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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-05-22
(54)【発明の名称】ゲラニル二リン酸誘導化合物の産生
(51)【国際特許分類】
C12N 1/16 20060101AFI20230515BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230515BHJP
C12P 7/22 20060101ALI20230515BHJP
C12N 9/00 20060101ALN20230515BHJP
A61K 8/31 20060101ALN20230515BHJP
A61K 8/34 20060101ALN20230515BHJP
A61K 31/015 20060101ALN20230515BHJP
A61K 31/045 20060101ALN20230515BHJP
A61K 8/9728 20170101ALN20230515BHJP
【ＦＩ】
C12N1/16
C12N1/19 ZNA
C12P7/22
C12N9/00
A61K8/31
A61K8/34
A61K31/015
A61K31/045
A61K8/9728
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022560923
(86)(22)【出願日】2021-04-07
(85)【翻訳文提出日】2022-12-02
(86)【国際出願番号】 DK2021050098
(87)【国際公開番号】W WO2021204338
(87)【国際公開日】2021-10-14
(31)【優先権主張番号】PA202070216
(32)【優先日】2020-04-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】DK
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522014057
【氏名又は名称】ケブンハウン ユニヴェルスィテイト
(74)【代理人】
【識別番号】110000659
【氏名又は名称】弁理士法人広江アソシエイツ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】カンプラニス，ソティリオス
(72)【発明者】
【氏名】デュッソー，サイモン
(72)【発明者】
【氏名】イグネア，コドルタ
(72)【発明者】
【氏名】ヴァイン，ウィリアム トーマス
【テーマコード（参考）】
4B050
4B064
4B065
4C083
4C206
【Ｆターム（参考）】
4B050CC07
4B050LL05
4B064AC18
4B064CA06
4B064CA19
4B064DA01
4B064DA10
4B064DA12
4B065AA72X
4B065AA72Y
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA41
4B065CA44
4B065CA48
4B065CA50
4B065CA51
4C083AA031
4C083AA032
4C083AD531
4C083AD532
4C083CC01
4C083FF01
4C206AA04
4C206BA04
4C206CA08
4C206KA01
4C206NA20
(57)【要約】
ペルオキシソーム局在化ＧＰＰシンターゼと、ＧＰＰをモノテルペノイド、カンナビノイド、モノテルペンインドールアルカロイドおよびプレニル化芳香族化合物に変換するペルオキシソーム局在化酵素、または前駆体を有する酵母細胞が開示され、したがって、酵母細胞は、ＧＰＰシンターゼおよびＧＰＰを変換する酵素が細胞質に位置する同じ酵母細胞と比較して、改善された量のモノテルペノイド、カンナビノイド、モノテルペンインドールアルカロイドおよびプレニル化芳香族化合物を産生することができる。モノテルペノイド、カンナビノイド、モノテルペンインドールアルカロイドおよびプレニル化芳香族化合物を産生するための酵母細胞の使用がさらに開示される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
分岐点化合物の形成を触媒するペルオキシソーム局在化酵素であって、前記分岐点化合物を優先経路および非優先経路で変換することができる局在化酵素、および前記非優先経路の前記第１の工程を触媒するペルオキシソーム局在化酵素を含む酵母細胞。
【請求項2】
サッカロミセス属、ピキア属、カンジダ属、オガテア属、またはヤロウィア属の１つに属する、請求項１に記載の酵母細胞。
【請求項3】
前記酵母が、サッカロミセス・セレビシエ、ピキア・パストリス、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・ボイディニー、オガタエア・ポリモルファ、またはヤロウィア・リポリティカの種の中から選択される、請求項２に記載の酵母細胞。
【請求項4】
ペルオキシソーム局在化が、ペルオキシソーム局在化シグナルを前記それぞれの酵素をコードする前記遺伝子に挿入することによってもたらされる、請求項１～３のいずれかに記載の酵母細胞。
【請求項5】
前記分岐点化合物の形成を触媒する前記酵素がＧＰＰシンターゼであり、前記非優先経路の前記第１の工程を触媒する前記酵素が、テルペンシンターゼ、プレニルトランスフェラーゼ、または他のイソプレノイドもしくは非イソプレノイドプレニルトランスフェラーゼの中から選択される、請求項１～４のいずれかに記載の酵母細胞。
【請求項6】
前記テルペンシンターゼが、（＋）－リモネンシンターゼ、（－）－リモネンシンターゼ、アルファ－ピネンシンターゼ、１，８－シネオールシンターゼ、サビネンシンターゼ、カンフェンシンターゼまたはゲラニオールシンターゼ、ベータ－ピネンシンターゼ、リナロールシンターゼ、ミルセンシンターゼ、ボルニル二リン酸シンターゼ、アルファ－テルピネオールシンターゼ、イソボルネオールシンターゼ、トリシクレンシンターゼ、アルファ－ツジエンシンターゼ、アルファ－フェンチェンシンターゼ、デルタ－２－カレンシンターゼ、アルファ－フェランドレンシンターゼ、３－カレンシンターゼ、１，４－シネオールシンターゼ、アルファ－テルピネンシンターゼ、ベータ－フェランドレンシンターゼ、（Ｚ）－ベータ－オシメンシンターゼ、（Ｅ）－ベータ－オシメンシンターゼ、ガンマ－テルピネンシンターゼ、テルピノレンシンターゼ、アロ－オシメンシンターゼ、シス－ベータ－テルピネオールシンターゼ、シス－テルピン－１－オールシンターゼ、デルタ－テルピネオールシンターゼ、ボルネオールシンターゼ、ボルタンオールシンターゼ、アルファ－テルピネオールシンターゼ、ネロールシンターゼ、２－メチル－イソボルネオールシンターゼ、２－メチレンボルネンシンターゼ、２－メチル－２－ボルネンシンターゼ、またはベータ－フェランドレンシンターゼから選択される、請求項５に記載の酵母細胞。
【請求項7】
前記テルペンシンターゼが、９、１１または１２の炭素原子を有する非標準のイソプレノイド基質を受け入れる、請求項５に記載の酵母細胞。
【請求項8】
前記プレニルトランスフェラーゼ、または別のイソプレノイドもしくは非イソプレノイドプレニルトランスフェラーゼが、芳香族プレニルトランスフェラーゼおよびゲラニル二リン酸：オリベトラートゲラニルトランスフェラーゼの中から選択される、請求項５に記載の酵母細胞。
【請求項9】
前記分岐点化合物の前記形成を触媒する前記酵素、および前記非優先経路の前記第１の工程を触媒する前記酵素が、ａ．ＤＭＡＰＰを合成できる酵素、例えばＩＤＩ、およびイソプレンシンターゼ活性を有する酵素、または
ｂ．ＤＭＡＰＰを合成することができる酵素、例えばＩＤＩ、およびＬａｖａｎｄｕｌａ ｘ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ由来のラバンデュリル二リン酸シンターゼ、またはＴａｎａｃｅｔｕｍ ｃｉｎｅｒａｒｉｉｆｏｌｉｕｍ由来のクリサンテミル二リン酸シンターゼと同様のプレニルトラスフェラーゼ活性を有する酵素、
ｃ．ＤＭＡＰＰを合成することができる酵素、例えばＩＤＩ、およびＡｒｔｅｍｉｓｉａ ｃａｐｉｌｌａｒｉｓ由来の７－ＤＭＡＴＳまたはＡｃＰＴ１と類似するＣ－プレニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素、
ｄ．ＤＭＡＰＰを合成することができる酵素、例えばＩＤＩ、およびＡｎｔｒｏｄｉａ ｃａｍｐｈｏｒａｔａ由来のＡｃａＰＴと同様のＯ－プレニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素
の中から選択される、請求項１～４のいずれかに記載の酵母細胞。
【請求項10】
モノテルペノイド、カンナビノイド、モノテルペンインドールアルカロイドおよびプレニル化芳香族化合物から選択される化合物を産生するための方法であって、ｅ．請求項１～９のいずれかに記載の酵母細胞をもたらす工程
ｆ．前記酵母細胞の増殖を支える基質で前記酵母細胞を発酵させる工程、
ｇ．必要に応じて、前記酵母にプレニル化される前記基質（例えば、オリベトール酸、オリベトール酸誘導体、またはｐ－クマリン酸）を供給する工程、および
ｈ．前記発酵ブロスから前記化合物を回収する工程
を含む、方法。
【請求項11】
ｅ．工程ｄの前記化合物を、さらなる天然または不均一に発現された酵素の作用によって前記酵母細胞内のより複雑な生成物を変換する工程をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記化合物が、サビネン、アルファ－ピネン、ベータ－ピネン、カンフェン、（＋）－リモネン、（－）－リモネン、ゲラニオール、リナロール、ミルセン、１，８－シネオール、ボルネオール、二リン酸ボルニル、アルファ－テルピネオール、イソボルネオール、トリシクレン、アルファ－ツエン、アルファ－フェンセン、デルタ－２－カレン、アルファ－フェランドレン、３－カレン、１，４－シネオール、アルファ－テルピネン、ベータ－フェランドレン、（Ｚ）－ベータ－オシメン、（Ｅ）－ベータ－オシメン、ガンマ－テルピネン、テルピネン－４－オール、テルピノレン、アロオシメン、シス－ベータ－テルピネオール、シス－テルピン－１－オール、デルタ－テルピネオール、アルファ－テルピネオール、ネロール、２－メチルイソボルネオール、２－メチレンボルネン、２－メチル－２－ボルネン、ベータ－フェランドレン、２－メチルリモネン、２－メチルミルセン、２－メチルゲラニオール、２－メチルリナロール、カンナビゲロール酸、カンナビベロール酸類似体、プレニルトリプトファン、アルテピリンＣ、ドルパニン、オスルチン、ゲラニル－レスベラトロール、ゲラニル化ケルセチン、ゲラニル－ナリンゲニン、ゲラニル－イソリキチゲニン、イソババカルコン、イソプレン、ラバンジュロール、クリサンテモールジメチルアリルトリプトファン、４’－ジメチルアリル－アピゲニン、６－プレニル－アピゲニン、４’－ジメチルアリル－ナリンギン、４’－ジメチルアリル－ケンペロール、４’－ジメチルアリル－ダイゼイン、７－ジメチルアリル－ダイゼイン、７，４’－ジ－（ジメチルアリル）－ダイゼイン、４’－ジメチルアリル－ゲニステイン、７－ジメチルアリル－ゲニステイン、７，４’－ジ－（ジメチルアリル）－ゲニステイン、４－ジメチルアリル－イソリキチゲニン、４’－ジメチルアリル－エコール、７－ジメチルアリル－エコール、６－ジメチルアリル－エコール、４’－ジメチルアリル－ダイジン、７－ジメチルアリル－ウンベリロン、８－ジメチルアリル－クルクミン、８’－ジ－メチルアリル－デメトキシクルクミン、８－ジメチルアリル－デメトキシクルクミン、４’－ジメチルアリル－レスベラトロール、または５－ジメチルアリル－ジエチルスチルベストロールから選択される、請求項１０または１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
