特表 2023-520636 Ｔ細胞二重特異性結合タンパク質

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-05-18

(54)【発明の名称】Ｔ細胞二重特異性結合タンパク質

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/46 20060101AFI20230511BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20230511BHJP

   A61P 7/00 20060101ALI20230511BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230511BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20230511BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20230511BHJP

   C12N 15/62 20060101ALN20230511BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20230511BHJP

   C07K 16/28 20060101ALN20230511BHJP

【ＦＩ】

C07K16/46

A61K39/395 N

A61P7/00

A61P35/00

A61P35/02

A61P37/02

C12N15/62 Z ZNA

C12N15/13

C07K16/28

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022555860

(86)(22)【出願日】2021-03-16

(85)【翻訳文提出日】2022-11-14

(86)【国際出願番号】 US2021022626

(87)【国際公開番号】W WO2021188590

(87)【国際公開日】2021-09-23

(31)【優先権主張番号】62/990,281

(32)【優先日】2020-03-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】518445159

【氏名又は名称】マジェンタ セラピューティクス インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＭＡＧＥＮＴＡ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ， ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100147485

【弁理士】

【氏名又は名称】杉村 憲司

(74)【代理人】

【識別番号】230118913

【弁護士】

【氏名又は名称】杉村 光嗣

(74)【代理人】

【識別番号】100175477

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 林太郎

(72)【発明者】

【氏名】ラーフル パルチョウデュリー

(72)【発明者】

【氏名】ブラッドリー アール ピアース

(72)【発明者】

【氏名】チン リ

【テーマコード（参考）】

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB01

4C085BB11

4C085DD62

4C085EE01

4C085GG01

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本明細書で提供されるのは、造血幹細胞（ＨＳＣ）抗原を発現するＨＳＣ、例えば、ＣＤ１１７＋細胞のＴ細胞媒介性枯渇、ならびになかでも様々な造血疾患、代謝障害、がん、例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）及び自己免疫疾患の治療に有用な組成物及び方法である。本明細書に記載されるのは、ＣＤ３などのＴ細胞抗原に対する第１の結合部分及びＣＤ１１７などのＨＳＣ抗原に対する第２の結合部分を含む、二重特異性結合ポリペプチド及びその二重特異性抗原結合部分である。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

造血幹細胞（ＨＳＣ）または造血前駆細胞上に発現されるＣＤ１１７に結合する第１の抗原結合部分；及び
Ｔ細胞上に発現される抗原に結合する第２の抗原結合部分
を含む、二重特異性結合ポリペプチド。

【請求項2】

前記第２の抗原結合部分がＣＤ３に結合する、請求項１に記載の二重特異性結合ポリペプチド。

【請求項3】

前記第１の抗原結合部分が抗ＣＤ１１７一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含み、前記第２の抗原結合部分が抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを含む、請求項１または２に記載の二重特異性結合ポリペプチド。

【請求項4】

前記二重特異性結合ポリペプチドが、二重特異性抗体またはその二重特異性抗原結合断片である、請求項１または２に記載の二重特異性結合ポリペプチド。

【請求項5】

前記抗ＣＤ１１７結合部分が、
（ｉ）配列番号７、８、及び９にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１０、１１、及び１２にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；または
（ｉｉ）配列番号１３に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１４に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または
（ｉｉｉ）配列番号２１、２２、及び２３にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号２４、２５、及び２６にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；または
（ｉｖ）配列番号２７に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号２８に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の二重特異性結合ポリペプチド。

【請求項6】

前記抗ＣＤ３結合部分が、
（ｉ）配列番号３７に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号３８に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または
（ｉｉ）配列番号４１に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号４５に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項２～５のいずれか１項に記載の二重特異性結合ポリペプチド。

【請求項7】

ＣＤ１１７結合領域及びＣＤ３結合領域を含む二重特異性抗体またはその二重特異性抗原結合部分であって、前記ＣＤ１１７結合領域は、
（ｉ）配列番号７、８、及び９にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１０、１１、及び１２にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；または
（ｉｉ）配列番号１３に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び
配列番号１４に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または
（ｉｉｉ）配列番号２１、２２、及び２３にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号２４、２５、及び２６にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；または
（ｉｖ）配列番号２７に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び
配列番号２８に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、前記二重特異性抗体またはその二重特異性抗原結合部分。

【請求項8】

前記ＣＤ３結合領域が、
（ｉ）配列番号３７に記載される抗ＣＤ１１７ ＶＨアミノ酸配列及び
配列番号３８に記載される抗ＣＤ１１７ ＶＬアミノ酸配列；または
（ｉｉ）配列番号４１に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び
配列番号４５に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項７に記載の二重特異性抗体またはその二重特異性抗原結合部分。

【請求項9】

第１の重鎖の第１のＣＨ３領域及び第２の重鎖の第２のＣＨ３領域を含むＦｃ領域を含み、ここで、前記第１及び前記第２のＣＨ３領域は、ノブインホール相互作用を介して安定的に会合することが可能である、請求項４、７または８のいずれか１項に記載の二重特異性抗体またはその二重特異性抗原結合部分。

【請求項10】

ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＥからなる群から選択されるアイソタイプである、請求項４または７～９に記載の二重特異性抗体またはその二重特異性抗原結合部分。

【請求項11】

前記ＩｇＧがＩｇＧ１またはＩｇＧ４である、請求項１０に記載の二重特異性抗体またはその二重特異性抗原結合部分。

【請求項12】

前記Ｆｃ領域が、野生型Ｆｃ領域と比較して、位置Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｈ４３５、またはこれらの組み合わせ（ＥＵインデックス）にアミノ酸置換（複数可）を含む、請求項４または７～１１のいずれか１項に記載の二重特異性抗体またはその二重特異性抗原結合部分。

【請求項13】

位置Ｌ２３４での前記アミノ酸置換がＬ２３４Ａである、請求項１２に記載の二重特異性抗体またはその二重特異性抗原結合部分。

【請求項14】

位置Ｌ２３５での前記アミノ酸置換がＬ２３５Ａである、請求項１２または１３に記載の二重特異性抗体またはその二重特異性抗原結合部分。

【請求項15】

位置Ｈ４３５での前記アミノ酸置換がＨ４３５Ａである、請求項１２～１４のいずれか１項に記載の二重特異性抗体またはその二重特異性抗原結合部分。

【請求項16】

前記第１のＣＨ３領域が、位置Ｔ３６６、Ｌ３６８、及びＹ４０７（ＥＵインデックス）にアミノ酸置換を含み、前記第２のＣＨ３領域が、位置Ｔ３６６（ＥＵインデックス）にアミノ酸置換を含む、請求項４または７～１５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体またはその二重特異性抗原結合部分。

【請求項17】

位置Ｔ３６６での前記アミノ酸置換がＴ３６６Ｓである、請求項１６に記載の二重特異性抗体またはその二重特異性抗原結合部分。

【請求項18】

位置Ｌ３６８での前記アミノ酸置換がＬ３６８Ａである、請求項１６または１７に記載の二重特異性抗体またはその二重特異性抗原結合部分。

【請求項19】

位置Ｙ４０７での前記アミノ酸置換がＹ４０７ＶまたはＹ４０７Ｔである、請求項１６～１８のいずれか１項に記載の二重特異性抗体またはその二重特異性抗原結合部分。

【請求項20】

位置Ｔ３６６での前記アミノ酸置換がＴ３６６ＷまたはＴ３６６Ｙである、請求項１６～１９のいずれか１項に記載の二重特異性抗体またはその二重特異性抗原結合部分。

【請求項21】

治療上有効な量の請求項１～２０のいずれか１項に記載の二重特異性結合ポリペプチド、二重特異性抗体、またはその二重特異性抗原結合部分を含む、医薬組成物。

【請求項22】

ヒト患者の幹細胞障害を治療する方法であって、前記患者に治療上有効な量の請求項１～２０のいずれか１項に記載の二重特異性結合ポリペプチド、二重特異性抗体、またはその二重特異性抗原結合部分を投与することを含む、前記方法。

【請求項23】

ヒト患者の免疫不全障害を治療する方法であって、前記患者に治療上有効な量の請求項１～２０のいずれか１項に記載の二重特異性結合ポリペプチド、二重特異性抗体、またはその二重特異性抗原結合部分を投与することを含む、前記方法。

【請求項24】

前記免疫不全障害が、先天性免疫不全または後天性免疫不全である、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

ヒト患者の代謝障害を治療する方法であって、前記患者に治療上有効な量の請求項１～２０のいずれか１項に記載の二重特異性結合ポリペプチド、二重特異性抗体、またはその二重特異性抗原結合部分を投与することを含む、前記方法。

【請求項26】

前記代謝障害が、グリコーゲン蓄積症、ムコ多糖症、ゴーシェ病、ハーラー病、スフィンゴリピド症、及び異染性白質ジストロフィーからなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

ヒト患者の自己免疫障害を治療する方法であって、前記患者に治療上有効な量の請求項１～２０のいずれか１項に記載の二重特異性結合ポリペプチド、二重特異性抗体、またはその二重特異性抗原結合部分を投与することを含む、前記方法。

【請求項28】

前記自己免疫障害が、多発性硬化症、ヒト全身性ループス、リウマチ様関節炎、炎症性腸疾患、乾癬治療、１型真性糖尿病、急性散在性脳脊髄炎、アジソン病、全身脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、再生不良性貧血、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ増殖症候群、自己免疫性卵巣炎、バロー病、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、シャーガス病、慢性疲労免疫機能不全症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、クローン病、瘢痕性類天疱瘡、セリアックスプルー－疱疹状皮膚炎、寒冷凝集素症、ＣＲＥＳＴ症候群、デゴス病、円板状ループス、自律神経障害、子宮内膜症、本態性混合クリオグロブリン血症、線維筋痛症－線維筋炎、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギランバレー症候群、橋本甲状腺炎、化膿性汗腺炎、特発性及び／または急性血小板減少性紫斑病、特発性肺線維症、ＩｇＡニューロパチー、間質性膀胱炎、若年性関節リウマチ、川崎病、扁平苔癬、ライム病、メニエール病、混合性結合組織病、重症筋無力症、神経性筋強直症、オプソクローヌスミオクローヌス症候群、視神経炎、オルド甲状腺炎、尋常性天疱瘡、悪性貧血、多発性軟骨炎、多発性筋炎及び皮膚筋炎、原発性胆汁性肝硬変、結節性多発動脈炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛症、原発性無ガンマグロブリン血症、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、全身硬直症候群、高安動脈炎、側頭動脈炎、潰瘍性大腸炎、ぶどう膜炎、血管炎、白斑、外陰痛、ならびにウェゲナー肉芽腫症からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

ヒト患者のがんを治療する方法であって、前記患者に治療上有効な量の請求項１～２０のいずれか１項に記載の二重特異性結合ポリペプチド、二重特異性抗体、またはその二重特異性抗原結合部分を投与することを含む、前記方法。

【請求項30】

前記がんが、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、及び神経芽細胞腫からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

ヒト患者の幹細胞の集団を枯渇させる方法であって、前記患者に有効量の請求項１～２０のいずれか１項に記載の二重特異性結合ポリペプチド、二重特異性抗体、またはその二重特異性抗原結合部分を投与することを含む、前記方法。

【請求項32】

造血幹細胞を含む移植を前記患者に行うことを更に含む、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

造血幹細胞（ＨＳＣ）を選択的に枯渇させることを、それを必要とするヒト患者に行う方法であって、ＨＳＣが枯渇するように、二重特異性抗体またはその二重特異性抗原結合部分を、それを必要とする前記ヒト対象に投与することを含み、前記二重特異性抗体またはその二重特異性抗原結合部分は、ヒトＨＳＣ細胞表面抗原に特異的に結合する第１の結合部分及びヒトＴ細胞表面抗原に特異的に結合する第２の結合部分を含む、前記方法。

【請求項34】

前記第１の抗原結合部分が、ＣＤ７、ＣＤｗ１２、ＣＤ１３、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａ、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４２ｃ、ＣＤ４２ｄ、ＣＤ４３、ＣＤ４８、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５０、ＣＤ５３、ＣＤ５５、ＣＤ６４ａ、ＣＤ６８、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８５Ａ、ＣＤ８５Ｋ、ＣＤ９０、ＣＤ９９、ＣＤ１０４、ＣＤ１０５、ＣＤ１０９、ＣＤ１１０、ＣＤ１１１、ＣＤ１１２、ＣＤ１１４、ＣＤ１１５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１２４、ＣＤ１２６、ＣＤ１２７、ＣＤ１３０、ＣＤ１３１、ＣＤ１３３、ＣＤ１３５、ＣＤ１３８、ＣＤ１５１、ＣＤ１５７、ＣＤ１６２、ＣＤ１６４、ＣＤ１６８、ＣＤ１７２ａ、ＣＤ１７３、ＣＤ１７４、ＣＤ１７５、ＣＤ１７５ｓ、ＣＤ１７６、ＣＤ１８３、ＣＤ１９１、ＣＤ２００、ＣＤ２０１、ＣＤ２０５、ＣＤ２１７、ＣＤ２２０、ＣＤ２２１、ＣＤ２２２、ＣＤ２２３、ＣＤ２２４、ＣＤ２２５、ＣＤ２２６、ＣＤ２２７、ＣＤ２２８、ＣＤ２２９、ＣＤ２３０、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ２３５ｂ、ＣＤ２３６、ＣＤ２３６Ｒ、ＣＤ２３８、ＣＤ２４０、ＣＤ２４２、ＣＤ２４３、ＣＤ２７７、ＣＤ２９２、ＣＤｗ２９３、ＣＤ２９５、ＣＤ２９８、ＣＤ３０９、ＣＤ３１８、ＣＤ３２４、ＣＤ３２５、ＣＤ３３８、ＣＤ３４４、ＣＤ３４９及びＣＤ３５０からなる群から選択されるヒトＨＳＣ細胞表面抗原に結合する、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

前記第１の抗原結合部分がＣＤ１１７に結合する、請求項３３に記載の方法。

【請求項36】

前記第２の抗原結合部分がヒトＣＤ３に結合する、請求項３３～３５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項37】

前記第１の抗原結合部分がＣＤ１１７に結合し、前記第１の抗原結合部分が、
（ｉ）配列番号７、８、及び９にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１０、１１、及び１２にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；または
（ｉｉ）配列番号１３に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び
配列番号１４に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または
（ｉｉｉ）配列番号２１、２２、及び２３にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号２４、２５、及び２６にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；または
（ｉｖ）配列番号２７に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び
配列番号２８に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項３５または３６に記載の方法。

【請求項38】

前記第２の抗原結合部分がＣＤ３に結合し、前記第２の抗原結合部分が、
（ｉ）配列番号３７に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び
配列番号３８に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または
（ｉｉ）配列番号４１に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号４５に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項４７に記載の方法。

【請求項39】

前記二重特異性抗体またはその二重特異性抗原結合断片がＩｇＧである、請求項３３～３８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項40】

前記ＩｇＧがＩｇＧ１またはＩｇＧ４である、請求項３９に記載の方法。

【請求項41】

前記二重特異性抗体またはその二重特異性抗原結合断片が、第１の重鎖の第１のＣＨ３領域及び第２の重鎖の第２のＣＨ３領域を含むＦｃ領域を含み、前記第１及び前記第２のＣＨ３領域は、ノブインホール相互作用を介して安定的に会合することが可能である、請求項３３～３８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項42】

前記第１のＣＨ３領域が、位置Ｔ３６６、Ｌ３６８、及びＹ４０７（ＥＵインデックス）にアミノ酸置換を含み、前記第２のＣＨ３領域が、位置Ｔ３６６（ＥＵインデックス）にアミノ酸置換を含む、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

位置Ｔ３６６での前記アミノ酸置換がＴ３６６Ｓである、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

位置Ｌ３６８での前記アミノ酸置換がＬ３６８Ａである、請求項４２または４３に記載の方法。

【請求項45】

位置Ｙ４０７での前記アミノ酸置換がＹ４０７ＶまたはＹ４０７Ｔである、請求項４２～４４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項46】

位置Ｔ３６６での前記アミノ酸置換がＴ３６６ＷまたはＴ３６６Ｙである、請求項４２～４５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項47】

前記患者が、幹細胞障害を有し、移植を必要としている、請求項３３～３８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項48】

枯渇後にＨＳＣ移植を前記患者に行うことを更に含む、請求項４７に記載の方法。

【請求項49】

前記患者が、免疫不全障害、代謝障害、自己免疫障害、またはがんを有する、請求項４０～４８のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年３月１６日に出願された米国仮出願第６２／９９０，２８１号の優先権を主張する。前述の優先権の出願は、その内容全体が参照により本明細書に援用される。

【0002】

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に援用される。２０２１年３月１６日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーは、Ｍ１０３０３４＿２２１０ＷＯ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔという名称であり、サイズは５６，３１１バイトである。

【0003】

本発明は、ＨＳＣ細胞上に発現される抗原を含む、標的細胞の免疫駆動型枯渇を媒介するための抗ＣＤ３二重特異性抗体などのＴ細胞二重特異性結合タンパク質の使用に関する。本発明は、更に、造血幹細胞などの造血細胞の表面上に発現される抗原に結合する第１の結合ドメイン及びＴ細胞に結合する第２の結合ドメインを含む、抗ＣＤ１１７二重特異性結合タンパク質またはその断片の組成物及びその使用に関する。

【背景技術】

【0004】

選択的な細胞枯渇は、幹細胞移植のためのコンディショニング、自己免疫疾患の治療、及び特定のがんの治療を含む、多数の治療法の治療になる可能性がある。例えば、Ｂ細胞枯渇療法は、特定の自己免疫状態の治療に使用することができる（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，ｖｏｌｕｍｅ ２０，ｐｐ．１７９－１９９）。

【0005】

コンディショニングは、患者が造血幹細胞を含有する移植を受けるための準備を行う（すなわち、「コンディショニングする」）プロセスである。コンディショニング処置により、造血幹細胞移植の生着が促進される。コンディショニングは、生着前に、患者が移植を受けるための適切な条件（例えば、幹細胞ニッチの形成）をもたらすために実施される。更に、いくつかの状況において、移植細胞が２０％生着すると、特定の疾患状態が緩和または治癒され得る。

【0006】

現在、造血幹細胞療法（ＨＳＣＴ）の適応症及び異常ヘモグロビン症には、多数の非特異的（すなわち、非標的化）コンディショニング法が使用されており、これらには、限定するものではないが、放射線照射（例えば、全身照射（ＴＢＩ））及びＤＮＡアルキル化／修飾剤の使用が含まれ、いずれも患者の臓器系の多くに対して高い毒性があるだけでなく、造血細胞及び非造血細胞ならびに造血微小環境に影響を及ぼす。これらの過酷なコンディショニングレジメンは、典型的に、レシピエント患者の免疫系及びニッチ細胞の破壊を招き、多くの場合、生命を脅かす合併症を引き起こす場合がある。

【0007】

したがって、上述の非特異的コンディショニング法の望ましくない毒性を回避しつつ、標的組織内の内因性造血幹細胞集団を選択的に枯渇させるマイルドなコンディショニングレジメンの開発が必要とされている。ＨＳＣなどの幹細胞の枯渇は、例えば、ＣＤ１１７を含む、ＨＳＣ上に発現される特定の分子を標的とすることによって促進することができる。

【0008】

ＣＤ１１７（ｃ－ｋｉｔまたは幹細胞因子受容体（ＳＣＲＦ）とも呼ばれる）は、リガンドである幹細胞因子（ＳＣＦ）に結合する１回膜貫通型受容体チロシンキナーゼである。ＳＣＦは、ｃＫＩＴのホモ二量体を誘導し、ＰＩ３－ＡＫＴ及びＭＡＰＫの両経路を介してそのチロシンキナーゼ活性及びシグナルを活性化させる（Ｋｉｎｄｂｌｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ．Ｐａｔｈ．１９９８ １５２（５）：１２５９）。ＣＤ１１７は、当初がん遺伝子として発見され、腫瘍学の分野で研究されてきた（例えば、Ｓｔａｎｋｏｖ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｄｅｓ．２０（１７）：２８４９－８０参照）。ＣＤ１１７は、造血幹細胞（ＨＳＣ）で高度に発現している。この発現パターンにより、ＣＤ１１７は、幅広い疾患にわたるコンディショニングの標的となる可能性がある。しかしながら、骨髄移植などの移植のために患者をコンディショニングするのに有効な抗ＣＤ１１７に基づく治療法が依然として必要とされている。

【0009】

現在、幹細胞、例えば、ＣＤ１１７＋幹細胞を標的とし、外因性幹細胞の生着を促進するコンディショニング剤として使用することができる代替方法及び組成物が必要とされている。そのような治療法及び剤は、選択的な細胞枯渇が治療的であるような他の疾患の治療にも有用であり得る。

【発明の概要】

【0010】

本明細書に記載されるのは、標的細胞の免疫駆動型枯渇を媒介するＴ細胞二重特異性結合タンパク質に関する方法及び組成物である。ある特定の実施形態において、本明細書で開示される方法及び組成物は、造血幹細胞（ＨＳＣ）などの幹細胞上に発現される標的抗原にも結合する、二重特異性抗体などのＣＤ３二重特異性結合タンパク質に関する。本明細書で開示される組成物及び方法の利点は、二重特異性物質がＴ細胞を使用して標的細胞を枯渇させ、化学療法または放射線照射などの細胞枯渇の非特異的方法の必要性を減少または排除することである。

【0011】

一態様において、本明細書に記載されるのは、造血幹細胞などの造血細胞の表面上に発現される抗原（すなわち、ヒトＣＤ１１７；ｃ－ｋｉｔとしても知られる）に結合する第１の結合ドメイン及びＴ細胞などの免疫細胞の表面上に発現される抗原（例えば、ＣＤ３）に結合する第２の結合ドメインを含む抗ＣＤ１１７二重特異性結合タンパク質またはその断片、ならびに当該二重特異性結合タンパク質の組成物及びその使用方法である。

【0012】

一態様において、本開示は、造血幹細胞（ＨＳＣ）または造血前駆細胞上に発現されるＣＤ１１７に結合する第１の抗原結合部分及びＴ細胞上に発現される抗原に結合する第２の抗原結合部分を有する二重特異性結合ポリペプチドを提供する。一実施形態において、第１の抗原結合部分は、抗ＣＤ１１７抗体、またはその抗原結合断片に由来する。別の実施形態において、第１の抗原結合部分は、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。更に別の実施形態において、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ジｓｃＦｖ、タンデムジｓｃＦｖ、トリｓｃＦｖ、タンデムトリｓｃＦｖ、Ｆｖ、ジスルフィド連結Ｆｖ、ＤＡＲＴ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ダイアボディ、タンデムダイアボディ、トリアボディ及びタンデムトリアボディからなる群から選択される。別の実施形態において、第１の抗原結合部分は、抗ＣＤ１１７ ｓｃＦｖを含む。

【0013】

他の実施形態において、抗ＣＤ１１７ ｓｃＦｖは、（ｉ）配列番号７、８、及び９にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１０、１１、及び１２にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、または（ｉｉ）配列番号１３に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１４に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または（ｉｉｉ）配列番号２１、２２、及び２３にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号２４、２５、及び２６にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、または（ｉｖ）配列番号２７に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号２８に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

【0014】

ある特定の実施形態において、二重特異性抗ＣＤ３／ＣＤ１１７抗体は、表４に記載される抗ＣＤ１１７抗体及び抗ＣＤ３抗体アミノ酸配列に記載される結合領域（例えば、ＶＨ及びＶＬ；またはＶＨ及びＶＬ ＣＤＲ）を含む。

【0015】

ある特定の他の実施形態において、第２の抗原結合部分は、抗体、またはその抗原結合断片に由来する。一実施形態において、第２の抗原結合部分は、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。別の実施形態において、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ジｓｃＦｖ、タンデムジｓｃＦｖ、トリｓｃＦｖ、タンデムトリｓｃＦｖ、Ｆｖ、ＤＡＲＴ、ジスルフィド連結Ｆｖ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ダイアボディ、タンデムダイアボディ、トリアボディ及びタンデムトリアボディからなる群から選択される。更に別の実施形態において、免疫細胞上に発現される抗原は、ＣＤ３である。いくつかの実施形態において、ＣＤ３は、ＣＤ３Ｄ（ＣＤ３δ）、ＣＤ３Ｅ（ＣＤ３ε）、ＣＤ３Ｇ（ＣＤ３γ）、及びＣＤ３Ｚ（ＣＤ３ζ）からなる群から選択される遺伝子によってコードされる。他の実施形態において、第２の抗原結合部分は、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを含む。

【0016】

他の実施形態において、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖは、配列番号３７に記載される抗ＣＤ１１７ ＶＨアミノ酸配列及び配列番号３８に記載される抗ＣＤ１１７ ＶＬアミノ酸配列を含む。

【0017】

別の実施形態において、第１の抗原結合部分は、第１の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含み、第２の抗原結合部分は、第２のｓｃＦｖを含む。更に別の実施形態において、二重特異性結合ポリペプチドは、第１のｓｃＦｖ及び第２のｓｃＦｖを含むタンデム一本鎖可変断片（ｔａ－ｓｃＦｖ）である。ある特定の他の実施形態において、第１のｓｃＦｖ及び第２のｓｃＦｖは、リンカーによって接続される。いくつかの実施形態において、第１のｓｃＦｖは、抗ＣＤ１１７ ｓｃＦｖであり、第２のｓｃＦｖは、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖである。

【0018】

ある特定の実施形態において、抗ＣＤ１１７ ｓｃＦｖは、（ｉ）配列番号７、８、及び９にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１０、１１、及び１２にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；または（ｉｉ）配列番号１３に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１４に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または（ｉｉｉ）配列番号２１、２２、及び２３にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号２４、２５、及び２６にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；または（ｉｖ）配列番号２７に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号２８に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。別の実施形態において、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖは、配列番号３７に記載される抗ＣＤ１１７ ＶＨアミノ酸配列及び配列番号３８に記載される抗ＣＤ１１７ ＶＬアミノ酸配列を含む。

【0019】

ある特定の他の実施形態において、二重特異性結合ポリペプチドは、安定的に会合することが可能な第１のＦｃドメイン及び第２のＦｃドメインを含むＦｃ領域を有する。いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＥからなる群から選択されるアイソタイプである。他の実施形態において、ＩｇＧは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４である。更に他の実施形態において、Ｆｃ領域は、野生型Ｆｃ領域と比較して、位置Ｌ２３４、Ｌ２３５（ＥＵインデックス）、及びＤ２６５（ＥＵインデックス）にアミノ酸置換を含む。一実施形態において、位置Ｌ２３４でのアミノ酸置換は、Ｌ２３４Ａである。別の実施形態において、位置Ｌ２３５でのアミノ酸置換は、Ｌ２３５Ａである。更に別の実施形態において、二重特異性結合ポリペプチドは、二重特異性抗体、またはその二重特異性抗原結合部分である。

