特表 2023-519970 抗原ターゲティングされた免疫療法における抗原陰性細胞死の増進

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-05-15

(54)【発明の名称】抗原ターゲティングされた免疫療法における抗原陰性細胞死の増進

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/12 20150101AFI20230508BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230508BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALI20230508BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20230508BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20230508BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20230508BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20230508BHJP

   C12N 5/0786 20100101ALI20230508BHJP

   C12N 5/0789 20100101ALI20230508BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230508BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20230508BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230508BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20230508BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20230508BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20230508BHJP

【ＦＩ】

A61K35/12

C12N5/10 ZNA

C12N5/0783

C12N15/62 Z

C12N15/13

C12N15/12

C12N15/09 110

C12N15/09 100

C12N5/0786

C12N5/0789

A61P35/00

A61P35/02

A61P43/00 121

A61K45/00

A61K48/00

A61K35/17

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022559564

(86)(22)【出願日】2021-03-31

(85)【翻訳文提出日】2022-11-28

(86)【国際出願番号】 US2021025260

(87)【国際公開番号】W WO2021202801

(87)【国際公開日】2021-10-07

(31)【優先権主張番号】63/003,209

(32)【優先日】2020-03-31

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522256406

【氏名又は名称】フレッド ハッチンソン キャンサー センター

(74)【代理人】

【識別番号】110001173

【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】タートル，キャメロン・ジェイ

(72)【発明者】

【氏名】フィオレンツァ，サルバトーレ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA94X

4B065AA94Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA44

4C084AA13

4C084AA19

4C084MA02

4C084MA17

4C084MA56

4C084MA60

4C084MA66

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZB271

4C084ZB272

4C084ZC751

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB65

4C087MA02

4C087MA17

4C087MA56

4C087MA60

4C087MA66

4C087NA05

4C087NA14

4C087ZB26

4C087ZB27

4C087ZC75

(57)【要約】

（ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又は類似分子を発現する免疫細胞、及び（ｉｉ）がん細胞に対する腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）のインビボでの作用を維持又は増強する化合物を含む併用療法が記載されている。併用療法は、免疫療法によりターゲティングされる抗原陽性細胞の近くの抗原陰性細胞の殺滅をもたらし、エスケープバリアントの生存率を低下させ、他の利点を提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ｉｉｉ）細胞外成分及び細胞内成分を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子修飾された免疫細胞であって、細胞外成分が、がん細胞によって発現された抗原に結合する結合ドメインを含み、細胞内成分が、エフェクタードメインを含む、免疫細胞、及び
（ｉｖ）腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）シグナル増強物質
を含む併用療法。

【請求項2】

ＴＮＦαシグナル増強物質が、ＴＮＦαシグナル伝達経路メンバーを活性化、増大若しくは支持する腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）メンバーの作用を活性化、増大若しくは支持する、並びに／又はＴＮＦαシグナル増強物質が、ＴＮＦαシグナル伝達経路メンバーの作用を活性化、増大若しくは支持する、請求項１に記載の併用療法。

【請求項3】

ＴＮＦαシグナル増強物質が、ＴＮＦαシグナル伝達経路メンバーを不活化、抑制又は破壊するＴＮＦＲＳＦメンバーの作用を不活化、抑制又は破壊する、請求項１に記載の併用療法。

【請求項4】

ＴＮＦαシグナル増強物質が、ＴＮＦＲＳＦメンバー１Ａ、１Ｂ、３、６、８、１０Ａ、１０Ｂ、１２Ａ、１９及び／若しくは２１を活性化、増大若しくは支持する、並びに／又はＴＮＦＲＳＦメンバー６Ｂ、１０Ｃ及び／若しくは１０Ｄの作用を不活化、抑制若しくは破壊する、請求項１に記載の併用療法。

【請求項5】

ＴＮＦαシグナル増強物質が、ＴＮＦαシグナル増強物質タンパク質の発現をもたらす分子である、請求項１に記載の併用療法。

【請求項6】

ＴＮＦαシグナル増強物質が、ＴＮＦαシグナル増強物質タンパク質である、請求項１に記載の併用療法。

【請求項7】

ＴＮＦαシグナル増強物質タンパク質が、腫瘍壊死因子様弱アポトーシス誘導因子（ＴＷＥＡＫ）、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）及び／又は誘導性発現を示し、Ｔリンパ球で発現される受容体であるヘルペスウイルス侵入メディエーターとの結合についてＨＳＶ糖タンパク質Ｄと競合するリンホトキシンとの相同体（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｔｏ ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ， ｅｘｈｉｂｉｔｓ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｍｐｅｔｅｓ ｗｉｔｈ ＨＳＶ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｄ ｆｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ ｅｎｔｒｙ ｍｅｄｉａｔｏｒ， ａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｏｎ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）（ＬＩＧＨＴ）を含む、請求項５に記載の併用療法。

【請求項8】

ＴＮＦαシグナル増強物質が、ＴＮＦαシグナル伝達経路メンバーを不活化、抑制又は破壊するＴＮＦＲＳＦメンバーの発現を破壊する分子である、請求項１に記載の併用療法。

【請求項9】

ＴＮＦαシグナル伝達経路メンバーを不活化、抑制又は破壊するＴＮＦＲＳＦメンバーの発現を破壊する分子が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子、ジンクフィンガーヌクレアーゼ分子、ＴＡＬＥＮ又はｍｅｇａＴＡＬを含む、請求項８に記載の併用療法。

【請求項10】

ＴＮＦαシグナル伝達経路メンバーを不活化、抑制又は破壊するＴＮＦＲＳＦメンバーの発現を破壊する分子が、塩基エディターを含む、請求項８に記載の併用療法。

【請求項11】

ＣＡＲを発現する請求項１に記載の免疫細胞がまた、ＴＮＦαシグナル増強物質を含む又は発現する、請求項１に記載の併用療法。

【請求項12】

ＣＡＲを発現する請求項１に記載の免疫細胞がまた、ＴＮＦαシグナル増強物質を含む又は発現するように遺伝子修飾されている、請求項１に記載の併用療法。

【請求項13】

ＴＮＦαシグナル増強物質が、ＢＶ－６、ＣＵＤＣ－４２７、ＧＤＣ－０１５２、ＬＣＬ１６１、ロカグラミド、シロリムス、エスシン、エムリカサン、ビリナパント、ＡＳＴＸ６６０、ＡＺＤ５５８２、ＢＩ ８９１０６５、ＤＥＢＩＯ １１４３、ＡＰＧ－１３８７、ＨＧＳ１０２９、ＡＥＧ３５１５６並びにＨｉｓタグ及びリンカーペプチドに連結したヒトＴＲＡＩＬの細胞外ドメインを有する組換えタンパク質のうちの１つ以上から選択される小分子を含む、請求項１に記載の併用療法。

【請求項14】

ＣＡＲ及び／又はＴＮＦαシグナル増強物質の発現が、ＮＦＡＴプロモーターによって制御される、請求項１に記載の併用療法。

【請求項15】

結合ドメインが、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）であるか、又は抗体のＣＤＲに由来する、請求項１に記載の併用療法。

【請求項16】

結合ドメインが、Ａ３３；ＢＡＧＥ；Ｂｃｌ－２；β－カテニン；ＢＣＭＡ；Ｂ７Ｈ４；ＢＴＬＡ；ＣＡ１２５；ＣＡ１９－９；ＣＤ３、ＣＤ５；ＣＤ２０；ＣＤ２１；ＣＤ２２；ＣＤ２５；ＣＤ２８；ＣＤ３０；ＣＤ３３；ＣＤ３７；ＣＤ３８；ＣＤ４０；ＣＤ５２；ＣＤ４４ｖ６；ＣＤ４５；ＣＤ５６；ＣＤ７９ｂ；ＣＤ８０；ＣＤ８１；ＣＤ８６；ＣＤ１２３；ＣＤ１３４；ＣＤ１３７；ＣＤ１５１；ＣＤ１７１；ＣＤ２７６；ＣＥＡ；ＣＥＡＣＡＭ６；ＣＬＬ－１；ｃ－Ｍｅｔ；ＣＳ－１；ＣＴＬＡ－４；サイクリンＢ１；ＤＡＧＥ；ＥＢＮＡ；ＥＧＦＲ；ＥＧＦＲｖＩＩＩ、エフリンＢ２；ＥｒｂＢ２；ＨＥＲ２；ＥｒｂＢ４；ＥｐｈＡ２；エストロゲン受容体；ＦＡＰ；フェリチン；α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）；ＦＬＴ１；ＦＬＴ４；葉酸結合タンパク質；ＦＯＬＲ；Ｆｒｉｚｚｌｅｄ；ＧＡＧＥ；Ｇ２５０；ＧＤ－２；ＧＨＲＨＲ；ＧＨＲ；ＧＩＴＲ；ＧＭ２；ＧＰＲＣ５Ｄ；ｇｐ７５；ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ １７）；ｇｐ１３０；ＨＬＡ；ＨＥＲ－２／ｎｅｕ；ＨＰＶ Ｅ６；ＨＰＶ Ｅ７；ｈＴＥＲＴ；ＨＶＥＭ；ＩＧＦ１Ｒ；ＩＬ６Ｒ；ＫＤＲ；Ｋｉ－６７；ルイスＡ；ルイスＹ；ＬＩＦＲβ；ＬＲＰ；ＬＲＰ５；ＬＴβＲ；ＭＡＧＥ；ＭＡＲＴ；メソテリン；ＭＵＣ；ＭＵＣ１；ＭＵＭ－１－Ｂ；ｍｙｃ；ＮＹＥＳＯ－１；Ｏ－アセチルＧＤ－２；Ｏ－アセチルＧＤ３；ＯＳＭＲβ；ｐ５３；ＰＤ１；ＰＤ－Ｌ１；ＰＤ－Ｌ２；ＰＲＡＭＥ；プロゲステロン受容体；ＰＳＡ；ＰＳＭＡ；ＰＴＣＨ１；ＲＡＮＫ；ｒａｓ；Ｒｏｂｏ１；ＲＯＲｌ；サバイビン；ＴＣＲα；ＴＣＲβ；テネイシン；ＴＧＦＢＲ１；ＴＧＦＢＲ２；ＴＬＲ７；ＴＬＲ９；ＴＮＦＲ１；ＴＮＦＲ２；ＴＮＦＲＳＦ４；ＴＷＥＡＫ－Ｒ；ＴＳＴＡチロシナーゼ；ＶＥＧＦ；又はＷＴ１に特異的に結合する、請求項１に記載の併用療法。

【請求項17】

結合ドメインが、ＨＥＲ２、ＥＲＢＢ２、ＣＤ３３、ＰＳＭＡ、ＰＤ－Ｌ１、ＭＵＣ１６、ＦＯＬＲ、ＣＤ１２３又はＣＬＬ－１に特異的に結合する、請求項１に記載の併用療法。

【請求項18】

結合ドメインが、ＦＭＣ６３、ＳＪ２５Ｃ１、ＨＤ３７、ハーセプチン、ペムブロリズマブ、ＦＡＺ０５３、アベルマブ、アテゾリズマブ又はアマツキシマブのＣＤＲセット、ＶＨ又はＶＬを含む抗体に由来する、請求項１に記載の併用療法。

【請求項19】

細胞外成分及び細胞内成分が、膜貫通ドメインを介して連結している、請求項１に記載の併用療法。

【請求項20】

エフェクタードメインが、４－１ＢＢ及び／又はＣＤ３ζを含む、請求項１に記載の併用療法。

【請求項21】

ＣＡＲが、結合ドメインと膜貫通ドメインとの間にスペーサー領域をさらに含む、請求項１９に記載の併用療法。

【請求項22】

ＣＡＲが、タグカセット、形質導入マーカー及び／又は自殺スイッチを含む制御機構をさらに含む又はそれらと共に発現される、請求項１に記載の併用療法。

【請求項23】

遺伝子修飾された免疫細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、単球／マクロファージ、造血幹細胞又は造血前駆細胞である、請求項１に記載の併用療法。

【請求項24】

Ｔ細胞が、ＣＤ３ Ｔ細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞及び／又はナイーブＴ細胞から選択される、請求項２３に記載の併用療法。

【請求項25】

Ｔ細胞が、ＣＤ４ Ｔ細胞及び／又はＣＤ８ Ｔ細胞である、請求項２３に記載の併用療法。

【請求項26】

１：１の比のＣＤ４ Ｔ細胞及びＣＤ８ Ｔ細胞を含む、請求項２５に記載の併用療法。

【請求項27】

遺伝子修飾された免疫細胞が、エクスビボ又はインビボにおけるものである、請求項１に記載の併用療法。

【請求項28】

選択された併用療法のＣＡＲを発現するようにエクスビボで遺伝子修飾された少なくとも２つの細胞種を含む組成物を含む、請求項１に記載の併用療法。

【請求項29】

少なくとも２つの細胞種が、Ｔ細胞及びナチュラルキラー細胞、Ｔ細胞及び単球／マクロファージ、Ｔ細胞及び造血幹細胞、Ｔ細胞及び造血前駆細胞、ナチュラルキラー細胞及び単球／マクロファージ、ナチュラルキラー細胞及び造血幹細胞、ナチュラルキラー細胞及び造血前駆細胞、単球／マクロファージ及び造血幹細胞、単球／マクロファージ及び造血前駆細胞、又は造血幹細胞及び造血前駆細胞を含む、請求項２８に記載の併用療法。

【請求項30】

併用療法のＣＡＲ部分を発現するように細胞のインビボでの遺伝子修飾をもたらすナノ粒子を含む、請求項１に記載の併用療法。

【請求項31】

ＴＮＦαシグナル増強物質を発現するか、又は含むように細胞のインビボでの遺伝子修飾をもたらすナノ粒子を含む、請求項１に記載の併用療法。

【請求項32】

請求項１に記載の併用療法を含む又は発現するように遺伝子修飾された細胞。

【請求項33】

ＣＡＲの発現が、ＮＦＡＴプロモーターによって制御される、請求項３２に記載の細胞。

【請求項34】

エクスビボ又はインビボにおけるものである、請求項３２に記載の細胞。

【請求項35】

Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、単球／マクロファージ、造血幹細胞又は造血前駆細胞である、請求項３２に記載の細胞。

【請求項36】

Ｔ細胞が、ＣＤ３ Ｔ細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞及び／又はナイーブＴ細胞である、請求項３５に記載の細胞。

【請求項37】

Ｔ細胞が、ＣＤ４ Ｔ細胞及び／又はＣＤ８ Ｔ細胞である、請求項３５に記載の細胞。

【請求項38】

治療有効量の請求項１に記載の併用療法を対象に投与することを含み、それによって、それを必要とする対象におけるがんを処置する、それを必要とする対象におけるがんを処置する方法。

【請求項39】

処置が、抗がん効果をもたらす、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

抗がん効果が、白血病、前立腺がん、乳がん、幹細胞がん、卵巣がん、中皮腫、腎細胞癌黒色腫、膵臓がん、肺がん、ＨＢＶ誘発性肝細胞癌又は多発性骨髄腫に対する、請求項３９に記載の方法。

【請求項41】

請求項１に記載の併用療法、請求項３２に記載の細胞及び／又は請求項３８に記載の方法を実施するための成分を含むキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、２０２０年３月３１日に出願された米国仮特許出願第６３／００３，２０９号に対する優先権を主張し、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

本開示の分野
本開示は、（ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又は類似分子を発現する免疫細胞、及び（ｉｉ）がん細胞に対する腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）のインビボでの作用を維持又は増強する化合物を含む併用療法を提供する。この化合物は、免疫細胞による遺伝子又はタンパク質発現に影響を与える小分子又は分子であり得る。併用療法は、免疫療法によりターゲティングされる抗原が陽性の細胞の近くの抗原陰性細胞の殺滅をもたらし、エスケープバリアントの生存率を低下させ、他の利点を提供する。

【背景技術】

【0003】

世界保健機関によると、がんは世界で２番目に多い死因であり、２０１８年には推定９６０万人の死亡の原因であった。長年にわたり、がんのために選択される処置は、手術、化学療法及び放射線療法であった。近年、がん細胞に主に見られる特定の分子変化を識別し、活用することにより、がん細胞を特異的に標的とする、多くのターゲティングされた療法が出現している。例えば、がん細胞などの望ましくない細胞種を標的として、殺滅するために免疫系のＴ細胞を遺伝子操作することに関して、大きな進歩が遂げられた。これらのＴ細胞の多くは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子操作されている。ＣＡＲは、遺伝子修飾Ｔ細胞が、がん細胞を認識し、殺滅することを可能にするいくつかの異なる副成分を含むタンパク質である。この副成分は、少なくとも細胞外成分及び細胞内成分を含む。細胞外成分は、望ましくない細胞の表面に選択的に存在する抗原に特異的に結合する結合ドメインを含む。結合ドメインがそのような抗原に結合すると、細胞内成分が、結合した細胞を破壊するためにＴ細胞にシグナルを送る。ＣＡＲはさらに、細胞外成分を細胞内成分に連結することができる膜貫通ドメイン、及びＣＡＲの機能を増加させることができる他の副成分を含む。例えば、スペーサー領域などの１つ以上のリンカー配列を含めることにより、ＣＡＲはさらなる立体構造の柔軟性を有することが可能になり、多くの場合、ターゲティングされる細胞抗原に結合する結合ドメインの能力を増加させ得る。

【0004】

ＣＡＲ発現Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）を用いた臨床試験では、従来の処置が失敗した難治性の大細胞型Ｂ細胞リンパ腫を有する患者においてポジティブな応答が示された（Ｎｅｅｌａｐｕら、２０１７年、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７７：２５３１～２５４４頁）。しかしながら、遺伝子操作されたＣＡＲ－Ｔ細胞は、がん細胞の破壊に成功したが、一部の適応症についてインビボで長期の抗がん活性を提供することはできなかった。例えば、抗原陰性の再発は、抗原指向性免疫療法後の処置失敗の一般的な原因である。

【0005】

腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）は、アポトーシス、免疫応答並びに細胞成長及び分化を含む細胞機能を調節する。がん細胞の近くでは、ＴＮＦαはがん細胞の死を促進する。ＴＮＦα経路は、ＴＮＦα誘発細胞死を増強又は阻害するために腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）メンバーの他のメンバーによってモジュレートされ得る。アポトーシスタンパク質の細胞インヒビター（ｃＩＡＰ）もまた、がん細胞の近くにあり得、逆にＴＮＦαの細胞殺滅効果からがん細胞を保護する。その結果として、ｃＩＡＰの作用を低減又は遮断する治療用ｃＩＡＰアンタゴニストが開発された。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Ｎｅｅｌａｐｕら、２０１７年、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７７：２５３１～２５４４頁

【発明の概要】

【0007】

本開示の要旨
本開示は、ＴＮＦαのインビボ細胞殺滅作用を増強又は維持する化合物と併用したＣＡＲ発現免疫細胞などの免疫療法の投与を提供する。本明細書に示されているように、これらの併用療法は、ＣＡＲ又は類似分子が結合した抗原陽性細胞の殺滅を可能にする。ＴＮＦαの作用を増強又は維持することで、ターゲティングされる抗原陽性細胞の領域において抗原陰性がん細胞を効果的に殺滅させることも可能になるので、他の利点の中でも特にエスケープバリアントの生存率を低下させる。

【0008】

ＴＮＦαのインビボ細胞殺滅作用を増強又は維持する化合物は、本明細書ではＴＮＦαシグナル増強物質と称される。特定の実施形態では、ＴＮＦαシグナル増強物質は、ＴＮＦαシグナル伝達経路メンバーを増強する腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）メンバーを活性化する分子を含む。特定の実施形態では、ＴＮＦαシグナル増強物質は、ＴＮＦαシグナル伝達経路メンバーを阻害するＴＮＦＳＲＦメンバーを阻害する分子を含む。特定の実施形態では、分子は、ＴＮＦαシグナル伝達経路メンバーを増強するＴＮＦＲＳＦメンバーをノックインする遺伝子操作分子、又はＴＮＦαシグナル伝達経路メンバーを阻害するＴＮＦＲＳＦメンバーの活性をノックダウン／ノックアウトする、若しくはそうでなければ破壊する遺伝子操作分子を含み得る。

【0009】

特定の実施形態では、遺伝子操作分子は、タンパク質ＴＷＥＡＫ（腫瘍壊死因子様弱アポトーシス誘導因子）、ＴＲＡＩＬ（腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド）及びＬＩＧＨＴ（誘導性発現を示し、Ｔリンパ球で発現される受容体であるヘルペスウイルス侵入メディエーターとの結合についてＨＳＶ糖タンパク質Ｄと競合するリンホトキシンとの相同体（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｔｏ ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ， ｅｘｈｉｂｉｔｓ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｍｐｅｔｅｓ ｗｉｔｈ ＨＳＶ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｄ ｆｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ ｅｎｔｒｙ ｍｅｄｉａｔｏｒ， ａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｏｎ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ））のうちの１つ以上の発現をもたらし得る。

【0010】

特定の実施形態では、ＣＡＲ又は類似分子を発現するように遺伝子修飾された免疫細胞はまた、ＴＮＦαシグナル増強物質のうちの１つ以上を発現するように遺伝子修飾されている。特定の実施形態では、ＣＡＲ又は類似分子を発現するように遺伝子修飾された免疫細胞はまた、ＴＮＦαシグナル伝達経路メンバーを阻害する１つ以上のＴＮＦＲＳＦメンバーをノックダウン、ノックアウト又はそうでなければ破壊するように遺伝子修飾されている。

【0011】

特定の実施形態では、ＴＮＦαシグナル増強物質は、例えば、ＢＶ－６、ＣＵＤＣ－４２７、ＧＤＣ－０１５２、ＬＣＬ１６１、ロカグラミド、シロリムス、エスシン、エムリカサン、ビリナパント、ＡＳＴＸ６６０、ＡＺＤ５５８２、ＫＩＬＬＥＲＴＲＡＩＬ（商標）（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ、ＮＹ）、ＢＩ ８９１０６５、ＤＥＢＩＯ １１４３、ＡＰＧ－１３８７、ＨＧＳ１０２９及びＡＥＧ３５１５６から選択される小分子又はタンパク質である。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1A】抗原陰性殺滅アッセイの概略図である。ＣＤ３３－ｐｏｓ ＡＭＬ細胞株であるＭＬ１細胞、又はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ターゲティングによるＣＤ３３欠損ＭＬ１細胞は、クロム^５１（Ｃｒ^５１）で標識され、以下の４つの組合せのうちの１つで培養される：（図１Ａ）＝ＣＤ３３－ｎｅｇ細胞で標識されたＣＤ３３－ｐｏｓ－Ｃｒ^５１、（図１Ｂ）＝ＣＤ３３－ｐｏｓ細胞で標識されたＣＤ３３－ｎｅｇ－Ｃｒ^５１、（図１Ｃ）＝ＣＤ３３－ｐｏｓ細胞で標識されたＣＤ３３－ｐｏｓ－Ｃｒ^５１、（図１Ｄ）＝ＣＤ３３－ｎｅｇ細胞で標識されたＣＤ３３－ｎｅｇ－Ｃｒ^５１。細胞は、ＣＤ３３_ＰＲＯＸＣＡＲ－Ｔ細胞に４時間又は２４時間曝露される。次いで、上清中のＣｒ^５１レベルがシンチレーションカウンターにより測定され、自然細胞溶解（培養培地のみ）から差し引いた最大細胞溶解（洗剤から）に対する細胞傷害性パーセントとして計算される。ＣＡＲ－Ｔ細胞によって溶解された細胞は、頭蓋骨及び横走骨として区別される。矢印はＣｒ^５１放出を表す。

【図1B】抗原陰性殺滅アッセイの概略図である。ＣＤ３３－ｐｏｓ ＡＭＬ細胞株であるＭＬ１細胞、又はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ターゲティングによるＣＤ３３欠損ＭＬ１細胞は、クロム^５１（Ｃｒ^５１）で標識され、以下の４つの組合せのうちの１つで培養される：（図１Ａ）＝ＣＤ３３－ｎｅｇ細胞で標識されたＣＤ３３－ｐｏｓ－Ｃｒ^５１、（図１Ｂ）＝ＣＤ３３－ｐｏｓ細胞で標識されたＣＤ３３－ｎｅｇ－Ｃｒ^５１、（図１Ｃ）＝ＣＤ３３－ｐｏｓ細胞で標識されたＣＤ３３－ｐｏｓ－Ｃｒ^５１、（図１Ｄ）＝ＣＤ３３－ｎｅｇ細胞で標識されたＣＤ３３－ｎｅｇ－Ｃｒ^５１。細胞は、ＣＤ３３_ＰＲＯＸＣＡＲ－Ｔ細胞に４時間又は２４時間曝露される。次いで、上清中のＣｒ^５１レベルがシンチレーションカウンターにより測定され、自然細胞溶解（培養培地のみ）から差し引いた最大細胞溶解（洗剤から）に対する細胞傷害性パーセントとして計算される。ＣＡＲ－Ｔ細胞によって溶解された細胞は、頭蓋骨及び横走骨として区別される。矢印はＣｒ^５１放出を表す。

【図1C】抗原陰性殺滅アッセイの概略図である。ＣＤ３３－ｐｏｓ ＡＭＬ細胞株であるＭＬ１細胞、又はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ターゲティングによるＣＤ３３欠損ＭＬ１細胞は、クロム^５１（Ｃｒ^５１）で標識され、以下の４つの組合せのうちの１つで培養される：（図１Ａ）＝ＣＤ３３－ｎｅｇ細胞で標識されたＣＤ３３－ｐｏｓ－Ｃｒ^５１、（図１Ｂ）＝ＣＤ３３－ｐｏｓ細胞で標識されたＣＤ３３－ｎｅｇ－Ｃｒ^５１、（図１Ｃ）＝ＣＤ３３－ｐｏｓ細胞で標識されたＣＤ３３－ｐｏｓ－Ｃｒ^５１、（図１Ｄ）＝ＣＤ３３－ｎｅｇ細胞で標識されたＣＤ３３－ｎｅｇ－Ｃｒ^５１。細胞は、ＣＤ３３_ＰＲＯＸＣＡＲ－Ｔ細胞に４時間又は２４時間曝露される。次いで、上清中のＣｒ^５１レベルがシンチレーションカウンターにより測定され、自然細胞溶解（培養培地のみ）から差し引いた最大細胞溶解（洗剤から）に対する細胞傷害性パーセントとして計算される。ＣＡＲ－Ｔ細胞によって溶解された細胞は、頭蓋骨及び横走骨として区別される。矢印はＣｒ^５１放出を表す。

【図1D】抗原陰性殺滅アッセイの概略図である。ＣＤ３３－ｐｏｓ ＡＭＬ細胞株であるＭＬ１細胞、又はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ターゲティングによるＣＤ３３欠損ＭＬ１細胞は、クロム^５１（Ｃｒ^５１）で標識され、以下の４つの組合せのうちの１つで培養される：（図１Ａ）＝ＣＤ３３－ｎｅｇ細胞で標識されたＣＤ３３－ｐｏｓ－Ｃｒ^５１、（図１Ｂ）＝ＣＤ３３－ｐｏｓ細胞で標識されたＣＤ３３－ｎｅｇ－Ｃｒ^５１、（図１Ｃ）＝ＣＤ３３－ｐｏｓ細胞で標識されたＣＤ３３－ｐｏｓ－Ｃｒ^５１、（図１Ｄ）＝ＣＤ３３－ｎｅｇ細胞で標識されたＣＤ３３－ｎｅｇ－Ｃｒ^５１。細胞は、ＣＤ３３_ＰＲＯＸＣＡＲ－Ｔ細胞に４時間又は２４時間曝露される。次いで、上清中のＣｒ^５１レベルがシンチレーションカウンターにより測定され、自然細胞溶解（培養培地のみ）から差し引いた最大細胞溶解（洗剤から）に対する細胞傷害性パーセントとして計算される。ＣＡＲ－Ｔ細胞によって溶解された細胞は、頭蓋骨及び横走骨として区別される。矢印はＣｒ^５１放出を表す。

【図2A】ＣＤ３３指向性ＣＤ８＋ＣＡＲ－Ｔ細胞が、異なるＣＡＲ長及び異なるドナーにわたって強力な抗原陰性バイスタンダー殺滅を示す図である。クロム^５１標識化ＣＤ３３陽性（ｐｏｓ）ＡＭＬ細胞株であるＭＬ１細胞、又はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ターゲティングによるＣＤ３３欠損ＭＬ１細胞は、ＣＤ３３指向性１Ｈ７ ＣＡＲ－Ｔ細胞と４時間又は２４時間共培養され、細胞上清が回収され、シンチレーションカウンターによって放出された放射線について解析された。シンチレーションからバックグラウンドを差し引いた値を最大放出（洗剤処理によって誘発された）で割って１００％を掛けて計算した細胞傷害性パーセント。培養の４時間後、１Ｈ７ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ３３ｐｏｓ ＭＬ１標的の抗原特異的殺滅をもたらしたが（バーは★及び■として指定されている。）、ＣＤ３３陰性（ｎｅｇ）ＭＬ１標的は殺滅をもたらさなかった（バーは●及び◆として指定されている。）。対照的に、２４時間で、ＣＤ３３－ｐｏｓ ＭＬ１標的と培養した場合にのみ、クロム標識化ＣＤ３３－ｎｅｇ ＭＬ１細胞の強力な殺滅（バーは●として指定されている。）が観察され、抗原陰性バイスタンダーＡＭＬ細胞死が、抗原陽性標的細胞によるＣＡＲ－Ｔ細胞活性化によって促進されたことを示している。この効果は、長い又は短いスペーサーを有するＣＡＲ構築物において観察された。（図２Ａ）～（図２Ｄ）健康なドナー０４：（図２Ａ）４時間；短いスペーサー；（図２Ｂ）２４時間；短いスペーサー；（図２Ｃ）４時間；中間のスペーサー；（図２Ｄ）２４時間；中間のスペーサー；（図２Ｅ）～（図２Ｈ）健康なドナー０７：（図２Ｅ）４時間；短いスペーサー；（図２Ｆ）２４時間；短いスペーサー；（図２Ｇ）４時間；中間のスペーサー；（図２Ｈ）２４時間；中間のスペーサー。

【図2B】ＣＤ３３指向性ＣＤ８＋ＣＡＲ－Ｔ細胞が、異なるＣＡＲ長及び異なるドナーにわたって強力な抗原陰性バイスタンダー殺滅を示す図である。クロム^５１標識化ＣＤ３３陽性（ｐｏｓ）ＡＭＬ細胞株であるＭＬ１細胞、又はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ターゲティングによるＣＤ３３欠損ＭＬ１細胞は、ＣＤ３３指向性１Ｈ７ ＣＡＲ－Ｔ細胞と４時間又は２４時間共培養され、細胞上清が回収され、シンチレーションカウンターによって放出された放射線について解析された。シンチレーションからバックグラウンドを差し引いた値を最大放出（洗剤処理によって誘発された）で割って１００％を掛けて計算した細胞傷害性パーセント。培養の４時間後、１Ｈ７ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ３３ｐｏｓ ＭＬ１標的の抗原特異的殺滅をもたらしたが（バーは★及び■として指定されている。）、ＣＤ３３陰性（ｎｅｇ）ＭＬ１標的は殺滅をもたらさなかった（バーは●及び◆として指定されている。）。対照的に、２４時間で、ＣＤ３３－ｐｏｓ ＭＬ１標的と培養した場合にのみ、クロム標識化ＣＤ３３－ｎｅｇ ＭＬ１細胞の強力な殺滅（バーは●として指定されている。）が観察され、抗原陰性バイスタンダーＡＭＬ細胞死が、抗原陽性標的細胞によるＣＡＲ－Ｔ細胞活性化によって促進されたことを示している。この効果は、長い又は短いスペーサーを有するＣＡＲ構築物において観察された。（図２Ａ）～（図２Ｄ）健康なドナー０４：（図２Ａ）４時間；短いスペーサー；（図２Ｂ）２４時間；短いスペーサー；（図２Ｃ）４時間；中間のスペーサー；（図２Ｄ）２４時間；中間のスペーサー；（図２Ｅ）～（図２Ｈ）健康なドナー０７：（図２Ｅ）４時間；短いスペーサー；（図２Ｆ）２４時間；短いスペーサー；（図２Ｇ）４時間；中間のスペーサー；（図２Ｈ）２４時間；中間のスペーサー。

【図2C】ＣＤ３３指向性ＣＤ８＋ＣＡＲ－Ｔ細胞が、異なるＣＡＲ長及び異なるドナーにわたって強力な抗原陰性バイスタンダー殺滅を示す図である。クロム^５１標識化ＣＤ３３陽性（ｐｏｓ）ＡＭＬ細胞株であるＭＬ１細胞、又はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ターゲティングによるＣＤ３３欠損ＭＬ１細胞は、ＣＤ３３指向性１Ｈ７ ＣＡＲ－Ｔ細胞と４時間又は２４時間共培養され、細胞上清が回収され、シンチレーションカウンターによって放出された放射線について解析された。シンチレーションからバックグラウンドを差し引いた値を最大放出（洗剤処理によって誘発された）で割って１００％を掛けて計算した細胞傷害性パーセント。培養の４時間後、１Ｈ７ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ３３ｐｏｓ ＭＬ１標的の抗原特異的殺滅をもたらしたが（バーは★及び■として指定されている。）、ＣＤ３３陰性（ｎｅｇ）ＭＬ１標的は殺滅をもたらさなかった（バーは●及び◆として指定されている。）。対照的に、２４時間で、ＣＤ３３－ｐｏｓ ＭＬ１標的と培養した場合にのみ、クロム標識化ＣＤ３３－ｎｅｇ ＭＬ１細胞の強力な殺滅（バーは●として指定されている。）が観察され、抗原陰性バイスタンダーＡＭＬ細胞死が、抗原陽性標的細胞によるＣＡＲ－Ｔ細胞活性化によって促進されたことを示している。この効果は、長い又は短いスペーサーを有するＣＡＲ構築物において観察された。（図２Ａ）～（図２Ｄ）健康なドナー０４：（図２Ａ）４時間；短いスペーサー；（図２Ｂ）２４時間；短いスペーサー；（図２Ｃ）４時間；中間のスペーサー；（図２Ｄ）２４時間；中間のスペーサー；（図２Ｅ）～（図２Ｈ）健康なドナー０７：（図２Ｅ）４時間；短いスペーサー；（図２Ｆ）２４時間；短いスペーサー；（図２Ｇ）４時間；中間のスペーサー；（図２Ｈ）２４時間；中間のスペーサー。

