特表 2023-520316 最適化された干渉散乱顕微鏡法のための方法および装置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-05-17

(54)【発明の名称】最適化された干渉散乱顕微鏡法のための方法および装置

(51)【国際特許分類】

   G02B 21/06 20060101AFI20230510BHJP

   G02B 21/36 20060101ALI20230510BHJP

【ＦＩ】

G02B21/06

G02B21/36

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022556540

(86)(22)【出願日】2021-03-15

(85)【翻訳文提出日】2022-11-11

(86)【国際出願番号】 GB2021050639

(87)【国際公開番号】W WO2021186154

(87)【国際公開日】2021-09-23

(31)【優先権主張番号】2003946.7

(32)【優先日】2020-03-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522368754

【氏名又は名称】レフェイン・リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100196508

【弁理士】

【氏名又は名称】松尾 淳一

(74)【代理人】

【識別番号】100210398

【弁理士】

【氏名又は名称】横尾 太郎

(72)【発明者】

【氏名】ケーン，ジョサイア

(72)【発明者】

【氏名】ハントケ，マックス・フェリックス

(72)【発明者】

【氏名】カーニー，ルイス

【テーマコード（参考）】

2H052

【Ｆターム（参考）】

2H052AA04

2H052AA08

2H052AC07

2H052AC34

2H052AD20

2H052AD34

2H052AF14

(57)【要約】

干渉散乱顕微鏡法によってサンプルを画像化する方法であって、少なくとも１つの光源でサンプルを照明するステップであって、サンプルは反射信号が形成されるように、反射面を含むサンプル位置に保持され、反射信号は光源からの光とサンプルによって散乱された光とを含む、ステップと、第１のフレームＮ_１について、第１の時間窓にわたって出力光を検出するステップと、第２のフレームＮ_２について、第２の時間窓にわたって出力光を検出するステップと、Ｎ_１とＮ_２の比から１を引いたレシオメトリ信号Ｒを計算するステップと、フレームＮ_１およびＮ_２からレシオメトリ動きシグネチャＳ＝（Ｓ_ｘ，Ｓ_ｙ）を推定するステップであって、Ｓは、与えられた動きベクトルｍ＝（ｍ_ｘ，ｍ_ｙ）に対してｘおよびｙに沿って動く不変のサンプルから測定されるレシオメトリ画像として定義される、ステップと、ＲがＳとｍを用いて近似されるように最も一貫性のあるベクトルとしてｍを推定するステップと、Ｒ、Ｓ、ｍから補正されたレシオメトリコントラスト画像Ｒ＊を計算するステップと、を含む。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

干渉散乱顕微鏡法によってサンプルを画像化する方法であって、
少なくとも１つの光源でサンプルを照明することであって、前記サンプルは反射信号が形成されるように、反射面を含むサンプル位置に保持され、反射信号は、前記光源からの光と前記サンプルによって散乱された光とを含むことと、
第１のフレームＮ_１について、第１の時間窓にわたって出力光を検出することと、
第２のフレームＮ_２について、第２の時間窓にわたって出力光を検出することと、
Ｎ_１とＮ_２の比から１を引いたレシオメトリ信号Ｒを計算することと、
与えられた動きベクトルｍ＝（ｍ_ｘ，ｍ_ｙ）に対してｘおよびｙに沿って動く不変のサンプルから測定されるレシオメトリ画像であるネイティブカメラフレームＮ_１およびＮ_２から、レシオメトリ動きシグネチャＳ＝（Ｓ_ｘ，Ｓ_ｙ）を推定することと、
ＲがＳとｍを用いて近似されるように最も一貫性のあるベクトルとしてｍを推定することと、
Ｒ、Ｓ、ｍから補正されたレシオメトリコントラスト画像Ｒ＊を計算することと
を含む、方法。

【請求項2】

ピクセル位置（ｘ，ｙ）における水平および垂直レシオメトリ動きシグネチャＳ_ｘおよびＳ_ｙは、ネイティブ画像Ｎから、
Ｓ_ｘ［ｘ，ｙ］＝（Ｎ［ｘ＋１，ｙ］－Ｎ［ｘ－１，ｙ］）／（２Ｎ［ｘ，ｙ］）
Ｓ_ｙ［ｘ，ｙ］＝（Ｎ［ｘ，ｙ＋１］－Ｎ［ｘ，ｙ－１］）／（２Ｎ［ｘ，ｙ］）
として推定される、
請求項１に記載の方法。

