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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-05-17
(54)【発明の名称】ＰＤ１ベースワクチン接種組成物およびその方法
(51)【国際特許分類】
A61K 39/00 20060101AFI20230510BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20230510BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230510BHJP
A61P 35/04 20060101ALI20230510BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230510BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20230510BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230510BHJP
A61K 38/49 20060101ALI20230510BHJP
【ＦＩ】
A61K39/00 H
A61P37/04
A61P35/00
A61P35/04
A61P43/00 121
A61K45/00
A61K39/395 D
A61K39/395 N
A61K39/395 M
A61K38/49 ZNA
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022547284
(86)(22)【出願日】2021-02-04
(85)【翻訳文提出日】2022-09-20
(86)【国際出願番号】 CN2021075254
(87)【国際公開番号】W WO2021164563
(87)【国際公開日】2021-08-26
(31)【優先権主張番号】62/978,911
(32)【優先日】2020-02-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】515134117
【氏名又は名称】ヴェルシテック リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100096758
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 剛
(74)【代理人】
【識別番号】100114845
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 雅和
(74)【代理人】
【識別番号】100148781
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 友和
(72)【発明者】
【氏名】チェン， ジウェイ
(72)【発明者】
【氏名】タン， ジウ
【テーマコード（参考）】
4C084
4C085
【Ｆターム（参考）】
4C084AA19
4C084DC21
4C084MA16
4C084MA56
4C084NA05
4C084ZB072
4C084ZB091
4C084ZB092
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZC751
4C085AA03
4C085AA13
4C085BB01
4C085BB23
4C085EE01
4C085EE03
4C085GG06
(57)【要約】
本明細書で提供されるのは、ＰＤ１ベースＴＷＩＳＴ１を含むＤＮＡワクチンおよび組成物である。同様に提供されるのは、ＰＤ１ベースＴＷＩＳＴ１ワクチンを投与することによりＴＷＩＳＴ１特異的Ｔ細胞応答を誘導する方法である。同様に提供されるのは、ＰＤ１ベースＴＷＩＳＴ１ワクチンおよび免疫チェックポイント阻害薬を投与することによりＴＷＩＳＴ１特異的Ｔ細胞応答を誘導する方法である。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象におけるＴＷＩＳＴ１特異的Ｔ細胞応答を誘導する方法であって、ＰＤ１およびＴＷＩＳＴ１を含む有効量のＤＮＡワクチンを前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項2】
腫瘍関連抗原（「ＴＡＡ」）に対する免疫寛容の克服に効果的である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ＴＡＡがＴＷＩＳＴ１である、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
癌の浸潤および転移の制御に効果的である、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記癌がＴＷＩＳＴ－１－発現癌である、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記癌が、中皮腫、ＡＢ１中皮腫、４Ｔ１乳癌、メラノーマ、結腸癌、前立腺癌、および胃癌からなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
免疫チェックポイント阻害薬を前記対象に投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記免疫チェックポイント阻害薬が抗ＣＴＬＡ－４抗体である、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
ＤＮＡワクチン構築物の前記有効量が１００μｇ～２００ｍｇである、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
前記ワクチンが、１０日間～３週間の間隔で３回、筋肉内に投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記抗ＣＴＬＡ－４抗体が、２００μｇ～４００ｍｇの投与量で投与される、請求項８に記載の方法。
【請求項12】
前記ワクチンが、ＰＤ１ベースＴＷＩＳＴ１ワクチンの投与の２４時間後および４日毎に３回、腹腔内に投与される、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
可溶性ＰＤ１およびＴＷＩＳＴ１を含むＤＮＡワクチン構築物。
【請求項14】
リンカーをさらに含む、請求項１３に記載のＤＮＡワクチン構築物。
【請求項15】
組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）をさらに含む、請求項１４に記載のＤＮＡワクチン構築物。
【請求項16】
（ｉ）可溶性ＰＤ１；および（ｉｉ）ＴＷＩＳＴ１；ならびに許容可能な医薬担体、を含むＤＮＡワクチン構築物を含む組成物。
【請求項17】
（ｉ）可溶性ＰＤ１；および（ｉｉ）ＴＷＩＳＴ１；ならびに許容可能な医薬担体、を含むＤＮＡワクチン構築物を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本国際出願は、２０２０年２月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／９７８，９１１号の利益を主張する。この仮出願の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
発明の分野
本開示は、癌免疫療法、癌ワクチン、その組成物および方法の分野に属する。
本開示は、癌免疫療法、癌ワクチン、その組成物および方法の分野に属する。
【背景技術】
【0003】
悪性中皮腫は通常、胸膜から発生する、吹き付けアスベストへの曝露に関連する致死型の癌である。中皮腫の発生率および死亡率は、主に発展途上国で上昇が続いている（１）。悪性中皮腫の治療は難度が高く、その理由は、大部分の患者（＞７５％）が集学的治療（手術、化学療法、および／または放射線療法の組み合わせ）の後であっても再発を経験するためである（２）。ペメトレキセドとシスプラチンによる化学療法は、１０年以上にわたり唯一の承認療法であったが、この手法は、せいぜいわずかな便益を達成したに過ぎず、多くの患者は、このような治療に適さない（３）。細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ－４）、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）およびプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）などの免疫チェックポイント分子を標的にする抗体は、特定の癌における治療効力を改善したが、それらの効果は、中皮腫の患者では満足できるものではない（４）。
