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▶ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミネソタの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-05-19
(54)【発明の名称】肺浮腫又は肺炎症を治療するための組成物及び方法
(51)【国際特許分類】
A61K 31/198 20060101AFI20230512BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20230512BHJP
【ＦＩ】
A61K31/198
A61P11/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022558131
(86)(22)【出願日】2021-03-26
(85)【翻訳文提出日】2022-11-24
(86)【国際出願番号】 US2021024345
(87)【国際公開番号】W WO2021195488
(87)【国際公開日】2021-09-30
(31)【優先権主張番号】63/000,939
(32)【優先日】2020-03-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】305023366
【氏名又は名称】リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミネソタ
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 達則
(72)【発明者】
【氏名】デイビッド エイチ．イングバー
(72)【発明者】
【氏名】ティモシー ピー．リッチ
(72)【発明者】
【氏名】ロバード ジェイ．シューマッハー
【テーマコード（参考）】
4C206
【Ｆターム（参考）】
4C206AA01
4C206FA53
4C206MA01
4C206MA04
4C206NA14
4C206ZA59
(57)【要約】
対象の肺管に直接投与するための医薬組成物は、トリヨードサイロニンの塩と、ｐＨ５．５～８．５に調整された医薬的に許容可能な緩衝液とを含む。組成物は、肺の炎症又は肺浮腫を治療するために、予防的又は治療的に対象に投与され得る。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象の急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を治療する方法であって、該方法は、前記対象における第１の血清Ｔ３レベルを測定すること、
トリヨードサイロニン（Ｔ３）の初期用量を前記対象の肺管に直接投与すること、
最初の時間間隔の後に第２の血清Ｔ３レベルを測定すること、
Ｔ３の第２の用量を前記対象に提供すること、を含む方法。
【請求項2】
前記第２の血清Ｔ３レベルが変曲点に達しておらず、かつ前記Ｔ３の第２の用量が、前記Ｔ３の初期用量よりも多くのＴ３の沈着用量を提供する、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記第２の血清Ｔ３レベルが変曲点に達しており、かつ前記Ｔ３の第２の用量が、前記Ｔ３の初期用量と同じＴ３の沈着用量を提供する、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記Ｔ３の初期用量が少なくとも１μｇから５０μｇ以下の沈着用量を提供する、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
前記初期の時間間隔が少なくとも５分間から４８時間以下である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項6】
前記第２の用量が少なくとも５μｇから５０μｇ以下である、請求項２に記載の方法。
【請求項7】
第２の時間間隔の後に第３の血清Ｔ３レベルを測定すること、そしてＴ３の３回目の用量を前記対象に提供することを、さらに含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
前記第３の血清Ｔ３レベルが変曲点に達しておらず、かつ前記Ｔ３の第３の用量が、前記Ｔ３の第２の用量よりも多くのＴ３の沈着用量を提供する、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記第３の血清Ｔ３レベルが変曲点に達しており、かつ前記Ｔ３の第３の用量が、前記Ｔ３の第２の用量と同じＴ３の沈着用量を提供する、請求項７に記載の方法。
【請求項10】
前記第２の時間間隔が少なくとも５分間から４８時間以下である、請求項７～９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
前記第３の用量が少なくとも１０μｇから５０μｇ以下である、請求項８に記載の方法。
【請求項12】
第３の時間間隔の後に第４の血清Ｔ３レベルを測定すること、そしてＴ３の第４の用量を前記対象に提供することを、さらに含む、請求項７～１１のいずれか１項に記載の方法
【請求項13】
前記第４の血清Ｔ３レベルが変曲点に達しておらず、かつ前記Ｔ３の第４の用量が、前記Ｔ３の第３の用量よりも多くのＴ３の沈着用量を提供する、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記第４の血清Ｔ３レベルが変曲点に達しており、かつ前記Ｔ３の第４の用量が、前記Ｔ３の第３の用量と同じＴ３の沈着を提供する、請求項１２に記載の方法。
【請求項15】
前記第３の時間間隔が少なくとも５分間から４８時間以下である、請求項１２～１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項16】
前記第４の用量が少なくとも２０μｇから５０μｇ以下である、請求項１３に記載の方法。
【請求項17】
第４の時間間隔の後に第５の血清Ｔ３レベルを測定すること、そしてＴ３の第５の用量を対象に提供することを、さらに含む、請求項１２～１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項18】
前記第５の血清Ｔ３レベルが変曲点に達しておらず、かつ前記Ｔ３の第５の用量が、前記Ｔ３の第４の用量よりも多くのＴ３の沈着用量を提供する、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記第５の血清Ｔ３レベルが変曲点に達しており、かつ前記Ｔ３の第５の用量が、前記Ｔ３の第４の用量と同じＴ３の沈着用量を提供する、請求項１７に記載の方法。
【請求項20】
前記第４の時間間隔が少なくとも５分間から４８時間以下である、請求項１７～１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項21】
前記第５の用量が少なくとも２５μｇから５０μｇ以下である、請求項１８に記載の方法。
【請求項22】
第５の時間間隔の後に第６の血清Ｔ３レベルを測定すること、そしてＴ３の第６の用量を前記対象に提供することを、さらに含む、請求項１７～２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項23】
前記第６の血清Ｔ３レベルが変曲点に達しておらず、かつ前記Ｔ３の第６の用量が、前記Ｔ３の第５の用量よりも多くのＴ３の沈着用量を提供する、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
前記第６の血清Ｔ３レベルが変曲点に達しており、かつ前記Ｔ３の第６の用量が、Ｔ３の第５の用量と同じＴ３の沈着用量を提供する、請求項２２に記載の方法。
【請求項25】
前記第５の時間間隔が少なくとも５分間から４８時間以下である、請求項２２～２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項26】
前記第５の用量が少なくとも５０μｇである、請求項２３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年３月２７日に出願された米国仮特許出願第６３／０００，９３９号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年３月２７日に出願された米国仮特許出願第６３／０００，９３９号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
【0002】
本開示は、１つの実施態様において、対象の肺管（例えば、鼻洞、気管内、気管支内、又は肺胞腔）に直接投与するための医薬組成物を記載する。一般に組成物は、トリヨードサイロニン（Ｔ３）の塩と、ｐＨ５．５～８．５に調整された医薬的に許容可能な緩衝液とを含む。
【0003】
いくつかの実施態様において、トリヨードサイロニンの塩は、１０ｍｌ当たり少なくとも５μｇの量で提供される。
【0004】
いくつかの実施態様において、組成物はエアロゾル化される。他の実施態様において、組成物は噴霧される。
【0005】
別の態様において、本開示は、対象における急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を治療する方法を記載する。一般にこの方法は、対象にＴ３の初期用量を提供すること、及び対象におけるＴ３の血清レベルが変曲点に達するまで、Ｔ３の用量を段階的に増加させることを含む。
【0006】
上記の概要は、開示された各実施態様又は本発明のすべての実施を説明することを意図するものではない。以下の説明は、例示的な実施態様をより具体的に例示する。本出願全体のいくつかの場所で、例のリストを通じてガイダンスが提供され、これらの例はさまざまな組み合わせで使用することができる。いずれの場合も、列挙されたリストは代表的な群としてのみ機能し、排他的なリストとして解釈されるべきではない．
【図面の簡単な説明】
【0007】
本特許又は出願ファイルには、カラーで作成された少なくとも１つの図面又は写真が含まれている。カラー図面又は写真を含む本特許又は特許出願公開のコピーは、請求と必要な料金の支払いに応じて、特許庁によって提供される。
【図1】成人型呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）患者及び正常なヒトの肺組織における酵素デヨージナーゼ－３（deiodinase-3）（Ｄ３）の免疫組織化学的局在化。（Ａ）ＡＲＤＳ組織試料は、複数の細胞型でびまん性陽性Ｄ３染色を伴う、肺胞腔中の特徴的なびまん性肺胞損傷とタンパク性肺胞充填を示した。（Ｄ）ＡＲＤＳ組織試料は、ＩＩ型肺胞肺細胞のＤ３陽性染色を伴うヒアリン膜形成を示した。（Ｇ）ＡＲＤＳ組織試料は、紡錘状細胞及び毛細血管内皮のＤ３陽性染色を伴う間質における増殖及び炎症細胞を示した。（Ｂ、Ｅ、Ｈ）正常なヒト肺からの対照組織試料は、有意なＤ３染色なしで、肺胞及び間質の正常な組織学的構造を示した。（Ｃ、Ｆ、Ｉ）１次抗体（特異性対照として）ではなく、正常なマウス血清で処理されたＡＲＤＳ試料も、有意なＤ３染色を示さなかった。
【図2】ＡＲＤＳの肺組織と正常なヒトの肺におけるデヨージナーゼ－３活性とＴ３量。肺Ｄ３酵素活性は初期ＡＲＤＳ肺で上昇し、肺Ｔ３濃度は初期及び後期ＡＲＤＳ肺の両方で減少する。Ｄ３活性（Ａ）及び総Ｔ３濃度（Ｂ）は、死後のヒト初期ＡＲＤＳ（ｎ＝３）、後期ＡＲＤＳ（ｎ＝５）、及び正常対照（ｎ＝４）の肺で測定された。データは平均±ＳＥＭとして表示される。共通の上付き文字を共有していない群は、一元配置分散分析とテューキーの多重比較検定によって有意に異なる（Ｐ＜０．０５）。
【図3】１回又は２回のＴ３投与プロトコール後の遊離Ｔ３レベル。以下のように［０時間目に０．０５μｇ／ｋｇ＋３時間目に０．１μｇ／ｋｇ（白三角）、０時間目に０．２μｇ／ｋｇ（黒丸）、又は０時間目に０．４μｇ／ｋｇ（黒菱形）］トリヨードサイロニンのボーラスのみを投与されているヒト患者の投与群による、平均±ＳＤ遊離トリヨードサイロニンレベル。影付きの四角は、無血清トリヨードサイロニンレベルの正常範囲を表す。
【図4】ＦＤＡ承認されたＡＲＤＳを治療するためのＴ３点滴の第Ｉ／ＩＩ相ヒト臨床試験計画。
【図5】ラットモデルにおける血清Ｔ３濃度の経時変化（平均±ＳＥＭ）。Ｔ３の単回投与は、２．７μｇ（約１０．０μｇ／ｋｇ）の用量で気管内点滴により行った。試料は、化学発光アッセイを使用して総Ｔ３について分析された。可能な限り、平均濃度は３匹の動物／性別／時点から得られた。
【図6】ラットへのリオチロニンナトリウム（３００μｌ中２．７μｇ、ｐＨ７．５）の静脈内又は気管内投与後の血清Ｔ３濃度（平均±ＳＥＭ）。Ｔ３の単回投与は、静脈内（ひし形）又は気管内点滴（四角）により行われた。試料は、化学発光アッセイを使用して総Ｔ３について分析された。
【図7】Ｔ３は、９５％酸素下及び酸素正常状態で回復中のＲＬＥ－６ＴＮ細胞の生存を上昇させる。（Ａ）Ｔ３は、高酸素ストレス下のＲＬＥ－６ＴＮ細胞の生存率を上昇させる。細胞は９０％Ｏ２と５％ＣＯ２中で７２時間、Ｔ３（Ａについて１０－６Ｍ）又はＲＴ３（Ａについて１０－６Ｍ）の存在下で、２％ストリップＦＢＳ培養培地中でインキュベートされた。（Ｂ）高酸素下でのＲＬＥ－６ＴＮ細胞生存のＴ３用量曲線。細胞は、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２中で、２１％Ｏ２と５％ＣＯ２中で一晩培養された。次に、細胞を９０％Ｏ２と５％ＣＯ２中で７２時間、２％ストリップＦＢＳを補足したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で、指示濃度のＴ３の存在下でインキュベートした。（Ｃ）ＲＬＥ－６ＴＮ細胞を、Ｔ３を有り又は無しで高酸素状態で７２時間インキュベートした後、細胞を室内空気に移し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２中でさらに７２時間培養した。７２時間の高酸素曝露の直後に、生存細胞をカウントする。細胞生存率は、トリパンブルーで評価される。特定の条件下で生存細胞は、高酸素状態単独からの細胞数のパーセントとして表示される。データは４つの独立した実験の平均値±標準偏差であり、＊＝Ｐ＜０．０５の、＊＊＝Ｐ＜０．０１である。
【図8】Ｔ３は、高酸素損傷後のＲＬＥ－６ＴＮ細胞の数を増加させる。（Ａ）ＲＬＥ－６ＴＮ細胞を高酸素状態に２４時間曝露した後、２％ストリップＦＢＳを補足したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で、Ｔ３又はｒＴ３の存在下で室内空気に４８時間移した。（Ｂ）ＲＬＥ－６ＴＮ細胞を高酸素状態に４８時間曝露した後、２％ストリップＦＢＳを補足したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で、Ｔ３又はｒＴ３の存在下で室内空気に４８時間移した。（Ａ）と（Ｂ）の両方で、特定の条件下での生存細胞数は、同じ実験内で高酸素状態のみに関連する細胞数のパーセントとして表示される。データは４つの独立した実験の平均値±標準偏差であり、＊＝Ｐ＜０．０５の、＊＊＝Ｐ＜０．０１である。
【図9】ＡＴＩＩの高酸素損傷に対するＴ３の防御作用には、Ｎｒｆ２の活性化が必要である。ＲＬＥ－６ＴＮ細胞を、１０－６ＭのＴ３有り又は無しで９０％Ｏ２と５％ＣＯ２中で２４時間、２％ストリップＦＢＳを補足したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中でＴ３（１０－６Ｍ）の存在下でインキュベートした。次に細胞をウェスタンブロッティング分析のために採取した。（Ａ）Ｎｒｆ２の細胞の総タンパク質。（Ｂ）核Ｎｒｆ２。
【図10】高酸素下のＴ３が増加したＲＬＥ－６ＴＮ細胞の生存には、ＨＯ－１アップレギュレーションが必要である。（Ａ）Ｔ３は、高酸素下で総細胞性ＨＯ－１タンパク質を増加させる。細胞を、９０％Ｏ２と５％ＣＯ２中で、Ｔ３（１０－６Ｍ）の存在下で７２時間インキュベートした。次に細胞を採取して、ウェスタンブロット分析を行った。（Ｂ）細胞を、２１％Ｏ２と５％ＣＯ２中で７２時間、ＨＯ－１阻害剤であるスズプロトポルフィリンＩＸ（１０－６Ｍ）又はＴ３（１０－６Ｍ）の存在下でインキュベートした。（Ｃ）細胞を、９０％Ｏ２と５％ＣＯ２中で７２時間、Ｔ３（１０－６Ｍ）又はスズプロトポルフィリン（１０－６Ｍ）の存在下でインキュベートした。細胞生存率はトリパンブルーで評価される。特定の条件下での生存細胞数は、高酸素状態のみに関連する細胞数のパーセントとして表示される。データは、３つの独立した実験の平均値±標準偏差であり、＊＝Ｐ＜０．０５、＊＊＝Ｐ＜０．０１である。
【図11】ＰＩ３Ｋ阻害剤ワートマニン（wortmannin ）は、高酸素下でＴ３誘導細胞の生存を阻止した。細胞を、９０％Ｏ２と５％ＣＯ２中で７２時間、２％ストリップＦＢＳを補足したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中のＴ３（１０－６Ｍ）又はワートマニン（１０－６Ｍ）の存在下でインキュベートした。細胞生存率はトリパンブルーで評価される。特定の条件下での生存細胞数は、高酸素状態のみに関連する細胞数のパーセントとして表示される。データは、４つの独立した実験の平均値±標準偏差であり、＊＝Ｐ＜０．０５、＊＊＝Ｐ＜０．０１である。
【図12】ＰＩ３Ｋを介するＮｒｆ２及びＨＯ－１タンパク質の、高酸素下のＴ３誘導性増加。（Ａ）総Ｎｒｆ２のウエスタンブロット及びデンシトメトリーデータ。（Ｂ）細胞質Ｎｒｆ２のウエスタンブロット及びデンシトメトリーデータ。（Ｃ）核Ｎｒｆ２のウエスタンブロット及びデンシトメトリーデータ。
【図13】高酸素状態は血清総Ｔ３濃度を低下させた。ラットを約９５％の酸素に６０時間曝露した。Ｔ３の補足は高酸素曝露の２４時間後に開始された。データは、独立した実験の平均±標準偏差（ＳＤ）として表示される（室内空気制御のラット８匹、高酸素状態のラット１０匹、Ｔ３補足のラット６匹）。＊＊＊、ｐ＜０．００１。ＲＡ：室内空気制御。
【図14】高酸素に誘導される徴候に対するＴ３の影響。（Ａ）Ｔ３は、ウェット／ドライ肺重量比の高酸素誘導性の増加を低下させる。（Ｂ）Ｔ３は、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）液体タンパク質濃度の高酸素誘導性の増加を低下させる。データは、独立した実験の平均±ＳＤとして表示される（４８時間曝露の２つの実験からの４匹のラット；６０時間曝露の３つの実験からの３匹のラット）。＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１。ＲＡ：室内空気制御。
【図15】Ｔ３は、ＢＡＬＦ有核細胞の高酸素誘導性の増加を低下させる。データは、独立した実験の平均±ＳＤとして表示される（４８時間曝露の２つの実験からの４匹のラット；６０時間曝露の３つの実験からの４匹のラット）。＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；ＲＡ：室内空気制御。
【図16】Ｔ３は、肺組織の高酸素誘導性のミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性を低下させる。データは、独立した実験の平均±ＳＤとして表示される（４８時間曝露の２つの実験からの４匹のラット；６０時間曝露の３つの実験からの４匹のラット）。＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１。ＲＡ：室内空気制御。
【図17】Ｔ３は、高酸素後の肺好中球（ＭＰＯ陽性細胞）を減少させる。肺組織は、Ｔ３点滴有り／無しで高酸素曝露の６０時間後に得られた。免疫染色は、１次抗ＭＰＯ抗体を使用して行われた。黒い点はＭＰＯ陽性細胞を示す。
【図18】Ｔ３注入は、形態学的な高酸素性肺損傷を軽減する。Ｔ３点滴有り／無しで６０時間の高酸素曝露のラット肺組織をヘマトキシリンで染色し、光学顕微鏡で観察した。（Ａ）対照：室内空気。（Ｂ）高酸素；（Ｃ）高酸素＋Ｔ３。
【図19】臨床医が治療移行点を超えてＴ３用量を増加させた症例の、時間の関数としての血清Ｔ３レベル、肺水、及びＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）のレベルを示すプロット。
【図20】臨床医が治療移行点を超えたＴ３用量を維持した症例の、時間の関数としての血清Ｔ３レベル、肺水、及びＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）のレベルを示すプロット。
【図21】Ｔ３で治療された患者の胸部レントゲン写真。２人の患者の、入院時、最初のＴ３投与前の朝、４回目のＴ３投与の２４時間後、最初の投与後のフォローアップの３０日目、及びフォローアップの６０日目の胸部レントゲン写真が示される。いずれの患者も、病気の後、比較的迅速に完全に回復し、胸部レントゲン写真が正常になった。
【図22】Ｔ３で治療された患者における酸素化の経時変化。患者１におけるＰａＯ２／ＦｉＯ２（Ｐ／Ｆ）比とＰＥＥＰレベルの経時変化が示される。Ｔ３投与の開始前に、患者１は、麻痺の使用、エポプロステノールナトリウムによる治療、及び腹臥位による酸素化にいくらかの改善があり、Ｐ／Ｆ比の２つの初期ピークの原因となっている。酸素化は、最初のＴ３投与前の１２時間にわたって悪化していた。
【図23】Ｔ３で治療された患者における酸素化の経時変化。患者２におけるＰａＯ２／ＦｉＯ２（Ｐ／Ｆ）比とＰＥＥＰレベルの経時変化が示される。患者２は、複数回の介入にもかかわらず、投与前に着実に悪化した経過をたどった。
【図24】Ｔ３で治療された患者の甲状腺ホルモンレベルの経時変化。患者１のＴ３投与期間中の遊離Ｔ３、総Ｔ３（未変性Ｔ３）、遊離Ｔ４、及びＴＳＨの変化。患者１は１日５０μｇを４日間投与された。遊離Ｔ３、総Ｔ３、及びＴＳＨは、４回のＴ３投与にわたって経時的に増加したが、遊離Ｔ４は変化しなかった。
