特表 2023-519969 リソソーム蓄積症に関するプロテオミクススクリーニング

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-05-15

(54)【発明の名称】リソソーム蓄積症に関するプロテオミクススクリーニング

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/68 20060101AFI20230508BHJP

   G01N 27/62 20210101ALI20230508BHJP

   C07K 16/18 20060101ALN20230508BHJP

   C12N 9/76 20060101ALN20230508BHJP

   C12Q 1/37 20060101ALN20230508BHJP

   C07K 17/00 20060101ALN20230508BHJP

【ＦＩ】

G01N33/68 ZNA

G01N27/62 V

C07K16/18

C12N9/76

C12Q1/37

C07K17/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022559563

(86)(22)【出願日】2021-03-31

(85)【翻訳文提出日】2022-10-21

(86)【国際出願番号】 US2021025270

(87)【国際公開番号】W WO2021202807

(87)【国際公開日】2021-10-07

(31)【優先権主張番号】63/002,992

(32)【優先日】2020-03-31

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】522349742

【氏名又は名称】シアトル・チルドレンズ・ホスピタル・ドゥーイング／ビジネス／アズ・シアトル・チルドレンズ・リサーチ・インスティテュート

(74)【代理人】

【識別番号】110001173

【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ハーン，シフーン

(72)【発明者】

【氏名】コリンズ，クリストファー

(72)【発明者】

【氏名】ダユハ，レムウィリン

(72)【発明者】

【氏名】イー，ファン

【テーマコード（参考）】

2G041

2G045

4B050

4B063

4H045

【Ｆターム（参考）】

2G041CA01

2G041EA04

2G041FA12

2G041GA09

2G041JA02

2G041LA08

2G045BB01

2G045CA25

2G045DA20

2G045DA44

2G045FB06

2G045FB07

2G045JA06

4B050CC07

4B050DD11

4B050KK18

4B050LL03

4B063QA01

4B063QA19

4B063QQ79

4B063QR16

4B063QR48

4B063QS33

4H045AA30

4H045BA15

4H045BA17

4H045BA60

4H045BA71

4H045CA40

4H045DA75

4H045EA50

(57)【要約】

Ｉ型ムコ多糖症（ＭＰＳ Ｉ）及びポンペ病を含むリソソーム蓄積症（ＬＳＤ）の初期検出は、各疾患が、一度症状が現れると致死性となる可能性があるため、患者の転帰を大幅に改善することができる。乾燥血液スポット（ＤＢＳ）、口腔スワブ、末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）、または白血球（ＷＢＣ）を含む生体試料を使用する、ＭＰＳ Ｉ及びポンペ病のスクリーニングについて記載する。開示された方法及びアッセイは、新生児でＬＳＤをスクリーニングするためのロバストな方法を提供する。開示された方法及び分析により、ＬＳＤを有する患者が、酵素補充療法（ＥＲＴ）に対する免疫応答を生み出すか否かについての速やかな予測もまた可能となり、これにより、ＬＳＤの患者に対する治療が改善される。開示された方法及びアッセイは、ＭＰＳ Ｉ及びポンペ病などの、ＬＳＤの偽欠損症症例により引き起こされる偽陽性の数もまた、さらに減少させることができる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

対象における、ポンペ病及びＩ型ムコ多糖症（ＭＰＳ Ｉ）のスクリーニング方法であって、前記方法が、
前記対象に由来する生体試料を入手することと、
前記生体試料由来のタンパク質を酵素により消化して、ペプチドの混合物を得ることと、
前記ペプチドの混合物から、
配列番号５のポンペ病のＧＡＡシグネチャーペプチドであって、前記ＧＡＡシグネチャーペプチドに結合し、配列番号６６のＣＤＲＨ１、配列番号６７のＣＤＲＨ２、及び配列番号６８のＣＤＲＨ３を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、ならびに、配列番号６９のＣＤＲＬ１、配列番号７０のＣＤＲＬ２、及び配列番号７１のＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む、抗体またはその抗原結合フラグメントを有する、前記ＧＡＡシグネチャーペプチドと、
配列番号２の第１のＩＤＵＡシグネチャーペプチドであって、前記第１のＩＤＵＡシグネチャーペプチドに結合し、配列番号２２のＣＤＲＨ１、配列番号２３のＣＤＲＨ２、及び配列番号２４のＣＤＲＨ３を含むＶＨドメイン、ならびに、配列番号２５のＣＤＲＬ１、配列番号２６のＣＤＲＬ２、及び配列番号２７のＣＤＲＬ３を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントを有する、前記第１のＩＤＵＡシグネチャーペプチドと、
配列番号１のＭＰＳ Ｉの第２のＩＤＵＡシグネチャーペプチドであって、前記第２のＩＤＵＡシグネチャーペプチドに結合し、配列番号１０のＣＤＲＨ１、配列番号１１のＣＤＲＨ２、及び配列番号１２のＣＤＲＨ３を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、ならびに、配列番号１３のＣＤＲＬ１、配列番号１４のＣＤＲＬ２、及び配列番号１５のＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む、抗体またはその抗原結合フラグメントを有する、前記第２のＩＤＵＡシグネチャーペプチドと、
を濃縮することと、
前記濃縮したペプチドで、液体クロマトグラフィー複数反応モニタリング質量分析（ＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳ）を実施して、各シグネチャーペプチドの濃度を測定することと、
前記対象が
前記ＧＡＡのシグネチャーペプチドの濃度が、所定の閾値濃度を下回る場合、または、前記ＧＡＡシグネチャーペプチドが存在しない場合に、ポンペ病を、及び
前記第１及び第２のＩＤＵＡシグネチャーペプチドの濃度が、対応する所定の閾値濃度を下回る場合、または、前記第１及び第２のＩＤＵＡシグネチャーペプチドが存在しない場合に、ＭＰＳ Ｉを
患うと診断することと、
を含む、前記方法。

【請求項2】

前記方法を、前記対象で、フェニルケトン尿症、原発性先天性甲状腺機能低下症、嚢胞性線維症、及び鎌状赤血球症のうちの１つ以上をさらにスクリーニングする、新生児スクリーニング（ＮＢＳ）の一部として実施する、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記方法を、前記対象においてポンペ病及び／またはＭＰＳ Ｉの臨床的症状が見られない中で実施する、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記生体試料が乾燥血液スポット（ＤＢＳ）、口腔スワブ、末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）、または白血球（ＷＢＣ）である、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記酵素がトリプシンである、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

生体試料内の、Ｉ型ムコ多糖症（ＭＰＳ Ｉ）及び／またはポンペ病の１つ以上のシグネチャーペプチドの検出方法であって、前記方法が、
対象から前記生体試料を入手することと、
前記生体試料由来のタンパク質を酵素により消化して、ペプチドの混合物を得ることと、
前記ペプチドの混合物から、
配列番号１のＭＰＳ Ｉの第１のＩＤＵＡシグネチャーペプチドであって、前記第１のＩＤＵＡシグネチャーペプチドに結合し、配列番号１０のＣＤＲＨ１、配列番号１１のＣＤＲＨ２、及び配列番号１２のＣＤＲＨ３を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、ならびに、配列番号１３のＣＤＲＬ１、配列番号１４のＣＤＲＬ２、及び配列番号１５のＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む、抗体またはその抗原結合フラグメントを有する、前記第１のＩＤＵＡシグネチャーペプチド；
配列番号２の第２のＩＤＵＡシグネチャーペプチドであって、前記第２のＩＤＵＡシグネチャーペプチドに結合し、配列番号２２のＣＤＲＨ１、配列番号２３のＣＤＲＨ２、及び配列番号２４のＣＤＲＨ３を含むＶＨドメイン、ならびに、配列番号２５のＣＤＲＬ１、配列番号２６のＣＤＲＬ２、及び配列番号２７のＣＤＲＬ３を含むＶＬドメイン、を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントを有する、前記第２のＩＤＵＡシグネチャーペプチド；
配列番号３のポンペ病の第１のＧＡＡシグネチャーペプチドであって、前記第１のＧＡＡシグネチャーペプチドに結合し、配列番号４４のＣＤＲＨ１、配列番号４５のＣＤＲＨ２、及び配列番号４６のＣＤＲＨ３を含むＶＨドメイン、ならびに、配列番号４７のＣＤＲＬ１、配列番号４８のＣＤＲＬ２、及び配列番号４９のＣＤＲＬ３を含むＶＬドメイン、を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントを有する、前記第１のＧＡＡシグネチャーペプチド；
配列番号４のポンペ病の第２のＧＡＡシグネチャーペプチドであって、前記第２のＧＡＡシグネチャーペプチドに結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを有する、前記第２のＧＡＡシグネチャーペプチド；
配列番号５のポンペ病の第３のＧＡＡシグネチャーペプチドであって、前記第３のＧＡＡシグネチャーペプチドに結合し、配列番号６６のＣＤＲＨ１、配列番号６７のＣＤＲＨ２、及び配列番号６８のＣＤＲＨ３を含むＶＨドメイン、ならびに、配列番号６９のＣＤＲＬ１、配列番号７０のＣＤＲＬ２、及び配列番号７１のＣＤＲＬ３を含むＶＬドメインを含む、抗体またはその抗原結合フラグメントを有する、前記第３のＧＡＡシグネチャーペプチド；
配列番号６のポンペ病の第４のＧＡＡシグネチャーペプチドであって、前記第４のＧＡＡシグネチャーペプチドに結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを有する、前記第４のＧＡＡシグネチャーペプチド；
配列番号７のポンペ病の第５のＧＡＡシグネチャーペプチドであって、前記第５のＧＡＡシグネチャーペプチドに結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを有する、前記第５のＧＡＡシグネチャーペプチド；
配列番号８のポンペ病の第６のＧＡＡシグネチャーペプチドであって、前記第６のＧＡＡシグネチャーペプチドに結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを有する、前記第６のＧＡＡシグネチャーペプチド；及び／または
配列番号９のポンペ病の第７のＧＡＡシグネチャーペプチドであって、前記第７のＧＡＡシグネチャーペプチドに結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを有する、前記第７のＧＡＡシグネチャーペプチド；
を濃縮することと、
ならびに、
前記濃縮したペプチドで、液体クロマトグラフィー複数反応モニタリング質量分析（ＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳ）を実施して、各シグネチャーペプチドの濃度を測定することで、前記生体試料内の、ＭＰＳ Ｉ及び／またはポンペ病の１つ以上のシグネチャーペプチドを検出することと、
を含む、前記方法。

【請求項7】

前記生体試料が乾燥血液スポット（ＤＢＳ）、口腔スワブ、末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）、または白血球（ＷＢＣ）である、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記酵素がトリプシンである、請求項６に記載の方法。

【請求項9】

各シグネチャーペプチドの濃度を、対応する所定の閾値濃度と比較することと、
前記対象が、
前記第１及び／または第２のＩＤＵＡシグネチャーペプチドの濃度が、対応する所定の閾値濃度を下回る場合、あるいは、前記第１及び／または第２のＩＤＵＡシグネチャーペプチドが存在しない場合に、ＭＰＳ Ｉを、及び／または
前記第１、第２、第３、第４、第５、第６、及び／または第７のＧＡＡシグネチャーペプチドの濃度が、対応する所定の閾値濃度を下回る場合、あるいは、前記第１、第２、第３、第４、第５、第６、及び／または第７のＧＡＡシグネチャーペプチドが存在しない場合に、ポンペ病を
患うと診断することと、
をさらに含む、請求項６に記載の方法。

【請求項10】

各シグネチャーペプチドに対する前記所定の閾値濃度が、正常な対照対象の集団に由来する、対応する生体試料中の各シグネチャーペプチドの平均濃度の標準偏差から計算される、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記生体試料がＤＢＳであり、正常な対照対象の集団由来のＤＢＳにおける、前記配列番号１のＭＰＳ Ｉの第１のＩＤＵＡシグネチャーペプチドの平均濃度が、１０ｐｍｏｌ／Ｌ～３５０ｐｍｏｌ／Ｌの範囲の濃度を含む、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記生体試料がＰＢＭＣであり、正常な対照対象の集団由来のＰＢＭＣにおける、前記配列番号１のＭＰＳ Ｉの第１のＩＤＵＡシグネチャーペプチドの平均濃度が、３００ｐｍｏｌ／Ｌ～１０００ｐｍｏｌ／Ｌの範囲の濃度を含む、請求項１０に記載の方法。

【請求項13】

前記生体試料が口腔スワブであり、正常な対照対象の集団由来の口腔スワブにおける、前記配列番号１のＭＰＳ Ｉの第１のＩＤＵＡシグネチャーペプチドの平均濃度が、１００ｐｍｏｌ／Ｌ～１０００ｐｍｏｌ／Ｌの範囲の濃度を含む、請求項１０に記載の方法。

【請求項14】

前記生体試料が口腔スワブであり、正常な対照対象の集団由来の口腔スワブにおける、前記配列番号１のＭＰＳ Ｉの第１のＩＤＵＡシグネチャーペプチドの平均濃度が、３０ｐｍｏｌ／ｇ～８５ｐｍｏｌ／ｇの範囲の濃度を含む、請求項１０に記載の方法。

【請求項15】

前記生体試料がＤＢＳであり、正常な対照対象の集団由来のＤＢＳにおける、前記配列番号２のＭＰＳ Ｉの第２のＩＤＵＡシグネチャーペプチドの平均濃度が、１０ｐｍｏｌ／Ｌ～２５０ｐｍｏｌ／Ｌの範囲の濃度を含む、請求項１０に記載の方法。

【請求項16】

前記生体試料がＰＢＭＣであり、正常な対照対象の集団由来のＰＢＭＣにおける、前記配列番号２のＭＰＳ Ｉの第２のＩＤＵＡシグネチャーペプチドの平均濃度が、３５０ｐｍｏｌ／Ｌ～１０００ｐｍｏｌ／Ｌの範囲の濃度を含む、請求項１０に記載の方法。

【請求項17】

前記生体試料が口腔スワブであり、正常な対照対象の集団由来の口腔スワブにおける、前記配列番号２のＭＰＳ Ｉの第２のＩＤＵＡシグネチャーペプチドの平均濃度が、１００ｐｍｏｌ／Ｌ～１０００ｐｍｏｌ／Ｌの範囲の濃度を含む、請求項１０に記載の方法。

【請求項18】

前記生体試料が口腔スワブであり、正常な対照対象の集団由来の口腔スワブにおける、前記配列番号２のＭＰＳ Ｉの第２のＩＤＵＡシグネチャーペプチドの平均濃度が、３０ｐｍｏｌ／ｇ～８０ｐｍｏｌ／ｇの範囲の濃度を含む、請求項１０に記載の方法。

【請求項19】

前記生体試料がＤＢＳであり、正常な対照対象の集団由来のＤＢＳにおける、前記配列番号５のポンペ病の第３のＧＡＡシグネチャーペプチドの平均濃度が、２５ｐｍｏｌ／Ｌ～２５０ｐｍｏｌ／Ｌの範囲の濃度を含む、請求項１０に記載の方法。

【請求項20】

前記配列番号１の第１のＩＤＵＡシグネチャーペプチドの濃縮に使用した、前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号１８のＶＨドメイン、及び／または配列番号２１のＶＬドメインを含む、請求項６に記載の方法。

【請求項21】

前記配列番号２の第２のＩＤＵＡシグネチャーペプチドの濃縮に使用した、前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号３０のＶＨドメイン、及び／または配列番号３３のＶＬドメインを含む、請求項６に記載の方法。

【請求項22】

前記配列番号３の第１のＧＡＡシグネチャーペプチドの濃縮に使用した、前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号５７のＶＨドメイン；配列番号６５のＶＬドメイン；配列番号５５の重鎖；または配列番号６３の軽鎖のうちの１つ以上を含む、請求項６に記載の方法。

【請求項23】

前記配列番号５の第３のＧＡＡシグネチャーペプチドの濃縮に使用した、前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号７９のＶＨドメイン；配列番号８７のＶＬドメイン；配列番号７７の重鎖；または配列番号８５の軽鎖のうちの１つ以上を含む、請求項６に記載の方法。

【請求項24】

前記対象が、ＭＰＳ Ｉ及び／またはポンペ病に対する１つ以上の治療を受けており、前記生体試料が、前記１つ以上の治療の前に入手され、前記方法が、
前記１つ以上の治療中または後に、前記対象に由来する第２の生体試料で、前記入手、消化、濃縮、及び実施を繰り返すこと、
ならびに
前記１つ以上の治療が、
前記１つ以上の治療中または後の、前記第１及び／または第２のＩＤＵＡシグネチャーペプチドの濃度が、前記１つ以上の治療前の、前記第１及び／または第２のＩＤＵＡシグネチャーペプチドの対応するペプチド濃度を上回る場合、ＭＰＳ Ｉに、及び／または
前記１つ以上の治療中または後の、前記第１、第２、第３、第４、第５、第６、及び／または第７のＧＡＡシグネチャーペプチドの濃度が、前記１つ以上の治療前の、前記第１、第２、第３、第４、第５、第６、及び／または第７のＧＡＡシグネチャーペプチドの対応する濃度を上回る場合、ポンペ病に
対して効果的であることを測定すること、
あるいは
前記１つ以上の治療が、
前記１つ以上の治療中または後の、前記第１及び／または第２のＩＤＵＡシグネチャーペプチドの濃度が、前記１つ以上の治療前の、前記第１及び／または第２のＩＤＵＡシグネチャーペプチドの対応する濃度以下である場合、または、前記第１及び／または第２のＩＤＵＡシグネチャーペプチドが存在しない場合、ＭＰＳ Ｉに、及び／または
前記１つ以上の治療中または後の、前記第１、第２、第３、第４、第５、第６、及び／または第７のＧＡＡシグネチャーペプチドの濃度が、前記１つ以上の治療前の、前記第１、第２、第３、第４、第５、第６、及び／または第７のＧＡＡシグネチャーペプチドの対応する濃度以下である場合、または、前記第１、第２、第３、第４、第５、第６、及び／または第７のＧＡＡシグネチャーペプチドが存在しない場合、ポンペ病に
対して効果的でないことを測定すること
をさらに含む、請求項６に記載の方法。

【請求項25】

前記対象が、
前記第１及び／または第２のＩＤＵＡシグネチャーペプチドの濃度が存在しない場合、ＭＰＳ Ｉに、及び／または
前記第１、第２、第３、第４、第５、第６、及び／または第７のＧＡＡシグネチャーペプチドの濃度が存在しない場合、ポンペ病に
対して、酵素補充療法（ＥＲＴ）に対する免疫応答を生み出すことを予測すること
をさらに含む、請求項６に記載の方法。

【請求項26】

ミコフェノール酸モフェチル、メトトレキサート（ＭＴＸ）、静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）、リツキシマブ、ボルテゾミブ、シクロホスファミド、及び／または血漿交換を前記対象に投与して、前記免疫応答を低下または防止することをさらに含む、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記免疫応答が、ＥＲＴにおいて、酵素に対する中和抗薬剤抗体を生み出すことを含む、請求項２５に記載の方法。

【請求項28】

対象における、Ｉ型ムコ多糖症（ＭＰＳ Ｉ）及び／またはポンペ病をスクリーニングするためのアッセイであって、前記アッセイが、
（ｉ）
配列番号１０のＣＤＲＨ１、配列番号１１のＣＤＲＨ２、及び配列番号１２のＣＤＲＨ３を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、ならびに、配列番号１のＭＰＳ Ｉのシグネチャーペプチドに結合する、配列番号１３のＣＤＲＬ１、配列番号１４のＣＤＲＬ２、及び配列番号１５のＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン；
配列番号２２のＣＤＲＨ１、配列番号２３のＣＤＲＨ２、及び配列番号２４のＣＤＲＨ３を含むＶＨドメイン、ならびに、配列番号２のＭＰＳ ＩのＩＤＵＡシグネチャーペプチドに結合する、配列番号２５のＣＤＲＬ１、配列番号２６のＣＤＲＬ２、及び配列番号２７のＣＤＲＬ３を含むＶＬドメイン；
配列番号４４のＣＤＲＨ１、配列番号４５のＣＤＲＨ２、及び配列番号４６のＣＤＲＨ３を含むＶＨドメイン、ならびに、配列番号３のポンペ病のＧＡＡシグネチャーペプチドに結合する、配列番号４７のＣＤＲＬ１、配列番号４８のＣＤＲＬ２、及び配列番号４９のＣＤＲＬ３を含むＶＬドメイン；及び／または
配列番号６６のＣＤＲＨ１、配列番号６７のＣＤＲＨ２、及び配列番号６８のＣＤＲＨ３を含むＶＨドメイン、ならびに、配列番号３のポンペ病のＧＡＡシグネチャーペプチドに結合する、配列番号６９のＣＤＲＬ１、配列番号７０のＣＤＲＬ２、及び配列番号７１のＣＤＲＬ３を含むＶＬドメイン；及び／または
を含む、抗体またはその抗原結合フラグメント：
及び／または
（ｉｉ）
配列番号４のポンペ病のＧＡＡシグネチャーペプチドに結合する抗体またはその抗原結合フラグメント；
配列番号６のポンペ病のＧＡＡシグネチャーペプチドに結合する抗体またはその抗原結合フラグメント；
配列番号７のポンペ病のＧＡＡシグネチャーペプチドに結合する抗体またはその抗原結合フラグメント；
配列番号８のポンペ病のＧＡＡシグネチャーペプチドに結合する抗体またはその抗原結合フラグメント；及び／または
配列番号９のポンペ病のＧＡＡシグネチャーペプチドに結合する抗体またはその抗原結合フラグメント；
及び／または
（ｉｉｉ）
配列番号１のＭＰＳ ＩのＩＤＵＡシグネチャーペプチド；
配列番号２のＭＰＳ ＩのＩＤＵＡシグネチャーペプチド；
配列番号３のポンペ病のＧＡＡシグネチャーペプチド；
配列番号４のポンペ病のＧＡＡシグネチャーペプチド；
配列番号５のポンペ病のＧＡＡシグネチャーペプチド；
配列番号６のポンペ病のＧＡＡシグネチャーペプチド；
配列番号７のポンペ病のＧＡＡシグネチャーペプチド；
配列番号８のポンペ病のＧＡＡシグネチャーペプチド；及び／または
配列番号９のポンペ病のＧＡＡシグネチャーペプチド
を含む参照シグネチャーペプチド
を含む、前記アッセイ。

【請求項29】

前記参照シグネチャーペプチドが同位体標識されている、請求項２８に記載のアッセイ。

【請求項30】

前記抗体またはその抗原結合フラグメントが磁気ビーズに付着している、請求項２８に記載のアッセイ。

【請求項31】

配列番号１０のＣＤＲＨ１、配列番号１１のＣＤＲＨ２、及び配列番号１２のＣＤＲＨ３を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、ならびに、配列番号１３のＣＤＲＬ１、配列番号１４のＣＤＲＬ２、及び配列番号１５のＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む、抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項32】

前記ＶＨドメインが配列番号１８で説明され、前記ＶＬドメインが配列番号２１で説明される、請求項３１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項33】

配列番号２２のＣＤＲＨ１、配列番号２３のＣＤＲＨ２、及び配列番号２４のＣＤＲＨ３を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、ならびに、配列番号２５のＣＤＲＬ１、配列番号２６のＣＤＲＬ２、及び配列番号２７のＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む、抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項34】

前記ＶＨドメインが配列番号３０で説明され、前記ＶＬドメインが配列番号３３で説明される、請求項３３に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項35】

配列番号４４のＣＤＲＨ１、配列番号４５のＣＤＲＨ２、及び配列番号４６のＣＤＲＨ３を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、ならびに、配列番号４７のＣＤＲＬ１、配列番号４８のＣＤＲＬ２、及び配列番号４９のＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む、抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項36】

前記ＶＨドメインが配列番号５７で説明される、及び／または、前記重鎖が配列番号５５で説明される；ならびに
前記ＶＬドメインが配列番号６５で説明される、及び／または、前記軽鎖が配列番号６３で説明される
請求項３５に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項37】

配列番号６６のＣＤＲＨ１、配列番号６７のＣＤＲＨ２、及び配列番号６８のＣＤＲＨ３を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、ならびに、配列番号６９のＣＤＲＬ１、配列番号７０のＣＤＲＬ２、及び配列番号７１のＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む、抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項38】

前記ＶＨドメインが配列番号７９で説明される、及び／または、前記重鎖が配列番号７７で説明される；ならびに
前記ＶＬドメインが配列番号８７で説明される、及び／または、前記軽鎖が配列番号８５で説明される
請求項３７に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項39】

（ｉ）
配列番号１０のＣＤＲＨ１、配列番号１１のＣＤＲＨ２、及び配列番号１２のＣＤＲＨ３を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、ならびに、配列番号１のＭＰＳ Ｉのシグネチャーペプチドに結合する、配列番号１３のＣＤＲＬ１、配列番号１４のＣＤＲＬ２、及び配列番号１５のＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン；
配列番号２２のＣＤＲＨ１、配列番号２３のＣＤＲＨ２、及び配列番号２４のＣＤＲＨ３を含むＶＨドメイン、ならびに、配列番号２のＭＰＳ ＩのＩＤＵＡシグネチャーペプチドに結合する、配列番号２５のＣＤＲＬ１、配列番号２６のＣＤＲＬ２、及び配列番号２７のＣＤＲＬ３を含むＶＬドメイン；
配列番号４４のＣＤＲＨ１、配列番号４５のＣＤＲＨ２、及び配列番号４６のＣＤＲＨ３を含むＶＨドメイン、ならびに、配列番号３のポンペ病のＧＡＡシグネチャーペプチドに結合する、配列番号４７のＣＤＲＬ１、配列番号４８のＣＤＲＬ２、及び配列番号４９のＣＤＲＬ３を含むＶＬドメイン；及び／または
配列番号６６のＣＤＲＨ１、配列番号６７のＣＤＲＨ２、及び配列番号６８のＣＤＲＨ３を含むＶＨドメイン、ならびに、配列番号３のポンペ病のＧＡＡシグネチャーペプチドに結合する、配列番号６９のＣＤＲＬ１、配列番号７０のＣＤＲＬ２、及び配列番号７１のＣＤＲＬ３を含むＶＬドメイン；
を含む、抗体またはその抗原結合フラグメント：
及び／または
（ｉｉ）
配列番号４のポンペ病のＧＡＡシグネチャーペプチドに結合する抗体またはその抗原結合フラグメント；
配列番号６のポンペ病のＧＡＡシグネチャーペプチドに結合する抗体またはその抗原結合フラグメント；
配列番号７のポンペ病のＧＡＡシグネチャーペプチドに結合する抗体またはその抗原結合フラグメント；
配列番号８のポンペ病のＧＡＡシグネチャーペプチドに結合する抗体またはその抗原結合フラグメント；及び／または
配列番号９のポンペ病のＧＡＡシグネチャーペプチドに結合する抗体またはその抗原結合フラグメント；
及び／または
（ｉｉｉ）
配列番号１のＭＰＳ ＩのＩＤＵＡシグネチャーペプチド；
配列番号２のＭＰＳ ＩのＩＤＵＡシグネチャーペプチド；
配列番号３のポンペ病のＧＡＡシグネチャーペプチド；
配列番号４のポンペ病のＧＡＡシグネチャーペプチド；
配列番号５のポンペ病のＧＡＡシグネチャーペプチド；
配列番号６のポンペ病のＧＡＡシグネチャーペプチド；
配列番号７のポンペ病のＧＡＡシグネチャーペプチド；
配列番号８のポンペ病のＧＡＡシグネチャーペプチド；及び／または
配列番号９のポンペ病のＧＡＡシグネチャーペプチド
を含む参照シグネチャーペプチド
を含むキット。

【請求項40】

濾紙カード、パンチツール、口腔スワブ、採血管、消化酵素、消化緩衝液、抗体またはその抗原結合フラグメントの固体支持体；及び溶出緩衝液のうちの１つ以上をさらに含む、請求項３９に記載のキット。

【請求項41】

前記参照シグネチャーペプチドが同位体標識されている、請求項３９に記載のキット。

【請求項42】

前記抗体またはその抗原結合フラグメントが磁気ビーズに付着している、請求項３９に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願への相互参照
本出願は、本明細書に完全に記載されているかのようにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０２０年３月３１日に出願された米国仮特許出願第６３／００２，９９２号の優先権を主張する。

【0002】

連邦政府が後援する研究または開発に関する声明
本発明は、全て国立衛生研究所によって授与されたＨＤ０９８１８０及びＡＩ１２３１３５の下で政府の支援を受けてなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。

【0003】

配列表に関する声明
本出願に関連する配列表は、紙のコピーの代わりにテキスト形式で提供され、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名前は２ＧＴ６０８３＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは７４ＫＢで、２０２１年３月３１日に作成され、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。

【0004】

本開示は、Ｉ型ムコ多糖症（ＭＰＳ Ｉまたはハーラー症候群）、及びポンペ病を含む、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）に関する臨床診断及び新生児スクリーニングを提供している。開示された方法及び分析により、ＬＳＤを有する患者が、酵素補充療法（ＥＲＴ）に対する免疫応答を生み出すか否かについての速やかな予測もまた可能となり、これにより、ＬＳＤの患者に対する治療が改善される。開示された方法及び分析はさらに、ＬＳＤの偽欠損症症例により引き起こされる偽陽性の数を減少させることができる。

【背景技術】

【0005】

利用可能な効果的な治療を伴う多くの疾患が存在する。しかし、これらの病気の多くでは、一旦、症状が現れると、その疾患は既に致命的であるか、不可逆的な損傷をもたらしている。そのような障害の例としては、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）などの代謝障害が挙げられる。これらとしては、Ｉ型ムコ多糖症（ＭＰＳ Ｉ）及びポンペ病が挙げられる。

【0006】

ＬＳＤは、リソソーム機能の欠陥によりもたらされる、５０種類を超える遺伝性代謝障害の群を含む。リソソームは、大型分子の破壊、及び、破壊フラグメントが、リサイクルのための細胞の他の部分への中継を担う酵素で満たされた、細胞内区画である。本プロセスは、いくつかの重要な酵素を必要とし、これらの酵素のうちの１つにおける欠陥は、大型分子の細胞内での蓄積を引き起こし得、最終的に細胞を殺傷する。ＬＳＤを有する患者は、骨格筋、骨、及び神経系への損傷を有し得る。

【0007】

ＬＳＤに対する治療としては、酵素補充療法（ＥＲＴ）における、（例えば、薬剤形態での）機能性外部酵素の提供が挙げられる。しかし、患者の中には、中和抗体を含む、ＥＲＴに対して免疫が媒介する阻害反応を生み出すものもある。免疫制御を行うと、患者が本免疫応答と戦うことができるものの、これは、ＥＲＴの前に開始するときが最も効果的である。したがって、ＬＳＤを患う患者が、治療の開始前に、ＥＲＴに対する免疫反応を生み出すか否かを知ることが、重要となり得る。現在、どの患者がこのような免疫反応を生み出すかを予想する分子分析は、時間がかかって労働集約的であり、完了するのに数ヶ月を要する。この時間の間に、患者はＥＲＴ中和抗体を生み出す場合がある。それにもかかわらず、現在、ＥＲＴに対する免疫反応の予想に速やかに役立ち得る、速いターンアラウンドタイムを備えた標準的な臨床試験は存在しない。

【0008】

新生児スクリーニング（ＮＢＳ）は、米国で毎年生まれる４００万人の乳児を対象とした、日常的に行われる標準的な公的予防必須スクリーニング検査である。ＮＢＳでは通常、生後２４～４８時間に血液検査が行われる。スクリーニングでは通常、濾紙に付着した新生児のかかとからの数滴の血液を使用する。乾燥血液スポット（ＤＢＳ）を含む紙は、検査が行われるまで保管してもよい。

【0009】

ＮＢＳ評価を実施するために、ＤＢＳから乾燥血液のパンチを採取し、臨床検査を実施して、出生時には明らかではないが、後年の深刻な健康問題の原因となる障害を示す血液内の特定の物質（マーカーまたはバイオマーカーと呼ばれる）の有無を検出する。スクリーニングされる障害は状態ごとに異なるが、ほとんどの状態では、フェニルケトン尿症、原発性先天性甲状腺機能低下症、嚢胞性線維症、及び鎌状赤血球症がスクリーニングされる。ＮＢＳは、患者の転帰を改善し、罹患した個体の長期的な障害を回避すると同時に、医療費を削減するのに非常に効果的であることが証明されている。

【0010】

ＭＰＳ Ｉ及びポンペ病を含む、いくつかのＬＳＤに対するＮＢＳは、多くの州で認可されている。スクリーニングには、典型的には、タンデム質量分析またはデジタルマイクロ流体蛍光分析法による、ＤＢＳにおけるリソソーム酵素活性の測定が伴う。所定のカットオフ値を下回る酵素活性に関するアッセイ値を有する新生児が、ＬＳＤに対して陽性であるとみなされる。しかし、分析精度を欠いていると、スクリーン陽性結果を確認するために、さらなる二番手の試験の保証が必要となる可能性がある。酵素アッセイは、自然の基質とは同一ではない、合成基質に依存する。したがって、酵素は、これらの人工基質に対して異なる挙動を有し、誤った診断を引き起こす可能性がある。さらに、酵素アッセイは、関連する酵素の機能及び構造がインタクトなままであることを必要とし、これによって、ＮＢＳ試料を、国または州の様々な場所から運搬及び貯蔵する間に制御することが困難となる。

