特表 2023-520969 抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体及びその用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-05-23

(54)【発明の名称】抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体及びその用途

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20230516BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20230516BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20230516BHJP

   C07K 16/40 20060101ALI20230516BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20230516BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20230516BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20230516BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230516BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20230516BHJP

   A61P 7/06 20060101ALI20230516BHJP

   A61P 7/00 20060101ALI20230516BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230516BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13 ZNA

C12N15/63 Z

C07K16/28

C07K16/40

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

A61K39/395 D

A61K39/395 N

A61P7/06

A61P7/00

A61P43/00 105

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022548950

(86)(22)【出願日】2021-04-05

(85)【翻訳文提出日】2022-08-10

(86)【国際出願番号】 US2021025775

(87)【国際公開番号】W WO2021207072

(87)【国際公開日】2021-10-14

(31)【優先権主張番号】63/006,695

(32)【優先日】2020-04-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/158,265

(32)【優先日】2021-03-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】522320350

【氏名又は名称】マブウェル セラピューティクス インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＭＡＢＷＥＬＬ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ ＩＮＣ．

【住所又は居所原語表記】５０５ Ｃｏａｓｔ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ Ｓｏｕｔｈ，Ｓｕｉｔｅ ３０１，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ９２０３７（ＵＳ）

(74)【代理人】

【識別番号】100109634

【弁理士】

【氏名又は名称】舛谷 威志

(74)【代理人】

【識別番号】100129263

【弁理士】

【氏名又は名称】中尾 洋之

(72)【発明者】

【氏名】デュー，シン

(72)【発明者】

【氏名】チェン，バクシン

(72)【発明者】

【氏名】ワン，ユ ジン

【テーマコード（参考）】

4B065

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA90X

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA25

4B065CA44

4C085AA13

4C085AA14

4C085AA16

4C085CC23

4C085EE01

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045DA76

4H045EA20

4H045EA27

4H045FA72

4H045FA74

(57)【要約】

細胞表面のＩＩ型膜貫通型セリンプロテアーゼ６（ＴＭＰＲＳＳ６）に結合し、ヘプシジンの発現を増加させる抗体及びその抗原結合フラグメント、並びに抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体及びフラグメントを用いた鉄代謝異常の治療方法が提供される。
【選択図】 図7Ｇ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒトＴＭＰＲＳＳ６を発現する細胞の表面でヒトＴＭＰＲＳＳ６と結合し、鉄代謝に関与する少なくとも１つの成分の活性を調節することができる抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体。

【請求項2】

抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体が、ヘプシジンの発現調節に関与する少なくとも１つの成分の活性を調節することができる、請求項１に記載の抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体。

【請求項3】

抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体が、ヘプシジン発現のＴＭＰＲＳＳ６抑制を実質的に阻害すること、ヘプシジン発現を増加させること、ヘプシジンプロモーターの活性を増加すること、及びヘプシジンのＢＭＰ／ＳＭＡＤ経路誘導性発現のＴＭＰＲＳＳ６抑制を実質的に阻害することのうち少なくとも１つを行うことができる、請求項２に記載の抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体。

【請求項4】

少なくとも１つの非ヒトＴＭＰＲＳＳ６と交差反応性を示す、請求項１に記載の抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体。

【請求項5】

前記非ヒトＴＭＰＲＳＳ６が、マウスＴＭＰＲＳＳ６又はカニクイザルＴＭＰＲＳＳ６のうち少なくとも１つである、請求項４に記載の抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体。

【請求項6】

前記抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体が、ヒトＴＭＰＲＳＳ６（マトリプターゼ－２）に特異的に結合し、ヒトマトリプターゼ－１（ＳＴ１４）又はヒトマトリプターゼ－３（ＴＭＰＲＳＳ７）のうち少なくとも一つから選択されるマトリプターゼ同族体に検出可能な結合を示さない、請求項１に記載の抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体。

【請求項7】

前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１に記載の抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体。

【請求項8】

前記抗体がキメラ抗体である、請求項１に記載の抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体。

【請求項9】

前記抗体がヒト化抗体である、請求項１に記載の抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体。

【請求項10】

前記抗体が抗原結合フラグメントである、請求項１に記載の抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体。

【請求項11】

配列番号１；配列番号２；配列番号３；配列番号４；配列番号６；配列番号７；配列番号８；配列番号９；配列番号１１；配列番号１２；配列番号１３；配列番号１４；配列番号１６；配列番号１７；配列番号１８；配列番号１９；配列番号２１；配列番号２２；配列番号２３；配列番号２４；配列番号２６；配列番号２７；配列番号２８；配列番号２９；配列番号３１；配列番号３２；配列番号３３；配列番号３４；配列番号３６；配列番号３７；配列番号３８；配列番号３９；配列番号４１；配列番号４２；配列番号４３；配列番号４４；配列番号４６；配列番号４７；配列番号４８；配列番号４９；配列番号５１；配列番号５２；配列番号５３；配列番号５４；配列番号５６；配列番号５７；配列番号５８；配列番号５９；配列番号６１；配列番号６３；配列番号６５；配列番号６７；配列番号６９；配列番号７１；配列番号７３；配列番号７５；配列番号７７；配列番号７９；配列番号８１；又は配列番号８３から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを少なくとも一つ含む、請求項１に記載の抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体。

【請求項12】

前記抗体が、（ａ）可変領域が、配列番号１のアミノ酸配列、配列番号１と実質的に同一の配列、配列番号３１のアミノ酸、及び配列番号３１と実質的に同一の配列から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖（ＨＣ）ポリペプチド、及び（ｂ）可変領域が、配列番号６のアミノ酸配列、配列番号６のアミノ酸と実質的に同一の配列、配列番号３６のアミノ酸、配列番号３６のアミノ酸と実質的に同一から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖（ＬＣ）ポリペプチドを含む、請求項１に記載の抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体。

【請求項13】

前記抗体が、（ａ）配列番号２の重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、配列番号３２のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号３の重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）、配列番号３３のＨＣ ＣＤＲ２、配列番号４の重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）、及び配列番号３４のＨＣ ＣＤＲ３のうち少なくとも１つを含む重鎖と、（ｂ）配列番号７の相補性決定領域１（ＬＣ ＣＤＲ１）、配列番号３７のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号８の軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ ＣＤＲ２）、配列番号３８のＬＣ ＣＤＲ２、配列番号９の軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ ＣＤＲ３）、及び配列番号３９のＬＣ ＣＤＲ３のうち少なくとも１つを含む軽鎖と、を含む、請求項１２に記載の抗体。

【請求項14】

前記抗体が、（ａ）可変領域が、配列番号１１のアミノ酸配列、配列番号１１と実質的に同一の配列、配列番号４１のアミノ酸、及び配列番号４１と実質的に同一の配列から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖（ＨＣ）ポリペプチドと、（ｂ）配列番号１６のアミノ酸配列、配列番号１６と実質的に同一の配列、配列番号４６のアミノ酸配列、配列番号４６のアミノ酸配列と実質的に同一の配列から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖（ＬＣ）ポリペプチドとを含む、請求項１に記載の抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体。

【請求項15】

前記抗体が、（ａ）配列番号１２の重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、配列番号４２のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号１３の重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）、配列番号４３のＨＣ ＣＤＲ２、配列番号１４の重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）、及び配列番号４４のＨＣ ＣＤＲ３のうち少なくとも１つを含む重鎖と、（ｂ）配列番号１７の相補性決定領域１（ＬＣ ＣＤＲ１）、配列番号４７のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号１８の軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ ＣＤＲ２）、配列番号４８のＬＣ ＣＤＲ２、配列番号１９の軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ ＣＤＲ３）、及び配列番号４９のＬＣ ＣＤＲ３のうち少なくとも１つを含む軽鎖と、を含む請求項１４に記載の抗体。

【請求項16】

前記抗体が、（ａ）可変領域が、配列番号２１のアミノ酸配列、配列番号２１と実質的に同一の配列、配列番号５１のアミノ酸、及び配列番号５１と実質的に同一の配列から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖（ＨＣ）ポリペプチドと、（ｂ）配列番号２６のアミノ酸配列、配列番号２６と実質的に同一の配列、配列番号５６のアミノ酸配列、及び配列番号５６のアミノ酸配列と実質的に同一の配列から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖（ＬＣ）ポリペプチドと、を含む、請求項１に記載の抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体。

【請求項17】

前記抗体が、（ａ）配列番号２２の重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、配列番号５２のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号２３の重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）、配列番号５３のＨＣ ＣＤＲ２、配列番号２４の重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）、及び配列番号５４のＨＣ ＣＤＲ３のうち少なくとも１つを含む重鎖と、（ｂ）配列番号２７の相補性決定領域１（ＬＣ ＣＤＲ１）、配列番号５７のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号２８の軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ ＣＤＲ２）、配列番号５８のＬＣ ＣＤＲ２、配列番号２９の軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ ＣＤＲ３）、及び配列番号５９のＬＣ ＣＤＲ３のうち少なくとも１つを含む軽鎖と、を含む、請求項１６に記載の抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体。

【請求項18】

有効量の請求項１記載の抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体を、それを必要とする対象に投与することを含む、鉄代謝障害の治療方法であって、抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の有効量の投与により、鉄代謝に関与する成分の活性を調節する方法。

【請求項19】

前記鉄代謝の障害が鉄過剰症である、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記鉄過剰症が無効造血の障害である、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記鉄過剰症がβサラセミアである、請求項１９に記載の方法。

【請求項22】

有効量の抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の投与により、ヘプシジンの発現調節に関与する少なくとも１つの成分の活性を調節する、請求項１８に記載の方法。

【請求項23】

有効量の抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の投与により、ＴＭＰＲＳＳ６によるヘプシジン発現抑制を阻害する、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

有効量の抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の投与により、ヘプシジンの発現を増加させる、請求項２２に記載の方法。

【請求項25】

有効量の抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の投与により、ヘプシジンプロモーターの活性を上昇させる、請求項２２に記載の方法。

【請求項26】

有効量の抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の投与により、ＴＭＰＲＳＳ６によるＢＭＰ／ＳＭＡＤ経路誘導型ヘプシジンの発現抑制を阻害する、請求項２２に記載の方法。

【請求項27】

有効量の抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の投与により、血清ヘプシジン濃度の増加、血清鉄濃度の減少、肝臓ヘプシジンＲＮＡ濃度の増加、肝臓非ヘム鉄の減少、脾腫の減少、赤血球数（ＲＢＣ）の増加、ヘマトクリット（ＨＣＴ）の増加、赤血球分布幅（ＲＤＷ）の減少、成熟赤血球生成の増加、及び赤血球生成の増加から選択される少なくとも一つの効果をもたらす、請求項１８に記載の方法。

【請求項28】

請求項１に記載の抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体と、好適な担体及び／又は賦形剤とを含む、医薬組成物。

【請求項29】

請求項１に記載の抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の少なくとも一部をコードする単離された核酸分子。