特に、抗ＣＴＬＡ－４抗体を用いた中皮腫に対する最初のランダム化第３相試験は、その主要エンドポイントの全生存期間の改善を達成できなかった（５、６）。ＰＤ１およびＰＤ－Ｌ１チェックポイント阻害抗体は、第１／２相試験で、進行型中皮腫の治療において、いくつかの有望な結果を示したが、全奏効率は、まだ、３０％未満である（７、８）。既存の免疫療法の有効性を高めるために、我々は、中皮腫患者の能動ワクチン接種により抗腫瘍応答を誘発することが必要であると考えている。
特に、抗ＣＴＬＡ－４抗体を用いた中皮腫に対する最初のランダム化第３相試験は、その主要エンドポイントの全生存期間の改善を達成できなかった（５、６）。ＰＤ１およびＰＤ－Ｌ１チェックポイント阻害抗体は、第１／２相試験で、進行型中皮腫の治療において、いくつかの有望な結果を示したが、全奏効率は、まだ、３０％未満である（７、８）。既存の免疫療法の有効性を高めるために、我々は、中皮腫患者の能動ワクチン接種により抗腫瘍応答を誘発することが必要であると考えている。
【0004】
癌ワクチンは、患者自身の免疫監視の増強と適切な活性化を必要とする（９、１０）。しかしながら、広範囲にわたる努力にもかかわらず、治療的癌ワクチンは、進行癌患者における臨床的応答の確立の点で、まだ、好ましい結果をほとんど示していない。これは、大部分が、免疫抑制腫瘍微小環境（ＴＥＭ）内の腫瘍抗原の限られた免疫原性に起因する（１３、１４）。これらの試験は、ＤＣベースワクチンの大きな治療可能性を示すが、既発症悪性腫瘍の治癒はまれである（１、３）。
【0005】
高頻度の上皮間葉転換（ＥＭＴ）は、悪性中皮腫の重要な特徴である（１７）。高ＥＭＴレベルは、中皮腫転移の増大および予後不良に密接に関連している（１８、１９）。ベーシック・ヘリックス・ループ・ヘリックス型転写因子ＴＷＩＳＴ１は、ＥＭＴを誘導し、メラノーマ、結腸癌、乳癌、前立腺癌、および胃癌を含む多くの固形腫瘍の転移過程を調節する最も重要な因子の１つである（２０～２３）。中皮腫ＥＭＴの調節および病因におけるＴＷＩＳＴ１の役割は、ほとんどが未知のまま残されている（２５）。ワクチンは、癌免疫療法のための安全で、簡単な費用対効果が大きい方法である。今まで、医院におけるその成功は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する免疫寛容の問題により妨害されてきた。
【発明の概要】
【0006】
本明細書で提供されるのは、ＴＷＩＳＴ１に対する免疫寛容を破壊し、中皮腫に対し直接的にＴ細胞応答を誘発する効果的なｓＰＤ１ベースＴＷＩＳＴ１ ＤＮＡワクチン、すなわち、ｓＰＤ１－ＴＷＩＳＴ１である。ＴＷＩＳＴ１発現は、中皮腫患者の腫瘍形成に関連し、このタンパク質は、実験のＡＢ１中皮腫の浸潤および転移のために必要である。予防的ｓＰＤ１－ＴＷＩＳＴ１ワクチン接種は、皮下および転移性中皮腫成長の両方を制御する。ｓＰＤ１－ＴＷＩＳＴ１ワクチン接種およびＣＴＬＡ－４免疫チェックポイント阻害の組み合わせは、ＴＷＩＳＴ１特異的Ｔ細胞応答をさらに高め、中皮腫および乳癌モデルの両方における治療効果をもたらす。観察された抗腫瘍療法は、大きな細胞傷害性潜在力を有し、高度に保存された免疫優性短鎖ペプチドに対してｓＰＤ１－ＴＷＩＳＴ１ワクチン接種により特異的に誘発される、ワクチン誘発ＴＷＩＳＴ１特異的持続性記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞に依存する。種々の癌型でのＴＷＩＳＴ１の広範な発現があるので、ｓＰＤ１－ＴＷＩＳＴ１ワクチン接種は、癌免疫療法に有用である。
【0007】
本明細書で提供されるのは、対象におけるＴＷＩＳＴ１特異的Ｔ細胞応答を誘導する方法であり、該方法は、ＰＤ１およびＴＷＩＳＴ１を含む有効量のＤＮＡワクチンを対象に投与することを含む。
【0008】
特定の実施形態では、方法は、腫瘍関連抗原（「ＴＡＡ」）に対する免疫寛容の克服に効果的である。
特定の実施形態では、ＴＡＡはＴＷＩＳＴ１である。
特定の実施形態では、ＴＡＡはＴＷＩＳＴ１である。
【0009】
特定の実施形態では、方法は、癌の浸潤および転移の制御に効果的である。
特定の実施形態では、癌はＴＷＩＳＴ－１－発現癌である。
特定の実施形態では、癌は、中皮腫、ＡＢ１中皮腫、４Ｔ１乳癌、メラノーマ、結腸癌、前立腺癌、および胃癌からなる群より選択される。
特定の実施形態では、癌はＴＷＩＳＴ－１－発現癌である。
特定の実施形態では、癌は、中皮腫、ＡＢ１中皮腫、４Ｔ１乳癌、メラノーマ、結腸癌、前立腺癌、および胃癌からなる群より選択される。
【0010】
特定の実施形態では、方法は、免疫チェックポイント阻害薬を対象に投与することをさらに含む。
特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害薬は、抗ＣＴＬＡ－４抗体である。
特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害薬は、抗ＣＴＬＡ－４抗体である。
【0011】
特定の実施形態では、ＤＮＡワクチン構築物の有効量は、１００μｇ～２００ｍｇである。
特定の実施形態では、ワクチンは、１０日間～３週間の間隔で３回、筋肉内に投与される。
特定の実施形態では、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、２００μｇ～４００ｍｇの投与量で投与される。
特定の実施形態では、ワクチンは、ＰＤ１ベースＴＷＩＳＴ１ワクチンの投与の２４時間後および４日毎に３回、腹腔内に投与される。
特定の実施形態では、ワクチンは、１０日間～３週間の間隔で３回、筋肉内に投与される。
特定の実施形態では、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、２００μｇ～４００ｍｇの投与量で投与される。
特定の実施形態では、ワクチンは、ＰＤ１ベースＴＷＩＳＴ１ワクチンの投与の２４時間後および４日毎に３回、腹腔内に投与される。
【0012】
本明細書で提供されるのは、可溶性ＰＤ１およびＴＷＩＳＴ１を含むＤＮＡワクチン構築物である。
特定の実施形態では、リンカーをさらに含む。
特定の実施形態では、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰａ）をさらに含む。
特定の実施形態では、リンカーをさらに含む。
特定の実施形態では、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰａ）をさらに含む。
【0013】
本明細書で提供されるのは、（ｉ）可溶性ＰＤ１；および（ｉｉ）ＴＷＩＳＴ１；ならびに許容可能な医薬担体、を含むＤＮＡワクチン構築物を含む組成物である。
【0014】
本明細書で提供されるのは、（ｉ）可溶性ＰＤ１；および（ｉｉ）ＴＷＩＳＴ１；ならびに許容可能な医薬担体、を含むＤＮＡワクチン構築物を含むキットである。
本特許または出願ファイルは、少なくとも１つのカラー図面を含む。カラー図面を含む本特許または特許出願公開のコピーは、要請があれば、必要な手数料を支払うことにより、特許庁により提供される。
本特許または出願ファイルは、少なくとも１つのカラー図面を含む。カラー図面を含む本特許または特許出願公開のコピーは、要請があれば、必要な手数料を支払うことにより、特許庁により提供される。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】ＴＷＩＳＴ１の発現は、ＡＢ１中皮腫の浸潤および転移を促進する。（Ａ）ＴＮＭステージによるＴＣＧＡ中皮腫コホート（ｎ＝８７）中のＴＷＩＳＴ１発現。ステージＩ／ＩＩ、ｎ＝２６。ステージＩＩＩ／ＩＶ、ｎ＝６１。（Ｂ）ＴＷＩＳＴ１の弱（ｎ＝４５、ＴＷＩＳＴ１≦８．３４６）または強（ｎ＝４２、ＴＷＩＳＴ１＞８．３４６）の発現レベルにより層別化した中皮腫患者のカプランマイヤー全生存曲線。（Ｃ）異なるマウス腫瘍細胞株でのＴＷＩＳＴ１のウェスタンブロット分析。ＡＢ１細胞中のＴＷＩＳＴ１の機能的役割を遺伝子過剰発現（ＯＥ）およびノックアウト（ＫＯ）により分析した。（Ｄ）ＴＷＩＳＴ１タンパク質のウェスタンブロット分析。ＷＴ、野性型ＡＢ１細胞；ＯＥ、レンチウイルスベクター媒介ＴＷＩＳＴ１過剰発現；ＫＯ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介ＴＷＩＳＴ１ノックアウト。（Ｅ）野性型、ＴＷＩＳＴ１過剰発現またはノックアウト細胞におけるビメンチン、Ｎ－カドヘリンおよびＥ－カドヘリンを含むＥＭＴ関連分子のｑＲＴ－ＰＣＲ定量化。（Ｆ）コロニー形成アッセイのために示された代表的ウェル。（Ｇ）マトリゲル細胞浸潤アッセイ；代表的画像（上段）および定量化（下段）。（Ｈ）１×１０６個のＡＢ１のＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝６匹）への静脈内接種後の肺転移。左パネル、生存曲線。右パネル、終了点で回収した肺の代表的画像。
