特表 2023-520080 ＣＯＶＩＤ－１９に対する保護のための弱毒化されたポックスウイルスベクターをベースとするワクチン

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-05-15

(54)【発明の名称】ＣＯＶＩＤ－１９に対する保護のための弱毒化されたポックスウイルスベクターをベースとするワクチン

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/76 20150101AFI20230508BHJP

   C12N 15/10 20060101ALI20230508BHJP

   C12N 15/863 20060101ALI20230508BHJP

   C12N 15/50 20060101ALI20230508BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20230508BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20230508BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20230508BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20230508BHJP

【ＦＩ】

A61K35/76

C12N15/10 200Z

C12N15/863 Z ZNA

C12N15/50

C12N7/01

A61K48/00

A61P31/14

A61P37/04

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022560153

(86)(22)【出願日】2021-03-29

(85)【翻訳文提出日】2022-11-17

(86)【国際出願番号】 AU2021050274

(87)【国際公開番号】W WO2021195694

(87)【国際公開日】2021-10-07

(31)【優先権主張番号】63/003,012

(32)【優先日】2020-03-31

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/066,927

(32)【優先日】2020-08-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

２．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】515260184

【氏名又は名称】セメンティス リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100069556

【弁理士】

【氏名又は名称】江崎 光史

(74)【代理人】

【識別番号】100111486

【弁理士】

【氏名又は名称】鍛冶澤 實

(74)【代理人】

【識別番号】100139527

【弁理士】

【氏名又は名称】上西 克礼

(74)【代理人】

【識別番号】100164781

【弁理士】

【氏名又は名称】虎山 一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100221981

【弁理士】

【氏名又は名称】石田 大成

(72)【発明者】

【氏名】プラウ・ナタリー

(72)【発明者】

【氏名】ハウリー・ポール

(72)【発明者】

【氏名】クーパー・タマラ

(72)【発明者】

【氏名】ヘイボール・ジョン・ディー

(72)【発明者】

【氏名】ディーナー・ケリリン・アール

(72)【発明者】

【氏名】リュー・リャン

(72)【発明者】

【氏名】エルディ・プリーティ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA95X

4B065AB01

4B065AC14

4B065AC20

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA45

4C084AA13

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZB091

4C084ZB092

4C084ZB331

4C084ZB332

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087MA66

4C087NA14

4C087ZB09

4C087ZB33

(57)【要約】

本発明は、コロナウイルス感染のリスクを防ぐかまたは減少させ、ならびに疾患の重症度を減少させる、動物における免疫反応を高めるための組成物に関する。特に、本発明は、世界保健機関によってＣＯＶＩＤ－１９と命名されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２疾患のリスクを防ぐかまたは減少させる、動物における免疫反応を高めるためのワクチンおよび／または免疫原性組成物に関する。当該組成物は、弱毒化されたポックスウイルス、とりわけ、ワクシニアウイルスを含み、当該弱毒化されたポックスウイルスゲノムは、スパイクタンパク質ポリペプチドおよび／もしくは膜タンパク質ポリペプチドおよび／もしくはヌクレオカプシドタンパク質ポリペプチドおよび／もしくはエンベロープタンパク質ポリペプチドまたはこれらのいずれかの免疫原性部分もしくは機能性部分をコードするコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸配列を含む。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルス疾患のリスクを防ぐかまたは減少させる、動物における免疫反応を高めるための組成物であって、前記組成物は、遺伝的に操作された弱毒化されたワクシニアウイルスを含み、ワクシニアウイルスゲノムは、スパイクタンパク質ポリペプチドまたはその免疫原性部分、膜タンパク質ポリペプチドまたはその免疫原性部分、ヌクレオカプシドタンパク質ポリペプチドまたはその免疫原性部分およびエンベロープタンパク質ポリペプチドまたはその免疫原性部分からなる群から選択される少なくとも１つのヒトコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ポリペプチドをコードする核酸配列を含み、弱毒化されたワクシニアウイルスは、内因性の必須のアセンブリまたは成熟タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の欠失を含む、前記組成物。

【請求項2】

弱毒化されたワクシニアウイルスゲノムが、ヒトコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質ポリペプチドまたはその免疫原性部分をコードする核酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

弱毒化されたワクシニアウイルスゲノムが、ヒトコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の膜タンパク質ポリペプチドまたはその免疫原性部分をコードする核酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項4】

弱毒化されたワクシニアウイルスゲノムが、ヒトコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヌクレオカプシドタンパク質ポリペプチドまたはその免疫原性部分をコードする核酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項5】

弱毒化されたワクシニアウイルスゲノムが、ヒトコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の膜タンパク質ポリペプチドまたはその免疫原性部分およびヌクレオカプシドタンパク質ポリペプチドまたはその免疫原性部分をコードする核酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項6】

弱毒化されたワクシニアウイルスゲノムが、ヒトコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質ポリペプチドまたはその免疫原性部分および膜タンパク質ポリペプチドまたはその免疫原性部分およびヌクレオカプシドタンパク質ポリペプチドまたはその免疫原性部分をコードする核酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項7】

弱毒化されたワクシニアウイルスゲノムが、ヒトコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクポリペプチドまたはその免疫原性部分および膜タンパク質ポリペプチドまたはその免疫原性部分およびヌクレオカプシドタンパク質ポリペプチドまたはその免疫原性部分およびエンベロープタンパク質ポリペプチドまたはその免疫原性部分をコードする核酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項8】

少なくとも１つのヒトコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ポリペプチドをコードする核酸配列が、ＣＯＰ－Ｃ２３Ｌ、ＣＯＰ－Ｂ２９Ｒ、ＣＯＰ－Ｃ３Ｌ、ＣＯＰ－Ｎ１Ｌ、ＣＯＰ－Ａ３５Ｒ、ＣＯＰ－Ａ３９Ｒ、ＣＯＰ－Ａ４１Ｌ、ＣＯＰ－Ａ４４Ｒ、ＣＯＰ－Ａ４６Ｒ、ＣＯＰ－Ｂ７Ｒ、ＣＯＰ－Ｂ８Ｒ、ＣＯＰ－Ｂ１３Ｒ、ＣＯＰ－Ｂ１６ＲおよびＣＯＰ－Ｂ１９Ｒからなる群から選択される１つまたは複数の免疫調節性遺伝子の欠失されたＯＲＦに挿入されている、請求項１に記載の組成物。

【請求項9】

少なくとも１つのヒトコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ポリペプチドをコードする核酸配列が、弱毒化されたワクシニアウイルスゲノムの遺伝子間領域（ＩＧＲ）に挿入され、前記ＩＧＲがワクシニアウイルスゲノムの２つの隣接するＯＲＦの間に位置するかまたはそれらに隣接している、請求項１に記載の組成物。

【請求項10】

弱毒化されたワクシニアウイルスゲノムのＩＧＲが、Ｆ９Ｌ－Ｆ１０Ｌ、Ｆ１２Ｌ－Ｆ１３Ｌ、Ｆ１７Ｒ－Ｅ１Ｌ、Ｅ１Ｌ－Ｅ２Ｌ、Ｅ８Ｒ－Ｅ９Ｌ、Ｅ９Ｌ－Ｅ１０Ｒ、Ｉ１Ｌ－Ｉ２Ｌ、Ｉ２Ｌ－Ｉ３Ｌ、Ｉ５Ｌ－Ｉ６Ｌ、Ｉ６Ｌ－Ｉ７Ｌ、Ｉ７Ｌ－Ｉ８Ｒ、Ｉ８Ｒ－Ｇ１Ｌ、Ｇ１Ｌ－Ｇ３Ｌ、Ｇ３Ｌ－Ｇ２Ｒ、Ｇ２Ｒ－Ｇ４Ｌ、Ｇ４Ｌ－Ｇ５Ｒ、Ｇ５Ｒ－Ｇ５．５Ｒ、Ｇ５．５Ｒ－Ｇ６Ｒ、Ｇ６Ｒ－Ｇ７Ｌ、Ｇ７Ｌ－Ｇ８Ｒ、Ｇ８Ｒ－Ｇ９Ｒ、Ｇ９Ｒ－Ｌ１Ｒ、Ｌ１Ｒ－Ｌ２Ｒ、Ｌ２Ｒ－Ｌ３Ｌ、Ｌ３Ｌ－Ｌ４Ｒ、Ｌ４Ｒ－Ｌ５Ｒ、Ｌ５Ｒ－Ｊ１Ｒ、Ｊ３Ｒ－Ｊ４Ｒ、Ｊ４Ｒ－Ｊ５Ｌ、Ｊ５Ｌ－Ｊ６Ｒ、Ｊ６Ｒ－Ｈ１Ｌ、Ｈ１Ｌ－Ｈ２Ｒ、Ｈ２Ｒ－Ｈ３Ｌ、Ｈ３Ｌ－Ｈ４Ｌ、Ｈ４Ｌ－Ｈ５Ｒ、Ｈ５Ｒ－Ｈ６Ｒ、Ｈ６Ｒ－Ｈ７Ｒ、Ｈ７Ｒ－Ｄ１Ｒ、Ｄ１Ｒ－Ｄ２Ｌ、Ｄ２Ｌ－Ｄ３Ｒ、Ｄ３Ｒ－Ｄ４Ｒ、Ｄ４Ｒ－Ｄ５Ｒ、Ｄ５Ｒ－Ｄ６Ｒ、Ｄ６Ｒ－Ｄ７Ｒ、Ｄ９Ｒ－Ｄ１０Ｒ、Ｄ１０Ｒ－Ｄ１１Ｌ、Ｄ１１Ｌ－Ｄ１２Ｌ、Ｄ１２Ｌ－Ｄ１３Ｌ、Ｄ１３Ｌ－Ａ１Ｌ、Ａ１Ｌ－Ａ２Ｌ、Ａ２Ｌ－Ａ２．５Ｌ、Ａ２．５Ｌ－Ａ３Ｌ、Ａ３Ｌ－Ａ４Ｌ、Ａ４Ｌ－Ａ５Ｒ、Ａ５Ｒ－Ａ６Ｌ、Ａ６Ｌ－Ａ７Ｌ、Ａ７Ｌ－Ａ８Ｒ、Ａ８Ｒ－Ａ９Ｌ、Ａ９Ｌ－Ａ１０Ｌ、Ａ１０Ｌ－Ａ１１Ｒ、Ａ１１Ｒ－Ａ１２Ｌ、Ａ１２Ｌ－Ａ１３Ｌ、Ａ１３Ｌ－Ａ１４Ｌ、Ａ１４Ｌ－Ａ１４．５Ｌ、Ａ１４．５Ｌ－Ａ１５Ｌ、Ａ１５Ｌ－Ａ１６Ｌ、Ａ１６Ｌ－Ａ１７Ｌ、Ａ１７Ｌ－Ａ１８Ｒ、Ａ１８Ｒ－Ａ１９Ｌ、Ａ１９Ｌ－Ａ２１Ｌ、Ａ２１Ｌ－Ａ２０Ｒ、Ａ２０Ｒ－Ａ２２Ｒ、Ａ２２Ｒ－Ａ２３Ｒ、Ａ２３Ｒ－Ａ２４Ｒ、Ａ２８Ｌ－Ａ２９ＬおよびＡ２９Ｌ－Ａ３０Ｌ、００１Ｌ－００２Ｌ、００２Ｌ－００３Ｌ、００５Ｒ－００６Ｒ、００６Ｌ－００７Ｒ、００７Ｒ－００８Ｌ、００８Ｌ－００９Ｌ、０１７Ｌ－０１８Ｌ、０１８Ｌ－０１９Ｌ、０１９Ｌ－０２ＯＬ、０２０Ｌ－０２１Ｌ、０２３Ｌ－０２４Ｌ、０２４Ｌ－０２５Ｌ、０２５Ｌ－０２６Ｌ、０２８Ｒ－０２９Ｌ、０３ＯＬ－０３１Ｌ、０３１Ｌ－０３２Ｌ、０３２Ｌ－０３３Ｌ、０３５Ｌ－０３６Ｌ、０３６Ｌ－０３７Ｌ、０３７Ｌ－０３８Ｌ、０３９Ｌ－０４０Ｌ、０４３Ｌ－０４４Ｌ、０４４Ｌ－０４５Ｌ、０４６Ｌ－０４７Ｒ、０４９Ｌ－０５０Ｌ、０５０Ｌ－０５１Ｌ、０５１Ｌ－０５２Ｒ、０５２Ｒ－０５３Ｒ、０５３Ｒ－０５４Ｒ、０５４Ｒ－０５５Ｒ、０５５Ｒ－０５６Ｌ、０６１Ｌ－０６２Ｌ、０６４Ｌ－０６５Ｌ、０６５Ｌ－０６６Ｌ、０６６Ｌ－０６７Ｌ、０７７Ｌ－０７８Ｒ、０７８Ｒ－０７９Ｒ、０８０Ｒ－０８１Ｒ、０８１Ｒ－０８２Ｌ、０８２Ｌ－０８３Ｒ、０８５Ｒ－０８６Ｒ、０８６Ｒ－０８７Ｒ、０８８Ｒ－０８９Ｌ、０８９Ｌ－０９０Ｒ、０９２Ｒ－０９３Ｌ、０９４Ｌ－０９５Ｒ、０９６Ｒ－０９７Ｒ、０９７Ｒ－０９８Ｒ、１０１Ｒ－１０２Ｒ、１０３Ｒ－１０４Ｒ、１０５Ｌ－１０６Ｒ、１０７Ｒ－１０８Ｌ、１０８Ｌ－１０９Ｌ、１０９Ｌ－１１０Ｌ、１１０Ｌ－１１１Ｌ、１１３Ｌ－１１４Ｌ、１１４Ｌ－１１５Ｌ、１１５Ｌ－１１６Ｒ、１１７Ｌ－１１８Ｌ、１１８Ｌ－１１９Ｒ、１２２Ｒ－１２３Ｌ、１２３Ｌ－１２４Ｌ、１２４Ｌ－１２５Ｌ、１２５Ｌ－１２６Ｌ、１３３Ｒ－１３４Ｒ、１３４Ｒ－１３５Ｒ、１３６Ｌ－１３７Ｌ、１３７Ｌ－１３８Ｌ、１４１Ｌ－１４２Ｒ、１４３Ｌ－１４４Ｒ、１４４Ｒ－１４５Ｒ、１４５Ｒ－１４６Ｒ、１４６Ｒ－１４７Ｒ、１４７Ｒ－１４８Ｒ、１４８Ｒ－１４９Ｌ、１５２Ｒ－１５３Ｌ、１５３Ｌ－１５４Ｒ、１５４Ｒ－１５５Ｒ、１５６Ｒ－１５７Ｌ、１５７Ｌ－１５８Ｒ、１５９Ｒ－１６０Ｌ、１６０Ｌ－１６１Ｒ、１６２Ｒ－１６３Ｒ、１６３Ｒ－１６４Ｒ、１６４Ｒ－１６５Ｒ、１６５Ｒ－１６６Ｒ、１６６Ｒ－１６７Ｒ、１６７Ｒ－１６８Ｒ、１７０Ｒ－１７１Ｒ、１７３Ｒ－１７４Ｒ、１７５Ｒ－１７６Ｒ、１７６Ｒ－１７７Ｒ、１７８Ｒ－１７９Ｒ、１７９Ｒ－１８０Ｒ、１８０Ｒ－１８１Ｒ、１８３Ｒ－１８４Ｒ、１８４Ｒ－１８５Ｌ、１８５Ｌ－１８６Ｒ、１８６Ｒ－１８７Ｒ、１８７Ｒ－１８８Ｒ、１８８Ｒ－１８９Ｒ、１８９Ｒ－１９０Ｒおよび１９２Ｒ－１９３Ｒからなる群から選択される、請求項９に記載の組成物。

【請求項11】

弱毒化されたワクシニアウイルスが、ワクシニアウイルスＡ４１Ｌ遺伝子、ワクシニアウイルスＤ１３Ｌ遺伝子、ワクシニアウイルスＢ７Ｒ－Ｂ８Ｒ遺伝子、ワクシニアウイルスＡ３９Ｒ遺伝子およびワクシニアウイルスＣ３Ｌ遺伝子からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の欠失を含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項12】

ヒトコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列が、１つまたは複数の遺伝子の少なくとも１つの欠失部位に挿入されている、請求項１１に記載の組成物。

【請求項13】

ヒトコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質ポリペプチドまたはその免疫原性部分が、ワクシニアウイルスＡ４１Ｌ遺伝子欠失部位に挿入されている、請求項１２に記載の組成物。

【請求項14】

ヒトコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の膜タンパク質ポリペプチドまたはその免疫原性部分およびヌクレオカプシドタンパク質ポリペプチドまたはその免疫原性部分が、ワクシニアウイルスＤ１３Ｌ遺伝子欠失部位に挿入されている、請求項１２に記載の組成物。

【請求項15】

ヒトコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質ポリペプチドまたはその免疫原性部分が、ワクシニアウイルスＢ７Ｒ－Ｂ８Ｒ遺伝子欠失部位に挿入されている、請求項１２に記載の組成物。

【請求項16】

ヒトコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８からなる群から選択される核酸配列を有する１つまたは複数の発現カセットによってコードされる、請求項１２に記載の組成物。

【請求項17】

薬学的に許容可能な担体または希釈剤を含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項18】

コロナウイルス疾患のリスクを減少させる、動物における免疫反応を高めるための組成物であって、前記組成物は、遺伝的に操作された弱毒化されたワクシニアウイルスを含み、ワクシニアウイルスゲノムは、ヒトコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質ポリペプチドまたはその免疫原性部分をコードする核酸配列を含み、弱毒化されたワクシニアウイルスは、内因性の必須のアセンブリまたは成熟タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の欠失を含み、第２の遺伝的に操作された弱毒化されたワクシニアウイルスと混合されており、第２のワクシニアウイルスゲノムは、ヒトコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の膜タンパク質ポリペプチドおよびヌクレオカプシドタンパク質ポリペプチドまたはそれらの免疫原性部分（１つまたは複数）をコードする核酸配列を含み、第２の弱毒化されたワクシニアウイルスは、内因性の必須のアセンブリまたは成熟タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の欠失を含む、前記組成物。

【請求項19】

遺伝的に操作された弱毒化されたワクシニアウイルスベクターであって、ワクシニアウイルスゲノムが、ヒトコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質ポリペプチド、膜タンパク質ポリペプチドおよびヌクレオカプシドタンパク質ポリペプチド、および／またはエンベロープタンパク質ポリペプチドをコードする核酸配列を含み、前記弱毒化されたワクシニアウイルスベクターは、ウイルス様粒子へとアセンブルされる前記のポリペプチドを発現する、前記の弱毒化されたワクシニアウイルスベクター。

【請求項20】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染のリスクを防ぐかまたは減少させる方法であって、請求項１に記載の組成物を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫反応を誘発するために有効な量で、ヒトを含む動物に投与することを含む方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、コロナウイルス感染のリスクを防ぐかまたは減少させ、ならびに疾患の重症度を減少させる、動物における免疫反応を高めるための組成物に関する。特に、本発明は、世界保健機関によってＣＯＶＩＤ－１９と命名されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２疾患のリスクを防ぐかまたは減少させる、動物における免疫反応を高めるためのワクチンおよび／または免疫原性組成物に関する。当該組成物は、弱毒化されたポックスウイルス、とりわけ、ワクシニアウイルスを含み、この場合、弱毒化されたポックスウイルスゲノムは、スパイクタンパク質ポリペプチドおよび／もしくは膜タンパク質ポリペプチドおよび／もしくはヌクレオカプシドタンパク質ポリペプチドおよび／もしくはエンベロープタンパク質ポリペプチドまたはこれらのいずれかの免疫原性部分もしくは機能性部分をコードするコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸配列を含む。

【背景技術】

【0002】

本明細書における参考文献の図書目録詳細については、本明細書の終わりに列挙する。

【0003】

任意の先行する刊行物（またはそれらから得られる情報）、または既知のいかなる事項に対する本明細書における参照も、先行の刊行物（またはそれらから得られる情報）または既知の事項が、本明細書が関係する努力傾注分野における共通の一般的知識の一環を成すことの承認または是認または任意の形態の提案ではなく、ならびにそのように受け取られるべきではない。

【0004】

本明細書において言及される全ての刊行物は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。

【0005】

当該ポックスウイルスファミリーは、２つのサブファミリーであるコルドポックスウイルス亜科（Ｃｈｏｒｄｏｐｏｘｖｉｒｉｎａｅ）およびエントモポックスウイルス亜科（Ｅｎｔｏｍｏｐｏｘｖｉｒｉｎａｅ）を含む。コルドポックスウイルス亜科は、男性に感染する種を含むオルトポックスウイルス科（Ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、痘瘡ウイルス、すなわち天然痘の原因因子、牛痘ウイルス（１７９６年にＪｅｎｎｅｒによって報告されたオリジナルの天然痘ワクチンを形成する）、ワクシニアウイルス（第二世代天然痘ワクチンとして使用される）、およびサル痘ウイルス）、および鳥に感染する種を含むアビポックスウイルス科（Ａｖｉｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ）ウイルス、例えば、鶏痘ウイルスおよびカナリア痘ウイルスなど、を含む８つの属を含む。天然痘ワクチンでの抗原としてのそれらの使用に加えて、「バックボーン」ベクターとしての組換えワクシニアベースのウイルスおよびアビポックスウイルスの使用に大きな関心が寄せられている。細胞質内ベクターとして、オルトポックスウイルス科は、とりわけ、宿主免疫システムによる認識のために宿主細胞質における外来抗原の産生を誘導することができる。外来抗原を発現するそのようなベクターは、例えば、ＡＩＤＳ、結核、マラリア、および他のワクチン接種戦略によって治療することが困難であると判明しているがんなどの疾患のためのワクチンの開発において集中して研究されている。

【0006】

コルドポックスウイルス亜科は、パラポックスウイルスの１３０ｋｂからアビポックスウイルスの３００ｋｂ超までのサイズに及ぶ直鎖状二本鎖ＤＮＡゲノムを有し、宿主におけるそれらのライフサイクルは全て宿主細胞の細胞質において費やされる。ポックスウイルスは、とりわけ初期ｍＲＮＡ合成に関わるプロセスに関して、それらの宿主細胞および宿主細胞分子にほとんど関係なく作動する。しかしながら、宿主分子は、中期および後期ウイルス転写の開始または終了のために使用されるようである。ポックスウイルスは、細胞状態をウイルス複製が可能であるようにするために宿主シグナル伝達経路を明確に標的にして操作する構造的に多様な「宿主域因子」を産生する。ほとんどのポックスウイルスは、哺乳動物細胞に結合して感染することができるが、後続の感染が許容的である（感染性ビリオンを産生することができる）かまたは非許容的（感染性ビリオンを実質的に産生できない）であるかは、関与する特定のポックスウイルスおよび特定の細胞タイプに依存する。宿主域遺伝子のレビューについては、その全体が本明細書に組み入れられるＷｅｒｄｅｎら ２００８（非特許文献１）を参照されたい。

【0007】

天然痘ワクチンとしておよびその後のウイルスベクターとしてのそれらの使用に関連するワクシニアの株は、１９６０年代前半から今日まで公開されている。天然痘ワクチンとして用いられる株を含むワクシニアのある特定の株は、ヒト細胞において増殖することができ、したがって、それらは、ウイルス性脳炎の発症などの健康リスクを提示する。より安全なワクチンを開発する観点から、アンカラ由来のワクシニア株（「ＣＶＡ」と呼ばれる）が、非ヒト細胞において５００回以上継代された。このプロセスの間に、ワクシニアゲノムは、オリジナルのＣＶＡゲノムと比較して少なくとも６つの主要な欠失の発生を伴って、大きく変化した。改変された当該ウイルスは、哺乳動物細胞において、複製欠損によりほとんど病原性ではなかったが、防御免疫応答を生じさせることは依然として可能である。この弱毒化されたワクシニアウイルスは、ＭＶＡ（改変ワクシニアアンカラ）と呼ばれ、異なる継代数を有するウイルスは、遺伝的および表現型的に異なることが分かっているため、継代数によっても分類される。しかしながら、継代数５１５までに、ＭＶＡ５１５は、遺伝的に安定であると特定された。１９９０年代前半に、ＭＶＡ株、例えば、ＭＶＡ５７２など、およびその派生物ＭＶＡ Ｆ６は、非許容細胞（ウイルスが増殖しない細胞）において高レベルでワクシニアタンパク質および非相同（組換え）タンパク質を発現することができることが観察され、それは、関心対象の非相同分子、例えば、ワクチンまたは治療法送達のための抗原をコードするものなど、のためのベクターとしてのＭＶＡの開発を可能にした。ＭＶＡは、ポックスウイルス（ｐｏｘｖｉｒａｌ）ワクチンベクターシステムの中でも最も研究されているが、他のポックスウイルスは、ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣ、および鶏痘などと同様に機能するように開発された。

【0008】

Ｓｅｍｅｎｔｉｓ Ｌｔｄ，によって開発された別のワクシニアウイルスは、いわゆるＳＣＶ（Ｓｅｍｅｎｔｉｓ Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ Ｖａｃｃｉｎｉａ）ワクシニアウイルスベクターである。ＳＣＶは、ワクシニアのコペンハーゲン株を使用して作製されており、必須のウイルスアセンブリタンパク質をコードするＤ１３Ｌを欠失させ、それにより、ＳＣＶに感染性子孫を複製し産生することをできなくするように操作された。ゲノム増幅は、ＳＣＶ感染細胞において保存され、その結果、ワクチン抗原の後期発現および当該挿入された抗原に対する強い免疫反応の発生を可能にする。ＳＣＶは、それが、複製能力があるワクシニアの免疫原性を有し、試験された哺乳動物細胞を複製することができないという点において、ＭＶＡと比べていくつかの利点を有する。ＳＣＶプラットフォームは、ＭＶＡプラットフォームとは異なる２つの重要な点、すなわち、（ｉ）それは、標的とされたＤ１３Ｌ遺伝子の欠失により複製欠損性であるように特異的に操作されており、その結果、シングルショット有効性による効力を維持しつつ、より安全であること、ならびに（ｉｉ）標準的でスケーラブルな商業的細胞系において製造されるようにも設計されていること、を有する。

【0009】

コロナウイルスは、約２７～３２キロベースのプラス鎖一本鎖ＲＮＡからなるＲＮＡウイルスである。名前が示すように、球状の外部のスパイクタンパク質は、電子顕微鏡の下で観察すると、特徴的な王冠形状を示す。当該ウイルスは、ヒトを含む広範な宿主に感染することが知られている。感染した宿主は、無症状から重度の症状にまで及ぶ異なる臨床経過を示す。コロナウイルスは、コロナウイルス科ファミリーに属し、それは、４つの属：アルファ、ベータ、デルタ、およびガンマコロナウイルス、に分けられる。ＣｏＶは、一般的に、コウモリ、ラクダおよびヒトを含む多くの種の動物において見出される。時々、動物ＣｏＶは、ゲノム複製または組換えメカニズムの間のエラーによって、遺伝的突然変異を獲得することができ、さらに、それらのトロピズムをヒトへと拡大することができる。最初のヒトＣｏＶは、１９６０年半ばに発見された。合計で７つのヒトＣｏＶタイプが、ヒトの呼吸器疾患を引き起こす原因であると特定されており、それは、２つのアルファＣｏＶおよび５つのベータＣｏＶを含む。典型的には、これらのＣｏＶは、発熱、咳および息切れを含む、無症状感染から重度の急性呼吸器疾患にまで及ぶ様々な臨床症状を引き起こし得る。胃腸炎および重症度の異なる神経系疾患などの他の症状も、報告されている。

【0010】

コロナウイルスは、４つの主要な構造タンパク質：スパイク（Ｓ）タンパク質、膜（Ｍ）タンパク質、エンベロープ（Ｅ）タンパク質、およびヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質、の標準のセットを含有する。ビリオンは、ゲノムＲＮＡおよびリン酸化ヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質で構成されるヌクレオカプシドを有する。ヌクレオカプシドは、リン脂質二重層の中に埋め込まれ、スパイク（Ｓ）タンパク質で覆われている。膜（Ｍ）タンパク質およびエンベロープ（Ｅ）タンパク質は、ウイルスエンベロープにおけるＳタンパク質の間に位置する。

【0011】

スパイクタンパク質は、ウイルス表面から突出する膜貫通型の三量体糖タンパク質で構成され、それは、コロナウイルスの多様性および宿主のトロピズムを決定する。スパイクは、２つの機能的サブユニット：受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含有し、宿主細胞受容体への結合を担うＳ１サブユニットと、ウイルスと細胞膜との融合のためのＳ２サブユニットとを含む。

【0012】

コロナウイルス粒子は、構造タンパク質が挿入された脂質二重層によって囲まれた、ヌクレオカプシドリンタンパク質とウイルスゲノムＲＮＡとの相互作用によって形成されるらせん状のヌクレオカプシド構造体からなる。トリプルスパンニング（ｔｒｉｐｌｅ－ｓｐａｎｎｉｎｇ）膜糖タンパク質Ｍは、小胞体－ゴルジ中間コンパートメント（ＥＲＧＩＣ）のルーメン中へと出芽するコロナウイルスのアセンブリを駆動する。膜タンパク質は、ビリオン中に組み込まれるウイルス成分を選別する最も豊富なウイルスタンパク質である。膜オリゴマー化は、ＥＲＧＩＣ膜での膜タンパク質の格子の形成を可能にする。スパイクタンパク質およびエンベロープタンパク質は、膜タンパク質との側方相互作用によって当該格子に統合され、その一方で、ヌクレオカプシドおよびウイルスＲＮＡは、サイトゾルに晒される膜Ｃ末端ドメインと相互作用する。エンベロープタンパク質は、イオンチャネルを形成してウイルス形態形成および出芽において重要な役割を果たすビロポリン（ｖｉｒｏｐｏｒｉｎ）であるが、しかしながら、このプロセスは、これまで完全には理解されていない。ＳＡＲＳ－ＣｏＶに関する研究は、コロナウイルスゲノムからのエンベロープ遺伝子の枯渇がウイルス増殖および粒子形成を強力に減少させることを実証した。ヌクレオカプシドタンパク質は、自己会合し、ビリオン内への組み込みのためにＲＮＡゲノムをカプシドで包む。

【0013】

ヒトコロナウイルスは、呼吸器感染症を引き起こす主要な病原体の１つである。２つの非常に病原性の高いウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶおよびＭＥＲＳ－ＣｏＶは、ヒトにおいて重度の呼吸器の症候群を引き起こし、ならびに４つの他のヒトコロナウイルス（ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶＨＫＵ１）は、軽症の上気道疾患を誘発する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶは、２００２～２００３年に８４２２人の患者を伴う主要なアウトブレークを引き起こし、世界的に２９カ国に広まった。ＳＡＲＳ－ＣｏＶの伝播の鎖が台湾において阻止されたため、蔓延は２００３年７月に封じ込められ、２００４年５月以来、ヒトの症例は報告されていない。ＭＥＲＳ－ＣｏＶは、２０１２年に中東諸国に出現し、諸国内において持続的な風土病を引き起こし、散発的に、中東地域の外の諸国へと広まった。２０１９年の終わり頃、未知の呼吸器感染症の最初の報告が、武漢（中国）からもたらされた。感染源は、新型コロナウイルスとしてすぐに識別され、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と呼ばれ、このウイルスによって引き起こされる疾患は、ＣＯＶＩＤ－１９と命名された。世界保健機関は、２０２０年３月１１日にパンデミックを宣言した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、０．１６％から１．６０％にまで及ぶ感染死亡率を有し、２０２１年２月半ばまでに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、１億８２０万人に感染し、全世界で２３０万人の死亡を引き起こした。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、世界の大部分にロックダウン実施の採用を強い、それは結果として、驚くべき経済の低迷および人的被害をもたらした。

【0014】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ヒトおよび他の哺乳動物に広く分布するオルトコロナウイルス亜科（Ｏｒｔｈｏｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｎａｅ）サブファミリーに含まれる、エンベロープ化され、非セグメント化されたプラス鎖ＲＮＡウイルスである。サルベコウイルス亜属（ｓａｒｂｅｃｏｖｉｒｕｓ ｇｅｎｕｓ）の一部として、その直径は、約６５ｎｍ～１２５ｎｍであり、一本鎖ＲＮＡを含み、外部表面上の先太の糖タンパク質スパイクが、王冠様またはコロナ状の外観を当該ウイルスに与えている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、肺不全および潜在的に致命的な気道感染症を引き起こす、以前に特定されたＳＡＲＳ－ＣｏＶおよびＭＥＲＳ－ＣｏＶの後の新型のβ－コロナウイルスである。ＷＨＯは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の再生産数（ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｎｕｍｂｅｒ）（二次感染者への一次感染者１人あたりの伝播の能力を表す）が、１．４から２．５の間に及ぶと推定している。しかしながら、世界的研究によるメタ分析では、再生産数はさらに２．８７に近づくと推定される。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の再生産数は、それぞれＳＡＲＳ－ＣｏＶおよびＭＥＲＳ（０．９５および０．９１）などの以前の感染性コロナウイルスよりかなり高い。再生産数がより高いことに対する考えられる理由は、このウイルス株に固有の生物学的特徴であり得る。例えば、人は、多くの方法、例えば、感染者との密接な物理的接触、呼吸器飛沫、媒介物、および空気感染による環境伝播など、によって感染し得る。その上、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染患者は、感染の２週間まで徴候的特徴を示さない場合があり、それは、新たな感染のリスクを指数関数的に増加し得る。感染者が、通常、無症状相の間、コミュニティにおいて他の人々と区別ができないためである。９人の患者の試料からの系統発生分析は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が、２００３年のＳＡＲＳアウトブレークの原因となったウイルスを含む既知のヒト感染性コロナウイルスよりも、２つのコウモリ由来のコロナウイルス株に似ていることを示した。異なる患者からの配列は、９９．９％を超える配列同一性で、ほぼ同一であり、それは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が非常に短い期間内に１つの源から生じたことを示唆している。現在利用可能なデータは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が、保有宿主であるコウモリからヒト集団に感染したこと、ならびに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ヒト感染のための好ましい遺伝的変化を積み重ねることによってコウモリコロナウイルスから進化した可能性があることを示唆している。構造タンパク質であるスパイクタンパク質および膜タンパク質は、大幅な突然変異変化を有することが分かっており、その一方で、エンベロープタンパク質およびヌクレオカプシドタンパク質は保存されていた。現在未知の動物種が、コウモリとヒトとの間の中間宿主として機能するか否かは、不明確なままである。

