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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-05-15
(54)【発明の名称】活性ＤＮＡトランスポゾンシステム及びその使用方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20230508BHJP
C12N 15/64 20060101ALI20230508BHJP
C12N 15/86 20060101ALI20230508BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20230508BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230508BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230508BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230508BHJP
C12N 1/13 20060101ALI20230508BHJP
C12N 15/54 20060101ALN20230508BHJP
C12N 9/12 20060101ALN20230508BHJP
C12N 5/078 20100101ALN20230508BHJP
C12N 5/077 20100101ALN20230508BHJP
C12N 5/09 20100101ALN20230508BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20230508BHJP
C12N 15/113 20100101ALN20230508BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 Z ZNA
C12N15/64 Z
C12N15/86 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12N1/13
C12N15/09 100
C12N15/54
C12N9/12
C12N5/078
C12N5/077
C12N5/09
C12N15/12
C12N15/113 Z
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022560171
(86)(22)【出願日】2021-03-30
(85)【翻訳文提出日】2022-11-30
(86)【国際出願番号】 CN2021084084
(87)【国際公開番号】W WO2021197342
(87)【国際公開日】2021-10-07
(31)【優先権主張番号】PCT/CN2020/082087
(32)【優先日】2020-03-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】520176566
【氏名又は名称】中国科学院動物研究所
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＯＦ ＺＯＯＬＯＧＹ，ＣＨＩＮＥＳＥ ＡＣＡＤＥＭＹ ＯＦ ＳＣＩＥＮＣＥＳ
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．５， １ Ｂｅｉｃｈｅｎ Ｗｅｓｔ Ｒｏａｄ， Ｃｈａｏｙａｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １００１０１， Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】100080791
【弁理士】
【氏名又は名称】高島 一
(74)【代理人】
【識別番号】100136629
【弁理士】
【氏名又は名称】鎌田 光宜
(74)【代理人】
【識別番号】100125070
【弁理士】
【氏名又は名称】土井 京子
(74)【代理人】
【識別番号】100121212
【弁理士】
【氏名又は名称】田村 弥栄子
(74)【代理人】
【識別番号】100174296
【弁理士】
【氏名又は名称】當麻 博文
(74)【代理人】
【識別番号】100137729
【弁理士】
【氏名又は名称】赤井 厚子
(74)【代理人】
【識別番号】100151301
【弁理士】
【氏名又は名称】戸崎 富哉
(74)【代理人】
【識別番号】100152308
【弁理士】
【氏名又は名称】中 正道
(74)【代理人】
【識別番号】100201558
【弁理士】
【氏名又は名称】亀井 恵二郎
(72)【発明者】
【氏名】王皓毅
(72)【発明者】
【氏名】張勇
(72)【発明者】
【氏名】譚生軍
(72)【発明者】
【氏名】張童童
【テーマコード（参考）】
4B050
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B050CC07
4B050KK07
4B050LL01
4B065AA01X
4B065AA01Y
4B065AA57X
4B065AA57Y
4B065AA72X
4B065AA72Y
4B065AA83X
4B065AA83Y
4B065AA88X
4B065AA88Y
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA44
(57)【要約】
本願は操作された転移因子、前記操作された転移因子を含む遺伝子導入システム、及びこれらを用いる方法とキットを提供する。開示される組成物、システム及び方法はインビトロ又は細胞内で標的核酸に異種核酸を挿入するのに有用である。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
操作された転移因子であって、５’から３’への順に、５’末端反復配列（５’ＴＲ）、異種核酸及び３’末端反復配列（３’ＴＲ）を含み、
前記５’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １～２６及び７９～９０から選択される核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含み、
前記３’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７～５２及び９１～１０２から選択される核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含み、
異種核酸の細胞ＤＮＡへの挿入を可能とする転移活性を示す操作された転移因子。
【請求項2】
前記５’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １～２６及び７９～９０から選択される核酸配列と少なくとも約９０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、及び／又は前記３’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７～５２及び９１～１０２から選択される核酸配列と少なくとも約９０％の配列同一性を有する核酸配列を含む請求項１に記載の転移因子。
【請求項3】
前記５’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １～２６及び７９～９０から選択される核酸配列を含み、及び／又は前記３’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７～５２及び９１～１０２から選択される核酸配列を含む請求項２に記載の転移因子。
【請求項4】
前記５’ＴＲの５’側に連結される５’標的部位反復配列（ＴＳＤ）又は前記３’ＴＲの３’側に連結される３’ＴＳＤをさらに含み、前記５’ＴＳＤはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９１～２０６から選択される核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含み、前記３’ＴＳＤはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９１～２０６から選択される核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む請求項１～３のいずれか１項に記載の転移因子。
【請求項5】
前記５’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３、８、１１、１２、１３、１６、２２、２３、７９及び８２から選択される核酸配列と少なくとも約９０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、前記３’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２９、３４、３７、３８、３９、４２、４８、４９、９１及び９４から選択される核酸配列と少なくとも約９０％の配列同一性を有する核酸配列である請求項１～４のいずれか１項に記載の転移因子。
【請求項6】
（ａ） 前記５’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３の核酸配列を含み、前記３’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２９の核酸配列を含み、（ｂ） 前記５’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８の核酸配列を含み、前記３’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３４の核酸配列を含み、
（ｃ） 前記５’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１の核酸配列を含み、前記３’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３７の核酸配列を含み、
（ｄ） 前記５’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２の核酸配列を含み、前記３’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３８の核酸配列を含み、又は
（ｅ） 前記５’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６の核酸配列を含み、前記３’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４２の核酸配列を含む請求項５に記載の転移因子。
【請求項7】
前記異種核酸はコード配列を含む請求項１～６のいずれか１項に記載の転移因子。
【請求項8】
前記異種核酸は前記コード配列に作動可能に連結されるプロモータをさらに含む請求項７に記載の転移因子。
【請求項9】
前記転移因子の転移活性はｐｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）トランスポゾン、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）トランスポゾン及び／又はＴｃＢｕｓｔｅｒ（ＴＢ）トランスポゾンの転移活性よりも高い請求項１～８のいずれか１項に記載の転移因子。
【請求項10】
前記細胞は動物細胞、植物細胞、藻類細胞、真菌細胞、酵母細胞又は細菌細胞である請求項１～９のいずれか１項に記載の転移因子。
【請求項11】
前記細胞は哺乳類細胞である請求項１～１０のいずれか１項に記載の転移因子。
【請求項12】
前記哺乳類細胞は免疫細胞、肝臓細胞、腫瘍細胞、幹細胞、受精卵、筋細胞及び皮膚細胞から選択される請求項１１に記載の転移因子。
【請求項13】
前記細胞はヒト細胞である請求項１１又は１２に記載の転移因子。
【請求項14】
ヒト胚腎２９３Ｔ（２９３Ｔ）細胞での転移活性がＨｅＬａ細胞での転移活性よりも高い請求項１～１３のいずれか１項に記載の転移因子。
【請求項15】
ベクターに存在する請求項１～１４のいずれか１項に記載の転移因子。
【請求項16】
前記ベクターはプラスミドベクター又はウイルスベクターである請求項１５に記載の転移因子。
【請求項17】
１）請求項１～１６のいずれか１項に記載の操作された転移因子と、２）トランスポザーゼ、又はトランスポザーゼをコードする核酸と、を含む遺伝子導入システム。
【請求項18】
前記トランスポザーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５３～７８及び１０３～１１４から選択されるアミノ酸配列又はその変異体を含む請求項１７に記載の遺伝子導入システム。
【請求項19】
１）操作された転移因子と、２）トランスポザーゼ、又はトランスポザーゼをコードする核酸と、を含み、前記転移因子は、５’から３’へ、５’末端反復配列（５’ＴＲ）、異種核酸及び３’末端反復配列（３’ＴＲ）を含み、
前記転移因子は異種核酸の細胞ＤＮＡへの挿入を可能とする転移活性を示し、
前記トランスポザーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５３～７８及び１０３～１１４から選択されるアミノ酸配列又はその変異体を含む、遺伝子導入システム。
【請求項20】
前記５’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １～２６及び７９～９０から選択される核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含み、前記３’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７～５２及び９１～１０２から選択される核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む請求項１９に記載の遺伝子導入システム。
【請求項21】
（ａ） 前記５’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３の核酸配列を含み、前記３’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２９の核酸配列を含み、前記トランスポザーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５５のアミノ酸配列を含み、（ｂ） 前記５’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８の核酸配列を含み、前記３’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３４の核酸配列を含み、前記トランスポザーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６０のアミノ酸配列を含み、
（ｃ） 前記５’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１の核酸配列を含み、前記３’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３７の核酸配列を含み、前記トランスポザーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６３のアミノ酸配列を含み、
（ｄ） 前記５’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２の核酸配列を含み、前記３’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３８の核酸配列を含み、前記トランスポザーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６４のアミノ酸配列を含み、又は
（ｅ） 前記５’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６の核酸配列を含み、前記３’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４２の核酸配列を含み、前記トランスポザーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６８のアミノ酸配列を含む請求項２０に記載の遺伝子導入システム。
【請求項22】
前記トランスポザーゼをコードする核酸を含む請求項１７～２１のいずれか１項に記載の遺伝子導入システム。
【請求項23】
前記転移因子及び前記トランスポザーゼをコードする核酸は異なるベクターにある請求項２２に記載の遺伝子導入システム。
【請求項24】
前記転移因子及び前記トランスポザーゼをコードする核酸は同一ベクターにある請求項２２に記載の遺伝子導入システム。
【請求項25】
標的核酸に異種核酸を挿入する方法であって、前記標的核酸と、請求項１～１６のいずれか１項に記載の転移因子又は請求項１７～２４のいずれか１項に記載の遺伝子導入システムとを接触させることで、前記異種核酸を前記標的核酸に挿入することを含む方法。
【請求項26】
インビトロで行われる請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
前記標的核酸は細胞内にある請求項２５に記載の方法。
【請求項28】
前記標的核酸はゲノムＤＮＡである請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
前記細胞は動物細胞、植物細胞、藻類細胞、真菌細胞、酵母細胞又は細菌細胞である請求項２７又は２８に記載の方法。
【請求項30】
前記細胞は哺乳類細胞である請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
前記哺乳類細胞は免疫細胞、肝臓細胞、腫瘍細胞、幹細胞、受精卵、筋細胞及び皮膚細胞から選択される請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
前記異種核酸の挿入により前記細胞の遺伝子を不活化させる請求項２８～３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項33】
前記異種核酸はタンパク質をコードする請求項２５～３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項34】
前記タンパク質は、レポータータンパク質、操作された受容体、サイトカイン、抗生物質耐性タンパク質、抗原及び治療的タンパク質からなる群から選択される請求項３３に記載の方法。
【請求項35】
前記異種核酸はＲＮＡをコードする請求項２５～３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項36】
前記ＲＮＡは、治療的ＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、微小ＲＮＡ、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ロングノンコードＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）からなる群から選択される請求項３５に記載の方法。
【請求項37】
前記異種核酸の長さが約２ｋｂ～約３００ｋｂである請求項２５～３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項38】
前記挿入はランダムである請求項２５～３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項39】
異種核酸を標的核酸に挿入する請求項１～１６のいずれか１項に記載の操作された転移因子、又は請求項１７～２４のいずれか１項に記載の遺伝子導入システム及びプロトコールを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本願は２０２０年３月３０日に提出された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＣＮ２０２０ ／０８２０８７の優先権を主張しており、その内容は引用により全体としてここに組み込まれる。
本願は２０２０年３月３０日に提出された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＣＮ２０２０ ／０８２０８７の優先権を主張しており、その内容は引用により全体としてここに組み込まれる。
【0002】
ＡＳＣＩＩテキストファイルの配列表の提出
提出された以下のＡＳＣＩＩテキストファイルの内容は引用により全体としてここに組み込まれる。配列表のコンピュータ読み取り可能な形式（ＣＲＦ）（ファイル名：１８２４５２０００６４１ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔ、記録日：２０２１年３月２９日、サイズ：２４４ｋｂ）。
提出された以下のＡＳＣＩＩテキストファイルの内容は引用により全体としてここに組み込まれる。配列表のコンピュータ読み取り可能な形式（ＣＲＦ）（ファイル名：１８２４５２０００６４１ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔ、記録日：２０２１年３月２９日、サイズ：２４４ｋｂ）。
【0003】
技術分野
本願は一般に遺伝学の分野に関する。より具体的には、本願は転移因子及びその使用に関する。
本願は一般に遺伝学の分野に関する。より具体的には、本願は転移因子及びその使用に関する。
【背景技術】
【0004】
ＤＮＡを細胞に導入する典型的な方法は、リン酸カルシウム、ポリエチレングリコールなどのＤＮＡ凝集剤、リポソーム、多層小胞などの脂質含有試薬、及びウイルス媒介性戦略を含む。しかし、そのような方法には限界がある。例えば、ＤＮＡ凝集剤及びウイルス媒介性戦略に関連するサイズ制限が存在する。さらに、細胞にトランスフェクション可能な核酸の量は、ウイルス戦略において制限される。全ての方法は送達された核酸を細胞の核酸に挿入することに有利であるわけではなく、ＤＮＡ凝集法や脂質含有試薬の調製は比較的容易であるが、ウイルスベクターに核酸を挿入するのは手間がかかる。ウイルス媒介性戦略は、細胞タイプ又は組織タイプに特異的なものであってもよく、ウイルス媒介性戦略を使用してインビボで使用すると、免疫学的な問題が生じる。
【0005】
これらの問題を克服するための適切なツールの１つは、転移因子を介することである。転移因子（トランスポゾン・エレメント）（ＴＥ、トランスポゾン、又はジャンピング遺伝子）は、核酸中のその位置を変化させることで、突然変異を生成又は逆転させ、ゲノム中の配列を変化させることができるＤＮＡ配列である。転移因子は多くの真核ゲノムの大部を表している。例えば、ヒトゲノムの約５０％は転移因子配列に由来するが、植物などの他のゲノムは、転移因子由来のＤＮＡの割合が高い。転移因子は通常、クラス１とクラス２の２つに分類される。クラス１の代表は、レトロトランスポゾンであり、１）内因性レトロウイルス（ＥＲＶ）のような長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）レトロトランスポゾン、及び２）長鎖散在反復配列（ＬＩＮＥ）及び短鎖散在反復配列（ＳＩＮＥ）のような非ＬＴＲレトロトランスポゾンを含む。クラス２ ＴＥは、１）末端反復配列（ＴＲ、末端逆向き反復配列ＴＩＲとも呼ばれる）を特徴とし、トランスポザーゼによって移動可能な「切り貼り」ＤＮＡトランスポゾン、及び２）例えば、ヘリトロン及びポリントンを含むような非「切り貼り」ＤＮＡトランスポゾンを含む。クラス２ ＴＥは多くの真核生物に広く存在し活性を有するが、これらの全てのＴＥが転移活性を有するわけではない。最近の活性転移因子の例には、過去数百万年の間に移動の兆候を示したｈＡＴ及びｐｉｇｇｙＢａスーパーファミリーのメンバーが含まれている。しかしながら、現在のところ、遺伝子発現研究や遺伝子治療に利用できる活性転移因子は限られている。
【0006】
したがって、ＤＮＡを細胞内に導入するのに適した新規な転移因子、及びこの転移因子を介して異なるサイズの異種配列を細胞の核酸に、又はＤＮＡを細胞のゲノムに効率的に挿入するための方法及びシステムが必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本願は、操作された転移因子、前記操作された転移因子を含む遺伝子導入システム、及びこれらを用いた方法とキットを提供する。また、インビトロ又は細胞内で異種核酸を標的核酸に挿入する方法を提供する。本明細書の前記組成物、システム及び方法は、タグ化、ゲノム工学及び遺伝子発現の研究など、様々な用途に有用である。
【課題を解決するための手段】
【0008】
一態様では、本願は、５’から３’への順に、５’末端反復配列（５’ＴＲ）、異種核酸及び３’末端反復配列（３’ＴＲ）を含み、５’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １～２６及び７９～９０から選択される核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含み、３’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７～５２及び９１～１０２から選択される核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含み、前記転移因子は異種核酸の細胞ＤＮＡへの挿入を可能とする転移活性を示す操作された転移因子を提供する。いくつかの実施形態では、前記５’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １～２６及び７９～９０から選択される核酸配列と少なくとも約９０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記５’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １～２６及び７９～９０から選択される核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記３’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７～５２及び９１～１０２から選択される核酸配列と少なくとも約９０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの更なる実施形態では、前記３’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７～５２及び９１～１０２から選択される核酸配列を含む。
【0009】
上記操作された転移因子の何れかに係る実施形態では、前記転移因子は、５’ＴＲの５’側に連結される５’標的部位反復配列（ＴＳＤ）又は３’ＴＲの３’側に連結される３’ＴＳＤをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記５’ＴＳＤと３’ＴＳＤの核酸配列は同一の配列である。いくつかの実施形態では、前記５’ＴＳＤはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９１～２０６から選択される核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含み、前記３’ＴＳＤはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９１～２０６から選択される核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む。
【0010】
上記操作された転移因子の何れかに係る実施形態では、前記５’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３、８、１１、１２、１３、１６、２２、２３、２９及び８２から選択される核酸配列と少なくとも約９０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、前記３’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２９、３４、３７、３８、３９、４２、４８、４９、９１及び９４から選択される核酸配列と少なくとも約９０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【0011】
上記操作された転移因子の何れかに係る実施形態では、前記操作された転移因子はＴｃ１－８Ｂ＿ＤＲ、Ｔｃ１－３＿ＦＲ、Ｍａｒｉｎｅｒ２＿ＡＧ、Ｔｃ１－１＿Ｘｔ、Ｔｃ１－１＿ＡＧ、Ｔｃ１－１＿ＰＭ、Ｔｃ１－４＿Ｘｔ、Ｔｃ１－１５＿Ｘｔ、Ｍａｒｉｎｅｒ－６＿ＡＭｉ又はＭａｒｉｎｅｒ－３＿Ｃｒｐに由来する。いくつかの実施形態では、前記操作された転移因子はＴｃ１－８Ｂ＿ＤＲ、Ｔｃ１－３＿ＦＲ、Ｍａｒｉｎｅｒ２＿ＡＧ、Ｔｃ１－１＿Ｘｔ又はＴｃ１－１＿ＰＭに由来する。いくつかの実施形態では、前記５’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３の核酸配列を含み、前記３’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２９の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記５’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８の核酸配列を含み、前記３’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３４の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記５’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１の核酸配列を含み、前記３’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３７の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記５’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２の核酸配列を含み、前記３’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３８の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記５’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６の核酸配列を含み、前記３’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４２の核酸配列を含む。
【0012】
上記操作された転移因子の何れかに係る実施形態では、前記異種核酸はコード配列を含む。いくつかの更なる実施形態では、前記異種核酸は前記コード配列に作動可能に連結されるプロモータをさらに含む。
【0013】
上記操作された転移因子の何れかに係る実施形態では、前記転移因子の転移活性がｐｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）トランスポゾン、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）トランスポゾン及び／又はＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンの転移活性よりも高い。
【0014】
上記操作された転移因子の何れかに係る実施形態では、前記細胞は動物細胞、植物細胞、藻類細胞、真菌細胞、酵母細胞又は細菌細胞である。いくつかの実施形態では、前記細胞は哺乳類細胞である。いくつかの実施形態では、前記哺乳類細胞は免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）、肝臓細胞、腫瘍細胞、幹細胞、受精卵、筋細胞及び皮膚細胞から選択される。いくつかの実施形態では、前記細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、前記転移因子はヒト胚腎２９３Ｔ（２９３Ｔ）細胞での転移活性がＨｅＬａ細胞での転移活性よりも高い。
【0015】
上記操作された転移因子の何れかに係る実施形態では、前記転移因子はベクターに存在する。いくつかの更なる実施形態では、前記ベクターはプラスミドベクター又はウイルスベクターである。
【0016】
本願の別の態様は、１）上記の転移因子の何れかに係る操作された転移因子と、２）トランスポザーゼ、又はトランスポザーゼをコードする核酸と、を含む遺伝子導入システムを提供する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５３～７８及び１０３～１１４から選択されるアミノ酸配列又はその変異体を含む。
【0017】
更なる態様では、本願は、１）操作された転移因子と、２）トランスポザーゼ又はトランスポザーゼをコードする核酸と、を含み、前記転移因子は、５’から３’への順に、５’末端反復配列（５’ＴＲ）、異種核酸及び３’末端反復配列（３’ＴＲ）を含み、前記転移因子は異種核酸の細胞ＤＮＡへの挿入を可能とする転移活性を示し、前記トランスポザーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５３～７８及び１０３～１１４から選択されるアミノ酸配列又はその変異体を含む遺伝子導入システムを提供する。いくつかの実施形態では、前記５’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １～２６及び７９～９０から選択される核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含み、３’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７～５２及び９１～１０２から選択される核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む。
【0018】
上記遺伝子導入システムの何れかに係るいくつかの実施形態では、前記転移因子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３、８、１１、１２、１３、１６、２２、２３、２９及び８２から選択される核酸配列と少なくとも約９０％の配列同一性を有する核酸配列を有する５’ＴＲを含み、前記３’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２９、３４、３７、３８、３９、４２、４８、４９、９１及び９４から選択される核酸配列と少なくとも約９０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記操作された転移因子はＴｃ１－８Ｂ＿ＤＲ、Ｔｃ１－３＿ＦＲ、Ｍａｒｉｎｅｒ２＿ＡＧ、Ｔｃ１－１＿Ｘｔ、Ｔｃ１－１＿ＡＧ、Ｔｃ１－１＿ＰＭ、Ｔｃ１－４＿Ｘｔ、Ｔｃ１－１５＿Ｘｔ、Ｍａｒｉｎｅｒ－６＿ＡＭｉ又はＭａｒｉｎｅｒ－３＿Ｃｒｐに由来する。いくつかの実施形態では、前記操作された転移因子はＴｃ１－８Ｂ＿ＤＲ、Ｔｃ１－３＿ＦＲ、Ｍａｒｉｎｅｒ２＿ＡＧ、Ｔｃ１－１＿Ｘｔ又はＴｃ１－１＿ＰＭに由来する。いくつかの実施形態では、前記５’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３の核酸配列を含み、前記３’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２９の核酸配列を含み、前記トランスポザーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記５’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８の核酸配列を含み、前記３’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３４の核酸配列を含み、前記トランスポザーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記５’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１の核酸配列を含み、前記３’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３７の核酸配列を含み、前記トランスポザーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記５’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２の核酸配列を含み、前記３’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３８の核酸配列を含み、前記トランスポザーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記５’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６の核酸配列を含み、前記３’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４２の核酸配列を含み、前記トランスポザーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６８のアミノ酸配列を含む。
【0019】
上記遺伝子導入システムの何れかに係るいくつかの実施形態では、前記遺伝子導入システムはトランスポザーゼをコードする核酸を含む。いくつかの更なる実施形態では、前記転移因子とトランスポザーゼをコードする核酸は異なるベクターにある。いくつかの更なる特定実施形態では、前記転移因子とトランスポザーゼをコードする核酸は同一ベクターにある。
【0020】
更なる態様では、本願は、標的核酸と、上記操作された転移因子の何れかに係る転移因子又は上記遺伝子導入システムの何れかに係る遺伝子導入システムとを接触させることを含む標的核酸に異種核酸を挿入する方法を提供する。いくつかの実施形態では、該方法はインビトロで行われる。いくつかの実施形態では、前記標的核酸は細胞内にある。いくつかの実施形態では、前記標的核酸はゲノムＤＮＡである。
【0021】
上記方法の何れかに係るいくつかの実施形態では、前記標的核酸は細胞内にあり、該細胞は動物細胞、植物細胞、藻類細胞、真菌細胞、酵母細胞又は細菌細胞である。いくつかの実施形態では、前記細胞は哺乳類細胞である。いくつかの実施形態では、前記哺乳類細胞は免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）、肝臓細胞、腫瘍細胞、幹細胞、受精卵、筋細胞及び皮膚細胞から選択される。いくつかの実施形態では、前記異種核酸の挿入により細胞の遺伝子が不活性化する。
【0022】
上記方法の何れかに係るいくつかの実施形態では、前記異種核酸はタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、前記タンパク質はレポータータンパク質、操作された受容体、サイトカイン、抗生物質耐性タンパク質、抗原及び治療的タンパク質から選択される。
【0023】
上記方法の何れかに係るいくつかの実施形態では、前記異種核酸はＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態では、前記ＲＮＡは治療的ＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、微小ＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ロングノンコードＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）から選択される。いくつかの実施形態では、前記異種核酸は１種以上の分子をコードする。
【0024】
上記方法の何れかに係るいくつかの実施形態では、前記異種核酸の長さが約３００,０００塩基（ｋｂ）以下、例えば、約１０ｋｂ～約３００ｋｂ、又は約１００塩基対（ｂｐ）～約１０ｋｂ、又は約１００ ｂｐ～約５ｋｂ、又は約１００ ｂｐ～約２ｋｂ、又は約２ｋｂ～約３００ｋｂである。
【0025】
上記方法の何れかに係るいくつかの実施例では、前記挿入はランダムである。
【0026】
更なる態様では、本願は、上記操作された転移因子の何れかに係る転移因子、又は上記遺伝子導入システムの何れかに係る遺伝子導入システム、及び異種核酸を標的核酸に挿入するプロトコールを含むキットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【0027】
【図1】活性転移因子（ＴＥ）の同定を説明する図を示す。
【図2】同定された１３１個の転移因子（ＴＥ）の要約を示し、これらの転移因子（ＴＥ）は長さ３００アミノ酸（ａａ）以上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、トランスポザーゼ（Ｔｎ）ドメイン及び２５％以下の平均差を有する。円グラフは同定された１３１個のＴＥの５つのスーパーファミリーの分布を説明する。
【図3】活性転移因子をスクリーニングするための例示的な二元構築体を示す。上段の構築体はトランスポザーゼが発現する補助構築体であり、５’から３’への順に、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ、トランスポザーゼ（Ｔｎ）遺伝子及びｐｏｌｙＡ（ｐＡ）シグナルを含む。下段の構築体はドナー構築体であり、５’から３’への順に、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモータ、５’標的部位反復（５’ＴＳＤ）配列、５’末端反復（５’ＴＲ）配列、ピューロマイシン－耐性増強型ＧＦＰ融合タンパク質（Ｐｕｒｏ－ｅＧＦＰ）をコードする配列、３’末端反復（３’ＴＲ）配列、３’標的部位反復（３’ＴＳＤ）配列及びｐｏｌｙＡ（ｐＡ）シグナルを含む。
【図4】図４Ａ～４Ｂは、ＨＥＫ２９３Ｔ（２９３Ｔ）及びＨｅＬａ細胞内で、ｐｉｇｇｙＢａｃ、Ｈｙｐｅｒ ｐｉｇｇｙＢａｃ及びＳＢ１００Ｘを含む対照ＴＥと比較した、５％以下の差を有する同定された転移因子の転移活性を示す。図４ＡはＨＥＫ２９３Ｔ（２９３Ｔ）及びＨｅＬａ細胞内で、ｐｉｇｇｙＢａｃ、Ｈｙｐｅｒ ｐｉｇｇｙＢａｃ、ＳＢ１００Ｘ、ＴｃＢｕｓｔｅｒ（ＴＢ）を含む対照ＴＥ及び陰性対照（ＮＣ）と比較した、以下の同定された転移因子の転移活性を示す：1_hAT-2_AG、2_AgaP12、 3_P3_AG、4_HAT2_CI、5_HAT5_CI、6_hAT-6_DR、7_Chaplin1_DR、8_Harbinger-4_XT、9_HAT1_AG、10_AgaP15、11_IS4EU-1_DR、12_POGO、14_Tc1-8B_DR、15_HOBO、17_hAT -6_PM、18_MARISP1、19_hAT-7_XT、20_BARI_DM、21_Mariner-3_PM、22_hAT-3_XT、23_P1_AG、24_IS4EU-2_DR、25_Tc1-3_Xt、26_Mariner-1_PM、27_P2_AG、28_hAT-5_DR、29_Tc1-3_FR、30_Mariner-4_XT、32_Tc1-5_Xt、33_Tc1-10_Xt及び34_hAT-1_D。図４Ｂは、ＨＥＫ２９３Ｔ（２９３Ｔ）及びＨｅＬａ細胞内で、ｐｉｇｇｙＢａｃ、Ｈｙｐｅｒ ｐｉｇｇｙＢａｃ、ＳＢ１００Ｘ、ＴｃＢｕｓｔｅｒ（ＴＢ）を含む対照ＴＥ及び陰性対照（ＮＣ）と比較した、以下の同定された転移因子の転移活性を示す：35_Mariner2_AG、36_Tc1-1_Xt、37_Tc1-1_AG、38_Mariner-1_XT、39_Tc1DR3_Xt、40_hAT-1B_PM、41_hAT-3_PM、42_hAT-6B_PM、43_Tc1-1_PM、44_TC1_XL、45_Mariner-4_AMi、46_Myotis_hAT1 、47_hAT-7_PM、48_TC1_FR4、49_hAT-8_PM、50_piggyBac1_Mm、51_Tc1-11_Xt、52_Tc1~16_Xt、53_TC1-2_DM、54_Tc1-4_Xt、55_TC1_DM、56_Tc1-15_Xt、59_TC1_FR2、60_Mariner-6B_AMi、61_Tc1-9_Xt、63_hAT-9_XT、64_Mariner-5_XT、65_S2_DM、67_PROTOP、68_Tc1-8_Xt及び69_Tc1-12_Xt。
【図5】図５Ａ～５Ｂは、ＨＥＫ２９３Ｔ（２９３Ｔ）において５％よりも大きい差を有する同定された転移因子の転移活性を示す。図５ＡはＨＥＫ２９３Ｔ（２９３Ｔ）における以下の同定された転移因子の転移活性を示す：70_Mariner-6_AMi、71_hAT-3_Gav、72_piggyBac2_Mm、73_Mariner-2_XT、74_hAT-4_Crp、75_OposCharlie2、76_hAT-1_AMi、77_Mariner-2_AMi、78_hAT-13_AMi、80_hAT-12_AMi、81_Mariner-7_Croc、82_piggyBac-2_XT、83_Mariner-3_AMi、84_piggyBac1_CI、86_piggyBac-1_AMi、87_Mariner-5_AMi、89_Mariner-6_Crp、90_Mariner-3_Crp、91_hAT-3_AMi、92_TC1_FR1、93_hAT-5_Croc、94_hAT-8_AMi、95_PARIS、96_Mariner-2_PM、97_piggyBac-1_XT、98_Tigger1、99_Mariner-1_Crp、101_S_DM、102_hAT-12_Crp、103_hAT-1_PM、104_Senkusha1、105_Tc1-2_PM、106_Harbinger-2_AMi、108_hAT-2_Gav及び110_Tigger2T。図５ＢはＨＥＫ２９３Ｔ（２９３Ｔ）における以下の同定された転移因子の転移活性を示す：111_TC1-4_DR、116_TIGGER17、117_TIGGE3、118_HAT-14_CRP、119_MARINER-9_CRP、124_HAT-111_AMI、126_MARINER-1_AMI、126_MARINER-10_CRP、139_hAT-17_Croc、140_hAT-4_AMi、142_Tigger4、144_Tigger7、156_Tigger2、180_hAT-19_Crp、183_hAT-17B_Croc、188_Tc1-13_Xt、197_hAT-19B_Croc、199_MarsTigger8、212_Tigger5、222_hAT-10_XT、237_hAT-6_AMi、245_MarsTigger1c、246_Tigger17c、258_Harbinger-1_AMi、260_Tc1-14_Xt、271_Kanga1、275_Arthur1、295_Harbinger-1_Crp、314_Zaphod3、320_Joey1、331_Zaphod、342_Harbinger-3_AMi、348_Harbinger-1B_Crp、349_MARWOLEN1及び351_Zaphod2。
【図6】図６Ａ～６Ｂは対照ＴＥ ｐｉｇｇｙＢａｃ、ｈｙｐｅｒｐｉｇｇｙＢａｃ及びＳＢ１００Ｘと比較した、各種の同定されたＴＥの転移（即ち導入）効率を示す。図６ＡはＨＥＫ２９３Ｔ（２９３Ｔ）細胞内で、対照ＴＥ ｐｉｇｇｙＢａｃ、ｈｙｐｅｒｐｉｇｇｙＢａｃ及びＳＢ１００Ｘと比較した、各種の同定されたＴＥの転移（導入）効率を示す。図６ＢはＨｅＬａ細胞内で、対照ＴＥ ｐｉｇｇｙＢａｃ、ｈｙｐｅｒｐｉｇｇｙＢａｃ及びＳＢ１００Ｘと比較した、各種の同定されたＴＥの転移（導入）効率を示す。
【図7】図７Ａ～７Ｃは、異なるスーパーファミリーに属する同定されたトランスポザーゼとその対照ＴＥとの間の系統発生関係を説明する系統樹を示す。図７Ａは以下の１４個の同定されたｈＡＴスーパーファミリートランスポザーゼと対照ＴＥ ＴｃＢｕｓｔｅｒとの間の系統発生関係を説明する系統樹を示す：103_hAT-1_PM、17_hAT-6_PM、46_Myotis_hAT1、28_hAT-5_DR、22_hAT-3_XT、41_hAT-3_PM、47_hAT-7_PM、180_hAT-19_Crp、1_hAT-2_AG、9_HAT1_AG、139_hAT-17_Croc、183_hAT-17B_Croc、63_hAT-9_XT、222_hAT-10_XT。図７Ｂは、２個の同定されたｐｉｇｇｙＢａｃスーパーファミリートランスポザーゼ８２＿ｐｉｇｇｙＢａｃ－２＿ＸＴ、８６＿ｐｉｇｇｙＢａｃ－１＿ＡＭｉと対照ＴＥ ＴｃＢｕｓｔｅｒとの間の系統発生関係を説明する系統樹を示す。図７Ｃは、２２個の同定されたＴｃＭａｒｉｎｅｒスーパーファミリートランスポザーゼと対照ＴＥ ＳＢ１００Ｘとの間の系統発生関係を説明する系統樹を示す。
【図8】図８Ａ～８ＢはＨＥＫ２９３Ｔ（２９３Ｔ）細胞及びＨｅＬａ細胞内で、ｐｉｇｇｙＢａｃ、ｈｙｐｅｒｐｉｇｇｙＢａｃ及びＳＢ１００Ｘを含む対照ＴＥ及び陰性対照（ＮＣ）と比較した、同定された転移因子及び１３１個の候補のうち活性の最も高い５個のＴＥの転移活性を示す。図８Ａは２９３Ｔ細胞内で、ｐｉｇｇｙＢａｃ、ｈｙｐｅｒｐｉｇｇｙＢａｃ及びＳＢ１００Ｘを含む対照ＴＥ及び陰性対照（ＮＣ）と比較した、各種の同定されたＴＥの転移（導入）効率を示す。図８ＢはＨｅＬａ細胞内で、ｐｉｇｇｙＢａｃ、ｈｙｐｅｒｐｉｇｇｙＢａｃ及びＳＢ１００Ｘを含む対照ＴＥ及び陰性対照（ＮＣ）と比較した、各種の同定されたＴＥの転移（導入）効率を示す。
【図9】図９Ａ～９ＢはＨｃｔ１１６及びＫ５６２細胞内で、ｐｉｇｇｙＢａｃ、ｈｙｐｅｒｐｉｇｇｙＢａｃ及びＳＢ１００Ｘを含む対照ＴＥ及び陰性対照（ＮＣ）と比較した、同定された転移因子及び１３１個の候補のうち活性の最も高い５個のＴＥの転移活性を示す。図９ＡはＨｃｔ１１６細胞内で、ｐｉｇｇｙＢａｃ、ｈｙｐｅｒｐｉｇｇｙＢａｃ及びＳＢ１００Ｘを含む対照ＴＥ及び陰性対照（ＮＣ）と比較した、各種の同定されたＴＥの転移（導入）効率を示す。図９ＢはＫ５６２細胞内で、ｐｉｇｇｙＢａｃ、ｈｙｐｅｒｐｉｇｇｙＢａｃ及びＳＢ１００Ｘを含む対照ＴＥ及び陰性対照（ＮＣ）と比較した、各種の同定されたＴＥの転移（導入）効率を示す。
【図10】図１０Ａ～１０Ｂは初代Ｔ細胞内で、対照ＴＥ ＳＢ１００Ｘと比較した、同定された転移因子１４－Ｔｃ１－８Ｂ＿ＤＲ、２９－Ｔｃ１－３＿ＦＲ、３５－Ｍａｒｉｎｅｒ２＿ＡＧ、３６－Ｔｃ１－１＿Ｘｔ、３７－Ｔｃ１－１＿ＡＧ、４３－Ｔｃ１－１＿ＰＭ、５２－Ｔｃ１～１６＿Ｘｔ、５４－Ｔｃ１－４＿Ｘｔ及び５６－Ｔｃ１－１５＿Ｘｔの転移活性を示す。図１０ＡはＥＦ１αプロモータとＣｏｐＧＦＰ遺伝子を含有するプラスミドでトランスフェクションされた初代Ｔ細胞の転移測定結果を示し、ここで、ＧＦＰ陽性Ｔ細胞の存在は細胞内の転移の成功を表す。図１０ＢはＥＦ１αプロモータと０１９ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ遺伝子を含有するプラスミドでトランスフェクションされた初代Ｔ細胞の転移測定結果を示し、ここで、ＧＦＰ陽性Ｔ細胞の存在は細胞内の転移の成功を表す。
【図11】図１１Ａ～１１Ｂは２９３Ｔ細胞及びＨｅＬａ細胞内で、対照ＴＥ ｐｉｇｇｙＢａｃ及び陰性対照（ＮＣ）と比較した、ヘルパープラスミド及び転移因子プラスミドに基づく各割合を示し、同定された転移因子ＳＢ１００Ｘ及び１３１個の候補のうち活性の最も高い５個のＴＥの転移活性を示す。図１１Ａは２９３Ｔ細胞内で、対照ＴＥ ＳＢ１００Ｘ及び陰性対照（ＮＣ）と比較した、各種の同定されたＴＥの転移（導入）効率を示す。図１１ＢはＨｅＬａ細胞内で、対照ＴＥ ＳＢ１００Ｘ及び陰性対照（ＮＣ）と比較した、各種の同定されたＴＥの転移（導入）効率を示す。
【図12】図１２は２９３Ｔ細胞内で、対照ＴＥ ｐｉｇｇｙＢａｃ、ｐｉｇｇｙＢａｃ、ｈｙｐｅｒｐｉｇｇｙ Ｂａｃ、ＳＢ１００Ｘと比較した、同定された転移因子ＳＢ１００Ｘ及び１３１個の候補のうち活性の最も高い５個のＴＥの負荷能力を示す。図１２は対照ＴＥ ｐｉｇｇｙＢａｃ、ｐｉｇｇｙＢａｃ、ｈｙｐｅｒｐｉｇｇｙＢａｃ、ＳＢ１００Ｘと比較した、各種の同定されたＴＥの転移（導入）効率を示す。
【図13】ＴＥ原始種及び安定転移Ｋ５６２細胞株由来のゲノムの標的部位の周囲の４０ ｂｐウィンドウにおけるゲノム挿入遺伝子座の共通配列を示す。
【図14】図１４Ａ～１４Ｂは、ｐｉｇｇｙＢａｃ、ｈｙｐｅｒｐｉｇｇｙＢａｃ、ＳＢ１００Ｘ及び１３１個の候補のうち活性の最も高い５個のＴＥを含む、距離の最も近い遺伝子の同定された転移因子の挿入頻度を示し、図１４Ａは０ｂｐ～１Ｍｂウィンドウ内の挿入頻度、図１４Ｂは５０ｋｂウィンドウ内のランダム挿入に対する濃縮倍数を示す。
【図15】図１５は遺伝子体の５’末端から３’末端への相対位置において、ｐｉｇｇｙＢａｃ、ｈｙｐｅｒｐｉｇｇｙ Ｂａｃ、ＳＢ１００Ｘ及び１３１個の候補のうち活性の最も高い５個のＴＥを含む、同定された転移因子のランダム挿入に対する濃縮倍数を示す。
【図16】図１６は様々な発現レベルの遺伝子において、ｐｉｇｇｙＢａｃ、ｈｙｐｅｒｐｉｇｇｙＢａｃ、ＳＢ１００Ｘ及び１３１個の候補のうち活性の最も高い５個のＴＥを含む、同定された転移因子のランダム挿入に対する濃縮倍数を示し、レベル７は最高発現、レベル０は最低発現を表す。
【発明を実施するための形態】
【0028】
本願は、操作された転移因子、操作された転移因子を含む遺伝子導入システム、及びそれらを用いた方法とキットを提供する。本願は、少なくとも部分的に、汎ゲノムバイオインフォマティクスにより解析された広範な種からの新規転移因子の同定（例えば、表２）、及び同定された多くの転移因子がヒト細胞内で効率的に転移することができるという驚くべき結果に基づいている。開示された組成物、システム及び方法は、異種ＤＮＡを細胞のゲノムに導入することを含む、標的核酸に異種核酸を挿入するのに有用である。本明細書の上記転移因子及び遺伝子導入システムは、遺伝子治療や遺伝子発見研究など、さまざまな用途に有用である。
【0029】
したがって、一態様では、本願は、５’から３’への順に、５’末端反復配列（５’ＴＲ）、異種核酸及び３’末端反復配列（３’ＴＲ）を含み、５’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １～２６及び７９～９０から選択される核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含み、３’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７～５２及び９１～１０２から選択される核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含み、上記転移因子は異種核酸の細胞ＤＮＡへの挿入を可能とする転移活性を示す操作された転移因子を提供する。
【0030】
別の態様では、本願は、１）操作された転移因子と、２）トランスポザーゼ又はトランスポザーゼをコードする核酸と、を含み、上記転移因子は、５’から３’へ、５’末端反復配列（５’ＴＲ）、異種核酸及び３’末端反復配列（３’ＴＲ）を含み、上記転移因子は異種核酸の細胞ＤＮＡへの挿入を可能とする転移活性を示す遺伝子導入システムを提供する。いくつかの実施形態では、上記転移因子は操作された転移因子である。いくつかの実施形態では、上記トランスポザーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５３～７８及び１０３～１１４から選択されるアミノ酸配列又はその変異体を含む。
【0031】
Ｉ．定義
本明細書で使用される場合、「トランスポゾン」、「転移因子」、又は「ＴＥ」という用語は、第１核酸（すなわち、ベクターのようなドナー核酸）から切断され、標的部位（例えば、細胞内の第２核酸、ゲノム又は染色体外ＤＮＡ）に組み込まれ得るポリヌクレオチドを意味する。少なくとも１つのシス作用核酸配列が核酸配列の５’に位置し、かつ少なくとも１つのシス作用核酸配列が核酸配列の３’に位置する場合、トランスポゾンは、転移因子の末端のシス作用核酸配列側に連結される核酸配列を含む。シス作用核酸配列は、トランスポザーゼが結合する転移因子の各末端に、少なくとも１つの末端反復配列（ＴＲ、逆末端反復配列（ＩＴＲ）又は末端逆反復配列（ＴＩＲ）とも呼ばれる）を含む。本明細書の上記転移因子は、トランスポザーゼをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含んでも含まなくてもよい。
本明細書で使用される場合、「トランスポゾン」、「転移因子」、又は「ＴＥ」という用語は、第１核酸（すなわち、ベクターのようなドナー核酸）から切断され、標的部位（例えば、細胞内の第２核酸、ゲノム又は染色体外ＤＮＡ）に組み込まれ得るポリヌクレオチドを意味する。少なくとも１つのシス作用核酸配列が核酸配列の５’に位置し、かつ少なくとも１つのシス作用核酸配列が核酸配列の３’に位置する場合、トランスポゾンは、転移因子の末端のシス作用核酸配列側に連結される核酸配列を含む。シス作用核酸配列は、トランスポザーゼが結合する転移因子の各末端に、少なくとも１つの末端反復配列（ＴＲ、逆末端反復配列（ＩＴＲ）又は末端逆反復配列（ＴＩＲ）とも呼ばれる）を含む。本明細書の上記転移因子は、トランスポザーゼをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含んでも含まなくてもよい。
【0032】
本明細書で使用される場合、「転移」という用語は、転移因子が第１核酸（例えば、ベクター）の位置から変更して標的部位（例えば、細胞内の第２核酸、又はゲノム又は染色体外ＤＮＡ）に組み込まれることを意味する。
【0033】
本明細書で使用される場合、「末端反復」又は「ＴＲ」という用語は、転移因子の両端に位置し、転移因子の第２核酸配列側に連結される核酸配列を意味する。第２核酸配列の５’（上流）に位置するＴＲを５’ＴＲと呼び、第２核酸配列の３’（下流）に位置するＴＲを３’ＴＲと呼ぶ。クラス２の転移因子では、ＴＲは互いに相補的である。
【0034】
本明細書で使用される場合、「標的部位反復」又は「ＴＳＤ」という用語は、転移因子の挿入部位に出現する核酸配列を意味する。ＴＳＤは、標的ＤＮＡ二本鎖体のトランスポザーゼによる互い違いの切断に起因する粘性末端のＤＮＡ修復により発現する可能性がある。ＴＳＤは、転移因子内のＴＲ側に連結されている。５’ＴＲの５’に位置するＴＳＤは５’ＴＳＤである。３’ＴＲの３’に位置するＴＳＤは３’ＴＳＤである。
【0035】
本明細書で使用される場合、「トランスポザーゼ」という用語は、トランスポゾンが第１核酸（例えば、ベクター）から切断され、標的部位（例えば、細胞内の第２核酸、又はゲノム又は染色体外ＤＮＡ）に組み込まれることを触媒するポリペプチドを意味する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、１つ又は２つの末端反復配列に結合する。
【0036】
本明細書で使用される場合、「左トランスポゾンフラグメント」又は「ＬＴＦ」は、天然に存在する転移因子における５’ＴＳＤからトランスポザーゼＯＲＦ配列の開始コドンまでのフラグメントを意味する。本明細書で使用される場合、「右トランスポゾンフラグメント」又は「ＲＴＦ」とは、天然に存在する転移因子におけるトランスポザーゼＯＲＦ配列の終止コドンから３’ＴＳＤまでのフラグメントを意味する。
【0037】
「核酸」、「ポリヌクレオチド」及び「核酸配列」という用語は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、それらの組み合わせ及びそれらの類似体を含む、任意の長さのヌクレオチドの重合形態を指し、交換して使用することができる。「オリゴヌクレオチド」及び「オリゴ（ｏｌｉｇｏ）」は、交換して使用することができ、約５０個以下のヌクレオチドを有する短いポリヌクレオチドを指す。
【0038】
本明細書で使用される場合、「異種核酸」とは、参照核酸配列とは異なる由来のＤＮＡ又はＲＮＡ配列を意味する。例えば、転移因子の場合、上記異種核酸は、末端反復配列とは異なるソースに由来する。例えば、末端反復配列とは異なる生体から単離された核酸配列は、上記末端反復配列に対する異種核酸であると考えられる。
【0039】
本明細書で使用される場合、「動作可能に連結される」という用語は、他の核酸配列と機能的な関係にある核酸配列を意味する。例えば、コード配列がプロモータ配列に動作可能に連結されている場合、通常、プロモータがコード配列の転写を促進できることを意味する。動作可能に連結されるとは、連結対象のＤＮＡ配列が通常連続しており、２つのタンパク質コード領域を連結しなければならない場合、連続しており、リーディングフレーム内にあることを意味する。エンハンサーは、プロモータから数千塩基離れた位置で機能し、イントロン配列が可変長であるので、いくつかの核酸配列は動作可能に連結されているが、不連続であることがある。
【0040】
核酸配列についての「配列同一性の百分率（％）」とは、配列をアライメントした後に特定の核酸配列のヌクレオチドと同一の候補配列のヌクレオチドの百分率として定義され、必要に応じて、配列同一性の百分率が最大となるようにキャップを設けてもよい。ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の配列についての「配列相同性の百分率（％）」は、配列をアライメントした後、特定のペプチド又はアミノ酸配列中のアミノ酸残基と同じ置換を有する候補配列中のアミノ酸残基の百分率であり、必要に応じて、配列相同性の百分率が最大となるようにキャップを設けてもよい。アミノ酸配列の同一性百分率を決定するためのアライメントは、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ又はＭＥＧＡＬＩＧＮＴＭ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの一般的に利用可能なコンピュータソフトウェアのような、当該分野の技術範囲内の様々な方法で実施することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、測定アライメントをするための適切なパラメータを決定することができる。
【0041】
