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特表2023-520503細胞カプセル化層，カプセル化された細胞，細胞カプセル化組成物及びその製造方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-05-17
(54)【発明の名称】細胞カプセル化層，カプセル化された細胞，細胞カプセル化組成物及びその製造方法
(51)【国際特許分類】
C12N 11/10 20060101AFI20230510BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20230510BHJP
C12N 11/04 20060101ALI20230510BHJP
A61K 35/17 20150101ALN20230510BHJP
【ＦＩ】
C12N11/10
C12N5/0783
C12N11/04
A61K35/17
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022560150
(86)(22)【出願日】2021-04-05
(85)【翻訳文提出日】2022-09-29
(86)【国際出願番号】 KR2021004203
(87)【国際公開番号】W WO2021201660
(87)【国際公開日】2021-10-07
(31)【優先権主張番号】10-2020-0040814
(32)【優先日】2020-04-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2021-0042722
(32)【優先日】2021-04-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521189156
【氏名又は名称】ソウル ナショナル ユニバーシティ アール アンド ディービー ファウンデーション
【氏名又は名称原語表記】ＳＥＯＵＬ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ Ｒ＆ＤＢ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ
(74)【代理人】
【識別番号】110001818
【氏名又は名称】弁理士法人Ｒ＆Ｃ
(72)【発明者】
【氏名】ファン，ナダニエル・ソ‐ヨン
(72)【発明者】
【氏名】キム，ビョン‐ギ
(72)【発明者】
【氏名】キム，ミンジ
【テーマコード（参考）】
4B033
4B065
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B033NA01
4B033NA15
4B033NB03
4B033NB44
4B033NB49
4B033NB62
4B033NC05
4B033NC08
4B033NC12
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4B033NF06
4B065AA94X
4B065BB25
4B065BC11
4B065BC26
4B065BD06
4B065CA44
4B065CA46
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB64
4C087NA03
(57)【要約】
本発明は、多種細胞共同培養方法に関するものであって、本発明によれば、細胞毒性を誘発しないながら、多種細胞間の相互作用を円滑にし、細胞に損傷がなしに単一細胞を分離させることができる。したがって、多種の組織細胞に対する再生研究に適用することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
キトサン及びヒアルロン酸を含み前記キトサン及びヒアルロン酸が、架橋結合を形成する、細胞カプセル化層。
【請求項2】
前記キトサン及び前記ヒアルロン酸が酵素反応によって架橋結合を形成する、請求項１に記載の細胞カプセル化層。
【請求項3】
前記キトサン及び前記ヒアルロン酸がアリールオキシ結合によって架橋結合を形成する、請求項１に記載の細胞カプセル化層。
【請求項4】
前記キトサン及び前記ヒアルロン酸がそれぞれ独立してフェノール、カテコールまたはキノンで官能化される、請求項１に記載の細胞カプセル化層。
【請求項5】
前記キトサン及び前記ヒアルロン酸がフェノールで官能化される、請求項１に記載の細胞カプセル化層。
【請求項6】
前記細胞カプセル化層の厚さが５０～５００ｎｍである、請求項１に記載の細胞カプセル化層。
【請求項7】
前記細胞カプセル化層の厚さが１００～２００ｎｍである、請求項１に記載の細胞カプセル化層。
【請求項8】
前記キトサンの分子量が１５～３１０ｋＤａである、請求項１に記載の細胞カプセル化層。
【請求項9】
前記ヒアルロン酸の分子量が１．２～８，０００ｋＤａである、請求項１に記載の細胞カプセル化層。
【請求項10】
請求項１～９の何れか一項に記載の細胞のカプセル化層及び細胞を含む、細胞カプセル化組成物。
【請求項11】
前記キトサンが細胞と直接接触する、請求項１０に記載の細胞カプセル化組成物。
【請求項12】
前記組成物が少なくとも２つの細胞カプセル化層を含む、請求項１０に記載の細胞カプセル化組成物。
【請求項13】
前記細胞カプセル化層が１～５個のキトサン層及び１～５個のヒアルロン酸層を含む、請求項１０に記載の細胞カプセル化組成物。
【請求項14】
請求項１０～１３の何れか一項に記載の細胞カプセル化組成物を製造する方法として、（ｉ）第１残基グループで官能化されたキトサン及び（ｉｉ）第２残基グループで官能化されたヒアルロン酸を含む溶液を製造する段階と、
前記溶液に酵素を添加して、前記（ｉ）及び（ｉｉ）を架橋結合する段階と、前記酵素の添加前、途中、または後に、前記溶液に細胞を添加する段階と、を含む、細胞カプセル化組成物の製造方法。
【請求項15】
前記第１残基グループ及び前記第２残基グループがそれぞれ独立してフェノール、カテコールまたはキノンを含む、請求項１４に記載の細胞カプセル化組成物の製造方法。
【請求項16】
前記第１残基グループ及び前記第２残基グループがフェノールを含む、請求項１４に記載の細胞カプセル化組成物の製造方法。
【請求項17】
前記架橋結合がアリールオキシ結合を含む、請求項１４に記載の細胞カプセル化組成物の製造方法。
【請求項18】
前記酵素がチロシナーゼを含む、請求項１４に記載の細胞カプセル化組成物の製造方法。
【請求項19】
前記酵素がストレプトマイセスエバーミチリスに由来するチロシナーゼを含む、請求項１４に記載の細胞カプセル化組成物の製造方法。
【請求項20】
前記溶液のうち前記（ｉ）が、少なくとも１つのアリールグループに変形されたキトサンを０．０１～５％含む、請求項１４に記載の細胞カプセル化組成物の製造方法。
【請求項21】
前記溶液のうち前記（ｉｉ）が、少なくとも１つのアリールグループに変形されたヒアルロン酸を０．０１～５％含む、請求項１４に記載の細胞カプセル化組成物の製造方法。
【請求項22】
請求項１～９の何れか一項に記載の細胞カプセル化層でカプセル化された、細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、細胞の表面にハイドロゲルフィルムを形成する細胞カプセル化層，細胞カプセル化組成物及び細胞カプセル化組成物を製造する方法に関する。
【0002】
本願は、２０２０年４月３日付の大韓民国特許出願第１０－２０２０－００４０８１４号及び２０２１年４月１日付の大韓民国特許出願第１０－２０２１－００４２７２２号に基づいた優先権の利益を主張し、当該大韓民国特許出願の文献に開示されたあらゆる内容は、本明細書の一部として含まれる。
【背景技術】
【0003】
細胞治療剤は、幹細胞，免疫細胞，β細胞など、細胞自体を体内に移植または注入する医薬品であって、重症疾患の治療法として注目を浴びている。現代の医薬分野では、治療が難しい肝硬変，関節炎，癌などに適用するために、代表的な血液癌細胞治療剤であるＣＡＲ－Ｔ細胞、第１型糖尿病細胞治療剤であるβ細胞移植、幹細胞治療剤のように細胞を医薬品として使用する細胞治療剤に対する商業的関心が高まっている。
【0004】
治療剤として使われる細胞は、体内移植時に、物理的ストレス、免疫反応などによって、生存率が大きく低下するという問題点があるので、組織工学及び再生医療分野で細胞をカプセル化する技術が研究されている。従来の細胞伝達プラットフォームとしては、アルギン酸を利用したマイクロビーズ技術、積層式細胞コーティング技術などがある。