【0011】

したがって、より低い偽陽性率及び高い陽性予測率でＬＳＤをスクリーニングするために、ロバストでシンプルな方法及びアッセイが必要であり、同時に、患者がＥＲＴに対して免疫反応を生み出すか否かの速やかな予測が可能となる。

【発明の概要】

【0012】

本開示は、Ｉ型ムコ多糖症（ＭＰＳ Ｉ；ハーラー症候群）及びポンペ病を含むＬＳＤに関して、対象をスクリーニングするために使用可能な多重アッセイの開発について記載する。このアッセイは、壊滅的でしばしば致命的な臨床症状が現れる前にこれらの障害を確実に診断することにより、影響を受けた個体の転帰を大幅に改善し得る。アッセイは、他の源の生体試料のなかでも、ＤＢＳを使用して、これらの障害と関連するマーカーの有無を検出することができる。特定の実施形態では、対象は新生児であり、ＤＢＳは既に、既存のＮＢＳ手順の一部としてルーティンにより収集されている。特定の実施形態では、試料は、ＮＢＳからの推定の陽性結果の後、フォローアップ確認のためにクリニックで収集される、口腔スワブ、末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）、または、白血球（ＷＢＣ）を含むことができる。特定の実施形態では、アッセイは、対象がＥＲＴに対する免疫反応を生み出すか否かを予測することができ、確認されたＬＳＤ患者から、酵素偽欠損症の症例を区別することができる。

【0013】

本開示は、選択された反応モニタリング質量分析（ｉｍｍｕｎｏ－ＳＲＭ）と組み合わせたペプチド免疫親和性濃縮を使用して確実に検出及び定量化され得る、各障害に関連するペプチドを記載している。本開示は、示されたペプチドを濃縮するために使用可能な高親和性抗体もまた提供する。

【0014】

特定の実施形態では、本開示の抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号５のＣＤＲ１、配列番号６のＣＤＲ２、及び配列番号７のＣＤＲ３を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、ならびに、配列番号８のＣＤＲ１、配列番号９のＣＤＲ２、及び配列番号１０のＣＤＲ３を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む。特定の実施形態では、本開示の抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１３として説明されるＶＨドメイン、及び、配列番号１６として説明されるＶＬドメインを含む。特定の実施形態では、本開示の抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１７のＣＤＲ１、配列番号１８のＣＤＲ２、及び配列番号１９のＣＤＲ３を含むＶＨドメイン、ならびに、配列番号２０のＣＤＲ１、配列番号２１のＣＤＲ２、及び配列番号２２のＣＤＲ３を含むＶＬドメインを含む。特定の実施形態では、本開示の抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２５として説明されるＶＨドメイン、及び、配列番号２８として説明されるＶＬドメインを含む。特定の実施形態では、本開示は、本明細書に記載する抗体またはその抗原結合フラグメントを含むアッセイ及びキットを提供する。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、組換え抗体またはその抗原結合フラグメントである。

【0015】

特定の実施形態は、本開示の抗体またはその抗原結合フラグメントを使用して、新生児、及びまた、高リスク対象において、ＭＰＳ Ｉ及び／またはポンペ病に関してスクリーニングをすることを含む。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントを使用して、ＭＰＳ Ｉ及び／またはポンペ病に関して治療されている対象において、正しい陽性症例を測定し、偽欠損症を取り除き、１つ以上の治療の有効性を測定することことができる。特定の実施形態は、本開示の抗体またはその抗原結合フラグメントを使用して、１つ以上の生体試料において、ＭＰＳ Ｉ及び／またはポンペ病の１つ以上のシグネチャーペプチドを検出することを含む。本開示は、対象が、ＭＰＳ Ｉ及び／またはポンペ病に対する酵素補充療法（ＥＲＴ）に対して免疫応答を生じるか否かを予測するための方法もまた提供する。

【0016】

本明細書で提出される図面のいくつかは、色つきにすることでよりよく理解され得る。出願人は、元の提出資料の一部として、色つき版の図面を考慮し、後の要旨において、図面の色つき画像を提示する権利を留保する。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】Ｉ型ムコ多糖症（ＭＰＳ Ｉ；ハーラー症候群）及びポンペ病に対して、選択された反応モニタリング質量分析（ｉｍｍｕｎｏ－ＳＲＭ－ＭＳ）に連結された、ペプチド免疫親和性濃縮に対して使用される、タンパク質標的及びペプチド配列を列挙する表を示す。総量、親イオン質量、娘ｙイオン質量、及び娘ｂイオン質量もまた示す。

【図2】ｉｍｍｕｎｏ－ＳＲＭ－ＭＳのプロセスを示す概略図である。

【図3】１１名のＭＰＳ Ｉ疾患患者（２つの処置後試料を含む９名の処置前患者：２名の弱毒化形態；４名の重症形態；及び３名の不明形態。２名の処置後患者）（ＥＲＴ：酵素補充療法；ＢＭＴ：骨髄移植；ＬＯＤ：検出下限）を示す。Ａは、１００名の正常対照及び１１名のＭＰＳ Ｉ患者における、ＩＤＵＡ ２１８ペプチドバイオマーカーレベルを示す（点線は、ＩＤＵＡ ２１８に対するカットオフを表す）。Ｂは、０～１０ｐｍｏｌ／Ｌからフォーカスした、図３Ａの拡大版を示す（破線は、ＩＤＵＡ ２１８のＬＯＤを表す）。Ｃは、１００名の正常対照及び１１名のＭＰＳ Ｉ患者における、ＩＤＵＡ ４６２ペプチドバイオマーカーレベルを示す（点線は、ＩＤＵＡ ４６２に対するカットオフを表す）。Ｄは、０～５ｐｍｏｌ／Ｌからフォーカスした、図３Ｃの拡大版を示す（破線は、ＩＤＵＡ ４６２のＬＯＤを表す）。

【図4】Ａ及びＢは、内部標準を乾燥血液スポット（ＤＢＳ）マトリックスにスパイクしたときの、ＩＤＵＡペプチドの線形応答を示す（点線は、正常コホートで発見されたペプチド最低レベルを表す）。

【図5】Ａ及びＢは、ＤＢＳ及び末梢血単核球（ＰＢＭＣ）試料におけるＩＤＵＡペプチド濃度を示す（ＤＢＳ：５つの３ｍｍパンチ；ＰＢＭＣ：２５０μｇのタンパク質）。

【図6】Ａ及びＢは、ＤＢＳ及び口腔スワブ試料におけるＩＤＵＡペプチド濃度を示す（ＤＢＳ：５つの３ｍｍパンチ）。

【図7】Ａ及びＢは、ＩＤＵＡ ２１８ペプチドバイオマーカー（図７Ａ）、及び、ＩＤＵＡ ４６２ペプチドバイオマーカー（図７Ｂ）に対する、１００名の正常対照（ＮＣ）、９名のＭＰＳ Ｉ患者（ＭＰＳ Ｉ ｐｔ）、及び４名の偽欠損症症例（偽ＭＰＳ Ｉ）における、ＩＤＵＡ濃度の比較を示す。

【図8A】免疫化ウサギ由来の血清によるペプチド捕捉後の、精製ペプチド（左）及びＤＢＳ試料（右）からのＧＡＡペプチドに対する、複数反応モニタリング（ＭＲＭ）追跡を示す。ＧＡＡ ３３２ ＭＲＭ追跡を示す。

【図8B】免疫化ウサギ由来の血清によるペプチド捕捉後の、精製ペプチド（左）及びＤＢＳ試料（右）からのＧＡＡペプチドに対する、複数反応モニタリング（ＭＲＭ）追跡を示す。ＧＡＡ ８５５ ＭＲＭ追跡を示す。

【図9】単離された形質細胞由来の上清抗体によるペプチド捕捉後の、ＰＢＭＣ試料からのＧＡＡ ８５５に対する、内部複数反応モニタリング（ＭＲＭ）追跡を示す。

【図10A】免疫化ウサギ由来の血清によるペプチド捕捉後の、精製ペプチド（Ｉ）、ＤＢＳ試料（ＩＩ）、及び口腔スワブ試料（ＩＩＩ）からのＧＡＡペプチドに対する、複数反応モニタリング（ＭＲＭ）追跡を示す。ＧＡＡ １５５ ＭＲＭ追跡を示し、ＴＴＰＴＦＦＰＫ（配列番号３）、親イオン質量４６９．７５２７＋＋である。

【図10B】免疫化ウサギ由来の血清によるペプチド捕捉後の、精製ペプチド（Ｉ）、ＤＢＳ試料（ＩＩ）、及び口腔スワブ試料（ＩＩＩ）からのＧＡＡペプチドに対する、複数反応モニタリング（ＭＲＭ）追跡を示す。ＧＡＡ ３７６ ＭＲＭ追跡を示し、ＷＧＹＳＳＴＡＩＴＲ（配列番号５）、親イオン質量５７１．２８５５＋＋である。

【図11】ＧＡＡ ３７６ペプチドバイオマーカー（ＷＧＹＳＳＴＡＩＴＲ（配列番号５）親イオン質量５７１．２８５５＋＋）に対する、３つの正常対照（ＮＣ１、ＮＣ２、ＮＣ３）、３つの真の陽性ポンペ患者（ＰＤ１、ＰＤ２、ＰＤ３）、ならびに２つの偽欠損症症例（偽１及び偽２）における、ＤＢＳでのＧＡＡ濃度の比較を示す。

【図12】以下を含む、本開示の例示的な配列を示す：

【表1-1】

【表1-2】

【発明を実施するための形態】

【0018】

利用可能な効果的な治療を伴う多くの疾患が存在する。しかし、これらの病気の多くでは、一旦、症状が現れると、その疾患は既に致命的であるか、不可逆的な損傷をもたらしている。初期診断によって恩恵にあずかる障害の例としては、Ｉ型ムコ多糖症（ＭＰＳ Ｉ）及びポンペ病を含む、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）などの代謝障害が挙げられる。

【0019】

ＬＳＤは、リソソーム機能の欠陥によりもたらされる、５０種類を超える遺伝性代謝障害の群を含む。リソソームは、大型分子の破壊、及び、破壊フラグメントが、リサイクルのための細胞の他の部分への中継を担う酵素で満たされた、細胞内区画である。本プロセスは、いくつかの重要な酵素を必要とする。これらの酵素のうちの１つにおける欠陥は、大型分子の細胞内での蓄積を引き起こし得、最終的に細胞を殺傷する。

【0020】

Ｉ型ムコ多糖症（ＭＰＳ Ｉ；ハーラー症候群）は、酸性ムコ多糖体症の群に属する希少なＬＳＤである。ＭＰＳ Ｉはさらに、重症型及び弱毒化型に分けることができる。ＭＰＳ Ｉの重症形態は、ハーラー症候群としても知られている。ＭＰＳ Ｉの重症形態及び弱毒化形態は、類似の症状及び合併症を有する。しかし、ＭＰＳ Ｉの弱毒化形態は、よりゆっくりとした疾患の進行、及び／または後の年齢での症状開始を示す。特定の実施形態では、弱毒化ＭＰＳ Ｉを患う対象は、早期の進行遅延を示さず、及び／または、精神能力の進行性衰退を経験しない。特定の実施形態では、症状及び合併症の開始は、弱毒化ＭＰＳ Ｉを患う患者に関しては、３歳から１０歳の間で生じる。特定の実施形態では、疾患重症度のスペクトルは、弱毒化ＭＰＳ Ｉを患う個体に対しては広範囲であり、彼ら彼女らの２０代から３０代における死をもたらす、生命を脅かす合併症から、通常の寿命で、深刻な関節問題及び心肺疾患を伴うことを含む。特定の実施形態では、重症ＭＰＳ Ｉを患う個体では、線形成長が３歳までに低下する。特定の実施形態では、精神障害は、重症ＭＰＳ Ｉを患う個体において進行性であり深刻である。特定の実施形態では、重症ＭＰＳ Ｉを患う個体では、人生の最初の１０年以内に死が生じる。特定の実施形態では、重症ＭＰＳ Ｉを患う個体と弱毒化ＭＰＳ Ｉを患う個体の診断を、臨床及び検査所見を用いて行う。ＭＰＳ Ｉを患う個体は、大頭症、脳内での流体増加、心臓弁異常、見た目の異なる顔面の特徴、低身長、関節変形、肝臓及び脾臓の拡大、ならびに大きな舌を有し得る。上気道感染症及び睡眠時無呼吸症が、気道狭窄によって生じる可能性がある。ＭＰＳ Ｉを患う人は多くの場合、角膜混濁が進行し、難聴を有し、再発性耳感染症を有する。深刻なＭＰＳ Ｉを患う子どもは通常、寿命が短くなり、後期小児期までしか生きない場合もある。心臓疾患及び気道閉塞が、重症及び減衰したの両方を患う人における、主たる死因である。ＭＰＳ Ｉは、ＩＤＵＡ遺伝子内での変化により引き起こされ、グリコサミノグリカン（またはムコ多糖）と呼ばれる、体内で産生される複合糖質類を破壊するために必要な、α－Ｌ－イズロニダーゼをコードする。ＩＤＵＡ酵素の欠損により、全ての細胞のリソソーム内での、グリコサミノグリカンの増加、及び、組織の進行性損傷がもたらされる。ＭＰＳ Ｉの治療法としては、酵素補充療法（ＥＲＴ）で欠損した、または失われたα－Ｌ－イズロニダーゼ酵素を提供すること；造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）；骨髄移植；及び、疾患の症状を緩和することが挙げられる。

【0021】

ポンペ病（ＰＤ）は、心筋及び骨格筋を無能にする、希少な遺伝リソソーム蓄積症である。ＰＤは、乳児期に開始するもの、及び遅発性のものを含むことができる。乳児期に開始するＰＤはさらに、古典的、または非古典的として特徴付けることができる。特定の実施形態では、症状は、古典的な形態である乳児期に開始するＰＤを患う乳児においては、生後数ヶ月以内に現れる可能性がある。特定の実施形態では、古典的な形態である乳児期に開始するＰＤを患う乳児は、以下の症状：筋肉衰弱；不十分な筋緊張；肝臓拡大；心臓欠陥；体重増加不能及び想定速度での成長不能；及び／または、呼吸問題を有する可能性がある。特定の実施形態では、古典的な形態である乳児期に開始するＰＤを患う乳児は、生後１年で心不全により死亡する。特定の実施形態では、症状は、非古典的な形態である乳児期に開始するＰＤを患う乳児に関しては、１歳までに現れる可能性がある。特定の実施形態では、非古典的な形態である乳児期に開始するＰＤを患う乳児は、以下の症状：運動スキルの遅れ及び進行性の筋肉衰弱；異常に大きな心臓；及び／または呼吸問題を有する可能性がある。特定の実施形態では、非古典的な乳児期に開始するポンペ病を患う子どもは、初期小児期までしか生きない。遅発性ＰＤは、小児期、青年期、または成人期の遅くに現れ、通常、乳児期に開始する形態よりも軽度である。特定の実施形態では、遅発性ＰＤは、心臓の問題を含む可能性が低い。特定の実施形態では、遅発性ＰＤの経験を患う個体は、特に脚、胴体、及び、呼吸を制御する筋肉において、進行性の筋肉衰弱を有する可能性がある。特定の実施形態では、遅発性ＰＤを患う個体は、呼吸不全を有する可能性がある。ＰＤは、酸α－グルコシダーゼ酵素をコードする、ＧＡＡ遺伝子における変異により引き起こされる。ＧＡＡ酵素は、リソソーム内で機能し、グリコーゲンを、筋肉の燃料となる糖であるグルコースに消化する。したがって、ＧＡＡ酵素の欠損は、体内のあらゆる箇所での、過剰量のリソソームグリコーゲン蓄積をもたらす一方で、心臓及び骨格筋の細胞が、もっとも深刻に影響を受ける細胞である。ＰＤの症状を引き起こす、ＧＡＡ遺伝子内での最大３００個の異なる変異が同定されており、これらは、開始年齢及び重症度の観点から広範に変化し得る。ＰＤの治療は、ＥＲＴを含む。アルグルコシダーゼアルファ（Ｍｙｏｚｙｍｅ(C)）と呼ばれる、ＦＤＡが認可した薬剤を、ＰＤを患う乳児及び子どもの治療に使用することができる。別のアルグルコシダーゼアルファ薬剤であるＬｕｍｉｚｙｍｅ(C)は、遅発性（非乳児）ポンペ病に対して認可されている。

【0022】

ＰＤ及びＭＰＳ Ｉを含む、いくつかのＬＳＤに対する新生児スクリーニング（ＮＢＳ）が、多くの州で認可されている。スクリーニングには、タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）による、または、デジタルマイクロ流体傾向分析法（ＤＭＦ－Ｆ）による、ＤＢＳにおけるリソソーム酵素活性の測定が伴う（Ｇｅｌｂ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｎｅｏｎａｔａｌ Ｓｃｒｅｅｎ．５（１）：１，２０１９）。酵素アッセイは、自然の基質とは同一ではない、合成基質に依存する。したがって、酵素は、これらの人工基質に対して異なる挙動を有し、誤った診断を引き起こす可能性がある。さらに、酵素アッセイは、関連する酵素の機能及び構造がインタクトなままであることを必要とし、これによって、ＮＢＳ試料を、国または州の様々な場所から運搬及び貯蔵する間に制御することが困難となる。現在のスクリーニング法は、高い偽陽性率及び低い陽性予測率を伴って存在する。さらに、現在のスクリーニング法では、患者がＥＲＴに対する免疫応答を生じるかどうかを測定することができない。

【0023】

ＥＲＴは、例えば、乳児期ＰＤを患う患者における生残の延長、及び認知発達の保護；ならびに、肺機能の改善、疾患進行の安定化、及び、ＭＰＳ Ｉを患う患者における生化学的パラメーターの低下において効果的である。しかし、患者の中には、ＥＲＴに対して免疫が媒介する阻害反応（中和抗体）を生み出すものもある。現在では、どの患者が、ＥＲＴに対する免疫媒介性阻害反応を生み出すかを予想するために、分子分析、及び交差反応性免疫材料（ＣＲＩＭ）分析を使用する。ＣＲＩＭ陰性状態は、ＰＤの不十分な予後因子である。ＰＤを患う患者の２５％以下がＣＲＩＭ陰性であり、ＧＡＡタンパク質を産生せず、ＥＲＴに対する持続性の高抗体力価の成長、及び非効果的な治療をもたらす。ＥＲＴに対する、免疫媒介性阻害反応は、ＭＰＳ Ｉでも生じる。ＭＰＳ Ｉを患う患者の９０％は、治療の最初の数ヶ月の間に、ラロニダーゼＥＲＴに対する抗薬剤ＩｇＧ抗体応答を生み出す。より高い抗薬剤ＩｇＧ抗体レベルは、標的組織での酵素取り込みを損なわせ、組織グリコサミノグリカンのクリアランスの低下、及び、免疫媒介性過敏性反応の低下をもたらす。

【0024】

ＥＲＴ中和抗体の産生を減らす免疫制御が、ＥＲＴの前に開始する場合には最も効果的である。したがって、特に、致命的な早期開始心筋症と関連する乳児期ＰＤに対しては、ＥＲＴの開始前にＣＲＩＭ状態を測定することが重要であり得る。しかし、ＣＲＩＭ状態は典型的には、培養した皮膚線維芽細胞を用いるウエスタンブロットによって測定され、これは数ヶ月を要するプロセスである。この時間の間に、患者はＥＲＴ中和抗体を生み出す場合がある。現在、ＥＲＴに対する免疫反応の予想に速やかに役立ち得る、速いターンアラウンドタイムを備えた標準的な臨床試験は存在しない。本明細書に開示されたアッセイ、組成物、及び方法は、関連するタンパク質の量を測定することで、ＬＳＤ患者の状態を測定し、これにより、人工基質及び酵素機能変動を伴う問題を回避するだけでなく、患者がＥＲＴに対して免疫反応を生み出すか否かの速やかな予測が可能となる。

【0025】

開示された組成物及び方法をさらに使用して、ＭＰＳ Ｉ及びポンペ病に対する、ＮＢＳにおける偽欠損症症例により引き起こされる偽陽性の数を減少させることができる。ＬＳＤと関連する遺伝子の偽欠損症対立遺伝子は、変化したタンパク質をコードする遺伝子の１つのコピーにおける、１つ以上の変異（対応する野生型遺伝子と比較して）を含むか、または、遺伝子の発現を変化させるが、疾患を引き起こさない。偽欠損症対立遺伝子を有する個体は、大幅に低下した酵素活性を示すが、健常である。特定の実施形態では、ＬＳＤと関連する遺伝子の偽欠損症対立遺伝子を有する、臨床的に健常な対象は、インビトロで遺伝子によりコードされる酵素の活性の低下を示す。特定の実施形態では、ＬＳＤと関連する遺伝子の偽欠損症対立遺伝子を有する、臨床的に健常な対象は、インビトロで遺伝子によりコードされた酵素の活性の低下を示すが、インビボでは同じ酵素の機能活性を示す。特定の実施形態では、臨床的に健常な対象は、偽欠損症対立遺伝子の１つまたは２つのコピーを有することができる。特定の実施形態では、偽陽性結果は、試験結果が陽性である場合の酵素アッセイ試験で生じるが、疾患もしくは罹患は試験した対象には存在しないか、または、疾患は、試験した対象では無症状レベルで存在する。特定の実施形態では、健常な対象は、疾患の症状を示さないか、非常に少ない疾患の症状を示す。特定の実施形態では、健常な対象は、疾患の治療を必要としない。特定の実施形態では、ＬＳＤと関連する偽欠損症対立遺伝子を有する健常な対象は、ＬＳＤの症状を示さないか、または、非常に少ないＬＳＤの症状を示す。特定の実施形態では、ＬＳＤと関連する偽欠損症対立遺伝子を有する健常な対象は、ＬＳＤの治療を必要としない。

【0026】

開示された組成物及び方法をさらに使用して、ＬＳＤを引き起こす遺伝子の病原性バリアントのキャリアである個体を同定することができる。大部分のＬＳＤは、常染色体劣性様式で遺伝している。したがって、疾患（病原性バリアント（複数可））を引き起こすＬＳＤと関連する、あるバージョンの遺伝子（対立遺伝子）の２つのコピーを有する（劣性である）、または２つの異なる対立遺伝子を有する場合に、個体では、ＬＳＤの症状及びＬＳＤの合併症が明らかになるが、キャリアは、ＬＳＤを引き起こす遺伝子の病原性バリアントの１つのみのコピーを有するが、疾患を示さない。特定の実施形態では、キャリアは、ＬＳＤを引き起こす遺伝子の病原性バリアントの１つのコピー、及び、対応する遺伝子の、１つの野生型コピーを有する。特定の実施形態では、キャリアは、ＬＳＤを引き起こす遺伝子の病原性バリアントの１つのコピー、及び、対応する遺伝子の、１つの偽欠損症対立遺伝子を有する。特定の実施形態では、ＬＳＤを引き起こす遺伝子の病原性バリアントのキャリアは、ＬＳＤの症状を示さないか、または、非常に少ないＬＳＤの症状を示す。特定の実施形態では、ＬＳＤを引き起こす遺伝子の病原性バリアントのキャリアは、ＬＳＤの治療を必要としない。

【0027】

ＮＢＳ評価を実施するために、ＤＢＳから乾燥血液のパンチを採取し、臨床検査を実施して、出生時には明らかではないが、後年の深刻な健康問題の原因となる障害を示す血液内の特定の物質（マーカーまたはバイオマーカーと呼ばれる）の有無を検出する。スクリーニングされる障害は状態ごとに異なるが、ほとんどの状態では、フェニルケトン尿症、原発性先天性甲状腺機能低下症、嚢胞性線維症、及び鎌状赤血球症がスクリーニングされる。ＮＢＳは、患者の転帰を改善し、罹患した個体の長期的な障害を回避すると同時に、医療費を削減するのに非常に効果的であることが証明されている。残念ながら、検出は多くの場合、血液細胞中での、極度に低いタンパク質濃度、及び、ＤＢＳ中に存在する限定的な血液量により制限される。

【0028】

タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）は、１９９０年代に最初にＮＢＳに適用され、出生時に収集されたＤＢＳ試料からの複数の代謝物、したがっていくつかの疾患の迅速なスクリーニングへの道を開いた（Ｃｈａｃｅ，Ｊ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．Ｗｉｌｅｙ－Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ；２００９；４４：１６３－１７０；Ｍｉｌｌｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｈｅｒｉｔ．Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓ．１９９０；１３：３２１－３２４；Ｓｗｅｅｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ．２００６；１１７：Ｓ３０８－Ｓ３１４；Ａｌｍａｎｎａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｅｄｉａｔｒ．２０１６；２８：６９４－６９９；Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｄ．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ；２００６．ｐｐ．１Ｓ－２５２Ｓ；Ｃｈａｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．１９９３；３９：６６－７１）。トリプル四重極質量分析計で実行される選択された反応モニタリング質量分析（ＳＲＭ－ＭＳ）により、特定のバイオマーカーの正確で高スループットの分析的にロバストな定量がさらに可能になった。そのため、現在、世界中の臨床ＮＢＳ検査室での標準治療となっている（Ｃｈａｃｅ，Ｊ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．Ｗｉｌｅｙ－Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ；２００９；４４：１６３－１７０；Ｃｈａｃｅ ＆ Ｋａｌａｓ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２００５；３８：２９６－３０９；Ｄｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｐａｒｔ Ａ．Ｗｉｌｅｙ Ｓｕｂｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ａ Ｗｉｌｅｙ Ｃｏｍｐａｎｙ；２００６；１４０：８３７－８４２）。

【0029】

ＰＢＭＣのトリプシン消化物由来のＢＴＫ、ＷＡＳＰ、及びＴ細胞マーカーＣＤ３εのシグネチャーペプチドを定量化するための、ＭＳベースのアプローチを使用して、それぞれ、Ｘ連鎖型無ガンマグロブリン血症（ＸＬＡ）、ウィスコットアルドリッチ症候群）（ＷＡＳ）、及びＳＣＩＤをスクリーニングすることができることが、以前に示されている（Ｋｅｒｆｏｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｃｌｉｎ Ａｐｐｌ，２０１２．６（７－８）：ｐ．３９４－４０２）。ＳＣＩＤ患者全員が、遺伝的不均一性にもかかわらずＴ細胞リンパ球減少を分かち合っているため、Ｔ細胞数の一般的表現として、ＣＤ３εを選択した。盲検調査における各患者は、それぞれの疾患に対して特異的なシグネチャーペプチドを欠損していた（すなわち、ブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）を欠くＸＬＡ患者、及び、ＷＡＳタンパク質（ＷＡＳＰ）を欠くＷＡＳ患者など）。

【0030】

ＳＲＭ－ＭＳは、目的のタンパク質の化学量論的代理として、タンパク質分解的に生成されたシグネチャーペプチドを利用する。これは、次に、試料中のそのタンパク質を発現する特定の細胞型の数を推定するために使用され得る（すなわち、血中のＣＤ３＋Ｔ細胞の量を示すためのＣＤ３εの定量化）。各シグネチャーペプチドに対するＭＳの高い特異性は、その質量、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分離時の保持時間、及び結果として生じる標的特異的フラグメンテーションパターンという３つの物理化学的特性によってもたらされる（Ｋｅｎｎｅｄｙ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１４；１１：１４９－１５５）。これらの進歩にもかかわらず、１００～１０００ｎｇタンパク質／ｍＬの範囲の定量限界があり、血液または血漿などの複雑なマトリックスを使用すると、ＳＲＭ－ＭＳベースのアッセイによる少量の標的の正確な定量が不可能になる場合が多い。

【0031】

ＳＲＭ－ＭＳに結合したペプチド免疫親和性濃縮（ｉｍｍｕｎｏ－ＳＲＭ）は、少量のマーカーの正確な定量化を可能にする方法である。ｉｍｍｕｎｏ－ＳＲＭは一般に、以下の工程を伴う：（ｉ）疾患の有無を示す標的タンパク質の選択；（ｉｉ）存在する場合、標的タンパク質を含む生体試料を酵素で処理し、生体試料中のタンパク質を全て、ペプチドと呼ばれるより小さなフラグメントにすること；（ｉｉｉ）標的タンパク質に由来する選択ペプチドマーカーに対する濃縮；ならびに、（ｉｖ）目的の濃縮ペプチドの、質量分析計での分析及び定量化。

【0032】

安定同位体標準及び抗ペプチド抗体による捕捉（Ｓｔａｂｌｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｃａｐｔｕｒｅ ｂｙ Ａｎｔｉ－Ｐｅｐｔｉｄｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）（ＳＩＳＣＡＰＡ）とも呼ばれる、ｉｍｍｕｎｏ－ＳＲＭは、ＳＲＭ－ＭＳ分析の前に、抗ペプチド抗体を利用して複雑な生物学的試料から目的のペプチドを精製及び濃縮することにより、ＳＲＭ－ＭＳアッセイの感度を高める（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ．２０１１；５３：２８１２；Ｗｈｉｔｅａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ；２０１０；９：１８４－１９６；Ｗｈｉｔｅａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ；２０１２；１１：Ｍ１１１．０１５３４７；Ｋｕｈｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２００９；５５：１１０８－１１１７；Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ．２００４；３（２）：２３５－２４４；Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１８．９（２７５６）；Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０２０；１１：４６４；Ｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ，２０１７．１６（２）：ｐ．８６２－８７１；Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，２０２１：Ｆｅｂ ２５；Ｓ００１６－５０８５（２１）００４５７－１）。例示的なｉｍｍｕｎｏ－ＳＲＭプロセスを図２に示す。

【0033】

抗ペプチド抗体を使用するシグネチャーペプチドバイオマーカーの、免疫親和性濃縮により、複雑な生物学的マトリックスから、目的のペプチドを単離する。これは、試料マトリックスを単純にし、バックグラウンドを減らし、検体を濃縮して、液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）アッセイの感度を向上させる（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ，２００４．３（２）：ｐ．２３５－４４；Ａｎｄｅｒｓｏｎ ａｎｄ Ｈｕｎｔｅｒ，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２００６．５（４）：ｐ．５７３－８８）。ｉｍｍｕｎｏ－ＳＲＭにより、高い再現性を伴って、血液中に低ピコモル濃度で存在するタンパク質の定量化が可能となる（Ｗｈｉｔｅａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２０１０．９（１）：ｐ．１８４－９６；Ｗｈｉｔｅａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ，２０１４．１３（４）：ｐ．２１８７－９６；Ｈｏｏｆｎａｇｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ，２００８．５４（１１）：ｐ．１７９６－８０４；Ｈｏｏｆｎａｇｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ，２０１６．６２（１）：ｐ．４８－６９；Ｋｕｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２０１２．１１（６）：ｐ．Ｍ１１１．０１３８５４）。この方法論を用いることで、８２個の試料（４０個の正常対照と、４２個の患者試料）の盲検スクリーニングにおいて、全てが、その対応するペプチド内で有意に減少し、診断カットオフにより、ＸＬＡ（ｎ＝２６）、ＷＡＳ（ｎ＝１１）、及びＳＣＩＤの３症例のうちの２つにおける、分子的に確認された各症例の陽性識別が可能となった（ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０５４８５６；Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１８．９（２７５６））。

【0034】

ｉｍｍｕｎｏ－ＳＲＭを使用して、Ｘ連鎖慢性肉芽腫症（Ｘ－ＣＧＤ）、Ｘ連鎖リンパ球増殖症候群（ＸＬＰ１；ＳＨ２Ｄ１Ａ欠損症）、家族性血球貪食性リンパ組織球症２（ＦＨＬ２）、血管拡張性失調症（ＡＴ）、分類不能型免疫不全（ＣＶＩＤ；Ｂ細胞機能障害）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損症、及び、細胞質分裂８（ＤＯＣＫ８）欠損症の寄与因子などの原発性免疫不全（ＰＣＴ／ＵＳ２０２１／０２０６７９）を診断するための、ならびに、血小板（ＣＤ４２）及びナチュラルキラー細胞（ＣＤ５６）に対する細胞特異的マーカー（ＰＣＴ／ＵＳ２０２１／０２０６７９）を検出するための、これらに結合するシグネチャーペプチドマーカー及び抗体もまた、開発されている。

【0035】

Ｘ連鎖型無ガンマグロブリン血症（ＸＬＡ）、ウィスコットアルドリッチ症候群（ＷＡＳ）、Ｘ－ＣＧＤ、ＤＯＣＫ８欠損症、及びＡＤＡ欠損症を示す、２つのキャリアを含む２８名の原発性免疫不全症（ＰＩＤＤ）患者由来の試料において、各疾患を示すペプチドは、正常対照と比較して著しく減少し、患者識別は、臨床及び分子診断と素晴らしく一致した。多重パネルには、血小板（ＣＤ４２）及びナチュラルキラー細胞（ＣＤ５６）に対する、細胞特異的マーカーもまた含まれた。ＷＡＳを患う患者において、ＣＤ４２レベルは、特徴的な血小板減少症と一致して、著しく減少したことが発見された。骨髄移植の前後で分析した、ＷＡＳを患う患者は、治療後に、正常化したＷＡＳタンパク質及び血小板ＣＤ４２を示した。このことは、ｉｍｍｕｎｏ－ＳＲＭの、ＰＩＤＤ治療の効果を監視する能力を強調している。（Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０２０．１１（４６４））。