【請求項30】

配列番号５を含むヌクレオチド配列、配列番号５と実質的に同一の配列を含むヌクレオチド配列、配列番号１５を含むヌクレオチド配列、配列番号１５と実質的に同一の配列を含むヌクレオチド配列、配列番号２５を含むヌクレオチド配列、配列番号２５と実質的に同一の配列を含むヌクレオチド配列、配列番号３５を含むヌクレオチド配列、配列番号３５と実質的に同一の配列を組むヌクレオチド配列、配列番号４５を含むヌクレオチド配列、配列番号４５と実質的に同一の配列を含むヌクレオチド配列、配列番号５５を含むヌクレオチド配列、又は配列番号５５と実質的に同一の配列を含むヌクレオチド配列から選択される重鎖（ＨＣ）ヌクレオチド配列を含む、請求項２９記載の単離された核酸分子。

【請求項31】

配列番号１０を含むヌクレオチド配列、配列番号１０と実質的に同一の配列を含むヌクレオチド配列、配列番号２０を含むヌクレオチド配列、配列番号２０と実質的に同一の配列を含むヌクレオチド配列、配列番号３０を含むヌクレオチド配列、配列番号３０と実質的に同一の配列を含むヌクレオチド配列、配列番号４０を含むヌクレオチド配列、配列番号４０と実質的に同一の配列を含むヌクレオチド配列、配列番号５０を含むヌクレオチド配列、配列番号５０と実質的に同一の配列を含むヌクレオチド配列、配列番号６０ を含むヌクレオチド配列、又は配列番号６０と実質的に同一の配列を含むヌクレオチド配列から選択される軽鎖（ＬＣ）ヌクレオチド配列を含む、請求項２９に記載の単離された核酸分子。

【請求項32】

請求項２９に記載の核酸分子を含むベクター。

【請求項33】

請求項３２に記載のベクターを含む宿主細胞。

【発明の詳細な説明】

【関連出願】

【0001】

本出願は、２０２０年４月７日に出願された「Ａｎｔｉ－ＴＭＰＲＳＳ６ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ（抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体及びその用途）」と題する米国仮出願第６３／００６，６９５号、及び２０２１年３月８日に出願された「Ａｎｔｉ－ＴＭＰＲＳＳ６ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ（抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体及びその用途）」と題する米国仮出願第６３／１５８，２６５号の優先権の利益を主張し、それぞれの内容の全体が参照により本願に援用されるものとする。
［配列表］

【0002】

本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本出願に援用される。２０２１年３月２９日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーは、１１２１＿１０１ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔという名前で、サイズは１３２，６７７バイトである。

【技術分野】

【0003】

本開示は、ＴＭＰＲＳＳ６と結合する抗体及び抗原結合フラグメント、並びにＴＭＰＲＳＳ６と結合する抗体及び抗原結合フラグメントを用いた鉄代謝異常の治療に関する。

【背景技術】

【0004】

ＩＩ型膜貫通型セリンプロテアーゼ６（ＴＭＰＲＳＳ６）は、ＴＭＰＲＳＳ６遺伝子にコードされ、主に肝臓で発現している。ＴＭＰＲＳＳ６の構造は、ＩＩ型膜貫通ドメイン、ウニ精子タンパク質、エンテロペプチダーゼ及びアグリン（ＳＥＡ）ドメイン、２つの補体因子Ｃ１ｒ／Ｃ１ｓ、ウニ胚成長因子及び骨形成タンパク質（ＣＵＢ）ドメイン及び３つの低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）クラスＡ反復を含む幹領域、並びにＣ末端トリプシン様セリンプロテアーゼドメインを含む（Ｗａｎｇ，Ｃ．－Ｙ．ら、Ｆｒｏｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１４．５：１１４）。ＴＭＰＲＳＳ６（ＥＣ３．４．２１）の別名には、マトリプターゼ－２；膜貫通型プロテアーゼセリン６；膜結合型モザイクセリンプロテイナーゼマトリプターゼ－２；及びＭＴ２などが含まれる。

【0005】

ＴＭＰＲＳＳ６は、鉄の吸収と貯蔵鉄からの移動を制御するホルモンであるヘプシジンの発現を制御するＢＭＰ－ＳＭＡＤシグナル伝達経路を通じて、鉄のホメオスタシスに重要な役割を担っている。ヘプシジン（ＨＡＭＰ（ｈｅｐｃｉｄｉｎ ａｎｔｉ－ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅ）とも呼ばれる。ヒトとヒト以外の霊長類ではＨＡＭＰ、マウスとラットではＨａｍｐによってコードされている）は、唯一の鉄排出チャネルであるフェロポーチンの機能活性を制御することによって、全身の鉄ホメオスタシスを制御する。ヘプシジンは、フェロポーチンに結合して複合体の内在化・分解を引き起こすことにより、小腸での鉄吸収と貯蔵鉄の放出を妨げて血漿中の鉄濃度を低下させることができる。ヘプシジン濃度の慢性的な上昇は全身性の鉄欠乏を、ヘプシジンの欠乏は全身性の鉄過剰症を引き起こす。

【0006】

ＴＭＰＲＳＳ６は、鉄欠乏によって引き起こされる膜貫通型シグナル伝達経路を通じてヘプシジンの産生を負に制御し、ＨＡＭＰの活性化を抑制する（Ｄｕ，Ｘ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００８．３２０：１０８８－１０９２；Ｗａｎｇ，Ｃ．－Ｙ．ら、Ｆｒｏｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１４．５：１１４）。血中鉄濃度の低下により、この経路が始動し、ヘプシジンの産生が減少することで、食事から摂取した多くの鉄が腸から吸収され、貯蔵部位から血流に運ばれるようになる。急性鉄欠乏下のラットでは、肝ＴＭＰＲＳＳ６タンパク質濃度が上昇し、ヘプシジンの発現及び産生が抑制される（Ｗａｎｇ，Ｃ．－Ｙ．ら、Ｆｒｏｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１４．５：１１４）。ＴＭＰＲＳＳ６分子全体、特に細胞外ドメインの変異は、鉄欠乏性貧血、特に経口鉄治療には反応せず、非経口鉄治療に部分的にしか反応しない鉄不応性鉄欠乏性貧血（ＩＲＩＤＡ）の対象者において確認されている（Ｗａｎｇ，Ｃ．－Ｙ．ら、Ｆｒｏｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１４．５：１１４）。ヒトのＴＭＰＲＳＳ６の機能喪失変異は、ヘプシジンの過剰産生が鉄の吸収及び利用に異常をきたすため、ヘプシジン濃度の上昇と鉄欠乏性貧血を引き起こす（Ｃａｍａｓｃｈｅｌｌａ，Ｃ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｍｅｄ ２０１３．１６８：２４）。

【0007】

鉄過剰症は、過剰な鉄が組織や臓器に蓄積され、その正常な機能が損なわれることで発症する。鉄中毒は鉄過剰症の代表的な合併症であり、主要臓器に鉄が蓄積する結果、高い死亡率につながる。βサラセミアは、ＨＢＢ遺伝子の変異によりβグロビン（ベータグロビン）の産生が低下又は消失し、赤芽球のアポトーシスや成熟赤血球の不足が起こり、その結果、赤血球造血がうまくいかず貧血と鉄分の過剰吸収により鉄過剰症を引き起こす疾患である。βサラセミア患者においては、患者の鉄負荷状態に応じてヘプシジンが異常に抑制され、ヘプシジン不足が生じ、過剰な鉄吸収と全身の鉄過剰症が進行する。ＭＤＳ（骨髄異形成症候群）、異常造血性貧血、鉄芽球性貧血などの無効増血も、ヘプシジンの低下により鉄過剰になることが特徴である。ヘモクロマトーシス（１型ヘモクロマトーシス、遺伝性ヘモクロマトーシスなど）は、食事から摂取した鉄の腸管での過剰吸収と、全身の鉄貯蔵量の病的な増加を特徴とする鉄過剰症である。鉄過剰症の現在の標準的な治療には、鉄過剰症をさらに悪化させ得る無効造血に対する輸血、患者のコンプライアンスが低い鉄キレーション、症状を管理するための瀉血や脾臓摘出などが含まれる。現在開発中の治療アプローチには、ＨＢＢ遺伝子を標的とする遺伝子治療、他の関連遺伝子を標的とする遺伝子治療及び遺伝子編集、ヘプシジン模倣薬、ＴＧＦスーパーファミリーリガンドを標的にしてＳＭＡＤシグナル伝達を阻害するＦｃ融合タンパク質、ＴＭＰＲＳＳ６を標的とするアンチセンスＲＮＡ薬剤（例えばＥｌ－Ｂｅｓｈｌａｗｙ Ａ．，ら、Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ２０１９．７６：５３－５８）及びＴＭＰＲＳＳ６を標的とするｉＲＮＡ薬剤がある。

【発明の概要】

【0008】

本発明は、ＴＭＰＲＳＳ６と結合する新規な抗体及びその抗原結合フラグメント、並びにＴＭＰＲＳＳ６と結合する抗体及びその抗原結合フラグメントの作製方法及び使用方法に関する。

【0009】

本開示は、抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体、抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体をコードする核酸、並びに抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の製造方法及び使用方法を提供する。本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、ＴＭＰＲＳＳ６と結合することができる抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体及びそのフラグメントを包含する。本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、ヒトＴＭＰＲＳＳ６を発現する細胞の表面でヒトＴＭＰＲＳＳ６に結合することができる。本開示は、治療及び診断用途のための抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体を提供する。本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、鉄過剰症、特に、限定されないが、非輸血依存性サラセミアを含むβサラセミア、及び無効造血の他の障害などの鉄代謝の障害を治療するために使用することができる。

【0010】

一態様において、ＴＭＰＲＳＳ６を発現する細胞の表面上のＴＭＰＲＳＳ６に結合し、鉄代謝に関与する少なくとも１つの成分の活性を調節することができる抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体が提供される。ここで成分は、ＴＭＰＲＳＳ６の機能に関連する分子又は生体プロセスであってもよい。特定の実施形態において、本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、ヘプシジン発現の制御に関与する少なくとも１つの成分の活性を調節することが可能である。特定の実施形態において、本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、ヘプシジン発現のＴＭＰＲＳＳ６抑制を実質的に阻害することが可能である。特定の実施形態において、本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、ヘプシジンの発現を増加させることが可能である。特定の実施形態において、本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、ヘプシジンプロモーターの活性を増加させることが可能である。特定の実施形態において、本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、ＴＭＰＲＳＳ６によるＢＭＰ／ＳＭＡＤ経路誘導型のヘプシジン発現の抑制を実質的に阻害することが可能である。本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、限定されないが、ヘプシジン発現のＴＭＰＲＳＳ６抑制を実質的に阻害すること、ヘプシジン発現を増加させること、ヘプシジンプロモーター活性を増加させること、又はＴＭＰＲＳＳ６によるＢＭＰ／ＳＭＡＤ経路誘導型のヘプシジンの発現の抑制を実質的に阻害することなど、用量依存的にヘプシジン発現を調節し得る。特定の実施形態において、本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、用量依存的にヘプシジンの発現を調節することができる。特定の実施形態において、本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、対象に投与された場合、用量依存的に血清ヘプシジン濃度を増加させることが可能である。特定の実施形態において、本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、対象に投与された場合、用量依存的に血清鉄濃度を低下させることができる。特定の実施形態において、本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、対象に投与された場合、用量依存的に肝臓ヘプシジンＲＮＡ濃度を増加させることが可能である。特定の実施形態において、本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、鉄過剰症、特にβサラセミアを有することが知られているか又は疑われている対象に投与された場合、肝臓非ヘム鉄を減少させ、血清ヘプシジンを増加させ、肝臓ヘプシジンＲＮＡを増加させ、脾腫を減少させ、赤血球数（ＲＢＣ）を増加させ、ヘマトクリットを減少させ、赤血球分布幅（ＲＤＷ）を減少させ、成熟赤血球の生成を増加（赤血球生成の増加）することを可能にする。

