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特表2023-520611複製欠損性鳥類アデノウイルスベクター、その設計および使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-05-17
(54)【発明の名称】複製欠損性鳥類アデノウイルスベクター、その設計および使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/861 20060101AFI20230510BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230510BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20230510BHJP
A61K 35/761 20150101ALI20230510BHJP
C12N 15/33 20060101ALN20230510BHJP
【ＦＩ】
C12N15/861 Z
C12N5/10
C12N7/01
A61K35/761
C12N15/33
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023502876
(86)(22)【出願日】2021-03-29
(85)【翻訳文提出日】2022-11-22
(86)【国際出願番号】 US2021024576
(87)【国際公開番号】W WO2021202331
(87)【国際公開日】2021-10-07
(31)【優先権主張番号】63/001,361
(32)【優先日】2020-03-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
２．ＰＬＵＲＯＮＩＣ
(71)【出願人】
【識別番号】522382691
【氏名又は名称】グレフェックス， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】シュテルツ， ウーベ ディー．
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA95Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065AC20
4B065BA01
4B065CA24
4B065CA45
4C087AA01
4C087BC83
4C087CA12
(57)【要約】
本明細書に開示される実施形態は、アビアデノウイルス系の複製欠損性遺伝子送達ベクターの設計、操作および生産に関する。より詳細には、遺伝子の導入、細胞および動物の遺伝子操作、タンパク質の発現、ワクチンの開発における該ベクターの使用が記載される。いくつかの実施形態では、部分的に欠失したアビアデノウイルスベクターの設計およびパッケージングが開示される。他の実施形態では、完全に欠失したアビアデノウイルスベクターの設計およびパッケージング、複製欠損性アビアデノウイルスベクターの増殖、ならびに宿主細胞の特徴および操作が開示される。他の実施形態では、獣医学における当該ベクターの使用が記載される。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
欠失アビアデノウイルスゲノムを含むアビアデノウイルス遺伝子導入ベクターであって、複製欠損性であり、そのゲノムが部分的に欠失している、アビアデノウイルスベクター。
【請求項2】
アビアデノウイルスベクターが、アビアデノウイルスとして同定された異なる種および血清型のうちの１つに由来する、請求項１に記載のアビアデノウイルス遺伝子導入ベクター。
【請求項3】
アビアデノウイルスベクターが、家禽アビアデノウイルスＡ、ファルコンアビアデノウイルスＡ、ウズラ気管支炎ウイルス、産卵低下症候群ウイルス、出血性腸炎ウイルス、大理石脾疾患ウイルスおよび封入体肝炎ウイルスに由来する、請求項１に記載のアビアデノウイルス遺伝子導入ベクター。
【請求項4】
アビアデノウイルスゲノムが、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ領域に対応するオープンリーディングフレームを機能的に欠失している、請求項３に記載のアビアデノウイルス遺伝子導入ベクター。
【請求項5】
アビアデノウイルスベクターが、ニワトリ胚致死オーファン（ＣＥＬＯ）ウイルスに由来する、請求項１に記載のアビアデノウイルス遺伝子導入ベクター。
【請求項6】
アビアデノウイルスゲノムが、オープンリーディングフレーム１、１５および２を部分的に欠失している、請求項５に記載のアビアデノウイルス遺伝子導入ベクター。
【請求項7】
オープンリーディングフレーム１、１５および２が、異種導入遺伝子によって部分的に置き換えられている、請求項５に記載のアビアデノウイルス遺伝子導入ベクター。
【請求項8】
ＣＥＬＯゲノムのオープンリーディングフレーム１、１５および２が発現する、アビアデノウイルス相補的ゲノムコンストラクト。
【請求項9】
オープンリーディングフレーム１、１５および２が、ＣＥＬＯゲノム断片と共に担持される、請求項９に記載のアビアデノウイルス相補的ゲノムコンストラクト。
【請求項10】
オープンリーディングフレーム１、１５および２が、発現ベクターから発現する、請求項９に記載のアビアデノウイルス相補的ゲノムコンストラクト。
【請求項11】
鳥類細胞を含む、アビアデノウイルスベクターのためのパッケージングおよび宿主細胞。
【請求項12】
細胞が、アデノウイルスＥ１ＡおよびＥ１Ｂ領域に対応する遺伝子を発現したコンストラクトでトランスフェクトされている、請求項１１に記載のパッケージングおよび宿主細胞。
【請求項13】
細胞が、ＣＥＬＯオープンリーディングフレーム２２および８を包含したコンストラクトでトランスフェクトされている、請求項１１に記載のパッケージングおよび宿主細胞。
【請求項14】
（１）複製欠損性アビアデノウイルスベクター；（２）相補的アビアデノウイルスコンストラクト；
（３）鳥類のパッケージングまたは宿主細胞；および
（４）鳥類パッケージングまたは宿主細胞への複製欠損性アビアデノウイルスベクターおよび相補的アビアデノウイルスコンストラクトのコトランスフェクション
を含む、複製欠損性アビアデノウイルスベクターのための複製およびカプシド形成スキーム。
【請求項15】
パッケージングシグナルΨが欠失したＣＥＬＯアビアデノウイルス由来ゲノムを含む、アビアデノウイルスパッケージング発現ベクター。
【請求項16】
そのゲノムが、そのＩＴＲのうちの少なくとも１つを欠失している、請求項１５に記載のアビアデノウイルスパッケージング発現ベクター。
【請求項17】
そのゲノムが、オープンリーディングフレーム９、１０および１１を機能的に欠失している、請求項１５に記載のアビアデノウイルスパッケージング発現ベクター。
【請求項18】
（１）完全に欠失した「中身抜き（ｇｕｔｔｅｄ）」アビアデノウイルスベクター；（２）アビアデノウイルスパッケージング発現ベクターコンストラクト；
（３）鳥類のパッケージングまたは宿主細胞；および
（４）完全に欠失した「中身抜き」アビアデノウイルスベクターおよびアビアデノウイルスパッケージング発現ベクターコンストラクトの鳥類パッケージングまたは宿主細胞へのコトランスフェクション
を含む、完全に欠失した「中身抜き」アビアデノウイルスベクターのための複製およびカプシド形成スキーム。
【請求項19】
遺伝子導入ベクターとして使用される、請求項１４に記載のカプシド形成された複製欠損性アビアデノウイルスベクター。
【請求項20】
ワクチン接種に使用される、請求項１４に記載のカプシド形成された複製欠損性アビアデノウイルスベクター。
【請求項21】
遺伝子導入ベクターとして使用される、請求項１８に記載のカプシド形成された複製欠損性アビアデノウイルスベクター。
【請求項22】
ワクチン接種に使用される、請求項１８に記載のカプシド形成された複製欠損性アビアデノウイルスベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、遺伝子導入ベクターの構成、ならびに細胞、組織および器官へ核酸を導入するための該ベクターの使用、特に動物の遺伝子工学およびワクチン接種などの獣医学で適用するための該ベクターの使用に関する。
【背景技術】
【0002】
動物およびヒトのアデノウイルスは、感染因子として、基礎研究の対象として、ならびに遺伝子治療およびワクチン接種などの遺伝子医薬におけるそれらの潜在的使用のために広く研究されている。アデノウイルス科には５つの属がある。それらは、動物のもの、アタデノウイルス、アビアデノウイルス（ＡＡｄ、鳥）、イクタアデノウイルス、シアデノウイルスおよびマストアデノウイルスである。最もよく調べられた例は、マストアデノウイルス、すなわちヒトアデノウイルスであり、４９の血清型が同定され、６つの種または亜属（Ａ～Ｆ）に分類されている。アビアデノウイルス（ＡＡｄ）または鳥類アデノウイルスは、主に鳥綱または鳥類の動物に感染する。現在、ＡＡｄの８種および１０の血清型が同定されている。
【0003】
アデノウイルスのゲノムは、アデノウイルスの複製に不可欠な逆方向末端反復配列（ＬＩＴＲおよびＲＩＴＲ）が両側に隣接している。Ψと呼ばれるパッケージングシグナルは、ＬＩＴＲに隣接して配置される。アデノウイルスの感染サイクルは、血清型５のヒトアデノウイルスなどの標準的なアデノウイルスで例示されるように、初期および後期に分けられる。初期段階では、ウイルスは脱殻し、ゲノムが核に輸送され、その後、初期遺伝子領域（Ｅ）、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３およびＥ４またはそれらの等価物が転写活性になる。Ｅ１は、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂと呼ばれる２つの領域を含む。Ｅ１Ａ領域（前初期領域と呼ばれることもある）は、宿主細胞周期の改変および他のウイルス転写領域の活性化に関与する２つの主要なタンパク質をコードする。Ｅ１Ｂ領域は、Ｅ１Ａタンパク質の活性に起因するアポトーシスの誘導を異なる経路を介して防止する２つの主要なタンパク質、１９Ｋおよび５５Ｋをコードする。さらに、Ｅ１Ｂ－５５Ｋタンパク質は、選択的ウイルスｍＲＮＡ輸送および宿主タンパク質発現の阻害のために後期で必要とされる。Ｅ２はまた、３つのタンパク質を一緒にコードするＥ２ＡおよびＥ２Ｂ領域に分割される。ＤＮＡ結合タンパク質、ウイルスポリメラーゼおよび前末端タンパク質はすべて、ウイルスゲノムの複製に関与する。Ｅ３領域は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの複製に必要ではないが、ウイルス感染に対して宿主防御機構を破壊するいくつかのタンパク質をコードする。Ｅ４領域は、ウイルスｍＲＮＡのスプライシングおよび輸送、宿主細胞のｍＲＮＡ輸送、ウイルスおよび細胞の転写および形質転換に関連するいくつかの異なる機能に関与する少なくとも６つのタンパク質をコードする。
【0004】
ウイルスカプシドの形成およびウイルスゲノムのパッケージングに必要な後期タンパク質はすべて、ウイルスＤＮＡ複製の開始後に完全に活性になる主要な後期転写単位から生成される。分化したスプライシングおよびポリアデニル化の複雑なプロセスにより、三要素リーダー配列を共有する１５超のｍＲＮＡ種が生じる。初期タンパク質Ｅ１Ｂ－５５ＫおよびＥ４－Ｏｒｆ３およびＯｒｆ６は、後期ｍＲＮＡプロセシングおよび核からの輸送の調節において極めて重要な役割を果たす。予め形成されたカプシドにおける新たに形成されたアデノウイルスゲノムのパッケージングは、Ａｄ５ゲノムの左端に位置するウイルスパッケージングシグナルΨとの相互作用を介して、少なくとも２つのアデノウイルスタンパク質、後期５２／５５ｋおよび中間タンパク質１Ｖａ２によって媒介される。第２の中間タンパク質ｐＩＸはカプシドの一部であり、ヘキソン－ヘキソン相互作用を安定化することが知られている。さらに、ｐＩＸは、ＥＩＡプロモーターおよび主要後期プロモーター（ＭＬＰ）のようなＴＡＴＡ含有プロモーターをトランス活性化することが記載されている。
【0005】
最も明確に定義されているＡＡｄの１つは、ＡＡｄの血清型１を表すニワトリ胚致死オーファン（ＣＥＬＯ）ウイルスである。ＣＥＬＯウイルスゲノムは４３，８０４ｂｐ長であり、完全に配列決定されており、その転写機構が確立されている（図１）。ウイルスゲノムの中央領域は、他のアデノウイルスと強く相同であり、下側鎖は複製機能（ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ結合タンパク質、ｐＴＰ）をコードし、上側鎖は単一の主要な後期プロモーター（ＭＬＰ）の制御下で転写され、カプシド構造タンパク質をコードする。この中央部分の両側には、哺乳動物アデノウイルスのＥ１、Ｅ３およびＥ４領域との配列相同性を有さない少なくとも２２個のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードする２つの領域が存在する。これらの２２個の遺伝子のうち２個のみが研究されており、ＯＲＦ８は、ヒトアデノウイルス亜属Ｅ１Ｂ １９Ｋタンパク質に対する機能的ホモログとして同定されたＧＡＭ－１タンパク質をコードし、ＯＲＦ２２は、ヒトアデノウイルス亜属ＥＩＡタンパク質に類似する網膜芽細胞腫タンパク質と相互作用するタンパク質をコードし、ＧＡＭ－１と協働してＥ２Ｆ経路を活性化する。
【0006】
ＣＥＬＯのいくつかのＯＲＦの機能に関する情報により、どのＣＥＬＯゲノムセグメントおよびＯＲＦがＣＥＬＯウイルスのウイルス複製に必須であるかが確立された。そのようなゲノムセグメントの保存がＣＥＬＯ系ベクターの複製能を提供し、したがってＣＥＬＯ系の複製可能なＡＡｄ遺伝子導入ベクターの構築を可能にするか否かも調べられた。外来遺伝子用の発現カセットをこの領域に挿入して、鳥類におけるワクチン適用に適した複製可能な遺伝子送達ベクターを作製できることが示された。また、ＣＥＬＯ系の複製可能なベクターがヒト細胞に感染し、したがって、未知の結果でヒト対象に感染し得ることも見出された。他の研究では、ゲノムの複製に必要なＣＥＬＯゲノムのセグメントが同定された。欠失断片ｃｉｙｋｄは、部分的に欠失した複製欠損性ＣＥＬＯゲノムの複製およびパッケージングを駆動するためにトランスで提供できることも示された。
【0007】
アデノウイルス系ベクターおよびアデノウイルスパッケージング細胞株
アデノウイルス系ベクターは、様々な細胞型への高レベルの遺伝子導入を達成するための手段として、ワクチン送達ビヒクルとして、組織移植への遺伝子導入のために、遺伝子治療のために、およびそうでなければ高効率でトランスフェクションすることが困難な細胞株および組織において組換えタンパク質を発現させるための手段として使用されてきた。ＥＬを欠失させた複製欠損性ヒトアデノウイルス系ベクターをパッケージングするための現在のシステムは、宿主細胞およびアデノウイルス後期遺伝子の供給源からなる。ＨＥＫ２９３細胞、ＯＢＩ細胞およびＰＥＲＣ．６細胞を含む現在知られているヒト宿主細胞株は、パッケージングに必要な後期アデノウイルス（構造）遺伝子ではなく、初期（非構造）アデノウイルス遺伝子のみを発現する。アデノウイルス後期遺伝子は、シスのアデノウイルスベクター自体によって、またはトランスのヘルパーアデノウイルスビムによって提供される。それらのカプシド形成に必要な遺伝子自体を提供するアデノウイルスベクターは、主にＥ１およびいくつかの場合にはＥ３および他のアデノウイルス領域が欠失した最小限に改変されたアデノウイルスゲノムを有する。複製可能なアデノウイルスベクターの場合、ヒトＡ５４９またはニワトリ肝細胞がん細胞（ＬＭＨ）などの非改変宿主細胞が使用されている。複製欠損性アデノウイルスベクターの場合、宿主細胞に、限定されないが、Ｅ１遺伝子などのアデノウイルスゲノムの左端のセグメントを送達する遺伝子発現コンストラクトを提供した。
アデノウイルス系ベクターは、様々な細胞型への高レベルの遺伝子導入を達成するための手段として、ワクチン送達ビヒクルとして、組織移植への遺伝子導入のために、遺伝子治療のために、およびそうでなければ高効率でトランスフェクションすることが困難な細胞株および組織において組換えタンパク質を発現させるための手段として使用されてきた。ＥＬを欠失させた複製欠損性ヒトアデノウイルス系ベクターをパッケージングするための現在のシステムは、宿主細胞およびアデノウイルス後期遺伝子の供給源からなる。ＨＥＫ２９３細胞、ＯＢＩ細胞およびＰＥＲＣ．６細胞を含む現在知られているヒト宿主細胞株は、パッケージングに必要な後期アデノウイルス（構造）遺伝子ではなく、初期（非構造）アデノウイルス遺伝子のみを発現する。アデノウイルス後期遺伝子は、シスのアデノウイルスベクター自体によって、またはトランスのヘルパーアデノウイルスビムによって提供される。それらのカプシド形成に必要な遺伝子自体を提供するアデノウイルスベクターは、主にＥ１およびいくつかの場合にはＥ３および他のアデノウイルス領域が欠失した最小限に改変されたアデノウイルスゲノムを有する。複製可能なアデノウイルスベクターの場合、ヒトＡ５４９またはニワトリ肝細胞がん細胞（ＬＭＨ）などの非改変宿主細胞が使用されている。複製欠損性アデノウイルスベクターの場合、宿主細胞に、限定されないが、Ｅ１遺伝子などのアデノウイルスゲノムの左端のセグメントを送達する遺伝子発現コンストラクトを提供した。
【0008】
より最近では、すべてのウイルスタンパク質をコードするＤＮＡ配列を欠いている完全に欠失した「中身抜き（ｇｕｔｌｅｓｓ）」アデノウイルスベクターが開発されている。「中身抜き」アデノウイルスベクターは、ウイルスゲノムの末端（ＬＩＴＲおよびＲＩＴＲ）、治療遺伝子などの目的の遺伝子、および正常パッケージング認識シグナル（Ψ）のみを含み、このゲノムを選択的にパッケージングすることを可能にする。しかしながら、「中身抜き」アデノウイルスベクターを増殖させるには、複製およびビリオンの組立てに必要なアデノウイルス遺伝子、ならびにＬＩＴＲ、ＲＩＴＲ、およびΨを含むヘルパーアデノウイルスが必要であった。このヘルパーウイルスに依存性の系は、大きな異種遺伝物質の導入を可能にするが、最大約３５ｋｂの完全に欠失したヒトアデノウイルスベクターの場合、ヘルパーウイルスは、この手法を使用して「中身抜き」アデノウイルスベクターの調製物に混入する。複製可能なヘルパーウイルスの混入は、複製可能なウイルスのために、およびヘルパーウイルスにおけるアデノウイルス遺伝子に対する宿主の免疫応答のために、遺伝子治療、ワクチン、および移植用途にとって深刻な問題を提起する。このヘルパーウイルス依存性ベクター系におけるヘルパー混入を減少させるための１つの手法は、パッケージング認識シグナル（Ψ）に条件付き遺伝子の欠損を導入して、そのＤＮＡがビリオンにパッケージングされる可能性を低くすることであった。
