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特表2023-519963アデノウイルスベースの遺伝子導入ベクターの産生の増強

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-05-15

(54)【発明の名称】アデノウイルスベースの遺伝子導入ベクターの産生の増強

(51)【国際特許分類】

C12N 15/861 20060101AFI20230508BHJP

C12N 5/10 20060101ALN20230508BHJP

【ＦＩ】

C12N15/861 Z

C12N5/10

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022559502

(86)(22)【出願日】2021-03-29

(85)【翻訳文提出日】2022-11-11

(86)【国際出願番号】 US2021024578

(87)【国際公開番号】W WO2021202333

(87)【国際公開日】2021-10-07

(31)【優先権主張番号】63/001,758

(32)【優先日】2020-03-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522382691

【氏名又は名称】グレフェックス，インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】シュテルツ，ウーベディー．

【テーマコード（参考）】

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B065AA93X

4B065AB01

4B065AC20

4B065BA02

4B065CA60

(57)【要約】

一態様では、ここに開示される実施形態は、アデノウイルスヘルパーウイルスを使用せずにパッケージされた、完全に欠失したアデノウイルスベースの遺伝子送達ベクターの産生、より詳細には遺伝子の導入及びタンパク質の発現、ワクチン開発、及び細胞工学におけるそれらの使用に関する。別の態様では、真核細胞に対して有害又は毒性活性を有する目的の遺伝子を保有するすべてのアデノウイルス遺伝子を欠失させたアデノウイルスベクターの産生が記載される。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

完全に欠失したアデノウイルスベースの遺伝子導入ベクターを伝播させるための方法であって、（ａ）アデノウイルスパッケージング細胞株を提供することと、（ｂ）完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュールのコンストラクトが、アデノウイルス逆方向末端反復配列、パッケージシグナル、及び１つ又は複数の目的のタンパク質をコードする１つ又は複数の遺伝子配列を含むがアデノウイルス構造遺伝子を含まない少なくとも１つ以上のＤＮＡインサートの両方を含む、完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュールを細胞株にトランスフェクトすることと、（ｃ）Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｅ２Ａ及びＥ４を含むアデノウイルス後期遺伝子のサブセット及びパッケージシグナルを有する複製欠損環状パッケージ発現プラスミドを細胞株にトランスフェクトすることであって、完全に欠失したアデノウイルスベクターコンストラクト及びパッケージコンストラクトが、アデノウイルスパッケージング細胞株をトランスフェクトして、ヘルパーアデノウイルスベクターとは独立して完全に欠失したアデノウイルスベースの遺伝子導入ベクターのカプシド形成をもたらすことができる、トランスフェクトすることと、（ｄ）完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュール上の１つ又は複数の目的のタンパク質をコードする遺伝子配列の１つ又は複数のアンチセンスコンストラクトをコードする１つ以上の発現カセットを保有する阻害性発現ベクターを、細胞株にトランスフェクトすることとを含む、方法。

【請求項2】

完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュールが、アデノウイルスヘルパーウイルスの助けを借りずにアデノウイルスカプシドにパッケージされる、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

宿主細胞に有害又は毒性の機能を有する１つ又は複数の目的の遺伝子を保有する完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュールが、アデノウイルスカプシドにパッケージされる、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

完全に欠失したアデノウイルスベースの遺伝子導入ベクターを伝播させるための方法であって、（ａ）アデノウイルスパッケージング細胞株を提供することと、（ｂ）完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュールのコンストラクトが、アデノウイルス逆方向末端反復配列、パッケージシグナル、及び１つ又は複数の目的のタンパク質をコードする１つ又は複数の遺伝子配列を含むがアデノウイルス構造遺伝子を含まない少なくとも１つ又は複数のＤＮＡインサートの両方を含む、完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュールを細胞株にトランスフェクトすることと、（ｃ）Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｅ２Ａ及びＥ４を含むアデノウイルス後期遺伝子のサブセット及びパッケージシグナルを有する複製欠損環状パッケージ発現プラスミドを細胞株にトランスフェクトすることであって、完全に欠失したアデノウイルスベクターコンストラクト及びパッケージコンストラクトが、アデノウイルスパッケージング細胞株をトランスフェクトして、ヘルパーアデノウイルスベクターとは独立して完全に欠失したアデノウイルスベースの遺伝子導入ベクターのカプシド形成をもたらすことができる、トランスフェクトすることと、（ｄ）完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュール上の１つ又は複数の目的の遺伝子のＲＮＡ断片アンチセンスを、細胞株にトランスフェクトすることとを含む、方法。

【請求項5】

完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュールが、アデノウイルスヘルパーウイルスの助けを借りずにアデノウイルスカプシドにパッケージされる、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

完全に欠失したアデノウイルスベクター、宿主細胞に有害又は毒性の機能を有する１つ又は複数の目的の遺伝子が、アデノウイルスカプシドにパッケージされる、請求項４に記載の方法。

【請求項7】

完全に欠失したアデノウイルスベースの遺伝子導入ベクターを伝播させるための方法であって、（ａ）アデノウイルスパッケージング細胞株を提供することと、（ｂ）完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュールのコンストラクトが、アデノウイルス逆方向末端反復配列、パッケージシグナル、及び１つ又は複数の目的のタンパク質をコードする１つ又は複数の遺伝子配列を含むがアデノウイルス構造遺伝子を含まない少なくとも１つ以上のＤＮＡインサートの両方を含む、完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュールを細胞株にトランスフェクトすることと、（ｃ）Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｅ２Ａ及びＥ４を含むアデノウイルス後期遺伝子のサブセット及びパッケージシグナルを有する複製欠損環状パッケージ発現プラスミドを細胞株にトランスフェクトすることであって、完全に欠失したアデノウイルスベクターコンストラクト及びパッケージコンストラクトが、アデノウイルスパッケージング細胞株をトランスフェクトして、ヘルパーアデノウイルスベクターとは独立して完全に欠失したアデノウイルスベースの遺伝子導入ベクターのカプシド形成をもたらすことができる、トランスフェクトすることと、（ｄ）完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュール上の１つ又は複数の目的の遺伝子のＤＮＡ断片アンチセンスを、細胞株にトランスフェクトすることとを含む、方法。

【請求項8】

完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュールが、アデノウイルスヘルパーウイルスの助けを借りずにアデノウイルスカプシドにパッケージされる、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

宿主細胞に有害又は毒性の機能を有する１つ又は複数の目的の遺伝子を保有する完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュールが、アデノウイルスカプシドにパッケージされる、請求項７に記載の方法。

【請求項10】

完全に欠失したアデノウイルスベースの遺伝子導入ベクターを伝播させるための方法であって、（ａ）アデノウイルスパッケージング細胞株を提供することと、（ｂ）カプシド形成した完全に欠失したアデノウイルスベクターのコンストラクトが、アデノウイルス逆方向末端反復配列、パッケージシグナル、及び１つ又は複数の目的のタンパク質をコードする１つ又は複数の遺伝子配列を含むがアデノウイルス構造遺伝子を含まない少なくとも１つ以上のＤＮＡインサートの両方を含む、カプシド形成した完全に欠失したアデノウイルスベクターを細胞株に形質導入することと、（ｃ）Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｅ２Ａ及びＥ４を含むアデノウイルス後期遺伝子のサブセット及びパッケージシグナルを有する複製欠損環状パッケージ発現プラスミドを細胞株にトランスフェクトすることであって、完全に欠失したアデノウイルスベクターコンストラクト及びパッケージコンストラクトが、アデノウイルスパッケージング細胞株をトランスフェクトして、ヘルパーアデノウイルスベクターとは独立して完全に欠失したアデノウイルスベースの遺伝子導入ベクターのカプシド形成をもたらすことができる、トランスフェクトすることと、（ｄ）１つ又は複数の目的のタンパク質をコードする遺伝子配列のアンチセンスコンストラクトをコードする１つ以上の発現カセットを保有する阻害性発現ベクターを、細胞株にトランスフェクトすることとを含む、方法。

【請求項11】

完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュールが、アデノウイルスヘルパーウイルスの助けを借りずにアデノウイルスカプシドにパッケージされる、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

宿主細胞に有害又は毒性の機能を有する１つ又は複数の目的の遺伝子を保有する完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュールが、アデノウイルスカプシドにパッケージされる、請求項１０に記載の方法。

【請求項13】

完全に欠失したアデノウイルスベースの遺伝子導入ベクターを伝播させるための方法であって、（ａ）アデノウイルスパッケージング細胞株を提供することと、（ｂ）カプシド形成した完全に欠失したアデノウイルスベクターのコンストラクトが、アデノウイルス逆方向末端反復配列、パッケージシグナル、及び１つ又は複数の目的のタンパク質をコードする１つ又は複数の遺伝子配列を含むがアデノウイルス構造遺伝子を含まない少なくとも１つ以上のＤＮＡインサートの両方を含む、カプシド形成した完全に欠失したアデノウイルスベクターを細胞株に形質導入することと、（ｃ）Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｅ２Ａ及びＥ４を含むアデノウイルス後期遺伝子のサブセット及びパッケージシグナルを有する複製欠損環状パッケージ発現プラスミドを細胞株にトランスフェクトすることであって、完全に欠失したアデノウイルスベクターコンストラクト及びパッケージコンストラクトが、アデノウイルスパッケージング細胞株をトランスフェクトして、ヘルパーアデノウイルスベクターとは独立して完全に欠失したアデノウイルスベースの遺伝子導入ベクターのカプシド形成をもたらすことができる、トランスフェクトすることと、（ｄ）完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュール上の１つ又は複数の目的の遺伝子の断片アンチセンスを、細胞株にトランスフェクトすることとを含む、方法。

【請求項14】

完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュールが、アデノウイルスヘルパーウイルスの助けを借りずにアデノウイルスカプシドにパッケージされる、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

完全に欠失したアデノウイルスベクター、宿主細胞に有害又は毒性の機能を有する１つ又は複数の目的の遺伝子が、アデノウイルスカプシドにパッケージされる、請求項１３に記載の方法。

【請求項16】

完全に欠失したアデノウイルスベースの遺伝子導入ベクターを伝播させるための方法であって、（ａ）アデノウイルスパッケージング細胞株を提供することと、（ｂ）カプシド形成した完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュールのコンストラクトが、アデノウイルス逆方向末端反復配列、パッケージシグナル、及び１つ又は複数の目的のタンパク質をコードする１つ又は複数の遺伝子配列を含むがアデノウイルス構造遺伝子を含まない少なくとも１つ以上のＤＮＡインサートの両方を含む、カプシド形成した完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュールを細胞株に形質導入することと、（ｃ）Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｅ２Ａ及びＥ４を含むアデノウイルス後期遺伝子のサブセット及びパッケージシグナルを有する複製欠損環状パッケージ発現プラスミドを細胞株にトランスフェクトすることであって、完全に欠失したアデノウイルスベクターコンストラクト及びパッケージコンストラクトが、アデノウイルスパッケージング細胞株をトランスフェクトして、ヘルパーアデノウイルスベクターとは独立して完全に欠失したアデノウイルスベースの遺伝子導入ベクターのカプシド形成をもたらすことができる、トランスフェクトすることと、（ｄ）完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュール上の１つ又は複数の目的の遺伝子のＤＮＡ断片アンチセンスを、細胞株にトランスフェクトすることとを含む、方法。

【請求項17】

完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュールが、アデノウイルスヘルパーウイルスの助けを借りずにアデノウイルスカプシドにパッケージされる、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

宿主細胞に有害又は毒性の機能を有する１つ又は複数の目的の遺伝子を保有する完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュールが、アデノウイルスカプシドにパッケージされる、請求項１６に記載の方法。

【請求項19】

最小限に修飾されたアデノウイルス遺伝子導入ベクターを伝播させるための方法であって、（ａ）アデノウイルスパッケージング細胞株を提供することと、（ｂ）２つのＩＴＲ、パッケージシグナル、並びにＬ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｅ２Ａ及びＥ４を含むものなどのアデノウイルス後期遺伝子のサブセットを保有し、１つ以上の目的の遺伝子を保有する１つ以上の発現カセットを保有する、最小限に修飾されたアデノウイルスベクターをコードするコンストラクトを細胞株にトランスフェクトすることと、（ｃ）最小限に修飾されたアデノウイルスベクター上の１つ又は複数の目的のタンパク質をコードする遺伝子配列のアンチセンスコンストラクトをコードする１つ以上の発現カセットを保有する阻害性発現ベクターを、細胞株にトランスフェクトすることとを含む、方法。

【請求項20】

最小限に修飾されたアデノウイルスベクターが、アデノウイルスヘルパーウイルスの助けを借りずにアデノウイルスカプシドにパッケージされる、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

宿主細胞に有害又は毒性の機能を有する１つ又は複数の目的の遺伝子を保有する最小限に修飾されたアデノウイルスベクターが、アデノウイルスカプシドにパッケージされる、請求項１９に記載の方法。

【請求項22】

最小限に修飾されたアデノウイルス導入ベクターを伝播させるための方法であって、（ａ）アデノウイルスパッケージング細胞株を提供することと、（ｂ）２つのＩＴＲ、パッケージシグナル、並びにＬ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｅ２Ａ及びＥ４を含むものなどのアデノウイルス後期遺伝子のサブセットを保有し、１つ以上の目的の遺伝子を保有する１つ以上の発現カセットを保有する、最小限に修飾されたアデノウイルスベクターをコードするコンストラクトを細胞株にトランスフェクトすることと、（ｃ）ＲＮＡ断片アンチセンス、最小限に修飾されたアデノウイルスベクター上の１つ又は複数の目的の遺伝子を、細胞株にトランスフェクトすることとを含む、方法。

【請求項23】

最小限に修飾されたアデノウイルスベクターが、アデノウイルスヘルパーウイルスの助けを借りずにアデノウイルスカプシドにパッケージされる、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

宿主細胞に有害又は毒性の機能を有する１つ又は複数の目的の遺伝子を保有する最小限に修飾されたアデノウイルスベクターが、アデノウイルスカプシドにパッケージされる、請求項２２に記載の方法。

【請求項25】

最小限に修飾されたアデノウイルス遺伝子導入ベクターを伝播させるための方法であって、（ａ）アデノウイルスパッケージング細胞株を提供することと、（ｂ）２つのＩＴＲ、パッケージシグナル、並びにＬ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｅ２Ａ及びＥ４を含むものなどのアデノウイルス後期遺伝子のサブセットを保有し、１つ以上の目的の遺伝子を保有する１つ以上の発現カセットを保有する、最小限に修飾されたアデノウイルスベクターをコードするコンストラクトを細胞株にトランスフェクトすることと、（ｃ）最小限に修飾されたアデノウイルスベクター上の１つ又は複数の目的の遺伝子のＤＮＡ断片アンチセンスを、細胞株にトランスフェクトすることとを含む、方法。

【請求項26】

最小限に修飾されたアデノウイルスベクターが、アデノウイルスヘルパーウイルスの助けを借りずにアデノウイルスカプシドにパッケージされる、請求項１５に記載の方法。

【請求項27】

宿主細胞に有害又は毒性の機能を有する１つ又は複数の目的の遺伝子を保有する最小限に修飾されたアデノウイルスベクターが、アデノウイルスカプシドにパッケージされる、請求項１５に記載の方法。

【請求項28】

最小限に修飾されたアデノウイルス遺伝子導入ベクターを伝播させるための方法であって、（ａ）アデノウイルスパッケージング細胞株を提供することと、（ｂ）２つのＩＴＲ、パッケージシグナル、並びにＬ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｅ２Ａ及びＥ４を含むものなどのアデノウイルス後期遺伝子のサブセットを保有し、１つ以上の目的の遺伝子を保有する１つ以上の発現カセットを保有する、最小限に修飾されたアデノウイルスベクターを細胞株に形質導入することと、（ｃ）最小限に修飾されたアデノウイルスベクター上の１つ又は複数の目的のタンパク質をコードする遺伝子配列のアンチセンスコンストラクトをコードする１つ以上の発現カセットを保有する阻害性発現ベクターを、細胞株にトランスフェクトすることとを含む、方法。

【請求項29】

最小限に修飾されたアデノウイルスベクターが、アデノウイルスヘルパーウイルスの助けを借りずにアデノウイルスカプシドにパッケージされる、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

宿主細胞に有害又は毒性の機能を有する１つ又は複数の目的の遺伝子を保有する最小限に修飾されたアデノウイルスベクターが、アデノウイルスカプシドにパッケージされる、請求項２８に記載の方法。

【請求項31】

最小限に修飾されたアデノウイルスベースの遺伝子導入ベクターを伝播させるための方法であって、（ａ）アデノウイルスパッケージング細胞株を提供することと、（ｂ）２つのＩＴＲ、パッケージシグナル、並びにＬ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｅ２Ａ及びＥ４を含むものなどのアデノウイルス後期遺伝子のサブセットを保有し、１つ以上の目的の遺伝子を保有する１つ以上の発現カセットを保有する、最小限に修飾されたアデノウイルスベクターを細胞株に形質導入することと、（ｃ）最小限に修飾されたアデノウイルスベクター上の最小限に修飾されたアデノウイルスベクター上の１つ又は複数の目的の遺伝子のＲＮＡ断片アンチセンスを、細胞株にトランスフェクトすることとを含む、方法。

【請求項32】

【請求項33】

【請求項34】

最小限に修飾されたアデノウイルスベースの遺伝子導入ベクターを伝播させるための方法であって、（ａ）アデノウイルスパッケージング細胞株を提供することと、（ｂ）２つのＩＴＲ、パッケージシグナル、並びにＬ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｅ２Ａ及びＥ４を含むものなどのアデノウイルス後期遺伝子のサブセットを保有し、１つ以上の目的の遺伝子を保有する１つ以上の発現カセットを保有する、最小限に修飾されたアデノウイルスベクターを細胞株に形質導入することと、（ｃ）最小限に修飾されたアデノウイルスベクター上の最小限に修飾されたアデノウイルスベクター上の１つ又は複数の目的の遺伝子のＤＮＡ断片アンチセンスを、細胞株にトランスフェクトすることとを含む、方法。

【請求項35】

最小限に修飾されたアデノウイルスベクターが、アデノウイルスヘルパーウイルスの助けを借りずにアデノウイルスカプシドにパッケージされる、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

宿主細胞に有害又は毒性の機能を有する１つ又は複数の目的の遺伝子を保有する最小限に修飾されたアデノウイルスベクターが、アデノウイルスカプシドにパッケージされる、請求項３４に記載の方法。