【0036】

ｉｍｍｕｎｏ－ＳＲＭアッセイの多くの態様は、診断される障害、各障害に利用可能なバイオマーカー、目的のペプチドを濃縮し得る分子実体を開発する能力、及び質量分析計での目的の各ペプチドの挙動に依存する。臨床症状が出現する前にＤＢＳを使用してＮＢＳパネルの障害を確実に検出できる信頼性の高いアッセイを実現するには、これら全ての態様及びその他の態様を慎重に検討及び実験する必要がある。

【0037】

本開示は、ＭＰＳ Ｉ及びＰＤを含むＬＳＤを確実に診断するための多重ｉｍｍｕｎｏ－ＳＲＭ法を提供する。本明細書に開示される多重ｉｍｍｕｎｏ－ＳＲＭアッセイは、ＭＰＳ Ｉ及びＰＤにおいて減少または欠如しているタンパク質のペプチドに対して生成された抗ペプチド抗体を利用し得る。開示された方法及び分析により、ＬＳＤを有する患者が、酵素補充療法（ＥＲＴ）に対する免疫応答を生み出すか否かについての速やかな予測が可能となる。開示された方法及び分析はさらに、ＬＳＤの偽欠損症症例により引き起こされる偽陽性の数を減少させることができる。

【0038】

本開示の以下の態様を、ここでより詳細に説明する：（Ｉ）生体試料の収集及び処理；（ＩＩ）ＭＰＳ Ｉ及びポンペ病のペプチドマーカー；（ＩＩＩ）生体試料におけるタンパク質の酵素的消化；（ＩＶ）ペプチドマーカーを濃縮するための抗体；（Ｖ）バリアント；（ＶＩ）ペプチドの濃縮戦略；（ＶＩＩ）液体クロマトグラフィー（ＬＣ）；（ＶＩＩＩ）質量分析（ＭＳ）；（ＩＸ）使用方法；（Ｘ）キット；（ＸＩ）例示的な実施形態；（ＸＩＩ）実験例；ならびに（ＸＩＩＩ）結部。

【0039】

（Ｉ）生体試料の収集及び処理。特定の実施形態では、本開示の方法で使用可能な生体試料としては、血液または細胞に由来する試料が挙げられる。特定の実施形態では、本開示の方法で使用される試料は、ＤＢＳである。特定の実施形態では、対象由来の全血は、血液を濾紙カード上に置き、血液を乾燥させることによって調製され得る。

【0040】

特定の実施形態では、対象由来の全血は、任意の抗凝血物質で収集することができる。特定の実施形態では、対象由来の全血は、ヘパリンで収集することができる。ＤＢＳは、５０～１００μＬ（例えば、７０μＬ）の血液／スポットを濾紙カード（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓａｖｅｒ（商標）９０３（登録商標）Ｃａｒｄ，Ｗｈａｔｍａｎ Ｉｎｃ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）上にピペッティングすることによって調製し、室温で乾燥させてもよい。特定の実施形態では、血液を濾紙カード上で一晩乾燥させる。ＤＢＳは、例えば、使用するまで－８０℃で密封されたビニール袋に保管してもよい。特定の実施形態では、ＤＢＳ丸ごとを本開示のｉｍｍｕｎｏ－ＳＲＭアッセイで使用してもよい。特定の実施形態では、ＤＢＳ由来の１つ以上の３ｍｍのパンチを、本開示のｉｍｍｕｎｏ－ＳＲＭアッセイで使用してもよい。特定の実施形態では、ＤＢＳは、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の５０ｍＭ重炭酸アンモニウム溶液中で可溶化することができる。

【0041】

特定の実施形態では、本開示の方法で使用する試料としては、口腔スワブまたは粘膜試料に由来する細胞が挙げられる。特定の実施形態では、粘膜試料としては、経口、経鼻、生殖器、及び直腸試料が挙げられる（Ｅｓｐｉｎｏｓａ－ｄｅ Ａｑｕｉｎｏ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ８：３７０－３７８）。特定の実施形態では、口腔スワブ試料としては、頬または口に由来する細胞が挙げられる。特定の実施形態では、口腔スワブ試料は、以下に記載する手順に従って、対象から入手することができる：ＣＨＬＡ．（２０１６年４月４日）．Ｂｕｃｃａｌ Ｓｗａｂ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ．ＣＨＬＡ－Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ；（２０１６年７月２７日）．Ｂｕｃｃａｌ ＤＮＡ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ．Ｐａｔｈｗａｙ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ；（２０１７年１２月１４日）．Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｂｕｃｃａｌ Ｓｗａｂ Ｓａｍｐｌｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ．Ｏｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ；ＰＤＸＬ ＰＤＸＬ．（２０１７年１１月２８日）．Ｂｕｃｃａｌ Ｓｗａｂ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ－ＰｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄＤｘ Ｌａｂｓ ［Ｖｉｄｅｏ］．ＹｏｕＴｕｂｅ．ｙｏｕｔｕ．ｂｅ／３ｆｔｖＨｋｆＭ７１ｏ？ｔ＝１４６のワールドワイドウェブ；及びＣｅｎｔｅｒｓ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ（ＣＤＣ）．（２０２０年７月８日）．Ｉｎｔｅｒｉｍ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｃｏｌｌｅｃｔｉｎｇ， ｈａｎｄｌｉｎｇ， ａｎｄ ｔｅｓｔｉｎｇ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ ｆｏｒ Ｃｏｖｉｄ－１９．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ／２０１９－ｎｃｏｖ／ｌａｂ／ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ－ｃｌｉｎｉｃａｌ－ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ．ｈｔｍｌのワールドワイドウェブ。

【0042】

特定の実施形態では、口腔スワブ試料は、以下の手順により対象から入手することができる。試料収集の前に、患者は少なくとも３０分間、喫煙、飲食、ガム噛み、または歯磨きを行わない。スワブをパッケージから注意深く取り出し、先端がいかなる物体または表面にも接触しないようにする。スワブを、頬、歯、及び上歯肉の間の口の片側に位置する、口腔に挿入する。スワブの先端を、片方の頬の内側に押しつけ前後、上下に、円を描くようにこすりつける。こすっている間にハンドルを回転させて、先端全体を、頬の細胞で覆う。先端は、収集プロセスの間、歯、歯茎、及び唇に接触させてはならない。スワブは唾液で飽和させてはならない。収集後、スワブを、歯、歯茎、または唇と接触させることなく、口から取り除く。スワブを室温で少なくとも３０分間、空気乾燥させる。ハンドルを取り除き、スワブを冷却バイアルに保管してよい。反対の頬で、第２のスワブを使用して、ステップを繰り返してよい。口腔スワブ試料を、収集後最大７２時間、２～８℃で保管してよい、または、７２時間を超える場合、－８０℃以下で冷凍庫で保管してよい。特定の実施形態では、口腔スワブによる細胞の収集は、少なくとも３０秒間であってよい。特定の実施形態では、口腔スワブによる細胞の収集を、最大粘膜表面から収集してよい。特定の実施形態では、対象当たり、１～５個の口腔スワブ試料を収集してよい。特定の実施形態では、口腔スワブ試料は、少なくとも５分間、少なくとも１０分間、少なくとも１５分間、少なくとも２０分間、少なくとも２５分間、少なくとも３０分間、またはそれ以上の間、滅菌表面で空気乾燥させてよい。特定の実施形態では、対象は、試料収集の前に、口をきれいな水でゆすぐことができる。特定の実施形態では、試料収集の領域を、別のスワブを用いて、生理食塩水で湿らせてもよい。特定の実施形態では、口腔スワブ試料は、２５℃、２０℃、１５℃、１０℃、５℃、０℃、－５℃、－１０℃、－１５℃、－２０℃、またはそれ以下で保管してよい。特定の実施形態では、口腔スワブ試料は、１～２週間、－２０℃で保管してよい。特定の実施形態では、口腔試料を、スワブの代わりに、水及び／またはマウスウォッシュすすぎ液から収集してよい（Ｍｉｃｈａｌｃｚｙｋ ｅｔ ａｌ．（２００４）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３７（２）：２６２－２６９）。

【0043】

特定の実施形態では、口腔スワブ試料からの細胞を、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の５０ｍＭ重炭酸アンモニウム溶液で可溶化することができる。特定の実施形態では、Ｅｓｐｉｎｏｓａ－ｄｅ Ａｑｕｉｎｏ ｅｔ ａｌ．（２０１７）に記載されている手順に従い、口腔スワブ試料からタンパク質を単離することができる。特定の実施形態では、口腔スワブ試料からの細胞を、ＴＲＩｚｏｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）などの適切な緩衝液で抽出してよく、核酸沈殿後の上清を、タンパク質抽出に使用してよい。特定の実施形態では、タンパク質をアセトンにより沈殿させてよく、タンパク質ペレットを、適切な緩衝液（例えば、２．５％グリセロールで懸濁した９５％エタノール中のグアニジンヒドロクロリド）に再懸濁してよく、ペレットを音波処理により分散させてよく、ペレットを遠心分離にかけて洗浄してよく、ペレットを乾燥させてよく、ペレットを、適切な緩衝液（例えば、ＰＢＳ及びドデシル硫酸ナトリウム）に可溶化してよい。特定の実施形態では、可溶化されペレットを１００℃で加熱した後、遠心分離にかけて使用のための上清を得ることができる。

【0044】

特定の実施形態では、本開示の方法で使用する試料としては、末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）が挙げられる。ＰＢＭＣは末梢血に由来し、骨髄中に存在する造血幹細胞（ＨＳＣ）を起源にする。ＰＢＭＣは、丸い核を有する血液細胞であり、単球、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、及びＮＫ細胞を含む）、樹状細胞、ならびに幹細胞を含む多くの種類の細胞を含むことができる。ＰＢＭＣは、密度遠心分離（例えば、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅを用いる）を含む、当該技術分野において既知の任意の技術により、単離することができる。密度勾配遠心分離は、細胞密度により細胞を分離する。特定の実施形態では、遠心分離後に、２つの層を混合することなく、全血または軟膜層を、密度培地の上に、またはこの下に層状とすることができる。特定の実施形態では、ＰＢＭＣは、血漿と密度勾配培地との界面にて、薄い白色の層として現れる。特定の実施形態では、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ、及び、採取される血液からＦｉｃｏｌｌ溶液を分離するゲルプラグを含有する、Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）採血管を使用することができる（ｃｅｌｌ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｔｕｂｅｓ ＣＰＴ（商標），ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ；Ｐｕｌｅｏ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｂｉｏ－ｐｒｏｔｏｃｏｌ７（２）：ｅ２１０３）。特定の実施形態では、遠心分離前に、密度勾配培地及び試料を混合させないための挿入物を用いて設計された、ＳｅｐＭａｔｅ（商標）管（ＳＴＥＭＣＥＬＬ（商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＣＡ）を使用することができる。（Ｋｅｒｆｏｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｃｌｉｎ Ａｐｐｌ，２０１２．６（７－８）：３９４－４０２；Ｇｒｉｅｖｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｒｅｓｅｒｖ Ｂｉｏｂａｎｋ．２０１６ Ｏｃｔ；１４（５）：４１０－４１５；Ｃｏｒｋｕｍ ｅｔ ａｌ．（２０１５）ＢＭＣ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：４８；Ｊｉａ ｅｔ ａｌ．（２０１８） Ｂｉｏｐｒｅｓｅｒｖ Ｂｉｏｂａｎｋ １６（２）：８２－９１）。特定の実施形態では、ＰＢＭＣは白血球搬出法により単離することができる。白血球搬出マシンは、血漿、赤血球、及び顆粒球を含む、血液の残りの部分をドナーに戻しながら、高速遠心分離を使用して、全血をドナーから採取し、ターゲットＰＢＭＣ画分を分離する自動化デバイスである。特定の実施形態では、単離されたＰＢＭＣは、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の５０ｍＭ重炭酸アンモニウム溶液中で可溶化することができる。

【0045】

特定の実施形態では、本開示の方法で使用する試料としては、白血球（ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｓ）（ＷＢＣ；白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ））が挙げられる。ＷＢＣは免疫系の一部であり、体を感染症及び外来侵入物から守る。特定の実施形態では、ＷＢＣとしては、顆粒球（多形核細胞）、リンパ球（単核球）、及び単球（単核球）が挙げられる。特定の実施形態では、ＷＢＣとしては、リンパ球及び単球が挙げられるが、顆粒球は含まない。ＷＢＣは、密度勾配遠心分離（Ｂｏｙｕｍ（１９６８） Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｂｌｏｏｄ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｏｎｅ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｏｆ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅｓ ｂｙ ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｔ １ ｇ．Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ．Ｓｕｐｐｌ．９７：７７；Ｂｏｙｕｍ（１９７７） Ｌｙｍｐｈｏｌｏｇｙ，１０（２）：７１－７６）；浸透圧ショックによる赤血球溶解（Ｍｏｒｇｅｎｓｅｎ ａｎｄ Ｃａｎｔｒｅｌｌ（１９７７）Ｐｈａｒｍ Ｔｈｅｒａｐ．１：３６９－３８３）；抗体が媒介する、赤血球への、不必要な細胞の結合、及び、密度勾配分離による除去（Ｂｅｅｔｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｎｄｙ（２００７）Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ．（８）：３２６）を含む、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標）（ＳＴＥＭＣＥＬＬ（商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＣＡ）；細胞濃縮または枯渇用の磁気ビーズ（Ｂｒｏｃｋｓ ｅｔ ａｌ（２００６）Ｉｎ ｖｉｖｏ ２０（２）：２３９）；Ｂ及び／またはＮＫ細胞を濃縮させるための補体媒介細胞溶解（Ｆａｇｕｅｔ ａｎｄ Ａｇｅｅ（１９９３）Ｊ Ｉｍｍ Ｍｅｔｈ １６５（２）： ２１７）；ならびに、抗体被覆プレートへの接着による、細胞濃縮または枯渇を含む、不必要な細胞を除去するためのパニング（Ｂｒｏｕｓｓｏ ｅｔ ａｌ（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔ ５９（２）：８５）を含む、当該技術分野において既知の任意の技術により単離され、場合により濃縮することができる。ＷＢＣに対する単離及び濃縮手順の概説に関しては、Ｄａｇｕｒ ａｎｄ ＭｃＣｏｙ（２０１５）Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｃｙｔｏｍ．７３：５．１．１－５．１．１６を参照されたい。

【0046】

（ＩＩ）ＭＰＳ Ｉ及びポンペ病のためのペプチドマーカー。標的タンパク質由来の多くの理論的なタンパク質分解ペプチドがある。それらは、モノクローナル抗体産生の潜在的な候補となり得る。それにもかかわらず、ＭＳ／ＭＳによってそれらの特徴をスクリーニングした後、最良の潜在的な候補ペプチドを選択した。最高の感度及び特異性を有するこれらのシグネチャーペプチドを選択して、対応するモノクローナル抗体を開発し、臨床試料を使用して検証した。特定の実施形態では、複数のペプチド及び抗体を多重分析に含めて、ｉｍｍｕｎｏ－ＳＲＭアッセイのスループットを増加させて、アッセイにより必要とされるコスト及び時間を低下させることができる。

【0047】

典型的には、目的のタンパク質に固有であり、ＭＳ実験で一貫して観察される１つまたは２つのシグネチャープロテオティピックペプチドを、目的のタンパク質を化学量論的に表すために選択する（Ｍａｌｌｉｃｋ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００７；２５：１２５－１３１）。シグネチャーペプチドは、以前のＭＳ実験での検出、ＭＳで観察可能な可能性が最も高いペプチドを予測するための計算ツールの使用、またはその両方の組合せによって選択され得る。特定の実施形態では、中程度の疎水性を有する長さ５～２２のアミノ酸のトリプシンペプチドを選択してもよい。極めて親水性及び極めて疎水性のペプチドは、ＨＰＬＣでの保持時間の変動及び表面への損失に起因して、安定性が低下する可能性がある。特定の実施形態では、メチオニン残基（酸化）、Ｎ末端グルタミン（環化）、アスパラギンに続くグリシンまたはプロリン（脱アミド化の傾向がある）、及び二塩基性末端（例えば、ＫＫ、ＫＲ、ＲＲ、ＲＫなどの隣接するリジンまたはアルギニン残基は、消化効率が変動する可能性がある）は望ましくない場合がある（Ｗｈｉｔｅａｋｅｒ及びＰａｕｌｏｖｉｃｈ Ｃｌｉｎ Ｌａｂ Ｍｅｄ．２０１１；３１（３）：３８５－３９６）。より短いペプチド及びプロリン残基を含むペプチドは、ＳＲＭのより良い標的となり得る（Ｌａｎｇｅ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２００８；４：２２２）。

【0048】

特定の実施形態では、ペプチドは、ＩＤＵＡ及び／またはＧＡＡの一部を含む。特定の実施形態では、ペプチドは、配列番号１～２１を含む。特定の実施形態では、本開示のペプチドは、表１Ａ～１Ｃ、及び図１に記載されているものを含む。

【0049】

特定の実施形態では、本開示の抗体の例示的なＣＤＲ配列は、図１Ａに示されている。特定の実施形態では、本開示の抗体の例示的な可変重（ＶＨ）及び可変軽（ＶＬ）ドメイン配列を、図１Ｂに示す。特定の実施形態では、本開示の例示的ペプチド及び抗体の配列番号を、表１Ｃに示す。

【表2】

【表3】

【表4-1】

【表4-2】

【0050】

（ＩＩＩ）生体試料におけるタンパク質の酵素的消化。生体試料のタンパク質を、タンパク質分解に供してペプチドを生成してもよく、これはＬＣ－ＳＲＭ－ＭＳによる分析の前に免疫親和性精製によってさらに選択してもよい。特定の実施形態では、生体試料としては、ＤＢＳ、口腔スワブ試料由来の細胞、ＰＢＭＣ、またはＷＢＣが挙げられる。タンパク質分解は、ペプシン、ａｒｇ－Ｃプロテイナーゼ、ａｓｐ－Ｎエンドペプチダーゼ、ＢＮＰＳ－スカトール、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、キモトリプシン、クロストリパイン（クロストリジオペプチダーゼＢ）、エンテロキナーゼ、Ｘａ因子、グルタミルエンドペプチダーゼ、グランザイムＢ、ｌｙｓＣ、プロリンエンドペプチダーゼ、プロテイナーゼＫ、ブドウ球菌ペプチダーゼＩ、サーモリシン、トロンビン及びトリプシンなどの部位特異的エンドプロテアーゼを使用して達成され得る。部位を特異的に切断する化学物質も使用してもよい。酵素及び／または化学物質の組合せを使用して、望ましい分析物を得てもよい。

【0051】

特定の実施形態では、生体試料中のタンパク質は、トリプシンでペプチドに消化してもよい。トリプシンは、アルギニン及びリジン残基のＣ末端を独占的に切断し、生成されたペプチドの質量がほとんどの質量分析計の検出能力（最大３０００ｍ／ｚ）と適合していることと、理論的なトリプシン生成ペプチドのデータベースの生成に利用可能な効率的なアルゴリズムがあるという理由のため、ペプチドを生成するための好ましい選択となり得る。高い切断特異性、利用可能性、及び低コストは、トリプシンの他の利点である。タンパク質をトリプシンで処理することによって形成されるペプチドは、トリプシンペプチドとして公知である。

【0052】

（ＩＶ）ペプチドマーカーを濃縮するための抗体。抗体は、天然であるか、または部分的もしくは完全に合成的に産生されたかにかかわらず、免疫グロブリン遺伝子（複数可）、またはその機能的フラグメントによって実質的にコードされるポリペプチドリガンドを含む。抗体は、エピトープ（例えば、抗原）に特異的に（または選択的に）結合して認識する。抗体は、免疫グロブリン結合ドメインと相同または大部分が相同である結合ドメインを有する任意のタンパク質を含み得る。抗体調製物はモノクローナルまたはポリクローナルであってもよい。抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥなどの任意のヒトのクラスを含む任意の免疫グロブリンクラスのメンバーであり得る。認識される免疫グロブリン遺伝子としては、カッパ及びラムダ軽鎖定常領域遺伝子、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン及びミュー重鎖定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。抗体の「Ｆｃ」部分は、１つ以上の重鎖定常領域ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含むが、重鎖可変領域を含まない免疫グロブリン重鎖のその部分を指す。

【0053】

インタクトな抗体は、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重鎖（Ｈ）鎖及び２つの軽鎖（Ｌ）鎖を含み得る。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨまたはＶＨと略される）及び重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域には、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３という３つのドメインが含まれる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬまたはＶＬと略される）及び軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域には、１つのドメインＣＬが含まれる。ＶＨ及びＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域（フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が点在する）にさらに細分化され得る。各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成され、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置されている。重鎖及び軽鎖の可変領域には、抗原と相互作用する結合ドメインが含まれている。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的な補体系の第１の成分（Ｃｌｑ）を含む、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。

【0054】

所定のＣＤＲまたはＦＲの正確なアミノ酸配列境界は、以下によって記載されたものを含む、いくつかの周知のスキームのいずれかを使用して容易に決定され得る：Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）”Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（Ｋａｂａｔナンバリングスキーム）；Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２７３：９２７－９４８（Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングスキーム）；Ｍａｃｃａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２６２：７３２－７４５（Ｃｏｎｔａｃｔナンバリングスキーム）；Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８６：９２６８－９２７２（ＡｂＭナンバリングスキーム）；Ｌｅｆｒａｎｃ Ｍ Ｐ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７（１）：５５－７７（ＩＭＧＴナンバリングスキーム）；ならびにＨｏｎｅｇｇｅｒ及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ（２００１）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３０９（３）：６５７－６７０（「Ａｈｏ」ナンバリングスキーム）。所定のＣＤＲまたはＦＲの境界は、識別に使用されるスキームによって異なる場合がある。例えば、Ｋａｂａｔスキームは構造アラインメントに基づいているが、Ｃｈｏｔｈｉａスキームは構造情報に基づいている。ＫａｂａｔスキームとＣｈｏｔｈｉａスキームの両方のナンバリングは、最も一般的な抗体領域の配列の長さに基づいており、挿入は「３０ａ」などの挿入文字に対応し、一部の抗体では欠失が表示される。２つのスキームでは、特定の挿入及び欠失（「インデル」）を異なる位置に配置し、異なるナンバリングをする。接触スキームは、複雑な結晶構造の分析に基づいており、多くの点でＣｈｏｔｈｉａのナンバリングスキームと類似している。特定の実施形態では、本明細書に開示される抗体ＣＤＲ配列は、Ｋａｂａｔナンバリングによる。

【0055】

抗体フラグメントは、完全長未満である抗体の任意の誘導体または部分を含む。特定の実施形態では、抗体フラグメントは、結合パートナーとしての全長抗体の特異的結合能力の少なくともかなりの部分を保持している。。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、Ｆｖ、ｄｓＦｖダイアボディ、及びＦｄフラグメント、及び／または本明細書に記載のエピトープに特異的に結合する免疫グロブリンの任意の生物学的に有効なフラグメントが挙げられる。抗体または抗体フラグメントとしては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、合成抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、ミニボディ、及び線状抗体の全部または一部が挙げられる。

【0056】

一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）は、短いリンカーペプチドに接続された免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の可変領域の融合タンパク質である。Ｆｖフラグメントには、抗体の単一のアームのＶＬドメイン及びＶＨドメインが含まれる。Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、ＶＬ及びＶＨは、別個の遺伝子によってコードされているが、それらは、例えば、組換え法を使用して、それらを単一のタンパク質鎖として作製することを可能にする合成リンカーによって結合されてもよく、ここでは、ＶＬ領域とＶＨ領域が対になって、一価分子（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ））を形成する。Ｆｖ及びｓｃＦｖに関する追加情報については、例えば、Ｂｉｒｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２（１９８８）４２３－４２６；Ｈｕｓｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５（１９８８）５８７９－５８８３；Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ（ｅｄｓ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），（１９９４）２６９－３１５；ＷＯ１９９３／１６１８５；米国特許第５，５７１，８９４号；及び米国特許第５，５８７，４５８号を参照のこと。

【0057】

Ｆａｂフラグメントは、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインを含む一価の抗体フラグメントである。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む２価フラグメントである。インビボ半減期が延長したＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２フラグメントの考察に関しては、米国特許第５，８６９，０４６号を参照のこと。ダイアボディには、二価であってもよい２つのエピトープ結合部位が含まれる。例えば、欧州特許第０４０４０９７号；ＷＯ１９９３／０１１６１；及びＨｏｌｌｉｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０（１９９３）６４４４－６４４８を参照のこと。二重親和性再標的化抗体（Ｄｕａｌ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）（ＤＡＲＴ（商標）；ダイアボディフォーマットに基づくが、追加の安定化のためのＣ末端ジスルフィドブリッジを特徴とする（Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １１７，４５４２－５１（２０１１））も使用してもよい。抗体フラグメントには単離されたＣＤＲも含まれ得る。抗体フラグメントのレビューについては、Ｈｕｄｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９（２００３）１２９－１３４を参照のこと。

【0058】

抗体フラグメントは、任意の手段によって産生され得る。例えば、抗体フラグメントは、インタクトな抗体の断片化によって酵素的もしくは化学的に生成されてもよいし、または部分的な抗体配列をコードする遺伝子から組換え的に生成されてもよい。あるいは、抗体フラグメントは、全体的または部分的に合成的に産生され得る。抗体フラグメントは、一本鎖抗体フラグメントを含んでもよい。別の実施形態では、このフラグメントは、例えば、ジスルフィド結合によって一緒に連結されている複数の鎖を含んでもよい。このフラグメントはまた、多分子複合体を含んでもよい。機能的抗体フラグメントは、典型的には少なくとも５０アミノ酸を含み得、より典型的には少なくとも２００アミノ酸を含む。

【0059】

特定の実施形態では、組換え免疫グロブリンを産生し得る。Ｃａｂｉｌｌｙ、米国特許第４，８１６，５６７号、及びＱｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，８６：１００２９－１００３３（１９８９）を参照のこと。

【0060】

示されるように、特定の実施形態では、操作された抗体または抗原結合フラグメントの結合ドメインは、リンカーを介して結合され得る。リンカーは、操作された抗体の結合ドメインまたは抗原結合フラグメントの間の高次構造移動のための可塑性及び余地を提供し得るアミノ酸配列である。任意の適切なリンカーを使用してもよい。リンカーの例は、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．２０１３ Ｏｃｔ１５；６５（１０）：１３５７－１３６９に見出され得る。リンカーは、標的への所望の機能ドメインの提示に応じて、可塑性であっても、固定であっても、または半固定であってもよい。一般的に使用される柔軟なリンカーとしては、ＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号３４）、ＧＧＳＧＧＧＳＧＳＧ（配列番号３５）及びＧＧＳＧＧＧＳＧ（配列番号３６）などのＧｌｙ－Ｓｅｒリンカーが挙げられる。追加の例はとしては以下が挙げられる：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３７）；ＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３８）；及びＧＧＳＧＧＳ（配列番号３９）。ＣＨ３単独またはＣＨ２ＣＨ３配列などの１つ以上の抗体ヒンジ領域及び／または免疫グロブリン重鎖定常領域を含むリンカーもまた使用してもよい。

【0061】

いくつかの状況において、可塑性リンカーは、特定の使用に必要な結合ドメインの距離または配置を維持できない場合がある。これらの例では、固定または半固定のリンカーが役立つ場合がある。固定または半固定のリンカーの例としては、プロリンリッチリンカーが挙げられる。特定の実施形態では、プロリンリッチのリンカーは、偶然のみに基づいて予想されるよりも多くのプロリン残基を有するペプチド配列である。特定の実施形態では、プロリンリッチのリンカーは、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも３６％、少なくとも３９％、少なくとも４０％、少なくとも４８％、少なくとも５０％、または少なくとも５１％のプロリン残基を有するリンカーである。プロリンリッチのリンカーの特定の例としては、プロリンリッチな唾液タンパク質（ＰＲＰ）のフラグメントが挙げられる（Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ７０（１１）：１６８９－１６９５，１９８８）。

【0062】

抗体が様々な翻訳後修飾を受け得ることも当業者によって理解されるであろう。これらの修飾の種類及び程度は、抗体の発現に使用される宿主細胞株及び培養条件に依存する場合が多い。このような修飾としては、グリコシル化、メチオニン酸化、ジケトピペラジン形成、アスパラギン酸異性化、及びアスパラギン脱アミド化の変化を含み得る。

【0063】

モノクローナル抗体は、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体を含み、すなわち、集団を含む個々の抗体は、モノクローナル抗体の産生中に生じ得る可能性のあるバリアント（そのようなバリアントは一般的には少量で存在する）を除いて、同一であるか、及び／または同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対して向けられた異なる抗体を通常含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して向けられている。このタイプの抗体は、単一の抗体産生ハイブリドーマの娘細胞によって産生される。モノクローナル抗体は通常、結合する任意のエピトープに対して単一の結合親和性を示す。

【0064】

修飾因子「モノクローナル」は、抗体の均一な集団から得られるものとしての抗体の特徴を示しており、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。モノクローナル抗体は１種類の抗原のみを認識する。本明細書のモノクローナル抗体としては、重鎖及び／または軽鎖の一部が特定の種に由来するか、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同であるが、鎖（複数可）の残りの部分は、別の種に由来するか、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列、ならびにそのような抗体のフラグメントと同一または相同である、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）が挙げられる。抗体を産生するための技術は、当該技術分野で周知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８８；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ “Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９；Ｔｉｃｋｌｅ ｅｔ ａｌ．ＪＡＬＡ：Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ．２００９；１４（５）：３０３－３０７；Ｂａｂｃｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９６；９３：７８４３－７８４８；及び米国特許第５，６２７，０５２号に記載されている。

【0065】

特定の実施形態では、「親和性」とは、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有相互作用の合計の強さを指す。特に明記しない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」とは、結合対のメンバー（例えば、抗体及びペプチド）間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般に、解離定数（Ｋ_Ｄ）または結合定数（Ｋ_Ａ）で表され得る。親和性は、当該技術分野で公知の一般的な方法によって測定され得る。

【0066】

特定の実施形態では、「結合」とは、抗体の結合ドメインが、１０^－８Ｍ以下の解離定数（Ｋ_Ｄ）、特定の実施形態では１０^－５Ｍ～１０^－１３Ｍ、特定の実施形態では１０^－５Ｍ～１０^－１０Ｍ、特定の実施形態では１０^－５Ｍ～１０^－７Ｍ、特定の実施形態では１０^－８Ｍ～１０^－１３Ｍ、または特定の実施形態では１０^－９Ｍ～１０^－１３Ｍという解離定数（Ｋ_Ｄ）でその標的ペプチドと会合することを意味する。この用語はさらに、結合ドメインが、存在する他の生体分子に結合しないことを示すために使用されてもよい（例えば、それは、１０^－４Ｍ以上、特定の実施形態では１０^－４Ｍ～１Ｍという解離定数（Ｋ_Ｄ）を有する他の生体分子に結合する。

【0067】

特定の実施形態では、「結合」とは、抗体の結合ドメインが、１０^７Ｍ^－１以上の親和性定数（すなわち、会合定数、Ｋ_Ａ）、特定の実施形態では１０^５Ｍ^－１～１０^１３Ｍ^－１、特定の実施形態では１０^５Ｍ^－１～１０^１０Ｍ^－１、特定の実施形態では１０^５Ｍ^－１～１０^８Ｍ^－１、特定の実施形態では１０^７Ｍ^－１～１０^１３Ｍ^－１、または特定の実施形態では１０^７Ｍ^－１～１０^８Ｍ^－１という親和性定数でその標的ペプチドと会合することを意味する。この用語はさらに、結合ドメインが存在する他の生体分子に結合しないことを示すために使用されてもよい（例えば、それは、１０^４Ｍ^－１以下の会合定数（ＫＡ）、特定の実施形態では１０^４Ｍ^－１～１Ｍ^－１の会合定数）で他の生体分子に結合する）。

【0068】

本開示の抗体は、ＭＰＳ Ｉ及びポンペ病の診断のためのＳＲＭアッセイで検出された、本明細書に記載のペプチドの免疫親和性濃縮に使用してもよい。高親和性抗体の特定の実施形態としては、抗ＩＤＵＡ ２１８、抗ＩＤＵＡ ４６２、抗ＧＡＡ １５５、抗ＧＡＡ ３３２、抗ＧＡＡ ３７６、抗ＧＡＡ ６０１、抗ＧＡＡ８５５、抗ＧＡＡ ８８２、及び抗ＧＡＡ ８９２が挙げられる。