【0015】

構造分析および機能分析は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤがヒトアンギオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）受容体と強く相互作用することを示した。ＡＣＥ２発現は、肺、心臓、回腸、腎臓、および膀胱において最も高かった。肺では、ＡＣＥ２は、肺上皮細胞において高く発現された。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２がＡＣＥ２受容体に結合した後、スパイクタンパク質は、プロテアーゼ切断を受ける。ＳＡＲＳ－ＣｏＶおよびＭＥＲＳ－ＣｏＶのスパイクタンパク質を活性化する、連続する二段階のプロテアーゼ切断が、プライミングのためのＳ１／Ｓ２切断部位での切断と、Ｓ２サブユニット内の融合ペプチドに隣接する位置であるＳ’２部位での活性化のための切断とからなるモデルとして提案された。Ｓ１／Ｓ２切断部位での切断の後、Ｓ１およびＳ２サブユニットは、非共有結合したままであり、ならびに遠位のＳ１サブユニットは、融合前（ｐｒｅｆｕｓｉｏｎ）状態において膜にアンカー固定されたＳ２サブユニットの安定化に貢献する。それに続くＳ’２部位での切断は、おそらく、不可逆な立体構造変化による膜融合のためにスパイクを活性化する。コロナウイルスのスパイクは、様々な異なるプロテアーゼが当該スパイクを切断し活性化することができるため、ウイルスの中でも独特である。コロナウイルスの中でもＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に特異的な特徴は、Ｓ１／Ｓ２部位におけるフューリン（ｆｕｒｉｎ）切断部位（「ＲＰＰＡ」配列）の存在である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ１／Ｓ２部位は、切断なしにアセンブリに組み込まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶスパイクとは対照的に、生合成の間に、完全に切断に付された。Ｓ１／Ｓ２部位は、ＩＩ型膜貫通型セリンプロテアーゼ（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｓｅｒｉｎｅ ２）（ＴＭＰＲＳＳ２）およびカテプシンＬなどの他のプロテアーゼによる切断も受けるが、フューリンの遍在的発現も、おそらく、ビルレンスの増加につながるより効率的なウイルス複製に貢献する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２において、ウイルススパイクタンパク質、特にＲＢＤは、ウイルス進化に関する遺伝子座である。２０２０年１０月から、ＲＢＤ内のアミノ酸変化として認識されるウイルスの進化が、ヨーロッパ、ブラジル、イギリス、および南アフリカにおいて検出された。突然変異の積み重ねは、結果として、スパイクＲＢＤにそれぞれ８つの突然変異、７つの突然変異、および１０個の突然変異と、１ａｂオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）における３つのアミノ酸の欠失とを有するイギリス、南アフリカ、およびブラジルから出現したバリアントによって示されるように、２週間毎に約１回の突然変異の発生をもたらした。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のこれらのバリアント株の特徴は、増強された適応性を有するウイルス種への、繰り返された収斂進化を示している。この現象に対する可能な仮説は、これらの突然変異が、慢性ＣＯＶＩＤ－１９感染症（その間、免疫系はウイルスに大きな圧をかける）の症例から、免疫を逃れるために出現しており、ウイルスは、浸潤細胞に関するそのメカニズムを洗練させることによってそれに反応する。結果として、これは、ＵＫ突然変異株Ｂ．１．１．７によって実証されるように、ウイルス量の増加およびより高い伝播性をもたらす。ウイルス未経験（ｖｉｒｕｓ－ｎａｉｖｅ）では、自然感染後免疫（ｎａｔｕｒａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ）選択圧が、バリアントの出現の主要なドライバーである。しかしながら、「ワクチン選択圧」の可能性も存在し、その場合、突然変異はワクチン関連理由に起因すると考えることができる。例えば、ワクチンが単一抗原のみに対する免疫反応を高めることを対象とする場合など、ワクチンが、制限された免疫反応を誘発する場合、ウイルスは、抗原的に進化することができる。集団全体にワクチン注射を投与することの遅れも、ウイルスの適応力に対して潜在的に影響を及ぼし得、ならびに、ウイルスが免疫反応を回避または当該反応に抵抗するのを助け得る突然変異を誘導し得る。エスケープ突然変異体の現象は、懸念されるバリアント（ｖａｒｉａｎｔｓ ｏｆ ｃｏｎｃｅｒｎ：ＶＯＣ）の出現に対して効率的に働くワクチンに対する必要性を強調する。記録された突然変異のほとんどは、スパイクタンパク質において生じており、他のウイルス抗原は、適切な予防免疫反応を確保するために、広範な免疫原性を誘導するために利用され得る。

【0016】

中和抗体は、宿主細胞内のウイルスに結合して中和し、予防接種のための免疫と相関する主要な指標として機能する抗体である。ＳＡＲＳおよびＭＥＲＳスパイク糖タンパク質に対する中和抗体は、これらのコロナウイルスに対する保護において、中心的な役割を果たす。これまで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の後に、保護のためにどの程度の中和抗体が必要か、または、中和抗体の持続性はどの程度かは知られていない。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0017】

【非特許文献1】Ｗｅｒｄｅｎら ２００８

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0018】

Ｔ細胞免疫も、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する保護と相関する指標として利用され得る。Ｔ細胞活性化は、感染の急性相および記憶相の両方において報告されているが、しかしながら、疾患進行または保護におけるＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞の両方の正確な役割は、依然として完全には理解されていない。抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞は、ウイルス感染細胞を直接に標的にするが、その一方で、Ｔｈ１分極化ＣＤ４ Ｔ細胞は、組織におけるウイルス感染細胞と戦うためにＣＤ８ Ｔ細胞および単球を活性化する可能性を有する。加えて、濾胞性ヘルパーＴ細胞は、胚中心反応および質の高い体液性免疫反応の形成のために必要である。これと一致して、複数の研究が、結合抗体力価とＣＤ４ Ｔ細胞反応との間の相関関係について言及している。したがって、Ｔ細胞は、感染細胞の直接的排除と、他の白血球の活性化および体液性免疫反応の増強との両方によって、防御機能を有することができる。その上、ロバストなＴｈ１バイアス反応の誘導は、ワクチン関連呼吸器疾患の増強またはＴｈ２反応に関連する抗体依存性感染増強（ＡＤＥ）の発生が起こりそうもないことと一致する。

【課題を解決するための手段】

【0019】

本発明のワクチンは、より良好な長期保護を生じるための抗原の組み合わせに基づいており、ならびに疾患の抗体依存性感染増強の可能性から保護する。これは、スパイク抗原のみを含んで開発されたワクチンに対する主要な差異である。複数の抗原の存在は、エスケープ突然変異体の現象にも対処し得る。複数の抗原が、広範な免疫反応を誘発し得、それは、ウイルスが抗原的に進化して生体防御の有効性を破壊するのを、より困難にするからである。

【0020】

本発明のワクチンのための抗原配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の、スパイクタンパク質、膜タンパク質、ヌクレオカプシドタンパク質およびエンベロープタンパク質を含む。

【0021】

免疫原性は、ポックスウイルスベクターから、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクポリペプチドまたは当該スパイクポリペプチドのＳ１受容体結合ドメインサブユニットを発現することによって達成され得る。コロナウイルスのスパイクタンパク質は、ウイルス感染の急性相の間に必要なウイルスを中和するために必須の主要な中和ドメインを含み、細胞媒介性免疫を刺激するために必要とされる。歴史的に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶまたはＭＥＲＳ－ＣｏＶなどのコロナウイルスのスパイクタンパク質は、免疫原性であり、ウイルスが宿主細胞に侵入するのを阻害する中和抗体を含む体液性免疫反応および細胞媒介性免疫反応を誘発することが見出された。

【0022】

免疫原性は、ポックスウイルスベクターからのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質ポリペプチドを発現することによって達成され得る。ＳＡＲＳ－ＣｏＶにおいて、膜タンパク質は、ウイルス表面上において豊富であることが分かっており；その上、ＳＡＲＳを有する患者において免疫付与のために使用される場合、膜タンパク質は、中和抗体の高力価を誘導した。免疫原性分析および構造分析は、ロバストな細胞免疫反応を引き起こすことができるＴ細胞エピトープクラスターが膜タンパク質に存在することを実証した。膜タンパク質も、多くのウイルス種において高度に保存されるため、それは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫反応を誘導するための良好な抗原候補である。

【0023】

免疫原性は、ポックスウイルスベクターからのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質ポリペプチドを発現することによって達成され得る。最近、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染が、ヌクレオカプシド抗原をほぼ対象とする抗体の産生につながることが発見された。しかしながら、Ｎタンパク質抗体はウイルスの侵入を防ぐことができず、それ自体は「非中和」抗体であると見なされているため、Ｎ抗体は見落とされていた。したがって、抗Ｎ抗体は、体液性免疫を評価するために現在使用されている中和アッセイによって測定することができない。最近の研究により、細胞の中に入る抗Ｎ抗体は、抗体受容体ＴＲＩＭ２１によって認識され、次いで、会合したＮタンパク質を断片化することが示された。次いで、Ｎタンパク質エピトープが、Ｔ細胞による検出のために提示される。この免疫反応メカニズムには、最終的に免疫学的記憶を媒介するであろうＴ細胞が関与するため、ヌクレオカプシドタンパク質に対する抗体は、将来の感染に対する長期保護を刺激し得る。

【0024】

免疫原性は、ポックスウイルスベクター内のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質もしくはその一部、膜タンパク質ポリペプチド、ヌクレオカプシドタンパク質ポリペプチド、および／またはエンベロープタンパク質ポリペプチドを同時に発現することによって達成され得る。マウス肝炎ウイルス、牛コロナウイルス、伝染性気管支炎ウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶに関する研究は、スパイクタンパク質、膜タンパク質、ヌクレオカプシドタンパク質、および場合によって、エンベロープ構造タンパク質が、トランスフェクトされた細胞によるウイルス様粒子（ＶＬＰ）の効率的なアセンブリおよび放出のために必要であることを確立した。Ｓ、ＭおよびＮおよび／またはＥポリペプチドの存在は、コロナウイルス構造を模倣するが感染性であるための遺伝物質を欠く空のウイルスシェルである真正のＶＬＰの形成につながり得る。ＶＬＰは、真正のビリオンと類似のサイズおよび形態学的特徴を共有するが、非感染性であり、複製することができない。ＶＬＰは、天然ウイルスのモルホロジーを模倣するだけでなく、許容性細胞に形質導入することもできる。ウイルス遺伝物質を欠いているため、ＶＬＰは、宿主細胞内において複製しないが、核酸、タンパク質、または薬物のキャリアとして使用することができる。さらに、ＶＬＰは、それらの表面抗原の反復曝露およびそれらの固有の構造が、天然ウイルスをエミュレートすることができ、体液性反応および細胞性反応を誘導するように免疫系と相互作用することができるため、ワクチン候補としての使用のために調査されている。これらのタンパク質の組み合わされた免疫原性は、よりロバストな抗原特異的免疫反応を引き起こし得る。本発明は、ポックスウイルス－ベクター化ワクチンにおける抗原としての、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質もしくはそれらの一部、ならびに／あるいはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質もしくはそれらの一部、ならびに／あるいはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質もしくはそれらの一部の使用を包含する。

【0025】

本発明は、体液性免疫および細胞媒介性免疫を含む広範な免疫反応を誘発するための、複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質の使用を包含する。自然感染において、免疫系は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含む全てのタンパク質を様々な程度まで認識する。ワクチンの製剤化において、Ｍ、Ｎ、およびＥなどの突然変異頻度の少ない構造遺伝子を利用することにより、誘導される免疫反応の幅は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のバリアントの出現から保護し、エスケープ変異の可能性を減少させるように拡大され得る。

【0026】

ある実施形態において、スパイクタンパク質またはその一部が、単一のポックスウイルスベクター化ワクチンにおけるワクチン抗原として使用される。

【0027】

ある実施形態において、膜タンパク質またはその一部が、単一のポックスウイルスベクター化ワクチンにおけるワクチン抗原として使用される。

【0028】

ある実施形態において、ヌクレオカプシドタンパク質またはその一部が、単一のポックスウイルスベクター化ワクチンにおけるワクチン抗原として使用される。

【0029】

ある実施形態において、膜およびヌクレオカプシドタンパク質または任意のそれらの一部が、単一のポックスウイルスベクター化ワクチンにおけるワクチン抗原として使用される。

【0030】

ある実施形態において、スパイクタンパク質またはその一部、膜タンパク質またはその一部、およびヌクレオカプシドタンパク質またはその一部が、単一のポックスウイルスベクター化ワクチンにおけるワクチン抗原として使用される。

【0031】

ある実施形態において、スパイクタンパク質またはその一部、膜およびヌクレオカプシドタンパク質または任意のそれらの一部、ならびにエンベロープタンパク質またはその一部が、単一のポックスウイルスベクター化ワクチンにおいて、ワクチン抗原として使用される。

【0032】

ある実施形態において、スパイクタンパク質またはその一部ならびに膜およびヌクレオカプシドタンパク質またはそれらの一部が、単一ワクチンの混合物として組み合わされる。

【0033】

概要
本発明者らは、内因性の必須のアセンブリまたは成熟タンパク質（ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｒ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）をコードする少なくとも１つの遺伝子の欠失によって弱毒化されたポックスウイルス、とりわけワクシニアウイルスであって、そのゲノムが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の、スパイクタンパク質ポリペプチド、および／または膜タンパク質ポリペプチド、および／またはヌクレオカプシドタンパク質ポリペプチド、および／またはエンベロープタンパク質ポリペプチド、あるいは任意のそれらの免疫原性部分または機能性部分をコードする核酸配列を含むように操作された、弱毒化されたポックスウイルス、とりわけワクシニアウイルスを利用することによって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染のリスクを防ぐかもしくは減少させ、および／または、ＣＯＶＩＤ－１９疾患の重症度を減少させる組成物を得ることができることを見出した。

【0034】

したがって、第一態様において、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染のリスクを防ぐかもしくは減少させ、および／または、ＣＯＶＩＤ－１９疾患の重症度を減少させる、動物における免疫反応を高めるための組成物であって、弱毒化されたポックスウイルス、とりわけワクシニアウイルスを含み、当該ポックスウイルスゲノムは改変されており、ならびに選択されたワクシニアウイルス遺伝子のオープンリーディングフレーム中へと置換されるかまたは遺伝子間領域に挿入された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクおよび／または膜および／またはヌクレオカプシドおよび／またはエンベロープポリペプチドあるいは任意のそれらの免疫原性部分または機能性部分（１または複数）をコードする核酸配列を含む、上記組成物を提供する。

【0035】

第二態様において、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染のリスクを防ぐかもしくは減少させ、および／または、ＣＯＶＩＤ－１９疾患の重症度を減少させる、動物における免疫反応を高めるための組成物であって、弱毒化されたポックスウイルス、とりわけワクシニアウイルスを含み、当該ポックスウイルスゲノムは改変されており、および合成初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクポリペプチドまたはその免疫原性部分もしくは機能性部分、鶏痘初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の膜ポリペプチドまたはその免疫原性部分もしくは機能性部分、および合成初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヌクレオカプシドポリペプチドまたはその免疫原性部分もしくは機能性部分をコードする核酸配列を含む、上記組成物を提供する。

【0036】

第三態様において、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染のリスクを防ぐかもしくは減少させ、および／または、ＣＯＶＩＤ－１９疾患の重症度を減少させる、動物における免疫反応を高めるための組成物であって、弱毒化されたポックスウイルス、とりわけワクシニアウイルスを含み、当該ポックスウイルスゲノムは改変されており、および天然初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクポリペプチドまたはその免疫原性部分もしくは機能性部分、鶏痘初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の膜ポリペプチドまたはその免疫原性部分もしくは機能性部分、および合成初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヌクレオカプシドポリペプチドまたはその免疫原性部分もしくは機能性部分をコードする核酸配列を含む、上記組成物を提供する。

【0037】

第四態様において、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染のリスクを防ぐかもしくは減少させ、および／または、ＣＯＶＩＤ－１９疾患の重症度を減少させる、動物における免疫反応を高めるための組成物であって、弱毒化されたポックスウイルス、とりわけワクシニアウイルスを含み、当該ポックスウイルスゲノムは、改変されており、および合成初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクポリペプチドまたはその免疫原性部分もしくは機能性部分をコードする核酸配列を含む、上記組成物を提供する。

【0038】

第五態様において、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染のリスクを防ぐかもしくは減少させ、および／または、ＣＯＶＩＤ－１９疾患の重症度を減少させる、動物における免疫反応を高めるための組成物であって、弱毒化されたポックスウイルス、とりわけワクシニアウイルスを含み、当該ポックスウイルスゲノムは、改変されており、および天然初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクポリペプチドまたはその免疫原性部分もしくは機能性部分をコードする核酸配列を含む、上記組成物を提供する。

【0039】

第六態様において、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染のリスクを防ぐかもしくは減少させ、および／または、ＣＯＶＩＤ－１９疾患の重症度を減少させる、動物における免疫反応を高めるための組成物であって、弱毒化されたポックスウイルス、とりわけワクシニアウイルスを含み、当該ポックスウイルスゲノムは、改変されており、ならびに鶏痘初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の膜ポリペプチドまたはその免疫原性部分もしくは機能性部分、および合成初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヌクレオカプシドポリペプチドまたはその免疫原性部分もしくは機能性部分をコードする核酸配列を含む、上記組成物を提供する。

【0040】

第七態様において、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染のリスクを防ぐかもしくは減少させ、および／または、ＣＯＶＩＤ－１９疾患の重症度を減少させる、動物における免疫反応を高めるための組成物であって、弱毒化されたポックスウイルス、とりわけワクシニアウイルスを含み、当該ポックスウイルスゲノムは、改変されており、および合成初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクポリペプチドのＳ１受容体結合ドメインサブユニットをコードする核酸配列を含む、上記組成物を提供する。

【0041】

第八態様において、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染のリスクを防ぐかもしくは減少させ、および／または、ＣＯＶＩＤ－１９疾患の重症度を減少させる、動物における免疫反応を高めるための組成物であって、弱毒化されたポックスウイルス、とりわけワクシニアウイルスを含み、当該ポックスウイルスゲノムは改変されており、ならびに合成初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクポリペプチドまたはその免疫原性部分もしくは機能性部分、鶏痘初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の膜ポリペプチドまたはその免疫原性部分もしくは機能性部分、および合成初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヌクレオカプシドポリペプチドまたはその免疫原性部分もしくは機能性部分、ならびに合成初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のエンベロープポリペプチドまたはその免疫原性部分もしくは機能性部分をコードする核酸配列を含む、上記組成物を提供する。

【0042】

第九態様において、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染のリスクを防ぐかもしくは減少させ、および／または、ＣＯＶＩＤ－１９疾患の重症度を減少させる、動物における免疫反応を高めるための組成物であって、弱毒化されたポックスウイルス、とりわけワクシニアウイルスを含み、当該ポックスウイルスゲノムは改変されており、ならびに天然初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクポリペプチドまたはその免疫原性部分もしくは機能性部分、鶏痘初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の膜ポリペプチドまたはその免疫原性部分もしくは機能性部分、合成初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヌクレオカプシドポリペプチドまたはその免疫原性部分もしくは機能性部分、および合成初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のエンベロープポリペプチドまたはその免疫原性部分もしくは機能性部分をコードする核酸配列を含む、上記組成物を提供する。

【0043】

第十態様において、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染のリスクを防ぐかもしくは減少させ、および／または、ＣＯＶＩＤ－１９疾患の重症度を減少させる、動物における免疫反応を高めるための組成物であって、弱毒化されたポックスウイルス、とりわけワクシニアウイルスを含み、当該ポックスウイルスゲノムは改変されており、ならびに合成初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクポリペプチドのＳ１受容体結合ドメインサブユニット、および鶏痘初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の膜ポリペプチドまたはその免疫原性部分もしくは機能性部分、および合成初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヌクレオカプシドポリペプチドまたはその免疫原性部分もしくは機能性部分をコードする核酸配列を含む、上記組成物を提供する。

【0044】

第十一態様において、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染のリスクを防ぐかもしくは減少させ、および／または、ＣＯＶＩＤ－１９疾患の重症度を減少させる、動物における免疫反応を高めるための組成物であって、弱毒化されたポックスウイルス、とりわけワクシニアウイルスを含み、当該ポックスウイルスゲノムは改変されており、ならびに合成初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクポリペプチドのＳ１受容体結合ドメインサブユニット、および鶏痘初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の膜ポリペプチドまたはその免疫原性部分もしくは機能性部分、および合成初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヌクレオカプシドポリペプチドまたはその免疫原性部分もしくは機能性部分、および合成初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のエンベロープポリペプチドまたはその免疫原性部分もしくは機能性部分をコードする核酸配列を含む、上記組成物を提供する。

【0045】

第十二態様において、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染のリスクを防ぐかもしくは減少させ、および／または、ＣＯＶＩＤ－１９疾患の重症度を減少させる、動物における免疫反応を高めるための組成物であって、弱毒化されたポックスウイルス、とりわけワクシニアウイルスを含み、当該ポックスウイルスゲノムは改変されており、および鶏痘初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の膜ポリペプチドまたはその免疫原性部分もしくは機能性部分をコードする核酸配列を含む、上記組成物を提供する。

【0046】

第十三態様において、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染のリスクを防ぐかもしくは減少させ、および／または、ＣＯＶＩＤ－１９疾患の重症度を減少させる、動物における免疫反応を高めるための組成物であって、弱毒化されたポックスウイルス、とりわけワクシニアウイルスを含み、当該ポックスウイルスゲノムは改変されており、および合成初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヌクレオカプシドポリペプチドまたはその免疫原性部分もしくは機能性部分をコードする核酸配列を含む、上記組成物を提供する。

【0047】

第十四態様において、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染に対して対象において防御免疫反応を誘導する方法であって、上記のうちのいずれかの組成物を当該対象に投与することを含む上記方法を提供する。

【0048】

第十五態様において、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染に対して対象において防御免疫反応を誘導する方法であって、本発明の第四および第六態様の組成物を当該対象に投与することを含む上記方法を提供する。

【0049】

第十六態様において、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染に対して対象において防御免疫反応を誘導する方法であって、本発明の第五および第六態様の組成物を当該対象に投与することを含む上記方法を提供する。

【0050】

第十七態様において、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス様粒子に似ることによってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染のリスクを防ぐかもしくは減少させ、および／または、ＣＯＶＩＤ－１９疾患の重症度を減少させる、動物における免疫反応を高めるための組成物を提供する。

【0051】

第十八態様において、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染のリスクを防ぐかもしくは減少させ、および／またはＣＯＶＩＤ－１９疾患およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して遺伝的類似性を有するコロナウイルスによって引き起こされる任意の他の感染の重症度を減少させる、動物における免疫反応を高めるための組成物であって、弱毒化されたポックスウイルス、とりわけワクシニアウイルスを含み、当該ポックスウイルスゲノムは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクポリペプチドまたはその免疫原性部分もしくは機能性部分、および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の膜ポリペプチドおよびヌクレオカプシドポリペプチドまたはそれらの免疫原性部分もしくは機能性部分、および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のエンベロープポリペプチドまたはその免疫原性部分もしくは機能性部分をコードする核酸配列を含む、上記組成物を提供する。

【0052】

第十九態様において、本発明は、コロナウイルス感染に対して対象において中和抗体反応および／または防御免疫反応を誘導するための医薬の調製における、本発明の第一態様から第十八態様までの組成物の使用を提供する。

【0053】

本発明は、以下も含む：

【0054】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルス疾患のリスクを防ぐかまたは減少させる、動物における免疫反応を高めるための組成物であって、遺伝的に操作された弱毒化されたワクシニアウイルスを含み、当該ワクシニアウイルスゲノムは、スパイクタンパク質ポリペプチドまたはその免疫原性部分、膜タンパク質ポリペプチドまたはその免疫原性部分、ヌクレオカプシドタンパク質ポリペプチドまたはその免疫原性部分、およびエンベロープタンパク質ポリペプチドまたはその免疫原性部分からなる群から選択される少なくとも１つのヒトコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ポリペプチドをコードする核酸配列を含み、当該弱毒化されたワクシニアウイルスが、内因性の必須のアセンブリまたは成熟タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の欠失を含む、組成物、

【0055】

当該弱毒化されたワクシニアウイルスゲノムが、ヒトコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質ポリペプチドまたはその免疫原性部分をコードする核酸配列を含む、上記の組成物、

【0056】

当該弱毒化されたワクシニアウイルスゲノムが、ヒトコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の膜タンパク質ポリペプチドまたはその免疫原性部分をコードする核酸配列を含む、上記の組成物、

【0057】

当該弱毒化されたワクシニアウイルスゲノムが、ヒトコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヌクレオカプシドタンパク質ポリペプチドまたはその免疫原性部分をコードする核酸配列を含む、上記の組成物、

【0058】

当該弱毒化されたワクシニアウイルスゲノムが、ヒトコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の膜タンパク質ポリペプチドまたはその免疫原性部分およびヌクレオカプシドタンパク質ポリペプチドまたはその免疫原性部分をコードする核酸配列を含む、上記の組成物、

【0059】

当該弱毒化されたワクシニアウイルスゲノムが、ヒトコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質ポリペプチドまたはその免疫原性部分および膜タンパク質ポリペプチドまたはその免疫原性部分およびヌクレオカプシドタンパク質ポリペプチドまたはその免疫原性部分をコードする核酸配列を含む、上記の組成物、

【0060】

当該弱毒化されたワクシニアウイルスゲノムが、ヒトコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクポリペプチドまたはその免疫原性部分および膜タンパク質ポリペプチドまたはその免疫原性部分およびヌクレオカプシドタンパク質ポリペプチドまたはその免疫原性部分およびエンベロープタンパク質ポリペプチドまたはその免疫原性部分をコードする核酸配列を含む、上記の組成物、

【0061】

ヒトコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列が、ＣＯＰ－Ｃ２３Ｌ、ＣＯＰ－Ｂ２９Ｒ、ＣＯＰ－Ｃ３Ｌ、ＣＯＰ－Ｎ１Ｌ、ＣＯＰ－Ａ３５Ｒ、ＣＯＰ－Ａ３９Ｒ、ＣＯＰ－Ａ４１Ｌ、ＣＯＰ－Ａ４４Ｒ、ＣＯＰ－Ａ４６Ｒ、ＣＯＰ－Ｂ７Ｒ、ＣＯＰ－Ｂ８Ｒ、ＣＯＰ－Ｂ１３Ｒ、ＣＯＰ－Ｂ１６Ｒ、およびＣＯＰ－Ｂ１９Ｒからなる群から選択される１つまたは複数の免疫調節遺伝子にの欠失されたＯＲＦに挿入されている、上記の組成物、

【0062】

ヒトコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列が、弱毒化されたワクシニアウイルスゲノムの遺伝子間領域（ＩＧＲ）に挿入され、当該ＩＧＲが、ワクシニアウイルスゲノムの２つの隣接するＯＲＦの間に位置するかまたはそれらに隣接する、上記の組成物、

【0063】

当該弱毒化されたワクシニアウイルスゲノムのＩＧＲが、Ｆ９Ｌ－Ｆ１０Ｌ、Ｆ１２Ｌ－Ｆ１３Ｌ、Ｆ１７Ｒ－Ｅ１Ｌ、Ｅ１Ｌ－Ｅ２Ｌ、Ｅ８Ｒ－Ｅ９Ｌ、Ｅ９Ｌ－Ｅ１０Ｒ、Ｉ１Ｌ－Ｉ２Ｌ、Ｉ２Ｌ－Ｉ３Ｌ、Ｉ５Ｌ－Ｉ６Ｌ、Ｉ６Ｌ－Ｉ７Ｌ、Ｉ７Ｌ－Ｉ８Ｒ、Ｉ８Ｒ－Ｇ１Ｌ、Ｇ１Ｌ－Ｇ３Ｌ、Ｇ３Ｌ－Ｇ２Ｒ、Ｇ２Ｒ－Ｇ４Ｌ、Ｇ４Ｌ－Ｇ５Ｒ、Ｇ５Ｒ－Ｇ５．５Ｒ、Ｇ５．５Ｒ－Ｇ６Ｒ、Ｇ６Ｒ－Ｇ７Ｌ、Ｇ７Ｌ－Ｇ８Ｒ、Ｇ８Ｒ－Ｇ９Ｒ、Ｇ９Ｒ－Ｌ１Ｒ、Ｌ１Ｒ－Ｌ２Ｒ、Ｌ２Ｒ－Ｌ３Ｌ、Ｌ３Ｌ－Ｌ４Ｒ、Ｌ４Ｒ－Ｌ５Ｒ、Ｌ５Ｒ－Ｊ１Ｒ、Ｊ３Ｒ－Ｊ４Ｒ、Ｊ４Ｒ－Ｊ５Ｌ、Ｊ５Ｌ－Ｊ６Ｒ、Ｊ６Ｒ－Ｈ１Ｌ、Ｈ１Ｌ－Ｈ２Ｒ、Ｈ２Ｒ－Ｈ３Ｌ、Ｈ３Ｌ－Ｈ４Ｌ、Ｈ４Ｌ－Ｈ５Ｒ、Ｈ５Ｒ－Ｈ６Ｒ、Ｈ６Ｒ－Ｈ７Ｒ、Ｈ７Ｒ－Ｄ１Ｒ、Ｄ１Ｒ－Ｄ２Ｌ、Ｄ２Ｌ－Ｄ３Ｒ、Ｄ３Ｒ－Ｄ４Ｒ、Ｄ４Ｒ－Ｄ５Ｒ、Ｄ５Ｒ－Ｄ６Ｒ、Ｄ６Ｒ－Ｄ７Ｒ、Ｄ９Ｒ－Ｄ１０Ｒ、Ｄ１０Ｒ－Ｄ１１Ｌ、Ｄ１１Ｌ－Ｄ１２Ｌ、Ｄ１２Ｌ－Ｄ１３Ｌ、Ｄ１３Ｌ－Ａ１Ｌ、Ａ１Ｌ－Ａ２Ｌ、Ａ２Ｌ－Ａ２．５Ｌ、Ａ２．５Ｌ－Ａ３Ｌ、Ａ３Ｌ－Ａ４Ｌ、Ａ４Ｌ－Ａ５Ｒ、Ａ５Ｒ－Ａ６Ｌ、Ａ６Ｌ－Ａ７Ｌ、Ａ７Ｌ－Ａ８Ｒ、Ａ８Ｒ－Ａ９Ｌ、Ａ９Ｌ－Ａ１０Ｌ、Ａ１０Ｌ－Ａ１１Ｒ、Ａ１１Ｒ－Ａ１２Ｌ、Ａ１２Ｌ－Ａ１３Ｌ、Ａ１３Ｌ－Ａ１４Ｌ、Ａ１４Ｌ－Ａ１４．５Ｌ、Ａ１４．５Ｌ－Ａ１５Ｌ、Ａ１５Ｌ－Ａ１６Ｌ、Ａ１６Ｌ－Ａ１７Ｌ、Ａ１７Ｌ－Ａ１８Ｒ、Ａ１８Ｒ－Ａ１９Ｌ、Ａ１９Ｌ－Ａ２１Ｌ、Ａ２１Ｌ－Ａ２０Ｒ、Ａ２０Ｒ－Ａ２２Ｒ、Ａ２２Ｒ－Ａ２３Ｒ、Ａ２３Ｒ－Ａ２４Ｒ、Ａ２８Ｌ－Ａ２９ＬおよびＡ２９Ｌ－Ａ３０Ｌ、ならびに、さらに００１Ｌ－００２Ｌ、００２Ｌ－００３Ｌ、００５Ｒ－００６Ｒ、００６Ｌ－００７Ｒ、００７Ｒ－００８Ｌ、００８Ｌ－００９Ｌ、０１７Ｌ－０１８Ｌ、０１８Ｌ－０１９Ｌ、０１９Ｌ－０２０Ｌ、０２０Ｌ－０２１Ｌ、０２３Ｌ－０２４Ｌ、０２４Ｌ－０２５Ｌ、０２５Ｌ－０２６Ｌ、０２８Ｒ－０２９Ｌ、０３０Ｌ－０３１Ｌ、０３１Ｌ－０３２Ｌ、０３２Ｌ－０３３Ｌ、０３５Ｌ－０３６Ｌ、０３６Ｌ－０３７Ｌ、０３７Ｌ－０３８Ｌ、０３９Ｌ－０４０Ｌ、０４３Ｌ－０４４Ｌ、０４４Ｌ－０４５Ｌ、０４６Ｌ－０４７Ｒ、０４９Ｌ－０５０Ｌ、０５０Ｌ－０５１Ｌ、０５１Ｌ－０５２Ｒ、０５２Ｒ－０５３Ｒ、０５３Ｒ－０５４Ｒ、０５４Ｒ－０５５Ｒ、０５５Ｒ－０５６Ｌ、０６１Ｌ－０６２Ｌ、０６４Ｌ－０６５Ｌ、０６５Ｌ－０６６Ｌ、０６６Ｌ－０６７Ｌ、０７７Ｌ－０７８Ｒ、０７８Ｒ－０７９Ｒ、０８０Ｒ－０８１Ｒ、０８１Ｒ－０８２Ｌ、０８２Ｌ－０８３Ｒ、０８５Ｒ－０８６Ｒ、０８６Ｒ－０８７Ｒ、０８８Ｒ－０８９Ｌ、０８９Ｌ－０９０Ｒ、０９２Ｒ－０９３Ｌ、０９４Ｌ－０９５Ｒ、０９６Ｒ－０９７Ｒ、０９７Ｒ－０９８Ｒ、１０１Ｒ－１０２Ｒ、１０３Ｒ－１０４Ｒ、１０５Ｌ－１０６Ｒ、１０７Ｒ－１０８Ｌ、１０８Ｌ－１０９Ｌ、１０９Ｌ－１１０Ｌ、１１０Ｌ－１１１Ｌ、１１３Ｌ－１１４Ｌ、１１４Ｌ－１１５Ｌ、１１５Ｌ－１１６Ｒ、１１７Ｌ－１１８Ｌ、１１８Ｌ－１１９Ｒ、１２２Ｒ－１２３Ｌ、１２３Ｌ－１２４Ｌ、１２４Ｌ－１２５Ｌ、１２５Ｌ－１２６Ｌ、１３３Ｒ－１３４Ｒ、１３４Ｒ－１３５Ｒ、１３６Ｌ－１３７Ｌ、１３７Ｌ－１３８Ｌ、１４１Ｌ－１４２Ｒ、１４３Ｌ－１４４Ｒ、１４４Ｒ－１４５Ｒ、１４５Ｒ－１４６Ｒ、１４６Ｒ－１４７Ｒ、１４７Ｒ－１４８Ｒ、１４８Ｒ－１４９Ｌ、１５２Ｒ－１５３Ｌ、１５３Ｌ－１５４Ｒ、１５４Ｒ－１５５Ｒ、１５６Ｒ－１５７Ｌ、１５７Ｌ－１５８Ｒ、１５９Ｒ－１６０Ｌ、１６０Ｌ－１６１Ｒ、１６２Ｒ－１６３Ｒ、１６３Ｒ－１６４Ｒ、１６４Ｒ－１６５Ｒ、１６５Ｒ－１６６Ｒ、１６６Ｒ－１６７Ｒ、１６７Ｒ－１６８Ｒ、１７０Ｒ－１７１Ｒ、１７３Ｒ－１７４Ｒ、１７５Ｒ－１７６Ｒ、１７６Ｒ－１７７Ｒ、１７８Ｒ－１７９Ｒ、１７９Ｒ－１８０Ｒ、１８０Ｒ－１８１Ｒ、１８３Ｒ－１８４Ｒ、１８４Ｒ－１８５Ｌ、１８５Ｌ－１８６Ｒ、１８６Ｒ－１８７Ｒ、１８７Ｒ－１８８Ｒ、１８８Ｒ－１８９Ｒ、１８９Ｒ－１９０Ｒ、１９２Ｒ－１９３Ｒからなる群から選択され、ここで、古い用語体系に従うと、ＯＲＦ ００６Ｌは、Ｃ１０Ｌに対応し、０１９ＬはＣ６Ｌに対応し、０２０ＬはＮ１Ｌに、０２１ＬはＮ２Ｌに、０２３ＬはＫ２Ｌに、０２８ＲはＫ７Ｒに、０２９ＬはＦ１Ｌに、０３７ＬはＦ８Ｌに、０４５ＬはＦ１５Ｌに、０５０ＬはＥ３Ｌに、０５２ＲはＥ５Ｒに、０５４ＲはＥ７Ｒに、０５５ＲはＥ８Ｒに、０５６ＬはＥ９Ｌに、０６２ＬはＩ１Ｌに、０６４ＬはＩ４Ｌに、０６５ＬはＩ５Ｌに、０８１ＲはＬ２Ｒに、０８２ＬはＬ３Ｌに、０８６ＲはＪ２Ｒに、０８７はＪ３Ｒに、０８８ＲはＪ４Ｒに、０８９ＬはＪ５Ｌに、０９２ＲはＨ２Ｒに、０９５ＲはＨ５Ｒに、１０７ＲはＤ１０Ｒに、１０８ＬはＤ１１Ｌに、１２２ＲはＡ１１Ｒに、１２３ＬはＡ１２Ｌに、１２５ＬはＡ１４Ｌに、１２６ＬはＡ１５Ｌに、１３５ＲはＡ２４Ｒに、１３６ＬはＡ２５Ｌに、１３７ＬはＡ２６Ｌに、１４１ＬはＡ３０Ｌに、１４８ＲはＡ３７Ｒに、１４９ＬはＡ３８Ｌに、１５２ＲはＡ４０Ｒに、１５３ＬはＡ４１Ｌに、１５４ＲはＡ４２Ｒに、１５７ＬはＡ４４Ｌに、１５９ＲはＡ４６Ｒに、１６０ＬはＡ４７Ｌに、１６５ＲはＡ５６Ｒに、１６６ＲはＡ５７Ｒに、１６７ＲはＢ１Ｒに、１７０ＲはＢ３Ｒに、１７６ＲはＢ８Ｒに、１８０ＲはＢ１２Ｒに、１８４ＲはＢ１６Ｒに、１８５ＬはＢ１７Ｌに、および１８７ＲはＢ１９Ｒに対応する、上記の組成物、

