特表 2023-520707 画像化システム用の光学トレーンおよびスペクトルエッジ検出

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-05-18

(54)【発明の名称】画像化システム用の光学トレーンおよびスペクトルエッジ検出

(51)【国際特許分類】

   G02B 21/00 20060101AFI20230511BHJP

   G01N 21/64 20060101ALI20230511BHJP

【ＦＩ】

G02B21/00

G01N21/64 E

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022560524

(86)(22)【出願日】2020-12-23

(85)【翻訳文提出日】2022-10-04

(86)【国際出願番号】 US2020066873

(87)【国際公開番号】W WO2021206768

(87)【国際公開日】2021-10-14

(31)【優先権主張番号】63/005,932

(32)【優先日】2020-04-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】518244644

【氏名又は名称】レアサイト インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100094569

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 伸一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100103610

【弁理士】

【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦

(74)【代理人】

【識別番号】100109070

【弁理士】

【氏名又は名称】須田 洋之

(74)【代理人】

【識別番号】100098475

【弁理士】

【氏名又は名称】倉澤 伊知郎

(74)【代理人】

【識別番号】100130937

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 泰史

(74)【代理人】

【識別番号】100144451

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 博子

(74)【代理人】

【識別番号】100128428

【弁理士】

【氏名又は名称】田巻 文孝

(72)【発明者】

【氏名】クーパー ジェレミー ライアン

(72)【発明者】

【氏名】スチュワート デイヴィッド

【テーマコード（参考）】

2G043

2H052

【Ｆターム（参考）】

2G043AA04

2G043BA16

2G043EA01

2G043FA02

2G043FA06

2G043HA09

2G043JA03

2G043LA03

2G043NA01

2H052AA09

2H052AC12

2H052AC13

2H052AC30

2H052AC34

2H052AD03

2H052AF01

2H052AF25

(57)【要約】

本開示は、一般に、画像化システム用の光学トレーン（optical train ）に関する。より具体的には、本開示は、光学収差を制限するよう構成された画像化システムに関する。さらに、本開示は、特に、複数の検出構成成分中の個々の検出構成成分を検出するためにサンプルを画像化するよう構成された画像化システムの光学収差を制限する方法に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

画像化システムであって、
前記画像化システムの光路内に位置決めされるよう構成された光学フィルタを含む少なくとも１つの傾動可能なフィルタ組立体と、
前記画像化システムの前記光路内に位置決めされるよう構成された動的補正光学系と、
前記画像化システムの前記光路内に位置決めされるよう構成された固定補正光学系とを含む、画像化システム。

【請求項2】

前記画像化システムの前記光路内に位置決めされるよう構成されたテレセントリックチューブレンズをさらに含む、請求項１記載の画像化システム。

【請求項3】

前記固定補正光学系は、前記光学フィルタと前記動的補正光学系の組み合わせによって生じる非点収差を実質的に軽減するよう構成されている、請求項１記載の画像化システム。

【請求項4】

前記固定補正光学系と前記動的補正光学系と前記光学フィルタとの組み合わせによって残留非点収差が生じたとしても該残留非点収差は、ほぼゼロ（０）である、請求項１記載の撮像装置。

【請求項5】

前記光学フィルタの選択された第１の入射角に関し、前記動的補正光学系は、第２の入射角まで傾けられるよう構成され、前記固定補正光学系の前記入射角は、前記選択された第１の入射角のところでの前記光学フィルタと前記第２の入射角のところでの前記動的補正光学系との組み合わせによって生じる前記非点収差を実質的に軽減するための非点収差を生じさせるよう構成されている、請求項１記載の画像化システム。

【請求項6】

前記動的補正光学系は、前記光学フィルタの傾動によって生じる横方向画像シフトを実質的に安定化するよう構成されている、請求項１記載の画像化システム。

【請求項7】

前記動的補正光学系によって生じる横方向画像シフトと前記光学フィルタの傾動によって生じる前記横方向画像シフトの合計は、ほぼ一定である、請求項６記載の画像化システム。

【請求項8】

前記光学フィルタの選択された第１の入射角に関し、前記動的補正光学系は、第２の入射角まで傾けられるよう構成され、前記動的補正光学系によって生じる横方向画像シフトと前記光学フィルタによって生じる前記横方向画像シフトの合計は、ほぼ一定である、請求項６記載の画像化システム。

【請求項9】

前記少なくとも１つの傾動可能なフィルタ組立体によって保持された前記光学フィルタ、および前記動的補正光学系は、ほぼ平行なＸ軸上で傾動するよう構成され、前記固定補正光学系は、実質的に垂直なＹ軸上で傾けられる、請求項１記載の画像化システム。

【請求項10】

前記テレセントリックチューブレンズは、前記テレセントリックチューブレンズが画像と物体空間の両方内でテレセントリックである位置で前記画像化システムの前記光路内に配置されている、請求項２記載の画像化システム。

【請求項11】

前記少なくとも１つの傾動可能なフィルタ組立体を保持するよう構成されたフィルタチェンジャをさらに含む、請求項１記載の画像化システム。

【請求項12】

前記フィルタチェンジャは、フィルタホイールであり、前記少なくとも１つの傾動可能なフィルタ組立体は、前記光学フィルタをほぼ０゜からほぼ８９．９゜までの範囲から選択された入射角まで傾斜させるよう構成されている、請求項１１記載の画像化システム。

【請求項13】

前記フィルタチェンジャは、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、または少なくとも２０個の傾動可能なフィルタ組立体を含む、請求項１１記載の画像化システム。

【請求項14】

ダイクロイックフィルタ、ポリクロイックフィルタ、ショートパスフィルタ、ロングパスフィルタ、バンドパスフィルタ、バンドストップフィルタ、およびマルチパスフィルタから成る群のうちの少なくとも１つを選択した低インシデンスフィルタをさらに含み、前記低インシデンスフィルタは、ほぼ１０．０゜からほぼ３０．０゜までの範囲にある角度から選択された励起光の入射角を有するよう構成されている、請求項１記載の画像化システム。

【請求項15】

前記低インシデンスフィルタは、ポリクロイックフィルタである、請求項１４記載の画像化システム。

【請求項16】

前記画像化システムは、蛍光顕微鏡型画像化システムである、請求項１記載の画像化システム。

【請求項17】

前記光学フィルタは、干渉フィルタである、請求項１記載の画像化システム。

【請求項18】

前記少なくとも１つの傾動可能なフィルタ組立体は、前記光学フィルタをほぼ０゜からほぼ８９．９゜までの範囲から選択された入射角まで傾動させるよう構成されている、請求項１記載の画像化システム。

【請求項19】

画像化システムの非点収差を軽減する方法であって、前記方法は、
光学フィルタを第１の入射角で前記画像化システムの光路内に位置決めするステップと、
動的補正光学系を第２の入射角で前記画像化システムの前記光路内に位置決めするステップと、
固定補正光学系を第３の入射角で前記画像化システムの前記光路内に位置決めするステップとを含み、
前記固定補正光学系の前記入射角は、前記第１の入射角での前記光学フィルタの非点収差と前記第２の入射角での前記動的補正光学系の総合非点収差を実質的に軽減するための非点収差を生じさせるよう構成されている、方法。

【請求項20】

画像化システムの横方向画像シフトを安定化する方法であって、前記方法は、
光学フィルタを、第１の入射角で前記画像化システムの光路内に位置決めするステップと、
動的補正光学系を第２の入射角で前記画像化システムの前記光路内に位置決めするステップとを含み、前記動的補正光学系は、前記光学フィルタの傾動によって生じる横方向画像シフトを実質的に安定化するよう構成されている、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示（本発明）は、一般に、サンプルの分析のための顕微鏡画像化システムに関する。特に、本開示は、蛍光顕微鏡用の画像化システムの光学収差の軽減に関する。さらに、本開示は、自動高スループット画像化システム用の光学トレーン（optical train）に関する。加うるに、本開示は、多数の検出構成成分を順次検出する方法および画像化システムに関する。

【0002】

〔関連出願の参照〕
本出願は、２０２０年４月６日に出願された米国特許仮出願第６３／００５，９３２号の優先権主張出願である。

【0003】

本明細書において言及する全ての刊行物および特許出願を参照により引用し、個々の刊行物または特許出願が具体的にかつ個々に参照により引用されているかのごとくこれらの記載内容全体が本明細書の一部をなすものとする。

【背景技術】

【0004】

顕微鏡検査法は、無機および有機サンプルを検査するとともに画像化するために用いられる強力な技術である。選択されるサンプルとしては、検出または画像化のために標的とされる場合のある１種類以上のバイオマーカーまたは成分を含む生物サンプルが挙げられる。顕微鏡検査法で用いられる現行の光学トレーン型フィルタおよび画像化システムでは、限定された数の標識（ラベル）しか任意所与の時点において使用することができない。さらに、画像化システムには、画像品質上の問題、例えば、収差、非点収差、焦点ずれ（シフト）および画像シフトなどの欠点がある。その結果、医療技師、研究者、および顕微鏡使用者は、サンプルをより効率的にかつ正確に画像化するためのシステムおよび方法を求め続けている。

【発明の概要】

【0005】

一観点では、画像化システムの諸実施形態が提供される。画像化システムは、画像化システムの光路内に位置決めされるよう構成された光学フィルタを含む少なくとも１つの傾動可能なフィルタ組立体と、画像化システムの光路内に位置決めされるよう構成された動的補正光学系と、画像化システムの光路内に位置決めされるよう構成された固定補正光学系とを含む。

【0006】

画像化システムは、画像化システムの光路内に位置決めされるよう構成されたテレセントリックチューブレンズをさらに含むのが良い。

【0007】

幾つかの実施形態では、固定補正光学系は、光学フィルタと動的補正光学系の組み合わせによって生じる非点収差を実質的に軽減するよう構成されている。

【0008】

固定補正光学系と動的補正光学系と光学フィルタとの組み合わせによって残留非点収差が生じたとしても、かかる残留非点収差は、ほぼゼロ（０）であると言える。

【0009】

幾つかの実施形態では、光学フィルタの選択された第１の入射角に関し、動的補正光学系は、第２の入射角まで傾けられるよう構成され、固定補正光学系の入射角は、選択された第１の入射角のところでの光学フィルタと第２の入射角のところでの動的補正光学系との組み合わせによって生じる非点収差を実質的に軽減するための非点収差を生じさせるよう構成されている。動的補正光学系は、光学フィルタの傾動によって生じる横方向画像シフトを実質的に安定化するよう構成されているのが良い。幾つかの実施形態では、動的補正光学系によって生じる横方向画像シフトと光学フィルタの傾動によって生じる横方向画像シフトの合計は、ほぼ一定である。光学フィルタの選択された第１の入射角に関し、動的補正光学系は、第２の入射角まで傾けられるよう構成されるのが良く、動的補正光学系によって生じる横方向画像シフトと光学フィルタによって生じる横方向画像シフトの合計は、ほぼ一定である。

【0010】

幾つかの実施形態では、少なくとも１つの傾動可能なフィルタ組立体によって保持された光学フィルタ、および動的補正光学系は、ほぼ平行なＸ軸を中心として傾動するよう構成され、固定補正光学系は、実質的に垂直なＹ軸を中心として傾けられる。テレセントリックチューブレンズは、テレセントリックチューブレンズが画像と物体空間の両方内でテレセントリックである位置で画像化システムの光路内に配置されるのが良い。

【0011】

幾つかの実施形態では、画像化システムは、少なくとも１つの傾動可能なフィルタ組立体を保持するよう構成されたフィルタチェンジャをさらに含む。フィルタチェンジャは、フィルタホイールであるのが良く、少なくとも１つの傾動可能なフィルタ組立体は、光学フィルタをほぼ０゜からほぼ８９．９゜までの範囲から選択された入射角まで傾斜させるよう構成されているのが良い。幾つかの実施形態では、フィルタチェンジャは、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、または少なくとも２０個の傾動可能なフィルタ組立体を含む。

【0012】

幾つかの実施形態では、画像化システムは、ダイクロイックフィルタ、ポリクロイックフィルタ、ショートパスフィルタ、ロングパスフィルタ、バンドパスフィルタ、バンドストップフィルタ、およびマルチパスフィルタから成る群のうちの少なくとも１つを選択した低インシデンスフィルタを含み、低インシデンスフィルタは、ほぼ１０．０゜からほぼ３０．０゜までの範囲にある角度から選択された励起光の入射角を有するよう構成されている。低インシデンスフィルタは、ポリクロイックフィルタであるのが良い。

【0013】

幾つかの実施形態では、画像化システムは、蛍光顕微鏡型画像化システムである。

【0014】

光学フィルタは、干渉フィルタであるのが良い。

【0015】

幾つかの実施形態では、少なくとも１つの傾動可能なフィルタ組立体は、光学フィルタをほぼ０゜からほぼ８９．９゜までの範囲から選択された入射角まで傾動させるよう構成されている。

【0016】

別の観点では、画像化システムの非点収差を軽減する方法が提供される。本方法は、光学フィルタを第１の入射角で画像化システムの光路内に位置決めするステップと、動的補正光学系を第２の入射角で画像化システムの光路内に位置決めするステップと、固定補正光学系を第３の入射角で画像化システムの光路内に位置決めするステップとを含み、固定補正光学系の入射角は、第１の入射角での光学フィルタの総合非点収差と第２の入射角での動的補正光学系の非点収差を実質的に軽減するための非点収差を生じさせるよう構成されている。

【0017】

さらに別の観点では、画像化システムの横方向画像シフトを安定化する方法が提供される。本方法は、光学フィルタを、第１の入射角で画像化システムの光路内に位置決めするステップと、動的補正光学系を第２の入射角で画像化システムの光路内に位置決めするステップとを含み、動的補正光学系は、光学フィルタの傾動によって生じる横方向画像シフトを実質的に安定化するよう構成されている。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】蛍光顕微鏡型画像化システム用の光学トレーンの一実施形態を示す略図である。

【図2A】フィルタホイールの一実施形態の斜視図である。

【図2B】フィルタ組立体の一実施形態の斜視図である。

【図3】フィルタ組立体、カム、およびモータの一実施形態の斜視図である。

【図4A】蛍光顕微鏡型画像化システム用の光学トレーンの一実施形態を示す略図である。

【図4B】蛍光顕微鏡型画像化システム用の光学トレーンの選択された要素の斜視図である。

【図5】蛍光顕微鏡型画像化システム用の光学トレーンの別の実施形態を示す略図である。

【図6】蛍光顕微鏡型画像化システム用の光学トレーンの別の実施形態を示す略図である。

【図7A】第１の検出構成成分の発光スペクトルを示すグラフ図である。

【図7B】第２の検出構成成分の発光スペクトルを示すグラフ図である。

【図7C】第３の検出構成成分の発光スペクトルを示すグラフ図である。

【図8A】発光スペクトルおよびバックグラウンド信号を示すグラフ図である。

【図8B】画像化中に得られた信号を示す図である。

【図9A】第１および第２の検出構成成分の発光スペクトルおよび画像化を示すグラフ図である。

【図9B】第１および第２の検出構成成分の発光スペクトルおよび画像化を示すグラフ図である。

【図9C】第１および第２の検出構成成分の発光スペクトルおよび画像化を示すグラフ図である。

【図9D】第１および第２の検出構成成分の発光スペクトルおよび画像化を示すグラフ図である。

【図9E】第１、第２、および第３の検出構成成分の発光スペクトルおよび画像化を示すグラフ図である。

【発明を実施するための形態】

【0019】

以下の説明において、「原画像」という用語は、センサまたは検出器によって捕捉されたデータまたは少なくとも１つの信号を含む未処理の画像（オペレータまたは最終使用者に視覚的に表示されようとそうでなかろうと、いずれにせよ）を表すために用いられる。

【0020】

以下の説明において、「最終画像」という用語は、処理されたデータまたは少なくとも１つの信号を含む画像（オペレータまたは最終使用者に視覚的に表示されようとそうでなかろうと、いずれにせよ）を表すために用いられている。「最終画像」はまた、２つ以上の原画像または他の最終画像の比較および／または分析の結果として得られる出力画像である画像（オペレータまたは最終使用者に視覚的に表示されようとそうでなかろうといずれにせよ）を表すために使用される場合がある。

【0021】

以下の説明において、「光」という用語は、電磁スペクトルの可視部分中の電磁線の表示には限定されず、電磁スペクトルの紫外線部分および赤外線部分中の放射線を表すことも意図される。

【0022】

以下の説明において、「サンプル」という用語は、有機固形物、有機流体、無機固形物、無機流体、生物学的流体、生物学的半固体、生物学的固体（固体、例えば組織のままである場合があり、あるいは任意適当な仕方で液化されている場合がある）、懸濁液、懸濁液の一部分、懸濁液の一成分などを表すために使用される。

【0023】

以下の説明において、「標的分析物」または「標的物質」という用語は、関心のある生物学的物質を表すために用いられる。

【0024】

以下の説明において、「非標的分析物」という用語は、標的分析物ではない生物学的物質を表すために用いられる。

【0025】

以下の説明において、「バイオマーカー（生体指標）」という用語は、標的分析物もしくは標的物質上または標的分析物もしくは標的物質内に存在する物質（すなわち、標的分析物内に例えば食菌作用を介して内在化された細胞内または細胞外標的分析物など）を表すために用いられる。バイオマーカーとしては、ペプチド、タンパク質、サブユニット、ドメイン、モチーフ、エピトープ、イソフォルム、ＤＮＡ、ＲＮＡなどが挙げられるが、これらには限定されない。バイオマーカーは、投薬のための標的分子であるのが良い。

【0026】

以下の説明において、「親和性分子」という用語は、別の分子に結合しまたはこれと相互作用することができる分子であればどのようなものでも表すために用いられる。相互作用または結合は、共有であっても良くまたは非共有であっても良い。親和性分子としては、抗体、ハプテン、タンパク質、アプタマー、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、または別の分子と相互作用しもしくは結合する任意の適当な分子（例えば、バイオマーカー、結合ペアの分子またはビオチンまたはアビジン（これらには限定されない）を含む相補分子、その他）が挙げられるが、これらには限定されない。

