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特表2023-520149組換えアデノ随伴ウイルス収量を増強させるための方法

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-05-16

(54)【発明の名称】組換えアデノ随伴ウイルス収量を増強させるための方法

(51)【国際特許分類】

C12N 15/864 20060101AFI20230509BHJP

【ＦＩ】

C12N15/864 100Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022555773

(86)(22)【出願日】2021-03-15

(85)【翻訳文提出日】2022-11-11

(86)【国際出願番号】 US2021022396

(87)【国際公開番号】W WO2021188449

(87)【国際公開日】2021-09-23

(31)【優先権主張番号】62/990,099

(32)【優先日】2020-03-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】513252910

【氏名又は名称】ウルトラジェニックスファーマシューティカルインコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110003797

【氏名又は名称】弁理士法人清原国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】パンテリ，ジャントーマス

(72)【発明者】

【氏名】フルコ，キャメロンテージ

(72)【発明者】

【氏名】アレン，ジョンエバレット

(72)【発明者】

【氏名】ジャン，ミンヤン

(72)【発明者】

【氏名】ホーガン，レイチェルシー．

(57)【要約】

本発明は、組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）の産生のための方法であって、宿主細胞を、式（Ｉ）、（Ｉ－Ａ）、（Ｉ－Ｂ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、もしくは（ＩＶ）の少なくとも１種の化合物、またはその塩、またはビタミンＢ、またはこれらの任意の組合せを含む溶液と接触させるステップを含む方法を提供する。宿主細胞によるｒＡＡＶの産生を増加させるための方法であって、宿主細胞を、式（Ｉ）、（Ｉ－Ａ）、（Ｉ－Ｂ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、もしくは（ＩＶ）の少なくとも１種の化合物、またはその塩、またはビタミンＢ、またはこれらの任意の組合せを含む溶液と接触させるステップを含む方法もまた、提供される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を産生する方法であって、宿主細胞を、式（Ｉ）

【化55】

の少なくとも１種の化合物またはその塩を含む溶液と接触させるステップを含み、式中、

【化56】

が、単結合または二重結合を表し、
ｎが、１～５から選択される整数であり、
それぞれのＲ^１が、独立して、各出現について、－ＯＨ、Ｃ_１～６アルキル、Ｃ_１～６アルキル－ＯＨ、Ｃ_１～６アルキル－Ｏ－Ｃ_１～６アルキル、－Ｏ－Ｃ_１～６アルキル、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^ａ）_２、および－Ｃ（Ｏ）ＯＲ^ｂからなる群より選択され、
Ｒ^ａが、独立して、各出現について、水素またはＣ_１～６アルキルであり、
Ｒ^ｂが、独立して、各出現について、水素またはＣ_１～６アルキルであり、
Ｘが、ＣＲ^ｃＲ^ｄまたはＮであり、
Ｒ^ｃおよびＲ^ｄが、独立して、各出現について、水素、Ｃ_１～６アルキル、－ＯＨ、および－Ｏ－Ｃ_１～６アルキルからなる群より選択され、Ｒ^ｃが、水素である場合、Ｒ^ｄは、Ｃ_１～６アルキル、－ＯＨ、および－Ｏ－Ｃ_１～６アルキルから選択され、Ｒ^ｃが、Ｃ_１～６アルキル、－ＯＨ、および－Ｏ－Ｃ_１～６アルキルから選択される場合、Ｒ^ｄは、水素であり、
前記少なくとも１種の化合物が、

【化57】

でもその塩でもない、
方法。

【請求項2】

ｒＡＡＶ力価収量を増加させる方法であって、宿主細胞を、式（Ｉ）

【化58】

の少なくとも１種の化合物またはその塩を含む溶液と接触させるステップを含み、式中、

【化59】

【化60】

でもその塩でもない、
方法。

【請求項3】

Ｘが、Ｎである、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

ｎが、１である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

それぞれのＲ^１が、独立して、各出現について、Ｃ_１～６アルキル－ＯＨ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^ａ）_２、および－Ｃ（Ｏ）ＯＲ^ｂからなる群より選択される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

それぞれのＲ^１が、独立して、各出現について、ＣＨ_２ＯＨ、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、－Ｃ（Ｏ）ＯＨ、および－Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ_３からなる群より選択される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

Ｘが、ＣＲ^ｃＲ^ｄである、請求項１または２に記載の方法。

【請求項8】

Ｒ^ｃが、水素であり、Ｒ^ｄが、－ＯＨである、請求項１、２、および７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

ｎが、５である、請求項１、２、３、および７から８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

Ｒ^１が、－ＯＨである、請求項１、２、３、４、および７から９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記溶液が、式（Ｉ－Ａ）

【化61】

の少なくとも１種の化合物またはその塩を含み、式中、
Ｒ^２およびＲ^３が、独立して、各出現について、水素もしくは－ＯＨであるか、
またはＲ^２およびＲ^３が、一緒になって、オキソを形成することができ、
Ｒ^４が、水素、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ_１～６アルキル、および－Ｎ（Ｒ^ｅ）_２からなる群より選択され、
Ｒ^ｅが、独立して、各出現について、水素またはＣ_１～６アルキルである、
請求項１または２に記載の方法。

【請求項12】

Ｒ^２およびＲ^３が、一緒になって、オキソを形成する、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

Ｒ^４が、－ＮＨ_２、－ＯＨ、および－ＯＣＨ_３からなる群より選択される、請求項１１または１２に記載の方法。

【請求項14】

Ｒ^２およびＲ^３が、いずれも、水素である、請求項１１に記載の方法。

【請求項15】

Ｒ^４が、－ＯＨである、請求項１１または１４に記載の方法。

【請求項16】

前記溶液が、

【化62】

およびこれらの任意の組合せからなる群より選択される少なくとも１種の化合物を含む、
請求項１、２、および１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記溶液が、式（Ｉ－Ｂ）

【化63】

の少なくとも１種の化合物またはその塩を含み、式中、
Ｘが、ＣＲ^ｃＲ^ｄであり、
Ｒ^５ａ、Ｒ^５ｂ、Ｒ^５ｃ、Ｒ^５ｄ、およびＲ^５ｅが、独立して、各出現について、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ_１～６アルキル、Ｃ_１～６アルキル、Ｃ_１～６アルキル－ＯＨ、およびＣ_１～６アルキル－Ｏ－Ｃ_１～６アルキルであり、
Ｒ^ｃおよびＲ^ｄが、請求項１に定義される通りである、
請求項１または２に記載の方法。

【請求項18】

Ｒ^ｃが、水素であり、Ｒ^ｄが、－ＯＨである、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

Ｒ^５ａ、Ｒ^５ｂ、Ｒ^５ｃ、Ｒ^５ｄ、およびＲ^５ｅが、－ＯＨである、請求項１７または１８に記載の方法。

【請求項20】

前記溶液が、化合物

【化64】

を含む、請求項１７から１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

ｒＡＡＶを産生する方法であって、宿主細胞を、式（ＩＩ）

【化65】

の少なくとも１種の化合物またはその塩を含む溶液と接触させるステップを含み、式中、
Ｒ^６およびＲ^７が、独立して、各出現について、水素、－ＯＨ、－ＣＮ、ハロゲン、およびＣ_１～６アルキルからなる群より選択され、
Ｒ^８およびＲ^９が、独立して、各出現について、水素、－ＯＨ、－ＣＮ、ハロゲン、およびＣ_１～６アルキルからなる群より選択され、
Ｙが、ＣまたはＮであり、
Ｒ^１０およびＲ^１１が、独立して、各出現について、水素、－ＯＨ、およびＣ_１～６アルキルからなる群より選択され、
Ａが、水素、Ｃ_１～６アルキル、および－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^ｆ）_２からなる群より選択され、
Ｒ^ｆが、独立して、各出現について、水素、Ｃ_１～６アルキル、Ｃ_１～６アルキル－Ｃ（Ｏ）ＯＨ、およびＣ_１～６アルキル－ＯＨからなる群より選択され、
前記少なくとも１種の化合物が、

【化66】

でもその塩でもない、
方法。

【請求項22】

ｒＡＡＶ力価収量を増加させる方法であって、宿主細胞を、式（ＩＩ）

【化67】

【化68】

でもその塩でもない、
方法。

【請求項23】

Ｒ^６およびＲ^７が、水素である、請求項２１または２２に記載の方法。

【請求項24】

Ｒ^８およびＲ^９が、水素である、請求項２１から２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

Ｙが、Ｎである、請求項２１から２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

Ｒ^１０およびＲ^１１が、ＣＨ_３である、請求項２１から２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

Ａが、ＣＨ_３である、請求項２１から２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

前記溶液が、化合物

【化69】

を含む、請求項２１から２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

ｒＡＡＶを産生するかまたはｒＡＡＶ力価収量を増加させる方法であって、宿主細胞を、ビタミンＢ_２、ビタミンＢ_７、ビタミンＢ_９、ビタミンＢ_１２、およびこれらの任意の組合せからなる群より選択される少なくとも１種のビタミンＢを含む溶液と接触させるステップを含む、方法。

【請求項30】

前記溶液中の前記少なくとも１種の化合物またはビタミンＢの最終濃度が、０．５ｍＭよりも高い、請求項１から２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

前記溶液中の前記少なくとも１種の化合物またはビタミンＢの最終濃度が、０．５ｍＭよりも高いかまたはそれと等しい、請求項１から２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

前記溶液中の前記少なくとも１種の化合物またはビタミンＢの最終濃度が、０．５ｍＭ～１０ｍＭの間である、請求項１から２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項33】

前記溶液中の前記少なくとも１種の化合物またはビタミンＢの最終濃度が、１ｍＭ～１０ｍＭの間である、請求項１から２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

前記溶液中の前記少なくとも１種の化合物またはビタミンＢの最終濃度が、前記少なくとも１種の化合物またはビタミンＢを含む溶液と接触していない宿主細胞によって産生されるものと比較して、少なくとも１．２倍大きい量の分泌ｒＡＡＶを産生させるのに十分である、請求項１から３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

前記溶液中の前記少なくとも１種の化合物の最終濃度が、前記少なくとも１種の化合物またはビタミンＢを含む溶液と接触していない宿主細胞によって産生されるものと比較して、少なくとも１．２倍大きい量の総ｒＡＡＶを産生させるのに十分である、請求項１から３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項36】

前記溶液中の前記少なくとも１種の化合物の最終濃度が、前記少なくとも１種の化合物またはビタミンＢを含む溶液と接触していない宿主細胞によって産生されるものと比較して、１．２～２．５倍大きい量の分泌ｒＡＡＶを産生させるのに十分である、請求項１から３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項37】

前記溶液中の前記少なくとも１種の化合物の最終濃度が、前記少なくとも１種の化合物またはビタミンＢを含む溶液と接触していない宿主細胞によって産生されるものと比較して、１．２～２．５倍大きい量の総ｒＡＡＶを産生させるのに十分である、請求項１から３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項38】

前記宿主細胞が、少なくとも２日間、前記少なくとも１種の化合物またはビタミンＢを含む前記溶液と接触する、請求項１から３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項39】

前記ｒＡＡＶを収集および精製するステップをさらに含む、請求項１から３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項40】

前記宿主細胞が、哺乳動物細胞である、請求項１から３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

前記宿主細胞が、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ、Ａ５４９、ＢＨＫ、およびＶｅｒｏ細胞からなる群より選択される、請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

前記宿主細胞が、ＨｅＬａ細胞である、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

前記宿主細胞が、ＨＥＫ２９３細胞である、請求項４１に記載の方法。

【請求項44】

前記宿主細胞が、昆虫細胞である、請求項１から３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項45】

前記宿主細胞が、Ｓｆ９、Ｓｆ－２１、Ｔｎ－３６８、およびＢＴＩ－Ｔｎ－５Ｂ１－４（Ｈｉｇｈ－Ｆｉｖｅ）細胞からなる群より選択される、請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

前記宿主細胞が、ＡＡＶ末端逆位配列が隣接した異種ヌクレオチド配列を含む、請求項１から４５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項47】

前記宿主細胞が、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含む、請求項１から４６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項48】

前記宿主細胞が、ヘルパーウイルス遺伝子を含む、請求項１から４７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項49】

前記宿主細胞が、ｉ）ＡＡＶ末端逆位配列が隣接した異種ヌクレオチド配列、ｉｉ）ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびにｉｉｉ）ヘルパーウイルス遺伝子を含む、請求項１から４８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項50】

前記宿主細胞が、前記少なくとも１種の化合物を含む溶液と接触していない宿主細胞によって産生されるものと比較して、少なくとも１．２倍大きい量の分泌ｒＡＡＶを産生する、請求項１から４９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項51】

前記宿主細胞が、前記少なくとも１種の化合物またはビタミンＢを含む溶液と接触していない宿主細胞によって産生されるものと比較して、少なくとも１．２倍大きい量の総ｒＡＡＶを産生する、請求項１から４９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項52】

前記宿主細胞が、前記少なくとも１種の化合物またはビタミンＢを含む溶液と接触していない宿主細胞によって産生されるものと比較して、１．２～２．５倍大きい量の分泌ｒＡＡＶを産生する、請求項１から４９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項53】

前記宿主細胞が、前記少なくとも１種の化合物またはビタミンＢを含む溶液と接触していない宿主細胞によって産生されるものと比較して、１．２～２．５倍大きい量の総ｒＡＡＶを産生する、請求項１から４９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項54】

前記溶液が、細胞培養培地を含む、請求項１から５３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項55】

前記溶液が、産生培地を含む、請求項１から５３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項56】

前記宿主細胞を、懸濁培養において培養するステップを含む、請求項１から５５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項57】

前記宿主細胞を、接着培養において培養するステップを含む、請求項１から５５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項58】

前記宿主細胞を、１Ｌのバイオリアクターにおいて培養するステップを含む、請求項１から５６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項59】

前記宿主細胞を、２Ｌのバイオリアクターにおいて培養するステップを含む、請求項１から５６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項60】

前記宿主細胞を、３Ｌのバイオリアクターにおいて培養するステップを含む、請求項１から５６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項61】

前記宿主細胞を、２５０Ｌのバイオリアクターにおいて培養するステップを含む、請求項１から５６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項62】

前記宿主細胞を、５００Ｌのバイオリアクターにおいて培養するステップを含む、請求項１から５６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項63】

前記宿主細胞を、２，０００Ｌのバイオリアクターにおいて培養するステップを含む、請求項１から５６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項64】

宿主細胞と、式（Ｉ）の化合物またはその塩とを含む、組成物。

【請求項65】

宿主細胞と、式（Ｉ－Ａ）の化合物またはその塩とを含む、組成物。

【請求項66】

宿主細胞と、式（Ｉ－Ｂ）の化合物またはその塩とを含む、組成物。

【請求項67】

宿主細胞と、式（ＩＩ）の化合物またはその塩とを含む、組成物。

【請求項68】

宿主細胞と、ビタミンＢ_２、ビタミンＢ_７、ビタミンＢ_９、およびビタミンＢ_１２、ならびにこれらの任意の組合せからなる群より選択される少なくとも１種のビタミンＢとを含む、組成物。

【請求項69】

組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を産生する方法であって、宿主細胞を、

【化70】

およびこれらの任意の組合せからなる群より選択される少なくとも１種の化合物を含む溶液と接触させるステップを含み、
前記宿主細胞が、
ｉ）ＡＡＶ末端逆位配列が隣接した異種ヌクレオチド配列、ならびに
ｉｉ）ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子
を含む、方法。

【請求項70】

ｒＡＡＶ力価収量を増加させる方法であって、宿主細胞を、

【化71】

【請求項71】

宿主細胞と、

【化72】

およびこれらの任意の組合せからなる群より選択される少なくとも１種の化合物とを含む、組成物であって、
前記宿主細胞が、
ｉ）ＡＡＶ末端逆位配列が隣接した異種ヌクレオチド配列、ならびに
ｉｉ）ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子
を含む、組成物。

