特表 2023-520871 核酸品質決定のための組成物および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-05-22

(54)【発明の名称】核酸品質決定のための組成物および方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/686 20180101AFI20230515BHJP

   C12Q 1/6806 20180101ALI20230515BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20230515BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/686 Z

C12Q1/6806 Z

C12N15/09 Z ZNA

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022559378

(86)(22)【出願日】2021-03-30

(85)【翻訳文提出日】2022-11-11

(86)【国際出願番号】 US2021024962

(87)【国際公開番号】W WO2021202583

(87)【国際公開日】2021-10-07

(31)【優先権主張番号】63/002,785

(32)【優先日】2020-03-31

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521209823

【氏名又は名称】パーソナル ゲノム ダイアグノスティクス インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】トンプソン， ジョン エフ．

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA13

4B063QQ42

4B063QR08

4B063QR32

4B063QR62

4B063QS25

(57)【要約】

第１のプライマーセットおよび第２のプライマーセットを含む、サンプル中の核酸の品質を決定するための組成物および方法が本明細書で提供される。さらに、本明細書では、反復核酸配列の増幅のためのプライマーセットを含む、サンプル中の核酸の品質を決定するための組成物および方法が提供される。本発明は、一般に、サンプル中の核酸の品質の決定に関し、より具体的には、ライブラリー調製および配列決定の前に核酸の品質を決定することに関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

サンプル中の核酸の品質を決定するためのシステムであって、
（ａ）複数の第１のフォワードプライマーおよび複数の第１のリバースプライマーを含む第１のプライマーセットであって、各第１のフォワードプライマーおよび各第１のリバースプライマーは、
（ｉ）前記核酸中の反復配列と相補性を有しかつ第１の融解温度を有する３’末端配列と、
（ｉｉ）前記核酸に存在せずかつ第２の融解温度を有し、前記第２の融解温度が前記第１の融解温度よりも高い、５’末端共通配列と
を含む、第１のプライマーセットと、
（ｂ）複数の第２のフォワードプライマーおよび複数の第２のリバースプライマーを含む第２のプライマーセットであって、各第２のフォワードプライマーおよび各第２のリバースプライマーが５’末端共通配列を含む、第２のプライマーセットと
を含む、システム。

【請求項2】

前記第２の融解温度が前記第１の融解温度よりも約５℃～２５℃高い、請求項１に記載のプライマーのシステム。

【請求項3】

前記第１の融解温度が約４５℃～７０℃である、請求項１に記載のプライマーのシステム。

【請求項4】

前記第２の融解温度が約６０℃～８５℃である、請求項１に記載のプライマーのシステム。

【請求項5】

前記第１のプライマーセットが、等しい数の第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーを含む、請求項１に記載のプライマーのシステム。

【請求項6】

前記第１のプライマーセットが、等しくない数の第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーを含む、請求項１に記載のプライマーのシステム。

【請求項7】

前記第２のプライマーセットが、等しい数の第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーを含む、請求項１に記載のプライマーのシステム。

【請求項8】

前記第２のプライマーセットが、等しくない数の第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーを含む、請求項１に記載のプライマーのシステム。

【請求項9】

前記第１のプライマーセットが、約１～２０の第１のフォワードプライマーおよび約１～２０の第１のリバースプライマーを含む、請求項１に記載のプライマーのシステム。

【請求項10】

前記第２のプライマーセットが、約１～２０の第２のフォワードプライマーおよび約１～２０の第２のリバースプライマーを含む、請求項１に記載のプライマーのシステム。

【請求項11】

前記反復核酸配列がレトロトランスポゾンを含む、請求項１に記載のプライマーのシステム。

【請求項12】

前記レトロトランスポゾンがＬ１レトロトランスポゾンである、請求項１１に記載のプライマーのシステム。

【請求項13】

各第１のフォワードプライマーの前記５’末端共通配列が配列番号１の配列を含む、請求項１に記載のプライマーのシステム。

【請求項14】

各第１のリバースプライマーの前記５’末端共通配列が配列番号２の配列を含む、請求項１に記載のプライマーのシステム。

【請求項15】

各第１のフォワードプライマーの前記３’末端配列が、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号８、またはそれらの任意の組み合わせの配列を含む、請求項１に記載のプライマーのシステム。

【請求項16】

各第１のリバースプライマーの前記３’末端配列が、配列番号７、配列番号１０、配列番号１２、またはそれらの任意の組み合わせの配列を含む、請求項１に記載のプライマーのシステム。

【請求項17】

サンプル中の核酸の品質を決定する方法であって、（ａ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）混合物を調製するステップであって、
（ｉ）複数の第１のフォワードプライマーおよび複数の第１のリバースプライマーを含む第１のプライマーセットであって、各第１のフォワードプライマーおよび各第１のリバースプライマーは、
（ｉ）前記核酸中の反復配列と相補性を有しかつ第１の融解温度を有する３’末端配列と、
（ｉｉ）前記核酸に存在せずかつ第２の融解温度を有し、前記第２の融解温度が前記第１の融解温度よりも高い、５’末端共通配列と
を含む、第１のプライマーセットと、
ｉｉ）複数の第２のフォワードプライマーおよび複数の第２のリバースプライマーを含む第２のプライマーセットであって、各第２のフォワードプライマーおよび各第２のリバースプライマーが５’末端共通配列を含む、第２のプライマーセットと
を含む、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）混合物を調製するステップと、
（ａ）前記サンプルに対して第１のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うステップであって、前記第１のＰＣＲの各サイクルの第１の伸長ステップが、前記第１の融解温度程度の温度である、ステップと、
（ｂ）前記サンプルに対して第２のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うステップであって、前記第２のＰＣＲにおける各サイクルの第２の伸長ステップが、前記第２の融解温度程度の温度である、ステップと、
（ｃ）アンプリコンのサイズ範囲を決定するステップと
を含む、方法。

【請求項18】

前記第２の融解温度が前記第１の融解温度よりも約５℃～２５℃高い、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記第１の融解温度が約４５℃～７０℃である、請求項１７に記載の方法。

【請求項20】

前記第２の融解温度が約６０℃～８５℃である、請求項１７に記載の方法。

【請求項21】

前記第１の伸長ステップが、前記第１の融解温度よりも約５℃低い温度から前記第１の融解温度よりも５℃高い温度であり、前記第２の融解温度よりも少なくとも５℃低い温度である、請求項１７に記載の方法。

【請求項22】

前記第２の伸長ステップが、前記第２の融解温度より約５℃低い温度から前記第２の融解温度よりも５．０℃高い温度であり、前記第１の融解温度より少なくとも５℃高い温度である、請求項１７に記載の方法。

【請求項23】

前記第１の伸長ステップが約２分間である、請求項１７に記載の方法。

【請求項24】

前記第２の伸長ステップが約１分間である、請求項１７に記載の方法。

【請求項25】

前記第１のプライマーセットが、等しい数の第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーを含む、請求項１７に記載の方法。

【請求項26】

前記第１のプライマーセットが、等しくない数の第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーを含む、請求項１７に記載の方法。

【請求項27】

前記第２のプライマーセットが、等しい数の第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーを含む、請求項１７に記載の方法。

【請求項28】

前記第２のプライマーセットが、等しくない数の第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーを含む、請求項１７に記載の方法。

【請求項29】

前記第１のプライマーセットが、約１～２０の第１のフォワードプライマーおよび約１～２０の第１のリバースプライマーを含む、請求項１７に記載の方法。

【請求項30】

前記第２のプライマーセットが、約１～２０の第２のフォワードプライマーおよび約１～２０の第２のリバースプライマーを含む、請求項１７に記載の方法。

【請求項31】

第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーの最終濃度が、第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーの最終濃度よりも高い、請求項１７に記載の方法。

【請求項32】

第１のフォワードプライマーの最終濃度が、第１のリバースプライマーの最終濃度と同じまたは同様である、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

第２のフォワードプライマーの最終濃度が、第２のリバースプライマーの最終濃度と同じまたは同様である、請求項３１に記載の方法。

【請求項34】

前記反復核酸配列がレトロトランスポゾンを含む、請求項１７に記載の方法。

【請求項35】

前記レトロトランスポゾンがＬ１レトロトランスポゾンである、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

前記第１のＰＣＲが約３～５サイクルを含む、請求項１７に記載の方法。

【請求項37】

前記第２のＰＣＲが約１０～３５サイクルを含む、請求項１７に記載の方法。

【請求項38】

アンプリコンの強度比を決定するステップをさらに含む、請求項１７に記載の方法。

【請求項39】

予測されるアンプリコンサイズの存在が核酸の品質と相関する、請求項１７に記載の方法。

【請求項40】

予測されるアンプリコンサイズの存在が核酸サイズと相関する、請求項１７に記載の方法。

【請求項41】

予測されるアンプリコン強度比の存在が核酸品質と相関する、請求項１７に記載の方法。

【請求項42】

予測されるアンプリコン強度比の存在が核酸サイズと相関する、請求項１７に記載の方法。

【請求項43】

各第１のフォワードプライマーの前記５’末端共通配列が配列番号１の配列を含む、請求項１７に記載の方法。

【請求項44】

各第１のリバースプライマーの前記５’末端共通配列が配列番号２の配列を含む、請求項１７に記載の方法。

【請求項45】

各第１のフォワードプライマーの前記３’末端配列が、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号８、またはそれらの任意の組み合わせの配列を含む、請求項１７に記載の方法。

【請求項46】

各第１のリバースプライマーの前記３’末端配列が、配列番号７、配列番号１０、配列番号１２、またはそれらの任意の組み合わせの配列を含む、請求項１７に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項の下、２０２０年３月３１日に出願された米国特許出願第６３／００２，７８５号に基づく利益を主張するものである。この先の出願の開示は、本出願の開示の一部とみなされ、参照により本出願の開示に組み込まれる。

【0002】

配列表の組み込み
添付の配列表のデータは、参照により本出願に組み込まれる。添付の配列表テキストファイル、ファイル名ＰＧＤＸ３１５０－１ ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔは、２０２１年３月１５日に作成され、３，１１６バイトである。ファイルは、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標） ＯＳを使用するコンピュータ上のＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｗｏｒｄを使用してアクセスすることができる。

【0003】

発明の背景
発明の分野
本発明は、一般に、サンプル中の核酸の品質の決定に関し、より具体的には、ライブラリー調製および配列決定の前に核酸の品質を決定することに関する。