【請求項37】

ヘルパー依存性のアデノウイルスベースの遺伝子導入ベクターを伝播させるための方法であって、（ａ）アデノウイルスパッケージング細胞株を提供することと、（ｂ）完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュールのコンストラクトが、アデノウイルス逆方向末端反復配列、パッケージシグナル、及び１つ又は複数の目的のタンパク質をコードする１つ又は複数の遺伝子配列を含むがアデノウイルス構造遺伝子を含まない少なくとも１つ以上のＤＮＡインサートの両方を含む、完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュールを細胞株にトランスフェクトすることと、（ｃ）Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｅ２Ａ及びＥ４を含むアデノウイルス後期遺伝子のサブセットを有するアデノウイルスヘルパーウイルスをコードするコンストラクトを、パッケージシグナルの有無にかかわらず、細胞株にトランスフェクト又は形質導入することであって、完全に欠失したアデノウイルスベクターコンストラクト及びパッケージコンストラクトが、ヘルパーアデノウイルスベクターとは独立して、完全に欠失したアデノウイルスベースの遺伝子導入ベクターのカプシド形成において、アデノウイルスパッケージング細胞株をトランスフェクトすることができる、トランスフェクト又は形質導入することことと、（ｄ）完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュール上の１つ又は複数の目的のタンパク質をコードする遺伝子配列の１つ又は複数のアンチセンスコンストラクトをコードする１つ以上の発現カセットを保有する阻害性発現ベクターを、細胞株にトランスフェクトすることとを含む、方法。

【請求項38】

完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュールが、アデノウイルスヘルパーウイルスの助けを借りずにアデノウイルスカプシドにパッケージされる、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

宿主細胞に有害又は毒性の機能を有する１つ又は複数の目的の遺伝子を保有する完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュールが、アデノウイルスカプシドにパッケージされる、請求項３７に記載の方法。

【請求項40】

ヘルパー依存性のアデノウイルスベースの遺伝子導入ベクターを伝播させるための方法であって、（ａ）アデノウイルスパッケージング細胞株を提供することと、（ｂ）完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュールのコンストラクトが、アデノウイルス逆方向末端反復配列、パッケージシグナル、及び１つ又は複数の目的のタンパク質をコードする１つ又は複数の遺伝子配列を含むがアデノウイルス構造遺伝子を含まない少なくとも１つ以上のＤＮＡインサートの両方を含む、完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュールを細胞株にトランスフェクトすることと、（ｃ）Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｅ２Ａ及びＥ４を含むアデノウイルス後期遺伝子のサブセットを有するアデノウイルスヘルパーウイルスをコードするコンストラクトを、パッケージシグナルの有無にかかわらず、細胞株にトランスフェクト又は形質導入することであって、完全に欠失したアデノウイルスベクターコンストラクト及びパッケージコンストラクトが、アデノウイルスパッケージング細胞株をトランスフェクトして、ヘルパーアデノウイルスベクターとは独立して完全に欠失したアデノウイルスベースの遺伝子導入ベクターのカプシド形成をもたらすことができる、トランスフェクト又は形質導入することと、（ｄ）完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュール上の１つ又は複数の目的の遺伝子のＲＮＡ断片アンチセンスを、細胞株にトランスフェクトすることとを含む、方法。

【請求項41】

完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュールが、アデノウイルスヘルパーウイルスの助けを借りずにアデノウイルスカプシドにパッケージされる、請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

宿主細胞に有害又は毒性の機能を有する１つ又は複数の目的の遺伝子を保有する完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュールが、アデノウイルスカプシドにパッケージされる、請求項４０に記載の方法。

【請求項43】

ヘルパー依存性のアデノウイルスベースの遺伝子導入ベクターを伝播させるための方法であって、（ａ）アデノウイルスパッケージング細胞株を提供することと、（ｂ）完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュールのコンストラクトが、アデノウイルス逆方向末端反復配列、パッケージシグナル、及び１つ又は複数の目的のタンパク質をコードする１つ又は複数の遺伝子配列を含むがアデノウイルス構造遺伝子を含まない少なくとも１つ以上のインサートの両方を含む、完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュールを細胞株にトランスフェクトすることと、（ｃ）Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｅ２Ａ及びＥ４を含むアデノウイルス後期遺伝子のサブセットを有するアデノウイルスヘルパーウイルスをコードするコンストラクトを、パッケージシグナルの有無にかかわらず、細胞株にトランスフェクト又は形質導入することであって、完全に欠失したアデノウイルスベクターコンストラクト及びパッケージコンストラクトが、アデノウイルスパッケージング細胞株をトランスフェクトして、ヘルパーアデノウイルスベクターとは独立して完全に欠失したアデノウイルスベースの遺伝子導入ベクターのカプシド形成をもたらすことができる、トランスフェクト又は形質導入することと、（ｄ）完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュール上の１つ又は複数の目的の遺伝子のＤＮＡ断片アンチセンスを、細胞株にトランスフェクトすることとを含む、方法。

【請求項44】

【請求項45】

【請求項46】

ヘルパー依存性のアデノウイルスベースの遺伝子導入ベクターを伝播させるための方法であって、（ａ）アデノウイルスパッケージング細胞株を提供することと、（ｂ）パッケージされた完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュールのコンストラクトが、アデノウイルス逆方向末端反復配列、パッケージシグナル、及び１つ又は複数の目的のタンパク質をコードする１つ又は複数の遺伝子配列を含むがアデノウイルス構造遺伝子を含まない少なくとも１つ以上のＤＮＡインサートの両方を含む、パッケージされた完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュールを細胞株に形質導入することと、（ｃ）Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｅ２Ａ及びＥ４を含むアデノウイルス後期遺伝子のサブセットを有するアデノウイルスヘルパーウイルスをコードするコンストラクトを、パッケージシグナルの有無にかかわらず、細胞株にトランスフェクト又は形質導入することであって、完全に欠失したアデノウイルスベクターコンストラクト及びパッケージコンストラクトが、アデノウイルスパッケージング細胞株をトランスフェクトして、ヘルパーアデノウイルスベクターとは独立して完全に欠失したアデノウイルスベースの遺伝子導入ベクターのカプシド形成をもたらすことができる、トランスフェクト又は形質導入することと、（ｄ）完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュール上の１つ又は複数の目的のタンパク質をコードする遺伝子配列の１つ又は複数のアンチセンスコンストラクトをコードする１つ以上の発現カセットを保有する阻害性発現ベクターを、細胞株にトランスフェクトすることとを含む、方法。

【請求項47】

完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュールが、アデノウイルスヘルパーウイルスの助けを借りずにアデノウイルスカプシドにパッケージされる、請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

宿主細胞に有害又は毒性の機能を有する１つ又は複数の目的の遺伝子を保有する完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュールが、アデノウイルスカプシドにパッケージされる、請求項４６に記載の方法。

【請求項49】

ヘルパー依存性のアデノウイルスベースの遺伝子導入ベクターを伝播させるための方法であって、（ａ）アデノウイルスパッケージング細胞株を提供することと、（ｂ）パッケージされた完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュールのコンストラクトが、アデノウイルス逆方向末端反復配列、パッケージシグナル、及び１つ又は複数の目的のタンパク質をコードする１つ又は複数の遺伝子配列を含むがアデノウイルス構造遺伝子を含まない少なくとも１つ以上のＤＮＡインサートの両方を含む、パッケージされた完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュールを細胞株に形質導入することと、（ｃ）Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｅ２Ａ及びＥ４を含むアデノウイルス後期遺伝子のサブセットを有するアデノウイルスヘルパーウイルスをコードするコンストラクトを、パッケージシグナルの有無にかかわらず、細胞株にトランスフェクト又は形質導入することであって、完全に欠失したアデノウイルスベクターコンストラクト及びパッケージコンストラクトが、アデノウイルスパッケージング細胞株をトランスフェクトして、ヘルパーアデノウイルスベクターとは独立して完全に欠失したアデノウイルスベースの遺伝子導入ベクターのカプシド形成をもたらすことができる、トランスフェクト又は形質導入することと、（ｄ）完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュール上の１つ又は複数の目的の遺伝子のＲＮＡ断片アンチセンスを、細胞株にトランスフェクトすることとを含む、方法。

【請求項50】

完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュールが、アデノウイルスヘルパーウイルスの助けを借りずにアデノウイルスカプシドにパッケージされる、請求項４９に記載の方法。

【請求項51】

宿主細胞に有害又は毒性の機能を有する１つ又は複数の目的の遺伝子を保有する完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュールが、アデノウイルスカプシドにパッケージされる、請求項４９に記載の方法。

【請求項52】

ヘルパー依存性のアデノウイルスベースの遺伝子導入ベクターを伝播させるための方法であって、（ａ）アデノウイルスパッケージング細胞株を提供することと、（ｂ）パッケージされた完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュールのコンストラクトが、アデノウイルス逆方向末端反復配列、パッケージシグナル、及び１つ又は複数の目的のタンパク質をコードする１つ又は複数の遺伝子配列を含むがアデノウイルス構造遺伝子を含まない少なくとも１つ以上のＤＮＡインサートの両方を含む、パッケージされた完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュールを細胞株に形質導入することと、（ｃ）Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｅ２Ａ及びＥ４を含むアデノウイルス後期遺伝子のサブセット及びパッケージシグナルを有する複製欠損環状パッケージ発現プラスミドを細胞株にトランスフェクトすることであって、完全に欠失したアデノウイルスベクターコンストラクト及びパッケージコンストラクトが、アデノウイルスパッケージング細胞株をトランスフェクトして、ヘルパーアデノウイルスベクターとは独立して完全に欠失したアデノウイルスベースの遺伝子導入ベクターのカプシド形成をもたらすことができる、トランスフェクトすることと、（ｄ）完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュール上の１つ又は複数の目的の遺伝子のＤＮＡ断片アンチセンスを、細胞株にトランスフェクトすることとを含む、方法。

【請求項53】

完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュールが、アデノウイルスヘルパーウイルスの助けを借りずにアデノウイルスカプシドにパッケージされる、請求項５２に記載の方法。

【請求項54】

宿主細胞に有害又は毒性の機能を有する１つ又は複数の目的の遺伝子を保有する完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュールが、アデノウイルスカプシドにパッケージされる、請求項５２に記載の方法。

【請求項55】

完全に欠失したアデノウイルスベースの遺伝子導入ベクターを伝播させるための方法であって、（ａ）アデノウイルスパッケージング細胞株を提供することと、（ｂ）完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュールのコンストラクトが、アデノウイルス逆方向末端反復配列、パッケージシグナル、及び１つ又は複数の目的のタンパク質をコードする１つ又は複数の遺伝子配列を含むがアデノウイルス構造遺伝子を含まない少なくとも１つ以上のＤＮＡインサートの両方を含む、完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュールを細胞株にトランスフェクトすることと、（ｃ）Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｅ２Ａ及びＥ４を含むアデノウイルス後期遺伝子のサブセット及びパッケージシグナルを有し、完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュール上の１つ又は複数の目的のタンパク質をコードする遺伝子配列の１つ又は複数のアンチセンスコンストラクトをコードする１つ以上の発現カセットを保有する複製欠損環状パッケージ発現プラスミドを細胞株にトランスフェクトすることであって、完全に欠失したアデノウイルスベクターコンストラクト及びパッケージコンストラクトが、アデノウイルスパッケージング細胞株をトランスフェクトして、ヘルパーアデノウイルスベクターとは独立して完全に欠失したアデノウイルスベースの遺伝子導入ベクターのカプシド形成をもたらすことができる、トランスフェクトすることとを含む、方法。

【請求項56】

完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュールが、アデノウイルスヘルパーウイルスの助けを借りずにアデノウイルスカプシドにパッケージされる、請求項５５に記載の方法。

【請求項57】

宿主細胞に有害又は毒性の機能を有する１つ又は複数の目的の遺伝子を保有する完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュールが、アデノウイルスカプシドにパッケージされる、請求項５５に記載の方法。

【請求項58】

完全に欠失したアデノウイルスベースの遺伝子導入ベクターを伝播させるための方法であって、（ａ）アデノウイルスパッケージング細胞株を提供することと、（ｂ）カプシド形成した完全に欠失したアデノウイルスベクターのコンストラクトが、アデノウイルス逆方向末端反復配列、パッケージシグナル、及び１つ又は複数の目的のタンパク質をコードする１つ又は複数の遺伝子配列を含むがアデノウイルス構造遺伝子を含まない少なくとも１つ以上のＤＮＡインサートの両方を含む、カプシド形成した完全に欠失したアデノウイルスベクターを細胞株に形質導入することと、（ｃ）Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｅ２Ａ及びＥ４を含むアデノウイルス後期遺伝子のサブセット及びパッケージシグナルを有し、完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュール上の１つ又は複数の目的のタンパク質をコードする遺伝子配列の１つ又は複数のアンチセンスコンストラクトをコードする１つ以上の発現カセットを保有する複製欠損環状パッケージ発現プラスミドを細胞株にトランスフェクトすることであって、完全に欠失したアデノウイルスベクターコンストラクト及びパッケージコンストラクトが、アデノウイルスパッケージング細胞株をトランスフェクトして、ヘルパーアデノウイルスベクターとは独立して完全に欠失したアデノウイルスベースの遺伝子導入ベクターのカプシド形成をもたらすことができる、トランスフェクトすることとを含む、方法。

【請求項59】

完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュールが、アデノウイルスヘルパーウイルスの助けを借りずにアデノウイルスカプシドにパッケージされる、請求項５８に記載の方法。

【請求項60】

宿主細胞に有害又は毒性の機能を有する１つ又は複数の目的の遺伝子を保有する完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュールが、アデノウイルスカプシドにパッケージされる、請求項５８に記載の方法。

【請求項61】

ヘルパー依存性のアデノウイルスベースの遺伝子導入ベクターを伝播させるための方法であって、（ａ）アデノウイルスパッケージング細胞株を提供することと、（ｂ）完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュールのコンストラクトが、アデノウイルス逆方向末端反復配列、パッケージシグナル、及び１つ又は複数の目的のタンパク質をコードする１つ又は複数の遺伝子配列を含むがアデノウイルス構造遺伝子を含まない少なくとも１つ以上のＤＮＡインサートの両方を含む、完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュールを細胞株にトランスフェクトすることと、（ｃ）Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３１Ｌ４１Ｌ５１Ｅ２Ａ１及びＥ４１を含むアデノウイルス後期遺伝子のサブセットをパッケージシグナルと共に、又はパッケージシグナルを有し、完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュール上の１つ又は複数の目的のタンパク質をコードする遺伝子配列の１つ又は複数のアンチセンスコンストラクトをコードする１つ以上の発現カセットを保有するアデノウイルスヘルパーウイルスをコードするコンストラクトを細胞株にトランスフェクト又は形質導入することであって、完全に欠失したアデノウイルスベクターコンストラクト及びパッケージコンストラクトが、アデノウイルスパッケージング細胞株をトランスフェクトして、ヘルパーアデノウイルスベクターとは独立して完全に欠失したアデノウイルスベースの遺伝子導入ベクターのカプシド形成をもたらすことができる、トランスフェクト又は形質導入することとを含む、方法。

【請求項62】

完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュールが、アデノウイルスヘルパーウイルスの助けを借りずにアデノウイルスカプシドにパッケージされる、請求項６１に記載の方法。

【請求項63】

宿主細胞に有害又は毒性の機能を有する１つ又は複数の目的の遺伝子を保有する完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュールが、アデノウイルスカプシドにパッケージされる、請求項６１に記載の方法。

【請求項64】

ヘルパー依存性のアデノウイルスベースの遺伝子導入ベクターを伝播させるための方法であって、（ａ）アデノウイルスパッケージング細胞株を提供することと、（ｂ）パッケージされた完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュールのコンストラクトが、アデノウイルス逆方向末端反復配列、パッケージシグナル、及び１つ又は複数の目的のタンパク質をコードする１つ又は複数の遺伝子配列を含むがアデノウイルス構造遺伝子を含まない少なくとも１つ以上のＤＮＡインサートの両方を含む、パッケージされた完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュールを細胞株に形質導入することと、（ｃ）パッケージシグナルの有無にかかわらず、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｅ２Ａ及びＥ４を含むアデノウイルス後期遺伝子のサブセットを有し、完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュール上の１つ又は複数の目的のタンパク質をコードする遺伝子配列の１つ又は複数のアンチセンスコンストラクトをコードする１つ以上の発現カセットを保有するアデノウイルスヘルパーウイルスをコードするコンストラクトを細胞株にトランスフェクト又は形質導入することであって、完全に欠失したアデノウイルスベクターコンストラクト及びパッケージコンストラクトが、アデノウイルスパッケージング細胞株をトランスフェクトして、ヘルパーアデノウイルスベクターとは独立して完全に欠失したアデノウイルスベースの遺伝子導入ベクターのカプシド形成をもたらすことができる、トランスフェクト又は形質導入することとを含む、方法。

【請求項65】

完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュールが、アデノウイルスヘルパーウイルスの助けを借りずにアデノウイルスカプシドにパッケージされる、請求項６４に記載の方法。

【請求項66】

宿主細胞に有害又は毒性の機能を有する１つ又は複数の目的の遺伝子を保有する完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュールが、アデノウイルスカプシドにパッケージされる、請求項６４に記載の方法。

【請求項67】

ウイルスベクターを伝播させるための方法であって、（ａ）産生細胞と、（ｂ）ウイルスベクターの伝播のための遺伝子情報を提供することができる操作されたベクターゲノムを産生細胞に送達することと、（ｃ）ウイルスベクターゲノム内にコードされた１つ又は複数の目的のタンパク質をコードする遺伝子配列の１つ又は複数のアンチセンスコンストラクトをコードする１つ以上の発現カセットを保有する阻害性発現ベクターを、産生細胞に送達することとを含む、方法。

【請求項68】

ウイルスベクターがレトロウイルスベースの又はＤＮＡウイルスベースのベクターの群に属する、請求項６７に記載の方法。

【請求項69】

ウイルスベクターの伝播のための遺伝子情報が、２つ以上のＤＮＡ断片に分割される、請求項６７に記載の方法。

【請求項70】

ウイルスベクターの伝播のための遺伝子情報が、ＲＮＡの断片として送達される、請求項６７に記載の方法。

【請求項71】

ウイルスベクターを伝播させるための方法であって、（ａ）産生細胞と、（ｂ）ウイルスベクターの伝播のための遺伝子情報を提供することができる操作されたベクターゲノムを産生細胞に送達することと、（ｃ）ウイルスベクターゲノム内にコードされた１つ又は複数の目的のタンパク質をコードする遺伝子配列の１つ又は複数のアンチセンスコンストラクトの１つ又は複数の阻害性遺伝子断片を、産生細胞に送達することとを含む、方法。

【請求項72】

阻害性遺伝子断片がＤＮＡ発現ベクターである、請求項７１に記載の方法。

【請求項73】

阻害性遺伝子断片がＤＮＡからなる、請求項７１に記載の方法。

【請求項74】

阻害性遺伝子断片がＲＮＡからなる、請求項７１に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本明細書に開示される実施形態は、ヘルパーアデノウイルスなしでパッケージされた真核細胞に有害又は毒性の遺伝子を送達する完全に欠失したアデノウイルスベースのベクターの産生に関し、より詳細には、遺伝子及びタンパク質の発現、ワクチン接種、並びに細胞及び組織の修飾のための遺伝子治療におけるそれらの使用に関する。

