５または配列番号６に記載されるアミノ酸配列に対し、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるもの、ポリペプチド切断シグナル、ならびにＴＣＲα定常ドメインの９０位、９１位、９２位、および９３位に最小マウス化アミノ酸置換、ならびにＴＣＲα定常ドメインの１１５位、１１８位、および１１９位に疎水性アミノ酸置換とを含む定常ドメインを含むＴＣＲα鎖であって、当該ＴＣＲα定常ドメインのアミノ酸配列は、配列番号４に記載されるアミノ酸配列に対し、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるもの、を含む融合タンパク質。

【0133】

特定の実施形態では、融合ポリペプチドは、定常ドメインに以下の最小マウス化アミノ酸置換であるＰ９０Ｓ、Ｅ９１Ｄ、Ｓ９２ＶおよびＳ９３Ｐ、ならびに定常ドメインの膜貫通ドメインに以下の疎水性アミノ酸置換であるＳ１１５Ｌ、Ｇ１１８Ｖ、およびＦ１１９Ｌとを含む定常ドメインを含むＴＣＲα鎖であって、当該ＴＣＲα定常ドメインのアミノ酸配列は、配列番号４に記載されるアミノ酸配列に対し、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるもの、ポリペプチド切断シグナル、ならびに以下の最小マウス化アミノ酸置換であるＥ１８Ｋ、Ｓ２２Ａ、Ｆ１３３Ｉ、Ｅ／Ｖ１３６Ａ、およびＱ１３９Ｈを含む定常ドメインを含むＴＣＲβ鎖であって、当該ＴＣＲβ定常ドメインのアミノ酸配列は、配列番号５または配列番号６に記載されるアミノ酸配列に対し、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるもの、を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、５’から３’に向かって、定常ドメインに以下の最小マウス化アミノ酸置換であるＰ９０Ｓ、Ｅ９１Ｄ、Ｓ９２ＶおよびＳ９３Ｐ、ならびに定常ドメインの膜貫通ドメインに以下の疎水性アミノ酸置換であるＳ１１５Ｌ、Ｇ１１８Ｖ、およびＦ１１９Ｌとを含む定常ドメインを含むＴＣＲα鎖であって、当該ＴＣＲα定常ドメインのアミノ酸配列は、配列番号４に記載されるアミノ酸配列に対し、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるもの、ポリペプチド切断シグナル、ならびに以下の最小マウス化アミノ酸置換であるＥ１８Ｋ、Ｓ２２Ａ、Ｆ１３３Ｉ、Ｅ／Ｖ１３６Ａ、およびＱ１３９Ｈを含む定常ドメインを含むＴＣＲβ鎖であって、当該ＴＣＲβ定常ドメインのアミノ酸配列は、配列番号５または配列番号６に記載されるアミノ酸配列に対し、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるもの、を含む。一部の実施形態では、５’から３’に向かって、以下の最小マウス化アミノ酸置換であるＥ１８Ｋ、Ｓ２２Ａ、Ｆ１３３Ｉ、Ｅ／Ｖ１３６Ａ、およびＱ１３９Ｈを含む定常ドメインを含むＴＣＲβ鎖であって、当該ＴＣＲβ定常ドメインのアミノ酸配列は、配列番号５または配列番号６に記載されるアミノ酸配列に対し、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるもの、ポリペプチド切断シグナル、ならびに定常ドメインに以下の最小マウス化アミノ酸置換であるＰ９０Ｓ、Ｅ９１Ｄ、Ｓ９２ＶおよびＳ９３Ｐ、ならびに定常ドメインの膜貫通ドメインに以下の疎水性アミノ酸置換であるＳ１１５Ｌ、Ｇ１１８Ｖ、およびＦ１１９Ｌとを含む定常ドメインを含むＴＣＲα鎖であって、当該ＴＣＲα定常ドメインのアミノ酸配列は、配列番号４に記載されるアミノ酸配列に対し、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるもの、を含む。

【0134】

特定の実施形態では、融合タンパク質は、ポリペプチド切断シグナルを含み、当該ポリペプチド切断シグナルは、ウイルス自己切断ペプチドまたはリボソームスキッピング配列である。

【0135】

特定の実施形態では、融合タンパク質は、ポリペプチド切断シグナルを含み、当該ポリペプチド切断シグナルは、ウイルス２Ａペプチドである。

【0136】

特定の実施形態では、融合タンパク質は、ポリペプチド切断シグナルを含み、当該ポリペプチド切断シグナルは、アフトウイルス２Ａペプチド、ポティウイルス２Ａペプチド、またはカルジオウイルス２Ａペプチドである。

【0137】

特定の実施形態では、融合タンパク質は、ポリペプチド切断シグナルを含み、当該ポリペプチド切断シグナルは、ウイルス２Ａペプチドであり、当該ウイルス２Ａペプチドは、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａペプチド、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａペプチド、ゾセアアシグナウイルス（ＴａＶ）２Ａペプチド、ブタテスコウイルス－１（ＰＴＶ－１）２Ａペプチド、タイロウイルス２Ａペプチド、および脳心筋炎ウイルス２Ａペプチドからなる群から選択される。

【0138】

Ｆ．ポリヌクレオチド
特定の実施形態では、一つ以上のＴＣＲポリペプチド、ＴＣＲα鎖ポリペプチド、ＴＣＲβ鎖ポリペプチド、ＴＣＲ融合ポリペプチド、およびそれらの断片をコードする一つ以上のポリヌクレオチドが提供される。本明細書において使用される場合、「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、およびＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを指す。ポリヌクレオチドは、モノシストロニックまたはポリシストロニックであってもよく、一本鎖または二本鎖であってもよく、および組み換え、合成または単離されていてもよい。ポリヌクレオチドとしては限定されないが、プレメッセンジャーＲＮＡ（プレｍＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡ、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、合成ＤＮＡ、または組み換えＤＮＡが挙げられる。ポリヌクレオチドとは、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも５０００、少なくとも１００００、または少なくとも１５０００以上のヌクレオチドの長さのヌクレオチドの多量体型を指し、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチド、またはいずれかタイプのヌクレオチドの改変型、ならびにすべての中間の長さのものを指す。本文脈において、「中間の長さ」とは、例えば、６、７、８、９など、１０１、１０２、１０３など、１５１、１５２、１５３など、２０１、２０２、２０３などの引用されている値の間の任意の長さを意味すると、容易に理解されるであろう。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドまたはバリアントは、参照配列に対し、少なくとも、もしくは約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％，７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。

【0139】

ポリヌクレオチドの例示としては限定されないが、配列番号４～２６をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。

【0140】

本明細書において使用される場合、「単離されたポリヌクレオチド」とは、自然状態で隣接する配列から精製されたポリヌクレオチドを指し、例えば、通常では当該断片と隣接する配列から取り出されたＤＮＡ断片を指す。特定の実施形態において、「単離されたポリヌクレオチド」はまた、自然界には存在せず、人為的に作製された、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、組換えＤＮＡ、または他のポリヌクレオチドも指す。特定の実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、合成ポリヌクレオチド、組み換えポリヌクレオチド、半合成ポリヌクレオチド、または組み換え源から取得された、もしくは誘導されたポリヌクレオチドである。

【0141】

様々な実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書において予期されるポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含有する。ある実施形態では、ｍＲＮＡは、キャップ、一つ以上のヌクレオチド、そしてポリ（Ａ）尾部を含有する。

【0142】

特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、コドン最適化されてもよい。本明細書で使用される、用語「コドン最適化」は、ポリペプチドの発現、安定性および／または活性を増加させるためにポリペプチドをコードするポリヌクレオチド中のコドンを置換することを指す。コドン最適化に影響を及ぼす因子としては限定されないが、以下のうちの一つ以上が挙げられる：（ｉ）二つ以上の生物体または遺伝子または合成構築されたバイアステーブルの間のコドンバイアスの変動、（ｉｉ）生物体、遺伝子または遺伝子セット内のコドンバイアスの程度の変動、（ｉｉｉ）コンテキストを含むコドンの体系的変動、（ｉｖ）その解読ｔＲＮＡに伴うコドンの変動、（ｖ）三つ組全体または三つ組の一つの位置のいずれかのＧＣ％に伴うコドンの変動、（ｖｉ）例えば天然配列などの参照配列に対する類似性における変動、（ｖｉｉ）コドン頻度のカットオフにおける変動、（ｖｉｉｉ）ＤＮＡ配列から転写されたｍＲＮＡの構造的性質、（ｉｘ）コドン置換セットの設計の基礎となるＤＮＡ配列の機能に関する予備知識、（ｘ）各アミノ酸に対するコドンセットの合成的変動、および／または（ｘｉ）誤った翻訳開始位置の分離された除去。

【0143】

本明細書において使用される場合、「ポリヌクレオチドバリアント」および「バリアント」などの用語は、参照ポリヌクレオチド配列と相当の配列同一性を呈するポリヌクレオチド、または本明細書において規定されるストリンジェントな条件下で参照配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。これらの用語は、一つ以上のヌクレオチドが、参照ポリヌクレオチドに比べて、付加もしくは欠失もしくは異なるヌクレオチドで置換されたポリヌクレオチドを含む。この点に関し、当分野において、参照ポリヌクレオチドに対し、変異、付加、欠失および置換を含むある変更が為され、変更されたポリヌクレオチドは、参照ポリヌクレオチドの生物学的機能または生物活性を保持し得ると理解されている。

【0144】

ポリヌクレオチドバリアントは、生物学的に活性なポリペプチド断片またはバリアントをコードするポリヌクレオチド断片が含まれる。本明細書で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド断片」は、少なくとも１００％、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、少なくとも３０％、少なくとも２０％、少なくとも１０％、または少なくとも５％の自然発生ポリペプチド活性を保持するポリペプチドをコードする、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００個、１６００、１７００以上のヌクレオチド長のポリヌクレオチド断片を指す。ポリヌクレオチド断片はアミノ末端欠失、カルボキシル末端欠失、カルボキシ末端欠失、および／または内部欠失または天然もしくは組換え産生ポリペプチドの一つ以上のアミノ酸の置換を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。

【0145】

「配列同一性」、または例えば「～に対して５０％同一の配列」を含む、という文章は、本明細書において使用される場合、比較ウィンドウ上で配列が、ヌクレオチド毎で同一である、またはアミノ酸ごとで同一である程度を指す。ゆえに「配列同一性の百分率」は、比較ウィンドウ上の二つの最適アライメント配列を比較する工程、同一核酸塩基（例えばＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）または同一アミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＣｙｓおよびＭｅｔ）が、両方の配列中に存在する位置の数を決定して、合致位置数を算出する工程、合致位置数を、比較ウィンドウ中の総位置数（すなわちウィンドウサイズ）で割る工程、および結果に１００を掛けて、配列同一性の百分率を算出する工程、により計算されてもよい。本明細書に記載される参照配列のいずれかに対して少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、８６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するヌクレオチドおよびポリペプチドが含まれ、典型的には、ポリペプチドバリアントは、参照ポリペプチドの少なくとも一つの生物学的活性を維持する。

【0146】

二つ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の配列関係を記載するために使用される用語には、「参照配列」、「比較ウィンドウ」、「配列同一性」、「配列同一性のパーセンテージ」、および「実質的な同一性」が挙げられる。「参照配列」は、長さが、少なくとも１２個の単量体単位であり、多くの場合、１５～１８個の単量体単位であり、多くの場合、少なくとも２５個の単量体単位である、ヌクレオチドおよびアミノ酸残基を含む。二つのポリヌクレオチドはそれぞれ、（１）二つのポリヌクレオチド間で類似する配列（すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部のみ）、および（２）二つのポリヌクレオチド間で発散する配列を含んでもよく、二つの（またはそれ以上の）ポリヌクレオチド間の配列比較は、典型的には、配列類似性の局所領域を同定し、比較するために、二つのポリヌクレオチドの配列を「比較ウィンドウ」で比較することによって行われる。「比較ウィンドウ」は、少なくとも６個の連続する位置、通常は、約５０～約１００、より一般的には約１００～約１５０の概念セグメントを指し、配列は、二つの配列が最適に整列された後、同じ数の連続する位置の参照配列と比較される。比較ウィンドウは、二つの配列の最適なアライメントのため、参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して約２０％以下の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含みうる。比較ウィンドウを整列するための配列の最適なアラインメントは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡにおけるアルゴリズム（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータ化実行によって、または選択された様々な方法のいずれかによって生成される検査および最良のアラインメント（すなわち、比較ウィンドウにわたり最も高い相同性をもたらす）によって行われ得る。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９により開示されるプログラムのＢＬＡＳＴファミリーを参照されたい。配列解析の詳細な考察は、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．、１９９４～１９９８年、第１５章のユニット１９．３に見ることができる。

【0147】

ポリヌクレオチドの方向性を記載する用語には、５’（通常、遊離リン酸基を有するポリヌクレオチドの末端）および３’（通常、遊離ヒドロキシル（ＯＨ）基を有するポリヌクレオチドの末端）が含まれる。ポリヌクレオチド配列は、５’から３’の向きまたは３’から５’の向きで注釈付けされ得る。ＤＮＡおよびｍＲＮＡについて、５’から３’の鎖は、その配列が、プレメッセンジャー（プレｍＲＮＡ）の配列と同一であるために、「センス」鎖、「プラス」鎖、または「コード」鎖と指定される［ＤＮＡ中のチミン（Ｔ）の代わりに、ＲＮＡ中のウラシル（Ｕ）を除く］。ＤＮＡおよびｍＲＮＡについては、ＲＮＡポリメラーゼによって転写された鎖である相補的な３’から５’鎖は、「鋳型」、「アンチセンス」、「マイナス」、または「非コード」鎖として指定される。本明細書で使用される、用語「逆方向」は、３’から５’の方向に書かれた５’から３’の配列、または５’から３’の方向に書かれた３’から５’の配列を指す。