【0020】

別の態様において、本開示は、治療上有効な量の本明細書で開示される二重特異性結合ポリペプチド、二重特異性抗体、またはその二重特異性抗原結合部分を有する医薬組成物を提供する。

【0021】

別の態様において、本開示は、ヒト患者の幹細胞障害を、患者に治療上有効な量の本明細書で開示される二重特異性結合ポリペプチド、二重特異性抗体、またはその二重特異性抗原結合部分を投与することによって治療する方法を提供する。

【0022】

別の態様において、本開示は、ヒト患者の免疫不全障害を、患者に治療上有効な量の本明細書に記載される二重特異性結合ポリペプチド、二重特異性抗体、またはその二重特異性抗原結合部分を投与することによって治療する方法を提供する。いくつかの実施形態において、免疫不全障害は、先天性免疫不全または後天性免疫不全である。

【0023】

別の態様において、本開示は、ヒト患者の代謝障害を、患者に治療上有効な量の本明細書で開示される二重特異性結合ポリペプチド、二重特異性抗体、またはその二重特異性抗原結合部分を投与することによって治療する方法を提供する。一実施形態において、代謝障害は、グリコーゲン蓄積症、ムコ多糖症、ゴーシェ病、ハーラー病、スフィンゴリピド症、及び異染性白質ジストロフィーからなる群から選択される。

【0024】

別の態様において、本開示は、ヒト患者の自己免疫障害を、患者に治療上有効な量の本明細書で開示される二重特異性結合ポリペプチド、二重特異性抗体、またはその二重特異性抗原結合部分を投与することによって治療する方法を提供する。一実施形態において、自己免疫障害は、多発性硬化症、ヒト全身性ループス、リウマチ様関節炎、炎症性腸疾患、乾癬治療、１型真性糖尿病、急性散在性脳脊髄炎、アジソン病、全身脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、再生不良性貧血、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ増殖症候群、自己免疫性卵巣炎、バロー病、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、シャーガス病、慢性疲労免疫機能不全症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、クローン病、瘢痕性類天疱瘡、セリアックスプルー－疱疹状皮膚炎、寒冷凝集素症、ＣＲＥＳＴ症候群、デゴス病、円板状ループス、自律神経障害、子宮内膜症、本態性混合クリオグロブリン血症、線維筋痛症－線維筋炎、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギランバレー症候群、橋本甲状腺炎、化膿性汗腺炎、特発性及び／または急性血小板減少性紫斑病、特発性肺線維症、ＩｇＡニューロパチー、間質性膀胱炎、若年性関節リウマチ、川崎病、扁平苔癬、ライム病、メニエール病、混合性結合組織病、重症筋無力症、神経性筋強直症、オプソクローヌスミオクローヌス症候群、視神経炎、オルド甲状腺炎、尋常性天疱瘡、悪性貧血、多発性軟骨炎、多発性筋炎及び皮膚筋炎、原発性胆汁性肝硬変、結節性多発動脈炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛症、原発性無ガンマグロブリン血症、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、全身硬直症候群、高安動脈炎、側頭動脈炎、潰瘍性大腸炎、ぶどう膜炎、血管炎、白斑、外陰痛、ならびにウェゲナー肉芽腫症からなる群から選択される。

【0025】

別の態様において、本開示は、ヒト患者のがんを治療する方法であって、患者に治療上有効な量の本明細書で開示される二重特異性結合ポリペプチド、二重特異性抗体、またはその二重特異性抗原結合部分を投与することを含む、方法を提供する。一実施形態において、がんは、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、及び神経芽細胞腫からなる群から選択される。

【0026】

別の態様において、本開示は、ヒト患者の幹細胞の集団を枯渇させる方法であって、患者に有効量の本明細書で開示される二重特異性結合ポリペプチド、二重特異性抗体、またはその二重特異性抗原結合部分を投与することを含む、方法を提供する。一実施形態において、方法は、造血幹細胞を含む移植を患者に行うことを含む。

【0027】

本明細書に含まれるのは、造血幹細胞（ＨＳＣ）または造血前駆細胞上に発現されるＣＤ１１７に結合する第１の抗原結合部分及びＴ細胞上に発現される抗原に結合する第２の抗原結合部分を含む二重特異性結合ポリペプチドである。

【0028】

ある特定の実施形態において、第２の抗原結合部分は、ＣＤ３に結合する。

【0029】

一実施形態において、第１の抗原結合部分は、抗ＣＤ１１７一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含み、第２の抗原結合部分は、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを含む。

【0030】

一実施形態において、二重特異性結合ポリペプチドは、二重特異性抗体、またはその二重特異性抗原結合断片である。

【0031】

一実施形態において、抗ＣＤ１１７結合部分は、配列番号７、８、及び９にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１０、１１、及び１２にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む。

【0032】

一実施形態において、抗ＣＤ１１７結合部分は、配列番号１３に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１４に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

【0033】

一実施形態において、抗ＣＤ１１７結合部分は、配列番号２１、２２、及び２３にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号２４、２５、及び２６にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む。

【0034】

一実施形態において、抗ＣＤ１１７結合部分は、配列番号２７に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号２８に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

【0035】

一実施形態において、抗ＣＤ３結合部分は、配列番号３７に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号３８に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

【0036】

一実施形態において、抗ＣＤ３結合部分は、配列番号４１に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号４５に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

【0037】

本明細書で開示されるのはまた、ＣＤ１１７結合領域及びＣＤ３結合領域を含む二重特異性抗体、またはその二重特異性抗原結合部分であり、ここで、ＣＤ１１７結合領域は、配列番号７、８、及び９にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１０、１１、及び１２にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；配列番号１３に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１４に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；配列番号２１、２２、及び２３にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号２４、２５、及び２６にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；または配列番号２７に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号２８に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

【0038】

一実施形態において、二重特異性抗体またはその二重特異性抗原結合部分のＣＤ３結合領域は、（ｉ）配列番号３７に記載される抗ＣＤ１１７ ＶＨアミノ酸配列及び配列番号３８に記載される抗ＣＤ１１７ ＶＬアミノ酸配列；または（ｉｉ）配列番号４１に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号４５に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

【0039】

一実施形態において、二重特異性抗体、またはその二重特異性抗原結合部分は、第１の重鎖の第１のＣＨ３領域及び第２の重鎖の第２のＣＨ３領域を含むＦｃ領域を含み、ここで、第１及び第２のＣＨ３領域は、ノブインホール相互作用を介して安定的に会合することが可能である。

【0040】

一実施形態において、二重特異性抗体、またはその二重特異性抗原結合部分は、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４）、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＥからなる群から選択されるアイソタイプである。

【0041】

一実施形態において、二重特異性抗体、またはその二重特異性抗原結合部分のＦｃ領域は、野生型Ｆｃ領域と比較して、位置Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｈ４３５、またはこれらの組み合わせ（ＥＵインデックス）にアミノ酸置換（複数可）を含む。一実施形態において、位置Ｌ２３４でのアミノ酸置換は、Ｌ２３４Ａである。一実施形態において、位置Ｌ２３５でのアミノ酸置換は、Ｌ２３５Ａである。一実施形態において、位置Ｈ４３５でのアミノ酸置換は、Ｈ４３５Ａである。

【0042】

ある特定の実施形態において、二重特異性抗体、またはその二重特異性抗原結合部分は、位置Ｔ３６６、Ｌ３６８、及びＹ４０７（ＥＵインデックス）でのアミノ酸置換を含む第１のＣＨ３領域と、位置Ｔ３６６（ＥＵインデックス）でのアミノ酸置換を含む第２のＣＨ３領域とを含む。一実施形態において、位置Ｔ３６６でのアミノ酸置換は、Ｔ３６６Ｓである。一実施形態において、位置Ｌ３６８でのアミノ酸置換は、Ｌ３６８Ａである。一実施形態において、位置Ｙ４０７でのアミノ酸置換は、Ｙ４０７ＶまたはＹ４０７Ｔである。一実施形態において、位置Ｔ３６６でのアミノ酸置換は、Ｔ３６６ＷまたはＴ３６６Ｙである。

【0043】

また、治療上有効な量の本明細書で開示される二重特異性結合ポリペプチド、二重特異性抗体、またはその二重特異性抗原結合部分を含む医薬組成物も開示される。

【0044】

更なる実施形態は、ヒト患者の幹細胞障害を治療する方法であって、患者に治療上有効な量の本明細書で開示される二重特異性結合ポリペプチド、二重特異性抗体、またはその二重特異性抗原結合部分を投与することを含む、方法を含む。

【0045】

また更なる実施形態は、ヒト患者の免疫不全障害を治療する方法であって、患者に治療上有効な量の本明細書で開示される二重特異性結合ポリペプチド、二重特異性抗体、またはその二重特異性抗原結合部分を投与することを含む、方法を含む。一実施形態において、免疫不全障害は、先天性免疫不全または後天性免疫不全である。

【0046】

別の実施形態は、ヒト患者の代謝障害を治療する方法であって、患者に治療上有効な量の本明細書で開示される二重特異性結合ポリペプチド、二重特異性抗体、またはその二重特異性抗原結合部分を投与することを含む、方法を含む。一実施形態において、代謝障害は、グリコーゲン蓄積症、ムコ多糖症、ゴーシェ病、ハーラー病、スフィンゴリピド症、及び異染性白質ジストロフィーからなる群から選択される。

【0047】

また別の実施形態は、ヒト患者の自己免疫障害を治療する方法であって、患者に治療上有効な量の本明細書で開示される二重特異性結合ポリペプチド、二重特異性抗体、またはその二重特異性抗原結合部分を投与することを含む、方法を含む。自己免疫障害の例は、多発性硬化症、ヒト全身性ループス、リウマチ様関節炎、炎症性腸疾患、乾癬治療、１型真性糖尿病、急性散在性脳脊髄炎、アジソン病、全身脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、再生不良性貧血、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ増殖症候群、自己免疫性卵巣炎、バロー病、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、シャーガス病、慢性疲労免疫機能不全症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、クローン病、瘢痕性類天疱瘡、セリアックスプルー－疱疹状皮膚炎、寒冷凝集素症、ＣＲＥＳＴ症候群、デゴス病、円板状ループス、自律神経障害、子宮内膜症、本態性混合クリオグロブリン血症、線維筋痛症－線維筋炎、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギランバレー症候群、橋本甲状腺炎、化膿性汗腺炎、特発性及び／または急性血小板減少性紫斑病、特発性肺線維症、ＩｇＡニューロパチー、間質性膀胱炎、若年性関節リウマチ、川崎病、扁平苔癬、ライム病、メニエール病、混合性結合組織病、重症筋無力症、神経性筋強直症、オプソクローヌスミオクローヌス症候群、視神経炎、オルド甲状腺炎、尋常性天疱瘡、悪性貧血、多発性軟骨炎、多発性筋炎及び皮膚筋炎、原発性胆汁性肝硬変、結節性多発動脈炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛症、原発性無ガンマグロブリン血症、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、全身硬直症候群、高安動脈炎、側頭動脈炎、潰瘍性大腸炎、ぶどう膜炎、血管炎、白斑、外陰痛、またはウェゲナー肉芽腫症が挙げられる。

【0048】

また別の実施形態は、ヒト患者のがんを治療する方法であって、患者に治療上有効な量の本明細書で開示される二重特異性結合ポリペプチド、二重特異性抗体、またはその二重特異性抗原結合部分を投与することを含む、方法を含む。一実施形態において、がんは、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、及び神経芽細胞腫からなる群から選択される。

【0049】

また更なる実施形態は、ヒト患者の幹細胞の集団を枯渇させる方法であって、患者に有効量の本明細書で開示される二重特異性結合ポリペプチド、二重特異性抗体、またはその二重特異性抗原結合部分を投与することを含む、方法を含む。ある特定の実施形態において、方法は、造血幹細胞を含む移植を患者に行うことを更に含む。

【0050】

本明細書に含まれるのはまた、造血幹細胞（ＨＳＣ）を選択的に枯渇させることを、それを必要とするヒト患者に行う方法であって、ＨＳＣが枯渇するように、二重特異性抗体またはその二重特異性抗原結合部分を、それを必要とするヒト対象に投与することを含み、二重特異性抗体またはその二重特異性抗原結合部分は、ヒトＨＳＣ細胞表面抗原に特異的に結合する第１の結合部分及びヒトＴ細胞表面抗原に特異的に結合する第２の結合部分を含む、方法である。一実施形態において、第１の抗原結合部分は、ＣＤ７、ＣＤｗ１２、ＣＤ１３、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａ、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４２ｃ、ＣＤ４２ｄ、ＣＤ４３、ＣＤ４８、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５０、ＣＤ５３、ＣＤ５５、ＣＤ６４ａ、ＣＤ６８、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８５Ａ、ＣＤ８５Ｋ、ＣＤ９０、ＣＤ９９、ＣＤ１０４、ＣＤ１０５、ＣＤ１０９、ＣＤ１１０、ＣＤ１１１、ＣＤ１１２、ＣＤ１１４、ＣＤ１１５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１２４、ＣＤ１２６、ＣＤ１２７、ＣＤ１３０、ＣＤ１３１、ＣＤ１３３、ＣＤ１３５、ＣＤ１３８、ＣＤ１５１、ＣＤ１５７、ＣＤ１６２、ＣＤ１６４、ＣＤ１６８、ＣＤ１７２ａ、ＣＤ１７３、ＣＤ１７４、ＣＤ１７５、ＣＤ１７５ｓ、ＣＤ１７６、ＣＤ１８３、ＣＤ１９１、ＣＤ２００、ＣＤ２０１、ＣＤ２０５、ＣＤ２１７、ＣＤ２２０、ＣＤ２２１、ＣＤ２２２、ＣＤ２２３、ＣＤ２２４、ＣＤ２２５、ＣＤ２２６、ＣＤ２２７、ＣＤ２２８、ＣＤ２２９、ＣＤ２３０、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ２３５ｂ、ＣＤ２３６、ＣＤ２３６Ｒ、ＣＤ２３８、ＣＤ２４０、ＣＤ２４２、ＣＤ２４３、ＣＤ２７７、ＣＤ２９２、ＣＤｗ２９３、ＣＤ２９５、ＣＤ２９８、ＣＤ３０９、ＣＤ３１８、ＣＤ３２４、ＣＤ３２５、ＣＤ３３８、ＣＤ３４４、ＣＤ３４９及びＣＤ３５０からなる群から選択されるヒトＨＳＣ細胞表面抗原に結合する。ある特定の実施形態において、第１の抗原結合部分は、ＣＤ１１７に結合する。ある特定の実施形態において、第２の抗原結合部分は、ヒトＣＤ３に結合する。

【0051】

一実施形態において、第１の抗原結合部分は、ＣＤ１１７に結合し、ここで、第１の抗原結合部分は、（ｉ）配列番号７、８、及び９にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１０、１１、及び１２にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；または（ｉｉ）配列番号１３に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１４に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または（ｉｉｉ）配列番号２１、２２、及び２３にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号２４、２５、及び２６にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；または（ｉｖ）配列番号２７に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号２８に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。

【0052】

一実施形態において、第２の抗原結合部分は、ＣＤ３に結合し、ここで、第２の抗原結合部分は、（ｉ）配列番号３７に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号３８に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または（ｉｉ）配列番号４１に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号４５に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

【0053】

一実施形態において、二重特異性抗体、またはその二重特異性抗原結合断片は、ＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４である。

【0054】

ある特定の実施形態において、二重特異性抗体、またはその二重特異性抗原結合断片は、第１の重鎖の第１のＣＨ３領域及び第２の重鎖の第２のＣＨ３領域を含むＦｃ領域を含み、ここで、第１及び第２のＣＨ３領域は、ノブインホール相互作用を介して安定的に会合することが可能である。一実施形態において、第１のＣＨ３領域は、位置Ｔ３６６、Ｌ３６８、及びＹ４０７（ＥＵインデックス）にアミノ酸置換を含み、第２のＣＨ３領域は、位置Ｔ３６６（ＥＵインデックス）にアミノ酸置換を含む。一実施形態において、位置Ｔ３６６でのアミノ酸置換は、Ｔ３６６Ｓである。一実施形態において、位置Ｌ３６８でのアミノ酸置換は、Ｌ３６８Ａである。一実施形態において、位置Ｙ４０７でのアミノ酸置換は、Ｙ４０７ＶまたはＹ４０７Ｔである。一実施形態において、位置Ｔ３６６でのアミノ酸置換は、Ｔ３６６ＷまたはＴ３６６Ｙである。

【0055】

一実施形態において、患者は、幹細胞障害を有し、移植を必要としている。一実施形態において、方法は、枯渇後にＨＳＣ移植を患者に行うことを更に含む。

【0056】

一実施形態において、患者は、免疫不全障害、代謝障害、自己免疫障害、またはがんを有する。

【図面の簡単な説明】

【0057】

【図1】ＣＤ１１７発現標的細胞（Ｋａｓｕｍｉ－１細胞）を使用した抗ＣＤ１１７／ＣＤ３二重特異性抗体（すなわち、「ｂｓ－Ａｂ－１」）のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞殺傷アッセイの結果を、１つの非標的化アーム及び１つの標的化アーム（すなわち、ＣＤ３またはＣＤ１１７標的化アームのいずれか）を有する抗体対照と比較してグラフで示す。図１中、対照抗体は、「抗ＣＤ１１７アイソタイプ抗体」及び「抗ＣＤ３アイソタイプ抗体」と称される。

【図2】初代ヒト造血幹細胞を使用したｂｓ－Ａｂ－１二重特異性抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞殺傷アッセイの結果を、１つの非標的化アーム及び１つの標的化アーム（すなわち、ＣＤ３またはＣＤ１１７標的化アームのいずれか）を有する抗体対照と比較してグラフで示す。図２中、対照は、「抗ＣＤ１１７アイソタイプ抗体」及び「抗ＣＤ３アイソタイプ抗体」と称される。

【図3A】ｂｓ－Ａｂ－１二重特異性抗体が、ヒト化ＮＳＧマウスにおいて、ヒトＨＳＣを選択的に枯渇させることを示すｉｎ ｖｉｖｏ細胞枯渇アッセイの結果をグラフで示す。様々な濃度の（ｉ）ｂｓ－Ａｂ－１二重特異性抗体、（ｉｉ）抗ＣＤ１１７アイソタイプ抗体、（ｉｉｉ）抗ＣＤ３アイソタイプ抗体、（ｉｖ）抗ＣＤ１１７アイソタイプ抗体と抗ＣＤ３アイソタイプ抗体の組み合わせ、及び（ｖ）対照（すなわち、「ＰＢＳ」）の単回投与で治療したマウスにおいて、２１日後に維持されたＣＤ３４＋細胞の存在比率（％）を示す。

【図3B】ｂｓ－Ａｂ－１二重特異性抗体が、ヒト化ＮＳＧマウスにおいて、ヒトＨＳＣを選択的に枯渇させることを示すｉｎ ｖｉｖｏ細胞枯渇アッセイの結果をグラフで示す。様々な濃度の（ｉ）ｂｓ－Ａｂ－１二重特異性抗体、（ｉｉ）抗ＣＤ１１７アイソタイプ抗体、（ｉｉｉ）抗ＣＤ３アイソタイプ抗体、（ｉｖ）抗ＣＤ１１７アイソタイプ抗体と抗ＣＤ３アイソタイプ抗体の組み合わせ、及び（ｖ）対照（すなわち、「ＰＢＳ」）の単回投与で治療したマウスにおいて、２１日後に維持されたＣＤ３４＋細胞の絶対数を示す。

【図3C】ｂｓ－Ａｂ－１二重特異性抗体が、ヒト化ＮＳＧマウスにおいて、ヒトＨＳＣを選択的に枯渇させることを示すｉｎ ｖｉｖｏ細胞枯渇アッセイの結果をグラフで示す。様々な濃度の（ｉ）ｂｓ－Ａｂ－１二重特異性抗体、（ｉｉ）抗ＣＤ１１７アイソタイプ抗体、（ｉｉｉ）抗ＣＤ３アイソタイプ抗体、（ｉｖ）抗ＣＤ１１７アイソタイプ抗体と抗ＣＤ３アイソタイプ抗体の組み合わせ、及び（ｖ）対照（すなわち、「ＰＢＳ」）の単回投与で治療したマウスにおいて、２１日後に維持されたＣＤ３４＋ＣＤ１１７＋細胞の存在比率（％）を示す。

【図3D】ｂｓ－Ａｂ－１二重特異性抗体が、ヒト化ＮＳＧマウスにおいて、ヒトＨＳＣを選択的に枯渇させることを示すｉｎ ｖｉｖｏ細胞枯渇アッセイの結果をグラフで示す。様々な濃度の（ｉ）ｂｓ－Ａｂ－１二重特異性抗体、（ｉｉ）抗ＣＤ１１７アイソタイプ抗体、（ｉｉｉ）抗ＣＤ３アイソタイプ抗体、（ｉｖ）抗ＣＤ１１７アイソタイプ抗体と抗ＣＤ３アイソタイプ抗体の組み合わせ、及び（ｖ）対照（すなわち、「ＰＢＳ」）の単回投与で治療したマウスにおいて、２１日後に維持されたＣＤ３４＋ＣＤ１１７＋細胞の絶対数を示す。上述のように、抗ＣＤ３アイソタイプ抗体及び抗ＣＤ１１７アイソタイプ抗体は、ＣＤ３またはＣＤ１１７標的化アームのいずれか及び非標的化アームを有する対照抗体を指す。

【図4】初代ヒト幹細胞を使用したｂｓ－Ａｂ－２二重特異性抗体及びｂｓ－Ａｂ－３二重特異性抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞殺傷アッセイの結果を、（ｉ）Ａｂ８５アイソタイプ抗体（すなわち、Ａｂ８５のＣＤ１１７標的化アーム（Ｔ３６６Ｙ及びＨ４３５Ａのアミノ酸置換を含む）及び非標的化アーム（Ｙ４０７Ｔ及びＨ４３５Ａのアミノ酸置換を含む）を含む抗体；図４中「Ａｂ８５－Ｉｓｏ」と称される）と抗ＣＤ３アイソタイプ抗体（すなわち、Ａｂ２のＣＤ３標的化アーム（Ｙ４０７Ｔ及びＨ４３５Ａのアミノ酸置換を含む）及び非標的化アーム（Ｔ３６６Ｙ及びＨ４３５Ａのアミノ酸置換を含む）を含む抗体；図４中「抗ＣＤ３－Ｉｓｏ」と称される）の組み合わせ、及び（ｉｉ）Ａｂ６７アイソタイプ（すなわち、Ａｂ６７のＣＤ１１７標的化アーム（Ｔ３６６Ｙ及びＨ４３５Ａのアミノ酸置換を含む）及び非標的化アーム（Ｙ４０７Ｔ及びＨ４３５Ａのアミノ酸置換を含む）を含む抗体；図４中「Ａｂ６５－Ｉｓｏ」と称される）と抗ＣＤ３アイソタイプ抗体（すなわち、Ａｂ２のＣＤ３標的化アーム（Ｙ４０７Ｔ及びＨ４３５Ａのアミノ酸置換を含む）及び非標的化アーム（Ｔ３６６Ｙ及びＨ４３５Ａのアミノ酸置換を含む）を含む抗体；図４中「抗ＣＤ３－Ｉｓｏ」と称される）の組み合わせと比較してグラフで示す。

【図5】標的細胞の免疫駆動型枯渇を媒介するために使用することができるＴ細胞二重特異性抗体の模式図を提供する。図５の二重特異性抗体は、ＣＤ３に結合するＴ細胞結合アーム（重鎖及び軽鎖）及びＣＤ１１７に結合する標的細胞（例えば、ＨＳＣ）結合アーム（重鎖及び軽鎖）を有する。

【発明を実施するための形態】

【0058】

本明細書に記載されるのは、Ｔ細胞を介して細胞枯渇を媒介するために使用することができる二重特異性物質である。本明細書で開示される方法及び組成物は、Ｔ細胞特異的二重特異性タンパク質によって結合されたＴ細胞を使用して標的細胞を枯渇させるものであり、その標的は、二重特異性タンパク質の第２のアームによって定義される。例えば、二重特異性物質は、ＣＤ３（Ｔ細胞抗原）及びＣＤ１１７（ＨＳＣ標的抗原）を標的とし得る。したがって、本明細書に含まれるのは、ヒトＣＤ１１７及びヒトＣＤ３に結合する抗ＣＤ１１７二重特異性結合タンパク質またはその断片に関する方法及び組成物である。

【0059】

一般に、本明細書で開示されるＨＳＣ及びＣＤ３標的化二重特異性タンパク質、例えば、本明細書で提供される抗ＣＤ１１７二重特異性結合タンパク質またはその断片は、幹細胞移植のためにヒト患者をコンディショニングする方法を含む治療法に有利な多くの特徴を有する。これらの特徴により、本明細書で開示される抗ＣＤ１１７二重特異性結合タンパク質またはその断片はまた、様々な病態、なかでも、血液疾患、代謝障害、がん、及び自己免疫疾患などに罹患している患者を治療する方法での使用にも有利となっている。

【0060】

本開示は、ヒトＣＤ１１７の外部ドメインに結合し、かつＴ細胞の表面上のヒトＣＤ３に結合する抗ＣＤ１１７二重特異性結合タンパク質またはその断片を提供する。本明細書で同定された単離された抗ＣＤ１１７二重特異性結合タンパク質またはその断片のある特定の実施形態の結合領域は、以下に記載される。

【0061】

本明細書で開示されるＨＳＣ及びＣＤ３標的化二重特異性タンパク質（例えば、本明細書に記載される抗ＣＤ１１７二重特異性結合タンパク質またはその断片）は、様々な障害、例えば、なかでも、造血系統細胞種の疾患、がん、自己免疫疾患、代謝障害、及び幹細胞障害を治療する方法に使用することができる。本明細書に記載される組成物及び方法は、（ｉ）がん細胞（例えば、白血病細胞）及び自己免疫細胞（例えば、自己反応性Ｔ細胞）の集団などの病態を生じさせる細胞の集団を直接枯渇させ、及び／または（ｉｉ）移植された細胞がホーミングし得るニッチを提供することによって移植された造血幹細胞の生着を促進するように、内因性造血幹細胞の集団を枯渇させることができる。前述の活性は、例えば、造血幹細胞（または内因性疾患原因細胞）によって発現される抗原、すなわち、ＣＤ１１７、及びＴ細胞などの免疫細胞によって発現される抗原、例えば、ＣＤ３に結合することが可能な抗ＣＤ１１７二重特異性結合タンパク質またはその断片の投与によって達成することができる。疾患を直接治療する場合、この投与により、目的の病態を生じさせる細胞の量を減少させることができる。患者の造血幹細胞移植療法の準備の場合、この投与により、内因性造血幹細胞の集団が選択に枯渇され得、それにより、骨髄などの造血組織に空きができ、その空きがその後移植される外因性造血幹細胞によって満たされ得る。本方法は、ＣＤ１１７（ＧＮＮＫ＋ＣＤ１１７など）及びＣＤ３に結合することが可能な抗ＣＤ１１７二重特異性結合タンパク質またはその断片を患者に投与して、上記活性の両方をもたらすことができるという発見に部分的に基づいている。ＣＤ１１７及びＣＤ３に結合する抗ＣＤ１１７二重特異性結合タンパク質またはその断片は、がん性細胞または自己免疫細胞の集団を直接枯渇させるために、がんまたは自己免疫疾患に罹患している患者に投与することができ、また、移植される造血幹細胞の生存及び生着能を促進するために、造血幹細胞移植療法を必要とする患者に投与することができる。