【背景技術】

【0002】

ヒト細胞への遺伝物質の送達のために最も一般的に使用されるベクターの中には、アデノウイルスがある。アデノウイルスは、多数の異なる種から単離されており、１００を超える異なる血清型が報告されている。アデノウイルスゲノムの全体的な構成は、特定の機能が同様に位置付けられるように、血清型間で保存されている。異なる血清型のアデノウイルスは完全に配列決定されており、それらのゲノム配列は公開されている。多くの成人は、多くの遺伝子導入ベクターの基礎を形成してきた血清型５（Ａｄ５）のヒトアデノウイルスに曝露されてきた。

【0003】

Ａｄ５ゲノムは、約３５ｋｂｐ（サイズは群ごとに異なる）の線状の非セグメント化二本鎖ＤＮＡであり、３０～４０個の遺伝子をコードする理論的能力を有する。Ａｄ５ゲノムは、アデノウイルスの複製に不可欠な逆方向末端反復配列（ＬＩＴＲ及びＲＩＴＲ）に両側で挟まれている。Ａｄ５などのアデノウイルスの感染サイクルは、早期段階と後期段階とに分けられる。早期段階では、ウイルスはコーティングされず、ゲノムが核に輸送され、その後、早期遺伝子領域（Ｅ）、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３及びＥ４が転写活性になる。Ｅ１は、Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂと呼ばれる２つの領域を含む。Ｅ１Ａ領域（最早期領域と呼ばれることもある）は、宿主細胞周期の修飾及び他のウイルス転写領域の活性化に関与する２つの主要なタンパク質をコードする。Ｅ１Ｂ領域は、異なる経路を介して、ＥＡタンパク質の活性に起因するアポトーシスの誘導を防止する２つの主要なタンパク質、１９Ｋ及び５５Ｋをコードする。さらに、Ｅ１Ｂ－５５Ｋタンパク質は、選択的ウイルスｍＲＮＡ輸送及び宿主タンパク質発現の阻害のために後期段階で必要とされる。Ｅ２はまた、３つのタンパク質を一緒にコードするＥ２Ａ及びＥ２Ｂ領域に分割される。ＤＮＡ結合タンパク質、ウイルスポリメラーゼ及び前末端タンパク質はすべて、ウイルスゲノムの複製に関与する。Ｅ３領域は、ｉｎｖｉｔｒｏでの複製には必要ではないが、ウイルス感染に対する宿主防御機構を破壊するいくつかのタンパク質をコードする。Ｅ４領域は、ウイルスｍＲＮＡのスプライシング及び輸送、宿主細胞ｍＲＮＡの輸送、ウイルス及び細胞の転写及び形質転換に関連するいくつかの異なる機能に関与する少なくとも６つのタンパク質をコードする。

【0004】

ウイルスカプシドの形成及びウイルスゲノムのパッケージに必要な後期タンパク質はすべて、ウイルスＤＮＡ複製の開始後に完全に活性になる主要な後期転写単位から生成される。異なるスプライシング及びポリアデニル化の複雑なプロセスにより、３つに分割されたリーダー配列を共有する１５を超えるｍＲＮＡ種が生じる。早期タンパク質Ｅ１Ｂ－５５Ｋ並びにＥ４－Ｏｒｆ３及びＯｒｆ６は、後期ｍＲＮＡプロセシング及び核からの輸送の調節において中心的な役割を果たす。

【0005】

予め形成されたカプシドにおける新たに形成されたアデノウイルスゲノムのパッケージは、Ａｄ５ゲノムの左端に位置するウイルスパッケージシグナル（Ψ）との相互作用を介して、少なくとも２つのアデノウイルスタンパク質、後期５２／５５ｋ及び中間体タンパク質１Ｖａ２によって媒介される。第２の中間体タンパク質ｐＩＸはカプシドの一部であり、ヘキソン－ヘキソン相互作用を安定化することが知られている。さらに、ｐＩＸは、ＥＩＡプロモーター及び主要後期プロモーター（ＭＬＰ）のようなＴＡＴＡ含有プロモーターをトランス活性化することが記載されている。

【0006】

アデノウイルスベースのベクター及びアデノウイルスパッケージング細胞株
アデノウイルスベースのベクターは、様々な細胞型への高レベルの遺伝子導入を達成するための手段として、ワクチン送達ビヒクルとして、移植組織片への遺伝子導入のために、遺伝子治療のために、及び他の場合には高効率でトランスフェクトすることが困難な細胞株及び組織において組換えタンパク質を発現させるための手段として使用されてきた。アデノウイルスベースのベクターをパッケージするための現在の系は、宿主細胞及びアデノウイルス後期遺伝子の供給源からなる。２９３、ＯＢＩ及びＰＥＲＣ．６細胞を含む現在知られている宿主細胞株は、パッケージに必要な後期アデノウイルス（構造）遺伝子ではなく、早期（非構造）アデノウイルス遺伝子のみを発現する。アデノウイルス後期遺伝子は、以前に、シスのアデノウイルスベクター自体によって、又はトランスのヘルパーアデノウイルスウイルスによって提供されている。それらのカプシド形成に必要な遺伝子自体を提供するアデノウイルスベクターは、主にＥ１の遺伝子、場合によってはＥ３及び他のアデノウイルス領域でも欠失した最小限に修飾されたアデノウイルスゲノムを保有する。

【0007】

より最近では、「ガットレス（ｇｕｔｌｅｓｓ）」アデノウイルスベクター、すなわち、すべてのウイルスタンパク質をコードするＤＮＡ配列を欠くベクターが開発されている。ガットレスアデノウイルスベクターは、ウイルスゲノムの末端（ＬＩＴＲ及びＲＩＴＲ）、治療遺伝子などの目的の遺伝子、及びこのゲノムを選択的にパッケージすることを可能にする正常パッケージ認識シグナル（Ψ）のみを含む。しかしながら、ガットレスアデノウイルスベクターを伝播させるためには、複製及びビリオン集合に必要なアデノウイルス遺伝子、並びにＬＩＴＲ、ＲＩＴＲ及びΨを含むヘルパーアデノウイルスが必要である。このヘルパーウイルス依存性の系は、最大約３５ｋｂの外来ＤＮＡの導入を可能にするが、ヘルパーウイルスは、この手法を使用してガットレスアデノウイルスベクターの調製物を汚染する。複製コンピテントヘルパーウイルスの汚染は、複製コンピテントウイルスのために、及びヘルパーウイルス中のアデノウイルス遺伝子に対する宿主の免疫応答のために、遺伝子治療、ワクチン、及び移植用途にとって深刻な問題を引き起こす。このヘルパーウイルス依存性ベクター系におけるヘルパー汚染を減少させるための１つの手法は、パッケージ認識シグナル（Ψ）に条件付き遺伝子欠損を導入して、そのＤＮＡがビリオンにパッケージされる可能性を低くすることであった。そのような系で産生されたガットレスアデノウイルスベクターは、依然としてヘルパーウイルスによる著しい汚染を有する。ヘルパーウイルス汚染を伴わずに、ガットレスアデノウイルス遺伝子導入ベクターを産生することができることにより、ヘルパーウイルス汚染が排除され、その結果、ヒト対象及び動物におけるベクター毒性の低減及び遺伝子発現の延長がもたらされる。

【0008】

アデノウイルス遺伝子、特に、最小限に修飾されたアデノウイルスベクター又はアデノウイルスヘルパーウイルスに保有されるアデノウイルス後期遺伝子は、１）アデノウイルス媒介遺伝子治療後に見られる炎症応答の一因となり、２）ワクチン用途において目的の遺伝子に対する免疫応答を減少させ、３）正常な細胞機能に干渉し、４）タンパク質発現用途においてタンパク質夾雑物をもたらすと考えられている。さらに、それらは、最小限に修飾されたアデノウイルスベクターにおいて、他の遺伝子情報を保有するために有益に使用することができる空間を占有する。この１０年間でアデノウイルスベクターは著しい進歩を遂げてきたが、重大な欠点が依然としてその使用を困難にしている。

【0009】

遺伝子治療及びタンパク質発現のためのアデノウイルスベクター
遺伝子送達又は遺伝子治療は、後天性及び遺伝性疾患の治療のための有望な方法である。生命を脅かすヒトの疾患に関連する異常発現の遺伝子アレイはますます増え続け、クローニングされ同定されている。ヒトにおいてそのようなクローン化遺伝子を発現する能力は、最終的に、多くの重要なヒト疾患、すなわち現在の治療が不十分であるか又は存在しない疾患の予防及び／又は治癒を可能にする。

【0010】

しかしながら、残念なことに、これまでに記載された遺伝子治療プロトコールは、特に、ベクターからの遺伝子発現が短期間であること、及び同じベクターを２回目に有効に再投与することができないことを含む様々な問題に悩まされており、これらは両方とも、ベクター及びその治療ペイロードに関連する抗原に対する宿主免疫応答によって引き起こされ得る。ウイルス及び／又は治療遺伝子を組み込んだ組織は、最初に、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞並びにＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞によって媒介される宿主細胞性免疫応答によって攻撃され、このことは、ベクターからの遺伝子発現の持続性を劇的に制限する。さらに、ＣＤ４＋Ｔ細胞によって媒介される宿主の体液性免疫応答は、同じベクターの再投与の成功を阻害することによって現在の遺伝子治療プロトコールの有効性をさらに制限する。

【0011】

例えば、アデノウイルスベクターの初期投与後、主要なウイルスカプシドタンパク質、すなわちペントン、ヘキソン及びファイバーのエピトープに対して血清型特異的抗体が生成される。そのようなカプシドタンパク質が、アデノウイルスがそれ自体を細胞に付着させ、続いて細胞に感染させる手段であることを考えると、そのような抗体は、同じ血清型のアデノウイルス又はアデノウイルスベクターによる細胞の再感染を阻止又は「中和」することができる。これは、遺伝子治療及びワクチンとの関連において、１用量又はそれに続く複数用量の外因性治療用ＤＮＡを投与するために、異なる血清型のアデノウイルスを使用することを必要とし得る。さらに、最小限に修飾されたアデノウイルスベクター又はアデノウイルスヘルパーウイルス汚染アデノウイルスベクター調製物を使用する場合、治療遺伝子産物及びウイルス遺伝子産物の両方が標的細胞上に発現される。これらの抗原は、形質導入された細胞又は組織の破壊をもたらす細胞性免疫応答によって認識することができ、したがって遺伝子治療及びワクチン接種の有益な効果は打ち消され得る。これらの免疫に関連する妨害の結果として、最小限に修飾されたウイルスベクターの広範な使用が妨げられてきた。

【0012】

少なくとも５３個の異なる形態のヒトアデノウイルス、さらに多数の動物アデノウイルスの特徴が明らかにされてきている。これらのウイルスの間の主な識別因子は、カプシドヘキソンタンパク質（Ｌ３遺伝子の様々な対立遺伝子によってコードされる）に対する体液性免疫（すなわち、抗体）応答である。実際、異なるヘキソンタンパク質間の変動の大部分は、３つの「超」可変領域で起こり、アデノウイルスに対する体液性免疫応答は、これらの超可変領域に集中している。アデノウイルス表面上のファイバータンパク質などの他の構造も、体液性免疫系によって認識され得る。したがって、最小限に修飾されたアデノウイルスベクターの活性による体液性免疫応答の干渉は、各適用間でアデノウイルス血清型を切り替えることによって軽減することができる。後期アデノウイルス遺伝子は変動性が少なく、したがって、最小限に修飾されたアデノウイルスベクター又はアデノウイルスヘルパーウイルスによって誘導されるＴ細胞応答は、ベクターのアデノウイルス血清型を切り替えることによって回避することができない。

【0013】

ヒト集団は、特定のアデノウイルス血清型の天然アデノウイルス感染に曝露されている。したがって、これらの対象は、これらの血清型のアデノウイルスに基づくこれらのアデノウイルス及びアデノウイルスベクターによって発現される体液性及び細胞性免疫応答指向遺伝子を保有する。２つの進歩が問題を克服しようとしてきた。それらは、「ガットレス」（完全に欠失した）アデノウイルスベクターの使用、及び希少又は動物血清型を発現する希少又は動物アデノウイルスに基づくアデノウイルスベクターの使用である。「ガットレス」アデノウイルスベクターの使用は、Ｌ３などのアデノウイルス遺伝子を治療ベクターから除去するが、これらの「ガットレス」アデノウイルスベクターの伝播は、依然としてアデノウイルス遺伝子を保有するヘルパーアデノウイルスの存在を必要とする。これらのヘルパーウイルスは、「ガットレス」アデノウイルスベクターの調製物における顕著な夾雑物である。希少又は動物血清型に基づく最小限に修飾されたアデノウイルスベクターの使用は、所与の血清型のアデノウイルスに以前に曝露されたことがある対象において、既存の体液性免疫及びおそらくより少ない程度の既存の細胞性免疫の問題を回避し得る。それでも、最小限に修飾されたアデノウイルスベクターは、高度に免疫原性のＬ３を含むアデノウイルス遺伝子を発現するため、これらのアデノウイルス遺伝子に対する強力な体液性及び細胞性免疫応答を誘導し得る。したがって、所与の血清型の最小限に修飾されたアデノウイルスベクターの反復適用は不可能である。

【0014】

ワクチンベクターとしてのアデノウイルス
アデノウイルスベクターは、遺伝子置換療法のためのツールから真正ワクチン送達ビヒクルに移行している。それらは、哺乳動物宿主において自然免疫応答及び適応免疫応答の両方を誘導するので、魅力的なワクチンベクターである。アデノウイルスベクターは、マラリア、結核、エボラ及びＨＩＶ－１などの多数の感染症のサブユニットワクチン系として送達するために試験されている。さらに、それらは、異なる腫瘍関連抗原に対するワクチンとして探求されてきた。これまでのところ、アデノウイルスに基づいてベクター化されたほとんどのワクチンは、ヒト及び動物血清型の最小限に修飾されたアデノウイルスベクターとしてコンストラクトされている。

【0015】

アデノウイルス遺伝子発現の動態は、アデノウイルスパッケージ系の設計を困難にしており、アデノウイルス早期機能的転写領域（Ｅ１Ａ）遺伝子の発現は、アデノウイルス後期遺伝子（構造的、免疫原性遺伝子）の発現を誘導し、これは細胞を死滅させる。

【0016】

したがって、アデノウイルス早期遺伝子を構成的に発現する宿主細胞は、「野生型」アデノウイルス後期シストロンを保有することができない。アデノウイルスベクターを伝播させるための以前の宿主細胞は、真正「パッケージ」細胞ではない。具体的には、２９３、ＱＢＩ及びＰＥＲＣ６細胞は、パッケージに必要なアデノウイルス後期遺伝子ではなく、早期（非構造）アデノウイルス遺伝子のみを発現する。アデノウイルス後期及び早期遺伝子が提供されなければならない。それらは、シスの最小限に修飾されたアデノウイルスベクターによって、又はトランスのヘルパーアデノウイルスによって以前に提供されている。

【0017】

最小限に修飾されたアデノウイルスベクター又は汚染ヘルパーアデノウイルスに見られるアデノウイルス遺伝子は、アデノウイルスベクター調製物に対する炎症応答及び免疫応答の一因となり、アデノウイルスベースのワクチンの目的の遺伝子に対する免疫応答を減少させ、正常な細胞機能に干渉し、アデノウイルスベースのタンパク質発現において汚染の一因となる。

【0018】

目的の遺伝子の発現のために、ウイルスプロモーターなどの強力で広範に活性なプロモーターを使用することが有益であり得る。これは、効果的な遺伝子治療又は強力な免疫原性を保証するために必要であり得る。しかしながら、遺伝子導入ベクターは、アデノウイルスベクターのパッケージに使用される宿主細胞に有害又は毒性である目的の遺伝子を保有し得る。したがって、それらの発現は、最小限に修飾されたアデノウイルスベクター及び「ガッティド（ｇｕｔｔｅｄ）」アデノウイルスベクターの両方のアデノウイルスベクターの効率的なカプシド形成に干渉し得る。これらの遺伝子は、例えば形質導入後にがん性細胞を除去するために設計によって毒性もしくは有害であり得るか、又は、高濃度で宿主細胞に有害もしくは毒性であるが、エボラ糖タンパク質などの防御免疫応答を惹起することができる細菌もしくはウイルス遺伝子を構成し得る。したがって、パッケージ中に目的の遺伝子の発現を下方制御することが必要な場合がある。記載された発明は、この問題に対処する。記載された発明は、最小限に修飾されたアデノウイルスベクター又は「ガッティド」（完全に欠失した）アデノウイルスベクターを、これらのベクターのカプシド形成に使用される宿主細胞に有害又は毒性の機能を有する目的の遺伝子を保有するアデノウイルスヘルパーウイルスを関与させずに、産生するための系及び方法を提供する。このようなベクターの使用について説明する。

【発明の概要】

【0019】

本明細書に開示される実施形態は、ヘルパーウイルスと共にパッケージされた完全に欠失したアデノウイルスベクターの構築及び産生に関する。これらはまた、これらのベクターの産生又はカプシド形成に使用される宿主細胞に有害又は毒性の機能及び活性を有する目的の遺伝子を保有する、最小限に修飾されたアデノウイルスベクター及び完全に欠失したアデノウイルスベクターの産生に関する。これらは、遺伝子治療、ワクチン接種、がん治療及び免疫抑制療法において使用されるこれらのベクターに関する。

【0020】

本明細書に例示する態様によれば、（ａ）アデノウイルスベクターをパッケージするためのアデノウイルス宿主細胞と、（ｂ）完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュールコンストラクトと、（ｃ）アデノウイルスベクターモジュールをアデノウイルスカプシドにカプシド形成することができる遺伝子を保有するパッケージ発現プラスミドと、（ｄ）別個の発現ベクター上の、又はアデノウイルスベクターモジュール上の目的の遺伝子の発現を阻害することができるパッケージ発現プラスミドに組み込まれた発現コンストラクトと、（ｅ）代替的に、アデノウイルスベクターモジュール上の目的の遺伝子に結合し、目的の遺伝子の発現を阻害することができる短い阻害性ＲＮＡ又はＤＮＡ断片のセットとを含む系が提供される。アデノウイルスベクターモジュール、最小限に修飾された、又は完全に欠失したアデノウイルスベクターのいずれかが、任意選択的に、パッケージ発現プラスミド、発現コンストラクト、又はアデノウイルスベクターモジュール上の目的の遺伝子の発現を阻害することができるＲＮＡもしくはＤＮＡ断片のセットとコトランスフェクトされる。