【0148】

さらに当業者であれば、遺伝子コードの縮重の結果として、本明細書に記載されるポリペプチドまたはそのバリアント断片をコードするヌクレオチド配列は多数存在することを認識するであろう。これらポリヌクレオチドの一部は、任意の天然遺伝子のヌクレオチド配列に対し、最小の相同性を担持する。とはいえコドン使用頻度の差異によって変化するポリヌクレオチドが予期され、特定の実施形態では例えばヒトおよび／または霊長類のコドン選択に最適化されたポリヌクレオチドが予期される。さらに、本明細書に提供されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子も使用され得る。対立遺伝子は、ヌクレオチドの欠失、付加および／または置換など、一つまたは複数の変異の結果として改変される内在性遺伝子である。

【0149】

本明細書において使用される場合、「核酸カセット」または「発現カセット」という用語は、ＲＮＡを発現し、その後にポリペプチドを発現することができるベクター中の遺伝子配列を指す。一つの実施形態では、核酸カセットは、対象となる遺伝子、例えば対象となるポリヌクレオチドを含有する。別の実施形態では、核酸カセットは、一つまたは複数の発現制御配列、例えばプロモーター、エンハンサー、ポリ（Ａ）配列、および例えば対象となるポリヌクレオチドなどの対象となる遺伝子を含有する。ベクターは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個以上の核酸カセットを含有してもよい。核酸カセットは、ベクター内で位置的に、そして連続的に方向付けられる。それにより、カセット中の核酸はＲＮＡに転写されることができ、必要な場合にはタンパク質またはポリペプチドへと翻訳され、形質転換細胞での活動に必要とされる適切な翻訳後修飾を受け、適切な細胞内区画に標的化されることで生物活性に適した区画へと移行され、または細胞外区画へと分泌されることができる。カセットは、ベクター内への即時の挿入に適合された３’末端および５’末端を有することが好ましく、例えば各末端に制限エンドヌクレアーゼ部位を有している。好ましい実施形態では、核酸カセットは、ＴＣＲの鎖を一つ以上コードする。カセットは取り出され、そして単一ユニットとしてプラスミドまたはウイルスベクター内に挿入されることができる。

【0150】

ポリヌクレオチドは、対象となるポリヌクレオチドを含む。本明細書で使用される場合、用語「目的のポリヌクレオチド」は、ポリペプチド、ポリペプチドバリアント、または融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。ベクターは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の目的のポリヌクレオチドを含んでもよい。特定の実施形態では、目的のポリヌクレオチドは、疾患または傷害の治療または予防において治療効果を提供するポリペプチドをコードする。目的のポリヌクレオチド、およびそれからコードされるポリペプチドは、野生型ポリペプチド、ならびに機能的バリアントおよび断片をコードする両方のポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、機能的バリアントは、対応する野生型参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を有する。特定の実施形態では、機能的バリアントまたは断片は、対応する野生型ポリペプチドの生物活性の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％を有する。

【0151】

本明細書において想定されるポリヌクレオチドは、コード配列自体の長さにかかわらず、本明細書の他の箇所に開示されるか当該技術分野で知られている、プロモーターおよび／またはエンハンサー、非翻訳領域（ＵＴＲ）、シグナル配列、コザック配列、ポリアデニル化シグナル、付加的な制限酵素部位、多重クローニング部位、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、リコンビナーゼ認識部位（例えば、ＬｏｘＰ、ＦＲＴ、およびＡｔｔ部位）、終止コドン、転写終結シグナル、および自己切断ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、エピトープタグなどの他のＤＮＡ配列と組み合わされてもよく、その結果、それらの全体的な長さが大幅に変動してもよい。したがって、ほぼ任意の長さのポリヌクレオチド断片が特定の実施形態で使用されてもよく、全長は、意図される組み換えＤＮＡプロトコルにおける調製および使用の容易さによって制限されることが好ましい。

【0152】

ポリヌクレオチドは、当分野で公知および利用可能な様々な確立された技術のいずれかを使用して調製され、操作され、および／または発現されてもよい。所望のポリペプチドを発現するために、当該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、適切なベクターに挿入されてもよい。

【0153】

ベクターの例示としては限定されないが、プラスミド、自己複製配列、および転位因子、例えば、ｐｉｇｇｙＢａｃ、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ、Ｍｏｓ１、Ｔｃ１／ｍａｒｉｎｅｒ、Ｔｏｌ２、ｍｉｎｉ－Ｔｏｌ２、Ｔｃ３、ＭｕＡ、Ｈｉｍａｒ Ｉ、Ｆｒｏｇ Ｐｒｉｎｃｅおよびその誘導体が挙げられる。

【0154】

ベクターの追加的な例示としては限定されないが、プラスミド、ファージミド、コスミド、例えば酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）などの人工染色体、例えばラムダファージまたはＭ１３ファージなどのバクテリオファージ、および動物ウイルスが挙げられる。

【0155】

ベクターとして有用なウイルスの例示としては限定されないが、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴型ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、およびパポバウイルス（例えばＳＶ４０）が挙げられる。

【0156】

発現ベクターの例示としては限定されないが、哺乳動物細胞における発現用のｐＣｌｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）、哺乳動物細胞におけるレンチウイルス介在性の遺伝子導入および発現のためのｐＬｅｎｔｉ４／Ｖ５－ＤＥＳＴ（商標）、ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５－ＤＥＳＴ（商標）、およびｐＬｅｎｔｉ６．２／Ｖ５－ＧＷ／ｌａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）が挙げられる。特定の実施形態では、本明細書に開示されるポリペプチドのコード配列は、哺乳動物細胞でのポリペプチドの発現のために、そうした発現ベクター内にライゲートされてもよい。

【0157】

特定の実施形態では、ベクターは、エピソーム性ベクター、または染色体外で維持されるベクターである。本明細書において使用される場合、「エピソーム性」という用語は、宿主の染色体ＤＮＡに統合されることなく複製することができるベクターであり、宿主細胞の分裂により徐々に減少することがないということは、当該ベクターが染色体外で、またはエピソーム性に複製することも意味している。

【0158】

発現ベクター中に存在する「制御要素」、「制御配列」は、ベクターの非翻訳領域であり、複製起源、選択カセット、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル（Ｓｈｉｎｅ Ｄａｌｇａｒｎｏ配列またはＫｏｚａｋ配列）、イントロン、ポリアデニル化配列、５’および３’の非翻訳領域が挙げられ、宿主の細胞タンパク質と相互作用して、転写と翻訳を実行する。そうした因子は、その強度および特異性を変化させてもよい。利用するベクターシステムおよび宿主に応じて、ユビキタスプロモーターおよび誘導性プロモーターをはじめとする任意の数の適切な転写因子および翻訳因子を使用してもよい。

【0159】

特定の実施形態では、ベクターとしては限定されないが、発現ベクターおよびウイルスベクターが挙げられ、それらは例えばプロモーターおよび／またはエンハンサーなどの外因性、内因性、または異種の制御配列を含む。「内因性」制御配列は、ゲノム中で所与の遺伝子と自然に連結される配列である。「外因性」制御配列は、その遺伝子の転写が連結されたエンハンサー／プロモーターによって指向されるように、遺伝子操作の手段（すなわち、分子生物学的技法）によって遺伝子と並立に配置されるものである。「異種」制御配列は、遺伝子操作される細胞とは異なる種に由来する外因性配列である。

【0160】

本明細書において使用される場合、「プロモーター」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼが結合するポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の認識部位を指す。ＲＮＡポリメラーゼは、プロモーターに操作可能に連結されたポリヌクレオチドの転写を開始させる。特定の実施形態では、哺乳動物細胞で動作するプロモーターは、転写が開始される部位からおよそ２５～３０塩基上流に位置するＡＴ－リッチ領域、および／または転写開始部位から７０～８０塩基上流に存在する別の配列であるＣＮＣＡＡＴ領域を含有し、式中、Ｎは任意のヌクレオチドであり得る。

【0161】

「エンハンサー」という用語は、転写の強化を提供することができる配列を含むＤＮＡセグメントを指し、一部の場合では、別の制御配列に対する方向性に関係なく機能することができる。エンハンサーは、プロモーター因子および／または他のエンハンサー因子と協働して、または相加的に機能することができる。「プロモーター／エンハンサー」という用語は、プロモーター機能とエンハンサー機能の両方を提供することができる配列を含むＤＮＡセグメントを指す。

【0162】

「操作可能に連結した」という用語は、記載される構成要素が、それらが意図された様式で機能することができるような関係にある並置を意味する。一実施形態では、用語は、核酸発現制御配列（プロモーターおよび／またはエンハンサーなど）と第二のポリヌクレオチド配列、例えば、対象のポリヌクレオチドとの間の機能的結合を指し、ここで、発現制御配列は、第二の配列に対応する核酸の転写を指示する。

【0163】

本明細書において使用される場合、「構造的発現制御配列」という用語は、操作可能に連結された配列の継続的な、または連続的な転写を可能にするプロモーター、エンハンサー、またはプロモーター／エンハンサーを指す。構造的発現制御配列は、様々な細胞型と組織型での発現を可能にする「ユビキタス」なプロモーター、エンハンサー、プロモーター／エンハンサーであってもよく、または限定的な細胞型および組織型での発現を可能にする、それぞれ「細胞特異的」、「細胞型特異的」、「細胞株特異的」、または「組織特異的」なプロモーター、エンハンサー、またはプロモーター／エンハンサーであってもよい。

【0164】

特定の実施形態における使用に適したユビキタス発現制御配列の例示としては限定されないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、ウイルス性シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば初期または後期）、モロニ－マウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）ＬＴＲプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーター、ワクシニアウイルス由来のＨ５、Ｐ７．５およびＰ１１プロモーター、伸長因子１アルファ（ＥＦ１ａ）プロモーター、初期増殖応答タンパク質１（ＥＧＲ１：ｅａｒｌｙ ｇｒｏｗｔｈ ｒｅｓｐｏｎｓｅ １）、フェリチンＨ（ＦｅｒＨ）、フェリチンＬ（ＦｅｒＬ）、グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）、真核細胞翻訳開始因子４Ａ１（ＥＩＦ４Ａ１）、ヒートショック７０ｋＤａタンパク質５（ＨＳＰＡ５）、ヒートショックタンパク質９０ｋＤａ ベータ、メンバー１（ＨＳＰ９０Ｂ１）、ヒートショックタンパク質７０ｋＤａ（ＨＳＰ７０）、β－キネシン（β－ＫＩＮ）、ヒトＲＯＳＡ ２６座位（Ｉｒｉｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２５，１４７７－１４８２（２００７））、ユビキチンＣプロモーター（ＵＢＣ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ－１（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ－アクチン（ＣＡＧ）プロモーター、β－アクチンプロモーターおよび骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、ネガティブ制御領域欠失型、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）Ｕ３プロモーター（Ｈａａｓ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２００３；７７（１７）：９４３９－９４５０）が挙げられる。

【0165】

一つの実施形態では、ベクターは、ＭＮＤＵ３プロモーターを含有する。

【0166】

一つの実施形態では、ベクターは、ヒトＥＦ１ａ遺伝子の第一イントロンを含むＥＦ１ａプロモーターを含有する。

【0167】

一つの実施形態では、ベクターは、ヒトＥＦ１ａ遺伝子の第一イントロンを欠くＥＦ１ａプロモーターを含有する。

【0168】

本明細書で使用される場合、「条件付き発現」とは、限定されないが、誘導性発現、抑制性発現、特定の生理学的状態、生物学的状態もしくは疾患状態を有する細胞または組織における発現などをはじめとする任意のタイプの条件付き発現を指す場合がある。この定義は、細胞型特異的または組織特異的な発現を除外することは意図されない。ある実施形態は、対象となるポリヌクレオチドの条件付き発現を提供するものであり、例えば発現は、細胞、組織、生物体を、ポリヌクレオチドが発現される処理または条件、または対象となるポリヌクレオチドにコードされるポリヌクレオチドの発現が増加もしくは減少する処理または条件に曝すことにより制御される。

【0169】

誘導性プロモーター／システムの例示としては限定されないが、ステロイド誘導性プロモーター、例えばグルココルチコイド受容体またはエストロゲン受容体をコードする遺伝子のプロモーター（対応するホルモンの処理で誘導可能）、メタロチオネインプロモーター（様々な重金属の処理で誘導可能）、ＭＸ－１プロモーター（インターフェロンで誘導可能）、「ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ」ミフェプリストン制御性システム（Ｓｉｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｇｅｎｅ，３２３：６７）、クミン酸塩（ｃｕｍａｔｅ）誘導性遺伝子スイッチ（ＷＯ２００２／０８８３４６）、テトラサイクリン依存性制御システムなどが挙げられる。

【0170】

本明細書において使用される場合、「内部リボソーム侵入部位」または「ＩＲＥＳ」とは、シストロン（タンパク質コード領域）の例えばＡＴＧなどの開始コドンに内部リボソームが直接侵入することを促進し、キャップ非依存性の遺伝子翻訳を生じさせる因子を指す。例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ １５（１２）：４７７－８３）およびＪａｃｋｓｏｎ ａｎｄ Ｋａｍｉｎｓｋｉ．１９９５．ＲＮＡ １（１０）：９８５－１０００を参照のこと。特定の実施形態では、ベクターは、一つ以上のポリペプチドをコードする一つ以上の目的のポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、複数のポリペプチドの各々の効率的な翻訳を達成するために、ポリヌクレオチド配列は、自己切断ポリペプチドをコードする一つ以上のＩＲＥＳ配列またはポリヌクレオチド配列によって分離され得る。一つの実施形態では、本明細書において予期されるポリヌクレオチドに使用されるＩＲＥＳは、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳである。