【図2】ＰＤ１ベースワクチン接種は、ＴＷＩＳＴ１特異的Ｔ細胞応答およびＡＢ１中皮腫の増殖制御を強化した。（Ａ）ＴＷＩＳＴ１ ＤＮＡワクチン構築物の概略図。ｔＰａ、組織プラスミノーゲンアクチベーターシグナル配列。（Ｂ）２９３Ｔ細胞中への遺伝子導入後のＴＷＩＳＴ１ ＤＮＡワクチン構築物の発現。ｓＰＤ１－ＴＷＩＳＴ１、ｓＴＷＩＳＴ１またはモック発現プラスミドを遺伝子導入した２９３Ｔ細胞の細胞ライセートまたは培養上清を、抗ＴＷＩＳＴ１抗体を用いてウェスタンブロット分析に供した。（Ｃ）可溶性タンパク質とマウスＰＤ－Ｌ１／Ｌ２遺伝子導入２９３細胞との間の結合のフローサイトメトリー分析。ｓＰＤ１－ＴＷＩＳＴ１－ＦＬＡＧ（赤色実線）、ｓＴＷＩＳＴ１－ＦＬＡＧ（黒色点線）またはモック（網掛領域）処理２９３Ｔ細胞から収集した遺伝子導入上清を用いて、マウスＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２発現ベクターで一過性に遺伝子導入した２９３Ｔ細胞をインキュベートした。（Ｄ）治療スケジュールの略図。ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝４）の群は、３回のＤＮＡ／ＥＰワクチン接種を受けた後、最後のワクチン接種の２週後にイムノアッセイまたは１×１０６個ＡＢ１細胞の皮下チャレンジのために屠殺された。（Ｅ）ＴＷＩＳＴ１特異的Ｔ細胞応答のエリスポット分析。（Ｆ）ＤＮＡ／ＥＰワクチン接種後に、ＩＦＮγ、ＩＬ－２、ＴＮＦα産生ＣＤ８＋（上段）およびＣＤ４＋（下段）Ｔ細胞の細胞内染色。（Ｇ）精製ＣＤ３＋Ｔ細胞の野性型（ＷＴ）またはＴＷＩＳＴ１ノックアウト（ＫＯ）ＡＢ１細胞と共にインキュベーション後のサイトカイン産生。１×１０６個のＡＢ１細胞の皮下チャレンジ後の、ＤＮＡ／ＥＰワクチン接種マウス（ｎ＝８）の腫瘍増殖（Ｈ）および生存曲線（Ｉ）。
【図3】ｓＰＤ１－ＴＷＩＳＴ１ワクチンは、ＡＢ１肺転移を抑制した。ワクチン接種ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝４）は、最後のワクチン接種の２週後に１×１０６個のＡＢ１細胞を受け、生物発光により腫瘍増殖（Ａ）が監視された。代表的生物発光画像（Ｂ）を示す。２８日目に、マウスの体重が測定され（Ｃ）、その後、マウスは、（Ｄ）巨視的な評価（左）およびＨ＆Ｅ染色（右）用の肺の収集のために屠殺された。（Ｅ）終了点での脾臓中のＴ細胞サブセット（上段）および免疫抑制細胞サブセット（下段）のエフェクター機能の評価。
【図4】チェックポイント調節は、既発症中皮腫の治癒のためのｓＰＤ１－ＴＷＩＳＴ１ワクチン接種の抗腫瘍活性を高める。（Ａ）治療試験の略図。ＢＡＬＢ／ｃマウスに５×１０５個のＡＢ１細胞を皮下接種し、続けて、ｓＴＷＩＳＴ１、ｓＰＤ１－ＴＷＩＳＴ１または模擬ワクチン接種を７日目に行い、１０日毎に３回繰り返した。注入毎に２００μｇの投与量の抗ＣＴＬＡ４抗体を腹腔内に８日目、およびワクチン接種の間４日毎に投与した。治療的ワクチン接種後の腫瘍増殖測定値（Ｂ）および無腫瘍生存曲線（Ｃ）。腫瘍径が＞１５ｍｍに達するとマウスを屠殺した。（Ｄ）全ての群のＴ細胞応答（左）またはｓＰＤ１－ＴＷＩＳＴ１ ＤＮＡ／ＥＰワクチン接種とＣＴＬＡ－４阻害の併用群のＴ細胞応答（右）。ＴＷＩＳＴ１ペプチドまたは対照ペプチド卵白アルブミン（ＯＶＡ２５７－２６４）による脾細胞のエクスビボ刺激後に、分泌ＩＦＮγをエリスポットアッセイにより定量化した。矢印は、その群中の個々の無腫瘍マウスを示す。雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５）の群は、２×１０５個の４Ｔ１細胞を乳腺中に接種され、続けて、１日目にワクチン接種を開始し、１０日毎に３回繰り返した。注入毎に２００μｇの投与量の抗ＣＴＬＡ４抗体を腹腔内に２日目、およびワクチン接種の間４日毎に投与した。（Ｅ）４Ｔ１接種後２７日目に回収した４Ｔ１原発腫瘍増殖曲線（左）および腫瘍重量（右）。（Ｆ）肺中のクローン原性転移性細胞の計数（左）およびインキュベーションの１４日後のクローン原性コロニーの代表的画像（右、×２００希釈因子）。（Ｇ）代表的ドットプロットおよび脾臓中のＩＦＮγ＋ＴＮＦα＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを終了点で測定した。
【図5】併用療法は、免疫優性ＴＷＩＳＴ１エピトープに対する永続性のＴ細胞免疫応答を誘導した。腫瘍アブレーションの６０日後に、ｓＰＤ１－ＴＷＩＳＴ１およびα－ＣＴＬＡ－４併用群の保護マウス（ｎ＝５）の皮下に再チャレンジを行い、腫瘍増殖（Ａ）を測定した。ＡＢ１－Ｌｕｃ腫瘍の代表的生物発光画像（Ｂ）を示す。（Ｃ）種々のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比率でのＡＢ１細胞に対するＴ細胞の細胞傷害性アッセイ。初期の完全な腫瘍拒絶後にｓＰＤ１－ＴＷＩＳＴ１ワクチン接種およびα－ＣＴＬＡ－４併用療法を受けたマウスの脾臓からＴ細胞を単離した。（Ｄ）Ｔ細胞養子移入に対する略図（上段）および腫瘍成長曲線（下段）。無感作またはワクチン接種／保護マウス由来のＴ細胞を、７日目のＡＢ１－Ｌｕｃ腫瘍を有するＳＣＩＤマウスに養子導入し、１５０ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミド（Ｃｙ）の腹腔内注入の１日後に腫瘍増殖を評価した。全体ＴＷＩＳＴ１配列をカバーするミニプール（Ｅ）またはミニプール３７～３９中のペプチド（Ｆ）を用いた、ＴＷＩＳＴ１免疫優性エピトープのキャラクタリゼーション。
【図6】ＴＷＩＳＴ１の発現は、ＡＢ１中皮腫の浸潤および転移を促進する。（Ａ）野性型、ＴＷＩＳＴ１過剰発現またはノックアウト細胞中のＦＳＰ１、ＺＥＢ１およびオクルディンを含むＥＭＴ関連分子のｑＲＴ－ＰＣＲ定量化。（Ｂ）種々のＴＷＩＳＴ１発現を有する異なるＡＢ１細胞のインビトロ増殖。皮下へ１×１０６細胞を受けたＢＡＬＢ／ｃマウスの腫瘍増殖（Ｃ）および生存曲線（Ｄ）。（Ｅ）創傷治癒遊走アッセイでの明視野画像化。生細胞イメージング顕微鏡により創傷中への細胞遊走を監視し、明視野画像を引っ掻き後の示した時間後に捕捉した。
【図7】ＰＤ１ベースワクチン接種は、ＴＷＩＳＴ１特異的Ｔ細胞応答およびＡＢ１中皮腫の増殖制御を高めた。脾細胞由来のＩＦＮγ、ＩＬ－２、ＴＮＦα産生ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の特定を示すフローサイトメトリー散布図に対するゲーティング戦略。
【図8】ｓＰＤ１－ＴＷＩＳＴ１ワクチンは、ＡＢ１肺転移を抑制した。（Ａ）静脈内チャレンジＢＡＬＢ／ｃマウスの終了点での肺画像。（Ｂ）終了点での脾臓中のＮＫ細胞の評価。
【図9】併用療法は、免疫優性ＴＷＩＳＴ１エピトープに対する永続性のＴ細胞免疫応答を誘導した。（Ａ）種々のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比率でのＡＢ１細胞に対する、マウスから単離したＴ細胞の細胞傷害性アッセイ。（Ｂ）ＩＦＮγエリスポットにより測定した、ＴＷＩＳＴ１ペプチド、ミニプール３７～３９、ミニプール４０～４２または単一１５マーペプチドのいずれかに対するＴ細胞応答。完全腫瘍拒絶後に、ｓＰＤ１－ＴＷＩＳＴ１ワクチン接種およびα－ＣＴＬＡ－４併用療法を受けたマウス由来の２×１０５個の脾細胞をアッセイに用いた。
【発明を実施するための形態】
【0016】
チェックポイント免疫療法は、癌治療のための大きなブレークスルーであるが、まだ、その有効性は、悪性中皮腫を含む多くのタイプの悪性腫瘍に対して限定的であることが多い。免疫療法の有効性は、免疫監視に依存することを考慮して、腫瘍自己抗原に対する免疫寛容を破壊する能動免疫獲得法が開発されている。現在の免疫療法におけるＴＡＡ自己免疫寛容の制約は、２つの手法により克服される。１つ目は、ＰＤ１ベースＤＮＡワクチン接種戦略を用いて、ＴＷＩＳＴ１特異的抗腫瘍Ｔ細胞免疫の誘導のために自己免疫寛容を回避することである。２つ目は、ＰＤ１ベースＴＷＩＳＴ１ワクチンおよびチェックポイント阻害剤抗ＣＴＬＡ１抗体の併用法が、ＴＷＩＳＴ１特異的Ｔ細胞応答を顕著に高め、既発症中皮腫の免疫療法治癒に繋がったことであり、これは、広範囲のＴＷＩＳＴ１発現癌に対する大きな意味を有した。ＴＷＩＳＴ１、ベーシック・ヘリックス・ループ・ヘリックス型転写因子、は、ヒト中皮腫腫瘍形成に関連し、免疫コンピテントマウスＡＢ１モデルにおいて、中皮腫の浸潤および転移に必要である。ＰＤ１ベースワクチン接種は、皮下および転移性中皮腫致死的チャレンジの両方に対して、ＴＷＩＳＴ１特異的Ｔ細胞応答を誘導することにより、予防的制御を提供した。さらに、ＣＴＬＡ－４阻害単独は、既発症中皮腫に対してなんらの免疫療法有効性を示さなかったが、それのＰＤ１ベースワクチン接種との組み合わせは、６０％完全寛解をもたらした。機構的には、これらの機能的Ｔ細胞は、新規の高度に保存された免疫優性ＴＷＩＳＴ１エピトープを認識し、細胞傷害活性および持続性の記憶を示し、既発症ＡＢ１中皮腫および４Ｔ１乳癌に対する永続性の腫瘍退縮および延命効果に繋がった。ＰＤ１ベースワクチン接種は、腫瘍自己抗原ＴＷＩＳＴ１に対する免疫寛容を破壊することにより中皮腫を制御する。本明細書で提供されるのは、広範囲のＴＷＩＳＴ１発現腫瘍に対する免疫療法を強化するためのＰＤ１ベースワクチン接種である。
【0017】
