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特表2023-520656ブデソニド２１－ホスファート塩及びそれを含有する医薬組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-05-18
(54)【発明の名称】ブデソニド２１－ホスファート塩及びそれを含有する医薬組成物
(51)【国際特許分類】
C07J 71/00 20060101AFI20230511BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20230511BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230511BHJP
A61K 31/58 20060101ALI20230511BHJP
A61K 31/137 20060101ALI20230511BHJP
A61K 31/27 20060101ALI20230511BHJP
A61K 31/4704 20060101ALI20230511BHJP
A61K 31/538 20060101ALI20230511BHJP
A61K 9/14 20060101ALI20230511BHJP
A61K 9/10 20060101ALI20230511BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20230511BHJP
A61K 9/72 20060101ALI20230511BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20230511BHJP
A61P 11/06 20060101ALI20230511BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20230511BHJP
【ＦＩ】
C07J71/00 CSP
A61K45/00
A61P43/00 121
A61K31/58
A61K31/137
A61K31/27
A61K31/4704
A61K31/538
A61K9/14
A61K9/10
A61K9/08
A61K9/72
A61P29/00
A61P11/06
A61P11/00
A61P43/00 105
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022557815
(86)(22)【出願日】2021-03-25
(85)【翻訳文提出日】2022-10-14
(86)【国際出願番号】 EP2021057780
(87)【国際公開番号】W WO2021191366
(87)【国際公開日】2021-09-30
(31)【優先権主張番号】102020000006442
(32)【優先日】2020-03-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】IT
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522374434
【氏名又は名称】ジェネティック ソシエタ ペル アチオニ
(74)【代理人】
【識別番号】110000855
【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】キャリエンド、ジュゼッペ
(72)【発明者】
【氏名】シリーノ、ジュゼッペ
(72)【発明者】
【氏名】フィオリーノ、フェルディナンド
(72)【発明者】
【氏名】フレチェンテーゼ、フランチェスコ
(72)【発明者】
【氏名】ムスカラ、マルセロ、ニコラス
(72)【発明者】
【氏名】ペリスッティ、エリーザ
(72)【発明者】
【氏名】ペッティ、アントニオ
(72)【発明者】
【氏名】ロヴィエッツォ、フィオレンティーナ
(72)【発明者】
【氏名】サンタガーダ、ヴィンチェンツォ
(72)【発明者】
【氏名】セヴェリーノ、ベアトリーチェ
(72)【発明者】
【氏名】マーリ、エリーザ
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C086
4C091
4C206
【Ｆターム（参考）】
4C076AA11
4C076AA22
4C076AA24
4C076AA29
4C076AA93
4C076BB01
4C076BB27
4C076CC04
4C076CC15
4C076CC26
4C084AA19
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4C084MA17
4C084MA23
4C084MA43
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4C086AA01
4C086AA02
4C086AA03
4C086AA04
4C086BC27
4C086BC74
4C086DA12
4C086GA14
4C086GA15
4C086MA02
4C086MA04
4C086MA13
4C086MA17
4C086MA23
4C086MA43
4C086MA52
4C086MA55
4C086NA05
4C086NA14
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4C091AA01
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4C091NN01
4C091PA02
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4C091SS01
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4C206AA02
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4C206HA24
4C206MA02
4C206MA04
4C206MA33
4C206MA37
4C206MA43
4C206MA63
4C206MA72
4C206MA75
4C206NA05
4C206NA14
4C206ZA59
4C206ZB11
4C206ZB21
4C206ZC75
(57)【要約】
本発明は、ブデソニド２１－ホスファートと、β２アドレナリン作動薬、好ましくはホルモテロールとの塩、それを含有する医薬組成物、並びに呼吸器炎症性病態、閉塞性病態及びアレルゲン誘発性気道機能不全の治療におけるその使用に関する。本発明は更に、当該塩を調製するプロセスに関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ブデソニド２１－ホスファートとβ２アドレナリン作動薬との塩。
【請求項2】
前記β２アドレナリン作動薬が、短時間作用型β２作動薬、長時間作用型β２作動薬又は超長時間作用型β２作動薬から選択される、請求項１に記載の塩。
【請求項3】
前記β２アドレナリン作動薬が、フェノテロール、オルシプレナリン、サルブタモール、テルブタリン、バンブテロール、クレンブテロール、ホルモテロール、サルメテロール、インダカテロール及びオロダテロールを含む群から選択され、好ましくは前記β２アドレナリン作動薬がホルモテロールである、請求項１又は２に記載の塩。
【請求項4】
ＣｕＫα線を使用することによって得られ、゜２θ角で表されるＸ線粉末回折スペクトルによって特性決定される結晶形態ＩＶの請求項３に記載のブデソニド２１－ホスファートのホルモテロール塩であって、約５．８２、８．２１、１１．６７、１３．０２、１３．５４、１４．１７、１４．８７、１６．４０、１６．９２、１８．３９、１９．６９、２０．１５、２０．６５、２１．４１、２２．２８、２３．４１、２３．６９、２４．１６、２４．７７、２５．２７、２６．４１、２７．３８、２７．８４、２８．５８、３０．１５、３１．６９、３３．５８、３４．４１、３５．４７、３６．０２、３７．５９、３８．６３ ２シータ±０．２０度に特徴的なピークが存在する、ブデソニド２１－ホスファートのホルモテロール塩。
【請求項5】
図８に表されるＸ線粉末回折スペクトルによって特性決定される、結晶形態ＩＶの請求項３に記載のブデソニド２１－ホスファートのホルモテロール塩。
【請求項6】
ｉ）ブデソニド２１－ホスファートを有機溶媒に溶解又は懸濁させる工程と、ｉｉ）撹拌下でβ２アドレナリン作動薬、好ましくはホルモテロールを添加する工程と、
ｉｉｉ）前記ブデソニド２１－ホスファートと、前記β２アドレナリン作動薬との塩、好ましくは前記ブデソニド２１－ホスファートホルモテロール塩を単離する工程と、
を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の塩を調製するプロセス。
【請求項7】
前記有機溶媒が、Ｃ１－Ｃ４脂肪族アルコール、Ｃ２－Ｃ６脂肪族ケトン、Ｃ４－Ｃ８脂肪族エーテル、Ｃ４－Ｃ６環状エーテル、Ｃ３－Ｃ８脂肪族エステル、Ｃ５－Ｃ８炭化水素、Ｃ１－Ｃ４塩素化炭化水素、脂肪族Ｃ２－Ｃ４ニトリル又はそれらの混合物からなる群から選択される、請求項６に記載のプロセス。
【請求項8】
前記有機溶媒が、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソプロピルケトン、ジエチルケトン、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジｔｅｒｔブチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、酢酸エチル、トルエン、キシレン、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン、アセトニトリル又はそれらの混合物、好ましくはメタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトニトリル、酢酸エチル又はそれらの混合物からなる群から選択される、請求項７に記載のプロセス。
【請求項9】
ブデソニド２１－ホスファートと前記有機溶媒との間のｍｍｏｌ／ｍＬ比が１：２０～１：４０、好ましくは１：３０である、請求項６～８のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項10】
ブデソニド２１－ホスファートと前記β２アドレナリン作動薬、好ましくはホルモテロールとのモル比が１：１～１：１．５である、請求項６～９のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項11】
前記単離工程ｉｉｉ）が、Ｃ５－Ｃ８脂肪族直鎖炭化水素、好ましくはヘキサン、Ｃ４－Ｃ６環状エーテル、好ましくはジエチルエーテル又はそれらの混合物から選択される逆溶剤を添加することによって行われる、請求項６～１０のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項12】
前記有機溶媒と前記逆溶剤との体積比が、２：１～１：２、好ましくは１：１の体積比である、請求項１１に記載のプロセス。
【請求項13】
前記単離工程ｉｉｉ）が、好ましくはｎ－ヘキサンからの結晶化によって行われる、請求項６～１０のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項14】
３０～８０℃、好ましくは４０～５０℃の範囲の温度での乾燥工程を更に含む、請求項６～１３のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項15】
少なくとも１つの生理学的に許容される賦形剤と組み合わせた、請求項１～５のいずれか一項に記載のブデソニド２１－ホスファートとβ２アドレナリン作動薬との塩を含む医薬組成物。
【請求項16】
前記組成物が粉末、懸濁液又は溶液の形態であり、好ましくは前記組成物が吸入又は経口経路による投与に適している、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項17】
医薬品として使用するための、請求項１～５のいずれか一項に記載の塩又は請求項１５若しくは１６に記載の医薬組成物。
【請求項18】
抗炎症剤として又は抗喘息剤として使用するための、式ＩＩＩの化合物：
【化1】
又は、少なくとも１つの生理学的に許容される賦形剤と組み合わせた式ＩＩＩの化合物を含む医薬組成物。
【請求項19】
喘息、ＣＯＰＤ及び肺線維症等の呼吸器炎症性病態、閉塞性病態、アレルゲン誘発性気道機能不全の治療における、請求項１７に記載の使用のための塩若しくは使用のための医薬組成物又は請求項１８に記載の使用のための化合物若しくは使用のための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ブデソニド２１－ホスファートと、β２アドレナリン作動薬、好ましくはホルモテロールとの塩、それを含有する医薬組成物、並びに呼吸器炎症性病態、閉塞性病態及びアレルゲン誘発性気道機能不全の治療におけるその使用に関する。本発明は更に、当該塩を調製するプロセスに関する。
【背景技術】
【0002】
ブデソニド（Ｂｕｄ）（化学名１１β，２１－ジヒドロキシ－１６α，１７α－（ブチリデンビス（オキシ））プレグナ－１，４－ジエン－３，２０－ジオン）は、式Ｉによって表される、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、非感染性鼻炎及びクローン病を治療するためのグルココルチコイドステロイドである。
【化1】
【0003】
ブデソニドのｌｏｇＰは３．２であり、その結果、腸管領域の生理学的ｐＨでは水（２８μｇ／ｍＬ）に実質的に不溶性である［１］。吸入コルチコステロイド（ＩＣＳ）は、これまでのところ喘息の治療に使用される最も効果的な治療ツールを表し、非常に低用量であっても、喘息気道の炎症を誘発するのに関連する多くの遺伝子を抑制及び活性化することができる化合物のクラスに属する。
【0004】
β２（ベータ２）アドレナリン受容体作動薬は、β２アドレナリン受容体に作用する薬物のクラスである。β２アドレナリン作動薬は、気管支組織の平滑筋拡張、筋肉及び肝臓の血管拡張、子宮筋の弛緩、及びインスリンの放出を引き起こす。それらは、主に喘息及びＣＯＰＤ等の他の肺障害を治療するために使用される。
【0005】
それらは、短時間作用型、長時間作用型及び超長時間作用型のβ２アドレナリン受容体作動薬に分けることができる。
【0006】
ＩＣＳは、一般に、長時間作用型β２作動薬（ＬＡＢＡ）と組み合わせて投与される。ブデソニドは、通常、式ＩＩで表されるホルモテロール（化学名Ｎ－［２－ヒドロキシ－５－［１－ヒドロキシ－２［［２－（ｐ－メトキシフェニル）－２－プロピル］－アミノ］－エチル］－フェニル］－ホルムアミド）に会合される。
【化2】
【0007】