【背景技術】

【0004】

背景情報
広範なライブラリー調製および配列決定の前のＤＮＡなどの核酸サンプルの品質の決定は、劣化しすぎてうまく解析されないサンプルに対する時間および費用を無駄にしないために、非常に有用である。現在のアッセイは、ＤＮＡの長さまたは増幅性（amplifiability）に基づく。いずれのアッセイも十分に堅牢性と予測性とを兼ね備えていない。

【0005】

原則として、増幅性は核酸の機能的評価に最も近いが、少数の特異的な断片で行われるため、必ずしも十分な情報を提供するとは限らない。したがって、解析のためのより広い範囲の核酸サイズに基づき、堅牢で予測的な情報を提供するアッセイが必要とされている。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0006】

発明の要旨
本発明は、反復核酸配列の増幅を使用して核酸品質を決定するための組成物および方法に関する。

【0007】

一実施形態では、本発明は、（ａ）複数の第１のフォワードプライマーおよび複数の第１のリバースプライマーを含む第１のプライマーセットであって、各第１のフォワードプライマーおよび各第１のリバースプライマーは、（ｉ）核酸中の反復配列と相補性を有しかつ第１の融解温度を有する３’末端配列と、（ｉｉ）核酸に存在せずかつ第２の融解温度を有し、第２の融解温度が第１の融解温度よりも高い、５’末端共通配列とを含む、第１のプライマーセットと、（ｂ）複数の第２のフォワードプライマーおよび複数の第２のリバースプライマーを含む第２のプライマーセットであって、各第２のフォワードプライマーおよび各第２のリバースプライマーが５’末端共通配列を含む、第２のプライマーセットとを含む、サンプル中の核酸の品質を決定するためのシステムを提供する。一態様では、第２の融解温度は、第１の融解温度よりも約５℃～２５℃高い。一態様では、第１の融解温度は約４５℃～７０℃である。一態様では、第２の融解温度は約６０℃～８５℃である。一態様では、第１のプライマーセットは、等しい数の第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーを含む。一態様では、第１のプライマーセットは、等しくない数の第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーを含む。一態様では、第２のプライマーセットは、等しい数の第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーを含む。一態様では、第２のプライマーセットは、等しくない数の第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーを含む。一態様では、第１のプライマーセットは、約１～２０の第１のフォワードプライマーおよび約１～２０の第１のリバースプライマーを含む。一態様では、第２のプライマーセットは、約１～２０の第２のフォワードプライマーおよび約１～２０の第２のリバースプライマーを含む。一態様では、反復核酸配列はレトロトランスポゾンを含む。一態様では、レトロトランスポゾンはＬ１レトロトランスポゾンである。一態様では、各第１のフォワードプライマーの５’末端共通配列は、配列番号１の配列を含む。一態様では、各第１のリバースプライマーの５’末端共通配列は、配列番号２の配列を含む。一態様では、各第１のフォワードプライマーの３’末端配列は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号８、またはそれらの任意の組み合わせの配列を含む。一態様では、各第１のリバースプライマーの３’末端配列は、配列番号７、配列番号１０、配列番号１２、またはそれらの任意の組み合わせの配列を含む。

【0008】

別の実施形態では、本発明は、サンプル中の核酸の品質を決定する方法であって、（ａ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）混合物を調製するステップであって、（ｉ）複数の第１のフォワードプライマーおよび複数の第１のリバースプライマーを含む第１のプライマーセットであって、各第１のフォワードプライマーおよび各第１のリバースプライマーは、（ｉ）核酸中の反復配列と相補性を有しかつ第１の融解温度を有する３’末端配列と、（ｉｉ）核酸に存在せずかつ第２の融解温度を有し、第２の融解温度が第１の融解温度よりも高い、５’末端共通配列とを含む、第１のプライマーセットと、ｉｉ）複数の第２のフォワードプライマーおよび複数の第２のリバースプライマーを含む第２のプライマーセットであって、各第２のフォワードプライマーおよび各第２のリバースプライマーが５’末端共通配列を含む、第２のプライマーセットと、を含むポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）混合物を調製するステップと、（ａ）サンプルに対して第１のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うステップであって、第１のＰＣＲの各サイクルの第１の伸長ステップが、第１の融解温度程度の温度である、ステップと、（ｂ）サンプルに対して第２のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うステップであって、第２のＰＣＲにおける各サイクルの第２の伸長ステップが、第２の融解温度程度の温度である、ステップと、（ｃ）アンプリコンのサイズ範囲を決定するステップとを含む、方法を提供する。一態様では、第２の融解温度は、第１の融解温度よりも約５℃～２５℃高い。一態様では、第１の融解温度は約４５℃～７０℃である。一態様では、第１の伸長ステップは約２分間である。一態様では、第２の伸長ステップは約１分間である。一態様では、第１のプライマーセットは、等しい数の第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーを含む。一態様では、第１のプライマーセットは、約１～２０の第１のフォワードプライマーおよび約１～２０の第１のリバースプライマーを含む。一態様では、第２のプライマーセットは、約１～２０の第２のフォワードプライマーおよび約１～２０の第２のリバースプライマーを含む。一態様では、反復核酸配列はレトロトランスポゾンを含む。一態様では、レトロトランスポゾンはＬ１レトロトランスポゾンである。一態様では、第２のＰＣＲは約１０～３５サイクルを含む。

【0009】

さらに別の態様では、本方法は、アンプリコンの強度比を決定するステップをさらに含む。一態様では、予測されるアンプリコンサイズの存在は核酸品質と相関する。一態様では、各第１のフォワードプライマーの５’末端共通配列は、配列番号１の配列を含む。一態様では、各第１のリバースプライマーの５’末端共通配列は、配列番号２の配列を含む。一態様では、各第１のフォワードプライマーの３’末端配列は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号８、またはそれらの任意の組み合わせの配列を含む。一態様では、各第１のリバースプライマーの３’末端配列は、配列番号７、配列番号１０、配列番号１２、またはそれらの任意の組み合わせの配列を含む。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】図１は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のためのプライマーおよび方法の概要を示す。

【0011】

【図2】図２は、核酸品質を決定するためのＰＣＲのための代表的なＬＩＮＥ配列を示す。

【0012】

【図3】図３は、核酸品質を決定するための代表的なプライマーおよびプライマー成分を示す。

【0013】

【図4】図４は、予測されたアンプリコンのサイズ分布を示す。

【発明を実施するための形態】

【0014】

発明の詳細な説明
本発明は、ゲノム内の数百以上の異なる部位を増幅することができる少数のプライマーを使用したヒトゲノムの反復配列の増幅が、ＤＮＡ品質に関するロバストで正確な情報を提供するという発見に基づいている。かかる情報は、例えば、ライブラリー調製および次世代シーケンシング（ＮＧＳ）に有用である。

【0015】

核酸の品質を決定するためのオリゴヌクレオチドプライマーのシステムが本明細書で提供される。本明細書で提供される核酸品質を決定するためのオリゴヌクレオチドプライマーのシステムは、第１のオリゴヌクレオチドプライマーセットを含み得る。本明細書で提供される核酸品質を決定するためのオリゴヌクレオチドプライマーのシステムはまた、第２のオリゴヌクレオチドプライマーセットを含み得る。

【0016】

任意の核酸の品質は、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドプライマーのシステムを使用して決定することができる。核酸は、任意のサンプルまたは任意の種類のサンプルに由来し得る。例えば、サンプルは、血液、唾液、血漿、血清、尿、または他の生物学的流体であり得る。更なる例示的な生物学的流体としては、漿膜液、リンパ液、脳脊髄液、粘膜分泌物、膣液、腹水液、胸膜液、心膜液、腹膜液、および腹腔液が挙げられる。いくつかの態様では、サンプルは組織サンプルである。いくつかの態様では、サンプルは細胞サンプルまたは単一細胞である。例えば、保存凍結サンプル、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）サンプル、および任意の他の方法によって保存されたサンプルを含む、新鮮なサンプルまたは保存サンプルを使用することができる。

【0017】

サンプルは、正常な健康な対象に由来し得る。サンプルはまた、疾患または障害を有する対象に由来し得る。任意の疾患または障害を有する対象に由来するサンプル中の核酸の品質は、本明細書で提供されるプライマーのシステムを使用して決定することができる。いくつかの態様では、疾患または障害は癌である。いくつかの態様では、サンプルは、癌を有する対象に由来する流体サンプルである。いくつかの態様では、サンプルは、健康な対象または癌を有するもしくは有する疑いがある対象に由来する組織サンプルまたは細胞サンプルである。癌サンプルは、固形腫瘍または液状腫瘍に由来するサンプルであり得る。癌は、腎癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、乳癌、子宮頸癌、卵巣癌、肺癌、結腸癌、直腸癌、口腔癌、咽頭癌、膵臓癌、甲状腺癌、黒色腫、皮膚癌、頭頸部癌、脳癌、造血器癌、白血病、リンパ腫、骨癌、筋肉癌、肉腫、および横紋筋肉腫などであり得る。疾患または障害は、感染性疾患、例えば、ウイルス感染、細菌感染、真菌感染または寄生虫感染であり得る。

【0018】

核酸の品質は、本明細書で提供される核酸品質を決定するための本発明のプライマーシステムを使用してサンプル中で決定することができる。核酸品質を決定する前に、サンプルから核酸を抽出、単離、または精製することもできる。抽出、単離、または精製のための任意の適切な方法を使用することができる。例示的な方法としては、フェノール－クロロホルム抽出、グアニジニウム－チオシアネート－フェノール－クロロホルム抽出、ゲル精製、ならびにカラムおよびビーズの使用が挙げられる。市販のキットは、核酸の抽出、単離、または精製に使用することができる。

【0019】

任意の生物または種に由来する核酸の品質は、本明細書で提供されるプライマーのシステムを使用して決定することができる。例えば、任意の動物、植物、または微生物に由来する核酸の品質は、本明細書で提供されるプライマーのシステムを使用して決定することができる。ヒト、げっ歯類（マウス、ラット、ハムスターおよびモルモットを含む）、ネコ、イヌ、ウサギ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタなどを含む家畜、ならびに霊長類（サル、チンパンジー、オランウータンおよびゴリラを含む）などに由来する核酸を含む、任意の哺乳動物に由来する核酸の品質を決定することができる。任意の他の動物に由来する核酸の品質は、例えば、爬虫類、鳥類、両生類、硬骨魚類、軟骨魚類、および無脊椎動物に由来する核酸を含む、本明細書で提供されるプライマーのシステムを使用して決定することができる。例えば、任意の被子植物、任意の裸子植物、任意のシダ類および関連生物、任意のツノゴケ類、任意のゼニゴケ類、任意のコケ類、および任意の緑藻類に由来する核酸の品質を決定することができる。例示的な微生物としては、真核生物または原核生物の単細胞生物、例えば細菌、古細菌、原生生物、原生動物、および真菌、ならびにウイルスおよびウイロイドが挙げられる。