【図2D】ＣＤ３３指向性ＣＤ８＋ＣＡＲ－Ｔ細胞が、異なるＣＡＲ長及び異なるドナーにわたって強力な抗原陰性バイスタンダー殺滅を示す図である。クロム^５１標識化ＣＤ３３陽性（ｐｏｓ）ＡＭＬ細胞株であるＭＬ１細胞、又はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ターゲティングによるＣＤ３３欠損ＭＬ１細胞は、ＣＤ３３指向性１Ｈ７ ＣＡＲ－Ｔ細胞と４時間又は２４時間共培養され、細胞上清が回収され、シンチレーションカウンターによって放出された放射線について解析された。シンチレーションからバックグラウンドを差し引いた値を最大放出（洗剤処理によって誘発された）で割って１００％を掛けて計算した細胞傷害性パーセント。培養の４時間後、１Ｈ７ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ３３ｐｏｓ ＭＬ１標的の抗原特異的殺滅をもたらしたが（バーは★及び■として指定されている。）、ＣＤ３３陰性（ｎｅｇ）ＭＬ１標的は殺滅をもたらさなかった（バーは●及び◆として指定されている。）。対照的に、２４時間で、ＣＤ３３－ｐｏｓ ＭＬ１標的と培養した場合にのみ、クロム標識化ＣＤ３３－ｎｅｇ ＭＬ１細胞の強力な殺滅（バーは●として指定されている。）が観察され、抗原陰性バイスタンダーＡＭＬ細胞死が、抗原陽性標的細胞によるＣＡＲ－Ｔ細胞活性化によって促進されたことを示している。この効果は、長い又は短いスペーサーを有するＣＡＲ構築物において観察された。（図２Ａ）～（図２Ｄ）健康なドナー０４：（図２Ａ）４時間；短いスペーサー；（図２Ｂ）２４時間；短いスペーサー；（図２Ｃ）４時間；中間のスペーサー；（図２Ｄ）２４時間；中間のスペーサー；（図２Ｅ）～（図２Ｈ）健康なドナー０７：（図２Ｅ）４時間；短いスペーサー；（図２Ｆ）２４時間；短いスペーサー；（図２Ｇ）４時間；中間のスペーサー；（図２Ｈ）２４時間；中間のスペーサー。

【図2E】ＣＤ３３指向性ＣＤ８＋ＣＡＲ－Ｔ細胞が、異なるＣＡＲ長及び異なるドナーにわたって強力な抗原陰性バイスタンダー殺滅を示す図である。クロム^５１標識化ＣＤ３３陽性（ｐｏｓ）ＡＭＬ細胞株であるＭＬ１細胞、又はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ターゲティングによるＣＤ３３欠損ＭＬ１細胞は、ＣＤ３３指向性１Ｈ７ ＣＡＲ－Ｔ細胞と４時間又は２４時間共培養され、細胞上清が回収され、シンチレーションカウンターによって放出された放射線について解析された。シンチレーションからバックグラウンドを差し引いた値を最大放出（洗剤処理によって誘発された）で割って１００％を掛けて計算した細胞傷害性パーセント。培養の４時間後、１Ｈ７ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ３３ｐｏｓ ＭＬ１標的の抗原特異的殺滅をもたらしたが（バーは★及び■として指定されている。）、ＣＤ３３陰性（ｎｅｇ）ＭＬ１標的は殺滅をもたらさなかった（バーは●及び◆として指定されている。）。対照的に、２４時間で、ＣＤ３３－ｐｏｓ ＭＬ１標的と培養した場合にのみ、クロム標識化ＣＤ３３－ｎｅｇ ＭＬ１細胞の強力な殺滅（バーは●として指定されている。）が観察され、抗原陰性バイスタンダーＡＭＬ細胞死が、抗原陽性標的細胞によるＣＡＲ－Ｔ細胞活性化によって促進されたことを示している。この効果は、長い又は短いスペーサーを有するＣＡＲ構築物において観察された。（図２Ａ）～（図２Ｄ）健康なドナー０４：（図２Ａ）４時間；短いスペーサー；（図２Ｂ）２４時間；短いスペーサー；（図２Ｃ）４時間；中間のスペーサー；（図２Ｄ）２４時間；中間のスペーサー；（図２Ｅ）～（図２Ｈ）健康なドナー０７：（図２Ｅ）４時間；短いスペーサー；（図２Ｆ）２４時間；短いスペーサー；（図２Ｇ）４時間；中間のスペーサー；（図２Ｈ）２４時間；中間のスペーサー。

【図2F】ＣＤ３３指向性ＣＤ８＋ＣＡＲ－Ｔ細胞が、異なるＣＡＲ長及び異なるドナーにわたって強力な抗原陰性バイスタンダー殺滅を示す図である。クロム^５１標識化ＣＤ３３陽性（ｐｏｓ）ＡＭＬ細胞株であるＭＬ１細胞、又はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ターゲティングによるＣＤ３３欠損ＭＬ１細胞は、ＣＤ３３指向性１Ｈ７ ＣＡＲ－Ｔ細胞と４時間又は２４時間共培養され、細胞上清が回収され、シンチレーションカウンターによって放出された放射線について解析された。シンチレーションからバックグラウンドを差し引いた値を最大放出（洗剤処理によって誘発された）で割って１００％を掛けて計算した細胞傷害性パーセント。培養の４時間後、１Ｈ７ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ３３ｐｏｓ ＭＬ１標的の抗原特異的殺滅をもたらしたが（バーは★及び■として指定されている。）、ＣＤ３３陰性（ｎｅｇ）ＭＬ１標的は殺滅をもたらさなかった（バーは●及び◆として指定されている。）。対照的に、２４時間で、ＣＤ３３－ｐｏｓ ＭＬ１標的と培養した場合にのみ、クロム標識化ＣＤ３３－ｎｅｇ ＭＬ１細胞の強力な殺滅（バーは●として指定されている。）が観察され、抗原陰性バイスタンダーＡＭＬ細胞死が、抗原陽性標的細胞によるＣＡＲ－Ｔ細胞活性化によって促進されたことを示している。この効果は、長い又は短いスペーサーを有するＣＡＲ構築物において観察された。（図２Ａ）～（図２Ｄ）健康なドナー０４：（図２Ａ）４時間；短いスペーサー；（図２Ｂ）２４時間；短いスペーサー；（図２Ｃ）４時間；中間のスペーサー；（図２Ｄ）２４時間；中間のスペーサー；（図２Ｅ）～（図２Ｈ）健康なドナー０７：（図２Ｅ）４時間；短いスペーサー；（図２Ｆ）２４時間；短いスペーサー；（図２Ｇ）４時間；中間のスペーサー；（図２Ｈ）２４時間；中間のスペーサー。

【図2G】ＣＤ３３指向性ＣＤ８＋ＣＡＲ－Ｔ細胞が、異なるＣＡＲ長及び異なるドナーにわたって強力な抗原陰性バイスタンダー殺滅を示す図である。クロム^５１標識化ＣＤ３３陽性（ｐｏｓ）ＡＭＬ細胞株であるＭＬ１細胞、又はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ターゲティングによるＣＤ３３欠損ＭＬ１細胞は、ＣＤ３３指向性１Ｈ７ ＣＡＲ－Ｔ細胞と４時間又は２４時間共培養され、細胞上清が回収され、シンチレーションカウンターによって放出された放射線について解析された。シンチレーションからバックグラウンドを差し引いた値を最大放出（洗剤処理によって誘発された）で割って１００％を掛けて計算した細胞傷害性パーセント。培養の４時間後、１Ｈ７ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ３３ｐｏｓ ＭＬ１標的の抗原特異的殺滅をもたらしたが（バーは★及び■として指定されている。）、ＣＤ３３陰性（ｎｅｇ）ＭＬ１標的は殺滅をもたらさなかった（バーは●及び◆として指定されている。）。対照的に、２４時間で、ＣＤ３３－ｐｏｓ ＭＬ１標的と培養した場合にのみ、クロム標識化ＣＤ３３－ｎｅｇ ＭＬ１細胞の強力な殺滅（バーは●として指定されている。）が観察され、抗原陰性バイスタンダーＡＭＬ細胞死が、抗原陽性標的細胞によるＣＡＲ－Ｔ細胞活性化によって促進されたことを示している。この効果は、長い又は短いスペーサーを有するＣＡＲ構築物において観察された。（図２Ａ）～（図２Ｄ）健康なドナー０４：（図２Ａ）４時間；短いスペーサー；（図２Ｂ）２４時間；短いスペーサー；（図２Ｃ）４時間；中間のスペーサー；（図２Ｄ）２４時間；中間のスペーサー；（図２Ｅ）～（図２Ｈ）健康なドナー０７：（図２Ｅ）４時間；短いスペーサー；（図２Ｆ）２４時間；短いスペーサー；（図２Ｇ）４時間；中間のスペーサー；（図２Ｈ）２４時間；中間のスペーサー。

【図2H】ＣＤ３３指向性ＣＤ８＋ＣＡＲ－Ｔ細胞が、異なるＣＡＲ長及び異なるドナーにわたって強力な抗原陰性バイスタンダー殺滅を示す図である。クロム^５１標識化ＣＤ３３陽性（ｐｏｓ）ＡＭＬ細胞株であるＭＬ１細胞、又はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ターゲティングによるＣＤ３３欠損ＭＬ１細胞は、ＣＤ３３指向性１Ｈ７ ＣＡＲ－Ｔ細胞と４時間又は２４時間共培養され、細胞上清が回収され、シンチレーションカウンターによって放出された放射線について解析された。シンチレーションからバックグラウンドを差し引いた値を最大放出（洗剤処理によって誘発された）で割って１００％を掛けて計算した細胞傷害性パーセント。培養の４時間後、１Ｈ７ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ３３ｐｏｓ ＭＬ１標的の抗原特異的殺滅をもたらしたが（バーは★及び■として指定されている。）、ＣＤ３３陰性（ｎｅｇ）ＭＬ１標的は殺滅をもたらさなかった（バーは●及び◆として指定されている。）。対照的に、２４時間で、ＣＤ３３－ｐｏｓ ＭＬ１標的と培養した場合にのみ、クロム標識化ＣＤ３３－ｎｅｇ ＭＬ１細胞の強力な殺滅（バーは●として指定されている。）が観察され、抗原陰性バイスタンダーＡＭＬ細胞死が、抗原陽性標的細胞によるＣＡＲ－Ｔ細胞活性化によって促進されたことを示している。この効果は、長い又は短いスペーサーを有するＣＡＲ構築物において観察された。（図２Ａ）～（図２Ｄ）健康なドナー０４：（図２Ａ）４時間；短いスペーサー；（図２Ｂ）２４時間；短いスペーサー；（図２Ｃ）４時間；中間のスペーサー；（図２Ｄ）２４時間；中間のスペーサー；（図２Ｅ）～（図２Ｈ）健康なドナー０７：（図２Ｅ）４時間；短いスペーサー；（図２Ｆ）２４時間；短いスペーサー；（図２Ｇ）４時間；中間のスペーサー；（図２Ｈ）２４時間；中間のスペーサー。

【図3A】ＣＤ３３指向性ＣＤ４^＋ＣＡＲ－Ｔ細胞が、強力な抗原陰性バイスタンダー殺滅を示す図である。クロム^５１標識化ＣＤ３３－ｐｏｓ ＡＭＬ細胞株であるＭＬ１細胞、又はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ターゲティングによるＣＤ３３欠損ＭＬ１細胞は、ＣＤ３３指向性１Ｈ７ ＣＤ４^＋ＣＡＲ－Ｔ細胞と４時間又は２４時間共培養され、細胞上清が回収され、シンチレーションカウンターによって放出された放射線について解析された。シンチレーションからバックグラウンドを差し引いた値を最大放出（洗剤処理によって誘発された）で割って１００％を掛けて計算した細胞傷害性パーセント。（図３Ａ）培養の４時間後、１Ｈ７ ＣＤ４^＋ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ３３－ｐｏｓ ＭＬ１標的の抗原特異的殺滅をもたらしたが（バーは★及び■として指定されている。）、ＣＤ３３－ｎｅｇ ＭＬ１標的は殺滅をもたらさなかった（バーは●及び◆として指定されている。）。（図３Ｂ）対照的に、２４時間で、ＣＤ３３－ｐｏｓ ＭＬ１標的と培養した場合にのみ、クロム標識化ＣＤ３３－ｎｅｇ ＭＬ１細胞の強力な殺滅（バーは●として指定されている。）が観察され、抗原陰性バイスタンダーＡＭＬ細胞死が、抗原陽性標的細胞によるＣＤ４^＋ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化によっても促進されたことを示している。

【図3B】ＣＤ３３指向性ＣＤ４^＋ＣＡＲ－Ｔ細胞が、強力な抗原陰性バイスタンダー殺滅を示す図である。クロム^５１標識化ＣＤ３３－ｐｏｓ ＡＭＬ細胞株であるＭＬ１細胞、又はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ターゲティングによるＣＤ３３欠損ＭＬ１細胞は、ＣＤ３３指向性１Ｈ７ ＣＤ４^＋ＣＡＲ－Ｔ細胞と４時間又は２４時間共培養され、細胞上清が回収され、シンチレーションカウンターによって放出された放射線について解析された。シンチレーションからバックグラウンドを差し引いた値を最大放出（洗剤処理によって誘発された）で割って１００％を掛けて計算した細胞傷害性パーセント。（図３Ａ）培養の４時間後、１Ｈ７ ＣＤ４^＋ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ３３－ｐｏｓ ＭＬ１標的の抗原特異的殺滅をもたらしたが（バーは★及び■として指定されている。）、ＣＤ３３－ｎｅｇ ＭＬ１標的は殺滅をもたらさなかった（バーは●及び◆として指定されている。）。（図３Ｂ）対照的に、２４時間で、ＣＤ３３－ｐｏｓ ＭＬ１標的と培養した場合にのみ、クロム標識化ＣＤ３３－ｎｅｇ ＭＬ１細胞の強力な殺滅（バーは●として指定されている。）が観察され、抗原陰性バイスタンダーＡＭＬ細胞死が、抗原陽性標的細胞によるＣＤ４^＋ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化によっても促進されたことを示している。

【図4】抗原陰性殺滅が、フロー細胞傷害性のアッセイにおいても見られる図である。ＣＤ３３（Ｃ２セット）の膜近位成分に対して指向された１Ｈ７ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＩＬ－７及びＩＬ－１５において１０日間にわたって拡大された。次いで、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、３つの条件のうちの１つで２４時間共培養された：１）クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート－Ｃａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９）技術によってＣＤ３３が遺伝的に欠損している非蛍光ＭＬ１細胞（ＣＤ３３_ｎｅｇ）を伴う内因性レベルのＣＤ３３を発現する蛍光標識化ＭＬ１細胞（ＣＤ３３_ｐｏｓ ^ＧＦＰ）；２）非ＧＦＰ発現ＣＤ３３_ｐｏｓ細胞を伴うＣＤ３３_ｎｅｇ ^ＧＦＰ細胞；３）非ＧＦＰ発現ＣＤ３３_ｎｅｇ細胞を伴うＣＤ３３_ｎｅｇ ^ＧＦＰ細胞。次いで、細胞死は、アネキシンＶ及び７ＡＡＤについて細胞を染色することによって分析された。アネキシンＶ陽性、アネキシンＶ及び７ＡＡＤ陽性又は７ＡＡＤ陽性細胞の総数が、ＴｒｕｅＣｏｕｎｔビーズカウンティングによって定量され、細胞死のパーセンテージが、１００％細胞死（１２００Ｗで１５秒間マイクロ波照射されたＭＬ１細胞）に対して測定された。このデータは、抗原陰性細胞殺滅が、クロム^５１放出アッセイに限定されないことを示す。

【図5A】抗原陰性細胞殺滅が、ＴＮＦα及びＦａｓＬに依存している図である。クロム^５１標識化ＣＤ３３－ｐｏｓ ＡＭＬ細胞株であるＭＬ１細胞、又はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ターゲティングによるＣＤ３３欠損ＭＬ１細胞は、１０：１のエフェクター：標的比のＴＮＦα（図５Ａ）、ＩＦＮγ（図５Ｂ）又はＦａｓＬインヒビター（図５Ｃ）の様々なレベルのインヒビターと共に、ＣＤ３３指向性１Ｈ７ ＣＤ８^＋ＣＡＲ－Ｔ細胞と２４時間共培養された。シンチレーションからバックグラウンドを差し引いた値を最大放出（洗剤処理によって誘発された）で割って１００％を掛けて計算した細胞傷害性パーセント。ＴＮＦα阻害は、抗原陰性細胞死をほとんどもたらさなかった。

【図5B】抗原陰性細胞殺滅が、ＴＮＦα及びＦａｓＬに依存している図である。クロム^５１標識化ＣＤ３３－ｐｏｓ ＡＭＬ細胞株であるＭＬ１細胞、又はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ターゲティングによるＣＤ３３欠損ＭＬ１細胞は、１０：１のエフェクター：標的比のＴＮＦα（図５Ａ）、ＩＦＮγ（図５Ｂ）又はＦａｓＬインヒビター（図５Ｃ）の様々なレベルのインヒビターと共に、ＣＤ３３指向性１Ｈ７ ＣＤ８^＋ＣＡＲ－Ｔ細胞と２４時間共培養された。シンチレーションからバックグラウンドを差し引いた値を最大放出（洗剤処理によって誘発された）で割って１００％を掛けて計算した細胞傷害性パーセント。ＴＮＦα阻害は、抗原陰性細胞死をほとんどもたらさなかった。

【図5C】抗原陰性細胞殺滅が、ＴＮＦα及びＦａｓＬに依存している図である。クロム^５１標識化ＣＤ３３－ｐｏｓ ＡＭＬ細胞株であるＭＬ１細胞、又はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ターゲティングによるＣＤ３３欠損ＭＬ１細胞は、１０：１のエフェクター：標的比のＴＮＦα（図５Ａ）、ＩＦＮγ（図５Ｂ）又はＦａｓＬインヒビター（図５Ｃ）の様々なレベルのインヒビターと共に、ＣＤ３３指向性１Ｈ７ ＣＤ８^＋ＣＡＲ－Ｔ細胞と２４時間共培養された。シンチレーションからバックグラウンドを差し引いた値を最大放出（洗剤処理によって誘発された）で割って１００％を掛けて計算した細胞傷害性パーセント。ＴＮＦα阻害は、抗原陰性細胞死をほとんどもたらさなかった。

【図6】抗原ターゲティングされた免疫療法において抗原陰性細胞死を増大するためにモジュレートされ得る腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）メンバーの図である。

【図7-1】キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が、抗原陽性細胞の死滅（Ａ）及びＴＮＦ受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）を介して近くの抗原陰性細胞にシグナルを送り得る腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα、Ａ）の発現（Ｂ）を誘導し、それによって本明細書で実証されている「バイスタンダー殺滅」を誘導する図である。しかしながら、この細胞死は、ＴＮＦ受容体関連因子２（ＴＲＡＦ２）などのＴＮＦα誘導細胞死を通常阻害する、がんにおいて過剰発現したタンパク質によって阻害される。ＣＡＲ－Ｔ細胞療法の開示された増進の１つは、上流のＮＦＡＴプロモーターを含有するＣＡＲ遺伝子を用いて導入遺伝子をシスに導入することを含む。ＣＡＲを介したシグナル伝達（Ｃ）は、ＮＦＡＴプロモーターからの転写（Ｄ）、及びそれに続くＴＮＦ関連弱アポトーシス誘導の膜結合型（ｍＴＷＥＡＫ）、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、又は誘導性発現を示し、Ｔリンパ球で発現される受容体であるヘルペスウイルス侵入メディエーターとの結合についてＨＳＶ糖タンパク質Ｄと競合するリンホトキシンとの相同体（ＬＩＧＨＴ）の発現（Ｅ）をもたらす。これらのタンパク質の３つ全てが、例えば、ＴＮＦα誘導細胞死（Ｆ～Ｇ）のインヒビターの分解を誘導することによって、ＴＮＦα誘導細胞死についての閾値を低下させることは知られている。

【図7-2】キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が、抗原陽性細胞の死滅（Ａ）及びＴＮＦ受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）を介して近くの抗原陰性細胞にシグナルを送り得る腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα、Ａ）の発現（Ｂ）を誘導し、それによって本明細書で実証されている「バイスタンダー殺滅」を誘導する図である。しかしながら、この細胞死は、ＴＮＦ受容体関連因子２（ＴＲＡＦ２）などのＴＮＦα誘導細胞死を通常阻害する、がんにおいて過剰発現したタンパク質によって阻害される。ＣＡＲ－Ｔ細胞療法の開示された増進の１つは、上流のＮＦＡＴプロモーターを含有するＣＡＲ遺伝子を用いて導入遺伝子をシスに導入することを含む。ＣＡＲを介したシグナル伝達（Ｃ）は、ＮＦＡＴプロモーターからの転写（Ｄ）、及びそれに続くＴＮＦ関連弱アポトーシス誘導の膜結合型（ｍＴＷＥＡＫ）、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、又は誘導性発現を示し、Ｔリンパ球で発現される受容体であるヘルペスウイルス侵入メディエーターとの結合についてＨＳＶ糖タンパク質Ｄと競合するリンホトキシンとの相同体（ＬＩＧＨＴ）の発現（Ｅ）をもたらす。これらのタンパク質の３つ全てが、例えば、ＴＮＦα誘導細胞死（Ｆ～Ｇ）のインヒビターの分解を誘導することによって、ＴＮＦα誘導細胞死についての閾値を低下させることは知られている。

【図8】正常な造血を維持しながら、薬物によって増進されたＴＮＦα媒介性抗原陰性殺滅の概略図である。ＣＤ３３の膜近位ドメインに対して指向されたＣＡＲ－Ｔ細胞は、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα、Ｂ）の放出を促進しながら、ＣＤ３３－ｐｏｓ ＡＭＬ細胞に効率的な殺滅シグナルを送達する（Ａ）。ＴＮＦαは、造血幹細胞における静止状態及び細胞生存を誘導する（Ｃ）。しかしながら、がん細胞では、ＴＮＦαは、ＡＭＬにおいて過剰発現される制御された細胞死の内因性インヒビターによって阻止される（Ｅ）、細胞死を誘発する（Ｄ）。次に、これらの細胞インヒビターは、臨床試験において検証されたか、又は臨床で使用されている薬理学的インヒビターによって阻害され得る（Ｆ並びに例えば図９Ａ及び図１０）。

【図9A】ＴＮＦα媒介性細胞死を増大する能力があると主張されているＳＭＡＣ／Ｄｉａｂｌｏ模倣物及びそれにより達成された結果を示す図である。（９Ａ）ＳＭＡＣ／Ｄｉａｂｌｏ模倣物は、ＴＮＦα媒介性シグナル伝達及び細胞死に対する閾値を減少させる薬物のクラスである。（９Ｂ）抗原陰性殺滅が、ＳＭＡＣ／Ｄｉａｂｌｏ模倣物によって増大され得る。ＣＤ３３を欠損している蛍光標識化ＭＬ１細胞（ＣＤ３３_ｎｅｇ ^ＧＦＰ）及び非蛍光ＭＬ１親細胞（ＣＤ３３_ｐｏｓ、上）又はＭＬ１ ＣＤ３３ＫＯ細胞（ＣＤ３３_ｎｅｇ、下）は、図９Ａに列挙した濃度で様々なＳＭＡＣ／Ｄｉａｂｌｏ模倣物と共培養された。２４時間後、ＭＬ１細胞は、培地又はＣＤ３３指向性ＣＡＲ－Ｔ細胞に曝露された。次いで、細胞死が、アネキシンＶ及び７ＡＡＤについて細胞を染色することにより分析された。生細胞の総数が、ＧＦＰ陽性アネキシンＶ及び７ＡＡＤ陰性細胞として分析され、ＴｒｕｅＣｏｕｎｔビーズカウンティングによって定量された。抗原陰性細胞死のパーセントは、（培地対照ウェル中の全細胞死－ＣＡＲ－Ｔウェル中の全細胞死）／培地対照ウェル中の全細胞死×１００％として計算された。^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎｓは、ｐｏｓｔ－ｈｏｃダネット検定を用いた通常の一元ＡＮＯＶＡによりビヒクル（ＤＭＳＯ）対照に対して有意ではない。

【図9B】ＴＮＦα媒介性細胞死を増大する能力があると主張されているＳＭＡＣ／Ｄｉａｂｌｏ模倣物及びそれにより達成された結果を示す図である。（９Ａ）ＳＭＡＣ／Ｄｉａｂｌｏ模倣物は、ＴＮＦα媒介性シグナル伝達及び細胞死に対する閾値を減少させる薬物のクラスである。（９Ｂ）抗原陰性殺滅が、ＳＭＡＣ／Ｄｉａｂｌｏ模倣物によって増大され得る。ＣＤ３３を欠損している蛍光標識化ＭＬ１細胞（ＣＤ３３_ｎｅｇ ^ＧＦＰ）及び非蛍光ＭＬ１親細胞（ＣＤ３３_ｐｏｓ、上）又はＭＬ１ ＣＤ３３ＫＯ細胞（ＣＤ３３_ｎｅｇ、下）は、図９Ａに列挙した濃度で様々なＳＭＡＣ／Ｄｉａｂｌｏ模倣物と共培養された。２４時間後、ＭＬ１細胞は、培地又はＣＤ３３指向性ＣＡＲ－Ｔ細胞に曝露された。次いで、細胞死が、アネキシンＶ及び７ＡＡＤについて細胞を染色することにより分析された。生細胞の総数が、ＧＦＰ陽性アネキシンＶ及び７ＡＡＤ陰性細胞として分析され、ＴｒｕｅＣｏｕｎｔビーズカウンティングによって定量された。抗原陰性細胞死のパーセントは、（培地対照ウェル中の全細胞死－ＣＡＲ－Ｔウェル中の全細胞死）／培地対照ウェル中の全細胞死×１００％として計算された。^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎｓは、ｐｏｓｔ－ｈｏｃダネット検定を用いた通常の一元ＡＮＯＶＡによりビヒクル（ＤＭＳＯ）対照に対して有意ではない。

【図10】マウス及びヒトにおいて試験され、本開示の教示内で使用され得る小分子ＴＮＦαシグナル伝達モジュレーターのさらなる例を示す図である。

【図11-1】本開示を支持する例示的な配列を示す図である。

【図11-2】本開示を支持する例示的な配列を示す図である。

【図11-3】本開示を支持する例示的な配列を示す図である。

【図11-4】本開示を支持する例示的な配列を示す図である。

【図11-5】本開示を支持する例示的な配列を示す図である。

【図11-6】本開示を支持する例示的な配列を示す図である。

【図11-7】本開示を支持する例示的な配列を示す図である。

【図11-8】本開示を支持する例示的な配列を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0013】

世界保健機関によると、がんは世界で２番目に多い死因であり、２０１８年には推定９６０万人の死亡の原因であった。長年にわたり、がんのために選択される処置は、手術、化学療法及び放射線療法であった。近年、これらの細胞に主に見られる特定の分子変化を識別し、活用することにより、がん細胞を特異的に標的とする、多くのターゲティングされた療法が出現している。例えば、がん細胞などの望ましくない細胞種を標的として、殺滅させるために免疫系のＴ細胞を遺伝子操作することに関して、大きな進歩が遂げられた。これらのＴ細胞の多くは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）構築物を発現するように遺伝子操作されている。ＣＡＲは、遺伝子修飾Ｔ細胞が、がん細胞を認識し、殺滅させることを可能にするいくつかの異なる副成分を含むタンパク質である。この副成分は、少なくとも細胞外成分及び細胞内成分を含む。

【0014】

細胞外成分は、望ましくない細胞の表面に選択的に存在する抗原に特異的に結合する結合ドメインを含む。結合ドメインがそのような抗原に結合すると、細胞内成分が、結合したがん細胞を破壊するようにＴ細胞に指示する。結合ドメインは、典型的に、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）に由来する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であるが、それは、例えば、抗体様抗原結合部位又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む他のフォーマットに基づき得る。

【0015】

細胞内成分は、エフェクタードメインの包含に基づいて活性化シグナルを提供する。第１世代のＣＡＲは、ＣＤ３ζの細胞質領域をエフェクタードメインとして利用した。第２世代のＣＡＲは、分化クラスター２８（ＣＤ２８）又は４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）と組み合わせてＣＤ３ζを利用したが、第３世代のＣＡＲは、細胞内エフェクタードメイン内でＣＤ２８及び４－１ＢＢと組み合わせてＣＤ３ζを利用した。

【0016】

ＣＡＲは一般に、分子内で様々な目的のために使用される１つ以上のリンカー配列も含む。例えば、膜貫通ドメインが、ＣＡＲの細胞外成分を細胞内成分に連結するために使用され得る。結合ドメインの膜近位にあるスペーサー領域としばしば称される柔軟なリンカー配列が、結合ドメインと細胞膜との間にさらなる距離を生じさせるために使用され得る。これは、膜への近接性に基づいて、結合に対する立体障害を低減させるのに有益であり得る。この目的のために使用される一般的なスペーサー領域はＩｇＧ４リンカーである。ターゲティングされる細胞抗原に応じて、より小型のスペーサー又はより長いスペーサーが使用され得る。他の潜在的なＣＡＲ副成分は、本明細書の他の場所により詳細に記載されている。

【0017】

ＣＡＲ発現Ｔ細胞を用いた臨床試験では、従来の処置が失敗した難治性の大細胞型Ｂ細胞リンパ腫を有する患者においてポジティブな応答が示された（Ｎｅｅｌａｐｕら、２０１７年、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７７：２５３１～２５４４頁）。しかしながら、ＣＡＲ構築物は、がん細胞の破壊をもたらすようにＴ細胞を首尾良く遺伝子操作し得るが、それらは、一部の適応症についてインビボで長期の抗がん活性を提供することはできなかった。例えば、抗原陰性の再発は、ＣＡＲ発現Ｔ細胞（一般的にＣＡＲ－Ｔ細胞と称される）による処置などの、抗原指向性免疫療法後の処置失敗の一般的な原因である。本開示は、特定の細胞抗原に対するＣＡＲ又は類似分子を発現するように修飾された免疫細胞が、ターゲティングされる細胞抗原の存在による最初のプライミング後に抗原を発現しないがん細胞の殺滅を誘導することもできることを提供する。例えば、骨髄性悪性腫瘍関連抗原であるＣＤ３３に対して指向されたＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ３３発現標的による最初のプライミングの後（すなわち、ＣＤ３３陽性細胞の存在下で）、ＣＤ３３陰性細胞の殺滅を誘導することができる。これにより、ＣＡＲ－Ｔ細胞は最初に標的抗原によって活性化され、次に標的抗原を発現しない腫瘍微小環境内の他の細胞を殺滅することが可能になり、寛解の深さを増加させ、抗原陰性エスケープのリスクを低減させる機会を提供する。

【0018】

この観察された「バイスタンダー殺滅」は、ＴＮＦα又はＦａｓＬが阻害された場合の抗原陰性細胞死の阻害によって証明されているように、ＴＮＦα経路シグナルに依存すると判断されている。したがって、本開示は、ＴＮＦαのインビボ細胞殺滅作用を増強又は維持する化合物と組み合わせた、ＣＡＲ発現免疫細胞などの免疫療法の投与を提供する。本明細書に示されているように、これらの併用療法は、ＣＡＲ又は類似分子が結合する抗原陽性細胞の殺滅を可能にする。ＴＮＦαの作用を増強又は維持することで、ターゲティングされる抗原陽性細胞の領域において抗原陰性がん細胞の効果的な殺滅も可能になり、したがって他の利点の中でも特にエスケープバリアントの生存率が低下する。

【0019】

ＴＮＦαのインビボ細胞殺滅作用を増強又は維持する化合物は、本明細書ではＴＮＦαシグナル増強物質と称される。特定の実施形態では、ＴＮＦαシグナル増強物質は、ＴＮＦαシグナル伝達経路メンバーを活性化、増大又は支持する腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）メンバーを活性化、増大又は支持する分子を含む。特定の実施形態では、ＴＮＦαシグナル増強物質は、ＴＮＦαシグナル伝達経路メンバーを活性化、増大又は支持する分子を含む。活性化とは、分子を不活性状態から活性状態に変化させることを指す。増大とは、分子を活性状態からより活性な状態にすることを指す。支持とは、別様では分子の活性が下方制御される状況で、分子の活性化状態を維持することを意味する。

【0020】

特定の実施形態では、ＴＮＦαシグナル増強物質は、ＴＮＦαシグナル伝達経路メンバーを不活化、抑制又は破壊するＴＮＦＳＲＦメンバーを不活化、抑制又は破壊する分子を含む。不活化とは、分子を活性状態から不活性状態に変化させることを指す。抑制とは、分子を活性状態から低活性状態にすることを指す。破壊とは、その活性が別様では維持される状況において分子の活性化状態を低減させること、及び／又は分子の機能形態の発現を阻止することを意味する。

【0021】

特定の実施形態では、ＴＮＦαシグナル増強物質は、ＴＮＦαシグナル伝達経路メンバーを増強するＴＮＦＲＳＦメンバーをノックインするか、又はＴＮＦαシグナル伝達経路メンバーを阻害するＴＮＦＲＳＦメンバーの発現をノックダウン／ノックアウトする、若しくはそうでなければ破壊する遺伝子操作分子を含み得る。

【0022】

特定の実施形態では、ＴＮＦ関連死シグナルの表面発現の増加などのタンパク質操作修飾が、バイスタンダー殺滅を増大させるためにＣＡＲ－Ｔ細胞及び他の抗原指向性療法において行われ得る。さらに、これらの増進機構は悪性腫瘍内でのみ発生する傾向があるため、正常な組織を温存し、毒性を低減させる。特定の実施形態では、ＴＮＦαシグナル増強物質は、タンパク質ＴＷＥＡＫ（腫瘍壊死因子様弱アポトーシス誘導因子）、ＴＲＡＩＬ（腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド）及びＬＩＧＨＴ（誘導性発現を示し、Ｔリンパ球で発現される受容体であるヘルペスウイルス侵入メディエーターとの結合についてＨＳＶ糖タンパク質Ｄと競合するリンホトキシンとの相同体）のうちの１つ以上を含む。これらのタンパク質は、ＴＮＦα誘導性細胞死の閾値を低下させる。理論に拘束されるわけではないが、これらのタンパク質は、ＴＮＦα誘導性細胞死を阻害する分子の分解を誘導することによってＴＮＦα誘導性細胞死の閾値を低下させる。特定の実施形態では、ＣＡＲ又は類似分子を発現するように遺伝子修飾された免疫細胞はまた、１つ以上のＴＮＦαシグナル増強物質を発現するか、又は含むように遺伝子修飾されている。