【0171】

本明細書において使用される場合、「Ｋｏｚａｋ配列」という用語は、リボソーム小サブユニットへのｍＲＮＡの初期結合を大きく促進し、翻訳を増加させる短いヌクレオチド配列を指す。コンセンサスＫｏｚａｋ配列は、（ＧＣＣ）ＲＣＣＡＴＧＧ（配列番号６３）であり、式中、Ｒはプリン（ＡまたはＧ）である（Ｋｏｚａｋ，１９８６．Ｃｅｌｌ．４４（２）：２８３－９２、およびＫｏｚａｋ，１９８７．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５（２０）：８１２５－４８）。特定の実施形態では、ベクターは、ポリヌクレオチドを含み、当該ポリヌクレオチドは、コンセンサスＫｏｚａｋ配列を有し、例えばＴＣＲなどの所望のポリペプチドをコードする。

【0172】

異種核酸転写物の効率的な終止とポリアデニル化を誘導する因子は、異種遺伝子の発現を増加させる。転写終止シグナルは、一般的にポリアデニル化シグナルの下流に存在する。特定の実施形態では、ベクターは、発現されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの３’側にポリアデニル化配列を含有する。本明細書において使用される場合、「ポリＡ部位」または「ポリＡ配列」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる初期ＲＮＡ転写物の終止とポリアデニル化の両方を誘導するＤＮＡ配列を示す。ポリアデニル化配列は、ポリＡテールをコード配列の３’末端に付加することによってｍＲＮＡ安定性を促進することができ、したがって、翻訳効率の向上に寄与する。切断およびポリアデニル化は、ＲＮＡ中のポリ（Ａ）配列によって指示される。哺乳類プレｍＲＮＡのコアポリ（Ａ）配列は、切断ポリアデニル化部位に隣接する二つの認識エレメントを有する。典型的には、ほぼ不変のＡＡＵＡＡＡ六量体が、Ｕ残基またはＧＵ残基が豊富な、より可変性の高い因子の上流２０～５０ヌクレオチドに存在する。初期転写物の切断はこれら二つの因子の間で発生し、５’切断産物に最大で２５０個のアデノシンが付加される。特定の実施形態では、コアポリ（Ａ）配列は、最良のポリＡ配列（例えば、ＡＡＴＡＡＡ、ＡＴＴＡＡＡ、ＡＧＴＡＡＡ）である。特定の実施形態では、ポリ（Ａ）配列は、ＳＶ４０のポリＡ配列、ウシ成長ホルモンポリＡ配列（ＢＧＨｐＡ）、ウサギβ－グロビンポリＡ配列（ｒβｇｐＡ）、それらのバリアント、または当分野に公知の別の適切な異種または内因性ポリＡ配列である。

【0173】

一部の実施形態では、ポリヌクレオチド、またはポリヌクレオチドを保有する細胞は、直接的な毒性および／または非制御増幅のリスクを減少させるための誘導性自殺遺伝子をはじめとする自殺遺伝子を利用する。特定の態様では、自殺遺伝子は、ポリヌクレオチドを保有する宿主、または細胞に対して免疫原性ではない。使用され得る自殺遺伝子の例は、カスパーゼ－９またはカスパーゼ－８またはシトシンデアミナーゼである。カスパーゼ－９は、二量体形成の特定の化学誘導物質（ＣＩＤ：ｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｎｄｕｃｅｒ ｏｆ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）を使用して活性化され得る。

【0174】

特定の実施形態では、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖をコードする一つ以上のポリヌクレオチドが、非ウイルスベクターまたはウイルスベクターによって、細胞（例えば、免疫エフェクター細胞）に導入される。「ベクター」という用語は、本明細書において、もう一つの核酸分子を移送または輸送することができる核酸分子を指すために使用される。伝達された核酸は、一般的に、例えば、ベクター核酸分子に挿入される。ベクターは、細胞内で自己複製を指示する配列を含んでもよく、または宿主細胞ＤＮＡへの組み込みを可能にするのに十分な配列を含んでもよい。特定の実施形態では、非ウイルスベクターを使用して、本明細書で意図される一つまたは複数のポリヌクレオチドをＴ細胞に送達する。

【0175】

非ウイルス性ベクターの例示としては限定されないが、ｍＲＮＡ、プラスミド（例えばＤＮＡプラスミドまたはＲＮＡプラスミド）、トランスポゾン、コスミド、および細菌人工染色体が挙げられる。

【0176】

特定の実施形態で予期されるポリヌクレオチドの非ウイルス性の送達法の例示としては限定されないが、エレクトロポレーション法、ソノポレーション法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、バイオリステック法、ウイロゾーム法、リポソーム法、免疫リポソーム法、ナノ粒子法、ポリカチオンまたは脂質：核酸複合体、ネイキッドＤＮＡ法、人工ビリオン、ＤＥＡＥ－デキストラン介在移送、遺伝子銃、およびヒートショックが挙げられる。

【0177】

特定の実施形態において予期される特定の実施形態での使用に適したポリヌクレオチド送達システムの例示としては限定されないが、Ａｍａｘａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．、ＢＴＸ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ．により提供されるシステムが挙げられる。リポフェクション試薬は市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体－認識リポフェクションに適したカチオン性脂質および中性脂質は、文献に記載されている。例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．１０：１８０－１８７；およびＢａｌａｚｓ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．２０１１：１－１２を参照のこと。抗体標的化送達、細菌誘導送達、非生物ナノセル系送達も特定の実施形態において予期される。

【0178】

様々な実施形態では、ポリヌクレオチドは、所望のポリペプチドを一過性に発現させるために細胞内に導入されるｍＲＮＡである。本明細書で使用される場合、「一過性」とは、数時間、数日、または数週間の期間にわたる非統合型導入遺伝子の発現を指し、発現期間は、細胞内のゲノムに統合されるか、または安定的なプラスミドレプリコン内に含有される場合、ポリヌクレオチドの発現期間よりも短い。

【0179】

特定の実施形態では、ウイルス性ベクターを使用して、本明細書に予期される一つ以上のポリヌクレオチドがＴ細胞に送達される。

【0180】

本明細書で予期される特定の実施形態における使用に適したウイルスベクター系の例示としては限定されないが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、およびワクシニアウイルスのベクターが挙げられる。

【0181】

特定の実施形態では、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を含むＴＣＲをコードするポリシストロニックなポリヌクレオチドが、非ウイルスベクターまたはウイルスベクターによって細胞に導入される。特定の実施形態では、最小限にマウス化されたＴＣＲα鎖、およびＴＣＲα膜貫通ドメインに疎水性アミノ酸置換、ポリペプチド切断シグナル、ならびに最小限にマウス化されたＴＣＲβ鎖を含む、本明細書で予期されるＴＣＲをコードする融合タンパク質をコードするポリシストロニックなポリヌクレオチド。

【0182】

特定の実施形態では、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を含むＴＣＲをコードするポリシストロニックなポリヌクレオチドが、非ウイルスベクターまたはウイルスベクターによって細胞に導入される。特定の実施形態では、最小限にマウス化されたＴＣＲα鎖、およびＴＣＲα膜貫通ドメインに疎水性アミノ酸置換、ＩＲＥＳ、ならびに最小限にマウス化されたＴＣＲβ鎖を含む、本明細書で予期されるＴＣＲをコードする融合タンパク質をコードするポリシストロニックなポリヌクレオチド。

【0183】

特定の実施形態では、ポリシストロニックなポリヌクレオチドは、ＴＣＲβ鎖に対し５’側にＴＣＲα鎖を含む。他の実施形態では、ポリシストロニックなポリヌクレオチドは、ＴＣＲβ鎖に対し３’側にＴＣＲα鎖を含む。

【0184】

Ｇ．遺伝子改変細胞
様々な実施形態において、最小限にマウス化されたＴＣＲα鎖、およびＴＣＲα膜貫通ドメインに疎水性アミノ酸置換、および最小限にマウス化されたＴＣＲβ鎖を含む、癌の治療における使用のための、本明細書で予期されるＴＣＲを発現するように遺伝子改変された細胞が、提供される。様々な実施形態において、最小限にマウス化されたＴＣＲα鎖、およびＴＣＲα膜貫通ドメインに疎水性アミノ酸置換、および最小限にマウス化されたＴＣＲβ鎖を含む、本明細書で予期されるＴＣＲを発現するように遺伝子改変された免疫エフェクター細胞は、癌治療用の医薬品の調製または製造において、使用される。

【0185】

特定の実施形態では、本明細書で予期されるＴＣＲをコードするポリヌクレオチドは、本明細書で予期されるＴＣＲを発現させるために、および免疫エフェクター細胞を、標的抗原を発現する標的細胞へとリダイレクトさせるために、免疫エフェクター細胞へと導入される。特定の実施形態では、最小限にマウス化されたＴＣＲα鎖、およびＴＣＲα膜貫通ドメインに疎水性アミノ酸置換、および最小限にマウス化されたＴＣＲβ鎖を含む、本明細書で予期されるＴＣＲをコードする一つ以上のポリヌクレオチドは、一つ以上の免疫エフェクター細胞に導入される。特定の実施形態では、最小限にマウス化されたＴＣＲα鎖、およびＴＣＲα膜貫通ドメインに疎水性アミノ酸置換、例えばポリペプチド切断シグナルなどのポリペプチドリンカー、および最小限にマウス化されたＴＣＲβ鎖を含むＴＣＲを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、一つ以上の免疫エフェクター細胞に導入される。

【0186】

「免疫エフェクター細胞」は、一つまたは複数のエフェクター機能（例えば細胞傷害性の細胞殺傷活性、サイトカイン分泌、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣの誘導など）を有する免疫系の任意の細胞である。本明細書で予期される免疫エフェクター細胞の例示は、限定されないが、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ；ＣＤ８^＋Ｔ細胞）、ＴＩＬ、およびヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ；ＣＤ４^＋Ｔ細胞）をはじめとするＴリンパ球である。特定の実施形態では、細胞は、αβ Ｔ細胞を含む。特定の実施形態では、αβＴＣＲを発現するよう改変されたγδ Ｔ細胞を含む。一つの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。一つの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞を含む。

【0187】

免疫エフェクター細胞は、自己（ｓｅｌｆ）または非自己（ｎｏｎ－ｓｅｌｆ、例えば同種、同系または異種）であってもよい。本明細書において使用される場合、「自己」とは、同じ対象に由来する細胞を指す。本明細書において使用される場合、「同種」とは、比較した細胞と遺伝的に異なる同じ種の細胞を指す。本明細書において使用される場合、「同系」とは、比較した細胞と遺伝的に同一である、異なる対象の細胞を指す。本明細書において使用される場合、「異種」とは、比較した細胞と異なる種の細胞を指す。好ましい実施形態では、細胞は自己である。

【0188】

特定の実施形態において予期されるＴＣＲとともに使用される免疫エフェクター細胞の例としては、Ｔリンパ球が挙げられる。「Ｔ細胞」または「Ｔリンパ球」という用語は、当分野において認識されており、胸腺細胞、未成熟Ｔリンパ球、成熟Ｔリンパ球、静止Ｔリンパ球、または活性化Ｔリンパ球を含むことが意図される。Ｔ細胞は、例えばＴヘルパー１（Ｔｈ１）細胞またはＴヘルパー２（Ｔｈ２）細胞などのＴヘルパー（Ｔｈ）細胞であってもよい。Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ；ＣＤ４^＋Ｔ細胞）のＣＤ４^＋Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ：ＣＤ８^＋Ｔ細胞）、ＣＤ４^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞、ＣＤ４^－ＣＤ８^－Ｔ細胞、またはＴ細胞の任意の他のサブセットであってもよい。特定の実施形態での使用に適したＴ細胞の他の例示的な集団としては、ナイーブＴ細胞（Ｔ_Ｎ）、Ｔメモリー幹細胞（Ｔ_ＳＣＭ）、中央メモリーＴ細胞（Ｔ_ＣＭ）、エフェクターメモリーＴ細胞（Ｔ_ＥＭ）、およびエフェクターＴ細胞（Ｔ_ＥＦＦ）が挙げられる。

【0189】

当業者によって理解されるように、他の細胞も免疫エフェクター細胞として本明細書に予期されるＴＣＲとともに使用され得る。特に、免疫エフェクター細胞は、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、好中球およびマクロファージも含む。免疫エフェクター細胞は、エフェクター細胞の前駆体も含み、このような前駆細胞は、インビボまたはインビトロで免疫エフェクター細胞に分化するように誘導されてもよい。したがって特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、例えば臍帯血、骨髄または動員末梢血に由来する細胞のＣＤ３４＋集団内に含有される造血幹細胞（ＨＳＣ）などの免疫エフェクター細胞の前駆体を含み、それらは対象に投与されたときに成熟免疫エフェクター細胞へと分化し、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導されて成熟免疫エフェクター細胞へと分化してもよい。