【0027】

以下の説明において、「チャネル」という用語は、蛍光体の１つ以上の検出構成成分によって提供された信号に基づいて色または色範囲を説明するために用いられている。色または色範囲は、選択された干渉フィルタ（すなわち、励起フィルタ、発光フィルタ、ポリクロイックフィルタ、ダイクロイックフィルタ）および／または信号の波長に基づいて得られる。例えば、チャネルは、紫色、青色、緑色、黄色、橙色、赤色、エンジ色などであって良い。さらに、複数のチャネルが用いられる場合、各チャネルは、特有の色または色範囲を有する。例えば、第１のチャネルは、緑色であるのが良く、第２のチャネルは、橙色であるのが良い。２つ以上の検出構成成分は、互いに異なる波長を呈する信号をもたらすことができるが、これら信号は、用いられるフィルタセットに基づいて同一のチャネル内に存在するのが良いことが注目されるべきである。例えば、第１の検出構成成分は、４８８ｎｍの波長を有する信号を提供し、第２の検出構成成分は、５００ｎｍの波長を有する信号を提供する。例えこれらの波長が互いに同一ではなくても、チャネルのうちの１つ内のフィルタセットは、４８８ｎｍと５００ｎｍの両方の波長を通し、それによりこれら両方の波長を同時に画像化することができ、それにより４８８ｎｍ発光および５００ｎｍ発光を含む単一の画像を生じさせることができる。チャネルはまた、励起バンドパス（帯域幅）と発光バンドパスの組み合わせを説明することができる。

【0028】

以下の説明において、「検出構成成分」という用語は、検出のための信号を提供し、それによりサンプルまたは試料内の別の化合物、別の物質、分析物などの存在を示す化合物または物質を表すために用いられる。検出構成成分は、蛍光性であるのが良く、例えば蛍光性プローブであり、あるいは発色性であるのが良く、例えば発色性染料であるのが良い。蛍光性プローブは、反応性染料、有機染料、蛍光性タンパク質、量子ドット、非タンパク質有機分子、ナノ粒子（例えば、ナノダイヤモンド）、リン一体形ドット（ＰＩＤ）などであるのが良い。

【0029】

検出構成成分は、検出のための信号を提供し、それによりサンプルまたは試料内の別の化合物、別の物質、分析物などの存在を示す化合物または物質である。検出構成成分は、トレーサーとして、ある特定の構造体のための標識として、バイオマーカーのための標識としてあるいはその他として使用できる。検出構成成分を分布しても良く、あるいは検出構成成分は、摂取、選択的摂取、拡散および結合分子への取り付け（これらには限定されない）を含む仕方で適当な構造またはバイオマーカーを標識表示することができる。検出構成成分は、直接的標識化または間接的標識化によってバイオマーカーに結合されるのが良い。

【0030】

種々の酵素標識（例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼおよびアルカリホスフェイト）とともに使用できる発色性染料としては、３，３’‐ジアミノベンジジン（ＤＡＢ），３‐アミノ‐９‐エチルカルバゾール（ＡＥＣ）、４‐クロロ‐１‐ナフトール（ＣＮ），Ｐ‐フェニレンジアミン二塩酸塩／ピロカテコール（Hanker-Yates試薬）、ファストレッドＴＲ、ニューフクシン、ファストブルーＢＢなどが挙げられるがこれらは限定されない。蛍光性プローブとしては、１，５ＩＡＥＤＡＮＳ、１，８‐ＡＮＳ、４‐メチルウンベリフェロン、５‐カルボキシ‐２，７ジクロロフルオレセイン、５‐カルボキシフルオレセイン（５‐ＦＡＭ）、５‐カルボキシナフトフルオレセイン、５‐カルボキシテトラメチルローダミン（５‐ＴＡＭＲＡ）、５‐ＦＡＭ（５‐カルボキシフルオレセイン）、５‐ＨＡＴ（ヒドロキシトリプタミン）、５‐ヒドロキシトリプタミン（ＨＡＴ）、５‐ＲＯＸ（カルボキシ‐Ｘ‐ローダミン）、５‐ＴＡＭＲＡ（５‐カルボキシテトラメチルローダミン）、６‐カルボキシローダミン６Ｇ、６‐ＣＲ ６Ｇ、６‐ＪＯＥ、７‐アミノ‐４‐メチルクマリン、７‐アミノアクチノマイシンＤ（７‐ＡＡＤ）、７‐ヒドロキシ‐４‐メチルクマリン、９‐アミノ‐６‐クロロ‐２‐メトキシアクリジン、ＡＢＱ、アシッドフクシン、ＡＣＭＡ（９‐アミノ‐６‐クロロ‐２‐メトキシアクリジン）、アクリジンオレンジ、アクリジンレッド、アクリジンイエロー、アクリフラビン、アクリフラビンフォイルゲンＳＩＴＳＡ、エクオリン（発光タンパク質）、自家蛍光タンパク質、Alexa Fluor３５０（商標）、Alexa Fluor４３０（商標）、Alexa Fluor４８８（商標）、Alexa Fluor５３２（商標）、Alexa Fluor５４６（商標）、Alexa Fluor５６８（商標）、Alexa Fluor５９４（商標）、Alexa Fluor６３３（商標）、Alexa Fluor６４７（商標）、Alexa Fluor６６０（商標）、Alexa Fluor６８０（商標）、アリザリンコンプレキソン、アリザリンレッド、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、ＡＭＣ、ＡＭＣＡ‐Ｓ、ＡＭＣＡ（アミノメチルクマリン）、ＡＭＣＡ‐Ｘ、アミノアクチノマイシンＤ、アミノクマリン、アミノメチルクマリン（ＡＭＣＡ）、アニリンブルー、ステアリン酸アントロシル、ＡＰＣ（アロフィコシアニン）、ＡＰＣ‐Ｃｙ７、ＡＰＴＲＡ‐ＢＴＣ、ＡＰＴＳ、アストラゾンブリリアントレッド４Ｇ、アストラゾンオレンジＲ、アストラゾンレッド６Ｂ、アストラゾンイエロー７ＧＬＬ、アタブリン、ＡＴＴＯ‐ＴＡＧ（商標）ＣＢＱＣＡ、ＡＴＴＯ‐ＴＡＧ（商標）ＦＱ、オーラミン、オーロホスフィンＧ、オーロホスフィン、ＢＡＯ９（ビスアミノフェニルオキサジアゾール）、ＢＣＥＣＦ（高ｐＨ）、ＢＣＥＣＦ（低ｐＨ）、ベルベリン硫酸塩、ベータラクタマーゼ、ＢＦＰ青方偏移ＧＦＰ（Ｙ６６Ｈ：青色蛍光タンパク質）、ＢＦＰ／ＧＦＰ ＦＲＥＴ、ビマン、ビスベンズアミド、ビスベンズアミド（ヘキスト）、ｂｉｓ‐ＢＴＣ、ブランコフォルＦＦＧ、ブランコフォルＳＶ、ＢＯＢＯ（商標）‐１、ＢＯＢＯ（商標）‐３、ボディパイ４９２／５１５、ボディパイ４９３／５０３、ボディパイ５００／５１０、ボディパイ５０５／５１５、ボディパイ５３０／５５０、ボディパイ５４２／５６３、ボディパイ５５８／５６８、ボディパイ５６４／５７０、ボディパイ５７６／５８９、ボディパイ５８１／５９１、ボディパイ６３０／６５０‐Ｘ、ボディパイ６５０／６６５‐Ｘ、ボディパイ６６５／６７６、ボディパイＦｌ、ボディパイＦＬ ＡＴＰ、ボディパイＦｌ‐セラミド、ボディパイＲ６Ｇ ＳＥ、ボディパイＴＭＲ、ボディパイＴＭＲ‐Ｘ 抱合体、ボディパイＴＭＲ‐Ｘ，ＳＥ、ボディパイＴＲ、ボディパイＴＲ ＡＴＰ、ボディパイＴＲ‐Ｘ ＳＥ、ＢＯ‐ＰＲＯ（商標）‐１、ＢＯ‐ＰＲＯ（商標）‐３、ブリリアントスルホフラビンＦＦ、ブリリアントバイオレット４２１、ブリリアントバイオレット５１０、ブリリアントバイオレット６０５、ブリリアントバイオレット６５０、ブリリアントバイオレット７１１、ブリリアントバイオレット７８６、ＢＴＣ、ＢＴＣ‐５Ｎ、カルセイン、カルセインブルー、カルシウムクリムソン（商標）、カルシウムグリーン、カルシウムグリーン‐１、カルシウムグリーン‐２、カルシウムグリーン‐５Ｎ、カルシウムグリーン‐Ｃ１８、カルシウムオレンジ、カルコフロールホワイト、カルボキシ‐Ｘ‐ホダミン（５‐ＲＯＸ）、カスケードブルー（商標）、カスケードイエロー、カテコールアミン、ＣＣＦ２（GeneBLazer）、ＣＦＤＡ、ＣＦＰ（シアン蛍光タンパク質）、ＣＦ４０５Ｓ、ＣＦ４８８Ａ、ＣＦ４８８、ＣＦ５４３、ＣＦ６４７、ＣＦ７５０、ＣＦ７６０、ＣＦ７８０、ＦＰ／ＹＦＰ ＦＲＥＴ、クロロフィル、クロモマイシンＡ、クロモマイシンＡ、ＣＬ‐ＮＥＲＦ、ＣＭＦＤＡ、セレンテラジン、セレンテラジンｃｐ、セレンテラジンｆ、セレンテラジンｆｃｐ、セレンテラジンｈ、セレンテラジンｈｃｐ、セレンテラジンｉｐ、セレンテラジンｎ、セレンテラジンＯ、クマリンファロイジン、Ｃ‐フィコシアニン、ＣＰＭメチルクマリン、ＣＴＣ、ＣＴＣホルマザン、Ｃｙ２（商標）、Ｃｙ３．１ ８、Ｃｙ３．５（商標）、Ｃｙ３（商標）、Ｃｙ５．１ ８、Ｃｙ５．５（商標）、Ｃｙ５（商標）、Ｃｙ７（商標）、シアンＧＦＰ、サイクリックＡＭＰフルオロセンサ（ＦｉＣＲｈＲ）、CyQuant 細胞増殖アッセイ、ダブシル、ダンシル、ダンシルアミン、ダンシルカダベリン、ダンシルクロリド、ダンシルＤＨＰＥ、ＤＡＰＩ、ダポキシル（Dapoxyl）、ダポキシル２（Dapoxyl２）、ダポキシル２（Dapoxyl３）、ＤＣＦＤＡ、ＤＣＦＨ（ジクロロジヒドロフルオレセインジアセタート）、ＤＤＡＯ、ＤＨＲ（ジヒドロローダミン１２３）、ジ‐４‐ＡＮＥＰＰＳ、ジ‐８‐ＡＮＥＰＰＳ、ＤｉＡ（４‐ジ‐１６‐ＡＳＰ）、ジクロロジヒドロフルオレセインジアセタート（ＤＣＦＨ）、ＤｉＤ‐脂溶性トレーサー、ＤｉＤ（ＤｉＩＣ１８（５））、ＤＩＤＳ、ジヒドロローダミン１２３（ＤＨＲ）、ＤｉＩ（ＤｉＩＣ１８（３））、ジニトロフェノール、ＤｉＯ（ＤｉＯＣ１８（３））、ＤｉＲ、ＤｉＲ（ＤｉＩＣ１８（７））、ＤＭ‐ＮＥＲＦ（高ｐＨ）、ＤＮＰ、ドーパミン、ＤｓＲｅｄ、ＤＴＡＦ、ＤＹ‐６３０‐ＮＨＳ、ＤＹ‐６３５‐ＮＨＳ、ＥＢＦＰ（高感度青色蛍光タンパク質）、ＥＣＦＰ（高感度シアン蛍光タンパク質）、ＥＧＦＰ（高感度緑色蛍光タンパク質）、ＥＬＦ９７、エオシン、ER‐Tracker（商標）グリーン、ER‐Tracker（商標）レッド、ER‐Tracker （商標）ブルー‐ホワイトＤＰＸ、エリスロシン、エリスロシンＩＴＣ、エチジウムブロミド、エチジウムホモダイマー１（ＥｔｈＤ‐１）、オイクリシン、ユーコライト（EukoLight）、塩化ユウロピウム（ＩＩＩ）、ＥＹＦＰ（高感度黄色蛍光タンパク質）、ファストブルー、ＦＤＡ、ＦＩＦ（ホルムアルデヒド誘起蛍光）、ＦＩＴＣ、ＦＩＴＣ抗体、フラゾオレンジ：Ｆｌｕｏ‐３、Ｆｌｕｏ‐４、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、フルオレセインジアセタート、フルオロエメラルド、フルオロゴールド（ヒドロキシスチルバミジン）、フルオロルビー、フルオロＸ、ＦＭ１‐４３（商標）、ＦＭ４‐４６、フラレッド（商標）（高ｐＨ）、フラレッド（商標）／Ｆｌｕｏ‐３、フラ‐２，高カルシウム、フラ‐２，低カルシウム、フラ‐２／ＢＣＥＣＦ、ゲナクリルブリリアントレッドＢ、ゲナクリルブリリアントイエロー１０ＧＦ、ゲナクリルピンク３Ｇ、ゲナクリルイエロー５ＧＦ、GeneBlazer（ＣＣＦ２）、ＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）、ＧＦＰ赤方偏移（ｒｓＧＦＰ）、ＧＦＰワイルドタイプ，非紫外光励起（ｗｔＧＦＰ）、ＧＦＰワイルドタイプ，紫外光励起（ｗｔＧＦＰ）、ＧＦＰｕｖ、シュウ酸、グラニュラブルー、ヘマトポルフィリン、ヘキスト３３２５８、ヘキスト３３３４２、ヘキスト３４５８０、ＨＰＴＳ、ヒドロキシクマリン、ヒドロキシスチルバミジン（フルオロゴールド）、ヒドロキシトリプタミン、Ｉｎｄｏ‐１，高カルシウム、Ｉｎｄｏ‐１，低カルシウム、インドジカルボシアニン（ＤｉＤ）、インドトリカルボシアニン（ＤｉＲ）、イントラホワイトＣｆＪＣ‐１、ＪＯ‐ＪＯ‐１、ＪＯ‐ＰＲＯ‐１、レーザープロ、ラウロダン、ＬＤＳ７５１、ロイコホールＰＡＦ、ロイコホールＳＦ、ロイコホールＷＳ、リサミンローダミン、リサミンローダミンＢ、カルセイン／エチジウムホモダイマー、ＬＯＬＯ‐１、ＬＯ‐ＰＲＯ‐１、ルシファーイエロー、リソトラッカーブルー、リソトラッカーブルー‐ホワイト、
リソトラッカーグリーン、リソトラッカーレッド、リソトラッカーイエロー、リソセンサーブルー、リソセンサーグリーン、リソセンサーイエロー／ブルー、マググリーン、マグダラレッド（フロキシンＢ）、マグ‐フラレッド、マグ‐フラ‐２、マグ‐フラ‐５、マグ‐Ｉｎｄｏ‐１、マグネシウムグリーン、マグネシウムオレンジ、マラカイトグリーン、マリーナブルー、マキシロンブリリアントフラビン１０ＧＦＦ、マキシロンブリリアントフラビン８ＧＦＦ、メロシアニン、メトキシクマリン、ミトトラッカーグリーン、ミトトラッカーオレンジ、ミトトラッカーレッド、ミトラマイシン、モノブロモビマン、モノブロモビマン（ｍＢＢｒ‐ＧＳＨ）、モノクロロビマン、ＭＰＳ（メチルグリーンピロニンスチルベン）、ｍストロベリー（mStrawberry）、ＮＢＤ、ＮＢＤアミン、ナイルレッド、ニトロベンゾオキサジドール、ノルアドレナリン、ヌクレアファストレッド、ヌクレアイエロー、ナイロサンブリリアントイアビンＥ８Ｇ、オレゴングリーン（商標）、オレゴングリーン（商標）４８８、オレゴングリーン（商標）５００、オレゴングリーン（商標）５１４、パシフィックブルー、パラローズアニリン（フォイルゲン）、ＰＢＦＩ、ＰＥ‐Ｃｙ５、ＰＥ‐Ｃｙ７、ＰｅｒＣＰ、ＰｅｒＣＰ‐Ｃｙ５．５、ＰＥ‐テキサスレッド（レッド６１３）、フロキシンＢ（マグダラレッド）、ホレートＡＲ、ホレートＢＫＬ、ホレートＲｅｖ、ホレートＲＰＡ、ホスフィン３Ｒ、フォトレジスト、フィコエリトリンＢ、フィコエリトリンＲ、ＰＫＨ２６（シグマ）、ＰＫＨ６７、ＰＭＩＡ、ポントクロームブルーブラック、ＰＯＰＯ‐１、ＰＯＰＯ‐３、ＰＯ‐ＰＲＯ‐１、ＰＯ‐ＰＲＯ‐３、プリムリン、プロシオンイエロー、プロピジウムヨウ化物（ＰＩ）、ピレン、ピロニン、ピロニンＢ、ピロザルブリリアントフラビン７ＧＦ、ＱＤ４００、ＱＤ４２５、ＱＤ４５０、ＱＤ５００、ＱＤ５２０、ＱＤ５２５、ＱＤ５３０、ＱＤ５３５、ＱＤ５４０、ＱＤ５４５、ＱＤ５６０、ＱＤ５６５、ＱＤ５７０、ＱＤ５８０、ＱＤ５８５、ＱＤ５９０、ＱＤ６００、ＱＤ６０５、ＱＤ６１０、ＱＤ６２０、ＱＤ６２５、ＱＤ６３０、ＱＤ６５０、ＱＤ６５５、ＱＤ７０５、ＱＤ８００、ＱＤ１０００、ＱＳＹ７、キナクリンマスタード、レッド６１３（ＰＥ‐テキサスレッド）、レソルフィン、ＲＦＰ、ＲＨ４１４、Ｒｈｏｄ‐２、ローダミン、ローダミン１１０、ローダミン１２３、ローダミン５ＧＬＤ、ローダミン６Ｇ、ローダミンＢ、ローダミンＢ２００、ローダミンＢエクストラ、ローダミンＢＢ、ローダミンＢＧ、ローダミングリーン、ローダミンファロイジン、ローダミンファロイジン、ローダミンレッド、ローダミンＷＴ、ローズベンガル、Ｒ‐フィコシアニン、Ｒ‐フィコエリスリン、ｒｓＧＦＰ（赤方偏移ＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ））、Ｓ６５Ａ、Ｓ６５Ｃ、Ｓ６５Ｌ、Ｓ６５Ｔ、サファイアＧＦＰ、ＳＢＦＩ、セロトニン、Sevronブリリアントレッド２Ｂ、Sevronブリリアントレッド４Ｇ、SevronブリリアントレッドＢ、Sevronオレンジ、SevronイエローＬ、ｓｇＧＦＰ（商標）（スーパーグローＧＦＰ（super glow GFP））、ＳＩＴＳ（プリムリン）、ＳＩＴＳ（スチルベンイソチオスルホン酸）、ＳＮＡＦＬカルセイン、ＳＮＡＦＬ‐１、ＳＮＡＦＬ‐２、ＳＮＡＲＦカルセイン、ＳＮＡＲＦ１、ソディウムグリーン、スペクトラムアクア、スペクトラムグリーン、スペクトラムオレンジ、スペクトラムレッド、ＳＰＱ（６‐メトキシ‐Ｎ‐（３‐スルホプロピル）キノリニウム）、スチルベン、スルホローダミンB can C 、スルホローダミンＧエクストラ、ＳＹＴＯ１１、ＳＹＴＯ１２、ＳＹＴＯ１３、ＳＹＴＯ１４、ＳＹＴＯ１５、ＳＹＴＯ１６、ＳＹＴＯ１７、ＳＹＴＯ１８、ＳＹＴＯ２０、ＳＹＴＯ２１、ＳＹＴＯ２２、ＳＹＴＯ２３、ＳＹＴＯ２４、ＳＹＴＯ２５、ＳＹＴＯ４０、ＳＹＴＯ４１、ＳＹＴＯ４２、ＳＹＴＯ４３、ＳＹＴＯ４４、ＳＹＴＯ４５、ＳＹＴＯ５９、ＳＹＴＯ６０、ＳＹＴＯ６１、ＳＹＴＯ６２、ＳＹＴＯ６３、ＳＹＴＯ６４、ＳＹＴＯ８０、ＳＹＴＯ８１、ＳＹＴＯ８２、ＳＹＴＯ８３、ＳＹＴＯ８４、ＳＹＴＯ８５、ＳＹＴＯＸブルー、ＳＹＴＯＸグリーン、ＳＹＴＯＸオレンジ、ＳＹＴＯＸレッド、テトラサイクリン、テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）、テキサスレッド（商標）、レキサスレッド‐Ｘ（商標）抱合体、チアジカルボシアニン（ＤｉＳＣ３）、チアジンレッドＲ、チアゾールオレンジ、チオフラビン５、チオフラビンＳ、チオフラビンＴＣＮ、チオライト、チオゾールオレンジ、チノポールＣＢＳ（カルコフロールホワイト）、ＴＭＲ、ＴＯ‐ＰＲＯ‐１、ＴＯ‐ＰＲＯ‐３、ＴＯ‐ＰＲＯ‐５、ＴＯＴＯ‐１、ＴＯＴＯ‐３、トリカラー（ＰＥ‐Ｃｙ５）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、トゥルーブルー、トゥルーレッド、チューブリントラッカー（商標）グリーン、ウルトラライト、ウラニンＢ、UvitexＳＦＣ、ｗｔＧＦＰ（ワイルドタイプＧＦＰ）、ＷＷ７８１、Ｘ‐ローダミン、ＸＲＩＴＣ、キシレンオレンジ、Ｙ６６Ｆ、Ｙ６６Ｈ、Ｙ６６Ｗ、イエローＧＦＰ（黄方偏移）、緑色蛍光タンパク質、ＹＦＰ（黄色蛍光タンパク質）、ＹＯ－ＰＲＯ－１、ＹＯ－ＰＲＯ－３、ＹＯＹＯ－１、ＹＯＹＯ－３、ＣＦ３５０、ＣＦ４０５Ｓ、ＣＦ４０５Ｍ、ＣＦ４０５Ｌ、ＣＦ４３０、ＣＦ４４０、ＣＦ４５０、ＣＦ４８８Ａ、ＣＦ５０３Ｒ、ＣＦ５１４、ＣＦ５３２、ＣＦ５４３、ＣＦ５５０Ｒ、ＣＦ５５５、ＣＦ５６８、ＣＦ５７０、ＣＦ５８３、ＣＦ５９４、ＣＦ６２０Ｒ、ＣＦ６３３、ＣＦ６４０Ｒ、ＣＦ６４７、ＣＦ６６０ｃ、ＣＦ６６０Ｒ、ＣＦ６８０、ＣＦ６８０Ｒ、ＣＦ７００、ＣＦ７５０、ＣＦ７７０、ＣＦ７９０、ＣＦ８００、ＣＦ８２０、ＤＹ－３４４ＩＮ、ＤＹ－３５０ＸＬ、ＤＹ－３６０ＸＬ、ＤＹ－３７０ＸＬ、ＤＹ－３７６ＸＬ、ＤＹ－３８０ＸＬ、ＤＹ－３９５ＸＬ、ＤＹ－３９６ＸＬ、ＤＹ－４８０ＸＬ、ＤＹ－４８１ＸＬ、ＤＹ－４８５ＸＬ、ＤＹ－５１０ＸＬ、ＤＹ－５１１ＸＬ、ＤＹ－５２０ＸＬ、ＤＹ－５２１ＸＬ、ＤＹ－６０１ＸＬ、ＤＹ－３５０、ＤＹ－３５１、ＤＹ－４０５、ＤＹ－４１０、ＤＹ－４１５、ＤＹ－４３０、ＤＹ－４３１、ＤＹ－４７８、ＤＹ－４８８、ＤＹ－４９０、ＤＹ－４９５、ＤＹ－５０５、ＤＹ－５３０、ＤＹ－５４６、ＤＹ－５４７、ＤＹ－５４７Ｐ１、ＤＹ－５４８、ＤＹ－５４８Ｐ１、ＤＹ－５４９、ＤＹ－５４９Ｐ１、ＤＹ－５５０、ＤＹ－５５４、ＤＹ－５５５、ＤＹ－５５６、ＤＹ－５５７、ＤＹ－５６０、ＤＹ－５８０、ＤＹ－５８５、ＤＹ－５９０、ＤＹ－５９１、ＤＹ－５９４、ＤＹ－６０５、ＤＹ－６１０、ＤＹ－６１５、ＤＹ－６３０、ＤＹ－６３１、ＤＹ－６３２、ＤＹ－６３３、ＤＹ－６３４、ＤＹ－６３５、ＤＹ－６３６、ＤＹ－６４１、ＤＹ－６４３、ＤＹ－６４７、ＤＹ－６４７Ｐ１、ＤＹ－６４８、ＤＹ－６４８Ｐ１、ＤＹ－６４９、ＤＹ－６４９Ｐ１、ＤＹ－６５０、ＤＹ－６５１、ＤＹ－６５２、ＤＹ－６５４、ＤＹ－６６０Ｐ１、ＤＹ－６７５、ＤＹ－６７６、ＤＹ－６７７、ＤＹ－６７８、ＤＹ－６７９Ｐ１、ＤＹ－６８０、ＤＹ－６８１、ＤＹ－６８２、ＤＹ－６８４、ＤＹ－７００、ＤＹ－７０１、ＤＹ－７０３、ＤＹ－７０４、ＤＹ－７０５、ＤＹ－７０６、ＤＹ－７２０、ＤＹ－７３０、ＤＹ－７３１、ＤＹ－７３２、ＤＹ－７３４、ＤＹ－７３６、ＤＹ－７４９、ＤＹ－７４７Ｐ１、ＤＹ－７４９Ｐ１、ＤＹ－７５０、ＤＹ－７５１、ＤＹ－７５２、ＤＹ－７５４、ＤＹ－７６５、ＤＹ－７７６、ＤＹ－７７７、ＤＹ－７７８、ＤＹ－７８０、ＤＹ－７８１、ＤＹ－７８２、ＤＹ－７８４、ＤＹ－８００、ＤＹ－８０５、ＤＹ－８２０、ＤＹ－８３１、ＤＹ－８４５、ＤＹ－８６５ならびにこれらの組み合わせおよび誘導体が挙げられるが、これらには限定されない。一実施形態では、検出構成成分、例えば有機蛍光体は、約０．０１ｋＤ以上の分子量を有するのが良く、かかる分子量としては、少なくとも１ｋＤ、少なくとも１０ｋＤ、少なくとも２５ｋＤ、少なくとも５０ｋＤ、少なくとも７５ｋＤ、少なくとも１００ｋＤ、少なくとも１５０ｋＤ、少なくとも２００ｋＤ、少なくとも２５０ｋＤ、少なくとも３００ｋＤ、少なくとも３４０ｋＤ、少なくとも３５０ｋＤ、少なくとも５００ｋＤ、および少なくとも７５０ｋＤが挙げられるが、これらには限定されない。