【図25】Ｔ３で治療された患者の甲状腺ホルモンレベルの経時変化。患者２のＴ３投与期間中の遊離Ｔ３、総Ｔ３（未変性Ｔ３）、遊離Ｔ４、及びＴＳＨの変化。患者２のＴ３投与量は段階的に増加した：１日目５μｇ；２日目１０μｇ；３日目２５μｇ；４日目５０μｇ。患者２は、各投与後に血清遊離Ｔ３が一時的に増加したが、血清総Ｔ３又は遊離Ｔ４の一貫した変化はなかった。
【発明を実施するための形態】
【0008】
本開示は、肺浮腫及び／又は肺炎症、例えば急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）で起きるプロセスを治療するのに有効なトリヨードサイロニン（Ｔ３）を含む組成物を記載する。Ｔ３組成物は、液体形態であってもエアロゾルであっても、肺に直接投与されるように製剤化される。本開示はさらに、Ｔ３の製剤を鼻洞、気管内、気管支内、又は肺胞腔に直接投与することによって肺炎症を治療する方法を記載する。
【0009】
肺は甲状腺ホルモン（ＴＨ）の標的組織である。甲状腺ホルモンは、肺の成長、肺機能、及び肺組織への損傷の修復に影響を与える。げっ歯類では、甲状腺機能低下症は肺の成長中に気腔液のクリアランスに損傷を与えるが、全身性Ｔ３は、成体ラットの肺の肺胞液クリアランスを増強する。肺胞液クリアランスのＴ３刺激は、肺で局所的かつ急速に発生する。さらに、甲状腺ホルモン受容体（ＴＲ）アルファ又はベータ遺伝子のいずれかをノックアウトしたマウスモデルでは、肺の成長、及びストレスや損傷に対する反応が変化している。ヒツジモデルでは、ベタメタゾン注射にサイロキシンを追加すると、早産子羊の周産期肺機能が大幅に改善された。
【0010】
臨床的には、甲状腺疾患は多様な肺症状と関連している。甲状腺機能低下症と甲状腺機能亢進症の両方が、呼吸筋の衰弱及び／又は肺機能の低下を引き起こす可能性がある。甲状腺機能低下症は呼吸ドライブを低下させ、閉塞性睡眠時無呼吸又は胸水を引き起こす可能性がある。逆に、甲状腺機能亢進症は呼吸ドライブを上昇させ、労作時に呼吸困難を引き起こす可能性がある。甲状腺機能低下症又は甲状腺機能亢進症のいずれかが、特発性原発性肺動脈性肺高血圧症（ＩＰＰＡＨ）に関連している可能性がある。さらに、根底にある甲状腺障害を治療することで肺高血圧症が改善する可能性があるが、病因に関与する正確なメカニズムは確立されていない。
【0011】
細胞レベルでは、甲状腺ホルモンの状態は、肺胞数、肺胞ＩＩ型肺細胞の数とサイズ、及びこれらのサーファクタント産生に影響を与える。Ｔ３は、増強されたＮａ，Ｋ－ＡＴＰａｓｅ活性を介して、肺胞上皮細胞の肺胞液クリアランス（ＡＦＣ）を上昇させる。活発なナトリウム再吸収は、出生時、急性肺損傷（ＡＬＩ）時、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）時、及びうっ血性心不全などの心原性浮腫時の肺の、肺（肺胞）浮腫の除去に関与している。逆に、肺のＴ３レベルを下げると、肺胞浮腫が悪化する可能性がある。
【0012】
本開示は、Ｔ３を鼻洞、気管内、気管支内、又は肺胞腔に、例えばスプレー、吸入、噴霧、又は点滴によって、直接投与することを含む方法を記載する。肺胞浮腫及び／又は肺炎症が急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）に関連する例示的な実施態様の文脈で本明細書に記載されているが、本明細書に記載の組成物及び方法は、炎症の根底にある原因に関係なく、肺胞浮腫及び／又は肺組織の炎症を治療するために使用することができる。本明細書に記載の組成物及び方法を使用して治療可能な肺炎症又は肺胞浮腫の例示的な他の原因には、例えば早産、胸部外傷、うっ血性心不全、肺移植の前及び／又は後、肺癌の放射線療法又は化学療法の前及び／又は後、肺炎、敗血症、喫煙（タバコ又はＴＨＣを問わず）、汚染物質への曝露（環境的又は職業的、例えば、石綿肺、珪肺症、ベリリウム症、石炭労働者、じん肺、ガス曝露、熱傷、又はその他の塵肺症）、過敏性肺炎、反応性又は閉塞性肺疾患（例えば、喘息、慢性気管支炎、反応性気道機能不全症候群、又は他の反応性気道疾患）、誤嚥性化学性肺炎又は肺炎、肺炎、又は鼻洞、気管内、気管支内、若しくは肺胞腔の感染（細菌、ウイルス、真菌など）、結合組織病（関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、強皮症、サルコイドーシス、及びその他の関連疾患）、ウェゲナー肉芽腫症、グッドパスチャー疾患、急性又は慢性の好酸球性肺炎、投薬関連の肺損傷（例えば、アミオダロン、ブレオマイシン、ブスルファン、マイトマイシンＣ、メトトレキサート、アポモルヒネ、ニトロフラントイン、又はその他の肺向性薬の使用による損傷）、原因不明の器質化肺炎、チャーグ・ストラウス症候群、又は先天性若しくは構造的肺疾患（例えば、嚢胞性線維症、気管支拡張症）が含まれる。
【0013】
急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）は、肺胞液クリアランス（ＡＦＣ）の減少と高い死亡率を伴う出血性炎症性肺浮腫を特徴とする。トリヨードサイロニン（Ｔ３）は、肺胞ＩＩ型肺細胞に作用してＮａ，Ｋ－ＡＴＰａｓｅ活性を増強し、それによって浮腫液クリアランスを促進し、毛細血管への酸素拡散を増強する。Ｔ３は酵素ヨードサイロニンデヨージナーゼＩＩＩ型（Ｄ３）によって不活性化される。ＡＲＤＳ患者のほとんどは、肺胞浮腫液を除去する能力が低下している。さらに、肺胞液クリアランスの速度が遅いほど、死亡率が高くなり、人工呼吸器によるサポートの必要性が長くなる。従って、肺胞液クリアランスを改善することで、ＡＲＤＳ患者の転帰を改善することができる。本開示は、Ｄ３の発現及び活性が初期のＡＲＤＳヒト肺組織において上昇していることを報告する。初期ＡＲＤＳにおけるＤ３の誘導は、局所的な肺Ｔ３の不活性化を伴い、肺組織における肺Ｔ３濃度の低下をもたらす。Ｔ３が肺胞液クリアランスを刺激することを考えると、肺Ｔ３のＤ３誘導性の不活性化は、ＡＲＤＳの肺胞液クリアランスを妨害し、液体による肺胞内の液貯留の程度と持続的な低酸素血症に寄与する可能性がある。
【0014】
ＡＲＤＳ肺組織試料は、肺胞腔内のタンパク質性肺胞充填、ヒアリン膜形成、及び間質中の炎症細胞を伴う特徴的なびまん性肺胞損傷を示した（図１Ａ、１Ｄ、１Ｇ）。対照組織試料は、肺胞及び間質の正常な組織構造を示した（図１Ｂ、１Ｅ、１Ｈ）。ＡＲＤＳ組織におけるＤ３の免疫組織化学的局在は、肺胞ＩＩ型肺細胞（図１Ａ、１Ｄ）、紡錘形間質細胞、及び毛細血管内皮細胞（図１Ｇ）における高レベルのＤ３発現を明らかにした。正常な対照組織は、これらの細胞型のそれぞれにおいて、Ｄ３抗体染色がはるかに少ないことを示した（図１Ｂ、１Ｅ、１Ｈ）。特異性対照として、１次抗体を除去しても、どの組織切片でも有意なＤ３染色は見られなかった（図１Ｃ、１Ｆ、１Ｉ）。
【0015】
ＡＲＤＳ肺におけるＤ３発現の上昇が酵素活性の上昇と関連しているかどうかを判定するために、初期ＡＲＤＳ（ｎ＝３）、後期ＡＲＤＳ（ｎ＝５）、及び対照（ｎ＝４）の肺試料で、Ｄ３酵素活性を測定した。肺Ｄ３酵素活性は、初期ＡＲＤＳでは正常対照組織より約１１．３倍高かった（１．５７対０．１４±ＳＥＭ ｆｍｏｌ／ｍｇ／分、ｐ＜０．０００１）（図２Ａ）。Ｄ３活性は、後期ＡＲＤＳでは対照肺より約２．５倍高かった（０．３４対０．１４ｆｍｏｌ／ｍｇ／分、ｐ＝０．２９、有意差無し）。肺Ｔ３レベルは、初期及び後期ＡＲＤＳでは対照の肺レベルより、それぞれ６５％及び７７％低かった（図２Ｂ）。まとめると、これらのデータは、Ｄ３の発現と活性が初期のＡＲＤＳ患者の肺で顕著に誘導され、Ｄ３の上昇が組織全体のＴ３の局所的な低下と関連していることを示している。これらのデータは、ＡＲＤＳにおける肺胞液クリアランス（ＡＦＣ）の促進におけるＴ３の役割と、低酸素、炎症状態においてＴ３の不活性化を引き起こすＤ３の役割とを関連付けている。
【0016】
肺損傷では、肺胞上皮及び毛細血管内皮の透過性が亢進し、間質及び肺胞腔へのタンパク質、溶質、及び液体の経毛細管拡散が容易になる。間質性浮腫、特に肺胞浮腫液の再吸収は、肺胞での効率的なガス交換に不可欠である。肺胞液クリアランスは、基底外側のＮａ，Ｋ－ＡＴＰａｓｅポンプと頂端ナトリウム輸送タンパク質の複合作用を介する、肺胞上皮バリアを通過する能動的肺胞上皮ナトリウム再吸収によって駆動される。
【0017】
正常なラットの肺と損傷したラットの肺の両方で、Ｔ３の点滴は肺胞液クリアランスを大幅に上昇させる。局所性及び／又は全身性の炎症は、ＡＲＤＳ肺のＤ３誘導を開始する可能性がある。急性細菌感染症及び／又は梗塞／虚血は、Ｄ３発現を誘発する可能性がある。本試験の患者におけるＡＲＤＳは、肺炎（ウイルス性又は細菌性）、敗血症、外傷、及び手術後の肺損傷を含むさまざまな病因に起因し、すべて炎症がＤ３誘導及びその後のＴ３枯渇への共通の経路である可能性がある。ＡＲＤＳ肺の局所Ｔ３濃度が低下すると、肺胞液クリアランスが妨げられる。減少した肺胞液クリアランスは酸素拡散を妨害し、ＡＲＤＳの特徴である低酸素血症を悪化させる。通常の状況のベースラインでは、全身の酸素摂取量の５％が呼吸と肺機能のために消費される。呼吸不全などの重大な病気では、通常、十分な酸素化と換気を維持するために、肺の代謝要件が大幅に増加する。ＡＲＤＳでは、全身性及び局所性炎症がＤ３の全身性及び局所性発現を上昇させ、Ｔ３レベルを低下させ、機能の促進が望まれるときに肺代謝をダウンレギュレートする可能性がある。他のすべての臓器は酸素について肺ガス交換に依存しており、Ｔ３は肺胞液クリアランスと拡散能力の維持に関与しているため、肺のＴ３欠乏は有害な影響を及ぼす。
【0018】
Ｔ３点滴は、正常肺組織及び高酸素損傷性肺組織の肺胞液クリアランスを上昇させる。高酸素誘導性の肺損傷（ＨＡＬＩ）は、急性肺損傷の確立された動物モデルである。高酸素状態によって生成された活性酸素種（ＲＯＳ）は、アポトーシス及び壊死による肺胞上皮細胞死及び内皮細胞死を引き起こし、肺損傷に寄与する。酸素毒性の分子的基礎は、分子状酸素から直接誘導され、及び／又は分子状酸素と他の化学種との相互作用から間接的に誘導されるフリーラジカルＲＯＳ（活性酸素種）によって媒介される。従って、酸化剤は、急性及び慢性の肺損傷の発症を媒介する。甲状腺ホルモンは、成体及び成育中のラットの脳と肺の両方の抗酸化防御に影響を与える。本開示は、ＨＡＬＩモデルにおける肺の炎症及び損傷に対する全身性Ｔ３補足の影響を評価するデータを提示する。
【0019】
高酸素は、血清総Ｔ３レベルを低下させた。重篤な疾患は、血清総Ｔ３濃度及び遊離Ｔ３濃度の低下を伴う、甲状腺機能亢進症症候群又は非甲状腺疾患を引き起こすことがよくある。図１３は、腹腔内Ｔ３補足（５０μｇ／ｋｇ体重／２４時間）有り又は無しで、９５％酸素に６０時間曝露されたラットにおける総血清Ｔ３レベルを測定したデータを示す。高酸素は、正常酸素室内空気（ＲＡ）ラットと比較して、血清総Ｔ３を有意に低下させ（ＲＡ：８２．９７±１４．４３９９、高酸素：５３．９±１１．２９５３、ｐ＝０．０００４３）、そして補足により血清総Ｔ３が上昇した。
【0020】
Ｔ３は、高酸素状態により誘導される肺浮腫及び気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）タンパク質濃度の増加を低下させた。９５％の酸素に６０時間曝露された成体ラットは、ＢＡＬＦタンパク質濃度上昇、透過性亢進、及び肺浮腫の増加によって示されるように、実質的な肺損傷を起こす。高酸素状態は、正常酸素圧のラットの肺と比較して、湿潤肺と乾いた肺の重量比の増加を誘導する（それぞれ６．４９±０．２７対５．３±０．１６、ｐ＝０．００４）。図１４Ａは、６０時間の高酸素状態が、室内空気と比較して湿潤肺と乾いた肺の重量比を再び顕著に上昇させたことを示す（Ｏ２：６．６１±０．６０対ＲＡ：４．８２±０．１４）。腹腔内Ｔ３による処置（１２．５μｇ／ｋｇ体重を１２時間ごとに注入）は、この高酸素誘導性増加を有意に低下させた（Ｏ２：６．６１±０．６０４；Ｔ３を伴うＯ２：５．８２±０．１９７、ｐ＝０．０４９５対Ｏ２処置）（図１４Ａ）。高酸素状態はまた、４８時間及び６０時間の両方の時点でＢＡＬＦタンパク質濃度を顕著に上昇させ、Ｔ３投与は、両方の時点でＢＡＬＦタンパク質濃度の高酸素性上昇を有意に弱めた（図１４Ｂ）。従ってＴ３の補足は、高酸素状態によって引き起こされる肺浮腫の程度と肺胞上皮バリアの機能不全を低下させた．
【0021】
Ｔ３は、ＢＡＬＦ細胞性及び肺組織の好中球蓄積の高酸素による上昇を低下させた。成体ラットの肺では、９５％酸素への曝露でＢＡＬＦ中の炎症細胞の数が増加した。実際、９５％酸素に４８時間又は６０時間曝露すると、室内空気中の対照ラットと比較して、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）細胞の数が顕著に増加した。ほとんどのＢＡＬ細胞は単核細胞とマクロファージであったが、血球百分率測定は行わなかった。高酸素状態中のＴ３投与は、高酸素状態単独の場合と比較して、両方の時点でＢＡＬＦ細胞数を有意に低下させた（図１５）。
【0022】
肺への好中球の浸潤は、肺炎症の構成要素であり、これはしばしば肺損傷の前兆及び構成要素である。しかしながら、高酸素後のＢＡＬＦ細胞の比較的少数が好中球であった（データは示していない）。高酸素下での肺組織好中球に対するＴ３の影響は、以下の２つの方法で直接評価された：肺ホモジネート中のミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性の測定と、ＭＰＯに対する肺の免疫染色。肺のＭＰＯ活性は４８時間の高酸素状態によって変化しなかったが（図１６、左パネル）、肺ＭＰＯ活性は、室内空気対照と比較して６０時間の高酸素で顕著に上昇した（図１６、右パネル）。Ｔ３補足は、高酸素誘導性ＭＰＯ活性を有意に低下させた（図１６、右パネル）。同様に、細胞化学反応は、９５％酸素に６０時間曝露されたＴ３注入ラットが示したＭＰＯ陽性細胞は、Ｔ３補足なしの高酸素肺より少なく、ＭＰＯ活性の結果が確認された（図１７）。全身のＴ３補足は、肺組織内の高酸素誘導性の好中球蓄積を抑制した。
【0023】
Ｔ３は、高酸素誘導性の形態学的肺損傷を軽減した。肺切片の組織病理学的評価も実施して、Ｔ３が高酸素性肺損傷を軽減したかどうかを定性的に評価した。予想通り、高酸素状態単独で、肺胞中隔肥厚、肺浮腫、及び肺胞炎症細胞が引き起こされた（図１８Ａ及び１８Ｂ）。対照的に、全身的なＴ３補足では、事実上正常な肺の形態が維持された（図１８Ｃ）。肺の組織学における顕著な違いは、Ｔ３補足が高酸素性肺損傷を顕著に軽減することをさらに証明した。
【0024】
従って本開示は、高酸素曝露と同時のＴ３投与が、高酸素誘導性のラット肺損傷の重症度を有意に低下させ、肺における好中球蓄積を減少、肺浮腫を減少、及び肺胞上皮透過性障壁の破壊を減少させたことを示すデータを提供する。Ｔ３補足は肺損傷と炎症を大幅に減少させたが、高酸素性肺損傷と炎症は排除しなかった．これらの結果は、高酸素性肺損傷に対するＴ３の防御的抗炎症作用を強く示唆している。
【0025】
高酸素曝露は血清総Ｔ３濃度を低下させた（図１３）。Ｔ３の腹腔内注入は、血清総Ｔ３を回復させ（図１３）、成体ラットにおける高酸素媒介性肺損傷を有意に低下させ、これは、（１）６０時間後の湿潤／乾燥肺重量の比（図１４Ａ）、（２）曝露の４８時間後又は６０時間後のＢＡＬ：体液総タンパク質濃度（図１４Ｂ）、（３）４８時間後又は６０時間後のＢＡＬ液中の有核細胞の数（図１５）、（４）６０時間後の肺組織における好中球の蓄積（図１６及び図１７）、及び（５）６０時間後のラット肺における組織病理学的びまん性肺胞壁損傷及び炎症細胞の浸潤（図１８）、の上昇が低下することによって測定された。これらの結果は、Ｔ３が高酸素媒介性の肺の炎症と損傷を軽減することを示している。
【0026】
甲状腺ホルモンは一般的に、肺機能の重要な調節因子として認識されていない。しかし、甲状腺ホルモンは肺にさまざまな影響を及ぼす。例えば甲状腺ホルモンは、肺胞ＩＩ型細胞の数、ラメラ体の数、及びサーファクタントの放出を上昇させる。全身的又は局所的Ｔ３投与は、正常ラット肺と高酸素損傷ラット肺の両方で肺胞浮腫液クリアランスを上昇させる。肺胞腔Ｔ３投与は、ラット肺における高酸素誘導性の肺損傷によって低下したＡＦＣを急速に回復させた。Ｔ３はまた、ＩＩ型肺胞上皮細胞のＮａ，Ｋ－ＡＴＰａｓｅ活性を有意に上昇させ、肺胞腔から浮腫液を除去するその役割と一致している。Ｔ３のこの作用には、ＰＩ－３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）／Ａｋｔ及びＥＲＫ１／２経路の両方の協調作用が関与する。ＰＩ－３Ｋ／Ａｋｔ経路は、炎症を含むストレスに対する多くの細胞応答に関与している。
【0027】
また、点滴されたＴ３は、高酸素ストレスに曝露された肺胞ＩＩ型細胞の生存も増強する。高酸素曝露は、肺胞上皮細胞のアポトーシスと壊死の両方を引き起こす。肺胞ＩＩ型（ＡＴ２）細胞の生存は、酸化剤誘導性の肺損傷後の回復に重要である。甲状腺ホルモン（Ｔ３）は、インビボで９５％超の酸素に曝露された成体ラットの高酸素誘導性の肺炎症を軽減した。
【0028】
動物における高酸素誘導性の急性肺損傷（ＨＡＬＩ）は、急性肺損傷とＡＲＤＳの十分に確立されたモデルである。高酸素状態に長時間曝露されると、過剰な活性酸素種が生成され、肺胞内皮細胞及び上皮細胞の損傷と死が引き起こされ、高肺胞レベルの炎症誘発性サイトカインと過剰な白血球浸潤を伴う。
【0029】
肺胞上皮細胞及び内皮細胞は、肺胞－毛細血管バリアを無傷の状態で維持し、酸化的損傷から防御する。高酸素状態に長時間曝露されると、活性酸素種（ＲＯＳ）が過剰に生成され、レドックス恒常性を壊滅させて細胞に損傷を与える。核因子赤血球２関連因子２（Ｎｒｆ２）転写因子は、ヘムオキシゲナーゼ－１（ＨＯ－１）、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：キノンオキシドレダクターゼ－１（ＮＱＯ－１）、グルタミン酸システインリガーゼ、ペルオキシレドキシン３、ペルオキシレドキシン６、マンガンスーパーオキシドジスムターゼ、及びカタラーゼを含む酸化防止剤／解毒酵素パネルの協調的転写活性化により、酸化的損傷及び化学的発癌物質から細胞を防御する。Ｎｒｆ２の遺伝子的除去は、高酸素状態によって誘導される肺損傷を増強するが、内因性Ｎｒｆ２活性の増幅はＨＡＬＩを弱体化させる。肺上皮細胞における抗酸化酵素及び第２相解毒酵素の発現の上昇は、高酸素状態によって生成されたＲＯＳによって引き起こされる損傷に対して防御作用をする。Ｎｒｆ２制御ＨＯ－１は、アポトーシスを阻害することにより、肺損傷のさまざまなモデルで細胞死に対する細胞防御を付与する。Ｎｒｆ２の活性化は、酸化的ストレス時の肺胞細胞の生存を促進する。
【0030】
Ｔ３は、９０％酸素に７２時間曝露した後の生存可能なＡＴ２細胞の数を増加させた。インビボの高酸素は、初期段階のＡＲＤＳと同様にラット肺の炎症と損傷を引き起こし、インビトロの高酸素曝露は、ＡＲＤＳにおける肺胞上皮細胞の損傷と機能を研究するために広く使用されているモデルである。ＭＤＣＫ細胞を使用すると、細胞密度は、高酸素曝露中にアポトーシス、壊死、及び細胞増殖のバランスを決定した。インビボの高酸素曝露は血清Ｔ３を劇的に減少させるが、Ｔ３の補足は、高酸素誘導性の肺の炎症を軽減する。図７は、Ｔ３が、肺胞上皮細胞を高酸素損傷から防御し、それらの生存を上昇させることを示している。ラット成体のＡＴＩＩ様細胞株ＲＬＥ－６ＴＮを、Ｔ３又はＲＴ３（不活性甲状腺ホルモン）の存在下又は非存在下で、９０％の酸素に７２時間曝露し、生存細胞数をトリパンブルー排除法によって測定した。高酸素状態は、生存するＡＴ２細胞の数を、室内空気（２１％酸素）培養条件と比較して、劇的にほぼ７５％低下させた（図７Ａ）。Ｔ３は、高酸素ストレス下で生き残った細胞の数を、高酸素対照と比較して、約２．５倍大幅に上昇させた。対照的に、ｒＴ３は細胞の生存に何の役割も持っていなかった。Ｔ３の防御作用は、薬理学的濃度範囲（１０－７から１０－５Ｍ）全体にわたって観察された（図７Ｂ）。外因性Ｔ３有り又は無しで、高酸素状態に７２時間曝露されたＡＴ２細胞をさらに７２時間室内空気で回復させた場合（補足的Ｔ３なし）、生存可能なＡＴ２細胞数に対するＴ３の防御作用が持続し、同様の大きさであった（図７Ｃ）。高酸素中に存在する薬理学的濃度のＴ３を有することの有益な影響は、室内空気での回復期間の後でも、ＡＴ２細胞の生存率が高いことで明らかになった。これらの結果は、Ｔ３が、高酸素時のＡＴ２細胞の生存を有意に保護したことを示している。
【0031】
Ｔ３は、高酸素損傷後のＡＴ２細胞数の回復を増強した。肺の炎症及び損傷後の肺胞上皮の回復は、ＡＲＤＳ患者の回復を促進する。図８は、Ｔ３が高酸素誘導性の損傷後のＡＴ２細胞回復にプラスの影響を与えたことを示している。ＲＬＥ－６ＴＮ細胞を、９０％の酸素に２４時間又は４８時間曝露した。その後、細胞は、２１％Ｏ２／５％ＣＯ２中で、Ｔ３又はｒＴ３の存在下又は非存在下で４８時間で回復した。２４時間又は４８時間の損傷（それぞれ図８Ａ及び図８Ｂ）に続く回復後に、Ｔ３は４８時間の回復で生存可能ＡＴ２細胞の数を有意に増加させたが、ｒＴ３には防御作用がなかった。すなわちＴ３はまた、回復期にのみ存在しても、高酸素からのＡＴ２細胞の回復にも有益な影響をもたらす。
【0032】
Ｔ３は、高酸素ストレス下でＮｒｆ－２タンパク質の発現と核移行を上昇させた。転写因子Ｎｒｆ２（ＮＦ－Ｅ２関連因子２）は、特に化学的ストレス又は酸化的ストレスに曝露されているときに、細胞の恒常性を促進する。Ｎｒｆ２は、多数の抗酸化タンパク質、解毒酵素、及び生体異物トランスポーターの基礎的発現及び誘導性発現を調節する。図９は、Ｔ３がＮｒｆ２活性を上昇させることを示す。総細胞性及び核のＮｒｆ２タンパク質は、２４時間の高酸素曝露で評価された。高酸素は、驚くべきことに核Ｎｒｆ２タンパク質レベルを変化させることなく、総Ｎｒｆ２タンパク質発現を低下させた。高酸素中のＴ３処理は、全細胞の及び核のＮｒｆ－２タンパク質発現の両方を有意に上昇させた（図９）。
【0033】