【0062】

ＣＤ３及び抗ＨＳＣ抗原に結合する二重特異性結合タンパク質、例えば、抗ＣＤ１１７二重特異性結合タンパク質またはその断片の投与による造血幹細胞移植の生着は、様々な経験的測定で明示することができる。例えば、移植された造血幹細胞の生着は、例えば、ＣＤ１１７及びＣＤ３に結合することが可能な抗ＣＤ１１７二重特異性結合タンパク質またはその断片の投与及び後続の造血幹細胞移植の実施後に、患者の骨髄内に存在する競合的再建単位（ＣＲＵ）の量を評価することによって評価することができる。更に、化学反応を触媒する酵素などの蛍光、発色、または発光生成物をもたらすレポーター遺伝子をベクターに組み込み、それをドナー造血幹細胞にトランスフェクトし、その後、造血幹細胞がホーミングした骨髄などの組織における対応するシグナルをモニタリングすることによって、造血幹細胞移植の生着を観察することができる。また、例えば、当該技術分野において知られている蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）解析法によって決定されるように、造血幹細胞及び前駆細胞の量及び生存率を評価することによって、造血幹細胞生着を観察することもできる。生着はまた、移植後の期間中に末梢血中の白血球数を測定することによって、及び／または骨髄穿刺液試料中のドナー細胞による骨髄細胞の回復を測定することによって、決定することもできる。

【0063】

以下のセクションは、Ｔ細胞抗原、例えば、ＣＤ３、及び幹細胞標的、例えば、ＣＤ１１７に結合する二重特異性結合タンパク質についての説明を提供する。例としては、抗ＣＤ１１７二重特異性結合タンパク質またはその断片が挙げられる。本明細書で開示される組成物及び方法は、がん（急性骨髄性白血病または骨髄異形成症候群など）もしくは自己免疫疾患に罹患している患者、または造血幹細胞移植片の生着を促進するために造血幹細胞移植療法を必要としている患者などの患者を治療するために使用することができ、そのような治療薬を患者に（例えば、造血幹細胞移植前に）投与する方法も同様である。

【0064】

定義
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、記載されている値の上または下５％以内の値を指す。

【0065】

本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、特定の抗原に特異的に結合するか、または特定の抗原と免疫学的に反応性である、免疫グロブリン分子を指す。抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、遺伝子操作された抗体、及び他の抗体の改変形態、例えば、限定するものではないが、脱免疫化抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヘテロコンジュゲート抗体（例えば、二重、三重及び四重特異性抗体、ダイアボディ、トリアボディ、ならびにテトラボディ）、及び抗体断片（すなわち、抗体の抗原結合断片）、例えば、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｒｌｇＧ、及びｓｃＦｖ断片（所望の抗原結合活性を呈する限り）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0066】

一般に、抗体は、抗原結合領域（本明細書において抗原結合部分とも呼ばれる）を含有する重鎖及び軽鎖を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書でＨＣＶＲまたはＶＨと略記される）及び重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書でＬＣＶＲまたはＶＬと略記される）及び軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬから構成される。ＶＨ領域及びＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域と、その間に点在するフレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存された領域とに更に分けることができる。各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成され、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、次の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配列されている。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む、宿主の組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介することができる。

【0067】

「抗原結合断片」という用語は、本明細書で使用される場合、標的抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の部分を指す。抗体の抗原結合機能は、全長抗体の断片でも果たすことができる。抗体断片は、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ、アフィボディ、ナノボディ、アプタマー、またはドメイン抗体であり得る。抗体の「抗原結合断片」という用語に包含される結合断片の例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含有する二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｖ）ＶＨ及びＶＬドメインを含むｄＡｂ；（ｖｉ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（例えば、Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６，１９８９参照）；（ｖｉｉ）ＶＨまたはＶＬドメインからなるｄＡｂ；（ｖｉｉｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）；及び（ｉｘ）任意選択により合成リンカーによって接続され得る２つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ）の単離されたＣＤＲの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。更に、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬ及びＶＨは、別々の遺伝子によってコードされているが、組み換え法を使用して、ＶＬ領域とＶＨ領域が対になって一価の分子を形成する単一タンパク質鎖としての作製を可能にするリンカーによって接続することができる（一本鎖抗体Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６，１９８８及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３，１９８８参照）。これらの抗体断片は、当業者に知られている従来の技術を使用して得ることができ、これらの断片は、インタクト抗体と同じ様式で有用性についてスクリーニングすることができる。抗原結合断片は、組み換えＤＮＡ技術、インタクト免疫グロブリンの酵素または化学的切断によって、あるいは、ある特定の場合、当該技術分野において知られている化学的ペプチド合成手順によって、作製することができる。二重特異性抗体の文脈では、抗原結合断片は、二重特異性断片、すなわち、二重特異性抗原結合断片（または部分）となる。

【0068】

「インタクト」または「全長」抗体は、本明細書で使用される場合、ジスルフィド結合によって相互に接続された２つの重鎖（Ｈ）ポリペプチド及び２つの軽鎖（Ｌ）ポリペプチドを有する抗体を指す。二重特異性抗体は、インタクト抗体であり得、ここで、二重特異性抗体の第１のアームは、第１の抗原（またはエピトープ）に結合する軽鎖及び重鎖を含み、二重特異性抗体の第２のアームは、第２の抗原（またはエピトープ）に結合する重鎖及び軽鎖を含む。

【0069】

「特異的に結合する」という用語は、本明細書で使用される場合、タンパク質一般ではなく、特定のタンパク質構造（エピトープ）を認識して結合する抗体または二重特異性結合タンパク質の能力を指す。抗体または二重特異性結合タンパク質がエピトープ「Ａ」に対して特異的である場合、標識された「Ａ」及び抗体を含有する反応において、エピトープＡを含有する分子（または遊離の非標識Ａ）が存在すると、抗体に結合する標識されたＡの量が減少する。例として、抗体は、標識されている場合、対応する非標識抗体と競合し、その標的から離れ得る場合、標的に「特異的に結合する」。一実施形態において、抗体が標的に対して少なくとも約１０^－４Ｍ、約１０^－５Ｍ、約１０^－６Ｍ、約１０^－７Ｍ、約１０^－８Ｍ、約１０^－９Ｍ、約１０^－１０Ｍ、約１０^－１１Ｍ、約１０^－１２Ｍまたはそれ以下（小さい（ｌｅｓｓ）とは約１０^－１２よりも小さい数、例えば、１０^－１３を意味する）のＫ_Ｄを有する場合、抗体または二重特異性結合タンパク質は、標的、例えば、造血幹細胞によって発現されるＣＤ１１７などの抗原に特異的に結合する。一実施形態において、Ｋ_Ｄは、標準的なバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）に従って決定される。しかしながら、抗体は、配列上関連する２つ以上抗原に特異的に結合することが可能であり得ることを理解されたい。例えば、一実施形態において、抗体は、抗原、例えば、ＣＤ１１７のヒト及び非ヒト（例えば、マウスまたは非ヒト霊長類）の両方のオルソログに特異的に結合することができる。

【0070】

本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、任意の真核生物、原核生物、またはファージクローンを含む単一クローンから、当該技術分野で利用可能であるまたは知られている任意の手段により得られる抗体を指し、ハイブリドーマ技術を介して産生される抗体に限定されない。本開示で有用なモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組み換え、及びファージディスプレイ技術、またはこれらの組み合わせの使用を含む、当該技術分野において知られている多種多様の技術を使用して調製することができる。

【0071】

本明細書で使用される場合、「免疫細胞」という用語は、造血系由来であり、免疫応答に関与する細胞を含むことが意図されるが、これに限定されない。免疫細胞には、Ｔ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれるが、これらに限定されない。ナチュラルキラー細胞は、当該技術分野においてよく知られている。一実施形態において、ナチュラルキラー細胞には、ＮＫ－９２細胞などの細胞株が含まれる。ＮＫ細胞株の更なる例としては、ＮＫＧ、ＹＴ、ＮＫ－ＹＳ、ＨＡＮＫ－１、ＹＴＳ細胞、及びＮＫＬ細胞が挙げられる。免疫細胞は、同種または自家であり得る。

【0072】

本明細書で使用される場合、「抗ＣＤ１１７抗体」または「ＣＤ１１７に結合する抗体」という用語は、抗体がＣＤ１１７を標的とする際に診断用剤及び／または治療薬剤として有用であるのに十分な親和性でＣＤ１１７に結合することが可能な抗体を指す。同様に、「抗ＣＤ１１７二重特異性結合タンパク質」または「ＣＤ１１７に結合する二重特異性結合タンパク質」という用語は、二重特異性結合タンパク質がＣＤ１１７を標的とする際に診断用剤及び／または治療薬剤として有用であるのに十分な親和性でＣＤ１１７に結合することが可能な二重特異性結合タンパク質を指す。

【0073】

本明細書で使用される場合、「二重特異性結合タンパク質」または「二重特異性結合ポリペプチド」という用語は、２つの抗原（または同じ抗原上の２つのエピトープ）に結合する抗原結合領域を含むタンパク質を指す。二重特異性結合タンパク質の例は、二重特異性抗体またはＢｉＴＥである（例えば、Ｅｉｎｓｅｌｅ ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ｃａｎｃｅｒ ｖｏｌ．１２６（１４）：３１９２－３２０１参照）。

【0074】

「二重特異性抗体」または「二重特異性抗体コンストラクト」という用語は、２つの異なる抗原または２つの異なるエピトープに対して二重結合特異性を示す抗体を指し、各結合部位は、異なっており、異なる抗原またはエピトープを認識する。例えば、結合特異性の一方は、造血幹細胞（ＨＳＣ）表面抗原、例えば、ＣＤ１１７（例えば、ＧＮＮＫ＋ＣＤ１１７）上のエピトープに向けられ、他方は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）などの異なる細胞上のエピトープまたは異なる造血幹細胞表面抗原もしくは別の細胞表面タンパク質、例えば、特に細胞成長を増強するシグナル伝達経路に関与する受容体もしくは受容体サブユニット上のエピトープに向けることができる。一実施形態において、二重特異性抗体は、図５に記載されるインタクト抗体によって表され、ここで、二重特異性抗体は、抗体重鎖及び軽鎖を含むＴ細胞特異的結合アームを含有し、抗体重鎖及び軽鎖を含む第２の標的特異的結合アーム（例えば、ＨＳＣ上に発現される抗原に結合する）を含有する。

【0075】

特定の実施形態において、「二重特異性結合タンパク質」または「二重特異性抗体」または「二重特異性抗体コンストラクト」は、ＣＤ１１７に結合する第１の抗原結合ドメイン（または結合部分）及びＣＤ３に結合する第２の抗原結合ドメイン（または結合部分）を有する。

【0076】

本明細書で開示される二重特異性結合タンパク質、例えば、抗ＣＤ１１７二重特異性結合タンパク質またはその断片が（少なくとも）二重特異性であることを考慮すると、これらは自然に生じることはなく、自然に生じる産物とは極めて異なるものである。したがって、「二重特異性」結合タンパク質または免疫グロブリンは、異なる特異性を含む少なくとも２つの異なる結合部位を有する人工的なハイブリッド抗体または免疫グロブリンである。二重特異性結合タンパク質は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の連結を含む様々な方法によって産生することができる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ ＆ Ｌａｃｈｍａｎｎ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｕｎｏｌ．７９：３１５－３２１（１９９０）を参照されたい。

【0077】

「ノブインホール」または「ノブズインホール」という用語は、第１の抗原（またはエピトープ）に結合する軽鎖及び重鎖を含有する第１のアームと、第２の抗原（またはエピトープ）に結合する第２の軽鎖及び重鎖を含有する第２のアームを含有する、二重特異性抗体の特定の種類を指す。ノブインホール二重特異性抗体は、各アームのＣＨ３ドメインを操作して各重鎖に「ノブ」または「ホール」のいずれかを作成し、２つの重鎖のヘテロ二量体化を促進することを伴う。

【0078】

特定の実施形態によれば、Ｔ細胞／ＨＳＣに特異的な二重特異性物質（例えば、抗ＣＤ３／ＣＤ１１７二重特異性抗体）は、「二重特異性一本鎖結合タンパク質」、より好ましくは、二重特異性「一本鎖Ｆｖ」（ｓｃＦｖ）である。Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬ及びＶＨは、別々の遺伝子によってコードされているが、組み換え法を使用して、ＶＬ領域とＶＨ領域が対になって一価の分子を形成する単一タンパク質鎖としての作製を可能にする合成リンカーによって接続することができる。例えば、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３）を参照されたい。これらの抗体断片は、当業者に知られている従来の技術を使用して得ることができ、これらの断片は、全抗体または全長抗体と同じ様式で機能について評価される。したがって、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）は、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）の可変領域及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質であり、通常、約１０～約２５アミノ酸、好ましくは、約１５～２０アミノ酸の短いリンカーペプチドで接続されている。リンカーは、通常、柔軟性のためにグリシンを多く含み、溶解性のためにセリンまたはトレオニンを多く含み、ＶＨのＮ末端とＶＬのＣ末端またはその逆を接続することができる。このタンパク質は、定常領域の除去及びリンカーの導入にもかかわらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持している。

【0079】

本明細書で使用される場合、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）という用語は、抗体（または本明細書に記載される二重特異性結合タンパク質）の軽鎖及び重鎖の両方の可変ドメインに存在する超可変領域を指す。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される。抗体（または本明細書に記載される二重特異性結合タンパク質）の超可変領域を画定するアミノ酸位置は、その文脈及び当該技術分野において知られている様々な定義に応じて変わり得る。可変ドメイン内のいくつかの位置は、ハイブリッド超可変位置とみなされることがあり、この場合、これらの位置は、ある一連の基準下では超可変領域内とみなすことができるが、別の一連の基準下では超可変領域外とみなされるものである。これらの位置のうちの１つ以上は、伸長超可変領域に存在する場合もある。本明細書に記載される抗体（または本明細書に記載される二重特異性結合タンパク質）は、これらのハイブリッド超可変位置に改変を含有し得る。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、３つのＣＤＲによって接続された主にβシート形状を取る４つのフレームワーク領域をそれぞれ含有し、ＣＤＲはβシート構造を接続するループを形成し、いくつかの場合にはβシート構造の一部を形成する。各鎖中のＣＤＲは、フレームワーク領域によって、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４の順に近接して一緒に保持され、他方の抗体鎖のＣＤＲとともに、抗体の標的結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．，１９８７参照）。ある特定の実施形態において、免疫グロブリンアミノ酸残基のナンバリングは、特に指示がない限り、Ｋａｂａｔらの免疫グロブリンアミノ酸残基ナンバリングシステムに従って行われる（ただし、任意の抗体ナンバリングスキーム、例えば、限定するものではないが、ＩＭＧＴ及びＣｈｏｔｈｉａも利用することができる）。

【0080】

「Ｆｃ」、「Ｆｃ領域」、「Ｆｃドメイン」、及び「ＩｇＧ Ｆｃドメイン」という用語は、本明細書で使用される場合、免疫グロブリン、例えば、ＩｇＧ分子の部分であって、ＩｇＧ分子のパパイン消化によって得られる結晶化可能な断片に関連する部分を指す。Ｆｃ領域は、ジスルフィド結合によって連結されたＩｇＧ分子の２つの重鎖のＣ末端側の半分を含む。Ｆｃ領域は、抗原結合活性を持たないが、炭水化物部分ならびに補体及びＦｃＲｎ受容体（下記参照）を含むＦｃ受容体に対する結合部位を含有する。例えば、Ｆｃドメインは、第２の定常ドメインＣＨ２（例えば、ヒトＩｇＧ１のＥＵ位置２３１～３４０の残基）及び第３の定常ドメインＣＨ３（例えば、ヒトＩｇＧ１のＥＵ位置３４１～４４７の残基）を含有する。本明細書で使用される場合、Ｆｃドメインは、「下部ヒンジ領域」（例えば、ヒトＩｇＧ１のＥＵ位置２３３～２３９の残基）を含む。

【0081】

Ｆｃは、この領域を単独で指すこともあれば、二重特異性結合タンパク質、抗体、抗体断片、またはＦｃ融合タンパク質の文脈の中でこの領域を指すこともある。Ｆｃドメインの多くの位置、例えば、限定するものではないが、ＥＵ位置２７０、２７２、３１２、３１５、３５６、及び３５８で多型が観察されていることから、本出願で提示される配列と当該技術分野において知られている配列との間にわずかな違いが存在し得る。したがって、「野生型ＩｇＧ Ｆｃドメイン」または「ＷＴ ＩｇＧ Ｆｃドメイン」は、天然に存在する任意のＩｇＧ Ｆｃ領域（すなわち、任意のアレル）を指す。ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４の重鎖の配列は、多くの配列データベースで見出すことができ、例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）では、それぞれＰ０１８５７（ＩＧＨＧ１＿ＨＵＭＡＮ）、Ｐ０１８５９（ＩＧＨＧ２＿ＨＵＭＡＮ）、Ｐ０１８６０（ＩＧＨＧ３＿ＨＵＭＡＮ）、及びＰ０１８６１（ＩＧＨＧ１＿ＨＵＭＡＮ）のアクセッション番号で見出すことができる。

【0082】

「修飾Ｆｃ領域」または「バリアントＦｃ領域」という用語は、本明細書で使用される場合、Ｆｃドメイン内の任意の位置に導入される１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入または修飾を含むＩｇＧ Ｆｃドメインを指す。ある特定の態様において、バリアントＩｇＧ Ｆｃドメインは、１つ以上のアミノ酸置換を含み、それにより、１つ以上のアミノ酸置換を含まない野生型Ｆｃドメインと比較して、ＦｃガンマＲ及び／またはＣ１ｑに対する結合親和性が低下または消失する。更に、Ｆｃ結合相互作用は、限定するものではないが、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を含む様々なエフェクター機能及び下流のシグナル伝達イベントに必要不可欠である。したがって、ある特定の態様において、バリアントＦｃドメインを含む抗体（例えば、抗体、融合タンパク質またはコンジュゲート）は、例えば、Ｆｃ領域の対応する位置に天然に存在するアミノ酸残基を含有する非修飾のＦｃ領域などの、同じアミノ酸配列を有するが、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入または修飾を含まない対応する抗体と比べて、少なくとも１つ以上のＦｃリガンド（例えば、ＦｃガンマＲ）に対して、改変された結合親和性を示し得る。

【0083】

バリアントＦｃドメインは、それらを構成するアミノ酸修飾に従って定義される。Ｆｃ領域に関して本明細書で考察されるアミノ酸置換の全てについて、ナンバリングは、常に、ＫａｂａｔにおけるＥＵインデックスに従う。したがって、例えば、Ｄ２６５Ｃは、親Ｆｃドメインを基準として、ＥＵ位置２６５のアスパラギン酸（Ｄ）がシステイン（Ｃ）で置換されたＦｃバリアントである。置換が提供される順序は任意であることに留意されたい。同様に、例えば、Ｄ２６５Ｃ／Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａは、親Ｆｃドメインを基準として、ＥＵ位置２６５（ＤからＣ）、２３４（ＬからＡ）、及び２３５（ＬからＡ）に置換を有するバリアントＦｃバリアントを定義する。バリアントはまた、変異したＥＵアミノ酸位置における最終アミノ酸組成物に従って指定することもできる。例えば、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａの変異体は、「ＬＡＬＡ」と呼ぶことができる。更なる例として、Ｅ２３３Ｐ．Ｌ２３４Ｖ．Ｌ２３５Ａ．ｄｅｌＧ２３６（２３６の欠失）変異体は、「ＥＰＬＶＬＡｄｅｌＧ」と呼ぶことができる。更に別の例として、Ｉ２５３Ａ．Ｈ３１０Ａ．Ｈ４３５Ａの変異体は、「ＩＨＨ」と呼ぶことができる。置換が提供される順序は任意であることに留意されたい。

【0084】

「Ｆｃガンマ受容体」または「ＦｃガンマＲ」という用語は、本明細書で使用される場合、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に結合し、ＦｃガンマＲ遺伝子によってコードされるタンパク質ファミリーの任意のメンバーを指す。ヒトにおいて、このファミリーには、アイソフォームのＦｃガンマＲＩａ、ＦｃガンマＲＩｂ、及びＦｃガンマＲＩｃを含むＦｃガンマＲＩ（ＣＤ６４）；アイソフォームのＦｃガンマＲＩＩａ（アロタイプＨ１３１及びＲ１３１を含む）、ＦｃガンマＲＩＩｂ（ＦｃガンマＲＩＩｂ－１及びＦｃガンマＲＩＩｂ－２を含む）、及びＦｃガンマＲＩＩｃを含むＦｃガンマＲＩＩ（ＣＤ３２）；及びアイソフォームのＦｃガンマＲＩＩＩａ（アロタイプＶ１５８及びＦ１５８を含む）及びＦｃガンマＲＩＩＩｂ（アロタイプＦｃガンマＲＩＩＩｂ－ＮＡ１及びＦｃガンマＲＩＩＩｂ－ＮＡ２を含む）を含むＦｃガンマＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、ならびに任意の未発見のヒトＦｃガンマＲまたはＦｃガンマＲアイソフォームもしくはアロタイプが含まれるが、これらに限定されない。ＦｃガンマＲは、限定するものではないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、及びサルを含む任意の生物に由来し得る。マウスＦｃガンマＲには、ＦｃガンマＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃガンマＲＩＩ（ＣＤ３２）、ＦｃガンマＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、及びＦｃガンマＲＩＩＩ－２（ＣＤ１６－２）、ならびに任意の未発見のマウスＦｃガンマＲまたはＦｃガンマＲアイソフォームもしくはアロタイプが含まれるが、これらに限定されない。

【0085】

「エフェクター機能」という用語は、本明細書で使用される場合、ＦｃドメインとＦｃ受容体の相互作用から生じる生化学的イベントを指す。エフェクター機能には、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及びＣＤＣが含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用される「エフェクター細胞」とは、１つ以上のＦｃ受容体を発現し、１つ以上のエフェクター機能を媒介する免疫系の細胞を意味する。エフェクター細胞には、限定するものではないが、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、好酸球、マスト細胞、血小板、Ｂ細胞、大型顆粒リンパ球、ランゲルハンス細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及びガンマデルタＴ細胞が含まれ、限定するものではないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、及びサルを含む任意の生物に由来し得る。

【0086】

本明細書で使用される「サイレント」、「サイレンス」、または「サイレンシング」という用語は、本明細書に記載される修飾Ｆｃ領域を有する抗体または二重特異性結合タンパク質であって、Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）に対する結合が非修飾のＦｃ領域を含む同一の抗体または二重特異性結合タンパク質のＦｃγＲに対する結合と比べて低減している抗体または二重特異性結合タンパク質を指す（例えば、ＦｃγＲに対する結合が、例えば、ＢＬＩによって測定した場合、非修飾のＦｃ領域を含む同一の抗体のＦｃγＲに対する結合と比べて、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％低減している）。いくつかの実施形態において、Ｆｃサイレンス抗体または二重特異性結合タンパク質は、ＦｃγＲへの検出可能な結合を有さない。修飾Ｆｃ領域を有する抗体のＦｃγＲへの結合は、当該技術分野において知られている様々な技術、例えば、限定するものではないが、平衡法（例えば、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）；ＫｉｎＥｘＡ，Ｒａｔｈａｎａｓｗａｍｉ ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．３７３：５２－６０，２００８；またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ））、または表面プラズモン共鳴アッセイもしくは他のメカニズムのカイネティクスベースアッセイ（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）解析またはＯｃｔｅｔ（商標）解析（ｆｏｒｔｅＢＩＯ））、ならびに間接的な結合アッセイ、競合結合アッセイ蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、ゲル電気泳動及びクロマトグラフィー（例えば、ゲル濾過）などの他の方法を使用して、決定することができる。これらの方法及び他の方法は、試験される成分のうちの１つ以上に標識を利用してもよいし、及び／または発色標識、蛍光標識、発光標識、もしくは同位体標識を含むがこれらに限定されない様々な検出法を採用することができる。結合親和性及びカイネティクスの詳細な説明については、抗体と免疫原の相互作用に焦点を当てたＰａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，ｅｄ．，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９９９）に見出すことができる。競合結合アッセイの一例は、目的の抗体と標識抗原を漸増量の非標識抗原の存在下でインキュベーションし、標識抗原に結合した抗体を検出することを含む、ラジオイムノアッセイである。特定の抗原に対する目的の抗体の親和性及び結合オフレートは、スキャッチャードプロット析によってデータから決定することができる。二次抗体との競合は、ラジオイムノアッセイを使用して決定することもできる。この場合、抗原は、標識した化合物とコンジュゲートした目的の抗体とともに、漸増量の非標識の二次抗体の存在下でインキュベートされる。

【0087】

本明細書で使用される場合、「非修飾のＦｃ領域を含む同一の抗体」または「非修飾のＦｃ領域を含む同一の二重特異性結合タンパク質」という用語は、列挙されるアミノ酸置換（例えば、Ｄ２６５Ｃ、Ｈ４３５Ａ、Ｌ２３４Ａ、及び／またはＬ２３５Ａ）を欠いているが、他の点では、比較されるＦｃ修飾抗体またはＦｃ修飾二重特異性結合タンパク質と同じアミノ酸配列を有する、抗体または二重特異性結合タンパク質を指す。

【0088】

「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」または「ＡＤＣＣ」という用語は、Ｆｃドメインを含むポリペプチド、例えば、抗体または二重特異性結合タンパク質が、ある特定の細胞傷害性細胞（例えば、主にＮＫ細胞、好中球、及びマクロファージ）に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合し、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が、抗原を持つ「標的細胞」に特異的に結合し、その後、その標的細胞を細胞毒で殺傷することができる細胞傷害性の一形態を指す。（Ｈｏｇａｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ２０１２，１１：３１３）抗体または二重特異性結合タンパク質及びその断片に加えて、抗原を持つ標的細胞に特異的に結合する能力を有する、Ｆｃドメインを含む他のポリペプチド、例えば、Ｆｃ融合タンパク質及びＦｃコンジュゲートタンパク質は、細胞媒介性細胞傷害を発揮することができることが企図される。