【請求項72】

組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を産生する方法であって、宿主細胞を、

【化73】

を含む溶液と接触させるステップを含み、
前記宿主細胞が、
ｉ）ＡＡＶ末端逆位配列が隣接した異種ヌクレオチド配列、ならびに
ｉｉ）ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子
を含む、方法。

【請求項73】

ｒＡＡＶ力価収量を増加させる方法であって、宿主細胞を、

【化74】

【請求項74】

宿主細胞と、

【化75】

とを含む、組成物であって、
前記宿主細胞が、
ｉ）ＡＡＶ末端逆位配列が隣接した異種ヌクレオチド配列、ならびに
ｉｉ）ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子
を含む、組成物。

【請求項75】

組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を産生する方法であって、宿主細胞を、

【化76】

【請求項76】

ｒＡＡＶ力価収量を増加させる方法であって、宿主細胞を、

【化77】

【請求項77】

宿主細胞と、

【化78】

【請求項78】

組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を産生する方法であって、宿主細胞を、ビタミンＢ_２、ビタミンＢ_７、ビタミンＢ_９、およびビタミンＢ_１２、ならびにこれらの任意の組合せからなる群より選択される少なくとも１種のビタミンＢを含む溶液と接触させるステップを含み、前記宿主細胞が、
ｉ）ＡＡＶ末端逆位配列が隣接した異種ヌクレオチド配列、ならびに
ｉｉ）ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子
を含む、方法。

【請求項79】

ｒＡＡＶ力価収量を増加させる方法であって、宿主細胞を、ビタミンＢ_２、ビタミンＢ_７、ビタミンＢ_９、およびビタミンＢ_１２、ならびにこれらの任意の組合せからなる群より選択される少なくとも１種のビタミンＢを含む溶液と接触させるステップを含み、前記宿主細胞が、
ｉ）ＡＡＶ末端逆位配列が隣接した異種ヌクレオチド配列、ならびに
ｉｉ）ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子
を含む、方法。

【請求項80】

前記宿主細胞が、ヘルパー遺伝子をさらに含む、請求項６９、７０、７２、７３、７５、７６、７８、または７９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項81】

宿主細胞と、ビタミンＢ_２、ビタミンＢ_７、ビタミンＢ_９、ビタミンＢ_１２、およびこれらの任意の組合せからなる群より選択される少なくとも１種のビタミンＢとを含む、組成物であって、前記宿主細胞が、
ｉ）ＡＡＶ末端逆位配列が隣接した異種ヌクレオチド配列、ならびに
ｉｉ）ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子
を含む、組成物。

【請求項82】

前記宿主細胞が、ヘルパー遺伝子をさらに含む、請求項７１、７４、７７、または８１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項83】

前記溶液が、

【化79】

もその塩も含まない、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項84】

前記溶液が、

【化80】

もその塩も含まない、請求項２１から２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項85】

前記組成物が、

【化81】

もその塩も含まない、請求項６４から６６、７１、または７４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項86】

前記組成物が、

【化82】

もその塩も含まない、請求項６７または７７に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願への相互参照
本出願は、２０２０年３月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／９９０，０９９号に基づく利益および優先権を主張しており、その全内容は、すべての目的のためにその全体が参照として本明細書によって援用される。
発明の分野
本発明は、全体として、組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）収量を増強させるための方法に関し、より具体的には、本発明は、ｒＡＡＶ収量を増強させるための化合物の使用に関する。

【背景技術】

【0002】

背景
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、非病原性の複製欠陥パルボウイルスである。組換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶ）は、多数の固有の特性を有し、それによって遺伝子治療のためのベクターとして魅力的なものとなっている。特に、ｒＡＡＶベクターは、分裂細胞および非分裂細胞に治療遺伝子を送達することができ、これらの遺伝子は、標的化された細胞のゲノムに組み込まれることなく、長期間存続することができる。ｒＡＡＶの広範な治療適用を踏まえると、高力価ｒＡＡＶベクター収量を達成するための方法を含め、改善されたｒＡＡＶベクター産生方法に対する継続的な必要性が存在する。様々なウイルスベクターの産生を改善しようとするこれまでの試みには、細胞培養添加物、例えば、金属、微量補充物質、塩などの使用が含まれた（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，９（３）：２５１－５（１９７０）、Ｗｅｉｎｂａｕｅｒｅｔａｌ．，ＬｉｍｎｏｌｏｇｙａｎｄＯｃｅａｎｏｇｒａｐｈｙ，５４（３）：７７４－７８４（２００９）、Ｙａｎｇｅｔａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，４８（５）：１３９６－４０３（２００８）、および米国公開第２０１５０３５３８９９号を参照されたい）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】米国特許出願公開第２０１５／０３５３８９９号明細書

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】Ｗｅｉｎｂａｕｅｒら、ＬｉｍｎｏｌｏｇｙａｎｄＯｃｅａｎｏｇｒａｐｈｙ（２００９）５４（３）：７７４～７８４

【非特許文献2】Ｙａｎｇら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（２００８）４８（５）：１３９６～４０３

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0005】

発明の概要
本発明は、組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）の産生に使用される宿主細胞が、それらを本明細書に記載される化合物を含む溶液と接触させた場合に、増加した量のｒＡＡＶを産生するという発見に部分的に基づく。
したがって、ある態様では、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を産生する方法であって、宿主細胞を、式（Ｉ）

【化1】

の少なくとも１種の化合物またはその塩を含む溶液と接触させるステップを含み、式中、

【化2】

【化3】

でもその塩でもない、
方法が本明細書に提供される。

【0006】

別の態様では、ｒＡＡＶ力価収量を増加させる方法であって、宿主細胞を、式（Ｉ）の化合物またはその塩を含む溶液と接触させるステップを含む、方法が本明細書に提供される。

【0007】

ある特定の実施形態では、溶液は、式（Ｉ－Ａ）

【化4】

【0008】

一部の実施形態では、溶液は、

【化5】

およびこれらの任意の組合せからなる群より選択される少なくとも１種の化合物を含む。

【0009】

ある特定の実施形態では、溶液は、式（Ｉ－Ｂ）

【化6】

の少なくとも１種の化合物またはその塩を含み、式中、
Ｘは、ＣＲ^ｃＲ^ｄであり、
Ｒ^５ａ、Ｒ^５ｂ、Ｒ^５ｃ、Ｒ^５ｄ、およびＲ^５ｅは、独立して、各出現について、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ_１～６アルキル、Ｃ_１～６アルキル、Ｃ_１～６アルキル－ＯＨ、およびＣ_１～６アルキル－Ｏ－Ｃ_１～６アルキルであり、
Ｒ^ｃおよびＲ^ｄは、独立して、各出現について、水素、Ｃ_１～６アルキル、－ＯＨ、および－Ｏ－Ｃ_１～６アルキルからなる群より選択され、Ｒ^ｃが、水素である場合、Ｒ^ｄは、Ｃ_１～６アルキル、－ＯＨ、および－Ｏ－Ｃ_１～６アルキルから選択され、Ｒ^ｃが、Ｃ_１～６アルキル、－ＯＨ、および－Ｏ－Ｃ_１～６アルキルから選択される場合、Ｒ^ｄは、水素である。

【0010】

一部の実施形態では、溶液は、式（ＩＩＩ）

【化7】

の化合物を含む。

【0011】

別の態様では、ｒＡＡＶを産生する方法であって、宿主細胞を、式（ＩＩ）

【化8】

【化9】

でもその塩でもない、
方法が本明細書に提供される。

【0012】

別の態様では、ｒＡＡＶ力価収量を増加させる方法であって、宿主細胞を、式（ＩＩ）の化合物またはその塩を含む溶液と接触させるステップを含む方法が本明細書に提供される。

【0013】

ある特定の実施形態では、式（ＩＩ）の少なくとも１種の化合物は、式（ＩＶ）

【化10】

の化合物である。

【0014】

別の態様では、ｒＡＡＶを産生するかまたはｒＡＡＶ力価収量を増加させる方法であって、宿主細胞を、ビタミンＢ_２、ビタミンＢ_７、ビタミンＢ_９、およびビタミンＢ_１２から選択されるビタミンＢを含む溶液と接触させるステップを含む、方法が、本明細書において提供される。

【0015】

一部の実施形態では、本明細書に記載される方法は、ｒＡＡＶを収集および精製するステップをさらに含みうる。

【0016】

溶液中の本明細書に記載される化合物（例えば、式（Ｉ）、（Ｉ－Ａ）、（Ｉ－Ｂ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、もしくは（ＩＶ）の化合物、またはビタミンＢ（例えば、ビタミンＢ_２、ビタミンＢ_７、ビタミンＢ_９、もしくはビタミンＢ_１２））の濃度は、１０ｍＭよりも高いもしくはそれと等しい、１２ｍＭよりも高いもしくはそれと等しい、１５ｍＭよりも高いもしくはそれと等しい、１ｍＭよりも高いもしくはそれと等しい、０．５ｍＭよりも高いもしくはそれと等しい、０．５ｍＭよりも高い、０．５ｍＭ～１５ｍＭの間、または１ｍＭ～１０ｍＭの間でありうることが、企図される。一実施形態では、溶液中の少なくとも１種の化合物（例えば、式（Ｉ）、（Ｉ－Ａ）、（Ｉ－Ｂ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、もしくは（ＩＶ）の化合物、またはビタミンＢ（例えば、ビタミンＢ_２、ビタミンＢ_７、ビタミンＢ_９、もしくはビタミンＢ_１２））の濃度は、少なくとも１種の化合物を含む溶液と接触していない宿主細胞によって産生されるものと比較して、少なくとも１．２倍大きい量の分泌ｒＡＡＶを産生するのに十分である。別の実施形態では、溶液中の少なくとも１種の化合物（例えば、式（Ｉ）、（Ｉ－Ａ）、（Ｉ－Ｂ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、もしくは（ＩＶ）の化合物、またはビタミンＢ（例えば、ビタミンＢ_２、ビタミンＢ_７、ビタミンＢ_９、もしくはビタミンＢ_１２））の濃度は、少なくとも１種の化合物を含む溶液と接触していない宿主細胞によって産生されるものと比較して、少なくとも１．２倍大きい量の総ｒＡＡＶを産生するのに十分である。一実施形態では、宿主細胞は、少なくとも２日間、少なくとも１種の化合物を含む溶液と接触する。

【0017】

宿主細胞は、哺乳動物細胞、例えば、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ、Ａ５４９、ＢＨＫ、またはＶｅｒｏ細胞でありうることが、企図される。宿主細胞は、昆虫細胞、例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ－２１、Ｔｎ－３６８、またはＢＴＩ－Ｔｎ－５Ｂ１－４（Ｈｉｇｈ－Ｆｉｖｅ）細胞でありうることもまた、企図される。一実施形態では、宿主細胞は、ＨｅＬａ細胞である。別の実施形態では、宿主細胞は、ＨＥＫ２９３細胞である。宿主細胞は、ＡＡＶ末端逆位配列が隣接した異種ヌクレオチド配列を含む組換え核酸構築物を含みうることが、企図される。一実施形態では、宿主細胞は、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子（例えば、ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子）を含みうる。一実施形態では、宿主細胞は、例えば、ヘルパープラスミドを介してまたはアデノウイルスによる感染を介して供給される、ヘルパーウイルス遺伝子を含みうる。一実施形態では、宿主細胞は、ｉ）ＡＡＶ末端逆位配列が隣接した異種ヌクレオチド配列、ｉｉ）ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびにｉｉｉ）ヘルパーウイルス遺伝子を含む。

【0018】

一実施形態では、宿主細胞は、少なくとも１種の化合物（例えば、式（Ｉ）、（Ｉ－Ａ）、（Ｉ－Ｂ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、もしくは（ＩＶ）の化合物、またはビタミンＢ（例えば、ビタミンＢ_２、ビタミンＢ_７、ビタミンＢ_９、もしくはビタミンＢ_１２））を含む溶液と接触していない宿主細胞によって産生されるものと比較して、少なくとも１．２倍大きい量の分泌ｒＡＡＶを産生する。別の実施形態では、宿主細胞は、少なくとも１種の化合物（例えば、式（Ｉ）、（Ｉ－Ａ）、（Ｉ－Ｂ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、もしくは（ＩＶ）の化合物、またはビタミンＢ（例えば、ビタミンＢ_２、ビタミンＢ_７、ビタミンＢ_９、もしくはビタミンＢ_１２））を含む溶液と接触していない宿主細胞によって産生されるものと比較して、少なくとも１．２倍大きい量の総ｒＡＡＶを産生する。

【0019】

一部の実施形態では、本発明は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を産生する方法であって、宿主細胞を、

【化11】

およびこれらの任意の組合せからなる群より選択される少なくとも１種の化合物を含む溶液と接触させるステップを含み、
宿主細胞が、ｉ）ＡＡＶ末端逆位配列が隣接した異種ヌクレオチド配列、ｉｉ）ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびにｉｉｉ）必要に応じてヘルパーウイルス遺伝子を含む、方法を提供する。

【0020】

一部の実施形態では、本発明は、ｒＡＡＶ力価収量を増加させる方法であって、宿主細胞を、

【化12】

およびこれらの任意の組合せからなる群より選択される少なくとも１種の化合物を含む溶液と接触させるステップを含み、
宿主細胞が、ｉ）ＡＡＶ末端逆位配列が隣接した異種ヌクレオチド配列、ｉｉ）ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子ならびにｉｉｉ）必要に応じてヘルパーウイルス遺伝子を含む、方法を提供する。

【0021】

一部の実施形態では、本発明は、宿主細胞と、

【化13】

およびこれらの任意の組合せからなる群より選択される少なくとも１種の化合物とを含む、組成物であって、
宿主細胞が、ｉ）ＡＡＶ末端逆位配列が隣接した異種ヌクレオチド配列、ｉｉ）ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子ならびにｉｉｉ）必要に応じてヘルパーウイルス遺伝子を含む、組成物を提供する。

【0022】

一部の実施形態では、本発明は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を産生する方法であって、宿主細胞を、

【化14】

を含む溶液と接触させるステップを含み、
宿主細胞が、ｉ）ＡＡＶ末端逆位配列が隣接した異種ヌクレオチド配列、ｉｉ）ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子ならびにｉｉｉ）必要に応じてヘルパーウイルス遺伝子を含む、方法を提供する。

【0023】

一部の実施形態では、本発明は、ｒＡＡＶ力価収量を増加させる方法であって、宿主細胞を、

【化15】

【0024】

一部の実施形態では、本発明は、宿主細胞と、

【化16】

とを含む、組成物であって、
宿主細胞が、ｉ）ＡＡＶ末端逆位配列が隣接した異種ヌクレオチド配列、ｉｉ）ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子ならびにｉｉｉ）必要に応じてヘルパーウイルス遺伝子を含む、組成物を提供する。

【0025】

一部の実施形態では、本発明は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を産生する方法であって、宿主細胞を、

【化17】

【0026】

一部の実施形態では、本発明は、ｒＡＡＶ力価収量を増加させる方法であって、宿主細胞を、

【化18】

【0027】

一部の実施形態では、本発明は、宿主細胞と、

【化19】

【0028】

一部の実施形態では、本発明は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を産生する方法であって、宿主細胞を、ビタミンＢ_２、ビタミンＢ_７、ビタミンＢ_９、およびビタミンＢ_１２、ならびにこれらの任意の組合せからなる群より選択される少なくとも１種の化合物を含む溶液と接触させるステップを含み、宿主細胞が、ｉ）ＡＡＶ末端逆位配列が隣接した異種ヌクレオチド配列、ｉｉ）ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子ならびにｉｉｉ）必要に応じてヘルパーウイルス遺伝子を含む、方法を提供する。