【0023】

特定の実施形態では、ＣＡＲ又は類似分子を発現するように遺伝子修飾された免疫細胞はまた、ＴＮＦαシグナル伝達経路メンバーを阻害する１つ以上のＴＮＦＲＳＦメンバーをノックダウン、ノックアウト、又はそうでなければ不活化するように遺伝子修飾されている。

【0024】

図６は、ＴＮＦＲＳＦメンバーの表を提供し、特定のファミリーメンバーが、本開示の文脈内でＴＮＦαシグナル増強物質として分類される分子について増強又は阻害されるべきか否かを提供する。図６に示しているように、ＴＮＦαシグナル増強物質は、ＴＮＦＲＳＦメンバー１Ａ、１Ｂ、３、６、８、１０Ａ、１０Ｂ、１２Ａ、１９及び／若しくは２１の作用を活性化、増大及び／若しくは支持し、並びに／又はＴＮＦＲＳＦメンバー６Ｂ、１０Ｃ及び／若しくは１０Ｄの作用を不活化、抑制若しくは破壊する。

【0025】

さらに、いくつかの臨床的に利用可能な小分子は、ＴＮＦα媒介性細胞死のインヒビターを遮断することによって抗原陰性バイスタンダー細胞殺滅を増進することができる。特定の実施形態では、これらの小分子には、ＢＶ－６、ＣＵＤＣ－４２７、ＧＤＣ－０１５２、ＬＣＬ１６１、ロカグラミド、シロリムス、エムリカサン、ビリナパント、ＡＳＴＸ６６０、ＡＺＤ５５８２、ＫＩＬＬＥＲＴＲＡＩＬ（商標）、ＢＩ ８９１０６５、ＤＥＢＩＯ １１４３、ＡＰＧ－１３８７、ＨＧＳ１０２９、エスシン及びＡＥＧ３５１５６のうちの１つ以上が含まれる。特定の実施形態では、小分子ＴＮＦαシグナル増強物質は、ｃＩＡＰアンタゴニストである。小分子ＴＮＦαシグナル増強物質はまた、ＳＭＡＣ模倣物であり得る。カスパーゼの第２のミトコンドリア由来活性化因子（ＳＭＡＣ）は、ｃＩＡＰに結合するミトコンドリアタンパク質（ＤＩＡＢＬＯとも称される）である。この結合により、アポトーシスを活性化するためにカスパーゼの遊離が生じ、ｃＩＡＰの枯渇が生じる。ＳＭＡＣ模倣物は、ｃＩＡＰに対するＳＭＡＣの作用を模倣する。

【0026】

本開示に関連する以下の態様及び選択肢は、以下のようにさらに詳細にここで記載されている。（Ｉ）免疫細胞；（ＩＩ）細胞試料の採取及び細胞濃縮；（ＩＩＩ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及び任意選択的にＴＮＦαシグナル増強物質タンパク質を発現するような細胞集団の遺伝子修飾；（ＩＩＩ－Ａ）遺伝子操作技術；（ＩＩＩ－Ｂ）ＣＡＲ副成分；（ＩＩＩ－Ｂ－ｉ）結合ドメイン及びターゲティングされる細胞抗原；（ＩＩＩ－Ｂ－ｉｉ）スペーサー領域（ＩＩＩ－Ｂ－ｉｉｉ）膜貫通ドメイン；（ＩＩＩ－Ｂ－ｉｖ）細胞内エフェクタードメイン；（ＩＩＩ－Ｂ－ｖ）リンカー；（ＩＩＩ－Ｂ－ｖｉ）タグカセット、形質導入マーカー及び／又は自殺スイッチを含む制御機構；（ＩＩＩ－Ｃ）ＴＮＦαシグナル増強物質タンパク質；（ＩＶ）細胞活性化培養条件；（Ｖ）エクスビボで製造された細胞製剤；（ＶＩ）ＴＮＦαシグナル増強物質－小分子及びタンパク質；（ＶＩＩ）ナノ粒子製剤；（ＶＩＩＩ）使用方法；（ＩＸ）キット；（Ｘ）例示的な実施形態；並びに（ＸＩ）最終パラグラフ。これらの見出しは、構成の目的のためにのみ提供されており、本開示の範囲又は解釈を限定するものではない。

【0027】

（Ｉ）免疫細胞。本開示は、ＣＡＲを発現するように遺伝子修飾された免疫細胞、及びＴＮＦαシグナル増強物質を発現するか、又は含むように遺伝子修飾された免疫細胞を記載している。特定の実施形態では、ＣＡＲを発現するように遺伝子修飾された免疫細胞は、ＴＮＦαシグナル増強物質を発現するか、又は含むように遺伝子修飾された免疫細胞と同じである。

【0028】

遺伝子修飾細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球／マクロファージ、リンパ球、造血幹細胞（ＨＳＣ）、造血前駆細胞（ＨＰＣ）並びに／又はＨＳＣ及びＨＳＣの混合物（すなわち、ＨＳＰＣ）を含み得る。特定の実施形態では、遺伝子修飾細胞はＴ細胞を含む。

【0029】

Ｔ細胞のいくつかの異なるサブセットが発見されており、各々が異なる機能を有する。例えば、Ｔ細胞の大部分は、いくつかのタンパク質の複合体として存在するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有する。実際のＴ細胞受容体は、独立したＴ細胞受容体アルファ及びベータ（ＴＣＲα及びＴＣＲβ）遺伝子から産生され、α－ＴＣＲ鎖及びβ－ＴＣＲ鎖と呼ばれる、２つの別個のペプチド鎖から構成される。

【0030】

γδＴ細胞は、それらの表面に異なるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するＴ細胞の小さなサブセットを表す。γδＴ細胞では、ＴＣＲは、１つのγ鎖及び１つのδ鎖から構成される。Ｔ細胞のこの群は、αβＴ細胞ほど一般的ではない（全Ｔ細胞の２％）。

【0031】

ＣＤ３は、全ての成熟Ｔ細胞上で発現される。活性化Ｔ細胞は、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ６９及びＣＤ２５を発現する。ＣＤ５及びトランスフェリン受容体もまた、Ｔ細胞上で発現される。

【0032】

Ｔ細胞はさらにヘルパー細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）及び細胞溶解性Ｔ細胞を含む細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ、ＣＤ８＋Ｔ細胞）に分類され得る。Ｔヘルパー細胞は、Ｂ細胞の形質細胞への成熟、並びに細胞傷害性Ｔ細胞及びマクロファージの活性化などの機能を含む、免疫学的プロセスにおいて他の白血球を補助する。これらの細胞はまた、それらの表面上にＣＤ４タンパク質を発現するため、ＣＤ４＋Ｔ細胞としても知られている。ヘルパーＴ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上で発現されるＭＨＣクラスＩＩ分子によりペプチド抗原を提示されると、活性化される。活性化されると、それらは迅速に分裂し、能動免疫応答を調節するか、又は補助するサイトカインと呼ばれる小さいタンパク質を分泌する。

【0033】

細胞傷害性Ｔ細胞は、ウイルス感染細胞及び腫瘍細胞を破壊し、移植片拒絶反応にも関与している。これらの細胞はまた、それらの表面上にＣＤ８糖タンパク質を発現するため、ＣＤ８＋Ｔ細胞としても知られている。これらの細胞は、生体のほぼ全ての細胞の表面上に存在するＭＨＣクラスＩと会合した抗原と結合することにより、それらの標的を認識する。

【0034】

本明細書で使用される場合、「セントラルメモリー」Ｔ細胞（又は「ＴＣＭ」）とは、抗原を経験したＣＴＬであり、それらの表面上でＣＤ６２Ｌ又はＣＣＲ７及びＣＤ４５ＲＯを発現し、ナイーブ細胞と比較してＣＤ４５ＲＡを発現しない又は発現が低下しているものを指す。特定の実施形態では、セントラルメモリー細胞は、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、ＣＤ４５ＲＯ及びＣＤ９５の発現が陽性であり、ナイーブ細胞と比較してＣＤ４５ＲＡの発現が低下している。

【0035】

本明細書で使用される場合、「エフェクターメモリー」Ｔ細胞（又は「ＴＥＭ」）とは、抗原を経験したＴ細胞であり、セントラルメモリー細胞と比較してそれらの表面上でＣＤ６２Ｌを発現しない又は発現が低下しており、ナイーブ細胞と比較してＣＤ４５ＲＡを発現しない又は発現が低下しているものを指す。特定の実施形態では、エフェクターメモリー細胞は、ナイーブ細胞又はセントラルメモリー細胞と比較してＣＤ６２Ｌ及びＣＣＲ７の発現が陰性であり、ＣＤ２８及びＣＤ４５ＲＡの発現にばらつきがある。エフェクターＴ細胞は、メモリー又はナイーブＴ細胞と比較して、グランザイムＢ及びパーフォリンが陽性である。

【0036】

本明細書で使用される場合、「ナイーブ」Ｔ細胞とは、抗原を経験していないＴ細胞であり、セントラルメモリー細胞又はエフェクターメモリー細胞と比較して、ＣＤ６２Ｌ及びＣＤ４５ＲＡを発現し、ＣＤ４５ＲＯを発現しないものを指す。特定の実施形態では、ナイーブＣＤ８＋Ｔリンパ球は、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ１２７及びＣＤ４５ＲＡを含むナイーブＴ細胞の表現型マーカーの発現を特徴とする。

【0037】

ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞、Ｋ細胞及びキラー細胞としても知られている）は、インターフェロン又はマクロファージ由来サイトカインに応答して活性化される。これらは、適応免疫応答により、感染症を排除することができる抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞が生成されている間に、ウイルス感染症を抑制するように機能する。ＮＫ細胞は、ＣＤ８、ＣＤ１６及びＣＤ５６を発現するが、ＣＤ３を発現しない。

【0038】

マクロファージ（及びそれらの前駆細胞である単球）は、生体の全ての組織に（ある特定の場合では、小膠細胞、クッパー細胞及び破骨細胞として）存在し、アポトーシス細胞、病原体及び他の非自己成分を飲み込む。単球／マクロファージは、ＣＤ１１ｂ、Ｆ４／８０、ＣＤ６８、ＣＤ１１ｃ、ＩＬ－４Ｒα及び／又はＣＤ１６３を発現する。

【0039】

未成熟樹状細胞（すなわち、活性化前）は、末梢において抗原及び他の非自己成分を飲み込んだ後、活性化形態において、リンパ組織のＴ細胞領域に移動し、Ｔ細胞への抗原提示を行う。樹状細胞は、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、ＣＤ２１、ＣＤ３５、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ８６、ＣＤ１０１、ＣＤ１４８、ＣＤ２０９及びＤＥＣ－２０５を発現する。

【0040】

造血幹細胞／前駆細胞又はＨＳＰＣとは、造血幹細胞及び造血前駆細胞の組合せを指す。

【0041】

造血幹細胞とは、インビボで自己複製でき、インビトロで本質的に無制限に増殖でき、他の全ての造血細胞種に分化できる未分化造血細胞を指す。

【0042】

造血前駆細胞は、成熟細胞型にさらに分化することができる造血幹細胞又は胎児組織に由来する細胞である。ある特定の実施形態では、造血前駆細胞は、ＣＤ２４^ｌｏＬｉｎ^－ＣＤ１１７^＋造血前駆細胞である。ＨＰＣは、（ｉ）最終的に単球及びマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板若しくは樹状細胞を生じさせる骨髄前駆細胞、又は（ｉｉ）最終的にＴ細胞、Ｂ細胞及びＮＫ細胞を生じさせるリンパ系前駆細胞に分化することができる。

【0043】

ＨＳＰＣは、他の型の造血細胞と比べて、ＨＳＰＣ上で増加したレベルで発現される特定のマーカーに対して陽性であり得る。例えば、そのようなマーカーには、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ５９、ＣＤ９０、ＣＤ１０９、ＣＤ１１７、ＣＤ１３３、ＣＤ１６６、ＨＬＡ ＤＲ又はそれらの組合せが含まれる。また、ＨＳＰＣは、他の型の造血細胞と比べて発現マーカーに対して陰性であり得る。例えば、そのようなマーカーには、Ｌｉｎ、ＣＤ３８又はそれらの組合せが含まれる。好ましくは、ＨＳＰＣはＣＤ３４^＋細胞である。

【0044】

細胞又は細胞集団が、特定のマーカーに対して「陽性」であるか、又は特定のマーカーを発現するという記述は、特定のマーカーの細胞上又は細胞中での検出可能な存在を指す。表面マーカーに言及する場合、この用語は、フローサイトメトリーによって、例えば、マーカーに特異的に結合する抗体で染色し、前記抗体を検出することによって、検出される表面発現の存在を指すことができ、染色は、他の点では同一の条件下でアイソタイプが一致した対照を用いて同じ手順を実行して検出された染色を実質的に上回るレベルで及び／又はマーカーに対して陽性であることが知られている細胞についてのレベルと実質的に同様のレベルで及び／又はマーカーに対して陰性であることが知られている細胞についてのレベルより実質的に高いレベルでフローサイトメトリーによって検出可能である。

【0045】

細胞又は細胞集団が、特定のマーカーに対して「陰性」であるか、又はマーカーの発現を欠いているという記述は、特定のマーカーの細胞上又は細胞中での実質的に検出可能な存在がないことを指す。表面マーカーに言及する場合、この用語は、フローサイトメトリーによって、例えば、マーカーに特異的に結合する抗体で染色し、前記抗体を検出することによって、検出される表面発現の欠如を指すことができ、染色は、他の点では同一の条件下でアイソタイプが一致した対照を用いて同じ手順を実行して検出された染色を実質的に上回るレベルで、及び／又はマーカーに対して陽性であることが知られている細胞についてのレベルより実質的に低いレベルで、及び／又はマーカーに対して陰性であることが知られている細胞についてのレベルと比較して実質的に同様のレベルでフローサイトメトリーによって検出されない。

【0046】

本開示の教示に従って遺伝子修飾された細胞は、患者由来細胞（自己由来）であり得るか、又は適切な場合、同種異系であり得る。

【0047】

（ＩＩ）細胞試料の採取及び細胞濃縮。試料採取及び濃縮の方法は当業者に公知である。一部の実施形態では、細胞は細胞株に由来する。一部の実施形態では、細胞は、異種源、例えば、マウス、ラット、非ヒト霊長類又はブタから得られる。特定の実施形態では、細胞はヒトに由来する。

【0048】

一部の実施形態では、Ｔ細胞は、全血、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、白血球、骨髄、胸腺、組織生検、腫瘍、白血病、リンパ腫、リンパ節、腸管関連リンパ組織、粘膜関連リンパ組織、脾臓、他のリンパ組織、肝臓、肺、胃、腸、結腸、腎臓、膵臓、乳房、骨、前立腺、子宮頸部、精巣、卵巣、扁桃腺若しくは他の臓器及び／又はそれらに由来する細胞などの試料に由来するか、又はそれらから単離される。特定の実施形態では、対象の循環血液からの細胞は、例えば、アフェレーシス又は白血球アフェレーシスによって得られる。試料は、特定の実施形態では、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、ＨＳＣ、ＨＰＣ、ＨＳＰＣ、赤血球及び／又は血小板を含むリンパ球を含有し、一部の態様では、赤血球及び血小板以外の細胞を含有し、さらに処理が必要である。

【0049】

一部の実施形態では、対象から採取された血液細胞は、例えば、血漿画分を除去し、後続の処理工程のために、細胞を、適切なバッファー又は培地中に入れるように、洗浄される。特定の実施形態では、細胞は、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）により洗浄される。一部の実施形態では、洗浄液は、カルシウム及び／若しくはマグネシウム並びに／又は多くの二価カチオン若しくは全ての二価カチオンを欠く。洗浄は、製造元の指示書に従い、半自動式「フロースルー」型遠心分離機（例えば、Ｃｏｂｅ ２９９１ ｃｅｌｌ ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ、Ｂａｘｔｅｒ）を使用して達せられ得る。接線流濾過（ＴＦＦ）もまた、実施され得る。特定の実施形態では、細胞は、洗浄の後に、Ｃａ＋＋／Ｍｇ＋＋非含有ＰＢＳなどの様々な生体適合性バッファー中で再懸濁され得る。

【0050】

単離は、サイズ、密度、特定の試薬に対する感受性若しくは耐性及び／又は親和性、例えば、抗体若しくは他の結合パートナーに対する免疫親和性などの１つ以上の特性に基づく分離を含む、種々の細胞調製及び分離工程のうちの１つ以上を含み得る。特定の実施形態では、単離は、同じ装置又は機器を使用して、単一のプロセスストリームにおいて順次及び／又は同時に実行される。特定の実施形態では、異なる集団の単離、培養及び／又は操作は、同じ試料からなどの、同じ出発組成物又は材料から実行される。

【0051】

特定の実施形態では、試料は、密度に基づく細胞分離方法及び関連する方法を使用することによって、Ｔ細胞について濃縮され得る。例えば、白血球は、赤血球を溶解し、Ｐｅｒｃｏｌｌ又はＦｉｃｏｌｌ勾配により試料を遠心分離することによって末梢血中の他の細胞種から分離され得る。

【0052】

特定の実施形態では、特定のＴ細胞種について濃縮されていないバルクＴ細胞集団が使用され得る。特定の実施形態では、選択されたＴ細胞種は、細胞マーカーに基づく陽性及び／又は陰性選択に基づいて濃縮及び／又は単離され得る。陽性選択では、細胞マーカーに結合した細胞が、さらなる使用のために保持される。陰性選択では、抗体などの捕捉剤によって細胞マーカーに結合していない細胞が、さらなる使用のために保持される。一部の例では、両方の画分がさらなる使用のために保持され得る。

【0053】

分離は、特定の細胞集団又は特定のマーカーを発現する細胞の１００％の濃縮又は除去をもたらす必要はない。例えば、特定の型の細胞の陽性選択又はそれについての濃縮とは、そのような細胞の数又はパーセンテージを増加させることを指すが、マーカーを発現しない細胞の完全な不在をもたらす必要はない。同様に、特定の型の細胞の陰性選択、除去又は枯渇は、そのような細胞の数又はパーセンテージを減少させることを指すが、そのような細胞の全ての完全な除去をもたらす必要はない。

【0054】

一部の例では、複数ラウンドの分離工程が実行され、ある工程から陽性又は陰性に選択された画分が、後続の陽性又は陰性選択などの別の分離工程に供される。

【0055】

一部の実施形態では、細胞マーカーについての抗体又は結合ドメインは、磁気ビーズ又は常磁性ビーズなどの固体支持体又はマトリックスに結合して、陽性及び／又は陰性選択のための細胞の分離を可能にする。例えば、一部の実施形態では、細胞及び細胞集団は、免疫磁性（又はアフィニティー磁気）分離技術を使用して分離又は単離される（Ｓ．Ａ．Ｂｒｏｏｋｓ及びＵ．Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ（コピーライト）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪによって編集された、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、ｖｏｌ．５８：Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｖｏｌ．２：Ｃｅｌｌ Ｂｅｈａｖｉｏｒ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ａｎｄ Ｉｎ Ｖｉｖｏ、１７～２５頁に概説されている）。ＵＳ４，４５２，７７３、ＵＳ４，７９５，６９８、ＵＳ５，２００，０８４及びＥＰ４５２３４２も参照のこと。

【0056】

一部の実施形態では、親和性に基づく選択は、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）による。ＭＡＣＳシステムは、磁化粒子が付着した細胞の高純度選択を可能にする。ある特定の実施形態では、ＭＡＣＳは、外部磁場の印加後に非標的種及び標的種が順次溶出されるモードにおいて動作する。すなわち、磁化粒子に付着した細胞は所定の位置に保持されるが、付着していない種は溶出される。次に、この最初の溶出工程が完了した後、磁場に捕捉され、溶出が阻止された種は、溶出及び回収され得るように何らかの方法で解放される。ある特定の実施形態では、非標的細胞が標識され、不均一な細胞集団から枯渇される。

【0057】

一部の実施形態では、本明細書に記載されている細胞集団は、フローサイトメトリーによって採取及び濃縮（又は枯渇）され、フローサイトメトリーでは、複数の細胞表面マーカーについて染色された細胞が流体流中で運ばれる。一部の実施形態では、本明細書に記載されている細胞集団は、分取規模（ＦＡＣＳ）選別によって採取及び濃縮（又は枯渇）される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されている細胞集団は、ＦＡＣＳに基づく検出システムと組み合わせた微小電気機械システム（ＭＥＭＳ）チップの使用によって採取及び濃縮（又は枯渇）される（例えば、ＷＯ２０１０／０３３１４０、Ｃｈｏら（２０１０年）Ｌａｂ Ｃｈｉｐ １０、１５６７～１５７３頁；及びＧｏｄｉｎら（２００８年）Ｊ Ｂｉｏｐｈｏｔｏｎ．１（５）：３５５～３７６頁を参照のこと。）。どちらの場合も、細胞は複数のマーカーで標識され得、明確に定義された細胞サブセットの単離を高純度で可能にする。

【0058】

異なるＴ細胞亜集団についての細胞マーカーは上に記載されている。特定の実施形態では、Ｔ細胞の特定の亜集団、例えば、陽性又は高レベルの１つ以上の表面マーカー、例えば、ＣＣＲ７、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ４及び／又はＣＤ４５ＲＡ Ｔ細胞を発現する細胞が、陽性又は陰性選択技術によって単離される。

【0059】

ＣＤ３＋、ＣＤ２８＋Ｔ細胞は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８コンジュゲート磁気ビーズ（例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ－４５０ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｄｅｒ）を使用して陽性選択され、拡大され得る。

【0060】

特定の実施形態では、ＣＤ８＋又はＣＤ４＋選択工程が、ＣＤ４＋ヘルパー及びＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞を分離するために使用される。そのようなＣＤ８＋及びＣＤ４＋集団は、１つ以上のナイーブ、メモリー及び／又はエフェクターＴ細胞亜集団上で発現されたか、又は比較的高度に発現されたマーカーについての陽性又は陰性選択によって亜集団にさらに選別され得る。特定の実施形態では、細胞は、１：１のＣＤ８＋対ＣＤ４＋比を得るために選別される。

【0061】

一部の実施形態では、セントラルメモリーＴ（ＴＣＭ）細胞についての濃縮が実行される。特定の実施形態では、メモリーＴ細胞は、ＣＤ８＋末梢血リンパ球の両方のＣＤ６２Ｌサブセットに存在する。ＰＢＭＣは、抗ＣＤ８及び抗ＣＤ６２Ｌ抗体を使用するなどして、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ８及び／又はＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ８＋画分について濃縮又は枯渇され得る。

【0062】

一部の実施形態では、セントラルメモリーＴ（ＴＣＭ）細胞についての濃縮は、ＣＣＲ７、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ２７、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２８、ＣＤ３及び／又はＣＤ１２７の陽性又は高表面発現に基づき、一部の態様では、それは、ＣＤ４５ＲＡ及び／又はグランザイムＢを発現するか、又は高度に発現する細胞についての陰性選択に基づく。一部の態様では、ＴＣＭ細胞について濃縮されたＣＤ８＋集団の単離は、ＣＤ４、ＣＤ１４、ＣＤ４５ＲＡを発現する細胞の枯渇、並びにＣＣＲ７、ＣＤ４５ＲＯ及び／又はＣＤ６２Ｌを発現する細胞についての陽性選択又は濃縮によって実行される。一態様では、セントラルメモリーＴ（ＴＣＭ）細胞についての濃縮は、ＣＤ１４及びＣＤ４５ＲＡの発現に基づいて陰性選択に供される、ＣＤ４発現に基づいて選択された細胞の陰性画分、並びにＣＤ６２Ｌに基づく陽性選択から開始して実行される。このような選択は、一部の態様では同時に実行され、他の態様ではいずれかの順序で順次実行される。一部の態様では、ＣＤ８＋細胞集団又は亜集団を調製する際に使用されるものと同じＣＤ４発現に基づく選択工程もまた、ＣＤ４＋細胞集団又は亜集団を生成するために使用され、それによって任意選択的に１つ以上のさらなる陽性又は陰性選択工程後にＣＤ４に基づく分離からの陽性画分及び陰性画分の両方が保持される。

【0063】

特定の例では、ＰＢＭＣの試料又は他の白血球試料は、ＣＤ４＋細胞の選択に供され、陰性画分及び陽性画分の両方が保持される。次に、陰性画分は、ＣＤ１４及びＣＤ４５ＲＡ又はＲＯＲｌの発現に基づく陰性選択、並びにＣＣＲ７、ＣＤ４５ＲＯ及び／又はＣＤ６２ＬなどのセントラルメモリーＴ細胞に特徴的なマーカーに基づく陽性選択に供され、陽性及び陰性選択はいずれかの順序で実行される。

【0064】

特定の実施形態では、細胞濃縮は、バルクＣＤ８＋ＦＡＣｓ選別細胞集団をもたらす。

【0065】

他の細胞種は、公知のマーカープロファイル及び技術に基づいて濃縮され得る。例えば、ＣＤ３４＋ＨＳＣ、ＨＳＰ及びＨＳＰＣは、磁気細胞分離装置、例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｃｅｌｌ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に接続された磁性粒子に直接的又は間接的にコンジュゲートされた抗ＣＤ３４抗体を使用して濃縮され得る。

【0066】

（ＩＩＩ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及び／又はＴＮＦαシグナル増強物質を発現するような細胞集団の遺伝子修飾。細胞集団は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及び／又はＴＮＦαシグナル増強物質を発現するように遺伝子修飾されている。

【0067】

（ＩＩＩ－Ａ）遺伝子操作技術。本明細書に開示されているＣＡＲ及び／又はＴＮＦαシグナル増強物質をコードする所望の遺伝子は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、遺伝子配列を含むウイルス又はバクテリオファージベクターによる感染、細胞融合、染色体媒介遺伝子導入、マイクロセル媒介遺伝子導入、スフェロプラスト融合、インビボナノ粒子媒介送達などを含む、当該技術分野において公知の任意の方法によって細胞に導入され得る。外来遺伝子を細胞に導入するための多数の技術が当該技術分野において公知であり（例えば、Ｌｏｅｆｆｌｅｒ及びＢｅｈｒ、１９９３年、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７、５９９～６１８頁；Ｃｏｈｅｎら、１９９３年、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：６１８～６４４頁；Ｃｌｉｎｅ、１９８５年、Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．２９：６９～９２頁を参照のこと。）、レシピエント細胞の必要な発達及び生理学的機能が必要以上に破壊されない限り、使用され得る。この技術は、遺伝子が細胞によって発現可能であり、ある特定の場合、好ましくは遺伝性であり、この細胞子孫によって発現可能であるように、遺伝子の細胞への安定な導入を提供する。

【0068】

「遺伝子」という用語は、本明細書に記載されているＣＡＲ及び／又はＴＮＦαシグナル増強物質をコードする核酸配列（ポリヌクレオチド又はヌクレオチド配列と交換可能に使用される）を指す。この定義には、このような変化が、コードされたＣＡＲ及び／又はＴＮＦαシグナル増強物質の機能に実質的に影響を及ぼさない、様々な配列多型、変異及び／又は配列バリアントが含まれる。「遺伝子」という用語は、コード配列だけでなく、プロモーター、エンハンサー及び終結領域などの調節領域も含み得る。この用語はさらに、選択的スプライス部位から生じるバリアントと共に、イントロンの全て及びｍＲＮＡの転写物からスプライスされた他のＤＮＡ配列を含み得る。分子をコードする遺伝子配列はキメラ分子の発現を指図するＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。これらの核酸配列は、ＲＮＡに転写されるＤＮＡ鎖配列であり得るか、又はタンパク質に翻訳されるＲＮＡ配列であり得る。核酸配列は、完全長の核酸配列及び完全長のタンパク質に由来する非完全長の配列の両方を含む。配列はまた、特定の細胞種においてコドン選択を提供するために導入され得る天然配列（単数又は複数）の縮重コドンを含み得る。当業者によって理解されるように、本開示の全体を通して完全な遺伝子配列の一部が参照される。

【0069】

ＣＡＲ及び／又はＴＮＦαシグナル増強物質をコードする遺伝子配列が本明細書に提供され、また、関連するアミノ酸配列及び本明細書に提供されている他の記述から合成又は組換え方法によって容易に調製され得る。実施形態では、これらの配列のいずれかをコードする遺伝子配列はまた、容易な切り出し及び配列をコードする遺伝子配列の、異なる配列をコードする別の遺伝子配列による置き換えを提供するために、コード配列の５’及び／又は３’末端にて１つ以上の制限酵素部位を有し得る。実施形態では、配列をコードする遺伝子配列は、哺乳動物細胞での発現のためにコドン最適化され得る。

【0070】

「コードすること」とは、アミノ酸の定義された配列などの他の巨大分子の合成のための鋳型として機能する、ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡなどの遺伝子におけるヌクレオチドの特定の配列の特性を指す。したがって、遺伝子に相当するｍＲＮＡの転写及び翻訳が、細胞又は他の生物系においてタンパク質を産生するのであれば、遺伝子はタンパク質をコードしている。「タンパク質をコードする遺伝子配列」は、互いの縮重型であり、実質的に類似の形態及び機能の同じアミノ酸配列（単数又は複数）をコードするヌクレオチド配列全てを含む。

【0071】

発現されたＣＡＲ及び／又はＴＮＦαシグナル増強物質の１つより多い部分をコードするポリヌクレオチド遺伝子配列は、互いに及び関連する調節配列に操作可能に連結され得る。例えば、調節配列と外来性核酸配列との間に機能的な結合があり、後者の発現を生じることができる。別の例については、第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的な関係で配置される場合、第１の核酸配列は第２の核酸配列と操作可能に連結され得る。例えば、プロモーターがコード配列の転写又は発現に影響を与える場合、プロモーターはコード配列に操作可能に連結される。一般に、操作可能に連結されたＤＮＡ配列は隣接しており、必要又は有益であれば、コード領域を同一のリーディングフレームに接合する。

【0072】

特定の実施形態では、プロモーターはＮＦＡＴプロモーターである。ＮＦＡＴプロモーターは、操作可能に連結されたコード配列の発現をＣａ２＋依存様式で駆動する。特定の実施形態では、ＮＦＡＴプロモーターは、任意の数の結合モチーフ、例えば、１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０個、少なくとも１１個又は最大で１２個の結合モチーフを含む。特定の実施形態では、ＮＦＡＴプロモーターは、４～８個のＮＦＡＴ結合モチーフを含む。

【0073】

本明細書に記載されている実施形態のいずれかでは、ポリヌクレオチドは、自己切断ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことができ、自己切断ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ＣＡＲ構築物をコードするポリヌクレオチドと、ＴＮＦαシグナル増強物質及び／又は形質導入マーカー（例えば、ｔＥＧＦＲ）をコードするポリヌクレオチドとの間に位置する。例示的な自己切断型ポリペプチドには、ブタテスコウイルス－１（ｐｏｒｃｉｎｅ ｔｅｓｃｈｏｖｉｒｕｓ－１）（Ｐ２Ａ）、トセアアシグナウイルス（Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ ｖｉｒｕｓ）（Ｔ２Ａ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（Ｅ２Ａ）、口蹄疫ウイルス（Ｆ２Ａ）又はそれらのバリアント由来の２Ａペプチドが含まれる（図１１を参照のこと。）。２Ａペプチドのさらなる例示的な核酸及びアミノ酸配列は、例えば、Ｋｉｍら（ＰＬＯＳ Ｏｎｅ ６：ｅ１８５５６（２０１１年）に記載されている。

【0074】

「ベクター」は、別の核酸を輸送することができる核酸分子である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス又はファージであり得る。「発現ベクター」は、それが適切な環境に存在する場合、ベクターによって運ばれる１つ以上の遺伝子によってコードされたタンパク質の発現を指図することができるベクターである。

【0075】

「レンチウイルス」とは、分裂細胞及び非分裂細胞に感染することができるレトロウイルスの属を指す。レンチウイルスのいくつかの例には、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス：１型ＨＩＶ及び２型ＨＩＶを含む）；ウマ伝染性貧血ウイルス；ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）；ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）；及びサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が含まれる。

【0076】

「レトロウイルス」はＲＮＡゲノムを有するウイルスである。「ガンマレトロウイルス」とは、レトロウイルス科の属を指す。例示的なガンマレトロウイルスには、マウス幹細胞ウイルス、マウス白血病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ肉腫ウイルス及びトリ細網内皮症ウイルスが含まれる。

【0077】

レトロウイルスベクター（Ｍｉｌｌｅｒら、１９９３年、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５８１～５９９頁を参照のこと。）が使用され得る。そのような実施形態では、発現される遺伝子は、細胞への送達のためにレトロウイルスベクターにクローニングされる。特定の実施形態では、レトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムのパッケージング及び組込みに必要なシス作用性の配列の全て、すなわち、（ａ）ベクターの各末端での長い末端反復（ＬＴＲ）又はその一部、（ｂ）マイナス鎖及びプラス鎖ＤＮＡの合成のためのプライマー結合部位、並びに（ｃ）ゲノムＲＮＡのビリオンへの取込みに必要なパッケージングシグナルを含む。レトロウイルスベクターについてのさらなる詳細は、Ｂｏｅｓｅｎら、１９９４年、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ６：２９１～３０２頁；Ｃｌｏｗｅｓら、１９９４年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：６４４～６５１頁；Ｋｉｅｍら、１９９４年、Ｂｌｏｏｄ ８３：１４６７～１４７３頁；Ｓａｌｍｏｎｓ及びＧｕｎｚｂｅｒｇ、１９９３年、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：１２９～１４１頁；並びにＧｒｏｓｓｍａｎ及びＷｉｌｓｏｎ、１９９３年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．３：１１０～１１４頁に見出され得る。アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）及びアルファウイルスも使用され得る。Ｋｏｚａｒｓｋｙ及びＷｉｌｓｏｎ、１９９３年、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ３：４９９～５０３頁、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１～４３４頁；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９２年、Ｃｅｌｌ ６８：１４３～１５５頁；Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｉら、１９９３年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：２２５～２３４頁；Ｗａｌｓｈら、１９９３年、Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｉ．Ｍｅｄ．２０４：２８９～３００頁；並びにＬｕｎｄｓｔｒｏｍ、１９９９年、Ｊ．Ｒｅｃｅｐｔ．Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔ．Ｒｅｓ．１９：６７３～６８６頁を参照のこと。遺伝子送達の他の方法には、哺乳動物の人工染色体（Ｖｏｓ、１９９８年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．８：３５１～３５９頁）；リポソーム（Ｔａｒａｈｏｖｓｋｙ及びＩｖａｎｉｔｓｋｙ、１９９８年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｍｏｓｃ）６３：６０７～６１８頁）；リボザイム（Ｂｒａｎｃｈ及びＫｌｏｔｍａｎ、１９９８年、Ｅｘｐ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．６：７８～８３頁）；並びにトリプレックスＤＮＡ（Ｃｈａｎ及びＧｌａｚｅｒ、１９９７年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７５：２６７～２８２頁）の使用が含まれる。