結果
ＴＷＩＳＴ１の発現は、中皮腫進行と相関し、ＡＢ１中皮腫の浸潤および転移を促進する。我々は、最初に、ヒト中皮腫中のＴＷＩＳＴ１発現の効果を、Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）の中皮腫コホート（ＭＥＳＯ）からの異なるステージの８７人の患者間のその発現レベルを比較することにより調査した。より高いＴＷＩＳＴ１発現は、初期ステージ腫瘍（ＴＮＭ ＩまたはＩＩ）に比べて、進行ステージ中皮腫（ＴＮＭ ＩＩＩおよびＩＶ）の患者で見つかった（図１Ａ）。加えて、患者が彼らの腫瘍中のＴＷＩＳＴ１発現に基づいて２つの群に層別化された場合、強いＴＷＩＳＴ１発現を有する患者は、有意に低減した全生存期間を示し（図１Ｂ）、ＴＷＩＳＴ１発現と中皮腫腫瘍形成の関連性を示唆した。
ＴＷＩＳＴ１の発現は、中皮腫進行と相関し、ＡＢ１中皮腫の浸潤および転移を促進する。我々は、最初に、ヒト中皮腫中のＴＷＩＳＴ１発現の効果を、Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）の中皮腫コホート（ＭＥＳＯ）からの異なるステージの８７人の患者間のその発現レベルを比較することにより調査した。より高いＴＷＩＳＴ１発現は、初期ステージ腫瘍（ＴＮＭ ＩまたはＩＩ）に比べて、進行ステージ中皮腫（ＴＮＭ ＩＩＩおよびＩＶ）の患者で見つかった（図１Ａ）。加えて、患者が彼らの腫瘍中のＴＷＩＳＴ１発現に基づいて２つの群に層別化された場合、強いＴＷＩＳＴ１発現を有する患者は、有意に低減した全生存期間を示し（図１Ｂ）、ＴＷＩＳＴ１発現と中皮腫腫瘍形成の関連性を示唆した。
【0018】
我々は次に、２種の中皮腫細胞株、ＡＢ１およびＡＥ１７中の、ならびに４Ｔ１乳癌細胞株中のＴＷＩＳＴ１タンパク質の発現を調査した。以前の知見（２６）と一致して、ＴＷＩＳＴ１は４Ｔ１細胞中で検出された（図１Ｃ）。さらに、我々は、両方の中皮腫細胞株は同様にＴＷＩＳＴ１タンパク質を発現し、その最高の発現レベルは、ＡＢ１細胞中で検出されることを見出した。ＡＢ１中皮腫発生におけるＴＷＩＳＴ１発現の役割を調査するために、我々は、ＴＷＩＳＴ１発現がレンチウイルスベクター媒介過剰発現またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介ノックアウト（ＫＯ）によりそれぞれ操作されるＡＢ１細胞を構築した（図１Ｄ）。リアルタイムｑＰＣＲを用いて、我々は、ＴＷＩＳＴ１の過剰発現は、ビメンチン、Ｎ－カドヘリン、線維芽細胞特異的タンパク質１（ＦＳＰ－１）およびジンクフィンガーＥ－ｂｏｘ結合ホメオボックス１（ＺＥＢ１）を含む間葉系マーカーの発現を誘導し、またＥ－カドヘリンおよびオクルディンの発現の抑制も誘導することを見出した（図１Ｅおよび図６Ａ）。この結果は、ＴＷＩＳＴ１は、他のＥＭＴ転写因子と協調し、中皮腫のＥＭＴおよび転移を促進することを示唆した。ＴＷＩＳＴ１過剰発現またはサイレンシングは、インビトロＡＢ１細胞の短期増殖を変えないが（図６Ｂ）、ＡＢ１細胞のコロニー形成効率は、ＴＷＩＳＴ１発現と密接に関連する（図１Ｆ）。具体的には、過剰発現細胞は、高められたクローン原性活性を示したが、一方、ＫＯ細胞は、低減した活性を示した。それらのインビトロクローン原性活性と一致して、皮下過剰発現腫瘍は、同系ＢＡＬＢ／ｃマウスの皮下ＫＯ腫瘍に比較して、同等に加速された増殖速度および有意に短縮された生存時間を示した（図６Ｃ～Ｄ）。我々は次に、ＴＷＩＳＴ１の発現が、ＡＢ１中皮腫の浸潤および転移に影響を与えるかどうかを判定することを試みた。ＴＷＩＳＴ１発現のＫＯは、ＡＢ１細胞の遊走を顕著に低減し、一方、その過剰発現は、マトリゲル細胞浸潤アッセイ（図１Ｇ）および創傷治癒遊走アッセイの両方でそれを促進した（図６Ｅ）。中皮腫転移を推進するＴＷＩＳＴ１の役割をさらに検証するために、我々は、ＢＡＬＢ／ｃ免疫コンピテントマウスの尾静脈を介してＡＢ１細胞の静脈内（ｉ．ｖ．）注射によるインビボ転移モデルを確立した。このモデルは、全肺中に転移巣を形成し、臨床転帰により、全ての治療動物の３０日以内の人道的安楽死が必要であった（図１Ｈ）。このモデルを用いて、我々は、野性型（ＷＴ）細胞に比べて、ＴＷＩＳＴ１過剰発現は、ＡＢ１細胞の転移活性を高め、一方、ＫＯは、それらの肺への転移能力を有意に抑制し、動物の無腫瘍生存を延長したことを見出した。全体として、これらの知見は、ＴＷＩＳＴ１は、中皮腫浸潤、転移および腫瘍進行の根底にある重要な転写因子であるという考えを裏付け、ＴＷＩＳＴ１は、癌成長および転移を阻止するための治療標的として機能し得ることを示唆する。
【0019】
ＰＤ１ベースワクチン接種は、ＴＷＩＳＴ１特異的Ｔ細胞応答およびＡＢ１中皮腫の増殖制御を高めた。ｓＰＤ１ベース融合ＤＮＡワクチンがＴＷＩＳＴ１特異的抗中皮腫免疫を高めるかどうかを判定するために、我々は、最初に、ｓＰＤ１とＴＷＩＳＴ１（ｓＰＤ１－ＴＷＩＳＴ１）を連結する融合タンパク質をコードするＤＮＡワクチン構築物を生成して、従来のｓＴＷＩＳＴ１ ＤＮＡワクチンと比較した（図２Ａ）。これらの２つの構築物からのコード化ＴＷＩＳＴ１タンパク質の発現は、ウェスタンブロット分析により確認された（図２Ｂ）。重要なのは、両ＴＷＩＳＴ１タンパク質は、可溶型として分泌され得るが、ｓＰＤ１－ＴＷＩＳＴ１のみが、ＰＤ－Ｌ１／Ｌ２発現細胞と相互作用し（図２Ｂ～Ｃ）、ｓＰＤ１ベースＴＷＩＳＴ１ワクチンは、以前に示したように（１１、２８）、ＴＷＩＳＴ１抗原をＤＣに向けることにより、養子Ｔ細胞免疫を改善し得る。これを試験するために、我々は、ｓＰＤ１－ＴＷＩＳＴ１が、ＢＡＬＢ／ｃマウス中、インビボでＴＷＩＳＴ１特異的免疫応答を高め得るかどうかの判定を試みた。手短に説明すると、我々が以前に確立したように（１１、２８）、１００μｇのｓＰＤ１－ＴＷＩＳＴ１またはｓＴＷＩＳＴ１のＤＮＡプラスミドをＥＰを介して、３週間間隔で３回、筋肉内（ｉ．ｍ）注射した。最後のワクチン接種の２週後、全てのマウスを屠殺し、免疫応答分析のために血液および脾臓検体を収集した（図２Ｄ）。我々は、ｓＰＤ１－ＴＷＩＳＴ１ワクチン接種が、ｓＴＷＩＳＴ１ワクチン接種に比べて、ＴＷＩＳＴ１特異的Ｔ細胞応答を有意に高めたことを見出した（図２Ｅ）。さらに、ｓＰＤ１－ＴＷＩＳＴ１ワクチン接種マウスは、ＴＷＩＳＴ１ペプチドプールでエクスビボ刺激後、より高い頻度のＩＦＮγおよびＴＮＦα発現ＣＤ４＋Ｔ細胞、ならびにＴＮＦα発現ＣＤ８＋Ｔ細胞を有し（図２Ｆおよび図７）、ｓＰＤ１ベースワクチンは、ＴＷＩＳＴ１自己抗原に対する免疫寛容を破壊することを示す。重要なのは、対照と比較した場合、ｓＰＤ１－ＴＷＩＳＴ１ワクチン接種マウスのＣＤ３＋Ｔ細胞は、ＷＴ ＡＢ１細胞とインビトロで共培養した場合、有意により多量のＩＦＮγおよびＴＮＦαを放出したが、ＴＷＩＳＴ１ ＫＯ細胞ではそうではなく（図２Ｇ）、従って、ＴＷＩＳＴ１発現腫瘍細胞の認識における、ワクチン誘発Ｔ細胞の特異性を示すことである。ＴＷＩＳＴ１ワクチン接種のインビボ腫瘍増殖を制御する能力を評価するために、３回目のワクチン接種の２週後に、致死用量の１×１０６個のＷＴ ＡＢ１細胞をワクチン接種マウスの皮下に（ｓ．ｃ．）接種した（図２Ｄ）。我々は、ｓＰＤ１－ＴＷＩＳＴ１ワクチンが、ｓＴＷＩＳＴ１またはモックワクチンに比べて、ＡＢ１中皮腫成長を有意に抑制したことを見出した（図２Ｈ）。さらに、ｓＰＤ１－ＴＷＩＳＴ１ワクチン接種マウスのみが、ＡＢ１チャレンジマウスの生存時間を実質的に延長し、３７．５％の無腫瘍生存をもたらした（図２Ｉ）。まとめると、我々の結果は、ｓＰＤ１－ＴＷＩＳＴ１ワクチンが、中皮腫に対する防御免疫を生成するために、ＴＷＩＳＴ１免疫寛容の破壊に有用であるという考えを裏付けた。
【0020】
ｓＰＤ１－ＴＷＩＳＴ１ワクチンは、ＡＢ１肺転移を抑制した。ＴＷＩＳＴ１の発現は、中皮腫転移活性に関与するので、我々は次に、ＡＢ１中皮腫細胞の転移の抑制におけるＴＷＩＳＴ１ワクチンの活性を調べることを試みた。上記と同じ転移モデルを用いて、ホタルルシフェラーゼを安定に形質導入したＷＴ ＡＢ１細胞（ＡＢ１－Ｌｕｃ）をワクチン免疫マウスの静脈内に注射して肺転移を誘導し、肺腫瘍増殖を生物発光画像化により監視した。モックワクチン接種に比べて、非標的化ｓＴＷＩＳＴ１ ＤＮＡワクチンは、何らの抗中皮腫活性も示すことができなかった（図３Ａ～Ｂ）。肺転移の有意な低減は、ｓＰＤ１－ＴＷＩＳＴ１ワクチン接種マウスでのみ見出された。ＡＢ１注射の２８日後の終了点で、ｓＴＷＩＳＴ１ワクチン接種およびモック治療群のマウスは、有意に低減した体重を示した（図３Ｃ）。重要なのは、インビボ画像化結果と一致して、ｓＰＤ１－ＴＷＩＳＴ１ワクチン接種マウスは、肺表面上に有意に低減した転移結節（図８Ａ）およびより少ない肺中の転移領域（図３Ｄ）を有し、ＡＢ１中皮腫の転移抑制におけるｓＰＤ１－ＴＷＩＳＴ１の強力な影響を示唆する。免疫抑制環境の形成は、腫瘍免疫回避および中皮腫発生に関連することが報告された（１１、２９、３０）。この転移モデルで中皮腫関連免疫抑制環境の克服におけるワクチン誘発Ｔ細胞免疫の重要性を示すために、我々は、実験の終了点でのＴ細胞機能ならびに種々の免疫抑制細胞の発生頻度をエクスビボで分析した。我々は、ｓＰＤ１－ＴＷＩＳＴ１ワクチン接種マウスは、対照と比較して、有意に高いレベルのＩＦＮγおよびＴＮＦα産生ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞（図３Ｅ）、ならびにＮＫ細胞（図８Ｂ）を有することを見出した。さらに、多形核および単球性骨髄由来サプレッサー細胞骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）サブセットおよびＣＤ４＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を含む、免疫抑制細胞の発生頻度は、ｓＴＷＩＳＴ１またはモックワクチン接種マウスよりも、ｓＰＤ１－ＴＷＩＳＴ１ワクチン接種マウス中で有意に低かった（図３Ｆ）。まとめると、これらの結果は、ｓＰＤ１－ＴＷＩＳＴ１ワクチン接種は、ＡＢ１中皮腫の転移を抑制し、腫瘍関連免疫抑制を低減することを示した。