本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、それに連結された別の核酸分子を輸送することができる核酸分子を意味する。ベクターの例としては、細菌、プラスミド、ファージ、コスミド、エピソーム（episomes）、ウイルス、及び挿入可能なＤＮＡフラグメント、すなわち相同組換えによって宿主細胞ゲノムに挿入可能なフラグメントが含まれるが、これらに限定されない。
【0042】
本明細書で使用される場合、「プラスミド」という用語は、外来ＤＮＡフラグメントを受け入れることができ、原核細胞又は真核細胞で複製することができる環状二本鎖ＤＮＡを意味する。
【0043】
「ポリペプチド」及び「ペプチド」という用語は、交換して使用することができ、任意の長さのアミノ酸ポリマーを指す。したがって、例えば、ペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、抗体、及び酵素という用語は、ポリペプチドの定義に含まれる。ポリマーは、直鎖又は分岐鎖であってもよく、修飾アミノ酸を含んでいてもよく、非アミノ酸によって切断されていてもよい。タンパク質は、１つ又は複数のポリペプチドを有していてもよい。この用語には、修飾アミノ酸ポリマーも含まれる。例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又は標識成分との結合のような他の任意の操作が可能である。
【0044】
本明細書で使用される場合、「変異体」は、参照ポリヌクレオチド又はポリペプチドとは異なるが、基本的な特性を保持するポリヌクレオチド又はポリペプチドと解釈される。ポリヌクレオチドの典型的な変異体は、他の参照ポリヌクレオチドの核酸配列とは異なる。変異体の核酸配列変化は、参照ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変化させてもよいし、変化させなくてもよい。以下で説明するように、ヌクレオチドの変化は、参照配列によってコードされるポリペプチド中のアミノ酸の置換、付加、欠失、融合、及び切断をもたらすことができる。ポリペプチドの典型的な変異体は、他の参照ポリペプチドのアミノ酸配列とは異なる。通常、相違は限定されており、したがって、参照ポリペプチド及び変異体の配列は、全体的に非常に類似しており、多くの領域において同一である。変異体及び参照ポリペプチドのアミノ酸配列は、１つ又は複数の置換、付加、欠失の任意の組み合わせの形態によって異なってもよい。置換又は挿入されたアミノ酸残基は、遺伝暗号によりコードされたアミノ酸残基であってもよいし、そうでなくてもよい。ポリヌクレオチド又はポリペプチドの変異体は、アリル変異体のように天然に存在していてもよく、又は天然に存在しない変異体であってもよい。ポリヌクレオチド及びポリペプチドの天然に存在しない変異体は、突然変異誘発技術、直接合成、及び当業者に知られている他の組換え方法によって調製することができる。
【0045】
本明細書で使用される場合、配列の「フラグメント」は、配列の一部を意味する。例えば、核酸配列のフラグメントは核酸配列の一部を意味し、アミノ酸配列のフラグメントはアミノ酸配列の一部を意味する。
【0046】
本明細書で使用される場合、「遺伝子回路」、「生体回路」、又は「合成回路」という用語は、論理機能を実行するように設計された生体構成要素のセットを意味する。一般に、遺伝子回路を活性化するために入力が必要であり、遺伝子回路は入力に応じて出力を生成する。
【0047】
本明細書で使用される場合、「操作された」という用語は、ポリヌクレオチド又はポリペプチドに検出可能な変化を生じさせる任意の操作を意味し、この操作は、ポリヌクレオチド又はアミノ酸配列の一部の挿入、削除及び置換を含むが、これらに限定されない。
【0048】
本明細書で使用される場合、「転移効率」という用語は、転移因子が標的細胞群に異種核酸を挿入する効率を意味する。例えば、転移効率は、レポーター遺伝子又は選択マーカーをコードする遺伝子、例えば抗生物質耐性遺伝子（例えば、ピューロマイシン）を含む転移因子を含むプラスミドを標的細胞群にトランスフェクションし、レポーター遺伝子又は選択マーカーによってコードされる遺伝子産物を発現する細胞の数を、例えば抗生物質耐性を有する細胞の数を測定することによって決定することによって決定されてもよい。
【0049】
本明細書で使用される場合、「トランスフェクションされた」、「形質転換された」、又は「形質導入された」という用語は、外来核酸を宿主細胞に転移又は導入するプロセスを意味する。「トランスフェクションされた」、「形質転換された」、又は「形質導入された」細胞は、外来核酸でトランスフェクション、形質転換、又は形質導入された細胞である。本明細書で使用される場合、「形質導入」及び「トランスフェクション」という用語は、感染因子（例えば、ウイルス）又は他の方法を使用して目的のタンパク質又は分子を発現させるためにＤＮＡを細胞に導入する当該分野で知られている全ての方法を含む。ウイルス又はウイルス様制剤に加えて、リン酸カルシウム、デンドリマー、リポソーム又はカチオン性ポリマー（例えば、ＤＥＡＥ－グルカン又はポリエチレンイミン）を使用する方法のような化学的トランスフェクション方法；電気穿孔、細胞スクイズ、音響穿孔、光トランスフェクション、穿刺トランスフェクション、プロトプラスト融合、プラスミド又はトランスポゾン送達などの非化学的方法；遺伝子銃、磁気トランスフェクション又は磁気補助トランスフェクション、粒子衝撃の使用などの粒子ベースの方法；核トランスフェクションなどの混合方法もある。
【0050】
「インビボ」という用語は、細胞を取得する生物の体内でのことである。「エクスビボ」又は「インビトロ」とは、細胞を取得する生物の体外でのことである。
【0051】
なお、本明細書に記載された本発明の実施形態は、「からなる」及び／又は「実質的にからなる」実施形態を含む。
【0052】
本明細書では、「約」が言及された数値又はパラメータが、当該数値又はパラメータ自体に対する変化を含む（説明している）。例えば、「約Ｘ」が言及された説明には、「Ｘ」の記載が含まれる。
【0053】
本明細書で使用される場合、「そうでない」が言及された数値又はパラメータは、通常、数値又はパラメータと「異なる」ことを表し、説明する。例えば、該方法がＸ型癌の治療に使用されないということは、Ｘ型以外の癌の治療に使用されることを意味する。
【0054】
本明細書で使用される用語「約Ｘ～Ｙ」は、「約Ｘから約Ｙ」と同じ意味を有する。
【0055】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１種」、「１つ」、及び「上記」は、文脈で別段の規定がない限り、複数形も含む。
【0056】
ＩＩ．操作された転移因子
本願の一態様は、５’から３’へ、５’末端反復配列（５’ＴＲ）、異種核酸及び３’末端反復配列（３’ＴＲ）を含む操作された転移因子を提供する。いくつかの実施形態では、上記転移因子は異種核酸の標的核酸（例えば、ＤＮＡ）へのインビトロ挿入を可能とする転移活性を示す。いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子は異種核酸の細胞内の標的核酸（例えば哺乳類又は細胞植物のＤＮＡ）への挿入を可能とする転移活性を示す。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含まない。
本願の一態様は、５’から３’へ、５’末端反復配列（５’ＴＲ）、異種核酸及び３’末端反復配列（３’ＴＲ）を含む操作された転移因子を提供する。いくつかの実施形態では、上記転移因子は異種核酸の標的核酸（例えば、ＤＮＡ）へのインビトロ挿入を可能とする転移活性を示す。いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子は異種核酸の細胞内の標的核酸（例えば哺乳類又は細胞植物のＤＮＡ）への挿入を可能とする転移活性を示す。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含まない。
【0057】
いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子は、５’から３’へ、５’標的部位反復配列（５’ＴＳＤ）、５’ＴＲ、異種核酸、３’ＴＲ及び３’ＴＳＤを含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は異種核酸の標的核酸（例えば、ＤＮＡ）へのインビトロ挿入を可能とする転移活性を示す。いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子は異種核酸の細胞内の標的核酸（例えば哺乳類又は細胞植物のＤＮＡ）への挿入を可能とする転移活性を示す。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含む。
【0058】
いくつかの実施形態では、本願は、ヒト細胞内で効率的に転移できる広範な種由来の新規な転移因子を提供する。本明細書の上記転移因子は天然活性を有する哺乳類の切り貼りＤＮＡトランスポゾンのための直接的な実験証拠を提供する。
【0059】
例示的な転移因子のリスト及びこれに対応する左末端フラグメント（ＬＴＦ）、右末端フラグメント（ＲＴＦ）、トランスポザーゼ、５’末端反復（ＴＲ）、３’ＴＲ、５’標的部位反復（ＴＳＤ）及び３’ＴＳＤ配列は１～２及び配列表に記載される。表１は本願で開示されたバイオインフォマティクス分析により同定された１３１個のＴＥを示し、この１３１個のＴＥは１１個のＴＥ（ＴＥ ＩＤ： ４、５、７、１２、１８、２０、２２、２５、２６、２８及び３０）を含み、その長さが３０００ ｂｐ以下、ＭＩＴＥコピー数が１０を超え、平均差が１％小さいことを満たし、高効率ゲノム工学に適用できる。表２はヒト細胞株ＨＥＫ２９３Ｔ及びＨｅｌａにおいて転移分析実験を使用して検証された活性ＴＥを示す。
【0060】
いくつかの実施形態では、上記転移因子はクラス２の転移因子である。クラス２の転移因子は、末端反復（ＴＲ）と、組み込む過程で生じたＴＲ側に連結された標的部位反復（ＴＳＤ）の長さとを含む、トランスポザーゼの相関性及び共有する構造的特徴によってスーパーファミリーとして分類されてもよい。本願の転移因子は各種の適切なＴＥスーパーファミリー及び／又はファミリーに由来し得ると想定する。いくつかの実施形態では、上記転移因子はｈＡＴスーパーファミリーに由来する。いくつかの実施形態では、上記転移因子はＰスーパーファミリーに由来する。いくつかの実施形態では、上記転移因子はＰＩＦ－Ｈａｒｂｉｎｇｅｒスーパーファミリーに由来する。いくつかの実施形態では、上記転移因子はｐｉｇｇｙＢａｃスーパーファミリーに由来する。いくつかの実施形態では、上記転移因子はＴｃＭａｒｉｎｅｒスーパーファミリーに由来する。いくつかの実施形態では、上記５’ＴＲは３’ＴＲの逆相補である。いくつかの実施形態では、上記５’ＴＲは３’ＴＲの逆相補ではない。
【0061】
いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子は、ｈＡＴ、Ｐ、ＰＩＦ－Ｈａｒｂｉｎｇｅｒ、ｐｉｇｇｙＢａｃ及びＴｃＭａｒｉｎｅｒから選択されるスーパーファミリーの転移因子の５’ＴＲと少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む５’ＴＲを含む。いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子は、ｈＡＴ、Ｐ、ＰＩＦ－Ｈａｒｂｉｎｇｅｒ、ｐｉｇｇｙＢａｃ及びＴｃＭａｒｉｎｅｒから選択されるスーパーファミリーの転移因子の３’ＴＲと少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む３’ＴＲを含む。
【0062】
いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子は５’ＴＲと３’ＴＲを含み、上記５’ＴＲはｈＡＴ、Ｐ、ＰＩＦ－Ｈａｒｂｉｎｇｅｒ、ｐｉｇｇｙＢａｃ及びＴｃＭａｒｉｎｅｒから選択されるスーパーファミリーの転移因子の５’ＴＲと少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含み、上記３’ＴＲはｈＡＴ、Ｐ、ＰＩＦ－Ｈａｒｂｉｎｇｅｒ、ｐｉｇｇｙＢａｃ及びＴｃＭａｒｉｎｅｒから選択されるスーパーファミリーの転移因子の３’ＴＲと少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【0063】
いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子は、表１のいずれか１つのＴＥ由来の５’ＴＲ、３’ＴＲ、ＬＴＦ、ＲＴＦ、トランスポザーゼ、５’ＴＳＤ及び／又は３’ＴＳＤを含む。いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子は表２のいずれか１つのＴＥ由来の５’ＴＲ、３’ＴＲ、ＬＴＦ、ＲＴＦ、トランスポザーゼ、５’ＴＳＤ及び／又は３’ＴＳＤを含む。いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子はＴｃ１－８Ｂ＿ＤＲ、Ｔｃ１－３＿ＦＲ、Ｍａｒｉｎｅｒ２＿ＡＧ、Ｔｃ１－１＿Ｘｔ、Ｔｃ１－１＿ＡＧ、Ｔｃ１－１＿ＰＭ、Ｔｃ１－４＿Ｘｔ、Ｔｃ１－１５＿Ｘｔ、Ｍａｒｉｎｅｒ－６＿ＡＭｉ、又はＭａｒｉｎｅｒ－３＿Ｃｒｐに由来する。いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子はＴｃ１－８Ｂ＿ＤＲ、Ｔｃ１－３＿ＦＲ、Ｍａｒｉｎｅｒ２＿ＡＧ、Ｔｃ１－１＿Ｘｔ又はＴｃ１－１＿ＰＭに由来する。
【0064】
いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１５～１４０及び１６７～１７８から選択される核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含むＬＴＦを含む。
【0065】
いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４１～１９０から選択される核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含むＲＴＦを含む。
【0066】
いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子はＬＴＦとＲＴＦを含み、上記ＬＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１５～１４０及び１６７～１７８から選択される核酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれかの配列同一性を有し、上記ＲＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４１～１９０から選択される核酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれかの配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１５～１４０及び１６７～１７８から選択される核酸配列を含むＬＴＦと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４１～１９０から選択される核酸配列を含むＲＴＦと、を含む。
【0067】
いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子はＬＴＦの５’ＴＲを含み、上記ＬＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１５～１４０及び１６７～１７８から選択される核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子はＲＴＦの３’ＴＲを含み、上記ＲＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４１～１９０から選択される核酸配列を含む。
【0068】
いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子はＬＴＦの５’ＴＲ、５’ＴＲの変異体又は５’ＴＲのフラグメントを含み、上記ＬＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１５～１４０及び１６７～１７８から選択される核酸配列と、ＲＴＦの３’ＴＲ、３’ＴＲの変異体又は３’ＴＲのフラグメントと、を含み、上記ＲＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４１～１９０から選択される核酸配列を含む。
【0069】
いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １～２６及び７９～９０から選択される核酸配列と少なくとも約９０％の配列同一性を有する核酸配列を有する５’ＴＲを含む。いくつかの実施形態では、本願の操作された転移因子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １～２６及び７９～９０から選択される核酸配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれかの配列同一性を有する５’ＴＲを含む。いくつかの実施形態では、上記５’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １～２６及び７９～９０から選択される核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子は５’ＴＲとしての相補的配列を有する３’ＴＲを含む。
【0070】
いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７～５２及び９１～１０２から選択される核酸配列と少なくとも約９０％の配列同一性を有する核酸配列を有する３’ＴＲを含む。いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７～５２及び９１～１０２から選択される核酸配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれかの配列同一性を有する３’ＴＲを含む。いくつかの実施形態では、上記３’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７～５２及び９１～１０２から選択される核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子は３’ＴＲとしての相補的配列を有する５’ＴＲを含む。
【0071】
いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １～２６及び７９～９０から選択される核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７～５２及び９１～１０２から選択される核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する３’ＴＲと、を含む。
【0072】
いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １～２６から選択される核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７～５２から選択される核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する３’ＴＲと、を含む。
【0073】
いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７９～９０から選択される核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９１～１０２から選択される核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する３’ＴＲと、を含む。
【0074】
本明細書では、本明細書の例えば表１及び２に記載の５’ＴＲ及び／又は３’ＴＲ、又はＬＴＦ及び／又はＲＴＦのいずれか１つの変異体又はフラグメントを含む操作された転移因子も考慮される。いくつかの実施形態では、上記変異体は約５０、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１個以下のいずれかのヌクレオチドの置換を含む。いくつかの実施形態では、上記フラグメントは少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００ 、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０又は５００個のいずれかのヌクレオチドを含む。
【0075】
いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子は５’ＴＳＤを含む。いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子は３’ＴＳＤを含む。いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子は５’ＴＳＤと３’ＴＳＤを含む。いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子は５’ＴＳＤを含まない。いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子は３’ＴＳＤを含まない。いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子は５’ＴＳＤ又は３’ＴＳＤを含まない。いくつかの実施形態では、上記５’ＴＳＤは３’ＴＳＤと同じである。いくつかの実施形態では、上記５’ＴＳＤは３’ＴＳＤと異なる。
【0076】
いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含まない。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは５’ＴＲ及び３’ＴＲ配列と同じ種に由来する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは５’ＴＲ及び３’ＴＲ配列に対する天然トランスポザーゼである。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは５’ＴＲ及び３’ＴＲ配列に対する天然トランスポザーゼに基づく操作されたトランスポザーゼである。
【0077】
トランスポザーゼは、ドナーポリヌクレオチド（例えば、ベクター）からトランスポゾンを切断してから、トランスポゾンを標的核酸、例えば標的細胞のゲノム又は染色体外ＤＮＡに組み込むことを触媒する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは転移因子の末端反復に結合する。
【0078】
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５３～７８及び１０３～１１４から選択されるアミノ酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む。
【0079】
本願のいくつかの実施形態では、表１～２及び配列表に記載のトランスポザーゼの変異体が考慮される。トランスポザーゼ変異体の表現は、参照トランスポザーゼポリペプチド（例えば天然に存在するトランスポザーゼポリペプチド）とは少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失、切断及び／又は置換が異なるが、転移活性を保持するトランスポザーゼポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼポリペプチド変異体は参照トランスポザーゼポリペプチドとは１つ又は複数の置換が異なり、本分野に知られるように、上記置換は保存的又は非保存的であってもよい。いくつかの実施形態では、変異体トランスポザーゼは参照トランスポザーゼに対応する配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれかの配列同一性又は類似性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体トランスポザーゼは約５０、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１個以下のアミノ酸置換を含む。
【0080】
本明細書の上記トランスポザーゼのアミノ酸欠失を有する機能性フラグメント又はアミノ酸付加を有する変異体も考慮される。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼフラグメントの長さは少なくとも約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００個以上のいずれかのアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、アミノ酸付加又は欠失は参照トランスポザーゼのＣ末端及び／又はＮ末端で起こる。いくつかの実施形態では、アミノ酸付加又は欠失は内部位置、例えば参照トランスポザーゼの可撓性ループで起こる。いくつかの実施形態では、アミノ酸欠失（例えば、Ｎ末端及び／又はＣ末端のトゥランケイション（truncation））は約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、約１００、約１０５、約１１０、約１１５、約１２０、約１２５、約１３０、約１３５、約１４０、約１４５、約１５０、約１５５、約１６０、約１６５、約１７０、約１７５個以上のアミノ酸を含み、これらの値の間の全ての及び範囲が含まれる。いくつかの実施形態では、変異体トランスポザーゼはＮ末端又はＣ末端精製タグ、選択マーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子）又はレポーター遺伝子（例えば、蛍光レポーター遺伝子）を含む。
【0081】
上記の通り、本発明のトランスポザーゼポリペプチドは、アミノ酸置換、欠失、切断や挿入などの多くの手段で変改されてもよい。このような操作の方法は通常本分野に知られているものである。例えば、参照ポリペプチドのアミノ酸配列変異体はＤＮＡの突然変異によって製造されてもよい。突然変異誘発及び核酸配列改変の方法は本分野に知られているものである。例えば、Kunkel (1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82: 488-492)、Kunkel et al., (1987, Methods in Enzymol, 154: 367-382)、U.S. Pat. No. 4,873,192、Watson, J. D. et al., (Molecular Biology of the Gene, Fourth Edition, Benjamin/Cummings, Menlo Park, Calif., 1987)及びそれに引用される参照文献を参照する。目的タンパク質の生物学的活性に影響しない適切なアミノ酸の替代の指導はDayhoff et al., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.)のモデルに記載される。
【0082】
いくつかの実施形態では、参照トランスポザーゼと比較して、トランスポザーゼはコドンが最適化される。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは哺乳類細胞例えばヒト細胞内で発現するようにコドンが最適化される。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは植物細胞内で発現するようにコドンが最適化される。
【0083】
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５３～７８及び１０３～１１４から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％ 、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５３～７８及び１０３～１１４から選択されるアミノ酸配列を含む。
【0084】
いくつかの実施形態では、上記転移因子は以下を含む。１）ＬＴＦの５’ＴＲであって、ＬＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１５の核酸配列を含む。２）ＲＴＦの３’ＴＲであって、上記ＲＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４１の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＴＡＧＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む５’ＴＲと、２）ＧＣＣＴＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７）の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １の核酸配列を含む５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７の核酸配列を含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＧＴＡＴＧＧＡＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９１）の核酸配列を含む５’ＴＳＤと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９１の核酸配列を含む３’ＴＳＤと、をさらに含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は５’ＴＳＤ及び／又は３’ＴＳＤを含まない。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１５の核酸配列の配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＬＴＦと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４１の核酸配列の配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＲＴＦと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５３のアミノ酸配列又はその変異体を含むトランスポザーゼに関連する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５３のアミノ酸配列と少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含まない。
SEQ ID NO: 53(hAT-2_AGのトランスポザーゼ)
MASNVATSSSIWDHFTRNGTKAKCRYCYNEIAFTKGSTSNLKRHMKAKHPSISLERQHLASTTSPSTQNSEPGPSCSSRPPNLISNFFKQPMNSETKRKLDMMLLKLICKDCLPLSIVESEAFKTFVGCLNQNYDLPTRKNVSNALLPSIYNEILVKVQGEVRNATSIALTTDGWTNVNNTSFLGLTAHFIDNDYKLRSCLLECSEISLSHSGQNIAAWIKEVIIKYEIQDKIVGIVTDNAANMKSAARELEFNHVTCFAHSLHLIVKDAIKKSIISTVDEVKRIVMYFKKSPKATNELADTQSKFNLPNLKLKQDVPTRWNSTYDMLNRFYKNKIAIVACADKLNTLDPIKIDWAILEHSLNALKIFDVATNMVSAEKNITVSHVGLLSKMIIRKLNETDYTIPELGNLVTHLKEGVKKRLEIYSNNQIIAKSMLLDPRIKKQGFHEEPLKYRETYELIIQELIPFQTPSMNAQEPHNIDNEANLLLGEFITWVNNAECEIESPIELAKNELNSFLKIRNIDIKNDPLEWWRIHSSKYPSIYALAKTIICIPGTSVPCERLFSKAGQIYSDKRSRLHPKKFKEIIFIQQNVDKF
SEQ ID NO: 53(hAT-2_AGのトランスポザーゼ)
MASNVATSSSIWDHFTRNGTKAKCRYCYNEIAFTKGSTSNLKRHMKAKHPSISLERQHLASTTSPSTQNSEPGPSCSSRPPNLISNFFKQPMNSETKRKLDMMLLKLICKDCLPLSIVESEAFKTFVGCLNQNYDLPTRKNVSNALLPSIYNEILVKVQGEVRNATSIALTTDGWTNVNNTSFLGLTAHFIDNDYKLRSCLLECSEISLSHSGQNIAAWIKEVIIKYEIQDKIVGIVTDNAANMKSAARELEFNHVTCFAHSLHLIVKDAIKKSIISTVDEVKRIVMYFKKSPKATNELADTQSKFNLPNLKLKQDVPTRWNSTYDMLNRFYKNKIAIVACADKLNTLDPIKIDWAILEHSLNALKIFDVATNMVSAEKNITVSHVGLLSKMIIRKLNETDYTIPELGNLVTHLKEGVKKRLEIYSNNQIIAKSMLLDPRIKKQGFHEEPLKYRETYELIIQELIPFQTPSMNAQEPHNIDNEANLLLGEFITWVNNAECEIESPIELAKNELNSFLKIRNIDIKNDPLEWWRIHSSKYPSIYALAKTIICIPGTSVPCERLFSKAGQIYSDKRSRLHPKKFKEIIFIQQNVDKF
【0085】
いくつかの実施形態では、上記転移因子は以下を含む：１）ＬＴＦの５’ＴＲであって、上記ＬＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１６の核酸配列を含む。２）ＲＴＦの３’ＴＲであって、上記ＲＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４２の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＴＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２）核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む５’ＴＲと、２）ＣＴＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２８）の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２８の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２の核酸配列を含む５’ＴＲｔ、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２８の核酸配列を含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＡＴＧＴＧＡＡＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９２）の核酸配列を含む５’ＴＳＤと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９２の核酸配列を含む３’ＴＳＤと、をさらに含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は５’ＴＳＤ及び／又は３’ＴＳＤを含まない。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１６の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＬＴＦと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４２の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＲＴＦと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５４のアミノ酸配列又はその変異体を含むトランスポザーゼに関連する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５４のアミノ酸配列と少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含まない。
SEQ ID NO: 54(HAT1_AGのトランスポザーゼ)
MMAPTNATTSPVWDHFSPVETGAKCLYCLKVFKYTKGTTSNLKRHLNLVHKTVPYLKQKQPIPQTINIDDEAGPSAVNFQPSNQYFNSNMSIQGYLKKPINSETKKVLDRMLLDLICKECLPFNLVESEIFKKFVYTLNPNYIMPTRKSLSNALLPSVYNQEFEKAKEKLSTAKAIAITSDGWTNLNQISFFALTGHYIDENCKLSSILIECSEFENPHSGRNIANWIQGTLNKFDIEDKIVAMVTDNASNMKAASTELNFCHIPCFAHTLNLIVRDAIKKSVLPVVEEVKRVVMLFKKSPKASQMLADTQKKLNLDQLKMIQEVSTRWNSGYDMLNRFYKNKIALLSCADSLKMKISLESHDWEAIEQIVRVLKYFYSATNIVSAQKYITISHVGLLCNVLLTKTSQFRNDEDIAENIQNLVALLIEGLQNKLKIYRSNEQILKSMILDPRIKQLGFQDDVEKFKNICESIISELLPLQKPAVEVEKVVKKVSKDVDMLFGDLLKNKGAQNYKTPRQIAENELHQYLSVENIDLENDPLLWWKEHQVLYPSLYTLAMSTLCIPGTSVPCERLFSKAGQIYSEKRSRLAPKKLQEILFIQQNA
SEQ ID NO: 54(HAT1_AGのトランスポザーゼ)
MMAPTNATTSPVWDHFSPVETGAKCLYCLKVFKYTKGTTSNLKRHLNLVHKTVPYLKQKQPIPQTINIDDEAGPSAVNFQPSNQYFNSNMSIQGYLKKPINSETKKVLDRMLLDLICKECLPFNLVESEIFKKFVYTLNPNYIMPTRKSLSNALLPSVYNQEFEKAKEKLSTAKAIAITSDGWTNLNQISFFALTGHYIDENCKLSSILIECSEFENPHSGRNIANWIQGTLNKFDIEDKIVAMVTDNASNMKAASTELNFCHIPCFAHTLNLIVRDAIKKSVLPVVEEVKRVVMLFKKSPKASQMLADTQKKLNLDQLKMIQEVSTRWNSGYDMLNRFYKNKIALLSCADSLKMKISLESHDWEAIEQIVRVLKYFYSATNIVSAQKYITISHVGLLCNVLLTKTSQFRNDEDIAENIQNLVALLIEGLQNKLKIYRSNEQILKSMILDPRIKQLGFQDDVEKFKNICESIISELLPLQKPAVEVEKVVKKVSKDVDMLFGDLLKNKGAQNYKTPRQIAENELHQYLSVENIDLENDPLLWWKEHQVLYPSLYTLAMSTLCIPGTSVPCERLFSKAGQIYSEKRSRLAPKKLQEILFIQQNA
【0086】
いくつかの実施形態では、上記転移因子は以下を含む。１）ＬＴＦの５’ＴＲであって、上記ＬＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１７の核酸配列を含む。２）ＲＴＦの３’ＴＲであって、上記ＲＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４３の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２９の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２９の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３の核酸配列を含む５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２９の核酸配列を含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＴＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９３）の核酸配列を含む ５’ＴＳＤと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９３の核酸配列を含む３’ＴＳＤと、をさらに含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は５’ＴＳＤ及び／又は３’ＴＳＤを含まない。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１７の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＬＴＦと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４３の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＲＴＦと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５５のアミノ酸配列又はその変異体を含むトランスポザーゼに関連する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５５のアミノ酸配列と少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、 ９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含まない。
SEQ ID NO: 3(Tc1-8B_DRの5'TR)
CAGCGGGGAAAATAAGTATTTGACACATCAGCATTTTTATCAGTAAGGGGATTTCTAAGTGGGCTACTGACACAAAATTCCTACCAGATGTAGCCATCAAGCCAAATATTGAATTCATACAAAGAAATCAGAACATTTAAGTATACAAGTTGAGTCATAATAAATAAAGTGAAATGACACAGGGAATAAGTATTGAACACA
SEQ ID NO: 29(Tc1-8B_DRの3'TR)
TGTGTTCAATACTTATTCCCTGTGTCATTTCACTTTATTTATTATGACTCAACTTGTATACTTAAATGTTCTGATTTCTTTGTATGAATTCAATATTTGGCTTGATGGCTACATCTGGTAGGAATTTTGTGTCAGTAGCCCACTTAGAAATCCCCTTACTGATAAAAATGCTGATGTGTCAAATACTTATTTTCCCCGCTG
SEQ ID NO: 55(Tc1-8B_DRのトランスポザーゼ)
MMGKNKELSQDLRSLIVEKHFDGNGYRRISRMLNVPVSTVGAIIRKWKKHKFTINRPRSGAPRKIPVRGVQRIIRRVLQEPRTTRAELQEDLASAGTIVSKKTISNALNHHGIHARSPRKTPLLNKKHVEARLKFAKQHLEKPVDYWETIVWSDESKIELFGSHSTHHVWRRNGTAHHPKNTIPTVKFGGGSIMVWGCFSARGTGRLHIIEGRMNGEMYRDILDKNLLPSTRKLKMKRGWTFQQDNDPKHKAKETMKWFQRKKIKLLEWPSQSPDLNPIENLWRELKIKVHKRGPRNLQDLKTVCVEEWARITPEQCRRLVSPYKRRLEAVITNKGFSTKY
SEQ ID NO: 3(Tc1-8B_DRの5'TR)
CAGCGGGGAAAATAAGTATTTGACACATCAGCATTTTTATCAGTAAGGGGATTTCTAAGTGGGCTACTGACACAAAATTCCTACCAGATGTAGCCATCAAGCCAAATATTGAATTCATACAAAGAAATCAGAACATTTAAGTATACAAGTTGAGTCATAATAAATAAAGTGAAATGACACAGGGAATAAGTATTGAACACA
SEQ ID NO: 29(Tc1-8B_DRの3'TR)
TGTGTTCAATACTTATTCCCTGTGTCATTTCACTTTATTTATTATGACTCAACTTGTATACTTAAATGTTCTGATTTCTTTGTATGAATTCAATATTTGGCTTGATGGCTACATCTGGTAGGAATTTTGTGTCAGTAGCCCACTTAGAAATCCCCTTACTGATAAAAATGCTGATGTGTCAAATACTTATTTTCCCCGCTG
SEQ ID NO: 55(Tc1-8B_DRのトランスポザーゼ)
MMGKNKELSQDLRSLIVEKHFDGNGYRRISRMLNVPVSTVGAIIRKWKKHKFTINRPRSGAPRKIPVRGVQRIIRRVLQEPRTTRAELQEDLASAGTIVSKKTISNALNHHGIHARSPRKTPLLNKKHVEARLKFAKQHLEKPVDYWETIVWSDESKIELFGSHSTHHVWRRNGTAHHPKNTIPTVKFGGGSIMVWGCFSARGTGRLHIIEGRMNGEMYRDILDKNLLPSTRKLKMKRGWTFQQDNDPKHKAKETMKWFQRKKIKLLEWPSQSPDLNPIENLWRELKIKVHKRGPRNLQDLKTVCVEEWARITPEQCRRLVSPYKRRLEAVITNKGFSTKY
【0087】
いくつかの実施形態では、上記転移因子は以下を含む。１）ＬＴＦの５’ＴＲであって、上記ＬＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１８の核酸配列を含む。２）ＲＴＦの３’ＴＲであって、上記ＲＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４４の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３０の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３０の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４の核酸配列を含む５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３０の核酸配列を含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＴＴＡＧＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９５）の核酸配列を含む５’ＴＳＤと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９５の核酸配列を含む３’ＴＳＤと、をさらに含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は５’ＴＳＤ及び／又は３’ＴＳＤを含まない。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１８の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＬＴＦと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４４の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＲＴＦと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５６のアミノ酸配列又はその変異体を含むトランスポザーゼに関連する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５６のアミノ酸配列と少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、 ９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含まない。
SEQ ID NO: 56(hAT-6_PMのトランスポザーゼ)
MAKRKKDDEYRTFQDEWTEEFAFVERAGSAVCLICNDKITSLKRSNVKRHFDTRHATFASKYPAGDSRKKACQELLSRVQASQQQLRVWTRQGDYNSASFAGSLAIVRNGKPFTDGEYAKTFMLDVANELFDDLPNKDKIIKRIQDMPLSARTVHDRTIVMANKVEETQVKDINAAPFFSLALDESTDVSHLSQFSVIARYAVGDTLREESLAVLPLKGSTRGEDLFKSFMEFAQEKSLPMDKLLSVCTDGAPCMVGKNKGFVALLREHENRPILSFHCIIHQEALCAQMCDRQFGEVMSLVIRVINFIVARALNDRQFKTLLDEVVNNYPGLLLHSNVRWLSRGKVLSRFAACLNEIRTFLEMKGVGHPELADTEWLLKFYYLVDLTEHLNQLNVKMQGIGNTVLSLQQAVFAFENKLELFITDLETGRLLHFEKLSQFKDACTASEPIQNLDLHQLAGCTSSLLQSFKARFGEFREHTRLFKFITHPNECSLNTADLNYIPGVSVRDFEAEVADLKASDMWVNKFKSLNEDLERITRQKAELASKHMWTEMKKLQPEDQLILKTWNALPVTYHTLQRVSIAVLTMFGSTYACEQSFSHLKNIKSNLRSRLTDESLNACMKLNLTKYQPDYKDISKSMQHQKSH
SEQ ID NO: 56(hAT-6_PMのトランスポザーゼ)
MAKRKKDDEYRTFQDEWTEEFAFVERAGSAVCLICNDKITSLKRSNVKRHFDTRHATFASKYPAGDSRKKACQELLSRVQASQQQLRVWTRQGDYNSASFAGSLAIVRNGKPFTDGEYAKTFMLDVANELFDDLPNKDKIIKRIQDMPLSARTVHDRTIVMANKVEETQVKDINAAPFFSLALDESTDVSHLSQFSVIARYAVGDTLREESLAVLPLKGSTRGEDLFKSFMEFAQEKSLPMDKLLSVCTDGAPCMVGKNKGFVALLREHENRPILSFHCIIHQEALCAQMCDRQFGEVMSLVIRVINFIVARALNDRQFKTLLDEVVNNYPGLLLHSNVRWLSRGKVLSRFAACLNEIRTFLEMKGVGHPELADTEWLLKFYYLVDLTEHLNQLNVKMQGIGNTVLSLQQAVFAFENKLELFITDLETGRLLHFEKLSQFKDACTASEPIQNLDLHQLAGCTSSLLQSFKARFGEFREHTRLFKFITHPNECSLNTADLNYIPGVSVRDFEAEVADLKASDMWVNKFKSLNEDLERITRQKAELASKHMWTEMKKLQPEDQLILKTWNALPVTYHTLQRVSIAVLTMFGSTYACEQSFSHLKNIKSNLRSRLTDESLNACMKLNLTKYQPDYKDISKSMQHQKSH
【0088】
いくつかの実施形態では、上記転移因子は以下を含む：１）ＬＴＦの５’ＴＲであって、上記ＬＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１９の核酸配列を含む。２）ＲＴＦの３’ＴＲであって、上記ＲＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４５の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＣＡＧＧＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５）の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３１の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３１の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８ ％、９９％以上）の配列同一性を有する核酸配列を有する３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５の核酸配列を含む５’ＴＲと、２）ＣＣＣＣＴＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３１）を含む核酸配列の３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＣＴＧＴＡＴＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９６）の核酸配列を含む５’ＴＳＤと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９６の核酸配列を含む３’ＴＳＤと、をさらに含む。転移因子は５’ＴＳＤ及び／又は３’ＴＳＤを含まない。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１９の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＬＴＦと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４５の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＲＴＦと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５７のアミノ酸配列又はその変異体を含むトランスポザーゼに関連する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５７のアミノ酸配列と少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、 ９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含まない。
SEQ ID NO: 57(hAT-3_XTのトランスポザーゼ)
MTSSQPAVKRKIDDEHRQFQEKWEMQYFFVEHRGIPTCLICAEKVAVHKEYNLKRHYSTKHAEECAKYQGDERAKRVASLKACLMRQQDFFKKATKENVASVQASYMVSEMIAKAGKPFTEGEFVKKCMLQVASIICPEKKGQFSKISLSANTVAERISDMSSDIYHQLCEKAKCFDAYSVALDESTDITGTAQLTIYVRGVDCNFELTEELLTIIPMHGQTTANEIFHHLCDAIENAGLPWKRFVGIITDGAPSMTGRKNGLVALVKKKLEEEGIEEEAIALHCIIHQQALCSKCLPCDNVMSVVVKCVNQIRSRGLTHRRFRAFLEEMGSEYGDVLYFTEVRWLSRGNVLKRFFELREEVKAFMEKNGKAVSELSDHKWLMDLAFLVDITQRLNVLNKMLQGQGQLVSAAYDNVRAFSTKLVLWKSQLSQTNLCHFPACKELVDAGIPFSGEKYVDAIFKLEKEFDHRFADFKTHRATFQIFVDPFSFDVQDAPPVLQMELIDLQCNSDIKAKFREMSGKADTHVQFLRELPPSFPELSRMFKRTMCLFGSTYLCEK
SEQ ID NO: 57(hAT-3_XTのトランスポザーゼ)
MTSSQPAVKRKIDDEHRQFQEKWEMQYFFVEHRGIPTCLICAEKVAVHKEYNLKRHYSTKHAEECAKYQGDERAKRVASLKACLMRQQDFFKKATKENVASVQASYMVSEMIAKAGKPFTEGEFVKKCMLQVASIICPEKKGQFSKISLSANTVAERISDMSSDIYHQLCEKAKCFDAYSVALDESTDITGTAQLTIYVRGVDCNFELTEELLTIIPMHGQTTANEIFHHLCDAIENAGLPWKRFVGIITDGAPSMTGRKNGLVALVKKKLEEEGIEEEAIALHCIIHQQALCSKCLPCDNVMSVVVKCVNQIRSRGLTHRRFRAFLEEMGSEYGDVLYFTEVRWLSRGNVLKRFFELREEVKAFMEKNGKAVSELSDHKWLMDLAFLVDITQRLNVLNKMLQGQGQLVSAAYDNVRAFSTKLVLWKSQLSQTNLCHFPACKELVDAGIPFSGEKYVDAIFKLEKEFDHRFADFKTHRATFQIFVDPFSFDVQDAPPVLQMELIDLQCNSDIKAKFREMSGKADTHVQFLRELPPSFPELSRMFKRTMCLFGSTYLCEK
【0089】
いくつかの実施形態では、上記転移因子は以下を含む。１）ＬＴＦの５’ＴＲであって、上記ＬＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２０の核酸配列を含む。２）ＲＴＦの３’ＴＲであって、上記ＲＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４６の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３２の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３２の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６の核酸配列を含む５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３２の核酸配列を含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９３の核酸配列を含む５’ＴＳＤと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９３の核酸配列を含む３’ＴＳＤと、をさらに含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は５’ＴＳＤ及び／又は３’ＴＳＤを含まない。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２０の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＬＴＦと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４６の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＲＴＦと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５８のアミノ酸配列又はその変異体を含むトランスポザーゼに関連する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５８のアミノ酸配列と少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含まない。
SEQ ID NO: 6(Tc1-3_Xtの5'TR)
CAGTGGAGGAAATAATTATTTGACCCCTCACTGATTTTGTAAGTTTGTCCAATGACAAAGAAATGAAAAGTCTCAGAACAGTATCATTTCAATGGTAGGTTTATTTTAACAGTGGCAGATAGCACATCAAAAGGAAAATCGAAAAAATAACTTTAAATAAAAGATAGCAACTGATTTGCATTTCATTGAGTGAAATAAGTTTTTGAACCC
SEQ ID NO: 32(Tc1-3_Xtの3'TR)
GGGTTCAAAAACTTATTTCACTCAATGAAATGCAAATCAGTTGCTATCTTTTATTTAAAGTTATTTTTTCGATTTTCCTTTTGATGTGCTATCTGCCACTGTTAAAATAAACCTACCATTGAAATGATACTGTTCTGAGACTTTTCATTTCTTTGTCATTGGACAAACTTACAAAATCAGTGAGGGGTCAAATAATTATTTCCTCCACTG
SEQ ID NO: 58(Tc1-3_Xtのトランスポザーゼ)
MGKTKELSKDVRDKIVDLHKAGMGYKTISKKLGEKVTTVGAIVRKWKEHKMTINRPRSGAPRKISPRGVSMILRKVKKHPRTTREELVNDLKLAGTTVTKKTIGNTLHRNGLKSCRARKVPLLKKAHVQARLKFANEHLNDSVSDWEKVLWSDETKIELFGINSTRCVWRKKNAAYDPQNTVPTVKHGGGNILLWGCFSAKGTGQLIRINGKMDGAMYREILNDNLLPSARKLKMGRGWVFQHDNDPKHTAKATKEWLKKKHIKVMEWPSQSPDLNPIENLWRELKLRVAQRQPRNLRDLEMICKEEWTNIPPKMCANLVINYKKRLTSVLANKGFSTKY
SEQ ID NO: 6(Tc1-3_Xtの5'TR)
CAGTGGAGGAAATAATTATTTGACCCCTCACTGATTTTGTAAGTTTGTCCAATGACAAAGAAATGAAAAGTCTCAGAACAGTATCATTTCAATGGTAGGTTTATTTTAACAGTGGCAGATAGCACATCAAAAGGAAAATCGAAAAAATAACTTTAAATAAAAGATAGCAACTGATTTGCATTTCATTGAGTGAAATAAGTTTTTGAACCC