【0020】

任意の種類の核酸の品質は、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および核酸断片を含む本明細書で提供されるプライマーのシステムを使用して決定することができる。ＤＮＡ源としては、例えば、染色体ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）、およびそれらの任意の断片が挙げられる。任意の適切な方法によりＲＮＡに対して逆転写を行ってＤＮＡを調製し、本明細書で提供されるプライマーのシステムを使用してＤＮＡ品質を決定することができる。核酸品質を決定した後、例えば、核酸ライブラリーの調製に核酸を使用することができる。いくつかの態様では、ライブラリーはゲノムライブラリーである。核酸ライブラリーは、例えば、末端修復、Ａテーリングおよびアダプターライゲーションにより、核酸分子に同定のための１つもしくはそれを超えるバーコードを含み得るオリゴヌクレオチドのセットまたはサブセットを結合することによって調製することができる。核酸および核酸のライブラリーは、例えば次世代シーケンシング（ＮＧＳ）によって解析することができる。任意の適切なシーケンシング法を使用して核酸を解析することができる。例示的なＮＧＳ方法としては、Ｒｏｃｈｅ ４５４シーケンサー、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＳＯＬｉＤシステム、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ、ＢＧＩ／ＭＧＩシステム、Ｇｅｎａｐｓｙｓシステム、およびＩｌｌｕｍｉｎａ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＩＩ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ、およびＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｏｖａＳｅｑ装置などのＩｌｌｕｍｉｎａシステムが挙げられる。

【0021】

本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドプライマーのシステムは、第１のプライマーセットを含み得る。第１のプライマーセットは、複数の第１のフォワードプライマーを含み得る。第１のプライマーセットはまた、複数の第１のリバースプライマーを含み得る。本明細書で使用される場合、フォワードプライマー」および リバースプライマー」という用語は、文脈上特に明記されていない限り、それぞれ「＋鎖プライマー」および「－鎖プライマー」という用語と互換的に使用することができる。複数の第１のフォワードプライマーおよび複数の第１のリバースプライマーの各第１のフォワードプライマーおよび各第１のリバースプライマーは、本明細書で提供されるプライマーのシステムを使用してその品質が決定される核酸中の反復配列と相補性を有する３’末端配列を含み得る。複数の第１のフォワードプライマーおよび複数の第１のリバースプライマーの各第１のフォワードプライマーおよび各第１のリバースプライマーはまた、品質が決定される核酸に存在しない５’末端共通配列を含み得る。したがって、第１のプライマーセットに含まれるプライマーは、ハイブリッドプライマーであり得る。本明細書で使用される場合、「ハイブリッドプライマー」という用語は、核酸分子内で連続していないかもしくは互いに隣接していない核酸分子内の少なくとも２つの配列と相補性を有するか、または核酸分子内に最初に存在しない少なくとも２つの配列の少なくとも１つを有する少なくとも２つの配列を有するプライマーを意味する。一例として、ハイブリッドプライマーが核酸配列と相補的な３’末端配列および核酸と相補性のない５’末端配列とを含む場合、ハイブリッドプライマーの５’末端配列と相補的な配列を有する核酸分子は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生成することができ、それによってハイブリッドプライマーの３’末端および５’末端配列の両方と相補性を有する核酸分子を生成する。

【0022】

本明細書で使用される場合、「相補的」および「相補性」という用語は、ポリヌクレオチドが互いに塩基対を形成する能力を指す。塩基対は、典型的には、逆平行ポリヌクレオチド鎖中のヌクレオチド間の水素結合によって形成される。相補的ポリヌクレオチド鎖は、ワトソン・クリック様式（例えば、Ａ－Ｔ、Ａ－Ｕ、Ｃ－Ｇ）で、または二重鎖の形成を可能にする任意の他の様式で塩基対合することができる。当業者が理解するように、ＤＮＡではなくＲＮＡを使用する場合、チミンではなくウラシルがアデノシンに相補的であると考えられる塩基である。

【0023】

正確もしくは完全な相補性または１００％相補性とは、１本のポリヌクレオチド鎖の各ヌクレオチドが逆平行ポリヌクレオチド鎖のヌクレオチドと水素結合することができる状況を指す。正確な相補性よりも低いとは、２本の鎖の全部ではなく一部のヌクレオチドが互いに水素結合することができる状況を指す。例えば、２つの２０量体について、各鎖上の２つの塩基対のみが互いに水素結合することができる場合、ポリヌクレオチド鎖は１０％相補性を示す。別の例として、各鎖上の２０ヌクレオチドのうち１８ヌクレオチドが互いに水素結合することができる場合、ポリヌクレオチド鎖は９０％相補性を示す。「実質的な相補性」とは、非相補的であるように選択されるポリヌクレオチド鎖の領域、例えばオーバーハングを除いて、７５％またはそれを超える相補性を示すポリヌクレオチド鎖を指す。したがって、相補性は、文脈上特に明記されていない限り、逆平行鎖上のヌクレオチドと類似または相補的でないように選択されるオーバーハングを考慮しない。いくつかの態様では、反復核酸配列と相補性を有する３’末端配列は、反復核酸配列に対して正確または完全な相補性を示す。いくつかの態様では、反復核酸配列と相補性を有する３’末端配列は、反復核酸配列に対して実質的な相補性を示す。

【0024】

本明細書で使用される場合、「５’末端共通配列」は、一部または全部のフォワードプライマーがプライマーの５’末端に同じ配列または実質的に同じ配列を含み、一部または全部のリバースプライマーがプライマーの５’末端に同じ配列または実質的に同じ配列を含むことを意味する。例えば、第１のフォワードプライマーおよび第２のフォワードプライマーの５’末端共通配列（後述）は同じ配列を含み得、５’末端共通配列の更なるヌクレオチド５’、３’または５’と３’との両方も含み得る。別の例として、第１のリバースプライマーおよび第２のリバースプライマーの５’末端共通配列（後述）は同じ配列を含み得、５’末端共通配列の更なるヌクレオチド５’、３’または５’と３’との両方も含み得る。フォワードプライマーの５’末端共通配列は同じであっても異なっていてもよい。例えば、フォワードプライマーは、フォワードプライマー間で共有される２つ以上の５’末端共通配列、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれを超える異なる５’末端共通配列を含み得る。リバースプライマーの５’末端共通配列は同じであっても異なっていてもよい。例えば、リバースプライマーは、リバースプライマー間で共有される２つ以上の５’末端共通配列、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれを超える異なる５’末端共通配列を含み得る。フォワードプライマーおよびリバースプライマーの５’末端共通配列は同じであっても異なっていてもよい。増幅される核酸に存在しない任意の配列は５’末端共通配列であり得る。

【0025】

本明細書で使用される場合、プライマー配列に言及する際の「３’末端配列」は、変動し得る各第１のフォワードプライマーおよび各第１のリバースプライマーの３’末端の配列を意味する。第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーの３’末端配列は、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３４、約３５ヌクレオチドを含む任意の長さであり得る。任意の数の異なる３’末端配列が、本明細書で提供される第１のプライマーセットの第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーに含まれ得る。例えば、第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーは、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０の異なる３’末端配列を含み得る。

【0026】

異なる数の３’配列の任意の組み合わせが、第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーに含まれ得る。例えば、第１のフォワードプライマーは４つの異なる３’末端配列を有し得る。第１のフォワードプライマーは、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号８、またはそれらの任意の組み合わせの配列を含み得る。いくつかの態様では、第１のリバースプライマーは３つの異なる３’末端配列を含む。いくつかの態様では、第１のリバースプライマーは、配列番号７、配列番号１０、配列番号１２、またはそれらの任意の組み合わせの配列を含む。したがって、本明細書で提供されるプライマーのシステムの第１のプライマーセットは、等しくない数の第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーを含み得る。一例として、第１のフォワードプライマーは４つの異なる３’末端配列および５’末端共通配列を含み得、第１のリバースプライマーは３つの異なる３’末端配列および５’末端共通配列を含み得る。本明細書で提供されるプライマーシステムの第１のプライマーセットはまた、等しい数の第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーを含み得る。一例として、第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーは、同じ数の異なる３’末端配列および５’末端共通配列を含み得る。いくつかの態様では、第１のプライマーセットは約１～２０の第１のフォワードプライマーを含む。いくつかの態様では、第１のプライマーセットは約１～２０の第１のリバースプライマーを含む。第１のプライマーセットは、任意の数の第１のフォワードプライマーおよび任意の数の第１のリバースプライマーを含み得る。

【0027】

５’末端共通配列は、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３４、約３５ヌクレオチドを含む任意の長さであり得る。第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーの５’末端共通配列は、同じまたは実質的に同じ配列を含み得る。第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーの５’末端共通配列は、本明細書で提供されるプライマーシステムを使用して品質について解析される核酸に存在しない任意の配列を含み得る。いくつかの態様では、第１のフォワードプライマーの５’末端共通配列は、配列番号１の配列を含む。いくつかの態様では、第１のリバースプライマーの５’末端共通配列は、配列番号２の配列を含む。

【0028】

本明細書で提供される核酸品質を決定するためのプライマーシステムに含まれる第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーの３’末端配列は、第１の融解温度を有し得る。本明細書で提供される核酸品質を決定するためのプライマーシステムに含まれる第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーの５’末端共通配列は、第２の融解温度を有し得る。第２の融解温度は、第１の融解温度よりも高くなり得る。いくつかの態様では、第２の融解温度は、第１の融解温度よりも約５℃～２５℃高い。第１の融解温度は４５℃～７０℃程度であり得る。第１の融解温度は、約４５℃～５０℃、約４５℃～５５℃、約４５℃～６０℃、約４５℃～６５℃、約４５℃～７０℃であり得る。いくつかの態様では、例として、第１の融解温度は、約７０℃～６５℃、約７０℃～６０℃、約７０℃～５５℃、約７０℃～５０℃、約７０℃～４５℃である。いくつかの態様では、第１の融解温度は約５０℃～５３℃である。いくつかの態様では、第１の融解温度は約５０．７℃～５２．５℃である。一般に、第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーの３’末端配列の融解温度は、互いに０．１℃、０．５℃、１．０℃、１．５℃、２．０℃、２．５℃、３．０℃、３．５℃、４．０℃、４．５℃、５．０℃、およびその間の任意の数または範囲内である。