【0009】
そのような系で産生された完全に欠失した「中身抜き」アデノウイルスベクターには、依然としてヘルパーウイルスが著しく混入している。新規な技術では、ヘルパーウイルスを、パッケージングシグナルΨが欠失しているパッケージング発現プラスミドに置き換える。パッケージング発現プラスミドと一緒にベクターゲノムを宿主細胞に共トランスフェクションして、ベクターカプシド形成を開始する。この系は、事前にヘルパーウイルスによる混入を防止し、同時に、複製可能なウイルスの出現をしばしばもたらすウイルス組換えを制限する。ヘルパーウイルスの混入なしで「中身抜き」アデノウイルス遺伝子導入ベクターを産生することができることにより、ヘルパーウイルスの混入が排除され、ヒト対象および動物におけるベクター毒性の低減および遺伝子発現の延長がもたらされる。
【0010】
アデノウイルス遺伝子、特に、最小限に改変されたアデノウイルスベクターまたはアデノウイルスヘルパーウイルスに保有されるアデノウイルス後期遺伝子は、１）アデノウイルス媒介性の遺伝子治療後に見られる炎症応答に寄与し、２）ワクチン適用において目的の遺伝子に対する免疫応答を減少させ、３）正常な細胞機能に干渉し、４）タンパク質発現適用にタンパク質夾雑物をもたらすと考えられている。さらに、内因性アデノウイルス遺伝子は、他の遺伝子情報を保有するために有益に使用され得る最小限に改変されたアデノウイルスベクターで空間を占有する。この１０年間でアデノウイルスベクターは著しい進歩を遂げてきたが、重大な欠点が依然としてその使用を困難にしている。
【0011】
遺伝子治療およびタンパク質発現のためのアデノウイルスベクター
遺伝子送達または遺伝子治療は、後天性疾患および遺伝性疾患の治療のための有望な方法である。異常発現が生命を脅かすヒトの疾患に関連している増え続ける遺伝子アレイをクローニングし同定する。そのようなクローニング遺伝子を発現する能力は、多くの重要なヒトの疾患、現在の治療が不十分であるかまたは存在しない疾患の予防および／または治癒を最終的に可能にする。
遺伝子送達または遺伝子治療は、後天性疾患および遺伝性疾患の治療のための有望な方法である。異常発現が生命を脅かすヒトの疾患に関連している増え続ける遺伝子アレイをクローニングし同定する。そのようなクローニング遺伝子を発現する能力は、多くの重要なヒトの疾患、現在の治療が不十分であるかまたは存在しない疾患の予防および／または治癒を最終的に可能にする。
【0012】
アデノウイルスベクターの初期投与後、主要なウイルスカプシドタンパク質、すなわちペントン、ヘキソンおよび線維のエピトープに対して血清型に特異的な抗体が生成される。そのようなカプシドタンパク質が、アデノウイルスがそれ自体を細胞に付着させ、続いて細胞に感染させる手段であることを考えると、そのような抗体は、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターの同じ血清型による細胞の再感染をブロックし、または「中和する」することができる。これは、遺伝子治療およびワクチンとの関連において外因性治療用ＤＮＡの１つ以上の後続用量を投与するために、異なる血清型のアデノウイルスの使用を必要とし得る。さらに、最小限に改変されたアデノウイルスベクターまたはアデノウイルスヘルパーウイルスが混入したアデノウイルスベクター調製物を使用する場合、治療遺伝子産物およびウイルス遺伝子産物の両方が標的細胞に発現する。これらの抗原は、形質導入された細胞または組織の破壊をもたらす細胞性免疫応答によって認識され、したがって遺伝子治療およびワクチン接種の有益な効果は打ち消され得る。これらの免疫関連障害の結果として、最小限に改変されたウイルスベクターの広範な使用が妨げられてきた。
【0013】
少なくとも５３の異なる形態のヒトアデノウイルス、さらに多数の動物アデノウイルスの特徴が明らかにされてきている。これらの微生物叢の主な識別因子は、カプシドヘキソンタンパク質（Ｌ３遺伝子の様々な対立遺伝子によってコードされる）に対する体液性免疫（すなわち、抗体）応答である。実際、異なるヘキソンタンパク質の変動の大部分は、３つの超可変領域で起き、アデノウイルスに対する体液性免疫応答は、これらの超可変領域に集中している。アデノウイルス表面上の線維タンパク質などの他の構造も、体液性免疫系によって認識され得る。したがって、最小限に改変されたアデノウイルスベクターの活性による体液性免疫応答の干渉は、各適用間でアデノウイルス血清型を切り替えることによって軽減することができる。後期アデノウイルス遺伝子は変動性が少なく、したがって、最小限に改変されたアデノウイルスベクターまたはアデノウイルスヘルパーウイルスによって誘導されるＴ細胞応答は、ベクターのアデノウイルス血清型を切り替えることによって回避することができない。
【0014】
ヒト集団は、特定のアデノウイルス血清型の天然アデノウイルス感染にさらされている。したがって、これらの対象は、これらの血清型のアデノウイルスに基づくこれらのアデノウイルスおよびアデノウイルスベクターによって発現される体液性および細胞性の免疫応答指向遺伝子を保有する。２つの進歩が問題を克服しようとしてきた。それらは、「中身抜き」（完全に欠失している）アデノウイルスベクターの使用、および希少または動物の血清型を発現する希少または動物のアデノウイルスに基づくアデノウイルスベクターの使用である。「中身抜き」アデノウイルスベクターの使用は、Ｌ３などのアデノウイルス遺伝子を治療用ベクターから除去するが、これらの「中身抜き」アデノウイルスベクターの増殖は、依然としてアデノウイルス遺伝子を保有するヘルパーアデノウイルスの存在を必要とする。これらのヘルパーウイルスは、「中身抜き」アデノウイルスベクターの調製における重大な夾雑物である。希少または動物の血清型に基づく最小限に改変されたアデノウイルスベクターの使用は、所与の血清型のアデノウイルスに以前に曝露されたことがある対象において、既存の体液性免疫およびおそらく程度は低いが既存の細胞性免疫の問題を回避し得る。それでも、最小限に改変されたアデノウイルスベクターは、高度に免疫原性のＬ３を含むアデノウイルス遺伝子を発現するため、これらのアデノウイルス遺伝子に対する強力な体液性および細胞性の免疫応答を誘導し得る。したがって、所与の血清型の最小限に改変されたアデノウイルスベクターの反復適用は不可能である。
【0015】
したがって、動物起源のアデノウイルスベクターが研究されている。それらは、動物ウイルス血清型に曝露されていない可能性があるため、ヒトを治療する場合に有用であり得る。さらに、動物アデノウイルスベクターは、アデノウイルスがこの動物に効率的に感染するように選択されているため、それぞれの動物で使用するのにより適している可能性がある。例えば、アビアデノウイルス系ベクターは、ヒトアデノウイルス系のアデノウイルスベクターよりも鳥用のワクチン担体として効率的であり得る。さらに、アビアデノウイルス系ベクターは、ヒトに感染する能力が制限されている場合、特に複製欠損性ベクターとして設計される場合、さらなる安全域を有し得る。
【0016】
ワクチンベクターとしてのアデノウイルス
アデノウイルスベクターは、遺伝子置換治療のためのツールから真正ワクチン送達ビヒクルに移行している。それらは、哺乳動物宿主において自然免疫応答および適応免疫応答の両方を誘導するため、魅力的なワクチンベクターである。アデノウイルスベクターは、マラリア、結核、エボラおよびＨＩＶ－１などの多数の感染、感染疾患のサブユニットワクチン系として送達するために試験されている。さらに、それらは、異なる腫瘍関連抗原に対するワクチンとして研究されてきた。これまでのところ、ほとんどのアデノウイルス的にベクター化されたワクチンは、ヒトおよび動物の血清型の最小限に改変されたアデノウイルスベクターとして構築されている。
アデノウイルスベクターは、遺伝子置換治療のためのツールから真正ワクチン送達ビヒクルに移行している。それらは、哺乳動物宿主において自然免疫応答および適応免疫応答の両方を誘導するため、魅力的なワクチンベクターである。アデノウイルスベクターは、マラリア、結核、エボラおよびＨＩＶ－１などの多数の感染、感染疾患のサブユニットワクチン系として送達するために試験されている。さらに、それらは、異なる腫瘍関連抗原に対するワクチンとして研究されてきた。これまでのところ、ほとんどのアデノウイルス的にベクター化されたワクチンは、ヒトおよび動物の血清型の最小限に改変されたアデノウイルスベクターとして構築されている。
【0017】
アデノウイルス遺伝子発現の動態は、アデノウイルスパッケージング系の設計を困難にし、アデノウイルス初期機能的転写領域（Ｅ１Ａ）遺伝子の発現は、アデノウイルス後期遺伝子（構造遺伝子、免疫原性遺伝子）の発現を誘導し、次に細胞を死滅させる。
【0018】
したがって、アデノウイルス初期遺伝子を構成的に発現する宿主細胞は、野生型アデノウイルス後期シストロンを保持することができない。アデノウイルスベクターを増殖させるための以前の宿主細胞は、真正の「パッケージング」細胞ではなく、パッケージングに必要なアデノウイルス後期遺伝子ではなく、例えば、初期（非構造）アデノウイルス遺伝子のみを発現するヒト細胞、２９３、ＱＢＩおよびＰＥＲＣ ６細胞などであるが、これらに限定されない。アデノウイルス後期、また初期遺伝子も提供されなければならない。それらは、シスの最小限に改変されたアデノウイルスベクターまたはトランスのヘルパーアデノウイルスのいずれかによって以前に提供されている。
【0019】
最小限に改変されたアデノウイルスベクターまたは混入しているヘルパーアデノウイルスに見出されるアデノウイルス遺伝子は、アデノウイルスベクター調製物に対する炎症応答および免疫応答に寄与し、アデノウイルス系ワクチンの目的の遺伝子に対する免疫応答を減少させ、正常な細胞機能に干渉し、アデノウイルス系タンパク質の発現における混入に寄与する。
【0020】
アデノウイルスベクターは、主にヒト治療のために、およびヒトワクチンの担体として使用されてきた。ヒトおよび霊長類の両アデノウイルスベクターが、広範な体液性免疫応答および細胞性免疫応答を誘導する非常に効率的であることが証明されている。ヒトアデノウイルスベクター系ワクチンは、鳥類などの動物において免疫原性を示したが、それらの有効性は、高用量を必要とすることが少なく、したがってコストが高いことが証明された。したがって、この種で使用される所与の動物種由来のアデノウイルス遺伝子導入ベクターを作製する戦略を開発することが必要であろう。この手法は、非常に効率的で強力なワクチン担体の製造をもたらす。これらのワクチンを完全に欠失した「中身抜き（ｇｕｔｔｅｄ）」ワクチンとして製造することにより、免疫応答がさらに集中し、抗アデノウイルス免疫応答の誘導が制限される。さらに、完全に欠失した「中身抜き」アデノウイルスベクターは、いくつかの疾患に対するいくつかの導入遺伝子の送達を可能にする大きなペイロードを提供する。したがって、単一のコンストラクトを広範な混合ワクチンの基礎として使用することができる。
【発明の概要】
【0021】
大容量遺伝子導入ベクターの系が、鳥綱または鳥類の動物における獣医学的適用のために記載されている。これらのベクターは、アビアデノウイルス（ＡＡｄ）に基づく。一態様では、本発明により、ＣＥＬＯ ＡＡｄに基づく遺伝子導入ベクターによって例示されるがこれらに限定されないこれらのベクターの一般的な設計が記載される。別の態様では、これらのベクターは、限定されるものではないが、同定された８種のＡＡｄおよび１０の血清型のＡＡｄなどの他のＡＡｄウイルスに基づく。そのようなＡＡｄウイルスの非限定的な例は、家禽アビアデノウイルスＡ、ファルコンアビアデノウイルスＡ、ウズラ気管支炎ウイルス、産卵低下症候群ウイルス、出血性腸炎ウイルス、大理石脾疾患ウイルスおよび封入体肝炎ウイルスである。
【0022】
一態様では、本発明により、異種遺伝子配列などの治療導入遺伝子の送達能力を増強し、それらの安全性プロファイルを強化するために複製欠損ベクターとして設計された部分的および完全に欠失したＡＡｄ系ベクターの構築および使用が記載される。ワクチン担体としての当該ベクターの使用が特に考慮される。
【0023】
一態様では、本発明はまた、異なる複製欠損性ＡＡｄベクターの複製およびカプシド形成に使用される宿主細胞の同定および遺伝子改変に部分的に基づく。一態様では、本発明により、鳥類においてだけでなく、ヒトを含む他の動物においても遺伝子導入ベクターとして使用される当該ＡＡｄ系ベクターの使用も記載される。ワクチンの開発のための当該ベクターの使用が特に考慮される。
【0024】
一態様では、本発明は、ゲノムに１つ以上の導入遺伝子発現コンストラクトを担持するワクチンコンストラクトを提供する。ワクチンコンストラクトは、プロモーター、配列内リボソーム進入部位によって分離された導入遺伝子または導入遺伝子のセット、およびポリアデニル化部位を有する発現カセットとして設計される。導入遺伝子は、ウイルス、細菌、原虫、プリオンおよび線虫などの異なる感染性病原体に由来し得るが、これらに限定されない。導入遺伝子は、発現が悪性増殖に関連する単数または複数のタンパク質をコードすることができる。この導入遺伝子配列は、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＭＬＰ）、アデノウイルス三要素リーダー（ＴＰＬ）配列、アデノウイルススプライスアクセプター配列、および／またはアデノウイルスポリアデニル化シグナル配列の制御下にあるか、または動作可能に連結され得る。特定の態様では、導入遺伝子発現カセットは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、もしくはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、または当該要素の任意の組み合わせに由来するエンハンサー、プロモーター、イントロン配列、および／またはリーダー配列などの非アデノウイルス転写および／または翻訳制御配列を含むおよび／またはその制御下にある。特定の実施形態では、導入遺伝子配列は、発現を増加させるように改変される。例えば、導入遺伝子配列は、コドン最適化され、および／またはコザック共通配列を含むように改変され得る。特定の実施形態では、導入遺伝子配列は、インフルエンザウイルス、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、バチルス属、シゲラ属、マイコバクテリウム、プラスモジウムなどの感染性病原体に由来する免疫原性ポリペプチドをコードする。特定の実施形態では、導入遺伝子配列は、感染性病原体に由来する少なくとも２つの別個のポリペプチドおよび／または免疫原性エピトープの多量体をコードする。
【0025】
他の目的および特徴は、部分的に明らかであり、以下に部分的に指摘される。
【図面の簡単な説明】
【0026】
【発明を実施するための形態】
【0027】
本明細書で使用される場合、以下の用語は以下の意味を有するものとする。
【0028】
「アデノウイルスベクター」という用語は、野生型、変異体、および／または組換えのアデノウイルスゲノム、ならびに当該ゲノムを含むアデノウイルスを指す。アデノウイルスベクターは、任意のアデノウイルス血清型のゲノムの全部または一部、ならびにそれらの組み合わせ（すなわち、ハイブリッドゲノム）を含むことができる。
【0029】
「アビアデノウイルスベクター」という用語は、鳥綱または鳥類の動物に優先的に見られるアデノウイルスに由来するアデノウイルスベクターを指す。
【0030】
「感染病原体」という用語は、感染し、健康の悪化を引き起こし、および／または免疫応答を誘発することができる任意の薬剤を指す。特定の実施形態では、感染性病原体は、インフルエンザウイルス、レトロウイルス（例えば、ＨＩＶ、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、ヒト内因性レトロウイルスＫ（ＨＥＲＶ－Ｋ））、ヒト内因性レトロウイルスＫ（ＨＥＲＶ－Ｋ）、パピローマウイルス（例えば、ヒトパピローマウイルス）、ピコルナウイルス（例えば、Ａ型肝炎、ポリオウイルス）、ヘパドナウイルス（例えば、Ｂ型肝炎）、フラビウイルス（例えば、Ｃ型肝炎、黄熱ウイルス、デング熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、西ナイルウイルス）、トガウイルス（例えば、チクングニアウイルス、東部ウマ脳炎（ＥＥＥ）ウイルス、西部ウマ脳炎（ＷＥＥ）ウイルス、ベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）ウイルス、）、ヘルペスウイルス（例えば、サイトメガロウイルス）、パラミクソウイルス（パラインフルエンザウイルス、肺炎ウイルス、細気管支炎ウイルス、風邪ウイルス、麻疹ウイルス、おたふくかぜウイルス）、ラブドウイルス（例えば、狂犬病ウイルス）、フィロウイルス（例えば、エボラウイルス）、ブニヤウイルス（例えば、ハンタウイルス、リフトバレー熱ウイルス）、カリシウイルス（例えば、ノロウイルス）、またはレオウイルス（例えば、ロタウイルス、エプスタイン・バーウイルス、単純ヘルペスウイルス１型および２型）などのウイルスである。
【0031】