【0011】

別の態様において、本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、少なくとも１つの非ヒトＴＭＰＲＳＳ６との交差反応性を示す。特定の実施形態において、本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、少なくとも１つの非ヒトＴＭＰＲＳＳ６を発現する細胞の表面上で少なくとも１つの非ヒトＴＭＰＲＳＳ６に結合することが可能である。本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、ヒトＴＭＰＲＳＳ６及びマウスＴＭＰＲＳＳ６と結合することが可能である。本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、ヒトＴＭＰＲＳＳ６及びカニクイザルＴＭＰＲＳＳ６に結合することが可能である。本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、ヒトＴＭＰＲＳＳ６、マウスＴＭＰＲＳＳ６、及びカニクイザルＴＭＰＲＳＳ６の各々に結合することができる。

【0012】

別の態様において、本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、ＴＭＰＲＳＳ６（マトリプターゼ－２）に特異的に結合する。特定の実施形態において、本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、ＴＭＰＲＳＳ６（マトリプターゼ－２）に結合し、マトリプターゼ同族体への検出可能な結合を示さない。特定の実施形態において、本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、ヒトＴＭＰＲＳＳ６（マトリプターゼ－２）に結合し、ヒトマトリプターゼ－１（ＳＴ１４）への検出可能な結合は示さない。特定の実施形態において、本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、ヒトＴＭＰＲＳＳ６（マトリプターゼ－２）に結合し、ヒトマトリプターゼ－３（ＴＭＰＲＳＳ７）への検出可能な結合は示さない。特定の実施形態において、本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、ヒトＴＭＰＲＳＳ６（マトリプターゼ２）に結合し、ヒトマトリプターゼ－１（ＳＴ１４）又はヒトマトリプターゼ－３（ＴＭＰＲＳＳ７）のいずれかに対する検出可能な結合は示さない。

【0013】

本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、組み換え抗体、アプタマー、単一ドメイン抗体（ＶＨＨ、ナノボディ）、若しくは他のＴＭＰＲＳＳ６結合フラグメント又はバリアントであってもよい。特定の実施形態において、本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、特に抗原結合能などの特性に影響を与えるために、既存の抗体フレームワークにアミノ酸が置換されたフレームワークを含んでいてもよい。特定の実施形態において、本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、親抗体とは異なるタイプ（クラス）の抗体及び／又は異なる生物からのフレームワーク、特にアクセプターヒトフレームワークにグラフト化（融合）されたソース（親）抗体からの相補性決定領域（ＣＤＲｓ）を含んでいてもよい。特定の実施形態において、本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、抗原結合又は抗体構造などの特性に影響を与えるために、ＣＤＲ以外の領域、例えば、ＣＤＲを囲む可変領域フレームワーク及び／又は定常領域、特にＦｃ領域においてアミノ酸が置換、変異、又は置き換えられているフレームワークを含んでいてもよい。特定の実施形態においては、１つ以上のＣＤＲが置換、変異、又は置き換えられている。特定の実施形態において、本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、ヒト化抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体バリアントであってもよい。

【0014】

特定の実施形態において、本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、表１、表２、又は表３に記載のアミノ酸配列、又は表１、表２、又は表３に記載のアミノ酸配列と実質的に同一（例えば、少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、又は９８％、９９％同一）の配列を有する少なくとも一つのポリペプチドを含む。本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、以下から選択されるアミノ酸配列、又は以下から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのポリペプチドと実質的に同一（例えば、少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、又は９８％、９９％同一）の配列を含んでもよい。配列番号１；配列番号２；配列番号３；配列番号４；配列番号６；配列番号７；配列番号８；配列番号９；配列番号１１；配列番号１２；配列番号１３；配列番号１４；配列番号１６；配列番号１７；配列番号１８；配列番号１９；配列番号２１；配列番号２２；配列番号２３；配列番号２４；配列番号２６；配列番号２７；配列番号２８；配列番号２９；配列番号３１；配列番号３２；配列番号３３；配列番号３４；配列番号３６；配列番号３７；配列番号３８；配列番号３９；配列番号４１；配列番号４２；配列番号４３；配列番号４４；配列番号４６；配列番号４７；配列番号４８；配列番号４９；配列番号５１；配列番号５２；配列番号５３；配列番号５４；配列番号５６；配列番号５７；配列番号５８；配列番号５９；配列番号６１；配列番号６３；配列番号６５；配列番号６７；配列番号６９；配列番号７１；配列番号７３；配列番号７５；配列番号７７；配列番号７９；配列番号８１；又は配列番号８３。

【0015】

一実施形態において、本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、配列番号１に記載のアミノ酸配列、又は配列番号１と実質的に同一の配列の重鎖（ＨＣ）可変領域ポリペプチド、及び配列番号６に記載のアミノ酸配列、又は配列番号６と実質的に同一の配列の軽鎖（ＬＣ）可変領域ポリペプチドを含む。一実施形態において、本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、配列番号２に記載のアミノ酸配列の重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、配列番号３に記載のアミノ酸配列の重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）、配列番号４に記載のアミノ酸配列の重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）、配列番号７に記載のアミノ酸配列の軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ ＣＤＲ１）、配列番号８に記載のアミノ酸配列の軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ ＣＤＲ２）、及び配列番号９に記載のアミノ酸配列の軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ ＣＤＲ３）；又はＣＤＲ領域における１、２、３、４、５又は６個のアミノ酸の置換を含む上記抗体のバリアントを含む。非限定的な一実施形態において、本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、配列番号６１に記載のアミノ酸配列を有するＨＣポリペプチド及び配列番号６３に記載のアミノ酸配列を有するＬＣポリペプチドを含む、本開示においてＭＷＴｘ－００１として同定される抗体である。

【0016】

一実施形態において、本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、配列番号１１に記載のアミノ酸配列、又は配列番号１１と実質的に同一の配列の重鎖（ＨＣ）可変領域ポリペプチド、及び配列番号１６に記載のアミノ酸配列、又は配列番号１６と実質的に同一の配列の軽鎖（ＬＣ）可変領域ポリペプチドを含む。一実施形態において、本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、配列番号１２に記載のアミノ酸配列のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号１３に記載のアミノ酸配列のＨＣ ＣＤＲ２、配列番号１４に記載のアミノ酸配列のＨＣ ＣＤＲ３、配列番号１７に記載のアミノ酸配列のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号１８に記載のアミノ酸配列のＬＣ ＣＤＲ２、及び配列番号１９に記載のアミノ酸配列のＬＣ ＣＤＲ３、又はＣＤＲ領域における１、２、３、４、５又は６個のアミノ酸の置換を含む上記抗体のバリアントを含む。非限定的な一実施形態において、本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、配列番号６５に記載のアミノ酸配列を有するＨＣポリペプチド及び配列番号６７に記載のアミノ酸配列を有するＬＣポリペプチドを含む、本開示においてＭＷＴｘ－００２として同定される抗体である。

【0017】

一実施形態において、本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、配列番号２１に記載のアミノ酸配列、又は配列番号２１と実質的に同一の配列の重鎖（ＨＣ）可変領域ポリペプチド、及び配列番号２６に記載のアミノ酸配列、又は配列番号２６と実質的に同一の配列の軽鎖（ＬＣ）可変領域ポリペプチドを含む。一実施形態において、本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、配列番号２２に記載のアミノ酸配列のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号２３に記載のアミノ酸配列のＨＣ ＣＤＲ２、配列番号２４に記載のアミノ酸配列のＨＣ ＣＤＲ３、配列番号２７に記載のアミノ酸配列のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号２８に記載のアミノ酸配列のＬＣ ＣＤＲ２、および配列番号２９に記載のアミノ酸配列のＬＣ ＣＤＲ３、又はＣＤＲ領域における１、２、３、４、５又は６個のアミノ酸の置換を含む前記抗体のバリアントを含む。非限定的な一実施形態において、本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、配列番号６９に記載のアミノ酸配列を有するＨＣポリペプチド及び配列番号７１に記載のアミノ酸配列を有するＬＣポリペプチドを含む、本開示においてＭＷＴｘ－００３として同定される抗体である。

【0018】

一実施形態において、本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、配列番号３１に記載のアミノ酸配列、又は配列番号３１と実質的に同一の配列の重鎖（ＨＣ）可変領域ポリペプチド、及び配列番号３６に記載のアミノ酸配列、又は配列番号３６と実質的に同一の配列の軽鎖（ＬＣ）可変領域ポリペプチドを含む。一実施形態において、本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、配列番号３２に記載のアミノ酸配列のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号３３に記載のアミノ酸配列のＨＣ ＣＤＲ２、配列番号３４に記載のアミノ酸配列のＨＣ ＣＤＲ３、配列番号３７に記載のアミノ酸配列のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号３８に記載のアミノ酸配列のＬＣ ＣＤＲ２、および配列番号３９に記載のアミノ酸配列のＬＣ ＣＤＲ３、又はＣＤＲ領域における１、２、３、４、５又は６個のアミノ酸の置換を含む前記抗体のバリアントを含む。非限定的な一実施形態において、本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、配列番号７３に記載のアミノ酸配列を有するＨＣポリペプチド及び配列番号７５に記載のアミノ酸配列を有するＬＣポリペプチドを含むヒト化抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体バリアントｈｚＭＷＴｘ－００１Ｖａｒとして、本開示にて同定される抗体である。

【0019】

一実施形態において、本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、配列番号４１に記載のアミノ酸配列、又は配列番号４１と実質的に同一の配列の重鎖（ＨＣ）可変領域ポリペプチド、及び配列番号４６に記載のアミノ酸配列、又は配列番号４６と実質的に同一の配列の軽鎖（ＬＣ）可変領域ポリペプチドを含む。一実施形態において、本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、配列番号４２に記載のアミノ酸配列のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号４３に記載のアミノ酸配列のＨＣ ＣＤＲ２、配列番号４４に記載のアミノ酸配列のＨＣ ＣＤＲ３、配列番号４７に記載のアミノ酸配列のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号４８に記載のアミノ酸配列のＬＣ ＣＤＲ２、及び配列番号４９に記載のアミノ酸配列のＬＣ ＣＤＲ３、又はＣＤＲ領域における１、２、３、４、５又は６個のアミノ酸の置換を含む上記抗体のバリアントを含む。非限定的な一実施形態では、本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、配列番号７７に記載のアミノ酸配列を有するＨＣポリペプチド及び配列番号７９に記載のアミノ酸配列を有するＬＣポリペプチドを含むヒト化抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体バリアントｈｚＭＷＴｘ－００２Ｖａｒとして、本開示にて同定される抗体である。