【0021】

目的の遺伝子を阻害するパッケージ発現ベクター及び発現コンストラクト自体をカプシド形成することはできない。アデノウイルスベクターモジュール自体は複製することができない。本明細書に例示する態様によれば、有害又は毒性の遺伝子を有するアデノウイルスベクターの伝播のための方法であって、（ａ）アデノウイルスパッケージング細胞を提供することと、（ｂ）すべてのアデノウイルス遺伝子が欠失したアデノウイルスベクターモジュールをパッケージング細胞株にトランスフェクトすることと、（ｃ）パッケージ発現プラスミドをパッケージング細胞にトランスフェクトすることであって、完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュール及びパッケージ発現プラスミドがパッケージング細胞をトランスフェクトし、ヘルパーウイルスとは独立してアデノウイルスカプシドにおいて完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュールのカプシド形成をもたらす、トランスフェクトすることと、（ｄ）完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュール上に見られる目的の遺伝子のアンチセンスＲＮＡの発現をコードする阻害性発現プラスミドをパッケージング細胞にトランスフェクトすることであって、完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュール上の目的の遺伝子の発現が阻害される、トランスフェクトすることと、（ｅ）完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュール、パッケージ発現プラスミド及び阻害発現プラスミドをパッケージング細胞にトランスフェクトして、ベクターカプシド形成中に目的の遺伝子の発現を阻害し、アデノウイルスカプシドへの完全アデノウイルスベクターモジュールのパッケージを改善することと、（ｆ）完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュール上に見られる目的の遺伝子に結合する短い阻害性ＲＮＡ又はＤＮＡ断片をトランスフェクトすることであって、完全に欠失したベクターモジュール上の目的の遺伝子の発現が阻害される、トランスフェクトすることと、（ｇ）完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュール、パッケージ発現プラスミド及び短い阻害性ＲＮＡ又はＤＮＡ断片をパッケージング細胞にトランスフェクトして、ベクターカプシド形成中に目的の遺伝子の発現を阻害し、アデノウイルスカプシドへの完全アデノウイルスベクターモジュールのパッケージを改善することとを含む方法が開示される。

【0022】

本明細書に例示する態様によれば、有害又は毒性の遺伝子を有するアデノウイルスベクターの伝播のための方法であって、（ａ）アデノウイルスパッケージング細胞を提供することと、（ｂ）最小限に修飾されたアデノウイルスベクターをパッケージング細胞に導入することと、（ｃ）完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュール上に見られる目的の遺伝子のアンチセンスＲＮＡの発現をコードする阻害性発現プラスミドをパッケージング細胞にトランスフェクトすることであって、完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュール上の目的の遺伝子の発現が阻害される、トランスフェクトすることと、（ｄ）完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュール、パッケージ発現プラスミド及び阻害性発現プラスミドをパッケージング細胞にトランスフェクトして、ベクターカプシド形成中に目的の遺伝子の発現を阻害し、アデノウイルスカプシドへの完全アデノウイルスベクターモジュールのパッケージを改善することと、（ｅ）完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュール上に見られる目的の遺伝子に結合する短い阻害性ＲＮＡ又はＤＮＡ断片をトランスフェクトすることであって、完全に欠失したベクターモジュール上の目的の遺伝子の発現が阻害される、トランスフェクトすることと、（ｇ）完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュール、パッケージ発現プラスミド及び短い阻害性ＲＮＡ又はＤＮＡ断片をパッケージング細胞にトランスフェクトして、ベクターカプシド形成中に目的の遺伝子の発現を阻害し、アデノウイルスカプシドへの完全アデノウイルスベクターモジュールのパッケージを改善することとを含む方法が開示される。

【0023】

一実施形態では、標的細胞に、状態、疾患又は障害の治療のために、カプシド形成した完全に欠失したアデノウイルスベクターを形質導入する。一実施形態では、カプシド形成した完全に欠失したアデノウイルスベクターは、目的の遺伝子の発現が治癒的機能を発揮するか又は免疫応答を誘導するように、ヒト対象に注射される。一実施形態では、カプシド形成した完全に欠失したアデノウイルスベクターを使用して、標的細胞又は標的組織に形質導入してそれらの活性を修飾するか、又は他の細胞及び組織成分の標的細胞又は標的組織に対する応答を修飾する。

【0024】

いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子導入ベクターは、がんを治療する方法において有用である。いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子導入ベクターは、皮膚障害を治療する方法において有用である。いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子導入ベクターは、血管疾患を治療する方法において有用である。いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子導入ベクターは、心疾患を治療する方法において有用である。いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子導入ベクターは、心疾患を治療する方法において有用である。いくつかの実施形態では、遺伝子導入ベクターは、自己免疫疾患を治療する方法において有用である。いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子導入ベクターは、寄生虫感染症を治療する方法において有用である。いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子導入ベクターは、ウイルス感染症を治療する方法において有用である。いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子導入ベクターは、細菌感染症を治療する方法において有用である。

【0025】

いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子導入ベクターは、酵母感染症を治療する方法において有用である。いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子導入ベクターは、神経疾患を治療する方法において有用である。いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子導入ベクターは、遺伝性疾患を治療する方法において有用である。

【0026】

いくつかの実施形態では、本開示の方法によって産生されたカプシド形成したアデノウイルスベクターは、タンパク質発現のための遺伝子送達ベクターとして使用される。いくつかの実施形態では、本開示の方法によって産生されたカプシド形成したアデノウイルスベクターは、ワクチンの開発及び製造に使用される。いくつかの実施形態では、本開示の方法によって産生されたカプシド形成したアデノウイルスベクターは、免疫抑制療法のための遺伝子送達ベクターとして使用される。一実施形態では、標的細胞に、以前に産生されたカプシド形成したアデノウイルスベクターを形質導入する。

【0027】

他の目的及び特徴は、部分的に明らかであり、以下に部分的に指摘される。

【図面の簡単な説明】

【0028】

【図1】完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュールの設計の一実施形態を示す概略図である。

【図2】アデノウイルスベクターモジュール上の目的の遺伝子の発現を阻害することができる発現カセットあり及びなしのパッケージ発現プラスミドの設計の一実施形態を示す概略図である。

【図3】最小限に修飾されたアデノウイルスベクターの設計の一実施形態を示す概略図である。

【図4】アデノウイルスベクターモジュール上に見られる１つ又は複数の目的の遺伝子の発現を阻害することができる１つ又は複数の発現カセットを保有する阻害性発現プラスミドの設計の一実施形態を示す概略図である。

【図5】完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュールとパッケージ発現プラスミドとのコトランスフェクションによるカプシド形成のための方法の一実施形態を示す概略図である。

【図6】完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュールと、アデノウイルスベクターモジュール上の目的の遺伝子の発現を阻害することができるパッケージプラスミド及び発現プラスミドとのコトランスフェクションによるカプシド形成のための方法の一実施形態を示す概略図である。

【発明を実施するための形態】

【0029】

本開示は、とりわけ、アデノウイルスヘルパーウイルスなしでパッケージされた完全に欠失したアデノウイルスベースの遺伝子導入ベクターを伝播させるための完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュール、パッケージ発現プラスミド及びアデノウイルスパッケージング細胞を提供する。最小限に修飾され、完全に欠失したベクターとしての遺伝子導入ベクターは、遺伝子及びタンパク質発現、ワクチン開発、細胞及び組織の操作及び免疫抑制療法のための遺伝子治療に使用される。任意のサブタイプ、サブタイプの混合物、又はキメラアデノウイルスを、アデノウイルス遺伝子導入ベクターを作製するためのＤＮＡの供給源として使用することができる。一実施形態では、ＤＮＡの供給源はヒト血清型５に由来する。

【0030】

本明細書に開示される系では、完全に欠失したアデノウイルスベクターをパッケージ発現プラスミドとコトランスフェクトする。目的の遺伝子に干渉することができる発現カセットは、パッケージ発現ベクター上、又はコトランスフェクトされた別個の発現ベクター上にも見られる。アデノウイルスベクターモジュール上の目的の遺伝子の発現を阻害する代替的なＲＮＡ又はＤＮＡ断片をコトランスフェクトする。本明細書に開示される別の系では、最小限に修飾されたアデノウイルスベクターは、パッケージ発現ベクター上に見られる目的の遺伝子に干渉することができる遺伝子を発現する発現ベクター、又はアデノウイルスベクター上の目的の遺伝子の発現に対して阻害性のＲＮＡもしくはＤＮＡ断片にパッケージング細胞内で曝露される。他に定義される場合、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書で使用される命名法、並びに以下に記載される細胞培養、分子遺伝学、並びに核酸化学及びハイブリダイゼーションにおける検査手順は、当該技術分野で周知であり、一般的に使用されているものである。組換え核酸法、ポリヌクレオチド合成、並びに微生物の培養及び形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）には、標準的な技術が使用される。一般に、酵素反応及び精製工程は、製造者の仕様に従って行われる。技術及び手順は、一般に、当該技術分野での従来の方法及び本文書全体を通して提供される様々な一般的な参考文献（一般的には、参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａ！．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂａｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，２ｄｅｄ．（１９８９）ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＬａｂａｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照されたい）に従って行われる。単位、接頭辞、及び記号は、それらのＳＩ許容形式で示され得る。別途指示がない限り、核酸は、５’から３’方向に左から右に書かれ、アミノ酸配列は、それぞれアミノからカルボキシルへの方向に左から右に書かれる。数値範囲は、範囲を定義する数を含み、定義された範囲内の各整数を含む。アミノ酸は、一般に知られている３文字の記号又はＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名委員会によって推奨される１文字の記号のいずれかによって本明細書で参照され得る。
同様に、ヌクレオチドは、一般に許容されている１文字のコードによって参照され得る。別途明記がない限り、本明細書で使用されるソフトウェア、電気、及び電子用語は、ＴｈｅＮｅｗＩＥＥＥＳｔａｎｄａｒｄＤｉｃｔｉｏｎａｒｙｏｆＥｌｅｃｔｒｉｃａｌａｎｄＥｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓＴｅｒｍｓ（５’ｈｅｄｉｔｉｏｎ，１９９３）で定義されている通りである。本開示を通して使用される場合、以下の用語は、別途指示がない限り、以下の意味を有すると理解されるものとし、明細書全体を参照することによってより完全に定義される。本明細書で使用される「アデノウイルス」及び「アデノウイルス粒子」という用語は、アデノウイルスとして分類され得る任意の及びすべてのウイルスを含み、すべての群、亜群、及び血清型を含む、ヒト又は動物に感染する任意のアデノウイルスを含む。したがって、本明細書で使用される場合、「アデノウイルス」及び「アデノウイルス粒子」とは、ウイルス自体又はその誘導体を指し、すべての血清型及びサブタイプ並びに天然に存在する形態及び組換え形態の両方を包含する。一実施形態では、そのようなアデノウイルスはヒト細胞に感染する。

【0031】

そのようなアデノウイルスは、野生型であり得るか、当該技術分野で公知の又は本明細書に開示される様々な方法で修飾され得る。そのような修飾には、感染性ウイルスを作製するために粒子にパッケージされたアデノウイルスゲノムに対する修飾が含まれる。そのような修飾には、Ｅｌａ、ＥＩｂ、Ｅ２ａ、Ｅ２ｂ、Ｅ３又はＥ４コード化領域の１つ以上における欠失など、当該技術分野で公知の欠失が含まれる。「アデノウイルスパッケージング細胞」は、アデノウイルスゲノム又は修飾されたゲノムをパッケージしてウイルス粒子を産生することができる細胞である。それは、欠損遺伝子産物又はその等価物を提供することができる。したがって、パッケージング細胞は、アデノウイルスゲノムで欠失された遺伝子の相補機能を提供することができ、アデノウイルスゲノムをアデノウイルス粒子にパッケージすることができる。そのような粒子の産生は、ゲノムが複製され、感染性ウイルスを組み立てるために必要なタンパク質が産生されることを必要とする。粒子はまた、ウイルス粒子の成熟に必要な特定のタンパク質を必要とし得る。そのようなタンパク質は、最小限に修飾されたベクター、パッケージ発現プラスミドによって、又はパッケージング細胞によって提供され得る。本発明によるパッケージング細胞株を作製するために使用され得る例示的な宿主細胞としては、限定されないが、宿主細胞がアデノウイルスの増殖を許容する限り、Ａ５４９、Ｈｅｌａ、ＭＲＣ５、Ｗ１３８、ＣＨＯ細胞、Ｖｅｒａ細胞、ヒト胚性網膜細胞、ヒト胚性腎臓細胞又は任意の真核細胞が挙げられる。いくつかの宿主細胞株としては、脂肪細胞、軟骨細胞、上皮細胞、線維芽細胞、膠芽細胞腫、肝細胞、ケラチノサイト、白血病、リンパ芽球様細胞、単球、マクロファージ、筋芽細胞及び神経細胞が挙げられる。他の細胞型としては、限定されないが、初代細胞培養物に由来する細胞、例えば、ヒト初代前立腺細胞、ヒト胚性網膜細胞、ヒト幹細胞が挙げられる。真核生物の二倍体細胞株及び異数体細胞株は、本発明の範囲内に含まれる。パッケージング細胞は、組換え遺伝子導入ベクターの高力価ストックを生成するために、アデノウイルスベクター及び／又はパッケージ発現プラスミドの産物並びに阻害性発現カセット及び／又はベクターの産物をそれらの産物の適切なレベルで発現させることができるものでなければならない。

【0032】

「抗原」とは、宿主の免疫系を刺激して細胞性抗原特異的免疫応答又は体液性抗体応答を引き起こす１つ以上のエピトープを含む分子を意味する。したがって、抗原としては、タンパク質、ポリペプチド、抗原性タンパク質断片、オリゴ糖類、多糖類などが挙げられる。さらに、抗原は、任意の公知のウイルス、細菌、寄生生物、植物、原生動物又は真菌に由来することができ、生物体全体であり得る。この用語には、腫瘍抗原も含まれる。同様に、例えばＤＮＡ免疫化用途において抗原を発現するオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドも抗原の定義に含まれる。合成抗原、例えば、ポリエピトープ、隣接エピトープ、及び他の組換え又は合成由来の抗原（Ｂｅｒｇｍａｎｎｅｔａ！．（１９９３）Ｅｕｒ．Ｊ．ｌｍｍｕｎｏｌ．２３：２７７７２７８１、Ｂｅｒｇｍａｎｎｅｔａ！．（１９９６）Ｊ．ｌｍｍｕｎｏｌ．１５７：３２４２３２４９、Ｓｕｈｒｂｉｅｒ，Ａ．（１９９７）ｌｍｍｕｎｏｌ．ａｎｄＣｅｌｌＢｉｏｉ．７５：４０２４０８、Ｇａｒｄｎｅｒｅｔａ！．（１９９８）１２ｔｈＷｏｒｌｄＡＩＤＳＣｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，Ｇｅｎｅｖａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，Ｊｕｎ．２８－Ｊｕｌ．３，１９９８）も含まれる。

【0033】

「コード配列」又は選択されたポリペプチドを「コードする」配列は、適切な調節配列（又は「制御要素」）の制御下に置かれた場合、ｉｎｖｉｖｏで転写され（ＤＮＡの場合）、ポリペプチドに翻訳される（ｍＲＮＡの場合）核酸分子である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドン及び３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって決定される。転写配列は、コード配列の３’側に位置し得る。コード配列の転写及び翻訳は、典型的には、転写プロモーター、転写エンハンサーエレメント、シャイン・ダルガノ配列、転写終止シグナル、ポリアデニル化配列（翻訳終止コドンに対して３’側に位置する）、翻訳開始の最適化のための配列（コード配列に対して５’側に位置する）、及び翻訳終止配列を含むがこれらに限定されない「制御要素」によって調節される。

【0034】

「コンストラクト」という用語は、本発明の完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュール、本発明のパッケージ発現ベクター、又は発現プラスミド上に位置する阻害性発現カセットの少なくとも１つを指す。本明細書で使用される「欠失する」又は「欠失した」という用語は、削除、消去、又は除去を指す。

【0035】

本明細書で使用される「Ｅ１領域」という用語は、アデノウイルスゲノムに存在する遺伝子の群を指す。これらの遺伝子、例えば限定されないが、Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂは、ウイルス複製の早期段階で発現され、他のウイルス遺伝子の発現を活性化する。一実施形態では、本開示のアデノウイルスパッケージング細胞株は、Ｅ１領域を構成するすべてのコード配列を含む。

【0036】

一実施形態では、本開示のアデノウイルスパッケージング細胞株は、Ｅ１領域（例えば、Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂ）を構成するいくつかのコード配列を含む。本明細書で使用される場合、「Ｅ１Ａ」という用語は、２つの主要なＲＮＡ、１３Ｓ及び１２Ｓの発現産物を含む、アデノウイルスＥ１Ａ領域のすべての遺伝子産物を指す。これらは、それぞれ２８９及び２４３アミノ酸のポリペプチドに翻訳される。これらの２つのタンパク質は、特に参照により本明細書に組み込まれるＣｈｏｗｅｔａｌ．（１９８０）ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂＳｙｍｐＱｕａｎｔＢｉｏｉ．４４Ｐｔ１：４０１１４、及びＣｈｏｗｅｔａｌ．（１９７９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３４（２）：２６５３０３に記載されているように、１２ＳｍＲＮＡからスプライシングされる４６アミノ酸で異なる。本発明の目的のために、パッケージング細胞株は、２８９ポリペプチド、２４３ポリペプチド、又は２８９ポリペプチド及び２４３ポリペプチドの両方を発現し得る。Ｅ１Ａという用語はまた、部分的及び変異体Ｅ１Ａコード配列に関して本明細書で使用される。本明細書中で使用される場合、「Ｅ１Ｂ」という用語は、１９ｋｄ及び５５ｋｄの３つの主要なポリペプチドを含む、アデノウイルスＥ１Ｂ領域のすべての遺伝子産物を指す。Ｅ１８１９ｋｄ及び５５ｋｄタンパク質は、細胞形質転換において重要である。本発明の目的のために、パッケージング細胞株は、１９Ｋｄポリペプチド、５５Ｋｄポリペプチド、又は１９Ｋｄポリペプチド及び５５Ｋｄポリペプチドの両方を発現し得る。Ｅ１Ｂという用語はまた、部分的及び変異体Ｅ１Ｂコード配列に関して本明細書で使用される。

【0037】

本明細書で使用される「Ｅ２」という用語は、ポリメラーゼを含む、そのすべてがＤＮＡ複製に関与する少なくとも３つのＯＲＦを有するシストロンを指す。アデノウイルスのＥ２後期プロモーターは、例えば、Ｓｗａｍｉｎａｔｈａｎ，Ｓ．，ａｎｄＴｈｉｍｍａｐａｙａ，８．（１９９５）Ｇｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．ｌｍｍｕｎｏｌ．，１９９，１７７－１９４に記載されている。アデノウイルス系において、Ｅ２後期プロモーターは、Ｅ２早期プロモーターと共に、アデノウイルスＥ２領域及び／又は遺伝子Ｅ２Ａ及びＥ２Ｂを制御する機能を有する。この場合、Ｅ２ｍＲＮＡの合成は、最初にＥ２早期プロモーターから開始して行われる。細胞の感染の約５～７時間後に、Ｅ２後期プロモーターへの切り替えが起こる。