【0029】

一部の実施形態では、本発明は、ｒＡＡＶ力価収量を増加させる方法であって、宿主細胞を、ビタミンＢ_２、ビタミンＢ_７、ビタミンＢ_９、およびビタミンＢ_１２、ならびにこれらの任意の組合せからなる群より選択される少なくとも１種の化合物を含む溶液と接触させるステップを含み、宿主細胞が、ｉ）ＡＡＶ末端逆位配列が隣接した異種ヌクレオチド配列、ｉｉ）ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子ならびにｉｉｉ）必要に応じてヘルパーウイルス遺伝子を含む、方法を提供する。

【0030】

提供される方法の一部の実施形態では、溶液は、

【化20】

もその塩も含まない。

【0031】

提供される方法の一部の実施形態では、溶液は、

【化21】

もその塩も含まない。

【0032】

一部の実施形態では、提供される組成物は、

【化22】

もその塩も含まない。

【0033】

一部の実施形態では、提供される組成物は、

【化23】

もその塩も含まない。

【0034】

一部の実施形態では、本発明は、宿主細胞と、ビタミンＢ_２、ビタミンＢ_７、ビタミンＢ_９、ビタミンＢ_１２、およびこれらの任意の組合せからなる群より選択される少なくとも１種の化合物とを含む、組成物であって、宿主細胞が、ｉ）ＡＡＶ末端逆位配列が隣接した異種ヌクレオチド配列、ｉｉ）ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびにｉｉｉ）必要に応じて、ヘルパーウイルス遺伝子を含む、組成物を提供する。

【0035】

他の態様では、本発明は、企図される方法のうちのいずれかによって産生されるｒＡＡＶ、企図される方法のうちのいずれかによって産生されるｒＡＡＶを含む組成物、または宿主細胞と本明細書に記載される少なくとも１種の化合物（例えば、式（Ｉ）、（Ｉ－Ａ）、（Ｉ－Ｂ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、もしくは（ＩＶ）の化合物、またはビタミンＢ（例えば、ビタミンＢ_２、ビタミンＢ_７、ビタミンＢ_９、ビタミンＢ_１２、もしくはこれらの任意の組合せ）、またはこれらの任意の組合せ）とを含む、組成物を提供する。

【0036】

本発明のこれらおよび他の態様および特性は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲に記載される。

【0037】

本発明の前述およびその他の目的、特性、および利点は、添付の図面に図示されるように、以下の好ましい実施形態の説明から明らかとなろう。同様の参照される要素は、対応する図面における共通の特性を識別する。

【図面の簡単な説明】

【0038】

【図1】図１は、変動するナイアシンアミド濃度（０．１ｍＭ～４０ｍＭ）においてＨｅＬａ産生細胞から産生される様々なクレードＥおよびＦｒＡＡＶの、正規化された容量組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）力価の概略的な棒グラフである。１ｍＬ当たりのゲノムコピー数（ＧＣ／ｍＬ）で測定される力価が、ナイアシンアミドの不在下におけるｒＡＡＶ産生に対して正規化されている。

【0039】

【図2】図２は、様々なナイアシンアミド濃度において異なるＨｅＬａ産生細胞クローンから産生されたクレードＥおよびＦｒＡＡＶの、正規化された容量ｒＡＡＶ力価（ＧＣ／ｍＬ）のデータ点の３次多項式当てはめである。

【0040】

【図3】図３は、第ＩＸ因子導入遺伝子をコードするクレードＥｒＡＡＶ（ＡＡＶｒｈ１０－ＦＩＸ）を産生することができるＨｅＬａ産生細胞株からのｒＡＡＶ産生に対するナイアシンアミドの容器スケーリングの効果を示す、棒グラフである。２つの一般的な容器スケール：３ｍＬのディープウェル（２４－ＤＷ）および１００ｍＬの振盪フラスコ（フラスコ）を使用した。ナイアシンアミドを、示される濃度（１ｍＭ～５０ｍＭ）で添加し、ｒＡＡＶ収量（ＧＣ／ｍＬ）を測定した。

【0041】

【図4A】図４Ａは、第ＩＸ因子導入遺伝子をコードする組換えクレードＥＡＡＶ（ＡＡＶｒｈ１０－ＦＩＸ）を産生することができるＨｅＬａ産生細胞株クローンからのｒＡＡＶ産生に対するナイアシンアミドの効果を示す、棒グラフである。ナイアシンアミドを、示される濃度（５ｍＭ～４０ｍＭ）で添加し、ｒＡＡＶ収量（ＧＣ／ｍＬ）を測定した。

【0042】

【図4B】図４Ｂは、グルコース６－ホスファターゼ（Ｇ６Ｐａｓｅ）導入遺伝子をコードする組換えクレードＥＡＡＶ（ＡＡＶ８－Ｇ６Ｐａｓｅ）を産生することができる第１のＨｅＬａ産生細胞株クローンからのｒＡＡＶ産生に対するナイアシンアミドの効果を示す、棒グラフである。ナイアシンアミドを、示される濃度（５ｍＭ～４０ｍＭ）で添加し、ｒＡＡＶ収量（ＧＣ／ｍＬ）を測定した。

【0043】

【図4C】図４Ｃは、グルコース６－ホスファターゼ（Ｇ６Ｐａｓｅ）導入遺伝子をコードする組換えクレードＥＡＡＶ（ＡＡＶ８－Ｇ６Ｐａｓｅ）を産生することができる第２のＨｅＬａ産生細胞株クローンからのｒＡＡＶ産生に対するナイアシンアミドの効果を示す、棒グラフである。ナイアシンアミドを、示される濃度（１ｍＭ～４０ｍＭ）で添加し、ｒＡＡＶ収量（ＧＣ／ｍＬ）を測定した。

【0044】

【図4D】図４Ｄは、第ＶＩＩＩ因子導入遺伝子をコードする組換えクレードＥＡＡＶ（ＡＡＶｈｕ３７－ＦＶＩＩＩ）を産生することができる第３のＨｅＬａ産生細胞株クローンからのｒＡＡＶ産生に対するナイアシンアミドの効果を示す、棒グラフである。ナイアシンアミドを、示される濃度（１ｍＭ～４０ｍＭ）で添加し、ｒＡＡＶ収量（ＧＣ／ｍＬ）を測定した。

【0045】

【図5】図５は、短縮型ＡＴＰ７Ｂ導入遺伝子をコードする組換えクレードＦＡＡＶ（ＡＡＶ９－ＡＴＰ７Ｂ）を産生することができる２つのＨｅＬａ産生細胞株クローンからのｒＡＡＶ産生に対するナイアシンアミドの効果を示す、棒グラフである。クローンを、２Ｌのバイオリアクターにおいて培養した。ナイアシンアミドを、示される濃度（３ｍＭ）で添加し、ｒＡＡＶ収量（ＧＣ／ｍＬ）を測定した。

【0046】

【図6】図６は、３０ｍＬのフラスコにおいて培養したＨＥＫ２９３細胞からのｒＡＡＶ産生に対するナイアシンアミドの効果を示す、棒グラフである。ＨＥＫ２９３細胞に、オルニチントランスカルバミラーゼをコードする組換えクレードＥＡＡＶ（ｒＡＡＶ８－ＯＴＣ）の産生を可能にするプラスミドをトランスフェクトした。ナイアシンアミドを、示される濃度（０．０３ｍＭ～３０ｍＭ）で添加し、ｒＡＡＶ収量（ＧＣ／ｍＬ）を測定した。

【発明を実施するための形態】

【0047】

詳細な説明
本発明は、組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）の産生に使用される宿主細胞が、化合物、例えば、式（Ｉ）の化合物、式（Ｉ－Ａ）の化合物、式（Ｉ－Ｂ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物、式（ＩＩＩ）の化合物、式（ＩＶ）の化合物、もしくはこれらのいずれか１つの塩、またはビタミンＢを宿主細胞培養物に添加した場合に、増加した量のｒＡＡＶを産生するという発見に部分的に基づく。
Ｉ．本方法において使用される化合物

【0048】

一態様では、本発明は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を産生する方法であって、宿主細胞を、式（Ｉ）

【化24】

の少なくとも１種の化合物またはその塩を含む溶液と接触させるステップを含み、式中、

【化25】

が、単結合または二重結合を表し、
ｎが、１～５から選択される整数であり、
それぞれのＲ^１が、独立して、各出現について、－ＯＨ、Ｃ_１～６アルキル、Ｃ_１～６アルキル－ＯＨ、Ｃ_１～６アルキル－Ｏ－Ｃ_１～６アルキル、－Ｏ－Ｃ_１～６アルキル、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^ａ）_２、および－Ｃ（Ｏ）ＯＲ^ｂからなる群より選択され、
Ｒ^ａが、独立して、各出現について、水素またはＣ_１～６アルキルであり、
Ｒ^ｂが、独立して、各出現について、水素またはＣ_１～６アルキルであり、
Ｘが、ＣＲ^ｃＲ^ｄまたはＮであり、
Ｒ^ｃおよびＲ^ｄが、独立して、各出現について、水素、Ｃ_１～６アルキル、－ＯＨ、および－Ｏ－Ｃ_１～６アルキルから選択され、Ｒ^ｃが、水素である場合、Ｒ^ｄは、Ｃ_１～６アルキル、－ＯＨ、および－Ｏ－Ｃ_１～６アルキルから選択され、Ｒ^ｃが、Ｃ_１～６アルキル、－ＯＨ、および－Ｏ－Ｃ_１～６アルキルから選択される場合、Ｒ^ｄは、水素であり、
前記少なくとも１種の化合物が、

【化26】

でもその塩でもない、
方法を提供する。

【0049】

別の態様では、本発明は、ｒＡＡＶ力価収量を増加させる方法であって、宿主細胞を、式（Ｉ）の化合物またはその塩を含む溶液と接触させるステップを含む方法を提供する。

【0050】

ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（Ｉ）の化合物は、Ｘが、Ｎである、化合物である。一部の実施形態では、本明細書に記載される式（Ｉ）の化合物は、Ｘが、Ｎであり、Ｒ^１が、独立して、各出現について、－ＯＨ、Ｃ_１～６アルキル、Ｃ_１～６アルキル－ＯＨ、Ｃ_１～６アルキル－Ｏ－Ｃ_１～６アルキル、－Ｏ－Ｃ_１～６アルキル、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^ａ）_２、および－Ｃ（Ｏ）ＯＲ^ｂから選択される、化合物である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（Ｉ）の化合物は、Ｘが、Ｎであり、Ｒ^１が、独立して、各出現について、Ｃ_１～６アルキル－ＯＨ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^ａ）_２、および－Ｃ（Ｏ）ＯＲ^ｂから選択される、化合物である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（Ｉ）の化合物は、Ｘが、Ｎであり、Ｒ^１が、Ｃ_１～６アルキル－ＯＨである（例えば、－ＣＨ_２ＯＨ）、化合物である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（Ｉ）の化合物は、Ｘが、Ｎであり、Ｒ^１が、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^ａ）_２であり、Ｒ^ａが、水素である（例えば、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２）、化合物である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（Ｉ）の化合物は、Ｘが、Ｎであり、Ｒ^１が、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ^ｂであり、Ｒ^ｂが、独立して、各出現について、水素またはメチルである（例えば、Ｃ（Ｏ）ＯＨおよび－Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ_３）、化合物である。

【0051】

ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（Ｉ）の化合物は、Ｘが、ＣＲ^ｃＲ^ｄであり、Ｒ^ｃが、水素であり、Ｒ^ｄが、Ｃ_１～６アルキル、－ＯＨ、および－Ｏ－Ｃ_１～６アルキルから選択され、それぞれのＲ^１が、独立して、各出現について、－ＯＨ、Ｃ_１～６アルキル、Ｃ_１～６アルキル－ＯＨ、Ｃ_１～６アルキル－Ｏ－Ｃ_１～６アルキル、－Ｏ－Ｃ_１～６アルキル、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^ａ）_２、および－Ｃ（Ｏ）ＯＲ^ｂから選択される、化合物である。一部の実施形態では、本明細書に記載される式（Ｉ）の化合物は、Ｘが、ＣＲ^ｃＲ^ｄであり、Ｒ^ｃが、Ｃ_１～６アルキル、－ＯＨ、および－Ｏ－Ｃ_１～６アルキルから選択され、Ｒ^ｄが、－ＯＨであり、Ｒ^１が、独立して、各出現について、－ＯＨ、Ｃ_１～６アルキル、Ｃ_１～６アルキル－ＯＨ、Ｃ_１～６アルキル－Ｏ－Ｃ_１～６アルキル、－Ｏ－Ｃ_１～６アルキル、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^ａ）_２、および－Ｃ（Ｏ）ＯＲ^ｂから選択される、化合物である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（Ｉ）の化合物は、Ｘが、ＣＲ^ｃＲ^ｄであり、Ｒ^ｃが、水素であり、Ｒ^ｄが、－ＯＨであり、Ｒ^１が、独立して、各出現について、－ＯＨ、Ｃ_１～６アルキル、Ｃ_１～６アルキル－ＯＨ、Ｃ_１～６アルキル－Ｏ－Ｃ_１～６アルキル、－Ｏ－Ｃ_１～６アルキル、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^ａ）_２、および－Ｃ（Ｏ）ＯＲ^ｂから選択される、化合物である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（Ｉ）の化合物は、Ｘが、ＣＲ^ｃＲ^ｄであり、Ｒ^ｃが、水素であり、Ｒ^ｄが、－ＯＨであり、Ｒ^１が、－ＯＨである、化合物である。

【0052】

ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（Ｉ）の化合物は、Ｘが、Ｎであり、ｎが、１であり、Ｒ^１が、独立して、各出現について、Ｃ_１～６アルキル－ＯＨ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^ａ）_２、および－Ｃ（Ｏ）ＯＲ^ｂから選択される（例えば、Ｒ^１が、独立して、各出現について、－ＣＨ_２ＯＨ、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、－Ｃ（Ｏ）ＯＨ、および－Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ_３から選択される）、化合物である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（Ｉ）の化合物は、Ｘが、ＣＲ^ｃＲ^ｄであり、Ｒ^ｃが、水素であり、Ｒ^ｄが、－ＯＨであり、ｎが、５であり、Ｒ^１が、－ＯＨである、化合物である。

【0053】

ある特定の実施形態では、本発明は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を産生する方法であって、宿主細胞を、式（Ｉ－Ａ）の少なくとも１種の化合物またはその塩を含む溶液と接触させるステップを含む、方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ｒＡＡＶ力価収量を増加させる方法であって、宿主細胞を、式（Ｉ－Ａ）

【化27】

の化合物またはその塩を含む溶液と接触させるステップを含み、式中、
Ｒ^２およびＲ^３が、独立して、各出現について、水素もしくは－ＯＨであるか、
またはＲ^２およびＲ^３が、一緒になって、オキソを形成することができ、
Ｒ^４が、水素、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ_１～６アルキル、および－Ｎ（Ｒ^ｅ）_２からなる群より選択され、
Ｒ^ｅが、独立して、各出現について、水素またはＣ_１～６アルキルである、
方法を提供する。

【0054】

ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（Ｉ－Ａ）の化合物は、Ｒ^２およびＲ^３が、一緒になって、オキソを形成する、化合物である。ある特定の実施形態では、式（Ｉ－Ａ）の化合物は、Ｒ^４が、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ_１～６アルキル、および－Ｎ（Ｒ^ｅ）_２（例えば、－ＮＨ_２、－ＯＨ、および－ＯＣＨ_３）から選択される、化合物である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（Ｉ－Ａ）の化合物は、Ｒ^４が、－ＮＨ_２、－ＯＨ、および－ＯＣＨ_３から選択される、化合物である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（Ｉ－Ａ）の化合物は、Ｒ^２およびＲ^３が、一緒になって、オキソを形成し、Ｒ^４が、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ_１～６アルキル、および－Ｎ（Ｒ^ｅ）_２（例えば、－ＮＨ_２、－ＯＨ、および－ＯＣＨ_３）から選択される、化合物である。一部の実施形態では、本明細書に記載される式（Ｉ－Ａ）の化合物は、Ｒ^２およびＲ^３が、一緒になって、オキソを形成し、Ｒ^４が、－ＮＨ_２、－ＯＨ、および－ＯＣＨ_３から選択される、化合物である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（Ｉ－Ａ）の化合物は、Ｒ^２およびＲ^３が、一緒になって、オキソを形成し、Ｒ^４が、－ＮＨ_２である、化合物である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（Ｉ－Ａ）の化合物は、Ｒ^２およびＲ^３が、一緒になって、オキソを形成し、Ｒ^４が、－ＯＨである、化合物である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（Ｉ－Ａ）の化合物は、Ｒ^２およびＲ^３が、一緒になって、オキソを形成し、Ｒ^４が、－ＯＣＨ_３である、化合物である。