【0005】
しかし、マイクロビーズ技術は、細胞のサイズに比べて過度に厚いハイドロゲルの厚さによって、栄養分、酸素のようなカプセル外部物質の供給及び交換に制限があるので、細胞が壊死するか、その機能が低下するという問題点がある。また、積層式細胞コーティング技術は、負電荷と正電荷とを帯びる高分子間の引力を利用するので、結合強度が比較的弱い静電気力に依存するために、コーティング層の厚さが相対的に薄く、注入過程で圧力、血液の流れなど外部の物理的なストレスによって容易に除去されるので、安定性、持続性、保持力に限界点がある。
【0006】
したがって、外部環境のストレスから細胞を保護して生存率を高めながら、同時に物質交換が容易であって、細胞カプセル化以後、細胞の生存率と増殖とに影響を及ぼさない細胞カプセル化と関連した研究が必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明の目的は、細胞カプセル化層を提供することである。
本発明の他の目的は、細胞カプセル化組成物を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、カプセル化された細胞を提供することである。
また、本発明のさらに他の目的は、前記細胞カプセル化組成物を製造する方法を提供することである。
本発明の他の目的は、細胞カプセル化組成物を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、カプセル化された細胞を提供することである。
また、本発明のさらに他の目的は、前記細胞カプセル化組成物を製造する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0008】
前記課題を解決するために、本発明は、キトサン及びヒアルロン酸を含み、前記キトサン及びヒアルロン酸が、架橋結合を形成する細胞カプセル化層を提供する。
【0009】
一具現例によれば、前記キトサン及び前記ヒアルロン酸は、酵素反応によって架橋結合を形成しうる。
【0010】
一具現例によれば、前記キトサンと前記ヒアルロン酸は、アリールオキシ結合によって架橋結合を形成しうる。
【0011】
一具現例によれば、前記キトサンと前記ヒアルロン酸は、それぞれ独立してフェノール、カテコールまたはキノンで官能化され、具体例を挙げれば、フェノールで官能化される。
【0012】
一具現例によれば、前記細胞カプセル化層の厚さは、５０～５００ｎｍ、具体例を挙げれば、１００～２００ｎｍである。
【0013】
一具現例によれば、前記キトサンの分子量は、１５～３１０ｋＤａである。
【0014】
また、前記ヒアルロン酸の分子量は、１．２～８，０００ｋＤａである。
【0015】
本発明の他の具現例によれば、前記のような細胞カプセル化層及び細胞を含む細胞カプセル化組成物を提供する。
【0016】
一具現例によれば、前記キトサンは、細胞と直接接触することができる。
【0017】
一具現例によれば、前記組成物は、少なくとも２つの細胞カプセル化層を含みうる。
【0018】
一具現例によれば、前記細胞カプセル化層は、１～５個のキトサン層及び１～５個のヒアルロン酸層を含みうる。
【0019】
本発明のさらに他の具現例によれば、前記のような細胞カプセル化組成物を製造する方法として、（ｉ）第１残基グループで官能化されたキトサン及び（ｉｉ）第２残基グループで官能化されたヒアルロン酸を含む溶液を製造する段階；前記溶液に酵素を添加して、前記（ｉ）及び（ｉｉ）を架橋結合する段階；及び前記酵素の添加前、途中、または後に、前記溶液に細胞を添加する段階；を含むものである細胞カプセル化組成物の製造方法を提供する。
【0020】
一具現例によれば、前記第１残基グループ及び前記第２残基グループは、それぞれ独立してフェノール、カテコールまたはキノンを含み、具体例を挙げれば、フェノールを含みうる。
【0021】
一具現例によれば、前記架橋結合は、アリールオキシ結合を含みうる。
【0022】
一具現例によれば、前記酵素は、チロシナーゼを含み、具体例を挙げれば、ストレプトマイセスエバーミチリスに由来するチロシナーゼ（Streptomyces avermitilis-derived tyrosinase）を含みうる。
【0023】
一具現例によれば、前記溶液のうち、前記（ｉ）は、少なくとも１つのアリールグループに変形されたキトサンを０．０１～５％含みうる。
【0024】
また、前記溶液のうち、前記（ｉｉ）は、少なくとも１つのアリールグループに変形されたヒアルロン酸を０．０１～５％含みうる。
【0025】
本発明の他の具現例によれば、前記のような細胞カプセル化層でカプセル化された細胞を提供する。
【0026】
その他の本発明の具現例の具体的な事項は、以下の詳細な説明に含まれている。
【発明の効果】
【0027】
本発明によれば、細胞に毒性を最小化しながらカプセルコーティング層外部物質と細胞との間の物質交換が容易であり、安定した細胞カプセル化組成物を提供することができる。また、単一または多種細胞をそれぞれの細胞（single cell）またはクラスター（cell cluster）単位でカプセル化することができ、臓器をコーティングしてカプセル化することができるので、組織工学、再生医療分野などの分野で安定した細胞移植、注入のような細胞運搬体としてのプラットフォームとして容易に適用することができ、細胞イメージング、局所部位伝達のような技術を果たしうる。
【図面の簡単な説明】
【0028】
【図1】高分子にフェノール残基を導入する過程を示す化学式である。
【図2】従来のキノコ由来のチロシナーゼと放線菌由来のチロシナーゼとの構造的な比較図である。
【図3】フェノール基が導入された高分子が架橋結合する過程を示す模式図である。
【図4】グリコールキトサン及びヒアルロン酸高分子にモノフェノール残基が導入されたことを確認した結果を示した図である。
【図5】高分子とチロシナーゼとの反応率を示すグラフである。
【図6】細胞カプセル化過程を示す模式図である。
【図7】カプセル化原理を模式化した図面である。
【図8】本発明によるカプセル化細胞を示す模式図及び写真図である。
【図9】ＧＣ－Ｔ濃度による細胞間の凝集現像を観察した写真図である。
【図10】放線菌由来のチロシナーゼの細胞毒性を確認したグラフである。
【図11】酵素濃度、反応時間及び高分子濃度による細胞カプセル化程度を示すグラフである。
【図12】チロシナーゼ及び静電気力による細胞カプセル化の形成の有無を示すグラフである。
【図13】水晶振動子微細スケール法でハイドロゲルナノフィルムの形成の有無を確認したグラフである。
【図14】カプセル化された細胞のゼータ電位を示すグラフである。
【図15】カプセル化された細胞のＦＡＣＳ結果を示すグラフである。
【図16】カプセル化された単一細胞のＣＬＳＭ結果を示す写真図である。
【図17】カプセル化されたβ細胞スフェロイドのＣＬＳＭ結果を示す写真図である。
【図18】カプセル化された細胞のＳＥＭ結果を示す写真図である。
【図19】カプセル化された細胞のＴＥＭ結果を示す写真図である。
【図20】カプセル化層の積層回数による細胞のカプセル化程度を確認した結果を示す写真図である。
【図21】カプセル化された細胞の生存率を確認した結果を示した図である。
【図22】酵素の架橋有無による細胞カプセル化層の持続力を確認した結果を示した図である。
【図23】ブドウ糖に対するカプセル化細胞の反応を確認した結果を示したグラフである。
【図24】カプセル化細胞のタンパク質分解酵素及び物理的ストレス抵抗性を確認した結果を示した図である。
【図25】カプセル化細胞のサイトカイン抵抗性を確認した結果を示したグラフである。
【図26】カプセル化細胞及びナチュラルキラー細胞（NK cell）の共培養の模式図及び結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【0029】
本発明は、多様な変換を加え、さまざまな実施例を有することができるので、特定実施例を図面に例示し、詳細な説明で詳細に説明する。しかし、これは、本発明を特定の実施形態に対して限定しようとするものではなく、本発明の思想及び技術範囲に含まれる、あらゆる変換、均等物または代替物を含むものと理解しなければならない。本発明を説明するに当って、関連した公知技術についての具体的な説明が、本発明の要旨を不明にする恐れがあると判断される場合、その詳細な説明を省略する。