他の実施形態では、感染性病原体は、グラム陰性菌、グラム陽性菌、または他の種類の細菌などの原核生物である。そのような原核生物には、バチルス属（例えば、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ））、マイコバクテリウム（例えば、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、らい菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｌｅｐｒａｅ））、シゲラ属（例えば、シゲラ・ソネイ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ）、志賀赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、シゲラ・フレックスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ））、ヘリコバクター（例えば、ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ））、サルモネラ属（例えば、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）、サルモネラ・チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ））、ナイセリア（例えば、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ））、モラクセラ（例えば、カタル球菌（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ））、ヘモフィルス（例えば、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ））、クレブシエラ属（例えば、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））、レジオネラ（例えば、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ））、シュードモナス属（例えば、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ））、アシネトバクター（例えば、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ））、リステリア（例えば、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ））、スタフィロコッカス属（例えば、メチシリン耐性、多剤耐性またはオキサシリン耐性の黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ））、ストレプトコッカス（例えば、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ））、コリネバクテリウム（例えば、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ））、クロストリジウム（例えば、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ））、クラミジア（例えば、肺炎クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ））、カンフィロバクター（例えば、カンフィロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ））、ボルデテラ（例えば、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ））、エンテロコッカス（例えば、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・フェカム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｕｍ）、バンコマイシン耐性腸球菌（Ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）（ＶＲＥ））、ビブリオ（例えば、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ））、エルシニア属（例えば、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ））、バークホルデリア（例えば、セパシア菌群（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ ｃｏｍｐｌｅｘ））、コクシエラ（例えば、コクシエラ・ブルネッティ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｔｉ））、フランシセラ（例えば、野兎病（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ））および大腸菌属（例えば、ＥＴＥＣ、ＥＨＥＣ、ＥＰＥＣ、ＥＩＥＣおよびＥＡＥＣなどの、腸内毒素原性、腸管出血性または志賀毒素産生の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））が含まれるが、これらに限定されない。
【0032】
さらに他の実施形態では、感染性病原体は真核生物である。真核生物の例には、プラスモジウム（例えば、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）、卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ）、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ）プラスモジウム下痢）などの原生生物、ならびにカンジダ属（例えば、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ））、アスペルギルス（例えば、アスペルギルス・フミガツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ））、クリプトコッカス（例えば、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ））、ヒストプラズマ（例えば、ヒストプラズマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ））、ニューモシスチス（例えば、ニューモシスチス・ジロベシ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ））およびコクシジオイデス（例えば、コクシジオイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ））などの真菌が含まれるが、これらに限定されない。
【0033】
「がん」、「がん性」、「悪性腫瘍」および「悪性（ｍａｌｉｇｎａｎｔ）」という用語は、特定の細胞集団の増殖における異常な増加を特徴とする医学的状態を指す。がん性細胞は、例えば、皮膚、筋肉、肺、心臓、肝臓、腎臓、神経組織などを含む任意の組織または器官に由来し得る。特定の実施形態では、がんは良性である（例えば、良性腫瘍）。他の実施形態では、がんは悪性（例えば、悪性腫瘍）である。特定の実施形態では、がんは転移性（すなわち、がん細胞は、起源の場所から別の組織または器官に移動することができる）である。
【0034】
本明細書全体を通して、必要に応じて追加の用語を定義するものとする。
【0035】
本発明は、組換えアデノウイルスワクチンに関する。本発明は、部分的には、異種配列または導入遺伝子を高レベルで発現する新規な組換えアデノウイルスベクターの開発に基づく。本発明はまた、一部には、宿主免疫応答を改善し、既存の中和抗体を回避するように設計された新規組換えアデノウイルスベクターの開発に基づく。本発明はまた、抗原特異的および／または万能インフルエンザワクチンとして使用される新規組換えアデノウイルスベクターの開発に部分的に基づく。
【0036】
したがって、一態様では、本発明は、導入遺伝子配列を含むアデノウイルスベクターを提供する。本明細書で使用される場合、「導入遺伝子配列」は、アデノウイルスベクターへの組み込み時に、アデノウイルス配列と核酸配列との天然に存在しない並置を生じる核酸配列である。典型的には、導入遺伝子配列は、非アデノウイルス起源の核酸配列を含むであろう。例えば、導入遺伝子配列は、完全に、大部分が、または部分的に非アデノウイルス（例えば、アデノウイルス配列および非アデノウイルス配列のモザイク）起源であり得る。しかしながら、いくつかの例では、導入遺伝子配列は完全にアデノウイルス起源であり、例えば、アデノウイルスの一種に由来するアデノウイルス配列は、異なる種類のアデノウイルスから作製されたアデノウイルスベクターに組み込まれ得る。例えば、アデノウイルスの一種に由来するヘキソンまたは線維タンパク質をコードするアデノウイルス配列を、異なる種類のアデノウイルスから作製されたアデノウイルスベクターに組み込んで、異なる血清型由来の線維タンパク質を有する組換えアデノウイルスおよび／またはキメラヘキソンおよびフ線維タンパク質を有するアデノウイルスを作製することができる。導入遺伝子配列を含むアデノウイルスベクターは、例えば、感染性病原体またはがん性細胞に対するワクチンとして有用であり得る。したがって、導入遺伝子配列は、感染性病原体由来の抗原をコードすることができる。あるいは、導入遺伝子配列は、がん性細胞に関連する抗原をコードすることができる。
【0037】
特定の実施形態では、導入遺伝子配列は、感染性病原体によって産生されるタンパク質の全部または一部をコードする。タンパク質またはその断片（例えば、切断産物、構造ドメイン、二次構造の単位、Ｂ細胞エピトープ、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープ、ヘルパーＴリンパ球（ＨＴＬ）エピトープなど）は、感染性病原体の表面に位置し得る。例えば、タンパク質またはその断片は、高度に抗原性であり、細胞標的化に関与し、および／または細胞侵入に関与し得る。あるいは、タンパク質またはその断片（例えば、切断産物、構造ドメイン、二次構造の単位、ＨＴＬエピトープまたはＣＴＬエピトープなど）は、感染性病原体の内部に位置し得る。例えば、タンパク質またはその断片は、細胞内タンパク質、エンベロープウイルスのカプシドまたはコアタンパク質、非エンベロープウイルスのコアタンパク質などであり得る。
【0038】
特定の実施形態では、エピトープ、構造ドメイン、または二次構造の単位は進化的に保存されている。本明細書で使用される場合、「進化的に保存された」という用語は、配列が特定の感染性病原体の多様な株群の間で少なくとも約５０％保存されていることを意味する。ウイルスの場合、多様な株群は、ワクチンの標的集団に感染し、それによって疾患または疾病を引き起こすことができる同定された各亜分類（例えば、血清型）からの少なくとも１つの分離株、またはそのような株の既知の多様性を含む代表的な数の感染性分離株を含む。例えば、特定の実施形態では、多様なインフルエンザ株群には、ヒト、ブタ、および／または鳥の疾患に関連する代表的な株が含まれ、Ｈ１Ｎ１株（例えば、Ａ／ウィルソン－スミス（Ｗｉｌｓｏｎ－Ｓｍｉｔｈ）／３３、Ａ／ニューカルクドニア（Ｎｅｗ Ｃａｌｃｄｏｎｉａ）／２０／９９、Ａ／ブタ韓国／Ｓ１０／２００４、Ａ／ブレビグミッション（Ｂｒｅｖｉｇ Ｍｉｓｓｉｏｎ）／１／１９１８、Ａ／プレトリコ（Ｐｕｒｅｔｏ Ｒｉｃｏ）／８／３４／マウントサイナイ（Ｍｏｕｎｔ Ｓｉｎａｉ）、Ａ／カリフォルニア／７／２００９、Ａ／カリフォルニア／０５／２００９、Ａ／カリフォルニア／０８／２００９、Ａ／テキサス／０４／２００９、Ａ／ブタ／サスカチュワン（Ｓａｓｋａｔｃｈａｗａｎ）／１８７８９／０２、Ａ／マガモ（ｍａｌｌａｒｄ）／アルバータ（Ａｌｂｅｒｔａ）／１３０／２００３、Ａ／マガモ／アルバータ／２００１、Ａ／ブタ／コートダモール（Ｃｏｔｅｓ ｄ’Ａｒｍｏｒ）／１４８２／９９、Ａ／ブタ／ベツィグ（Ｂｅｔｚｉｇ）／２／２００１、および／またはＡ／七面鳥／ドイツ／３／９１）、Ｈ３Ｎ２株（例えば、Ａ／パース（Ｐｅｒｔｈ）／１６／２００９）、Ｈ２Ｎ２株（例えば、Ａ／日本／３０５／５７、ＡＪアナーバー（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ）／６／６０、Ａ／カナダ／７２０／０５、Ａ／マガモ／ＮＹ／６７５０／７８、Ａ／マガモ／ポツダム（Ｐｏｔｓｄａｍ）／１７７－４／８３、および／またはＡ／アヒル（ｄｕｃｋ）／北海道／９５／２００１）、Ｎ３Ｎ２株（例えば、Ａ／香港／１／６６、Ａ／シャルロッテスビル（Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｓｖｉｌｌｅ）／０３／２００４、Ａ／カンタベリー（Ｃａｎｔｅｒｂｕｒｙ）／１２９／２００５、Ａ／フジアン（Ｆｕｊｉａｎ）／４１１／０１様、Ａ／アヒル／韓国／Ｓ９／２００３、Ａ／ブタ／テキサス／４１９９－２／９８、Ａ／七面鳥／オハイオ（Ｏｈｉｏ）／３１３０５３／２００４、および／またはＡ／七面鳥／ノースカロライナ（Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ）／１２３４４／０３）、Ｈ５Ｎ１株（例えば、Ａ／ブタ／山東（Ｓｈａｎｄｏｎｇ）／２／０３、Ａ／ガチョウ／広東（Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ）／１／９６、Ａ／アヒル／湖南（Ｈｕｎａｎ）／１１４／０５、Ａ／ベトナム／１２０３／２００４、Ａ／ベトナム／ＤＴ－０３６／２００５、Ａ／ベトナム／１１９４／２００４、Ａ／ベトナム／１２０３／２００４、Ａ／安徽（Ａｎｈｕｉ）／１／２００５、Ａ／エジプト／２３２１／２００７、Ａ／エジプト／３３００－ＮＡＭＲＵ３／２００８、Ａ／カイツブリ（ｇｒｅｂｅ）／ノヴォシビルスク（Ｎｏｖｏｓｉｂｉｒｓｋ）／２９／２００５、Ａ／インドガン（Ｂａｒ－ｈｅａｄｅｄ ｇｏｏｓｅ）／モンドリア（Ｍｏｎｄｏｌｉａ）／１／０５、Ａ／ネコ／タイランド／ＫＵ－０２／０４、Ａ／香港／２１３／０３、Ａ／ニワトリ／広東／１７４／０４、および／またはＡ／ＨＫ／１５９／９７）、Ｈ６Ｎ１株（例えば、Ａ／コガモ（ｔｅａｌ）／香港／１０７３／９９）、Ｈ６Ｎ２株（例えば、Ａ／ニワトリ／カリフォルニア／０１３９／２００１、および／またはＡ／ウミバト（Ｇｕｉｌｌｅｍｏｔ）／スウェーデン／３／２０００）、Ｈ６Ｎ９株（例えば、Ａ／ガチョウ（ｇｏｏｓｅ）／香港／Ｗ２１７／９７）、Ｈ７Ｎ１株（例えば、Ａ／ＦＰＶ／ロストック（Ｒｏｓｔｏｃｋ）／３４）、Ｈ７Ｎ３株（例えば、Ａ／ニワトリ／ブリティッシュ・コロンビア／０４、および／またはＡ／七面鳥／イタリア／２２０１５８／２００２）、Ｈ７Ｎ７株（例えば、Ａ／ニワトリ／オランダ／１／２００３、Ａ／オランダ／２１９／０３、Ａ／ＦＰＶ／ドブソン（Ｄｏｂｓｏｎ）／２７、および／またはＡ／ニワトリ／ＦＰＶ／ウェイブリッジ）、Ｈ９Ｎ２株（例えば、Ａ／ショアバード／デラウェア／９／９６、Ａ／ブタ／韓国／Ｓ４５２／２００４、Ａ／アヒル／香港／Ｙ４３９／９７、Ａ／香港／１０７３／９９、Ａ／ＨＫ／２１０８／２００３、Ａ／ウズラ／香港／Ｇ１／９７、Ａ／アヒル／香港／Ｙ２８０／９７、Ａ／ニワトリＨＫ／ＦＹ２３／０３、および／またはＡ／ニワトリＨＫ／Ｇ９／９７）、およびＢインフルエンザ株（例えば、Ｂ／ブリスベン／６０／２００８）を含む。特定の実施形態では、多様なインフルエンザ株群は、前述の株のすべて、ならびにヒト、ブタ、または鳥類の疾患に関連することが知られている追加のインフルエンザ株を含む。細菌、原生生物、真菌などの細胞病原体の場合、多様な株群は、ワクチンの標的集団に感染し、それによって疾患または疾病を引き起こすことができる各種からの少なくとも１つの分離株、またはそのような株の既知の多様性を包含する代表的な数の感染性分離株を含む。特定の実施形態では、エピトープおよび／または構造モチーフは、少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上保存されている。
【0039】
特定の実施形態では、導入遺伝子配列は、インフルエンザウイルス由来の抗原をコードする。適切なインフルエンザ抗原は、表面抗原、例えばヘマグルチニン（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、Ｍ２、またはその断片（例えば、１つ以上のＨＴＬエピトープまたはＣＴＬエピトープ）であり得る。他の適切なインフルエンザ抗原としては、Ｍ１、ＮＰ、ＮＳ１、ＮＳ２、ＰＡ、ＰＢ１およびＰＢ２、またはそれらの断片（例えば、１つ以上のＨＴＬエピトープまたはＣＴＬエピトープ）が挙げられる。
【0040】
導入遺伝子配列は、本明細書に開示される任意の感染性病原体由来の免疫原性タンパク質または抗原をコードすることができる。例えば、いくつかの実施形態では、導入遺伝子配列は、ウイルス、細菌、原生生物、および／または真菌由来の免疫原性タンパク質をコードする。一実施形態では、導入遺伝子配列は、インフルエンザウイルス、ポリオウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、チクングニアウイルス、および／またはデング熱ウイルスに由来する免疫原性タンパク質をコードする。別の実施形態では、導入遺伝子配列は、バチルス属（例えば、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ））、マイコバクテリウム（例えば、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、らい菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｌｅｐｒａｅ））、シゲラ属（例えば、シゲラ・ソネイ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ）、志賀赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、シゲラ・フレックスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ））、ストレプトコッカス、および／または大腸菌属（例えば、腸内毒素原性、腸管出血性または志賀毒素産生の大腸菌）に由来する免疫原性タンパク質をコードする。別の実施形態では、導入遺伝子配列は、腸内毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）、腸管病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）、腸管侵入性大腸菌（ＥＩＥＣ）、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、および／または腸管凝集性大腸菌（ＥＡＥＣ）に由来する免疫原性タンパク質をコードする。