【0069】

特定の実施形態では、例示的抗体は、表１Ａ～１Ｃ、及び図１２に示す、ＶＨ ＣＤＲ、ＶＨドメイン、重鎖、ＬＨ ＣＤＲ、ＶＬドメイン、及び軽鎖の配列番号を含む。

【0070】

特定の実施形態では、例示的な抗体は、リーダー配列を有する、重鎖または軽鎖コード配列を含む。特定の実施形態では、例示的な抗体は、リーダー配列を有する、可変重ドメインまたは軽ドメインコード配列を含む。特定の実施形態では、例示的な抗体は、リーダーペプチドを有する、重鎖または軽鎖アミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、例示的な抗体は、引き出し線配列を有しない、重鎖または軽鎖アミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、例示的な抗体は、リーダーペプチドを有する、可変重ドメインまたは可変軽ドメインアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、例示的な抗体は、リーダーペプチドを有しない、可変重ドメインまたは可変軽ドメインアミノ酸配列を含む。

【0071】

（Ｖ）バリアント。本明細書に開示及び言及される配列のバリアントも含まれる。機能性バリアントは、タンパク質の生理学的効果に実質的に影響を及ぼさない、１つ以上の残基付加または置換を含む。機能性フラグメントは、タンパク質の生理学的効果に実質的に影響を及ぼさない、１つ以上の欠失または切断を含む。実質的な影響の欠如は、結合試験において、実験により比較結果を観察することにより確認することができる。結合ドメインの機能性バリアント及び機能性フラグメントは、野生型参照に相当するレベルで、そのコグネイト抗原またはリガンドに結合する。

【0072】

生物学的活性を損なうことなくどのアミノ酸残基を置換、挿入、または削除できるかを決定する際のガイダンスは、ＤＮＡＳＴＡＲ（商標）（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）ソフトウェアなどの当該技術分野で周知のコンピュータープログラムを使用して見出され得る。好ましくは、本明細書に開示されるタンパク質バリアントにおけるアミノ酸変化は、保存的アミノ酸変化、すなわち、同様に荷電されたアミノ酸または非荷電アミノ酸の置換である。保守的なアミノ酸の変更には、側鎖に関連するアミノ酸ファミリーの１つの置換が含まれる。

【0073】

ペプチドまたはタンパク質において、アミノ酸の適切な保存的置換は、当該技術分野の当業者に公知であり、一般に、得られる分子の生物学的活性を変えることなく行ってもよい。この分野の当業者は、一般に、ポリペプチドの非必須領域における単一アミノ酸置換は、生物学的活性を実質的に変化させないことを認識している（例えば、Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ，４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８７，Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，ｐ．２２４を参照のこと）。天然に存在するアミノ酸は、一般的に次のように保存的置換ファミリーに分類される：グループ１：アラニン（Ａｌａ）、グリシン（Ｇｌｙ）、セリン（Ｓｅｒ）、及びスレオニン（Ｔｈｒ）；グループ２：（酸性）：アスパラギン酸（Ａｓｐ）、及びグルタミン酸（Ｇｌｕ）；グループ３：（酸性；極性の負に荷電した残基及びそれらのアミドとしても分類される）：アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、Ａｓｐ、及びＧｌｕ；グループ４：Ｇｌｎ及びＡｓｎ；グループ５：（塩基性；極性の正に荷電した残基としても分類される）：アルギニン（Ａｒｇ）、リジン（Ｌｙｓ）、及びヒスチジン（Ｈｉｓ）；グループ６（大きな脂肪族、非極性残基）：イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、バリン（Ｖａｌ）、及びシステイン（Ｃｙｓ）；グループ７（非荷電極性）：チロシン（Ｔｙｒ）、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、及びＴｈｒ；グループ８（大きな芳香族残基）：フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、及びＴｙｒ；グループ９（非極性）：プロリン（Ｐｒｏ）、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、及びＴｒｐ；グループ１１（脂肪族）：Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、及びＩｌｅ；グループ１０（小さな脂肪族、非極性、またはわずかに極性の残基）：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、及びＧｌｙ；ならびにグループ１２（硫黄含有）：Ｍｅｔ及びＣｙｓ。追加情報は、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８４）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙに見出され得る。

【0074】

そのような変更を行う際に、アミノ酸のハイドロパシー指数を考慮し得る。タンパク質に相互作用的な生物学的機能を付与する際のハイドロパシーアミノ酸インデックスの重要性は、当該技術分野で一般的に理解されている（Ｋｙｔｅ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７（１），１０５－３２）。各アミノ酸には、その疎水性及び電荷特徴に基づいてハイドロパシーインデックスが割り当てられている（Ｋｙｔｅ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２）。これらの値は次のとおりである。Ｉｌｅ（＋４．５）；Ｖａｌ（＋４．２）；Ｌｅｕ（＋３．８）；Ｐｈｅ（＋２．８）；Ｃｙｓ（＋２．５）；Ｍｅｔ（＋１．９）；Ａｌａ（＋１．８）；Ｇｌｙ（－０．４）；Ｔｈｒ（－０．７）；Ｓｅｒ（－０．８）；Ｔｒｐ（－０．９）；Ｔｙｒ（－１．３）；Ｐｒｏ（－１．６）；Ｈｉｓ（－３．２）；グルタミン酸塩（－３．５）；Ｇｌｎ（－３．５）；アスパラギン酸塩（－３．５）；Ａｓｎ（－３．５）；Ｌｙｓ（－３．９）；及びＡｒｇ（－４．５）。

【0075】

特定のアミノ酸が、同様のハイドロパシー指数またはスコアを有する他のアミノ酸によって置換され得、それでも同様の生物学的活性を有するタンパク質をもたらし得る、すなわち、生物学的に機能的に同等のタンパク質を依然として得ることが当該技術分野で公知である。このような変更を行う際には、ハイドロパシー指数が±２以内のアミノ酸の置換が好ましく、±１以内のアミノ酸の置換が特に好ましく、±０．５以内のアミノ酸の置換がさらに特に好ましい。同様のアミノ酸の置換は、親水性に基づいて効果的に行うことができることも当該技術分野で理解されている。

【0076】

米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されているように、以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられている：Ａｒｇ（＋３．０）；Ｌｙｓ（＋３．０）；アスパラギン酸塩（＋３．０±１）；グルタミン酸塩（＋３．０±１）；Ｓｅｒ（＋０．３）；Ａｓｎ（＋０．２）；Ｇｌｎ（＋０．２）；Ｇｌｙ（０）；Ｔｈｒ（－０．４）；Ｐｒｏ（－０．５±１）；Ａｌａ（－０．５）；Ｈｉｓ（－０．５）；Ｃｙｓ（－１．０）；Ｍｅｔ（－１．３）；Ｖａｌ（－１．５）；Ｌｅｕ（－１．８）；Ｉｌｅ（－１．８）；Ｔｙｒ（－２．３）；Ｐｈｅ（－２．５）；Ｔｒｐ（－３．４）。アミノ酸は、同様の親水性値を有する別のアミノ酸で置換されてもよく、それでも生物学的に同等の、特に免疫学的に同等のタンパク質を得ることができることが理解される。そのような変化において、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内のものが特に好ましく、そして±０．５内のものがさらに特に好ましい。

【0077】

上記で概説したように、アミノ酸置換は、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づき得る。

【0078】

特定の実施形態では、結合ドメインＶＨ領域は、既知の抗体または本明細書で開示する抗体のＶＨに由来することができるか、またはこれに基づくことができ、場合により、既知の抗体または本明細書で開示する抗体のＶＨと比較して、１つ以上の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個の）挿入、１つ以上の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個の）欠失、１つ以上の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個の）アミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換もしくは非保存的アミノ酸置換）、または、上述の変化の組合せを含有することができる。挿入、欠失、または置換は、ＶＨ領域のアミノもしくはカルボキシ末端、または両端を含む、本領域のあらゆる箇所に存在し得るが、但し、各ＣＤＲは、変化がゼロか、または最大でも、１、２、もしくは３個の変化を含み、また、但し、修飾ＶＨ領域を含有する結合ドメインは依然として、野生型結合ドメインと同様の親和性で、その標的に特異的に結合することができる。

【0079】

特定の実施形態では、結合ドメイン中のＶＬ領域は、既知の抗体または本明細書で開示する抗体のＶＬに由来するか、またはこれに基づき、場合により、既知の抗体または本明細書で開示する抗体のＶＬと比較して、１つ以上の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個の）挿入、１つ以上の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個の）欠失、１つ以上の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個の）アミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）、または、上述の変化の組合せを含有する。挿入、欠失、または置換は、ＶＬ領域のアミノもしくはカルボキシ末端、または両端を含む、本領域のあらゆる箇所に存在し得るが、但し、各ＣＤＲは、変化がゼロか、または最大でも、１、２、もしくは３個の変化を含み、また、但し、修飾ＶＬ領域を含有する結合ドメインは依然として、野生型結合ドメインと同様の親和性で、その標的に特異的に結合することができる。

【0080】

他の場所で示されるように、遺伝子配列のバリアントとしては、コドン最適化バリアント、配列多型、スプライスバリアント、及び／またはコード化産物の機能に統計的に有意な程度に影響を及ぼさない突然変異が挙げられる。

【0081】

タンパク質、核酸、及び遺伝子配列のバリアントとしてはまた、本明細書に開示されるタンパク質、核酸、または遺伝子配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、８０％の配列同一性、８５％の配列、９０％の配列同一性、９５％の配列同一性、９６％の配列同一性、９７％の配列同一性、９８％の配列同一性、または９９％の配列同一性を有する配列も挙げられる。

【0082】

「％配列同一性」とは、配列を比較することによって決定される、２つ以上の配列間の関係を指す。当該技術分野において、「同一性」はまた、そのような配列のストリング間の一致によって決定される、タンパク質、核酸、または遺伝子配列間の配列関連性の程度を意味する。「同一性」（しばしば「類似性」と呼ばれる）は、以下に記載されているものを含む（ただしこれらに限定されない）公知の方法によって容易に計算され得る：Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，ＡＭ．，ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９４）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，及びＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ（１９９４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ，Ｇ．，ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８７）；及びＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．及びＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９２）。同一性を決定するための好ましい方法は、試験される配列の間の最適適合を得るように設計される。同一性及び類似性を決定するための方法は、公的に利用可能なコンピュータープログラムに体系化されている。配列アラインメント及びパーセント同一性計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ、Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）のＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを使用して実行され得る。配列のマルチプルアラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌのアラインメント方法（Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ ＣＡＢＩＯＳ，５，１５１－１５３（１９８９）をデフォルトのパラメーター（ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０，ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０）で使用しても実行され得る。関連するプログラムとしてはまた、プログラムのＧＣＧスイート（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）；ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）；ＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）；及びＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを組み込んだＦＡＳＴＡプログラム（Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４），Ｍｅｅｔｉｎｇ Ｄａｔｅ １９９２，１１１－２０．Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ．Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．。この開示の文脈内で、配列分析ソフトウェアが分析に使用される場合、分析の結果は、参照されるプログラムの「デフォルト値」に基づいていることが理解されよう。本明細書で使用される「デフォルト値」とは、元々最初に初期化されたときソフトウェアをロードする任意の設定の値またはパラメーターを意味する。

【0083】

（ＶＩ）ペプチドの濃縮戦略。ＳＲＭの前の所望のペプチド標的の濃縮は、当該技術分野で公知の任意の手段によって達成され得る。試料からの豊富なタンパク質種の免疫吸着ベースの枯渇、沈殿、クロマトグラフィー、電気泳動、溶媒分配、免疫沈降、免疫電気泳動、及び免疫クロマトグラフィーを含む、多くの濃縮手順が利用可能である。特定の実施形態では、試料の消化物からの個々のトリプシンペプチドの特異的抗体ベースの捕捉のためのＳＩＳＣＡＰＡ法を使用してもよい（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００４；３：２３５－２４４；米国特許第７，６３２，６８６号）。

【0084】

特定の実施形態では、本明細書に開示される抗体などのペプチドマーカーに結合する抗体は、固体支持体に付着され得る。特定の実施形態は、抗体がクロマトグラフィー媒体に共有結合しているアフィニティーカラムを使用する。特定の実施形態では、ＰＯＲＯＳ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）ナノカラムを、ＳＩＳＣＡＰＡ濃縮で使用してもよく、高い結合能力、標的ペプチドの迅速な濃縮を可能にする比較的高濃度の抗体、及び様々な官能化基によってカラムを調製する能力を特徴とする。あるいは、抗体は、ビーズ、磁気ビーズ、または他の固体粒子に付着されてもよい。付着の１つの手段は、ビーズ上にコーティングされたタンパク質への抗体の結合である。例えば、プロテインＧでコーティングされた粒子は、好ましい方向で抗体の結合を提供する。ビーズを抗体で直接コーティングするなど、他の付着手段を使用してもよい。磁性粒子は、抗体への結合を可能にする多様な化学物質で利用し得る。粒子に付着した抗体で濃縮すると、試料の並列処理が可能になる。磁粉処理は、質量分析による分析のためにプレートで溶出するＳＩＳＣＡＰＡ濃縮ステップ用に９６ウェルプレートで自動化されている。他の特定の実施形態は、ナノフロークロマトグラフィーシステムに沿ってビーズ処理ステップを実行するために開発された新規のビーズトラップデバイスを使用する（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ２００９；８（５）：９９５－１００５）。これにより、溶出ステップと分析ステップの間の容器へのペプチドの損失が最小限に抑えられる。ペプチド濃縮は、ピペットチップに抗ペプチド抗体を固定化することによっても実行され得る（Ｎｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．１９９５；６７（７）：１１５３－１１５８）。遊離ペプチドから抗体結合ペプチドを分離した後、結合ペプチドを溶出し得る。任意の溶出手段を使用してもよい。効率的であることがわかっている１つの溶出手段は、５％酢酸／３％アセトニトリルである。特定のペプチドに効率的であるように、他の酸を含む他の溶出手段、及び他の濃度の酢酸を使用してもよい。

【0085】

（ＶＩＩ）液体クロマトグラフィー（ＬＣ）。特定の実施形態では、１つ以上のＬＣ精製ステップを、ＳＲＭ－ＭＳの前に実行する。濃縮ペプチドの混合物（移動相）は、材料が充填されたカラム（固定相）を通過して、カラムの移動相と固定相に対する重量と親和性に基づいてペプチドを分離し得る。従来のＬＣ分析は、試料成分とカラム充填物質との間の化学的相互作用に依存しており、カラムを通過する試料の層流が、試験試料から目的の分析物を分離するための基礎である。当業者は、そのようなカラムでの分離が拡散プロセスであることを理解するであろう。試料のクロマトグラフィー分離にはさまざまなカラムパッキング材料が利用可能であり、適切な分離プロトコルの選択は、試料の特性、目的の分析物、存在する干渉物質及びその特性などに依存する経験的プロセスである。さまざまなパッキングケミストリーを、必要に応じて使用してもよい（例えば、精製される化合物の構造、極性、溶解性）。特定の実施形態では、カラムは、極性、イオン交換（カチオン及びアニオンの両方）、疎水性相互作用、フェニル、Ｃ－２、Ｃ－８、Ｃ－１８カラム、多孔質ポリマー上の極性コーティング、またはその他の市販されているものである。クロマトグラフィーの間、材料の分離は、溶離液（「移動相」としても知られる）の選択、勾配溶出の選択、及び勾配条件、温度などの変数の影響を受ける。特定の実施形態では、分析物は、目的の分析物がカラムパッキング材料によって可逆的に保持され、１つ以上の他の材料が保持されない条件下で、試料をカラムにアプライすることによって精製され得る。これらの実施形態では、目的の分析物がカラムによって保持される第１の移動相条件を使用してもよく、その後、保持されていない材料が一旦洗浄されれば、第２の移動相条件を使用して、保持された材料をカラムから除去してもよい。あるいは、分析物は、目的の分析物が１つ以上の他の材料と比較して異なる速度で溶出する、移動相条件下でカラムに試料をアプライすることによって精製され得る。上記のように、そのような手順は、試料の他の１つ以上の成分と比較して、目的の１つ以上の分析物の量を濃縮し得る。特定の実施形態では、ＬＣは、マイクロフローＬＣ（マイクロＬＣ）である。マイクロフローＬＣでは、クロマトグラフィー分離は、毎分少ないマイクロリットルの範囲の流量を使用して実行される。特定の実施形態では、ＬＣは、ナノフローＬＣ（ナノＬＣ）である。ナノフローＬＣ（ｎａｎｏＬＣ）では、クロマトグラフィー分離は、毎分３００ナノリットルの範囲の流量を使用して実行される。示した流速により、このタイプのクロマトグラフィーによって得られる高い濃縮効率に起因して、高い分析感度が得られる（Ｃｕｔｉｌｌａｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｎａｎｏｓｃｉｅｎｃｅ，２００５；１：６５－７１）。

【0086】

（ＶＩＩＩ）質量分析（ＭＳ）。質量分析計には、気相イオンの質量電荷（ｍ／ｚ）比に変換できるパラメーターを測定する気相イオン分光計が備えられている。質量分析とは、質量分析計を使用して気相イオンを検出することを指す。質量分析計には通常、イオン源及び質量分析計が含まれる。質量分析計の例は、飛行時間型（ＴＯＦ）、磁気セクター、四重極フィルター、イオントラップ、イオンサイクロトロン共鳴、静電セクターアナライザー、及びこれらのハイブリッドである。レーザー脱離質量分析計には、分析物を脱離、揮発、及びイオン化する手段としてレーザーエネルギーを使用する質量分析計が備えられる。タンデム質量分析計には、イオン混合物中のイオンを含むイオンのｍ／ｚベースの識別または測定の２つの連続した段階を実行し得る任意の質量分析計を備える。このフレーズには、ｍ／ｚベースの識別またはイオンの空間的タンデム測定の２つの連続した段階を実行し得る２つの質量分析計を備えた質量分析計が含まれる。このフレーズはさらに、ｍ／ｚベースの識別またはイオンの時間的タンデム測定の２つの連続する段階を実行し得る単一の質量分析器を有する質量分析計を含む。したがって、このフレーズには、Ｑｑ－ＴＯＦ質量分析計、イオントラップ質量分析計、イオントラップ－ＴＯＦ質量分析計、ＴＯＦ－ＴＯＦ質量分析計、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計、静電セクター－磁気セクター質量分析計、トリプル四重極質量分析計、及びそれらの組合せが明示的に含まれる。

【0087】

質量分析におけるイオン化には、試料中の分析物がイオン化されるプロセスを含む。このような分析物は、さらなる分析に使用される荷電分子になる場合がある。例えば、試料のイオン化は、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、レーザースプレーイオン化（ＬＳＩ）、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）、光イオン化、電子イオン化、高速原子衝撃（ＦＡＢ）／液体二次イオン化（ＬＳＩＭＳ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）、フィールドイオン化、フィールド脱離、サーモスプレー／プラズマスプレーイオン化、及び粒子ビームイオン化によって実行され得る。当業者は、イオン化方法の選択が、測定される分析物、試料のタイプ、検出器のタイプ、ポジティブモード対ネガティブモードの選択などに基づいて決定され得ることを理解するであろう。

【0088】

質量分析器は、イオン化された質量を取り、それらをｍ／ｚ比に基づいて分離し、それらを検出器に出力し、ここでそれらが検出され、後でデジタル出力に変換される質量分析計の構成要素を備える。ｍ／ｚ比を決定するための適切な質量分析計としては、四重極質量分析計、飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析計、磁気または静電セクター質量分析計、及びイオントラップ（例えば、イオンサイクロトロン共鳴）質量分析計が挙げられる。

【0089】

選択された反応モニタリング（ＳＲＭ）－ＭＳアッセイは、目的の所定のタンパク質について所定のペプチドのセットを標的とする。ＳＲＭは、タンデム質量分析の第１段階で特定の質量のイオン（親イオンまたはプリカーサーイオン）を選択し、検出のための第２質量分析ステージでプリカーサーイオンのフラグメンテーション反応のイオン生成物を選択するタンデム質量分析モードである。選択したプリカーサーイオン及びフラグメントイオンに関連付けられたｍ／ｚ値の特定のペアは、トランジションと呼ばれる。各シグネチャーペプチドについて、最適なシグナル強度を提供し、試料に存在する他の種から標的されたペプチドを区別するフラグメントイオンが識別される。最適化されたトランジションは、効果的なＳＲＭアッセイに貢献する。このようないくつかのトランジション（プリカーサー／フラグメントイオン対）を経時的にモニターし、特定のトランジションの保持時間及びシグナル強度を座標として有する一連のクロマトグラフィートレースが生成される。シグネチャーペプチドのＳＲＭ－ＭＳ分析は、通常、トリプル四重極質量分析計（ＱＱＱ－ＭＳ）で実行され、これは、シグネチャーペプチドのｍ／ｚに対応するプリカーサーイオンを選択的に分離し、ペプチド特異的なフラグメントイオンを選択的にモニターする機能を備えた機器である。ＳＲＭ分析では、特異性は複数の質量分析計（質量フィルター）に依存する。最初の四重極は、所望の親イオンまたはプリカーサーイオンを選択するためである。第３の四重極は、（１つ以上の）フラグメントイオン（複数可）をモニターするためである。フラグメントイオン（複数可）は、第２の四重極で衝突によって誘発される解離によって生成される。共溶出するバックグラウンドイオンが非常に効果的にろ過されるので、２つのレベルの質量選択により高い選択性が可能になる。試料中の全ての分析物を調査する従来のタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）実験とは異なり、ＳＲＭ分析は、特定の分析物を選択的に標的（フィルター）し、これは、従来の「フルスキャン」技術と比較して感度が１桁または２桁向上することを意味する。さらに、ＳＲＭは、最大５桁の広いダイナミックレンジにわたって線形応答を提供する。これにより、非常に複雑な混合物中の少量のタンパク質の検出が可能になる。したがって、ＳＲＭは、バックグラウンド干渉が少ない、非常に特殊な検出／モニタリング方法である。１回のＭＳ実施で複数の親イオンをモニタリングする場合、このタイプの分析は、マルチプルリアクションモニタリング（ＭＲＭ）として公知である。ＭＲＭ分析を使用すると、１回の質量分析実施で複数のタンパク質及びタンパク質の複数の領域（シグネチャーペプチド）をモニタリングし得る。選択された反応モニタリング／多重反応モニタリング質量分析（ＳＲＭ／ＭＲＭ－ＭＳ）は、例えば、米国特許第８，３８３，４１７号、ＷＯ２０１３／１０６６０３、及び米国特許出願公開第２０１３／１０５６８４号に記載されている。

【0090】

特定の実施形態では、以下のパラメーターを使用して、特定のＬＣ－ＳＲＭ－ＭＳシステム下でのタンパク質のＬＣ－ＳＲＭ－ＭＳアッセイを特定し得る：（１）所定のタンパク質の濃縮トリプシンペプチド；（２）ＬＣカラムでのペプチドの保持時間（ＲＴ）；（３）ペプチドプリカーサーイオンのｍ／ｚ値；（４）プリカーサーイオンをイオン化するために使用されるデクラスタリングポテンシャル；（５）ペプチドプリカーサーイオンから生成されたフラグメントイオンのｍ／ｚ値；及び（６）特定のペプチド用に最適化されたペプチドプリカーサーイオンをフラグメント化するために使用される衝突エネルギー（ＣＥ）。ＲＴには、分析物の注入から溶出までの経過時間が含まれる。デクラスタリングポテンシャル（ＤＰ）には、イオンクラスターを溶解及び解離するための電位が含まれる。これは、製造業者次第で、「フラグメント電圧」または「イオントランスファーキャピラリオフセット電圧」としても公知である。衝突エネルギー（ＣＥ）には、プリカーサーイオンが衝突セルに加速されるときに受け取るエネルギーの量が含まれる。

【0091】

本明細書に開示される方法によるペプチドの正確な定量化を容易にするために、目的のペプチドの同位体標識された合成バージョンのセットを、内部標準として使用するために既知の量で試料に添加してもよい。同位体標識ペプチドは、対応する代理のペプチドと同一の物理的及び化学的特性を有するので、クロマトグラフィーカラムから共溶出し、得られたマススペクトルで容易に識別可能である（Ｇｅｒｂｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｓｓｏ．Ｓｃｉ．２００３；１００：６９４０－６９４５；Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００５；３５：２６５－２７３）。所定のペプチドのアミノ酸を標識できる同位体としては、^１３Ｃ、^２Ｈ、^１５Ｎ、^１７Ｏ、^１８Ｏ、及び^３４Ｓが挙げられる。特定の実施形態では、ペプチドは、^１３Ｃ及び／または^１５Ｎの重同位体で標識されている。標識標準の添加は、タンパク質分解消化の前または後に行ってもよい。特定の実施形態では、標識された内部標準ペプチドを、タンパク質分解消化の前に加える。同位体標識されたペプチドを合成する方法は、当業者に公知であろう。したがって、特定の実施形態では、実験試料は、内部標準ペプチドを含む。特定の実施形態では、内部標準ペプチドは、参照シグネチャーペプチドを含む。特定の実施形態では、シグネチャーペプチド濃度は、以下を組み合わせることによって決定され得る：（ｉ）シグネチャーペプチドのピーク面積を、ＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳアッセイから得られたその対応する参照シグネチャーペプチドのピーク面積と比較することから計算された比、及び（ｉｉ）参照シグネチャーペプチドの既知の濃度。参照標準として選択され、定量に適したペプチドは、量子型ペプチド（Ｑ－ペプチド）と呼ばれることもある。Ｑ－ペプチドは、プロテオタイプペプチドの全ての特性を含むが、人工的な修飾及び／または不完全な切断を根絶するために参照ペプチドを構成し得る残基にも制限を課す（Ｈｏｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ ２０１２；４（１４）：１７６３－１７８６）。

【0092】

所定のタンパク質（複数可）の絶対定量的レベルは、ＳＲＭ／ＭＲＭ方法論によって決定され得、それにより、１つの生物学的試料中の所定のタンパク質からの個々のペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積を、既知量の「スパイクされた」内部標準のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積と比較する。特定の実施形態では、内部標準は、１つ以上の重い同位体で標識された１つ以上のアミノ酸残基を含む同じ正確なペプチドの合成バージョンである。このような同位体標識内部標準は、質量分析がネイティブペプチドシグネチャピークとは異なっており、かつ別個であり、コンパレータピークとして使用され得る、予測可能でかつ一貫性のあるＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピークを生成するように合成される。したがって、内部標準を生物学的試料由来のタンパク質調製物に既知の量でスパイクし、質量分析によって分析すると、ネイティブペプチドのシグネチャーピーク面積が内部標準ペプチドのシグネチャーピーク面積と比較され、この数値比較が、生物学的試料からの元のタンパク質調製物に存在する天然ペプチドの絶対モル濃度及び／または絶対重量のいずれかを示す。フラグメントペプチドの絶対定量データは、試料ごとに分析されたタンパク質の量に従って表示される。絶対定量を、多くのペプチド、したがってタンパク質にわたって、単一の試料で同時に、及び／または多くの試料にわたって実行して、個々の生物学的試料及び個々の試料のコホート全体におけるタンパク質の絶対量に関する洞察を得てもよい。

【0093】

ペプチドの絶対定量のための別の戦略は、イコライザーペプチドによる等モル性である。この方法論では、同位体標識された目的のＱペプチドをジペプチドとして化学的に合成することを含む。一般的なアミノ酸配列は、Ｑ－ペプチドのＮ末端に位置し、イコライザーペプチドと呼ばれる。可溶化及びタンパク質分解消化後、Ｑ－ペプチドの量は、単一の光標識ペプチドを参照することにより正確に決定され得る。次に、適切な量の各標準ペプチドを目的の試料に追加して（前消化またはタンパク質分解前のいずれか）、絶対定量を容易にする（Ｈｏｌｚｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００９；８１：１０２５４－１０２６１）。絶対定量には、定量コンカテマー（ＱｃｏｎＣＡＴ）タンパク質を使用してもよい（Ｂｅｙｎｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００５；２：５８７－５８９；Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２００９；２０：２２１１－２２２０；Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ．２０１１；１０：３６５２－３６５９；Ｃａｒｏｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＆Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ２０１１；Ｓｅｐ １９：ｍｃｐ－Ｍ１１１）。この戦略では、親和性のタグ付けされた、目的のいくつかのタンパク質由来の標準ペプチドの連結である組換え人工タンパク質が、安定した同位体濃縮培地で増殖したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉで異種生産される。次に、ＱｃｏｎＣＡＴタンパク質は、アフィニティー精製され、試料と共消化され、それを構成する全ての「重い」Ｑペプチドの化学量論的混合物が生成され、ネイティブタンパク質由来のタンパク質分解ペプチド及び内部標準を、その後分析する。ペプチド連結型標準（ｐｅｐｔｉｄｅ－ｃｏｎｃａｔｅｎａｔｅｄ ｓｔａｎｄａｒｄｓ）（ＰＣＳ）と呼ばれるＱｃｏｎＣＡＴアプローチの変形は、内因性環境を反映する人工タンパク質配列内のＱペプチド間の隣接領域を使用する（Ｋｉｔｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ．２００７；６：７９２－８００）。他の特定の実施形態は、絶対定量化（ＰＳＡＱ）のためにタンパク質標準を使用する（Ｂｒｕｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ２００７；６：２１３９－２１４９）。ＰＳＡＱは、組換えタンパク質を使用するが、いくつかのタンパク質からのペプチドの連結ではなく、定量されるタンパク質全体が、安定な同位体標識された形で発現される。次に、１つ以上のＰＳＡＱを、試料の前消化に追加して、定量を容易にしてもよい。

【0094】

特定の実施形態は、強度ベースの測定（Ａｍｅｒｉｃａ ａｎｄ Ｃｏｒｄｅｗｅｎｅｒ，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ２００８；８：７３１－７４９）またはスペクトルカウント（Ｌｕｎｄｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ２０１０；７：３９－５３）などのタンパク質定量化のための標識なしの戦略を使用する。

【0095】

所定のペプチドの相対的定量的レベルを取得するために、１つの生物学試料における所定のタンパク質からの個々のペプチドまたは複数のペプチドの質量分析由来のシグネチャーピーク面積（またはピークが十分に分解されている場合はピーク高さ）を、同じＳＲＭ／ＭＲＭ手法を使用して、１つ以上の追加のかつ異なる生物学的試料で、同じペプチドまたは同じタンパク質由来のペプチドに対して決定されたシグネチャーピーク面積と比較してもよい。このようにして、所定のタンパク質由来の特定のペプチド（複数可）の量は、同じ実験条件下での２つ以上の生物学的試料にまたがり同じペプチドまたは同じタンパク質由来のペプチドと比較して決定される。さらに、ＳＲＭ／ＭＲＭ手法により、その所定のタンパク質のそのペプチドのシグネチャーピーク面積を、生物学的試料由来の同じタンパク質調製物内の異なるタンパク質由来の別の異なるペプチド（複数可）についてのシグネチャーピーク面積に対して比較することにより、単一の試料内の単一のタンパク質由来の所定のペプチド（複数可）について、相対定量を決定し得る。このようにして、所定のタンパク質由来の特定のペプチドの量、したがって所定のタンパク質の量を、同じ試料内の別のタンパク質と比較して決定する。これらのアプローチは、所定のタンパク質由来の個々のペプチド（複数可）を、試料間及び試料内の同じタンパク質由来または異なるタンパク質由来の別のペプチド（複数可）の量に対して定量し、ここで、シグネチャーピーク面積によって決定される量は、この生物学的試料由来のタンパク質調製物中のペプチドの絶対重量対容積または重量対重量の量に関係なく、互いに相対的である。異なる試料間の個々のシグネチャーピーク面積に関する相対的な定量データは、試料ごとに分析されたタンパク質の量に正規化してもよい。相対定量を、単一の試料中で同時に多くのペプチドにわたって、及び／または多くの試料にわたって実行して、相対的なタンパク質量についての洞察を得てもよい。

【0096】

シグネチャーペプチドレベルは、濃度単位（例えば、ｐｍｏｌ／Ｌ）で表してもよい。特定の実施形態では、ＭＰＳ Ｉ及び／またはポンペ病についてスクリーニングされている対象に由来する試験試料中のシグネチャーペプチドの平均濃度を、正常な対照試料中の対応するペプチドの平均濃度と比較してもよい。特定の実施形態では、正常対照試料は、１つ以上の正常な対照対象から、または正常な対照対象の集団から誘導され得る。特定の実施形態では、正常な対照対象としては、ＭＰＳ Ｉ及び／またはポンペ病を有しないか、または有することが知られていない対象が挙げられる。