【0064】

当該弱毒化されたワクシニアウイルスが、ワクシニアウイルスＡ４１Ｌ遺伝子、ワクシニアウイルスＤ１３Ｌ遺伝子、ワクシニアウイルスＢ７Ｒ－Ｂ８Ｒ遺伝子、ワクシニアウイルスＡ３９Ｒ遺伝子、およびワクシニアウイルスＣ３Ｌ遺伝子からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の欠失を含む、上記の組成物、

【0065】

ヒトコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列が、１つまたは複数の遺伝子の少なくとも１つの欠失部位に挿入されている、上記の組成物、

【0066】

ヒトコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質ポリペプチドまたはその免疫原性部分が、ワクシニアウイルスＡ４１Ｌ遺伝子欠失部位に挿入されている、上記の組成物、

【0067】

ヒトコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の膜タンパク質ポリペプチドまたはその免疫原性部分およびヌクレオカプシドタンパク質ポリペプチドまたはその免疫原性部分が、ワクシニアウイルスＤ１３Ｌ遺伝子欠失部位に挿入されている、上記の組成物、

【0068】

ヒトコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質ポリペプチドまたはその免疫原性部分が、ワクシニアウイルスＢ７Ｒ－Ｂ８Ｒ遺伝子欠失部位に挿入されている、上記の組成物、

【0069】

ヒトコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列が、弱毒化されたワクシニアウイルスゲノムの遺伝子間領域（ＩＧＲ）に挿入され、当該ＩＧＲが、ワクシニアウイルスゲノムの２つの隣接するＯＲＦの間に位置するかまたはそれらに隣接する、上記の組成物、

【0070】

ヒトコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８からなる群から選択される核酸配列を有する１つまたは複数の発現カセットによってコードされる、上記の組成物、

【0071】

ヒトコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ポリペプチドが、配列番号１に示される核酸配列を有する発現カセットおよび配列番号４に示される核酸配列を有する発現カセットによってコードされる、上記の組成物、

【0072】

ヒトコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ポリペプチドが、配列番号２に示される核酸配列を有する発現カセットおよび配列番号４に示される核酸配列を有する発現カセットによってコードされる、上記の組成物、

【0073】

ヒトコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ポリペプチドが、配列番号１に示される核酸配列を有する発現カセットによってコードされる、上記の組成物、

【0074】

ヒトコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ポリペプチドが、配列番号２に示される核酸配列を有する発現カセットによってコードされる、上記の組成物、

【0075】

ヒトコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ポリペプチドが、配列番号５に示される核酸配列を有する発現カセットによってコードされる、上記の組成物、

【0076】

ヒトコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ポリペプチドが、配列番号３に示される核酸配列を有する発現カセットによってコードされる、上記の組成物、

【0077】

ヒトコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ポリペプチドが、配列番号４に示される核酸配列を有する発現カセットによってコードされる、上記の組成物、

【0078】

ヒトコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ポリペプチドが、配列番号１に示される核酸配列を有する発現カセットおよび配列番号４に示される核酸配列を有する発現カセットおよび配列番号８に示される核酸配列を有する発現カセットによってコードされる、上記の組成物、

【0079】

ヒトコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ポリペプチドが、配列番号２に示される核酸配列を有する発現カセットおよび配列番号４に示される核酸配列を有する発現カセットおよび配列番号８に示される核酸配列を有する発現カセットによってコードされる、上記の組成物、

【0080】

ヒトコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ポリペプチドが、配列番号３に示される核酸配列を有する発現カセットおよび配列番号４に示される核酸配列を有する発現カセットによってコードされる、上記の組成物、

【0081】

ヒトコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ポリペプチドが、配列番号３に示される核酸配列を有する発現カセットおよび配列番号４に示される核酸配列を有する発現カセットおよび配列番号８に示される核酸配列を有する発現カセットによってコードされる、上記の組成物、

【0082】

ヒトコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ポリペプチドが、配列番号６に示される核酸配列を有する発現カセットによってコードされる、上記の組成物、

【0083】

ヒトコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ポリペプチドが、配列番号７に示される核酸配列を有する発現カセットによってコードされる、上記の組成物、

【0084】

薬学的に許容可能な担体または希釈剤を含む上記の組成物、

【0085】

コロナウイルス疾患のリスクを減少させる、動物における免疫反応を高めるための組成物であって、遺伝的に操作された弱毒化されたワクシニアウイルスを含み、当該ワクシニアウイルスゲノムは、ヒトコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質ポリペプチドまたはその免疫原性部分をコードする核酸配列を含み、ならびに、当該弱毒化されたワクシニアウイルスが、内因性の必須のアセンブリまたは成熟タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の欠失を含み、第２の遺伝的に操作された弱毒化されたワクシニアウイルスと混合されており、当該第２のワクシニアウイルスゲノムが、ヒトコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の膜タンパク質ポリペプチドおよびヌクレオカプシドタンパク質ポリペプチドまたはそれらの免疫原性部分（１または複数）をコードする核酸配列を含み、当該第２の弱毒化されたワクシニアウイルスが、内因性の必須のアセンブリまたは成熟タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の欠失を含む、上記の組成物、

【0086】

遺伝的に操作された弱毒化されたワクシニアウイルスベクターであって、当該ワクシニアウイルスゲノムが、ヒトコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の、スパイクタンパク質ポリペプチド、膜タンパク質ポリペプチド、およびヌクレオカプシドタンパク質ポリペプチド、および／または、エンベロープタンパク質ポリペプチドをコードする核酸配列を含み、当該弱毒化されたワクシニアウイルスベクターが、ウイルス様粒子へとアセンブルされる前述のポリペプチドを発現する、遺伝的に操作された弱毒化されたワクシニアウイルスベクター。

【0087】

弱毒化されたワクシニアウイルスを含む組成物を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫反応を誘導するのに有効な量において、ヒトを含む動物に投与することを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染のリスクを防ぐかまたは減少させる方法であって、当該ワクシニアウイルスゲノムが、ヒトコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の、スパイクポリペプチドまたはその免疫原性部分および膜タンパク質ポリペプチドまたはその免疫原性部分およびヌクレオカプシドタンパク質ポリペプチドまたはその免疫原性部分、および任意選択的にエンベロープタンパク質ポリペプチドまたはその免疫原性部分、をコードする核酸配列を含む、方法、

【0088】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原に対する上記免疫反応が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する遺伝的類似性を有するコロナウイルスに対して交差反応性である抗体を提供する上記の方法。

【0089】

コロナウイルス感染に対して対象における防御免疫反応の誘導に使用するための医薬の製造における上記のいずれかのような組成物の使用。

【図面の簡単な説明】

【0090】

【図1-1】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ、Ｍ、ＮおよびＥに関して、ポックスウイルス発現カセットを合成するか（Ａ、Ｂ、ＦおよびＧ）またはＰＣＲによって構築した（Ｃ、ＤおよびＥ）。 Ａ．合成初期／後期プロモーター（ｐｒＰｓ）の転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を含む発現カセット。 Ｂ．天然初期／後期プロモーター（ｐｒ７．５）の転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を含む発現カセット。 Ｃ．合成初期／後期プロモーター（ｐｒＰｓ）の転写制御下のスパイクタンパク質のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１を含む発現カセット。 Ｄ．鶏痘初期／後期プロモーター（ｐｒＥ／Ｌ）の転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質を含む発現カセット。 Ｅ．合成初期／後期プロモーター（ｐｒＰｓ）の転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質を含む発現カセット。 Ｆ．鶏痘初期／後期プロモーター（ｐｒＥ／Ｌ）の転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質および合成初期／後期プロモーター（ｐｒＰｓ）の転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質を含む発現カセット。 Ｇ．合成初期／後期プロモーター（ｐｒＰｓ）の転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質を含む発現カセット。

【図1-2】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ、Ｍ、ＮおよびＥに関して、ポックスウイルス発現カセットを合成するか（Ａ、Ｂ、ＦおよびＧ）またはＰＣＲによって構築した（Ｃ、ＤおよびＥ）。 Ａ．合成初期／後期プロモーター（ｐｒＰｓ）の転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を含む発現カセット。 Ｂ．天然初期／後期プロモーター（ｐｒ７．５）の転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を含む発現カセット。 Ｃ．合成初期／後期プロモーター（ｐｒＰｓ）の転写制御下のスパイクタンパク質のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１を含む発現カセット。 Ｄ．鶏痘初期／後期プロモーター（ｐｒＥ／Ｌ）の転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質を含む発現カセット。 Ｅ．合成初期／後期プロモーター（ｐｒＰｓ）の転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質を含む発現カセット。 Ｆ．鶏痘初期／後期プロモーター（ｐｒＥ／Ｌ）の転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質および合成初期／後期プロモーター（ｐｒＰｓ）の転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質を含む発現カセット。 Ｇ．合成初期／後期プロモーター（ｐｒＰｓ）の転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質を含む発現カセット。

【図2】ワクシニアウイルスコペンハーゲン株（ＶＡＣＶ－ＣＯＰ）ゲノムに関してＦ１およびＦ２組換えアームによって示される相同組換え部位。 Ａ．ＳＣＶ－ＳＭＸ０６において欠失されたＶＡＣＶ－ＣＯＰ領域に隣接し、その間にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原が挿入され得るＦ１－Ａ３９ＲおよびＦ２－Ａ３９Ｒ相同組換えアームを伴うＶＡＣＶ－ＣＯＰのＡ３９Ｒ領域。 Ｂ．ＳＣＶ－ＳＭＸ０６において欠失されたＶＡＣＶ－ＣＯＰ領域に隣接し、その間にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原が挿入され得るＦ１－Ａ４１ＬおよびＦ２－Ａ４２Ｌ相同組換えアームを伴うＶＡＣＶ－ＣＯＰのＡ４１Ｌ領域。 Ｃ．ＳＣＶ－ＳＭＸ０６において欠失されたＶＡＣＶ－ＣＯＰ領域に隣接し、その間にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原が挿入され得るＦ１－Ｂ７Ｂ８ＲおよびＦ２－Ｂ７Ｂ８Ｒ相同組換えアームを伴うＶＡＣＶ－ＣＯＰのＢ７／Ｂ８Ｒ領域。 Ｄ．ＳＣＶ－ＳＭＸ０６において欠失されたＶＡＣＶ－ＣＯＰ領域に隣接し、その間にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原が挿入され得るＦ１－Ｃ３ＬおよびＦ２－Ｃ３Ｌ相同組換えアームを伴うＶＡＣＶ－ＣＯＰのＣ３Ｌ領域。 Ｅ．ＳＣＶ－ＳＭＸ０６において欠失されたＶＡＣＶ－ＣＯＰ領域に隣接し、その間にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原が挿入され得るＦ１－Ｄ１３ＬおよびＦ２－Ｄ１３Ｌ相同組換えアームを伴うＶＡＣＶ－ＣＯＰのＤ１３Ｌ領域。 Ｆ．その間にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原が挿入され得るＶＡＣＶ－ＣＯＰ領域に隣接するＦ１－Ｊ２／Ｊ３ＲおよびＦ２－Ｊ２／Ｊ３Ｒ相同組換えアームを伴うＶＡＣＶ－ＣＯＰのＪ２Ｒ－Ｊ３Ｒ遺伝子間領域。

【図3A】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２導入遺伝子に対する相同組換え（ＨＲ）カセットの詳細なマップおよび要素。 Ａ．ｐｒＰｓ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク発現カセットを含むＡ４１Ｌ置換のためのＨＲカセット。 Ｂ．ｐｒ７．５ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク発現カセットを含むＡ４１Ｌ置換のためのＨＲカセット。 Ｃ．スパイク発現カセットのｐｒＰｓ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓ１サブユニットを含むＡ４１Ｌ置換のためのＨＲカセット。 Ｄ．ｐｒＥ／Ｌ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜およびｐｒＰｓ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド発現カセットを含むＤ１３Ｌ置換のためのＨＲカセット。 Ｅ．ｐｒＥ／Ｌ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜およびｐｒＰｓ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド発現カセットを含む遺伝子間部位Ｊ２／Ｊ３Ｒへの挿入のためのＨＲカセット。 Ｆ．ｐｒＥ／Ｌ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜発現カセットを含むＣ３Ｌ置換のためのＨＲカセット。 Ｇ．ｐｒＰｓ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド発現カセットを含むＤ１３Ｌ置換のためのＨＲカセット。 Ｈ．ｐｒＰｓ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープ発現カセットを含むＢ７／Ｂ８Ｒ置換のためのＨＲカセット。

【図3B】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２導入遺伝子に対する相同組換え（ＨＲ）カセットの詳細なマップおよび要素。 Ａ．ｐｒＰｓ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク発現カセットを含むＡ４１Ｌ置換のためのＨＲカセット。 Ｂ．ｐｒ７．５ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク発現カセットを含むＡ４１Ｌ置換のためのＨＲカセット。 Ｃ．スパイク発現カセットのｐｒＰｓ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓ１サブユニットを含むＡ４１Ｌ置換のためのＨＲカセット。 Ｄ．ｐｒＥ／Ｌ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜およびｐｒＰｓ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド発現カセットを含むＤ１３Ｌ置換のためのＨＲカセット。 Ｅ．ｐｒＥ／Ｌ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜およびｐｒＰｓ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド発現カセットを含む遺伝子間部位Ｊ２／Ｊ３Ｒへの挿入のためのＨＲカセット。 Ｆ．ｐｒＥ／Ｌ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜発現カセットを含むＣ３Ｌ置換のためのＨＲカセット。 Ｇ．ｐｒＰｓ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド発現カセットを含むＤ１３Ｌ置換のためのＨＲカセット。 Ｈ．ｐｒＰｓ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープ発現カセットを含むＢ７／Ｂ８Ｒ置換のためのＨＲカセット。

【図3C】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２導入遺伝子に対する相同組換え（ＨＲ）カセットの詳細なマップおよび要素。 Ａ．ｐｒＰｓ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク発現カセットを含むＡ４１Ｌ置換のためのＨＲカセット。 Ｂ．ｐｒ７．５ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク発現カセットを含むＡ４１Ｌ置換のためのＨＲカセット。 Ｃ．スパイク発現カセットのｐｒＰｓ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓ１サブユニットを含むＡ４１Ｌ置換のためのＨＲカセット。 Ｄ．ｐｒＥ／Ｌ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜およびｐｒＰｓ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド発現カセットを含むＤ１３Ｌ置換のためのＨＲカセット。 Ｅ．ｐｒＥ／Ｌ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜およびｐｒＰｓ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド発現カセットを含む遺伝子間部位Ｊ２／Ｊ３Ｒへの挿入のためのＨＲカセット。 Ｆ．ｐｒＥ／Ｌ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜発現カセットを含むＣ３Ｌ置換のためのＨＲカセット。 Ｇ．ｐｒＰｓ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド発現カセットを含むＤ１３Ｌ置換のためのＨＲカセット。 Ｈ．ｐｒＰｓ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープ発現カセットを含むＢ７／Ｂ８Ｒ置換のためのＨＲカセット。

【図3D-1】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２導入遺伝子に対する相同組換え（ＨＲ）カセットの詳細なマップおよび要素。 Ａ．ｐｒＰｓ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク発現カセットを含むＡ４１Ｌ置換のためのＨＲカセット。 Ｂ．ｐｒ７．５ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク発現カセットを含むＡ４１Ｌ置換のためのＨＲカセット。 Ｃ．スパイク発現カセットのｐｒＰｓ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓ１サブユニットを含むＡ４１Ｌ置換のためのＨＲカセット。 Ｄ．ｐｒＥ／Ｌ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜およびｐｒＰｓ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド発現カセットを含むＤ１３Ｌ置換のためのＨＲカセット。 Ｅ．ｐｒＥ／Ｌ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜およびｐｒＰｓ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド発現カセットを含む遺伝子間部位Ｊ２／Ｊ３Ｒへの挿入のためのＨＲカセット。 Ｆ．ｐｒＥ／Ｌ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜発現カセットを含むＣ３Ｌ置換のためのＨＲカセット。 Ｇ．ｐｒＰｓ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド発現カセットを含むＤ１３Ｌ置換のためのＨＲカセット。 Ｈ．ｐｒＰｓ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープ発現カセットを含むＢ７／Ｂ８Ｒ置換のためのＨＲカセット。

【図3D-2】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２導入遺伝子に対する相同組換え（ＨＲ）カセットの詳細なマップおよび要素。 Ａ．ｐｒＰｓ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク発現カセットを含むＡ４１Ｌ置換のためのＨＲカセット。 Ｂ．ｐｒ７．５ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク発現カセットを含むＡ４１Ｌ置換のためのＨＲカセット。 Ｃ．スパイク発現カセットのｐｒＰｓ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓ１サブユニットを含むＡ４１Ｌ置換のためのＨＲカセット。 Ｄ．ｐｒＥ／Ｌ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜およびｐｒＰｓ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド発現カセットを含むＤ１３Ｌ置換のためのＨＲカセット。 Ｅ．ｐｒＥ／Ｌ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜およびｐｒＰｓ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド発現カセットを含む遺伝子間部位Ｊ２／Ｊ３Ｒへの挿入のためのＨＲカセット。 Ｆ．ｐｒＥ／Ｌ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜発現カセットを含むＣ３Ｌ置換のためのＨＲカセット。 Ｇ．ｐｒＰｓ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド発現カセットを含むＤ１３Ｌ置換のためのＨＲカセット。 Ｈ．ｐｒＰｓ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープ発現カセットを含むＢ７／Ｂ８Ｒ置換のためのＨＲカセット。

【図3E】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２導入遺伝子に対する相同組換え（ＨＲ）カセットの詳細なマップおよび要素。 Ａ．ｐｒＰｓ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク発現カセットを含むＡ４１Ｌ置換のためのＨＲカセット。 Ｂ．ｐｒ７．５ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク発現カセットを含むＡ４１Ｌ置換のためのＨＲカセット。 Ｃ．スパイク発現カセットのｐｒＰｓ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓ１サブユニットを含むＡ４１Ｌ置換のためのＨＲカセット。 Ｄ．ｐｒＥ／Ｌ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜およびｐｒＰｓ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド発現カセットを含むＤ１３Ｌ置換のためのＨＲカセット。 Ｅ．ｐｒＥ／Ｌ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜およびｐｒＰｓ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド発現カセットを含む遺伝子間部位Ｊ２／Ｊ３Ｒへの挿入のためのＨＲカセット。 Ｆ．ｐｒＥ／Ｌ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜発現カセットを含むＣ３Ｌ置換のためのＨＲカセット。 Ｇ．ｐｒＰｓ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド発現カセットを含むＤ１３Ｌ置換のためのＨＲカセット。 Ｈ．ｐｒＰｓ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープ発現カセットを含むＢ７／Ｂ８Ｒ置換のためのＨＲカセット。

【図3F】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２導入遺伝子に対する相同組換え（ＨＲ）カセットの詳細なマップおよび要素。 Ａ．ｐｒＰｓ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク発現カセットを含むＡ４１Ｌ置換のためのＨＲカセット。 Ｂ．ｐｒ７．５ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク発現カセットを含むＡ４１Ｌ置換のためのＨＲカセット。 Ｃ．スパイク発現カセットのｐｒＰｓ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓ１サブユニットを含むＡ４１Ｌ置換のためのＨＲカセット。 Ｄ．ｐｒＥ／Ｌ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜およびｐｒＰｓ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド発現カセットを含むＤ１３Ｌ置換のためのＨＲカセット。 Ｅ．ｐｒＥ／Ｌ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜およびｐｒＰｓ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド発現カセットを含む遺伝子間部位Ｊ２／Ｊ３Ｒへの挿入のためのＨＲカセット。 Ｆ．ｐｒＥ／Ｌ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜発現カセットを含むＣ３Ｌ置換のためのＨＲカセット。 Ｇ．ｐｒＰｓ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド発現カセットを含むＤ１３Ｌ置換のためのＨＲカセット。 Ｈ．ｐｒＰｓ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープ発現カセットを含むＢ７／Ｂ８Ｒ置換のためのＨＲカセット。

【図3G】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２導入遺伝子に対する相同組換え（ＨＲ）カセットの詳細なマップおよび要素。 Ａ．ｐｒＰｓ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク発現カセットを含むＡ４１Ｌ置換のためのＨＲカセット。 Ｂ．ｐｒ７．５ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク発現カセットを含むＡ４１Ｌ置換のためのＨＲカセット。 Ｃ．スパイク発現カセットのｐｒＰｓ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓ１サブユニットを含むＡ４１Ｌ置換のためのＨＲカセット。 Ｄ．ｐｒＥ／Ｌ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜およびｐｒＰｓ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド発現カセットを含むＤ１３Ｌ置換のためのＨＲカセット。 Ｅ．ｐｒＥ／Ｌ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜およびｐｒＰｓ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド発現カセットを含む遺伝子間部位Ｊ２／Ｊ３Ｒへの挿入のためのＨＲカセット。 Ｆ．ｐｒＥ／Ｌ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜発現カセットを含むＣ３Ｌ置換のためのＨＲカセット。 Ｇ．ｐｒＰｓ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド発現カセットを含むＤ１３Ｌ置換のためのＨＲカセット。 Ｈ．ｐｒＰｓ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープ発現カセットを含むＢ７／Ｂ８Ｒ置換のためのＨＲカセット。

【図3H】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２導入遺伝子に対する相同組換え（ＨＲ）カセットの詳細なマップおよび要素。 Ａ．ｐｒＰｓ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク発現カセットを含むＡ４１Ｌ置換のためのＨＲカセット。 Ｂ．ｐｒ７．５ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク発現カセットを含むＡ４１Ｌ置換のためのＨＲカセット。 Ｃ．スパイク発現カセットのｐｒＰｓ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓ１サブユニットを含むＡ４１Ｌ置換のためのＨＲカセット。 Ｄ．ｐｒＥ／Ｌ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜およびｐｒＰｓ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド発現カセットを含むＤ１３Ｌ置換のためのＨＲカセット。 Ｅ．ｐｒＥ／Ｌ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜およびｐｒＰｓ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド発現カセットを含む遺伝子間部位Ｊ２／Ｊ３Ｒへの挿入のためのＨＲカセット。 Ｆ．ｐｒＥ／Ｌ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜発現カセットを含むＣ３Ｌ置換のためのＨＲカセット。 Ｇ．ｐｒＰｓ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド発現カセットを含むＤ１３Ｌ置換のためのＨＲカセット。 Ｈ．ｐｒＰｓ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープ発現カセットを含むＢ７／Ｂ８Ｒ置換のためのＨＲカセット。

【図4】ワクチン構築プロセスの概略図。

【図5-1】ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９ワクチン内のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原挿入領域。 Ａ．Ａ４１Ｌ ＯＲＦ中に置換された合成初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク導入遺伝子。 Ｂ．Ａ４１Ｌ ＯＲＦ中に置換された天然初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク導入遺伝子。 Ｃ．Ａ４１Ｌ ＯＲＦ中に置換されたスパイク導入遺伝子のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓ１サブユニット。 Ｄ．Ｄ１３Ｌ ＯＲＦと置き換えられたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜およびヌクレオカプシド導入遺伝子。 Ｅ．Ｊ２ＲおよびＪ３Ｒ ＯＲＦの間の遺伝子間領域に挿入されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜およびヌクレオカプシド導入遺伝子。 Ｆ．Ｂ７／Ｂ８Ｒ ＯＲＦと置き換えられたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープ導入遺伝子。 Ｇ．Ｃ３Ｌ ＯＲＦと置き換えられたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜導入遺伝子。 Ｈ．Ｄ１３Ｌ ＯＲＦと置き換えられたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド導入遺伝子。

【図5-2】ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９ワクチン内のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原挿入領域。 Ａ．Ａ４１Ｌ ＯＲＦ中に置換された合成初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク導入遺伝子。 Ｂ．Ａ４１Ｌ ＯＲＦ中に置換された天然初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク導入遺伝子。 Ｃ．Ａ４１Ｌ ＯＲＦ中に置換されたスパイク導入遺伝子のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓ１サブユニット。 Ｄ．Ｄ１３Ｌ ＯＲＦと置き換えられたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜およびヌクレオカプシド導入遺伝子。 Ｅ．Ｊ２ＲおよびＪ３Ｒ ＯＲＦの間の遺伝子間領域に挿入されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜およびヌクレオカプシド導入遺伝子。 Ｆ．Ｂ７／Ｂ８Ｒ ＯＲＦと置き換えられたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープ導入遺伝子。 Ｇ．Ｃ３Ｌ ＯＲＦと置き換えられたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜導入遺伝子。 Ｈ．Ｄ１３Ｌ ＯＲＦと置き換えられたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド導入遺伝子。

【図6】ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｄによる単一のワクチン接種は、非近交系および近交系マウスにおいて中和ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体およびＴｈ１バイアス抗体プロファイルを生じさせる。 Ａ．ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｄシングルショットワクチン接種後の２１日目における非近交系ＡＲＣ（ｓ）および近交系Ｃ５７ＢＬ／６株のウイルス特異的中和抗体のレベル。 Ｂ．ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｄシングルショットワクチン接種後の２１日目における非近交系ＡＲＣ（ｓ）および近交系Ｃ５７ＢＬ／６株のＳ１特異的抗体のレベル。 Ｃ．ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｄシングルショットワクチン接種後の２１日目における非近交系ＡＲＣ（ｓ）および近交系Ｃ５７ＢＬ／６株のＩｇＧ２ｃ（Ｔｈ１）およびＩｇＧ１（Ｔｈ２）抗体のレベル。

【図7】ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｄによる単一ワクチン接種が、スパイク特異的ＣＤ８ Ｔ細胞反応を生じさせる。 Ａ．ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｄシングルショットワクチン接種後の細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）によるスパイク特異的ＩＦＮγ^＋ＣＤ８ Ｔ細胞のレベル。 Ｂ．ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｄシングルショットワクチン接種後のＥＬＩＳｐｏｔによるスパイク特異的ＩＦＮγ^＋ＣＤ８ Ｔ細胞のレベル。

【図8】ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃは、ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｄよりも良好なスパイク特異的抗体を誘発する。 Ａ．ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９ワクチンに感染した細胞におけるスパイク抗原発現のウエスタンブロットによる検出。 Ｂ．ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃ、ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｄ、およびＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｆシングルショットワクチン接種後の２１日目のＳ１特異的抗体のレベル。

【図9】ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃによる単一のワクチン接種は、近交系および非近交系マウスにおいて抗体反応を誘導する。 Ａ．ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃシングルショットワクチン接種後の１４日目における非近交系ＡＲＣ（ｓ）および近交系Ｃ５７ＢＬ／６株のＳ１特異的抗体のレベル。 Ｂ．ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃシングルショットワクチン接種後の１４日目における非近交系ＡＲＣ（ｓ）および近交系Ｃ５７ＢＬ／６株のＳ１特異的抗体の力価。 Ｃ．ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃシングルショットワクチン接種後の１４日目における非近交系ＡＲＣ（ｓ）および近交系Ｃ５７ＢＬ／６株の中和抗体のレベル。

【図10】トリプルサイトカイン産生ＣＤ８ Ｔ細胞の同定のためのゲーティング戦略。

【図11-1】ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃによる単一のワクチン接種が、ロバストなスパイク特異的Ｔ細胞反応を誘導する。 Ａ．ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃシングルショットワクチン接種後の、スパイク特異的ＩＦＮγ^＋ＣＤ８ Ｔ細胞の検出を示す代表的フローサイトメトリープロット。 Ｂ．ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃシングルショットワクチン接種後の、スパイクプール１（Ｓ１）特異的（左側）、スパイクプール２（Ｓ２）特異的（中央）、およびエピトープ特異的（右側）である、シングル、ダブルおよびトリプルサイトカイン産生ＩＦＮγ^＋ＣＤ８ Ｔ細胞の総数のグラフ要約。 Ｃ．ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃシングルショットワクチン接種後の、グランザイムＢ産生ＣＤ８ Ｔ細胞の代表的フローサイトメトリープロットおよびグラフ要約。 Ｄ．ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃシングルショットワクチン接種後の、Ｓ１およびＳ２特異的トリプルサイトカイン産生ＣＤ４ Ｔ細胞の総数。

【図11-2】ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃによる単一のワクチン接種が、ロバストなスパイク特異的Ｔ細胞反応を誘導する。 Ａ．ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃシングルショットワクチン接種後の、スパイク特異的ＩＦＮγ^＋ＣＤ８ Ｔ細胞の検出を示す代表的フローサイトメトリープロット。 Ｂ．ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃシングルショットワクチン接種後の、スパイクプール１（Ｓ１）特異的（左側）、スパイクプール２（Ｓ２）特異的（中央）、およびエピトープ特異的（右側）である、シングル、ダブルおよびトリプルサイトカイン産生ＩＦＮγ^＋ＣＤ８ Ｔ細胞の総数のグラフ要約。 Ｃ．ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃシングルショットワクチン接種後の、グランザイムＢ産生ＣＤ８ Ｔ細胞の代表的フローサイトメトリープロットおよびグラフ要約。 Ｄ．ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃシングルショットワクチン接種後の、Ｓ１およびＳ２特異的トリプルサイトカイン産生ＣＤ４ Ｔ細胞の総数。