SEQ ID NO: 32(Tc1-3_Xtの3'TR)
GGGTTCAAAAACTTATTTCACTCAATGAAATGCAAATCAGTTGCTATCTTTTATTTAAAGTTATTTTTTCGATTTTCCTTTTGATGTGCTATCTGCCACTGTTAAAATAAACCTACCATTGAAATGATACTGTTCTGAGACTTTTCATTTCTTTGTCATTGGACAAACTTACAAAATCAGTGAGGGGTCAAATAATTATTTCCTCCACTG
SEQ ID NO: 58(Tc1-3_Xtのトランスポザーゼ)
MGKTKELSKDVRDKIVDLHKAGMGYKTISKKLGEKVTTVGAIVRKWKEHKMTINRPRSGAPRKISPRGVSMILRKVKKHPRTTREELVNDLKLAGTTVTKKTIGNTLHRNGLKSCRARKVPLLKKAHVQARLKFANEHLNDSVSDWEKVLWSDETKIELFGINSTRCVWRKKNAAYDPQNTVPTVKHGGGNILLWGCFSAKGTGQLIRINGKMDGAMYREILNDNLLPSARKLKMGRGWVFQHDNDPKHTAKATKEWLKKKHIKVMEWPSQSPDLNPIENLWRELKLRVAQRQPRNLRDLEMICKEEWTNIPPKMCANLVINYKKRLTSVLANKGFSTKY
【0090】
いくつかの実施形態では、上記転移因子は以下を含む：１）ＬＴＦの５’ＴＲであって、上記ＬＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２１の核酸配列を含む。２）ＲＴＦの３’ＴＲであって、上記ＲＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４７の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＣＡＧＧＧＧＴＧＧＣＧＡＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７）核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む５’ＴＲと、２）ＧＧＴＴＣＧＣＣＡＣＣＣＣＴＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３３）の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３３の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７の核酸配列を含む５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３３の核酸配列を含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＧＴＣＴＡＴＡＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９４）の核酸配列を含む５’ＴＳＤと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９４の核酸配列を含む３’ＴＳＤと、をさらに含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は５’ＴＳＤ及び／又は３’ＴＳＤを含まない。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２１の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＬＴＦと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４７の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＲＴＦと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５９のアミノ酸配列又はその変異体を含むトランスポザーゼに関連する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５９のアミノ酸配列と少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含まない。
SEQ ID NO: 59(hAT-5_DRのトランスポザーゼ)
MAESGKRTAKRKYEDERRTFLSEWEDLYFFVERNGKPFCLICQTSLSHFKASNLERHFTSLHSAVAREFPKGSELRKHKVKTLKGQAEKQTQLFRKFTKHSETVTLASYQLAWNIARAKKPYLEGEFVKKCLSDAVAILCPENENLKRSVKDLQLSRHTVEQRISDIDNSVETHLLSDLQKCQYFSIALDESCDVQDKPQLAIFVRFVSEDCTIREELLDIVPLKDRTRGIDLKETLMTVVEKANLQLSKLTAIVTDGAPAMLGSERGLVGLCKADDRFPAFWTFHCIIHQEHLVSKKLNLDHIMKPVLEIVNFVRTHALNHRQFKNLIDELDEDLPSDLLFHCAVRWLSRGHVLSRFFELLNPVKLFLAEKHKEYPELHDPQWISDLAFLVDVLHYLNGLNVDLQGKLKMLPDLVQSVFAFVNKLKLFKTHLQKRDYTHFPTLLKASGQEAEVVKGSTARYATLLENLEQSFEERFSNLRQKRQQITFLINPFTAESGCLKAPLVEDEAASQLEMIELSEDDRLKSVLREGTVEFWKIVPVERYPNVKQAALKLLSMFGSTYVCESLFSTLKLVKSKHRSVLTDTHVKELLRVATTEYEPDLKKIVETKECQVSH
SEQ ID NO: 59(hAT-5_DRのトランスポザーゼ)
MAESGKRTAKRKYEDERRTFLSEWEDLYFFVERNGKPFCLICQTSLSHFKASNLERHFTSLHSAVAREFPKGSELRKHKVKTLKGQAEKQTQLFRKFTKHSETVTLASYQLAWNIARAKKPYLEGEFVKKCLSDAVAILCPENENLKRSVKDLQLSRHTVEQRISDIDNSVETHLLSDLQKCQYFSIALDESCDVQDKPQLAIFVRFVSEDCTIREELLDIVPLKDRTRGIDLKETLMTVVEKANLQLSKLTAIVTDGAPAMLGSERGLVGLCKADDRFPAFWTFHCIIHQEHLVSKKLNLDHIMKPVLEIVNFVRTHALNHRQFKNLIDELDEDLPSDLLFHCAVRWLSRGHVLSRFFELLNPVKLFLAEKHKEYPELHDPQWISDLAFLVDVLHYLNGLNVDLQGKLKMLPDLVQSVFAFVNKLKLFKTHLQKRDYTHFPTLLKASGQEAEVVKGSTARYATLLENLEQSFEERFSNLRQKRQQITFLINPFTAESGCLKAPLVEDEAASQLEMIELSEDDRLKSVLREGTVEFWKIVPVERYPNVKQAALKLLSMFGSTYVCESLFSTLKLVKSKHRSVLTDTHVKELLRVATTEYEPDLKKIVETKECQVSH
【0091】
いくつかの実施形態では、上記転移因子は以下を含む：１）ＬＴＦの５’ＴＲであって、上記ＬＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２２の核酸配列を含む。２）ＲＴＦの３’ＴＲであって、上記ＲＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４８の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３４の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３４の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８の核酸配列を含む５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３４の核酸配列を含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９３の核酸配列を含む５’ＴＳＤと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９３の核酸配列を含む３’ＴＲと、をさらに含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は５’ＴＳＤ及び／又は３’ＴＳＤを含まない。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２２の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＬＴＦと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４８の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＲＴＦと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６０のアミノ酸配列又はその変異体を含むトランスポザーゼに関連する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６０のアミノ酸配列と少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含まない。
SEQ ID NO: 8 (Tc1-3_FRの5'TR)
CAGTGAGAGTAAAAAGTATTTGATCCCTTGCTGATTTTGTTGGTTTGTCCACTAATAAAGACATGATCATTCTATACTTTTAATGGTAGATGTATTCTAACATGGAGAGACAGAATATCAAAAAGAAAATC
SEQ ID NO: 34 (Tc1-3_FRの3'TR)
GATTTTCTTTTTGATATTCTGTCTCTCCATGTTAGAATACATCTACCATTAAAAGTATAGAATGATCATGTCTTTATTAGTGGACAAACCAACAAAATCAGCAAGGGATCAAATACTTTTTACTCTCACTG
SEQ ID NO: 60 (Tc1-3_FRのトランスポザーゼ)
MGKTKELSQDLRDRIVDLHKSGMGYKNISKLLGIKVTTIGAIVRKFKKYNMTINRPRSGAPQKISPRGVAMIMRTVRNRPATTQQELVNDLQAAGTKVTRKTIGNTLRRNGLKSCSARKVPLLKKAHVEARLKYANDHLKDAQSDWEKVLWSDETKIELFGLNSTRHVWRKKNAAYDPRNTVPTVKHGGGNIMFWGCFSAKGTGLLHRITGKMDGAMYRAVLRDNLLPSARKLKMGRGWVFQHDNDPKHTAKATKEWLKKNHIKVMEWPSQSPDLNPIENLWRELKVRVAKRQPTNLNDLERICKEEWAKIPPDMCANLVVNYNKRLTAVLANNGFATKY
SEQ ID NO: 8 (Tc1-3_FRの5'TR)
CAGTGAGAGTAAAAAGTATTTGATCCCTTGCTGATTTTGTTGGTTTGTCCACTAATAAAGACATGATCATTCTATACTTTTAATGGTAGATGTATTCTAACATGGAGAGACAGAATATCAAAAAGAAAATC
SEQ ID NO: 34 (Tc1-3_FRの3'TR)
GATTTTCTTTTTGATATTCTGTCTCTCCATGTTAGAATACATCTACCATTAAAAGTATAGAATGATCATGTCTTTATTAGTGGACAAACCAACAAAATCAGCAAGGGATCAAATACTTTTTACTCTCACTG
SEQ ID NO: 60 (Tc1-3_FRのトランスポザーゼ)
MGKTKELSQDLRDRIVDLHKSGMGYKNISKLLGIKVTTIGAIVRKFKKYNMTINRPRSGAPQKISPRGVAMIMRTVRNRPATTQQELVNDLQAAGTKVTRKTIGNTLRRNGLKSCSARKVPLLKKAHVEARLKYANDHLKDAQSDWEKVLWSDETKIELFGLNSTRHVWRKKNAAYDPRNTVPTVKHGGGNIMFWGCFSAKGTGLLHRITGKMDGAMYRAVLRDNLLPSARKLKMGRGWVFQHDNDPKHTAKATKEWLKKNHIKVMEWPSQSPDLNPIENLWRELKVRVAKRQPTNLNDLERICKEEWAKIPPDMCANLVVNYNKRLTAVLANNGFATKY
【0092】
いくつかの実施形態では、上記転移因子は以下を含む：１）ＬＴＦの５’ＴＲであって、上記ＬＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２３の核酸配列を含む。 ２）ＲＴＦの３’ＴＲであって、上記ＲＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４９の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３５の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３５の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９の核酸配列を含む５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３５の核酸配列を含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９３の核酸配列を含む５’ＴＳＤと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９３の核酸配列を含む３’ＴＳＤと、をさらに含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は５’ＴＳＤ及び／又は３’ＴＳＤを含まない。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２３の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＬＴＦと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４９の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＲＴＦと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６１のアミノ酸配列又はその変異体を含むトランスポザーゼに関連する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６１のアミノ酸配列と少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含まない。
SEQ ID NO: 9 (Tc1-5_Xtの5'TR)
CAAACCGGATTCCAAAAAAGTTGGGACACTAAACAAATTGTGAATAAAAACTGAACGCAATGATGTGGAGGTGCCAACTTCTAATATTTTATTCAGAATAGAACATAAATCACGGAACAAAAGTTTAAACTGAGAAAATGTACCATTTTAAGGGAAAAATATGTTGATTCAGAATTTCATGGTGTCAACAAATCCCAAAAAAGTTGGGACAAG
SEQ ID NO: 35 (Tc1-5_Xtの3'TR)
CTTGTCCCAACTTTTTTGGGATTTGTTGACACCATGAAATTCTGAATCAACATATTTTTCCCTTAAAATGGTACATTTTCTCAGTTTAAACTTTTGTTCCGTGATTTATGTTCTATTCTGAATAAAATATTAGAAGTTGGCACCTCCACATCATTGCGTTCAGTTTTTATTCACAATTTGTTTAGTGTCCCAACTTTTTTGGAATCCGGGTTG
SEQ ID NO: 61 (Tc1-5_Xtのトランスポザーゼ)
MIGYKKSFSEWQCLSEAKMGRGSPIPTMLRRKIVEQYQKGVTQRKIAKILHLSSSTVHNIIRRFRESGTISVRKGQGRKTILDARDLRALKRHCTTNRNATVKEITEWAQEYFQKPLSVNTIHRAIRRCQLKLYSAKKKPFLSKIHKLRRFHWARDHLKWSVAKWKTVLWSDESRFEVLFGNLGRHVIRTKEDKDNPSCYQRSVQKPASLMVWGCMSACGMGSLHVWKGSINAEKYIQVLEQHMLPSRRHLFQGRPCIFQQDNARPHSASITTSWLRRRRIRVLKWPVCSPDLSPIENIWRIIKRKVRQRRPKTIEQLEACIRQEWESIPIPKLEKLVSSVPRRLLSVVRRRGDATQW
SEQ ID NO: 9 (Tc1-5_Xtの5'TR)
CAAACCGGATTCCAAAAAAGTTGGGACACTAAACAAATTGTGAATAAAAACTGAACGCAATGATGTGGAGGTGCCAACTTCTAATATTTTATTCAGAATAGAACATAAATCACGGAACAAAAGTTTAAACTGAGAAAATGTACCATTTTAAGGGAAAAATATGTTGATTCAGAATTTCATGGTGTCAACAAATCCCAAAAAAGTTGGGACAAG
SEQ ID NO: 35 (Tc1-5_Xtの3'TR)
CTTGTCCCAACTTTTTTGGGATTTGTTGACACCATGAAATTCTGAATCAACATATTTTTCCCTTAAAATGGTACATTTTCTCAGTTTAAACTTTTGTTCCGTGATTTATGTTCTATTCTGAATAAAATATTAGAAGTTGGCACCTCCACATCATTGCGTTCAGTTTTTATTCACAATTTGTTTAGTGTCCCAACTTTTTTGGAATCCGGGTTG
SEQ ID NO: 61 (Tc1-5_Xtのトランスポザーゼ)
MIGYKKSFSEWQCLSEAKMGRGSPIPTMLRRKIVEQYQKGVTQRKIAKILHLSSSTVHNIIRRFRESGTISVRKGQGRKTILDARDLRALKRHCTTNRNATVKEITEWAQEYFQKPLSVNTIHRAIRRCQLKLYSAKKKPFLSKIHKLRRFHWARDHLKWSVAKWKTVLWSDESRFEVLFGNLGRHVIRTKEDKDNPSCYQRSVQKPASLMVWGCMSACGMGSLHVWKGSINAEKYIQVLEQHMLPSRRHLFQGRPCIFQQDNARPHSASITTSWLRRRRIRVLKWPVCSPDLSPIENIWRIIKRKVRQRRPKTIEQLEACIRQEWESIPIPKLEKLVSSVPRRLLSVVRRRGDATQW
【0093】
いくつかの実施形態では、上記転移因子は以下を含む：１）ＬＴＦの５’ＴＲであって、上記ＬＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２４の核酸配列を含む。２）ＲＴＦの３’ＴＲであって、上記ＲＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５０の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３６の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３６の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０の核酸配列を含む５’ＴＲと、和２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３６の核酸配列を含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９３の核酸配列を含む５’ＴＳＤと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９３の核酸配列を含む３’ＴＳＤと、をさらに含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は５’ＴＳＤ及び／又は３’ＴＳＤを含まない。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２４の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＬＴＦと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５０の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＲＴＦと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６２のアミノ酸配列又はその変異体を含むトランスポザーゼに関連する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６２のアミノ酸配列と少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含まない。
SEQ ID NO: 10 (c1-10_Xtの5'TRT)
CAGTGGCTTGCAAAAGTATTCGGCCCCCTTGAACTTTTCCACATTTTGTCACATTACAGCCACAAACATGAATCAATTTTATTGGAATTCCACGTGAAAGACCAATACAAAGTGGTGTACACGTGAGAAGTGGAACGAAAATCATACATGATTCCAAACATTTTTTACAAATAAATAACTGCAAAGTGGGGTGTGCGTAATTATTCAGCCCCCT
SEQ ID NO: 36 (c1-10_Xtの3'TR T)
AGGGGGCTGAATAATTACGCACACCCCACTTTGCAGTTATTTATTTGTAAAAAATGTTTGGAATCATGTATGATTTTCGTTCCACTTCTCACGTGTACACCACTTTGTATTGGTCTTTCACGTGGAATTCCAATAAAATTGATTCATGTTTGTGGCTGTAATGTGACAAAATGTGGAAAAGTTCAAGGGGGCCGAATACTTTTGCAAGCCACTG
SEQ ID NO: 62 (Tc1-10_Xのトランスポザーゼ t)
MKSKEHTRQVRDKVIEKFKAGLGYKKISKALNIPRSTVQAIIQKWKEYGTTVNLPRQGRPPKLTGRTRRALIRNAAKRPMVTLDELQRSTAQVGESVHRTTISRALHKVGLYGRVARRKPLLTENHKKSRLQFATSHVGDTANMWKKVLWSDETKMELFGQNAKRYVWRKTNTAHHSEHTIPTVKYGGGSIMLWGCFSSAGTGKLVRVDGKMDGAKYRAILEENLLESAKDLRLGRRFTFQQDNDPKHKARATMEWFKTKHIHVLEWPSQSPDLNPIENLWQDLKTAVHKRCPSNLTELELFCKEEWARISVSRCAKLVETYPKRLAAVIAAKGGSTKY
SEQ ID NO: 10 (c1-10_Xtの5'TRT)
CAGTGGCTTGCAAAAGTATTCGGCCCCCTTGAACTTTTCCACATTTTGTCACATTACAGCCACAAACATGAATCAATTTTATTGGAATTCCACGTGAAAGACCAATACAAAGTGGTGTACACGTGAGAAGTGGAACGAAAATCATACATGATTCCAAACATTTTTTACAAATAAATAACTGCAAAGTGGGGTGTGCGTAATTATTCAGCCCCCT
SEQ ID NO: 36 (c1-10_Xtの3'TR T)
AGGGGGCTGAATAATTACGCACACCCCACTTTGCAGTTATTTATTTGTAAAAAATGTTTGGAATCATGTATGATTTTCGTTCCACTTCTCACGTGTACACCACTTTGTATTGGTCTTTCACGTGGAATTCCAATAAAATTGATTCATGTTTGTGGCTGTAATGTGACAAAATGTGGAAAAGTTCAAGGGGGCCGAATACTTTTGCAAGCCACTG
SEQ ID NO: 62 (Tc1-10_Xのトランスポザーゼ t)
MKSKEHTRQVRDKVIEKFKAGLGYKKISKALNIPRSTVQAIIQKWKEYGTTVNLPRQGRPPKLTGRTRRALIRNAAKRPMVTLDELQRSTAQVGESVHRTTISRALHKVGLYGRVARRKPLLTENHKKSRLQFATSHVGDTANMWKKVLWSDETKMELFGQNAKRYVWRKTNTAHHSEHTIPTVKYGGGSIMLWGCFSSAGTGKLVRVDGKMDGAKYRAILEENLLESAKDLRLGRRFTFQQDNDPKHKARATMEWFKTKHIHVLEWPSQSPDLNPIENLWQDLKTAVHKRCPSNLTELELFCKEEWARISVSRCAKLVETYPKRLAAVIAAKGGSTKY
【0094】
いくつかの実施形態では、上記転移因子は以下を含む：１）ＬＴＦの５’ＴＲであって、上記ＬＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２５の核酸配列を含む。２）ＲＴＦの３’ＴＲであって、上記ＲＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５１の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＴＡＣＡＧＴＧＴＣＧＧＡＣＡＡＡＴＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１）の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む５’ＴＲと、２）ＧＡＴＴＴＧＴＣＣＧＡＣＡＣＴＧＴＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３７）の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３７の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１の核酸配列を含む５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３７の核酸配列を含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９３の核酸配列を含む５’ＴＳＤと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９３の核酸配列を含む３’ＴＳＤと、をさらに含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は５’ＴＳＤ及び／又は３’ＴＳＤを含まない。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２５の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＬＴＦと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５１の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＲＴＦと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６３のアミノ酸配列又はその変異体を含むトランスポザーゼに関連する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６３のアミノ酸配列と少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含まない。
SEQ ID NO: 63 (Mariner2_AGのトランスポザーゼ)
MGRSAHSTQQQRLDIKRLSAAGYSQRKIAEILGRSKTFVYNALHSTGTKIPTGRPRKTSARDDARMTRLCKADPFKSARAIRDELQLSVSDRTVQRRLFENNLVGRNPRKVPLLRRCHVQARLQFAREHYDWAGENLNKWRNVLWSDESKVNLVGSDGKRFVRRPKNTAYRPQYTLKTVKHGGGNIMVWACFSWYGVGPIFWIKDIMDQHRYLNIIQTVMLPHAEWEMPLKWQFMHDNDPKHTAKAVKKWFVDQKIDVMNWPAQSPDLNPIENLWKIVKAKLPPAGSRTKEKLWKHIENAWYSIPPSTCKSLVESMPKRMRAVIRNNGHATKY
SEQ ID NO: 63 (Mariner2_AGのトランスポザーゼ)
MGRSAHSTQQQRLDIKRLSAAGYSQRKIAEILGRSKTFVYNALHSTGTKIPTGRPRKTSARDDARMTRLCKADPFKSARAIRDELQLSVSDRTVQRRLFENNLVGRNPRKVPLLRRCHVQARLQFAREHYDWAGENLNKWRNVLWSDESKVNLVGSDGKRFVRRPKNTAYRPQYTLKTVKHGGGNIMVWACFSWYGVGPIFWIKDIMDQHRYLNIIQTVMLPHAEWEMPLKWQFMHDNDPKHTAKAVKKWFVDQKIDVMNWPAQSPDLNPIENLWKIVKAKLPPAGSRTKEKLWKHIENAWYSIPPSTCKSLVESMPKRMRAVIRNNGHATKY
【0095】
いくつかの実施形態では、上記転移因子は以下を含む：１）ＬＴＦの５’ＴＲであって、上記ＬＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２６の核酸配列を含む。２）ＲＴＦの３’ＴＲであって、上記ＲＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５２の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３８の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３８の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２の核酸配列を含む５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３８の核酸配列を含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９３の核酸配列を含む５’ＴＳＤと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９３の核酸配列を含む３’ＴＳＤと、をさらに含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は５’ＴＳＤ及び／又は３’ＴＳＤを含まない。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２６の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＬＴＦと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５２の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＲＴＦと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６４のアミノ酸配列又はその変異体を含むトランスポザーゼに関連する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６４のアミノ酸配列と少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含まない。
SEQ ID NO: 12 (Tc1-1_Xtの5'TR)
CAGTGGTGTGAAAAACTATTTGCCCCCTTCCTGATTTCTTATTCTTTTGCATGTTTGTCACAC
SEQ ID NO: 38 (Tc1-1_Xtの3'TR)
GTGTGACAAACATGCAAAAGAATAAGAAATCAGGAAGGGGGCAAATAGTTTTTCACACCACTG
SEQ ID NO: 64 (Tc1-1_Xtのトランスポザーゼ)
MPRSKEIQEQMRTKVIEIYQSGKGYKAISKALGLQRTTVRAIIHKWQKHGTVVNLPRSGRPTKITPRAQRQLIREATKDPRTTSKELQASLASIKVSVHDSTIRKRLGKNGLHGRFPRRKPLLSKKNIKARLNFAKKHLNDCQDFWENTLWTDETKVELFGRCVSRYIWRKSNTAFQKKNIIPTVKYGGGSVMVWGCFAASGPGRLAVIDGTMNSTVYQKILKENVRPSVRQLKLKRSWVLQQDNDPKHTSKSTSEWLKKNKMKTLEWPSQSPDLNPIEMLWHDLKKAVHARKPSNKAELQQFCKDEWAKIPPERCKRLVASYRKRLIAVIAAKGGPTSY
SEQ ID NO: 12 (Tc1-1_Xtの5'TR)
CAGTGGTGTGAAAAACTATTTGCCCCCTTCCTGATTTCTTATTCTTTTGCATGTTTGTCACAC
SEQ ID NO: 38 (Tc1-1_Xtの3'TR)
GTGTGACAAACATGCAAAAGAATAAGAAATCAGGAAGGGGGCAAATAGTTTTTCACACCACTG
SEQ ID NO: 64 (Tc1-1_Xtのトランスポザーゼ)
MPRSKEIQEQMRTKVIEIYQSGKGYKAISKALGLQRTTVRAIIHKWQKHGTVVNLPRSGRPTKITPRAQRQLIREATKDPRTTSKELQASLASIKVSVHDSTIRKRLGKNGLHGRFPRRKPLLSKKNIKARLNFAKKHLNDCQDFWENTLWTDETKVELFGRCVSRYIWRKSNTAFQKKNIIPTVKYGGGSVMVWGCFAASGPGRLAVIDGTMNSTVYQKILKENVRPSVRQLKLKRSWVLQQDNDPKHTSKSTSEWLKKNKMKTLEWPSQSPDLNPIEMLWHDLKKAVHARKPSNKAELQQFCKDEWAKIPPERCKRLVASYRKRLIAVIAAKGGPTSY
【0096】
いくつかの実施形態では、上記転移因子は以下を含む：１）ＬＴＦの５’ＴＲであって、上記ＬＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２７の核酸配列を含む。２）ＲＴＦの３’ＴＲであって、上記ＲＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５３の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＣＡＣＴＧＧＴＧＧＡＣＡＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３）核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む５’ＴＲと、２）ＡＴＧＴＣＣＡＣＣＡＧＴＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３９）の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含み３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３９の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３の核酸配列を含む５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３９の核酸配列を含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９３の核酸配列を含む５’ＴＳＤと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９３の核酸配列を含む３’ＴＳＤと、をさらに含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は５’ＴＳＤ及び／又は３’ＴＳＤを含まない。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２７の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有するＬＴＦと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５３の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＲＴＦと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６５のアミノ酸配列又はその変異体を含むトランスポザーゼに関連する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６５のアミノ酸配列と少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含まない。
SEQ ID NO: 65 (Tc1-1_AGのトランスポザーゼ)
MGRGKHCTPEERKHIQGLYRENVPIKTICKAFGRSRTFVDNAIRSEATGKSTGRPRKTTADVDAQIVEMIRADPFKTCTRIKQELGLQVSAKTVSRRLHAAGFCARRPRKVRKLLPHHVEARIRFAEEHLAASIFWWSKIIFSDESRINLDGSDGIKYVWRFPNQAYHPKNTIKTLSHGGGHVMVWGCFSWHGTGPLFRINGTLNSEGYRKILSRKMLPYARQQFGDEEHYIFQHDNDSKHTSRTVKCYLANQDVQVLPWPALSPDLNPIENLWSTLKRQLKNQPARSADDLWTRCKVMWERIPRSECRNLIGDMAKRCQEVIANNGHQIDR
SEQ ID NO: 65 (Tc1-1_AGのトランスポザーゼ)
MGRGKHCTPEERKHIQGLYRENVPIKTICKAFGRSRTFVDNAIRSEATGKSTGRPRKTTADVDAQIVEMIRADPFKTCTRIKQELGLQVSAKTVSRRLHAAGFCARRPRKVRKLLPHHVEARIRFAEEHLAASIFWWSKIIFSDESRINLDGSDGIKYVWRFPNQAYHPKNTIKTLSHGGGHVMVWGCFSWHGTGPLFRINGTLNSEGYRKILSRKMLPYARQQFGDEEHYIFQHDNDSKHTSRTVKCYLANQDVQVLPWPALSPDLNPIENLWSTLKRQLKNQPARSADDLWTRCKVMWERIPRSECRNLIGDMAKRCQEVIANNGHQIDR
【0097】
いくつかの実施形態では、上記転移因子は以下を含む：１）ＬＴＦの５’ＴＲであって、上記ＬＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２８の核酸配列を含む。２）ＲＴＦの３’ＴＲであって、上記ＲＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５４の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＡＴＡＴＡＣＡＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４）核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む５’ＴＲと、２）ＧＴＧＴＡＴＡＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４０）の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を有する５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４０の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を有する３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４の核酸配列を含む５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４０の核酸配列を含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＡＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９８）の核酸配列を含む５’ＴＳＤと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９８の核酸配列を含む３’ＴＳＤと、をさらに含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は５’ＴＳＤ及び／又は３’ＴＳＤを含まない。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２８の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＬＴＦと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５４の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＲＴＦと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６６のアミノ酸配列又はその変異体を含むトランスポザーゼに関連する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６６のアミノ酸配列と少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含まない。
SEQ ID NO: 66 (Tc1DR3_Xtのトランスポザーゼ)
MGKKGDLSNFERGMVVGARRAGLSISQSAQLLGFSRTTISRVYKEWCEKGKTSSMRQSCGRKCLVDARGQRRMGRLIQADRRATLTEITTRYNRGMQQSICEATTRTTLRRMGYNSRRPHRVPLISTTNRKKRLQFAQAHQNWTVEDWKNVAWSDESRFLLRHSNGRVRIWRKQNENMDPSCLVTTVQAGGGGVMVWGMFSWHTLGPLVPIGHRLNATAYLSIVSDHVHPFMTTMYPSSDGYFQQDNAPCHKARIISNWFLEHDNEFTVLKWPPQSPDLNPIEHLWDVVERELRALDVHPTNLHQLQDAILSIWANISKECFQHLVESMPRRIKAVLKAKGGQTPY
SEQ ID NO: 66 (Tc1DR3_Xtのトランスポザーゼ)
MGKKGDLSNFERGMVVGARRAGLSISQSAQLLGFSRTTISRVYKEWCEKGKTSSMRQSCGRKCLVDARGQRRMGRLIQADRRATLTEITTRYNRGMQQSICEATTRTTLRRMGYNSRRPHRVPLISTTNRKKRLQFAQAHQNWTVEDWKNVAWSDESRFLLRHSNGRVRIWRKQNENMDPSCLVTTVQAGGGGVMVWGMFSWHTLGPLVPIGHRLNATAYLSIVSDHVHPFMTTMYPSSDGYFQQDNAPCHKARIISNWFLEHDNEFTVLKWPPQSPDLNPIEHLWDVVERELRALDVHPTNLHQLQDAILSIWANISKECFQHLVESMPRRIKAVLKAKGGQTPY
【0098】
いくつかの実施形態では、上記転移因子は以下を含む：１）ＬＴＦの５’ＴＲであって、上記ＬＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２９の核酸配列を含む。２）ＲＴＦの３’ＴＲであって、上記ＲＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５５の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＣＡＧＧＧＧＴＣＡＣＣＡＡＡＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５）核酸配列その変異体又はそのフラグメントを含む５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４１の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を有する５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４１の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を有する３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５の核酸配列を含む５ＴＲと、２）ＡＧＴＴＴＧＧＴＧＡＣＣＣＣＴＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４１）の核酸配列を含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＣＴＣＴＡＧＡＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９９）の核酸配列を含む５’ＴＳＤと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９９の核酸配列を含む３’ＴＳＤと、をさらに含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は５’ＴＳＤ及び／又は３’ＴＳＤを含まない。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２９の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＬＴＦと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５５の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＲＴＦと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６７のアミノ酸配列又はその変異体を含むトランスポザーゼに関連する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６７のアミノ酸配列と少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含まない。
SEQ ID NO: 67 (hAT-3_PMのトランスポザーゼ)
MATKKRKVDAECRVFNEEWGVKYFFVETKDQKASCVICSESVAVLKEYNLRRHYETKHLSTYSKFSGKLRSEKYESMKRGLETQRNLFTRKFAENESVTRTSYKIVHKMAERGKPFTDGNFIKECMMEAANDLCPERADLFGSISLSASSVVRRTEELGENIVLQIREKARNLLWYSLALDESTDLSSTSQLLVFIRGVNLDFQITEELASVCSMHGTTTGKDIFMEVQKTLQDYNLQWNQLRGVTVDGGKNMAGVRKGLVGQIRTQLEDLQIPGALFIHCIIHQQALCGKDLDISCVLKPVVSAVNFIRGHALNHRQFQAFLEEMDSDFCDLPYHTAVRWLSCGKVLFRFYKLRNEIDVFLTEKDRADPQLSDPTWLSKLSFLVDITSHMNELNLKLQGKDNLVCDLYRIIKGFRRKLSLFEAQLEGENFSHFHCFKEFCATIAEDVNLDFPKKIIRDLKKHFLKRFSDLDRIESDILLFQNPFDCNLDDVPVELQLELIDLQANDLLKEKHREGKLVEFYRCLPDVEFPKLKKFAAGMASVFGTTYVCEQTFSKMKYVKSTHRTRLTDEHLKAILLIGCSNSKPNIDDILKAKRQFHKSH
SEQ ID NO: 67 (hAT-3_PMのトランスポザーゼ)
MATKKRKVDAECRVFNEEWGVKYFFVETKDQKASCVICSESVAVLKEYNLRRHYETKHLSTYSKFSGKLRSEKYESMKRGLETQRNLFTRKFAENESVTRTSYKIVHKMAERGKPFTDGNFIKECMMEAANDLCPERADLFGSISLSASSVVRRTEELGENIVLQIREKARNLLWYSLALDESTDLSSTSQLLVFIRGVNLDFQITEELASVCSMHGTTTGKDIFMEVQKTLQDYNLQWNQLRGVTVDGGKNMAGVRKGLVGQIRTQLEDLQIPGALFIHCIIHQQALCGKDLDISCVLKPVVSAVNFIRGHALNHRQFQAFLEEMDSDFCDLPYHTAVRWLSCGKVLFRFYKLRNEIDVFLTEKDRADPQLSDPTWLSKLSFLVDITSHMNELNLKLQGKDNLVCDLYRIIKGFRRKLSLFEAQLEGENFSHFHCFKEFCATIAEDVNLDFPKKIIRDLKKHFLKRFSDLDRIESDILLFQNPFDCNLDDVPVELQLELIDLQANDLLKEKHREGKLVEFYRCLPDVEFPKLKKFAAGMASVFGTTYVCEQTFSKMKYVKSTHRTRLTDEHLKAILLIGCSNSKPNIDDILKAKRQFHKSH
【0099】
いくつかの実施形態では、上記転移因子は以下を含む：１）ＬＴＦの５’ＴＲであって、上記ＬＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３０の核酸配列を含む。２）ＲＴＦの３’ＴＲであって、上記ＲＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５６の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＣＡＧＧＧＧＴＣＡＣＣＡＡＡＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６）核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む５’ＴＲと、２）ＡＧＴＴＴＧＧＴＧＡＣＣＣＣＴＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４２）の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４２の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６の核酸配列を含む５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４２の核酸配列を含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９３の核酸配列を含む５’ＴＳＤとＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９３の核酸配列を含む３’ＴＳＤと、をさらに含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は５’ＴＳＤ及び／又は３’ＴＳＤを含まない。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３０の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＬＴＦと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５６の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＲＴＦと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６８のアミノ酸配列又はその変異体を含むトランスポザーゼに関連する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６８のアミノ酸配列と少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含まない。
SEQ ID NO: 68 (Tc1-1_PMのトランスポザーゼ)
MATKKRKVDAECRVFNEEWGVKYFFVETKDQKASCVICSESVAVLKEYNLRRHYETKHLSTYSKFSGKLRSEKYESMKRGLETQRNLFTRKFAENESVTRTSYKIVHKMAERGKPFTDGNFIKECMMEAANDLCPERADLFGSISLSASSVVRRTEELGENIVLQIREKARNLLWYSLALDESTDLSSTSQLLVFIRGVNLDFQITEELASVCSMHGTTTGKDIFMEVQKTLQDYNLQWNQLRGVTVDGGKNMAGVRKGLVGQIRTQLEDLQIPGALFIHCIIHQQALCGKDLDISCVLKPVVSAVNFIRGHALNHRQFQAFLEEMDSDFCDLPYHTAVRWLSCGKVLFRFYKLRNEIDVFLTEKDRADPQLSDPTWLSKLSFLVDITSHMNELNLKLQGKDNLVCDLYRIIKGFRRKLSLFEAQLEGENFSHFHCFKEFCATIAEDVNLDFPKKIIRDLKKHFLKRFSDLDRIESDILLFQNPFDCNLDDVPVELQLELIDLQANDLLKEKHREGKLVEFYRCLPDVEFPKLKKFAAGMASVFGTTYVCEQTFSKMKYVKSTHRTRLTDEHLKAILLIGCSNSKPNIDDILKAKRQFHKSH
SEQ ID NO: 68 (Tc1-1_PMのトランスポザーゼ)
MATKKRKVDAECRVFNEEWGVKYFFVETKDQKASCVICSESVAVLKEYNLRRHYETKHLSTYSKFSGKLRSEKYESMKRGLETQRNLFTRKFAENESVTRTSYKIVHKMAERGKPFTDGNFIKECMMEAANDLCPERADLFGSISLSASSVVRRTEELGENIVLQIREKARNLLWYSLALDESTDLSSTSQLLVFIRGVNLDFQITEELASVCSMHGTTTGKDIFMEVQKTLQDYNLQWNQLRGVTVDGGKNMAGVRKGLVGQIRTQLEDLQIPGALFIHCIIHQQALCGKDLDISCVLKPVVSAVNFIRGHALNHRQFQAFLEEMDSDFCDLPYHTAVRWLSCGKVLFRFYKLRNEIDVFLTEKDRADPQLSDPTWLSKLSFLVDITSHMNELNLKLQGKDNLVCDLYRIIKGFRRKLSLFEAQLEGENFSHFHCFKEFCATIAEDVNLDFPKKIIRDLKKHFLKRFSDLDRIESDILLFQNPFDCNLDDVPVELQLELIDLQANDLLKEKHREGKLVEFYRCLPDVEFPKLKKFAAGMASVFGTTYVCEQTFSKMKYVKSTHRTRLTDEHLKAILLIGCSNSKPNIDDILKAKRQFHKSH
【0100】
いくつかの実施形態では、上記転移因子は以下を含む：１）ＬＴＦの５’ＴＲであって、上記ＬＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３１の核酸配列を含む。２）ＲＴＦの３’ＴＲであって、上記ＲＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５７の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＣＡＧＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７）の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む５’ＴＲと、２）ＧＣＣＴＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４３）の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４３の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７の核酸配列を含む５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４３の核酸配列を含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９３の核酸配列を含む５’ＴＳＤと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９３の核酸配列を含む３’ＴＳＤと、をさらに含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は５’ＴＳＤ及び／又は３’ＴＳＤを含まない。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３１の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＬＴＦと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５７の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＲＴＦと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６９のアミノ酸配列又はその変異体を含むトランスポザーゼに関連する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６９のアミノ酸配列と少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含まない。
SEQ ID NO: 69 (Mariner-4_AMiのトランスポザーゼ)
MSAKRKSMTSPGGSAKKQRKAIDLEMKMKIINDYEAGKKVKAIARDLELAHSTISTILKDKDRVKEAVQASTGFKAIITRQRKGLIHEMEKLLAIWFDDQIQKRMPMSLLIIQAKARSIFETLKAREGEESTETFTASRGWFQRFRRRFNVHNRSISGEAASADVEAAEKFVDQFDEIIEKGGYRPEQIFNVDETGLFWKKMPERSYIHKEAKAMPGFKAFKDRVTLLLGGNVAGFKLKPFLIHRSENPRALKQVSKHTLPVYYRANSKAWMTQALFEDWFINCFIPSVKHYCLEKGVPFKIILLLDNAPGHPQHLDDLHPDVKVVYLPKNTTAILQPMDQGAIATFKVYYLRATFSKAVAATESDEVTLRDFWKSYNILHCIKNIESAWEGVTEKCMQGIWKKCLKVFVNNFEGFDKDEHVDVINKKIVELANVLNLDVEVKDIEELVEYVEGELTNEDLIELEAQQHLEEEEEEEEERMEEVQKKFTVNGLAGVFSKVNAAILELEGMDPNVERFTKVERQMNELLRCYCEIYEEKKKKKRKLQSRPH
SEQ ID NO: 69 (Mariner-4_AMiのトランスポザーゼ)
MSAKRKSMTSPGGSAKKQRKAIDLEMKMKIINDYEAGKKVKAIARDLELAHSTISTILKDKDRVKEAVQASTGFKAIITRQRKGLIHEMEKLLAIWFDDQIQKRMPMSLLIIQAKARSIFETLKAREGEESTETFTASRGWFQRFRRRFNVHNRSISGEAASADVEAAEKFVDQFDEIIEKGGYRPEQIFNVDETGLFWKKMPERSYIHKEAKAMPGFKAFKDRVTLLLGGNVAGFKLKPFLIHRSENPRALKQVSKHTLPVYYRANSKAWMTQALFEDWFINCFIPSVKHYCLEKGVPFKIILLLDNAPGHPQHLDDLHPDVKVVYLPKNTTAILQPMDQGAIATFKVYYLRATFSKAVAATESDEVTLRDFWKSYNILHCIKNIESAWEGVTEKCMQGIWKKCLKVFVNNFEGFDKDEHVDVINKKIVELANVLNLDVEVKDIEELVEYVEGELTNEDLIELEAQQHLEEEEEEEEERMEEVQKKFTVNGLAGVFSKVNAAILELEGMDPNVERFTKVERQMNELLRCYCEIYEEKKKKKRKLQSRPH
【0101】