【0055】

ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（Ｉ－Ａ）の化合物は、Ｒ^２およびＲ^３が、いずれも水素である、化合物である。ある特定の実施形態では、式（Ｉ－Ａ）の化合物は、Ｒ^４が、水素、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ_１～６アルキル、および－Ｎ（Ｒ^ｅ）_２（例えば、－ＮＨ_２、－ＯＨ、および－ＯＣＨ_３）から選択される、化合物である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（Ｉ－Ａ）の化合物は、Ｒ^４が、水素、－ＮＨ_２、－ＯＨ、および－ＯＣＨ_３から選択される、化合物である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（Ｉ－Ａ）の化合物は、Ｒ^２およびＲ^３が、いずれも水素であり、Ｒ^４が、水素、－ＮＨ_２、－ＯＨ、および－ＯＣＨ_３からなる群より選択される、化合物である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（Ｉ－Ａ）の化合物は、Ｒ^２およびＲ^３が、いずれも水素であり、Ｒ^４が、水素である、化合物である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（Ｉ－Ａ）の化合物は、Ｒ^２およびＲ^３が、いずれも水素であり、Ｒ^４が、－ＮＨ_２である、化合物である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（Ｉ－Ａ）の化合物は、Ｒ^２およびＲ^３が、いずれも水素であり、Ｒ^４が、－ＯＨである、化合物である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（Ｉ－Ａ）の化合物は、Ｒ^２およびＲ^３が、いずれも水素であり、Ｒ^４が、－ＯＣＨ_３である、化合物である。

【0056】

ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（Ｉ－Ａ）の化合物は、Ｒ^２およびＲ^３が、独立して、各出現について、水素もしくは－ＯＨであるか、またはＲ^２およびＲ^３が、一緒になって、オキソを形成することができ、Ｒ^４が、－ＯＨである、化合物である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（Ｉ－Ａ）の化合物は、Ｒ^２およびＲ^３が、独立して、各出現について、水素もしくは－ＯＨであるか、またはＲ^２およびＲ^３が、一緒になって、オキソを形成することができ、Ｒ^４が、－ＯＣＨ_３である、化合物である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（Ｉ－Ａ）の化合物は、Ｒ^２およびＲ^３が、独立して、各出現について、水素もしくは－ＯＨであるか、またはＲ^２およびＲ^３が、一緒になって、オキソを形成することができ、Ｒ^４が、－ＮＨ_２である、化合物である。

【0057】

ある特定の実施形態では、本発明は、ｒＡＡＶを産生する方法であって、宿主細胞を、

【化28】

およびこれらの任意の組合せからなる群より選択される少なくとも１種の化合物を含む溶液と接触させるステップを含む、方法を提供する。

【0058】

ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶを産生する方法であって、宿主細胞を、ナイアシンアミド、ナイアシン、ニコチン酸メチル、ニコチニルアルコール、およびこれらの任意の組合せからなる群より選択される少なくとも１種の化合物を含む溶液と接触させるステップを含む、方法が、提供される。

【0059】

ある特定の実施形態では、本発明は、ｒＡＡＶ力価収量を増加させる方法であって、宿主細胞を、

【化29】

およびこれらの任意の組合せからなる群より選択される少なくとも１種の化合物を含む溶液と接触させるステップを含む、方法を提供する。

【0060】

ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ力価収量を増加させる方法であって、宿主細胞を、ナイアシンアミド、ナイアシン、ニコチン酸メチル、ニコチニルアルコール、およびこれらの任意の組合せからなる群より選択される少なくとも１種の化合物を含む溶液と接触させるステップを含む、方法が、提供される。

【0061】

ある特定の実施形態では、本発明は、ｒＡＡＶを産生する方法であって、宿主細胞を、式（Ｉ－Ｂ）の少なくとも１種の化合物またはその塩を含む溶液と接触させるステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、ｒＡＡＶ力価収量を増加させる方法であって、宿主細胞を、式（Ｉ－Ｂ）

【化30】

の少なくとも１種の化合物またはその塩を含む溶液と接触させるステップを含み、式中、
Ｘが、ＣＲ^ｃＲ^ｄであり、
Ｒ^５ａ、Ｒ^５ｂ、Ｒ^５ｃ、Ｒ^５ｄ、およびＲ^５ｅが、独立して、各出現について、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ_１～６アルキル、Ｃ_１～６アルキル、Ｃ_１～６アルキル－ＯＨ、およびＣ_１～６アルキル－Ｏ－Ｃ_１～６アルキルであり、
Ｒ^ｃおよびＲ^ｄが、独立して、各出現について、水素、Ｃ_１～６アルキル、－ＯＨ、および－Ｏ－Ｃ_１～６アルキルから選択され、Ｒ^ｃが、水素である場合、Ｒ^ｄは、Ｃ_１～６アルキル、－ＯＨ、および－Ｏ－Ｃ_１～６アルキルから選択され、Ｒ^ｃが、Ｃ_１～６アルキル、－ＯＨ、および－Ｏ－Ｃ_１～６アルキルから選択される場合、Ｒ^ｄは、水素である、
方法を提供する。

【0062】

ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（Ｉ－Ｂ）の化合物は、Ｒ^ｃが、水素であり、Ｒ^ｄが、Ｃ_１～６アルキル、－ＯＨ、および－Ｏ－Ｃ_１～６アルキルから選択される、化合物である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（Ｉ－Ｂ）の化合物は、Ｒ^ｃが、Ｃ_１～６アルキル、－ＯＨ、および－Ｏ－Ｃ_１～６アルキルから選択され、Ｒ^ｄが、水素である、化合物である。一部の実施形態では、本明細書に記載される式（Ｉ－Ｂ）の化合物は、Ｒ^ｃが、水素であり、Ｒ^ｄが、－ＯＨである、化合物である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（Ｉ－Ｂ）の化合物は、Ｒ^ｃが、水素であり、Ｒ^ｄが、－Ｏ－Ｃ_１～６アルキルである、化合物である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（Ｉ－Ｂ）の化合物は、Ｒ^ｃが、水素であり、Ｒ^ｄが、Ｃ_１～６アルキルである、化合物である。

【0063】

ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（Ｉ－Ｂ）の化合物は、Ｒ^５ａ、Ｒ^５ｂ、Ｒ^５ｃ、Ｒ^５ｄ、およびＲ^５ｅが、－ＯＨである、化合物である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（Ｉ－Ｂ）の化合物は、Ｒ^ｃが、水素であり、Ｒ^ｄが、－ＯＨである、化合物である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（Ｉ－Ｂ）の化合物は、Ｒ^５ａ、Ｒ^５ｂ、Ｒ^５ｃ、Ｒ^５ｄ、およびＲ^５ｅが、－ＯＨであり、Ｒ^ｃおよびＲ^ｄが、独立して、各出現について、水素、Ｃ_１～６アルキル、－ＯＨ、および－Ｏ－Ｃ_１～６アルキルから選択され、Ｒ^ｃが、水素である場合、Ｒ^ｄは、Ｃ_１～６アルキル、－ＯＨ、および－Ｏ－Ｃ_１～６アルキルから選択され、Ｒ^ｃが、Ｃ_１～６アルキル、－ＯＨ、および－Ｏ－Ｃ_１～６アルキルから選択される場合、Ｒ^ｄは、水素である、化合物である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（Ｉ－Ｂ）の化合物は、Ｒ^５ａ、Ｒ^５ｂ、Ｒ^５ｃ、Ｒ^５ｄ、およびＲ^５ｅが、－ＯＨであり、Ｒ^ｃが、水素であり、Ｒ^ｄが、Ｃ_１～６アルキル、－ＯＨ、および－Ｏ－Ｃ_１～６アルキルから選択される、化合物である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（Ｉ－Ｂ）の化合物は、Ｒ^５ａ、Ｒ^５ｂ、Ｒ^５ｃ、Ｒ^５ｄ、およびＲ^５ｅが、－ＯＨであり、Ｒ^ｃが、水素であり、Ｒ^ｄが、－ＯＨから選択される、化合物である。

【0064】

ある特定の実施形態では、本発明は、ｒＡＡＶを産生する方法であって、宿主細胞を、式（ＩＩＩ）

【化31】

の化合物またはその塩を含む溶液と接触させるステップを含む、方法を提供する。

【0065】

ある特定の実施形態では、本発明は、ｒＡＡＶを産生する方法であって、宿主細胞を、ミオ－イノシトールまたはその塩を含む溶液と接触させるステップを含む、方法を提供する。

【0066】

ある特定の実施形態では、本発明は、ｒＡＡＶ力価収量を増加させる方法であって、宿主細胞を、式（ＩＩＩ）

【化32】

の化合物またはその塩を含む溶液と接触させるステップを含む、方法を提供する。

【0067】

ある特定の実施形態では、本発明は、ｒＡＡＶ力価収量を増加させる方法であって、宿主細胞を、ミオ－イノシトールまたはその塩を含む溶液と接触させるステップを含む、方法を提供する。

【0068】

別の態様では、本発明は、ｒＡＡＶを産生する方法であって、宿主細胞を、式（ＩＩ）の化合物またはその塩を含む溶液と接触させるステップを含む、方法を提供する。別の態様では、本発明は、ｒＡＡＶ力価収量を増加させる方法であって、宿主細胞を、式（ＩＩ）

【化33】

【化34】

でもその塩でもない、
方法を提供する。

【0069】

ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（ＩＩ）の化合物は、Ｒ^６およびＲ^７が、水素である、化合物である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（ＩＩ）の化合物は、Ｒ^８およびＲ^９が、水素である、化合物である。ある特定の実施形態では、式（ＩＩ）の化合物は、Ｒ^６およびＲ^７が、水素であり、Ｒ^８およびＲ^９が、独立して、各出現について、水素、－ＯＨ、－ＣＮ、ハロゲン、およびＣ_１～６アルキルから選択される、化合物である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（ＩＩ）の化合物は、Ｒ^８およびＲ^９が、水素であり、Ｒ^６およびＲ^７が、独立して、各出現について、水素、－ＯＨ、－ＣＮ、ハロゲン、およびＣ_１～６アルキルから選択される、化合物である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（ＩＩ）の化合物は、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^８、およびＲ^９が、水素である、化合物である。

【0070】

ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（ＩＩ）の化合物は、Ｙが、Ｃである、化合物である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（ＩＩ）の化合物は、Ｙが、Ｃであり、Ｒ^６およびＲ^７が、水素であり、Ｒ^８およびＲ^９が、独立して、各出現について、水素、－ＯＨ、－ＣＮ、ハロゲン、およびＣ_１～６アルキルから選択される、化合物である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（ＩＩ）の化合物は、Ｙが、Ｃであり、Ｒ^８およびＲ^９が、水素であり、Ｒ^６およびＲ^７が、独立して、各出現について、水素、－ＯＨ、－ＣＮ、ハロゲン、およびＣ_１～６アルキルから選択される、化合物である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（ＩＩ）の化合物は、Ｙが、Ｃであり、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^８、およびＲ^９が、水素である、化合物である。

【0071】

ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（ＩＩ）の化合物は、Ｙが、Ｎである、化合物である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（ＩＩ）の化合物は、Ｙが、Ｎであり、Ｒ^６およびＲ^７が、水素であり、Ｒ^８およびＲ^９が、独立して、各出現について、水素、－ＯＨ、－ＣＮ、ハロゲン、およびＣ_１～６アルキルから選択される、化合物である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（ＩＩ）の化合物は、Ｙが、Ｎであり、Ｒ^８およびＲ^９が、水素であり、Ｒ^６およびＲ^７が、独立して、各出現について、水素、－ＯＨ、－ＣＮ、ハロゲン、およびＣ_１～６アルキルから選択される、化合物である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（ＩＩ）の化合物は、Ｙが、Ｎであり、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^８、およびＲ^９が、水素である、化合物である。

【0072】

ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（ＩＩ）の化合物は、Ｒ^１０およびＲ^１１が、Ｃ_１～６アルキルである、化合物である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（ＩＩ）の化合物は、Ｒ^１０およびＲ^１１が、ＣＨ_３である、化合物である。

【0073】

ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（ＩＩ）の化合物は、Ｙが、Ｃであり、Ｒ^１０およびＲ^１１が、Ｃ_１～６アルキルであり、Ｒ^６およびＲ^７が、水素であり、Ｒ^８およびＲ^９が、独立して、各出現について、水素、－ＯＨ、－ＣＮ、ハロゲン、およびＣ_１～６アルキルから選択される、化合物である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（ＩＩ）の化合物は、Ｙが、Ｃであり、Ｒ^１０およびＲ^１１が、Ｃ_１～６アルキルであり、Ｒ^８およびＲ^９が、水素であり、Ｒ^６およびＲ^７が、独立して、各出現について、水素、－ＯＨ、－ＣＮ、ハロゲン、およびＣ_１～６アルキルから選択される、化合物である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（ＩＩ）の化合物は、Ｙが、Ｃであり、Ｒ^１０およびＲ^１１が、Ｃ_１～６アルキルであり、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^８、およびＲ^９が、水素である、化合物である。

【0074】

ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（ＩＩ）の化合物は、Ｙが、Ｎであり、Ｒ^１０およびＲ^１１が、Ｃ_１～６アルキルであり、Ｒ^６およびＲ^７が、水素であり、Ｒ^８およびＲ^９が、独立して、各出現について、水素、－ＯＨ、－ＣＮ、ハロゲン、およびＣ_１～６アルキルから選択される、化合物である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（ＩＩ）の化合物は、Ｙが、Ｎであり、Ｒ^１０およびＲ^１１が、Ｃ_１～６アルキルであり、Ｒ^８およびＲ^９が、水素であり、Ｒ^６およびＲ^７が、独立して、各出現について、水素、－ＯＨ、－ＣＮ、ハロゲン、およびＣ_１～６アルキルから選択される、化合物である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（ＩＩ）の化合物は、Ｙが、Ｎであり、Ｒ^１０およびＲ^１１が、Ｃ_１～６アルキルであり、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^８、およびＲ^９が、水素である、化合物である。

【0075】

ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（ＩＩ）の化合物は、Ｙが、Ｃであり、Ｒ^１０およびＲ^１１が、ＣＨ_３であり、Ｒ^６およびＲ^７が、水素であり、Ｒ^８およびＲ^９が、独立して、各出現について、水素、－ＯＨ、－ＣＮ、ハロゲン、およびＣ_１～６アルキルから選択される、化合物である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（ＩＩ）の化合物は、Ｙが、Ｃであり、Ｒ^１０およびＲ^１１が、ＣＨ_３であり、Ｒ^８およびＲ^９が、水素であり、Ｒ^６およびＲ^７が、独立して、各出現について、水素、－ＯＨ、－ＣＮ、ハロゲン、およびＣ_１～６アルキルから選択される、化合物である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（ＩＩ）の化合物は、Ｙが、Ｃであり、Ｒ^１０およびＲ^１１が、ＣＨ_３であり、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^８、およびＲ^９が、水素である、化合物である。