【請求項3】

ｍは、Ｒ＝ｍ_ｘＳ_ｘ＋ｍ_ｙＳ_ｙとなるように最も一貫性のあるベクトルとして推定される、
請求項１または請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記補正されたレシオメトリコントラスト画像フレームＲ＊は、
Ｒ＊＝Ｒ－（ｍ_ｘＳ_ｘ＋ｍ_ｙＳ_ｙ）
として計算される、
請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

動きを補償するために前記サンプルを移動させること
をさらに含む、
請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記検出された動きが所定のレベルを超える場合、アラートがトリガされる、
請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

反射信号の少なくとも１つを空間フィルタに通すこと
をさらに含み、
前記空間フィルタは、入射放射の強度の減衰をもたらすように構成され、
強度の前記減衰は、所定の開口数内でより大きい、
請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記光源はコヒーレント光源である、
請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

サンプルをサンプル位置に保持するためのサンプルホルダと、
照明光を供給するように配置された照明光源と、
検出器と、
照明光を前記サンプル位置に向けるように配置され、反射した出力光を集めるように配置された光学系であって、前記出力光は前記サンプル位置からの散乱光と前記サンプル位置からの反射照明光の両方を含み、前記出力光を前記検出器に向けるように配置された光学系と、
前記出力光をフィルタリングするように配置された空間フィルタであって、出力光を通過させるが、より大きな開口数よりも所定の開口数内でより大きい強度を減衰させるように配置された空間フィルタと、
請求項１～８のいずれか一項に記載のステップを実行するように装置に指示するように構成されたコンピュータプログラム手段と、
を含む、
干渉散乱顕微鏡。

【請求項10】

前記推定された動きベクトルｍに応答して前記サンプルを安定化させるアクチュエータ
をさらに含む、
請求項９に記載の干渉散乱顕微鏡。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、最適化された干渉散乱顕微鏡法（本明細書ではＩＳｃａｔと呼ぶ）のための方法および装置に関する。

【背景技術】

【0002】

ＩＳｃａｔは、独自の時空間分解能を持つ単一粒子追跡と、単一分子レベルまでのラベルフリー感度の両方、および、質量光度法および質量イメージングによる単一粒子の質量決定に対する強力なアプローチとして具現化された。

【0003】

ＩＳｃａｔは、例えば、Ｋｕｋｕｒａ等の「単一ウイルスの位置および向きの高速ナノスコピック追跡（Ｈｉｇｈ－ｓｐｅｅｄ ｎａｎｏｓｃｏｐｉｃ ｔｒａｃｋｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｖｉｒｕｓ）」、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００９ ６：９２３－９３５、およびＯｒｔｅｇａ Ａｒｒｏｙｏ等の「干渉散乱顕微鏡法（ＩＳｃａｔ）：超高速および超高感度光学顕微鏡の新展開（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｉｃ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ （ＩＳｃａｔ）：ｎｅｗ ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ ｕｌｔｒａｆａｓｔ ａｎｄ ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｏｐｔｉｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）」、Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｃｓ ２０１２ １４：１５６２５－１５６３６において、開示されている。

【0004】

かなりの可能性があるにもかかわらず、ＩＳｃａｔの広範な適用は、特注の顕微鏡、従来とは異なるカメラおよび複雑なサンプル照明の要件によって制限されており、単一分子と同程度の小さな物体の確実かつ正確な検出、画像化および特性評価に対するＩＳｃａｔの能力が制限されている。

【0005】

本出願人の以前の特許であるＷＯ２０１８／０１１５９１では、参照光フィールドと散乱光フィールドの相対振幅を改善するように構成された新規のコントラスト増強空間マスクを含む干渉散乱顕微鏡を開示した。そこに記載された顕微鏡は、従来のＩＳｃａｔ技術と同様の感度を達成することができるが、従来の顕微鏡が空間マスクの簡単な修正および包含によってＩＳｃａｔを行うように構成され得る程度に、実装の複雑性および費用を劇的に減少させることが可能である。

【0006】

しかしながら、そのアプローチを用いて達成可能な測定感度に対する多くの限界が、本願の発明者らに明らかになった。
ＩＳｃａｔ顕微鏡では、境界に結合した粒子によって生成された信号を検出するために、隣接するフレーム間の比率がよく用いられる。このようにして、ある時点の前後２つの進行するフレームからピクセル強度の相対的な変化を表示するレシオメトリコントラスト画像が計算される。