【0089】

簡潔さのために、Ｆｃドメインを含むポリペプチドの活性に起因する細胞媒介性細胞傷害もまた、本明細書において、ＡＤＣＣ活性と呼ばれる。ＡＤＣＣによる標的細胞の溶解を媒介する本開示の任意の特定のポリペプチドの能力は、アッセイすることができる。ＡＤＣＣ活性を評価するためには、目的のポリペプチド（例えば、抗体）を免疫エフェクター細胞と組み合わせて標的細胞に加えることで、標的細胞の細胞溶解をもたらす。細胞溶解は、一般に、標識（例えば、放射性基質、蛍光色素または天然の細胞内タンパク質）が溶解した細胞から放出されることによって検出される。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣアッセイの具体例は、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１３５１（１９８７）；Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５８：１８３（２００１）；Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８４：２９（１９９５）に記載されている。代替的または追加的に、目的の抗体または二重特異性結合タンパク質のＡＤＣＣ活性は、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：６５２（１９９８）に開示されているような動物モデルでｉｎ ｖｉｖｏ評価することができる。

【0090】

本明細書で使用される場合、「コンディション」及び「コンディショニング」という用語は、患者が造血幹細胞を含有する移植を受けるための準備を行うプロセスを指す。そのような処置は、造血幹細胞移植の生着を促進する（例えば、コンディショニング処置及び後続の造血幹細胞移植後に患者から単離された血液試料内の生存可能な造血幹細胞の量の持続的な増加から推測される）。本明細書に記載される方法に従って、Ｔ細胞媒介性ＨＳＣ細胞枯渇二重特異性抗体（例えば、造血幹細胞によって発現されるＣＤ１１７（例えば、ＧＮＮＫ＋ＣＤ１１７）などの抗原及びＴ細胞によって発現されるＣＤ３などの抗原に結合することが可能な抗ＣＤ１１７二重特異性結合タンパク質またはその断片）を患者に投与することによって、患者は、造血幹細胞移植療法のためのコンディショニングがなされ得る。ある特定の実施形態において、ＨＳＣ上の抗原（例えば、ＣＤ１１７）及びＴ細胞上の抗原（例えば、ＣＤ３）に結合することが可能な二重特異性結合タンパク質またはその断片を、造血幹細胞移植療法を必要とする患者に投与することは、例えば、内因性造血幹細胞を選択的に枯渇させ、それにより、外因性造血幹細胞移植で補われる空きを作り出すことによって、造血幹細胞移植片の生着を促進することができる。

【0091】

提供されるのはまた、本明細書に記載される配列番号に記載される配列の「保存的配列修飾」であり、すなわち、ヌクレオチド及びアミノ酸配列の修飾は、ヌクレオチド配列によってコードされるまたはアミノ酸配列を含有する抗体または二重特異性結合タンパク質の抗原への結合を損なわないものである。そのような保存的配列修飾には、保存的なヌクレオチド及びアミノ酸の置換、ならびにヌクレオチド及びアミノ酸の付加及び欠失が含まれる。例えば、修飾は、部位特異的変異導入及びＰＣＲによる変異導入などの当該技術分野において知られている標準的な技術によって本明細書に記載される配列番号に導入することができる。保存的配列修飾には、アミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換える、保存的アミノ酸置換が含まれる。類似の側鎖を有するアミノ酸残基ファミリーは、当該技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分岐状側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含むアミノ酸が含まれる。したがって、二重特異性抗体、例えば、抗ＣＤ１１７抗体または抗ＣＤ１１７二重特異性結合タンパク質において、必要でないと予測されるアミノ酸残基は、好ましくは、同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸残基で置き換えられる。抗原結合を排除しないヌクレオチド及びアミノ酸の保存的置換を同定する方法は、当該技術分野において知られている（例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：１１８０－１１８７（１９９３）；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１２（１０）：８７９－８８４（１９９９）；及びＢｕｒｋｓ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：４１２－４１７（１９９７）参照）。

【0092】

本明細書で使用される場合、「ドナー」という用語は、１つ以上の細胞が単離されるヒトまたは動物を指し、その後、その細胞またはその子孫がレシピエントに投与される。１つ以上の細胞は、例えば、造血幹細胞の集団であり得る。

【0093】

本明細書で使用される場合、「ダイアボディ」という用語は、２つのポリペプチド鎖を含有する二価抗体を指し、この場合、各ポリペプチド鎖は、同じペプチド鎖上のＶ_ＨドメインとＶ_Ｌドメインの分子内会合が起きないような短いリンカー（例えば、５つのアミノ酸から構成されるリンカー）によって接続されたＶ_Ｈドメイン及びＶ_Ｌドメインを含む。この配置により、各ドメインは、別のポリペプチド鎖上の相補的なドメインと対合し、ホモ二量体構造が形成される。したがって、「トリアボディ」という用語は、３つのペプチド鎖を含有する三価抗体を指し、そのそれぞれは、同じペプチド鎖内のＶ_ＨドメインとＶ_Ｌドメインの分子内会合が生じるような極めて短いリンカー（例えば、１～２つのアミノ酸から構成されるリンカー）によって接続された１つのＶ_Ｈドメイン及び１つのＶ_Ｌドメインを含有する。このように構成されたペプチドは、本来の構造へ折り畳まれるために、典型的に、隣接するペプチド鎖のＶ_Ｈドメイン及びＶ_Ｌドメインが互いに空間的に近接して配置されるように三量体化する（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４－４８，１９９３参照）。

【0094】

本明細書で使用される場合、「内因性」という用語は、ヒト患者などの特定の生物で自然に見出される物質、例えば、分子、細胞、組織、または臓器（例えば、造血幹細胞または造血系統の細胞、例えば、巨核球、栓球、血小板、赤血球、マスト細胞、骨髄芽球、好塩基球、好中球、好酸球、ミクログリア細胞、顆粒球、単球、破骨細胞、抗原提示細胞、マクロファージ、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｔリンパ球、またはＢリンパ球など）を記述するものである。

【0095】

本明細書で使用される場合、「生着能」という用語は、造血幹細胞及び前駆細胞が、かかる細胞が自然に循環しているか、移植によって提供されるかにかかわらず、組織を再建する能力を指すために使用される。この用語は、細胞の組織へのホーミング及び目的の組織内での細胞のコロニー化など、生着にまつわるまたは生着に至るまでの全ての事象を包含する。生着効率または生着率は、当業者に知られている任意の臨床的に許容されるパラメーターを使用して評価または定量化することができ、例えば、競合的再建単位（ＣＲＵ）の評価；幹細胞がホーミング、コロニー化、もしくは生着した組織（複数可）におけるマーカーの取り込みもしくは発現；または疾患の進行を介した対象の進捗、造血幹細胞及び前駆細胞の生存、もしくはレシピエントの生存の評価が含まれ得る。生着はまた、移植後の期間中に末梢血中の白血球数を測定することによっても決定することができる。生着はまた、骨髄穿刺液試料中のドナー細胞による骨髄細胞の回復を測定することによっても評価することができる。

【0096】

本明細書で使用される場合、「外因性」という用語は、ヒト患者などの特定の生物で自然に見出されない物質、例えば、分子、細胞、組織、または臓器（例えば、造血幹細胞または造血系統の細胞、例えば、巨核球、栓球、血小板、赤血球、マスト細胞、骨髄芽球、好塩基球、好中球、好酸球、ミクログリア細胞、顆粒球、単球、破骨細胞、抗原提示細胞、マクロファージ、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｔリンパ球、またはＢリンパ球など）を記述するものである。外因性物質には、生物または生物から抽出された培養物に外の供給源から供給されるものが含まれる。

【0097】

本明細書で使用される場合、「フレームワーク領域」または「ＦＷ領域」という用語は、抗体またはその抗原結合断片のＣＤＲに隣接するアミノ酸残基を含む。ＦＷ領域残基は、例えば、なかでも、ヒト抗体、ヒト化抗体、モノクローナル抗体、抗体断片、Ｆａｂ断片、一本鎖抗体断片、ｓｃＦｖ断片、抗体ドメイン、及び二重特異性結合タンパク質またはその断片に存在し得る。

【0098】

本明細書で使用される場合、「造血幹細胞」（「ＨＳＣ」）という用語は、自己複製する能力と、様々な系統、例えば、限定するものではないが、顆粒球（例えば、前骨髄球、好中球、好酸球、好塩基球）、赤血球（例えば、網状赤血球、赤血球）、栓球（例えば、巨核芽球、血小板産生巨核球、血小板）、単球（例えば、単球、マクロファージ）、樹状細胞、ミクログリア、破骨細胞、及びリンパ球（例えば、ＮＫ細胞、Ｂ細胞及びＴ細胞）を含む成熟血液細胞に分化する能力とを有する未成熟血液細胞を指す。そのような細胞は、ＣＤ３４^＋細胞を含み得る。ＣＤ３４^＋細胞は、ＣＤ３４細胞表面マーカーを発現する未成熟細胞である。ヒトの場合、ＣＤ３４＋細胞は、上に定義される幹細胞の特性を持つ細胞の亜集団を含むと考えられており、マウスの場合、ＨＳＣは、ＣＤ３４－である。加えて、ＨＳＣはまた、長期的な再建能を持つＨＳＣ（ＬＴ－ＨＳＣ）及び短期的な再建能を持つＨＳＣ（ＳＴ－ＨＳＣ）を指す。ＬＴ－ＨＳＣ及びＳＴ－ＨＳＣは、機能的な潜在能力、細胞表面マーカーの発現に基づいて、分化する。例えば、ヒトＨＳＣは、ＣＤ３４＋、ＣＤ３８－、ＣＤ４５ＲＡ－、ＣＤ９０＋、ＣＤ４９Ｆ＋、及びｌｉｎ－（ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１Ｂ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ５６、ＣＤ２３５Ａを含む成熟系統マーカーが陰性）である。マウスにおいて、骨髄ＬＴ－ＨＳＣは、ＣＤ３４－、ＳＣＡ－１＋、Ｃ－ｋｉｔ＋、ＣＤ１３５－、Ｓｌａｍｆｌ／ＣＤ１５０＋、ＣＤ４８－、及びｌｉｎ－（Ｔｅｒ１１９、ＣＤ１１ｂ、Ｇｒ１、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、Ｂ２２０、ＩＬ７ｒａを含む成熟系統マーカーが陰性）であり、一方、ＳＴ－ＨＳＣは、ＣＤ３４＋、ＳＣＡ－１＋、Ｃ－ｋｉｔ＋、ＣＤ１３５－、Ｓｌａｍｆｌ／ＣＤ１５０＋、及びｌｉｎ－（Ｔｅｒ１１９、ＣＤ１１ｂ、Ｇｒ１、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、Ｂ２２０、ＩＬ７ｒａを含む成熟系統マーカーが陰性）である。加えて、ＳＴ－ＨＳＣは、恒常的な条件下において、ＬＴ－ＨＳＣよりも静止状態が少なく、増殖性が高い。しかしながら、ＬＴ－ＨＳＣは、自己複製能が高く（すなわち、成人期を通して生存し、継続的なレシピエントに連続して移植することができる）、ＳＴ－ＨＳＣは、自己複製能に限りがある（すなわち、限られた期間しか生存できず、連続的な移植能力を持たない）。これらのＨＳＣのいずれも、本明細書に記載される方法に使用することができる。ＳＴ－ＨＳＣは、増殖性が高く、そのため、分化した子孫をより迅速に生み出すことができるので、特に有用である。

【0099】

本明細書で使用される場合、「造血幹細胞の機能的な潜在能力」という用語は、１）多能性（複数の異なる血液系統、例えば、限定するものではないが、顆粒球（例えば、前骨髄球、好中球、好酸球、好塩基球）、赤血球（例えば、網状赤血球、赤血球）、栓球（例えば、巨核芽球、血小板産生巨核球、血小板）、単球（例えば、単球、マクロファージ）、樹状細胞、ミクログリア、破骨細胞、及びリンパ球（例えば、ＮＫ細胞、Ｂ細胞及びＴ細胞に分化する能力を指す）、２）自己複製能（母細胞と同等の能力を有する娘細胞を生み出し、更にその能力が生涯を通じて枯渇することなく繰り返し生じ得る造血幹細胞の能力を指す）、及び３）移植レシピエントに再導入され、その造血幹細胞ニッチにホーミングし、生産的かつ持続的な造血を再建する造血幹細胞またはその子孫の能力を含む、造血幹細胞の機能上の特性を指す。

【0100】

本明細書で使用される場合、「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する抗体を含むことが意図される。ヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのランダム変異導入もしくは部位特異的変異導入、または遺伝子再構成、またはｉｎ ｖｉｖｏでの体細胞変異によって導入される変異）を含み得る。ただし、「ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列にグラフトされた抗体を含むことは意図されていない。ヒト抗体は、ヒト細胞（例えば、組み換え発現）において、または機能的に再構成されたヒト免疫グロブリン（重鎖及び／または軽鎖など）遺伝子を発現することが可能な非ヒト動物もしくは原核細胞もしくは真核細胞によって産生され得る。ヒト抗体が一本鎖抗体である場合、天然のヒト抗体にはないリンカーペプチドを含むことができる。例えば、Ｆｖは、重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域とを接続する、２～約８個のグリシンまたは他のアミノ酸残基などのリンカーペプチドを含有することができる。そのようなリンカーペプチドは、ヒト由来であるとみなされる。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを使用したファージディスプレイ法を含む、当該技術分野で知られている様々な方法で作製することができる。ヒト抗体はまた、機能的な内因性免疫グロブリンを発現できないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを使用して作製することもできる（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ１９９８／２４８９３号；同第ＷＯ１９９２／０１０４７号；同第ＷＯ１９９６／３４０９６号；同第ＷＯ１９９６／３３７３５号；米国特許第５，４１３，９２３号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６６１，０１６号；同第５，５４５，８０６号；同第５，８１４，３１８号；同第５，８８５，７９３号；同第５，９１６，７７１号；及び同第５，９３９，５９８号参照）。

【0101】

本明細書で使用される場合、造血幹細胞移植を「必要とする」患者には、１つ以上の血液細胞種に欠損または欠失を呈する患者だけでなく、幹細胞障害、自己免疫疾患、がん、または本明細書に記載される他の病態を有する患者が含まれる。造血幹細胞は、一般に、１）多能性を示し、そのため、複数の異なる血液系統、例えば、限定するものではないが、顆粒球（例えば、前骨髄球、好中球、好酸球、好塩基球）、赤血球（例えば、網状赤血球、赤血球）、栓球（例えば、巨核芽球、血小板産生巨核球、血小板）、単球（例えば、単球、マクロファージ）、樹状細胞、ミクログリア、破骨細胞、及びリンパ球（例えば、ＮＫ細胞、Ｂ細胞及びＴ細胞）に分化することができ、２）自己複製能を示し、そのため、母細胞と同等の能力を有する娘細胞を生み出すことができ、３）移植レシピエントに再導入され、その造血幹細胞ニッチにホーミングし、生産的かつ持続的な造血を再建する能力を示す。したがって、造血幹細胞は、造血系統の１つ以上の細胞種に欠損または欠失がある患者に投与し、欠損または欠失した細胞集団をｉｎ ｖｉｖｏで再構成することができる。例えば、患者は、がんに罹患している場合があり、当該欠失は、選択的または非特異的にがん性細胞集団を枯渇させる化学療法剤または他の薬剤の投与によって生じ得る。追加的または代替的に、患者は、鎌状赤血球貧血、サラセミア、ファンコーニ貧血、再生不良性貧血、及びウィスコットアルドリッチ症候群などの異常ヘモグロビン症（例えば、非悪性異常ヘモグロビン症）に罹患している場合がある。対象は、アデノシンデアミナーゼ重症複合型免疫不全（ＡＤＡ ＳＣＩＤ）、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、異染性白質ジストロフィー、ダイヤモンドブラックファン貧血、及びシュワッハマンダイアモンド症候群に罹患している者であり得る。対象は、遺伝性血液障害（例えば、鎌状赤血球貧血）または自己免疫障害を有するか、またはその影響を受けている場合がある。追加的または代替的に、対象は、神経芽細胞腫または血液系がんなどの悪性腫瘍を有するか、またはその影響を受けている場合がある。例えば、対象は、白血病、リンパ腫、または骨髄腫を有し得る。いくつかの実施形態において、対象は、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、または非ホジキンリンパ腫を有する。いくつかの実施形態において、対象は、骨髄異形成症候群を有する。いくつかの実施形態において、対象は、強皮症、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、クローン病、１型糖尿病、または本明細書に記載される別の自己免疫的病態などの自己免疫疾患を有する。いくつかの実施形態において、対象は、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲＴ）療法を必要とする。いくつかの実施形態において、対象は、代謝性蓄積障害を有するか、または別様に影響を受けている。対象は、グリコーゲン蓄積症、ムコ多糖症、ゴーシェ病、ハーラー病、スフィンゴリピド症、異染性白質ジストロフィー、または本明細書で開示される治療及び療法から利益を得ることができる任意の他の疾患もしくは障害、例えば、限定するものではないが、重症複合免疫不全、ウィスコットアルドリッチ症候群、高免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）症候群、チェディアック東病、遺伝性リンパ組織球症、骨粗鬆症、骨形成不全症、蓄積症、大サラセミア、鎌状赤血球症、全身性強皮症、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、若年性関節リウマチ及びそれらの疾患、もしくは“Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｎｏｎ－Ｍａｌｉｇｎａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅ，”ＡＳＨ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｂｏｏｋ，１：３１９－３３８（２０００）（当該開示は、造血幹細胞移植療法の実施によって治療され得る病態に関して、その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されている障害からなる群から選択される代謝性障害に罹患しているか、または別様にその影響を受けている。追加的または代替的に、造血幹細胞移植を「必要とする」患者は、前述の病態の１つに罹患している者であるか、または罹患していないにもかかわらず、巨核球、栓球、血小板、赤血球、マスト細胞、骨髄芽球、好塩基球、好中球、好酸球、ミクログリア、顆粒球、単球、破骨細胞、抗原提示細胞、マクロファージ、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｔリンパ球、及びＢリンパ球などの造血系統内の１つ以上の内因性細胞種が減少したレベル（例えば、健康な対象のレベルと比較して）を示す者であってもよい。当業者であれば、例えば、当該技術分野において知られている他の手順のなかでも、フローサイトメトリー及び蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）法によって、前述の細胞種のうちの１つ以上または他の血液細胞種のレベルが他の健康な対象と比べて減少しているかどうかを容易に決定することができる。

【0102】

本明細書で使用される場合、「レシピエント」という用語は、造血幹細胞の集団を含有する移植などの移植を受ける患者を指す。レシピエントに投与される移植される細胞は、例えば、自家細胞、同系細胞、または同種細胞であり得る。

【0103】

本明細書で使用される場合、「試料」という用語は、対象から採取された検体（例えば、血液、血液成分（例えば、血清または血漿）、尿、唾液、羊水、脳脊髄液、組織（例えば、胎盤または皮膚）、膵液、絨毛試料、及び細胞）を指す。

【0104】

本明細書で使用される場合、「ｓｃＦｖ」という用語は、抗体由来の重鎖及び軽鎖の可変ドメインが接続されて１つの鎖を形成している一本鎖Ｆｖ抗体を指す。ｓｃＦｖ断片は、リンカーによって分離された抗体（または本明細書に記載される二重特異性結合タンパク質）軽鎖（Ｖ_Ｌ）の可変領域（例えば、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及び／またはＣＤＲ－Ｌ３）及び抗体（または本明細書に記載される二重特異性結合タンパク質）重鎖（Ｖ_Ｈ）の可変領域（例えば、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及び／またはＣＤＲ－Ｈ３）を含む単一のポリペプチド鎖を含有する。ｓｃＦｖ断片のＶ_Ｌ領域及びＶ_Ｈ領域を接続するリンカーは、タンパク質生成アミノ酸で構成されるペプチドリンカーであり得る。タンパク質分解に対するｓｃＦｖ断片の耐性を増加させるために（例えば、Ｄ－アミノ酸含有リンカー）、ｓｃＦｖ断片の溶解性を強化するために（例えば、ポリエチレングリコール含有リンカーまたはグリシン及びセリン残基の繰り返しを含有するポリペプチドなどの親水性リンカー）、分子の生物物理学的安定性を改善するために（例えば、分子内または分子間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基含有リンカー）、またはｓｃＦｖ断片の免疫原性を減弱させるために（例えば、グリコシル化部位含有リンカー）、代替リンカーが使用され得る。当業者であれば、本明細書に記載されるｓｃＦｖ分子の可変領域は、その由来となる抗体分子とアミノ酸配列が異なるように修飾することができることも理解するであろう。例えば、保存的置換をもたらすヌクレオチドもしくはアミノ酸置換またはアミノ酸残基での変更を（例えば、ＣＤＲ及び／またはフレームワーク残基に）行い、対応する抗体または二重特異性結合タンパク質によって認識される抗原に結合するｓｃＦｖの能力を維持または強化することができる。

【0105】

本明細書で使用される場合、「対象」及び「患者」という用語は、本明細書に記載される特定の疾患または状態に対する治療を受けるヒトなどの生物を指す。例えば、ヒト患者などの患者は、外因性造血幹細胞の生着を促進するために、造血幹細胞移植療法の前に治療を受けることがある。

【0106】

本明細書で使用される場合、「血液から実質的に消失した」という文言は、治療薬剤（抗ＣＤ１１７二重特異性抗体またはその抗原結合断片など）の患者への投与後の時点であって、患者から単離された血液試料中の治療薬剤の濃度について、治療薬剤が従来の手段によって検出されない（例えば、治療薬剤を検出するために使用されるデバイスまたはアッセイのノイズ閾値を上回って治療薬剤が検出されない）時点を指す。抗体、抗体断片、二重特異性抗体、及びその抗原結合断片を検出するには、当該技術分野において知られている様々な技術、例えば、当該技術分野において知られているまたは本明細書に記載されるＥＬＩＳＡベース検出アッセイなどを使用することができる。抗体、または抗体断片、二重特異性抗体及びその抗原結合断片を検出するために使用することができる追加のアッセイとしては、当該技術分野において知られているもののなかでも、免疫沈降技術及びイムノブロットアッセイが含まれる。

【0107】

本明細書で使用される場合、「幹細胞障害」という文言は、対象の標的組織のコンディショニング、及び／または標的組織内の内因性幹細胞集団の除去（例えば、対象の骨髄組織からの内因性造血幹細胞または前駆細胞集団の除去）、及び／または対象の標的組織への幹細胞の生着もしくは移植によって、治療または治癒され得る任意の疾患、障害、または状態を広く指す。例えば、Ｉ型糖尿病は、造血幹細胞移植によって治癒されることが示されており、本明細書に記載される組成物及び方法に従ったコンディショニングから利益を得ることができる。本明細書に記載される組成物及び方法を使用して治療することができる追加の障害には、限定するものではないが、鎌状赤血球貧血、サラセミア、ファンコーニ貧血、再生不良性貧血、ウィスコットアルドリッチ症候群、ＡＤＡ ＳＣＩＤ、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、異染性白質ジストロフィー、ダイヤモンドブラックファン貧血、及びシュワッハマンダイアモンド症候群が含まれる。本明細書に記載される患者コンディショニング及び／または造血幹細胞移植方法を使用して治療され得る追加の疾患には、遺伝性血液障害（例えば、鎌状赤血球貧血）ならびに強皮症、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、及びクローン病などの自己免疫障害が含まれる。本明細書に記載されるコンディショニング及び／または移植方法を使用して治療され得る追加の疾患には、神経芽細胞腫などの悪性腫瘍または白血病、リンパ腫、及び骨髄腫などの血液系がんが含まれる。例えば、がんは、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、または非ホジキンリンパ腫であり得る。本明細書に記載されるコンディショニング及び／または移植方法を使用して治療することが可能な追加の疾患には、骨髄異形成症候群が含まれる。いくつかの実施形態において、対象は、代謝性蓄積障害を有するか、または別様にその影響を受けている。例えば、対象は、グリコーゲン蓄積症、ムコ多糖症、ゴーシェ病、ハーラー病、スフィンゴリピド症、異染性白質ジストロフィー、または本明細書で開示される治療及び療法から利益を得ることができる任意の他の疾患もしくは障害、例えば、限定するものではないが、重症複合免疫不全、ウィスコットアルドリッチ症候群、高免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）症候群、チェディアック東病、遺伝性リンパ組織球症、骨粗鬆症、骨形成不全症、蓄積症、大サラセミア、鎌状赤血球症、全身性強皮症、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、若年性関節リウマチ及びそれらの疾患、もしくは“Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｎｏｎ－Ｍａｌｉｇｎａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅ，”ＡＳＨ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｂｏｏｋ，１：３１９－３３８（２０００）（当該開示は、造血幹細胞移植療法の実施によって治療され得る病態に関して、その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されている障害からなる群から選択される代謝性障害に罹患しているか、または別様にその影響を受けている場合がある。

【0108】

本明細書で使用される場合、「トランスフェクション」という用語は、原核生物または真核生物宿主細胞に外因性ＤＮＡを導入するために一般的に使用される多様な技術のいずれか、例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ－デキストラントランスフェクションなどを指す。

【0109】

本明細書で使用される場合、「治療する」または「治療」という用語は、疾患症状の重症度及び／または頻度の軽減、疾患症状及び／または当該症状の根本原因の排除、疾患症状及び／またはその根本原因の頻度または可能性の軽減、ならびに疾患によって直接的または間接的に引き起こされる損傷の改善または修復を指す。有益なまたは所望の臨床結果には、本明細書に記載される抗体コンディショニング療法及び後続の造血幹細胞移植療法後の患者における外因性造血細胞の生着を促進させることが含まれるが、これらに限定されない。追加の有益な結果には、コンディショニング療法及び患者に対する外因性造血幹細胞移植片の後続投与後の造血幹細胞移植を必要とする患者における造血幹細胞の細胞数または相対濃度の増加が含まれる。本明細書に記載される療法の有益な結果にはまた、コンディショニング療法及び後続の造血幹細胞移植療法後における、巨核球、栓球、血小板、赤血球、マスト細胞、骨髄芽球、好塩基球、好中球、好酸球、ミクログリア細胞、顆粒球、単球、破骨細胞、抗原提示細胞、マクロファージ、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｔリンパ球、またはＢリンパ球などの造血系統細胞のうちの１つ以上の細胞数または相対濃度の増加が含まれ得る。追加の有益な結果には、がん細胞（例えば、ＣＤ１１７＋白血病細胞）または自己免疫細胞（例えば、自己抗原と交差反応するＴ細胞受容体を発現するＣＤ１１７＋Ｔ細胞などのＣＤ１１７＋自己免疫リンパ球）の集団などの疾患を引き起こす細胞集団の量の減少が含まれ得る。本発明の方法が障害の予防を対象とするものである限り、「予防する」という用語は、その疾患状態が完全に阻止されることを要しないことが理解される。むしろ、本明細書で使用される場合、予防するという用語は、疾患の発症前に本発明の化合物の投与が行われ得るように、障害に罹患しやすい集団を特定する当業者の能力を指す。この用語は、疾病状態が完全に回避されることを意味するものではない。