喘息の制御において組み合わせて使用されることの多い吸入β２作動薬及びコルチコステロイドは、重要な分子相互作用を示す［２］。特に、コルチコステロイドはβ２受容体の遺伝子転写を増加させ、長期投与後のそれらの下方制御から保護する［３］。更に、コルチコステロイドはまた、β２受容体のＧタンパク質へのカップリングを改善するβ２作動薬効果を増強し得る［４］。これらの効果は、これらの２つのクラスの薬物の組み合わせの治療上の利点を更に維持する。
【0008】
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ４１６（２０１１），ｐａｇｅｓ ４９３－４９８は、実験的抗原誘発性関節炎（ＡＩＡ）中の視床下部－下垂体－副腎（ＨＰＡ）系の関節炎症及び活性に対するリポソーム製剤及び遊離グルココルチコイド製剤の効果を開示している。リポソーム送達は、より低い有効投与を可能にすることによってグルココルチコイドの安全性を改善する。リポソームグルココルチコイドの安全性は、プレドニゾロンホスファートではなくブデソニドホスファートをカプセル化することによって更に改善され得る。
【0009】
国際公開第９９／６４０１４号は、喘息の急性状態の予防又は治療のための、ホルモテロール及びブデソニドを含む組成物の使用を開示している。
【0010】
定義
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語、表記及び他の科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有することを意図している。場合によっては、一般的に理解される意味を有する用語は、明確にするため及び／又は容易に参照するために本明細書で定義され、したがって、本明細書におけるそのような定義の包含は、当技術分野で一般的に理解されているものに対する実質的な差異を表すと解釈されるべきではない。
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語、表記及び他の科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有することを意図している。場合によっては、一般的に理解される意味を有する用語は、明確にするため及び／又は容易に参照するために本明細書で定義され、したがって、本明細書におけるそのような定義の包含は、当技術分野で一般的に理解されているものに対する実質的な差異を表すと解釈されるべきではない。
【0011】
本明細書における「生理学的に許容される賦形剤」という用語は、それ自体の薬理学的効果がなく、哺乳動物、好ましくはヒトに投与した場合に有害反応を生じない物質を指す。生理学的に許容される賦形剤は、当技術分野で周知であり、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，ｓｉｘｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ ２００９に開示されている。
【0012】
本明細書における「短時間作用型β２アドレナリン受容体作動薬」又は「短時間作用型β２作動薬」又は「ＳＡＢＡ」という用語は、約４～６時間の作用持続時間を有するβ２アドレナリン受容体作動薬を指す。本発明で使用され得るＳＡＢＡの好ましい例は、フェノテロール、オルシプレナリン、サルブタモール及びテルブタリンである。
【0013】
用語「長時間作用型β２アドレナリン受容体作動薬」又は「長時間作用型β２作動薬」又は「ＬＡＢＡ」は、本明細書では、１２時間までの作用持続時間を有するβ２アドレナリン受容体作動薬を指す。本発明で使用され得るＬＡＢＡの好ましい例は、バンブテロール、クレンブテロール、ホルモテロール及びサルメテロールである。
【0014】
本明細書における「超長時間作用型β２アドレナリン受容体作動薬」又は「超長時間作用型β２作動薬」又は「超ＬＡＢＡ」という用語は、２４時間の持続時間を有し、１日１回の投与を可能にするβ２アドレナリン受容体作動薬を指す。本発明で使用され得るＵｌｔｒａ－ＬＡＢＡの好ましい例は、インダカテロール及びオロダテロールである。
【0015】
本明細書における「ホルモテロール」という用語は、ホルモテロール遊離塩基を指す。
【0016】
本明細書における「およそ」及び「約」という用語は、測定において生じ得る実験誤差の範囲を指す。
【0017】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語は、非限定的な用語（すなわち、「含むが、限定されない」を意味する）と解釈されるべきであり、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ）」又は「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語の支援も提供すると見なされるべきである。
【0018】
「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語は、半閉鎖的な用語として解釈されるべきであり、本発明の基本的かつ新規な特徴に実質的に影響を及ぼす他の成分が含まれないことを意味する（したがって、任意の賦形剤が含まれてもよい）。
【0019】
「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語は、閉じた用語として解釈されるべきである。
【発明の概要】
【0020】
ブデソニドは実質的に水に不溶性であるが、アルコールに容易に溶解する。このため、通常、水溶性アルコール等の可溶化剤に適量の活性物質を溶解させた水アルコール溶液が調製される。しかし、このように調製された溶液は、大量のブデソニドが短時間で分解されるため、安定性が低い。更に、ブデソニド製剤は、固相が容器の底部に時間と共に堆積する傾向がある水性懸濁液の形態で調製されてきており、したがって化学添加剤又は激しい撹拌を必要とする。これらは、ブデソニドを電気ネブライザによる送達に適さなくする理由である。
【0021】
いくつかのコルチコステロイドの２１－ホスファート一級エステルが調製され、いくつかの医薬組成物の活性成分として主に使用されている。これらの分子は、親ステロイドが有さない価値のある特性を有し、第１に、それらは水溶性であり、したがって水溶液中での投与を可能にする。
【0022】
ブデソニド２１－ホスファート（以下、Ｂｕｄ－２１Ｐ又はＢとも呼ばれる）（式ＩＩＩ）は、抗体－薬物コンジュゲートの標的化送達のためのリンカーとして記載されているいくつかの研究で使用されている［５－８］。
【化3】
【0023】
本発明において、式ＩＩＩの化合物は、抗炎症特性及び抗喘息特性を有するより水溶性の化合物として記載される。
【0024】
最近、炎症性気道疾患の治療のために承認された多数の医薬品は、相乗的な治療効果を目指して、ベクロメタゾン／ホルモテロール、フロ酸フルチカゾン／ビランテロール、ブデソニド／ホルモテロール、インダカテロール／グリコピロニウム等の分子と異なる作用機序との組み合わせを特徴としている。
【0025】
本発明の目的は、相乗的な治療効果を有する新規なブデソニド２１－ホスファート塩を提供することである。
【0026】
第１の態様によれば、本発明は、ブデソニド２１－ホスファートとβ２アドレナリン作動薬との塩に関する。
【0027】
本発明者等は、驚くべきことに、本発明の塩がアレルゲン誘発性気道機能不全の制御において相乗効果を示すことを見出した。
【0028】
本発明の第２の態様は、ブデソニド２１－ホスファート塩の調製プロセスである。
【0029】
本発明の第３の態様は、少なくとも１つの生理学的に許容される賦形剤と組み合わせてブデソニド２１－ホスファート塩を含む医薬組成物である。
【0030】
本発明の第４の態様は、医薬品として使用するための上記ブデソニド２１－ホスファート塩及び医薬組成物である。
【0031】
本発明の第５の態様は、抗炎症剤として、又は抗喘息剤として使用するための少なくとも１つの生理学的に許容される賦形剤を含むブデソニド２１－ホスファート又はその医薬組成物である。
【0032】
本発明の第６の態様は、呼吸器炎症性病態、閉塞性病態、アレルゲン誘発性気道機能不全の治療に使用するための上記ブデソニド２１－ホスファート塩、ブデソニド２１－ホスファート及びそれらの医薬組成物である。
【図面の簡単な説明】
【0033】
【図1】ＣＤ３ＯＤ－ｄ４中のブデソニド２１－ホスファートの３１Ｐ ＮＭＲを示す図である。
【図2】ブデソニド２１－ホスファートのＸ線粉末回折を示す図である。
【図3】ブデソニド２１－ホスファートのＦＴ－ＩＲスペクトルを示す図である。
【図4】ＣＤ３ＯＤ－ｄ４中のブデソニド２１－ホスファートホルモテロール塩の１Ｈ ＮＭＲを示す図である。
【図5】ＣＤ３ＯＤ－ｄ４中のブデソニド２１－ホスファートホルモテロール塩の１３Ｃ ＮＭＲを示す図である。
【図6】ブデソニド２１－ホスファートホルモテロール塩（下線のデータ）、ブデソニド２１－ホスファート及びホルモテロール（下線なしのデータ）の１Ｈ－ＮＭＲ比較スペクトルを示す図である。
【図7】ブデソニド２１－ホスファートホルモテロール塩（下線のデータ）、ブデソニド２１－ホスファート及びホルモテロール（下線なしデータ）の１３Ｃ－ＮＭＲ比較スペクトルを示す図である。
【図8】ブデソニド２１－ホスファート（Ｂ）、ホルモテロール（Ｆ）及びブデソニド２１－ホスファートホルモテロール塩（ＦＢ）のＸ線粉末回折の重合わせを示す図である。
【図9】ブデソニド２１－ホスファートホルモテロール塩のＦＴ－ＩＲスペクトルを示す図である。
【図10】ＯＶＡ感作マウスにおける気管支反応性及び血漿ＩｇＥレベルに対するＦＢ、Ｆ及びＢの効果を示す図である。各データ点は、ｎ＝６動物／群の平均±ＳＥＭを表す。パネルＡ：ビヒクル対ＯＶＡ ｐ＜０．００１；Ｆ対ＯＶＡ ＊＊＊Ｐ＜０．００１；ＦＢ対ＯＶＡ ｐ＜０．００１。パネルＢ：ビヒクル対ＯＶＡ ｐ＜０．００１；ＦＢ対ＯＶＡ ｐ＜０．００１。データを二元ＡＮＯＶＡ、引き続いてボンフェローニ検定によって分析する。パネルＣ：ビヒクル対ＯＶＡ ｐ＜０．０１；Ｂ対ＯＶＡ ｐ＜０．０１；ＦＢ対ＯＶＡ ｐ＜０．０１。データを一元ＡＮＯＶＡによって分析する。
【図11A】ＯＶＡ誘発性アレルギー性喘息を有するマウスにおけるＰｅｎｈ測定に対するＦＢ、Ｆ及びＢの効果を示す図である。
【図11B】ＯＶＡ誘発性アレルギー性喘息を有するマウスにおけるＰｅｎｈ測定に対するＦＢ、Ｆ及びＢの効果を示す図である。気管支収縮は、無拘束動物を吸入生理食塩水（パネルＢ）又は増加する濃度の吸入メタコリン（ＭＣｈ；パネルＡ）に曝露した後に測定されたエンハンスドポーズ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐａｕｓｅ）（Ｐｅｎｈ）によって評価した。ＦＢ、Ｆ又はＢを、ＯＶＡチャレンジの常に６０分前（週に２回）の２週間の時間枠の間、毎日投与した。各データ点は、Ｓｈａｍ群（ｎ＝５）を除いて、ｎ＝６動物／群の平均±ＳＥＭを表す。パネルＡ：ＭＣｈ用量対応答曲線；パネルＣ：ピークＰｅｎｈ応答（Ｅｍａｘ）；パネルＤ：Ｐｅｎｈ対ＭＣｈ用量曲線下面積（ＡＵＣ）。＊＊Ｐ＜０．０１対Ｓｈａｍ；＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１及び＃＃＃Ｐ＜０．００１対未処置ＯＶＡ群。データを一元ＡＮＯＶＡ、引き続いてＤｕｎｎｅｔｔ検定によって分析する。
【図12A】ＯＶＡ誘発性アレルギー性喘息を有するマウスからのＢＡＬ液中の総白血球数及び白血球分画数に対するＦＢ、Ｆ及びＢの効果を示す図である。
【図12B】ＯＶＡ誘発性アレルギー性喘息を有するマウスからのＢＡＬ液中の総白血球数及び白血球分画数に対するＦＢ、Ｆ及びＢの効果を示す図である。
【図12C】ＯＶＡ誘発性アレルギー性喘息を有するマウスからのＢＡＬ液中の総白血球数及び白血球分画数に対するＦＢ、Ｆ及びＢの効果を示す図である。未処置のＳｈａｍ及びＯＶＡ誘発性アレルギー動物からＢＡＬ液を回収した。ＦＢ、Ｆ又はＢを２週間の時間枠の間毎日投与し、ＯＶＡチャレンジの６０分前に常に投与した（週に２回）。各バーは、Ｓｈａｍ群（ｎ＝５）を除いて、ｎ＝６動物／群の平均±ＳＥＭを表す。パネルＡ：総ＢＡＬ白血球；パネルＢ：ＢＡＬ好酸球；パネルＣ：ＢＡＬ好中球；パネルＤ：ＢＡＬマクロファージ；パネルＥ：ＢＡＬリンパ球。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１及び＊＊＊ Ｐ＜０．００１対Ｓｈａｍ；＃＃Ｐ＜０．０１及び＃＃＃Ｐ＜０．００１対未処置ＯＶＡ群。データを一元ＡＮＯＶＡ、引き続いてＤｕｎｎｅｔｔ検定によって分析する。
【図13A】ＯＶＡ誘発性アレルギー性喘息を有するマウスからの総白血球数及び循環白血球分画数に対するＦＢ、Ｆ及びＢの効果を示す図である。
【図13B】ＯＶＡ誘発性アレルギー性喘息を有するマウスからの総白血球数及び循環白血球分画数に対するＦＢ、Ｆ及びＢの効果を示す図である。
【図13C】ＯＶＡ誘発性アレルギー性喘息を有するマウスからの総白血球数及び循環白血球分画数に対するＦＢ、Ｆ及びＢの効果を示す図である。未処置のＳｈａｍ及びＯＶＡ誘発性アレルギー動物から血液試料を回収した。ＦＢ、Ｆ又はＢを２週間の時間枠の間毎日投与し、ＯＶＡチャレンジの６０分前に常に投与した（週に２回）。各バーは、Ｓｈａｍ群（ｎ＝５）を除いて、ｎ＝６動物／群の平均±ＳＥＭを表す。パネルＡ：総血中白血球；パネルＢ：血中好酸球；パネルＣ：血中好中球；パネルＤ：血液マクロファージ；パネルＥ：血液リンパ球。＊＊Ｐ＜０．０１及び＊＊＊Ｐ＜０．００１対Ｓｈａｍ；＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１及び＃＃＃Ｐ＜０．００１対未処置ＯＶＡ群。データを一元ＡＮＯＶＡ、引き続いてダネット検定によって分析する。
【図14A】ＯＶＡ誘発性アレルギー性喘息を有するマウスにおける気管支収縮に対するブデソニド（Ｂｕｄ）及びその２１ホスファート（Ｂｕｄ－２１Ｐ）の比較効果の図である。
【図14B】ＯＶＡ誘発性アレルギー性喘息を有するマウスにおける気管支収縮に対するブデソニド（Ｂｕｄ）及びその２１ホスファート（Ｂｕｄ－２１Ｐ）の比較効果の図である。
【図14C】ＯＶＡ誘発性アレルギー性喘息を有するマウスにおける気管支収縮に対するブデソニド（Ｂｕｄ）及びその２１ホスファート（Ｂｕｄ－２１Ｐ）の比較効果の図である。化合物を４週間にわたって毎日投与した後（最初のＯＶＡチャレンジ後）、無拘束動物を、漸増濃度（パネルＡ及びＢ）の吸入メタコリンに曝露した後、エンハンスドポーズ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐａｕｓｅ）応答（Ｐｅｎｈ）を測定した。各データ点は、ｎ＝５～６動物／群の平均±ＳＥＭを表す。パネルＣ：基礎Ｐｅｎｈ測定（すなわち、メタコリン曝露なし）；パネルＥ：Ｐｅｎｈ対ＭＣｈ用量曲線下面積（ＡＵＣ）；パネルＤ：ピークＰｅｎｈ応答（Ｅｍａｘ）。データを、一元ＡＮＯＶＡ、続いて多重平均比較のためのフィッシャーのＬＳＤ検定によって分析した。＊Ｐ＜０．０５対Ｓｈａｍ；＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１及び＃＃＃Ｐ＜０．００１対未処置ＯＶＡ群。