配列表の参照
本願は、コンピュータ可読形式の配列表を含み、これは参照により組み込まれる。
本願は、コンピュータ可読形式の配列表を含み、これは参照により組み込まれる。
【0002】
本発明は、酵母細胞などの真核細胞におけるモノテルペノイド、カンナビノイド、イリドイド、モノテルペンインドールアルカロイド、およびプレニル化芳香族化合物の産生に関する。本発明はさらに、特にそのような産生に適合した操作された酵母細胞に関する。
【背景技術】
【0003】
テルペン、テルペノイド、その誘導体および他のプレニル化芳香族化合物は、例えば医薬品、化粧品、栄養補助食品、フレーバー、香料および殺虫剤として広く使用されている。天然または操作された細胞におけるこれらの化合物の産生を増加させる方法は、当技術分野において豊富である。
【0004】
再生可能な供給原料から価値のある分子を生産するために操作された微生物を使用することは、従来の生産手段からの望ましい代替手段である。しかし、経済的に実現可能な収量、力価および生産性を達成することは、工業化に対する大きな障害である。頻繁に遭遇する障害が、反対方向に引っ張っている、操作された経路と天然の代謝との間の相殺から生じる。代謝は、増殖および経路変更の必要性を満たす方向に進化しており、遺伝子調節、下流産生物による酵素レベルでの負のフィードバックループ、および効率的な競合経路などの複数の制御層のために困難であり得る。
【0005】
モノテルペンおよび他のゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）由来の化合物は、フレーバー、香料、殺虫剤として広く使用されており、ジェット燃料またはバイオポリマーの滴剤としての用途を見出すことができるが、これらの問題の主要な例である。一方では、植物天然源からの抽出は、増大する要求を満たすことがほとんどできず、環境的な課題を代表しているのに対して、他方では、微生物宿主による産生は、低い収率をもたらし、天然の代謝の制約によって妨げられる。
【0006】
操作された微生物によるモノテルペンの産生は、ＭＥＰ経路（主に原核生物）、ＭＶＡ経路、または代替ＭＶＡ経路のいずれかに依存し、３つすべてがＤＭＡＰＰおよびＩＰＰの形成をもたらし、これらは次に凝縮してＧＰＰを形成する。ＧＰＰは、ＧＰＰの１０の炭素骨格を様々なモノテルペンまたはその前駆体に再配列するモノテルペンシンターゼ（ＭＴＳ）によって広範囲のモノテルペンに変換されるか、またはＩＰＰ分子の連続的な付加によってＦＰＰまたはＧＧＰＰにさらに伸長され、それぞれセスキテルペンおよびジテルペンを形成する。ＧＰＰはまた、カンナビノイド、イリドイド、モノテルペンインドールアルカロイド、プレニル化芳香族化合物、および他のメロテルペノイドなどのテルペン部分を含むいくつかの化合物の合成の前駆体としても機能する。
【0007】
酵母は、その操作の容易さ、その天然のメバロン酸経路、およびテルペンの足場のデコレーションのためにその小胞体（ＥＲ）膜に機能性シトクロムＰ４５０を保有する良好な能力のために、テルペン産生の良好な宿主と考えられている。それは、工業規模でアルテミシニンおよびファルネセンなどのセスキテルペンを産生する多大な能力を示している。しかし、モノテルペンの産生はこれまではるかに成功に劣っている。
【0008】
これは主に、天然のステロール生合成とモノテルペンをもたらす異種経路との間のＧＰＰ分岐点で行われ、主に天然代謝に有利な、ロープを引っ張るゲームによって、説明することができる。野生型酵母では、生成されるＧＰＰベースの化合物はなく、ＧＰＰの唯一の目的は、ステロール経路でスクアレンを生成するためにＦＰＰにさらに伸長する中間体として機能することである。このため、酵母には専用のＧＰＰシンターゼは存在せず、ＧＰＰは二官能性ＧＰＰ－ＦＰＰシンターゼ、Ｅｒｇ２０ｐによって産生され、これは、形成されるとすぐにＧＰＰをＦＰＰに非常に効率的に変換し、ステロール合成に導くことが示されている。Ｅｒｇ２０ｐを厳密なＧＰＰシンターゼに変換することによって、またはその活性を低下させることによって、Ｅｒｇ２０ｐを下方制御するために様々な戦略が採用されてきたが、ステロール合成の本態的な本質は、ステロール合成に負荷をかけることによって細胞生存率を低下させながらも、それらの試みの中程度の成果しかもたらさなかった。区画化は、真核細胞が自身の代謝内の同様の問題を解決するために使用する戦略である。ミトコンドリア、ペルオキシソームおよび小胞体（ＥＲ）などの細胞小器官は、細胞の残りを毒性化合物から保護し、中間体を競合経路から単離し、酵素を阻害剤から遮蔽し、全体として、反応が代謝の主要部分から離れて起こるためのより適切な環境をもたらすように設計されている。
【0009】
そのような戦略の例が最近報告され、細胞質ゾルにおける同じ改変と比較して、ゲラニオールシンターゼと共にミトコンドリア内にＭＶＡ経路全体の余分なコピーを区画化することによって、ゲラニオールの産生が１１．５倍改善された。
【0010】
これは成功した戦略であることが証明されたが、ミトコンドリアをハイジャックすることは、より低い細胞生存率および増殖の株に代謝の負荷をもたらすようであった。これは、細胞のパワーハウスとしてのミトコンドリアの本質的な性質に起因する可能性があり、工業用途に必要な著しく高い力価に達するためのさらなる操作を妨げる可能性がある。これらの知見はまた、ミトコンドリアが、代謝の完全性を損なうことなく、どの程度まで操作され得るかに制限を伴い得ることを示した。
【0011】
米国特許出願公開第２０１５００１０９７８号明細書は、テルペノイドの生合成に関与する酵素をコードする遺伝子で細胞を形質転換することによって、膨大な数の細胞でテルペノイドを産生する方法を開示している。これらの遺伝子は、葉緑体を有する細胞の葉緑体ゲノムに導入され得る。例示は、ジテルペンの産生を開示している。
【0012】
韓国公開特許第２０１９００７９５７５号明細書は、ペルオキシソームの数が増加し、テルペノイドの産生の増加をもたらす組換え酵母を開示している。異種ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼの挿入も開示される。
【0013】
米国特許出願公開第２０１３０３０２８６１号明細書は、テルペンシンターゼをミトコンドリアに局在化させることによる酵母におけるテルペノイド産生を開示している。例示は、ＦＰＰ由来のセスキテルペンに焦点を当てている。
【0014】
Ｇｕｏ－Ｓｏｎｇ Ｌｉｕら（Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．２０２０，６８，７，２１３２－２１３８）は、酵母ペルオキシソームにおけるエルゴステロールのＦＰＰベースの前駆体であるスクアレンの産生を報告し、この細胞小器官におけるＭＶＡ経路の機能性を実証した。しかし、得られた株は、その細胞質ゾル対応物を上回ることはなかった。極めて可能性が高いのは、元の経路が既に十分に調整されており、細胞質ゾルでスクアレンを効率的に産生するように設計されているという事実のためである。
【発明の概要】
【0015】
第１の態様では、本発明は、分岐点化合物の形成を触媒するペルオキシソーム局在化酵素であって、分岐点化合物を優先経路および非優先経路で変換することができる局在化酵素、および非優先経路の第１の工程を触媒するペルオキシソーム局在化酵素を含む酵母細胞に関する。好ましい実施形態では、本発明は、ペルオキシソーム局在化ＧＰＰシンターゼおよびペルオキシソーム局在化モノテルペンシンターゼを含む酵母細胞に関する。
【0016】
第２の態様では、本発明は、本発明の酵母細胞を使用して、モノテルペノイド、カンナビノイド、イリドイド、モノテルペンインドールアルカロイド、およびプレニル化芳香族化合物を産生する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1】酵母におけるリモネンの産生を開示するチャートを示し、リモネンシンターゼ（ＭＴＳ）および／またはＧＰＰシンターゼは、細胞質またはペルオキシソームのいずれかに局在していた。さらなる詳細については、実施例１を参照されたい。
【図2】リモネンシンターゼ（ＭＴＳ）およびＧＰＰシンターゼと共にＭＶＡ経路の遺伝子をペルオキシソームに局在化させる効果を開示するチャートを示す。さらなる詳細については、実施例２を参照されたい。
【図3】それぞれのシンターゼのペルオキシソーム局在化による６つのモノテルペノイド、カンフェン、サビネン、（Ｓ）－（－）－リモネン、アルファ－ピネン、（Ｒ）－（＋）－リモネンおよび（Ｒ）－（＋）－リナロールの改善された産生を開示するチャートを示す。さらなる詳細については、実施例３を参照されたい。
【図5】テルペン産生に対するペルオキシソームへの二官能性ＧＰＰシンターゼ／テルペンシンターゼの酵素（ＧＰＰシンターゼ－テルペンシンターゼ融合物）の局在化の効果を開示するチャートを示す。さらなる詳細については、実施例５を参照されたい。
【図6A】トランス－イソピペリテノールおよび８－ヒドロキシ－ゲラニオールの産生を開示するグラフを示す。図６Ａは、株ＣＹＴＬｉｍ０６、ＰＥＲＬｉｍ２９およびＰＥＲＬｉｍ３０における（－）－リモネンおよびトランス－イソピペリテノールの産生を示す。
【0018】
配列表の概要
配列番号１は、サッカロミセス・セレビシエＥｒｇ２０ｐタンパク質に由来し、Ｅｒｇ２０ｐＮ１２７Ｗとして示される操作されたゲラニル二リン酸シンターゼのアミノ酸配列である。