【0020】

一実施形態において、本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、配列番号５１に記載のアミノ酸配列、又は配列番号５１と実質的に同一の配列の重鎖（ＨＣ）可変領域ポリペプチド、及び配列番号５６に記載のアミノ酸配列、又は配列番号５６と実質的に同一の配列の軽鎖（ＬＣ）可変領域ポリペプチドを含む。一実施形態において、本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、配列番号５２に記載のアミノ酸配列のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号５３に記載のアミノ酸配列のＨＣ ＣＤＲ２、配列番号５４に記載のアミノ酸配列のＨＣ ＣＤＲ３、配列番号５７に記載のアミノ酸配列のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号５８に記載のアミノ酸配列のＬＣ ＣＤＲ２、及び配列番号５９に記載のアミノ酸配列のＬＣ ＣＤＲ３、又はＣＤＲ領域における１、２、３、４、５又は６個のアミノ酸の置換を含む上記抗体のバリアントを含む。非限定的な一実施形態では、本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、配列番号８１に記載のアミノ酸配列を有するＨＣポリペプチド及び配列番号８３に記載のアミノ酸配列を有するＬＣポリペプチドを含むヒト化抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体バリアントｈｚＭＷＴｘ－００３Ｖａｒとして、本開示にて同定される抗体である。

【0021】

別の態様において、鉄過剰症、特にβサラセミア及び無効造血の他の障害などの鉄代謝の障害を治療するために使用することができる抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体（本開示にて開示するようなバリアント及びフラグメントを含む）が提供される。限定されないが、鉄過剰症、特にβサラセミア及び無効造血の他の障害などの鉄代謝の障害を治療することを含む治療用途のために、本開示にて開示する抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体を用いるための方法及び組成物が提供される。特定の実施形態においては、本開示に開示する抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体と、好適な担体及び／又は賦形剤とを含む医薬組成物が提供される。

【0022】

別の実施形態においては、鉄代謝障害の治療方法であって、かかる方法は有効量の本開示に開示する抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体を、それを必要とする対象に投与することを含み、抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の有効量の投与により、鉄代謝に関与する成分の活性を調節する方法が提供される。特定の実施形態において、鉄過剰症の治療方法は、有効量の本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体を投与することを含み、抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の有効量の投与により、鉄代謝に関与する成分の活性を調節する。特定の実施形態において、鉄過剰症の治療方法は、本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の有効量を投与することを含み、抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の有効量の投与は、ヘプシジン発現の調節に関与する少なくとも１つの成分の活性を調節する。特定の実施形態において、方法は、有効量の抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の投与により、ＴＭＰＲＳＳ６によるヘプシジン発現の抑制を阻害することを含む。特定の実施形態において、有効量の抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の投与により、ヘプシジンの発現が増加する。特定の実施形態において、方法は、有効量の抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の投与により、ヘプシジンプロモーターの活性を上昇させる。特定の実施形態において、方法は、有効量の抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の投与により、ＴＭＰＲＳＳ６によるＢＭＰ／ＳＭＡＤ経路誘導型のヘプシジン発現の抑制を阻害することを含む。特定の実施形態において、方法は、限定されないが、血清鉄の減少、肝臓非ヘム鉄の減少、血清ヘプシジンの増加、肝臓ヘプシジンＲＮＡの増加、脾腫の減少、赤血球数（ＲＢＣ）の増加、ヘマトクリット（ＨＣＴ）の増加、赤血球分布幅（ＲＤＷ）の減少、及び／又は成熟赤血球の産生の増加（赤血球造血の増加）などを含む、鉄過剰症に関連する１つ以上の生物学的効果をもたらす有効量の抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体を対象に投与することを含む。

【0023】

別の態様においては、ヘプシジン発現の異常抑制が関与する疾患又は疾患状態を治療する方法が提供され、かかる方法は、本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の有効量をそれを必要とする対象に投与することを含み、抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の有効量の投与により、ヘプシジン発現の異常抑制に関わる少なくとも一つの成分の活性を調節し、ヘプシジン発現の異常抑制を軽減することを含む。特定の実施形態において、上記方法は、ヘプシジンの発現の増加をもたらす。

【0024】

別の実施形態においては、抑制されたヘプシジン濃度に関わる鉄代謝障害の治療方法であって、かかる方法は有効量の本開示に開示する抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体を、それを必要とする対象に投与することを含み、抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の有効量の投与により、ヘプシジン濃度の抑制に関与する成分の活性を調節する方法が提供される。特定の実施形態において、方法は、血清ヘプシジン濃度を増加させ、肝臓ヘプシジンＲＮＡを増加させ、血清鉄濃度を低下させる有効量の抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体を投与することを含む。

【0025】

別の態様においては、限定されないがβサラセミアを含み得る、無効造血に関連する及び／又は無効造血によって特徴付けられる障害を含む、鉄代謝の障害を治療するための方法が提供される。この態様によれば、上記方法は、本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の有効量を、無効造血に関連する及び／又は無効造血によって特徴付けられる鉄代謝の障害を有することが知られているか又は疑われている対象に投与することを含み、投与により、対象における鉄代謝及び／又は赤血球生成に関連する１以上の変更がもたらされる。特定の実施形態においては、有効量の抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の投与が、障害に関わる少なくとも１つの生物学的効果又は症状を治療又は改善する、方法が提供される。特定の実施形態において、上記方法を実践することにより、限定されないが、肝臓非ヘム鉄の減少、血清ヘプシジンの増加、肝臓ヘプシジンＲＮＡの増加、脾腫の減少、赤血球数（ＲＢＣ）の増加、ヘマトクリット（ＨＣＴ）の増加、赤血球分布幅（ＲＤＷ）の減少、成熟赤血球の生成の増加（赤血球造血の増加）などの１以上の変化をもたらす。

【0026】

別の態様では、対象における鉄過剰症の診断又はスクリーニングのための方法が提供される。特定の実施形態において、方法は、鉄過剰症であることが知られている又は疑われている対象に抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体を投与すること、及び鉄過剰症に関連する１つ以上の生物学的効果又は症状を測定することを含む。

【0027】

別の態様では、本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の少なくとも１つの少なくとも一部をコードする、１つ以上の単離核酸分子が提供される。特定の実施形態において、本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の少なくとも１つの少なくとも一部をコードする単離された核酸分子は、表１、表２、又は表３に記載のヌクレオチド配列、又は表１、表２、又は表３に記載のヌクレオチド配列と実質的に同一（例えば、少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％又は９８％、９９％同一）の配列を含む。特定の実施形態においては、本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の重鎖（ＨＣ）配列の少なくとも１つをコードする単離された核酸分子は、配列番号５若しくは配列番号５と実質的に同一の配列、配列番号１５若しくは配列番号１５と実質的に同一の配列、配列番号２５若しくは配列番号２５と実質的に同一の配列、配列番号３５若しくは配列番号３５と実質的に同一の配列、配列番号４５若しくは配列番号４５と実質的に同一の配列、配列番号５５若しくは配列番号５５と実質的に同一の配列、配列番号６２若しくは配列番号６２と実質的に同一の配列、配列番号６６若しくは配列番号６６と実質的に同一の配列、配列番号７０若しくは配列番号７０と実質的に同一の配列、配列番号７４若しくは配列番号７４と実質的に同一の配列、配列番号７８若しくは配列番号７８と実質的に同一の配列、又は配列番号８２若しくは配列番号８２と実質的に同一の配列のうち少なくとも１つから選択されるヌクレオチド配列を含んでいてよい。特定の実施形態において、本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖（ＬＣ）配列の少なくとも１つをコードする単離された核酸分子は、配列番号１０若しくは配列番号１０と実質的に同一の配列、配列番号２０若しくは配列番号２０と実質的に同一の配列、又は配列番号３０若しくは配列番号３０と実質的に同一の配列、配列番号４０若しくは配列番号４０と実質的に同一の配列、配列番号５０若しくは配列番号５０と実質的に同一の配列、配列番号６０若しくは配列番号６０と実質的に同一の配列、配列番号６４若しくは配列番号６４と実質的に同一の配列、配列番号６８若しくは配列番号６８と実質的に同一の配列；配列番号７２若しくは配列番号７２と実質的に同一の配列；配列番号７６若しくは配列番号７６と実質的に同一の配列；配列番号８０若しくは配列番号８０と実質的に同一の配列又は配列番号８４若しくは配列番号８４と実質的に同一の配列のうち少なくとも１つから選択されるヌクレオチド配列を含んでもよい。

【0028】

別の態様においては、本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の少なくとも１つのアミノ酸配列をコードする１つ以上の核酸分子を含むベクターが提供される。特定の実施形態においては、本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の重鎖（ＨＣ）又は軽鎖（ＬＣ）配列の少なくとも１つをコードする１つ以上の核酸分子を含むベクターが提供される。特定の実施形態においては、表１、表２、又は表３に記載のアミノ酸配列の少なくとも１つの少なくとも一部、又は表１、表２、又は表３に記載のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列の少なくとも一部をコードする核酸分子を含むベクターが提供される。特定の実施形態においては、表１、表２、又は表３に記載のＨＣ又はＬＣ配列の少なくとも１つの少なくとも一部、又は表１、表２、又は表３に記載のＨＣ又はＬＣ配列の少なくとも１つと実質的に同一のアミノ酸配列の少なくとも一部をコードする核酸分子を含むベクターが提供される。

【0029】

別の態様では、本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体のアミノ酸配列をコードする１つ又は複数の核酸分子を含むベクターを含む少なくとも１つの宿主細胞が提供される。特定の実施形態においては、表１、表２、又は表３に記載のＨＣ又はＬＣ配列の少なくとも１つの少なくとも一部、又は表１、表２、又は表３に記載のＨＣ又はＬＣ配列の少なくとも１つと実質的に同一のアミノ酸配列の少なくとも一部をコードする核酸分子を含むベクターを含有する宿主細胞が提供される。特定の実施形態においては、少なくとも１つの宿主細胞は、ベクターの発現及びベクターによってコードされる抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体又はその抗原結合フラグメントの組換え産生をサポートすることが可能である。特定の実施形態においては、少なくとも１つの宿主細胞は、表１、表２、又は表３に記載のＨＣ又はＬＣ配列の少なくとも１つの少なくとも一部、又は表１、表２、又は表３に記載のＨＣ又はＬＣ配列の少なくとも１つと実質的に同一のアミノ酸配列の少なくとも一部をコードする核酸分子を含むベクターによってコードされた抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体又はその抗原結合フラグメントのベクター発現及び組み換え産出をサポートすることが可能である。特定の実施形態においては、宿主細胞は、本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体又はその抗原結合フラグメントのアミノ酸配列をコードする１つ以上の核酸分子を含むベクターで一過性にトランスフェクトされ、宿主細胞は、ベクターの発現及びベクターによってコードされる抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体又はその抗原結合フラグメントの組換え産生をサポートすることが可能である。