Ｔ３誘導性のＨＯ－１の増加は、高酸素下のＴ３誘導性のＲＬＥ－６ＴＮ細胞の生存に必要である。ヘムオキシゲナーゼ－１（ＨＯ－１）は、主要な転写因子Ｎｒｆ２の活性化によって調節される抗炎症性、抗酸化性、及び細胞防御酵素である。ＨＯ－１は、ヘム分解の最初のかつ律速制限酵素の誘導性アイソフォームであり、その誘導は酸化的ストレスとアポトーシス細胞死に対する防御となる。デスオキシラポンチゲニンは、マクロファージ及び炎症性肺損傷においてＮｒｆ２を介するヘムオキシゲナーゼ－１発現をアップレギュレートする。図１０は、高酸素状態の間、Ｔ３がＡＴ２細胞におけるＨＯ－１発現を変化させたことを示す。ＲＬＥ－６ＴＮ細胞を９０％Ｏ２に２４時間曝露した後、細胞生存とＨＯ－１の発現を測定した。細胞生存に対するＨＯ－１阻害剤であるスズプロトポルフィリンの影響も測定した。Ｔ３治療は、高酸素状態の間、ＨＯ－１の総細胞タンパク質を有意に増強した（図１０Ａ）。スズプロトポルフィリンは室内空気中のＡＴ２細胞数に影響を及ぼさなかったが（図１０Ｂ）、Ｔ３による細胞生存率の増加及び細胞死の増大を阻止した（図１０Ｃ）。従って、Ｔ３は高酸素状態中のＨＯ－１発現を増強し、ＨＯ－１アップレギュレーションは ＡＴ２細胞の生存に対するＴ３の防御作用を促進する。
【0034】
ＰＩ３－キナーゼ活性は、ＡＴ２細胞の生存、Ｎｒｆ２活性、及びＨＯ－１発現に対するＴ３の作用を媒介する。ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔは、抗アポトーシス生存経路であり、いくつかの受容体依存性メカニズムによって調節されている。Ｔ３はＰＩ３Ｋ活性を刺激し、この経路の活性化は、Ｔ３に誘導されるＮａ，Ｋ－ＡＴＰａｓｅ活性と原形質膜発現の上昇を促進する。血管内皮では、ＰＩ３Ｋの活性化によりＨＯ－１の発現が上昇するが、一方ＰＩ３Ｋの活性化は、他の細胞タイプにおけるＮｒｆ２タンパク質レベルとＨＯ－１の活性化を上昇させる。高酸素状態中の肺胞細胞生存、Ｎｒｆ２活性、及びＨＯ－１タンパク質レベルに対するＴ３防御作用にＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路が必要かどうかを検出するために、ＲＬＥ－６ＴＮ細胞を高酸素状態で１０－６ＭのＴ３及び／又は１００ｎＭのワートマニンの存在下で７２時間培養した。ワートマニンは、高酸素状態中のＴ３誘導性の細胞生存を阻止し、ほとんどすべての細胞の死をもたらした（図１１）。
【0035】
図１２は、リン酸化によるＡｋｔの活性化に対するＰＩ３Ｋの作用を示す。ＲＬＥ－６ＴＮ細胞を高酸素状態に２４時間曝露し、Ｔ３を一部の細胞に２０分間添加した。高酸素状態単独では、室内空気対照細胞と比較して、総量又はホスホ－Ａｋｔの量は変化しなかったが、Ｔ３は、室内空気対照及び高酸素状態単独と比較して、Ｓｅｒ４７３でのＡｋｔのリン酸化を増強した（図１２Ａ）。ＰＩ３キナーゼは高酸素状態中にＴ３によって活性化され、この経路の活性化は、ＡＴ２細胞の生存に対するＴ３の防御作用を促進する。さらに、ＰＩ３Ｋ阻害剤であるワートマニンは、Ｎｒｆ２総細胞タンパク質及び核タンパク質の両方（図１２Ｂ）の、及び総細胞ＨＯ－１タンパク質量（図１２Ｃ）のＴ３誘導性増加も阻止した。従って、ＰＩ３－キナーゼ経路は、高酸素状態中にＴ３によって活性化され、この経路の活性化は、細胞防御エフェクターであるＨＯ－１及びＮｒｆ２に対する、及びＡＴ２細胞生存に対する、Ｔ３の有益な作用に関与している。
【0036】
肺胞上皮バリアの回復は、ＡＲＤＳからの回復の構成要素である。損傷時の死滅から肺胞上皮細胞を防御すること及び／又は再上皮化を促進することは、治癒を早めるための戦略である。甲状腺ホルモンは肺治癒の決定因子とは考えられていないが、血清Ｔ３レベルは、急性肺損傷を有するヒトとラットの両方で低下している。肺組織のＴ３レベルも顕著に低下する。ＡＴ２細胞は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ介在経路及びＭＡＰキナーゼ介在経路の両方を介して、Ｔ３の薬理学的及び生理学的濃度に応答し、これらの経路は、Ｎａ，Ｋ－ＡＴＰａｓｅ活性を増加させ、インビボで肺胞液クリアランスも増加させる。
【0037】
本開示は、薬理学的濃度のＴ３が高酸素状態中のＡＴ２細胞生存を上昇させ、高酸素状態後のＡＴ２細胞数の回復を加速すしたとを示すデータを提供する。これらの作用は、ＰＩ３キナーゼ及びＮｒｆ２の活性化と、ＨＯ－１発現のアップレギュレーションとに関連していた。ＰＩ３Ｋ活性化がワートマニンによって阻止された場合、又はＨＯ－１の発現がスズプロトポルフィリンによって阻止された場合に、Ｔ３の細胞防御作用は阻止された。これらの知見は、肺におけるＴ３増強が肺胞上皮修復を増強することを示唆している。
【0038】
多くの研究では、肺上皮細胞を高酸素状態に６０～７２時間曝露すると細胞死が引き起こされる。しかしながら本開示は、高酸素状態への曝露前に、ＲＬＥ－６ＴＮ細胞をＴ３で処理すると、未処理対照と比較して生存細胞数が増加したことを示すデータを提供する。細胞数に対するＴ３の作用は、少なくとも部分的には、細胞増殖を維持すること、壊死による細胞死を減少させること、アポトーシスによる細胞死を減少させること、及び／又は他のメカニズムにより引き起こされる可能性がある。Ｔ３は、ＰＩ３Ｋ経路活性を介して一部の選択された細胞タイプ（ヒト神経膠腫、ヒト膵島腫瘍）の増殖を増強するが、他のタイプ（ヒト近位尿細管細胞株（ＨＫ２）及び腎癌細胞株（Ｃａｋｉ－２、Ｃａｋｉ－１））の増殖を阻害する。培養ＡＴ２細胞の過去の研究では、甲状腺ホルモンによる増殖の刺激は示されていない。従って、細胞増殖に対するＴ３の効果は、細胞型に特異的であると思われる。さまざまな種類の細胞の細胞死に対する甲状腺ホルモンの作用は、まだ十分に検討されていない。
【0039】
ＡＴ２細胞の高酸素曝露は、細胞増殖の阻止を引き起こし、壊死とアポトーシスの組み合わせによって細胞死を増加させる。本開示は、Ｔ３の存在下で高酸素ストレス下の生存しているＡＴ２細胞の数が、高酸素状態単独の場合よりも２．５倍高かったこと（図７）、これはおそらく高酸素下のＴ３の強力な細胞防御的役割によるものであることを示すデータを示す。肺損傷後の肺胞細胞の再生及び／又は回復は、正常な肺の構造及び機能の回復を改善する。Ｔ３はまた、高酸素損傷からのＲＬＥ－６ＴＮ細胞の回復も促進した（図８）。
【0040】
Ｎｒｆ－２は、抗酸化物質防御の調節に関与している。酸化物質曝露に応答したＮｒｆ－２の活性化は、細胞ストレスを緩和するいくつかの抗酸化酵素及び細胞防御酵素の誘導に関与している。動物実験では、Ｎｒｆ－２の発現は高酸素性肺損傷に対する防御に関与している。活性酸素種（ＲＯＳ）のスカベンジャーである水素ガスは、Ｎｒｆ－２経路を介して高酸素性肺損傷を軽減する。肺上皮細胞及び内皮細胞死は、高酸素性肺損傷の主要な特徴である。本開示は、高酸素下のＴ３が、Ｎｒｆ２発現及び核蓄積を増加させ（図９）、これは、Ｔ３が肺胞上皮細胞におけるＮｒｆ２活性を増加させることを示していることを示すデータを提供する。Ｎｒｆ２のサイトゾルから核への移動は、フリーラジカル又は求電子物質の毒性を制限するＴ３の新しい細胞防御メカニズムである可能性がある。
【0041】
酸化的ストレス／求電子ストレスのセンサーとしてのＮｒｆ２は、細胞質内のＫｅａｐ１／Ｃｕｌｌｉｎ３／Ｒｉｎｇ Ｂｏｘ１（Ｃｕｌ３／Ｒｂｘ１）Ｅ３ユビキチンリガーゼ複合体経路を介して、常に分解されている。細胞が酸化的ストレスに曝露されると、Ｎｒｆ２はＫｅａｐ１複合体から解離し安定されて、核内に移動し、ＡＲＥを介する遺伝子発現が活性化される。ＰＫＣ、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ、ｐ３８、ＰＥＲＫ、及びＰＩ３Ｋ／Ａｋｔを含むいくつかのプロテインキナーゼはＮｒｆ２を活性化できるが、Ｓｅｒ９でのＡｋｔ介在リン酸化によってその活性を阻害することができるＧＳＫ－３ベータは、Ｎｒｆ２を不活性化する。ＧＳＫ－３ベータはチロシンキナーゼであるＦｙｎをリン酸化し、Ｆｙｎの核局在化を引き起こす。ＦｙｎはＮｒｆ２のチロシン５６８をリン酸化し、Ｎｒｆ２の核外輸送、Ｋｅａｐ１との結合、及びＮｒｆ２の分解をもたらす。高酸素状態への６０分間の曝露は、肺上皮細胞におけるＰＩ３Ｋ／Ａｋｔを介するＮｒｆ２活性を上昇させる。本開示は、ＰＩ３Ｋ阻害剤ワートマニンが、高酸素下のＮｒｆ２の核レベルでのＴ３誘導性増加を無効にし（図１２Ｂ）、Ｔ３によるＰＩ３Ｋ活性化がＮｒｆ２の核移行に関与していることを示唆することを示すデータを提供する。
【0042】
ヘムオキシゲナーゼ－１（ＨＯ－１）は、酸化的ストレスに対する細胞防御を媒介する抗酸化酵素である。ＨＯ－１は、マウスモデルで高酸素誘導性の肺内皮細胞死滅を防ぐ。チャイニーズハムスター肺線維芽細胞（Ｖ７９－４）における、エコール（eckol）による、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路を介するＮｒｆ２媒介性のヘムオキシゲナーゼ－１発現のアップレギュレーション。本開示は、Ｔ３が高酸素条件下の肺胞上皮細胞におけるＨＯ－１発現を増加させたことを示すデータを提示する（図１０Ａ）。ＨＯ－１阻害剤であるＴＩＮは、Ｔ３誘導性の細胞生存の上昇を阻止した（図１０Ｃ）。これらの結果は、ＨＯ－１が高酸素下のＴ３の細胞防御作用を促進することを示した。
【0043】
要約すると、Ｎｒｆ－２による抗酸化的及び細胞防御的遺伝子発現のアップレギュレーションは、高酸素ストレスに応答して、肺胞上皮細胞の生存を媒介し及び／又は細胞死を減少させる。Ｔ３は、肺胞上皮細胞の生存率を高め、高酸素損傷からの細胞回復を加速させる。Ｔ３のこれらの細胞防御作用には、Ｔ３活性化ＰＩ３Ｋを介するＮｒｆ２の活性化とＨＯ－１遺伝子発現のアップレギュレーションが含まれる。
【0044】
従って、本開示は、対象におけるＴ３レベルを維持又は回復するための組成物及び方法を記載する。通常、被験者はヒトである。組成物は一般に、改変された製剤中にＴ３を含む。改変された製剤により、全身曝露が制限された忍容性の高い点滴剤が得られる。改変された製剤中で、点滴されたＴ３は、肺の炎症（例えば、肺移植、放射線療法、又は化学療法に関連する）を軽減、場合によっては除去、肺浮腫の体液クリアランスの増強、肺損傷の減少、及び／又は肺疾患又は損傷（例えば、ＡＲＤＳ）に関連する肺の炎症の治療に効果的である可能性がある。Ｔ３は、全身ではなく肺に直接投与されると、肺炎症の安全な予防及び／又は治療処置である。
【0045】
従来のＴ３液体製剤は、血流に直接静脈内投与することによる粘液浮腫昏睡／前昏睡を治療するための臨床的使用がＦＤＡにより承認されている。血流への静脈内投与により、Ｔ３が急速に希釈され、血清タンパク質及び他の血液成分の緩衝能力によって緩衝化されるため、従来の製剤はｐＨ調整されていない。従来のＴ３製剤を肺に直接投与した場合、その濃度はすぐには希釈されず、気管気管支樹と肺胞内膜液の両方の肺の緩衝能力の程度は不明である。従って、製造業者のバイアルから直接、つまりｐＨを調整せずにＴ３を気道と肺に点滴すると、ラットの肺粘膜と肺胞腔に対して極めて有毒である。
【0046】
本明細書に記載の改変製剤は、中性ｐＨ（５．５～８．５）に調整されたＴ３を含む。Ｔ３は、任意の適切な医薬的に許容可能な担体とともに製剤化することができる。本明細書で使用される「担体」には、任意の溶媒、分散媒体、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤及び／又は抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤、緩衝剤、担体溶液、懸濁液、コロイドなどが含まれる。医薬活性物質のためのそのような媒体及び／又は薬剤の使用は、当技術分野で周知である。従来の媒体又は薬剤が活性成分と適合しないか又は肺組織に有害であることが知られている場合を除き、治療組成物におけるその使用が企図される。補助活性成分も組成物に組み込むことができる。本明細書で使用される「医薬的に許容可能な」とは、生物学的に又は他の意味で望ましくない物質を指し、すなわち、その物質は、望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく、又はそれが含まれる医薬組成物の他の成分のいずれかと有害な方法で相互作用することなく、Ｔ３とともに個体に投与することができる。
【0047】
従ってＴ３は、医薬組成物に製剤化することができる。医薬組成物は、鼻洞、気管内、気管支内、又は肺胞腔への送達に適合した様々な形態で製剤化することができる。医薬組成物は、例えば、呼吸器粘膜への投与（例えば、スプレー、エアロゾル、噴霧、又は点滴による）により、粘膜表面に投与することができる。組成物は、徐放又は遅延放出によって投与することもできる。持続又は遅延放出は、持続又は遅延薬物送達のための従来の一般的な技術によって達成することができる。徐放はまた、Ｔ３を、Ｔ３を分解又は肺から除去するメカニズムを阻害する第２の薬物と組み合わせることによって達成することができる。１つの例示的な第２の薬物は、例えば、イオパン酸などのＤ３の阻害剤である。
【0048】
本明細書に記載の改変製剤は、中性ｐＨに調整されたＴ３を含む。本明細書で使用される用語「中性ｐＨ」は、ｐＨ７．０±１．５、すなわちｐＨ５．５～８．５を指す。いくつかの実施態様において、製剤は、少なくとも５．５、少なくとも６．０、少なくとも６．５、少なくとも７．０、又は少なくとも７．５の最小ｐＨに緩衝化することができる。いくつかの実施態様において、製剤は、８．５以下、８．０以下、７．５以下、７．０以下、又は６．５以下の最大ｐＨに緩衝化することができる。いくつかの実施態様において、製剤は、上に列挙された任意の最小ｐＨ、及び最小ｐＨより大きい上に列挙された任意の最大ｐＨによって定義される終点を有する範囲内に入るｐＨに緩衝化することができる。従って、例えば製剤は、ｐＨ５．５～８．５、例えばｐＨ５．５～７．０、ｐＨ６．０～８．０、ｐＨ６．０～７．０、又は６．５－７．５に緩衝化することができる。
【0049】
Ｔ３は、特に限定されるものではないが、溶液、懸濁液、エマルジョン、スプレー、エアロゾル、又は任意の形態の混合物を含む任意の適切な形態で提供することができる。組成物は、任意の医薬的に許容可能な賦形剤、担体、又はビヒクルを含む製剤で送達することができる。例示的な適切な賦形剤には、特に限定されるものではないが、デキストロース及び水酸化アンモニウムが含まれる。例えば製剤は、肺への直接送達に適した剤形、例えばエアロゾル製剤、非エアロゾルスプレー、溶液、液体懸濁液などで送達することができる。製剤は、例えば補助剤、着色剤、芳香剤、香味剤などを含む１つ以上の添加剤をさらに含んでもよい。
【0050】
製剤は、単位剤形で便利に提供することができ、薬学の分野で周知の方法によって調製することができる。医薬的に許容可能な担体を含む組成物を調製する方法は、Ｔ３を１つ以上の補助成分を構成する担体と組合わせる工程を含む。一般に、製剤は、活性化合物を液体担体、微粉固体担体、又はその両方と、均一及び／又は密接に組合わせることによって調製することができる。
【0051】
投与されるＴ３の量は、特に限定されるものではないが、対象の体重、体調、及び／又は年齢；被験者が示す特定の臨床徴候又は症状；肺炎症又は肺浮腫の種類又は原因；及び／又は投与方法を含む様々な要因に応じて変化し得る。従って、所定の単位剤形に含まれるＴ３の絶対量は大きく変動する可能性があり、対象の種、年齢、体重、及び体調、及び／又は投与方法などの要因に依存する。従って、すべての可能な用途に有効なＴ３の量を構成する量を一般的に示すことは実際的ではない。細胞レベルでの生理的に活性なＴ３濃度が決定されており、細胞の種類と特定のホルモン標的効果によって変化する。Ｔ３の投与は、生理学的又は薬理学的な局所組織レベルを達成するように設計することができる。しかしながら、当業者は、そのような要因を考慮して適切な量を決定することができる。
【0052】
例えば、Ｔ３は、Ｔ３がすでに規制当局の承認を受けているのと同じ用量及び頻度で、肺浮腫又は肺炎症を治療するために投与することができる。他の場合では、Ｔ３は、臨床又は前臨床研究で薬物が評価されているのと同じ用量及び頻度で、肺胞浮腫又は肺の炎症を治療するために投与することができる。所望のレベルのＴ３を達成するために、必要に応じて投与量及び／又は頻度を変更することができる。従って、必要に応じて、標準／既知の投薬処方を使用したり、投薬をカスタマイズすることができる。しかし、Ｔ３の主な活性型、つまり最も大きな生理活性を持つ形態は、Ｔ３が「遊離」である場合、つまりアルブミンなどの大きなタンパク質に結合していない場合である。従って、所定量のＴ３の生理学的効果は、そこに導入されるタンパク質や環境の他の態様によっても影響を受ける可能性がある。従って、本明細書に記載の方法のための効果的な薬物沈着用量を達成するために必要とされるＴ３の量は、すなわち「遊離」状態で、鼻洞、気管内、気管支内、又は肺胞腔に直接送達されるＴ３の量は、静脈内送達による他の状態の治療に対して規制当局の承認を受けている用量よりも少なくてもよい。
【0053】
いくつかの実施態様において、この方法は、例えば約０．５μｇ～約２．０ｍｇの沈着用量を対象に提供するのに十分なＴ３を投与することを含むことができるが、いくつかの実施態様においては、この方法は、Ｔ３をこの範囲外の用量で投与することによって実施することができる。これらの実施態様のいくつかでは、この方法は、対象に約５μｇ～約５０μｇの沈着用量を提供するのに十分なＴ３を投与することを含む。μｇ／ｋｇ基準では、生理学的効果を達成するための計算されたＴ３用量は、２ｎｇ／ｋｇという低用量から１ｍｇ／ｋｇまでの範囲であり得る。一例として、５０μｇ用量は、約０．０３μｇ／ｋｇ（１６０ｋｇのヒトに対して）～高用量の２５μｇ／ｋｇ（２ｋｇの早産児に対して）のμｇ／ｋｇ用量範囲を提供することができる。しかし、多くの場合、肺組織への直接点滴は静脈内投与などの全身希釈の影響を受けないため、μｇ／ｋｇベースの投与は絶対量ほど重要ではない。成人の肺のサイズは体重によって大きく変化しないため、送達されるＴ３の量が適切な用量のより重要な尺度となることがよくある。
【0054】
本明細書で使用される用語「沈着用量」又は「肺送達」用量は、気道の表面に沈着したＴ３の量を指す。点滴の場合、沈着用量は基本的に点滴される全用量である。しかし、エアロゾル又は噴霧製剤では、沈着用量は、従来、エアロゾル化又は噴霧される薬物の１０％以下である。薬物の９０％は、送達装置内で失われるか及び／又は吐き出されると予想される。これは、損傷したＡＲＤＳ肺ではより大きくなる可能性がある。従って、５００μｇのＴ３をエアロゾル化又は噴霧化して、５０μｇのエアロゾル化又は噴霧化された沈着用量を達成することができる。「沈着用量」又は「肺送達」用量という用語を使用することは、さまざまな投与経路全体で用量を標準化するのに有用である。
【0055】
十分な沈着用量又は肺沈着用量は、少なくとも５ｎｇのＴ３の最小量、例えば少なくとも１００ｎｇ、少なくとも１μｇ、少なくとも１０μｇ、少なくとも５０μｇ、少なくとも１００μｇ、少なくとも２５０μｇ、少なくとも５００μｇ、少なくとも１ｍｇ、少なくとも１．５ｍｇ、少なくとも２ｍｇ、少なくとも５ｍｇ、少なくとも１０ｍｇ、少なくとも１５ｍｇ、少なくとも２０ｍｇ、又は少なくとも２５ｍｇの送達を提供することができる。
【0056】
十分な沈着用量又は肺沈着用量は、５０ｍｇ以下のＴ３の最大量、例えば３０ｍｇ以下、２０ｍｇ以下、１５ｍｇ以下、１０ｍｇ以下、５ｍｇ以下、４ｍｇ以下、３ｍｇ以下、２ｍｇ以下、１．５ｍｇ以下、１ｍｇ以下、５００μｇ以下、３００μｇ以下、２００μｇ以下、１００μｇ以下、５０μｇ以下、３０μｇ以下、２０μｇ以下、又は１０μｇ以下の送達を提供することができる。
【0057】
十分な沈着用量又は肺沈着用量は、エンドポイントとして、上記で特定された最小沈着用量又は肺沈着用量と、前記最小沈着用量又は肺沈着用量を超える上記で特定された任意の最大沈着用量又は肺沈着用量との任意の組み合わせを含む、任意の範囲によっても特徴付けることができる。例えば、いくつかの実施態様において、沈着用量又は肺沈着用量は、１μｇ～１．５ｍｇ、例えば５μｇ～５０μｇであり得る。
【0058】
いくつかの実施態様において、Ｔ３は、例えば１日当たり単回投与から複数回投与で投与することができるが、いくつかの実施態様において、この方法は、この範囲外の頻度でＴ３を投与することによって実施することができる。一定期間内に用量を送達するために複数回投与が使用される場合、各投与の量は同じであっても異なっていてもよい。例えば、１日５０μｇの用量は、５０μｇの単回投与、２５μｇの２回の投与、又は複数回の不均等な投与として投与することができる。また、一定期間内に複数回投与する場合、投与間隔は同じであっても異なっていてもよい。特定の実施態様において、Ｔ３は、１日約１回、１日４回、又は連続的に投与することができる。
【0059】
いくつかの実施態様において、Ｔ３は、例えば、単回投与から複数日の期間にわたって投与することができるが、いくつかの実施態様において、この方法は、この範囲外の期間Ｔ３を投与することによって実施することができる。特定の実施態様において、Ｔ３は、３日間に１回、又は７日間に１回投与することができる。特定の実施態様において、Ｔ３は、１日約１回から、１日４回、又は連続的に投与することができる。通常、ヒトの臨床的甲状腺機能低下症に対する甲状腺ホルモンの補充は、サイロキシンＴ４、又はＴ４とＴ３の組み合わせが毎日投与される。リオチロニン５０μｇの単回経口投与を使用した最近の試験では、平均半減期２２．５時間で２．５時間でピーク血清濃度が得られた。５時間でのピーク血清濃度と心拍数増加の生理的効果との間にはタイムラグがあった（Jonklaas et al., Ther Drug Monit. 37(1): 110-118, 2015）。粘液浮腫性昏睡を伴う急性の重篤なヒトの病気の場合、４時間ごとから１２～２４時間ごとまで、静脈内Ｔ３投与の幅広い推奨頻度がある。すなわち、いくつかの実施態様において、Ｔ３は、漸増用量で気管内点滴によって１日１回投与することができ、血行力学的パラメーターの頻繁な生理学的測定及び血管外肺水（ＥＶＬＷ）の低頻度の測定を伴う。