【0029】

第２の融解温度は６０℃～８５℃程度であり得る。いくつかの態様では、例として、第２の融解温度は、約６０℃～８５℃、約６０℃～８０℃、約６０℃～７５℃、約６０℃～７０℃、約６０℃～６５℃である。いくつかの態様では、第２の融解温度は、約８０℃～８５℃、約７５℃～８５℃、約７０℃～８５℃、約６５℃～８５℃、約６０℃～８５℃である。いくつかの態様では、第２の融解温度は約７０℃～７５℃である。いくつかの態様では、第２の融解温度は約７０℃～７３℃である。いくつかの態様では、第２の融解温度は約７０℃～７２℃である。いくつかの態様では、第２の融解温度は約７０℃～７１℃である。いくつかの態様では、第２の融解温度は約７０℃～７０．９℃である。

【0030】

本明細書で提供される第１のプライマーセットの第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーは、本明細書で提供されるプライマーのシステムを使用してその品質が決定される核酸中の反復配列と相補性を有する３’末端配列を含み得る。反復核酸配列はレトロトランスポゾンを含み得る。クラスＩ転移因子またはＲＮＡ中間体介在トランスポゾンとも呼ばれるレトロトランスポゾンは、ＲＮＡ転移中間体を介した逆転写によりＲＮＡをＤＮＡに変換することによって、それ自身をして異なるゲノム位置にコピーアンドペーストすることができる遺伝要素である。

【0031】

レトロトランスポゾンの種類としては、ＬＴＲおよび非ＬＴＲレトロトランスポゾンが挙げられる。ＬＴＲレトロトランスポゾンは、サイズが５キロベースを超える。ＬＴＲレトロトランスポゾンは、レトロトランスポゾンの各末端に、長末端反復配列（ＬＴＲ）と呼ばれる反復ＤＮＡの長鎖を含む。例示的なＬＴＲレトロトランスポゾンとしては、Ｔｙ１－コピア様（シュウドウイルス科）、Ｔｙ３－ジプシー様（メタウイルス科）およびレトロトランスポゾンのＢＥＬ－Ｐａｏ様群が挙げられる。レトロトランスポゾンのＴｙ１－コピア様およびＴｙ３－ジプシー様群の半数体核あたり数百万コピーが、動物、真菌、原生生物、および植物のゲノムにおいて見出され得るが、ＢＥＬ－Ｐａｏ様因子は動物においてのみ見出され得る。

【0032】

非ＬＴＲレトロトランスポゾンとしては、長鎖散在反復配列（ＬＩＮＥ）および短鎖散在反復配列（ＳＩＮＥ）が挙げられる。ＬＩＮＥ転写物は、ゲノムの部位への挿入後にＬＩＮＥをコピーすることを可能にするＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを含む。ＬＩＮＥ転写物は、逆転写酵素の翻訳のために核から細胞質に移動する転移中間体である。逆転写酵素は、ゲノムの新しい部位に組み込まれ得るＬＩＮＥ ＲＮＡのＤＮＡコピーを生成する。各ＬＩＮＥは約７，０００塩基対（ｂｐ）の長さであり、ヒトゲノムには推定１００，０００～４，０００の完全長ＬＩＮＥ－１因子が存在する。多くのＬＩＮＥは、突然変異の蓄積があるために転写または翻訳されない。ＬＩＮＥの５つの主要な群としては、Ｌ１、ＲＴＥ、Ｒ２、Ｉ、およびＪｏｃｋｅｙの群が挙げられる。ヒトＬＩＮＥは、ＬＩＮＥ－１／Ｌ１ならびにＬ２およびＬ３の残物を含む。ヒトゲノムは、約８５０，０００のＬＩＮＥ因子を含み、約５１６，０００コピーのＬ１因子、約３１５，０００コピーのＬ２因子および約３７，０００コピーのＬ３因子を含む。ＬＩＮＥ－１／Ｌ１因子は、哺乳動物に広く見出され、ヒトゲノムにおいて依然として活性である。更なるＬＩＮＥ因子としては、Ｔａｄ、ＣＲＥ、Ｄｅｃｅｉｖｅｒ、およびＩｎｋｃａｐ様因子が挙げられる。

【0033】

ＳＩＮＥ因子としては、約１００～７００ｂｐの非自律的な非コード転移因子（ＴＥ）が含まれる。ＳＩＮＥ因子としては、ＣＯＲＥ－ＳＩＮＥ、Ｖ－ＳＩＮＥ、ＡｍｎＳＩＮＥの３つの種類が挙げられる。ＳＩＮＥ因子はＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって転写され、転写領域はプロモーター要素を含む。ＳＩＮＥ因子はタンパク質をコードせず、逆転写およびゲノムへの組み込みのために、ＬＩＮＥによってコードされるタンパク質を使用する可能性が高い。例示的なＳＩＮＥとしては、約３００ヌクレオチドの短鎖散在反復配列であり、ヒトおよび他の種に見出され得るＡｌｕ因子が挙げられる。Ａｌｕ因子は、ヒトにおいて最も一般的なＳＩＮＥであり、ヒトゲノム全体で１，０００，０００コピーを超える。更なる例示的なＳＩＮＥとしては、イヌのＳＩＮＥ＿Ｃｆリピート、ならびに植物のＡｕ－ＳＩＮＥおよびＡｎｇｉｏ－ＳＩＮＥが挙げられる。

【0034】

第１のプライマーセットの第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーの３’末端配列は、任意の生物に由来する任意のレトロトランスポゾンの配列と相補性を有し得る。例えば、第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーの３’末端配列は、本明細書で提供されるプライマーのシステムを使用してその品質が決定される核酸源に基づいて設計することができる。したがって、３’末端配列は、その品質が決定された核酸が得られた生物に見出されるレトロトランスポゾンと相補性を有し得る。核酸はヒト由来であり得る。いくつかの態様では、レトロトランスポゾンはＬ１レトロトランスポゾンである。

【0035】

第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーの３’末端配列は、レトロトランスポゾンの両鎖に沿ったジグザグ配列と相補性を有するように設計することができる。レトロトランスポゾンの両鎖に沿ったジグザグ配列は重複していなくてよい。いくつかの態様では、各第１のフォワードプライマーは各第１のリバースプライマーでアンプリコンを生成し、各第１のリバースプライマーは各第１のフォワードプライマーでアンプリコンを生成する。このようにして、約５０ｂｐ～２００ｂｐ、約５０ｂｐ～３００ｂｐ、約５０ｂｐ～４００ｂｐ、約５０ｂｐ～５００ｂｐ、約５０ｂｐ～６００ｂｐ、約５０ｂｐ～７００ｂｐ、約５０ｂｐ～８００ｂｐ、約５０ｂｐ～９００ｂｐ、約５０ｂｐ～１，０００ｂｐ、約５０ｂｐ～１，５００ｂｐ、約５０ｂｐ～２，０００ｂｐ、約５０ｂｐ～２，５００ｂｐ、約５０ｂｐ～３，０００ｂｐ、約５０ｂｐ～３，５００ｂｐ、約５０ｂｐ～４，０００ｂｐ、約５０ｂｐ～４，５００ｂｐ、約５０ｂｐ～５，０００ｂｐを含むサイズの範囲に沿って多数のアンプリコンを生成することができる。いくつかの態様では、アンプリコンは約１００～２，０００ｂｐの範囲である。

【0036】

サンプル中の核酸の品質を決定するためのプライマーシステムは、第２のプライマーセットを含み得る。第２のプライマーセットは、複数の第２のフォワードプライマーおよび複数の第２のリバースプライマーを含み得る。各第２のフォワードプライマーおよび各第２のリバースプライマーは、５’末端共通配列を含み得る。

【0037】

第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーに含まれる５’末端共通配列は、第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーに含まれ得る。例えば、各フォワードプライマーは、プライマーの５’末端に同じ配列または実質的に同じ配列を含み得、各リバースプライマーは、プライマーの５’末端に同じ配列または実質的に同じ配列を含み得る。別の例として、第１のフォワードプライマーおよび第２のフォワードプライマーの５’末端共通配列は、同じ配列を含み得、５’末端共通配列の更なるヌクレオチド５’、３’または５’と３’との両方も含み得る。別の例として、第１のリバースプライマーおよび第２のリバースプライマーの５’末端共通配列は同じ配列を含み得、５’末端共通配列の更なるヌクレオチド５’、３’または５’と３’との両方も含み得る。フォワードプライマーの５’末端共通配列は同じであっても異なっていてもよい。リバースプライマーの５’末端共通配列は同じであっても異なっていてもよい。フォワードプライマーおよびリバースプライマーの５’末端共通配列は同じであっても異なっていてもよい。

【0038】

いくつかの態様では、第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーは、第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーに含まれる５’末端共通配列のみを含み、他の配列またはヌクレオチドを含まない。いくつかの態様では、第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーは、第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーに含まれる５’末端共通配列に加えて、他の配列またはヌクレオチドを含み得る。例えば、第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーは、５’末端共通配列のヌクレオチド上流または５’に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれを超える更なるヌクレオチドを含み得る。別の例として、第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーはまた、５’末端共通配列のヌクレオチド下流または３’に５’末端共通配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれを超える更なるヌクレオチドを含み得る。５’末端共通配列の下流または３’の更なるヌクレオチドは、第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーの３’末端配列に存在するヌクレオチドのすべてを含まずに、第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーの３’末端配列に存在する５’ヌクレオチドを含み得る。したがって、第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーの５’末端共通配列の下流または３’に含まれる更なるヌクレオチドは、第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーに含まれる３’末端配列に伸長することができる。いくつかの態様では、第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーに含まれる３’末端配列は、第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーに含まれる３’末端配列よりも少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０少ない３’ヌクレオチドを含む。したがって、第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーの３’末端配列は、第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーに含まれる３’末端配列よりも少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０多い３’ヌクレオチドを含み得る。

【0039】

５’末端共通配列を含む第２のフォワードプライマー、５’末端共通配列および任意の数の追加のヌクレオチドを含む第２のフォワードプライマー、５’末端共通配列を含む第２のリバースプライマー、ならびに５’末端共通配列および任意の数の追加のヌクレオチドを含む第２のリバースプライマーを含む、第２のフォワードプライマーと第２のリバースプライマーとの任意の組み合わせを第２のプライマーセットに含めることができる。したがって、第２のプライマーセットは、等しい数の第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーを含み得る。第２のプライマーセットはまた、等しくない数の第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーを含み得る。いくつかの態様では、第２のプライマーセットは約１～２０の第２のフォワードプライマーを含む。いくつかの態様では、第２のプライマーセットは約１～２０の第２のリバースプライマーを含む。第２のプライマーセットは、任意の数の第２のフォワードプライマーおよび任意の数の第２のリバースプライマーを含み得る。