【0038】

本明細書で使用される「Ｅ３領域」という用語は、アデノウイルスゲノムに存在し、ウイルス複製サイクルの早期段階で発現される遺伝子の群を指す。これらの遺伝子は、宿主免疫系と相互作用するタンパク質を発現する。それらは、ｉｎｖｉｔｒｏでのウイルス複製に必要ではなく、したがって、アデノウイルスベクターにおいて欠失され得る。

【0039】

本明細書で使用される「Ｅ４領域」という用語は、右側のＩＴＲの隣のアデノウイルスゲノムに存在し、ウイルス複製サイクルの早期段階で発現される遺伝子の群を指す。Ｅ４領域は、少なくとも７個のＯＲＦを含む。Ｅ４領域の産物は、ウイルス遺伝子の発現及び複製を促進し、宿主細胞成分と相互作用し、溶菌感染及び腫瘍形成に関与する。

【0040】

「発現」という用語は、細胞内の内因性遺伝子、導入遺伝子又はコード化領域の転写及び／又は翻訳を指す。本明細書で使用される「完全に欠失したアデノウイルス」、「ガットレス」、「ガッティド」、「最小」、「完全に欠失した」、又は「擬似」ベクターとは、約２６～３７ｋｂで分離された逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、ウイルスパッケージシグナル（Ψ）、及び目的のタンパク質をコードする遺伝子配列を含む少なくとも１つのＤＮＡインサート（少なくとも１つの目的の遺伝子（ＧＯＩ）の全部又は断片）を有する線状の二本鎖ＤＮＡ分子を指す。遺伝子配列は調節可能であり得る。遺伝子発現の調節は、１）遺伝子構造の変化：部位特異的リコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅ－ｌｏｘＰ系に基づくＣｒｅ）は、プロモーターと遺伝子との間の挿入配列を除去することによって遺伝子発現を活性化することができる、２）転写の変化：誘導（カバーされた）によるか、又は阻害の軽減による、３）ｍＲＮＡに組み込まれた特定の配列又はｓｉＲＮＡによるｍＲＮＡ安定性の変化、４）ｍＲＮＡ中の配列による翻訳の変化の１つによって達成することができる。

【0041】

完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュールにはウイルスコード遺伝子は含まれない。完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュールは、最大３６キロベースの「外来」ＤＮＡを収容することができるので、「高容量」アデノウイルスベクターとも呼ばれる。ベクターカプシドは、アデノウイルスゲノム全体の７５～１０５％のサイズのＤＮＡのみを効率的にパッケージし、治療発現カセットは通常合計３６ｋｂにならないので、カプシド形成のためのゲノムサイズを完成させるために「スタッファー」ＤＮＡを使用する必要がある。早期の完全に欠失したアデノウイルスベクターは、不可欠なアデノウイルスコード化領域を保有するヘルパーアデノウイルスを必要とするので、「ヘルパー依存性」アデノウイルスと呼ばれる。

【0042】

本明細書で使用される場合、「遺伝子発現コンストラクト」という用語は、プロモーター、少なくとも目的の遺伝子の断片、及びポリアデニル化シグナル配列を指す。本開示の完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュールは、遺伝子発現コンストラクトを含む。「目的の遺伝子」又は「ＧＯＩ」は、ＲＮＡ又はタンパク質のレベルでその効果を発揮するものであり得る。目的の遺伝子の例としては、限定されないが、治療遺伝子、免疫調節遺伝子、ウイルス遺伝子、細菌遺伝子、タンパク質産生遺伝子、阻害性ＲＮＡ又はタンパク質、真核細胞又は制御タンパク質に対して毒性又は有害な産物をコードする遺伝子が挙げられる。例えば、治療遺伝子によってコードされるタンパク質は、遺伝性疾患の治療、例えば嚢胞性線維症の治療における嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子をコードするｅＤＮＡの使用において使用することができる。

【0043】

さらに、治療遺伝子は、例えば、アンチセンスメッセージもしくはリボザイム、当該技術分野で公知のｓｉＲＮＡ、代替的ＲＮＡスプライスアクセプターもしくはドナー、スプライシングもしくは３’プロセシングに影響を及ぼすタンパク質（例えば、ポリアデニル化）、又は細胞内の別の遺伝子の発現レベルに影響を及ぼすタンパク質（すなわち、遺伝子発現が、転写の開始からプロセシングされたタンパク質の産生までのすべての工程を含むと広く考えられている場合）をコードすることによって、おそらくとりわけ、ｍＲＮＡ蓄積率の変化、ｍＲＮＡ輸送の変化、及び／又は転写後調節の変化を媒介することによって、ＲＮＡのレベルでその効果を発揮することができる。

【0044】

本明細書で使用される場合、「遺伝子治療」という語句は、遺伝性又は後天性の疾患又は状態を治療又は予防するための目的の遺伝物質（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）の宿主への導入を指す。目的の遺伝物質は、ｉｎｖｉｖｏでの産生が望まれる産物（例えば、タンパク質ポリペプチド、ペプチド又は機能性ＲＮＡ）をコードする。例えば、目的の遺伝物質は、治療的価値のあるホルモン、受容体、酵素又は（ポリ）ペプチドをコードすることができる。目的の遺伝物質の例としては、嚢胞性線維症膜制御因子（ＣＦＴＲ）、第ＶＩＩＩ因子、低密度リポタンパク質受容体、ベータガラクトシダーゼ、アルファ－ガラクトシダーゼ、ベータ－グルコセレブロシダーゼ、インスリン、副甲状腺ホルモン、及びアルファ－１－アンチトリプシンをコードするＤＮＡが挙げられる。別の形態の「遺伝子治療」は、例えば悪性増殖の治療のために、不要な細胞又は細胞集団を生物体から除去するための「毒性」遺伝子の送達を伴い得る。そのような毒性遺伝子の例としては、限定されないが、細菌Ｌ－メチオナーゼ、重要な細胞経路をブロックするモノクローナル抗体、プロドラッグ変換酵素、細菌性毒素（ボツリヌス毒素、破傷風毒素、志賀毒素、ジフテリア毒素、コレラ毒素、ジフテリア毒素、炭疽毒素ＬＦ、リステリオリシン）、及び植物性毒素（リシン）が挙げられる。

【0045】

「遺伝子送達ベクター」とは、ヘルパーアデノウイルスなしでパッケージされた、本開示のカプシド形成した完全に欠失したアデノウイルスベースのベクターを含む組成物を意味する。

【0046】

本明細書で使用される「ヘルパー非依存性」という用語は、複製及びカプシド形成のためにヘルパーウイルスの存在を必要としない、本開示のカプシド形成した完全に欠失したアデノウイルスベースのベクターモジュールを作製するためのプロセスを指す。

【0047】

アデノウイルスには、最小限に修飾された「第１世代」及び「第２世代」アデノウイルスベクターが含まれる。第１世代アデノウイルスベクターとは、外因性ＤＮＡがＥ１領域、又は任意選択的にＥ３領域、又は任意選択的にＥ１領域及びＥ３領域の両方を置換するアデノウイルスを指す。第２世代アデノウイルスベクターとは、Ｅ１及びＥ３領域に加えて、アデノウイルスゲノムのＥ２領域、Ｅ４領域、及び任意の他の領域、又はそれらの組み合わせにさらなる欠失を含む第１世代アデノウイルスベクターを指す。

【0048】

本明細書で使用される「ヘルパーウイルス」という用語は、それ自体で複製する能力を有さないヘルパー依存性ウイルスベクターのコピーを産生するときに使用されるウイルスを指す。ヘルパーウイルスは、ガットレスウイルスと一緒に細胞を共感染させるために使用され、ガットレスウイルスのゲノムの複製に必要な酵素及びガットレスウイルスカプシドの組み立てに必要な構造タンパク質を提供する。

【0049】

本明細書で使用される「阻害性発現カセット」という用語は、最小限に修飾されたアデノウイルスベクター又は完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュール上に位置する目的の遺伝子の発現を阻害する能力を有する遺伝子配列が挿入及び発現される、プロモーター及びポリアデニル化部位からなるＤＮＡコンストラクトを指す。この「阻害性」遺伝子は、目的の遺伝子と相同性であってもよく、向きにおいて目的の遺伝子とアンチセンスであってもよい。「阻害性」遺伝子は、目的の遺伝子ＲＮＡと異なる様式で干渉する産物をコードしていてもよく、又は目的の遺伝子によってコードされるタンパク質と干渉する産物をコードしていてもよい。

【0050】

本明細書で使用される「阻害性ＲＮＡ断片」及び「阻害性ＤＮＡ断片」という用語は、目的の遺伝子のＲＮＡに結合する能力を有し、したがって目的の遺伝子の発現に干渉するＲＮＡ及びＤＮＡポリヌクレオチドを指す。これらのＲＮＡ及びＤＮＡ断片は、目的の遺伝子と相同性であってもよく、向きにおいて目的の遺伝子とアンチセンスであってもよい。これらのＲＮＡ及びＤＮＡ断片は、目的の遺伝子と相同性であってもよく、目的の遺伝子のＲＮＡ及び／又はＤＮＡを切断することができる。

【0051】

「免疫応答」とは、好ましくは、獲得免疫応答、例えば細胞性又は体液性免疫応答を意味する。本明細書の文脈において、「免疫調節分子」は、一般的又は抗原特異的な様式で標的細胞に対する細胞性及び／又は体液性宿主免疫応答を調節する、すなわち増加又は減少させるポリペプチド分子であり、好ましくは宿主免疫応答を減少させるポリペプチド分子である。

【0052】

本明細書で使用される「逆方向末端反復配列」という用語は、アデノウイルスゲノムの左右の末端に位置するＤＮＡ配列を指す。これらの配列は互いに同一であるが、反対方向に配置される。アデノウイルスの逆方向末端反復配列の長さは、アデノウイルスの血清型に応じて、約５０ｂｐ～約１７０ｂｐで変動する。逆方向末端反復配列は、ウイルスＤＮＡ複製のコア起源及びＥ１領域の活性化のためのエンハンサーエレメントなど、ウイルス増殖に必要ないくつかの異なるシス作用エレメントを含む。

【0053】

「ｉｎｖｉｖｏ遺伝子治療」及び「ｉｎｖｉｔｒｏ遺伝子治療」は、エクスビボでの適用を含む、当業者に一般的に知られており、「遺伝子治療」と呼ばれているものの過去、現在及び将来のすべての変形及び改変を包含することが意図される。

【0054】

本明細書で使用される「線状ＤＮＡ」という用語は、非環状化ＤＮＡ分子を指す。

【0055】

本明細書で使用される「天然」という用語は、天然に見られるもの、野生型、生来的に又は先天的に見られるものを指す。

【0056】

「核酸」という用語は、一本鎖又は二本鎖形態のいずれかのデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドポリマーを指し、特に限定されない限り、天然に存在するヌクレオチド（例えば、ペプチド、核酸）と同様の様式で一本鎖核酸にハイブリダイズするという点で、天然ヌクレオチドの本質的な性質を有する公知のアナログを包含する。

【0057】

核酸は、別の核酸配列と機能的関係に配置された場合、「動作可能に連結されて」いる。例えば、プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に動作可能に連結されている。一般に、「動作可能に連結された」とは、連結されているＤＮＡ配列が近接していることを意味する。しかしながら、エンハンサーは近接している必要はない。連結は、好都合な制限部位でのライゲーションによって達成される。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーは、従来の慣例に従って使用される。

【0058】

「パッケージ発現プラスミド」及び「パッケージコンストラクト」又は「ｐＰａｃ」という用語は、環状二本鎖ＤＮＡ分子の操作されたプラスミドコンストラクトを指し、ＤＮＡ分子は、プロモーターの制御下にあるアデノウイルス後期遺伝子のサブセット（例えば、ＬＩ、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｅ２Ａ、及びＥ４）を少なくとも含む。ｐＰａｃは、逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）の１つ又は２つのアデノウイルスから欠失され得、パッケージシグナル（Ｔ）を含まない。ｐＰａｃは「複製欠損性」であり、ウイルスゲノムは、独立して複製し細胞内に感染性ウイルス粒子を産生することを可能にするのに十分な遺伝子情報を単独では含まない。任意のサブタイプ、サブタイプの混合物、又はキメラアデノウイルスを、完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュール及びｐＰａｃを作製するためのＤＮＡの供給源として使用することができる。ｐＰａｃは、本質的に環状又は線状であり得る。

【0059】

本明細書で使用される「パッケージシグナル」という用語は、ウイルスゲノムに存在し、ウイルス組み立て中にウイルスカプシド内にウイルスゲノムを組み込むために必要なヌクレオチド配列を指す。

【0060】

アデノウイルスのパッケージシグナルは、天然に、左逆方向末端反復配列の下流の左端末端に位置する。「Ψ」と表記される場合がある。

【0061】

「病原体」という用語は、免疫応答を誘発する任意の分子の供給源を指すために広い意味で使用される。したがって、病原体としては、限定されないが、病毒性又は弱毒化ウイルス、細菌、真菌、原生動物、寄生生物、がん細胞などが挙げられる。典型的には、免疫応答は、これらの病原体によって産生される１つ以上のペプチドによって誘発される。以下に詳細に記載されるように、これら及び他の病原体由来の抗原性ペプチドをコードするゲノムＤＮＡを使用して、自然感染に対する応答を模倣する免疫応答を生成する。本明細書の教示を考慮すると、本方法が２つ以上の病原体から得られたゲノムＤＮＡの使用を含むことも明らかであろう。

【0062】

「許容」細胞は、ウイルスの複製を支援する。

【0063】

本明細書で使用される「プラスミド」という用語は、染色体ＤＮＡとは独立して複製することができる、染色体ＤＮＡとは別個の染色体外ＤＮＡ分子を指す。多くの場合、それは環状で二本鎖である。

【0064】

「ポリリンカー」という用語は、任意のプロモーター又はＤＮＡセグメントの容易な挿入を可能にするいくつかの固有の制限部位を有する人工的に合成されたＤＮＡの短いストレッチに使用される。「異種」という用語は、通常は自然界で密接に関連していることが見られないＤＮＡ配列の任意の組み合わせに使用される。

【0065】

「プロモーター」という用語は、特定の遺伝子の転写を促進するＤＮＡの調節領域を意味することを意図している。プロモーターは通常、特定のコード配列に関して適切な転写開始部位でＲＮＡ合成を開始するようにＲＮＡポリメラーゼＩＩに指示することができるＴＡＴＡボックスを含む。プロモーターは、転写開始速度に影響を及ぼす、上流プロモーター要素と呼ばれる、一般にＴＡＴＡボックスの上流又は５’側に位置する他の認識配列をさらに含み得る。「構成的プロモーター」は、多くの細胞型においてその関連遺伝子の連続的な転写を可能にするプロモーターを指す。「誘導性プロモーター系」とは、遺伝子を誘導又はサイレンシングするために調節剤（小分子、例えばテトラサイクリン、ペプチド及びステロイドホルモン、神経伝達物質、並びに環境因子、例えば熱及び重量オスモル濃度を含む）を使用する系を指す。そのような系は、それらの応答が段階的であり、調節剤の濃度に依存するという意味で「アナログ」である。また、そのような系は、調節剤の除去によって可逆的である。これらのプロモーターの活性は、生物因子又は非生物因子の存在又は非存在によって誘導される。誘導性プロモーターは、それらに動作可能に連結された遺伝子の発現を生物体又は特定の組織の発生の特定の段階でオン又はオフにすることができるので、遺伝子工学における強力なツールである。

【0066】

本明細書で使用される「伝播する」又は「伝播した」という用語は、任意のプロセスによって数、量又は程度が再生、倍加、又は増加することを指す。

【0067】

本明細書中で使用される「精製」という用語は、外来、外生又は好ましくない要素を精製するか又は含まないようにするプロセスを指す。

【0068】

本明細書で使用される「調節配列」（「調節領域」又は「調節要素」とも呼ばれる）という用語は、転写因子などの制御タンパク質が優先的に結合するＤＮＡのプロモーター、エンハンサー又は他のセグメントを指す。それらは、遺伝子発現、したがってタンパク質発現を制御する。

【0069】

本明細書で使用される「リコンビナーゼ」という用語は、遺伝子組換えを触媒する酵素を指す。リコンビナーゼ酵素は、２本の長いＤＮＡ鎖間の短いＤＮＡ片の交換、特に対になった父性及び母性染色体間の相同領域の交換を触媒する。

【0070】

「制限酵素」（又は「制限エンドヌクレアーゼ」という用語は、二本鎖ＤＮＡを切断する酵素を指す。「制限部位」又は「制限認識部位」という用語は、ＤＮＡ分子を切断する部位として制限酵素によって認識されるヌクレオチドの特定の配列を指す。これらの部位は、一般に、ただし必ずしもそうとは限らないが、回文構造であり（制限酵素は通常ホモダイマーとして結合するため）、特定の酵素は、その認識部位内の２つのヌクレオチド間、又はその近くのどこかで切断し得る。

【0071】

本明細書で使用される「複製」又は「複製する」という用語は、例えば、限定されないが、ウイルス粒子などの対象物の同一のコピーを作製することを指す。本明細書で使用される「複製欠損」という用語は、自然環境で複製することができないウイルスの特徴を指す。複製欠損ウイルスは、その複製に不可欠な１つ以上の遺伝子、例えば、限定されないが、Ｅ１遺伝子が欠失したウイルスである。複製欠損ウイルスは、欠失遺伝子を発現する細胞株において実験室で伝播させることができる。

【0072】

本明細書で使用される「スタッファー」という用語は、そのサイズを増大させるために別のＤＮＡ配列に挿入されるＤＮＡ配列を指す。例えば、スタッファー断片をアデノウイルスゲノムの内部に挿入して、そのサイズを約３６ｋｂに増大させることができる。スタッファー断片は、通常、いかなるタンパク質もコードせず、転写エンハンサー又はプロモーターなどの遺伝子発現のための調節要素も含まない。

【0073】

本明細書で使用される「標的」又は「標的とする」という用語は、例えば、限定されないが、その活性が外部刺激によって修飾され得るタンパク質、細胞、器官、又は核酸などの生物学的実体を指す。刺激の性質に応じて、標的に直接変化がないか、又は標的の立体構造変化が誘導され得る。