【図15A】ＯＶＡ誘発性アレルギー性喘息を有するマウス由来のＢＡＬ液中のブデソニド（Ｂｕｄ）及びその２１ホスファート（Ｂｕｄ－２１Ｐ）の総白血球数及び白血球分画の比較効果の図である。
【図15B】ＯＶＡ誘発性アレルギー性喘息を有するマウス由来のＢＡＬ液中のブデソニド（Ｂｕｄ）及びその２１ホスファート（Ｂｕｄ－２１Ｐ）の総白血球数及び白血球分画の比較効果の図である。
【図15C】ＯＶＡ誘発性アレルギー性喘息を有するマウス由来のＢＡＬ液中のブデソニド（Ｂｕｄ）及びその２１ホスファート（Ｂｕｄ－２１Ｐ）の総白血球数及び白血球分画の比較効果の図である。４週間の間（最初のＯＶＡチャレンジ後）、化合物を毎日投与した後、未処置Ｓｈａｍ及びＯＶＡ誘発性アレルギー動物からＢＡＬ液を回収した。バーは、ｎ＝５～６動物／群の平均±ＳＥＭを表す。パネルＡ：総ＢＡＬ白血球；パネルＢ：ＢＡＬ好酸球；パネルＣ：ＢＡＬ好中球；パネルＤ：ＢＡＬリンパ球；パネルＥ：ＢＡＬマクロファージ。データを、一元ＡＮＯＶＡ、続いて多重平均比較のためのフィッシャーのＬＳＤ検定によって分析した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１及び＊＊＊ Ｐ＜０．００１対Ｓｈａｍ；＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１及び＃＃＃Ｐ＜０．００１対未処置ＯＶＡ群。
【図16】血漿溢出を、浮腫誘発剤のｉ．ｄ．注射３０分後にエバンスブルー法によって評価した図である。等モル投与量のコルチコステロイドで、浮腫誘発の６０分前に動物を前処置した（ｉ．ｐ．）。パネルＡは、各試験化合物２．３２μｍｏｌ／ｋｇ（１．０ｍｇ／ｋｇのＢｕｄ及び１．２ｍｇ／ｋｇのＢｕｄ２１－Ｐに相当）で処置した後に得られた結果を示す。パネルＢは、０．７０μｍｏｌ／ｋｇの各試験化合物（０．３０ｍｇ／ｋｇのＢｕｄ及び０．３６ｍｇ／ｋｇのＢｕｄ２１－Ｐに相当）で処置した後に得られた結果を示す。＊＊Ｐ＜０．０１及び＊＊＊Ｐ＜０．００１対タイロード；一元ＡＮＯＶＡ、引き続いてフィッシャー検定によって分析した場合、＃Ｐ＜０．０５及び＃＃Ｐ＜０．０１対ビヒクル処置群。
【発明を実施するための形態】
【0034】
本発明は、ブデソニド２１－ホスファートとβ２アドレナリン作動薬との塩に関する。
【0035】
本発明の好ましい実施形態では、β２アドレナリン作動薬は、短時間作用型β２作動薬、長時間作用型β２作動薬又は超長時間作用型β２作動薬から選択される。
【0036】
本発明の別の好ましい実施形態では、β２アドレナリン作動薬は、フェノテロール、オルシプレナリン、サルブタモール、テルブタリン、バンブテロール、クレンブテロール、ホルモテロール、サルメテロール、インダカテロール及びオロダテロールを含む群から選択される。
【0037】
より好ましくは、β２アドレナリン作動薬はホルモテロールである。
【0038】
ブデソニド２１－ホスファートホルモテロール塩（式ＩＶ）は、異なる作用機序によって作用する２つの薬物の同時存在に由来する相乗作用とより良好な溶解特性をコンジュゲートさせるために設計された、治療可能性を高めることができる薬学的に許容される塩を表す。
【化4】
【0039】
塩は、固体状態であり得、全ての結晶性、多形性及び偽型多形性塩を含む。
【0040】
本発明による実施形態では、結晶形態ＩＶのブデソニド２１－ホスファートホルモテロール塩は、ＣｕＫα線を使用することによって得られ、゜２θ角で表されるＸ線粉末回折パターンによって特性決定され、約５．８２、８．２１、１１．６７、１３．０２、１３．５４、１４．１７、１４．８７、１６．４０、１６．９２、１８．３９、１９．６９、２０．１５、２０．６５、２１．４１、２２．２８、２３．４１、２３．６９、２４．１６、２４．７７、２５．２７、２６．４１、２７．３８、２７．８４、２８．５８、３０．１５、３１．６９、３３．５８、３４．４１、３５．４７、３６．０２、３７．５９、３８．６３ ２シータ±０．２０度に特徴的なピークが存在する。
【0041】
本発明による実施形態では、結晶形態ＩＶのブデソニド２１－ホスファートホルモテロール塩は、以下のような作動条件を有する自動回折計によって得られるＸ線粉末回折パターンによって特性決定される。ＣｕＫα線、４゜～４０゜の範囲の゜２θ角、ステップ当たりの時間１２０秒当量。
【0042】
特徴的なピークを表１に列挙する。
【表1】
【0043】
本発明による別の実施形態では、結晶形態ＩＶのブデソニド２１－ホスファートホルモテロール塩は、図８に表されるＸ線粉末回折スペクトルによって特性決定される。
【0044】
実験セクションに示すように、ブデソニド２１－ホスファートホルモテロール塩（ＦＢ）を前臨床試験を実施して評価した。研究は、アレルギー性喘息の２つのモデルを使用して行われた。
【0045】
第１セットの実験によって得られたデータは、１ｍｇ／Ｋｇの用量のＦＢの腹腔内投与で処置した感作動物における気管支過敏性の有意な減少を実証した。
【0046】
したがって、ＦＢは、同じ用量で親化合物であるホルモテロール（Ｆ）又はブデソニド２１－ホスファート（Ｂ）と比較した場合、気道機能不全の維持において有意な有効性を示した。
【0047】
第２セットの実験によって得られたデータは、親化合物Ｆ及びＢの用量の１０分の１よりも低い用量で投与した場合の、アレルギーマウスにおいてＭＣｈによって誘導された気管支収縮に対するＦＢの効果を実証した。
【0048】
本発明の別の態様は、少なくとも１つの生理学的に許容される賦形剤と組み合わせたβ２アドレナリン作動薬と共にブデソニド２１－ホスファート塩を有効成分として含む医薬組成物に関する。
【0049】
好ましくは、当該組成物は、粉末、懸濁液又は溶液の形態であり、より好ましくは、当該組成物は、吸入又は経口経路によって投与される。
【0050】
組成物は、粘膜を介した吸入のために使用されてもよく、又はエアロゾル療法のための溶液からなる。吸入による投与の場合、本発明の化合物は、加圧パック中のエアロゾルスプレーの形態で、又はネブライザの使用によって送達され得る。更に、製剤はまた、吸入装置の吹送によって吸入される粉末として送達されてもよい。吸入のための好ましい送達システムは、吸入可能な医薬製剤に適した噴射剤中の成分の懸濁液又は溶液として製剤化された定量噴霧式吸入エアロゾルである。
【0051】
経口使用に適した医薬組成物は、錠剤、カプセル又はシロップの形態で投与することができる。
【0052】
本発明の別の態様は、医薬品として使用するための本発明によるブデソニド２１－ホスファート塩又はそれらの医薬組成物に関する。
【0053】
本発明の好ましい実施形態によれば、ブデソニド２１－ホスファート塩又はそれらの医薬組成物は、喘息、ＣＯＰＤ及び肺線維症等の呼吸器炎症性病態、閉塞性病態、アレルゲン誘発性気道機能不全の治療に有用である。
【0054】
有利には、本発明のブデソニド２１－ホスファート塩は、単一薬物よりも低い用量で投与された場合であっても、アレルゲン誘発性気道機能不全を有意に減少させる。
【0055】
特に、試験した最低ＦＢ用量がＢ又はＦ単独のものと同等又は更に優れた有意な有益な効果（呼吸機能並びに循環白血球の数及び肺への細胞動員の両方に関して）を示したことを考慮すると、本発明者等は、ＦＢとして投与した場合、喘息様特徴の制御において、ＦとＢとの間に正の相乗作用が生じることを示唆する。
【0056】
本発明の別の態様は、本発明によるブデソニド２１－ホスファート塩の調製プロセスであって、
ｉ）ブデソニド２１－ホスファートを有機溶媒に溶解又は懸濁させる工程と、
ｉｉ）撹拌下でβ２アドレナリン作動薬、好ましくはホルモテロールを添加する工程と、
ｉｉｉ）ブデソニド２１－ホスファートと、β２アドレナリン作動薬との塩、好ましくはブデソニド２１－ホスファートホルモテロール塩を単離する工程と、
を含む調製プロセスに関する。
ｉ）ブデソニド２１－ホスファートを有機溶媒に溶解又は懸濁させる工程と、
ｉｉ）撹拌下でβ２アドレナリン作動薬、好ましくはホルモテロールを添加する工程と、
ｉｉｉ）ブデソニド２１－ホスファートと、β２アドレナリン作動薬との塩、好ましくはブデソニド２１－ホスファートホルモテロール塩を単離する工程と、
を含む調製プロセスに関する。
【0057】
塩形成に有用な溶媒には、Ｃ１－Ｃ４脂肪族アルコール（メタノール、エタノール、イソプロパノール）、Ｃ２－Ｃ６脂肪族ケトン（アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソプロピルケトン、ジエチルケトン）、Ｃ４－Ｃ８脂肪族エーテル（ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジｔｅｒｔブチルエーテル）、Ｃ４－Ｃ６環状エーテル（テトラヒドロフラン、ジオキサン）、Ｃ３－Ｃ８脂肪族エステル（酢酸エチル）、Ｃ５－Ｃ８炭化水素（トルエン、キシレン、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン）、Ｃ１－Ｃ４塩素化炭化水素（ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン）、脂肪族Ｃ２－Ｃ４ニトリル（アセトニトリル）又はそれらの混合物が含まれる。
【0058】
塩形成のための好ましい溶媒は、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトニトリル、酢酸エチル又はそれらの混合物である。
【0059】
好ましくは、本発明によるプロセスにおいて、ブデソニド２１－ホスファートと有機溶媒との間のｍｍｏｌ／ｍＬ比は、１：２０～１：４０、好ましくは１：３０である。
【0060】
好ましくは、本発明によるプロセスにおいて、ブデソニド２１－ホスファートとβ２アドレナリン作動薬、好ましくはホルモテロールとのモル比は、１：１～１：１．５である。
【0061】
本発明のプロセスの好ましい実施形態によれば、単離工程ｉｉｉ）は、Ｃ５－Ｃ８脂肪族直鎖炭化水素、好ましくはヘキサン、Ｃ４－Ｃ８エーテル、好ましくはジエチルエーテル又はそれらの混合物から選択される逆溶剤を添加することによって実施される。
【0062】
好ましくは、有機溶媒と逆溶剤との体積比は、２：１～１：２、好ましくは１：１の体積比である。
【0063】
代替では、単離工程ｉｉｉ）は結晶化によって実施される。
【0064】
結晶化に有用な溶媒は、塩形成について上記で報告したものと同じであり、好ましくはｎ－ヘキサンである。
【0065】
本発明による実施形態では、本プロセスは、３０～８０℃、好ましくは４０～５０℃の範囲の温度での乾燥工程を更に含む。好ましくは、乾燥工程はオーブン内で行われる。
【0066】
本発明の別の態様は、抗炎症剤又は抗喘息剤として使用するための、少なくとも１つの生理学的に許容される賦形剤と組み合わせたブデソニド２１－ホスファート又はその医薬組成物に関する。
【0067】
有利には、本発明者等は、式ＩＩＩの化合物（以下、Ｂ又はＢｕｄ－２１Ｐとも呼ばれる）が、抗炎症特性及び抗喘息特性を示すブデソニドのより水溶性の誘導体であることを見出した。２１－ホスファートブデソニドは、試験した用量で、全身投与した場合に気管支過敏性を阻害し、血漿ＩｇＥレベルを低下させる。一方、鼻腔内投与された場合、肺において有意な抗炎症効果を示す。
【0068】
更に、２１－ホスファートブデソニドは、親ブデソニドよりも強力であり、ＯＶＡ誘発性アレルギー性喘息及び皮膚誘発浮腫を有するマウスにおいてそれらの有益な効果を発揮する。
【0069】
本発明の好ましい実施形態によれば、ブデソニド２１－ホスファート又はその医薬組成物は、喘息、ＣＯＰＤ及び肺線維症等の呼吸器炎症性病態、閉塞性病態、アレルゲン誘発性気道機能不全の治療に有用である。
【0070】
実験セクション
材料及び方法
ａ）化学的性質
１．材料及び方法
他の全ての市販製品は、Ｍｅｒｃｋ－Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。１Ｈ（５００ＭＨｚ）及び１３Ｃ（１２５ＭＨｚ）ＮＭＲスペクトルをＡｇｉｌｅｎｔ ＩＮＯＶＡ分光計で記録し、化学シフトは、残留溶媒シグナル（ＣＤ３ＯＤ：δＨ＝３．３１、δＣ＝４９．０）を基準とした。等核１Ｈ結合性をＣＯＳＹ実験によって決定した。８Ｈｚの２，３Ｊに対して最適化された勾配２Ｄ ＨＭＢＣ実験によって、２及び３結合１Ｈ－１３Ｃ結合度を決定した。Ｘ線粉末回折（ＸＲＰＤ）は、Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｘ’ｐｅｒｔ ＰＲＯ回折計を使用して行った。強度プロファイルは、４０ｋＶ及び３０ｍＡ、ステップサイズ０．０２゜、１２０秒／ステップの走査時間でＮｉフィルタＣｕＫα線（λ＝１．５４０６Å）を使用して４～４０゜の２θ範囲で回収した。回折パターンは、Ｈｉｇｈｓｃｏｒｅ Ｐｌｕｓスイートを使用して処理した。ＩＲスペクトルは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｎｉｃｏｌｅｔ５７００ＦＴ－ＩＲ分光計で記録した。
材料及び方法
ａ）化学的性質
１．材料及び方法
他の全ての市販製品は、Ｍｅｒｃｋ－Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。１Ｈ（５００ＭＨｚ）及び１３Ｃ（１２５ＭＨｚ）ＮＭＲスペクトルをＡｇｉｌｅｎｔ ＩＮＯＶＡ分光計で記録し、化学シフトは、残留溶媒シグナル（ＣＤ３ＯＤ：δＨ＝３．３１、δＣ＝４９．０）を基準とした。等核１Ｈ結合性をＣＯＳＹ実験によって決定した。８Ｈｚの２，３Ｊに対して最適化された勾配２Ｄ ＨＭＢＣ実験によって、２及び３結合１Ｈ－１３Ｃ結合度を決定した。Ｘ線粉末回折（ＸＲＰＤ）は、Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｘ’ｐｅｒｔ ＰＲＯ回折計を使用して行った。強度プロファイルは、４０ｋＶ及び３０ｍＡ、ステップサイズ０．０２゜、１２０秒／ステップの走査時間でＮｉフィルタＣｕＫα線（λ＝１．５４０６Å）を使用して４～４０゜の２θ範囲で回収した。回折パターンは、Ｈｉｇｈｓｃｏｒｅ Ｐｌｕｓスイートを使用して処理した。ＩＲスペクトルは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｎｉｃｏｌｅｔ５７００ＦＴ－ＩＲ分光計で記録した。
【0071】
２．ブデソニド２１－ホスファート（ＩＩＩ）の合成
－４０℃のブデソニド（１０ｇ、０．０２３ｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（３５ｍＬ）中撹拌溶液に、塩化ジホスホリル（８．０ｍＬ、０．０５８ｍｏｌ）を加え、得られた混合物を－４０℃で２０分間撹拌した。反応物を水でクエンチし、混合物を室温で１時間撹拌しながら約ｐＨ８になるまで飽和重炭酸ナトリウム溶液で処理した。溶液を酢酸エチルで抽出し、水相を１ＮのＨＣｌ溶液を用いて酸性にし、酢酸エチルで数回抽出した。合わせた有機相をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して、ブデソニド２１－ホスファート（１０．１ｇ、８６％）を得た。Ｍ．Ｐ．２１９－２２１℃ ＬＲＭＳ（ＥＳ）（Ｍ＋Ｈ）＋：ｃａｌｃｄ，５１０．５；ｆｏｕｎｄ，５１１．２．
