特表 2023-520811 抗ＣＤ９８抗体およびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-05-19

(54)【発明の名称】抗ＣＤ９８抗体およびその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20230512BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20230512BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20230512BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20230512BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20230512BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20230512BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20230512BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20230512BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20230512BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230512BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20230512BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20230512BHJP

   A61P 25/16 20060101ALI20230512BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20230512BHJP

   A61P 25/14 20060101ALI20230512BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230512BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20230512BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20230512BHJP

   A61K 47/55 20170101ALI20230512BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20230512BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13 ZNA

C12N15/62 Z

C12N15/63 Z

C07K16/28

C07K16/46

C07K19/00

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/08

A61P25/28

A61P25/16

A61P25/00

A61P25/14

A61P35/00

A61K39/395 N

A61K47/68

A61K47/55

G01N33/53 V

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022562042

(86)(22)【出願日】2021-04-07

(85)【翻訳文提出日】2022-12-07

(86)【国際出願番号】 IB2021052892

(87)【国際公開番号】W WO2021205361

(87)【国際公開日】2021-10-14

(31)【優先権主張番号】63/006,988

(32)【優先日】2020-04-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/035,961

(32)【優先日】2020-06-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522395749

【氏名又は名称】アリアダ セラピューティクス，インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100153693

【弁理士】

【氏名又は名称】岩田 耕一

(72)【発明者】

【氏名】エダヴェタル，スゼンヌ

(72)【発明者】

【氏名】シング，サンジャヤ

(72)【発明者】

【氏名】ドミンゴ，デリック

(72)【発明者】

【氏名】ウィルキンソン，ディープティ

(72)【発明者】

【氏名】セジュド－マーティン，ピラー

(72)【発明者】

【氏名】ジャイプラサート，ファービー

(72)【発明者】

【氏名】ガイスト，ブライアン

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C076

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG27

4B064CA10

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B065AA91X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA25

4B065CA44

4C076AA11

4C076AA95

4C076BB13

4C076CC01

4C076CC27

4C076EE59

4C076FF67

4C076FF70

4C085AA14

4C085BB31

4C085CC23

4C085EE01

4C085GG02

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045DA76

4H045EA20

4H045EA21

4H045EA28

4H045FA74

(57)【要約】

薬剤を、それを必要とする対象の脳に送達するためのモノクローナル抗ＣＤ９８抗体およびその抗原結合性断片が、記載される。神経学的障害を処置もしくは検出するため、および／または治療剤もしくは診断剤を血液脳関門を越えて送達するための、治療剤または診断剤、例えば、第２の抗体およびその抗原結合性断片に連結された抗ＣＤ９８抗体またはその抗原結合性断片を含む、コンジュゲートおよび融合構築物もまた、記載される。抗体、コンジュゲート、および融合構築物をコードする核酸、ならびに関連する組換え宿主細胞もまた、記載される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

薬剤を、それを必要とする対象の脳に送達するための抗ＣＤ９８抗体またはその抗原結合性断片であって、中性ｐＨにおいて、少なくとも１ｎＭ、好ましくは、１～５００ｎＭの解離定数Ｋ_Ｄで、酸性ｐＨ、好ましくは、ｐＨ５において、少なくとも１０^－４秒^－１、好ましくは１０^－４～１０^－１秒^－１の解離速度定数ｋ_ｄで、ＣＤ９８、好ましくは、ヒトＣＤ９８ｈｃに結合する、抗ＣＤ９８抗体またはその抗原結合性断片。

【請求項2】

中性ｐＨにおいて、２×１０^－２～２×１０^－４秒^－１、好ましくは、８×１０^－３秒^－１の解離速度定数ｋ_ｄを有する、請求項１に記載の抗ＣＤ９８抗体またはその抗原結合性断片。

【請求項3】

（１）重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、ならびに軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域であって、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３が、
（ｉ）それぞれ、配列番号７、８、９、１０、１１、および１２、
（ｉｉ）それぞれ、配列番号６７、６８、６９、７０、７１、および７２、
（ｉｉｉ）それぞれ、配列番号８９、９０、９１、９２、９３、および９４、
（ｉｖ）それぞれ、配列番号１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、および１１８、
（ｖ）それぞれ、配列番号１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、および１２８、
（ｖｉ）それぞれ、配列番号１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、および１３８、
（ｖｉｉ）それぞれ、配列番号１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、および１５５、
（ｖｉｉｉ）それぞれ、配列番号１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、および１６５、
（ｉｘ）それぞれ、配列番号１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、および１７５、
（ｘ）それぞれ、配列番号１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、および１８５、
（ｘｉ）それぞれ、配列番号１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、および１９９、もしくは
（ｘｉｉ）それぞれ、配列番号２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、および２０９、のアミノ酸配列を有する、重鎖可変領域および軽鎖可変領域、または
（２）重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む重鎖の単一可変ドメイン（ＶＨＨ）であって、
（ｉ）それぞれ、配列番号２９、３０、および３１、
（ｉｉ）それぞれ、配列番号４８、４９、および５０、
（ｉｉｉ）それぞれ、配列番号１４３、１４４、および１４５、
のアミノ酸配列を有する、重鎖の単一可変ドメイン（ＶＨＨ）
を含む、請求項１または２に記載の抗ＣＤ９８抗体またはその抗原結合性断片。

【請求項4】

配列番号２８、配列番号４７、または配列番号１４２に対して少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＶＨＨ断片である、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗ＣＤ９８抗体またはその抗原結合性断片。

【請求項5】

リンカーを介して軽鎖可変領域に共有結合的に連結された重鎖可変領域を含む、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であり、好ましくは、前記リンカーが、配列番号１８９のアミノ酸配列を有し、より好ましくは、前記ｓｃＦｖが、配列番号６、配列番号６６、配列番号８８、配列番号１１２、配列番号１２２、配列番号１３２、配列番号１４９、配列番号１５９、配列番号１６９、配列番号１７９、配列番号１９３、または配列番号２０３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗ＣＤ９８抗体またはその抗原結合性断片。

【請求項6】

治療剤または診断剤に連結された、請求項１から５のいずれか一項に記載の抗ＣＤ９８抗体またはその抗原結合性断片を含む、コンジュゲートであって、好ましくは、前記コンジュゲートが、ＣＤ９８に結合し、請求項１から５のいずれか一項に記載の抗原結合性断片を含む、第１の抗原結合性領域と、脳の標的、例えば、ベータ－セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）、アミロイドベータ（Ａベータ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、Ｔａｕ、アポリポタンパク質Ｅ４（ＡｐｏＥ４）、アルファ－シヌクレイン、ＣＤ２０、ハンチンチン、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）、ロイシンリッチ反復キナーゼ２（ＬＲＲＫ２）、パーキン、プレセニリン１、プレセニリン２、ガンマセクレターゼ、死受容体６（ＤＲ６）、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ｐ７５ニューロトロフィン受容体（ｐ７５ＮＴＲ）、およびカスパーゼ６からなる群から選択される脳の標的に結合する、第２の抗原結合性領域とを含む、多重特異性抗体である、コンジュゲート。

【請求項7】

脳の標的、例えば、ベータ－セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）、アミロイドベータ（Ａベータ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、Ｔａｕ、アポリポタンパク質Ｅ４（ＡｐｏＥ４）、アルファ－シヌクレイン、ＣＤ２０、ハンチンチン、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）、ロイシンリッチ反復キナーゼ２（ＬＲＲＫ２）、パーキン、プレセニリン１、プレセニリン２、ガンマセクレターゼ、死受容体６（ＤＲ６）、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ｐ７５ニューロトロフィン受容体（ｐ７５ＮＴＲ）、およびカスパーゼ６からなる群から選択される脳の標的に結合する第２の抗体またはその抗原結合性断片に共有結合的に連結された、請求項１から５のいずれか一項に記載の抗ＣＤ９８抗体またはその抗原結合性断片を含む、融合構築物。

【請求項8】

前記抗ＣＤ９８抗体またはその抗原結合性断片が、リンカーを介して前記第２の抗体またはその抗原結合性断片の２つの重鎖のうちの一方のみのカルボキシ末端に共有結合的に連結されており、好ましくは、前記リンカーが、配列番号１９０または配列番号１９１のアミノ酸配列を有する、請求項７に記載の融合構築物。

【請求項9】

前記第２の抗体またはその抗原結合性断片の前記２つの重鎖のそれぞれが、野生型ＣＨ３ドメインポリペプチドと比較して、１つもしくは複数のヘテロ二量体突然変異、例えば、改変されたヘテロ二量体ＣＨ３ドメイン、または１つもしくは複数のノブ・アンド・ホール突然変異を含む、請求項８に記載の融合構築物。

【請求項10】

前記ヘテロ二量体突然変異が、Ｔ３５０位、Ｌ３５１位、Ｆ４０５位、およびＹ４０７位におけるアミノ酸改変を含む前記第１の重鎖の前記改変されたヘテロ二量体ＣＨ３ドメイン、ならびにＴ３５０位、Ｔ３６６位、Ｋ３９２位、およびＴ３９４位におけるアミノ酸改変を含む前記第２の重鎖の前記改変されたヘテロ二量体ＣＨ３ドメインを含み、Ｔ３５０位における前記アミノ酸改変が、Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３５０Ｉ、Ｔ３５０Ｌ、またはＴ３５０Ｍであり、Ｌ３５１位における前記アミノ酸改変が、Ｌ３５１Ｙであり、Ｆ４０５位における前記アミノ酸改変が、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｖ、Ｆ４０５Ｔ、またはＦ４０５Ｓであり、Ｙ４０７位における前記アミノ酸改変が、Ｙ４０７Ｖ、Ｙ４０７Ａ、またはＹ４０７Ｉであり、Ｔ３６６位における前記アミノ酸改変が、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｖ、またはＴ３６６Ｍであり、Ｋ３９２位における前記アミノ酸改変が、Ｋ３９２Ｆ、Ｋ３９２Ｌ、またはＫ３９２Ｍであり、Ｔ３９４位における前記アミノ酸改変が、Ｔ３９４Ｗであり、アミノ酸残基の番号付けが、Ｋａｂａｔに記載されるＥＵインデックスによるものである、請求項９に記載の融合構築物。

【請求項11】

前記第１の重鎖の前記改変されたヘテロ二量体ＣＨ３ドメインが、突然変異Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、前記第２の重鎖の前記改変されたヘテロ二量体ＣＨ３ドメインが、突然変異Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｌ、およびＴ３９４Ｗを含む、請求項１０に記載の融合構築物。

【請求項12】

前記第２の抗体またはその抗原結合性断片が、胎児性Ｆｃ受容体（ＲｃＲｎ）への前記融合体の結合を増強させる、Ｆｃドメインにおける１つまたは複数の突然変異を含み、好ましくは、前記１つまたは複数の突然変異が、酸性ｐＨにおいて前記結合を増強させ、より好ましくは、前記Ｆｃが、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ（ＹＴＥ）突然変異を有し、アミノ酸残基の番号付けが、Ｋａｂａｔに記載されるＥＵインデックスによるものである、請求項７から１１のいずれか一項に記載の融合体。

【請求項13】

前記第２の抗体またはその抗原結合性断片が、エフェクター機能を低減または排除する、前記Ｆｃドメインにおける１つまたは複数の突然変異を含み、好ましくは、前記Ｆｃが、Ｌ２３４位、Ｌ２３５位、Ｄ２７０位、Ｎ２９７位、Ｅ３１８位、Ｋ３２０位、Ｋ３２２位、Ｐ３３１位、およびＰ３２９位における１つまたは複数のアミノ酸改変、例えば、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＰ３３１Ｓのうちの１つ、２つ、または３つの突然変異を有し、アミノ酸残基の番号付けが、Ｋａｂａｔに記載されるＥＵインデックスによるものである、請求項７から１２のいずれか一項に記載の融合体。

【請求項14】

前記第２の抗体またはその抗原結合性断片が、Ｔａｕに結合し、それぞれ配列番号２１３～２１８のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、好ましくは、前記第２の抗体が、配列番号１１０のアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号１１１のアミノ酸配列を有する軽鎖を含むモノクローナル抗体である、請求項７から１３のいずれか一項に記載の融合構築物。

【請求項15】

（１）配列番号１３、１６、１９、２２、２５、３２、３５、３８、４１、４４、５１、５４、５７、６０、６３、７３、７６、７９、８２、８５、９５、９８、１０１、１０４、１０７、１１９、１２９、１３９、１４６、１５６、１６６、１７６、１８６、２００、２１０、および２１９からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有する、第１の重鎖と、
（２）それぞれ配列番号１４、１７、２０、２３、２６、３３、３６、４２、４５、５２、５５、５８、６１、６４、７４、７７、８０、８３、８６、９６、９９、１０２、１０５、１０８、１２０、１３０、１４０、１４７、１５７、１６７、１７７、１８７、２０１、２１１、および２２０からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を、それぞれが独立して有する、２つの軽鎖と、
（３）それぞれ配列番号１５、１８、２１、２４、２７、３４、３７、４３、４６、５３、５６、５９、６２、６５、７５、７８、８１、８４、８７、９７、１００、１０３、１０６、１０９、１２１、１３１、１４１、１４８、１５８、１６８、１７８、１８８、２０２、２１２、および２２１からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有する、第２の重鎖と
を含む、請求項７から１４のいずれか一項に記載の融合構築物。

【請求項16】

請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片、請求項６に記載のコンジュゲート、または請求項７から１５のいずれか一項に記載の融合構築物をコードする、単離された核酸。

【請求項17】

請求項１６に記載の単離された核酸を含む、ベクター。

【請求項18】

請求項１６に記載の核酸または請求項１７に記載のベクターを含む、宿主細胞。

【請求項19】

請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合性断片、請求項６に記載のコンジュゲート、または請求項７から１５のいずれか一項に記載の融合構築物を産生させる方法であって、前記抗体もしくは抗原結合性断片、前記コンジュゲート、または前記融合構築物をコードする核酸を含む細胞を、前記抗体もしくは抗原結合性断片、前記コンジュゲート、または前記融合構築物を産生させる条件下において培養するステップと、前記抗体もしくは抗原結合性断片、前記コンジュゲート、または前記融合構築物を、前記細胞または細胞培養物から回収するステップとを含む、方法。

【請求項20】

請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合性断片、請求項６に記載のコンジュゲート、または請求項７から１５のいずれか一項に記載の融合構築物と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。

【請求項21】

障害、好ましくは、神経学的障害の処置または検出を、それを必要とする対象において行う方法であって、前記対象に、請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合性断片、請求項６に記載のコンジュゲート、請求項７から１５のいずれか一項に記載の融合構築物、または請求項２０に記載の医薬組成物を投与するステップを含み、好ましくは、前記神経学的障害が、神経変性疾患（例えば、レビー小体病、ポリオ後症候群、シャイ・ドレーガー症候群、オリーブ橋小脳萎縮症、パーキンソン病、多系統萎縮症、線条体黒質変性症、脊髄小脳失調症、脊髄性筋萎縮症）、タウオパチー（例えば、アルツハイマー病および核上性麻痺）、プリオン病（例えば、ウシ海綿状脳症、スクレイピー、クロイツフェルト・ヤコブ病、クールー病、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病、慢性消耗性疾患、および致死性家族性不眠症）、球麻痺、運動ニューロン疾患、および神経系ヘテロ変性障害（nervous system heterodegenerative disorder）（例えば、カナバン病、ハンチントン病、神経セロイドリポフスチン症、アレキサンダー病、トゥーレット病、メンケス症候群、コケイン症候群、ハラーホルデン・スパッツ症候群、ラフォラ病、レット症候群、肝レンズ核変性症、レッシュ・ナイハン症候群、およびウンフェルリヒト・ルントボルグ病）、認知症（例えば、ピック病および脊髄小脳失調症）、ならびにＣＮＳおよび／または脳のがん（例えば、身体の他の箇所のがんから生じる脳転移）からなる群から選択される、方法。

【請求項22】

前記抗体もしくはその抗原結合性断片、コンジュゲート、または医薬組成物が、静脈内投与される、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

治療剤または診断剤を、それを必要とする対象の血液脳関門（ＢＢＢ）を越えて送達する方法であって、前記対象に、請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片に連結、好ましくは共有結合的にコンジュゲートされた前記治療剤または診断剤を含む、複合体を投与するステップを含む、方法。

【請求項24】

前記投与が、Ｆｃによって媒介されるエフェクター機能を低減させる、および／または急速な網状赤血球枯渇を誘導しない、請求項２１から２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

抗体依存性ファゴサイトーシス（ＡＤＰ）の誘導を、それを必要とする対象において、炎症促進性サイトカインの分泌を刺激することなく行う方法であって、前記対象に、請求項１から５のいずれか一項に記載のその抗原結合性断片に連結、好ましくは、共有結合的にコンジュゲートされた治療用抗体またはその抗原結合性断片を含む、複合体を投与するステップを含み、前記治療用抗体またはその抗原結合性断片が、Ｌ２３４位、Ｌ２３５位、Ｄ２７０位、Ｎ２９７位、Ｅ３１８位、Ｋ３２０位、Ｋ３２２位、Ｐ３３１位、およびＰ３２９位における１つまたは複数のアミノ酸改変、例えば、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＰ３３１Ｓのうちの１つ、２つ、または３つの突然変異を含み、アミノ酸残基の番号付けが、Ｋａｂａｔに記載されるＥＵインデックスによるものである、方法。

【請求項26】

前記治療用抗体またはその抗原結合性断片が、ｔａｕ凝集体に特異的に結合する、請求項２５に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年４月８日に出願された米国仮出願第６３／００６，９８８号および２０２０年６月８日に出願された米国仮出願第６３／０３５，９６１号の優先権を主張し、これらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

電子的に提出された配列表の参照
本出願は、配列表を含み、これは、「ＪＢＩ６２９０ＷＯＰＣＴ１ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ Ｌｉｓｔｉｎｇ」というファイル名で作成日が２０２１年３月３１日であり、４７８ｋＢのサイズを有する、ＥＦＳ－Ｗｅｂを通じて電子的に提出されたＡＳＣＩＩ形式の配列表である。ＥＦＳ－Ｗｅｂを通じて提出された配列表は、本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0003】

本発明は、ヒトＣＤ９８ｈｃに結合する血液脳関門シャトル、およびそれを使用する方法に関する。

【背景技術】

【0004】

血液脳関門（ＢＢＢ）は、有害な物質が脳内に進入するのを防止し、脳の恒常性のためには必須であるが、薬物を脳へ効率的に送達するには手強い障壁となる。大型の分子、例えば、モノクローナル抗体および他の生物学的治療薬は、中枢神経系（ＣＮＳ）における病態を処置／検出することに関して、大きな治療的／診断的可能性を有する。しかしながら、脳へのそれらの経路は、ＢＢＢによって妨げられる。これまでの研究により、血流中に注射されたＩｇＧのうち、非常にわずかなパーセンテージ（およそ０．１％）のみが、ＢＢＢを通ってＣＮＳコンパートメントに入ることができることが示されている（Felgenhauer, Klin. Wschr. 52: 1158-1164, 1974)）。これにより、ＣＮＳ内での抗体の濃度が低いことに起因して、任意の薬理学的作用が制限されることになる。

【0005】

受容体によって媒介されるトランスサイトーシス（ＲＭＴ）の使用を含め、治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の脳への送達を改善するために、多数のアプローチが研究されている。ＲＭＴは、ＢＢＢの管腔側に豊富に発現される受容体を、脳内皮細胞を通じた輸送に利用する。治療用ｍＡｂを脳内に送達するための臨床的に実現可能なプラットフォームを生成するためのこれまでの取り組みは、トランスサイトーシスの効率を増加させるように抗体を操作することに焦点を当てており、結合価、ｐＨ依存性、および親和性に対する観察を通じて結果を得ていた（Goulatis et al., 2017, Curr Opin Struct Biol 45: 109-115において考察されている）。しかしながら、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）および診療所への移行は、標的によって媒介される薬物体内動態（ＴＭＤＤ）に起因する急速な末梢クリアランス、および急性網状赤血球枯渇に起因する安全性によって、制限されている（Gadkar K, et al. Eur J Pharm Biopharm. 2016; 101: 53-61）。

【0006】

ＣＤ９８重鎖サブユニット（ＣＤ９８ｈｃ）は、溶質輸送体ファミリーのメンバーであり、いくつかのＣＤ９８軽鎖メンバーとヘテロ二量体を形成して、ＢＢＢにおけるアミノ酸輸送体を形成する（Zuchero YJ, et al. Neuron. 2016; 89(1): 70-82、Boado RJ, et al. PNAS 1999; 96(21): 12079-84を引用）。ＣＤ９８ｈｃの細胞内部分は、インテグリンシグナル伝達を媒介するように機能し、これは、細胞増殖および腫瘍発生の両方において役割を果たす（Zuchero YJ, et al. Neuron. 2016; 89(1): 70-82、Feral CC, et al. J Cell Biol 2007; 178: 701-711を引用、Cantor JM and Ginsburg MH. J Cell Sci 2012; 125: 1373-82）。ＣＤ９８ｈｃは、ヒト脳微小血管構造に高度に発現され、抗ＣＤ９８ｈｃ二重特異性抗体が、治療用抗体をマウスの脳に送達するために使用されている（Zuchero YJ, et al. Neuron. 2016; 89(1): 70-82）。しかしながら、ヒトにおいて安全にＣＤ９８ｈｃを標的とする能力は、まだ調査されていない。

【0007】

したがって、改善された安全性およびＰＫで効率的に薬物を脳へと輸送するために使用することができる、抗ＣＤ９８モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片に対する必要性が存在する。

【発明の概要】

【0008】

本出願は、送達される薬剤、例えば、治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の脳内濃度だけではなく、ｍＡｂの末梢薬物動態、安全性、および薬力学を含むｍＡｂの治療的に関連する特徴も考慮した、脳への送達のための最適化されたプラットフォームに関する。このプラットフォームは、ＣＤ９８結合分子、特に、ＣＤ９８、好ましくは、ヒトＣＤ９８重鎖（ｈｕＣＤ９８ｈｃ）に結合する抗体またはその抗原結合性断片であって、ＣＤ９８結合分子が、６．８～７．８の中性ｐＨ、例えば、生理学的ｐＨ（例えば、７．４）、および４．５～６．５の酸性ｐＨ、例えば、エンドソームコンパートメントにおいて見出されることが多い酸性ｐＨの両方において、結合速度ｋ_ａおよび解離速度ｋ_ｄ値によって定義される最適化された輸送機能を有する、ＴｆＲ結合分子を利用する。