【図12】既存の免疫は、ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃワクチンの単回投与後のスパイク特異的抗体反応の量および質に影響を及ぼさない。 Ａ．ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃシングルショットワクチン接種後２８日目、４４日目、および８０日目の、既存の免疫を有するかまたは有しないマウスに関するＳ１特異的抗体のレベル。 Ｂ．ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃシングルショットワクチン接種後２８日目、４４日目、および８０日目の、既存の免疫を有するか有しないマウスの中和抗体に関するレベル。

【図13】既存の免疫は、プライム－ブーストワクチン接種後のスパイク特異的抗体反応の量および質に影響を及ぼさない。 Ａ．ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃ相同的プライム－ブーストワクチン接種での２８日目（ブースト前）ならびにブースター接種後１４日目および５０日目における、既存の免疫を有するか有しないマウスに関するＳ１特異的抗体のレベル。 Ｂ．ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃ相同的プライム－ブーストワクチン接種での２８日目（ブースト前）ならびにブースター接種後１４日目および５０日目における、既存の免疫を有するか有しないマウスに関するＳ１特異的抗体のレベル。

【図14】ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃによる単一のワクチン接種が、加齢マウスにおいて抗原特異的抗体反応を誘導する。 Ａ．ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃシングルショットワクチン接種後１４日目および２１日目における、若齢マウスおよび加齢マウスのＳ１特異的抗体のレベル。 Ｂ．ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃシングルショットワクチン接種後１４日目および２１日目における、若齢マウスおよび加齢マウスの中和抗体のレベル。

【図15】相同的プライム－ブーストは、抗体反応の著しいブースティングを生じさせ、それは、ワクチン接種後、最高で３か月間維持される。 Ａ．ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃシングルショットワクチン接種後２１日目およびＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃ相同的プライム－ブーストワクチン接種後２１日目（ブースト後）における、若齢マウスおよび加齢マウスのＳ１特異的抗体のレベル。 Ｂ．ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃシングルショットワクチン接種後２１日目およびＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃ相同的プライム－ブーストワクチン接種後２１日目（ブースト後）における、若齢マウスおよび加齢マウスの中和抗体のレベル。 Ｃ．ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃ相同的プライム－ブーストワクチン接種後３週間目、９週間目、および１２週間目（ブースト後）における、若齢マウスおよび加齢マウスの中和抗体のレベル。

【図16】細胞表面マーカーを使用したＴ細胞メモリー細胞タイプのフローサイトメトリー同定のためのゲーティング戦略。

【図17-1】ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃの相同的プライム－ブーストは、長期Ｔ細胞反応を誘導する。 Ａ．若齢マウスおよび加齢マウスにおける、ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃシングルショットワクチン接種後３か月ならびにＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃ相同的プライム－ブーストワクチン接種後３か月（ブースト後）の、短命エフェクター（Ｔ_ＳＬＥ）、エフェクターメモリー（Ｔ_ＥＭ）、およびセントラルメモリー（Ｔ_ＣＭ）ＣＤ８ Ｔ細胞の総数。 Ｂ．若齢マウスおよび加齢マウスにおける、ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃシングルショットワクチン接種後３か月ならびにＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃ相同的プライム－ブーストワクチン接種後３か月（ブースト後）の、スパイク特異的ＩＦＮγ^＋ＣＤ８ Ｔ細胞のレベル。 Ｃ．若齢マウスおよび加齢マウスにおける、ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃシングルショットワクチン接種後３か月ならびにＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃ相同的プライム－ブーストワクチン接種後３か月（ブースト後）の、ＥＬＩＳｐｏｔによって検出されるＳ１－、ＲＢＤ－およびＳ２特異的ＩＦＮγ^＋スポット形成単位のレベル。 Ｄ．若齢マウスおよび加齢マウスにおける、ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃシングルショットワクチン接種後３か月ならびにＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃ相同的プライム－ブーストワクチン接種後３か月（ブースト後）の、ＩＣＳによって検出されるＳ１－、ＲＢＤ－およびＳ２特異的ＩＦＮγ^＋ＣＤ８ Ｔ細胞の割合。 Ｅ．若齢マウスおよび加齢マウスにおける、ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃシングルショットワクチン接種後３か月およびＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃ相同的プライム－ブーストワクチン接種後３か月（ブースト後）の、ＩＣＳによって検出されるＳ１－、ＲＢＤ－およびＳ２特異的トリプルサイトカイン産生ＣＤ８ Ｔ細胞の総数。

【図17-2】ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃの相同的プライム－ブーストは、長期Ｔ細胞反応を誘導する。 Ａ．若齢マウスおよび加齢マウスにおける、ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃシングルショットワクチン接種後３か月ならびにＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃ相同的プライム－ブーストワクチン接種後３か月（ブースト後）の、短命エフェクター（Ｔ_ＳＬＥ）、エフェクターメモリー（Ｔ_ＥＭ）、およびセントラルメモリー（Ｔ_ＣＭ）ＣＤ８ Ｔ細胞の総数。 Ｂ．若齢マウスおよび加齢マウスにおける、ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃシングルショットワクチン接種後３か月ならびにＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃ相同的プライム－ブーストワクチン接種後３か月（ブースト後）の、スパイク特異的ＩＦＮγ^＋ＣＤ８ Ｔ細胞のレベル。 Ｃ．若齢マウスおよび加齢マウスにおける、ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃシングルショットワクチン接種後３か月ならびにＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃ相同的プライム－ブーストワクチン接種後３か月（ブースト後）の、ＥＬＩＳｐｏｔによって検出されるＳ１－、ＲＢＤ－およびＳ２特異的ＩＦＮγ^＋スポット形成単位のレベル。 Ｄ．若齢マウスおよび加齢マウスにおける、ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃシングルショットワクチン接種後３か月ならびにＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃ相同的プライム－ブーストワクチン接種後３か月（ブースト後）の、ＩＣＳによって検出されるＳ１－、ＲＢＤ－およびＳ２特異的ＩＦＮγ^＋ＣＤ８ Ｔ細胞の割合。 Ｅ．若齢マウスおよび加齢マウスにおける、ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃシングルショットワクチン接種後３か月およびＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃ相同的プライム－ブーストワクチン接種後３か月（ブースト後）の、ＩＣＳによって検出されるＳ１－、ＲＢＤ－およびＳ２特異的トリプルサイトカイン産生ＣＤ８ Ｔ細胞の総数。

【図17-3】ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃの相同的プライム－ブーストは、長期Ｔ細胞反応を誘導する。 Ａ．若齢マウスおよび加齢マウスにおける、ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃシングルショットワクチン接種後３か月ならびにＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃ相同的プライム－ブーストワクチン接種後３か月（ブースト後）の、短命エフェクター（Ｔ_ＳＬＥ）、エフェクターメモリー（Ｔ_ＥＭ）、およびセントラルメモリー（Ｔ_ＣＭ）ＣＤ８ Ｔ細胞の総数。 Ｂ．若齢マウスおよび加齢マウスにおける、ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃシングルショットワクチン接種後３か月ならびにＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃ相同的プライム－ブーストワクチン接種後３か月（ブースト後）の、スパイク特異的ＩＦＮγ^＋ＣＤ８ Ｔ細胞のレベル。 Ｃ．若齢マウスおよび加齢マウスにおける、ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃシングルショットワクチン接種後３か月ならびにＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃ相同的プライム－ブーストワクチン接種後３か月（ブースト後）の、ＥＬＩＳｐｏｔによって検出されるＳ１－、ＲＢＤ－およびＳ２特異的ＩＦＮγ^＋スポット形成単位のレベル。 Ｄ．若齢マウスおよび加齢マウスにおける、ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃシングルショットワクチン接種後３か月ならびにＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃ相同的プライム－ブーストワクチン接種後３か月（ブースト後）の、ＩＣＳによって検出されるＳ１－、ＲＢＤ－およびＳ２特異的ＩＦＮγ^＋ＣＤ８ Ｔ細胞の割合。 Ｅ．若齢マウスおよび加齢マウスにおける、ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃシングルショットワクチン接種後３か月およびＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃ相同的プライム－ブーストワクチン接種後３か月（ブースト後）の、ＩＣＳによって検出されるＳ１－、ＲＢＤ－およびＳ２特異的トリプルサイトカイン産生ＣＤ８ Ｔ細胞の総数。

【図18】ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃの相同的プライム－ブーストは、潜在的に、スパイクＲＢＤにおけるＣＤ８ Ｔ細胞エピトープに基づいてＳＡＲＳ－ＣｏＶと交差反応し得る。 Ａ．ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃシングルショットワクチン接種後７日目における、ＥＬＩＳｐｏｔによるエピトープ特異的ＩＦＮγ^＋ＣＤ８ Ｔ細胞のレベル。 Ｂ．ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃシングルショットワクチン接種後７日目における、ＩＣＳによるエピトープ特異的ＩＦＮγ^＋ＣＤ８ Ｔ細胞を示す代表的フローサイトメトリーパネル。

【図19】ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ａによるシングルワクチン接種は、スパイク－および膜特異的ＣＤ８ Ｔ細胞反応を生じさせる Ａ．ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ａシングルショットワクチン接種後２１日目における、Ｓ１－、ＲＢＤ－およびＳ２特異的ＩＦＮγ^＋ＣＤ８ Ｔ細胞のレベル。 Ｂ．ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ａシングルショットワクチン接種後２１日目における、膜特異的ＩＦＮγ^＋ＣＤ８ Ｔ細胞のレベル。 Ｃ．ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ａシングルショットワクチン接種後２１日目における、ヌクレオカプシド特異的ＩＦＮγ^＋ＣＤ８ Ｔ細胞のレベル。

【図20-1】均等割合のＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９ＣおよびＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｇでの単回ワクチン接種は、スパイクおよび膜タンパク質に対するスパイク特異的抗体反応およびＣＤ８^＋Ｔ細胞反応を誘導する。 Ａ．ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９ＣおよびＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｇを含む混合ワクチンによるシングルショットワクチン接種後２１日目におけるＳ１特異的抗体のレベル。 Ｂ．ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９ＣおよびＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｇを含む混合ワクチンによるシングルショットワクチン接種後２１日目におけるＳ１特異的抗体の力価。 Ｃ．ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９ＣおよびＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｇを含む混合ワクチンによるシングルショットワクチン接種後の、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）によるスパイク特異的ＩＦＮγ^＋産生Ｔ細胞反応のレベル。 Ｄ．ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９ＣおよびＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｇを含む混合ワクチンによるシングルショットワクチン接種後の、ＥＬＩＳｐｏｔによるスパイク－および膜特異的ＩＦＮγ^＋産生Ｔ細胞反応のレベル。

【図20-2】均等割合のＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９ＣおよびＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｇでの単回ワクチン接種は、スパイクおよび膜タンパク質に対するスパイク特異的抗体反応およびＣＤ８^＋Ｔ細胞反応を誘導する。 Ａ．ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９ＣおよびＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｇを含む混合ワクチンによるシングルショットワクチン接種後２１日目におけるＳ１特異的抗体のレベル。 Ｂ．ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９ＣおよびＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｇを含む混合ワクチンによるシングルショットワクチン接種後２１日目におけるＳ１特異的抗体の力価。 Ｃ．ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９ＣおよびＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｇを含む混合ワクチンによるシングルショットワクチン接種後の、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）によるスパイク特異的ＩＦＮγ^＋産生Ｔ細胞反応のレベル。 Ｄ．ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９ＣおよびＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｇを含む混合ワクチンによるシングルショットワクチン接種後の、ＥＬＩＳｐｏｔによるスパイク－および膜特異的ＩＦＮγ^＋産生Ｔ細胞反応のレベル。

【図21-1】ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃによるシングルワクチン接種は、エピトープ特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）活性を生じさせる。 Ａ．ワクチン接種後７日目におけるペプチドＹＮＹＬＹＲＬＦ（配列番号９）でパルスした標的細胞に対するＣＴＬ反応。 Ｂ．ワクチン接種後７日目におけるペプチドＶＮＦＮＦＮＧＬ（配列番号１１）でパルスした標的細胞に対するＣＴＬ反応。 Ｃ．非パルス標的細胞に対するＣＴＬ反応。

【図21-2】ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃによるシングルワクチン接種は、エピトープ特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）活性を生じさせる。 Ａ．ワクチン接種後７日目におけるペプチドＹＮＹＬＹＲＬＦ（配列番号９）でパルスした標的細胞に対するＣＴＬ反応。 Ｂ．ワクチン接種後７日目におけるペプチドＶＮＦＮＦＮＧＬ（配列番号１１）でパルスした標的細胞に対するＣＴＬ反応。 Ｃ．非パルス標的細胞に対するＣＴＬ反応。

【発明を実施するための形態】

【0091】

本発明は、特定の手順または剤、剤の特定の製剤および様々な医学的方法論に限定されるものではなく、そのため、それらは変更され得る。本明細書において使用される専門用語は、特定の実施形態を説明するためだけのものであり、限定することを意図するものではない。特に明記されない限り、本明細書において使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。

【0092】

本明細書において説明されるものと類似もしくは同等の任意の材料および方法は、本発明を実施または試験するために使用することができる。実施者は、特に、以下に向けられる：Ｓａｍｂｒｏｏｋら， （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｓｖｉｅｗ， Ｎ．Ｙ．：Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９９） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ４７） Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｍｕｒｐｈｙら （１９９５） Ｖｉｒｕｓ Ｔａｘｏｎｏｍｙ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ：７９－８７， Ｍａｈｙ Ｂｒｉａｎ ＷＪ ａｎｄ Ｋａｎｇｒｏ Ｏ Ｈｉｌｌａｒ （Ｅｄｓ）：Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ １９９６， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；およびＤａｖｉｓｏｎ ＡＪ ａｎｄ Ｅｌｉｏｔｔ ＲＭ （Ｅｄｓ）：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ １９９３， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ； Ｐｅｒｋｕｓら， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ （１９９０） １７９（１）：２７６～８６、または当技術分野の定義および用語ならびに当業者に既知の他の方法。

【0093】

本明細書において説明されるものと類似または同等の任意の方法および材料は、本発明の実践または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料について説明する。本発明の目的のために、次の用語を以下のように定義する。

【0094】

本明細書を通して、文脈上特に必要がない限り、語句「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、または「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、言明されたステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群の包含を意味するがいかなる他のステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群の排除を意味するものではないと理解されるであろう。したがって、用語「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの使用は、列挙される要素は、必要であるかまたは必須であるが、他の要素は任意であり、存在し得るかまたはし得ないことを示している。弱毒化されたオルトポックスベクターとの関連において、対象のベクターは、弱毒化のために、以下の欠失を含むことによって改変される

【0095】

成熟遺伝子またはアセンブリ遺伝子、しかしながら、ベクター、抗原または他のタンパク質などに対するさらなる改変が包含される。

【0096】

「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」によって、当該成句「からなる」の後に続くものを含み、それらに限定されることが意図される。したがって、当該成句「からなる」は、列挙される要素が、必要であるかまたは必須であり、ならびに他の要素は存在し得ないことを示している。「実質的に、～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」によって、当該成句の後に列挙される任意の要素を含むことが意図されるが、列挙される要素に対して本開示において指定される活性または作用を妨害しないかまたは貢献しない他の要素に限定される。したがって、当該成句「実質的に、～からなる」は、列挙される要素は、必要であるかまたは必須であるが、他の要素は任意であり、それらが当該列挙される要素の作用の活性に影響するかまたはしないかに応じて、存在し得るかまたはし得ないことを示している。

【0097】

本明細書において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上明記されない限り、複数の態様を包含する。したがって、例えば、「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」に対する言及は、単一の細胞ならびに２つ以上の細胞を含み；「有機体（ａｎ ｏｒｇａｎｉｓｍ）」に対する言及は、単一の有機体ならびに２つ以上の有機体を含む；など。いくつかの実施形態において、「ａｎ」は、「１または１超」を意味する。

【0098】

本明細書で使用される場合、「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」は、列挙された関連項目の１つまたは複数のあらゆる可能な組み合わせを意味し、ならびに包含すると共に、選択的に（または（ｏｒ））解釈される際の組み合わせの欠如を意味しそれを包含する。

【0099】

「弱毒化」または「弱毒化された」は、本明細書において使用される場合、ウイルスベクターのビルレンスの減少を意味する。ビルレンスは、特定の宿主において疾患を引き起こすウイルスの能力として定義される。感染性ウイルスを作り出すことができないポックスウイルスベクターは、初めに細胞に感染し得るが、実質的に、それ自体を完全に複製すること、または宿主内で増殖すること、またはある状態を引き起こすことはできない。これは、当該ベクターはそのタンパク質または核酸を宿主細胞の細胞質に送達するが対象を害さないため、望ましい。

【0100】

「制御要素」または「制御配列」によって、特定のポックスウイルス、ベクター、プラスミドまたは細胞における作動可能に連結されたコード配列の発現にとって必要な核酸配列（例えば、ＤＮＡ）が意味される。真核細胞にとって好適である制御配列としては、転写制御配列、例えば、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、転写エンハンサーなど、翻訳制御配列、例えば、翻訳エンハンサーおよび内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）など、ｍＲＮＡ安定性を調節する核酸配列、ならびに細胞内の細胞内コンパートメントまたは細胞外環境へと転写されたポリヌクレオチドによってコードされた産生物を標的にする標的化配列が挙げられる。

【0101】

配列が提供される場合、対応する配列も包含される。「に対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｓ ｔｏ）」、「対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ）」、または「に対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ）」によって、参照核酸配列に対してかなりの配列同一性（例えば、参照核酸配列の全てまたは一部に対して、少なくとも約５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３ｍ８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９６、９８、９９％、さらには最高で１００％までの配列同一性）を示す核酸配列または参照アミノ酸配列に対してかなりの配列類似性または配列同一性（例えば、参照アミノ酸配列の全てまたは一部に対して、少なくとも５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３ｍ８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９６、９８、９９％、さらには最高で１００％までの配列類似性または配列同一性）を示すアミノ酸配列が意図される。

【0102】

ある状態の治療もしくは予防との関連における、もしくは標的抗原もしくは有機体に対する免疫反応を調整するための、「有効量」によって、ある症状を被ることを予防するため、そのような症状を食い止めるため、および／もしくは既存の症状を治療するため、その状態を予防するため、または標的抗原もしくは有機体に対する免疫反応を調整するために有効な、一回用量においてまたは一連の用量の一部として、剤（例えば、本明細書において説明される弱毒化されたオルトポックスベクター）またはそれを含む組成物の、そのような治療または予防を必要とする個体への、ある量の投与が意図される。有効量は、治療される個体の健康状態および身体的状態、治療される個体の分類群、組成物の製剤、医学的状況の評価、および他の関連要因に応じて変わるであろう。当該量は、日常的作業のトライアルによって決定することができる比較的広い範囲に収まるであろうことが予想される。

【0103】

本明細書において使用される場合、用語「コードする（ｅｎｃｏｄｅ）」、「コードすること（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）」などは、核酸が別の核酸またはポリペプチドを提供する能力を意味する。例えば、核酸配列は、転写および／または翻訳されることによってポリペプチドを作り出し得る場合、または転写および／または翻訳されることによってポリペプチドを作り出し得るような形態へとプロセシングされ得る場合、当該核酸配列は、当該ポリペプチドを「コードする」と言われる。そのような核酸配列は、コード配列、あるいはコード配列と非コード配列との両方を含み得る。したがって、用語「コードする（ｅｎｃｏｄｅ）」、「コードすること（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）」などは、ＤＮＡ分子の転写から生じるＲＮＡ産物、ＲＮＡ分子の翻訳から生じるタンパク質、ＲＮＡ産物を形成するＤＮＡ分子の転写およびＲＮＡ産物のその後の翻訳からから生じるタンパク質、またはＲＮＡ産物を提供するためのＤＮＡ分子の転写、プロセシングされたＲＮＡ産物（例えば、ｍＲＮＡ）を提供するためのＲＮＡ産物のプロセシング、およびプロセシングされたＲＮＡ産物のその後の翻訳から生じるタンパク質を包含する。

【0104】

用語「内因性」は、宿主有機体において通常見出される遺伝子または核酸配列またはセグメントを意味する。

【0105】

用語「発現可能（ｅｘｐｒｅｓｓｉｂｌｅ）」、「発現された（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ）」、およびその変形は、細胞が、ヌクレオチド配列をＲＮＡへと転写し、任意選択的に、生物学的または生化学的機能を提供するペプチドまたはポリペプチドを合成するためにｍＲＮＡを翻訳する能力を意味する。

【0106】

本明細書において使用される場合、用語「遺伝子」は、任意選択的にこのプロセスを支援するための要素の追加を伴って、ｍＲＮＡを作り出すために使用することができる核酸分子を包含する。遺伝子は、機能的タンパク質を作り出すために使用することができる場合もありまたはできない場合もある。遺伝子は、コード領域および非コード領域（例えば、イントロン、調節要素、プロモーター、エンハンサー、終止配列、ならびに５’および３’非翻訳領域）の両方を含むことができる。

【0107】

用語「非相同核酸配列」、「非相同ヌクレオチド配列」、「非相同ポリヌクレオチド」、「外来ポリヌクレオチド」、「外因性ポリヌクレオチド」などは、実験的操作によって有機体のゲノム内に導入され、導入された遺伝子が、改変前のウイルスゲノム配列と比べて、いくつかの改変（例えば、少なくとも１つのヌクレオチドの、点突然変異、欠失、置換または付加、エンドヌクレアーゼ切断部位の存在、ｌｏｘＰ部位の存在など）を含む限りその有機体において見出される遺伝子配列を含み得る、任意の核酸（例えば、ＩＲＥＳを含むヌクレオチド配列Ｉ）を意味するために相互互換的に使用される。

【0108】

用語「非相同ポリペプチド」、「外来ポリペプチド」、および「外因性ポリペプチド」は、上記において定義されるような、「非相同核酸配列」、「非相同ヌクレオチド配列」、「非相同ポリヌクレオチド」、「外来ポリヌクレオチド」、および「外因性ポリヌクレオチド」によってコードされる任意のペプチドまたはポリペプチドを意味するために相互互換的に使用される。

【0109】

ある実施形態において、当該非相同ＤＮＡ配列は、少なくとも１つのコード配列を含む。当該コード配列は、転写制御要素に作動的に連結される。

【0110】

ある実施形態において、当該非相同ＤＮＡ配列は、１つまたは複数の転写制御要素に連結された２つ以上のコード配列も含むことができる。好ましくは、当該コード配列は、１つまたは複数のタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、外来抗原、または抗原性エピトープ、とりわけ、治療的関心対象の遺伝子のそれらをコードする。治療的関心対象の遺伝子は、疾患を引き起こす病原体または感染性微生物の遺伝子から得られ得るか、またはそれに対して相同であり得る。治療的関心対象の遺伝子は、特異的免疫反応に影響を及ぼすため、好ましくは、それを誘導するために、有機体の免疫系に対して提示され、それによって、感染に対して当該有機体をワクチン接種するかまたは予防的に保護する。

【0111】

ある実施形態において、非相同ＤＮＡ配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２から得られ、スパイクタンパク質、および／または膜タンパク質、および／またはヌクレオカプシドタンパク質、および／またはエンベロープタンパク質、または任意のそれらの一部をコードする。

【0112】

用語「防御免疫反応」は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染のリスクを防ぐかもしくは減少させるか、またはコロナウイルス疾患の重症のリスクを減少させる免疫反応を意味する。

【0113】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原に対する免疫反応は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する遺伝的類似性を有するコロナウイルスに対して交差反応性である抗体を提供し得る。

【0114】

用語「中和抗体反応」は、ウイルス感染性を中和することができる抗体が誘発される免疫反応を意味する。ワクチン接種によって中和抗体を生じさせることは、ウイルス感染に対する保護にとって必要かつ十分であり得る。中和抗体の存在は、ワクチン接種後のウイルス感染からの保護と相関する最良の指標である。同様に、それらは、免疫のマーカーである。

【0115】

本明細書において意図されるような免疫反応を誘導することは、免疫反応を引き起こすかまたは刺激すること、および／または以前に存在した免疫反応を強化することを含むことは理解されるであろう。

【0116】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染のリスクおよび／またはコロナウイルス疾患の重症度を防ぐかまたは減少させる、動物における免疫反応は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２伝播の防止または減少によって媒介され得る。

【0117】

本発明のポックスウイルスベクターは、好ましくは、哺乳動物細胞において増殖する。本発明において使用することができる哺乳動物細胞の詳細は、ＰＣＴ／ＡＵ２０１４／０５０３３０号において提供され、その開示は、相互参照によって本明細書に組み入れられる。

【0118】

いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞は、ヒト細胞、霊長類細胞、ハムスター細胞、またはウサギ細胞である。

【0119】

細胞は、単細胞であり得、または液体培養、単層などとして組織培養において培養することができる。宿主細胞も、組織から直接的もしくは間接的に得られ得、あるいは動物を含む有機体内に存在し得る。細胞は、ユビキチン化されたＴ細胞抗原を発現するように改変されている細胞系を含む株化細胞であり得る。

【0120】

いくつかの実施形態において、相同組換えおよび／またはウイルス増殖は、Ｄ１３Ｌタンパク質および牛痘宿主域タンパク質（ＣＰ７７）を発現するＧＭＰ－ＣＨＯ－Ｓ細胞系から得られるＳＣＶ細胞基質であるＢＣ１９Ａ－１２細胞系において行われる。ＳＣＶワクチンプラットフォームは、ウイルスアセンブリを防ぐためにウイルスゲノムにＤ１３Ｌ遺伝子の標的化欠失を組み込み、それによって、ＳＣＶを通常の許容細胞系において感染性子孫を生じることができないようにするが；しかしながら、ＳＣＶゲノムの増殖は維持される。ＣＨＯ細胞は、Ｄ１３およびＣＰ７７を構成的に発現するように操作され、それにより、ウイルス増殖を可能にした。ＢＣ１９Ａ－１２細胞系を使用するウイルス増殖の方法の完全な説明のため、その全体が本明細書に組み入れられるＥｌｄｉら ２０１７を参照されたい。

【0121】

いくつかの実施形態において、相同組換えおよび／またはウイルス増殖は、ワクシニアウイルスＤ１３タンパク質を構成的に発現し、ならびに無タンパク質培地または無血清培地において培養することができるモノクローナル懸濁ＣＨＯ細胞であるＳＤ０７－１細胞系において行われる。

【0122】

用語「作動可能に接続された」または「作動可能に連結された」は、本明細書に使用される場合、説明される構成要素が、それらがそれらの意図される方式において機能することを可能にする関係にある並置を意味する。例えば、コード配列に「作動可能に連結された」転写制御配列は、当該転写制御配列に適合する条件下での、コード配列の発現を可能にするようなコード配列に対する当該転写制御配列の位置決めおよび／または方向付けを意味する。別の例において、オルトポックスウイルスコード配列に作動可能に接続されたＩＲＥＳは、オルトポックスウイルスコード配列のキャップ非依存性翻訳を可能にするようなオルトポックスウイルスコード配列に対するＩＲＥＳの位置決めおよび／または方向付けを意味する。

【0123】

本明細書において使用される場合、用語「オープンリーディングフレーム」および「ＯＲＦ」は、コード配列の翻訳開始コドンと翻訳終止コドンとの間におけるコードされたアミノ酸配列を意味するために本明細書において相互互換的に使用される。用語「開始コドン」（例えば、ＡＴＧ）および「終止コドン」（例えば、ＴＧＡ、ＴＡＡ、ＴＡＧ）は、タンパク質合成（ｍＲＮＡ翻訳）のそれぞれ開始および鎖終止を指定する、コード配列における３つの隣接するヌクレオチドの単位（「コドン」）を意味する。

【0124】

用語「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、または「核酸配列」は、本明細書に使用される場合、ｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＤＮＡを指定する。当該用語は、典型的には、少なくとも１０塩基長のヌクレオチドの重合形態であるリボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドのどちらか、またはヌクレオチドのどちらかのタイプの改変形態を意味する。当該用語は、ＲＮＡまたはＤＮＡの一本鎖形態および二本鎖形態を包含する。

【0125】

「ポリペプチド」、「ペプチド」、「タンパク質」、および「タンパク質性分子（ｐｒｏｔｅｉｎａｃｅｏｕｓ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」は、アミノ酸残基の重合体を含むかまたはそれからなる分子ならびにそれらのバリアントおよび合成アナログを意味するために本明細書において相互互換的に使用される。したがって、これらの用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が、天然に存在しない合成アミノ酸、例えば、対応する天然に存在するアミノ酸の化学的アナログなど、であるアミノ酸重合体、ならびに天然に存在するアミノ酸重合体に当てはまる。

【0126】

本明細書において使用される場合、「核酸分子」、「ポリヌクレオチド」などに適用される用語「組換え（体）」は、本明細書において説明される宿主細胞または無細胞系において転写および／または翻訳することができる人工核酸構造体（すなわち、非複製性ｃＤＮＡまたはＲＮＡ；または自己複製性相補的ｃＤＮＡまたはＲＮＡであるレプリコン）を意味すると理解される。組換え核酸分子またはポリヌクレオチドは、ベクターに挿入され得る。プラスミド発現ベクターなどの非ウイルスベクターまたはウイルスベクターが使用され得る。ベクターの種類および本発明による核酸コンストラクトの挿入の技術は、当業者に既知である。本発明による核酸分子またはポリヌクレオチドは、本発明よって説明される配置において天然には生じない。換言すれば、非相同ヌクレオチド配列は、天然においては、親ウイルスゲノムの要素（例えば、プロモーター、ＯＲＦ、ポリアデニル化シグナル、リボザイム）と組み合わされない。

【0127】

本明細書において使用される場合、用語「組換えウイルス」は、少なくとも１つの非相同核酸配列を含む「親ウイルス」に対する言及であると理解されるであろう。

【0128】

用語「配列同一性」は、本明細書に使用される場合、配列が比較ウィンドウにおいてヌクレオチド－ヌクレオチドベースで、またはアミノ酸－アミノ酸ベースで同一であることの程度を意味する。したがって、「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウィンドウにおいて最適にアラインメントされた２つの配列を比較し、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）または同一のアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、およびＭｅｔ）が両方の配列において現れる位置の数を決定することによってマッチした位置の数を得て、当該マッチした位置の数を比較ウィンドウにおける位置の総数（すなわち、ウィンドウのサイズ）で割り、結果に１００を掛けることで配列同一性のパーセンテージを得ることによって算出される。本発明の目的において、「配列同一性」は、ＤＮＡＳＩＳコンピュータプログラム（Ｗｉｎｄｏｗｓ版バージョン２．５；Ｈｉａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、サンフランシスコ、カルフォルニア州、米国から入手可能）によって、当該ソフトウェアに付属するレファレンスマニュアルにおいて使用される標準デフォルト値を使用して算出された「マッチパーセンテージ（ｍａｔｃｈ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ）」を意味すると理解されるであろう。

【0129】

用語「シグナル配列」または「シグナルペプチド」は、サイトゾルからある特定のオルガネラ、例えば、核、ミトコンドリアマトリックス、および小胞体など、へのタンパク質の共翻訳輸送または翻訳後輸送を指示する、短い（およそ３～約６０のアミノ酸長）ペプチドを意味する。ＥＲ標的シグナルペプチドを有するタンパク質の場合、シグナルペプチドは、典型的には、タンパク質がＥＲへ輸送された後に、シグナルペプチドによって前駆体形態から切断され、結果のタンパク質は、分泌経路に沿ってそれらの細胞内（例えば、ゴルジ装置、細胞膜、または細胞壁）または細胞外位置へと移動する。「ＥＲ標的化シグナルペプチド」は、本明細書に使用される場合、通常、ＥＲ膜を通って当該ＥＲのルーメン内へとタンパク質の一部または全てが挿入された後に酵素的に除去されるアミノ末端疎水性配列を含む。したがって、ある配列のシグナル前駆体形態は、タンパク質の前駆体形態の一部として存在し得るが、一般的に、当該タンパク質の成熟形態には存在しないであろう。

【0130】

「類似性」は、下記の表Ａに定義されるような、同一であるかまたは構成的に保存された置換であるアミノ酸のパーセンテージの数を意味する。類似性は、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒａｕｘら １９８４， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２： ３８７～３９５）などの配列比較プログラムを使用して決定され得る。この方法において、本明細書において列記されたものと類似のまたは実質的に異なる長さの配列は、アラインメント内にギャップを挿入することによって比較され得、そのようなギャップは、例えば、ＧＡＰによって使用した比較アルゴリズムによって決定される。

【0131】

【表A】

【0132】

比較ウィンドウを整列させるための配列の最適なアラインメントは、アルゴリズムをコンピュータ化した手段（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州、米国）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または観察によって行うことができ、種々の方法によって生成された最良のアラインメント（すなわち、比較ウィンドウにおいて最も高いパーセンテージ相同性をもたらす）が選択される。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら， １９９７， Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９によって開示されるプログラムのＢＬＡＳＴファミリーも参照され得る。配列分析の詳細な説明は、Ａｕｓｕｂｅｌら， 「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ， １９９４－１９９８， Ｃｈａｐｔｅｒ １５のユニット１９．３に見出すことができる。