【0190】

本明細書において使用される場合、「ＣＤ３４＋細胞」という用語は、その細胞表面上にＣＤ３４タンパク質を発現する細胞を指す。本明細書において使用される場合、「ＣＤ３４」とは、細胞－細胞接着因子として作用することが多く、リンパ節へのＴ細胞の侵入に関与する細胞表面糖タンパク質（例えばシアロムチンタンパク質）を指す。ＣＤ３４＋細胞集団は、造血幹細胞（ＨＳＣ）を含有し、ＨＳＣは患者に投与されたときに分化し、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、好中球、および単球／マクロファージ系統の細胞を含むすべての造血系の元となる。

【0191】

本明細書に予期されるＴＣＲを発現する免疫エフェクター細胞を作製する方法が、特定の実施形態において提供される。一つの実施形態では、当該方法は、個体から単離された免疫エフェクター細胞をトランスフェクトまたは形質導入することを含み、その結果、当該免疫エフェクター細胞は、改変ＴＣＲα鎖と改変ＴＣＲβ鎖を含むＴＣＲ、または最小限にマウス化されたＴＣＲα鎖およびＴＣＲα膜貫通ドメインに疎水性アミノ酸置換、ポリペプチドリンカー、ならびに最小限にマウス化されたＴＣＲβ鎖を含む、本明細書に予期されるＴＣＲをコードする融合タンパク質、をコードするポリシストロニックなメッセージを発現するようになる。

【0192】

好ましい実施形態では、当該方法は、個体から単離された免疫エフェクター細胞をトランスフェクトまたは形質導入することによって、当該免疫エフェクター細胞が、最小限にマウス化されたＴＣＲα鎖、およびＴＣＲα膜貫通ドメインに疎水性アミノ酸置換、２Ａ自己切断型ポリペプチド、および最小限にマウス化されたＴＣＲβ鎖を含む、本明細書に予期されるＴＣＲをコードするポリシストロニックなメッセージを発現することを含む。特定の実施形態では、形質導入された細胞は続いて培養されて拡張し、その後に対象に投与される。

【0193】

ある実施形態では、免疫エフェクター細胞は、インビトロでのさらなる操作を伴わずに個体から単離され、および遺伝子改変される。次いでそうした細胞を当該個体に直接再投与してもよい。さらなる実施形態において、免疫エフェクター細胞はまず活性化および刺激され、インビトロで増殖し、その後に遺伝子改変されて、最小限にマウス化されたＴＣＲα鎖、およびＴＣＲα膜貫通ドメインに疎水性アミノ酸置換、リンカー、および最小限にマウス化されたＴＣＲβ鎖を含む、本明細書で予期されるＴＣＲを発現する。これに関し、免疫エフェクター細胞は、遺伝子改変される前、および／または遺伝子改変された後に培養され得る。

【0194】

特定の実施形態では、本明細書に記載される免疫エフェクター細胞のインビトロ操作または遺伝子改変の前に、対象から細胞源が取得される。特定の実施形態では、改変された免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞を含有する。

【0195】

特定の実施形態では、本明細書で予期される方法を使用して、ＰＢＭＣが直接遺伝子改変されて、最小限にマウス化されたＴＣＲα鎖、およびＴＣＲα膜貫通ドメインに疎水性アミノ酸置換、ポリペプチドリンカー、および最小限にマウス化されたＴＣＲβ鎖を含む、本明細書で予期されるＴＣＲをコードするポリシストロニックなメッセージが発現されてもよい。特定の実施形態では、ＰＢＭＣの単離後、Ｔリンパ球をさらに単離し、特定の実施形態において、細胞傷害性Ｔリンパ球とヘルパーＴリンパ球の両方を、遺伝子改変および／または増殖の前または後のいずれかに、ナイーブ、メモリーおよびエフェクターＴ細胞亜集団に保存することができる。

【0196】

例えばＴ細胞などの免疫エフェクター細胞は、公知の方法を使用して単離された後に遺伝子改変されてもよく、または免疫エフェクター細胞は、インビトロで活性化および拡張されて（または前駆細胞の場合には分化されて）、その後に遺伝子改変されてもよい。特定の実施形態では、例えばＴ細胞などの免疫エフェクター細胞は、拡張のために活性化および刺激され、その後に本明細書で予期されるＴＣＲで遺伝子改変され（例えば、最小限にマウス化されたＴＣＲα鎖、およびＴＣＲα膜貫通ドメインに疎水性アミノ酸置換、ポリペプチドリンカー、および最小限にマウス化されたＴＣＲβ鎖を含む、本明細書で予期されるＴＣＲをコードするポリシストロニックなメッセージをコードする核酸を含むウイルスベクターで形質導入され）、その後にインビトロで活性化および拡張される。様々な実施形態では、Ｔ細胞は、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号、第６，５３４，０５５号、第６，９０５，６８０号、第６，６９２，９６４号、第５，８５８，３５８号、第６，８８７，４６６号、第６，９０５，６８１号、第７，１４４，５７５号、第７，０６７，３１８号、第７，１７２，８６９号、第７，２３２，５６６号、第７，１７５，８４３号、第５，８８３，２２３号、第６，９０５，８７４号、第６，７９７，５１４号、第６，８６７，０４１号、および米国特許出願公開２００６０１２１００５に記載される方法を使用して、遺伝子改変の前または後に、活性化および拡張されてもよい。

【0197】

一つの実施形態では、ＣＤ３４^＋細胞は、本明細書で予期される核酸構築物で形質導入される。特定の実施形態では、形質導入されたＣＤ３４^＋細胞は、概して、細胞が本来単離された対象である対象に投与後、インビボで成熟免疫エフェクター細胞に分化される。別の実施形態では、ＣＤ３４^＋細胞は、過去に報告された方法（Ａｓｈｅｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｉｍｒｅｎ，ｅｔ ａｌ．，２００４）に従い、以下のサイトカイン：Ｆｌｔ－３リガンド（ＦＬＴ３）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、巨核球成長および分化因子（ＴＰＯ）、ＩＬ－３、ならびにＩＬ－６のうちの一つ以上への曝露の前に、またはそれらを用いて、遺伝子改変された後に、インビトロで刺激されてもよい。

【0198】

特定の実施形態では、癌の治療のための改変された免疫エフェクター細胞の集団は、本明細書で予期されるＣＡＲおよびＣＣＲを含む。例えば、改変された免疫エフェクター細胞の集団は、本明細書に記載されるＢ細胞悪性腫瘍と診断された患者（自己ドナー）から得られた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から調製される。ＰＢＭＣは、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、またはＣＤ４＋およびＣＤ８＋であってもよいＴリンパ球の異種集団を形成する。

【0199】

Ｈ．組成物および製剤
本明細書に予期される組成物は、本明細書に予期される一つ以上のＴＣＲポリペプチド、ＴＣＲα鎖ポリペプチド、ＴＣＲβ鎖ポリペプチド、ＴＣＲ融合ポリペプチド、ポリヌクレオチド、それを含むベクター、遺伝子改変された免疫エフェクター細胞などを含み得る。組成物としては限定されないが、医薬組成物が挙げられる。好ましい実施形態では、組成物は、最小限にマウス化されたＴＣＲα鎖、およびＴＣＲα膜貫通ドメインに疎水性アミノ酸置換、および最小限にマウス化されたＴＣＲβ鎖を含む操作されたＴＣＲを発現するように改変された一つ以上の細胞を含むか、または最小限にマウス化されたＴＣＲα鎖、およびＴＣＲα膜貫通ドメインに疎水性アミノ酸置換、例えばポリペプチド切断シグナルなどのポリペプチドリンカー、および最小限にマウス化されたＴＣＲβ鎖を含むＴＣＲを含む融合タンパク質を発現するように改変された一つ以上の細胞を含む。好ましい実施形態では、組成物は、最小限にマウス化されたＴＣＲα鎖、およびＴＣＲα膜貫通ドメインに疎水性アミノ酸置換、２Ａ自己切断型ポリペプチド、および最小限にマウス化されたＴＣＲβ鎖を含むＴＣＲを含む融合タンパク質を発現するように改変された一つ以上の細胞を含む。

【0200】

「医薬組成物」とは、細胞または動物への投与に対し、薬学的に許容可能な溶液または生理学的に許容可能な溶液中で、単独で、または一つまたは複数の他の治療モダリティと併用されて製剤化される組成物を指す。所望の場合には、組成物は、例えばサイトカイン、増殖因子、ホルモン、低分子、化学療法剤、プロドラッグ、薬剤、抗体、または他の様々な薬学的に活性な剤などの他の剤も同様に併用されて投与され得ることも理解されたい。事実上、組成物に含有され得る他の構成要素に制限はないが、追加される剤は、意図される療法を送達する組成物の能力に有害な影響を与えないものとする。好ましい実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤と、最小限にマウス化されたＴＣＲα鎖、およびＴＣＲα膜貫通ドメインに疎水性アミノ酸置換、および最小限にマウス化されたＴＣＲβ鎖を含む操作されたＴＣＲを発現するように改変された一つ以上の細胞、または最小限にマウス化されたＴＣＲα鎖、およびＴＣＲα膜貫通ドメインに疎水性アミノ酸置換、ポリペプチドリンカー、および最小限にマウス化されたＴＣＲβ鎖を含むＴＣＲを含む融合タンパク質を発現するように改変された一つ以上の細胞とを含む。

【0201】

本明細書において、「薬学的に許容可能」という文言は、適切な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴わずにヒトおよび動物の組織と接触して使用することに適し、合理的な利益／リスク比に見合った、それら化合物、物質、組成物および／または剤型を指すために採用される。

【0202】

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤」としては限定されないが、等張生理食塩水、リンゲル液、エチルアルコール、リン酸緩衝液、および医薬製剤で採用される任意の他の適合性のある物質が挙げられる。

【0203】

特定の実施形態では、組成物は、ある量の免疫エフェクター細胞を含み、当該免疫エフェクター細胞は、最小限にマウス化されたＴＣＲα鎖、およびＴＣＲα膜貫通ドメインに疎水性アミノ酸置換、および最小限にマウス化されたＴＣＲβ鎖を含むＴＣＲを発現する。本明細書で使用される場合、「量」という用語は、臨床結果を含む、有益または所望の予防または治療結果を達成するために、遺伝子改変された治療用細胞、例えば、Ｔ細胞などの「有効な量」または「有効量」を指す。

【0204】

「予防的有効量」は、所望の予防的結果を達成するために有効な遺伝子改変された治療用細胞の量を指す。必ずではないが典型的には、予防的投与量は、疾患の早期ステージの前、または早期ステージの対象において使用されるため、予防的有効量は、治療有効量よりも少ない。

【0205】

遺伝子改変された治療用細胞の「治療有効量」は、個体の病態、年齢、性別、および体重などの因子、ならびに個体において所望の応答を引き出す幹細胞および前駆細胞の能力に応じて変化し得る。治療有効量はまた、ウイルスまたは形質導入された治療用細胞の任意の毒性または有害な影響を、治療上有益な効果が上回るものである。用語「治療有効量」は、対象（例えば、患者）を「治療する」のに有効な量を含む。治療的な量が示されている場合、投与される組成物の正確な量は、患者（対象）の年齢、体重、腫瘍の大きさ、感染または転移の程度、および状態における個々の差を考慮し、医師により決定され得る。

【0206】

一般的に、本明細書に記載されるＴ細胞を含む医薬組成物は、１０^６～１０^１３細胞／体重ｋｇ、好ましくは１０^８～１０^１３細胞／体重ｋｇの用量で、当該範囲内のすべての整数値を含み、投与され得ると言える。細胞数は、組成物の意図される最終用途、組成物中に含有される細胞のタイプに依存する。本明細書において提示される用途に関し、細胞は一般的に、リットル以下の量であり、５００ｍＬ以下、さらには２５０ｍＬまたは１００ｍＬ以下であり得る。ゆえに所望される細胞の密度は、多くの場合、１０^６細胞／ｍｌ超であり、一般的には、１０^７細胞／ｍｌ超、一般的には１０^８細胞／ｍｌ以上である。臨床的に関連する免疫細胞数は、複数回の点滴に分けられてもよく、累積的には、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、１０^１２または１０^１３細胞以上となる。組成物は、これらの範囲内の用量で複数回投与されてもよい。細胞は、療法を受けている患者にとって同種、同系、異種、または自己であってもよい。

【0207】

組成物は、非経口投与、例えば、血管内（静脈内または動脈内）腹腔内または筋肉内投与のために製剤化されることが好ましい。

【0208】

液体医薬組成物は、溶液、懸濁液、または他の類似の形態であるかどうかにかかわらず、注射用水、生理食塩水、好ましくは生理食塩液、リンゲル液、または等張食塩水などの滅菌希釈剤のうちの一つまたは複数を含み得る。非経口調製物は、アンプル、使い捨てシリンジ、またはガラスもしくはプラスチックで作製された複数回用量バイアルに封入され得る。注射用医薬組成物は、滅菌であることが好ましい。

【0209】

一つの実施形態では、本明細書に予期されるＴ細胞組成物は、薬学的に許容可能な細胞培養培地中で製剤化される。そうした組成物は、ヒト対象への投与に適している。特定の実施形態では、薬学的に許容可能な細胞培養培地は、無血清培地である。

【0210】

無血清培地は、血清含有培地を超える利点をいくつか有しており、シンプルでより明白な組成、汚染物質量の低下、感染性実体の源となる可能性の排除、およびコスト低下が挙げられる。様々な実施形態では、無血清培地は、動物質を含まず、任意で無タンパク質であってもよい。任意で培地はバイオ医薬品的に受容可能な組み換えタンパク質を含有してもよい。「動物質を含まない」培地とは、構成要素が非動物源に由来する培地を指す。組み換えタンパク質は、動物質を含まない培地中で天然動物性タンパク質を置き換え、その栄養素は合成、植物または微生物の源から取得される。「タンパク質を含まない」培地は、対照的に、実質的にタンパク質を含まないと規定される。