【0074】

本明細書で使用される場合、「標的細胞」とは、単一の実体として存在し得るか、又は細胞のより大きな集合の一部であり得る。そのような「細胞のより大きな集合」は、例えば、細胞培養物（混合物又は純粋物のいずれか）、組織（例えば、上皮組織又は他の組織）、器官（例えば、心臓、肺、肝臓、胆嚢、膀胱、眼又は他の器官）、器官系（例えば、循環系、呼吸系、胃腸系、泌尿器系、神経系、外皮系又は他の器官系）、又は生物体（例えば、鳥類、哺乳動物、特にヒトなど）を含み得る。好ましくは、標的とされる器官／組織／細胞は、循環系（例えば、限定されないが、心臓、血管、及び血液を含む）、呼吸系（例えば、鼻、咽頭、喉頭、気管、気管支、気管支系、肺など）、胃腸系（例えば、口、咽頭、食道、胃、腸、唾液腺、膵臓、肝臓、胆嚢などを含む）、泌尿器系（例えば、腎臓、尿管、膀胱、尿道など）、神経系（例えば、限定されないが、脳及び脊髄、並びに眼などの特別な感覚器官を含む）、及び外皮系（例えば、皮膚）のものである。さらにより好ましくは、細胞は、心臓、血管、肺、肝臓、胆嚢、膀胱、眼細胞及び幹細胞からなる群から選択される。一実施形態では、標的細胞は肝細胞であり、対象における同種異系肝細胞のベトベクター媒介移植のための方法が提供される。一実施形態では、標的細胞はケラチノサイトであり、対象、例えば操作された皮膚における同種異系ケラチノサイトのベトベクター媒介移植のための方法が提供される。一実施形態では、標的細胞は膵島である。一実施形態では、標的細胞は心筋細胞である。一実施形態では、標的細胞は腎臓細胞であり、対象における同種異系腎臓のベトベクター媒介移植のための方法が提供される。一実施形態では、標的細胞は線維芽細胞であり、対象、例えば操作された皮膚における同種異系線維芽細胞のベトベクター媒介移植のための方法が提供される。一実施形態では、標的細胞は神経細胞である。

【0075】

一実施形態では、標的細胞はグリア細胞である。

【0076】

本明細書で使用される「トランスフェクション」という用語は、ＤＮＡとしての細胞ＤＮＡへの導入（例えば、単離された核酸分子又は本開示のコンストラクトの導入）を指す。本明細書に開示されるアデノウイルスパッケージング細胞株は、完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュール又は本開示のｐＰａｃの少なくとも１つをトランスフェクトされ得る。本明細書に開示されるアデノウイルスパッケージング細胞株は、最小限に修飾されたアデノウイルスベクターのＤＮＡ又はウイルス粒子をトランスフェクト又は形質導入され得る。

【0077】

本明細書で使用される「形質導入」という用語は、ＤＮＡとしての、又は本開示の遺伝子導入ベクターによる細胞ＤＮＡへの導入を指す。本開示の遺伝子導入ベクターは、標的細胞に形質導入することができる。

【0078】

「ベクター」という用語は、宿主細胞の感染に使用され、その中にポリヌクレオチドを挿入することができる核酸を指す。ベクターはしばしばレプリコンである。発現ベクターは、その中に挿入された核酸の転写を可能にする。いくつかの一般的なベクターとしては、限定されないが、プラスミド、コスミド、ウイルス、ファージ、組換え発現カセット及びトランスポゾンが挙げられる。「ベクター」という用語はまた、ある場所から別の場所への遺伝子の導入を助ける要素を指し得る。

【0079】

本明細書で使用される「ウイルスＤＮＡ」という用語は、ウイルス粒子に見られるＤＮＡの配列を指す。本明細書で使用される「ウイルスゲノム」という用語は、ウイルス粒子に見られ、ウイルス複製に必要なすべての要素を含むＤＮＡの全体を指す。ゲノムは複製され、ウイルス複製の各サイクルでウイルス子孫に伝達される。

【0080】

本明細書で使用される「ビリオン」という用語は、ウイルス粒子を指す。各ビリオンは、保護タンパク質カプシド内の遺伝物質からなる。

【0081】

本明細書で使用される「野生型」という用語は、生物体、株、遺伝子、タンパク質、核酸、又は自然界で生じる特徴の典型的な形態を指す。野生型とは、天然集団において最も一般的な表現型を指す。

【0082】

「野生型」及び「天然に存在する」という用語は互換的に使用される。

【0083】

完全に欠失したアデノウイルスベクター
本明細書で使用される完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュールとは、完全なアデノウイルスベクターモジュールのアデノウイルスカプシドへのウイルス複製及びカプシド形成に必要なシス作用アデノウイルス配列（すなわち、ＩＴＲ、￥ＩＩ）のみを含む線状ＤＮＡ配列又は線状ＤＮＡ配列からの環状配列が放出され得ることを指す。完全に欠失したアデノウイルスベクターは、ウイルスゲノムの複製及びカプシド形成に必要なシス作用配列（すなわち、ＩＴＲ、Ｗ）のみを保有する。完全に欠失したアデノウイルスベクター（完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュール）をパッケージするためのいくつかの系及び方法は、免疫原性アデノウイルス抗原の供給源であり得るアデノウイルス「ヘルパー」ウイルスによるそれらの共感染を必要とする。汚染アデノウイルスヘルパーウイルスを治療用アデノウイルスベクター調製物から除去する方法が提案されている。一例は、アデノウイルスヘルパーウイルスのパッケージ部位ΨをＣｒｅリコンビナーゼのｌｏｘ配列で挟むこと（ｆｌａｘ）である。理論的には、完全に欠失したアデノウイルスベクター及び「フロックスされた（ｆｌｏｘｅｄ）」アデノウイルスヘルパーウイルスの継代培養は、アデノウイルスヘルパーウイルスからΨ（パッケージ）配列を切り出し、それによってアデノウイルスヘルパーヘルパーウイルスのパッケージを防止することによって汚染を減少させる。実際には、この手法は、アデノウイルスヘルパー」ウイルス汚染を１０^３分の１未満に低減することはできなかった。

【0084】

図１は、完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュールの設計の一実施形態を示す概略図である。この完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュールは、完全なアデノウイルスベクターモジュールのアデノウイルスカプシドへのウイルス複製及びカプシド形成に必要なシス作用アデノウイルス配列（すなわち、ＩＴＲ、Ψ）を、非アデノウイルススタッファー配列及びポリリンカー部位と共に含み、その中に目的の単一又はいくつかの遺伝子の発現カセットをクローニングすることができる。付加制限部位がスタッファー内に見出され、その中に、単一又はいくつかの目的の遺伝子の付加発現カセットをクローニングすることができる。

【0085】

図２は、アデノウイルスベクターモジュール上の目的の遺伝子の発現を阻害することができる発現カセットあり及びなしのパッケージ発現プラスミドの設計の一実施形態を示す概略図である。パッケージ発現プラスミドは、プロモーターの制御下にあるアデノウイルス後期遺伝子のサブセット（例えば、ＬＩ、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｅ２Ａ、及びＥ４）から構成される二本鎖ＤＮＡのプラスミドからなる。これは、逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）の１つ又は２つのアデノウイルスから欠失され得、パッケージシグナル（「Ψ」）を含まない。

【0086】

図３は、プロモーターの制御下にあるアデノウイルス後期遺伝子のサブセット（例えば、ＬＩ、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｅ２Ａ、及びＥ４）、並びに２つのアデノウイルス逆方向反復配列（ＩＴＲ）及びパッケージシグナル（Ψ）を保有する最小限に修飾されたアデノウイルスベクターの一実施形態を示す概略図である。

【0087】

図４は、阻害性発現プラスミドの設計の一実施形態を示す概略図である。これは、アデノウイルスベクターモジュール上に見られる１つ又は複数の目的の遺伝子の発現を阻害することができる１つ又は複数の発現カセットを保有する。

【0088】

図５は、完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュールとパッケージ発現プラスミドとのコトランスフェクションによるパッケージのための方法の一実施形態を示す概略図である。両方のＤＮＡコンストラクトを特定のモル比で混合し、パッケージング細胞にコトランスフェクトし、完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュールを複製、カプシド形成する。このプロセスの遺伝子プログラムは、パッケージ発現プラスミド上にコードされる。カプシド形成した完全に欠失したアデノウイルスベクターをパッケージング細胞から回収する。

【0089】

図６は、完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュールと、アデノウイルスベクターモジュール上の目的の遺伝子の発現を阻害することができるパッケージプラスミド及び発現プラスミドとのコトランスフェクションによるカプシド形成のための方法の一実施形態を示す概略図である。ＤＮＡコンストラクトを特定のモル比で混合し、パッケージング細胞にコトランスフェクトし、完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュールを複製、カプシド形成する。このプロセスの遺伝子プログラムは、パッケージ発現プラスミド上にコードされる。１つ又は複数の目的の遺伝子の発現は、阻害性発現プラスミド上に発現される、目的の遺伝子のアンチセンスコンストラクトのアンチセンスなどの遺伝子によって阻害される。カプシド形成した完全に欠失したアデノウイルスベクターをパッケージング細胞から回収する。

【0090】

１つ又は複数の目的の遺伝子の発現は、目的の遺伝子のアンチセンスコンストラクトのアンチセンスなどのＲＮＡ又はＤＮＡ断片の存在によって阻害される。カプシド形成した完全に欠失したアデノウイルスベクターをパッケージング細胞から回収する。

【0091】

当業者は、本開示の遺伝子導入ベクターを治療目的、例えば、遺伝子治療、免疫抑制療法、組織工学、ワクチン接種などのためにヒト対象又は動物に投与する適切な方法を理解するであろう（例えば、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２，４３１４３４（１９９１）、Ｊａｆｆｅｅｔａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｒｅｓ．，３９（２），３０２Ａ（１９９１）、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄｅｔａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｒｅｓ．，３９（２），３１１Ａ（１９９１）、Ｂｅｒｋｎｅｒ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６，６１６６２９（１９ＳＳ）が利用可能であり、遺伝子導入ベクターを投与するために２つ以上の経路を使用することができるが、特定の経路は、別の投与、排泄速度、薬物の組み合わせ、経路の重要度よりも迅速かつ効果的な反応を提供することができる。薬学的に許容される賦形剤も当業者に周知であり、容易に入手可能である。賦形剤の選択は、部分的に状態で、及び治療を受ける宿主において決定される。

【0092】

本発明の文脈では、動物、特にヒトに投与される用量は、目的の治療導入遺伝子及び／又は分子の性質、使用される組成物、投与方法、及び特定の部位、並びに遺伝子導入ベクターを投与するために使用される特定の方法によって変動する。したがって、本発明の遺伝子導入ベクターの多種多様な適切な製剤が存在する。以下の製剤及び方法は単なる例示であり、決して限定するものではない。しかしながら、経口、注射及びエアロゾル製剤が好ましい。経口投与に適した製剤は、ａ）液体溶液、（ｂ）カプセル剤、サシェ剤又は錠剤、（ｃ）適切な液体中の懸濁液、及び（ｄ）適切なエマルジョンからなることができる。一実施形態では、本発明の遺伝子導入ベクターは、単独で、又は他の適切な成分と組み合わせて、吸入によって投与されるエアロゾル製剤にすることができる。これらのエアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの加圧された許容可能な噴射剤に入れることができる。本発明の遺伝子導入ベクターは、ネブライザー又はアトマイザーなどの非加圧製剤用の医薬品として製剤化することもできる。非経口投与に適した製剤としては、抗酸化剤、バッファー、静菌剤、及び製剤を目的のレシピエントの血液と等張にする溶質を含むことができる水性及び非水性の等張性滅菌注射溶液、並びに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、及び防腐剤を含むことができる水性及び非水性の滅菌懸濁液が挙げられる。

【0093】

製剤は、アンプル及びバイアルなどの単位用量又は複数用量の密封容器で提供することができ、使用直前に、注射用の滅菌液体賦形剤、例えば水の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存することができる。即時注射溶液及び懸濁液は、前述の種類の滅菌粉末、顆粒、及び錠剤から調製することができる。本発明の文脈では、動物、特にヒトに投与される用量は、目的の遺伝子又は他の配列、使用される組成物、投与方法、並びに治療されている特定の部位及び器官によって変動する。用量は、望ましい時間枠内で望ましい応答、例えば治療応答又は免疫応答をもたらすのに十分でなければならない。したがって、以下の経路、すなわち経口投与、注射（直接注射など）、局所、吸入、非経口投与、粘膜投与、筋肉内投与、静脈内投与、皮下投与、眼内投与又は経皮投与の１つ以上によって、本開示の遺伝子導入ベクターは投与され得る。一実施形態では、本開示のカプシド形成した完全に欠失したアデノウイルスベクターは、注射によって投与される。一実施形態では、本開示の遺伝子導入ベクターは局所投与される。一実施形態では、本開示の遺伝子導入ベクターは吸入によって投与される。一実施形態では、本開示の遺伝子導入ベクターは、非経口、粘膜、筋肉内、静脈内、皮下、眼内又は経皮投与手段の１つ以上によって投与され、そのような投与向けに製剤化される。典型的には、医師は、個々の対象に最も適した遺伝子導入ベクターの実際の投与量を決定し、投与量は、特定の患者の年齢、体重及び応答並びに状態の重症度によって変動する。任意の特定の患者に対する特定の用量レベル及び投与頻度は変動する可能性があり、使用される特定の化合物の活性、その化合物の代謝安定性及び作用の長さ、年齢、体重、全身の健康状態、性別、食事、投与様式及び投与時間、排泄速度、薬物の組み合わせ、特定の状態の重症度、並びに治療を受けている宿主を含む様々な要因に依存する。本発明の文脈では、動物、特にヒトに投与される用量は、目的の治療導入遺伝子及び／又は免疫調節分子の性質、使用される組成物、投与方法、並びに治療されている特定の部位及び生物体によって変動する。ただし、好ましくは、有効量のＧＤＶに相当する用量を採用する。「有効量」とは、宿主において所望の効果を生じさせるのに十分な量であり、当業者に公知のいくつかのエンドポイントを用いてモニターすることができる。例えば、１つの所望の効果は、宿主細胞への核酸導入である。例えば、限定されないが、治療効果（例えば、治療されている疾患、状態、障害又は症候に関連する何らかの症候の緩和）、又は導入された遺伝子もしくはコード配列もしくは宿主内でのその発現の証拠による効果（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、ノーザンもしくはハイブリダイゼーション、又は転写アッセイを使用して宿主細胞中の核酸を検出するか、又は分析、抗体媒介検出、もしくは特殊化アッセイを使用して、導入された核酸によってコードされるか、又はそのような導入に起因してレベルもしくは機能に影響を受けたタンパク質もしくはポリペプチドを検出する）である。

【0094】

記載されたこれらの方法は、決して包括的ではなく、特定の用途に適するさらなる方法が当業者には明らかであろう。これに関して、遺伝子導入ベクターの導入に対する宿主の応答は、投与されるウイルスの用量、送達部位、及び遺伝子導入ベクターの遺伝子構成、並びに導入遺伝子及び免疫応答を阻害する手段に応じて変化し得ることに留意すべきである。

【0095】

一般に、本発明の遺伝子導入ベクターの効果的な導入を確実にするために、所与の投与経路を考慮して、接触させる細胞のおおよその数に基づいて、接触させる細胞あたり約１～約５，０００コピーの本発明の遺伝子導入ベクターを使用することが好ましく、約３～約３００ｐｆｕが各細胞に入ることがさらに好ましい。しかしながら、これは単なる一般的な指針であり、ｉｎｖｉｔｒｏ又はｉｎｖｉｖｏのいずれかでの特定の適用において保証され得るようなより高い又はより低い量の使用を決して排除するものではない。同様に、免疫応答を阻害する手段の量は、タンパク質を含む組成物の形態である場合、導入遺伝子又は目的の遺伝子を含む組換え遺伝子導入ベクターに対する免疫応答を阻害するのに十分でなければならない。例えば、実際の用量及びスケジュールは、組成物が他の薬学的組成物と組み合わせて投与されるかどうかに応じて、又は薬物速度論、薬物動態及び代謝の個体間の違いに応じて異なり得る。同様に、量は、標的とされる特定の細胞型又は遺伝子導入ベクターが導入される手段に応じて、ｉｎｖｉｔｒｏ適用において変動し得る。当業者は、特定の状況の必要性に従って任意の必要な調整を容易に行うことができる。

【0096】

遺伝子導入ベクターの送達は、細胞株をトランスフェクト又は形質導入するための実験室手順でのようにｉｎｖｉｔｒｏ、エクスビボで、又は特定の病状の治療でのようにｉｎｖｉｖｏ又はエクスビボで達成され得る。遺伝子導入ベクターが細胞に送達されると、所望のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド配列をコードする核酸は、異なる部位に配置され、発現され得る。特定の実施形態では、コンストラクトをコードする核酸は、細胞のゲノムに安定に組み込まれ得る。この組み込みは、相同組換えを介して特異的な位置及び向きにあってもよく（遺伝子置換）、又は組換えに組み込まれてもよく（遺伝子置換）、又はランダムな非特異的な位置に組み込まれてもよい（遺伝子増強）。さらなる好ましい実施形態では、核酸は、ＤＮＡの別個のエピソームセグメントとして細胞内で安定に維持され得る。そのような核酸セグメント又は「エピソーム」は、宿主細胞周期から独立して、又は宿主細胞周期と同期して維持及び複製を可能にするのに十分な配列をコードする。免疫調節遺伝子は、ＣＤ８ポリペプチドのすべて又は機能的部分をコードし得る。

【0097】

限定されないが、ＩＬ－１０、ＴＧＦ－ベータ、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－４及びＧＭＣＳＦを含む、免疫調節分子をコードするさらなる免疫調節遺伝子が企図される。

【0098】

遺伝子及びタンパク質発現のための遺伝子治療
遺伝子治療は、一般に、目的の遺伝子又は導入遺伝子としても知られている治療遺伝子の細胞への導入を含み、その発現は遺伝性障害の改善又は治療をもたらす。関与する治療遺伝子は、タンパク質、構造的もしくは酵素的ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡもしくはＤＮＡなどの阻害性産物、又は任意の他の遺伝子産物をコードする遺伝子であり得る。発現は、そのような遺伝子産物の生成又はそのような遺伝子産物の生成の結果として生じる効果である。したがって、発現の増強には、任意の治療遺伝子のより大きな産生、又は細胞、組織、器官もしくは生物体の状態を判定する際のその産物の役割の増強が含まれる。

【0099】

一般に、本発明は、選択された目的の遺伝物質（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）をｉｎｖｉｖｏで細胞に導入するためのＧＤＶに関する。本発明はまた、開示された遺伝子導入ベクターを使用する遺伝子治療の方法、及びこの方法によって産生された遺伝子操作された細胞に関する。本発明によって治療され得る疾患としては、限定されないが、血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子による）、パーキンソン病、うっ血性心不全及び嚢胞性線維症が挙げられる。