【0133】

本明細書において相互互換的に使用される用語「対象」、「患者」、「宿主」、または「個体」は、療法または予防が望ましくある任意の対象、詳細には脊椎動物対象、さらにより詳細には哺乳動物対象を意味する。本発明の範囲内の好適な脊椎動物には、これらに限定されるわけではないが、霊長類（例えば、ヒト、サルおよび類人猿）を含む、脊索動物亜門の任意のメンバーが含まれ、ならびにマカク属からのそのようサルの種（例えば、カニクイザル類（ｃｙｎｏｍｏｌｏｇｕｓ ｍｏｎｋｅｙｓ）、例えば、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）など、および／またはアカゲザル類（ｒｈｅｓｕｓ ｍｏｎｋｅｙｓ）（アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）、およびヒヒ（チャクマヒヒ（Ｐａｐｉｏ ｕｒｓｉｎｕｓ））、ならびにマーモセット類（ｍａｒｍｏｓｅｔｓ）（マーモセット属（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ）からの種）、リスザル類（ｓｑｕｉｒｒｅｌ ｍｏｎｋｅｙｓ）（リスザル属（Ｓａｉｍｉｒｉ）からの種）、フェレット類（ｆｅｒｒｅｔｓ）（イタチ属（Ｍｕｓｔｅｌａ）からの種）、およびタマリン類（ｔａｍａｒｉｎｓ）（サグイヌス属（Ｓａｇｕｉｎｕｓ）からの種）、ならびにチンパンジーなどの類人猿の種（コモンチンパンジー（Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ））、齧歯類（例えば、マウス、ラット、モルモット）、ウサギ類（ｌａｇｏｍｏｒｐｈｓ）（例えば、ウサギ、ノウサギ）、ウシ類（ｂｏｖｉｎｅｓ）（例えば、ウシ）、ヒツジ類（ｏｖｉｎｅｓ）（例えば、ヒツジ）、ヤギ類（ｃａｐｒｉｎｅｓ）（例えば、ヤギ）、ブタ類（ｐｏｒｃｉｎｅｓ）（例えば、ブタ）、ウマ類（ｅｑｕｉｎｅｓ）（例えば、ウマ）、イヌ類（ｃａｎｉｎｅｓ）（例えば、イヌ）、ネコ類（ｆｅｌｉｎｅｓ）（例えば、ネコ）、鳥類（ａｖｉａｎｓ）（例えば、ニワトリ、七面鳥、アヒル、ガチョウ、およびカナリア、セキセイインコなどのコンパニオンバード）、海獣（例えば、イルカ、クジラ）、爬虫類（ヘビ、カエル、トカゲなど）、および魚が含まれる。好ましい対象は、ある状態の治療または予防を必要とするヒトである。しかしながら、前述の用語が症状の存在することを必然的に含むものではないことは理解されるであろう。

【0134】

用語「導入遺伝子」は、宿主生物のゲノム中に人工的に導入されているかまたは導入されようとしており、宿主の子孫に伝えられる、遺伝物質を記載するために本明細書において使用される。いくつかの実施形態において、それは、それが導入される哺乳動物細胞もしくはオルトポックスベクターに所望の特性を付与するか、またはさもなければ、所望の治療結果もしくは診断結果をもたらす。

【0135】

本明細書において使用される場合、用語「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」などは、所望の薬理学的効果および／または生理学的効果を得ることを意味する。当該効果は、疾患またはその症状を完全にまたは部分的に予防する観点において予防的であり得、および／または疾患および／または当該疾患に起因する有害な効果に対する部分的または完全な治癒の観点において治療的であり得る。「治療」は、本明細書に使用される場合、哺乳動物、特にヒトにおける疾患の任意の治療を網羅し、ならびに以下：（ａ）疾患に罹りやすくあり得るが疾患に罹っているとは診断されていない対象において疾患が生じることを防ぐこと；（ｂ）疾患を抑制する、すなわち、その進行を阻止すること；および（ｃ）疾患を軽減する、すなわち、疾患の改善を引き起こすこと、を含む。

【0136】

有機体、ポリペプチドまたは核酸配列に関する用語「野生型」、「自然（の）」、「天然（の）」などは、有機体のポリペプチドまたは核酸配列が、天然に存在するか、またはヒトによって変更されていない、変異されていない、または別の方法で操作されていない少なくとも１種の天然に存在する有機体において入手可能であることを意味する。

【0137】

用語「ウイルス感染」は、対象からの生物学的サンプルにおけるウイルス病原体による感染を意味する。

【0138】

用語「ウイルス様粒子」または「ＶＬＰ」は、抗原的および形態学的に天然のウイルスに類似する構造体を意味する。

【0139】

バリアントは、選択的ハイブリダイゼーションが、中程度のまたは高いストリンジェンシーの条件下において達成され得るような、参照された分子と十分に類似した核酸分子、またはそれらの全てまたは一部に対するそれらの相補的な形態、あるいは、少なくとも約１５のヌクレオチドを含む比較ウィンドウにおいて参照されたポックスウイルス宿主域因子を定義するヌクレオチド配列に対して約６０％～９０％または９０％～９８％の配列同一性を有する核酸分子を含む。好ましくは、ハイブリダイゼーション領域は、約１２～約１８の核酸塩基長またはそれ以上の長さである。好ましくは、特定のヌクレオチド配列と参照配列との間のパーセント同一性は、少なくとも約８０％、または８５％、より好ましくは約９０％の類似性またはそれ以上、例えば、約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上など、である。８０％～１００％の間のパーセント同一性も包含される。当該ヌクレオチド配列の長さは、提案されるその機能に依存する。ホモログも包含される。用語「ホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」または「相同遺伝子」、または「ホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇｓ）」は、広くは、他の種に由来するものを含む機能的および構造的に関連する分子を意味する。ホモログおよびオーソログは、バリアントの例である。

【0140】

核酸配列同一性は、下記の方法において決定することができる。対象核酸配列は、プログラムＢＬＡＳＴＭバージョン２．１（Ａｌｔｓｃｈｕｌら （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２５：３３８９～３４０２に基づく）を使用して、核酸配列データベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋデータベース（ウェブサイトｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｎ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／においてアクセス可能）を検索するために使用される。プログラムは、ｕｎｇａｐｐｅｄモードにおいて使用される。低複雑度の領域に起因する配列相同性を除去するために、デフォルトのフィルタリングが使用される。ＢＬＡＳＴＭのデフォルトのパラメータが使用される。

【0141】

アミノ酸配列同一性は、下記の方法において決定することができる。対象ポリペプチド配列は、ＢＬＡＳＴＰプログラムを使用して、ポリペプチド配列データベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋデータベース（ウェブサイトｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｎ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／においてアクセス可能）を検索するために使用される。プログラムは、ｕｎｇａｐｐｅｄモードにおいて使用される。低複雑度の領域に起因する配列相同性を除去するために、デフォルトのフィルタリングが使用される。ＢＬＡＳＴＰのデフォルトのパラメータが用いられる。低複雑度の配列に対するフィルタリングは、ＳＥＧプログラムを使用し得る。

【0142】

好ましい配列は、参照配列またはその相補物に対してストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするであろう。用語「ストリンジェントな条件下においてハイブリダイズする」およびその文法的同等な用語は、核酸分子が、温度および塩濃度における定義された条件下において標的核酸分子（例えば、サザンブロットまたはノーザンブロットなどのＤＮＡまたはＲＮＡブロット上に固定された標的核酸分子）に対してハイブリダイズする能力を意味する。約１００を超える塩基長の核酸分子に関して典型的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、天然デュプレックスの融解温度（Ｔｍ）より２５℃以下から３０℃（例えば、１０℃）だけ低い（概して、Ｓａｍｂｒｏｏｋら， （上記）； Ａｕｓｕｂｅｌら， （１９９９）を参照されたい）。約１００を超える塩基の核酸分子のＴｍは、式Ｔｍ＝８１．５＋０．４１％（Ｇ＋Ｃ－ｌｏｇ（Ｎａ^＋））によって算出することができる。１００を超える塩基の長さを有する核酸分子に関して、例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、Ｔｍ未満より５℃～１０℃低い。

【0143】

文脈との関連における用語「欠失」は、標的遺伝子のコード領域の全てまたは一部の除去を意味する。当該用語は、標的遺伝子の遺伝子発現を除去するかまたはコードされたタンパク質のレベルもしくは活性を除去するかもしくは大幅に下方制御する任意の形態の突然変異または形質転換も包含する。

【0144】

「遺伝子」についての言及は、遺伝子のエキソンまたはオープンリーディングフレームに対応するＤＮＡを含む。本明細書においての「遺伝子」に対する言及は、転写および／もしくは翻訳調節配列および／もしくはコード領域および／もしくは非翻訳配列（すなわち、イントロン、５’および３’非翻訳配列）からなる古典的ゲノム遺伝子；または当該遺伝子のコード領域（すなわち、エキソン）ならびに５’および３’非翻訳配列に対応するｍＲＮＡもしくはｃＤＮＡも包含すると見なされる。

【0145】

「調節要素」または「調節配列」によって、特定の宿主細胞における作動可能に連結されたコード配列の発現にとって必要な核酸配列（例えば、ＤＮＡ）が意図される。例えば、原核細胞にとって好適な調節配列は、プロモーター、および、任意選択的にシス作用配列、例えば、オペレーター配列およびリボソーム結合部位など、を含む。真核細胞にとって好適な制御配列は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、転写エンハンサー、翻訳エンハンサー、ｍＲＮＡ安定性を調節するリーダー配列またはトレイリング配列（ｔｒａｉｌｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、および転写されたポリヌクレオチドによってコードされた産物を細胞内の細胞内コンパートメントまたは細胞外環境へと標的化する標的化配列を含む。

【0146】

本願の改変された哺乳動物細胞をもたらすために好適なキメラコンストラクトは、調節配列に作動可能に連結される、オルトポックス宿主域をコードする調節配列を含む。調節配列は、好適には、転写および／または翻訳制御配列を含み、それらは、細胞での発現に対して適合性である。典型的には、転写および翻訳調節制御配列としては、これらに限定されるわけではないが、プロモーター配列、５’非コード領域、シス調節領域、例えば、転写制御タンパク質もしくは翻訳調節タンパク質のための機能的結合部位、上流オープンリーディングフレーム、リボソーム結合配列、転写開始部位、翻訳開始部位、ならびに／または、リーダー配列、終止コドン、翻訳停止部位、および３’非翻訳領域をコードするヌクレオチド配列が挙げられる。当技術分野において既知の構成的または誘導性プロモーターが想到される。当該プロモーターは、天然に存在するプロモーターかまたは、要素または２つ以上のプロモーターを組み合わせるハイブリッドプロモーターであり得る。

【0147】

想到されるプロモーター配列は、哺乳動物細胞に対して天然であり得るか、または当該領域が当該選択された有機体において機能的であるような代替源から得られ得る。プロモーターの選択は、意図される宿主細胞に応じて異なるであろう。例えば、哺乳動物細胞における発現のために使用することができるプロモーターとしては、中でも、カドミウムなどの重金属に反応して誘導され得るメタロチオネインプロモーター、βアクチンプロモーター、ならびにウイルスプロモーター、例えば、ＳＶ４０ラージＴ抗原プロモーター、ヒト－サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期（ＩＥ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲプロモーター、マウス乳癌ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）、単純ヘルペスウイルスプロモーター、およびＨＰＶプロモーター、特にＨＰＶ上流調節領域（ＵＲＲ）が挙げられる。これら全てのプロモーターは、当技術分野において十分に説明され、容易に入手可能である。

【0148】

ポックスウイルスプロモータータイプであって、それらが活性なウイルス複製サイクル内の期間によって区別されるいくつかのポックスウイルスプロモータータイプが存在する。初期プロモーターは、感染の後期においても活性であり得るが、それに対して、後期プロモーターの活性は、後期相に限定される。中期プロモーターと呼ばれるプロモーターの第３のクラスは、初期相から後期相への移行期において活性であり、ウイルスＤＮＡ複製に依存する。ポックスウイルス複製サイクルの初期相および後期相の両方において活性なプロモーターは、通常、ポックスウイルスベクターにおける新生抗原の発現を指示するために用いられる。コンパクトな合成プロモーター（ｐｒＰｓ）は、強力な初期および後期遺伝子発現を指示するために広く使用されている。ｐｒ７．５プロモーターは、ワクシニアウイルスベクターによる組換え遺伝子発現のために使用される天然の初期－後期プロモーターの別の例である。

【0149】

本明細書において使用される場合、用語「初期／後期プロモーター」は、ウイルスＤＮＡ複製が生じる前および後の、ウイルス感染細胞において活性なプロモーターを意味する。特に好ましいのは、合成ワクシニア初期／後期プロモーター（Ｐｓ）、天然ワクシニア初期／後期プロモーター（ｐ７．５）、および鶏痘初期／後期プロモーター（ｐＥ／Ｌ）を含むポックスウイルス初期／後期プロモーターである。本明細書において使用されるプロモーターは、特に明記されない限り、ワクシニアウイルスプロモーターである。

【0150】

エンハンサー要素は、哺乳動物コンストラクトの発現レベルを増加させるためにも本明細書において使用され得る。例としては、例えば、Ｄｉｊｋｅｍａら （１９８５） ＥＭＢＯ Ｊ． ４：７６１に記載されるＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー、例えば、Ｇｏｒｍａｎら， （１９８２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７９：６７７７に記載されるラウス肉腫ウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ：ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）から得られるエンハンサー／プロモーター、および例えば、Ｂｏｓｈａｒｔら （１９８５） Ｃｅｌｌ ４１：５２１に記載されるヒトＣＭＶから得られるエレメント、例えば、ＣＭＶイントロンＡ配列に含まれるエレメントなど、が挙げられる。

【0151】

当該キメラコンストラクトは、３’非翻訳配列も含み得る。３’非翻訳配列は、ポリアデニル化シグナルと、ｍＲＮＡプロセシングまたは遺伝子発現をもたらすことができる任意の他の調節シグナルとを含むＤＮＡセグメントを含む遺伝子の一部を意味する。ポリアデニル化シグナルは、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸部分（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｔｒａｃｔ）の付加をもたらすことによって特徴づけられる。ポリアデニル化シグナルは、一般的に、標準形態５’ＡＡＴＡＡＡ－３’に対する相同性の存在によって認識されるが、バリエーションは一般的ではない。３’非翻訳調節ＤＮＡ配列は、好ましくは、約５０～１，０００ｎｔを含み、ならびにポリアデニル化シグナルに加えて、転写および翻訳終止配列と、ｍＲＮＡプロセシングまたは遺伝子発現をもたらすことができる任意の他の調節シグナルとを含み得る。

【0152】

いくつかの実施形態において、当該キメラコンストラクトは、さらに、当該コンストラクトを含む細胞の選択を可能にする選択可能マーカー遺伝子を含む。選択遺伝子は、当分野において周知であり、および関心対象の細胞における発現に対して適合性であろう。

【0153】

一実施形態において、ポックスウイルス構造的遺伝子またはアセンブリ遺伝子の発現は、プロモーターの制御下にある。非限定的な一実施形態において、当該プロモーターは、細胞構成的プロモーター、例えば、ヒトＥＦ１アルファ（ヒト伸長因子１アルファ遺伝子プロモーター）、ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子プロモーター）、またはＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子プロモーター）（宿主細胞に対する著しい毒性効果の非存在下でのウイルス増殖を維持するのに十分なレベルのＣＰ７７の発現を導く）など、である。プロモーターは、誘導性、例えば、細胞誘導性プロモーター、ＭＴＨ（メタロチオネイン遺伝子由来の）など、でもあり得、ウイルスプロモーターも、哺乳動物細胞、例えば、ＣＭＶ、ＲＳＶ、ＳＶ－４０、およびＭｏＵ３など、において用いられる。

【0154】

本発明は、コロナウイルス感染症１９（ＣＯＶＩＤ－１９）と呼ばれる疾患に対する原因因子である、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）と命名された新規のコロナウイルスに対する予防的ワクチンのための組成物を提供する。ＣＯＶＩＤ－１９は、世界保健機関（ＷＨＯ）によってパンデミックが宣言され、世界中の大勢の人々に衝撃を与えた。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、プラス鎖一本鎖ＲＮＡウイルスである。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムは、約２９，７００ヌクレオチド長であり、ならびにＳＡＲＳ－ＣｏＶに対して７９．５％の配列類似性を有し；それは、１５または１６の非構造タンパク質をコードする５’末端の長いＯＲＦ１ａｂポリプロテインを有し、その一方で、３’末端ゲノムは、４つの主要な構造タンパク質（スパイク、ヌクレオカプシド、膜、およびエンベロープ）をコードする。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ウイルス侵入および最終的病因のために宿主細胞上に発現されるアンギオテンシン受容体変換酵素２（ＡＣＥ２）に結合する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスは、主に、発熱、乾性咳、呼吸困難、頭痛、めまい、全身衰弱、嘔吐、および下痢を含む症状によって呼吸器系に影響を及ぼす。現在の医療管理は、主に、利用可能な標的療法はなく対症的である。

【0155】

突然変異によって変化するという、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含めたＲＮＡウイルスの固有の傾向が、時間経過と共に新しいバリアントについて世界的に報告されている。ほとんどの出現した突然変異は、流行に対して著しい影響を有さないだろうが、その一方で、当該ウイルスに選択有利性を与える突然変異は、概して、当該集団においてバリアントの罹患率増加に反映されるように維持される。記録された多くのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントの中でも、選ばれた少数は、それらの伝播性の増加、より重症の病気を罹患させる能力、および／または感染またはワクチン接種後に生じる免疫反応を回避する能力の増加により、公衆衛生上、懸念される。２０２１年に、懸念されるバリアント（ＶＯＣ）を反映する３つの特定のウイルス系統：Ｂ．１．１．７、Ｂ．１．３５１、およびＢ．１．１．２８．１が出現した。Ｄ６１４Ｇと呼ばれた当該突然変異は、３つの懸念されるバリアントによって共有される。それは、この突然変異を有さない他の支配的ウイルスおよび他のＳＡＲＳ ＣｏＶ２株と比較して、増加した伝播性をウイルスに与える。

【0156】

本明細書において使用される場合、懸念されるバリアントは、Ｂ．１．１．１７、Ｂ．１．３５１、およびＢ．１．１．２８．１、具体的にはＰ．１系統、を意味する。Ｂ．１．１．７バリアントは、最初、２０２０年９月にイギリスの南部において同定された。このバリアントは、５０１位においてスパイクタンパク質のＲＢＤに突然変異を有し、その位置では、アミノ酸アスパラギン（Ｎ）がチロシン（Ｙ）に置換されており、したがって、当該突然変異は、Ｎ５０１Ｙと呼ばれる。Ｂ．１．１．７バリアントは、他のバリアントと比べてより効率的で急速な伝播および死亡のリスクの増加に関連している。Ｂ１．１．３５１バリアントは、最初、２０２０年１０月に南アフリカにおいて同定された。このバリアントは、Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、およびＮ５０１Ｙを含むスパイクタンパク質における複数の突然変異を有する。突然変異Ｅ４８４Ｋは、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体による中和に影響を及ぼすことが分かっている。Ｂ．１．１．２８バリアント、具体的には当該系統のＰ．１枝（ｂｒａｎｃｈ）は、最初、２０２１年１月に、日本に到着したブラジルからの旅行者において同定された。Ｐ．１系統は、Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、およびＮ５０１Ｙを含むスパイクタンパク質ＲＢＤにおける３つの突然変異を含む。当該突然変異は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の伝播性および抗原プロファイルを増加させる。

【0157】

本明細書において使用される場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質のＳ１サブユニットは、受容体結合ドメイン領域内に、免疫優性Ｔ細胞エピトープＹＮＹＬＹＲＬＦ（配列番号９）、ＶＶＬＳＦＥＬＬ（配列番号１０）、およびＶＮＦＮＦＮＧＬ（配列番号１１）を含む。ＶＶＬＳＦＥＬＬ（配列番号１０）およびＶＮＦＮＦＮＧＬ（配列番号１１）エピトープは、以前に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶのマウス研究において同定された。ＳＡＲＳ－ＣｏＶとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２との間において保存されるこれらのエピトープは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２において免疫反応を起こすように向けられたワクチンが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶに対する交差反応であり得ることを示し得ることは当業者によって理解されるであろう。

【0158】

ヒトコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株／分離株の遺伝子配列は、Ｓｈａｒｉｎｇ Ａｌｌ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｄａｔａ（ＧＩＳＡＩＤ）のＧｌｏｂａｌ Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅによって利用可能となり、例えば、Ｗｕｈａｎ／ＩＶＤＣ－ＨＢ－０１／２０１９（ＧＩＳＡＩＤアクセッションＩＤ：ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿４０２１１９～１２１）を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の様々な株／分離株からのゲノム配列データを含む。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノム配列は、ＣＯＶＩＤ１９に対するワクチンなどの潜在的介入オプションを設計および評価する上で重要である。

【0159】

本発明は、非相同コロナウイルス抗原を発現するための弱毒化されたポックスウイルスを含む組成物を提供し、それは、コロナウイルス感染に対する免疫反応および／または中和抗体反応を誘導するためのワクチンとして使用することができる。用語「弱毒化」、「弱毒化された」などは、本明細書に使用される場合、ウイルスベクターのビルレンスの低下を意味する。ビルレンスは、典型的には、ウイルスが特定の宿主において疾患を生じさせる能力として定義される。例えば、感染性ウイルスを生じることができないポックスウイルスは、最初、細胞に感染し得るが、実質的に、それ自体を完全に複製することができず、または宿主または宿主細胞内において増殖することができず、または疾患または状態を引き起こすことができない。このことは、ポックスウイルスベクターは、宿主または宿主細胞に核酸を送達することができるが、典型的には、宿主または宿主細胞を害することができないため、望ましい。

【0160】

ポックスウイルスファミリーは、２つの亜科のコルドポックスウイルス亜科およびエントモポックスウイルス亜科を含む。コルドポックスウイルス亜科は、人に感染する種を含むオルトポックスウイルス科を含む８つの属を含み、その一方で、エントモポックスウイルス亜科は、昆虫に感染する。オルトポックスウイルス科は、例えば、天然痘の原因因子である痘瘡ウイルス、１７９６年にＪｅｎｎｅｒによって報告されたオリジナルの天然痘ワクチンを形成した牛痘ウイルス、および第二世代天然痘ワクチンとして使用されてきたワクシニアウイルスを含む。アビポックスウイルス科ウイルスは、鶏痘およびカナリア痘ウイルスなどの鳥に感染する種を含む。天然痘ワクチンにおける抗原としてのそれらの使用に加えて、関心対象の非相同遺伝子を送達および／または発現するためのベクターとしての組換えワクシニアベースのウイルスおよびアビポックスウイルスの使用に、大きな関心が寄せられている。細胞質内ベクターとして、オルトポックスウイルス科は、外来抗原を、宿主細胞質と細胞表面での提示のために抗原をペプチドへと処理する抗原プロセシング経路とに送達することができる。外来抗原を発現するそのようなベクターは、広範な状態および疾患のための遺伝子治療およびワクチン開発における使用にとって好適である。

【0161】

ポックスウイルスは、大きくて直鎖状のｄｓＤＮＡゲノム、増殖の細胞質部位、および複雑なビリオンモルホロジーによって特徴づけられるウイルスの大きなファミリーを構成する。ワクシニアウイルスは、ウイルスのこのグループの代表的ウイルスであり、ウイルス形態形成に関して最も研究されたウイルスの１つである。様々なワクシニアウイルスが、「側体」が隣接する、壁で囲まれた両凹のコアを特徴とする複雑な内部構造を有する「レンガ形状」または「卵形」の膜結合粒子のように見える。ビリオンアセンブリ経路は、未熟なビリオン（ＩＶ）へと成長し、成熟ビリオン（ＭＶ）へと発達する膜含有半月体の組み立てを伴う。７０超の特異的遺伝子産物が、ワクシニアウイルスビリオン内に含まれており、ワクシニアウイルスアセンブリに対する５０超の特異的遺伝子における突然変異の効果が、現在、報告されている。

【0162】

好適な弱毒化ポックスウイルスは、当業者に既知であろう。例証的な例としては、弱毒化された改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）、ＮＹＶＡＣ、アビポックス、カナリア痘、および鶏痘が挙げられる。

【0163】

本明細書において開示される実施形態において、弱毒化ポックスウイルスは、弱毒化されたワクシニアウイルスである。ワクシニアウイルス株の例証的な例としては、ＭＶＡ、ＮＹＶＡＣ、コペンハーゲン（ＣＯＰ：Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ）、ウエスタンリザーブ（ＷＲ：Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ）、ＮＹＣＢＨ、ワイス（Ｗｙｅｔｈ）株、ＡＣＡＭ２０００、ＬＣ１６ｍ８、およびコンノート研究所（ＣＬ：Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）が挙げられる。

【0164】

本明細書において使用される場合、用語「セメンシスコペンハーゲンベクター（Ｓｅｍｅｎｔｉｓ Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ Ｖｅｃｔｏｒ）」または「ＳＣＶ」は、改変ＣＨＯ細胞での製造を可能にするワクシニアウイルスをベースとした増殖欠損性（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ－ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ）なワクチンベクター技術プラットフォームを意味する。

【0165】

他のオルトポックスウイルス株が、弱毒化ポックスウイルスを産生するように改変され得ることは当業者によって理解されるであろう。例証的な例において、弱毒化ポックスウイルスは、内因性の必須のアセンブリまたは成熟タンパク質をコードするポックスウイルスゲノム由来の遺伝子を改変すること（例えば、欠失させる、置換する、そうでなければその機能を妨げること）によって作製することができる。したがって、本明細書で開示される一実施形態において、弱毒化ポックスウイルスは、改変オルトポックスウイルスであり、この場合、改変は、内因性の必須のアセンブリまたは成熟タンパク質をコードする遺伝子の欠失を含む。

【0166】

ある実施形態において、弱毒化ポックスウイルスは、改変ワクシニアウイルスであり、前記改変は、内因性のアセンブリまたは成熟タンパク質をコードするワクシニアウイルスゲノムの遺伝子の欠失（または別の方法でのその機能の途絶）を含み、前記改変は、宿主細胞（例えば、ヒト細胞）において増殖する（または増殖し得る）ワクシニアベクターを、宿主細胞において実質的に非複製性である弱毒化されたワクシニアベクターへと形質転換させる。

【0167】

ある実施形態において、必須の内因性アセンブリまたは成熟遺伝子は、ＣＯＰ－Ａ２．５Ｌ、ＣＯＰ－Ａ３Ｌ、ＣＯＰ－Ａ４Ｌ、ＣＯＰ－Ａ７Ｌ、ＣＯＰ－Ａ８Ｒ、ＣＯＰ－Ａ９Ｌ、ＣＯＰ－Ａ１０Ｌ、ＣＯＰ－Ａ１１Ｒ、ＣＯＰ－Ａ１２Ｌ、ＣＯＰ－Ａ１３Ｌ、ＣＯＰ－Ａ１４Ｌ、ＣＯＰ－Ａ１４．５Ｌ、ＣＯＰ－Ａ１５Ｌ、ＣＯＰ－Ａ１６Ｌ、ＣＯＰ－Ａ１７Ｌ、ＣＯＰ－Ａ２１Ｌ、ＣＯＰ－Ａ２２Ｒ、ＣＯＰ－Ａ２６Ｌ、ＣＯＰ－Ａ２７Ｌ、ＣＯＰ－Ａ２８Ｌ、ＣＯＰ－Ａ３０Ｌ、ＣＯＰ－Ａ３２Ｌ、ＣＯＰ－Ｄ２Ｌ、ＣＯＰ－Ｄ３Ｒ、ＣＯＰ－Ｄ６Ｒ、ＣＯＰ－Ｄ８Ｌ、ＣＯＰ－Ｄ１３Ｌ、ＣＯＰ－Ｄ１４Ｌ、ＣＯＰ－Ｅ８Ｒ、ＣＯＰ－Ｅ１０Ｒ、ＣＯＰ－Ｅ１１Ｌ、ＣＯＰ－Ｆ１０Ｌ、ＣＯＰ－Ｆ１７Ｒ、ＣＯＰ－Ｇ１Ｌ、ＣＯＰ－Ｇ３Ｌ、ＣＯＰ－Ｇ４Ｌ、ＣＯＰ－Ｇ５Ｒ、ＣＯＰ－Ｇ７Ｌ、ＣＯＰ－Ｈ１Ｌ、ＣＯＰ－Ｈ２Ｒ、ＣＯＰ－Ｈ３Ｌ、ＣＯＰ－Ｈ４Ｌ、ＣＯＰ－Ｈ５Ｒ、ＣＯＰ－Ｈ６Ｒ、ＣＯＰ－Ｉ１Ｌ、ＣＯＰ－Ｉ２Ｌ、ＣＯＰ－Ｉ６Ｌ、ＣＯＰ－Ｉ７Ｌ、ＣＯＰ－Ｉ８Ｒ、ＣＯＰ－Ｊ１Ｒ、ＣＯＰ－Ｊ４Ｒ、ＣＯＰ－Ｊ６Ｒ、ＣＯＰ－Ｌ１Ｒ、ＣＯＰ－Ｌ３Ｌ、ＣＯＰ－Ｌ４Ｒ、およびＣＯＰ－Ｌ５Ｒを含む群から選択される。

【0168】

他のオルトポックスウイルス株が、ポックスウイルスの免疫原生を変更するように改変され得ることは当業者によって理解されるであろう。例証的な例において、免疫原性の亢進を伴うポックスウイルスは、免疫調節タンパク質をコードするポックスウイルスゲノムからある遺伝子を欠失させることによって作製することができる。したがって、本明細書において開示される実施形態において、弱毒化ポックスウイルスは、改変オルトポックスウイルスであり、ここで前記改変は、免疫調節タンパク質（１または複数）をコードする１つまたは複数の遺伝子の欠失を含む。

【0169】

ある実施形態において、免疫調節遺伝子（１または複数）は、ＣＯＰ－Ｃ２３Ｌ、ＣＯＰ－Ｂ２９Ｒ、ＣＯＰ－Ｃ３Ｌ、ＣＯＰ－Ｎ１Ｌ、ＣＯＰ－Ａ３５Ｒ、ＣＯＰ－Ａ３９Ｒ、ＣＯＰ－Ａ４１Ｌ、ＣＯＰ－Ａ４４Ｒ、ＣＯＰ－Ａ４６Ｒ、ＣＯＰ－Ｂ７Ｒ、ＣＯＰ－Ｂ８Ｒ、ＣＯＰ－Ｂ１３Ｒ、ＣＯＰ－Ｂ１６Ｒ、およびＣＯＰ－Ｂ１９Ｒを含む群から選択されるものを含む。

【0170】

他のオルトポックスウイルス株は、コード配列を途絶または変更することなく、特に遺伝子間領域の、ワクシニアゲノムに安定して挿入できる非相同ＤＮＡ配列を組み込むように改変され得、それにより、当該ウイルスの典型的な特性および遺伝子発現を維持することは当業者によって理解されるであろう。

【0171】

ある実施形態において、弱毒化ポックスウイルスは、改変ワクシニアウイルスであり、ここで前記改変は、ウイルスゲノムの遺伝子間領域に挿入された外因性ＤＮＡ配列、例えば、コロナウイルス株に由来するＤＮＡ配列を含み、その遺伝子間領域はそれはそれで、ワクシニアゲノムの２つの隣接するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の間に位置するかまたはそれらに隣接しており、オープンリーディングフレームは、保存遺伝子に対応する。

【0172】

ある実施形態において、非相同ＤＮＡ配列を挿入することができる２つの隣接するＯＲＦの間の遺伝子間領域（１または複数）は、００１Ｌ－００２Ｌ、００２Ｌ－００３Ｌ、００５Ｒ－００６Ｒ、００６Ｌ－００７Ｒ、００７Ｒ－００８Ｌ、００８Ｌ－００９Ｌ、０１７Ｌ－０１８Ｌ、０１８Ｌ－０１９Ｌ、０１９Ｌ－０２０Ｌ、０２０Ｌ－０２１Ｌ、０２３Ｌ－０２４Ｌ、０２４Ｌ－０２５Ｌ、０２５Ｌ－０２６Ｌ、０２８Ｒ－０２９Ｌ、０３０Ｌ－０３１Ｌ、０３１Ｌ－０３２Ｌ、０３２Ｌ－０３３Ｌ、０３５Ｌ－０３６Ｌ、０３６Ｌ－０３７Ｌ、０３７Ｌ－０３８Ｌ、０３９Ｌ－０４０Ｌ、０４３Ｌ－０４４Ｌ、０４４Ｌ－０４５Ｌ、０４６Ｌ－０４７Ｒ、０４９Ｌ－０５０Ｌ、０５０Ｌ－０５１Ｌ、０５１Ｌ－０５２Ｒ、０５２Ｒ－０５３Ｒ、０５３Ｒ－０５４Ｒ、０５４Ｒ－０５５Ｒ、０５５Ｒ－０５６Ｌ、０６１Ｌ－０６２Ｌ、０６４Ｌ－０６５Ｌ、０６５Ｌ－０６６Ｌ、０６６Ｌ－０６７Ｌ、０７７Ｌ－０７８Ｒ、０７８Ｒ－０７９Ｒ、０８０Ｒ－０８１Ｒ、０８１Ｒ－０８２Ｌ、０８２Ｌ－０８３Ｒ、０８５Ｒ－０８６Ｒ、０８６Ｒ－０８７Ｒ、０８８Ｒ－０８９Ｌ、０８９Ｌ－０９０Ｒ、０９２Ｒ－０９３Ｌ、０９４Ｌ－０９５Ｒ、０９６Ｒ－０９７Ｒ、０９７Ｒ－０９８Ｒ、１０１Ｒ－１０２Ｒ、１０３Ｒ－１０４Ｒ、１０５Ｌ－１０６Ｒ、１０７Ｒ－１０８Ｌ、１０８Ｌ－１０９Ｌ、１０９Ｌ－１１０Ｌ、１１０Ｌ－１１１Ｌ、１１３Ｌ－１１４Ｌ、１１４Ｌ－１１５Ｌ、１１５Ｌ－１１６Ｒ、１１７Ｌ－１１８Ｌ、１１８Ｌ－１１９Ｒ、１２２Ｒ－１２３Ｌ、１２３Ｌ－１２４Ｌ、１２４Ｌ－１２５Ｌ、１２５Ｌ－１２６Ｌ、１３３Ｒ－１３４Ｒ、１３４Ｒ－１３５Ｒ、１３６Ｌ－１３７Ｌ、１３７Ｌ－１３８Ｌ、１４１Ｌ－１４２Ｒ、１４３Ｌ－１４４Ｒ、１４４Ｒ－１４５Ｒ、１４５Ｒ－１４６Ｒ、１４６Ｒ－１４７Ｒ、１４７Ｒ－１４８Ｒ、１４８Ｒ－１４９Ｌ、１５２Ｒ－１５３Ｌ、１５３Ｌ－１５４Ｒ、１５４Ｒ－１５５Ｒ、１５６Ｒ－１５７Ｌ、１５７Ｌ－１５８Ｒ、１５９Ｒ－１６０Ｌ、１６０Ｌ－１６１Ｒ、１６２Ｒ－１６３Ｒ、１６３Ｒ－１６４Ｒ、１６４Ｒ－１６５Ｒ、１６５Ｒ－１６６Ｒ、１６６Ｒ－１６７Ｒ、１６７Ｒ－１６８Ｒ、１７０Ｒ－１７１Ｒ、１７３Ｒ－１７４Ｒ、１７５Ｒ－１７６Ｒ、１７６Ｒ－１７７Ｒ、１７８Ｒ－１７９Ｒ、１７９Ｒ－１８０Ｒ、１８０Ｒ－１８１Ｒ、１８３Ｒ－１８４Ｒ、１８４Ｒ－１８５Ｌ、１８５Ｌ－１８６Ｒ、１８６Ｒ－１８７Ｒ、１８７Ｒ－１８８Ｒ、１８８Ｒ－１８９Ｒ、１８９Ｒ－１９０Ｒ、１９２Ｒ－１９３Ｒを含む群から選択されるものを含む（ＰＣＴ／ＥＰ０３／０５０４５号も参照されたい）。