【図面の簡単な説明】

【0030】

【図1】抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体のカスケードスクリーニングの結果であり、ヒトＴＭＰＲＳＳ６に結合する抗体をＨＡＭＰプロモーター活性のｉｎ ｖｉｔｒｏ機能アッセイを用いて評価し、ＨＡＭＰプロモーター活性に効果を示した抗体について、非ヒトＴＭＰＲＳＳ６との交差反応性を評価したものである。

【図2A-2F】図２Ａ～２Ｆは、ＨｅｐＧ２細胞で実施したデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイによって測定したＨＡＭＰプロモーター活性に対する抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の効果を、抗体濃度の範囲について示す図である。各プロットにおいて、白丸は抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体を用いた結果を、白四角は陰性（非特異的結合）対照として同じ濃度のマウスＩｇＧ又はヒトＩｇＧ１を用いた結果を示す。図２Ａは、ＭＷＴｘ－００１抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体のＨＡＭＰプロモーター活性に対する効果を、抗体濃度の範囲にわたって示した図である。図２Ｂは、ＭＷＴｘ－００２抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体のＨＡＭＰプロモーター活性に対する効果を、抗体濃度の範囲にわたって示した図である。図２Ｃは、ＭＷＴｘ－００３抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体のＨＡＭＰプロモーター活性に対する効果を、抗体濃度の範囲にわたって示した図である。図２Ｄは、ｈｚＭＷＴｘ－００１Ｖａｒ抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体のＨＡＭＰプロモーター活性に対する効果を、抗体濃度の範囲にわたって示した図である。図２Ｅは、ｈｚＭＷＴｘ－００２Ｖａｒ抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体のＨＡＭＰプロモーター活性に対する効果を、抗体濃度の範囲にわたって示した図である。図２Ｆは、ｈｚＭＷＴｘ－００３Ｖａｒ抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体のＨＡＭＰプロモーター活性に対する効果を、抗体濃度の範囲にわたって示した図である。

【図3A-3M】図３Ａ～３Ｍは抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の結合親和性の測定結果を示す図である。図３Ａ～３Ｆは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞上に発現したヒトＴＭＰＲＳＳ６に対する抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の結合親和性を、２種類の方法で測定した結果を示す図である。各プロットにおいて、白丸は抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の濃度範囲での使用結果を、白四角は同濃度のマウスＩｇＧを陰性対照として使用した結果を表している。図３Ａ～３Ｃは、細胞表面ＥＬＩＳＡ（ＨＲＰ標識二次抗体の測定）を用いてＭＷＴｘ－００１（図３Ａ）、ＭＷＴｘ－００２（図３Ｂ）、及びＭＷＴｘ－００３（図３Ｃ）のヒトＴＭＰＲＳＳ６への結合を測定した結果を示す図であり、各抗体の計算ＥＣ_５０値が結合親和性の推定値として使用している。図３Ｄ～３Ｆは、ＦＡＣＳ（ＡＰＣ結合二次抗体を測定）を用いてＭＷＴｘ－００１（図３Ｄ）、ＭＷＴｘ－００２（図３Ｅ）、及びＭＷＴｘ－００３（図３Ｆ）のヒトＴＭＰＲＳＳ６への結合を測定した結果を示す図であり、各抗体の計算ＥＣ_５０値を結合親和性の推定値として使用している。図３Ｇ－３Ｍは、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）ＲＥＤ９６ｅを用いて、ヒトｅｃｔｏ－ＴＭＰＲＳＳ６－ＦＬＡＧに対する抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の親和性と結合動態を、分析物濃度５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭ、３．１３ｎＭ、１．５６ｎＭ及び０．７８ｎＭの条件で測定した結果を示す図である。図３Ｇは、ＭＷＴｘ－００１抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体のｅｃｔｏ－ＴＭＰＲＳＳ６－ＦＬＡＧに対する結合動態を示す図である。図３Ｈは、ＭＷＴｘ－００２抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体のｅｃｔｏ－ＴＭＰＲＳＳ６－ＦＬＡＧに対する結合動態を示す。図３Ｉは、ＭＷＴｘ－００３抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体のｅｃｔｏ－ＴＭＰＲＳＳ６－ＦＬＡＧに対する結合動態を示す図である。図３Ｊは、ｈｚＭＷＴｘ－００１Ｖａｒ抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体のｅｃｔｏ－ＴＭＰＲＳＳ６－ＦＬＡＧに対する結合動態を示す図である。図３Ｋは、ｈｚＭＷＴｘ－００２Ｖａｒ抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体のｅｃｔｏ－ＴＭＰＲＳＳ６－ＦＬＡＧに対する結合動態を示す図である。図３Ｌは、ｈｚＭＷＴｘ－００３Ｖａｒ抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体のｅｃｔｏ－ＴＭＰＲＳＳ６－ＦＬＡＧに対する結合動態を示す図である。図３Ｍは、すべての抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の親和性測定をまとめたものである。

【図4A-4U】図４Ａ～４Ｕは、抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の交差反応性を測定した結果を示す図である。図４Ａ～４Ｉは、抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体ＭＷＴｘ－００１、ＭＷＴｘ－００２、及びＭＷＴｘ－００３の、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞上に発現したヒトＴＭＰＲＳＳ６及び非ヒトＴＭＰＲＳＳ６に対する交差反応性を測定した結果を示す図である。各ヒストグラムプロットは、ＴＭＰＲＳＳ６標的を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞（細い線、淡い塗りつぶし；抗体名と共に示す）を単一の抗体と共にインキュベートしたＦＡＣＳの結果と、ＴＭＰＲＳＳ６タンパク質を発現しない対照ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（太い線、濃い塗りつぶし；Ｃｔｒｌと共に示す）を同じ抗体と共にインキュベートしたＦＡＣＳの結果である。図４Ａ～４Ｃは、ヒトＴＭＰＲＳＳ６（ＨｕＴＭＰＲＳＳ６－（Ｈｉｓ_）６）を安定的に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＭＷＴｘ－００１（図４Ａ）、ＭＷＴｘ－００２（図４Ｂ）、及びＭＷＴｘ－００３（図４Ｃ）と共に用いた結果を示す図である。図４Ｄ～４Ｆは、マウスＴＭＰＲＳＳ６（ＭｏＴＭＰＲＳＳ６－（Ｈｉｓ_）６）を安定的に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＭＷＴｘ－００１（図４Ｄ）、ＭＷＴｘ－００２（図４Ｅ）、及びＭＷＴｘ－００３（図４Ｆ）と共に用いた結果を示す図である。図４Ｇ～４Ｉは、カニクイザルＴＭＰＲＳＳ６（ＣｙｎｏＴＭＰＲＳＳ６－（Ｈｉｓ_）６）を一過性に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＭＷＴｘ－００１（図４Ｇ）、ＭＷＴｘ－００２（図４Ｈ）、及びＭＷＴｘ－００３（図４Ｉ）と共に用いた結果を示す図である。図４Ｊ～４Ｕは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞上に発現した非ヒト（マウス（図４Ｊ、４Ｌ、４Ｎ、４Ｐ、４Ｒ、４Ｔ）又はカニクイザル（図４Ｋ、４Ｍ、４Ｏ、４Ｑ、４Ｓ、４Ｕ））ＴＭＰＲＳＳ６に対する抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の交差反応性について、細胞表面ＥＬＩＳＡ（ＨＲＰ標識二次抗体を測定）を用いて、ＭＷＴｘ－００１抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体（図４Ｊ～４Ｋ）、ＭＷＴｘ－００２抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体（図４Ｌ～４Ｍ）、ＭＷＴｘ－００３抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体（図４Ｎ～４Ｏ）、ｈｚＭＷＴｘ－００１Ｖａｒ抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体（図４Ｐ～４Ｑ）、ｈｚＭＷＴｘ－００２Ｖａｒ抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体（図４Ｒ～４Ｓ）及びｈｚＭＷＴｘ－００３Ｖａｒ抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体（図４Ｔ～４Ｕ）と非ヒトＴＭＰＲＳＳ６との結合を測定した結果を示す図である。各プロットにおいて、白丸は抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体を用いた結果を、白四角は陰性（非特異的結合）対照としてマウスＩｇＧ又はヒトＩｇＧ１を用いた結果を示し、各抗体のＥＣ_５０値を結合親和性の推定値として使用している。

【図5A-5R】図５Ａ～５Ｒは、抗ＴＭＰＲＳＳ６モノクローナル抗体ＭＷＴｘ－００１（図５Ａ～５Ｃ）、ＭＷＴｘ－００２（図５Ｄ～５Ｆ）、ＭＷＴｘ－００３（図５Ｇ～５Ｉ）抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体、及びそのヒト化バリアントｈｚＭＷＴｘ－００１Ｖａｒ（図５Ｊ～５Ｌ）、ｈｚＭＷＴｘ－００２Ｖａｒ（図５Ｍ～５Ｏ）、ｈｚＭＷＴｘ－００３Ｖａｒ（図５Ｐ～５Ｒ）抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の、相同マトリプターゼを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞への結合のＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。ヒトＴＭＰＲＳＳ６（マトリプターゼ－２）を安定的に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞（図５Ａ、５Ｄ、５Ｇ、５Ｊ、５Ｍ、５Ｐ）を陽性対照として使用し、マトリプターゼ（ＳＴ１４）を過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞（図５Ｂ、５Ｅ、５Ｈ、５Ｋ、５Ｎ、５Ｑ）及び／又はマトリプターゼ－３（ＴＭＰＲＳＳ７）（図５Ｃ、５Ｆ、５Ｉ、５Ｌ、５Ｏ、５Ｒ）タンパク質を、相同マトリプターゼへの結合を試験するために使用した。各パネル（図５Ａ～５Ｒ）において、マトリプターゼ（ＨＥＫ２９３Ｔ）を発現していないＨＥＫ２９３Ｔ細胞を陰性対照として使用し、対照（Ｃｔｒｌ）の結果を明確に示した。