【0078】

ヒトの遺伝子療法への応用のために特定されたものを含む、本開示の範囲内で好適な多数の利用できるウイルスベクターが存在する（Ｐｆｅｉｆｅｒ及びＶｅｒｍａ、２００１年、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．２：１７７頁を参照のこと。）。レトロウイルスベクター及びレンチウイルスベクターを使用し、ＣＡＲ導入遺伝子を含むウイルス粒子を哺乳動物宿主細胞に形質導入するために細胞をパッケージングする方法は、例えば、ＵＳ８，１１９，７７２；Ｗａｌｃｈｌｉら、２０１１年、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ６：３２７９３０頁；Ｚｈａｏら、２００５年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７４：４４１５頁；Ｅｎｇｅｌｓら、２００３年、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１４：１１５５頁；Ｆｒｅｃｈａら、２０１０年、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１８：１７４８頁；及びＶｅｒｈｏｅｙｅｎら、２００９年、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５０６：９７頁に記載されている。レトロウイルス及びレンチウイルスのベクター構築物及び発現系も市販されている。

【0079】

ターゲティングされた遺伝子操作アプローチはまた、（ｉ）活性が増強されるべきＴＮＦＲＳファミリーメンバーの発現のための遺伝子を挿入するために利用され得る及び／又は（ｉｉ）阻害されるべきＴＮＦＲＳファミリーメンバーの活性を破壊するために利用され得る。特定の実施形態では、これらのファミリーメンバーの活性を破壊することは、ターゲティングされた遺伝子操作アプローチを利用してそれらのコード配列及び／又は発現を破壊することに基づき得る。

【0080】

ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）／Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質）ヌクレアーゼ系は、細菌系に基づく遺伝子操作のために使用される操作されたヌクレアーゼ系である。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系及びその成分に関する情報は、例えば、ＵＳ８６９７３５９、ＵＳ８７７１９４５、ＵＳ８７９５９６５、ＵＳ８８６５４０６、ＵＳ８８７１４４５、ＵＳ８８８９３５６、ＵＳ８８８９４１８、ＵＳ８８９５３０８、ＵＳ８９０６６１６、ＵＳ８９３２８１４、ＵＳ８９４５８３９、ＵＳ８９９３２３３及びＵＳ８９９９６４１並びにこれらと関連する出願；並びにＷＯ２０１４／０１８４２３、ＷＯ２０１４／０９３５９５、ＷＯ２０１４／０９３６２２、ＷＯ２０１４／０９３６３５、ＷＯ２０１４／０９３６５５、ＷＯ２０１４／０９３６６１、ＷＯ２０１４／０９３６９４、ＷＯ２０１４／０９３７０１、ＷＯ２０１４／０９３７０９、ＷＯ２０１４／０９３７１２、ＷＯ２０１４／０９３７１８、ＷＯ２０１４／１４５５９９、ＷＯ２０１４／２０４７２３、ＷＯ２０１４／２０４７２４、ＷＯ２０１４／２０４７２５、ＷＯ２０１４／２０４７２６、ＷＯ２０１４／２０４７２７、ＷＯ２０１４／２０４７２８、ＷＯ２０１４／２０４７２９、ＷＯ２０１５／０６５９６４、ＷＯ２０１５／０８９３５１、ＷＯ２０１５／０８９３５４、ＷＯ２０１５／０８９３６４、ＷＯ２０１５／０８９４１９、ＷＯ２０１５／０８９４２７、ＷＯ２０１５／０８９４６２、ＷＯ２０１５／０８９４６５、ＷＯ２０１５／０８９４７３及びＷＯ２０１５／０８９４８６、ＷＯ２０１６２０５７１１、ＷＯ２０１７／１０６６５７、ＷＯ２０１７／１２７８０７並びにこれらと関連する出願に記載されている。

【0081】

特定の実施形態は、遺伝子編集剤として、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を利用する。ＺＦＮは、特異的な位置において、ＤＮＡに結合し、それを切断するように操作された部位特異的ヌクレアーゼのクラスである。ＺＦＮは、ＤＮＡ配列内の特異的な部位において二本鎖切断（ＤＳＢ）を導入するのに使用され、これは、ＺＦＮが、様々な異なる細胞におけるゲノム内の固有の配列を標的とすることを可能とする。

【0082】

ＺＦＮ及び本開示の教示の範囲内の有用なＺＦＮに関するさらなる情報については、例えば、ＵＳ６，５３４，２６１；ＵＳ６，６０７，８８２；ＵＳ６，７４６，８３８；ＵＳ６，７９４，１３６；ＵＳ６，８２４，９７８；６，８６６，９９７；ＵＳ６，９３３，１１３；６，９７９，５３９；ＵＳ７，０１３，２１９；ＵＳ７，０３０，２１５；ＵＳ７，２２０，７１９；ＵＳ７，２４１，５７３；ＵＳ７，２４１，５７４；ＵＳ７，５８５，８４９；ＵＳ７，５９５，３７６；ＵＳ６，９０３，１８５；ＵＳ６，４７９，６２６；ＵＳ２００３／０２３２４１０及びＵＳ２００９／０２０３１４０並びにＧａｊら、Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０１２年、９（８）：８０５～７頁；Ｒａｍｉｒｅｚら、Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、２０１２年、４０（１２）：５５６０～８頁；Ｋｉｍら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ、２０１２年、２２（７）：１３２７～３３頁；Ｕｒｎｏｖら、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２０１０年、１１：６３６～６４６頁；Ｍｉｌｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２５、７７８～７８５頁（２００７年）；Ｂｉｂｉｋｏｖａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３００、７６４頁（２００３年）；Ｂｉｂｉｋｏｖａら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６１、１１６９～１１７５頁（２００２年）；Ｗｏｌｆｅら、Ａｎｎｕａｌ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ ａｎｄ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２９、１８３～２１２頁（２０００年）；Ｋｉｍら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ９３、１１５６～１１６０頁（１９９６年）；及びＭｉｌｌｅｒら、Ｔｈｅ ＥＭＢＯ ｊｏｕｒｎａｌ ４、１６０９～１６１４頁（１９８５年）を参照のこと。

【0083】

特定の実施形態は、遺伝子編集剤として、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を使用することができる。ＴＡＬＥＮとは、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合タンパク質及びＤＮＡ切断ドメインを含む融合タンパク質を指す。ＴＡＬＥＮは、ＤＮＡ内に、細胞内の修復機構を誘導する２つのＤＳＢを誘導することにより、遺伝子及びゲノムを編集するのに使用される。一般に、２つのＴＡＬＥＮは、ＤＮＡ切断ドメインが、二量体化し、ＤＳＢを誘導するように、標的ＤＮＡ部位の各側に結合し、これらを挟まなければならない。ＴＡＬＥＮに関するさらなる情報については、ＵＳ８，４４０，４３１；ＵＳ８，４４０，４３２；ＵＳ８，４５０，４７１；ＵＳ８，５８６，３６３；及びＵＳ８，６９７，８５３；並びにＪｏｕｎｇ及びＳａｎｄｅｒ、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、２０１３年、１４（ｌ）：４９～５５頁；Ｂｅｕｒｄｅｌｅｙら、Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ、２０１３年、４：１７６２頁；Ｓｃｈａｒｅｎｂｅｒｇら、Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ、２０１３年、１３（４）：２９１～３０３頁；Ｇａｊら、Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０１２年、９（８）：８０５～７頁；Ｍｉｌｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９、１４３～１４８頁（２０１１年）；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １８６、７５７～７６１頁（２０１０年）；Ｂｏｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６、１５０９～１５１２頁（２００９年）；並びにＭｏｓｃｏｕ及びＢｏｇｄａｎｏｖｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６、１５０１頁（２００９年）を参照のこと。

【0084】

特定の実施形態は、ＭｅｇａＴＡＬを、遺伝子編集剤として利用することができる。ＭｅｇａＴＡＬは、ＴＡＬＥが、メガヌクレアーゼのＤＮＡ切断ドメインと融合されたｓｃ希少切断型ヌクレアーゼ構造を有する。ホーミングエンドヌクレアーゼとしても公知のメガヌクレアーゼは、同じドメイン内にＤＮＡ認識機能及びヌクレアーゼ機能の両方を有する、単一のペプチド鎖である。ＴＡＬＥＮとは対照的に、ｍｅｇａＴＡＬは、機能的な活性のために、単一のペプチド鎖の送達だけを要求する。

【0085】

標的化細胞種の選択的インビボ遺伝子修飾をもたらすナノ粒子が記載されており、本開示の教示の範囲内で使用され得る。特定の実施形態では、ナノ粒子は、ＷＯ２０１４１５３１１４、ＷＯ２０１７１８１１１０及びＷＯ２０１８２２６７２に記載されているものであり得る。

【0086】

（ＩＩＩ－Ｂ）ＣＡＲ副成分。以前に記載されているように、ＣＡＲ分子は、遺伝子修飾細胞が、がん細胞などの望ましくない細胞を認識し、殺滅することを可能にするいくつかの異なる副成分を含む。副成分は、少なくとも細胞外成分及び細胞内成分を含む。細胞外成分は、望ましくない細胞の表面上に選択的に存在する抗原マーカーに特異的に結合する結合ドメインを含む。結合ドメインがそのような抗原マーカーに結合すると、細胞内成分は、結合した細胞を破壊するために細胞を活性化する。ＣＡＲはさらに、細胞外成分を細胞内成分に連結する膜貫通ドメイン、及びＣＡＲの機能を増加させることができる他の副成分を含む。例えば、スペーサー領域及び／又は１つ以上のリンカー配列を含めることにより、ＣＡＲはさらなる立体構造の柔軟性を有することが可能になり、多くの場合、ターゲティングされる細胞マーカーに結合する結合ドメインの能力を増加させることができる。

【0087】

（ＩＩＩ－Ｂ－ｉ）結合ドメイン及びターゲティングされる細胞抗原。結合ドメインには、細胞抗原に結合して複合体を形成する任意の物質が含まれる。結合ドメインの選択は、標的細胞の表面を定義する細胞抗原の型及び数に依存し得る。結合ドメインの例には、細胞抗原リガンド、受容体リガンド、抗体、ペプチド、ペプチドアプタマー、受容体（例えば、Ｔ細胞受容体）又はそれらの組合せ及び操作された断片若しくはフォーマットが含まれる。

【0088】

抗体は、結合ドメインの一例であり、抗体全体又は抗体の結合断片、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２並びに細胞抗原に特異的に結合する一本鎖（ｓｃ）形態及びその断片を含む。抗体又は抗原結合断片は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、合成抗体、非ヒト抗体、組換え抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、ミニボディ及び線状抗体の全て又は一部を含むことができる。それらの機能的断片には、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及びラクダ由来のナノボディの可変ドメイン（ＶＨＨ）などの単一ドメイン抗体が含まれる。

【0089】

一部の場合、ｓｃＦｖは、当該技術分野において公知の方法に従って調製され得る（例えば、Ｂｉｒｄら、（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３～４２６頁及びＨｕｓｔｏｎら、（１９８８年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９～５８８３頁を参照のこと。）。ＳｃＦｖ分子は、柔軟性ポリペプチドリンカーを使用して抗体のＶＨ領域及びＶＬ領域を連結して一緒にすることによって生成され得る。短いポリペプチドリンカー（例えば、５～１０アミノ酸）が利用される場合、鎖内フォールディングが阻止される。２つの可変領域が一緒になって機能性のエピトープ結合部位を形成するには鎖間フォールディングも必要とされる。リンカーの配向及びサイズの例については、例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、１９９３年 Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６４４４～６４４８頁、ＵＳ２００５／０１００５４３、ＵＳ２００５／０１７５６０６、ＵＳ２００７／００１４７９４並びにＷＯ２００６／０２０２５８及びＷＯ２００７／０２４７１５を参照のこと。

【0090】

ｓｃＦｖは、そのＶＬ領域とＶＨ領域との間に、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０又はそれ以上のアミノ酸残基のリンカーを含み得る。特定の実施形態では、リンカー配列は、任意の天然に存在するアミノ酸を含み得る。一般に、ｓｃＦｖのＶＨ及びＶＬを接続するために使用されるリンカー配列は５～３５アミノ酸長である。特定の実施形態では、ＶＨ－ＶＬリンカーは、５～３５、１０～３０アミノ酸、又は１５～２５アミノ酸を含む。リンカーの長さを変動させることで活性が保持又は増大され、活性試験において優れた効力が生じ得る。

【0091】

一部の実施形態では、リンカー配列は、アミノ酸グリシン及びセリンを含む。特定の実施形態では、リンカー配列は、（Ｇｌｙ_ｘＳｅｒ_ｙ）_ｎの１～１０個の反復などのグリシン及びセリンの反復のセットを含み、ここで、ｘ及びｙは独立して０～１０の整数であり、ただし、ｘ及びｙの両方が０ではなく、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０の整数である）、連結したＶＨ－ＶＬ領域は、機能性の免疫グロブリン様結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｃＴＣＲ）を形成する。特定の例には、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_ｎ（配列番号１）、（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_ｎ（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_ｎ（配列番号２）、（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_ｎ（Ｇｌｙ_２Ｓｅｒ）_ｎ（配列番号３）、（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_ｎ（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_１（配列番号４）、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_１（配列番号５）、（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_１（配列番号６）又は（Ｇｌｙ_２Ｓｅｒ）_１が含まれる。特定の実施形態では、リンカーは、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_４（配列番号７）又は（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３（配列番号８）である。上記にｓｃＴＣＲへの言及を通じて示されているように、そのようなリンカーは、Ｔ細胞受容体Ｖ_α／β鎖及びＣ_α／β鎖を連結するためにも使用され得る（例えば、Ｖ_α－Ｃ_α、Ｖ_β－Ｃ_β、Ｖ_α－Ｖ_β）。

【0092】

追加の例には、ｓｃＦｖベースのグラバボディ及び可溶性ＶＨドメイン抗体が含まれる。これらの抗体は、重鎖可変領域のみを使用して結合領域を形成する。例えば、Ｊｅｓｐｅｒｓら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：１１６１頁、２００４年；Ｃｏｒｔｅｚ－Ｒｅｔａｍｏｚｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６４：２８５３頁、２００４年；Ｂａｒａｌら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．１２：５８０頁、２００６年；及びＢａｒｔｈｅｌｅｍｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３：３６３９頁、２００８年を参照のこと。

【0093】

一部の場合、結合ドメインを、それが最終的に使用されることになる種と同じ種に由来するものにすることが有益である。例えば、ヒトでの使用については、抗原結合ドメインがヒト抗体、ヒト化抗体又はその断片若しくは操作された形態を含むことが有益であり得る。ヒト起源の抗体又はヒト化抗体は、ヒトでの免疫原性が低下しているか、又は存在せず、非ヒト抗体と比較して非免疫原性エピトープの数が少ない。抗体及びそれらの操作された断片は、一般に、ヒト対象での抗原性が低レベルとなるか、又は存在しないように選択される。

【0094】

特定の実施形態では、結合ドメインは、ヒト化抗体又はその操作された断片を含む。一部の態様では、非ヒト抗体はヒト化され、抗体の１つ以上のアミノ酸残基が、ヒトにおいて天然に産生される抗体又はその断片との類似性を増加するように修飾される。これらの非ヒトアミノ酸残基は、「移入」残基と称されることが多く、この「移入」残基は、典型的には、「移入」可変ドメインから取得される。本明細書で提供されるように、ヒト化抗体又は抗体断片は、非ヒト免疫グロブリン分子由来の１つ以上のＣＤＲ及びフレームワーク領域を含み、フレームワークを含むアミノ酸残基は、完全に又はほとんどがヒト生殖系列に由来する。一態様では、抗原結合ドメインはヒト化される。ヒト化抗体は、当該技術分野において公知の様々な技術を使用して産生され得、それらの技術には、ＣＤＲ移植（例えば、欧州特許第ＥＰ２３９，４００号、ＷＯ９１／０９９６７並びにＵＳ５，２２５，５３９、ＵＳ５，５３０，１０１及びＵＳ５，５８５，０８９を参照のこと。）、ベニアリング又はリサーフェイシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（例えば、ＥＰ５９２，１０６及びＥＰ５１９，５９６；Ｐａｄｌａｎ、１９９１年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２８（４／５）：４８９～４９８頁；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、１９９４年、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、７（６）：８０５～８１４頁；並びにＲｏｇｕｓｋａら、１９９４年、ＰＮＡＳ、９１：９６９～９７３頁を参照のこと。）、鎖シャフリング（例えば、ＵＳ．５，５６５，３３２を参照のこと。）並びに例えば、ＵＳ２００５／００４２６６４、ＵＳ２００５／００４８６１７、ＵＳ６，４０７，２１３、ＵＳ５，７６６，８８６、ＷＯ９３１７１０５、Ｔａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６９：１１１９～２５頁（２００２年）、Ｃａｌｄａｓら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，１３（５）：３５３～６０頁（２０００年）、Ｍｏｒｅａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０（３）：２６７～７９頁（２０００年）、Ｂａｃａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２（１６）：１０６７８～８４頁（１９９７年）、Ｒｏｇｕｓｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、９（１０）：８９５～９０４頁（１９９６年）、Ｃｏｕｔｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５５（２３ Ｓｕｐｐ）：５９７３ｓ～５９７７ｓ頁（１９９５年）、Ｃｏｕｔｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５５（８）：１７１７～２２頁（１９９５年）、Ｓａｎｄｈｕ Ｊ Ｓ、Ｇｅｎｅ、１５０（２）：４０９～１０頁（１９９４年）及びＰｅｄｅｒｓｅｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２３５（３）：９５９～７３頁（１９９４年）に開示されている技術が含まれる。多くの場合、フレームワーク領域中のフレームワーク残基が、細胞抗原結合を改変、例えば、改善するためにＣＤＲドナー抗体由来の対応残基により置換される。これらのフレームワーク置換は、当該技術分野における周知の方法によって、例えば、細胞抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するためにＣＤＲ及びフレームワーク残基の相互作用をモデル化すること、並びに特定の位置における異常なフレームワーク残基を同定するための配列比較によって同定される。（例えば、ＵＳ５，５８５，０８９；及びＲｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８年、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３頁を参照のこと。）。

【0095】

特定の細胞抗原に特異的に結合する抗体は、モノクローナル抗体を得る方法、ファージディスプレイ法、ヒト抗体若しくはヒト化抗体を生成させるための方法又は抗体を産生するように操作されたトランスジェニック動物若しくは植物を使用する方法を使用して調製され得、こうした方法は当業者に公知である（例えば、ＵＳ６，２９１，１６１及びＵＳ６，２９１，１５８を参照のこと。）。部分合成抗体又は完全合成抗体のファージディスプレイライブラリーが利用可能であり、細胞抗原に結合し得る抗体又はその断片についてスクリーニングされ得る。例えば、結合ドメインは、目的の細胞抗原に特異的に結合するＦａｂ断片についてＦａｂファージライブラリーをスクリーニングすることによって同定され得る（Ｈｏｅｔら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：３４４頁、２００５年を参照のこと。）。ヒト抗体のファージディスプレイライブラリーも利用可能である。さらに、簡便な系（例えば、マウス、ＨｕＭＡｂマウス（登録商標）（ＧｅｎＰｈａｒｍ Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｎｃ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）、ＴＣマウス（登録商標）（Ｋｉｒｉｎ Ｐｈａｒｍａ Ｃｏ．Ｌｔｄ．、Ｔｏｋｙｏ、ＪＰ）、ＫＭ－マウス（登録商標）（Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）、ラマ、ニワトリ、ラット、ハムスター、ウサギなど）において目的の細胞抗原を免疫原として使用する従来のハイブリドーマ開発のためのストラテジーが、結合ドメインを開発するために使用され得る。特定の実施形態では、抗体は、特定の望ましくない細胞種が選択的に発現する細胞抗原に特異的に結合し、非特異的な成分又は非関連標的とは交差反応しない。同定されると、抗体のアミノ酸配列及び抗体をコードする遺伝子配列が単離及び／又は決定され得る。

【0096】

結合ドメインの代替の供給源には、無作為ペプチドライブラリーをコードする配列又は代替の非抗体骨格のループ領域中の操作された多様なアミノ酸をコードする配列が含まれ、代替の非抗体骨格は、例えば、ｓｃＴＣＲ（例えば、Ｌａｋｅら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：７４５頁、１９９９年；Ｍａｙｎａｒｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３０６：５１頁、２００５年；ＵＳ８，３６１，７９４を参照のこと。）、フィブリノゲンドメイン（例えば、Ｗｅｉｓｅｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１３８８頁、１９８５年を参照のこと。）、クニッツドメイン（例えば、ＵＳ６，４２３，４９８を参照のこと。）、設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎｓ；Ｂｉｎｚら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３２：４８９頁、２００３年及びＢｉｎｚら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：５７５頁、２００４年）、フィブロネクチン結合ドメイン（アドネクチン又はモノボディ；Ｒｉｃｈａｒｄｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２６：１４７５頁、２００３年；Ｐａｒｋｅｒら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌｅｃ．１８：４３５頁、２００５年及びＨａｃｋｅｌら（２００８年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３８１：１２３８～１２５２頁）、システインノットミニタンパク質（Ｖｉｔａら、１９９５年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９２：６４０４～６４０８頁；Ｍａｒｔｉｎら、２００２年、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：７１頁、２００２年及びＨｕａｎｇら（２００５年）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １３：７５５頁、２００５年）、テトラトリコペプチドリピートドメイン（Ｍａｉｎら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １１：４９７頁、２００３年及びＣｏｒｔａｊａｒｅｎａら、ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．３：１６１頁、２００８年）、ロイシンリッチリピートドメイン（Ｓｔｕｍｐｐら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３２：４７１頁、２００３年）、リポカリンドメイン（例えば、ＷＯ２００６／０９５１６４、Ｂｅｓｔｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９６：１８９８頁、１９９９年及びＳｃｈｏｎｆｅｌｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）１０６：８１９８頁、２００９年を参照のこと。）、Ｖ様ドメイン（例えば、ＵＳ２００７／００６５４３１を参照のこと。）、Ｃ型レクチンドメイン（Ｚｅｌｅｎｓｋｙ及びＧｒｅａｄｙ、ＦＥＢＳ Ｊ．２７２：６１７９頁、２００５年；Ｂｅａｖｉｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８９：７５３頁、１９９２年並びにＳａｔｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）１００：７７７９頁、２００３年）、ｍＡｂ２又は抗原結合ドメインを有するＦｃ領域（Ｆｃａｂ（商標）（Ｆ－Ｓｔａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＵＫ；例えば、ＷＯ２００７／０９８９３４及びＷＯ２００６／０７２６２０を参照のこと。）、アルマジロリピートタンパク質（例えば、Ｍａｄｈｕｒａｎｔａｋａｍら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．２１：１０１５頁、２０１２年；ＷＯ２００９／０４０３３８を参照のこと。）、アフィリン（ａｆｆｉｌｉｎ）（Ｅｂｅｒｓｂａｃｈら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３７２：１７２頁、２００７年）、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）、アビマー（ａｖｉｍｅｒ）、ノッチン、フィノマー（ｆｙｎｏｍｅｒ）、アトリマー（ａｔｒｉｍｅｒ）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質－４（Ｗｅｉｄｌｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎ．Ｐｒｏｔｅｏ．１０：１５５頁、２０１３年）又は同様のもの（Ｎｏｒｄら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８：６０１頁、１９９５年；Ｎｏｒｄら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：７７２頁、１９９７年；Ｎｏｒｄら、Ｅｕｒｏ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６８：４２６９頁、２００１年；Ｂｉｎｚら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１２５７頁、２００５年；Ｂｏｅｒｓｍａ及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：８４９頁、２０１１年）である。

【0097】

ペプチドアプタマーは、両末端においてタンパク質骨格に結合したペプチドループ（細胞抗原に特異的である）を含む。この二重の構造的制約によってペプチドアプタマーの結合親和性は抗体と同等のレベルに上昇する。可変ループの長さは、典型的には、８～２０アミノ酸であり、骨格は安定、可溶性、小型、かつ無毒な任意のタンパク質であり得る。ペプチドアプタマーの選択は、酵母ツーハイブリッド系（例えば、Ｇａｌ４酵母ツーハイブリッド系）又はＬｅｘＡ相互作用捕捉系などの異なる系を使用して行われ得る。

【0098】

特定の実施形態では、結合ドメインは、Ｖα／β鎖及びＣα／β鎖（例えば、Ｖα－Ｃα、Ｖβ－Ｃβ、Ｖα－Ｖβ）を含むｓｃＴ細胞受容体（ｓｃＴＣＲ）であるか、又は目的の細胞抗原（例えば、ペプチド－ＭＨＣ複合体）に特異的なＶα－Ｃα対、Ｖβ－Ｃβ対、Ｖα－Ｖβ対を含むｓｃＴＣＲである。

【0099】

特定の実施形態では、操作されたＣＡＲは、既知又は同定されたＴＣＲ Ｖα、Ｖβ、Ｃα又はＣβのアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％又は１００％同一である配列を含み、各ＣＤＲは、ターゲティングされる細胞抗原に特異的に結合するＴＣＲ又はその断片若しくは誘導体からの変化を含まない、又は１つ、２つ若しくは３つ以下の変化を含む。

【0100】

特定の実施形態では、操作されたＣＡＲは、既知又は同定されたＴＣＲ（例えば、高親和性ＴＣＲ）のＶα、Ｖβ、Ｃα又はＣβに由来するか、又は基づくＶα領域、Ｖβ領域、Ｃα領域又はＣβ領域を含み、既知又は同定されたＴＣＲのＶα、Ｖβ、Ｃα又はＣβと比較して、１つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個）の挿入、１つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個）の欠失、１つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個）のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換又は非保存的アミノ酸置換）、又は上記の変化の組合せを含む。挿入、欠失又は置換は、これらの領域のアミノ末端若しくはカルボキシ末端又は両末端を含む、Ｖα領域、Ｖβ領域、Ｃα領域又はＣβ領域中の任意の場所に存在し得るが、ただし、各ＣＤＲは、変化を含まない、又は１つ、２つ若しくは３つ以下の変化を含み、修飾されたＶα領域、Ｖβ領域、Ｃα領域又はＣβ領域を含む標的結合ドメインが、野生型と同様の親和性及び作用を伴ってその標的に依然として特異的に結合し得ることが条件である。

【0101】

結合ドメインは、がん細胞マーカーなどの望ましくない細胞種と関連する多数の細胞抗原に結合するように選択され得る。例示的な細胞抗原には、Ａ３３；ＢＡＧＥ；Ｂｃｌ－２；βカテニン；ＢＣＭＡ；Ｂ７Ｈ４；ＢＴＬＡ；ＣＡ１２５；ＣＡ１９－９；ＣＤ３、ＣＤ５；ＣＤ２０；ＣＤ２１；ＣＤ２２；ＣＤ２５；ＣＤ２８；ＣＤ３０；ＣＤ３３；ＣＤ３７；ＣＤ３８；ＣＤ４０；ＣＤ５２；ＣＤ４４ｖ６；ＣＤ４５；ＣＤ５６；ＣＤ７９ｂ；ＣＤ８０；ＣＤ８１；ＣＤ８６；ＣＤ１２３；ＣＤ１３４；ＣＤ１３７；ＣＤ１５１；ＣＤ１７１；ＣＤ２７６；ＣＥＡ；ＣＥＡＣＡＭ６；ｃ－Ｍｅｔ；ＣＳ－１；ＣＴＬＡ－４；サイクリンＢ１；ＤＡＧＥ；ＥＢＮＡ；ＥＧＦＲ；ＥＧＦＲｖＩＩＩ、エフリンＢ２；ＥｒｂＢ２；ＥｒｂＢ３；ＥｒｂＢ４；ＥｐｈＡ２；エストロゲン受容体；ＦＡＰ；フェリチン；α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）；ＦＬＴ１；ＦＬＴ４；葉酸結合タンパク質；ＦＯＬＲ；Ｆｒｉｚｚｌｅｄ；ＧＡＧＥ；Ｇ２５０；ＧＤ－２；ＧＨＲＨＲ；ＧＨＲ；ＧＩＴＲ；ＧＭ２；ＧＰＲＣ５Ｄ；ｇｐ７５；ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ １７）；ｇｐ１３０；ＨＬＡ；ＨＥＲ－２／ｎｅｕ；ＨＰＶ Ｅ６；ＨＰＶ Ｅ７；ｈＴＥＲＴ；ＨＶＥＭ；ＩＧＦ１Ｒ；ＩＬ６Ｒ；ＫＤＲ；Ｋｉ－６７；ルイスＡ；ルイスＹ；ＬＩＦＲβ；ＬＲＰ；ＬＲＰ５；ＬＴβＲ；ＭＡＧＥ；ＭＡＲＴ；メソテリン；ＭＵＣ；ＭＵＣ１；ＭＵＭ－１－Ｂ；ｍｙｃ；ＮＹＥＳＯ－１；Ｏ－アセチルＧＤ－２；Ｏ－アセチルＧＤ３；ＯＳＭＲβ；ｐ５３；ＰＤ１；ＰＤ－Ｌ１；ＰＤ－Ｌ２；ＰＲＡＭＥ；プロゲステロン受容体；ＰＳＡ；ＰＳＭＡ；ＰＴＣＨ１；ＲＡＮＫ；ｒａｓ；Ｒｏｂｏ１；ＲＯＲｌ；サバイビン；ＴＣＲα；ＴＣＲβ；テネイシン；ＴＧＦＢＲ１；ＴＧＦＢＲ２；ＴＬＲ７；ＴＬＲ９；ＴＮＦＲ１；ＴＮＦＲ２；ＴＮＦＲＳＦ４；ＴＷＥＡＫ－Ｒ；ＴＳＴＡチロシナーゼ；ＶＥＧＦ；及びＷＴ１が含まれる。

【0102】

前立腺がんと関連する特定の細胞抗原には、ＰＳＭＡ、ＷＴ１、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）及びＳＶ４０ Ｔが含まれる。乳がんと関連する特定の抗原には、ＨＥＲ２及びＥＲＢＢ２が含まれる。卵巣がんと関連する特定の細胞抗原には、Ｌ１－ＣＡＭ、ＭＵＣ１６の細胞外ドメイン（ＭＵＣ－ＣＤ）、葉酸結合タンパク質（葉酸受容体）、ルイスＹ、メソテリン及びＷＴ－１が含まれる。膵がんと関連する特定の細胞抗原には、メソテリン、ＣＥＡ及びＣＤ２４が含まれる。多発性骨髄腫と関連する特定の細胞抗原には、ＢＣＭＡ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＤ３８及びＣＳ－１が含まれる。白血病及び／又はリンパ腫と関連する特定の抗原には、ＣＬＬ－１、ＣＤ１２３、ＣＤ３３及びＰＤ－Ｌ１が含まれる。

【0103】

特定の実施形態では、ＣＡＲの結合ドメインはＣＤ３３に結合し得る。特定の実施形態では、ＣＡＲの結合ドメインは、細胞抗原ＣＤ３３に結合する。特定の実施形態では、ＣＤ３３に結合する結合ドメインは、ゲムツズマブ、アクリズマブ又はＨｕＭ１９５のうちの１つに由来する。特定の実施形態では、ＣＤ３３結合ドメインは、ＴＡＳＳＳＶＮＹＩＨ（配列番号１４）を含むＣＤＲＬ１配列、ＴＳＫＶＡＳ（配列番号１５）を含むＣＤＲＬ２配列及びＱＱＷＲＳＹＰＬＴ（配列番号１６）を含むＣＤＲＬ３配列を含む可変軽鎖、並びにＤＹＶＶＨ（配列番号１７）を含むＣＤＲＨ１配列、ＹＩＮＰＹＮＤＧＴＫＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号１８）を含むＣＤＲＨ２配列及びＤＹＲＹＥＶＹＧＭＤＹ（配列番号１９）を含むＣＤＲＨ３配列を含む可変重鎖を含むヒト結合ドメイン又はヒト化結合ドメインである。

【0104】

特定の実施形態では、ＣＤ３３結合ドメインは、ＲＡＳＥＶＤＮＹＧＩＳＦＭＮ（配列番号２０）を含むＣＤＲＬ１配列、ＡＡＳＮＱＧＳ（配列番号２１）を含むＣＤＲＬ２配列及びＱＱＳＫＥＶＰＷ（配列番号２２）を含むＣＤＲＬ３配列を含む可変軽鎖、並びにＤＹＮＭＨ（配列番号２３）を含むＣＤＲＨ１配列、ＹＩＹＰＹＮＧＧＴＧＹＮＱＫＦＫＳ（配列番号２４）を含むＣＤＲＨ２配列及びＧＲＰＡＭＤＹ（配列番号２５）を含むＣＤＲＨ３配列を含む可変重鎖を含むヒトｓｃＦｖ又はヒト化ｓｃＦｖである。ＣＤ３３に結合する結合ドメインに関する詳細な情報については、米国特許第８７５９４９４号を参照のこと。