【0173】

古い用語体系によれば、ＯＲＦ ００６Ｌは、Ｃ１０Ｌに対応し、０１９ＬはＣ６Ｌに対応し、０２０ＬはＮ１Ｌに、０２１ＬはＮ２Ｌに、０２３ＬはＫ２Ｌに、０２８ＲはＫ７Ｒに、０２９ＬはＦ１Ｌに、０３７ＬはＦ８Ｌに、０４５ＬはＦ１５Ｌに、０５０ＬはＥ３Ｌに、０５２ＲはＥ５Ｒに、０５４ＲはＥ７Ｒに、０５５ＲはＥ８Ｒに、０５６ＬはＥ９Ｌに、０６２ＬはＩ１Ｌに、０６４ＬはＩ４Ｌに、０６５ＬはＩ５Ｌに、０８１ＲはＬ２Ｒに、０８２ＬはＬ３Ｌに、０８６ＲはＪ２Ｒに、０８７はＪ３Ｒに、０８８ＲはＪ４Ｒに、０８９ＬはＪ５Ｌに、０９２ＲはＨ２Ｒに、０９５ＲはＨ５Ｒに、１０７ＲはＤ１０Ｒに、１０８ＬはＤ１１Ｌに、１２２ＲはＡ１１Ｒに、１２３ＬはＡ１２Ｌに、１２５ＬはＡ１４Ｌに、１２６ＬはＡ１５Ｌに、１３５ＲはＡ２４Ｒに、１３６ＬはＡ２５Ｌに、１３７ＬはＡ２６Ｌに、１４１ＬはＡ３０Ｌに、１４８ＲはＡ３７Ｒに、１４９ＬはＡ３８Ｌに、１５２ＲはＡ４０Ｒに、１５３ＬはＡ４１Ｌに、１５４ＲはＡ４２Ｒに、１５７ＬはＡ４４Ｌに、１５９ＲはＡ４６Ｒに、１６０ＬはＡ４７Ｌに、１６５ＲはＡ５６Ｒに、１６６ＲはＡ５７Ｒに、１６７ＲはＢ１Ｒに、１７０ＲはＢ３Ｒに、１７６ＲはＢ８Ｒに、１８ＯＲはＢ１２Ｒに、１８４ＲはＢ１６Ｒに、１８５ＬはＢ１７Ｌに、および１８７ＲはＢ１９Ｒに対応する。

【0174】

ある実施形態において、非相同ＤＮＡ配列を挿入することができる２つの隣接するＯＲＦの間の遺伝子間領域（１または複数）は、Ｆ９Ｌ－Ｆ１０Ｌ、Ｆ１２Ｌ－Ｆ１３Ｌ、Ｆ１７Ｒ－Ｅ１Ｌ、Ｅ１Ｌ－Ｅ２Ｌ、Ｅ８Ｒ－Ｅ９Ｌ、Ｅ９Ｌ－Ｅ１０Ｒ、Ｉ１Ｌ－Ｉ２Ｌ、Ｉ２Ｌ－Ｉ３Ｌ、Ｉ５Ｌ－Ｉ６Ｌ、Ｉ６Ｌ－Ｉ７Ｌ、Ｉ７Ｌ－Ｉ８Ｒ、Ｉ８Ｒ－Ｇ１Ｌ、Ｇ１Ｌ－Ｇ３Ｌ、Ｇ３Ｌ－Ｇ２Ｒ、Ｇ２Ｒ－Ｇ４Ｌ、Ｇ４Ｌ－Ｇ５Ｒ、Ｇ５Ｒ－Ｇ５．５Ｒ、Ｇ５．５Ｒ－Ｇ６Ｒ、Ｇ６Ｒ－Ｇ７Ｌ、Ｇ７Ｌ－Ｇ８Ｒ、Ｇ８Ｒ－Ｇ９Ｒ、Ｇ９Ｒ－Ｌ１Ｒ、Ｌ１Ｒ－Ｌ２Ｒ、Ｌ２Ｒ－Ｌ３Ｌ、Ｌ３Ｌ－Ｌ４Ｒ、Ｌ４Ｒ－Ｌ５Ｒ、Ｌ５Ｒ－Ｊ１Ｒ、Ｊ３Ｒ－Ｊ４Ｒ、Ｊ４Ｒ－Ｊ５Ｌ、Ｊ５Ｌ－Ｊ６Ｒ、Ｊ６Ｒ－Ｈ１Ｌ、Ｈ１Ｌ－Ｈ２Ｒ、Ｈ２Ｒ－Ｈ３Ｌ、Ｈ３Ｌ－Ｈ４Ｌ、Ｈ４Ｌ－Ｈ５Ｒ、Ｈ５Ｒ－Ｈ６Ｒ、Ｈ６Ｒ－Ｈ７Ｒ、Ｈ７Ｒ－Ｄ１Ｒ、Ｄ１Ｒ－Ｄ２Ｌ、Ｄ２Ｌ－Ｄ３Ｒ、Ｄ３Ｒ－Ｄ４Ｒ、Ｄ４Ｒ－Ｄ５Ｒ、Ｄ５Ｒ－Ｄ６Ｒ、Ｄ６Ｒ－Ｄ７Ｒ、Ｄ９Ｒ－Ｄ１０Ｒ、Ｄ１０Ｒ－Ｄ１１Ｌ、Ｄ１１Ｌ－Ｄ１２Ｌ、Ｄ１２Ｌ－Ｄ１３Ｌ、Ｄ１３Ｌ－Ａ１Ｌ、Ａ１Ｌ－Ａ２Ｌ、Ａ２Ｌ－Ａ２．５Ｌ、Ａ２．５Ｌ－Ａ３Ｌ、Ａ３Ｌ－Ａ４Ｌ、Ａ４Ｌ－Ａ５Ｒ、Ａ５Ｒ－Ａ６Ｌ、Ａ６Ｌ－Ａ７Ｌ、Ａ７Ｌ－Ａ８Ｒ、Ａ８Ｒ－Ａ９Ｌ、Ａ９Ｌ－Ａ１０Ｌ、Ａ１０Ｌ－Ａ１１Ｒ、Ａ１１Ｒ－Ａ１２Ｌ、Ａ１２Ｌ－Ａ１３Ｌ、Ａ１３Ｌ－Ａ１４Ｌ、Ａ１４Ｌ－Ａ１４．５Ｌ、Ａ１４．５Ｌ－Ａ１５Ｌ、Ａ１５Ｌ－Ａ１６Ｌ、Ａ１６Ｌ－Ａ１７Ｌ、Ａ１７Ｌ－Ａ１８Ｒ、Ａ１８Ｒ－Ａ１９Ｌ、Ａ１９Ｌ－Ａ２１Ｌ、Ａ２１Ｌ－Ａ２０Ｒ、Ａ２０Ｒ－Ａ２２Ｒ、Ａ２２Ｒ－Ａ２３Ｒ、Ａ２３Ｒ－Ａ２４Ｒ、Ａ２８Ｌ－Ａ２９Ｌ、Ａ２９Ｌ－Ａ３０Ｌを含む群から選択されるものを含む（ＰＣＴ／ＩＢ２００７／００４５７５号も参照されたい）。

【0175】

ある実施形態において、改変は、Ａ４１Ｌ遺伝子の欠失を含む。

【0176】

ある実施形態において、改変は、Ａ４１Ｌ遺伝子および／またはＤ１３Ｌ遺伝子の欠失を含む。

【0177】

ある実施形態において、改変は、Ａ４１Ｌ遺伝子および／またはＤ１３Ｌ遺伝子および／またはＢ７Ｒ－Ｂ８Ｒ遺伝子の欠失を含む。

【0178】

ある実施形態において、改変は、Ａ４１Ｌ遺伝子および／またはＤ１３Ｌ遺伝子および／またはＢ７Ｒ－Ｂ８Ｒ遺伝子、および／またはＣ３Ｌ遺伝子、および／またはＡ３９Ｒ遺伝子の欠失を含む。

【0179】

Ａ４１Ｌ遺伝子および／またはＤ１３Ｌ遺伝子および／またはＢ７Ｒ－Ｂ８Ｒ遺伝子、および／またはＣ３Ｌ遺伝子、および／またはＡ３９Ｒ遺伝子の欠失は、ポックスウイルスに、有利な特性、例えば、弱毒化および免疫原性の増加など、を付与することは当業者によって理解されるであろう。

【0180】

ある実施形態において、改変は、Ｊ２Ｒ遺伝子とＪ３Ｒ遺伝子との間に位置する、遺伝子間領域への非相同ＤＮＡ配列の挿入を含む。

【0181】

当該遺伝子間領域への非相同ＤＮＡ配列の挿入は、当該ウイルスのコード配列を途絶または変更しないことは当業者によって理解されるであろう。

【0182】

ある実施形態において、組換えＳＣＶベクターは、ＶＬＰへとアセンブルされる１つまたは複数の構造タンパク質および非構造タンパク質を発現する。

【0183】

ある実施形態において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、発現された場合、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）へとアセンブルされる。

【0184】

ある実施形態において、当該ベクターは、ＶＬＰを形成し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原またはその免疫原性断片に対する免疫反応を生じさせる、タンパク質を発現する。

【0185】

例示的実施形態において、免疫反応は、長期持続性であり、反復ブースターを必要としないように持続性であるが、１つまたは複数の実施形態において、本明細書において提供される組成物の１回または複数回の投与が、初期プライムされた免疫反応をブーストするために提供される。

【0186】

ある実施形態において、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染のリスクを防ぐかもしくは減少させ、および／または、ＣＯＶＩＤ－１９疾患の重症度を減少させる、動物における免疫反応を高めるための組成物であって、弱毒化されたポックスウイルス、とりわけワクシニアウイルスを含み、当該ポックスウイルスゲノムは、改変されており、ならびに合成初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクポリペプチドまたはその免疫原性部分もしくは機能性部分、鶏痘初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の膜ポリペプチドまたはその免疫原性部分もしくは機能性部分、および合成初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヌクレオカプシドポリペプチドまたはその免疫原性部分もしくは機能性部分をコードする核酸配列を含む、上記組成物を提供する。

【0187】

ある実施形態において、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染のリスクを防ぐかもしくは減少させ、および／または、ＣＯＶＩＤ－１９疾患の重症度を減少させる、動物における免疫反応を高めるための組成物であって、弱毒化されたポックスウイルス、とりわけワクシニアウイルスを含み、当該ポックスウイルスゲノムは、改変されており、ならびに天然初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクポリペプチドまたはその免疫原性部分もしくは機能性部分、鶏痘初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の膜ポリペプチドまたはその免疫原性部分もしくは機能性部分、および合成初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヌクレオカプシドポリペプチドまたはその免疫原性部分もしくは機能性部分をコードする核酸配列を含む、上記組成物を提供する。

【0188】

ある実施形態において、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染のリスクを防ぐかもしくは減少させ、および／または、ＣＯＶＩＤ－１９疾患の重症度を減少させる、動物における免疫反応を高めるための組成物であって、弱毒化されたポックスウイルス、とりわけワクシニアウイルスを含み、当該ポックスウイルスゲノムは、改変されており、および合成初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクポリペプチドまたはその免疫原性部分もしくは機能性部分をコードする核酸配列を含む、上記組成物を提供する。

【0189】

ある実施形態において、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染のリスクを防ぐかもしくは減少させ、および／または、ＣＯＶＩＤ－１９疾患の重症度を減少させる、動物における免疫反応を高めるための組成物であって、弱毒化されたポックスウイルス、とりわけワクシニアウイルスを含み、当該ポックスウイルスゲノムは、改変されており、および天然初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクポリペプチドまたはその免疫原性部分もしくは機能性部分をコードする核酸配列を含む、上記組成物を提供する。

【0190】

本明細書において使用される場合、スパイクタンパク質の使用は、融合前（ｐｒｅｆｕｓｉｏｎ）コンフォメーションのスパイクタンパク質を安定化し、構造の再配置（ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）を防ぎ、および優れた免疫反応を誘発するために抗原的に好ましい表面を暴露させることを目的として操作されたバリアントを含む。これらの改変は、これらに限定されるわけではないが、安定化突然変異の導入および分子クランプの使用を含む。

【0191】

ある実施形態において、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染のリスクを防ぐかもしくは減少させ、および／または、ＣＯＶＩＤ－１９疾患の重症度を減少させる、動物における免疫反応を高めるための組成物であって、弱毒化されたポックスウイルス、とりわけワクシニアウイルスを含み、当該ポックスウイルスゲノムは、改変されており、ならびに鶏痘初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の膜ポリペプチドまたはその免疫原性部分もしくは機能性部分および合成初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヌクレオカプシドポリペプチドまたはその免疫原性部分もしくは機能性部分をコードする核酸配列を含む、上記組成物を提供する。

【0192】

ある実施形態において、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染のリスクを防ぐかもしくは減少させ、および／または、ＣＯＶＩＤ－１９疾患の重症度を減少させる、動物における免疫反応を高めるための組成物であって、弱毒化されたポックスウイルス、とりわけワクシニアウイルスを含み、当該ポックスウイルスゲノムは、改変されており、および合成初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクポリペプチドのＳ１受容体結合ドメインサブユニットをコードする核酸配列を含む、上記組成物を提供する。

【0193】

ある実施形態において、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染のリスクを防ぐかもしくは減少させ、および／または、ＣＯＶＩＤ－１９疾患の重症度を減少させる、動物における免疫反応を高めるための組成物であって、弱毒化されたポックスウイルス、とりわけワクシニアウイルスを含み、当該ポックスウイルスゲノムは、改変されており、ならびに合成初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクポリペプチドまたはその免疫原性部分もしくは機能性部分、鶏痘初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の膜ポリペプチドまたはその免疫原性部分もしくは機能性部分、合成初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヌクレオカプシドポリペプチドまたはその免疫原性部分もしくは機能性部分、および合成初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のエンベロープポリペプチドまたはその免疫原性部分もしくは機能性部分をコードする核酸配列を含む、上記組成物を提供する。

【0194】

ある実施形態において、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染のリスクを防ぐかもしくは減少させ、および／または、ＣＯＶＩＤ－１９疾患の重症度を減少させる、動物における免疫反応を高めるための組成物であって、弱毒化されたポックスウイルス、とりわけワクシニアウイルスを含み、当該ポックスウイルスゲノムは、改変されており、ならびに天然初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクポリペプチドまたはその免疫原性部分もしくは機能性部分、鶏痘初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の膜ポリペプチドまたはその免疫原性部分もしくは機能性部分、および合成初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヌクレオカプシドポリペプチドまたはその免疫原性部分もしくは機能性部分、および合成初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のエンベロープポリペプチドまたはその免疫原性部分もしくは機能性部分をコードする核酸配列を含む、上記組成物を提供する。

【0195】

ある実施形態において、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染のリスクを防ぐかもしくは減少させ、および／または、ＣＯＶＩＤ－１９疾患の重症度を減少させる、動物における免疫反応を高めるための組成物であって、弱毒化されたポックスウイルス、とりわけワクシニアウイルスを含み、当該ポックスウイルスゲノムは改変されており、ならびに合成初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクポリペプチドのＳ１受容体結合ドメインサブユニット、および鶏痘初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の膜ポリペプチドまたはその免疫原性部分もしくは機能性部分、および合成初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヌクレオカプシドポリペプチドまたはその免疫原性部分もしくは機能性部分をコードする核酸配列を含む、上記組成物を提供する。

【0196】

ある実施形態において、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染のリスクを防ぐかもしくは減少させ、および／または、ＣＯＶＩＤ－１９疾患の重症度を減少させる、動物における免疫反応を高めるための組成物であって、弱毒化されたポックスウイルス、とりわけワクシニアウイルスを含み、当該ポックスウイルスゲノムは、改変されており、ならびに合成初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクポリペプチドのＳ１受容体結合ドメインサブユニット、および鶏痘初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の膜ポリペプチドまたはその免疫原性部分もしくは機能性部分、および合成初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヌクレオカプシドポリペプチドまたはその免疫原性部分もしくは機能性部分、および合成初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のエンベロープポリペプチドまたはその免疫原性部分もしくは機能性部分をコードする核酸配列を含む、上記組成物を提供する。

【0197】

ある実施形態において、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染のリスクを防ぐかもしくは減少させ、および／または、ＣＯＶＩＤ－１９疾患の重症度を減少させる、動物における防御免疫反応を誘導するための方法であって、弱毒化されたポックスウイルス、とりわけワクシニアウイルスを含み、当該ポックスウイルスゲノムは、改変されており、および鶏痘初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の膜ポリペプチドまたはその免疫原性部分もしくは機能性部分をコードする核酸配列を含む、上記方法を提供する。

【0198】

ある実施形態において、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染のリスクを防ぐかもしくは減少させ、および／または、ＣＯＶＩＤ－１９疾患の重症度を減少させる、動物における防御免疫反応を誘導する方法であって、組成物が、弱毒化されたポックスウイルス、とりわけワクシニアウイルスを含み、当該ポックスウイルスゲノムは、改変されており、および合成初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヌクレオカプシドポリペプチドまたはその免疫原性部分もしくは機能性部分をコードする核酸配列を含む、上記方法を提供する。

【0199】

ある実施形態において、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染に対して対象において防御免疫反応を誘導する方法であって、弱毒化ポックスウイルスを含む組成物であって、当該ポックスウイルスゲノムが改変されており、ならびに合成初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクポリペプチドまたはその免疫原性部分もしくは機能性部分をコードする核酸配列を含む前記組成物と、弱毒化ポックスウイルスを含む組成物であって、当該ポックスウイルスゲノムが改変されており、ならびにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の膜ポリペプチドおよびヌクレオカプシドポリペプチドまたはそれらの免疫原性もしくは機能性部分（１または複数）をコードする核酸配列を含む前記組成物とを等量で含む混合組成物を対象に投与することを含む、上記方法を提供する。

【0200】

ある実施形態において、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染に対して対象において防御免疫反応を誘導する方法であって、弱毒化ポックスウイルスを含む組成物であって、当該ポックスウイルスゲノムが改変されており、ならびに天然初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクポリペプチドまたはその免疫原性部分もしくは機能性部分をコードする核酸配列を含む前記組成物と、弱毒化ポックスウイルスを含む組成物であって、当該ポックスウイルスゲノムが改変されており、ならびにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の膜ポリペプチドおよびヌクレオカプシドポリペプチドまたはそれらの免疫原性部分もしくは機能性部分（１または複数）をコードする核酸配列を含む前記組成物とを等量で含む混合組成物を対象に投与することを含む、上記方法を提供する。

【0201】

第一態様において、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染に対して対象において防御免疫反応を誘導する方法であって、上記のうちのいずれかの組成物を当該対象に投与することを含む、上記方法を提供する。

【0202】

第二態様において、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス様粒子に似せることによってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染のリスクを減少させる、動物における免疫反応を高めるための組成物を提供する。

【0203】

第三態様において、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して遺伝的類似性を有するコロナウイルスによって引き起こされる任意の他の感染のリスクを減少させる、動物における免疫反応を高めるための組成物であって、弱毒化ポックスウイルスを含み、当該ポックスウイルスゲノムは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクポリペプチドまたはその免疫原性部分もしくは機能性部分ならびに／あるいはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の膜ポリペプチドおよびヌクレオカプシドポリペプチドまたはそれらの免疫原性部分もしくは機能性部分ならびに／あるいはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のエンベロープポリペプチドまたはその免疫原性部分もしくは機能性部分、をコードする核酸配列を含む、上記組成物を提供する。

【0204】

第四態様において、本発明は、コロナウイルス感染に対して対象において中和抗体反応および／または防御免疫反応を誘導するための医薬の製造における、本明細書において想到される実施形態の組成物の使用を提供する。

【0205】

免疫原性は、ポックスウイルスベクターからＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクポリペプチドまたは当該スパイクポリペプチドのＳ１受容体結合ドメインサブユニットを発現させることによって達成され得る。歴史的に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶまたはＭＥＲＳ－ＣｏＶなどのコロナウイルスのスパイクタンパク質は、免疫原性であり、ウイルスが宿主細胞に侵入するのを阻害する中和抗体を含む体液性免疫反応および細胞媒介性免疫反応を誘発することが分かっている。免疫原性は、スパイク特異的Ｔ細胞反応を誘導することによっても達成され得る。ポックスウイルスベクターによって誘導される抗体のＴｈ１バイアス産生によって補われた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対するＳＣＶ－ＣＯＶＩＤワクチンによって誘導されるスパイク特異的細胞性および体液性反応は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対する予防的保護を提供し得る。

【0206】

免疫原性は、ポックスウイルスベクターからＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質ポリペプチドを発現させることによって実現され得る。ＳＡＲＳ－ＣｏＶにおいて、膜タンパク質は、ウイルス表面上において豊富であることが分かっており；その上、ＳＡＲＳを有する患者において免疫付与のために使用される場合、膜タンパク質は、中和抗体の高力価を誘導した。免疫原性分析および構造分析は、ロバストな細胞免疫反応を引き起こすことができるＴ細胞エピトープクラスターが膜タンパク質に存在することを実証した。膜タンパク質も、多くのウイルス種において高度に保存されるため、それは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫反応を誘導するための良好な抗原候補である。ポックスウイルスベクターによって誘導される抗体のＴｈ１バイアス産生によって補われた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対するＳＣＶ－ＣＯＶＩＤワクチンによって誘導される膜特異的細胞性および体液性反応は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対する予防的保護を提供し得る。

【0207】

免疫原性は、ポックスウイルスベクターからＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質ポリペプチドを発現させることによって達成され得る。最近、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染が、ヌクレオカプシド抗原をほぼ対象とする抗体の生成につながることが発見された。しかしながら、Ｎタンパク質抗体はウイルスの侵入を防ぐことができず、それ自体は「非中和」抗体であると見なされているため、Ｎ抗体は見落とされていた。したがって、抗Ｎ抗体は、体液性免疫を評価するために現在使用されている中和アッセイによって測定することができない。最近の研究により、細胞内に入る抗Ｎ抗体は、抗体受容体ＴＲＩＭ２１によって認識され、次いで、会合したＮタンパク質を断片化することが示された。次いで、Ｎタンパク質エピトープは、Ｔ細胞による検出のために提示される。この免疫反応メカニズムには、最終的に免疫学的記憶を媒介するであろうＴ細胞が関与するため、ヌクレオカプシドタンパク質に対する抗体は、将来の感染に対する長期保護を刺激し得る。ポックスウイルスベクターによって誘導される抗体のＴｈ１バイアス産生によって補われた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対するＳＣＶ－ＣＯＶＩＤワクチンによって誘導されるヌクレオカプシド特異的細胞性および体液性反応は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対する予防的保護を提供し得る。

【0208】

免疫原性は、ポックスウイルスベクター内の、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質もしくはその一部、膜タンパク質ポリペプチド、ヌクレオカプシドタンパク質ポリペプチド、および／またはエンベロープタンパク質ポリペプチドを同時に発現させることによって達成され得る。構造タンパク質の組み合わされた免疫原性は、よりロバストな抗原特異的免疫反応を引き起こし得る。その上、Ｓ、Ｍ、ならびにＮおよび／またはＥポリペプチドの存在は、コロナウイルス構造を模倣するが感染性であるための遺伝物質を欠く空のウイルスシェルである真正のウイルス様粒子（ＶＬＰ）の形成につながり得る。ポックスウイルスベクターによって誘導される抗体のＴｈ１バイアス産生によって補われた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対するＳＣＶ－ＣＯＶＩＤワクチンによって誘導される抗原特異的およびＶＬＰ特異的細胞性および体液性反応は、ＣＯＶＩＤ－１９に対する予防的保護を提供し得る。ポックスウイルスベクターによって誘導される抗体のＴｈ１バイアス産生によって補われた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対するＳＣＶ－ＣＯＶＩＤワクチンによって誘導されるＶＬＰ特異的細胞性および体液性反応は、ＣＯＶＩＤ－１９に対する予防的保護を提供し得る。

【0209】

本発明の好ましい形態において、弱毒化ポックスウイルスは、ワクシニアウイルス、ＮＹＶＡＣ、およびＳＣＶからなる群から選択される。弱毒化ポックスウイルスは、改変オルトポックスウイルスであり、当該改変が内因性の必須のアセンブリまたは成熟タンパク質をコードする遺伝子の欠失を含むことは、好ましい。当該改変が、Ｄ１３Ｌ遺伝子の欠失を含み、好ましくは、さらに、Ｋ１Ｌ遺伝子の欠失を含むことは、さらに好ましい。

【0210】

本明細書において可能な様々な実施形態について、以下の非限定的な例によりさらに説明する。

【実施例】

【0211】

例１
ワクチンの構築
ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９ワクチンを構築するために、抗原コード配列内の初期転写終止シグナルをサイレント突然変異を使用して除去し、抗原性導入遺伝子のための発現カセットを、新たに合成するか、または合成したカセットからＲＣＲによって構築した。各カセットは、上流のポックスウイルスプロモーターの必要制御要素およびコザック配列ならびに遺伝子発現を可能にする下流のポックスウイルス初期転写終止シグナルが隣接する導入遺伝子からなる。隣接するエンドヌクレアーゼ認識部位も、分子操作を可能にするために含まれ得る。発現カセットの具体的な例は、合成初期／後期プロモーターを有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクポリペプチド（図１Ａ）、天然の初期／後期プロモーターを有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクポリペプチド（図１Ｂ）、合成初期／後期プロモーターを有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクポリペプチドのＳ１受容体結合ドメインサブユニット（図１Ｃ）、鶏痘初期／後期プロモーターを有する膜ポリペプチド（図１Ｄ）、合成初期／後期プロモーターを有するヌクレオカプシドポリペプチド（図１Ｅ）、鶏痘初期／後期プロモーターを有する膜ポリペプチドおよび合成初期／後期プロモーターを有するヌクレオカプシドポリペプチド（図１Ｆ）、合成初期／後期プロモーターを有するエンベロープポリペプチド（図１Ｇ）に関して示される。

【0212】

次いで、導入遺伝子発現カセットを、標準的な分子生物学的方法を使用して、細菌において増殖できる適切な相同組換え（ＨＲ）プラスミドに挿入した。当該ＨＲプラスミドは、導入遺伝子がその間に位置するポックスウイルスゲノム部位に対して相同である隣接する組換えアーム（Ｆ１およびＦ２）からなるＨＲカセットを含む。ワクシニア－ＣＯＰゲノムに対する相同組換え部位は、図２に示される。導入遺伝子発現カセットは、新規の組換えウイルスのポジティブ選択（例えば、緑色または青色蛍光タンパク質（ＧＦＰまたはＢＦＰ）などの蛍光レポータータンパク質と組み合わせたＣＰ７７、ゼオシン（Ｚｅｏｃｉｎ）耐性または他の薬物選択）を可能にする遺伝子を含む追加のポックスウイルス発現カセットに隣接して、当該組換えアームの間に挿入される。選択遺伝子には、親ウイルスが排除された後の選択遺伝子欠失を可能にする１５０ｂｐの同じ非コードＤＮＡ配列が隣接する。ウイルス構築のためのＨＲプラスミドを調製するために、制限エンドヌクレアーゼ消化（例えば、Ｎｏｔ Ｉ）を使用して、ＨＲカセットを放出させる。以下に対してＨＲカセットの具体的な例を示す：
・ワクシニアＡ４１Ｌ ＯＲＦに隣接する配列に対して相同であったＦ１およびＦ２組換えアームが隣接する合成初期／後期プロモーター発現カセットの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクポリペプチド（図３Ａ；配列番号１）、
・ワクシニアＡ４１Ｌ ＯＲＦに隣接する配列に対して相同であったＦ１およびＦ２組換えアームが隣接する天然の初期／後期プロモーター発現カセットの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクポリペプチド（図３Ｂ；配列番号２）、
・ワクシニアＡ４１Ｌ ＯＲＦに隣接する配列に対して相同であったＦ１およびＦ２組換えアームが隣接するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクポリペプチド発現カセットのＳ１サブユニット（図３Ｃ；配列番号３）、
・ワクシニアＤ１３Ｌ ＯＲＦ（図３Ｄ、配列番号４）またはＪ２ＲとＪ３Ｒとの間の挿入を可能にするワクシニアＪ２ＲおよびＪ３Ｒ ＯＲＦ（図２Ｅ、配列番号５）に隣接する配列に対して相同であった左側および右側組換えアームが隣接するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜およびヌクレオカプシドタンパク質発現カセット、
・ワクシニアＣ３Ｌ ＯＲＦに隣接する配列に対して相同であった左側および右側組換えアームが隣接するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質発現カセット（図３Ｆ；配列番号６）、
・ワクシニアＤ１３Ｌ ＯＲＦに隣接する配列に対して相同であった左側および右側組換えアームが隣接するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質発現カセット（図３Ｇ；配列番号７）、
・ワクシニアＢ７／Ｂ８Ｒ ＯＲＦに隣接する配列に対して相同であった左側および右側組換えアームが隣接するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質発現カセット（図３Ｈ；配列番号８）。

【0213】

簡潔に説明すると、組換えＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９ワクチン（図４）を構築するために、ＢＣ１９Ａ－１２細胞またはＳＤ０７－１細胞（ＣＰ７７宿主域選択が必要）のどちらかにおいて相同組換えを実施する。Ｄ１３Ｌ、Ａ３９Ｒ、Ｂ７／Ｂ８Ｒ、およびＣ３Ｌ ＯＲＦの欠失を有するコペンハーゲン株から得られる複製能力がないワクシニアウイルスであるＳＣＶ－ＳＭＸ０６によって、１時間かけて、０．０１ｐｆｕ／細胞の感染多重度（ｍｏｉ）において細胞を感染させた。次いで、感染した細胞を、ＥＦＦＥＣＴＥＮＥ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ）などのトランスフェクション試薬を使用して、Ｎｏｔ Ｉ消化された相同組換えプラスミドによってトランスフェクトした。当該感染した／トランスフェクトした細胞を、蛍光細胞が見られるまで、２～３日間インキュベートする。当該組換えウイルスを、反復されるポジティブ薬物選択および蛍光ベースの単一細胞選別を使用して、親ウイルスから精製した。親ウイルス除去を達成した後（ＰＣＲによって確認した）、任意の追加の発現カセットを、相同組換えと精製の反復において挿入した。親ウイルスの非存在下において、ＢＣ１９Ａ－１２細胞の感染の間における１５０ｂｐのリピート配列の間での分子内組換えによる選択遺伝子の欠失を可能にするために、選択圧を除去した。選択マーカーを有さないウイルスを富化させ、ならびに蛍光ベースの単一細胞選別および／または限界希釈によって精製した。ウイルス集団が選択マーカーを含まなくなった後、候補のクローンをＢＣ１９Ａ－１２細胞において増幅することにより、ウイルスシードストックを作製し、それらを、導入遺伝子の位置および完全性についてはＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定によって、ならびに導入遺伝子の発現についてはウエスタンブロットまたは他の免疫染色手法によって確認した。

【0214】

構築戦略のまとめ
ＳＣＶは、必須のウイルスアセンブリタンパク質をコードする遺伝子であるＤ１３Ｌを削除することによって当該ＳＣＶウイルスを実質的に感染性ウイルス子孫を生じることができなくするように遺伝的に操作されたワクシニアウイルスのコペンハーゲン株に由来する。

【0215】

ＳＣＶ－ＳＭＸ０６は、詳細には免疫調節遺伝子Ａ３９Ｒ、Ｂ７／Ｂ８Ｒ、およびＣ３Ｌの、追加の遺伝子欠失を有するＳＣＶの変型である。遺伝子を、図２に示されるような相同組換えを使用して順次欠失させ、当該図において、Ｆ１組換えアームとＦ２組換えアームとの間のＤ１３Ｌ、Ａ３９Ｒ、Ｂ７／Ｂ８Ｒ、およびＣ３Ｌ領域が欠失している。ＳＣＶ－ＳＭＸ０６は、ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤワクチンのバリエーションを構築するために使用したベースＳＣＶウイルスである。必要な場合、欠失部位への導入遺伝子の挿入は、同じＦ１組換えアームおよびＦ２組換えアームを使用することによって促進した（図３）。

【0216】

さらに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクまたはその免疫原性部分が導入遺伝子として挿入されたバリエーションでは、Ａ４１Ｌ ＯＲＦは、当該導入遺伝子が挿入されるときに欠失させられる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクまたはその免疫原性部分を欠くバリエーションでは、Ａ４１Ｌ遺伝子は、改変されないままである。