【0009】

本発明者らは、予想外なことに、最適な値が、単純に、典型的な抗体－標的相互作用において予測され得るような、もっとも速い結合速度ｋ_ａ値およびもっとも遅い解離速度ｋ_ｄ値ではないことを発見した。すなわち、この系に関しては、かならずしも、抗体－標的複合体の寿命がもっとも長くなるように比較的高い速度でＣＤ９８に「結合」および会合し、次いで、より緩徐にＣＤ９８から解離する分子を使用することが求められるわけではない。代わりに、一実施形態では、本明細書に記載されるＣＤ９８結合剤の最適化された輸送機能は、好ましくは、生理学的ｐＨ（例えば、７．４）および低いｐＨ（例えば、６．５または６．０）の両方において、類似の（例えば、同じ桁の範囲内で）ｋ_ａ速度を有するが、低いｐＨ（例えば、ｐＨ６．５または６．０）では、生理学的ｐＨ（例えば、７．４）におけるｋ_ｄ速度と比較して、より速い解離速度ｋ_ｄを有する。

【0010】

１つの一般的な態様では、本出願は、治療剤または診断剤を、それを必要とする対象の脳に送達するための抗ＣＤ９８抗体またはその抗原結合性断片であって、中性ｐＨにおいて、少なくとも１ｎＭ、好ましくは、１ｎＭ～５００ｎＭの解離定数Ｋ_Ｄで、酸性ｐＨ、好ましくは、ｐＨ５において、少なくとも１０^－４秒^－１、好ましくは、１０^－４～１０^－１秒^－１の解離速度定数ｋ_ｄで、ＣＤ９８、好ましくは、ヒトＣＤ９８ｈｃに結合する、抗ＣＤ９８抗体またはその抗原結合性断片について記載する。

【0011】

一部の実施形態では、本出願の抗ＣＤ９８抗体またはその抗原結合性断片は、中性ｐＨにおいて、２×１０^－２～２×１０^－４秒^－１、好ましくは、９×１０^－３秒^－１の解離速度定数ｋ_ｄを有する。

【0012】

別の実施形態では、本明細書に記載されるある特定のＣＤ９８結合剤の最適化された輸送機能は、好ましくは、生理学的ｐＨ（例えば、７．４）で、少なくとも１．０５×１０^５のｋ_ａ速度、および少なくとも９×１０^－３ｓ^－１またはそれよりも速いｋ_ｄ速度を有する。前述のｐＨ、ＫＤ、ｋ_ａ、およびｋ_ｄパラメーターは、最適化されたトランスサイトーシス条件を反映するにすぎず、決して、本明細書におけるある特定のＣＤ９８結合剤にコンジュゲートされたある特定の分子のＣＤ９８によって媒介される輸送が、いずれにせよ記載される好ましいパラメーター外で生じ得るという本発明者らの発見を制限するものではない。

【0013】

１つの一般的な態様では、本出願は、薬剤を、それを必要とする対象の脳に送達するための抗体またはその抗原結合性断片であって、ＣＤ９８、好ましくは、ヒトＣＤ９８重鎖（ｈｕＣＤ９８ｈｃ）に結合し、
（１）重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、ならびに軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域であって、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３が、
（ｉ）それぞれ、配列番号７、８、９、１０、１１および１２、
（ｉｉ）それぞれ、配列番号６７、６８、６９、７０、７１および７２、
（ｉｉｉ）それぞれ、配列番号８９、９０、９１、９２、９３および９４、
（ｉｖ）それぞれ、配列番号１１３、１１４、１１５、１１６、１１７および１１８、
（ｖ）それぞれ、配列番号１２３、１２４、１２５、１２６、１２７および１２８、
（ｖｉ）それぞれ、配列番号１３３、１３４、１３５、１３６、１３７および１３８、
（ｖｉｉ）それぞれ、配列番号１５０、１５１、１５２、１５３、１５４および１５５、
（ｖｉｉｉ）それぞれ、配列番号１６０、１６１、１６２、１６３、１６４および１６５、
（ｉｘ）それぞれ、配列番号１７０、１７１、１７２、１７３、１７４および１７５、
（ｘ）それぞれ、配列番号１８０、１８１、１８２、１８３、１８４および１８５、
（ｘｉ）それぞれ、配列番号１９４、１９５、１９６、１９７、１９８および１９９、もしくは
（ｘｉｉ）それぞれ、配列番号２０４、２０５、２０６、２０７、２０８および２０９、
のアミノ酸配列を有する、
重鎖可変領域および軽鎖可変領域、または
（２）重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む重鎖の単一可変ドメイン（ＶＨＨ）であって、
（ｉ）それぞれ、配列番号２９、３０および３１、
（ｉｉ）それぞれ、配列番号４８、４９および５０、もしくは
（ｉｉｉ）それぞれ、配列番号１４３、１４４および１４５
のアミノ酸配列を有する、重鎖の単一可変ドメイン（ＶＨＨ）
を含む、抗体またはその抗原結合性断片に関する。

【0014】

ある特定の実施形態では、本出願は、配列番号２８、配列番号４７、または配列番号１４２に対して少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、抗ＣＤ９８ ＶＨＨ断片に関する。

【0015】

他の実施形態では、本出願は、抗ＣＤ９８一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であって、リンカーを介して軽鎖可変領域に共有結合的に連結された、重鎖可変領域を含み、好ましくは、リンカーが、配列番号１８９のアミノ酸配列を有する、抗ＴｆＲ一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）に関する。より好ましくは、ｓｃＦｖは、配列番号６、配列番号６６、配列番号８８、配列番号１１２、配列番号１２２、配列番号１３２、配列番号１４９、配列番号１５９、配列番号１６９、配列番号１７９、配列番号１９３、または配列番号２０３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0016】

本出願の別の態様は、治療剤または診断剤、例えば、神経学的障害薬または神経学的障害を検出するための薬剤に連結された本出願の抗ＣＤ９８抗体またはその抗原結合性断片を含む、コンジュゲートに関する。好ましくは、治療剤または診断剤は、脳の標的に結合する第２の抗体またはその抗原結合性断片である。

【0017】

ある特定の実施形態では、本出願は、脳の標的、例えば、ベータ－セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）、アミロイドベータ（Ａベータ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、Ｔａｕ、アポリポタンパク質Ｅ４（ＡｐｏＥ４）、アルファ－シヌクレイン、ＣＤ２０、ハンチンチン、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）、ロイシンリッチ反復キナーゼ２（ＬＲＲＫ２）、パーキン、プレセニリン１、プレセニリン２、ガンマセクレターゼ、死受容体６（ＤＲ６）、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ｐ７５ニューロトロフィン受容体（ｐ７５ＮＴＲ）、およびカスパーゼ６からなる群から選択される脳の標的に結合する第２の抗体またはその抗原結合性断片に共有結合的に連結された、本出願の抗ＣＤ９８抗体またはその抗原結合性断片を含む、融合構築物に関する。

【0018】

ある特定の実施形態では、本出願の融合構築物は、Ｔａｕに結合し、それぞれ配列番号２１３～２１８のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む、第２の抗体またはその抗原結合性断片を含む。好ましくは、第２の抗体は、配列番号１１０のアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号１１１のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む、モノクローナル抗体である。

【0019】

一実施形態では、本出願の融合構築物は、リンカーを介して、脳の標的に結合する第２の抗体またはその抗原結合性断片の２つの重鎖のうちの一方のみのカルボキシル末端に共有結合的に連結された、本出願の抗ＣＤ９８抗体またはその抗原結合性断片、好ましくは、抗ｈｕＣＤ９８ｈｃ ＶＨＨまたはｓｃＦｖ断片を含む。好ましくは、リンカーは、配列番号１９０または配列番号１９１のアミノ酸配列を有する。

【0020】

ある特定の実施形態では、第２の抗体またはその抗原結合性断片の２つの重鎖のそれぞれは、２つの重鎖間のヘテロ二量体の形成を促進するように、野生型重鎖定常３（ＣＨ３）ドメインと比較して改変されたＣＨ３ドメインを含む。２つの重鎖間のヘテロ二量体の形成を促進する任意の突然変異を、使用することができる。好ましくは、第１の重鎖の改変されたＣＨ３ドメインは、Ｔ３５０位、Ｌ３５１位、Ｆ４０５位、およびＹ４０７位におけるアミノ酸改変を含み、第２の重鎖の改変されたＣＨ３ドメインは、Ｔ３５０位、Ｔ３６６位、Ｋ３９２位、およびＴ３９４位におけるアミノ酸改変を含む。好ましくは、Ｔ３５０位におけるアミノ酸改変は、Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３５０Ｉ、Ｔ３５０Ｌ、またはＴ３５０Ｍであり、Ｌ３５１位におけるアミノ酸改変は、Ｌ３５１Ｙであり、Ｆ４０５位におけるアミノ酸改変は、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｖ、Ｆ４０５Ｔ、またはＦ４０５Ｓであり、Ｙ４０７位におけるアミノ酸改変は、Ｙ４０７Ｖ、Ｙ４０７Ａ、またはＹ４０７Ｉであり、Ｔ３６６位におけるアミノ酸改変は、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｖ、またはＴ３６６Ｍであり、Ｋ３９２位におけるアミノ酸改変は、Ｋ３９２Ｆ、Ｋ３９２Ｌ、またはＫ３９２Ｍであり、Ｔ３９４位におけるアミノ酸改変は、Ｔ３９４Ｗである。より好ましくは、第１の重鎖の改変されたヘテロ二量体ＣＨ３ドメインは、突然変異Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、第２の重鎖の改変されたヘテロ二量体ＣＨ３ドメインは、突然変異Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｌ、およびＴ３９４Ｗを含む。本明細書全体を通じて抗体におけるアミノ酸残基の番号付けは、別途明示されない限り、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)に記載されるＥＵインデックスに従って行われる。

【0021】

ある特定の実施形態では、第２の抗体またはその抗原結合性断片の結晶性断片領域（Ｆｃ領域）は、エフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を変更する（増加または減少させる）、好ましくは、排除する、置換を含む。好ましくは、第２の抗体またはその抗原結合性断片のＦｃ領域は、第２の抗体またはその抗原結合性断片の、Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）への結合を減少または停止させ、エフェクター機能によって媒介される毒性を回避する、１つまたは複数のアミノ酸改変を含む。例えば、第２の抗体またはその抗原結合性断片のＦｃ領域は、Ｌ２３４位、Ｌ２３５位、Ｄ２７０位、Ｎ２９７位、Ｅ３１８位、Ｋ３２０位、Ｋ３２２位、Ｐ３３１位、およびＰ３２９位における１つまたは複数のアミノ酸改変、例えば、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＰ３３１Ｓのうちの１つ、２つ、または３つの突然変異を含み得、ここで、アミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔに記載されるＥＵインデックスによるものである。

【0022】

ある特定の実施形態では、第２の抗体またはその抗原結合性断片のＦｃ領域は、第２の抗体またはその抗原結合性断片の、胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合を変更する（増加または減少させる）、好ましくは、増加させる、置換を含む。好ましくは、１つまたは複数の突然変異は、酸性ｐＨにおける結合を増強させ、より好ましくは、Ｆｃは、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ（ＹＴＥ）突然変異を有し、ここで、アミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔに記載されるＥＵインデックスによるものである。

【0023】

ある特定の実施形態では、本出願の融合構築物は、
（１）配列番号１３、１６、１９、２２、２５、３２、３５、３８、４１、４４、５１、５４、５７、６０、６３、７３、７６、７９、８２、８５、９５、９８、１０１、１０４、１０７、１１９、１２９、１３９、１４６、１５６、１６６、１７６、１８６、２００、２１０、および２１９からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有する、第１の重鎖と、
（２）それぞれ配列番号１４、１７、２０、２３、２６、３３、３６、４２、４５、５２、５５、５８、６１、６４、７４、７７、８０、８３、８６、９６、９９、１０２、１０５、１０８、１２０、１３０、１４０、１４７、１５７、１６７、１７７、１８７、２０１、２１１、および２２０からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を、それぞれが独立して有する、２つの軽鎖と、
（３）それぞれ配列番号１５、１８、２１、２４、２７、３４、３７、４３、４６、５３、５６、５９、６２、６５、７５、７８、８１、８４、８７、９７、１００、１０３、１０６、１０９、１２１、１３１、１４１、１４８、１５８、１６８、１７８、１８８、２０２、２１２、および２２１からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有する、第２の重鎖と
を含む。

【0024】

本出願の別の一般的な態様は、本出願の抗体もしくは抗原結合性断片、コンジュゲート、または融合構築物をコードする、単離された核酸に関する。また、本出願の単離された核酸を含むベクター、本出願の核酸またはベクターを含む宿主細胞も、提供される。

【0025】

本出願の別の一般的な態様は、本出願の抗体もしくは抗原結合性断片、コンジュゲート、または融合構築物を産生させる方法に関する。本方法は、本出願の核酸を含む細胞を、抗体もしくは抗原結合性断片、コンジュゲート、または融合構築物を産生させる条件下において培養するステップと、抗体もしくは抗原結合性断片、コンジュゲート、または融合構築物を、細胞または細胞培養物から回収するステップとを含む。

【0026】

さらに、本出願のコンジュゲートまたは融合構築物と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物が、提供される。

【0027】

本出願の別の一般的な態様は、神経学的障害の処置または検出を、それを必要とする対象において行う方法であって、対象に、有効量の本出願の抗ＣＤ９８抗体もしくはその抗原結合性断片、コンジュゲート、または融合構築物、または医薬組成物を投与するステップを含む、方法に関する。好ましくは、神経学的障害は、神経変性疾患（例えば、レビー小体病、ポリオ後症候群、シャイ・ドレーガー症候群、オリーブ橋小脳萎縮症、パーキンソン病、多系統萎縮症、線条体黒質変性症、脊髄小脳失調症、脊髄性筋萎縮症）、タウオパチー（例えば、アルツハイマー病および核上性麻痺）、プリオン病（例えば、ウシ海綿状脳症、スクレイピー、クロイツフェルト・ヤコブ病、クールー病、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病、慢性消耗性疾患、および致死性家族性不眠症）、球麻痺、運動ニューロン疾患、および神経系ヘテロ変性障害（nervous system heterodegenerative disorder）（例えば、カナバン病、ハンチントン病、神経セロイドリポフスチン症、アレキサンダー病、トゥーレット病、メンケス症候群、コケイン症候群、ハラーホルデン・スパッツ症候群、ラフォラ病、レット症候群、肝レンズ核変性症、レッシュ・ナイハン症候群、およびウンフェルリヒト・ルントボルグ病）、認知症（例えば、ピック病および脊髄小脳失調症）、ならびにＣＮＳおよび／または脳のがん（例えば、身体の他の箇所のがんから生じる脳転移）からなる群から選択される。

【0028】

好ましくは、本出願の抗体もしくはその抗原結合性断片、コンジュゲート、融合構築物、または医薬組成物は、静脈内投与される。

【0029】

また、治療剤または診断剤を、それを必要とする対象の脳に送達する方法であって、対象に、本出願の抗ＣＤ９８抗体またはその抗原結合性断片に連結された治療剤または診断剤を含むコンジュゲートを投与するステップを含む、方法も記載される。好ましくは、治療剤または診断剤は、脳の標的に結合する第２の抗体またはその抗原結合性断片である。より好ましくは、対象の脳への、本出願の抗ＣＤ９８抗体またはその抗原結合性断片に連結された治療剤または診断剤の投与は、抗ＣＤ９８抗体またはその抗原結合性断片に連結されていない治療剤または診断剤の投与と比較して、Ｆｃによって媒介されるエフェクター機能の低減をもたらし、かつ／または急速な網状赤血球枯渇を誘導しない。

【0030】

本発明のさらに別の一般的な態様は、抗体依存性ファゴサイトーシス（ＡＤＰ）の誘導を、それを必要とする対象において、炎症促進性サイトカインの分泌を刺激することなく行う方法であって、対象に、本発明の実施形態に記載のその抗原結合性断片に連結、好ましくは、共有結合的にコンジュゲートされた治療用抗体またはその抗原結合性断片を含む、複合体を投与するステップを含み、治療用抗体またはその抗原結合性断片が、エフェクター機能を有さず、例えば、治療用抗体またはその抗原結合性断片が、Ｌ２３４位、Ｌ２３５位、Ｄ２７０位、Ｎ２９７位、Ｅ３１８位、Ｋ３２０位、Ｋ３２２位、Ｐ３３１位、およびＰ３２９位における１つまたは複数のアミノ酸改変、例えば、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＰ３３１Ｓのうちの１つ、２つ、または３つの突然変異を含み、アミノ酸残基の番号付けが、Ｋａｂａｔに記載されるＥＵインデックスによるものである、方法に関する。好ましくは、治療用抗体またはその抗原結合性断片は、ｔａｕ凝集体に特異的に結合する。

【0031】

本発明の他の態様、特性、および利点は、本発明の詳細な説明およびその好ましい実施形態、ならびに添付の特許請求の範囲を含む、以下の説明から明らかであろう。

【0032】

上述の概要ならびに以下の本発明の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むとより良好に理解されるだろう。図面には、本発明を説明する目的で、本件において好ましい実施形態が示されている。しかしながら、本発明は、図面に示されているまさにそのような実施形態に限定されないことが理解されるべきである。

【0033】

特許または出願の書類は、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を有する本特許または本特許出願公報のコピーは、請求および必要な手数料の支払いに応じて特許庁によって提供される。

【図面の簡単な説明】

【0034】

【図1】脳送達プラットフォームに使用されるトリポッドｍＡｂフォーマットの説明図である。

【図2】 ^３Ｈ－ロイシン取込みに対する抗ＣＤ９８ｈｃ Ｚｙｍｅｗｏｒｋｓトリポッド抗体の作用を示す、棒グラフである。データは、四連の平均±標準誤差である。点線は、Ｚｙｍｅｗｏｒｋｓトリポッドアイソタイプ対照（Ｂ６２４）の±（３×標準偏差）を表す。

【図3】ヒト脳内皮細胞におけるトリポッドｍＡｂの内部移行を示す画像である。トリポッドｍＡｂは赤色に、核は青色に、アクチンは緑色に染色されている。示される画像は、ＢＢＢＢ４４９についてのものである。

【図4】ｐＨ７．４でのオフレートを、ｐＨを６．５および６．０に低減させた際のオフレートと比較することによって評価したｐＨ依存性結合を示すグラフである。ｐＨの減少と共にオフレートがより速くなった場合、トリポッドｍＡｂにプラスのスコアを付けた。データは、ＢＢＢＢ５７８についてのものである。

【図5】ヒト脳内皮細胞でのトリポッドｍＡｂ ＢＢＢＢ１０６７の内部移行を示す画像である。トリポッドｍＡｂは赤色に、アクチンは緑色に染色されている。

【図6】静脈内投薬したｍＡｂの脳内濃度を示すグラフである。すべてのブレインシャトルｍＡｂは、非ブレインシャトルｍＡｂよりも増加した曝露を有した。個々の点は、それぞれの動物を表す（ｎ＝３匹）。

【図7】ｍＡｂによって媒介されるミクログリアファゴソーム内への取込みを示すグラフである。すべてのブレインシャトルｍＡｂは、非ブレインシャトルｍＡｂ、ＰＴ１Ｂ８４４と比べて同様のファゴソーム内への取込みを促進した。

【発明を実施するための形態】

【0035】

様々な刊行物、論文、および特許が、背景技術および本明細書全体において引用または記載されており、これらの参考文献のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に含まれている文書、動作、材料、デバイス、物品などに関する考察は、本発明の文脈を提供する目的のためのものである。そのような考察は、これらのものの一部またはすべてが、開示または特許請求される任意の発明に関する先行技術の一部を形成することを認めるものではない。

【0036】

別途定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって広く理解されているものと同じ意味を有する。それ以外の場合、本明細書に使用されるある特定の用語は、本明細書に記載される意味を有する。本明細書に引用されているすべての特許、公開特許出願、および刊行物は、参照によって、本明細書に全内容が記載されているように組み込まれる。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形の「１つの（a）」、「１つの（an）」、および「その（the）」は、文脈により別途明確に示されない限り、複数形の参照物を含むことに留意しなければならない。

【0037】

別途示されない限り、本明細書に記載される任意の数値、例えば、濃度または濃度範囲は、すべての事例において「約」という用語によって修飾されているものとして理解されたい。したがって、数値は、典型的に、言及された値の±１０％を含む。例えば、１０ｍｇの投薬量は、９ｍｇ～１１ｍｇを含む。本明細書に使用される場合、数値範囲の使用は、文脈により別途明確に示されない限り、すべての可能性のある部分範囲、その範囲内のすべての個々の数値を含み、そのような範囲内の整数および数値の分数が含まれる。

【0038】

本明細書に使用される場合、複数の言及される要素間の「および／または」という接続詞は、個別および組合せの両方の選択肢を包含するものとして理解される。例えば、２つの要素が、「および／または」によって接続されている場合、第１の選択肢は、第２の要素なしで第１の要素を適用することを指す。第２の選択肢は、第１の要素なしで第２の要素を適用することを指す。第３の選択肢は、第１および第２の要素を一緒に適用することを指す。これらの選択肢のうちのいずれのものも、この意味の範囲内に含まれ、したがって、本明細書に使用される「および／または」という用語の要件を満たことが理解される。選択肢のうちの１つを上回るものを同時に適用することもまた、この意味の範囲内に含まれ、したがって、「および／または」という用語の要件を満たすことが理解される。

【0039】

本明細書およびそれに続く特許請求の範囲を通じて、文脈により別途要求されない限り、「含む（comprise）」という言葉、ならびに「含む（comprises）」および「含むこと（comprising）」などの変化形は、言及された整数もしくはステップまたは整数もしくはステップの群の包含を意味し、任意の他の整数もしくはステップまたは整数もしくはステップの群の除外を意味するものではないことを理解されたい。本明細書に使用される場合、「含む（comprising）は、「含む（containing）」もしくは「含む（including）」という用語、または本明細書に使用される一部の場合には「有する」という用語と置換することができる。

【0040】

本明細書に使用される場合、「からなる」は、特許請求要素に示されていない任意の要素、ステップ、または成分を除外する。本明細書に使用される場合、「から本質的になる」は、特許請求の基本的かつ新規な特徴に実質的に影響を及ぼさない材料またはステップを除外しない。「含む（comprising）」、「含む（containing）」、「含む（including）」、および「有する」という前述の用語のいずれも、本発明の態様または実施形態の文脈において本明細書に使用される場合は常に、「からなる」または「から本質的になる」という用語と置き換えて、本開示の範囲を変動させてもよい。