【0110】

本明細書で使用される場合、「バリアント」及び「誘導体」という用語は、区別なく使用され、本明細書に記載される化合物、ペプチド、タンパク質、または他の物質の天然、合成、及び半合成の類似体を指す。本明細書に記載される化合物、ペプチド、タンパク質、または他の物質のバリアントまたは誘導体は、元の物質の生物活性を保持または改善し得る。

【0111】

本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、プラスミド、ＤＮＡベクター、プラスミド、ＲＮＡベクター、ウイルス、または他の好適なレプリコンなどの核酸ベクターを含む。本明細書に記載される発現ベクターは、ポリヌクレオチド配列だけでなく、例えば、タンパクの発現及び／またはこれらのポリヌクレオチド配列の哺乳動物細胞のゲノムへの組み込みに使用される追加の配列要素を含有し得る。本発明の二重特異性抗体及び二重特異性抗体断片の発現に使用することができるある特定のベクターには、遺伝子の転写を指示するプロモーター領域及びエンハンサー領域などの制御配列を含有するプラスミドが含まれる。二重特異性抗体及び二重特異性抗体断片の発現に有用な他のベクターは、これらの遺伝子の翻訳速度を向上させるか、または遺伝子の転写から生じるｍＲＮＡの安定性もしくは核外輸送を改善するポリヌクレオチド配列を含有する。これらの配列要素には、発現ベクター上に搭載された遺伝子の効率的な転写を指示するために、例えば、５’及び３’非翻訳領域、ならびにポリアデニル化シグナル部位が含まれ得る。本明細書に記載される発現ベクターはまた、そのようなベクターを含有する細胞を選択するためのマーカーをコードするポリヌクレオチドを含んでもよい。好適なマーカーの例としては、アンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、及びノーセオトリシン（ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）などの抗生物質に対する耐性をコードする遺伝子が挙げられる。

【0112】

Ｔ細胞抗原及びＨＳＣ抗原を標的とする二重特異性結合タンパク質
本明細書に記載される組成物及び方法は、標的細胞、特に、コンディショニングのために枯渇される標的細胞であるＨＳＣのＴ細胞媒介性枯渇に基づいている。本明細書における開示の１つの利点は、二重特異性結合タンパク質、例えば、抗ＣＤ３／抗ＨＳＣ二重特異性抗体が、免疫媒介性細胞傷害を使用してＨＳＣを枯渇させる能力であり、細胞傷害性薬剤または全般的な細胞枯渇を引き起こす治療法、例えば化学療法もしくは放射線照射を必要とせず、あるいはその必要性が減少することである。この標的化アプローチは、標的細胞集団に関連する抗原を発現する細胞、例えば、ＨＳＣに焦点を当て、標的以外の細胞への影響を最小限に抑えている。更に、細胞枯渇は、本明細書で開示される二重特異性タンパク質を使用して、Ｔ細胞を標的細胞に向かわせることによって達成される。

【0113】

本明細書で使用される場合、「抗造血細胞抗体」または「抗ＨＣ抗体」という用語は、造血幹細胞によって発現されるＣＤ１１７（例えば、ＧＮＮＫ＋ＣＤ１１７）などの抗原に特異的に結合する抗体を指す。二重特異性抗体またはその二重特異性抗原結合領域は、抗ＨＣ抗体に由来する第１の結合部分、例えば、ＣＤ１１７に特異的な重鎖及び軽鎖の組み合わせを含み得る。

【0114】

本明細書で開示される二重特異性物質を含む組成物及び方法は、任意の標的特異的抗原を発現する細胞を標的にするために使用することができる。ある特定の実施形態において、本明細書で開示される組成物及び方法は、ヒトＨＳＣ上に発現される抗原、例えば、ＣＤ７、ＣＤｗ１２、ＣＤ１３、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａ、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４２ｃ、ＣＤ４２ｄ、ＣＤ４３、ＣＤ４８、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５０、ＣＤ５３、ＣＤ５５、ＣＤ６４ａ、ＣＤ６８、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８５Ａ、ＣＤ８５Ｋ、ＣＤ９０、ＣＤ９９、ＣＤ１０４、ＣＤ１０５、ＣＤ１０９、ＣＤ１１０、ＣＤ１１１、ＣＤ１１２、ＣＤ１１４、ＣＤ１１５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１２４、ＣＤ１２６、ＣＤ１２７、ＣＤ１３０、ＣＤ１３１、ＣＤ１３３、ＣＤ１３５、ＣＤ１３８、ＣＤ１５１、ＣＤ１５７、ＣＤ１６２、ＣＤ１６４、ＣＤ１６８、ＣＤ１７２ａ、ＣＤ１７３、ＣＤ１７４、ＣＤ１７５、ＣＤ１７５ｓ、ＣＤ１７６、ＣＤ１８３、ＣＤ１９１、ＣＤ２００、ＣＤ２０１、ＣＤ２０５、ＣＤ２１７、ＣＤ２２０、ＣＤ２２１、ＣＤ２２２、ＣＤ２２３、ＣＤ２２４、ＣＤ２２５、ＣＤ２２６、ＣＤ２２７、ＣＤ２２８、ＣＤ２２９、ＣＤ２３０、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ２３５ｂ、ＣＤ２３６、ＣＤ２３６Ｒ、ＣＤ２３８、ＣＤ２４０、ＣＤ２４２、ＣＤ２４３、ＣＤ２７７、ＣＤ２９２、ＣＤｗ２９３、ＣＤ２９５、ＣＤ２９８、ＣＤ３０９、ＣＤ３１８、ＣＤ３２４、ＣＤ３２５、ＣＤ３３８、ＣＤ３４４、ＣＤ３４９及びＣＤ３５０などの抗原に特異的である。ある特定の実施形態において、標的細胞は、標的となり得る１つ以上のマーカーを発現するヒト造血幹細胞を含み、そのような抗原は、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８、ＣＤ３７、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ５８、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ７４、ＣＤ９７、ＣＤ１０３、ＣＤ１３２、ＣＤ１５６ａ、ＣＤ１７９ａ、ＣＤ１７９ｂ、ＣＤ１８４、ＣＤ２３２、ＣＤ２４４、ＣＤ２５２、ＣＤ３０２、ＣＤ３０５、ＣＤ３１７またはＣＤ３６１を含む。

【0115】

ある特定の実施形態において、標的細胞は、本明細書で開示される抗ＣＤ３二重特異性抗体の標的となり得る１つ以上のマーカーを発現するヒト造血幹細胞であり、ここで、マーカーは、ＣＤ７、ＣＤｗ１２、ＣＤ１３、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａ、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４２ｃ、ＣＤ４２ｄ、ＣＤ４３、ＣＤ４８、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５０、ＣＤ５３、ＣＤ５５、ＣＤ６４ａ、ＣＤ６８、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８５Ａ、ＣＤ８５Ｋ、ＣＤ９０、ＣＤ９９、ＣＤ１０４、ＣＤ１０５、ＣＤ１０９、ＣＤ１１０、ＣＤ１１１、ＣＤ１１２、ＣＤ１１４、ＣＤ１１５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１２４、ＣＤ１２６、ＣＤ１２７、ＣＤ１３０、ＣＤ１３１、ＣＤ１３３、ＣＤ１３５、ＣＤ１３８、ＣＤ１５１、ＣＤ１５７、ＣＤ１６２、ＣＤ１６４、ＣＤ１６８、ＣＤ１７２ａ、ＣＤ１７３、ＣＤ１７４、ＣＤ１７５、ＣＤ１７５ｓ、ＣＤ１７６、ＣＤ１８３、ＣＤ１９１、ＣＤ２００、ＣＤ２０１、ＣＤ２０５、ＣＤ２１７、ＣＤ２２０、ＣＤ２２１、ＣＤ２２２、ＣＤ２２３、ＣＤ２２４、ＣＤ２２５、ＣＤ２２６、ＣＤ２２７、ＣＤ２２８、ＣＤ２２９、ＣＤ２３０、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ２３５ｂ、ＣＤ２３６、ＣＤ２３６Ｒ、ＣＤ２３８、ＣＤ２４０、ＣＤ２４２、ＣＤ２４３、ＣＤ２７７、ＣＤ２９２、ＣＤｗ２９３、ＣＤ２９５、ＣＤ２９８、ＣＤ３０９、ＣＤ３１８、ＣＤ３２４、ＣＤ３２５、ＣＤ３３８、ＣＤ３４４、ＣＤ３４９、またはＣＤ３５０である。本開示は、造血幹細胞の表面上に発現される抗原に結合する第１の結合ドメイン及びＴ細胞の表面上のヒトＣＤ３に結合する第２の結合ドメインを含む、二重特異性抗体を提供する。本開示のいくつかの実施形態において、二重特異性抗体はヒトＣＤ３イプシロンに結合する。

【0116】

ある特定の実施形態において、抗ＣＤ３結合ドメインは、ＵＳ１０，８５１，１７０、ＵＳ１０，９３３，１３２、ＵＳ１０，７８１，２６４、ＵＳ１０，７３８，１３０、及びＷＯ２００８／１１９５６７に記載されている抗ＣＤ３抗体に由来する抗原結合領域（可変領域またはＣＤＲ）を含み、そのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に援用される。

【0117】

いくつかの実施形態において、二重特異性抗体の抗ＣＤ３結合ドメインは、表４に記載される重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。一実施形態において、二重特異性抗体の抗ＣＤ３結合ドメインは、表４に記載される、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む。

【0118】

他の実施形態において、抗ＣＤ３／抗ＨＣ二重特異性抗体、またはその二重特異性抗原結合断片は、表４に記載される抗ＣＤ３軽鎖及び／または重鎖可変領域配列に対して少なくとも９５％の同一性、例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖及び／または重鎖可変領域を含む、抗ＣＤ３結合部分を含む。ある特定の実施形態において、抗ＣＤ３／抗ＨＣ二重特異性抗体、またはその二重特異性抗原結合断片は、表４に記載される抗ＣＤ３抗体またはそのバリアントの軽鎖及び／または重鎖可変ドメインを含む修飾軽鎖または重鎖可変領域を含み、ここで、バリアントは、（ｉ）１、２、３、４もしくは５つのアミノ酸の置換、付加もしくは欠失において抗ＣＤ３抗原結合領域と異なり、（ｉｉ）最大５、４、３、２、もしくは１つのアミノ酸の置換、付加もしくは欠失において抗ＣＤ３抗原結合領域と異なり、（ｉｉｉ）１～５、１～３、１～２、２～５もしくは３～５個のアミノ酸の置換、付加もしくは欠失において抗ＣＤ３抗原結合領域と異なり、及び／または（ｉｖ）抗ＣＤ３抗原結合領域に対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含み、（ｉ）～（ｉｖ）のいずれにおいても、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換であっても、非保存的アミノ酸置換であってもよく、修飾軽鎖及び／または重鎖可変領域は、二重特異性抗体のＣＤ３結合特異性を保持しつつ、抗ＣＤ３抗体の軽鎖及び／または重鎖可変領域と比べて向上した生物活性を有し得る。

【0119】

他の実施形態において、本明細書で開示される二重特異性物質の抗ＣＤ３抗原結合領域は、表４に記載される以下の配列から選択されるＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３を含む可変軽鎖（ＶＬ）領域を含む：（ａ）配列番号６０に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６１に示されるＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号６２に示されるＣＤＲ－Ｌ３；（ｂ）配列番号１０８に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１０９に示されるＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１１０に示されるＣＤＲ－Ｌ３；ならびに（ｃ）配列番号１２９に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１３０に示されるＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１３１に示されるＣＤＲ－Ｌ３。

【0120】

他の実施形態において、本明細書で開示される二重特異性物質の抗ＣＤ３抗原結合領域は、表４に記載される以下の配列から選択されるＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３を含む可変重鎖（ＶＨ）領域を含む：（ａ）配列番号５１に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５２に示されるＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号５３に示されるＣＤＲ－Ｈ３、（ｂ）配列番号６３に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号６４に示されるＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号６５に示されるＣＤＲ－Ｈ３、（ｃ）配列番号７２に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号７３に示されるＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号７４に示されるＣＤＲ－Ｈ３、（ｄ）配列番号８１に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号８２に示されるＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号８３に示されるＣＤＲ－Ｈ３、（ｅ）配列番号９０に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号９１に示されるＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号９２に示されるＣＤＲ－Ｈ３、（ｆ）配列番号９９に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１００に示されるＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１０１に示されるＣＤＲ－Ｈ３、（ｇ）配列番号１１１に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１１２に示されるＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１１３に示されるＣＤＲ－Ｈ３、（ｈ）配列番号１２０に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１２１に示されるＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１２２に示されるＣＤＲ－Ｈ３、（ｉ）配列番号１３２に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１３３に示されるＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１３４に示されるＣＤＲ－Ｈ３、ならびに（ｊ）配列番号１４１に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１４２に示されるＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１４３に示されるＣＤＲ－Ｈ３。

【0121】

更なる実施形態において、本明細書で開示される二重特異性物質の抗ＣＤ３抗原結合領域は、表４の配列番号６７、６９、１１５、１１７、１３６または１３８に示されるＶＬ領域からなる群から選択されるＶＬ領域を含む。

【0122】

他の実施形態において、本明細書で開示される二重特異性物質の抗ＣＤ３抗原結合領域は、表４の配列番号５４、５６、６６、６８、７５、７７、８４、８６、９３、９５、１０２、１０４、１１４、１１６、１２３、１２５、１３５、１３７、１４４または１４６に示されるＶＨ領域からなる群から選択されるＶＨ領域を含む。

【0123】

ある特定の他の実施形態において、本明細書で開示される二重特異性物質の抗ＣＤ３抗原結合領域は、表４に記載される以下の配列からなる群から選択されるＶＬ領域及びＶＨ領域を含む：（ａ）配列番号５５または５７に示されるＶＬ領域、及び配列番号５４または５６に示されるＶＨ領域、（ｂ）配列番号６７または６９に示されるＶＬ領域、及び配列番号６６または６８に示されるＶＨ領域、（ｃ）配列番号７６または７８に示されるＶＬ領域、及び配列番号７５または７７に示されるＶＨ領域、（ｄ）配列番号８５または８７に示されるＶＬ領域、及び配列番号８４または８６に示されるＶＨ領域、（ｅ）配列番号９４または９６に示されるＶＬ領域、及び配列番号９３または９５に示されるＶＨ領域、（ｆ）配列番号１０３または１０５に示されるＶＬ領域、及び配列番号１０２または１０４に示されるＶＨ領域、（ｇ）配列番号１１５または１１７に示されるＶＬ領域、及び配列番号１１４または１１６に示されるＶＨ領域、（ｈ）配列番号１２４または１２６に示されるＶＬ領域、及び配列番号１２３または１２５に示されるＶＨ領域、（ｉ）配列番号１３６または１３８に示されるＶＬ領域、及び配列番号１３５または１３７に示されるＶＨ領域、ならびに（ｊ）配列番号１４５または１４７に示されるＶＬ領域、及び配列番号１４４または１４６に示されるＶＨ領域。

【0124】

本開示の他の実施形態において、抗ＣＤ３結合ドメインは、本明細書で開示されるＶＨ領域とＶＬ領域（または本明細書で開示されるＣＤＲを有する可変領域）のペアを一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）の形態で含む。ＶＨ領域及びＶＬ領域は、ＶＨ－ＶＬまたはＶＬ－ＶＨの順序で配置される。一実施形態において、ＶＨ領域は、リンカー配列のＮ末端に位置し、ＶＬ領域は、リンカー配列のＣ末端に位置する。

【0125】

本開示の他の実施形態において、本明細書で開示される二重特異性物質の抗ＣＤ３抗原結合領域は、表４の配列番号５８、５９、７０、７１、７９、８０、８８、８９、９７、９８、１０６、１０７、１１８、１１９、１２７、１２８、１３９、１４０、１４８または１４９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0126】

抗ＣＤ１１７／抗ＣＤ３二重特異性結合タンパク質
本開示は、Ｔ細胞特異的抗原（例えば、ＣＤ３）及びＣＤ１１７、例えば、ＧＮＮＫ＋ＣＤ１１７に結合することが可能な二重特異性結合タンパク質またはその抗原結合断片が、（ｉ）ＣＤ１１７＋細胞を特徴とするがん（急性骨髄性白血病または骨髄異形成症候群など）及び自己免疫疾患を治療し、（ｉｉ）移植療法を必要とする患者において移植された造血幹細胞の生着を促進するために、治療薬剤として使用することができるという発見に部分的に基づいている。これらの治療活性は、例えば、がん細胞、自己免疫細胞、または造血幹細胞などの細胞の表面上に発現されるＣＤ１１７（例えば、ＧＮＮＫ＋ＣＤ１１７）に抗ＣＤ１１７二重特異性抗体またはその抗原結合断片が結合し、その後、細胞死が誘導されることによって生じ得る。内因性造血幹細胞の枯渇により、移植された造血幹細胞がホーミングするニッチが提供され、その後、生産的な造血が確立され得る。このようにして、移植された造血幹細胞は、本明細書に記載される幹細胞障害に罹患しているヒト患者などの患者に首尾よく生着し得る。

【0127】

したがって、本明細書で提供されるのは、ＣＤ１１７及びＣＤ３の両方に結合する二重特異性結合ポリペプチド、またはその断片である。本明細書で提供されるのはまた、そのような二重特異性結合ポリペプチドまたはその断片をコードする相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）などの単離核酸（ポリヌクレオチド）である。更に提供されるのは、そのような二重特異性結合分子またはその断片をコードする核酸（ポリヌクレオチド）またはベクター（例えば、発現ベクター）を含むベクター（例えば、発現ベクター）である。本明細書で提供されるのはまた、そのような二重特異性結合分子、細胞、及びベクターを作製する方法である。他の実施形態において、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載される二重特異性結合ポリペプチド、核酸、及び／またはベクターを使用して、なかでも、様々な血液疾患、代謝障害、がん、及び自己免疫疾患を治療するための方法及び使用である。更に、関連する組成物（例えば、医薬組成物）、キット、及び診断方法も本明細書で提供される。

【0128】

ある特定の実施形態において、本明細書で提供されるのは、ＣＤ１１７及びＣＤ３に特異的に結合し、血液疾患、幹細胞疾患、がん及び免疫障害を含むが、これらに限定されない様々な疾患を治療するためにＴ細胞の細胞傷害性を誘発する、二重特異性結合ポリペプチド、またはその断片である。いかなる理論にも束縛されるものではないが、本明細書に記載される二重特異性結合分子は、腫瘍とＴ細胞を結合させるだけでなく、Ｔ細胞上のＣＤ３と架橋して活性化カスケードを開始し、このようにして、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）による細胞傷害性が、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）拘束性を回避して、所望の腫瘍標的に向け直されると考えられる。

【0129】

ヒトＣＤ１１７（ｃ－Ｋｉｔとも呼ばれる、ｍＲＮＡ ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０００２２２．２、Ｐｒｏｔｅｉｎ ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿０００２１３．１）に結合することが可能な二重特異性結合ポリペプチド、またはその断片は、ＧＮＮＫ＋ＣＤ１１７に結合することが可能なものを含め、造血幹細胞移植療法のために患者をコンディショニングするために、本明細書に記載される組成物及び方法に関連して使用することができる。人口のかなりの割合でＣＤ１１７のコーディング領域または細胞外ドメインに影響する多型は、現在、腫瘍以外の適応症ではよく知られていない。ＣＤ１１７には、少なくとも４つのアイソフォームが同定されており、腫瘍細胞で発現される更なるアイソフォームも存在する可能性がある。ＣＤ１１７アイソフォームのうちの２つは、当該タンパク質の細胞内ドメインに位置しており、２つは、外側の膜近傍領域に存在する。２つの細胞外アイソフォームのＧＮＮＫ＋及びＧＮＮＫ－は、４アミノ酸配列の存在（ＧＮＮＫ＋）または不在（ＧＮＮＫ－）の点で異なる。これらのアイソフォームは、リガンド（ＳＣＦ）に対して同じ親和性を有することが報告されているが、ＧＮＮＫ－アイソフォームに結合するリガンドは、内在化及び分解を増加させることが報告されている。ＧＮＮＫ＋アイソフォームは、このアイソフォームに対して生成される抗体がＧＮＮＫ＋及びＧＮＮＫ－タンパク質を含むことになるため、ＣＤ１１７に結合することが可能な抗体を生成するための免疫原として使用することができる。

【0130】

ＣＤ３は、ガンマ鎖、デルタ鎖、及び２つのイプシロン鎖を含むＴ細胞共受容体である。具体的な一実施形態において、ＣＤ３は、ヒトＣＤ３である。ＧｅｎＢａｎｋ（商標）アクセッション番号ＮＭ＿００００７３．２（配列番号３１）は、例示的なヒトＣＤ３ガンマ核酸配列を提供する。ＧｅｎＢａｎｋ（商標）アクセッション番号ＮＰ＿００００６４．１（配列番号３２）は、例示的なヒトＣＤ３ガンマアミノ酸配列を提供する。ＧｅｎＢａｎｋ（商標）アクセッション番号ＮＭ＿０００７３２．４（配列番号３３）は、例示的なヒトＣＤ３デルタ核酸配列を提供する。ＧｅｎＢａｎｋ（商標）アクセッション番号ＮＰ＿０００７２３．１（配列番号３４）は、例示的なヒトＣＤ３デルタアミノ酸配列を提供する。ＧｅｎＢａｎｋ（商標）アクセッション番号ＮＭ＿０００７３３．３（配列番号３５）は、例示的なヒトＣＤ３イプシロン核酸配列を提供する。ＧｅｎＢａｎｋ（商標）アクセッション番号ＮＰ＿０００７２４．１（配列番号３６）は、例示的なヒトＣＤ３イプシロンアミノ酸配列を提供する。また、本発明の抗ＣＤ１１７二重特異性結合タンパク質またはその断片に関連して好ましいのは、配列番号３８に示されるＶＬ領域及び配列番号３７に示されるＶＨ領域を含む、Ｔ細胞の表面上のヒトＣＤ３に結合する第２の結合ドメインである。

【0131】

本発明の二重特異性結合分子における免疫グロブリンは、非限定的な例として、モノクローナル抗体、ネイキッド抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体であり得る。

【0132】

一実施形態において、抗ＣＤ１１７二重特異性結合ポリペプチド、またはその断片は、配列番号１３のアミノ酸配列に記載される重鎖可変領域及び配列番号１４のアミノ酸配列に記載される軽鎖可変領域を含む。

【0133】

別の実施形態において、抗ＣＤ１１７二重特異性結合ポリペプチド、またはその断片は、Ａｂ８５の重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列の３つのＣＤＲ配列及び軽鎖可変領域（ＬＨ）アミノ酸配列の３つのＣＤＲ配列を含む。

【0134】

別の実施形態において、抗ＣＤ１１７二重特異性結合ポリペプチド、またはその断片は、Ａｂ８５の重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列及び軽鎖可変領域（ＬＨ）アミノ酸配列を含む。

【0135】

以下に提供される重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列は、配列番号１３として以下に記載される。Ａｂ８５のＶＨ ＣＤＲアミノ酸配列は、以下に下線で示され、次のとおりである：ＮＹＷＩＧ（ＶＨ ＣＤＲ１；配列番号７）；ＩＩＮＰＲＤＳＤＴＲＹＲＰＳＦＱＧ（ＶＨ ＣＤＲ２；配列番号８）；及びＨＧＲＧＹＥＧＹＥＧＡＦＤＩ（ＶＨ ＣＤＲ３；配列番号９）。
Ａｂ８５ ＶＨ配列

【化1】

【0136】

Ａｂ８５の軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列は、配列番号１４として以下に提供される。Ａｂ８５のＶＬ ＣＤＲアミノ酸配列は、以下に下線で示され、次のとおりである：ＲＳＳＱＧＩＲＳＤＬＧ（ＶＬ ＣＤＲ１；配列番号１０）；ＤＡＳＮＬＥＴ（ＶＬ ＣＤＲ２；配列番号１１；及びＱＱＡＮＧＦＰＬＴ（ＶＬ ＣＤＲ３；配列番号１２）。
Ａｂ８５ ＶＬ配列

【化2】

【0137】

したがって、ある特定の実施形態において、抗ＣＤ１１７二重特異性結合ポリペプチド、またはその断片は、配列番号７、８、及び９に記載されるＣＤＲセット（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）を含む重鎖と、配列番号１０、１１、及び１２に記載されるＣＤＲセットを含む軽鎖とを含む。

【0138】

別の実施形態において、抗ＣＤ１１７二重特異性結合ポリペプチド、またはその断片は、Ａｂ６７の重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列及び軽鎖可変領域（ＬＨ）アミノ酸配列を含む。

【0139】

Ａｂ６７の重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列は、配列番号２７に記載される。

【化3】

【0140】

Ａｂ６７のＶＨ ＣＤＲアミノ酸配列は、次のとおりである：ＦＴＦＳＤＡＤＭＤ（ＶＨ ＣＤＲ１；配列番号２１）；ＲＴＲＮＫＡＧＳＹＴＴＥＹＡＡＳＶＫＧ（ＶＨ ＣＤＲ２；配列番号２２）；及びＡＲＥＰＫＹＷＩＤＦＤＬ（ＶＨ ＣＤＲ３；配列番号２３）。

【0141】

Ａｂ６７の軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列は、配列番号２８として以下に提供される。

【化4】

【0142】

Ａｂ６７のＶＬ ＣＤＲアミノ酸配列は、以下に下線で示され、次のとおりである：ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ（ＶＬ ＣＤＲ１；配列番号２４）；ＡＡＳＳＬＱＳ（ＶＬ ＣＤＲ２；配列番号２５）；及びＱＱＳＹＩＡＰＹＴ（ＶＬ ＣＤＲ３；配列番号２６）。

【0143】

他の実施形態において、本明細書で開示される抗ＣＤ１１７二重特異性抗体、またはその断片は、ＷＯ２０２０／２１９７７０（その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されるエピトープ（複数可）などのＣＤ１１７エピトープに結合することが可能である。更に他の実施形態において、本明細書で開示される抗ＣＤ１１７二重特異性抗体、またはその断片は、ＷＯ２０２０／２１９７４８（その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されるエピトープ（複数可）などのＣＤ１１７エピトープに結合することが可能である。