１Ｈ ＮＭＲ（５００ ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ ７．４５（ｄ，Ｊ＝１０．１ Ｈｚ，１Ｈ），６．２５（ｄ，Ｊ＝１０．１ Ｈｚ，１Ｈ），６．０１（ｓ，１Ｈ），５．２１（ｔ，Ｊ＝４．９ Ｈｚ，０．５Ｈ），５．１４（ｄ，Ｊ＝７．２ Ｈｚ，０．５Ｈ），５．０１－４．８３（ｍ，２Ｈ），４．７７－４．５９（ｍ，２Ｈ），４．４７－４．３７（ｍ，１Ｈ），２．６５（ｔｄ，Ｊ＝１３．４，５．３ Ｈｚ，１Ｈ），２．３７（ｄ，Ｊ＝９．６ Ｈｚ，１Ｈ），２．２８－２．０７（ｍ，３Ｈ），２．０１－１．９２（ｍ，１Ｈ），１．８７－１．７９（ｍ，１．５Ｈ），１．７７－１．６７（ｍ，１．５Ｈ），１．６４－１．５６（ｍ，３Ｈ），１．５４－１．４５（ｍ，４Ｈ），１．０３－０．８８（ｍ，７Ｈ）．
１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ ２０６．１４，２０４．８８，１９０．１２，１７５．５１，１６０．９９，１３３．１６，１２９．１７，１２３．８７，１１０．７３，１０６．８８，１０１．１１，１００．２６，８５．５９，８４．３７，７１．７１，５８．４１，５５．４３，５２．５７，４８．３０，４７．１８，４２．５３，３９．４９，３７．３８，３６．７６，３５．６０，３４．２７，３３．６８，３２．９５，２２．８３，１９．６８，１９．３２，１９．２１，１８．９３，１５．６３，１５．５５．
－４０℃のブデソニド（１０ｇ、０．０２３ｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（３５ｍＬ）中撹拌溶液に、塩化ジホスホリル（８．０ｍＬ、０．０５８ｍｏｌ）を加え、得られた混合物を－４０℃で２０分間撹拌した。反応物を水でクエンチし、混合物を室温で１時間撹拌しながら約ｐＨ８になるまで飽和重炭酸ナトリウム溶液で処理した。溶液を酢酸エチルで抽出し、水相を１ＮのＨＣｌ溶液を用いて酸性にし、酢酸エチルで数回抽出した。合わせた有機相をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して、ブデソニド２１－ホスファート（１０．１ｇ、８６％）を得た。Ｍ．Ｐ．２１９－２２１℃ ＬＲＭＳ（ＥＳ）（Ｍ＋Ｈ）＋：ｃａｌｃｄ，５１０．５；ｆｏｕｎｄ，５１１．２．
１Ｈ ＮＭＲ（５００ ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ ７．４５（ｄ，Ｊ＝１０．１ Ｈｚ，１Ｈ），６．２５（ｄ，Ｊ＝１０．１ Ｈｚ，１Ｈ），６．０１（ｓ，１Ｈ），５．２１（ｔ，Ｊ＝４．９ Ｈｚ，０．５Ｈ），５．１４（ｄ，Ｊ＝７．２ Ｈｚ，０．５Ｈ），５．０１－４．８３（ｍ，２Ｈ），４．７７－４．５９（ｍ，２Ｈ），４．４７－４．３７（ｍ，１Ｈ），２．６５（ｔｄ，Ｊ＝１３．４，５．３ Ｈｚ，１Ｈ），２．３７（ｄ，Ｊ＝９．６ Ｈｚ，１Ｈ），２．２８－２．０７（ｍ，３Ｈ），２．０１－１．９２（ｍ，１Ｈ），１．８７－１．７９（ｍ，１．５Ｈ），１．７７－１．６７（ｍ，１．５Ｈ），１．６４－１．５６（ｍ，３Ｈ），１．５４－１．４５（ｍ，４Ｈ），１．０３－０．８８（ｍ，７Ｈ）．
１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ ２０６．１４，２０４．８８，１９０．１２，１７５．５１，１６０．９９，１３３．１６，１２９．１７，１２３．８７，１１０．７３，１０６．８８，１０１．１１，１００．２６，８５．５９，８４．３７，７１．７１，５８．４１，５５．４３，５２．５７，４８．３０，４７．１８，４２．５３，３９．４９，３７．３８，３６．７６，３５．６０，３４．２７，３３．６８，３２．９５，２２．８３，１９．６８，１９．３２，１９．２１，１８．９３，１５．６３，１５．５５．
【0072】
ブデソニド２１－ホスファート（式ＩＩＩ）の３１Ｐ ＮＭＲを図１に報告する。
【0073】
【0074】
３．ブデソニド２１－ホスファートホルモテロール塩（ＩＶ）の合成
３．１．例１
ブデソニド２１－ホスファート（１ｇ、２．０ｍｍｏｌ）を６０ｍＬの酢酸エチルに溶解した。ホルモテロール（０．６９ｇ、２．０ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を激しく撹拌した。１時間後、６０ｍＬのｎ－ヘキサンを添加し、混合物を更に１２時間撹拌した。このようにして形成された固体を濾別し、ｎ－ヘキサン（２ｘ１０ｍＬ）で洗浄し、オーブン（５０℃、１２時間）で乾燥させた。収率１．４４ｇ（８５％）。Ｍ．Ｐ．１７０．０±１７２．５℃．
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ－ｄ４）δ ８．３１（ｓ，１Ｈ），８．１０（ｓ，１Ｈ），７．４６（ｄ，１Ｈ），７．１７（ｄ，２Ｈ），７．０９（ｔ，１Ｈ），６．８９（ｄ，３Ｈ），６．２４（ｔ，１Ｈ），６．００（ｓ，１Ｈ），５．１９（ｔ，０．５Ｈ），５．１２（ｔ，０．５Ｈ），４．９７－４．８０（ｍ，３Ｈ），４．７３－４．６５（ｍ，２Ｈ），４．６０（ｍ，１Ｈ），４．４１－４．３９（ｍ，１Ｈ），３．７７（ｓ，３Ｈ），３．５７－３．４７（ｍ，１Ｈ），３．１８（ｄｄ，２Ｈ），２．６６（ｄｄｄ，１Ｈ），２．３７－２．３５（ｍ，１Ｈ），２．２０－２．０９（ｍ，３Ｈ），１．９３－１．８９（ｍ，１Ｈ），１．７０－１．６６（ｍ，２Ｈ），１．６３－１．５６（ｍ，４Ｈ），１．４８（ｓ，３Ｈ），１．２３（ｄ，３Ｈ），１．００－０．８７（ｍ，７Ｈ）．
１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ－ｄ４）δ ２０８．２１，２０６．８７，１９０．３７，１７５．４９，１６３．３１，１６１．６１，１６１．１６，１４９．８０，１３４．５４，１３２．６８，１３０．５５，１２９．１３，１２８．１４，１２５．０７，１２３．８３，１２１．５９，１１７．４２，１１６．５４，１１０．６４，１０６．７４，１０１．２１，１００．３２，９６．７２，８５．３１，８４．２０，７１．８０，７１．３１，５８．４６，５８．３０，５６．９６，５３．６６，５２．６０，４８．２３，４７．２２，４２．７９，４２．４４，４０．７４，３９．５４，３９．０５，３７．４２，３６．７８，３６．６３，３５．５９，３５．０８，３４．２９，３３．６９，３２．９８，２２．８４，１９．６７，１９．３０，１９．２０，１８．９３，１６．８３，１５．６７，１５．５５．
３．１．例１
ブデソニド２１－ホスファート（１ｇ、２．０ｍｍｏｌ）を６０ｍＬの酢酸エチルに溶解した。ホルモテロール（０．６９ｇ、２．０ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を激しく撹拌した。１時間後、６０ｍＬのｎ－ヘキサンを添加し、混合物を更に１２時間撹拌した。このようにして形成された固体を濾別し、ｎ－ヘキサン（２ｘ１０ｍＬ）で洗浄し、オーブン（５０℃、１２時間）で乾燥させた。収率１．４４ｇ（８５％）。Ｍ．Ｐ．１７０．０±１７２．５℃．
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ－ｄ４）δ ８．３１（ｓ，１Ｈ），８．１０（ｓ，１Ｈ），７．４６（ｄ，１Ｈ），７．１７（ｄ，２Ｈ），７．０９（ｔ，１Ｈ），６．８９（ｄ，３Ｈ），６．２４（ｔ，１Ｈ），６．００（ｓ，１Ｈ），５．１９（ｔ，０．５Ｈ），５．１２（ｔ，０．５Ｈ），４．９７－４．８０（ｍ，３Ｈ），４．７３－４．６５（ｍ，２Ｈ），４．６０（ｍ，１Ｈ），４．４１－４．３９（ｍ，１Ｈ），３．７７（ｓ，３Ｈ），３．５７－３．４７（ｍ，１Ｈ），３．１８（ｄｄ，２Ｈ），２．６６（ｄｄｄ，１Ｈ），２．３７－２．３５（ｍ，１Ｈ），２．２０－２．０９（ｍ，３Ｈ），１．９３－１．８９（ｍ，１Ｈ），１．７０－１．６６（ｍ，２Ｈ），１．６３－１．５６（ｍ，４Ｈ），１．４８（ｓ，３Ｈ），１．２３（ｄ，３Ｈ），１．００－０．８７（ｍ，７Ｈ）．
１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ－ｄ４）δ ２０８．２１，２０６．８７，１９０．３７，１７５．４９，１６３．３１，１６１．６１，１６１．１６，１４９．８０，１３４．５４，１３２．６８，１３０．５５，１２９．１３，１２８．１４，１２５．０７，１２３．８３，１２１．５９，１１７．４２，１１６．５４，１１０．６４，１０６．７４，１０１．２１，１００．３２，９６．７２，８５．３１，８４．２０，７１．８０，７１．３１，５８．４６，５８．３０，５６．９６，５３．６６，５２．６０，４８．２３，４７．２２，４２．７９，４２．４４，４０．７４，３９．５４，３９．０５，３７．４２，３６．７８，３６．６３，３５．５９，３５．０８，３４．２９，３３．６９，３２．９８，２２．８４，１９．６７，１９．３０，１９．２０，１８．９３，１６．８３，１５．６７，１５．５５．
【0075】
３．２．例２
ブデソニド２１－ホスファート（５００ｍｇ）及びホルモテロール（３５０ｍｇ）をアセトニトリル（３０ｍＬ）に懸濁した。激しく撹拌しながら沸点で４時間後、混合物を冷却し、沈殿物を濾過によって回収した。粉末をアセトニトリルで洗浄した。ジエチルエーテルからの再結晶化により、所望の化合物を得た。収率５８％。
ブデソニド２１－ホスファート（５００ｍｇ）及びホルモテロール（３５０ｍｇ）をアセトニトリル（３０ｍＬ）に懸濁した。激しく撹拌しながら沸点で４時間後、混合物を冷却し、沈殿物を濾過によって回収した。粉末をアセトニトリルで洗浄した。ジエチルエーテルからの再結晶化により、所望の化合物を得た。収率５８％。
【0076】
３．３．例３
ブデソニド２１－ホスファート（５００ｍｇ）をエタノール（５０ｍＬ）及び水（２５ｍＬ）に溶解した。ホルモテロール（３５０ｍｇ）を添加し、混合物を４時間激しく撹拌し続けた。次いで、溶媒を凍結乾燥によって除去し、得られた固体をｎ－ヘキサンから再結晶化させ、オーブン内で乾燥させた（５０℃、１２時間）。収率６５％。
ブデソニド２１－ホスファート（５００ｍｇ）をエタノール（５０ｍＬ）及び水（２５ｍＬ）に溶解した。ホルモテロール（３５０ｍｇ）を添加し、混合物を４時間激しく撹拌し続けた。次いで、溶媒を凍結乾燥によって除去し、得られた固体をｎ－ヘキサンから再結晶化させ、オーブン内で乾燥させた（５０℃、１２時間）。収率６５％。
【0077】
【0078】
更に、有機酸及び塩基で表される２成分間の特異的相互作用を検証するために、一次元及び二次元ＮＭＲ解析を行った。特に、ブデソニド２１－ホスファートホルモテロール塩の１Ｈ ＮＭＲスペクトルは、先に分析したブデソニド２１－ホスファート及びホルモテロールと比較した化学シフト値の差を示した。特に、化学シフト値の最も顕著な変動は、以下の図６に報告されるように、ホルモテロール二級アミンに近い化学領域の炭素原子に結合したプロトンに関連するものである。
【0079】
ブデソニド２１－ホスファートプロトンの化学シフト値には、より少ない変動が記録されている。しかし、この場合、δＰシフト（遊離酸中の０．９９ｐｐｍから塩中の１．７６ｐｐｍ）は非常に重要である。
【0080】
１３Ｃ ＮＭＲ分析により、１Ｈ ＮＭＲで得られた結果が確認され、親化合物及び塩を比較した場合の同じ化学領域における化学シフトの変動が強調された（図７）。
【0081】
３つの化合物ブデソニド２１－ホスファート（赤色）、ホルモテロール（青色）及びブデソニド２１－ホスファートホルモテロール塩（黒色）のＸＲＰＤ分析を図８に報告し、図９はブデソニド２１－ホスファートホルモテロール塩のＦＴ－ＩＲスペクトルを示す。
【0082】
ｂ）薬理学
１．動物
１．１．プロトコル－１
雌Ｂａｌｂ／ｃ（８週齢、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、Ｃａｌｃｏ、Ｉｔａｌｙ）を、制御された環境（温度２１±２℃及び湿度６０±１０％）でイタリアのＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎａｐｌｅｓの動物ケア施設に収容し、標準的なげっ歯類の餌及び水を提供した。全ての動物を実験前に４日間順応させ、１２時間明－１２時間暗スケジュールにさらした。実験は、明相の間に行った。実験手順は、国際及び国家の法律及び方針に従ってイタリアの省によって承認された（動物実験についてはＥＵ指令２０１０／６３／ＥＵ及びイタリアＤＬ２６／２０１４）。
１．動物
１．１．プロトコル－１
雌Ｂａｌｂ／ｃ（８週齢、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、Ｃａｌｃｏ、Ｉｔａｌｙ）を、制御された環境（温度２１±２℃及び湿度６０±１０％）でイタリアのＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎａｐｌｅｓの動物ケア施設に収容し、標準的なげっ歯類の餌及び水を提供した。全ての動物を実験前に４日間順応させ、１２時間明－１２時間暗スケジュールにさらした。実験は、明相の間に行った。実験手順は、国際及び国家の法律及び方針に従ってイタリアの省によって承認された（動物実験についてはＥＵ指令２０１０／６３／ＥＵ及びイタリアＤＬ２６／２０１４）。
【0083】
１．２．プロトコル－２及び３
雄Ｂａｌｂ／ｃ ＳＰＦマウス（２５±２ｇ、６週齢）をサンパウロ薬科大学（Ｆｅｄｅｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓａｏ Ｐａｕｌｏ，Ｂｒａｚｉｌ）の動物収容施設から購入した。それらを２２℃の温度制御された部屋に１２／１２時間の明暗サイクルでグループ収容し、食物及び水への自由なアクセスを可能にした。この研究は、Ｂｒａｚｉｌｉａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ（ＣＯＢＥＡ）によって確立された動物実験のための倫理的方針（Ｅｔｈｉｃａｌ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）と一致している。実験室内部の規則によれば、実験中に発生した試験薬剤に関連する重度の苦痛の場合、安楽死を行う。
雄Ｂａｌｂ／ｃ ＳＰＦマウス（２５±２ｇ、６週齢）をサンパウロ薬科大学（Ｆｅｄｅｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓａｏ Ｐａｕｌｏ，Ｂｒａｚｉｌ）の動物収容施設から購入した。それらを２２℃の温度制御された部屋に１２／１２時間の明暗サイクルでグループ収容し、食物及び水への自由なアクセスを可能にした。この研究は、Ｂｒａｚｉｌｉａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ（ＣＯＢＥＡ）によって確立された動物実験のための倫理的方針（Ｅｔｈｉｃａｌ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）と一致している。実験室内部の規則によれば、実験中に発生した試験薬剤に関連する重度の苦痛の場合、安楽死を行う。