【0060】
肺胞浮腫、肺炎症、又は関連状態の治療は、予防的である場合もあれば、あるいは、対象が肺浮腫若しくは肺炎症、又は関連する症状、又は状態の臨床徴候の発症後に開始することもできる。予防的である治療、例えば、対象がある事象（例えば、癌の放射線療法）を経験する前、又は状態の症状もしくは臨床徴候を示す前（例えば、感染症が無症状のままである間）に開始されることは、本明細書では、状態を有する「危険がある」対象の治療と呼ばれる。本明細書で使用される用語「危険がある」は、記述された危険を実際に有するかもしれないし、有していないかもしれない対象を指す。従って、例えば、感染状態の「危険がある」対象は、他人が感染状態を有すると特定された地域に存在する対象であり、及び／又は対象が、微生物による感染の検出可能な兆候を示していなくても、及び対象が症状が出ない量の微生物を保有しているかどうかに関係なく．感染病原体に曝露される可能性が高い対象である。別の例として、非感染状態の「危険がある」対象は、例えば遺伝的素因、家系、年齢、性別、地理的位置、又は病歴などの状態に関連する１つ以上の危険因子を有する対象である。
【0061】
従って、Ｔ３を含む医薬組成物は、対象が最初に肺浮腫、肺炎症、又は関連する状態の他の症状もしくは臨床徴候を示す前、その最中、又は後に投与することができ、又は感染状態の場合には、対象が最初に感染病原体と接触する前、その最中、又は後に投与することができる。対象が最初に肺浮腫又は肺炎症又は他の関連する症状若しくは臨床徴候を示す前に開始された治療は、組成物が投与されていない対象と比較して、対象が臨床的結果を経験する可能性を低下させ、重症度を低下させ、及び／又は肺の異常を完全に解消する。対象が最初に臨床症状を示した後に開始された治療は、組成物が投与されていない対象と比較して、対象が経験した肺浮腫及び／又は肺炎症の重症度の低下及び／又は完全な解消をもたらす可能性がある。
【0062】
例えば、インビボでのラットへの及びインビトロでの肺胞ＩＩ型細胞への高酸素損傷は、Ｔ３が、有害な高酸素曝露に先立って又はそれと同時に投与されると、減少する。インビトロでは、肺胞ＩＩ型細胞死が顕著に減少した。インビボでは、肺の炎症、肺損傷、好中球の浸潤、肺胞腔へのタンパク質の漏出が大幅に減少した。
【0063】
従って、この方法は、肺浮腫又は肺炎症を有するか又は有する危険がある対象に、有効量のＴ３組成物を投与することを含む。この態様において「有効量」は、肺浮腫又は肺炎症を、ある程度まで軽減、進行を制限、改善、又は解消するのに有効な量である。例えば、Ｔ３医薬組成物の「有効量」は、肺胞体液クリアランスを増加させ、肺胞ＩＩ型肺細胞の集団を増加させ、肺胞ＩＩ型肺細胞のサイズを増加させ、肺胞上皮細胞におけるＮａ，Ｋ－ＡＴＰアーゼ活性を上昇させ、又は肺胞損傷を低減又は修復し、低酸素血症を減少させ、及び／又は気道全体（例えば、鼻洞、気管内、気管支内、及び肺胞腔）の炎症を減少させる。
【0064】
予備試験は、気管内点滴によるＴ３組成物の投与の安全性を示している。安全性試験は、後述の実施例３に記載されている。優良試験所基準（Good Laboratory Practices（ＧＬＰ））に準拠して実施された安全性試験では、体重２５０～３５０グラムのラットに、０．３ｍＬ（３００μｌ）が気管内点滴により５日間連続して毎日投与された。組織病理学的、生理学的、及び臨床検査値評価の組み合わせを使用して、材料の投与では、重大な問題又は変化は観察されなかった。すべてのラットは、同じ用量のＴ３（０．３ｍＬで約２．７μｇ）を投与された。１日目の体重に基づいて投与されたＴ３の計算用量は１０μｇ／ｋｇであった。肺重量に基づいて計算された用量は、約１．５７μｇ／ｇ湿潤肺重量であった。
【0065】
投与前及び投与中に、雄と雌の両方のラットでわずかな／軽度のポルフィリン染色が観察された。これは、麻酔と挿管を伴う５日間の取り扱いと輸送によって誘発された軽度の非特異的ストレスを反映している可能性がある。これは、馴化及び取り扱い期間中に非Ｔ３処理ラットで発生したため、ポルフィリン染色に関する観察結果は、Ｔ３処理に直接起因するものではあり得ない．
【0066】
平均して、すべての群の体重は、投与の最初の２日以内に減少する傾向があった。最終の安楽死の時点で、体重は投与前の体重よりも大きくなったが、Ｔ３の雌は投与前の体重よりもわずかに軽かった。最後の安楽死の前に、毒性期の雄の体重は２６７．１７ｇ～３０９．６０ｇで、平均±標準偏差は２８５．２８±１１．１０ｇであった。毒性期の雌の体重は２４０．１１ｇ～２７８．４４ｇで、平均±標準偏差は２５８．２４±９．７９ｇであった。
【0067】
試験への登録時から安楽死までの毎日の観察中に、臨床的に重大な異常はどの動物にも認めらなかったが、例外として、重症度と原因が異なる以下に示す少数の麻酔回復の問題が観察された。試験の過程を通して、他の顕著な問題はなかった。他のすべての生き残った動物は、最終的な安楽死まで明らかに健康であった。試験の毒性期では、４匹の生理食塩水対照動物と１匹のビヒクル対照動物が、投与後の麻酔からの回復中に死亡した。これらの死亡は、投与後約３０～６０分で発生し、これは、剖検を行った獣医病理学者によって、加熱パッド上の麻酔からの回復中に過度の温度に曝露されたことが原因であると判断された。２匹のＴ３試験動物が用量投与後に死亡した。これらの死亡のうちの１匹については、肉眼的病理所見から、結腸埋伏によるものであることが示され、もう１匹の動物では、原因は不明であったが、点滴処置中の損傷によるものと考えられた。試験物質又は対照物質を投与されたすべての動物のうち、早期に死亡した７例のうち２例のみは、リオチロニンナトリウム注射で処置された動物であった。これらの損失にもかかわらず、各群の予備動物の投与により、試験計画で概説された各性別／群の動物の計画数は確実に達成された。
【0068】
凝固した試料のために血液学分析を受けなかった１匹の動物を除いて、予定された終了時まで生き残ったすべての毒性期の動物で、血液学及び血清化学的評価を実施した。
【0069】
雌の血液学検査の結果は、対照群と比較して、Ｔ３群では、軽度に増加した網状赤血球数と多色症の程度を示した（おそらく臨床的に有意ではない）．雄の血液学パラメーターには、統計的又は臨床的に有意な変化はなかった。雌ラットの化学検査の結果では、唯一の知見は、Ｔ３群と対照群の間の平均アルブミン濃度のわずかな統計的差異であった（おそらく臨床的に有意ではない）。雄では、化学検査値の唯一の差は、Ｔ３群と対照群の間の平均グロブリンレベルのわずかな差であった。雌の平均アルブミンと平均グロブリンのＴ３群と対照群の差は、変化が最小限であり、臨床検査データに他の臨床的に重要な変化がないため、臨床的に有意ではないと見なされる。Ｔ３で処置した雌ラット群で網状赤血球数がわずかに多いことは、真の標準範囲がなく、ヘマトクリット、ヘモグロビン、ＲＢＣ数、ＲＢＣ形態の異常の同時低下、又は赤血球代謝回転の上昇の証拠が無いことを考えると、臨床的に有意ではない可能性がある。
【0070】
一般に、Ｔ３群と対照群の間で認められた変化は、臨床的に有意ではなく、Ｔ３とは直接関係がないと考えられる。
【0071】
動物の剖検及び肉眼的病理観察は、委員会認定の独立した評価者によって実施された。７匹の早期死亡例を除いて、すべての毒性期の動物は、予定された安楽死の時点で安楽死させられた。すべての動物について死亡した日に剖検を行ったが、麻酔からの回復中に死亡した５匹の動物については死亡の翌日に剖検を行った。どの剖検方法でも明らかな問題はなく、この試験のどの動物の肺にも肉眼的病変は検出されなかった。割り当てられた終了日に、３つの治療群からの合計４匹の動物で病変が検出されたが、これはおそらく末期の腹腔内注入に関連したものであった。全体的に毒性の証拠は観察されず、剖検中に、試験物質又は対照物質の投与に関連する臨床的に有意な異常は認められなかった。
【0072】
動物の組織学的評価は、以下の結論をもたらした。Ｔ３による治療に関連する肺の臓器重量に差はなかった。すべての肉眼的所見は、苦痛の変化、自己融解、及び／又は腹腔内注入及び／又は気管内点滴に関連する変化と一致していた。肺のすべての顕微鏡所見は、治療群全体で強度と頻度が類似していた。
【0073】
この試験では、予定外の死亡が７例あった：ビヒクル対照１例、生理食塩水対照４例、及びリオチロニンナトリウム注射動物２例。すべての症例において、動物は気管内注入の直後に死亡したか、又は投与後に死亡したことが判明した。すべての動物の肉眼的及び顕微鏡的所見は、自己分解及び／又は苦痛の変化と一致しており、リオチロニンナトリウム注入動物の死因は、点滴操作に関連している可能性が高く、試験物質には関連していなかった。検査された末端器官のいずれにも肉眼的又は顕微鏡的所見はなく、これらはリオチロニンナトリウム注入による処置に関連すると決定された。
【0074】
Ｔ３は、提出されたすべての試料で正常に定量された。報告されたすべての値は、アッセイの定量限界内であった（１０ｐｇ／ｍＬ～４６０ｐｇ／ｍＬ）。測定値を図５に示す（平均±標準誤差）。男性よりも女性の方が血清Ｔ３濃度が高いのは、女性の方が体重がやや軽いこと、そして平均して女性の方が男性よりも肺重量／体重比が大きいという予備試験の知見、全身循環へのＴ３のより大きな吸収を可能にする比較的大きな肺表面積による可能性が高い。
【0075】
従ってＴ３は、試験材料関連の有害事象又は問題が最小である直接点滴によって肺に投与された。投与操作後に毒性期の７匹の動物が死亡し、毒物動態学期の動物の死亡は０匹であった。
【0076】
試験中、有害なＴ３関連の臨床観察結果はなかった。リオチロニンナトリウムを投与された毒性期の雌ラットは、雄の群又は対照群と同じ速度で体重を回復することはなかった。Ｔ３群と対照群の間で認められた臨床病理学的変化は、臨床的に有意ではなく、Ｔ３とは直接関係がないと考えられた。
【0077】
Ｔ３のピークレベルは、雄では１時間の時点で、雌では２時間の時点で観察された。雄の値は、雌の対応する時点より一貫して低かった。体重に関係なく、すべての動物に同じ用量のＴ３を投与した。平均して、雌は雄よりも体重が軽いため、雄よりも体重あたりの計算された用量がわずかに高く、計算された湿潤肺の重量あたりの用量がわずかに高かった。
【0078】
ラットモデルでＴ３、生理食塩水、又はＴ３ビヒクルの気管内点滴を介するを投与を、投与の５日後に評価した結果、Ｔ３による治療に関連すると考えられる、試験物質又は対照物質に起因する可能性のある予定外の死亡はなく、肺重量に差はなく、肉眼的又は顕微鏡的観察所見に差はなかった。従って、すべての試験物質は、有害事象又は臨床的に有意な試験材料に関連する問題なしで、投与は成功した。
【0079】
予備的な用量設定試験では、３．０μｇの中性ｐＨのＴ３の１回の静脈内送達後又は５日間の気管内送達に、生理学的パラメーター（例えば、呼吸数、Ｏ２飽和度、又は心拍数）に急性の影響はなかった。また３．０μｇのＴ３を気管内投与した場合、Ｔ３のＣｍａｘは３．０μｇのＴ３の静脈内投与後に見られた値の約１／１７で、ＡＵＣは約１／５であった（データは示していない）。
【0080】
この試験で使用された実行可能な最大用量（肺重量あたりのＴ３のμｇに基づく）は、提案された最初のヒト臨床試験の開始用量よりも３００倍高く、大きな安全マージンを提供する。
【0081】
いくつかの実施態様において、この方法は、血清Ｔ３が、点滴Ｔ３の投与量をさらに増加させてはならないレベルに上昇するまで、Ｔ３の投与量を段階的に増加させて、肺に送達されるＴ３を増加させることを含み得る。通常、血清Ｔ３レベルが変曲点に達すると、点滴されたＴ３の投与量は増加しなくなり、これは、肺が、点滴された過剰なＴ３を肺から血流に排出していることを示す。この方法では、肺に直接送達されるＴ３が提供されるため、肺の体液レベルが低下し、酸素化が上昇する。一方、Ｔ３の全身レベルは、Ｔ３レベルが肺で上昇するほどには上昇しない。従って、治療は肺のみを標的とし、肺のＴ３を差別的に上昇させ、従って体内の他の臓器に対するＴ３の全身的作用を制限する。
【0082】
酸素化は、任意の適切な方法で追跡することができる。酸素化を追跡するための例示的な方法には、特に限定されるものではないが、酸素飽和度（Ｏ２ｓａｔ）、ＰａＯ２／ＦｉＯ２比（動脈酸素の分圧と吸気酸素のパーセントの比）、呼気終末陽圧（ＰＥＥＰ）、及びベッドサイド超音波が含まれる。
【0083】
肺の液体の減少と肺の炎症の減少によって肺の機能が改善されると、肺の液体の減少と肺の炎症の減少により、肺への酸素補助が減少する可能性がある。この減少は、適用される酸素と他のガスとのパーセントを変化させることによって、あるいは酸素の流量又は酸素の体積を減らすことによって行うことができる。
【0084】
患者への酸素療法におけるこれらの変更は、特に限定されるものではないが、血清Ｔ３、肺液／水、Ｃ反応性タンパク質、及び／又は酸素化を含む１つ以上の測定項目を考慮した後、臨床医が用手法で行うことができる。すなわち１つの実施態様において、本開示は、複数の生物学的マーカー又は測定可能な測定項目の同時改善のためにＴ３を肺に投与することを含む、ＡＲＤＳを治療する方法を記載する。これらのマーカー又は測定項目には、特に限定されるものではないが、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、肺液又は水レベル、及び／又は全身性若しくは血清Ｔ３の測定が含まれる。
【0085】
肺水は、任意の適切な方法を使用して測定することができる。例えば、肺水は、肺に存在する肺水の量を計算するハードウェア／ソフトウェアに接続された身体の他のセンサーと共に、大腿動脈内のカテーテルを使用して測定することができる。このようなシステムは市販されている。同様に、血清Ｔ３及びＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）レベルは、任意の適切な方法によって測定することができる。例えば、血清Ｔ３やＣ反応性タンパクは、医療施設で一般的に行われている血液検査を使用して測定することができる。
【0086】
図１９は、血清Ｔ３、肺水、及び血清Ｃ反応性タンパク質の例示的なプロットを示す。変曲点が発生し、適用されたＴ３薬物を肺が吸収及び使用し続けなくなると、所望の投与量が実現され、従って、過剰分が身体又は血流に排出されて廃棄される。これは、血清Ｔ３の増加として観察される。図２０では、臨床医はＴ３の定常状態用量を達成しており、血清Ｔ３レベルはその範囲でより静的である。
【0087】
肺の細胞はＴ３を吸収し始めると、細胞内液を廃棄のために腎臓に送り始め、こうして肺から体液を取り除く。これにより、肺機能が徐々に改善される。図１９及び図２０にプロットされているように、肺水が減少し始め、最小化の状態に移行する。
【0088】
Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）は、身体の炎症の一般的な検査であり、肺の状態（及び身体の他の部位の損傷）を知る手がかりとなる。Ｔ３が肺に適用されると、肺の損傷状態が改善され、こうして肺のＣＲＰが低下する。
【0089】
従って、所定の患者に対する最適用量は、血清Ｔ２、肺水、及び／又は血清ＣＲＰレベルを追跡することによって決定することができる。臨床医は、主に血清Ｔ３レベルを追跡することができる。肺が過剰なＴ３を血流に流し出すと、血清Ｔ３が増加し、最大有効量に達したことを臨床医に知らせる。過剰分は肺から単に流し出されるのみなので、肺に適用されるＴ３のレベルをこの値を超えるまで上げても、結果は改善されない。肺水及び／又は血清ＣＲＰレベルの低下を観察することは、Ｔ３用量が有効であることを繰り返している。
【0090】
Ｔ３が気道点滴によって投与される例示的な実施態様に関して上記で説明されているが、Ｔ３はまた、エアロゾル送達又は噴霧器を使用して投与することもできる。例えば、噴霧器は、一定の送達薬物レベルを提供することができる時定数用量を送達することができる。対照的に、点滴投与はボーラス事象であり、典型的には定期的な間隔で（例えば１２時間ごと又は２４時間ごとに）行われる。点滴用量、典型的には肺への点滴用の液体は、一定の半減期を有し、肺への一定の送達薬物レベルを必ずしも維持していない。ただし、点滴は機械的に簡単でコストが低くなる。
【0091】
血清Ｔ３、肺水、及びＣＲＰは、Ｔ３肺治療の有効性に関する情報を提供すると共に、ＡＲＤＳ患者の治療中に使用する貴重なツールを臨床医に提供する。それらは臨床医に、ＡＲＤＳを有するそれぞれ固有の患者を管理するためのツールを提供すると共に、酸素療法の最適レベルを管理するための指針を提供し、こうして、患者の健康と安心感のバランスを最大にし、一方患者の肺へのさらなる負担（例えば、純粋なＯ２の刺激）を最小にする。
【0092】
従って１つの実施態様において、本開示は、対象における急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を治療する方法を記載する。一般にこの方法は、肺が過剰なＴ３を血流に流し始めるまで、肺へのＴ３の沈着用量を徐々に増加させながら、対象の血清Ｔ３レベルを追跡することを含む。従ってこの方法は、対象の血清Ｔ３レベルを測定すること、トリヨードサイロニン（Ｔ３）の初回用量を対象の肺管に直接投与すること、次に、一定時間後に対象の血清Ｔ３を測定した後、２回目の用量のトリヨードサイロニン（Ｔ３）を投与することを含む。血清Ｔ３レベルが変曲点に達した場合、肺はＴ３を血流に放出しており、Ｔ３の最大有効量に達している。従って、Ｔ３の２回目の用量は、１回目の用量と同じか又はそれより少ない。一方、血清Ｔ３レベルが変曲点に達していない場合は、Ｔ３の２回目の投与量を増やすことができる。血清Ｔ３を測定し、対象の肺管に投与されるＴ３のその後の投与量を調整するサイクルは、血清Ｔ３の変曲点に達するまで、又はＴ３の所望の最大沈着用量に達するまで、必要に応じて繰り返すことができる。従って、血清Ｔ３は、適切な時間間隔の後に再び測定することができる。この場合も、血清Ｔ３が変曲点に達していない場合はその後のＴ３用量を増加させるか、又は血清Ｔ３レベルが変曲点に達した場合はＴ３用量を維持することができる。
【0093】
Ｔ３の用量を対象の肺管に投与してから血清Ｔ３を測定するまでの最小時間間隔は、少なくとも５分、例えば少なくとも１０分、少なくとも１５分、少なくとも３０分、少なくとも６０分、少なくとも９０分、少なくとも１２０分、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも６時間、少なくとも９時間、少なくとも１２時間、又は少なくとも２４時間であり得る。Ｔ３の用量を対象の肺管に投与してから血清Ｔ３を測定するまでの最大時間間隔は、４８時間以下、３６時間以下、２４時間以下、２１時間以下、１８時間以下、１５時間以下、１２時間以下、１０時間以下、８時間以下、６時間以下、４時間以下、３時間以下、２時間以下時間、９０分以下、７５分以下、６０分以下、４５分以下、３０分以下、２０分以下、１５分以下、又は１０分以下であり得る。Ｔ３が存在しないのではなく、所定量までで所定量を含む量で存在する場合、Ｔ３は所定の量「以下」の量で存在すると言われる。
【0094】
時間間隔は、上記で特定された任意の最小時間間隔、及び最小時間間隔より大きい上記で特定された任意の最大時間間隔によって定義されるエンドポイントを有する範囲によって特徴付けることができる。例えば、いくつかの実施態様において、時間間隔は、５分～１２時間、１５分～２４時間、３０分～１２時間などであり得る。特定の実施態様において、時間間隔は、任意の最小値に等しくなり得るか、又は上記で特定された最大時間間隔に等しくなり得る。従って、例えば時間間隔は、５分、１０分、３０分、６０分、７５分、９０分、２時間、６時間、１２時間、２４時間などであり得る。
【0095】
この方法に複数の時間間隔が含まれる場合、各間隔は、他の時間間隔と同じか又は異なってもよい。
【0096】
Ｔ３の初期用量は、少なくとも５ｎｇ、例えば少なくとも１００ｎｇ、少なくとも１μｇ、少なくとも２μｇ、少なくとも５μｇ、少なくとも１０μｇ、少なくとも１５μｇ、又は少なくとも２０μｇの最小沈着用量を提供することができる。Ｔ３の初回用量は、１００μｇ以下、５０μｇ以下、３０μｇ以下、２０μｇ以下、又は１０μｇ以下の最大沈着用量を提供することができる。Ｔ３の初期用量は、エンドポイントとして、上記で特定された最小沈着用量と、最小沈着用量より大きい上記で特定された任意の最大沈着用量との任意の組み合わせを含む任意の範囲によって特徴付けることができる。例えば、いくつかの実施態様において、Ｔ３の初期用量は、１μｇ～１００μｇ、例えば５μｇ～５０μｇの沈着用量を提供することができる。
【0097】
上記で説明したように、血清Ｔ３レベルが変曲点に達していない場合、Ｔ３の後続用量を増やすことができる。後続用量は、少なくとも５ｎｇの最小沈着用量、例えば少なくとも１００ｎｇ、少なくとも１μｇ、少なくとも１０μｇ、少なくとも２０μｇ、少なくとも２５μｇ、少なくとも５０μｇ、少なくとも１００μｇ、少なくとも２５０μｇ、少なくとも５００μｇ、少なくとも１ｍｇ、少なくとも１．５ｍｇ、少なくとも２ｍｇ、少なくとも５ｍｇ、少なくとも１０ｍｇ、少なくとも１５ｍｇ、少なくとも２０ｍｇ、又は少なくとも２５ｍｇを提供することができる。後続用量は、５０ｍｇ以下のＴ３の最大量、例えば３０ｍｇ以下、２０ｍｇ以下、１５ｍｇ以下、１０ｍｇ以下、５ｍｇ以下、４ｍｇ以下、３ｍｇ以下、２ｍｇ以下、１．５ｍｇ以下、１ｍｇ以下、５００μｇ以下、３００μｇ以下、２００μｇ以下、１００μｇ以下、５０μｇ以下、３０μｇ以下、２０μｇ以下、又は１０μｇ以下を提供することができる。
【0098】
後続用量はまた、エンドポイントとして、上記で特定された最小沈着用量と、最小沈着用量よりも大きい上記で特定された任意の最大沈着用量との任意の組み合わせを含む任意の範囲によって特徴付けることができる。例えば、いくつかの実施態様において、後続用量は、少なくとも１０μｇ～５０μｇの沈着用量、例えば少なくとも２０μｇ～５０μｇ又は２５μｇ～５０μｇを提供することができる。
【0099】