【0076】

ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（ＩＩ）の化合物は、Ｙが、Ｎであり、Ｒ^１０およびＲ^１１が、ＣＨ_３であり、Ｒ^６およびＲ^７が、水素であり、Ｒ^８およびＲ^９が、独立して、各出現について、水素、－ＯＨ、－ＣＮ、ハロゲン、およびＣ_１～６アルキルから選択される、化合物である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（ＩＩ）の化合物は、Ｙが、Ｎであり、Ｒ^１０およびＲ^１１が、ＣＨ_３であり、Ｒ^８およびＲ^９が、水素であり、Ｒ^６およびＲ^７が、独立して、各出現について、水素、－ＯＨ、－ＣＮ、ハロゲン、およびＣ_１～６アルキルから選択される、化合物である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（ＩＩ）の化合物は、Ｙが、Ｎであり、Ｒ^１０およびＲ^１１が、ＣＨ_３であり、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^８、およびＲ^９が、水素である、化合物である。

【0077】

ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（ＩＩ）の化合物は、Ａが、Ｃ_１～６アルキルである、化合物である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（ＩＩ）の化合物は、Ａが、ＣＨ_３である、化合物である。

【0078】

ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（ＩＩ）の化合物は、Ｙが、Ｃであり、Ａが、Ｃ_１～６アルキルであり、Ｒ^１０およびＲ^１１が、ＣＨ_３であり、Ｒ^６およびＲ^７が、水素であり、Ｒ^８およびＲ^９が、独立して、各出現について、水素、－ＯＨ、－ＣＮ、ハロゲン、およびＣ_１～６アルキルから選択される、化合物である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（ＩＩ）の化合物は、Ｙが、Ｃであり、Ａが、Ｃ_１～６アルキルであり、Ｒ^１０およびＲ^１１が、ＣＨ_３であり、Ｒ^８およびＲ^９が、水素であり、Ｒ^６およびＲ^７が、独立して、各出現について、水素、－ＯＨ、－ＣＮ、ハロゲン、およびＣ_１～６アルキルから選択される、化合物である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（ＩＩ）の化合物は、Ｙが、Ｃであり、Ａが、Ｃ_１～６アルキルであり、Ｒ^１０およびＲ^１１が、ＣＨ_３であり、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^８、およびＲ^９が、水素である、化合物である。

【0079】

ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（ＩＩ）の化合物は、Ｙが、Ｎであり、Ａが、Ｃ_１～６アルキルであり、Ｒ^１０およびＲ^１１が、ＣＨ_３であり、Ｒ^６およびＲ^７が、水素であり、Ｒ^８およびＲ^９が、独立して、各出現について、水素、－ＯＨ、－ＣＮ、ハロゲン、およびＣ_１～６アルキルから選択される、化合物である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（ＩＩ）の化合物は、Ｙが、Ｎであり、Ａが、Ｃ_１～６アルキルであり、Ｒ^１０およびＲ^１１が、ＣＨ_３であり、Ｒ^８およびＲ^９が、水素であり、Ｒ^６およびＲ^７が、独立して、各出現について、水素、－ＯＨ、－ＣＮ、ハロゲン、およびＣ_１～６アルキルから選択される、化合物である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（ＩＩ）の化合物は、Ｙが、Ｎであり、Ａが、Ｃ_１～６アルキルであり、Ｒ^１０およびＲ^１１が、ＣＨ_３であり、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^８、およびＲ^９が、水素である、化合物である。

【0080】

ある特定の実施形態では、本明細書に記載される式（ＩＩ）の化合物は、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^８、およびＲ^９が、水素であり、Ｙが、Ｎであり、Ｒ^１０およびＲ^１１が、ＣＨ_３であり、Ａが、ＣＨ_３である、化合物である。

【0081】

ある特定の実施形態では、本発明は、ｒＡＡＶを産生する方法であって、宿主細胞を、式（ＩＶ）

【化35】

の化合物またはその塩を含む溶液と接触させるステップを含む、方法を提供する。

【0082】

ある特定の実施形態では、本発明は、ｒＡＡＶを産生する方法であって、宿主細胞を、コリンまたはその塩を含む溶液と接触させるステップを含む、方法を提供する。

【0083】

ある特定の実施形態では、本発明は、ｒＡＡＶ力価収量を増加させる方法であって、宿主細胞を、式（ＩＶ）

【化36】

の化合物またはその塩を含む溶液と接触させるステップを含む、方法を提供する。

【0084】

ある特定の実施形態では、本発明は、ｒＡＡＶ力価収量を増加させる方法であって、宿主細胞を、コリンまたはその塩を含む溶液と接触させるステップを含む、方法を提供する。

【0085】

別の態様では、本発明は、ｒＡＡＶを産生する方法であって、宿主細胞を、ビタミンＢ_２、ビタミンＢ_７、ビタミンＢ_９、ビタミンＢ_１２、またはこれらの任意の組合せから選択される少なくとも１種のビタミンＢを含む溶液と接触させるステップを含む、方法を提供する。

【0086】

別の態様では、本発明は、ｒＡＡＶ力価収量を増加させる方法であって、宿主細胞を、ビタミンＢ_２、ビタミンＢ_７、ビタミンＢ_９、ビタミンＢ_１２、またはこれらの任意の組合せから選択される少なくとも１種のビタミンＢを含む溶液と接触させるステップを含む、方法を提供する。

【0087】

ＩＩ．培養条件
ある特定の実施形態では、本発明は、ｒＡＡＶを産生するかまたはｒＡＡＶ力価収量を増加させる方法であって、宿主細胞を、本明細書に記載される少なくとも１種の化合物（例えば、式（Ｉ）、（Ｉ－Ａ）、（Ｉ－Ｂ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、もしくは（ＩＶ）の化合物、またはビタミンＢ（例えば、ビタミンＢ_２、ビタミンＢ_７、ビタミンＢ_９、ビタミンＢ_１２、もしくはこれらの任意の組合せ）、またはこれらの任意の組合せ）を含む溶液と接触させるステップを含み、溶液中の少なくとも１種の化合物の最終濃度が、０．５ｍＭよりも高い、方法を提供する。他の実施形態では、溶液中の少なくとも１種の化合物の最終濃度は、０．５ｍＭよりも高いかまたはそれと等しい。

【0088】

ある特定の実施形態では、本発明は、ｒＡＡＶを産生するかまたはｒＡＡＶ力価収量を増加させる方法であって、宿主細胞を、本明細書に記載される少なくとも１種の化合物（例えば、式（Ｉ）、（Ｉ－Ａ）、（Ｉ－Ｂ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、もしくは（ＩＶ）の化合物、またはビタミンＢ（例えば、ビタミンＢ_２、ビタミンＢ_７、ビタミンＢ_９、ビタミンＢ_１２、もしくはこれらの任意の組合せ）、またはこれらの任意の組合せ）を含む溶液と接触させるステップを含み、溶液中の少なくとも１種の化合物の最終濃度が、０．５ｍＭ～１５ｍＭの間（例えば、０．５ｍＭ～１４ｍＭの間、０．５ｍＭ～１３ｍＭの間、０．５ｍＭ～１２ｍＭの間、０．５ｍＭ～１１ｍＭの間、０．５ｍＭ～１０ｍＭの間、０．５ｍＭ～９ｍＭの間、０．５ｍＭ～８ｍＭの間、０．５ｍＭ～７ｍＭの間、０．５ｍＭ～６ｍＭの間、０．５ｍＭ～５ｍＭの間、０．５ｍＭ～４ｍＭの間、０．５ｍＭ～３ｍＭの間、０．５ｍＭ～２ｍＭの間、０．５ｍＭ～１ｍＭの間、１ｍＭ～１５ｍＭの間、２ｍＭ～１５ｍＭの間、３ｍＭ～１５ｍＭの間、４ｍＭ～１５ｍＭの間、５ｍＭ～１５ｍＭの間、６ｍＭ～１５ｍＭの間、７ｍＭ～１５ｍＭの間、８ｍＭ～１５ｍＭの間、９ｍＭ～１５ｍＭの間、１０ｍＭ～１５ｍＭの間、１１ｍＭ～１５ｍＭの間、１２ｍＭ～１５ｍＭの間、１３ｍＭ～１５ｍＭの間、および１４ｍＭ～１５ｍＭの間）である、方法を提供する。一部の例示的な実施形態では、溶液中の少なくとも１種の化合物の最終濃度は、１ｍＭ～１０ｍＭの間である。一部の実施形態では、溶液中の少なくとも１種の化合物の最終濃度は、０．５ｍＭ、１ｍＭ、１．５ｍＭ、２ｍＭ、２．５ｍＭ、３ｍＭ、３．５ｍＭ、４ｍＭ、４．５ｍＭ、５ｍＭ、５．５ｍＭ、６ｍＭ、６．５ｍＭ、７ｍＭ、７．５ｍＭ、８ｍＭ、８．５ｍＭ、９ｍＭ、９．５ｍＭ、１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、または１５ｍＭ、ならびに０．５ｍＭ～１５ｍＭの間のすべての少数値および分数値から選択される。

【0089】

【0090】

【0091】

【0092】

【0093】

ある特定の実施形態では、宿主細胞は、少なくとも２日間、少なくとも１種の化合物を含む溶液と接触する。

【0094】

ある特定の実施形態では、本方法は、ｒＡＡＶを収集および精製するステップをさらに含む。

【0095】

ある特定の実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞は、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ、Ａ５４９、ＢＨＫ、およびＶｅｒｏ細胞から選択される。

【0096】

一実施形態では、宿主細胞は、ＨｅＬａ細胞である。ＨｅＬａ細胞の意味には、任意のクローン誘導体、例えば、無血清培地ならびに懸濁培養において増殖することができるＨｅＬａ細胞株のサブクローンであるＨｅＬａＳ３細胞が含まれることが、当業者には理解され、容易に認識されるであろう。

【0097】

別の実施形態では、宿主細胞は、ＨＥＫ２９３細胞である。ＨＥＫ２９３細胞の意味には、任意のクローン誘導体、例えば、ＨＥＫ２９３－Ｆ細胞、ＨＥＫ２９３－Ｔ細胞、またはＨＥＫ－ＥＸＰＩ２９３細胞が含まれることが、当業者には理解され、容易に認識されるであろう。

【0098】

ある特定の実施形態では、宿主細胞は、昆虫細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞は、Ｓｆ９、Ｓｆ－２１、Ｔｎ－３６８、およびＢＴＩ－Ｔｎ－５Ｂ１－４（Ｈｉｇｈ－Ｆｉｖｅ）細胞からなる群より選択される。

【0099】

一部の実施形態では、宿主細胞は、ＡＡＶ末端逆位配列が隣接した異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子（例えば、ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子）を含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、ヘルパーウイルス遺伝子を含む。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、ｉ）ＡＡＶ末端逆位配列が隣接した異種ヌクレオチド配列、ｉｉ）ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子（例えば、ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子）、ならびにｉｉｉ）ヘルパーウイルス遺伝子を含む。

【0100】

【0101】

【0102】

【0103】

【0104】

ある特定の実施形態では、溶液は、細胞培養培地を含む。一部の実施形態では、溶液は、産生培地を含む。

【0105】

ある特定の実施形態では、本方法は、宿主細胞を、懸濁培養において培養することを含む。ある特定の実施形態では、本方法は、宿主細胞を、接着培養において培養することを含む。ある特定の実施形態では、本方法は、宿主細胞を、１Ｌのバイオリアクターにおいて培養することを含む。ある特定の実施形態では、本方法は、宿主細胞を、２Ｌのバイオリアクターにおいて培養することを含む。ある特定の実施形態では、本方法は、宿主細胞を、３Ｌのバイオリアクターにおいて培養することを含む。ある特定の実施形態では、本方法は、宿主細胞を、２５０Ｌのバイオリアクターにおいて培養することを含む。ある特定の実施形態では、本方法は、宿主細胞を、５００Ｌのバイオリアクターにおいて培養することを含む。ある特定の実施形態では、本方法は、宿主細胞を、２，０００Ｌのバイオリアクターにおいて培養することを含む。

【0106】

ＩＩＩ．組成物
ある態様では、本発明は、宿主細胞と、式（Ｉ）の化合物またはその塩とを含む、組成物を提供する。

【0107】

別の態様では、本発明は、宿主細胞と、式（Ｉ－Ａ）の化合物またはその塩とを含む、組成物を提供する。

【0108】

一部の実施形態では、本発明は、宿主細胞と、

【化37】

およびこれらの任意の組合せからなる群より選択される少なくとも１種の化合物とを含む、組成物を提供する。

【0109】

一部の実施形態では、本発明は、宿主細胞と、ナイアシンアミド、ナイアシン、ニコチン酸メチル、ニコチニルアルコール、およびこれらの任意の組合せからなる群より選択される少なくとも１種の化合物とを含む、組成物を提供する。

【0110】

ある態様では、本発明は、宿主細胞と、式（Ｉ－Ｂ）の少なくとも１種の化合物またはその塩とを含む、組成物を提供する。

【0111】

ある特定の実施形態では、本発明は、宿主細胞と、式（ＩＩＩ）の化合物またはその塩とを含む、組成物を提供する。

【化38】

【0112】

ある特定の実施形態では、本発明は、宿主細胞と、ミオ－イノシトールまたはその塩とを含む、組成物を提供する。

【0113】

別の態様では、本発明は、宿主細胞と、式（ＩＩ）の化合物またはその塩とを含む、組成物を提供する。

【0114】

ある特定の実施形態では、本発明は、宿主細胞と、式（ＩＶ）の化合物またはその塩とを含む、組成物を提供する。

【化39】

【0115】

ある特定の実施形態では、本発明は、宿主細胞と、コリンの化合物またはその塩とを含む、組成物を提供する。

【0116】

ある態様では、本発明は、宿主細胞と、ビタミンＢ_２、ビタミンＢ_７、ビタミンＢ_９、ビタミンＢ_１２、またはこれらの任意の組合せから選択される少なくとも１種のビタミンＢとを含む、組成物を提供する。
ＩＶ．化学的定義

【0117】

特定の官能基および化学用語の定義を、以下により詳細に記載する。化学元素は、ＣＡＳバージョンのＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＣｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＰｈｙｓｉｃｓ，７５^ｔｈＥｄ．の内表紙の元素周期表に従って同定され、特定の官能基は、一般に、そこに記載されるように定義される。さらに、有機化学の一般原則、ならびに特定の官能性部分および反応性は、ＴｈｏｍａｓＳｏｒｒｅｌｌ，ＯｒｇａｎｉｃＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＳｃｉｅｎｃｅＢｏｏｋｓ，Ｓａｕｓａｌｉｔｏ，１９９９；ＳｍｉｔｈａｎｄＭａｒｃｈ，Ｍａｒｃｈ’ｓＡｄｖａｎｃｅｄＯｒｇａｎｉｃＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，５^ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ，２００１、Ｌａｒｏｃｋ，ＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅＯｒｇａｎｉｃＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，ＶＣＨＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８９、およびＣａｒｒｕｔｈｅｒｓ，ＳｏｍｅＭｏｄｅｒｎＭｅｔｈｏｄｓｏｆＯｒｇａｎｉｃＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，３^ｒｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＣａｍｂｒｉｄｇｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，１９８７に記載されている。

【0118】

「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」という冠詞は、１つまたは１つを上回る（すなわち、少なくとも１つの）その冠詞の文法上の目的物を指して本明細書に使用されうる。例として、「１つのアナログ」は、１つのアナログまたは１つを上回るアナログを意味する。

【0119】

値の範囲が列挙されている場合、範囲内のそれぞれの値および部分範囲を包含することが意図される。例えば、「Ｃ_１～６アルキル」は、Ｃ_１、Ｃ_２、Ｃ_３、Ｃ_４、Ｃ_５、Ｃ_６、Ｃ_１～６、Ｃ_１～５、Ｃ_１～４、Ｃ_１～３、Ｃ_１～２、Ｃ_２～６、Ｃ_２～５、Ｃ_２～４、Ｃ_２～３、Ｃ_３～６、Ｃ_３～５、Ｃ_３～４、Ｃ_４～６、Ｃ_４～５、およびＣ_５～６アルキルを包含することが意図される。