【0084】
１．３．プロトコル－４
雄Ｃ５７Ｂｌ／６ ＳＰＦマウス（２５±２ｇ、６週齢）をサンパウロ薬科大学（Ｆｅｄｅｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓａｏ Ｐａｕｌｏ，Ｂｒａｚｉｌ）の動物収容施設から購入した。それらは、１２時間／１２時間の明暗サイクルで２２℃の温度制御された部屋にグループで収容され、食物及び水への自由なアクセスを有し、実験手順の開始前に１週間、本発明者等の現地施設に順応させた。この研究は、Ｂｒａｚｉｌｉａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ（ＣＯＢＥＡ）によって確立された動物実験のための倫理的方針（Ｅｔｈｉｃａｌ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）と一致している。実験室内部の規則によれば、実験中に発生した試験薬剤に関連する重度の苦痛の場合、安楽死を行う。
雄Ｃ５７Ｂｌ／６ ＳＰＦマウス（２５±２ｇ、６週齢）をサンパウロ薬科大学（Ｆｅｄｅｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓａｏ Ｐａｕｌｏ，Ｂｒａｚｉｌ）の動物収容施設から購入した。それらは、１２時間／１２時間の明暗サイクルで２２℃の温度制御された部屋にグループで収容され、食物及び水への自由なアクセスを有し、実験手順の開始前に１週間、本発明者等の現地施設に順応させた。この研究は、Ｂｒａｚｉｌｉａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ（ＣＯＢＥＡ）によって確立された動物実験のための倫理的方針（Ｅｔｈｉｃａｌ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）と一致している。実験室内部の規則によれば、実験中に発生した試験薬剤に関連する重度の苦痛の場合、安楽死を行う。
【0085】
２．試験物質及び試薬
試験化合物ブデソニド２１－ホスファートホルモテロール塩（ＦＢ）並びに対照化合物ブデソニド２１－ホスファート（Ｂ）及びホルモテロール（Ｆ）を１ｍｇ／Ｋｇの用量で各ＯＶＡチャレンジの３０分前に腹腔内投与した。別の一連の実験では、ＦＢ（それぞれ０．３、１．０及び３．０ｎｍｏｌ／動物に相当する０．２６、０．８５及び２．５６μｇ／動物の用量で）、Ｂ及びＦ（１．５３及び１．０３μｇ／動物のそれぞれの用量で、両方とも３ｎｍｏｌ／動物に相当する）を鼻腔内投与した。化合物を、動物当たりの決定された用量が１００μｌの溶液（１：１０ＤＭＳＯ）の腹腔内投与及び１０μｌ／動物（５μｌ／鼻孔）の溶液の鼻腔内（ｉ．ｎ．）投与から生じる濃度でＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に溶解した。
試験化合物ブデソニド２１－ホスファートホルモテロール塩（ＦＢ）並びに対照化合物ブデソニド２１－ホスファート（Ｂ）及びホルモテロール（Ｆ）を１ｍｇ／Ｋｇの用量で各ＯＶＡチャレンジの３０分前に腹腔内投与した。別の一連の実験では、ＦＢ（それぞれ０．３、１．０及び３．０ｎｍｏｌ／動物に相当する０．２６、０．８５及び２．５６μｇ／動物の用量で）、Ｂ及びＦ（１．５３及び１．０３μｇ／動物のそれぞれの用量で、両方とも３ｎｍｏｌ／動物に相当する）を鼻腔内投与した。化合物を、動物当たりの決定された用量が１００μｌの溶液（１：１０ＤＭＳＯ）の腹腔内投与及び１０μｌ／動物（５μｌ／鼻孔）の溶液の鼻腔内（ｉ．ｎ．）投与から生じる濃度でＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に溶解した。
【0086】
プロトコル３では、試験化合物ブデソニド（Ｂｕｄ；ＭＷ：４３０，５３ｇ／ｍｏｌ）及びブデソニド２１－ホスファート遊離酸（Ｂｕｄ－２１ Ｐ；ＭＷ：５１０，５１ｇ／ｍｏｌ）を、それぞれ１．３、４．３及び１２．９μｇ／動物／日のＢｕｄ、１．５、５．１及び１５．３μｇ／動物／日のＢｕｄ－２１ Ｐに相当する３、１０及び３０ｎｍｏｌ／動物／日の等モル用量で投与した。化合物を、１０％滅菌生理食塩水＋９０％ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に、動物当たりの上記用量が鼻腔内（ｉ．ｎ．）各溶液１０μｌ／動物（５μｌ／鼻孔）の投与から生じる濃度で溶解した。
【0087】
ニワトリ卵アルブミン（ＯＶＡ；ｇｒａｄｅ Ｖ，ｃａｔ．Ａ５５０３，Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液（２５０μｇ／ｍｌ）に溶解し、Ａｌ（ＯＨ）３を添加した（１３ｍｇ／ｍｌ）。この混合物を使用して、皮下注射によって動物のアレルギー感作を誘導した。ＯＶＡを滅菌ＰＢＳ溶液に１％で溶解し、この溶液を噴霧した（免疫学的チャレンジとして）。
【0088】
プロトコル４では、Ｂｕｄ（１．０及び０．３０ｍｇ／ｋｇの用量）及びＢｕｄ２１－Ｐ（１．２及び０．３６ｍｇ／ｋｇの用量）をモルベースで投与し、これらの用量はそれぞれ各化合物０．７０及び２．３２μｍｏｌ／ｋｇに相当した。化合物を溶解するためのビヒクルは、１２．５％ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含有する滅菌生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）であった。化合物溶液は、体重１ｋｇ当たりの投与量が各溶液１０ｍｌ／ｋｇの腹腔内（ｉ．ｐ．）投与から生じるような濃度で調製した。酢酸ブラジキニン（ＢＫ；ｃａｔ．Ｂ３２５９，Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）及び化合物４８／８０（Ｃ４８／８０；ｃａｔ．Ｃ２３１３，Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を、それぞれ６０μＭ及び２００μｇ／ｍｌの濃度で滅菌タイロード溶液に溶解した（このようにして、５０μｌの各薬剤のｉ．ｄ．注射は、それぞれ注射部位当たり３ｎｍｏｌ及び１０μｇの用量をもたらした）。
【0089】
３．実験群Ｉ
以下の表は、評価のための群を示す。
以下の表は、評価のための群を示す。
【表2】
【0090】
３．１喘息のマウスモデル
雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（８週間；Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）を、０日目及び８日目に卵アルブミン（４００μｌのＡｌ（ＯＨ）３ １３．５ｍｇ／ｍｌに溶解したＯＶＡ１００μｇ）の皮下投与によって感作させ、２１日目にマウスをＯＶＡのエアロゾル投与（３％を２０分間）によって刺激した。マウスを４８時間後に屠殺し、気管支をカルバコール及びサルブタモールでの気管支反応性の評価に使用した。アレルゲンへの各曝露の前に、薬物を腹腔内投与した。全ての化合物を１ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。ＩｇＥの血漿レベルを感作の指標として測定した。
雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（８週間；Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）を、０日目及び８日目に卵アルブミン（４００μｌのＡｌ（ＯＨ）３ １３．５ｍｇ／ｍｌに溶解したＯＶＡ１００μｇ）の皮下投与によって感作させ、２１日目にマウスをＯＶＡのエアロゾル投与（３％を２０分間）によって刺激した。マウスを４８時間後に屠殺し、気管支をカルバコール及びサルブタモールでの気管支反応性の評価に使用した。アレルゲンへの各曝露の前に、薬物を腹腔内投与した。全ての化合物を１ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。ＩｇＥの血漿レベルを感作の指標として測定した。
【0091】
３．２気管支過敏性
主気管支を迅速に切開し、脂肪及び結合組織から除去した。長さ１～２ｍｍのリングを切断し、３７℃、酸素化（９５％Ｏ２及び５％ＣＯ２）のクレブス溶液を含有する２．５ｍｌ臓器浴に取り付け、Ｐｏｗｅｒｌａｂ ８００（ＡＤ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に関連する等尺力変換器（ｔｙｐｅ ７００６，Ｕｇｏ Ｂａｓｉｌｅ，Ｃｏｍｅｒｉｏ，Ｉｔａｌｙ）に接続した。リングを最初に０．５ｇの静止張力まで伸ばし、少なくとも３０分間平衡化させた。各実験では、再現性のある応答曲線が得られるまで、気管支リングにアセチルコリン（１０－６Ｍ）を事前にチャレンジした。続いて、組織洗浄後、カルバコール（１０－９－３ｘ１０－６Ｍ）に対する累積濃度応答曲線を行った。カルバコールで予め収縮させたリングについて、サルブタモールに対する濃度曲線を行った。結果を組織１ｍｇ当たりのダインとして表した。
主気管支を迅速に切開し、脂肪及び結合組織から除去した。長さ１～２ｍｍのリングを切断し、３７℃、酸素化（９５％Ｏ２及び５％ＣＯ２）のクレブス溶液を含有する２．５ｍｌ臓器浴に取り付け、Ｐｏｗｅｒｌａｂ ８００（ＡＤ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に関連する等尺力変換器（ｔｙｐｅ ７００６，Ｕｇｏ Ｂａｓｉｌｅ，Ｃｏｍｅｒｉｏ，Ｉｔａｌｙ）に接続した。リングを最初に０．５ｇの静止張力まで伸ばし、少なくとも３０分間平衡化させた。各実験では、再現性のある応答曲線が得られるまで、気管支リングにアセチルコリン（１０－６Ｍ）を事前にチャレンジした。続いて、組織洗浄後、カルバコール（１０－９－３ｘ１０－６Ｍ）に対する累積濃度応答曲線を行った。カルバコールで予め収縮させたリングについて、サルブタモールに対する濃度曲線を行った。結果を組織１ｍｇ当たりのダインとして表した。
【0092】
３．３血漿ＩｇＥレベル
抗凝固剤としてシトラートを用いて心臓内穿刺により血液を採取した。次いで、８００ｘｇ、４℃で１０分間の遠心分離によって血漿を得、直ちに－８０℃で凍結した。一致した抗体対（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用してＥＬＩＳＡによって総ＩｇＥレベルを測定した。
抗凝固剤としてシトラートを用いて心臓内穿刺により血液を採取した。次いで、８００ｘｇ、４℃で１０分間の遠心分離によって血漿を得、直ちに－８０℃で凍結した。一致した抗体対（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用してＥＬＩＳＡによって総ＩｇＥレベルを測定した。
【0093】
４．実験群ＩＩ
以下の表は、評価のための群を示す。
以下の表は、評価のための群を示す。
【表3】
【0094】
実験群ＩＩＩ
以下の表は、評価のための群を示す。
以下の表は、評価のための群を示す。
【表4】
【0095】
４．１気道過敏の誘導及び処置
マウスを、０．４ｍｌのＯＶＡ／Ａｌ（ＯＨ）３の２回の皮下注射で７日間の間隔を置いて感作させた（Ｓｈａｍ動物は、ＯＶＡを含まないＰＢＳ中のＡｌ（ＯＨ）３懸濁液を受けた）。２回目の感作の７日後（すなわち、３週目）、動物を１％ＯＶＡ溶液で週に２回（Ｓｈａｍ及び未処置ＯＶＡ群をＰＢＳで噴霧した）、次の２週間に２０分間噴霧した。チャレンジの６０分前（ＯＶＡ噴霧）及び次の４週間にわたって毎日、マウスをそれぞれの化合物／ビヒクルで鼻腔内処置した（５μｌ／鼻孔として１０μｌ／動物）。
マウスを、０．４ｍｌのＯＶＡ／Ａｌ（ＯＨ）３の２回の皮下注射で７日間の間隔を置いて感作させた（Ｓｈａｍ動物は、ＯＶＡを含まないＰＢＳ中のＡｌ（ＯＨ）３懸濁液を受けた）。２回目の感作の７日後（すなわち、３週目）、動物を１％ＯＶＡ溶液で週に２回（Ｓｈａｍ及び未処置ＯＶＡ群をＰＢＳで噴霧した）、次の２週間に２０分間噴霧した。チャレンジの６０分前（ＯＶＡ噴霧）及び次の４週間にわたって毎日、マウスをそれぞれの化合物／ビヒクルで鼻腔内処置した（５μｌ／鼻孔として１０μｌ／動物）。
【0096】
４．２肺の過剰反応性／Ｐｅｎｈ機能
意識下で自発的に呼吸している動物における気道反応性を、先に記載されたように［９］、全身プレチスモグラフィによる最後のＯＶＡ／ＰＢＳチャレンジの２４時間後の第４週（すなわち、２週間のＯＶＡチャレンジ＋処置後）の終わりに測定した（Ｂｕｘｃｏ Ｅｕｒｏｐｅ Ｌｔｄ，Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ）。実験は、処置の性質を知らない調査員によって静かな部屋で行われた。エアロゾル化生理食塩水（６０秒間に５０μｌ／マウス）、次いで、増加する濃度（ＰＢＳ中３．１２、６．２５、１２．５及び２５．０ｍｇ／ｍｌ）のムスカリン作動薬メタコリン（ＭＣｈ）を主チャンバの入口からそれぞれ３分間噴霧して、気管支収縮を誘発し、読取り値を取得し、各噴霧後６分間を平均化した。２０分後、ベースライン値は通常、この期間の終わりに戻った。気管支収縮及びその結果としての気道抵抗の増加の指標としてエンハンスドポーズ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐａｕｓｅ）（Ｐｅｎｈ）を測定した。Ｐｅｎｈ＝［（呼息時間／弛緩時間）－１］／（最大呼息流量／最大吸気流量）
意識下で自発的に呼吸している動物における気道反応性を、先に記載されたように［９］、全身プレチスモグラフィによる最後のＯＶＡ／ＰＢＳチャレンジの２４時間後の第４週（すなわち、２週間のＯＶＡチャレンジ＋処置後）の終わりに測定した（Ｂｕｘｃｏ Ｅｕｒｏｐｅ Ｌｔｄ，Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ）。実験は、処置の性質を知らない調査員によって静かな部屋で行われた。エアロゾル化生理食塩水（６０秒間に５０μｌ／マウス）、次いで、増加する濃度（ＰＢＳ中３．１２、６．２５、１２．５及び２５．０ｍｇ／ｍｌ）のムスカリン作動薬メタコリン（ＭＣｈ）を主チャンバの入口からそれぞれ３分間噴霧して、気管支収縮を誘発し、読取り値を取得し、各噴霧後６分間を平均化した。２０分後、ベースライン値は通常、この期間の終わりに戻った。気管支収縮及びその結果としての気道抵抗の増加の指標としてエンハンスドポーズ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐａｕｓｅ）（Ｐｅｎｈ）を測定した。Ｐｅｎｈ＝［（呼息時間／弛緩時間）－１］／（最大呼息流量／最大吸気流量）
【0097】
４．３ＢＡＬ液及び血液試料の回収