さらに別の実施形態では、導入遺伝子配列は、バークホルデリア（例えば、セパシア菌群（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ ｃｏｍｐｌｅｘ））、シュードモナス属（例えば、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ））、クロストリジウム（例えば、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ））、ブドウ球菌属（例えば、メチシリン耐性、多剤耐性、またはオキサシリン耐性の黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ））、エンテロコッカス（例えば、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・フェカム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｕｍ）、バンコマイシン耐性腸球菌（Ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）（ＶＲＥ））、ストレプトコッカス（例えば、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ））、および／またはビブリオ（例えば、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ））に由来する免疫原性タンパク質をコードする。別の実施形態では、導入遺伝子配列は、カンフィロバクター（例えば、カンフィロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ））、ボルデテラ（例えば、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ））、クラミジア（例えば、肺炎クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ））、コリネバクテリウム（例えば、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ））、レジオネラ（例えば、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ））、リステリア（例えば、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ））、ナイセリア（例えば、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ））、サルモネラ属（例えば、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）、サルモネラ・チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ））、エルシニア属（例えば、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ））、ヘモフィルス（例えば、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ））、ヘリコバクター（例えば、ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ））、コクシエラ（例えば、コクシエラ・ブルネッティ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｔｉ））および／またはフランシセラ（例えば、野兎病（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ））に由来する免疫原性タンパク質をコードする。特定の実施形態では、導入遺伝子配列は、インフルエンザ、ＨＩＶ、ＨＰＶ、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、プラスモジウムおよび／またはシゲラ属に由来する免疫原性タンパク質をコードする。さらに他の実施形態では、導入遺伝子配列は、インフルエンザ、ＨＩＶ、および／または炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）に由来する免疫原性タンパク質をコードする。
【0041】
導入遺伝子配列によってコードされるインフルエンザ抗原は、例えば、１９１８年のスペインインフルエンザ（Ｈ１Ｎ１）、１９５７年のアジアインフルエンザ（Ｈ２Ｎ２）、１９６８年の香港インフルエンザ（Ｈ３Ｎ２）、１９９７年の香港インフルエンザ（Ｈ５Ｎ１）、２００４年のベトナムインフルエンザ（Ｈ５Ｎ１）、２００９年のブタインフルエンザ（Ｈ１Ｎ１）などに関連する株を含む、現在存在しているまたは後で単離される任意のインフルエンザ株に由来し得る。したがって、例えば、ＨＡ抗原は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６またはＢ ＨＡ抗原であり、ＮＡ抗原は、例えば、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８またはＮ９ ＮＡ抗原であり得る。いくつかの実施形態では、ＨＡ抗原は、Ｈ１、Ｈ３、Ｈ５、またはＢ ＨＡ抗原である。本発明の異種配列の基礎となり得るインフルエンザ株の非限定的な例には、Ａ／ガチョウ／広東／１／９６（Ｈ５Ｎ１）；Ａ／ブレビグミッション／１／１９１８（Ｈ１Ｎ１）；Ａ／ウィルソン－スミス／３３（Ｈ１Ｎ１）；Ａ／プエルトリコ／８／３４／マウントサイナイ（Ｈ１Ｎ１）；Ａ／フォートモンマウス／１／４７（Ｈ１Ｎ１）；Ａ／ＵＳＳＲ／９０／１９７７（Ｈ１Ｎ１）；Ａ／ニューカルクドニア／２０／１９９９（Ｈ１Ｎ１）；Ａ／ソロモン諸島／３／２００６（Ｈ１Ｎ１）；Ａ／ブリスベン／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）；Ａ／カリフォルニア／７／２００９（Ｈ１Ｎ１）；Ａ／カリフォルニア／１４／２００９（Ｈ１Ｎ１）；Ａ／カリフォルニア／０８／２００９（Ｈ１Ｎ１）；Ａ／カリフォルニア／０５／２００９（Ｈ１Ｎ１）；Ａ／テキサス／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１）；Ａ／メキシコ／ＩｎＤＲＥ ４１１４／２００９（Ｈ１Ｎ１）；Ａ／ニューヨーク／１６６９／２００９（Ｈ１Ｎ１）；Ａ／カナダ－ＡＢ／ＲＶｌ ５３２／２００９（Ｈ１Ｎ１）；Ａ／レニングラード／１３４／４７／５７（Ｈ２Ｎ２）；Ａ／アナーバー／６／６０（Ｈ２Ｎ２）；Ａ／ベルリン／３／６４（Ｈ２Ｎ２）；Ａ／東京／３／６７（Ｈ２Ｎ２）；Ａ／シンガポール／１／５７（Ｈ２Ｎ２）；Ａ／香港／１／６８（Ｈ３Ｎ２）；Ａ／オールバニ／１／７６（Ｈ３Ｎ２）；Ａ／パノラマ／２００７／９９（Ｈ３Ｎ２）；Ａ／ウィスコンシン／６７／０５（Ｈ３Ｎ２）；Ａ／香港／１７７４／９９（Ｈ３Ｎ２）；Ａ／モスクワ／１０／９９（Ｈ３Ｎ２）；Ａ／広島／５２／２００５（Ｈ３Ｎ２）；Ａ／カリフォルニア／７／２００４（Ｈ３Ｎ２）；Ａ／ニューヨーク／５５／２００４（Ｈ３Ｎ２）；Ａ／ブリスベン／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）；Ａ／パース／１６／２００９（Ｈ３Ｎ２）；Ａ／ガチョウ／貴陽／３３７／２００６（Ｈ５Ｎ１）グレード４；Ａ／ＨＫ／１５６／９７（Ｈ５Ｎ１）；Ａ／ＨＫ／４８３／９７（Ｈ５Ｎ１）；Ａ／ベトナム／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）グレード１；Ａ／ベトナム／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）グレード１；Ａ／アヒル／ＮＣＶＤ１／０７（Ｈ５Ｎ１）；Ａ／ニワトリ／ベトナム／ＮＣＶＤ－２１／０７（Ｈ５Ｎ１）；Ａ／インドネシア／５／０５（Ｈ５Ｎ１）グレード２．１；Ａ／ターキー／６５－５９６／０６（Ｈ５Ｎ１）グレード２．２；Ａ／ニワトリ／インド／ＮＩＶ ３３４８７／２００６（Ｈ５Ｎ１）グレード２．２；Ａ／七面鳥／七面鳥／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）グレード２．２；Ａ／エジプト／９０２７８２／２００６（Ｈ５Ｎ１）；Ａ／エジプト／２３２１／２００７（Ｈ５Ｎ１）；Ａ／エジプト／３３００－ＮＡＭＲＵ ３／２００８（Ｈ５Ｎ１）；Ａ／安徽／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）；Ａ／中国／ＧＤ０１／２００６（Ｈ５Ｎ１）；Ａ／カササギ／香港／５０５２５／０７（Ｈ５Ｎ１）グレード２．３．２；Ａ／メジロ／香港／１０３８／２００６（Ｈ５Ｎ１）グレード２．３．４；Ａ／ニワトリ／ベトナム／ＮＣＶＤ－１５／２００７（Ｈ５Ｎ１）；Ａ／ニワトリ／イタリア／２３３５／２０００（Ｈ７Ｎ１）；Ａ／七面鳥／イタリア／３６７５／９９（Ｈ７Ｎ１）；Ａ／ニワトリ／ニューヨーク／２１２１１－２／０５（Ｈ７Ｎ２）；Ａ／ニューヨーク／１０７／０３（Ｈ７Ｎ２）；Ａ／ニワトリ／ブリティッシュ・コロンビア／ＧＳＣヒトＢ／０４（Ｈ７Ｎ３）；Ａ／カナダ／Ｓｖ５０４／０４（Ｈ７Ｎ３）；Ａ／ニワトリ／ブリティッシュ・コロンビア／ＣＮ－６／０４（Ｈ７Ｎ３）；Ａ／ウマ／サンパウロ／４／７６（Ｈ７Ｎ７）；Ａ／シール／Ｍａｓｓ／１／１９８０（Ｈ７Ｎ７）；Ａ／ニワトリ／ビクトリア／１／１９８５（Ｈ７Ｎ７）；Ａ／ニワトリ／オランダ／２５８６／２００３（Ｈ７Ｎ７）；Ａ／バラード／カリフォルニア／ＨＫＷＦ １９７１／２００７（Ｈ７Ｎ７）；Ａ／ニワトリ／北京／１／９４（Ｈ９Ｎ２）；Ａ／ウズラ／香港／Ｇ１／１９９７（Ｈ９Ｎ２）；Ａ／韓国／ＫＢＮＰ－００２８／２０００（Ｈ９Ｎ２）；Ａ／ニワトリ／香港／Ｇ９／９７（Ｈ９Ｎ２）；Ａ／ニワトリ／香港／ＣＳＷ １５３／２００３（Ｈ９Ｎ２）；Ａ／ニワトリ／山東／６７８１／２００５（Ｈ９Ｎ２）；Ａ／ニワトリ／江西省／Ｌ１／２００４（Ｈ９Ｎ２）；Ａ／香港／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）；Ａ／香港／２１０８／２００３（Ｈ９Ｎ２）；Ａ／ニワトリ／シラーズ／ＡＩＶ－ＩＲ ００４／２００７（Ｈ９Ｎ２）；Ａ／ニワトリ／▲づー▼博／Ｌ２／２００８（Ｈ９Ｎ２）；Ａ／ニワトリ／河南／Ｌ１／２００８（Ｈ９Ｎ２）；Ａ／鳥類／イスラエル／３１３／２００８（Ｈ９Ｎ２）およびＢ／ブリスベン／６０／２００８が含まれる。さらなるインフルエンザ株は、当業者によって容易に同定され得る。
【0042】
特定の実施形態では、導入遺伝子配列は、ＨＩ、Ｈ３、Ｈ５、またはＢインフルエンザウイルスから選択されるインフルエンザＨＡ抗原をコードする。ＨＡ抗原は、いくつかの実施形態では、Ａ／ベトナム／１１９４／２００４、Ａ／ベトナム／１２０３／２００４、Ａ／安徽／１／２００５、Ａ／エジプト／２３２１／２００７、Ａ／エジプト／３３００－ＮＡＭＲＵ３／２００８、Ａ／パース／１６／２００９、Ａ／カリフォルニア／０５／２００９、またはＢ／ブリスベン／６０／２００８からなる群より選択される株の１つ以上に由来し得る。いくつかの態様では、導入遺伝子配列はインフルエンザのＮＰ抗原またはＭ１抗原をコードする。一実施形態では、ＮＰ抗原またはＭｌ抗原は、Ａ／テキサス／０４／２００９またはＡ／カリフォルニア／０８／２００９のインフルエンザ株に由来する。
【0043】
他の実施形態では、導入遺伝子配列は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）由来の抗原をコードする。ＨＰＶは、任意の公知のまたは後に発見される株（例えば、ＨＰＶ－１、ＨＰＶ－２、ＨＰＶ－６、ＨＰＶ－１１、ＨＰＶ－１６、ＨＰＶ－１８、ＨＰＶ－３１、ＨＰＶ－４５など）であり得る。一実施形態では、導入遺伝子配列は、ＨＰＶ－１６またはＨＰＶ－１８株由来の抗原をコードする。特定の実施形態では、ＨＰＶ抗原は、完全長ＬＩタンパク質またはその断片（例えば、進化的に保存されたエピトープおよび／またはＨＴＬエピトープもしくはＣＴＬエピトープ）などの表面抗原である。一実施形態では、導入遺伝子配列は、完全にまたは部分的にコドン最適化された全長ＬＩタンパク質をコードする。他の実施形態では、ＨＰＶ抗原は、完全長Ｌ２またはその断片（例えば、進化的に保存されたエピトープおよび／またはＨＴＬエピトープもしくはＣＴＬエピトープ）である。他の実施形態では、ＨＰＶ抗原は、Ｌ１ハイブリッドポリペプチドまたはＬ１／Ｌ２ハイブリッドポリペプチドである。例えば、特定の一実施形態では、ＨＰＶ抗原は、Ｌ２ポリペプチドの断片（例えば、Ｌ２断片をＬＩポリペプチドのループに挿入することができる）を含むＬ１ポリペプチドである。さらに他の実施形態では、ＨＰＶ抗原は、全長Ｅ６もしくはＥ７タンパク質またはその断片（例えば、進化的に保存されたエピトープおよび／またはＨＴＬエピトープもしくはＣＴＬエピトープ）である。さらに他の実施形態では、ＨＰＶ抗原は、Ｌ１、Ｌ２および／またはＥ６およびＥ７タンパク質を含む融合タンパク質である。例えば、いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原は、Ｅ７タンパク質に融合したＬ１／Ｌ２ハイブリッドポリペプチドを含む融合タンパク質である。他の実施形態では、ＨＰＶ抗原は、Ｅ６タンパク質に融合したＬ１／Ｌ２ハイブリッドポリペプチドを含む融合タンパク質である。
【0044】
他の実施形態では、導入遺伝子配列は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）由来の抗原をコードする。ＨＩＶは、任意の公知のまたは後に発見される株（例えば、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２など）であり得る。特定の実施形態では、ＨＩＶ抗原は、表面抗原、例えば、全長Ｅｎｖタンパク質（例えば、ｇｐ１６０）またはその断片もしくはオリゴマー（例えば、ｇｐ１４０、ｇｐ１２０、ｇｐ４１、進化的に保存されたエピトープ、および／またはＨＴＬエピトープもしくはＣＴＬエピトープ）である。他の実施形態では、ＨＩＶ抗原は、全長カプシドタンパク質（ｐ２４）、マトリックスタンパク質（ｐ１７）、またはその断片（例えば、進化的に保存されたエピトープおよび／またはＨＴＬエピトープもしくはＣＴＬエピトープ）である。他の実施形態では、ＨＩＶ抗原は、Ｔａｔ（例えば、ｐ１６またはｐ１４）、Ｒｅｖ（ｐ１９）、Ｖｉｆ（ｐ２３）、Ｖｐｒ（ｐ１４）、Ｎｅｆ（ｐ２７）、Ｖｐｕ（ｐ１６）またはＧａｇタンパク質である。ＨＩＶ抗原は、全長またはその他の任意のＨＩＶタンパク質、例えばＨＴＬエピトープまたはＣＴＬエピトープであり、進化的に保存された任意の配列であり得る。いくつかの実施形態では、ＨＩＶ抗原配列を、異種三量体化ドメイン（例えば、酵母ＧＣＮ、例えばＧＣＮ４およびＴ４バクテリオファージフィブリチン－ＦＴモチーフに由来する）または翻訳後修飾のための特定のシグナル配列、例えばグリコシルホスファチジルイノトール（ＧＰＩ）アンカー部位を含有するように操作することができる。例えば、一実施形態では、ｇｐ１４０またはｇｐ１２０などのＨＩＶエンベロープタンパク質を、ＧＰＩアンカー部位を含むように改変することができる。別の実施形態では、ＨＩＶ ｇｐ１４０配列を、異種ＧＣＮ三量化ドメインおよび／またはＧＰＩアンカー部位を含有するように改変することができる。いくつかの実施形態では、ＧＣＮ三量体化ドメインまたはＧＰＩアンカー部位を、ＨＩＶエンベロープタンパク質配列（例えば、ＨＩＶ ｇｐ１４０配列）のカルボキシル末端と融合する。
【0045】
他の実施形態では、導入遺伝子配列は、バチルス属細菌由来の抗原をコードする。バチルス属は、多くの病原性種（例えば、炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、セレウス菌（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）など）のいずれかであり、そのような種の任意の公知のまたは後に発見される単離物であり得る。特定の実施形態では、バチルス属抗原は、細胞膜に常在するタンパク質などの表面抗原、またはその断片（例えば、進化的に保存されたエピトープ、および／またはＨＴＬエピトープもしくはＣＴＬエピトープ）である。他の実施形態では、バチルス属抗原は、細胞内タンパク質またはその断片（例えば、進化的に保存されたエピトープ、および／またはＨＴＬエピトープもしくはＣＴＬエピトープ）である。特定の実施形態では、バチルス属抗原は、宿主細胞の侵入に関連する。例えば、抗原は、標的細胞に結合するタンパク質（例えば、保護抗原（ＰｒＡｇまたはＰＡ））、メタロペプチダーゼ（例えば、致死因子（ＬＦ））、アデ二レートシクラーゼ（例えば、浮腫因子（ＥＦ））またはその断片（例えば、進化的に保存されたエピトープ、および／またはＨＴＬエピトープもしくはＣＴＬエピトープ）であり得る。いくつかの実施形態では、バチルス属抗原は、サーモリシン切断部位を欠失させるか、またはＧＰＩアンカーを含有するように改変され得る。一実施形態では、導入遺伝子配列は、サーモリシン切断部位を除去するかまたはＧＰＩアンカーを含有するように改変された保護抗原または改変保護抗原をコードする。
【0046】
他の実施形態では、導入遺伝子配列は、シゲラ属細菌由来の抗原をコードする。シゲラ属は、多くの病原性種（例えば、シゲラ・ソネイ（Ｓ．ｓｏｎｎｅｉ）、志賀赤痢菌（Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、シゲラ・フレックスネリ（Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ）など）のいずれかであり、そのような種の任意の公知のまたは後に発見される単離物であり得る。特定の実施形態では、シゲラ属抗原は、表面抗原、例えば、内在性膜タンパク質または表在性膜タンパク質などの細胞膜に常在するまたは細胞膜に関連するタンパク質、またはその断片（例えば、進化的に保存されたエピトープ、および／またはＨＴＬエピトープもしくはＣＴＬエピトープ）である。例えば、抗原は、Ｋａｒｐ株ｐ５６などの外膜タンパク質であり得る。他の実施形態では、シゲラ属抗原は、細胞内タンパク質またはその断片（例えば、進化的に保存されたエピトープ、および／またはＨＴＬエピトープもしくはＣＴＬエピトープ）である。特定の実施形態では、シゲラ属抗原は、侵入タンパク質ＩｐａＢ、ＩｐａＣ、またはＩｐａＤタンパク質などの宿主細胞の侵入に関連する。別の実施形態では、シゲラ属抗原は、ＩｃｓＰおよび／またはＳｉｇＡポリペプチドを含む万能抗原である。
【0047】