【0030】
以下、本発明の具現例による細胞カプセル化層，細胞カプセル化組成物及び細胞カプセル化組成物の製造方法についてより詳細に説明する。
【0031】
本発明は、マイクロビーズの外部物質交換の制限問題、細胞積層コーティング法の安定性の低下問題を解決するために、カプセル内外部の物質交換が容易になるように適切な厚さとコーティング層の強い結合とを有する細胞カプセル化組成物を提供する。
【0032】
具体的に、本発明による細胞カプセル化組成物は、キトサン（chitosan）及びヒアルロン酸（hyaluronic acid）を含み、前記キトサン及びヒアルロン酸が、互いに架橋結合を形成する細胞カプセル化層でカプセル化された細胞を含む。前記カプセル化された細胞は、１つの細胞がカプセル化されたものであり、２つ以上の細胞がカプセル化されたものである。
【0033】
一具現例によれば、前記キトサンは、キトサンまたはその誘導体を含みうる。具体例を挙げれば、グリコールキトサン（glycol chitosan）を含み、キトサンの分子量は、例えば、１５～３１０ｋＤａ、例えば、７５～３１０ｋＤａである。
【0034】
また、例えばヒアルロン酸の分子量は、１．２～８，０００ｋＤａ、例えば４０～６４ｋＤａである。
【0035】
前記「架橋結合（cross-linked bond）」は、「橋かけ結合」または「交差結合」のような意味として使われる。また、分子と分子間の共有結合またはイオン結合のように完全な化学的結合が形成されたものを意味する。例えば、本発明において、キトサンとヒアルロン酸は、互いに共有結合を形成することができ、アリールオキシ結合（aryloxyl coupling）によって架橋される。
【0036】
一具現例によれば、キトサン及びヒアルロン酸は、それぞれ独立してフェノール、カテコールまたはキノンで官能化され、具体例を挙げれば、キトサン及びヒアルロン酸は、それぞれフェノール（phenol）、例えば、モノフェノール（mono-phenol）で官能化される。
【0037】
前記のように、本発明は、細胞カプセル化層及び細胞を含む細胞カプセル化組成物を提供する。
【0038】
本発明の他の具現例によれば、前記のような細胞カプセル化層でカプセル化された細胞を提供する。
【0039】
一具現例によれば、カプセル化対象となる細胞は、特に制限されず、単一種類の細胞または１種以上の多種細胞をカプセル化することができる。また、それぞれの細胞をカプセル化するか、細胞クラスター（cell cluster）を一回にカプセル化することができ、臓器をコーティングしてカプセル化するものも可能である。
【0040】
一具現例によれば、細胞カプセル化層が含むキトサンは、細胞と直接接触することができる。
【0041】
一具現例によれば、本発明による細胞カプセル化組成物は、細胞の外郭に１～１０層、例えば２～８層、例えば３～７層でフィルムが積層された形態を形成しうる。具体例を挙げれば、前記組成物は、少なくとも２つの細胞カプセル化層を含み、例えば、キトサン層及びヒアルロン酸層をそれぞれ独立して１～５個、例えばそれぞれ独立して１～３個含みうる。
【0042】
従来のアルギン酸塩ビーズを使用する細胞球面カプセル化の場合に比べて、前記のような本発明の多層薄膜（Layer-by-layer、ＬＢＬ）形態のカプセル化層は、非常に薄い高分子層で形成されるので、細胞のブドウ糖感知及びインスリン分泌などの速い反応を許容する。具体的に、従来、５００ミクロンサイズのアルギン酸塩ビーズを使用し、これは、グルコースがアルギン酸塩ビーズ内に数百ミクロンを移動しなければならないために、細胞がブドウ糖を感知し、インスリンを分泌するのに速い反応を制限する。
【0043】
多層薄膜形態のコーティングを形成するために、従来、高分子間の静電気相互作用を適用したが、このような方法は、最適の細胞カプセル化条件を果たすために、過度に長い準備時間を必要とするという短所がある。
【0044】
本発明では、酵素を活用した速い交差結合を誘導して、このような短所を解決することができる。
【0045】
本発明のさらに他の具現例によれば、前記組成物を製造する方法として、（ｉ）第１残基グループで官能化されたキトサン及び（ｉｉ）第２残基グループで官能化されたヒアルロン酸を含む溶液を製造する段階；前記溶液に酵素を添加して、前記（ｉ）及び（ｉｉ）を架橋結合する段階；及び前記酵素を添加する前、または前記酵素を添加する間に、または前記酵素を添加した後に、前記溶液に細胞を添加する段階；を含む細胞カプセル化組成物の製造方法を提供する。
【0046】
一具現例によれば、前記第１残基グループ及び前記第２残基グループは、それぞれ独立してフェノール、カテコールまたはキノンを含み、例えば、フェノールを含みうる。キトサン及びヒアルロン酸高分子にそれぞれ第１残基グループ及び第２残基グループを導入することにより、高分子間の架橋を誘導することができる。例えば、グリコールキトサンに４－ヒドロキシフェニル酢酸（4-hydroxyphenylacetic acid）、３－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオン酸［3-(4-hydroxyphenyl)propionic acid］を処理してグリコールキトサンにモノフェノール残基を導入することができる。また、カテキン（catechin）、エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）、その他のポリフェノール類化合物を導入することができる。
【0047】
また、ヒアルロン酸にチラミン（tyramine）、チロシン（tyrosine）からなる群から選択される１つ以上を処理して、ヒアルロン酸にモノフェノール残基を導入することができる。また、例えば、前記チラミンは、塩酸塩の形態であるものを使用することができる。一具現例によるフェノール残基の導入過程を図１に示した。
【0048】
一具現例によれば、前記第１残基グループ及び第２残基グループでフェノールを導入する段階以後に、キトサン及びヒアルロン酸にモノフェノール酸化酵素、ジフェノール酸化酵素及びラッカーゼ（laccase）からなる群から選択される１つ以上の酵素を添加して、酵素反応によって架橋結合を形成しうる。また、例えば、前記架橋結合は、アリールオキシ結合（aryloxyl coupling）を含みうる。
【0049】
一具現例によれば、前記溶液のうち、前記「（ｉ）第１残基グループで官能化されたキトサン」が、少なくとも１つのアリールグループに変形されたキトサンを０．０１～５％、例えば、０．１～１％含みうる。
【0050】
また、前記溶液のうち、前記「（ｉｉ）第２残基グループで官能化されたヒアルロン酸」が、少なくとも１つのアリールグループに変形されたヒアルロン酸を０．０１～５％、例えば、０．１～１％含みうる。
【0051】
一具現例によれば、モノフェノール酸化酵素としてチロシナーゼ（tyrosinase）、ジフェノール酸化酵素としてカテコール酸化酵素（catechol oxidase）を含みうる。
【0052】
チロシナーゼは、銅を含んでいる金属酵素であって、キノコ、ジャガイモ、リンゴなど、多様な植物と動物とに存在する。モノフェノールを酸化してｏ－ジフェノール（diphenol）を生成するクレゾラーゼ（cresolase）作用、生成されたｏ－ジフェノールを再び酸化してｏ－キノン（o-quinone）で生成するカテコラーゼ（catecholase）作用を行う。
【0053】
カテコール酸化酵素（Catechol oxidase）は、チロシナーゼほぼ類似した機能を有する。しかし、カテコール酸化酵素は、ｏ－キノンを生成するカテコラーゼの作用はできるが、チロシナーゼの作用のうち、他の１つであるモノフェノールを酸化させるクレゾラーゼの作用はできない。
【0054】
本発明の酵素は、チロシナーゼ（tyrosinase）を含み、例えば、ストレプトマイセス属（Streptomes sp.）に由来するチロシナーゼを使用することができる。具体例を挙げれば、本発明の酵素は、ストレプトマイセスエバーミチリスに由来するチロシナーゼ（Streptomyces avermitilis-derived tyrosinase）を含みうる。ストレブトミセス属放線菌由来のチロシナーゼは、キノコ由来のチロシナーゼよりも高分子に結合されているチロシン残基に対する触媒化効率が高いので、ドーパまたはキノン残基への変換効率が高い。変換された残基は、共有結合あるいは配位結合によって架橋が行われ、稠密な架橋反応によって、非特異的な交差結合を除去して、交差リンク時間を短縮し、高い熱的安定性及び機械的安定性を有する。架橋を成すタンパク質と架橋を進行するチロシンのみが使われるので、単位体化学物質の毒性及び酵素の限界的接近性に対する従来の技術限界を克服することができる。