【0105】

特定の実施形態では、ヒトＣＤ３３に結合する配列は、配列：

【0106】

【化1】

を含む可変軽鎖及び配列：

【0107】

【化2】

を含む可変重鎖を含む。

【0108】

特定の実施形態では、ヒトＣＤ３３に結合する配列は、配列：

【0109】

【化3】

を含む可変軽鎖及び配列：

【0110】

【化4】

を含む可変重鎖を含む。

【0111】

特定の実施形態では、ＣＡＲの結合ドメインは、細胞抗原ＣＤ３３デルタＥ２（ＣＤ３３ΔＥ２）に結合する。特定の実施形態では、ＣＤ３３ΔＥ２に結合する結合ドメインは１Ｈ７に由来する。特定の実施形態では、１Ｈ７結合ドメインは、ＲＡＳＱＤＩＮＹＹＬＮ（配列番号４５）を含むＣＤＲＬ１配列、ＹＹＳＳＲＬＨＳ（配列番号４６）を含むＣＤＲＬ２配列、ＱＱＤＤＡＬＰＹＴ（配列番号４７）を含むＣＤＲＬ３配列、ＫＡＳＧＹＡＦＳＮＹＷＭＮ（配列番号４８）を含むＣＤＲＨ１配列、ＱＩＮＰＧＤＧＤＴＮ（配列番号４９）を含むＣＤＲＨ２配列及びＡＲＥＤＲＤＹＦＤＹ（配列番号５０）を含むＣＤＲＨ３配列を含む可変軽鎖を含む。このＣＤＲセットはＮｏｒｔｈに従う。

【0112】

特定の実施形態では、１Ｈ７結合ドメインは、ＱＤＩＮＹＹ（配列番号１６３）を含むＣＤＲＬ１配列、ＹＳＳを含むＣＤＲＬ２配列、ＱＱＤＤＡＬＰＹＴ（配列番号４７）を含むＣＤＲＬ３配列、ＧＹＡＦＳＮＹＷ（配列番号１６４）を含むＣＤＲＨ１配列、ＩＮＰＧＤＧＤＴ（配列番号１６５）を含むＣＤＲＨ２配列及びＡＲＥＤＲＤＹＦＤＹ（配列番号５０）を含むＣＤＲＨ３配列を含む可変軽鎖を含む。このＣＤＲセットはＩＭＧＴに従う。

【0113】

特定の実施形態では、１Ｈ７結合ドメインは、ＲＡＳＱＤＩＮＹＹＬＮ（配列番号４５）を含むＣＤＲＬ１配列、ＹＳＳＲＬＨＳ（配列番号１６６）を含むＣＤＲＬ２配列、ＱＱＤＤＡＬＰＹＴ（配列番号４７）を含むＣＤＲＬ３配列、ＮＹＷＭＮ（配列番号１６７）を含むＣＤＲＨ１配列、ＱＩＮＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧ（配列番号１６８）を含むＣＤＲＨ２配列、ＥＤＲＤＹＦＤＹ（配列番号１６９）を含むＣＤＲＨ３配列を含む可変軽鎖を含む。このＣＤＲセットはＫａｂａｔに従う。

【0114】

特定の実施形態では、１Ｈ７結合ドメインは、ＲＡＳＱＤＩＮＹＹＬＮ（配列番号４５）を含むＣＤＲＬ１配列、ＹＳＳＲＬＨＳ（配列番号１６６）を含むＣＤＲＬ２配列、ＱＱＤＤＡＬＰＹＴ（配列番号４７）を含むＣＤＲＬ３配列、ＧＹＡＦＳＮＹ（配列番号１７０）を含むＣＤＲＨ１配列、ＮＰＧＤＧＤ（配列番号１７１）を含むＣＤＲＨ２配列、ＥＤＲＤＹＦＤＹ（配列番号１６９）を含むＣＤＲＨ３配列を含む可変軽鎖を含む。このＣＤＲセットはＣｈｏｔｈｉａに従う。

【0115】

特定の実施形態では、１Ｈ７結合ドメインは、配列：

【0116】

【化5】

を含む可変軽鎖及び配列：

【0117】

【化6】

を含む可変重鎖を含む。

【0118】

特定の実施形態では、ＣＡＲの結合ドメインは、細胞抗原Ｈｅｒ２に結合する。特定の実施形態では、ＨＥＲ２に結合する結合ドメインは、トラスツズマブ（ハーセプチン）に由来する。特定の実施形態では、結合ドメインは、ＫＡＳＱＤＶＳＩＧＶＡ（配列番号５３）を含むＣＤＲＬ１配列、ＡＳＹＲＹＴ（配列番号５４）を含むＣＤＲＬ２配列及びＱＱＹＹＩＹＰＹＴ（配列番号５５）を含むＣＤＲＬ３配列を含む可変軽鎖、並びにＧＦＴＦＴＤＹＴＭＤ（配列番号５６）を含むＣＤＲＨ１配列、ＤＶＮＰＮＳＧＧＳＩＹＮＱＲＦＫ（配列番号５７）を含むＣＤＲＨ２配列及びＬＧＰＳＦＹＦＤＹ（配列番号５８）を含むＣＤＲＨ３配列を含む可変重鎖を含む。

【0119】

特定の実施形態では、ＣＡＲの結合ドメインは、細胞抗原ＰＤ－Ｌ１に結合する。特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に結合する結合ドメインは、ペムブロリズマブ又はＦＡＺ０５３（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）のうちの少なくとも１つに由来する。特定の実施形態では、結合ドメインは、ＲＡＳＫＧＶＳＴＳＧＹＳＹＬＨ（配列番号５９）を含むＣＤＲＬ１配列、ＬＡＳＹＬＥＳ（配列番号６０）を含むＣＤＲＬ２配列及びＱＨＳＲＤＬＰＬＴ（配列番号６１）を含むＣＤＲＬ３配列を含む可変軽鎖、並びにＮＹＹＭＹ（配列番号６２）を含むＣＤＲＨ１配列、ＧＩＮＰＳＮＧＧＴＮＦＮＥＫＦＫＮ（配列番号６３）を含むＣＤＲＨ２配列及びＲＤＹＲＦＤＭＧＦＤＹ（配列番号６４）を含むＣＤＲＨ３配列を含む可変重鎖を含む。

【0120】

ＰＤ－Ｌ１についての例示的な結合ドメインは、アベルマブ又はアテゾリズマブを含み得るか、又はそれらに由来し得る。特定の実施形態では、アベルマブの可変軽鎖は、

【0121】

【化7】

を含む。

【0122】

特定の実施形態では、アベルマブの可変重鎖は、

【0123】

【化8】

を含む。

【0124】

特定の実施形態では、アベルマブのＣＤＲ領域は、ＣＤＲＬ１：ＴＧＴＳＳＤＶＧＧＹＮＹＶＳ（配列番号６７）；ＣＤＲＬ２：ＤＶＳＮＲＰＳ（配列番号６８）；ＣＤＲＬ３：ＳＳＹＴＳＳＳＴＲＶ（配列番号６９）；ＣＤＲＨ１：ＳＧＦＴＦＳＳＹＩＭＭ（配列番号７０）；ＣＤＲＨ２：ＳＩＹＰＳＧＧＩＴＦＹＡＤＴＶＫＧ（配列番号７１）；及びＣＤＲＨ３：ＩＫＬＧＴＶＴＴＶＤＹ（配列番号７２）を含む。

【0125】

特定の実施形態では、アテゾリズマブの可変軽鎖は、

【0126】

【化9】

を含む。

【0127】

特定の実施形態では、アテゾリズマブの可変重鎖は、

【0128】

【化10】

を含む。

【0129】

特定の実施形態では、アテゾリズマブのＣＤＲ領域は、ＣＤＲＬ１：ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号７５）；ＣＤＲＬ２：ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号７６）；ＣＤＲＬ３：ＱＱＹＬＹＨＰＡＴ（配列番号７７）；ＣＤＲＨ１：ＳＧＦＴＦＳＤＳＷＩＨ（配列番号７８）；ＣＤＲＨ２：ＷＩＳＰＹＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７９）；及びＣＤＲＨ３：ＲＨＷＰＧＧＦＤＹ（配列番号８０）を含む。

【0130】

特定の実施形態では、ＣＡＲの結合ドメインは、細胞抗原ＰＳＭＡに結合する。特定の実施形態では、結合ドメインは、ＫＡＳＱＤＶＧＴＡＶＤ（配列番号８１）を含むＣＤＲＬ１配列、ＷＡＳＴＲＨＴ（配列番号８２）を含むＣＤＲＬ２配列、ＱＱＹＮＳＹＰＬＴ（配列番号８３）を含むＣＤＲＬ３配列を含む可変軽鎖を含む。特定の実施形態では、結合ドメインは、ＧＹＴＦＴＥＹＴＩＨ（配列番号８４）を含むＣＤＲＨ１配列、ＮＩＮＰＮＮＧＧＴＴＹＮＱＫＦＥＤ（配列番号８５）を含むＣＤＲＨ２配列及びＧＷＮＦＤＹ（配列番号８６）を含むＣＤＲＨ３配列を含む可変重鎖を含む。

【0131】

メソテリンについての例示的な結合ドメインは、アマツキシマブを含み得るか、又はそれに由来し得る。

【0132】

特定の実施形態では、アマツキシマブの可変軽鎖は、

【0133】

【化11】

を含む。

【0134】

特定の実施形態では、アマツキシマブの可変重鎖は、

【0135】

【化12】

を含む。

【0136】

特定の実施形態では、アマツキシマブのＣＤＲ領域は、ＣＤＲＬ１：ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＨ（配列番号１００）；ＣＤＲＬ２：ＤＴＳＫＬＡＳ（配列番号１０１）；及びＣＤＲＬ３：ＱＱＷＳＫＨＰＬＴ（配列番号１０２）；ＣＤＲＨ１：ＧＹＳＦＴＧＹＴＭＮ（配列番号１０３）；ＣＤＲＨ２：ＬＩＴＰＹＮＧＡＳＳＹＮＱ（配列番号１０４）；及びＣＤＲＨ３：ＧＧＹＤＧＲＧＦＤＹ（配列番号１０５）を含む。

【0137】

以前に示したように、結合ドメインは、例えば、Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖベースのグラバボディ及び可溶性ＶＨドメイン抗体を含む、様々な操作されたフォーマットを採用することができる。

【0138】

特定の実施形態では、ＣＡＲの結合ドメインは、軽鎖可変領域（ＶＬ）若しくは重鎖可変領域（ＶＨ）、又はその両方のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％又は１００％同一である配列を含む又はその配列であり、各ＣＤＲは、目的の細胞抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体又はその断片若しくは誘導体からの変化を含まない、又は１つ、２つ若しくは３つ以下の変化を含む。

【0139】

特定の実施形態では、本開示の結合ドメインＶＨ領域は、既知のモノクローナル抗体のＶＨに由来し得るか、又は基づき得、既知のモノクローナル抗体のＶＨと比較して、１つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個）の挿入、１つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個）の欠失、１つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個）のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換若しくは非保存的アミノ酸置換）、又は上記の変化の組合せを含み得る。挿入、欠失又は置換は、この領域のアミノ末端若しくはカルボキシ末端又は両末端を含む、ＶＨ領域中の任意の場所に存在し得るが、ただし、各ＣＤＲは、変化を含まない、又は１つ、２つ若しくは３つ以下の変化を含み、修飾されたＶＨ領域を含む結合ドメインが、野生型結合ドメインと同様の親和性を伴ってその標的に依然として特異的に結合し得ることが条件である。

【0140】

特定の実施形態では、本開示の結合ドメインにおけるＶＬ領域は、既知のモノクローナル抗体のＶＬに由来し得るか、又は基づき得、既知のモノクローナル抗体のＶＬと比較して、１つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個）の挿入、１つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個）の欠失、１つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個）のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）、又は上記の変化の組合せを含む。挿入、欠失又は置換は、この領域のアミノ末端若しくはカルボキシ末端又は両末端を含む、ＶＬ領域中の任意の場所に存在し得るが、ただし、各ＣＤＲは、変化を含まない、又は１つ、２つ若しくは３つ以下の変化を含み、修飾されたＶＬ領域を含む結合ドメインが、野生型結合ドメインと同様の親和性を伴ってその標的に依然として特異的に結合し得ることが条件である。

【0141】

所与のＣＤＲ又はＦＲの正確なアミノ酸配列境界は、いくつかの周知スキームのいずれかを使用して容易に決定され得、そのようなスキームには、Ｋａｂａｔら（１９９１年）「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ．（Ｋａｂａｔ番号付けスキーム）；Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉら（１９９７年）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２７３：９２７～９４８頁（Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキーム）；Ｍａｃｃａｌｌｕｍら（１９９６年）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２６２：７３２～７４５頁（Ｃｏｎｔａｃｔ番号付けスキーム）；Ｍａｒｔｉｎら（１９８９年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８６：９２６８～９２７２頁（ＡｂＭ番号付けスキーム）；Ｌｅｆｒａｎｃ Ｍ Ｐら（２００３年）Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７（１）：５５～７７頁（ＩＭＧＴ番号付けスキーム）；並びにＨｏｎｅｇｇｅｒ及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ（２００１年）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３０９（３）：６５７～６７０頁（「Ａｈｏ」番号付けスキーム）に記載されているものが含まれる。所与のＣＤＲ又はＦＲの境界は、同定に使用されるスキームによって変わり得る。例えば、Ｋａｂａｔスキームは、構造アラインメントに基づき、その一方でＣｈｏｔｈｉａスキームは、構造情報に基づく。Ｋａｂａｔスキーム及びＣｈｏｔｈｉａスキームの両方についての番号付けは、最も一般的な抗体領域配列長に基づくものであり、挿入には挿入文字、例えば「３０ａ」によって対応し、一部の抗体には欠失が出現する。２つのスキームは、ある特定の挿入及び欠失（「インデル」）を異なる位置に配置するため、結果として異なる番号付けになる。Ｃｏｎｔａｃｔスキームは、複雑な結晶構造の分析に基づくものであり、多くの点でＣｈｏｔｈｉａ番号付けスキームと類似している。特定の実施形態では、本明細書に開示されている抗体ＣＤＲ配列は、Ｋａｂａｔ番号付けに従う。

【0142】

（ＩＩＩ－Ｂ－ｉｉ）スペーサー領域。スペーサー領域は、他のＣＡＲ副成分から適切な距離及び／又は柔軟性を作製するために使用される。示されているように、特定の実施形態では、スペーサー領域の長さは、特定の細胞抗原に結合し、破壊を媒介するためにカスタマイズされる。特定の実施形態では、スペーサー領域の長さは、細胞抗原エピトープの位置、エピトープに対する結合ドメインの親和性及び／又は細胞抗原への結合後の細胞破壊を媒介するターゲティング剤の能力に基づいて選択され得る。

【0143】

スペーサー領域は、典型的に、１０～２５０アミノ酸、１０～２００アミノ酸、１０～１５０アミノ酸、１０～１００アミノ酸、１０～５０アミノ酸又は１０～２５アミノ酸を有するものを含む。

【0144】

特定の実施形態では、スペーサー領域は、５アミノ酸、８アミノ酸、１０アミノ酸、１２アミノ酸、１４アミノ酸、２０アミノ酸、２１アミノ酸、２６アミノ酸、２７アミノ酸、４５アミノ酸又は５０アミノ酸である。これらの長さは、短いスペーサー領域とみなされる。

【0145】

特定の実施形態では、スペーサー領域は、１００アミノ酸、１１０アミノ酸、１２０アミノ酸、１２５アミノ酸、１２８アミノ酸、１３１アミノ酸、１３５アミノ酸、１４０アミノ酸、１５０アミノ酸、１６０アミノ酸又は１７０個アミノ酸である。これらの長さは、中間のスペーサー領域とみなされる。

【0146】

長いスペーサー領域は、１７０を超えるアミノ酸を有する。

【0147】

例示的なスペーサー領域は、免疫グロブリンヒンジ領域の全部又は一部を含む。免疫グロブリンヒンジ領域は、野生型免疫グロブリンヒンジ領域又は改変された野生型免疫グロブリンヒンジ領域であり得る。ある特定の実施形態では、免疫グロブリンヒンジ領域は、ヒト免疫グロブリンヒンジ領域である。本明細書で使用される場合、「野生型免疫グロブリンヒンジ領域」とは、ＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメイン（ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＤについて）の間に介在して、それらを接続するか、又は抗体の重鎖に見出されるＣＨ１ドメイン及びＣＨ３ドメイン（ＩｇＥ及びＩｇＭについて）の間に介在して、それらを接続する、天然に存在するアッパーヒンジアミノ酸配列及びミドルヒンジアミノ酸配列を指す。

【0148】

免疫グロブリンヒンジ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭヒンジ領域であり得る。ＩｇＧヒンジ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４ヒンジ領域であり得る。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４若しくはＩｇＤからの配列は、単独で、又はＣＨ２領域の全部若しくは一部、ＣＨ３領域の全部若しくは一部又はＣＨ２領域の全部若しくは一部及びＣＨ３領域の全部若しくは一部と組み合わせて使用され得る。

【0149】

特定の実施形態では、スペーサーは、ＩｇＧ４ヒンジ領域を含む短いスペーサーである。特定の実施形態では、短いスペーサーは、配列番号１２９であるか、又は配列番号１３０によってコードされる配列である。特定の実施形態では、スペーサーは、ＩｇＧ４ヒンジ領域及びＩｇＧ４ヒンジＣＨ３領域を含む中間のスペーサーである。特定の実施形態では、中間のスペーサーは、配列番号１３１によってコードされる。特定の実施形態では、スペーサーは、ＩｇＧ４ヒンジ領域、ＩｇＧ４ ＣＨ３領域及びＩｇＧ４ ＣＨ２領域を含む長いスペーサーである。特定の実施形態では、長いスペーサーは、配列番号１３２によってコードされる。

【0150】

本明細書に記載されているＣＡＲに使用され得るヒンジ領域の他の例には、野生型又はそのバリアントであり得る、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８及びＣＤ７などの１型膜タンパク質の細胞外領域に存在するヒンジ領域が含まれる。

【0151】

特定の実施形態では、スペーサー領域は、ＩＩ型Ｃ型レクチンドメイン間（ストーク）領域又は分化クラスター（ＣＤ）分子ストーク領域を含むヒンジ領域を含む。ＩＩ型Ｃ型レクチン又はＣＤ分子の「ストーク領域」とは、ＩＩ型Ｃ型レクチン又はＣＤ分子の細胞外ドメインのうちで、Ｃ型レクチン様ドメイン（ＣＴＬＤ；例えば、ナチュラルキラー細胞受容体のＣＴＬＤと同様のもの）と疎水性部分（膜貫通ドメイン）との間に位置する部分を指す。例えば、ヒトＣＤ９４（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＣ５０２９１．１）の細胞外ドメインはアミノ酸残基３４～１７９に対応するが、ＣＴＬＤはアミノ酸残基６１～１７６に対応するため、ヒトＣＤ９４分子のストーク領域はアミノ酸残基３４～６０を含み、このアミノ酸残基３４～６０は、疎水性部分（膜貫通ドメイン）とＣＴＬＤとの間に位置する（Ｂｏｙｉｎｇｔｏｎら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １０：１５頁、１９９９年を参照のこと。他のストーク領域の説明については、Ｂｅａｖｉｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１５３頁、１９９２年及びＦｉｇｄｏｒら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：１１頁、２００２年も参照のこと。）。これらのＩＩ型Ｃ型レクチン又はＣＤ分子は、ストーク領域と膜貫通領域又はＣＴＬＤとの間に連結部アミノ酸（以下に記載のもの）も有し得る。別の例では、２３３アミノ酸のヒトＮＫＧ２Ａタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ２６７１５．１）は、アミノ酸７１～９３の範囲の疎水性部分（膜貫通ドメイン）及びアミノ酸９４～２３３の範囲の細胞外ドメインを有する。ＣＴＬＤはアミノ酸１１９～２３１を含み、ストーク領域はアミノ酸９９～１１６を含み、このストーク領域は追加の連結部アミノ酸と隣接し得る。他のＩＩ型Ｃ型レクチン又はＣＤ分子並びにそれらの細胞外リガンド結合ドメイン、ストーク領域及びＣＴＬＤは、当該技術分野において知られている（例えば、ヒトのＣＤ２３、ＣＤ６９、ＣＤ７２、ＮＫＧ２Ａ及びＮＫＧ２Ｄの配列並びにそれらの説明については、それぞれＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ００１９９３．２、ＡＡＨ０７０３７．１、ＮＰ００１７７３．１、ＡＡＬ６５２３４．１、ＣＡＡ０４９２５．１を参照のこと。）。

【0152】

（ＩＩＩ－Ｂ－ｉｉｉ）膜貫通ドメイン。示されているように、ＣＡＲ内の膜貫通ドメインは、細胞膜を介して細胞外成分及び細胞内成分を連結するように機能する。膜貫通ドメインは、修飾細胞の膜において発現分子を固定し得る。

【0153】

膜貫通ドメインは、天然源及び／又は合成源に由来し得る。起源が天然である場合、膜貫通ドメインは、任意の膜結合型タンパク質又は膜貫通タンパク質に由来し得る。膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のα鎖、β鎖又はζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７及びＣＤ１５４の膜貫通領域を少なくとも含み得る。特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、例えば、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒ ａ、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤｌ ｌｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤｌ ｌａ、ＩＴＧＡＭ、ＣＤｌ ｌｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤｌ ｌｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ ＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙｌ０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫＧ２Ｄ又はＮＫＧ２Ｃの膜貫通領域を少なくとも含み得る。特定の実施形態では、同様にヒトＩｇ（免疫グロブリン）ヒンジ（例えば、ＩｇＧ４ヒンジ、ＩｇＤヒンジ）、ＧＳリンカー（例えば、本明細書に記載されているＧＳリンカー）、ＫＩＲ２ＤＳ２ヒンジ又はＣＤ８ａヒンジを含む、様々なヒトヒンジが利用され得る。

【0154】

特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、細胞膜中で熱力学的に安定な三次元構造を有し、一般に、１５～３０アミノ酸の長さの範囲である。膜貫通ドメインの構造は、αヘリックス、βバレル、βシート、βヘリックス又はそれらの任意の組合せを含み得る。

【0155】

膜貫通ドメインは、膜貫通領域と隣接する１つ以上の追加のアミノ酸、例えば、ＣＡＲの細胞外領域内の１つ以上のアミノ酸（例えば、細胞外領域の最大で１５アミノ酸）及び／又はＣＡＲの細胞内領域内の１つ以上の追加のアミノ酸（例えば、細胞内成分の最大で１５アミノ酸）を含み得る。一態様では、膜貫通ドメインは、シグナル伝達ドメイン、共刺激ドメイン又はヒンジドメインが由来するタンパク質と同じタンパク質由来である。別の態様では、膜貫通ドメインは、ＣＡＲの任意の他のドメインが由来するタンパク質と同じタンパク質に由来しない。一部の場合、膜貫通ドメインは、受容体複合体の他の意図しないメンバーとの相互作用を最小化するために同じ又は異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへのこのようなドメインの結合を回避するように選択又はアミノ酸置換により修飾され得る。特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメイン（配列番号１３３～１３６）をコードする核酸配列によってコードされる。特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメイン（配列番号１３７及び１３８）のアミノ酸配列を含む。

【0156】

（ＩＩＩ－Ｂ－ｉｖ）細胞内エフェクタードメイン。ＣＡＲの細胞内エフェクタードメインは、ＣＡＲが発現される細胞の活性化に関与する。したがって、「エフェクタードメイン」という用語は、活性化シグナルを伝達するのに十分な細胞内ドメインの任意の部分を含むことを意味する。エフェクタードメインは、適切なシグナルを受け取ったときの細胞における生物学的応答又は生理的応答を直接的又は間接的に促進することができる。ある特定の実施形態では、エフェクタードメインは、結合したときにシグナルを受け取るタンパク質若しくはタンパク質複合体の一部であるか、又はエフェクタードメインからのシグナルを誘発する標的分子に直接結合する。エフェクタードメインは、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）などの１つ以上のシグナル伝達ドメイン又はモチーフを含む場合、細胞応答を直接促進することができる。他の実施形態では、エフェクタードメインは、共刺激ドメインなどの細胞応答を直接的に促進する１つ以上の他のタンパク質と会合することによって、細胞応答を間接的に促進する。

【0157】

エフェクタードメインは、がん細胞によって発現された細胞抗原に結合すると修飾細胞の少なくとも１つの機能の活性化を提供し得る。修飾細胞の活性化は、分化、増殖及び／若しくは活性化又は他のエフェクター機能のうちの１つ以上を含み得る。特定の実施形態では、エフェクタードメインは、Ｔ細胞受容体、及び共受容体又は共刺激分子由来の細胞質配列を含み得る共刺激ドメインを含む細胞内シグナル伝達成分を含み得る。

【0158】

エフェクタードメインは、１つ、２つ、３つ又はそれ以上の細胞内シグナル伝達成分（例えば、受容体シグナル伝達ドメイン、細胞質シグナル伝達配列）、共刺激ドメイン又はそれらの組合せを含み得る。例示的なエフェクタードメインには、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＤＡＰ１０、ＦｃＲα、ＦｃＲβ（ＦｃεＲ１ｂ）、ＦｃＲγ、Ｆｙｎ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＩＣＯＳ、ＬＡＧ３、ＬＡＴ、Ｌｃｋ、ＬＲＰ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＯＴＣＨ１、ｐＴα、ＰＴＣＨ２、ＯＸ４０、ＲＯＲ２、Ｒｙｋ、ＳＬＡＭＦ１、Ｓｌｐ７６、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＲＩＭ、Ｗｎｔ、Ｚａｐ７０又はそれらの任意の組合せから選択されるシグナル伝達ドメイン及び刺激ドメインが含まれる。特定の実施形態では、例示的なエフェクタードメインには、ＣＤ８６、ＦｃγＲＩＩａ、ＤＡＰ１２、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＣＤ１２７、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＧＡＤＳ、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０又はＮＫｐ４６から選択されるシグナル伝達ドメイン及び共刺激ドメインが含まれる。

【0159】

刺激様式において作用する細胞内シグナル伝達成分配列はｉＴＡＭを含み得る。一次細胞質シグナル伝達配列を含むｉＴＡＭの例には、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ並びに一般的なＦｃＲγ（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃγＲｌｌａ、ＦｃＲβ（Ｆｃε Ｒｉｂ）、ＤＡＰ１０及びＤＡＰ１２に由来するものが含まれる。特定の実施形態では、ＣＤ３ζのバリアントは、少なくとも１つ、２つ、３つ又は全てのＩＴＡＭ領域を保持する。

【0160】

特定の実施形態では、エフェクタードメインは、細胞質シグナル伝達タンパク質と会合した細胞質部分を含み、細胞質シグナル伝達タンパク質は、リンパ球受容体若しくはそのシグナル伝達ドメイン、複数のＩＴＡＭを含むタンパク質、共刺激ドメイン又はそれらの任意の組合せである。

【0161】

細胞内シグナル伝達成分の追加の例には、ＣＤ３ζ鎖の細胞質配列及び／又は結合ドメインエンゲージメント後にシグナル伝達を開始するように協調して作用する共受容体が含まれる。

【0162】

共刺激ドメインは、活性化が細胞抗原結合に対する効率的なリンパ球応答について必要とされ得るドメインである。いくつかの分子は、細胞内シグナル伝達成分又は共刺激ドメインとして互換可能である。共刺激ドメインの例には、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３及びＣＤ８３と特異的に結合するリガンドが含まれる。例えば、ＣＤ２７共刺激は、インビトロでのヒトＣＡＲＴ細胞の拡大、エフェクター機能及び生存を増大し、インビボでのヒトＴ細胞の持続性及び抗がん活性を増進することが実証されている（Ｓｏｎｇら、Ｂｌｏｏｄ．２０１２年；１１９（３）：６９６～７０６頁）。そのような共刺激ドメイン分子のさらなる例には、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤｌｌｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤｌｌａ、ＩＴＧＡＭ、ＣＤｌ ｌｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤｌｌｃ、ＩＴＧＢｌ、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙｌ０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ及びＣＤ１９ａが含まれる。

【0163】

特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達成分をコードする核酸配列は、ＣＤ３ｚコード配列（配列番号１３９～１４１）及び４－１ＢＢシグナル伝達コード配列のバリアント（配列番号１４４～１４６）を含む。特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達成分のアミノ酸配列は、ＣＤ３ζのバリアント（配列番号１４２及び１４３）及び４－１ＢＢの一部（配列番号１４７及び４８）の細胞内シグナル伝達成分を含む。

【0164】

特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達成分は、（ｉ）ＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインの全部若しくは一部、（ｉｉ）４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインの全部若しくは一部、又は（ｉｉｉ）ＣＤ３ζ及び４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインの全部若しくは一部を含む。特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達成分は、（ｉ）ＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインの全部若しくは一部、（ｉｉ）４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインの全部若しくは一部、（ｉｉｉ）ＣＤ２８のシグナル伝達ドメインの全部若しくは一部、又は（ｉｖ）ＣＤ３ζ、４－１ＢＢ及びＣＤ２８のシグナル伝達ドメインの全部若しくは一部を含む。

【0165】

細胞内成分はまた、Ｗｎｔシグナル伝達経路のタンパク質（例えば、ＬＲＰ、Ｒｙｋ又はＲＯＲ２）、ＮＯＴＣＨシグナル伝達経路のタンパク質（例えば、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３又はＮＯＴＣＨ４）、ヘッジホッグシグナル伝達経路のタンパク質（例えば、ＰＴＣＨ又はＳＭＯ）、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）（例えば、上皮増殖因子（ＥＧＦ）受容体ファミリー、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）受容体ファミリー、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）受容体ファミリー、インスリン受容体（ＩＲ）ファミリー、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）受容体ファミリー、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体ファミリー、トロポマイシン（ｔｒｏｐｏｍｙｃｉｎ）受容体キナーゼ（Ｔｒｋ）受容体ファミリー、エフリン（Ｅｐｈ）受容体ファミリー、ＡＸＬ受容体ファミリー、白血球チロシンキナーゼ（ＬＴＫ）受容体ファミリー、免疫グロブリン様ドメイン及びＥＧＦ様ドメインを有するチロシンキナーゼ１（ＴＩＥ）受容体ファミリー、受容体チロシンキナーゼ様オーファン（ＲＯＲ）受容体ファミリー、ジスコイジンドメイン（ＤＤＲ）受容体ファミリー、トランスフェクション中の再編成（ＲＥＴ）受容体ファミリー、チロシン－タンパク質キナーゼ様（ＰＴＫ７）受容体ファミリー、受容体チロシンキナーゼ関連（ＲＹＫ）受容体ファミリー又は筋特異的キナーゼ（ＭｕＳＫ）受容体ファミリー）、Ｇタンパク質共役型受容体、ＧＰＣＲ（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ又はＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄ）、セリン／トレオニンキナーゼ受容体（ＢＭＰＲ又はＴＧＦＲ）又はサイトカイン受容体（ＩＬ１Ｒ、ＩＬ２Ｒ、ＩＬ７Ｒ又はＩＬ１５Ｒ）のうちの１つ以上も含み得る。

【0166】

（ＩＩＩ－Ｂ－ｖ）リンカー。本明細書で使用される場合、リンカーは、分子の２つの他の副成分を接続するのに機能するＣＡＲ分子の任意の部分を含み得る。多くのリンカーが追加の目的を果たす一方で、一部のリンカーは、成分を連結する以外の目的は果たさない。リンカーは、例えば、抗体のＶＬ及びＶＨに由来するｓｃＦｖの結合ドメインを連結し、ＣＡＲの副成分部分間の連結部アミノ酸として機能する。

【0167】

リンカーは、リンカーの所望の機能に応じて、柔軟性、剛性又は半剛性であり得る。リンカーは、連結部アミノ酸を含み得る。例えば、特定の実施形態では、リンカーは、ＣＡＲの異なる成分間の立体配座移動についての柔軟性及び余地を提供する。一般的に使用される柔軟なリンカーには、Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカーが含まれる。特定の実施形態では、リンカー配列は、（Ｇｌｙ_ｘＳｅｒ_ｙ）_ｎの１～１０個の反復などのグリシン及びセリンの反復のセットを含み、ここで、ｘ及びｙは独立して０～１０の整数であり、ただし、ｘ及びｙの両方が０ではなく、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０の整数である）。特定の例には、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（配列番号１）、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）ｎ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（配列番号２）、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）ｎ（Ｇｌｙ２Ｓｅｒ）ｎ（配列番号３）又は（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）ｎ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１（配列番号４）が含まれる。特定の実施形態では、リンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）_４（配列番号７）、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）_３（配列番号８）、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）_２（配列番号１０６）、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）_１（配列番号５）、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）_２（配列番号１０７）、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）_１（配列番号６）、（Ｇｌｙ２Ｓｅｒ）_２（配列番号１０８）又は（Ｇｌｙ２Ｓｅｒ）_１、ＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号１０９）、ＧＧＳＧＧＧＳＧＳＧ（配列番号１１０）若しくはＧＧＳＧＧＧＳＧ（配列番号１１１）である。

【0168】

特定の実施形態では、リンカー領域は、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１）であり、ここで、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９又はそれ以上を含む整数である。特定の実施形態では、スペーサー領域は、（ＥＡＡＡＫ）ｎ（配列番号１１２）であり、ここで、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９又はそれ以上を含む整数である。

【0169】

一部の状況では、柔軟なリンカーは、特定の用途に必要とされるＣＡＲの距離又は配置を維持することができない場合がある。これらの例では、剛性又は半剛性リンカーが有用な場合がある。剛性又は半剛性リンカーの例には、プロリンリッチリンカーが含まれる。特定の実施形態では、プロリンリッチリンカーは、偶然のみに基づいて予測されるよりも多くのプロリン残基を有するペプチド配列である。特定の実施形態では、プロリンリッチリンカーは、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも３６％、少なくとも３９％、少なくとも４０％、少なくとも４８％、少なくとも５０％又は少なくとも５１％のプロリン残基を有するリンカーである。プロリンリッチリンカーの特定の例には、プロリンリッチ唾液タンパク質（ＰＲＰ）の断片が含まれる。

【0170】

リンカーは、酸誘導切断、光誘導切断、ペプチダーゼ誘導切断、エステラーゼ誘導切断及びジスルフィド結合切断などの切断を受けやすい可能性がある（切断可能なリンカー）。或いは、リンカーは、切断に対して実質的に耐性であり得る（例えば、安定したリンカー又は切断不可能なリンカー）。一部の態様では、リンカーは、プロチャージリンカー、親水性リンカー又はジカルボン酸ベースのリンカーである。