いくつかの実施形態では、上記転移因子は以下を含む：１）ＬＴＦの５’ＴＲであって、上記ＬＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３２の核酸配列を含む。２）ＲＴＦの３’ＴＲであって、上記ＲＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５８の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＣＡＧＴＧＡＴＧＧＣＧＡＡＣＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８）の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む５’ＴＲと、２）ＡＧＧＴＴＣＧＣＣＡＴＣＡＣＴＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４４）の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４４の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８の核酸配列を含む５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４４の核酸配列を含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＧＴＣＴＡＧＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９７）の核酸配列を含む５’ＴＳＤと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９７の核酸配列を含む３’ＴＳＤと、をさらに含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は５’ＴＳＤ及び／又は３’ＴＳＤを含まない。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３２の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＬＴＦと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５８の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＲＴＦと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７０のアミノ酸配列又はその変異体を含むトランスポザーゼに関連する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７０のアミノ酸配列と少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含まない。
SEQ ID NO: 70 (Myotis_hAT1のトランスポザーゼ)
MENQKNKKARLNDKGSGSSSSRPFQDIWTEMYGIVDRNNRSLCILCNETVVSRTWNVKRHFETNHCQLLKKSIDERKEYISRQLHLYKSQSNSIIKFVRCSTNLTSASYCIAHSIAQHGKALSDGEFIKETFLRCAPALFHDMKNKDDIIKRISELPLSRNTIKDRIIDLNKNVQHQLKKDLNSCKYFSISLDETTDVTSNARLAIIARYSDGLTMREELIKLESVPISTSGNEICKVVIKTFSDLNIDISKIVSVTTDGAPNMVGKNVGFLKLFMEAIRHPLVPFHCIIHQEVLCAKSGFSELNDLMSVVTKIVNFIASRPLHKREFSALLQEVDSTYSGLLMFNNVRWLSRGKVLERFVECFEEITVFIENKDLANFPQINDHKWVSNLMFFTDLSVHMNELNLKLQGFGKSIDVMFGYIKSFESKLKIFKRDIETKTYKYFPRIKKYFEKATTTSVMESILMYQNIVNSLFEQFSERFDQFRSLEQTIKIIKYPDVVVYSTLELKDFQWMQIDDLEMQLADFQGSIWTHVFVDLRSKLENLERNRLNNEEECNYEQEILSAWNRVPDTFSDIKNLAMALLTIFSSTYFCETLFSALNNIKTNKRNRLTDEVSGACLALKCTKYEPAIEELADKLQHQKSH
SEQ ID NO: 70 (Myotis_hAT1のトランスポザーゼ)
MENQKNKKARLNDKGSGSSSSRPFQDIWTEMYGIVDRNNRSLCILCNETVVSRTWNVKRHFETNHCQLLKKSIDERKEYISRQLHLYKSQSNSIIKFVRCSTNLTSASYCIAHSIAQHGKALSDGEFIKETFLRCAPALFHDMKNKDDIIKRISELPLSRNTIKDRIIDLNKNVQHQLKKDLNSCKYFSISLDETTDVTSNARLAIIARYSDGLTMREELIKLESVPISTSGNEICKVVIKTFSDLNIDISKIVSVTTDGAPNMVGKNVGFLKLFMEAIRHPLVPFHCIIHQEVLCAKSGFSELNDLMSVVTKIVNFIASRPLHKREFSALLQEVDSTYSGLLMFNNVRWLSRGKVLERFVECFEEITVFIENKDLANFPQINDHKWVSNLMFFTDLSVHMNELNLKLQGFGKSIDVMFGYIKSFESKLKIFKRDIETKTYKYFPRIKKYFEKATTTSVMESILMYQNIVNSLFEQFSERFDQFRSLEQTIKIIKYPDVVVYSTLELKDFQWMQIDDLEMQLADFQGSIWTHVFVDLRSKLENLERNRLNNEEECNYEQEILSAWNRVPDTFSDIKNLAMALLTIFSSTYFCETLFSALNNIKTNKRNRLTDEVSGACLALKCTKYEPAIEELADKLQHQKSH
【0102】
いくつかの実施形態では、上記転移因子は以下を含む：１）ＬＴＦの５’ＴＲであって、上記ＬＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３３の核酸配列を含む。２）ＲＴＦの３’ＴＲであって、上記ＲＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５９の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＣＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９） 核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む５’ＴＲと、２）ＣＴＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４５）の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４５の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９の核酸配列を含む５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４５の核酸配列を含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＧＴＣＴＡＧＡＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２００）の核酸配列を含む５’ＴＳＤと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２００の核酸配列を含む３’ＴＳＤとをさらに含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は５’ＴＳＤ及び／又は３’ＴＳＤを含まない。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３３の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＬＴＦと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５９の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＲＴＦと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７１のアミノ酸配列又はその変異体を含むトランスポザーゼに関連する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７１のアミノ酸配列と少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含まない。
SEQ ID NO: 71 (hAT-7_PMのトランスポザーゼ)
MSGSRKRKVDNECRVFNTEWTTKYFFTEVQSKAVCLICRETVAVFKEYNISRHFATKHANYASKQSTQERAATAQRLAANLQTQQHFFHRQTAIQESTTKASFLVAFEIAKASKPFSEGEFVKECMVQTADILCPEIKSKFEKVSLSRRTVTRRVELIDENIASQLNKKSDSFELYSLALDESTDVKDTAQLLIFIRGIDDSFAITEEFLTMESLKGTTRGEDLYNQVSAVIERMKLPWSKLVNVTTDGSPNLTGKNVGLLKRIQNKVKEENPDQDLIFLHCIIHQESLCKSVLQLNHVVNPAVKLVNFIRARGLQHRQFITFLEETDADHQDLLYHSRVRWLSLGKVLQRVWELKEDIIAFLELMGKSDEFPELSDKNWLSDFAFAVDIFSHMNELNVKLQGKDQFVHDMYKHVKAFKSKLTLFSRQIANKSFAHFPTLAMQEEAPRNAKKYSKSLEDLHGEFCRRFSDFENIEQSLQLVSCPLSQDSETAPQELQLELIDLQSDSVLKEKFNSVKLNDFYASLNRATFPNLRRTAQKMLTLFGSTYVCEQTFSVMNANKARHRSKLTDQHLRSILRIATTKITPDLDALAKMGDQQHCSH
SEQ ID NO: 71 (hAT-7_PMのトランスポザーゼ)
MSGSRKRKVDNECRVFNTEWTTKYFFTEVQSKAVCLICRETVAVFKEYNISRHFATKHANYASKQSTQERAATAQRLAANLQTQQHFFHRQTAIQESTTKASFLVAFEIAKASKPFSEGEFVKECMVQTADILCPEIKSKFEKVSLSRRTVTRRVELIDENIASQLNKKSDSFELYSLALDESTDVKDTAQLLIFIRGIDDSFAITEEFLTMESLKGTTRGEDLYNQVSAVIERMKLPWSKLVNVTTDGSPNLTGKNVGLLKRIQNKVKEENPDQDLIFLHCIIHQESLCKSVLQLNHVVNPAVKLVNFIRARGLQHRQFITFLEETDADHQDLLYHSRVRWLSLGKVLQRVWELKEDIIAFLELMGKSDEFPELSDKNWLSDFAFAVDIFSHMNELNVKLQGKDQFVHDMYKHVKAFKSKLTLFSRQIANKSFAHFPTLAMQEEAPRNAKKYSKSLEDLHGEFCRRFSDFENIEQSLQLVSCPLSQDSETAPQELQLELIDLQSDSVLKEKFNSVKLNDFYASLNRATFPNLRRTAQKMLTLFGSTYVCEQTFSVMNANKARHRSKLTDQHLRSILRIATTKITPDLDALAKMGDQQHCSH
【0103】
いくつかの実施形態では、上記転移因子は以下を含む：１）ＬＴＦの５’ＴＲであって、上記ＬＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３４の核酸配列を含む。２）ＲＴＦの３’ＴＲであって、上記ＲＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６０の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４６の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４６の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０の核酸配列を含む５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４６の核酸配列を含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９３の核酸配列を含む５’ＴＳＤと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９３の核酸配列を含む３’ＴＳＤと、をさらに含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は５’ＴＳＤ及び／又は３’ＴＳＤを含まない。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３４の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＬＴＦと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６０の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＲＴＦと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７２のアミノ酸配列又はその変異体を含むトランスポザーゼに関連する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７２のアミノ酸配列と少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含まない。
SEQ ID NO: 20 (Tc1-11_Xtの5'TR)
CAGTGGATATAAAAAGTCTACACACCCCTGGTAAAATGTCAGGTTCCTGTGCTGTACAAAAATGAGACAAAGATAAATCATTTCAGAACTTTTTCCACCTTTAATGTGACCTATAAACTGTACCACTCAATTGAAAAACAAACTGAAATCTTTTAGG
SEQ ID NO: 46 (Tc1-11_Xtの3'TR)
CCTAAAAGATTTCAGTTTGTTTTTCAATTGAGTGGTACAGTTTATAGGTCACATTAAAGGTGGAAAAAGTTCTGAAATGATTTATCTTTGTCTCATTTTTGTACAGCACAGGAACCTGACATTTTACCAGGGGTGTGTAGACTTTTTATATCCACTG
SEQ ID NO: 72 (Tc1-11_Xtのトランスポザーゼ)
MVHRELPKHQRDLIVKRYQSGEGYKRISKALDIPWNTVKTVIIKWRKYGTTVTLPRTGRPSKIDEKTRRKLVREATKRPTATLKELQEYLASTGCVVHVTTISRILHMSGLWGRVARRKPFLTKKNIQARLHFAKTHLKSPKSMWEKVLWSDETKVELFGHNSKKYVWRKNNTAHHQKNTIPTVKHGGGSIMLWGCFSSAGTGALVKIEGIMNSSKYQSILAQNLQASARKLNMRRNFIFQHDNDPKHTSKSTKEWLHRKKIKVLEWPSQSPDLNPIENLWGDLKRAVHRRCPRNLTDLECFCKEEWANLAKSKCAMLIDSYPKRLSAVIKSKGASTKY
SEQ ID NO: 20 (Tc1-11_Xtの5'TR)
CAGTGGATATAAAAAGTCTACACACCCCTGGTAAAATGTCAGGTTCCTGTGCTGTACAAAAATGAGACAAAGATAAATCATTTCAGAACTTTTTCCACCTTTAATGTGACCTATAAACTGTACCACTCAATTGAAAAACAAACTGAAATCTTTTAGG
SEQ ID NO: 46 (Tc1-11_Xtの3'TR)
CCTAAAAGATTTCAGTTTGTTTTTCAATTGAGTGGTACAGTTTATAGGTCACATTAAAGGTGGAAAAAGTTCTGAAATGATTTATCTTTGTCTCATTTTTGTACAGCACAGGAACCTGACATTTTACCAGGGGTGTGTAGACTTTTTATATCCACTG
SEQ ID NO: 72 (Tc1-11_Xtのトランスポザーゼ)
MVHRELPKHQRDLIVKRYQSGEGYKRISKALDIPWNTVKTVIIKWRKYGTTVTLPRTGRPSKIDEKTRRKLVREATKRPTATLKELQEYLASTGCVVHVTTISRILHMSGLWGRVARRKPFLTKKNIQARLHFAKTHLKSPKSMWEKVLWSDETKVELFGHNSKKYVWRKNNTAHHQKNTIPTVKHGGGSIMLWGCFSSAGTGALVKIEGIMNSSKYQSILAQNLQASARKLNMRRNFIFQHDNDPKHTSKSTKEWLHRKKIKVLEWPSQSPDLNPIENLWGDLKRAVHRRCPRNLTDLECFCKEEWANLAKSKCAMLIDSYPKRLSAVIKSKGASTKY
【0104】
いくつかの実施形態では、上記転移因子は以下を含む：１）ＬＴＦの５’ＴＲであって、上記ＬＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３５の核酸配列を含む。２）ＲＴＦの３’ＴＲであって、上記ＲＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６１の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４７の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４７の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１の核酸配列を含む５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４７の核酸配列を含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９３の核酸配列を含む５’ＴＳＤと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９３の核酸配列を含む３’ＴＳＤと、をさらに含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は５’ＴＳＤ及び／又は３’ＴＳＤを含まない。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３５の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＬＴＦと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６１の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＲＴＦと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７３のアミノ酸配列又はその変異体を含むトランスポザーゼに関連する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７３のアミノ酸配列と少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含まない。
SEQ ID NO: 21 (Tc1-16_Xtの5'TR)
CAGTCATGGCCAAAATTGTTGGCACCCCAGAAATTTTTCCAGAAAATCAAGTATTTCTCACAGAAAAGTATTGCAGTAACACATGTTTTGCTATACACATGTTTATTCCCTTTGTGTGTATTGGAACAGAACAAAAAAGGGAGGAAAAAAAGCAAATTGGACATAATGTCACACAAAACTCCAAAAATGGGCTGGACAAAATTATTGGCACCCTT
SEQ ID NO: 47 (Tc1-16_Xtの3'TR)
AAGGGTGCCAATAATTTTGTCCAGCCCATTTTTGGAGTTTTGTGTGACATTATGTCCAATTTGCTTTTTTTCCTCCCTTTTTTGTTCTGTTCCAATACACACAAAGGGAATAAACATGTGTATAGCAAAACATGTGTTACTGCAATACTTTTCTGTGAGAAATACTTGATTTTCTGGAAAAATTTCTGGGGTGCCAACAATTTTGGCCATGACTG
SEQ ID NO: 73 (Tc1-16_Xtのトランスポザーゼ)
MDNRKRRRELSEDLRTKIVEKYQQSQGYKSISRDLDLPLSTVRNIIKKFATHGTVANLPGRGRKRKIDERLQRRIVRMVDKQPQTSSKEIQAVLQAQGASVSARTIRRHLNEMKRYGRRPRRTPLLTQRHKKARLQFAKMYLSKPQSFWENVLWTDETKIELFGKAHHSTVYRKRNEAYKEKNTVPTVKYGGGSMMFWGCFAASGTGCLECVQGIMKSEDYQRILGRTVEPSVRKLGLRPRSWVFQQDNDPKHTSKSTQKWMATKRWRVLKWPAMSPDLNPIEHLWRDLKIAVGKRRPSNKRDLEQFAKEEWSKIPGERCKKLIDGYRKRLISVIFSKGCATKY
SEQ ID NO: 21 (Tc1-16_Xtの5'TR)
CAGTCATGGCCAAAATTGTTGGCACCCCAGAAATTTTTCCAGAAAATCAAGTATTTCTCACAGAAAAGTATTGCAGTAACACATGTTTTGCTATACACATGTTTATTCCCTTTGTGTGTATTGGAACAGAACAAAAAAGGGAGGAAAAAAAGCAAATTGGACATAATGTCACACAAAACTCCAAAAATGGGCTGGACAAAATTATTGGCACCCTT
SEQ ID NO: 47 (Tc1-16_Xtの3'TR)
AAGGGTGCCAATAATTTTGTCCAGCCCATTTTTGGAGTTTTGTGTGACATTATGTCCAATTTGCTTTTTTTCCTCCCTTTTTTGTTCTGTTCCAATACACACAAAGGGAATAAACATGTGTATAGCAAAACATGTGTTACTGCAATACTTTTCTGTGAGAAATACTTGATTTTCTGGAAAAATTTCTGGGGTGCCAACAATTTTGGCCATGACTG
SEQ ID NO: 73 (Tc1-16_Xtのトランスポザーゼ)
MDNRKRRRELSEDLRTKIVEKYQQSQGYKSISRDLDLPLSTVRNIIKKFATHGTVANLPGRGRKRKIDERLQRRIVRMVDKQPQTSSKEIQAVLQAQGASVSARTIRRHLNEMKRYGRRPRRTPLLTQRHKKARLQFAKMYLSKPQSFWENVLWTDETKIELFGKAHHSTVYRKRNEAYKEKNTVPTVKYGGGSMMFWGCFAASGTGCLECVQGIMKSEDYQRILGRTVEPSVRKLGLRPRSWVFQQDNDPKHTSKSTQKWMATKRWRVLKWPAMSPDLNPIEHLWRDLKIAVGKRRPSNKRDLEQFAKEEWSKIPGERCKKLIDGYRKRLISVIFSKGCATKY
【0105】
いくつかの実施形態では、上記転移因子は以下を含む：１）ＬＴＦの５’ＴＲであって、上記ＬＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３６の核酸配列を含む。２）ＲＴＦの３’ＴＲであって、上記ＲＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６２の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２２の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４８の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２２の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４８の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２２の核酸配列を含む５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４８の核酸配列を含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９３の核酸配列を含む５’ＴＳＤと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９３の核酸配列を含む３’ＴＳＤと、をさらに含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は５’ＴＳＤ及び／又は３’ＴＳＤを含まない。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３６の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＬＴＦと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６２の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＲＴＦと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７４のアミノ酸配列又はその変異体を含むトランスポザーゼに関連する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７４のアミノ酸配列と少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含まない。
SEQ ID NO: 22 (Tc1-4_Xtの5'TR)
CAGTGAGGAACATAAGTATTTGAACACCCTGCGATTTTGCAAGTTCTCCCACTTAGAAATCATGGAGGGGTCTGAAATTCACATTGTAGGTGCATTCCCACTGTGAGAGACAGCATTTAAAAAAAAAATTCAGGAAATCACATTGTATGATTTTTAAAGAATGTATTTGTATTGCACTGCTGCACATAAGTATTTGAACACCTG
SEQ ID NO: 48 (Tc1-4_Xtの3'TR)
CAGGTGTTCAAATACTTATGTGCAGCAGTGCAATACAAATACATTCTTTAAAAATCATACAATGTGATTTCCTGAATTTTTTTTTTAAATGCTGTCTCTCACAGTGGGAATGCACCTACAATGTGAATTTCAGACCCCTCCATGATTTCTAAGTGGGAGAACTTGCAAAATCGCAGGGTGTTCAAATACTTATGTTCCTCACTG
SEQ ID NO: 74 (Tc1-4_Xtのトランスポザーゼ)
MGKTKELSKDTRDKIVDLHKAGKGYGAIAKQLGENRSTVGAIVRKWKRLKTTVSLPRTGAPCKISPRGVSLMIRKVRNQPRTTREELVNDMKRAGTTVSKVTVGRTLRRHGFKSCIARKVPLLKSSHVQARLKFANDHLDDPEEAWEKVMWSDETKVELFGLNFTRRVWRKNKDELHPKNTIPTVKHGGGNIMLWGCFSAKGTGRLHCIKERMNGAMYCEILSNNLLPSVRALKMGRGWVFQHDNDPKHTARITKEWLRKRHIKVLEWPSQSPDLNPIENLWRELKLRVAQRQPRNLTDLEEICVEEWAKIPVAVCANLVKNYRKRLTSVIANKGFCTKY
SEQ ID NO: 22 (Tc1-4_Xtの5'TR)
CAGTGAGGAACATAAGTATTTGAACACCCTGCGATTTTGCAAGTTCTCCCACTTAGAAATCATGGAGGGGTCTGAAATTCACATTGTAGGTGCATTCCCACTGTGAGAGACAGCATTTAAAAAAAAAATTCAGGAAATCACATTGTATGATTTTTAAAGAATGTATTTGTATTGCACTGCTGCACATAAGTATTTGAACACCTG
SEQ ID NO: 48 (Tc1-4_Xtの3'TR)
CAGGTGTTCAAATACTTATGTGCAGCAGTGCAATACAAATACATTCTTTAAAAATCATACAATGTGATTTCCTGAATTTTTTTTTTAAATGCTGTCTCTCACAGTGGGAATGCACCTACAATGTGAATTTCAGACCCCTCCATGATTTCTAAGTGGGAGAACTTGCAAAATCGCAGGGTGTTCAAATACTTATGTTCCTCACTG
SEQ ID NO: 74 (Tc1-4_Xtのトランスポザーゼ)
MGKTKELSKDTRDKIVDLHKAGKGYGAIAKQLGENRSTVGAIVRKWKRLKTTVSLPRTGAPCKISPRGVSLMIRKVRNQPRTTREELVNDMKRAGTTVSKVTVGRTLRRHGFKSCIARKVPLLKSSHVQARLKFANDHLDDPEEAWEKVMWSDETKVELFGLNFTRRVWRKNKDELHPKNTIPTVKHGGGNIMLWGCFSAKGTGRLHCIKERMNGAMYCEILSNNLLPSVRALKMGRGWVFQHDNDPKHTARITKEWLRKRHIKVLEWPSQSPDLNPIENLWRELKLRVAQRQPRNLTDLEEICVEEWAKIPVAVCANLVKNYRKRLTSVIANKGFCTKY
【0106】
いくつかの実施形態では、上記転移因子は以下を含む：１）ＬＴＦの５’ＴＲであって、上記ＬＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３７の核酸配列を含む。２）ＲＴＦの３’ＴＲであって、上記ＲＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６３の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＣＡＣＴＧＣＴＣＡＡＡＡＡＡＡＴＡＡＡＧＧＧＡＡＣＡＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２３）の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む５’ＴＲと、２）ＧＴＧＴＴＣＣＣＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＴＴＧＡＧＣＡＧＴＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４９）の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２３の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４９の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２３の核酸配列を含む５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４９の核酸配列を含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９３の核酸配列を含む５’ＴＳＤと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４９の核酸配列を含む３’ＴＳＤと、をさらに含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は５’ＴＳＤ及び／又は３’ＴＳＤを含まない。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３７の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＬＴＦと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６３の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＲＴＦと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７５のアミノ酸配列又はその変異体を含むトランスポザーゼに関連する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７５のアミノ酸配列と少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含まない。
SEQ ID NO: 75 (Tc1-15_Xtのトランスポザーゼ)
MRRSLQPTQMAQVVQLIQDGTSMRAVARRFAVSVSVVSRAWRRYQETGQYIRRRGGGRRRATTQQQDRYLRLCARRNRRSTARALQNDLQRATNVHVSAQTVRNRLHEGGMRARRPQVGVVLTAQHRAGRLAFAREHQDWQIRHWRPVLFTDESRFTLSTCDRRDRVWRRRGERSAACNILQHDRFGSGSVMVWGGISLGGRTALHVLARGSLTAIRYRDEILRPLVRPYAGAVGPGFLLMQDNARPHVAGVCQQFLQDEGIDAMDWPARSPDLNPIEHIWDIMSRSIHQRHVAPQTVQELVDALVQVWEEIPQETIRHLIRSMPRRCREVIQARGGHTHY
SEQ ID NO: 75 (Tc1-15_Xtのトランスポザーゼ)
MRRSLQPTQMAQVVQLIQDGTSMRAVARRFAVSVSVVSRAWRRYQETGQYIRRRGGGRRRATTQQQDRYLRLCARRNRRSTARALQNDLQRATNVHVSAQTVRNRLHEGGMRARRPQVGVVLTAQHRAGRLAFAREHQDWQIRHWRPVLFTDESRFTLSTCDRRDRVWRRRGERSAACNILQHDRFGSGSVMVWGGISLGGRTALHVLARGSLTAIRYRDEILRPLVRPYAGAVGPGFLLMQDNARPHVAGVCQQFLQDEGIDAMDWPARSPDLNPIEHIWDIMSRSIHQRHVAPQTVQELVDALVQVWEEIPQETIRHLIRSMPRRCREVIQARGGHTHY
【0107】
いくつかの実施形態では、上記転移因子は以下を含む：１）ＬＴＦの５’ＴＲであって、上記ＬＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３８の核酸配列を含む。２）ＲＴＦの３’ＴＲであって、上記ＲＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６４の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＣＡＣＴＧＣＴＣＡＡＡＡＡＡＡＴＴＡＧＡＧＧＡＡＣＡＣＴＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２４）の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む５’ＴＲと、２）ＡＡＧＴＧＴＴＴＣＣＴＣＴＡＡＴＴＴＴＴＴＴＴＧＡＧＣＡＧＴＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５０）の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２４の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５０の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２４の核酸配列を含む５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５０の核酸配列を含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９３の核酸配列を含む５’ＴＳＤと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９３の核酸配列を含む３’ＴＳＤと、をさらに含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は５’ＴＳＤ及び／又は３’ＴＳＤを含まない。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３８の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＬＴＦと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６４の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＲＴＦと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７６のアミノ酸配列又はその変異体を含むトランスポザーゼに関連する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７６のアミノ酸配列と少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含まない。
SEQ ID NO: 76(TC1_FR2のトランスポザーゼ)
MVRYLDATEVAQVVQLLQDGTSIRAVARRFAVSPSTVSRAWRRFQETGSYSRRAGQGRRRSLNPQQDRYLLLCARRNRMSTARALQNDLQQATGVNVSDQTIRNRLHEGGLRARRPVVGPVLTARHRRARLAFAIDHQNWQLRHWRPVLFTDESRFNLSTCDRRERVWRCRGERYAACNIIQHDRFGGGSVMVWGGISLEGRTDLYRLDNGTLTAIRYRDEILGPIVRTYAGAVGPGFLLVHDNARPHVARVCRQFLEDEGIDTIDWPPRSPDLNPIEHLWDIMFRSIRRRQVDPQTVQELSDALVQIWEEIPQDTIRRLIRSMPRRCQACVQARGGHTNY
SEQ ID NO: 76(TC1_FR2のトランスポザーゼ)
MVRYLDATEVAQVVQLLQDGTSIRAVARRFAVSPSTVSRAWRRFQETGSYSRRAGQGRRRSLNPQQDRYLLLCARRNRMSTARALQNDLQQATGVNVSDQTIRNRLHEGGLRARRPVVGPVLTARHRRARLAFAIDHQNWQLRHWRPVLFTDESRFNLSTCDRRERVWRCRGERYAACNIIQHDRFGGGSVMVWGGISLEGRTDLYRLDNGTLTAIRYRDEILGPIVRTYAGAVGPGFLLVHDNARPHVARVCRQFLEDEGIDTIDWPPRSPDLNPIEHLWDIMFRSIRRRQVDPQTVQELSDALVQIWEEIPQDTIRRLIRSMPRRCQACVQARGGHTNY
【0108】
いくつかの実施形態では、上記転移因子は以下を含む：１）ＬＴＦの５’ＴＲであって、上記ＬＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３９の核酸配列を含む。２）ＲＴＦの３’ＴＲであって、上記ＲＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６５の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＴＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５）の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む５’ＴＲと、２）ＣＴＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５１）の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５１の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５の核酸配列を含む５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５１の核酸配列を含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＡＴＣＡＴＣＡＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０１）の核酸配列を含む５’ＴＳＤと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０１の核酸配列を含む３’ＴＳＤと、をさらに含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は５’ＴＳＤ及び／又は３’ＴＳＤを含まない。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３９の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＬＴＦと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６５の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＲＴＦと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７７のアミノ酸配列又はその変異体を含むトランスポザーゼに関連する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７７のアミノ酸配列と少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含まない。
SEQ ID NO: 77(hAT-9_XTのトランスポザーゼ)
MPGKGRPPRRGTRGRAAMISCGPRKLPSFPKALTLNSQNAEEVVDWLTQHTPSSTVSNFATTSSSSSAMGTPRTTSSTTAAPSSLESEELFTHEFVELSDAQPLLPEEDEGDEDVTPDIIIQAGNTTEMDIRCDEVPAAAVFCELSEEIDASEENDDEEIDILWVPTRREQEEDSSDGETESQRGRRRIRLRRSRDSSQGTVGQQHESAPVVSQPTHPPTSTVTARKPTSKGSAVWHFFNVCASDKSAVICNECSQKLSLGKPNTHLGTTAMRRHMNAKHKALWEQHLKGSSQTLSHPPSAPASYCSTSAVLDPSQPPSTPPSTLTTSSCSSAPSQVSVRAMFERKKPMPPSHPLARRLTAGLSALLARQLLPYQLVDSEAFHQFVAIGTPQWKVPSRNFFSQKGIPHLYQHVQSQVTASLSFSVGAKVHMTTDTWSSKHGQGRYVTYTAHWVNLVMAGKQGMRGSTTVELVSPPRVACGSATTSTPPLLSNSSSKSSSNSSSNLASSSASSSSAAVSSSTPVHPQLHIGYSTCQVRRCHAVLGMTCLESRNHTGSALLSSLHSQADRWLTPHQLKIGKVVCDNGSNLLAALRLGNLTHVPCMAHVLNLIVQRFVSKYPGLQDILRQSRKVSGHFRRSYTAMARLADIQRRHNLPVRRLICDSQTRWNSTLMMFERLLQQQRAVNEYLFELGGRTGSAELGIFFPRYWVLMRDACRLMRPFDEVTNMVSRTEGTISDLIPFAFFLERAVRRVTDDAVDQRDQEHDFWAESPERSQAPAATQGEVSEVESEEEGGFVEAEDQQEQASRGACGHLLWSPGLVRGWGEETVVDEDVVLDNEEGEMDTSASNLVRMGSFMLSCLLKDPRIKRLKEKDLYWVATLLDPRYKHKVAEMLPTYHKSERMLHFQTSLQNMLYNAFKGDVTPHSRGRGAGNPPTSTPARTMHFGHSVTSDMQSFFSPRQRQDPSGSTLRERLDRQVADYLALTADIDTLRSDEPLDYWVRRLDLWPELSQFAINLLSCPASSVLSERTFSAAGGIVTEKRTRLGHKSVDYLTFIKMNEAWISEGYCTPEDLF
SEQ ID NO: 77(hAT-9_XTのトランスポザーゼ)
MPGKGRPPRRGTRGRAAMISCGPRKLPSFPKALTLNSQNAEEVVDWLTQHTPSSTVSNFATTSSSSSAMGTPRTTSSTTAAPSSLESEELFTHEFVELSDAQPLLPEEDEGDEDVTPDIIIQAGNTTEMDIRCDEVPAAAVFCELSEEIDASEENDDEEIDILWVPTRREQEEDSSDGETESQRGRRRIRLRRSRDSSQGTVGQQHESAPVVSQPTHPPTSTVTARKPTSKGSAVWHFFNVCASDKSAVICNECSQKLSLGKPNTHLGTTAMRRHMNAKHKALWEQHLKGSSQTLSHPPSAPASYCSTSAVLDPSQPPSTPPSTLTTSSCSSAPSQVSVRAMFERKKPMPPSHPLARRLTAGLSALLARQLLPYQLVDSEAFHQFVAIGTPQWKVPSRNFFSQKGIPHLYQHVQSQVTASLSFSVGAKVHMTTDTWSSKHGQGRYVTYTAHWVNLVMAGKQGMRGSTTVELVSPPRVACGSATTSTPPLLSNSSSKSSSNSSSNLASSSASSSSAAVSSSTPVHPQLHIGYSTCQVRRCHAVLGMTCLESRNHTGSALLSSLHSQADRWLTPHQLKIGKVVCDNGSNLLAALRLGNLTHVPCMAHVLNLIVQRFVSKYPGLQDILRQSRKVSGHFRRSYTAMARLADIQRRHNLPVRRLICDSQTRWNSTLMMFERLLQQQRAVNEYLFELGGRTGSAELGIFFPRYWVLMRDACRLMRPFDEVTNMVSRTEGTISDLIPFAFFLERAVRRVTDDAVDQRDQEHDFWAESPERSQAPAATQGEVSEVESEEEGGFVEAEDQQEQASRGACGHLLWSPGLVRGWGEETVVDEDVVLDNEEGEMDTSASNLVRMGSFMLSCLLKDPRIKRLKEKDLYWVATLLDPRYKHKVAEMLPTYHKSERMLHFQTSLQNMLYNAFKGDVTPHSRGRGAGNPPTSTPARTMHFGHSVTSDMQSFFSPRQRQDPSGSTLRERLDRQVADYLALTADIDTLRSDEPLDYWVRRLDLWPELSQFAINLLSCPASSVLSERTFSAAGGIVTEKRTRLGHKSVDYLTFIKMNEAWISEGYCTPEDLF
【0109】
いくつかの実施形態では、上記転移因子は以下を含む：１）ＬＴＦの５’ＴＲであって、上記ＬＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４０の核酸配列を含む。２）ＲＴＦの３’ＴＲであって、上記ＲＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６８の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＣＣＧＴＡＴＴＴＴＣＣＧＣＡＣＴＡＴＡＡＧＧＣＧＣＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２６）の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む５’ＴＲｔ、２）ＧＧＴＧＣＧＣＣＴＴＡＴＡＧＴＧＣＧＧＡＡＡＡＴＡＣＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５２）の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２６の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５２の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２６の核酸配列を含む５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５２の核酸配列を含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９３の核酸配列を含む５’ＴＳＤと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９３の核酸配列を含む３’ＴＳＤと、をさらに含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は５’ＴＳＤ及び／又は３’ＴＳＤを含まない。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４０の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＬＴＦと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６８の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＲＴＦと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７８のアミノ酸配列又はその変異体を含むトランスポザーゼに関連する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７８のアミノ酸配列と少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含まない。
SEQ ID NO: 78(Mariner-5_XTのトランスポザーゼ)
MAPKKRHAYEAQFKLQAASYAVVNGNRAAAKEFNINESMVRKWRKQENELRQVKKTKQSFRGNKARWPQLEDQLEQWVIEQRTAGRSVSTVTIRLKATTIAQDLEIEHFQGGPSWCFRFMKRRHLSIRARTTVAQQLPADYKEKMAIFRTYCSNKITDKKIQPNHITNMDEVPLTFDIPVNHTVEIKGTSTVSIRTTGHEKSAFTVVLSCHGNGQKLPPMVIFKRKTLPKEKFPAGVIVKANQKGWMDEEKMREWLREVYVKRPDGFFHTSPSLLICDSMRAHLTATVKKQVKQMNSELAIIPGGLTKELQPLDVGVNRAFKVKLRTAWERWMTDGEHTFTKTGKQRRASYATICEWIVDAWAKVSAITVVRAFAKTGIIAEQPPGNDTGNETDSDNDEREPGMFDGEIAQLFNSDTEDEDFDGFVGED
SEQ ID NO: 78(Mariner-5_XTのトランスポザーゼ)
MAPKKRHAYEAQFKLQAASYAVVNGNRAAAKEFNINESMVRKWRKQENELRQVKKTKQSFRGNKARWPQLEDQLEQWVIEQRTAGRSVSTVTIRLKATTIAQDLEIEHFQGGPSWCFRFMKRRHLSIRARTTVAQQLPADYKEKMAIFRTYCSNKITDKKIQPNHITNMDEVPLTFDIPVNHTVEIKGTSTVSIRTTGHEKSAFTVVLSCHGNGQKLPPMVIFKRKTLPKEKFPAGVIVKANQKGWMDEEKMREWLREVYVKRPDGFFHTSPSLLICDSMRAHLTATVKKQVKQMNSELAIIPGGLTKELQPLDVGVNRAFKVKLRTAWERWMTDGEHTFTKTGKQRRASYATICEWIVDAWAKVSAITVVRAFAKTGIIAEQPPGNDTGNETDSDNDEREPGMFDGEIAQLFNSDTEDEDFDGFVGED
【0110】
いくつかの実施形態では、上記転移因子は以下を含む：１）ＬＴＦの５’ＴＲであって、上記ＬＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６７の核酸配列を含む。２）ＲＴＦの３’ＴＲであって、上記ＲＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７９の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＣＣＧＴＡＴＴＴＴＣＴＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７９）の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む５’ＴＲと、２）ＧＡＧＡＡＡＡＴＡＣＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９１）の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７９の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９１の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７９の核酸配列を含む５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９１の核酸配列を含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９３の核酸配列を含む５’ＴＳＤと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９３の核酸配列を含む３’ＴＳＤと、をさらに含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は５’ＴＳＤ及び／又は３’ＴＳＤを含まない。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６７の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＬＴＦと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７９の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＲＴＦと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０３のアミノ酸配列又はその変異体を含むトランスポザーゼに関連する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０３のアミノ酸配列と少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含まない。
SEQ ID NO: 103(Mariner-6_AMiのトランスポザーゼ)
MPKRKSYTFDFKLSVIDYAKKHGNRAAGREFSVDEKSVREWRKEEDILKTLNPRKRARRGKHCKWPTLEANLKEWVVAQRESNKVVSTIAIRQKARVMANEMKITDFGGGCNWVHKFMHRNNLAVRSRTTVGQKLPDDWEEKLTKFRDFVRKECRVHNLCPADIINMDEVPISFDVPATRTVDQRGKKTIAISTTGHERTNFTVVLACTASGVKLKPMVIFKRVTMPREKIPNGVAVICNKKGWMNEDIMKEWTERCFRTRQGGFFAPKSLLIFDAMAAHKHSSVQKQINKAGAHIAVIPGGLTCKLQPLDISVNHSFKCFMRKEWEKWMSQGVHSFTPSGKQRRATYTEVCNWIVAAWRAVKPSSIINGFFKAGILDGASGEESDYTDSEDYADELDDAAFVDAYFGESSYDTDFEGFPASEKEEAPNWV
SEQ ID NO: 103(Mariner-6_AMiのトランスポザーゼ)
MPKRKSYTFDFKLSVIDYAKKHGNRAAGREFSVDEKSVREWRKEEDILKTLNPRKRARRGKHCKWPTLEANLKEWVVAQRESNKVVSTIAIRQKARVMANEMKITDFGGGCNWVHKFMHRNNLAVRSRTTVGQKLPDDWEEKLTKFRDFVRKECRVHNLCPADIINMDEVPISFDVPATRTVDQRGKKTIAISTTGHERTNFTVVLACTASGVKLKPMVIFKRVTMPREKIPNGVAVICNKKGWMNEDIMKEWTERCFRTRQGGFFAPKSLLIFDAMAAHKHSSVQKQINKAGAHIAVIPGGLTCKLQPLDISVNHSFKCFMRKEWEKWMSQGVHSFTPSGKQRRATYTEVCNWIVAAWRAVKPSSIINGFFKAGILDGASGEESDYTDSEDYADELDDAAFVDAYFGESSYDTDFEGFPASEKEEAPNWV
【0111】
いくつかの実施形態では、上記転移因子は以下を含む：１）ＬＴＦの５’ＴＲであって、上記ＬＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６８の核酸配列を含む。２）ＲＴＦの３’ＴＲであって、上記ＲＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８０の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＣＣＣＴＴＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８０）の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む５’ＴＲと、２）ＡＡＡＧＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９２）の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８０の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９２の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８０の核酸配列を含む５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９２の核酸配列を含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はＴＴＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０２）の核酸配列を含む５’ＴＳＤと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０２の核酸配列を含む３’ＴＳＤと、をさらに含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は５’ＴＳＤ及び／又は３’ＴＳＤを含まない。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６８の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＬＴＦと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８０の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＲＴＦと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０４のアミノ酸配列又はその変異体を含むトランスポザーゼに関連する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０４のアミノ酸配列と少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含まない。
SEQ ID NO: 104(piggyBac-2_XTのトランスポザーゼ)
MAKRFYSAEEAAAHCMASSSEEFSGSDSEYVPPASESDSSTEESWCSSSTVSALEEPMEVDEDVDDLEDQEAGDRADAAAGGEPAWGPPCNFPPEIPPFTTVPGVKVDTSNFEPINFFQLFMTEAILQDMVLYTNVYAEQYLTQNPLPRYARAHAWHPTDIAEMKRFVGLTLAMGLIKANSLESYWDTTTVLSIPVFSATMSRNRYQLLLRFLHFNNNATAVPPDQPGHDRLHKLRPLIDSLSERFAAVYTPCQNICIDESLLLFKGRLQFRQYIPSKRARYGIKFYKLCESSSGYTSYFLIYEGKDSKLDPPGCPPDLTVSGKIVWELISPLLGQGFHLYVDNFYSSIPLFTALYCLDTPACGTINRNRKGLPRALLDKKLNRGETYALRKNELLAIKFFDKKNVFMLTSIHDESVIREQRVGRPPKNKPLCSKEYSKYMGGVDRTDQLQHYYNATRKTRAWYKKVGIYLIQMALRNSYIVYKAAVPGPKLSYYKYQLQILPALLFGGVEEQTVPEMPPSDNVARLIGKHFIDTLPPTPGKQRPQKGCKVCRKRGIRRDTRYYCPKCPRNPGLCFKPCFEIYHTQLHY
SEQ ID NO: 104(piggyBac-2_XTのトランスポザーゼ)