配列番号１は、サッカロミセス・セレビシエＥｒｇ２０ｐタンパク質に由来し、Ｅｒｇ２０ｐＮ１２７Ｗとして示される操作されたゲラニル二リン酸シンターゼのアミノ酸配列である。
【0019】
配列番号２は、サッカロミセス・セレビシエＥｒｇ２０ｐタンパク質から誘導され、Ｅｒｇ２０ｐＮ１２７Ｗとして示され、ＳＫＬペルオキシソーム局在化シグナルがもたらされるゲラニル二リン酸シンターゼのアミノ酸配列である。
【0020】
配列番号：３は、Ｃ／ＬｉｍＳ遺伝子によってコードされる、シトラスリモン由来の（＋）－リモネンシンターゼのアミノ酸配列である。
【0021】
配列番号４は、Ｃ／ＬｉｍＳ遺伝子によってコードされ、ＳＫＬペルオキシソーム局在化シグナルがもたらされる、シトラスリモン由来の（＋）－リモネンシンターゼのアミノ酸配列である。
【0022】
配列番号５は、ソラリウム・エリア・アグニフォリウム（Ｓｏ－ｌａｎｕｍ ｅｌａｅａｇｎｉｆｏｌｉｕｍ）に由来し、ＳｅＣａｍＳ遺伝子によってコードされるカンフェンシンターゼのアミノ酸配列である。
【0023】
配列番号６は、ソラリウム・エリア・アグニフォリウムに由来し、ＳｅＣａｍＳ遺伝子によってコードされ、ＳＫＬペルオキシソーム局在化シグナルがもたらされるカンフェンシンターゼのアミノ酸配列である。
【0024】
配列番号７は、ＰｔＰｉｎＳ遺伝子によってコードされる、ピヌスタエダ由来のα－ピネンシンターゼのアミノ酸配列である。
【0025】
配列番号８は、ＰｔＰｉｎＳ遺伝子によってコードされ、ＳＫＬペルオキシソーム局在化シグナルがもたらされる、ピヌスタエダ由来のα－ピネンシンターゼのアミノ酸配列である。
【0026】
配列番号９は、サルビア・ポミフェラ（Ｓａｌｖｉａ ｐｏｍｉｆｅｒａ）由来の、ＳｐＳａｂＳ遺伝子によってコードされるサビネンシンターゼのアミノ酸配列である。
【0027】
配列番号１０は、サルビア・ポミフェラ由来の、ＳｐＳａｂＳ遺伝子によってコードされ、ＳＫＬペルオキシソーム局在化シグナルがもたらされるサビネンシンターゼのアミノ酸配列である。
【0028】
配列番号１１は、オシマム・バシリカム（Ｏｃｉｍｕｍ ｂａｓｉｌｉｃｕｍ）由来であり、ｔＯｂＧＥＳ遺伝子によってコードされるゲラニオールシンターゼのアミノ酸配列である。
【0029】
配列番号１２は、オシマム・バシリカムに由来し、ｔＯｂＧＥＳ遺伝子によってコードされ、ＳＫＬペルオキシソーム局在化シグナルがもたらされるゲラニオールシンターゼのアミノ酸配列である。
【0030】
配列番号１３は、カンナビス・サティバ（Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ）由来であり、ＣｓＰＴ４遺伝子によってコードされるゲラニル二リン酸：オリベトラートゲラニルトランスフェラーゼのアミノ酸配列である。
【0031】
配列番号１４は、カンナビス・サティバ由来であり、ＣｓＰＴ４遺伝子によってコードされ、ＳＫＬペルオキシソーム局在化シグナルでもたらされるゲラニル二リン酸：オリベトラートゲラニルトランスフェラーゼのアミノ酸配列である。
【0032】
配列番号１５は、５ｘＧＳポリペプチドによって連結され、Ｃ末端ＰＴＳ１によってペルオキシソームに標的化されるＧＰＰシンターゼドメイン（Ｅｒｇ２０ｐＮ１２７Ｗ）とテルペンシンターゼドメイン（Ｃ／ＬｉｍＳ）とを有する間の融合タンパク質のアミノ酸配列である。
【0033】
配列番号１６は、５ｘＧＳポリペプチドによって連結され、Ｃ末端ＰＴＳ１によってペルオキシソームに標的化されるテルペンシンターゼドメイン（Ｃ／ＬｉｍＳ）とＧＰＰシンターゼドメイン（Ｅｒｇ２０ｐＮ１２７Ｗ）とを有する間の融合タンパク質のアミノ酸配列である。
【0034】
配列番号１７は、ニチノウソウ由来であり、ＣｒＧ８０Ｈ遺伝子によってコードされるゲラニオール８－ヒドロキシラーゼのアミノ酸配列である。
【0035】
配列番号１８は、ニチノウソウに由来し、Ｃｉ ＯＰＲ遺伝子によってコードされるシトクロムＰ４５０レダクターゼのアミノ酸配列である。
【0036】
配列番号１９は、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）由来の芳香族プレニルトランスフェラーゼＡｔａＰＴのアミノ酸配列である。
【0037】
配列番号２０は、Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ由来の７－ジメチルアリルトリプトファンシンターゼ（７－ＤＭＡＴＳ）のアミノ酸配列である。
【0038】
配列番号２１は、Ａｒｔｅｍｉｓｉａ ｃａｐｉｌｌａｒｉｓ由来のフェニルプロパン特異的プレニルトランスフェラーゼＡｃＰＴ１のアミノ酸配列である。
【0039】
配列番号２２は、メンタ・シトラータ由来であり、ＭｃＬｉＳ遺伝子によってコードされる（Ｒ）－（＋）－リナロールシンターゼのアミノ酸配列である。
【0040】
配列番号２３は、メンタ・シトラータ由来であり、ＭｃＬｉＳ遺伝子によってコードされ、ＳＫＬペルオキシソーム局在化シグナルがもたらされる（Ｒ）－（＋）－リナロールシンターゼのアミノ酸配列である。
【0041】
配列番号２４は、スペアミント由来の、ＭｓＬｉｍＳ遺伝子によってコードされる（Ｓ）－（－）－リモネンシンターゼのアミノ酸配列である。
【0042】
配列番号２５は、スペアミント由来の、ＭｓＬｉｍＳ遺伝子によってコードされ、ＳＫＬペルオキシソーム局在化シグナルがもたらされる（Ｓ）－（－）－リモネンシンターゼのアミノ酸配列である。
【0043】
配列番号２６は、オシマム・バシリカムに由来し、ＯｂＭｙｒＳ遺伝子によってコードされ、ＳＫＬペルオキシソーム局在化シグナルがもたらされるベータ－ミルセンシンターゼのアミノ酸配列である。
【0044】
配列番号２７は、ＭｓＬｉｍ３Ｈ遺伝子によってコードされる、スペアミント由来のリモネン－３－ヒドロキシラーゼのアミノ酸配列である。
【0045】
配列番号２８は、タキスス・カスピダタ（Ｔａｘｕｓ ｃｕｓｐｉｄａｔａ）由来であり、ｔｃＣＰＲ遺伝子によってコードされるシトクロムＰ４５０レダクターゼのアミノ酸配列である。
【0046】
配列番号２９は、カンナビス・サティバ由来であり、ＣｓＰＴ４遺伝子によってコードされ、Ｎ末端ペルオキシソーム局在化シグナルがもたらされるゲラニル二リン酸：オリベトラートゲラニルトランスフェラーゼのアミノ酸配列である。
定義および略語
定義および略語
【0047】
分岐点分子：分岐点分子は、本発明によれば、２つ以上の異なる他の分子または経路に変換することができる生化学的経路の分子を意味することを意図している。例は、ＦＰＰに変換され、それによってセスキテルペンおよび高級テルペンの合成に導くことができるＧＰＰであるか、またはそれは、モノテルペンシンターゼによってモノテルペンに、プレニルトランスフェラーゼ酵素によってカンナビノイドに、または対応するプレニルトランスフェラーゼによってプレニル化芳香族化合物に変換することができる。分岐点分子には、典型的には、好まれるまたは優先される経路、これは天然酵母細胞において、例えば生合成の必要性のために優先される、および非優先的な１つまたは複数の他の経路が存在する。
【0048】
ＤＭＡＰＰおよびＩＰＰ：ジメチルアリルピロリン酸（またはジメチルアリル二リン酸；ＤＭＡＰＰ）およびイソペンテニルピロリン酸（またはイソペンテニル二リン酸；ＩＰＰ）は、イソプレノイドを作製するために使用される５炭素前駆体である。
【0049】
ＧＰＰ：ゲラニル二リン酸（またはゲラニルピロリン酸；ＧＰＰ）。ＧＰＰは、ＤＭＡＰＰとＩＰＰ分子との縮合によって形成される。ＧＰＰはイソプレノイド合成における分岐点分子であり、ＩＰＰ分子の添加によってＦＰＰに変換され、それによってセスキテルペン、ジテルペンもしくはトリテルペンの生合成またはステロール合成に導くことができ、またはモノテルペンシンターゼの作用によって、モノテルペノイド、イリドイドおよびモノテルペンインドールアルカロイドの合成に導くことができる。他のプレニルトランスフェラーゼは、一般に、カンナビノイド、プレニル化芳香族化合物、またはメロテルペノイドの産生にＧＰＰを向けることもできる。
【0050】
ＦＰＰ：ファルネシルピロリン酸（またはファルネシル二リン酸；ＦＰＰ）は、ＧＰＰをＩＰＰ分子と縮合させることにより形成される。ＦＰＰは、セスキテルペン、ジテルペン、トリテルペンおよびステロールの合成のための前駆体である。
【0051】
ＧＧＰＰ：ゲラニルゲラニルピロホスファート（またはゲラニルゲラニル二リン酸；ＧＧＰＰ）。
【0052】
ＧＧＰＰは、ＦＰＰをＩＰＰ分子と縮合させることにより形成される。ＧＧＰＰは、ジテルペンの合成のための前駆体である。
【0053】
高級テルペン：本願では、１０個を超える炭素原子のイソプレノイド構造を含む分子を意味することを意図している。例としては、セスキテルペン、ジテルペンおよびトリテルペンが挙げられる。高級テルペンは、テルペン構造に加えて、イソプレノイド構造を有さない部分を含み得る。
【0054】
モノテルペン：モノテルペン（またはモノテルペノイド）は、１０炭素イソプレノイド構造を含む分子である。モノテルペノイドは、１０炭素イソプレノイド構造に加えて、イソプレノイド構造を有さない部分を含み得る。多くの場合、モノテルペノイドの生合成は、ＧＰＰの塩基性モノテルペン骨格への初期変換の後にいくつかの追加の工程を含む。これらのさらなる工程は、酸化（例えば、シトクロムＰ４５０酵素によって触媒される）、還元、異性化、アセチル化、メチル化などであり得る。
【0055】
イリドイド：植物および一部の動物に見られる化合物の群であり、８－オキソゲラニオールから生体合成的に誘導される。
【0056】
モノテルペンインドールアルカロイドは、トリプタミンの単位およびテルペノイド起源の１０炭素または９炭素の単位に由来し、同様に、８－オキソ－ゲラニオールに由来する、植物化学化合物の大きな多様な群である。
【0057】
カンナビノイド：メンバーが植物カンナビス・サティバから最初に単離された化合物群である。多くのカンナビノイドは、オリベトール酸にＧＰＰを添加することによって生体合成される。
【0058】
ＭＥＰ経路：ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰを形成するメチルエリスリトール４－リン酸（ＭＥＰ）経路。経路は、例えばほとんどの細菌、藻類に見られ、高等植物の色素体である。
【0059】
ＭＶＡ経路：メバロン酸経路（ＭＶＡ経路）は、アセチル－ＣｏＡから出発してＩＰＰおよびＤＭＡＰＰを形成する真核生物および一部の細菌に存在する必須の代謝経路である。
【0060】
代替的なＭＶＡ経路：代替的なＭＶＡ経路は古細菌において見出され、アセチル－ＣｏＡから出発するが中間体としてイソペンテニルホスフェートを利用するＩＰＰおよびＤＭＡＰＰを供給する。
【0061】