【0100】

一実施形態では、少なくとも目的の遺伝子の断片を保有する本開示の遺伝子導入ベクターは、心内注射後にｉｎｖｉｖｏで心筋に感染することができる。一実施形態では、少なくともＣＦＴＲ遺伝子の断片を保有する本開示の遺伝子導入ベクターを、エアロゾル吸入によって嚢胞性線維症患者の肺にｉｎｓｉｔｕで導入することができる。一実施形態では、少なくとも第ＶＩＩＩ因子をコードする遺伝子の断片を保有する本開示の遺伝子治療ベクターを、血友病Ａ患者の腕の筋肉にｉｎｓｉｔｕで導入することができる。一実施形態では、少なくともＡＤＡ遺伝子の断片を保有する本開示の遺伝子導入ベクターを、エクスビボで骨髄細胞の部分母集団に形質導入することができ、次いで、形質導入された骨髄細胞を、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損症に罹患している患者に移植することができる。本開示の遺伝子治療ベクターによってコードされる特定の治療遺伝子は限定されず、様々な治療及び研究目的に有用なもの、並びに導入遺伝子の発現及びアデノウイルスベクター形質導入の有効性を追跡するのに有用なレポーター遺伝子及びレポーター遺伝子系及びコンストラクトを含む。したがって、例として、以下は、本開示のＧＤＶを使用することによって発現が増強され得る可能な遺伝子のクラスである：発生遺伝子（例えば、接着分子、サイクリンキナーゼ阻害剤、Ｗｎｔファミリーメンバー、Ｐａｘファミリーメンバー、ウィングドヘリックスファミリーメンバー、Ｈｏｘファミリーメンバー、サイトカイン／リンホカイン及びそれらの受容体、成長又は分化因子及びそれらの受容体、神経伝達物質及びそれらの受容体）、がん遺伝子（例えば、ＡＢＵ、ＢＬＣＩ、ＢＣＬ６、ＣＢＦＡＩ、ＣＢＬ、ＣＳＦＩＲ、ＥＲＢＡ、ＥＲＢＢ、ＥＢＲＢ２、ＥＴＳＩ、ＥＴＳＩ、ＥＴＶ６、ＦＧＲ、ＦＯＸ、ＦＹＮ、ＨＣＲ、ＨＲＡＳ、ＪＵＮ、ＫＲＡＳ、ＬＣＫ、ＬＹＮ、ＭＤＭ２、ＭＬＬ、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＭＹＣＵ、ＭＹＣＮ、ＮＲＡＳ、ＰＩＭＩ、ＰＭＬ、ＲＥＴ、ＳＲＣ、ＴＡＵ、ＴＣＬ３及びＹＥＳ）、腫瘍抑制遺伝子（例えば、ＡＰＣ、ＢＲＣＡＩ、ＢＲＣＡ２、ＭＡＤＨ４、ＭＣＣ、ＮＦＩ、ＮＦ２、Ｒ１３１、ＴＰ５３及びＷＴＩ）、酵素（例えば、ＡＣＰデサチュラーゼ及びヒクロキシラーゼ、ＡＤＰ－グルコースピロフォリラーゼ、ＡＴＰアーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、シクロオキシゲナーゼ、デカルボキシラーゼ、デキストリナーゼ、エステラーゼ、ＤＮＡ及びＲＮＡポリメラーゼ、ヒアルロン合成酵素、ガラクトシダーゼ、グルカナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ＧＴＰアーゼ、ヘリカーゼ、ヘミセルラーゼ、ヒアルロニダーゼ、インテグラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、リアーゼ、イソザイム、ペクチナーゼ、ペクチンエステラーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、ホスホリラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテイナーゼ及びペプチダーゼ、プラナーゼ、リコンビナーゼ、逆転写酵素、トポイソメラーゼ、キシラナーゼ、レポーター遺伝子（例えば、緑色蛍光タンパク質及びその多くの色変異体、ルシフェラーゼ、ＣＡＴレポーター系、ベータガラクトシダーゼなど）、血液誘導体、ホルモン、リンホカイン（インターロイキンを含む）、インターフェロン、ＴＮＦ、成長因子、神経伝達物質又はそれらの前駆体又は合成酵素、栄養因子（例えば、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＧＦ、ＩＧＦ、ＧＭＦ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＮＴ３、ＮＴＳなど）、アポリポタンパク質（例えば、ＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡＩＶ、ＡｐｏＥなど）、ジストロフィン又はミニジストロフィー性、腫瘍抑制遺伝子（例えばｐ５３、Ｒｂ、ＲａｐｉＡ、ＤＣＣ、ｋ－ｒｅｖなど）、凝固に関与する因子をコードする遺伝子（例えば、第ＶＩＩ因子、第ＶＩ因子、第ＩＸ因子など）、自殺遺伝子（チミジンキナーゼなど）、シトシンデアミナーゼ、又は天然もしくは人工免疫グロブリンの全部もしくは一部（Ｆａｂ、ＳｃＦｖ等）。治療遺伝子の他の例としては、ｆｕｓ、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ及びＡＤＰ（アデノウイルス死タンパク質）が挙げられる。治療遺伝子はまた、標的細胞における発現が細胞遺伝子の発現又は細胞ｍＲＮＡの転写を制御することを可能にするアンチセンス遺伝子又は配列であり得る。そのような配列は、例えば、標的細胞において、細胞ｍＲＮＡに相補的なＲＮＡに転写され得る。治療遺伝子はまた、ヒトにおいて免疫応答を生成することができる抗原性ペプチドをコードする遺伝子であり得る。この特定の実施形態では、本開示は、特に微生物、ウイルス及びがんに対してヒトを免疫化することを可能にするワクチンを製造することを可能にする。様々な酵素遺伝子も治療遺伝子と考えられている。発現のための特に適切な遺伝子には、対象哺乳動物の標的細胞において正常レベル未満で発現されると考えられる遺伝子が含まれる。特に有用な遺伝子産物の例としては、限定されないが、カルバモイルシンテターゼＩ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギノコハク酸シンテターゼ、アルギノコハク酸リアーゼ、及びアルギナーゼが挙げられる。他の望ましい遺伝子産物としては、フマリルアセト酢酸ヒドラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、アルファ－アンチトリプシン、グルコース－６－ホスファターゼ、低密度リポタンパク質受容体、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、シスタチオン－ベータ－シンターゼ（ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｅ．ｂｅｔａ．－ｓｙｎｔｈａｓｅ）、分枝鎖ケト酸デカルボキシラーゼ、アルブミン、イソバレリ－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ｉｓｏｖａｌｅｒｙｉ－ＣｏＡｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、グルタリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、インスリン、ａ－グルコシダーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、肝ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシンデカルボキシラーゼ（ａｓＰ－タンパク質とも呼ばれる）、Ｈ－タンパク質、Ｔ－タンパク質、メンケス病銅輸送ＡＴＰアーゼ、及びウィルソン病銅輸送ＡＴＰアーゼが挙げられる。遺伝子産物の他の例としては、限定されないが、シトシンデアミナーゼ、ガラクトース－１－リン酸ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ウリジルトランスフェラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、グルコセルブロシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、ａ－Ｌ－イズロニダーゼ、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、ＨＳＶチミジンキナーゼ及びヒトチミジンキナーゼが挙げられる。ホルモンは、本明細書中に記載されるアデノウイルス由来ベクターにおいて使用され得る遺伝子の別の群である。成長ホルモン、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、黄体ホルモン、卵胞刺激ホルモン、絨毛性ゴナドトロピン、甲状腺刺激ホルモン、レプチン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、アンジオテンシンＩ及びＩＩ、エンドルフィン、メラノサイト刺激ホルモン（ＭＳＨ）、コレシストキニン、エンドセリン、ガラニン、胃抑制ペプチド（ＧＩＰ）、グルカゴン、インスリン、リポトロピン、ニューロフィシン、ソマトスタチン、カルシトニン、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、悪性腫瘍因子の高カルシウム血症（１～４０）、副甲状腺ホルモン関連タンパク質（１０７～１３９）（ＰＴＨ－ｒＰ）、副甲状腺ホルモン関連タンパク質（１０７～１１１）（ＰＴＨ－ｒＰ）、グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ－１）、パンクレアスタチン、膵臓ペプチド、ペプチドＹＹ、ＰＨＭ、セクレチン、血管作用性小腸ペプチド（ＶＩＰ）、オキシトシン、バソプレシン（ＡＶＰ）、バソトシン、エンケファリンアミド、メトルフィンアミド（ｍｅｔｏｒｐｈｉｎａｍｉｄｅ）、アルファメラノサイト刺激ホルモン（アルファ－ＭＳＨ）、心房性ナトリウム利尿因子（５～２８）（ＡＮＦ）、アミリン、アミロイドＰ成分（ＳＡＰ－１）、コルチコトロピン放出ホルモン（ＣＲＨ）、成長ホルモン放出因子（ＧＨＲＨ）、黄体ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、ニューロペプチドＹ、サブスタンスＫ（ニューロキニンＡ）、サブスタンスＰ及び甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）が挙げられる。本開示のＧＤＶに挿入されることが企図される他のクラスの遺伝子としては、限定されないが、インターロイキン及びサイトカイン（インターロイキン１（ＩＬ－１）、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－Ｓ、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１ＩＬ－１２、ＧＭ－ＣＳＦ及びＧ－ＣＳＦが挙げられる。

【0101】

本発明によって治療することができる疾患としては、限定されないが、フェニルケトン尿症（フェニルアラニン－Ｌ－モノオキシゲナーゼ）、アデノシンデアミナーゼ欠損症、嚢胞性線維症（嚢胞性線維症コンダクタンス制御因子）、パーキンソン病、オルニチンカラミルトランスフェラーゼ欠損症（ｏｒｎｉｔｈｉｎｅｃａｒａｍｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）（ＯＴＣ）、血友病（第ＩＸ因子欠損症、第Ｖｌｌｌ因子欠損症）、テイ・サックス病（Ｎ－アセチルヘキソサミミダーゼＡ（Ｎ－ａｃｅｔｙｌｈｅｘｏｓａｍｉｍｉｄａｓｅＡ）｝、嚢胞性線維症などの一般的な遺伝性疾患、嚢胞性線維症コンダクタンス制御因子遺伝子の置換を含む嚢胞性線維症、及び他の脂質貯蔵疾患が挙げられる。また、エリスロポエチン（ＥＰＯ）をコードする遺伝子を使用することができる。

【0102】

さらに、細菌毒素、植物毒素及び真核生物毒素が導入遺伝子として想定される。それらは、限定されないが、ボツリヌス毒素、破傷風毒素、志賀毒素、ジフテリア毒素、コレラ毒素、ジフテリア毒素、炭疽毒素ＬＦ、リステリオリシン及びリシンである。

【0103】

本開示の完全に欠失したアデノウイルスベクターは、アデノウイルスの早期領域及び後期遺伝子を含まない。本開示の遺伝子導入ベクターは、血管新生阻害剤又は細胞周期阻害剤をコードする遺伝子の導入による関節リウマチ又は再狭窄などの過剰増殖性疾患の治療に使用することができる。ＨＳＶＴＫ遺伝子などのプロドラッグ活性化因子の導入も、がんを含む過剰増殖性疾患の治療に使用することができる。一実施形態では、本開示の遺伝子導入ベクターは、治療遺伝子配列及びＣＤ８遺伝子配列を含み、ＣＤ８遺伝子配列は、以下に記載されるように、治療遺伝子配列に対する免疫応答を防止することができる。そのような用途には、限定されないが、患者が欠損遺伝子（ヌル対立遺伝子）からタンパク質を産生しない第ＶＩＩＩ因子欠損症（血友病Ａ）が含まれる。これらの患者では、第ＶＩＩＩ因子タンパク質の注射によって治療された血友病Ａ患者で免疫応答が頻繁に起こるのと同様に、免疫応答が治療遺伝子の産物に対して開始され得る。アデノウイルスベクターは、疾患の治療に有用な組換えタンパク質を産生するために使用されてきた。しかしながら、アデノウイルスタンパク質及び／又はアデノウイルスによる治療用組換えタンパク質の汚染は、継続的な課題である。したがって、アデノウイルス由来の増殖を支援し、アデノウイルス遺伝子の補体が低減された、及び／又は複製コンピテント又はヘルパーアデノウイルスによる汚染がない系が必要とされている。多量体タンパク質に対するポリペプチドの同時発現は、アデノウイルスベクターからの共発現によって調整することができる。例えば、等モル量の免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖の発現は、アデノウイルスベクターからの同時発現によって促進される。本明細書に例示する態様によれば、一実施形態では、タンパク質発現プロトコールは、本開示の遺伝子導入ベクターを投与することを含む。

【0104】

ワクチン開発
一実施形態では、本発明は、バイオテクノロジー並びにワクチンの開発及び製造に関する。本発明は、脊椎動物、特に哺乳動物、特にヒトのウイルス性及び細菌性病原体に対する保護を助けるためのワクチンの製造に特に有用である。

【0105】

本発明のワクチンは、予防的（例えば、任意の天然又は「野生」病原体による将来の感染の影響を予防又は改善するために）、又は治療的（例えば、がんに対するワクチン）であり得る。ワクチン接種は、ウイルス感染に対処する最も重要な経路である。いくつかの抗ウイルス剤が利用可能であるが、典型的には、これらの薬剤の有効性は限られている。ウイルスに対する抗体を投与することは、個体が感染すると、ウイルス感染に対処するための良好な方法であり得（受動免疫化）、典型的には、ヒト又はヒト化抗体は、いくつかのウイルス感染に対処するために有望であると思われる。しかし、ウイルス感染に対処する最も効果的で安全な方法は、能動免疫化による予防であり、おそらく予防であり得る。能動免疫化は、一般にワクチン接種と呼ばれ、ワクチンは、例えば、少なくとも１つのウイルスのポリペプチド又はウイルス由来のタンパク質をワクチンに組み込むことによって（サブユニットワクチン）、ウイルスの少なくとも１つの抗原決定基、好ましくは少なくとも１つのウイルスのいくつかの異なる抗原決定基を含む。典型的には、これまでに述べたフォーマットは、免疫応答を増強するためのアジュバントを含む。これは、全ウイルスに基づくワクチンについても、例えば不活性化フォーマットで可能である。さらなる可能性は、生きているが弱毒化された形態の病原性ウイルスの使用である。さらなる可能性は、野生型ウイルスの使用であり、例えば、成人個体は感染の危険性がないが、乳児は感染の危険性があり、母体抗体などによって保護され得る場合である。ワクチンの製造は必ずしも容易な手順ではない。場合によっては、ウイルス物質の産生が卵上であり、それにより、物質の精製が困難になり、汚染などに対する広範な安全対策が必要になる。細菌及び／又は酵母上での産生は、常にではないが、時として卵の代替となるが、これもまた、多くの精製及び安全性工程を必要とする。哺乳動物細胞での産生は代替となるであろうが、これまでに使用されている哺乳動物細胞はすべて、例えば、血清の存在及び／又は固体支持体への接着を増殖のために必要とする。第１のケースの場合、やはり、精製及び安全性、並びに例えば、いくつかのウイルスの複製を支援するためのプロテアーゼの必要性が問題になる。第２のケースの場合、高収率及び製造の容易さがさらなる問題になる。ワクチンは、公衆衛生上非常に重要な多くのウイルス性疾患について依然として不足している。死滅ウイルスワクチンは、製造するのに危険かつ高価であり得、免疫原性ではないことが多い。アデノウイルスベクターにウイルスタンパク質をコードする配列を含めることは、これらの問題を回避し得るが、そのようなアデノウイルスベクターを作製することには課題がある。例えば、アデノウイルスベクターにはほとんど空間がなく、アデノウイルスベクターに対する免疫応答はワクチンタンパク質に対する免疫応答に干渉する。

【0106】

したがって、本発明の目的は、宿主の身体の多数の増加する異なる細胞において長期維持が可能であり、それによって所望の抗原の安定した発現を提供することが可能な遺伝子導入ベクターを提供することである。本発明の別の目的は、ベクターを最初に受け取り、有糸細胞分裂後にそれを娘細胞に導入した細胞において長期間維持される遺伝子導入ベクターを提供することである。本発明のさらに別の目的は、１つ又は複数の目的の遺伝子に加えて、好ましくはレシピエント細胞における長期維持に必要な遺伝子のみを発現し、したがって、毒性であるか又はレシピエントに疾患の症候を引き起こす成分を欠く遺伝子導入ベクターを提供することである。本発明のさらなる目的は、特に体内で倍加する機能において弱毒化された生きたウイルスワクチンを模倣し、疾患の重大な徴候を誘導せず、ＤＮＡワクチンを注射された宿主において有害反応を誘導し得る望ましくないタンパク質を発現させない遺伝子導入ベクターを提供することである。本発明のワクチンは、適切な薬学的担体中に本発明の遺伝子導入ベクター又は該ベクターの混合物を含む。本発明のワクチンは、任意の従来の投与経路、すなわち筋肉内、皮内などによって投与されるワクチンを製造するために、ワクチン製剤の標準的な方法を使用して製剤化される。特定の実施形態では、本発明の遺伝子導入ベクターは、感染を治療及び／又は予防するために使用され（受動免疫）、典型的には、ヒト又はヒト化抗体は、いくつかのウイルス感染に対処するために有望であると思われる。しかし、ウイルス感染に対処する最も効果的で安全な方法は、能動免疫化による予防であり、おそらく予防であり得る。能動免疫化は、一般にワクチン接種と呼ばれ、ワクチンは、例えば、少なくとも１つのウイルスのポリペプチド又はウイルス由来のタンパク質をワクチンに組み込むことによって（サブユニットワクチン）、ウイルスの少なくとも１つの抗原決定基、好ましくは少なくとも１つのウイルスのいくつかの異なる抗原決定基を含む。典型的には、これまでに述べたフォーマットは、免疫応答を増強するためのアジュバントを含む。これは、全ウイルスに基づくワクチンについても、例えば不活性化フォーマットで可能である。さらなる可能性は、生きているが弱毒化された形態の病原性ウイルスの使用である。さらなる可能性は、野生型ウイルスの使用であり、例えば、成人個体は感染の危険性がないが、乳児は感染の危険性があり、母体抗体などによって保護され得る場合である。ワクチンの製造は必ずしも容易な手順ではない。場合によっては、ウイルス物質の産生が卵上であり、それにより、物質の精製が困難になり、汚染などに対する広範な安全対策が必要になる。細菌及び／又は酵母上での産生は、常にではないが、時として卵の代替となるが、これもまた、多くの精製及び安全性工程を必要とする。哺乳動物細胞での産生は代替となるであろうが、これまでに使用されている哺乳動物細胞はすべて、例えば、血清の存在及び／又は固体支持体への接着を増殖のために必要とする。第１のケースの場合、やはり、精製及び安全性、並びに例えば、いくつかのウイルスの複製を支援するためのプロテアーゼの必要性が問題になる。第２のケースの場合、高収率及び製造の容易さがさらなる問題になる。ワクチンは、公衆衛生上非常に重要な多くのウイルス性疾患について依然として不足している。死滅ウイルスワクチンは、製造するのに危険かつ高価であり得、免疫原性ではないことが多い。アデノウイルスベクターにウイルスタンパク質をコードする配列を含めることは、これらの問題を回避し得るが、そのようなアデノウイルスベクターを作製することには課題がある。例えば、アデノウイルスベクターにはほとんど空間がなく、アデノウイルスベクターに対する免疫応答はワクチンタンパク質に対する免疫応答に干渉する。したがって、本発明の目的は、宿主の身体の多数の増加する異なる細胞において長期維持が可能であり、それによって所望の抗原の安定した発現を提供することが可能な遺伝子導入ベクターを提供することである。本発明の別の目的は、ベクターを最初に受け取り、有糸細胞分裂後にそれを娘細胞に導入した細胞において長期間維持される遺伝子導入ベクターを提供することである。本発明のさらに別の目的は、１つ又は複数の目的の遺伝子に加えて、好ましくはレシピエント細胞における長期維持に必要な遺伝子のみを発現し、したがって、毒性であるか又はレシピエントに疾患の症候を引き起こす成分を欠く遺伝子導入ベクターを提供することである。本発明のさらなる目的は、特に体内で倍加する機能において弱毒化された生きたウイルスワクチンを模倣し、疾患の重大な徴候を誘導せず、ＤＮＡワクチンを注射された宿主において有害反応を誘導し得る望ましくないタンパク質を発現させない遺伝子導入ベクターを提供することである。本発明のワクチンは、適切な薬学的担体中に本発明の遺伝子導入ベクター又は該ベクターの混合物を含む。本発明のワクチンは、任意の従来の投与経路、すなわち筋肉内、皮内などによって投与されるワクチンを製造するために、ワクチン製剤の標準的な方法を使用して製剤化される。特定の実施形態では、本発明の遺伝子導入ベクターは、感染性疾患を治療及び／又は予防するために使用される。