【0021】
チェックポイント調節は、既発症中皮腫の治癒のためのｓＰＤ１－ＴＷＩＳＴ１ワクチン接種の抗腫瘍活性を高める。腫瘍負荷ホストにおける内因性抗腫瘍Ｔ細胞応答の調節の除去での抗体媒介免疫チェックポイント阻害の成功を考慮して、我々は、ｓＰＤ１－ＴＷＩＳＴ１ワクチンにより生成された抗中皮腫応答が抗ＣＴＬＡ－４（α－ＣＴＬＡ－４）抗体によるチェックポイント阻害から恩恵を受けることができるかどうかを調べた。我々は、α－ＣＴＬＡ－４抗体は、ｓＰＤ１－ＴＷＩＳＴ１ワクチン接種の抗腫瘍活性を高め得ることを仮定した（３１）。この仮説を試験するために、我々は最初に、既発症ＡＢ１中皮腫に対する抗腫瘍有効性を調査した。最初に、マウスの皮下に致死用量の５×１０５個のＡＢ１細胞を接種し、これに続けて、ｓＴＷＩＳＴ１、ｓＰＤ１－ＴＷＩＳＴ１または模擬ワクチン接種を固形腫瘍が触知できる腫瘍接種の７日後に開始して、１０日間隔で３回実施した（図４Ａ）。同時に、注入毎に２００μｇの投与量のα－ＣＴＬＡ－４抗体を腹腔内（ｉ．ｐ．）に８日目に、およびワクチン接種の間、４日毎に投与した。我々は、α－ＣＴＬＡ－４単剤療法は、既発症ＡＢ１中皮腫に対して、なんらの抗腫瘍活性を示さず、全てのマウスは、それらの臨床転帰により４０日以内に安楽死させる必要があったことを明らかにした（図４Ｂ～Ｃ）。ｓＰＤ１－ＴＷＩＳＴ１ワクチン接種単剤療法は、腫瘍増殖を遅らせるわずかな抗中皮腫活性を示し、１／６マウスで腫瘍退縮を生じた。特に、腫瘍接種の２５日後に測定して、ｓＰＤ１－ＴＷＩＳＴ１ワクチン接種およびα－ＣＴＬＡ－４の併用療法は、α－ＣＴＬＡ－４単剤療法およびＰＢＳ治療群の両方に比べて、腫瘍増殖を減速させ、腫瘍体積の有意な減少があった（α－ＣＴＬＡ－４単独に比べてｐ＝０．０２２４；ＰＢＳに比べてｐ＝０．０３８６）。ＰＤ１ベースワクチンのα－ＣＴＬＡ－４治療との併用療法はまた、マウスの６／１０での腫瘍根絶に到達し、一方、ｓＴＷＩＳＴ１およびα－ＣＴＬＡ－４併用療法は、動物生存に対する有意な強化を示すことができず、終了点で１／７のみの無腫瘍生存であった（図４Ｂ～Ｃ）。この結果は、効果的抗腫瘍応答の誘発におけるｓＰＤ１－ＴＷＩＳＴ１ワクチン接種の重要な役割を実証した。次に、我々は、これらのマウスでのＴＷＩＳＴ１特異的Ｔ細胞応答を測定し、ｓＰＤ１－ＴＷＩＳＴ１ワクチン接種およびα－ＣＴＬＡ－４併用療法由来の脾細胞が、より多くのＴＷＩＳＴ１特異的Ｔ細胞を誘発し、一方、ｓＴＷＩＳＴ１ワクチン接種およびα－ＣＴＬＡ－４併用療法も、単剤療法も、そのようにできないことを見出した（図４Ｄ）。特に、腫瘍根絶を有するマウスは、担腫瘍マウスより強力なＩＦＮγ Ｔ細胞応答を誘発し、既発症ＡＢ１中皮腫の除去におけるワクチン誘発Ｔ細胞応答の関与を示している。別のモデルでは、以前の調査は、４Ｔ１乳癌転移におけるＴＷＩＳＴ１および乳癌免疫療法のためのＴＷＩＳＴ１ワクチン接種の役割を主に実証した（２６、２７）。我々は、ｓＰＤ１－ＴＷＩＳＴ１およびα－ＣＴＬＡ－４の併用療法が腫瘍増殖および原発性４Ｔ１乳房腫瘍のサイズを低減し、４Ｔ１肺転移に対してより強力な抗腫瘍効果を有し（図４Ｅ～Ｆ）、これには、顕著に増大したインビボＩＦＮγ＋ＴＮＦα＋ＣＤ８＋Ｔ細胞が付随した（図４Ｇ）ことを見出した。まとめるとこれらの結果は、チェックポイント調節物質α－ＣＴＬＡ－４が、ｓＰＤ１－ＴＷＩＳＴ１ワクチン接種により誘発された抗腫瘍活性を有意に高め、既発症ＡＢ１中皮腫の退縮ならびに乳腺癌および転移性４Ｔ１乳癌の増殖抑制を誘導することを示した。
【0022】
併用療法は、免疫優性ＴＷＩＳＴ１ペプチドに対する永続性のＴ細胞免疫応答を誘導した。我々は次に、併用ｓＰＤ１－ＴＷＩＳＴ１およびα－ＣＴＬＡ－４により誘導された抗腫瘍応答の持続力を調査することを試みた。ｓＰＤ１－ＴＷＩＳＴ１およびα－ＣＴＬＡ－４の併用療法を受けた後にＡＢ１中皮腫を除去した別のマウス群で、追加のより高い投与量の１×１０６個のＡＢ１－Ｌｕｃ細胞をそれらの反対側の側腹部の皮下に初期完全腫瘍拒絶の９０日を越える日数後に再チャレンジした。ＡＢ１－Ｌｕｃ中皮腫の完全拒絶は、これらのマウスで２１日後に観察されたが、一方、全ての無感作マウスは、ＡＢ１－Ｌｕｃチャレンジで死亡し（図５Ａ～Ｂ）、長期記憶応答の誘導を示唆する。中皮腫除去に関与したＴ細胞の型を詳しく検討するために、初期の完全腫瘍拒絶後のｓＰＤ１－ＴＷＩＳＴ１ワクチン接種マウス由来の精製した脾臓Ｔ細胞を用いて、インビトロ細胞傷害性アッセイを実施した。上記のＩＦＮγ応答と一致して、併用ｓＰＤ１－ＴＷＩＳＴ１およびα－ＣＴＬＡ－４を受けたマウス由来のＣＤ３＋Ｔ細胞は、ｓＴＷＩＳＴ１併用療法（図５Ｃ）または単剤療法（図９Ａ）に比べて、高められたインビトロ細胞傷害活性を示した。より重要なことに、標的細胞の死滅は、ＣＤ８＋Ｔ細胞により実施されたが、ＣＤ４＋Ｔ細胞によっては実施されなかったことである（図５Ｃ）。加えて、これらの細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞の養子移入は、ＡＢ１－Ｌｕｃ腫瘍を有するＳＣＩＤマウスの腫瘍増殖の減速および長期生存をもたらし（図５Ｄ）、効果的抗中皮腫ＣＴＬの誘導における併用療法の重要な役割を示す。次に我々は、併用ｓＰＤ１－ＴＷＩＳＴ１およびα－ＣＴＬＡ－４により誘導されたＴ細胞により認識されるＴＷＩＳＴ１アミノ酸配列を特徴付けた。エクスビボ単離脾細胞を最初に、全体ＴＷＩＳＴ１タンパク質をカバーする３つの１５マーを含むミニプールを用いたエリスポットアッセイでスクリーニングした。および特異的反応性は、ミニプール３７～３９（ＤＫＬＳＫＩＱＴＬＫＬＡＡＲＹＩＤＦＬＹＱＶＬ）に対して主に見出された（図５Ｅおよび図９Ｂ）。対照的に、ミニプール４０～４２（ＡＲＹＩＤＦＬＹＱＶＬＱＳＤＥＬＤＳＫＭＡＳＣ）（これは、以前に報告したエピトープＬＹＱＶＬＱＳＤＥＬを含む）に対しては、応答は認められなかった（２６、３２）。次に、我々は、２つのミニプール中の個別の単一１５マーを試験し、ペプチド３７および３８は、ペプチド３９よりも強力な活性を示すことが明らかになり、ペプチド３７～３８（ＤＫＬＳＫＩＱＴＬＫＬＡＡＲＹＩＤＦＬ）はＢＡＬＢ／ｃマウス中の免疫優性エピトープを含むことを示唆する（図５Ｆおよび図９Ｂ）。特に、この配列は、異なるホスト種間で高度に保存されている。従って、これらのデータは、併用療法が、ＴＷＩＳＴ１タンパク質内の免疫優性短鎖エピトープに対するワクチン特異的および永続性抗腫瘍ＣＤ８＋ＣＴＬ応答を誘発したことを示す。
【0023】
考察
悪性中皮腫の治療のための新規および潜在的治療標的の解明は、この高悪性度腫瘍型に対する効果的治療の非存在下で、差し迫った必要性のまま残されている。以前の研究は、マウスモデルにおける乳癌および前立腺癌を制御するための抗原特異的Ｔ細胞応答を誘発する免疫療法の手法として、ＴＷＩＳＴ１を送達するための酵母およびポックスウイルスベクターの使用について記載した（２６、２７、３３）。比較すると、本研究は、我々の知る限りでは、免疫コンピテント中皮腫癌モデルでのＤＮＡワクチンによるＴＷＩＳＴ１特異的Ｔ細胞の誘導を最初に示すものである。我々の結果は、ｓＰＤ１－ＴＷＩＳＴ１ワクチン接種が、ＴＷＩＳＴ１特異的Ｔ細胞応答に依存する皮下および転移性中皮腫チャレンジの両方での腫瘍抑制を提供するために、中皮腫免疫療法のための治療的介入としての潜在力を有することを示す。重要なのは、我々は、ＣＴＬＡ－４免疫チェックポイント阻害と組み合わせたｓＰＤ１－ＴＷＩＳＴ１ワクチン接種が、免疫抑制ＴＭＥ中で、ＴＷＩＳＴ１特異的Ｔ細胞をさらに活性化および強化して、より良好な細胞傷害活性および長く続く記憶を付与し、マウス中の既発症ＡＢ１中皮腫および４Ｔ１乳癌に対して、永続性の腫瘍退縮および延命効果に繋がることを示すことである。最終的に、我々は、効果的Ｔ細胞は、マウスおよびヒトＴＷＩＳＴ１配列間で高度に保存された、高度に免疫優性短鎖ペプチドを認識し、それにより、ヒトＰＤ１－ＴＷＩＳＴ１ワクチンをさらに最適化し、その有効性を最大化し、潜在的副作用を最小化するための論理的根拠を提供することを明らかにした。