【0097】

特定の実施形態では、正常な対照対象としては、ＭＰＳ Ｉまたはポンペ病に関連する遺伝子変異を有しない対象が挙げられる。

【0098】

特定の実施形態では、正常な対照対象の集団由来のＤＢＳにおけるＩＤＵＡシグネチャーペプチドの平均濃度は、１０ｐｍｏｌ／Ｌ～３５０ｐｍｏｌ／Ｌの範囲、１５０ｐｍｏｌ／Ｌ～３００ｐｍｏｌ／Ｌの範囲、及び２０ｐｍｏｌ／Ｌ～２５０ｐｍｏｌ／Ｌの範囲の濃度を含む。特定の実施形態では、正常な対照対象の集団由来のＤＢＳにおける、ＩＤＵＡ ２１８シグネチャーペプチドの平均濃度は、１０ｐｍｏｌ／Ｌ、１５ｐｍｏｌ／Ｌ、２０ｐｍｏｌ／Ｌ、２５ｐｍｏｌ／Ｌ、３０ｐｍｏｌ／Ｌ、３５ｐｍｏｌ／Ｌ、４０ｐｍｏｌ／Ｌ、４５ｐｍｏｌ／Ｌ、５０ｐｍｏｌ／Ｌ、５５ｐｍｏｌ／Ｌ、６０ｐｍｏｌ／Ｌ、６５ｐｍｏｌ／Ｌ、７０ｐｍｏｌ／Ｌ、７５ｐｍｏｌ／Ｌ、８０ｐｍｏｌ／Ｌ、８５ｐｍｏｌ／Ｌ、９０ｐｍｏｌ／Ｌ、９５ｐｍｏｌ／Ｌ、１００ｐｍｏｌ／Ｌ、１１０ｐｍｏｌ／Ｌ、１２０ｐｍｏｌ／Ｌ、１３０ｐｍｏｌ／Ｌ、１４０ｐｍｏｌ／Ｌ、１５０ｐｍｏｌ／Ｌ、１６０ｐｍｏｌ／Ｌ、１７０ｐｍｏｌ／Ｌ、１８０ｐｍｏｌ／Ｌ、１９０ｐｍｏｌ／Ｌ、２００ｐｍｏｌ／Ｌ、２１０ｐｍｏｌ／Ｌ、２２０ｐｍｏｌ／Ｌ、２３０ｐｍｏｌ／Ｌ、２４０ｐｍｏｌ／Ｌ、２５０ｐｍｏｌ／Ｌ、２６０ｐｍｏｌ／Ｌ、２７０ｐｍｏｌ／Ｌ、２８０ｐｍｏｌ／Ｌ、２９０ｐｍｏｌ／Ｌ、３００ｐｍｏｌ／Ｌ、３１０ｐｍｏｌ／Ｌ、３２０ｐｍｏｌ／Ｌ、３３０ｐｍｏｌ／Ｌ、３４０ｐｍｏｌ／Ｌ、３５０ｐｍｏｌ／Ｌ、またはそれ以上の濃度を含む。

【0099】

特定の実施形態では、正常な対照対象の集団由来のＰＢＭＣにおける、ＩＤＵＡ ２１８シグネチャーペプチドの平均濃度は、３００ｐｍｏｌ／Ｌ～１０００ｐｍｏｌ／Ｌの範囲、３５０ｐｍｏｌ／Ｌ～８００ｐｍｏｌ／Ｌの範囲、及び４００ｐｍｏｌ／Ｌ～７００ｐｍｏｌ／Ｌの範囲の濃度を含む。特定の実施形態では、正常な対照対象の集団由来のＰＢＭＣにおける、ＩＤＵＡ ２１８シグネチャーペプチドの平均濃度は、３００ｐｍｏｌ／Ｌ、３１０ｐｍｏｌ／Ｌ、３２０ｐｍｏｌ／Ｌ、３３０ｐｍｏｌ／Ｌ、３４０ｐｍｏｌ／Ｌ、３５０ｐｍｏｌ／Ｌ、３６０ｐｍｏｌ／Ｌ、３７０ｐｍｏｌ／Ｌ、３８０ｐｍｏｌ／Ｌ、３９０ｐｍｏｌ／Ｌ、４００ｐｍｏｌ／Ｌ、４１０ｐｍｏｌ／Ｌ、４２０ｐｍｏｌ／Ｌ、４３０ｐｍｏｌ／Ｌ、４４０ｐｍｏｌ／Ｌ、４５０ｐｍｏｌ／Ｌ、４６０ｐｍｏｌ／Ｌ、４７０ｐｍｏｌ／Ｌ、４８０ｐｍｏｌ／Ｌ、４９０ｐｍｏｌ／Ｌ、５００ｐｍｏｌ／Ｌ、５１０ｐｍｏｌ／Ｌ、５２０ｐｍｏｌ／Ｌ、５３０ｐｍｏｌ／Ｌ、５４０ｐｍｏｌ／Ｌ、５５０ｐｍｏｌ／Ｌ、５６０ｐｍｏｌ／Ｌ、５７０ｐｍｏｌ／Ｌ、５８０ｐｍｏｌ／Ｌ、５９０ｐｍｏｌ／Ｌ、６００ｐｍｏｌ／Ｌ、６１０ｐｍｏｌ／Ｌ、６２０ｐｍｏｌ／Ｌ、６３０ｐｍｏｌ／Ｌ、６４０ｐｍｏｌ／Ｌ、６５０ｐｍｏｌ／Ｌ、６６０ｐｍｏｌ／Ｌ、６７０ｐｍｏｌ／Ｌ、６８０ｐｍｏｌ／Ｌ、６９０ｐｍｏｌ／Ｌ、７００ｐｍｏｌ／Ｌ、７１０ｐｍｏｌ／Ｌ、７２０ｐｍｏｌ／Ｌ、７３０ｐｍｏｌ／Ｌ、７４０ｐｍｏｌ／Ｌ、７５０ｐｍｏｌ／Ｌ、７６０ｐｍｏｌ／Ｌ、７７０ｐｍｏｌ／Ｌ、７８０ｐｍｏｌ／Ｌ、７９０ｐｍｏｌ／Ｌ、８００ｐｍｏｌ／Ｌ、８１０ｐｍｏｌ／Ｌ、８２０ｐｍｏｌ／Ｌ、８３０ｐｍｏｌ／Ｌ、８４０ｐｍｏｌ／Ｌ、８５０ｐｍｏｌ／Ｌ、８６０ｐｍｏｌ／Ｌ、８７０ｐｍｏｌ／Ｌ、８８０ｐｍｏｌ／Ｌ、８９０ｐｍｏｌ／Ｌ、９００ｐｍｏｌ／Ｌ、９１０ｐｍｏｌ／Ｌ、９２０ｐｍｏｌ／Ｌ、９３０ｐｍｏｌ／Ｌ、９４０ｐｍｏｌ／Ｌ、９５０ｐｍｏｌ／Ｌ、９６０ｐｍｏｌ／Ｌ、９７０ｐｍｏｌ／Ｌ、９８０ｐｍｏｌ／Ｌ、９９０ｐｍｏｌ／Ｌ、１０００ｐｍｏｌ／Ｌ、またはそれ以上の濃度を含む。

【0100】

特定の実施形態では、正常な対照対象の集団由来の口腔スワブ試料における、ＩＤＵＡ ２１８シグネチャーペプチドの平均濃度は、１００ｐｍｏｌ／Ｌ～１０００ｐｍｏｌ／Ｌの範囲、１００ｐｍｏｌ／Ｌ～９００ｐｍｏｌ／Ｌの範囲、及び１００ｐｍｏｌ／Ｌ～８００ｐｍｏｌ／Ｌの範囲の濃度を含む。特定の実施形態では、正常な対照対象の集団由来の口腔スワブ試料における、ＩＤＵＡ ２１８シグネチャーペプチドの平均濃度は、１００ｐｍｏｌ／Ｌ、１２５ｐｍｏｌ／Ｌ、１５０ｐｍｏｌ／Ｌ、１７５ｐｍｏｌ／Ｌ、２００ｐｍｏｌ／Ｌ、２２５ｐｍｏｌ／Ｌ、２５０ｐｍｏｌ／Ｌ、２７５ｐｍｏｌ／Ｌ、３００ｐｍｏｌ／Ｌ、３２５ｐｍｏｌ／Ｌ、３５０ｐｍｏｌ／Ｌ、３７５ｐｍｏｌ／Ｌ、４００ｐｍｏｌ／Ｌ、４２５ｐｍｏｌ／Ｌ、４５０ｐｍｏｌ／Ｌ、４７５ｐｍｏｌ／Ｌ、５００ｐｍｏｌ／Ｌ、５２５ｐｍｏｌ／Ｌ、５５０ｐｍｏｌ／Ｌ、５７５ｐｍｏｌ／Ｌ、６００ｐｍｏｌ／Ｌ、６２５ｐｍｏｌ／Ｌ、６５０ｐｍｏｌ／Ｌ、６７５ｐｍｏｌ／Ｌ、７００ｐｍｏｌ／Ｌ、７２５ｐｍｏｌ／Ｌ、７５０ｐｍｏｌ／Ｌ、７７５ｐｍｏｌ／Ｌ、８００ｐｍｏｌ／Ｌ、８２５ｐｍｏｌ／Ｌ、８５０ｐｍｏｌ／Ｌ、８７５ｐｍｏｌ／Ｌ、９００ｐｍｏｌ／Ｌ、９２５ｐｍｏｌ／Ｌ、９５０ｐｍｏｌ／Ｌ、９７５ｐｍｏｌ／Ｌ、１０００ｐｍｏｌ／Ｌ、またはそれ以上の濃度を含む。特定の実施形態では、正常な対照対象の集団由来の口腔スワブ試料における、ＩＤＵＡ ２１８シグネチャーペプチドの平均濃度は、３０ｐｍｏｌ／ｇのタンパク質～８５ｐｍｏｌ／ｇのタンパク質の範囲、３０ｐｍｏｌ／ｇのタンパク質～８０ｐｍｏｌ／ｇのタンパク質の範囲、及び、３０ｐｍｏｌ／ｇのタンパク質～７０ｐｍｏｌ／ｇのタンパク質の範囲の濃度を含む。特定の実施形態では、正常な対照対象の集団由来の口腔スワブ試料における、ＩＤＵＡ ２１８シグネチャーペプチドの平均濃度は、３０ｐｍｏｌ／ｇのタンパク質、３５ｐｍｏｌ／ｇのタンパク質、４０ｐｍｏｌ／ｇのタンパク質、４５ｐｍｏｌ／ｇのタンパク質、５０ｐｍｏｌ／ｇのタンパク質、５５ｐｍｏｌ／ｇのタンパク質、６０ｐｍｏｌ／ｇのタンパク質、６５ｐｍｏｌ／ｇのタンパク質、７０ｐｍｏｌ／ｇのタンパク質、７５ｐｍｏｌ／ｇのタンパク質、８０ｐｍｏｌ／ｇのタンパク質、８５ｐｍｏｌ／ｇのタンパク質、またはそれ以上の濃度を含む。

【0101】

特定の実施形態では、正常な対照対象の集団由来のＤＢＳにおける、ＩＤＵＡ ４６２シグネチャーペプチドの平均濃度は、１０ｐｍｏｌ／Ｌ～２５０ｐｍｏｌ／Ｌの範囲、１０ｐｍｏｌ／Ｌ～２００ｐｍｏｌ／Ｌの範囲、及び２０ｐｍｏｌ／Ｌ～１５０ｐｍｏｌ／Ｌの範囲の濃度を含む。特定の実施形態では、正常な対照対象の集団由来のＤＢＳにおける、ＩＤＵＡ ４６２シグネチャーペプチドの平均濃度は、１０ｐｍｏｌ／Ｌ、１５ｐｍｏｌ／Ｌ、２０ｐｍｏｌ／Ｌ、２５ｐｍｏｌ／Ｌ、３０ｐｍｏｌ／Ｌ、３５ｐｍｏｌ／Ｌ、４０ｐｍｏｌ／Ｌ、４５ｐｍｏｌ／Ｌ、５０ｐｍｏｌ／Ｌ、５５ｐｍｏｌ／Ｌ、６０ｐｍｏｌ／Ｌ、６５ｐｍｏｌ／Ｌ、７０ｐｍｏｌ／Ｌ、７５ｐｍｏｌ／Ｌ、８０ｐｍｏｌ／Ｌ、８５ｐｍｏｌ／Ｌ、９０ｐｍｏｌ／Ｌ、９５ｐｍｏｌ／Ｌ、１００ｐｍｏｌ／Ｌ、１１０ｐｍｏｌ／Ｌ、１２０ｐｍｏｌ／Ｌ、１３０ｐｍｏｌ／Ｌ、１４０ｐｍｏｌ／Ｌ、１５０ｐｍｏｌ／Ｌ、１６０ｐｍｏｌ／Ｌ、１７０ｐｍｏｌ／Ｌ、１８０ｐｍｏｌ／Ｌ、１９０ｐｍｏｌ／Ｌ、２００ｐｍｏｌ／Ｌ、２１０ｐｍｏｌ／Ｌ、２２０ｐｍｏｌ／Ｌ、２３０ｐｍｏｌ／Ｌ、２４０ｐｍｏｌ／Ｌ、２５０ｐｍｏｌ／Ｌ、またはそれ以上の濃度を含む。

【0102】

特定の実施形態では、正常な対照対象の集団由来のＰＢＭＣにおける、ＩＤＵＡ ４６２シグネチャーペプチドの平均濃度は、３５０ｐｍｏｌ／Ｌ～１０００ｐｍｏｌ／Ｌの範囲、４００ｐｍｏｌ／Ｌ～９００ｐｍｏｌ／Ｌの範囲、及び４５０ｐｍｏｌ／Ｌ～８５０ｐｍｏｌ／Ｌの範囲の濃度を含む。特定の実施形態では、正常な対照対象の集団由来のＰＢＭＣにおける、ＩＤＵＡ ４６２シグネチャーペプチドの平均濃度は、３５０ｐｍｏｌ／Ｌ、３６０ｐｍｏｌ／Ｌ、３７０ｐｍｏｌ／Ｌ、３８０ｐｍｏｌ／Ｌ、３９０ｐｍｏｌ／Ｌ、４００ｐｍｏｌ／Ｌ、４１０ｐｍｏｌ／Ｌ、４２０ｐｍｏｌ／Ｌ、４３０ｐｍｏｌ／Ｌ、４４０ｐｍｏｌ／Ｌ、４５０ｐｍｏｌ／Ｌ、４６０ｐｍｏｌ／Ｌ、４７０ｐｍｏｌ／Ｌ、４８０ｐｍｏｌ／Ｌ、４９０ｐｍｏｌ／Ｌ、５００ｐｍｏｌ／Ｌ、５１０ｐｍｏｌ／Ｌ、５２０ｐｍｏｌ／Ｌ、５３０ｐｍｏｌ／Ｌ、５４０ｐｍｏｌ／Ｌ、５５０ｐｍｏｌ／Ｌ、５６０ｐｍｏｌ／Ｌ、５７０ｐｍｏｌ／Ｌ、５８０ｐｍｏｌ／Ｌ、５９０ｐｍｏｌ／Ｌ、６００ｐｍｏｌ／Ｌ、６１０ｐｍｏｌ／Ｌ、６２０ｐｍｏｌ／Ｌ、６３０ｐｍｏｌ／Ｌ、６４０ｐｍｏｌ／Ｌ、６５０ｐｍｏｌ／Ｌ、６６０ｐｍｏｌ／Ｌ、６７０ｐｍｏｌ／Ｌ、６８０ｐｍｏｌ／Ｌ、６９０ｐｍｏｌ／Ｌ、７００ｐｍｏｌ／Ｌ、７１０ｐｍｏｌ／Ｌ、７２０ｐｍｏｌ／Ｌ、７３０ｐｍｏｌ／Ｌ、７４０ｐｍｏｌ／Ｌ、７５０ｐｍｏｌ／Ｌ、７６０ｐｍｏｌ／Ｌ、７７０ｐｍｏｌ／Ｌ、７８０ｐｍｏｌ／Ｌ、７９０ｐｍｏｌ／Ｌ、８００ｐｍｏｌ／Ｌ、８１０ｐｍｏｌ／Ｌ、８２０ｐｍｏｌ／Ｌ、８３０ｐｍｏｌ／Ｌ、８４０ｐｍｏｌ／Ｌ、８５０ｐｍｏｌ／Ｌ、８６０ｐｍｏｌ／Ｌ、８７０ｐｍｏｌ／Ｌ、８８０ｐｍｏｌ／Ｌ、８９０ｐｍｏｌ／Ｌ、９００ｐｍｏｌ／Ｌ、９１０ｐｍｏｌ／Ｌ、９２０ｐｍｏｌ／Ｌ、９３０ｐｍｏｌ／Ｌ、９４０ｐｍｏｌ／Ｌ、９５０ｐｍｏｌ／Ｌ、９６０ｐｍｏｌ／Ｌ、９７０ｐｍｏｌ／Ｌ、９８０ｐｍｏｌ／Ｌ、９９０ｐｍｏｌ／Ｌ、１０００ｐｍｏｌ／Ｌ、またはそれ以上の濃度を含む。

【0103】

特定の実施形態では、正常な対照対象の集団由来の口腔スワブ試料における、ＩＤＵＡ ４６２シグネチャーペプチドの平均濃度は、１００ｐｍｏｌ／Ｌ～１０００ｐｍｏｌ／Ｌの範囲、１００ｐｍｏｌ／Ｌ～９００ｐｍｏｌ／Ｌの範囲、及び１５０ｐｍｏｌ／Ｌ～８５０ｐｍｏｌ／Ｌの範囲の濃度を含む。特定の実施形態では、正常な対照対象の集団由来の口腔スワブ試料における、ＩＤＵＡ ４６２シグネチャーペプチドの平均濃度は、１００ｐｍｏｌ／Ｌ、１２５ｐｍｏｌ／Ｌ、１５０ｐｍｏｌ／Ｌ、１７５ｐｍｏｌ／Ｌ、２００ｐｍｏｌ／Ｌ、２２５ｐｍｏｌ／Ｌ、２５０ｐｍｏｌ／Ｌ、２７５ｐｍｏｌ／Ｌ、３００ｐｍｏｌ／Ｌ、３２５ｐｍｏｌ／Ｌ、３５０ｐｍｏｌ／Ｌ、３７５ｐｍｏｌ／Ｌ、４００ｐｍｏｌ／Ｌ、４２５ｐｍｏｌ／Ｌ、４５０ｐｍｏｌ／Ｌ、４７５ｐｍｏｌ／Ｌ、５００ｐｍｏｌ／Ｌ、５２５ｐｍｏｌ／Ｌ、５５０ｐｍｏｌ／Ｌ、５７５ｐｍｏｌ／Ｌ、６００ｐｍｏｌ／Ｌ、６２５ｐｍｏｌ／Ｌ、６５０ｐｍｏｌ／Ｌ、６７５ｐｍｏｌ／Ｌ、７００ｐｍｏｌ／Ｌ、７２５ｐｍｏｌ／Ｌ、７５０ｐｍｏｌ／Ｌ、７７５ｐｍｏｌ／Ｌ、８００ｐｍｏｌ／Ｌ、８２５ｐｍｏｌ／Ｌ、８５０ｐｍｏｌ／Ｌ、８７５ｐｍｏｌ／Ｌ、９００ｐｍｏｌ／Ｌ、９２５ｐｍｏｌ／Ｌ、９５０ｐｍｏｌ／Ｌ、９７５ｐｍｏｌ／Ｌ、１０００ｐｍｏｌ／Ｌ、またはそれ以上の濃度を含む。特定の実施形態では、正常な対照対象の集団由来の口腔スワブ試料における、ＩＤＵＡ ４６２シグネチャーペプチドの平均濃度は、３０ｐｍｏｌ／ｇのタンパク質～８０ｐｍｏｌ／ｇのタンパク質の範囲、３０ｐｍｏｌ／ｇのタンパク質～７５ｐｍｏｌ／ｇのタンパク質の範囲、及び、３０ｐｍｏｌ／ｇのタンパク質～７０ｐｍｏｌ／ｇのタンパク質の範囲の濃度を含む。特定の実施形態では、正常な対照対象の集団由来の口腔スワブ試料における、ＩＤＵＡ ４６２シグネチャーペプチドの平均濃度は、３０ｐｍｏｌ／ｇのタンパク質、３５ｐｍｏｌ／ｇのタンパク質、４０ｐｍｏｌ／ｇのタンパク質、４５ｐｍｏｌ／ｇのタンパク質、５０ｐｍｏｌ／ｇのタンパク質、５５ｐｍｏｌ／ｇのタンパク質、６０ｐｍｏｌ／ｇのタンパク質、６５ｐｍｏｌ／ｇのタンパク質、７０ｐｍｏｌ／ｇのタンパク質、７５ｐｍｏｌ／ｇのタンパク質、８０ｐｍｏｌ／ｇのタンパク質、またはそれ以上の濃度を含む。

【0104】

特定の実施形態では、正常な対照対象の集団由来のＤＢＳにおける、ＧＡＡ ３７６シグネチャーペプチドの平均濃度は、２５ｐｍｏｌ／Ｌ～２００ｐｍｏｌ／Ｌの範囲、３０ｐｍｏｌ／Ｌ～１８０ｐｍｏｌ／Ｌの範囲、及び３５ｐｍｏｌ／Ｌ～１６０ｐｍｏｌ／Ｌの範囲の濃度を含む。特定の実施形態では、正常な対照対象の集団由来のＤＢＳにおける、ＧＡＡ ３７６シグネチャーペプチドの平均濃度は、２５ｐｍｏｌ／Ｌ、３０ｐｍｏｌ／Ｌ、３５ｐｍｏｌ／Ｌ、４０ｐｍｏｌ／Ｌ、４５ｐｍｏｌ／Ｌ、５０ｐｍｏｌ／Ｌ、５５ｐｍｏｌ／Ｌ、６０ｐｍｏｌ／Ｌ、６５ｐｍｏｌ／Ｌ、７０ｐｍｏｌ／Ｌ、７５ｐｍｏｌ／Ｌ、８０ｐｍｏｌ／Ｌ、８５ｐｍｏｌ／Ｌ、９０ｐｍｏｌ／Ｌ、９５ｐｍｏｌ／Ｌ、１００ｐｍｏｌ／Ｌ、１１０ｐｍｏｌ／Ｌ、１２０ｐｍｏｌ／Ｌ、１３０ｐｍｏｌ／Ｌ、１４０ｐｍｏｌ／Ｌ、１５０ｐｍｏｌ／Ｌ、１６０ｐｍｏｌ／Ｌ、１７０ｐｍｏｌ／Ｌ、１８０ｐｍｏｌ／Ｌ、１９０ｐｍｏｌ／Ｌ、２００ｐｍｏｌ／Ｌ、またはそれ以上の濃度を含む。

【0105】

１つ以上の標準ペプチドは、当該分野で公知の任意の方法で合成され得る。そのような合成ペプチドは、１つ以上の天然修飾を有するアミノ酸をさらに含み得る。このような自然な修飾としては、グルタミン及びアスパラギンの脱アミノ化、アミノ化、酸化、ならびにヒドロキシル化が含まれ得る。

【0106】

（ＩＸ）使用方法。本開示の方法は、ＭＰＳ Ｉ及び／またはポンペ病のうちの１つ以上を有する個体を同定することを含む。特定の実施形態では、ＭＰＳ Ｉ及び／またはポンペ病を有する個体の診断は、例えば、ＮＢＳの一部として、または障害の症状が個体に明らかになる前に、早期に行われる。特定の実施形態では、本開示の方法は、重症形態のＭＰＳ Ｉを患う個体を同定することを含む。特定の実施形態では、本開示の方法は、弱毒化形態のＭＰＳ Ｉを患う個体を同定することを含む。特定の実施形態では、本開示の方法は、弱毒化形態のＭＰＳ Ｉを患う個体から、重症形態のＭＰＳ Ｉを患う個体を区別することを含む。特定の実施形態では、本開示の方法は、乳児期に開始するポンペ病を患う個体を同定することを含む。特定の実施形態では、本開示の方法は、遅発性ポンペ病を患う個体を同定することを含む。特定の実施形態では、本開示の方法は、遅発性ポンペ病を患う個体から、乳児期に開始するポンペ病を患う個体を区別することを含む。

【0107】

本開示の方法は、ＤＢＳ、口腔スワブ、ＰＢＭＣ、またはＷＢＣ試料を入手することを含む。特定の実施形態では、ＤＢＳ、口腔スワブ、ＰＢＭＣ、またはＷＢＣ試料を、本明細書に記載する方法に従って入手する。特定の実施形態では、ＤＢＳ、口腔スワブ、ＰＢＭＣ、またはＷＢＣ試料を、将来の試験のために、ＤＢＳ、口腔スワブ、ＰＢＭＣ、またはＷＢＣ試料を保管する、ＤＢＳ、口腔スワブ、ＰＢＭＣ、またはＷＢＣ貯蔵庫または実験室から入手する。

【0108】

本開示の方法は、生体試料中のタンパク質を消化酵素で分解させることを含む。特定の実施形態では、生体試料としては、ＤＢＳ、口腔スワブ由来の細胞、ＰＢＭＣ、またはＷＢＣが挙げられる。特定の実施形態では、ＤＢＳ、全ＤＢＳ、口腔スワブ由来の細胞、ＰＢＭＣ、またはＷＢＣの１つ以上のパンチを、適切な緩衝液中で可溶化することができ、本明細書に記載する適切な消化酵素を添加して、ＤＢＳ、口腔スワブ由来の細胞、ＰＢＭＣ、またはＷＢＣに存在するタンパク質を消化し、ペプチドフラグメントにすることができる。特定の実施形態では、ＤＢＳ、口腔スワブ由来の細胞、ＰＢＭＣ、またはＷＢＣを、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の５０ｍＭ重炭酸アンモニウム溶液で可溶化し、トリプシンにより消化することができる。

【0109】

本開示の方法は、ＭＰＳ Ｉ及び／またはポンペ病をスクリーニングするために使用するシグネチャーペプチドを濃縮することを含む。シグネチャーペプチドとしては、ＭＰＳ Ｉに対するＩＤＵＡ ２１８；ＭＰＳ Ｉに対するＩＤＵＡ ４６２；ポンペ病に対するＧＡＡ １５５；ポンペ病に対するＧＡＡ ３３２；ポンペ病に対するＧＡＡ ３７６；ポンペ病に対するＧＡＡ ６０１；ポンペ病に対するＧＡＡ ８５５；ポンペ病に対するＧＡＡ ８８２；及び、ポンペ病に対するＧＡＡ ８９２が挙げられる。特定の実施形態では、シグネチャーペプチドを濃縮することは、消化した生体試料由来のペプチドフラグメントの混合物を、シグネチャーペプチドを認識する１つ以上の結合要素と接触させることを含む。特定の実施形態では、生体試料としては、ＤＢＳ、口腔スワブ由来の細胞、ＰＢＭＣ、またはＷＢＣが挙げられる。特定の実施形態では、結合要素は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。特定の実施形態では、抗体としては、表１Ａ～１Ｃ、及び図１２に開示されているものが挙げられる。特定の実施形態では、本開示の抗体のアミノ酸配列としては、配列番号１０～１５、１７、１８、２０、２１、２２～２７、２９、３０、３２、３３、４４～４９、５４～５７、６２～７１、７６～７９、及び８４～８７が挙げられる。特定の実施形態では、本開示の抗体のコード配列としては、配列番号１６、１９、２８、３１、４０～４３、５０～５３、５８～６１、７２～７５、及び８０～８３が挙げられる。特定の実施形態では、抗体としては、ＩＤＵＡ ２１８、ＩＤＵＡ ４６２、ＧＡＡ １５５、ＧＡＡ ３３２、ＧＡＡ ３７６、ＧＡＡ ６０１、ＧＡＡ ８５５、ＧＡＡ ８８２、及びＧＡＡ ８９２に結合する抗体が挙げられる。特定の実施形態では、配列番号１０～１５、１７、１８、２０、及び２１を含む抗体を使用して、配列番号１を含むＩＤＵＡペプチドを濃縮する。特定の実施形態では、配列番号２２～２７、２９、３０、３２、及び３３を含む抗体を使用して、配列番号２を含むＩＤＵＡペプチドを濃縮する。特定の実施形態では、配列番号４４～４９、５４～５７、及び６２～６５を含む抗体を使用して、配列番号３を含むＧＡＡペプチドを濃縮する。特定の実施形態では、配列番号６６～７１、７６～７９、及び８４～８７を含む抗体を使用して、配列番号５を含むＧＡＡペプチドを濃縮する。

【0110】

特定の実施形態では、抗体を使用して、配列番号４を含むＧＡＡペプチドを濃縮する。特定の実施形態では、抗体を使用して、配列番号６を含むＧＡＡペプチドを濃縮する。特定の実施形態では、抗体を使用して、配列番号７を含むＧＡＡペプチドを濃縮する。特定の実施形態では、抗体を使用して、配列番号８を含むＧＡＡペプチドを濃縮する。特定の実施形態では、抗体を使用して、配列番号９を含むＧＡＡペプチドを濃縮する。

【0111】

特定の実施形態では、コグネイトシグネチャーペプチドに結合する、表１Ａ～１Ｃ、及び図１２に開示されている１つ以上の抗体の任意の組合せを使用して、ＭＰＳ Ｉをスクリーニングすることができる。特定の実施形態では、コグネイトシグネチャーペプチドに結合する、表１Ａ～１Ｃ、及び図１２に開示されている１つ以上の抗体の任意の組合せを使用して、ＭＰＳ Ｉに対する集団をスクリーニングすることができる。特定の実施形態では、コグネイトシグネチャーペプチドに結合する、表１Ａ～１Ｃ、及び図１２に開示されている１つ以上の抗体の任意の組合せを使用して、ポンペ病をスクリーニングすることができる。特定の実施形態では、コグネイトシグネチャーペプチドに結合する、表１Ａ～１Ｃ、及び図１２に開示されている１つ以上の抗体の任意の組合せを使用して、ポンペ病に対する集団をスクリーニングすることができる。

【0112】

本開示の方法は、ＭＳ分析の前にペプチドを分離するために、免疫親和性に富むペプチドに対して必要に応じて液体クロマトグラフィーを実施することを含む。液体クロマトグラフィーは、カラムの移動相及び固定相に対するその重量及び親和性に基づいてペプチドを分離し得る。

【0113】

本開示の方法は、所定のシグネチャーペプチドの量を定量化するために、免疫親和性で濃縮したペプチドに対してＳＲＭ－ＭＳまたはＭＲＭ－ＭＳを実行することを含む。特定の実施形態では、ＳＲＭ－ＭＳまたはＭＲＭ－ＭＳは、本明細書に記載のとおりに実行される。特定の実施形態では、シグネチャーペプチドの定量化は、既知の量でアッセイに導入される参照ペプチドを使用することを含む。特定の実施形態では、参照ペプチドは、参照ペプチドをシグネチャーペプチドから区別するために、例えば、１つ以上の重い同位体で示差的に標識されていることを除いて、あらゆる点でシグネチャーペプチドと同一であり得る。

【0114】

特定の実施形態では、ＳＲＭ－ＭＳまたはＭＲＭ－ＭＳは、ＩＤＵＡペプチドにおける減少または不存在を検出する。特定の実施形態では、ＩＤＵＡペプチドは配列番号１を含む。特定の実施形態では、ＩＤＵＡペプチドは配列番号２を含む。

【0115】

特定の実施形態では、ＳＲＭ－ＭＳまたはＭＲＭ－ＭＳは、ＧＡＡペプチドにおける減少または不存在を検出する。特定の実施形態では、ＧＡＡペプチドは配列番号３を含む。特定の実施形態では、ＧＡＡペプチドは配列番号４を含む。特定の実施形態では、ＧＡＡペプチドは配列番号５を含む。特定の実施形態では、ＧＡＡペプチドは配列番号６を含む。特定の実施形態では、ＧＡＡペプチドは配列番号７を含む。特定の実施形態では、ＧＡＡペプチドは配列番号８を含む。特定の実施形態では、ＧＡＡペプチドは配列番号９を含む。

【0116】

特定の実施形態は、一定時間にわたり、本明細書に記載するｉｍｍｕｎｏ－ＳＲＭを使用して、対象のシグネチャーペプチドレベルを監視することを含む。特定の実施形態では、本明細書に記載するＭＰＳ Ｉ及び／またはポンペ病の兆候または症状を示す、あるいは、ＭＰＳ Ｉ及び／またはポンペ病の治療を受けているが故に、本明細書で開示するシステム及び方法に従い監視するために対象を選択する。

【0117】

本明細書にて開示された実施形態は、１つ以上の治療の前に、及び、１つ以上の治療の間、及び／または後で、対象に由来する生体試料を入手することを含む、ＭＰＳ Ｉ及び／またはポンペ病を治療されている対象において、治療の有効性を測定することと、本明細書に記載するｉｍｍｕｎｏ－ＳＲＭを使用する治療の前に、対象においてシグネチャーペプチドレベルを検出することと、本明細書に記載するｉｍｍｕｎｏ－ＳＲＭを使用する１つ以上の治療の間または後に、対象におけるシグネチャーペプチドレベルを検出することと、治療中もしくは治療後のシグネチャーペプチドレベルが、治療前のシグネチャーペプチドレベルより高い場合に、治療が有効であると測定する、または、治療中もしくは治療後のシグネチャーペプチドレベルが、治療前のシグネチャーペプチドレベル以下である場合に、治療が有効でないと測定することと、を含む。特定の実施形態では、生体試料は、ＤＢＳ、口腔スワブ由来の細胞、ＰＢＭＣ、またはＷＢＣを含む。