【0217】

単一ベクター化ワクチンを提供するために、ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９ウイルスが構築される。当該単一のベクター化ワクチンは、混合ワクチンとして組み合わせてもよい。

【0218】

組換えウイルスＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ａは、ＳＣＶ－ＳＭＸ０６のＡ４１Ｌ ＯＲＦを、合成初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクポリヌクレオチドをコードする発現カセット（例えば、配列番号１において定義されるヌクレオチド配列を有する発現カセット）で置換することによって、および、鶏痘初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜ポリペプチドと合成初期／後期プロモーターの転写制御下のヌクレオカプシドポリヌクレオチドとを含む発現カセット（例えば、配列番号４において定義されるヌクレオチド配列を有する発現カセット）を、ＳＣＶ－ＳＭＸ０６のＤ１３Ｌ ＯＲＦ欠失部位に挿入することによって、構築される。

【0219】

組換えウイルスＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｂは、ＳＣＶ－ＳＭＸ０６のＡ４１Ｌ ＯＲＦを、天然初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクポリヌクレオチドをコードする発現カセット（例えば、配列番号２において定義されるヌクレオチド配列を有する発現カセット）で置換することによって、および鶏痘初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜ポリペプチドと合成初期／後期プロモーターの転写制御下のヌクレオカプシドポリヌクレオチドとを含む発現カセット（例えば、配列番号４において定義されるヌクレオチド配列を有する発現カセット）を、ＳＣＶ－ＳＭＸ０６のＤ１３Ｌ ＯＲＦ欠失部位に挿入することによって構築される。

【0220】

組換えウイルスＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃは、ＳＣＶ－ＳＭＸ０６のＡ４１Ｌ ＯＲＦを、合成初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクポリヌクレオチドをコードする発現カセット（例えば、配列番号１において定義されるヌクレオチド配列を有する発現カセット）で置換することによって構築される。

【0221】

組換えウイルスＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｄは、ＳＣＶ－ＳＭＸ０６のＡ４１Ｌ ＯＲＦを、天然初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクポリヌクレオチドをコードする発現カセット（例えば、配列番号２において定義されるヌクレオチド配列を有する発現カセット）で置換することによって構築される。

【0222】

組換えウイルスＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｅは、鶏痘初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜ポリペプチドと合成初期／後期プロモーターの転写制御下のヌクレオカプシドポリヌクレオチドとをコードする発現カセット（例えば、配列番号５において定義されるヌクレオチド配列を有する発現カセット）を、ＳＣＶ－ＳＭＸ０６のＪ２Ｒ遺伝子とＪ３Ｒ遺伝子との間に挿入することによって構築される。

【0223】

組換えウイルスＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｆは、ＳＣＶ－ＳＭＸ０６のＡ４１Ｌ ＯＲＦを、合成初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクポリペプチドのＳ１受容体結合ドメインサブユニットをコードする発現カセット（例えば、配列番号３において定義されるヌクレオチド配列を有する発現カセット）で置換することによって構築される。

【0224】

組換えウイルスＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｇは、鶏痘初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜ポリペプチドと合成初期／後期プロモーターの転写制御下のヌクレオカプシドポリヌクレオチドとをコードする発現カセット（例えば、配列番号４において定義されるヌクレオチド配列を有する発現カセット）を、ＳＣＶ－ＳＭＸ０６のＤ１３Ｌ ＯＲＦ欠失部位に挿入することによって構築される。

【0225】

組換えウイルスＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｈは、ＳＣＶ－ＳＭＸ０６ワクシニアウイルス株のＡ４１Ｌ ＯＲＦを、合成初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクポリヌクレオチドをコードする発現カセット（例えば、配列番号１において定義されるヌクレオチド配列を有する発現カセット）で置換し、鶏痘初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜ポリペプチドと合成初期／後期プロモーターの転写制御下のヌクレオカプシドポリヌクレオチドとをコードする発現カセット（例えば、配列番号４において定義されるヌクレオチド配列を有する発現カセット）を、ＳＣＶ－ＳＭＸ０６のＤ１３Ｌ ＯＲＦ欠失部位に挿入することによって、および合成初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープポリヌクレオチドをコードする発現カセット（例えば、配列番号８において定義されるヌクレオチド配列を有する発現カセット）を、ＳＣＶ－ＳＭＸ０６のＢ７／Ｂ８Ｒ ＯＲＦ欠失部位に挿入することによって構築される。

【0226】

組換えウイルスＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｉは、ＳＣＶ－ＳＭＸ０６ワクシニアウイルス株のＡ４１Ｌ ＯＲＦを、天然初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクポリヌクレオチドをコードする発現カセット（例えば、配列番号２において定義されるヌクレオチド配列を有する発現カセット）で置換することによって、および鶏痘初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜ポリペプチドと合成初期／後期プロモーターの転写制御下のヌクレオカプシドポリヌクレオチドとをコードする発現カセット（例えば、配列番号４において定義されるヌクレオチド配列を有する発現カセット）を、ＳＣＶ－ＳＭＸ０６のＤ１３Ｌ ＯＲＦ欠失部位に挿入することによって、および合成初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープポリヌクレオチドをコードする発現カセット（例えば、配列番号８において定義されるヌクレオチド配列を有する発現カセット）を、ＳＣＶ－ＳＭＸ０６のＢ７／Ｂ８Ｒ ＯＲＦ欠失部位に挿入することによって、構築される。

【0227】

組換えウイルスＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｊは、ＳＣＶ－ＳＭＸ０６ワクシニアウイルス株のＡ４１Ｌ ＯＲＦを、合成初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクポリペプチドのＳ１受容体結合ドメインサブユニットをコードする発現カセット（例えば、配列番号３において定義されるヌクレオチド配列を有する発現カセット）で置換することによって、および鶏痘初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜ポリペプチドと合成初期／後期プロモーターの転写制御下のヌクレオカプシドポリヌクレオチドとをコードする発現カセット（例えば、配列番号４において定義されるヌクレオチド配列を有する発現カセット）を、ＳＣＶ－ＳＭＸ０６のＤ１３Ｌ ＯＲＦ欠失部位に挿入することによって構築される。

【0228】

組換えウイルスＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｋは、ＳＣＶ－ＳＭＸ０６ワクシニアウイルス株のＡ４１Ｌ ＯＲＦを、合成初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクポリペプチドのＳ１受容体結合ドメインサブユニットをコードする発現カセット（例えば、配列番号３において定義されるヌクレオチド配列を有する発現カセット）で置換することによって、および鶏痘初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜ポリペプチドと合成初期／後期プロモーターの転写制御下のヌクレオカプシドポリヌクレオチドとをコードする発現カセット（例えば、配列番号４において定義されるヌクレオチド配列を有する発現カセット）を、ＳＣＶ－ＳＭＸ０６のＤ１３Ｌ ＯＲＦ欠失部位に挿入することによって、および合成初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープポリヌクレオチドをコードする発現カセット（例えば、配列番号８において定義されるヌクレオチド配列を有する発現カセット）を、ＳＣＶ－ＳＭＸ０６のＢ７／Ｂ８Ｒ ＯＲＦ欠失部位に挿入することによって、構築される。

【0229】

組換えウイルスＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｌは、鶏痘初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜ポリペプチドをコードする発現カセット（例えば、配列番号６において定義されるヌクレオチド配列を有する発現カセット）を、ＳＣＶ－ＳＭＸ０６のＣ３Ｌ ＯＲＦ欠失部位に挿入することによって構築される。

【0230】

組換えウイルスＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｍは、合成初期／後期プロモーターの転写制御下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドポリペプチドをコードする発現カセット（例えば、配列番号７において定義されるヌクレオチド配列を有する発現カセット）を、ＳＣＶ－ＳＭＸ０６のＤ１３Ｌ ＯＲＦ欠失部位に挿入することによって構築される。

【0231】

ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９ウイルスワクチン内のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原挿入領域は、図５に示される。詳細には、Ａ４１Ｌ ＯＲＦにおける合成初期／後期プロモーター下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクポリペプチド（図５Ａ）、Ａ４１Ｌ ＯＲＦにおける天然初期／後期プロモーター下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクポリペプチド（図５Ｂ）、Ａ４１Ｌ ＯＲＦにおけるスパイクポリペプチドのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１サブユニット（図５Ｃ）、Ｄ１３Ｌ ＯＲＦにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜およびヌクレオカプシドポリペプチド（図５Ｄ）、Ｊ２ＲとＪ３Ｒとの間の遺伝子間部位におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜およびヌクレオカプシドポリペプチド（図５Ｅ）、Ｂ７／Ｂ８Ｒ ＯＲＦにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープポリペプチド（図５Ｆ）、Ｃ３Ｌ ＯＲＦにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜ポリペプチド（図５Ｇ）、およびＤ１３Ｌ ＯＲＦにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドポリペプチド（図５Ｈ）。

【0232】

表１に、ＳＣＶ－ＳＭＸ０６ゲノム内のＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９挿入および欠失部位をまとめる。スパイクまたはＳ１導入遺伝子を含むＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９種の場合、Ａ４１Ｌ遺伝子は欠失されている。Ｊ２↓Ｊ３Ｒは、隣接するＪ２Ｒ遺伝子およびＪ３Ｒ遺伝子に対する改変なしに抗原が挿入される遺伝子間挿入部位を示す。未改変部位は、「＋」によって示され、その一方で、「－」は、遺伝子のＯＲＦが欠失されていることを示す。

【0233】

【表1】

【0234】

さらに、２つの単一ベクター化ワクチンを等しい割合で混合することによって混合ワクチン、具体的にはＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９ＣおよびＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｇの混合ワクチンが調製され、単一の注射器によって送達される。

【0235】

さらに、２つの単一ベクター化ワクチンを等しい割合で混合することによって混合ワクチン、具体的にはＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９ＤおよびＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｇの混合ワクチンが調製され、単一の注射器によって送達される。

【0236】

さらに、２つの単一ベクター化ワクチンを等しい割合で混合することによって混合ワクチン、具体的にはＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９ＣおよびＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｅの混合ワクチンが調製され、単一の注射器によって送達される。

【0237】

さらに、２つの単一ベクター化ワクチンを等しい割合で混合することによって混合ワクチン、具体的にはＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９ＤおよびＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｅの混合ワクチンが調製され、単一の注射器によって送達される。

【0238】

例２
ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｄによる単一のワクチン接種は非近交系および近交系マウスにおいて中和ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体およびＴｈ１バイアス抗体プロファイルを生じる
実験戦略
６～９週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６マウスまたはＡＲＣスイスマウスの群（１つの群あたりｎ＝５匹のマウス）に、ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｄ（１０^７、１０^８ＰＦＵ）またはベクターコントロールＳＣＶ－ＳＭＸ０６による筋肉内投与によってワクチン接種した。ワクチン接種前および接種後２１日目に血液試料を得た。Ｓ１特異的ＩｇＧレベルおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス特異的中和抗体レベルを、エンドポイントＥＬＩＳＡおよび中和アッセイによって決定した。

【0239】

遺伝的ヘテロ接合性を説明するために、マウスの２つのコホートを使用した。第１のコホートは、表現型または特性の変動性を最小にするために近交系マウス株Ｃ５７ＢＬ／６を使用し、結果として、再現性が向上し、その一方で、第２の群は、遺伝的多様性を、したがって集団にわたる反応のさらなる一般化可能性を表すために非近交系スイスマウス株を用いた。

【0240】

ウイルス中和試験
血清を５６℃で３０分かけて熱不活性化し、処理を行う日まで－８０℃で貯蔵した。処理の日の単層コンフルエンスを確保するために、Ｖｅｒｏ細胞を含む９６ウェルプレートも培養した。中和アッセイの当日、血清の２倍段階希釈を、最小必須培地（ＭＥＭ）培養培地において調製し、Ｖｅｒｏプレートを、ＭＥＭおよび抗生物質およびトリプシンで構成される感染培地で洗浄した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ５０μｌあたり１００ＴＣＩＤ_５０を、予め調製した血清希釈の各希釈に加え、時々揺動させながら、室温で１時間インキュベートした。次いで、ウイルス：血清混合物をＶｅｒｏ細胞に加え、３７℃および５％ＣＯ_２においてインキュベートし、次いで、光学顕微鏡によりモニターし、処置後４日目に細胞変性効果をスコア化した。ウイルス中和力価を、依然としてウイルス複製を阻害する血清の最も高い希釈の逆数値として表した。

【0241】

マウス血清に対する酵素結合免疫吸着測定法
ＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ）を、４℃において一晩かけて吸着させるために、ＰＢＳ中におけるＳ１（１２０ ｎｇ／ウェル）によってコーティングした。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（０．０５％ｖ／ｖ）において洗浄し、ウェルを、室温で１時間かけて、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ中における３％スキムミルクを使用してブロックした。段階希釈したマウス血清試料を加え、室温で２時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧを、全てのウェルに室温において加え１時間おき、洗浄後、ＴＭＢ液体基質（Ｓｉｇｍａ）を加え、反応を３ＭのＨＣｌを使用して停止させた。各ウェルの光学密度（ＯＤ）値を４５０ｎｍにおいて測定した。エンドポイント力価を以下のように算出した：ｌｏｇ_１０試料希釈に対するｌｏｇ_１０ＯＤをプロットし、この曲線の直線部分を回帰分析することで、エンドポイント力価の算出を可能にした。ＯＤ読み取り値がネガティブ血清試料の平均吸光度値＋標準偏差の３倍に達したときのエンドポイント力価を算出した。ＩｇＧサブクラスＥＬＩＳＡの結果を、ＯＤ値を使用して表した。

【0242】

結果
ウイルス特異的中和抗体が、ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｄでワクチン接種した全てのマウスにおいて検出された（図６Ａ）。１０^７ＰＦＵ用量のワクチン接種において、非近交系スイスマウスおよび近交系Ｃ５７Ｂｌ／６マウスによって生成された中和抗体の力価は、ＳＣＶ－ＳＭＸ０６よりも高く、中和抗体のレベルは、同じ用量での非近交系マウスと近交系マウスとの間において同等であった。スイスマウスに対する１０^８ＰＦＵ用量のワクチン接種では、中和抗体力価の増加が見られた。非近交系スイス株およびＣ５７ＢＬ／６マウスの両方において、スパイクタンパク質のＳ１サブユニットに対して、総ＩｇＧ力価も検出した（図６Ｂ）。ＥＬＩＳＡによるＩｇＧサブクラスのプロファイリングは、ＩｇＧ１と比較して、より高いＳ１特異的ＩｇＧ２ｃのレベルを示し、それは、ワクチン接種後にＴｈ１反応が支配的であることを示している（図６Ｃ）。

【0243】

例３
ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｄによる単一のワクチン接種はスパイク特異的ＣＤ８ Ｔ細胞反応を生じさせる
Ｔ細胞は、呼吸器系の多くのウイルス感染の初期の抑制および排除を引き起こすために重要である。遺伝子導入マウスモデルにおける最近の研究は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染後のウイルス排除および疾患の解消において、Ｔ細胞が利用されていることの証拠を提供した。本明細書において、本発明者らは、ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｄによる免疫付与が、疾患重症度の抑制において潜在的に有益であろう初期Ｔ細胞反応を誘発するか否かを明確にする。

【0244】

実験戦略
６～９週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６マウスの群（１つの群あたりｎ＝５匹のマウス）に、１０^７ＰＦＵの用量でのＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９ＤまたはベクターコントロールＳＣＶ－ＳＭＸ０６による筋肉内投与によってワクチン接種した。ワクチン接種の３か月後に、スパイク特異的Ｔ細胞反応（スパイクタンパク質の全長に及ぶペプチドを使用する）を、ＥＬＩＳｐｏｔおよび細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）によって検出した。

【0245】

ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ
細胞を、完全培地での再懸濁の前に、７０μＭ細胞ストレーナーおよびＡＣＫ溶解を経させることによって、マウス脾細胞の単一細胞懸濁液の希釈物を調製した。ＥＬＩＳｐｏｔによるインターフェロン－ガンマ（ＩＦＮγ）産生の分析のために、ＰＶＤＦ ＥＬＩＳｐｏｔプレート（ＭａｂＴｅｃｈ）を、抗マウスＩＦＮγコーティング抗体を用いて一晩インキュベートし、次いで、細胞培養培地によってブロックした。細胞希釈物を、全スパイクタンパク質に及ぶペプチドのプールと（ペプチドあたり２μｇ／ｍｌ）、ＥＬＩＳｐｏｔプレートにおいて、５％ＣＯ_２の３７℃に加湿されたインキュベーターにおいて、１８～２０時間インキュベートした。刺激の後、ＩＦＮγスポット形成単位（ＳＦＵ）を、抗マウスＩＦＧＮγビチオン検出抗体で膜を染色することによって検出し、その後、ストレプトアビジン－アルカリホスファターゼで処理し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質キット（ＭａｂＴｅｃｈ）によって顕色させた。サイトカイン分泌Ｔ細胞を表すスポットを、ＥＬＩＳｐｏｔリーダーを使用して定量化した。

【0246】

細胞内サイトカイン染色分析
ＥＬＩＳｐｏｔの結果を補足および検証するために、ＩＦＮγの細胞内サイトカイン産生を実施した。タンパク質輸送阻害剤であるブレフェルジンＡと共に、全スパイクタンパク質に及ぶペプチドのプールを用いて（ペプチドあたり２μｇ／ｍｌ）、細胞を３７℃で６時間刺激した。表面マーカーＣＤ３およびＣＤ８に対して細胞を染色し、次いで、４％パラホルムアルデヒドで固定した。ＢＤ ｃｙｔｏｆｉｘ／ｐｅｒｍ緩衝液を使用して、細胞を透過処理し、ＩＦＮγに対する細胞内染色を実施した。ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ２（ＢＤ）において試料収集を実施し、ＦｌｏｗＪｏ Ｖ１０（ＴｒｅｅＳｔａｒ）においてデータを分析した。二重ネガティブ生リンパ球、サイズ、ＣＤ３^＋、ＣＤ８^＋細胞、およびＩＦＮγサイトカインポジティブに対するゲーティングによって、サイトカイン分泌Ｔ細胞を同定した。

【0247】

結果
ベクターコントロールと比較した、Ｔ細胞反応を生じるスパイク特異的ＩＦＮγ^＋における著しい増加を、ＩＣＳ（図７Ａ）およびＥＬＩＳｐｏｔ（図７Ｂ）の両方によって、ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｄワクチン接種したマウスにおいて検出した。ベクターコントロール群は、低い（＜１００ＳＦＵ）または最小の検出可能な反応を有した（図１５Ｂ）。

【0248】

結論
本明細書における例２および３は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質をコードするＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９ワクチンによる動物モデルの免疫付与が、Ｓ１特異的抗体、中和抗体の産生、およびスパイク特異的ＩＦＮγ分泌ＣＤ８^＋Ｔ細胞の増加によって示されるような細胞性および体液性反応を誘導することを示している。これらは、ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９ワクチンは、ＣＯＶＩＤ－１９に関する感染性病原因子であるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する予防的保護を提供し得る。

【0249】

例４
ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃは、ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９ＤおよびＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｆよりも良好なスパイク特異的抗体を生じさせる
ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９ＣおよびＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｄワクチンは、抗原の発現のために使用されるポックスウイルスプロモーターのタイプが異なっている。ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９ＣおよびＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｆワクチンは、挿入された導入遺伝子の長さが異なっており、ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃは、スパイクタンパク質の全長を含むが、その一方で、ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｆは、スパイクタンパク質のＳ１サブユニットのみを含む。本明細書において、本発明者らは、ウエスタンブロットによって３つのワクチンの抗原発現の効率を比較し、ＥＬＩＳＡを使用して、スパイクＳ１特異的抗体反応を誘導するそれらの能力を評価した。

【0250】

実験戦略
ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃ、ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｄ、およびＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｆを細胞系に感染させ、スパイクタンパク質またはＳ１サブユニットの発現を、ウエスタンブロットによって調べた。６～９週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６マウスの群（１つの群あたりｎ＝５匹のマウス）に、マウス１匹あたり１０^７ＰＦＵの用量において、ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃ、ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｄ、ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９ＦまたはベクターコントロールＳＣＶ－ＳＭＸ０６による筋肉内投与によってワクチン接種し、スパイクＳ１特異的抗体反応を、ＥＬＩＳＡによって評価した。

【0251】

ウエスタンブロット
ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃ、ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｄ、およびＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｆ濃縮物を、ローディングバッファーにおいて溶解させ、各試料に対して総タンパク質の８μｇの同等物を、１０％ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲルにおいて分離し、ニトロセルロースフィルター膜上に転写した。当該膜をブロックし、１：１０００に希釈したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＲＢＤ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ４０５９２－Ｔ６２）に対するウサギｍＡｂとインキュベートした。結合した抗体を、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗ウサギＩｇＧ、それに続く膜（Ｓｉｇｍａ）に対してＣｌａｒｉｔｙ ＥＣＬおよびＴＭＢを使用する増強化学発光を使用して検出した。

【0252】

Ｓ１－特異抗体エンドポイント力価に関する酵素結合免疫吸着測定法
ＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ）を、４℃において一晩かけて吸着させるために、ＰＢＳ中におけるＳ１（１２０ ｎｇ／ウェル）によってコーティングした。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（０．０５％ｖ／ｖ）において洗浄し、ウェルを、室温で１時間かけて、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ中における３％スキムミルクを使用してブロックした。段階希釈したマウス血清試料を加え、室温で２時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧを、全てのウェルに室温において加え１時間おいた。洗浄後、ＴＭＢ液体基質（Ｓｉｇｍａ）を加え、反応を３ＭのＨＣｌを使用して停止させた。各ウェルの光学密度（ＯＤ）値を４５０ｎｍにおいて測定した。エンドポイント力価を以下のように算出した：ｌｏｇ_１０試料希釈に対するｌｏｇ_１０ＯＤをプロットし、この曲線の直線部分を回帰分析することで、エンドポイント力価の算出を可能にした。ＯＤ読み取り値がネガティブ血清試料の平均吸光度値＋標準偏差の３倍に達したときのエンドポイント力価を算出した。

【0253】

結果
図８Ａは、ウエスタンブロットによって、細胞溶解物におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の発現を示している。ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９ＣおよびＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｄの両方に対する溶解物は、全長スパイクタンパク質の発現を反映する、１８０ｋＤａにおけるバンドを示しており、その一方で、ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｆに対する溶解物は、スパイクタンパク質のＳ１サブユニットの発現を反映する、８０ｋＤａにおけるバンドを示した。しかしながら、ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃは、ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｄと比較してより強いシグナルを示し、これは、合成初期／後期プロモーター下でのスパイクタンパク質のより効率的な発現を示唆している。免疫付与後２１日目における、ＥＬＩＳＡによるＳ１特異的抗体反応の比較は、ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃによって誘導された、ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９ＤまたはＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｆより高い抗体力価を裏付けた（図８Ｂ）。

【0254】

結論
例４は、合成初期／後期プロモーターの制御下のスパイクタンパク質を有するＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃワクチンは、ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｄワクチンと比較してより高いレベルのスパイクタンパク質を発現することを実証している。抗体力価は、ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９ＤまたはＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｆと比較して、ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃに対するより大きい免疫原性を実証している。下記の例は、ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃワクチンの有効性をさらに調査している。

【0255】

例５
ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃによる単一のワクチン接種は近交系および非近交系マウスにおいて抗体反応を誘導する
実験戦略
６～９週齢の雌の近交系Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびＡＲＣ（ｓ）マウスの群（１つの群あたりｎ＝５匹のマウス）に、マウス１匹あたり１０^７ＰＦＵの用量でのＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９ＣまたはベクターのみのコントロールＳＭＸ０６による筋肉内投与によってワクチン接種した。ワクチン接種前および接種後１４日目に血液試料を得た。（Ｓ１）タンパク質特異的ＩｇＧレベルおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス特異的中和抗体レベルを、エンドポイントＥＬＩＳＡおよび疑似中和アッセイ（ｐｅｕｄｏ－ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ） （ｃＰａｓｓ（商標）；Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）によって決定した。

【0256】

遺伝的ヘテロ接合性におけるバリエーションを説明するために、マウスの２つのコホートを使用した。第１のコホートは、表現型または特性の変動性を最小にするために近交系マウス株Ｃ５７ＢＬ／６を使用し、結果として、再現性が向上し、その一方で、第２のコホートは、遺伝的多様性を、したがって集団にわたる反応のさらなる一般化可能性を表すために非近交系スイスマウス株を用いた。

【0257】

Ｓ１－特異抗体エンドポイント力価に関する酵素結合免疫吸着測定法
ＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ）を、４℃において一晩かけて吸着させるために、ＰＢＳ中におけるＳ１（１２０ ｎｇ／ウェル）によってコーティングした。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（０．０５％ｖ／ｖ）において洗浄し、ウェルを、室温で１時間かけて、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ中における３％スキムミルクを使用してブロックした。段階希釈したマウス血清試料を加え、室温で２時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧを、全てのウェルに室温において加え１時間おいた。洗浄後、ＴＭＢ液体基質（Ｓｉｇｍａ）を加え、反応を３ＭのＨＣｌを使用して停止させた。各ウェルの光学密度（ＯＤ）値を４５０ｎｍにおいて測定した。エンドポイント力価を以下のように算出した：ｌｏｇ_１０試料希釈に対するｌｏｇ_１０ＯＤをプロットし、この曲線の直線部分を回帰分析することで、エンドポイント力価の算出を可能にした。ＯＤ読み取り値がネガティブ血清試料の平均吸光度値＋標準偏差の３倍に達したときのエンドポイント力価を算出した。

【0258】

ｃＰａｓｓ（商標）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体検出
ｃＰａｓｓ（商標）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体検出キット（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、米国）は、血清および血漿におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する総中和抗体の定量的直接検出を意図するブロッキングＥＬＩＳＡである。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染は、血液中における抗体または結合抗体の産生を含む免疫反応を開始させる。精製された受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）、ウイルススパイク（Ｓ）タンパク質由来のタンパク質、および宿主細胞受容体ＡＣＥ２を使用することにより、当該試験は、試験管またはＥＬＩＳＡプレートのウェルでの直接タンパク質－タンパク質相互作用によって、ウイルス－宿主相互作用を模倣する。次いで、従来のウイルス中和試験と同じ方式において、非常に特異的な相互作用を中和することができる。簡潔に説明すると、試料およびコントロールを試料希釈緩衝液で希釈し、ＨＲＤ標識ＲＢＤとプレインキュベートすることにより、ＨＲＰ－ＲＢＤへの循環中和抗体の結合を可能にさせる。次いで、当該混合物を、ＡＣＥ２タンパク質でプレコーティングされた捕捉プレートに加えた。未結合ＨＲＰ－ＲＢＤならびに非中和抗体に結合したＨＲＰ－ＲＢＤは、当該プレート上において捕捉され、その一方で、循環中和抗体ＨＲＰ－ＲＢＤ複合体は、上清中に残り、洗浄の間に除去される。洗浄サイクルの後で、ＴＭＢ基質溶液が加えられ、続いて停止液が加えられ、次いで、当該反応がクエンチされ、色は黄色に変わる。最終溶液の吸光度が、マイクロプレートリーダーにおいて４５０ｎｍで読み取られ、パーセントシグナル阻害が、以下の式を使用して決定される：
パーセントシグナル阻害＝（１－試料のＯＤ値／ネガティブコントロールのＯＤ値）×１００％

【0259】

パーセントシグナル阻害は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の総中和抗体の定性的検出を意味する。ｃＰａｓｓ（ＴＭ）キットは、ワクチンの有効性の評価および集団免疫の評価での使用に対して、食品医薬品局（ＦＤＡ）によって認可されている。

【0260】

結果
図９Ａは、ワクチン接種後の１４日目における、ベクターのみのコントロールＳＭＸ０６と比較した、ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃでワクチン接種したマウスの２つのコホートにおいて観察されるＳ１特異的ＩｇＧのレベルを示している。近交系および非近交系マウスの両方において、Ｓ１特異的ＩｇＧが検出され（図９Ａ）、この場合、非近交系マウスは、近交系マウスと比較して、より高い抗体のレベルを生じた（図９Ｂ）。これと一致して、近交系Ｃ５７ＢＬ／６マウスと比較して、非近交系ＡＲＣ（ｓ）マウスにおいて、ｃＰａｓｓアッセイによって、より高い中和抗体のレベルが検出され（図９Ｃ）、この場合、両方のコホートは、ベクターコントロールＳＭＸ０６と比較して、より高い中和抗体を生じた。これらの結果は、ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃが、非近交系マウス（遺伝的ヘテロ接合性の代表、したがってヒト集団への置き換え）および近交系マウスの両方において、中和能力を有するスパイク特異的抗体を誘導することができることを実証している。これらの結果およびＣ５７ＢＬ／６に対する試薬可用性に基づいて、ワクチン媒介免疫反応のさらなる調査のための実験モデルとして、近郊マウスを選択した。

【0261】

例６
ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃによる単一のワクチン接種はロバストなスパイク特異的Ｔ細胞反応を誘導する
Ｔ細胞は、呼吸器系の多くのウイルス感染の初期の抑制および排除を引き起こすために重要である。遺伝子導入マウスモデルにおける最近の研究は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染後のウイルス排除および疾患の解消において、Ｔ細胞が利用されていることの証拠を提供した。本明細書において、本発明者らは、ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃによる免疫付与が、疾患重症度の抑制において潜在的に有益であろう初期Ｔ細胞反応を誘発するか否かを明確にする。

【0262】

実験戦略
雄（１群あたりｎ＝３）および雌（１群あたりｎ＝３）の６～９週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを３つにグループ分けした：（１）ナイーブなマウス／ワクチンなし、（２）ベクターのみのコントロールＳＭＸ０６によってワクチン接種したマウス、および（３）ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃ（１０^７ＰＦＵ）の一回用量でワクチン接種したマウス。

【0263】

方法
ワクチン接種後の７日目に、脾臓を採取し、フローサイトメトリーによる単一細胞キャラクタリゼーションのために処理した。当該脾臓からの単一細胞調製物を、標準的な方法で単離した。簡潔に説明すると、小さい注射器のプランジャーを使用して、７０μｍの細胞ストレーナーを通すことにより脾臓を破壊した。結果として得られた単一細胞懸濁液をスピン処理し（３００ｘｇ、５分）、赤血球を排除するために５分かけて１ｍＬのアンモニウム－塩化物－カリウム（ＡＣＫ）溶解用緩衝液に再懸濁させた。次いで、当該溶解用緩衝液を中和するために、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補ったＲＰＭＩ培養培地を加えた。脾細胞を、ＰＢＳで２回洗浄し、マルチパラメータフローサイトメトリーのために２×１０^７細胞／ｍＬにおいて再懸濁させた。

【0264】

例３において説明される細胞内サイトカイン染色を使用して、ＣＤ８およびＣＤ４ Ｔ細胞反応を評価した。図１０に示されるゲーティング戦略を使用してサイトカインＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、およびＩＬ－２の産生を評価するために、細胞内サイトカイン染色を使用した。エフェクターＣＤ８ Ｔ細胞によって産生される重要な細胞傷害性エフェクター分子であるグランザイムＢの産生も、フローサイトメトリーによって測定した。

【0265】

ワクチン媒介性ＣＤ８ Ｔ細胞反応およびＣＤ４ Ｔ細胞反応の特異性を測定するために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のＳ１およびＳ２領域に及ぶ重複するペプチドで構成される２つのペプチドプールを使用した。スパイクプール１は、Ｓ１の全配列に及ぶ重複する１１ｍｅｒを伴う１５のＡＡ長ペプチドで構成され、スパイクプール２は、Ｓ２の全配列に及ぶ重複する１１ｍｅｒを伴う１５のＡＡ長ペプチドで構成される。加えて、ペプチドミックス（ｐｅｐｍｉｘ）は、Ｓ１のＲＢＤ領域内の免疫優性Ｔ細胞エピトープＹＮＹＬＹＲＬＦ（配列番号９）、ＶＶＬＳＦＥＬＬ（配列番号１０）、およびＶＮＦＮＦＮＧＬ（配列番号１１）を含有する重複するペプチドプールを含む。これらのＴ細胞エピトープは、以前に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶにおけるＣＤ８ Ｔ細胞活性化のマウス研究において同定された。タンパク質輸送阻害剤であるブレフェルジンＡと共に１条件あたりの２μｇ／ｍｌ／ペプチドによって細胞を３７℃で６時間刺激し、産生されたサイトカインをＩＣＳによって分析した。

【0266】

結果：スパイク特異的トリプルサイトカインポジティブＣＤ８ Ｔ細胞反応
ワクチン接種後の７日目における細胞内サイトカイン染色は、ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃの一回用量（図１１Ａ；下側パネル）は、スパイク特異的ＩＦＮ－γＣＤ８ Ｔ細胞の数における著しい増加をもたらすが、その一方で、ナイーブ（図１１Ａ；上側パネル）マウスおよびベクターのみ（図１１Ａ；中央パネル）コントロールマウスからのＣＤ８ Ｔ細胞は、最小レベルのＩＦＮ－γを産生する。ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃによるワクチン接種後に誘導されるスパイク特異的ＩＦＮ－γ産生Ｔ細胞は、多機能性であり、追加のサイトカインを分泌し、その上、半分超は、ＴＮＦ－α産生性であった。細胞の約１５％は、トリプルサイトカインプロデューサー（ｔｒｉｐｌｅ－ｃｙｔｏｋｉｎｅ－ｐｒｏｄｕｃｅｒｓ）（ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、およびＩＬ－２）として分類され、これらの細胞は、良質のＴ細胞反応の特質と見なされる（図１１Ａ；下側パネル）。

【0267】

図１１Ｂは、実験マウスの全ての群におけるスパイクプール１（Ｓ１）特異的（左側パネル）、およびスパイクプール２（Ｓ２）特異的（中央パネル）、およびエピトープ特異的（ＹＮＹＬＹＲＬＦ（配列番号９）、ＶＶＬＳＦＥＬＬ（配列番号１０）、およびＶＮＦＮＦＮＧＬ（配列番号１１）；右側パネル）である、シングル、ダブルおよびトリプルサイトカイン産生ＩＦＮ－γ＋ＣＤ８ Ｔ細胞の数のグラフ表示である。