【0007】

しかし、隣接するフレーム間でサンプルが移動すると、問題が発生し得る。サンプルの動きもピクセル強度の変化と関連しており、これらもレシオメトリ画像で検出され、粒子の検出とデータからの質量決定に問題が生じる。実際、この技術は感度が高いため、１ピクセルより小さい移動距離であっても、粒子からの信号がサンプルキャリアの動きによってかき消されてしまうことがある。ピクセルサイズの１％程度の動きでも、タンパク質１個と同じ振幅を有する信号が得られる。このように、非常に小さな動きでも、非常に誤った信号を出す可能性がある。

【0008】

現在、サブピクセルレベルの動きを補正する方法には、反復画像レジストレーション、フーリエ変換、オプティカルフローなどが含まれる。これらの方法は，レシオメトリ画像に直接適用することはできず、また、ｋＨｚのフレームレートでリアルタイムに十分な精度で実行することはできない。

【0009】

本発明は、サンプルの動きを補正する最適化されたＩＳｃａｔ技術のための方法および装置を提供する。本明細書に開示される方法は、動きを検出し、信号から差し引くことによってこれに対処する。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明の一態様によれば、干渉散乱顕微鏡法によってサンプルを画像化する方法が提供される。
方法は、干渉散乱顕微鏡法によってサンプルを画像化する方法を含み、方法は、少なくとも１つの光源でサンプルを照明するステップであって、サンプルは反射信号が形成されるように、反射面を含むサンプル位置に保持され、反射信号は、光源からの光とサンプルによって散乱された光とを含むステップと、第１のフレームＮ_１について、第１の時間窓にわたって出力光を検出するステップと、第２のフレームＮ_２について、第２の時間窓にわたって出力光を検出するステップと、Ｎ_１とＮ_２の比から１を引いたレシオメトリ信号Ｒを計算するステップと、与えられた動きベクトルｍ＝（ｍ_ｘ，ｍ_ｙ）に対してｘおよびｙに沿って動く不変のサンプルから測定されるレシオメトリ画像であるネイティブカメラフレームＮ_１およびＮ_２からレシオメトリ動きシグネチャＳ＝（Ｓ_ｘ，Ｓ_ｙ）を推定するステップと、ＲがＳとｍを用いて近似されるように最も一貫性のあるベクトルとしてｍを推定するステップと、Ｒ、Ｓ、ｍから補正されたレシオメトリコントラスト画像Ｒ＊を計算するステップと、を含む。

【0011】

従来の画像位置合わせではなく、このようにレシオメトリック信号から動きシグネチャを取り除くことで、ｋＨｚのレートで引き続きリアルタイムに画像処理を行うことができる。

【0012】

ピクセル位置（ｘ，ｙ）における水平および垂直レシオメトリ動きシグネチャＳ_ｘおよびＳ_ｙは、ネイティブ画像Ｎから、
Ｓ_ｘ［ｘ，ｙ］＝（Ｎ［ｘ＋１，ｙ］－Ｎ［ｘ－１，ｙ］）／（２Ｎ［ｘ，ｙ］）
Ｓ_ｙ［ｘ，ｙ］＝（Ｎ［ｘ，ｙ＋１］－Ｎ［ｘ，ｙ－１］）／（２Ｎ［ｘ，ｙ］）
として推定される。

【0013】

ｍは、Ｒ＝ｍ_ｘＳ_ｘ＋ｍ_ｙＳ_ｙとなるように最も一貫性のあるベクトルとして推定される。
補正されたレシオメトリコントラスト画像フレームＲ＊は、Ｒ＊＝Ｒ－（ｍ_ｘＳ_ｘ＋ｍ_ｙＳ_ｙ）として計算される。

【0014】

計算された動きベクトルｍに基づいて、高精度なアクチュエータでサンプルを移動させる、または安定させることにより、移動、ドリフト、または振動を補償することができる。

【0015】

さらに、または代替として、検出された動きが所定のレベルを超える場合、アラートがトリガされ、検出された画像が信頼できない可能性があることをユーザーに警告する。
上記のいずれか一項に記載の方法において、動きを補償するためにサンプルを移動させるステップ、をさらに含む。

【0016】

第１のフレームは、第１の複数のネイティブフレームにわたる平均を含み、第２のフレームは、第２の複数のネイティブフレームにわたる平均を含んでもよい。
方法は、反射信号の少なくとも１つを空間フィルタに通すステップをさらに含んでもよく、空間フィルタは、入射放射の強度の減衰をもたらすように構成され、強度の減衰は、所定の開口数内でより大きい。空間フィルタを使用すると、反射光の大部分を除去することができる。しかし、散乱光は一般的に開口率が高いので、空間フィルタでは除去されない。そのため、この空間フィルタを使用することで、よりコントラストの高い画像を得ることができる。