【0144】

本明細書で開示される抗ＣＤ１１７二重特異性結合ポリペプチドまたはその断片のある特定の実施形態において、ＣＤ３に結合するｓｃＦｖを含み、例えば、ｈｕＯＫＴ３（例えば、Ａｄａｉｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｈｕｍ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ５：４１－４７参照）、ＹＴＨ１２．５（例えば、Ｒｏｕｔｌｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２１：２７１７－２７２５参照）、ＨＵＭ２９１（例えば、Ｎｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，７０（１２）：１７０７－１７１２参照）、テプリズマブ（例えば、Ｈｅｒｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１３２：１６６－１７３参照）、ｈｕＣＬＢ－Ｔ３／４（例えば、Ｌａｂｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１１０（１３）：５１４５－５１５０参照）、オテリキシズマブ（例えば、Ｋｅｙｍｅｕｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，５３：６１４－６２３参照）、ブリナツモマブ（例えば、Ｃｈｅａｄｌｅ，２００６，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，８（１）：６２－６８参照）、ＭＴ１１０（例えば、Ｓｉｌｋｅ ａｎｄ Ｇｉｒｅｓ，２０１１，ＭＡｂｓ，３（１）：３１－３７参照）、カツマクソマブ（例えば、Ｈｅｉｓｓ ａｎｄ Ｍｕｒａｗａ，２０１０，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，１２７（９）：２２０９－２２２１参照）などの当該技術分野において知られているＣＤ３特異的抗体のＶＨ及びＶＬを含む。

【0145】

ある特定の実施形態において、抗ＣＤ１１７二重特異性結合ポリペプチドまたはその断片のｓｃＦｖは、当該技術分野において知られているＣＤ３特異的抗体と同じエピトープに結合する。具体的な実施形態において、本発明の二重特異性結合分子のｓｃＦｖは、ＣＤ３特異的抗体ｈｕＯＫＴ３と同じエピトープに結合する。同じエピトープへの結合は、例えば、変異解析または結晶学的研究などの当業者に知られているアッセイによって決定することができる。ある特定の実施形態において、ｓｃＦｖは、当該技術分野において知られている抗体とＣＤ３への結合について競合する。具体的な実施形態において、本発明の二重特異性結合分子のｓｃＦｖは、ＣＤ３特異的抗体ｈｕＯＫＴ３とＣＤ３への結合について競合する。ＣＤ３への結合についての競合は、例えば、フローサイトメトリーなどの当業者に知られているアッセイによって決定することができる。ある特定の実施形態において、ｓｃＦｖは、当該技術分野において知られているＣＤ３特異的抗体のＶＨに対して、少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または少なくとも９９％の類似性を有するＶＨを含む。ある特定の実施形態において、ｓｃＦｖは、１～５つの保存的アミノ酸置換を含む、当該技術分野において知られているＣＤ３特異的抗体のＶＨを含む。ある特定の実施形態において、ｓｃＦｖは、当該技術分野において知られているＣＤ３特異的抗体のＶＬに対して、少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または少なくとも９９％の類似性を有するＶＬを含む。ある特定の実施形態において、ｓｃＦｖは、１～５つの保存的アミノ酸置換を含む、当該技術分野において知られているＣＤ３特異的抗体のＶＬを含む。

【0146】

本明細書に記載される抗ＣＤ１１７二重特異性結合ポリペプチド、またはその断片はまた、当該技術分野において知られているように、半減期を増加させるもの、ＡＤＣＣを増加または減少させるものなどの抗体及び／または断片の特性を変える修飾及び／または変異を含み得る。

【0147】

一実施形態において、抗ＣＤ１１７二重特異性結合ポリペプチド、またはその断片は、バリアントＦｃ領域を含み、当該バリアントＦｃ領域は、当該分子のＦｃガンマＲに対する親和性が変化するように、野生型Ｆｃ領域と比べて少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。Ｆｃ領域内のある特定のアミノ酸位置は、ＦｃγＲと直接接触していることが結晶学的研究により知られている。具体的には、アミノ酸２３４～２３９（ヒンジ領域）、アミノ酸２６５～２６９（Ｂ／Ｃループ）、アミノ酸２９７～２９９（Ｃ’／Ｅループ）、及びアミノ酸３２７～３３２（Ｆ／Ｇ）ループである（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０００ Ｎａｔｕｒｅ，４０６：２６７－２７３参照）。例えば、Ｆｃ領域のアミノ酸位置２３４及び２３５でのアミノ酸置換は、Ｆｃ受容体、特にＦｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）への結合に対するＩｇＧ抗体の親和性を減少させることが特定されている。一実施形態において、本明細書に記載される抗ＣＤ１１７抗体は、Ｌ２３４及び／またはＬ２３５でのアミノ酸置換、例えば、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＥＵインデックス）を含むＦｃ領域を含む。したがって、本明細書に記載される抗ＣＤ１１７二重特異性結合ポリペプチド、またはその断片は、構造分析及び結晶学的分析に基づいて、ＦｃγＲと直接接触する少なくとも１つの残基の修飾を含むバリアントＦｃ領域を含み得る。一実施形態において、抗ＣＤ１１７二重特異性結合ポリペプチド、またはその断片（またはそのＦｃ含有断片）のＦｃ領域は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，ＮＨ１，ＭＤ（１９９１）（明示的に参照により本明細書に援用される）におけるＥＵインデックスに従って、アミノ酸２６５にアミノ酸置換を含む。「ＫａｂａｔにおけるＥＵインデックス」または「ＥＵインデックス」は、ヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体のナンバリングを指し、特に指定のない限り、Ｆｃアミノ酸位置に関して、本明細書において使用される。

【0148】

一実施形態において、Ｆｃ領域は、Ｄ２６５Ａの変異を含む。一実施形態において、Ｆｃ領域は、Ｄ２６５Ｃの変異を含む。

【0149】

いくつかの実施形態において、抗ＣＤ１１７二重特異性結合ポリペプチド、またはその断片（またはその断片）のＦｃ領域は、ＫａｂａｔにおけるＥＵインデックスに従って、アミノ酸２３４にアミノ酸置換を含む。一実施形態において、Ｆｃ領域は、Ｌ２３４Ａの変異を含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ１１７二重特異性結合ポリペプチド、またはその断片（またはその断片）のＦｃ領域は、ＫａｂａｔにおけるＥＵインデックスに従って、アミノ酸２３５にアミノ酸置換を含む。一実施形態において、Ｆｃ領域は、Ｌ２３５Ａの変異を含む。更に別の実施形態において、Ｆｃ領域は、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａの変異を含む。更なる実施形態において、Ｆｃ領域は、Ｄ２６５Ｃ、Ｌ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａの変異を含む。

【0150】

ある特定の態様において、バリアントＩｇＧ Ｆｃドメインは、１つ以上のアミノ酸置換を含み、それにより、１つ以上のアミノ酸置換を含まない野生型Ｆｃドメインと比較して、ＦｃガンマＲ及び／またはＣ１ｑに対する結合親和性が低下または消失する。Ｆｃ結合相互作用は、限定するものではないが、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を含む様々なエフェクター機能及び下流のシグナル伝達イベントに必要不可欠である。したがって、ある特定の態様において、修飾Ｆｃ領域を含む（例えば、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＤ２６５Ｃ変異を含む）二重特異性結合ポリペプチド、またはその断片は、実質的にエフェクター機能が減少または消失している。

【0151】

Ｆｃ領域に対する親和性は、当該技術分野において知られている様々な技術、例えば、限定するものではないが、平衡法（例えば、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）；ＫｉｎＥｘＡ，Ｒａｔｈａｎａｓｗａｍｉ ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．３７３：５２－６０，２００８；またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ））、または表面プラズモン共鳴アッセイもしくは他のメカニズムのカイネティクスベースアッセイ（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）解析またはＯｃｔｅｔ（商標）解析（ｆｏｒｔｅＢＩＯ））、ならびに間接的な結合アッセイ、競合結合アッセイ蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、ゲル電気泳動及びクロマトグラフィー（例えば、ゲル濾過）などの他の方法を使用して、決定することができる。これらの方法及び他の方法は、試験される成分のうちの１つ以上に標識を利用してもよいし、及び／または発色標識、蛍光標識、発光標識、もしくは同位体標識を含むがこれらに限定されない様々な検出法を採用することができる。結合親和性及びカイネティクスの詳細な説明については、抗体と免疫原の相互作用に焦点を当てたＰａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，ｅｄ．，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９９９）に見出すことができる。競合結合アッセイの一例は、目的の抗体と標識抗原を漸増量の非標識抗原の存在下でインキュベーションし、標識抗原に結合した抗体を検出することを含む、ラジオイムノアッセイである。特定の抗原に対する目的の抗体の親和性及び結合オフレートは、スキャッチャードプロット分析によってデータから決定することができる。二次抗体との競合は、ラジオイムノアッセイを使用して決定することもできる。この場合、抗原は、標識した化合物とコンジュゲートした目的の抗体とともに、漸増量の非標識の二次抗体の存在下でインキュベートされる。

【0152】

一実施形態において、本明細書に記載される抗ＣＤ１１７二重特異性結合ポリペプチド、またはその断片は、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＤ２６５Ｃ（ＥＵインデックス）を含むＦｃ領域を含む。本発明の二重特異性結合ポリペプチドまたはその断片は、例えば、（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８１：２３５１４－２４）、（Ｚａｌｅｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２８：１５７－９）、（Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７９：６２１３－６）、（Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７６：３４６－５６）、（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６：６５９１－６０４）、（Ｐｅｔｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８：１７５９－６９）、（Ｄａｔｔａ－Ｍａｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓｐｏｓ ３５：８６－９４）、（Ｖａｃｃａｒｏ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２３：１２８３－８）、（Ｙｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７０：３２６９－７７）及び（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２９：２８１９－２５）に記載されているものなどの追加のＦｃ変異を導入することによって抗体半減期を更に調節するように更に操作されてもよく、位置２５０、２５２、２５３、２５４、２５６、２５７、３０７、３７６、３８０、４２８、４３４及び４３５が含まれる。単一でまたは組み合わせて行うことができる例示的な変異は、Ｔ２５０Ｑ、Ｍ２５２Ｙ、１２５３Ａ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｐ２５７１、Ｔ３０７Ａ、Ｄ３７６Ｖ、Ｅ３８０Ａ、Ｍ４２８Ｌ、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｓ、Ｎ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｈ、Ｎ４３４Ｆ、Ｈ４３５Ａ及びＨ４３５Ｒ変異である。

【0153】

したがって、一実施形態において、Ｆｃ領域は、半減期の減少をもたらす変異を含む。短い半減期（本明細書において「高速」半減期とも呼ばれる）を有する二重特異性結合ポリペプチドまたはその断片は、二重特異性結合ポリペプチドまたはその断片が短命の治療薬として機能することが期待される特定の場合、例えば、二重特異性結合ポリペプチドまたはその断片の投与の後にＨＳＣが投与される本明細書に記載されるコンディショニングステップに有利であり得る。理想的には、二重特異性結合ポリペプチド、またはその断片は、ＨＳＣの送達前に実質的にクリアリングされ、ＨＳＣも、一般的にはＣＤ１１７を発現するが、内因性幹細胞とは異なり、抗ＣＤ１１７二重特異性結合ポリペプチド、またはその断片の標的ではない。一実施形態において、Ｆｃ領域は、位置４３５に変異を含む（Ｋａｂａｔに従うＥＵインデックス）。一実施形態において、変異は、Ｈ４３５Ａ変異である。別の実施形態において、変異は、Ｄ２６５Ｃ変異である。更に別の実施形態において、変異は、Ｈ４３５Ａ変異及びＤ２６５Ｃ変異である。

【0154】

一実施形態において、本明細書に記載される抗ＣＤ１１７二重特異性結合ポリペプチドまたはその断片は、２４時間以下、２２時間以下、２０時間以下、１８時間以下、１６時間以下、１４時間以下、１３時間以下、１２時間以下、１１時間以下、１０時間以下、９時間以下、８時間以下、７時間以下、６時間以下、または５時間以下の半減期を有する。一実施形態において、抗体の半減期は、５時間～７時間；５時間～９時間；１５時間～１１時間；５時間～１３時間；５時間～１５時間；５時間～２０時間；５時間～２４時間；７時間～２４時間；９時間～２４時間；１１時間～２４時間；１２時間～２２時間；１０時間～２０時間；８時間～１８時間；または１４時間～２４時間である。

【0155】

本明細書に記載される患者コンディショニング法に関連して使用することができる抗ＣＤ１１７二重特異性結合ポリペプチド、またはその断片には、例えば、米国特許第５，４８９，５１６号に記載されるＳＲ－１抗体などの、例えば、ＡＴＣＣアクセッション番号１０７１６（ＢＡ７．３Ｃ．９として寄託）から産生及び放出される抗体部分が含まれ、その開示は、抗ＣＤ１１７抗体に関して、参照により本明細書に援用される。

【0156】

一実施形態において、本明細書に記載される抗ＣＤ１１７二重特異性結合ポリペプチド、またはその断片は、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｄ２６５Ｃ、及びＨ４３５Ａ（ＥＵインデックス）を含むＦｃ領域を含む。

【0157】

本明細書に記載される患者コンディショニング法に関連して使用することができる追加の抗ＣＤ１１７二重特異性結合ポリペプチドまたはその断片には、米国特許第７，９１５，３９１号（例えば、ヒト化ＳＲ－１抗体について記載）；米国特許第５，８０８，００２号（例えば、抗ＣＤ１１７ Ａ３Ｃ６Ｅ２抗体について記載）に記載されるもの、ならびに、例えば、ＷＯ２０１５／０５０９５９（ヒトＣＤ１１７のＰｒｏ３１７、Ａｓｎ３２０、Ｇｌｕ３２９、Ｖａｌ３３１、Ａｓｐ３３２、Ｌｕｓ３５８、Ｇｌｕｅ３６０、Ｇｌｕｅ３７６、Ｈｉｓ３７８、及び／またはＴｈｒ３８０を含有するエピトープに結合する抗ＣＤ１１７抗体について記載）；及びＵＳ２０１２／０２８８５０６（米国特許第８，５５２，１５７号としても公開されている）（例えば、
アミノ酸配列ＳＹＷＩＧ（配列番号１）を有するＣＤＲ－Ｈ１；
アミノ酸配列ＩＩＹＰＧＤＳＤＴＲＹＳＰＳＦＱＧ（配列番号２）を有するＣＤＲ－Ｈ２；
アミノ酸配列ＨＧＲＧＹＮＧＹＥＧＡＦＤＩ（配列番号３）を有するＣＤＲ－Ｈ３；
アミノ酸配列ＲＡＳＱＧＩＳＳＡＬＡ（配列番号４）を有するＣＤＲ－Ｌ１；
アミノ酸配列ＤＡＳＳＬＥＳ（配列番号５）を有するＣＤＲ－Ｌ２；及び
アミノ酸配列ＣＱＱＦＮＳＹＰＬＴ（配列番号６）を有するＣＤＲ－Ｌ３
のＣＤＲ配列を有する抗ＣＤ１１７抗体ＣＫ６について記載）に記載されるものが含まれる。

【0158】

ＣＫ６の重鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号２７）に提供される：

【化5】

【0159】

ＣＫ６の軽鎖アミノ酸可変配列は、配列番号２８に提供される：

【化6】

【0160】

本明細書に記載される組成物及び方法に関連して使用され得る追加の抗ＣＤ１１７二重特異性結合ポリペプチド、またはその断片には、クローン９Ｐ３、ＮＥＧ０２４、ＮＥＧ０２７、ＮＥＧ０８５、ＮＥＧ０８６、及び２０３７６などのＵＳ２０１５／０３２０８８０に記載されるものが含まれる。

【0161】

前述の公開物のそれぞれの開示は、抗ＣＤ１１７抗体に関して、参照により本明細書に援用される。本明細書に記載される組成物及び方法に関連して使用され得る抗ＣＤ１１７二重特異性結合ポリペプチド、またはその断片には、上記抗体及びその抗原結合断片だけでなく、上記のそれらの非ヒト抗体及び抗原結合断片のヒト化バリアント、ならびに、例えば、競合ＣＤ１１７結合アッセイによって評価されるように、上記のものと同じエピトープに結合する抗体または抗原結合断片が含まれる。

【0162】

前述の抗体の例示的な抗原結合断片には、なかでも、二重可変免疫グロブリンドメイン、一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、トリアボディ、ナノボディ、抗体様タンパク質スカフォールド、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２分子、及びタンデムジｓｃＦｖが含まれる。

【0163】

抗ＣＤ１１７二重特異性結合ポリペプチド、またはその断片は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載される組み換え法及び組成物を使用して作製され得る。一実施形態において、本明細書に記載される抗ＣＤ１１７二重特異性結合ポリペプチド、またはその断片をコードする単離核酸が提供される。そのような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び／またはＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／または重鎖）をコードし得る。更なる実施形態において、そのような核酸を含む１つ以上のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。更なる実施形態において、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。そのような一実施形態において、宿主細胞は、（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１のベクター及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２のベクターを含む（例えば、それにより形質転換されている）。一実施形態において、宿主細胞は、真核生物、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一実施形態において、抗ＣＬＬ－１抗体を作製する方法が提供され、当該方法は、上に提供される抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を抗体の発現に好適な条件下で培養することと、任意選択により、宿主細胞（または宿主細胞培地）から抗体を回収することとを含む。

【0164】

抗ＣＤ１１７二重特異性結合ポリペプチドまたはその断片の組み換え産生のために、抗体、例えば、上記の抗体をコードする核酸が単離され、更なるクローニング及び／または宿主細胞における発現のために、１つ以上のベクターに挿入される。そのような核酸は、従来の手順を使用して（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することが可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用して）、容易に単離及びシーケンシングされ得る。

【0165】

抗体をコードするベクターのクローニングまたは発現に好適な宿主細胞には、本明細書に記載される原核細胞または真核細胞が含まれる。例えば、抗体は、特に、グリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要とされない場合、細菌中で産生され得る。細菌中での抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、同第５，７８９，１９９号、及び同第５，８４０，５２３号を参照されたい。（Ｅ．ｃｏｌｉ．での抗体断片の発現について記載するＣｈａｒｌｔｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，２００３），ｐｐ．２４５－２５４も参照されたい。）発現後、抗体は、細菌細胞ペーストから可溶性画分で単離され得、更に精製することができる。

【0166】

脊椎動物細胞もまた宿主として使用され得る。例えば、懸濁液中で成長するように改良された哺乳動物細胞株が有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７）；ヒト胚性腎臓株（２９３細胞または例えばＧｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７）に記載の２９３細胞）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３－２５１（１９８０）に記載のＴＭ４細胞）；サル腎臓細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ科腎臓細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２）；例えば、Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４－６８（１９８２）に記載のＴＲＩ細胞；ＭＲＣ ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳類宿主細胞株には、ＤＨＦＲ－ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６（１９８０））を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；ならびにＹ０、ＮＳ０及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株が含まれる。抗体産生に好適な特定の哺乳動物宿主細胞株の総説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ ａｎｄ Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．），ｐｐ．２５５－２６８（２００３）を参照されたい。

【0167】

一実施形態において、抗ＣＤ１１７二重特異性結合ポリペプチド、またはその断片は、本明細書で開示される配列番号に対して、少なくとも９５％、９６％、９７％または９９％同一であるアミノ酸配列を有する可変領域を含む。あるいは、抗ＣＤ１１７二重特異性結合ポリペプチド、またはその断片は、本明細書で開示される配列番号に対して、少なくとも９５％、９６％、９７％または９９％同一であるアミノ酸配列を有する本明細書に記載される可変領域のフレームワーク領域とともに、本明細書で開示される配列番号を含むＣＤＲを含む。

【0168】

一実施形態において、抗ＣＤ１１７二重特異性結合ポリペプチド、またはその断片は、本明細書で開示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び重鎖定常領域を含む。別の実施形態において、抗ＣＤ１１７二重特異性結合ポリペプチド、またはその断片は、本明細書で開示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域を含む。更に別の実施形態において、抗ＣＤ１１７二重特異性結合ポリペプチド、またはその断片は、本明細書で開示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、軽鎖可変領域、重鎖定常領域及び軽鎖定常領域を含む。

【0169】

二重特異性抗体の調製方法
二重特異性抗体は、いくつかの実施形態において、全長抗体または抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ）２二重特異性抗体など）のいずれかとして、当該技術分野において知られている標準的な方法に従って調製することができる。全長二重特異性抗体の従来の産生は、２つの鎖が異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖ペアの共発現に基づく。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖がランダムに対合するため、異なる抗体分子の混合物が生成される可能性があるが、一般に、二重特異性ヘテロ二量体の正しい対合は１つである。正しいヘテロ二量体分子の精製は、通常、アフィニティークロマトグラフィーによってなされる。

【0170】

二重特異性抗体はまた、重鎖ヘテロ二量体化法を使用して産生することができる。そのような方法には、例えば、米国特許第７，６９５，９３６号、米国特許第５，８０７，７０６号及び米国特許出願公開第２００３／００７８３８５号に記載されている「ノブインホール」法が含まれ、これらは、その全体が参照により本明細書に援用される。「ノブインホール」法では、第１の抗体分子の界面の１つ以上の小さいアミノ酸側鎖（例えば、アラニンまたはトレオニン）を、より大きい側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置き換えることによって、「突起」を作製する。この大きい側鎖（複数可）と同一または同様の大きさの補償である「キャビティ」を、第２の抗体分子の界面上に、大きい側鎖を有するアミノ酸を小さい側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニンまたはトレオニン）に置き換えることによって作製する。これにより、ホモ二量体などの他の望ましくない最終産物よりもヘテロ二量体の収率が増加する機構が提供される。「ノブインホール」法によって産生される二重特異性抗体の多くの実施形態において、Ｆｃ領域は、ノブ及びホールの置換のペアを１つ含有する。いくつかの実施形態において、第１の重鎖、すなわち、鎖ＡのＦｃ領域は、１つ以上のアミノ酸置換を含有し、第２の重鎖、すなわち、鎖ＢのＦｃ領域は、１つ以上のアミノ酸置換を含有する。例えば、鎖Ａ及び鎖ＢにおけるＩｇＧ１ Ｆｃ領域の次のノブ及びホールの置換は、非修飾の鎖Ａ及び鎖Ｂに見出されるものと比較して、ヘテロ二量体形成を増加させることがわかっている：１）鎖ＡのＹ４０７Ｔ及び鎖ＢのＴ３６６Ｙ；２）鎖ＡのＹ４０７Ａ及び鎖ＢのＴ３６６Ｗ；３）鎖ＡのＦ４０５Ａ及び鎖ＢのＴ３９４Ｗ；４）鎖ＡのＦ４０５Ｗ及び鎖ＢのＴ３９４Ｓ；５）鎖ＡのＹ４０７Ｔ及び鎖ＢのＴ３６６Ｙ；６）鎖ＡのＴ３６６Ｙ及びＦ４０５Ａならびに鎖ＢのＴ３９４Ｗ及びＹ４０７Ｔ；７）鎖ＡのＴ３６６Ｗ及びＦ４０５Ｗならびに鎖ＢのＴ３９４Ｓ及びＹ４０７Ａ；８）鎖ＡのＦ４０５Ｗ及びＹ４０７Ａならびに鎖ＢのＴ３６６Ｗ及びＴ３９４Ｓ；ならびに９）鎖ＡのＴ３６６Ｗならびに鎖ＢのＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ。同様に、ＷＯ２００９／０８９００４（その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されるように、１つ以上のアミノ酸残基、例えば、ＣＨ３－ＣＨ３界面における１つ以上のアミノ酸残基の電荷を変更する置換は、ヘテロ二量体の形成を向上させることができる。そのような置換は、本明細書において「電荷ペア置換」とも呼ばれ、したがって、Ａ鎖に１つ以上の電荷ペア置換を含有するＦｃ領域は、Ｂ鎖とは異なる置換（複数可）を含有し得る。電荷ペア置換の一般的な例としては、次が挙げられる：１）鎖ＡのＫ４０９ＤまたはＫ４０９Ｅと鎖ＢのＤ３９９ＫまたはＤ３９９Ｒ；２）鎖ＡのＫ３９２ＤまたはＫ３９２Ｅと鎖ＢのＤ３９９ＫまたはＤ３９９Ｒ；３）鎖ＡのＫ４３９ＤまたはＫ４３９Ｅと鎖ＢのＥ３５６ＫまたはＥ３５６Ｒ；及び４）鎖ＡのＫ３７０ＤまたはＫ３７０Ｅと鎖ＢのＥ３５７ＫまたはＥ３５７Ｒ。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体またはその一部は、共通の軽鎖を使用して産生されてもよい。共通の軽鎖を使用することにより、ＷＯ９８／５０４３１（その内容全体が参照により援用される）に記載されるように、起こり得るミスペアリングの数を減少させることができる。これらの「ノブインホール」及び／または「電荷ペア置換」のうちの１つ以上を、本明細書に記載されるヘテロ二量体二重特異性抗体のＦｃ領域に使用することができる。

【0171】

いくつかの実施形態において、「ノブインホール」法を使用して二重特異性抗体を産生する方法は、「ノブ」変異を含む重鎖を含む第１のタンパク質分子を、「ホール」変異を含む重鎖を含む第２のタンパク質分子とともに、ヒンジ領域のシステインがジスルフィド結合異性化を受けるのに十分な還元条件下でインキュベートすることを含む。好適な条件の例は、米国特許出願公開第２０１６／００４６７２７号に記載されており、その全体が参照により本明細書に援用される。いくつかの実施形態において、ヒンジ領域のシステインがジスルフィド結合異性化を受ける最小要件は、ホモ二量体出発タンパク質に応じて、特に、ヒンジ領域中の正確な配列に応じて、異なり得る。いくつかの実施形態において、「ノブ」及び「ホール」変異を含む第１及び第２の重鎖ＣＨ３領域のそれぞれのホモ二量体相互作用は、ヒンジ領域のシステインが所与の条件下でジスルフィド結合異性化を受けるのに十分弱いものである。いくつかの実施形態において、還元条件には、還元剤、例えば、トリペプチドグルタチオン（ＧＳＨ）、２－メルカプトエチルアミン（２－ＭＥＡ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリトリトール（ＤＴＥ）、グルタチオン、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、Ｌ－システイン及びベータ－メルカプト－エタノールからなる群から選択される還元剤の添加が含まれる。他の実施形態において、還元条件は、必要な酸化還元電位を基準にして記載される。酸化還元電位は、ＧＳＳＧあたり２個のＧＳＨが酸化されるという化学量論を考慮すると、酸化還元状態の定量的な指標となる。いくつかの実施形態において、反応は、－５０ｍＶ未満、例えば、－１５０ｍＶ未満、－１５０～－６００ｍＶ、例えば、－２００～－５００ｍＶ、－２５０～－４５０ｍＶ、例えば、－２５０～－４００ｍＶ、－２６０～－３００ｍＶの範囲の酸化還元電位の還元条件で実施される。本明細書に記載される他の実施形態において、「ノブインホール」法を使用して二重特異性抗体を産生することは、還元反応の完了後に、例えば、還元剤を除去することによって、例えば、脱塩によって、非還元性または低還元性になるように条件を回復させることを含む。