【0211】

特定の組成物において使用される無血清培地の例示としては限定されないが、ＱＢＳＦ－６０（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｉｎｃ．）、ＳｔｅｍＰｒｏ－３４（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、およびＸ－ＶＩＶＯ １０が挙げられる。

【0212】

ある好ましい実施形態では、本明細書に予期される免疫エフェクター細胞を含む組成物は、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａを含む溶液中で製剤化される。

【0213】

別の好ましい実施形態では、本明細書で予期される免疫エフェクター細胞を含む組成物は、凍結保存媒体を含む溶液中で製剤化される。例えば凍結保存剤を含む凍結保存培地を使用して、融解後の高い細胞活性成績を維持してもよい。特定の組成物において使用される凍結保存培地の例示としては限定されないが、ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ１０、ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ５、およびＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ２が挙げられる。

【0214】

より好ましい実施形態では、本明細書で予期される免疫エフェクター細胞を含む組成物は、ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ１０に対してＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａを５０：５０で含む溶液中で製剤化される。

【0215】

特定の実施形態では、組成物は、有効量のゲノム編集済み免疫エフェクター細胞を単独で、または一種以上の治療剤と組み合わせて含み、当該免疫エフェクター細胞は、最小限にマウス化されたＴＣＲα鎖、およびＴＣＲα膜貫通ドメインに疎水性アミノ酸置換、および最小限にマウス化されたＴＣＲβ鎖を含むＴＣＲを発現するように改変されている。したがって、免疫エフェクター細胞組成物は、単独で、または放射線療法、化学療法、移植、免疫療法、ホルモン療法、光力学的療法などの他の公知の癌治療と組み合わせて投与されてもよい。組成物は、抗生物質と併用して投与されてもよい。そうした治療剤は、例えば特定の癌などの本明細書に記載の特定の疾患状態に対する標準治療として当分野において承認されている場合がある。特定の実施形態において予期される治療剤の例としては、サイトカイン、成長因子、ステロイド、ＮＳＡＩＤ、ＤＭＡＲＤ、抗炎症剤、化学療法剤、放射線療法、治療用抗体、またはは他の活性で補助的な剤が挙げられる。

【0216】

特定の実施形態では、ゲノム編集済み免疫エフェクター細胞を含む組成物は、任意の数の化学療法剤と併用されて投与されてもよく、当該免疫エフェクター細胞は、最小限にマウス化されたＴＣＲα鎖、およびＴＣＲα膜貫通ドメインに疎水性アミノ酸置換、および最小限にマウス化されたＴＣＲβ鎖を含むＴＣＲを発現するように改変されている。

【0217】

特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞を含む組成物は、治療用抗体とともに投与されるものであり、当該免疫エフェクター細胞は、最小限にマウス化されたＴＣＲα鎖、およびＴＣＲα膜貫通ドメインに疎水性アミノ酸置換、および最小限にマウス化されたＴＣＲβ鎖を含むＴＣＲを発現するように改変されている。特定の実施形態において予期されるＣＡＲ改変Ｔ細胞との併用に適した治療用抗体の例示としては限定されないが、アテゾリズマブ、アベルマブ、バビツキシマブ、ベバシズマブ（アバスチン）、ビバツズマブ、ブリナツモマブ、コナツムマブ、クリゾチニブ、ダラツムマブ、デュリゴツマブ（ｄｕｌｉｇｏｔｕｍａｂ）、ダセツズマブ、ダロツズマブ、デュルバルマブ、エロツズマブ（ＨｕＬｕｃ６３）、ゲムツズマブ、イブリツモマブ、インダツキシマブ、イノツズマブ、イピリムマブ、ロルボツズマブ、ルカツムマブ、ミラツズマブ、モキセツモマブ、ニボルマブ、オカラツズマブ、オファツムマブ、ペムブロリズマブ、リツキシマブ、シルツキシマブ、テプロツムマブ、およびウブリツキシマブが挙げられる。

【0218】

特定の実施形態では、薬学的に許容可能な担体溶液の製剤は、当分野に公知であり、例えば腸内および非経口、例えば血管内、静脈内、動脈内、骨内、脳室内、大脳内、頭蓋内、髄腔内、クモ膜下腔内、および髄内の投与ならびに製剤を含む様々な治療レジメンにおける、本明細書に記載の特定の組成物の使用に関する適切な投薬レジメンおよび治療レジメンの開発も同様である。当業者であれば、本明細書に予期される特定の実施形態は、例えば、薬学分野で公知であり、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，ｖｏｌｕｍｅ Ｉ ａｎｄ ｖｏｌｕｍｅ ＩＩ．２２^ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｌｏｙｄ Ｖ．Ａｌｌｅｎ Ｊｒ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ：Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ；２０１２に記載される製剤などの他の製剤を含み得ることを理解するであろう。

【0219】

Ｉ．治療方法
本明細書に予期される最小限にマウス化されたＴＣＲα鎖、およびＴＣＲα膜貫通ドメインに疎水性アミノ酸置換、および最小限にマウス化されたＴＣＲβ鎖を含むＴＣＲを発現する遺伝子改変免疫エフェクター細胞は、癌の予防、治療、および改善に使用される、または癌に関連する少なくとも一つの症状の予防、治療、または改善に使用される養子免疫治療の改善方法を提供する。

【0220】

一つの実施形態では、最小限にマウス化されたＴＣＲα鎖、およびＴＣＲα膜貫通ドメインに疎水性アミノ酸置換、および最小限にマウス化されたＴＣＲβ鎖を含むＴＣＲを発現するようにＴ細胞が遺伝子改変されている、あるタイプの細胞療法は、その必要のあるレシピエントに点滴され、提供される。注入された細胞は、レシピエントにおいて疾患を引き起こす細胞を死滅させることができる。抗体療法とは異なり、Ｔ細胞療法は、インビボで複製することができ、その結果、持続的な癌治療をもたらすことができる長期持続性をもたらす。

【0221】

一つの実施形態では、最小限にマウス化されたＴＣＲα鎖、およびＴＣＲα鎖膜貫通ドメインに疎水性アミノ酸置換、および最小限にマウス化されたＴＣＲβ鎖を含むＴＣＲを発現するＴ細胞は、安定的なインビボＴ細胞拡張を経ることができ、および長時間、持続することができる。別の実施形態では、最小限にマウス化されたＴＣＲα鎖、およびＴＣＲα膜貫通ドメインに疎水性アミノ酸置換、および最小限にマウス化されたＴＣＲβ鎖を含むＴＣＲを発現するＴ細胞は、特異的メモリーＴ細胞または幹細胞メモリーＴ細胞へと分化し、それらは再活性化されて、任意の追加的な腫瘍の形成または増殖を阻害することができる。

【0222】

特定の実施形態では、本明細書で予期される最小限にマウス化されたＴＣＲα鎖、およびＴＣＲα膜貫通ドメインに疎水性アミノ酸置換、および最小限にマウス化されたＴＣＲβ鎖を含むＴＣＲを発現する改変免疫エフェクター細胞は、固形腫瘍または癌の治療において使用される。

【0223】

特定の実施形態では、本明細書において予期される改変免疫エフェクター細胞は、限定されないが、副腎癌、副腎皮質癌、肛門癌、虫垂癌、星状細胞腫、非定型奇形腫様腫瘍／非定型横紋筋様腫瘍、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳／ＣＮＳ癌、乳癌、気管支腫瘍、心臓腫瘍、子宮頸癌、胆管癌、軟骨肉腫、脊索腫、結腸癌、結腸直腸癌、頭蓋咽頭腫、非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）、子宮内膜癌、上位腫、食道癌、鼻腔神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、眼癌、卵管癌、線維性組織肉腫、線維肉腫、胆嚢癌、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胚細胞腫瘍、神経膠腫、グリア芽腫、頭頚部癌、血管芽細胞腫、肝細胞癌、下咽頭癌、眼内黒色腫、カポジ肉腫、腎癌、喉頭癌、平滑筋肉腫、舌癌、脂肪肉腫、肝癌、肺癌、非小細胞肺癌、胚カルチノイド腫瘍、悪性中皮腫、髄様癌、髄芽腫、髄膜腫、黒色腫、メルケル細胞癌、正中線癌、口腔癌（ｍｏｕｔｈ ｃａｎｃｅｒ）、粘液肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性新生物、鼻腔および副鼻腔の癌、上咽頭癌、神経芽細胞腫、乏突起神経膠腫、口腔癌（ｏｒａｌ ｃａｎｃｅｒ、ｏｒａｌ ｃａｖｉｔｙ ｃａｎｃｅｒ）、口腔咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、膵島細胞腫瘍、乳頭癌、傍神経節腫、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、松果体腫、下垂体腫瘍、胸膜肺芽腫、原発性胸膜腫、前立腺癌、直腸癌、網膜芽腫、腎細胞癌、腎盂および尿管の癌、横紋筋肉腫、唾液腺癌、皮脂腺癌、皮膚癌、軟部組織肉腫、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、小腸癌、胃癌、汗腺癌、滑液腫瘍、精巣癌、咽頭癌、胸腺癌、甲状腺癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、血管癌、外陰癌、およびウィルムス腫瘍を含む固形腫瘍または癌の治療に使用される

【0224】

特定の実施形態において、本明細書で予期される改変免疫エフェクター細胞は、非小細胞肺癌、頭頸部扁平上皮癌、結腸直腸癌、膵癌、乳癌、甲状腺癌、膀胱癌、子宮頸癌、食道癌、卵巣癌、胃癌、子宮内膜癌、神経膠腫、神経膠芽腫、および乏突起神経膠腫を含むが、これらに限定されない、固形腫瘍または癌の治療において使用される。

【0225】

特定の実施形態において、本明細書で予期される改変免疫エフェクター細胞は、非小細胞肺癌、転移性結腸直腸癌、神経膠芽腫、頭頸部癌、膵癌、および乳癌を含むが、これらに限定されない、固形腫瘍または癌の治療において使用される。

【0226】

特定の実施形態において、本明細書で予期される改変免疫エフェクター細胞は、神経膠芽腫の治療において使用される。

【0227】

特定の実施形態において、本明細書で予期される最小限にマウス化されたＴＣＲα鎖、およびＴＣＲα膜貫通ドメインに疎水性アミノ酸置換、および最小限にマウス化されたＴＣＲβ鎖を含むＴＣＲを発現する改変免疫エフェクター細胞は、液状癌または血液の癌の治療において使用される。

【0228】

特定の実施形態では、本明細書において予期される改変免疫エフェクター細胞は、限定されないが、白血病、リンパ腫および多発性骨髄腫を含むＢ細胞悪性腫瘍の治療に使用される。

【0229】

特定の実施形態では、本明細書において予期される改変免疫エフェクター細胞は、限定されないが、白血病、リンパ腫および多発性骨髄腫：急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、赤白血病、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、および真性多血症、ホジキンリンパ腫、結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、菌状息肉症、未分化大細胞リンパ腫、セザリー症候群、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫、多発性骨髄腫、顕性多発性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫、形質細胞白血病、非分泌性骨髄腫、ＩｇＤ骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、孤立性骨形質細胞腫、および髄外形質細胞腫を含む液状の癌の治療に使用される。

【0230】

特定の実施形態において、本明細書で予期される改変免疫エフェクター細胞は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の治療に使用される。

【0231】

本明細書において使用される場合、「個体」および「対象」という用語はしばしば相互交換可能に使用され、本明細書において別段に予期される遺伝子療法ベクター、細胞系治療剤、および方法で治療され得る疾患、傷害または病の症状を呈する任意の動物を指す。好ましい実施形態では、対象は、遺伝子療法ベクター、細胞系治療剤、および本明細書において別段に予期される方法を用いて治療され得る癌に関連する疾患、傷害、または病態の症状を呈する任意の動物を含む。適切な対象（例えば、患者）としては、実験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギまたはモルモット）、家畜（ｆａｒｍ ａｎｉｍａｌ、ｄｏｍｅｓｔｉｃ ａｎｉｍａｌ）、またはペット（例えば、ネコまたはイヌ）が挙げられる。非ヒト霊長類、好ましくはヒト患者も含まれる。

【0232】

本明細書で使用される場合、用語「患者」は、遺伝子療法ベクター、細胞系治療剤、および本明細書の他の場所で開示される方法を用いて治療され得る特定の疾患、傷害または病態と診断された対象を指す。

【0233】

本明細書で使用される「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」には、疾患または病態の症状もしくは病理に対する、あらゆる有益な作用または望ましい作用を含み、治療される疾患または状態の一つ以上の測定可能なマーカーの最小の低減さえも含み得る。治療には、任意で、疾患もしくは病態の減少、または疾患もしくは病態の進行の遅延のいずれかが含まれてもよい。「治療」は必ずしも、疾患もしくは状態、またはその関連症状の完全な排除または治癒を示すものではない。

【0234】

本明細書において使用される場合、「予防する」、および例えば「予防される」、「予防すること」といった類似の文言は、疾患もしくは状態の予防、阻害、または発生もしくは再発の可能性の低下を目的としたアプローチを示す。さらに、疾患もしくは状態の発生または再発の遅延、または疾患もしくは状態の症状の発生または再発の遅延も指す。本明細書において使用される場合、「予防」およびその類似文言も、疾患もしくは症状の発生または再発の前の、疾患もしくは状態の強度、作用、症状、および／または負荷量の低下を含む。