【0120】

以下の用語は、以下に一緒に提示される意味を有することが意図され、本発明の説明および意図される範囲を理解するのに有用である。

【0121】

「アルキル」は、１～２０個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖の飽和炭化水素基のラジカルを指す（「Ｃ_１～２０アルキル」）。一部の実施形態では、アルキル基は、１～１２個の炭素原子を有する（「Ｃ_１～１２アルキル」）。一部の実施形態では、アルキル基は、１～１０個の炭素原子を有する（「Ｃ_１～１０アルキル」）。一部の実施形態では、アルキル基は、１～９個の炭素原子を有する（「Ｃ_１～９アルキル」）。一部の実施形態では、アルキル基は、１～８個の炭素原子を有する（「Ｃ_１～８アルキル」）。一部の実施形態では、アルキル基は、１～７個の炭素原子を有する（「Ｃ_１～７アルキル」）。一部の実施形態では、アルキル基は、１～６個の炭素原子を有する（「Ｃ_１～６アルキル」）。一部の実施形態では、アルキル基は、１～５個の炭素原子を有する（「Ｃ_１～５アルキル」）。一部の実施形態では、アルキル基は、１～４個の炭素原子を有する（「Ｃ_１～４アルキル」）。一部の実施形態では、アルキル基は、１～３個の炭素原子を有する（「Ｃ_１～３アルキル」）。一部の実施形態では、アルキル基は、１～２個の炭素原子を有する（「Ｃ_１～２アルキル」）。一部の実施形態では、アルキル基は、１個の炭素原子を有する（「Ｃ_１アルキル」）。一部の実施形態では、アルキル基は、２～６個の炭素原子を有する（「Ｃ_２～６アルキル」）。Ｃ_１～６アルキル基の例としては、メチル（Ｃ_１）、エチル（Ｃ_２）、ｎ－プロピル（Ｃ_３）、イソプロピル（Ｃ_３）、ｎ－ブチル（Ｃ_４）、ｔｅｒｔ－ブチル（Ｃ_４）、ｓｅｃ－ブチル（Ｃ_４）、ｉｓｏ－ブチル（Ｃ_４）、ｎ－ペンチル（Ｃ_５）、３－ペンタニル（Ｃ_５）、アミル（Ｃ_５）、ネオペンチル（Ｃ_５）、３－メチル－２－ブタニル（Ｃ_５）、第三級アミル（Ｃ_５）、およびｎ－ヘキシル（Ｃ_６）が挙げられる。アルキル基のさらなる例としては、ｎ－ヘプチル（Ｃ_７）、ｎ－オクチル（Ｃ_８）などが挙げられる。別途示されない限り、アルキル基のそれぞれの場合は、独立して、必要に応じて置換される、すなわち、置換されない（「非置換アルキル」）または１つもしくは複数の置換基、例えば、１～５個の置換基、１～３個の置換基、もしくは１個の置換基で置換される（「置換アルキル」）。ある特定の実施形態では、アルキル基は、非置換Ｃ_１～１０アルキル（例えば、－ＣＨ_３）である。ある特定の実施形態では、アルキル基は、置換Ｃ_１～１０アルキルである。一般的なアルキルの略語としては、Ｍｅ（－ＣＨ_３）、Ｅｔ（－ＣＨ_２ＣＨ_３）、ｉＰｒ（－ＣＨ（ＣＨ_３）_２）、ｎＰｒ（－ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３）、ｎ－Ｂｕ（－ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３）、またはｉ－Ｂｕ（－ＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３）_２）が挙げられる。

【0122】

「オキソ基」は、－Ｃ（＝Ｏ）－を指す。

【0123】

「ハロ」または「ハロゲン」は、フルオロ（Ｆ）、クロロ（Ｃｌ）、ブロモ（Ｂｒ）、およびヨード（Ｉ）を指す。ある特定の実施形態では、ハロゲン基は、フルオロまたはクロロのいずれかである。

【0124】

「対イオン」または「アニオン性対イオン」は、電子的な中性を維持するための、カチオン性第四級アミノ基と関連する負に荷電した基である。対イオンの例としては、ハロゲン化物イオン（例えば、Ｆ－、Ｃｌ－、Ｂｒ－、Ｉ－）、ＮＯ３－、ＣｌＯ４－、ＯＨ－、Ｈ２ＰＯ４－、ＨＳＯ４－、スルホン酸イオン（例えば、メタンスルホン酸イオン、トリフルオロメタンスルホン酸イオン、ｐ－トルエンスルホン酸イオン、ベンゼンスルホン酸イオン、１０－カンファースルホン酸イオン、ナフタレン－２－スルホン酸イオン、ナフタレン－１－スルホン酸－５－スルホン酸イオン、エタン－１－スルホン酸－２－スルホン酸イオンなど）、およびカルボン酸イオン（例えば、酢酸イオン、エタン酸イオン、プロパン酸イオン、安息香酸イオン、グリセリン酸イオン、乳酸イオン、酒石酸イオン、グリコール酸イオンなど）が挙げられる。

【0125】

「薬学的に許容される塩」は、薬学的に許容され、親化合物の所望される薬理学的活性を有する、本発明の化合物の塩を指す。具体的には、そのような塩は、非毒性であり、無機または有機酸付加塩および塩基付加塩でありうる。具体的には、そのような塩としては、（１）無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などを用いて形成されるか、もしくは有機酸、例えば、酢酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、シクロペンタンプロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、乳酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、３－（４－ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、１，２－エタン－ジスルホン酸、２－ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４－クロロベンゼンスルホン酸、２－ナフタレンスルホン酸、４－トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸、４－メチルビシクロ［２．２．２］－オクト－２－エン－１－カルボン酸、グルコヘプトン酸、３－フェニルプロピオン酸、トリメチル酢酸、第三級ブチル酢酸、ラウリル硫酸、グルコン酸、グルタミン酸、ヒドロキシナフトエ酸、サリチル酸、ステアリン酸、ムコン酸などを用いて形成される、酸付加塩、または（２）親化合物に存在する酸性プロトンが、金属イオン、例えば、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、もしくはアルミニウムイオンによって置き換えられるか、もしくは有機塩基、例えば、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、Ｎ－メチルグルカミンなどと配位する場合に形成される塩が挙げられる。塩としては、単なる例として、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム、テトラアルキルアンモニウムなど、ならびに化合物が塩基性官能基を含む場合には、非毒性有機もしくは無機酸の塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、酒石酸塩、メシル酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、シュウ酸塩などが挙げられる。「薬学的に許容されるカチオン」という用語は、酸性官能基の許容可能なカチオン性対イオンを指す。そのようなカチオンは、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム、テトラアルキルアンモニウムカチオンなどによって例証される。例えば、Ｂｅｒｇｅ，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．（１９７７）６６（１）：１－７９を参照されたい。

【0126】

これらおよび他の例示的な置換基は、詳細な説明および特許請求の範囲において、より詳細に記載されている。本発明は、決して、上記の例示的な置換基の列挙によって限定することを意図するものではない。

【0127】

Ｖ．アデノ随伴ウイルス
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、ディペンドパルボウイルス属およびパルボウイルス科の小型で非エンベロープ型の正十二面体ウイルスである。ＡＡＶは、およそ４．７ｋｂの一本鎖線形ＤＮＡゲノムを有する。ＡＡＶは、血清型ＡＡＶ－１～ＡＡＶ－１２だけでなく、非ヒト霊長類由来の１００を超える血清型を含む、多数の血清学的に識別可能なタイプを含む（例えば、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｃｈｅｍ．，１０５（１）：１７－２４（２００８）、およびＧａｏｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８（１２），６３８１－６３８８（２００４）を参照されたい）。任意のＡＡＶ型を、本発明の方法において使用することができる。ＡＡＶは、いくつかの組織型の分裂細胞および休眠細胞の両方に感染することができ、異なるＡＡＶ血清型では、異なる組織向性を示す。ＡＡＶは、非自律的に複製し、潜伏期および感染期を有する生活環を有する。潜伏期において、細胞がＡＡＶに感染した後、ＡＡＶはプロウイルスとして宿主のゲノムに部位特異的に組み込まれる。ＡＡＶの複製を可能にするヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス（ＡＶ）または単純ヘルペスウイルス）もまた細胞に感染しなければ、感染期は生じない。

【0128】

野生型ＡＡＶゲノムは、ＡＡＶ複製、ゲノムカプシド封入および組み込みを指示するシグナル配列を含有する２つの１４５ヌクレオチドの末端逆位配列（ＩＴＲ）を含有する。ＩＴＲに加えて、３つのＡＡＶプロモーター、ｐ５、ｐ１９およびｐ４０は、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をコードする２つのオープンリーディングフレームの発現を駆動する。２つのｒｅｐプロモーターは、単一のＡＡＶイントロンの差次的スプライシングと組み合わされて、ｒｅｐ遺伝子から４つのｒｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０）の産生をもたらす。ｒｅｐタンパク質はゲノム複製を担う。ｃａｐ遺伝子はｐ４０プロモーターから発現し、Ｃａｐ遺伝子のスプライスバリアントである３つのカプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３）をコードする。これらのタンパク質は、ＡＡＶ粒子のカプシドを形成する。

【0129】

複製、カプシド封入および組み込みのためのシス作用性シグナルがＩＴＲ内に含有されるため、一部またはすべての４．３ｋｂ内部ゲノムは、外来ＤＮＡ、例えば目的の外来タンパク質のための発現カセットで置換されうる。この場合、ｒｅｐおよびｃａｐタンパク質（例えば、ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐタンパク質）は、例えばプラスミド上でトランスに提供される。ＡＡＶベクターを産生するために、ＡＡＶ複製を許容する宿主細胞株は、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ＩＴＲ隣接発現カセット、ならびにヘルパーウイルス、例えばアデノウイルス（ＡＶ）遺伝子Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ５５Ｋ、Ｅ２ａ、Ｅ４ｏｒｆ６およびＶＡによって提供されるヘルパー機能を典型的には発現すべきである（Ｗｅｉｔｚｍａｎｅｔａｌ．，Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｖｉｒｕｓｂｉｏｌｏｇｙ．Ａｄｅｎｏ－ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒｕｓ：ＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＰｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｐｐ．１－２３，２０１１）。ＡＡＶベクターの産生は、一部の実施形態ではＡＡＶベクターの使用前に除去されなければならないまたは不活性化されなければならないヘルパーウイルス粒子の産生ももたらしうる。ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞、Ｖｅｒｏ細胞および昆虫細胞を含む多数の細胞型がＡＡＶベクターを産生するのに好適である（例えば米国特許第６，１５６，３０３号、第５，３８７，４８４号、第５，７４１，６８３号、第５，６９１，１７６号、第５，６８８，６７６号、第８，１６３，５４３号、米国公開第２００２００８１７２１号、ＰＣＴ公開第ＷＯ００／４７７５７号、第ＷＯ００／２４９１６号および第ＷＯ９６／１７９４７号を参照されたい）。ＡＡＶベクターは典型的には、これらの細胞型において、ＩＴＲ隣接発現カセットを含有する１つのプラスミド、ならびに追加的なＡＡＶおよびヘルパーウイルス遺伝子を提供する１つまたは複数の追加的なプラスミドによって産生される。ある特定の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＩＴＲ隣接型発現カセットおよびＡＡＶウイルス遺伝子を含む１つのプラスミド、ならびにヘルパーウイルス遺伝子を提供する１つまたは複数の追加のプラスミドによって、これらの細胞型において産生される。

【0130】

任意の血清型のＡＡＶを本発明において使用することができる。同様に、任意のＡＶタイプを使用することができることが企図され、当業者はその所望の組換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶ）の産生に好適なＡＡＶおよびＡＶタイプを特定することができる。ＡＡＶおよびＡＶ粒子は、例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオジキサノール勾配またはＣｓＣｌ勾配によって精製されうる。

【0131】

野生型ＡＡＶのゲノムは、一本鎖ＤＮＡであり、４．７ｋｂである。ＡＡＶベクターは、サイズが４．７ｋｂであるか、または５．２ｋｂ規模の特大ゲノムもしくは３．０ｋｂほどの小さなゲノムを含む、４．７ｋｂよりも大きいかもしくは小さい一本鎖ゲノムを有しうる。さらに、ベクターゲノムは、ウイルス内でゲノムが実質的に二本鎖であるように、実質的に自己相補性でありうる。すべてのタイプのゲノムを含有するＡＡＶベクターは、本発明の方法における使用に好適である。

【0132】

上で論じたように、ＡＡＶは、その生活環の感染期に入るためにヘルパーウイルスとの共感染を必要とする。ヘルパーウイルスとしてはアデノウイルス（ＡＶ）および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）が挙げられ、バキュロウイルスを使用して昆虫細胞においてＡＡＶを産生するための系が存在する。パピローマウイルスもまたＡＡＶのためのヘルパー機能を提供しうるということも提唱されている（例えば、Ｈｅｒｍｏｎａｔｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｈｅｒａｐｙ９，Ｓ２８９－Ｓ２９０（２００４）を参照されたい）。ヘルパーウイルスとしては、ＡＡＶ複製を生み出し、可能にすることができる任意のウイルスが挙げられる。ＡＶは、およそ３６ｋｂの二本鎖ＤＮＡゲノムを有する無エンベロープの核ＤＮＡウイルスである。ＡＶは、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ５５Ｋ、Ｅ２ａ、Ｅ４ｏｒｆ６およびＶＡ遺伝子を提供し、ＡＡＶ複製およびカプシド封入を可能にすることによって細胞における潜在ＡＡＶプロウイルスをレスキューすることができる。ＨＳＶは、比較的大きな二本鎖直鎖ＤＮＡゲノムが脂質二重層エンベロープに包まれている正二十面体カプシドにカプシド封入されたウイルスのファミリーである。ＨＳＶは感染性かつ高度に伝染性である。以下のＨＳＶ－１複製タンパク質：ヘリカーゼ／プライマーゼ複合体（ＵＬ５、ＵＬ８およびＵＬ５２）ならびにＵＬ２９遺伝子によってコードされるＤＮＡ結合タンパク質ＩＣＰ８は、ＡＡＶ複製のためのＨＳＶ－１ヘルパー機能に典型的には必要なものとして同定され、他のタンパク質はヘルパー機能を増強した。

【0133】

ＶＩ．ｒＡＡＶの産生
本発明は、当該技術分野において公知の任意の好適な方法を使用した、宿主細胞からの組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）の産生を含む。本明細書において使用される場合、用語「宿主細胞」は、ｒＡＡＶを産生することができる任意の１つまたは複数の細胞を指す。一部の実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物細胞、例えば、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ａ５４９細胞、ＢＨＫ細胞、またはＶｅｒｏ細胞である。他の実施形態では、宿主細胞は、昆虫細胞、例えば、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ－２１細胞、Ｔｎ－３６８細胞、またはＢＴＩ－Ｔｎ－５Ｂ１－４（Ｈｉｇｈ－Ｆｉｖｅ）細胞である。別途示されない限り、用語「細胞」または「細胞株」は、示される細胞または細胞株の改変されたまたは操作されたバリアントを含むと理解される。