【図6A-6L】図６Ａ～６Ｌは、抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体処理により、マウスにおけるヘプシジンの発現が用量依存的に増加することを示す図である。図６Ａ～６Ｃは、ＭＷＴｘ－００３抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体（図６Ａ～６Ｂ）又はそのヒト化バリアントｈｚＭＷＴｘ－００３Ｖａｒ抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体（図６Ｃ）の血清鉄への影響を示す図である。図６Ｄは、ＧＦＰ－ＴＭＰＲＳＳ６が血清ヘプシジンに及ぼす影響を示す図である。図６Ｄ～６Ｆは、ＭＷＴｘ－００３抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体（図６Ｄ～６Ｅ）又はそのヒト化バリアントｈｚＭＷＴｘ－００３Ｖａｒ抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体（図６Ｆ）の血清ヘプシジンへの影響を示す図である。図６Ｇは、ＧＦＰ－ＴＭＰＲＳＳ６が肝臓ヘプシジンＲＮＡに及ぼす影響を示す図である。図６Ｇ～６Ｉは、ＭＷＴｘ－００３抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体（図６Ｇ～６Ｈ）又はそのヒト化バリアントｈｚＭＷＴｘ－００３Ｖａｒ抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体（図６Ｉ）の肝臓ヘプシジンＲＮＡへの影響を示す図である。図６Ｊ～６Ｌは、ＭＷＴｘ－００３抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体（図６Ｊ～６Ｋ）又はそのヒト化バリアントｈｚＭＷＴｘ－００３Ｖａｒ抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体（図６Ｌ）の血清中濃度を示す図である。マウスＩｇＧ２ｂ（ＭｏＩＧ２ｂ）（図６Ａ～６Ｂ、６Ｄ～６Ｅ、６Ｇ～６Ｈ、６Ｊ～６Ｋ）又はヒトＩｇＧ１（ＨｕＩＧｇ１）（図６Ｃ、６Ｆ、６Ｉ、６Ｌ）はアイソタイプコントロールとして使用し、ＰＢＳはビークルコントロールとして使用し、ＧＦＰベクトルはベクターコントロール（図６Ａ、６Ｄ、６Ｇ、６Ｊ）として使用した。

【図7A-7R】図７Ａ～７Ｒは、βサラセミアマウスモデルを用いた抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体のｉｎ ｖｉｖｏでの有効性を示す図である。図７Ａ～７Ｄは、Ｔｈ３／＋マウスを用いた、ＲＢＣ（図７Ａ）、ＨＧＢ（図７Ｂ）、ＨＣＴ（図７Ｃ）及びＲＤＷ（図７Ｄ）に対するＭＷＴｘ－００３抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の影響を示す図である。図７Ｅは、Ｔｈ３／＋マウスを用いたＭＷＴｘ－００３抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の脾臓重量への影響を示す図である。図７Ｆは、Ｔｈ３／＋マウスを用いたＭＷＴｘ－００３抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の血清鉄への影響を示す図である。図７Ｇは、Ｔｈ３／＋マウスを用いたＭＷＴｘ－００３抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の肝臓非ヘム鉄への影響を示す図である。図７Ｈは、Ｔｈ３／＋マウスを用いたＭＷＴｘ－００３抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の血清ヘプシジンへの影響を示す図である。図７Ｉは、Ｔｈ３／＋マウスを用いたＭＷＴｘ－００３抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の肝臓ヘプシジンＲＮＡへの影響を示す図である。図７Ｊは、Ｔｈ３／＋マウスを用いたＭＷＴｘ－００３抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の血清濃度を示す図である。図７Ｌ～７Ｍは、Ｔｈ３／＋マウスの骨髄を用いたＭＷＴｘ－００３抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の赤血球生成への影響を示す図である。図７Ｏ～７Ｐは、Ｔｈ３／＋マウスの脾臓細胞を用いた赤血球生成に対するＭＷＴｘ－００３抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の影響を示す図である。図７Ｋ～７Ｐの代表的なプロットは、４つの異なる細胞クラスター（Ｉ：好塩基性赤芽球、ＩＩ：多色性赤芽球、ＩＩＩ：正色性赤芽球及び無核網状赤血球、ＩＶ：成熟赤血球）と、細胞数のそれらの対応割合を強調表示している。野生型マウスを陽性対照として使用し（図７Ａ～７Ｊ、７Ｋ、７Ｎ）、マウスＩｇＧ２ｂ（ＭｏＩｇＧ２ｂ）を処理におけるアイソタイプコントロールとして使用した（図７Ａ～７Ｊ、７Ｌ、７Ｏ）。図７Ｑ～７Ｒの棒グラフは、４週間後の各治療計画（ＷＴ、Ｔｈ３／＋ｗ／ＭｏＩｇＧ２ｂ、Ｔｈ３／＋ｗ／ＭＷＴｘ－００３）の骨髄（図７Ｑ）と脾臓（図７Ｒ）における細胞クラスターＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶに体する平均結果を示す図であり、比較により各集団のシフト、特にＭＷＴｘ－００３処置後の成熟赤血球へのシフトを識別することが可能である。

【図8A-8D】図８Ａ～８Ｄは、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）ＲＥＤ９６ｅを用いた、ヒトｅｃｔｏ－ＴＭＰＲＳＳ６－ＦＬＡＧに対するＭＷＴｘ－００１、ＭＷＴｘ－００２及びＭＷＴｘ－００３抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体のエピトープビニングの結果を示す図である。図８Ａは、ＭＷＴｘ－００１抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体のｅｃｔｏ－ＴＭＰＲＳＳ６－ＦＬＡＧに対するエピトープビニングを示す。図８Ｂは、ＭＷＴｘ－００２抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体のｅｃｔｏ－ＴＭＰＲＳＳ６－ＦＬＡＧに対するエピトープビニングを示す。図８Ｃは、ＭＷＴｘ－００３抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体のｅｃｔｏ－ＴＭＰＲＳＳ６－ＦＬＡＧに対するエピトープビニングを示す。図８Ｄは、ＭＷＴｘ－００１、ＭＷＴｘ－００２、及びＭＷＴｘ－００３抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体のアソシエーションシグナルをまとめたものである。

【発明を実施するための形態】

【0031】

本発明は、ＴＭＰＲＳＳ６と結合する新規な抗体及びその抗原結合フラグメント、並びにＴＭＰＲＳＳ６と結合する抗体の作製方法及び使用方法に関する。
用語／定義

【0032】

本発明に関連して使用される科学技術用語は、特に定義されない限り、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。単数形の用語（「ａ」又は「ａｎ」又は「ｔｈｅ」又はその他の単数形の用語の使用）の使用は、文脈上明らかに異なることが指示されない限り、複数の参照を含み、複数の用語は単数形を含むものとする。したがって、例えば、「抗体」への言及は、「１つ又は複数の」抗体又はそのような抗体の「複数」を含む。本開示に記載されたすべての出版物は、その全体が参照により本明細書に援用される。

【0033】

一般に、本開示にて開示される抗体、抗原結合フラグメント、組成物、及び方法には、当業者が利用可能な分子生物学、微生物学、細胞及び組織培養、タンパク質及びヌクレオチド化学、ならびに組み換えＤＮＡ技術の命名法及び技術を採用することができる。本開示に記載の技術及び手順は、一般に、当該技術分野で周知の従来の方法に従い、様々な一般的且つより具体的な参考文献、特に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ（第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）及びＡｕｓｕｂｅｌら（１９９４） ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＩＩ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．）に記述されているように実施される。酵素反応及び精製技術は、本開示に特に明記しない限り、製造業者の仕様書若しくは当該技術分野で一般的に達成される方法、又は本開示に記載の方法に従って実施される。医薬品の調製及び製剤、ならびに対象の治療に関する技術及び方法は、従来の命名法を用いて本開示に記載される。

【0034】

「抗体」とは、広義には、１つ以上の免疫グロブリン可変領域を通じて抗原を認識し結合するポリペプチド又はポリペプチドの組み合わせを指す。ここで免疫グロブリン可変領域は、天然に存在するか、あるいは例えば、工学、キメラ化、ヒト化、最適化、ＣＤＲ－グラフト化、又はアフィニティ成熟の結果として非天然に存在するかは問わない。

【0035】

本開示にて開示される「抗体」は、全体（無傷、全長）抗体、単鎖抗体、又は１本もしくは２本の鎖を有する抗原結合フラグメントであり、天然由来のものであっても非天然由来のものであってもよい。抗体は、フレームワーク領域（ＦＲ）が点在する少なくとも十分な相補性決定領域（ＣＤＲ）とを有し、抗原を認識し結合することができる。本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、アプタマー、単一ドメイン抗体（ＶＨＨ又はナノ体）、組み換え抗体、抗体にペプチド／他の部位が付加した改変抗体、及び／又はＮ末端又はＣ末端にアミノ酸を追加した改変抗体、又はその他のＴＭＰＲＳＳ６結合フラグメント又はバリアントのうち少なくとも１つであってよいが、これらに限定されない。全抗体、全長抗体、無傷抗体、天然由来の抗体、又は同等の用語は、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２本の重鎖（ＨＣ）と２本の軽鎖（ＬＣ）を含むポリペプチド、特に糖タンパク質を指すものと理解されている。各ＨＣは重鎖可変領域（ＶＨ）とＨＣ定常領域（ＣＨ）とからなり、各軽鎖は軽鎖可変領域（ＶＬ）とＬＣ定常領域（ＣＬ）とからなる。ＨＣとＬＣの可変領域であるＶＨとＶＬには、抗原と相互作用する結合ドメインが含まれている。ＶＨ及びＶＬ領域はさらに、超可変性を特徴とするＣＤＲ領域と、一般的に保存度の高いＦＲ領域とに分けることができる。各ＶＨ及びＶＬは、通常、アミノ末端からカルボキシ末端まで、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で配置された３つのＣＤＲと４つのＦＲから構成されている。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞や古典的補体系を含む宿主組織や因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。典型的には、抗体は少なくとも重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３及び軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３配列を含み、これらの配列のいずれか１つは天然又は非天然に存在し得るものである。抗体は、抗原を認識し結合することができれば、ＣＤＲ配列の数は少なくてもよい。

【0036】

本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、少なくとも１つの変化したＣＤＲ又はフレームワーク配列を含むバリアントであってもよく、ＣＤＲ及び／又はフレームワーク配列は、かかるフレームワーク配列をコードする核酸分子を変異させることによって最適化されてもよい。また、ＨＣ部分とＬＣ部分がそれぞれ独立に異なるソースに由来するバリアントを構築することも可能である。バリアントを作成する技術には、保存的アミノ酸置換、コンピュータモデリング、候補ポリペプチドの単独又は組み合わせによるスクリーニング、及びコドン最適化が含まれるがこれらに限定されず、当業者は必要に応じて抗体バリアントを作成することができることが理解されよう。本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、フラグメントであってもよい。抗体の抗原結合機能は、Ｆａｂフラグメント、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる１価のフラグメント、Ｆ（ａｂ_）２フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド結合した２つのＦａｂフラグメントを含む２価のフラグメント、ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント、抗体の片腕のＶＬドメイン及びＶＨドメインからなる一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ＶＨドメインからなる単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）フラグメント、単離したＣＤＲ（ＶＨＨ、ナノボディ）、又はアプタマーなどのセグメントによって果たすことができる。抗原結合部分は、単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、ナノボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ－ＮＡＲ及びｂｉｓ－ｓｃＦｖに組み込むことができる（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ，２００５，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２３，９，１１２６－１１３６を参照）。抗体の抗原結合部分をポリペプチドに基づく足場にグラフト化し、モノボディを形成することができる（例えば、フィブロネクチンポリペプチドモノボディを記載した米国特許第６，７０３，１９９号を参照のこと）。