MAKRFYSAEEAAAHCMASSSEEFSGSDSEYVPPASESDSSTEESWCSSSTVSALEEPMEVDEDVDDLEDQEAGDRADAAAGGEPAWGPPCNFPPEIPPFTTVPGVKVDTSNFEPINFFQLFMTEAILQDMVLYTNVYAEQYLTQNPLPRYARAHAWHPTDIAEMKRFVGLTLAMGLIKANSLESYWDTTTVLSIPVFSATMSRNRYQLLLRFLHFNNNATAVPPDQPGHDRLHKLRPLIDSLSERFAAVYTPCQNICIDESLLLFKGRLQFRQYIPSKRARYGIKFYKLCESSSGYTSYFLIYEGKDSKLDPPGCPPDLTVSGKIVWELISPLLGQGFHLYVDNFYSSIPLFTALYCLDTPACGTINRNRKGLPRALLDKKLNRGETYALRKNELLAIKFFDKKNVFMLTSIHDESVIREQRVGRPPKNKPLCSKEYSKYMGGVDRTDQLQHYYNATRKTRAWYKKVGIYLIQMALRNSYIVYKAAVPGPKLSYYKYQLQILPALLFGGVEEQTVPEMPPSDNVARLIGKHFIDTLPPTPGKQRPQKGCKVCRKRGIRRDTRYYCPKCPRNPGLCFKPCFEIYHTQLHY
【0112】
いくつかの実施形態では、上記転移因子は以下を含む：１）ＬＴＦの５’ＴＲであって、上記ＬＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６９の核酸配列を含む。２）ＲＴＦの３’ＴＲであって、上記ＲＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８１の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＣＣＴＴＣＡＴＡＣＧ ＴＴＣＣＣＡＴＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８１）の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む５’ＴＲと、２）ＣＡＴＧＡＧＡＡＣＧ ＧＡＴＧＡＧＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９３）の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８１の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９３の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８１の核酸配列を含む５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９３の核酸配列を含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０２の核酸配列を含む５’ＴＳＤと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０２の核酸配列を含む３’ＴＳＤと、をさらに含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は５’ＴＳＤ及び／又は３’ＴＳＤを含まない。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６９の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＬＴＦと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８１の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＲＴＦと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０５のアミノ酸配列又はその変異体を含むトランスポザーゼに関連する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０５のアミノ酸配列と少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含まない。
SEQ ID NO: 105(piggyBac-1_AMiのトランスポザーゼ)
MRRQRIFSAEACLAQVTGDDSDTSTDEILSQGSEDADFVPDMGDCSEQEDHASTEASSSSDEEELVPQAEVMPTLPVGKGRGPARGRRGRPRRATAGRGAEPLPPPPENIADDDTFRGRNGRVWGKSPQLIHHRRTAKDIVHESAGPTRESNKDTVVETFHLFLSQDILTVIIRETNREAERRFREWNDSHPENRKEWKKLDETELKAYIGLLLLSGLYHGGHEALEELWEQRTGRPCFRATMSLKRFRQITNYLRFDNKLTREERRAVDKLAAFRDIWTQFVEQLRKWYIPGIHLTVDEQLIAFRGRCPFRQYMPSKPAKYGLKIWWCCDAATSFPLSGDIYLGKQPEAPRQGNLGTQVIEKLVHPWYKTGRNIVGDNFFTSTDLAERLLQQDLTYVGTIRKNKADIPNEMQANRRRETFSSIFAFDGELTLVSYVPKKSKVVLLLSSMHHDLSVGGEQRKPDIIHDYNKNKGGVDNLDHLVRMTTCRRKINRWPMTLFFNMLDVAAIASLIIWLGHNANWKQRSHLRRRRFFLQELGEQLIDGQIKRRMMDTRNLSKSVKSGMTALNYKLPQRTPVEPSASMSGRCAFCPRTDDRKTRKRCEDCKRFACVHHSTSLLLCEECNI
SEQ ID NO: 105(piggyBac-1_AMiのトランスポザーゼ)
MRRQRIFSAEACLAQVTGDDSDTSTDEILSQGSEDADFVPDMGDCSEQEDHASTEASSSSDEEELVPQAEVMPTLPVGKGRGPARGRRGRPRRATAGRGAEPLPPPPENIADDDTFRGRNGRVWGKSPQLIHHRRTAKDIVHESAGPTRESNKDTVVETFHLFLSQDILTVIIRETNREAERRFREWNDSHPENRKEWKKLDETELKAYIGLLLLSGLYHGGHEALEELWEQRTGRPCFRATMSLKRFRQITNYLRFDNKLTREERRAVDKLAAFRDIWTQFVEQLRKWYIPGIHLTVDEQLIAFRGRCPFRQYMPSKPAKYGLKIWWCCDAATSFPLSGDIYLGKQPEAPRQGNLGTQVIEKLVHPWYKTGRNIVGDNFFTSTDLAERLLQQDLTYVGTIRKNKADIPNEMQANRRRETFSSIFAFDGELTLVSYVPKKSKVVLLLSSMHHDLSVGGEQRKPDIIHDYNKNKGGVDNLDHLVRMTTCRRKINRWPMTLFFNMLDVAAIASLIIWLGHNANWKQRSHLRRRRFFLQELGEQLIDGQIKRRMMDTRNLSKSVKSGMTALNYKLPQRTPVEPSASMSGRCAFCPRTDDRKTRKRCEDCKRFACVHHSTSLLLCEECNI
【0113】
いくつかの実施形態では、上記転移因子は以下を含む：１）ＬＴＦの５’ＴＲであって、上記ＬＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７０の核酸配列を含む。２）ＲＴＦの３’ＴＲであって、上記ＲＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８２の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＣＡＧＴＡＧＡＡＣＣ ＣＣＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８２）の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む５’ＴＲと、２）ＣＧＧＧＧＴＴＣＴＡＣＴＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９４）の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８２の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９４の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８２の核酸配列を含む５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９４の核酸配列を含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９３の核酸配列を含む５’ＴＳＤと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９３の核酸配列を含む３’ＴＳＤと、をさらに含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は５’ＴＳＤ及び／又は３’ＴＳＤを含まない。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７０の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＬＴＦと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８２の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＲＴＦと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０６のアミノ酸配列又はその変異体を含むトランスポザーゼに関連する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０６のアミノ酸配列と少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含まない。
SEQ ID NO: 106(Mariner-3_Crpのトランスポザーゼ)
MRRPSQMELRAAWVPKQDSGFSLSVAIVFKMSASNTDSTSASASTRKRKAITLEEKLEVVKRYERGEKTKEIRCATGLSESTLRTIRDNAEKIKESCKSATRLSTARVSLTRSAIMEKMERMLTTWIEHQNQEHVPLSTQVIQAKARSIYEVLKRDDPEAKPFNASAGWFDRFKARHGFHNLKLTGEAAAADKSAADKFPSILQAAIEEGSYDPRQVFNLDETGLFWKRMPSRTFISVEERTAPGFKAAKDRCTLLLGANAAGDFKLKPLMVYHAENPRALKGYAKGHLPVYWRANRKGWVTGSLFEDYFSSLLHLELRAYCDRQNLPFKILLLLDNAPGHPPSLGDLSENIKVLFLPPNTTSLIQPMDQGVIRAFKSYYLRRTFKKLINETESKEKANVKEFWKAFNIKMAIDIIGDAWNDVTQQCLNGVWKNIWPAVVNDFRGFAADEFISDARHEIVEMAKSVGFEQVDEENVAELLDSHREELSNEDLLELDRERHEEEEPMEENERPSPRVLTMKGMADAFKLLDGYLAFFDENDPNRERSAKVARLMKEANACYTELYREKRRCSVQSSLDKFFRKRDSTISTQSTDSQPSTSGGEPATSGGEISPPSFDVFDLDEDSAPH
SEQ ID NO: 106(Mariner-3_Crpのトランスポザーゼ)
MRRPSQMELRAAWVPKQDSGFSLSVAIVFKMSASNTDSTSASASTRKRKAITLEEKLEVVKRYERGEKTKEIRCATGLSESTLRTIRDNAEKIKESCKSATRLSTARVSLTRSAIMEKMERMLTTWIEHQNQEHVPLSTQVIQAKARSIYEVLKRDDPEAKPFNASAGWFDRFKARHGFHNLKLTGEAAAADKSAADKFPSILQAAIEEGSYDPRQVFNLDETGLFWKRMPSRTFISVEERTAPGFKAAKDRCTLLLGANAAGDFKLKPLMVYHAENPRALKGYAKGHLPVYWRANRKGWVTGSLFEDYFSSLLHLELRAYCDRQNLPFKILLLLDNAPGHPPSLGDLSENIKVLFLPPNTTSLIQPMDQGVIRAFKSYYLRRTFKKLINETESKEKANVKEFWKAFNIKMAIDIIGDAWNDVTQQCLNGVWKNIWPAVVNDFRGFAADEFISDARHEIVEMAKSVGFEQVDEENVAELLDSHREELSNEDLLELDRERHEEEEPMEENERPSPRVLTMKGMADAFKLLDGYLAFFDENDPNRERSAKVARLMKEANACYTELYREKRRCSVQSSLDKFFRKRDSTISTQSTDSQPSTSGGEPATSGGEISPPSFDVFDLDEDSAPH
【0114】
いくつかの実施形態では、上記転移因子は以下を含む：１）ＬＴＦの５’ＴＲであって、上記ＬＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７１の核酸配列を含む。２）ＲＴＦの３’ＴＲであって、上記ＲＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８３の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＣＡＧＴＧＧＴＴＣＴ ＴＡＡＣＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８３）の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む５’ＴＲと、２）ＡＧＧＴＴＡＡＧＡＡ ＣＣＡＣＴＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９５）の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８３の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９５の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８３の核酸配列を含む５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９５の核酸配列を含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はＣＴＣＴＡＧＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０３）の核酸配列を含む５’ＴＳＤと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０３の核酸配列を含む３’ＴＳＤと、をさらに含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は５’ＴＳＤ及び／又は３’ＴＳＤを含まない。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７１の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＬＴＦと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８３の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＲＴＦと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０７のアミノ酸配列又はその変異体を含むトランスポザーゼに関連する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０７のアミノ酸配列と少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含まない。
SEQ ID NO: 107(hAT-1_PMのトランスポザーゼ)
MSGKRRKWSDEYVQHGFSCITERDGSERPICMICNAKLSNSSLAPAKLKEHFLKLHGDGEYKNTTLAEFRVKRARFDERATLPALGFVPVNKPILTASYEVAYLIAKQGKPHTIGETLVKPAALKMANLILGTAAEGKLSQIPLSNDTVSDRIEDMSKDILAQVVADLISSPAKFSLQLDETTDVSDLSQLAVFVRYVKDDMIKEEFLFCKPLTTTTKAADVKKLVDDFFRDNNLSWDMVSAVCTDGAPVMLGRKSGFGALVKADAPHIIVTHCILHRHALATKTLPPKMAEVLKTVVECVNYVRKSALRHRIFSELCKEMGSEFEVLLLHSNIRWLSRGQVLNRVFAMRVELALFLQEHQHCHADCFKNPEFILILAYMADIFAALNHLNQQMQGGGVNIMEAEEHLKAFQKKLPLWKRRTENNNFANFPLLDDCASKIEDVSGIGDISVSTELKQTIATHLDELAKSLDGYFPTRESYPAWVRQPFTFAVETADVNDEFLDEIIEIQQSQVQQQLFRTTTLSTFWCRQMNKYPVIAKKALDFFIPFVTTYLCEQSFSRMLDIKTKKRNRLCCENDMRVALAKVKPRISELISQRQQQKSH
SEQ ID NO: 107(hAT-1_PMのトランスポザーゼ)
MSGKRRKWSDEYVQHGFSCITERDGSERPICMICNAKLSNSSLAPAKLKEHFLKLHGDGEYKNTTLAEFRVKRARFDERATLPALGFVPVNKPILTASYEVAYLIAKQGKPHTIGETLVKPAALKMANLILGTAAEGKLSQIPLSNDTVSDRIEDMSKDILAQVVADLISSPAKFSLQLDETTDVSDLSQLAVFVRYVKDDMIKEEFLFCKPLTTTTKAADVKKLVDDFFRDNNLSWDMVSAVCTDGAPVMLGRKSGFGALVKADAPHIIVTHCILHRHALATKTLPPKMAEVLKTVVECVNYVRKSALRHRIFSELCKEMGSEFEVLLLHSNIRWLSRGQVLNRVFAMRVELALFLQEHQHCHADCFKNPEFILILAYMADIFAALNHLNQQMQGGGVNIMEAEEHLKAFQKKLPLWKRRTENNNFANFPLLDDCASKIEDVSGIGDISVSTELKQTIATHLDELAKSLDGYFPTRESYPAWVRQPFTFAVETADVNDEFLDEIIEIQQSQVQQQLFRTTTLSTFWCRQMNKYPVIAKKALDFFIPFVTTYLCEQSFSRMLDIKTKKRNRLCCENDMRVALAKVKPRISELISQRQQQKSH
【0115】
いくつかの実施形態では、上記転移因子は以下を含む：１）ＬＴＦの５’ＴＲであって、上記ＬＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７２の核酸配列を含む。２）ＲＴＦの３’ＴＲであって、上記ＲＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８４の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＴＡＧＧＧＣＴＧＴＧ ＣＧＡＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８４） の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む５’ＴＲと、２）ＴＴＴＣＧＣＡＣＡＧ ＣＣＣＴＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９６）の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８４の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９６の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８４の核酸配列を含む５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９６の核酸配列を含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９６の核酸配列を含む５’ＴＳＤと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９６の核酸配列を含む３’ＴＳＤと、をさらに含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は５’ＴＳＤ及び／又は３’ＴＳＤを含まない。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７２の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＬＴＦと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８４の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＲＴＦと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０８のアミノ酸配列又はその変異体を含むトランスポザーゼに関連する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０８のアミノ酸配列と少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含まない。
SEQ ID NO: 108(hAT-17_Crocのトランスポザーゼ)
MTVSSTPISLPMLSLPVPEEELELDLDLSAIAREILGKEGESSEFVLHTPQVSPRARSPSPEGTSEEAEVEVAEASGSAESAPPVAVPLPAEEGEKAASAHAPAPQKRAGSVVWDHFELADDPTYAICLHCRAKTSRGKGTKHMSTTGMLMHLRRHHPLALAPPQPGTSGSVPKGKSPSRSKAPVPPKQRQATLEQWGKGGQKGGRVARASEITQSIGEMLAVDGQPFSLVERPGFRRLMALVAPSYQVPARTTFSRTVVPSLYEACREYLREELRKAGPQVALHFTSDIWSSRGGDHAYLSLTGHWCDQSGRRWALLQAEVMDESHTATEIMGAMNRLVQGWLVGQGELTRGFMVTDNGANMVKAVRDANFVGIRCVAHKFHLIVRDALEGDRAAGDGASTTSKLISKCRKVAGYFHRSIKGGKMLRDKQAELNIPQHKIMQDVETRWNSTYLMLERLVEQQKAIHEMALLGEIGISGPLNRAEWDTISQILVVLKPFLEATETLSAGDALLSQVIPVVRELQSQMESFQGINVPGWGKPLSPDVQALVRRLKEGIRKRLDPLRSSTVHVLAATCDPRVKGSVCGSQSLNQWTEVLVKRVREAERRRRGDVEEGDPLSRASTPSTSQSPPPPQALPMWAKGMASMVGSRGTRPHHQAGSAQALVAAYLAEDVEPLLCDPLAYWASRSQMWPDLATVAREHLSCPPTSVPSERVFSIAGDVVTPHRTSLDPGLVEQLVFLKVNLPLLGFPKLQVQTE
SEQ ID NO: 108(hAT-17_Crocのトランスポザーゼ)
MTVSSTPISLPMLSLPVPEEELELDLDLSAIAREILGKEGESSEFVLHTPQVSPRARSPSPEGTSEEAEVEVAEASGSAESAPPVAVPLPAEEGEKAASAHAPAPQKRAGSVVWDHFELADDPTYAICLHCRAKTSRGKGTKHMSTTGMLMHLRRHHPLALAPPQPGTSGSVPKGKSPSRSKAPVPPKQRQATLEQWGKGGQKGGRVARASEITQSIGEMLAVDGQPFSLVERPGFRRLMALVAPSYQVPARTTFSRTVVPSLYEACREYLREELRKAGPQVALHFTSDIWSSRGGDHAYLSLTGHWCDQSGRRWALLQAEVMDESHTATEIMGAMNRLVQGWLVGQGELTRGFMVTDNGANMVKAVRDANFVGIRCVAHKFHLIVRDALEGDRAAGDGASTTSKLISKCRKVAGYFHRSIKGGKMLRDKQAELNIPQHKIMQDVETRWNSTYLMLERLVEQQKAIHEMALLGEIGISGPLNRAEWDTISQILVVLKPFLEATETLSAGDALLSQVIPVVRELQSQMESFQGINVPGWGKPLSPDVQALVRRLKEGIRKRLDPLRSSTVHVLAATCDPRVKGSVCGSQSLNQWTEVLVKRVREAERRRRGDVEEGDPLSRASTPSTSQSPPPPQALPMWAKGMASMVGSRGTRPHHQAGSAQALVAAYLAEDVEPLLCDPLAYWASRSQMWPDLATVAREHLSCPPTSVPSERVFSIAGDVVTPHRTSLDPGLVEQLVFLKVNLPLLGFPKLQVQTE
【0116】
いくつかの実施形態では、上記転移因子は以下を含む：１）ＬＴＦの５’ＴＲであって、上記ＬＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７３の核酸配列を含む。２）ＲＴＦの３’ＴＲであって、上記ＲＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８５の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＣＡＧＧＴＴＧＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８５）の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む５’ＴＲと、２）ＣＴＣＡＡＣＣＴＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９７）の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８５の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９７の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８５の核酸配列を含む５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９７の核酸配列を含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９３の核酸配列を含む５’ＴＳＤと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９３の核酸配列を含む３’ＴＳＤとをさらに含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は５’ＴＳＤ及び／又は３’ＴＳＤを含まない。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７３の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＬＴＦと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８５の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＲＴＦと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０９のアミノ酸配列又はその変異体を含むトランスポザーゼに関連する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０９のアミノ酸配列と少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含まない。
SEQ ID NO: 109(Tigger4のトランスポザーゼ)
MSKRPADTPMGNSDKKKRKHLCLSIAQKVKLLEKLDSGVSVKRLTEEYGVGMTTIYDLKKQKDKLLKFYAESDEQKLMKNRKTLHKAKNEDLDRVLKEWIRQRRSEHMPLNGMLIMKQAKIYHDELKIEGNCEYSTGWLQKFKKRHGIKFLKICGDKASADHEAAEKFIDEFAKVIADENLTPEQVYNADETSLFWRYCPRKTLTTADETAPTGIKDAKDRITVLGCANAAGTHKCKLAVIGKSLRPRCFQGVNFLPVHYYANKKAWITRDIFSDWFHKHFVPAARAHCREAGLDDDCKILLFLDNCSAHPPAEILIKNNVYAMYFPPNVTSLIQPCDQGILRSMKSKYKNTFLNSMLAAVNRGVGVEGFQKEFSMKDAIYAVANAWNTVTKDTVVHAWHNLWPATMFSDDDEQGGDFEGFRMSSEKKMMSDLLTYAKNIPSESVSKLEEVDIEEVFNIDNEAPVVHSLTDGEIAEMVLNQGDRDNSDDEDDVVNTAEKVPIDDMVKMCDGLIEGLEQRAFITEQEIMSVYKIKERLLRQKPLLMRQMTLEETF
SEQ ID NO: 109(Tigger4のトランスポザーゼ)
MSKRPADTPMGNSDKKKRKHLCLSIAQKVKLLEKLDSGVSVKRLTEEYGVGMTTIYDLKKQKDKLLKFYAESDEQKLMKNRKTLHKAKNEDLDRVLKEWIRQRRSEHMPLNGMLIMKQAKIYHDELKIEGNCEYSTGWLQKFKKRHGIKFLKICGDKASADHEAAEKFIDEFAKVIADENLTPEQVYNADETSLFWRYCPRKTLTTADETAPTGIKDAKDRITVLGCANAAGTHKCKLAVIGKSLRPRCFQGVNFLPVHYYANKKAWITRDIFSDWFHKHFVPAARAHCREAGLDDDCKILLFLDNCSAHPPAEILIKNNVYAMYFPPNVTSLIQPCDQGILRSMKSKYKNTFLNSMLAAVNRGVGVEGFQKEFSMKDAIYAVANAWNTVTKDTVVHAWHNLWPATMFSDDDEQGGDFEGFRMSSEKKMMSDLLTYAKNIPSESVSKLEEVDIEEVFNIDNEAPVVHSLTDGEIAEMVLNQGDRDNSDDEDDVVNTAEKVPIDDMVKMCDGLIEGLEQRAFITEQEIMSVYKIKERLLRQKPLLMRQMTLEETF
【0117】
いくつかの実施形態では、上記転移因子は以下を含む：１）ＬＴＦの５’ＴＲであって、上記ＬＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７３の核酸配列を含む。２）ＲＴＦの３’ＴＲであって、上記ＲＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８５の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＣＡＧＴＡＧＴＣＣＣ ＣＣＣＴＴＡＴＣＣＧ ＣＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ： ８６）の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む５’ＴＲと、２）ＣＣＧＣＧＧＡＴＡＡ ＧＧＧＧＧＧＡＣＴＡ ＣＴＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９８）の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８６の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９８の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８６の核酸配列を含む５’ＴＲと、；和２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９８の核酸配列を含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９３の核酸配列を含む５’ＴＳＤと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９３の核酸配列を含む３’ＴＳＤとをさらに含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は５’ＴＳＤ及び／又は３’ＴＳＤを含まない。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７３の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＬＴＦと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８５の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＲＴＦと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１０のアミノ酸配列又はその変異体を含むトランスポザーゼに関連する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１０のアミノ酸配列と少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含まない。
SEQ ID NO: 110(Tigger7のトランスポザーゼ)
MAPKRKSSDAGNSDMPKRSRKVLPLSEKVKVLDLIRKEKKSYAEVAKIYGKNESSIREIVKKEKEIRASFAVAPQTAKVTATVRDKCLVKMEKALNLWVEDMNRKRVPIDGNVLRQKALSLYEDFSKGSPETSDTKPFTASKGWLHRFRNRFGLKNIKITGEAASANEEAAATFPAELKKLIKEKGYHPKQVFNCDETGLFWKKMPNRTYIHKSAKEAPGHKTWKDRLTLVLCGNAAGHMIKPGVVYRAKNPRALKNKNKNYLPVFWQHNQKAWVTAILFMEWFHQCFIPEVKKYLEEEGLEFKVLLIIDNAPGHPESVCYENENVEVVFLPPNTTSLLQPLDQGIIRFVKATYTRLVFDRIRSAIDADPNLDIMQCWKSFTIADAITFIKAAMDELKPETVNACWKNLWSEVVNDFKGFPGIDGEVRKIIHAARQVGGEGFADMLDEEVEEHIEGHREVLTNEELEELVESSTEEEEDEEETEAEPAMWTLPKFAEVFRIAQTLKDKIMEYDPRMERSIKVTRMITEGLQPLQQHFDELKRKRQQLPITMFFQKISAKNLQLSRIPNHRHRLLLTSNHRHRHGSMIQDHPKQMILLLTYRQKVNSSLTLRHNAYVIHLTSSHHVGIVSSHIITRRRVSTVQ
SEQ ID NO: 110(Tigger7のトランスポザーゼ)
MAPKRKSSDAGNSDMPKRSRKVLPLSEKVKVLDLIRKEKKSYAEVAKIYGKNESSIREIVKKEKEIRASFAVAPQTAKVTATVRDKCLVKMEKALNLWVEDMNRKRVPIDGNVLRQKALSLYEDFSKGSPETSDTKPFTASKGWLHRFRNRFGLKNIKITGEAASANEEAAATFPAELKKLIKEKGYHPKQVFNCDETGLFWKKMPNRTYIHKSAKEAPGHKTWKDRLTLVLCGNAAGHMIKPGVVYRAKNPRALKNKNKNYLPVFWQHNQKAWVTAILFMEWFHQCFIPEVKKYLEEEGLEFKVLLIIDNAPGHPESVCYENENVEVVFLPPNTTSLLQPLDQGIIRFVKATYTRLVFDRIRSAIDADPNLDIMQCWKSFTIADAITFIKAAMDELKPETVNACWKNLWSEVVNDFKGFPGIDGEVRKIIHAARQVGGEGFADMLDEEVEEHIEGHREVLTNEELEELVESSTEEEEDEEETEAEPAMWTLPKFAEVFRIAQTLKDKIMEYDPRMERSIKVTRMITEGLQPLQQHFDELKRKRQQLPITMFFQKISAKNLQLSRIPNHRHRLLLTSNHRHRHGSMIQDHPKQMILLLTYRQKVNSSLTLRHNAYVIHLTSSHHVGIVSSHIITRRRVSTVQ
【0118】
いくつかの実施形態では、上記転移因子は以下を含む：１）ＬＴＦの５’ＴＲであって、上記ＬＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７５の核酸配列を含む。２）ＲＴＦの３’ＴＲであって、上記ＲＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８７の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＴＡＧＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８７）の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む５’ＴＲと、２）ＣＣＣＴＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９９）の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８７の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９９の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８７の核酸配列を含む５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９９の核酸配列を含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はＴＴＴＡＴＡＡＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０４）の核酸配列を含む５’ＴＳＤと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０４の核酸配列を含む３’ＴＳＤと、をさらに含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は５’ＴＳＤ及び／又は３’ＴＳＤを含まない。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７５の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＬＴＦと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８７の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＲＴＦと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１１のアミノ酸配列又はその変異体を含むトランスポザーゼに関連する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１１のアミノ酸配列と少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含まない。
SEQ ID NO: 111(hAT-19_Crpのトランスポザーゼ)
MNAKKSSKTAKYVSALDRARQYPAGTLHADGGRLFCTSCNVTLDVSRKTSIDRHLESEAHMKRKAAAEAEGQSKKQATVSSLFKRTTESSLARREAAFSLVEAFAAANIPLEKLDHPKLRDYLNQNVPNAGSFPRANKLRQDYLPAVIASHVQSTKAALAEYHSFSIVADEATDPQDNYVLHILFVPGSWTDRDLPVFQTEPVHLTSVNFSTVSQAIVKVIVSYGVDFNKISAFLSDNAMYMCKAFSDVLQGMLPNAVHVTCNAHILSLVSDIWRTQFPEVDSLVSSFKKAFKHCPGRKVRYRESVASQSGDSHGTVPLPPEPVLTRWNSWFNAVRYHAKHMQHYQQFVSEELEITPSTQCMLKLRDLLGRGDIQDQVTFVADNATRFMELLTWFEGRQAVIHHAHNKLMDLISWVEDRASQELSSCPRENQRRRDLFQAIAVKLNQYYRYDPSLPPRFRQPAAPFLSAVRILDPNQVPLLSCDPQLLKAIPGWGKEHDNERAAYVNFVKECQMPVPVPVFWDSVCDRFPHLYALARRCLTIPTNSVDAERAISVYGQVFTPQRQRMSPATAAGCSMLAFNT
SEQ ID NO: 111(hAT-19_Crpのトランスポザーゼ)
MNAKKSSKTAKYVSALDRARQYPAGTLHADGGRLFCTSCNVTLDVSRKTSIDRHLESEAHMKRKAAAEAEGQSKKQATVSSLFKRTTESSLARREAAFSLVEAFAAANIPLEKLDHPKLRDYLNQNVPNAGSFPRANKLRQDYLPAVIASHVQSTKAALAEYHSFSIVADEATDPQDNYVLHILFVPGSWTDRDLPVFQTEPVHLTSVNFSTVSQAIVKVIVSYGVDFNKISAFLSDNAMYMCKAFSDVLQGMLPNAVHVTCNAHILSLVSDIWRTQFPEVDSLVSSFKKAFKHCPGRKVRYRESVASQSGDSHGTVPLPPEPVLTRWNSWFNAVRYHAKHMQHYQQFVSEELEITPSTQCMLKLRDLLGRGDIQDQVTFVADNATRFMELLTWFEGRQAVIHHAHNKLMDLISWVEDRASQELSSCPRENQRRRDLFQAIAVKLNQYYRYDPSLPPRFRQPAAPFLSAVRILDPNQVPLLSCDPQLLKAIPGWGKEHDNERAAYVNFVKECQMPVPVPVFWDSVCDRFPHLYALARRCLTIPTNSVDAERAISVYGQVFTPQRQRMSPATAAGCSMLAFNT
【0119】
いくつかの実施形態では、上記転移因子は以下を含む：１）ＬＴＦの５’ＴＲであって、上記ＬＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７６の核酸配列を含む。２）ＲＴＦの３’ＴＲであって、上記ＲＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８８の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＴＡＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８８）の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む５’ＴＲと、２）ＣＣＴＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １００）の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８８の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １００の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８８の核酸配列を含む５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １００の核酸配列を含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はＣＴＡＴＡＴＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０５）の核酸配列を含む５’ＴＳＤと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０５の核酸配列を含む３’ＴＳＤと、をさらに含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は５’ＴＳＤ及び／又は３’ＴＳＤを含まない。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７６の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＬＴＦと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８８の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＲＴＦと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１２のアミノ酸配列又はその変異体を含むトランスポザーゼに関連する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１２のアミノ酸配列と少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含まない。
SEQ ID NO: 112(hAT-17B_Crocのトランスポザーゼ)
MTVSSTPISSPSVSLPVPEEELDLEAGDLSALAKEILGTEGESEFVLHTPQSSPRARSPSPEGTSEEVEVVEASGSAESAPPVVVPLPAEEGDKAGSPPSTQKRGGSVVWDHFEVADDPKYAICQHCRRQISRGKEVKHFTTTAMLLHLRRQHPLALAPPQPGTSGSVPKGKSPSRSKAPVPTKQRQATLERWGKAADKGGRVARASEVTQSIGEMLALDGQPFSLVERPGFRRLMALVAPSYQVPARTTFSRTVVPSLYEACREYLREELRKAGPQVALHFTSDIWSSRGGDHAYLSLTGHWCDQSGRRWALLQAEVMDESHTAREIMVAMNRMVQGWLVGQGELTRGFMVTDNGANMVKAVRDANFVGIRCVAHKLHLIVRDALEGDRAAGDGAVTTTQLISKCRKVAGYFHRSIKGGKMLRDKQAELSVPQHKIMQDVETRWNSTYLMLERLVEQQKAIHEMALLGEIGISGPLNKAEWDTISQILVVLKPFLEATETLSAGDALLSQVIPVVRELENQMEKFQGIDVPGWGKPLSPEVQALVKRLKEGIKKWLDPLRSSTVHVLAGMCDPRVKGSMCTGSTKTLDHWTEVLVNRVREAEGQRRGDVEEGDPLSRASTPSTSQSPPRQPLPMWAKGMASMLGSRRTRPQPRAGSAEASVATYLAEDVEPLDCDPLAYWATRSQMWQDLATVAREHLSCPPTSVPSERVFSIAGDVVTPHRTSLDPGLVEQLVFLKVNLPLLGFPELHLQTE
SEQ ID NO: 112(hAT-17B_Crocのトランスポザーゼ)
MTVSSTPISSPSVSLPVPEEELDLEAGDLSALAKEILGTEGESEFVLHTPQSSPRARSPSPEGTSEEVEVVEASGSAESAPPVVVPLPAEEGDKAGSPPSTQKRGGSVVWDHFEVADDPKYAICQHCRRQISRGKEVKHFTTTAMLLHLRRQHPLALAPPQPGTSGSVPKGKSPSRSKAPVPTKQRQATLERWGKAADKGGRVARASEVTQSIGEMLALDGQPFSLVERPGFRRLMALVAPSYQVPARTTFSRTVVPSLYEACREYLREELRKAGPQVALHFTSDIWSSRGGDHAYLSLTGHWCDQSGRRWALLQAEVMDESHTAREIMVAMNRMVQGWLVGQGELTRGFMVTDNGANMVKAVRDANFVGIRCVAHKLHLIVRDALEGDRAAGDGAVTTTQLISKCRKVAGYFHRSIKGGKMLRDKQAELSVPQHKIMQDVETRWNSTYLMLERLVEQQKAIHEMALLGEIGISGPLNKAEWDTISQILVVLKPFLEATETLSAGDALLSQVIPVVRELENQMEKFQGIDVPGWGKPLSPEVQALVKRLKEGIKKWLDPLRSSTVHVLAGMCDPRVKGSMCTGSTKTLDHWTEVLVNRVREAEGQRRGDVEEGDPLSRASTPSTSQSPPRQPLPMWAKGMASMLGSRRTRPQPRAGSAEASVATYLAEDVEPLDCDPLAYWATRSQMWQDLATVAREHLSCPPTSVPSERVFSIAGDVVTPHRTSLDPGLVEQLVFLKVNLPLLGFPELHLQTE
【0120】
いくつかの実施形態では、上記転移因子は以下を含む：１）ＬＴＦの５’ＴＲであって、上記ＬＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７７の核酸配列を含む。２）ＲＴＦの３’ＴＲであって、上記ＲＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８９の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８９の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０１の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８９の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０１の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８９の核酸配列を含む５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０１の核酸配列を含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はＡＴＴＡＡＴＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０６）の核酸配列を含む５’ＴＳＤと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０６の核酸配列を含む３’ＴＳＤと、をさらに含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は５’ＴＳＤ及び／又は３’ＴＳＤを含まない。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７７の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＬＴＦと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８９の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＲＴＦと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１３のアミノ酸配列又はその変異体を含むトランスポザーゼに関連する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１３のアミノ酸配列と少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含まない。
SEQ ID NO: 113(hAT-10_XTのトランスポザーゼ)
MTGRGRGRKGGMGGKGGEGGRKGGVGGEGGRKGGVGGEGGVGGKGGLGGRSRGAGCGQEPSTRAMPSLGNIGQQPQQQSQQQQQQLQQQQVAGRSGATGSRKTLPDFFATTSRPIQSQQAEAVMDWLTQATSSAADSSEQQEVASPASSVIRGMLSPLLFDPEVDFSPDTQDLFDDQTGMGGAFLSDEEEVYVAQHTTSAVGDVGQGPLMAGQQADEPDVDVDAGSDLGEDVEDDGDRSWVPAQEDNSSSSEGELCVVVSDADEEPAPKKQKTPPTTARGGRQQGSTAPGSTGSGRMGRDLQPSGPQPSTAGKVVARTSAVWAFFTCQSQDPSVAVCHLCRQKVRRGQTGSHMGTSALSSHMKRHHRMTWEQHQSGRAPGGSGASCPPPPIPQGTGASSPIPVAREEDSEAHSWRRPLCSSASSAAPSVSSSSLLPSAQPLSRQVSLPQFLGRKAPLSSSHPQVQRLNACLAKLLAVQLLPYQLVDAAPFRQLMACAAPNWRIPSRHYFARKAVPALHQQVVDNVSLSLDYAVGGRVHCTTDTWTSRHGQGRYISYTAHWVTLMSAGEGAGSRTPLRLEVPPRGVKGKPHTATSSSSSSTMDEPPLKRPRSYASVQYKRCQAVLQLLCLGERSHTAPELHAAFQTQVQRWFTPRQLQAGNVVCDNGRNLLAALHLGRLTHVPCFAHVLNLVVQHFLKSYTGLGVVLEKARRVCGHFRRSPTASASLSRMQRQHSLPPHRLICDLPTRWNSTLHMVERLVEQRWAVSNYLLEHSARGTQGANLGYFSTEQWQQMRQLCRVLAPFEQATRFVSRDNACVSDIIPLVFLLKRTLDGLLEEGDVPEEEECRPRRQVEGAARHDEEDMPNEEDEGEEDWVPAEQGEQGPRHPTTPAVVRGWEDTEQGEEAGDDLLHLQGSQEEVGRGHLFYMAAHMQTCLRSDSRICAIKDREDYWVATMIDPRYKEKMAQFLVPSQRERRVGQLKRALCAKLMEAFPQPDTQASTTPHIQQRQESSSSSSSAARGGGNLMDVWRSFFEPRQAAAGLVSTQSHHQQRLDNMVADYMGSVSVQDAMHTDDDPMNFWVSRLDQWPELAQYALEVLACPPASVLSERVFSAAGGVVTEKRTRLSTGSVDRLSFIKMNEAWISGDIHVPIADIRD
SEQ ID NO: 113(hAT-10_XTのトランスポザーゼ)
MTGRGRGRKGGMGGKGGEGGRKGGVGGEGGRKGGVGGEGGVGGKGGLGGRSRGAGCGQEPSTRAMPSLGNIGQQPQQQSQQQQQQLQQQQVAGRSGATGSRKTLPDFFATTSRPIQSQQAEAVMDWLTQATSSAADSSEQQEVASPASSVIRGMLSPLLFDPEVDFSPDTQDLFDDQTGMGGAFLSDEEEVYVAQHTTSAVGDVGQGPLMAGQQADEPDVDVDAGSDLGEDVEDDGDRSWVPAQEDNSSSSEGELCVVVSDADEEPAPKKQKTPPTTARGGRQQGSTAPGSTGSGRMGRDLQPSGPQPSTAGKVVARTSAVWAFFTCQSQDPSVAVCHLCRQKVRRGQTGSHMGTSALSSHMKRHHRMTWEQHQSGRAPGGSGASCPPPPIPQGTGASSPIPVAREEDSEAHSWRRPLCSSASSAAPSVSSSSLLPSAQPLSRQVSLPQFLGRKAPLSSSHPQVQRLNACLAKLLAVQLLPYQLVDAAPFRQLMACAAPNWRIPSRHYFARKAVPALHQQVVDNVSLSLDYAVGGRVHCTTDTWTSRHGQGRYISYTAHWVTLMSAGEGAGSRTPLRLEVPPRGVKGKPHTATSSSSSSTMDEPPLKRPRSYASVQYKRCQAVLQLLCLGERSHTAPELHAAFQTQVQRWFTPRQLQAGNVVCDNGRNLLAALHLGRLTHVPCFAHVLNLVVQHFLKSYTGLGVVLEKARRVCGHFRRSPTASASLSRMQRQHSLPPHRLICDLPTRWNSTLHMVERLVEQRWAVSNYLLEHSARGTQGANLGYFSTEQWQQMRQLCRVLAPFEQATRFVSRDNACVSDIIPLVFLLKRTLDGLLEEGDVPEEEECRPRRQVEGAARHDEEDMPNEEDEGEEDWVPAEQGEQGPRHPTTPAVVRGWEDTEQGEEAGDDLLHLQGSQEEVGRGHLFYMAAHMQTCLRSDSRICAIKDREDYWVATMIDPRYKEKMAQFLVPSQRERRVGQLKRALCAKLMEAFPQPDTQASTTPHIQQRQESSSSSSSAARGGGNLMDVWRSFFEPRQAAAGLVSTQSHHQQRLDNMVADYMGSVSVQDAMHTDDDPMNFWVSRLDQWPELAQYALEVLACPPASVLSERVFSAAGGVVTEKRTRLSTGSVDRLSFIKMNEAWISGDIHVPIADIRD
【0121】
いくつかの実施形態では、上記転移因子は以下を含む：１）ＬＴＦの５’ＴＲであって、上記ＬＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７８の核酸配列を含む。２）ＲＴＦの３’ＴＲであって、上記ＲＴＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９０の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９０の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０２の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９０の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０２の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有する核酸配列を有する３’ＴＲｖと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９０の核酸配列を含む５’ＴＲと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０２の核酸配列を含む３’ＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９３の核酸配列を含む５’ＴＳＤと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９３の核酸配列を含む３’ＴＳＤと、をさらに含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子は５’ＴＳＤ及び／又は３’ＴＳＤを含まない。いくつかの実施形態では、上記転移因子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７８の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＬＴＦと、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９０の核酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れか）の配列同一性を有する核酸配列を含むＲＴＦと、を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１４のアミノ酸配列又はその変異体を含むトランスポザーゼに関連する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１４のアミノ酸配列と少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれか）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記転移因子はトランスポザーゼをコードする核酸配列を含まない。
SEQ ID NO: 90(MARWOLEN1の5'TR)
TACAGTGGCGAGCAAAACTGAGTGCATGTTCACAACTCTCACTTTGGCCATCAATAAAAACACAACCGCTTATGCAAATTCAATAATTTTTTTTATATTATTAATCTTAATTAATTTATAACTTATTTTATGAGAAAAAACAAATTTAGCATATATATTCAAAGACTTAGAATAAAAAAACTAAATAAACTCACATAAACTCAATTTTGCACGTTT
SEQ ID NO: 102(MARWOLEN1の3'TR)
AAACGTGCAAAATTGAGTTTATGTGAGTTTATTTAGTTTTTTTATTCTAAGTCTTTGAATATATATGCTAAATTTGTTTTTTCTCATAAAATAAGTTATAAATTAATTAAGATTAATAATATAAAAAAAATTATTGAATTTGCATAAGCGGTTGTGTTTTTATTGATGGCCAAAGTGAGAGTTGTGAACATGCACTCAGTTTTGCTCGCCACTGTA
SEQ ID NO: 114(MARWOLEN1のトランスポザーゼ)
MRKLSGEIQNNIVSLTESGNSTRQIAERLGISQSAVVSIQKRRKLTPKPQVSGRKKLLKDSDARLMMSEMRKNKNLTPKGACLAINKNVSEWTARRALQDIGYMSIVKKNKPALSDKNVKARLKFAKDHKNWTIDDWKRVVWSDESKFNRFQSDGKQYCWIRPGDRVQRHHVKQTVKHGGGNIMVWGCFTWWHIGPLQLVEGIMKKEDYLRILQTNLPNYFDKCAYPEKDIIFQQDGDPKHTAKIVKEWIGKQHFQLMEWPAQSPDLNPIENLWSIVKRRLGQYDSAPKNMGDLWERVAVEWSRIPQDILRNLVESMPKRVTEVIVNKGLWTKY