【0017】

光源はコヒーレント光源であってもよい。
本発明によれば、干渉散乱顕微鏡が提供される。干渉散乱顕微鏡は、サンプルをサンプル位置に保持するためのサンプルホルダと、照明光を供給するように配置された照明光源と、検出器と、照明光をサンプル位置に向けるように配置され、反射した出力光を集めるように配置された光学系であって、出力光はサンプル位置からの散乱光とサンプル位置からの反射照明光の両方を含み、出力光を検出器に向けるように配置された光学系と、出力光をフィルタリングするように配置された空間フィルタであって、出力光を通過させるが、より大きな開口数よりも所定の開口数内でより大きい強度を減衰させるように配置された空間フィルタと、上記のステップを実行するように装置に指示するように構成されたコンピュータプログラム手段と、を含む。

【0018】

上記の干渉散乱顕微鏡は、推定された動きベクトルｍに応答してサンプルを安定化させるアクチュエータをさらに含む。アクチュエータは、電動アクチュエータであってもよい。

【0019】

本発明は、１０^－１５ｍ^２以下の照明光に対する散乱断面積を有する物体を含むサンプルに有利に適用され得る。典型的には、そのような物体は、１０^－２６ｍ^２以上、すなわち１０^－１５ｍ^２から１０^－２６ｍ^２までの範囲内の照明光に関する散乱断面積を有することもできる。研究され得る物体の例としては、タンパク質またはその小さな凝集体、ならびに金属、有機または無機のナノ粒子が挙げられる。

【0020】

非常に弱い散乱体である物体を画像化するために、空間フィルタは、所定の開口数内で強度が入射強度の１０^－２以下に減衰した出力光を通過させるように配置される。典型的には、空間フィルタは、例えば入射強度の１０^－２から１０^－４の範囲において、所定の開口数内で強度を入射強度の１０^－４以上に減衰させた出力光を通過させるように配置されてもよい。

【0021】

以下、より良い理解を得るために、本発明の実施形態は、次に、添付の図面を参照して、非限定的な例として説明される。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1】従来技術のＩＳｃａｔ顕微鏡の概略図である。

【図2】従来技術のＩＳｃａｔ顕微鏡の改良版の概略図である。

【図3】動き補正が適用されていないＩＳｃａｔ顕微鏡からの画像を示す図である。

【図4】本発明による動き補正が適用されたＩＳｃａｔ顕微鏡からの画像を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0023】

本明細書に記載のシステムおよび方法において、使用される光は、紫外線（本明細書において、１０ｎｍ～３８０ｎｍの範囲の波長を有すると定義され得る）、可視光（本明細書において、３８０ｎｍ～７４０ｎｍの範囲の波長を有すると定義され得る）、または赤外線（本明細書において、７４０ｎｍ～３００μｍの範囲の波長を有すると定義され得る）であり得る。光は、波長の混合物であってもよい。本明細書において、「光学の」および「光学」という用語は、方法が適用される光に一般的に言及するために使用される。

【0024】

図１および図２は、本発明の装置および方法と共通する多くの構造的特徴および機能性を有する、ＷＯ２０１８／０１１５９１に開示されたＩＳｃａｔ顕微鏡の構成を示す図である。

【0025】

ＷＯ２０１８／０１１５９１の開示は、参照により本明細書に組み込まれるが、完全を期すために、以下の説明では、ＷＯ２０１８／０１１５９１のものと共通し、図１および図２に示される本発明のＩＳｃａｔ顕微鏡の構成および機能性を示し、次に、本開示によってもたらされる上記構成の種々の改良を述べ、その実施形態例を提供する。

【0026】

したがって、図１を参照すると、顕微鏡１は、サンプル３をサンプル位置に保持するためのサンプルホルダ２を含む。サンプル３は、以下により詳細に説明する撮像対象物を含む液体サンプルであってもよい。サンプルホルダ２は、サンプル３を保持するのに適した任意の形態をとることができる。典型的には、サンプルホルダ２は、サンプルホルダ２とサンプル３との間の界面を形成する表面上にサンプル３を保持する。例えば、サンプルホルダ２は、カバースリップであってもよく、および／またはガラスから作られてもよい。サンプル３は、例えばマイクロピペットを用いて、簡単な方法でサンプルホルダ２上に提供されてもよい。

【0027】

顕微鏡１は、さらに、照明源４と検出器５とを備える。照明源４は、照明光を提供するように配置される。照明光は、コヒーレント光であってもよい。例えば、照明源４は、レーザであってもよい。照明光の波長は、サンプル３の性質および／または検査される性質に依存して選択され得る。一例では、照明光は、４０５ｎｍの波長を有する。