他の実施形態では、導入遺伝子配列は、マイコバクテリウム由来の抗原をコードする。マイコバクテリウムは、多数の病原性種（例えば、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、らい菌（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ）、М．レプロマトーシス（Ｍ．ｌｅｐｒｏｍａｔｏｓｉｓ）など）のいずれかであり、そのような種の任意の公知のまたは後に発見される単離物であり得る。特定の実施形態では、マイコバクテリウム抗原は、表面抗原、例えば、内在性膜タンパク質または表在性膜タンパク質などの細胞膜に常在するまたは細胞膜に関連するタンパク質、またはその断片（例えば、進化的に保存されたエピトープ、および／またはＨＴＬエピトープもしくはＣＴＬエピトープ）である。他の実施形態では、マイコバクテリウム抗原は、細胞内タンパク質またはその断片（例えば、進化的に保存されたエピトープ、および／またはＨＴＬエピトープもしくはＣＴＬエピトープ）である。特定の実施形態では、マイコバクテリウム抗原は、Ａｇ８５Ａ、Ａｇ８５Ｂ、Ａｇ８５Ｃ、ＥＳＡＴ－６、ＣＦＰ－１０、ＨｓｐＸ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【0048】
他の実施形態では、導入遺伝子配列は、プラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）由来の抗原をコードする。プラスモジウムは、多数の病原性種（例えば、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（Ｐ．ｖｉｖａｘ）、卵形マラリア原虫（Ｐ．ｏｖａｌｅ）、四日熱マラリア原虫（Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ）など）のいずれかであり、そのような種の任意の公知のまたは後に発見される単離物であり得る。特定の実施形態では、プラスモジウム抗原は、表面抗原、例えば、内在性膜タンパク質または表在性膜タンパク質などの細胞膜に常在するまたは細胞膜に関連するタンパク質、またはその断片（例えば、進化的に保存されたエピトープ、および／またはＨＴＬエピトープもしくはＣＴＬエピトープ）である。他の実施形態では、プラスモジウム抗原は、細胞内タンパク質またはその断片（例えば、進化的に保存されたエピトープ、および／またはＨＴＬエピトープもしくはＣＴＬエピトープ）である。特定の実施形態では、プラスモジウム抗原は、ＣＳ、ＣＳＰ（非切断）、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２（ｃ末端ｐ４２）、ＬＳＡ１、ＥＢＡ－１７５、ＡＭＡ１、ＦＭＰ１、Ｐｆｓ４８／４５、およびＭＳＰＳからなる群から選択される。
【0049】
特定の実施形態では、導入遺伝子配列は、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（例えば肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ））由来の抗原をコードする。特定の実施形態では、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）抗原は、表面抗原、例えば、内在性膜タンパク質または表在性膜タンパク質などの細胞膜に常在するまたは細胞膜に関連するタンパク質、またはその断片（例えば、進化的に保存されたエピトープ、および／またはＨＴＬエピトープもしくはＣＴＬエピトープ）である。他の実施形態では、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）抗原は、細胞内タンパク質またはその断片（例えば、進化的に保存されたエピトープ、および／またはＨＴＬエピトープもしくはＣＴＬエピトープ）である。特定の実施形態では、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）抗原は、肺炎球菌表面タンパク質（例えば、ＰｓｐＡ、ＰｓｐＣ）、ニューモリシン（Ｐｌｙ）、ノイラミニダーゼ酵素（例えば、ＮａｎＡ、ＮａｎＢ）、オートライシンＡ（ＬｙｔＡ）、肺炎球菌ヒスチジン三価タンパク質、ＰｉａＡ、ＰｉｕＡ、フルクトースビスホスファートアルドラーゼ（ＦＢＡ）、アドヘシンＡ、およびニューモリソイドからなる群から選択される。
【0050】
さらに他の実施形態では、導入遺伝子配列は、表面抗原、内部タンパク質、毒素、侵入関連タンパク質、プロテアーゼもしくは他の酵素、熱ショックタンパク質、または任意の他の感染性病原体に由来する他の抗原をコードする。例えば、表面抗原は、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔａｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、クラミジア肺炎（例えば、膜タンパク質Ｄ、外膜タンパク質）、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）（例えば、膜タンパク質Ｄ、外膜タンパク質）、レジオネラ・ニューモフィリア（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ）、メチシリン耐性株、多剤耐性株、およびオキサシリン耐性株を含む黄色ブドウ球菌（例えば、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＳｄｒＤ、ＳｄｒＥ）、肺炎連鎖球菌（例えば、ＰｓＰＡ）、緑膿菌（例えば、鞭毛Ａｇ、ポリン）、化膿性連鎖球菌（例えば、Ｍタンパク質、フィブロネクチン結合タンパク質Ｓｆｂｌ）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、腸管出血性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（例えば、インチミン、ＦｉｍＨアドヘシン）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）（例えば、Ｐｉｌｉ、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ４、Ｐ６）、カンジダ属（例えば、Ａ１ｓ１ｐ、Ａ１ｓ３ｐ）、コクシジオイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ）（例えばＡｇ２）、緑膿菌（例えば、鞭毛抗原、ポリン）、ラウス肉腫ウイルス（例えば、Ｆタンパク質、Ｇタンパク質）、ヒト内因性レトロウイルスＫ（例えば、メラノーマ抗原ＨＥＲＶ－Ｋ－ＭＥＬ）、ヘルペスウイルス（例えば糖タンパク質Ｄ２）、デング熱ウイルス（例えば、ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３、ＤＥＮ４エンベロープタンパク質、４価４×（ｔｉｍｅｓ）ＥＤＩＩＩドメインタンパク質）などからなる群から選択される感染病原体に由来し得る。毒素は、カンフィロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）の不安定毒素、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の毒素ＡおよびＢ、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来の発熱性外毒素およびエンドトキシン、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）の毒素Ｂ、腸管出血性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の志賀毒素（例えば、Ｓｔｘ－１、Ｓｔｘ－２）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来の外毒素Ａなどからなる群から選択され得る。プロテアーゼまたは他の酵素は、クラミジアの分泌プロテアーゼ因子、ニューモリシン、オートリシン、または肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のノイラミニダーゼ、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のシステインプロテアーゼまたはＣ５ａペプチダーゼ、ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）由来のウレアーゼ、コクシジオイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ）のウレアーゼ、Ｈｉｓ－６２、Ｈ抗原、およびヒストプラズマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）のｈｓｐ７０などからなる群から選択することができる。
【0051】
特定の実施形態では、導入遺伝子配列は、がん細胞によって産生されるタンパク質の全部または一部をコードする。タンパク質またはその断片（例えば、切断産物、構造ドメイン、二次構造の単位、Ｂ細胞エピトープ、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープ、ヘルパーＴリンパ球（ＨＴＬ）エピトープなど）は、がん細胞の表面に位置し得る。例えば、タンパク質またはその断片は、高度に抗原性および／またはがん細胞のマーカー（例えば、がん細胞に特異的なマーカーまたはがん細胞に高度に濃縮された抗原）であり得る。あるいは、タンパク質またはその断片（例えば、切断産物、構造ドメイン、二次構造の単位、ＨＴＬエピトープまたはＣＴＬエピトープなど）は、がん細胞の内部に位置し得る。例えば、タンパク質またはその断片は、サイトゾルタンパク質、核タンパク質などであり得る。
【0052】
特定の実施形態では、導入遺伝子配列は、少なくとも１つの完全なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、少なくとも１つの完全なＯＲＦは、アデノウイルスベクターに感染した宿主細胞で発現することができる個別のポリペプチドをコードする。特定の実施形態では、導入遺伝子配列は、２つ以上の完全なＯＲＦを含み、その各々は、アデノウイルスベクターに感染した宿主細胞で発現することができる個別のポリペプチドをコードする。上記のように、１つ以上の個別のポリペプチドは、全長タンパク質またはその断片であり得る。同様に、１つ以上の個別のポリペプチドは、上記のように、タンパク質ドメイン、構造モチーフ、またはエピトープの多量体（例えば、Ｂ細胞エピトープ、ＨＴＬエピトープまたはＣＴＬエピトープ）であり得る。例えば、特定の実施形態では、導入遺伝子配列は、全長タンパク質（例えば、インフルエンザＨＡ）をコードする第１のＯＲＦと、タンパク質ドメイン、構造モチーフまたはエピトープの多量体（例えば、１つ以上のインフルエンザＭ２配列の多量体、１つ以上のインフルエンザＢ細胞エピトープの多量体、１つ以上のインフルエンザＨＴＬエピトープの多量体、または１つ以上のインフルエンザＣＴＬエピトープの多量体）をコードする第２のＯＲＦとを含む。
【0053】
したがって、いくつかの実施形態では、導入遺伝子配列は融合タンパク質をコードする。融合タンパク質は、同じ感染性病原体または異なる感染性病原体からの抗原性タンパク質または全長タンパク質に由来する１つ以上のエピトープまたは断片を含むことができる。例えば、一実施形態では、融合タンパク質は、ＨＰＶのＥ６またはＥ７タンパク質に融合した本明細書に記載のＨＰＶのＬ１／Ｌ２ハイブリッドポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、Ｅ７タンパク質に融合したＨＰＶ－１６（例えば、ＨＰＶ－１６ Ｌ２断片がＬ１ループに挿入された完全長ＨＰＶ－１６ Ｌ１タンパク質）に由来するＬ１／Ｌ２ハイブリッドポリペプチドを含む。他の実施形態では、融合タンパク質は、Ｅ６タンパク質に融合したＨＰＶ－１８（例えば、ＨＰＶ－１８ Ｌ２断片がＬ１ループに挿入された完全長ＨＰＶ－１８ Ｌ１タンパク質）に由来するＬ１／Ｌ２ハイブリッドポリペプチドを含む。別の実施形態では、融合タンパク質は、一緒に融合されたインフルエンザＨＡおよびＮＡタンパク質由来の免疫原性断片を含む（例えば、本明細書に記載のインフルエンザＨＡまたはＮＡタンパク質の中和エピトープ）。別の実施形態では、融合タンパク質は、全長インフルエンザＮＡタンパク質に融合した本明細書に記載のインフルエンザＨＡタンパク質の１つ以上の中和エピトープを含む。さらに別の実施形態では、融合タンパク質は、本明細書に記載の様々なエピトープの多量体であり得る。例えば、融合タンパク質は、ＨＴＬエピトープの多量体であり得、各エピトープは、リンカー配列によって連結される（代表的な多量体については実施例１３を参照のこと）。いくつかの実施形態では、導入遺伝子配列によってコードされる融合タンパク質は、感染性病原体の２つ以上の種または血清型に由来する抗原を含む。例えば、融合タンパク質は、４つのデング熱ウイルス血清型１～４のそれぞれのエンベロープタンパク質由来のＥＤＩＩＩドメインを含むことができる。
【0054】
特定の実施形態では、導入遺伝子配列は２つの完全なＯＲＦを含み、第１および第２のＯＲＦは平行に配向される（例えば、ヘッドトゥーテール）。特定の関連する実施形態では、導入遺伝子配列は、第１のＯＲＥの終止コドンの３’および第２のＯＲＦの開始コドンの５’に位置する配列内リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）をさらに含み、それによって第１および第２のＯＲＦによってコードされるポリペプチドが単一のｍＲＮＡ転写産物から翻訳されることを可能にする。当業者は、哺乳動物（例えば、ヒト）細胞において機能的である適切なＩＲＥＳ配列、および第２のＯＲＦの十分な翻訳を確実にするためにそのような配列をどのように配置すべきかを容易に同定することができる。
【0055】
特定の関連する実施形態では、導入遺伝子配列は、２つの完全なＯＲＦを含み、第１および第２のＯＲＦは、平行に配向され（例えば、ヘッドトゥーテール）、第１のＯＲＦの終止コドンの３’および第２のＯＲＦの開始コドンの５’に位置するスプライスアクセプターをさらに含み、それにより、単一のｍＲＮＡ転写物からまたは２つの別個のｍＲＮＡ転写物として、第１および第２のＯＲＦによってコードされるポリペプチドを翻訳することができる。当業者は、スプライシング要素を同定し、正しい方法で組み込むことができる。スプライシングアクセプターは、所望の結果に応じて、コンセンサス配列（ＳＶ４０スプライス部位など）または非コンセンサス配列（Ａｄ５ ＡＤＰスプライスアクセプターなど）のいずれかであり得る。例えば、アデノウイルス主要後期転写単位では、非定型ポリピリミジントラクトを有する３’スプライス部位がウイルス感染の後期に好ましい。例えば、Ｍｕｈｌｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６９（１１）：７３２４を参照されたい。
【0056】
特定の関連する実施形態では、導入遺伝子配列は、２つの完全なＯＲＦを含み、第１および第２のＯＲＦは、平行に配向され（例えば、ヘッドトゥーテール）、第１のＯＲＦの３’末端（終止コドンは除去される）と、第２のＯＲＦの開始コドンのインフレームの５’との間のインフレームに位置する２Ａスキップ要素（リボソーム内自己プロセシング）をさらに含み、それにより、Ａ２要素の位置でペプチド結合を「スキップ」し、それによって２つのポリペプチドを生成する単一ペプチドとして、単一ｍＲＮＡ転写物から第１および第２のＯＲＦによってコードされるポリペプチドを翻訳することができる。当業者は、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）およびピコルナウイルスに由来するものなどの２Ａスキップ要素を同定し、２つのＯＲＦが単一の連続ペプチドを形成するようにそれらを編成することができる。
【0057】
特定の実施形態では、導入遺伝子配列は２つの完全なＯＲＦを含み、第１および第２のＯＲＦはエンドツーエンドに配向される。例えば、第１のＯＲＦの３’末端は、第２のＯＲＦの３’末端に隣接することができる。あるいは、第１のＯＲＦの５’末端は、第２のＯＲＦの５’末端に隣接することができる。
【0058】
一般に、導入遺伝子配列は、転写エンハンサーおよび／またはプロモーターならびにポリアデニル化配列を最小限に含む転写単位の一部である。特定の実施形態では、転写単位は、１つ以上のイントロン、１つ以上のスプライスエンハンサー、リーダー配列、コザック共通配列、ＲＮＡの安定性および／またはプロセシングを増加させる１つ以上の要素、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む。
【0059】
特定の実施形態では、導入遺伝子配列は、アデノウイルス転写および／または翻訳制御配列の制御下にあるか、またはそれに動作可能に連結される。これに関連して本明細書で使用されるように、「の制御下」および「動作可能に連結された」とは、異種配列に含まれるＯＲＦの転写および／または翻訳が制御配列の影響を受けることを意味する。したがって、例えば、ＯＲＦの転写および／または翻訳は、アデノウイルス転写および／または翻訳制御配列の結果として増加し得る。特定の実施形態では、「動作可能に連結される」とは、対照配列と異種配列が互いに近接していることを示す。例えば、特定の実施形態では、異種配列に動作可能に連結されたアデノウイルス制御配列が、異種配列の一端から約１００ｂｐ以内、約１００～約２００ｂｐ、約２００～約３００ｂｐ、約３００～約４００ｂｐ、または約４００～約５００ｂｐに位置する。
【0060】
本明細書で使用される場合、「アデノウイルス転写および／または翻訳制御配列」は、アデノウイルスに由来する転写および／または翻訳調節に関与する核酸配列である。そのような配列としては、限定されないが、アデノウイルスプロモーター（例えば、主要後期転写単位（ＭＬＴＵ）内の主要後期プロモーター（ＭＬＰ）またはプロモーター）、アデノウイルス転写エンハンサー、アデノウイルススプライスアクセプター部位、アデノウイルススプライスエンハンサー、アデノウイルスリーダー配列（例えば、三要素リーダー（ＴＰＬ）配列）、ＲＮＡの安定性および／またはプロセシングを増加させるアデノウイルス要素（例えば、シス作用性ＲＮＡ搬出要素）、およびアデノウイルスポリＡシグナル配列が挙げられる。アデノウイルス転写および／または翻訳制御配列は、任意のアデノウイルス株に由来し得る。したがって、本発明のアデノウイルスベクターは、異なるアデノウイルス株に由来するアデノウイルス転写および／または翻訳制御配列を含むことができる。アデノウイルス転写および／または翻訳制御配列は、野生型配列（すなわち、天然に存在するアデノウイルスに見られる配列）またはその変異配列を有することができる。アデノウイルス転写および／または翻訳制御配列は、当技術分野で記載されている。例えば、アデノウイルスＴＰＬ配列は、米国特許出願第２００６／０１１５４５６号に記載され、エンハンサーは、Ｍａｓｉｅ ｅｔ ａｌ．（１９９５）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３（６）：６０２に記載され、ポリアデニル化配列は、Ｂｈａｔ ａｎｄ Ｗｏｌｄ（１９８６）、Ｊ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５７（３）：１１５５に記載されている。さらなるアデノウイルス転写および／または翻訳制御配列は、当業者によって同定され得る。