【0055】
放線菌由来のチロシナーゼは、触媒化反応周辺が開放された構造であって、立体障害的な要因が非常に小さくて、構造的に他種由来のチロシナーゼと差異点がある。キノコ由来のチロシナーゼと放線菌由来のチロシナーゼとの構造的な比較図を図２に示した。図２のａは、放線菌由来のチロシナーゼであって、チロシナーゼが基質を受け入れる入口周辺の立体的障害が少ない。
【0056】
一方、図２のｂは、キノコ由来のチロシナーゼであって、入口周辺の不要なペプチドによる立体障害的な要因によって、ゼラチンのように体積が大きいタンパク質にあるチロシンとの接近性が低下する。すなわち、放線菌由来のチロシナーゼは、従来のキノコ由来のチロシナーゼに比べて、高分子物質のチロシン水酸化反応及び酸化反応に有利である。
【0057】
その結果、従来のチロシナーゼの反応時間が数時間であれば、ストレプトマイセスエバーミチリスに由来するチロシナーゼは、反応時間が数秒に急激かつ迅速な反応を誘導することができる。したがって、前記酵素を添加して架橋結合する段階で反応時間は、１分～１時間、例えば、１～３０分、例えば、３～２０分、例えば、５～１５分である。
【0058】
前記のような酵素によってキトサン及びヒアルロン酸高分子に導入されたフェノールが酸化されて、ドーパ（dopa）またはキノン（quinone）、例えば、ｏ－キノン（o-quinone）を形成することができ、ドーパまたはキノン残基は、配位結合、すなわち、共有結合による架橋を形成しうるので、稠密な架橋構造によって高い安定性を有しうる。
【0059】
本発明の一具現例によって、高分子にフェノール基を導入し、それを酸化して架橋する過程を図３に示した。従来のＤＯＰＡ変形された巨大分子と比較して、本発明による酵素を利用した分子は、特に、フェノール部分の酸化に効率的であり、カテコールキノンとアミン、チオール及びその他のフェノールグループの間の永久共有結合を通じて架橋結合を加速化することができる。また、このような酵素自体、カテコール、カテコールキノンに基づいた物質は、細胞毒性または炎症性がないので、チラミン結合されたキトサン及びヒアルロン酸を用いて細胞に薄いハイドロゲルを形成しうる。
【0060】
一具現例によれば、前記酵素を添加する段階は、キトサン０．０１～１％、例えば０．０５～０．５、例えば０．０５～０．３及びヒアルロン酸０．０１～１％、例えば０．０５～０．５、例えば０．０５～０．３の濃度にチロシナーゼを０．０１～０．５ｕ／ｍｌ、例えば０．０１～０．３ｕ／ｍｌ、例えば０．０１～０．１ｕ／ｍｌ添加する段階を含みうる。
【0061】
一具現例によれば、前記細胞を添加する段階は、メンブレン上に細胞を処理して浸漬する段階を含み、例えば、細胞を１×１０４～１×１０１０ｃｅｌｌ／ｍｌでメンブレン上にシーディング（seeding）することができる。また、前記メンブレンは、気孔が０．５～１０ｕｍ、例えば、１～８ｕｍ、例えば、２～５ｕｍである。メンブレンの種類は、例えば、ポリカーボネート（ＰＣ）、セルロース、フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）からなる群から選択される１つ以上を使用することができるが、特に制限されるものではない。
【0062】
一具現例によれば、本発明による細胞カプセル化層は、積層式ハイドロゲルナノフィルムの形態に形成され、その厚さは、５０～５００ｎｍ、例えば、１００～３００ｎｍ、例えば、１００～２００ｎｍに形成され、用途、適用環境などによって適切にその厚さを調節することができる。
【0063】
一具現例によれば、前記細胞カプセル化層組成物に蛍光分子、発光分子などの標識物質を導入してイメージング化することができる。また、薬物、成長因子などを導入して適用対象に局所的に伝達することができる。例えば、ペルオキシダーゼ（peroxidase）のような発色酵素、アルカリホスファターゼ（alkaline phosphatase）、放射性同位元素、コロイド、ＰＥ（phycoerythrin）、ＦＣＡ（フルオレセインカルボン酸）、ＨＲＰ、ＴＡＭＲＡ、ＦＩＴＣ（ポリＬ－リジン－フルオレセインイソチオシアネート）、ＲＩＴＣ（ローダミン－Ｂイソシアネート）、ローダミン（rhodamine）、シアニン（cyanine）、テキサスレッド（texas Red）、フルオレセイン（fluorescein）、フィコエリスリン（phycoerythrin）、クアンタムドット（quantum dots）などの標識物質を導入してイメージング化することができる。また、例えば、抗体エピトープ（epitope）、基質（substrate）、補助因子（cofactor）、阻害剤または親和リガンドなどを導入することができる。
【0064】
前記のように、本発明の細胞カプセル化組成物は、静電気的引力と酵素媒介化学反応とを同時に適用してカプセルを構成する高分子間に共有結合を形成するので、カプセル化された細胞の注入時に、圧力、体内血流のような物理的刺激によって容易に損傷されないので、安定性及び持続性を向上させうる。また、細胞の種類に関係なく生細胞を単一細胞単位または２種以上の多種細胞単位でカプセル化することができる。
【0065】
また、本発明によれば、細胞の種類に関係なく細胞カプセル化を適用することができ、それを用いて細胞クラスターだけではなく、抗体タンパク質のようなバイオ医薬品の体内生存率を向上させうる。本発明のカプセル化層は、細胞をサイトカイン攻撃から保護することができるので、臓器をコーティングしてカプセル化し、臓器移植または細胞治療剤としてのプラットフォームとして適用して、体内で免疫細胞との物理的な接触を防止し、免疫拒絶反応を緩和させることができる。
【0066】
以下、当業者が容易に実施できるように、本発明の実施例について詳しく説明する。しかし、本発明は、さまざまな異なる形態として具現可能であり、ここで説明する実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【0067】
〔実施例１〕
グリコールキトサン及びヒアルロン酸のフェノール残基の導入
グリコールキトサン（ＧＣ）及びヒアルロン酸（ＨＡ）高分子のそれぞれにモノフェノール残基を導入してキトサン－モノフェノール（ＧＣ－Ｔ）及びヒアルロン酸－モノフェノール（ＨＡ－Ｔ）を合成した。２００ｍｇのグリコールキトサンを０．１Ｍ ｐＨ４．７ ＭＥＳバッファ１０ｍｌに溶解させた後、１６０．８２ｍｇの４－ヒドロキシフェニル酢酸（ＨＰＡ）を１０ｍｌ ＭＥＳバッファに溶解させ、２０２．６４ｍｇのＥＤＣ及び１１４．７６ｍｇのＮＨＳを溶液に添加し、５分間撹拌した。引き続き、２つの溶液を混合し、室温で一晩中反応させた。引き続き、溶液を蒸留水に対して７２時間透析し、７２時間以上の間に凍結乾燥させた。２００ｍｇのヒアルロン酸を０．１Ｍ ｐＨ４．７ ＭＥＳバッファ２０ｍｌに溶解させた後、１９７．４５２ｍｇのＥＤＣ及び１１１．８２２ｍｇのＮＨＳを添加し、５分間撹拌した。引き続き、１７８．８５ｍｇのチラミン塩酸塩（tyramine hydrochloride）を添加し、室温で一晩中反応させた。引き続き、溶液を蒸留水に対して７２時間透析し、７２時間以上の間に凍結乾燥させた。
グリコールキトサン及びヒアルロン酸のフェノール残基の導入
グリコールキトサン（ＧＣ）及びヒアルロン酸（ＨＡ）高分子のそれぞれにモノフェノール残基を導入してキトサン－モノフェノール（ＧＣ－Ｔ）及びヒアルロン酸－モノフェノール（ＨＡ－Ｔ）を合成した。２００ｍｇのグリコールキトサンを０．１Ｍ ｐＨ４．７ ＭＥＳバッファ１０ｍｌに溶解させた後、１６０．８２ｍｇの４－ヒドロキシフェニル酢酸（ＨＰＡ）を１０ｍｌ ＭＥＳバッファに溶解させ、２０２．６４ｍｇのＥＤＣ及び１１４．７６ｍｇのＮＨＳを溶液に添加し、５分間撹拌した。引き続き、２つの溶液を混合し、室温で一晩中反応させた。引き続き、溶液を蒸留水に対して７２時間透析し、７２時間以上の間に凍結乾燥させた。２００ｍｇのヒアルロン酸を０．１Ｍ ｐＨ４．７ ＭＥＳバッファ２０ｍｌに溶解させた後、１９７．４５２ｍｇのＥＤＣ及び１１１．８２２ｍｇのＮＨＳを添加し、５分間撹拌した。引き続き、１７８．８５ｍｇのチラミン塩酸塩（tyramine hydrochloride）を添加し、室温で一晩中反応させた。引き続き、溶液を蒸留水に対して７２時間透析し、７２時間以上の間に凍結乾燥させた。