【0041】

本明細書における「抗体」という用語は、広義に使用され、具体的には全長モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ならびに別途示されない限りまたは文脈に矛盾しない限り、所望される生物学的活性を呈する限りは、それらの抗原結合性断片、抗体バリアント、および多重特異性分子を含む。一般に、全長抗体は、ジスルフィド結合によって相互に接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質、またはその抗原結合性部分である。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（本明細書において、ＶＨと略される）および重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３の３つのドメインから構成される。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＶＬと略される）および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬから構成される。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される保存性の高い領域が点在した、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域にさらに分割することができる。それぞれのＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成され、これらはアミノ末端からカルボキシ末端に以下の順序で配置される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合性ドメインを含有する。抗体分子構造の一般原則、および抗体の産生に関する様々な技法は、例えば、Harlow and Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., (1988)に提供されている。

【0042】

それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、全長抗体は、異なる「クラス」に割り当てられ得る。全長抗体の５つの主要なクラスには、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、これらのうちのいくつかは、「サブクラス」（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、およびＩｇＡ２にさらに分割され得る。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと称される。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元構成は、周知である。

【0043】

「抗体」はまた、重鎖単独抗体（ＨｃＡｂ）とも称される重鎖の単一可変ドメイン（ＶＨＨ）抗体であってもよく、これは、軽鎖が欠如しており、ラクダ科動物またはサメによって天然に産生され得る。ＨｃＡｂの抗原結合性部分は、ＶＨＨ断片から構成される。

【0044】

「組換え抗体」という用語は、本明細書に使用される場合、抗体をコードする核酸を含む組換え宿主細胞によって発現される抗体（例えば、キメラ、ヒト化、もしくはヒト抗体、またはその抗原結合性断片）を指す。組換え抗体を産生させるための「宿主細胞」の例としては、（１）哺乳動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＣＯＳ、骨髄腫細胞（ＹＯおよびＮＳＯ細胞を含む）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）、Ｈｅｌａ、およびＶｅｒｏ細胞、（２）昆虫細胞、例えば、ｓｆ９、ｓｆ２１、およびＴｎ５、（３）植物細胞、例えば、ニコチアナ（Nicotiana）属に属する植物（例えば、ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum））、（４）酵母細胞、例えば、サッカロマイセス（Saccharomyces）属に属するもの（例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae））、またはアスペルギルス（Aspergillus）属に属するもの（例えば、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger））、（５）細菌細胞、例えば、大腸菌（Escherichia, coli）細胞、または枯草菌（Bacillus subtilis）細胞などが挙げられる。

【0045】

抗体の「抗原結合性断片」は、抗原に検出可能に結合することができる全長抗体の一部分を含む、典型的には、少なくともＶＨ領域の１つまたは複数の部分を含む、分子である。抗原結合性断片は、抗体の１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の抗原結合性部分を含む多価分子、ならびにＶＬおよびＶＨ領域、またはその選択された部分が、合成リンカーまたは組換え方法によって結合されて、機能的抗原結合性分子を形成した一本鎖構築物を含む。抗原結合性断片はまた、ナノボディとしても知られている単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）であってもよく、これは、単一の単量体可変抗体ドメイン（ＶＨＨ）からなる抗体断片である。抗体のいくつかの抗原結合性断片は、より大きな抗体分子の実際の断片形成（例えば、酵素切断）によって得ることができるが、ほとんどは、典型的には、組換え技法によって産生される。本発明の抗体は、全長抗体またはその抗原結合性断片として調製することができる。抗原結合性断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）_２、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆ（ａｂ）_３、Ｆｖ（典型的には、抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨドメイン）、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ、例えば、Bird et al., Science 1988; 242:423-426およびHuston et al. PNAS 1988; 85:5879-5883を参照されたい）、ｄｓＦｖ、Ｆｄ（典型的には、ＶＨおよびＣＨ１ドメイン）、ならびにｄＡｂ（典型的には、ＶＨドメイン）断片；ＶＨ、ＶＬ、ＶＨＨ、およびＶ－ＮＡＲドメイン；単一のＶＨおよび単一のＶＬ鎖を含む一価分子；ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、およびカッパボディ（例えば、Ill et al., Protein Eng 1997; 10:949-57を参照されたい）；ラクダＩｇＧ；ＩｇＮＡＲ；ならびに１つまたは複数の単離されたＣＤＲまたは機能性パラトープ（ここで、単離されたＣＤＲまたは抗原結合性残基もしくはポリペプチドは、機能性抗体断片を形成するように、一緒に会合または連結され得る）が挙げられる。様々なタイプの抗体断片が、例えば、Holliger and Hudson, Nat Biotechnol 2005; 23:1126-1136、国際公開第ＷＯ２００５０４０２１９号、ならびに公開済みの米国特許出願第２００５０２３８６４６号および同第２００２０１６１２０１号において記載または考察されている。抗体断片は、従来的な組換えまたはタンパク質操作技法を使用して得ることができ、断片は、インタクトな抗体と同じ様式で、抗原結合性または他の機能についてスクリーニングすることができる。

【0046】

抗体断片の産生のための様々な技法が開発されている。従来的には、これらの断片は、全長抗体のタンパク質分解による消化を介して導出されていた（例えば、Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 24:107-117 (1992)、およびBrennan et al., Science, 229:81 (1985)を参照されたい）。しかしながら、これらの断片は、現在では、組換え宿主細胞によって、直接的に産生させることができる。あるいは、Ｆａｂ’－ＳＨ断片は、大腸菌（E. coli）から直接的に回収し、化学的に結合させて、Ｆ（ａｂ’）２断片を形成することができる（Carter et al., Bio/Technology, 10:163-167 (1992)）。別のアプローチによると、Ｆ（ａｂ’）２断片は、組換え宿主細胞培養物から直接的に単離することができる。他の実施形態では、選択される抗体は、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。国際公開第ＷＯ １９９３／１６１８５号、米国特許第５，５７１，８９４号、および米国特許第５，５８７，４５８号を参照されたい。抗体断片はまた、例えば、例として、米国特許第５，６４１，８７０号に記載されるような「線形抗体」であってもよい。そのような線形抗体断片は、単一特異性であってもよく、または二重特異性であってもよい。

【0047】

「抗体誘導体」という用語は、本明細書に使用される場合、１つまたは複数のアミノ酸が、化学的に改変または置換された、全長抗体またはその抗原結合性断片を含む分子を指す。抗体誘導体において使用することができる化学的改変としては、例えば、アルキル化、ＰＥＧ化、アシル化、エステル形成、またはアミド形成など、例えば、抗体を第２の分子に連結させるためのものが挙げられる。例示的な改変としては、ＰＥＧ化（例えば、システイン－ＰＥＧ化）、ビオチニル化、放射標識、および第２の薬剤（例えば、細胞毒性剤）とのコンジュゲーションが挙げられる。

【0048】

本明細書における抗体は、変更された抗原結合性または生物学的活性を有する「アミノ酸配列バリアント」を含む。そのようなアミノ酸変更の例としては、抗原に対する増強された親和性を有する抗体（例えば、「親和性成熟」抗体）、ならびに変更されたＦｃ領域を有し、存在する場合には、例えば、変更された（増加または減少した）抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）および／もしくは補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）（例えば、国際公開第ＷＯ ００／４２０７２号、Ｐｒｅｓｔａ， Ｌ．および同第ＷＯ ９９／５１６４２号、Ｉｄｕｏｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ）、および／または増加もしくは減少した血清半減期（例えば、国際公開第ＷＯ００／４２０７２号、Ｐｒｅｓｔａ， Ｌ．）を有する抗体が挙げられる。

【0049】

「多重特異性分子」は、少なくとも１つの他の機能性分子（例えば、別のペプチドまたはタンパク質、例えば、別の抗体または受容体のリガンド）と会合しているか、またはそれに連結された、抗体またはその抗原結合性断片を含み、それによって、少なくとも２つの異なる結合部位または標的分子に結合する分子が形成される。例示的な多重特異性分子としては、二重特異性抗体、および可溶性受容体断片もしくはリガンドに連結された抗体が挙げられる。

【0050】

「ヒト抗体」という用語は、本明細書に使用される場合、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域の両方が、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する（すなわち、それと同一であるか、またはそれと本質的に同一である）可変領域を有する、抗体を含むことを意図する。さらに、抗体が定常領域を含む場合には、定常領域もまた、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に「由来」する。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのランダムもしくは部位特異的突然変異生成によって、またはｉｎ ｖｉｖｏでの体細胞突然変異によって導入された突然変異）を含み得る。しかしながら、「ヒト抗体」という用語は、本明細書に使用される場合、別の哺乳動物種、例えば、マウスの生殖細胞系に由来するＣＤＲ配列が、ヒトフレームワーク配列にグラフトされている抗体を含むことは意図しない。

【0051】

「ヒト化」抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含む、ヒト／非ヒトキメラ抗体である。ほとんどの部分について、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域に由来する残基が、所望される特異性、親和性、および能力を有する、マウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域に由来する残基で置き換えられている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。一部の事例では、ヒト免疫グロブリンのＦＲ残基が、対応する非ヒト残基で置き換えられている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基を含み得る。これらの改変は、抗体の性能をさらに洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含むことになり、ここで、超可変ループのすべてまたは実質的にすべてが、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ残基のすべてまたは実質的にすべてが、ヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体はまた、必要に応じて、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分、典型的にはヒト免疫グロブリンのものを含み得る。さらなる詳細については、例えば、Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)、Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)、およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)、国際公開第ＷＯ ９２／０２１９０号、米国特許出願第２００６００７３１３７号、ならびに米国特許第６，７５０，３２５号、同第６，６３２，９２７号、同第６，６３９，０５５号、同第６，５４８，６４０号、同第６，４０７，２１３号、同第６，１８０，３７０号、同第６，０５４，２９７号、同第５，９２９，２１２号、同第５，８９５，２０５号、同第５，８８６，１５２号、同第５，８７７，２９３号、同第５，８６９，６１９号、同第５，８２１，３３７号、同第５，８２１，１２３号、同第５，７７０，１９６号、同第５，７７７，０８５号、同第５，７６６，８８６号、同第５，７１４，３５０号、同第５，６９３，７６２号、同第５，６９３，７６１号、同第５，５３０，１０１号、同第５，５８５，０８９号、および同第５，２２５，５３９号を参照されたい。

【0052】

「超可変領域」という用語は、本明細書に使用される場合、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、一般に、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」（軽鎖可変ドメインの残基２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）、および８９～９７（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインの３１～３５（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）、および９５～１０２（Ｈ３）、（Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242）に由来するアミノ酸残基、ならびに／または「超可変ループ」（軽鎖可変ドメインの残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）、および９１～９６（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインの２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）、および９６～１０１（Ｈ３）、Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 1987; 196:901-917）に由来する残基を含む。典型的には、この領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al.,（上記）に記載される方法によって行われる。本明細書における「Ｋａｂａｔの位置」、「Ｋａｂａｔによる可変ドメイン残基番号付け」、および「Ｋａｂａｔによる」などの語句は、重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインのこの番号付けシステムを指す。Ｋａｂａｔの番号付けシステムを使用すると、ペプチドの実際の線形アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲまたはＣＤＲの短縮形に相当する、より少ないアミノ酸を含み得るか、またはそれへの挿入に相当する、追加のアミノ酸を含み得る。例えば、重鎖可変ドメインは、ＣＤＲ Ｈ２の残基５２の後に、単一のアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔによる残基５２ａ）、および重鎖ＦＲ残基８２の後に、挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔによる残基８２ａ、８２ｂ、および８２ｃなど）を含み得る。Ｋａｂａｔの残基番号付けは、所与の抗体に関して、その抗体の配列の相同性の領域における、「標準の」Ｋａｂａｔの番号付けを行った配列とのアライメントによって、決定され得る。

【0053】

「フレームワーク領域」または「ＦＲ」残基は、本明細書に定義されるＣＤＲ以外のＶＨまたはＶＬ残基である。

【0054】

「エピトープ」または「結合部位」は、抗原結合性ペプチド（例えば、抗体）が特異的に結合する抗原上の範囲または領域である。タンパク質エピトープは、結合に直接的に関与するアミノ酸残基（エピトープの免疫優性成分とも称される）、および結合には直接的に関与しない他のアミノ酸残基、例えば、特異的に抗原結合性ペプチドによって効果的に遮断されるアミノ酸残基（換言すると、アミノ酸残基は、特異的に抗原結合性ペプチドの「溶媒排除表面（solvent-excluded surface）」および／または「フットプリント」内にある）を含み得る。

【0055】

「パラトープ」は、抗原に特異的に結合する抗体の抗原結合性部分の範囲または領域である。別途示されない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、パラトープは、エピトープ結合に直接的に関与する、いくつかが典型的にはＣＤＲ内にあるアミノ酸残基、ならびに結合に直接的に関与しない他のアミノ酸残基、例えば、特異的に結合した抗原によって効果的に遮断されるアミノ酸残基（換言すると、アミノ酸残基は、特異的に結合した抗原の「溶媒排除表面」および／または「フットプリント」内にある）を含み得る。

【0056】

参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」とは、参照抗体のその抗原への結合を、競合アッセイにおいて、５０％またはそれ以上遮断する抗体を指し、逆に、参照抗体は、抗体のその抗原への結合を、競合アッセイにおいて、５０％またはそれ以上遮断する。

【0057】

「単離された」抗体は、その天然の環境の成分から分離されているものである。一部の実施形態では、抗体は、例えば、電気泳動法（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）、またはクロマトグラフィー法（例えば、イオン交換もしくは逆相ＨＰＬＣ）によって判定した場合に、９５％または９９％を上回る純度まで精製される。抗体純度の評価のための方法に関する考察については、Flatman et al, J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)を参照されたい。

【0058】

本発明の方法に関して、「投与すること」という用語は、本発明のコンジュゲート、またはその形態、組成物、もしくは医薬を使用することによって、本明細書に記載される症候群、障害、または疾患を、治療的または予防的に予防、処置、または緩和するための方法を意味する。そのような方法は、有効量の前記抗体、その抗原結合性断片、またはコンジュゲート、またはその形態、組成物、もしくは医薬品を、治療過程の間の異なる時点において、または組合せ形態で同時に、投与するステップを含む。本発明の方法は、すべての公知の治療的処置レジメンを包含するものとして理解されたい。

【0059】

標的抗体が標的分子の天然の標的リガンドへの結合を「遮断する」能力は、抗体が、可溶性または細胞表面結合型標的およびリガンド分子を使用するアッセイにおいて、標的分子のリガンドへの結合を、用量依存的様式で検出可能に低減させることができ、標的分子が、その抗体の不在下においてはリガンドに検出可能に結合することを意味する。

【0060】

「血液脳関門」または「ＢＢＢ」は、分子の脳内への輸送を制限する緻密な障壁を作成する、脳毛細血管内皮形質膜内のタイトジャンクションによって形成される末梢循環と脳および脊髄との間の生理学的障壁を指す。ＢＢＢは、非常に小さな分子、例えば、尿素（６０ダルトン）でさえも、脳への輸送を制限することができる。ＢＢＢの例としては、脳内のＢＢＢ、脊髄内の血液脊髄関門、および網膜内の血液網膜関門が挙げられ、これらのすべては、ＣＮＳ内の連続的な毛細血管関門である。ＢＢＢはまた、障壁が毛細血管内皮細胞ではなく上衣細胞から構成されている、血液ＣＳＦ関門（脈絡叢）も包含する。

【0061】

「血液脳関門受容体」（本明細書において「Ｒ／ＢＢＢ」と略される）は、分子をＢＢＢを越えて輸送することができるか、または投与された外因性分子を輸送するために使用される、脳内皮細胞上に発現される細胞外膜結合型受容体タンパク質である。Ｒ／ＢＢＢの例としては、ＣＤ９８成分を含む、大型の中性アミノ酸輸送体（ＬＡＴ）複合体、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）、インスリン受容体、インスリン様増殖因子受容体（ＩＧＦ－Ｒ）、限定することなく、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１（ＬＲＰ１）および低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８（ＬＲＰ８）を含む、低密度リポタンパク質受容体、ならびにヘパリン結合上皮増殖因子様増殖因子（ＨＢ－ＥＧＦ）が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書における例示的なＲ／ＢＢＢは、ＣＤ９８ｈｃである。

【0062】

「中枢神経系」または「ＣＮＳ」は、身体機能を制御する神経組織の複合体を指し、これには、脳および脊髄が含まれる。

【0063】

「コンジュゲート」は、本明細書に使用される場合、治療用ペプチドもしくはタンパク質、抗体、標識、または神経学的障害薬を含むがこれらに限定されない、１つまたは複数の異種分子に共有結合的に連結されたタンパク質を指す。

【0064】

本明細書に使用される場合、「連結された」という用語は、２つまたはそれ以上の物体が一緒に結合していることまたはその接続を指す。化学的または生物学的化合物に言及する場合、連結されたとは、２つまたはそれ以上の化学的または生物学的化合物の間の共有結合的な接続を指し得る。非限定的な例として、本発明の抗体は、目的のペプチドと連結されて、抗体連結型ペプチドを形成し得る。抗体連結型ペプチドは、抗体をペプチドにコンジュゲートするように設計された特定の化学反応を通じて形成され得る。ある特定の実施形態では、本発明の抗体は、リンカーを通じて本発明のペプチドに共有結合的に連結され得る。リンカーは、例えば、まず、抗体またはペプチドに共有結合的に接続され、次いで、ペプチドまたは抗体に共有結合的に接続され得る。

【0065】

薬剤、例えば、医薬製剤の「有効量」または「治療有効量」は、必要とされる投薬量および期間で、所望される治療的または予防的結果を達成するのに有効な量を指す。

【0066】

「リンカー」は、本明細書に使用される場合、２つの異なる実体を共有結合的に接続する、化学的リンカーまたは一本鎖ペプチドリンカーを指す。リンカーは、本発明の抗体またはその断片、血液脳関門シャトル、融合タンパク質、およびコンジュゲートのうちの任意の２つを接続するために使用され得る。リンカーは、例えば、ｓｃＦｖにおけるＶＨおよびＶＬ、またはモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片を、治療用分子、例えば、第２の抗体に接続することができる。一部の実施形態では、一価の結合性実体が、ＣＤ９８、好ましくは、ヒトＣＤ９８ｈｃに指向されるｓｃＦｖを含み、治療用分子が、ＣＮＳ標的、例えば、Ｔａｕに指向される抗体を含む場合、リンカーは、ｓｃＦｖを、Ｔａｕに指向される抗体に接続することができる。ペプチド結合によって結合された、１～２５個のアミノ酸、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、または２５個のアミノ酸から構成される、一本鎖ペプチドリンカーを、使用することができる。ある特定の実施形態では、アミノ酸は、２０個の天然に存在するアミノ酸から選択される。ある特定の他の実施形態では、アミノ酸のうちの１つまたは複数は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、およびリジンから選択される。化学的リンカー、例えば、炭化水素リンカー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカー、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）リンカー、多糖リンカー、ポリエステルリンカー、ＰＥＧおよび埋め込まれた複素環からなるハイブリッドリンカー、ならびに炭化水素鎖もまた、使用することができる。

【0067】

「神経学的障害」は、本明細書に使用される場合、ＣＮＳに罹患する、および／またはＣＮＳに病因を有する、疾患または障害を指す。ＣＮＳ疾患または障害の例としては、ニューロパチー、アミロイドーシス、がん、眼疾患または障害、ウイルスまたは微生物感染症、炎症、虚血、神経変性疾患、発作、行動障害、およびリソソーム貯蔵疾患が挙げられるが、これらに限定されない。本出願の目的で、ＣＮＳは、血液網膜関門によって身体の残りの部分から通常は封鎖されている眼を含むことが理解されるであろう。神経学的障害の特定の例としては神経変性疾患（レビー小体病、ポリオ後症候群、シャイ・ドレーガー症候群、オリーブ橋小脳萎縮症、パーキンソン病、多系統萎縮症、線条体黒質変性症、脊髄小脳失調症、脊髄性筋萎縮症を含むが、これらに限定されない）、タウオパチー（アルツハイマー病および核上性麻痺を含むが、これらに限定されない）、プリオン病（ウシ海綿状脳症、スクレイピー、クロイツフェルト・ヤコブ病、クールー病、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病、慢性消耗性疾患、および致死性家族性不眠症を含むが、これらに限定されない）、球麻痺、運動ニューロン疾患、および神経系ヘテロ変性障害（nervous system heterodegenerative disorder）（カナバン病、ハンチントン病、神経セロイドリポフスチン症、アレキサンダー病、トゥーレット病、メンケス症候群、コケイン症候群、ハラーホルデン・スパッツ症候群、ラフォラ病、レット症候群、肝レンズ核変性症、レッシュ・ナイハン症候群、およびウンフェルリヒト・ルントボルグ病を含むが、これらに限定されない）、認知症（ピック病および脊髄小脳失調症を含むが、これらに限定されない）、がん（例えば、ＣＮＳおよび／または脳のもの、身体の他の箇所のがんから生じる脳転移を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0068】

「神経学的障害薬」は、１つまたは複数の神経学的障害の作用を処置または緩和するのに有用な薬物または治療剤である。本発明の神経学的障害薬としては、小分子化合物、抗体、ペプチド、タンパク質、１つもしくは複数のＣＮＳ標的の天然のリガンド、１つもしくは複数のＣＮＳ標的の天然のリガンドの改変バージョン、アプタマー、阻害性核酸（すなわち、低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）および短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））、リボザイム、または前述のもののいずれかの活性な断片が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の例示的な神経学的障害薬は、本明細書に記載されており、これには、それ自体が、ＣＮＳ抗原または標的分子、例えば、限定されないが、アミロイド前駆体タンパク質またはその一部分、アミロイドベータ、ベータ－セクレターゼ、ガンマ－セクレターゼ、ｔａｕ、アルファ－シヌクレイン、パーキン、ハンチンチン、ＤＲ６、プレセニリン、ＡｐｏＥ、神経膠腫または他のＣＮＳがんマーカー、ならびにニューロトロフィンであるか、またはそれらを特異的に認識する、および／もしくはそれらに対して作用する（すなわち、阻害、活性化、もしくは検出する）かのいずれかである、抗体、アプタマー、タンパク質、ペプチド、阻害性核酸、および小分子、ならびに前述のもののいずれかの活性な断片が挙げられるが、これらに限定されない。神経学的障害薬の非限定的な例、およびそれらを使用して処置され得る対応する障害：脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、慢性脳損傷（神経発生）、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ－２）、抗上皮増殖因子受容体脳がん、（ＥＧＦＲ）－抗体、グリア細胞株由来神経因子 パーキンソン病、（ＧＤＮＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ） 筋萎縮性側索硬化症、鬱、脳のリソソーム酵素リソソーム貯蔵障害、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ） 筋萎縮性側索硬化症、ニューレグリン－１ 統合失調症、抗ＨＥＲ２抗体（例えば、トラスツズマブ） ＨＥＲ２陽性がんからの脳転移。

【0069】

「医薬製剤」という用語は、中に含まれる活性成分の生物学的活性が有効となるのを許容するような形態にあり、製剤が投与されるであろう対象にとって、許容できないほどに毒性である追加の成分を含まない、調製物を指す。