２回以上の後続用量が与えられる場合、後続用量の量は、最初の用量であろうと中間の後続用量であろうと、他の用量とは無関係であり得る。Ｔ３用量の段階的増加を伴う実施態様において、後続用量に対する唯一の制限は、それが以前に投与された用量より多いことである。
【0100】
フェーズＩ／フェーズＩＩ臨床試験の一環として、２人の患者が点滴Ｔ３で治療された。両方の患者で、Ｔ３点滴直前の血清遊離Ｔ３レベルは非常に低かった（それぞれ＜１．５ｐｇ／ｍｌ及び１．８ｐｇ／ｍｌ；正常範囲２．２～４．５ｐｇ／ｍｌ）。患者１は、１日５０μｇの用量を５日間で４回投与された（図２４）。送達が困難であったため、１回の投与が１日延期された。血清遊離Ｔ３レベルは、Ｔ３点滴治療のすべての日で正常範囲（１．９～３．４ｐｇ／ｍｌ）であり、遊離Ｔ４レベルは安定しており変化しなかった（０．７～０．８ｎｇ／ｄＬ；正常範囲０．７～１．７ｎｇ／ｄＬ）。患者２は、毎日増量するＴ３用量を４日間にわたって投与された（図２５）。血清遊離Ｔ３レベルは正常範囲未満又は正常範囲内（＜１．５～２．２ｐｇ／ｍｌ）のままであり、遊離血清Ｔ４レベルは低いか又は正常（０．５～０．８ｎｇ／ｄＬ）であった。
【0101】
患者１と患者２の点滴前のＴＳＨレベルは、それぞれ０．５９μＩＵ／ｍＬと０．２μＩＵ／ｍＬであった（正常範囲：０．４０～３．９９μＩＵ／ｍＬ）。その後の９６時間のＴＳＨレベルは、患者１では０．５３～２．６４μＩＵ／ｍＬ、患者２では０．３６～０．７μＩＵ／ｍＬの範囲であった。
【0102】
いずれの患者も、Ｔ３点滴に起因する肺又は全身の重大な有害事象はなかった。両方の患者は、低血圧のために昇圧剤を必要とし、適切な平均動脈圧を維持するために必要な昇圧剤の投与量は、Ｔ３点滴と一時的に関連して減少した。
【0103】
上記の説明及び以下の特許請求の範囲において、「及び／又は」という用語は、列挙された要素の１つ又はすべて、又は列挙された要素の任意の２つ以上の組み合わせを意味する。用語「含む（comprise）」、「含む（comprising）」、及びその変形は、制限のないものとして解釈されるべきであり、すなわち、追加の要素又は工程は任意選択的であり、存在してもしなくてもよい。他に明記されない限り、「１つ（a）」、「１つ（an）」、「その（the）」、及び「少なくとも１つ（at least one）」は互換的に使用され、１つ又は２つ以上を意味する。エンドポイントによる数値範囲の説明には、その範囲内に含まれるすべての数値が含まれる（例えば、１～５には、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５などが含まれる）。
【0104】
前述の説明では、明確にするために、具体的な実施態様を単独に説明している場合がある。具体的な実施態様の特徴が他の実施態様の特徴と矛盾していることを明記されない限り、特定の実施態様は、１つ以上の実施態様に関連して本明細書で説明される適合する特徴の組み合わせを含むことができる。
【0105】
個別の工程を含む本明細書に開示される任意の方法について、工程は、実行可能な任意の順序で実施することができる。また、必要に応じて、２つ以上の工程の任意の組み合わせを同時に実行することもできる。
【0106】
本発明は、以下の実施例によって例示される。具体的な例、材料、量、及び操作は、本明細書に記載の本発明の範囲及び精神に従って広く解釈されるべきであることを理解すべきである。
【実施例】
【0107】
実施例１
ヒト肺組織の入手
死後の肺組織は、ＡＲＤＳの臨床診断を受けた連続した成人患者（男性及び女性）から得られた。剖検は治験審査委員会（Institutional Review Board）によって承認され、家族の同意を得た後、２００８年１２月から２００９年１０月まで実施された。ＡＲＤＳの診断は、以下の基準に基づいた：ＰａＯ２／ＦＩＯ２＜２００ｍｍＨｇ、楔入圧＜１８ｍｍＨｇ又はＣＶＰ＜１２ｍｍＨｇ、及び米国欧州コンセンサス会議（American European Consensus Conference）によって定義された両側に斑状の浸潤を有するＣＸＲ。ＡＲＤＳは、肺炎（ウイルス性又は細菌性）、敗血症、外傷、及び手術後の肺損傷を含むさまざまな病因に起因する（表１）。肺以外の原因で死亡し、検死官による剖検を受けた連続した成人患者を対照として使用した（例えば、アルコールの過剰摂取、低体温症、心筋梗塞、及び自動車外傷（表１））。
ヒト肺組織の入手
死後の肺組織は、ＡＲＤＳの臨床診断を受けた連続した成人患者（男性及び女性）から得られた。剖検は治験審査委員会（Institutional Review Board）によって承認され、家族の同意を得た後、２００８年１２月から２００９年１０月まで実施された。ＡＲＤＳの診断は、以下の基準に基づいた：ＰａＯ２／ＦＩＯ２＜２００ｍｍＨｇ、楔入圧＜１８ｍｍＨｇ又はＣＶＰ＜１２ｍｍＨｇ、及び米国欧州コンセンサス会議（American European Consensus Conference）によって定義された両側に斑状の浸潤を有するＣＸＲ。ＡＲＤＳは、肺炎（ウイルス性又は細菌性）、敗血症、外傷、及び手術後の肺損傷を含むさまざまな病因に起因する（表１）。肺以外の原因で死亡し、検死官による剖検を受けた連続した成人患者を対照として使用した（例えば、アルコールの過剰摂取、低体温症、心筋梗塞、及び自動車外傷（表１））。
【表1】
【0108】
肺の試料は死後４～１２時間以内に入手した。組織試料は、前肺野の末梢／胸膜下実質から切り裂かれ、２ｃｍ×２ｃｍ片にスライスされ、液体窒素で瞬間凍結され、将来のアッセイのために－８０℃で保存されたか、又はホルマリンで固定され、組織学的及び免疫化学的分析用に包埋された。スタッフの病理学者（Department of Pathology and Laboratory Medicine, Essentia Health- St. Mary's Medical Center and Duluth Clinic, Duluth, MN）は、組織学的診断を組織の各セットに割り当てた。びまん性肺胞損傷（ＤＡＤ）を示す肺試料（過細胞性、及びヒアリン膜／フィブリン沈着を含む）を研究組織として使用した。肺以外の原因で死亡し、正常な肺の組織学的構造を示す患者からの肺試料を対照組織として使用した。組織構造がはっきりしないすべての試料は除外した。
【0109】
ヒト肺デヨージナーゼＩＩＩ（Ｄ３）免疫組織化学検査
Ｄ３の検出のための免疫組織化学検査は、１次ウサギ抗デヨージナーゼ３抗体（１：１００；Domenico Salvatore, M.D., Ph.D., University of Naples Federico II, Naples, Italyからの寄贈）、及びビオチン化ヤギ抗ウサギ２次抗体を使用し、続いてアビジンビオチン複合体（Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA）を使用して行った。ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を発色源として使用した。以下のプロトコールを使用した：キシレンでスライドからパラフィンを除去し、内因性ペルオキシダーゼ活性をメタノール中の０．３％過酸化水素で阻止した。スライドを再水和し、トリプシンで９０℃で３０分間処理した。冷却後、切片を、ＰＢＳ＋０．１％ツイーン２０中の１０％正常ヤギ血清で３０分間ブロックした。抗Ｄ３抗体（１：１００）を室温で１時間添加した後、ＰＢＳで洗浄し、２次ビオチン化ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体と共に室温で６０分間インキュベートした。アビジンビオチン複合体（Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA）を組織と共に３０分間インキュベートした後、所望の染色強度に達するまでジアミノベンジジンで発色させた。スライドをヘマトキシリンで１分間対比染色し、脱水し、観察した。すべての組織は、同じ露出時間で同じように処理された。光学顕微鏡（DMRB, Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany）を使用して、観察と写真撮影を行った。
Ｄ３の検出のための免疫組織化学検査は、１次ウサギ抗デヨージナーゼ３抗体（１：１００；Domenico Salvatore, M.D., Ph.D., University of Naples Federico II, Naples, Italyからの寄贈）、及びビオチン化ヤギ抗ウサギ２次抗体を使用し、続いてアビジンビオチン複合体（Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA）を使用して行った。ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を発色源として使用した。以下のプロトコールを使用した：キシレンでスライドからパラフィンを除去し、内因性ペルオキシダーゼ活性をメタノール中の０．３％過酸化水素で阻止した。スライドを再水和し、トリプシンで９０℃で３０分間処理した。冷却後、切片を、ＰＢＳ＋０．１％ツイーン２０中の１０％正常ヤギ血清で３０分間ブロックした。抗Ｄ３抗体（１：１００）を室温で１時間添加した後、ＰＢＳで洗浄し、２次ビオチン化ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体と共に室温で６０分間インキュベートした。アビジンビオチン複合体（Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA）を組織と共に３０分間インキュベートした後、所望の染色強度に達するまでジアミノベンジジンで発色させた。スライドをヘマトキシリンで１分間対比染色し、脱水し、観察した。すべての組織は、同じ露出時間で同じように処理された。光学顕微鏡（DMRB, Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany）を使用して、観察と写真撮影を行った。
【0110】
Ｄ３酵素活性
凍結肺組織試料を解凍し、０．１Ｍリン酸塩、及び１０ｍＭジチオスレイトールと０．２５Ｍスクロースを含むｐＨ６．９の１ｍＭ ＥＤＴＡで超音波処理した。Ｄ３活性は、１５０μｇの細胞タンパク質、２００，０００ｃｐｍの３，５－［１２５Ｉ］３’－トリヨードサイロニン（PerkinElmer, Inc., Waltham, MA）、１ｍＭの６Ｎ－プロピルチオウラシル（ＰＴＵ）、１０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、及び前述のように各反応で０～５００ｎＭの非標識Ｔ３を使用してＨＰＬＣで測定した（Simonides et al., J Clin Invest 118:975-983; 2008）。メタノールを添加することによって反応を停止させ、脱ヨウ素化の生成物を、既に記載されているようにＨＰＬＣによって定量した（Richard et al., J Clin Endocrinol Metab 83:2868-2874; 1998）。Ｄ３速度は、１分あたりの超音波処理タンパク質１ｍｇあたりの内環脱ヨウ素化Ｔ３のｆｍｏｌ（ｆｍｏｌ／ｍｇ／分）として表された。速度がアッセイの検出限界を下回る試料は、最小検出可能活性（ＭＤＡ）値０．０５ｆｍｏｌ／ｍｇ／分に設定された。ＭＤＡは、統計的にバックグラウンド活性を３標準偏差だけ超える値として計算された。
凍結肺組織試料を解凍し、０．１Ｍリン酸塩、及び１０ｍＭジチオスレイトールと０．２５Ｍスクロースを含むｐＨ６．９の１ｍＭ ＥＤＴＡで超音波処理した。Ｄ３活性は、１５０μｇの細胞タンパク質、２００，０００ｃｐｍの３，５－［１２５Ｉ］３’－トリヨードサイロニン（PerkinElmer, Inc., Waltham, MA）、１ｍＭの６Ｎ－プロピルチオウラシル（ＰＴＵ）、１０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、及び前述のように各反応で０～５００ｎＭの非標識Ｔ３を使用してＨＰＬＣで測定した（Simonides et al., J Clin Invest 118:975-983; 2008）。メタノールを添加することによって反応を停止させ、脱ヨウ素化の生成物を、既に記載されているようにＨＰＬＣによって定量した（Richard et al., J Clin Endocrinol Metab 83:2868-2874; 1998）。Ｄ３速度は、１分あたりの超音波処理タンパク質１ｍｇあたりの内環脱ヨウ素化Ｔ３のｆｍｏｌ（ｆｍｏｌ／ｍｇ／分）として表された。速度がアッセイの検出限界を下回る試料は、最小検出可能活性（ＭＤＡ）値０．０５ｆｍｏｌ／ｍｇ／分に設定された。ＭＤＡは、統計的にバックグラウンド活性を３標準偏差だけ超える値として計算された。
【0111】
肺の全組織Ｔ３測定
甲状腺ホルモンは、約０．５ｇの重さのヒト肺試料から、既に記載された方法（Excobare et al., Endocrinology 117:1890-1900; 1985）の修正を使用して抽出された。組織１グラムあたり１ｍＭのＰＴＵ（メタノール－ＰＴＵ）を含む４ｍＬメタノール中で、組織を、ローター／ステーターホモジナイザーを使用して約３０，０００ｒｐｍで３０秒間ホモジナイズした。個々の試料の回収率を評価するために、１００μＬの１２５Ｉ－Ｔ４トレーサー（メタノール－ＰＴＵ中０．０２ｐｇ／μＬ）を各試料に添加した。メタノール－ＰＴＵの２倍量のクロロホルムを添加し、試料をボルテックス混合した。混合物を２０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清液をきれいな５０ｍＬ試験管に移した。残りのペレットは、組織１グラムあたり５ｍＬのクロロホルム：メタノール（２：１）中でボルテックス混合し、２０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して２回抽出し、上清を取り出して最初の抽出物と合わせた。合わせた抽出物に、抽出物５ｍＬごとに１ｍＬの０．０５％ＣａＣｌ２を加えた。混合物をボルテックス混合し、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。甲状腺ホルモンを含む上の水層をきれいな５０ｍＬ試験管に移した。前の工程で取り出された上層の量に等しい量の純粋な上層（クロロホルム：メタノール：０．０５％ＣａＣｌ２、３：４９：４８）で、下の有機層をさらに２回再抽出した。合わせた抽出した上層をロータリーエバポレーションにかけて、残りのクロロホルムとメタノールを除去した。水性混合物をシェル凍結し、凍結乾燥により蒸発させることにより完全に乾燥させた。各凍結乾燥試料を５００μＬのストリップラット血清に溶解し、Ｔ３レベルを、血清総Ｔ３ＲＩＡアッセイキット（Siemens Medical Solutions Diagnostics; Los Angeles, CA）を使用して、既に記載されているように（Bastian et al., Endocrinology 151:4055-4065; 2010）測定した。
甲状腺ホルモンは、約０．５ｇの重さのヒト肺試料から、既に記載された方法（Excobare et al., Endocrinology 117:1890-1900; 1985）の修正を使用して抽出された。組織１グラムあたり１ｍＭのＰＴＵ（メタノール－ＰＴＵ）を含む４ｍＬメタノール中で、組織を、ローター／ステーターホモジナイザーを使用して約３０，０００ｒｐｍで３０秒間ホモジナイズした。個々の試料の回収率を評価するために、１００μＬの１２５Ｉ－Ｔ４トレーサー（メタノール－ＰＴＵ中０．０２ｐｇ／μＬ）を各試料に添加した。メタノール－ＰＴＵの２倍量のクロロホルムを添加し、試料をボルテックス混合した。混合物を２０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清液をきれいな５０ｍＬ試験管に移した。残りのペレットは、組織１グラムあたり５ｍＬのクロロホルム：メタノール（２：１）中でボルテックス混合し、２０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して２回抽出し、上清を取り出して最初の抽出物と合わせた。合わせた抽出物に、抽出物５ｍＬごとに１ｍＬの０．０５％ＣａＣｌ２を加えた。混合物をボルテックス混合し、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。甲状腺ホルモンを含む上の水層をきれいな５０ｍＬ試験管に移した。前の工程で取り出された上層の量に等しい量の純粋な上層（クロロホルム：メタノール：０．０５％ＣａＣｌ２、３：４９：４８）で、下の有機層をさらに２回再抽出した。合わせた抽出した上層をロータリーエバポレーションにかけて、残りのクロロホルムとメタノールを除去した。水性混合物をシェル凍結し、凍結乾燥により蒸発させることにより完全に乾燥させた。各凍結乾燥試料を５００μＬのストリップラット血清に溶解し、Ｔ３レベルを、血清総Ｔ３ＲＩＡアッセイキット（Siemens Medical Solutions Diagnostics; Los Angeles, CA）を使用して、既に記載されているように（Bastian et al., Endocrinology 151:4055-4065; 2010）測定した。
【0112】
統計解析
Ｄ３活性と組織Ｔ３レベルの統計解析は、一元配置分散分析とテューキーの事後多重比較検定を使用して行った。統計解析とデータのグラフ化は、Prism（GraphPad Software, La Jolla, CA）ソフトウェアパッケージを使用して行った。データは平均±ＳＥＭとして表示される。有意差を定義するためにα＝０．０５が選択された。
Ｄ３活性と組織Ｔ３レベルの統計解析は、一元配置分散分析とテューキーの事後多重比較検定を使用して行った。統計解析とデータのグラフ化は、Prism（GraphPad Software, La Jolla, CA）ソフトウェアパッケージを使用して行った。データは平均±ＳＥＭとして表示される。有意差を定義するためにα＝０．０５が選択された。
【0113】
実施例２
試験計画
ＦＤＡに承認された治験薬（Investigative New Drug）（＃１２６２０４）に記載されている最初のヒト臨床試験。試験薬の投与前２４時間以内にインフォームドコンセントを得る。治療群（介入）と対照群（非介入）の両方について、試験プロトコールは時間０に開始し、６時間目のＥＶＬＷＩ／ＰＶＰＩ測定、１２時間目のＥＶＬＷＩ／ＰＶＰＩ測定、２４時間目のＥＶＬＷＩ／ＰＶＰＩ測定、４８時間目のＥＶＬＷＩ／ＰＶＰＩ測定、７２時間目のＥＶＬＷＩ／ＰＶＰＩ測定、９６時間目のＥＶＬＷＩ／ＰＶＰＩ測定を行う。
試験計画
ＦＤＡに承認された治験薬（Investigative New Drug）（＃１２６２０４）に記載されている最初のヒト臨床試験。試験薬の投与前２４時間以内にインフォームドコンセントを得る。治療群（介入）と対照群（非介入）の両方について、試験プロトコールは時間０に開始し、６時間目のＥＶＬＷＩ／ＰＶＰＩ測定、１２時間目のＥＶＬＷＩ／ＰＶＰＩ測定、２４時間目のＥＶＬＷＩ／ＰＶＰＩ測定、４８時間目のＥＶＬＷＩ／ＰＶＰＩ測定、７２時間目のＥＶＬＷＩ／ＰＶＰＩ測定、９６時間目のＥＶＬＷＩ／ＰＶＰＩ測定を行う。
【0114】
試験薬
ヒトＡＲＤＳ患者は、甲状腺ホルモンＴ３の合成形態であるリオチロニンナトリウム（Ｔ３）で治療される。リオチロニンナトリウムは、６．８％アルコール（容量）、０．１７５ｍｇ無水クエン酸、及び２．１９ｍｇ水酸化アンモニウムの無菌非発熱性水溶液中に１０μｇ（１ｍｌのバイアル中１０ｍｃｇ／ｍｌ）のリオチロニンナトリウムを含む琥珀色のバイアルで提供される。点滴の前に、１．０Ｎ ＨＣＬを加えてリオチロニンナトリウムを中性ｐＨ（６－８）に調整し、次に適切に訓練された薬剤師が無菌条件下で０．９％生理食塩水（ＮＳ）で希釈する。
ヒトＡＲＤＳ患者は、甲状腺ホルモンＴ３の合成形態であるリオチロニンナトリウム（Ｔ３）で治療される。リオチロニンナトリウムは、６．８％アルコール（容量）、０．１７５ｍｇ無水クエン酸、及び２．１９ｍｇ水酸化アンモニウムの無菌非発熱性水溶液中に１０μｇ（１ｍｌのバイアル中１０ｍｃｇ／ｍｌ）のリオチロニンナトリウムを含む琥珀色のバイアルで提供される。点滴の前に、１．０Ｎ ＨＣＬを加えてリオチロニンナトリウムを中性ｐＨ（６－８）に調整し、次に適切に訓練された薬剤師が無菌条件下で０．９％生理食塩水（ＮＳ）で希釈する。
【0115】
リオチロニンナトリウムは、次のように投与用に配合される：５μｇ用量（０．５ｍｌリオチロニンナトリウム＋０．９％ＮＳで総量１０ｍｌへ）；１０μｇ用量（１．０ｍｌリオチロニンナトリウム＋０．９％ＮＳで総量１０ｍｌへ）；２５μｇ用量（２．５ｍｌリオチロニンナトリウム＋０．９％ＮＳで総量１０ｍｌへ）；５０μｇ用量（５．０ｍｌリオチロニンナトリウム＋０．９％ＮＳで総量１０ｍｌへ）。
【0116】
治療群（介入）
５０人の患者が治療を受ける。登録とベースライン値の測定時に、患者は気道点滴により５μｇのＴ３を投与される。患者は、有害作用及びＥＶＬＷＩの変化について２４時間追跡される。２４時間後、有害作用が見られず、ＥＶＬＷＩ及び／又はＰＶＰＩに変化がない場合、患者は気道点滴により２倍増量の１０μｇのＴ３を投与される。患者は、有害作用並びにＥＶＬＷＩ及び／又はＰＶＰＩの変化について２４時間追跡される。最初のＴ３投与からｔ＝４８時間に、有害作用が見られず、ＥＶＬＷＩに変化がない場合、患者は気道点滴により２．５倍増量の２５μｇのＴ３を投与される。患者は、有害作用並びにＥＶＬＷＩ及び／又はＰＶＰＩの変化について２４時間追跡される。最初のＴ３投与からｔ＝７２時間に、有害作用が見られず、ＥＶＬＷＩに変化がない場合、患者は気道点滴により２倍増量の５０μｇのＴ３を投与される。最終ＥＶＬＷＩ及びＰＶＰＩ測定は、最終Ｔ３投与の２４時間後の９６時間目（終了時点）に行われる。