悪性中皮腫の治療のための新規および潜在的治療標的の解明は、この高悪性度腫瘍型に対する効果的治療の非存在下で、差し迫った必要性のまま残されている。以前の研究は、マウスモデルにおける乳癌および前立腺癌を制御するための抗原特異的Ｔ細胞応答を誘発する免疫療法の手法として、ＴＷＩＳＴ１を送達するための酵母およびポックスウイルスベクターの使用について記載した（２６、２７、３３）。比較すると、本研究は、我々の知る限りでは、免疫コンピテント中皮腫癌モデルでのＤＮＡワクチンによるＴＷＩＳＴ１特異的Ｔ細胞の誘導を最初に示すものである。我々の結果は、ｓＰＤ１－ＴＷＩＳＴ１ワクチン接種が、ＴＷＩＳＴ１特異的Ｔ細胞応答に依存する皮下および転移性中皮腫チャレンジの両方での腫瘍抑制を提供するために、中皮腫免疫療法のための治療的介入としての潜在力を有することを示す。重要なのは、我々は、ＣＴＬＡ－４免疫チェックポイント阻害と組み合わせたｓＰＤ１－ＴＷＩＳＴ１ワクチン接種が、免疫抑制ＴＭＥ中で、ＴＷＩＳＴ１特異的Ｔ細胞をさらに活性化および強化して、より良好な細胞傷害活性および長く続く記憶を付与し、マウス中の既発症ＡＢ１中皮腫および４Ｔ１乳癌に対して、永続性の腫瘍退縮および延命効果に繋がることを示すことである。最終的に、我々は、効果的Ｔ細胞は、マウスおよびヒトＴＷＩＳＴ１配列間で高度に保存された、高度に免疫優性短鎖ペプチドを認識し、それにより、ヒトＰＤ１－ＴＷＩＳＴ１ワクチンをさらに最適化し、その有効性を最大化し、潜在的副作用を最小化するための論理的根拠を提供することを明らかにした。
【0024】
我々の研究は、ＴＷＩＳＴ１が中皮腫浸潤および転移に必要であることを示す。多数の腫瘍モデルでは、癌細胞は、増殖を維持するために、またはＥＭＴ誘導を介して転移拡散を促進するために、ＴＷＩＳＴ１に依存したままであることが示された（２０、２１、２３）。しかし、以前の２つの論文、１つは要約形式、のみが、発現上昇したＴＷＩＳＴ１発現と中皮腫の予後不良との間に関連性がある可能性を報告した（２４、２５）。中皮腫での高ＴＷＩＳＴ１発現の役割は、まだ探求されていないままである。ここで、我々は、ＴＷＩＳＴ１発現と中皮腫患者の臨床ステージとの間の関連を報告する。ノックアウトおよび過剰発現手法により、我々は、ＴＷＩＳＴ１がＥＭＴ関連分子の発現を促進し、中皮腫細胞インビトロ浸潤およびインビボ転移を増大する方向に調節することをさらに示す。ＴＷＩＳＴ１による浸潤の促進は、２種の異なる浸潤アッセイで検出された。ＴＷＩＳＴ１インビボ発現により媒介される転移能を調査するために、我々は、ＡＢ１細胞の静脈内注射により実験的転移モデルを確立した。これは、肺転移および動物の急速死亡を生じた。我々は、ＴＷＩＳＴ１のサイレンシングは、ＡＢ１中皮腫の転移能力をほぼ消滅させ、一方、その過剰発現は、転移をさらに顕著に強化しないことを明らかにし、これは、浸潤および血管内異物侵入が達成されると、極端に高いＴＷＩＳＴ１発現の維持は、中皮腫に必要でない可能性があることを意味する（２２、２３）。興味深いことに、より少ない程度ではあるが、ＴＷＩＳＴ１は、クローン原性潜在力およびＡＢ１中皮腫の皮下腫瘍増殖を促進する。これと一致して、以前の研究はまた、ＴＷＩＳＴ１は、ｐ５３腫瘍抑制因子経路を妨害し、種々の悪性細胞に対し、生存優位性を提供することを明らかにした（２０、２１）。全体として、ＴＷＩＳＴ１の阻害は、中皮腫成長および転移を阻止する。従って、我々は、ＴＷＩＳＴ１が中皮腫ワクチンのための潜在的抗原として機能し得ることを支持する。
【0025】
ｓＰＤ１－ＴＷＩＳＴ１ワクチンは、Ｔ細胞応答の誘発に対する免疫原性を有する。癌細胞により異常に発現される自己タンパク質である標的化ＴＡＡは、腫瘍ワクチンの共通の戦略である。しかし、この手法は、高親和性Ｔ細胞の胸腺欠失の問題に直面し、弱められた低結合力レパートリーを残す。それにもかかわらず、分化抗原（例えば、チロシナーゼ関連タンパク質２、ＴＲＰ２）または癌精巣抗原（例えば、前立腺酸ホスファターゼ、ＰＡＰ）の治療的ワクチン接種は、胸腺免疫寛容をバイパスし、腫瘍退縮を誘導することが示された（１４、３４～３６）。ＴＷＩＳＴ１は、マウス精巣またはヒト胎盤中で主に発現され、それを、治療ワクチンのための可能な癌抗原候補にする（２６、３７）。実際に、酵母またはポックスウイルスベクターにより送達される２つのＴＷＩＳＴ１ベースワクチンは、何らの明確な毒作用なしに、ＴＷＩＳＴ１特異的ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞免疫応答を誘発する能力を実証した（２６、２７、３３）。しかし、両ワクチン接種戦略は、限定的なＴ細胞活性化および治療効力を示し、ワクチン免疫原性を改良する必要性を示唆した。ここで、我々は、ＴＷＩＳＴ１特異的Ｔ細胞応答を高め、最も効果的な腫瘍除去を達成するための２つの手法を採用した。１つは、ｓＰＤ１ベースワクチン接種を採用することであり、もう１つは、このワクチンと免疫チェックポイント阻害薬を組み合わせることである。
【0026】
本発明の試験は、ＴＷＩＳＴ１に対する免疫寛容のＤＮＡワクチンによる破壊は、ＴＷＩＳＴ１抗原のｓＰＤ１への融合を必要とすることを示す。ｓＰＤ１ベースワクチン接種は、抗原結合を高め、ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ相互作用を介して、ＤＣによる取り込みを高めることにより、ＨＩＶ－１ ｐ２４特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を増強することが、以前に報告された（２８）。加えて、単剤療法としてのｓＰＤ１－ｐ２４ワクチン接種は、効力の高いエフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞を誘発し、ｐ２４異種抗原を発現している悪性中皮腫を防止および治癒した（１１）。このような戦略のＴＷＩＳＴ１への適用は、ＴＷＩＳＴ１特異的ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞の誘導に成功し、これは、従来のｓＴＷＩＳＴ１ワクチン接種によっては達成されなかった。ワクチンコード化ｓＰＤ１－ＴＷＩＳＴ１は、ＰＤ－Ｌ１／Ｌ２への結合のために細胞外に分泌する能力を保持するが、ワクチン投与のためのＥＰの使用は、局在化した炎症をインビボで誘導し、ＤＣ動員を促進し（２８）、これはまた、検出されるワクチン免疫原性の強化に寄与する可能性がある。ワクチン誘発Ｔ細胞は、ＴＷＩＳＴ１発現の認識を介して、ＡＢ１中皮腫に対して反応性であり、移植皮下ＡＢ１腫瘍の拒絶および肺転移の低減に繋がる。特に、増大したワクチン誘発ＩＦＮγおよびＴＮＦα産生ＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＭＤＳＣおよびＦｏｘｐ３＋ＣＤ４＋Ｔｒｅｇなどの免疫抑制ネットワークの抑制に付随する。これらの属性の全ては、抗ＴＷＩＳＴ１免疫応答の生成に寄与し、我々がｓＰＤ１－ＴＷＩＳＴ１ワクチン接種で観察した改善された予防効果に寄与し得る。
【0027】
併用ｓＰＤ１－ＴＷＩＳＴ１およびα－ＣＴＬＡ－４抗体治療は、相乗的に作用し、ＴＷＩＳＴ１特異的Ｔ細胞応答および免疫療法の有効性を高める。現在まで、ワクチン接種を介した抗腫瘍Ｔ細胞の誘導は、おそらく、誘導免疫応答が望ましい臨床転帰を生成するためには十分に強力または広範でない、またはＴＭＥ中で、エフェクターＴ細胞による免疫チェックポイント分子の取得がそれらを次第に疲弊させ、エフェクター機能を発揮できなくするために、より少ない臨床的成果に遭遇してきた（１３、３８、３９）。加えて、単剤療法としてのＣＴＬＡ－４およびＰＤ１阻害は、限られた数の患者でのみ機能し、それらの臨床的有用性は、既存の腫瘍特異的Ｔ細胞応答の存在下で最も効果的である（４０）。従って、最近の研究は、これらの新規治療戦略の全体有効性を高めるために組み合わせ戦略を探索してきた。癌ワクチンと免疫チェックポイント調節の組み合わせは、前臨床モデルおよび癌患者の両方で有望な結果を示した（３１、４１～４３）。従って、ＰＤ１阻害は、抗原送達のためにＰＤ－Ｌ相互作用を伴うｓＰＤ１－ＴＷＩＳＴ１タンパク質の標的化を破壊する可能性があるので（２８）、我々は、代わりα－ＣＴＬＡ－４抗体と組み合わせる場合には、ｓＰＤ１－ＴＷＩＳＴ１ワクチン接種誘導抗腫瘍Ｔ細胞応答が最適化できると仮定した。我々は、α－ＣＴＬＡ－４抗体も、ｓＰＤ１－ＴＷＩＳＴ１ワクチン接種も、単剤療法としては、中皮腫退縮を誘導できないことを見出した。しかし、それらの併用免疫療法は、中皮腫の除去のために、効果的で、永続性のＣＤ８＋ＣＴＬを誘導した。我々は、この二重治療は、複数の作用機序を介して機能すると考えている。一方では、非標的化ワクチンは、併用免疫療法設定であっても、Ｔ細胞応答の誘導に失敗するので、ｓＰＤ１ベースＤＣ標的化が不可欠であり、従って、Ｔ細胞免疫刺激におけるｓＰＤ１ベースワクチン接種戦略のユニークな利点を明確に示す。他方では、α－ＣＴＬＡ－４抗体は、Ｔ細胞刺激に対する免疫抑制を戻すために不可欠であり、これは、ｓＰＤ１－ＴＷＩＳＴ１ワクチン接種単剤療法では、ほとんど無効にされる。それにもかかわらず、ＣＤ８＋ＣＴＬの活性化は、ＡＢ１中皮腫および４Ｔ１乳癌モデルの両方で観察される併用免疫療法の成功に重要であるが、それらが抗腫瘍活性を媒介する詳細機序は、まだ解明される必要がある。全体として、我々の結果は、悪性中皮腫に対する単剤療法としてのワクチン接種またはＣＴＬＡ－４阻害の主な使用制限を明らかにする。より重要なことは、我々は、抗腫瘍免疫療法の有効性を促進するための、併用ｓＰＤ１ベースワクチン接種およびα－ＣＴＬＡ－４抗体免疫療法の優位性を示すことである。