【0068】
核磁気共鳴分光法（NMR Spectroscopy）でグリコールキトサン及びヒアルロン酸高分子にモノフェノール残基が導入されたことを確認し、図４に、その結果を示した。
【0069】
また、蛍光を帯びる高分子を合成するために、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解された１ｍｌの１０ｍｇ／ｍｌ ＲＩＴＣ（Rhodamine B isothiocyanate/Sigma-Aldrich）及びＦＡ（Fluoresceinamine isomer I/Sigma-Aldrich）溶液をそれぞれＧＣ－Ｔ及びＨＡ－Ｔの反応溶液に添加して、ＧＣ－Ｔ－ＲＩＴＣ及びＨＡ－Ｔ－ＦＡを合成した。
【0070】
ＧＣ－Ｔ及びＨＡ－Ｔとチロシナーゼの反応
チロシナーゼは、放線菌であるStreptomyces avermitilis（ＳＡ）由来のものを使用した。ＳＡ由来のチロシナーゼ（ＳＡ－Ｔｙ）２．５ｕＭ、ＣｕＳＯ４５ｕＭ及び基質を総体積２００ｕｌの５０ｍＭ Tris-HClバッファ、ｐＨ８．０で製造した。前記基質は、ＧＣ－Ｔ １％（ｗ／ｖ）、ＨＡ－Ｔ １％（ｗ／ｖ）またはＬ－チロシン（L-turosine）２００ｕＭである。マイクロプレートリーダー（Infinite Ｍ２００ ＰＲＯ、ＴＥＣＡＮ、Switzerland）を使用して３７℃で吸光度４７５ｎｍ（εdopachrome＝３６００Ｍ－１ｃｍ－１）で３０分間１分ごとに測定した。その結果は、図５に示し、ＳＡ－Ｔｙの初期反応率は、生成物の濃度と反応時間との勾配と定義される。また、酵素活性は、ｍｌ当たり単位（unit）（Ｕ／ｍｌ）で表示され、ここで、１単位（Ｕ）は、分当たり１ｕｍｏｌのＬ－チロシン反応を触媒するＳＡ－Ｔｙ量である。
チロシナーゼは、放線菌であるStreptomyces avermitilis（ＳＡ）由来のものを使用した。ＳＡ由来のチロシナーゼ（ＳＡ－Ｔｙ）２．５ｕＭ、ＣｕＳＯ４５ｕＭ及び基質を総体積２００ｕｌの５０ｍＭ Tris-HClバッファ、ｐＨ８．０で製造した。前記基質は、ＧＣ－Ｔ １％（ｗ／ｖ）、ＨＡ－Ｔ １％（ｗ／ｖ）またはＬ－チロシン（L-turosine）２００ｕＭである。マイクロプレートリーダー（Infinite Ｍ２００ ＰＲＯ、ＴＥＣＡＮ、Switzerland）を使用して３７℃で吸光度４７５ｎｍ（εdopachrome＝３６００Ｍ－１ｃｍ－１）で３０分間１分ごとに測定した。その結果は、図５に示し、ＳＡ－Ｔｙの初期反応率は、生成物の濃度と反応時間との勾配と定義される。また、酵素活性は、ｍｌ当たり単位（unit）（Ｕ／ｍｌ）で表示され、ここで、１単位（Ｕ）は、分当たり１ｕｍｏｌのＬ－チロシン反応を触媒するＳＡ－Ｔｙ量である。
【0071】
細胞カプセル化
凍結乾燥されたＧＣ－Ｔ及びＨＡ－Ｔをそれぞれ１０ｍｇ／ｍｌずつＰＢＳ及び０．１％酢酸に溶解させた。完全に溶解した後、それぞれの溶液をＰＢＳで１０倍希釈して最終濃度１ｍｇ／ｍｌで製造し、滅菌された０．２ｕｍのメンブレン（membrane）を通じて濾過した。収集されたJurkat細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ １ｍｌ当たり１×１０７の密度で準備した。細胞懸濁液１００ｕｌを３．０ｕｍのポリカーボネートメンブレン（Transwell（登録商標） ６．５ｍｍ insert、２４－well plate、Corning（登録商標））にシーディングした。１，３，５層の奇数番目の層は、ＧＣ－Ｔ溶液、２，４，６層の偶数番目の層は、ＨＡ－Ｔ溶液を使用して、次のような方法を繰り返して細胞カプセル化を進行した。１ｍｇ／ｍｌ ＧＣ－ＴまたはＨＡ－Ｔ溶液６００ｕｌ及び０．０５Ｕ／ｍｌ ＳＡ－Ｔｙを２４ウェルプレート（２４－well plate）に添加した後、細胞がシーディングされた挿入物を室温（ＲＴ）で１０分間浸漬した。
凍結乾燥されたＧＣ－Ｔ及びＨＡ－Ｔをそれぞれ１０ｍｇ／ｍｌずつＰＢＳ及び０．１％酢酸に溶解させた。完全に溶解した後、それぞれの溶液をＰＢＳで１０倍希釈して最終濃度１ｍｇ／ｍｌで製造し、滅菌された０．２ｕｍのメンブレン（membrane）を通じて濾過した。収集されたJurkat細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ １ｍｌ当たり１×１０７の密度で準備した。細胞懸濁液１００ｕｌを３．０ｕｍのポリカーボネートメンブレン（Transwell（登録商標） ６．５ｍｍ insert、２４－well plate、Corning（登録商標））にシーディングした。１，３，５層の奇数番目の層は、ＧＣ－Ｔ溶液、２，４，６層の偶数番目の層は、ＨＡ－Ｔ溶液を使用して、次のような方法を繰り返して細胞カプセル化を進行した。１ｍｇ／ｍｌ ＧＣ－ＴまたはＨＡ－Ｔ溶液６００ｕｌ及び０．０５Ｕ／ｍｌ ＳＡ－Ｔｙを２４ウェルプレート（２４－well plate）に添加した後、細胞がシーディングされた挿入物を室温（ＲＴ）で１０分間浸漬した。
【0072】
培養する間に、プレートを２分ごとにタップした。１０分後、振盪培養器（shaking incubator）で前記挿入物を３０秒間培地（１０％ ＦＢＳ（Corning）が含まれたRoswell Park Memorial Institure 1640（Gibco））５００ｕｌが添加されたウェルに移し、１分間ＰＢＳ ５００ｕｌが添加されたウェルに移した。その後、ＨＡ－Ｔ及びＧＣ－Ｔに対して、前記のような方法を適用して、最後の層を生成し、細胞を細胞培養培地（１０％ ＦＢＳ（Corning）が含まれたRoswell Park Memorial Institure 1640（Gibco））に分散させた。前記のような過程を模式化した図面を図６に示した。また、具体的なカプセル化原理を図７に模式化した。
【0073】
前記のような方法で製造したカプセル化された細胞の形状を図８に示した。図８は、ハイドロゲルナノフィルムが６層で積層されたカプセル化細胞の形状であり、赤色蛍光（ＲＩＴＣ）標識されたグリコールキトサン層及び緑色蛍光（ＦＡ）標識されたヒアルロン酸層の視覚化写真を確認することができる。また、細胞の外郭に積層されたハイドロゲルナノフィルムの厚さが、１３９．４ｎｍであることを確認した。
【0074】
ＧＣ－Ｔ濃度による細胞間の凝集現像の確認
グリコールキトサン－モノフェノール（ＧＣ－Ｔ）の濃度を異ならせて、細胞間の凝集特性（cell clumping）を有するJurkat細胞をカプセル化し、その結果は、図９に示した。１６時間後、細胞を観察した時、０．０５％以下の濃度では、細胞凝集現像を示す一方、０．１％以上の濃度では、細胞間の分離（repulsion）現象が起こることを確認した。これは、細胞表面にカプセル化されたグリコールキトサン－モノフェノール（ＧＣ－Ｔ）の電荷による現象である。
グリコールキトサン－モノフェノール（ＧＣ－Ｔ）の濃度を異ならせて、細胞間の凝集特性（cell clumping）を有するJurkat細胞をカプセル化し、その結果は、図９に示した。１６時間後、細胞を観察した時、０．０５％以下の濃度では、細胞凝集現像を示す一方、０．１％以上の濃度では、細胞間の分離（repulsion）現象が起こることを確認した。これは、細胞表面にカプセル化されたグリコールキトサン－モノフェノール（ＧＣ－Ｔ）の電荷による現象である。
【0075】
〔実験例１〕放線菌由来のチロシナーゼの細胞毒性の確認
Streptomyces avermitilis（ＳＡ）由来のチロシナーゼ（SA-Ty）を０～５ｕＭの濃度でそれぞれ１０、３０、６０分間メディアに混ぜて培養した後、細胞生存率をLive/Dead assayを通じて確認した。その結果は、図１０に示し、全体で９７％以上の生存率を示した。したがって、最大５ｕＭ、６０分間細胞に処理した時、毒性がないことを確認した。
Streptomyces avermitilis（ＳＡ）由来のチロシナーゼ（SA-Ty）を０～５ｕＭの濃度でそれぞれ１０、３０、６０分間メディアに混ぜて培養した後、細胞生存率をLive/Dead assayを通じて確認した。その結果は、図１０に示し、全体で９７％以上の生存率を示した。したがって、最大５ｕＭ、６０分間細胞に処理した時、毒性がないことを確認した。