５０人の患者が治療を受ける。登録とベースライン値の測定時に、患者は気道点滴により５μｇのＴ３を投与される。患者は、有害作用及びＥＶＬＷＩの変化について２４時間追跡される。２４時間後、有害作用が見られず、ＥＶＬＷＩ及び／又はＰＶＰＩに変化がない場合、患者は気道点滴により２倍増量の１０μｇのＴ３を投与される。患者は、有害作用並びにＥＶＬＷＩ及び／又はＰＶＰＩの変化について２４時間追跡される。最初のＴ３投与からｔ＝４８時間に、有害作用が見られず、ＥＶＬＷＩに変化がない場合、患者は気道点滴により２．５倍増量の２５μｇのＴ３を投与される。患者は、有害作用並びにＥＶＬＷＩ及び／又はＰＶＰＩの変化について２４時間追跡される。最初のＴ３投与からｔ＝７２時間に、有害作用が見られず、ＥＶＬＷＩに変化がない場合、患者は気道点滴により２倍増量の５０μｇのＴ３を投与される。最終ＥＶＬＷＩ及びＰＶＰＩ測定は、最終Ｔ３投与の２４時間後の９６時間目（終了時点）に行われる。
【0117】
対照群（非介入）
対照群には１８人の患者が含まれる。登録及びベースライン値の測定時に、対照患者は試験の介入を受けない。対照群は標準治療を受ける。ＥＶＬＷＩ及びＰＶＰＩは、時間０（治療前）、６時間目、１２時間目、２４時間目、４８時間目、７２時間目、及び９６時間目に測定される。
対照群には１８人の患者が含まれる。登録及びベースライン値の測定時に、対照患者は試験の介入を受けない。対照群は標準治療を受ける。ＥＶＬＷＩ及びＰＶＰＩは、時間０（治療前）、６時間目、１２時間目、２４時間目、４８時間目、７２時間目、及び９６時間目に測定される。
【0118】
１次試験のエンドポイント
試験プロトコールを開始する前、及びその後も連続して、点滴Ｔ３療法に対する気道の安全性と忍容性が評価される。被験者は、肺事象（例えば、進行性喀血；量≧３０ｍｌの血痰）、心臓事象（例えば、新たな持続性心室性不整脈（持続時間＞３０秒）；低血圧の悪化を伴う新たな持続性加速接合部不整脈（速度＞８０ｂｐｍ）；低血圧の悪化を伴う急速な心室反応（心室拍数＞１６０ｂｐｍ）を伴う新たな持続性心房細動；又は心停止（不全収縮又は無脈性電気活動）；及び／又は高血圧クリーゼ（収縮期＞２００、又は拡張期＞１２０、又はＭＡＰの変化＞２０ｍｍＨｇ）を含む複合的エンドポイントについて追跡される。
試験プロトコールを開始する前、及びその後も連続して、点滴Ｔ３療法に対する気道の安全性と忍容性が評価される。被験者は、肺事象（例えば、進行性喀血；量≧３０ｍｌの血痰）、心臓事象（例えば、新たな持続性心室性不整脈（持続時間＞３０秒）；低血圧の悪化を伴う新たな持続性加速接合部不整脈（速度＞８０ｂｐｍ）；低血圧の悪化を伴う急速な心室反応（心室拍数＞１６０ｂｐｍ）を伴う新たな持続性心房細動；又は心停止（不全収縮又は無脈性電気活動）；及び／又は高血圧クリーゼ（収縮期＞２００、又は拡張期＞１２０、又はＭＡＰの変化＞２０ｍｍＨｇ）を含む複合的エンドポイントについて追跡される。
【0119】
２次試験のエンドポイント
ＡＲＤＳ患者のＥＶＬＷＩ及び／又はＰＶＰＩの減少に対する気道点滴Ｔ３の有効性を評価するために、ＥＶＬＷＩ、ＰＶＰＩ、及び酸素化（動脈血ガス、ＡＢＧ）を、治療群と対照群の両方の被験者で、ベースライン（Ｔ＝０）から開始して、その６時間後、１２時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後、及び９６時間後に測定する。追加の連続測定には、血圧（ＢＰ）、平均動脈圧（ＭＡＰ）、中心静脈圧（ＣＶＰ）、心係数（ＣＩ）、全身性血管抵抗指数（ＳＶＲＩ）、酸素飽和度Ｏ２ｓａｔが含まれる。最後に血清遊離Ｔ３、遊離Ｔ４、及びＴＳＨが各時間間隔で測定される。
ＡＲＤＳ患者のＥＶＬＷＩ及び／又はＰＶＰＩの減少に対する気道点滴Ｔ３の有効性を評価するために、ＥＶＬＷＩ、ＰＶＰＩ、及び酸素化（動脈血ガス、ＡＢＧ）を、治療群と対照群の両方の被験者で、ベースライン（Ｔ＝０）から開始して、その６時間後、１２時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後、及び９６時間後に測定する。追加の連続測定には、血圧（ＢＰ）、平均動脈圧（ＭＡＰ）、中心静脈圧（ＣＶＰ）、心係数（ＣＩ）、全身性血管抵抗指数（ＳＶＲＩ）、酸素飽和度Ｏ２ｓａｔが含まれる。最後に血清遊離Ｔ３、遊離Ｔ４、及びＴＳＨが各時間間隔で測定される。
【0120】
実施例３
試験システム
この試験は、雄と雌の両方のスプラーグドーレイ（Sprague-Dawley）ラット（Envigo, Huntingdon, United Kingdom）を使用して実施された。ヒトの臨床試験におけるリオチロニンナトリウム注射液点滴の気管内経路の安全性の評価は、適切な用量レベルでこの種で達成できる。さらに、ラットの甲状腺ホルモンに対する反応は、ヒトの反応と同様であり、ラットモデルの選択は、甲状腺ホルモン及び関連する受容体の試験からの薬理学的データと、ラットの肺における生理学的反応に大きく基づいている。ミネソタ大学は、国際実験動物ケア評価認証協会（Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care, International （ＡＡＡＬＡＣ））の認定を受けており、実験動物で研究を行うために米国農務省に登録されている。動物試験は、ＮＩＨガイドライン（実験動物の管理と使用に関するガイドライン（Guide for the Care and Use of Laboratory Animals、ＮＩＨ発行番号８６－２３、１９８５年改訂）に準拠した。プロトコールは、ミネソタ大学の施設内動物管理使用委員会（Institutional Animal Care and Use Committee：ＩＡＣＵＣ）によって審査され、規制を順守しており適切であるとして認可され、試験が開始されたか又は修正作業が行われた。
試験システム
この試験は、雄と雌の両方のスプラーグドーレイ（Sprague-Dawley）ラット（Envigo, Huntingdon, United Kingdom）を使用して実施された。ヒトの臨床試験におけるリオチロニンナトリウム注射液点滴の気管内経路の安全性の評価は、適切な用量レベルでこの種で達成できる。さらに、ラットの甲状腺ホルモンに対する反応は、ヒトの反応と同様であり、ラットモデルの選択は、甲状腺ホルモン及び関連する受容体の試験からの薬理学的データと、ラットの肺における生理学的反応に大きく基づいている。ミネソタ大学は、国際実験動物ケア評価認証協会（Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care, International （ＡＡＡＬＡＣ））の認定を受けており、実験動物で研究を行うために米国農務省に登録されている。動物試験は、ＮＩＨガイドライン（実験動物の管理と使用に関するガイドライン（Guide for the Care and Use of Laboratory Animals、ＮＩＨ発行番号８６－２３、１９８５年改訂）に準拠した。プロトコールは、ミネソタ大学の施設内動物管理使用委員会（Institutional Animal Care and Use Committee：ＩＡＣＵＣ）によって審査され、規制を順守しており適切であるとして認可され、試験が開始されたか又は修正作業が行われた。
【0121】
毒性試験計画の要約
試験計画の詳細を表１に示す。６０匹の動物（及び２匹の予備動物／性別／群）に麻酔をかけ、５日間連続して試験物質又は対照物質を気管内点滴により投与した。最後の投与の翌日、臨床病理検査のために最終採血を実施し、その後、動物を安楽死させ、委員会認定の獣医病理学者によって、すべての臓器の肉眼的観察が実施された。組織病理学検査のために選択した組織を採取した。毒物動態学（ＴＫ）期の２４匹の動物に麻酔をして、Ｔ３を１回の気管内点滴により投与した。毒物動態学評価のために、動物１匹当たり、投与後最大２４時間までの２つの指定された時点で、最終採血を行った。ＴＫ動物は、最終的な採血後、さらに評価することなく安楽死させた。すべての動物は、投与操作の前に最低７日間順応させた。動物は、試験の開始前にベースラインの観察と検査を受け、臨床観察と体重のモニタリングは、試験の実施期間を通して行われた。すべての動物は、同じ量（０．３ｍＬ）の試験物質又は対照物質を投与された。この最大実行可能用量（ＭＦＤ）は、体重２５０ｇ～３５０ｇのラットの肺に安全かつ再現可能に（５日間以上）点滴できる最大容量によって制限され、これは、予備的な毒性試験で０．３ｍＬであると決定された。送達される実際の用量は、μｇ／ｋｇ体重及びμｇ／ｇ湿潤肺重量の両方として報告される。毒性期の動物は、最初の投与時に７２～１３５日齢であった。雄の体重は２５６．５２ｇ～３０７．５０ｇで、平均±標準偏差は２８６．７４±１１．７７ｇであり、雌の体重は２５０．４６ｇ～２９９．０１ｇで、平均±標準偏差は２６０．６４±１０．３４ｇであった。ＴＫ期の動物は、初回投与時に６８～１４４日齢であった。雄の体重は２６１．２３ｇ～３１６．１９ｇで、雌の体重は２５０．０６ｇ～２８０．３２ｇであった。
Ｆ＝雌、Ｍ＝雄、ＮＡ＝該当せず
ａ 予備の使用 － 各群の動物と共に各性別／毒性群の２匹の予備動物に投与し、同様の時間枠内で交換できるようにした。試験材料に関連しない問題による初期死亡を経験したため、第２群の追加の２匹の雌に投与された。予備の動物は、最終的な臨床病理学検査及び肉眼的剖検評価を受けた。
ｂ 予備の使用 －４匹の追加の未使用の予備は、試験責任者の指示で研究からはずされた。
試験計画の詳細を表１に示す。６０匹の動物（及び２匹の予備動物／性別／群）に麻酔をかけ、５日間連続して試験物質又は対照物質を気管内点滴により投与した。最後の投与の翌日、臨床病理検査のために最終採血を実施し、その後、動物を安楽死させ、委員会認定の獣医病理学者によって、すべての臓器の肉眼的観察が実施された。組織病理学検査のために選択した組織を採取した。毒物動態学（ＴＫ）期の２４匹の動物に麻酔をして、Ｔ３を１回の気管内点滴により投与した。毒物動態学評価のために、動物１匹当たり、投与後最大２４時間までの２つの指定された時点で、最終採血を行った。ＴＫ動物は、最終的な採血後、さらに評価することなく安楽死させた。すべての動物は、投与操作の前に最低７日間順応させた。動物は、試験の開始前にベースラインの観察と検査を受け、臨床観察と体重のモニタリングは、試験の実施期間を通して行われた。すべての動物は、同じ量（０．３ｍＬ）の試験物質又は対照物質を投与された。この最大実行可能用量（ＭＦＤ）は、体重２５０ｇ～３５０ｇのラットの肺に安全かつ再現可能に（５日間以上）点滴できる最大容量によって制限され、これは、予備的な毒性試験で０．３ｍＬであると決定された。送達される実際の用量は、μｇ／ｋｇ体重及びμｇ／ｇ湿潤肺重量の両方として報告される。毒性期の動物は、最初の投与時に７２～１３５日齢であった。雄の体重は２５６．５２ｇ～３０７．５０ｇで、平均±標準偏差は２８６．７４±１１．７７ｇであり、雌の体重は２５０．４６ｇ～２９９．０１ｇで、平均±標準偏差は２６０．６４±１０．３４ｇであった。ＴＫ期の動物は、初回投与時に６８～１４４日齢であった。雄の体重は２６１．２３ｇ～３１６．１９ｇで、雌の体重は２５０．０６ｇ～２８０．３２ｇであった。
【表2】
ａ 予備の使用 － 各群の動物と共に各性別／毒性群の２匹の予備動物に投与し、同様の時間枠内で交換できるようにした。試験材料に関連しない問題による初期死亡を経験したため、第２群の追加の２匹の雌に投与された。予備の動物は、最終的な臨床病理学検査及び肉眼的剖検評価を受けた。
ｂ 予備の使用 －４匹の追加の未使用の予備は、試験責任者の指示で研究からはずされた。
【0122】
試験物質及び対照物質
この試験に使用されたＴ３は、１．０ｍＬの琥珀色のガラス製バイアルに入った１．０ｍＬ中１０μｇの濃度のリオチロニンナトリウム注射液（X-GEN Pharmaceuticals, Inc., Horseheads, NY）である。リオチロニンナトリウム注射液の各１ｍＬには、無菌の非発熱性ＵＳＰグレードの水に、１０μｇのリオチロニン（Ｔ３）に相当するリオチロニンナトリウム、６．８容量％のアルコール、０．１７５ｍｇの無水クエン酸、及び２．１９ｍｇのアンモニア（水酸化アンモニウムとして）が含まれている。予備試験では、市販されているリオチロニンナトリウムのｐＨが１０．０を超えると、ラットは気管内点滴に耐えられないことが判明した。従って、リオチロニンナトリウムとビヒクルは、バイオセーフティキャビネットに無菌的に加えられた無菌１．０Ｎ ＨＣｌ（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）で中性ｐＨ（６．０～８．０）に調整した後、動物への気管内点滴を行った。無菌技術を使用して、リオチロニンナトリウムのバイアルを開け、全内容物を無菌の１．５ｍＬエッペンドルフチューブに移した。８０～９０μＬの１．０Ｎ ＨＣｌをチューブに加え、穏やかにボルテックス混合し、ｐＨ試験紙（ｐＨ４．５～１０．０、Ricca Chemical Co., Arlington, TX）を使用してｐＨを測定した。ｐＨが所望の範囲になるまで、必要に応じて追加のＨＣｌを徐々に滴定した。１．０Ｎ ＨＣｌでｐＨを中性に調整した後、体積は約１０％増加し、リオチロニンナトリウムの最終濃度は約２．７３μｇＴ３／３００μＬ（９．１７μｇ／ｍｌ）になる。この溶液は４℃で保存され、ｐＨ調整操作後最大２６時間まで使用された。
この試験に使用されたＴ３は、１．０ｍＬの琥珀色のガラス製バイアルに入った１．０ｍＬ中１０μｇの濃度のリオチロニンナトリウム注射液（X-GEN Pharmaceuticals, Inc., Horseheads, NY）である。リオチロニンナトリウム注射液の各１ｍＬには、無菌の非発熱性ＵＳＰグレードの水に、１０μｇのリオチロニン（Ｔ３）に相当するリオチロニンナトリウム、６．８容量％のアルコール、０．１７５ｍｇの無水クエン酸、及び２．１９ｍｇのアンモニア（水酸化アンモニウムとして）が含まれている。予備試験では、市販されているリオチロニンナトリウムのｐＨが１０．０を超えると、ラットは気管内点滴に耐えられないことが判明した。従って、リオチロニンナトリウムとビヒクルは、バイオセーフティキャビネットに無菌的に加えられた無菌１．０Ｎ ＨＣｌ（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）で中性ｐＨ（６．０～８．０）に調整した後、動物への気管内点滴を行った。無菌技術を使用して、リオチロニンナトリウムのバイアルを開け、全内容物を無菌の１．５ｍＬエッペンドルフチューブに移した。８０～９０μＬの１．０Ｎ ＨＣｌをチューブに加え、穏やかにボルテックス混合し、ｐＨ試験紙（ｐＨ４．５～１０．０、Ricca Chemical Co., Arlington, TX）を使用してｐＨを測定した。ｐＨが所望の範囲になるまで、必要に応じて追加のＨＣｌを徐々に滴定した。１．０Ｎ ＨＣｌでｐＨを中性に調整した後、体積は約１０％増加し、リオチロニンナトリウムの最終濃度は約２．７３μｇＴ３／３００μＬ（９．１７μｇ／ｍｌ）になる。この溶液は４℃で保存され、ｐＨ調整操作後最大２６時間まで使用された。
【0123】
ビヒクル対照溶液は、無菌の非発熱性ＵＳＰグレードの水（USP/EP Purified, Ricca Chemical Co., Arlington, TX）で調製され、溶液１ｍＬあたり６．８容量％のエタノール（Decon Laboratories, Inc., King of Prussia, PA）、０．１７５ｍｇの無水クエン酸（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）、及び２．１９ｍｇのアンモニア（J.T. Baker Chemical Co., Avantor Performance Materials LLC, Radnor, PA、強アンモニア溶液、２７．０～３０．０％、Ｎ．Ｆ．－Ｆ．Ｃ．Ｃ．）を含有した。上記のように、ビヒクルも１．０Ｎ ＨＣｌで中性ｐＨ（６．０～８．０）に調整した。無菌技術を使用して、ビヒクルをフィルター滅菌し、２１本の滅菌使い捨て試験管（各５ｍＬ）に分注して４℃で保存し、使用日ごとに新しい試験管を開けた。通常の生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム注射液ＵＳＰ、B. Braun Medical, Inc., Bethlehem, PA）は室温で保存された。使用日ごとに新しいパッケージが開封された。
【0124】
動物の生活ケア
到着後、訓練を受けたスタッフが動物を視覚的に検査し、体重を計り、数を数え、性別を判断し、適切に収容ボックスに分けた。各動物は、個々の識別子を含む金属製の耳タグを取り付けられた後に、投薬された。動物は、ＡＡＡＬＡＣ認定の檻に衛生的な状態で収容され、強さと仲間つきあいがよくなるように社会的に収容された。収容エリアの温度と湿度は、少なくとも１日１回追跡された。動物は、少なくとも７日間順応させた後に、投与が開始された。この期間中、予備調整を行って、動物を計量、検査、及び投与操作中に経験する取り扱いに順応させた。すべての動物には、食物（TEKLAD, Envigo, Huntingdon, United Kingdom）と飲料用の水道水が自由に与えられた。処置のために動物を絶食させることはなかった。試験期間を通して、獣医によるケアが利用可能であった。動物の活動、外観、食物と水の摂取量、死亡率／瀕死率、及びその他のエンドポイント（表２）を含む一般的な健康状態に関する観察が行われ、試験への登録時から訓練を受けた技術者による安楽死まで少なくとも１日１回記録された。獣医師は、活動又は外観の異常について知らされた。観察、健康上の懸念、又は治療に関する偏りを防ぐために、獣医及び一般的な動物ケア担当者は、投与群の分布について知らされなかった。
到着後、訓練を受けたスタッフが動物を視覚的に検査し、体重を計り、数を数え、性別を判断し、適切に収容ボックスに分けた。各動物は、個々の識別子を含む金属製の耳タグを取り付けられた後に、投薬された。動物は、ＡＡＡＬＡＣ認定の檻に衛生的な状態で収容され、強さと仲間つきあいがよくなるように社会的に収容された。収容エリアの温度と湿度は、少なくとも１日１回追跡された。動物は、少なくとも７日間順応させた後に、投与が開始された。この期間中、予備調整を行って、動物を計量、検査、及び投与操作中に経験する取り扱いに順応させた。すべての動物には、食物（TEKLAD, Envigo, Huntingdon, United Kingdom）と飲料用の水道水が自由に与えられた。処置のために動物を絶食させることはなかった。試験期間を通して、獣医によるケアが利用可能であった。動物の活動、外観、食物と水の摂取量、死亡率／瀕死率、及びその他のエンドポイント（表２）を含む一般的な健康状態に関する観察が行われ、試験への登録時から訓練を受けた技術者による安楽死まで少なくとも１日１回記録された。獣医師は、活動又は外観の異常について知らされた。観察、健康上の懸念、又は治療に関する偏りを防ぐために、獣医及び一般的な動物ケア担当者は、投与群の分布について知らされなかった。
【表3】
【0125】
投与操作
無菌技術を使用して、試験物質及び対照物質を投与シリンジに引き込んだ。１８Ｇ針を使用して、０．５ｍＬの空気を１ｃｃのシリンジに引き込み、続いて０．３ｍＬ（３００μＬ）の溶液を引き込んだ。動物は、ケタミン４０ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇとキシラジン１ｍｇ／ｋｇ～７ｍｇ／ｋｇの組み合わせを腹腔内（ＩＰ）投与して麻酔をかけた。投与量は、個々の動物の応答と回復に基づいて、必要に応じて毎日調整した。麻酔の深さはつま先のピンチで評価し、目に潤滑剤を塗布した。傾斜して立っているスタンドを使用して、動物の前切歯で、スタンドの上部にある柔らかい非ラテックスゴムバンドから動物を吊るすことにより、投与操作中に動物を所望の位置に支持した。先の鈍い胃管栄養針を使用して最大２０μＬの２％リドカインを喉の奥に局所適用した後、気管カテーテルを挿管して、喉頭けいれんを最小限に抑え、気管への配置を容易にした。リドカインが効果を発揮している間、動物をスタンドから外し、腹臥位に置いた。
無菌技術を使用して、試験物質及び対照物質を投与シリンジに引き込んだ。１８Ｇ針を使用して、０．５ｍＬの空気を１ｃｃのシリンジに引き込み、続いて０．３ｍＬ（３００μＬ）の溶液を引き込んだ。動物は、ケタミン４０ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇとキシラジン１ｍｇ／ｋｇ～７ｍｇ／ｋｇの組み合わせを腹腔内（ＩＰ）投与して麻酔をかけた。投与量は、個々の動物の応答と回復に基づいて、必要に応じて毎日調整した。麻酔の深さはつま先のピンチで評価し、目に潤滑剤を塗布した。傾斜して立っているスタンドを使用して、動物の前切歯で、スタンドの上部にある柔らかい非ラテックスゴムバンドから動物を吊るすことにより、投与操作中に動物を所望の位置に支持した。先の鈍い胃管栄養針を使用して最大２０μＬの２％リドカインを喉の奥に局所適用した後、気管カテーテルを挿管して、喉頭けいれんを最小限に抑え、気管への配置を容易にした。リドカインが効果を発揮している間、動物をスタンドから外し、腹臥位に置いた。
【0126】
リドカインが効果を発揮するのに十分な時間を与えた後、動物を再び装置に吊るし、まず、喉に向けられた外部光源の助けを借りて、口腔を介して咽喉部を視覚化して、カテーテル（INTRAMEDIC、内径１．１９ｍｍ、外径１．７０ｍｍ、Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA）を気管に挿入した。先の鈍い鉗子と水で湿らせたガーゼで舌を脇に保持すると、気道の視覚化するのに有用であった。カテーテルを、主気管支の分岐点から約１．０ｃｍ手前の所定の深さまで気管内に進めた（気管及び気管支を露出させた動物の死体で測定された）。気道へのカテーテルの配置は、カテーテルの開口部に配置された歯科用ミラーの曇りによって確認された。次に、投与シリンジの針をカテーテルに挿入し、試験物質と空気のボーラスを１～２秒間隔で急速に送達した。試験物質の後に投与された空気ボーラスは、下気道への液体の投与を促進し、色素溶液を使用した予備実験で確認されたように、液体が気管又は主気管支に保持されないことが保証された。気管カテーテルを気道から取り外し、動物を支持装置から静かに取り外した。動物は、点滴後少なくとも２分間、胸部を上げて加温パッド上に腹臥位で置かれた。２分後、動物は、完全に回復するまで加熱パッドの上に平らに置かれた。