【0118】

特定の実施形態では、ＭＰＳ Ｉ及び／またはポンペ病を治療されている対象において、治療の有効性を測定することで、１つ以上の治療が継続されるべきかもしくは断続されるべきか、または、新しい治療を行うべきか否かをガイドすることができる。特定の実施形態では、１つ以上の治療の間または後の、対象におけるシグネチャーペプチドレベルが、１つ以上の治療の前の、対象におけるシグネチャーペプチドレベルよりも高い場合に、１つ以上の治療を継続することができる。特定の実施形態では、対象における、１つ以上の治療の間または後のシグネチャーペプチドレベルが、ＭＰＳ Ｉ及び／またはポンペ病による影響を受けていない正常対照対象または対照対象で測定したシグネチャーペプチドレベルの、１％超、５％超、１０％超、１５％超、２０％超、２５％超、３０％超、３５％超、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、１００％超、またはそれ以上である場合に、１つ以上の治療を断続することができる。特定の実施形態では、治療の間または後の、対象におけるシグネチャーペプチドレベルが、治療前の、対象におけるシグネチャーペプチドレベルと等しい場合、または、シグネチャーペプチドが存在しない場合に、新しい治療を行うことができる。

【0119】

特定の実施形態では、シグネチャーペプチドレベルの「安定した」指標とは、同じ対象での以前の比較に関連して評価した指標であり、最後の測定以来、（ｔ検定またはｐ値、例えば、ｐ値＞０．０５などの、当該技術分野において既知の統計指標により測定されるように）有意に変化していない、シグネチャーペプチドレベルを意味する。特定の実施形態では、「安定した」指標とは、同じ患者での以前の比較に関連して評価した指標であり、集約群または平均群の先行測定（例えば、最後の３、４、または５回の測定）以来、（ｔ検定またはｐ値、例えば、ｐ値＞０．０５などの、当該技術分野において既知の統計指標により測定されるように）有意に変化していない、シグネチャーペプチドレベルを意味する。

【0120】

シグネチャーペプチドレベルの「未変化の」指標とは、同じ患者での以前の比較に関連して評価した指標であり、特定の対象における参照シグネチャーペプチドレベルに近づく、またはこれから離れる、スコアの統計的に有意な変化を実現することができないことを意味する。特定の実施形態では、「未変化の」指標とは、同じ患者での以前の比較に関連して評価した指標、または、集約群もしくは平均群の先行測定（例えば、最後の３、４、もしくは５回の測定）以来の指標である。

【0121】

リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）の特定の実施形態では、より多くの乳児が、ＮＢＳによって早期診断を受けるため、どの患者が、酵素補充療法（ＥＲＴ）に対する免疫応答を生じるのかを予測する能力は、ますます重要になっている。特定の実施形態では、注射された酵素薬剤は、対象によって外来であると認識され、免疫応答を引き起こす可能性がある。特定の実施形態では、免疫応答を生み出すことは、提供される外部酵素薬剤に対する、中和抗薬剤抗体を生み出すことを含む。特定の実施形態では、ＭＰＳ Ｉ及び／またはポンペ病に関する、ＥＲＴに対する免疫応答は、生体試料におけるＥＲＴナイーブ酵素濃度の定量化により、予想することができる。特定の実施形態では、生体試料は、ＤＢＳ、口腔スワブ由来の細胞、ＰＢＭＣ、またはＷＢＣを含む。特定の実施形態では、ＭＰＳ Ｉに関する、ＥＲＴに対する免疫応答は、ＩＤＵＡ ２１８及び／またはＩＤＵＡ ４６２が存在しない場合に生じる。特定の実施形態では、ポンペ病に関する、ＥＲＴに対する免疫応答は、ＧＡＡ １５５、ＧＡＡ ３３２、ＧＡＡ ３７６、ＧＡＡ ６０１、ＧＡＡ ８５５、ＧＡＡ ８８２、ＧＡＡ ８９２、またはこれらの組合せが存在しない場合に生じる。

【0122】

ＭＰＳ Ｉ及び／またはポンペ病に関して、ＥＲＴに対する免疫応答が、対象において予想または同定される場合、対象、または対象の家族に知らせることができ、免疫応答を予防または治療するための計画を実行することができる。特定の実施形態では、ＥＲＴに対する免疫応答を治療する戦略は、ＥＲＴナイーブ患者における抗薬剤抗体形成の防止、及び、既存の抗薬剤抗体の急激な減少を含むことができる。特定の実施形態では、ＥＲＴナイーブ患者における抗薬剤抗体形成の防止は、Ｂ細胞枯渇、免疫抑制、ｍＴＯＲ（ラパマイシンのメカニズム標的）阻害、及び／または免疫制御を含むことができる。特定の実施形態では、ＥＲＴナイーブ患者における抗薬剤抗体形成の防止は、ＥＲＴの開始前、またはＥＲＴの間に、メトトレキサート（ＭＴＸ）、リツキシマブ、及び／または静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）を投与することを含むことができる。特定の実施形態では、既存の抗薬剤抗体の急激な減少は、葉酸代謝の阻害（新規のＤＮＡ合成の遮断）、ＤＮＡのアルキル化（ＤＮＡ複製の遮断）、抗体が媒介する特異的なＢ細胞枯渇、Ｂ細胞／形質細胞枯渇、及び／または、免疫抑制プロテアソームの阻害を含むことができる。特定の実施形態では、既存の抗薬剤抗体の急激な減少は、ミコフェノール酸モフェチル、ＭＴＸ、ＩＶＩＧ、リツキシマブ、ボルテゾミブ、シクロホスファミドの投与、及び／または血漿交換を含むことができる。

【0123】

特定の実施形態では、開示されたアッセイ及び方法により、ＬＳＤにおける偽欠損症症例から生じるアッセイにおける、偽陽性結果の数を減少させることができる。特定の実施形態では、開示されたアッセイ及び方法により、ＬＳＤのスクリーニングにおける陽性予想率（すなわち、陽性適中率）を増加させることができる。特定の実施形態では、本方法により、一次または二次力価アッセイとして、開示されたｉｍｍｕｎｏ－ＳＲＭアッセイを使用して、ＬＳＤのスクリーニングにおいて入手した偽陽性の数を減少させることができる。特定の実施形態では、開示されたアッセイ及び方法が、酵素偽欠損症の症例と、確認されたＬＳＤ症例とにおける、シグネチャーペプチドの濃度差を測定することができるため、開示されたアッセイ及び方法は、確認されたＬＳＤ症例から、酵素偽欠損症の症例を区別する。特定の実施形態では、疾患をスクリーニングされている対象のアッセイ結果が陽性である（すなわち、対象が疾患を有することを示す）ときに、偽陽性結果が生じるが、対象は健常である。特定の実施形態では、健常な対象は、疾患の症状を示さないか、非常に少ない疾患の症状を示す。特定の実施形態では、健常な対象は、疾患の治療を必要としない。特定の実施形態では、陽性予想率（すなわち、陽性適中率）とは、陽性スクリーニングテストを行う対象が、間違いなく疾患を有する確率を意味する。特定の実施形態では、偽欠損症対立遺伝子を有する患者は、大幅に低下した酵素活性を示すが、健常である。特定の実施形態では、ＬＳＤに対する酵素偽欠損症を患う患者は、正常対照と比較して、酵素活性の低下を示し、ＬＳＤを患うと確認された患者（「間違いなく陽性の」患者）と同様の酵素活性を示す。特定の実施形態では、対象は、ＬＳＤと関連する遺伝子の、同一または異なる病原性バリアント（複数可）の２つのコピーの存在を、対象で分子遺伝試験をすることにより、ＬＳＤを有することが確認される。特定の実施形態では、対象は、分子遺伝試験によりＬＳＤにおいて偽欠損症を有することが確認される。分子遺伝試験としては、配列決定、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、一塩基多型マイクロアレイ、及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む、遺伝子で変異、欠失、及び／または挿入を検出可能なアッセイを挙げることができる。

【0124】

図７Ａ及び７Ｂに示すように、ｉｍｍｕｎｏ－ＳＲＭアッセイにより、ＬＳＤにおいて偽欠陥対立遺伝子を有する対象と、ＬＳＤを患う対象との区別が可能となる。特定の実施形態では、対象は、ＬＳＤと関連する遺伝子の同一または異なる病原性バリアント（複数可）の２つのコピーを有する場合に、ＬＳＤを有する。特定の実施形態では、ＬＳＤを有する対象は、「間違いなく陽性」であると考えられる。特定の実施形態では、測定したシグネチャーペプチド濃度が、当該測定したシグネチャーペプチドに対する所定の閾値濃度を下回る場合に、対象は、ｉｍｍｕｎｏ－ＳＲＭアッセイにより、ＬＳＤに対して間違いなく陽性であると同定される。所定の閾値濃度は、本明細書に記載する正常な対照対象の集団に由来する、対応する生体試料中の各シグネチャーペプチドの平均濃度の標準偏差から計算することができる。特定の実施形態では、測定したシグネチャーペプチド濃度が、当該シグネチャーペプチドの検出下限（ＬＯＤ）濃度を下回る場合に、対象は、ｉｍｍｕｎｏ－ＳＲＭアッセイにより、ＬＳＤに対して間違いなく陽性であると同定される。特定の実施形態では、ＬＳＤにおいて偽欠損症を有する対象は、ＬＳＤに関して間違いなく陽性である、または、ＬＳＤを有することが確認された対象の、対応する平均シグネチャーペプチド濃度を上回る、測定したシグネチャーペプチド濃度を有する。特定の実施形態では、ＬＳＤにおいて偽欠損症を有する対象は、正常な対照対象の集団の、対応するシグネチャーペプチド濃度の範囲内にある、測定したシグネチャーペプチド濃度を有する。本開示のシグネチャーペプチドのＬＯＤは、ｉｍｍｕｎｏ－ＳＲＭアッセイを使用して速やかに検出可能な、シグネチャーペプチドの最低濃度を含む。特定の実施形態では、シグネチャーペプチドのＬＯＤは、シグネチャーペプチドを含まない陰性対照とは統計的に区別可能な、シグネチャーペプチドの最低濃度を含む。ＬＯＤの計算は、当業者に既知である。一例として、シグネチャーペプチドを含まない陰性対照は、ｉｍｍｕｎｏ－ＳＲＭアッセイで２０回アッセイ可能であり、結果の平均及び標準偏差を計算する。特定の実施形態では、ＬＯＤは、陰性対照の平均を２標準偏差、または３標準偏差上回ると考えられる。

【0125】

特定の実施形態では、ＩＤＵＡ ２１８シグネチャーペプチドに対するＬＯＤは、１０ｐｍｏｌ／Ｌ以下、９ｐｍｏｌ／Ｌ以下、８ｐｍｏｌ／Ｌ以下、７ｐｍｏｌ／Ｌ以下、６ｐｍｏｌ／Ｌ以下、５ｐｍｏｌ／Ｌ以下、４ｐｍｏｌ／Ｌ以下、３ｐｍｏｌ／Ｌ以下、２ｐｍｏｌ／Ｌ以下、１ｐｍｏｌ／Ｌ以下、またはそれ以下を含む。特定の実施形態では、ＩＤＵＡ ２１８シグネチャーペプチドに対するＬＯＤは、３．５ｐｍｏｌ／Ｌ以下を含む。

【0126】

特定の実施形態では、ＩＤＵＡ ４６２シグネチャーペプチドに対するＬＯＤは、１０ｐｍｏｌ／Ｌ以下、９ｐｍｏｌ／Ｌ以下、８ｐｍｏｌ／Ｌ以下、７ｐｍｏｌ／Ｌ以下、６ｐｍｏｌ／Ｌ以下、５ｐｍｏｌ／Ｌ以下、４ｐｍｏｌ／Ｌ以下、３ｐｍｏｌ／Ｌ以下、２ｐｍｏｌ／Ｌ以下、１ｐｍｏｌ／Ｌ以下、またはそれ以下を含む。特定の実施形態では、ＩＤＵＡ ４６２ペプチドに対するＬＯＤは、２．１ｐｍｏｌ／Ｌ以下を含む。

【0127】

特定の実施形態では、ＧＡＡ １５５シグネチャーペプチドに対するＬＯＤは、１０ｐｍｏｌ／Ｌ以下、９ｐｍｏｌ／Ｌ以下、８ｐｍｏｌ／Ｌ以下、７ｐｍｏｌ／Ｌ以下、６ｐｍｏｌ／Ｌ以下、５ｐｍｏｌ／Ｌ以下、４ｐｍｏｌ／Ｌ以下、３ｐｍｏｌ／Ｌ以下、２ｐｍｏｌ／Ｌ以下、１ｐｍｏｌ／Ｌ以下、またはそれ以下を含む。

【0128】

特定の実施形態では、ＧＡＡ ３７６シグネチャーペプチドに対するＬＯＤは、１０ｐｍｏｌ／Ｌ以下、９ｐｍｏｌ／Ｌ以下、８ｐｍｏｌ／Ｌ以下、７ｐｍｏｌ／Ｌ以下、６ｐｍｏｌ／Ｌ以下、５ｐｍｏｌ／Ｌ以下、４ｐｍｏｌ／Ｌ以下、３ｐｍｏｌ／Ｌ以下、２ｐｍｏｌ／Ｌ以下、１ｐｍｏｌ／Ｌ以下、またはそれ以下を含む。

【0129】

特定の実施形態では、ＩＤＵＡ ２１８、ＩＤＵＡ ４６２、またはこれらの組合せの測定したシグネチャーペプチド濃度が、対応するシグネチャーペプチドに対する所定の閾値濃度を下回る場合に、対象は、ｉｍｍｕｎｏ－ＳＲＭアッセイにより、ＭＰＳ Ｉを有する（すなわち、対象はＭＰＳ Ｉに対して間違いなく陽性である）と同定される。所定の閾値濃度は、本明細書に記載する正常な対照対象の集団に由来する、対応する生体試料中の各シグネチャーペプチドの平均濃度の標準偏差から計算することができる。特定の実施形態では、ＩＤＵＡ ２１８、ＩＤＵＡ ４６２、またはこれらの組合せの測定したシグネチャーペプチド濃度が、対応するシグネチャーペプチドに対するＬＯＤ濃度を下回る場合に、対象は、ｉｍｍｕｎｏ－ＳＲＭアッセイにより、ＭＰＳ Ｉを有する（すなわち、対象はＭＰＳ Ｉに対して間違いなく陽性である）と同定される。特定の実施形態では、ＭＰＳ Ｉにおいて偽欠損症を有する対象は、ＭＰＳ Ｉを有することが確認された、または、ＭＰＳ Ｉに対して間違いなく陽性であることが確認された対象、または対象の集団由来の試料の、対応する平均ペプチド濃度を上回る、ＩＤＵＡ ２１８、ＩＤＵＡ ４６２、またはこれらの組合せの測定したシグネチャーペプチド濃度を有する。特定の実施形態では、ＭＰＳ Ｉにおいて偽欠損症を有する対象は、正常対照対象の集団の、対応するＩＤＵＡペプチド濃度の範囲内の、ＩＤＵＡ ２１８、ＩＤＵＡ ４６２、またはこれらの組合せの測定したシグネチャーペプチド濃度を有する。特定の実施形態では、ＩＤＵＡ遺伝子の同一または異なる病原性バリアント（複数可）の２つのコピーの存在を、対象で分子遺伝試験することにより、対象はＭＰＳ Ｉを有することが確認される。特定の実施形態では、分子遺伝試験により、対象は、ＭＰＳ Ｉの偽欠陥対立遺伝子を有することが確認される。特定の実施形態では、正常な対照対象は、ＭＰＳ Ｉの症状を示さないか、または、非常に少ないＭＰＳ Ｉの症状を示す。特定の実施形態では、正常な対照対象は、ＭＰＳ Ｉを有しない。

【0130】

特定の実施形態では、ＧＡＡ １５５、ＧＡＡ ３３２、ＧＡＡ ３７６、ＧＡＡ ６０１、ＧＡＡ ８５５、ＧＡＡ ８８２、ＧＡＡ ８９２、またはこれらの組合せの測定したシグネチャーペプチド濃度が、対応するシグネチャーペプチドの所定閾値濃度を下回る場合に、対象ｉｍｍｕｎｏ－ＳＲＭアッセイにより、ポンペ病を有する（すなわち、対象はポンペ病に対して間違いなく陽性である）と同定される。所定の閾値濃度は、本明細書に記載する正常な対照対象の集団に由来する、対応する生体試料中の各シグネチャーペプチドの平均濃度の標準偏差から計算することができる。特定の実施形態では、ＧＡＡ １５５、ＧＡＡ ３３２、ＧＡＡ ３７６、ＧＡＡ ６０１、ＧＡＡ ８５５、ＧＡＡ ８８２、ＧＡＡ ８９２、またはこれらの組合せの測定したシグネチャーペプチド濃度が、対応するシグネチャーペプチドのＬＯＤ濃度を下回る場合に、対象ｉｍｍｕｎｏ－ＳＲＭアッセイにより、ポンペ病を有する（すなわち、対象はポンペ病に対して間違いなく陽性である）と同定される。特定の実施形態では、ポンペ病において偽欠損症を有する対象は、ポンペ病を有することが確認された、または、ポンペ病に対して間違いなく陽性であることが確認された対象、または対象の集団由来の試料の、対応する平均ペプチド濃度を上回る、ＧＡＡ １５５、ＧＡＡ ３３２、ＧＡＡ ３７６、ＧＡＡ ６０１、ＧＡＡ ８５５、ＧＡＡ ８８２、ＧＡＡ ８９２、またはこれらの組合せの測定したシグネチャーペプチド濃度を有する。特定の実施形態では、ポンペ病において偽欠損症を有する対象は、正常対照対象の集団の、対応するＧＡＡペプチド濃度の範囲内の、ＧＡＡ １５５、ＧＡＡ ３３２、ＧＡＡ ３７６、ＧＡＡ ６０１、ＧＡＡ ８５５、ＧＡＡ ８８２、ＧＡＡ ８９２、またはこれらの組合せの測定したシグネチャーペプチド濃度を有する特定の実施形態では、ＧＡＡ遺伝子の同一または異なる病原性バリアント（複数可）の２つのコピーの存在を、対象で分子遺伝試験することにより、対象はポンペ病を有することが確認される。特定の実施形態では、分子遺伝試験により、対象は、ポンペ病の偽欠陥対立遺伝子を有することが確認される。特定の実施形態では、正常な対照対象は、ポンペ病の症状を示さないか、または、非常に少ないＭＰＳ Ｉの症状を示す。特定の実施形態では、正常な対照対象は、ポンペ病を有しない。

【0131】

特定の実施形態では、開示されたアッセイ及び方法は、弱毒化形態のＭＰＳ Ｉを患う固体から、重症形態のＭＰＳ Ｉを患う固体を区別する。特定の実施形態では、ＩＤＵＡ ２１８及び／またはＩＤＵＡ ４６２のペプチド濃度が、健常な対象の集団に由来する対照試料の、対応する平均ＩＤＵＡペプチド濃度を下回る、及び、重症形態のＭＰＳ Ｉを有することが確認された対象、または対象の集団由来の試料の、対応する平均ＩＤＵＡペプチド濃度を上回るときに、対象は、ｉｍｍｕｎｏ－ＳＲＭアッセイにより、弱毒化形態のＭＰＳ Ｉを有すると同定される。特定の実施形態では、ＩＤＵＡ ２１８及び／またはＩＤＵＡ ４６２のペプチド濃度が、健常な対象の集団に由来する対照試料の、対応する平均ＩＤＵＡペプチド濃度を下回る、及び、弱毒化形態のＭＰＳ Ｉを有することが確認された対象、または対象の集団由来の試料の、対応する平均ＩＤＵＡペプチド濃度を下回る、または存在しないときに、対象は、ｉｍｍｕｎｏ－ＳＲＭアッセイにより、重症形態のＭＰＳ Ｉを有すると同定される。特定の実施形態では、対象は、ＭＰＳ Ｉの症状の観察及び／または測定；患者及び家族歴；ＩＤＵＡ酵素活性レベルの測定；グリコサミノグリカンレベルの測定；及び／または、ＩＤＵＡ遺伝子バリアントを同定するための分子遺伝試験を含む、臨床所見及び検査所見により、弱毒化または重症形態のＭＰＳ Ｉを有することが確認される。特定の実施形態では、ＩＤＵＡ ２１８及び／またはＩＤＵＡ ４６２ペプチドは、ｉｍｍｕｎｏ－ＳＲＭアッセイにより測定されるように、弱毒化ＭＰＳ Ｉを有する対象由来の生体試料に存在し、重症ＭＰＳ Ｉを有する対象由来の、対応する生体試料には存在しない。特定の実施形態では、健常な対象は、ＭＰＳ Ｉの症状を示さないか、または、非常に少ないＭＰＳ Ｉの症状を示す。特定の実施形態では、健常な対象は、ＭＰＳ Ｉを有しない。特定の実施形態では、生体試料としては、口腔スワブ由来の細胞、ＰＢＭＣ、またはＷＢＣ由来が挙げられる。

【0132】

特定の実施形態では、開示されたアッセイ及び方法は、遅くに開始するＰＤを患う個体から、乳児期に開始するポンペ病（ＰＤ）を患う個体を区別する。特定の実施形態では、ＧＡＡ １５５、ＧＡＡ ３３２、ＧＡＡ ３７６、ＧＡＡ ６０１、ＧＡＡ ８５５、ＧＡＡ ８８２、ＧＡＡ ８９２ペプチド、またはこれらの組合せのペプチド濃度が、健常な対象の集団に由来する対照試料の、対応する平均ＧＡＡペプチド濃度を下回る、及び、乳児期に開始するＰＤを有することが確認された対象、または対象の集団由来の試料の、対応する平均ＧＡＡペプチド濃度を上回るときに、対象は、ｉｍｍｕｎｏ－ＳＲＭアッセイにより、遅くに開始するＰＤを有すると同定される。特定の実施形態では、ＧＡＡ １５５、ＧＡＡ ３３２、ＧＡＡ ３７６、ＧＡＡ ６０１、ＧＡＡ ８５５、ＧＡＡ ８８２、ＧＡＡ ８９２ペプチド、またはこれらの組合せのペプチド濃度が、健常な対象の集団に由来する対照試料の、対応する平均ＧＡＡペプチド濃度を下回る、及び、遅くに開始するＰＤを有することが確認された対象の集団由来の試料の、対応する平均ＧＡＡペプチド濃度を下回る、または存在しないときに、対象は、ｉｍｍｕｎｏ－ＳＲＭアッセイにより、乳児期に開始するＰＤを有すると同定される。特定の実施形態では、対象は、睡眠試験、肺機能試験、筋機能試験（例えば、核磁気共鳴画像診断）、心機能試験（例えば、胸部ｘ線、心電図法、心エコー法）；患者及び家族歴；ＧＡＡ酵素活性の測定；及び／または、ＧＡＡ遺伝子バリアントを同定するための分子遺伝試験などの、ＰＤの症状を測定する試験を含む、臨床及び検査所見により、乳児期に開始するＰＤまたは遅くに開始するＰＤを有することが確認される。特定の実施形態では、ｉｍｍｕｎｏ－ＳＲＭアッセイにより測定されるように、ＧＡＡ １５５、ＧＡＡ ３３２、ＧＡＡ ３７６、ＧＡＡ ６０１、ＧＡＡ ８５５、ＧＡＡ ８８２、及び／またはＧＡＡ ８９２ペプチドは、遅くに開始するＰＤを有する対象由来の生体試料に存在し、乳児期に開始するＰＤを有する由来の、対応する生体試料には存在しない。特定の実施形態では、健常な対象は、ＰＤの症状を示さないか、または、非常に少ないＭＰＳ Ｉの症状を示す。特定の実施形態では、健常な対象は、ＰＤを有しない。特定の実施形態では、生体試料としては、口腔スワブ由来の細胞、ＰＢＭＣ、またはＷＢＣ由来が挙げられる。

【0133】

特定の実施形態では、本開示の抗体は、不明瞭な生化学的結果を伴う患者に対して、及び、遺伝試験により、意義不明の変異（ＶＵＳ）を有する患者に対して、ＭＰＳ Ｉ及び／またはポンペ病を診断するための無料臨床試験でもまた、使用可能である。特定の実施形態では、本明細書で開示する、ＭＰＳ ＩのＩＤＵＡ、及び／または、ポンペ病のＧＡＡをコードする遺伝子にＶＵＳを有する対象を、本開示のｉｍｍｕｎｏ－ＳＲＭアッセイにより試験して、ＶＵＳが、これらの対象において、対応するシグネチャーペプチドレベルに影響を及ぼすか否かを測定することができる。

【0134】

特定の実施形態では、所定のカットオフ値を、所与のシグネチャーペプチドに対する閾値として使用する。閾値を上回る、所与のシグネチャーペプチドの濃度は、アッセイした生体試料（例えば、ＤＢＳ、口腔スワブ由来の細胞、ＰＢＭＣ、またはＷＢＣ）が、ＭＰＳ Ｉまたはポンペ病により苦しまない個体に由来することを示す。閾値を下回る、または存在しない、所与のシグネチャーペプチドの濃度は、アッセイした生体試料（例えば、ＤＢＳ、口腔スワブ由来の細胞、ＰＢＭＣ、またはＷＢＣ）が、ＭＰＳ Ｉまたはポンペ病により苦しむ個体に由来することを示す。特定の実施形態では、閾値は、正常対照の集団を分析し、本集団における所与のシグネチャーペプチドの濃度の標準偏差（ＳＤ）を計算することにより測定することができる。閾値は、所与のシグネチャーペプチドの平均濃度から、一定のＳＤにて設定することができる。特定の実施形態では、閾値は、所与のシグネチャーペプチドの平均濃度から、－１ＳＤ、－１．１ＳＤ、－１．２ＳＤ、－１．３ＳＤ、－１．４ＳＤ、－１．５ＳＤ、－１．６ＳＤ、－１．７ＳＤ、－１．８ＳＤ、－１．９ＳＤ、－２．０ＳＤ、－２．１ＳＤ、－２．２ＳＤ、－２．３ＳＤ、－２．４ＳＤ、－２．５ＳＤ、－２．６ＳＤ、－２．７ＳＤ、－２．８ＳＤ、－２．９ＳＤ、－３．０ＳＤ、またはそれ以上である。特定の実施形態では、ＭＰＳ Ｉまたはポンペ病の診断またはスクリーニングのために、正常対照の集団を分析し、本集団におけるＡＴＰ７Ｂの内部濃度に対する、所与のシグネチャーペプチドの濃度の比率の標準偏差（ＳＤ）を計算することにより、閾値を測定することができる。各ＬＳＤに対するペプチド濃度カットオフは、各シグネチャーペプチドの平均濃度、または、ＡＴＰ７Ｂの内部濃度に対する、所与のシグネチャーペプチドの濃度の比率から導かれる、一定のＳＤで設定することができる。

【0135】

特定の実施形態では、本開示のシグネチャーペプチドに対する閾値濃度は、正常対照の集団における、対応するシグネチャーペプチドの平均濃度から、－１．０ＳＤ、－１．２５ＳＤ、－１．３ＳＤ、－１．３５ＳＤ、－１．４ＳＤ、－１．４５ＳＤ、－１．５ＳＤ、－１．５５ＳＤ、－１．６ＳＤ、－１．６５ＳＤ、－１．７ＳＤ、－１．７５ＳＤ、－１．８ＳＤ、－１．８５ＳＤ、－１．９ＳＤ、－１．９５ＳＤ、－２．０ＳＤ、－２．２５ＳＤ、－２．３ＳＤ、－２．３５ＳＤ、－２．４ＳＤ、－２．４５ＳＤ、－２．５ＳＤ、－２．５５ＳＤ、－２．６ＳＤ、－２．６５ＳＤ、－２．７ＳＤ、－２．７５ＳＤ、－２．８ＳＤ、－２．８５ＳＤ、－２．９ＳＤ、－２．９５ＳＤ、－３．０ＳＤ、またはそれ以上を含む。

【0136】

特定の実施形態では、ＤＢＳ中のＩＤＵＡ ２１８ペプチドに対する閾値濃度は、３５ｐｍｏｌ／Ｌ以下、３４ｐｍｏｌ／Ｌ以下、３３ｐｍｏｌ／Ｌ以下、３２ｐｍｏｌ／Ｌ以下、３１ｐｍｏｌ／Ｌ以下、３０ｐｍｏｌ／Ｌ以下、２９ｐｍｏｌ／Ｌ以下、２８ｐｍｏｌ／Ｌ以下、２７ｐｍｏｌ／Ｌ以下、２６ｐｍｏｌ／Ｌ以下、２５ｐｍｏｌ／Ｌ以下、２４ｐｍｏｌ／Ｌ以下、２３ｐｍｏｌ／Ｌ以下、２２ｐｍｏｌ／Ｌ以下、２１ｐｍｏｌ／Ｌ以下、２０ｐｍｏｌ／Ｌ以下、１９．５ｐｍｏｌ／Ｌ以下、１９ｐｍｏｌ／Ｌ以下、１８．５ｐｍｏｌ／Ｌ以下、１８ｐｍｏｌ／Ｌ以下、１７．５ｐｍｏｌ／Ｌ以下、１７ｐｍｏｌ／Ｌ以下、１６．５ｐｍｏｌ／Ｌ以下、１６ｐｍｏｌ／Ｌ以下、１５．５ｐｍｏｌ／Ｌ以下、１５ｐｍｏｌ／Ｌ以下、１４．５ｐｍｏｌ／Ｌ以下、１４ｐｍｏｌ／Ｌ以下、１３．５ｐｍｏｌ／Ｌ以下、１３ｐｍｏｌ／Ｌ以下、１２．５ｐｍｏｌ／Ｌ以下、１２ｐｍｏｌ／Ｌ以下、１１．５ｐｍｏｌ／Ｌ以下、１１ｐｍｏｌ／Ｌ以下、１０．５ｐｍｏｌ／Ｌ以下、１０ｐｍｏｌ／Ｌ以下を含む。

【0137】

特定の実施形態では、ＤＢＳ中のＩＤＵＡ ４６２ペプチドに対する閾値濃度は、２５ｐｍｏｌ／Ｌ以下、２４ｐｍｏｌ／Ｌ以下、２３ｐｍｏｌ／Ｌ以下、２２ｐｍｏｌ／Ｌ以下、２１ｐｍｏｌ／Ｌ以下、２０ｐｍｏｌ／Ｌ以下、１９．５ｐｍｏｌ／Ｌ以下、１９ｐｍｏｌ／Ｌ以下、１８．５ｐｍｏｌ／Ｌ以下、１８ｐｍｏｌ／Ｌ以下、１７．５ｐｍｏｌ／Ｌ以下、１７ｐｍｏｌ／Ｌ以下、１６．５ｐｍｏｌ／Ｌ以下、１６ｐｍｏｌ／Ｌ以下、１５．５ｐｍｏｌ／Ｌ以下、１５ｐｍｏｌ／Ｌ以下、１４．５ｐｍｏｌ／Ｌ以下、１４ｐｍｏｌ／Ｌ以下、１３．５ｐｍｏｌ／Ｌ以下、１３ｐｍｏｌ／Ｌ以下、１２．５ｐｍｏｌ／Ｌ以下、１２ｐｍｏｌ／Ｌ以下、１１．５ｐｍｏｌ／Ｌ以下、１１ｐｍｏｌ／Ｌ以下、１０．５ｐｍｏｌ／Ｌ以下、１０ｐｍｏｌ／Ｌ以下、９．５ｐｍｏｌ／Ｌ以下、９ｐｍｏｌ／Ｌ以下、８．５ｐｍｏｌ／Ｌ以下、８ｐｍｏｌ／Ｌ以下、７．５ｐｍｏｌ／Ｌ以下、７ｐｍｏｌ／Ｌ以下、６．５ｐｍｏｌ／Ｌ以下、６ｐｍｏｌ／Ｌ以下、５．５ｐｍｏｌ／Ｌ以下、５ｐｍｏｌ／Ｌ以下を含む。