【0235】

本明細書において使用される場合、「～の少なくとも一つの症状の改善」とは、対象が治療される疾患もしくは状態の一つまたは複数の症状の減少を指す。特定の実施形態では、治療される疾患または状態は、癌であり、この場合において改善される一つまたは複数の症状としては限定されないが、脱力、疲労、息切れ、あざができやすい、および出血しやすい、頻発する感染、リンパ節の拡張、腹部膨張または腹部疼痛（膨張した腹部臓器が原因）、骨または関節の疼痛、骨折、予期せぬ体重減少、食欲低下、寝汗、持続性の微熱、および排尿減少（腎機能の障害が原因）が挙げられる。

【0236】

「強化する」、または「促進する」、または「増加する」、または「拡張する」とは概して、本明細書において予期される組成物、例えば、最小限にマウス化されたＴＣＲα鎖、およびＴＣＲα膜貫通ドメインに疎水性アミノ酸置換、および最小限にマウス化されたＴＣＲβ鎖を含むＴＣＲを発現する遺伝子改変Ｔ細胞が、ビヒクルまたは対照の分子／組成物のいずれかにより引き起こされる応答と比較して、大きな生理学的応答（すなわち下流効果）を生じさせる、惹起させる、または引き起こすことを指す。測定可能な生理学的反応としては特にＴ細胞の拡張、活性化、持続性、および／または癌細胞殺傷能力の増加が挙げられ、当分野および本明細書の記載の理解から明白である。「増加した」または「強化された」量は、典型的には「統計的に有意な」量であり、ビヒクルまたは対照組成物によりもたらされる反応の１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０またはそれ以上（例えば５００倍、１０００倍）（その間および１を超えるすべての整数および小数点を含む、例えば１．５、１．６、１．７、１．８など）である増加を含む場合がある。

【0237】

「減少する」、または「下げる」、または「低める」、または「低下する」、または「弱める」とは概して、本明細書において予期される組成物が、ビヒクルまたは対照の分子／組成物による反応と比較して、小さな生理学的反応（すなわち下流効果）をもたらす、惹起させる、または発生させる能力を指す。「減少」または「低下した」量は、典型的には「統計的に有意な」量であり、ビヒクル、対照組成物によりもたらされる反応、または特定の細胞株での反応の１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０またはそれ以上（例えば５００倍、１０００倍）（その間および１を超えるすべての整数および小数点を含む、例えば１．５、１．６、１．７、１．８など）である減少を含む場合がある。

【0238】

「維持する」、または「保存する」、または「維持」、または「変化がない」、または「実質的な変化がない」、または「実質的な減少が無い」とは概して、本明細書において予期される組成物が、ビヒクル、対照の分子／組成物により生じた反応、または特定の細胞株での反応と比較して、細胞において類似した、または同等の生理学的反応（すなわち、下流効果）を生成する、惹起させる、または生じさせることを指す。同等の反応は、基準反応と実質的に違わない、または測定可能な程度に違わない反応である。

【0239】

一つの実施形態では、それを必要とする対象における癌を治療する方法は、例えば、本明細書に予期される遺伝子改変された免疫エフェクター細胞を含む組成物の治療有効量などの有効量を投与することを含む。投与の量ならびに頻度は、患者の状態、患者の疾患のタイプおよび重大度といった因子により決定されるが、適切な用量は、臨床試験により決定されてもよい。

【0240】

一つの実施形態では、例えば最小限にマウス化されたＴＣＲα鎖、およびＴＣＲα膜貫通ドメインに疎水性アミノ酸置換、および最小限にマウス化されたＴＣＲβ鎖を含むＴＣＲを発現するＴ細胞などの免疫エフェクター細胞の、対象に投与される組成物中での量は、少なくとも１ｘ１０^７細胞、少なくとも０．５ｘ１０^８細胞、少なくとも１ｘ１０^８細胞、少なくとも０．５ｘ１０^９細胞、少なくとも１ｘ１０^９細胞、少なくとも１ｘ１０^１０細胞、少なくとも１ｘ１０^１１細胞、少なくとも１ｘ１０^１２細胞、少なくとも５ｘ１０^１２細胞、または少なくとも１ｘ１０^１３細胞である。

【0241】

特定の実施形態では、約１ｘ１０^７Ｔ細胞～約１ｘ１０^１３Ｔ細胞、約１ｘ１０^８Ｔ細胞～約１ｘ１０^１３Ｔ細胞、約１ｘ１０^９Ｔ細胞～約１ｘ１０^１３Ｔ細胞、約１ｘ１０^１０Ｔ細胞～約１ｘ１０^１３Ｔ細胞、約１ｘ１０^１１Ｔ細胞～約１ｘ１０^１３Ｔ細胞、または約１ｘ１０^１２Ｔ細胞～約１ｘ１０^１３Ｔ細胞が、対象に投与される。

【0242】

一つの実施形態では、例えば最小限にマウス化されたＴＣＲα鎖、およびＴＣＲα膜貫通ドメインに疎水性アミノ酸置換、および最小限にマウス化されたＴＣＲβ鎖を含むＴＣＲを発現するＴ細胞などの免疫エフェクター細胞の、対象に投与される組成物中での量は、少なくとも０．１ｘ１０^４細胞／体重ｋｇ、少なくとも０．５ｘ１０^４細胞／体重ｋｇ、少なくとも１ｘ１０^４細胞／体重ｋｇ、少なくとも５ｘ１０^４細胞／体重ｋｇ、少なくとも１ｘ１０^５細胞／体重ｋｇ、少なくとも０．５ｘ１０^６細胞／体重ｋｇ、少なくとも１ｘ１０^６細胞／体重ｋｇ、少なくとも０．５ｘ１０^７細胞／体重ｋｇ、少なくとも１ｘ１０^７細胞／体重ｋｇ、少なくとも０．５ｘ１０^８細胞／体重ｋｇ、少なくとも１ｘ１０^８細胞／体重ｋｇ、少なくとも２ｘ１０^８細胞／体重ｋｇ、少なくとも３ｘ１０^８細胞／体重ｋｇ、少なくとも４ｘ１０^８細胞／体重ｋｇ、少なくとも５ｘ１０^８細胞／体重ｋｇ、または少なくとも１ｘ１０^９細胞／体重ｋｇである。

【0243】

特定の実施形態では、約１ｘ１０^６Ｔ細胞／体重ｋｇ～約１ｘ１０^８Ｔ細胞／体重ｋｇ、約２ｘ１０^６Ｔ細胞／体重ｋｇ～約０．９ｘ１０^８Ｔ細胞／体重ｋｇ、約３ｘ１０^６Ｔ細胞／体重ｋｇ～約０．８ｘ１０^８Ｔ細胞／体重ｋｇ、約４ｘ１０^６Ｔ細胞／体重ｋｇ～約０．７ｘ１０^８Ｔ細胞／体重ｋｇ、約５ｘ１０^６Ｔ細胞／体重ｋｇ～約０．６ｘ１０^８Ｔ細胞／体重ｋｇ、または約５ｘ１０^６Ｔ細胞／体重ｋｇ～約０．５ｘ１０^８Ｔ細胞／体重ｋｇが対象に投与される。

【0244】

当業者であれば、所望の治療効果を発揮させるために、本明細書に予期される組成物の投与が複数回必要とされる場合があることを認識するであろう。例えば組成物は、１週、２週、３週、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、１年、２年、５年、１０年またはそれ以上の期間にわたり、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回以上投与される場合がある。

【0245】

ある実施形態では、対象に活性化された免疫エフェクター細胞が投与され、次いで対象から採血して（またはアフェレーシス療法を実施し）、それに由来する免疫エフェクター細胞を活性化し、そしてこれら活性化および拡張された免疫エフェクター細胞を患者に再注入することが望ましい場合がある。このプロセスは、数週ごとに複数回実施されてもよい。ある実施形態では、免疫エフェクター細胞は、１０ｃｃ～４００ｃｃの採血から活性化されてもよい。ある実施形態では、免疫エフェクター細胞は、２０ｃｃ、３０ｃｃ、４０ｃｃ、５０ｃｃ、６０ｃｃ、７０ｃｃ、８０ｃｃ、９０ｃｃ、１００ｃｃ、１５０ｃｃ、２００ｃｃ、２５０ｃｃ、３００ｃｃ、３５０ｃｃ、または４００ｃｃ以上の採血から活性化される。学説には拘束されないが、複数回の採血／複数回の再注入のプロトコルを使用することで、免疫エフェクター細胞のある群の選択に役立つ場合がある。

【0246】

本明細書で予期される組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸血、移植、または移植を含む、任意の都合の良い方法で実施されうる。好ましい実施形態では、組成物は非経口的に投与される。本明細書で使用されるとき、「非経口投与」および「非経口的に投与」という語句は、経腸投与および局所投与以外の投与様式を指し、通常は注射によって、限定されるものではないが、血管内、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、関節内、眼窩内、腫瘍内、心臓内、皮内、腹腔内の、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、および胸骨内注射および注入が挙げられる。一実施形態では、本明細書で予期される組成物は、腫瘍、リンパ節、または感染部位への直接注射によって対象に投与される。

【0247】

一実施形態では、対象のＢ細胞関連状態に対する細胞性免疫反応を増加させる組成物の有効量がそれを必要とする対象に投与される。免疫応答は、感染細胞を殺傷することができる細胞傷害性Ｔ細胞、制御Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞応答によって媒介される細胞免疫応答を含んでもよい。主にＢ細胞を活性化することができるヘルパーＴ細胞によって媒介され、したがって抗体産生をもたらす液性免疫応答も誘発され得る。様々な技術を使用して、組成物によって誘導される免疫応答のタイプを分析してもよく、それら技術は当分野において例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ：Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａｄａ Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄａｖｉｄ Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅｔｈａｎ Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗａｒｒｅｎ Ｓｔｒｏｂｅｒ（２００１）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．において充分に記載されている。

【0248】

一つの実施形態では、癌と診断された対象を治療する方法が提供され、当該方法は、対象から免疫エフェクター細胞を取り出すこと、本明細書に予期される最小限にマウス化されたＴＣＲα鎖、およびＴＣＲα膜貫通ドメインに疎水性アミノ酸置換、ポリペプチドリンカー、および最小限にマウス化されたＴＣＲβ鎖を含むＴＣＲをコードする核酸を含ベクターを用いて、当該免疫エフェクター細胞を遺伝子改変すること、それにより、改変免疫エフェクター細胞の集団を作製すること、および当該対象に当該改変免疫エフェクター細胞の集団を投与すること、を含む。好ましい実施形態では、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞を含む。

【0249】

ある特定の実施形態では、対象において標的細胞集団に対する免疫エフェクター細胞介在性の免疫調節因子応答を刺激する方法が提供され、当該方法は、最小限にマウス化されたＴＣＲα鎖、およびＴＣＲα膜貫通ドメインに疎水性アミノ酸置換、ポリペプチドリンカー、および最小限にマウス化されたＴＣＲβ鎖を含むＴＣＲをコードする核酸構築物を発現する免疫エフェクター細胞集団を当該対象に投与する工程を含む。

【0250】

特定の実施形態において予期される細胞組成物を投与する方法は、生体外で遺伝子改変された免疫エフェクター細胞の再導入をもたらすのに有効な任意の方法を含み、当該遺伝子改変された免疫エフェクター細胞は、本明細書で予期される最小限にマウス化されたＴＣＲα鎖、およびＴＣＲα膜貫通ドメインに疎水性アミノ酸置換、ポリペプチドリンカー、および最小限にマウス化されたＴＣＲβ鎖を含むＴＣＲを対象において直接発現するか、または免疫エフェクター細胞の遺伝子改変前駆細胞の再導入時に発現するかのいずれかであり、当該免疫エフェクター細胞の遺伝子改変前駆細胞は、対象への導入時にＴＣＲを発現する成熟免疫エフェクター細胞へと分化する。一つの方法は、本明細書に予期される核酸構築物を用いて生体外で末梢血Ｔ細胞を形質導入することと、当該形質導入細胞を対象に戻すことと、を含む。

【0251】

本明細書において引用される全ての刊行物、特許出願、および登録された特許は、あたかも個々の刊行物、特許出願、または登録された特許が、参照により組み込まれることを具体的かつ個別に示したかのように、参照により本明細書に組み込まれる。

【0252】

前述の実施形態は、明確性および理解を目的として、図および実施例により詳細に記載されているが、本明細書に予期される教示に照らし、特定の変化および改変が、添付の請求の範囲の主旨または範囲から逸脱することなく実施され得ることが当業者には容易に明らかであろう。以下の実施例は、説明の目的のみで提供され、限定の目的で提供されるものではない。当業者であれば、本質的に類似した結果をもたらすために変更または修正され得る様々な非臨界パラメータを容易に認識するであろう。

【実施例】

【0253】

実施例１
ＴＣＲ発現を相乗的に増加させるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）定常領域中のアミノ酸置換
ＭＡＧＥＡ４ ＴＣＲ配列を、標準的なクローニング技術を使用してレンチウイルスベクター内にクローニングし、改変した。ＴＣＲ^ＷＴ構築物は、非改変の親構築物である。ＴＣＲ^ＴＭ構築物は、ＴＣＲα鎖膜貫通ドメインに３個の疎水性アミノ酸置換（Ｓ１１５Ｌ、Ｇ１１８Ｖ、Ｆ１１９Ｌ；ＴＣＲα定常領域を参照して番号付けられた）を含む。ＴＣＲ^ＭＭ構築物は、ＴＣＲα鎖定常領域に４個のマウス化アミノ酸置換（Ｐ９０Ｓ、Ｅ９１Ｄ、Ｓ９２Ｖ、Ｓ９３Ｐ；ＴＣＲα鎖定常領域を参照して番号付けられた）を含み、さらにＴＣＲβ鎖定常領域に５個のマウス化アミノ酸置換（Ｅ１８Ｋ、Ｓ２２Ａ、Ｆ１３３Ｉ、Ｅ／Ｖ１３６Ａ、Ｑ１３９Ｈ；ＴＣＲβ定常領域を参照して番号付けられた）を含む。ＴＣＲＴＭ／^ＭＭ構築物は、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の定常領域に９個のマウス化アミノ酸置換を含み、ならびにＴＣＲα鎖膜貫通ドメインに３個の疎水性アミノ酸置換を含む。