【0127】
終末安楽死の方法
臨床病理学（血液学及び生化学）検査のための採血
最終（５回目）の気管内投与の１日後に、臨床病理学検査のために毒性期の動物から血液試料を採取した。必要に応じてノーズコーンを介する吸入麻酔により、イソフルラン２～５％及び酸素１～１．５Ｌ／分で動物を麻酔した。血液学検査用に、０．５ｍＬ以上の全血を眼窩洞経由で、プレーン又はコーティングされたマイクロヘマトクリット毛細管を介して、さらに３０μＬの２％ＥＤＴＡ溶液（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）を含むＫ２ＥＤＴＡ採血管（BD Biosciences, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA）に採取し、同日の分析まで４℃に保持した。血清化学検査のために、≧０．７５ｍＬの全血を眼窩洞経由で、コーティングされていない毛細管を介して、赤い上部の血清マイクロチューブ（Sarstedt AG & Co. KG, Numbrecht, Germany）に採取した。血清を採取するために、チューブを採血後３０～６０分間室温で維持し、１０，０００×ｇで４℃で５分間遠心分離した。得られた血清を分離し、分析を翌日に行う場合は－７０℃以下で保存し、当日分析を行う場合は４℃で保存した。すべての試料は、分析のためにミネソタ大学獣医医療センター（Veterinary Medical Center：ＶＭＣ）の臨床病理学研究室に送られた。血液学検査について評価されたパラメーターを表３に示す。臨床化学検査について評価されたパラメーターを表４に示す。採血後、動物を≧８６ｍｇ／ｋｇＩＰのユーサゾル（EUTHASOL）（Virbac Corp., Fort Worth, TX）で安楽死させ、次に剖検を行った。臨床病理値の評価は、ミネソタ大学の Jill Schappa Faustich, DVM, DACVP によって実施された。
臨床病理学（血液学及び生化学）検査のための採血
最終（５回目）の気管内投与の１日後に、臨床病理学検査のために毒性期の動物から血液試料を採取した。必要に応じてノーズコーンを介する吸入麻酔により、イソフルラン２～５％及び酸素１～１．５Ｌ／分で動物を麻酔した。血液学検査用に、０．５ｍＬ以上の全血を眼窩洞経由で、プレーン又はコーティングされたマイクロヘマトクリット毛細管を介して、さらに３０μＬの２％ＥＤＴＡ溶液（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）を含むＫ２ＥＤＴＡ採血管（BD Biosciences, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA）に採取し、同日の分析まで４℃に保持した。血清化学検査のために、≧０．７５ｍＬの全血を眼窩洞経由で、コーティングされていない毛細管を介して、赤い上部の血清マイクロチューブ（Sarstedt AG & Co. KG, Numbrecht, Germany）に採取した。血清を採取するために、チューブを採血後３０～６０分間室温で維持し、１０，０００×ｇで４℃で５分間遠心分離した。得られた血清を分離し、分析を翌日に行う場合は－７０℃以下で保存し、当日分析を行う場合は４℃で保存した。すべての試料は、分析のためにミネソタ大学獣医医療センター（Veterinary Medical Center：ＶＭＣ）の臨床病理学研究室に送られた。血液学検査について評価されたパラメーターを表３に示す。臨床化学検査について評価されたパラメーターを表４に示す。採血後、動物を≧８６ｍｇ／ｋｇＩＰのユーサゾル（EUTHASOL）（Virbac Corp., Fort Worth, TX）で安楽死させ、次に剖検を行った。臨床病理値の評価は、ミネソタ大学の Jill Schappa Faustich, DVM, DACVP によって実施された。
【表4】
【表5】
【0128】
毒物動態学（ＴＫ）
採血
毒物動態学実験のために、ラットは、ケタミン４０ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇとキシラジン１ｍｇ／ｋｇ～７ｍｇ／ｋｇの組み合わせの腹腔内（ＩＰ）投与で麻酔して、投与操作を行い、既に記載されているようにリオチロニンナトリウム注射液を気管内投与した。ＴＫ試料採取プロトコールの詳細を表５及び表６に示す。投与と１回目又は２回目の採血時点までの時間に応じて、動物は注入可能な麻酔薬で麻酔をかけたまま採血するか、又は回復した場合は、必要に応じて、イソフルラン２～５％と酸素１～１．５Ｌ／分でノーズコーンを介して吸入麻酔で麻酔して（つま先のピンチで評価）、適切な麻酔深度を維持した。局所プロパリカイン麻酔点眼液を各眼に適用した後、１回目の採血をい、効果が現れるまで待った。ＴＫ分析のための血清試料の採取は、上記の血清化学試料について説明したとおりであり、試料はアッセイするまで≦－７０℃以下で保存された。動物は、最終的な採血後に、ユーサゾル（EUTHASOL）（Virbac Corp., Fort Worth, TX）≧８６ｍｇ／ｋｇＩＰで安楽死させた。
採血
毒物動態学実験のために、ラットは、ケタミン４０ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇとキシラジン１ｍｇ／ｋｇ～７ｍｇ／ｋｇの組み合わせの腹腔内（ＩＰ）投与で麻酔して、投与操作を行い、既に記載されているようにリオチロニンナトリウム注射液を気管内投与した。ＴＫ試料採取プロトコールの詳細を表５及び表６に示す。投与と１回目又は２回目の採血時点までの時間に応じて、動物は注入可能な麻酔薬で麻酔をかけたまま採血するか、又は回復した場合は、必要に応じて、イソフルラン２～５％と酸素１～１．５Ｌ／分でノーズコーンを介して吸入麻酔で麻酔して（つま先のピンチで評価）、適切な麻酔深度を維持した。局所プロパリカイン麻酔点眼液を各眼に適用した後、１回目の採血をい、効果が現れるまで待った。ＴＫ分析のための血清試料の採取は、上記の血清化学試料について説明したとおりであり、試料はアッセイするまで≦－７０℃以下で保存された。動物は、最終的な採血後に、ユーサゾル（EUTHASOL）（Virbac Corp., Fort Worth, TX）≧８６ｍｇ／ｋｇＩＰで安楽死させた。
【表6】
【表7】
【0129】
生物分析操作
血清Ｔ３レベルの評価のために、試料は分析のためにミネソタ州フェアビュー大学メディカルセンターイーストバンク診断研究所（Fairview University of Minnesota Medical Center East Bank Diagnostic Laboratory）（ＣＬＩＡ及びＣＡＰによって認定された臨床検査室）に送られた。血清試料を分析ラボに送る前に、各試料を通常の（０．９％）生理食塩水で１：４又は１：８に希釈した。予備試験で決定されたこれらの希釈により、試料の総Ｔ３濃度がアッセイ範囲（１０ｐｇ／ｍＬ～４６０ｐｇ／ｍＬ）内に収まることが保証された。試料は、総トリヨードサイロニン（Ｔ３）の化学発光アッセイによって分析された。
血清Ｔ３レベルの評価のために、試料は分析のためにミネソタ州フェアビュー大学メディカルセンターイーストバンク診断研究所（Fairview University of Minnesota Medical Center East Bank Diagnostic Laboratory）（ＣＬＩＡ及びＣＡＰによって認定された臨床検査室）に送られた。血清試料を分析ラボに送る前に、各試料を通常の（０．９％）生理食塩水で１：４又は１：８に希釈した。予備試験で決定されたこれらの希釈により、試料の総Ｔ３濃度がアッセイ範囲（１０ｐｇ／ｍＬ～４６０ｐｇ／ｍＬ）内に収まることが保証された。試料は、総トリヨードサイロニン（Ｔ３）の化学発光アッセイによって分析された。
【0130】
ＴＫ分析
毒物動態学パラメーターは、Phoenix 64 WinNonlin 薬物動態ソフトウェアバージョン７．０（Pharsight Corp., Mountain View, CA）を使用して推定された。パラメーターの推定には、投与経路と一致する非コンパートメント（ＮＣＡ）アプローチが使用された。すべてのパラメーター（表７）は、特に明記しない限り、すべての時点からの血清中の平均Ｔ３濃度から生成された。可能な限り、平均濃度は３つの動物／性別／時点から得られた。パラメーターは、各用量投与の開始に対するサンプリング時間を使用して推定された。生データは、ｐｇ／ｄｌ値を１００で割り、その試料の希釈係数４又は８を掛けることにより、血清のｎｇ／ｍｌに変換された。定量限界未満の値は０として計算された。
毒物動態学パラメーターは、Phoenix 64 WinNonlin 薬物動態ソフトウェアバージョン７．０（Pharsight Corp., Mountain View, CA）を使用して推定された。パラメーターの推定には、投与経路と一致する非コンパートメント（ＮＣＡ）アプローチが使用された。すべてのパラメーター（表７）は、特に明記しない限り、すべての時点からの血清中の平均Ｔ３濃度から生成された。可能な限り、平均濃度は３つの動物／性別／時点から得られた。パラメーターは、各用量投与の開始に対するサンプリング時間を使用して推定された。生データは、ｐｇ／ｄｌ値を１００で割り、その試料の希釈係数４又は８を掛けることにより、血清のｎｇ／ｍｌに変換された。定量限界未満の値は０として計算された。
【表8】
【0131】
マトリックス濃度データの算術平均及び標準偏差の計算は、レポート目的でエクセル（Microsoft, Corp., Redmond, WA）で実行／複製された。平均濃度対時間曲線からのパラメーター推定値に加えて、用量群、日、及び性別（適宜）ごとのＡＵＣ（０－ｔ）及びＣｍａｘの標準誤差を、ＷＩＮＮＯＮＬＩＮ（Cetara USA, Inc., Princeton, NJ）を使用して作成した。
【0132】
Ｃｍａｘ及びＴｍａｘは、データの検査によって得られた。時間ゼロで観察された濃度に基づいて、測定可能な内因性化合物が存在するため、ベースライン減算が実行された。平均濃度データを使用して、雄と雌の動物の残っている濃度から時間ゼロの濃度を差し引いた。ベースラインを差し引いた濃度の曲線下面積（ＡＵＣ）は、線形台形則を使用して計算された。雄と雌の両方の動物の２４時間濃度がほぼベースライン（投与前）濃度に戻ったため、これらの観察結果はＡＵＣと半減期の計算では無視された。最終消失半減期は、２時間、４時間、及び６時間での最後の３つの観察から計算された。ＷＩＮＮＯＮＬＩＮ ＮＣＡは、濃度の対数に対して線形回帰を実行する。均一な重み付けスキームが選択された。対数線形プロフィールの一部であるように見えても、２つの観察のみに基づいて半減期を提供しなくても、ＮＣＡのデフォルトの回帰アルゴリズムは、半減期の計算にＣｍａｘを使用しない。雄動物のデフォルトの回帰が使用された。ただし、雌動物については、２時間後の濃度もＣｍａｘ値であった。これは、３つの濃度すべての回帰直線（調整済みＲ２乗＝１．０）に収まるように見えたため、半減期の計算に含めた。パラメーターは、評価者の裁量で適切に評価された。結果は個々の値として提供され、可能な場合は適切な群ごとに、エクセル（Microsoft, Corp., Redmond, WA）及びＷＩＮＮＯＮＬＩＮ（Cetara USA, Inc., Princeton, NJ）を使用して平均値と標準誤差のグラフ化を含む。
【0133】
剖検方法
肉眼的所見
予定された終了時に安楽死されたか、又は予定された終了時前に死亡していることが見つかったか又は安楽死された毒性期の動物は、委員会認定の獣医病理学者によって実施される広範な剖検を受けた。剖検には、動物の死体と筋骨格系、外面とそのすべての開口部、及び頸部、胸部、腹部、骨盤領域、空洞、及び内容物の検査が含まれた。末端眼窩採血法のため、眼は検査しなかった。
肉眼的所見
予定された終了時に安楽死されたか、又は予定された終了時前に死亡していることが見つかったか又は安楽死された毒性期の動物は、委員会認定の獣医病理学者によって実施される広範な剖検を受けた。剖検には、動物の死体と筋骨格系、外面とそのすべての開口部、及び頸部、胸部、腹部、骨盤領域、空洞、及び内容物の検査が含まれた。末端眼窩採血法のため、眼は検査しなかった。
【0134】
組織病理
組織病理的変化についてこの試験で評価された主要な標的組織には、肺、気管－気管支分岐点、及び気管気管支リンパ節が含まれた。上記のすべての標的組織を含む無傷の心－肺臓器が、無傷の動物から取り出された。心－肺臓器の重量を測定し、写真を撮った後、１０％中性緩衝化ホルマリン（ＮＢＦ）で気管を介して肺を灌流膨張させた。膨張のために、１０％ＮＢＦのリザーバーに接続された１８ｇのバタフライカテーテルを気管に挿入し、肺を約２０～２５ｃｍの一定圧力で２分間膨張させた後、気管を縫合糸で結び、固定中の肺の膨張を維持した。次に、心肺臓器全体を１０％ＮＢＦに浸漬固定した。組織検査のためにさらに処理する前に、心臓、気管、及びその他の接着組織を肺から除去し、重量を測定した。この重量は、剖検時に採取された心－肺臓器の重量から差し引かれると、その後の実際の投与量の計算に使用される湿潤肺の重量を提供した。脳、心臓、肝臓、脾臓、膵臓、腎臓、及び副腎を含む非標的組織の肉眼的病変を評価した。非標的臓器は全体を採取し（代表的な標本が右葉前葉から採取された肝臓を除く）、可能性のある将来の分析のために１０％ＮＢＦに保存された。組織学的処理と評価は、独立した評価者によって行われた（Alizee Pathology, LLC, Thurmont, MD）。
組織病理的変化についてこの試験で評価された主要な標的組織には、肺、気管－気管支分岐点、及び気管気管支リンパ節が含まれた。上記のすべての標的組織を含む無傷の心－肺臓器が、無傷の動物から取り出された。心－肺臓器の重量を測定し、写真を撮った後、１０％中性緩衝化ホルマリン（ＮＢＦ）で気管を介して肺を灌流膨張させた。膨張のために、１０％ＮＢＦのリザーバーに接続された１８ｇのバタフライカテーテルを気管に挿入し、肺を約２０～２５ｃｍの一定圧力で２分間膨張させた後、気管を縫合糸で結び、固定中の肺の膨張を維持した。次に、心肺臓器全体を１０％ＮＢＦに浸漬固定した。組織検査のためにさらに処理する前に、心臓、気管、及びその他の接着組織を肺から除去し、重量を測定した。この重量は、剖検時に採取された心－肺臓器の重量から差し引かれると、その後の実際の投与量の計算に使用される湿潤肺の重量を提供した。脳、心臓、肝臓、脾臓、膵臓、腎臓、及び副腎を含む非標的組織の肉眼的病変を評価した。非標的臓器は全体を採取し（代表的な標本が右葉前葉から採取された肝臓を除く）、可能性のある将来の分析のために１０％ＮＢＦに保存された。組織学的処理と評価は、独立した評価者によって行われた（Alizee Pathology, LLC, Thurmont, MD）。
【0135】
用量管理
すべての用量は、５日間連続して毎日安全かつ再現可能に送達できる最大量で気管内点滴により投与された。この量は、予備試験では体重２５０～３５０ｇのラットに対して０．３ｍＬ（３００μｌ）であると決定された。ＬＲＴ６３３（Ｔ３ビヒクル群）への用量３投与中に、２０～５０μｌのビヒクル対照物質が投与シリンジの上部から出てくる１つの例を除いて、材料の投与による明らかな問題はなかった。
すべての用量は、５日間連続して毎日安全かつ再現可能に送達できる最大量で気管内点滴により投与された。この量は、予備試験では体重２５０～３５０ｇのラットに対して０．３ｍＬ（３００μｌ）であると決定された。ＬＲＴ６３３（Ｔ３ビヒクル群）への用量３投与中に、２０～５０μｌのビヒクル対照物質が投与シリンジの上部から出てくる１つの例を除いて、材料の投与による明らかな問題はなかった。
【0136】
投与の初日（１日目）の体重及び計算された湿潤肺の重量に基づいて投与されたＴ３の計算された用量を表８に詳述する。
【表9】
【0137】
毒物動態学（ＴＫ）
リオチロニンナトリウム（Ｔ３）は、提出されたすべての試料で正常に定量された。報告されたすべての値は、アッセイの定量限界内であった（１０ｐｇ／ｍＬ～４６０ｐｇ／ｍＬ）。
測定可能な値を表９に列挙し、図５にグラフ化する（平均±標準誤差）。ＴＫ分析は、単回Ｔ３用量を投与された２４匹の動物すべての希釈試料について行った（表１０）。
リオチロニンナトリウム（Ｔ３）は、提出されたすべての試料で正常に定量された。報告されたすべての値は、アッセイの定量限界内であった（１０ｐｇ／ｍＬ～４６０ｐｇ／ｍＬ）。
測定可能な値を表９に列挙し、図５にグラフ化する（平均±標準誤差）。ＴＫ分析は、単回Ｔ３用量を投与された２４匹の動物すべての希釈試料について行った（表１０）。
【表10】
【表11】
【0138】
実施例４
細胞培養と高酸素曝露
成体ラットＡＴ２細胞株ＲＬＥ－６ＴＮ（ATCC, Manassas, VA）を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で９５％空気、５％ＣＯ２環境で、約５０％コンフルエンスに達するまで培養し、次に細胞を、２％ストリップＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２中のＴ３の存在下又は非存在下で、９５％Ｏ２、５％ＣＯ２に、指定された期間曝露した。高酸素曝露期間の終わりに、トリパンブルー色素排除によって生存細胞を数えた。
細胞培養と高酸素曝露
成体ラットＡＴ２細胞株ＲＬＥ－６ＴＮ（ATCC, Manassas, VA）を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で９５％空気、５％ＣＯ２環境で、約５０％コンフルエンスに達するまで培養し、次に細胞を、２％ストリップＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２中のＴ３の存在下又は非存在下で、９５％Ｏ２、５％ＣＯ２に、指定された期間曝露した。高酸素曝露期間の終わりに、トリパンブルー色素排除によって生存細胞を数えた。
【0139】
核の抽出
核は、製造元の説明書に従って、ＮＥ－ＰＥＲ核及び細胞質抽出試薬キット（Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA）を用いて抽出された。
核は、製造元の説明書に従って、ＮＥ－ＰＥＲ核及び細胞質抽出試薬キット（Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA）を用いて抽出された。
【0140】
細胞溶解とウエスタンブロット
細胞は、２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、プロテアーゼ阻害剤（１ｍＭ ＰＭＳＦ、２μｇ／ｍｌペプスタチン、及びそれぞれ１０μｇ／ｍｌのアプロチニンとロイペプチン）を有する１％（容量／容量）トリトンＸ－１００、及びホスファターゼ阻害剤（２．５ｍＭピロリン酸ナトリウム、１ｍＭ β－グリセロリン酸、及び１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４）を含む溶解緩衝液中で溶解させた。溶解物を、氷上で２５ゲージの針を通して１０回吸引してさらに溶解させた後、１３，０００ｒｐｍで４℃で１５分間遠心分離した。上清を採取し、タンパク質濃度をＢＣＡタンパク質アッセイキット（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）を使用して測定した。この工程の直後に、等量のタンパク質をウェスタンブロッティング分析にかけた。
細胞は、２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、プロテアーゼ阻害剤（１ｍＭ ＰＭＳＦ、２μｇ／ｍｌペプスタチン、及びそれぞれ１０μｇ／ｍｌのアプロチニンとロイペプチン）を有する１％（容量／容量）トリトンＸ－１００、及びホスファターゼ阻害剤（２．５ｍＭピロリン酸ナトリウム、１ｍＭ β－グリセロリン酸、及び１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４）を含む溶解緩衝液中で溶解させた。溶解物を、氷上で２５ゲージの針を通して１０回吸引してさらに溶解させた後、１３，０００ｒｐｍで４℃で１５分間遠心分離した。上清を採取し、タンパク質濃度をＢＣＡタンパク質アッセイキット（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）を使用して測定した。この工程の直後に、等量のタンパク質をウェスタンブロッティング分析にかけた。
【0141】
核の抽出
核は、製造元の説明書に従って、ＮＥ－ＰＥＲ核及び細胞質抽出試薬キット（Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA）を用いて抽出した。
核は、製造元の説明書に従って、ＮＥ－ＰＥＲ核及び細胞質抽出試薬キット（Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA）を用いて抽出した。
【0142】
統計
他に明記されない限り、すべてのデータは、少なくとも３回以上の独立した実験の平均値±ＳＤとして表される。ほとんどの実験において、実験内の個々のデータポイントは、少なくとも２つの重複の平均を表す。３つ以上の群を含む比較は、ＡＮＯＶＡ及び事後の対になった比較によって分析された。平均間の差は、Ｐ＜０．０５で有意と見なされた。
他に明記されない限り、すべてのデータは、少なくとも３回以上の独立した実験の平均値±ＳＤとして表される。ほとんどの実験において、実験内の個々のデータポイントは、少なくとも２つの重複の平均を表す。３つ以上の群を含む比較は、ＡＮＯＶＡ及び事後の対になった比較によって分析された。平均間の差は、Ｐ＜０．０５で有意と見なされた。