【0076】
〔実験例２〕細胞カプセル化条件の最適化
細胞カプセル化ハイドロゲルフィルムコーティングの最適化のために、SA-Ty濃度、反応時間及びポリマー濃度との関係を分析した。コーティング程度は、ＧＣ－Ｔ－ＲＩＴＣ及びＨＡ－Ｔ－ＦＡの蛍光強度を測定して確認した。９６－ｗｅｌｌ組織培養プレートにシーディングされたＭＩＮ６ β細胞を０．１％ ＧＣ－Ｔ－ＲＩＴＣ溶液０．１％またはＨＡ－Ｔ－ＦＡ溶液で０．０５Ｕ／ｍｌ SA-Tyと共に１０分間培養した。ＰＢＳで洗浄した後、２つの異なる領域で蛍光強度を測定した；測定領域のうち、１つは、λｅｘ＝５４３ｎｍ／λｅｍ＝５８０ｎｍ（ＲＩＴＣ）であり、他の１つは、λｅｘ＝４９５ｎｍ／λｅｍ＝５２５ｎｍ（ＦＡ）である。Native（Ｎ）としては、コーティング溶液の代わりに、ＰＢＳを使用して同じ過程を進行したＭＩＮ６ β細胞を使用した。
細胞カプセル化ハイドロゲルフィルムコーティングの最適化のために、SA-Ty濃度、反応時間及びポリマー濃度との関係を分析した。コーティング程度は、ＧＣ－Ｔ－ＲＩＴＣ及びＨＡ－Ｔ－ＦＡの蛍光強度を測定して確認した。９６－ｗｅｌｌ組織培養プレートにシーディングされたＭＩＮ６ β細胞を０．１％ ＧＣ－Ｔ－ＲＩＴＣ溶液０．１％またはＨＡ－Ｔ－ＦＡ溶液で０．０５Ｕ／ｍｌ SA-Tyと共に１０分間培養した。ＰＢＳで洗浄した後、２つの異なる領域で蛍光強度を測定した；測定領域のうち、１つは、λｅｘ＝５４３ｎｍ／λｅｍ＝５８０ｎｍ（ＲＩＴＣ）であり、他の１つは、λｅｘ＝４９５ｎｍ／λｅｍ＝５２５ｎｍ（ＦＡ）である。Native（Ｎ）としては、コーティング溶液の代わりに、ＰＢＳを使用して同じ過程を進行したＭＩＮ６ β細胞を使用した。
【0077】
その結果は、図１１に示した。
【0078】
SA-Tyの濃度は、０．０５Ｕ／ｍｌ、反応時間は、１０分、キトサン高分子の濃度は、０．１％で最も高いＲＩＴＣ強度を示した。SA-Ty濃度が０．０５Ｕ／ｍｌであり、キトサン高分子濃度が０．１％である時、ＧＣ－Ｔ－ＲＩＴＣのコーティングレベルは、反応時間が長いほど増加した。
【0079】
また、ＧＣ－Ｔ－ＲＩＴＣ及びＨＡ－Ｔ－ＦＡ溶液でそれぞれSA-Tyの存在によるコーティング効果を調査した。また、単一ＨＡ－ＴフィルムとＧＣ－Ｔフィルムとを先にコーティングした細胞上にＨＡ－Ｔフィルムをコーティングした細胞を比較して、コーティング順序の影響を分析した。その結果は、図１２に示した。SA-Tyの存在によって正電荷を帯びるＧＣ－Ｔ－ＲＩＴＣは、２．９倍の差を示した一方、負電荷を帯びるＨＡ－Ｔ－ＦＡは、コーティング程度の差が微小であった。また、ＦＡ強度は、ＧＣ－Ｔフィルムがコーティングされた細胞上にＨＡ－Ｔフィルムがコーティングされる場合、２．４倍増加した。
【0080】
〔実験例３〕細胞カプセル化の確認
ハイドロゲルナノフィルムの形成の有無を確認するために、水晶振動子微細スケール法を使用した。Ｃｒ／Ａｕ（クロム／金）結晶（５ＭＨｚ、１インチ直径、ＡＴ－カット、平面－平面）を使用してＧＣ－Ｔ／ＨＡ－Ｔ層を蒸着させた。蒸着前に、結晶をピラニア溶液（Ｈ２ＳＯ４：Ｈ２Ｏ２＝３：１）で５分間処理し、酸素プラズマを５分間処理して表面を洗浄し、負電荷を設定した。次いで、結晶を０．０５Ｕ／ｍｌ ＳＡ－Ｔｙで０．１％ ＧＣ－Ｔ溶液に浸した。１０分後、電極を１分間ＰＢＳで２回洗浄した。残存するＰＢＳを除去するために、結晶を送風機で乾燥した。総５個の二重層が積もるまで０．１％ ＨＡ－Ｔ溶液で多層薄膜（layer-by-layer，ＬＢＬ）蒸着（deposition）を進行した。ハイドロゲルフィルムが蒸着された結晶は、それぞれの層に対して水晶振動子微細スケール法ＱＣＭ（Quartz Crystal Microbalance，ＱＣＭ２００，Stanford Research Systems，ＵＳＡ）で分析され、その結果は、図１３に示した。
ハイドロゲルナノフィルムの形成の有無を確認するために、水晶振動子微細スケール法を使用した。Ｃｒ／Ａｕ（クロム／金）結晶（５ＭＨｚ、１インチ直径、ＡＴ－カット、平面－平面）を使用してＧＣ－Ｔ／ＨＡ－Ｔ層を蒸着させた。蒸着前に、結晶をピラニア溶液（Ｈ２ＳＯ４：Ｈ２Ｏ２＝３：１）で５分間処理し、酸素プラズマを５分間処理して表面を洗浄し、負電荷を設定した。次いで、結晶を０．０５Ｕ／ｍｌ ＳＡ－Ｔｙで０．１％ ＧＣ－Ｔ溶液に浸した。１０分後、電極を１分間ＰＢＳで２回洗浄した。残存するＰＢＳを除去するために、結晶を送風機で乾燥した。総５個の二重層が積もるまで０．１％ ＨＡ－Ｔ溶液で多層薄膜（layer-by-layer，ＬＢＬ）蒸着（deposition）を進行した。ハイドロゲルフィルムが蒸着された結晶は、それぞれの層に対して水晶振動子微細スケール法ＱＣＭ（Quartz Crystal Microbalance，ＱＣＭ２００，Stanford Research Systems，ＵＳＡ）で分析され、その結果は、図１３に示した。
【0081】
また、細胞のカプセル化を証明した。
【0082】
ゼータ電位
細胞を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ、paraformaldehyde）で１０分間固定させ、ＰＢＳ １ｍｌ当たり１×１０６細胞の密度で製造した。自然細胞（native cell）またはカプセル化された細胞のゼータ電位は、Ｎａｎｏ ＺＳ（Malvern Instruments，Germany）で測定して、図１４に示した。
細胞を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ、paraformaldehyde）で１０分間固定させ、ＰＢＳ １ｍｌ当たり１×１０６細胞の密度で製造した。自然細胞（native cell）またはカプセル化された細胞のゼータ電位は、Ｎａｎｏ ＺＳ（Malvern Instruments，Germany）で測定して、図１４に示した。
【0083】
ＦＡＣＳ（Fluorescence Activated Cell Sorter）
細胞をＧＣ－Ｔ及びＨＡ－Ｔの代わりに、ＧＣ－Ｔ－ＲＩＴＣ及びＨＡ－Ｔ－ＦＡでカプセル化した。固定後、ＰＢＳ ５００μＬ当たり１×１０６個の細胞で製造した。ＲＩＴＣ及びＦＡの蛍光は、４８８ｎｍ及び６３３ｎｍの波長のレーザを使用して流細胞分析（FACS Aria II，BD Biosciences，ＵＳＡ）で測定した。ＧＣ－Ｔ－ＲＩＴＣ及びＨＡ－Ｔ－ＦＡで単一層カプセル化された細胞は、ゲーティング（gating）のための陽性対照群として使用し、その結果は、図１５に示した。
細胞をＧＣ－Ｔ及びＨＡ－Ｔの代わりに、ＧＣ－Ｔ－ＲＩＴＣ及びＨＡ－Ｔ－ＦＡでカプセル化した。固定後、ＰＢＳ ５００μＬ当たり１×１０６個の細胞で製造した。ＲＩＴＣ及びＦＡの蛍光は、４８８ｎｍ及び６３３ｎｍの波長のレーザを使用して流細胞分析（FACS Aria II，BD Biosciences，ＵＳＡ）で測定した。ＧＣ－Ｔ－ＲＩＴＣ及びＨＡ－Ｔ－ＦＡで単一層カプセル化された細胞は、ゲーティング（gating）のための陽性対照群として使用し、その結果は、図１５に示した。
【0084】
ＣＬＳＭ（Confocal Llaser Scanning Microscope）
単一細胞またはβ細胞スフェロイド（β-cell spheroids、膵臓細胞）をそれぞれＧＣ－Ｔ－ＲＩＴＣ及びＨＡ－Ｔ－ＦＡでカプセル化した後、常温（ＲＴ）で１５分間４％ ＰＦＡで固定させた。回転楕円体形態のスフェロイドを２０ｍｍの共焦点皿に置いた。共焦点顕微鏡（ＬＳＭ ７８０，Carl Zeiss，Germany）を通じてイメージングした。単一細胞に対する結果は図１６、β細胞スフェロイドによる結果は図１７に示した。主にカプセル化スフェロイドの外部表面に蛍光が表われるので、ハイドロゲルナノフィルムが巨大分子の表面に均一な蓋で形成されることを確認した。
単一細胞またはβ細胞スフェロイド（β-cell spheroids、膵臓細胞）をそれぞれＧＣ－Ｔ－ＲＩＴＣ及びＨＡ－Ｔ－ＦＡでカプセル化した後、常温（ＲＴ）で１５分間４％ ＰＦＡで固定させた。回転楕円体形態のスフェロイドを２０ｍｍの共焦点皿に置いた。共焦点顕微鏡（ＬＳＭ ７８０，Carl Zeiss，Germany）を通じてイメージングした。単一細胞に対する結果は図１６、β細胞スフェロイドによる結果は図１７に示した。主にカプセル化スフェロイドの外部表面に蛍光が表われるので、ハイドロゲルナノフィルムが巨大分子の表面に均一な蓋で形成されることを確認した。