【0171】

連結部アミノ酸は、スペーサー領域によって提供される距離が必要とされない及び／又は望まれない場合に配列を接続するために使用され得るリンカーであり得る。例えば、連結部アミノ酸は、共刺激細胞内シグナル伝達成分を接続するために使用され得る短いアミノ酸配列であり得る。特定の実施形態では、連結部アミノ酸は、９アミノ酸又はそれ未満（例えば、２、３、４、５、６、７、８又は９アミノ酸）である。特定の実施形態では、グリシン－セリンダブレットが、適切な連結部アミノ酸リンカーとして使用され得る。特定の実施形態では、単一のアミノ酸、例えば、アラニン、グリシンが、適切な連結部アミノ酸として使用され得る。

【0172】

（ＩＩＩ－Ｂ－ｖｉ）タグカセット、形質導入マーカー及び／又は自殺スイッチを含む制御機構。特定の実施形態では、ＣＡＲ構築物は、１つ以上のタグカセット及び／又は形質導入マーカーを含み得る。タグカセット及び形質導入マーカーは、インビトロ、インビボ及び／又はエクスビボで遺伝子修飾細胞を活性化、増殖促進、検出、濃縮、単離、追跡、枯渇及び／又は除去するために使用され得る。「タグカセット」とは、ＣＡＲに付加される、ＣＡＲと融合されるか、又はＣＡＲの一部であり、対応結合分子（例えば、リガンド、抗体又は他の結合パートナー）が特異的に結合することできる特有の合成ペプチド配列を指し、この結合特性は、タグ付きタンパク質及び／又はタグ付きタンパク質を発現する細胞を活性化、増殖促進、検出、濃縮、単離、追跡、枯渇、及び／又は除去するために使用され得る。形質導入マーカーも同じ目的を果たし得るが、天然に存在する分子に由来し、ＣＡＲ分子の残部から形質導入マーカーを分離するスキッピングエレメントを使用して発現されることが多い。

【0173】

対応結合分子に結合するタグカセットには、例えば、Ｈｉｓタグ（ＨＨＨＨＨＨ；配列番号１１３）、Ｆｌａｇタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ；配列番号１１４）、Ｘｐｒｅｓｓタグ（ＤＬＹＤＤＤＤＫ；配列番号１１５）、Ａｖｉタグ（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ；配列番号１１６）、カルモジュリンタグ（ＫＲＲＷＫＫＮＦＩＡＶＳＡＡＮＲＦＫＫＩＳＳＳＧＡＬ；配列番号１１７）、ポリグルタメートタグ、ＨＡタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ；配列番号１１８）、Ｍｙｃタグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ；配列番号１１９）、Ｓｔｒｅｐタグ（これは、元のＳＴＲＥＰ（登録商標）タグを指す（ＷＲＨＰＱＦＧＧ；配列番号１２０）、ＳＴＲＥＰ（登録商標）タグＩＩ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ；配列番号１２１（ＩＢＡ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ｆｕｒ Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｋ、Ｇｅｒｍａｎｙ）；例えば、ＵＳ７，９８１，６３２を参照のこと。）、Ｓｏｆｔａｇ１（ＳＬＡＥＬＬＮＡＧＬＧＧＳ；配列番号１２２）、Ｓｏｆｔａｇ３（ＴＱＤＰＳＲＶＧ；配列番号１２３）及びＶ５タグ（ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ；配列番号１２４）が含まれる。

【0174】

本明細書に開示されているタグカセット配列に特異的に結合するコンジュゲート結合分子は商業的に利用可能である。例えば、Ｈｉｓタグ抗体は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐｉｅｒｃｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ及びＧｅｎＳｃｒｉｐｔを含む供給業者から商業的に利用可能である。Ｆｌａｇタグ抗体は、Ｐｉｅｒｃｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ及びＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈを含む供給業者から商業的に利用可能である。Ｘｐｒｅｓｓタグ抗体は、Ｐｉｅｒｃｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ及びＧｅｎＳｃｒｉｐｔを含む供給業者から商業的に利用可能である。Ａｖｉタグ抗体は、Ｐｉｅｒｃｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ＩｓＢｉｏ及びＧｅｎｅｃｏｐｏｅｉａを含む供給業者から商業的に利用可能である。カルモジュリンタグ抗体は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ａｂｃａｍ及びＰｉｅｒｃｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓを含む供給業者から商業的に利用可能である。ＨＡタグ抗体は、Ｐｉｅｒｃｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ及びＡｂｃａｍを含む供給業者から商業的に利用可能である。Ｍｙｃタグ抗体は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ａｂｃａｍ及びＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌを含む供給業者から商業的に利用可能である。Ｓｔｒｅｐタグ抗体は、Ａｂｃａｍ、Ｉｂａ及びＱｉａｇｅｎを含む供給業者から商業的に利用可能である。

【0175】

形質導入マーカーは、トランケートされたＣＤ１９（ｔＣＤ１９；Ｂｕｄｄｅら、Ｂｌｏｏｄ １２２：１６６０頁、２０１３年を参照のこと。）、トランケートされたヒトＥＧＦＲ（ｔＥＧＦＲ；Ｗａｎｇら、Ｂｌｏｏｄ １１８：１２５５頁、２０１１年を参照のこと。）、ヒトＣＤ３４の細胞外ドメイン並びに／又はＣＤ３４抗原由来の標的エピトープ（Ｆｅｈｓｅら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ １（５ Ｐｔ １）；４４８～４５６頁、２０００年を参照のこと。）及びＣＤ２０抗原由来の標的エピトープ（Ｐｈｉｌｉｐら、Ｂｌｏｏｄ １２４：１２７７～１２７８頁を参照のこと。）を組み合わせたＲＱＲ８のうちの少なくとも１つから選択され得る。

【0176】

特定の実施形態では、ｉカスパーゼ９構築物（ｉＣａｓｐ９）をコードするポリヌクレオチドが自殺スイッチとしてＣＡＲ構築物に挿入され得る。

【0177】

制御機構は、ＣＡＲ中に複数のコピーで存在し得るか、又はスキッピングエレメント（配列番号１４９～１５２）を使用して異なる分子として発現され得る。例えば、ＣＡＲは、１つ、２つ、３つ、４つ若しくは５つのタグカセットを有し得る及び／又は１つ、２つ、３つ、４つ若しくは５つの形質導入マーカーも発現され得る。例えば、実施形態は、２つのＭｙｃタグカセット又はＨｉｓタグ及びＨＡタグカセット又はＨＡタグ及びＳｏｆｔａｇ１タグカセット又はＭｙｃタグ及びＳＢＰタグカセットを有するＣＡＲ構築物を含み得る。例示的な形質導入マーカー及び対応対は、ＵＳ１３／４６３，２４７に記載されている。

【0178】

ＣＡＲ中に少なくとも１つの制御機構を含めることの１つの利点は、対象に投与されるＣＡＲを発現する細胞を、タグカセットに対応結合分子を使用して増加させ得るか、又は枯渇させ得ることである。ある特定の実施形態では、本開示は、タグカセットに特異的な抗体を使用すること、制御機構に特異的な対応結合分子を使用すること、又はＣＡＲを発現し、制御機構に対する特異性を有する第２の修飾細胞を使用することによってＣＡＲを発現する修飾細胞を枯渇させるための方法を提供する。修飾細胞の除去は、制御機構に特異的な枯渇剤を使用して達成され得る。例えば、ｔＥＧＦＲが使用される場合、細胞毒性試薬（毒素、放射性金属など）に融合又はコンジュゲートした抗ｔＥＧＦＲ結合ドメイン（例えば、抗体、ｓｃＦｖ）が使用されてもよく、又は抗ｔＥＧＦＲ／抗ＣＤ３二重特異性ｓｃＦｖ若しくは抗ｔＥＧＦＲ ＣＡＲ Ｔ細胞が使用されてもよい。

【0179】

ある特定の実施形態では、キメラ分子を発現する修飾細胞は、制御機構に特異的に結合する抗体（例えば、抗Ｔａｇ抗体）又は制御機構に特異的に結合する他の対応結合分子を使用することによってインビボで検出又は追跡され得、制御機構に対するこの結合パートナーは、蛍光色素、放射性トレーサー、鉄－オキシドナノ粒子又はＸ線、ＣＴスキャン、ＭＲＩスキャン、ＰＥＴスキャン、超音波、フローサイトメトリー、近赤外造影システム若しくは他の画像診断法によって検出するための当該技術分野において公知の他の造影剤にコンジュゲートされる（例えば、Ｙｕら、Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ ２：３、２０１２年を参照のこと。）。

【0180】

したがって、ＣＡＲと共に少なくとも１つの制御機構を発現する修飾細胞は、例えば、タグカセットを有しない修飾細胞と比較して、より容易に同定、単離、選別、増殖誘導、追跡及び／又は除去され得る。

【0181】

（ＩＩＩ－Ｃ）ＴＮＦαシグナル増強物質。以前に示されているように、ＴＮＦＲＳファミリーメンバーが図６に提供され、化合物が、ＴＮＦαシグナル増強物質として適したものになるようにファミリーメンバーの活性を活性化又は阻害すべきか否かを含む。特定の実施形態では、細胞は、ＴＮＦαを増強する１つ以上のＴＮＦＲＳＦメンバーを発現するように遺伝子修飾されている。特定の実施形態では、細胞は、ＴＮＦαを阻害するＴＮＦＲＳＦメンバーを阻害又は不活化するように遺伝子修飾されている。ＴＮＦαシグナル増強物質タンパク質を発現するように遺伝子修飾された細胞は、ＣＡＲを発現するように遺伝子修飾された細胞と同じ細胞であり得るか、又は異なる細胞であり得る。

【0182】

ＴＮＦαシグナル増強物質として発現され得るタンパク質の特定の例には、ＴＷＥＡＫ（腫瘍壊死因子様弱アポトーシス誘導因子）、ＴＲＡＩＬ（腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド）及びＬＩＧＨＴ（誘導性発現を示し、Ｔリンパ球で発現される受容体であるヘルペスウイルス侵入メディエーターとの結合についてＨＳＶ糖タンパク質Ｄと競合するリンホトキシンとの相同体）が含まれる。

【0183】

ＴＮＦＲＳＦ１２Ａとしても知られているＴＷＥＡＫは、１９９７年に腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーのメンバーとして最初に記載された。ＴＷＥＡＫは、細胞表面関連ＩＩ型膜貫通タンパク質であるが、より小さな生物学的に活性な形態も細胞外環境に放出され得る。生理学的親和性でＴＷＥＡＫに結合することが現在知られている１つの受容体が存在し、それは、文献ではＴＷＥＡＫ受容体（ＴｗｅａｋＲ）又は線維芽細胞成長因子誘導性１４（Ｆｎ１４）と称されるＩ型膜貫通タンパク質である。ＴｗｅａｋＲ／Ｆｎ１４は、現在までに報告されているＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーの最小のメンバーであり、いくつかの異なるＴＮＦＲ関連因子の動員を介してシグナルを送るようである。ＴＷＥＡＫは、細胞成長及び血管新生の刺激、炎症性サイトカインの誘導及びいくつかの実験条件下でのアポトーシスの刺激を含む、複数の生物学的活性を有する。（ＰＭＩＤ：１２７８７５６２）。ＴＷＥＡＫに関するさらなる情報については、ＷＯ２０１１０８４７１４Ａ２を参照のこと。

【0184】

ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２Ｌは、その死受容体の関与を通じてアポトーシスを開始することができるリガンドの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーのメンバーである。ＴＲＡＩＬは、様々な腫瘍細胞及び形質転換細胞のアポトーシスを選択的に誘導するが、ほとんどの正常細胞では誘導しないため、がん治療についての有望な薬剤として強い関心を集めている。ＴＲＡＩＬは免疫系の異なる細胞で発現され、Ｔ細胞及びナチュラルキラー細胞を介した腫瘍監視並びに腫瘍転移を抑制することの抑制の両方における役割を果たす。

【0185】

腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー１４（ＴＮＦＳＦ１４）としても知られているＬＩＧＨＴは、ＴＮＦスーパーファミリーの分泌タンパク質である。これは、ヘルペスウイルス侵入メディエーター（ＨＶＥＭ）及びデコイ受容体３によって認識される。ＬＩＧＨＴに関する詳細な情報については、ＥＰ３１０５３１７Ｂ１及びＵＳ２００５０１６３７４７を参照のこと。

【0186】

（ＩＶ）細胞活性化培養条件。細胞集団は、遺伝子修飾された細胞集団を拡大するために培養開始組成物中でインキュベートされ得る。インキュベーションは、バッグ、細胞培養プレート、フラスコ、チャンバー、クロマトグラフィーカラム、架橋ゲル、架橋ポリマー、カラム、培養ディッシュ、中空糸、マイクロタイタープレート、シリカコーティングガラスプレート、チューブ、チューブセット、ウェル、バイアル又は培養若しくは細胞培養のための他の容器などの培養容器内で実行され得る。

【0187】

培養条件は、特定の培地、温度、酸素含有量、二酸化炭素含有量、時間、作用物質、例えば、栄養素、アミノ酸、抗生物質、イオン及び／又は刺激因子、例えば、サイトカイン、ケモカイン、抗原、結合パートナー、融合タンパク質、組換え可溶性受容体並びに細胞を活性化するように設計された任意の他の作用物質のうちの１つ以上を含み得る。

【0188】

一部の態様では、インキュベーションは、ＵＳ６，０４０，１７７、Ｋｌｅｂａｎｏｆｆら（２０１２年）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３５（９）：６５１～６６０頁；Ｔｅｒａｋｕｒａら（２０１２年）Ｂｌｏｏｄ．１：７２～８２頁及び／又はＷａｎｇら（２０１２年）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３５（９）：６８９～７０１頁に記載されている技術などの技術に従って実行される。

【0189】

Ｔ細胞を培養するための例示的な培養培地には、（ｉ）非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム及びペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ；（ｉｉ）ＨＥＰＥＳ、５～１５％のヒト血清、１～３％のＬ－グルタミン、０．５～１．５％のペニシリン／ストレプトマイシン及び０．２５×１０－４～０．７５×１０－４Ｍのβ－メルカプトエタノールを含むＲＰＭＩ；（ｉｉｉ）１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、２ｍＭのＬ－グルタミン、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び１００ｍ／ｍＬのストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ－１６４０；（ｉｖ）１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ－グルタミン、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び１００ｍ／ｍＬのストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ培地；並びに（ｖ）５％のヒトＡＢ血清（Ｇｅｍｃｅｌｌ、Ｗｅｓｔ Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ、ＣＡ）、１％のＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）、１％のＰｅｎ－Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ）、１％のＧｌｕｔａＭａｘ（Ｇｉｂｃｏ）及び２％のＮ－アセチルシステイン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を補充したＸ－Ｖｉｖｏ １５培地（Ｌｏｎｚａ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）が含まれる。Ｔ細胞培養培地はまた、Ｈｙｃｌｏｎｅ（Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）からも市販されている。このような培養培地へと添加され得る、さらなるＴ細胞活性化成分については、下記において、より詳細に記載されている。

【0190】

一部の実施形態では、Ｔ細胞は、非分裂末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）などのフィーダー細胞を培養開始組成物に添加し（例えば、結果として得られる細胞集団が、拡大される初期集団内の各Ｔリンパ球につき、少なくとも５、１０、２０又は４０個以上のＰＢＭＣフィーダー細胞を含有するように）、培養物をインキュベートする（例えば、Ｔ細胞の数を拡大するのに十分な時間）ことにより拡大される。一部の態様では、非分裂フィーダー細胞は、ガンマ照射ＰＢＭＣフィーダー細胞を含み得る。一部の実施形態では、ＰＢＭＣは、細胞分裂を阻止するように、３０００～３６００ｒａｄの範囲のガンマ線により照射される。一部の態様では、フィーダー細胞は、Ｔ細胞の集団が添加される前に、培養培地に添加される。

【0191】

任意選択的に、インキュベーションは、ＥＢＶ形質転換非分裂リンパ芽球様細胞（ＬＣＬ）を、フィーダー細胞として添加することをさらに含み得る。ＬＣＬは、６０００～１０，０００ｒａｄの範囲のガンマ線により照射され得る。一部の態様では、ＬＣＬフィーダー細胞は、少なくとも１０：１の比のＬＣＬフィーダー細胞対初期Ｔリンパ球などの任意の適切な量において提供される。

【0192】

一部の実施形態では、刺激条件には、ヒトＴリンパ球の成長に適した温度、例えば、少なくとも２５℃、少なくとも３０℃又は３７℃が含まれる。

【0193】

Ｔ細胞についての活性化培養条件には、培養開始組成物のＴ細胞が増殖又は拡大する条件が含まれる。Ｔ細胞活性化条件には、１つ以上のサイトカイン、例えば、インターロイキン（ＩＬ）－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５及び／又はＩＬ－２１が含まれ得る。ＩＬ－２は、１～１００ｎｇ／μｌ（例えば、４０、５０又は６０ｎｇ／μｌ）の範囲にて含まれ得る。ＩＬ－７、ＩＬ－１５及び／又はＩＬ－２１は、０．１～５０ｎｇ／μｌ（例えば、５、１０又は１５ｎｇ／μｌ）の範囲にて個々に含まれ得る。特定の実施形態は、２５及び５０ＩＵ／μｌにてＩＬ－２を利用する。特定の実施形態は、１０ｎｇ／μｌにて個々に含まれるＩＬ－７、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１を利用する。

【0194】

特定の実施形態では、Ｔ細胞活性化培養条件の条件は、Ｔ細胞刺激エピトープを含み得る。Ｔ細胞刺激エピトープには、ＣＤ３、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５６、ＣＤ８３、ＣＤ９０、ＣＤ９５、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、Ｂ７－Ｈ３、ＣＴＬＡ－４、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－１（ＦＺＤ１）、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、ＦＺＤ１０、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、ＩＬ－１Ｒ、ＬＡＴ、ＬＦＡ－１、ＬＩＧＨＴ、ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ、ＮＫＧ２Ｄ、ＯＸ４０、ＲＯＲ２及びＲＴＫが含まれる。

【0195】

ＣＤ３は、Ｔ細胞受容体の主要なシグナル伝達エレメントである。以前に示されているように、ＣＤ３は全ての成熟Ｔ細胞上で発現される。特定の実施形態では、ＣＤ３刺激分子（すなわち、ＣＤ３結合ドメイン）は、ＯＫＴ３抗体（ＵＳ５，９２９，２１２；ＵＳ４，３６１，５４９；ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－８００１（商標）；及びＡｒａｋａｗａら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２０、６５７～６６２頁（１９９６年）を参照のこと。）、２０Ｇ６－Ｆ３抗体、４Ｂ４－Ｄ７抗体、４Ｅ７－Ｃ９又は１８Ｆ５－Ｈ１０抗体に由来し得る。

【0196】

特定の実施形態では、ＣＤ３刺激分子は、少なくとも０．２５若しくは０．５ｎｇ／ｍｌの濃度又は２．５～１０μｇ／ｍｌの濃度にて培養培地内に含まれ得る。特定の実施形態は、５μｇ／ｍｌにてＣＤ３刺激分子（例えば、ＯＫＴ３）を利用する。

【0197】

特定の実施形態では、ａｖｉタグに関連する活性化分子が、ビオチン化され、ストレプトアビジンビーズに結合され得る。このアプローチは、例えば、除去可能なＴ細胞エピトープ刺激活性化システムを作製するために使用され得る。

【0198】

ＣＤ２８についての例示的な結合ドメインは、ＴＧＮ１４１２、ＣＤ８０、ＣＤ８６又は９Ｄ７抗体を含み得るか、又はそれらに由来し得る。ＣＤ２８に結合するさらなる抗体には、９．３、ＫＯＬＴ－２、１５Ｅ８、２４８．２３．２、ＥＸ５．３Ｄ１０及びＣＤ２８．３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ４５１９７４．１の下で合成一本鎖Ｆｖ構築物として寄託されている；Ｖａｎｈｏｖｅら、ＢＬＯＯＤ、２００３年７月１５日、Ｖｏｌ．１０２、Ｎｏ．２、５６４～５７０頁も参照のこと。）が含まれる。さらに、１ＹＪＤは、有糸分裂促進抗体（５．１１Ａ１）のＦａｂ断片と複合体を形成したヒトＣＤ２８の結晶構造を提供する。特定の実施形態では、９Ｄ７と競合しない抗体が選択される。

【0199】

４－１ＢＢ結合ドメインは、Ｔａｒａｂａｎら、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２年１２月；３２（１２）：３６１７～２７頁に記載されているようにＬＯＢ１２、ＩｇＧ２ａ、ＬＯＢ１２．３又はＩｇＧ１に由来し得る。特定の実施形態では、４－１ＢＢ結合ドメインは、ＵＳ９，３８２，３２８に記載されているモノクローナル抗体に由来する。さらなる４－１ＢＢ結合ドメインは、ＵＳ６，５６９，９９７、ＵＳ６，３０３，１２１及びＭｉｔｔｌｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ．２００４年；２９（１～３）：１９７～２０８頁に記載されている。

【0200】

ＯＸ４０（ＣＤ１３４）及び／又はＩＣＯＳ活性化も使用され得る。ＯＸ４０結合ドメインは、ＵＳ２０１００１９６３５９、ＵＳ２０１５０３０７６１７、ＷＯ２０１５／１５３５１３、ＷＯ２０１３／０３８１９１及びＭｅｌｅｒｏら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１３年３月１日；１９（５）：１０４４～５３頁に記載されている。ＩＣＯＳに結合し、活性化し得る例示的な結合ドメインは、例えば、ＵＳ２００８０２７９８５１及びＤｅｎｇら、Ｈｙｂｒｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍｉｃｓ．２００４年６月；２３（３）：１７６～８２頁に記載されている。

【0201】

可溶型の場合、Ｔ細胞活性化剤は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子などの別の分子とカップリングされ得る。任意の適切なＰＥＧ分子が使用され得る。典型的に、最大で１０００Ｄａまでの分子量のＰＥＧ分子が水又は培養培地に溶解する。一部の場合、このようなＰＥＧベースの試薬は、市販の活性化ＰＥＧ分子（例えば、ＮＯＦ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｉｒｖｉｎｅ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡから入手可能なＰＥＧ－ＮＨＳ誘導体、又はＣｒｅａｔｉｖｅ ＰＥＧＷｏｒｋｓ、Ｃｈａｐｅｌ Ｈｉｌｌｓ、Ｎ．Ｃ．、ＵＳＡから入手可能な活性化ＰＥＧ誘導体）を使用して調製され得る。

【0202】

特定の実施形態では、細胞刺激剤は培養培地内の固相上に固定化される。特定の実施形態では、固相は、培養容器（例えば、バッグ、細胞培養プレート、チャンバー、クロマトグラフィーカラム、架橋ゲル、架橋ポリマー、カラム、培養ディッシュ、中空糸、マイクロタイタープレート、シリカコーティングガラスプレート、チューブ、チューブセット、ウェル、バイアル、培養若しくは細胞培養のための他の構造又は容器）の表面である。

【0203】

特定の実施形態では、固相は培養培地に添加され得る。このような固相には、例えば、ビーズ、中空糸、樹脂、膜及びポリマーが含まれ得る。

【0204】

例示的なビーズには、磁気ビーズ、ポリマービーズ及び樹脂ビーズ（例えば、Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ及びＳｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）ＭａｃｒｏＰｒｅｐ ＩＢＡ ＧｍｂＨ、Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ））が含まれる。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズは、Ｔ細胞拡大用の市販の試薬である（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。これらのビーズは、ヒトＴ細胞上のＣＤ３及びＣＤ２８細胞表面分子に対するアフィニティー精製モノクローナル抗体の混合物でコーティングされた均一な、４．５μｍの超常磁性、無菌、非発熱性ポリスチレンビーズである。中空糸は、ＴｅｒｕｍｏＢＣＴ Ｉｎｃ．（Ｌａｋｅｗｏｏｄ、Ｃｏｌｏ．、ＵＳＡ）から入手可能である。樹脂には、金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）樹脂（例えば、ＴＡＬＯＮ（登録商標）樹脂（Ｗｅｓｔｂｕｒｇ、Ｌｅｕｓｄｅｎ））が含まれる。膜には、紙及びクロマトグラフィーマトリックスの膜基材（例えば、ニトロセルロース膜又はポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜）が含まれる。

【0205】

例示的なポリマーには、多糖マトリックスなどの多糖が含まれる。このようなマトリックスには、アガロースゲル（例えば、Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ（商標）アガロース又はＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）材料、例えば、異なるビーズ及び孔径で市販されているＳｕｐｅｒｆｌｏｗ（商標）Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標））又は架橋デキストランのゲルが含まれる。さらなる例示的な例は、デキストランが共有結合している、粒子状の架橋アガロースマトリックスであり、これは、（様々なビーズサイズ及び様々な孔径で）Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）又はＳｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）として市販されており、両方ともＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから入手可能である。

【0206】

使用され得る合成ポリマーには、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、多糖及びアガロースのコポリマー（例えば、ポリアクリルアミド／アガロース複合体）又は多糖及びＮ，Ｎ’－メチレンビスアクリルアミドが含まれる。デキストラン及びＮ，Ｎ’－メチレンビスアクリルアミドのコポリマーの例は、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ（登録商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）シリーズの材料である。

【0207】

特定の実施形態は、多糖グラフトシリカ、ポリビニルピロリドングラフトシリカ、ポリエチレンオキシドグラフトシリカ、ポリ（２－ヒドロキシエチルアスパルトアミド）シリカ及びポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）グラフトシリカなどの合成ポリマー又は天然ポリマーにカップリングしたシリカ粒子を利用することができる。

【0208】

細胞活性化剤は、共有結合を介して固相に固定化され得るか、又は非共有結合を介して可逆的に固定化され得る。

【0209】

特定の実施形態では、Ｔ細胞活性化培養培地は、ＨＥＰＥＳ、５～１５％のヒト血清、１～３％のＬ－グルタミン、０．５～１．５％のＰｅｎ／ｓｔｒｅｐ、０．２５×１０－４～０．７５×１０^－４Ｍのβ－メルカプトエタノールを含むＲＰＭＩ内で、５～１５（例えば、１０）ｎｇ／μｌで含まれるＩＬ－７、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１と個々に培養されたＦＡＣＳ選別Ｔ細胞集団を含む。培養は、０．１～０．５×１０ｅ６個の細胞／ウェルをプレーティングした平底ウェルプレート上で実行される。活性化後３日目に、細胞はＴＣ処理プレートに移される。

【0210】

特定の実施形態では、Ｔ細胞活性化培養培地は、ＨＥＰＥＳ、１０％のヒト血清、２％のＬ－グルタミン、１％のＰｅｎ／ｓｔｒｅｐ、０．５×１０^－４Ｍのβ－メルカプトエタノールを含むＲＰＭＩ内で、５～１５（例えば、１０）ｎｇ／μｌで含まれるＩＬ－７、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１と個々に培養されたＦＡＣＳ選別ＣＤ８＋Ｔ集団を含む。培養は、０．１～０．５×１０ｅ６個の細胞／ウェルをプレーティングした平底非組織培養（ＴＣ）処理９６／４８ウェルプレート上で実行される。活性化後３日目に、細胞はＴＣ処理プレートに移される。

【0211】

ＨＳＣ／ＨＳＰについての培養条件は、Ｎｏｔｃｈアゴニストによる拡大（例えば、ＵＳ７，３９９，６３３；ＵＳ５，７８０，３００；ＵＳ５，６４８，４６４；ＵＳ５，８４９，８６９；及びＵＳ５，８５６，４４１を参照のこと、並びに以下のような培養条件で存在する増殖因子：２５～３００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、２５～３００ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ－３Ｌ、２５～１００ｎｇ／ｍｌのＴＰＯ、２５～１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ－６及び１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－３を含み得る。より具体的な実施形態では、５０、１００又は２００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ；５０、１００又は２００ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ－３Ｌ；５０又は１００ｎｇ／ｍｌのＴＰＯ；５０又は１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ－６；及び１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－３が使用され得る。

【0212】

（Ｖ）エクスビボで製造された細胞製剤。特定の実施形態では、遺伝子修飾された細胞は、培養培地から回収され、洗浄され、治療有効量において、担体へと濃縮され得る。例示的な担体には、食塩水、緩衝食塩液、生理食塩液、水、ハンクス液、リンゲル液、Ｎｏｎｎｏｓｏｌ－Ｒ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｓ）、ＰＬＡＳＭＡ－ＬＹＴＥ Ａ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｍｏｒｔｏｎ Ｇｒｏｖｅ、ＩＬ）、グリセロール、エタノール及びこれらの組合せが含まれる。

【0213】

特定の実施形態では、担体は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）又は他のヒト血清成分又はウシ胎仔血清が補充され得る。特定の実施形態では、注入のための担体には、５％のＨＡＳ又はデキストロースを伴う緩衝食塩液が含まれる。さらなる等張剤には、グリセリン、エリトリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール又はマンニトールなどの三価以上の糖アルコールを含む、多価糖アルコールが含まれる。

【0214】

担体には、クエン酸バッファー、コハク酸バッファー、酒石酸バッファー、フマル酸バッファー、グルコン酸バッファー、シュウ酸バッファー、乳酸バッファー、酢酸バッファー、リン酸バッファー、ヒスチジンバッファー及び／又はトリメチルアミン塩などの緩衝剤が含まれ得る。

【0215】

安定剤とは、増量剤から、容器壁面への細胞の付着を阻止する一助となる添加剤に至る機能の範囲にわたり得る、広範な類型の賦形剤を指す。典型的な安定剤には、多価糖アルコール；アミノ酸、例えば、アルギニン、リジン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、Ｌ－ロイシン、２－フェニルアラニン、グルタミン酸及びトレオニン；有機糖又は糖アルコール、例えば、ラクトース、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイニシトール、ガラクチトール、グリセロール及びシクリトール、例えば、イノシトール；ＰＥＧ；アミノ酸ポリマー；硫黄含有還元剤、例えば、尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、アルファ－モノチオグリセロール及びチオ硫酸ナトリウム；低分子量ポリペプチド（すなわち、１０残基未満）；タンパク質、例えば、ＨＳＡ、ウシ血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；単糖類、例えば、キシロース、マンノース、フルクトース及びグルコース；二糖類、例えば、ラクトース、マルトース及びスクロース；三糖類、例えば、ラフィノース並びに多糖類、例えば、デキストランが含まれ得る。

【0216】

必要な場合又は有益な場合、組成物又は製剤は、注射部位における疼痛を和らげるように、リドカインなどの局所麻酔剤を含み得る。

【0217】

例示的な保存剤には、フェノール、ベンジルアルコール、メタクレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、ハロゲン化ベンザルコニウム、塩化ヘキサメトニウム、アルキルパラベン、例えば、メチル又はプロピルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール及び３－ペンタノールが含まれる。

【0218】

組成物又は製剤中の細胞の治療有効量は、１０^２個超の細胞、１０^３個超の細胞、１０^４個超の細胞、１０^５個超の細胞、１０^６個超の細胞、１０^７個超の細胞、１０^８個超の細胞、１０^９個超の細胞、１０^１０個超の細胞又は１０^１１個超であり得る。

【0219】

本明細書に開示された組成物及び製剤中において、細胞は、一般に、１リットル以下、５００ｍｌ以下、２５０ｍｌ以下又は１００ｍｌ以下の容量である。よって、投与された細胞の密度は、典型的に、１０^４個の細胞／ｍｌ、１０^７個の細胞／ｍｌ又は１０^８個の細胞／ｍｌより多い。

【0220】

示されているように、組成物は、少なくとも１つの遺伝子修飾された細胞種（例えば、修飾されたＴ細胞、ＮＫ細胞又は幹細胞）を含む。製剤は、異なる型の遺伝子修飾された細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞及び／又は組み合わせた幹細胞）を含み得る。

【0221】

異なる型の遺伝子修飾された細胞又は細胞サブセット（例えば、修飾されたＴ細胞、ＮＫ細胞及び／又は幹細胞）は、異なる比、例えば、１：１：１の比、２：１：１の比、１：２：１の比、１：１：２の比、５：１：１の比、１：５：１の比、１：１：５の比、１０：１：１の比、１：１０：１の比、１：１：１０の比、２：２：１の比、１：２：２の比、２：１：２の比、５：５：１の比、１：５：５の比、５：１：５の比、１０：１０：１の比、１：１０：１０の比、１０：１：１０の比などで提供され得る。これらの比は、同じ又は異なる組換えＣＡＲ成分を発現する細胞の数にも適用することができる。細胞種のうちの２つのみが組み合わされる場合又は発現されたＣＡＲ成分の２つの組合せのみが製剤内に含まれる場合、比は、上記に提供された３つの数字の組み合わせから作成され得る任意の２つの数字の組み合わせを含み得る。実施形態では、組み合わされた細胞集団は、有効性及び／又は細胞増殖について、インビトロ、インビボ及び／又はエクスビボで試験され、細胞の有効性及び／又は増殖をもたらす細胞の比が選択される。特定の実施形態は、１：１の比のＣＤ４ Ｔ細胞及びＣＤ８ Ｔ細胞を含む。

【0222】

本明細書に開示された細胞ベースの組成物は、例えば、注射、注入、灌流又は洗浄による投与のために調製され得る。組成物及び製剤は、骨髄、静脈内、皮内、動脈内、結節内、リンパ内、腹腔内、病巣内、腫瘍内、膀胱内及び／又は皮下注射のためにさらに製剤化され得る。

【0223】

（ＶＩ）ＴＮＦαシグナル増強物質－小分子及びタンパク質。小分子ＴＮＦαシグナル増強物質として機能し得る本開示内で使用される化合物には、ＢＶ－６、ＣＵＤＣ－４２７、ＧＤＣ－０１５２、ＬＣＬ１６１、ロカグラミド、シロリムス、エムリカサン、ビリナパント、ＡＳＴＸ６６０、ＡＺＤ５５８２、ＢＩ ８９１０６５、ＤＥＢＩＯ １１４３、ＡＰＧ－１３８７、ＨＧＳ１０２９、ＡＥＧ３５１５６、エスシン及びＫＩＬＬＥＲＴＲＡＩＬ（商標）が含まれる。

【0224】

特定の実施形態では、ＴＮＦαシグナル増強物質は、ロカグラミド、シロリムス及びエムリカサンから選択される。
ロカグラミド （１Ｒ，２Ｒ，３Ｓ，３ａＲ，８ｂＳ）－１，８ｂ－ジヒドロキシ－６，８－ジメトキシ－３ａ－（４－メトキシフェニル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－フェニル－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ｂ］［１］ベンゾフラン－２－カルボキサミド、