Ｐｅｎｈ評価後、マウスを吸入イソフルオラン（Ｏ２中５％ｖ／ｖ）で麻酔し、下行腹部大動脈から血液試料を回収した。次いで、マウスを放血によって安楽死させ（血液試料を白血球細胞計数のために各動物から採取した）、シリンジに接続したポリエチレンチューブ（外径１ｍｍ）で気管を露出させ、カニューレを挿入することによって気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を行った。ヘパリン含有ＰＢＳ溶液３００μＬ（２０ＵＩ／ｍＬ）をフラッシングすることによって肺を洗浄した。回収したＢＡＬ洗浄の一定分量を得、同じ手順を更に４回繰り返した。試料を遠心分離（１０００ｇで１０分間）に供し、細胞ペレットを２００μＬのＰＢＳ溶液に再懸濁した。Ｎｅｕｂａｕｅｒチャンバを使用して総細胞数を決定し、メイ－グリュンバルド色素で染色したサイトスピン（Ｆａｎｅｍ Ｍｏｄ ２４００；Ｓａｏ Ｐａｕｌｏ，Ｂｒａｚｉｌ）調製物で分画計数を行った。白血球を正常な形態学的基準に基づいて分類した。
Ｐｅｎｈ評価後、マウスを吸入イソフルオラン（Ｏ２中５％ｖ／ｖ）で麻酔し、下行腹部大動脈から血液試料を回収した。次いで、マウスを放血によって安楽死させ（血液試料を白血球細胞計数のために各動物から採取した）、シリンジに接続したポリエチレンチューブ（外径１ｍｍ）で気管を露出させ、カニューレを挿入することによって気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を行った。ヘパリン含有ＰＢＳ溶液３００μＬ（２０ＵＩ／ｍＬ）をフラッシングすることによって肺を洗浄した。回収したＢＡＬ洗浄の一定分量を得、同じ手順を更に４回繰り返した。試料を遠心分離（１０００ｇで１０分間）に供し、細胞ペレットを２００μＬのＰＢＳ溶液に再懸濁した。Ｎｅｕｂａｕｅｒチャンバを使用して総細胞数を決定し、メイ－グリュンバルド色素で染色したサイトスピン（Ｆａｎｅｍ Ｍｏｄ ２４００；Ｓａｏ Ｐａｕｌｏ，Ｂｒａｚｉｌ）調製物で分画計数を行った。白血球を正常な形態学的基準に基づいて分類した。
【0098】
５．実験群ＩＶ
以下の表は、評価のための実験群を示す。
以下の表は、評価のための実験群を示す。
【表5】
【表6】
【0099】
５．１皮膚浮腫の誘導及び処置
皮膚浮腫を、Ｃｏｓｔａ ｅｔ ａｌ．（２００６）［１０］及びＹｓｈｉｉ ｅｔ ａｌ．（２００９）［１１］によって以前に記載された方法に従ってマウスにおいて評価した。マウスをウレタン（２５％ｗ／ｖ、１０ｍｌ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）で麻酔し、背部皮膚を剃毛し、その後、ビヒクル／試験化合物でｉ．ｐ．処置した。５５分後、一定量の１００μＬのエバンスブルー色素溶液（滅菌生理食塩水中０．２５％）を、尾静脈を介して静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。５分後、ＢＫ及びＣ４８／８０を無作為化スキームを使用して５０μｌの固定体積で背部皮膚に皮内（ｉ．ｄ．）注射した。同じ体積のタイロード溶液５０μｌを対照として注射した。３０分後、心臓穿刺によって１ｍｌの血液試料を得、ウレタン過剰投与とそれに続く頸椎脱臼によってマウスを屠殺した。血液試料を６，０００ｇで４分間遠心分離して血漿を得た。背側の皮膚を除去し、直径８ｍｍのコルクボーラを用いて注射部位を打ち抜いた。注射部位から離れた非注射皮膚部位も打ち抜き、ブランクとした。ホルムアミドを用いて皮膚及び血漿（１００μｌ）試料のそれぞれから色素を抽出し、得られた溶液の吸光度を６２０ｎｍで測定した。各薬剤による血漿溢出（μｌ／部位で表される）を、ブランク値によって補正された各それぞれの皮膚片の吸光度と希釈係数によって適切に調整された血漿試料溶液との比として計算した［１０］。異なる動物群の変動性（群間変動）に起因してデータを均質化するために、浮腫データを、各実験の平均タイロード（対照）応答に対する倍数変化応答として表す。
皮膚浮腫を、Ｃｏｓｔａ ｅｔ ａｌ．（２００６）［１０］及びＹｓｈｉｉ ｅｔ ａｌ．（２００９）［１１］によって以前に記載された方法に従ってマウスにおいて評価した。マウスをウレタン（２５％ｗ／ｖ、１０ｍｌ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）で麻酔し、背部皮膚を剃毛し、その後、ビヒクル／試験化合物でｉ．ｐ．処置した。５５分後、一定量の１００μＬのエバンスブルー色素溶液（滅菌生理食塩水中０．２５％）を、尾静脈を介して静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。５分後、ＢＫ及びＣ４８／８０を無作為化スキームを使用して５０μｌの固定体積で背部皮膚に皮内（ｉ．ｄ．）注射した。同じ体積のタイロード溶液５０μｌを対照として注射した。３０分後、心臓穿刺によって１ｍｌの血液試料を得、ウレタン過剰投与とそれに続く頸椎脱臼によってマウスを屠殺した。血液試料を６，０００ｇで４分間遠心分離して血漿を得た。背側の皮膚を除去し、直径８ｍｍのコルクボーラを用いて注射部位を打ち抜いた。注射部位から離れた非注射皮膚部位も打ち抜き、ブランクとした。ホルムアミドを用いて皮膚及び血漿（１００μｌ）試料のそれぞれから色素を抽出し、得られた溶液の吸光度を６２０ｎｍで測定した。各薬剤による血漿溢出（μｌ／部位で表される）を、ブランク値によって補正された各それぞれの皮膚片の吸光度と希釈係数によって適切に調整された血漿試料溶液との比として計算した［１０］。異なる動物群の変動性（群間変動）に起因してデータを均質化するために、浮腫データを、各実験の平均タイロード（対照）応答に対する倍数変化応答として表す。
【0100】
６．統計解析
データを、ｎ匹の個々の動物からの算術平均±ＳＥＭとして表す。ソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ５．０１を用いて、データの統計分析を行った。結果は、一元ＡＮＯＶＡを使用して分析し、続いてＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を使用して分析し、Ｐ＜０．０５の値を有する群平均間の差を有意と見なした。
データを、ｎ匹の個々の動物からの算術平均±ＳＥＭとして表す。ソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ５．０１を用いて、データの統計分析を行った。結果は、一元ＡＮＯＶＡを使用して分析し、続いてＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を使用して分析し、Ｐ＜０．０５の値を有する群平均間の差を有意と見なした。
【0101】
結果
１．実験群Ｉ
ビヒクル群と比較した場合、カルバコールに対する単離気管支の応答の増加によって評価されるように、ＯＶＡ誘発性感作は、気管支反応性を有意に増加させた。Ｆ又はＦＢのいずれかの腹腔内投与で処置したアレルギー動物では、気管支過敏性の有意な減少が観察された（図１０Ａ）。逆に、１ｍｇ／Ｋｇの用量のＢは、カルバコールの応答増加に有意に影響しなかった（図１０Ａ）。ＯＶＡ噴霧はまた、サルブタモールに対する気管支弛緩の有意な減少を誘導する。Ｆ又はＢによる前処置は、サルブタモールに対する気管支反応の欠如を改善しなかったが、ＦＢは気管支弛緩を有意に増加させた（図１０Ｂ）。血液を心臓内穿刺によって回収し、血漿ＩｇＥレベルを測定した。パネルＣで明らかなように、Ｂ及びＦＢによる両方の処置は、ＯＶＡ誘発性のＩｇＥ血漿レベルの増加を有意に減少させた。
１．実験群Ｉ
ビヒクル群と比較した場合、カルバコールに対する単離気管支の応答の増加によって評価されるように、ＯＶＡ誘発性感作は、気管支反応性を有意に増加させた。Ｆ又はＦＢのいずれかの腹腔内投与で処置したアレルギー動物では、気管支過敏性の有意な減少が観察された（図１０Ａ）。逆に、１ｍｇ／Ｋｇの用量のＢは、カルバコールの応答増加に有意に影響しなかった（図１０Ａ）。ＯＶＡ噴霧はまた、サルブタモールに対する気管支弛緩の有意な減少を誘導する。Ｆ又はＢによる前処置は、サルブタモールに対する気管支反応の欠如を改善しなかったが、ＦＢは気管支弛緩を有意に増加させた（図１０Ｂ）。血液を心臓内穿刺によって回収し、血漿ＩｇＥレベルを測定した。パネルＣで明らかなように、Ｂ及びＦＢによる両方の処置は、ＯＶＡ誘発性のＩｇＥ血漿レベルの増加を有意に減少させた。
【0102】
２．実験群ＩＩ
２．１肺の過敏反応性／Ｐｅｎｈ機能
ＯＶＡ誘発性アレルギーは、基礎条件下でのＰｅｎｈ測定によって評価されるように、気道反応性を有意に増加させた（ＰＢＳ溶液の吸入；図１１Ｂ、パネルＢ）。いずれの処置も基礎応答の低下をもたらさなかった。吸入されるメタコリン（ＭＣｈ）の濃度の増加は、Ｐｅｎｈ機能の用量依存的増加をもたらした。ＯＶＡ誘発性アレルギー状態では、ｉ）最大応答の増加（Ｅｍａｘ；図１１Ａ、パネルＣ）、ｉｉ）Ｐｅｎｈメタコリン濃度曲線下面積（ＡＵＣ；図１１Ｂ、パネルＤ）によって証明されるように、この気道反応性は有意に増大した（図１１Ａ、パネルＡ）。試験した全ての用量でＦ又はＦＢのいずれかで処置したアレルギー動物において、最大応答Ｅｍａｘの有意な減少が観察された（図１１Ａ、パネルＣ）。試験した全ての用量のＦＢ化合物のみが、試験した全てのＭＣｈ用量でＰｅｎｈを有意に減少させた（図１１Ｂ、パネルＤ）（すなわち、ＭＣｈチャレンジ予防プロトコルの前に）。
２．１肺の過敏反応性／Ｐｅｎｈ機能
ＯＶＡ誘発性アレルギーは、基礎条件下でのＰｅｎｈ測定によって評価されるように、気道反応性を有意に増加させた（ＰＢＳ溶液の吸入；図１１Ｂ、パネルＢ）。いずれの処置も基礎応答の低下をもたらさなかった。吸入されるメタコリン（ＭＣｈ）の濃度の増加は、Ｐｅｎｈ機能の用量依存的増加をもたらした。ＯＶＡ誘発性アレルギー状態では、ｉ）最大応答の増加（Ｅｍａｘ；図１１Ａ、パネルＣ）、ｉｉ）Ｐｅｎｈメタコリン濃度曲線下面積（ＡＵＣ；図１１Ｂ、パネルＤ）によって証明されるように、この気道反応性は有意に増大した（図１１Ａ、パネルＡ）。試験した全ての用量でＦ又はＦＢのいずれかで処置したアレルギー動物において、最大応答Ｅｍａｘの有意な減少が観察された（図１１Ａ、パネルＣ）。試験した全ての用量のＦＢ化合物のみが、試験した全てのＭＣｈ用量でＰｅｎｈを有意に減少させた（図１１Ｂ、パネルＤ）（すなわち、ＭＣｈチャレンジ予防プロトコルの前に）。
【0103】
２．２ＢＡＬ液細胞数
図１２Ａ、１２Ｂ及び１２Ｃは、ＯＶＡ誘発性アレルギーが、回収されたＢＡＬ液中の総白血球数を有意に増加させたことを示す（パネルＡ）。この応答は、ＦＢ（０．３及び３ｎｍｏｌ／動物用量）又はＢ（３ｎｍｏｌ／動物）を投与された動物において有意に減少した。パネルＢは、全ての処置がＢＡＬ試料中の好酸球の数を減少させたことを示す。ＦＢ又はＢ（３ｎｍｏｌ／動物）のいずれかによる処置は、ＢＡＬマクロファージのＯＶＡ誘発性増加を無効にした（パネルＤ）。一方、実験群間で好中球及びリンパ球の両方に関して統計学的に有意な差はなかった（パネルＣ及びＥのそれぞれ）。
図１２Ａ、１２Ｂ及び１２Ｃは、ＯＶＡ誘発性アレルギーが、回収されたＢＡＬ液中の総白血球数を有意に増加させたことを示す（パネルＡ）。この応答は、ＦＢ（０．３及び３ｎｍｏｌ／動物用量）又はＢ（３ｎｍｏｌ／動物）を投与された動物において有意に減少した。パネルＢは、全ての処置がＢＡＬ試料中の好酸球の数を減少させたことを示す。ＦＢ又はＢ（３ｎｍｏｌ／動物）のいずれかによる処置は、ＢＡＬマクロファージのＯＶＡ誘発性増加を無効にした（パネルＤ）。一方、実験群間で好中球及びリンパ球の両方に関して統計学的に有意な差はなかった（パネルＣ及びＥのそれぞれ）。
【0104】
２．３循環白血球細胞数
図１３Ａ、１３Ｂ及び１３Ｃは、ＯＶＡ誘発性アレルギーが、採取した血液試料中の総白血球数を有意に増加させたことを示す（パネルＡ）。この応答は、ＦＢを投与した動物（３ｎｍｏｌ／動物用量）でのみ有意に低下したが、他の処置では低下しなかった。同様に、リンパ球に関して、３ｎｍｏｌ／日のＦＢで処置した動物のみが、未処置のアレルギー動物よりも少ない循環細胞数を示した（パネルＤ）。図１３Ｂは、全ての処置が循環好酸球の数を減少させたことを示す。Ｂ又はＦＢ（全ての試験用量）のいずれかでの処置はマクロファージの数を有意に減少させたが、ＦＢ（全ての試験用量）のみがこれらの細胞の数を対照動物で観察された値よりも低い値に減少させた（パネルＤ）。一方、実験群間で循環好中球に関して統計学的に有意な差はなかった（パネルＣ）。
図１３Ａ、１３Ｂ及び１３Ｃは、ＯＶＡ誘発性アレルギーが、採取した血液試料中の総白血球数を有意に増加させたことを示す（パネルＡ）。この応答は、ＦＢを投与した動物（３ｎｍｏｌ／動物用量）でのみ有意に低下したが、他の処置では低下しなかった。同様に、リンパ球に関して、３ｎｍｏｌ／日のＦＢで処置した動物のみが、未処置のアレルギー動物よりも少ない循環細胞数を示した（パネルＤ）。図１３Ｂは、全ての処置が循環好酸球の数を減少させたことを示す。Ｂ又はＦＢ（全ての試験用量）のいずれかでの処置はマクロファージの数を有意に減少させたが、ＦＢ（全ての試験用量）のみがこれらの細胞の数を対照動物で観察された値よりも低い値に減少させた（パネルＤ）。一方、実験群間で循環好中球に関して統計学的に有意な差はなかった（パネルＣ）。
【0105】
３．実験群ＩＩＩ
３．１肺の過敏反応性／Ｐｅｎｈ機能
ＯＶＡ誘発性アレルギーは、Ｐｅｎｈメタコリン濃度曲線下面積の増加（ＡＵＣ；パネルＥ）及び最大応答（Ｅｍａｘ；パネルＤ）によって証明されるように、漸増濃度の吸入メタコリンへの曝露後（図１４Ａ、図１４Ｂ及び図１４Ｃ、パネルＡ及びＢに示すプロファイル）のＰｅｎｈ測定によって評価されるように、気道応答性を有意に増加させた。基礎Ｐｅｎｈ（すなわち、メタコリン曝露なしの場合）は群間で有意差はなかった。
３．１肺の過敏反応性／Ｐｅｎｈ機能
ＯＶＡ誘発性アレルギーは、Ｐｅｎｈメタコリン濃度曲線下面積の増加（ＡＵＣ；パネルＥ）及び最大応答（Ｅｍａｘ；パネルＤ）によって証明されるように、漸増濃度の吸入メタコリンへの曝露後（図１４Ａ、図１４Ｂ及び図１４Ｃ、パネルＡ及びＢに示すプロファイル）のＰｅｎｈ測定によって評価されるように、気道応答性を有意に増加させた。基礎Ｐｅｎｈ（すなわち、メタコリン曝露なしの場合）は群間で有意差はなかった。
【0106】
両方のＰｅｎｈパラメータ（ＡＵＣ及びＥｍａｘ）は、試験した全ての用量（３、１０及び３０ｎｍｏｌ／動物／日）でブデソニド２１－ホスファート（Ｂｕｄ－２１Ｐ）によって有意に減少したが、親化合物Ｂｕｄによる処置は、ちょうど最高用量（３０ｎｍｏｌ／動物／日）でこの応答の有意な減少をもたらした。
【0107】
３．２ＢＡＬ液細胞数