【0061】
特定の実施形態では、導入遺伝子配列は、アデノウイルスＭＬＰの下（すなわち、制御下）にある。本明細書中で使用される場合、「主要後期プロモーター（ＭＬＰ）」は、主要後期転写単位（ＭＬＴＵ）プロモーターと同義で使用される。他の実施形態では、導入遺伝子配列は、アデノウイルスＭＬＰおよびアデノウイルスＴＰＬの下にある。他の実施形態では、導入遺伝子配列は、アデノウイルスＭＬＰの下にあり、アデノウイルススプライスアクセプター配列に動作可能に連結される。さらに他の実施形態では、導入遺伝子配列は、アデノウイルスＭＬＰおよびアデノウイルスＴＬＰの下にあり、アデノウイルススプライスアクセプター配列に動作可能に連結される。特定の実施形態では、アデノウイルススプライスアクセプター配列は、非コンセンサス配列である。理論によって制限されることを意図するものではないが、非コンセンサスプライスアクセプターは、アデノウイルスＭＬＰと組み合わせて使用される場合、コンセンサスプライスアクセプターよりも良好に機能すると考えられる。前述の実施形態のいずれかにおいて、導入遺伝子配列はさらに、アデノウイルスポリアデニル化シグナル配列に動作可能に連結され得る。
【0062】
特定の実施形態では、導入遺伝子配列は、内因性アデノウイルス転写および／または翻訳制御配列の下（すなわち、制御下）にある。本明細書で使用される場合、「内因性」のアデノウイルス転写および／または翻訳制御配列とは、アデノウイルスベクターに固有な転写および／または翻訳調節に関与する核酸配列であり、組換え技術によって新しい場所に導入または移動されていない。
【0063】
特定の実施形態では、導入遺伝子配列は、外因性転写および／または翻訳制御配列を含む。本明細書で使用される場合、「外因性」の転写および／または翻訳制御配列とは、非アデノウイルス転写および／または翻訳制御配列、または野生型の状況から取り出され、異種配列内の新しい状況に置かれたアデノウイルス転写および／または翻訳制御配列のいずれかを指す。外因性の転写および／または翻訳制御配列の例としては、哺乳動物細胞で機能するプロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）プロモーター、ｂ－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ＥＦ１．アルファ、プロモーター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの構成的プロモーター）、哺乳動物細胞で機能するエンハンサー配列（例えば、ＣＭＶまたはＲＳＶエンハンサー配列）、スプライシングシグナル、スプライスエンハンサー、リーダー配列、コザック配列、ＲＮＡの安定性および／またはプロセシングを増加させる配列（例えば、シス作用性ＲＮＡ搬出要素、ウッドチャック肝炎ウイルス翻訳後調節要素（ＷＰＲＥ））、ポリＡシグナル配列（例えば、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）またはＳＶ４０ポリＡシグナル配列）などが挙げられるが、これらに限定されない。様々な適切な転写および／または翻訳制御配列が先行技術に記載されている。適切なＣＭＶプロモーターは、例えば、米国特許出願第２００６／０１１５４５６号に記載されている。ＷＰＲＥ要素は、例えば、Ｄｏｎｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．（１９９８）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２（６）：５０８５に記載されている。ＷＰＲＥ要素は、ＯＲＦメッセージ内に、典型的には遺伝子の３’末端と５’ポリアデニル化配列との間に位置しなければならない。理論によって制限されることを意図するものではないが、ＷＰＲＥは、核からのｍＲＮＡ転位の効率を増加させ、ならびにＲＮＡ翻訳および安定性を増加させることによって機能すると考えられる。コザック配列は、例えば、Ｋｏｚａｋ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ １５（２０）、８１２５－４８（１９８７）にも記載されている。
【0064】
適切な転写および／または翻訳制御配列は、アデノウイルスであろうと他であろうと、天然に存在する配列ならびにそのような配列の修飾型を含む。そのような修飾型は、転写および／または翻訳制御配列に関連する望ましい活性を増強するか、内因性アデノウイルス転写および／または翻訳制御配列に関連する望ましくない活性を低減または排除するように設計された１つ以上の塩基変化（例えば、欠失、挿入、置換）を含み得る。
【0065】
特定の実施形態では、導入遺伝子配列は、複数の転写または翻訳制御配列を含む。例えば、導入遺伝子配列は、アデノウイルスベクターによる適切な細胞（例えば、ヒト細胞）の感染時に導入遺伝子配列内のＯＲＦの発現を確実にするのに十分な転写または翻訳制御配列を含むことができる。特定の実施形態では、導入遺伝子配列は、プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター）およびアデノウイルスＴＰＬ配列を含む。他の実施形態では、導入遺伝子配列は、プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター）、アデノウイルスＴＰＬ、およびアデノウイルスポリＡシグナル配列（例えば、Ａｄ５ Ｅ３ＡポリＡシグナル配列）を含む。前述の実施形態のいずれかに関連して、導入遺伝子配列はコザック配列をさらに含むことができる。
【0066】
特定の実施形態では、導入遺伝子配列は、２つ以上のＯＲＦのそれぞれについて１つ以上の転写または翻訳制御配列を含む。例えば、導入遺伝子配列は、２つ以上のＯＲＦのそれぞれの発現を確実にするのに十分な転写または翻訳制御配列を含むことができる。したがって、特定の実施形態では、導入遺伝子配列は、２つのＯＲＦのそれぞれについてプロモーターおよびポリＡシグナル配列を含む。導入遺伝子配列は、ＯＲＦのそれぞれについてアデノウイルスＴＰＬおよび／またはコザック配列をさらに含むことができる。あるいは、特定の実施形態では、導入遺伝子配列は、内因性アデノウイルス転写または翻訳制御配列の制御下にあるかまたはそれに動作可能に連結された第２のＯＲＦを含みながら、１つのＯＲＦ（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサーおよびポリＡシグナル配列）の発現を確実にするのに十分な転写または翻訳制御配列を含み得る。
【0067】
特定の実施形態では、導入遺伝子配列は、少なくとも１つのＯＲＦの発現および／または翻訳を増加または最大化するように最適化されている。例えば、特定の実施形態では、導入遺伝子配列のＯＲＦはコドン最適化されている（例えば、ヒト細胞などの哺乳動物細胞における発現用に）。一実施形態では、導入遺伝子配列はコドン最適化されており、ＣＭＶプロモーターなどの非アデノウイルスプロモーターの制御下にある。他の実施形態では、ＯＲＦに動作可能に連結されたコザック配列は、導入遺伝子配列が、例えばコザック共通配列を生じるように最適化されていることである。さらに他の実施形態では、導入遺伝子配列は、エクソンスプライスサイレンサーまたはインシュレーター配列（例えば、クロマチンを編成し、プロモーターおよび／またはエンハンサーの長期的影響をブロックするように機能する配列）などの潜在的な阻害配列を除去するように最適化されている。コドン最適化および他の種類の配列最適化は当技術分野で常套的であり、当業者はそのような最適化をどのように実行するかを容易に理解するであろう。
【0068】
導入遺伝子配列がＭＬＰプロモーターの制御下にあるいくつかの実施形態では、導入遺伝子配列はコドン最適化されていない－すなわち、導入遺伝子配列は感染性病原体由来の天然配列である。例えば、一実施形態では、アデノウイルスベクターは、アデノウイルスＭＬＰプロモーターの制御下に非コドン最適化導入遺伝子配列を含み、アデノウイルスベクターは複製能であり、部分的なＥ３欠失を有する。
【0069】
いくつかの実施形態では、ＡＡｄに由来する複製欠損性遺伝子導入ベクターは、ＡＡｄウイルスに基づく。ＡＡｄに由来するベクターの一実施形態では、ＡＡｄゲノムの左領域の一部が欠失しているため、欠失したゲノムが別の遺伝子コンストラクトによって部分的または完全にトランスで提供されない限り、得られたＡＡｄゲノムはもはや複製することができない（図２Ｃ）。別の実施形態では、ＡＡｄゲノムのこの左領域の一部のこれらの欠失は、単数または複数の導入遺伝子コンストラクトによって部分的または全体的に置き換えられる。
【0070】
ＡＡｄに由来する複製欠損性遺伝子導入ベクターの別の実施形態では、ＡＡｄゲノムが以下の様式で欠失する：１）それ自体では、いかなる相補的遺伝子コンストラクトの非存在下でも、このＡＡｄゲノムの複製を妨げないように、ＡＡｄゲノムの右領域の一部が欠失し、２）欠失したゲノムが別の遺伝子コンストラクトによって部分的または完全にトランスで提供されない限り、得られるＡＡｄゲノムはもはや複製することができないようにＡＡｄゲノムの左領域の一部が欠失する（図２Ｃ）。別の実施形態では、ＡＡｄゲノムのこれらの欠失は、単数または複数の導入遺伝子コンストラクトによって部分的または全体的に置き換えられる。
【0071】
ＡＡｄに由来する複製欠損性遺伝子導入ベクターの別の実施形態では、ＡＡｄゲノムは、別の遺伝子コンストラクトによって部分的または完全にトランスで提供されない限り、得られるＡＡｄゲノムがもはや複製できないように欠失したゲノムが欠失する（図２Ｄ）。別の実施形態では、ＡＡｄゲノムのこれらの欠失は、単数または複数の導入遺伝子コンストラクトによって部分的または全体的に置き換えられる。ＡＡｄに由来する複製欠損性遺伝子導入ベクターの別の実施形態では、パッケージングシグナルΨと共に左右のＩＴＲのみが残るようにＡＡｄゲノムはすべての内因性ＡＡｄ遺伝子が欠失する（図２Ｄ）。完全に欠失した「中身抜き」ＡＡｄベクターのこれらの実施形態では、欠失した領域は、部分的または全体的に不活性な詰め物（ｓｔｕｆｆｅｒ）配列によって置き換えられる。他の実施形態では、欠失物は、部分的に不活性な詰め物配列によって、および部分的に単数または複数の導入遺伝子コンストラクトによって置き換えられる。
【0072】
これらのＡＡｄに由来する複製欠損性遺伝子導入の他の実施形態では、ＣＥＬＯ ＡＡｄゲノムは、記載されたＡＡｄ由来の遺伝子導入ベクターの基礎として使用される。これらのＡＡｄに由来する複製欠損性遺伝子導入の他の実施形態では、他のＡＡｄウイルスは、記載されたＡＡｄ由来の遺伝子導入ベクターの基礎として使用される。それらは、家禽アビアデノウイルスＡ、ファルコンアビアデノウイルスＡ、ウズラ気管支炎ウイルス、産卵低下症候群ウイルス、出血性腸炎ウイルス、大理石脾疾患ウイルスおよび封入体肝炎ウイルスであるが、これらに限定されない。
【0073】
他の実施形態では、部分的に欠失したＡＡｄ由来ベクターの複製およびパッケージングを媒介するために必要とされる断片化された相補的ＡＡｄ由来ゲノムは、部分的に欠失した複製欠損ＡＡｄ由来ベクターから欠失した部分から構成される（図５）。他の実施形態では、部分的に欠失したＡＡｄ由来ベクターの複製およびパッケージングを媒介するために必要とされる断片化された相補的ＡＡｄ由来ゲノムは、部分的に欠失した複製欠損ＡＡｄ由来ベクターから欠失した一部または全部の部分から構成される。他の実施形態では、部分的に欠失したＡＡｄ由来ベクターの複製およびパッケージングを媒介するために必要とされる断片化された相補的ＡＡｄ由来ゲノムは、部分的に欠失した複製欠損ＡＡｄ由来ベクターから欠失した一部または全部の部分の１つ以上の遺伝子コンストラクトによって提供される。
【0074】
他の実施形態では、相補的ＡＡｄ由来ゲノム断片は、ＣＥＬＯ ＡＡｄゲノムに由来する。他の実施形態では、相補的ＡＡｄ由来ゲノム断片は、他のＡＡｄゲノムに由来する。それらは、家禽アビアデノウイルスＡ、ファルコンアビアデノウイルスＡ、ウズラ気管支炎ウイルス、産卵低下症候群ウイルス、出血性腸炎ウイルス、大理石脾疾患ウイルスおよび封入体肝炎ウイルスであるが、これらに限定されない。
【0075】
他の実施形態では、完全に欠失した「中身抜き」ＡＡｄ由来ベクターの複製を可能にするために必要なパッケージングコンストラクトと呼ばれる相補的なＡＡｄ由来ゲノム断片は、パッケージングシグナルΨが欠失しているすべての場合において、全部または部分的なＡＡｄ由来ゲノムから構成される（図３および図６）。他の実施形態では、完全に欠失した「中身抜き」ＡＡｄ由来ベクターの複製を可能にするために必要なパッケージングコンストラクトと呼ばれる相補的なＡＡｄ由来ゲノム断片は、１つまたは両方のＩＴＲおよびパッケージングシグナルΨも欠失しているすべての場合において、全部または部分的なＡＡｄ由来ゲノムから構成される（図３および図６）。
【0076】
他の実施形態では、ＡＡｄ由来の遺伝子導入ベクターを複製およびカプセル化するために使用される宿主細胞は、真核細胞、例えば、限定されないが、ヒト細胞である。他の実施形態では、ＡＡｄ由来の遺伝子導入ベクターを複製およびカプセル化するために使用される宿主細胞は、鳥綱または鳥類の動物に由来する真核細胞である。他の実施形態では、ＡＡｄ由来の遺伝子導入ベクターを複製およびカプセル化するために使用される宿主細胞は、化学的に誘導されたニワトリヘパルトがん細胞株（ＬＭＨ）などの細胞である。
【0077】
他の実施形態では、複製欠損性ＡＡｄ由来ベクターの複製およびパッケージングを媒介するために必要とされる断片化された相補的ＡＡｄ由来ゲノムは、宿主細胞で一過性に発現する。他の実施形態では、複製欠損性ＡＡｄ由来ベクターの複製およびパッケージングを媒介するために必要とされる断片化された相補的ＡＡｄ由来ゲノムは、宿主細胞で安定に発現する。
【0078】
他の実施形態では、ＡＡｄ由来の遺伝子導入ベクターを複製およびカプセル化するために使用される宿主細胞は、ＡＡｄゲノムの左側の遺伝物質を担持する発現カセットを安定に保持するように改変される（図４）。この発現カセットは、ＰＧＫプロモーターなどであるがこれに限定されないプロモーターと、ＨＳＶポリアデニル化部位などであるがこれに限定されないポリアデニル化部位とを含む。他の実施形態では、宿主細胞を改変するために使用されるＡＡｄゲノムは、ＡＡｄウイルス、例えば、限定されないが、ＣＥＬＯウイルス、家禽アビアデノウイルスＡ、ファルコンアビアデノウイルスＡ、ウズラ気管支炎ウイルス、産卵低下症候群ウイルス、出血性腸炎ウイルス、大理石脾臓疾患ウイルスおよび封入体肝炎ウイルスに由来する。
【0079】
他の実施形態では、ＡＡｄ由来の遺伝子導入ベクターを複製およびカプセル化するために使用される宿主細胞は、非ＡＡｄゲノムの左側の遺伝物質、例えば、限定されないが、別のクラスの動物由来のアデノウイルスを担持する発現カセットを安定に保持するように改変される。
【0080】
他の実施形態では、部分的に欠失したＡＡｄ由来の複製欠損性ベクターは、以下の様式で作製される：１）ＡＡｄ由来ゲノムは、左右のＩＴＲに隣接した線状ＤＮＡ分子からなるように、そのクローニングベクターから放出され、２）複製欠損性ＡＡｄ由来ゲノムの複製を可能にするのに必要なＡＡｄ由来の相補的遺伝子コンストラクトが、そのクローニングベクターから放出され、３）両方の遺伝子コンストラクトを宿主細胞にコトランスフェクトし、４）ＡＡｄ由来複製欠損性ベクターが複製され、カプセル化されるように、トランスフェクトされた宿主細胞をインキュベートし、５）カプシド形成されたＡＡｄベクターが細胞から放出され、回収される。
【0081】
別の実施形態では、宿主細胞は、複製欠損性ＡＡｄ由来ゲノムの複製を可能にするのに必要なＡＡｄ由来相補的遺伝子コンストラクトを安定に保有および発現するように改変される。この改変宿主細胞に、そのクローニングベクターから放出されたＡＡｄ由来ゲノムをトランスフェクションし、トランスフェクトされた宿主を、ＡＡｄ由来複製欠損性ベクターが複製され、カプシド形成されるように細胞インキュベートし、カプシド形成されたＡＡｄベクターが細胞から放出され、回収される。
【0082】
他の実施形態では、完全に欠失した「中身抜き」ＡＡｄ由来複製欠損性ベクターが、以下の様式で作製される：１）完全に欠失した「中身抜き」ＡＡｄ由来ゲノムは、左右のＩＴＲに隣接した線状ＤＮＡ分子からなるように、そのクローニングベクターから放出され、２）完全に欠失した「中身抜き」ＡＡｄ由来ベクターの複製を可能にするために必要とされるパッケージングコンストラクトと呼ばれる相補的ＡＡｄ由来ゲノム断片がその発現ベクター中に提供され、３）完全に欠失した「中身抜き」ＡＡｄ由来ゲノムの複製を可能にするために必要なＡＡｄ由来相補的遺伝子コンストラクトを安定に保持し発現するように改変された宿主細胞に両方の遺伝子コンストラクトをコトランスフェクトし、４）ＡＡｄ由来複製欠損性ベクターが複製され、カプシド形成されるようにトランスフェクトされた宿主細胞をインキュベートし、５）カプシド形成されたＡＡｄベクターが細胞から放出され、回収される。
【0083】