モノテルペンシンターゼ。この用語は、ＧＰＰのモノテルペノイドへの再配置を触媒することができる任意の酵素を含む。モノテルペンシンターゼは、典型的には複数の生成物を合成するが、生成物の多様性はテルペンシンターゼ間で異なる。いくつかのテルペンシンターゼは、高い生成物特異性を有し、限られた数の生成物の合成を触媒し、他のテルペンシンターゼは低い生成物特異性を有し、多種多様な異なるテルペンの合成を触媒する。モノテルペンシンターゼの生成物の例には、以下の化合物、トリシクレン、アルファ－ツエン、アルファ－ピネン、アルファ－フェンセン、カンフェン、サビネン、ベータ－ピネン、ミルセン、デルタ－２－カレン、アルファ－フェランドレン、３－カレン、１，４－シネオール、アルファ－ｔｅｒ－ピネン、ベータ－フェランドレン、１，８－シネオール、リモネン、（Ｚ）－ベータ－オシメン、（Ｅ）－ベータ－オシメン、ガンマ－テルピネン、テルピノレン、リナロール、ペリレン、アロ－オシメン、シス－ベータ－テルピネオール、シス－テルピン－１－オール、イソボルネオール、デルタ－テルピネオール、ボルネオール、クリサンテモール、ラバンジュロール、アルファ－テルピネオール、ネオール、ゲラニオールが含まれるが、これらに限定されない。ＧＰＰに加えて、特定のテルペンシンターゼ（またはタンパク質の操作によって開発されたテルペンシンターゼ変異体）は、非標準のプレニル二リン酸基質、例えば１１炭素基質２－メチル－ＧＰＰを非標準のプレニル足場を有するテルペンに変換することが報告されている（Ｉｇｎｅａら、２０１８）。本開示の文脈において、１０とは異なる炭素の長さを有する非標準のプレニル二リン酸を、８、９、１１、または１２個の炭素を有する非標準のテルペノイドに変換することができる酵素も、モノテルペンシンターゼの定義に含まれる。
【0062】
プレニルトランスフェラーゼ：プレニル部分をイソプレノイドまたは非イソプレノイド骨格に付加する酵素である。プレニル部分を他のイソプレノイド鎖に付加する多くのプレニルトランスフェラーゼは、プレニル二リン酸前駆体、例えばＧＰＰ（ＧＰＰシンターゼ）、ＦＰＰ（ＦＰＰシンターゼ）、ＧＧＰＰ（ＧＧＰＰシンターゼ）またはゲラニル－ファルネシル二リン酸シンターゼ（ＧＦＰＰシンターゼ）の合成に関与する。これらの酵素は、典型的にはＩＰＰ単位を付加して、トランス配置のより大きなサイズのプレニル二リン酸にＤＭＡＰＰを拡張する。このため、それらはトランスポリプレニルシンターゼまたはトランスポリプレニルトランスフェラーゼとも呼ばれる。ＩＰＰを用いたＤＭＡＰＰのシス縮合および伸長を触媒するいくつかのプレニルトランスフェラーゼ酵素が存在する。これらの酵素は、シス－プレニルトランスフェラーゼ、またはシス－ポリプレニル二リン酸シンターゼ、またはシス－ポリプレニルトランスフェラーゼと呼ばれ、二リン酸ネリル、ｃｉｓ，ｃｉｓ－ファルネシル二リン酸、およびネリルネリル二リン酸の合成を担う。
【0063】
さらに、ある特定のイソプレノイドプレニルトランスフェラーゼは、２つのＤＭＡＰＰ分子をラバンデュリル二リン酸またはクリサンテミル二リン酸に縮合させることが報告されている。
【0064】
プレニル部分を非イソプレノイド骨格に付加するプレニルトランスフェラーゼは、ＤＭＡＰＰ、ＧＰＰ、ＦＰＰまたはＧＧＰＰを、フラボノイド、アミノ酸残基およびペプチド、芳香族化合物、ならびに一般に他の化学化合物を含む非イソプレノイド化合物に付加する。そのようなプレニルトランスフェラーゼ酵素は、カンナビノイド、プレニル化フラボノイド、または他のメロテルペノイドを含むがこれらに限定されない多くの異なる天然産物の生合成に関与する。カンナビノイド合成の場合、この酵素はゲラニル二リン酸：オリベトラートゲラニルトランスフェラーゼである。
【0065】
プレニルトランスフェラーゼは、別個のポリペプチドの一部であってもよく、または１つのポリペプチド鎖に融合していてもよい。プレニルトランスフェラーゼはまた、ＧＰＰシンターゼ、テルペンシンターゼ、または別の非テルペン合成タンパク質に融合され得る。プレニルトランスフェラーゼはまた、酵母または別の生物においてペルオキシソームマトリックスまたはその膜に天然に局在する酵素に融合されてもよく、またはそれ自体がペルオキシソーム標的化シグナルに融合されたポリペプチド鎖に融合されてもよい。
【0066】
芳香族プレニルトランスフェラーゼは、イソプレノイド部分を別のイソプレノイドまたは非イソプレノイド化合物に転移することができる、任意の生物または操作された生物から同定されるプレニルトランスフェラーゼ活性を有する任意の酵素の中から選択される。プレニルトランスフェラーゼは別個のポリペプチドの一部であってもよく、または１つのポリペプチド鎖に融合していてもよい。プレニルトランスフェラーゼはまた、ＧＰＰシンターゼ、テルペンシンターゼ、または別の非テルペン合成タンパク質に融合され得る。プレニルトランスフェラーゼはまた、酵母もしくは別の生物においてペルオキシソームマトリックスまたはその膜に天然に局在する酵素に融合されてもよく、またはそれ自体がペルオキシソーム標的化シグナルに融合されているポリペプチド鎖に融合されてもよい。
【発明を実施するための形態】
【0067】
本発明は、生化学的経路において、分岐点分子を異なる生化学的経路に迂回させることができる分岐点が存在し、優先された経路は特定の生物の増殖に必須の化合物をもたらすが、他の経路は優先順位付けされない（指定された非優先順位付け経路）ことが認められたことに基づいている。その結果、細胞に非優先経路を優先させるには特別な措置が必要となる。
【0068】
本発明によれば、非優先経路の化合物の産生は、分岐点化合物の形成を触媒する酵素および非優先経路の第１の工程を触媒する酵素のペルオキシソーム局在化によって増加する。
【0069】
分岐点化合物の形成を触媒する酵素および非優先経路の第１の工程を触媒する酵素は、別個の分子として存在してもよく、それらは、分岐点化合物の形成を触媒するドメインおよび非優先経路の第１の工程を触媒する別のドメインを含む単一の分子として存在してもよく、またはそれらは、２つの酵素活性の１つまたは２つに加えて異なる機能を有する１つまたは複数の追加のドメインを含むマルチドメイン分子の形態で存在してもよい。
【0070】
ＧＰＰは、テルペン合成におけるそのような分岐点分子であり、モノテルペノイドまたは非プレニル部分に結合した炭素１０のモノテルペノイド構造を含む化合物、セスキテルペノイド、ジセスキテルペノイドもしくはトリテルペノイドまたは炭素１５のセスキテルペノイド、炭素２０のジセスキテルペノイドもしくは炭素３０のトリテルペノイド構造を含む化合物に、またはステロールに変換することができる。
【0071】
酵母では、ステロールが細胞の増殖および生存に必須であるため、ＧＰＰのＦＰＰへの、また最終的にはステロールへの変換が優先される。
【0072】
したがって、第１の態様では、本発明は、ＧＰＰの形成を触媒する酵素、およびＧＰＰから始まり、モノテルペノイド、カンナビノイド、イリドイド、モノテルペンインドールアルカロイド、またはプレニル化芳香族化合物を形成する経路の第１の工程を触媒する酵素がペルオキシソームに局在している酵母細胞に関する。
【0073】
ＧＰＰシンターゼとも呼ばれるＧＰＰの形成を触媒する酵素は、当業者に公知である。本発明は、任意の特定のＧＰＰシンターゼに限定されないので、原則として、任意のＧＰＰシンターゼがペルオキシソームに局在し、本発明に従って使用され得る。ＧＰＰシンターゼは、相同ＧＰＰシンターゼ、すなわち宿主細胞と同じ種に由来する酵素であってもよく、異種酵素、すなわち宿主細胞とは異なる種に由来する酵素であってもよく、またはシンターゼ、すなわち天然には存在しないが遺伝子工学の分野で公知の技術を使用して人工的に作製された酵素であってもよい。ＧＰＰシンターゼは、単一サブユニットまたは同一もしくは非同一サブユニット（いくつかのそのような例が自然界に存在し、当業者に知られている、すなわち、大型と小型のサブユニットのスナップドラゴンＧＧＰＰシンターゼ（Ｏｒｌｏｖａ Ｉ．ら、２００９）の組み合わせ）から構成されるマルチサブユニット酵素であり得る。ＧＰＰシンターゼのサブユニットは、別個のポリペプチドの一部であってもよく、または１つのポリペプチド鎖に融合していてもよい。サブユニットはまた、テルペンシンターゼ、プレニルトランスフェラーゼ、または別の非テルペン合成タンパク質に融合され得る。特に、それは、酵母または別の生物においてペルオキシソームに天然に局在する酵素に融合され得るか、またはひいてはペルオキシソーム標的化シグナルに融合されるポリペプチド鎖に融合され得る。
【0074】
本発明による好ましいＧＰＰシンターゼの例は、Ｎ１２７Ｗの置換を含有する天然のＳ．セレビシエＧＰＰシンターゼである操作されたＧＰＰシンターゼＥｒｇ２０ｐＮ１２７Ｗ（配列番号１）である。Ｎ１２７Ｗの置換は、酵素の触媒部位を遮断して、ＩＰＰ分子の添加によるＧＰＰのＦＰＰへのさらなる変換を防ぐ。
【0075】
他の好ましいＧＰＰシンターゼには、単独でまたは他のポリペプチドと組み合わせてＧＰＰシンターゼ活性を有するポリペプチドが含まれ、前記ポリペプチドは、生命界のいずれかに属する生物、すなわち細菌、古細菌、原生動物、クロミスタ、植物、真菌または動物に由来する。他の好ましいシンターゼには、タンパク質の操作を使用して、単独でまたは他のポリペプチドと組み合わせてＧＰＰシンターゼ活性を有するように操作された酵素が含まれる。
【0076】
ＧＰＰから出発し、モノテルペノイド、イリドイド、カンナビノイド、モノテルペンインドールアルカロイド、プレニル化芳香族化合物、または他のメロテルペノイドを形成する経路の第１の工程を触媒する酵素は、当業者にも知られている。非限定的な例としては、モノテルペンシンターゼ、例えば（＋）－リモネンシンターゼ、（－）－リモネンシンターゼ、α－ピネンシンターゼ、１，８－シネオールシンターゼ、サビネンシンターゼ、カンフェンシンターゼ、リナロールシンターゼ、ミルセンシンターゼまたはゲラニオールシンターゼ、およびプレニルトランスフェラーゼ、例えばゲラニル二リン酸：オリベトラートゲラニルトランスフェラーゼまたは広範な特異性芳香族プレニルトランスフェラーゼが挙げられる。
【0077】
本発明による好ましいモノテルペンシンターゼの例としては、シトラスリモン由来であり、配列番号３のアミノ酸配列を有する（＋）－リモネンシンターゼ、ソラリウム・エリア・アグニフォリウムに由来し、配列番号５のアミノ酸配列を有するカンフェンシンターゼ、配列番号２５のアミノ酸配列を有するスペアミント（Ｍｅｎｔｈａ ｓｐｉｃａｔａ）由来の（－）－リモネンシンターゼ、配列番号２３のアミノ酸配列を有するメンタ・シトラータ由来の（＋）－リナロールシンターゼ、配列番号２６のアミノ酸配列を有するオシマム・バシリカム由来のミルセンシンターゼ、テーダマツの由来であり、配列番号７のアミノ酸配列を有するα－ピネンシンターゼ、サルビア・ポミフェラ由来であり、配列番号９のアミノ酸配列を有するサビネンシンターゼ、および配列番号１１のアミノ酸配列を有するゲラニオールシンターゼはオシマム・バシリカム形成が挙げられる。