【0138】

特定の実施形態では、ＤＢＳ中のＧＡＡ ３７６ペプチドに対する閾値濃度は、３０ｐｍｏｌ／Ｌ以下、２９ｐｍｏｌ／Ｌ以下、２８ｐｍｏｌ／Ｌ以下、２７ｐｍｏｌ／Ｌ以下、２６ｐｍｏｌ／Ｌ以下、２５ｐｍｏｌ／Ｌ以下、２４ｐｍｏｌ／Ｌ以下、２３ｐｍｏｌ／Ｌ以下、２２ｐｍｏｌ／Ｌ以下、２１ｐｍｏｌ／Ｌ以下、２０ｐｍｏｌ／Ｌ以下、１９．５ｐｍｏｌ／Ｌ以下、１９ｐｍｏｌ／Ｌ以下、１８．５ｐｍｏｌ／Ｌ以下、１８ｐｍｏｌ／Ｌ以下、１７．５ｐｍｏｌ／Ｌ以下、１７ｐｍｏｌ／Ｌ以下、１６．５ｐｍｏｌ／Ｌ以下、１６ｐｍｏｌ／Ｌ以下、１５．５ｐｍｏｌ／Ｌ以下、１５ｐｍｏｌ／Ｌ以下、１４．５ｐｍｏｌ／Ｌ以下、１４ｐｍｏｌ／Ｌ以下、１３．５ｐｍｏｌ／Ｌ以下、１３ｐｍｏｌ／Ｌ以下、１２．５ｐｍｏｌ／Ｌ以下、１２ｐｍｏｌ／Ｌ以下、１１．５ｐｍｏｌ／Ｌ以下、１１ｐｍｏｌ／Ｌ以下、１０．５ｐｍｏｌ／Ｌ以下、１０ｐｍｏｌ／Ｌ以下、９．５ｐｍｏｌ／Ｌ以下、９ｐｍｏｌ／Ｌ以下、８．５ｐｍｏｌ／Ｌ以下、８ｐｍｏｌ／Ｌ以下、７．５ｐｍｏｌ／Ｌ以下、７ｐｍｏｌ／Ｌ以下、６．５ｐｍｏｌ／Ｌ以下、６ｐｍｏｌ／Ｌ以下、５．５ｐｍｏｌ／Ｌ以下、５ｐｍｏｌ／Ｌ以下を含む。

【0139】

特定の実施形態では、シグネチャーペプチドは、所与の疾患を診断またはスクリーニングするための、一次バイオマーカーであると考えることができる。一次シグネチャーペプチドとしては、まず、所与の病気を診断またはスクリーニングするために使用するペプチドを挙げることができる。特定の実施形態では、一次マーカーは、対応するタンパク質を消化することにより何度も入手可能であり、免疫親和性濃縮のための高親和性抗体を有し、及び／または、独立した液体クロマトグラフィーカラム及び／または質量分析機器により再現可能である。特定の実施形態では、シグネチャーペプチドは、所与の疾患を診断またはスクリーニングするための、二次バイオマーカーであると考えることができる。二次シグネチャーペプチドとしては、一次マーカーによる所与の病気の診断またはスクリーニングを確認するために、二番目に使用するペプチドを挙げることができる。特定の実施形態では、ＩＤＵＡペプチドを、ＭＰＳ Ｉを有する対象をスクリーニングするための一次バイオマーカーとして使用することができる。特定の実施形態では、ＩＤＵＡペプチドを、ＭＰＳ Ｉを有する対象を確認するための二次バイオマーカーとして使用することができる。特定の実施形態では、ＧＡＡペプチドを、ポンペ病を有する対象をスクリーニングするための一次バイオマーカーとして使用することができる。特定の実施形態では、ＧＡＡペプチドを、対象がポンペ病を有することを確認するための二次バイオマーカーとして使用することができる。

【0140】

本明細書に開示される方法は、本明細書に開示される組成物及び方法による、ＭＰＳ Ｉ及び／またはポンペ病のスクリーニングの転帰に基づく対象（例えば、ヒト）の治療を含む。対象の治療には、治療上有効な量の送達が含まれる。治療有効量としては、有効量、予防的処置及び／または治療的処置を提供する量が含まれる。

【0141】

「有効量」は、対象において所望の生理学的変化をもたらすのに必要な組成物の量である。例えば、有効量は、症状の緩和、症状の除去、またはＭＰＳ Ｉ及び／もしくはポンペ病の治癒を提供し得る。有効量は研究目的で投与される場合が多い。本明細書に開示される有効量は、疾患の発達、進行、及び／または解消の評価に関連する動物モデルまたはインビトロアッセイにおいて統計的に有意な効果を引き起こし得る。

【0142】

特定の実施形態は、「予防的処置」として組成物を投与することを含み得る。予防的処置としては、その処置が、障害を発症するリスクを軽減または低減する目的で施される、ＭＰＳ Ｉ及び／もしくはポンペ病の兆候もしくは症状を示さないか、またはＭＰＳ Ｉ及び／もしくはポンペ病の初期の兆候もしくは症状のみを示す対象に施される処置が含まれる。したがって、予防的処置は、ＭＰＳ Ｉ及び／またはポンペ病に対する予防的処置として機能する。

【0143】

特定の実施形態では、予防的処置は、ＭＰＳ Ｉ及び／またはポンペ病の発症を予防、遅延、または低減し得る。特定の実施形態では、予防的処置は、ＭＰＳ Ｉ及び／またはポンペ病に関連する症状または合併症の重症度を予防または軽減し得る。

【0144】

ＭＰＳ Ｉの症状及び合併症としては、体重減少、鬱血、嘔吐の反復、逆流、及び／または皮疹が挙げられる。ポンペ病の症状及び合併症としては、筋肉の衰え、肝臓の拡大；発育不良、呼吸困難、授乳問題、呼吸器感染症、及び／または聴覚問題が挙げられる。

【0145】

「治療的処置」としては、ＭＰＳ Ｉ及び／またはポンペ病の症状または兆候を示す対象に施され、ＭＰＳ Ｉ及び／またはポンペ病の兆候または症状を軽減または排除する目的で対象に施される処置が挙げられる。特定の実施形態では、治療的処置により、ＭＰＳ Ｉを患う対象の細胞内の、リソソームグリコサミノグリカンを減少させることができる。特定の実施形態では、治療的処置により、ポンペ病を患う対象の細胞内の、リソソームグリコーゲンを減少させることができる。特定の実施形態では、この治療的処置は、上記のようなＭＰＳ Ｉ及び／またはポンペ病の症状及び合併症を低減、制御、または排除し得る。

【0146】

予防的処置及び治療的処置は、相互に排他的である必要はなく、特定の実施形態では、投与された投薬量は、複数の処置タイプを達成し得る。特定の実施形態では、治療法としては、ＭＰＳ Ｉ及びポンペ病に対する酵素療法が挙げられる。

【0147】

特定の実施形態では、治療に有効な量は、ＭＰＳ Ｉと診断された対象の細胞のリソソーム内での、グリコサミノグリカンの蓄積を防止する。特定の実施形態では、治療法としては、ＭＰＳ Ｉに対するラロニダーゼ酵素を提供することを含む。特定の実施形態では、ラロニダーゼを提供することで、上述のとおり、ＭＰＳ Ｉの症状が緩和される、または取り除かれる。

【0148】

特定の実施形態では、治療に有効な量は、ポンペ病と診断された対象の細胞のリソソーム内での、グリコーゲンの蓄積を防止する。特定の実施形態では、治療法としては、ポンペ病に対するアルグルコシダーゼアルファ酵素を提供することが挙げられる。特定の実施形態では、アルグルコシダーゼアルファを提供することで、上述のとおり、ポンペ病の症状が緩和される、または取り除かれる。

【0149】

特定の実施形態では、治療用組成物の投与は、別個のアジュバントの投与を伴ってもよい。例示的なアジュバントとしては、ミョウバン、ベントナイト、ラテックス、及びアクリル粒子；不完全フロイントアジュバント、完全フロイントアジュバント；水酸化アルミニウムなどのアルミニウムベースの塩；カルシウムベースの塩；シリカまたは任意のＴＬＲ生物学的リガンド（複数可）；シグマアジュバントシステム（Ｓｉｇｍａ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ）（ＳＡＳ）；及びＲｉｂｉアジュバントが挙げられる。

【0150】

投与について、治療有効量（本明細書では用量とも呼ばれる）は、インビトロアッセイ及び／または動物モデル研究からの結果に基づいて最初に推定され得る。そのような情報は、目的の対象における有用な用量をより正確に決定するために使用され得る。特定の対象に投与される実際の投与量は、標的、体重、状態の重症度、以前または同時の治療的介入、対象の突発性疾患及び投与経路を含む物理的及び生理学的要因などのパラメーターを考慮して、医師、獣医または研究者によって決定され得る。

【0151】

治療上有効な量の細胞は、１０^４細胞／ｋｇ～１０^９細胞／ｋｇの範囲であり得る。特定の実施形態では、治療有効量の細胞としては、１０^４細胞／ｋｇ、１０^５細胞／ｋｇ、１０^６細胞／ｋｇ、１０^７細胞／ｋｇ、１０^８細胞／ｋｇ、１０^９細胞／ｋｇ、またはそれ以上を含んでもよい。

【0152】

有用な用量は、０．１～５μｇ／ｋｇまたは０．５～１μｇ／ｋｇの範囲であり得る。特定の実施形態では、用量としては、１μｇ／ｋｇ、１５μｇ／ｋｇ、３０μｇ／ｋｇ、５０μｇ／ｋｇ、５５μｇ／ｋｇ、７０μｇ／ｋｇ、９０μｇ／ｋｇ、１５０μｇ／ｋｇ、３５０μｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ、７５０μｇ／ｋｇ、１０００μｇ／ｋｇ、０．１～５ｍｇ／ｋｇ、または０．５～１ｍｇ／ｋｇを含み得る。特定の実施形態では、用量としては、１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ以上を含み得る。

【0153】

治療有効量は、治療レジメンの過程中に単回または複数回投与することによって達成され得る（例えば、毎日、隔日、３日ごと、４日ごと、５日ごと、６日ごと、毎週、２週間ごと、３週間ごと、毎月、２か月ごと、３か月ごと、４か月ごと、５か月ごと、６か月ごと、７か月ごと、８か月ごと、９か月ごと、１０か月ごと、１１か月ごと、または毎年）。

【0154】

（Ｘ）キット。先天性障害を試験するためのキットも提供されている。キットは、血液を刺すためのランセット、血液滴を収集するためのフィルターカード、頬の上皮細胞を収集するための口腔スワブ、採血するための管、溶液または細胞を可溶化するための溶液、ならびに、ＤＢＳまたは細胞内のマーカータンパク質を消化するための緩衝剤及び酵素を含むことができる。キットは、ＩＤＵＡ及び／またはＧＡＡの非存在または減少を評価するための抗ペプチド結合剤（例えば、抗体）及び／または試薬または供給品を含む１つ以上の容器をさらに備えてもよい。特定の実施形態では、キットは、以下の抗ペプチド抗体：抗ＩＤＵＡ ２１８、抗ＩＤＵＡ ４６２、抗ＧＡＡ １５５、抗ＧＡＡ ３３２、抗ＧＡＡ ３７６、抗ＧＡＡ ６０１、抗ＧＡＡ ８５５、抗ＧＡＡ ８８２、及び抗ＧＡＡ ８９２を含む、１つ以上のキャリアを含む。特定の実施形態では、抗ＩＤＵＡ ２１８抗体は、配列番号１０～２１、４０、及び４１を含む。特定の実施形態では、抗ＩＤＵＡ ４６２抗体は、配列番号２２～３３、４２、及び４３を含む。特定の実施形態では、抗ＧＡＡ １５５抗体は、配列番号４４～６５を含む。特定の実施形態では、抗ＧＡＡ ３７６抗体は、配列番号６６～８７を含む。抗体は、カラムまたはビーズなどの固体支持体に固定してもよい。キットには、抗体からペプチドを放出するための溶出緩衝液をさらに備えてもよい。特定の実施形態では、キットは、シグネチャーペプチドの絶対定量化を実行するために、１つ以上の標識された参照ペプチドを備えてもよい。特定の実施形態では、キットはまた、ガーゼ、滅菌接着ストリップ、手袋、チューブなどのような、キットを効果的に使用するために必要な必須の実験室及び／または医療用品のいくつかまたは全てを備えてもよい。本明細書に記載されているキットのいずれの内容にも変更を加えてもよい。

【0155】

キットの構成要素は、保管及び後で使用するために調製し得る。そのような容器（複数可）に関連するのは、キットの製造、使用、または販売を規制する政府機関によって規定された形式の通知であり得、この通知は、必要に応じて、製造、使用、または販売の機関による承認を反映する。

【0156】

必要に応じて、キットは、この方法においてキットを使用するための説明書をさらに含む。様々な実施形態において、この説明書は、このキットの使用に関連する結果を解釈するための適切な指示；関連する廃棄物の適切な処分；などを含んでもよい。この説明書は、キット内で提供される印刷された説明書の形態であってもよいし、またはこの説明書はキット自体の一部に印刷されてもよい。説明書は、シート、パンフレット、小冊子、ＣＤ－ＲＯＭ、もしくはコンピューターで読み取り可能なデバイスの形式である場合もあれば、Ｗｅｂサイトなどの離れた場所にある説明書への指示を提供する場合もある。

【0157】

本開示の特定の実施形態を示すために、以下の例示的実施形態及び実施例を含める。当業者は、本開示の見地から、多くの変化を、本明細書にて開示された特定の実施形態に加えることが可能であり、本開示の精神及び範囲から逸脱することなく、依然として同様または類似の結果を得ることができることを認識するべきである。

【0158】

（ＸＩ）例示的実施形態。

【0159】

１．生体試料内の、Ｉ型ムコ多糖症（ＭＰＳ Ｉ）及び／またはポンペ病の１つ以上のシグネチャーペプチドの検出方法であって、上記方法が、
対象から上記生体試料を入手することと、
上記生体試料由来のタンパク質を酵素により消化して、ペプチドの混合物を得ることと、
上記ペプチドの混合物から、
配列番号１のＭＰＳ Ｉの第１のＩＤＵＡシグネチャーペプチドであって、上記第１のＩＤＵＡシグネチャーペプチドに結合し、配列番号１０のＣＤＲＨ１、配列番号１１のＣＤＲＨ２、及び配列番号１２のＣＤＲＨ３を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメインと、配列番号１３のＣＤＲＬ１、配列番号１４のＣＤＲＬ２、及び配列番号１５のＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメインと、を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントを有する、上記第１のＩＤＵＡシグネチャーペプチド；
配列番号２の第２のＩＤＵＡシグネチャーペプチドであって、上記第２のＩＤＵＡシグネチャーペプチドに結合し、配列番号２２のＣＤＲＨ１、配列番号２３のＣＤＲＨ２、及び配列番号２４のＣＤＲＨ３を含むＶＨドメインと、配列番号２５のＣＤＲＬ１、配列番号２６のＣＤＲＬ２、及び配列番号２７のＣＤＲＬ３を含むＶＬドメインと、を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントを有する、上記第２のＩＤＵＡシグネチャーペプチド；
配列番号３のポンペ病の第１のＧＡＡシグネチャーペプチドであって、上記第１のＧＡＡシグネチャーペプチドに結合し、配列番号４４のＣＤＲＨ１、配列番号４５のＣＤＲＨ２、及び配列番号４６のＣＤＲＨ３を含むＶＨドメインと、配列番号４７のＣＤＲＬ１、配列番号４８のＣＤＲＬ２、及び配列番号４９のＣＤＲＬ３を含むＶＬドメインと、を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントを有する、上記第１のＧＡＡシグネチャーペプチド；
配列番号４のポンペ病の第２のＧＡＡシグネチャーペプチドであって、上記第２のＧＡＡシグネチャーペプチドに結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを有する、上記第２のＧＡＡシグネチャーペプチド；
配列番号５のポンペ病の第３のＧＡＡシグネチャーペプチドであって、上記第３のＧＡＡシグネチャーペプチドに結合し、配列番号６６のＣＤＲＨ１、配列番号６７のＣＤＲＨ２、及び配列番号５８のＣＤＲＨ３を含むＶＨドメインと、配列番号６９のＣＤＲＬ１、配列番号７０のＣＤＲＬ２、及び配列番号７１のＣＤＲＬ３を含むＶＬドメインと、を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントを有する、上記第３のＧＡＡシグネチャーペプチド；
配列番号６のポンペ病の第４のＧＡＡシグネチャーペプチドであって、上記第４のＧＡＡシグネチャーペプチドに結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを有する、上記第４のＧＡＡシグネチャーペプチド；
配列番号７のポンペ病の第５のＧＡＡシグネチャーペプチドであって、上記第５のＧＡＡシグネチャーペプチドに結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを有する、上記第５のＧＡＡシグネチャーペプチド；
配列番号８のポンペ病の第６のＧＡＡシグネチャーペプチドであって、上記第６のＧＡＡシグネチャーペプチドに結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを有する、上記第６のＧＡＡシグネチャーペプチド；及び／または

配列番号９のポンペ病の第７のＧＡＡシグネチャーペプチドであって、上記第７のＧＡＡシグネチャーペプチドに結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを有する、上記第７のＧＡＡシグネチャーペプチド；
を濃縮することと、
上記濃縮したペプチドで、液体クロマトグラフィー複数反応モニタリング質量分析（ＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳ）を実施して、各シグネチャーペプチドの濃度を測定することで、上記生体試料内の、ＭＰＳ Ｉ及び／またはポンペ病の１つ以上のシグネチャーペプチドを検出することと、
を含む、上記方法。

【0160】

２．上記方法を、上記対象で、フェニルケトン尿症、原発性先天性甲状腺機能低下症、嚢胞性線維症、及び鎌状赤血球症のうちの１つ以上をさらにスクリーニングする、新生児スクリーニング（ＮＢＳ）の一部として実施する、実施形態１に記載の方法。

【0161】

３．上記方法を、上記対象においてポンペ病及び／またはＭＰＳ Ｉの臨床的症状が見られない中で実施する、実施形態１または２に記載の方法。

【0162】

４．上記生体試料が、乾燥血液スポット（ＤＢＳ）、口腔スワブ、末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）、または白血球（ＷＢＣ）である、実施形態１～３のいずれか１つに記載の方法。

【0163】

５．上記酵素がトリプシンである、実施形態１～４のいずれか１つに記載の方法。

【0164】

６．各シグネチャーペプチドの濃度を、対応する所定の閾値濃度と比較することと、
上記対象が、
上記第１及び／または第２のＩＤＵＡシグネチャーペプチドの濃度が、対応する所定の閾値濃度を下回る場合、あるいは、上記第１及び／または第２のＩＤＵＡシグネチャーペプチドが存在しない場合に、ＭＰＳ Ｉを、及び／または
上記第１、第２、第３、第４、第５、第６、及び／または第７のＧＡＡシグネチャーペプチドの濃度が、対応する所定の閾値濃度を下回る場合、あるいは、上記第１、第２、第３、第４、第５、第６、及び／または第７のＧＡＡシグネチャーペプチドが存在しない場合に、ポンペ病を
患うと診断することと、
をさらに含む、実施形態１～５のいずれか１つに記載の方法。

【0165】

７．各シグネチャーペプチドに対する所定の閾値濃度が、正常な対照対象の集団に由来する、対応する生体試料中の各シグネチャーペプチドの平均濃度の標準偏差から計算される、実施形態６に記載の方法。

【0166】

８．上記生体試料がＤＢＳであり、正常な対照対象の集団由来のＤＢＳにおける、上記配列番号１のＭＰＳ Ｉの第１のＩＤＵＡシグネチャーペプチドの平均濃度が、１０ｐｍｏｌ／Ｌ～３５０ｐｍｏｌ／Ｌの範囲の濃度を含む、実施形態７に記載の方法。

【0167】

９．上記生体試料がＤＢＳであり、上記配列番号１のＭＰＳ Ｉの第１のＩＤＵＡシグネチャーペプチドの所定の閾値濃度が、３５ｐｍｏｌ／Ｌ以下を含む、実施形態６～８のいずれか１つに記載の方法。

【0168】

１０．上記生体試料がＰＢＭＣであり、正常な対照対象の集団由来のＰＢＭＣにおける、上記配列番号１のＭＰＳ Ｉの第１のＩＤＵＡシグネチャーペプチドの平均濃度が、３００ｐｍｏｌ／Ｌ～１０００ｐｍｏｌ／Ｌの範囲の濃度を含む、実施形態７に記載の方法。

【0169】

１１．上記生体試料が口腔スワブであり、正常な対照対象の集団由来の口腔スワブにおける、上記配列番号１のＭＰＳ Ｉの第１のＩＤＵＡシグネチャーペプチドの平均濃度が、１００ｐｍｏｌ／Ｌ～１０００ｐｍｏｌ／Ｌの範囲の濃度を含む、実施形態７に記載の方法。

【0170】

１２．上記生体試料が口腔スワブであり、正常な対照対象の集団由来の口腔スワブにおける、上記配列番号１のＭＰＳ Ｉの第１のＩＤＵＡシグネチャーペプチドの平均濃度が、３０ｐｍｏｌ／ｇ～８５ｐｍｏｌ／ｇの範囲の濃度を含む、実施形態７に記載の方法。

【0171】

１３．上記生体試料がＤＢＳであり、正常な対照対象の集団由来のＤＢＳにおける、上記配列番号２のＭＰＳ Ｉの第２のＩＤＵＡシグネチャーペプチドの平均濃度が、１０ｐｍｏｌ／Ｌ～２５０ｐｍｏｌ／Ｌの範囲の濃度を含む、実施形態７～９のいずれか１つに記載の方法。

【0172】

１４．上記生体試料がＤＢＳであり、上記配列番号２のＭＰＳ Ｉの第２のＩＤＵＡシグネチャーペプチドの所定の閾値濃度が、２５ｐｍｏｌ／Ｌ以下を含む、実施形態６～９、及び１３のいずれか１つに記載の方法。

【0173】

１５．上記生体試料がＰＢＭＣであり、正常な対照対象の集団由来のＰＢＭＣにおける、上記配列番号２のＭＰＳ Ｉの第２のＩＤＵＡシグネチャーペプチドの平均濃度が、３５０ｐｍｏｌ／Ｌ～１０００ｐｍｏｌ／Ｌの範囲の濃度を含む、実施形態７または１０に記載の方法。

【0174】

１６．上記生体試料が口腔スワブであり、正常な対照対象の集団由来の口腔スワブにおける、上記配列番号２のＭＰＳ Ｉの第２のＩＤＵＡシグネチャーペプチドの平均濃度が、１００ｐｍｏｌ／Ｌ～１０００ｐｍｏｌ／Ｌの範囲の濃度を含む、実施形態７、１１、及び１２のいずれか１つに記載の方法。

【0175】

１７．上記生体試料が口腔スワブであり、正常な対照対象の集団由来の口腔スワブにおける、上記配列番号２のＭＰＳ Ｉの第２のＩＤＵＡシグネチャーペプチドの平均濃度が、３０ｐｍｏｌ／ｇ～８０ｐｍｏｌ／ｇの範囲の濃度を含む、実施形態７、１１、１２、及び１３のいずれか１つに記載の方法。

【0176】

１８．上記生体試料がＤＢＳであり、正常な対照対象の集団由来のＤＢＳにおける、上記配列番号５のポンペ病の第３のＧＡＡシグネチャーペプチドの平均濃度が、２５ｐｍｏｌ／Ｌ～２５０ｐｍｏｌ／Ｌの範囲の濃度を含む、実施形態６～９、１３、及び１４のいずれか１つに記載の方法。

【0177】

１９．上記生体試料がＤＢＳであり、上記配列番号５のポンペ病の第３のＧＡＡシグネチャーペプチドの所定の閾値濃度が、３０ｐｍｏｌ／Ｌ以下を含む、実施形態６～９、１３、１４、及び１８のいずれか１つに記載の方法。

【0178】

２０．上記配列番号１の第１のＩＤＵＡシグネチャーペプチドの濃縮に使用した、上記抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号１８のＶＨドメイン、及び／または配列番号２１のＶＬドメインを含む、実施形態１～１９のいずれか１つに記載の方法。

【0179】

２１．上記配列番号２の第２のＩＤＵＡシグネチャーペプチドの濃縮に使用した、上記抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号３０のＶＨドメイン、及び／または配列番号３３のＶＬドメインを含む、実施形態１～２０のいずれか１つに記載の方法。

【0180】

２２．上記配列番号３の第１のＧＡＡシグネチャーペプチドの濃縮に使用した、上記抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号５７のＶＨドメイン；配列番号６５のＶＬドメイン；配列番号５５の重鎖；または配列番号６３の軽鎖のうちの１つ以上を含む、実施形態１～２１のいずれか１つに記載の方法。

【0181】

２３．上記配列番号５の第３のＧＡＡシグネチャーペプチドの濃縮に使用した、上記抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号７９のＶＨドメイン；配列番号８７のＶＬドメイン；配列番号７７の重鎖；または配列番号８５の軽鎖のうちの１つ以上を含む、実施形態１～２２のいずれか１つに記載の方法。

【0182】

２４．上記対象が、ＭＰＳ Ｉ及び／またはポンペ病に対する１つ以上の治療を受けており、上記生体試料が、上記１つ以上の治療の前に入手され、上記方法が、
上記１つ以上の治療中または後に、上記対象に由来する第２の生体試料で、上記入手、消化、濃縮、及び実施を繰り返すこと、
ならびに、
上記１つ以上の治療が、
上記１つ以上の治療中または後の、上記第１及び／または第２のＩＤＵＡシグネチャーペプチドの濃度が、上記１つ以上の治療前の、上記第１及び／または第２のＩＤＵＡシグネチャーペプチドの対応するペプチド濃度を上回る場合、ＭＰＳ Ｉに、及び／または
上記１つ以上の治療中または後の、上記第１、第２、第３、第４、第５、第６、及び／または第７のＧＡＡシグネチャーペプチドの濃度が、上記１つ以上の治療前の、上記第１、第２、第３、第４、第５、第６、及び／または第７のＧＡＡシグネチャーペプチドの対応する濃度を上回る場合、ポンペ病に
対して効果的であることを測定すること、
あるいは、
上記１つ以上の治療が、
上記１つ以上の治療中または後の、上記第１及び／または第２のＩＤＵＡシグネチャーペプチドの濃度が、上記１つ以上の治療前の、上記第１及び／または第２のＩＤＵＡシグネチャーペプチドの対応する濃度以下である場合、または、上記第１及び／または第２のＩＤＵＡシグネチャーペプチドが存在しない場合、ＭＰＳ Ｉに、及び／または
上記１つ以上の治療中または後の、上記第１、第２、第３、第４、第５、第６、及び／または第７のＧＡＡシグネチャーペプチドの濃度が、上記１つ以上の治療前の、上記第１、第２、第３、第４、第５、第６、及び／または第７のＧＡＡシグネチャーペプチドの対応する濃度以下である場合、または、上記第１、第２、第３、第４、第５、第６、及び／または第７のＧＡＡシグネチャーペプチドが存在しない場合、ポンペ病に
対して効果的でないことを測定すること
をさらに含む、実施形態１～２３のいずれか１つに記載の方法。

【0183】

２５．上記対象が、
上記第１及び／または第２のＩＤＵＡシグネチャーペプチドの濃度が存在しない場合、ＭＰＳ Ｉに、及び／または
上記第１、第２、第３、第４、第５、第６、及び／または第７のＧＡＡシグネチャーペプチドの濃度が存在しない場合、ポンペ病に
対して、酵素補充療法（ＥＲＴ）に対する免疫応答を生み出すことを予測すること
をさらに含む、実施形態１～２４のいずれか１つに記載の方法。

【0184】

２６．ミコフェノール酸モフェチル、メトトレキサート（ＭＴＸ）、静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）、リツキシマブ、ボルテゾミブ、シクロホスファミド、及び／または血漿交換を上記対象に投与して、上記免疫応答を低下または防止することをさらに含む、実施形態２５に記載の方法。

【0185】

２７．上記免疫応答が、ＥＲＴにおいて、酵素に対する中和抗薬剤抗体を生み出すことを含む、実施形態２５または２６に記載の方法。

【0186】

２８．対象における、Ｉ型ムコ多糖症（ＭＰＳ Ｉ）及び／またはポンペ病をスクリーニングするためのアッセイであって、上記アッセイが、
（ｉ）
配列番号１０のＣＤＲＨ１、配列番号１１のＣＤＲＨ２、及び配列番号１２のＣＤＲＨ３を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、ならびに、配列番号１のＭＰＳ Ｉのシグネチャーペプチドに結合する、配列番号１３のＣＤＲＬ１、配列番号１４のＣＤＲＬ２、及び配列番号１５のＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン；
配列番号２２のＣＤＲＨ１、配列番号２３のＣＤＲＨ２、及び配列番号２４のＣＤＲＨ３を含むＶＨドメイン、ならびに、配列番号２のＭＰＳ ＩのＩＤＵＡシグネチャーペプチドに結合する、配列番号２５のＣＤＲＬ１、配列番号２６のＣＤＲＬ２、及び配列番号２７のＣＤＲＬ３を含むＶＬドメイン；
配列番号４４のＣＤＲＨ１、配列番号４５のＣＤＲＨ２、及び配列番号４６のＣＤＲＨ３を含むＶＨドメイン、ならびに、配列番号３のポンペ病のＧＡＡシグネチャーペプチドに結合する、配列番号４７のＣＤＲＬ１、配列番号４８のＣＤＲＬ２、及び配列番号４９のＣＤＲＬ３を含むＶＬドメイン；及び／または
配列番号６６のＣＤＲＨ１、配列番号６７のＣＤＲＨ２、及び配列番号６８のＣＤＲＨ３を含むＶＨドメイン、ならびに、配列番号５のポンペ病のＧＡＡシグネチャーペプチドに結合する、配列番号６９のＣＤＲＬ１、配列番号７０のＣＤＲＬ２、及び配列番号７１のＣＤＲＬ３を含むＶＬドメイン；
を含む、抗体またはその抗原結合フラグメント：
及び／または
（ｉｉ）
配列番号４のポンペ病のＧＡＡシグネチャーペプチドに結合する抗体またはその抗原結合フラグメント；
配列番号６のポンペ病のＧＡＡシグネチャーペプチドに結合する抗体またはその抗原結合フラグメント；
配列番号７のポンペ病のＧＡＡシグネチャーペプチドに結合する抗体またはその抗原結合フラグメント；
配列番号８のポンペ病のＧＡＡシグネチャーペプチドに結合する抗体またはその抗原結合フラグメント；及び／または
配列番号９のポンペ病のＧＡＡシグネチャーペプチドに結合する抗体またはその抗原結合フラグメント；
及び／または
（ｉｉｉ）
配列番号１のＭＰＳ ＩのＩＤＵＡシグネチャーペプチド；
配列番号２のＭＰＳ ＩのＩＤＵＡシグネチャーペプチド；
配列番号３のポンペ病のＧＡＡシグネチャーペプチド；
配列番号４のポンペ病のＧＡＡシグネチャーペプチド；
配列番号５のポンペ病のＧＡＡシグネチャーペプチド；
配列番号６のポンペ病のＧＡＡシグネチャーペプチド；
配列番号７のポンペ病のＧＡＡシグネチャーペプチド；
配列番号８のポンペ病のＧＡＡシグネチャーペプチド；及び／または
配列番号９のポンペ病のＧＡＡシグネチャーペプチド
を含む参照シグネチャーペプチド
を含む、上記アッセイ。

【0187】

２９．上記参照シグネチャーペプチドが同位体標識されている、実施形態２８に記載のアッセイ。

【0188】

３０．上記抗体またはその抗原結合フラグメントが磁気ビーズに付着している、実施形態２８または２９に記載のアッセイ。

【0189】

３１．配列番号１０のＣＤＲＨ１、配列番号１１のＣＤＲＨ２、及び配列番号１２のＣＤＲＨ３を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、ならびに、配列番号１３のＣＤＲＬ１、配列番号１４のＣＤＲＬ２、及び配列番号１５のＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む、抗体またはその抗原結合フラグメント。

【0190】

３２．上記ＶＨドメインが配列番号１８で説明され、上記ＶＬドメインが配列番号２１で説明される、実施形態３１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。

【0191】

３３．配列番号２２のＣＤＲＨ１、配列番号２３のＣＤＲＨ２、及び配列番号２４のＣＤＲＨ３を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、ならびに、配列番号２５のＣＤＲＬ１、配列番号２６のＣＤＲＬ２、及び配列番号２７のＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む、抗体またはその抗原結合フラグメント。

【0192】

３４．上記ＶＨドメインが配列番号３０で説明され、上記ＶＬドメインが配列番号３３で説明される、実施形態３３に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。

【0193】

３５．配列番号４４のＣＤＲＨ１、配列番号４５のＣＤＲＨ２、及び配列番号４６のＣＤＲＨ３を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、ならびに、配列番号４７のＣＤＲＬ１、配列番号４８のＣＤＲＬ２、及び配列番号４９のＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む、抗体またはその抗原結合フラグメント。

【0194】

３６．上記ＶＨドメインが配列番号５７で説明される、及び／または、上記重鎖が配列番号５５で説明される；ならびに
上記ＶＬドメインが配列番号６５で説明される、及び／または、上記軽鎖が配列番号６３で説明される
実施形態３５に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。

【0195】

３７．配列番号６６のＣＤＲＨ１、配列番号６７のＣＤＲＨ２、及び配列番号６８のＣＤＲＨ３を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、ならびに、配列番号６９のＣＤＲＬ１、配列番号７０のＣＤＲＬ２、及び配列番号７１のＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む、抗体またはその抗原結合フラグメント。

【0196】

３８．上記ＶＨドメインが配列番号７９で説明される、及び／または、上記重鎖が配列番号７７で説明される；ならびに
上記ＶＬドメインが配列番号８７で説明される、及び／または、上記軽鎖が配列番号８５で説明される
実施形態３７に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。