【0037】

抗体という用語は、生化学的に区別できる様々な広範なクラスのポリペプチドを包含する。抗体の「クラス」とは、その重鎖が持つ定常ドメインや定常領域の種類を指す。当業者であれば、抗体には５つの主要なクラス、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらのいくつかはさらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２に分けられ、それぞれが十分に特徴づけられ、機能的特殊性を付与することが知られていると理解する。これらのクラス及びアイソタイプのそれぞれの改変バージョンは容易に識別可能であり、本開示の範囲内である。すべての免疫グロブリンクラスが本開示の範囲内にあるが、本開示は、免疫グロブリン分子のＩｇＧクラスに対して主に向けられるであろう。

【0038】

キメラ抗体とは、免疫反応部位の形成に関与する重鎖（ＨＣ）及び／又は軽鎖（ＬＣ）の一部が特定の供給源又は種に由来し、一方ＨＣ及び／又はＬＣの残りが異なる供給源又は種に由来する抗体のことを指す。特定の実施形態においては、標的結合領域又は部位は非ヒト由来（例えば、マウス又は非ヒト霊長類）であり、定常領域はヒトである。

【0039】

本明細書で使用する場合、「ヒト化抗体」という語は、非ヒト抗体、典型的にはマウスモノクローナル抗体由来の抗体又は抗体バリアントを指し、親である非ヒト抗体由来のＣＤＲは、ヒト免疫グロブリンフレームワーク、特にアクセプターヒトフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク由来の可変領域を含むフレームワークにグラフト化（融合化）されている。ヒト化抗体の設計、作製、試験のための技術や原理が知られている（Ｊｏｎｅｓ ＰＴ，Ｄｅａｒ ＰＨ，Ｆｏｏｔｅ Ｊ，Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ＭＳ，Ｗｉｎｔｅｒ Ｇ． Ｒｅｐｌａｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｗｉｔｈ ｔｈｏｓｅ ｆｒｏｍ ａ ｍｏｕｓｅ． Ｎａｔｕｒｅ．１９８６ Ｍａｙ ２９－Ｊｕｎ ４；３２１（６０６９）：５２２－５；Ａｌｍａｇｒｏ ＪＣ，Ｆｒａｎｓｓｏｎ Ｊ．Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ． ２００８ Ｊａｎ １；１３：１６１９－３３）。標的に対する高い親和性、低いクリアランス、低毒性など、所望の用途に応じて改善された特徴を有するヒト化抗体を開発するために、複数の位置でアクセプターフレームワークに変更を加えることができることが理解される。本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、ヒト化バリアントであってもよい。

【0040】

「親和性」とは、分子（例えば、抗体）の１つの結合部位とその結合相手（例えば、抗原）の間の非共有結合相互作用の総和の強さを指す。特に断りのない限り、本開示で使用する結合親和性は、結合ペア（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する内在性結合親和性を指す。親和性は、本開示に記載されたものを含む、当該技術分野において既知の一般的な方法によって測定することができる。最大結合の約５０％が結合する計算濃度（計算上のＥＣ_５０）を親和性の推定値として使用することができる。分子ＸのパートナーＹに対する親和性は、一般に解離定数（Ｋｄ又はＫＤ、相互作用について測定されたｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎを表す）で表すことができる。

【0041】

「対象」は哺乳類であり、哺乳類には、霊長類（例えば、ヒト及びサルなどの非ヒト霊長類）、家畜（例えば、牛、羊、猫、犬、豚、ラマ、馬）、ウサギ、齧歯類（例えば、マウス及びラット）が含まれるが、これらに限定されるものではない。特定の実施形態においては、対象はヒトである。「それを必要とする対象に」又は「それを必要とする患者に」又は「治療を必要とする患者に」又は「治療を必要とする対象に」という句は、鉄過剰症の治療のために、本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の投与から利益を得るであろう対象者を含むことができる。抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の投与が「それを必要とする対象」への投与を包含することは、症状、家族歴、遺伝子型などの指標に基づいて、鉄過剰症、特にβサラセミアを有することが知られている、又は疑われている対象を指すと解釈できることが理解される。さらに、抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、鉄代謝の障害を有することが知られていない又は疑われていない対象に、予防又は予防目的、スクリーニング目的、診断目的、研究目的、又は障害の治療とは異なる結果を得るために投与することができるが、目的はこれらに限定されない。

【0042】

抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の「有効量」とは、例えば、医薬製剤において、所望の治療又は予防効果を得るために必要な投与量及び期間で有効な量を意味する。「有効量」とは、測定対象である細胞、組織、システム、非ヒト動物対象、非ヒト哺乳類対象、又はヒト対象の生物学的反応、又は望ましい治療効果を引き出す、抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体又は抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体を含む医薬組成物の量を指すことが意図されていると理解される。「治療的有効量」、「薬理学的有効量」、及び「生理学的有効量」という用語は、血流中又は標的組織内での活性成分の閾値レベルを提供するために必要な抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の量を指すために互換的に使用される。正確な量は、多くの要因、例えば、特定の抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体（活性剤）、組成物の成分及び物理的特性、治療される対象／患者の意図された集団、対象の病状、年齢、性別及び体重などの考慮事項等に依存し、当業者は、本開示に提供される情報又は関連文献で入手可能な他の情報に基づき容易に決定することが可能であろう。この文脈において使用される「改善」、「増加」又は「減少」という用語は、本開示に記載の治療の開始前の同じ対象における測定値、又は本開示に記載の治療がない場合の対照個体（又は複数の対照個体）における測定値などの、基線測定値に対する値又はパラメータを示している。

【0043】

「医薬組成物」又は「医薬製剤」という用語は、そこに含まれる有効成分、特に抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の生物活性を有効にするような形態にある製剤を意味する。医薬組成物は、２つ以上の有効成分、例えば、２つ以上の抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体、又は別の標的に作用する別の活性成分と抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体との組み合わせを含んでもよいことが理解される。ここで、そのような組み合わせは、限定されないが、抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体と、造血過程、特に赤血球生成への所望の効果を有する別の有効成分との組み合わせ、抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体と、ＨＢＢ遺伝子を標的とした遺伝子治療を行う薬剤などの遺伝子治療剤との組み合わせ、又は抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体と、ＴＧＦスーパーファミリーリガンドを標的とし赤血球生成を促進するＦｃ融合タンパク質との組み合わせ、などであってもよい。「薬学的に許容される担体」とは、医薬製剤中の有効成分以外の成分で、対象に無毒なものを指す。薬学的に許容される担体は、限定されないが、緩衝剤、賦形剤、安定剤、アジュバント、又は防腐剤であり得ることが理解される。

【0044】

本明細書で使用される「治療（処置）」若しくは「治療（処置）する」、又はその類似の用語は、定義された一連の状況において特定の対象にとって有益であるとみなされる結果を指すことができる。鉄代謝の障害を治療することは、既存の症状、障害、状態、又は疾患の進行又は重症度を低減、改善、減速、中断、阻止、緩和、停止、又は逆転することのいずれかを非排他的に指し、さらに、鉄過剰症の１つ以上の症状の発症を予防又は遅延すること、及び／又は鉄過剰症の１つ以上の症状の重症度及び頻度を少なくすることも包含し得る。用語「治療する」又は「治療する方法」又は同等物は、治療的、予防的、予防的、診断的、画像化的、及びスクリーニング的な使用を含むがこれらに限定されず、本開示に開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の１以上の使用を包含し得る。

【0045】

本開示において使用される「ベクター」という語は、ベクター配列が連結された核酸を、ベクターが導入された宿主細胞内で増殖させることができる核酸分子をいう。本開示においては、それらが作動可能に連結されている核酸の発現を誘導することができるベクターを「発現ベクター」と呼ぶ。
抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体

【0046】

細胞表面のＴＭＰＲＳＳ６と結合し、鉄代謝に関与する少なくとも１つの成分、特にヘプシジンの発現異常抑制に伴う鉄過剰症に関与する少なくとも１つの成分の活性を調節することができる抗体及び抗原結合フラグメントが提供される。細胞表面のＴＭＰＲＳＳ６と結合し、ヘプシジン発現の制御に関与する少なくとも１つの成分の活性を調節することができる抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、ヘプシジン発現の異常抑制に伴う鉄過剰症の治療方法に用いることができる。細胞表面のＴＭＰＲＳＳ６と結合し、ＴＭＰＲＳＳ６によるヘプシジン発現の抑制を調節することができる抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、ヘプシジン発現の異常抑制に関連する鉄過剰症の治療方法において、ＴＭＰＲＳＳ６を治療的に標的とするために用いることが可能である。

【0047】

ＴＭＰＲＳＳ６、特に細胞表面に発現するヒトＴＭＰＲＳＳ６に特異的な抗体又はフラグメントが得られると、その鉄代謝に関与する少なくとも１つの成分の活性を調節するという所望の生物活性は、当業者に公知のいくつかの方法によって試験することが可能である。

【0048】

本開示において使用される「調節」若しくは「調節する」、又はその類似の用語は、本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体がその標的と結合するときに生じ得る１つ又は複数の効果を指し得ることが理解される。「調節する」及びその等価な表現は、考慮される成分によって異なる作用および効果を指す場合がある。すなわち、「調節」とは、鉄代謝に関与する特定の成分の活性を中和、逆転、阻害、遮断、低減、拮抗、又はその他の方法で妨害することを意味し、鉄代謝に関与する他の成分については、調節という語は、これらの成分に対して増加、増強、又はアゴニスト効果を有することを指し得る。

【0049】

なお、「成分」という用語は、標的分子ＴＭＰＲＳＳ６だけでなく、鉄代謝に関与する下流のプロセスや経路も指すことができることが理解される。したがって、プロセス又は経路の意味における成分は、限定されないが、ヘプシジン発現の調節、ヘプシジン発現のＴＭＰＲＳＳ６抑制、ヘプシジン発現のプロセス、ヘプシジン濃度の調節、ヘプシジン濃度の増加、ヘプシジンプロモーターの活性、又はＴＭＰＲＳＳ６によるＢＭＰ／ＳＭＡＤ経路誘導型のヘプシジン発現の抑制、肝臓非ヘム鉄濃度の調節、脾腫に関わる１つ以上のプロセス、又は赤血球数（ＲＢＣ）、ヘマトクリット（ＨＣＴ）、赤血球分布幅（ＲＤＷ）及び赤血球生成、特に成熟赤血球の形成の調節に関わる１つ以上の造血プロセスであり得る。