いくつかの実施形態では、本発明のアデノウイルスベクターは、アデノウイルスプロモーター（例えば、主要後期プロモーター）の制御下にある導入遺伝子配列を含み、導入遺伝子配列は、インフルエンザ、バチルス属、ＨＩＶ、ＨＰＶ、トガウイルス（例えば、デング熱ウイルス）、シゲラ属、マイコバクテリウム、ストレプトコッカスまたはプラスモディウム由来の抗原をコードする。一実施形態では、導入遺伝子配列は、インフルエンザ由来のＨ１ ＨＡ、Ｈ３ ＨＡ、Ｈ５ ＨＡ、またはＢ ＨＡ抗原をコードする。別の実施形態では、導入遺伝子配列は、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）由来の保護抗原または改変された保護抗原をコードする。別の実施形態では、導入遺伝子配列は、エンベロープタンパク質（例えば、ｇｐ１６０、ｇｐ１４０、ｇｐ１２０）、改変されたエンベロープタンパク質、またはＨＩＶ由来のｇａｇタンパク質をコードする。さらに別の実施形態では、導入遺伝子配列は、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８を含むＨＰＶ由来のＬ１タンパク質、Ｌ２タンパク質、Ｅ６タンパク質、Ｅ７タンパク質またはそれらの融合物をコードする。さらに別の実施形態では、導入遺伝子配列は、プラスモジウム由来のＣＳＰ、Ｐｆｓ４８／４５、ＭＳＰ１、ＭＳＰ（Ｃ項、ｐ４２）、またはＬＳＡ１をコードする。いくつかの実施形態では、導入遺伝子配列は、マイコバクテリウム由来のＡｇ８５、ＥＳＡＴ、ＨｓｐＸ、またはそれらの組み合わせをコードする。他の実施形態では、導入遺伝子配列は、ＰＳＳＰ、ｒ５６Ｋａ ｒｐタンパク質、またはシゲラ属由来の侵入タンパク質（例えば、ＩｐａＢ、ＩｐａＣまたはＩｐａＤタンパク質）をコードする。なおさらなる実施形態では、アデノウイルスベクターは、アデノウイルス三要素リーダー配列をさらに含むことができる。例えば、導入遺伝子配列は、アデノウイルスＭＬＰおよび三要素リーダーの制御下にあり得、導入遺伝子配列は、インフルエンザ、バチルス属、ＨＩＶ、ＨＰＶ、トガウイルス（例えば、デング熱ウイルス）、シゲラ属、マイコバクテリウム、ストレプトコッカスまたはプラスモジウム由来の抗原をコードする。
【0084】
他の実施形態では、本発明のアデノウイルスベクターは、非アデノウイルスプロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶ ＬＴＲプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＤＨＦＲプロモーター、ｂ－アクチンプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＥＦ１アルファ、プロモーター）の制御下にある導入遺伝子配列を含み、導入遺伝子配列は、インフルエンザ、バチルス属、ＨＩＶ、ＨＰＶ、トガウイルス（例えば、デング熱ウイルス）、シゲラ属、マイコバクテリウム、ストレプトコッカスまたはプラスモディウム由来の抗原をコードする。例えば、一実施形態では、導入遺伝子配列はＣＭＶプロモーターの制御下にあり、インフルエンザ、バチルス属、またはＨＩＶ由来の抗原をコードする。特定の一実施形態では、導入遺伝子配列は、インフルエンザ、バチルス属、またはＨＩＶ由来のコドン最適化配列である。別の一実施形態では、導入遺伝子配列は、インフルエンザ、バチルス属、またはＨＩＶ由来の天然配列である。別の実施形態では、導入遺伝子配列は、インフルエンザ由来のＨ１ ＨＡ、Ｈ３ ＨＡ、Ｈ５ ＨＡ、Ｂ ＨＡ、ＮＰ、またはＭ１抗原をコードする。別の実施形態では、導入遺伝子配列は、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）由来の保護抗原または改変された保護抗原をコードする。さらに別の実施形態では、導入遺伝子配列は、エンベロープタンパク質（例えば、ｇｐ１６０、ｇｐ１４０、ｇｐ１２０）、改変されたエンベロープタンパク質、またはＨＩＶ由来のｇａｇタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、アデノウイルスベクターは、アデノウイルス三要素リーダー配列をさらに含むことができる。例えば、導入遺伝子配列は、ＣＭＶプロモーターおよびアデノウイルス三要素リーダーの制御下にあり得、導入遺伝子配列は、インフルエンザ、バチルス属、ＨＩＶ、ＨＰＶ、トガウイルス（例えば、デング熱ウイルス）、シゲラ属、マイコバクテリウム、ストレプトコッカスまたはプラスモジウム由来の抗原をコードする。
【0085】
特定の実施形態では、本発明のアデノウイルスベクターは、第２の導入遺伝子配列を含む。したがって、特定の実施形態では、本発明のアデノウイルスベクターは、導入遺伝子配列と第２の導入遺伝子配列の両方を含む。あるいは、本発明のアデノウイルスベクターは、導入遺伝子配列の代わりに第２の導入遺伝子配列を含むことができる。
【0086】
導入遺伝子配列は、導入遺伝子配列について上記のような構造を有することができ、上記の任意の様式でアデノウイルスゲノムに挿入することができる。したがって、特定の実施形態では、導入遺伝子配列は、全長抗原またはその断片（例えば、ドメイン、二次構造の単位、保存されたエピトープ、Ｂ細胞、ＨＴＬもしくはＣＴＬエピトープ、またはそれらの組み合わせ）をコードすることができる。いくつかの実施形態では、導入遺伝子配列は、サイトカインもしくは増殖因子または免疫系を刺激する他のタンパク質などの治療用タンパク質をコードする。例えば、一実施形態では、導入遺伝子配列は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）などの白血球を刺激するタンパク質をコードする。いくつかの態様では、導入遺伝子配列は感染性病原体由来の抗原をコードし、導入遺伝子配列は治療用タンパク質をコードする。特定の一実施形態では、導入遺伝子配列はインフルエンザ抗原（例えば、Ｈ１ ＨＡ、Ｈ３ ＨＡ、Ｈ５ ＨＡ、またはＢＨＡ抗原）をコードし、導入遺伝子配列は白血球（例えば、ＧＭ－ＣＳＦ）を刺激するタンパク質をコードする。特定の実施形態では、導入遺伝子配列は、導入遺伝子配列と同じアデノウイルスベクターの領域に（例えば、第１および導入遺伝子配列が互いに近位に位置するように）挿入される。他の実施形態では、第１および導入遺伝子配列は、アデノウイルスベクターの異なる領域に挿入される。
【0087】
導入遺伝子配列は、アデノウイルスＯＲＥに組み込むこともできる。特定の実施形態では、アデノウイルスＯＲＦは、アデノウイルス構造タンパク質（例えば、カプシドタンパク質、例えば、ヘキソンタンパク質または線維タンパク質）をコードする。したがって、特定の実施形態では、導入遺伝子配列は、アデノウイルスのヘキソンＯＲＦに組み込まれ、ヘキソンＯＲＦと異種配列との得られる融合物は、キメラヘキソンタンパク質をコードする。他の実施形態では、導入遺伝子配列は、アデノウイルス線維ＯＲＦに組み込まれ、線維ＯＲＦと異種配列との得られる融合物は、キメラ線維タンパク質をコードする。一般に、本発明のキメラヘキソンまたは線維タンパク質は、得られるアデノウイルスの表面の新しい抗原を提示しながら、ヘキソンまたは線維の機能（例えば、ヘキソン・カプソメアまたは線維を形成し、カプシド形成に寄与する）を保持する。本発明の組換えアデノウイルスの表面の新しい抗原の提示は、一般集団における既存のアデノウイルス免疫の問題を回避するのに役立つため、有利であり、これはアデノウイルス系ワクチンの有効性を低下させ得る。さらに、組換えアデノウイルスの表面上の感染性病原体からの抗原の提示は、ワクチンを摂取する対象の免疫系に対してより多様な感染性病原体抗原を提示することによって、本発明のアデノウイルス系ワクチンによって刺激される免疫応答を広げることができる。
【0088】
したがって、特定の実施形態では、導入遺伝子配列は、アデノウイルス構造タンパク質（例えば、カプシドタンパク質、例えばヘキソンまたはタンパク質）のＯＲＦに組み込まれ、導入遺伝子配列は、感染性病原体由来の抗原をコードする。感染病原体およびその抗原は、上記の通りであり得る。特定の実施形態では、抗原は、Ｍ２（例えば、Ｍ２の外部ドメイン、断片またはエピトープ）などのインフルエンザ表面タンパク質に由来する。特定の実施形態では、Ｍ２抗原は、一連のＭ２ペプチド配列から選択される。特定の実施形態では、導入遺伝子配列は、表４に列挙されるＭ２ペプチド配列のうちの２つ以上をコードする。例えば、導入遺伝子配列は、Ｈ１、Ｈ２、および／またはＨ３インフルエンザ株、Ｈ５インフルエンザ株、Ｈ７インフルエンザ株、またはＨ９インフルエンザ株由来の少なくとも２つのＭ２配列をコードすることができる。あるいは、導入遺伝子配列は、複数の異なるインフルエンザ血清型由来のＭ２配列をコードし得る。他の実施形態では、導入遺伝子配列は、インフルエンザマトリックス配列またはインフルエンザＮＰ配列の１つ以上のコピーをコードし得る。さらに他の実施形態では、インフルエンザ抗原は、ＨＴＬエピトープまたはＣＴＬエピトープである。例えば、導入遺伝子配列は、１つ以上のＨＴＬエピトープをコードすることができる。
【0089】
単一のヘキソンＨＶＲに挿入できる配列の量は、特定のＨＶＲ（例えば、ＨＶＲ１、ＨＶＲ２など）およびＨＶＲの長さに依存する。一般に、挿入は、ＨＶＲポリペプチド配列の長さ（ＨＶＲ配列が置換されている場合）に加えて、さらに０～７５、１～７０、２～６５、３～６０、４～５５、または５～５０個のアミノ酸の長さに対応するポリペプチド配列をコードすることができる。ヘキソンＨＶＲ挿入は、例えば、Ｍａｔｔｈｅｗｓ ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ ５：９８のＡｄ５について記載されている。
【0090】
感染性病原体由来の抗原をコードする配列は、ヘキソン配列と抗原配列が互いに隣接するように、ヘキソンＨＶＲを置き換えることができる。これに関連して本明細書使用されるように、用語「隣接する」とは、ヘキソンコード配列と抗原コード配列との間のインフレーム融合のことを指し、ヘキソン配列と抗原配列とを連結するリンカー配列は存在しない。あるいは、ヘキソン配列と抗原配列とを連結するためにリンカー配列を使用することができる。特定の実施形態では、リンカー配列は、トリペプチド「ＬＧＳ」をコードする配列である。リンカー配列は、例えば、図１２に示すように、抗原配列の最初および最後に含めることができる。理論に拘束されることを意図するものではないが、ＬＧＳリンカー配列は、構造的柔軟性を提供し、得られるヘキソン融合タンパク質の安定性を改善し、および／またはヘキソンタンパク質配列と異種配列によってコードされるタンパク質配列との間の接合点の免疫原性を低下させると考えられる。他の実施形態では、リンカー配列は、ペプチド配列「ＧＡＡＡ」、（配列番号３５２）または「ＮＡＡ」をコードする。そのようなリンカー配列は、例えば、異種配列によってコードされるタンパク質のＮ末端のＧＡＡＡ配列およびＣ末端の「ＮＡＡ」配列と組み合わせて使用することができる。他の適切なリンカー配列は、当業者によって同定され得る。
【0091】
特定の実施形態では、本発明のアデノウイルスベクターは、第３の異種配列を含む。したがって、特定の実施形態では、本発明のアデノウイルスベクターは、第１、第２および第３の異種配列を含む。あるいは、本発明のアデノウイルスベクターは、第２および第３の異種配列を含むことができる。第３の異種配列は、導入遺伝子配列について上記の構造または導入遺伝子配列を有することができ、上記の任意の様式でアデノウイルスゲノムに挿入することができる。
【0092】
組換えアデノウイルスベクターを構築し、遺伝子操作し、増殖させるための技術は、以下に示される実施例に開示される。例えば、国際公開第２００８／０１０８６４号、米国特許出願第２００６／０１１５４５６号、および米国特許第６，１２７，５２５号も参照されたい。その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【0093】
別の態様では、本発明は、本発明の１つ以上のアデノウイルスベクターを含むワクチンを提供する。本明細書で使用される場合、「ワクチン」という用語は、本発明のアデノウイルスベクターおよび担体を含む組成物を指す。特定の実施形態では、アデノウイルスベクターはウイルスである。他の実施形態では、アデノウイルスベクターはゲノム単独であり、アデノウイルスカプシドを含まない。特定の実施形態では、担体はアジュバントである。そのようなアジュバントの例としては、限定されないが、リン酸カルシウム、リン酸アルミニウム、水酸化カルシウムおよび水酸化アルミニウムなどの塩、藻類グルカン（例えば、ベータグルカン）、キトサンまたは結晶化イヌリンなどの天然ポリマー、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリラクチド－コ－グリコリドまたはメチルアクリレートポリマーなどの合成ポリマー、ミセル形成カチオン性もしくは非イオン性ブロック共重合体または界面活性剤、例えばＰｌｕｒｏｎｉｃｓ、Ｌ１２１、１２２もしくは１２３、Ｔｗｅｅｎ ８０、またはＮＰ－４０、脂肪酸、脂質または脂質およびタンパク質に基づくベシクル、例えば、リポソーム、プロテオリポソーム、ＩＳＣＯＭおよび渦巻構造、および合成油または天然油および水溶液から構成される界面活性剤安定化エマルジョンが挙げられる。特定の実施形態では、本発明のワクチンは、対象への投与時に、対象において免疫応答（例えば、体液性免疫応答、細胞性免疫応答、またはその両方）を刺激することができる。特定の実施形態では、免疫応答は、ワクチンのアデノウイルスベクターに挿入または組み込まれた異種配列によってコードされるエピトープに対する測定可能な応答（例えば、測定可能な体液性もしくは細胞性免疫応答、またはそれらの組み合わせ）を含む。特定の実施形態では、本発明のワクチンは、感染性病原体またはがんに対する保護を提供することができる。例えば、特定の実施形態では、ワクチンは、１つ以上の抗原（例えば、異種配列によってコードされる）に対する免疫応答を刺激することができ、後にそのような抗原に遭遇すると、ワクチンを受けている対象は、ワクチンが以前に投与されていなかった場合よりも強い免疫応答を有する。いくつかの実施形態では、本発明のワクチンは、アデノウイルスに対する既存の免疫を有する対象において感染性病原体またはがんに対する保護を提供することができる。他の実施形態では、本発明のワクチンは、病原体感染もしくはがんを改善することができ、および／または病原体感染もしくはがんの少なくとも１つの症候を低減することができる。例えば、一実施形態では、本発明のワクチンは、病原体感染またはがんの症候および／または合併症がそのような感染またはがんに罹患している対象において軽減、低減または改善されるように、異種配列によってコードされる１つ以上の抗原に対する治療的免疫応答を誘導する。
【0094】
ワクチンに使用されるアデノウイルスベクターは、当技術分野で周知の技術に従って哺乳動物への投与のために調製および製剤化することができる。非経口、例えば、限定されないが、筋肉内、静脈内、皮下および皮内、または経腸、例えば、限定されないが、経口投与のための製剤が、アデノウイルスベクター用に開発されている。
【0095】
経口投与は、所定量の本発明の組換えアデノウイルスベクターを含有するカプセルまたは錠剤、液体溶液、例えば、水、生理食塩水、オレンジジュースなどの摂取可能な希釈剤に溶解した有効量の医薬など、適切な液体中の懸濁液、および適切なエマルジョンからなり得る。本発明のアデノウイルスベクターは、例えば、上気道を迂回し、腸内でのウイルス複製を可能にするために、前述のように経口投与用の腸溶コーティングカプセルとして製剤化することができる。例えば、Ｔａｃｋｅｔ ｅｔ ａｋ，Ｖａｃｃｉｎｅ １０：６７３－６７６，１９９２、Ｈｏｒｗｉｔｚ，ｉｎ Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｋ，ｅｄｓ．，Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，ｖｏｈ ２，ｐｐ．２１４９－２１７１，１９９６、Ｔａｋａｆｕｊｉ ｅｔ ａｋ，Ｊ．Ｉｎｆｅｃ．Ｄｉｓ．１４０：４８－５３，１９７９およびＴｏｐ ｅｔ ａｋ，Ｊ．Ｉｎｆｅｃ．Ｄｉｓ．１２４：１５５－１６０，１９７１を参照のこと。あるいは、アデノウイルスベクターは、滅菌生理食塩水などの従来の溶液に製剤化することができ、１つ以上の薬学的に許容される担体または賦形剤を組み込むことができる。薬学的組成物は、他の活性剤をさらに含むことができる。
【0096】
特定の実施形態では、本発明の製剤は、薬学的に許容される担体にアデノウイルスベクター（例えば、ウイルス）を含むバッファー溶液を含む。バッファー食塩水、水などの様々な担体を使用することができる。そのような溶液は、一般に滅菌であり、望ましくない物質を含まない。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技術によって滅菌することができ、または滅菌濾過することができる。組成物は、ｐＨ調整剤およびバッファー剤、等張化剤など、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどの生理的条件に近似するために必要とされる薬学的に許容される補助物質を含有し得る。
【0097】
薬学的に許容される担体は、例えば、組成物を安定化するために、またはウイルスおよび／もしくは薬学的組成物の吸収を増減させるために作用する生理的に許容され得る化合物を含み得る。生理的に許容され得る化合物としては、例えば、グルコース、スクロースもしくはデキストランなどの糖、アスコルビン酸もしくはグルタチオンなどの抗酸化剤、キレート剤、低分子量タンパク質、任意の共投与された薬剤のクリアランスもしくは加水分解を減少させる組成物、または賦形剤、または他の安定剤および／もしくはバッファーが挙げられ得る。洗剤を使用して、組成物を安定化させるか、または吸収を増減少させることもできる。生理的に許容される化合物を含む薬学的に許容される担体の選択は、例えば、アデノウイルス調製物の投与経路および任意の共投与される薬剤の特定の生理化学的特性に依存することが当業者には理解されよう。
【0098】
アデノウイルスベクターはまた、脂質製剤中で、より具体的には、リポソームと複合体化されるか、または脂質／核酸複合体に複合体化されるか、またはリポソームに封入されるかのいずれかで投与され得る。本発明のベクターは、単独で、または他の適切な成分と組み合わせて、吸入によって投与されるエアロゾル製剤にすることもできる。ワクチンは、鼻腔を介した投与用に製剤化することもできる。担体が固体である経鼻投与に適した製剤には、例えば約１０～約５００ミクロンの範囲の粒径を有する粗粉末が含まれ、これは嗅ぎタバコを取るように、すなわち、鼻の近くに保持された粉末の容器から鼻腔を通して急速吸入することによって投与される。担体が、例えば、鼻腔スプレー、点鼻薬として、またはネブライザーによるエアロゾル投与による投与用の液体である適切な製剤には、活性成分の水溶液または油性溶液が含まれる。いくつかの実施形態では、本発明のアデノウイルスベクターは、例えば直腸投与または膣内投与用の坐剤として製剤化することができる。
【0099】