【0070】

本明細書に使用される場合、「薬学的に許容される担体または希釈剤」は、個体への投与に使用するのに好適な任意の物質を意味する。例えば、薬学的に許容される担体は、滅菌水溶液、例えば、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）または注射用水であり得る。

【0071】

本明細書に使用される場合、「薬学的に許容される塩」とは、化合物、例えば、オリゴマー化合物またはオリゴヌクレオチドの生理学的および薬学的に許容される塩、すなわち、親化合物の所望される生物学的活性を保持し、望ましくない毒物学的作用を与えない、塩を意味する。

【0072】

本発明において使用するための薬学的に許容される酸性／アニオン性塩としては、酢酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重炭酸塩、重酒石酸塩、臭化物、エデト酸カルシウム、カンシラート、炭酸塩、塩化物、クエン酸塩、ジヒドロクロリド、エデト酸塩、エジシル酸塩、エストレート、エシレート、フマル酸塩、グリセプテート（glyceptate）、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリコリルアルサニル酸塩（glycollylarsanilate）、ヘキシルレゾルシネート（hexylresorcinate）、ヒドラバミン、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヒドロキシナフトエ酸塩、ヨウ化物、イセチオン酸塩、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、臭化メチル、硝酸メチル、硫酸メチル、ムカート、ナプシレート、硝酸塩、パモ酸塩、パントテン酸塩、リン酸塩／二リン酸塩、ポリガラクツロン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクル酸塩、トシル酸塩、およびトリエチオジドが挙げられ、これらに限定されない。また、有機酸または無機酸としては、ヨウ化水素酸、過塩素酸、硫酸、リン酸、プロピオン酸、グリコール酸、メタンスルホン酸、ヒドロキシエタンスルホン酸、シュウ酸、２－ナフタレンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、シクロヘキサンスルファミン酸、サッカリン酸、またはトリフルオロ酢酸が挙げられ、これらに限定されない。薬学的に許容される塩基性／カチオン性塩としては、アルミニウム、２－アミノ－２－ヒドロキシメチル－プロパン－１，３－ジオール（また、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、トロメタン、または「ＴＲＩＳ」としても知られている）、アンモニア、ベンザチン、ｔ－ブチルアミン、カルシウム、クロロプロカイン、コリン、シクロヘキシルアミン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、リチウム、Ｌ－リジン、マグネシウム、メグルミン、Ｎ－メチル－Ｄ－グルカミン、ピペリジン、カリウム、プロカイン、キニン、ナトリウム、トリエタノールアミン、または亜鉛が挙げられ、これらに限定されない。

【0073】

「ポリペプチド」または「タンパク質」は、ペプチド結合によって連結されてポリペプチドを形成した、少なくとも２つのアミノ酸残基を含む、分子を意味する。５０個未満のアミノ酸の小さなポリペプチドは、「ペプチド」と称され得る。

【0074】

「配列同一性」、または「配列同一性パーセント（％）」、または「同一性％」、または「％同一である」という語句は、アミノ酸配列を参照して使用される場合、２つまたはそれ以上のアライメントされるアミノ酸配列の、アミノ酸配列の全長を構成するアミノ酸残基の数と比較した、同一のアミノ酸の一致（「ヒット」）の数を説明する。換言すると、アライメントを使用して、２つまたはそれ以上の配列について、同じであるアミノ酸残基のパーセンテージ（例えば、アミノ酸配列の全長にわたって９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性）は、配列を、当該技術分野において公知の配列比較アルゴリズムを使用して測定される最大の一致について比較およびアライメントした場合、または手作業でアライメントされ目視で調査した場合に、判定され得る。配列同一性を判定するために比較される配列は、したがって、アミノ酸の置換、付加、または欠失によって異なり得る。タンパク質配列をアライメントするのに好適なプログラムは、当業者に公知である。タンパク質配列の配列同一性パーセンテージは、例えば、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ、ＦＡＳＴＡ、またはＢＬＡＳＴなどのプログラムを用いて、例えば、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Altschul SF, et al (1997), Nucleic Acids Res. 25:3389-3402）を使用して、判定することができる。

【0075】

「特異的に結合すること」、または「特異的に結合する」、または「結合する」とは、抗体が、他の抗原よりも高い親和性で、抗原または抗原内のエピトープに結合することを指す。典型的に、抗体は、約１×１０^－８Ｍもしくはそれ未満、例えば、約１×１０^－９Ｍもしくはそれ未満、約１×１０^－１０Ｍもしくはそれ未満、約１×１０^－１１Ｍもしくはそれ未満、または約１×１０^－１２Ｍもしくはそれ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）で、典型的には、その非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）への結合のＫ_Ｄよりも少なくとも１００分の１のＫ_Ｄで、抗原または抗原内のエピトープに結合する。Ｋ_Ｄは、抗体とその抗原との間のｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎの比である平衡解離定数である。Ｋ_Ｄおよび親和性は、逆相関する。「結合速度」（ｋ_ｏｎ）は、抗体がその標的にどれほど迅速に結合するかを特徴付けるために使用される定数である。「解離速度」（ｋ_ｏｆｆ）は、抗体がその標的からどれほど迅速に解離されるかを特徴付けるために使用される定数である。解離定数Ｋ_Ｄは、標準的な手順を使用して測定され得る。例えば、抗体のＫ_Ｄは、表面プラズモン共鳴を使用することによって、例えば、バイオセンサーシステム、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムを使用することによって、またはバイオレイヤーインターフェロメトリー技術、例えば、Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ９６システムを使用することによって、判定することができる。抗体のＫ_Ｄの値が小さいほど、抗体が標的抗原に結合する親和性は高い。抗原または抗原内のエピトープに特異的に結合する抗体は、しかしながら、他の関連する抗原、例えば、他の種（ホモログ）、例えば、ヒトまたはサル、例えば、カニクイザル（Macaca fascicularis）（カニクイザル（cynomolgus、ｃｙｎｏ））、チンパンジー（Pan troglodytes）（チンパンジー（chimpanzee、ｃｈｉｍｐ））、またはコモンマーモセット（Callithrix jacchus）（コモンマーモセット（common marmoset、ｍａｒｍｏｓｅｔ））に由来する同じ抗原に対して、交差反応性を有し得る。単一特異性抗体は、１つの抗原または１つのエピトープに特異的に結合するが、一方で二重特異性抗体は、２つの異なる抗原または２つの異なるエピトープに特異的に結合する。

【0076】

「対象」という用語は、本明細書に使用される場合、哺乳動物を指す。哺乳動物としては、飼育動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、およびウマ）、霊長類（例えば、ヒト、および非ヒト霊長類、例えば、サル）、ウサギ、ならびにげっ歯動物（例えば、マウスおよびラット）が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、個体または対象は、ヒトである。対象がヒトである場合、それらは、「患者」と称することができる。

【0077】

２つのアミノ酸配列の文脈において、「実質的に同一である」という用語は、配列が、例えば、ＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴのプログラムによって、デフォルトのギャップ重みを使用して最適にアライメントした場合に、少なくとも約５０パーセントの配列同一性を共有することを意味する。典型的に、実質的に同一である配列は、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約９５、少なくとも約９８、または少なくとも約９９パーセントの配列同一性を呈するであろう。

【0078】

「ＣＤ９８」または「ＣＤ９８ｈｃ」という用語は、本明細書に使用される場合、ジスルフィド結合によって複数の軽鎖のうちのいずれかに連結される、分化のクラスター９８重鎖（ＣＤ９８ｈｃ）からなる内在性膜タンパク質を指す。ＬＡＴ１またはＬＡＴ２と会合すると、ヘテロ二量体輸送体複合体は、強制的なアミノ酸交換体として挙動する。ＣＤ９８ｈｃは、約８０ｋＤａの分子量を有する。好ましくは、ＣＤ９８ｈｃは、ヒトＣＤ９８ｈｃ（ｈｕＣＤ９８ｈｃ）である。ｈｕＣＤ９８ｈｃは、ＳＬＣ３Ａ２遺伝子によってコードされる。

【0079】

「標的抗原」または「脳の標的」は、本明細書に使用される場合、抗体または小分子により標的化することができる、脳を含め、ＣＮＳにおいて発現される抗原および／または分子を指す。そのような抗原および／または分子の例としては、限定することなく、ベータ－セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）、アミロイドベータ（Ａベータ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、Ｔａｕ、アポリポタンパク質Ｅ４（ＡｐｏＥ４）、アルファ－シヌクレイン、ＣＤ２０、ハンチンチン、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）、ロイシンリッチ反復キナーゼ２（ＬＲＲＫ２）、パーキン、プレセニリン１、プレセニリン２、ガンマセクレターゼ、死受容体６（ＤＲ６）、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ｐ７５ニューロトロフィン受容体（ｐ７５ＮＴＲ）、およびカスパーゼ６が挙げられる。一部の実施形態では、標的抗原は、ＢＡＣＥ１である。一部の実施形態では、標的抗原は、Ｔａｕである。

【0080】

本明細書に使用される場合、「処置」（およびその文法上の変化形、例えば、「処置する」または「処置すること」）は、処置されている個体の自然な経過を変更するよう試みる臨床介入を指し、予防のために、または臨床病理の過程の間のいずれかで、行われ得る。処置の所望される作用としては、疾患の発症または再発を予防すること、症状の緩和、疾患の任意の直接的または間接的な病理結果の減少、転移を予防すること、疾患進行の速度を減少させること、疾患状態の軽減または緩和、ならびに寛解または予後の改善が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるため、または疾患の進行を遅らせるために使用される。

【0081】

抗体または免疫グロブリンは、重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、５つの主要なクラス、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭに割り当てることができる。ＩｇＧは、免疫グロブリンの５つのタイプの中でもっとも安定しており、ヒトにおいては約２３日間の血清半減期を有する。ＩｇＡおよびＩｇＧは、さらに、アイソタイプＩｇＡ_１、ＩｇＡ_２、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、およびＩｇＧ_４に細分類される。４つのＩｇＧサブクラスのそれぞれは、エフェクター機能として知られる異なる生物学的機能を有する。これらのエフェクター機能は、一般に、Ｆｃ受容体（ＦｃγＲ）との相互作用を通じて、および／またはＣ１ｑに結合し補体を固定することによって、媒介される。ＦｃγＲへの結合は、抗体依存性細胞媒介型細胞溶解または抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）をもたらし得るが、一方で補体因子への結合は、補体によって媒介される細胞溶解または補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）をもたらし得る。本発明の抗ＣＤ９８抗体、または抗ＣＤ９８抗体にコンジュゲートもしくは融合させようとする治療用もしくは診断用抗体は、エフェクター機能をまったく有さないかまたは最小限しか有さなくてよいが、ＦｃＲｎに結合するその能力は保持し、その結合は、抗体が長いインビボ半減期を有する主要な手段となり得る。

【0082】

ＦｃγＲまたは補体（例えば、Ｃ１ｑ）の抗体への結合は、いわゆるＦｃ部分結合部位における定義されたタンパク質－タンパク質相互作用によって引き起こされる。そのようなＦｃ部分結合部位は、当該技術分野において公知である。そのようなＦｃ部分結合部位としては、アミノ酸Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１、およびＰ３２９（番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）が挙げられ、例えば、これによって特徴付けられる。一部の実施形態では、本発明の抗ＣＤ９８抗体、または抗ＣＤ９８抗体にコンジュゲートもしくは融合させようとする治療用もしくは診断用抗体は、エフェクター機能を排除するために、１つまたは複数のＦｃ部分結合部位における１つまたは複数の置換を含む。例えば、本発明の抗ＣＤ９８抗体、または抗ＣＤ９８抗体にコンジュゲートもしくは融合させようとする治療用もしくは診断用抗体は、以下の置換：残基２３３におけるプロリンとグルタミン酸との置換、残基２３４におけるアラニンまたはバリンとフェニルアラニンとの置換、および残基２３５におけるアラニンまたはグルタミン酸とロイシンとの置換のうちの１つまたは複数を含む、Ｆｃ領域を含み得る（ＥＵ番号付け、Kabat, E. A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. U.S. Dept. of Health and Human Services, Bethesda, Md., NIH Publication no. 91-3242）。好ましくは、目的の抗体は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＰ３３１Ｓ（ＥＵ番号付け、Ｋａｂａｔ）のうちの１つ、２つ、または３つの突然変異を含む。

【0083】

サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ３の抗体は、通常、Ｃ１ｑおよびＣ３結合を含む補体活性化を示し、一方で、ＩｇＧ４は、補体系を活性化せず、Ｃ１ｑおよび／またはＣ３に結合しない。ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域は、他のＩｇＧサブタイプと比較して低減されたＦｃγＲおよび補体因子に結合する能力を有する。好ましくは、本発明の抗ＣＤ９８抗体、または抗ＣＤ９８抗体にコンジュゲートもしくは融合させようとする治療用もしくは診断用抗体は、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域を含む。より好ましくは、Ｆｃ領域は、エフェクター機能を排除する置換を有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域を含む。例えば、ＩｇＧ４ Ｆｃ領域におけるＮ結合型グリコシル化部位を、残基２９７（ＥＵ番号付け）におけるＡｌａをＡｓｎと置換することによって除去することは、残留エフェクター活性を確実に排除する別の手段である。

【0084】

抗ＣＤ９８抗体およびその抗原結合性断片
１つの一般的な態様では、本出願は、霊長類ＣＤ９８、例えば、ヒトＣＤ９８またはサルＣＤ９８に結合する抗体またはその抗原結合性断片に関し、抗体またはその抗原結合性断片は、薬物を、それを必要とする対象の脳に送達するために最適化されている。本発明の発明者らは、驚くべきことに、結合速度および解離速度の両方からの影響が、脳内濃度に影響を及ぼすという、これまでに説明されていたものとはわずかに異なる親和性とトランスサイトーシス効率との間の関係性を発見した。具体的には、速すぎることも遅すぎることもない中間の解離速度が、薬剤（例えば、ｍＡｂ）が抗ＣＤ９８抗体またはその抗原結合性断片によって効率的に送達されるための最適な脳内ＰＫおよびＰＤに必要である。

【0085】

好ましくは、本出願の抗ＣＤ９８抗体またはその抗原結合性断片は、ｐＨ感受性であり、例えば、それは、異なるｐＨではＣＤ９８に対する異なる結合親和性を有する。例えば、本出願の抗ＣＤ９８抗体は、中性ｐＨ、例えば、生理学的ｐＨ（例えば、ｐＨ７．４）においては、高い親和性で細胞表面ＣＤ９８に結合することができるが、エンドソームコンパートメントに内部移行されると、酸性ｐＨ、例えば、比較的低いｐＨ（ｐＨ５～６．０）において、ＣＤ９８から解離される。親和性は、２つの部分の間、例えば、抗体と抗原との間の結合の強度の尺度である。親和性は、いくつかの手段で表すことができる。１つの手段は、相互作用の解離定数（Ｋ_Ｄ）に関する。Ｋ_Ｄは、平衡透析、または抗原－抗体の解離および結合の速度、それぞれ、ｋ_ｏｆｆ（ｋｄもしくはｋ_ｄｉｓ）およびｋ_ｏｎ（もしくはｋａ）速度を直接的に測定することによるものを含め、日常的な方法によって測定することができる（例えば、Nature, 1993 361:186-87を参照されたい）。ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎの比は、親和性に関連しないすべてのパラメーターを打ち消し、解離定数Ｋ_Ｄに等しくなる（一般に、Davies et al., Annual Rev Biochem, 1990 59:439-473を参照されたい）。したがって、Ｋ_Ｄの低さは、親和性の高さを意味する。親和性の別の表現は、Ｋ_ａであり、これは、Ｋ_Ｄの逆数、すなわちｋ_ｏｎ／ｋ_ｏｆｆである。したがって、Ｋ_ａの高さは、親和性の高さを意味する。例えば、本出願の組成物および／または方法において使用するための抗体またはその抗原結合性断片は、中性ｐＨ（例えば、ｐＨ６．８～７．８）、例えば、生理学的ｐＨ（例えば、ｐＨ７．４）において、１ナノモル（ｎＭ、１０^－９Ｍ）またはそれ以上のＫ_Ｄで、ＣＤ９８に結合し、酸性ｐＨ（例えば、ｐＨ４．５～６．５）、例えば、ｐＨ５．０）において、１０^－４秒^－１またはそれ以上のｋ_ｄｉｓで、ＣＤ９８から解離する、抗体またはその断片であり得る。

【0086】

したがって、本出願の一般的な態様は、薬剤を、それを必要とする対象の脳に送達するための抗ＣＤ９８抗体またはその抗原結合性断片であって、中性ｐＨにおいて、少なくとも１ｎＭ、好ましくは、１ｎＭ～５００ｎＭの解離定数Ｋ_Ｄで、酸性ｐＨ、好ましくは、ｐＨ５において、少なくとも１０^－４秒^－１、好ましくは、１０^－４～１０^－１秒^－１の解離速度定数ｋ_ｄで、ＣＤ９８、好ましくは、ＣＤ９８ｈｃ、より好ましくは、ヒトＣＤ９８ｈｃに結合する、抗ＣＤ９８抗体またはその抗原結合性断片に関する。

【0087】

一実施形態では、本出願の抗ＣＤ９８抗体またはその抗原結合性断片は、中性ｐＨにおいて、２×１０^－２～２×１０^－４秒^－１、例えば、２×１０^－２、１×１０^－２、９×１０^－３、８×１０^－３、７×１０^－３、６×１０^－３、５×１０^－３、４×１０^－３、３×１０^－３、２×１０^－３、１×１０^－３、９×１０^－４、８×１０^－４、７×１０^－４、６×１０^－４、５×１０^－４、４×１０^－４、３×１０^－４、２×１０^－４秒^－１、またはこれらの間の任意の値の解離速度定数ｋ_ｄを有する。

【0088】

ある特定の実施形態では、ヒトＣＤ９８に結合する抗体またはその抗原結合性断片は、
（ｉ）それぞれ、配列番号２９、３０、および３１、
（ｉｉ）それぞれ、配列番号４８、４９、および５０、または
（ｉｉｉ）それぞれ、配列番号１４３、１４４、および１４５
のアミノ酸配列を有する、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む、重鎖の単一可変ドメイン（ＶＨＨ）抗体である。

【0089】

好ましくは、それは、配列番号２８、配列番号４７、または配列番号１４２に対して少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＶＨＨ断片である。

【0090】

他の実施形態では、ヒトＣＤ９８に結合する抗体またはその抗原結合性断片は、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、ならびに軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域であって、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３が、
（ｉ）それぞれ、配列番号７、８、９、１０、１１および１２、
（ｉｉ）それぞれ、配列番号６７、６８、６９、７０、７１および７２、
（ｉｉｉ）それぞれ、配列番号８９、９０、９１、９２、９３および９４、
（ｉｖ）それぞれ、配列番号１１３、１１４、１１５、１１６、１１７および１１８、
（ｖ）それぞれ、配列番号１２３、１２４、１２５、１２６、１２７および１２８、
（ｖｉ）それぞれ、配列番号１３３、１３４、１３５、１３６、１３７および１３８、
（ｖｉｉ）それぞれ、配列番号１５０、１５１、１５２、１５３、１５４および１５５、
（ｖｉｉｉ）それぞれ、配列番号１６０、１６１、１６２、１６３、１６４および１６５、
（ｉｘ）それぞれ、配列番号１７０、１７１、１７２、１７３、１７４および１７５、
（ｘ）それぞれ、配列番号１８０、１８１、１８２、１８３、１８４および１８５、
（ｘｉ）それぞれ、配列番号１９４、１９５、１９６、１９７、１９８および１９９、または
（ｘｉｉ）それぞれ、配列番号２０４、２０５、２０６、２０７、２０８および２０９
のアミノ酸配列を有する、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。

【0091】

他の実施形態では、本出願の抗体またはその抗原結合性断片は、本明細書に例証される抗体または抗原結合性断片と競合する。抗体または抗原の結合部位は、公知の方法、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットなどによって判定することができる。ある特定の実施形態では、そのような競合する抗体は、例証された抗体またはその抗原結合性断片が結合するのと同じエピトープ（例えば、線形または立体構造エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示的な方法は、Morris, G. E., (ed.), “Epitope Mapping Protocols,” In: Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Humana Press, Totowa, N.J. (1996)に提供されている。参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」とは、参照抗体のその抗原への結合を、競合アッセイにおいて、５０％またはそれ以上遮断する抗体を指し、逆に、参照抗体は、抗体のその抗原への結合を、競合アッセイにおいて、５０％またはそれ以上遮断する。

【0092】

好ましくは、抗体またはその抗原結合性断片は、可動性リンカーを介して軽鎖可変領域（Ｌ_Ｖ）に共有結合的に連結された重鎖可変領域（Ｈ_Ｖ）を含む、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。ｓｃＦｖは、定常領域の除去およびリンカーの導入にもかかわらず、もともとの免疫グロブリンの特異性を保持することができる。ｓｃＦｖにおいて、ドメインの順序は、Ｈ_Ｖ－リンカー－Ｌ_Ｖ、またはＬ_Ｖ－リンカー－Ｈ_Ｖのいずれかであり得る。リンカーは、デノボで設計することができるか、または重大な立体障害を有することなくｓｃＦｖの可変ドメインを架橋するのに適合する長さおよび立体構造を提供する公知のタンパク質構造に由来してもよい。リンカーは、１０～約２５個のアミノ酸の長さを有し得る。好ましくは、リンカーは、ドメインがフォールディングし、インタクトな抗原結合性部位を形成する能力に影響を及ぼすことのない、可変ドメインのカルボキシ末端と他のドメインのアミノ末端との間の約３．５ｎｍ（３５Å）に及ぶペプチドリンカーである（Huston et al., Methods in Enzymology, vol. 203, pp. 46-88, 1991、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。リンカーは、好ましくは、タンパク質フォールディングを通して可変ドメイン内または可変ドメイン間のペプチドのインターカレーションを回避するために、親水性配列を含む（Argos, Journal of Molecular Biology, vol. 211, no. 4, pp. 943-958, 1990）。例えば、リンカーは、ＧｌｙおよびＳｅｒ残基を含み得、かつ／または可溶性を増強させるためにＧｌｕ、Ｔｈｒ、およびＬｙｓなどの荷電残基が一緒に介在していてもよい。一実施形態では、リンカーは、配列番号１８９（ＧＴＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴ）のアミノ酸配列を有する。任意の他の好適なリンカーもまた、本開示を踏まえて、使用することができる。

【0093】

一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号６、配列番号６６、配列番号８８、配列番号１１２、配列番号１２２、配列番号１３２、配列番号１４９、配列番号１５９、配列番号１６９、配列番号１７９、配列番号１９３、または配列番号２０３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0094】