【0134】

上記のように、ｒＡＡＶの産生を可能にするために、宿主細胞は、ＡＡＶの末端逆位配列（ＩＴＲ）（例えば、目的の異種性ヌクレオチド配列に隣接していてよい）、ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子機能ならびに追加的ヘルパー機能も典型的には含んで提供されるべきである。これらは、任意の数のプラスミドまたはベクターを使用して宿主細胞に提供されうる。追加的ヘルパー機能は、例えばアデノウイルス（ＡＶ）感染によって、必要なすべてのＡＶヘルパー機能遺伝子を保有するプラスミドによって、またはＨＳＶもしくはバキュロウイルスなどのウイルスによって提供されうる。任意の遺伝子、遺伝子機能または宿主細胞によるｒＡＡＶ産生のために必要な他の遺伝材料は、例えば、宿主細胞内に一過的に存在しうる、または宿主細胞ゲノムに安定に挿入されうる。一部の実施形態では、宿主細胞は、ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子機能ならびにｒＡＡＶベクターゲノムを含む、産生細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞は、産生時に、別個の組換えウイルスによってｒＡＡＶベクターゲノムが提供される、ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子機能を含む、パッケージング細胞である。本発明の方法とともに使用されるのに好適なｒＡＡＶ産生方法は、Ｃｌａｒｋら、ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ、６巻：１３２９～１３４１頁（１９９５年）、Ｍａｒｔｉｎら、ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙＭｅｔｈｏｄｓ、２４巻：２５３～２６９頁（２０１３年）、Ｔｈｏｒｎｅら、ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ、２０巻：７０７～７１４頁（２００９年）、ＦｒａｓｅｒＷｒｉｇｈｔ、ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ、２０巻：６９８～７０６頁（２００９年）およびＶｉｒａｇら、ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ、２０巻：８０７～８１７頁（２００９年）に開示されたものを含む。

【0135】

ＶＩＩ．ｒＡＡＶ粒子の精製
本発明の一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、宿主細胞が、本明細書に記載される化合物（例えば、式（Ｉ）、（Ｉ－Ａ）、（Ｉ－Ｂ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、もしくは（ＩＶ）の化合物、またはビタミンＢ（例えば、ビタミンＢ_２、ビタミンＢ_７、ビタミンＢ_９、およびビタミンＢ_１２））またはその塩を含む溶液と接触した後に、宿主細胞から収集および／または精製される。ｒＡＡＶ粒子は、宿主細胞を溶解することによって、その細胞から得られうる。宿主細胞の溶解は、感染性ウイルス粒子を放出するために細胞を化学的にまたは酵素的に処理する方法により達成されうる。これらの方法は、ベンゾナーゼもしくはＤＮＡｓｅなどのヌクレアーゼ、トリプシンなどのプロテアーゼ、または洗剤もしくは界面活性剤の使用を含む。ホモジナイゼーションもしくは粉砕などの物理的破壊、またはマイクロフルイダイザー圧力セルによる加圧、または凍結融解サイクルも使用されうる。ある特定の実施形態では、操作されたｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞由来の溶解液は、ｒＡＡＶ粒子を収集するために使用することができる。代替的に、細胞溶解を必要とすることなく、上清を宿主細胞から収集してもよい。本明細書において使用される場合、「総ｒＡＡＶ」は、宿主細胞によって産生される総ｒＡＡＶを指し、「分泌ｒＡＡＶ」は、細胞溶解を必要とすることなく宿主細胞から収集することができるｒＡＡＶを指す。

【0136】

ｒＡＡＶ粒子を回収した後に、例えば、細胞溶解の結果として生じた細胞残屑を除去するために、ｒＡＡＶ粒子を含有する試料を精製することが望ましくあり得る。ＡＡＶ粒子の最小限の精製の方法は、当分野で公知である。２つの例示的な精製方法は、塩化セシウム（ＣｓＣｌ）およびイオジキサノールに基づく密度勾配精製である。両方法は、Ｓｔｒｏｂｅｌら、ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙＭｅｔｈｏｄｓ、２６巻（４号）：１４７～１５７頁（２０１５年）に記載されている。最小限の精製は、例えば、ＡＶＢセファロース親和性樹脂（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＢｉｏ－ＳｃｉｅｎｃｅｓＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用するアフィニティークロマトグラフィーを使用して達成することもできる。ＡＶＢセファロース親和性樹脂を使用するＡＡＶ精製の方法は、例えば、Ｗａｎｇら、ＭｏｌＴｈｅｒＭｅｔｈｏｄｓＣｌｉｎＤｅｖ．、２巻：１５０４０頁（２０１５年）に記載されている。精製後、ｒＡＡＶ粒子はフィルタリングされ、－６０℃以下で保存されうる。
ＶＩＩＩ．ｒＡＡＶ粒子の定量

【0137】

ｒＡＡＶ粒子の定量は、ＡＡＶ感染がｉｎｖｉｔｒｏの細胞変性効果をもたらさず、したがって、感染力価を決定するためにプラークアッセイが使用できないという事実により、複雑である。しかしながら、ｒＡＡＶ粒子は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）（Ｃｌａｒｋら、Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．、１０巻、１０３１～１０３９頁（１９９９年））、ドットブロットハイブリダイゼーション（Ｓａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６３巻、３８２２～３８２８頁（１９８９年））を含むいくつかの方法を使用して、および高度に精製されたベクター調製物の光学密度により（Ｓｏｍｍｅｒら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、７巻、１２２～１２８頁（２００３年））定量可能である。ＤＮａｓｅ抵抗性粒子（ＤＲＰ）は、サーモサイクラー（例えば、ｉＣｙｃｌｅｒｉＱ９６ウエルブロックフォーマットサーモサイクラー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ））におけるリアルタイム定量的遺伝子発現低減ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）（ＤＲＰ－ｑＰＣＲ）により、定量可能である。ｒＡＡＶ粒子を含有する試料が、ＤＮａｓｅＩ（１００Ｕ／ｍｌ；Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）の存在下、３７℃で６０分間インキュベートされ、続いて、５０℃で６０分間のプロテイナーゼＫ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）消化（１０Ｕ／ｍＬ）、次いで、９５℃で３０分間、変性させられる。使用されるプライマープローブセットは、ｒＡＡＶベクターゲノムの非天然部分、例えば、目的のタンパク質のポリ（Ａ）配列に特異的であるべきである。ＰＣＲ産物は、プライマー、プローブおよび増幅された配列の長さおよび組成に基づく、任意の適切なサイクリングパラメータのセットを使用して増幅されうる。代替プロトコールは、例えば、Ｌｏｃｋら、ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙＭｅｔｈｏｄｓ、２５巻（２号）：１１５～１２５頁（２０１４年）に開示されている。

【0138】

本明細書全体を通じて、装置、デバイス、およびシステムが、特定の成分を有する、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、もしくは含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）と記載されているか、またはプロセスおよび方法が、特定のステップを有する、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、もしくは含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）と記載されている場合、追加として、列挙された構成成分から本質的になるかまたはそれからなる本発明の装置、デバイス、およびシステムが存在すること、ならびに列挙されたプロセスことから本質的になるかまたはそれからなる本発明によるプロセスおよび方法が存在することが、企図される。

【0139】

本発明の実施は、例示的目的のためだけに本明細書において提示され、いかなる方法においても本発明を限定すると解釈されるべきでない、前述の例からさらに十分に理解される。

【実施例】

【0140】

（実施例１：ＨｅＬａ細胞でのｒＡＡＶ産生に対する異なる濃度のナイアシンアミドの効果）
この例では、ｒＡＡＶ産生に対する、０．１ｍＭ～４０ｍＭの範囲の様々な濃度のナイアシンアミドの効果を、様々なＨｅＬａ産生細胞株において試験した。実験は、３ｍＬの作業体積、細胞培養産生培地において０．２×１０^６個の細胞の播種密度、および２００ｖｐ／細胞のＡｄ５感染多重度（ＭＯＩ）で、２４ディープウェルプレート培養システムにおいて実行した。図１は、変動するナイアシンアミド濃度（０．１ｍＭ～４０ｍＭ）においてＨｅＬａ産生細胞から産生される様々なクレードＥおよびＦｒＡＡＶの、正規化された容量ｒＡＡＶ力価の概略的なグラフを示す。ｒＡＡＶ力価の増加は、０．１ｍＭ～１０ｍＭで見られ、１ｍＭ～１０ｍＭの間でもっとも有意な増加が観察された。この分析に含まれたカプシド血清型は、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ｒｈ１０、およびｈｕ３７であった。

【0141】

図２は、変動するナイアシンアミド濃度ごとの正規化された容量ｒＡＡＶ力価（ＧＣ／ｍＬ）、ならびにデータ点の３次多項式当てはめを使用した場合の予測最大値のグラフを示す。ｒＡＡＶ力価の有意な増加が、１ｍＭ～１０ｍＭの間で見られ、５ｍＭに予測最大値があった。

【0142】

（実施例２：ｒＡＡＶ産生に対する容器スケールの効果）
この例では、ｒＡＡＶ産生に対する、ナイアシンアミドを有する２つの一般的な容器（３ｍＬのディープウェル（「２４－ＤＷ」）および１００ｍＬの振盪フラスコ（「フラスコ」））を使用したスケールの効果を、試験した。分析は、第ＩＸ因子導入遺伝子をコードするクレードＥｒＡＡＶ（ＡＡＶｒｈ１０－ＦＩＸ）を産生することができるＨｅＬａ産生細胞株を使用して行った。図３は、異なるスケールにおける変動するナイアシンアミド濃度でのｒＡＡＶ力価（ＧＣ／ｍＬ）を示す棒グラフを示す。ナイアシンアミド、スケール、およびそれらの間の相互作用の因子を考察する二元配置ＡＮＯＶＡは、ナイアシンアミドからのみ統計学的に有意な影響を示した（ｐ＜０．０００１）。スケールおよび相互作用の因子は、有意ではなかった（それぞれ、ｐ＝０．３９１５およびｐ＝０．１３５３）。ダネットの検定を行ったが、これは、因子としてスケールを除去した場合に、すべての濃度において有意性を示した。

【0143】

（実施例３：クレードＥＨｅＬａクローンでのｒＡＡＶ産生に対するナイアシンアミドの効果）
４つの異なるＨｅＬａクローンを、実施例１に記載される条件を使用して試験した。図４Ａ～Ｄは、それぞれ、クローン１（ＡＡＶｒｈ１０－ＦＩＸ）フォローアップ上清、クローン２（ＡＡＶ８－Ｇ６Ｐａｓｅ）上清、クローン３（ＡＡＶ８－Ｇ６Ｐａｓｅ）補充物質なしの広範囲、およびクローン４（ＡＡＶｈｕ３７－ＦＶＩＩＩ）補充物質なしの広範囲の懸濁物（すなわち、Ｔｒｉｔｏｎ溶解試料）についての変動するナイアシンアミド濃度あたりのｒＡＡＶ力価（ＧＣ／ｍＬ）を示す。１ｍＭ～５ｍＭの間のナイアシンアミドを添加した場合に、４つすべてのクローンにおいて、力価の増加が示された。

【0144】

（実施例４：クレードＦＨｅＬａクローンでのｒＡＡＶ産生に対するナイアシンアミドの効果）
この例では、短縮型ＡＴＰ７Ｂ導入遺伝子をコードする組換えクレードＦＡＡＶ（ＡＡＶ９－ＡＴＰ７Ｂ）を発現する２つのＨｅＬａ産生細胞株クローンに対する３ｍＭナイアシンアミドの効果を、２Ｌのバイオリアクターにおいて試験した。図５に示されるように、バイオリアクターに３ｍＭナイアシンアミドを添加することにより、両方のクローンについて、有意な力価の増加が観察された。

【0145】

（実施例５：ＨＥＫ２９３細胞でのｒＡＡＶ産生に対する異なる濃度のナイアシンアミドの効果）
この例では、ｒＡＡＶ産生に対する、０．０３ｍＭ～３０ｍＭの範囲の様々な濃度のナイアシンアミドの効果を、ＨＥＫ２９３細胞で試験した。実験は、１．３×１０^６～２．０×１０^６個の細胞／ｍＬのトランスフェクション密度を使用して、３０ｍＬのフラスコにおいて行った。この実験において使用したＨＥＫ２９３細胞には、オルニチントランスカルバミラーゼをコードするｒＡＡＶ８（ｒＡＡＶ８－ＯＴＣ）の産生を可能にするプラスミドをトランスフェクトした。図６に示されるように、０．３ｍＭと３ｍＭのナイアシンアミドの添加により、ＨＥＫ２９３細胞で、力価の増加が観察された。また、２Ｌのバイオリアクタースケールで試行を繰り返したところ、ＨＥＫ２９３細胞について、ナイアシンアミドの添加により力価の増加が示された（データは示されない）。

【0146】

（実施例６：ＨＥＫ２９３細胞でのｒＡＡＶ産生に対する追加の化合物の効果）
この例では、ＨＥＫ２９３細胞におけるｒＡＡＶ産生に対するナイアシンアミド以外の化合物の効果を、試験した。この例において分析した化合物には、ナイアシン、ニコチン酸メチル、ミオ－イノシトール、パントテン酸、ピリドキシン、コリン、チアミン、グルコサミン、カフェイン、ｎ－アセチルグルコサミン、およびチミジンが含まれた。

【0147】

実験は、実施例５に記載されるものと同じ細胞を使用して、類似のトランスフェクションおよび培養条件下で、２４ディープウェルプレートにおいて行った。試験したそれぞれの化合物の濃度は、１ｍＭ、３ｍＭ、および９ｍＭであった。試験した化合物の中でも、ナイアシンは、１ｍＭにおいて力価の２０％の増加をもたらし、ニコチン酸メチルは、３ｍＭにおいて力価の４２％の増加をもたらし、ミオ－イノシトールは、３ｍＭおよび９ｍＭにおいて力価のおよそ２０％の増加をもたらしたが、コリンは、３ｍＭにおいて力価の６５％の増加をもたらした。試験した他の化合物はいずれも、試験した３つの濃度のいずれにおいても、ｒＡＡＶ力価に対して有意な利益をもたらさなかった。

【0148】

この例は、ナイアシン、ニコチン酸メチル、ミオ－イノシトール、およびコリンを含む代替的な化合物が、ｒＡＡＶ力価をブーストすることができるが、試験した他の１１種類の化合物よりも実質的かつ驚異的に優れていると見られるナイアシンアミドによってもたらされる利益レベルを提供する化合物はなかったことを示す。

【0149】

番号付き実施形態
本明細書に開示される実施形態は、本開示の番号付き実施形態に提供される実施形態Ｐ１～Ｐ６８を含む。

【0150】

実施形態Ｐ１：組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を産生する方法であって、宿主細胞を、式（Ｉ）

【化40】

の化合物またはその塩を含む溶液と接触させるステップを含み、式中、

【化41】

が、単結合または二重結合を表し、
ｎが、１～５から選択される整数であり、
Ｒ^１が、－ＯＨ、Ｃ_１～６アルキル、Ｃ_１～６アルキル－ＯＨ、Ｃ_１～６アルキル－Ｏ－Ｃ_１～６アルキル、－Ｏ－Ｃ_１～６アルキル、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^ａ）_２、および－Ｃ（Ｏ）ＯＲ^ｂからなる群より選択され、
Ｒ^ａが、独立して、各出現について、水素またはＣ_１～６アルキルであり、
Ｒ^ｂが、独立して、各出現について、水素またはＣ_１～６アルキルであり、
Ｘが、ＣＲ^ｃＲ^ｄまたはＮであり、
Ｒ^ｃおよびＲ^ｄが、独立して、各出現について、水素、Ｃ_１～６アルキル、－ＯＨ、および－Ｏ－Ｃ_１～６アルキルからなる群より選択され、Ｒ^ｃが、水素である場合、Ｒ^ｄは、Ｃ_１～６アルキル、－ＯＨ、および－Ｏ－Ｃ_１～６アルキルから選択され、Ｒ^ｃが、Ｃ_１～６アルキル、－ＯＨ、および－Ｏ－Ｃ_１～６アルキルから選択される場合、Ｒ^ｄは、水素であり、
前記化合物が、

【化42】

でもその塩でもない、
方法。

【0151】

実施形態Ｐ２：ｒＡＡＶ力価収量を増加させる方法であって、宿主細胞を、式（Ｉ）

【化43】

の化合物またはその塩を含む溶液と接触させるステップを含み、式中、

【化44】

【化45】

でもその塩でもない、
方法。

【0152】

実施形態Ｐ３：Ｘが、Ｎである、実施形態Ｐ１またはＰ２に記載の方法。

【0153】

実施形態Ｐ４：ｎが、１である、実施形態Ｐ１からＰ３のいずれか一項に記載の方法。

【0154】

実施形態Ｐ５：Ｒ^１が、Ｃ_１～６アルキル－ＯＨ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^ａ）_２、および－Ｃ（Ｏ）ＯＲ^ｂからなる群より選択される、実施形態Ｐ１からＰ４のいずれか一項に記載の方法。