別の態様では、本発明は、対象において本明細書に記載の任意の感染性病原体に対する免疫応答を誘導する方法を提供し、該方法は、対象に本発明のワクチンを投与することを含む。一実施形態では、本発明は、感染性病原体に対して対象にワクチン接種する方法を提供し、該方法は、感染性病原体に感染するリスクがある対象に十分な量の本発明のワクチンを投与することを含む。別の実施形態では、対象は、感染性病原体によって誘導されて感染する。したがって、例えば、一実施形態では、本発明は、感染性病原体によって誘導される感染を経験している対象において、治療的免疫応答を誘導する方法を提供する。いくつかの実施形態では、感染の１つ以上の症候または合併症は、ワクチンの投与後に対象において低減または緩和される。本発明のワクチンは、ヒトまたは獣医学的対象にワクチン接種するために使用することができる。
【0100】
本発明のワクチンは、単独で投与することができるか、または他の免疫学的、抗原性、ワクチンもしくは治療組成物と同時投与もしくは逐次投与することができる。そのような組成物は、免疫応答を増強または拡大するための他の薬剤、例えば、ＩＬ－２または特定の時間間隔で投与され得るか、または連続的に投与され得る他のサイトカイン（例えば、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｈ，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ １９９７ Ａｐｒ．２４；３３６（１７）：１２６０－１、およびＳｍｉｔｈ，Ｃａｎｃｅｒ Ｊ Ｓｃｉ Ａｍ．１９９７ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ；３ Ｓｕｐｐｌ １：Ｓ １３７－４０を参照されたい）を含み得る。ワクチンまたはベクターは、他のワクチンまたはベクターと併せて投与することもできる。例えば、本発明のアデノウイルスは、異なる血清型のアデノウイルスの投与前または投与後のいずれかに投与することができる。アデノウイルス調製物はまた、例えば、追加のワクチン剤を使用するワクチンレジメンにおけるプライミングのために使用され得る。
【0101】
アデノウイルス製剤は、全身、局所的、または局所に送達することができる。領域投与（Ｒｅｇｉｏｎａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）とは、特定の解剖学的空間、例えば腹腔内、髄腔内、硬膜下、または特定の器官などへの投与を指す。局所投与とは、腫瘍塊への腫瘍内注射、皮下注射、筋肉内注射などの限られたまたは限局性の解剖学的空間への組成物の投与を指す。当業者は、局所投与または領域投与が循環系へのウイルス調製物の侵入ももたらし得ることを認識する。典型的な送達経路としては、非経口投与、例えば、皮内、筋肉内または皮下経路が挙げられる。他の経路としては、口腔粘膜（例えば、扁桃腺）への投与を含む経口投与、鼻腔内、舌下、膀胱内（例えば、膀胱内）、直腸および膣内の経路が挙げられる。アデノウイルスの送達のために、投与はしばしば吸入によって行うことができる。エアロゾル製剤は、例えば、ジクロロジフルオロメタン、窒素などの加圧された薬学的に許容される噴射剤に入れることができる。それらは、ネブライザーまたはアトマイザーなどの非加圧調製物用の医薬品として製剤化することもできる。典型的には、そのような投与は、上記の水性の薬理的に許容されるバッファーで行われる。肺への送達は、例えば気管支鏡を使用して達成することもできる。
【0102】
本発明のワクチンは、目的の用途、例えば予防的ワクチンまたは治療レジメン、および投与経路に応じて、様々な単位投与形態で投与することができる。治療的使用に関して、各患者の特定の状態または疾患および一般的な医学的状態は、投薬レジメンに影響を及ぼす。
【0103】
ウイルスの量および濃度ならびに所与の用量または「治療上有効な」用量の製剤は、獣医または臨床医によって決定することができる。ワクチンの治療上有効な用量は、ウイルスベクターに含まれる異種核酸によってコードされるタンパク質に対する免疫応答を刺激するアデノウイルスの量である。投与スケジュール、すなわち投与レジメンは、様々な要因、例えば患者の健康状態、身体状態、年齢などに依存する。最新技術により、臨床医は、個々の患者のための投薬レジメンを決定することが可能になる。アデノウイルスは、ヒトワクチンに長年安全に使用されてきた。例えば、前出のＦｒａｎｋｌｉｎ ｅｔ ａｈ，ｓｕｐｒａ、Ｊａｇ－Ａｈｍａｄｅ ｅｔ ａｈ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，５７：２６７，１９８６、Ｂａｌｌａｙ ｅｔ ａｈ，ＥＭＢＯ Ｊ．４：３８６１，１９８５、ＰＣＴ公開ＷＯ９４／１７８３２を参照されたい。これらの例示的な実施例はまた、本発明の方法を実施する場合の投与計画を決定するためのガイダンスとして使用することができる。
【0104】
アデノウイルス製剤の単回投与または複数回投与は、予防的または治療的ワクチンとして投与することができる。一実施形態では、保護的または治療的な免疫応答を誘導または増強するために、複数回用量（例えば、２回以上、３回以上、４回以上、または５回以上の用量）が対象に投与される。２回以上の用量は、周期的な間隔、例えば、１週間、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、または６ヶ月の間隔で分けることができる。
【0105】
さらに別の態様では、本発明はまた、本発明のベクター、ベクター系またはワクチンを含有するキットを提供する。キットは、例えば、本発明のアデノウイルスを増殖させるための細胞も含み得る。キットはまた、キットを使用してアデノウイルスを作製するための教材教示方法を含むことができ、ワクチンの場合、投与量、投与経路および投与方法などの指示のための説明書を含むことができる。
【0106】
以下の実施例は、本発明の様々な態様を例示する。無論、実施例は、本発明の特定の実施形態のみの単なる例示であり、本明細書の最後に添付される特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲に対する限定を構成するものではないと理解されるべきである。
【0107】
本開示を詳細に説明してきたが、特許請求の範囲から逸脱することなく修正および変形が可能であることは明らかであろう。
【実施例】
【0108】
以下の非限定的な実施例は、本開示をさらに説明するために提供される。
【0109】
実施例１
組換え複製欠損性ＣＥＬＯ ＡＡｄ由来遺伝子導入ベクターの構築。
組換え複製欠損性ＣＥＬＯ ＡＡｄ由来遺伝子導入ベクターの構築。
【0110】
アビアデノウイルスＣＥＬＯのゲノムは、約４４ｋｂ長の線状ＤＮＡである（図１）。これは、約１２０ｂｐ長の逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接している。左ＩＴＲの上流では、パッケージングシグナルＹは、ほぼヌクレオチド７０～２００内に位置する。
【0111】
他の研究者らは、ＣＥＬＯゲノムが複製し、宿主細胞にパッケージングされる能力を破壊することなく、ＣＥＬＯゲノムのヌクレオチド４０００６５～４３６８４を欠失させるか、または導入遺伝子コンストラクトと置き換えることができることを実証した（図２Ａ）。この上流ゲノム領域は、オープンリーディングフレーム９、１０および１１に大まかに対応する。
【0112】
ヌクレオチド９３８～２３００のＣＥＬＯゲノムの欠失または置換は、ＣＥＬＯゲノムがそれ自体複製する能力を無効にする（図２Ｂ）。この下流ゲノム領域は、オープンリーディングフレーム１、１５および２に大まかに対応する。この部分的に欠失したＣＥＬＯゲノムの複製およびカプシド形成は、オープンリーディングフレーム１、１５および２を包含し、オープンリーディングフレーム１の上流にプロモーター配列を有するゲノム断片から構成される相補的ＣＥＬＯゲノム断片の存在によって可能になり得る。例えば、そのようなａａ相補的ＣＥＬＯゲノム断片は、限定されないが、ヌクレオチド１～３１００または２５０～３１００を包含する２つのＣＥＬＯゲノム断片からなり得る。
【0113】
図２Ｃに図式的に示されているように、ＣＥＬｒｄと命名された、複製欠損性ＣＥＬＯ系アビアデノウイルスベクターは、オープンリーディングフレーム１、１５および２を機能的および／または部分的に欠失する、またはヌクレオチド７９４～２８２９で構成されるゲノム断片に大まかに対応する、ＣＥＬＯゲノムの下流側のゲノム断片の欠失によって構築することができる。導入遺伝子コンストラクトは、それ自体のプロモーターおよびポリアデニル化部位を有するか、またはＣＥＬＯゲノムのこの領域に見られる各部位を使用するこの欠失に組み込むことができる。
【0114】
図２Ｃに図式的に示されているように、上記の下流欠失に対する第２の欠失を有する別の複製欠損性ＣＥＬＯ系アビアデノウイルスベクターを構築することができる。ＣＥＬＯゲノムはまた、オープンリーディングフレーム９、１０および１１を機能的および／または部分的に欠失するか、またはヌクレオチド４００３７～４２３６５で構成されるゲノム断片に大まかに対応する、ＣＥＬＯゲノムの上流側のゲノム断片を欠失させることもできる。導入遺伝子コンストラクトは、それ自体のプロモーターおよびポリアデニル化部位を有するか、またはＣＥＬＯゲノムのこの領域に見られる各部位を使用するこの欠失に組み込むことができる。制限酵素部位は、制限酵素切断によってベクターゲノムが放出され得るように、ＩＴＲに隣接するベクターコンストラクトの外側に配置される。
【0115】
実施例２
完全に欠失した「中身抜き」複製欠損性ＣＥＬＯ ＡＡｄ由来遺伝子導入ベクターの構築。
完全に欠失した「中身抜き」複製欠損性ＣＥＬＯ ＡＡｄ由来遺伝子導入ベクターの構築。
【0116】
図２Ｄに図式的に示すように、ＣＥＬＯ ＡＡｄ由来の遺伝子導入ベクターは、ＣＥＬＯゲノムの大きな断片を欠失させ、それらを非アデノウイルス詰め物配列で置き換えることによって構築することができる。欠失断片は、プロモーターおよびポリアデニル化部位に連結された目的の導入遺伝子から構成されるか、またはＣＥＬＯゲノム内に見られるプロモーターおよびポリアデニル化部位を使用する導入遺伝子コンストラクトで置き換えることができる。２つ以上の導入遺伝子コンストラクトを、欠失したＣＥＬＯゲノムに組み込むことができる。ＣＥＬＯゲノムは、ＩＴＲ、パッケージングシグナルＹおよび非コードＣＥＬＯ配列を適所に残して、すべてのＣＥＬＯ遺伝子を欠失させることができる。欠失配列は、不活性詰め物および／または導入遺伝子発現コンストラクトによって置き換えられる。そのようなＣＥＬＯベクトルは、完全に削除された、および／または「中身抜き」と示され、ＣＥＬｆｄと呼ばれる。残りのＣＥＬＯ配列は、ヌクレオチド４３６０４～４３８０４の欠失と共に、ヌクレオチド１～２００、または１～３５０のＣＥＬＯゲノムに大まかに対応する。制限酵素部位は、制限酵素切断によってベクターゲノムが放出され得るように、ＩＴＲに隣接するベクターコンストラクトの外側に配置される。
【0117】
実施例３
複製欠損性ＣＥＬＯ ＡＡｄ由来ベクターの複製およびカプシド形成を可能にする相補的遺伝子コンストラクトの構築。
複製欠損性ＣＥＬＯ ＡＡｄ由来ベクターの複製およびカプシド形成を可能にする相補的遺伝子コンストラクトの構築。
【0118】
実施例１に記載されているＣＥＬｒ型の部分的に欠失したＣＥＬＯ ＡＡｄ由来ベクターの複製およびカプシド形成を可能にするために、ＣＥＬｒｄゲノムの導入時に、ＣＥＬｒ型ベクターについて記載されている下流欠失に対して大まかに相補的なＣＥＬＯゲノムのセグメントがパッケージング細胞または宿主細胞に存在しなければならない。この相補的なＣＥＬＯゲノムセグメントは、遺伝子情報、したがってオープンリーディングフレーム１、１５および２によってコードされるタンパク質を提供しなければならない。この相補的なＣＥＬＯゲノムセグメントは、オープンリーディングフレーム１、１５および２によってコードされるタンパク質の発現を提供する形態のヌクレオチド７９４～２８２９のＣＥＬＯゲノムを少なくとも包含しなければならない。これらのタンパク質の発現は、ヌクレオチド１～３１００、または２５０～３１００のＣＥＬＯゲノム断片などのＣＥＬＯゲノム断片によって可能になり得るが、これらに限定されない（図３Ａ）。これらのタンパク質の発現は、オープンリーディングフレーム１、１５および２の発現を促進するために、異種プロモーターおよび異種ポリアデニル化部位、または異種プロモーターおよび異種ポリアデニル化部位を使用する発現ベクターによって可能になり得る（図３Ｂ）。
【0119】
実施例４
完全に欠失した「中身抜き」ＣＥＬＯ ＡＡｄ由来遺伝子導入ベクターゲノムの複製およびカプシド形成を可能にするパッケージング発現ベクターの構築
完全に欠失した「中身抜き」ＣＥＬＯ ＡＡｄ由来遺伝子導入ベクターゲノムの複製およびカプシド形成を可能にするパッケージング発現ベクターの構築
【0120】
ＣＥＬＯゲノムの大きな欠失を有するＣＥＬＯ ＡＡｄ由来遺伝子導入ベクター、または実施例２に記載される完全に欠失した「中身抜き」ＣＥＬＯベクター、例えばＣＥＬｆｄベクターの複製およびカプシド形成を可能にするために、パッケージング発現ベクターは、ＣＥＬＯベクターゲノムと共にパッケージング細胞または宿主細胞に提供されなければならない。
【0121】
このパッケージング発現ベクターは、ヌクレオチド７０～２００または３５０付近のＣＥＬＯゲノム領域に見出されるパッケージングシグナルΨを欠失している（図４）。パッケージング発現プラスミドはまた、リードフレーム８、１０および１１の部分的または完全な欠失に対応するＣＥＬＯゲノムの逆方向末端反復およびセグメントの一方または両方を欠失し得る（図４）。
【0122】
実施例５
パッケージングまたは宿主細胞の機能を強化するためのＣＥＬＯゲノム断片の構築。
パッケージングまたは宿主細胞の機能を強化するためのＣＥＬＯゲノム断片の構築。
【0123】
パッケージング細胞または宿主細胞の活性は、オープンリーディングフレーム２２および８（ｐＡｄＣＥＬＯ）によってコードされる遺伝子などのＣＥＬＯ遺伝子を発現する発現コンストラクトによって強化される。アデノウイルスＥ１ＡおよびＥ１Ｂの遺伝子を保有するヒトアデノウイルスベクターのパッケージングを可能にするために使用される発現ベクターに対応して、この発現コンストラクトは、リーディングフレーム２２および８の遺伝子を発現するように設計される（図５Ａ）。そのような発現ベクターの例を図５Ｂに示す。これは、プロモーターを異種またはアデノウイルスのいずれかで担持し、オープンリーディングフレーム２２および８は、おそらく配列内リボソーム進入部位によって連結され、その後、異種またはアデノウイルスのいずれかのポリアデニル化部位が続く。この発現コンストラクトは、パッケージングまたは宿主細胞のゲノムに安定に組み込まれるか、またはＣＥＬＯ ＡＡｄ由来ベクターの複製およびカプシド形成中にパッケージングまたは宿主細胞にコトランスフェクトされ得る。
【0124】
実施例６
複製欠損性ＣＥＬＯ ＡＡｄ由来遺伝子導入ベクターの複製およびカプシド形成（図６）。
複製欠損性ＣＥＬＯ ＡＡｄ由来遺伝子導入ベクターの複製およびカプシド形成（図６）。
【0125】
完全に欠失した「中身抜き」ＣＥＬＯ ＡＡｄ由来遺伝子導入ベクターについて本明細書で例示するように、ＣＥＬＯ ＡＡｄ由来ベクターのゲノム、本明細書ではＣＥＬｆｄゲノムは、制限酵素切断によってそのクローニングベクターから放出される（図６Ａ）。パッケージング発現コンストラクト（図６Ｂ）と共に、ｐＡｄＣＥＬＯ発現コンストラクトを担持することによって改変されていてもよいパッケージング細胞またはＬＭＨ細胞などの宿主細胞（図６Ｃ）にコトランスフェクトされる。数日間のインキュベーション後、カプシド形成されたＣＥＬｆｄベクターを放出する。
【0126】
ＣＥＬｒｄ型の部分的に欠失したＣＥＬＯ ＡＡｄ由来遺伝子導入ベクターを以下のようにして作製する。そのゲノムは、制限酵素切断によって放出される。実施例３に記載されるような相補的な遺伝子コンストラクトと一緒に、ｐＡｄＣＥＬＯ発現コンストラクトを担持することによって改変されていてもよいパッケージング細胞または宿主細胞、例えばＬＭＨ細胞にコトランスフェクトされるであろう。数日間のインキュベーション後、カプシド形成されたＣＥＬｆｄベクターを放出する。実施例３の相補的遺伝子コンストラクトをパッケージング細胞または宿主細胞に安定に組み込むことが可能であり得る。次いで、ＣＥＬｒｄゲノムによるパッケージングまたは宿主細胞のトランスフェクションによって、またはカプシド形成されたＣＥＬｒｄベクターによるパッケージングまたは宿主細胞の形質導入によって、ＣＥＬｒｄを複製およびパッケージングすることができる。
【0127】
実施例７
鳥インフルエンザに対する複製欠損性ＣＥＬＯ ＡＡｄベクター化ワクチンの設計
鳥インフルエンザに対する複製欠損性ＣＥＬＯ ＡＡｄベクター化ワクチンの設計
【0128】
ＣＥＬｆｄコンストラクトのＣＥＬｒｄに、サイトメガロウイルスプロモーターと、その後に続くヘマグルチニン遺伝子、配列内リボソーム進入部位、ノイラミニダーゼ遺伝子およびポリアデニル化部位とから構成される導入遺伝子コンストラクトを積載し、ヘマグルチニン遺伝子およびノイラミニダーゼ遺伝子は、Ｈ５Ｎ１またはＨ７Ｎ９血清型のインフルエンザウイルスに由来する。鳥および他の種の動物にも、筋肉内、静脈内、皮下、鼻腔内または経腸ワクチンとして送達されるこのコンストラクトをワクチン接種することができる。鳥の場合、ワクチンは受精卵を注射することによって与えられ得る。
【0129】
あるいは、ＣＥＬｆｄコンストラクトは、異なる血清型のインフルエンザに対するワクチン接種が単一のコンストラクトで達成され得るように、上記設計の２つ以上の導入遺伝子発現コンストラクトを積載する。
【0130】
あるいは、ＣＥＬｆｄコンストラクトに、異なる感染疾患に由来する導入遺伝子を積載させて、混合ワクチンとして使用する。
【0131】
本開示またはその好ましい実施形態の要素を導入する場合、冠詞「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、および「当該（ｓａｉｄ）」は、１つ以上の要素があることを意味することを意図している。「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語は、包括的であることを意図しており、列挙された要素以外の追加の要素が存在してもよいことを意味する。
【0132】
上記を考慮すると、本開示のいくつかの目的が達成され、他の有利な結果が得られることが分かるであろう。
【0133】
本開示の範囲から逸脱することなく、上記の製品および方法に様々な変更を加えることができるため、上記の説明に含まれるすべての事項は例示的なものとして解釈されるべきであり、限定的な意味で解釈されるべきではないことが意図される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【国際調査報告】