【0040】

第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーは、第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーの３’末端配列の第１の融解温度よりも高い融解温度を有し得る。第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーの融解温度は、第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーの５’末端共通配列の第２の融解温度と同様であり得るか、またはそれに対応し得る。例えば、第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーが５’末端共通配列に加えて配列またはヌクレオチドを含まない場合、第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーの融解温度は、第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーに含まれる５’末端共通配列の第２の融解温度に対応し得る。別の例として、第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーが５’末端共通配列に加えて配列またはヌクレオチドを含む場合、第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーの融解温度は、第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーに含まれる５’末端共通配列の第２の融解温度よりも高くなり得る。第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーの融解温度は、第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーに含まれる５’末端共通配列の第２融解温度よりも約０．５℃、１．０℃、１．５℃、２．０℃、２．５℃、３．０℃、３．５℃、４．０℃、４．５℃、５．０℃、５．５℃、６．０℃、６．５℃、７．０℃、７．５℃、８．０℃、８．５℃、９．０℃、９．５℃、１０．０℃、１０．５℃、１１．０℃、１１．５℃、１２．０℃、１２．５℃、１３．０℃、１３．５℃、１４．０℃、１４．５℃、１５．０℃、１５．５℃、１６．０℃、１６．５℃、１７．０℃、１７．５℃、１８．０℃、１８．５℃、１９．０℃、１９．５℃、２０．０℃、２０．５℃、２１．０℃、２１．５℃、２２．０℃、２２．５℃、２３．０℃、２３．５℃、２４．０℃、２４．５℃、２５．０℃、およびその間の任意の数または範囲で高くなり得る。

【0041】

いくつかの態様では、本明細書で提供されるプライマーセットの第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーはタグまたは標識を含む。タグまたは標識は、例えば、ＰＣＲにより生成されたアンプリコンの検出に使用することができる。カラータグまたはラベルを含む任意の種類のタグまたはラベルを使用することができる。例示的なカラータグまたはラベルは、フルオロフォアを含む。例えば、ユウロピウムおよびテルビウムのものを含む蛍光ランタニド錯体、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチル－クマリン、ピレン、マラカイトグリーン、スチルベン、ルシファーイエロー、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から入手可能である）、および参照によりその全体が本明細書に明確に組み込まれる１１ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｂｙ Ｒｉｃｈａｒｄ Ｐ．Ｈａｕｇｌａｎｄに記載されている他のものを含む、任意のフルオロフォアを使用することができる。他のフルオロフォアとしては、例えば、Ｃｙ３－ｄＣＴＰ、Ｃｙ３－ｄＵＴＰ、Ｃｙ５－ｄＣＴＰ、Ｃｙ５－ｄＵＴＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、フルオレセイン－１２－ｄＵＴＰ、テトラメチルローダミン－６－ｄＵＴＰ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（登録商標）－５－ｄＵＴＰ、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ（登録商標）－７－ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ－１４－ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）Ｒ－１４－ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＲ－１４－ｄＵＴＰ、ローダミングリーン（商標）－５－ｄＵＴＰ、オレゴングリーン（登録商標）４８８－５－ｄＵＴＰ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（登録商標）－１２－ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）６３０／６５０－１４－ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）６５０／６６５－１ ４－ｄＵＴＰ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８－５－ｄＵＴＰ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５３２－５－ｄＵＴＰ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８－５－ｄＵＴＰ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４－５－ｄＵＴＰ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６－１ ４－ｄＵＴＰ、フルオレセイン－１２－ＵＴＰ、テトラメチルローダミン－６－ＵＴＰ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（登録商標）－５－ＵＴＰ、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ（登録商標）－７－ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ－１４－ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＭＲ－１４－ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＲ－１４－ＵＴＰ、ローダミングリーン（商標）－５－ＵＴＰ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８－５－ＵＴＰ、およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６－１ ４－ＵＴＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５３２、Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４、Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７、ＢＯＤＩＰＹ ４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ ６５０／６６５、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ、Ｃａｓｃａｄｅ Ｙｅｌｌｏｗ、Ｄａｎｓｙｌ、リサミンローダミンＢ、Ｍａｒｉｎａ Ｂｌｕｅ、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ４８８、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ５１４、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、ローダミン６ Ｇ、ローダミングリーン、ローダミンレッド、ならびにＣｙ２、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５．５、およびＣｙ７（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）が挙げられる。

【0042】

いくつかの実施形態では、サンプル中の核酸の品質を決定する方法が本明細書で提供される。

【0043】

本明細書で提供されるサンプル中の核酸品質を決定する方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）混合物を調製するステップを含み得る。ＰＣＲ混合物は、複数の第１のフォワードプライマーおよび複数の第１のリバースプライマーを含む第１のプライマーセットを含み得る。各第１のフォワードプライマーおよび各第１のリバースプライマーは、核酸に存在しかつ第１の融解温度を有する反復配列と相補性を有する３’末端配列を含み得る。各第１のフォワードプライマーおよび各第１のリバースプライマーはまた、核酸に存在せずかつ第２の融解温度を有する５’末端共通配列を含み得る。第２の融解温度は、第１の融解温度よりも高くなり得る。いくつかの態様では、第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーは、低濃度または最終限界濃度、例えば、約０．０５μＭ、約０．０４μＭ、約０．０３μＭ、約０．０２μＭ、約０．０１μＭ、約０．００９μＭ、約０．００８μＭ、約０．００７μＭ、約０．００６μＭ、約０．００５μＭ、約０．００４μＭ、約０．００３μＭ、約０．００２μＭ、約０．００１μＭ、およびその間の任意の数または範囲でＰＣＲ反応混合物に含められる。いくつかの態様では、第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーの最終濃度は同じまたは同様である。本明細書で使用される場合、「同様のプライマー濃度」とは、２倍以下しか異ならないプライマー濃度を指す。

【0044】

ＰＣＲ混合物はまた、第２のプライマーセットを含み得る。第２のプライマーセットは、複数の第２のフォワードプライマーおよび複数の第２のリバースプライマーを含み得る。各第２のフォワードプライマーおよび各第２のリバースプライマーは、５’末端共通配列を含み得る。いくつかの態様では、第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーは、０．０５μＭ、０．０６μＭ、０．０７μＭ、０．０８μＭ、０．０９μＭ、０．１μＭ、０．２μＭ、０．３μＭ、０．４μＭ、０．５μＭ、０．６μＭ、０．７μＭ、０．８μＭ、０．９μＭ、１．０μＭ、１．５μＭ、２．０μＭ、およびその間の任意の数または範囲などの大モル過剰に対応する最終濃度でＰＣＲ反応混合物に含まれる。いくつかの態様では、第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーは、０．１μＭ～０．５μＭの最終濃度でＰＣＲ反応混合物に含まれる。いくつかの態様では、第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーの最終濃度は同じまたは同様である。

【0045】

いくつかの態様では、ＰＣＲ反応混合物に含まれる第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーの最終濃度は、ＰＣＲ反応混合物に含まれる第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーの最終濃度よりも高い。大モル過剰に対応するＰＣＲ反応混合物に含まれる第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーの最終濃度は、低濃度または限界濃度に対応する第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーの最終濃度よりも高くなり得る。いくつかの態様では、ＰＣＲ反応混合物に含まれる第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーの最終濃度は、第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーの最終濃度よりも少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも３０倍、少なくとも３５倍、少なくとも４０倍、少なくとも４５倍、少なくとも５０倍、少なくとも５５倍、少なくとも６０倍、少なくとも６５倍、少なくとも７０倍、少なくとも７５倍、少なくとも８０倍、少なくとも８５倍、少なくとも９０倍、少なくとも９５倍、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍、少なくとも３００倍、少なくとも４００倍、少なくとも５００倍、少なくとも６００倍、少なくとも７００倍、少なくとも８００倍、少なくとも９００倍、少なくとも１，０００倍、少なくとも２，０００倍、少なくとも３，０００倍、少なくとも４，０００倍、少なくとも５，０００倍、少なくとも６，０００倍、少なくとも７，０００倍、少なくとも８，０００倍、少なくとも９，０００倍、少なくとも１０，０００倍、少なくとも５０，０００倍、少なくとも１００，０００倍、およびその間の任意の数または範囲である。

【0046】

本明細書で提供されるプライマーのシステムに含まれる任意のプライマーセットは、本明細書で提供される核酸品質を決定するための方法のＰＣＲ混合物に含まれ得る。

【0047】

本明細書で提供されるサンプル中の核酸品質を決定するための方法のＰＣＲ混合物は、第１のプライマーセットを含み得る。第１のプライマーセットは、複数の第１のフォワードプライマーを含み得る。第１のプライマーセットはまた、複数の第１のリバースプライマーを含み得る。複数の第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーの各第１のフォワードプライマーおよび各第１のリバースプライマーは、本明細書で提供される方法を用いてその品質が決定される核酸中の反復配列と相補性を有する３’末端配列を含み得る。複数の第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーの各第１のフォワードプライマーおよび各第１のリバースプライマーはまた、品質が決定される核酸に存在しない５’末端共通配列を含み得る。したがって、第１のプライマーセットに含まれるプライマーは、上記のようにハイブリッドプライマーであり得る。反復核酸配列と相補性を有する３’末端配列は、核酸中の反復配列に対して正確または完全な相補性を示し得る。反復核酸配列と相補性を有する３’末端配列はまた、核酸中の反復配列に対して実質的な相補性を示し得る。

【0048】

各第１のフォワードプライマーおよび各第１のリバースプライマーは、同じ５’共通末端配列を含み得る。各第１のフォワードプライマーおよび各第１のリバースプライマーの３’末端配列は変化し得る。第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーの３’末端配列は、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３４、約３５ヌクレオチドを含む任意の長さであり得る。本明細書で提供される方法のＰＣＲ混合物に含まれる第１のプライマーセットの第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーには、任意の数の異なる３’末端配列が含まれ得る。例えば、第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーは、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０の異なる３’末端配列を含み得る。