【0031】

以下の説明において、「染料」または「標識」という用語は、区別なく用いられ、これらは、検出構成成分に結合されまたはこれと相互作用する親和性分子を表すために用いられる。結合または相互作用は、直接的または間接的である。直接的結合または相互作用は、バイオマーカーと検出構成成分との共有結合性または非共有結合性相互作用を含む。間接的結合または相互作用は、結合ペアを形成する少なくとも第１および第２の相補分子の使用を含む。第１および第２の相補分子は、組み合わせ状態で、以下の方法、すなわち、疎水性相互作用、イオン性相互作用、水素結合性相互作用、非共有結合性相互作用、共有結合性相互作用、親和性相互作用などのうちの少なくとも１つの仕方で結合しまたは相互作用する結合ペアである。結合ペアとしては、免疫型結合ペア、例えば抗原抗体反応、抗原抗体フラグメント、ハプテン‐抗ハプテン、または一次抗体‐二次抗体、非免疫型結合ペア、例えばビオチン‐アビジン、ビオチン‐ストレプトアビジン、葉酸‐葉酸結合タンパク質、ホルモン‐ホルモン受容体、レクチン‐特定の炭水化物、酵素‐酵素、酵素‐基質、酵素‐基質類似体、酵素‐偽基質（酵素活性によっては触媒できない基質類似体）、酵素‐補因子、酵素‐モジュレータ、酵素‐阻害剤、またはビタミンＢ１２‐内因子が挙げられるが、これらには限定されない。結合ペアの他の適当な例としては、相補的核酸フラグメント（相補的ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチドを含む）、プロテインＡ抗体、プロテインＧ抗体、核酸‐核酸結合タンパク質、ポリマーリンカー（例えば、ポリエチレングリコール）、またはポリヌクレオチド‐ポリヌクレオチド結合タンパク質が挙げられる。結合ペアは、増幅法に含まれる場合がありまたは増幅法として使用できる。増幅法はまた、信号を増大させるようバイオマーカーに結合されまたはこれと相互作用する検出構成成分の数を増大させるよう実施される。一実施形態では、結合ペアが用いられる場合、染料は、あらかじめ共役されるのが良く、例えば、標識化、染色、または付加ステップ中、親和性分子がサンプルに付加されたときの検出構成成分に既に結合されまたは相互作用するようになっている。一実施形態では、結合ペアが用いられる場合、染料がサンプル内に共役されるのが良く、その結果、標識化、染色、または付加ステップが親和性分子‐最初の結合分子抱合体、第２の結合ペア分子‐検出構成成分抱合体の導入（任意所望のまたは適当な順序で）を含み、第１および第２の結合ペア分子は、互いに相補するとともに互いに結合しまたは相互作用する。

【0032】

さらに、「複数の染料」は、親和性分子および／または検出構成成分が互いに異なる２つ以上の染料を表すために使用される場合がある。例えば、抗CK-Alexa 647が抗EpCAM-Alexa 647とは異なる。別の例として、抗CK-Alexa 647は、抗CK-Alexa 488とは異なる。

【0033】

以下の説明において、「抱合体」という用語は、第２の化学物質、分子、構成成分などに結合されまたはこれと相互作用する第１の化学物質、分子、構成成分などを表すために用いられる。結合または相互作用は、直接的または間接的である。直接的結合または相互作用は、バイオマーカーと検出構成成分との共有結合性または非共有結合性相互作用を含む。間接的結合または相互作用は、結合ペアを形成する少なくとも第１および第２の相補分子の使用を含む。第１および第２の相補分子は、組み合わせ状態で、以下の方法、すなわち、疎水性相互作用、イオン性相互作用、水素結合性相互作用、非共有結合性相互作用、共有結合性相互作用、親和性相互作用などのうちの少なくとも１つの仕方で結合しまたは相互作用する結合ペアである。結合ペアとしては、免疫型結合ペア、例えば抗原抗体反応、抗原抗体フラグメント、ハプテン‐抗ハプテン、または一次抗体‐二次抗体、非免疫型結合ペア、例えばビオチン‐アビジン、ビオチン‐ストレプトアビジン、葉酸‐葉酸結合タンパク質、ホルモン‐ホルモン受容体、レクチン‐特定の炭水化物、酵素‐酵素、酵素‐基質、酵素‐基質類似体、酵素‐偽基質（酵素活性によっては触媒できない基質類似体）、酵素‐補因子、酵素‐モジュレータ、酵素‐阻害剤、またはビタミンＢ１２‐内因子が挙げられるが、これらには限定されない。結合ペアの他の適当な例としては、相補的核酸フラグメント（相補的ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチドを含む）、プロテインＡ抗体、プロテインＧ抗体、核酸‐核酸結合タンパク質、ポリマーリンカー（例えば、ポリエチレングリコール）、またはポリヌクレオチド‐ポリヌクレオチド結合タンパク質が挙げられる。

【0034】

以下の説明において、「信号」という用語は、データを１つの場所または源から別の場所または検出器に伝える電流または電磁場を表すために用いられる。例えば、信号を検出構成成分によって発光させることができ、それによりサンプルまたは標的分析物、例えば細胞上または細胞内の検出構成成分の存在を伝えることができる。

【0035】

以下の説明において、「多重化」という用語は、サンプルを複数の染料で標識化するプロセスまたはキットを表すために用いられる。検出構成成分の各々は、互いに異なる波長を放出する。例えば、少なくとも２つの染料は、サンプルを標識化するよう使用できる。多重化は、２個、４個、６個、８個、１０個、１２個、１６個、２０個、２４個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個またはそれ以上の染料を含むのが良い。

【0036】

標的分析物上のバイオマーカーを標識化する例示の方法について説明する。一実施形態では、少なくとも１つの標的分析物を含むことが疑われるサンプルを得る。サンプル収集および／または処理の適当な装置、システム、および／または方法としては、以下の米国特許および米国特許出願公開、すなわち、米国特許第７，０７４，５７７号明細書、同第７，２２０，５９３号明細書、同第７，３２９，５３４号明細書、同第７，３５８，０９５号明細書、同第７，６２９，１７６号明細書、同第７，９１５，０２９号明細書、同第７，９１９，０４９号明細書、同第８，０１２，７４２号明細書、同第９，０３９，９９９号明細書、同第９，２１７，６９７号明細書、同第９，４９２，８１９号明細書、同第９，５１３，２９１号明細書、同第９，５３３，３０３号明細書、同第９，５３９，５７０号明細書、同第９，５４１，４８１号明細書、同第９，６２５，３６０号明細書、同第１０，３４５，２３７号明細書、米国特許出願公開第２０１４／０１６１６８８号明細書、同第２０１７／００１４８１９号明細書、同第２０１７／００５９５５２号明細書、同第２０１７／００７４７５９号明細書、米国特許仮出願第６２／８７３，３９０号明細書のうちの１つ以上に記載された装置、システム、および／または方法を含むのが良く、これら米国特許および米国特許出願公開の各々を参照により引用し、その記載内容全体を本明細書の一部とする。標的分析物の回収、隔離、または採取に適した装置、システム、および／または方法は、以下の米国特許および米国特許出願公開、すなわち、米国特許第９，２２２，９５３号明細書、同第９，４４０，２３４号明細書、同第９，５１９，００２号明細書、同第９，８１０，６０５号明細書、米国特許出願公開第２０１７／０２１９４６３号明細書、同第２０１７／０２７６５７５号明細書のうちの１つ以上に記載された装置、システム、および／または方法を含むのが良く、これら米国特許および米国特許出願公開の各々を参照により引用し、その記載内容全体を本明細書の一部とする。

【0037】

一実施形態では、サンプルは、サンプル収集および／または処理後に染色を受けるのが良い。一実施形態では、サンプルを多重化するのが良い。少なくとも１つの染料が例えばオートステイナー（autostainer）によりまたはオペレータによって手動で標識のためにサンプルに添加される。一実施形態では、少なくとも１つの標的分析物を染色する。一実施形態では、少なくとも１つの非標的分析物または非標的物質を染色する。一実施形態では、少なくとも１つの標的分析物および少なくとも１つの非標的分析物または物質を染色する。

【0038】

染色後、サンプルを画像化するのが良く、それにより、染色されたサンプルを光源、例えばレーザまたは発光ダイオードからの励起光、例えば赤外光、赤色光、青色光、緑色光、および／または紫外光の１つ以上の波長で照明する。画像化は、フローサイトメーターまたは顕微鏡、例えば蛍光顕微鏡、スキャナ、または任意他の適当な画像化システムもしくはモダリティにより行われるのが良い。一実施形態では、画像化は、検出構成成分が画像化されると、明視野および／または暗視野照明、蛍光など（これらには限定されない）を含むスペクトルにわたって信号を提供することができるシステムで実施されるのが良い。生成された画像を複数の検出構成成分が用いられる場合に重ね合わせるのが良い。発光、反射、回折、散乱およびこれらの組み合わせが検出／画像化に用いられる。画像を分析すると、例えば標的分析物を回収しまたは採取することが望ましい場合、標的分析物を検出し、数え上げ、かつ／あるいはその存在場所を突き止めることができる。画像化は、管内で、顕微鏡スライド上で、または画像化のための任意適当な容器または基体内で実施される。

【0039】

上記方法は、画像化顕微鏡、スキャナ、フローサイトメーター、またはマイクロフルイディックデバイス、例えばチップもしくはマイクロチャネルのうちの少なくとも１つによって実施でき、あるいは、この方法は、上記の任意の組み合わせによって実施できる。説明する方法は、検出構成成分が画像化されると、明視野および／または暗視野照明、蛍光など（これらには限定されない）を含むスペクトルにわたって信号を提供することができるシステムで使用できる。