【0028】

任意選択で、照明光は、例えばＫｕｋｕｒａ等の「単一ウイルスの位置および向きの高速ナノスコピック追跡（Ｈｉｇｈ－ｓｐｅｅｄ ｎａｎｏｓｃｏｐｉｃ ｔｒａｃｋｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｖｉｒｕｓ）」、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００９ ６：９２３－９３５に詳述されているように、照明およびレーザノイズのコヒーレントな性質から生じるスペックルパターンを除去するために空間的に変調されてもよい。

【0029】

検出器５は、サンプル位置からの反射で出力光を受光する。検出器に到達する照明光は、サンプルの表面、典型的にはサンプルとサンプルホルダの間の界面から主に反射され、それによってその表面に近いサンプル中の物体との干渉がもたらされる。

【0030】

ガラスと水の界面が使用される例では、比較的少量（典型的にはわずか０．５％）の照明光が反射されるが、界面にあるナノスコピックの物体で散乱した光は、照明光の方向へ戻ってくる量が非常に多い（典型的には９０％を超える）。これにより、散乱光と反射光の比が透過型の幾何学的形状に比べて本質的に１０００倍超向上し、干渉計のコントラストが大きくなる。その結果、特定の散乱体、照明強度、および露光時間が与えられた場合に、同じ公称Ｓ／Ｎを達成するために検出する必要がある光子の数は、透過型セットアップの場合よりも３桁少なくなる。

【0031】

典型的には、顕微鏡１は、広視野モードで動作してもよく、この場合、検出器５は、サンプル３の画像を捕捉する画像センサであってもよい。顕微鏡１は、代替的に共焦点モードで動作してもよく、この場合、検出器５は、イメージセンサであってもよく、またはフォトダイオードのような点状検出器であってもよく、この場合、走査配置が、画像を構築するためにサンプル３の領域を走査するために使用されてもよい。検出器５として採用され得るイメージセンサの例としては、ＣＭＯＳ（相補型金属酸化膜半導体）イメージセンサまたはＣＣＤ（電荷結合素子）などが挙げられる。

【0032】

顕微鏡１は、サンプルホルダ２と照明源４と検出器５との間に配置された光学系１０をさらに備える。光学系１０は、サンプル３を照明するために照明光をサンプル位置に照射し、サンプル位置からの反射で出力光を集め、出力光を検出器５に導くように、以下のように配置されている。

【0033】

光学系１０は、サンプルホルダ２の前方に配置されたレンズ系である対物レンズ１１を含む。また、光学系１０は、集光レンズ１２と、チューブレンズ１３とを含む。集光レンズ１２は、光源１１（図１に連続線で示す）からの照明光を、対物レンズ１１を通してサンプル位置のサンプル３に集光する。

【0034】

対物レンズ１１は、（ａ）サンプル位置からの反射した照明光（図１に連続線で示す）と、（ｂ）サンプル位置のサンプル３からの散乱光（図１に点線で示す）の双方を含む出力光を集光する。反射光は、サンプルホルダ２とサンプル３との界面からの反射が主である。

【0035】

典型的には、これは比較的弱い反射、例えばガラス－水反射である。例えば、反射照明光の強度は、入射した照明光の強度の０．５％程度であり得る。この散乱光は、サンプル３内の物体によって散乱する。サンプルの表面または表面に近い物体からの散乱光は、反射光と建設的に干渉するので、検出器５によって捕捉された画像において視認可能である。

【0036】

図１に示すように、反射照明光と散乱光は、異なる指向性を有する。特に、反射照明光は、光源４および光学系６によって出力された光ビームの幾何学的形状に起因する開口数を有する。散乱光は、大きな範囲の角度で散乱するため、反射照明光よりも大きな開口数を満たす。チューブレンズ１３は、対物レンズ１１からの出力光を検出器５上に集光する。

【0037】

光学系１０は、光源４からの照明光と検出器５に向けられた出力光との光路を分割するように配置されたビームスプリッタ１４も含む。ビームスプリッタ１４は、そこに入射する光の部分反射と部分透過を提供する従来の構造を有し得る。

【0038】

本開示の実施例では、光源４は、光源４からの照明光がビームスプリッタ１４によって対物レンズ１１に反射されるように対物レンズ１１の光路からオフセットされ、逆に検出器５は、サンプル位置からの出力光がビームスプリッタ１４を介して検出器５に向かって透過するように対物レンズ１１の光路に整合される。