【0225】

【化13】

シロリムス （１Ｒ，９Ｓ，１２Ｓ，１５Ｒ，１６Ｅ，１８Ｒ，１９Ｒ，２１Ｒ，２３Ｓ，２４Ｅ，２６Ｅ，２８Ｅ，３０Ｓ，３２Ｓ，３５Ｒ）－１，１８－ジヒドロキシ－１２－［（２Ｒ）－１－［（１Ｓ，３Ｒ，４Ｒ）－４－ヒドロキシ－３－メトキシシクロヘキシル］プロパン－２－イル］－１９，３０－ジメトキシ－１５，１７，２１，２３，２９，３５－ヘキサメチル－１１，３６－ジオキサ－４－アザトリシクロ［３０．３．１．０４，９］ヘキサトリアコンタ－１６，２４，２６，２８－テトラエン－２，３，１０，１４，２０－ペントン、

【0226】

【化14】

及び
エムリカサン （３Ｓ）－３－［［（２Ｓ）－２－［［２－（２－ｔｅｒｔ－ブチルアニリノ）－２－オキソアセチル］アミノ］プロパノイル］アミノ］－４－オキソ－５－（２，３，５，６－テトラフルオロフェノキシ）ペンタン酸、

【0227】

【化15】

特定の実施形態では、ＴＮＦαを増幅させる化合物は、以下を含むＳＭＡＣ模倣物である。ビリナパント （２Ｓ）－Ｎ－［（２Ｓ）－１－［（２Ｒ，４Ｓ）－２－［［６－フルオロ－２－［６－フルオロ－３－［［（２Ｒ，４Ｓ）－４－ヒドロキシ－１－［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－２－（メチルアミノ）プロパノイル］アミノ］ブタノイル］ピロリジン－２－イル］メチル］－１Ｈ－インドール－２－イル］－１Ｈ－インドール－３－イル］メチル］－４－ヒドロキシピロリジン－１－イル］－１－オキソブタン－２－イル］－２－（メチルアミノ）プロペンアミド、

【0228】

【化16】

ＬＣＬ１６１ （２Ｓ）－Ｎ－［（１Ｓ）－１－シクロヘキシル－２－［（２Ｓ）－２－［４－（４－フルオロベンゾイル）－１，３－チアゾール－２－イル］ピロリジン－１－イル］－２－オキソエチル］－２－（メチルアミノ）プロペンアミド、

【0229】

【化17】

ＡＳＴＸ６６０ １－［６－［（４－フルオロフェニル）メチル］－５－（ヒドロキシメチル）－３，３－ジメチル－２Ｈ－ピロロ［３，２－ｂ］ピリジン－１－イル］－２－［（２Ｒ，５Ｒ）－５－メチル－２－［［（３Ｒ）－３－メチルモルホリン－４－イル］メチル］ピペラジン－１－イル］エタノン、

【0230】

【化18】

ＢＩ ８９１０６５；ＣＵＤＣ－４２７ （２Ｓ）－１－［（２Ｓ）－２－シクロヘキシル－２－［［（２Ｓ）－２－（メチルアミノ）プロパノイル］アミノ］アセチル］－Ｎ－［２－（１，３－オキサゾール－２－イル）－４－フェニル－１，３－チアゾール－５－イル］ピロリジン－２－カルボキサミド、

【0231】

【化19】

ＤＥＢＩＯ １１４３ （５Ｓ，８Ｓ，１０ａＲ）－Ｎ－ベンズヒドリル－５－［［（２Ｓ）－２－（メチルアミノ）プロパノイル］アミノ］－３－（３－メチルブタノイル）－６－オキソ－１，２，４，５，８，９，１０，１０ａ－オクタヒドロピロロ［１，２－ａ］［１，５］ジアゾシン－８－カルボキサミド、

【0232】

【化20】

ＡＰＧ－１３８７ （５Ｓ，８Ｓ，１０ａＲ）－３－［３－［［（５Ｓ，８Ｓ，１０ａＲ）－８－（ベンズヒドリルカルバモイル）－５－［［（２Ｓ）－２－（メチルアミノ）プロパノイル］アミノ］－６－オキソ－１，２，４，５，８，９，１０，１０ａ－オクタヒドロピロロ［１，２－ａ］［１，５］ジアゾシン－３－イル］スルホニル］フェニル］スルホニル－Ｎ－ベンズヒドリル－５－［［（２Ｓ）－２－（メチルアミノ）プロパノイル］アミノ］－６－オキソ－１，２，４，５，８，９，１０，１０ａ－オクタヒドロピロロ［１，２－ａ］［１，５］ジアゾシン－８－カルボキサミド、

【0233】

【化21】

ＨＧＳ１０２９；ＡＥＧ３５１５６；ＡＺＤ５５８２ （２Ｓ）－１－［（２Ｓ）－２－シクロヘキシル－２－［［（２Ｓ）－２－（メチルアミノ）プロパノイル］アミノ］アセチル］－Ｎ－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－［６－［［（１Ｓ，２Ｒ）－１－［［（２Ｓ）－１－［（２Ｓ）－２－シクロヘキシル－２－［［（２Ｓ）－２－（メチルアミノ）プロパノイル］アミノ］アセチル］ピロリジン－２－カルボニル］アミノ］－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－インデン－２－イル］オキシ］ヘキサ－２，４－ジノキシ］－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－インデン－１－イル］ピロリジン－２－カルボキサミド、

【0234】

【化22】

ＡＰＧ－１３８７ （５Ｓ，８Ｓ，１０ａＲ）－３－［３－［［（５Ｓ，８Ｓ，１０ａＲ）－８－（ベンズヒドリルカルバモイル）－５－［［（２Ｓ）－２－（メチルアミノ）プロパノイル］アミノ］－６－オキソ－１，２，４，５，８，９，１０，１０ａ－オクタヒドロピロロ［１，２－ａ］［１，５］ジアゾシン－３－イル］スルホニル］フェニル］スルホニル－Ｎ－ベンズヒドリル－５－［［（２Ｓ）－２－（メチルアミノ）プロパノイル］アミノ］－６－オキソ－１，２，４，５，８，９，１０，１０ａ－オクタヒドロピロロ［１，２－ａ］［１，５］ジアゾシン－８－カルボキサミド、

【0235】

【化23】

ＧＤＣ－０１５２ （２Ｓ）－１－［（２Ｓ）－２－シクロヘキシル－２－［［（２Ｓ）－２－（メチルアミノ）プロパノイル］アミノ］アセチル］－Ｎ－（４－フェニルチアジアゾール－５－イル）ピロリジン－２－カルボキサミド、

【0236】

【化24】

ＷＸ２０１２０１０８

【0237】

【化25】

ＳＭ－１２２ （３Ｓ，６Ｓ，１０Ａｓ）－Ｎ－ベンズヒドリル－６－［［（２Ｓ）－２－（メチルアミノ）プロパノイル］アミノ］－５－オキソ－２，３，６，７，８，９，１０，１０ａ－オクタヒドロ－１Ｈ－ピロロ［１，２－ａ］アゾシン－３－カルボキサミド、

【0238】

【化26】

ＳＭ－１６４ （３Ｓ，６Ｓ，１０Ａｓ）－Ｎ－［（Ｓ）－［１－［４－［４－［４－［４－［（Ｓ）－［［（３Ｓ，６Ｓ，１０ａＳ）－６－［［（２Ｓ）－２－（メチルアミノ）プロパノイル］アミノ］－５－オキソ－２，３，６，７，８，９，１０，１０ａ－オクタヒドロ－１Ｈ－ピロロ［１，２－ａ］アゾシン－３－カルボニル］アミノ］－フェニルメチル］トリアゾール－１－イル］ブチル］フェニル］ブチル］トリアゾール－４－イル］－フェニルメチル］－６－［［（２Ｓ）－２－（メチルアミノ）プロパノイル］アミノ］－５－オキソ－２，３，６，７，８，９，１０，１０ａ－オクタヒドロ－１Ｈ－ピロロ［１，２－ａ］アゾシン－３－カルボキサミド、

【0239】

【化27】

ＢＶ－６ （Ｓ，Ｓ，２Ｓ，２’Ｓ）－Ｎ，Ｎ’－（（２Ｓ，２’Ｓ）－（ヘキサン－１，６－ジイルビス（アザンジイル））ビス（３－オキソ－１，１－ジフェニルプロパン－３，２－ジイル））ビス（１－（（Ｓ）－２－シクロヘキシル－２－（（Ｓ）－２－（メチルアミノ）プロパンアミド）アセチル）ピロリジン－２－カルボキサミド）、

【0240】

【化28】

ＡＺＤ５５８２ （（２Ｓ）－１－［（２Ｓ）－２－シクロヘキシル－２－［［（２Ｓ）－２－（メチルアミノ）プロパノイル］アミノ］アセチル］－Ｎ－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－［６－［［（１Ｓ，２Ｒ）－１－［［（２Ｓ）－１－［（２Ｓ）－２－シクロヘキシル－２－［［（２Ｓ）－２－（メチルアミノ）プロパノイル］アミノ］アセチル］ピロリジン－２－カルボニル］アミノ］－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－インデン－２－イル］オキシ］ヘキサ－２，４－ジノキシ］－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－インデン－１－イル］ピロリジン－２－カルボキサミド）

【0241】

【化29】

ＣＵＤＣ－４２７ （（２Ｓ）－１－［（２Ｓ）－２－シクロヘキシル－２－［［（２Ｓ）－２－（メチルアミノ）プロパノイル］アミノ］アセチル］－Ｎ－［２－（１，３－オキサゾール－２－イル）－４－フェニル－１，３－チアゾール－５－イル］ピロリジン－２－カルボキサミド）

【0242】

【化30】

又は
エスシン（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）－６－［［（３Ｓ，４Ｓ，４ａＲ，６ａＲ，６ｂＳ，８Ｒ，８ａＲ，９Ｒ，１０Ｒ，１２ａＳ，１４ａＲ，１４ｂＲ）－９－アセチルオキシ－８－ヒドロキシ－４，８ａ－ビス（ヒドロキシメチル）－４，６ａ，６ｂ，１１，１１，１４ｂ－ヘキサメチル－１０－［（Ｚ）－２－メチルブト－２－エノイル］オキシ－１，２，３，４ａ，５，６，７，８，９，１０，１２，１２ａ，１４，１４ａ－テトラデカヒドロピセン－３－イル］オキシ］－４－ヒドロキシ－３，５－ビス［［（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）－３，４，５－トリヒドロキシ－６－（ヒドロキシメチル）オキサン－２－イル］オキシ］オキサン－２－カルボン酸

【0243】

【化31】

ＫＩＬＬＥＲＴＲＡＩＬ（商標）とは、Ｎ末端においてＨｉｓタグ及びリンカーペプチドに融合されたヒトＴＲＡＩＬの細胞外ドメイン（ａａ９５～２８１）を含む組換えタンパク質を指す。

【0244】

示されているように、ＳＭＡＣ模倣物及びＴＮＦスーパーファミリーリガンド調節細胞死の増強物質が使用され得る。さらなるＳＭＡＣ模倣物の構造及び類似の機能特性を有する誘導体に関する詳細な情報については、ＵＳ２０１８１５５３２２、ＵＳ２０１７０３７００４、ＵＳ２０１５１５８９０８、ＵＳ８９８６９９３、ＵＳ８２８３３７２、ＵＳ２０１９０３１７６６、ＵＳ２０１９１８５５１１、ＵＳ２０１９１３５７９４、ＵＳ２０１８１８６８８２、ＵＳ２０１８１７９１８３、ＵＳ２０１８０６５９５９、ＵＳ９７８３５３８、ＵＳ２０１９１５１２９５、ＵＳ８７１６２３６、ＵＳ８６６４２１２、ＵＳ８２７８２９３、ＷＯ２０２００２４９３２、ＷＯ２０１９１２２９４１、ＷＯ２０１９１２２３３７、ＷＯ２０１５１０９３９１、ＡＵ２０１７２２３２３３、ＷＯ２０１７１１７６８４、ＷＯ２０１９１６５２１５、ＵＳ２０１６０１８４３８３、ＵＳ２０１７０３１９５９２、ＵＳ２０１０３１７５９３、ＵＳ２０１８１９３４７０、ＵＳ８８８３７７１、ＵＳ８９８０８３７、ＵＳ８２０２９０２、ＵＳ２０１２０２３８７６６、ＥＰ１６９３０５９、ＵＳ２０１０００９８７７０、ＷＯ２００６１１６７２７、ＷＯ２０１８０１７４２６及びＰＭＩＤ：３１３１６１７６を参照のこと。本開示はまた、本明細書に記載又は参照されている化合物の薬学的に許容される塩、溶媒和物、プロドラッグ、互変異性体、鏡像異性体、立体異性体及びジアステレオ異性体の使用も含む。小分子ＴＮＦαの小分子に関するさらなる情報については、Ｔｒａｃｅら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．１９９４年；４５：４９１～５０３頁；ＷＯ２０１７１１７６８４；ＵＳ２０１８０６５９５９；及びＵＳ９７８３５３８を参照のこと。

【0245】

（ＶＩＩ）ナノ粒子製剤。本明細書に記載されている細胞及び／又は小分子のインビボ遺伝子修飾をもたらすナノ粒子は、対象への投与のために単独で又は組み合わせて組成物に製剤化され得る。組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体を用いて製剤化されたナノ粒子及び／又は小分子を含む。

【0246】

注射用に、組成物は、水溶液として、例えば、ハンクス液、リンガー液又は生理食塩水を含むバッファー中で製剤化され得る。水溶液は、製剤化剤、例えば、懸濁化剤、安定剤及び／又は分散剤を含み得る。或いは、製剤は、適切なビヒクル、例えば、発熱物質非含有無菌水で使用前に構成するための凍結乾燥形態及び／又は粉末形態であり得る。
異なる溶媒（例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、酢酸エチル、トリアセチン、Ｎ－メチルピロリドン、テトラヒドロフラン、フェノール又はそれらの組合せ）の使用により、放出特性をモジュレートするためにナノ粒子のサイズ及び構造を変化させることができる。他の有用な溶媒には、水、エタノール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ－メチル－２－ピロリドン（ＮＭＰ）、アセトン、メタノール、イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）、安息香酸エチル及び安息香酸ベンジルが含まれる。

【0247】

例示的な放出修飾剤には、界面活性剤、洗剤、内相増粘剤、錯化剤、界面活性分子、共溶媒、キレート剤、安定剤、セルロースの誘導体、（ヒドロキシプロピル）メチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ＨＰＭＣアセテート、セルロースアセテート、プルロニック（登録商標）（例えば、Ｆ６８／Ｆ１２７）、ポリソルベート、Ｓｐａｎ（登録商標）（Ｃｒｏｄａ Ａｍｅｒｉｃａｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、Ｄｅｌａｗａｒｅ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、Ｂｒｉｊ（登録商標）（Ｃｒｏｄａ Ａｍｅｒｉｃａｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、Ｄｅｌａｗａｒｅ）、スクロースアセテートイソブチラート（ＳＡＩＢ）、塩及びバッファーが含まれ得る。

【0248】

本明細書に開示されている任意の組成物は、投与の利益を越える有意に有害なアレルギー性の又は他の厄介な反応を引き起こさないものを含む任意の他の薬学的に許容される担体を有利に含み得る。例示的な薬学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０年に開示されている。さらに、製剤は、米国ＦＤＡ生物学的標準局（ＵＳ ＦＤＡ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ）及び／又は他の関連する外国の規制当局により要求される無菌性、発熱性、一般的安全性及び純度基準を満たすように調製され得る。

【0249】

（ＶＩＩＩ）使用方法。本明細書に開示された方法は、本明細書に開示された組成物及び製剤を用いて、対象（ヒト、獣医科動物（イヌ、ネコ、爬虫類、鳥類など）、家畜（ウマ、ウシ、ヤギ、ブタ、ニワトリなど）及び研究動物（サル、ラット、マウス、魚類など）を処置することを含む。対象を処置することは、治療有効量を送達することを含む。治療有効量は、有効量、予防的処置及び／又は治療的処置を提供する量を含む。

【0250】

「有効量」は、対象において所望の生理学的変化をもたらすのに必要な組成物の量である。例えば、有効量は、免疫原性抗がん効果をもたらし得る。有効量は、多くの場合、研究目的で投与される。本明細書に開示された有効量は、がんの発生又は進行の評価に関連した動物モデル又はインビトロアッセイにおける統計的に有意な効果をもたらし得る。免疫原性組成物は有効量で提供され得、この有効量は免疫応答を刺激する。

【0251】

「予防的処置」は、がんの徴候若しくは症状を示さず、又はがんの初期の徴候若しくは症状のみを示す対象に投与された処置を含み、それにより、処置は、がんをさらに進展させるリスクを低減又は減少させる目的で投与される。したがって、予防的処置は、がんを予防する処置として機能する。特定の実施形態では、予防的処置は、原発性がん腫瘍部位からの転移の発生を低減、遅延又は阻止する。

【0252】

「治療的処置」は、がんの症状又は徴候を示す対象に投与され、がんのそれらの徴候又は症状を軽減又は排除する目的で対象に投与される処置を含む。治療的処置は、がんの存在若しくは活性を低減、制御若しくは排除し、及び／又はがんの副作用を低減、制御若しくは排除し得る。

【0253】

有効量としての機能、予防的処置又は治療的処置は相互に排他的ではなく、特定の実施形態では、投与される用量は２つ以上の処置の種類を達成し得る。

【0254】

特定の実施形態では、治療有効量は抗がん効果をもたらす。抗がん効果は、がん細胞数の減少、転移数の減少、腫瘍体積の減少、平均余命の延長、がん細胞における化学感受性若しくは放射線感受性の誘発、がん細胞近くの血管新生の阻害、がん細胞増殖の阻害、腫瘍成長の阻害、転移の阻止若しくは低減、対象の寿命の延長、がん関連疼痛の低減及び／又は処置後のがんの再燃若しくは再発の低減を含む。特定の実施形態では、本明細書に開示された併用療法は、抗原陰性バイスタンダー細胞の殺滅を増大する。

【0255】

「腫瘍」は、細胞（新生細胞又は腫瘍細胞と呼ばれる）の異常成長により形成される腫脹又は病変である。「腫瘍細胞」は、急速な無制御細胞増殖により成長する異常細胞であり、新たな成長を開始した刺激が停止した後も成長し続ける異常細胞である。腫瘍は、正常組織との構造的組織化及び機能的協調の部分的又は完全な欠如を示し、通常、良性、前悪性又は悪性であり得る明瞭な組織塊を形成する。

【0256】

本明細書に記載されている併用療法を使用して処置され得るがんの種類には、前立腺がん、乳がん、幹細胞がん、卵巣がん、中皮腫、腎細胞癌黒色腫、膵臓がん、肺がん、ＨＢＶ誘発性肝細胞癌及び多発性骨髄腫が含まれる。処置され得るさらなる例示的ながんには、髄芽腫、乏突起神経膠腫、卵巣明細胞癌、卵巣類内膜癌、卵巣漿液性腺癌、膵管腺癌、膵内分泌腫瘍、悪性横紋筋様腫瘍、星状細胞腫、非定型奇形腫様ラブドイド腫瘍、脈絡叢癌、脈絡叢乳頭腫、上衣腫、神経膠芽腫、髄膜腫、神経膠腫瘍、乏突起星細胞腫、乏突起神経膠腫、松果体芽腫、癌肉腫、脊索腫、性腺外胚細胞腫瘍、腎外ラブドイド腫瘍、シュワン腫、皮膚扁平上皮癌、軟骨肉腫、軟組織の明細胞肉腫、ユーイング肉腫、消化管間質肉腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、類上皮肉腫、腎髄質癌（ｒｅｎａｌ ｍｅｄｕｌｌｏ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫及び別段指定されていない（ＮＯＳ）肉腫が含まれる。

【0257】

急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＢＰＤＣＮ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、ナチュラルキラー細胞リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ；急性リンパ芽球性リンパ腫としても知られている）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、他の白血病、血液がん又は腫瘍、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、Ｂ細胞ＨＬ、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、Ｔ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫（難治性、再発性など）、全身性肥満細胞症（ＳＭ）、好酸球増加症候群（ＨＥＳ）、骨髄線維症、貧血、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、乾癬及び全身性硬化症（強皮症）もまた、本明細書に開示された併用療法を用いて処置され得る。

【0258】

投与に関して、インビトロアッセイ及び／又は動物モデル研究からの結果に基づいて、治療有効量（本明細書において用量とも称される）が最初に推定され得る。そのような情報は、目的の対象における有用な用量をより正確に決定するために使用され得る。特定の対象に投与される実際の投与量は、標的、体重、状態の重症度、がんの種類、がんの病期、過去の又は併用される治療的介入、対象の特発性疾患及び投与経路を含む、身体的及び生理学的要因などのパラメーターを考慮して、医師、獣医又は研究者により決定され得る。

【0259】

投与するための治療有効量は、１０^２個超の細胞、１０^３個超の細胞、１０^４個超の細胞、１０^５個超の細胞、１０^６個超の細胞、１０^７個超の細胞、１０^８個超の細胞、１０^９個超の細胞、１０^１０個超の細胞又は１０^１１個超を含み得る。

【0260】

ナノ粒子及び／又は小分子の有用な用量は、０．１～５μｇ／ｋｇ又は０．５～１μｇ／ｋｇの範囲であり得る。他の例では、用量は、１μｇ／ｋｇ、１５μｇ／ｋｇ、３０μｇ／ｋｇ、５０μｇ／ｋｇ、５５μｇ／ｋｇ、７０μｇ／ｋｇ、９０μｇ／ｋｇ、１５０μｇ／ｋｇ、３５０μｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ、７５０μｇ／ｋｇ、１０００μｇ／ｋｇ、０．１～５ｍｇ／ｋｇ又は０．５～１ｍｇ／ｋｇを含み得る。他の例では、用量は、１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、３００ｍｇ／ｋｇ、５００ｍｇ／ｋｇ、７００ｍｇ／ｋｇ、１０００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上を含み得る。

【0261】

ビリナパントの例示的な用量は、０．１～７０ｍｇ／ｍ^２を含む。ＬＣＬ１６１の例示的な用量は、１０～３０００ｍｇを含む。ＡＥＧ３５１５６の例示的な用量は、１０～５００ｍｇ／ｍ^２を含む。シロリムスの例示的な用量は、２～２０ｍｇの負荷用量及び１日当たり１～１０ｍｇを含む。ＣＵＤＣ－４２７の例示的な用量は、２１日サイクルで１４日間にわたって１日当たり１００～６００ｍｇを含む。

【0262】

治療有効量は、治療レジメンの過程の間、単一又は複数の用量を（例えば、毎日、隔日、３日ごと、４日ごと、５日ごと、６日ごと、毎週、２週間ごと、３週間ごと、毎月、２か月ごと、３か月ごと、４か月ごと、５か月ごと、６か月ごと、７か月ごと、８か月ごと、９か月ごと、１０か月ごと、１１か月ごと又は毎年）投与することにより達成され得る。治療有効量はまた、２１日又は２８日サイクルにわたって１～４週間にわたって用量を投与することによって達成され得る。

【0263】

示されているように、本明細書に開示された組成物及び製剤は、例えば、注射、注入、灌流又は洗浄によって投与され得、より具体的には、１つ以上の骨髄、静脈内、皮内、動脈内、結節内、リンパ内、腹腔内、病巣内、前立腺内、膣内、直腸内、局所、髄腔内、腫瘍内、筋肉内、膀胱内並びに／又は皮下注入及び／若しくはボーラス注射による投与を含み得る。

【0264】

ある特定の実施形態では、細胞若しくはナノ粒子ベース又は小分子ベースの製剤は、任意の数の関連する治療法と併せて（例えば、前、同時、又は後に）患者に投与される。特定の実施形態では、細胞若しくはナノ粒子ベース又は小分子ベースの製剤は、化学療法、放射線、免疫抑制剤、例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキセート、ミコフェノレート及びＦＫ５０６、抗体又は他の免疫除去剤（ｉｍｍｕｎｏａｂｌａｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）、例えば、ＣＡＭ ＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体又は他の抗体療法、サイトキシン（ｃｙｔｏｘｉｎ）、フルダリビン（ｆｌｕｄａｒｉｂｉｎｅ）、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコプリエノール酸（ｍｙｃｏｐｌｉｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカイン及び放射線治療と組み合わせて使用され得る。

【0265】

（ＩＸ）キット。本明細書に開示されたキットは、本明細書に開示された併用療法を実施するための成分を含む。成分は、実施される特定の実施形態に基づいて変化し得る。キットの実施形態は、例えば、（ｉ）ＣＡＲ若しくは類似分子及び／又はＴＮＦαシグナル増強物質タンパク質を発現するように、又は（ｉｉ）ＴＮＦαシグナル伝達経路メンバーを阻害するＴＮＦＲＳファミリーメンバー（図６を参照のこと。）の破壊された活性を有するように、事前に遺伝子修飾及び／又は遺伝子修飾された、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋）、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球／マクロファージ、リンパ球、ＨＳＣ、ＨＰＣ、ＨＳＰＣ）；ＣＡＲ、ＴＣＲ、ＣＡＲ／ＴＣＲハイブリッド並びに／又は１つ以上のＴＮＦαシグナル増強物質（例えば、ＴＷＥＡＫ、ＴＲＡＩＬ、ＬＩＧＨＴ及び図６を参照のこと。）、ＴＮＦαシグナル伝達経路メンバーを阻害するＴＮＦＲＳファミリーメンバー（図６を参照のこと。）の発現及び／若しくは活性の破壊をもたらす分子をコードする遺伝子；ＴＮＦαシグナル増強物質タンパク質（例えば、ＴＷＥＡＫ、ＴＲＡＩＬ、ＬＩＧＨＴ及び図６を参照のこと。）；ＴＮＦαシグナル増強物質小分子（例えば、ＢＶ－６、ＣＵＤＣ－４２７、ＧＤＣ－０１５２、ＬＣＬ１６１、ロカグラミド、シロリムス、エスシン、エムリカサン、ビリナパント、ＡＳＴＸ６６０、ＡＺＤ５５８２、ＫＩＬＬＥＲＴＲＡＩＬ（商標）、ＢＩ ８９１０６５、ＤＥＢＩＯ １１４３、ＡＰＧ－１３８７、ＨＧＳ１０２９及びＡＥＧ３５１５６）；洗浄バッファー；ＰＢＳ；Ｐｅｒｃｏｌｌ及び／又はＦｉｃｏｌｌ勾配；磁性ビーズ；ベクター（例えば、ウイルスベクター）、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集成分；塩基編集成分；ナノ粒子；バッグ、細胞培養プレート、フラスコ、チャンバー、クロマトグラフィーカラム、架橋ゲル、架橋ポリマー、カラム、培養ディッシュ、中空糸、マイクロタイタープレート、シリカコーティングガラスプレート、チューブ、チューブセット、ウェル、バイアル又は細胞を培養若しくは育てるための他の容器；１つ以上のサイトカイン、例えば、インターロイキン（ＩＬ）－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５及び／又はＩＬ－２１；ＣＤ３刺激分子；ＣＤ２８刺激分子；４－１ＢＢ刺激分子；Ｎｏｔｃｈアゴニスト；生理食塩水、水、ハンクス液、クエン酸バッファー、コハク酸バッファー、酒石酸バッファー、フマル酸バッファー、グルコン酸バッファー、シュウ酸バッファー、乳酸バッファー、酢酸バッファー、リン酸バッファー、ヒスチジンバッファー及び／又はトリメチルアミン塩のうちの１つ以上を含み得る。

【0266】

（Ｘ）例示的な実施形態。

【0267】

１．（ｉ）細胞外成分及び細胞内成分を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子修飾された免疫細胞であって、細胞外成分が、がん細胞によって発現された抗原に結合する結合ドメインを含み、細胞内成分が、エフェクタードメインを含む、免疫細胞、及び
（ｉｉ）腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）シグナル増強物質
を含む併用療法。

【0268】

２．ＴＮＦαシグナル増強物質が、ＴＮＦαシグナル伝達経路メンバーを活性化、増大若しくは支持する腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）メンバーの作用を活性化、増大若しくは支持する、並びに／又はＴＮＦαシグナル増強物質が、ＴＮＦαシグナル伝達経路メンバーの作用を活性化、増大若しくは支持する、実施形態１に記載の併用療法。

【0269】

３．ＴＮＦαシグナル増強物質が、ＴＮＦαシグナル伝達経路メンバーを不活化、抑制又は破壊するＴＮＦＲＳＦメンバーの作用を不活化、抑制又は破壊する、実施形態１又は２に記載の併用療法。

【0270】

４．ＴＮＦαシグナル増強物質が、ＴＮＦＲＳＦメンバー１Ａ、１Ｂ、３、６、８、１０Ａ、１０Ｂ、１２Ａ、１９及び／若しくは２１を活性化、増大若しくは支持する、並びに／又はＴＮＦＲＳＦメンバー６Ｂ、１０Ｃ及び／若しくは１０Ｄの作用を不活化、抑制若しくは破壊する、実施形態１～３のいずれかに記載の併用療法。

【0271】

５．ＴＮＦαシグナル増強物質が、ＴＮＦαシグナル増強物質タンパク質の発現をもたらす分子である、実施形態１～４のいずれかに記載の併用療法。

【0272】

６．ＴＮＦαシグナル増強物質が、ＴＮＦαシグナル増強物質タンパク質である、実施形態１～５のいずれかに記載の併用療法。

【0273】

７．ＴＮＦαシグナル増強物質タンパク質が、腫瘍壊死因子様弱アポトーシス誘導因子（ＴＷＥＡＫ）、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、及び／又は誘導性発現を示し、Ｔリンパ球で発現される受容体であるヘルペスウイルス侵入メディエーターとの結合についてＨＳＶ糖タンパク質Ｄと競合するリンホトキシンとの相同体（ＬＩＧＨＴ）を含む、実施形態５又は６に記載の併用療法。

【0274】

８．ＴＮＦαシグナル増強物質が、ＴＮＦαシグナル伝達経路メンバーを不活化、抑制又は破壊するＴＮＦＲＳＦメンバーの発現を破壊する分子である、実施形態１～７のいずれかに記載の併用療法。

【0275】

９．ＴＮＦαシグナル伝達経路メンバーを不活化、抑制又は破壊するＴＮＦＲＳＦメンバーの発現を破壊する分子が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子、ジンクフィンガーヌクレアーゼ分子、ＴＡＬＥＮ又はｍｅｇａＴＡＬを含む、実施形態８に記載の併用療法。

【0276】

１０．ＴＮＦαシグナル伝達経路メンバーを不活化、抑制又は破壊するＴＮＦＲＳＦメンバーの発現を破壊する分子が、塩基エディターを含む、実施形態８又は９に記載の併用療法。

【0277】

１１．ＣＡＲを発現する実施形態１に記載の免疫細胞がまた、ＴＮＦαシグナル増強物質を含む又は発現する、実施形態１～１０のいずれかに記載の併用療法。

【0278】

１２．ＣＡＲを発現する実施形態１に記載の免疫細胞がまた、ＴＮＦαシグナル増強物質を含む又は発現するように遺伝子修飾されている、実施形態１～１１のいずれかに記載の併用療法。

【0279】

１３．ＴＮＦαシグナル増強物質が、
ＢＶ－６、ＣＵＤＣ－４２７、ＧＤＣ－０１５２、ＬＣＬ１６１、エスシン、ロカグラミド、シロリムス、エムリカサン、ビリナパント、ＡＳＴＸ６６０、ＡＺＤ５５８２、ＢＩ ８９１０６５、ＤＥＢＩＯ １１４３、ＡＰＧ－１３８７、ＨＧＳ１０２９、ＡＥＧ３５１５６、ヒトＴＲＡＩＬの細胞外ドメインを有する組換えタンパク質並びにヒトＴＲＡＩＬ及びリンカーの細胞外ドメインを有する組換えタンパク質（例えば、ＫＩＬＬＥＲＴＲＡＩＬ（商標））のうちの１つ以上から選択される、
ＢＶ－６、ＣＵＤＣ－４２７、ＧＤＣ－０１５２、ＬＣＬ１６１、ＡＳＴＸ６６０、ＡＺＤ５５８２、ビリナパント並びにヒトＴＲＡＩＬの細胞外ドメインを有する組換えタンパク質並びにヒトＴＲＡＩＬ及びリンカーの細胞外ドメインを有する組換えタンパク質（例えば、ＫＩＬＬＥＲＴＲＡＩＬ（商標））のうちの１つ以上から選択される、
ＢＶ－６、ＣＵＤＣ－４２７、ＧＤＣ－０１５２及びＬＣＬ１６１のうちの１つ以上から選択されるか、又は
ロカグラミド、シロリムス、エムリカサン、ＢＩ ８９１０６５、ＤＥＢＩＯ １１４３、ＡＰＧ－１３８７、ＨＧＳ１０２９及びＡＥＧ３５１５６のうちの１つ以上から選択される、
小分子又はタンパク質を含む、実施形態１～１２のいずれかに記載の併用療法。

【0280】

１４．ＣＡＲ及び／又はＴＮＦαシグナル増強物質の発現が、ＮＦＡＴプロモーターによって制御される、実施形態１～１３のいずれかに記載の併用療法。

【0281】

１５．結合ドメインが、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）であるか、又は抗体のＣＤＲに由来する、実施形態１～１４のいずれかに記載の併用療法。