SEQ ID NO: 90(MARWOLEN1の5'TR)
TACAGTGGCGAGCAAAACTGAGTGCATGTTCACAACTCTCACTTTGGCCATCAATAAAAACACAACCGCTTATGCAAATTCAATAATTTTTTTTATATTATTAATCTTAATTAATTTATAACTTATTTTATGAGAAAAAACAAATTTAGCATATATATTCAAAGACTTAGAATAAAAAAACTAAATAAACTCACATAAACTCAATTTTGCACGTTT
SEQ ID NO: 102(MARWOLEN1の3'TR)
AAACGTGCAAAATTGAGTTTATGTGAGTTTATTTAGTTTTTTTATTCTAAGTCTTTGAATATATATGCTAAATTTGTTTTTTCTCATAAAATAAGTTATAAATTAATTAAGATTAATAATATAAAAAAAATTATTGAATTTGCATAAGCGGTTGTGTTTTTATTGATGGCCAAAGTGAGAGTTGTGAACATGCACTCAGTTTTGCTCGCCACTGTA
SEQ ID NO: 114(MARWOLEN1のトランスポザーゼ)
MRKLSGEIQNNIVSLTESGNSTRQIAERLGISQSAVVSIQKRRKLTPKPQVSGRKKLLKDSDARLMMSEMRKNKNLTPKGACLAINKNVSEWTARRALQDIGYMSIVKKNKPALSDKNVKARLKFAKDHKNWTIDDWKRVVWSDESKFNRFQSDGKQYCWIRPGDRVQRHHVKQTVKHGGGNIMVWGCFTWWHIGPLQLVEGIMKKEDYLRILQTNLPNYFDKCAYPEKDIIFQQDGDPKHTAKIVKEWIGKQHFQLMEWPAQSPDLNPIENLWSIVKRRLGQYDSAPKNMGDLWERVAVEWSRIPQDILRNLVESMPKRVTEVIVNKGLWTKY
【0122】
異種核酸
本明細書に記載された操作された転移因子は、種々の異種核酸の転移に適している。いくつかの実施形態では、上記異種核酸はＤＮＡである。いくつかの実施形態では、上記異種核酸は二本鎖である。いくつかの実施形態では、上記異種核酸は、１つ又は複数の修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、上記異種核酸は修飾されていない。
本明細書に記載された操作された転移因子は、種々の異種核酸の転移に適している。いくつかの実施形態では、上記異種核酸はＤＮＡである。いくつかの実施形態では、上記異種核酸は二本鎖である。いくつかの実施形態では、上記異種核酸は、１つ又は複数の修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、上記異種核酸は修飾されていない。
【0123】
転移因子中の異種核酸は、種々の適切な長さを有し得る。いくつかの実施形態では、上記異種核酸の長さは、少なくとも約１ｋｂ、２ｋｂ、１０ｋｂ、２０ｋｂ、３０ｋｂ、４０ｋｂ、５０ｋｂ、６０ｋｂ、７０ｋｂ、８０ｋｂ、９０ｋｂ、１００ｋｂ、１５０ｋｂ、２００ｋｂ、２５０ｋｂ、３００ｋｂ、３５０ｋｂ、４００ｋｂ、４５０ｋｂ、５００ｋｂ、６００ｋｂ、７００ｋｂ、８００ｋｂ、９００ｋｂ、１０００ｋｂ又はそれ以上のいずれかである。いくつかの実施形態では、上記異種核酸の長さは、１０００ｋｂ、９００ｋｂ、８００ｋｂ、７００ｋｂ、６００ｋｂ、５００ｋｂ、４５０ｋｂ、４００ｋｂ、３５０ｋｂ、３００ｋｂ、２５０ｋｂ、２００ｋｂ、１５０ｋｂ、１００ｋｂ、９０ｋｂ、８０ｋｂ、７０ｋｂ、６０ｋｂ、５０ｋｂ、４０ｋｂ、３０ｋｂ、２０ｋｂ、１０ｋｂ、５ｋｂ、２ｋｂ又は１ｋｂのいずれかを超えない。いくつかの実施形態では、上記異種核酸の長さは、約１００ｂｐから約１ｋｂ、約１ｋｂから約２ｋｂ、約２ｋｂから約５ｋｂ、約５ｋｂから約１０ｋｂ、約１００ｂｐから約５ｋｂ、約１００ｂｐから約２ｋｂ、約２ｋｂから約１０ｋｂ、約１ｋｂから約１０ｋｂ、約１０ｋｂから約２０ｋｂ、約２０ｋｂから約５０ｋｂ、約５０ｋｂから約１００ｋｂ、約１ｋｂから約１００ｋｂ、約１５０ｋｂから約２００ｋｂ、約２００ｋｂから約３００ｋｂ、約３００ｋｂから約４００ｋｂ、約４００ｋｂから約５００ｋｂ、約５００ｋｂから約６００ｋｂ、約６００ｋｂから約７００ｋｂ、約７００ｋｂから約８０ｋｂ、約８００ｋｂから約９００ｋｂ、約９００ｋｂから約１０００ｋｂ、約１０ｋｂから約１００ｋｂ、約１００ｋｂから約５００ｋｂ、約５００ｋｂから約１０００ｋｂ、或約１０ｋｂから約５００ｋｂである。いくつかの実施形態では、上記異種核酸の長さは、約１０ｋｂから約３００ｋｂヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、上記異種核酸の長さは、約１００ｂｐから約３００ｋｂヌクレオチドである。
【0124】
異種核酸は、１、２、３、４、５、６、１０又はそれ以上のいずれかのコード配列を含む１つ又は複数のコード配列を含んでもよい。本願では、任意の適切なコード配列を使用してもよく、コード配列は任意の適切な目的生物産物をコードすることができる。いくつかの実施形態では、上記コード配列は、ＲＮＡ分子をコードする。いくつかの実施形態では、上記コード配列は、タンパク質などのポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、上記異種核酸は、第１タンパク質をコードする第１コード配列と、第２タンパク質をコードする第２コード配列とを含む。いくつかの実施形態では、上記異種核酸は、第１ＲＮＡをコードする第１コード配列と、第２ＲＮＡをコードする第２コード配列とを含む。いくつかの実施形態では、上記異種核酸は、タンパク質をコードする第１コード配列と、ＲＮＡをコードする第２コード配列とを含む。
【0125】
いくつかの実施形態では、上記コード配列は、治療的タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、上記コード配列は、モノクローナル抗体、多特異性抗体、及び抗体フラグメントを含む治療的抗体をコードする。いくつかの実施形態では、上記コード配列はサイトカインをコードする。いくつかの実施形態では、上記コード配列は抗原をコードする。いくつかの実施形態では、上記コード配列は、遺伝子治療に有用な治療薬をコードする。遺伝子治療に有用な例示的な治療的タンパク質は、アデノシンデアミナーゼ、リソソーム蓄積症で影響を受ける酵素、アポリポタンパク質Ｅ、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、骨形態形成タンパク質２（ＢＭＰ－２）、骨形態形成タンパク質６（ＢＭＰ－６）、骨形態形成タンパク質７（ＢＭＰ－７）、心筋栄養因子１（ＣＴ－１）、ＣＤ２２、ＣＤ４０、毛様体栄養因子（ＣＮＴＦ）、ＣＣＬ１－ＣＣＬ２８、ＣＸＣＬ１－ＣＸＣＬ１７、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸ３ＣＬ１、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、ドーパミン、エリスロポエチン、因子ＩＸ、因子ＶＩＩＩ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、エストロゲン、ＦＡＳ－リガンド、線維芽細胞増殖因子１（ＦＧＦ－１）、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ－２）、線維芽細胞増殖因子４（ＦＧＦ－４）、線維芽細胞増殖因子５（ＦＧＦ－５）、線維芽細胞増殖因子６（ＦＧＦ－６）、線維芽細胞増殖因子７（ＦＧＦ－７）、線維芽細胞増殖因子１０（ＦＧＦ－１０）、Ｆｌｔ－３、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージ刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、成長ホルモン、肝臓細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インターフェロンα（ＩＦＮ－ａ）、インターフェロンβ（ＩＦＮ－ｂ）、インターフェロンγ（ＩＦＮｇ）、インスリン、グルカゴン、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ－１）、インスリン様増殖因子２（ＩＧＦ－２）、インターロイキン１（ＩＬ－１）、インターロイキン２（ＩＬ－２）、インターロイキン３（ＩＬ－３）、インターロイキン４（ＩＬ－４）、インターロイキン ５（ＩＬ－５）、インターロイキン６（ＩＬ－６）、インターロイキン７（ＩＬ－７）、インターロイキン８（ＩＬ－８）、インターロイキン９（ＩＬ－９）、インターロイキン１０（ＩＬ－１０）、インターロイキン１１（ＩＬ－１１）、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン１３（ＩＬ－１３）、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）、インターロイキン１７（ＩＬ－１７）、インターロイキン１９（ＩＬ－１９）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、単球走化タンパク質１（ＭＣＰ－１）、マクロファージ炎症性タンパク質３ａ（ＭＩＰ－３ａ）、マクロファージ炎症タンパク質３ｂ（ＭＩＰ－３ｂ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、神経栄養因子３（ＮＴ－３）、神経栄養因子４（ＮＴ－４）、副甲状腺ホルモン、血小板由来成長因子ＡＡ（ＰＤＧＦ－ＡＡ）、血小板由来成長因子ＡＢ（ＰＤＧＦ－ＡＢ）、血小板由来成長因子ＢＢ（ＰＤＧＦ－ＢＢ）、血小板由来成長因子ＣＣ（ＰＤＧＦ－ＣＣ）、血小板由来成長因子ＤＤ（ＰＤＧＦ－ＤＤ）、ＲＡＮＴＥＳ、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ストローマ細胞由来成長因子１（ＳＤＦ－１）、形質転換成長因子α（ＴＧＦ－ａ）、形質転換成長因子β（ＴＧＦ－ｂ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－ａ）、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ／１３、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ７ｃ、Ｗｎｔ８、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ８ｃ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１４、Ｗｎｔ１５又はＷｎｔ１６、ソニック・ヘッジホッグ、デザートヘッジホッグ、及びインディアンヘッジホッグを含むが、これらに限定されない。
【0126】
いくつかの実施形態では、上記コード配列は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又は操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のような操作された受容体をコードする。
【0127】
本明細書で使用される場合、「キメラ抗原受容体」又は「ＣＡＲ」は、１つ又は複数の抗原をＴ細胞などの細胞に特異的に移植する操作された受容体を意味する。ＣＡＲは「人工Ｔ細胞受容体」、「キメラＴ細胞受容体」や「キメラ免疫受容体」とも呼ばれる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、腫瘍抗原に特異的な抗体の細胞外可変ドメインと、Ｔ細胞又は他の受容体の細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば１つ又は複数の共刺激ドメインと、を含む。「ＣＡＲ－Ｔ」とはＣＡＲを発現するＴ細胞のことである。
【0128】
いくつかの特定実施形態では、上記コード配列は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする。多くのキメラ抗原受容体は当業者に知られており、本願に適用することができる。また、例えば抗体分子の抗原結合フラグメントや抗体可変ドメインを利用することにより、いかなる細胞表面マーカーに対しても特異性を有するＣＡＲを構築することができる。本明細書では、ＣＡＲを生成する任意の方法を使用することができる。例えば、US6,410,319、US7,446、191、US7,514,537、US9765342B2、WO 2002/077029、WO2015/142675、US2010/065818、US 2010/025177、US 2007/059298及びBerger C. et al., J. Clinical Investigation 118: 1 294-308 (2008)を参照し、これらは参照によって本明細書に組み込まれる。
【0129】
本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞受容体」又は「ＴＣＲ」は、ＭＨＣ分子に結合した特定の抗原ペプチドに結合する細胞外抗原結合ドメインを含む内因性又は組換えＴ細胞受容体を意味する。いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、ＴＣＲαポリペプチド鎖及びＴＣＲβポリペプチド鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＴＣＲは腫瘍抗原に特異的に結合する。「ＴＣＲ－Ｔ」とは、組換えＴＣＲを発現するＴ細胞を指す。「組換え体」という用語は、（１）天然に存在する環境から除去された、（２）自然界にその遺伝子が発見されたポリヌクレオチドの全部又は一部と関連しない、（３）自然界に関連しないポリヌクレオチドに作動可能に連結されている、又は（４）自然に存在しない、遺伝子又はタンパク質などの生体分子を指す。「組換え体」という用語は、クローニングされたＤＮＡ単離体、化学的に合成されたポリヌクレオチド類似体、又は異種系統によって生合成されたポリヌクレオチド類似体、及びそのような核酸によってコードされるタンパク質及び／又はｍＲＮＡを指すために使用され得る。
【0130】
いくつかの特定実施形態では、上記コード配列は、操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする。いくつかの実施形態では、操作されたに改変されたＴＣＲは、腫瘍抗原に対して特異的である。 いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、腫瘍細胞の細胞内タンパク質に由来する。腫瘍抗原（腫瘍関連抗原を含む）に特異的な多くのＴＣＲが記載されており、例えば、ＮＹ－ＥＳＯ－１癌－精巣抗原、ｐ５３腫瘍阻害抗原、メラノーマにおける腫瘍抗原のＴＣＲ（例えば、ＭＡＲＴＩ、ｇｐ１００）、白血病（例えば、ＷＴ１、マイナー組織適合抗原）、及び乳癌（例えば、ＨＥＲ２、ＮＹ－ＢＲ１）を含む。当分野で知られている任意のＴＣＲを本願に使用することができる。いくつかの実施形態では、ＴＣＲは腫瘍抗原に対して増強された親和性を有する。例示的なＴＣＲ及びＴＣＲを製造する方法は、例えばＵＳ５８３０７５５及びKessels et al.Immunotherapy through TCR gene transfer. Nat. Immunol. 2, 957-961 (2001)に記載されている。
【0131】
いくつかの実施形態では、上記コード配列は選択マーカーをコードする。「選択マーカー」は、検出可能な表現型を生成するように発現し、標的核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ）に挿入された選択マーカーをコードする異種核酸を有する宿主細胞の検出を容易にする遺伝子である。いくつかの実施形態では、選択マーカーは、ピューロマイシンなどの抗生物質に対する耐性を与える。選択マーカーの他の非限定的な例としては、薬剤耐性遺伝子及び栄養マーカーが含まれる。例えば、選択マーカーは、アンピシリン、カナマイシン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、カスガマイシン、リファンピシン、スペクチノマイシン、Ｄ－サイクロセリン、ナリジキシン酸、ストレプトマイシン、テトラサイクリンからなる群から選択される抗生物質耐性を付与する遺伝子であってもよい。選択マーカーの他の非限定的な例としては、アデノシルデアミナーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸還元酵素、ハイグロマイシン－Ｂ－ホスホトランスフェラーゼ、チミジンキナーゼ、及びキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼが含まれる。哺乳類細胞に適した選択マーカーの例としては、ＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン－Ｉ及び－ＩＩ、好ましくは霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなどが含まれる。いくつかの特定実施形態では、上記異種核酸は、ピューロマイシン耐性遺伝子のコード配列を含む。
【0132】
いくつかの実施形態では、上記コード配列はレポーター遺伝子である。「レポーター遺伝子」は、検出可能な産物をコードする遺伝子であるため、レポーター遺伝子産物の検出は、標的核酸の機能の評価に利用することができる。レポーター遺伝子は、任意の適切な標的核酸（例えば、プロモータ、標的遺伝子、選択マーカー、及び／又は転移因子の末端反復）と融合して、標的核酸が所与の条件下で発現又は変化した（例えば、トランスポザーゼによって切断された）か否かを検出することを可能にすることができる。レポーター遺伝子の非限定的な例としては、３－ガラクトシダーゼ、３－グルクロニダーゼ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ、例えばｅＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、カテコール２,３－オキシゲナーゼ（ｘｙｌＥ）、及びブルー蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を含む自家蛍光タンパク質が含まれる。いくつかの実施形態では、上記異種核酸は、増強型緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）をコードするコード配列を含む。 いくつかの実施形態では、上記コード配列は、複数の生物産物をコードするか、又は、融合タンパク質をコードすることができる。いくつかの実施形態では、本願の異種核酸は、ピューロマイシン耐性増強型緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）融合タンパク質をコードするコード配列を含む。
【0133】
いくつかの実施形態では、上記コード配列はトランスポザーゼをコードする。
【0134】
いくつかの実施形態では、上記コード配列は、ゲノム編集に有用なポリペプチドをコードする。ゲノム編集は、ゲノム中の所望の位置に特定の二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成し、細胞の内在性機構を利用して、相同指向性修復（ＨＤＲ）（例えば相同組換え）又は非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって誘導された切断を修復するヌクレアーゼを使用することによって達成され得る。ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ、例えば、Ｃａｓ９）ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ、例えば、ＦｏｋＩ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ、例えば、ＴＡＬＥ）、ホーミングエンドヌクレアーゼ、及びこれらの変異体を含むがこれに限定されない、任意の適切なヌクレアーゼを細胞に導入して、標的ＤＮＡ配列のゲノム編集を誘導することができる(Shukla et al. (2009) Nature 459: 437- 441; Townsend et al (2009) Nature 459: 442-445)。いくつかの実施形態では、上記コード配列はＣａｓ９ポリペプチドをコードする。
【0135】
いくつかの実施形態では、上記コード配列はＲＮＡ分子をコードする。ＲＮＡ分子は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のようなタンパク質コードＲＮＡ、又はトランスポーターＲＮＡ（ｔＲＮＡ）及びリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、微小ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）のようなスモールＲＮＡ、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）又はｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、及び長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）を含むがこれらに限定されない非タンパク質コードＲＮＡであってもよい。微小ＲＮＡやｓｉＲＮＡなど小ＲＮＡはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の過程で重要である。ＲＮＡｉは、転写後の分解や翻訳の阻害により小ＲＮＡを干渉し、本来正常に発現している標的遺伝子の発現を阻害する遺伝子調節プロセスである。ＲＮＡｉ技術の詳細な説明については、例えば、U.S. Pat. No. 6,326,527；6,452,067；6,573,099；6,753,139；及び6,777,588を参照する。いくつかの実施形態では、上記コード配列は制御性ＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態では、上記コード配列はＲＮＡｉ分子をコードする。いくつかの実施形態では、上記コード配列はｓｈＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態では、上記コード配列はｍｉＲＮＡをコードする。
【0136】
いくつかの実施形態では、上記コード配列は、ゲノム編集に有用なＲＮＡ分子をコードすることができる。このようなＲＮＡ分子の例としては、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、及びシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。
【0137】
いくつかの実施形態では、上記異種核酸は、コード配列の発現を調節する１つ又は複数の調節要素をさらに含む。調節要素は、本明細書に記載された方法及び構築体と共に使用されることが想定される。「調節要素」という用語は、プロモータ、エンハンサー、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、及び他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化（ｐｏｌｙ－Ａ）シグナル及びｐｏｌｙ－Ｕ配列のような転写終了シグナル）を含むことが意図されている。このような調節要素は、例えば、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)に記載される。
【0138】
プロモータはコード配列の発現パターンを導く重要な制御要素である。いくつかの実施形態では、上記異種核酸は、コード配列に作動可能に連結されたプロモータを含む。本願では、任意の適切なプロモータを使用することができる。いくつかの実施形態では、プロモータは内在性プロモータである。いくつかの実施形態では、プロモータは異種プロモータである。哺乳類細胞における遺伝子発現のための複数のプロモータが探索されており、当分野で知られている任意のプロモータは本願に使用することができる。プロモータは、構成性プロモータ又は誘導性プロモータのような調節性プロモータに大別できる。いくつかの実施形態では、上記異種核酸は、構成性プロモータに動作可能に連結されたコード配列（例えば、トランスポザーゼコード配列）を含む。いくつかの実施形態では、上記異種核酸は、誘導性プロモータに動作可能に連結されたコード配列（例えば、トランスポザーゼコード配列）を含む。
【0139】
構成性プロモータは、異種核酸を宿主細胞において構成的に発現させることを可能にする。本明細書で考慮される例示的な構成性プロモータは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ、ヒト伸長因子－１α（ｈＥＦ１α）、ユビキチンＣプロモータ（ＵｂｉＣ）、ホスホグリセリンキナーゼプロモータ（ＰＧＫ）、サルウイルス４０初期プロモータ（ＳＶ４０）、及びＣＭＶ初期エンハンサー（ＣＡＧＧ）に結合したニワトリβアクチンプロモータを含むが、これらに限定されない。このような構成性プロモータはトランスジーン発現（transgene expression）を駆動する面での効率が多くの研究で広範に比較されている。例えば、Ｍｉｃｈａｅｌ Ｃ．Ｍｉｌｏｎｅらは、ヒト初代Ｔ細胞におけるキメラ抗原受容体の発現を駆動するＣＭＶ、ｈＥＦ１α、ＵｂｉＣ、ＰＧＫの効率を比較し、ｈＥＦ１αプロモータが最高レベルのトランスジェニック発現を誘導するだけでなく、ＣＤ４及びＣＤ８ヒトＴ細胞においても理想的に維持されていると結論づけている(Molecular Therapy, 17(8): 1453-1464 (2009))。いくつかの実施形態では、上記異種核酸中のプロモータはＣＡＧプロモータである。図３に、構成性プロモータによって駆動されるトランスポザーゼ又は選択マーカー／レポーター遺伝子をコードする異種核酸配列を含む例示的な操作された転移因子が示されている。ここで、プロモータはＣＭＶプロモータ又はＰＧＫプロモータである。
【0140】
いくつかの用途では、いくつかの遺伝子治療において、強発現プロモータ（例えば、ＣＭＶプロモータ）の代わりに、コード配列の中程度又は弱発現パターンを有するプロモータを使用することが、過剰生産阻害（ＯＰＩ）と総称されるトランスポザーゼに基づく自動調節イベントを回避又は低減するために必要であることが想定される。
【0141】
誘導性プロモータのような調節性プロモータは、特定の発達段階、特定の組織タイプ又は亜細胞位置などの場合に異種核酸の発現を可能にする。当該分野では、誘導性、組織特異性、細胞タイプ特異性、細胞周期特異性を含む様々なタイプの調節性プロモータが知られており、例えSambrook and Russell, 2001を参照する。誘導性プロモータは調節性プロモータのカテゴリに入る。誘導性プロモータは、物理的条件、操作された哺乳類細胞の微小環境、又は操作された哺乳類細胞の生理学的状態、インデューサー（すなわち、誘導剤）、又はそれらの組み合わせのような１つ又は複数の条件によって誘導され得る。
【0142】
いくつかの実施形態では、プロモータを使用してコード配列を発現させることは、細胞タイプ、細胞系譜（cell lineages）、又は組織のサブセットにおいてのみ、又は特定の発達段階においてのみ望ましい。その例としては、Ｂ２９プロモータ（Ｂ細胞発現）、低転写因子（ＣＢＦａ２）プロモータ（幹細胞発現）、ＣＤ１４プロモータ（単球発現）、ＣＤ４３プロモータ（白血球と血小板発現）、ＣＤ４５プロモータ（造血細胞発現）、ＣＤ６８プロモータ（マクロファージ発現）、内皮糖タンパク質プロモータ（内皮細胞発現）、ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ１（ＦＬＴ１）プロモータ（内皮細胞発現）、インテグリン、α２ｂ（ＩＴＧＡ２Ｂ）プロモータ（巨核球発現）、細胞内接着分子２（ＩＣＡＭ－２）プロモータ（内皮細胞発現）、インターフェロンβ（ＩＦＮ－β）プロモータ（造血細胞発現）、β－グロビンＬＣＲ（赤血球発現）、グロビンプロモータ（赤血球発現）、β－グロビンプロモータ（赤血球発現）、α－グロビンＨＳ４０エンハンサー（赤血球発現）、アンキリン－１プロモータ（赤血球発現）、ビスコットアルドリッチ症候群タンパク質（ＷＡＳＰ）プロモータ（ヘモグロビントポロジー細胞発現）が含まれるが、これらに限定されない。
【0143】
本明細書で説明される方法の態様はターミネータ配列を利用することができる。ターミネータ配列は、転写中に遺伝子又はオペロンの末端を標識する核酸配列のセグメントを含む。この配列は、転写複合体からｍＲＮＡを放出するプロセスをトリガするシグナルを新たに合成されたｍＲＮＡに提供することによって転写終止を媒介する。これらのプロセスは、ｍＲＮＡ二次構造と複合体との直接的な相互作用及び／又は募集された終止因子の間接的な活動を含む。転写複合体の放出は、ＲＮＡポリメラーゼ及び関連する転写機構を解放し、新しいｍＲＮＡの転写を開始する。ターミネータ配列は、当該分野で知られているものを含む。本願のいくつかの実施形態では、ターミネータ配列はポリアデニル化（ｐｏｌｙ－Ａ）シグナルである。
【0144】
いくつかの実施形態では、上記異種核酸は、少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼ認識部位、例えば制限部位を含み、外来核酸を挿入する部位として使用される。当該分野では、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｌＩ、ＡｃｃＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＳｍａＩ、ＸｍａＩ、ＫｐｎＩ、ＳａｃＩ、ＥｃｏＲＩなどを含むがこれに限定されない様々な制限部位が知られている。いくつかの実施形態では、制限部位は、マルチクローニング部位（ＭＣＳ、マルチリンカーとも呼ばれる）、すなわち、複数の異なる制限エンドヌクレアーゼ（例えば、上記のもの）によって識別される密に配列されたシリーズ又は部位のアレイである。他の実施形態では、本願の異種核酸は、Ｃｒｅ、Ｆｌｐ及びＰｈｉＣ３１組換え酵素によってそれぞれ認識されるＬｏｘＰ、ＦＲＴ又はＡｔｔＢ／ＡｔｔＰ部位のような組換え酵素認識部位を含む。
【0145】
いくつかの実施形態では、上記異種核酸はタグ配列を含む。タグ配列は、分子を同定するために、又は例えばハイブリダイゼーションによって分子を捕捉するための部位を提供するために使用され得る。
【0146】
いくつかの実施形態では、上記異種核酸はバーコード配列を含む。「バーコード配列」とは、この核酸バーコードに結合された１つ又は複数の第１分子と１つ又は複数の第２分子とを識別及び／又は区別するのに有用な配列を有する核酸を意味する。核酸バーコード配列は、通常、非常に短く、例えば、長さが約５～２０塩基であり、１つ又は複数の目的の標的分子又はその増幅産物と結合することができる。核酸バーコード配列は、一本鎖又は二本鎖であってもよい。
【0147】
いくつかの実施形態では、上記異種核酸は一意の分子識別子（ＵＭＩ）を含む。本明細書で使用される場合、「一意の分子識別子」又は「ＵＭＩ」という用語は、ＵＭＩに結合される１つ又は複数の第１分子と１つ又は複数の第２分子とを識別及び／又は区別するために使用され得る核酸配列を意味する。ＵＭＩは一般的に短く、例えば、長さが約５～２０塩基であり、１つ又は複数の目的の標的分子又はその増幅産物と結合することができる。ＵＭＩは、１本鎖又は２本鎖であってもよい。いくつかの実施形態では、核酸バーコード配列及びＵＭＩの両方が、核酸標的分子又はその増幅産物に組み込まれる。通常、ＵＭＩは集団又はグループ内の類似タイプの分子を区別するために使用され、核酸バーコード配列は分子の集団又はグループを区別するために使用される。ＵＭＩと核酸バーコード配列とを併用するいくつかの実施形態では、ＵＭＩの配列長は核酸バーコード配列よりも短い。いくつかの実施形態では、ＵＭＩと核酸バーコード配列とを併用する場合、ＵＭＩは核酸バーコード配列に組み込まれる前に、標的核酸又はその増幅産物に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＵＭＩと核酸バーコード配列とを併用する場合、ＵＭＩは標的核酸又はその増幅産物に組み込まれた後、核酸バーコード配列はＵＭＩ又はその増幅産物に組み込まれる。
【0148】
転移活性
いくつかの実施形態では、本願の転移因子は、インビトロ又は細胞内で転移活性を示す。
いくつかの実施形態では、本願の転移因子は、インビトロ又は細胞内で転移活性を示す。
【0149】
転移活性は、当業者に知られている多くの技術によって検出されてもよい。ベクターからの転移因子の切除、細胞のゲノム又は染色体外ＤＮＡへの転移因子の組み込み、及び逆反復配列へのトランスポザーゼの結合能力を測定するための例は、例えば、Ivies et al. Cell, 91, 501-510 (1997), WO 98/40510 (Hackett et al.), WO 99/25817 (Hackett et al.), and WO00/68399 (Mclvor et al.)を参照する。
【0150】
いくつかの実施形態では、転移測定は、転移因子システムにおける２つの成分のトランス相補性に基づいており、１つの成分は、側部連結末端反復の選択マーカー／レポーター遺伝子（ドナー）を含み、もう１つの成分は、トランスポザーゼを発現し、転移（ヘルパー）を実行するために末端反復を識別、結合する。例えば、図３は、活性転移因子をスクリーニングするための例示的な二元構築体を示している。上の構築体は、５’から３’へ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ、トランスポザーゼ（Ｔｎ）遺伝子、及びｐｏｌｙ（Ａ）シグナルを含むトランスポザーゼ発現補助構築体である。下の構築体はドナー構築体であり、５’から３’へ、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモータ、５’標的部位反復（ＴＳＤ）配列、５’末端反復（５’ＴＲ）配列、ピューロマイシン及び増強型ＧＦＰ融合（Ｐｕｒｏ－ｅＧＦＰ）をコードする配列、３’末端反復（３’ＴＲ）配列、３’標的部位反復（ＴＳＤ）配列、及びポリ（Ａ）シグナルを含む。転移測定において、培養哺乳類細胞（例えば、ヒト２９３Ｔ、ＨｅＬａ又はＨｃｔ１１６細胞）へのドナープラスミドと補助プラスミド又は対照プラスミドとの共トランスフェクションでは、染色体の組み込み及びピューロマイシン耐性遺伝子の発現に起因してピューロマイシン耐性を発現する細胞クローンの数を遺伝子導入効率の指標とし、メチレンブルー染色によって表す。Ｋ５６２や初代Ｔ細胞などの懸濁細胞については、電気穿孔後のＧＦＰレポーター遺伝子陽性細胞から転移活性を評価することができる。図４Ａ～６Ｂは転移測定に基づくメチレンブルー染色結果のコロニーカウントを示し、対照と比較して評価したＴＥの転移測定効率を示す。このような測定における転移効率は「導入効率」とも呼ばれる。
【0151】
いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子の導入効率は、少なくとも約０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％又はそれ以上のいずれかである。いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子の導入効率は、ヒト２９３Ｔ、ＨｅＬａ、Ｈｃｔ１１６、Ｋ５６２、又は初代Ｔ細胞のようなヒト細胞において測定される。
【0152】
いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子の転移活性は、ｐｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）トランスポゾン、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）トランスポゾン、及び／又はＴｃＢｕｓｔｅｒ（ＴＢ）トランスポゾンの転移活性よりも高い。いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子の転移活性は、レポーター遺伝子に基づく転移測定（例えば、実施例２で説明したように）によって哺乳類細胞において決定されるように、ｐｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）トランスポゾンの転移活性よりも、例えば、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２ｘ、３ｘ、５ｘ、１０ｘ又はそれ以上のいずれか高い。いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子の転移活性は、レポーター遺伝子に基づく転移測定（例えば、実施例２で説明したように、）によって哺乳類細胞において決定されるように、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）トランスポゾンの転移活性よりも、例えば、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２ｘ、３ｘ、５ｘ、１０ｘ又はそれ以上のいずれか高い。いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子の転移活性は、レポーター遺伝子に基づく転移測定（例えば、実施形態２で説明したように）によって哺乳類細胞において決定されるように、ＴｃＢｕｓｔｅｒ（ＴＢ）トランスポゾンの転移活性よりも、例えば、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２ｘ、３ｘ、５ｘ、１０ｘ、又はそれ以上のいずれか高い。いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子の転移活性は、ＰＢトランスポゾン及びＳＢトランスポゾンの転移活性よりも高い。いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子の転移活性は、ＰＢトランスポゾン及びＴＢトランスポゾンの転移活性よりも高い。いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子の転移活性は、ＴＢトランスポゾン及びＳＢトランスポゾンの転移活性よりも高い。いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子の転移活性は、ＰＢトランスポゾン、ＳＢトランスポゾン、及びＴＢトランスポゾンの転移活性よりも高い。
【0153】
いくつかの実施形態では、上記この操作された転移因子の転移活性は、哺乳類細胞において評価される。いくつかの実施形態では、上記哺乳類細胞はＨｅＬａ細胞である。いくつかの実施形態では、上記哺乳類細胞はヒト胚腎２９３Ｔ（２９３Ｔ）である。いくつかの実施形態では、上記哺乳類細胞はＫ５６２細胞である。いくつかの実施形態では、上記哺乳類細胞はＨｃｔ１１６細胞である。いくつかの実施形態では、上記哺乳類細胞はヒトＴ細胞、例えばドナー由来の初代Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子は、２９３Ｔ細胞においてＨｅＬａ細胞よりも高い転移活性を有し、例えば２９３Ｔ細胞における転移活性は、ＨｅＬａ細胞における転移活性よりも、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２ｘ、３ｘ、５ｘ、１０ｘ又はそれ以上のいずれか高い。
【0154】
細胞
本明細書に記載の操作された転移因子は、様々な細胞において転移活性を有し、任意の適切な細胞の標的核酸に異種核酸を挿入するために使用され得る。
本明細書に記載の操作された転移因子は、様々な細胞において転移活性を有し、任意の適切な細胞の標的核酸に異種核酸を挿入するために使用され得る。
【0155】
いくつかの実施形態では、上記細胞は単離された細胞である。いくつかの実施形態では、上記細胞は細胞培養物中にある。いくつかの実施形態では、上記細胞はエクスビボのものである。いくつかの実施形態では、上記細胞は生きた生物から得られ、細胞培養物中に維持される。いくつかの実施形態では、上記細胞は単細胞生物である。細胞は細胞の由来、由来組織、形態、機能、組織学的マーカー、発現プロファイルなどに基づいて異なるタイプに分類することができる。
【0156】
いくつかの実施形態では、上記細胞は原核細胞である。いくつかの実施形態では、上記細胞は細菌細胞であるか、又は細菌細胞由来である。いくつかの実施形態では、上記細胞は古細菌細胞であるか、又は古細菌細胞由来である。いくつかの実施形態では、上記細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態では、上記細胞は植物細胞であるか、又は植物細胞由来である。いくつかの実施形態では、上記細胞は真菌細胞であるか、又は真菌細胞由来である。いくつかの実施形態では、上記細胞は動物細胞であるか、又は動物細胞由来である。いくつかの実施形態では、銭細胞は無脊椎動物細胞であるか、無脊椎動物細胞由来である。いくつかの実施形態では、上記細胞は脊椎動物細胞であるか、又は脊椎動物細胞由来である。いくつかの実施形態では、上記細胞は哺乳類細胞であるか、又は哺乳類細胞由来である。いくつかの実施形態では、上記細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、上記細胞はゼブラフィッシュ(D. rerio)細胞である。いくつかの実施形態では、上記細胞はげっ歯類細胞である。いくつかの実施形態では、上記細胞は合成手段により製造され、人工細胞と呼ばれることもある。いくつかの実施形態では、上記細胞は、５’ＴＲ、３’ＴＲ及び／又はトランスポザーゼ由来の動物種に関連する。いくつかの実施形態では、上記細胞は、５’ＴＲ、３’ＴＲ及び／又はトランスポザーゼ由来の動物種とは無関係である。
【0157】
いくつかの実施形態では、上記細胞は、細菌、酵母細胞、真菌細胞、藻類細胞、植物細胞又は動物細胞である。いくつかの実施形態では、上記細胞は、組織生検のような天然由来から単離された細胞である。いくつかの実施形態では、上記細胞はインビトロで培養された細胞株から単離された細胞である。いくつかの実施形態では、上記細胞は遺伝子操作された細胞である。いくつかの実施形態では、上記細胞は、核内で増殖、分化、又はその両方を経験する種子細胞である。
【0158】
いくつかの実施形態では、上記細胞は、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、シカ、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウサギ及び魚から選択される生物由来の動物細胞である。
【0159】
いくつかの実施形態では、上記細胞は、トウモロコシ、小麦、大麦、オーツ麦、イネ、大豆、アブラヤシ、ベニバナ、ゴマ、タバコ、亜麻、綿、ヒマワリ、トウジンビエ、アワ、モロコシ、アブラナ、大麻、野菜作物、飼料作物、経済作物、木本作物及びバイオマス作物から選択される生物由来の植物細胞である。
【0160】
いくつかの実施形態では、上記細胞は、ヒト、飼養動物及び農場動物、動物園、運動場、又は犬（Ｃ．ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）、ウマ、ネコ、ウシなどのペット由来の細胞を含む哺乳類細胞である。いくつかの実施形態では、上記細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、ヒト細胞はヒト胚腎２９３Ｔ（ＨＥＫ２９３Ｔ又は２９３Ｔ）細胞又はＨｅＬａ細胞である。
【0161】
いくつかの実施形態では、上記細胞は初代細胞に由来する。例えば、初代細胞の培養物を０回、１回、２回、４回、５回、１０回、１５回以上継代することができる。いくつかの実施形態では、いずれかの公知の方法によって個体から初代細胞が得られる。例えば、血液成分置換、白血球分離術、密度勾配分離などにより白血球を採取することができる。皮膚、筋、骨髄、脾臓、肝臓、膵臓、肺、腸、胃などの組織由来の細胞を生検により採取することができる。適切な溶液は、採取された細胞を分散又は懸濁させるために使用することができる。このような溶液は、一般的に平衡塩溶液（例えば、生理食塩水、リン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）、ハンクス平衡塩溶液など）であり、許容可能な低濃度緩衝液とともに、子ウシ血清又は他の天然に存在する因子を容易に補充することができる。緩衝液は、ＨＥＰＥＳ、リン酸緩衝液、乳酸緩衝液などを含んでもよい。細胞はすぐに使用することも、（例えば、冷凍することで）保存することもできる。凍結細胞は解凍可能であり、再利用可能である。細胞は、ＤＭＳＯ、血清、培地系緩衝液（例えば、１０％ＤＭＳＯ、５０％血清、４０％緩衝培地）、及び／又は凍結温度で細胞を保存するために使用される他のこのような一般的な溶液で凍結され得る。
【0162】
いくつかの実施形態では、上記細胞は細胞株に由来する。当該分野では、種々の細胞株が知られている。細胞株の例としては、２９３Ｔ、ＭＦ７、Ｋ５６２、ＨｅＬａ及びこれらのトランスジェニック品種が含まれるが、これらに限定されない。細胞株は、当業者に知られている様々なソースから入手することができる（例えば、米国典型培養物寄託センター（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓｕｓ,Ｖａ．）を参照）。
【0163】
いくつかの実施形態では、上記細胞は接着細胞を含む。いくつかの実施形態では、上記細胞は分化した接着細胞を含む。いくつかの実施形態では、上記細胞は未分化接着細胞を含む。いくつかの実施形態では、上記細胞は多能性幹細胞を含む。いくつかの実施形態では、上記細胞は非接着細胞を含む。
【0164】
いくつかの実施形態では、上記細胞は、上皮組織、筋組織、神経組織、結合組織、又はそれらの任意の組み合わせに由来する。いくつかの実施形態では、上記細胞は、肝臓、胃腸管、膵臓、腎臓、肺、気管、血管、骨格筋、心臓、皮膚、平滑筋、結合組織、角膜、泌尿器生殖系、乳腺、生殖、内皮、上皮、線維芽細胞、神経、シュワン細胞（Ｓｃｈｗａｎｎ）、脂肪、骨、骨髄、軟骨、周皮細胞（ｐｅｒｉｃｙｔｅ）、中皮、内分泌、基質、リンパ、血液、内胚葉、外胚葉、中胚葉及びそれらの組み合わせから選択される組織に由来する。いくつかの実施形態では、上記細胞は、結合組織（例えば、疎性結合組織、密性結合組織、弾性組織、網状結合組織及び脂肪組織）、筋組織（例えば、骨格筋、平滑筋及び心筋）、泌尿器生殖組織、胃腸組織、肺組織、骨組織、神経組織及び上皮組織（例えば、単層上皮及び複層上皮）、内胚葉由来の組織、中胚葉由来の組織及び外胚葉由来の組織、又はこれらの任意の組み合わせから選択される組織に由来する。いくつかの実施形態では、上記細胞は腫瘍由来である。
【0165】
いくつかの実施形態では、上記細胞は、肝臓細胞、胃腸細胞、膵臓細胞、腎臓細胞、肺細胞、気管細胞、血管細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、皮膚細胞、平滑筋細胞、結合組織細胞、角膜細胞、泌尿器生殖細胞、乳腺細胞、生殖細胞、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、神経細胞、シュワン細胞、脂肪細胞、骨細胞、骨髄細胞、軟骨細胞、周皮細胞、中皮細胞、内分泌組織由来の細胞、間質細胞、幹細胞、前駆細胞、リンパ球、血球、内胚葉由来の細胞、外胚葉由来の細胞、中胚葉由来の細胞、未分化細胞（例えば幹細胞や前駆細胞）、腫瘍細胞、ｉＰＳ細胞及びそれらの組み合わせから選択される。
【0166】
いくつかの実施形態では、上記細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）及びマクロファージなどの免疫細胞である。いくつかの実施形態では、上記細胞は、患者又はドナーから得られたヒトＴ細胞である。いくつかの実施形態では、上記細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞、ｉＮＫ－Ｔ細胞、ＮＫ－Ｔ様細胞、αβＴ細胞、αγδＴ細胞、腫瘍浸潤性Ｔ細胞、及び樹状細胞（ＤＣ）活性化Ｔ細胞から選択される免疫細胞である。いくつかの実施形態では、上記細胞は、本願の操作された転移因子又は遺伝子導入システムを使用して修飾された免疫細胞である。いくつかの実施形態では、修飾された免疫細胞はＣＡＲ－Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、修飾された免疫細胞はＴＣＲ－Ｔ細胞である。
【0167】
いくつかの実施形態では、本願の細胞は哺乳類細胞である。 いくつかの実施形態では、前記哺乳類細胞は、ヒトＨＫＴ２９３細胞又はＨｅＬａ細胞である。さらにいくつかの実施形態では、２９３Ｔ細胞における前記転移因子の転移活性は、ＨｅＬａ細胞における転移活性よりも高い。いくつかの実施形態では、前記哺乳類細胞は、免疫細胞、肝臓細胞、腫瘍細胞、幹細胞、受精卵、筋細胞及び皮膚細胞から選択される。
【0168】
いくつかの実施形態では、上記細胞は幹細胞又は前駆細胞である。細胞は、幹細胞（例えば、成体幹細胞、胚性幹細胞、ｉＰＳ細胞）及び前駆細胞（例えば、心臓前駆細胞、神経前駆細胞など）を含んでもよい。細胞は、齧歯動物幹細胞、齧歯動物前駆細胞、ヒト幹細胞、ヒト前駆細胞など、哺乳類幹細胞及び前駆細胞を含んでもよい。
【0169】
いくつかの実施形態では、上記細胞は罹患細胞である。罹患細胞は、代謝、遺伝子発現及び／又は形態的特徴が変化している場合がある。罹患細胞は、癌細胞、糖尿病細胞及びアポトーシス細胞であってもよい。罹患細胞は、罹患対象由来の細胞であってもよい。
【0170】
いくつかの実施形態では、本願の細胞は、遺伝子治療に有用な標的細胞タイプに属する。標的細胞タイプの例としては、造血幹細胞、造血前駆細胞、骨髄前駆細胞、リンパ球前駆細胞、血小板産生前駆細胞、赤血球前駆細胞、顆粒球産生前駆細胞、単球前駆細胞、巨核球、巨核芽球、巨核球、血液凝固細胞／血小板、前赤芽球、好塩基性赤芽球、多染性赤芽球、正染性赤芽球、多染性赤血球、赤血球（赤血球又はＲＢＣ）、好塩基性前骨髄球、好塩基性骨髄細胞、好塩基性後骨髄細胞、好塩基球、中性前骨髄細胞、中性後骨髄細胞、中性後骨髄細胞、好中球、好酸性前骨髄細胞、好酸性骨髄細胞、マクロファージ、樹状細胞、リンパ芽球、幼若リンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、小リンパ球、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、形質細胞、及びリンパ樹状細胞が含まれる。好ましい実施形態では、標的細胞タイプは、１つ又は複数の赤血球、例えば、前赤芽球、好塩基性赤血球、多染色赤血球、正染色赤血球、多染色赤血球、及び赤血球（ＲＢＣ）である。好ましい実施形態では、標的細胞タイプは、１つ又は複数の赤血球、例えば、前赤芽球、好塩基性赤芽球、多染性赤芽球、正染色赤芽球、多染性赤血球、及び赤血球（ＲＢＣ）である。
【0171】
ベクター
いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子及び／又はトランスポザーゼをコードする核酸配列は、１つ又は複数のベクターに存在する。
いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子及び／又はトランスポザーゼをコードする核酸配列は、１つ又は複数のベクターに存在する。
【0172】
本願では、様々な適切なベクターを使用することができる。いくつかの実施形態では、ベクターは、プラスミドベクター、コスミドベクター、人工染色体（例えば、細菌人工染色体、酵母人工染色体又は哺乳類人工染色体）、ファージ、バキュロウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、牛痘ウイルス、セムリキフォレストウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどのウイルスベクターであり、これらは全て公知であり、市販品として購入することができる。通常、適切なベクターは、少なくとも１つの生物において機能を有する複製開始点、プロモータ配列、都合のよい制限エンドヌクレアーゼ部位、及び１つ又は複数の選択マーカーを含む。
【0173】
いくつかの実施形態では、上記ベクターはプラスミドである。いくつかの実施形態では、プラスミドは、貯蔵又は増幅のために細菌に形質転換されてもよく、哺乳類細胞にトランスフェクションされてもよい。
【0174】
このベクターを哺乳類細胞に導入する方法は、当該分野において知られている。このベクターは、物理的、化学的及び／又は生物学的方法によって宿主細胞に導入することができる。本願では、様々なベクタータイプ及びベクター送達方法を単独で又は組み合わせて使用することができることが予想される。
【0175】
ベクターを宿主細胞に導入するための物理的方法は、リン酸カルシウム沈殿、脂質トランスフェクション、粒子衝撃、マイクロインジェクション、電気穿孔などを含む。ベクター及び／又は外来核酸を含む細胞を製造する方法は当該分野に公知である。例えば、Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New Yorkを参照する。いくつかの実施形態では、ベクターは、電気穿孔によって細胞内に導入される。
【0176】
異種核酸を宿主細胞に導入するための生物学的方法は、ＤＮＡ及びＲＮＡベクターを使用することを含む。ウイルスベクターは、哺乳類（例えばヒトの細胞）に遺伝子を挿入するために最も広く使用されている方法となっている。
【0177】
ベクターを宿主細胞に導入するための化学的方法は、高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、及び水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル及びリポソームを含む脂質系のようなコロイド分散系を含む。インビトロ送達ベクターとして使用されるコロイド系の例は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。
【0178】
いくつかの実施形態では、上記ベクターはウイルスベクターである。ウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、牛痘ベクター、単純ヘルペスウイルスベクター及びそれらの誘導体が含まれるが、これらに限定されない。ウイルスベクター技術は、当該分野において公知であり、例えば、Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)、及び他のウイルス学や分子生物学マニュアルに記載されている。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターの効率的な遺伝子送達と、転移因子によって達成される遺伝子発現の安定性とが組み合わされた遺伝子治療において、ウイルスベクター送達転移因子を使用することができる。例えば、Yant, Stephen R., et al. “Transposition from a gutless adeno-transposon vector stabilizes transgene expression in vivo.” Nature biotechnology 20.10 (2002): 999-1005。を参照する。
【0179】
ＩＩＩ．遺伝子導入システム
本願の別の態様は、１）操作された転移因子（例えば、本明細書に記載されたいずれかの転移因子）と、２）トランスポザーゼ、又はトランスポザーゼをコードする核酸と、を含む遺伝子導入システムを提供する。
本願の別の態様は、１）操作された転移因子（例えば、本明細書に記載されたいずれかの転移因子）と、２）トランスポザーゼ、又はトランスポザーゼをコードする核酸と、を含む遺伝子導入システムを提供する。
【0180】
いくつかの実施形態では、１）５’から３’へ、５’末端反復配列（５’ＴＲ）、異種核酸及び３’末端反復配列（３’ＴＲ）を含み、５’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １～２６及び７９～９０から選択される核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含み、３’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７～５２及び９１～１０２から選択される核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む操作された転移因子と、２）トランスポザーゼと、を含む遺伝子導入システムを提供する。いくつかの実施形態では、上記転移因子は異種核酸の細胞（例えば哺乳類細胞又は植物細胞）のＤＮＡへの挿入を可能とする転移活性を示す。いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子は表２のＴＥのいずれか１種に由来する。いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子はＴｃ１－８Ｂ＿ＤＲ、Ｔｃ１－３＿ＦＲ、Ｍａｒｉｎｅｒ２＿ＡＧ、Ｔｃ１－１＿Ｘｔ又はＴｃ１－１＿ＰＭに由来する。
【0181】
いくつかの実施形態では、１）５’から３’へ、５’末端反復配列（５’ＴＲ）、異種核酸及び３’末端反復配列（３’ＴＲ）を含み、５’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １～２６及び７９～９０から選択される核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含み、３’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７～５２及び９１～１０２から選択される核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む操作された転移因子と、２）トランスポザーゼをコードする核酸（例えばＤＮＡ又はＲＮＡ）とを含む遺伝子導入システムを提供する。いくつかの実施形態では、上記転移因子は異種核酸の細胞（例えば哺乳類細胞又は植物細胞）のＤＮＡへの挿入を可能とする転移活性を示す。いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子は表２のＴＥのいずれか１種に由来する。いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子はＴｃ１－８Ｂ＿ＤＲ、Ｔｃ１－３＿ＦＲ、Ｍａｒｉｎｅｒ２＿ＡＧ、Ｔｃ１－１＿Ｘｔ又はＴｃ１－１＿ＰＭに由来する。
【0182】
いくつかの実施形態では、１）５’から３’へ、５’末端反復配列（５’ＴＲ）、異種核酸及び３’末端反復配列（３’ＴＲ）を含む操作された転移因子と、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５３～７８及び１０３～１１４から選択されるアミノ酸配列又はその変異体を含むトランスポザーゼと、を含む遺伝子導入システムを提供する。いくつかの実施形態では、上記転移因子は異種核酸の細胞（例えば哺乳類細胞又は植物細胞）のＤＮＡへの挿入を可能とする転移活性を示す。いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子は表２のＴＥのいずれか１種に由来する。いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子はＴｃ１－８Ｂ＿ＤＲ、Ｔｃ１－３＿ＦＲ、Ｍａｒｉｎｅｒ２＿ＡＧ、Ｔｃ１－１＿Ｘｔ又はＴｃ１－１＿ＰＭに由来する。
【0183】
いくつかの実施形態では、１）５’から３’へ、５’末端反復配列（５’ＴＲ）、異種核酸及び３’末端反復配列（３’ＴＲ）を含む操作された転移因子と、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５３～７８及び１０３～１１４から選択されるアミノ酸配列又はその変異体を含むトランスポザーゼをコードする核酸（例えばＤＮＡ又はＲＮＡ）と、を含む遺伝子導入システムを提供する。いくつかの実施形態では、上記転移因子は異種核酸の細胞（例えば哺乳類細胞又は植物細胞）のＤＮＡへの挿入を可能とする転移活性を示す。いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子は表２のＴＥのいずれか１種に由来する。いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子はＴｃ１－８Ｂ＿ＤＲ、Ｔｃ１－３＿ＦＲ、Ｍａｒｉｎｅｒ２＿ＡＧ、Ｔｃ１－１＿Ｘｔ又はＴｃ１－１＿ＰＭに由来する。
【0184】
いくつかの実施形態では、１）操作された転移因子と、２）トランスポザーゼとを含み、上記転移因子は、５’から３’へ、５’末端反復配列（５’ＴＲ）、異種核酸及び３’末端反復配列（３’ＴＲ）を含み、５’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １～２６及び７９～９０から選択される核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含み、３’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７～５２及び９１～１０２から選択される核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含み、上記トランスポザーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５３～７８及び１０３～１１４から選択されるアミノ酸配列又はその変異体を含む遺伝子導入システムを提供する。いくつかの実施形態では、上記転移因子は異種核酸の細胞（例えば哺乳類細胞又は植物細胞）のＤＮＡへの挿入を可能とする転移活性を示す。いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子は表２のＴＥのいずれか１種に由来する。いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子はＴｃ１－８Ｂ＿ＤＲ、Ｔｃ１－３＿ＦＲ、Ｍａｒｉｎｅｒ２＿ＡＧ、Ｔｃ１－１＿Ｘｔ又はＴｃ１－１＿ＰＭに由来する。