【0078】
他の好ましいモノテルペンシンターゼは、ベータ－ピネンシンターゼ、（－）－リモネンシンターゼ、リナロールシンターゼ、ミルセンシンターゼ、ボルニル二リン酸シンターゼ、アルファ－テルピネオールシンターゼ、イソボルネオールシンターゼ、トリシクレンシンターゼ、アルファ－ツジエンシンターゼ、アルファ－フェンチェンシンターゼ、デルタ－２－カレンシンターゼ、アルファ－フェランドレンシンターゼ、３－カレンシンターゼ、１，４－シネオールシンターゼ、アルファ－テルピネンシンターゼ、ベータ－フェランドレンシンターゼ、１，８－シネオールシンターゼ、（Ｚ）－ベータ－オシメンシンターゼ、（Ｅ）－ベータ－オシメンシンターゼ、ガンマ－テルピネンシンターゼ、テルピノレンシンターゼ、アロ－オシメンシンターゼ、シス－ベータ－テルピネオールシンターゼ、シス－テルピン－１－オールシンターゼ、デルタ－テルピネオールシンターゼ、ボルネオールシンターゼ、ボルタンオールシンターゼ、アルファ－テルピネオールシンターゼ、ネロールシンターゼ、２－メチル－イソボルネオールシンターゼ、２－メチレンボルネンシンターゼ、２－メチル－２－ボルネンシンターゼ、またはベータ－フェランドレンシンターゼとしての活性を有するポリペプチドを含む。
【0079】
ゲラニル部分を非イソプレノイド骨格に結合することができるプレニルトランスフェラーゼとしては、カンナビス・サティバ由来であり、配列番号１３のアミノ酸配列を有するゲラニル二リン酸：オリベトールゲラニルトランスフェラーゼＣｓＰＴ４、またはアスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）由来であり、配列番号１９のアミノ酸配列を有する芳香族プレニルトランスフェラーゼＡｔａＰＴが挙げられる。
【0080】
イソプレノイド骨格にプレニル基を付加することができる他の好ましいプレニルトランスフェラーゼとしては、ネリル二リン酸シンターゼ、クリサンテミル二リン酸シンターゼまたはラバンデュリル二リン酸シンターゼが挙げられ、プレニル基を非イソプレノイド骨格に付加することができる好ましいプレニルトランスフェラーゼとしては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ由来の７－ジメチルアリルトリプトファンシンターゼ（７－ＤＭＡＴＳ）（配列番号２０）およびＡｒｔｅｍｉｓｉａ ｃａｐｉｌｌａｒｉｓ由来のフェニルプロパン種特異的プレニルトランスフェラーゼＡｃＰＴ１（配列番号２１）が挙げられる。
【0081】
好ましい一実施形態では、ＧＰＰシンターゼおよびリモネンシンターゼがペルオキシソームに局在しているサッカロミセス・セレビシエ細胞がもたらされる。本発明者らは、これ単独で、これらの２つの酵素がサイトゾル中で発現される場合、または２つの酵素の一方のみがペルオキシソームに存在し、他方がサイトゾルに存在する場合に得られる産生と比較して、モノテルペン（リモネン）の産生の３２倍の改善を誘導するのに十分であることを見出した。さらに、ＥｆｍｖａＳ、ＥｆｍｖａＥ、Ｅｒｇ１２ｐ、Ｅｒｇ９ｐおよびＩｄｉ１ｐから構成される完全なＭＶＡ経路のさらなるペルオキシソーム区画化は、酵素が細胞質ゾルに局在する同一の酵母細胞と比較して、カンフェン、ピネン、（－）－リモネン、（＋）－リナロール、サビネンおよび（＋）－リモネンについて、それぞれ１４倍、１７倍、１７倍、２０．５倍、２２倍および１２５倍、モノテルペンの産生を改善した。
【0082】
別の好ましい実施形態では、ＧＰＰシンターゼおよびゲラニオールシンターゼがペルオキシソームに局在しているＳ．セレビシエ細胞がもたらされる。酵母細胞は、酵素が細胞質ゾルに局在している同じ細胞と比較して、イリドイドおよびモノテルペンインドールアルカロイドの前駆体であるゲラニオールのレベルが改善されている。
【0083】
さらに好ましい実施形態では、ＧＰＰシンターゼおよびオリベトール酸プレニルトランスフェラーゼがペルオキシソームに局在しているＳ．セレビシエ細胞がもたらされる。酵母細胞は、いくつかのカンナビノイド化合物の前駆体であるカンナビゲロール酸を産生するのに効率的である。
【0084】
さらなる実施形態では、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）由来のＧＰＰシンターゼおよび芳香族プレニルトランスフェラーゼＡｔａＰＴがペロキシソームに局在するＳ．セレビシエ細胞がもたらされる。ウンベリフェロン、ケルセチン、イソケルセチン、レスベラトロール、またはナリンゲニンがもたらされると、酵母細胞は、それぞれオスルチン、ゲラニル化クエスチン、ゲラニル化イソケルセチン、ゲラニルレスベラトロール、およびゲラニル－ナリンゲニンの効率的な合成をもたらした。さらなる実施形態では、ＤＭＡＰＰシンターゼであるイソペンテニルジホスフェートイソメラーゼ（ＩＤＩ）、およびイソプレンの合成を触媒するテルペンシンターゼ（イソプレンシンターゼ；ＩＳＰＳ）がペルオキシソームに局在する、Ｓ．セレビシエ細胞がもたらされる。産生された酵母細胞は、イソプレンの効率的な合成をもたらした。さらなる実施形態では、イソペンテニルジホスフェートイソメラーゼ（ＩＤＩ）およびＬａｖａｎｄｕｌａ ｘ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ由来のラバンデュリル二リン酸シンターゼがペルオキシソームに局在する、Ｓ．セレビシエ細胞がもたらされる。酵母細胞は、ラバンジュロールの効率的な合成をもたらした。
【0085】
さらなる実施形態では、イソペンテニルジホスフェートイソメラーゼ（ＩＤＩ）およびＴａｎａｃｅｔｕｍ ｃｉｎｅｒａｒｉｉｆｏｌｉｕｍ由来のクリサンテミル二リン酸シンターゼがペルオキシソームに局在する、Ｓ．セレビシエ細胞がもたらされる。酵母細胞は、クリサンテモールの効率的な合成をもたらした。
【0086】
さらなる実施形態では、イソペンテニルジホスフェートイソメラーゼ（ＩＤＩ）およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ由来の７－ジメチルアリルトリプトファンシンターゼ（７－ＤＭＡＴＳ）がペルオキシソームに局在する、Ｓ．セレビシエ細胞がもたらされる。酵母細胞は、プレニル－トリプトファンの効率的な合成をもたらした。
【0087】
さらなる実施形態では、イソペンテニルジホスフェートイソメラーゼ（ＩＤＩ）およびＡｒｔｅｍｉｓｉａ ｃａｐｉｌｌａｒｉｓ由来のフェニルプロパン特異的プレニルトランスフェラーゼＡｃＰＴ１がペルオキシソームに局在する、Ｓ．セレビシエ細胞がもたらされる。ｐ－クマリン酸がもたらされたときに、酵母細胞は、ドルパニンおよびアルテピリンＣの効率的な合成をもたらした。
【0088】
さらなる実施形態では、イソペンテニルジホスフェートイソメラーゼ（ＩＤＩ）およびＡｎｔｒｏｄｉａ ｃａｍｐｈｏｒａｔａ由来のＯ－プレニルトラスフェラーゼＡｃａＰＴがペルオキシソームに局在する、Ｓ．セレビシエ細胞がもたらされる。アピゲニン、ケンペロール、ダイゼイン、ナリンゲニン、ゲニステイン、イソリキリチゲニン、エコール、ウンベリフェロン、クルクミン、レスベラトロール、またはジエチルスチルベストロールがもたらされた場合、酵母細胞は、４’－ジメチルアリル－アピゲニン、４’－ジメチルアリル－ナリンゲニン、４’－ジメチルアリル－ケンペロール、４’－ジメチルアリル－ダイゼイン、７－ジメチルアリル－ダイゼイン、７，４’－ジ－（ジメチルアリル）－ダイゼイン、４’－ジメチルアリル－ゲニステイン、７－ジメチルアリル－ゲニステイン、７，４’－ジ－（ジメチルアリル）－ゲニステイン、４－ジメチルアリル－イソリキチゲニン、４’－ジメチルアリル－エコール、７－ジメチルアリル－エコール、６－ジメチルアリル－エコール、４’－ジメチルアリル－ダイジン、７－ジメチルアリル－ウンベリフェロン、８－ジメチルアリル－クルクミン、８’－ジ－メチルアリル－デメトキシクルクミン、８－ジメチルアリル－デメトキシクルクミン、７－ジメチルアリル－Ｌ－トリプトファン、４’－ジメチルアリル－レスベラトロール、５－ジメチルアリル－ジエチルスチルベストロールの合成を効果的にもたらした。
【0089】
ペルオキシソーム局在化
本発明によれば、テルペン経路の生合成酵素に関連するペルオキシソーム局在化または文法的に等価な用語の表現は、問題の酵素が合成後にペルオキシソームまたはペルオキシソーム膜に転位し、その後酵素がペルオキシソームにおいてそれらの触媒機能を発揮することを意味することを意図している。
本発明によれば、テルペン経路の生合成酵素に関連するペルオキシソーム局在化または文法的に等価な用語の表現は、問題の酵素が合成後にペルオキシソームまたはペルオキシソーム膜に転位し、その後酵素がペルオキシソームにおいてそれらの触媒機能を発揮することを意味することを意図している。
【0090】
ペルオキシソーム局在化は、ペルオキシソーム局在化シグナルでペルオキシソーム局在化される酵素をコードする遺伝子を供給することによって達成することができる。ペルオキシソーム局在化およびペルオキシソーム局在化シグナルは、当技術分野で公知であり、例えば、国際公開第９４２４２８９号パンフレットおよび韓国特許第１０１３０８９７１号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）があり、当技術分野で公知のそのような信号および方法はまた、本発明に従って使用可能である。
【0091】
好ましいペルオキシソーム局在化シグナルは、ペルオキシソームとして局在化するようにポリペプチドのＣ末端に付加されたＳＫＬ（ＳｅｒＬｙｓＬｅｕ）または標準の配列（Ｓ／Ａ／Ｃ）－（Ｋ／Ｒ／Ｈ）－（Ｌ／Ｍ）を有する任意のＣ末端トリペプチドである。
【0092】
酵母の場合、別の好ましい局在化シグナルは、ペルオキシソームに局在するようにポリペプチドのＮ末端に付加された保存ペプチド（Ｒ／Ｋ）－（Ｌ／Ｖ／Ｉ）－Ｘ５－（Ｈ／Ｑ）－（Ｌ／Ａ／Ｆ）からなる。
【0093】
タンパク質のペルオキシソーム局在化を達成するためのさらなる方法は、酵母または他の生物のペルオキシソームにて天然に見出される別のタンパク質と前記タンパク質を融合させることである。タンパク質のペルオキシソーム局在化を達成するためのさらなる方法は、前記タンパク質と、通常はペルオキシソームに存在しないが、上記のような局在化シグナルの付加によってペルオキシソームに局在化するように操作された別のタンパク質（またはタンパク質ドメイン）との間にタンパク質融合物を構築することである。