図１５Ａ、図１５Ｂ及び図１５Ｃは、Ｓｈａｍ群と比較して、アレルギー性喘息を有する動物が気管支肺胞空間に動員された総白血球数がより多く、全ての処置がこれらの数の有意な減少をもたらしたが、３ｎｍｏｌ／動物／日の用量でＢｕｄで処置した動物で観察された応答は、Ｓｈａｍマウスで観察された応答よりも依然として有意に高かったことを示す（パネルＡ）。肺へのより顕著な好酸球移動がアレルギー未処置動物で観察され、全ての処置（３ｎｍｏｌ／動物／日のＢｕｄを除く）が有意にこの細胞動員を減少させた（パネルＢ）。気管支肺胞空間へのマクロファージ動員もまた、アレルギー未処置動物において増強され、この応答は全ての処置によって有意に減少したが、３又は１０ｎｍｏｌ／動物／日のいずれかでＢｕｄで処置した動物の応答は、Ｓｈａｍ群で観察された応答よりも依然として有意に高かった（パネルＥ）。未処置のアレルギー動物は、ＢＡＬ液中の有意な好中球（パネルＣ）又はリンパ球（パネルＤ）の増加を示さなかったが、処置の一部は、気管支肺胞空間へのこれらの細胞の遊走を減少させることができるか、又は消失させることさえできた。
図１５Ａ、図１５Ｂ及び図１５Ｃは、Ｓｈａｍ群と比較して、アレルギー性喘息を有する動物が気管支肺胞空間に動員された総白血球数がより多く、全ての処置がこれらの数の有意な減少をもたらしたが、３ｎｍｏｌ／動物／日の用量でＢｕｄで処置した動物で観察された応答は、Ｓｈａｍマウスで観察された応答よりも依然として有意に高かったことを示す（パネルＡ）。肺へのより顕著な好酸球移動がアレルギー未処置動物で観察され、全ての処置（３ｎｍｏｌ／動物／日のＢｕｄを除く）が有意にこの細胞動員を減少させた（パネルＢ）。気管支肺胞空間へのマクロファージ動員もまた、アレルギー未処置動物において増強され、この応答は全ての処置によって有意に減少したが、３又は１０ｎｍｏｌ／動物／日のいずれかでＢｕｄで処置した動物の応答は、Ｓｈａｍ群で観察された応答よりも依然として有意に高かった（パネルＥ）。未処置のアレルギー動物は、ＢＡＬ液中の有意な好中球（パネルＣ）又はリンパ球（パネルＤ）の増加を示さなかったが、処置の一部は、気管支肺胞空間へのこれらの細胞の遊走を減少させることができるか、又は消失させることさえできた。
【0108】
４．実験群ＩＶ
４．１皮膚浮腫
図１６（パネルＡ及びＢ）に示されるように、ＢＫ及びＣ４８／８０の両方が、注射の３０分後に測定される有意な血漿溢出を誘導した。パネルＡに示されるように、浮腫誘発剤のｉ．ｄ．注射の６０分前に投与された等モル（２．３２μｍｏｌ／ｋｇ）用量の２つの化合物（１．０ｍｇ／ｋｇのＢｕｄ及び１．２ｍｇ／ｋｇのＢｕｄ２１－Ｐのいずれかに相当）は、同様の効果、すなわちＢＫ誘発応答の消失又は約５０％のＣ４８／８０誘発血漿溢出の減少を示した。しかし、パネルＢに示すように、試験化合物を０．３０ｍｇ／ｋｇのＢｕｄ又は０．３６ｍｇ／ｋｇのＢｕｄ２１－Ｐに相当するより低い等モル投与量０．７０μｍｏｌ／ｋｇで投与した場合、ＢｕｄはＢＫ又はＣ４８／８０のいずれにも効果がなかった。逆に、Ｂｕｄ２１－Ｐは、ＢＫ応答を有意に低下させ、Ｃ４８／８０誘導性浮腫を有意に阻害した。
４．１皮膚浮腫
図１６（パネルＡ及びＢ）に示されるように、ＢＫ及びＣ４８／８０の両方が、注射の３０分後に測定される有意な血漿溢出を誘導した。パネルＡに示されるように、浮腫誘発剤のｉ．ｄ．注射の６０分前に投与された等モル（２．３２μｍｏｌ／ｋｇ）用量の２つの化合物（１．０ｍｇ／ｋｇのＢｕｄ及び１．２ｍｇ／ｋｇのＢｕｄ２１－Ｐのいずれかに相当）は、同様の効果、すなわちＢＫ誘発応答の消失又は約５０％のＣ４８／８０誘発血漿溢出の減少を示した。しかし、パネルＢに示すように、試験化合物を０．３０ｍｇ／ｋｇのＢｕｄ又は０．３６ｍｇ／ｋｇのＢｕｄ２１－Ｐに相当するより低い等モル投与量０．７０μｍｏｌ／ｋｇで投与した場合、ＢｕｄはＢＫ又はＣ４８／８０のいずれにも効果がなかった。逆に、Ｂｕｄ２１－Ｐは、ＢＫ応答を有意に低下させ、Ｃ４８／８０誘導性浮腫を有意に阻害した。
【0109】
結論
研究は、アレルギー性喘息の２つのモデルを使用して行われた。このアプローチは、全てのヒト喘息の特徴を再現する単一の動物モデルが存在しないため、新しい薬物の薬理学的プロファイルをよりよく定義するために使用されている。実際、各単一モデルは、薬理活性プロファイルの定義に寄与するいくつかのわずかに異なる情報を与える。第１セットの実験によって得られたデータは、１ｍｇ／Ｋｇの用量のＦ又はＦＢのいずれかの腹腔内投与で処置した感作動物における気管支過敏性の有意な減少を実証した。逆に、同じ用量のＢは、アレルゲン誘発性気道過敏性に対してより低い効果を有した。更に、アレルゲン噴霧は、サルブタモールに対する気管支弛緩の有意な減少も誘導した。ＦＢは、気管支弛緩を有意に改善し、サルブタモールに対する薬理学的応答を回復させた。他の場合では、Ｆ又はＢによる前処置は、サルブタモールに対する気管支応答の欠如を予防しなかった。したがって、ＦＢは、同じ用量の親化合物Ｆ又はＢと比較した場合、気道機能不全の維持において有意な有効性を示した。血液を心臓内穿刺によって回収し、血漿ＩｇＥレベルを測定した。明らかなように、Ｂ及びＦＢによる両方の処置は、ＯＶＡ誘発性のＩｇＥ血漿レベルの増加を有意に減少させ、Ｆと組み合わせた場合にも、ＢがＩｇＥ媒介性免疫応答を予防する有効性を確認した。
研究は、アレルギー性喘息の２つのモデルを使用して行われた。このアプローチは、全てのヒト喘息の特徴を再現する単一の動物モデルが存在しないため、新しい薬物の薬理学的プロファイルをよりよく定義するために使用されている。実際、各単一モデルは、薬理活性プロファイルの定義に寄与するいくつかのわずかに異なる情報を与える。第１セットの実験によって得られたデータは、１ｍｇ／Ｋｇの用量のＦ又はＦＢのいずれかの腹腔内投与で処置した感作動物における気管支過敏性の有意な減少を実証した。逆に、同じ用量のＢは、アレルゲン誘発性気道過敏性に対してより低い効果を有した。更に、アレルゲン噴霧は、サルブタモールに対する気管支弛緩の有意な減少も誘導した。ＦＢは、気管支弛緩を有意に改善し、サルブタモールに対する薬理学的応答を回復させた。他の場合では、Ｆ又はＢによる前処置は、サルブタモールに対する気管支応答の欠如を予防しなかった。したがって、ＦＢは、同じ用量の親化合物Ｆ又はＢと比較した場合、気道機能不全の維持において有意な有効性を示した。血液を心臓内穿刺によって回収し、血漿ＩｇＥレベルを測定した。明らかなように、Ｂ及びＦＢによる両方の処置は、ＯＶＡ誘発性のＩｇＥ血漿レベルの増加を有意に減少させ、Ｆと組み合わせた場合にも、ＢがＩｇＥ媒介性免疫応答を予防する有効性を確認した。
【0110】
第２の実験セットでは、本発明者等はＦＢの鼻腔内有効性を試験した。
【0111】
ＯＶＡ誘発性アレルギー性喘息は、Ｐｅｎｈ測定によって評価されるように気道反応性の増加をもたらし、これは、Ｅｍａｘ又はＡＵＣのいずれかとして分析した場合、０．３、１又は３ｎｍｏｌ／動物／日のＦＢで処置した動物では無効であった。比較のために、３ｎｍｏｌ／動物で投与した場合、最大応答ＥｍａｘのみがＦによって部分的に減少したが、この等モル用量では、Ｂは効果を示さなかった。親化合物Ｆ及びＢに比べて、１０分の１より低い用量で投与した場合のアレルギーマウスにおけるＭＣｈによって誘発された気管支収縮に対するＦＢの効果を考慮すると、塩ＦＢが親化合物を超える利点を提供することは明らかである。
【0112】
予想されるように、このアレルギー状態はまた、気管支肺胞空間に動員される好酸球の数の増加を特徴とし、これは、全ての用量でのＦＢによる処置（明確な用量応答パターンを示す）、並びにＢ及びＦによる処置によって有意に制御された。更に、３ｎｍｏｌ／動物用量でのＦＢ及びＢの両方もまた、ＯＶＡによって誘導されるマクロファージの数の増加を無効にするのに有効であった。
【0113】
ＯＶＡ誘発性アレルギー性喘息はまた、循環白血球数の増加をもたらし、これは３ｎｍｏｌ／動物用量のＦＢによってのみほぼ無効になった。未処置アレルギー性マウスにおける増加した循環好酸球もまた、試験した全ての用量でＦＢ処置によって減少し、用量依存的パターンを示した（最高用量では、循環好酸球の数は、対照Ｓｈａｍ動物よりも更に少なかった）。これは循環マクロファージの場合も同様であり、この強力な低下効果は０．３ｎｍｏｌ／動物用量でも観察されたが、Ｂは３ｎｍｏｌ／動物用量で循環マクロファージの軽度の減少を引き起こしただけであり、Ｆは何の効果もなかった。
【0114】
マウスにおける卵アルブミン誘発性喘息の本発明者等のモデルを使用して、以前に公開された結果に基づいて化合物用量を計算したことに言及する価値がある。ホルモテロールに関して、用量は０．５～３．８μｇ／動物の範囲であるが、ブデソニド吸入の通常の用量は８～７５μｇ／動物の範囲である。このように、本研究で使用したＦ用量（１．０３μｇ／動物に相当の３ｎｍｏｌ／動物）が治療範囲の最低値の範囲内であり、ブデソニドの同じモル用量（１．５３μｇ／動物に相当）は治療用量範囲の十分外側及び下であることは明らかである。Ｆ及びＢがモル比１：１であることを考慮して、本発明者等は、Ｆの用量に基づいて使用するＦＢ用量を決定した（他の場合では、モル用量がＢに通常使用されるものに基づいて考慮された場合、Ｆによる、全身、主に心臓の効果が現れるはずである）。
【0115】
このようにして、試験した最低ＦＢ用量がＢ又はＦ単独のものと同等又は更に優れた有意な有益な効果を示した（呼吸機能及び循環白血球の数及び肺への細胞動員の両方に関して）ことを考慮すると、本発明者等は、ＦとＢとの間の正の相乗作用がＯＶＡ誘発性アレルギー性喘息の本発明者等のマウスモデルにおける化合物ＦＢの有益な効果を説明することを示唆する。
【0116】
（Ｐｅｎｈ関数によって評価した）メタコリンに対する気管支収縮反応を考慮すると、実験群ＩＩＩの結果は、最低用量の２１－ホスファートブデソニド（３ｎｍｏｌ／動物／日）で観察された有益な治療効果が、ブデソニドを更に高いモル用量（すなわち、３及び１０ｎｍｏｌ／動物／日）で投与した場合には存在しなかったことを示している。同様の状況が、気管支肺胞空間（洗浄によって評価される）、特に好酸球（アレルギー応答に関与する主な白血球型である）、並びにマクロファージ又は全白血球への白血球動員に関して観察された。
【0117】
皮膚浮腫を考慮すると、実験群ＩＶの結果は、ＢｕｄがＢＫ又はＣ４８／８０のいずれにも無効であったことを示している。逆に、Ｂｕｄ２１－Ｐは、ＢＫ応答を有意に低下させ、Ｃ４８／８０誘導性浮腫を有意に阻害した。
【0118】
結論として、これらの事実は、２１－ホスファートブデソニドが親ブデソニドよりも強力であり、ＯＶＡ誘発性アレルギー性喘息及び皮膚誘発浮腫を有するマウスにおいて、それらの有益な効果を発揮することを明確に証明している。
【0119】
参考文献
［１］．Ｈ．Ｓ．Ａｌｉ，Ｐ．Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｂｌａｇｄｅｎ，Ｓ．Ｓｏｌｔａｎｐｏｕｒ，Ｗ．Ｅ．Ａｃｒｅｅ Ｊｒ．，ａｎｄ Ａ．Ｊｏｕｙｂａｎ，２９８．２ Ｋにおける、ブデソニド、ヒドロコルチゾン、及びプレドニゾロンのエタノール＋水混合物中の溶解度（Ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｂｕｄｅｓｏｎｉｄｅ，ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ，ａｎｄ ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ ｉｎ ｅｔｈａｎｏｌ＋ｗａｔｅｒ ｍｉｘｔｕｒｅｓ ａｔ ２９８．２ Ｋ），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｄａｔａ，ｖｏｌ．５５，ｎｏ．１，ｐｐ．５７８－５８２，２０１０
［２］．Ｂａｒｎｅｓ Ｐ．Ｊ．長時間作用型ｂ２作動薬とコルチコステロイドとの組み合わせ吸入器についての科学的根拠（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｒａｔｉｏｎａｌｅ ｆｏｒ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎｈａｌｅｒｓ ｗｉｔｈ ａ ｌｏｎｇ－ａｃｔｉｎｇ ｂ２－ａｇｏｎｉｓｔｓ ａｎｄ ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄｓ）．Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｊ．２００２；１９：１８２－１９１
［３］．Ｍａｋ Ｊ．Ｃ．Ｗ．，Ｎｉｓｈｉｋａｗａ Ｍ．，Ｓｈｉｒａｓａｋｉ Ｈ．，Ｍｉｙａｙａｓｕ Ｋ．，Ｂａｒｎｅｓ Ｐ．Ｊ．インビボにおける、肺ｂ２アドレナリン受容体の下方制御に対するグルココルチコイドの保護的効果（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａ ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ ｏｎ ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｂ２－ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎ ｖｉｖｏ）．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９５；９６：９９－１０６
［４］．Ｍａｋ Ｊ．Ｃ．，Ｃｈｕａｎｇ Ｔ．Ｔ．，Ｈａｒｒｉｓ Ｃ．Ａ．，Ｂａｒｎｅｓ Ｐ．Ｊ．肺嚢胞性線維症におけるＧタンパク質結合受容体キナーゼの発現増加（Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｋｉｎａｓｅｓ ｉｎ ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｌｕｎｇ）．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００２；４３６：１６５－１７２
［５］．Ｇａｒｂａｃｃｉｏ，Ｒ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．薬物コンジュゲートの細胞内送達のためのホスファート系リンカー（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂａｓｅｄ ｌｉｎｋｅｒｓ ｆｏｒ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）．ＰＣＴ Ｉｎｔ．Ａｐｐｌ．（２０１５），国際公開第２０１５１５３４０１号．
［６］．Ｋｅｒｎ ＪＣ，Ｄｏｏｎｅｙ Ｄ，Ｚｈａｎｇ Ｒ，Ｌｉａｎｇ Ｌ，Ｂｒａｎｄｉｓｈ ＰＥ，Ｃｈｅｎｇ Ｍ，Ｆｅｎｇ Ｇ，Ｂｅｃｋ Ａ，Ｂｒｅｓｓｏｎ Ｄ，Ｆｉｒｄｏｓ Ｊ，Ｇａｔｅｌｙ Ｄ，Ｋｎｕｄｓｅｎ Ｎ，Ｍａｎｉｂｕｓａｎ Ａ，Ｓｕｎ Ｙ，Ｇａｒｂａｃｃｉｏ ＲＭ．バイオコンジュゲート（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）Ｃｈｅｍ．２０１６，２７，２０８１－２０８８．