【0039】

従来の構造であってよい上述の構成要素に加えて、顕微鏡１は、空間マスクまたはフィルタ２０を含む。図１の例では、空間フィルタ２０は、ビームスプリッタ１４上に形成され、これにより対物レンズ１１のバックアパーチャの後方に、したがって対物レンズ１１のバックフォーカルプレーン１５の直後方に配置されるが、空間フィルタ２０は、以下に述べるような同じ効果を達成するために、ＩＳｃａｔ顕微鏡の光路に沿って他のポイントに配置されてもよい。

【0040】

空間フィルタ２０は、サンプルホルダインターフェースから検出器５へ通過する逆伝播出力光をフィルタリングするように配置される。検出器５が対物レンズ１１の光路と整列している本開示の実施例では、空間フィルタ２０は、したがって、透過性である。

【0041】

空間フィルタ２０は、部分的に透過性であるため、反射した照明光を含む出力光を通過させるが、強度が低下する。また、空間フィルタ２０は、光軸と整合しており、所定の開口を有するので、所定の開口数内で強度の低減を提供する。ここで、開口数は、出力光が由来するサンプル位置に対する角度の範囲を特徴付ける無次元量であるとして、その通常の態様で定義される。

【0042】

具体的には、開口数ＮＡは、以下の式で定義することができる。ＮＡ＝ｎ・ｓｉｎ（θ）、ここでθは収集の半角、ｎは出力光が通過する材料（例えば、光学系１０の構成要素の材料）の屈折率である。

【0043】

空間フィルタ２０は、任意の適切な方法で形成されてもよく、典型的には、堆積材料の層を含む。材料は、例えば、銀のような金属であってもよい。いくつかの実施形態では、空間フィルタは、１つまたは複数の誘電体コーティングを含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、空間フィルタは、所定の角度範囲内で入射放射に対して部分的に反射するように形成されてもよい。蒸着は、任意の適切な技術を用いて行われてもよい。

【0044】

界面付近のサブ回折の大きさの物体は、反射照明光よりも大きな開口数に優先的に光を散乱させるので、空間フィルタ２０によって与えられる強度の低減は、散乱光よりも反射照明光の検出強度を優先的に低減させる。したがって、低開口数における空間フィルタ２０による強度の低減は、反射照明光に主に影響を与え、散乱光には最小限の影響を与えるので、キャプチャ画像におけるコントラストを最大化することができる。撮像コントラストが向上することで、弱い散乱体である物体を高コントラストで検出することが可能となる。

【0045】

コントラストの向上は、以下のように理解することができる。空間フィルタ２０が所定の開口数の出力光の一部を通過させる（すなわち、この例では部分的に透過性である）ので、照明光および散乱光フィールドのフラクションは検出器に到達し、十分にコヒーレントな照明源について干渉する。そして、検出器に到達する光強度Ｉ_ｄｅｔは、次式で与えられる。

【0046】

Ｉ_ｄｅｔ＝│Ｅ_ｉｎｃ│^２｛ｒ^２ｔ^２＋│ｓ│^２＋２ｒｔ│ｓ│ｃｏｓΦ｝
ここで、Ｅ_ｉｎｃは入射光フィールド、ｒ^２は界面の反射率、ｔ^２は空間フィルタ２０の透過率、ｓは物体の散乱振幅、Φは透過した照明光と散乱光との位相差である。

【0047】

空間フィルタ２０によって提供される追加のフィルタリングは、標準的なＩＳｃａｔのようにガラス－水界面の反射率によって固定されるのではなく、空間フィルタ２０の透過率ｔ^２の選択によって、参照フィールドの振幅を直接調整することを可能にする。空間フィルタ２０が堆積材料の層である場合、透過率ｔ^２は、層の材料および／または厚さの選択によって選択され得る。このような調整は、例えば、関心のある散乱体、カメラのフルウェル容量、および倍率に応じて行うことができる。

【0048】

明視野照明は、通常対物レンズに由来する最も強い不要な後方反射が検出器５から遠ざかるようにし、撮像バックグラウンドを最小化し、照明光ビームの複雑な走査なしに広い視野を可能にする。

【0049】

比較的弱い散乱体である物体を撮像するために、空間フィルタ２０は、所定の開口数内で、入射強度（この文脈では、空間フィルタ２０に入射する出力光の強度）の１０^－２から１０^－４の範囲内の強度まで低減した反射照明光を通過させるように配置されてもよい。