【0094】
ペルオキシソーム局在化酵素は均一であってもよく、これは、ペルオキシソーム局在化酵素が宿主細胞の細胞質に天然に見出される酵素と同一であることを意味する、または異種であってもよく、これは宿主細胞の細胞質に天然に見出される酵素とは異なることを意味する。
【0095】
本発明によれば、酵素のペルオキシソーム局在化は、コードされたペルオキシソーム局在化シグナルがもたらされる、問題の酵素をコードする遺伝子が宿主細胞に導入されることを意味する。問題の酵素が宿主細胞に天然に見出される酵素である場合、ペルオキシソーム局在化酵素は、モノテルペノイド、カンナビノイド、イリドイドモノテルペンインドールアルカロイドおよび本発明による他のプレニル化化合物の改善された合成をもたらすが、宿主細胞の細胞質に局在化した天然の酵素は、宿主細胞の生存および増殖に必要な生体分子の正常な生合成をもたらすと考えられる。例えば、問題の酵素がＧＰＰシンターゼである場合、ペルオキシソーム局在化ＧＰＰシンターゼは、モノテルペノイド、カンナビノイド、イリドイド、モノテルペンインドールアルカロイド、および本発明に適合する他のプレニル化化合物の改善された合成をもたらし、細胞質に局在化した天然ＧＰＰシンターゼは、ＧＰＰが必要な分子、例えばステロールの生合成のために供給されることを確実にする。それは、宿主細胞の生存および正常な増殖を確保するために必要である。
【0096】
選択された宿主細胞が多倍数体細胞、例えば２倍体細胞または４倍体細胞である場合、当の酵素をコードする遺伝子の１つまたは複数の対立遺伝子にペルオキシソーム局在化シグナルをもたらし、少なくとも１つの対立遺伝子を変化させないままにする遺伝子編集技術によってペルオキシソーム局在化をもたらすことさえ可能であり得る。これにより、編集された対立遺伝子がペルオキシソーム局在化酵素を備え、編集されていない対立遺伝子が細胞質に局在化した天然酵素を備えることが確実になる。
【0097】
宿主細胞
宿主細胞は、本発明によれば酵母細胞、すなわち真核生物の単一細胞生物である。例えばＴｈｅ ｙｅａｓｔｓ．５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ．Ａ ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｓｔｕｄｙ．Ｅｄｉｔｏｒｓ：Ｋｕｒｔｚ－ｍａｎ，Ｆｅｌｌ，Ｂｏｅｋｈｏｕｔ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２０１１で概説される。
宿主細胞は、本発明によれば酵母細胞、すなわち真核生物の単一細胞生物である。例えばＴｈｅ ｙｅａｓｔｓ．５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ．Ａ ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｓｔｕｄｙ．Ｅｄｉｔｏｒｓ：Ｋｕｒｔｚ－ｍａｎ，Ｆｅｌｌ，Ｂｏｅｋｈｏｕｔ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２０１１で概説される。
【0098】
好ましい宿主細胞には、サッカロミセス属、ピキア属、カンジダ属、ヤロウィア属、オガテア属に属する細胞が含まれる。より好ましくは、宿主細胞は、サッカロミセス・セレビシエ、ピキア・パストリス、ヤロウィア・リポリティカ、オガタエア・ポリモルファ、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・ボイディニーの種の中から選択される。
【0099】
本発明は、本発明による酵素のためのペルオキシソームの局在化をもたらすための任意の特定の方法に限定されない。適切な遺伝子をもたらすため、コドンの使用頻度を最適化するため、プロモーター、ターミネーター、アデニル化部位、イントロン、エクソン、エンハンサーエレメント、リボソーム結合部位、コザック配列、形質転換酵母などの適切な調節エレメントをもたらすための当技術分野で公知の任意の方法を、本発明に従って使用することができる。
【0100】
産生
本発明はまた、本発明の酵母細胞を用いたモノテルペノイド、カンナビノイド、イリドイド、モノテルペンインドールアルカロイド、および他のプレニル化化合物の産生に関する。
本発明はまた、本発明の酵母細胞を用いたモノテルペノイド、カンナビノイド、イリドイド、モノテルペンインドールアルカロイド、および他のプレニル化化合物の産生に関する。
【0101】
本発明によれば、モノテルペノイド、カンナビノイド、イリドイド、モノテルペンインドールアルカロイド、およびプレニル化化合物は、
ａ．本発明により酵母細胞をもたらす工程、
ｂ．酵母細胞の増殖を支える基質において酵母細胞を増殖させる工程、
および
ｃ．必要に応じて、プレニル化される共基質をもたらす工程、
ｄ．発酵ブロスから化合物を回収する、またはさらなる天然または異種発現酵素の作用によって酵母細胞内で化合物をより複雑な生成物に変換する工程
を含む方法を使用して生成することができる。
ａ．本発明により酵母細胞をもたらす工程、
ｂ．酵母細胞の増殖を支える基質において酵母細胞を増殖させる工程、
および
ｃ．必要に応じて、プレニル化される共基質をもたらす工程、
ｄ．発酵ブロスから化合物を回収する、またはさらなる天然または異種発現酵素の作用によって酵母細胞内で化合物をより複雑な生成物に変換する工程
を含む方法を使用して生成することができる。
【0102】
この方法によってもたらされる化合物は、さらなる天然または異種発現酵素の作用によって酵母細胞内でより複雑な生成物にさらに変換され得る。
【0103】
酵母の増殖は、原則として酵母を増殖させるための任意の公知の方法で行うことができるが、回収を容易にするために、振盪フラスコまたは発酵槽などの容器の液体培地で酵母細胞を増殖させることが好ましい。
【0104】
発酵槽で酵母細胞を増殖させることが特に好ましく、発酵のプロセスは、当技術分野で知られているように、バッチ発酵、フェドバッチ発酵、または連続発酵として実施することができる。
【0105】
酵母細胞の増殖を支持する基質は、炭素源、窒素源、ミネラル、および特定の酵母細胞が必要とする栄養を含む任意の適切な培地であり得る。
【0106】
基質は、完全に精製されてはいない成分を含む複合的な基質であってもよく、または規定された成分のみを含む規定された媒体であってもよい。
【0107】
複合的な培地の成分の例として、糖蜜、デキストリン、デンプンおよび／またはタンパク質の加水分解物を挙げることができる。
【0108】
規定の培地の成分の例として、グルコース、スクロース、アンモニア、塩、ミネラルおよびビタミンを挙げることができる。
【0109】
発酵プロセスは、細胞、水、生成物、残りの栄養物およびミネラル、ならびに細胞によって生成された廃棄物を含む発酵ブロスを生成する。発酵ブロスからのモノテルペノイド、カンナビノイド、イリドイド、モノテルペンインドールアルカロイド、および他のプレニル化化合物の回収は、そのような化合物を回収するための当技術分野で公知の方法を使用して行われる。
【0110】
材料および方法
使用した遺伝子：
使用した遺伝子：
【表1】
【0111】
酵母株
本願で使用した酵母株は、（Ｉｇｎｅａ ｅｔ ａｌ（２０１１）、Ｔｈｏｍａｓ Ｂ．Ｊ．ａｎｄ Ｒ．Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ（１９８９）、および（Ｅｌｌｅｒｓｔｒｏｍ Ｍ ｅｔ ａｌ（１９９２））に開示されているＥＧＹ ４８サッカロミセス・セレビシエ株に基づいており、表２に従って改変した。
本願で使用した酵母株は、（Ｉｇｎｅａ ｅｔ ａｌ（２０１１）、Ｔｈｏｍａｓ Ｂ．Ｊ．ａｎｄ Ｒ．Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ（１９８９）、および（Ｅｌｌｅｒｓｔｒｏｍ Ｍ ｅｔ ａｌ（１９９２））に開示されているＥＧＹ ４８サッカロミセス・セレビシエ株に基づいており、表２に従って改変した。
【表2】
【0112】
プラスミドの構築：
プラスミドは、遺伝子工学の中で使用され、当技術分野で公知の標準的な方法を使用して作製した。プラスミド構築のための方法の詳細なプロトコルは、分子クローニングのための方法を含む一般的なハンドブックに見出すことができる。
プラスミドは、遺伝子工学の中で使用され、当技術分野で公知の標準的な方法を使用して作製した。プラスミド構築のための方法の詳細なプロトコルは、分子クローニングのための方法を含む一般的なハンドブックに見出すことができる。
【0113】
ｐＰＥＲと呼ばれる酵素のペルオキシソーム局在化をもたらすように設計されたプラスミドは、酵素のアミノ酸配列にＣ末端で融合したペルオキシソーム局在化シグナル（－ＳＫＬ）またはＮ末端ペルオキシソーム局在化シグナルを含むが、酵素の細胞質局在化をもたらすように設計されたプラスミド（ｐＣＹＴ）はこのシグナルを含有していなかった。
【0114】
遺伝子をＰＣＲによって増幅し、二重誘導性プロモーターＰＧＡＬ１およびＰＧＡＬ１０の制御下に置いた。次いで、コーディング遺伝子配列を、ＵＳＥＲクローニング（Ｎｏｕｒ－Ｅｌｄｉｎら（２０１０））を使用して、ｐＥＳＣ－ＵＲＡ、ｐＥＳＣ－ＬＥＵ、ｐＥＳＣ－ＴＲＰ、およびｐＥＳＣ－ＨＩＳベクター（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の骨格に連結して、表３に列挙されるプラスミドを構築した。
【表3】
【0115】
本願で使用するプラスミドを保有する株の呼称
次いで、プラスミド（表３）を使用して、酢酸リチウム／ＰＥＧ法を使用して酵母細胞（表２）を形質転換した。形質転換体を、対応する最小培地でのそれぞれの栄養要求性によって選択した。
次いで、プラスミド（表３）を使用して、酢酸リチウム／ＰＥＧ法を使用して酵母細胞（表２）を形質転換した。形質転換体を、対応する最小培地でのそれぞれの栄養要求性によって選択した。
【表4】
【0116】
培養条件
酵母細胞を、最初に、グルコースを含む選択的最小培地で、３０°Ｃにて一晩培養した。完全な最小培地は、０．１３％ｗ／ｖの滴下粉末、硫酸アンモニウムを含むアミノ酸を含まない０．６７％ｗ／ｖの酵母窒素塩基（ＹＮＢ＋ＡＳ）、２％ｗ／ｖのグルコースからなっていた。ロイシン、ヒスチジン、ウラシルおよびトリプトファンを欠くために、ドロップアウト粉末を購入した。必要に応じて、これらの４つの栄養素を０．０１～０．０２％ｗ／ｖで添加した。次いで、遠心分離によって細胞を回収して培地を除去し、０．５前後の初期のＯＤ６００ｎｍを有する選択的な最小産生培地に再懸濁した。この培地を使用してガラクトースプロモーターを誘導し、別の炭素源としてラフィノースを追加した。培地の組成：０．１３％ｗ／ｖのドロップアウト粉末、０．６４％ｗ／ｖのＹＮＢ＋ＡＳ、２％のガラクトース、１％ｗ／ｖのラフィノース。適切な場合には、上記と同じ４つの栄養素を０．０１～０．０２％ｗ／ｖで添加した。