【0049】

異なる数の３’配列の任意の組み合わせが、本明細書で提供される方法において調製されるＰＣＲ混合物の第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーに含まれ得る。例えば、第１のフォワードプライマーは４つの異なる３’末端配列を有し得る。いくつかの態様では、第１のフォワードプライマーは、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号８、またはそれらの任意の組み合わせの配列を含む。いくつかの態様では、第１のリバースプライマーは３つの異なる３’末端配列を含む。いくつかの態様では、第１のリバースプライマーは、配列番号７、配列番号１０、配列番号１２、またはそれらの任意の組み合わせの配列を含む。したがって、本明細書で提供される方法で調製されたＰＣＲ混合物の第１のプライマーセットは、等しくない数の第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーを含み得る。一例として、第１のフォワードプライマーは４つの異なる３’末端配列および５’末端共通配列を含み得、第１のリバースプライマーは３つの異なる３’末端配列および５’末端共通配列を含み得る。本明細書で提供される方法で調製されたＰＣＲ混合物の第１のプライマーセットはまた、等しい数の第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーを含み得る。一例として、第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーは、同じ数の異なる３’末端配列および５’末端共通配列を含み得る。いくつかの態様では、第１のプライマーセットは約１～２０の第１のフォワードプライマーを含む。いくつかの態様では、第１のプライマーセットは約１～２０の第１のリバースプライマーを含む。第１のプライマーセットは、任意の数の第１のフォワードプライマーおよび任意の数の第１のリバースプライマーを含み得る。

【0050】

５’末端共通配列は、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３４、約３５ヌクレオチドを含む任意の長さであり得る。第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーの５’末端共通配列は、同じまたは実質的に同じ配列を含み得る。第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーの５’末端共通配列は、本明細書で提供される方法を使用して品質について解析される核酸に存在しない任意の配列を含み得る。いくつかの態様では、第１のフォワードプライマーの５’末端共通配列は、配列番号１の配列を含む。いくつかの態様では、第１のリバースプライマーの５’末端共通配列は、配列番号２の配列を含む。

【0051】

本明細書で提供される核酸品質を決定するための方法のＰＣＲ混合物に含まれる第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーの３’末端配列は、第１の融解温度を有し得る。核酸品質を決定するための方法のＰＣＲ混合物に含まれる第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーの５’末端共通配列は、第２の融解温度を有し得る。第２の融解温度は、第１の融解温度よりも高くなり得る。いくつかの態様では、第２の融解温度は、第１の融解温度よりも約５℃～２５℃高い。第１の融解温度は４５℃～７０℃程度であり得る。いくつかの態様では、第１の融解温度は、約４５℃～５０℃、約４５℃～５５℃、約４５℃～６０℃、約４５℃～６５℃、約４５℃～７０℃である。いくつかの態様では、例として、第１の融解温度は、約７０℃～６５℃、約７０℃～６０℃、約７０℃～５５℃、約７０℃～５０℃、約７０℃～４５℃である。いくつかの態様では、第１の融解温度は約５０℃～５３℃である。いくつかの態様では、第１の融解温度は約５０．７℃～５２．５℃である。いくつかの態様では、第１の融解温度は約５０．７℃～５２．５℃である。一般に、第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーの３’末端配列の融解温度は、互いに０．１℃、０．５℃、１．０℃、１．５℃、２．０℃、２．５℃、３．０℃、３．５℃、４．０℃、４．５℃、５．０℃、およびその間の任意の数または範囲内である。

【0052】

第２の融解温度は６０℃～８５℃程度であり得る。いくつかの態様では、例として、第２の融解温度は、約６０℃～８５℃、約６０℃～８０℃、約６０℃～７５℃、約６０℃～７０℃、約６０℃～６５℃である。いくつかの態様では、第２の融解温度は、約８０℃～８５℃、約７５℃～８５℃、約７０℃～８５℃、約６５℃～８５℃、約６０℃～８５℃である。いくつかの態様では、第２の融解温度は約７０℃～７５℃である。いくつかの態様では、第２の融解温度は約７０℃～７３℃である。いくつかの態様では、第２の融解温度は約７０℃～７２℃である。いくつかの態様では、第２の融解温度は約７０℃～７１℃である。いくつかの態様では、第２の融解温度は約７０℃～７０．９℃である。

【0053】

ＰＣＲ混合物に含まれる第１のプライマーセットの第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーは、本明細書で提供されるサンプル中の核酸品質を決定するための方法を使用してその品質が決定される核酸中の反復配列と相補性を有する３’末端配列を含み得る。反復核酸配列はレトロトランスポゾンを含み得る。３’末端配列は、ＬＴＲおよび非ＬＴＲレトロトランスポゾンを含む任意のレトロトランスポゾンと相補性を有し得る。例示的なレトロトランスポゾンとしては、Ｔｙ１－コピア様（シュウドウイルス科）、Ｔｙ３－ジプシー様（メタウイルス科）、およびレトロトランスポゾンのＢＥＬ－Ｐａｏ様群、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、ＲＴＥ、Ｒ２、Ｉ、およびＪｏｃｋｅｙ、およびＴａｄ、ＣＲＥ、Ｄｅｃｅｉｖｅｒ、およびＩｎｋｃａｐ様因子を含むＬＩＮＥの任意のグループ、ならびにＳＩＮＥ、例えばＣＯＲＥ－ＳＩＮＥ、Ｖ－ＳＩＮＥ、およびＡｍｎＳＩＮＥが挙げられる。

【0054】

本明細書で提供される方法で調製されたＰＣＲ混合物の第１のプライマーセットの第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーの３’末端配列は、任意の生物に由来する任意のレトロトランスポゾンの配列と相補性を有し得る。例えば、第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーの３’末端配列は、本明細書で提供される方法を使用してその品質が決定される核酸源に基づいて設計することができる。したがって、３’末端配列は、その品質が決定された核酸が得られた生物に見出されるレトロトランスポゾンと相補性を有し得る。核酸はヒト由来であり得る。いくつかの態様では、レトロトランスポゾンはＬ１レトロトランスポゾンである。

【0055】

第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーの３’末端配列は、レトロトランスポゾンの両鎖に沿ったジグザグ配列と相補性を有するように設計することができる。レトロトランスポゾンの両鎖に沿ったジグザグ配列は重複していなくてよい。いくつかの態様では、各第１のフォワードプライマーは各第１のリバースプライマーでアンプリコンを生成することができ、各第１のリバースプライマーは各第１のフォワードプライマーでアンプリコンを生成することができる。このようにして、約５０ｂｐ～２００ｂｐ、約５０ｂｐ～３００ｂｐ、約５０ｂｐ～４００ｂｐ、約５０ｂｐ～５００ｂｐ、約５０ｂｐ～６００ｂｐ、約５０ｂｐ～７００ｂｐ、約５０ｂｐ～８００ｂｐ、約５０ｂｐ～９００ｂｐ、約５０ｂｐ～１，０００ｂｐ、約５０ｂｐ～１，５００ｂｐ、約５０ｂｐ～２，０００ｂｐ、約５０ｂｐ～２，５００ｂｐ、約５０ｂｐ～３，０００ｂｐ、約５０ｂｐ～３，５００ｂｐ、約５０ｂｐ～４，０００ｂｐ、約５０ｂｐ～４，５００ｂｐ、約５０ｂｐ～５，０００ｂｐを含むサイズの範囲に沿って多数のアンプリコンを生成することができる。いくつかの態様では、アンプリコンは約１００～２，０００ｂｐの範囲である。

【0056】

本明細書で提供されるサンプル中の核酸の品質を決定する方法で調製されたＰＣＲ混合物は、第２のプライマーセットを含み得る。第２のプライマーセットは、複数の第２のフォワードプライマーおよび複数の第２のリバースプライマーを含み得る。各第２のフォワードプライマーおよび各第２のリバースプライマーは、５’末端共通配列を含み得る。

【0057】

第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーに含まれる５’末端共通配列は、第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーに含まれ得る。いくつかの態様では、第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーは、第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーに含まれる５’末端共通配列のみを含み、他の配列またはヌクレオチドを含まない。いくつかの態様では、第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーは、第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーに含まれる５’末端共通配列に加えて、他の配列またはヌクレオチドを含み得る。例えば、第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーは、５’末端共通配列のヌクレオチド上流または５’に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれを超える更なるヌクレオチドを含み得る。別の例として、第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーはまた、５’末端共通配列のヌクレオチド下流または３’に５’末端共通配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれを超える更なるヌクレオチドを含み得る。５’末端共通配列の下流または３’の更なる配列またはヌクレオチドは、第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーの３’末端配列に存在するヌクレオチドのすべてを含まずに、第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーの３’末端配列に存在する５’ヌクレオチドを含み得る。したがって、第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーの５’末端共通配列の下流または３’に含まれる更なるヌクレオチドは、第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーに含まれる３’末端配列に伸長することができる。いくつかの態様では、第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーに含まれる３’末端配列は、第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーに含まれる３’末端配列よりも少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０少ない３’ヌクレオチドを含む。したがって、いくつかの態様では、第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーの３’末端配列は、第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーに含まれる３’末端配列よりも少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０多い３’ヌクレオチドを含む。

【0058】

５’末端共通配列を含む第２のフォワードプライマー、５’末端共通配列および任意の数の更なるヌクレオチドを含む第２のフォワードプライマー、５’末端共通配列を含む第２のリバースプライマー、および５’末端共通配列および任意の数の更なるヌクレオチドを含む第２のリバースプライマー、ならびに５’末端共通配列および任意の数の更なるヌクレオチドを含む第２のリバースプライマーを含む、第２のフォワードプライマーと第２のリバースプライマーとの任意の組み合わせを、本明細書で提供される核酸品質を決定する方法において調製されるＰＣＲ混合物の第２のプライマーセットに含めることができる。したがって、第２のプライマーセットは、等しい数の第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーを含み得る。第２のプライマーセットはまた、等しくない数の第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーを含み得る。いくつかの態様では、第２のプライマーセットは約１～２０の第２のフォワードプライマーを含む。いくつかの態様では、第２のプライマーセットは約１～２０の第２のリバースプライマーを含む。第２のプライマーセットは、任意の数の第２のフォワードプライマーおよび任意の数の第２のリバースプライマーを含み得る。