【0050】

例えば、５０００ｋＤａ以下の質量を有する物体を含むサンプルを撮像することができる。典型的には、開示された技術は、１０ｋＤａ以上の質量を有する物体、例えば１０ｋＤａ～５０００ｋＤａの範囲内の質量を有する物体、および／または１０^－１２ｍ^２以下、より好ましくは１０^－１７ｍ^２以下の照明光に関する散乱断面積を有する物体を含むサンプルに適用されてもよい。典型的には、そのような物体は、例えば、１０^－１７ｍ^２～１０^－２６ｍ^２の範囲内の、照明光に関する散乱断面積を有することもできる。本開示の技術を適用して画像化することができる物体の例には、タンパク質またはその小さな凝集体、またはそれらの結合パートナーが含まれる。

【0051】

より強い散乱体を同時に画像化するために、第２のフィルタの透過率は、所望の検出範囲に応じて、１～１０^－２の間の任意の範囲に設定され得る。
図２を参照すると、顕微鏡１の第２の例の構成が図示されている。図２の構成は、ＷＯ２０１８／０１１５９１にも開示されており、同様に、本発明の技術の適用により最適化するのに適している。

【0052】

図２の構成は、空間フィルタ２０を、対物レンズ１１の後方開口の後方に位置させるのではなく、対物レンズ１１の後方焦点面の共役焦点面２１に位置させる。対物レンズ１１の後方焦点面１５の共役焦点面２１は、チューブレンズ１３の後方に配置された一対のテレスコープレンズ２２、２３の間に形成される。

【0053】

光源４の後に音響光学デフレクタ３２が配置され、照明光の走査を行う。音響光学デフレクタ３２は、画像を構築するためにサンプル３の領域を走査するように、および／または、上述のように照明およびレーザノイズのコヒーレントな性質から生じるスペックルパターンを除去するために空間変調を提供するように、動作させることができる。

【0054】

集光レンズ１２は、音響光学デフレクタ３２におけるビーム経路のあらゆる修正を結像対物レンズの後方焦点面に結像させる機能を果たす一対のテレセントリックレンズ３０および３１に置き換えられる。

【0055】

光源４と検出器５の位置は、光源４からの照明光がビームスプリッタ１４を通って対物レンズ１１に透過し、逆にサンプル位置からの出力光がビームスプリッタ１４によって検出器５に向かって反射されるように、図１の構成に対して逆になっている。

【0056】

ビームスプリッタ１４は偏光ビームスプリッタであり、ビームスプリッタ１４とサンプル３との間には１／４波長板３３が配置されており、ビームスプリッタ１４が光を分岐するようになっている。また、ビームスプリッタ１４で反射された出射光を偏向させるためにミラー３４が配置されている。

【0057】

レシオメトリフレームＲは、位置（ｘ、ｙ）の各ピクセルについて、レシオメトリ信号がＲ［ｘ，ｙ］＝Ｎ_２［ｘ，ｙ］／Ｎ_１［ｘ，ｙ］－１として計算されるように、２つのネイティブフレームＮ_１およびＮ_２から計算される。

【0058】

しかし、フレームＮ_１とＮ_２の間でサンプルが移動すると、隣接するピクセルからの寄与がある。例えば、サブピクセル移動の場合、位置（ｘ、ｙ）のピクセルは、（ｘ＋１，ｙ）、（ｘ－１，ｙ）、（ｘ，ｙ＋１）、（ｘ，ｙ－１）を含む任意の隣接ピクセルからの寄与があり得る。

【0059】

ｘ方向のみの動きを考慮すると、フレームＮ_１のピクセルＮ_１［ｘ＋１，ｙ］からＮ_２の取得時にピクセルＮ_２［ｘ，ｙ］への動き寄与ｍ_ｘが存在する可能性がある。これは、一次的には、次のように表すことができる。

【0060】

Ｎ_２［ｘ，ｙ］＝ｍ_ｘＮ_１［ｘ＋１，ｙ］＋（１－ｍ_ｘ）Ｎ_１［ｘ，ｙ］
レシオメトリ画像への寄与は、数１式のようになる。

【0061】

【数1】

【0062】

このように、隣接ピクセルの比率が計算できれば、フレーム内の全ピクセルに最も適合するｍ_ｘの値として、動きの寄与を計算することができる。
同様に、ｙ方向の動きについては、フレームＮ_１のピクセルＮ_１［ｘ，ｙ＋１］からＮ_２の取得時にピクセルＮ_２［ｘ，ｙ］への動き寄与ｍ_ｙがあり得る。これは、レシオメトリ画像に数２式の寄与を与えることになる。

【0063】

【数2】

【0064】

２次元で見ると、フレーム間の動きベクトルはｍ＝（ｍ_ｘ，ｍ_ｙ）である。ｍは、ＲとＳから、Ｒ＝ｍ_ｘＳ_ｘ＋ｍ_ｙＳ_ｙとなるような最も一貫性のあるベクトルとして推定される。