【0172】

「ノブインホール」法を使用して産生される本明細書で提供されるバリアント重鎖分子は、二重特異性抗体の生成に有用であり、上述の制限及び技術的困難（例えば、不適切なペアリング）を克服することができる。いくつかの実施形態において、抗体内の１つの重鎖及び１つの軽鎖は、天然システインが非システインアミノ酸によって置換され、天然非システインアミノ酸がシステインアミノ酸によって置換されるように修飾される。本明細書で提供されるそのような修飾は、重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）ドメインに生じるものであり、それにより、ＨＣ－ＬＣ鎖内ジスルフィド架橋の再配置がもたらされる。他の実施形態において、４つの別個のポリペプチドから二重特異性抗体を作製する場合、例えば、修飾アームが１つの標的に対する結合特異性を有し、非修飾アームが異なる標的に対する結合特異性を有する場合、４つのポリペプチドは、修飾重鎖ポリペプチドが修飾軽鎖と適切にハイブリダイズし、非修飾重鎖が非修飾軽鎖と適切にハイブリダイズするように組み立てられる。本明細書で使用される場合、「非修飾」という用語は、本明細書に記載される及び／または当該技術分野において知られているＣＨ２及び／またはＣＨ３領域に、本明細書に記載されるＨＣ－ＬＣ修飾（例えば、「ノブインホール」またはシステイン修飾）を含有しない重鎖及び軽鎖を指す。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるＨＣ－ＬＣ修飾は、適切な重鎖ヘテロ二量体化を確実にし、及び／または重鎖ヘテロ二量体の精製を向上させるために、重鎖の更なる修飾、特に、ＣＨ２及び／またはＣＨ３領域中における修飾と組み合わせることができる。

【0173】

二重特異性結合タンパク質の同定方法
二重特異性結合タンパク質、またはその断片、ＣＤ１１７（例えば、ＧＮＮＫ＋ＣＤ１１７）（及び／またはＣＤ３）に結合することが可能な分子のためのライブラリーのハイスループットスクリーニングのための方法を使用して、がん、自己免疫疾患の治療、及び本明細書に記載される造血幹細胞療法を必要とする患者（例えば、ヒト患者）のコンディショニングに有用な抗体を同定し、親和性成熟を行うことができる。そのような方法には、なかでも、ファージディスプレイ、細菌ディスプレイ、酵母ディスプレイ、哺乳動物細胞ディスプレイ、リボソームディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ、及びｃＤＮＡディスプレイなどの当該技術分野において知られているｉｎ ｖｉｔｒｏディスプレイ技術が含まれる。生物学的に関連する分子に結合するリガンドを単離するためのファージディスプレイの使用は、例えば、Ｆｅｌｉｃｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ．１：１４９－１８３，１９９５；Ｋａｔｚ，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．２６：２７－４５，１９９７；及びＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４：１－２０，１９９８に概説されており、そのそれぞれの開示は、ｉｎ ｖｉｔｒｏディスプレイ技術に関して、参照により本明細書に援用される。細胞表面抗原に結合するポリペプチドを選択するために、ランダム化されたコンビナトリアルペプチドライブラリーが構築されており、Ｋａｙ，Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｄｅｓ．２：２５１－２６８，１９９５及びＫａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｄｉｖｅｒｓ．１：１３９－１４０，１９９６に記載されているとおりであり、そのそれぞれの開示は、抗原結合分子の発見に関して、参照により本明細書に援用される。多量体タンパク質などのタンパク質が機能性分子として良好にファージディスプレイされている（例えば、ＥＰ０３４９５７８；ＥＰ４５２７８３９；及びＥＰ０５８９８７７、ならびにＣｈｉｓｗｅｌｌ ａｎｄ ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：８０－８４ １９９２を参照されたく、そのそれぞれの開示は、抗原結合分子の発見のためのｉｎ ｖｉｔｒｏディスプレイ技術の使用に関して、参照により本明細書に援用される)。加えて、Ｆａｂ及びｓｃＦｖ断片などの機能性抗体断片が、ｉｎ ｖｉｔｒｏディスプレイ形式で発現されている（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２－５５４，１９９０；Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：７９７８－７９８２，１９９１；及びＣｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８，１９９１を参照されたく、そのそれぞれの開示は、抗原結合分子の発見のためのｉｎ ｖｉｔｒｏディスプレイプラットフォームに関して、参照により本明細書に援用される）。それらの技術は、なかでも、ＣＤ１１７（例えば、ＧＮＮＫ＋ＣＤ１１７）（及び／またはＣＤ３）に結合する抗体を同定し、その親和性を改善するために使用することができ、それにより、造血幹細胞移植療法を必要とする患者（例えば、ヒト患者）において内因性造血幹細胞を枯渇させるために使用することができる。

【0174】

ｉｎ ｖｉｔｒｏディスプレイ技術に加えて、計算論的モデリング技術を使用して、ＣＤ１１７（例えば、ＧＮＮＫ＋ＣＤ１１７）（及び／またはＣＤ３）に結合する二重特異性結合タンパク質、またはその断片をｉｎ ｓｉｌｉｃｏで設計及び同定することができる。例えば、当業者であれば、計算論的モデリング技術を使用して、この抗原の細胞外エピトープなどの特定のエピトープに結合することが可能な分子について、二重特異性結合タンパク質、抗体、または抗体断片のライブラリーをｉｎ ｓｉｌｉｃｏでスクリーニングすることができる。これらの計算技術によって同定された二重特異性結合タンパク質、抗体、またはその抗原結合断片は、本明細書に記載される治療法、例えば、本明細書に記載されるがん及び自己免疫疾患の治療法ならびに本明細書に記載される患者コンディショニング処置に関連して使用することができる。

【0175】

追加の技術を使用して、細胞（例えば、がん細胞、自己免疫細胞、または造血幹細胞）の表面上のＣＤ１１７（例えば、ＧＮＮＫ＋ＣＤ１１７）（及び／またはＣＤ３）に結合し、例えば、受容体媒介性エンドサイトーシスによって、細胞によって内在化される、二重特異性結合タンパク質、抗体、またはその抗原結合断片を同定することができる。例えば、がん細胞、自己免疫細胞、または造血幹細胞の表面上のＣＤ１１７（例えば、ＧＮＮＫ＋ＣＤ１１７）（及び／またはＣＤ３）に結合し、その後、内在化される二重特異性結合タンパク質、抗体、またはその抗原結合断片についてスクリーニングするように、上記のｉｎ ｖｉｔｒｏディスプレイ技術を適切に変更することができる。ファージディスプレイは、このスクリーニングパラダイムと組み合わせて使用することができるそのような技術の１つである。ＣＤ１１７（例えば、ＧＮＮＫ＋ＣＤ１１７）（及び／またはＣＤ３）に結合し、その後、がん細胞、自己免疫細胞、または造血幹細胞によって内在化される二重特異性結合タンパク質、抗体、またはその断片を同定するために、当業者は、例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ １９：１４３２－１４３８，２００５，に記載されるファージディスプレイ技術を応用することができる（その開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）。例えば、当該技術分野において知られている突然変異誘発法を使用して、ランダム化されたアミノ酸カセット（例えば、ＣＤＲもしくはその同等の領域の１つ以上もしくは全て、または二重特異性結合タンパク質、抗体もしくは抗体断片）を含有する、二重特異性結合タンパク質、抗体、抗体断片、例えば、なかでも、ｓｃＦｖ断片、Ｆａｂ断片、ダイアボディ、トリアボディ、及び^１０Ｆｎ３ドメインをコードする、組み換えファージライブラリーを作製することができる。二重特異性結合タンパク質、抗体または抗体断片のフレームワーク領域、ヒンジ、Ｆｃドメイン、及び他の領域は、例えば、ヒト生殖細胞系列抗体配列またはヒト生殖細胞系列抗体に対してわずかな変化しか示さない配列を有することによって、ヒトにおいて非免疫原性であるように設計され得る。

【0176】

本明細書に記載されるまたは当該技術分野において知られているファージディスプレイ技術を使用して、例えば、まず、非特異的タンパク質結合を示す二重特異性結合タンパク質、抗体、またはその断片をコードするファージ、及びＦｃドメインに結合する二重特異性結合タンパク質、抗体またはその断片をコードするファージを除去するために、ファージライブラリーをブロック剤（例えば、乳タンパク質、ウシ血清アルブミン、及び／またはＩｇＧなどと一緒にインキュベートし、次いで、ファージライブラリーを造血幹細胞の集団と一緒にインキュベートすることによって、ファージ粒子に共有結合したランダム化二重特異性結合タンパク質、抗体、または抗体断片を含有するファージライブラリーをＣＤ１１７（例えば、ＧＮＮＫ＋ＣＤ１１７）（及び／またはＣＤ３）抗原とともにインキュベートすることができる。ファージライブラリーは、抗ＣＤ１１７特異的二重特異性結合タンパク質、抗体、またはその抗原結合断片（例えば、ＧＮＮＫ＋ＣＤ１１７特異的抗体、またはその抗原結合断片）が細胞表面ＣＤ１１７（例えば、細胞表面ＧＮＮＫ＋ＣＤ１１７）（及び／またはＣＤ３）抗原に結合し、その後、がん細胞、自己免疫細胞、または造血幹細胞によって内在化されるのを可能にするのに十分な時間（例えば、４℃で３０分～６時間、例えば、４℃で１時間）、がん細胞、自己免疫細胞、または造血幹細胞などの標的細胞とインキュベートすることができる。その後、これらの抗原のうちの１つ以上に対する十分な親和性を示さないために、がん細胞、自己免疫細胞、または造血幹細胞に結合されず、それらによって内在化されない二重特異性結合タンパク質、抗体、またはその断片を含有するファージは、例えば、ｐＨ２．８の冷（４℃）０．１Ｍグリシン緩衝液を用いて細胞を洗浄することによって、除去することができる。二重特異性結合タンパク質、抗体、もしくはその断片に結合しているファージ、またはがん細胞、自己免疫細胞、もしくは造血幹細胞によって内在化されたファージは、例えば、細胞を溶解し、内在化したファージを細胞培養液から回収することによって、同定することができる。次いで、当該技術分野において知られている方法を使用して、例えば、２ｘＹＴ培地中で回収したファージと細菌細胞を一緒にインキュベートすることによって、ファージを細菌細胞で増幅することができる。次いで、この培地から回収されたファージを、例えば、ファージゲノム内に挿入された二重特異性結合タンパク質、抗体、またはその断片をコードする遺伝子（複数可）の核酸配列を決定することによって、特性決定することができる。その後、コードされた二重特異性結合タンパク質、抗体、またはその断片は、化学的合成（例えば、ｓｃＦｖ断片などの抗体断片）または組み換え発現（例えば、全長抗体）によって、新規に調製することができる。

【0177】

調製された二重特異性結合タンパク質、抗体、またはその断片の内在化能力は、例えば、当該技術分野において知られている放射性核種内在化アッセイを使用して評価することができる。例えば、本明細書に記載されるまたは当該技術分野において知られているｉｎ ｖｉｔｒｏディスプレイ技術を使用して同定された二重特異性結合タンパク質、抗体、またはその断片は、^１８Ｆ、^７５Ｂｒ、^７７Ｂｒ、^１２２Ｉ、^１２３Ｉ、^１２４Ｉ、^１２５Ｉ、^１２９Ｉ、^１３１Ｉ、^２１１Ａｔ、^６７Ｇａ、^１１１Ｉｎ、^９９Ｔｃ、^１６９Ｙｂ、^１８６Ｒｅ、^６４Ｃｕ、^６７Ｃｕ、^１７７Ｌｕ、^７７Ａｓ、^７２Ａｓ、^８６Ｙ、^９０Ｙ、^８９Ｚｒ、^２１２Ｂｉ、^２１３Ｂｉ、または^２２５Ａｃなどの放射性同位体の組み込みによって、機能化することができる。例えば、^１８Ｆ、^７５Ｂｒ、^７７Ｂｒ、^１２２Ｉ、^１２３Ｉ、^１２４Ｉ、^１２５Ｉ、^１２９Ｉ、^１３１Ｉ、^２１１Ａｔなどの放射性ハロゲンを、求電子ハロゲン試薬を含有するポリスチレンビーズ（例えば、Ｉｏｄｉｎａｔｉｏｎ Ｂｅａｄｓ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）などのビーズを使用して、二重特異性結合タンパク質、抗体、またはその断片に組み込むことができる。放射性標識された二重特異性結合タンパク質、抗体、またはその断片は、内在化を可能にするのに十分な時間（例えば、４℃で３０分～６時間、例えば、４℃で１時間）、がん細胞、自己免疫細胞、または造血幹細胞とインキュベートすることができる。次いで、細胞を洗浄して、内在化していない抗体またはその断片を除去することができる（例えば、ｐＨ２．８の冷（４℃）０．１Ｍグリシン緩衝液を使用して）。内在化された二重特異性結合タンパク質、抗体、またはその断片は、得られたがん細胞、自己免疫細胞、または造血幹細胞から放出される放射線（例えば、γ線）を、回収した洗浄緩衝液から放出される放射線（例えば、γ線）と比較して検出することによって同定することができる。

【0178】

治療及び標的化細胞枯渇の方法
本明細書に記載されるように、造血幹細胞移植療法は、１つ以上の血液細胞種を増殖または再増殖させるために、治療を必要とする対象に行うことができる。造血幹細胞は、一般に、多能性を示し、そのため、複数の異なる血液系統、例えば、限定するものではないが、顆粒球（例えば、前骨髄球、好中球、好酸球、好塩基球）、赤血球（例えば、網状赤血球、赤血球）、栓球（例えば、巨核芽球、血小板産生巨核球、血小板）、単球（例えば、単球、マクロファージ）、樹状細胞、ミクログリア、破骨細胞、及びリンパ球（例えば、ＮＫ細胞、Ｂ細胞及びＴ細胞）に分化することができる。造血幹細胞は、更に自己複製することが可能であり、そのため、母細胞と同等の能力を有する娘細胞を生み出すことができ、また、移植レシピエントに再導入され、その造血幹細胞ニッチにホーミングし、生産的かつ持続的な造血を再建する能力を特徴とする。

【0179】

したがって、造血幹細胞は、造血系統の１つ以上の細胞種に欠損または欠失がある患者に投与し、欠損または欠失した細胞集団をｉｎ ｖｉｖｏで再構成し、それにより、内因性血液細胞集団の欠損または枯渇に関連する病態を治療することができる。したがって、本明細書に記載される組成物及び方法は、非悪性異常ヘモグロビン症（例えば、鎌状赤血球貧血、サラセミア、ファンコーニ貧血、再生不良性貧血、及びウィスコットアルドリッチ症候群からなる群から選択される異常ヘモグロビン症）を治療するために使用することができる。追加的または代替的に、本明細書に記載される組成物及び方法は、先天性免疫不全などの免疫不全を治療するために使用することができる。追加的または代替的に、本明細書に記載される組成物及び方法は、後天性免疫不全（例えば、ＨＩＶ及びＡＩＤＳからなる群から選択される後天性免疫不全）を治療するために使用することができる。本明細書に記載される組成物及び方法は、代謝性障害（例えば、グリコーゲン蓄積症、ムコ多糖症、ゴーシェ病、ハーラー病、スフィンゴリピド症、及び異染性白質ジストロフィーからなる群から選択される代謝性障害）を治療するために使用することができる。

【0180】

追加的または代替的に、本明細書に記載される組成物及び方法は、血液系がん、骨髄増殖性疾患などの悪性腫瘍または増殖性障害を治療するために使用することができる。がん治療の場合、本明細書に記載される組成物及び方法は、造血幹細胞移植療法の前に内因性造血幹細胞の集団を枯渇させるために患者に投与され得、この場合、移植細胞は、内因性細胞枯渇ステップによって形成されたニッチにホーミングし、生産的な造血を確立することができる。その結果、全身化学療法などのがん細胞根絶中に枯渇した細胞集団を再構築することができる。本明細書に記載される組成物及び方法を使用して治療することができる例示的な血液系がんには、限定するものではないが、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、及び非ホジキンリンパ腫、ならびに神経芽細胞腫を含む他のがん性状態が含まれる。

【0181】

本明細書に記載される組成物及び方法で治療することができる追加の疾患には、限定するものではないが、アデノシンデアミナーゼ欠損症及び重症複合免疫不全、高免疫グロブリンＭ症候群、チェディアック東病、遺伝性リンパ組織球症、骨粗鬆症、骨形成不全症、蓄積症、大サラセミア、全身性強皮症、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、及び若年性関節リウマチが含まれる。

【0182】

本明細書に記載される抗ＣＤ３／抗ＨＣ二重特異性結合タンパク質、抗体、その抗原結合断片、及びコンジュゲートは、実質臓器移植寛容を誘導するために使用され得る。例えば、本明細書に記載される組成物及び方法は、標的組織から細胞集団を枯渇または除去するために（例えば、骨髄幹細胞ニッチから造血幹細胞を枯渇させるために）使用され得る。標的組織からのこのような細胞の枯渇に続いて、臓器ドナーからの幹細胞または前駆細胞（例えば、臓器ドナーからの造血幹細胞）の集団が移植レシピエントに投与され得、そのような幹細胞または前駆細胞の生着に続いて、一時的または安定した混合キメリズムが達成され得ることで、更なる免疫抑制剤を必要とすることなく、長期移植臓器寛容が可能となる。例えば、本明細書に記載される組成物及び方法は、実質臓器移植レシピエント（例えば、なかでも、腎臓移植、肺移植、肝臓移植、及び心臓移植）における移植寛容を誘導するために使用され得る。本明細書に記載される組成物及び方法は、例えば、移植臓器の長期寛容の誘導には、低い割合の一時的または安定したドナー生着で十分であるため、実質臓器移植寛容の誘導に関連して使用するのによく適している。

【0183】

加えて、本明細書に記載される組成物及び方法は、ＣＤ１１７＋である細胞を特徴とするがんなどのがんを直接治療するために使用することができる。例えば、本明細書に記載される組成物及び方法は、白血病、特に、ＣＤ１１７＋白血病細胞を呈する患者を治療するために使用することができる。本明細書に記載される組成物及び方法を使用して白血病細胞などのＣＤ１１７＋がん性細胞を枯渇することによって、様々ながんを直接治療することができる。このようにして治療され得る例示的ながんには、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、及び非ホジキンリンパ腫などの血液系がんが含まれる。

【0184】

急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、異常な白血球が急速に成長し、骨髄中に蓄積され、正常な血液細胞の産生を妨げることを特徴とする骨髄系血液細胞のがんである。ＡＭＬは、成人に生じる最も一般的な急性白血病であり、その発症率は、年齢とともに増加する。ＡＭＬの症状は、正常な骨髄が白血病細胞に置き換わり、赤血球、血小板、及び正常な白血球の減少が生じることによって発生する。急性白血病のため、ＡＭＬは、急速に進行し、未治療のままであると、数週間または数ヶ月で死に至る場合もある。一実施形態において、本明細書に記載される抗ＣＤ１１７二重特異性結合タンパク質は、それを必要とするヒト患者のＡＭＬを治療するために使用される。ある特定の実施形態において、抗ＣＤ１１７二重特異性結合タンパク質治療は、治療される対象のＡＭＬ細胞を枯渇させる。いくつかの実施形態において、ＡＭＬ細胞の５０％以上が枯渇する。他の実施形態において、ＡＭＬ細胞の６０％以上が枯渇するか、またはＡＭＬ細胞の７０％以上が枯渇するか、またはＡＭＬ細胞の８０％以上もしくは９０％以上もしくは９５％以上が枯渇する。ある特定の実施形態において、抗ＣＤ１１７二重特異性結合タンパク質治療は、単回投与治療である。ある特定の実施形態において、単回投与による抗ＣＤ１１７二重特異性結合タンパク質治療は、ＡＭＬ細胞の６０％、７０％、８０％、９０％または９５％以上を枯渇させる。

【0185】

加えて、本明細書に記載される組成物及び方法は、自己免疫障害を治療するために使用することができる。例えば、抗ＣＤ３／ＣＤ１１７二重特異性抗体、またはその抗原結合断片は、ＣＤ１１７＋免疫細胞を殺傷するために、自己免疫障害に罹患しているヒト患者などの対象に投与することができる。ＣＤ１１７＋免疫細胞は、自己抗原に特異的に結合し、自己抗原に対する免疫応答を起こすＴ細胞受容体を発現するＴ細胞などの自己反応性リンパ球であり得る。本明細書に記載される組成物及び方法を使用して自己反応性ＣＤ１１７＋細胞を枯渇させることによって、以下に記載されるものなどの自己免疫病態を治療することができる。追加的または代替的に、本明細書に記載される組成物及び方法は、造血幹細胞移植療法の前に内因性造血幹細胞の集団を枯渇させることによって自己免疫疾患を治療するために使用することができ、この場合、移植細胞は、内因性細胞枯渇ステップによって形成されたニッチにホーミングし、生産的な造血を確立することができる。その結果、自己免疫細胞根絶中に枯渇した細胞集団を再構築することができる。

【0186】

本明細書に記載される組成物及び方法を使用して治療することができる自己免疫疾患には、限定するものではないが、乾癬、乾癬性関節炎、１型真性糖尿病（１型糖尿病）、リウマチ様関節炎（ＲＡ）、ヒト全身性ループス（ＳＬＥ）、多発性硬化症（ＭＳ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、リンパ球性大腸炎、急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、アジソン病、全身脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、再生不良性貧血、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性リンパ増殖症候群（ＡＬＰＳ）、自己免疫性卵巣炎、バロー病、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、シャーガス病、慢性疲労免疫機能不全症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、クローン病、瘢痕性類天疱瘡、セリアックスプルー－疱疹状皮膚炎、寒冷凝集素症、ＣＲＥＳＴ症候群、デゴス病、円板状ループス、自律神経障害、子宮内膜症、本態性混合クリオグロブリン血症、線維筋痛症－線維筋炎、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギランバレー症候群（ＧＢＳ）、橋本甲状腺炎、化膿性汗腺炎、特発性及び／または急性血小板減少性紫斑病、特発性肺線維症、ＩｇＡニューロパチー、間質性膀胱炎、若年性関節リウマチ、川崎病、扁平苔癬、ライム病、メニエール病、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、重症筋無力症、神経性筋強直症、オプソクローヌスミオクローヌス症候群（ＯＭＳ）、視神経炎、オルド甲状腺炎、尋常性天疱瘡、悪性貧血、多発性軟骨炎、多発性筋炎及び皮膚筋炎、原発性胆汁性肝硬変、結節性多発動脈炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛症、原発性無ガンマグロブリン血症、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、全身硬直症候群、高安動脈炎、側頭動脈炎（「巨細胞性動脈炎」としても知られる）、潰瘍性大腸炎、膠原性大腸炎、ぶどう膜炎、血管炎、白斑、外陰痛（「外陰部前庭炎」）、及びウェゲナー肉芽腫症が含まれる。

【0187】

本明細書に記載される抗ＣＤ１１７／ＣＤ３二重特異性結合タンパク質、抗体、またはその抗原結合断片は、様々な剤形で、患者（例えば、がん、自己免疫疾患に罹患しているか、または造血幹細胞移植療法を必要としているヒト患者）に投与することができる。例えば、本明細書に記載される二重特異性抗体結合タンパク質、またはその抗原結合断片は、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含有する水溶液などの水溶液の形態で、がん、自己免疫疾患に罹患しているか、または造血幹細胞移植療法を必要とする患者に投与することができる。本明細書に記載される組成物及び方法とともに使用される薬学的に許容される賦形剤は、粘性調整剤を含む。水溶液は、当該技術分野において知られる技術を使用して、滅菌され得る。

【0188】

本明細書に記載される抗ＣＤ１１７／ＣＤ３二重特異性結合タンパク質を含む医薬製剤は、抗ＣＤ１１７／ＣＤ３二重特異性結合タンパク質を１つ以上の任意選択の薬学的に許容される担体（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））と混合することによって、凍結乾燥製剤または水溶液の形態に調製される。薬学的に許容される担体は、一般に、採用される投薬量及び濃度で、レシピエントに対して無毒であり、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルパラベンまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンなどのアミノ酸；単糖、二糖、及びグルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；及び／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含むが、これらに限定されない。

【0189】

本明細書に記載される抗ＣＤ１１７／ＣＤ３二重特異性結合タンパク質または抗原結合断片は、経口、経皮、皮下、鼻腔内、静脈内、筋肉内、眼内、または非経口などの様々な経路によって投与され得る。任意の所与の症例における投与に最も好適な経路は、投与される特定の抗ＣＤ１１７二重特異性結合タンパク質、または抗原結合断片、患者、医薬製剤法、投与方法（例えば、投与時間及び投与経路）、患者の年齢、体重、性別、治療される疾患の重症度、患者の食事、及び患者の排泄速度に応じて変わることになる。

【0190】

本明細書に記載される抗ＣＤ１１７／ＣＤ３二重特異性結合タンパク質、またはその抗原結合断片の有効用量は、単回（例えば、ボーラス）投与、複数回投与、もしくは連続投与あたり、または抗体、その抗原結合断片の最適な血清中濃度（例えば、０．０００１～５０００μｇ／ｍＬの血清中濃度）を達成するために、例えば、約０．００１～約１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であり得る。

【0191】

一実施形態において、ヒト患者に投与される抗ＣＤ１１７／ＣＤ３二重特異性結合タンパク質の用量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約０．３ｍｇ／ｋｇである。

【0192】

一実施形態において、ヒト患者に投与される抗ＣＤ１１７／ＣＤ３二重特異性結合タンパク質の用量は、約０．１５ｍｇ／ｋｇ～約０．３ｍｇ／ｋｇである。

【0193】

一実施形態において、ヒト患者に投与される抗ＣＤ１１７／ＣＤ３二重特異性結合タンパク質の用量は、約０．１５ｍｇ／ｋｇ～約０．２５ｍｇ／ｋｇである。

【0194】

一実施形態において、ヒト患者に投与される抗ＣＤ１１７／ＣＤ３二重特異性結合タンパク質の用量は、約０．２ｍｇ／ｋｇ～約０．３ｍｇ／ｋｇである。

【0195】

一実施形態において、ヒト患者に投与される抗ＣＤ１１７／ＣＤ３二重特異性結合タンパク質の用量は、約０．２５ｍｇ／ｋｇ～約０．３ｍｇ／ｋｇである。

【0196】

一実施形態において、ヒト患者に投与される抗ＣＤ１１７／ＣＤ３二重特異性結合タンパク質の用量は、約０．１ｍｇ／ｋｇである。

【0197】

一実施形態において、ヒト患者に投与される抗ＣＤ１１７／ＣＤ３二重特異性結合タンパク質の用量は、約０．２ｍｇ／ｋｇである。

【0198】

一実施形態において、ヒト患者に投与される抗ＣＤ１１７／ＣＤ３二重特異性結合タンパク質の用量は、約０．３ｍｇ／ｋｇである。

【0199】

投与は、がん、自己免疫疾患に罹患しているか、または造血幹細胞移植を受けるための準備としてコンディショニング療法を受けている対象（例えば、ヒト）に１日、１週間、または１ヶ月に１回以上（例えば、約２～１０回）、実施され得る。造血幹細胞移植前のコンディショニング処置の場合、抗ＣＤ１１７二重特異性結合タンパク質、またはその抗原結合断片は、外因性造血幹細胞の生着を最適に促進する時点、例えば、外因性造血幹細胞移植を実施する約１時間～１週間（例えば、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、または７日）またはそれ以上前に、患者に投与することができる。