【0085】
ＳＥＭ（scanning electron microscope）
カプセル化されたβ細胞スフェロイドの表面を観察するために、ＳＥＭ（ＪＳＭ－６７０１Ｆ，ＪＥＯＬ）イメージを分析した。
カプセル化されたβ細胞スフェロイドの表面を観察するために、ＳＥＭ（ＪＳＭ－６７０１Ｆ，ＪＥＯＬ）イメージを分析した。
【0086】
ＳＥＭ分析サンプルの製造のために、スフェロイドを２．５％グルタルアルデヒド（glutaraldehyde）溶液で４時間固定し、エタノール（ethanol）で脱水処理した。その後、ヘキサメチルジシラザン（Hexamethyldisilazane）を通じて乾燥し、白金コーティングを１２０秒間進行して観察した。
【0087】
その結果は、図１８に示した。ＧＣ－ＴをJurkat細胞に均一にコーティングすれば、細胞が互いに押し出して高分子の均質な蓋でコーティングされる。カプセル化されたスフェロイドの表面に交差結合された高分子が均一に積層されたことを確認した。カプセル化層表面の構造は、メッシュ（mesh）構造を形成する。
【0088】
一方、自然スフェロイド（native spheroid）は、高分子がコーティングされていない滑らかな表面を有する。
【0089】
ＴＥＭ（Transmission Electron Microscope）
細胞表面のナノメートル（ｎｍ）厚さのハイドロゲルを確認するために、ＴＥＭ（Talos L120C，１２０ｋＶ，ＦＥＩ，Czech）イメージを分析した。ＴＥＭサンプルの製造のために、自然細胞（native cell）及びカプセル化された細胞をKarnovskyの固定液で固定した。細胞をカコジル酸緩衝液（cacodylate buffer）中の四酸化オスミウム（osmium tetroxide）１％で１時間処理し、０．５％酢酸ウラニル（uranul acetate）で４℃で一日間処理した。エタノールで脱水した後、サンプルをSpurr樹脂に包埋させた。ウルトラミクロトーム（ultramicrotome，ＥＭ ＵＣ７，Leica，Germany）を使用して試片を切断し、分析結果は図１９に示した。
細胞表面のナノメートル（ｎｍ）厚さのハイドロゲルを確認するために、ＴＥＭ（Talos L120C，１２０ｋＶ，ＦＥＩ，Czech）イメージを分析した。ＴＥＭサンプルの製造のために、自然細胞（native cell）及びカプセル化された細胞をKarnovskyの固定液で固定した。細胞をカコジル酸緩衝液（cacodylate buffer）中の四酸化オスミウム（osmium tetroxide）１％で１時間処理し、０．５％酢酸ウラニル（uranul acetate）で４℃で一日間処理した。エタノールで脱水した後、サンプルをSpurr樹脂に包埋させた。ウルトラミクロトーム（ultramicrotome，ＥＭ ＵＣ７，Leica，Germany）を使用して試片を切断し、分析結果は図１９に示した。
【0090】
蛍光顕微鏡
カプセル化されたβ細胞スフェロイドの積層回数別の細胞カプセル化程度を確認するために、蛍光イメージを観察した。
カプセル化されたβ細胞スフェロイドの積層回数別の細胞カプセル化程度を確認するために、蛍光イメージを観察した。
【0091】
β細胞スフェロイドをＧＣ－Ｔ－ＲＩＴＣ、ＨＡ－Ｔ－ＦＡでカプセル化した時、積層回数が増加するにつれて蛍光強度が増加することを蛍光顕微鏡（ＥＶＯＳ（登録商標） Cell Imaging Systems、Thermo Fisher Scientific）でイメージングして確認した。
【0092】
その結果は、図２０に示した。
【0093】
〔実験例４〕カプセル化された細胞生存率の確認
カプセル化された細胞生存力を確認するために、カルセイン－ＡＭ（clacein-AM）及びＥｔｈＤ－１（ethidium homodimer-1）を含有するLive/Dead（登録商標） Viability/Cytotoxicity Kitで細胞を染めて分析した。
カプセル化された細胞生存力を確認するために、カルセイン－ＡＭ（clacein-AM）及びＥｔｈＤ－１（ethidium homodimer-1）を含有するLive/Dead（登録商標） Viability/Cytotoxicity Kitで細胞を染めて分析した。
【0094】
カルセイン－ＡＭは、細胞間の直接接触で形成される細胞トンネルを通じてのみ隣接細胞に伝達される。細胞膜を通過したカルセイン－ＡＭは、細胞内のエステル加水分解酵素（esterase）によってアセトキシメチルエステル（acetoxymethyl ester）結合が切れてカルセイン（calcein）に分離しながら膜透過性を失って細胞内に留まる。これを顕微鏡、Fluorometer、Flow cytometryなどで測定した緑色蛍光量は、生きている細胞の膜透過性とエステル加水分解酵素の活性の有無によって決定されるので、細胞活性をそのまま反映する。
【0095】
ＥｔｈＤ－１は、細胞膜が損傷した死んだ細胞のみに入って核酸と結合しながら赤色蛍光を帯びる。
【0096】
染色された細胞を蛍光顕微鏡（ＥＶＯＳ（登録商標） Cell Imaging Systems、Thermo Fisher Scientific）でイメージングした後、細胞を別途の４個のフィールドで計数して生きている細胞の百分率を計算した。増殖のために、alamarBlue（登録商標）試薬を使用して２４時間の間隔で３日または４日間細胞代謝を測定した。測定した試薬の蛍光は、初日の値で標準化した。結果は、図２１に示した。図２１のＡは、カプセル化していないJurkat細胞と実施例１によって６層でカプセル化されたJurkat細胞との生存率を視覚化した写真である。図２１のＢは、ハイドロゲルナノフィルムカプセル化層数による細胞生存率を示すグラフである。図２１のＣは、カプセル化層数及び経時的な細胞増殖率を示すグラフである。
【0097】
〔実験例５〕カプセル化層の持続力の確認
酵素の架橋有無による細胞カプセル化層の持続力を確認するために、経時的なカプセル化層の蛍光強度を確認した。
酵素の架橋有無による細胞カプセル化層の持続力を確認するために、経時的なカプセル化層の蛍光強度を確認した。
【0098】
ＧＣ－Ｔ－ＲＩＴＣ及びＨＡ－Ｔ－ＦＡを用いてβ細胞スフェロイドをカプセル化し、カプセル化時に、酵素の使用有無（－Ｔｙまたは＋Ｔｙ）によるカプセル化層の持続力を蛍光顕微鏡（ＥＶＯＳ（登録商標） Cell Imaging Systems、Thermo Fisher Scientific）でイメージングした。その結果は、図２２のＡに示し、酵素を使用した場合、（＋Ｔｙ）細胞の体外培養６日後まで蛍光を保持することを確認した。
【0099】
また、２Ｄ状態の細胞層にＧＣ－Ｔ－ＲＩＴＣとＨＡ－Ｔとを用いてカプセル化し、マイクロプレートリーダー（Infinite M200 PRO，ＴＥＣＡＮ，Switzerland）を使用して、同様に酵素の使用有無によるカプセル化層の持続力を励起（excitation）５４３ｎｍ、放出（emission）５８０ｎｍで２４時間ごとに測定した。その結果は、図２２のＢに示し、カプセル化された細胞は、４８時間目にも細胞の解離が抑制されることを確認した。
【0100】
〔実験例６〕ブドウ糖に対するカプセル化細胞の反応の確認
カプセル化細胞の積層回数によるインスリン分泌能及び関連遺伝子発現を確認するために、インスリンＥＬＩＳＡ（enzyme-linked immunosorbent assay）分析を実施した。本発明のカプセル化層は、ブドウ糖、アミノ酸、インスリンなど低分子の細胞内、外部拡散が自在である。Ｌ６カプセル化層は、２０ｋＤａ及び７０ｋＤａのＦＩＴＣ－デキストラン両方で低い拡散率を示すが、５．８ｋＤａのインスリン分泌は妨害しない。
カプセル化細胞の積層回数によるインスリン分泌能及び関連遺伝子発現を確認するために、インスリンＥＬＩＳＡ（enzyme-linked immunosorbent assay）分析を実施した。本発明のカプセル化層は、ブドウ糖、アミノ酸、インスリンなど低分子の細胞内、外部拡散が自在である。Ｌ６カプセル化層は、２０ｋＤａ及び７０ｋＤａのＦＩＴＣ－デキストラン両方で低い拡散率を示すが、５．８ｋＤａのインスリン分泌は妨害しない。
【0101】