【0065】

ピクセルインデックス（ｘ，ｙ）における水平および垂直方向の動きシグネチャＳ_ｘ，Ｓ_ｙは、ネイティブ画像Ｎから、次のように推定することができる。
Ｓ_ｘ［ｘ，ｙ］＝（Ｎ［ｘ－１，ｙ］－Ｎ［ｘ＋１，ｙ］）／（２Ｎ［ｘ，ｙ］）
Ｓ_ｙ［ｘ，ｙ］＝（Ｎ［ｘ，ｙ－１］－Ｎ［ｘ，ｙ＋１］）／（２Ｎ［ｘ，ｙ］）
そして、動き補正されたレシオメトリ画像Ｒ＊は、Ｒ＊＝Ｒ－（ｍ_ｘＳ_ｘ＋ｍ_ｙＳ_ｙ）として計算することができる。

【0066】

これは、ピクセル間の線形補間を使用しているが、より洗練された動き推定を生成するために、Ｌａｎｃｚｏｓリサンプリングのようなより高度な補間を使用することができる。さらに、このアプローチは、フレーム全体のピクセルの勾配を計算することによって、１つを超えるピクセルの動きに適用することができる。

【0067】

この方法の他の応用は、観察方向と平行な動きの検出を含む。これは、（上述のような並進による線形運動ではなく）非線形運動として検出される。画像内のボケは、顕微鏡の光学特性を用いて較正する必要がある。

【0068】

本説明では個々のネイティブフレームＮ_１とＮ_２を使用しているが、ネイティブフレームの代わりにフレームの平均を使用することも可能である。
ＩＳｃａｔ顕微鏡は、検出された動きが所定値を超える場合に、アラームまたはアラートが通知されるアラームまたはアラートを含んでもよい。アラームは、音声または視覚アラームであってもよい。

【0069】

ＩＳｃａｔ顕微鏡は、動き、ドリフトもしくは振動を補正する、または補償するためのアクチュエータを含んでいてもよい。アクチュエータは、サンプルを直交する３方向に移動させることができる電動アクチュエータであってもよい。

【0070】

図３と図４は、単量体、二量体、三量体という３つの明確な分子種を有するサンプルのＩＳｃａｔ顕微鏡による画像を示す。
図３は、本発明による動き抑制を行わずにＩＳｃａｔ顕微鏡で撮影した（レシオメトリ）フレームを示すものである。動きがあるため、個々の粒子を識別することはできない。アプリケーションウィンドウの右上隅にある感嘆符で示されるように、プログラムによって動きが検出される。左下のパネルでは、動きの振幅が時間に対してプロットされている。図３の右側は、観察スライドに着地した検出された粒子の質量のヒストグラムである。動きによるノイズが選択と同定のプロセスを妨害しているため、３つの異なる分子種について明確なピークがない。

【0071】

図４は、ＩＳｃａｔ顕微鏡で撮影した同じ（レシオメトリ）フレームを示しているが、今回は本発明によって動きが補正されている。２つの粒子が黒丸ではっきりと見え、左下パネルの運動振幅プロットは、図３よりもはるかに低い値を示している。レシオメトリフレームから計算されたヒストグラムでは、３つの明確なピークが見られ、これはサンプル中の３種の粒子の質量に対応する。

【0072】

この顕微鏡１は、単一分子の検出を含む幅広い用途のＩＳｃａｔを行うために使用することができる。特に、弱い散乱体のラベルフリー画像化の用途では、関心のある物体を大きな背景の上に必ず検出しなければならないため、画像化コントラストが低下する。顕微鏡１は、例えば、単一分子の結合／脱離、相転移、クラスタリング、集合／分解、凝集、タンパク質／タンパク質相互作用、タンパク質／低分子相互作用、高感度ラベルフリー画像化を含む、屈折率のあらゆる変化の測定など、広範囲の研究および測定に使用することができる。

【0073】

このように、顕微鏡１には、基礎研究から製薬業界などの産業応用まで、数多くの用途がある。例えば、ＩＳｃａｔは現在、世界で最も高感度なラベルフリー単一分子画像化バイオセンサであり、例えば表面プラズモン共鳴センシング市場に大きな影響を与える可能性がある。また、上述のように顕微鏡１は質量測定にも利用でき、溶液中で正確、精密かつ高分解能の単一分子質量分析計として機能し、研究および産業界で多くの用途がある。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【国際調査報告】