【0268】

結果：スパイク特異的グランザイムＢ産生ＣＤ８ Ｔ細胞反応
ナイーブマウスと比較して、ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃは、ワクチン接種後にグランザイムＢ産生ＣＤ８ Ｔ細胞を生じた（図１１Ｃ）。

【0269】

結果：スパイク特異的ＩＦＮ－γ産生ＣＤ４ Ｔ細胞反応
ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃの単一ワクチン接種が、抗原特異的ＣＤ４ Ｔ細胞反応を誘導したかどうかを評価するために、脾細胞を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ１（プール１）およびＳ２（プール２）領域に及ぶペプチドプールによって再刺激した。ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃによるワクチン接種は、Ｓ１およびＳ２特異的トリプルサイトカイン産生ＣＤ４ Ｔ細胞を誘導し、これは、図１１Ｄに表される。

【0270】

結論
ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃの単一ワクチン接種は、細胞傷害能を有するＣＤ８ Ｔ細胞（グランザイムＢ産生）およびスパイク特異的多機能性ＣＤ８およびＣＤ４ Ｔ細胞を生成する。

【0271】

例７
既存の免疫はＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃワクチンの単回投与後のスパイク特異的抗体反応の量および質に影響を及ぼさない。
ウイルスベクターに対する既存の免疫の影響は、ウイルスベクター化ワクチンの開発に対する主要な問題である。オルトポックスウイルスベースのワクチンの使用には、成人のヒト集団の一部は、１９７０年台半ばまで実施され、最終的に天然痘の撲滅につながった種痘キャンペーンにより、当該ワクチンベクターに対する免疫を有するという潜在的欠点が存在する。したがって、結果としてワクチンの免疫原性および有効性の減少につながる、後続のＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９ワクチン接種をオルトポックスウイルス特異的な既存の免疫が妨害することに対する大きな関心が存在する。本明細書において、本発明者らは、前臨床マウスモデルにおける、ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃのシングルショットまたはそのワクチンの相同的プライム－ブーストのどちらかの、免疫原性に対する既存のワクシニアウイルス免疫の影響を調べた。

【0272】

実験戦略
雌および雄の６～９週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウスのミックス（１つの群あたりｎ＝５匹のマウス）を、２つの処理群に分けた：
（１）ポックスウイルスに対する既存免疫の状態を誘導するために、１０^７ＰＦＵ／マウスの用量でのＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃによるワクチン接種の４０日前にワクシニアウイルスを投与したマウス、および（２）１０^７ＰＦＵ／マウスの用量でのＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃによってワクチン接種した既存の免疫を有さないナイーブマウス。

【0273】

ワクチン接種後２８日目、４４日目、および８０日目に得た血液試料を使用して、抗原特異的抗体反応の大きさおよび寿命をモニターした。スパイク（Ｓ１）タンパク質特異的ＩｇＧレベルおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス特異的中和抗体レベルを、エンドポイントＥＬＩＳＡおよび疑似中和アッセイ（ｃＰａｓｓ（商標）；Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）によって決定した。

【0274】

方法
例５において説明されるＳ１特異的抗体エンドポイント力価およびｃＰａｓｓ（商標） ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体検出のための酵素結合免疫吸着測定法。

【0275】

結果
ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃのシングルショットは、ワクチン接種後２８日目、４４日目、および８０日目における、既存の免疫を有するかまたは有しないマウスに対して、同等のレベルのＳ１特異的抗体を誘導した（図１２Ａ）。このデータに一致して、中和抗体のレベルも（ＧｅｎｓｃｒｉｐｔからのｃＰａｓｓ（商標）キットを使用して測定した）、マウスの当該２つの群の間において同等であった（図１２Ｂ）。
既存の免疫は、プライム－ブーストワクチン接種後の抗体反応に影響を及ぼさない。

【0276】

実験戦略
雌および雄の６～９週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウスのミックスを、２つの処理群に分けた：（１）ポックスウイルスに対する既存免疫の状態を誘導するために、相同的プライム－ブースト戦略（０日目および２８日目）においてＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃによるワクチン接種の４０日前にワクシニアウイルスを投与したマウス、および（２）相同的プライム－ブースト戦略（０日目および２８日目）においてＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃによってワクチン接種した既存の免疫を有さないナイーブマウス。

【0277】

抗体反応の大きさおよび寿命をモニターするために、２８日目（ブースト前）ならびに１４日目および５０日目（ブースター接種後）に、血液試料を入手した。スパイク（Ｓ１）タンパク質特異的ＩｇＧレベルおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス特異的中和抗体レベルを、エンドポイントＥＬＩＳＡおよび疑似中和アッセイ（ｃＰａｓｓ（商標）；Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）によって決定した。

【0278】

方法
例５において説明されるＳ１特異的抗体エンドポイント力価およびｃＰａｓｓ（商標）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体検出のための酵素結合免疫吸着測定法。

【0279】

結果
Ｄ２８におけるブースター接種の投与後に、スパイク（Ｓ１）特異的抗体反応における著しい増加が観察された。既存の免疫は、Ｓ１特異的抗体レベル（図１３Ａ）および中和抗体レベル（図１３Ｂ）に影響を及ぼさなかった。

【0280】

結論
既存の免疫は、単回投与または相同的プライム－ブースト戦略のどちらかにおけるＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃによるワクチン接種後の抗原特異的抗体反応の質、量、または動態に影響を及ぼさない。

【0281】

例８
ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃによる単一のワクチン接種は加齢マウスにおいて抗原特異的抗体反応を誘導する
年齢は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染後の不十分な健康アウトカムに対する最も重要なリスク要因の１つであり、したがって任意の新規のワクチン候補は高齢者におけるロバストな免疫反応を誘発することが望ましい。本明細書において、本発明者らは、加齢マウスにおいてＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃワクチン接種の単回投与によって誘導される免疫反応について調べた。

【0282】

実験戦略
年齢に従って抗体反応のレベルを評価するために、６～９週齢の雌（ｎ＝１０；若齢マウスと呼ばれる）および９～１０月齢の雌（ｎ＝２０；老齢マウスと呼ばれる）のＣ５７ＢＬ／６マウスに、ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃ（１０^７ＰＦＵ／マウス）の筋肉内投与によってワクチン接種した。ワクチン接種後の１４日目および２１日目に血液試料を採取し、抗体分析のために血清を単離した。スパイク（Ｓ１）タンパク質特異的ＩｇＧレベルおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス特異的中和抗体レベルを、エンドポイントＥＬＩＳＡおよび疑似中和アッセイ（ｃＰａｓｓ（商標）；Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）によって決定した。

【0283】

方法
例５において説明されるＳ１特異的抗体エンドポイント力価およびｃＰａｓｓ（商標）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体検出のための酵素結合免疫吸着測定法。

【0284】

結果
ワクチン接種後の１４日目および２１日目において若齢マウスと老齢マウスとの間において、Ｓ１特異的抗体のレベルは同等であった（図１４Ａ）。同様に、ワクチン接種後の１４日目および２１日目において若齢マウスと老齢マウスとの間において、中和抗体力価における違いは検出されなかった（図１４Ｂ）。

【0285】

結論
ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃの単回投与は、若齢マウスにおいて見られるレベルに匹敵する抗原特異的免疫反応を老齢マウスにおいて誘導する。

【0286】

例９
相同的プライム－ブーストは抗体反応の著しいブースティングをもたらし、それはワクチン接種後最長で３か月維持される
プライム－ブースト戦略が若齢マウスおよび老齢マウスにおいて体液性反応を高めることができるか否かを調べるために、相同的プライム－ブーストアプローチを評価した。

【0287】

実験戦略
ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃ（１０^７ＰＦＵ）ワクチンの最初の注射（プライム投与）を受けた後の２８日目に、ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃ（１０^７ＰＦＵ）のブーストを、若齢マウスおよび老齢マウスに筋肉内注射によって投与した。ブースト後の２１日目に、Ｓ１特異的抗体レベルおよび中和抗体力価の評価のために血液試料を採取した。寿命研究のため、Ｓ１特異的抗体力価および中和抗体のパーセント阻害の評価のために、ブースト後の３週間目、９週間目、および１２週間目に血液試料を採取した。

【0288】

方法
例５において説明されるＳ１特異的抗体エンドポイント力価およびｃＰａｓｓ（商標）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体検出のための酵素結合免疫吸着測定法。

【0289】

結果
相同的プライム－ブーストワクチンレジメンにおけるＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃのブースター用量の投与は、ブースト後２１日目における、若齢マウスおよび老齢マウスの両方のスパイク（Ｓ１）特異的抗体反応および中和抗体反応を著しく増加させる（図１５Ａ、Ｂ）。ブースト後の２１日目の若齢マウスと老齢マウスとの間において、中和抗体レベルにおける統計的違いは記録されなかった。ブースト後の３週間、９週間、および１２週間での中和抗体レベルを分析したところ、若齢マウスおよび老齢マウスにおける時間を一致させた比較において有意な違いは記録されず、抗体レベルは維持されることが観察された（図１５Ｃ）。

【0290】

結論
ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃワクチンの第２の用量の投与によって、スパイク特異的抗体反応の量および質は著しく高められ、抗体反応は、ブースト後最長で３か月維持された（分析の時点において）。

【0291】

例１０
ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃの相同的プライム－ブーストは長期Ｔ細胞反応を誘導する
メモリーＣＤ８ Ｔ細胞の存在は、効率的な病原体排除を促進することによって体液性反応を補うため、ウイルス感染への応答において、特に重要である。Ｔ細胞記憶は、中和抗体の防御能力または規模が損なわれた場合に、強力な二次防御として作用する。最も重要なことに、長期Ｔ細胞反応は、ワクチン接種によって与えられた免疫は持続性であり得ることを示し得る。

【0292】

実験戦略
処理群を２つのコホート：６～９週齢の若齢マウスと９～１０月齢の老齢マウス、に分ける。各コホート内において、マウスを、ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃ（１０^７ＰＦＵ）のシングルショット、プライム後２８日目に投与されたセカンドショットによる相同的プライム－ブースト（１０^７ＰＦＵ、１０^７ＰＦＵ）、またはベクターのみのコントロールＳＭＸ０６のいずれかによって免疫付与した。

【0293】

方法
マルチカラーフローサイトメトリーを使用して、短命エフェクター細胞（Ｔ_ＳＬＥ；ＣＤ４４、ＫＬＲＧ１の高発現と、ＣＤ６２Ｌの低発現とによって同定される）、エフェクターメモリー細胞（Ｔ_ＥＭ；ＣＤ４４の高発現と、ＫＬＲＧ１およびＣＤ６２Ｌの低発現とによって同定される）、およびセントラルメモリー細胞（Ｔ_ＣＭ；ＣＤ４４およびＣＤ６２Ｌの高発現と、ＫＬＲＧ１の低発現とによって同定される）としてのメモリーＴ細胞集団を特性評価した（図１６）。

【0294】

ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ（前に説明した）を使用して、ＩＦＮ－γ産生Ｔ細胞を定量化し、その一方で、細胞内サイトカイン染色（前に説明した）を使用して、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、およびＩＬ－２などのサイトカインを産生することができる細胞を同定した。

【0295】

ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃワクチン接種によって誘発されたＩＦＮ－γＴ細胞反応の性質を評価するために、本発明者らは、以下の領域の配列に及ぶ３つの異なるペプチドプールによってＣＤ８ Ｔ細胞を再刺激した：ＲＢＤなしのＳ１、ＲＢＤおよびＲＢＤの後の残りのＳ１領域、ならびにＳ２。

【0296】

結果：相同的プライム－ブーストはＣＤ８エフェクターＴ細胞集団を拡大する
ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃの単回投与またはプライム－ブーストのどちらかによってワクチン接種した若齢マウスおよび老齢マウスのエフェクターメモリーおよびセントラルメモリーＣＤ８ Ｔ細胞の総数を、図１７Ａに示す。結果は、プライム－ブーストワクチン接種が、短命エフェクター細胞集団およびエフェクターメモリー細胞集団の両方において、エフェクターメモリー細胞の著しい増加を生じさせることを実証している。ブースター用量の投与後のセントラルメモリーＴ細胞の著しい増加は、若齢マウスにおいて記録されたが、しかしながら、この違いは、老齢マウスでは観察されなかった。

【0297】

結果：相同的プライム－ブーストはＴ細胞記憶を増加させる
若齢マウスおよび老齢マウスの両方において、ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃワクチンのシングルショットは、ベクターのみのコントロールマウスと比較して、スパイク特異的ＩＦＮ－γＴ細胞反応の著しい増加を誘導する。ブースター用量の投与は、結果として、スパイク特異的ＩＦＮ－γ Ｔ細胞の著しい増加をもたらし、ならびにこれは、若齢マウスおよび老齢マウスの両方において観察された（図１７Ｂ）。

【0298】

Ｓ１領域（ＲＢＤなし；プール１）、ＲＢＤおよび残りのＳ１領域（プール２）、ならびにＳ２領域（プール３）に及ぶペプチドプールによって細胞を再刺激することによって、Ｓ１特異的、ＲＢＤ特異的、またはＳ２特異的のように、スパイク特異的Ｔ細胞反応のさらなるプロファイリングを行った。若齢マウスおよび加齢マウスの両方において、Ｓ１、ＲＢＤ、Ｓ２領域に対するＩＦＮ－γＴ細胞反応が検出され、これは、幅広いＴ細胞反応を示している。ＥＬＩＳｐｏｔによるＩＦＮ－γスポット形成単位（図１７Ｃ）、細胞内サイトカイン染色による、ＩＦＮ－γ産生ＣＤ８ Ｔ細胞の割合（図１７Ｄ）、およびトリプルサイトカイン陽性（ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ２）産生ＣＤ８Ｔ（図１７Ｅ）の数によって証明されるように、ＩＦＮ－γ産生Ｔ細胞反応は、主にＲＢＤ領域に向けられていた。期待されるように、単回投与のワクチン接種と比較して、プライム－ブーストレジメンにおいて、抗原特異的Ｔ細胞集団の著しいブーストが観察された。

【0299】

結論
ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃによるワクチン接種は、シングルショットワクチン接種レジメン後の若齢マウスおよび老齢マウスの両方において、スパイクタンパク質の両方のサブユニットに対する多機能性ＣＤ８ Ｔ細胞反応を誘導する（Ｓ１およびＳ２；Ｓ１サブユニットのＲＢＤ領域を主に対象とする）。相同的プライム－ブーストワクチン接種戦略の後の若齢マウスおよび老齢マウスの両方において、抗原特異的ＩＦＮ－γ産生Ｔ細胞反応およびエフェクターメモリー集団の著しい増加が観察された。

【0300】

例１１
ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃの相同的プライム－ブーストは、潜在的に、スパイクＲＢＤにおけるＣＤ８ Ｔ細胞エピトープに基づいてＳＡＲＳ－ＣｏＶと交差反応し得る
実験戦略
６～９週齢の雌のマウスおよび９～１０月齢の老齢マウスに、１０^７ＰＦＵ／マウスの用量での筋肉内投与によって、ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃまたはベクターのみのコントロールでワクチン接種し、ワクチン接種後の７日目に、ＥＬＩＳｐｏｔによって、エピトープ特異的Ｔ細胞反応を分析した。

【0301】

方法
ＳＡＲＳ－ＣｏＶおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＶＶＬＳＦＥＬＬ（配列番号１０）およびＶＮＦＮＦＮＧＬ（配列番号１１））の間において１００％保存されるＲＢＤ領域の２つのＣＤ８ Ｔ細胞エピトープによる再刺激の後に、ＬＩＳｐｏｔアッセイ（以前に説明した）および細胞内サイトカイン染色（以前に説明した）を使用して、ＩＦＮ－γ産生Ｔ細胞を定量化した。

【0302】

結果
ＥＬＩＳｐｏｔ（図１８Ａ）およびＩＣＳ（図１８Ｂ）の両方によってベクターコントロールと比較して、ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃワクチン接種マウスにおいて、エピトープ特異的ＩＦＮ－γ産生Ｔ細胞反応の著しい増加が検出された。

【0303】

結論
ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃによるワクチン接種後の、ＣＤ８ Ｔ細胞エピトープＶＶＬＳＦＥＬＬ（配列番号１０）およびＶＮＦＮＦＮＧＬ（配列番号１１）（ＳＡＲＳ－ＣｏＶおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の間で保存される）に対するＩＦＮ－γ産生Ｔ細胞反応の発生は、当該ワクチンがＳＡＲＳ－ＣｏＶおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の両方に対する予防的保護を提供することができ得ることを示唆している。

【0304】

例１２
ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ａによる単一のワクチン接種はスパイクおよび膜特異的ＣＤ８ Ｔ細胞反応を生じさせる
実験戦略
６～９週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６マウスの群（１つの群あたりｎ＝５匹のマウス）に、ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ａ（１０^７ＰＦＵ／マウス）またはベクターコントロールＳＣＶ－ＳＭＸ０６による筋肉内投与によってワクチン接種した。ワクチン接種後の２１日目に、血液試料を採取し、スパイクタンパク質、膜タンパク質、ヌクレオカプシドタンパク質に対するＴ細胞反応を、ＥＬＩＳｐｏｔによって検出した。

【0305】

方法
ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ（前に説明した）を使用して、ＩＦＮ－γ産生Ｔ細胞を定量化した。ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ａワクチン接種によって誘発されたＩＦＮ－γＴ細胞反応の性質を評価するために、本発明者らは、以下の領域の配列に及ぶ３つの異なるペプチドプールによってＣＤ８ Ｔ細胞を再刺激した：ＲＢＤなしのＳ１、ＲＢＤおよびＲＢＤの後の残りのＳ１領域、ならびにＳ２。膜またはヌクレオカプシドを標的にするＣＤ８ Ｔ細胞反応が生じたか否かを特定するために、膜タンパク質およびヌクレオカプシドタンパク質の配列に及ぶペプチドプールによって細胞を再刺激した。

【0306】

結果
Ｓ１領域、ＲＢＤ領域、およびＳ２領域に及ぶベクターコントロールと比較して、ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ａワクチン接種したマウスにおいて、スパイク特異的ＩＦＮγ^＋産生Ｔ細胞反応における著しい増加が検出された（図１９Ａ）。膜特異的ＩＦＮγ^＋産生Ｔ細胞反応は、ベクターコントロールと比較して著しく高いことが示されたが（図１９Ｂ）、その一方で、ヌクレオカプシド特異的Ｔ細胞反応は、ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ａでワクチン接種したマウスとベクターコントロールとの間において同等であった（図１９Ｃ）。

【0307】

結論
ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９ワクチン接種の単回投与は、スパイク特異的および膜特異的ＩＦＮγ分泌ＣＤ８^＋ Ｔ細胞の増加によって示されるような、幅広いＴ細胞反応を誘導する。

【0308】

例１３
ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９ＣおよびＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｇの均等割合による単回のワクチン接種は、スパイクおよび膜タンパク質に対するスパイク特異的抗体反応およびＣＤ８^＋Ｔ細胞反応を誘導する
実験戦略
６～９週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６マウスの群（１つの群あたりｎ＝５匹のマウス）に、均等割合のＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃ（１０^７ＰＦＵ／マウス）およびＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｇ（１０^７ＰＦＵ／マウス）を含有する混合ワクチン、またはベクターコントロールＳＣＶ－ＳＭＸ０６による筋肉内投与によってワクチン接種した。ワクチン接種後２１日目に血液試料を収集し、抗体分析のために血清を単離した。スパイク（Ｓ１）特異的抗体反応を、ＥＬＩＳＡによって決定し、ならびにスパイクおよび膜タンパク質に対するＴ細胞反応を、ＥＬＩＳｐｏｔおよびＩＣＳによって検出した。

【0309】

方法
Ｓ１特異的抗体レベルに関する酵素結合免疫吸着測定法を、前に説明したように実施した。タンパク質の全長に及ぶペプチドを使用してスパイクおよび膜特異的ＩＦＮ－γ産生Ｔ細胞反応を同定するために、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ（前に説明した）を使用した。

【0310】

結果
免疫付与後２１日目において、ＥＬＩＳＡによってＳ１特異的抗体反応を評価した。ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９ＣおよびＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｇで構成される混合ワクチンによるワクチン接種は、ベクターのみのＳＭＸ０６コントロールと比較して著しく高いＳ１特異的抗体反応を生じた（図２０Ａ）。混合ワクチンによるシングルショットワクチン接種後に、ＩＣＳによって検出されるスパイク特異的ＩＦＮγ^＋産生Ｔ細胞のレベルも、ベクターコントロールと比較した高かった（図２０Ｂ）。混合ワクチンによるワクチン接種は、ベクターコントロールと比較して、スパイクタンパク質および膜タンパク質の全長に及ぶペプチドに対する抗原特異的スポット形成単位（ＳＦＵ）の著しい増加を引き起こした（図２０Ｃ）。

【0311】

結論
本明細書における例１３は、それぞれ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜およびヌクレオカプシドタンパク質をコードするＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９ＣおよびＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｇで構成される混合ワクチンによる動物モデルの免疫付与は、Ｓ１特異的抗体の産生によって示される細胞性および体液性反応を誘導し、スパイク特異的ＩＦＮγ分泌ＣＤ８^＋Ｔ細胞を増加させる。これらは、混合ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９ワクチンが、ＣＯＶＩＤ－１９の感染性病原因子であるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する予防的保護を提供し得ることを示唆している。

【0312】

例１４
同じベクターから複数の優性抗原を発現することは、各優性抗原を単一のベクターから発現させることと比較した場合、最適な免疫反応の刺激において有害ではないかどうかを決定する
異なる弱毒化生ウイルスワクチンを組み合わせる場合、ワクチン間での競合は、最も頻繁に観察される問題である。それは、混合ワクチンの用量を増加させるか、または、優性ワクチン（１または複数）成分からの競合に打ち勝つように各ワクチン成分の投与量を調節することによって回避することができる。

【0313】

「免疫学的干渉（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）」による抗原競合は、三価のジフテリア－百日咳－破傷風ワクチンの成分間において、イヌジステンパーバクテリンと生イヌジステンパーウイルスとの間において、ならびに、ジステンパーウイルス、アデノウイルス２型、パルボウイルス、およびパラインフルエンザウイルスの生混合ワクチンのための希釈剤としてボルデテラ属が使用される場合に、報告されている。場合によって、多成分ワクチンによる接種は、当該成分が単独で投与される場合よりも少ない抗体を誘発する。他の場合において、１つの抗原に対する反応が支配的であり、その一方で、他の成分に対する反応は抑制される。他の場合において、相互の競合が生じる場合、全成分に対する反応は減少する。

【0314】

抗原競合の程度は、競合する抗原の接種の関連部位、抗原の投与の間の時間間隔、および抑制される抗原に対する優性抗原の用量を含む、ワクチン接種のいくつかのパラメータに依存することが示されている。

【0315】

たとえ、上記のことが、同じベクターからいくつかの疾患原因因子由来の免疫抗原を発現させることによって解決することができ、それにより、免疫系への各免疫抗原の等しい提示を確保することができ、ならびに、抗原送達のための単一ベクターを用いることで、ベクターのみのためのワクチン接種の最適経路だけを考慮すれば十分だとしても、優先的な抗原捕捉ならびにＢ細胞および樹状細胞などの抗原提示細胞によるＭＨＣ提示によって抗原干渉が生じ得るリスクは存在する。優性Ｂ細胞および／またはＴ細胞エピトールを伴う抗原は、準最適Ｂ細胞またはＴ細胞エピトープを有する抗原よりも強い免疫反応を生じるであろう。したがって、これは、複数の疾患原因因子に由来する複数の抗原を発現する単一ベクターによってワクチン接種された場合に、最も優性な抗原へとバイアスされた免疫反応を生じるであろう。

【0316】

複数の疾患原因ウイルス由来の複数の優性抗原の発現が、お互いの免疫反応に干渉するか否かを決定するために、研究を行った。同じベクターから２つの優性抗原を発現させることは、それらのそれぞれのウイルスに対する強力な免疫反応を刺激するお互いの能力に干渉し得、すなわち、ある優性抗原は、他の優性抗原に対してより優位性を有し得る。

【0317】

単一のベクターから各優性抗原を発現させる場合と比較して、同じベクターから複数の優性抗原を発現させることは、最適な免疫反応を刺激する点において有害ではないか否かを決定するために、マウスにおけるワクチン接種研究を実施した。

【0318】

実験戦略
野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスならびにインターフェロン受容体欠損マウス（ＩＦＮＡＲ）の雌のマウスまたはＡＣＥ－２欠損マウスに、処置群あたり６匹のマウスの群において、組換えウイルスＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９ＡもしくはＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｂ、またはＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃ、ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｄ、もしくはＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｅの混合物、または空のベクターコントロールによって一回ワクチン接種した。全ての処置群に、腹腔内注射によって１０^６ＰＦＵ／マウスのワクチンを与え、ワクチン接種後２週間および４週間において採血した。ワクチン接種後６週間において、全てのマウスをチャレンジ感染させる。

【0319】

中和アッセイ
多くの場合、中和抗体のレベルが、保護と相関する指標として使用される。したがって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対してＶｅｒｏ細胞における標準的マイクロ中和アッセイを使用して、全てのワクチン群において、チャレンジ感染の前に中和抗体のレベルを算出した。簡単に言えば、血清を熱不活性化し（５６℃で３０分）、９６ウェルプレートにおいて、各マウスからの血清をデュプリケートにおいて段階希釈し、および、１００ＣＣＩＤ１_５０単位のウイルスと３７℃で１時間インキュベートする。この中和ステップの後に、新たに分裂したＶｅｒｏ細胞を、当該血清／ウイルス混合物の上に重ね（ウェルあたり１０^４細胞）、細胞変性効果が顕微鏡下において可視化されるまで、５日間インキュベートする。細胞変性効果に対して１００％保護を与える血清希釈を、クリスタルバイオレット染色を使用して決定する。

【0320】

結果
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原を発現する両方のワクチン候補が、ワクチンの一回投与の後に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する中和抗体を誘導する。

【0321】

妊娠前に組換えＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９ウイルスによって事前にワクチン接種したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに感染した母からのマウス胎仔の保護
この研究の目的は、妊娠前にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原を発現する雌マウスにおける事前にのワクチン接種は、それらのまだ生まれていない胎仔のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染に対して保護することができることを示すことである。

【0322】

この研究は、ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ａ、ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｂ、またはベクターのみによって、雌のＩＦＮＡＲ－／－にワクチン接種し、その後に、雄のＩＦＮＡＲマウスと交配させることによって実施される。次いで、妊娠マウスにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させる。

【0323】

実験戦略
６～８週齢のＩＦＮＡＲ－／－に、０週間目に、１０^６ＰＦＵ／マウスにおいて、単一のベクター化ワクチンであるＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ａ、ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｂ、またはベクターのみによって、筋肉内経路により一回ワクチン接種する。ワクチンに対するセロコンバージョンを確認するために、ワクチン接種後４週間目に、マウスの群を採血した。ワクチン接種後６週間目に、ワクチン接種したマウスにおいて妊娠を生じさせるために、タイミングを合わせた交配を開始する。首尾よく妊娠したことの証拠のために、雌のマウスを毎日チェックする（膣栓）。胚性６．５日目に、１０^４ＣＣＩＤ_５０単位において、皮下感染によって妊娠マウスをＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させる。感染後、ウイルス血症を確認するために、妊娠マウスを、１日目から５日目までの間、毎日採血する。胚性１７．５日目に、妊娠マウスを選別し、感染性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に関して評価するために、データを収集する。

【0324】

結果
妊娠する前にＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９ＡまたはＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｂによって事前にワクチン接種した雌の妊娠マウスは、チャレンジ感染後にウイルス血症が検出されないことによって示されるように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によるチャレンジ感染の間に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス複製を防ぐことができる。ＳＣＶベクターのみでワクチン接種したマウスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスによるウイルス複製を防ぐことができない。

【0325】

交配および妊娠前にＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９ＡまたはＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｂワクチンのシングルショットによって事前にワクチン接種した雌マウスは、チャレンジ感染後に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの検出可能なレベルを示さない。ワクチン接種は、チャレンジ感染ウイルスが胎盤に感染するのを防ぎ、そうすることによって、脆弱な胎仔へのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの前方伝染（ｏｎｗａｒｄ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ）を妨げる。

【0326】

しかしながら、これは、ＳＣＶベクターのみで事前にワクチン接種した雌のマウスのケースではなく、それらは、チャレンジ感染後、妊娠中に、胎盤のいくらかは感染し得、胎仔へのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染の伝染は生じ得る。

【0327】

結論
ＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９ＡまたはＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｂの単一ベクター化ワクチンのシングルショットによって事前にワクチン接種された雌の妊娠マウスは、コントロールワクチンと比較して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジ感染から保護され、これはウイルス血症結果によって示される。

【0328】

妊娠前の母親マウスのワクチン接種は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスが胎盤子宮部に感染するのを防ぎ、胎児脳への前方伝染を妨げることによって、まだ生まれていない胎仔を保護し得る。

【0329】

胎仔へのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジ感染ウイルスの前方伝染は、妊娠前の母親マウスの事前ワクチン接種によって妨げられる。

【0330】

例１５
ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃによる単一のワクチン接種はエピトープ特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）活性を生じさせる
ＣＤ８細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、クラスＩのＭＨＣ関連ペプチドを認識し、ならびに抗原依存性刺激において、グランザイムおよびパーフォリンを分泌することによってウイルス感染細胞を殺す。ウイルス特異的ＣＴＬ反応は、ウイルス血症を阻止する上で重要な役割を果たす。パーフォリンは細胞膜細孔を作り出して、グランザイムの細胞内送達を可能にし、アポトーシス死を誘導するカスパーゼの切断および活性化を生じさせる。この例において、本発明者らは、ウイルス特異的Ｔ細胞媒介細胞毒性を評価するために、放射性同位体^５１クロム放出を使用したエフェクターＴ細胞の活性化を実証する。

【0331】

実験戦略
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、マウス１匹あたり１０^７ＰＦＵの用量において、ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９ＣまたはベクターコントロールＳＣＶ－ＳＭＸ０６による筋肉内投与によってワクチン接種した。ワクチン接種後の７日目に、脾臓を収穫し、標準^５１クロム（^５１Ｃｒ）放出により、ペプチド決定基－パルスされたＥＬ４標的細胞に対する直接的エクスビボ細胞溶解性Ｔリンパ球活性について、エフェクター細胞をアッセイした。

【0332】

細胞溶解性Ｔリンパ球アッセイ
ＥＬ４（Ｈ－２^ｂ）細胞を増殖させ、ペプチドパルスおよび^５１Ｃｒラベリングによってアッセイのために準備した。ＥＬ４細胞を洗浄し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２免疫優性Ｔ細胞エピトープＹＮＹＬＹＲＬＦ（配列番号９）またはＶＮＦＮＦＮＧＬ（配列番号１１）を提示するペプチドによって２時間パルスした。これら２つのエピトープは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のＳ１サブユニットのＲＢＤ領域に位置する。当該細胞を、優しくタップしながら２０分間混合した。次いで、過剰なペプチドを除去するために、ペプチドパルスＥＬ４細胞を２回洗浄し、４５～６０分かけて２０～５０μＣｉの^５１Ｃｒで標識した。過剰な^５１Ｃｒを除去するために、細胞を２回洗浄し、２×１０^４ペプチドパルスした放射標識標的細胞／１００μｌ体積で再懸濁させた。

【0333】

エフェクター細胞を、ワクチン接種した動物の収穫した脾臓から調製した。細胞を、完全培地での再懸濁の前に、７０μＭ細胞ストレーナーおよびＡＣＫ溶解を経させることによって、脾細胞の単一細胞懸濁液の希釈物を調製した。細胞を、２×１０^７細胞／ｍｌにおいて再懸濁させ、３倍の段階希釈においてウェルに分配した。

【0334】

エフェクター細胞を含むウェルに標的細胞を加え、６時間インキュベートした。最大放出コントロールのため、１００μｌのＴｒｉｔｏｎ Ｘを当該ウェルに加えて、細胞を溶解させ、培地中にクロムを完全に放出させた。インキュベーション後、当該プレートを１２００ｒｐｍで５分間回転させ、放射活性の測定のために、３０μｌの上清をＬｕｍａプレートに移した。当該プレートを一晩乾燥させ、次の日に、Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ２プレートリーダーにおいて評価した。エフェクター細胞の各濃度に対するパーセント溶解を、以下の式を使用して決定した：

【0335】

パーセント特異的溶解＝［試料^５１Ｃｒ放出（ｃｐｍ）－自然放出（ｃｐｍ）］／［最大放出（ｃｐｍ）－自然放出（ｃｐｍ）］ｘ１００％

【0336】

結果
結果は、ペプチドＹＮＹＬＹＲＬＦ（配列番号９）およびＶＮＦＮＦＮＧＬ（配列番号１１）によってパルスした標的細胞の特異的溶解が存在する（図２１Ａ、Ｂ）ことを示しており、それは、当該ワクチンがエピトープ特異的細胞傷害性Ｔ細胞を生じさせることを示唆している。当該結果は、コントロールマウスおよびコントロール標的細胞（それぞれ、ＳＭＸ０６ワクチン接種したマウスおよびパルスされていない標的細胞）に対して溶解は検出されない、エピトープ特異的に見える。

【0337】

結論
ＳＣＶ－ＣＯＶＩＤ１９Ｃの単一ワクチン接種は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エピトープ特異的細胞溶解性Ｔリンパ球反応を生じさせる。

【0338】

参考文献
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【図1-1】

【図1-2】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D-1】

【図3D-2】

【図3E】

【図3F】

【図3G】

【図3H】

【図4】

【図5-1】

【図5-2】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11-1】

【図11-2】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17-1】

【図17-2】

【図17-3】

【図18】

【図19】

【図20-1】

【図20-2】

【図21-1】

【図21-2】

【配列表】

2023520080000001.app

【国際調査報告】