【0282】

１６．結合ドメインが、Ａ３３；ＢＡＧＥ；Ｂｃｌ－２；β－カテニン；ＢＣＭＡ；Ｂ７Ｈ４；ＢＴＬＡ；ＣＡ１２５；ＣＡ１９－９；ＣＤ３、ＣＤ５；ＣＤ２０；ＣＤ２１；ＣＤ２２；ＣＤ２５；ＣＤ２８；ＣＤ３０；ＣＤ３３；ＣＤ３７；ＣＤ３８；ＣＤ４０；ＣＤ５２；ＣＤ４４ｖ６；ＣＤ４５；ＣＤ５６；ＣＤ７９ｂ；ＣＤ８０；ＣＤ８１；ＣＤ８６；ＣＤ１２３；ＣＤ１３４；ＣＤ１３７；ＣＤ１５１；ＣＤ１７１；ＣＤ２７６；ＣＥＡ；ＣＥＡＣＡＭ６；ＣＬＬ－１；ｃ－Ｍｅｔ；ＣＳ－１；ＣＴＬＡ－４；サイクリンＢ１；ＤＡＧＥ；ＥＢＮＡ；ＥＧＦＲ；ＥＧＦＲｖＩＩＩ、エフリンＢ２；ＥｒｂＢ２；ＨＥＲ２；ＥｒｂＢ４；ＥｐｈＡ２；エストロゲン受容体；ＦＡＰ；フェリチン；α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）；ＦＬＴ１；ＦＬＴ４；葉酸結合タンパク質；ＦＯＬＲ；Ｆｒｉｚｚｌｅｄ；ＧＡＧＥ；Ｇ２５０；ＧＤ－２；ＧＨＲＨＲ；ＧＨＲ；ＧＩＴＲ；ＧＭ２；ＧＰＲＣ５Ｄ；ｇｐ７５；ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ １７）；ｇｐ１３０；ＨＬＡ；ＨＥＲ－２／ｎｅｕ；ＨＰＶ Ｅ６；ＨＰＶ Ｅ７；ｈＴＥＲＴ；ＨＶＥＭ；ＩＧＦ１Ｒ；ＩＬ６Ｒ；ＫＤＲ；Ｋｉ－６７；ルイスＡ；ルイスＹ；ＬＩＦＲβ；ＬＲＰ；ＬＲＰ５；ＬＴβＲ；ＭＡＧＥ；ＭＡＲＴ；メソテリン；ＭＵＣ；ＭＵＣ１；ＭＵＭ－１－Ｂ；ｍｙｃ；ＮＹＥＳＯ－１；Ｏ－アセチルＧＤ－２；Ｏ－アセチルＧＤ３；ＯＳＭＲβ；ｐ５３；ＰＤ１；ＰＤ－Ｌ１；ＰＤ－Ｌ２；ＰＲＡＭＥ；プロゲステロン受容体；ＰＳＡ；ＰＳＭＡ；ＰＴＣＨ１；ＲＡＮＫ；ｒａｓ；Ｒｏｂｏ１；ＲＯＲｌ；サバイビン；ＴＣＲα；ＴＣＲβ；テネイシン；ＴＧＦＢＲ１；ＴＧＦＢＲ２；ＴＬＲ７；ＴＬＲ９；ＴＮＦＲ１；ＴＮＦＲ２；ＴＮＦＲＳＦ４；ＴＷＥＡＫ－Ｒ；ＴＳＴＡチロシナーゼ；ＶＥＧＦ；又はＷＴ１に特異的に結合する、実施形態１～１５のいずれかに記載の併用療法。

【0283】

１７．結合ドメインが、ＨＥＲ２、ＥＲＢＢ２、ＣＤ３３、ＰＳＭＡ、ＰＤ－Ｌ１、ＭＵＣ１６、ＦＯＬＲ、ＣＤ１２３又はＣＬＬ－１に特異的に結合する、実施形態１～１６のいずれかに記載の併用療法。

【0284】

１８．結合ドメインが、ＦＭＣ６３、ＳＪ２５Ｃ１、ＨＤ３７、ハーセプチン、ペムブロリズマブ、ＦＡＺ０５３、アベルマブ、アテゾリズマブ又はアマツキシマブのＣＤＲセット、ＶＨ又はＶＬを含む抗体に由来する、実施形態１～１７のいずれかに記載の併用療法。

【0285】

１９．結合ドメインがｓｃＦｖを含む、実施形態１～１５のいずれかに記載の併用療法。

【0286】

２０．結合ドメインが、
（ａ）ＴＡＳＳＳＶＮＹＩＨ（配列番号１４）を含むＣＤＲＬ１、ＴＳＫＶＡＳ（配列番号１５）を含むＣＤＲＬ２、ＱＱＷＲＳＹＰＬＴ（配列番号１６）を含むＣＤＲＬ３、ＤＹＶＶＨ（配列番号１７）を含むＣＤＲＨ１、ＹＩＮＰＹＮＤＧＴＫＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号１８）を含むＣＤＲＨ２及びＤＹＲＹＥＶＹＧＭＤＹ（配列番号１９）を含むＣＤＲＨ３、
（ｂ）ＲＡＳＥＶＤＮＹＧＩＳＦＭＮ（配列番号２０）を含むＣＤＲＬ１、ＡＡＳＮＱＧＳ（配列番号２１）を含むＣＤＲＬ２、ＱＱＳＫＥＶＰＷ（配列番号２２）を含むＣＤＲＬ３、ＤＹＮＭＨ（配列番号２３）を含むＣＤＲＨ１、ＹＩＹＰＹＮＧＧＴＧＹＮＱＫＦＫＳ（配列番号２４）を含むＣＤＲＨ２及びＧＲＰＡＭＤＹ（配列番号２５）を含むＣＤＲＨ３、
（ｃ）

【0287】

【化32】

を含む可変軽鎖及び

【0288】

【化33】

を含む可変重鎖、
（ｄ）

【0289】

【化34】

を含む可変軽鎖及び

【0290】

【化35】

を含む可変重鎖、
（ｅ）ＲＡＳＱＤＩＮＹＹＬＮ（配列番号４５）を含むＣＤＲＬ１、ＹＹＳＳＲＬＨＳ（配列番号４６）を含むＣＤＲＬ２、ＱＱＤＤＡＬＰＹＴ（配列番号４７）を含むＣＤＲＬ３、ＫＡＳＧＹＡＦＳＮＹＷＭＮ（配列番号４８）を含むＣＤＲＨ１、ＱＩＮＰＧＤＧＤＴＮ（配列番号４９）を含むＣＤＲＨ２及びＡＲＥＤＲＤＹＦＤＹ（配列番号５０）を含むＣＤＲＨ３、
（ｆ）ＱＤＩＮＹＹ（配列番号１６３）を含むＣＤＲＬ１、ＹＳＳを含むＣＤＲＬ２、ＱＱＤＤＡＬＰＹＴ（配列番号４７）を含むＣＤＲＬ３、ＧＹＡＦＳＮＹＷ（配列番号１６４）を含むＣＤＲＨ１、ＩＮＰＧＤＧＤＴ（配列番号１６５）を含むＣＤＲＨ２及びＡＲＥＤＲＤＹＦＤＹ（配列番号５０）を含むＣＤＲＨ３、
（ｇ）ＲＡＳＱＤＩＮＹＹＬＮ（配列番号４５）を含むＣＤＲＬ１、ＹＳＳＲＬＨＳ（配列番号１６６）を含むＣＤＲＬ２、ＱＱＤＤＡＬＰＹＴ（配列番号４７）を含むＣＤＲＬ３、ＮＹＷＭＮ（配列番号１６７）を含むＣＤＲＨ１、ＱＩＮＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧ（配列番号１６８）を含むＣＤＲＨ２及びＥＤＲＤＹＦＤＹ（配列番号１６９）を含むＣＤＲＨ３、
（ｈ）ＲＡＳＱＤＩＮＹＹＬＮ（配列番号４５）を含むＣＤＲＬ１、ＹＳＳＲＬＨＳ（配列番号１６６）を含むＣＤＲＬ２、ＱＱＤＤＡＬＰＹＴ（配列番号４７）を含むＣＤＲＬ３、ＧＹＡＦＳＮＹ（配列番号１７０）を含むＣＤＲＨ１、ＮＰＧＤＧＤ（配列番号１７１）を含むＣＤＲＨ２及びＥＤＲＤＹＦＤＹ（配列番号１６９）を含むＣＤＲＨ３、又は
（ｉ）

【0291】

【化36】

を含む可変軽鎖及び

【0292】

【化37】

を含む可変重鎖
を含む、実施形態１～１５又は１９のいずれかに記載の併用療法。

【0293】

２１．細胞外成分及び細胞内成分が、膜貫通ドメインを介して連結している、実施形態１～２０のいずれかに記載の併用療法。

【0294】

２２．膜貫通ドメインが、Ｔ細胞受容体、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７又はＣＤ１５４のα鎖、β鎖又はζ鎖の膜貫通ドメインである、請求項２１に記載の併用療法。

【0295】

２３．膜貫通ドメインが、ＣＤ２８の膜貫通ドメインである、請求項２１に記載の併用療法。

【0296】

２４．エフェクタードメインが、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＣＤ２７、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ－１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ及び／又はＢ７－Ｈ３の細胞内シグナル伝達ドメインを含む、実施形態１～２３のいずれかに記載の併用療法。

【0297】

２５．エフェクタードメインが、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８及び／又は４－１ＢＢの細胞内シグナル伝達ドメインを含む、実施形態１～２４のいずれかに記載の併用療法。

【0298】

２６．エフェクタードメインが、ＣＤ３ζ及び４－１ＢＢの細胞内シグナル伝達ドメインを含む、実施形態１～２５のいずれかに記載の併用療法。

【0299】

２７．エフェクタードメインが、ＣＤ３ζのバリアント（配列番号１４２又は１４３）及び４－１ＢＢの一部（配列番号１４７又は１４８）を含む、実施形態１～２５のいずれかに記載の併用療法。

【0300】

２８．ＣＡＲが、結合ドメインと細胞内成分との間にスペーサー領域をさらに含む、実施形態１～２７のいずれかに記載の併用療法。

【0301】

２９．スペーサー領域が、免疫グロブリンヒンジ領域又はその一部を含む、実施形態２８に記載の併用療法。

【0302】

３０．スペーサー領域が、ＩｇＧ４ヒンジ領域、ＩｇＧ４ヒンジ領域及びＩｇＧ４ヒンジＣＨ３領域又はＩｇＧ４ヒンジ領域、ＩｇＧ４ ＣＨ３領域及びＩｇＧ４ ＣＨ２領域を含む、実施形態２９又は３０に記載の併用療法。

【0303】

３１．ＣＡＲが、タグカセット、形質導入マーカー及び／又は自殺スイッチを含む制御機構をさらに含む、実施形態１～３０のいずれかに記載の併用療法。

【0304】

３２．ＣＡＲが配列番号１７６又は１７７によってコードされる、実施形態１～３１のいずれかに記載の併用療法。

【0305】

３３．遺伝子修飾された免疫細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、単球／マクロファージ、造血幹細胞又は造血前駆細胞である、実施形態１～３２のいずれかに記載の併用療法。

【0306】

３４．Ｔ細胞が、ＣＤ３ Ｔ細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞及び／又はナイーブＴ細胞から選択される、実施形態３３に記載の併用療法。

【0307】

３５．Ｔ細胞が、ＣＤ４ Ｔ細胞及び／又はＣＤ８ Ｔ細胞である、実施形態３３に記載の併用療法。

【0308】

３６．１：１の比のＣＤ４ Ｔ細胞及びＣＤ８ Ｔ細胞を含む、実施形態３５に記載の併用療法。

【0309】

３７．遺伝子修飾された免疫細胞が、エクスビボ又はインビボにおけるものである、実施形態１～３６のいずれかに記載の併用療法。

【0310】

３８．選択された併用療法のＣＡＲを発現するようにエクスビボで遺伝子修飾された少なくとも２つの細胞種を含む組成物を含む、実施形態１～３７のいずれかに記載の併用療法。

【0311】

３９．少なくとも２つの細胞種が、Ｔ細胞及びナチュラルキラー細胞、Ｔ細胞及び単球／マクロファージ、Ｔ細胞及び造血幹細胞、Ｔ細胞及び造血前駆細胞、ナチュラルキラー細胞及び単球／マクロファージ、ナチュラルキラー細胞及び造血幹細胞、ナチュラルキラー細胞及び造血前駆細胞、単球／マクロファージ及び造血幹細胞、単球／マクロファージ及び造血前駆細胞、又は造血幹細胞及び造血前駆細胞を含む、実施形態３８に記載の併用療法。

【0312】

４０．併用療法のＣＡＲ部分を発現するように細胞のインビボでの遺伝子修飾をもたらすナノ粒子を含む、実施形態１３９のいずれかに記載の併用療法。

【0313】

４１．ＴＮＦαシグナル増強物質を発現するか、又は含むように細胞のインビボでの遺伝子修飾をもたらすナノ粒子を含む、実施形態１～４０のいずれかに記載の併用療法。

【0314】

４２．実施形態１～４１のいずれかに記載の併用療法を含む又は発現するように遺伝子修飾された細胞。

【0315】

４３．ＴＮＦαシグナル増強物質の発現が、ＮＦＡＴプロモーターによって制御される、実施形態４２に記載の細胞。

【0316】

４４．エクスビボ又はインビボにおけるものである、実施形態４２又は４３に記載の細胞。

【0317】

４５．Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、単球／マクロファージ、造血幹細胞又は造血前駆細胞である、実施形態４２～４４のいずれかに記載の細胞。

【0318】

４６．Ｔ細胞が、ＣＤ３ Ｔ細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞及び／又はナイーブＴ細胞である、実施形態４５に記載の細胞。

【0319】

４７．Ｔ細胞が、ＣＤ４ Ｔ細胞及び／又はＣＤ８ Ｔ細胞である、実施形態４５に記載の細胞。

【0320】

４８．治療有効量の実施形態１～４１のいずれかに記載の併用療法を対象に投与することを含み、それによって、それを必要とする対象におけるがんを処置する、それを必要とする対象におけるがんを処置する方法。

【0321】

４９．処置が、抗がん効果をもたらす、実施形態４８に記載の方法。

【0322】

５０．抗がん効果が、白血病、前立腺がん、乳がん、幹細胞がん、卵巣がん、中皮腫、腎細胞癌黒色腫、膵臓がん、肺がん、ＨＢＶ誘発性肝細胞癌又は多発性骨髄腫に対する、実施形態４９に記載の方法。

【0323】

５１．実施形態１～４１のいずれかに記載の併用療法、実施形態４２～４７のいずれかに記載の細胞及び／又は実施形態４８～５０のいずれかに記載の方法を実施するための成分を含むキット。

【0324】

（ＸＩ）最終パラグラフ。本明細書に提供されている核酸及びアミノ酸配列は、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２において規定され、ＷＩＰＯ Ｓｔａｎｄａｒｄ ＳＴ．２５（１９９８年）、付録２、表１及び３の表に示されているヌクレオチド塩基及びアミノ酸残基についての略号を使用して示されている。各核酸配列の１つの鎖だけが示されているが、適切である実施形態では相補鎖も含まれるものとして理解される。

【0325】

本明細書で明示的に提供されていない範囲で、本明細書で開示されているタンパク質についてのコード配列、及び本明細書で開示されているコード配列についてのタンパク質配列は、当業者により、容易に導出され得る。

【0326】

本明細書で開示及び参照されている配列のバリアントも含まれる。生物活性を失わずにどのアミノ酸残基を置換、挿入、又は削除できるかを決定する指針は、ＤＮＡＳＴＡＲ（商標）（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）ソフトウェアなどの当該技術分野において周知のコンピュータープログラムを使用して見出すことができる。好ましくは、本明細書に開示されているタンパク質バリアントにおけるアミノ酸変化は、保存的アミノ酸変化、すなわち、同様に帯電したか、又は帯電していないアミノ酸の置換である。保存的アミノ酸変化には、それらの側鎖において関連するアミノ酸ファミリーの１つの置換が含まれる。

【0327】

ペプチド又はタンパク質において、アミノ酸の適切な保存的置換は当業者に公知であり、一般に、得られる分子の生物学的活性を変化させずに行うことができる。当業者は、一般に、ポリペプチドの非必須領域における単一のアミノ酸置換が、生物学的活性を実質的に変化させないことを認識する（例えば、Ｗａｔｓｏｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ、第４版、１９８７年、Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂ．Ｃｏ．、２２４頁を参照のこと。）。天然に存在するアミノ酸は、一般に、以下のような保存的置換ファミリーに分類される：群１：アラニン（Ａｌａ）、グリシン（Ｇｌｙ）、セリン（Ｓｅｒ）及びトレオニン（Ｔｈｒ）；群２：（酸性）：アスパラギン酸（Ａｓｐ）及びグルタミン酸（Ｇｌｕ）；群３：（酸性；極性負電荷残基及びそれらのアミドとしても分類される）：アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、Ａｓｐ及びＧｌｕ；群４：Ｇｌｎ及びＡｓｎ；群５：（塩基性；極性正電荷残基としても分類される）：アルギニン（Ａｒｇ）、リジン（Ｌｙｓ）及びヒスチジン（Ｈｉｓ）；群６（大きな脂肪族、非極性残基）：イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、バリン（Ｖａｌ）及びシステイン（Ｃｙｓ）；群７（非電荷極性）：チロシン（Ｔｙｒ）、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ及びＴｈｒ；群８（大きな芳香族残基）：フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）及びＴｙｒ；群９（非極性）：プロリン（Ｐｒｏ）、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ及びＴｒｐ；群１１（脂肪族）：Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＩｌｅ；群１０（小さな脂肪族、非極性又はわずかに極性の残基）：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ及びＧｌｙ；並びに群１２（硫黄含有）：Ｍｅｔ及びＣｙｓ。さらなる情報は、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８４年）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙに見出され得る。

【0328】

このような変更を行う場合、アミノ酸のハイドロパシー指数が考慮され得る。相互作用的な生物学的機能をタンパク質に付与する上でのハイドロパシーアミノ酸指数の重要性は、当該技術分野において一般に理解されている（Ｋｙｔｅ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７（１）、１０５～３２頁）。各アミノ酸には、その疎水性特徴及び電荷特徴に基づいてハイドロパシー指数が割り当てられている（Ｋｙｔｅ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２年）。これらの値は下記のものである：Ｉｌｅ（＋４．５）、Ｖａｌ（＋４．２）、Ｌｅｕ（＋３．８）、Ｐｈｅ（＋２．８）、Ｃｙｓ（＋２．５）、Ｍｅｔ（＋１．９）、Ａｌａ（＋１．８）、Ｇｌｙ（－０．４）、Ｔｈｒ（－０．７）、Ｓｅｒ（－０．８）、Ｔｒｐ（－０．９）、Ｔｙｒ（－１．３）、Ｐｒｏ（－１．６）、Ｈｉｓ（－３．２）、グルタミン酸（－３．５）、Ｇｌｎ（－３．５）、アスパラギン酸（－３．５）、Ａｓｎ（－３．５）、Ｌｙｓ（－３．９）及びＡｒｇ（－４．５）。

【0329】

当該技術分野では、ある特定のアミノ酸を同様のハイドロパシー指数又はスコアを有する他のアミノ酸によって置換し、同様の生物学的活性を有するタンパク質を依然として得ることができること、すなわち、生物学的機能的に同等のタンパク質を依然として得ることができることが知られている。そのような変更を行う場合、ハイドロパシー指数が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるアミノ酸の置換が特に好ましく、±０．５以内であるアミノ酸の置換がさらに特に好ましい。当該技術分野において、同様のアミノ酸の置換は、親水性に基づいても効率的に行われ得ることも理解される。

【0330】

ＵＳ４，５５４，１０１に詳述されているように、アミノ酸残基には下記の親水性値が割り当てられている：Ａｒｇ（＋３．０）、Ｌｙｓ（＋３．０）、アスパラギン酸（＋３．０±１）、グルタミン酸（＋３．０±１）、Ｓｅｒ（＋０．３）、Ａｓｎ（＋０．２）、Ｇｌｎ（＋０．２）、Ｇｌｙ（０）、Ｔｈｒ（－０．４）、Ｐｒｏ（－０．５±１）、Ａｌａ（－０．５）、Ｈｉｓ（－０．５）、Ｃｙｓ（－１．０）、Ｍｅｔ（－１．３）、Ｖａｌ（－１．５）、Ｌｅｕ（－１．８）、Ｉｌｅ（－１．８）、Ｔｙｒ（－２．３）、Ｐｈｅ（－２．５）、Ｔｒｐ（－３．４）。アミノ酸を同様の親水性値を有する別のアミノ酸に置換し、生物学的に同等のタンパク質、具体的には免疫学的に同等のタンパク質を依然として得ることができることは理解される。そのような変更では、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、親水性値が±１以内であるアミノ酸の置換が特に好ましく、親水性値が±０．５以内であるアミノ酸の置換がさらに特に好ましい。

【0331】

上に概要が示されているように、アミノ酸置換は、アミノ酸側鎖置換基の関連類似性、例えば、その疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づくものであり得る。

【0332】

他の箇所に示されているように、遺伝子配列のバリアントには、コドン最適化バリアント、配列多型、スプライスバリアント及び／又は統計的に有意な程度にコードタンパク質の機能に影響を与えない変異が含まれ得る。

【0333】

本明細書に開示されているタンパク質、核酸及び遺伝子配列のバリアントには、本明細書に開示されているタンパク質、核酸又は遺伝子配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、８０％の配列同一性、８５％の配列、９０％の配列同一性、９５％の配列同一性、９６％の配列同一性、９７％の配列同一性、９８％の配列同一性又は９９％の配列同一性を有する配列も含まれる。

【0334】

「配列同一性％」とは、２つ以上の配列を比較することによって決定されるそれらの配列の間の関連性を指す。当該技術分野では、「同一性」は、タンパク質配列の鎖間の一致、核酸配列の鎖間の一致又は遺伝子配列の鎖間の一致によって決定されるそのような配列の間の配列関連度も意味する。「同一性」（「類似性」と称されることが多い）は、公知の方法によって容易に計算され得、こうした方法には、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．、ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９８８年）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．、ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９９４年）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．及びＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．、ｅｄｓ．）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、ＮＪ（１９９４年）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ，Ｇ．、ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８７年）；並びにＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．及びＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．、ｅｄｓ．）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９９２年）に記載されているものが含まれる。同一性を決定するための好ましい方法は、被検配列間の一致が最良となるように設計される。同一性及び類似性を決定するための方法は、公的に利用可能なコンピュータープログラムにおいて体系化されている。配列アライメント及び同一性パーセント計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）のＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを使用して実施され得る。デフォルトパラメーター（ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝１０）を用いて、Ｃｌｕｓｔａｌアライメント法（Ｈｉｇｇｉｎｓ及びＳｈａｒｐ ＣＡＢＩＯＳ、５、１５１～１５３頁（１９８９年））を使用して多重配列アライメントも実施され得る。関連プログラムには、ＧＣＧプログラムスイート（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）；ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３～４１０頁（１９９０年）；ＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）；及びＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムが組み込まれたＦＡＳＴＡプログラム（Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４年）、Ｍｅｅｔｉｎｇ Ｄａｔｅ １９９２年、１１１～２０頁、編集者：Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ、出版社：Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．）も含まれる。本開示の文脈内では解析に配列解析ソフトウェアが使用される場合、解析の結果は言及プログラムの「デフォルト値」に基づくものであることが理解される。本明細書で使用される場合、「デフォルト値」は、任意の一連の値又はパラメーターを意味し、こうした一連の値又はパラメーターは、最初の初期化時にソフトウェアに最初に設定されるものである。

【0335】

バリアントには、本明細書に開示された配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の下でハイブリダイズし、参照配列と同じ機能を与える核酸分子も含まれる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例には、５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭのＮａＣｌ、７５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート溶液、１０％の硫酸デキストラン及び２０μｇ／ｍｌの変性断片化サケ精子ＤＮＡを含む４２℃の溶液中で一晩のインキュベートを行い、その後に５０℃の０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄するものが含まれる。ハイブリダイゼーション及びシグナル検出のストリンジェンシーの変更は、ホルムアミド濃度（ホルムアミドのパーセントを下げるとストリンジェンシーが低下する。）、塩条件又は温度を操作することによって主に達成される。例えば、中程度に高いストリンジェンシー条件には、６×ＳＳＰＥ（２０×ＳＳＰＥ＝３ＭのＮａＣｌ、０．２ＭのＮａＨ２ＰＯ４、０．０２ＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、０．５％のＳＤＳ、３０％のホルムアミド、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ブロッキングＤＮＡを含む３７℃の溶液中で一晩のインキュベートを行い、その後に１×ＳＳＰＥ、０．１％のＳＤＳを用いて５０℃での洗浄を行うものが含まれる。さらに、ストリンジェンシーをさらに下げるには、ストリンジェントなハイブリダイゼーションの後に実施される洗浄が、塩濃度を高めて（例えば、５×ＳＳＣ）行われ得る。上記の条件の変形形態は、ハイブリダイゼーション実験でのバックグラウンドの抑制に使用される代替のブロッキング試薬を含め、及び／又はそれで置き換えることによって達成され得る。典型的なブロッキング試薬には、デンハート試薬、ＢＬＯＴＴＯ、ヘパリン、変性サケ精子ＤＮＡ及び商業的に利用可能な専売製剤が含まれる。特定のブロッキング試薬を含めるには、適合性に関する問題に起因して上記のハイブリダイゼーション条件を改変する必要があり得る。

【0336】

「特異的に結合する」とは、結合ドメイン（例えば、ＣＡＲ結合ドメイン又はナノ粒子選択細胞をターゲティングするリガンドのもの）とその対応結合分子とが、関連環境試料中のいずれの他の分子又は成分とも顕著に会合することなく１０^５Ｍ^－１以上の親和性又はＫ_ａ（すなわち、１／Ｍの単位を有する特定の結合相互作用の平衡結合定数）で会合することを指す。「特異的に結合する」とは、本明細書において「結合する」とも称される。結合ドメインは、「高親和性」又は「低親和性」として分類され得る。特定の実施形態では、「高親和性」結合ドメインとは、Ｋ_ａが少なくとも１０^７Ｍ^－１、少なくとも１０^８Ｍ^－１、少なくとも１０^９Ｍ^－１、少なくとも１０^１０Ｍ^－１、少なくとも１０^１１Ｍ^－１、少なくとも１０^１２Ｍ^－１又は少なくとも１０^１３Ｍ^－１である結合ドメインを指す。特定の実施形態では、「低親和性」結合ドメインとは、Ｋ_ａが最大１０^７Ｍ^－１、最大１０^６Ｍ^－１、最大１０^５Ｍ^－１である結合ドメインを指す。或いは、親和性は、Ｍの単位を有する特定の結合相互作用の平衡解離定数（Ｋ_ｄ）（例えば、１０^－５Ｍ～１０^－１３Ｍ）として定義され得る。ある特定の実施形態では、結合ドメインは、「親和性の増強」が行われたものであり得、これは、野生型（又は親）結合ドメインより対応結合分子への結合が強まるように結合ドメインが選択又は操作されることを指す。例えば、親和性の増強は、参照結合ドメインより対応結合分子に対するＫ_ａ（平衡会合定数）が大きいことに起因し得るか、又は参照結合ドメインのものより対応結合分子に対するＫ_ｄ（解離定数）が小さいことに起因し得るか、又は参照結合ドメインのものより対応結合分子に対するｏｆｆ速度（Ｋ_ｏｆｆ）が低いことに起因し得る。特定の対応結合分子に特異的に結合する結合ドメインを検出するため、並びに結合親和性を決定するための様々なアッセイ、例えば、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ及びＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）分析が知られている（例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄら、１９４９年、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０頁；及びＵＳ５，２８３，１７３、ＵＳ５，４６８，６１４又は同等の文献も参照のこと。）。

【0337】

別段の指定がない限り、本開示の実施は、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学及び組換えＤＮＡの従来の技術を用いることができる。これらの方法は、下記の刊行物に記載されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９年）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、（１９８７年）；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ＩＮ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｍ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら、ＰＣＲ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９１年）；ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら、ｅｄｓ．ＰＣＲ ２：Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、（１９９５年）；Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、ｅｄｓ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、（１９８８年）；並びにＲ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、ｅｄ．Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（１９８７年）を参照のこと。

【0338】

当業者によって理解されるように、本明細書に開示された各実施形態は、その特定の記載の要素、工程、成分又は構成要素を含む、それから本質的になるか、又はそれからなり得る。したがって、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」又は「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）、からなるか、又はから本質的になる」を記載するものと解釈すべきである。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という移行用語は、主要量である場合でさえも、不特定の要素、工程、成分又は構成要素を含むこと、それに限定されないこと、及びをそれ含むことが可能であることを意味する。「からなる」という移行句は、特定されない要素、工程、成分又は構成要素はいずれも除外するものである。「から本質的になる」という移行句は、特定の要素、工程、成分又は構成要素、及び実施形態に実質的に影響を与えないものに実施形態の範囲を限定するものである。実質的な影響があれば、望ましくない細胞（例えば、がん細胞）の抗原非依存性殺滅が統計的に有意に低減されることになる。

【0339】

別段の指定がない限り、本明細書及び特許請求の範囲において使用される成分量、特性、例えば、分子量、反応条件などを表す全ての数は、全ての場合において「約」という用語によって修飾されていると理解されるものとする。したがって、矛盾する指定がない限り、本明細書及び添付の特許請求の範囲に示されている数値パラメーターは、本発明によって得ようとする所望の特性に応じて変動し得る近似値である。最低でも、特許請求の範囲への均等論の適用を制限することは意図しないが、少なくとも、報告される有効桁の数を踏まえ、通常の丸め手法を適用することによって、各数値パラメーターを解釈すべきである。さらに明瞭化することが求められる場合、「約」という用語は、記載の数値又は範囲と共に使用される場合、当業者によって合理的に理解される意味を有し、すなわち、記載の値又は範囲よりいくらか多い又はいくらか少ないことを示し、記載の値の±２０％の範囲内、記載の値の±１９％の範囲内、記載の値の±１８％の範囲内、記載の値の±１７％の範囲内、記載の値の±１６％の範囲内、記載の値の±１５％の範囲内、記載の値の±１４％の範囲内、記載の値の±１３％の範囲内、記載の値の±１２％の範囲内、記載の値の±１１％の範囲内、記載の値の±１０％の範囲内、記載の値の±９％の範囲内、記載の値の±８％の範囲内、記載の値の±７％の範囲内、記載の値の±６％の範囲内、記載の値の±５％の範囲内、記載の値の±４％の範囲内、記載の値の±３％の範囲内、記載の値の±２％の範囲内又は記載の値の±１％の範囲内である。

【0340】

本発明の広い範囲を示す数値範囲及びパラメーターが近似であるかにかかわらず、具体例に示されている数値は可能な限り正確に報告されている。しかしながら、いずれの数値も、そのそれぞれの試験測定において見られる標準偏差に必然的に起因するある特定の誤差を本質的に含む。

【0341】

本発明について記載する文脈において（特に、以下の特許請求の範囲の文脈において）使用された、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、「その」という用語及び同様の指示対象は、本明細書に別段の指定がない限り、又は文脈上明確に矛盾しない限り、単数及び複数の両方を含むと解釈されるものとする。本明細書での値の範囲の記載は、単に、そうした範囲に入るそれぞれの個々の値に個別に言及することを簡潔化する方法とすることを意図するものにすぎない。本明細書に別段の指定がない限り、それぞれの個別値は、それが本明細書に個別に記載されている場合と同様に本明細書に組み込まれる。本明細書に別段の指定がない限り、又はその他の状況で文脈上明確に矛盾しない限り、本明細書に記載されている方法は全て、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書で提供されている例又は例示の言葉（例えば、「など」）のいずれか又は全ての使用は、単に、本発明の理解を容易にすることを意図するものにすぎず、そうした言葉を使用せずに請求される本発明の範囲を限定するものではない。本明細書のいずれの言葉も、本発明の実施に必要不可欠ないずれかの非請求要素を示すものとして解釈してはならない。

【0342】

本明細書に開示されている本発明の代替の要素又は実施形態を群化することは、限定とは解釈されない。それぞれの群メンバーは、個別に言及及び請求され得るか、又は他の群のメンバー若しくは本明細書に見出される他の要素との任意の組み合わせで言及及び請求され得る。利便性及び／又は特許性の理由から、群のメンバーの１つ以上が、群に含められ得るか、又は群から除外され得るものと予測される。いずれかのそのような包含又は除外が生じた場合、本明細書は、改変された群を含むものと見なされ、したがって、添付の特許請求の範囲において使用される全てのマーカッシュ群の記述を満たす。

【0343】

本発明の実施に最良の様式であると本発明者らが認識するものを含めて、本明細書には本発明のある特定の実施形態が記載されている。当然のことながら、前述の説明を読めば、こうした記載の実施形態に対する変形形態が当業者に明らかになる。本発明者らは、そのような変形形態を当業者が必要に応じて利用することを予想し、本発明者らは、本明細書に具体的に記載されているものとは異なる様式で本発明を実施することを意図する。したがって、本発明は、本明細書に添付される特許請求の範囲に記載の主題の改変形態及び均等物を全て、適用法によって許容されるものとして含む。さらに、本明細書に別段の指定がない限り、又はその他の状況で文脈上明確に矛盾しない限り、上記の要素の任意の組合せがその可能な全ての変形形態において本発明に含まれる。

【0344】

さらに、本明細書を通じて特許、印刷刊行物、学術論文及び他の文書（本明細書での参照物）への参照が多数なされている。そうした参照物はそれぞれ、それらの全体がそれらの参照教示内容を対象として参照によって本明細書に個別に組み込まれる。

【0345】

最後に、本明細書に開示されている本発明の実施形態は本発明の原理を例示するものであることが理解される。利用され得る他の改変形態も本発明の範囲に含まれる。したがって、例として、限定されないが、本明細書の教示内容に従って本発明の代替構成が利用され得る。したがって、本発明は、明確に提示及び記載されているものに限定されない。

【0346】

本明細書に示されている詳細は例としてのものであり、本発明の好ましい実施形態の例示的な議論を目的とするものにすぎず、本発明の様々な実施形態の原理及び概念的側面の説明として最も有用かつ理解が容易であると考えられるものを提供するために提示される。この点に関して、本発明の基礎的理解に必要なものよりも詳細に本発明の構造詳細を示そうとしているわけではなく、説明を図面及び／又は例と併用することで、本発明のいくつかの形態が実施の際にどのように具体化し得るかを当業者に明らかにしようとするものである。

【0347】

本開示において使用される定義及び説明は、例の中で明確かつ曖昧さを残さずに改変されない限り、又は意味を適用するといずれかの解釈が無意味若しくは本質的に無意味となる場合、任意の将来の解釈において優先される意図及び意向を有するものである。用語の解釈を当てはめると当該用語が無意味又は本質的に無意味になる場合、Ｗｅｂｓｔｅｒ’ｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ、第３版又は当業者に知られている辞書、例えば、Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｄｓ．Ａｔｔｗｏｏｄ Ｔら、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、２００６年）から定義が取得されるものとする。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図2F】

【図2G】

【図2H】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6】

【図7-1】

【図7-2】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図10】

【図11-1】

【図11-2】

【図11-3】

【図11-4】

【図11-5】

【図11-6】

【図11-7】

【図11-8】

【配列表】

2023519970000001.app

【国際調査報告】