【0197】

３９．キットであって、
（ｉ）
配列番号１０のＣＤＲＨ１、配列番号１１のＣＤＲＨ２、及び配列番号１２のＣＤＲＨ３を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、ならびに、配列番号１のＭＰＳ Ｉのシグネチャーペプチドに結合する、配列番号１３のＣＤＲＬ１、配列番号１４のＣＤＲＬ２、及び配列番号１５のＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン；
配列番号２２のＣＤＲＨ１、配列番号２３のＣＤＲＨ２、及び配列番号２４のＣＤＲＨ３を含むＶＨドメイン、ならびに、配列番号２のＭＰＳ ＩのＩＤＵＡシグネチャーペプチドに結合する、配列番号２５のＣＤＲＬ１、配列番号２６のＣＤＲＬ２、及び配列番号２７のＣＤＲＬ３を含むＶＬドメイン；
配列番号４４のＣＤＲＨ１、配列番号４５のＣＤＲＨ２、及び配列番号４６のＣＤＲＨ３を含むＶＨドメイン、ならびに、配列番号３のポンペ病のＧＡＡシグネチャーペプチドに結合する、配列番号４７のＣＤＲＬ１、配列番号４８のＣＤＲＬ２、及び配列番号４９のＣＤＲＬ３を含むＶＬドメイン；及び／または
配列番号６６のＣＤＲＨ１、配列番号６７のＣＤＲＨ２、及び配列番号６８のＣＤＲＨ３を含むＶＨドメイン、ならびに、配列番号５のポンペ病のＧＡＡシグネチャーペプチドに結合する、配列番号６９のＣＤＲＬ１、配列番号７０のＣＤＲＬ２、及び配列番号７１のＣＤＲＬ３を含むＶＬドメイン；
を含む、抗体またはその抗原結合フラグメント：
及び／または
（ｉｉ）
配列番号４のポンペ病のＧＡＡシグネチャーペプチドに結合する抗体またはその抗原結合フラグメント；
配列番号６のポンペ病のＧＡＡシグネチャーペプチドに結合する抗体またはその抗原結合フラグメント；
配列番号７のポンペ病のＧＡＡシグネチャーペプチドに結合する抗体またはその抗原結合フラグメント；
配列番号８のポンペ病のＧＡＡシグネチャーペプチドに結合する抗体またはその抗原結合フラグメント；及び／または
配列番号９のポンペ病のＧＡＡシグネチャーペプチドに結合する抗体またはその抗原結合フラグメント；
及び／または
（ｉｉｉ）
配列番号１のＭＰＳ ＩのＩＤＵＡシグネチャーペプチド；
配列番号２のＭＰＳ ＩのＩＤＵＡシグネチャーペプチド；
配列番号３のポンペ病のＧＡＡシグネチャーペプチド；
配列番号４のポンペ病のＧＡＡシグネチャーペプチド；
配列番号５のポンペ病のＧＡＡシグネチャーペプチド；
配列番号６のポンペ病のＧＡＡシグネチャーペプチド；
配列番号７のポンペ病のＧＡＡシグネチャーペプチド；
配列番号８のポンペ病のＧＡＡシグネチャーペプチド；及び／または
配列番号９のポンペ病のＧＡＡシグネチャーペプチド
を含む参照シグネチャーペプチド
を含む上記キット。

【0198】

４０．濾紙カード、パンチツール、口腔スワブ、採血管、消化酵素、消化緩衝液、抗体またはその抗原結合フラグメントの固体支持体；及び溶出緩衝液のうちの１つ以上をさらに含む、実施形態３９に記載のキット。

【0199】

４１．上記参照シグネチャーペプチドが同位体標識されている、実施形態３９または４０に記載のキット。

【0200】

４２．上記抗体またはその抗原結合フラグメントが磁気ビーズに付着している、実施形態３９～４１のいずれか１つに記載のキット。

【0201】

（ＸＩＩ）実験実施例。

【0202】

実施例１。本研究は、ＤＢＳを生体試料として使用するｉｍｍｕｎｏ－ＳＲＭ法により、ＭＰＳ Ｉ患者をスクリーニングするための、２つのＩＤＵＡシグネチャーペプチドバイオマーカー、及びこれらの関連する抗体の有効性を示した。関連する抗体を使用して、２つのＩＤＵＡシグネチャーペプチドバイオマーカーが、市販されているＰＢＭＣで検出されたこともまた、本研究は示した。

【0203】

材料及び方法。標準的なｉｍｍｕｎｏ－ＳＲＭプロトコルを、本研究で使用した。簡潔に述べると、１．２５インチのＤＢＳパンチを、各試料に対して入手し、９６ウェルプレート（９６ Ｗｅｌｌ ＭＡＳＴＥＲＢＬＯＣＫ（登録商標），ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ，０．５ｍｌ，Ｇｒｅｉｎｅｒ）の、指定されたウェルに配置した。各ウェルに、２００μＬの、０．１％ｔｒｉｔｏｎの５０ｍＭ重炭酸アンモニウム緩衝液、及び、６μＬの０．２Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）を添加し、ＤＢＳを３０分間、３７℃のオーブン（ハイブリダイゼーションオーブン，Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で抽出した。抽出後、３７．５μＬのトリプシン（１μｇ／μＬの５０ｍＭ酢酸）（ＴＰＣＫ－処理済トリプシン，Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ，ＬＳ００３７４２）を各ウェルに添加し、３７℃オーブンで２時間、消化を行った。その後、消化の後で、適量の内部標準（ＩＳ）、及び１０μＬのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）を各試料に添加し、１０００ｒｐｍにて２分間、十分混合した。

【0204】

次に、２００μＬの消化溶液を新しいウェルに移し、タンパク質はセーブペーパー（ＤＢＳ製）に残したままにした。各標的化ペプチドに対して、適量のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）被覆磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ－Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ磁気ビーズ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｎｏ．１０００４Ｄ）を溶液に添加し、混合物を４℃、１０００ｒｐｍで一晩放置した。翌日、ｍＡｂ－ビーズ－ペプチド複合体を、２５０μＬの０．１×ＰＢＳ＋０．０１％ ＣＨＡＰＳにより、磁気プレートラックを使用して２回洗浄した。２回目の洗浄後、３０μＬの５％酢酸＋３％ＡＣＮの水溶液を、ペプチド溶出のためにｍＡｂ－ビーズ－ペプチド複合体に添加し、１０００ｒｐｍで５分間放置した。次に、溶出液及びビーズを磁気プレートラック上で分離した。溶出液を異なる９６ウェルプレートに移し、３０００ｒｐｍで２分間遠心分離にかけた。各ウェルからの、１５μＬの透明溶出液を、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いるデータ分析のために、新しいウェルに移した。残りの溶出液を－２０℃で、バックアップとして保管した。

【0205】

Ｉｏｎｋｅｙ源、ならびに、デュアルＭクラスグラジエント及びローディングクロマトグラフィーポンプを備えたＷａｔｅｒｓ Ｘｅｖｏ ＴＱ－ＸＳ（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）で、単離したペプチド混合物のＬＣ－ＭＳ／ＭＳを行った。クロマトグラフ溶媒は、Ａ：Ｈ_２Ｏ＋０．１％ＦＡ、及びＢ：ＡＣＮ＋０．１％ＦＡであった。初期ステップとして、ペプチドを、Ｍ－Ｃｌａｓｓ Ｔｒａｐ Ｓｙｍｍｅｔｒｙ Ｃ１８カラム（３００μＭ×２５ｍｍ、１００Ａ、５ｕＭ）に３分間、Ａ：Ｂを９８：２で、２０μＬ／分の一定速度でロードした。ロード後、逆流させた。ペプチドをトラップカラムから溶出させ、１５０ｕＭ×１００ｍｍのＢＥＨ Ｃ１８イオンキー（１３０Ａ，１．７μＭ）を使用して分離した。Ｑ１及びＱ３四重極の両方でのユニット解像度で、ＳＲＭ遷移を入手した。各ペプチドに対して、プリカーサー及びフラグメント質量を選択して、最高強度の遷移を生み出した。プリカーサー質量、フラグメント質量、及び衝突エネルギーをチューニングして、生成したシグナルを最適化した。

【0206】

ＤＢＳでのイズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）レベルを監視して、Ｉ型ムコ多糖症（ＭＰＳ Ｉ）患者をスクリーニングするために、シグネチャーペプチドバイオマーカーＩＤＵＡ ２１８及びＩＤＵＡ ４６２を開発した。標準的なｉｍｍｕｎｏ－ＳＲＭプロトコルを用いて、それぞれ、ＩＤＵＡ ２１８及びＩＤＵＡ ４６２に対する、１μｇ及び４μｇの抗体をアッセイで使用して、外部ペプチドと１．２５ｆｍｏｌのＩＳの両方を捕捉した。研究には、１１名のＭＰＳ Ｉ患者（弱毒化形態を有する２名の患者：１名の患者はＥＲＴ前及びＥＲＴ後試料の両方を提供する；重症形態を有する４名の患者：１名の患者は、ＥＲＴ前、ＥＲＴ後、及び、骨髄移植（ＢＭＴ）後試料を提供する；未知の形態のＭＰＳ Ｉを有する３名の患者；ならびに、２名のＢＭＴ後患者）を含んだ。治療前患者は全員、疾患の重症度に関係なく、極度に低レベルのＩＤＵＡを示した一方で、正常対照、及び治療後患者は、正常範囲で、一定レベルのＩＤＵＡを示した（図３Ａ～３Ｄ）。ＩＤＵＡペプチドバイオマーカーを使用して、ＭＰＳ Ｉを診断、及び／または予測することができる。

【0207】

図４Ａ及び４Ｂに示すように、異なる量のＩＳを、ＤＢＳマトリックスにスパイクすることにより、両方のＩＤＵＡペプチドバイオマーカーに対して、線形曲線が構築された。図中の点線は、正常前記で定量化された最低量のペプチドを示し、ＩＤＵＡ ２１８及びＩＤＵＡ ４６２に対してそれぞれ、０．６４ｆｍｏｌ（２９．４３ｐｍｏｌ／Ｌ）及び０．３０ｆｍｏｌ（１３．７７ｐｍｏｌ／Ｌ）であった。表２では、正常範囲、暫定的なカットオフ、検出下限（ＬＯＤ）、定量下限（ＬＯＱ）、日中及び日間のバリアント係数（ＣＶＳ）、ならびに、ＩＤＵＡｉｍｍｕｎｏ－ＳＲＭ法のためのＩＤＵＡペプチドの、相対的な安定性をまとめている。日中及び日間アッセイＣＶは、異なる５日間において、５通りのアッセイを行うことで入手した。日中ＣＶは、同日中での、同一試料の５回のアッセイでの結果の一貫性を評価する一方で、ＣＶは、異なる５日間でのアッセイの結果の一貫性を評価する。表２にまとめるように、ＩＤＵＡ分析に対するＣＶは全て、１５％未満であった。ＤＢＳ試料における、ＩＤＵＡペプチドの相対的安定性は、２週間の過程にわたり、－２０℃、室温（ＲＴ）、及び３７℃を含む、異なる温度でＤＢＳを保管することにより評価した。ＲＴ及び３７℃で保管したＤＢＳのＩＤＵＡ濃度を、－２０℃で保管したＤＢＳのＩＤＵＡ濃度と比較することにより、相対的安定性を計算した。合わせると、ＩＤＵＡ分析のためのｉｍｍｕｎｏ－ＳＲＭ法は、高定量様式で実施することができることをこれらのデータは示す。

【表5】

【0208】

図３Ｂ及び３Ｄに示すように、大部分のＭＰＳ Ｉ患者が、存在しないレベルのＩＤＵＡを示す、すなわち、ＩＤＵＡ濃度が、両方のＩＤＵＡペプチドのＬＯＤを下回るにもかかわらず、弱毒化ＭＰＳ Ｉを患う１名の患者は、わずかに増加したＩＤＵＡ濃度（両方のＩＤＵＡペプチドのＬＯＤを上回る）を示した。より濃縮されたタンパク質、例えば白血球、ＰＢＭＣ、または口腔スワブを有する生体試料により、ｉｍｍｕｎｏ－ＳＲＭ法により、これらの２つの患者集団でのタンパク質濃度差の、より細かい調査が可能となるはずであることが予想される。

【0209】

図５Ａ及び５Ｂに示すように、５００μＬの商業ＰＢＭＣ試料（５００μｇのタンパク質／ｍＬ）を用いると、対照ＤＢＳ試料と比較したときに、両方のＩＤＵＡペプチドバイオマーカーに対して検出されたペプチド濃度は、８～１２倍増加した。

【0210】

実施例２。口腔スワブ由来の細胞において、実施例１に記載する、関連する抗体を使用するｉｍｍｕｎｏ－ＳＲＭ法により、２つのＩＤＵＡシグネチャーペプチドバイオマーカーが検出されたことを、本研究は示した。

【0211】

口腔スワブ試料。制御倫理審査委員会は、口腔スワブ試料用のプロトコルを認可し、対象全員に、書面によるインフォームドコンセントが与えられた。正常な対照の口腔スワブ試料を、商業ベンダーから入手した。口腔スワブ試料は全て、実験室で、－２０℃または－８０℃で保管した。盲検試料には、送付者により付与されたＩＤで標識をして識別し、同意した患者試料に、受領時に実験室ＩＤを付与した。剥離パウチ中の、ナイロンでフロック加工された乾燥スワブを、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ；カタログ番号２３－６００－９５１）から入手した。２ｍＬの冷却保管バイアル内部スレッドを、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ；カタログ番号１２－５６７－５０１）から入手した。口腔スワブ試料収集後のプロトコルは、ＣＨＬＡ．（２０１６年４月４日）．Ｂｕｃｃａｌ Ｓｗａｂ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ．ＣＨＬＡ－Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ；（２０１６年７月２７日）．Ｂｕｃｃａｌ ＤＮＡ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ．Ｐａｔｈｗａｙ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ；（２０１７年１２月１４日）．Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｂｕｃｃａｌ Ｓｗａｂ Ｓａｍｐｌｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ．Ｏｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ；ＰＤＸＬ ＰＤＸＬ．（２０１７年１１月２８日）．Ｂｕｃｃａｌ Ｓｗａｂ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ － ＰｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄＤｘ Ｌａｂｓ ［Ｖｉｄｅｏ］．ＹｏｕＴｕｂｅ．ｙｏｕｔｕｂｅ／３ｆｔｖＨｋｆＭ７１ｏ？ｔ＝１４６のワールドワイドウェブ；及び、Ｃｅｎｔｅｒｓ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ（ＣＤＣ）（２０２０年７月８日）に記載されている。Ｉｎｔｅｒｉｍ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｃｏｌｌｅｃｔｉｎｇ， ｈａｎｄｌｉｎｇ， ａｎｄ ｔｅｓｔｉｎｇ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ ｆｏｒ Ｃｏｖｉｄ－１９．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ／２０１９－ｎｃｏｖ／ｌａｂ／ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ－ｃｌｉｎｉｃａｌ－ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ．ｈｔｍｌのワールドワイドウェブに記載されている。細胞を含有する口腔スワブの先端を、可溶化のために管にクリップ止めし、ＤＢＳに関して上述したように消化を行った。

【0212】

図６Ａ及び６Ｂに示すように、口腔スワブを用いて収集した上皮細胞により、ＤＢＳ試料と比較して、両方のＩＤＵＡペプチドバイオマーカーに対するペプチド濃度の、２．９～１８．２倍の増加がもたらされ、このことにより、同様の体積の唾液が推定される。

【0213】

実施例３。ｉｍｍｕｎｏ－ＳＲＭ法は、確認されたＭＰＳ Ｉ患者から、ＭＰＳ Ｉの偽欠損症症例を区別するための実行可能なオプションであることを、本研究は示した。

【0214】

実施例１で論じる、標準的なｉｍｍｕｎｏ－ＳＲＭプロトコルに従い、実験を行った。図７Ａ及び７Ｂは、４名のＭＰＳ Ｉ偽欠損症症例に対する、ＩＤＵＡ ２１８及びＩＤＵＡ ４６２の両方のペプチド濃度を示す。偽欠損症ＩＤＵＡ濃度は広範囲にわたった。しかし、偽欠損症症例に対する最低ＩＤＵＡ濃度（ＩＤＵＡ ２１８及びＩＤＵＡ ４６２に対してそれぞれ、８．６３ｐｍｏｌ／Ｌ及び３．８２ｐｍｏｌ／Ｌ）であっても、確認されたＭＰＳ Ｉ患者に対する最高ＩＤＵＡ濃度（ＩＤＵＡ ２１８及びＩＤＵＡ ４６２に対してそれぞれ、６．７６ｐｍｏｌ／Ｌ及び２．３２ｐｍｏｌ／Ｌ）よりも依然として高かった。ｉｍｍｕｎｏ－ＳＲＭを、ＭＰＳ ＩのＮＢＳに対する一次または二次力価試験として使用し、偽欠損症症例から偽陽性率を減らすことができることを、本研究は示す。ｉｍｍｕｎｏ－ＳＲＭを一次スクリーニング法として使用する、将来的な大型コホートパイロットスタディは、ＭＰＳ Ｉ及びポンペ病をスクリーニングするための現在の方法と比較して、優れた偽陽性率を試験するために実施されるであろう。

【0215】

実施例４。ＧＡＡペプチドに対するモノクローナル抗体を開発することは実現可能であることを、本研究は示した。

【0216】

抗体産生を以下のとおりに実施した：ｉ）ペプチドを、Ｎ末端システインで合成して、ウサギ免疫化の前に、アジュバントタンパク質にコンジュゲートした；ｉｉ）免疫化ウサギからの血清試料を収集し、血清中の抗体を、ウサギを選択するためのｉｍｍｕｎｏ－ＳＲＭによるペプチド捕捉試験で使用した；ｉｉｉ）２～３回の免疫化ブースト（ウサギへの複数回の免疫付与）後、最良のウサギを選択して、その形質細胞を、細胞選別により単離し、培養して抗体を作製した；ｉｖ）実施例１に記載のとおりにｉｍｍｕｎｏ－ＳＲＭを実施し、形質細胞が、目的のターゲットに対する利用可能な抗体を産生することを実証した。ｃＤＮＡをクローニングし、発現させて最終のモノクローナル抗体を産生した。

【0217】

ＧＡＡ ３３２及びＧＡＡ ８５５に対するモノクローナル抗体を開発するために、免疫化ウサギの血清試料中の抗体を使用して、図８Ａ及び８Ｂに示すように、精製したＧＡＡ ３３２及びＧＡＡ ８５５ペプチド、加えて、ＤＢＳ試料由来の内部ＧＡＡ ３３２及びＧＡＡ ８５５ペプチドを捕捉した。免疫化ウサギが、ＧＡＡ ３３２及びＧＡＡ ８５５ペプチドに対する、対応する抗体を産生することができることを、本データは示す。抗体を含有する上清を、ＰＢＭＣを用いるｉｍｍｕｎｏ－ＳＲＭアッセイで使用した。図９に示すように、ＧＡＡ ８５５に対する上清中の抗体は、ＰＢＭＣ試料（５００μＬの、商用ＰＢＭＣ試料（５００μｇのタンパク質／ｍＬ））由来のペプチド捕捉後に、強力なシグナルを得ることが可能であった。ウサギは、抗ＧＡＡペプチド抗体を生み出すことができることを、本研究は示す。

【0218】

ＧＡＡ １５５及びＧＡＡ ３７６に対するモノクローナル抗体を開発するために、免疫化ウサギの血清試料中の抗体を使用して、図１０Ａ及び１０Ｂに示すように、精製したＧＡＡ １５５及びＧＡＡ ３７６ペプチド、ＤＢＳ試料由来の内部ＧＡＡ １５５及びＧＡＡ ３７６ペプチド、ならびに、口腔スワブ試料由来の内部ＧＡＡ １５５及びＧＡＡ ３７６ペプチドを捕捉した。ＤＢＳ及び口腔スワブ試料を入手し、実施例１及び２に記載するｉｍｍｕｎｏ－ＳＲＭのために、試料からペプチドを調製した。免疫化ウサギが、ＧＡＡ １５５及びＧＡＡ ３７６ペプチドに対する、対応する抗体を産生することができることを、本データは示す。抗体を含有する上清を、口腔スワブを用いるｉｍｍｕｎｏ－ＳＲＭアッセイで使用した。図１０Ａ及び１０Ｂに示すように、ＧＡＡ １５５及びＧＡＡ ３７６に対する上清中の抗体は、ＤＢＳよりも口腔スワブにおいて、２～１００倍大きな分析応答を得ることができた。ウサギは、ＤＢＳ及び口腔スワブからの濃縮のために、抗ＧＡＡペプチド抗体を生み出すことができることを、本研究は示す。

【0219】

実施例５。実施例１で論じる、ＤＢＳ試料を用いる標準的なｉｍｍｕｎｏ－ＳＲＭプロトコルに従い、実験を行った。図１１に示すように、ｉｍｍｕｎｏ－ＳＲＭ法が、酸α－グルコシダーゼ酵素の偽欠損症から、ポンペ患者を区別するための実行可能なオプションであることを、本研究は示した。ＧＡＡペプチドは、間違いなく陽性のポンペ患者において、有意に減少した、または存在しなかった。ＤＢＳからの、乳児期に開始するポンペ病を患う患者と、遅発性形態のポンペ病を患う患者とのＧＡＡ濃度では、わずかな差が存在した。より濃縮されたタンパク質、例えば白血球、ＰＢＭＣ、または口腔スワブを有する生体試料により、ｉｍｍｕｎｏ－ＳＲＭ法により、これらの２つの患者集団でのタンパク質濃度差の、より細かい調査が可能となろうことが予想される。ＧＡＡがない患者は、ＣＲＩＭ陰性状態と適合性がある可能性があり、最終的には、ＥＲＴの前に遮断抗体を減らすために免疫調節を行う必要がある可能性がある。

【0220】

図１１に示すように、ｉｍｍｕｎｏ－ＳＲＭ法は、確認されたポンペ患者から、偽欠損症症例を区別するための実行可能なオプションであることを、本研究は示した。したがって、ｉｍｍｕｎｏ－ＳＲＭを、ポンペ病のＮＢＳに対する一次または二次力価試験として使用し、偽欠損症症例から偽陽性率を減らすことができる。

【0221】

予測実施例１。ポンペ病（ＰＤ）の診断のための、ＧＡＡシグネチャーペプチド（複数可）のｉｍｍｕｎｏ－ＳＲＭアッセイ。

【0222】

ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及び白血球（ＷＢＣ）。ＰＢＭＣ及びＷＢＣを、例えば、Ｋｅｒｆｏｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｃｌｉｎ Ａｐｐｌ，２０１２．６（７－８）：３９４－４０２；Ｇｒｉｅｖｉｎｋ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｂｉｏｐｒｅｓｅｒｖ Ｂｉｏｂａｎｋ １４（５）：４１０－４１５；Ｃｏｒｋｕｍ ｅｔ ａｌ．（２０１５）ＢＭＣ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：４８；Ｊｉａ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｂｉｏｐｒｅｓｅｒｖ Ｂｉｏｂａｎｋ １６（２）：８２－９１；Ｂｏｙｕｍ（１９６８）Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ．Ｓｕｐｐｌ．９７：７７；Ｂｏｙｕｍ（１９７７）Ｌｙｍｐｈｏｌｏｇｙ １０（２）：７１－７６；Ｍｏｒｇｅｎｓｅｎ ａｎｄ Ｃａｎｔｒｅｌｌ（１９７７）Ｐｈａｒｍ Ｔｈｅｒａｐ．１：３６９－３８３；Ｂｅｅｔｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｎｄｙ（２００７）Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ．（８）：３２６；Ｂｒｏｃｋｓ ｅｔ ａｌ（２００６）Ｉｎ ｖｉｖｏ ２０（２）：２３９；Ｆａｇｕｅｔａｎｄ Ａｇｅｅ（１９９３）Ｊ Ｉｍｍ Ｍｅｔｈ １６５（２）：２１７；Ｂｒｏｕｓｓｏｅｔ ａｌ（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔ ５９（２）：８５；及び、Ｄａｇｕｒ ａｎｄ ＭｃＣｏｙ（２０１５）ＣｕｒｒＰｒｏｔｏｃＣｙｔｏｍ．７３：５．１．１－５．１．１６に記載されているものなどの、当該技術分野において既知のプロトコルにより、収集することができる。単離したＰＢＭＣまたはＷＢＣＷＢＣを可溶化することができ、細胞由来のタンパク質を、ＤＢＳに関して上述したとおりに消化する。

【0223】

正常な対照由来の対応する試料と共に、ＰＤを患う患者、または、ＰＤを有することが疑われる患者の、ＤＢＳ、口腔スワブ試料、ＰＢＭＣ、またはＷＢＣ（本明細書に記載するとおり）を、本明細書に記載するように、ＧＡＡ １５５、ＧＡＡ ３３２、ＧＡＡ ３７６、ＧＡＡ ６０１、ＧＡＡ ８５５、ＧＡＡ ８８２、ＧＡＡ ８９２シグネチャーペプチド、またはこれらの組合せを使用するｉｍｍｕｎｏ－ＳＲＭにより、分析することができる。ｉｍｍｕｎｏ－ＳＲＭ診断を、臨床診断と比較する。入手可能であれば、ＧＡＡ遺伝子に関する遺伝子情報、及び治療情報を、各患者に関して入手する。ｉｍｍｕｎｏ－ＳＲＭアッセイをシグネチャーペプチドで多重化し、ＭＰＳ Ｉ（ＩＤＵＡ ２１８及び／またはＩＤＵＡ ４６２）を試験することができる。本明細書に記載する抗体を利用するｉｍｍｕｎｏ－ＳＲＭアッセイを使用して、ＤＢＳ、口腔スワブ試料、ＰＢＭＣ、またはＷＢＣを含む生体試料中で、開示されたＧＡＡ及び／またはＩＤＵＡシグネチャーペプチドを検出することができる、ならびに、検出したシグネチャーペプチドのレベルに基づき、対象がポンペ病及び／またはＭＰＳ Ｉを有するか否かを診断することができる。ことを、これらの研究は示すであろう。さらに、ポンペ病及び／またはＭＰＳ Ｉの偽欠損症症例を、ポンペ病及び／またはＭＰＳ Ｉの真の症例から区別し、これらのＬＳＤ診断の偽陽性率を減少させることができることを、研究は示すであろう。

【0224】

（ＸＩＩＩ）締めの段落。本明細書に開示される各実施形態は、その特定の記載された要素、ステップ、成分または構成要素を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなってもよい。したがって、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」または「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、「含む、からなる、または本質的にからなる」を意味すると解釈されるべきである。移行用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」とは、不特定の要素、ステップ、成分、または構成要素を、たとえ大量であっても、含むがこれらに限定されず有することを意味する。「からなる」という移行句は、指定されていない任意の要素、ステップ、成分、または構成要素を除外する。「本質的にからなる」という移行句は、実施形態の範囲を、特定の要素、ステップ、成分、または構成要素に、及び実施形態に実質的に影響を及ぼさないものに限定する。重大な影響により、ＤＢＳ、口スワブ、ＰＢＭＣ、またはＷＢＣに由来する細胞、本明細書に開示された抗体、及びｉｍｍｕｎｏ－ＳＲＭを利用して、ＭＰＳ Ｉ及び／またはポンペ病を確実に診断する能力が統計的に有意に低下する。

【0225】

別段示さない限り、本明細書及び特許請求の範囲で使用される成分の量、分子量などの特性、反応条件などを表す全ての数字は、全ての場合において「約」という用語によって修飾されると理解されるべきである。したがって、反対に示されない限り、本明細書及び添付の特許請求の範囲に記載された数値パラメーターは、本発明によって得られることが求められる所望の特性に応じて変化し得る近似値である。少なくとも、均等論の適用を請求項の範囲に限定する試みとしてではなく、各数値パラメーターは、少なくとも報告された有効桁数に照らして、及び通常の丸め手法を適用することによって解釈されるべきである。さらに明確にする必要がある場合、「約」という用語は、記載された数値または範囲と組み合わせて使用される場合、すなわち、記載された値または範囲よりいくらか多いまたはいくらか少ないことを示すとき（記載された値の±２０％の範囲内まで；記載値の±１９％；記載値の±１８％；記載値の±１７％；記載値の±１６％；記載値の±１５％；記載値の±１４％；記載値の±１３％；記載値の±１２％；記載値の±１１％；記載値の±１０％；記載値の±９％；記載値の±８％；記載値の±７％；記載値の±６％；記載値の±５％；記載値の±４％；記載値の±３％；記載値の±２％；または記載値の±１％）、当業者によって合理的に帰される意味を有する。

【0226】

本発明の広い範囲を示す数値範囲及びパラメーターは近似値であるにもかかわらず、特定の実施例に記載される数値は、可能な限り正確に報告される。ただし、数値には本質的に、それぞれの試験測定で見出された標準偏差から必然的に生じる特定の誤差が含まれている。

【0227】

本発明を説明する文脈で（特に以下の特許請求の範囲で）使用される用語「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」及び同様の指示対象は、本書に別段の記載がない限り、または文脈によって明確に矛盾しない限り、単数形及び複数形の両方をカバーすると解釈されるべきである。本明細書での値の範囲の列挙は、単に、その範囲内にある各々の個別の値を個別に言及する簡単な方法として機能することを意図している。本明細書に別段の記載がない限り、個々の値は、本明細書に個別に記載されているかのように本明細書に組み込まれる。本明細書に記載される全ての方法は、本明細書に別段の指示がない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実行され得る。本明細書で提供されるありとあらゆる例、または例示的な言語（例えば、「など」）の使用は、単に本発明をよりよく解明することを意図したものであり、それ以外に特許請求される本発明の範囲を制限するものではない。本明細書のいかなる文言も、本発明の実施に不可欠な特許請求されていない要素を示すものとして解釈されるべきではない。

【0228】

本明細書に開示される本発明の代替要素または実施形態の分類は、限定として解釈されるべきではない。各グループのメンバーは、個別に、またはグループの他のメンバーまたは本明細書に見られる他の要素と任意の組合せで参照及び請求され得る。グループの１つ以上のメンバーが、利便性及び／または特許性の理由から、あるグループに含まれるか、またはあるグループから削除されることが予想される。そのような包含または削除が発生した場合、本明細書には変更されたグループが含まれていると見なされ、したがって、添付の特許請求の範囲で使用されている全てのマーカッシュ（Ｍａｒｋｕｓｈグループ）の書面による説明が満たされる。

【0229】

本発明を実施するために本発明者に知られている最良のモードを含む、本発明の特定の実施形態が本明細書に記載されている。当然ながら、これらの説明された実施形態の変形は、前述の説明を読むと、当業者には明らかになるであろう。本発明者は、当業者がそのような変形を適切に使用することを期待し、本発明者らは、本明細書に具体的に記載されている以外の方法で本発明を実施することを意図している。したがって、本発明は、適用法令によって許可されるように、本明細書に添付された特許請求の範囲に列挙された主題の全ての変更及び同等物を含む。さらに、その全ての可能な変形における上記の要素の任意の組合せは、本明細書に別段の指示がない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、本発明に含まれる。

【0230】

さらに、本明細書全体を通して、特許、印刷された刊行物、雑誌記事、及び他の書面のテキスト（本明細書の参照資料）に対して多数の参照がなされてきた。参照される資料のそれぞれは、それらの参照される教示のために、その全体が参照により本明細書に個別に組み込まれる。

【0231】

本明細書に開示される本発明の実施形態は、本発明の原理の例示であることが理解されるべきである。使用され得る他の変更は、本発明の範囲内である。したがって、限定ではないが例として、本発明の代替の構成を、本明細書の教示に従って利用し得る。したがって、本発明は、正確に示され、説明されたものに限定されない。

【0232】

本明細書に示される詳細は、例として、本発明の好ましい実施形態の例示的な議論を目的とするものにすぎず、本発明の様々な実施形態の原理及び概念的態様の最も有用かつ容易に理解される説明であると考えられるものを提供する目的で提示される。この点に関して、本発明の基本的な理解に必要であるよりも詳細に本発明の構造の詳細を示す試みはなされておらず、図面及び／または実施例とともに行った説明は、本発明のいくつかの形態が、実際に具体化され得る方法を当業者に明らかにしている。

【0233】

本開示で使用される定義及び説明は、以下の実施例で明確かつ明瞭に変更されない限り、または意味の適用がなんらかの構造を無意味または本質的に無意味にする場合を除いて、なんらかの将来の構造を制御することを意味及び意図する。用語の構成によって意味がなくなるか、または本質的に意味がなくなる場合、定義はＷｅｂｓｔｅｒ’ｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ、３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、またはＯｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｄｓ．ＡｔｔｗｏｏｄＴ ｅｔ ａｌ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，２００６）などの当業者に公知の辞書から取得する必要がある。

【図1-1】

【図1-2】

【図1-3】

【図1-4】

【図1-5】

【図1-6】

【図1-7】

【図1-8】

【図1-9】

【図1-10】

【図1-11】

【図1-12】

【図1-13】

【図1-14】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図11】

【図12-1】

【図12-2】

【図12-3】

【図12-4】

【図12-5】

【図12-6】

【図12-7】

【図12-8】

【図12-9】

【図12-10】

【図12-11】

【配列表】

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【国際調査報告】