【0040】

画像化システム用の光学トレーン
蛍光顕微鏡検査法では、蛍光体（または蛍光染料）が検査または研究のためのサンプル、例えば関心のあるタンパク質または他の分子、組織、および細胞を染色するために用いられる。蛍光体は、一波長の光を吸収し、別の波長の光（蛍光）を放出することができる。典型的な蛍光顕微鏡セットアップでは、３つのフィルタ、すなわち、励起フィルタ、発光フィルタ、およびダイクロイックフィルタが用いられる。各蛍光体は、特有の吸収または励起波長帯域を有し、励起フィルタは、当該励起波長範囲を透過するよう選択される。蛍光体は、いったん励起されると、ある範囲の波長を放出する。発光フィルタは、所望の発光波長を透過する。励起波長を反射し、発光波長を透過するよう特別に設計されたダイクロイックフィルタは、励起チャンネルと発光チャンネルを分離するために用いられる。ダイクロイックフィルタはまた、発光波長を反射し、励起波長を透過するよう設計される場合がある。

【0041】

図１は、蛍光顕微鏡型画像化システムの光学トレーンの一実施形態を示している。光路は、少なくとも１つの励起光１０４、例えば可視スペクトル、赤外線（“ＩＲ”）、または紫外線（“ＵＶ”）スペクトルの光を放出する励起源１０２を含むのが良い。励起源１０２としては、レーザ光源、ＬＥＤ光源、キセノン光源、ハロゲン光源、白熱光源、または他の適当な光源が挙げられる。幾つかの実施形態では、励起光１０４は、少なくとも第１の励起波長１０６および第２の励起波長１０８を含む複数の波長を有する。かかる実施形態では、励起光１０４は、励起スペクトルセレクタ１１０と相互作用し、その結果、第１の励起波長１０６は、励起スペクトルセレクタ１１０を通り、第２の励起波長１０８は、励起スペクトルセレクタ１１０を通ることがないよう遮断される。特定の実施形態では、励起源セレクタ１１０は、１つ以上の光学フィルタまたは干渉フィルタ、例えば１つ以上の可変励起フィルタを含むのが良い。かかる一実施形態では、第１の励起波長１０６が励起スペクトルセレクタ１１０の励起フィルタを出た後、この第１の励起波長は、次に、第２のフィルタ１１２で反射される。第２のフィルタ１１２は、第１の励起波長１０６の方向を対物レンズ１１４中に向ける。第２のフィルタ１１２は、ダイクロイック、ポリクロイック、ショートパス、ロングパス、バンドパス、バンドストップ、または任意適当なフィルタであって良い。

【0042】

引き続き図１を参照すると、対物レンズ１１４は、第２のフィルタ１１２で反射された第１の励起波長１０６を受け取って第１の励起波長１０６をサンプルまたはそのフラクション１３４上、その中、またはその近くの一点または表面のところに集束させる。第１の励起波長１０６は、サンプルまたはそのフラクション１３４上またはその中の第１の検出構成成分（図示せず）を刺激し、それにより第１の検出構成成分（図示せず）が第１の発光波長信号１１６を放出する。第１の発光波長信号１１６は、対物レンズ１１４によって捕捉され、第１の発光波長を通すよう構成された第２のフィルタ１１２を透過し、発光スペクトルセレクタ１３０を透過し、そして発光検出器１４０に至り、ここで原画像が捕捉されまたは収集される。発光検出器１４０は、画像データを捕捉するための電荷結合素子（“ＣＣＤ”）、ＣＭＯＳカメラ、科学ＣＭＯＳカメラ、フォトダイオード、光電子増倍管などであるのが良く、画像データは、次に、画像にコンパイルされ、コンピュータまたは関連ソフトウェアまたはプログラムによって処理されて分析されるのが良い。ある特定の実施形態では、第２のフィルタ１１２は、原型的には蛍光体を励起する短い波長を反射し、蛍光体によって放出される長い波長を透過するよう構成されたダイクロイックフィルタである。第２のフィルタ１１２と発光スペクトルセレクタ１３０は、一緒になって、非発光エネルギーおよび迷光が発光検出器１４０のセンサに到達するのを制限しまたは阻止するよう構成されている。

【0043】

別の実施形態では、励起源１０２は、励起光１０４を放出し、次に、励起スペクトルセレクタ１１０と相互作用し、その結果、第２の励起波長１０８は、励起スペクトルセレクタ１１０を通り、第１の励起波長１０６は、励起スペクトルセレクタ１１０を通らないよう遮断される。次に、第２の励起波長１０８は、第２のフィルタ１１２で反射され、それにより第２の励起波長１０８の向きが対物レンズ１１４中に変えられる。対物レンズ１１４は、第２の励起波長１０８を受け取って第２の励起波長１０８をサンプルまたはそのフラクション１３４上、その中、またはその近くの一点または表面のところに集束させる。第２の励起波長１０８は、サンプルまたはそのフラクション１３４上またはその中の第２の検出構成成分（図示せず）を刺激し、それにより第２の検出構成成分（図示せず）が第２の発光波長信号１１８を放出する。第２の発光波長信号１１８は、対物レンズ１１４によって捕捉され、第２のフィルタ１１２を透過し、発光スペクトルセレクタ１３０を通され、そして発光検出器１４０上に至るのが良く、ここで原画像を捕捉するのが良い。説明したプロセスを所望の数の検出構成成分について１回以上実施するのが良い。

【0044】

変形実施形態では、励起源１０２は、励起光１０４を１つ以上の別々の波長、例えば第１の励起波長１０６および第２の励起波長１０８として放出するよう構成されているのが良い。他の実施形態では、図１に示された蛍光顕微鏡の光路は、オプションとして、励起スペクトルセレクタ１１０を含まない。

【0045】

引き続き図１を参照すると、サンプルまたはそのフラクション１３４は、ベース１３２上にまたはカバー１３６とベース１３２との間に配置されるのが良い。カバー１３６およびベース１３２は、画像化を可能にするよう光学的にクリアであるのが良くまたは光学的に透明であるのが良い。幾つかの実施形態では、ベース１３２およびカバー１３６は、ガラス、不活性金属、金属、半金属、有機または無機材料、およびプラスチック材料、例えばポリマー、ならびにこれらの組み合わせのうちの１つ以上で構成されるのが良い。

【0046】

サンプル１３４、カバー１３６、およびベース１３２は、サンプル１３４を必要に応じてｘ方向、ｙ方向、またはｚ方向に動かすようプラットホーム１２８上に配置されるのが良い。プラットホーム１２８は、第１の励起波長１０６をサンプルまたはそのフラクション１３４内、その上、またはその近くに対物レンズ１１４によって集束させることができるアパーチュア１３８を有するのが良い。プラットホーム１２８は、駆動装置１２０によって駆動されるのが良く、駆動装置１２０は、サンプル１３４を位置決めするためにｚ方向駆動装置１２４、ｘ方向駆動装置１２２、およびｙ方向駆動装置１２６のうちの少なくとも１つを含む。駆動装置１２０は、モータ、例えばサーボモータまたはステッピングモータ、圧電アクチュエータ、ソレノイドなどであるのが良い。

【0047】

光路は、境界光信号のＳＮ比を増大させるよう、例えば共焦点顕微鏡に設けられたカットオフアパーチュア（図示せず）をさらに含むのが良い。

【0048】

一実施形態では、励起スペクトルセレクタ１１０または発光スペクトルセレクタ１３０は、所望の波長の光を遮断しまたは通すよう構成された少なくとも一つの固定フィルタまたは少なくとも一つの可変もしくは傾動可能なフィルタであるのが良い。一実施形態では、励起スペクトルセレクタ１１０または発光スペクトルセレクタ１３０は、ノッチフィルタ、バンドストップフィルタ、ロングパスフィルタ、ショートパスフィルタ、バンドパスフィルタ、またはポリクロイックフィルタであるのが良い。一実施形態では、励起スペクトルセレクタ１１０または発光スペクトルセレクタ１３０は、回折格子であるのが良い。一実施形態では、励起スペクトルセレクタ１１０または発光スペクトルセレクタ１３０は、フィルタに対する到来励起または放出光線の相対入射角を変化させることによって選択済み波長を遮断しまたは通過させるよう再角度付け可能な可変角度または可変傾きフィルタを含むのが良い。一例として、第１の励起波長１０６は、励起スペクトルセレクタ１１０を通過し、第２の励起波長１０８は、少なくとも一つには励起スペクトルセレクタ１１０の角度に起因して、励起スペクトルセレクタ１１０を通過しないよう遮断される。変形例として、励起スペクトルセレクタ１１０は、第１の励起波長１０６を遮断し、第２の励起波長１０８を通過させるよう選択的に角度付けされても良い。本明細書で用いられる入射角は、表面上に入射する光線と、入射箇所のところの表面に垂直な線とのなす角度（θ）である。

【0049】

別の実施形態では、第１の発光波長信号１１６は、発光スペクトルセレクタ１３０を通過し、第２の発光波長信号１１８は、少なくとも１つには発光スペクトルセレクタ１３０の角度に起因して発光スペクトルセレクタ１３０を通過するのが制止される。変形例として、発光スペクトルセレクタ１３０は、第１の発光波長信号１１６を遮断し、第２の発光波長信号１１８を通過させるよう選択的に角度付けされても良い。

【0050】

引き続き図１を参照すると、発光スペクトルセレクタ１３０は、少なくとも１つ以上の干渉フィルタ、または特に発光フィルタ、例えば第１の発光フィルタ１４２および第２の発光フィルタ１４４を含むのが良い。第１の発光フィルタ１４２および第２の発光フィルタ１４４は、それぞれが互いに平行でありまたは変形例として互いに垂直である軸線上で傾けられまたは角度付けされることができる可変フィルタであるように構成されているのが良い。第１の発光フィルタ１４２は、第１の発光フィルタ１４２と放出光線との間の所望の入射角（長い破線で描かれたフィルタ１４２によって示されている）を実現するよう傾けられまたは角度付けられるのが良い。同様に、第２の発光フィルタ１４４は、第２の発光フィルタ１４４と放出光線との間の所望の入射角（長い破線で描かれたフィルタ１４４によって示されている）を実現するよう傾けられまたは角度付けられるのが良い。

【0051】

第１の発光フィルタ１４２と第２の発光フィルタ１４４を互いに別個独立に傾動させまたは角度付けすることができる。ある特定の実施形態では、第１の発光フィルタ１４２は、任意所望の位置（すなわち、第１の位置、第２の位置、第３の位置、第４の位置、……ｎ番目の位置）まで可変的に位置決めされるのが良く、各位置は、異なる角度θに対応している。同様に、第２の発光フィルタ１４４は、任意所望の位置（すなわち、第１の位置、第２の位置、第３の位置、第４の位置、……ｎ番目の位置）まで可変的に位置決めされるのが良く、各位置は、異なる角度θに対応している。第１の発光フィルタ１４２と第２の発光フィルタ１４４は、互いに独立の位置および角度を有するのが良く、その結果、第１の発光フィルタ１４２および第２の発光フィルタ１４４のうちの一方または両方を一本以上の放出光線に対して同一の入射角または異なる入射角に角度付けしまたは傾動させることができるようになっている。特定の実施形態では、第１の発光フィルタ１４２および第２の発光フィルタ１４４は、所望の波長の発光を通過させまたは遮断するよう角度付けされるのが良い。

【0052】

例えば、第１の原画像を第１の発光フィルタ１４２が第１の入射角に向けられるとともに第２の発光フィルタ１４４が第３の入射角に向けられた状態で得ることができる。次に、第１の発光フィルタ１４２の角度を第１の入射角から第２の入射角に向け直すことができ、その間、第２の発光フィルタ１４４は、第３の入射角の状態にとどまる。すると、第２の原画像を得ることができる。加うるに、少なくとも１つ以上の原画像を捕捉する際、第２の発光フィルタ１４４の角度を第３の入射角から第４の入射角に向け直すことができる。すると、第３の原画像を得ることができる。一実施形態では、第１、第２、第３、および第４の角度のうちの少なくとも２つは、同一である。一実施形態では、第１、第２、第３、および第４の角度のうちで同一の角度のものはない。

【0053】

少なくとも１つのフィルタを傾動させまたは角度付ける実施形態の任意のものに関し、任意の発光フィルタを任意所望の時間またはシーケンスだけ傾動させまたは角度付けると、所望の発光波長範囲を遮断し又は通すことができる。例えば、第１の発光フィルタ１４２が第１の入射角に向けられた状態で第１の原画像を得た後、第１の発光フィルタ１４２を第２の入射角に傾動させまたは角度付けることができる。すると、第２の原画像を得ることができる。次に、第１の発光フィルタ１４２を再び傾動させまたは角度付け、第３の原画像を得ることができる。換言すると、各フィルタを任意の点でかつ任意の量だけ他の１つまたは複数の発光フィルタとは独立して傾動させまたは角度付けると、任意の原画像および／または任意所望の発光波長範囲を得ることができる。

【0054】

一実施形態では、任意個数のフィルタを用いることができ、かかる個数としては、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１５個、２０個、２５個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、７５個、８０個、９０個、または１００個が挙げられるが、これらには限定されない。

【0055】

励起スペクトルセレクタ１１０の幾つかの特定の実施例および実施形態は、フィルタを傾動させてフィルタ上への光路の入射角を変えることによって波長遮断および透過をチューニングすることができるよう構成された１つ以上の可変干渉フィルタを含むのが良い。幾つかの実施形態では、励起スペクトルセレクタ１１０および／または発光スペクトルセレクタ１３０のうちの少なくとも一方は、傾けることができまたは角度付けすることができる少なくとも１つの可変干渉フィルタを含むのが良い。かかるある特定の実施形態では、励起スペクトルセレクタ１１０と発光スペクトルセレクタ１３０の両方は、少なくとも１つの可変干渉フィルタを含むのが良い。かかる実施形態では、可変干渉フィルタは、励起フィルタ、発光フィルタ、ポリクロイックフィルタであるのが良く、そしてマルチチャンネル蛍光顕微鏡および高スループット画像化システムと共に用いられるよう構成されている。

【0056】

励起スペクトルセレクタ１１０または発光スペクトルセレクタ１３０の個々のフィルタおよび／またはこれらフィルタと励起または放出光線との間の入射角は、１つ以上の検出構成成分の発光スペクトルの選択済み帯域幅（バンドパス）で原画像を捕捉するための所望の波長を提供するよう選択されるのが良い。例えば、励起スペクトルセレクタ１１０および／または発光スペクトルセレクタ１３０に含まれる干渉フィルタは、１つ以上の発光スペクトルエッジのうちの低い方のエッジおよび高い方のエッジ上の場所で原画像を捕捉するために光路に沿って所望の波長を遮断するとともに／あるいは透過させるよう構成されている。例えば、一実施形態では、検出構成成分は、これらのピークのところで５０ｎｍ以下のスペクトル差を有するのが良い。一実施形態では、検出構成成分は、これらのピークのところで１０ｎｍ以下のスペクトル差を有するのが良い。一実施形態では、検出構成成分は、これらのピークのところで１～５０ｎｍのスペクトル差を有するのが良い。一実施形態では、検出構成成分は、これらのピークのところでスペクトルが数ナノメートルだけ離されるのが良く、かかる数ナノメートルとしては、１ｎｍ、２ｎｍ、３ｎｍ、４ｎｍ、５ｎｍ、６ｎｍ、７ｎｍ、８ｎｍ、９ｎｍ、１０ｎｍ、１１ｎｍ、１２ｎｍ、１５ｎｍ、２０ｎｍ、２５ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、または１００ｎｍが挙げられるが、これらには限定されない。一実施形態では、連続して位置するスペクトル（例えば、ピークのところ）相互間の差は、同一であるのが良い（例えば、第１の検出構成成分と第２の検出構成成分は、１０ｎｍだけ離され、第２の検出構成成分と第３の検出構成成分は、１０ｎｍだけ離される）。一実施形態では、連続して位置するスペクトル（例えば、ピークのところ）相互間の差は、互いに異なるのが良い（例えば、第１の検出構成成分と第２の検出構成成分は、１０ｎｍだけ離され、第２の検出構成成分と第３の検出構成成分は、２５ｎｍだけ離される）。

【0057】

一実施形態では、任意のフィルタへの光の入射角θは、ほぼ０．０゜、１．０゜、２．０゜、３．０゜、４．０゜、５．０゜、６．０゜、７．０゜、８．０゜、９．０゜、１０．０゜、１１．０゜、１２．０゜、１５．０゜、２０．０゜、２５．０゜、３０．０゜、４０．０゜、４５．０゜、５０．０゜、６０．０゜、７０．０゜、７５．０゜、８０．０゜、８５．０゜、または８９．９゜であるのが良い。一実施形態では、任意のフィルタへの光の入射角は、最大９０゜まで（しかしながら９０゜を含まない）であるのが良い。一実施形態では、任意のフィルタに対する光の入射角は、９０゜未満であるのが良い。一実施形態では、任意のフィルタに対する光の入射角は、０．０゜～８９．９゜であるのが良い。ある特定の実施形態では、２つ以上の傾動可能なフィルタが設けられている場合、各フィルタは、互いに自由にかつ独立して傾動することができ、その結果、２つ以上のフィルタは、同一の入射角を有することができまたは同一の入射角を有するフィルタが２つとして存在しないようになっている。特定の実施形態では、入射角は、フィルタによって通されまたは遮断されるべき所望の波長に応じて選択される。

【0058】

フィルタチェンジャ
本明細書において開示される画像化システムの光学トレーンは、多数の光学フィルタを迅速かつ容易に交換するよう構成されたフィルタチェンジャを含むのが良い。ある特定の実施形態では、フィルタチェンジャは、１つ以上の光学フィルタを保持するよう構成されたフィルタスライダまたはフィルタホイールであるのが良い。本明細書において開示するフィルタチェンジャは、マルチチャンネル型蛍光顕微鏡検査法用のシステムおよび方法ならびに自動高スループット画像化システムで使用されるよう構成されているのが良い。幾つかの実施形態では、励起スペクトルセレクタ１１０および／または発光スペクトルセレクタ１３０のうちの少なくとも一方は、傾けることができまたは角度を付けることができる１つ以上の可変光学フィルタ、例えば１つ以上の可変干渉フィルタを有する少なくとも１つのフィルタチェンジャを含むよう構成されているのが良い。例えば、図１を参照すると、第１または第２の発光フィルタ１４２，１４４のうちの一方または両方は、１つ以上の可変干渉フィルタを有するフィルタチェンジャによって保持される可変干渉フィルタであるのが良い。