酵母細胞を、最初に、グルコースを含む選択的最小培地で、３０°Ｃにて一晩培養した。完全な最小培地は、０．１３％ｗ／ｖの滴下粉末、硫酸アンモニウムを含むアミノ酸を含まない０．６７％ｗ／ｖの酵母窒素塩基（ＹＮＢ＋ＡＳ）、２％ｗ／ｖのグルコースからなっていた。ロイシン、ヒスチジン、ウラシルおよびトリプトファンを欠くために、ドロップアウト粉末を購入した。必要に応じて、これらの４つの栄養素を０．０１～０．０２％ｗ／ｖで添加した。次いで、遠心分離によって細胞を回収して培地を除去し、０．５前後の初期のＯＤ６００ｎｍを有する選択的な最小産生培地に再懸濁した。この培地を使用してガラクトースプロモーターを誘導し、別の炭素源としてラフィノースを追加した。培地の組成：０．１３％ｗ／ｖのドロップアウト粉末、０．６４％ｗ／ｖのＹＮＢ＋ＡＳ、２％のガラクトース、１％ｗ／ｖのラフィノース。適切な場合には、上記と同じ４つの栄養素を０．０１～０．０２％ｗ／ｖで添加した。
【0117】
ミリスチン酸イソプロピル（ＩＰＭ）を培養物の体積の１０％に相当するオーバーレイとして加えた。培養物を３０°Ｃ、１５０ｒｐｍで指示された時間増殖させ、次いで細胞を遠心分離によって回収し、ＩＰＭ相を回収し、ＧＣ－ＦＩＤおよび／またはＧＣ－ＭＳを使用して分析した。
【実施例】
【0118】
実施例１：ＧＰＰシンターゼとテルペンシンターゼのペルオキシソーム共局在化はテルペン産生を改善する
【0119】
酵母株の構築
使用したサッカロミセス・セレビシエ株は、ＥＧＹ４８株（Ｍａｔ α、ｕｒａ３、ｔｒｐ１、ｈｉｓ３、６ｘＬｅｘＡ ｏｐｅｒａｔｏｒｓ：：ＬＥＵ２）に由来した。操作されたＧＰＰシンターゼ、Ｓ．セレビシエ由来のＥＲＧ２０Ｎ１２７Ｗ、およびリモネンシンターゼ、シトラスリモン由来のＣ／ＬｉｍＳとして特徴付けられるモノテルペンシンターゼ（ＭＴ）を、ＰＧＡＬ１－ＰＧＡＬ１０プロモーターの制御下で発現させた。
使用したサッカロミセス・セレビシエ株は、ＥＧＹ４８株（Ｍａｔ α、ｕｒａ３、ｔｒｐ１、ｈｉｓ３、６ｘＬｅｘＡ ｏｐｅｒａｔｏｒｓ：：ＬＥＵ２）に由来した。操作されたＧＰＰシンターゼ、Ｓ．セレビシエ由来のＥＲＧ２０Ｎ１２７Ｗ、およびリモネンシンターゼ、シトラスリモン由来のＣ／ＬｉｍＳとして特徴付けられるモノテルペンシンターゼ（ＭＴ）を、ＰＧＡＬ１－ＰＧＡＬ１０プロモーターの制御下で発現させた。
【0120】
まず、ＥＧＹ４８株（ＣＹＴＬｉｍ０１株）の細胞質ゾルにＣ／ＬｉｍＳを発現させた。図１に示すように、この株は０．３１ｍｇ／Ｌのリモネンしか産生しなかった。Ｃ末端ＰＴＳ１ ＳＫＬ（ＰＥＲＬｉｍ０１株）の添加によってＣ／ＬｉｍＳをペルオキシソームに標的化したとき、非常に似た結果が観察された。実際、ＧＰＰは細胞質ゾルからペルオキシソームに転位することができるが、天然の非常に低い細胞質ＧＰＰプールは、この分子の他の区画への非常に限られた輸送をもたらす可能性が最も高い。
【0121】
（ＧＰＰシンターゼとしての）エンテロコッカス・ファエカリスＥｆｍｖａＥおよびＥｆｍｖａＳの遺伝子（酵母におけるＥｒｇ１０ｐ、Ｅｒｇ１３ｐおよびＨｍｇＲｐと同等）、Ｅｒｇ８ｐ、Ｅｒｇ１２ｐ、Ｅｒｇ９ｐ、Ｉｄｉ１ｐおよびＥｒｇ２０ｐＮ１２７Ｗを使用して、サイトゾルでＭＶＡ経路全体を過剰発現させると、リモネン産生の折り目が１．１２ｍｇ／Ｌまで増加し、３．６倍になった（ＣＹＴＬｉｍ０２株）。
【0122】
しかし、ＧＰＰシンターゼＥＲＧ２０ｐＮ１２７ＷおよびＣ／ＬｉｍＳをペルオキシソーム（ＰＥＲＬｉｍ０２株）に標的化するだけで、リモネンの産生はＣＹＴＬｉｍ０２と比較して３２倍劇的に改善され、３５ｍｇ／Ｌに達した。これは、前駆体ＩＰＰおよび／またはＤＭＡＰＰがペルオキシソームに輸送され得、この細胞小器官においてＧＰＰに変換され得ることを示す。
【0123】
リモネンの産生の顕著な増加はまた、ペルオキシソームがバリアとして効果的に作用し、この新しく形成されたＧＰＰを細胞質ＥＲＧ２０ｐから保護し、したがってＣ／ＬｉｍＳによる取り込みを可能にすることができることを示す。
【0124】
結果をまた図１に示す。
【0125】
実施例２：ペルオキシソームへのメバロン酸経路の局在化はテルペノイドの産生を増強する
【0126】
この細胞小器官においてＧＰＰを産生するためペルオキシソームアセチル－ＣｏＡを収集する可能性を評価するために、８つのＭＶＡ経路の酵素を、トリペプチドＳＫＬから構成される１型のＣ末端ペルオキシソーム標的化シグナル（ＰＴＳ１）の添加によってペルオキシソームに標的化した（配列部分参照）。ＧＰＰシンターゼＥｒｇ２０ｐＮ１２７ＷおよびＣ／ＬｉｍＳの存在は、リモネンの産生の顕著な飛躍を観察するのに十分であったが、ペルオキシソームへのＭＶＡ経路のさらなる酵素の段階的局在化は、経路がこのオルガネラで完了していない場合にはわずかしかリモネンの産生を改善しなかった。しかしながら、８つすべての酵素をペルオキシソームで標的化したとき、リモネンの産生が１４１ｍｇ／Ｌへさらに４倍増加したことが認められた（図２）。
【0127】
アセチル－ＣｏＡからリモネンへの経路全体をサイトゾル（ＣＹＴＬｉｍ０２株）からペルオキシソーム（ＰＥＲＬｉｍ０５株）に移すと、産生が全体的に１２５倍改善される。
【0128】
実施例３：本発明を他のモノテルペノイドに拡張する。ペルオキシソームを用いた、改良されたカンフェン、ピネン、（Ｓ）－（－）－リモネン、（Ｒ）－（＋）－リモネン、（Ｒ）－（＋）－リナロールおよびサビネンの産生のための酵母株の構築。
【0129】
実施例１および２で報告されたペルオキシソームに関連する改善がリモネンの産生に特異的であるか、またはモノテルペン全般に適用可能であるかを評価するために、本発明者らは、ＭＶＡ経路の残りの過剰発現を伴うＥｒｇ２０ｐＮ１２７Ｗと共に、サイトゾルまたはペルオキシソームのいずれかに５つの追加のＭＴＰを標的とした。カンフェンシンターゼ（ＳｅＣａｍＳ）、（Ｓ）－（－）－リモネンシンターゼ（ＭｓＬｉｍＳ）、（Ｒ）－（＋）－リモネンシンターゼ（Ｃ／ＬｉｍＳ）、（Ｒ）－（＋）－リナロールシンターゼ（ＭｃＬｉｍＳ）、アルファ－ピネンシンターゼ（ＰｔＰｉｎＳ）、およびサビネンシンターゼ（ＳｐＳａｂＳ）を選択し、それらの主要生成物の産生力価を決定することによって評価した。ＧＰＰシンターゼ（Ｅｒｇ２０ｐＮ１２７Ｗ）と共にこれら５つのモノテルペンシンターゼ（ＭＴＳ）のペルオキシソーム標的化の同じ正の効果が、同じ酵素の対応するサイトゾルの発現と比較して、それぞれカンフェン、ピネン、サビネン、（Ｓ）－（－）－リモネン、（Ｒ）－（＋）－リノネンおよび（Ｒ）－（＋）－リナロールについて、１４倍（ＰＥＲＣａｍ０２対ＣＹＴＣａｍ０２）、１７倍（ＰＥＲＰｉｎ０２対ＣＹＴＰｉｎ０２）、２２倍（ＰＥＲＳａｂ０２対ＣＹＴＳａｂ０２）、１７倍（ＰＥＲＬｉｍ２７対ＣＹＴＬｉｍ０４）、１２５倍（ＰＥＲＬｉｍ０５対ＣＹＴＬｉｍ０２）、および２０．５倍（ＰＥＲＬｉｎ０１対ＣＹＴＬｉｎ０１）の改善で、認められた（図３）。
【0130】
実施例４：最適化させた緩衝合成最小培地を使用した改善されたモノテルペンの産生。
【0131】
工業的に適切な培地での産生を評価するために、合成での最小規定培地を使用した。この合成での最小規定培地は、以下の、５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、３ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、０．００６４ｇ／ＬのＤ－ビオチン、０．０３ｇ／Ｌのニコチン酸、０．１ｇ／ＬのチアミンＨＣＬ、０．０４ｇ／ＬのＤ－パントテン酸、０．０８ｇ／Ｌのミオイノシトール、０．０２ｇ／Ｌのピリドキシン、０．０６７ｇ／ＬのトリチプレックスＩＩＩ、０．０６７ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２Ｆｅ（ＳＯ４）２６Ｈ２Ｏ、０．００５５ｇ／ＬのＣｕＳＯ４、０．０２ｇ／ＬのＺｎＳＯ４、０．０２ｇ／ＬのＭｎＳＯ４、０．００１２５ｇ／ＬのＮｉＳＯ４、０．００１２５ｇ／ＬのＣｏＣＬ２、０．００１２５ｇ／Ｌのホウ酸、０．００１２５ｇ／ＬのＫｌおよび０．００１１５のＮａ２ＭｏＯ４から構成された。これにより、ｐＨを、６．３という開始の値で、ＭＥＳで緩衝する。
【0132】
ＰＥＲＬｉｍ０５、ＰＥＲＧｅｒ０２、ＰＥＲＰｉｎ０２およびＰＥＲＬｉｎ０１の株を使用して、この培地のモノテルペン産生レベルを判定した。さらに、ベータ－ミルセンを産生するＰＥＲＭｙｒ０１と命名した株を、ベータ－ミルセンシンターゼＯｂＭｙｒＳをＧＰＰシンターゼＥＲＧ２０Ｎ１２７、およびＣ末端トリペプチドＳＫＬとの融合によってペルオキシソームを標的とする残りのＭＶＡ経路と共に導入することによって構築した（配列番号２６）。すべての株を、振とうフラスコで、１０％のミリスチン酸イソプロピルオーバーレイにて、３０度で７２時間培養した。前述の合成での最小規定培地を使用し、増殖および遺伝子の誘導のために４％のガラクトースを補充した。
【0133】
ＰＥＲＬｉｍ０５株は７７０ｍｇのリモネン／Ｌの培養物を産生し、ＰＥＲＧｅｒ０２株は１６８１ｍｇのゲラニオール／Ｌの培養物を産生し、ＰＥＲＰｉｎ０２株は２５０ｍｇのアルファ－ピネン／Ｌの培養物を産生し、ＰＥＲＬｉｎ０１株は５４７ｍｇのリナロール／Ｌの培養物を産生し、ＰＥＲ－Ｍｙｒ０１株は２５１ｍｇのミルセン／Ｌの培養物を産生する。これは、実施例３で使用した非緩衝完全培地で培養した同じ株と比較して、ＰＥＲＬｉｍ０５、ＰＥＲＧｅｒ０２、ＰＥＲＰｉｎ０２およびＰＥＲＬｉｎ０１の株について、それぞれ５．４倍、５．２倍、５．１倍および２．９倍の改善を表している。
【0134】
実施例５：ＧＰＰＳおよびＬｉｍＳまたはＧＥＳを伴うＭＶＡ経路の遺伝子のゲノム組み込みおよびプラスミドに基づく発現の組み合わされた戦略による、高レベルの（＋）－リモネンおよびゲラニオールの産生。
【0135】
ペルオキシソームを標的とするＭＶＡ経路の各遺伝子の単一コピーを、ＥＲＧ２０ｐＮ１２７ＷおよびＣ／ＬｉｍＳ／ｔＯｂＧＥＳと共にＥＧＹ４８株のゲノムに組み込み、ＰＥＲＬｉｍ０６株およびＰＥＲＧｅｒ０１株を得た。さらに、ＭＶＡ経路の各遺伝子、Ｅｒｇ２０ｐＮ１２７ＷおよびＣ／ＬｉｍＳまたはｔＯｂＧＥＳの追加のコピーを、ＰＥＲＬｉｍ０７およびＰＥＲＧｅｒ０２の株をそれぞれ与えるＰＥＲＬｉｍ０６株およびＰＥＲＧｅｒ０１株のプラスミドに導入した。
【0136】