好ましい実施形態では、ＣＤ９８、好ましくは、ＣＤ９８ｈｃ、より好ましくは、ヒトＣＤ９８ｈｃに結合する抗体またはその抗原結合性断片は、遊離システインを含まない。

【0095】

抗ＣＤ９８抗体またはその抗原結合性断片（例えば、ＶＨＨもしくはｓｃＦｖ断片）は、本開示を踏まえて、当該技術分野における好適な方法を使用して、産生させることができる。例えば、ＶＨＨまたはｓｃＦｖ断片は、抗体断片の産生に好適な条件下において、組換え宿主細胞（例えば、細菌、酵母、または哺乳動物細胞）を増殖させ、細胞培養物から断片を回収することによって、組換えで産生させることができる。

【0096】

脳シャトル構築物
本質的なトランスサイトーシス効率を増強させ、末梢薬物動態を拡張し、治療用ｍＡｂの有効性を維持すると同時に許容可能な安全性プロファイルとなるように操作することによって、ＣＤ９８を使用した最適化されたＲＭＴ脳送達プラットフォームが、開発されている。カニクイザルにおけるトランスサイトーシス受容体親和性と脳内濃度との間の相互作用が、研究されている。結合動態に関する十分な研究により、ｍＡｂの最適な脳内ＰＫおよびＰＤのためには、速すぎることも遅すぎることもない中間の解離速度が必要であることが示されている。

【0097】

胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への増加した結合を有する操作された抗体定常領域が、末梢クリアランスの減少および脳内濃度の増強をもたらしたこともまた、発見されている。

【0098】

Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）への結合を停止させ、エフェクター機能によって媒介される毒性を回避するために、追加のＦｃ突然変異が導入される。高親和性抗Ｔａｕ結合ｍＡｂと連結された場合、これらの突然変異は、末梢におけるエフェクター機能によって媒介される毒性を予防し、同時に、ミクログリア取り込みおよび標的分解のための新規な非ＦｃγＲ機序を通じて抗体依存性ファゴサイトーシス（ＡＤＰ）を維持する。この機序は、ＣＤ９８を通じた内部移行に依存し、炎症促進性サイトカインの分泌を刺激することなく、従来的なＦｃγＲによって媒介されるＡＤＰよりも標的分解の促進がより効率的である。本発明者らが知る限り、様々な治療適用に利用することができる、新規の効率的な非炎症性ファゴサイトーシス機序を表すＦｃγＲによって媒介されないＡＤＰに関する報告は、これが初めてである。

【0099】

したがって、１つの一般的な態様では、本出願は、本出願の抗ＣＤ９８抗体またはその抗原結合性断片を含む、抗体標的化脳送達システムに関する。抗ＣＤ９８抗体またはその抗原結合性断片は、治療剤または診断剤を、細胞（例えば、がん細胞）またはＢＢＢ系に送達するために使用することができる。送達することができる薬剤としては、任意の神経学的障害薬、または神経学的障害薬を検出もしくは分析するために使用することができる薬剤が挙げられる。例えば、そのような薬剤は、神経増殖因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞株神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、およびインスリン様増殖因子（ＩＧＦ）を含むがこれらに限定されない、神経栄養因子；サブスタンスＰ、神経ペプチドＹ、血管作動性腸ペプチド（ＶＩＰ）、ガンマ－アミノ－酪酸（ＧＡＢＡ）、ドーパミン、コレシストキニン（ＣＣＫ）、エンドルフィン、エンケファリン、およびチロトロピン放出ホルモン（ＴＲＨ）を含むがこれらに限定されない、神経ペプチド；サイトカイン；抗不安剤；抗けいれん薬；例えば、低分子干渉ＲＮＡおよび／もしくはアンチセンスオリゴを含む、ポリヌクレオチドおよび導入遺伝子；または脳の標的に結合する抗体もしくはその抗原結合性断片であり得る。本出願の抗ＣＤ９８抗体またはその抗原結合性断片は、目的の薬剤の、血液から脳への送達、およびそこでの機能を増強させるための有効な手段であり得る。

【0100】

具体的には、目的の薬剤は、本出願の抗ＣＤ９８抗体またはその抗原結合性断片と組み合わされた形態、またはそれと連結された状態で、非経口で、例えば、静脈内に、送達することができる。例えば、薬剤は、抗ＣＤ９８抗体またはその抗原結合性断片に非共有結合的に結合していてもよい。薬剤はまた、抗ＣＤ９８抗体またはその抗原結合性断片に共有結合的に結合されて、コンジュゲートを形成してもよい。ある特定の実施形態では、コンジュゲーションは、タンパク質融合体の構築によるもの（すなわち、抗ＣＤ９８抗体またはその抗原結合性断片および神経学的障害薬をコードする２つの遺伝子の遺伝子融合、ならびに単一のタンパク質としての発現によるもの）である。公知の方法を使用して、本開示を踏まえて、薬剤を、抗体またはその抗原結合性断片に連結することができる。例えば、Wu et al., Nat Biotechnol., 23(9):1137-46, 2005、Trail et al., Cancer Immunol Immunother., 52(5):328-37, 2003、Saito et al., Adv Drug Deliv Rev., 55(2):199-215, 2003、Jones et al., Pharmaceutical Research, 24(9):1759-1771, 2007を参照されたい。

【0101】

一部の実施形態では、脳に送達しようとする治療剤または診断剤、ならびに抗ＣＤ９８抗体またはその抗原結合性断片は、非ペプチドリンカーまたはペプチドリンカーを介して、一緒に共有結合的に連結され得る（またはコンジュゲートされ得る）。非ペプチドリンカーの例としては、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、多糖、デキストラン、ポリビニルエーテル、生体分解性ポリマー、重合脂質、キチン、およびヒアルロン酸、またはこれらの誘導体、またはこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。ペプチドリンカーは、ペプチド結合またはその誘導体によって連結された１～５０個のアミノ酸からなるペプチド鎖であってもよく、そのＮ末端およびＣ末端は、抗ＣＤ９８抗体またはその抗原結合性断片に共有結合的に連結され得る。

【0102】

ある特定の実施形態では、本出願のコンジュゲートは、ＣＤ９８に結合する第１の抗原結合性領域と、脳の抗原、例えば、ベータ－セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）、ｔａｕ、および本明細書に開示される他の脳の抗原に結合する第２の抗原結合性領域とを含む、多重特異性抗体である。多重特異性抗体を作製するための技法としては、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対の組換え共発現（Milstein and Cuello, Nature 305: 537, 1983）、国際公開第ＷＯ ９３／０８８２９号、およびTraunecker et al, EMBO J. 10: 3655, 1991を参照されたい）、ならびに「ノブ・イン・ホール」操作（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。多重特異性抗体はまた、静電ステアリング作用を操作すること（国際公開第ＷＯ ２００９／０８９００４号Ａ１）、２つまたはそれ以上の抗体または断片を架橋すること（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号およびBrennan et al, Science, 229: 81, 1985を参照されたい）、ロイシンジッパーを使用すること（例えば、Kostelny et al, J. Immunol., 148(5): 1547-1553,1992)を使用すること）、「ダイアボディ」技術を使用すること（例えば、Hollinger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448, 1993)を参照されたい）、一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を使用すること（例えば、Gruber et al, J. Immunol, 152:5368 (1994)を参照されたい）、ならびに例えばTutt et al. J. Immunol. 147: 60, 1991に記載される三重特異性抗体を調製することによって、作製することができる。本出願の多重特異性抗体はまた、３つまたはそれ以上の機能性抗原性結合部位を有する抗体を包含し、これには、「オクトパス抗体」または「二重可変ドメイン免疫グロブリン」（ＤＶＤ）が挙げられる（例えば、米国出願第ＵＳ２００６／００２５５７６号Ａ１、Wu et al. Nature Biotechnology, 25(11):1290-7, 2007を参照されたい）。本出願の多重特異性抗体は、ＣＤ９８ならびに脳の抗原（例えば、ＢＡＣＥ１またはＴａｕ）に結合する抗原結合性領域を含む、「二重作用性Ｆａｂ」または「ＤＡＦ」も包含する（米国出願公開第ＵＳ２００８／００６９８２０号を参照されたい）。一実施形態では、抗体は、抗体断片であり、様々なそのような断片が、本明細書に開示されている。

【0103】

一実施形態では、本出願の多重特異性抗体は、第２の抗体またはその抗原結合性断片に共有結合的に連結（または融合）された本出願の抗ＣＤ９８抗体またはその抗原結合性断片を含む、融合構築物である。好ましくは、第２の抗体またはその抗原結合性断片は、脳の標的、例えば、ＢＡＣＥ、ｔａｕ、または他の脳の抗原、例えば、本明細書に記載されるものに結合する。抗ＣＤ９８抗体またはその抗原結合性断片は、直接的に、またはリンカーを介して、第２の抗体またはその抗原結合性断片の軽鎖および／または重鎖のカルボキシ末端および／またはアミノ末端に融合され得る。

【0104】

一実施形態では、抗ＣＤ９８抗体またはその抗原結合性断片は、直接的に、またはリンカーを介して、第２の抗体またはその抗原結合性断片の軽鎖のカルボキシ末端に融合される。

【0105】

別の実施形態では、抗ＣＤ９８抗体またはその抗原結合性断片は、直接的に、またはリンカーを介して、第２の抗体またはその抗原結合性断片の軽鎖のアミノ末端に融合される。

【0106】

別の実施形態では、抗ＣＤ９８抗体またはその抗原結合性断片は、直接的に、またはリンカーを介して、第２の抗体またはその抗原結合性断片の重鎖のカルボキシ末端に融合される。

【0107】

別の実施形態では、抗ＣＤ９８抗体またはその抗原結合性断片は、直接的に、またはリンカーを介して、第２の抗体またはその抗原結合性断片の重鎖のアミノ末端に融合される。

【0108】

好ましい実施形態では、本出願の融合構築物は、リンカーを介して、脳の標的に結合する第２の抗体またはその抗原結合性断片の２つの重鎖のうちの一方のみのカルボキシ末端に共有結合的に連結された、抗ＣＤ９８抗体またはその抗原結合性断片、好ましくは、本出願の抗ｈｕＣＤ９８ｈｃ ＶＨＨまたはｓｃＦｖ断片を含む。好ましくは、リンカーは、配列番号３１２または配列番号３１３のアミノ酸配列を有する。

【0109】

２つの重鎖間、例えば、抗ＣＤ９８抗体もしくはその抗原結合性断片の融合体を有するものと有さないものとの間、または抗ＣＤ９８アームのためのＦｃを含むものと抗脳標的アームのためのものとの間のヘテロ二量体の形成を促進するために、ヘテロ二量体突然変異が、２つの重鎖のＦｃに導入される。そのようなＦｃ突然変異の例としては、Ｚｙｍｅｗｏｒｋ突然変異（例えば、米国特許第１０，４５７，７４２号を参照されたい）および「ノブ・イン・ホール」突然変異（例えば、Ridgway et al., Protein Eng., 9(7): 617-621, 1996を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。他のヘテロ二量体突然変異もまた、本発明において使用することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載される改変されたＣＨ３が、２つの重鎖間のヘテロ二量体の形成を促進するために使用される。

【0110】

ヘテロ二量体突然変異に加えて、他の突然変異もまた導入され得る。一部の実施形態では、融合構築物または二重特異性抗体のＦｃ領域は、さらに、ＡＤＣＣ／ＣＤＣを変更する（増加もしくは減少させる）、好ましくは、排除する、１つもしくは複数の突然変異（例えば、本明細書に記載されるＡＡＳ突然変異）、ならびに／またはＦｃＲｎへの融合構築物もしくは二重特異性抗体の結合を変更する（増加もしくは減少させる）、好ましくは、増加させる、１つもしくは複数の突然変異（例えば、本明細書に記載されるＹＴＥ突然変異）を含む。一部の実施形態では、融合構築物または二重特異性抗体における１つまたは複数のシステイン残基が、他のアミノ酸、例えば、セリンと置換される。

【0111】

ある特定の実施形態では、本出願の融合構築物は、
（１）配列番号１３、１６、１９、２２、２５、３２、３５、３８、４１、４４、５１、５４、５７、６０、６３、７３、７６、７９、８２、８５、９５、９８、１０１、１０４、１０７、１１９、１２９、１３９、１４６、１５６、１６６、１７６、１８６、２００、２１０、および２１９からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有する、第１の重鎖と、
（２）それぞれ配列番号１４、１７、２０、２３、２６、３３、３６、４２、４５、５２、５５、５８、６１、６４、７４、７７、８０、８３、８６、９６、９９、１０２、１０５、１０８、１２０、１３０、１４０、１４７、１５７、１６７、１７７、１８７、２０１、２１１、および２２０からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を、それぞれが独立して有する、２つの軽鎖と、
（３）それぞれ配列番号１５、１８、２１、２４、２７、３４、３７、４３、４６、５３、５６、５９、６２、６５、７５、７８、８１、８４、８７、９７、１００、１０３、１０６、１０９、１２１、１３１、１４１、１４８、１５８、１６８、１７８、１８８、２０２、２１２、および２２１からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有する、第２の重鎖と
を含む。

【0112】

本出願のコンジュゲート、例えば、多重特異性抗体または融合構築物は、本開示を踏まえて、当該技術分野において公知のいくつかの技法のうちのいずれかによって産生させることができる。例えば、それは、融合構築物または多重特異性抗体の重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターが、標準的な技法によって宿主細胞にトランスフェクトされた、組換え宿主細胞から発現させることができる。宿主細胞は、原核生物宿主細胞であってもよく、または真核生物宿主細胞であってもよい。

【0113】

例示的な系では、本出願の融合構築物のヘテロ二量体の２つの重鎖および軽鎖をコードする１つまたは複数の組換え発現ベクターは、トランスフェクションまたはエレクトロポレーションによって、宿主細胞に導入される。選択された形質転換体宿主細胞を、融合構築物を産生させるのに十分な条件下において、重鎖および軽鎖の発現を可能にするように培養し、融合構築物を、培養培地から回収する。標準的な分子生物学技法を使用して、組換え発現ベクターを調製し、宿主細胞にトランスフェクトし、形質転換体を選択し、宿主細胞を培養し、培養培地からタンパク質構築物を回収する。

【0114】

本出願は、本明細書に記載される実施形態のうちのいずれかまたは特許請求の範囲のうちのいずれかにおける、単独または融合構築物もしくは多重特異性抗体の一部としての、抗ＣＤ９８抗体またはその抗原結合性断片のアミノ酸配列をコードする単離された核酸を提供する。単離された核酸は、ベクター、好ましくは、発現ベクターの一部であってもよい。

【0115】

別の態様では、本出願は、本明細書に開示されるベクターが形質転換された宿主細胞に関する。ある実施形態では、宿主細胞は、原核生物細胞、例えば、大腸菌（E. coli）である。別の実施形態では、宿主細胞は、真核生物細胞、例えば、原生生物細胞、動物細胞、植物細胞、または真菌細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＮＳ０、ＳＰ２、ＰＥＲ．Ｃ６を含むがこれらに限定されない、哺乳動物細胞、または真菌細胞、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、または昆虫細胞、例えば、Ｓｆ９である。

【0116】

医薬組成物および関連する方法
本発明はまた、医薬組成物、その調製方法、およびその使用方法にも関する。

【0117】

別の一般的な態様において、本発明は、本発明の抗ＣＤ９８抗体もしくはその抗原結合性断片、またはそのコンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物に関する。本発明の抗ＣＤ９８抗体もしくはその抗原結合性断片、またはコンジュゲート（例えば、多重特異性抗体もしくは融合構築物）はまた、本明細書に言及される治療適用のための医薬の製造においても有用である。薬学的に許容される担体は、任意の好適な賦形剤、希釈剤、増量剤、塩、緩衝化剤、安定化剤、可溶化剤、油、脂質、脂質含有小胞、ミクロスフェア、リポソームカプセル封入、または医薬製剤における使用について当該技術分野において周知の他の材料であり得る。担体、賦形剤、または希釈剤の特徴は、具体的な適用の投与経路に依存するであろうことが、理解されるであろう。

【0118】

したがって、一実施形態では、本出願は、治療剤または診断剤を、血液脳関門（ＢＢＢ）を越えて輸送する方法であって、治療剤または診断剤に連結された抗ＣＤ９８抗体またはその抗原結合性断片を、血液脳関門に曝露するステップを含み、結果として抗体またはその抗原結合性断片が、そこに連結された薬剤を、血液脳関門を越えて輸送することになる、方法に関する。一実施形態では、薬剤は、神経学的障害薬である。別の実施形態では、薬剤は、イメージング剤、または神経学的障害を検出するための薬剤である。好ましくは、抗ＣＤ９８抗体もしくはその抗原結合性断片、またはそのコンジュゲートは、アミノ酸輸送を妨害しない。抗体は、それがアミノ酸輸送を妨害しない様式で、ＣＤ９８に特異的に結合する。一部の実施形態では、ＢＢＢは、哺乳動物、好ましくは、霊長類、例えば、ヒト、より好ましくは、神経学的障害を有するヒトにおけるものである。一実施形態では、神経学的障害は、アルツハイマー病（ＡＤ）、卒中、認知症、筋ジストロフィー（ＭＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、嚢胞性線維症、アンジェルマン症候群、リドル症候群、パーキンソン病、ピック病、ページェット病、がん、および外傷性脳損傷からなる群から選択される。

【0119】

一実施形態では、本出願の抗ＣＤ９８抗体もしくはその抗原結合性断片、またはそのコンジュゲートは、症状の発生前に神経学的障害を検出するため、および／または疾患もしくは障害の重症度もしくは期間を評価するために、使用される。抗体、その抗原結合性断片、またはコンジュゲートは、放射線撮影法、断層撮影法、または磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）によるイメージングを含め、神経学的障害の検出および／またはイメージングを可能にする。

【0120】

別の実施形態では、抗ＣＤ９８抗体もしくはその抗原結合性断片、またはそのコンジュゲートは、処置を必要とする対象に、有効量の抗ＣＤ９８抗体もしくはその抗原結合性断片、またはそのコンジュゲートを投与するステップを含む、神経学的障害（例えば、アルツハイマー病）の処置において、使用される。一部の実施形態では、本方法は、さらに、対象に、有効量の少なくとも１つの追加の治療剤を投与するステップを含む。

【0121】

別の実施形態では、本出願は、医薬の製造または調製における、本出願の抗ＣＤ９８抗体もしくは抗原結合性断片、またはそのコンジュゲートの使用に関する。一実施形態では、医薬は、神経学的疾患または障害の処置のためのものである。さらなる実施形態では、医薬は、神経学的疾患または障害を有する個体に、有効量の医薬を投与するステップを含む、神経学的疾患または障害を処置する方法における使用のためのものである。

【0122】

本出願の別の一般的な態様は、抗体依存性ファゴサイトーシス（ＡＤＰ）の誘導を、それを必要とする対象において、炎症促進性サイトカインの分泌を刺激することなく行う方法であって、対象に、本出願の実施形態による抗ＣＤ９８抗体またはその抗原結合性断片に連結、好ましくは、共有結合的にコンジュゲートされた、治療用抗体またはその抗原結合性断片を含む、複合体を投与するステップを含み、治療用抗体またはその抗原結合性断片が、エフェクター機能を有さない、方法に関する。例えば、治療用抗体またはその抗原結合性断片は、エフェクター機能、例えば、ＡＤＣＣまたはＣＤＣを低減または排除する１つまたは複数のアミノ酸改変、例えば、Ｆｃガンマ受容体への結合を低減または停止させる突然変異を含み得る。そのような突然変異は、Ｌ２３４位、Ｌ２３５位、Ｄ２７０位、Ｎ２９７位、Ｅ３１８位、Ｋ３２０位、Ｋ３２２位、Ｐ３３１位、およびＰ３２９位におけるもの、例えば、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＰ３３１Ｓのうちの１つ、２つ、または３つの突然変異であり得、ここで、アミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔに記載されるＥＵインデックスによるものである。一実施形態では、治療用抗体またはその抗原結合性断片は、ｔａｕ凝集体に特異的に結合する。

【0123】

一部の実施形態では、本方法は、さらに、対象に、有効量の少なくとも１つの追加の治療剤を投与するステップを含む。ある特定の実施形態では、追加の治療剤は、抗ＣＤ９８抗体もしくはその抗原結合性断片またはコンジュゲートが処置に利用されるものと同じかまたは異なる神経学的障害を処置するのに有効な治療剤である。例示的な追加の治療剤としては、上述の様々な神経学的薬物、コリンエステラーゼ阻害剤（例えば、ドネペジル、ガランタミン、リバスチグミン（rovastigmine）、およびタクリン）、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニスト（例えば、メマンチン）、アミロイドベータペプチド凝集阻害剤、抗酸化剤、γ－セクレターゼモジュレーター、神経増殖因子（ＮＧＦ）模倣体またはＮＧＦ遺伝子療法、ＰＰＡＲｙアゴニスト、ＨＭＳ－ＣｏＡ還元酵素阻害剤（スタチン）、アムパキン（ampakine）、カルシウムチャネル遮断剤、ＧＡＢＡ受容体アンタゴニスト、グリコーゲンシンターゼキナーゼ阻害剤、静脈内免疫グロブリン、ムスカリン受容体アゴニスト、ニクロチン（nicrotinic）受容体モジュレーター、能動的または受動的アミロイドベータペプチド免疫付与、ホスホジエステラーゼ阻害剤、セロトニン受容体アンタゴニスト、ならびに抗アミロイドベータペプチド抗体が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの追加の治療剤は、神経学的薬物の１つまたは複数の副作用を軽減するその能力に関して、選択される。追加の治療剤は、同じかまたは別個の製剤で投与することができ、抗ＣＤ９８抗体もしくはその抗原結合性断片またはコンジュゲートと一緒または別個に投与することができる。本出願の抗ＣＤ９８抗体もしくは抗原結合性断片またはコンジュゲートは、追加の治療剤および／またはアジュバントの投与の前に、それと同時に、および／またはその後に、投与することができる。本出願の抗ＣＤ９８抗体もしくはその抗原結合性断片またはコンジュゲートはまた、放射線療法、行動療法、または当該技術分野において公知であり、処置もしくは予防しようとする神経学的障害に適切な他の治療などであるがこれらに限定されない、他の介入治療と組み合わせて使用することもできる。

【0124】

本出願の抗ＣＤ９８抗体もしくはその抗原結合性断片またはコンジュゲート（および任意の追加の治療剤）は、非経口、肺内、および鼻内、ならびに所望される場合には局所処置、病巣内投与を含む、任意の好適な手段によって、投与することができる。非経口注入としては、投与が短期間であるか慢性的であるかに部分的に応じて、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下投与が挙げられる。単回投与または様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、およびパルス注入を含むがこれらに限定されない、様々な投薬スケジュールが、本明細書において企図される。