【0059】

図２Ａを参照すると、フィルタチェンジャの一実施形態が回転フィルタホイールであるのが良く、フィルタホイール２００は、光学トレーンの光路内に位置決めされるのが良い１つ以上の光学フィルタ、例えば可変干渉フィルタ２４２を含む。フィルタホイール２００は、ハブ２５０のところの軸線またはアクスルを中心としてまたはこの回りに時計回りにまたは反時計回りの方向に回転するよう構成されているのが良い。フィルタホイール２００は、設計上、フィルタホイール２００の所望の位置に配置された位置表示器または戻り止めを備えるのが良い。例えば、フィルタホイール２００を手動でまたはアクスルがハブ２５０に取り付けられたモータによって回転させることができ、その目的は、可変干渉フィルタ２４２を任意所望のフィルタ位置、例えばフィルタ位置２５２に位置決めすることにある。好ましい実施形態では、フィルタ位置２５２は、光学トレーンを通って進んでいる光ビームの光路内に配置され、それにより可変干渉フィルタ２４２が光ビームの光路内に配置される。例えば、フィルタホイール２００をアクスルがハブ２５０に取り付けられたモータによって回転させて、可変干渉フィルタ２４２を第１の発光波長信号１１６および第２の発光波長信号１１８の一方または両方の光路内に位置決めする（例えば、図１および図４Ｂもまた参照されたい）。

【0060】

幾つかの実施形態では、フィルタチェンジャ、例えばフィルタスライダまたはフィルタホイール２００は、光学フィルタを保持するよう構成された少なくとも１つのフィルタ組立体を有するのが良い。図２Ａに示されているように、フィルタホイール２００は、光学フィルタ、例えば可変干渉フィルタ２４２を保持するよう構成された少なくとも１つのフィルタ組立体２６０を有するのが良い。ある特定の実施形態では、フィルタホイール２００は、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、およびそれ以上のフィルタ組立体２６０を有することができる。一実施形態では、フィルタホイール２００は、２つ以上のフィルタ組立体２６０を有し、各フィルタ組立体２６０は、光学フィルタを含み、全て同一の光学フィルタ特性を有する光学フィルタは２つとしてない。別の実施形態では、２つ以上のフィルタ組立体２６０の各々は、光学フィルタを含み、少なくとも２つの光学フィルタは、同一の光学フィルタ特性を有する。さらに別の実施形態では、フィルタチェンジャは、フィルタが設けられていない少なくとも１つのフィルタ組立体２６０を有することができ、例えば、フィルタ組立体２６０は、光学窓、クリアなガラスから成り、あるいは、フィルタ組立体２６０は、何も保持していない場合がある。

【0061】

図２Ｂを参照すると、フィルタ組立体２６０の幾つかの実施形態は、ベース２６４およびリテーナ２６６を備えたケース内に干渉フィルタ、例えば可変干渉フィルタ２４２を保持するよう構成されている。一実施形態では、ベース２６４およびリテーナ２６６は、１つ以上のホールドダウンクリップ２７６を含み、そして光が可変干渉フィルタ２４２を通過することができるようにするよう構成された窓２７４をもたらすのが良い。特定の実施形態では、ベース２６４は、フィルタホイール２００に取り付けられた状態でフィルタ組立体２６０の傾動、回転および／または並進を可能にするよう構成された少なくとも１つの軸受２７８をさらに有するのが良い。一実施形態では、少なくとも１つの軸受２７８は、可変干渉フィルタ２４２と光学トレーンの光路内の励起または放出光線との間の入射角を変化させるためにフィルタホイール２００に取り付けられた状態で可変干渉フィルタ２４２、ベース２６４、およびリテーナ２６６を含むフィルタ組立体２６０の傾動および／または並進を可能にするよう構成されているのが良い。

【0062】

次に図３を参照すると、フィルタホイール２００を含む画像化システム用の光学トレーンのある特定の実施形態では、傾斜（チルト）機構体がフィルタ組立体に係合してフィルタ組立体を傾動させるよう構成されているのが良い。例えば、傾斜機構体、例えばカム３００は、これが光路内に配置された状態でフィルタ組立体２６０に係合するよう構成されているのが良い。特定の実施形態では、傾斜機構体、例えばカム３００は、フィルタ組立体２６０の軸受２７２と係合するよう構成されるとともに、フィルタ組立体２６０および可変干渉フィルタ２４２を傾動させるよう構成されており、それにより、可変干渉フィルタ２４２と光路内の放出または励起光線との間の入射角を変化させる。

【0063】

カム３００は、本体３０２および本体３０２から延びる尾部３０４を有するのが良く、尾部は、フィルタ組立体２６０の軸受２７２に係合するよう係合面３０８を有する。カム３００の尾部３０４は、任意適当な形状または形態のものであって良く、例えば、長方形、立方体、三角形、ピラミッド形、湾曲形、鍵形、角形、またはこれらの組み合わせなどである。さらに、尾部３０４は、カムを回転させたときに任意他の部品を回避するような寸法形状のものであるのが良い。カム３００の一実施形態では、本体３０２は、モータ３２０とカム３００とを結合するためにモータ３２０またはコネクタと嵌合するよう本体３０２を少なくとも部分的に貫通して延びるボア３１０を有する。一実施形態では、本体３０２は、モータ３２０と嵌合するアクスルまたは他のコネクタを有する。別の実施形態では、カム３００とモータ３２０は、一体型ユニットまたは単一部品であるのが良い。

【0064】

フィルタホイール２００の一実施形態では、フィルタ組立体２６０および可変干渉フィルタ２４２をフィルタ位置２５２のところで、軸受２７２とカム３００の係合によって傾動させることができ、その結果、フィルタへの光の入射角は、ほぼ０．０゜からほぼ８９．９゜までの範囲にある任意の入射角であって良い。例えば、所望のフィルタへの光の入射角は、ほぼ０．０゜、１．０゜、２．０゜、３．０゜、４．０゜、５．０゜、６．０゜、７．０゜、８．０゜、９．０゜、１０．０゜、１１．０゜、１２．０゜、１５．０゜、２０．０゜、２５．０゜、３０．０゜、４０．０゜、４５．０゜、５０．０゜、６０．０゜、７０．０゜、７５．０゜、８０．０゜、８５．０゜、または８９．９゜（これらには限定されない）であるのが良い。ある特定の実施形態では、２つ以上の可変干渉フィルタが光路内に配置されている場合、各フィルタは、自由にかつ他のフィルタとは別個独立に傾動することができるよう構成されているのが良く、その結果、２つ以上のフィルタは、同一の入射角を有することができ、または同一の入射角を有するフィルタが２つとしてないようになっている。入射角は、フィルタによって遮断されまたは通されるべき所望の波長に基づいて選択されるのが良い。

【0065】

光学収差の補正
光線が本明細書において説明した蛍光顕微鏡の光学トレーンを通って進んでいるとき、光線は、光学素子、例えばガラスや他のサブストレートで作られた光学窓および光学フィルタに当たる。フィルタのガラス表面に入射する光線は、これら光線が屈折して空気からガラスに入り、そしてガラスから空気中に戻る際に歪められることになる。光学素子による光の屈折および歪みにより光学収差が生じ、かかる光学収差により光学システムの性能および画像品質の劣化が生じる場合がある。光学収差は、非点収差、横方向画像シフト、焦点シフト、球面収差、色収差、コマ（コマ収差）、口径食、および視界全体にわたる可変スペクトル選択が挙げられる。光学収差により、画像レジストレーションエラー、合焦エラー、ならびに画像分解能および精度の低下が生じる場合がある。光学収差が生じることは、種々の検出構成成分、互いに異なる蛍光体およびフィルタセットから捕捉される多数の画像のアライメントを利用するマルチチャンネル型蛍光顕微鏡システムを用いる際に特に問題である。光学収差を最小限にし、制限し、ゼロにするとともに／あるいは補正する蛍光顕微鏡型画像化システム用の光学トレーンの実施形態が本明細書において開示される。

【0066】

図４Ａおよび図４Ｂを参照すると、蛍光顕微鏡システム用の光学トレーンの実施形態は、フィルタチェンジャ４００によって保持されるとともに光路内に位置決めされた傾動可能または可変光学フィルタ、例えば可変干渉フィルタ２４２を含むのが良い。幾つかの実施形態では、可変光学フィルタは、これが一般的に別の方式、例えば液晶を利用した可変フィルタよりも著しく良好な透過効率を提供するので、発光帯スペクトルまたは発光波長を選択するために用いられるのが良い。励起光線または放出光線は、これらが可変干渉フィルタ２４２を通過する際に屈折して歪み、それにより多くの場合、横方向画像シフトおよび非点収差が生じる。可変干渉フィルタ２４２の入射角を変えると、結果としての何らかの横方向画像シフトおよび非点収差もまた変わる。本明細書において開示するように、光学素子は、可変干渉フィルタ２４２によって生じる漸変光学収差を軽減し、最小限に抑え、あるいは補正するために光路内に配置されるのが良い。例えば、ある特定の実施形態では、動的補正光学系４１０が可変干渉フィルタ２４２と一緒に働いて可変干渉フィルタ２４２の任意所望の入射角に関して予測可能でありかつほぼ一定の横方向画像シフトおよび非点収差を生じさせるよう構成されているのが良い。他の実施形態では、固定補正光学系４２０が光路内に位置決めされるとともに、可変干渉フィルタ２４２および動的補正光学系４１０によって生じる任意の非点収差を実質的に軽減しまたは最小限に抑えるよう構成されているのが良い。他の実施形態では、固定補正光学系４２０、動的補正光学系４１０および可変干渉フィルタ２４２は、光路内に位置決めされるとともに非点収差、横方向画像シフト、および焦点シフトを同時に最小限に抑えるよう構成されているのが良い。

【0067】

図４Ｂを参照すると、光学トレーンの実施形態は、Ｙ軸４２２に実質的に垂直なＸ軸４１２を中心として傾動可能な動的補正光学系４１０を含むのが良く、固定補正光学系４２０は、Ｙ軸４２２を中心として傾動してある。動的補正光学系４１０は、平たい光学的に透明なプレート、例えば所望のサブストレートで形成された光学窓であるのが良い。動的補正光学系４１０は、可変干渉フィルタ２４２の前か後かのいずれかの場所で光学トレーンの光路内に位置決め可能である。

【0068】

一実施形態では、動的補正光学系４１０は、ハブ４１６を含む動的光学系組立体４１４によって支持されている。ある特定の実施形態では、ハブ４１６は、実質的にＸ軸４１２に沿って配置されている。動的補正光学系４１０を、手動で、またはモータおよび／またはアクスルとハブ４１６の係合によって、Ｘ軸４１２回りに選択的に傾動させることができる。特定の実施形態では、動的補正光学系４１０の表面に対する光路内の光の入射角は、ほぼ０．０゜からほぼ８９．９゜までの範囲にある任意の入射角であって良い。例えば、動的補正光学系４１０への光の入射角は、ほぼ０．０゜、１．０゜、２．０゜、３．０゜、４．０゜、５．０゜、６．０゜、７．０゜、８．０゜、９．０゜、１０．０゜、１１．０゜、１２．０゜、１５．０゜、２０．０゜、２５．０゜、３０．０゜、４０．０゜、４５．０゜、５０．０゜、６０．０゜、７０．０゜、７５．０゜、８０．０゜、８５．０゜、または８９．９゜（これらには限定されない）であるのが良い。

【0069】

図４Ａおよび４Ｂを参照すると、固定補正光学系４２０は、平たい光学的に透明なプレート、例えば所望のサブストレートで形成された光学窓であるのが良い。固定補正光学系４２０は、Ｙ軸４２２回りに傾けられた固定角度で光学トレーンの光路内に配置されており、この角度は、ほぼ０゜からほぼ９０゜まで、ほぼ１０゜からほぼ８０゜まで、ほぼ２０゜からほぼ７０゜まで、ほぼ３０゜からほぼ６０゜まで、およびほぼ４０゜からほぼ５０゜まで（これらには限定されない）の範囲にある任意の角度から選択される。特定の実施形態では、固定補正光学系４２０の固定角度は、光学トレーン内の１つ以上の光学素子によってもたらされる場合のある光学収差のうちの１つ以上を実質的に補正することができる任意の角度である。

【0070】

本明細書において説明するように、固定補正光学系４２０をＹ軸４２２を中心として傾動させ、動的補正光学系４１０をＸ軸４１２を中心として傾動させる。図４Ｂを参照すると、可変干渉フィルタ２４２をＸ軸４１２にほぼ平行でありかつＹ軸４２２にほぼ垂直なＸ軸を中心として傾動させる。したがって、可変干渉フィルタ２４２および動的補正光学系４１０は、固定補正光学系４２０の傾動の中心となるＹ軸４２２にほぼ垂直であるほぼ平行なＸ軸を中心として傾動するよう構成されている。

【0071】

動的補正光学系４１０と可変干渉フィルタ２４２を互いに独立に傾動させることができる。ある特定の実施形態では、可変干渉フィルタ２４２を任意所望の位置（すなわち、第１の位置、第２の位置、第３の位置、第４の位置、そしてｎ番目の位置まで様々な位置）まで可変的に傾動させると、所望の波長の放出光を通しまたは遮断することができ、各位置は、異なる角度に対応している。同様に、動的補正光学系４１０を任意の所望の位置（すなわち、第１の位置、第２の位置、第３の位置、第４の位置、そしてｎ番目の位置まで様々な位置）まで可変的に傾動させることができ、各位置は、異なる角度に対応している。動的補正光学系４１０および可変干渉フィルタ２４２は、互いに独立した位置または角度を有することができ、その結果、動的補正光学系４１０および可変干渉フィルタ２４２のうちの一方または両方を１つ以上の放出光線に対して同一の入射角までまたは互いに異なる入射角まで傾動させることができるようになっている。

【0072】

例えば、多数の原画像の捕捉中、第１の原画像を第１の入射角で可変干渉フィルタ２４２で、かつ対応の第３の入射角で動的補正光学系４１０で得ることができる。第２の原画像に関し、可変干渉フィルタ２４２を第１の入射角から第２の入射角まで再角度付けすることができ、他方、動的補正光学系４１０を対応の第４の入射角まで傾動させる。このよう、動的補正光学系４１０は、可変干渉フィルタ２４２と一緒に働いて、可変干渉フィルタ２４２の任意所望の入射角に関し、予測可能でありかつほぼ一定の横方向画像シフトおよび非点収差を生じさせるよう構成されているのが良い。

【0073】

可変干渉フィルタ２４２、動的補正光学系４１０、および固定補正光学系４２０は、特定の順序で光学トレーン内に位置決めされる必要はない。幾つかの実施形態では、光学トレーンの光路は、固定補正光学系４２０、動的補正光学系４１０、およびフィルタホイール２００をこの順序で通過する。

【0074】

Ａ．非点収差
蛍光顕微鏡の動作中、本明細書において説明したような光学トレーンは、含まれている光学素子のうちの１つ以上によって生じる光学収差を実質的に軽減し、最小限におさえ、ゼロにするとともに／あるいは打ち消すよう構成されている。引き続き図４Ａおよび図４Ｂを参照すると、一実施形態では、固定補正光学系４２０は、動的補正光学系４１０と可変干渉フィルタ２４２の両方によってもたらされる非点収差を実質的に軽減するとともに／あるいはほぼゼロにするよう構成されている。別の実施形態では、固定補正光学系４２０と動的補正光学系４１０と可変干渉フィルタ２４２の組み合わせによって引き起こされまたはもたらされる残留非点収差は、ほぼゼロ（０）である。

【0075】

かかる実施形態では、動的補正光学系４１０および可変干渉フィルタ２４２により生じる総合非点収差は、たとえ可変干渉フィルタ２４２がＸ軸回りに選択的に傾けられているときでも、ほぼ一定の値であるよう定められる。したがって、可変干渉フィルタ２４２の選択された角度に関し、動的補正光学系４１０もまた傾けられ、その結果、これらの総合非点収差は、固定補正光学系４２０によって生じる非点収差をほぼ打ち消すようになっている。

【0076】

Ｂ．横方向画像シフト
別の実施形態では、動的補正光学系４１０と可変干渉フィルタ２４２の両方によってもたらされる横方向画像シフトの合計は、可変干渉フィルタ２４２の任意所望の入射角に関してほぼ一定に保たれる。例えば、動的補正光学系４１０（ＬＳＨＦＴ₄₁₀）および可変干渉フィルタ２４２（ＬＳＨＦＴ₂₄₂）により引き起こされる総合横方向シフトは、ほぼ一定（ＬＳＨＦＴ_Constant）である。別の形態では、次の通りである。
ＬＳＨＦＴ_Constant＝ＬＳＨＦＴ₄₁₀＋ＬＳＨＦＴ₂₄₂

【0077】

したがって、可変干渉フィルタ２４２の選択された入射角に関し、動的補正光学系４１０（ＬＳＨＦＴ₄₁₀）および可変干渉フィルタ２４２（ＬＳＨＦＴ₂₄₂）により引き起こされる総合横方向画像シフトは、たとえ可変干渉フィルタ２４２がＸ軸回りに選択的に傾けられたとしてもほぼ一定の値である。

【0078】

Ｃ．焦点シフト
別の実施形態では、本明細書において説明しているような光学トレーンは、動的補正光学系４１０および可変干渉フィルタ２４２を介する屈折によってもたらされる経路焦点距離によって生じる全焦点シフトを実質的に安定化するよう構成されている。焦点シフトが安定化されると、システム焦点は、センサまたはカメラ、および／または対物レンズを光軸に沿って調節して、所望の画像焦点を達成することによってオフセットされるのが良い。

【0079】

テレセントリックチューブレンズ
無限補正対物レンズは、無限に焦点を持つ顕微鏡対物レンズである。無限補正対物レンズで画像を作るため、チューブレンズを用いて、画像を画像平面に焦点合わせするのが良い。チューブレンズと共に無限補正対物レンズを用いた場合の一利点は、対物レンズとチューブレンズとの間に追加の光学部品、例えば光学フィルタをシステム中に挿入することができる空間が存在することである。本明細書において説明する幾つかの実施形態では、無限補正対物レンズと共に用いられるよう構成されたテレセントリックチューブレンズは、口径食、色収差、球面収差、および視界全体にわたる可変スペクトル選択などの光学収差を最小限に抑え、軽減し、制限し、ゼロにするとともに／あるいは補正するために蛍光顕微鏡の光路内に位置決めされるのが良い。また、テレセントリックチューブレンズを用いると、光学収差をデジタル補正する必要性を最小限に抑えることができ、それにより、画像処理がＣＰＵ負荷を軽減することによって迅速に動作することができ、それにより高いシステムスループットが得られる。