【0185】
いくつかの実施形態では、１）操作された転移因子と、２）トランスポザーゼをコードする核酸（例えばＤＮＡ又はＲＮＡ）と、を含み、上記転移因子は、５’から３’へ、５’末端反復配列（５’ＴＲ）、異種核酸及び３’末端反復配列（３’ＴＲ）を含み、５’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １～２６及び７９～９０から選択される核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含み、３’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７～５２及び９１～１０２から選択される核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含み、上記トランスポザーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５３～７８及び１０３～１１４から選択されるアミノ酸配列又はその変異体を含む遺伝子導入システムを提供する。いくつかの実施形態では、上記転移因子は異種核酸の細胞（例えば哺乳類細胞又は植物細胞）のＤＮＡへの挿入を可能とする転移活性を示す。いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子は表２のＴＥのいずれか１種に由来する。いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子はＴｃ１－８Ｂ＿ＤＲ、Ｔｃ１－３＿ＦＲ、Ｍａｒｉｎｅｒ２＿ＡＧ、Ｔｃ１－１＿Ｘｔ又はＴｃ１－１＿ＰＭに由来する。
【0186】
いくつかの実施形態では、１）５’から３’へ、５’末端反復配列（５’ＴＲ）、異種核酸及び３’末端反復配列（３’ＴＲ）を含み、５’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含み、３’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２９の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む操作された転移因子と、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５５のアミノ酸配列を含むトランスポザーゼ、又はトランスポザーゼをコードする核酸と、を含む遺伝子導入システムを提供する。
【0187】
いくつかの実施形態では、１）５’から３’へ、５’末端反復配列（５’ＴＲ）、異種核酸及び３’末端反復配列（３’ＴＲ）を含み、５’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含み、３’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３４の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む操作された転移因子と、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６０のアミノ酸配列を含むトランスポザーゼ、又はトランスポザーゼをコードする核酸と、を含む遺伝子導入システムを提供する。
【0188】
いくつかの実施形態では、１）５’から３’へ、５’末端反復配列（５’ＴＲ）、異種核酸及び３’末端反復配列（３’ＴＲ）を含み、５’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含み、３’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３７の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む操作された転移因子と、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６３のアミノ酸配列を含むトランスポザーゼ、又はトランスポザーゼをコードする核酸と、を含む遺伝子導入システムを提供する。
【0189】
いくつかの実施形態では、１）５’から３’へ、５’末端反復配列（５’ＴＲ）、異種核酸及び３’末端反復配列（３’ＴＲ）を含み、５’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含み、３’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３８の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む操作された転移因子と、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６４のアミノ酸配列を含むトランスポザーゼ、又はトランスポザーゼをコードする核酸と、を含む遺伝子導入システムを提供する。
【0190】
いくつかの実施形態では、１）５’から３’へ、５’末端反復配列（５’ＴＲ）、異種核酸及び３’末端反復配列（３’ＴＲ）を含み、５’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含み、３’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３９の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む操作された転移因子と、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６５のアミノ酸配列を含むトランスポザーゼ、又はトランスポザーゼをコードする核酸と、を含む遺伝子導入システムを提供する。
【0191】
いくつかの実施形態では、１）５’から３’へ、５’末端反復配列（５’ＴＲ）、異種核酸及び３’末端反復配列（３’ＴＲ）を含み、５’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含み、３’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４２の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む操作された転移因子と、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６８のアミノ酸配列を含むトランスポザーゼ、又はトランスポザーゼをコードする核酸と、を含む遺伝子導入システムを提供する。
【0192】
いくつかの実施形態では、１）５’から３’へ、５’末端反復配列（５’ＴＲ）、異種核酸及び３’末端反復配列（３’ＴＲ）を含み、５’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２２の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含み、３’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４８の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む操作された転移因子と、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７４のアミノ酸配列を含むトランスポザーゼ、又はトランスポザーゼをコードする核酸とを含む遺伝子導入システムを提供する。
【0193】
いくつかの実施形態では、１）５’から３’へ、５’末端反復配列（５’ＴＲ）、異種核酸及び３’末端反復配列（３’ＴＲ）を含み、５’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２３の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含み、３’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４９の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む操作された転移因子と、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７５のアミノ酸配列を含むトランスポザーゼ、又はトランスポザーゼをコードする核酸と、を含む遺伝子導入システムを提供する。
【0194】
いくつかの実施形態では、１）５’から３’へ、５’末端反復配列（５’ＴＲ）、異種核酸及び３’末端反復配列（３’ＴＲ）を含み、５’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７９の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含み、３’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９１の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む操作された転移因子と、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０３のアミノ酸配列を含むトランスポザーゼ、又はトランスポザーゼをコードする核酸と、を含む遺伝子導入システムを提供する。
【0195】
いくつかの実施形態では、１）５’から３’へ、５’末端反復配列（５’ＴＲ）、異種核酸及び３’末端反復配列（３’ＴＲ）を含み、５’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８２の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含み、３’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９４の核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む操作された転移因子と、２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０６のアミノ酸配列を含むトランスポザーゼ、又はトランスポザーゼをコードする核酸と、を含む遺伝子導入システムを提供する。
【0196】
本明細書の上記遺伝子導入システムはトランスポザーゼを含む。トランスポザーゼはポリペプチドとして存在してもよい。或いは、トランスポザーゼはトランスポザーゼをコードするコード配列を含むポリヌクレオチドの形態として存在してもよい。ポリヌクレオチドはＲＮＡ、例えばトランスポザーゼをコードするｍＲＮＡ、又はＤＮＡ、例えばトランスポザーゼをコードするコード配列であってもよい。トランスポザーゼがトランスポザーゼをコードするコード配列として存在する場合、いくつかの実施形態では、上記コード配列は転移因子を含む同一のベクターに存在してもよく、すなわち、シス式である。いくつかの実施形態では、上記遺伝子導入システムは操作された転移因子を含む第１ベクターと、トランスポザーゼコード配列を含む第２ベクターとを含み、すなわち、トランス式である。
【0197】
いくつかの実施形態では、上記遺伝子導入システムは、１）操作された転移因子（本明細書の上記操作された転移因子のいずれか）を含むベクターと、２）トランスポザーゼと、を含む。
【0198】
いくつかの実施形態では、上記遺伝子導入システムは、１）操作された転移因子（本明細書の上記操作された転移因子のいずれか）と、２）トランスポザーゼをコードする核酸とを含み、上記核酸はＤＮＡである。いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子及び核酸は同一のベクターに存在する。いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子及び核酸は個別のベクターに存在する。
【0199】
いくつかの実施形態では、上記遺伝子導入システムは、１）操作された転移因子（本明細書の上記操作された転移因子のいずれか）と、２）トランスポザーゼをコードする核酸とを含み、上記核酸はＲＮＡである。いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子及び核酸は、同一のベクターに存在する。いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子及び核酸は個別のベクターに存在する。
【0200】
本明細書の前記遺伝子導入システムでは、操作された転移因子及びトランスポザーゼ又はトランスポザーゼをコードする核酸について、多くの潜在的かつ適切な細胞内送達方法の組み合わせが存在する。トランスポザーゼは、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質として送達され得る。操作された転移因子及びトランスポザーゼは、一緒に又は別々に送達することができる。例えば、トランスポゾン遺伝子とトランスポザーゼ遺伝子は、同じ組換えウイルスゲノムに一緒に含めることができ、単一感染送達系の２つの部分は、トランスポザーゼの発現が、後に細胞染色体に組み込むために、組換えウイルスゲノムからトランスポゾンを切断することを指示するようにする。別の例では、トランスポザーゼ及び転移因子は、ウイルス及び／又は脂質含有試薬のような非ウイルス系の組み合わせによって別々に送達され得る。これらの場合、上記転移因子及び／又はトランスポザーゼ遺伝子は、組換えウイルスを介して送達され得る。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、標的位置に組み込むために、そのドナーＤＮＡから転移因子を放出するように指示する。
【0201】
トランスポザーゼは、タンパク質又はトランスポザーゼタンパク質をコードする核酸として細胞に提供することができる。トランスポザーゼタンパク質をコードする核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡの形態をとることができる。タンパク質は、細胞内に単独で導入されてもよいし、プラスミド又はウイルスベクターのようなベクターに導入されてもよい。さらに、トランスポザーゼタンパク質をコードする核酸は、トランスポザーゼタンパク質の細胞内での一時的又は延長的な発現を促進するように、細胞のゲノムに安定的に又は瞬間的に組み込まれてもよい。さらに、プロモータ又は他の発現制御領域は、トランスポザーゼタンパク質をコードする核酸に作動可能に連結されて、このタンパク質の発現を定量的に又は組織特異的に調節することができる。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼタンパク質は、ＤＮＡ結合ドメイン、触媒ドメイン（トランスポザーゼ活性を有する）、及び／又は核局在シグナル（ＮＬＳ）を含む。
【0202】
したがって、本願の遺伝子導入システムを細胞に送達するために、様々な方法及び材料を使用することができる。
【0203】
例えば、１つの方法は、プラスミドベクターを使用して遺伝子導入システムを送達することである。例えば、このシステムは、トランスポザーゼ発現カセットを担持したヘルパープラスミドと、転移因子を担持したドナープラスミドとの２種類のプラスミドから構成され得る。トランスフェクション後、両方のプラスミドは細胞核に向けられ、ヘルパープラスミドからトランスポザーゼコードＲＮＡの産生を可能にし、次いで、核に導入されたトランスポザーゼサブユニットによって促進されるドナープラスミドからの転移因子の切除を行う。このような方法は単一のプラスミドにトランスポザーゼ遺伝子と転移因子を配置することによってさらに改良されてもよく、このプラスミドは、本来はヘルパー独立転移因子－トランスポザーゼベクターと呼ばれる。あるいは、トランスフェクションされたインビトロ転写ｍＲＮＡは、トランスポザーゼの豊富な供給源として働くことができ、これにより、トランスポザーゼの発現が延長された細胞を産生するリスクを排除する。
【0204】
したがって、いくつかの実施形態では、上記転移因子は第１ベクター（ドナーベクター）に存在し、トランスポザーゼをコードする核酸は第２ベクター（補助ベクター）に存在する。いくつかの実施形態では、第１ベクター及び第２ベクターは、転移のために細胞を共トランスフェクションするために使用される。
【0205】
別の方法は、ウイルスベクターを使用して遺伝子導入システムを送達することである。ウイルスベクターは免疫原性又は発がん性の問題があるかもしれないが、いくつかの用途では、高い送達効率が必要とされることがある。遺伝子導入システムの構成要素はウイルスキャプシドによって担持、伝達されてもよく、それにより、アデノウイルス又は単純ヘルペスウイルスベクターのような他の付加的ベクターに、遺伝子を組み込み、長期的なトランスジェニック発現を確立する能力を付与する。ウイルスキャプシドはベクターの安定性、組織特異的転移因子送達、及び細胞膜間輸送を提供することができ、転移因子は、転移因子の特徴的な組み込みスペクトルに従ってウイルスベクターの組み込みを促進する。ウイルスベクターに基づく送達方法及び技術は当該分野に知られている。例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンシステムのウイルスベクターに基づく転移が、アデノウイルスベクターを持つマウスの肝臓で最初に確認され、最近の研究では、大型動物へのこの方法の適用性が証明されている。アデノ随伴ウイルスベクターは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙシステムのベクターとしても好適である。例えば、Yant, Stephen R., et al. “Transposition from a gutless adeno-transposon vector stabilizes transgene expression in vivo.” Nature biotechnology 20.10 (2002): 999-1005,Hausl, Martin A., et al. “Hyperactive sleeping beauty transposase enables persistent phenotypic correction in mice and a canine model for hemophilia B.” Molecular Therapy 18.11 (2010): 1896-1906,及びZhang, Wenli, et al. “Hybrid adeno-associated viral vectors utilizing transposase-mediated somatic integration for stable transgene expression in human cells.” PloS one 8.10 (2013)を参照する。
【0206】
上述したように、本願の遺伝子導入システムは、物理的、化学的、生物学的、又はそれらの組み合わせによって宿主細胞に送達され得る。様々な送達ベクター及び方法は、いくつかの用途の所望の結果を達成するために、単独で又は組み合わせて本願に使用されることが想定される。したがって、当業者は、遺伝子治療などの想定される特定の用途に適合するために、種々の改変を有する種々の送達方法及び技術を最も好適に利用することができる。遺伝子治療を確実に実行できるようにするためには、長期的で費用対効果のある治療を提供するために、罹患組織のゲノムに治療的トランスジェニック遺伝子の安定した組み込みを実現すべきである。例えば、患者体内への効率的で免疫原性の低い遺伝子導入を実現するために、合成化合物とプラスミドとを組み合わせて使用して、ＤＮＡを細胞に送達することができる。リポソームやその他のナノ粒子は、この任務を達成するのに十分である。例えば、２つのプラスミドを患者に送達することができ、１つはトランスポザーゼの発現を提供するもの（ヘルパープラスミド）であり、もう１つは治療的トランスジェニック遺伝子を含む転移因子を提供するもの（ドナープラスミド）である。これらのＤＮＡは、リポソームと複合化され、胃腸外注射により投与されてもよい。細胞に入ると、トランスポザーゼはドナープラスミドの転移因子に結合し、それを切除してゲノムに組み込むことができる。この挿入は安定して永続的になる。ヘルパープラスミド及びドナープラスミドは、最終的には細胞及び宿主防御機構によって失われる可能性があるが、治療的トランスジェニック遺伝子を含むゲノム組み込み転移因子は、全て安定かつ永続的な修飾となる。また、これらのプラスミドの一過性は過剰な転移を減少させ、発がんリスクを最小限に抑える。
【0207】
より詳細で例示的な転移因子の送達方法及び技術は、例えば、Skipper, Kristian Alsbjerg, et al. “DNA transposon-based gene vehicles-scenes from an evolutionary drive.” Journal of biomedical science 20.1 (2013): 92に記載される。
【0208】
ＩＶ．方法
本願はさらに、標的核酸を操作された転移因子又は遺伝子導入システムと接触させることを含み、上記操作された転移因子は本明細書の上記操作された転移因子のいずれかに係る異種核酸を含み、上記遺伝子導入システムは本明細書の上記記遺伝子導入システムのいずれかに係る異種核酸を含む、標的核酸に異種核酸を挿入する方法を提供する。この方法は、インビトロ又は細胞内で行われる。
本願はさらに、標的核酸を操作された転移因子又は遺伝子導入システムと接触させることを含み、上記操作された転移因子は本明細書の上記操作された転移因子のいずれかに係る異種核酸を含み、上記遺伝子導入システムは本明細書の上記記遺伝子導入システムのいずれかに係る異種核酸を含む、標的核酸に異種核酸を挿入する方法を提供する。この方法は、インビトロ又は細胞内で行われる。
【0209】
インビトロ方法
いくつかの実施形態では、標的核酸を操作された転移因子と接触させることを含み、上記操作された転移因子は、１）操作された転移因子と、２）トランスポザーゼと、を含み、上記転移因子は、５’から３’へ、５’末端反復配列（５’ＴＲ）、異種核酸及び３’末端反復配列（３’ＴＲ）を含み、５’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １～２６及び７９～９０から選択される核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含み、３’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７～５２及び９１～１０２から選択される核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含み、上記トランスポザーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５３～７８及び１０３～１１４から選択されるアミノ酸配列又はその変異体を含む、標的核酸に異種核酸をインビトロで挿入する方法を提供する。いくつかの実施形態では、上記標的核酸は環状ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、上記標的核酸は線状ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子は表２のＴＥのいずれかに由来する。いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子はＴｃ１－８Ｂ＿ＤＲ、Ｔｃ１－３＿ＦＲ、Ｍａｒｉｎｅｒ２＿ＡＧ、Ｔｃ１－１＿Ｘｔ又はＴｃ１－１＿ＰＭに由来する。
いくつかの実施形態では、標的核酸を操作された転移因子と接触させることを含み、上記操作された転移因子は、１）操作された転移因子と、２）トランスポザーゼと、を含み、上記転移因子は、５’から３’へ、５’末端反復配列（５’ＴＲ）、異種核酸及び３’末端反復配列（３’ＴＲ）を含み、５’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １～２６及び７９～９０から選択される核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含み、３’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７～５２及び９１～１０２から選択される核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含み、上記トランスポザーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５３～７８及び１０３～１１４から選択されるアミノ酸配列又はその変異体を含む、標的核酸に異種核酸をインビトロで挿入する方法を提供する。いくつかの実施形態では、上記標的核酸は環状ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、上記標的核酸は線状ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子は表２のＴＥのいずれかに由来する。いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子はＴｃ１－８Ｂ＿ＤＲ、Ｔｃ１－３＿ＦＲ、Ｍａｒｉｎｅｒ２＿ＡＧ、Ｔｃ１－１＿Ｘｔ又はＴｃ１－１＿ＰＭに由来する。
【0210】
本明細書の上記方法は無細胞システムを含め、インビトロ転移に用いられてもよい。例えば、Goryshin, Igor Yu, and William S. Reznikoff. 「Tn5 in vitrotransposition.」 Journal of Biological Chemistry 273.13 (1998): 7367-7374を参照する。インビトロ転移活性を示す転移因子は第２世代配列決定（ＮＧＳ）ライブラリーの構築、例えばタグ付加方法に有用である。
【0211】
いくつかの実施形態では、標的核酸を操作された転移因子と接触させることを含み、上記操作された転移因子は、１）操作された転移因子と、２）トランスポザーゼと、を含み、上記転移因子は、５’から３’へ、５’末端反復配列（５’ＴＲ）、バーコード配列を含む異種核酸及び３’末端反復配列（３’ＴＲ）を含み、５’ＴＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １～２６及び７９～９０から選択される核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含み、３’ＴＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７～５２及び９１～１０２から選択される核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含み、上記トランスポザーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５３～７８及び１０３～１１４から選択されるアミノ酸配列又はその変異体を含み、これにより、複数のバーコード化核酸を提供する、標的核酸から複数のバーコード化核酸を製造する方法を提供する。いくつかの実施形態では、上記標的核酸はゲノムＤＮＡである。いくつかの実施形態では、上記標的核酸はｃＤＮＡである。いくつかの実施形態では、上記標的核酸は増幅されたＤＮＡである。いくつかの実施形態では、上記異種核酸はプライマー配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、該方法は、複数のバーコード化核酸を増幅して核酸配列決定ライブラリーを提供することをさらに含む。いくつかの実施形態では、該方法は核酸配列決定ライブラリーについて配列決定を行うことをさらに含む。いくつかの実施形態では、該方法は標的核酸を複数の操作された転移因子と接触させることを含み、各操作された転移因子は個別のバーコード配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書の上記インビトロ方法を用いて製造される核酸配列決定ライブラリーは標的核酸配列中の隣接情報を保持している。いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子は表２のＴＥのいずれかに由来する。いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子はＴｃ１－８Ｂ＿ＤＲ、Ｔｃ１－３＿ＦＲ、Ｍａｒｉｎｅｒ２＿ＡＧ、Ｔｃ１－１＿Ｘｔ又はＴｃ１－１＿ＰＭに由来する。
【0212】
いくつかの実施形態では、本明細書の上記トランスポザーゼ及び／又はＴＲ配列のいずれかを用いてタグ付加方法を提供する。Ｔｎ５トランスポゾンを用いたタグ付加方法は当該分野に知られており、例えばＵＳ９０８０２１１Ｂ２の通りであり、これは引用により全体として本明細書に組み込まれる。本明細書の上記タグ付加方法はトランスポソーム複合体組成物を用いる。
【0213】
いくつかの実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５３～７８及び１０３～１１４から選択されるアミノ酸配列又はその変異体を含むトランスポザーゼと、１つ又は２つのＴＲ配列とタグ配列を含む異種核酸と、を含むトランスポソーム複合体組成物を提供する。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体はヘアピンを形成する単一の異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、ヘアピンは切断可能な部位を含む。
【0214】
いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は２種類の異種核酸に結合する２種類のトランスポザーゼを含む。いくつかの実施形態では、５’ＴＲ配列と第１タグ配列を含む第１異種核酸に結合する第１トランスポザーゼと、３’ＴＲ配列と第２タグ配列を含む第２異種核酸に結合する第２トランスポザーゼと、を含むトランスポソーム複合体組成物を提供する。いくつかの実施形態では、上記５’ＴＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １～２６及び７９～９０から選択される核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含み、３’ＴＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７～５２及び９１～１０２から選択される核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、第１タグ配列は第２タグ配列と異なる。いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子は表２のＴＥのいずれかに由来する。いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子はＴｃ１－８Ｂ＿ＤＲ、Ｔｃ１－３＿ＦＲ、Ｍａｒｉｎｅｒ２＿ＡＧ、Ｔｃ１－１＿Ｘｔ又はＴｃ１－１＿ＰＭに由来する。
【0215】
いくつかの実施形態では、標的核酸を複数のトランスポソーム複合体と接触させることを含み、上記トランスポソーム複合体は、（１）第１トランスポザーゼとＴＲ配列及び第１タグ配列を含む第１異種核酸とを含む第１トランスポソーム複合体と、（２）第２トランスポザーゼとＴＲ配列及び第２タグ配列を含む第２異種核酸とを含む第２トランスポソーム複合体と、を含み、第１タグ配列は第２タグ配列と異なり、上記トランスポザーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５３～７８及び１０３～１１４から選択されるアミノ酸配列又はその変異体を含み、第１異種核酸及び第２異種核酸は標的核酸に挿入され、標的核酸はフラグメント化されて複数の核酸フラグメントになり、上記核酸フラグメントは核酸フラグメントの各５’末端に連結される第１又は第２核酸のうちの１つを含み、これにより、核酸フラグメントのライブラリーを提供する、標的核酸用の第１タグ配列及び第２タグ配列を有する核酸（例えば、ＤＮＡ）フラグメントライブラリーの製造方法を提供する。いくつかの実施形態では、（１）におけるトランスポソーム複合体は２つの第１異種核酸を含み、（２）におけるトランスポソーム複合体は２つの第２異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、上記５’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １～２６及び７９～９０から選択される核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含み、３’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７～５２及び９１～１０２から選択される核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、該方法は核酸フラグメントを増幅することをさらに含む。いくつかの実施形態では、該方法は核酸フラグメント又はそのアンプリコンについて配列決定を行うことをさらに含む。いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子は表２のＴＥのいずれかに由来する。いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子はＴｃ１－８Ｂ＿ＤＲ、Ｔｃ１－３＿ＦＲ、Ｍａｒｉｎｅｒ２＿ＡＧ、Ｔｃ１－１＿Ｘｔ又はＴｃ１－１＿ＰＭに由来する。
【0216】
いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子又はトランスポソーム複合体は標的核酸にランダムに、すなわち、特定の配列基序に偏らないように挿入される。いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子又はトランスポソーム複合体はＰＢ、ＳＢ又はＴＢトランスポゾンよりもランダムに標的核酸に挿入される。
【0217】
いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子又はトランスポソーム複合体は開放クロマチン領域、核小体又は他のＤＮＡ結合タンパク質に結合しない領域など、標的核酸の空間自由領域に優先的に挿入される。したがって、本明細書の上記インビトロ方法を使用して、エピゲノミクスを研究するための測定用の核酸配列ライブラリーを製造することができる（例えば、クロマチンのリモデリング又はＤＮＡメチル化）。これには、クロマチントランスポザーゼの接近可能性配列決定（ＡＴＡＣ－ｓｅｑ）、標的及びタグ下の切断（ＣＵＴ＆ＴＡＧ）、トランスポザーゼの接近可能性クロマチン及びＤＮＡのメチル化測定（ＡＴＡＣ－Ｍｅ）、及びトランスポザーゼを介したクロマチンの環化測定（Ｔｒａｃ－ｌｏｏｐｉｎｇ）が含まれるが、これらに限定されない。Ｔｎ５トランスポゾンを使用したＡＴＡＣ－ｓｅｑ、ＣＵＴ＆ＴＡＧ、ＡＴＡＣ－Ｍｅ及びＴｒａｃ－ｌｏｏｐｉｎｇ測定は、例えばBuenrostro, Jason D., et al. 「Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position.」 Nature methods (2013) 10(2): 1213;Kaya-Okur HS, et al., 「CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.」 Nature Communications (2019), 10(1):1-10;Barnett KR et al. 「ATAC-Me Captures Prolonged DNA Methylation of Dynamic Chromatin Accessibility Loci during Cell Fate Transitions.」 Molecular Cell, 2020; and Lai B. et al. 「Trac-looping measures genome structure and chromatin accessibility,」 Nature methods, 2018, 15(9): 741に記載されており、これは全体として引用により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、配列決定ライブラリー製造物はクロマチントランスポザーゼ接近可能性配列決定（ＡＴＡＣ－ｓｅｑ）に用いられる。
【0218】
いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子又はトランスポソーム複合体は空間的に接近する標的核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ）の領域へのタグ付加に有用である。空間的に互いに接近する２つの領域は末端に同じタグ配列対を含むことがある。したがって、本明細書の上記インビトロ方法は蛍光標識プローブを製造することに用いられ、該プローブはゲノムＤＮＡ中のクロマチン相互作用境界とインサイチュハイブリダイゼーション、例えばトランスポザーゼに基づく蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を行うことに用いられる。Ｔｎ５に基づくＦＩＳＨ方法は例えば、Zhang X. et al. 「Imaging chromatin interactions at sub-kilobase resolution via Tn5-FISH,」 bioRxiv, 2019:601690に記載されており、その全文は引用により本明細書に組み込まれる。
【0219】
細胞内の方法
いくつかの実施形態では、標的核酸を操作された転移因子と接触させることを含み、上記操作された転移因子は、１）操作された転移因子と、２）トランスポザーゼと、を含み、上記転移因子は、５’から３’へ、５’末端反復配列（５’ＴＲ）、異種核酸及び３’末端反復配列（３’ＴＲ）を含み、５’ＴＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １～２６及び７９～９０から選択される核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含み、３’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７～５２及び９１～１０２から選択される核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含み、上記トランスポザーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５３～７８及び１０３～１１４から選択されるアミノ酸配列又はその変異体を含む、細胞内の標的核酸に異種核酸を挿入する方法を提供する。いくつかの実施形態では、上記標的核酸はゲノムＤＮＡである。いくつかの実施形態では、上記標的核酸は染色体内ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子は表２のＴＥのいずれかに由来する。いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子はＴｃ１－８Ｂ＿ＤＲ、Ｔｃ１－３＿ＦＲ、Ｍａｒｉｎｅｒ２＿ＡＧ、Ｔｃ１－１＿Ｘｔ又はＴｃ１－１＿ＰＭに由来する。
いくつかの実施形態では、標的核酸を操作された転移因子と接触させることを含み、上記操作された転移因子は、１）操作された転移因子と、２）トランスポザーゼと、を含み、上記転移因子は、５’から３’へ、５’末端反復配列（５’ＴＲ）、異種核酸及び３’末端反復配列（３’ＴＲ）を含み、５’ＴＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １～２６及び７９～９０から選択される核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含み、３’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７～５２及び９１～１０２から選択される核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含み、上記トランスポザーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５３～７８及び１０３～１１４から選択されるアミノ酸配列又はその変異体を含む、細胞内の標的核酸に異種核酸を挿入する方法を提供する。いくつかの実施形態では、上記標的核酸はゲノムＤＮＡである。いくつかの実施形態では、上記標的核酸は染色体内ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子は表２のＴＥのいずれかに由来する。いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子はＴｃ１－８Ｂ＿ＤＲ、Ｔｃ１－３＿ＦＲ、Ｍａｒｉｎｅｒ２＿ＡＧ、Ｔｃ１－１＿Ｘｔ又はＴｃ１－１＿ＰＭに由来する。
【0220】
いくつかの実施形態では、標的核酸を操作された転移因子と接触させることを含み、上記操作された転移因子は、１）操作された転移因子と、２）トランスポザーゼと、を含み、上記転移因子は、５’から３’へ、５’末端反復配列（５’ＴＲ）、異種核酸及び３’末端反復配列（３’ＴＲ）を含み、５’ＴＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １～２６及び７９～９０から選択される核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含み、３’ＴＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７～５２及び９１～１０２から選択される核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含み、上記トランスポザーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５３～７８及び１０３～１１４から選択されるアミノ酸配列又はその変異体を含む、哺乳類細胞内の標的核酸に異種核酸を挿入する方法を提供する。いくつかの実施形態では、上記哺乳類細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、上記哺乳類細胞は動物細胞、例えば齧歯動物細胞である。いくつかの実施形態では、上記哺乳類細胞は免疫細胞、例えばＴ細胞である。いくつかの実施形態では、該方法はエクスビボで行われる。いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子は表２のＴＥのいずれかに由来する。いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子はＴｃ１－８Ｂ＿ＤＲ、Ｔｃ１－３＿ＦＲ、Ｍａｒｉｎｅｒ２＿ＡＧ、Ｔｃ１－１＿Ｘｔ又はＴｃ１－１＿ＰＭに由来する。
【0221】
いくつかの実施形態では、標的核酸を操作された転移因子と接触させることを含み、上記操作された転移因子は、１）操作された転移因子と、２）トランスポザーゼと、を含み、上記転移因子は、５’から３’へ、５’末端反復配列（５’ＴＲ）、異種核酸及び３’末端反復配列（３’ＴＲ）を含み、５’ＴＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １～２６及び７９～９０から選択される核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含み、３’ＴＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７～５２及び９１～１０２から選択される核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含み、上記トランスポザーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５３～７８及び１０３～１１４から選択されるアミノ酸配列又はその変異体を含む、植物細胞内の標的核酸に異種核酸を挿入する方法を提供する。いくつかの実施形態では、植物細胞は農作物の細胞である。いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子は表２のＴＥのいずれかに由来する。いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子はＴｃ１－８Ｂ＿ＤＲ、Ｔｃ１－３＿ＦＲ、Ｍａｒｉｎｅｒ２＿ＡＧ、Ｔｃ１－１＿Ｘｔ又はＴｃ１－１＿ＰＭに由来する。
【0222】
本明細書の上記転移因子又は遺伝子導入システムは、当該分野に知られている種々の技術のいずれかを使用して、１つ又は複数の細胞に導入することができ、例えば、マイクロインジェクション、脂質小胞（例えばカチオン性脂質小胞）への核酸フラグメントの結合、粒子衝撃、電気穿孔、ＤＮＡ凝集試薬（例えばリン酸カルシウム、ポリリジン、ポリエチレンイミン）、又はウイルスベクターに核酸フラグメントを組込み、ウイルスベクターと細胞とを接触させることなどが含まれるが、これらに限定されない。ウイルスベクターが使用される場合、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターから選択されるウイルスベクターを含む、当該分野に知られている複数のウイルスベクターのいずれかを含んでもよい。
【0223】
異種核酸は複数のオペロンを含むことができ、又は異種核酸は複数の生物産物をコードすることができることが想定される。いくつかの実施形態では、上記異種核酸は遺伝子回路をコードする。例示的な遺伝子回路は、それぞれｍＲＮＡ又はタンパク質を生成するために転写及び／又は翻訳されるエレメントの集合（各エレメントの「出力」）である。エレメント出力は、他の部分と相互作用することができ（例えば、転写又は翻訳を調節する）、又は細胞内の他の分子（例えば、細胞環境内に存在する小分子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はタンパク質）と相互作用することができる。例えば、回路は、代謝経路又は遺伝子カスケードであってもよく、それは、天然又は非天然に存在し、人工的に工学化されていてもよい。回路内の各エレメントは、プロモータ、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、コード配列（ＣＤＳ）、及び／又はターミネータなどの構成要素又は遺伝子モジュールを含んでもよい。これらの構成要素は、異なるエレメントを実現するために異なる方法で相互接続又は組み立てられてもよく、最終的なエレメントは、異なる回路又は経路を作成するために異なる方法で組み合わされてもよい。これらのエレメントに加えて、回路は、細胞内に存在するか、又は構成要素と相互作用する細胞環境内に存在する他の種類の分子を含んでもよい。
【0224】
したがって、いくつかの実施形態では、細胞を操作された転移因子と接触させることを含み、上記操作された転移因子は、１）操作された転移因子と、２）トランスポザーゼと、を含み、上記転移因子は、５’から３’へ、５’末端反復配列（５’ＴＲ）、異種核酸及び３’末端反復配列（３’ＴＲ）を含み、５’ＴＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １～２６及び７９～９０から選択される核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含み、３’ＴＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７～５２及び９１～１０２から選択される核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含み、上記トランスポザーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５３～７８及び１０３～１１４から選択されるアミノ酸配列又はその変異体を含み、異種核酸は遺伝子回路をコードする、細胞内の標的核酸に異種核酸を挿入する方法を提供する。いくつかの実施形態では、上記標的核酸はゲノムＤＮＡである。いくつかの実施形態では、上記標的核酸は染色体内ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子は表２のＴＥのいずれかに由来する。いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子はＴｃ１－８Ｂ＿ＤＲ、Ｔｃ１－３＿ＦＲ、Ｍａｒｉｎｅｒ２＿ＡＧ、Ｔｃ１－１＿Ｘｔ又はＴｃ１－１＿ＰＭに由来する。
【0225】
遺伝子回路は遺伝子治療に用いられる。遺伝子回路の設計使用方法及び技術は当該分野で知られている。さらに、例えばBrophy, Jennifer AN, and Christopher A. Voigt. "Principles of genetic circuit design." Nature methods 11.5 (2014): 508を参照することができる。
【0226】
該方法は任意の適切な細胞タイプに適用することができる。いくつかの実施形態では、上記細胞は、細菌、酵母細胞、真菌細胞、藻類細胞、植物細胞又は動物細胞である。いくつかの実施形態では、上記細胞は、組織生検のような天然由来から単離された細胞である。いくつかの実施形態では、上記細胞は、インビトロで培養された細胞株から単離された細胞である。いくつかの実施形態では、上記細胞は遺伝子操作された細胞である。いくつかの実施形態では、上記細胞は、核内で増殖、分化、又はその両方を経験する種子細胞である。
【0227】
いくつかの実施形態では、上記細胞は、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、シカ、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウサギ及び魚から選択される生物由来の動物細胞である。
【0228】
いくつかの実施形態では、上記細胞は、トウモロコシ、小麦、大麦、オーツ麦、イネ、大豆、アブラヤシ、ベニバナ、ゴマ、タバコ、亜麻、綿、ヒマワリ、トウジンビエ、アワ、モロコシ、アブラナ、大麻、野菜作物、飼料作物、経済作物、木本作物及びバイオマス作物から選択される生物由来の植物細胞である。
【0229】
いくつかの実施形態では、上記細胞は哺乳類細胞である。いくつかの実施形態では、上記細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、ヒト細胞はヒト胚腎２９３Ｔ（ＨＥＫ２９３Ｔ又は２９３Ｔ）細胞又はＨｅＬａ細胞である。いくつかの実施形態では、上記哺乳類細胞は、免疫細胞、肝臓細胞、腫瘍細胞、幹細胞、受精卵、筋細胞及び皮膚細胞から選択される。
【0230】
いくつかの実施形態では、上記細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞、ｉＮＫ－Ｔ細胞、ＮＫ－Ｔ様細胞、αγδＴ細胞、腫瘍浸潤性Ｔ細胞、及び樹状細胞（ＤＣ）活性化Ｔ細胞からなる群から選択される免疫細胞である。いくつかの実施形態では、この方法は、ＣＡＲ－Ｔ細胞又はＴＣＲ－Ｔ細胞のような修飾免疫細胞を生成する。
【0231】
いくつかの実施形態では、上記異種核酸は、細胞のゲノムに挿入される。さらにいくつかの実施形態では、上記異種核酸の挿入は細胞の遺伝子を不活性化する。いくつかの実施形態では、上記異種核酸はタンパク質又はＲＮＡｉ分子をコードする。
【0232】
さらに、上記異種核酸は、ゲノム編集に有用なＲＮＡ分子をコードすることができる。このようなＲＮＡ分子の例としては、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、及びシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。
【0233】
いくつかの実施形態では、上記異種核酸は、レポータータンパク質、抗原特異的受容体、治療的タンパク質、抗生物質耐性タンパク質、ＲＮＡｉ分子、サイトカイン、キナーゼ、抗原、抗原特異的受容体、サイトカイン受容体、及び自殺ポリペプチドからなる群から選択される生物産物をコードする。例えば、上記異種核酸は、腫瘍関連抗原に特異的な受容体をコードすることができる。この方法により操作されたＴ細胞は、腫瘍関連抗原を発現する腫瘍細胞を認識し、特異的に殺傷することができる。別の例では、上記異種核酸は、ハイグロマイシン耐性タンパク質をコードし、ハイグロマイシン耐性細胞株を樹立することができる。あるいは、上記異種核酸は、生物学的機能を有さず、それ自体を必須遺伝子に挿入することにより、他の遺伝子の機能を遮断し、その機能を遮断することにも利用可能である。
【0234】
いくつかの特定実施形態において、上記異種核酸は、遺伝子治療に有用な治療的タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、上記異種核酸は治療的抗体をコードする。いくつかの実施形態では、上記異種核酸は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又は操作されたＴＣＲのような操作された受容体をコードする。
【0235】
いくつかの実施形態では、上記異種核酸は、標的ポリヌクレオチド（「貨物遺伝子」）の挿入を促進するために、１つ又は複数のマルチクリーニング部位（ＭＣＳ）を含む。
【0236】
いくつかの実施形態では、この方法はエクスビボで行われる。いくつかの実施形態では、形質導入又はトランスフェクションされた細胞（例えば、哺乳類細胞）は、異種核酸を細胞に導入した後、エクスビボで増殖する。いくつかの実施形態では、形質導入又はトランスフェクションされた細胞は、増殖のために少なくとも約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、１２日、又は１４日のいずれか培養される。いくつかの実施形態では、形質導入又はトランスフェクションされた細胞は、約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、１２日、又は１４日のいずれかを超えないように培養される。いくつかの実施形態では、形質導入又はトランスフェクトされた細胞をさらに評価又はスクリーニングして、操作された細胞を選択する。
【0237】
レポーター遺伝子又は選択マーカーは、潜在的にトランスフェクションされた細胞を同定するため、及び調節配列の機能を評価するために使用され得る。一般に、レポーター遺伝子は、受容体生物又は組織に存在しないか、又は受容体生物又は組織によって発現されない遺伝子であり、そのコードするポリペプチドの発現が酵素活性のような容易に検出可能ないくつかの特性によって証明される。レポーター遺伝子の発現を、ＤＮＡを受容体細胞に導入した後、適切なタイミングで測定する。適切なレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼ、又は緑色蛍光タンパク質遺伝子（例えば、Ui-Tei et al. FEBS Letters 479: 79-82 (2000)）をコードする遺伝子を含んでもよい。適切な表現システムは公知であり、公知の技術を用いて作成又は商業的に入手することができる。
【0238】
細胞内の異種核酸の存在を確認する他の方法としては、例えば、当業者によく知られている、Southernブロット法、Northernブロット法、ＲＴ－ＰＣＲ、ＰＣＲなど、分子生物学的アッセイ；例えば免疫学的方法（例えばＥＬＩＳＡやプロテインブロット法）による特定のペプチドの存在の有無の検出などの生化学的アッセイが含まれる。
【0239】
本願は、遺伝的変異を研究するために哺乳類細胞の準同質遺伝子系統を生成する方法を想定している。本願はまた、生物医学的、農業的及び産業的に有用な生成物を生成するための微生物、細胞、植物、動物又は合成生物のゲノム修飾も考慮する。これらの方法は、遺伝子ノックアウト又はノックイン研究のような、ゲノムを理解するための生物学的研究ツールとして使用することができる。
【0240】
本明細書に記載のいずれかの方法を使用して異種核酸によって修飾された細胞、及びそのような細胞を含むか又はそのような細胞から産生される生物（例えば、動物、植物又は真菌）も提供される。
【0241】
標的核酸
本明細書の上記方法は、種々の標的核酸に異種核酸を挿入するのに適している。いくつかの実施形態では、上記標的核酸はＤＮＡである。いくつかの実施形態では、上記標的核酸は一本鎖である。いくつかの実施形態では、上記標的核酸は二本鎖である。いくつかの実施形態では、上記標的核酸は、一本鎖領域及び二本鎖領域を含む。いくつかの実施形態では、上記標的核酸は線状である。いくつかの実施形態では、上記標的核酸は環状である。いくつかの実施形態では、上記標的核酸は、メチル化ヌクレオチド、損傷ヌクレオチド、又はヌクレオチドアナログのような１つ又は複数の修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、上記標的核酸は修飾されていない。いくつかの実施形態では、上記標的核酸は、核小体のような１つ又は複数のタンパク質に結合する。
本明細書の上記方法は、種々の標的核酸に異種核酸を挿入するのに適している。いくつかの実施形態では、上記標的核酸はＤＮＡである。いくつかの実施形態では、上記標的核酸は一本鎖である。いくつかの実施形態では、上記標的核酸は二本鎖である。いくつかの実施形態では、上記標的核酸は、一本鎖領域及び二本鎖領域を含む。いくつかの実施形態では、上記標的核酸は線状である。いくつかの実施形態では、上記標的核酸は環状である。いくつかの実施形態では、上記標的核酸は、メチル化ヌクレオチド、損傷ヌクレオチド、又はヌクレオチドアナログのような１つ又は複数の修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、上記標的核酸は修飾されていない。いくつかの実施形態では、上記標的核酸は、核小体のような１つ又は複数のタンパク質に結合する。
【0242】
標的核酸は、任意の長さ、例えば、約１００ｂｐ、２００ｂｐ、５００ｂｐ、１０００ｂｐ、２０００ｂｐ、５０００ｂｐ、１０ｋｂ、２０ｋｂ、５０ｋｂ、１００ｋｂ、２００ｋｂ、５００ｋｂ、１Ｍｂ以上の少なくともいずれかであってもよい。いくつかの実施形態では、上記標的核酸は、約５００ｋｂ、２００ｋｂ、１００ｋｂ、５０ｋｂ、４０ｋｂ、３０ｋｂ、２０ｋｂ、１０ｋｂ、５ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、５００ｂｐ、２００ｂｐ以下のいずれかを超えない。いくつかの実施形態では、上記標的核酸は、約１００ｂｐ～５００ｂｐ、５００ｂｐ～１ｋｂ、１００ｂｐ～１ｋｂ、１ｋｂ～２ｋｂ、１００ｂｐ～５ｋｂ、１００ｂｐ～１０ｋｂ、１００ｂｐ～２０ｋｂ、１ｋｂ～５ｋｂ、１ｋｂ～１０ｋｂ、１ｋｂ～２０ｋｂ、２０ｋｂ～１００ｋｂ、１００ｋｂ～１Ｍｂのいずれかである。標的核酸はまた、任意の配列を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、上記標的核酸は、本明細書の上記操作された転移因子又は遺伝子送達システムの転移のホットスポットである特定の配列を濃縮する。いくつかの実施形態では、上記標的核酸は、ＡＴを濃縮し、例えば、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％又はそれ以上のＡＴ含有量のいずれかを有する。いくつかの実施形態では、上記標的核酸はＡＴを濃縮しない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載された操作された転移因子又は遺伝子送達システムは、特定の配列又は配列モチーフに異種核酸を挿入することを好まないので、標的核酸は特定のホットスポット配列を濃縮しない。いくつかの実施形態では、上記標的核酸は、１つ又は複数の二次構造又はより高次構造を有する。いくつかの実施形態では、上記標的核酸はクロマチン中のように凝集状態ではない。
【0243】
いくつかの実施形態では、上記標的核酸は細胞内に存在する。いくつかの実施形態では、上記標的核酸は細胞核内に存在する。いくつかの実施形態では、上記標的核酸は細胞に対して内因性である。いくつかの実施形態では、上記標的核酸はゲノムＤＮＡである。いくつかの実施形態では、上記標的核酸は染色体ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、上記標的核酸は、タンパク質コード遺伝子又はその機能領域、例えばコード領域、又はプロモータ、エンハンサー、５’又は３’非翻訳領域などの制御要素である。いくつかの実施形態では、上記標的核酸は、トランスポゾン、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム又はｌｉｎｃＲＮＡなどの非コード遺伝子である。いくつかの実施形態では、上記標的核酸はプラスミドである。
【0244】
いくつかの実施形態では、上記標的核酸は細胞に対して外因性である。いくつかの実施形態では、上記標的核酸は、ウイルスＤＮＡなどのウイルス核酸である。いくつかの実施形態では、上記標的核酸は水平に転移するプラスミドである。いくつかの実施形態では、上記標的核酸は、細胞のゲノムに組み込まれる。いくつかの実施形態では、上記標的核酸は細胞のゲノムに組み込まれていない。いくつかの実施形態では、上記標的核酸は細胞内のプラスミドである。いくつかの実施形態では、上記標的核酸は染色体外アレイ中に存在する。
【0245】
いくつかの実施形態では、上記標的核酸は、単離されたＤＮＡのような単離された核酸である。いくつかの実施形態では、上記標的核酸は無細胞環境中に存在する。いくつかの実施形態では、上記標的核酸は、プラスミドなどの単離されたベクターである。いくつかの実施形態では、上記標的核酸は単離された線状ＤＮＡフラグメントである。