【0254】

二名の正常ドナーに由来する末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、ＣＤ３抗体とＣＤ２８抗体を使用して活性化し、ＴＣＲ^ＷＴ、ＴＣＲ^ＴＭ、ＴＣＲ^ＭＭ、またはＴＣＲ^{ＴＭ／ＭＭ}をコードするレンチウイルスベクターで形質導入して、１０日間培養した。１０日後、ＵＴＤ Ｔ細胞、またはＴＣＲ^ＷＴ、ＴＣＲ^ＴＭ、ＴＣＲ^ＭＭもしくはＴＣＲ^{ＴＭ／ＭＭ}をコードするレンチウイルスベクターで形質導入されたＴ細胞を、フロー染色緩衝液中、１：２０希釈のＭＡＧＥＡ４五量体－ペプチド標識試薬で染色し、ＰＥ蛍光についてフローサイトメトリーで分析した。フロー分析によって、ＴＣＲ^ＷＴをコードするレンチウイルスベクターで形質導入されたＴ細胞と比較して、ＴＣＲ^ＴＭおよびＴＣＲ^ＭＭのレンチウイルスベクターで形質導入されたＴ細胞ではＴＣＲ発現が２倍増加していたこと、ＴＣＲ^{ＴＭ／ＭＭ}をコードするレンチウイルスベクターで形質導入されたＴ細胞では相乗的に４倍増加していたことが示された。図１。レンチウイルスベクターで形質導入されたＴ細胞は、同等のベクターコピー数（ＶＣＮ：ｖｅｃｔｏｒ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ）を示した。

【0255】

実施例２
改変ＴＣＲで形質導入されたＴ細胞は、非改変ＴＣＲで形質導入されたＴ細胞と比較し、発現が増加していた。

【0256】

二名の正常ドナーに由来するＰＢＭＣを、ＣＤ３抗体およびＣＤ２８抗体を使用して活性化し、ＴＣＲ^ＷＴまたはＴＣＲ^{ＴＭ／ＭＭ}をコードするレンチウイルスベクターで、二つの異なる形質導入条件（Ｔｄｘｎ １－強化ｔｄｘｎプロセス、Ｔｄｘｎ ２－基礎的ｔｄｘｎプロセス）を使用して形質導入し、１０日間培養した。非形質導入（ＵＴＤ：ｕｎｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ）Ｔ細胞は、対照として使用した。

【0257】

１０日後、細胞を、フロー染色緩衝液中、１：２０希釈のＭＡＧＥＡ４五量体－ペプチド標識試薬で染色し、ＰＥ蛍光についてフローサイトメトリーで分析した。フロー分析によって、ＴＣＲ^ＷＴをコードするレンチウイルスベクターで形質導入されたＴ細胞と比較し、ＴＣＲ^{ＴＭ／ＭＭ}をコードするレンチウイルスベクターで形質導入されたＴ細胞では４倍の増加が、両方の形質導入条件下で示された。図２Ａ。

【0258】

ＲＴ－ＰＣＲを使用して、ベクターコピー数（ＶＣＮ）を測定し、各形質導入条件下でのＬＶＶ統合を評価した。ＶＣＮは、各形質導入条件下で同等であった。図２Ｂ。

【0259】

実施例３
改変ＴＣＲで形質導入されたＴ細胞は、ＴＣＲミスペアリングを消滅させる。
ＰＢＭＣを、ＣＤ３抗体とＣＤ２８抗体を使用して活性化し、ＴＣＲ^ＷＴまたはＴＣＲ^{ＴＭ／ＭＭ}をコードするレンチウイルスベクターで形質導入して、１０日間培養した。

【0260】

１０日後、ＴＣＲ^ＷＴおよびＴＣＲ^{ＴＭ／ＭＭ}を形質導入されたＴ細胞を、フロー染色緩衝液中、１：２０希釈の五量体－ペプチド標識ＰＥ試薬と、１：１００希釈のｖ－ベータ鎖ＦＩＴＣ標識蛍光色素を用いた二重染色を使用して、特異的ＴＣＲペアリングについて評価した。ｖ－ベータ染色および四量体抗原染色によって検出された陽性細胞の割合が等しい場合は、特異的ＴＣＲペアリングが示唆される。

【0261】

ＴＣＲ^{ＴＭ／ＭＭ}が形質導入されたＴ細胞は、ＴＣＲ^ＷＴで形質導入されたＴ細胞と比較して、９０％を超える特異的ペアリングを示した。これらのデータから、ＴＣＲ^{ＴＭ／ＭＭ}に存在する改変によって、ＴＣＲミスペアリングが消滅したことが示される。図３Ａおよび図３Ｂ。

【0262】

実施例４
改変ＴＣＲで形質導入されたＴ細胞は、強力な抗腫瘍性能を有する
二名の正常ドナーに由来するＰＢＭＣを、ＣＤ３抗体とＣＤ２８抗体を使用して活性化し、ＴＣＲ^ＷＴまたはＴＣＲ^{ＴＭ／ＭＭ}をコードするレンチウイルスベクターで形質導入して、１０日間培養した。

【0263】

ＩＦＮγ－アッセイ：ＵＴＤ Ｔ細胞、またはＴＣＲ^ＷＴもしくはＴＣＲ^{ＴＭ／ＭＭ}をコードするレンチウイルスベクターで形質導入されたＴ細胞を、ＭＡＧＥＡ４陽性Ａ５４９腫瘍Ｎｕｃ－ｒｅｄ細胞とともに、１：１のＥ：Ｔ比率で２４時間共培養し、ＴＣＲ発現に基づいて正規化を行った。２４時間後、これらのサンプルから上清を回収し、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）アッセイを使用して分析を行い、サイトカイン産生を測定した。ＴＣＲ^{ＴＭ／ＭＭ}－発現Ｔ細胞は、ＴＣＲ^ＷＴ－発現Ｔ細胞と比較して、ＩＦＮγ産生において有意な（４倍）増加を示した。図４Ａ。

【0264】

細胞障害性アッセイ：ＵＴＤ Ｔ細胞、またはＴＣＲ^ＷＴもしくはＴＣＲ^{ＴＭ／ＭＭ}をコードするレンチウイルスベクターで形質導入されたＴ細胞を、ＭＡＧＥＡ４陽性Ａ５４９腫瘍Ｎｕｃ－ｒｅｄ細胞と１：１のＥ：Ｔ比率で共培養し、ＴＣＲ発現に基づいて正規化を行った。Ｉｎｃｕｃｙｔｅ Ｓ３を使用して、細胞傷害性を３日間にわたりモニタリングした。ＴＣＲ^{ＴＭ／ＭＭ}－発現Ｔ細胞は、ＴＣＲ^ＷＴ－発現Ｔ細胞またはＵＴＤ Ｔ細胞と比較して、急勾配の殺傷曲線を示した。図４Ｂ。

【0265】

実施例５
ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲにおいて、ＴＣＲ発現および特異的ＴＣＲペアリングを相乗的に増加させるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）定常領域中のアミノ酸置換
ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲの配列（配列番号１５および１６）を、標準的なクローニング技術を使用してレンチウイルスベクター内にクローニングし、改変した。ＴＣＲ^ＭＭ構築物は、ＴＣＲα鎖定常領域に４個のマウス化アミノ酸置換（Ｐ９０Ｓ、Ｅ９１Ｄ、Ｓ９２Ｖ、Ｓ９３Ｐ；ＴＣＲα鎖定常領域を参照して番号付けられた）を含み、さらにＴＣＲβ鎖定常領域に５個のマウス化アミノ酸置換（Ｅ１８Ｋ、Ｓ２２Ａ、Ｆ１３３Ｉ、Ｅ／Ｖ１３６Ａ、Ｑ１３９Ｈ；ＴＣＲβ定常領域を参照して番号付けられた）を含む。ＴＣＲＴＭ／^ＭＭ構築物は、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の定常領域に９個のマウス化アミノ酸置換を含み、ならびにＴＣＲα鎖膜貫通ドメインに３個の疎水性アミノ酸置換（Ｓ１１５Ｌ、Ｇ１１８Ｖ、Ｆ１１９Ｌ；ＴＣＲα定常領域を参照して番号付けられた）を含む。

【0266】

二名の正常ドナーに由来する末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、ＣＤ３抗体とＣＤ２８抗体を使用して活性化し、ＴＣＲ^ＷＴ、ＴＣＲ^ＭＭ、またはＴＣＲ^{ＴＭ／ＭＭ}をコードするレンチウイルスベクターで形質導入して、１０日間培養した。

【0267】

発現：１０日後、ＵＴＤ Ｔ細胞、またはＴＣＲ^ＷＴ、ＴＣＲ^ＭＭ、もしくはＴＣＲ^{ＴＭ／ＭＭ}をコードするレンチウイルスベクターで形質導入された細胞を、フロー染色緩衝液中、１：２０希釈のＮＹ－ＥＳＯ－１五量体－ペプチド標識試薬で染色し、ＰＥ蛍光についてフローサイトメトリーで分析した。フロー分析によって、ＵＴＤ Ｔ細胞、またはＴＣＲ^ＷＴもしくはＴＣＲ^ＭＭをコードするレンチウイルスベクターで形質導入されたＴ細胞と比較し、ＴＣＲ^{ＴＭ／ＭＭ}をコードするレンチウイルスベクターで形質導入されたＴ細胞は、ＴＣＲ発現が増加したことが示された。図５Ａ。各ドナーにおけるＴＣＲ染色の平均蛍光強度を、図５Ｂに示す。

【0268】

ペアリング：１０日後、ＵＴＤ Ｔ細胞、またはＴＣＲ^ＷＴ、ＴＣＲ^ＭＭ、もしくはＴＣＲ^{ＴＭ／ＭＭ}をコードするレンチウイルスベクターで形質導入された細胞を、フロー染色緩衝液中、１：２０希釈のＮＹ－ＥＳＯ－１五量体－ペプチド標識ＰＥ試薬と、１：１００希釈のｖ－ベータ鎖ＦＩＴＣ標識蛍光色素を用いた二重染色を使用して、特異的ＴＣＲペアリングについて評価した。ｖ－ベータ染色および四量体抗原染色によって検出された陽性細胞の割合が等しい場合は、特異的ＴＣＲペアリングが示唆される。ＵＴＤ Ｔ細胞、またはＴＣＲ^ＷＴもしくはＴＣＲ^ＭＭをコードするレンチウイルスベクターで形質導入されたＴ細胞と比較し、ＴＣＲ^{ＴＭ／ＭＭ}を形質導入されたＴ細胞は、特異的ペアリングの増加を示した。図６。

【0269】

実施例６
ＭＡＲＴ－１ ＴＣＲにおける、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）定常領域中のアミノ酸置換
ペアリング強化変異を含むＭＡＲＴ－１ ＴＣＲα鎖およびβ鎖の配列（配列番号７および８；配列番号９および１０）を作製し（ＴＣＲ^{ＴＭ／ＭＭ}）、これを標準的なクローニング技術を使用してレンチウイルスベクター内にクローニングする。ＴＣＲ^{ＴＭ／ＭＭ}は、ＴＣＲα鎖の定常領域に４個のマウス化アミノ酸置換（Ｐ９０Ｓ、Ｅ９１Ｄ、Ｓ９２Ｖ、Ｓ９３Ｐ；ＴＣＲα鎖定常領域を参照して番号付けられた）、および３個の疎水性アミノ酸置換（Ｓ１１５Ｌ、Ｇ１１８Ｖ、Ｆ１１９Ｌ；ＴＣＲα定常領域を参照して番号付けられた）を含み、さらにＴＣＲβ鎖の定常領域に５個のマウス化アミノ酸置換（Ｅ１８Ｋ、Ｓ２２Ａ、Ｆ１３３Ｉ、Ｅ／Ｖ１３６Ａ、Ｑ１３９Ｈ；ＴＣＲβ定常領域を参照して番号付けられた）を含む。

【0270】

二名の正常ドナーに由来する末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、ＣＤ３抗体とＣＤ２８抗体を使用して活性化し、ＴＣＲ^ＷＴ、またはＴＣＲ^{ＴＭ／ＭＭ}をコードするレンチウイルスベクターで形質導入して、１０日間培養する。

【0271】

発現：１０日後、ＵＴＤ Ｔ細胞、またはＴＣＲ^ＷＴもしくはＴＣＲ^{ＴＭ／ＭＭ}をコードするレンチウイルスベクターで形質導入された細胞を、フロー染色緩衝液中、１：２０希釈のＭＡＲＴ－１五量体－ペプチド標識試薬で染色し、ＰＥ蛍光についてフローサイトメトリーで分析した。

【0272】

ペアリング：１０日後、ＵＴＤ Ｔ細胞、またはＴＣＲ^ＷＴもしくはＴＣＲ^{ＴＭ／ＭＭ}をコードするレンチウイルスベクターで形質導入された細胞を、フロー染色緩衝液中、１：２０希釈のＭＡＲＴ－１五量体－ペプチド標識ＰＥ試薬と、１：１００希釈のｖ－ベータ鎖ＦＩＴＣ標識蛍光色素を用いた二重染色を使用して、特異的ＴＣＲペアリングについて評価する。