経路をペルオキシソームに合わせることによって達成可能な最大のリモネンおよびゲラニオールの力価を判定するために、ＰＥＲＬｉｍ０７およびＰＥＲＧｅｒ０２株を用いて、半連続流加実験を行った。培養物に４０ｇ／Ｌガラクトースおよび２０ｇ／Ｌラフィノースを４８時間ごとに供給し、ｐＨを４．５に調整した。また、４８時間毎にＩＰＭ層を収穫してモノテルペンの産生を測定した。
【0137】
ＰＥＲＬｉｍ０７およびＰＥＲＧｅｒ０２の株を用いたフェドバッチフラスコ培養物は、形成されたバイオマスの量に大きく比例するリモネンおよびゲラニオールの連続的な蓄積をもたらした。７００時間後、２５７５ｍｇのリモネン／Ｌ培養物（図４Ａ）、および５５１６ｍｇのゲラニオール／Ｌ培養物（図４Ｂ）の力価を判定した。
【0138】
実施例６：ＧＰＰシンターゼドメインおよびテルペンシンターゼドメインを含む融合タンパク質のペルオキシソーム局在化は、テルペンの産生を増加させる。
【0139】
本発明のこの実施例では、ＧＰＰシンターゼおよびテルペンシンターゼ活性の両方を有する単一のポリペプチドを使用する可能性を調査する。そのような二機能性酵素は、自然界で既に見出され得るか、または合成的に作出され得る。例示目的のために、本発明者らは、ＧＰＰシンターゼドメインとテルペンシンターゼドメインを一緒に融合することによってそのようなポリペプチドを作製し、それをペルオキシソームに標的化した。
【0140】
そうするために、ＧＰＰシンターゼＥｒｇ２０ｐＮ１２７Ｗを、５つのグリシン－セリンリピート（５ｘＧＳ）から構成されるリンカーポリペプチドによって、テルペンシンターゼＣ／ＬｉｍＳに融合した。ＧＰＰシンターゼドメインはタンパク質のＮ末端にあり得、テルペンシンターゼはタンパク質のＣ末端にあり得る。あるいは、テルペンシンターゼドメインはタンパク質のＮ末端にあり得、ＧＰＰシンターゼドメインはタンパク質のＣ末端にあり得る。この実施例では、これらの構成の両方を試験した。これらの２つの合成酵素の構築により、配列番号１５および配列番号１６に記載の２つの新規ポリペプチドが得られた。続いて、両方の配列を酵母の発現ベクターに導入してプラスミドｐＰＥＲ１５およびｐＰＥＲ１６を得て、ＰＥＲＬｉｍ０６株を２つのプラスミドのいずれか１つで形質転換して、ＰＥＲＬｉｍ１０およびＰＥＲＬｉｍ１１を得た。ＰＥＲＬｉｍ１０およびＰＥＲＩｉｍ１１をＩＰＭオーバーレイで３０°Ｃで７２時間培養した後、リモネンの産生を測定し、ＰＥＲＬｉｍ０８株およびＰＥＲＩｉｍ０９株の１つと比較した。図５に見られるように、一方または他方の二機能性ＧＰＰ－テルペンシンターゼ融合物をペルオキシソーム標的化することによって得られるリモネンの産生（ＰＥＲＬｉｍ１０およびＰＥＲＬｉｍ１１）は、別個の酵素としてＧＰＰシンターゼおよびテルペンシンターゼをペルオキシソーム標的化する場合に認められる産生（ＰＥＲ－Ｌｉｍ０９）と比較して、類似またはより良好である。さらに、二機能性ＧＰＰ－テルペンシンターゼをペルオキシソームに標的化すると、ＧＰＰシンターゼ活性のみをペルオキシソームに標的化する場合（ＰＥＲ－Ｌｉｍ０８）と比較して、リモネンの産生の１６倍および１１倍の改善が認められる。
【0141】
実施例７Ａ：メントールの前駆体であるトランス－イソピペリテノールの効率的な産生。
【0142】
本発明者らはさらに、高値化合物メントールの前駆体であるトランス－イソピペリテノールの産生における本発明の寄与を評価した。本発明者らは、スペアミント由来のリモネン－３－ヒドロキシラーゼ（ＭｓＬｉｍ３Ｈ；Ｑ６ ＩＶ１３．１）をタキスス・カスピダタ由来のシトクロムＰ４５０レダクターゼ（ｔｃＣＰＲ／ＰＯＲ）と共にＰＥＲＬｉｍ２７株に導入して、ＰＥＲＬｉｍ３０株または空のベクター（ｐＥＳＣ－Ｌｅｕ）を得て、ＰＥＲ－Ｌｉｍ２９を得た。比較として、本発明者らは、スペアミント由来のリモネン－３－ヒドロキシラーゼ（ＭｓＬｉｍ３Ｈ；Ｑ６ＩＶ１３．１）をタキスス・カスピダタ由来のシトクロムＰ４５０レダクターゼ（ｔｃＣＰＲ／ＰＯＲ）と共にＣＹＴＬｉｍ０４株に導入して、ＣＹＴＬｉｍ０６株を得た。完全な最小培地で７２時間増殖させた後、トランス－イソピペリテノールの産生を培養抽出物のＧＣ－ＦＩＤによって評価した。図６Ａに示すように、（－）－リモネンおよびトランス－イソピペリテノールの両方をＰＥＲＬｉｍ３０株から抽出することができたが、リモネン－３－ヒドロキシラーゼＭｓＬｉｍ３ＨおよびシトクロムＰ４５０レダクターゼｔｃＣＰＲを欠くＰＥＲＬｉｍ２９株では、リモネンのみが検出された（図６Ａ）。ＰＥＲＬｉｍ２９と比較した、ＰＥＲＬｉｍ３０培養物から回収された（－）－リモネンの減少は、トランス－イソピペリテノール（１９．２４ｍｇ／Ｌ）への３７％の変換に従っている（図６Ａ）。しかし、リモネンの産生をＣＹＴＬｉｍ０６株のサイトゾルで行った場合、０．２８ｍｇ／Ｌのトランス－イソピペリテノールしか得られず、リモネン変換率はわずか１４％に相当した。これらの結果は、ペルオキシソームにおけるリモネンの産生の増加により、そのかなりの量が小胞体（ＥＲ）を通って導かれ、そこでＭｓＬｉｍ３Ｈによってヒドロキシル化され得ることを実証している。
【0143】
実施例７Ｂ：イリドイドおよびモノテルペンインドールアルカロイドの前駆体である８－ヒドロキシゲラニオールの効率的な産生。
【0144】
イリドイドおよびモノテルペンインドールアルカロイドを含む高値化合物の大きな群の前駆体である８－ヒドロキシゲラニオールの産生における本発明の寄与をさらに評価した。本発明者らは、ニチノウソウ（ＣｒＧ８０Ｈ；ＣＹＰ７６Ｂ６）由来のゲラニオール８－ヒドロキシラーゼを同じ種由来のシトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣｒＣＰＲ／ＰＯＲ）と共にＰＥＲＧｅｒ０２株に導入して、ＰＥＲＧｅｒ０４株または空のベクター（ｐＥＳＣ－Ｌｅｕ）を得て、ＰＥＲＧｅｒ０３を得た。完全な最小培地で７２時間増殖させた後、８－ヒドロキシ－ゲラニオールの産生を培養抽出物のＧＣ－ＦＩＤによって評価した。図６Ｂに示すように、ゲラニオールおよび８－ヒドロキシ－イゲラニオールの両方をＰＥＲＧｅｒ０４株から抽出することができたが、ゲラニオール８－ヒドロキシラーゼＣｒＧ８０ＨおよびシトクロムＰ４５０レダクターゼＣｒＣＰＲを欠くＰＥＲＧｅｒ０３株ではゲラニオールのみが検出された（図６Ｂ）。ＰＥＲＧｅｒ０３と比較したＰＥＲＧｅｒ０４培養物から回収されたゲラニオールの減少は、８－ヒドロキシ－ゲラニオールへの部分的な変換に従っている（図６Ｂ）。これらの結果は、ペルオキシソームにおけるゲラニオールの産生の増加により、そのかなりの量が小胞体（ＥＲ）を通って導かれ、そこでＣｒＧ８０Ｈによってヒドロキシル化され得ることを実証している。
【0145】
実施例８：ＧＰＰシンターゼおよびゲラニル二リン酸：オリベトラートゲラニルトランスフェラーゼをペルオキシソームに標的化することによるカンナビノイドの効率的な産生。
【0146】
モノテルペノイドおよびモノテルペンインドールアルカロイドを超える別の群のＧＰＰ由来の高値化合物の産生、カンナビノイドの産生における本発明の適用性について評価した。カンナビノイド生合成経路では、オリベトール酸（ＯＡ）がＧＰＰによってプレニル化され、専用のゲラニルトランスフェラーゼの作用を介してカンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）を形成する。ＣＢＧＡは、テトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）およびカンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）などの様々な種類のカンナビノイドの最後の一般的な前駆体であるため、経路の重要な工程を表す。酵母では、このプレニル化工程は、サイトゾルにおけるＧＰＰのプールが限られているため、高い力価のカンナビノイドを産生するプロセスの大きな障害となる。
【0147】
この実施例では、Ｃ．ｓａｔｉｖａ由来のＧＰＰシンターゼＥｒｇ２０ｐＮ１２７Ｗおよびゲラニル二リン酸：オリベトラートゲラニルトランスフェラーゼＣｓＰＴ４を、ＣＢＧＡの産生のためにＣ末端標的化シグナルＳＫＬを使用して酵母ペルオキシソームに標的化した。両遺伝子を誘導性プロモーターＰＧＡＬ１およびＰＧＡＬ１０の制御下でＰＥＲＭｖａ０１株に導入してＰＥＲＣａｎ０１株を得た。ガラクトース誘導条件下で完全な最小培地で７２時間増殖させ、様々な濃度のオリベトール酸（０．０５ｍＭ、０．１ｍＭ、０．２５ｍＭまたは０．５ｍＭ）を補充した後、ＣＢＧＡの産生をＬＣ－ＭＳによって分析した。細胞を破壊し、酢酸エチル／ギ酸（０．０５％ｖ／ｖ）を１：１の比で使用し、ガラスビーズで叩解して、細胞の画分（ペレット）からＣＢＧＡを抽出した。有機層を遠心分離によって分離し、ＳｐｉｎＶａｃを使用して蒸発させた。残りの乾燥画分をメタノールに溶解し、０．２２μｍの孔径のＰＶＤＦフィルターで濾過した。試料をＬＣ－ＭＳ分析の前に１０倍希釈した。
【0148】
図７Ａに示すように、ＯＡおよびＣＢＧＡの両方をＰＥＲＣａｎ０１株から抽出することができたが、ＧＰＰシンターゼＥＲＧ２０ｐＮ１２７Ｗおよびゲラニル二リン酸：オリベトラートゲラニルトランスフェラーゼＣｓＰＴ４を欠くＰＥＲＭｖａ０１株では、ＯＡのみが検出された。ＰＥＲＭｖａ０１と比較したＰＥＲＣａｎ０１の細胞の内部に回収されたＯＡの減少は、ＣＢＧＡへの部分的な変換による。これらの結果は、１）ＯＡがペルオキシソームに輸送および／または拡散され得ること、２）ＣｓＰＴ４がペルオキシソームにおいて活性であること、および３）ＧＰＰのプールがペルオキシソームにおいて効率的なＯＡプレニル化を可能にするのに十分であることを実証している。
【0149】
さらに、代替的なＮ末端ペルオキシソーム標的化シグナルをＣｓＰＴ４について調べた（配列番号２９）。ＰＴＳ２－ＣｓＰＴ４をＧＰＰシンターゼＥｒｇ２０ｐＮ１２７Ｗ－ＳＫＬと共にＰＥＲＭｖａ０１株に導入し、両酵素のペルオキシソーム局在化を得た。ＰＥＲＣａｎ０２と呼ばれるこの新しい株は、ＯＡの消費およびＣＢＧＡの産生について以前と同様に評価された。比較のために、ＣｓＰＴ４およびＥｒｇ２０ｐＮ１２７ＷをＣＹＴＭｖａ０１株に導入して、細胞質ＣＢＧＡの産生のためのＣＹＴＣａｎ０１株を得た。図７Ｂに示すように、ＰＥＲＣａｎ０２株は８２．３ｍｇ／ＬのＣＢＧＡを産生し、４．２ｍｇ／ＬのＣＢＧＡのみを有するＣＹＴＣａｎ０１株よりも１９．５倍多かった。
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【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5】
【図6a】
【図6b】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【配列表】
【国際調査報告】