【0125】

疾患の予防または処置に関して、本出願の抗ＣＤ９８抗体もしくはその抗原結合性断片またはコンジュゲート（単独で、または１つもしくは複数の他の追加の治療剤と組み合わせて使用される場合）の適切な投薬量は、様々な要因、例えば、処置しようとする疾患のタイプ、抗体またはコンジュゲートのタイプ、疾患の重症度および経過、抗体、その抗原結合性断片、またはコンジュゲートが、予防目的で投与されるか治療目的で投与されるか、これまでの治療、患者の臨床病歴および抗体に対する応答、対象の生理学的状態（例えば、年齢、体重、健康状態を含む）、ならびに担当医師の判断に依存するであろう。処置投薬量は、最適には、安全性および有効性を最適化するために、滴定される。抗体、その抗原結合性断片、またはコンジュゲートは、好適には、一回、または一連の処置にわたって、患者に投与される。

【0126】

特定の実施形態によると、治療有効量は、以下の作用のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上を達成するのに十分である、治療の量を指す：（ｉ）処置しようとする疾患、障害、もしくは状態、またはそれらと関連する症状の重症度を低減または緩和すること、（ｉｉ）処置しようとする疾患、障害、もしくは状態、またはそれらと関連する症状の持続期間を低減させること、（ｉｉｉ）処置しようとする疾患、障害、もしくは状態、またはそれらと関連する症状の進行を予防すること、（ｉｖ）処置しようとする疾患、障害、もしくは状態、またはそれらと関連する症状の退縮を引き起こすこと、（ｖ）処置しようとする疾患、障害、もしくは状態、またはそれらと関連する症状の発症または発生を予防すること、（ｖｉ）処置しようとする疾患、障害、もしくは状態、またはそれらと関連する症状の再発を予防すること、（ｖｉｉ）処置しようとする疾患、障害、もしくは状態、またはそれらと関連する症状を有する対象の入院を低減させること、（ｖｉｉｉ）処置しようとする疾患、障害、もしくは状態、またはそれらと関連する症状を有する対象の入院の長さを低減させること、（ｉｘ）処置しようとする疾患、障害、もしくは状態、またはそれらと関連する症状を有する対象の生存期間を増加させること、（ｘｉ）対象における処置しようとする疾患、障害、もしくは状態、またはそれらと関連する症状を阻害または低減させること、ならびに／あるいは（ｘｉｉ）別の治療の予防作用または治療作用を増強または改善すること。

【0127】

別の態様では、本出願は、上記に記載される障害の処置、予防、および／または診断に有用な材料を含む、製品（例えば、キット）に関し、それが提供される。製品は、容器、および容器上または容器と関連するラベルもしくは添付文書を含む。好適な容器としては、例えばボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグなどが挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成することができる。容器は、組成物を、それ自体で、または状態の処置、予防、および／もしくは診断に有効な別の組成物との組合せで保持し、滅菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射用ニードルによって穿刺可能なストッパーを有する、静注バッグまたはバイアルであり得る）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本出願の抗体、その抗原結合性断片、またはコンジュゲートである。ラベルまたは添付文書は、組成物が、選択された状態を処置するために使用されることを示す。さらに、製品は、（ａ）本出願の抗体、その抗原結合性断片、またはコンジュゲートを含む組成物が中に含まれる第１の容器、および（ｂ）さらなる細胞毒性剤またはそれ以外の治療剤を含む組成物が中に含まれる第２の容器を含み得る。本発明のこの実施形態における製品は、さらに、組成物が、特定の状態を処置するために使用することができることを示す、添付文書を含み得る。必要に応じて、製品は、薬学的に許容される緩衝液、例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩水、リンガー溶液、およびデキストロース溶液を含む、第２の（または第３の）容器をさらに含み得る。これは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、ニードル、およびシリンジを含め、商業上および使用者の観点から望ましい他の材料を、さらに含んでもよい。

【0128】

実施形態
また、本発明は、以下の非限定的な実施形態を提供する。
１． 薬剤を、それを必要とする対象の脳に送達するための抗ＣＤ９８抗体またはその抗原結合性断片であって、中性ｐＨにおいて、少なくとも１ｎＭの解離定数ＫＤで、酸性ｐＨ、好ましくは、ｐＨ５において、少なくとも１０^－４秒^－１の解離速度定数ｋｄで、ＣＤ９８、好ましくは、ヒトＣＤ９８重鎖（ｈｕＣＤ９８ｈｃ）に結合する、抗ＣＤ９８抗体またはその抗原結合性断片。
１ａ． 中性ｐＨにおいて、１ｎＭ～５００ｎＭ、例えば１ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭ、５００ｎＭ、またはその間の任意の値の解離定数ＫＤを有する、実施形態１に記載の抗ＣＤ９８抗体またはその抗原結合性断片。
１ｂ． 酸性ｐＨにおいて、１０^－４秒^－１～１０^－１秒^－１、例えば１０^－４、１０^－３、１０^－２、１０^－１秒^－１、またはその間の任意の値の解離速度定数ｋｄを有する、実施形態１または１ａに記載の抗ＣＤ９８抗体またはその抗原結合性断片。
２． 中性ｐＨにおいて、２×１０^－２～２×１０^－４秒^－１、好ましくは、８×１０^－３秒^－１の解離速度定数ｋｄを有する、実施形態１～１ｂのいずれか一項に記載の抗ＣＤ９８抗体またはその抗原結合性断片。
２ａ． 中性ｐＨにおける解離速度定数ｋｄが、２×１０^－２～２×１０^－４秒^－１、例えば２×１０^－２、１×１０^－２、９×１０^－３、８×１０^－３、７×１０^－３、６×１０^－３、５×１０^－３、４×１０^－３、３×１０^－３、２×１０^－３、１×１０^－３、９×１０^－４、８×１０^－４、７×１０^－４、６×１０^－４、５×１０^－４、４×１０^－４、３×１０^－４、２×１０^－４秒^－１、またはその間の任意の値である、実施形態２に記載の抗ＣＤ９８抗体またはその抗原結合性断片。
３．
（１）重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、ならびに軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域であって、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３が、
ｉ．それぞれ、配列番号７、８、９、１０、１１および１２、
ｉｉ．それぞれ、配列番号６７、６８、６９、７０、７１および７２、
ｉｉｉ．それぞれ、配列番号８９、９０、９１、９２、９３および９４、
ｉｖ．それぞれ、配列番号１１３、１１４、１１５、１１６、１１７および１１８、
ｖ．それぞれ、配列番号１２３、１２４、１２５、１２６、１２７および１２８、
ｖｉ．それぞれ、配列番号１３３、１３４、１３５、１３６、１３７および１３８、
ｖｉｉ．それぞれ、配列番号１５０、１５１、１５２、１５３、１５４および１５５、
ｖｉｉｉ．それぞれ、配列番号１６０、１６１、１６２、１６３、１６４および１６５、
ｉｘ．それぞれ、配列番号１７０、１７１、１７２、１７３、１７４および１７５、
ｘ．それぞれ、配列番号１８０、１８１、１８２、１８３、１８４および１８５、
のアミノ酸配列を有する、重鎖可変領域および軽鎖可変領域、
または
（２）重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む重鎖の単一可変ドメイン（ＶＨＨ）であって、
ｉ．それぞれ、配列番号２９、３０および３１、
ｉｉ．それぞれ、配列番号４８、４９および５０、もしくは
ｉｉｉ．それぞれ、配列番号１４３、１４４、および１４５、
のアミノ酸配列を有する、重鎖の単一可変ドメイン（ＶＨＨ）
を含む、実施形態１から２ａのいずれか一項に記載の抗ＣＤ９８抗体またはその抗原結合性断片。
４． 配列番号２８、配列番号４７、または配列番号１４２に対して少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＶＨＨ断片である、実施形態３に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
４ａ． ＶＨＨ断片が、配列番号２８、配列番号４７、または配列番号１４２のアミノ酸配列を含む、実施形態３に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
５． 約１０～約２５アミノ酸長を有するペプチドリンカーなどのリンカーを介して軽鎖可変領域（ＶＬ）に共有結合的に連結された重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、実施形態３に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
５ａ． ＶＨが、ｓｃＦｖにあるリンカーを介してＶＬのアミノ末端に連結されている、実施形態５に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
５ｂ． ＶＨが、ｓｃＦｖにあるリンカーを介してＶＬのカルボキシ末端に連結されている、実施形態５に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
５ｃ． リンカーが、ＧｌｙおよびＳｅｒのうちの１つまたは複数を含み、１つまたは複数のＧｌｕ、Ｔｈｒ、およびＬｙｓ残基が散在しており、好ましくは、リンカーが配列番号１８９のアミノ酸配列を有する、実施形態５ａまたは５ｂに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
５ｄ． ｓｃＦｖが、それぞれ、配列番号２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、および２８４のアミノ酸配列、またはそれぞれ、配列番号２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、および２９７のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む、実施形態５ｃに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
５ｅ． ｓｃＦｖが、配列番号６、配列番号６６、配列番号８８、配列番号１１２、配列番号１２２、配列番号１３２、配列番号１４９、配列番号１５９、配列番号１６９、配列番号１７９、配列番号１９３、または配列番号２０３に対して少なくとも８０％、例えば８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態５ｃもしくは５ｄに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
５ｆ． ｓｃＦｖが、配列番号６、配列番号６６、配列番号８８、配列番号１１２、配列番号１２２、配列番号１３２、配列番号１４９、配列番号１５９、配列番号１６９、配列番号１７９、配列番号１９３、または配列番号２０３のアミノ酸配列を含む、実施形態５ｅに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
５ｇ． ｓｃＦｖが、配列番号２７８、２９１、１６２、または２１８のアミノ酸配列を含む、実施形態５ｅに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
５ｈ． 実施形態１から５ｇのいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片の同じエピトープに結合する抗体またはその抗原結合性断片。
５ｉ． ＣＤ９８に対する結合を、実施形態１から５ｇのいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片と競合する抗体またはその抗原結合性断片。
５ｊ． ｐＨ７．４において、１～５００ｎＭ、例えば１ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭ、５００ｎＭ、またはその間の任意の値の解離定数ＫＤでヒトＣＤ９８に結合する、実施形態１から５ｉのいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
５ｋ． ｐＨ５において、１０^－４～１０^－１秒^－１、例えば１０^－４、１０^－３、１０^－２、１０^－１秒^－１、またはその間の任意の値の解離速度定数ｋｄでヒトＣＤ９８１に結合する、実施形態１から５ｊのいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
６． 治療剤または診断剤に連結された、実施形態１から５ｋのいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片を含む複合体。
６ａ． 抗体またはその抗原結合性断片が、治療剤または診断剤に非共有結合的に連結されている、実施形態６に記載の複合体。
６ｂ． 抗体またはその抗原結合性断片が、治療剤または診断剤に共有結合的に連結されてコンジュゲートを形成している、実施形態６に記載の複合体。
６ｃ． 抗体またはその抗原結合性断片が、リンカーを介して治療剤または診断剤に共有結合的に連結されている、実施形態６に記載の複合体。
６ｄ． リンカーが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールのコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、多糖類、デキストラン、ポリビニルエーテル、生分解性ポリマー、重合脂質、キチン、およびヒアルロン酸、またはそれらの誘導体、またはそれらの組合せなどの非ペプチドリンカーである、実施形態６ｃに記載の複合体。
６ｅ． リンカーが、ペプチド結合によって連結された１～５０個のアミノ酸からなるペプチド鎖などのペプチドリンカーまたはその誘導体である、実施形態６ｃに記載の複合体。
６ｆ． 抗体またはその抗原結合性断片が、神経学的障害を検出するための診断剤に連結されており、好ましくは、診断剤が、陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）用の薬剤またはＩＤＫ用の薬剤である、実施形態６から６ｅのいずれか一項に記載の複合体。
６ｇ． 抗体またはその抗原結合性断片が、治療剤、好ましくは神経学的障害薬に連結されている、実施形態６から６ｅのいずれか一項に記載の複合体。
６ｈ． 神経学的障害薬が、小分子化合物、抗体、ペプチド、タンパク質、１つまたは複数のＣＮＳ標的の天然リガンド、１つまたは複数のＣＮＳ標的の天然リガンドの修飾型、アプタマー、阻害性核酸（つまり、低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）および短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））、リボザイム、および上述のものの活性断片からなる群から選択される、実施形態６ｇに記載の複合体。
６ｉ． 神経学的障害薬が、これらに限定されないが、アミロイド前駆体タンパク質またはその部分、アミロイドベータ、ベータ－セクレターゼ、ガンマ－セクレターゼ、Ｔａｕ、アルファ－シヌクレイン、パーキン、ハンチンチン、ＤＲ６、プレセニリン、ＡｐｏＥ、神経膠腫または他のＣＮＳがんマーカー、およびニューロトロフィンなどの、ＣＮＳ抗原もしくは標的分子それ自体であるかまたはそれらを特異的に認識および／もしくはそれらに対して作用する（つまり、阻害する、活性化する、または検出する）抗体、アプタマー、タンパク質、ペプチド、阻害性核酸、および小分子、ならびに上述のもののいずれかの活性断片からなる群から選択され、神経学的障害薬およびそれらを使用して治療することができる対応する障害の非限定的な例は、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、慢性脳傷害（神経発生）、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ－２）、抗上皮増殖因子受容体 脳がん、（ＥＧＦＲ）抗体、グリア細胞株由来神経因子 パーキンソン病、（ＧＤＮＦ）、脳来神経栄養因子（ＢＤＮＦ） 筋萎縮性側索硬化症、うつ病、脳のリソソーム酵素リソソーム貯蔵障害、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ） 筋萎縮性側索硬化症、ニューレグリン１統合失調症、抗ＨＥＲ２抗体（例えば、トラスツズマブ） ＨＥＲ２陽性がんからの脳転移である、実施形態６ｇに記載の複合体。
７． ＣＤ９８に結合する第１の抗原結合性領域および脳抗原（または脳標的）に結合する第２の抗原結合性領域を含む多重特異性抗体であり、第１の抗原結合性領域が、実施形態１から５ｋのいずれか一項に記載のその抗原結合性断片を含む、実施形態６に記載の複合体。
７ａ． 脳標的が、ベータ－セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）、アミロイドベータ（Ａベータ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、Ｔａｕ、アポリポタンパク質Ｅ４（ＡｐｏＥ４）、アルファ－シヌクレイン、ＣＤ２０、ハンチンチン、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）、ロイシンリッチ反復キナーゼ２（ＬＲＲＫ２）、パーキン、プレセニリン１、プレセニリン２、ガンマセクレターゼ、死受容体６（ＤＲ６）、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ｐ７５ニューロトロフィン受容体（ｐ７５ＮＴＲ）、およびカスパーゼ６からなる群から選択される、実施形態７に記載の多重特異性抗体。
７ｂ． 第２の抗原結合性領域が、ＢＡＣＥ１またはＴａｕに結合する、実施形態７ａに記載の多重特異性抗体。
７ｃ． 第１の抗原結合性領域が、第１のＦｃに共有結合的に連結されており、第２の抗原結合性領域が、第２のＦｃに共有結合的に連結されている、実施形態７から７ｂのいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
７ｄ． 第１のＦｃは、第１のＦｃと第２のＦｃとのヘテロ二量体形成を促進するために、１つまたは複数のアミノ酸残基が第２のＦｃとは異なる、実施形態７ｃに記載の多重特異性抗体。
８． 脳抗原（または脳標的）に結合する第２の抗体またはその抗原結合性断片に共有結合的に連結されている実施形態１から５ｋのいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片を含む融合構築物である、実施形態７から７ｂのいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
８ａ． 実施形態１から５ｋのいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片が、第２の抗体またはその抗原結合性断片の重鎖のアミノ末端に、好ましくはリンカーを介して共有結合的に連結されている、実施形態８に記載の融合構築物。
８ｂ． 実施形態１から５ｋのいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片が、第２の抗体またはその抗原結合性断片の軽鎖のアミノ末端に、好ましくはリンカーを介して共有結合的に連結されている、実施形態８に記載の融合構築物。
８ｃ． 実施形態１から５ｋのいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片が、第２の抗体またはその抗原結合性断片の軽鎖のカルボキシ末端に、好ましくはリンカーを介して共有結合的に連結されている、実施形態８に記載の融合構築物。
８ｄ． 実施形態１から５ｋのいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片が、第２の抗体またはその抗原結合性断片の重鎖のカルボキシ末端に、好ましくはリンカーを介して共有結合的に連結されている、実施形態８に記載の融合構築物。
９． 実施形態１から５ｋのいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片が、第２の抗体またはその抗原結合性断片の２つの重鎖のうちの一方のみのカルボキシ末端に、リンカーを介して共有結合的に連結されている、実施形態８ｄに記載の融合構築物。
９ａ． リンカーが、ＧｌｙおよびＳｅｒのうちの１つまたは複数を含むペプチドリンカーであり、好ましくは、リンカーが、配列番号１９０または配列番号１９１のアミノ酸配列を有する、実施形態８ａから９のいずれか一項に記載の融合構築物。
９ｂ． 第２の抗体またはその抗原結合性断片が、その第１の重鎖に第１のＦｃを含み、その第２の重鎖に第２のＦｃを含み、第１のＦｃは、第１のＦｃと第２のＦｃとのヘテロ二量体の形成を促進するために、１つまたは複数のアミノ酸残基が第２のＦｃとは異なる、実施形態８から９ａのいずれか一項に記載の融合構築物。
９ｃ． 第１のＦｃが１つまたは複数の「ノブ」突然変異を含み、第２のＦｃが１つまたは複数の対応する「ホール」突然変異を含むかまたはその逆であり（例えば、「ノブ・イン・ホール」突然変異については、米国特許第５，７３１，１６８号明細書、Ridgway et al., Protein Eng., 9(7): 617-621, 1996を参照。これら文献は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）、好ましくはノブ突然変異はＴ３６６Ｗであり、ホール突然変異はＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、またはＹ４０７Ｖである、実施形態７ｄに記載の多重特異性抗体または実施形態９ｂに記載の融合構築物。
９ｄ． 第１のＦｃおよび第２のＦｃの各々が、野生型ＣＨ３ドメインポリペプチドと比較して改変されたヘテロ二量体ＣＨ３ドメインを含み、好ましくは改変されたヘテロ二量体ＣＨ３ドメインが、米国特許第１０，４５７，７４２号明細書に記載の１つまたは複数の突然変異を含む、実施形態７ｄに記載の多重特異性抗体または実施形態９ｂに記載の融合構築物。
９ｅ． 第１のＦｃの改変されたヘテロ二量体ＣＨ３ドメインが、Ｔ３５０位、Ｌ３５１位、Ｆ４０５位、およびＹ４０７位にアミノ酸改変を含み、第２のＦｃの改変されたヘテロ二量体ＣＨ３ドメインが、Ｔ３５０位、Ｔ３６６位、Ｋ３９２位、およびＴ３９４位にアミノ酸改変を含む、実施形態９ｄに記載の多重特異性抗体または融合構築物。
９ｆ． Ｔ３５０位のアミノ酸修飾が、Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３５０Ｉ、Ｔ３５０Ｌ、またはＴ３５０Ｍであり、Ｌ３５１位のアミノ酸改変がＬ３５１Ｙであり、Ｆ４０５位のアミノ酸改変が、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｖ、Ｆ４０５Ｔ、またはＦ４０５Ｓであり、Ｙ４０７位のアミノ酸改変が、Ｙ４０７Ｖ、Ｙ４０７Ａ、またはＹ４０７Ｉであり、Ｔ３６６位のアミノ酸改変が、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｖ、またはＴ３６６Ｍであり、Ｋ３９２位のアミノ酸改変が、Ｋ３９２Ｆ、Ｋ３９２Ｌ、またはＫ３９２Ｍであり、Ｔ３９４位のアミノ酸改変がＴ３９４Ｗである、実施形態９ｅに記載の多重特異性抗体または融合構築物。
９ｇ． 第１のＦｃの改変されたヘテロ二量体ＣＨ３ドメインが、突然変異Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、第２のＦｃの改変されたヘテロ二量体ＣＨ３ドメインが、突然変異Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｌ、およびＴ３９４Ｗを含むか、またはその逆である、実施形態９ｅに記載の多重特異性抗体または融合構築物。
１０． 多重特異性抗体または融合構築物のＦｃ領域が、胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する第２の抗体またはその抗原結合性断片の結合を変更する（増加または減弱させる）、好ましくは増加させる置換をさらに含む、実施形態７から９ｇのいずれか一項に記載の多重特異性抗体または融合構築物。
１０ａ． 第２の抗体またはその抗原結合性断片が、融合体と胎児性Ｆｃ受容体（ＲｃＲｎ）との結合を増強する１つまたは複数の突然変異をＦｃドメインに含む、実施形態１０に記載の多重特異性抗体または融合構築物。
１０ｂ． １つまたは複数の突然変異が、酸性ｐＨにおける結合を増強させる、実施形態１０または１０ａに記載の多重特異性抗体または融合構築物。
１０ｃ． 第２の抗体のＦｃが、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ（ＹＴＥ）突然変異を有し、アミノ酸残基の番号付けが、Ｋａｂａｔに記載されるＥＵインデックスに従う、実施形態１０ｂに記載の多重特異性抗体または融合構築物。
１１． 多重特異性抗体または融合構築物のＦｃ領域が、エフェクター機能を変更する（増加または減弱させる）、好ましくは低減または排除する置換をさらに含む、実施形態７から１０ｃのいずれか一項に記載の多重特異性抗体または融合構築物。
１１ａ． 第２の抗体またはその抗原結合性断片が、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）などのエフェクター機能を低減または排除する１つまたは複数の突然変異をＦｃドメインに含む、実施形態１１に記載の多重特異性抗体または融合構築物。
１１ｂ． 第２の抗体のＦｃが、Ｌ２３４位、Ｌ２３５位、Ｄ２７０位、Ｎ２９７位、Ｅ３１８位、Ｋ３２０位、Ｋ３２２位、Ｐ３３１位、およびＰ３２９位に１つまたは複数のアミノ酸改変を有し、アミノ酸残基の番号付けが、Ｋａｂａｔに記載されるＥＵインデックスに従う、実施形態１１ａに記載の多重特異性抗体または融合構築物。
１１ｃ． 第２の抗体のＦｃが、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＰ３３１Ｓのうちの１つ、２つまたは３つの突然変異（ＡＡＳ突然変異）を有する、実施形態１１ｂに記載の多重特異性抗体または融合構築物。
１２． 第１の抗原結合性領域または抗体もしくはその抗原結合性断片がシステインを含まない、実施形態７から１１ｃのいずれか一項に記載の多重特異性抗体または融合構築物。
１３． 第２の抗原結合性領域または第２の抗体もしくはその抗原結合性断片が、Ｔａｕに結合し、好ましくは、それぞれ配列番号２１３～２１８のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、好ましくは、第２の抗体が、配列番号１１０のアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号１１１のアミノ酸配列を有する軽鎖を含むモノクローナル抗体である、実施形態７から１２に記載の多重特異性抗体または融合構築物。
１４．
（１）配列番号１３、１６、１９、２２、２５、３２、３５、３８、４１、４４、５１、５４、５７、６０、６３、７３、７６、７９、８２、８５、９５、９８、１０１、１０４、１０７、１１９、１２９、１３９、１４６、１５６、１６６、１７６、１８６、２００、２１０、および２１９からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有する、第１の重鎖と、
（２）それぞれ配列番号１４、１７、２０、２３、２６、３３、３６、４２、４５、５２、５５、５８、６１、６４、７４、７７、８０、８３、８６、９６、９９、１０２、１０５、１０８、１２０、１３０、１４０、１４７、１５７、１６７、１７７、１８７、２０１、２１１、および２２０からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を、それぞれが独立して有する、２つの軽鎖と、
（３）それぞれ配列番号１５、１８、２１、２４、２７、３４、３７、４３、４６、５３、５６、５９、６２、６５、７５、７８、８１、８４、８７、９７、１００、１０３、１０６、１０９、１２１、１３１、１４１、１４８、１５８、１６８、１７８、１８８、２０２、２１２、および２２１からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有する、第２の重鎖と
を含む、実施形態９に記載の融合構築物。
１４ａ． ２つの軽鎖が同一のアミノ酸配列を有する、実施形態１４に記載の融合構築物。
１４ｂ． ２つの軽鎖が異なるアミノ酸配列を有する、実施形態１４に記載の融合構築物。
１４ｃ．
（１）第１の重鎖が、配列番号１３、１６、１９、２２、２５、３２、３５、３８、４１、４４、５１、５４、５７、６０、６３、７３、７６、７９、８２、８５、９５、９８、１０１、１０４、１０７、１１９、１２９、１３９、１４６、１５６、１６６、１７６、１８６、２００、２１０、および２１９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、
（２）２つの軽鎖は、それぞれ配列番号１４、１７、２０、２３、２６、３３、３６、４２、４５、５２、５５、５８、６１、６４、７４、７７、８０、８３、８６、９６、９９、１０２、１０５、１０８、１２０、１３０、１４０、１４７、１５７、１６７、１７７、１８７、２０１、２１１、および２２０からなる群から選択されるアミノ酸配列をそれぞれ有し、
（３）第２の重鎖が、それぞれ配列番号１５、１８、２１、２４、２７、３４、３７、４３、４６、５３、５６、５９、６２、６５、７５、７８、８１、８４、８７、９７、１００、１０３、１０６、１０９、１２１、１３１、１４１、１４８、１５８、１６８、１７８、１８８、２０２、２１２、および２２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、
実施形態１４に記載の融合構築物。
１５． 実施形態１から５ｋのいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片または実施形態７から１４ｃのいずれか一項に記載の融合構築物をコードする、単離された核酸。
１６． 請求項１５に記載の単離された核酸を含む、ベクター。
１７． 実施形態１５に記載の核酸または請求項１６に記載のベクターを含む、宿主細胞。
１８． 実施形態１から５ｋのいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合性断片、または実施形態７から１４ｃのいずれか一項に記載の融合構築物を産生させる方法であって、抗体もしくは抗原結合性断片または融合構築物をコードする核酸を含む細胞を、抗体もしくは抗原結合性断片または融合構築物を産生させる条件下において培養するステップと、抗体もしくは抗原結合性断片または融合構築物を、細胞または細胞培養物から回収するステップとを含む、方法。
１９． 実施形態１から５ｋのいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合性断片、実施形態６から６ｉのいずれか一項に記載の複合体、または請求項７から１４ｃのいずれか一項に記載の多重特異性抗体もしくは融合構築物と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
２０． それを必要とする対象の神経学的障害を処置または検出する方法であって、実施形態１から５ｋのいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合性断片、実施形態６から６ｉのいずれか一項に記載の複合体、または実施形態７から１４ｃのいずれか一項に記載の多重特異性抗体もしくは融合構築物、または実施形態１９に記載の医薬組成物の有効量を、対象に投与するステップを含む、方法。
２１． それを必要とする対象の脳への治療剤または診断剤の送達を増加させる方法であって、対象に、実施形態１から５ｋのいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片に連結された治療剤または診断剤を含むコンジュゲートを投与するステップを含む、方法。
２２． 血液脳関門（ＢＢＢ）を越えて治療剤または診断剤を輸送する方法であって、治療剤または診断剤に連結された、実施形態１から５ｋのいずれか一項に記載の抗ＣＤ９８抗体またはその抗原結合性断片を、抗体またはその抗原結合性断片が、それに連結された薬剤が血液脳関門を越えて輸送されるように血液脳関門に曝露するステップを含む、方法。
２３． 治療剤または診断剤を、それを必要とする対象の血液脳関門（ＢＢＢ）を越えて送達する方法であって、対象に、実施形態１から５のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片に連結、好ましくは共有結合的にコンジュゲートされた治療剤または診断剤を含む複合体を投与するステップを含む、方法。
２４． 抗体依存性ファゴサイトーシス（ＡＤＰ）の誘導を、それを必要とする対象において、炎症促進性サイトカインの分泌を刺激することなく行う方法であって、対象に、実施形態１から５のいずれか一項に記載のその抗原結合性断片に連結、好ましくは共有結合的にコンジュゲートされた治療用抗体またはその抗原結合性断片を含む複合体を投与するステップを含み、治療用抗体またはその抗原結合性断片が、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）などのエフェクター機能を低減または排除する１つまたは複数の突然変異をＦｃドメインに含む、方法。
２４ａ． 治療用抗体またはその抗原結合性断片が、Ｌ２３４位、Ｌ２３５位、Ｄ２７０位、Ｎ２９７位、Ｅ３１８位、Ｋ３２０位、Ｋ３２２位、Ｐ３３１位、およびＰ３２９位に１つまたは複数のアミノ酸改変を含み、アミノ酸残基の番号付けが、Ｋａｂａｔに記載されるＥＵインデックスに従う、実施形態２４に記載の方法。
２４ｂ． 治療用抗体またはその抗原結合性断片が、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＰ３３１Ｓのうちの１つ、２つ、または３つの突然変異を含む、実施形態２４ａに記載の方法。
２５． 対象が、神経学的障害の処置を必要としており、好ましくは、神経学的障害が、神経変性疾患（例えば、レビー小体病、ポリオ後症候群、シャイ・ドレーガー症候群、オリーブ橋小脳萎縮症、パーキンソン病、多系統萎縮症、線条体黒質変性症、脊髄小脳失調症、脊髄性筋萎縮症）、タウオパチー（例えば、アルツハイマー病および核上性麻痺）、プリオン病（例えば、ウシ海綿状脳症、スクレイピー、クロイツフェルト・ヤコブ病、クールー病、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病、慢性消耗性疾患、および致死性家族性不眠症）、球麻痺、運動ニューロン疾患、および神経系ヘテロ変性障害（nervous system heterodegenerative disorder）（例えば、カナバン病、ハンチントン病、神経セロイドリポフスチン症、アレキサンダー病、トゥーレット病、メンケス症候群、コケイン症候群、ハラーホルデン・スパッツ症候群、ラフォラ病、レット症候群、肝レンズ核変性症、レッシュ・ナイハン症候群、およびウンフェルリヒト・ルントボルグ病）、認知症（例えば、ピック病および脊髄小脳失調症）、ならびにＣＮＳおよび／または脳のがん（例えば、身体の他の箇所のがんから生じる脳転移）からなる群から選択される、実施形態２０から２４ｂのいずれか一項に記載の方法。
２６． 抗体もしくはその抗原結合性断片、複合体、多重特異性抗体、融合構築物、または医薬組成物が、静脈内投与される、実施形態２０から２５のいずれか一項に記載の方法。
２７． 治療剤または治療用抗体もしくはその抗原結合性断片が、神経学的障害薬である、実施形態２０から２６のいずれか一項に記載の方法。
２８． 薬剤が、造影剤または神経学的障害を検出するための薬剤である、実施形態２０から２３のいずれか一項に記載の方法。
２９． 抗ＣＤ９８抗体もしくはその抗原結合性断片、複合体、またはその融合体が、アミノ酸輸送を妨害しない、実施形態２０から２８のいずれか一項に記載の方法。
３０． 投与が、Ｆｃによって媒介されるエフェクター機能を低減させる、実施形態２０から２９のいずれか一項に記載の方法。
３１． 投与が、急速な網状赤血球枯渇を誘導しない、実施形態２１から３０のいずれか一項に記載の方法。
３２． 治療用抗体またはその抗原結合性断片が、ｔａｕ凝集体に特異的に結合する、請求項３１に記載の方法。
３３． 対象が、霊長類、例えばヒト、より好ましくは神経学的障害を有するヒトである、実施形態２０から３２のいずれか一項に記載の方法。
３４． 神経学的障害が、アルツハイマー病（ＡＤ）、脳卒中、認知症、筋ジストロフィー（ＭＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、嚢胞性線維症、エンジェルマン症候群、リドル症候群、パーキンソン病、ピック病、パジェット病、がん、および外傷性脳傷害からなる群から選択される、実施形態３３に記載の方法。