【0273】

実施例７
ＷＴ－１ ＴＣＲにおける、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）定常領域中のアミノ酸置換
ペアリング強化変異を含むＷＴ－１ ＴＣＲα鎖およびβ鎖の配列（配列番号１１および１２）を作製し（ＴＣＲ^{ＴＭ／ＭＭ}）、これを標準的なクローニング技術を使用してレンチウイルスベクター内にクローニングする。ＴＣＲ^{ＴＭ／ＭＭ}は、ＴＣＲα鎖の定常領域に４個のマウス化アミノ酸置換（Ｐ９０Ｓ、Ｅ９１Ｄ、Ｓ９２Ｖ、Ｓ９３Ｐ；ＴＣＲα鎖定常領域を参照して番号付けられた）、および３個の疎水性アミノ酸置換（Ｓ１１５Ｌ、Ｇ１１８Ｖ、Ｆ１１９Ｌ；ＴＣＲα定常領域を参照して番号付けられた）を含み、さらにＴＣＲβ鎖の定常領域に５個のマウス化アミノ酸置換（Ｅ１８Ｋ、Ｓ２２Ａ、Ｆ１３３Ｉ、Ｅ／Ｖ１３６Ａ、Ｑ１３９Ｈ；ＴＣＲβ定常領域を参照して番号付けられた）を含む。

【0274】

二名の正常ドナーに由来する末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、ＣＤ３抗体とＣＤ２８抗体を使用して活性化し、ＴＣＲ^ＷＴ、またはＴＣＲ^{ＴＭ／ＭＭ}をコードするレンチウイルスベクターで形質導入して、１０日間培養する。

【0275】

発現：１０日後、ＵＴＤ Ｔ細胞、またはＴＣＲ^ＷＴもしくはＴＣＲ^{ＴＭ／ＭＭ}をコードするレンチウイルスベクターで形質導入された細胞を、フロー染色緩衝液中、１：２０希釈のＷＴ－１五量体－ペプチド標識試薬で染色し、ＰＥ蛍光についてフローサイトメトリーで分析した。

【0276】

ペアリング：１０日後、ＵＴＤ Ｔ細胞、またはＴＣＲ^ＷＴもしくはＴＣＲ^{ＴＭ／ＭＭ}をコードするレンチウイルスベクターで形質導入された細胞を、フロー染色緩衝液中、１：２０希釈のＷＴ－１五量体－ペプチド標識ＰＥ試薬と、１：１００希釈のｖ－ベータ鎖ＦＩＴＣ標識蛍光色素を用いた二重染色を使用して、特異的ＴＣＲペアリングについて評価する。

【0277】

実施例８
ＨＰＶ１６ Ｅ６ ＴＣＲにおける、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）定常領域中のアミノ酸置換
ペアリング強化変異を含むＨＰＶ１６ Ｅ６ ＴＣＲα鎖およびβ鎖の配列（配列番号１３および１４）を作製し（ＴＣＲ^{ＴＭ／ＭＭ}）、これを標準的なクローニング技術を使用してレンチウイルスベクター内にクローニングする。ＴＣＲ^{ＴＭ／ＭＭ}は、ＴＣＲα鎖の定常領域に４個のマウス化アミノ酸置換（Ｐ９０Ｓ、Ｅ９１Ｄ、Ｓ９２Ｖ、Ｓ９３Ｐ；ＴＣＲα鎖定常領域を参照して番号付けられた）、および３個の疎水性アミノ酸置換（Ｓ１１５Ｌ、Ｇ１１８Ｖ、Ｆ１１９Ｌ；ＴＣＲα定常領域を参照して番号付けられた）を含み、さらにＴＣＲβ鎖の定常領域に５個のマウス化アミノ酸置換（Ｅ１８Ｋ、Ｓ２２Ａ、Ｆ１３３Ｉ、Ｅ／Ｖ１３６Ａ、Ｑ１３９Ｈ；ＴＣＲβ定常領域を参照して番号付けられた）を含む。

【0278】

二名の正常ドナーに由来する末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、ＣＤ３抗体とＣＤ２８抗体を使用して活性化し、ＴＣＲ^ＷＴ、またはＴＣＲ^{ＴＭ／ＭＭ}をコードするレンチウイルスベクターで形質導入して、１０日間培養する。

【0279】

発現：１０日後、ＵＴＤ Ｔ細胞、またはＴＣＲ^ＷＴもしくはＴＣＲ^{ＴＭ／ＭＭ}をコードするレンチウイルスベクターで形質導入された細胞を、フロー染色緩衝液中、１：２０希釈のＨＰＶ１６ Ｅ６五量体－ペプチド標識試薬で染色し、ＰＥ蛍光についてフローサイトメトリーで分析した。

【0280】

ペアリング：１０日後、ＵＴＤ Ｔ細胞、またはＴＣＲ^ＷＴもしくはＴＣＲ^{ＴＭ／ＭＭ}をコードするレンチウイルスベクターで形質導入された細胞を、フロー染色緩衝液中、１：２０希釈のＨＰＶ１６ Ｅ６五量体－ペプチド標識ＰＥ試薬と、１：１００希釈のｖ－ベータ鎖ＦＩＴＣ標識蛍光色素を用いた二重染色を使用して、特異的ＴＣＲペアリングについて評価する。

【0281】

実施例９
ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲにおける、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）定常領域中のアミノ酸置換
ペアリング強化変異を含むＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲα鎖およびβ鎖の配列（配列番号１７および１８；配列番号１９および２０；配列番号２１および２２）を作製し（ＴＣＲ^{ＴＭ／ＭＭ}）、これを標準的なクローニング技術を使用してレンチウイルスベクター内にクローニングする。ＴＣＲ^{ＴＭ／ＭＭ}は、ＴＣＲα鎖の定常領域に４個のマウス化アミノ酸置換（Ｐ９０Ｓ、Ｅ９１Ｄ、Ｓ９２Ｖ、Ｓ９３Ｐ；ＴＣＲα鎖定常領域を参照して番号付けられた）、および３個の疎水性アミノ酸置換（Ｓ１１５Ｌ、Ｇ１１８Ｖ、Ｆ１１９Ｌ；ＴＣＲα定常領域を参照して番号付けられた）を含み、さらにＴＣＲβ鎖の定常領域に５個のマウス化アミノ酸置換（Ｅ１８Ｋ、Ｓ２２Ａ、Ｆ１３３Ｉ、Ｅ／Ｖ１３６Ａ、Ｑ１３９Ｈ；ＴＣＲβ定常領域を参照して番号付けられた）を含む。

【0282】

二名の正常ドナーに由来する末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、ＣＤ３抗体とＣＤ２８抗体を使用して活性化し、ＴＣＲ^ＷＴ、またはＴＣＲ^{ＴＭ／ＭＭ}をコードするレンチウイルスベクターで形質導入して、１０日間培養する。

【0283】

発現：１０日後、ＵＴＤ Ｔ細胞、またはＴＣＲ^ＷＴもしくはＴＣＲ^{ＴＭ／ＭＭ}をコードするレンチウイルスベクターで形質導入された細胞を、フロー染色緩衝液中、１：２０希釈のＮＹ－ＥＳＯ－１五量体－ペプチド標識試薬で染色し、ＰＥ蛍光についてフローサイトメトリーで分析した。

【0284】

ペアリング：１０日後、ＵＴＤ Ｔ細胞、またはＴＣＲ^ＷＴもしくはＴＣＲ^{ＴＭ／ＭＭ}をコードするレンチウイルスベクターで形質導入された細胞を、フロー染色緩衝液中、１：２０希釈のＮＹ－ＥＳＯ－１五量体－ペプチド標識ＰＥ試薬と、１：１００希釈のｖ－ベータ鎖ＦＩＴＣ標識蛍光色素を用いた二重染色を使用して、特異的ＴＣＲペアリングについて評価する。

【0285】

実施例１０
ＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲにおける、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）定常領域中のアミノ酸置換
ペアリング強化変異を含むＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲα鎖およびβ鎖の配列（配列番号２３および２４）を作製し（ＴＣＲ^{ＴＭ／ＭＭ}）、これを標準的なクローニング技術を使用してレンチウイルスベクター内にクローニングする。ＴＣＲ^{ＴＭ／ＭＭ}は、ＴＣＲα鎖の定常領域に４個のマウス化アミノ酸置換（Ｐ９０Ｓ、Ｅ９１Ｄ、Ｓ９２Ｖ、Ｓ９３Ｐ；ＴＣＲα鎖定常領域を参照して番号付けられた）、および３個の疎水性アミノ酸置換（Ｓ１１５Ｌ、Ｇ１１８Ｖ、Ｆ１１９Ｌ；ＴＣＲα定常領域を参照して番号付けられた）を含み、さらにＴＣＲβ鎖の定常領域に５個のマウス化アミノ酸置換（Ｅ１８Ｋ、Ｓ２２Ａ、Ｆ１３３Ｉ、Ｅ／Ｖ１３６Ａ、Ｑ１３９Ｈ；ＴＣＲβ定常領域を参照して番号付けられた）を含む。

【0286】

二名の正常ドナーに由来する末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、ＣＤ３抗体とＣＤ２８抗体を使用して活性化し、ＴＣＲ^ＷＴ、またはＴＣＲ^{ＴＭ／ＭＭ}をコードするレンチウイルスベクターで形質導入して、１０日間培養する。

【0287】

発現：１０日後、ＵＴＤ Ｔ細胞、またはＴＣＲ^ＷＴもしくはＴＣＲ^{ＴＭ／ＭＭ}をコードするレンチウイルスベクターで形質導入された細胞を、フロー染色緩衝液中、１：２０希釈のＨＰＶ１６ Ｅ７五量体－ペプチド標識試薬で染色し、ＰＥ蛍光についてフローサイトメトリーで分析した。

【0288】

ペアリング：１０日後、ＵＴＤ Ｔ細胞、またはＴＣＲ^ＷＴもしくはＴＣＲ^{ＴＭ／ＭＭ}をコードするレンチウイルスベクターで形質導入された細胞を、フロー染色緩衝液中、１：２０希釈のＨＰＶ１６ Ｅ７五量体－ペプチド標識ＰＥ試薬と、１：１００希釈のｖ－ベータ鎖ＦＩＴＣ標識蛍光色素を用いた二重染色を使用して、特異的ＴＣＲペアリングについて評価する。

【0289】

実施例１１
ＧＰ１００ ＴＣＲにおける、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）定常領域中のアミノ酸置換
ペアリング強化変異を含むＧＰ１００ ＴＣＲα鎖およびβ鎖の配列（配列番号２５および２６）を作製し（ＴＣＲ^{ＴＭ／ＭＭ}）、これを標準的なクローニング技術を使用してレンチウイルスベクター内にクローニングする。ＴＣＲ^{ＴＭ／ＭＭ}は、ＴＣＲα鎖の定常領域に４個のマウス化アミノ酸置換（Ｐ９０Ｓ、Ｅ９１Ｄ、Ｓ９２Ｖ、Ｓ９３Ｐ；ＴＣＲα鎖定常領域を参照して番号付けられた）、および３個の疎水性アミノ酸置換（Ｓ１１５Ｌ、Ｇ１１８Ｖ、Ｆ１１９Ｌ；ＴＣＲα定常領域を参照して番号付けられた）を含み、さらにＴＣＲβ鎖の定常領域に５個のマウス化アミノ酸置換（Ｅ１８Ｋ、Ｓ２２Ａ、Ｆ１３３Ｉ、Ｅ／Ｖ１３６Ａ、Ｑ１３９Ｈ；ＴＣＲβ定常領域を参照して番号付けられた）を含む。

【0290】

二名の正常ドナーに由来する末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、ＣＤ３抗体とＣＤ２８抗体を使用して活性化し、ＴＣＲ^ＷＴ、またはＴＣＲ^{ＴＭ／ＭＭ}をコードするレンチウイルスベクターで形質導入して、１０日間培養する。

【0291】

発現：１０日後、ＵＴＤ Ｔ細胞、またはＴＣＲ^ＷＴもしくはＴＣＲ^{ＴＭ／ＭＭ}をコードするレンチウイルスベクターで形質導入された細胞を、フロー染色緩衝液中、１：２０希釈のＧＰ１００五量体－ペプチド標識試薬で染色し、ＰＥ蛍光についてフローサイトメトリーで分析した。

【0292】

ペアリング：１０日後、ＵＴＤ Ｔ細胞、またはＴＣＲ^ＷＴもしくはＴＣＲ^{ＴＭ／ＭＭ}をコードするレンチウイルスベクターで形質導入された細胞を、フロー染色緩衝液中、１：２０希釈のＧＰ１００五量体－ペプチド標識ＰＥ試薬と、１：１００希釈のｖ－ベータ鎖ＦＩＴＣ標識蛍光色素を用いた二重染色を使用して、特異的ＴＣＲペアリングについて評価する。

【0293】

全般に、以下の特許請求の範囲において、使用された用語は、特許請求の範囲を、本明細書および特許請求の範囲に開示されている特定の実施形態に限定させるものと解釈されるべきではないが、かかる特許請求の範囲が権利を与える等価物の完全な範囲と共に全ての可能な実施形態を含むものと解釈されるべきである。したがって、請求の範囲は、本開示により限定されない。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6】

【配列表】

2023519868000001.app

【国際調査報告】