【0080】

図５を参照すると、蛍光顕微鏡システム用の光学トレーンの実施形態が、二重テレセントリックチューブレンズ５００を含むのが良い。テレセントリックチューブレンズは、無限のところに入射瞳または出射瞳を備えた複合レンズである。テレセントリックチューブレンズは、光路の光軸に平行である主光線を生じさせる。互いに平行な主光線は、これらが傾動型または可変光学フィルタ、例えば可変干渉フィルタ２４２（図４Ｂ）を通る際に、これらが視界全体にわたって一定の選択されたスペクトルを生じさせるので望ましい。換言すると、テレセントリックチューブレンズにより作られる平行な主光線は、可変光学フィルタに対して同一の入射角を持ち、したがって、一般に、可変光学フィルタに対する同一のスペクトル応答を呈する。

【0081】

ある特定の実施形態では、二重テレセントリックチューブレンズ５００は、傾傾動型フィルタまたは可変干渉フィルタ、例えば可変干渉フィルタ２４２から見て上流側の位置５１０のところに配置されるよう構成されている。位置５１０は、光路内に配置されるのが良く、この位置では、二重テレセントリックチューブレンズ５００は、画像空間と物体空間の両方内でテレセントリックである。かかる実施形態では、二重テレセントリックチューブレンズ５００は、画像空間（レンズと検出器との間の空間）を通る実質的に平行である主光線を生じさせる。同様なかかる実施形態では、二重テレセントリックチューブレンズ５００は、実質的に平行でありかつ発光検出器１４０のところでほぼゼロ（０）の入射角を有する主光線を生じさせるよう構成されている。主光線は、互いに平行であるので、視界全体にわたる可変スペクトル選択、球面収差、色収差、コマ（コマ収差）、および口径食を最小限に抑えまたは制限することができ、それにより画像分解能および品質が向上する。

【0082】

低インシデンスフィルタ
一般に、ダイクロイックフィルタおよびポリクロイックフィルタは、標準の４５゜の入射角で動作するよう設計された所望の通過帯および遮断帯を有するよう構成されている。しかしながら、入射角が小さいと、良好なフィルタ性能が得られ、かかる良好なフィルタ性能としては、遮断、透過、急なバンドパス（帯域通過）エッジ、およびビーム視準の向上が挙げられる。本明細書では、標準の４５°の入射角よりも小さいまたは狭い励起光の入射角を有するポリクロイック励起フィルタを含む蛍光顕微鏡用の光学トレーンの実施形態が開示されている。

【0083】

図６を参照すると、光路は、励起スペクトルセレクタ１１０に向かって方向づけられる励起光１０４を放出する励起源１０２を含むのが良く、励起スペクトルセレクタ１１０は、所望の励起波長、例えば第１の励起波長１０６および／または第２の励起波長１０８を透過するよう構成された少なくとも１つの励起フィルタを含む。第１の励起波長１０６および／または第２の励起波長１０８が励起スペクトルセレクタ１１０の励起フィルタによって透過された後、かかる第１の励起波長１０６および／または第２の励起波長１０８は、光路に対して小さい入射角を生じさせるよう位置決めされた低インシデンスフィルタ６００の方へ差し向けられる。ある特定の実施形態では、低インシデンスフィルタ６００の入射角は、ほぼ１０．０゜からほぼ３０．０゜までの範囲にある任意の入射角であって良い。例えば、低インシデンスフィルタ６００に対する光の入射角は、ほぼ１０．０゜、１１．０゜、１２．０゜、１３．０゜、１４．０゜、１５．０゜、１６．０゜、１７．０゜、１８．０゜、１９．０゜、２０．０゜、２１．０゜、２２．０゜、２３．０゜、２４．０゜、２５．０゜、２６．０゜、２７．０゜、２８．０゜、２９．０゜、または３０．０゜（これらには限定されない）であるのが良い。

【0084】

選択された入射角θでは、低インシデンスフィルタ６００は、第１の励起波長１０６および／または第２の励起波長１０８を対物レンズ１１４に反射し、そして第１の発光波長信号１１６および／または第２の発光波長信号１１８の透過を可能にするよう構成されている。狭または低インシデンスフィルタ６００は、ダイクロイック、ポリクロイック、ショートパス、ロングパス、バンドパス、バンドストップ、マルチパス、または任意所望のフィルタであって良い。

【0085】

スペクトルエッジ検出
多数の検出構成成分または蛍光体がマルチチャンネル・マルチカラー型蛍光顕微鏡に用いられる場合、スペクトルオーバーラップまたはクロストークは、１つの検出構成成分信号を別の検出構成成分から識別する能力を制限する場合がある。本明細書において開示するように、スペクトルエッジ検出は、どの検出構成成分が検出されているとともに／あるいは画像化されているかについて曖昧さのないという点で、例えば検出構成成分を直交的に識別することによって個々の検出構成成分を複数の検出構成成分（例えば、多重化中）から識別することができる手段としてのプロセスである。スペクトルエッジ検出の性能の向上は、マルチチャンネル・マルチカラー型蛍光顕微鏡に用いられる光学トレーン中の光学収差を最小限に抑え、制限するとともに／あるいはゼロにすることによって実現できる。

【0086】

本明細書において説明する蛍光顕微鏡の幾つかの実施形態に関し、原画像は、発光スペクトルの選択された波長で発光検出器によって収集される。各原画像は、全選択発光スペクトル信号を含む。各全信号は、１つ以上の検出構成成分からの１つ以上の信号を含む。各全信号は、さらに、バックグラウンドまたは自己蛍光に起因する信号をさらに含む場合がある。スペクトルエッジ検出に関し、関心のある信号、例えば関心のある検出構成成分からの信号の特徴は、特徴のない信号（すなわち、信号が未知の値および／または構造を有する）の存在下において、例えば、バックグラウンド、自己蛍光、または望まれない検出構成成分から識別できる。換言すると、スペクトルエッジ検出は、検出構成成分の強度（およびかくしてそれぞれの寄与分）が未知である場合、複数の信号（または画像）中の望まれない検出構成成分から寄与分をなくすことによって、少なくとも部分的にオーバーラップしたスペクトルを有する複数の検出構成成分からの寄与分で構成される複数の信号（または画像）中の関心のある検出構成成分の寄与分を決定する。

【0087】

スペクトルエッジ検出はまた、例えば、検出構成成分を基準検出構成成分に対して検出する際、または、意図していようと（例えば、酸素濃度、金属イオン濃度、環境上の変化、細胞内取り込み（エンドサイトーシス）、細胞外放出（エキサイトーシス）などを含むサンプル変数を検出する検出構成成分）、非意図的であろうと（例えば、サンプルまたは試薬の可変ｐＨにより検出構成成分が発光シフトを呈する）いずれにせよ、１つ以上の要因に基づく発光シフトを呈する検出構成成分を組み込む際、信号の小規模な変化を考慮に入れるのが良い。

【0088】

スペクトルエッジ検出は、発光スペクトル曲線または励起スペクトル曲線、例えば検出構成成分のための発光スペクトル曲線または励起スペクトル曲線のエッジ（例えば、後側エッジ（後縁）または前側エッジ（前縁））を用いて複数のスペクトル的にオーバーラップした検出構成成分内の単一の検出構成成分を同定する。例えば、２つの原画像を検出構成成分発光スペクトル曲線の同一の前側または後側スペクトルエッジに沿って得ることができ、２つの原画像を検出構成成分発光スペクトル曲線の異なる前側および後側スペクトルエッジに沿って得ることができ、あるいは、１つの原画像を検出構成成分発光スペクトル曲線の前側または後側スペクトルエッジに沿って得ることができかつ１つの原画像を検出構成成分発光スペクトル曲線のピーク発光で得ることができる。

【0089】

スペクトルエッジ検出はまた、単一の検出構成成分または複数の検出構成成分について本明細書において説明した実施例および方法の組み合わせを利用することができる。例えば、複数の検出構成成分を用いる場合、第１の検出構成成分をピークおよび前側スペクトルエッジからの信号により検出することができ、第２の検出構成成分を前側スペクトルエッジからの信号により検出することができ、第３の検出構成成分を前側スペクトルエッジおよび後側スペクトルエッジからの信号により検出することができる。さらに、スペクトルエッジ検出は、第１の検出構成成分のための曲線および第２の検出構成成分のための線を形成することができ、その結果、この線の少なくとも一部分が各発光スペクトルのデータ点（例えば、所与の発光／励起波長での信号）を含む曲線に該当する。

【0090】

図７Ａは、第１の検出構成成分の発光スペクトル７０２を示している。発光スペクトル７０２は、前側スペクトルエッジ（スペクトル前縁）７０４および後側スペクトルエッジ（スペクトル後縁）７０６を含む。換言すると、前側スペクトルエッジ７０４は、ピーク発光７０８の左側に位置しまたはピーク発光７０８よりも短い波長をもつ発光スペクトル７０２の一部分であり、後側スペクトルエッジ７０６は、ピーク発光７０８の右側に位置しまたはピーク発光７０８よりも長い波長をもつ発光スペクトル７０２の一部分である。発光スペクトル７０２が示されているが、このスペクトルは、励起スペクトルであっても良い。

【0091】

図７Ｂは、第２の検出構成成分の発光スペクトル７１０を示している。発光スペクトル７１０は、前側スペクトルエッジ（スペクトル前縁）７１２および後側スペクトルエッジ（スペクトル後縁）７１４を含む。換言すると、前側スペクトルエッジ７１２は、ピーク発光７１６の左側に位置しまたはピーク発光７１６よりも短い波長をもつ発光スペクトル７１０の一部分であり、後側スペクトルエッジ７１４は、ピーク発光７１６の右側に位置しまたはピーク発光７１６よりも長い波長をもつ発光スペクトル７１０の一部分である。発光スペクトル７１０が示されているが、このスペクトルは、励起スペクトルであっても良い。

【0092】

図７Ｃは、第３の検出構成成分の発光スペクトル７２０を示している。発光スペクトル７２０は、前側スペクトルエッジ（スペクトル前縁）７２２および後側スペクトルエッジ（スペクトル後縁）７２４を含む。換言すると、前側スペクトルエッジ７２２は、ピーク発光７２６の左側に位置しまたはピーク発光７２６よりも短い波長をもつ発光スペクトル７２０の一部分であり、後側スペクトルエッジ７２４は、ピーク発光７２６の右側に位置しまたはピーク発光７２６よりも長い波長をもつ発光スペクトル７２０の一部分である。発光スペクトル７２０が示されているが、このスペクトルは、励起スペクトルであっても良い。

【0093】

一実施形態では、バックグラウンドまたは自己蛍光を画像または信号から除きながら染料または検出構成成分を検出する方法またはシステムのうちの任意のものを用いることができる。例えば、第１の検出構成成分の２つ以上の原画像が提供され、その結果、これら画像の少なくとも１つが第１の検出構成成分のスペクトルエッジの下方端部に位置し、これら画像の少なくとも１つが第１の検出構成成分のスペクトルエッジの上方端部に位置する。原画像のうちの少なくとも１つは、自己蛍光またはバックグラウンドにより生じる信号を含む。第１の検出構成成分の第１の最終画像が提供され、この第１の最終画像は、第１の最終画像が第１の検出構成成分からの原画像に基づいており、第１の最終画像は、自己蛍光またはバックグラウンドにより生じる信号を含まない。これは、バックグラウンドまたは自己蛍光をどの画像からも除くよう任意の数の検出構成成分について実施できる。

【0094】

図８Ａおよび図８Ｂでは、第４の検出構成成分（発光スペクトル８０４で示されている）が個々の検出構成成分をバックグラウンドまたは自己蛍光に対して識別する方法の一例として用いられている。しかしながら、注目されるべきこととして、本明細書において説明する方法は、これには限定されず、この方法を第１、第２、および／または第３の検出構成成分（発光スペクトル７０２，７１０，７２０によって示されている）または他の任意の適当な検出構成成分について実施することができる。

【0095】

図８Ａは、発光スペクトル８０４およびバックグラウンド信号８０２を示している。バックグラウンド信号８０２は、関心のある信号に対して比較的不変であり、したがって既知の値を持つ一定値（すなわち、直線）として示されると見込まれる。加うるに、発光スペクトル８０４とバックグラウンド信号８０２との相対的強度は未知である。

【0096】

わかりやすくするために、図８Ｂ～図９Ｅは、単一波長から得られた画像Ｉ₁～Ｉ₁₈を示している。しかしながら、画像Ｉ₁～Ｉ₁₈を所与の帯域幅全体にわたって得ることができ（すなわち、１ｎｍ、２ｎｍ、３ｎｍ、４ｎｍ、５ｎｍ、６ｎｍ、７ｎｍ、８ｎｍ、９ｎｍ、１０ｎｍ、１１ｎｍ、１２ｎｍ、１５ｎｍ、２０ｎｍ、２５ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１５０ｎｍ、２００ｎｍまたはそれ以上）、その結果、画像（二点鎖線で示されている）は、それぞれの帯域幅全体にわたって平均信号を示している。加うるに、原画像が得られるが、信号（例えば、個々の信号を含む全信号）は、画像相互間のサンプルの同一の場所に相当する原画像中の画素からのものである。例えば、点Ａは、画像化対象のサンプル上またはサンプル内の所与の場所である。第１の原画像中の点Ａを表す第１の画素は、第１の全信号を含む。第２の原画像中の点Ａを表す第２の画素は、第２の全信号を含む。本明細書において説明する方法のうちの１つ以上を用いて、第１および第２の原画像のそれぞれの第１および第２の画素の第１および第２の全信号を評価するとともに／あるいは比較して個々の検出構成成分の寄与分を求める。

【0097】

図８Ｂは、画像化中に得られた第１および第２の信号Ｓ₁，Ｓ₂をそれぞれ含む原画像Ｉ₁，Ｉ₂を示している。信号Ｓ₁，Ｓ₂は、第４の検出構成成分およびバックグラウンド８０２の全寄与分を示している。原画像Ｉ₁は、前側スペクトルエッジの下方端部上の第１の信号Ｓ₁を含み、原画像Ｉ₂は、前側スペクトルエッジの高い方の端上のところで取られている。第４の検出構成成分（発光スペクトル８０４で示されている）を識別するため、原画像Ｉ₁，Ｉ₂を分析するとともに、第１の信号Ｓ₁と第２の信号Ｓ₂との間の第４の検出構成成分の相対寄与分を求めるために任意適当な数学的、コンピュータ計算的、または代数的プロセスまたは変換により信号の変化を処理し、比較するとともに／あるいは分析し、かかるプロセスまたは変換としては、減算、微分、またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらには限定されない。次に、処理、比較および／または分析に基づいて第４の検出構成成分を示す最終の画像を提供することができる。

【0098】

スペクトルエッジ検出を複数の検出構成成分内の各検出構成成分について実施することができ、それにより任意所望の数の検出構成成分によりサンプルまたはそのフラクションの多重化を可能にする。一実施形態では、少なくとも２つの検出構成成分を多重化のために用いることができる。一実施形態では、任意適当な数の検出構成成分を用いることができ、その数は、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１６個、２０個、２４個、２８個、３０個、３２個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、または１００個であるが、これらには限定されない。

【0099】

スペクトルエッジ検出を、スペクトルオフセットを有する検出構成成分について実施することができ、この場合、スペクトルオフセットは、比較可能なスペクトルエッジ上またはスペクトルピークのところのスペクトルの差である。一実施形態では、このプロセスは、スペクトルオフセットの差が５０ｎｍ以下である検出構成成分について実施できる。一実施形態では、このプロセスは、スペクトルオフセットの差が１０ｎｍ以下である検出構成成分について実施できる。一実施形態では、このプロセスは、スペクトルオフセットの差が１～５０ｎｍ以下である検出構成成分について実施できる。一実施形態では、このプロセスは、スペクトル差が１０～５０ｎｍ以下である検出構成成分について実施できる。一実施形態では、このプロセスをスペクトルオフセットの差が１ｎｍ、２ｎｍ、３ｎｍ、４ｎｍ、５ｎｍ、６ｎｍ、７ｎｍ、８ｎｍ、９ｎｍ、１０ｎｍ、１１ｎｍ、１２ｎｍ、１５ｎｍ、２０ｎｍ、２５ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、または１００ｎｍである検出構成成分について実施できるが、これらには限定されない。一実施形態では、連続して位置するスペクトル相互間（例えば、ピークのところでの）差は、同一であるのが良い（例えば、第１の検出構成成分と第２の検出構成成分は、１０ｎｍだけ離されており、第２の検出構成成分と第３の検出構成成分は、１０ｎｍだけ離されている）。一実施形態では、連続して位置するスペクトル相互間（例えば、ピークのところでの）差は、互いに異なっていても良い（例えば、第１の検出構成成分と第２の検出構成成分は、１０ｎｍだけ離されており、第２の検出構成成分と第３の検出構成成分は、２５ｎｍだけ離されている）。

【0100】

一実施形態では、各検出構成成分の信号寄与分（例えば、寄与分または減算係数による）は、例えば、関心のない検出構成成分（すなわち、第１の検出構成成分は、関心のない検出構成成分であり、第２の検出構成成分は、関心のある検出構成成分である場合、かつ／あるいはまた第１の検出構成成分は、関心のある検出構成成分であり、第２の検出構成成分は、関心のない検出構成成分である場合）またはバックグラウンド／自己蛍光によって提供される信号寄与分を打ち消しまたはゼロにすることによって少なくとも２つの原画像により決定できる。２以上であればどのような数の原画像をもスペクトルエッジ検出のために得ることができ、かかる数は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、９０、１００またはこれ以上を含むが、これらには限定されない。