【実施例】

【0200】

以下の実施例は、本明細書に記載される組成物及び方法がどのように使用、製造、評価され得るかについての説明を当業者に提供するために提示されるものであり、本発明の純粋な例示であることが意図され、本発明者らが発明とみなす範囲を制限することを意図するものではない。ＣＤ３／ＣＤ１１７二重特異性抗体ｂｓ－Ａｂ－１、ｂｓ－Ａｂ－２、及びｂｓ－Ａｂ－３は、図５に記載される二重特異性抗体によって表される。以下の実施例において二重特異性抗体について記載される様々なアミノ酸置換に加えて、各二重特異性抗体は、そのＦｃ領域にＬＡＬＡ変異も含む。これらの二重特異性抗体の結合領域のアミノ酸配列は、表４に記載される。

【0201】

実施例１．ＣＤ１１７／ＣＤ３二重特異性抗体ｂｓ－Ａｂ－１の産生
以下に記載されるように、抗ＣＤ１１７抗体Ａｂ８５由来の抗原結合領域及び抗ＣＤ３抗体Ａｂ２由来の抗原結合領域を使用し、「ノブインホール」ヘテロ二量体化技術を使用して、ＣＤ１１７抗原結合アーム及びＣＤ３抗原結合アームを有する二重特異性抗体ｂｓ－Ａｂ－１を調製した。

【0202】

ｂｓ－Ａｂ－１は、配列番号１３に記載される抗ＣＤ１１７重鎖可変領域配列及び配列番号１４に記載される軽鎖可変領域配列を含み、次のＦｃ置換Ｔ３６６Ｗが導入されるように操作した。部位特異的変異導入を使用して、抗ＣＤ１１７抗体Ａｂ８５の重鎖配列のＦｃ領域（すなわち、ＵＳ２０１９／０１５３１１４Ａ１に記載されている配列番号１５０；その内容全体が参照により本明細書に明示的に援用される）を、次の置換Ｔ３６６Ｗ（ＥＵインデックスに従う）が導入されるように操作した。続いて、抗ＣＤ１１７ Ａｂ８５抗体バリアント、すなわち、「Ａｂ８５ Ｔ３６６Ｗ」を発現させた。

【0203】

ｂｓ－Ａｂ－１のＣＤ３結合アームは、配列番号４１に記載される重鎖可変領域配列及び配列番号４５に記載される軽鎖可変領域配列を含む。抗ＣＤ３重鎖を次のＦｃ置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖが導入されるように操作した。配列番号４９に記載されるＡｂ２（抗ＣＤ３）抗体重鎖配列のＦｃ領域は、次の置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖが導入されるように操作した（アミノ酸位置は、ＥＵインデックスに従ったＦｃ領域を指す）。続いて、Ａｂ２（抗ＣＤ３）抗体バリアント「抗ＣＤ３ Ｔ３６６Ｓ Ｌ３６８Ａ Ｙ４０７Ｖ」を発現させた。

【0204】

次いで、Ａｂ８５ Ｔ３６６Ｗ親抗体及び抗ＣＤ３ Ｔ３６６Ｓ Ｌ３６８Ａ Ｙ４０７Ｖ親抗体を標準的なノブインホール技術を使用して組み立てて、二重特異性ヘテロ二量体ｂｓ－Ａｂ－１を得た。

【0205】

凍結融解サイクルを２回繰り返した後、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用する分析により、ｂｓ－Ａｂ－１の安定性を評価した。凝集レベルを評価するために、２０μｇのｂｓ－Ａｂ－１をＡｄｖａｎｃｅＢｉｏ ＳＥＣ ３００Åカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に注入した。溶出したタンパク質は、２８０ｎｍのＵＶ吸光度を使用して検出され、２回の凍結融解後でも観察可能な凝集は示されなかった（データ示さず）。非還元キャピラリーＳＤＳ ＰＡＧＥ（非還元型ＣＥ－ＳＤＳ）を使用して、更なる試験を実施し、これにより、部分的に還元された二重特異性抗体のレベルは、最小であったと決定された（母集団中で優勢な種（＞９５％）はｂｓ－Ａｂ－１であった）。

【0206】

また、ＯＣＴＥＴ（登録商標）プラットフォームによるバイオレイヤー干渉計を使用して、ｂｓ－Ａｂ－１のヒトＣＤ１１７（ｈＣＤ１１７）に対する結合能力についても評価し、二重特異性フォーマットが二重特異性抗体の抗ＣＤ１１７アームを妨げないことを確認した。結合を決定するための方法は、当該技術分野において知られているもの、例えば、Ｔｏｂｉａｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ Ａｓｓａｙｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｏｃｔｅｔ Ｐｌａｔｆｏｒｍ，” Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏｔｅ １４，２２ ｐａｇｅｓ（２０１３）に記載されているものに従った。結合アッセイは、Ｂｉｏ－Ｌａｙｅｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ Ｄｅｖｉｃｅ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用して、リン酸緩衝生理食塩水（０．１％ＢＳＡ）中２５℃で実施した。Ｂｓ－Ａｂ－１を、６６．７ｎＭの濃度で、ＯＣＴＥＴ（登録商標）Ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ Ｃａｐｔｕｒｅ（ＡＨＣ）バイオセンサーにローディングした。次いで、３３ｎＭのｈＣＤ１１７抗原と会合させ、３３ｎＭのｈＣＤ３抗原と解離させて、ｂｓ－Ａｂ－１が両方の抗原（ＣＤ３及びＣＤ１１７）に結合できるようにした。この方法を使用すると、ｈＣＤ１１７に対するｂｓ－Ａｂ１の結合応答は確認されたが、ｈＣＤ３抗原への結合は検出されなかった（データ示さず）。更に、バキュロウイルス粒子アッセイは、ｂｓ－Ａｂ－１が非特異的結合を呈さないことを示した。これらの結果により、ｈＣＤ１１７に対するｂｓ－Ａｂ－１の結合能力が維持されることが示された。

【0207】

最後に、示差走査蛍光測定法（ＤＳＦ）を使用して、ｂｓ－Ａｂ－１の熱安定性を評価した。２マイクログラムのｂｓ－Ａｂ－１を、タンパク質熱シフトキット仕様書（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｓｈｉｆｔ Ｄｙｅキット（品番＃４４６１１４６）に従って、タンパク質熱シフト緩衝液及び色素と混合し、Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｑｕａｎｔ Ｓｔｕｄｉｏ７ Ｆｌｅｘ機器を使用して分析して、各抗体の融解温度（Ｔｍ）を決定した。データにより、ｂｓ－Ａｂ－１二重特異性抗体が高い固有の熱安定性を示すことが示された。

【0208】

実施例２．抗ＣＤ１１７／抗ＣＤ３二重特異性抗体ｂｓ－１－Ａｂを使用したｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞殺傷アッセイの分析
ＣＤ１１７発現標的細胞（Ｋａｓｕｍｉ－１細胞）を実施例１のｂｓ－Ａｂ－１存在下で６日間培養し、その後、ＣＤ１１７発現標的細胞の生存数を決定した。

【0209】

図１の結果は、６日目において、ｂｓ－Ａｂ－１がＣＤ１１７発現標的細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ殺傷に極めて効果的であることを示しており、抗ＣＤ１１７アイソタイプ抗体（すなわち、１つのＣＤ１１７結合アーム及び１つの非標的化結合（アイソタイプ）アームを有する抗体）及び抗ＣＤ３アイソタイプ抗体（すなわち、１つのＣＤ３結合アーム及び１つの非標的化結合（アイソタイプ）アームを有する抗体）と比較して（図１参照；ＣＤ１１７発現標的細胞の有意な枯渇は観察されなかった）、ＣＤ１１７発現標的細胞の有意な殺傷（図１；ＩＣ_５０＝６．０ｐＭ）を示している。実施例１のｂｓ－Ａｂ－１に関するＩＣ_５０（ｐＭ）値及び有効性のデータを以下の表１に記載する。

【表1】

【0210】

したがって、ｂｓ－Ａｂ－１は、ＣＤ１１７発現標的細胞の殺傷に極めて効果的であった。

【0211】

実施例３．ｂｓ－Ａｂ－１を使用したｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞殺傷アッセイの分析
ヒト造血幹細胞を使用したｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞殺傷アッセイのために、ヒト骨髄由来ＣＤ３４＋細胞を、実施例１のｂｓ－Ａｂ－１、抗ＣＤ３アイソタイプ抗体（すなわち、１つのＣＤ３結合アーム及び１つの非結合（アイソタイプ）アームを有する抗体）、または抗ＣＤ１１７アイソタイプ抗体（すなわち、１つのＣＤ１１７結合アーム及び１つの非結合（アイソタイプ）アームを有する抗体）のいずれかの存在下で、７日間培養した。フローサイトメトリーを使用して、細胞生存率を測定した。

【0212】

図２の結果は、６日目において、実施例１のｂｓ－Ａｂ－１が、抗ＣＤ１１７アイソタイプ抗体及び抗ＣＤ３アイソタイプ抗体と比較して（図２；ＣＤ１１７発現標的細胞の有意な枯渇は観察されなかった）、初代ヒトＣＤ３４＋骨髄細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ殺傷に効果的であったことを示している（図２；ＩＣ_５０＝１５．１ｐＭ）。

【0213】

実施例１のｂｓ－Ａｂ－１に関するＩＣ_５０（ｐＭ）値及び有効性のデータを以下の表２に記載する。

【表2】

【0214】

したがって、実施例１のｂｓ－Ａｂ－１は、ＣＤ１１７発現細胞株（実施例２参照）及び初代ヒトＣＤ３４＋細胞（本実施例）の殺傷に効果的であった。

【0215】

実施例４．ｂｓ－Ａｂ－１を使用したｉｎ ｖｉｖｏ枯渇アッセイ
抗ＣＤ３－アイソタイプ抗体、抗ＣＤ１１７－アイソタイプ抗体及び様々な対照（例えば、ＰＢＳ（陰性対照））と比較した実施例１のｂｓ－Ａｂ－１の細胞枯渇能力を比較するために、ｉｎ ｖｉｖｏ枯渇アッセイを実施した。ヒト化ＮＳＧマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入）を使用して、ｉｎ ｖｉｖｏ ＨＳＣ枯渇アッセイを実施した。実施例１のｂｓ－Ａｂ－１二重特異性抗体を、０．３ｍｇ／ｋｇのｂｓ－Ａｂ－１二重特異性抗体、１．０ｍｇ／ｋｇのｂｓ－Ａｂ－１二重特異性抗体、または６．０ｍｇ／ｋｇのｂｓ－Ａｂ－１二重特異性抗体の単回注射としてヒト化マウスモデルに投与した。加えて、同様に、抗ＣＤ１１７アイソタイプ抗体（すなわち、１つのＣＤ１１７結合アーム及び１つの非標的化アームを有する）、抗ＣＤ３アイソタイプ抗体（すなわち、１つのＣＤ３結合アーム及び１つの非標的化アームを有する）、及び抗ＣＤ１１７－アイソタイプ抗体と抗ＣＤ３－アイソタイプ抗体の両方の組み合わせを６ｍｇ／ｋｇの単回注射としてヒト化マウスに０日目に投与した。２１日目に骨髄を採取し、フローサイトメトリーで調べた。単回投与から２１日後の治療マウスまたは対照マウスにおける、ＣＤ３４＋細胞（図３Ａ及びＢ）及びＣＤ３４＋ＣＤ１１７＋細胞（図３Ｃ及びＤ）の存在率（維持された細胞の％）及び絶対数を図３Ａ～Ｄに示す。

【0216】

結果は、実施例１のｂｓ－Ａｂ－１二重特異性抗体で治療されたヒト化ＮＳＧマウスが、治療レジメンの単回投与から２１日後に、ＰＢＳ対照と比べて、骨髄中のヒトＣＤ３４＋細胞の有意な枯渇を示したことを示している（図３Ａ及びＢ；図３Ａでは維持された細胞の％として、図３Ｂでは大腿骨あたりの細胞絶対数として示される）。更に、結果は、実施例１のｂｓ－Ａｂ１二重特異性抗体が、治療レジメンの単回投与から２１日後に、骨髄中のヒトＣＤ３４＋ＣＤ１１７＋細胞の有意な枯渇を示したことを示している（図３Ｃ及び３Ｄ；図３Ｃでは維持された細胞の％として、図３Ｄでは大腿骨あたりの細胞絶対数として示される）。

【0217】

実施例５．ＣＤ１１７／ＣＤ３二重特異性抗体、ｂｓ－Ａｂ－２及びｂｓ－Ａｂ－３の産生
表４に記載される抗原結合配列及び「ノブインホール」二重特異性操作技術を使用して、ＣＤ３／ＣＤ１１７二重特異性抗体ｂｓ－Ａｂ－２及びｂｓ－Ａｂ－３を設計した。

【0218】

ＣＤ１１７結合アーム及びＣＤ３結合アームを有するｂｓ－Ａｂ－２を、以下に記載される「ノブインホール」ヘテロ二量体化技術を使用して調製した。ｂｓ－Ａｂ－２のＣＤ１１７結合アームは、配列番号１３に記載される重鎖可変領域配列及び配列番号１４に記載される軽鎖可変領域配列を含み、次のＦｃ置換Ｔ３６６Ｙ及びＨ４３５Ａが導入されるように操作した。部位特異的変異導入を使用して、抗ＣＤ１１７抗体Ａｂ８５の重鎖配列のＦｃ領域（すなわち、ＵＳ２０１９／０１５３１１４Ａ１に記載されている配列番号１５０；その内容全体が参照により本明細書に明示的に援用される）を、次の置換Ｔ３６６Ｙ及びＨ４３５Ａが導入されるように操作した（アミノ酸位置は、ＥＵインデックスに従ったＦｃ領域を指す）。続いて、抗ＣＤ１１７ Ａｂ８５バリアント、すなわち、「Ａｂ８５ Ｔ３６６Ｙ Ｈ４３５Ａ」を発現させた。

【0219】

ｂｓ－Ａｂ－２のＣＤ３結合アームは、配列番号４１に記載される重鎖可変領域配列及び配列番号４５に記載される軽鎖可変領域配列を含み、次のＦｃ置換Ｙ４０７Ｔ及びＨ４３５Ａが導入されるように操作した。

【0220】

配列番号４９に記載されるＡｂ２（抗ＣＤ３）抗体重鎖配列のＦｃ領域は、次の置換Ｙ４０７Ｔ及びＨ４３５Ａが導入されるように操作した（アミノ酸位置は、ＥＵインデックスに従ったＦｃ領域を指す）。続いて、抗ＣＤ３抗体バリアント「抗ＣＤ３ Ｙ４０７Ｔ Ｈ４３５Ａ」を発現させた。次いで、Ａｂ８５ Ｔ３６６Ｙ Ｈ４３５Ａ親抗体及び抗ＣＤ３ Ｙ４０７Ｔ Ｈ４３５Ａ親抗体を標準的なノブ及びホール技術を使用して組み立てて、二重特異性ヘテロ二量体ｂｓ－Ａｂ－２を得た。

【0221】

もう１つの二重特異性抗体、すなわち、ＣＤ１１７結合アーム及びＣＤ３結合アームを有するｂｓ－Ａｂ－３を、以下に記載される「ノブインホール」ヘテロ二量体化技術を使用して調製した。ｂｓ－Ａｂ－３のＣＤ１１７結合アームは、配列番号２７に記載される重鎖可変領域配列及び配列番号２８に記載される軽鎖可変領域配列を含み、次のＦｃ置換Ｔ３６６Ｙ Ｈ４５３Ａが導入されるように操作した。部位特異的変異導入を使用して、抗ＣＤ１１７抗体Ａｂ６７の重鎖配列のＦｃ領域（すなわち、ＵＳ２０１９－０１４４５５８Ａ１に記載されている配列番号１５２；その内容全体が参照により本明細書に明示的に援用される）を、次の置換Ｔ３６６Ｙ及びＨ４３５Ａが導入されるように操作した（アミノ酸位置は、ＥＵインデックスに従ったＦｃ領域を指す）。続いて、抗ＣＤ１１７ Ａｂ６７バリアント、すなわち、「Ａｂ６７ Ｔ３６６Ｙ Ｈ４５３Ａ」を発現させた。

【0222】

加えて、ｂｓ－Ａｂ－３のＣＤ３結合アームは、配列番号４１に記載される重鎖可変領域配列及び配列番号４５に記載される軽鎖可変領域配列を含み、次のＦｃ置換Ｙ４０７Ｔ及びＨ４３５Ａが導入されるように操作した。

【0223】

配列番号４９に記載されるＡｂ２（抗ＣＤ３）抗体重鎖配列のＦｃ領域は、次の置換Ｙ４０７Ｔ Ｈ４３５Ａが導入されるように操作した（アミノ酸位置は、ＥＵインデックスに従ったＦｃ領域を指す）。続いて、抗ＣＤ３抗体バリアント「抗ＣＤ３ Ｙ４０７Ｔ Ｈ４３５Ａ」を発現させた。次いで、Ａｂ６７ Ｔ３６６Ｙ Ｈ４５３Ａ親抗体及び抗ＣＤ３ Ｙ４０７Ｖ Ｈ４３５Ａ親抗体を標準的なノブ及びホール技術を使用して組み立てて、二重特異性ヘテロ二量体ｂｓ－Ａｂ－３を得た。

【0224】

加えて、３つの単一特異性抗体（すなわち、１つの結合アーム及び１つの非標的化アームを有する抗体）を対照として設計した。第１の単一特異性抗体（すなわち、１つの結合アーム及び１つの非標的化アームを有する抗体）である、ＣＤ１１７結合アーム及びアイソタイプ（すなわち、非結合）アームを有するＡｂ８５－Ｔ３６６Ｙ－Ｈ４３５Ａ－Ｉｓｏ－Ｙ４０７Ｔ－Ｈ４３５Ａを、「ノブインホール」ヘテロ二量体化技術を使用して調製した。Ａｂ８５－Ｔ３６６Ｙ－Ｈ４３５Ａ－Ｉｓｏ－Ｙ４０７Ｔ－Ｈ４３５ＡのＣＤ１１７結合アームは、配列番号１３に記載される重鎖可変領域配列及び配列番号１４に記載される軽鎖可変領域配列を含むように調製され、次のＦｃ置換Ｔ３６６Ｙ及びＨ４３５Ａが導入されるように操作した。加えて、Ａｂ８５－Ｔ３６６Ｙ－Ｈ４３５Ａ－Ｉｓｏ－Ｙ４０７Ｔ－Ｈ４３５Ａのアイソタイプ結合アームは、アイソタイプ抗体の重鎖可変領域配列を含むように調製され、次のＦｃ置換Ｙ４０７Ｔ及びＨ４３５Ａが導入されるように操作した。

【0225】

第２の単一特異性抗体（すなわち、１つの結合アーム及び１つの非標的化アームを有する抗体）である、ＣＤ１１７結合アーム及びアイソタイプ（すなわち、非結合）アームを有するＡｂ６７－Ｔ３６６Ｙ－Ｈ４３５Ａ－Ｉｓｏ－Ｙ４０７Ｔ－Ｈ４３５Ａを、「ノブインホール」ヘテロ二量体化技術を使用して調製した。Ａｂ６７－Ｔ３６６Ｙ－Ｈ４３５Ａ－Ｉｓｏ－Ｙ４０７Ｔ－Ｈ４３５ＡのＣＤ１１７結合アームは、配列番号２７に記載される重鎖可変領域配列及び配列番号２８に記載される軽鎖可変領域配列を含むように調製され、次のＦｃ置換Ｔ３６６Ｙ及びＨ４３５Ａが導入されるように操作した。加えて、Ａｂ６７－Ｔ３６６Ｙ－Ｈ４３５Ａ－Ｉｓｏ－Ｙ４０７Ｔ－Ｈ４３５Ａのアイソタイプ結合アームは、アイソタイプ抗体の重鎖可変領域配列を含むように調製され、次のＦｃ置換Ｙ４０７Ｔ及びＨ４３５Ａが導入されるように操作した。

【0226】

第３の単一特異性抗体（すなわち、１つの結合アーム及び１つの非標的化アームを有する抗体）である、ＣＤ３結合アーム及びアイソタイプ（すなわち、非結合）アームを有するＡｂ２－Ｙ４０７Ｔ－Ｈ４３５Ａ－Ｉｓｏ－Ｔ３６６Ｙ－Ｈ４３５Ａを、「ノブインホール」ヘテロ二量体化技術を使用して調製した。Ａｂ２－Ｙ４０７Ｔ－Ｈ４３５Ａ－Ｉｓｏ－Ｔ３６６Ｙ－Ｈ４３５ＡのＣＤ３結合アームは、配列番号４１に記載される重鎖可変領域配列及び配列番号４５に記載される軽鎖可変領域配列を含むように調製され、次のＦｃ置換Ｔ３６６Ｙ及びＨ４３５Ａが導入されるように操作した。加えて、Ａｂ２－Ｙ４０７Ｔ－Ｈ４３５Ａ－Ｉｓｏ－Ｔ３６６Ｙ－Ｈ４３５Ａのアイソタイプ結合アームは、アイソタイプ抗体の重鎖可変領域配列を含むように調製され、次のＦｃ置換Ｙ４０７Ｔ及びＨ４３５Ａが導入されるように操作した。

【0227】

ｂｓ－Ａｂ－２二重特異性抗体、ｂｓ－Ａｂ－３二重特異性抗体、及び３つの対照抗体（すなわち、Ａｂ８５－Ｔ３６６Ｙ－Ｈ４３５Ａ－Ｉｓｏ－Ｙ４０７Ｔ－Ｈ４３５Ａ抗体、Ａｂ６７－Ｔ３６６Ｙ－Ｈ４３５Ａ－アイソタイプ－Ｙ４０７Ｔ－Ｈ４３５Ａ抗体及び抗ＣＤ３－Ｙ４０７Ｔ－Ｈ４３５Ａ－Ｉｓｏ－Ｔ３６６Ｙ－Ｈ４３５Ａ抗体）の安定性を、二重特異性抗体について実施した試験に従って安定性について評価すると、観察可能な凝集がないことを含め、安定性が確認された。

【0228】

実施例６．抗ＣＤ１１７／抗ＣＤ３二重特異性抗体を使用したｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞殺傷アッセイ
ヒト造血幹細胞を使用したｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞殺傷アッセイのために、ヒト骨髄由来ＣＤ３４＋細胞を、実施例５のｂｓ－Ａｂ－２二重特異性抗体、実施例５のｂｓ－Ａｂ－３二重特異性抗体、Ａｂ８５－Ｔ３６６Ｙ－Ｈ４３５Ａ－Ｉｓｏ－Ｙ４０７Ｔ－Ｈ４３５Ａ抗体（実施例５）と抗ＣＤ３－Ｙ４０７Ｔ－Ｈ４３５Ａ－Ｉｓｏ－Ｔ３６６Ｙ－Ｈ４３５Ａ抗体（実施例５）の組み合わせ、及びＡｂ６７－Ｔ３６６Ｙ－Ｈ４３５Ａ－アイソタイプ－Ｙ４０７Ｔ－Ｈ４３５Ａ抗体（実施例５）と抗ＣＤ３－Ｙ４０７Ｔ－Ｈ４３５Ａ－Ｉｓｏ－Ｔ３６６Ｙ－Ｈ４３５Ａ抗体（実施例５）の組み合わせのいずれかの存在下で、６日間培養した。フローサイトメトリーを使用して、細胞生存率を測定した。

【0229】

図４の結果は、６日目において、実施例５のｂｓ－Ａｂ－２二重特異性抗体が、Ａｂ８５－Ｔ３６６Ｙ－Ｈ４３５Ａ－Ｉｓｏ－Ｙ４０７Ｔ－Ｈ４３５Ａ単一特異性抗体と抗ＣＤ３－Ｙ４０７Ｔ－Ｈ４３５Ａ－Ｉｓｏ－Ｔ３６６Ｙ－Ｈ４３５Ａ抗体の組み合わせ及びＡｂ６７－Ｔ３６６Ｙ－Ｈ４３５Ａ－アイソタイプ－Ｙ４０７Ｔ－Ｈ４３５Ａ抗体と抗ＣＤ３－Ｙ４０７Ｔ－Ｈ４３５Ａ－Ｉｓｏ－Ｔ３６６Ｙ－Ｈ４３５Ａ単一特異性抗体の組み合わせのいずれかと比較して（図４；ＣＤ３４＋細胞の有意な枯渇は観察されなかった）、初代ヒトＣＤ３４＋骨髄細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ殺傷に効果的であったことを示している（図４；ＩＣ_５０＝６．４ｐＭ）。これらのデータもまた、実施例５のｂｓ－Ａｂ－２二重特異性抗体が実施例５のｂｓ－Ａｂ－３二重特異性抗体よりも効果的であることを示した（図４）。有効性の差は、ｂｓ－Ａｂ－３エピトープの細胞膜への近接性（Ａｂ６７抗体エピトープはＷＯ２０２０／２１９７４８に記載されている；その全体が参照により本明細書に援用される）と比較した、ｂｓ－Ａｂ－２エピトープの細胞膜への近接性（Ａｂ８５抗体のエピトープはＷＯ２０２０／２１９７７０に記載されている；その全体が参照により本明細書に援用される）による可能性がある。

【0230】

二重特異性抗体１ｎＭにおける有効率（％）の値を以下の表３に記載する。

【表3】

【表4-1】

【表4-2】

【表4-3】

【表4-4】

【表4-5】

【表4-6】

【表4-7】

【表4-8】

【表4-9】

【表4-10】

【表4-11】

【表4-12】

【表4-13】

【表4-14】

【表4-15】

【表4-16】

【表4-17】

【表4-18】

【表4-19】

【表4-20】

【表4-21】

【表4-22】

【表4-23】

【表4-24】

【表4-25】

【表4-26】

【0231】

他の実施形態
本明細書において言及される全ての公開物、特許、及び特許出願は、それぞれの個々の公開物または特許出願が参照により本明細書に援用されることが具体的かつ個別に示される場合と同様に、参照により本明細書に援用される。

【0232】

特定の実施形態に関連して本発明が説明されてきたが、更なる変更が可能であることが理解される。本出願は、一般に、本発明の原則に従った本発明のあらゆる変形、使用、または適合を含むことが意図され、本発明が属する技術分野における既知のまたは慣習的な実施の範囲内であり、かつ本明細書に前述される本質的な特徴に適用され得る本開示からの逸脱を含み、特許請求の範囲の範囲に従うものである。

【0233】

他の実施形態は、特許請求の範囲内である。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図4】

【図5】

【配列表】

2023520636000001.app

【国際調査報告】