【0129】

本発明の以下の実施例は、本発明の性質をさらに説明するためのものである。以下の実施例は本発明を限定するものではなく、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によって決定されるものであることが理解されるべきである。

【実施例】

【0130】

[実施例１]
血液脳関門（ＢＢＢ）は、有害物質の脳進入を防止し、脳恒常性にとって不可欠であるが、薬物の効率的な脳送達の場合は厄介な障害物になる。そのため、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）ブレインシャトルプラットフォームが開発された。これは、ＢＢＢを通過し、ｍＡｂ単独よりも実質的により高い脳内濃度をもたらす。

【0131】

抗体生成（ＯＭＴラットおよびＡｂｌｅｘｉｓマウス）
ＯＭＴラット（Ｌｉｇａｎｄ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓのＯｍｎｉＲａｔ（登録商標））およびＡｂｌｅｘｉｓマウス（Ａｂｌｅｘｉｓ， ＬＬＣ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に、ヒトＣＤ９８ｈｃ（配列番号１）、またはヒトＣＤ９８ｈｃ、カニクイザルＣＤ９８ｈｃ（配列番号２）、およびマーモセットＣＤ９８ｈｃ（配列番号３）で免疫付与した。ＯＭＴ免疫付与には、短期間（２８日間）および長期間のプロトコール（４８日間）の２つのプロトコールを、プロトコールごとに５匹のＯＭＴラットの免疫付与に使用した。Ａｂｌｅｘｉｓマウスには、２０または５１日間のいずれかで、Ｓｉｇｍａ／ＣＦＡアジュバントを用いて、複数部位における反復的免疫付与（ＲＩＭＭＳ）プロトコールを使用して、免疫付与を行った。簡単に述べると、動物に、流入領域リンパ節に近接した複数の皮下部位において反復的に免疫付与を行った。ＥＬＩＳＡによる血清滴定を、長期間のプロトコールについては３１日目、および短期間のプロトコールについては１４日目に、ｈｕＣＤ９８ｈｃ ＥＣＤをコーティングしたプレート（ＯＭＴ）またはｈｕＣＤ９８ｈｃを過剰発現するＣＨＯ－Ｓ細胞（Ａｂｌｅｘｉｓ）を使用して、行った。血清陽性動物からリンパ節を採取し、融合させて、ハイブリドーマを生成したか、または単一Ｂ細胞としてスクリーニングした。

【0132】

ハイブリドーマを、まず、ｈｕＣＤ９８ｈｃをコーティングしたプレートへの結合について、ＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。ヒットを、次いで、ヒト、カニクイザル（配列番号２）、マーモセット（配列番号３）、マウス（配列番号４）、およびラット（配列番号５）ＣＤ９８ｈｃをコーティングしたＥＬＩＳＡプレートに対する確認スクリーニングにおいて試験した。次いで、ｈｕＣＤ９８ｈｃまたはｃｙＣＤ９８ｈｃを過剰発現するＣＨＯ－Ｓ細胞、ｐＢＥＣＳ（初代ヒト脳内皮皮質細胞、内因性ＣＤ９８ｈｃ発現）、ならびに陰性細胞株としてのＣＨＯ親細胞を使用して、細胞に基づくスクリーニングアッセイを完了した。確認のＥＬＩＳＡの後に、９４個のヒットを選択した（融合体１から６２個のヒット、および融合体２から３２個のヒット）。ＦＡＣＳアッセイにおいて、３１個の細胞結合物質を確認することができたが、そのうち２０個は、ＥＬＩＳＡでは陽性が確認されなかった。

【0133】

アッセイし、少なくとも１つのアッセイにおいて陽性であることが見出されたすべてのクローンを、再配列し（９４個のクローン）、ＥＬＩＳＡおよび細胞結合（ＦＡＣＳ）で再測定した。１回目の確認スクリーニングのデータが、２回目の確認スクリーニングにおいて確認された。ｍＡｂを、次いで、ｐＢＥＣにおける内部移行に関して評価した。次いで、内部移行されたｍＡｂのＶ領域のシーケンシングデータを、取得した。シーケンシングデータを使用して、トリポッドｍＡｂを構築した（図１）。

【0134】

抗体生成（ラマ）
ヒトＣＤ９８ｈｃに対する単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）の生成のために、２頭のラマを、Ａｂｃｏｒｅでの免疫付与に使用した。抗体力価を、ヒトＣＤ９８ｈｃタンパク質（１μｇ／ｍｌ）を使用したＥＬＩＳＡによって判定した。２匹の動物から得た３つの採血を、試験し、両方の動物について、いずれの動物も、良好な初期力価を示した。

【0135】

ファージディスプレイは、Ａｂｃｏｒｅにおいてこの会社の標準的プロトコールを使用して行われた。２つのライブラリー：両動物の２回目の採血物に由来するライブラリー１ならびに２回目および３回目の採血物に由来するライブラリー２を作製した。１２個のランダムな個々のクローンに由来するプラスミドＤＮＡを配列決定した。＞８０％が正しいリーディングフレームを有するＶＨＨインサートを含んでいた。両ファージディスプレイライブラリーを、標準的Ａｂｃｏｒｅパニング手順を使用してヒトＣＤ９８ｈｃでスクリーニングした。１０μｇ／ｍｌのヒトＣＤ９８ｈｃを用いて３ラウンドのパニングを行った。パニングした後、９４個の個々のクローンを、プロテアーゼ活性化受容体１（Ｐａｒ１）Ｎ末端ドメインとの特異的結合およびＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）との非特異的結合についてファージＥＬＩＳＡでスクリーニングした。カニクイザル、マウス、およびラットＣＤ９８ｈｃとの交差反応性を、測定した。結合を示した９４個のクローンを、重鎖および軽鎖可変領域における配列分析に選択した。配列を使用して、トリポッドｍＡｂを構築した（図１）。

【0136】

本発明のＣＤ９８ｈｃ抗体または抗原結合性断片の例は、表１にまとめられている。

【0137】

【表1】

【0138】

トリポッド構築物の設計
ＣＤ９８に対して生成された抗体を、ＣＤ９８、およびトリポッドｍＡｂ（ＴＴＰ ｍＡｂとも称される）アーキテクチャのｓｃＦｖまたはナノボディとしてフォーマットされた非競合的ｍＡｂとの結合競合についてスクリーニングし、特徴付けた。トリポッドを使用して、目的の物質（例えば、モノクローナル抗体）を脳に送達する。より具体的には、ＣＤ９８ｈｃに対する抗体の抗原結合性断片と目的のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）との融合物を含むトリポッド構築物（図１）を、ｍＡｂがＢＢＢの通過を支援し、ｍＡｂ単独よりも実質的により高い脳内濃度のｍＡｂがもたらされるように開発した。

【0139】

例えば、トリポッドｍＡｂは、ＣＤ９８ｈｃ結合ｓｃＦｖまたはナノボディが短い可撓性リンカーを使用して１つの抗体重鎖のＣ末端に付加された治療用ｍＡｂからなる。トリポッドｍＡｂを、トランスサイトーシスを増強することが以前に記載されている特徴（Goulatis and Shusta 2017に概説されている）：原子価、結合親和性、ｐＨ依存性結合、および脳内皮細胞での迅速な内部移行について分析した。

【0140】

以下のフォーマット：Ｈｃ＿ＧＴＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴ（配列番号１８９）＿Ｌｃを使用して、ＣＤ９８ｈｃに対する抗体の重鎖および軽鎖可変配列を、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）としての単一遺伝子構築物に融合した。

【0141】

次いで、ＣＤ９８ｈｃに対するｓｃＦｖまたはＶＨＨを、ＧＧＳＧＧＳ（配列番号１９０）またはＧＧＡＧＧＡ（配列番号１９１）のいずれかのリンカーを使用して、目的の抗体の一方の重鎖のＣ末端に融合させた。ＣＨ３のＺｙｍｅｗｏｒｋｓヘテロ二量体化突然変異（Zymeworks heterodimerization mutation）を、抗体Ｈｃ（Ｈｃ Ａ：Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ；Ｈｃ Ｂ：Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ）に使用して、トリポッド構築物（図１）を生成した。これは、トリポッドｍＡｂとも呼ばれる。トリポッドｍＡｂは、同一のアミノ酸配列を有する２つの軽鎖、及び異なるアミノ酸配列を有する２つの重鎖を含む。２つの重鎖のうちの１つのみが、本発明のＣＤ９８抗体のｓｃＦｖまたはＶＨＨに融合されており、２つの重鎖は定常領域も異なり、２つの重鎖間のヘテロ二量体化が促進される。したがって、本出願の一実施形態による各トリポッドｍＡｂは、３つのアミノ酸配列：ＣＤ９８抗体の抗原結合性断片に融合されている第１の重鎖のアミノ酸配列、軽鎖のアミノ酸配列、およびＣＤ９８抗体の抗原結合性断片に融合されていない第２の重鎖のアミノ酸配列に関連付けられる。

【0142】

トリポッド発現および精製
トリポッドｍＡｂを、ＣＨＯ－Ｅｘｐｉ細胞で発現させ、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー、続いてサイズ排除クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーを使用して精製した。

【0143】

作製したトリポッドｍＡｂの例は、表１ａに示されている。

【0144】

【表2】

【0145】

細胞結合およびＣＤ９８ｈｃ特異性
ヒト脳内皮細胞（ｈＣＭＥＣＤ３、５０，０００細胞）を１０ｕｇ／ｍＬの精製トリポッドｍＡｂと共にインキュベートし、１０×モル濃度のｈｕＣＤ９８ｈｃ（配列番号１）の存在下で４℃にて一晩のインキュベートを可能にした。翌朝、細胞を固定および洗浄し、二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｅｎｃｅｓ カタログ番号１０９－５４６－１７０）と共にインキュベートし、再度洗浄し、次いでＦＡＣＳで分析した。陽性結合物質は、結合シグナルがアイソタイプ対照の３倍を超えるものであると規定した（表２）。

【0146】

【表3】

【0147】

ＣＤ９８ｈｃ機能性評価
ｈＣＭＥＣＤ３細胞を、白色の不透明３８４ウェルプレートに播種し、３７℃で一晩インキュベートした。翌日に、細胞を、３７℃で３０分間、ナトリウム不含リンガー溶液で洗浄し、パルスした。細胞を、ナトリウム不含リンガー溶液でもう一度洗浄し、抗ＣＤ９８ｈｃ抗体（１４０ｎＭ）、またはＬＡＴ阻害剤ＢＣＨ（５０ｍＭ）およびＴ３（２００μＭ）を、細胞に添加した。次いで、Ｌ－［３，４，５－３Ｈ（Ｎ）］－ロイシン（０．４μＣｉ）を添加し、５分間のインキュベーションの後に、細胞を、氷冷ナトリウム不含リンガー溶液で２回洗浄し、０．２Ｎ ＮａＯＨ溶液中の０．２％ ＳＤＳで、細胞を溶解させた。ライセートを、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ－ＰＳ溶液とともに室温で１時間インキュベートし、シンチレーション計数を、Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ ＴｏｐＣｏｕｎｔ ＮＸＴ機器で得た。アンタゴニスト活性の基準は、Ｚｙｍｅｗｏｒｋｓトリポッドアイソタイプ対照［平均－（３×標準偏差）］と比べた^３Ｈ－ロイシンの阻害であった（図２）。この基準に基づくと、試験抗体はいずれも、^３Ｈ－ロイシン取込みの阻害を示さなかったが、ＢＣＨおよびＴ３ ＬＡＴ阻害剤の両方が、^３Ｈ－ロイシン取込みの有意な阻害を示した。ＣＮＴＯ３９３０（ｈＩｇＧ１アイソタイプ対照）が、追加の陰性対照として含まれ、活性を示さなかった。

【0148】

内部移行
ヒト脳内皮細胞（ｈＣＭＥＣＤ３）を、コラーゲンコーティング３８４ウェルＣｅｌｌ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｕｌｔｒａプレート（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）に１０，０００細胞／ウェルで播種し、加湿インキュベーター内で１６時間３７℃にて付着を可能にした。次いで、細胞（５０，０００細胞）を、２００ｕｇ／ｍＬの精製トリポッドｍＡｂと共にインキュベートし、３７℃で１時間のインキュベートを可能にした。細胞を固定し、洗浄し、蛍光標識二次抗体と共に１時間インキュベートした。次いで、細胞を再度洗浄し、蛍光標識アクチン染色剤ファロイジンおよび核染色剤Ｈｏｅｓｃｈｓｔ３３３４２と共にインキュベートした。細胞を再度洗浄し、ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ Ｍｉｃｒｏ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を４０×対物レンズで使用して画像化した。ｍＡｂの内部移行は、ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ ６．０を使用して、ファロイジンとの共局在化に基づいて特定した（図３の例）。ｍＡｂはすべて、内部移行について陽性だった。