【0107】

本開示の遺伝子導入ベクターは、免疫を誘導することによって個体を疾患に対して保護するためのワクチン開発に使用することができる。ワクチン開発のために本開示のＧＤＶを使用することの１つの利点は、レシピエントの免疫応答がＡｄ遺伝子によって偏向されないことである。一実施形態では、本開示の遺伝子導入ベクターは、ヒトの健康又は農業にとって重要なウイルス由来の１つ以上のタンパク質及び／又はＲＮＡ（抗原）をコードする。一実施形態では、ワクチンは、免疫を誘導することによって個体を疾患に対して保護するために使用される。一実施形態では、同じ又は異なる病原体からの多価ワクチンのために、複数の目的の遺伝子を含めることができる。特定の実施形態では、遺伝子導入ベクターは、目的のＤＮＡ配列の１つ以上の発現カセットをさらに含む。ある特定の場合には、目的のＤＮＡ配列は、感染性病原体のＤＮＡ配列である。特定の実施形態では、感染性病原体はウイルスである。

【0108】

特定の具体的な実施形態では、ウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨｅｐａｔｉｔｉｓＣＶｉｒｕｓ）、インフルエンザウイルス（ｌｎｆｌｕｅｎｚａｅＶｉｒｕｓ）、ロタウイルス（Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）、パピローマウイルス（ＰａｐｉｌｌｏｍａＶｉｒｕｓ）、レンチウイルス（Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）、エンテレウイルス（Ｅｎｔｅｒｅｖｉｒｕｓ）又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。特定の実施形態では、目的のＤＮＡ配列は、細菌のＤＮＡ配列である。特定の実施形態では、細菌は、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）及びマイコプラズマ肺炎（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｐｎｅｕｍｏｎｉａ）からなる群より選択される。特定の実施形態では、目的のＤＮＡ配列は、真菌病原体のＤＮＡ配列である。特定の実施形態では、のＤＮＡ配列は、ＨＩＶ起源のＤＮＡ配列である。

【0109】

一実施形態では、ワクチンは、個体をインフルエンザウイルスに対して保護するために使用される。一実施形態では、インフルエンザウイルスは、ブタインフルエンザ（ｓｗｉｎｅｆｌｕ）である。一実施形態では、インフルエンザウイルスは、トリインフルエンザ（ａｖｉａｎｆｌｕ）である。一実施形態では、本開示の遺伝子導入ベクターの１つ以上のタンパク質及び／又はＲＮＡは、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、ヌクレオカプシド（ＮＰ）、Ｍ１（マトリックスタンパク質）、Ｍ２（イオンチャネル）、ＮＳ１、ＮＳ２４０（ＮＥＰ）、脂質二重層、ＰＢＩ、ＰＢ２又はＰＡの１つから選択される。本開示のワクチンの代表的なウイルス及び細菌候補を以下に列挙する。これらのワクチンの遺伝子を括弧内に示す。
ウイルス－オルソミクソウイルス（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）
インフルエンザＡ（ＩｎｆｌｕｅｎｚａＡ）－ヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）、核タンパク質（ＮＰ）、
ＭｕＭ２、ＮＳＩ、ＮＳ２（ＮＥＰ）、ＰＡ、ＰＢ／、ＰＢ１－Ｆ２及びＰＢ２）
インフルエンザＢ（ＩｎｆｌｕｅｎｚａＢ）
インフルエンザＣ（ＩｎｆｌｕｅｎｚａＣ）
ウイルス－ヘルペスウイルス（ＨｅｒｐｅｓＶｉｒｕｓ）
単純ヘルペス１（口腔ヘルペス）、単純ヘルペス２（生殖器ヘルペス）－ポリペプチド；ウイルス糖タンパク質（ｇＢ、ｇＣ、ｇＤ、ｇＥ、ｇＧ、ｇＨ、ｇｉ、ｇＪ、ｇＫ、ｇＬ及びｇＭと命名）は公知であり、もう１つは（ｇＮ）が予測される；糖タンパク質バンド０。
エプスタイン・バー（Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ）（単核症（ｍｏｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｓ）、バーキットリンパ腫（Ｂｕｒｋｉｔｔ’ｓＩｙｍｐｈｏｍａ）、鼻咽頭癌（ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌｃａｒｃｉｎｏｍａ））－エプスタイン・バー核抗原［ＥＢＮＡ］１、２、３Ａ、３８、３Ｃ、ＬＰ及びＬＭＰ；ｇｐ３５０１２２０、別名ｇｐ３４０サイトメガロウイルス（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）－Ｇ／ｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎＢ、１ＥＩ、ｐｐ８９、ｇＢ及びｐｐ６５は、抗体の中和及び細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を誘導するためのワクチンにおける最小要件である。追加のタンパク質、例えば、抗体を中和するためのｇＨ、ｇＮ及びＣＴＬ応答のためのＥｌ、エクソン４及びｐｐ１５０による免疫化は、防御免疫応答を強化するであろう。
水痘帯状疱疹ウイルス（Ｖａｒｉｃｅｌｌａｚｏｓｔｅｒｖｉｒｕｓ）（水痘及び帯状疱疹）－ｇＥ、ｇＩ及びｇＢ遺伝子由来の組換えタンパク質
カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（Ｋａｐｏｓｉ’ｓｓａｒｃｏｍａ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）８（カポジ肉腫）
ヘルペス６（Ａ及び８）
ヘルペス７
ヘルペス８－糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）；
ウイルス－パピローマウイルス：
すべてのＨＰＶＬ１カプシドタンパク質について、ＥＩ、Ｅ２、Ｅ６、及びＥ７遺伝子
ＨＰＶ（子宮頸癌（Ｃｅｒｖｉｃａｌｃａｒｃｉｎｏｍａ）高リスク：１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９；おそらく高リスク：２６、５３、６６、６８、７３、８２）
ＨＰＶ（尋常性疣贅：２、７）
ＨＰＶ（足底疣贅：１、２、４、６３）
ＨＰＶ（フィアット（Ｆｉａｔ）疣贅：３、１０）
ＨＰＶ（肛門性器疣贅：６、１１、４２、４３、４４、５５）
ウイルス－レオウイルス科（Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）
ロタウイルスＡ（胃腸炎（ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓ））－ＶＰ２及びＶＰ６タンパク質
ウイルス－コロナウイルス（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（重症急性呼吸器症候群）－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＭＥＲＳ－ＣｏＶは、レプリカーゼ（Ｒｅｐ）をコードする－３０ｋｂゲノム、構造タンパク質スパイク（Ｓ）、エンベロープ（Ｅ）、膜（Ｍ）及びヌクレオカプシド（Ｎ）スパイク又はヌクレオカプシドタンパク質、それぞれＳ及びＮ遺伝子、を有するエンベローププラス鎖ＲＮＡウイルスである－ヒトコロナウイルス２２９Ｅスパイク及びエンベロープ遺伝子
ヒトコロナウイルスＮＬ６３
ウイルス－アストロウイルス（Ａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ）（胃腸炎）－アストロウイルス８７ｋＤａ構造ポリタンパク質
ウイルス－ノロウイルス（Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ）（胃腸炎）－ウイルスカプシド遺伝子、ＶＰＩ及びＶＰ２
ウイルス－フィアビウイルス科（Ｆｉａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）
デング熱－前膜（ｐｒＭ）及びエンベロープ（Ｅ）遺伝子
日本脳炎（Ｊａｐａｎｅｓｅｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）－ｐｒＭ、Ｅ及びＮＳＩ遺伝子；ｐｒＭ、及びＪＥウイルスのエンベロープ（Ｅ）コード化領域。
キャサヌール森林病（ＫｙａｓａｎｕｒＦｏｒｅｓｔｄｉｓｅａｓｅ）
マレーバレー脳炎（ＭｕｒｒａｙＶａｌｌｅｙｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）
セントルイス脳炎（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）
ダニ媒介性脳炎（Ｔｉｃｋ－ｂｏｒｎｅｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）
西ナイル脳炎（ＷｅｓｔＮｉｌｅｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）
Ｃ型肝炎（ＨｅｐａｔｉｔｉｓＣ）－Ｃ型肝炎ウイルス糖タンパク質Ｅ２；Ｃ型肝炎の糖タンパク質ＥＩ及びＥ２；ＨＣＶのコア遺伝子
ウイルス－ピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）－エンテロウイルス（Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ）
ヒトエンテロウイルスＡ（一部のコクサッキー（ｃｏｘｓａｃｋｉｅ）Ａウイルスを含む２１種類）
ヒトエンテロウイルスＢ（エンテロウイルス、コクサッキーＢウイルスを含む５７種類）
ヒトエンテロウイルスＣ（一部のコクサッキーＡウイルスを含む１４種類）
ヒトエンテロウイルス０（ＥＶ－６８、ＥＶ－７０、ＥＶ－９４の３種類）－ＶＰＩ遺伝子；
ウイルス－ピコルナウイルス科－ライノウイルス（Ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ）
ヒトライノウイルスＡ（７４血清型）
ヒトライノウイルスＢ（２５血清型）
ヒトライノウイルスＣ（７血清型）－ライノウイルス由来ＶＰＩ；呼吸器細胞の感染に決定的に関与する表面タンパク質
ウイルス－ピコルナウイルス科－ヘパトウイルス（Ｈｅｐａｔｏｖｉｒｕｓ）
Ａ型肝炎（ＨｅｐａｔｉｔｉｓＡ）
ウイルス－トガウイルス科（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）－アイファウイルス（Ａｉｐｈａｖｉｒｕｓ）
シンドビスウイルス（Ｓｉｎｄｂｉｓｖｉｒｕｓ）
東部ウマ脳炎ウイルス（Ｅａｓｔｅｒｎｅｑｕｉｎｅｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓｖｉｒｕｓ）
西部ウマ脳炎ウイルス（Ｗｅｓｔｅｒｎｅｑｕｉｎｅｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓｖｉｒｕｓ）
ベネズエラウマ脳炎ウイルス（Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎｅｑｕｉｎｅｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓｖｉｒｕｓ）
ロスリバーウイルス（ＲｏｓｓＲｉｖｅｒｖｉｒｕｓ）
オニョンニョンウイルス（Ｏ’ｎｙｏｎｇ’ｎｙｏｎｇｖｉｒｕｓ）
ウイルス－トガウイルス科－ルビウイルス（Ｒｕｂｉｖｉｒｕｓ）
風疹ウイルス（Ｒｕｂｅｌｌａｖｉｒｕｓ）
ウイルス－トガウイルス科－ヘペウイルス（Ｈｅｐｅｖｉｒｕｓ）
Ｅ型肝炎（ＨｅｐａｔｉｔｉｓＥ）ウイルス－ＯＲＦ２タンパク質；組換えＨＥＹカプシドタンパク質；ワクチンペプチドは、ＨＥＹカプシドタンパク質の別のペプチドＥ２のＮ末端から２６アミノ酸の伸長を有する
ウイルス－トガウイルス科－ボマウイルス科（Ｂｏｍａｖｉｒｉｄａｅ）
バルナ病ウイルス（Ｂａｒｎａｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓ）－ＢＤＶ核タンパク質（ＢＤＶ－Ｎ）
ウイルス－トガウイルス科－フィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）
エボラウイルス（Ｅｂｏｌａｖｉｒｕｓ）
マールブルグウイルス（Ｍａｒｂｕｒｇｖｉｒｕｓ）
ウイルス－トガウイルス科－パラミクソウイルス（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）
はしか（Ｍｅａｓｌｅｓ）
センダイウイルス（Ｓｅｎｄａｉｖｉｒｕｓ）
ヒトパラインフルエンザウイルス（Ｈｕｍａｎｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｅ）１及び３、
おたふくかぜウイルス（Ｍｕｍｐｓｖｉｒｕｓ）
ヒトパラインフルエンザウイルス２及び４
ヒト呼吸器合胞体ウイルス（Ｈｕｍａｎｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｃｙｔｉａｌｖｉｒｕｓ）
ニューカッスル病ウイルス（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓ）
ウイルス－トガウイルス科レトロウイルス（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）
ＨＩＶ－ｇａｇ：ｐ１８、ｐ２４、ｐ５５；ｐｏｌ：ｐ３１、ｐ５１、ｐ６６；ｅｎｖ：ｐ４１、ｐ１２０、ｐ１６０
Ｂ型肝炎（ＨｅｐａｔｉｔｉｓＢ）ウイルス
ＨＴＬＶＩ、ＩＩ
ウイルス－トガウイルス科－ラブドウイルス（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓｅｓ）
狂犬病（Ｒａｂｉｅｓ）
ウイルス－トガウイルス科－アレナウイルス（Ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）
ランタウイルス（Ｒａｎｔａｖｉｒｕｓ）
韓国出血熱（Ｋｏｒｅａｎｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｆｅｖｅｒ）
リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃｃｈｏｒｉｏｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓｖｉｒｕｓ）
フニン（Ｊｕｎｉｎ）
マチュポ（Ｍａｃｈｕｐｏ）
ラッサ（Ｌａｓｓａ）
サビア（Ｓａｂｉａ）
グアナリト（Ｇｕａｎａｒｉｔｏ）
カリフォルニア脳炎（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）
コンゴ－クリミア出血熱（Ｃｏｎｇｏ－Ｃｒｉｍｅａｎｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｆｅｖｅｒ）
リットバレー熱（Ｒｉｔｔｖａｌｌｅｙｆｅｖｅｒ）
ウイルス－パルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）
ヒトパルボウイルス（Ｂ１９）
細菌
バルトネラ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）
ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）（Ｂ．ａｂｏｒｔｕｓ、Ｂ．ｃａｎｉｓ、Ｂ．ｓｕｉｓを含む）
バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）（シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ））ｍａｌｌｅｉ、Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ
コクシエラ・ブルネッティ（Ｃｏｘｉｅｌｌａｂｕｒｎｅｔｉｉ）
フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）
マイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｏｖｉｓ）（ＢＣＧ株を除く、付録Ｂ－１１－Ａ、リスク群２（ＲＧ２）－クラミジアを含む細菌薬剤を参照のこと）、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）
パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｍｕｌｔｏｃｉｄａ）Ｂ型「ｂｕｆｆａｌｏ」及び他の病毒性株
Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａａｋａｒｉ、Ｒ．ａｕｓｔｒａｌｉｓ、Ｒ．ｃａｎａｄａ、Ｒ．ｃｏｎｏｒｉｉ、Ｒ．ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ、Ｒ．ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ、Ｒ．ｓｉｂｅｒｉｃａ、Ｒ．ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ、Ｒ．ｔｙｐｈｉ（Ｒ．ｍｏｏｓｅｒｉ）
エルシニア・ペスチス（Ｙｅｒｓｉｎｉａｐｅｓｔｉｓ）

【0110】

個体において免疫応答を調節する方法は、本開示の遺伝子導入ベクターを個体に投与することを含み、遺伝子導入ベクターは、少なくとも１つの治療遺伝子（目的の遺伝子、「ＧＯＩ」）をコードする。

【0111】

ベクター
アデノウイルスに基づく遺伝子導入ベクターに加えて、ベクター内の導入遺伝子によってコードされるタンパク質の産生によって集合が妨げられる他のベクター系が想定される。そのような遺伝子導入ベクターは、限定されないが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ＳＶ４０ベースのベクター、ワクシニアウイルスベクター、及びエプスタイン・バーウイルスベクターなどのウイルスベクターの群に属する。

【0112】

本発明は、本発明の理解を助けるために記載されている以下の実施例に記載されており、以後、何らかの形で限定すると解釈されるべきではない。以下の実施例は、記載された発明を作成及び使用する方法の完全な開示及び説明を当業者に提供するために記載されており、本発明者らが本発明と見なすものの範囲を限定することを意図するものではなく、以下の実験が実施されたすべて又は唯一の実験であることを表すことを意図するものでもない。使用される数（例えば、量、温度など）に関して正確性を確保するための努力がなされているが、いくつかの実験誤差及び偏差が考慮されるべきである。別途指示がない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧又は大気圧付近である。

【0113】

もちろん、実施例は、本発明の特定の実施形態のみの単なる例示であり、本明細書の最後に添付される特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲に対する限定を構成するものではないと理解されるべきである。

【0114】

本開示を詳細に説明してきたが、特許請求の範囲から逸脱することなく修正及び変形が可能であることは明らかであろう。

【実施例】

【0115】

以下の非限定的な実施例は、本開示をさらに説明するために提供される。

【0116】

実施例１
ヒト胚性腎臓細胞などの宿主細胞を、真核生物組織培養培地中の組織培養フラスコに播種する。それらをＣＯ_２（５％）及び大気酸素分圧下で３日間培養する。以下のＤＮＡコンストラクトの混合物を、限定されないが、リン酸カルシウムなどのトランスフェクタントと共に一定の比で添加する：ａ）ＣＭＶプロモーターから駆動される発現カセット中にエボラ糖タンパク質遺伝子を保有する線状の完全に欠失したアデノウイルスベクターモジュール、ｂ）パッケージ発現プラスミド、ｃ）ＣＭＶプロモーターから駆動されるエボラ糖タンパク質のアンチセンスコンストラクトを保有する阻害性発現プラスミド。培養の３日後、宿主細胞を回収し、凍結融解によって溶解して、カプシド形成した完全に欠失したアデノウイルスベクターを放出する。

【0117】

本開示又はその好ましい実施形態の要素を導入する場合、冠詞「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、及び「ｓａｉｄ」は、１つ以上の要素があることを意味することを意図している。「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、及び「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語は、包括的であることを意図しており、列挙された要素以外の追加の要素が存在してもよいことを意味する。

【0118】

上記を考慮すると、本開示のいくつかの目的が達成され、他の有利な結果が達成されることが分かるであろう。

【0119】

本開示の範囲から逸脱することなく、上記の製品及び方法に様々な変更を加えることができるので、上記の説明に含まれるすべての事項は例示的なものとして解釈されるべきであり、限定的な意味で解釈されるべきではないことが意図される。

【図1】