【0059】

第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーは、第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーの３’末端配列の第１の融解温度よりも高い融解温度を有し得る。第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーの融解温度は、第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーの５’末端共通配列の第２の融解温度と同様であり得るか、またはそれに対応し得る。例えば、第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーが５’末端共通配列以外の配列を含まない場合、第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーの融解温度は、第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーに含まれる５’末端共通配列の第２の融解温度に対応し得る。別の例として、第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーが５’末端共通配列に加えてヌクレオチドを含む場合、第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーの融解温度は、第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーに含まれる５’末端共通配列の第２の融解温度よりも高くなり得る。第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーの融解温度は、第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーに含まれる５’末端共通配列の第２融解温度よりも約０．５℃、１．０℃、１．５℃、２．０℃、２．５℃、３．０℃、３．５℃、４．０℃、４．５℃、５．０℃、５．５℃、６．０℃、６．５℃、７．０℃、７．５℃、８．０℃、８．５℃、９．０℃、９．５℃、１０．０℃、１０．５℃、１１．０℃、１１．５℃、１２．０℃、１２．５℃、１３．０℃、１３．５℃、１４．０℃、１４．５℃、１５．０℃、１５．５℃、１６．０℃、１６．５℃、１７．０℃、１７．５℃、１８．０℃、１８．５℃、１９．０℃、１９．５℃、２０．０℃、２０．５℃、２１．０℃、２１．５℃、２２．０℃、２２．５℃、２３．０℃、２３．５℃、２４．０℃、２４．５℃、２５．０℃、およびその間の任意の数または範囲で高くなり得る。

【0060】

いくつかの態様では、本明細書で提供される方法において使用されるプライマーセットの第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーはタグまたは標識を含む。タグまたは標識は、例えば、ＰＣＲにより生成されたアンプリコンの検出に使用することができる。カラータグまたはラベルを含む任意の種類のタグまたはラベルを使用することができる。例示的なカラータグまたはラベルは、フルオロフォアを含む。例えば、ユウロピウムおよびテルビウムのものを含む蛍光ランタニド錯体、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチル－クマリン、ピレン、マラカイトグリーン、スチルベン、ルシファーイエロー、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から入手可能である）、および参照によりその全体が本明細書に明確に組み込まれる１１ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｂｙ Ｒｉｃｈａｒｄ Ｐ．Ｈａｕｇｌａｎｄに記載されている他のものを含む、任意のフルオロフォアを使用することができる。他のフルオロフォアとしては、例えば、Ｃｙ３－ｄＣＴＰ、Ｃｙ３－ｄＵＴＰ、Ｃｙ５－ｄＣＴＰ、Ｃｙ５－ｄＵＴＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、フルオレセイン－１２－ｄＵＴＰ、テトラメチルローダミン－６－ｄＵＴＰ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（登録商標）－５－ｄＵＴＰ、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ（登録商標）－７－ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ－１４－ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）Ｒ－１４－ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＲ－１４－ｄＵＴＰ、ローダミングリーン（商標）－５－ｄＵＴＰ、オレゴングリーン（登録商標）４８８－５－ｄＵＴＰ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（登録商標）－１２－ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）６３０／６５０－１４－ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）６５０／６６５－１ ４－ｄＵＴＰ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８－５－ｄＵＴＰ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５３２－５－ｄＵＴＰ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８－５－ｄＵＴＰ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４－５－ｄＵＴＰ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６－１ ４－ｄＵＴＰ、フルオレセイン－１２－ＵＴＰ、テトラメチルローダミン－６－ＵＴＰ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（登録商標）－５－ＵＴＰ、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ（登録商標）－７－ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ－１４－ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＭＲ－１４－ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＲ－１４－ＵＴＰ、ローダミングリーン（商標）－５－ＵＴＰ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８－５－ＵＴＰ、およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６－１ ４－ＵＴＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５３２、Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４、Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７、ＢＯＤＩＰＹ ４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ ６５０／６６５、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ、Ｃａｓｃａｄｅ Ｙｅｌｌｏｗ、Ｄａｎｓｙｌ、リサミンローダミンＢ、Ｍａｒｉｎａ Ｂｌｕｅ、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ４８８、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ５１４、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、ローダミン６ Ｇ、ローダミングリーン、ローダミンレッド、ならびにＣｙ２、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５．５、およびＣｙ７（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）が挙げられる。

【0061】

本明細書で提供されるサンプル中の核酸の品質を決定する方法は、サンプルに対して第１のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うステップを含み得る。いくつかの態様では、第１のＰＣＲの各サイクルの第１の伸長ステップは、本明細書で提供されるＰＣＲ反応混合物に含まれる第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーの３’末端配列の第１の融解温度程度の温度である。いくつかの態様では、第１の伸長ステップは、第１の融解温度よりも約５℃低い温度から第１の融解温度よりも５℃高い温度である。いくつかの態様では、第１の伸長ステップは、第２の融解温度よりも少なくとも５℃低い温度である。いくつかの態様では、第１の伸長ステップは、第１の融解温度よりも約５℃低い温度から第１の融解温度よりも５℃高く、第２の融解温度より少なくとも５℃低い温度である。いくつかの態様では、第１の伸長ステップは約４５℃～７０℃である。いくつかの態様では、第１の伸長ステップは、約４５℃～５０℃、約４５℃～５５℃、約４５℃～６０℃、約４５℃～６５℃、約４５℃～７０℃である。いくつかの態様では、例として、第１の伸長ステップは、約７０℃～６５℃、約７０℃～６０℃、約７０℃～５５℃、約７０℃～５０℃、約７０℃～４５℃である。いくつかの態様では、第１の伸長ステップは約５０℃～５３℃である。いくつかの態様では、第１の伸長ステップは約５０．７℃～５２．５℃である。いくつかの態様では、第１の伸長ステップは約５０℃である。

【0062】

第１の伸長ステップは、任意の適切な長さの時間であり得る。例えば、第１の伸長ステップは、約３０秒、約４０秒、約５０秒、約１分、約１分１０秒、約１分２０秒、約１分３０秒、約１分４０秒、約１分５０秒、約２分、約２分１０秒、約２分２０秒、約２分３０秒、約２分４０秒、約２分５０秒、約３分、およびその間の任意の数または範囲であり得る。いくつかの態様では、第１の伸長ステップは約２分間である。

【0063】

第１のＰＣＲは、任意の適切な数のサイクルを含み得る。一般に、第１のＰＣＲのサイクル数は１０サイクル未満であるが、より多くのサイクル数を行うこともできる。第１のＰＣＲは、約１サイクル、約２サイクル、約３サイクル、約４サイクル、約５サイクル、約６サイクル、約７サイクル、約８サイクル、約９サイクル、約１０サイクルであり得る。いくつかの態様では、第１のＰＣＲは約３～５サイクルを含む。

【0064】

本明細書で提供されるサンプル中の核酸の品質を決定する方法は、サンプルに対して第２のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うステップを含み得る。いくつかの態様では、第２のＰＣＲにおける各サイクルの第２の伸長ステップは、本明細書で提供されるＰＣＲ反応混合物に含まれる第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーの５’末端共通配列の第２の融解温度程度である。いくつかの態様では、第２の伸長ステップは、第２の融解温度よりも約５℃低い温度から第２の融解温度よりも５℃高い温度である。いくつかの態様では、第２の伸長ステップは、第１の融解温度よりも少なくとも５℃高い温度である。いくつかの態様では、第２の伸長ステップは、第２の融解温度よりも約５℃低い温度から第２の融解温度よりも５℃高く、第１の融解温度よりも少なくとも５℃高い温度である。いくつかの態様では、第２の伸長ステップは約６０℃～８５℃である。いくつかの態様では、例として、第２の伸長ステップは、約６０℃～８５℃、約６０℃～８０℃、約６０℃～７５℃、約６０℃～７０℃、約６０℃～６５℃である。いくつかの態様では、第２の伸長ステップは、約８０℃～８５℃、約７５℃～８５℃、約７０℃～８５℃、約６５℃～８５℃、約６０℃～８５℃である。いくつかの態様では、第２の伸長ステップは約７０℃～７５℃である。いくつかの態様では、第２の伸長ステップは約７０℃～７３℃である。いくつかの態様では、第２の伸長ステップは約７０℃～７２℃である。いくつかの態様では、第２の伸長ステップは約７０℃～７１℃である。いくつかの態様では、第２の伸長ステップは約７０℃～７０．９℃である。いくつかの態様では、第２の伸長ステップは約７０℃である。

【0065】

第２の伸長ステップは、任意の適切な長さの時間であり得る。例えば、第２の伸長ステップは、約３０秒、約４０秒、約５０秒、約１分、約１分１０秒、約１分２０秒、約１分３０秒、約１分４０秒、約１分５０秒、約２分、約２分１０秒、約２分２０秒、約２分３０秒、約２分４０秒、約２分５０秒、約３分、およびその間の任意の数または範囲であり得る。いくつかの態様では、第２の伸長ステップは約１分間である。

【0066】

第２のＰＣＲは、任意の適切な数のサイクルを含み得る。一般に、第２のＰＣＲのサイクル数は１０サイクルを超えるが、より少ないサイクル数で行うこともできる。第２のＰＣＲは、約１０サイクル、１１サイクル、約１２サイクル、約１３サイクル、約１４サイクル、約１５サイクル、約１６サイクル、約１７サイクル、約１８サイクル、約１９サイクル、約２０サイクル、約２１サイクル、約２２サイクル、約２３サイクル、約２４サイクル、約２５サイクル、約２６サイクル、約２７サイクル、約２８サイクル、約２９サイクル、約３０サイクル、約３１サイクル、約３２サイクル、約３４サイクル、約３５サイクル、約３６サイクル、約３７サイクル、約３８サイクル、約３９サイクル、約４０サイクル、約４１サイクル、約４２サイクル、約４３サイクル、約４４サイクル、約４５サイクル、約４６サイクル、約４７サイクル、約４８サイクル、約４９サイクル、約５０サイクル、またはそれを超えるサイクル数であり得る。いくつかの態様では、第２のＰＣＲは約１０～３５サイクルを含む。いくつかの態様では、第２のＰＣＲは約１５～２５サイクルを含む。

【0067】

本明細書で提供されるサンプル中の核酸の品質を決定する方法は、アンプリコンのサイズ範囲を決定するステップを含み得る。本明細書で使用される場合、アンプリコン」は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、または遺伝子重複などの増幅または複製事象の産物である核酸を意味する。ＰＣＲなどの増幅反応の産物に言及する場合、文脈上特に明記されていない限り、「アンプリコン」および「ＰＣＲ産物」という用語は互換的に使用することができる。