ＧＣ－Ｔ、ＨＡ－Ｔを用いてカプセル化されたβ細胞スフェロイドをそれぞれ１日、７日後にＥＬＩＳＡ分析してインスリン分泌量を測定した。
【0102】
低血糖及び高血糖の溶液でインスリンレベルを確認した結果を図２３のＡ及びＢに示した。
【0103】
また、インスリン分泌量を分析するために、カプセル化されたβ細胞スフェロイドサンプルを３．３ｍＭの低濃度ブドウ糖（D-Glucose）、２０ｍＭの高濃度ブドウ糖の溶液でそれぞれ２時間ずつ培養した後、上澄み液を収得した。以後、マウスインスリン（mouse insulin）ＥＬＩＳＡ（８０ＩＮＳＭＳ－Ｅ０１，ＡＬＰＣＯ）キットを用いてインスリンの濃度を分析した。
【0104】
高濃度ブドウ糖の溶液でのインスリン分泌量を低濃度ブドウ糖の溶液でのインスリン分泌量で割った値でブドウ糖反応性（glucose sensitivity）を確認して、図２３のＣに示した。
【0105】
また、ブドウ糖及びインスリン関連遺伝子であるＧＬＵＴ－２、ＩＮＳ－１、ＩＮＳ－２の発現程度を比較するために、重合酵素連鎖反応（polymerase chain reaction）を進行した。スフェロイドサンプルをトリゾール（Trizol）溶液５００μｌが入れられたチューブに移し、クロロホルム（Chloroform）溶液１００μｌを追加して、２１，０５５ｘｇ、２０分、４℃の条件で遠心分離した。透明な水溶液層を収得した後、イソプロパノール（Isopropanol）２５０μｌを追加して、２１，０５５ｘｇ、２０分、４℃の条件で遠心分離した。上澄み液を除去した後、７５％エタノール５００μｌで洗浄し、沈殿されたサンプルを蒸留水に溶解した。６０℃で１０分間変性（denaturation）させた後、ＥＺ０６６Ｍ（Enzynomics，Korea）キットを用いてｃＤＮＡを製作した。
【0106】
ＧＬＵＴ－２、ＩＮＳ－１、ＩＮＳ－２遺伝子の発現程度は、StepOnePlusTM Real-Time PCR system（Applied Biosystems）装備とSYBR Green PCR Mastermixとを用いて分析した。
【0107】
その結果、インスリン合成及び分泌に関連したβ細胞関連遺伝子ＧＬＵＴ－２、ＩＮＳ－１、ＩＮＳ－２の積層回数別の変化を示すグラフを図２３のＤに示した。
【0108】
〔実験例７〕カプセル化細胞のタンパク質分解酵素及び物理的ストレス抵抗性の確認
β細胞スフェロイドのカプセル化有無によって、タンパク質分解酵素である０．０５％トリプシン（Trypsin）溶液でそれぞれ３０分間培養した後、軽くピペッティングして（pipetting）、経時的に分解される程度を観察した。
β細胞スフェロイドのカプセル化有無によって、タンパク質分解酵素である０．０５％トリプシン（Trypsin）溶液でそれぞれ３０分間培養した後、軽くピペッティングして（pipetting）、経時的に分解される程度を観察した。
【0109】
また、β細胞スフェロイドのカプセル化有無によって、タンパク質分解酵素である１０ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼ２（Collagenase Type2）溶液で最大１８時間培養後、分解程度を観察した。
【0110】
また、β細胞スフェロイドのカプセル化有無によって、物理的ストレス（遠心分離）に耐える程度を確認するために、自然スフェロイドまたはカプセル化されたβ細胞スフェロイドグループを８０ｘｇ及び１０７３ｘｇの条件でそれぞれ５分間遠心分離を進行した後、確認した。
【0111】
その結果は、図２４に示した。
【0112】
トリプシンまたはコラゲナーゼ２を処理した自然スフェロイドグループは、崩壊して軽いピペッティングで容易に解離された一方、カプセル化されたスフェロイドグループは、細胞の分離が少なく、その構造を保持した。
【0113】
また、物理的ストレスに対して、低い遠心速度では自然スフェロイド及びカプセル化されたスフェロイドグループいずれも球状を保持したが、高速では自然スフェロイドが崩壊した。一方、Ｌ６カプセル化スフェロイドグループは、高圧を耐えることから耐久性があることを確認した。
【0114】
〔実験例８〕カプセル化細胞のサイトカイン抵抗性の確認
カプセル化されたβ細胞スフェロイドのサイトカイン抵抗性を確認した。
カプセル化されたβ細胞スフェロイドのサイトカイン抵抗性を確認した。
【0115】
炎症誘導サイトカイン（cytokine）であるＴＮＦ－αは、β細胞の細胞死（apoptosis）を誘導するが、カプセル化層のＴＮＦ－α接近の遮断如何をＰＣＲを通じて分析した。培養条件に１０ｎＭの濃度のＴＮＦ－αを追加して培養し、４８時間後、ＰＣＲを通じて自然スフェロイド群とカプセル化されたスフェロイド群との細胞死関連遺伝子の発現程度を比較した。ＰＣＲ方式は、前記に説明したものと同じであり、遺伝子は、ｐ５３とＣaspase-3とを選定した。
【0116】
その結果は、図２５に示した。カプセル化されたスフェロイド群は、サイトカイン攻撃を防御することによって、ＴＮＦ－α処理に反応しないことを確認した。このような結果は、２０ｋＤａに近い分子量を有したサイトカインが、６層のハイドロゲルナノフィルムを有するＬ６カプセル化細胞を通じて拡散することができないことを示す。
【0117】
一方、自然スフェロイド群は、細胞周期及び細胞死に関与するｐ５３とCaspase-3のような細胞遺伝子が相当なレベルに増加した。
【0118】
〔実験例９〕カプセル化細胞の免疫細胞の遮断確認
カプセル化細胞の免疫細胞の遮断如何を確認するために、カプセル化されたβ細胞スフェロイドとナチュラルキラー細胞（NK92c cell）とを共培養した。細胞－細胞接触で、β細胞を攻撃するナチュラルキラー細胞との共培養を通じてカプセル化層の免疫細胞接触の遮断如何を確認した。
カプセル化細胞の免疫細胞の遮断如何を確認するために、カプセル化されたβ細胞スフェロイドとナチュラルキラー細胞（NK92c cell）とを共培養した。細胞－細胞接触で、β細胞を攻撃するナチュラルキラー細胞との共培養を通じてカプセル化層の免疫細胞接触の遮断如何を確認した。
【0119】
β細胞スフェロイドサンプルは、CellTrackerTM Green（Invitrogen）、ナチュラルキラー細胞（NK-92 cell）は、cellTrace Far-red（Invitrogen）を用いてそれぞれ蛍光染色し、Chamlide TC incubator system（Live-cell Instrument，Korea）を用いて培養及びイメージングした。
【0120】
その結果は図２６に示し、カプセル化されたβ細胞スフェロイドには、ナチュラルキラー細胞の接触が少なく、スフェロイドのサイズも保持されることを確認した。これに比べて、自然スフェロイドには、ナチュラルキラー細胞の接触が高く、面積が迅速に減少することを確認した。
【0121】
前記の結果から確認できるように、細胞に及ぼす毒性なしにナノメートル厚さのハイドロゲルナノフィルムを細胞の外郭に形成することができ、ナノフィルムを構成する高分子間の共有結合の形成で安定性を向上させうる。また、適切な厚さを容易に形成しうるので、細胞と外部環境との間の物質交換が円滑であって、細胞を保護しながら機能を保持することができる。
【0122】
以上の説明は、本発明の技術思想を例示的に説明したものに過ぎないものであって、当業者ならば、本発明の本質的な特性から外れない範囲で多様な修正及び変形が可能である。また、本発明に開示された実施例は、本発明の技術思想を限定するためのものではなく、説明するためのものであり、このような実施例によって、本発明の技術思想の範囲が限定されるものではない。本発明の保護範囲は、特許請求の範囲によって解釈されねばならず、それと同等な範囲内にあるあらゆる技術思想は、本発明の権利範囲に含まれていると解釈されねばならない。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
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【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
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【図24】
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【図26】
【国際調査報告】