【0155】

実施形態Ｐ６：Ｒ^１が、ＣＨ_２ＯＨ、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、－Ｃ（Ｏ）ＯＨ、および－Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ_３からなる群より選択される、実施形態Ｐ１からＰ５のいずれか一項に記載の方法。

【0156】

実施形態Ｐ７：Ｘが、ＣＲ^ｃＲ^ｄである、実施形態Ｐ１またはＰ２に記載の方法。

【0157】

実施形態Ｐ８：Ｒ^ｃが、水素であり、Ｒ^ｄが、－ＯＨである、実施形態Ｐ１、Ｐ２、およびＰ７のいずれか一項に記載の方法。

【0158】

実施形態Ｐ９：ｎが、５である、実施形態Ｐ１、Ｐ２およびＰ７からＰ８のいずれか一項に記載の方法。

【0159】

実施形態Ｐ１０：Ｒ^１が、－ＯＨである、実施形態Ｐ１、Ｐ２およびＰ７からＰ９のいずれか一項に記載の方法。

【0160】

実施形態Ｐ１１：前記化合物が、式（Ｉ－Ａ）

【化46】

の化合物またはその塩であり、式中、
Ｒ^２およびＲ^３が、独立して、各出現について、水素もしくは－ＯＨであるか、
またはＲ^２およびＲ^３が、一緒になって、オキソを形成することができ、
Ｒ^４が、水素、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ_１～６アルキル、および－Ｎ（Ｒ^ｅ）_２からなる群より選択され、
Ｒ^ｅが、独立して、各出現について、水素またはＣ_１～６アルキルである、
実施形態Ｐ１またはＰ２に記載の方法。

【0161】

実施形態Ｐ１２：Ｒ^２およびＲ^３が、一緒になって、オキソを形成する、実施形態Ｐ１１に記載の方法。

【0162】

実施形態Ｐ１３：Ｒ^４が、－ＮＨ_２、－ＯＨ、および－ＯＣＨ_３からなる群より選択される、実施形態Ｐ１１またはＰ１２に記載の方法。

【0163】

実施形態Ｐ１４：Ｒ^２およびＲ^３が、いずれも、水素である、実施形態Ｐ１１に記載の方法。

【0164】

実施形態Ｐ１５：Ｒ^４が、－ＯＨである、実施形態Ｐ１１またはＰ１４に記載の方法。

【0165】

実施形態Ｐ１６：前記化合物が、

【化47】

からなる群より選択される、
実施形態Ｐ１、Ｐ２、およびＰ１１のいずれか一項に記載の方法。

【0166】

実施形態Ｐ１７：前記化合物が、式（Ｉ－Ｂ）

【化48】

の化合物またはその塩であり、式中、
Ｘが、ＣＲ^ｃＲ^ｄであり、
Ｒ^５ａ、Ｒ^５ｂ、Ｒ^５ｃ、Ｒ^５ｄ、およびＲ^５ｅが、独立して、各出現について、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ_１～６アルキル、Ｃ_１～６アルキル、Ｃ_１～６アルキル－ＯＨ、およびＣ_１～６アルキル－Ｏ－Ｃ_１～６アルキルであり、
Ｒ^ｃおよびＲ^ｄが、実施形態Ｐ１に定義される通りである、
実施形態Ｐ１またはＰ２に記載の方法。

【0167】

実施形態Ｐ１８：Ｒ^ｃが、水素であり、Ｒ^ｄが、－ＯＨである、実施形態Ｐ１７に記載の方法。

【0168】

実施形態Ｐ１９：Ｒ^５ａ、Ｒ^５ｂ、Ｒ^５ｃ、Ｒ^５ｄ、およびＲ^５ｅが、－ＯＨである、実施形態Ｐ１７またはＰ１８に記載の方法。

【0169】

実施形態Ｐ２０：前記化合物が、

【化49】

である、実施形態Ｐ１７からＰ１９のいずれか一項に記載の方法。

【0170】

実施形態Ｐ２１：ｒＡＡＶを産生する方法であって、宿主細胞を、式（ＩＩ）

【化50】

の化合物またはその塩を含む溶液と接触させるステップを含み、式中、
Ｒ^６およびＲ^７が、独立して、各出現について、水素、－ＯＨ、－ＣＮ、ハロゲン、およびＣ_１～６アルキルからなる群より選択され、
Ｒ^８およびＲ^９が、独立して、各出現について、水素、－ＯＨ、－ＣＮ、ハロゲン、およびＣ_１～６アルキルからなる群より選択され、
Ｙが、ＣまたはＮであり、
Ｒ^１０およびＲ^１１が、独立して、各出現について、水素、－ＯＨ、およびＣ_１～６アルキルからなる群より選択され、
Ａが、水素、Ｃ_１～６アルキル、および－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^ｆ）_２からなる群より選択され、
Ｒ^ｆが、独立して、各出現について、水素、Ｃ_１～６アルキル、Ｃ_１～６アルキル－Ｃ（Ｏ）ＯＨ、およびＣ_１～６アルキル－ＯＨからなる群より選択され、
前記化合物が、

【化51】

でない、
方法。

【0171】

実施形態Ｐ２２：ｒＡＡＶ力価収量を増加させる方法であって、宿主細胞を、式（ＩＩ）

【化52】

【化53】

でない、
方法。

【0172】

実施形態Ｐ２３：Ｒ^６およびＲ^７が、水素である、実施形態Ｐ２１またはＰ２２に記載の方法。

【0173】

実施形態Ｐ２４：Ｒ^８およびＲ^９が、水素である、実施形態Ｐ２１からＰ２３のいずれか一項に記載の方法。

【0174】

実施形態Ｐ２５：Ｙが、Ｎである、実施形態Ｐ２１からＰ２４のいずれか一項に記載の方法。

【0175】

実施形態Ｐ２６：Ｒ^１０およびＲ^１１が、ＣＨ_３である、実施形態Ｐ２１からＰ２５のいずれか一項に記載の方法。

【0176】

実施形態Ｐ２７：Ａが、ＣＨ_３である、実施形態Ｐ２１からＰ２６のいずれか一項に記載の方法。

【0177】

実施形態Ｐ２８：前記化合物が、

【化54】

である、実施形態Ｐ２１からＰ２７のいずれか一項に記載の方法。

【0178】

実施形態Ｐ２９：ｒＡＡＶを産生するかまたはｒＡＡＶ力価収量を増加させる方法であって、宿主細胞を、ビタミンＢ_２、ビタミンＢ_７、ビタミンＢ_９、およびビタミンＢ_１２からなる群より選択されるビタミンＢを含む溶液と接触させるステップを含む、方法。

【0179】

実施形態Ｐ３０：前記溶液中の前記化合物の最終濃度が、０．５ｍＭよりも高い、実施形態Ｐ１からＰ２９のいずれか一項に記載の方法。

【0180】

実施形態Ｐ３１：前記溶液中の前記化合物の最終濃度が、０．５ｍＭよりも高いかまたはそれと等しい、実施形態Ｐ１からＰ２９のいずれか一項に記載の方法。

【0181】

実施形態Ｐ３２：前記溶液中の前記化合物の最終濃度が、０．５ｍＭ～１０ｍＭの間である、実施形態Ｐ１からＰ２９のいずれか一項に記載の方法。

【0182】

実施形態Ｐ３３：前記溶液中の前記化合物の最終濃度が、１ｍＭ～１０ｍＭの間である、実施形態Ｐ１からＰ２９のいずれか一項に記載の方法。

【0183】

実施形態Ｐ３４：前記溶液中の前記化合物の最終濃度が、前記化合物を含む溶液と接触していない宿主細胞によって産生されるものと比較して、少なくとも１．２倍大きい量の分泌ｒＡＡＶを産生させるのに十分である、実施形態Ｐ１からＰ３３のいずれか一項に記載の方法。

【0184】

実施形態Ｐ３５：前記溶液中の前記化合物の最終濃度が、前記化合物を含む溶液と接触していない宿主細胞によって産生されるものと比較して、少なくとも１．２倍大きい量の総ｒＡＡＶを産生させるのに十分である、実施形態Ｐ１からＰ３３のいずれか一項に記載の方法。

【0185】

実施形態Ｐ３６：前記溶液中の前記化合物の最終濃度が、前記化合物を含む溶液と接触していない宿主細胞によって産生されるものと比較して、１．２～２．５倍大きい量の分泌ｒＡＡＶを産生させるのに十分である、実施形態Ｐ１からＰ３３のいずれか一項に記載の方法。

【0186】

実施形態Ｐ３７：前記溶液中の前記化合物の最終濃度が、前記化合物を含む溶液と接触していない宿主細胞によって産生されるものと比較して、１．２～２．５倍大きい量の総ｒＡＡＶを産生させるのに十分である、実施形態Ｐ１からＰ３３のいずれか一項に記載の方法。

【0187】

実施形態Ｐ３８：前記宿主細胞が、少なくとも２日間、前記化合物を含む前記溶液と接触する、実施形態Ｐ１からＰ３７のいずれか一項に記載の方法。

【0188】

実施形態Ｐ３９：前記ｒＡＡＶを収集および精製するステップをさらに含む、実施形態Ｐ１からＰ３８のいずれか一項に記載の方法。

【0189】

実施形態Ｐ４０：前記宿主細胞が、哺乳動物細胞である、実施形態Ｐ１からＰ３９のいずれか一項に記載の方法。

【0190】

実施形態Ｐ４１：前記宿主細胞が、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ、Ａ５４９、ＢＨＫ、およびＶｅｒｏ細胞からなる群より選択される、実施形態Ｐ４０に記載の方法。

【0191】

実施形態Ｐ４２：前記宿主細胞が、ＨｅＬａ細胞である、実施形態Ｐ４１に記載の方法。

【0192】

実施形態Ｐ４３：前記宿主細胞が、ＨＥＫ２９３細胞である、実施形態Ｐ４１に記載の方法。

【0193】

実施形態Ｐ４４：前記宿主細胞が、昆虫細胞である、実施形態Ｐ１からＰ３９のいずれか一項に記載の方法。

【0194】

実施形態Ｐ４５：前記宿主細胞が、Ｓｆ９、Ｓｆ－２１、Ｔｎ－３６８、およびＢＴＩ－Ｔｎ－５Ｂ１－４（Ｈｉｇｈ－Ｆｉｖｅ）細胞からなる群より選択される、実施形態Ｐ４４に記載の方法。

【0195】

実施形態Ｐ４６：前記宿主細胞が、ＡＡＶ末端逆位配列が隣接した異種ヌクレオチド配列を含む、実施形態Ｐ１からＰ４５のいずれか一項に記載の方法。

【0196】

実施形態Ｐ４７：前記宿主細胞が、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含む、実施形態Ｐ１からＰ４６のいずれか一項に記載の方法。

【0197】

実施形態Ｐ４８：前記宿主細胞が、ヘルパーウイルス遺伝子を含む、実施形態Ｐ１からＰ４７のいずれか一項に記載の方法。

【0198】

実施形態Ｐ４９：前記宿主細胞が、ＡＡＶ末端逆位配列が隣接した異種ヌクレオチド配列、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス遺伝子を含む、実施形態Ｐ１からＰ４８のいずれか一項に記載の方法。

【0199】

実施形態Ｐ５０：前記宿主細胞が、前記化合物を含む溶液と接触していない宿主細胞によって産生されるものと比較して、少なくとも１．２倍大きい量の分泌ｒＡＡＶを産生する、実施形態Ｐ１からＰ４９のいずれか一項に記載の方法。

【0200】

実施形態Ｐ５１：前記宿主細胞が、前記化合物を含む溶液と接触していない宿主細胞によって産生されるものと比較して、少なくとも１．２倍大きい量の総ｒＡＡＶを産生する、実施形態Ｐ１からＰ４９のいずれか一項に記載の方法。

【0201】

実施形態Ｐ５２：前記宿主細胞が、前記化合物を含む溶液と接触していない宿主細胞によって産生されるものと比較して、１．２～２．５倍大きい量の分泌ｒＡＡＶを産生する、実施形態Ｐ１からＰ４９のいずれか一項に記載の方法。

【0202】

実施形態Ｐ５３：前記宿主細胞が、前記化合物を含む溶液と接触していない宿主細胞によって産生されるものと比較して、１．２～２．５倍大きい量の総ｒＡＡＶを産生する、実施形態Ｐ１からＰ４９のいずれか一項に記載の方法。

【0203】

実施形態Ｐ５４：前記溶液が、細胞培養培地を含む、実施形態Ｐ１からＰ５３のいずれか一項に記載の方法。

【0204】

実施形態Ｐ５５：前記溶液が、産生培地を含む、実施形態Ｐ１からＰ５３のいずれか一項に記載の方法。

【0205】

実施形態Ｐ５６：前記宿主細胞を、懸濁培養において培養するステップを含む、実施形態Ｐ１からＰ５５のいずれか一項に記載の方法。

【0206】

実施形態Ｐ５７：前記宿主細胞を、接着培養において培養するステップを含む、実施形態Ｐ１からＰ５５のいずれか一項に記載の方法。

【0207】

実施形態Ｐ５８：前記宿主細胞を、１Ｌのバイオリアクターにおいて培養するステップを含む、実施形態Ｐ１からＰ５６のいずれか一項に記載の方法。

【0208】

実施形態Ｐ５９：前記宿主細胞を、２Ｌのバイオリアクターにおいて培養するステップを含む、実施形態Ｐ１からＰ５６のいずれか一項に記載の方法。

【0209】

実施形態Ｐ６０：前記宿主細胞を、３Ｌのバイオリアクターにおいて培養するステップを含む、実施形態Ｐ１から５６のいずれか一項に記載の方法。

【0210】

実施形態Ｐ６１：前記宿主細胞を、２５０Ｌのバイオリアクターにおいて培養するステップを含む、実施形態Ｐ１からＰ５６のいずれか一項に記載の方法。

【0211】

実施形態Ｐ６２：前記宿主細胞を、５００Ｌのバイオリアクターにおいて培養するステップを含む、実施形態Ｐ１からＰ５６のいずれか一項に記載の方法。

【0212】

実施形態Ｐ６３：前記宿主細胞を、２，０００Ｌのバイオリアクターにおいて培養するステップを含む、実施形態Ｐ１からＰ５６のいずれか一項に記載の方法。

【0213】

実施形態Ｐ６４：宿主細胞と、式（Ｉ）の化合物またはその塩とを含む、組成物。

【0214】

実施形態Ｐ６５：宿主細胞と、式（Ｉ－Ａ）の化合物またはその塩とを含む、組成物。

【0215】

実施形態Ｐ６６：宿主細胞と、式（Ｉ－Ｂ）の化合物またはその塩とを含む、組成物。

【0216】

実施形態Ｐ６７：宿主細胞と、式（ＩＩ）の化合物またはその塩とを含む、組成物。

【0217】

実施形態Ｐ６８：宿主細胞と、ビタミンＢ_２、ビタミンＢ_７、ビタミンＢ_９、およびビタミンＢ_１２からなる群より選択されるビタミンＢとを含む、組成物。
参照による組み込み

【0218】

本明細書において参照される特許および科学文書のそれぞれの開示全体は、すべての目的について参照により組み込まれる。
均等物

【0219】

本発明は、その精神または本質的特徴から逸脱することなく、他の具体的な形態において具体化されうる。したがって、前述の実施形態は、本明細書に記載される本発明への制限よりむしろ、あらゆる点で例示的であると見なされるべきである。本発明の範囲は、したがって前述の記載によってよりむしろ添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の等価の意味および範囲内に生じるすべての変化は、それに含まれることが意図される。

【図1】