【0068】

第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーは、レトロトランスポゾンの両鎖に沿ったジグザグ配列および／または非重複配列に対して、それらの３’末端で相補性を有するように設計することができる。各第１のフォワードプライマーは、一般に各第１のリバースプライマーでアンプリコンを生成することができ、各第１のリバースプライマーは、一般に各第１のフォワードリバースプライマーでアンプリコンを生成することができるので、本明細書で提供される方法を使用して、約５０～２００ｂｐ、約５０～３００ｂｐ、約５０～４００ｂｐ、約５０～５００ｂｐ、約５０～６００ｂｐ、約５０～７００ｂｐ、約５０～８００ｂｐ、約５０～９００ｂｐ、約５０～１，０００ｂｐ、約５０～１，５００ｂｐ、約５０～２，０００ｂｐ、約５０～２，５００ｂｐ、約５０～３，０００ｂｐ、約５０～３，５００ｂｐ、約５０～４，０００ｂｐ、約５０～４，５００ｂｐ、約５０～５，０００ｂｐを含む、様々なサイズのアンプリコンを単独で生成することができる。いくつかの態様では、アンプリコンは約１００～２，０００ｂｐの範囲である。本明細書で提供される方法によって生成される任意のアンプリコンのサイズ範囲は、核酸品質の解析に使用することができる。

【0069】

本明細書で提供される核酸品質を決定する方法は、アンプリコンの強度比を決定するステップを含み得る。Ａｇｉｌｅｎｔ ４２００ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎシステム、Ａｇｉｌｅｎｔ ２２００ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎシステム、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒシステム、Ａｇｉｌｅｎｔ ＤＮＡ ＳｃｒｅｅｎＴａｐｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｄ１０００ ａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｄ１０００ Ｓｃｒｅｅｎ Ｔａｐｅ Ａｓｓａｙｓ、Ｌａｂ９０１ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ、およびＳｈｉｍａｄｚｕ ＭＣＥ－２０２ ＭｕｌｔｉＮＡなどを含む任意の適切な方法を使用してアンプリコンサイズおよびアンプリコン強度比を決定することができる。いくつかの態様では、予測されるアンプリコンサイズの存在は核酸品質と相関する。いくつかの態様では、予測されるアンプリコンサイズの存在は核酸サイズと相関する。いくつかの態様では、予測されるアンプリコン強度の存在は核酸品質と相関する。いくつかの態様では、予測されるアンプリコン強度の存在は核酸品質と相関する。

【0070】

本明細書で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数の参照を含む。したがって、例えば、「方法」への言及は、本開示などを読めば当業者には明らかになるであろう本明細書に記載される種類の１つもしくはそれを超える方法および／またはステップを含む。

【0071】

他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。

【0072】

量、持続時間などの測定可能な値に言及する際に本明細書で使用される「約」とは、指定された値から±２０％または±１０％、または±５％、またはさらには±１％の変動を包含することを意味し、かかる変動は、開示された組成物または開示された方法を実施するのに適切である。

【0073】

本明細書で使用される場合、「核酸」という用語は、任意のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子、リボ核酸（ＲＮＡ）分子、または核酸類似体を指す。ＤＮＡまたはＲＮＡ分子は、二本鎖または一本鎖であり得、任意のサイズであり得る。例示的な核酸としては、染色体ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲ）、ｈｎＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な核酸類似体としては、ペプチド核酸、モルホリノおよびロックド核酸、グリコール核酸およびトレオース核酸が挙げられる。本明細書で使用される場合、「核酸分子」および「核酸」という用語は、例えば、核酸分子および核酸の断片、ならびに任意の全長または非断片化核酸分子および核酸を含むことを意味する。

【0074】

本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド」という用語は、リボ核酸およびデオキシリボ核酸の両方の個々の単位、ならびにヌクレオシドおよびヌクレオチド類似体、および標識ヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチドを含む。さらに、「ヌクレオチド」は、糖、リン酸および／または塩基単位が存在しないかもしくは他の化学構造によって置き換えられているものなど、天然に存在しない類似体構造を含む。したがって、「ヌクレオチド」という用語は、個々のペプチド核酸（ＰＮＡ）（Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１９９４；５（ｌ）：３－７）ユニットおよびロックド核酸（ＬＮＡ）（Ｂｒａａｓｃｈ ａｎｄ Ｃｏｒｅｙ，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２００１；８（１）：１－７）ユニットならびに他の同様のユニットを包含する。

【0075】

本明細書で使用される場合、「サンプル」および「生物学的サンプル」という用語は、本明細書で提供される組成物および方法での使用に適した任意のサンプルを指す。本組成物および方法と共に使用されるサンプルは、対象に由来する組織サンプルもしくは体液、または生検手順（例えば、針生検）もしくは外科的処置によって得られた組織から得ることができる。本方法の生物学的サンプルは、体液、例えば脳脊髄液（ＣＳＦ）、血液、血清、血漿、尿、唾液、涙、および腹水などのサンプルであり得る。体液のサンプルは、当業者に公知の任意の適切な方法によって回収することができる。

【0076】

本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、本明細書に開示される方法が実施される任意の個体または患者を指す。「対象」という用語はまた、本明細書で提供される組成物および方法と共に使用するための核酸の供給源である任意の個体または患者を含み得る。「対象」という用語は、「個体」または「患者」という用語と互換的に使用することができる。対象はヒトであってもよいが、当業者には理解されるように、対象は動物であってもよい。したがって、哺乳動物、例えばげっ歯類（マウス、ラット、ハムスターおよびモルモットを含む）、ネコ、イヌ、ウサギ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタなどを含む家畜、霊長類（サル、チンパンジー、オランウータンおよびゴリラを含む）、爬虫類、鳥類、両生類、硬骨魚類、軟骨魚類、および無脊椎動物を含む他の動物が、対象の定義内に含まれる。対象は、植物または微生物であってもよい。

【実施例】

【0077】

実施例１
この実施例は、単一の増幅反応からの核酸品質の解析のためのより広い範囲のＤＮＡサイズを提供し、より少ない量のＤＮＡと共に使用することができ、個々の部位でのＤＮＡ変化の影響を受けにくい新規アッセイの設計を説明する。

【0078】

ＤＮＡ品質を決定するための現在の方法は、例えば、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）のためのライブラリー調製にサンプルを進めるべきかどうかを効果的に評価するには不十分である。サンプルが首尾よく変換され得るかどうかの成功を予測する機能的アッセイを有している場合、非常に有用であろう。定量的機能指標（ＱＦＩ）アッセイは、増幅性について少数のＤＮＡセグメントを調べるが、断片の数およびサイズが限られているため、その有用性に限界がある。したがって、アッセイの予測可能性を改善するために、より適切なサイズ範囲にわたってより多くのゲノム断片を増幅するアッセイを生成した。

【0079】

ＤＮＡ品質を決定するための新規なアッセイは、ゲノム上の数百以上の異なる部位を増幅することができる少数のプライマーを用いた、ヒトゲノムの反復配列の増幅に依拠している。これらのプライマーは、ＮＧＳに関連する領域を増幅することができ、その結果、ＤＮＡ品質のより正確な把握を行うことができるようにする。

【0080】

Ｌ１レトロトランスポゾンの高度に反復された５’末端の配列に基づいてプライマーを設計した。両鎖に沿ったジグザグ配列を、均一な融解温度を有し、１０７～８３３ｂｐの範囲の断片サイズを生じるように選択した。選択された７つのプライマーの各々は、反対の鎖上の他のプライマーの各々と６８を超える異なるアンプリコンを生成するはずである。これは、１００～２，０００ｂｐ領域に多くのサイズを有する断片をもたらす。図１は、ＤＮＡプライマーおよびアッセイ方法の概要を提供する。

【0081】

Ｌ１結合プライマーは、ヒトＤＮＡに存在しない共通の配列に融合され、１つの配列が＋鎖プライマーに付加され、２つ目の配列が－鎖プライマーに融合される。融合点に隣接する塩基は、Ｌ１配列との重複を最小限に抑えるように選択した。次いで、融合プライマーを低濃度で増幅混合物に添加し、ごく少数のサイクル（例えば、３～５サイクルであり、サイクル数は最適化することができる）でＬ１配列のＴｍでゲノムＤＮＡを増幅するために使用する。図２は、初回ＰＣＲの代表的なＬＩＮＥ配列を、予想されるアンプリコン長および予測されるアンプリコンの数と共に示す。

【0082】

少数のサイクルの後、温度を５’末端融合配列のＴｍまで上昇させ、次いで、大モル過剰の融合プライマーにより、反応をさらに多くのサイクルにわたって増幅する（例えば、１５～２５サイクルであり、サイクル数は最適化することができる）。これにより、標準的なＤＮＡサイジング装置（例えば、ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ、ＤＮＡシーケンサー、またはサイズによってＤＮＡを分離するための他の方法）で分離される広範囲のＤＮＡ断片が生成される。特定のサイズまたはサイズ範囲における強度比は、ＤＮＡサイズおよび品質と相関させるために使用される。プライマーおよびプライマー成分を図３に示す。予測されるアンプリコンのサイズ分布を図４に示す。

【0083】

アッセイのいくつかの改変が可能である。例えば、共通のプライマーを１つまたは数塩基だけＬ１配列に伸長させ、異なる色のタグで標識することができ、その結果、特異的な断片のより良好な分解能が起こり得る。例えば、可能な性能向上のために異なるプライマーを使用することもできる。

【0084】

この方法の利点は、出発物質としての反復ＤＮＡの使用に由来する。ゲノム当たりＤＮＡの１００～１０００倍のコピーの存在により、はるかに少量のＤＮＡの検出および非常に少量の出発物質の使用が可能になる。ＤＮＡ断片の多くはわずかに異なるサイズを有するので、標準的なＱＦＩアッセイと比較して、より多くのサイズが調べられる。さらに、ゲノム全体からの領域が検査されるので、ゲノムの単一領域が変化してもアッセイに実質的な影響を及ぼすことはない。

【0085】

要約すると、核酸品質を決定するための新規なアッセイを、反復核酸配列の解析に基づいて設計した。新規なアッセイは、例えばライブラリー調製および次世代シーケンシング（ＮＧＳ）などの用途、ならびに核酸品質が重要である任意の他の用途のために核酸品質を決定するのに有用である。

【化1】

【表1】

【0086】

本開示を通してなされた、特許、特許出願、特許公報、雑誌、書籍、論文、ウェブコンテンツなどの他の文書へのありとあらゆる参照および引用は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。

【0087】

本発明を上記の例を参照して説明したが、本発明の精神および範囲内に修正および変形が包含されることは理解されよう。したがって、本発明は、以下の特許請求の範囲によってのみ限定される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【配列表】

2023520871000001.app

【国際調査報告】