【0101】

図９Ａ～図９Ｅに関して分かりやすくするために、第１の検出構成成分の発光スペクトル７０２はまた、“Ａ”によって示され、第２の検出構成成分の発光スペクトル７１０は、“Ｂ”によって示され、第３の検出構成成分の発光スペクトル７２０は、“Ｃ”によって示されている。この別名におけるＡ、Ｂ、またはＣに続く添え字は、関心のある検出構成成分が寄与強度である画像を示している。例えば、データ点Ａ₃は、発光スペクトル７０２上のデータ点Ａ₃によって示された原画像Ｉ₃内のＡの寄与分（または第１の検出構成成分）を示している。そこで、Ａ₃～Ａ₁₈は、それぞれ原画像Ｉ₃～Ｉ₁₈中のＡの寄与分（または、第１の検出構成成分）を示し、Ｂ₃～Ｂ₁₈は、それぞれ原画像Ｉ₃～Ｉ₁₈中のＢの寄与分（または、第２の検出構成成分）を示し、Ｃ₃～Ｃ₁₈は、それぞれ原画像Ｉ₃～Ｉ₁₈中のＣの寄与分（または、第３の検出構成成分）を示している。

【0102】

図９Ａは、第１の検出構成成分の発光スペクトル７０２および第２の検出構成成分の発光スペクトル７０４を示している。原画像Ｉ₃，Ｉ₄，Ｉ₅が発光スペクトル７０２および発光スペクトル７１０上の指定配置場所で得られている。原画像Ｉ₃は、発光スペクトル７０２の前側スペクトルエッジ７０４の低い方の端のところで取られ、原画像Ｉ₄は、発光スペクトル７０２の前側スペクトルエッジ７１２の高い方の端のところで取られ、この高い方の端はまた、発光スペクトル７１０の前側スペクトルエッジ７１２の低い方の端とオーバーラップし、原画像Ｉ₅は、発光スペクトル７１０の前側スペクトルエッジ７１２の高い方の端のところで取られている。発光スペクトル７０２，７１０が示されているが、このスペクトルは、励起スペクトルであっても良い。

【0103】

一実施形態では、４つ以上の原画像を得ることができる。一実施形態では、原画像の各々を用いて検出構成成分のうちの唯一の検出構成成分を分析する。一実施形態では、原画像のうちの１つ以上を用いて検出構成成分のうちの少なくとも２つ（すなわち、オーバーラップが存在する）を分析する。一実施形態では、第１の検出構成成分と第２の検出構成成分との間の原画像のうちで同一のものが存在しない（すなわち、全ての画像は、別々である）。一実施形態では、第１の検出構成成分の原画像のうちの少なくとも１つと第２の検出構成成分の原画像のうちの少なくとも１つは、同一の画像である。

【0104】

一実施形態では、後側スペクトルエッジの高い方の端のところで取られた原画像は、前側スペクトルエッジの高い方の端を含むことができ、またその逆が成り立つ（すなわち、前側スペクトルエッジの高い方の端のところで取られた原画像は、後側スペクトルエッジの高い方の端を含むことができる）。一実施形態では、特定のスペクトルエッジの高い方の端のところで取られた原画像は、対向したスペクトルエッジの高い方の端を含まない（すなわち、上の方の後側スペクトルエッジのところの原画像は、上の方の前側スペクトルエッジを含まず、上の方の前側スペクトルエッジのところの原画像は、上の方の後側スペクトルエッジを含まない）。

【0105】

第１の検出構成成分（発光スペクトル７０２によって示されている）および第２の検出構成成分（発光スペクトル７１０によって示されている）を識別するため、原画像Ｉ₃，Ｉ₄，Ｉ₅を分析し、第１および第２の検出構成成分の相対寄与分を求める。例えば、相対寄与分を任意適当な数学的、コンピュータ計算的、または代数的プロセスまたは変換によって求めることができ、かかるプロセスまたは変換としては、減算、微分、積分またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらには限定されない。次に、第１の検出構成成分の最終画像を原画像Ｉ₃，Ｉ₄の分析結果、例えば原画像Ｉ₃，Ｉ₄全体にわたる第１の検出構成成分の相対寄与分に基づいて提供する。次に第２の検出構成成分の最終画像を原画像Ｉ₄，Ｉ₅の分析結果、例えば原画像Ｉ₄，Ｉ₅全体にわたる第２の検出構成成分の相対寄与分に基づいて提供する。

【0106】

図９Ｂは、得られた原画像Ｉ₆，Ｉ₇，Ｉ₈を有することを除き、図９Ａの発光スペクトルとほぼ同じ例示の第１および第２の発光スペクトルを示している。原画像Ｉ₆，Ｉ₈は、第１の検出構成成分の発光強度が同一または実質的に同一の値を有しかつ第２の検出構成成分の発光強度が画像相互間で異なる点のところで取られている。原画像Ｉ₇は、第２の検出構成成分に関する少なくとも３つのデータ点が線を形成する一点のところで取られている。

【0107】

図９Ｃは、得られた原画像Ｉ₉，Ｉ₁₀を有することを除き、図９Ａの発光スペクトルとほぼ同じ例示の第１および第２の発光スペクトルを示している。原画像Ｉ₉は、第１の検出構成成分の後側スペクトルエッジの高い方の端が第２の検出構成成分の前側スペクトルエッジの低い方の端とオーバーラップする一点のところで取られている。原画像Ｉ₁₀は、第１の検出構成成分の後側スペクトルエッジの低い方の端が第２の検出構成成分の前側スペクトルエッジの高い方の端とオーバーラップする一点のところで取られている。図９Ｃに示されているように、第１の検出構成成分の後側エッジは、第２の検出構成成分の前側エッジとオーバーラップしており、その結果、原画像Ｉ₉は、第１の検出構成成分の後側スペクトルエッジの高い方の端および第２の検出構成成分の前側スペクトルエッジの低い方の端を含み、原画像Ｉ₁₀は、第１の検出構成成分の後側スペクトルエッジの低い方の端および第２の検出構成成分の前側スペクトルエッジの高い方の端を含む。一実施形態では、第１の検出構成成分の前側エッジは、第２の検出構成成分の後側エッジとオーバーラップしている。

【0108】

図９Ｄは、得られた原画像Ｉ₁₁～Ｉ₁₄を有することを除き、図９Ｃの発光スペクトルとほぼ同じ例示の第１および第２の発光スペクトルを示している。原画像Ｉ₁₂，Ｉ₁₃は、それぞれ発光スペクトル７０２および発光スペクトル７１０のピークのところで取られている。スペクトルのピーク発光を用いると、原画像相互間の検出構成成分の相対寄与分を求めることができ、他方の原画像は、ピーク発光が収集される検出構成成分の発光スペクトルのスペクトルエッジ（前側または後側）内にある。

【0109】

一実施形態では、第１の発光スペクトルの２つ以上の原画像が得られ、この場合、これら画像のうちの少なくとも１つは、第１の発光スペクトルのスペクトルエッジの低い方の端のところにあり、画像のうちの少なくとも１つは、第１の発光スペクトルの同一のスペクトルエッジの高い方の端のところにある。第２の発光スペクトルの２つ以上の原画像が得られ、この場合、これら画像のうちの少なくとも１つは、第２の発光スペクトルのスペクトルエッジの低い方の端のところにあり、画像のうちの少なくとも１つは、第２の発光スペクトルの同一のスペクトルエッジの高い方の端のところにある。第１の検出構成成分（第１の発光スペクトルによって示されている）の第１の最終画像および第２の検出構成成分（第２の発光スペクトルによって示されている）の第２の最終画像が提供され、この場合、第１および第２の最終画像は、第１および第２の検出構成成分からの原画像に基づいている。一実施形態では、第１および第２の発光スペクトルの原画像のうちの少なくとも１つは、同一の画像である。例えば、第１の発光スペクトルの第２の画像（第１の発光スペクトルのスペクトルエッジの高い方の端のところに位置する）は、第２の発光スペクトルの第１の画像（第２の発光スペクトルのスペクトルエッジの低い方の端のところに位置する）と同一の画像である。

【0110】

２つの検出構成成分を説明したが、このプロセスを任意の数の検出構成成分に使用することができる。換言すると、ｎ番目の発光／励起スペクトルの２つ以上の原画像が得られ、この場合、これら画像のうちの少なくとも１つは、ｎ番目の発光／励起スペクトルのスペクトルエッジの低い方の端のところにあり、これら画像のうちの少なくとも１つは、ｎ番目の発光／励起スペクトルのスペクトルエッジの高い方の端のところにあり、ｎは、１以上（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１６、２０、２４、２８、３０、３２、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００またはそれ以上）である。次に、このプロセスを少なくとも１つ以上の発光／励起スペクトルについて繰り返す。

【0111】

一実施形態では、オーバーラップしたスペクトルを有する個々の検出構成成分による信号寄与分を求めるため、一検出構成成分の少なくとも３つのデータ点を得るべきであり、その結果、３つのデータ点が曲線を形成し、別の検出構成成分の少なくとも２つのデータ点が得られるべきであり、その結果、２つのデータ点が線を形成する。どの検出構成成分が曲線を形成するためのデータ点または線を形成するためのデータ点を必要とするかについての決定は相対的スペクトルエッジに基づくことが必要である。換言すると、互いに異なる発光スペクトルの同一のスペクトルエッジ（すなわち、前側または後側）を用いる場合、同一のスペクトルエッジの少なくとも一部分を有する発光スペクトルは、少なくとも２つのデータ点だけを必要とする他の発光スペクトルのうちの発光スペクトルに分類される。少なくとも２つのデータ点（すなわち、線を形成するデータ点）を用いると、他の検出構成成分により提供される曲線の存否を問わず、検出構成成分の寄与分を求めることができ、さらに、少なくとも３つのデータ点（すなわち、曲線を形成するデータ点）を用いると、当初の検出構成成分により提供される線の存否を問わず他の検出構成成分の寄与分を求めることができる。

【0112】

一実施形態では、オーバーラップしたスペクトルを有する個々の検出構成成分による信号寄与分を求めるため、一検出構成成分の少なくとも３つのデータ点が収集され、その結果、３つのデータ点は、曲線を形成し、別の検出構成成分の少なくとも３つのデータ点が収集され、その結果、これら３つのデータ点は、曲線または線を形成する。例えば、図９Ｄに戻ってこれを参照すると、データ点Ｂ₁₂～Ｂ₁₄のデータ点を以下の方程式に代入することができる。

上式において、Ｃ_Bは、発光Ｂの曲率（例えば、第２導関数）であり、Ｓ_B12は、画像Ｉ₁₂の波長における発光Ｂの信号強度であり、Ｓ_B13は、画像Ｉ₁₃の波長における発光Ｂの信号強度であり、Ｓ_B14は、画像Ｉ₁₄の波長における発光Ｂの信号強度である。Ａ₁₂～Ａ₁₄のデータ点を以下の方程式に代入することができる。

上式において、Ｃ_Aは、発光Ａの曲率（例えば、第２導関数）であり、Ｓ_A12は、画像Ｉ₁₂の波長における発光Ａの信号強度であり、Ｓ_A13は、画像Ｉ₁₃の波長における発光Ａの信号強度であり、Ｓ_A14は、画像Ｉ₁₄の波長における発光Ａの信号強度である。検出構成成分は、これら発光波長における大きな曲率（すなわち、より正（例えば、＋５が＋２よりも大きく、別の例として、＋４は－１よりも大きい）またはより負（例えば、－６は－１よりも大きく（絶対値で言って）、別の例として、－５は＋２よりも大きい））が個々の検出構成成分に一致しているので、互いに識別可能である。換言すると、検出構成成分は、互いに異なる発光波長全体にわたり大きな曲率を有する。例えば、Alexa ６４７は、６６０ｎｍ、６７０ｎｍ、および６８０ｎｍにわたり、同一の発光波長にわたるAlexa ５９４よりも大きな曲率を有する。Alexa ５９４は、６０９ｎｍ、６１９ｎｍ、および６３２ｎｍにわたり、同一の発光波長にわたるAlexa ６４７よりも大きな曲率を有する。したがって、６６０ｎｍ、６７０ｎｍ、および６８０ｎｍにわたる曲率に基づいて、Alexa ６７４をAlexa ５９４から識別することができ、６０９ｎｍ、６１９ｎｍ、および６３２ｎｍにわたる曲率に基づいて、Alexa ５９４をAlexa ６４７から識別することができる。

【0113】

図９Ｅは、４つの画像Ｉ₁₅～Ｉ₁₈の３つの発光スペクトル７０２，７１０，７２０（Ａ，Ｂ，Ｃ）を示している。発光Ｂの前側エッジは、発光Ａの前側エッジの下側に位置する。したがって、発光Ａについては少なくとも３つのデータ点（例えばＡ₁₅～Ａ₁₇またはＡ₁₅，Ａ₁₆，Ａ₁₈）が得られ、発光Ｂについては少なくとも２つのデータ点（例えば、Ｂ₁₅とＢ₁₆、またはＢ₁₅とＢ₁₇、またはＢ₁₆とＢ₁₇）が得られる。加うるに、発光Ｃの前側エッジは、発光Ｂの前側エッジの下に位置する。したがって、発光Ｂについては少なくとも３つのデータ点（例えばＢ₁₅，Ｂ₁₇，Ｂ₁₈またはＢ₁₆～Ｂ₁₈）が得られ、発光Ｃについては少なくとも２つのデータ点（例えば、Ｃ₁₆とＣ₁₇、またはＣ₁₇とＣ₁₈、またはＣ₁₆とＣ₁₈）が得られる。発光Ａ～発光Ｃのそれぞれのデータ点を用いると、検出構成成分のそれぞれの寄与分を求めることができる。

【0114】

一実施形態では、第１の発光スペクトルの２つの別々の発光波長における２つ以上の原画像が得られ、この場合、これら画像のうちの少なくとも１つは、第１の発光スペクトルの前側スペクトルエッジまたは後側スペクトルエッジ内にあり、これら画像のうちの少なくとも１つは、第１の発光スペクトルの後側スペクトルエッジまたは前側スペクトルエッジ内にある。換言すると、２つ以上の原画像は、同一の発光スペクトルの互いに異なるスペクトルエッジ内にある（すなわち、前側スペクトルエッジ内の少なくとも１つの原画像および後側スペクトルエッジ内の少なくとも１つの原画像、前側スペクトルエッジは、一検出構成成分の発光スペクトル内にある）。

【0115】

図９Ｅに示されているように、発光スペクトルＡ，Ｂの信号は、これらの発光スペクトルの互いに異なるスペクトルエッジ上の原画像を介して収集される（発光スペクトルＡについてはＡ₁₅とＡ₁₇、発光スペクトルＢについてはＢ₁₅／Ｂ₁₆／Ｂ₁₇とＢ₁₈）。互いに異なるスペクトルエッジ上の信号の強度は、互いに等しくても良くまたはそうでなくても良い（例えば、強度は、一方のスペクトルエッジ上で大きく、他方のスペクトルエッジ上で小さくても良い）。

【0116】

一実施形態では、第１の発光スペクトルの２つ以上の原画像が得られ、この場合、原画像のうちの少なくとも１つは、第１の発光スペクトルの前側スペクトルエッジまたは後側スペクトルエッジ内にあり、これら画像のうちの少なくとも１つは、第１の発光スペクトルの後側スペクトルエッジまたは前側スペクトルエッジ内にあり、原画像のうちの少なくとも１つは、ピーク強度波長の状態にある。換言すると、２つ以上の原画像は、同一の発光スペクトルの互いに異なるスペクトルエッジ内にあり、１つの原画像は、ピーク強度波長の状態にある。図９Ｅに示されているように、発光スペクトルＡは、この発光スペクトル（発光スペクトルＡについてはＡ₁₅とＡ₁₇）の互いに異なるスペクトルエッジ上に信号を提供し、ピーク強度波長（発光スペクトルＡについてはＡ₁₆）の状態で信号を提供する。

【0117】

図９Ｅは、前側スペクトルエッジ、ピーク発光、および後側スペクトルエッジ内で発光スペクトルＡから収集された原画像を示しているが、これは、１つだけの発光スペクトルには限定されるようにはなっていない。同一形式の原画像を所望した数の発光スペクトルについて収集することができる。

【0118】

一実施形態では、信号強度の変化（例えば、画素レベル）を用いると、検出構成成分を識別することができる。

【0119】

一実施形態では、例えば発光スペクトルの代表的な点が得られる場合、信号強度の変化率または変化分をそのスペクトルの後側エッジに基づいて求めることができる。一実施形態では、例えば発光スペクトルの代表的な点が得られる場合、信号強度の変化率または変化分をスペクトルの前側エッジに基づいて求めることができる。

【0120】

一実施形態では、例えば励起スペクトルの代表的な点が得られる場合、強度の変化率または変化分をそのスペクトルの後側エッジに基づいて求めることができる。一実施形態では、例えば励起スペクトルの代表的な点が得られる場合、強度の変化率または変化分をスペクトルの前側エッジに基づいて求めることができる。

【0121】

一実施形態では、信号強度の変化分を予想値と比較するのが良い。例えば、強度の変化分は、予想値の±（プラスまたはマイナス）０．０１％まで、０．０２％まで、０．０５％まで、０．１％まで、０．１５％まで、０．２％まで、０．２５％まで、０．３％まで、０．３５％まで、０．４％まで、０．４５％まで、０．５％まで、０．５５％まで、０．６％まで、０．６５％まで、０．７％まで、０．７５％まで、０．８％まで、０．８５％まで、０．９％まで、０．９５％まで、１％まで、２％まで、５％まで、１０％まで、１５％まで、２０％まで、２５％まで、３０％まで、３３％まで、３５％まで、４０％まで、４５％まで、５０％まで、５５％まで、６０％まで、６５％まで、７０％まで、７５％まで、８０％まで、８５％まで、９０％まで、９５％まで、または９９％までであるのが良い。一実施形態では、信号強度の変化分をしきい値と比較するのが良い。一実施形態では、信号強度の変化分は、正または負である場合があり、その結果、正または負の変化分は、所望の検出構成成分を識別する。

【0122】

一実施形態では、例えば画像処理および分析中、しきい値を適用して信号が所望の検出構成成分、望ましくない検出構成成分、ノイズ、またはバックグラウンドによって生じたかどうかを判定することができる。

【0123】

一実施形態では、例えば所望のまたは所定の波長における第１の画像と第２の画像との信号強度の変化分が第１のしきい値以上である場合、画素または信号は、結果的に生じる分析のための画像のために「続行」され、これに対し、第１の画像と第２の画像との間の信号の変化分が第１のしきい値未満である場合、画素または信号は、結果的に生じる分析のための画像にとって「ターンオフ」される。