【0028】
ｓＰＤ１－ＴＷＩＳＴ１ワクチン接種およびα－ＣＴＬＡ－４併用療法により誘発された効果的Ｔ細胞は、ＴＷＩＳＴ１抗原内の高度に免疫優性短鎖ペプチドを認識する。これは、この研究の前には報告されていない。以前に、ＴＷＩＳＴ１エピトープＬＹＱＶＬＱＳＤＥＬが、４Ｔ１乳癌に対してマウスＣＴＬを特異的に活性化するために特定された。これは、要約形式として発表された（４４）。このエピトープは、Ｔ細胞の長期刺激後に、エクスビボ培養上清中のＩＦＮγ産生を評価することにより、ＴＷＩＳＴ１特異的Ｔ細胞応答を検出するための次の研究で使用され、Ｔ細胞応答のその弱い誘導因子を示唆するのであろう（２６、３２、３３）。対照的に、我々の結果は、ＬＹＱＶＬＱＳＤＥＬ以外のミニプール３７～３９の短鎖ペプチドに対するＴ細胞応答がＡＢ１中皮腫の治癒マウス中に主に存在することを示す。観察された特異性は、ＰＤ１ベースワクチン接種手法および腫瘍型に依存する可能性がある。それにもかかわらず、我々の知見は、ＰＤ１ベースＴＷＩＳＴ１ワクチン設計のさらなる最適化のための論理的根拠を提供する。
【0029】
まとめると、ＴＷＩＳＴ１をコードするｓＰＤ１ベースＤＮＡワクチンを用いた免疫化は、ＴＷＩＳＴ１特異的Ｔ細胞応答を誘導し、転移を抑制し、中皮腫成長を制御する。ｓＰＤ１－ＴＷＩＳＴ１ワクチン接種とＣＴＬＡ－４免疫チェックポイント調節との合理的な組み合わせは、ＴＷＩＳＴ１特異的Ｔ細胞媒介腫瘍拒絶を促進する。種々の固形腫瘍型にわたる広範囲の発現があるので、この前臨床試験は、将来のヒトＴＷＩＳＴ１抗原を標的とする臨床試験のための基盤として役立つであろう。
【0030】
実施例
方法
マウス。全てのマウスは、ＨＫＵ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｕｎｉｔ（ＬＡＵ）の標準操作手順に従って維持し、全ての手順は、ＨＫＵの教育および研究における生動物の使用に関する委員会（ＣＵＬＡＴＲ）により承認された（認可番号＃４２４９－１７）。６～８週齢雌ＢＡＬＢ／ｃおよびＳＣＩＤマウスを使用した。
方法
マウス。全てのマウスは、ＨＫＵ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｕｎｉｔ（ＬＡＵ）の標準操作手順に従って維持し、全ての手順は、ＨＫＵの教育および研究における生動物の使用に関する委員会（ＣＵＬＡＴＲ）により承認された（認可番号＃４２４９－１７）。６～８週齢雌ＢＡＬＢ／ｃおよびＳＣＩＤマウスを使用した。
【0031】
細胞株および培養条件ＡＢ１細胞株（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓから購入）および４Ｔ１細胞株（Ｐｒｏｆ．Ｊｉａｎ－Ｄｏｎｇ Ｈｕａｎｇ（Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＨＫＵ）から譲り受けた）を、完全Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ－１６４０培地（ＲＰＭＩ、Ｇｉｂｃｏ；１０％ＦＢＳ、２ｍＭのＬ－グルタミンおよび抗生物質を補充）中で維持した。ＴＷＩＳＴ１ ＫＯ腫瘍細胞を生成するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ＴＷＩＳＴ１（ＴＷＩＳＴ１ ｓｇＲＮＡ、５’－ＴＴＧＣＴＣＡＧＧＣＴＧＴＣＧＴＣＧＧＣ－３’）標的化Ｃａｓ９－シングルガイドＲＮＡ含有レンチウイルス発現ベクターｐＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲを、ｐＣＭＶ－ＶＳＶ－ＧおよびｐｓＰＡＸ２プラスミド（Ｄｒ．Ｋｉｎ－Ｈａｎｇ Ｋｏｋ（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ＨＫＵ）から譲り受けた）と共に遺伝子導入した。ＴＷＩＳＴ１過剰発現腫瘍細胞を生成するために、ＴＷＩＳＴ１遺伝子をｐＣＤＨベクター（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に挿入し、ｐＰＡＣＫＨ１レンチウイルスパッケージングシステム（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と一緒に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の遺伝子導入に使用した。これらの遺伝子導入の上清由来のウィルスをＡＢ１細胞の形質導入とそれに続くピューロマイシン選択に使用した。ＴＷＩＳＴ１過剰発現、ＫＯおよびルシフェラーゼ発現細胞株（ＡＢ１－Ｌｕｃ）を、１μｇ／ｍｌのピューロマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充した完全ＲＰＭＩ中で維持した。Ｔ細胞および脾細胞を、５０μＭの２－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）を補充した完全ＲＰＭＩ中で培養した。
【0032】
抗体。次の抗体をウェスタンブロッティングに使用した：抗ＴＷＩＳＴ１（クローンＴｗｉｓｔ２Ｃ１ａ、Ａｂｃａｍ）、抗β－アクチン（クローンＡＣ－１５、Ａｂｃａｍ）および抗ＧＡＰＤＨ（クローンＥＰＲ１６８９１、Ａｂｃａｍ）。次の抗体をｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入し、フローサイトメトリーに使用した：抗ＣＤ１１ｂ（クローンＭ１／７０）、抗Ｌｙ６Ｃ（クローンＨＫ１．４）、抗Ｌｙ６Ｇ（クローン１Ａ８－Ｌｙ６ｇ）、抗ＣＤ３（クローン１７Ａ２）、抗ＣＤ４（クローンＧＫ１．５）、抗ＣＤ８（クローン５３－６．７）、抗ＰＤ１（クローンＪ４３）。次の抗体をＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入し、フローサイトメトリーに使用した：抗ＣＤ２５（クローン３Ｃ７）、抗Ｆｏｘｐ３（クローン１５０Ｄ）、抗ＣＤ４９ｂ（ＨＭα２）、抗ＰＤ－Ｌ１（クローン１０Ｆ．９Ｇ２）、抗ＰＤ－Ｌ２（クローンＴＹ２５）、抗ＩＦＮγ（クローンＸＭＧ１．２）、抗ＴＮＦ－α（クローンＭＰ６－ＸＴ２２）、抗ＩＬ－２（クローンＪＥＳ６－５Ｈ４）。細胞表面および細胞内免疫染色法を以前記載したように（１１）実施した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ、ｖ１０）を用いてフローサイトメトリーデータ分析を実施した。インビボ試験で使用した抗ＣＴＬＡ４抗体は、ＢｉｏＸｃｅｌｌから購入した（クローン９Ｄ９）。
【0033】
腫瘍モデル。腫瘍細胞を回収し、１００μｌのＰＢＳ中の５×１０５個の細胞の単細胞懸濁液をＢＡＬＢ／ｃマウスの右後部側腹中に（ＡＢ１モデルの場合）または第２の乳腺中に（４Ｔ１モデルの場合）皮下注射した。腫瘍体積をノギスで測定した（腫瘍体積＝１／２（長さ×幅２））。ルシフェラーゼ発現腫瘍をＩＶＩＳスペクトル（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で測定し、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ ｓｏｆｔｗａｒｅ（バージョン４．０、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて、以前記載したように（１１、４５）、対象領域（ＲＯＩ）内の光子／ｓ／ｃｍ２／ｓｒとして提示したＡＢ１実験の転移モデルでは、１×１０６個のＡＢ１細胞をＢＡＬＢ／ｃマウスの尾静脈に注射し、非侵襲的生物発光画像化およびＨ＆Ｅ染色により、終了点での肺中のＡＢ１細胞のコロニー形成を測定した。原発腫瘍アブレーションの６０日後に、動物の反対側の側腹部にＡＢ１－Ｌｕｃの再チャレンジを実施した。４Ｔ１自然発生的転移モデルでは、終了点での標準的クローン原性アッセイにより４Ｔ１腫瘍細胞の肺中への転移が試験される（４６）。検体を亜鉛ホルマリン固定液（ｓｉｇｍａ）で固定した後、次のＨ＆Ｅ染色のために、パラフィンブロックに埋め込んだ。転移領域は、ＩｍａｇｅＪにより測定される転移腫瘍により占められる肺領域のパーセンテージとして定義された。
【0034】