［７］．Ｋｅｒｎ ＪＣ，Ｃａｎｃｉｌｌａ Ｍ，Ｄｏｏｎｅｙ Ｄ，Ｋｗａｓｎｊｕｋ Ｋ，Ｚｈａｎｇ Ｒ，Ｂｅａｕｍｏｎｔ Ｍ，Ｆｉｇｕｅｒｏａ Ｉ，Ｈｓｉｅｈ Ｓ，Ｌｉａｎｇ Ｌ，Ｔｏｍａｚｅｌａ Ｄ，Ｚｈａｎｇ Ｊ，Ｂｒａｎｄｉｓｈ ＰＥ，Ｐａｌｍｉｅｒｉ Ａ，Ｓｔｉｖｅｒｓ Ｐ，Ｃｈｅｎｇ Ｍ，Ｆｅｎｇ Ｇ，Ｇｅｄａ Ｐ，Ｓｈａｈ Ｓ，Ｂｅｃｋ Ａ，Ｂｒｅｓｓｏｎ Ｄ，Ｆｉｒｄｏｓ Ｊ，Ｇａｔｅｌｙ Ｄ，Ｋｎｕｄｓｅｎ Ｎ，Ｍａｎｉｂｕｓａｎ Ａ，Ｓｃｈｕｌｔｚ ＰＧ，Ｓｕｎ Ｙ，Ｇａｒｂａｃｃｉｏ ＲＭ．部位特異的抗体薬コンジュゲートのための調節可能、可溶性、バイオ直交型のリンカーとしてのピロホスファートジエステルの発見（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｄｉｅｓｔｅｒｓ ａｓ Ｔｕｎａｂｌｅ，Ｓｏｌｕｂｌｅ，ａｎｄ Ｂｉｏｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ Ｌｉｎｋｅｒｓ ｆｏｒ Ｓｉｔｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１６，１３８，１４３０－１４４５
［８］．Ｂｒａｎｄｉｓｈ，Ｐ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．抗炎症用途のための抗体薬コンジュゲート（Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｆｏｒ ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）．ＰＣＴ Ｉｎｔ．Ａｐｐｌ．（２０１７），国際公開第２０１７０６２２７１号
［９］．Ｓａｎｔｏｓ Ｋｔ，Ｆｌｏｒｅｎｚａｎｏ Ｊ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ Ｌ，Ｆａｖａｒｏ Ｒｒ，Ｖｅｎｔｕｒａ Ｆｆ，Ｒｉｂｅｉｒｏ Ｍｇ，Ｔｅｉｘｅｉｒａ Ｓａ，Ｆｅｒｒｅｉｒａ Ｈｈ，Ｂｒａｉｎ Ｓｄ，Ｄａｍａｚｏ Ａｓ，Ｚｏｒｎ Ｔｍ，Ｃａｍａｒａ Ｎｏ，Ｍｕｓｃａｒａ Ｍｎ，Ｐｅｒｏｎ Ｊｐ，Ｃｏｓｔａ Ｓｋ（２０１４）．出生後早期であるが、後期ではない、化学的周囲汚染物質１，２－ナフトキノンへの曝露は、成人期に肺アレルギー性炎症に対する感受性を増加させる（Ｅａｒｌｙ ｐｏｓｔｎａｔａｌ，ｂｕｔ ｎｏｔ ｌａｔｅ，ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｔｏ ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｍｂｉｅｎｔ ｐｏｌｌｕｔａｎｔ １，２－ｎａｐｈｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ａｌｌｅｒｇｉｃ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｔ ａｄｕｌｔｈｏｏｄ）．Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，８８：１５８９－１６０５．
［１０］．Ｃｏｓｔａ ＳＫ，Ｓｔａｒｒ Ａ，Ｈｙｓｌｏｐ Ｓ，Ｇｉｌｍｏｒｅ Ｄ，Ｂｒａｉｎ ＳＤ（２００６）．皮膚の微小血管炎症及びかゆみに影響を及ぼすためのＮＫ１受容体はどの程度重要であるか？フォニュートリア・ニグリヴェンター（Ｐｈｏｎｅｕｔｒｉａ ｎｉｇｒｉｖｅｎｔｅｒ）毒液を用いた研究（Ｈｏｗ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ａｒｅ ＮＫ１ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｆｏｒ ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｔｃｈ ｉｎ ｔｈｅ ｓｋｉｎ？Ｓｔｕｄｉｅｓ ｕｓｉｎｇ Ｐｈｏｎｅｕｔｒｉａ ｎｉｇｒｉｖｅｎｔｅｒ ｖｅｎｏｍ）．Ｖａｓｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ；４５：２０９－２１４．
［１１］．Ｙｓｈｉｉ ＬＭ，Ｓｏｕｚａ ＧＨＭＦ，Ｃａｍａｒｇｏ ＥＡ，Ｅｂｅｒｌｉｎ ＭＮ，Ｒｉｂｅｌａ ＭＴＣＰ，Ｍｕｓｃａｒａ ＭＮ，Ｈｙｓｌｏｐ Ｓ，Ｃｏｓｔａ ＳＫＰ（２００９）．マウス背側皮膚におけるポリステス・ラニオ（Ｐｏｌｉｓｔｅｓ ｌａｎｉｏ ｌａｎｉｏ）（アシナガバチ）毒液に対する炎症応答の根底にある機序の特性決定（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ ｔｈｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ Ｐｏｌｉｓｔｅｓ ｌａｎｉｏ ｌａｎｉｏ（ｐａｐｅｒ ｗａｓｐ）ｖｅｎｏｍ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｄｏｒｓａｌ ｓｋｉｎ）．Ｔｏｘｉｃｏｎ；５３：４２－５２．
［１］．Ｈ．Ｓ．Ａｌｉ，Ｐ．Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｂｌａｇｄｅｎ，Ｓ．Ｓｏｌｔａｎｐｏｕｒ，Ｗ．Ｅ．Ａｃｒｅｅ Ｊｒ．，ａｎｄ Ａ．Ｊｏｕｙｂａｎ，２９８．２ Ｋにおける、ブデソニド、ヒドロコルチゾン、及びプレドニゾロンのエタノール＋水混合物中の溶解度（Ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｂｕｄｅｓｏｎｉｄｅ，ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ，ａｎｄ ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ ｉｎ ｅｔｈａｎｏｌ＋ｗａｔｅｒ ｍｉｘｔｕｒｅｓ ａｔ ２９８．２ Ｋ），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｄａｔａ，ｖｏｌ．５５，ｎｏ．１，ｐｐ．５７８－５８２，２０１０
［２］．Ｂａｒｎｅｓ Ｐ．Ｊ．長時間作用型ｂ２作動薬とコルチコステロイドとの組み合わせ吸入器についての科学的根拠（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｒａｔｉｏｎａｌｅ ｆｏｒ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎｈａｌｅｒｓ ｗｉｔｈ ａ ｌｏｎｇ－ａｃｔｉｎｇ ｂ２－ａｇｏｎｉｓｔｓ ａｎｄ ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄｓ）．Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｊ．２００２；１９：１８２－１９１
［３］．Ｍａｋ Ｊ．Ｃ．Ｗ．，Ｎｉｓｈｉｋａｗａ Ｍ．，Ｓｈｉｒａｓａｋｉ Ｈ．，Ｍｉｙａｙａｓｕ Ｋ．，Ｂａｒｎｅｓ Ｐ．Ｊ．インビボにおける、肺ｂ２アドレナリン受容体の下方制御に対するグルココルチコイドの保護的効果（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａ ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ ｏｎ ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｂ２－ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎ ｖｉｖｏ）．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９５；９６：９９－１０６
［４］．Ｍａｋ Ｊ．Ｃ．，Ｃｈｕａｎｇ Ｔ．Ｔ．，Ｈａｒｒｉｓ Ｃ．Ａ．，Ｂａｒｎｅｓ Ｐ．Ｊ．肺嚢胞性線維症におけるＧタンパク質結合受容体キナーゼの発現増加（Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｋｉｎａｓｅｓ ｉｎ ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｌｕｎｇ）．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００２；４３６：１６５－１７２
［５］．Ｇａｒｂａｃｃｉｏ，Ｒ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．薬物コンジュゲートの細胞内送達のためのホスファート系リンカー（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂａｓｅｄ ｌｉｎｋｅｒｓ ｆｏｒ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）．ＰＣＴ Ｉｎｔ．Ａｐｐｌ．（２０１５），国際公開第２０１５１５３４０１号．
［６］．Ｋｅｒｎ ＪＣ，Ｄｏｏｎｅｙ Ｄ，Ｚｈａｎｇ Ｒ，Ｌｉａｎｇ Ｌ，Ｂｒａｎｄｉｓｈ ＰＥ，Ｃｈｅｎｇ Ｍ，Ｆｅｎｇ Ｇ，Ｂｅｃｋ Ａ，Ｂｒｅｓｓｏｎ Ｄ，Ｆｉｒｄｏｓ Ｊ，Ｇａｔｅｌｙ Ｄ，Ｋｎｕｄｓｅｎ Ｎ，Ｍａｎｉｂｕｓａｎ Ａ，Ｓｕｎ Ｙ，Ｇａｒｂａｃｃｉｏ ＲＭ．バイオコンジュゲート（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）Ｃｈｅｍ．２０１６，２７，２０８１－２０８８．
［７］．Ｋｅｒｎ ＪＣ，Ｃａｎｃｉｌｌａ Ｍ，Ｄｏｏｎｅｙ Ｄ，Ｋｗａｓｎｊｕｋ Ｋ，Ｚｈａｎｇ Ｒ，Ｂｅａｕｍｏｎｔ Ｍ，Ｆｉｇｕｅｒｏａ Ｉ，Ｈｓｉｅｈ Ｓ，Ｌｉａｎｇ Ｌ，Ｔｏｍａｚｅｌａ Ｄ，Ｚｈａｎｇ Ｊ，Ｂｒａｎｄｉｓｈ ＰＥ，Ｐａｌｍｉｅｒｉ Ａ，Ｓｔｉｖｅｒｓ Ｐ，Ｃｈｅｎｇ Ｍ，Ｆｅｎｇ Ｇ，Ｇｅｄａ Ｐ，Ｓｈａｈ Ｓ，Ｂｅｃｋ Ａ，Ｂｒｅｓｓｏｎ Ｄ，Ｆｉｒｄｏｓ Ｊ，Ｇａｔｅｌｙ Ｄ，Ｋｎｕｄｓｅｎ Ｎ，Ｍａｎｉｂｕｓａｎ Ａ，Ｓｃｈｕｌｔｚ ＰＧ，Ｓｕｎ Ｙ，Ｇａｒｂａｃｃｉｏ ＲＭ．部位特異的抗体薬コンジュゲートのための調節可能、可溶性、バイオ直交型のリンカーとしてのピロホスファートジエステルの発見（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｄｉｅｓｔｅｒｓ ａｓ Ｔｕｎａｂｌｅ，Ｓｏｌｕｂｌｅ，ａｎｄ Ｂｉｏｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ Ｌｉｎｋｅｒｓ ｆｏｒ Ｓｉｔｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１６，１３８，１４３０－１４４５
［８］．Ｂｒａｎｄｉｓｈ，Ｐ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．抗炎症用途のための抗体薬コンジュゲート（Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｆｏｒ ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）．ＰＣＴ Ｉｎｔ．Ａｐｐｌ．（２０１７），国際公開第２０１７０６２２７１号
［９］．Ｓａｎｔｏｓ Ｋｔ，Ｆｌｏｒｅｎｚａｎｏ Ｊ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ Ｌ，Ｆａｖａｒｏ Ｒｒ，Ｖｅｎｔｕｒａ Ｆｆ，Ｒｉｂｅｉｒｏ Ｍｇ，Ｔｅｉｘｅｉｒａ Ｓａ，Ｆｅｒｒｅｉｒａ Ｈｈ，Ｂｒａｉｎ Ｓｄ，Ｄａｍａｚｏ Ａｓ，Ｚｏｒｎ Ｔｍ，Ｃａｍａｒａ Ｎｏ，Ｍｕｓｃａｒａ Ｍｎ，Ｐｅｒｏｎ Ｊｐ，Ｃｏｓｔａ Ｓｋ（２０１４）．出生後早期であるが、後期ではない、化学的周囲汚染物質１，２－ナフトキノンへの曝露は、成人期に肺アレルギー性炎症に対する感受性を増加させる（Ｅａｒｌｙ ｐｏｓｔｎａｔａｌ，ｂｕｔ ｎｏｔ ｌａｔｅ，ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｔｏ ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｍｂｉｅｎｔ ｐｏｌｌｕｔａｎｔ １，２－ｎａｐｈｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ａｌｌｅｒｇｉｃ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｔ ａｄｕｌｔｈｏｏｄ）．Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，８８：１５８９－１６０５．
［１０］．Ｃｏｓｔａ ＳＫ，Ｓｔａｒｒ Ａ，Ｈｙｓｌｏｐ Ｓ，Ｇｉｌｍｏｒｅ Ｄ，Ｂｒａｉｎ ＳＤ（２００６）．皮膚の微小血管炎症及びかゆみに影響を及ぼすためのＮＫ１受容体はどの程度重要であるか？フォニュートリア・ニグリヴェンター（Ｐｈｏｎｅｕｔｒｉａ ｎｉｇｒｉｖｅｎｔｅｒ）毒液を用いた研究（Ｈｏｗ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ａｒｅ ＮＫ１ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｆｏｒ ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｔｃｈ ｉｎ ｔｈｅ ｓｋｉｎ？Ｓｔｕｄｉｅｓ ｕｓｉｎｇ Ｐｈｏｎｅｕｔｒｉａ ｎｉｇｒｉｖｅｎｔｅｒ ｖｅｎｏｍ）．Ｖａｓｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ；４５：２０９－２１４．
［１１］．Ｙｓｈｉｉ ＬＭ，Ｓｏｕｚａ ＧＨＭＦ，Ｃａｍａｒｇｏ ＥＡ，Ｅｂｅｒｌｉｎ ＭＮ，Ｒｉｂｅｌａ ＭＴＣＰ，Ｍｕｓｃａｒａ ＭＮ，Ｈｙｓｌｏｐ Ｓ，Ｃｏｓｔａ ＳＫＰ（２００９）．マウス背側皮膚におけるポリステス・ラニオ（Ｐｏｌｉｓｔｅｓ ｌａｎｉｏ ｌａｎｉｏ）（アシナガバチ）毒液に対する炎症応答の根底にある機序の特性決定（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ ｔｈｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ Ｐｏｌｉｓｔｅｓ ｌａｎｉｏ ｌａｎｉｏ（ｐａｐｅｒ ｗａｓｐ）ｖｅｎｏｍ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｄｏｒｓａｌ ｓｋｉｎ）．Ｔｏｘｉｃｏｎ；５３：４２－５２．
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図12A】
【図12B】
【図12C】
【図13A】
【図13B】
【図13C】
【図14A】
【図14B】
【図14C】
【図15A】
【図15B】
【図15C】
【図16】
【国際調査報告】