【0143】
実施例５
実験計画
動物治療のためのすべての実験プロトコールは、ミネソタ大学の施設内動物管理使用委員会（Institutional Animal Care and Use Committee）によって承認された。生理食塩水又はＴ３のいずれかを腹腔内（ｉｐ）注射された特定病原菌を含まない（ＳＰＦ）成体雄スプラーグドーレイラット（２５０ｇ～３００ｇ）を、チャンバー内で食物と水へのアクセスを自由にして、標準圧高酸素（ＦＩＯ２＞９５％、５ＬＰＭ）に、室温で４８時間又は６０時間曝露して、肺の炎症と損傷を誘発した。室内空気対照ラットは、大学の動物飼育施設で飼育した。表１１にまとめた２つのプロトコールに詳述されている用量と時点で、ラットにＴ３又は生理食塩水を腹腔内注射した。高酸素曝露の最後に、ラットをペントバルビタールの腹腔内注射により殺処分し、肺を採取した。右葉は、組織病理検査、肺組織のミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性、及び湿潤対乾燥重量比の測定に割り当てられた。左葉は気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を受け、ＢＡＬタンパク質濃度と示差的細胞数を測定した。
実験計画
動物治療のためのすべての実験プロトコールは、ミネソタ大学の施設内動物管理使用委員会（Institutional Animal Care and Use Committee）によって承認された。生理食塩水又はＴ３のいずれかを腹腔内（ｉｐ）注射された特定病原菌を含まない（ＳＰＦ）成体雄スプラーグドーレイラット（２５０ｇ～３００ｇ）を、チャンバー内で食物と水へのアクセスを自由にして、標準圧高酸素（ＦＩＯ２＞９５％、５ＬＰＭ）に、室温で４８時間又は６０時間曝露して、肺の炎症と損傷を誘発した。室内空気対照ラットは、大学の動物飼育施設で飼育した。表１１にまとめた２つのプロトコールに詳述されている用量と時点で、ラットにＴ３又は生理食塩水を腹腔内注射した。高酸素曝露の最後に、ラットをペントバルビタールの腹腔内注射により殺処分し、肺を採取した。右葉は、組織病理検査、肺組織のミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性、及び湿潤対乾燥重量比の測定に割り当てられた。左葉は気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を受け、ＢＡＬタンパク質濃度と示差的細胞数を測定した。
【表12】
【0144】
湿潤－乾燥重量比
右肺の一部を ＰＢＳで簡単にすすぎ、水分を吸い取り、次に重量を量って「湿重量」を得た。次に肺を８０℃のオーブンで７日間乾燥させて「乾燥」重量を得た。
右肺の一部を ＰＢＳで簡単にすすぎ、水分を吸い取り、次に重量を量って「湿重量」を得た。次に肺を８０℃のオーブンで７日間乾燥させて「乾燥」重量を得た。
【0145】
肺洗浄分析
左肺の気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）は、既に記載された方法（Pace et al., Exp Lung Res 35:380-398, 2009）の修正を使用して実行された。簡単に説明すると、４ｍｌの氷冷した１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を左肺に注入し、取り出し、２回続けて再注入した後、洗浄液を分析した。採取したＢＡＬ液を１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、細胞及び破片を取り出した。細胞ペレットを１ｍｌの１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に再懸濁し、血球計を用いて総細胞数を計数した。Ｈｅｍａ３染色キット（Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA）を使用してＢＡＬサイトスピン調製物を染色して、有核細胞を同定した。タンパク質濃度は、標準的なＢＣＡアッセイ（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）を使用して、ＢＡＬ液の上清で決定された。
左肺の気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）は、既に記載された方法（Pace et al., Exp Lung Res 35:380-398, 2009）の修正を使用して実行された。簡単に説明すると、４ｍｌの氷冷した１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を左肺に注入し、取り出し、２回続けて再注入した後、洗浄液を分析した。採取したＢＡＬ液を１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、細胞及び破片を取り出した。細胞ペレットを１ｍｌの１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に再懸濁し、血球計を用いて総細胞数を計数した。Ｈｅｍａ３染色キット（Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA）を使用してＢＡＬサイトスピン調製物を染色して、有核細胞を同定した。タンパク質濃度は、標準的なＢＣＡアッセイ（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）を使用して、ＢＡＬ液の上清で決定された。
【0146】
ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）アッセイ
肺における好中球活性を定量するために、既に記載されたようにＭＰＯ活性をアッセイした（Abraham et al., J Immunol 165:2950-2954, 2000）。事前の洗浄なしで肺組織を液体窒素で凍結し、重量を測定し、－８６℃で保存した。肺を１．５ｍｌの２０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．４で３０秒間ホモジナイズし、４℃、４０，０００×ｇで３０分間遠心分離した。ペレットを、０．５％臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウムを含む１．５ｍｌの５０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．０に再懸濁し、９０秒間超音波処理し、６０℃で２時間インキュベートし、１４，０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離した。上清を、肺重量に補正されたペルオキシダーゼ活性についてアッセイした。ＭＰＯは、肺組織１グラムあたりの活性として表された。
肺における好中球活性を定量するために、既に記載されたようにＭＰＯ活性をアッセイした（Abraham et al., J Immunol 165:2950-2954, 2000）。事前の洗浄なしで肺組織を液体窒素で凍結し、重量を測定し、－８６℃で保存した。肺を１．５ｍｌの２０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．４で３０秒間ホモジナイズし、４℃、４０，０００×ｇで３０分間遠心分離した。ペレットを、０．５％臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウムを含む１．５ｍｌの５０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．０に再懸濁し、９０秒間超音波処理し、６０℃で２時間インキュベートし、１４，０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離した。上清を、肺重量に補正されたペルオキシダーゼ活性についてアッセイした。ＭＰＯは、肺組織１グラムあたりの活性として表された。
【0147】
組織化学
肺組織を取り出し、４％パラホルムアルデヒド中で２０ｃｍ水圧で膨張固定し、パラフィン包埋し、５ミクロンの切片として切断し、ポリ－Ｌ－リジンスライドにマウントした。切片をキシレン中で脱パラフィンし、メタノール中の段階的アルコール系列で再水和し、抗原採取のためにクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で９８℃水浴に３０分間入れた。ＰＢＳ中の０．３％過酸化水素でクエンチした後、切片を正常血清中でアビジン／ビオチンブロッキングキット（Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA）と共に、各３０分間と１５分間インキュベートした。ミエロペルオキシダーゼＡｂ－１（Thermo Fisher Scientific, Inc., Fremont, CA）と共に４℃で一晩インキュベーションした後、ビオチン化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（１：５００）及びＲＴＵストレプトアビジン（Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA）を３０分間連続して適用し、３，３’－ジアミノベンジジンをペルオキシダーゼ基質として使用した。切片をヘマトキシリンで対比染色した。画像解析と写真撮影には、Leica Leitz DMRB顕微鏡を使用した。
肺組織を取り出し、４％パラホルムアルデヒド中で２０ｃｍ水圧で膨張固定し、パラフィン包埋し、５ミクロンの切片として切断し、ポリ－Ｌ－リジンスライドにマウントした。切片をキシレン中で脱パラフィンし、メタノール中の段階的アルコール系列で再水和し、抗原採取のためにクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で９８℃水浴に３０分間入れた。ＰＢＳ中の０．３％過酸化水素でクエンチした後、切片を正常血清中でアビジン／ビオチンブロッキングキット（Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA）と共に、各３０分間と１５分間インキュベートした。ミエロペルオキシダーゼＡｂ－１（Thermo Fisher Scientific, Inc., Fremont, CA）と共に４℃で一晩インキュベーションした後、ビオチン化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（１：５００）及びＲＴＵストレプトアビジン（Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA）を３０分間連続して適用し、３，３’－ジアミノベンジジンをペルオキシダーゼ基質として使用した。切片をヘマトキシリンで対比染色した。画像解析と写真撮影には、Leica Leitz DMRB顕微鏡を使用した。
【0148】
血清Ｔ３測定
６０時間の高酸素状態の終了時に血液試料を採取し、１３，０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離した。上清は－２０℃で保存した。血清総Ｔ３濃度は、市販のＲＩＡキット（Siemens Medical Solutions Diagnostics, Los Angeles, CA）を用いて、既に記載されたように測定した（Bastian et al., Endocrinology 151:4055-4065, 2010）。
６０時間の高酸素状態の終了時に血液試料を採取し、１３，０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離した。上清は－２０℃で保存した。血清総Ｔ３濃度は、市販のＲＩＡキット（Siemens Medical Solutions Diagnostics, Los Angeles, CA）を用いて、既に記載されたように測定した（Bastian et al., Endocrinology 151:4055-4065, 2010）。
【0149】
統計解析
値は、少なくとも３回の実験の平均値±ＳＤとして表された。３つ以上の群を含む比較は、ＡＮＯＶＡ及び事後の対になった比較によって分析された。平均値間の差は、ｐ＜０．０５で有意と見なされ、比較の数について整された。
値は、少なくとも３回の実験の平均値±ＳＤとして表された。３つ以上の群を含む比較は、ＡＮＯＶＡ及び事後の対になった比較によって分析された。平均値間の差は、ｐ＜０．０５で有意と見なされ、比較の数について整された。
【0150】
実施例６
挿管されたＡＲＤＳ患者のＴ３局所肺治療の合同第Ｉ／ＩＩ相試験は、非臨床試験実施基準の毒性学及び薬物動態学及び薬力学研究（ＦＤＡ ＩＮＤ１２６２０４）の後にＦＤＡによって承認された。１０ミリリットル（ｍｌ）の製剤化され、ｐＨ調整された市販の静脈内Ｔ３溶液（Par Pharmaceutical, Navi Mumbai, India; 及び XGen Pharmaceuticals DJB, Inc., Horseheads, NY）を、挿管されたＡＲＤＳ患者の気管内チューブの吸引カテーテルを介して肺胞腔に直接点滴した。１回の投与あたり最大５０マイクログラムのＴ３用量を、４日間毎日投与した。この試験は、Essentia IRB (Duluth, MN)によって承認され、ClinicalTrials.gov (NCT04115514)に掲載された。
挿管されたＡＲＤＳ患者のＴ３局所肺治療の合同第Ｉ／ＩＩ相試験は、非臨床試験実施基準の毒性学及び薬物動態学及び薬力学研究（ＦＤＡ ＩＮＤ１２６２０４）の後にＦＤＡによって承認された。１０ミリリットル（ｍｌ）の製剤化され、ｐＨ調整された市販の静脈内Ｔ３溶液（Par Pharmaceutical, Navi Mumbai, India; 及び XGen Pharmaceuticals DJB, Inc., Horseheads, NY）を、挿管されたＡＲＤＳ患者の気管内チューブの吸引カテーテルを介して肺胞腔に直接点滴した。１回の投与あたり最大５０マイクログラムのＴ３用量を、４日間毎日投与した。この試験は、Essentia IRB (Duluth, MN)によって承認され、ClinicalTrials.gov (NCT04115514)に掲載された。
【0151】
患者１
６７歳の男性は、高血圧と閉塞性睡眠時無呼吸の病歴があった。彼は、フロリダでのキャンプ旅行で、乾いた咳、息切れ、及び発熱が５日間にわたって進行した後、ミネソタ州北部に戻った．救急科（ＥＤ）では、彼は低酸素血症と微熱（３８．６℃）があり、胸部画像では両側に斑状の陰影があり、呼吸困難のために挿管された。入院検査室は、正常な好中球数、絶対リンパ球減少症で、Ｃ反応性タンパク質、フェリチン、及びＤダイマーレベルの上昇が目立った。彼はＣＯＶＩＤ－１９とライノウイルスの両方が陽性であった。
６７歳の男性は、高血圧と閉塞性睡眠時無呼吸の病歴があった。彼は、フロリダでのキャンプ旅行で、乾いた咳、息切れ、及び発熱が５日間にわたって進行した後、ミネソタ州北部に戻った．救急科（ＥＤ）では、彼は低酸素血症と微熱（３８．６℃）があり、胸部画像では両側に斑状の陰影があり、呼吸困難のために挿管された。入院検査室は、正常な好中球数、絶対リンパ球減少症で、Ｃ反応性タンパク質、フェリチン、及びＤダイマーレベルの上昇が目立った。彼はＣＯＶＩＤ－１９とライノウイルスの両方が陽性であった。
【0152】
圧力解放容量制御換気モード（ＰＲＶＣ）の人工呼吸器の初期設定は、１回換気量６ｍｌ／ｋｇ、静圧２５ｃｍＨ２Ｏ、ＦｉＯ２ １００％、１６ｃｍ Ｈ２Ｏ ＰＥＥＰで、Ｐ／Ｆ比１６０であった。彼は、最初の数日間は、肺保護換気方法、腹臥位、麻痺、吸入エポプロステノール、保存的輸液療法、及び経験的広域抗生物質とアジスロマイシン及びヒドロキシクロロキンで治療された。
【0153】
３日目に、彼は、まず気管内チューブの吸引カテーテルを介して点滴されたＴ３（５０マイクログラム）の１日４回の投与を受けた。その後の投与は、４、６、及び７日目に行われた。５日目の投与は、新たに調製された再配合Ｔ３溶液をミネソタ州ミネアポリスからミネソタ州ダルースに運ぶのに技術的な問題が逢ったために延期された。喀痰培養がクレブシエラ・アエロゲネス（Klebsiella aerogenes）陽性であったにもかかわらず、彼は１１日目に人工呼吸器から抜管された。ＩＣＵから出た後、彼は軽い意識障害と譫妄があった。彼は退院し、室内空気の自宅に戻り、Ｔ３治療が開始されてから３０日目のフォローアップで無症候性であり、肺の聴診はクリアであり、６０日目に肺機能検査（ＰＦＴ）は完全で胸部レントゲン写真は正常であった．
【0154】
患者２
５１歳の男性は、高血圧、閉塞性睡眠時無呼吸、肥満（ＢＭＩ ４６ｋｇ／ｍ２）の病歴があり、非喫煙者であった。彼は、１０日間の進行性の乾いた咳、鼻漏、喉の痛み、息切れ、及び発熱を示した．入院時、彼は微熱（３８．６℃）で、かすかな粗い呼吸音、両側の斑状の胸部レントゲン写真の混濁、ＣＯＶＩＤ－１９検査陽性、白血球数１０．６、並びにＣ反応性タンパク質、フェリチン、ＬＤＨ、Ｄダイマー、フィブリノゲン、及びクレアチンキナーゼの上昇を伴っていた。
５１歳の男性は、高血圧、閉塞性睡眠時無呼吸、肥満（ＢＭＩ ４６ｋｇ／ｍ２）の病歴があり、非喫煙者であった。彼は、１０日間の進行性の乾いた咳、鼻漏、喉の痛み、息切れ、及び発熱を示した．入院時、彼は微熱（３８．６℃）で、かすかな粗い呼吸音、両側の斑状の胸部レントゲン写真の混濁、ＣＯＶＩＤ－１９検査陽性、白血球数１０．６、並びにＣ反応性タンパク質、フェリチン、ＬＤＨ、Ｄダイマー、フィブリノゲン、及びクレアチンキナーゼの上昇を伴っていた。
【0155】
彼は急いで挿管され、ＰＲＶＣモード、ＦｉＯ２ １００％、ＰＥＥＰ １５、一回換気量７ｍｌ／ｋｇ理想体重、静圧２８ｃｍＨ２Ｏで、ＰａＯ２／ＦｉＯ２比が６０で換気された。彼はまた、肺の保護的換気、腹臥位、麻痺、吸入エポプロステノール、保存的輸液療法、ヒドロキシクロロキン、トシリズマブ、デキサメタゾン、セファゾリン、メロペネム、経験的ミカファンギンで治療された。喀痰培養では、メチシリン感受性の黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）とセラチア菌（Serratia marcescens）が増殖した。急性腎障害は、１日目から血液透析で治療された。体外膜酸素化治療のためのミネソタ大学の急性呼吸不全プログラム（University of Minnesota Acute Respiratory Failure program）への転院の可能性が請求されたが、肥満と彼が輸送を乗り切ることができないという懸念のために実現しなかった．
【0156】
人工呼吸器で３日目に、彼は、Ｔ３の点滴用量が１日に４回増量（５μｇ、１０μｇ、２５μｇ、及び５０μｇ）する最初の気管内投与を受けた。投与量は患者１とは異なり、ＦＤＡは第Ｉ相で１日あたり５０μｇの投与を既に承認していたが、Essentia IRBが、患者２に対して当初計画された用量漸増プロトコールに従うように要求した。患者は、各点滴に耐え、明らかな有害な副作用はなかった。
【0157】
患者の以前悪化していた酸素化は４日間の治療で安定し、人工呼吸器は２０日目に抜管され、その後、酸素補給なしで医療フロアに移動した。短いリハビリ入院の後、彼は退院し自宅に戻り、６０日目の診療所のフォローアップでは、彼は肺検査が正常で、胸部レントゲン写真、及びＰＦＴで無症候性であった。
【0158】
本明細書に引用されたすべての特許、特許出願、出版物、及び電子的に入手可能な資料（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ及びＲｅｆＳｅｑのヌクレオチド配列の提出、及びＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＤＢのアミノ酸配列の提出、及びＧｅｎＢａｎｋ及びＲｅｆＳｅｑの注釈付きコード領域からの翻訳）の完全な開示は、参照によりその全体が組み込まれる。本出願の開示と参照により本明細書に組み込まれる任意の文書の開示との間に矛盾が存在する場合、本出願の開示が支配するものとする。上記の詳細な説明及び実施例は、理解を明確にするためだけに与えられたものである。そこから不必要な制限は理解されるべきではない。本発明は、示され記載された正確な詳細に限定されず、当業者に明らかな変更態様は、特許請求の範囲によって定義される本発明内に含まれる。
【0159】
別段の指示がない限り、明細書及び特許請求の範囲で使用される成分の量、分子量などを表すすべての数字は、すべての場合において用語「約」によって修飾されていると理解されるべきである。従って、別段の断りがない限り、本明細書及び特許請求の範囲に記載の数値パラメーターは、本発明によって得ようとする所望の特性に応じて変化し得る近似値である。少なくとも、特許請求の範囲に均等論を限定する試みとしてではなく、各数値パラメーターは、少なくとも報告された有効桁数に照らして、通常の丸め手法を適用することによって解釈されるべきである。
【0160】
本発明の広い範囲を示す数値範囲及びパラメーターは近似値であるにもかかわらず、特定の実施例に示す数値は可能な限り正確に報告されている。ただし、すべての数値には、それぞれの試験測定で検出された標準偏差から必然的に生じる範囲が本質的に含まれている。
【0161】
すべての見出しは読者の便宜のためのものであり、特に明記されていない限り、見出しに続くテキストの意味を制限するために使用されるべきではない。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18A】
【図18B】
【図18C】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【国際調査報告】