【0124】

一実施形態では、第１の検出構成成分の発光スペクトル７０２の第１の発光導関数を得ることができ、第２の検出構成成分の発光スペクトル７１０の第２の発光導関数を得ることができる。一次導関数について説明するが、任意のこれよりも高次の導関数を実施することが望ましい場合には計算するのが良い。

【0125】

一実施形態では、例えば発光スペクトルの代表的な点が得られる場合、変化率は、しきい値以上であるのが良い。一実施形態では、例えば発光スペクトルの代表的な点が得られる場合、強度の変化分は、正であっても良く、少なくともしきい値の量だけ正であっても良く、かつ／あるいは第１の発光のある特定の倍数だけ正であっても良い。一実施形態では、例えば励起スペクトルの代表的な点が得られる場合、変化率は、しきい値以下であるのが良い（すなわち、より負であり、例えば、－５は、－３よりも小さい）。一実施形態では、例えば励起スペクトルの代表的な点が得られる場合、強度の変化分は、負であっても良く、少なくともしきい値の量だけ負であっても良く、かつ／あるいは第１の励起のある特定の倍数だけ負であっても良い。

【0126】

一例として、Δｘ（発光波長の変化分）が１０ｎｍであり、Δｙ（発光強度の変化分）が５０％であり、勾配が５０％／１０ｎｍまたは５％／ｎｍである。第１の画像と第２の画像を比較した場合、それぞれの画素相互間の少なくとも５倍の強度の増加分は、第１の検出構成成分のせいにすることができ、画素は、「続行」され、これに対し、それぞれの画素相互間の５倍未満の強度の増加分の原因を第１の検出構成成分以外の何か（例えば、バックグラウンド）のせいにすることができ、画素は、「ターンオフ」される。この実施例は、値および／または百分率に限定されるものではない。第１のしきい値は、発光強度の予期または予想変化分に基づく範囲を含むのが良い。例えば、第１のしきい値は、勾配±（プラスまたはマイナス）０．０１％まで、０．０２％まで、０．０５％まで、０．１％まで、０．１５％まで、０．２％まで、０．２５％まで、０．３％まで、０．３５％まで、０．４％まで、０．４５％まで、０．５％まで、０．５５％まで、０．６％まで、０．６５％まで、０．７％まで、０．７５％まで、０．８％まで、０．８５％まで、０．９％まで、０．９５％まで、１％まで、２％まで、５％まで、１０％まで、１５％まで、２０％まで、２５％まで、３０％まで、３３％まで、３５％まで、４０％まで、４５％まで、５０％まで、５５％まで、６０％まで、６５％まで、７０％まで、７５％まで、８０％まで、８５％まで、９０％まで、９５％まで、または９９％であるのが良い。

【0127】

勾配は、次式によって与えられる条件を満たす。

【0128】

一実施形態では、第１の検出構成成分を励起した（それにより第１の画像を得た）場合、第１の励起光の波長は、第２の検出構成成分を励起しないよう選択されるのが良い。次に、第２の励起光の波長もまた、第１の検出構成成分を励起し（それにより第２の画像を提供し）、第２の検出構成成分を励起しないよう選択されるのが良い。第１の画像と第２の画像を処理してこれらを比較すると、励起波長の変化に起因する第１の検出構成成分の発光に基づいて発光強度の変化分（換言すると、勾配、またはｙ／ｘ）を得ることができる。

【0129】

一実施形態では、励起光のうちの少なくとも１つは、１つ以上の検出構成成分を刺激することができる。しかしながら、結果として生じる勾配は、以下に説明するように、１つ以上の望まれない検出構成成分の信号を除去するよう使用できる。

【0130】

一実施形態では、２つ以上の励起波長に起因して生じる２つ以上の画像を互いに比較して処理すると、所望の勾配を算出することができる。結果的に生じる勾配を用いると、最終画像において信号をオンの状態に保ちまたは信号をオフにすることができる。一実施形態では、２つ以上の励起波長に起因して生じる２つ以上の信号を互いに比較して処理すると、所望の勾配を算出することができる。結果的に生じる勾配は、最終画像において信号をオンに保ちまたは信号をオフにするよう使用できる。

【0131】

一実施形態では、一次またはこれよりも高次の導関数を各検出構成成分スペクトルエッジについて計算することができる。一実施形態では、それぞれの検出構成成分のスペクトルエッジを用いると、互いに異なる検出構成成分の発光を区別することができる。

【0132】

一実施形態では、原画像の最小数は、ｎであり、この場合、ｎは、検出構成成分の数である。例えば、第１の原画像を第１の発光スペクトルの後側エッジの上方端部のところでおよび第２の発光スペクトルの前側エッジの下方端部のところで得ることができる。第２の原画像を第１の発光スペクトルの後側エッジの下方端部のところでおよび第２の発光スペクトルの前側エッジの上方端部のところで得ることができる。第１の原画像と第２の原画像を処理するとともに／あるいは分析すると、第１の検出構成成分（第１の発光スペクトルによって示されている）の第１の最終画像および第２の検出構成成分（第２の発光スペクトルによって示されている）の第２の最終画像を提供することができる。発光スペクトルについて説明しているが、この実施形態は、励起スペクトルについて実施することができる。

【0133】

一実施形態では、原画像の最小数は、ｎ＋１であり、この場合、ｎは、検出構成成分の数である。

【0134】

一実施形態では、第１および第２の検出構成成分の原画像および最終画像の全ては、例えばスクリーン（例えば、電話、タブレット、コンピュータ、テレビ、ＰＤＡ、手持ち型デバイスなどのうちの少なくとも１つのスクリーン）上で最終使用者またはオペレータに表示される。一実施形態では、第１および／または第２の検出構成成分の原画像のうちの少なくとも１つが表示される。一実施形態では、第１および／または第２の検出構成成分の最終画像のうちの少なくとも１つが表示される。一実施形態では、原画像のうちのどれも表示されないが、最終画像のうちの少なくとも１つが表示される。一実施形態では、原画像のうちのどれも表示されないが、最終画像の全てが表示される。

【0135】

信号（例えば、同一のスペクトルエッジ、互いに異なるスペクトルエッジ、ピークおよび１つのスペクトルエッジ、ピークおよび２つのスペクトルエッジなど）を収集する実施例は、例示の収集について具体的に説明される発光スペクトルに限定されるものではない。むしろ、信号収集は、１つ以上の発光スペクトルに適用可能であり、この場合、全ての発光スペクトルが、同一の収集（例えば、同一のスペクトルエッジ、互いに異なるスペクトルエッジ、ピークおよび１つのスペクトルエッジ、ピークおよび２つのスペクトルエッジなど）を有し、少なくとも２つの発光スペクトルが同一の収集を有し、または同一の収集を有する発光スペクトルはない。

【0136】

原画像を得るため、画像化がフローサイトメーターまたは顕微鏡、例えば蛍光顕微鏡、スキャナなどを用いて実施されるのが良い。画像化は、従来型落射蛍光、ライトシート（light sheet ）顕微鏡、超解像度顕微鏡、および共焦点顕微鏡を用いて実施できる。

【0137】

画像またはファイルのどれであっても、原画像であろうと処理済みであろうといずれにせよ、本発明の任意の実施形態の実施の際、任意の時点において任意適当な記憶媒体に記憶させることができる。記憶媒体としては、ハードディスク、読み取り書き込み記憶装置（ＲＡＭ）、読み取り専用記憶装置（ＲＯＭ）、分散型コンピューティングシステムの記憶装置、光ディスク（例えば、コンパクトディスク、デジタル多用途ディスク、またはＢｌｕ－ｒａｙ（登録商標）ディスク）、フラッシュメモリデバイス、メモリーカードなどが挙げられるが、これらには限定されない。

【0138】

本発明の実施形態は、上述した方法およびその任意のステップ（これらは、方法およびステップの任意の組み合わせを含む）を実施する命令を記憶することができる非一過性コンピュータ可読媒体を含む。例えば、非一過性コンピュータ可読媒体は、１つ以上のプロセッサまたは類似のデバイスによって実行可能な命令を記憶することができる。

【0139】

本発明の実施形態は、上述の方法およびこれら方法の任意のステップ（これらは、方法およびステップの任意の組み合わせを含む）を実施する命令を記憶することができる２つ以上の非一過性コンピュータ可読媒体を含む。例えば、実行のための命令は、２つ以上のプロセッサまたは類似のデバイスに分割することができる。

【0140】

本発明の別の実施形態は、コンピュータにより実行可能な命令を読みだして実行するコンピュータまたは機器（例えば、電話、タブレット、ＰＤＡなど）、例えば、任意の実施形態の機能を実行するために記憶媒体（上述したように、画像またはファイルを記憶する記憶媒体と同一であっても良くまたはこれとは異なっていても良い）上に記録されまたは記憶された非一過性コンピュータ可読媒体をさらに含むのが良い。コンピュータは、中央処理装置（ＣＰＵ）、超小型演算処理装置（ＭＰＵ）、または他の回路構成のうちの１つ以上を含むことができ、また、別々のコンピュータまたは別々のコンピュータプロセッサのネットワークを含むことができる。コンピュータにより実行可能な命令は、例えば、ネットワークまたは記憶媒体からコンピュータに提供可能である。

【0141】

コンピュータまたは機器はまた、例えばモニターまたはスクリーン上に、原画像であれ処理済みの画像であれいずれにせよ、画像またはファイルのうちの任意のものを表示するよう構成されているのが良い。

【0142】

特徴または要素が本明細書において別の特徴または要素「上」に位置していると記載されている場合、これは、他の特徴または要素上に直接位置する場合があり、または介在する特徴または要素もまた存在している場合がある。これとは対照的に、特徴または要素が別の特徴または要素「上に直接」位置していると記載されている場合、介在する特徴または要素は存在しない。また、特徴または要素が別の特徴または要素に「連結され」、「取り付けられ」、または「結合され」と記載されている場合、これは、他の特徴または要素に直接連結され、取り付けられ、もしくは結合されている場合があり、または介在する特徴または要素が存在している場合がある。これとは対照的に、特徴または要素が別の特徴または要素に「直接連結され」、「直接取り付けられ」、または「直接結合され」と記載されている場合、これは介在する特徴または要素は存在しない。一実施形態に対して説明しまたは図示しているが、説明されまたは図示されている特徴または要素は、他の実施形態に当てはまる。また、当業者であれば理解されるように、別の特徴に「隣接して」設けられている構造または特徴への言及は、この隣接の特徴とオーバーラップしまたはその下に位置する部分を有する場合がある。

【0143】

本明細書で用いられる用語法は、特定の実施形態についてのみ説明するためであり、かかる用語法は、本発明を限定するものではない。例えば、原文明細書で用いられている単数形“a”、“an”、および“the”は、別段の明示の指定がなければ、複数形をも含むものである。さらに理解されるように、“comprises ”（訳文では、「～を有する」としている場合が多い）および／または“comprising”という用語は、本明細書で用いられる場合、記載した特徴、ステップ、操作、要素および／またはコンポーネントの存在を特定するが、１つ以上の他の特徴、ステップ、操作、要素、コンポーネントおよび／またはこれらの群の存在または追加を排除しない。本明細書で用いられている「および／または」という表現は、関連の列記したアイテムのうちの１つ以上の任意の組み合わせおよび全ての組み合わせを含んでおり、この表現を“／”と省略表記している場合がある。

【0144】

空間的に、図形的に、または数的に関連性のある用語、例えば、「～の下に」、「～より下に」、「～の下の」、「～の上に」、「～の上の方に」、「～よりも高い」などは、本明細書においては、図面に示されているように１つの要素または特徴の別の要素または特徴に対する関係を説明するために説明の便宜上用いられている場合がある。理解されるように、空間的に関連性のある用語は、図面に示された向きに加えて、使用または操作の際に異なる向きを含むことが意図されている。例えば、図示のデバイス、システム、または方向を逆にした場合、他の要素または特徴の「～の下の」または「～の下の方に」と記載された要素は、他の要素または特徴「の上に」向く。かくして、例示の用語「～の下に」は、上と下の向きの両方を含む場合がある。もしくは、デバイスが別の方向に差し向けられる場合があり（９０゜または他の向きに回転され）、本明細書で用いられる空間的に関連性のある記述はそれに従って解釈される。同様に、「～の上方に」、「～の下方に」、「～に垂直の」、「～に水平の」などは、特段の指定がなければ、説明の目的で本明細書において用いられている。さらに、「～の下の」、「～よりも高い」などは、要素、特徴、情報などを示すために用いられ、これらは、表、グラフ、またはプロットのさらに下にまたはさらに上に位置し、あるいは、値もしくは強度において小さいまたは大きい。

【0145】

「第１」および「第２」という用語は、本明細書においては、種々の特徴／要素（ステップを含む）を説明するために用いられている場合があるが、これら特徴／要素は、別段の指定がなければ、これらの用語によって制限されるべきではない。これらの用語は、一特徴／要素を別の特徴／要素から識別するために用いられている場合がある。かくして、以下に説明する第１の特徴／要素は、第２の特徴／要素と呼ばれる場合があり、同様に、以下に説明する第２の特徴／要素は、第１の特徴／要素と呼ばれる場合があり、このことは、本発明の教示から逸脱しない。加うるに、「第１」および「第２」が用いられるが、これらの用語は、種々の特徴／要素を１つだけまたは２つだけに限定することを意図していない。むしろ、３つ（すなわち、第３）、４つ（すなわち、第４）以上が該当する場合またはそのようにすることが望ましい場合に含められまたは用いられる場合がある。

【0146】

原文明細書および以下の原文特許請求の範囲全体を通じて、別段の必要がなければ、“comprise”およびその語尾変化、例えば“comprises”および“comprising”は、種々のコンポーネントを方法および物品（例えば、装置および方法を含む構成物および機器）において共同して用いることができることを意味している。例えば、“comprising”という用語は、任意の記載された要素またはステップを含めることを示唆するが、任意他の要素またはステップを排除することを意味していないと理解される。

【0147】

本明細書および特許請求の範囲において、実施例に用いられるものとして、しかも別段の明示の指定がなければ全ての数は、単語の前に「約」または「ほぼ」が位置しているように読まれるべきであり、これは、この用語が明示的に現れていない場合であってもそうである。「約」または「ほぼ」という語句は、記載された値および／または位置が値および／または位置の妥当な予想範囲内にあるということを示すために大きさおよび／または位置を記載している場合に使用される場合がある。例えば、数値は、記載された値（または値の範囲）の±０．１％、記載された値（または値の範囲）の±１％、記載された値（または値の範囲）の±２％、記載された値（または値の範囲）の±５％、記載された値（または値の範囲）の±１０％などの値を有する場合がある。本明細書において与えられている任意の数値はまた、別段の指定がなければ、約またはほぼその値を含むものと理解されるべきである。例えば、値「１０」が示されている場合、「約１０」もまた示されている。本明細書において列記された任意の数値範囲は、本明細書において包含された全ての部分範囲を含むことが意図されている。また、当業者によって適切に理解されるように、値が示されている場合、その値「以下」、「その値以上」およびこれら値相互間の考えられる範囲もまた示されていることは言うまでもない。例えば、値「Ｘ」が示されている場合、「Ｘ以下」、ならびに「Ｘ以上」（例えば、Ｘは数値である）もまた示されている。また、本願全体を通じて、データが多くの互いに異なるフォーマットで提供されており、このデータが終点および始点ならびにデータ点の任意の組み合わせによる範囲を表している。例えば、特定のデータ点「１０」および特定のデータ点「１５」が示されている場合、１０超、１０以上、１０未満、１０以下、１０に等しい、ならびに１５超、１５以上、１５未満、１５以下、１５に等しいが開示されているとともに１０～１５とみなされることは言うまでもない。また、２つの特定の単位相互間の各単位もまた開示されていることは言うまでもない。例えば、１０および１５が示されている場合、１１、１２、１３，１４もまた示されている。

【0148】

種々の例示の実施形態を上述したが、多くの変更のうちの任意のものを特許請求の範囲に記載された本発明の範囲から逸脱することなく、種々の実施形態に対して行うことができる。例えば、種々の説明した方法ステップを実施する順序を変形実施形態では変更する場合が多くあり、他の変形実施形態では、１つ以上の方法ステップが全て省かれる場合がある。種々の装置およびシステム実施形態のオプションとしての特徴が含まれている実施形態もあれば、含まれていない実施形態もある。したがって、上記説明は、主として、例示目的であり、本発明の範囲が特許請求の範囲に記載されているかのように本発明の範囲を限定するものと解されるべきではない。

【0149】

本明細書に含まれる実施例および例は、例示のためであって限定する目的ではなく、本発明の主題を実施する特定の実施形態を示している。上述したように、他の実施形態を利用するとともに特定の実施形態から導き出すことができ、その結果、構造上および論理上の置換および変更を本発明の範囲から逸脱することなく実施できる。単に便宜上であって本発明の範囲を任意の単一の本発明または本発明の技術的思想に自発的に制限することを意図せず、事実、２以上が開示されている場合、本発明の主題のかかる実施形態を本明細書では個々にまたはひとまとめに「本発明」という表現によって言及する場合がある。かくして、特定の実施形態を本明細書において図示するとともに説明したが、同一の目的を達成するよう工夫された構成を図示の特定の実施形態に代えて用いることができる。本開示内容は、種々の実施形態の任意かつ全ての改造例または変形例を含むものである。上述の実施形態、および本明細書において具体的に説明した他の実施形態の組み合わせは、上述の説明を検討すると、当業者には明らかになろう。

【0150】

上記説明は、例示目的で、本発明の徹底的な理解を提供するよう特定の用語体系を用いた。しかしながら、当業者には明らかなように、特定の細部は、本明細書において説明したシステムおよび方法を実施するために必要とされるわけではない。特定の実施形態の上述の説明は、図示および説明の目的のために例示的に提供されている。上記説明は、本開示内容が全てでありまたは本開示内容を説明した形態そのものに限定することを意図していない。多くの改造および変形が上記教示を考慮して可能である。実施形態は、本開示内容の原理および実用的な利用可能性を最もよく説明し、それにより当業者が本開示内容および意図した特定の用途に合った種々の変更を加えた種々の実施形態を最適利用することができるようにするために図示されるとともに説明されている。本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲の記載かおよびその均等範囲によって定められる。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図8A】

【図8B】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図9D】

【図9E】

【国際調査報告】