【0246】
Ｖ．キット及び物品
本願はまた、本明細書に記載されたいずれかの転移因子又は遺伝子導入システムを含むキット及び物品を提供する。いくつかの実施形態では、キットは、標的核酸に異種核酸を挿入するためのプロトコールを含む（例えば、本明細書に記載のいずれかの方法を使用する）。いくつかの実施形態では、キットは、標的核酸に異種核酸をインビトロで挿入するために使用される。いくつかの実施形態では、キットは、哺乳類細胞又は植物細胞などの細胞内の標的核酸に異種核酸を挿入するために使用される。本明細書の上記キット及び物品は、インビトロ又はエクスボ、遺伝的研究及び遺伝子治療において標的核酸を修飾するために有用である。
本願はまた、本明細書に記載されたいずれかの転移因子又は遺伝子導入システムを含むキット及び物品を提供する。いくつかの実施形態では、キットは、標的核酸に異種核酸を挿入するためのプロトコールを含む（例えば、本明細書に記載のいずれかの方法を使用する）。いくつかの実施形態では、キットは、標的核酸に異種核酸をインビトロで挿入するために使用される。いくつかの実施形態では、キットは、哺乳類細胞又は植物細胞などの細胞内の標的核酸に異種核酸を挿入するために使用される。本明細書の上記キット及び物品は、インビトロ又はエクスボ、遺伝的研究及び遺伝子治療において標的核酸を修飾するために有用である。
【0247】
いくつかの実施形態では、操作された転移因子を含むキットを提供し、上記操作された転移因子は、５’から３’へ、５’末端反復配列（５’ＴＲ）、異種核酸及び３’末端反復配列（３’ＴＲ）を含み、５’ＴＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １～２６及び７９～９０から選択される核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含み、３’ＴＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７～５２及び９１～１０２から選択される核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含み、上記転移因子は異種核酸の細胞（例えば哺乳類細胞又は植物細胞）のＤＮＡへの挿入を可能とする転移活性を示す。いくつかの実施形態では、上記異種核酸は、目的ポリヌクレオチド（「貨物遺伝子」）の挿入を促進するために１つ又は複数のマルチクローニング部位（ＭＣＳ）を含む。いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子は表２のＴＥのいずれかに由来する。いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子はＴｃ１－８Ｂ＿ＤＲ、Ｔｃ１－３＿ＦＲ、Ｍａｒｉｎｅｒ２＿ＡＧ、Ｔｃ１－１＿Ｘｔ又はＴｃ１－１＿ＰＭに由来する。
【0248】
いくつかの実施形態では、遺伝子導入システムを含むキットを提供し、上記遺伝子導入システムは、１）操作された転移因子と、２）トランスポザーゼ又はトランスポザーゼをコードする核酸と、を含む、上記転移因子は、５’から３’へ、５’末端反復配列（５’ＴＲ）、異種核酸及び３’末端反復配列（３’ＴＲ）を含み、５’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １～２６及び７９～９０から選択される核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含み、３’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７～５２及び９１～１０２から選択される核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含み、上記トランスポザーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５３～７８及び１０３～１１４から選択されるアミノ酸配列、又はその変異体を含み、上記転移因子は異種核酸の細胞（例えば哺乳類細胞又は植物細胞）のＤＮＡへの挿入を可能とする転移活性を示す。いくつかの実施形態では、上記異種核酸は、目的ポリヌクレオチド（「貨物遺伝子」）の挿入を促進するために１つ又は複数のマルチクローニング（ＭＣＳ）を含む。いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子は表２のＴＥのいずれかに由来する。いくつかの実施形態では、上記操作された転移因子はＴｃ１－８Ｂ＿ＤＲ、Ｔｃ１－３＿ＦＲ、Ｍａｒｉｎｅｒ２＿ＡＧ、Ｔｃ１－１＿Ｘｔ又はＴｃ１－１＿ＰＭに由来する。
【0249】
いくつかの実施形態では、キットは、本明細書の上記方法のいずれかで使用される１つ又は複数の試薬を含む。試薬は任意の適切な容器で提供してもよい。例えば、キットは、１つ又は複数の反応性又は貯蔵性緩衝液を提供してもよい。試薬は、特定のアッセイに使用し得る形態で提供するか、又は使用前に１つ又は複数の他の成分を添加することが必要な形態（例えば、濃縮液又は凍結乾燥形態）で提供してもよい。緩衝液は、炭酸ナトリウム緩衝液、炭酸水素ナトリウム緩衝液、ホウ酸塩緩衝液、トリス緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、及びこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない任意の緩衝液であってもよい。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書の上記操作された転移因子又は遺伝子導入システムを使用して修飾された細胞の増殖又は誘導を可能にするための培地、緩衝液、試薬などを含む。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書の上記操作された転移因子又は遺伝子導入システムを使用して修飾された標的核酸を単離及び／又は製造するための緩衝液、試薬などを含む。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書の上記操作された転移因子又は遺伝子導入システムを使用して配列決定ライブラリーを製造するためのプライマー及び試薬を含む。
【0250】
キットは、適切な包装を採用する。適切な包装には、バイアル、ボトル、広口ボトル、軟包装（例えば、密封ポリエステルフィルム袋又はビニール袋）などが含まれるが、これらに限定されない。キットは、緩衝液及び説明情報のような追加の成分を選択的に提供してもよい。したがって、本願は、バイアル（例えば、密封バイアル）、ボトル、広口ボトル、軟包装などを含む物品も提供する。
【0251】
実施例
以下の実施例は、単に本発明を例示することを目的とするものであり、本発明を如何なる態様でも限定するものとは考えられない。以下の実施例及び詳細な説明は、限定ではなく、説明的に提供される。
以下の実施例は、単に本発明を例示することを目的とするものであり、本発明を如何なる態様でも限定するものとは考えられない。以下の実施例及び詳細な説明は、限定ではなく、説明的に提供される。
【0252】
実施例１：候補活性転移因子の同定
本実施例は、種間の候補活性転移因子（ＴＥ、トランスポゾン）のコンピュータ同定を記載する。トランスポゾンは様々な種に大量に存在する。しかしながら、哺乳類細胞において転移活性を示すトランスポゾンは少数である。したがって、ゲノム工学及び遺伝子治療のための試薬として有用な候補活性トランスポゾンを系統的に同定する方法が必要である。この実施例は、末端逆反復配列（ＴＩＲ、末端反復ＴＲとも呼ばれる）を有するトランスポゾンを同定することに集中しているが、この方法は、任意の他のタイプのトランスポゾンを同定することに使用されてもよい。
本実施例は、種間の候補活性転移因子（ＴＥ、トランスポゾン）のコンピュータ同定を記載する。トランスポゾンは様々な種に大量に存在する。しかしながら、哺乳類細胞において転移活性を示すトランスポゾンは少数である。したがって、ゲノム工学及び遺伝子治療のための試薬として有用な候補活性トランスポゾンを系統的に同定する方法が必要である。この実施例は、末端逆反復配列（ＴＩＲ、末端反復ＴＲとも呼ばれる）を有するトランスポゾンを同定することに集中しているが、この方法は、任意の他のタイプのトランスポゾンを同定することに使用されてもよい。
【0253】
材料及び方法
Ｒｅｐｂａｓｅは最も一般的なトランスポゾンデータベースで、さまざまな真核種から３８,０００個のトランスポゾン配列が含まれている(Bao, W., K.K. Kojima, and O. Kohany, Repbase Update, a database of repetitive elements in eukaryotic genomes. Mob DNA, 2015. 6:p.11)。これらのプロトタイプ配列の多くは共通配列であり、それぞれのトランスポゾンファミリーを再構成し、その祖先の活性化状態を近似する配列である。したがって、共通配列は、Sleeping Beauty (Ivics, Z., et al., Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells. Cell, 1997. 91(4): p. 501-10)のような、トランスジェニック及び遺伝子治療のための活性トランスポゾンの実験的再構築に有用である。このプロジェクトの最初のステップとして、候補トランスポゾンスクリーニング用に、全ての共通配列がＲｅｐｂａｓｅ（バージョンＲｅｂａｓｅ２４．０２）からダウンロードされる。
共通配列は必ずしも完全なトランスポザーゼ遺伝子を含んでいるとは限らないからである（特に高度に退化した古いトランスポゾンの場合）。他のシステム（例えば哺乳類の細胞）では、活性トランスポゾンとして機能しないので、その原始種における同定されたＴＥ転移活性を、トランスポザーゼによってコードされる重要なドメイン、共通及びファミリーメンバー間の平均配列差、コピー数、保存的末端逆反復（ＴＲ）配列、及びＴＥ側に連結される保存的標的部位反復（ＴＳＤ）を含むいくつかのパラメータを使用して評価した。上記の情報を得るために、ＵＣＳＣ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒから１００種類の動物のゲノム配列(Haeussler, M., et al., The UCSC Genome Browser database: 2019 update. Nucleic Acids Res, 2019. 47(D1): p. D853-D858)をダウンロードする。ゲノム配列は、Ｒｅｐｂａｓｅからの共通配列を使用して繰り返しマスキングされる。活性トランスポゾンは次のように定義される：１）候補トランスポゾンは最初から最後まで共通配列にマッチングする。及び２）候補トランスポゾンの長さは、トランスポゾン内に明らかな欠損がないことを確実にするために、共通トランスポゾンの長さの９０％に達する。
Ｒｅｐｂａｓｅは最も一般的なトランスポゾンデータベースで、さまざまな真核種から３８,０００個のトランスポゾン配列が含まれている(Bao, W., K.K. Kojima, and O. Kohany, Repbase Update, a database of repetitive elements in eukaryotic genomes. Mob DNA, 2015. 6:p.11)。これらのプロトタイプ配列の多くは共通配列であり、それぞれのトランスポゾンファミリーを再構成し、その祖先の活性化状態を近似する配列である。したがって、共通配列は、Sleeping Beauty (Ivics, Z., et al., Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells. Cell, 1997. 91(4): p. 501-10)のような、トランスジェニック及び遺伝子治療のための活性トランスポゾンの実験的再構築に有用である。このプロジェクトの最初のステップとして、候補トランスポゾンスクリーニング用に、全ての共通配列がＲｅｐｂａｓｅ（バージョンＲｅｂａｓｅ２４．０２）からダウンロードされる。
共通配列は必ずしも完全なトランスポザーゼ遺伝子を含んでいるとは限らないからである（特に高度に退化した古いトランスポゾンの場合）。他のシステム（例えば哺乳類の細胞）では、活性トランスポゾンとして機能しないので、その原始種における同定されたＴＥ転移活性を、トランスポザーゼによってコードされる重要なドメイン、共通及びファミリーメンバー間の平均配列差、コピー数、保存的末端逆反復（ＴＲ）配列、及びＴＥ側に連結される保存的標的部位反復（ＴＳＤ）を含むいくつかのパラメータを使用して評価した。上記の情報を得るために、ＵＣＳＣ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒから１００種類の動物のゲノム配列(Haeussler, M., et al., The UCSC Genome Browser database: 2019 update. Nucleic Acids Res, 2019. 47(D1): p. D853-D858)をダウンロードする。ゲノム配列は、Ｒｅｐｂａｓｅからの共通配列を使用して繰り返しマスキングされる。活性トランスポゾンは次のように定義される：１）候補トランスポゾンは最初から最後まで共通配列にマッチングする。及び２）候補トランスポゾンの長さは、トランスポゾン内に明らかな欠損がないことを確実にするために、共通トランスポゾンの長さの９０％に達する。
【0254】
結果
図１は、バイオインフォマティクスパイプラインのフローチャートと、パイプラインの各段階における候補活性転移因子の数を示している。
合計１００個の動物ゲノムから２６,８５３,０１９個のＤＮＡトランスポゾンのコピー（主にＴＩＲトランスポゾン）が同定された。大量のコピーは活性トランスポゾンから退化したフラグメントである。全長ＤＮＡトランスポゾンのコピー総数は１,８９５,４６６であり、Ｒｅｐｂａｓｅ内の１,５７７個の共通ＤＮＡトランスポゾンにマッピングされている。
次に、これらのトランスポゾンを調べて、トランスポザーゼ遺伝子が含まれているか否かを調べた。ＯＲＦｆｉｎｄｅｒはオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を検出するものであり、長さカットオフ値が３００アミノ酸に設定される。次いで、このタンパク質配列は、ＰｆａｍＨＭＭライブラリーに対するＰｆａｍＳｃａｎによる重要ドメインの探索に使用される(Madeira, F., et al., The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019. Nucleic Acids Res, 2019. 47(W1): p. W636-W641)。このフィルタリングステップの後、Ｔｎドメインを有する１３１個のトランスポゾンがパイプラインに残る。
次に、ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒを使用して、トランスポゾンごとのコピー数を決定する(Smit, AFA, Hubley, R & Green, P. RepeatMasker Open-4.0.2013-2015)。各種の共通トランスポゾンとそのファミリーメンバーとの間の平均配列差値を計算し、この差値は、異なる種において０～２４．４％の範囲である。表１に示すように、６２個の同定されたＴＥの平均差値は５％以下であり、６９個の同定されたＴＥの平均差値は５％以上であった。これら１３１個の活性トランスポゾンが５つのスーパーファミリーに分布していることがわかった（図２）
表１で同定された６２個のトランスポゾンのうち、合計１１個のトランスポゾンが以下のより厳格な基準を満たしていることを発見し、それらはゲノム工学に非常に適している：１）トランスポゾンの長さは３０００ｂｐ未満である。２）トランスポゾン内のミニチュア逆方向反復転移因子（ＭＩＴＥ）の数が１０個を超える。３）トランスポゾンの平均差値は１％未満である（ＴＥ ＩＤｓ：４、５、７、１２、１８、２０、２２、２５、２６、２８及び３０、表１参照）。
要約すると、これらのデータは１００個のゲノムの汎ゲノムバイオインフォマティクス解析によって同定された１３１個の候補活性トランスポゾンを示している。したがって、この実施例は、候補活性転移因子を同定するための強力なバイオインフォマティクスパイプラインの開発の成功を示している。
図１は、バイオインフォマティクスパイプラインのフローチャートと、パイプラインの各段階における候補活性転移因子の数を示している。
合計１００個の動物ゲノムから２６,８５３,０１９個のＤＮＡトランスポゾンのコピー（主にＴＩＲトランスポゾン）が同定された。大量のコピーは活性トランスポゾンから退化したフラグメントである。全長ＤＮＡトランスポゾンのコピー総数は１,８９５,４６６であり、Ｒｅｐｂａｓｅ内の１,５７７個の共通ＤＮＡトランスポゾンにマッピングされている。
次に、これらのトランスポゾンを調べて、トランスポザーゼ遺伝子が含まれているか否かを調べた。ＯＲＦｆｉｎｄｅｒはオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を検出するものであり、長さカットオフ値が３００アミノ酸に設定される。次いで、このタンパク質配列は、ＰｆａｍＨＭＭライブラリーに対するＰｆａｍＳｃａｎによる重要ドメインの探索に使用される(Madeira, F., et al., The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019. Nucleic Acids Res, 2019. 47(W1): p. W636-W641)。このフィルタリングステップの後、Ｔｎドメインを有する１３１個のトランスポゾンがパイプラインに残る。
次に、ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒを使用して、トランスポゾンごとのコピー数を決定する(Smit, AFA, Hubley, R & Green, P. RepeatMasker Open-4.0.2013-2015)。各種の共通トランスポゾンとそのファミリーメンバーとの間の平均配列差値を計算し、この差値は、異なる種において０～２４．４％の範囲である。表１に示すように、６２個の同定されたＴＥの平均差値は５％以下であり、６９個の同定されたＴＥの平均差値は５％以上であった。これら１３１個の活性トランスポゾンが５つのスーパーファミリーに分布していることがわかった（図２）
表１で同定された６２個のトランスポゾンのうち、合計１１個のトランスポゾンが以下のより厳格な基準を満たしていることを発見し、それらはゲノム工学に非常に適している：１）トランスポゾンの長さは３０００ｂｐ未満である。２）トランスポゾン内のミニチュア逆方向反復転移因子（ＭＩＴＥ）の数が１０個を超える。３）トランスポゾンの平均差値は１％未満である（ＴＥ ＩＤｓ：４、５、７、１２、１８、２０、２２、２５、２６、２８及び３０、表１参照）。
要約すると、これらのデータは１００個のゲノムの汎ゲノムバイオインフォマティクス解析によって同定された１３１個の候補活性トランスポゾンを示している。したがって、この実施例は、候補活性転移因子を同定するための強力なバイオインフォマティクスパイプラインの開発の成功を示している。
【0255】
実施例２：候補活性転移因子の検証
本実施例は、実施例１で同定された候補活性転移因子の実験的検証を説明する。
本実施例は、実施例１で同定された候補活性転移因子の実験的検証を説明する。
【0256】
材料及び方法
ＤＮＡ合成及びプラスミド構築
ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩが側部に連結された哺乳類コドン最適化トランスポザーゼＯＲＦを合成し、ＣＭＶ－ｈｙＰＢａｓｅベクターにクローニングする(K. Yusa, et al., A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proc Natl Acad Sci U S A, 2011. 108(4): p. 1531-6)。これらのベクターは、ヒトＣＭＶプロモータの下でトランスポザーゼ発現を助けるためのヘルパープラスミドである。トランスポゾンドナープラスミドは、抗生物質耐性遺伝子の両側に位置する左右のトランスポゾンフラグメントを含む。本明細書で使用される場合、左トランスポゾンフラグメント（ＬＴＦ）は、５’ＴＳＤからＴＥ配列までのトランスポゾンＯＲＦ配列の開始コドンのフラグメントを指す。本明細書で使用される場合、右転移因子フラグメント（ＲＴＦ）は、トランスポザーゼＯＲＦ配列の終止コドンからＴＥ配列の３’ＴＳＤまでのフラグメントを意味する。通常、ＴＲ配列は、左右トランスポゾンフラグメント内に位置する。例えば、前記５’ＴＲ配列はＬＴＦ配列内にあり、前記３’ＴＲ配列はＲＴＦ配列内にある。本実験で使用されるＬＴＦ及びＲＴＦ配列は、青蘭生物技術社（Ｑｉｎｇｌａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．，）により合成され、ｐＭＶベクターにクローニングされた。貨物遺伝子クローニングのためのトランスポゾンフラグメントにおいて、５’及び３’マルチクリーニング部位（ＭＣＳ）も合成された。ＴＳＤ配列は最も外側に位置する。哺乳類細胞における転移スクリーニングのためのドナープラスミドは、Ｐ２Ａ結合ピューロマイシン耐性遺伝子と、ＰＧＫプロモータにより発現される増強型ＧＦＰ遺伝子とを担持する。図３は、活性転移因子を検証するための一組の例示的な補助体及びドナー構築体を示している。
ＤＮＡ合成及びプラスミド構築
ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩが側部に連結された哺乳類コドン最適化トランスポザーゼＯＲＦを合成し、ＣＭＶ－ｈｙＰＢａｓｅベクターにクローニングする(K. Yusa, et al., A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proc Natl Acad Sci U S A, 2011. 108(4): p. 1531-6)。これらのベクターは、ヒトＣＭＶプロモータの下でトランスポザーゼ発現を助けるためのヘルパープラスミドである。トランスポゾンドナープラスミドは、抗生物質耐性遺伝子の両側に位置する左右のトランスポゾンフラグメントを含む。本明細書で使用される場合、左トランスポゾンフラグメント（ＬＴＦ）は、５’ＴＳＤからＴＥ配列までのトランスポゾンＯＲＦ配列の開始コドンのフラグメントを指す。本明細書で使用される場合、右転移因子フラグメント（ＲＴＦ）は、トランスポザーゼＯＲＦ配列の終止コドンからＴＥ配列の３’ＴＳＤまでのフラグメントを意味する。通常、ＴＲ配列は、左右トランスポゾンフラグメント内に位置する。例えば、前記５’ＴＲ配列はＬＴＦ配列内にあり、前記３’ＴＲ配列はＲＴＦ配列内にある。本実験で使用されるＬＴＦ及びＲＴＦ配列は、青蘭生物技術社（Ｑｉｎｇｌａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．，）により合成され、ｐＭＶベクターにクローニングされた。貨物遺伝子クローニングのためのトランスポゾンフラグメントにおいて、５’及び３’マルチクリーニング部位（ＭＣＳ）も合成された。ＴＳＤ配列は最も外側に位置する。哺乳類細胞における転移スクリーニングのためのドナープラスミドは、Ｐ２Ａ結合ピューロマイシン耐性遺伝子と、ＰＧＫプロモータにより発現される増強型ＧＦＰ遺伝子とを担持する。図３は、活性転移因子を検証するための一組の例示的な補助体及びドナー構築体を示している。
【0257】
哺乳類細胞における転移
４つの哺乳類細胞株ＨＥＫ２９３Ｔ（２９３Ｔとも呼ばれる）、ＨｅＬａ、Ｈｃｔ１１６及びＫ５６２は活性トランスポゾンのスクリーニングに用いられる。２９３ＴとＨｅＬａ細胞株をＤＭＥＭ培地に維持し、１０％のウシ胎児血清と１％のペニシリン／ストレプトマイシンを補充した。Ｈｃｔ１１６とＫ５６２細胞株をＲＰＭＩ １６４０培地に維持し、１０％のウシ胎児血清と１％のペニシリン／ストレプトマイシンを補充した。これらの細胞株に加えて、ＥａｓｙＳｅｐ Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔキットを用いてＣＤ３＋Ｔ細胞を単離し、その後、ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ－１０７７（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）勾配分離により単球を収集して、ＣＤ３＋Ｔ細胞を５％（ｖ／ｖ）熱不活化ウシ胎児血清、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、及び１ｍＭピルビン酸ナトリウムを補充したＸ－Ｖｉｖｏ １５培地（Ｌｏｎｚａ）に培養した。
転移測定では、トランスフェクション１８時間前に、１．２×１０５個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞、０．７×１０５個のＨｅＬａ細胞又は１．０×１０５個のＨｃｔ１１６細胞を２４ウェルプレートの各ウェルに接種した。Ｌｉｐｏ３０００を使用して、２００ｎｇのヘルパープラスミドと１００ｎｇのドナープラスミド、又は１００ｎｇのドナープラスミドだけを個々の細胞株に送達した。トランスフェクション２日後、細胞数を計算し、ＦＡＣＳによりトランスフェクション効率を測定した。次に、１／１００ｔｈトランスフェクション後のＨＥＫ２９３Ｔ、１／１００ｔｈトランスフェクション後のＨｅＬａ細胞又は１／１００ｔｈトランスフェクション後のＨｃｔ１１６細胞を１００－ｍｍプレートに移して、ピューロマイシン（０．５μｇ／ｍｌ）を用いて１０日間（ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞株）又は１４日間（ＨｅＬａ細胞株及びＨｃｔ１１６細胞株）選択した。
ピューロマイシンスクリーニング後、冷たいＰＢＳ ５ｍｌで細胞を１回洗浄し、４％ＰＦＡで１５分間固定化した後、０．２％メチレンブルー（ＰＢＳ中）で１時間染色した(Wu et al., piggyBac is a flexible and highly active transposon as compared to Sleeping Beauty, Tol2, and Mos1 in mammalian cells. PNAS, 2006. 103: p. 15008－15013)。最後に、残った非特異的に染色したものをＰＢＳで洗い流した。Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアにより単一染色コロニーをカウントした。先に算出したトランスフェクション細胞の総数とトランスフェクション効率とに基づいて、転移効率を算出した。
Ｋ５６２細胞株やＣＤ３＋Ｔ細胞などの懸濁細胞については、プラスミドをごくわずかな割合に希釈した電気穿孔後１４日目のＧＦＰ陽性細胞の割合に基づいて転移活性を評価した。
４つの哺乳類細胞株ＨＥＫ２９３Ｔ（２９３Ｔとも呼ばれる）、ＨｅＬａ、Ｈｃｔ１１６及びＫ５６２は活性トランスポゾンのスクリーニングに用いられる。２９３ＴとＨｅＬａ細胞株をＤＭＥＭ培地に維持し、１０％のウシ胎児血清と１％のペニシリン／ストレプトマイシンを補充した。Ｈｃｔ１１６とＫ５６２細胞株をＲＰＭＩ １６４０培地に維持し、１０％のウシ胎児血清と１％のペニシリン／ストレプトマイシンを補充した。これらの細胞株に加えて、ＥａｓｙＳｅｐ Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔキットを用いてＣＤ３＋Ｔ細胞を単離し、その後、ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ－１０７７（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）勾配分離により単球を収集して、ＣＤ３＋Ｔ細胞を５％（ｖ／ｖ）熱不活化ウシ胎児血清、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、及び１ｍＭピルビン酸ナトリウムを補充したＸ－Ｖｉｖｏ １５培地（Ｌｏｎｚａ）に培養した。
転移測定では、トランスフェクション１８時間前に、１．２×１０５個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞、０．７×１０５個のＨｅＬａ細胞又は１．０×１０５個のＨｃｔ１１６細胞を２４ウェルプレートの各ウェルに接種した。Ｌｉｐｏ３０００を使用して、２００ｎｇのヘルパープラスミドと１００ｎｇのドナープラスミド、又は１００ｎｇのドナープラスミドだけを個々の細胞株に送達した。トランスフェクション２日後、細胞数を計算し、ＦＡＣＳによりトランスフェクション効率を測定した。次に、１／１００ｔｈトランスフェクション後のＨＥＫ２９３Ｔ、１／１００ｔｈトランスフェクション後のＨｅＬａ細胞又は１／１００ｔｈトランスフェクション後のＨｃｔ１１６細胞を１００－ｍｍプレートに移して、ピューロマイシン（０．５μｇ／ｍｌ）を用いて１０日間（ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞株）又は１４日間（ＨｅＬａ細胞株及びＨｃｔ１１６細胞株）選択した。
ピューロマイシンスクリーニング後、冷たいＰＢＳ ５ｍｌで細胞を１回洗浄し、４％ＰＦＡで１５分間固定化した後、０．２％メチレンブルー（ＰＢＳ中）で１時間染色した(Wu et al., piggyBac is a flexible and highly active transposon as compared to Sleeping Beauty, Tol2, and Mos1 in mammalian cells. PNAS, 2006. 103: p. 15008－15013)。最後に、残った非特異的に染色したものをＰＢＳで洗い流した。Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアにより単一染色コロニーをカウントした。先に算出したトランスフェクション細胞の総数とトランスフェクション効率とに基づいて、転移効率を算出した。
Ｋ５６２細胞株やＣＤ３＋Ｔ細胞などの懸濁細胞については、プラスミドをごくわずかな割合に希釈した電気穿孔後１４日目のＧＦＰ陽性細胞の割合に基づいて転移活性を評価した。
【0258】
ＴＥ挿入ライブラリーの構築及びバイオインフォマティクス分析
ＤＮｅａｓｙ血液及び組織キット（Ｑｉａｇｅｎ,Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて安定な転移Ｋ５６２細胞からゲノムＤＮＡを単離し、Ｃｏｖａｒｉｓ Ｍ２２０超音波発生器（Ｃｏｖａｒｉｓ,ＵＳＡ）を用いて平均長さ６００ｂｐまで切断した。ＤＮＡサンプルに対して末端修復を行い、ネストＰＣＲによりリンカーライゲーションおよび増幅を行い、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑシーケンサー上で精製と配列決定を行った。次いで、ＴＥ組込み部位とベクター組込み部位の側に連結される１次配列の上流及び下流領域におけるランダム挿入部位について、最も近い遺伝子及びＴＳＳまでの距離、及び異なるクロマチン状態を比較した。
ＤＮｅａｓｙ血液及び組織キット（Ｑｉａｇｅｎ,Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて安定な転移Ｋ５６２細胞からゲノムＤＮＡを単離し、Ｃｏｖａｒｉｓ Ｍ２２０超音波発生器（Ｃｏｖａｒｉｓ,ＵＳＡ）を用いて平均長さ６００ｂｐまで切断した。ＤＮＡサンプルに対して末端修復を行い、ネストＰＣＲによりリンカーライゲーションおよび増幅を行い、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑシーケンサー上で精製と配列決定を行った。次いで、ＴＥ組込み部位とベクター組込み部位の側に連結される１次配列の上流及び下流領域におけるランダム挿入部位について、最も近い遺伝子及びＴＳＳまでの距離、及び異なるクロマチン状態を比較した。
【0259】
結果
検証項目には３回の実験が含まれる。
１回目では、まず、１％未満の差値及び１０より大きいＭＩＴＥコピー数を有する１１個のＴＥ（すなわち、ＴＥ ＩＤ：４、５、７、１２、１８、２０、２２、２５、２６、２８及び３０）を検証した。いかなる理論にも縛られることは望ましくないが、低い差値と高いＭＩＴＥコピー数は、転移因子が最近ある種で活性である可能性が高いことを示していると仮定する(R. Mitra, et al., Functional characterization of piggyBat from the bat Myotis lucifugus unveils an active mammalian DNA transposon. Proc Natl Acad Sci U S A, 2013. 110(1): p. 234-9参照)。
プラスミド構築中に、異なるソースからの２つのトランスポゾンＴＲ配列が利用可能であることを発見した。１つはデータベースが提供する共通配列からものであり、もう１つは自律配列とＭＩＴＥ配列とのアライメントによるものである。異なるＴＲ配列のソースが測定結果に影響を及ぼすか否かをテストするために、異なるソースからのＴＲ配列をそれぞれ使用して、転写測定のために２組のドナープラスミドを設計した。
その結果、初期検証でテストした１１個の候補ＴＥでは、３つのＴＥが活性であることがわかった。Ｔｃ１－３＿Ｘｔ（ＴＥ ＩＤ２５）はＨＥＫ２９３Ｔ細胞とＨｅＬａ細胞の両方で活性であることを見出し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞では、導入効率が約９．６％、ＨｅＬａ細胞では、導入効率が約３．６％であり、ｐｉｇｇｙＢａｃの約半分（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞では１８．４％、ＨｅＬａ細胞では８．３％）に相当する。２つのＴＥは、テストされた２つの細胞株のうちの１つにおいてのみ活性であることが見出された：ｈＡＴ－３＿ＸＴ（ＴＥ ＩＤ ２２）はＨｅＬａ細胞における活性が約１％であり、ｈＡＴ－５＿ＤＲ（ＴＥ ＩＤ ２８）はＨＥＫ－２９３Ｔ細胞における活性が約２％である。異なるソースのＴＲ配列を有する２つのドナープラスミド群間で転移効率に有意な差が認められなかったため、その後の実験はデータベースの共通配列からのＴＲ配列のみに依存した。
次の実験では、表１から選ばれた４８個の候補ＴＥについて、２９３Ｔ細胞株とＨｅＬａ細胞株における転移活性を評価した（そのうち、２９３Ｔ細胞のみで１６個のＴＥをテストした）。驚くほど高い成功率で、テストした４８個の候補ＴＥの中から２２個のＴＥが活性であることを発見した。このうち、Ｔｃ１－８Ｂ＿ＤＲ （ＴＥ ＩＤ １４）、Ｔｃ１－３＿ＦＲ （ＴＥ ＩＤ ２９）、Ｍａｒｉｎｅｒ２＿ＡＧ （ＴＥ ＩＤ ３５）、Ｔｃ１－１＿Ｘｔ （ＴＥ ＩＤ ３６）、Ｔｃ１－１＿ＡＧ（ＴＥ ＩＤ ３７）、Ｔｃ１－１＿ＰＭ（ＴＥ ＩＤ ４３）、Ｔｃ１－４＿Ｘｔ（ＴＥ ＩＤ ５４）及びＴｃ１－１５＿Ｘｔ（ＴＥ ＩＤ ５６）の８つのＴＥは、ｐｉｇｇｙＢａｃと同等以上の転移効率を有する。参照として、ｐｉｇｇｙＢａｃは２９３Ｔ細胞では１７．４４％、ＨｅＬａ細胞では１０．２５％の導入効率であった。
いくつかの活性ＴＥについては、転位効率が予想よりもはるかに高いため、上記細胞の標準希釈度は、個々のコロニーを正確にカウントするために、生存コロニーを測定プレート上で分離したままにするのに十分ではない。その結果、画像ソフトがカウントした染色コロニー数は過小評価されていた。これらのＴＥについては、検出プレートの染色がより高い導入効率を明確に示していたとしても、過小評価されたコロニーカウントに基づいて算出された導入効率は、実際の導入効率を過小評価したにすぎなかった。
つまり、２回の実験から５９個の候補ＴＥの転移活性を評価した。図４Ａ～５Ｂは、対照ＴＥと比較して評価されたＴＥの転移効率を示している。合計２５個のＴＥがヒト細胞株において活性であることを見出した。
２５個の活性ＴＥのうち、９個のＴＥはｈＡＴスーパーファミリーに属し、１６個のＴＥはＴｃＭａｒｉｎｅｒスーパーファミリーに属していた。８個の活性ＴＥの転移活性はｐｉｇｇｙＢａｃと同程度以上であった。この８個の高効率な活性ＴＥは全てＴｃＭａｒｉｎｅｒスーパーファミリーに属し、このスーパーファミリーの中にもっと多くの活性トランスポゾンが分布していることを示した。さらに、２５個の活性ＴＥのうち９個がネッタイツメガエル由来であった。また、ＴＥの転移活性と差値やＭＩＴＥコピー数には有意な関係は認められなかった。
３回目の実験では、表１から選ばれた残り７２個の候補ＴＥについて、２９３Ｔ細胞株及びＨｅＬａ細胞株における転移活性を評価した。候補ＴＥのうち、２９３Ｔ細胞で５％よりも大きい差値を持つ６９個のＴＥのみをテストした。テストされた７２個の候補ＴＥのうち１３個のＴＥが活性であることがわかった。結果を図６Ａ～６Ｂに示す。
表２は、２９３Ｔ細胞株とＨｅＬａ細胞株の両方又は両方の細胞株の一方のみで活性が検証された合計３８個のＴＥを含む、上記実験の経験による活性ＴＥをまとめたものである。トランスポザーゼ配列に基づいて同定された異なるスーパーファミリーに属するＴＥの系統樹を図７Ａ～７Ｃに示す。各スーパーファミリー内の種々のトランスポザーゼ間の配列類似性の百分率を表３～５に示す。
なお、５個のＤＮＡ ＴＥ（Ｔｃ１－８Ｂ＿ＤＲ （ＴＥ ＩＤ １４）、Ｔｃ１－３＿ＦＲ （ＴＥ ＩＤ ２９）、Ｍａｒｉｎｅｒ２＿ＡＧ （ＴＥ ＩＤ ３５）、Ｔｃ１－１＿Ｘｔ （ＴＥ ＩＤ ３６）、Ｔｃ１－１＿ＰＭ （ＴＥ ＩＤ ４３）は、複数回最適化されたＳＢ１００Ｘよりも高い転移活性を示す。活性が最も高い５つのＴＥは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＨＣＴ１１６細胞においてもより高い転移活性を有しており（図８Ａ～９Ｂ）、図１０Ａ～１０Ｂは、初代Ｔ細胞におけるＴＥの転移活性を示している。３つのＴＥ（Ｔｃ１－８Ｂ＿ＤＲ （ＴＥ ＩＤ １４）、Ｔｃ１－３＿ＦＲ （ＴＥ ＩＤ ２９）、Ｔｃ１－１＿ＰＭ （ＴＥ ＩＤ ４３））では、過剰生産阻害（ＯＰＩ）と呼ばれる現象は発生していない。図１１Ａ～１１Ｂは、トランスポザーゼをコードするヘルパープラスミドとトランスポゾンプラスミドの比率が最適化されるにつれて、転移活性が増加することを示している。図１２は同定した対照ＴＥ、ｐｉｇｇｙＢＡＣ、ｈｙｐｅｒＰｉｇｇｙＢａｃ及びＳＢ１００Ｘと比較して、活性が最も高い５つのＴＥの貨物（カーゴ）容量を示し、２ ｋｂ、５ ｋｂ、１０ ｋｂ及び２０ ｋｂの遺伝子長を含む。
１３１個の候補ＴＥのうち、活性ＴＥと不活性ＴＥを比較すると、活性ＴＥは低い平均多様性、やや長い予測ＴＩＲ配列、及び有意に増加した自律ＴＥの数を示した。これらの差は、予備的及び大規模なスクリーニング設定を含む、活性ＴＥを同定するためにバイオインフォマティクスパイプラインで使用できる特徴を識別するのに役立つ。
トランスポゾン組み込み部位で検索された組み込み部位は、最も活性の高い５つのＴＥの高度に好ましいＴＡ標的部位ジヌクレオチドを明らかにする（図１３）。ＴＥの標的部位ジヌクレオチドはＴｃ／Ｍａｒｉｎｅｒスーパーファミリーに属し、非常に保存的である。図１４Ａ～１８は、コンピュータで生成されたランダムデータと対照ＴＥ、ｐｉｇｇｙＢＡＣを比較することで、遺伝子と転写開始部位（ＴＳＳ）までの距離、異なるクロマチン状態を含むゲノムの特徴に組み込まれた頻度を示している。データによると、最も活性の高い５つのＴＥは全て、遺伝子配列付近の組み込みに対する選好度が非常に低く、遺伝子とＴＳＳの上下流配列に対する選好度がなかった。遺伝子発現レベルとクロマチン状態についても、活性の最も高い５つのＴＥはほぼランダムな組み込みパターンを示し、過剰な活性の発現領域に挿入されないことが多い。
検証項目には３回の実験が含まれる。
１回目では、まず、１％未満の差値及び１０より大きいＭＩＴＥコピー数を有する１１個のＴＥ（すなわち、ＴＥ ＩＤ：４、５、７、１２、１８、２０、２２、２５、２６、２８及び３０）を検証した。いかなる理論にも縛られることは望ましくないが、低い差値と高いＭＩＴＥコピー数は、転移因子が最近ある種で活性である可能性が高いことを示していると仮定する(R. Mitra, et al., Functional characterization of piggyBat from the bat Myotis lucifugus unveils an active mammalian DNA transposon. Proc Natl Acad Sci U S A, 2013. 110(1): p. 234-9参照)。
プラスミド構築中に、異なるソースからの２つのトランスポゾンＴＲ配列が利用可能であることを発見した。１つはデータベースが提供する共通配列からものであり、もう１つは自律配列とＭＩＴＥ配列とのアライメントによるものである。異なるＴＲ配列のソースが測定結果に影響を及ぼすか否かをテストするために、異なるソースからのＴＲ配列をそれぞれ使用して、転写測定のために２組のドナープラスミドを設計した。
その結果、初期検証でテストした１１個の候補ＴＥでは、３つのＴＥが活性であることがわかった。Ｔｃ１－３＿Ｘｔ（ＴＥ ＩＤ２５）はＨＥＫ２９３Ｔ細胞とＨｅＬａ細胞の両方で活性であることを見出し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞では、導入効率が約９．６％、ＨｅＬａ細胞では、導入効率が約３．６％であり、ｐｉｇｇｙＢａｃの約半分（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞では１８．４％、ＨｅＬａ細胞では８．３％）に相当する。２つのＴＥは、テストされた２つの細胞株のうちの１つにおいてのみ活性であることが見出された：ｈＡＴ－３＿ＸＴ（ＴＥ ＩＤ ２２）はＨｅＬａ細胞における活性が約１％であり、ｈＡＴ－５＿ＤＲ（ＴＥ ＩＤ ２８）はＨＥＫ－２９３Ｔ細胞における活性が約２％である。異なるソースのＴＲ配列を有する２つのドナープラスミド群間で転移効率に有意な差が認められなかったため、その後の実験はデータベースの共通配列からのＴＲ配列のみに依存した。
次の実験では、表１から選ばれた４８個の候補ＴＥについて、２９３Ｔ細胞株とＨｅＬａ細胞株における転移活性を評価した（そのうち、２９３Ｔ細胞のみで１６個のＴＥをテストした）。驚くほど高い成功率で、テストした４８個の候補ＴＥの中から２２個のＴＥが活性であることを発見した。このうち、Ｔｃ１－８Ｂ＿ＤＲ （ＴＥ ＩＤ １４）、Ｔｃ１－３＿ＦＲ （ＴＥ ＩＤ ２９）、Ｍａｒｉｎｅｒ２＿ＡＧ （ＴＥ ＩＤ ３５）、Ｔｃ１－１＿Ｘｔ （ＴＥ ＩＤ ３６）、Ｔｃ１－１＿ＡＧ（ＴＥ ＩＤ ３７）、Ｔｃ１－１＿ＰＭ（ＴＥ ＩＤ ４３）、Ｔｃ１－４＿Ｘｔ（ＴＥ ＩＤ ５４）及びＴｃ１－１５＿Ｘｔ（ＴＥ ＩＤ ５６）の８つのＴＥは、ｐｉｇｇｙＢａｃと同等以上の転移効率を有する。参照として、ｐｉｇｇｙＢａｃは２９３Ｔ細胞では１７．４４％、ＨｅＬａ細胞では１０．２５％の導入効率であった。
いくつかの活性ＴＥについては、転位効率が予想よりもはるかに高いため、上記細胞の標準希釈度は、個々のコロニーを正確にカウントするために、生存コロニーを測定プレート上で分離したままにするのに十分ではない。その結果、画像ソフトがカウントした染色コロニー数は過小評価されていた。これらのＴＥについては、検出プレートの染色がより高い導入効率を明確に示していたとしても、過小評価されたコロニーカウントに基づいて算出された導入効率は、実際の導入効率を過小評価したにすぎなかった。
つまり、２回の実験から５９個の候補ＴＥの転移活性を評価した。図４Ａ～５Ｂは、対照ＴＥと比較して評価されたＴＥの転移効率を示している。合計２５個のＴＥがヒト細胞株において活性であることを見出した。
２５個の活性ＴＥのうち、９個のＴＥはｈＡＴスーパーファミリーに属し、１６個のＴＥはＴｃＭａｒｉｎｅｒスーパーファミリーに属していた。８個の活性ＴＥの転移活性はｐｉｇｇｙＢａｃと同程度以上であった。この８個の高効率な活性ＴＥは全てＴｃＭａｒｉｎｅｒスーパーファミリーに属し、このスーパーファミリーの中にもっと多くの活性トランスポゾンが分布していることを示した。さらに、２５個の活性ＴＥのうち９個がネッタイツメガエル由来であった。また、ＴＥの転移活性と差値やＭＩＴＥコピー数には有意な関係は認められなかった。
３回目の実験では、表１から選ばれた残り７２個の候補ＴＥについて、２９３Ｔ細胞株及びＨｅＬａ細胞株における転移活性を評価した。候補ＴＥのうち、２９３Ｔ細胞で５％よりも大きい差値を持つ６９個のＴＥのみをテストした。テストされた７２個の候補ＴＥのうち１３個のＴＥが活性であることがわかった。結果を図６Ａ～６Ｂに示す。
表２は、２９３Ｔ細胞株とＨｅＬａ細胞株の両方又は両方の細胞株の一方のみで活性が検証された合計３８個のＴＥを含む、上記実験の経験による活性ＴＥをまとめたものである。トランスポザーゼ配列に基づいて同定された異なるスーパーファミリーに属するＴＥの系統樹を図７Ａ～７Ｃに示す。各スーパーファミリー内の種々のトランスポザーゼ間の配列類似性の百分率を表３～５に示す。
なお、５個のＤＮＡ ＴＥ（Ｔｃ１－８Ｂ＿ＤＲ （ＴＥ ＩＤ １４）、Ｔｃ１－３＿ＦＲ （ＴＥ ＩＤ ２９）、Ｍａｒｉｎｅｒ２＿ＡＧ （ＴＥ ＩＤ ３５）、Ｔｃ１－１＿Ｘｔ （ＴＥ ＩＤ ３６）、Ｔｃ１－１＿ＰＭ （ＴＥ ＩＤ ４３）は、複数回最適化されたＳＢ１００Ｘよりも高い転移活性を示す。活性が最も高い５つのＴＥは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＨＣＴ１１６細胞においてもより高い転移活性を有しており（図８Ａ～９Ｂ）、図１０Ａ～１０Ｂは、初代Ｔ細胞におけるＴＥの転移活性を示している。３つのＴＥ（Ｔｃ１－８Ｂ＿ＤＲ （ＴＥ ＩＤ １４）、Ｔｃ１－３＿ＦＲ （ＴＥ ＩＤ ２９）、Ｔｃ１－１＿ＰＭ （ＴＥ ＩＤ ４３））では、過剰生産阻害（ＯＰＩ）と呼ばれる現象は発生していない。図１１Ａ～１１Ｂは、トランスポザーゼをコードするヘルパープラスミドとトランスポゾンプラスミドの比率が最適化されるにつれて、転移活性が増加することを示している。図１２は同定した対照ＴＥ、ｐｉｇｇｙＢＡＣ、ｈｙｐｅｒＰｉｇｇｙＢａｃ及びＳＢ１００Ｘと比較して、活性が最も高い５つのＴＥの貨物（カーゴ）容量を示し、２ ｋｂ、５ ｋｂ、１０ ｋｂ及び２０ ｋｂの遺伝子長を含む。
１３１個の候補ＴＥのうち、活性ＴＥと不活性ＴＥを比較すると、活性ＴＥは低い平均多様性、やや長い予測ＴＩＲ配列、及び有意に増加した自律ＴＥの数を示した。これらの差は、予備的及び大規模なスクリーニング設定を含む、活性ＴＥを同定するためにバイオインフォマティクスパイプラインで使用できる特徴を識別するのに役立つ。
トランスポゾン組み込み部位で検索された組み込み部位は、最も活性の高い５つのＴＥの高度に好ましいＴＡ標的部位ジヌクレオチドを明らかにする（図１３）。ＴＥの標的部位ジヌクレオチドはＴｃ／Ｍａｒｉｎｅｒスーパーファミリーに属し、非常に保存的である。図１４Ａ～１８は、コンピュータで生成されたランダムデータと対照ＴＥ、ｐｉｇｇｙＢＡＣを比較することで、遺伝子と転写開始部位（ＴＳＳ）までの距離、異なるクロマチン状態を含むゲノムの特徴に組み込まれた頻度を示している。データによると、最も活性の高い５つのＴＥは全て、遺伝子配列付近の組み込みに対する選好度が非常に低く、遺伝子とＴＳＳの上下流配列に対する選好度がなかった。遺伝子発現レベルとクロマチン状態についても、活性の最も高い５つのＴＥはほぼランダムな組み込みパターンを示し、過剰な活性の発現領域に挿入されないことが多い。
【0260】
要約すると、これらのデータは、候補活性転移因子を識別するための確実なバイオインフォマティクスパイプラインの確立に成功したことと、同定されたＴＥの実験的検証に成功したことを示している。様々なＴＥの転移効率及び組み込みパターンは、これらのＴＥがゲノム工学的応用及び遺伝子治療に有用である可能性を示唆している。
【0261】
【表1-1】
【0262】
【表1-2】
【0263】
【表1-3】
【0264】
【表1-4】
【0265】
【表1-5】
【0266】
【表1-6】
【0267】
【表1-7】
【0268】
【表1-8】
【0269】
【表1-9】
【0270】
【表1-10】
【0271】
【表1-11】
【0272】
【表1-12】
【0273】
【表1-13】
【0274】
【表1-14】
【0275】
【表1-15】
【0276】
【表1-16】
【0277】
【表1-17】
【0278】
【表1-18】
【0279】
【表1-19】
【0280】
【表1-20】
【0281】
【表1-21】
【0282】
【表1-22】
【0283】
【表1-23】
【0284】
【表1-24】
【0285】
【表1-25】
【0286】
【表1-26】
【0287】
【表2-1】
【0288】
【表2-2】
【0289】
【表2-3】
【0290】
【表2-4】
【0291】
【表3】
【0292】
【表4】
【0293】
【表5-1】
【0294】
【表5-2】
【0295】
【表5-3】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A-B】
【図5A-B】
【図6A-B】
【図7A-B】
【図7C】
【図8A-B】
【図9A-B】
【図10A-B】
【図11A-B】
【図12】
【図13】
【図14A-B】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2022-11-30
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
操作された転移因子であって、５’から３’への順に、５’末端反復配列（５’ＴＲ）、異種核酸及び３’末端反復配列（３’ＴＲ）を含み、
前記５’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １～２６及び７９～９０から選択される核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含み、
前記３’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７～５２及び９１～１０２から選択される核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含み、
異種核酸の細胞ＤＮＡへの挿入を可能とする転移活性を示す操作された転移因子。
【請求項2】
前記５’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １～２６及び７９～９０から選択される核酸配列と少なくとも約９０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、及び／又は前記３’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７～５２及び９１～１０２から選択される核酸配列と少なくとも約９０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、好ましくは、前記５’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １～２６及び７９～９０から選択される核酸配列を含み、及び／又は前記３’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７～５２及び９１～１０２から選択される核酸配列を含む請求項１に記載の転移因子。
【請求項3】
前記５’ＴＲの５’側に連結される５’標的部位反復配列（ＴＳＤ）又は前記３’ＴＲの３’側に連結される３’ＴＳＤをさらに含み、前記５’ＴＳＤはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９１～２０６から選択される核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含み、前記３’ＴＳＤはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９１～２０６から選択される核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含む請求項１～２のいずれか１項に記載の転移因子。
【請求項4】
前記５’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３、８、１１、１２、１３、１６、２２、２３、７９及び８２から選択される核酸配列と少なくとも約９０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、前記３’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２９、３４、３７、３８、３９、４２、４８、４９、９１及び９４から選択される核酸配列と少なくとも約９０％の配列同一性を有する核酸配列であり、好ましくは、
（ａ） 前記５’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３の核酸配列を含み、前記３’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２９の核酸配列を含み、
（ｂ） 前記５’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８の核酸配列を含み、前記３’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３４の核酸配列を含み、
（ｃ） 前記５’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１の核酸配列を含み、前記３’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３７の核酸配列を含み、
（ｄ） 前記５’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２の核酸配列を含み、前記３’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３８の核酸配列を含み、又は
（ｅ） 前記５’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６の核酸配列を含み、前記３’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４２の核酸配列を含み、
更に好ましくは、前記異種核酸はコード配列を含み、
更に好ましくは、前記異種核酸は前記コード配列に作動可能に連結されるプロモータをさらに含む請求項１～３のいずれか１項に記載の転移因子。
【請求項5】
前記転移因子の転移活性はｐｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）トランスポゾン、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）トランスポゾン及び／又はＴｃＢｕｓｔｅｒ（ＴＢ）トランスポゾンの転移活性よりも高く、
好ましくは、前記細胞は動物細胞、植物細胞、藻類細胞、真菌細胞、酵母細胞又は細菌細胞であり、
更に好ましくは、前記細胞は哺乳類細胞であり、
更に好ましくは、前記哺乳類細胞は免疫細胞、肝臓細胞、腫瘍細胞、幹細胞、受精卵、筋細胞及び皮膚細胞から選択され、
更に好ましくは、前記細胞はヒト細胞である請求項１～４のいずれか１項に記載の転移因子。
【請求項6】
ヒト胚腎２９３Ｔ（２９３Ｔ）細胞での転移活性がＨｅＬａ細胞での転移活性よりも高く、
好ましくは、ベクターに存在し、
更に好ましくは、前記ベクターはプラスミドベクター又はウイルスベクターである請求項１～５のいずれか１項に記載の転移因子。
【請求項7】
１）請求項１～６のいずれか１項に記載の操作された転移因子と、２）トランスポザーゼ、又はトランスポザーゼをコードする核酸と、を含む遺伝子導入システムであって、
好ましくは、前記トランスポザーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５３～７８及び１０３～１１４から選択されるアミノ酸配列又はその変異体を含む遺伝子導入システム。
【請求項8】
１）操作された転移因子と、２）トランスポザーゼ、又はトランスポザーゼをコードする核酸と、を含み、前記転移因子は、５’から３’へ、５’末端反復配列（５’ＴＲ）、異種核酸及び３’末端反復配列（３’ＴＲ）を含み、
前記転移因子は異種核酸の細胞ＤＮＡへの挿入を可能とする転移活性を示し、
前記トランスポザーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５３～７８及び１０３～１１４から選択されるアミノ酸配列又はその変異体を含む、遺伝子導入システム。
【請求項9】
前記５’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １～２６及び７９～９０から選択される核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含み、前記３’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７～５２及び９１～１０２から選択される核酸配列、その変異体又はそのフラグメントを含み、
好ましくは、
（ａ） 前記５’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３の核酸配列を含み、前記３’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２９の核酸配列を含み、前記トランスポザーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５５のアミノ酸配列を含み、
（ｂ） 前記５’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８の核酸配列を含み、前記３’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３４の核酸配列を含み、前記トランスポザーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６０のアミノ酸配列を含み、
（ｃ） 前記５’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１の核酸配列を含み、前記３’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３７の核酸配列を含み、前記トランスポザーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６３のアミノ酸配列を含み、
（ｄ） 前記５’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２の核酸配列を含み、前記３’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３８の核酸配列を含み、前記トランスポザーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６４のアミノ酸配列を含み、又は
（ｅ） 前記５’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６の核酸配列を含み、前記３’ＴＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４２の核酸配列を含み、前記トランスポザーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６８のアミノ酸配列を含み、
更に好ましくは、前記トランスポザーゼをコードする核酸を含み、
更に好ましくは、前記転移因子及び前記トランスポザーゼをコードする核酸は異なるベクターにあるもしくは同一ベクターにある請求項８に記載の遺伝子導入システム。
【請求項10】
標的核酸に異種核酸を挿入する方法であって、前記標的核酸と、請求項１～６のいずれか１項に記載の転移因子又は請求項７～９のいずれか１項に記載の遺伝子導入システムとを接触させることで、前記異種核酸を前記標的核酸に挿入することを含む方法。
【請求項11】
インビトロで行われるもしくは、前記標的核酸は細胞内にあり、
好ましくは、前記標的核酸はゲノムＤＮＡである、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記細胞は動物細胞、植物細胞、藻類細胞、真菌細胞、酵母細胞又は細菌細胞であり、好ましくは、前記細胞は哺乳類細胞であり、更に好ましくは、前記哺乳類細胞は免疫細胞、肝臓細胞、腫瘍細胞、幹細胞、受精卵、筋細胞及び皮膚細胞から選択される請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項13】
前記異種核酸の挿入により前記細胞の遺伝子を不活化させ、好ましくは、前記異種核酸はタンパク質をコードし、更に好ましくは、前記タンパク質は、レポータータンパク質、操作された受容体、サイトカイン、抗生物質耐性タンパク質、抗原及び治療的タンパク質からなる群から選択され又は前記異種核酸はＲＮＡをコードし、更に好ましくは、前記ＲＮＡは、治療的ＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、微小ＲＮＡ、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ロングノンコードＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）からなる群から選択される請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記異種核酸の長さが約２ｋｂ～約３００ｋｂであり、及び／又は前記挿入はランダムである請求項１０～１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項15】
異種核酸を標的核酸に挿入する請求項１～６のいずれか１項に記載の操作された転移因子、又は請求項７～９のいずれか１項に記載の遺伝子導入システム及びプロトコールを含むキット。
【国際調査報告】