【0149】

親和性分析＆ｐＨ依存性結合、種間交差反応性
親和性測定のさらなる正確性を得るために、ｈｕＣＤ９８ｈｃに対するトリポッドｍＡｂ親和性を、ＢｉｏＲａｄ、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６システムで表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）を使用して決定した。Ｆｃ捕捉表面は、アミンカップリング化学（ＢｉｏＲａｄ）を使用して抗ＩｇＧ Ｆｃ ｍＡｂ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）をＧＬＣチップ（ＢｉｏＲａｄ）にカップリングすることによって生成した。トリポッドｍＡｂを、０．３ｕｇ／ｍＬの濃度を使用して捕捉し、約２００ＲＵの目標密度を得るために６０ｕＬ／分で３０秒間流し、次いでｈｕＣＤ９８ｈｃを、固定化されたトリポッドｍＡｂに対して６．２５～４００ｎＭ、８００ｎＭ、または１００～１６００ｎＭ（４倍系列希釈）の濃度で４分間（５０μＬ／分で）流して結合させ、続いて５０ｕＬ／分で３０分間解離させた。１００ｍＭ Ｈ_３ＰＯ_４（Ｓｉｇｍａ）を１００μＬ／分で２回１８秒間パルスすることによって、チップ表面を再生した。収集したデータを、ＰｒｏｔｅＯｎ ＭａｎａｇｅｒソフトウェアＶ３．１．０．６（ＢｉｏＲａｄ）を使用して処理した。まず、インタースポットを使用してデータのバックグラウンドを補正した。次いで、分析物を注入するための緩衝剤を注入することによって、データの二重参照減算を実施した。ラングミュア１：１結合モデルを使用して、データの動力学的分析を実施した。各ｍＡｂの結果を、Ｋａ（オンレート）、Ｋｄ（オフレート）、およびＫＤ（平衡解離定数）の形式で報告した（表３および３ａ）。

【0150】

【表4】

【0151】

【表5】

【0152】

ｐＨ依存性結合を、上述のＳＰＲ（ｐｒｏｔｅｏｎ）法を使用して評価したが、ビオチニル化ＣＤ９８ｈｃを、ストレプトアビジンチップに固定化し、解離中に緩衝液のｐＨを７．４から６．５、さらに６．０へと段階的に下げたことを除く。個々のセンサグラムを評価し、ｐＨが減少するにつれて解離速度が速くなった場合には、ｐＨ依存性結合についてスコア付けした（図４の例）。

【0153】

種間交差反応性を、結合親和性を判定するためのものと同じ方法を使用して評価したが、使用したＣＤ９８ｈｃが、カニクイザル（配列番号２）、マーモセット（配列番号３）、マウス（配列番号４）、およびラット（配列番号５）であったことを除く。ラット交差反応性ｍＡｂもマウス交差反応性ｍＡｂも、特定されなかった。カニクイザルおよびマーモセット交差反応性トリポッドｍＡｂが、特定された（表４）。

【0154】

【表6】

【0155】

ｃｙｎｏ研究のためのｍＡｂの選択および抗Ｔａｕ ｍＡｂに融合させたブレインシャトルの評価
ＣＤ９８ｈｃ標的指向性トリポッドｍＡｂがヒトにおいて治療用抗体脳曝露を増強する能力を確認するためには、非ヒト霊長類において脳への送達の増強を示すことが重要である。ＢＢＢＢ５７８、ＢＢＢＢ４４８、およびＢＢＢＢ５８４を、カニクイザルＰＫ研究に選択した。抗ＣＤ９８ｈｃ ｓｃＦｖを、抗Ｔａｕ ｍＡｂ、ＰＴ１Ｂ８４４（配列番号１１０、１１１）に融合させて、ＢＢＢＢ１０６７／ＢＢＢＢ１０６５（配列番号７６、７７、７８／配列番号７９、８０、８１）、ＢＢＢＢ１０６１（配列番号３５、３６、３７）、およびＢＢＢＢ１０７０（配列番号９８、９９、１００）を生成した。ｈｕＣＤ９８ｈｃに対する親和性を測定すると（表５）、抗Ｂ２１Ｍ ｍＡｂに融合した場合の結合と類似であった。

【0156】

【表7】

【0157】

以前の研究と同様に内部移行も評価した。抗Ｔａｕ ｍＡｂとブレインシャトルとの融合は、ヒト脳内皮細胞に内部移行するその能力に影響を及ぼさなかった（図５）。

【0158】

抗ＴａｕブレインシャトルｍＡｂのＣｙｎｏ薬物動態
カニクイザルに、ＩＶ注射（緩徐ボーラス）によって試験物質を表示用量で投与した。予定の時点で、上半身を生理食塩水で最低５分間灌流した後、カニクイザル脳を収集し、冷却生理食塩溶液ですすいだ。所定の脳位置を単離し、液体窒素で瞬間凍結し、組織ホモジナイズおよび毛細血管枯渇処理まで－８０℃で保管した。

【0159】

ＢＢＢＢ１０６７、ＢＢＢＢ１０６１、およびＢＢＢＢ１０７０を、非ブレインシャトル対応化ｍＡｂ ＰＴ１Ｂ８４４およびＰＴ１Ｂ９１６と共に１０ｍｇ／ｋｇでカニクイザルにｉ．ｖ．投与した。血漿を、４、２４、および７２時間時に試料採取した。上半身を生理食塩水で最低で５分間灌流した後、カニクイザル脳を収集し、冷却生理食塩溶液ですすいだ。所定の脳位置を単離し、液体窒素で瞬間凍結し、組織ホモジナイズおよび毛細血管枯渇処理まで－８０℃で保管した。

【0160】

毛細血管枯渇脳組織ライセートの試料調製のために、収集した脳位置の個々の組織重量を得た。脳組織試料を、プロテアーゼ阻害剤（Ｐｉｅｒｃｅ；Ａ３２９５５）を含む計算体積の改変ｄＰＢＳ緩衝剤（組織１ｍｇ当たり２．５μＬの緩衝剤）に添加し、溶解マトリックスＤ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ（商標）；６９１３－１００）チューブに移した。Ｂｅａｄ Ｒｕｐｔｏｒ ２４ Ｅｌｉｔｅ（Ｏｍｎｉ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使用して、組織試料を２．９ｍ／ｓで１５秒間ホモジナイズした。全細胞懸濁物を新しいチューブに移し、等体積の２６％デキストラン緩衝剤と混合した（最終デキストラン濃度１３％）。混合組織ホモジネートを２，０００ｇで１０分間４℃にて遠心分離した。上部層（毛細血管枯渇画分）を残りの試料から慎重に分離し、１０×ＲＩＰＡ溶解緩衝剤（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（商標）；２０－１８８）を含む新しいチューブに移した。溶解緩衝剤を加えた毛細血管枯渇試料を十分にボルテックスし、１４，０００ｒｐｍで３０分間４℃にて遠心分離し、上清を新しいチューブに移した。脳組織試料溶解物は、－７０℃で凍結保管したか、またはＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ（商標）；２３２２７）を使用してタンパク質濃度を測定したかのいずれかだった。最終的な脳組織試料ライセートを、ＢＢＢ対応化ｍＡｂのイムノアッセイ決定前に、７ｍｇ／ｍＬの総タンパク質濃度に対して正規化した。

【0161】

ＰＫ評価のために、カニクイザル脳組織におけるＢＢＢ対応化ｍＡｂの濃度を、典型的なサンドイッチイムノアッセイ形式で開発されたＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ（登録商標）、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）ＥＣＬＩＡ技術を使用して判定した。アッセイは、ＭＳＤ Ｇｏｌｄ（商標）Ｓｍａｌｌ Ｓｐｏｔストレプトアビジン９６ウェルプレート（カタログ：Ｌ４５ＳＡ）で実行した。ストレプトアビジンコーティングプレートを、１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で３０分間室温にてブロッキングした。５０％ナイーブｃｙｎｏ脳組織ライセートを新たに系列希釈して、標準曲線を作成した。作業アッセイ濃度の２×のナイーブｃｙｎｏ脳組織ライセートで調製した凍結品質管理対照（ＱＣ）を希釈し、各アッセイで試験した。捕捉（ビオチン化抗ヒトＦｃ ｍＡｂ、１μｇ／ｍＬ）および検出（ルテニウム標識抗ヒトＦｃ ｍＡｂ、０．５μｇ／ｍＬ）試薬を含むマスターミックスを、希釈した標準物質、ＱＣ、および試料とアッセイプレートにて１：１体積比で一緒にした。混合物を室温で振盪しながら１時間インキュベートした。アッセイプレートを洗浄し、ＭＳＤ Ｔ読取用緩衝剤（１×）をすべてのウェルに添加した。生データ値を、ＭＳＤ ＳＥＣＴＯＲ（登録商標）Ｓ６００イメージャーで読み取った。アッセイの標準曲線範囲を、最小必要試料希釈（ＭＲＤ）が１：２の１～５１２ｎｇ／ｍＬにて試験し、脳組織ライセートでは２ｎｇ／ｍＬの感度限界が得られた。生ＥＣＬ計数を含むＭＳＤ出力ファイルを、Ｗａｔｓｏｎ ＬＩＭＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にインポートし、次いで１／Ｆ２加重による５パラメーターロジスティックフィッティングで回帰分析した。

【0162】

様々な区域にわたって４つのｍＡｂの脳内濃度を判定した（図６）。すべてのブレインシャトル含有ｍＡｂは、脳のすべての領域において、非ブレインシャトル含有ｍＡｂよりも増加した脳曝露を有した。データを、脳１ｋｇ当たりの注射用量％に変換し、領域にわたって平均すると、ブレインシャトルｍＡｂについて、脳内濃度における１６倍の改善が実現した。

【0163】

ＣＤ９８ｈｃの広範な組織発現に起因して、ＦｃｇＲに結合することができるトリポッドｍＡｂは、様々な組織でＡＤＣＣ／ＡＤＣＰを誘導し得る。この可能性を回避するために、「ＡＡＳ」突然変異をトリポッドｍＡｂに導入することによって、エフェクターサイレントＦｃを利用した。ＡＤＣＣ／ＡＤＣＰを回避することは、治療用ｍＡｂの安全性にとって重要な特徴であるが、１つの可能性のある治療的作用機序は、Ｔａｕ凝集体のＦｃ依存性ミクログリアファゴサイトーシスに依存する。ブレインシャトルｍＡｂがＦｃγＲに結合する能力を阻害することによって、ｍＡｂは、ミクログリア細胞上のＦｃγＲに結合してＴａｕ凝集体のファゴサイトーシスを促進することができなくなるであろう。しかしながら、本発明者らのブレインシャトルによって、ＣＤ９８ｈｃに媒介される非Ｆｃ依存性内部移行を通じた新規なミクログリア取込み機序が、利用される。

【0164】

ミクログリア細胞におけるＴａｕ凝集体の取込みを促進するＡＡＳ ＩｇＧ１トリポッドｍＡｂの能力を評価するために、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来するヒトミクログリアを、３８４ウェルのＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｕｌｔｒａプレートに、プレート当たり７０００個の細胞の希釈で播種し、Ｇｌｕｔａｍａｘ＋、ペニシリン／ストレプトマイシン、ＩＬ３４（１００ｎｇ／ｍｌ）、およびＧＭＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を含むアドバンストＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で維持した。アッセイの当日、ビオチニル化ホスホ－ｔａｕオリゴマー［配列：ＳＣＢｉｏｔ－（ｄＰＥＧ４）ＧＴＰＧＳＲＳＲ（ｐＴ）ＰＳＬＰ（ｐＴ） ＰＰＴＲＥＰＬＬ－アミド（配列番号１９２）］を、１５倍モル過剰のストレプトアビジンＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ４８８（ＡＦ４８８）と複合体を形成させた。次いで、標識ホスホＴａｕオリゴマーが、およそ２×モル過剰の試験ｍＡｂと結合することを室温で３０分間可能にした。次いで、ｍＡｂ：Ｔａｕオリゴマー複合体を、２０μｌ／ウェルでミクログリアに送達した。インキュベーションの２、４、および８時間後に、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドの存在下で１５分間室温にて固定した。固定した後、細胞を再びＰＢＳで２回洗浄し、透過処理緩衝剤（０．１％サポニン＋１％魚皮ゼラチン）中４μｇ／ｍｌの濃度の、リソソームのマーカーであるＬＡＭＰ１一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ６４７にコンジュゲートした透過処理緩衝剤中１μｇ／ｍｌの二次抗体で１時間４℃にて染色した。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ中１μｇ／ｍｌのヘキストＤＮＡ染色剤で１０分間室温にて対比染色した。次いで、細胞を最後にもう１回ＰＢＳで洗浄し、１ウェル当たり２０μｌのＰＢＳに再懸濁し、Ｏｐｅｒａ Ｐｈｅｎｉｘ共焦点ハイコンテント顕微鏡で画像化した。取得した画像を、ＨａｒｍｏｎｙおよびＩｍａｇｅＪ分析ソフトウェアを使用して分析した。１条件当たりおよそ５００個の細胞を、ファゴリソソーム構造内のＴａｕオリゴマーの存在についてスコア化し、ＬＡＭＰ１抗体で標識した。

【0165】

ブレインシャトルｍＡｂ ＢＢＢＢ１０６７は、ファゴソーム内への同等の取込みを、非ブレインシャトルｍＡｂ、ＰＴ１Ｂ８４４よりも促進し（図７）、予想外なことには、ＢＢＢＢ１０６５が、さらに悪かった。こうしたデータは、ＦｃγＲとの結合を排除しも、抗Ｔａｕ ｍＡｂの治療有効性に影響を及ぼさないはずであることを示している。実際、ＣＤ９８ｈｃ媒介性内部移行およびファゴリソソームへの輸送は、ミクログリアでは、従来のＦｃγＲ媒介性ファゴサイトーシスよりも効率的であると思われる。

【0166】

考察
受容体媒介性トランスサイトーシスに基づく最適化脳送達プラットフォームを実現するために、ｐＨ依存的様式にて一連の親和性でヒトＣＤ９８ｈｃに特異的に結合するｍＡｂを生成した。結合親和性とトランスサイトーシス効率との関係性は、平衡解離定数Ｋ_Ｄに焦点を当てた数多くの出版物に広範に取り上げられている。Ｋ_Ｄは重要な尺度であるが、驚くべきことに、トランスサイトーシスに関しては、結合動態ｋ_ａおよびｋ_ｄが重要であることが本発明にて実証された。本発明者らは、送達される治療用ｍＡｂの効率的なトランスサイトーシスおよび薬物動力学的活性のために、オンレートおよびオフレートの両方を最適化する必要があることを発見した。こうした結果に基づくと、最適なトランスサイトーシスは、例えば、ｋ_ａ≧１０^５Ｍ^－１ｓ^－１および中性ｋ_ｄ＝８×１０^－３秒^－１の場合に生じる。理論に束縛されることは望まないが、オンレートとオフレートとの相互関係は、分極細胞でのタンパク質輸送に関与する多様な細胞内小胞による効率的な経細胞輸送を確保するために重要であるという仮説が立てられる。

【0167】

カニクイザルにトリポッドｍＡｂを投薬すると、対照ｍＡｂよりも１６×の脳内濃度の増強がもたらされることが示された。酸性ＦｃＲｎ結合の増加は、末梢クリアランスの低減および脳内濃度の増強をもたらした。通常の生理学的条件下では、脳からのＦｃＲｎ媒介性抗体排出は、脳内の望ましくない炎症および免疫応答を回避することによって脳恒常性を維持する上で重要である可能性が高い（Schlachetzki, Zhu et al. 2002, Roopenian and Akilesh 2007）。有力な証拠が、ＦｃＲｎ媒介性抗体流出に果たす役割が強力であることを示唆するが、このクリアランス機序については議論の余地が残っている（Garg and Balthasar 2009, Abuqayyas and Balthasar 2013）。本発明者らは、ＦｃＲｎに対する結合親和性の増加が、末梢濃度および脳内濃度の両方に肯定的な影響を及ぼすことを発見した。これは、この系ではいかなる排出増強もあまり著しいものではないことが示唆される。

【0168】

Ｆｃ突然変異誘発の明らかな欠点は、治療用ｍＡｂからエフェクター機能が排除されることである。ベータアミロイドおよびＴａｕのような、脳内の多くの治療標的にとって、ＡＤＰは、有効性に重要であると考えられている。本発明者らは、多価積荷のこの内因性転送を、ＡＤＰの代替的非古典的非ＦｃγＲ機序として使用することができることを示した。非古典的および古典的ＡＤＰによって内部移行されたＴａｕは、ミクログリアでは同様に輸送され、Ｔａｕ凝集体は、分解のためにエンドリソソーム系からリソソームへと輸送される。記載されている非古典的ＡＤＰは、有効性のためにはＡＤＰを必要とするが、安全性のためには古典的ＡＤＰが有害である様々な治療適用に活用することができる。

【0169】

データは、非古典的ＡＤＰが、古典的ＡＤＰよりも効率的であることを示す。マクロファージ疲弊に関する観察は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび患者において行われており（Baig, 2014）、この疲弊表現型が、エフェクター機能を有するｍＡｂの治療有効性に影響を及ぼし得ることを示している。非古典的ＡＤＰは、有効性の利点を提供し、ＦｃγＲと結合することでミクログリアを活性化することなくＡＤＰを媒介することによって、この枯渇表現型を回避する。

【0170】

非古典的ＡＤＰの別の利点は、ミクログリアの活性化を回避することによって、炎症促進性サイトカインの産生を刺激することなくＡＤＰが生じることである。脳、特に、慢性神経炎症をすでに罹患している患者における増加している神経炎症の近傍において疾患を処置する際にエフェクター機能コンピテントｍＡｂを使用することの安全性に関しては、議論の余地が残っている（Heneka, et al. Lancet Neurol. 2015 Apr; 14(4): 388-405において概説されている）。加えて、炎症の増加が関与すると考えられる神経変性疾患の病因において炎症が果たす役割、ならびに議論中のすでに疲弊している可能性のあるミクログリアに係合するかまたはそれをさらに活性化する能力に対する注目が高まっている。例えば、ニューロンに対する古典的なＡＤＰの毒性の影響が示されており、エフェクター機能コンピテントｍＡｂが、安全上のリスクを呈する可能性があるという仮説が立てられていた（Lee, etal. 2016）。結論として、ロバストな脳送達プラットフォームは、薬物動態、薬物動力学、および安全性が特徴付けられており、臨床試験に進むために必要なロバストな前臨床特徴付けが確立されている。

【0171】

最適化されたブレインシャトルを、Ｔａｕに結合するｍＡｂであるＰＴ１Ｂ８４４に融合させた。ＰＴ１Ｂ８４４に融合させたブレインシャトルは、カニクイザルにおいて静脈内投薬した場合に、脳内濃度に１６倍の改善を示した。脳内濃度の向上は、文献に報告されている最良のブレインシャトルを上まわった。優れた脳ＰＫに加えて、本ブレインシャトルは、Ｆｃによって媒介されるエフェクター機能を低減させるように遺伝子操作されており、競合者によって報告されているようなカニクイザルでの急速な網状赤血球枯渇を誘発しない。重要なことに、ブレインシャトルは、ミクログリアによるＴａｕ取込みの媒介が、ＰＴ１Ｂ８４４単独よりも効率的であるため、Ｆｃ機能の喪失は、治療用Ｔａｕ ｍＡｂの有効性に影響を及ぼさない。

【0172】

[実施例２]
選択した抗ＣＤ９８ブレインシャトルを、プロトタイプの抗ＢＡＣＥ（β－セクレターゼ）ｍＡｂに融合させ、上述のものと同じ方法を使用して、結合親和性を再評価した。抗ＣＤ９８ブレインシャトルの親和性は、Ｂ２１Ｍ ｍＡｂ（抗ヒト呼吸器合胞体ウイルス）および抗ＢＡＣＥアンタゴニストｍＡｂに融合した場合に、同様となることが予測される。選択した分子の内部移行について評価するが、これは、抗ＣＤ９８ブレインシャトルをＢ２１Ｍ ｍＡｂに融合した場合に観察される内部移行から変化しないことが見出されると予測されるであろう。

【0173】

抗ＣＤ９８ブレインシャトルのいずれも、マウスまたはラットＣＤ９８に結合しなかったため、抗ＢＡＣＥアンタゴニストｍＡｂを使用して、ｈｕＣＤ９８ｈｃノックイン（ＫＩ）マウスにおいてｉｎ ｖｉｖｏげっ歯動物研究を実施することになる。抗ＢＡＣＥアンタゴニストｍＡｂは、脳内に輸送されるｍＡｂの量を反映するＢＡＣＥ１の阻害を（その産物であるペプチドＡβ１～４０の濃度を通じて）測定するためのモデルＰＤ系として選択した。

【0174】

最初のｉｎ ｖｉｖｏ研究では、ｈｕＣＤ９８ｈｃマウスの網膜におけるＰＫ／ＰＤ関係性を評価することになる。ノックイン（ＫＩ）マウスに、１０ｍｇ／ｋｇの抗ＢＡＣＥアンタゴニストｍＡｂおよび対照ｍＡｂを静脈内投薬する。投薬の４時間および２４時間後に、眼および血漿を採取することになる。予定の時点で、マウスをイソフルランの吸入で麻酔することになる。５ｍＬの０．９％生理食塩溶液で全身灌流した後で、ＫＩマウスからマウス眼を収集することになる。収集した眼試料（視神経を除く）を、液体窒素で瞬間凍結し、組織をホモジナイズするまでまたは免疫組織化学用に調製するまで－７０℃で保管することになる。

【0175】

ＢＡＣＥ活性測定は、マウス眼を溶解マトリックスＤチューブ中でホモジナイズすることによって行うことになる（脳重量１ｍｇ当たり８μｌの０．４％ＤＥＡ／５０ｍＭ ＮａＣｌ、Ｆａｓｔ Ｐｒｅｐ－２４で６回／振盪／秒で２０秒間）。次いで、チューブを、最高速度に設定したＥｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離機で５分間４℃にて遠心分離することになる。次いで、ホモジネート（上清）を予冷チューブに移すことになり、次いでそれを１３，０００ｒｐｍで７０分間４℃にて遠心分離した。次いで、上清を１０％の０．５Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣＬを含むチューブに移し、アッセイまで－８０℃で凍結することになる。Ａβ１～４０ペプチド標準物質および解凍処理された眼ホモジネートを、ルテニウム（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）、Ｒ９１ＡＮ－１）標識抗Ａβ抗体と１：１で事前に複合体化させる。Ａβ１～４０に対する捕捉抗体を含むブロックキングされたプレートに５０ｕｌの複合体を添加することになる。振盪せずに２～８℃で一晩インキュベーションした後、プレートを洗浄し、２×読取用緩衝剤（ＭＳＤ、Ｒ９２ＴＣ－１）を添加することになる。Ｍｅｓｏ Ｓｅｃｔｏｒ Ｓ６００（ＭＳＤ、ＩＣ０ＡＡ）を使用してプレートを読み取ることになる。

【0176】

当業者であれば、その幅広い発明概念から逸脱することなく、上記に記載の実施形態に変更をなすことができることを理解するだろう。したがって、本発明は、本開示の特定の実施形態に限定されず、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨および範囲内の改変を包含することが意図されていることが理解される。

【0177】

引用文献

【0178】

【表8】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【配列表】

2023520811000001.app

【国際調査報告】