定量的逆転写酵素－ＰＣＲ。総細胞ＲＮＡをＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）で抽出し、ｃＤＮＡをＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により生成した。その後、次のプライマーをＰｒｉｍｅＳｔａｒ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）と共に用いてＰＣＲを実施した：Ｔｗｉｓｔ１、５’－ＡＧＣＴＡＣＧＣＣＴＴＣＴＣＣＧＴＣＴＧ－３’、５’－ＣＴＣＣＴＴＣＴＣＴＧＧＡＡＡＣＡＡＴＧＡＣＡ－３’；ビメンチン、５’－ＴＧＡＣＣＴＣＴＣＴＧＡＧＧＣＴＧＣＣＡＡＣＣ－３’、５’－ＴＴＣＣＡＴＣＴＣＡＣＧＣＡＴＣＴＧＧＣＧＣＴＣ－３’；Ｎ－カドヘリン、５’－ＡＡＡＧＡＧＣＧＣＣＡＡＧＣＣＡＡＧＣＡＧＣ－３’、５’－ＴＧＣＧＧＡＴＣＧＧＡＣＴＧＧＧＴＡＣＴＧＴＧ－３’；Ｅ－カドヘリン、５’－ＡＣＡＣＣＧＡＴＧＧＴＧＡＧＧＧＴＡＣＡＣＡＧＧ－３’、５’－ＧＣＣＧＣＣＡＣＡＣＡＣＡＧＣＡＴＡＧＴＣＴＣ－３’；Ｆｓｐ１、５’－ＣＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡＴＴＧＣＣＡＴＧＡＴ－３’、５’－ＣＣＣＡＣＴＧＧＣＡＡＡＣＴＡＣＡＣＣＣ－３’；Ｚｅｂ１、５’－ＧＡＴＴＣＣＣＣＡＡＧＴＧＧＣＡＴＡＴＡＣＡ－３’、５’－ＴＧＧＡＧＡＣＴＣＣＴＴＣＴＧＡＧＣＴＡＧＴＧ－３’；オクルディン、５’－ＴＧＣＴＡＡＧＧＣＡＧＴＴＴＴＧＧＣＴＡＡＧＴＣＴ－３’、５’－ＡＡＡＡＡＣＡＧＴＧＧＴＧＧＧＧＡＡＣＡＴＧ－３’；アクチン、５’－ＧＧＣＡＴＧＧＧＴＣＡＧＡＡＧＧＡＴＴ－３’、５’－ＧＧＧＧＴＧＴＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣＡＡＡ－３’；Ｇａｐｄｈ、５’－ＧＧＴＣＣＴＣＡＧＴＧＴＡＧＣＣＣＡＡＧ－３’、５’－ＡＡＴＧＴＧＴＣＣＧＴＣＧＴＧＧＡＴＣＴ－３’。
【0035】
インビトロ腫瘍細胞ベースアッセイ。各ウェル当り０．５×１０４個の細胞の密度のＡＢ１細胞を、増殖アッセイのために９６ウェルプレートの完全ＲＰＭＩ培地中に播種し、製造業者の説明書に従い、ＭＴＳ細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を０、２４、４８および７２時間で実施した。各ウェル当り５００個の完全ＲＰＭＩ培地中のＡＢ１細胞の初期細胞密度で、コロニー形成アッセイを６ウェルプレートで実施し、標準プロトコル（４７）に従って、９日後にクリスタルバイオレット（０．５ｗ／ｖ）で染色した。単層創傷治癒アッセイのために、プラスチックチップ（１ｍｍ）により引っ掻き傷を付けた１日後に、１×１０６個の細胞を６ウェルプレート中に播種した。細胞を洗浄してデブリを除去後、細胞を完全ＲＰＭＩ培地中で培養し、創傷治癒を経時的に監視した。細胞浸潤アッセイのために、ＡＢ１細胞を無血清ＲＰＭＩ培地中で一晩飢餓状態にした。３０μｌの解凍マトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、８μｍの細孔径のミクロポアフィルターを備えた各浸潤チャンバー（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）をコートした。次に、チャンバーを３７℃で３０分間インキュベートし、無血清ＲＰＭＩで静かに濯いだ。その間に、トリプシン処理後にＡＢ１細胞を回収し、無血清ＲＰＭＩ培地で１回洗浄した。次に、無血清ＲＰＭＩ中の１×１０６細胞／ｍｌの密度の２５０μｌのＡＢ１細胞を上段チャンバーに加えた。化学誘引物質としての１０％ＦＢＳと共に、５００μｌのＲＰＭＩを下段チャンバーに加えた。３７℃で２４時間のインキュベーション後、フィルター上のマトリゲルを綿棒で除去した。クリスタルバイオレット染色後、膜をＰＢＳで数回洗浄し、その後、画像を取得した。次に、細胞染色を抽出緩衝液で室温下、３０分間溶解し、吸光度をマイクロプレートリーダーにより５６０ｎｍで読み取った。
【0036】
エクスビボ細胞調製。以前記載したように（１１、４５）、脾細胞を単離した。腫瘍を小片に切断し、１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＩＶ（Ｓｉｇｍａ）および０．５Ｕ／ｍｌのＤＮアーゼＩ（Ｒｏｃｈｅ）で３７℃下、１．５～２．０時間消化した。細胞を７０μｍストレーナーを通した後、４０％／８０％パーコール勾配（Ｓｉｇｍａ）に供した。×８００ｇで２０分の遠心分離後、界面層の白血球を回収した。ＣＤ３＋、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含むＴ細胞をＵｎｔｏｕｃｈｅｄ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）により単離した。
【0037】
エリスポット、サイトカイン産生アッセイおよびＴ細胞細胞傷害性アッセイ。単離脾細胞中のＩＦＮγ産生Ｔ細胞をエリスポットアッセイにより評価した（１１、４５）。１１アミノ酸による１５マーオーバーラッピングとして生成された４９ペプチドのマウスＴＷＩＳＴ１ペプチドライブラリーをＧＬ Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）により合成した。共培養上清中のサイトカイン濃度をＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘ Ｔ Ｈｅｌｐｅｒ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｐａｎｅｌ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）により測定した。精製Ｔ細胞のＡＢ１細胞に対する細胞毒性効果をＮｏｎＲａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、製造業者の説明書に従って測定した。
【0038】
統計分析。全データは平均値±ｓ．ｅ．ｍ．で表される。試験概要、標本数、および統計解析に関する情報は、本文、図、および図の説明に示される。平均差異の有意性は、ノンパラメトリックマン・ホイットニーＵ検定またはウィルコクソンマッチドペア検定（ｍａｔｃｈｅｄ－ｐａｉｒｓ ｔｅｓｔｓ）を対応のないおよび対応のある分析のそれぞれに対して用いてデータセットを比較して決定した。２元配置分散分析を用いて、マウス腫瘍体積データを異なる群間で比較した。生存データをカプランマイヤー生存曲線としてプロットし、ｌｏｇ－ｒａｎｋ（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）検定を実施し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ７ソフトウェア中の差異を分析した。全ての統計解析では、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１である。
【0039】
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47. Franken NA, Rodermond HM, Stap J, Haveman J, van Bree C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nat Protoc. 2006;1(5):2315-9.
【0040】
前述の特定の実施形態の記載は、当該技術（引用されたおよび本明細書に参照により組み込まれた文書の内容を含む）の技能の範囲内の知識を適用することにより、他者が、過度の実験をすることなく、また本開示の一般的概念から逸脱することなく、様々な用途に向けてこのような特定の実施形態を容易に修正および／または適応させることができるという本開示の一般的性質を完全に明らかにしている。従って、このような適応および修正は、本明細書で提示された教示および手引きに基づいて、開示された実施形態の等価物の意味および範囲に入ることが意図されている。本明細書の用語または表現が、当業者の知識と組み合わせて、本明細書で提供される教示および手引きを考慮して当業者により解釈され得るように、本明細書の表現または用語は、説明を目的とし、限定を目的とするものではないことを理解されたい。
【0041】
本開示の種々の実施形態を上記で記載してきたが、それらは例示の目的のみで提示され、限定するものではないことを理解されたい。形式および詳細における種々の変更を、本開示の趣旨および範囲から逸脱することなしに本明細書でなし得ることが当業者には明らかであろう。従って、本開示は、上述した例示的実施形態のいずれかにより限定されるべきではなく、次の特許請求の範囲およびそれらの等価物によってのみ定められるべきものである。
【0042】
本明細書で引用される全ての参考文献は、それぞれ個別の刊行物または特許または特許出願が具体的に、個別にその全体が参照により組み込まれることが示された場合と同程度にそれらの全体が本出願において参照により本明細書に組み込まれる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【国際調査報告】