【0050】

本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、鉄代謝に関与する少なくとも１つの成分、特に鉄過剰症に関与する少なくとも１つの成分を治療的に標的とするために使用することができる。特定の実施形態において、本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、ヘプシジン発現の調節に関与する少なくとも１つの成分を治療的に標的とし、成分の活性を調節してヘプシジン発現の増加を達成するために使用することができる。特定の実施形態において、本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、ヘプシジンプロモーターの活性を調節してヘプシジン発現の増加を達成するために使用することができる。本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、ＴＭＰＲＳＳ６を治療的に標的とし、それによって、限定されないが、肝臓非ヘム鉄濃度の調節、脾臓肥大に関与する１つ以上のプロセス、又は赤血球数（ＲＢＣ）、ヘマトクリット（ＨＣＴ）、赤血球分布幅（ＲＤＷ）、及び赤血球生成、特に成熟赤血球の生成の調節に関与する１つ以上の造血プロセスなどの、ヘプシジン発現の他の構成要素の下流活性を調節するために使用できることが理解される。

【0051】

本開示にて開示された抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体を用いて、鉄代謝に関与する少なくとも１つの成分を治療的に標的とすることにより、標的成分の正確な調節が可能となる。本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体を使用して、ＴＭＰＲＳＳ６、及びヘプシジン発現の調節に関与する少なくとも１つの成分へのその下流効果を正確に標的とすることにより、現在使用中又は開発中の鉄過剰症の治療に対する他のアプローチ、例えば、鉄過剰症をさらに悪化させる可能性のある輸血、患者のコンプライアンスが低い鉄キレート、症状を管理するだけの押し付けがましい瀉血又は脾臓摘出、複数のシステムで永久的に多面的な影響を及ぼす可能性のあるＨＢＢ遺伝子を標的とする遺伝子療法、未知のオフターゲット効果を有する遺伝子療法及び遺伝子編集、鉄過剰症を管理するための鉄キレート療法の必要性を低減しない、ＳＭＡＤシグナルを阻害するためのＴＧＦスーパーファミリーリガンドを標的としたＦｃ融合タンパク質、及びヘプシジン模倣薬、ＴＭＰＲＳＳ６を標的としたアンチセンス又はｉＲＮＡ薬剤など、制御や送達が困難な他のアプローチなどに関連する望ましくない効果、送達及び／又は有効性の困難、並びに規制のハードルを回避できることが理解される。正確な治療標的化のために抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体を使用することは、併用治療のための方法及び組成物、例えば、異なる標的に作用する別の有効成分との組み合わせ、異なる標的と結合する抗体との組み合わせ、ＨＢＢ遺伝子を標的とする遺伝子治療剤及び方法との組み合わせ、又は赤血球生成を刺激するＴＧＦスーパーファミリーリガンドを標的とするＦｃ融合蛋白との組み合わせで抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体を用いる可能性を排除しないことが理解される。

【0052】

本開示にて開示された抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体により、各対象に合わせた治療法（例えば、投与量、投与頻度）、継続と中止が容易な治療法、および他の治療法との併用が可能な治療法を開発することができる。ある戦略的実施形態においては、本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、複数の治療標的を扱うことができる他の治療法と組み合わせることができ、及び／又は併用療法におけるいずれかの治療法の短所又は望ましくない効果に対処することができる。
抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体及びその用途の例示的な実施形態

【0053】

本発明の抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の非限定的な例示的実施形態をここに示し、特に実施例、表、及び図に開示する。
ＴＭＰＲＳＳ６と結合可能な抗体

【0054】

実施例に示されるように、本発明の抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体を同定し特徴付けるために機能カスケードを使用することができる。カスケードの第一ステップは、ＴＭＰＲＳＳ６を発現する細胞の表面上でヒトＴＭＰＲＳＳ６に結合することができる抗体をスクリーニングすることを含み（実施例１、図１）、次いで第二ステップでは、ＴＭＰＲＳＳ６を発現する細胞の表面上でヒトＴＭＰＲＳＳ６に結合し、鉄代謝に関与する成分の活性を調節することができる抗体を同定することを含み、この場合、ヘプシジン（ＨＡＭＰ）プロモーター活性を増加する能力について試験する（実施例２）。図１に示す例示的な実施形態によって示されるように、第１ステップでは、ＴＭＰＲＳＳ６を発現する細胞の表面上でヒトＴＭＰＲＳＳ６に結合することができる１４３個の抗体（クローン）を同定し、第２ステップでは、（スクリーニングされた１４３個のうち）１０個の抗体をヘプシジン（ＨＡＭＰ）プロモーター活性を増大することができた「活性」抗体（クローン）として同定した。

【0055】

機能カスケードの第３段階（図１）において、１０個の「活性」抗体を試験して、さらなる研究に関連するソースからの非ヒトＴＭＰＲＳＳ６標的との交差反応性について調べた。すなわち、マウスモデルにおける前臨床効力試験に関連するマウスＴＭＰＲＳＳ６との交差反応性について試験し、毒性（安全性）試験に関連するカニクイザルＴＭＰＲＳＳ６との交差反応性について試験した。図１に示す例示的な実施形態によって実証され、実施例４で示され、図４に示されるように、（スクリーニングした１０のうち）３つの（３）クローンが少なくとも１つの非ヒトＴＭＰＲＳＳ６と交差反応を示し、ＭＷＴｘ－００１、ＭＷＴｘ－００２、及びＭＷＴｘ－００３と名付けられた。各モノクローナル抗体の配列を決定し、各ＨＣ及びＬＣ上のＣＤＲを特定した（カバット（Ｋａｂａｔ）の番号付け）。ＨＣ及びＬＣ配列は、以下のように同定された。ＭＷＴｘ－００１（配列番号６１（ＨＣ）及び６３（ＬＣ））、ＭＷＴｘ－００２（配列番号６５（ＨＣ）及び６７（ＬＣ））、及びＭＷＴｘ－００３９配列番号６９（ＨＣ）及び７１（ＬＣ））。ＭＷＴｘ－００１モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株は、２０２０年５月２７日に、ブダペスト条約の条項に基づいて、ＡＴＣＣ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＰＴＡ－１２６７５９の下、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ（登録商標）））， １０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ，２０１１０，米国に寄託されている。ＭＷＴｘ－００２モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株は、２０２０年５月２７日に、ブダペスト条約の条項に基づいて、ＡＴＣＣ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＰＴＡ－１２６７６０の下、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ（登録商標））），１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ，２０１１０，米国に寄託されている。ＭＷＴｘ－００３モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株は、２０２０年５月２７日に、ブダペスト条約の条項に基づいて、ＡＴＣＣ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＰＴＡ－１２６７６１の下、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ（登録商標））），１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ， Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ，２０１１０，米国に寄託されている。
ヒト化バリアント

【0056】

ヒト由来抗体フレームワークに非ヒト源由来のＣＤＲをグラフト化したものを含むヒト化抗体は、ヒトに投与した場合、非免疫原性が期待される。実施例２に開示される例示的な実施形態によって実証されるように、ヒト化抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体バリアントは、首尾良く生成、試験、最適化、及び選択された。各ＨＣ又はＬＣバリアントにおいて、ＣＤＲの配列は同じだが、可変領域のフレームワークの配列がフレームワークの９０％以上の位置で異なる複数のＨＣ及びＬＣバリアント候補を開発し、これらのバリアントを異なるＨＣ／ＬＣの組み合わせで試験し、望ましい特徴を持つ組み合わせを同定した。初期設計と試験の後、限定されないがアスパラギン酸異性化などの潜在的な望ましくない事象を回避するための一部の親ＣＤＲ配列の改変や及び抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の最小化など所望の機能を達成するための一部の定常領域（Ｆｃ）の改変を行い、所望の抗原結合親和性を示したバリアントをさらなる評価と開発のために選択し、ヒト化バリアントｈｚＭＷＴｘ－００１Ｖａｒ（配列番号７３（ＨＣ）及び７５（ＬＣ））、ｈｚＭＷＴｘ－００２Ｖａｒ（配列番号７７（ＨＣ）及び７９（ＬＣ））、及びｈｚＭＷＴｘ－００３Ｖａｒ（配列番号８１（ＨＣ）及び８３（ＬＣ））に到達した。
ヘプシジンプロモーター活性を増加させる抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体

【0057】

本開示にて開示されるように、ヘプシジン発現の減少によって特徴づけられる鉄過剰症の治療に用いるための抗体は、ヘプシジン発現に関与する少なくとも１つの成分の活性を調節し得る。ここでその成分はヘプシジンプロモーターの活性であってもよい。実施例２に開示されたｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを用いた例示的な実施形態によって実証されたように、抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体ＭＷＴｘ－００１、ＭＷＴｘ－００２、ＭＷＴｘ－００３、ｈｚＭＷＴｘ－００１Ｖａｒ、ｈｚＭＷＴｘ－００２Ｖａｒ、及びｈｚＭＷＴｘ－００３Ｖａｒは用量依存的にＨＡＭＰプロモーター活性を増加し（図２Ａ～２Ｆ）、同じ濃度のアイソタイプコントロールはＨＡＭＰプロモーター活性を増加しないことが示された。
関連する生物学的状況において標的に対して高い親和性を有する抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体

【0058】

抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、生物学的に適切なターゲット、すなわち細胞表面に発現しているヒトＴＭＰＲＳＳ６に対して高い親和性を示した。実施例３及び図３Ｍに開示された３つの異なる方法を用いた親和性測定の例示的な実施形態によって示されるように、モノクローナル抗体ＭＷＴｘ－００１、ＭＷＴｘ－００２、及びＭＷＴｘ－００３、並びにヒト化バリアントｈｚＭＷＴｘ－００１Ｖａｒ、ｈｚＭＷＴｘ－００２Ｖａｒ、及びｈｚＭＷＴｘ－００３Ｖａｒは、治療的に有効な抗体又は抗体フラグメントに対して好適な親和特性を常に示している。
非ヒト標的との交差反応性を有する抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体

【0059】

治療上有用な抗体又は抗体フラグメントは、抗体又は抗体フラグメントは、例えば、マウス相同体、及び／又はカニクイザル由来のような霊長類相同体を認識するように、前臨床有効性研究、疾患動物モデル、毒性研究などのさらなる研究に関連するであろう供給源からの非ヒト標的（非ヒト同族体）と十分な交差反応性を有することが望ましい。実施例４に開示された例示的な実施形態によって実証されたように、ＭＷＴｘ－００１、ｈｚＭＷＴｘ－００１Ｖａｒ、ＭＷＴｘ－００３、及びｈｚＭＷＴｘ－００３ＶａｒはマウスＴＭＰＲＳＳ６と検出可能な交差反応性を示し、一方、ＭＷＴｘ－００１、ＭＷＴｘ－００２、ＭＷＴｘ－００３、ｈｚＭＷＴｘ－００１Ｖａｒ、ｈｚＭＷＴｘ－００２Ｖａｒ、及びｈｚＭＷＴｘ－００３ＶａｒはカニクイザルＴＭＰＲＳＳ６と検出可能な交差反応性を示した。
抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、ＴＭＰＲＳＳ６（マトリプターゼ－２）に特異的に結合する

【0060】

標的タンパク質への特異的な結合が高く、同一生物内の相同タンパク質との交差反応性が低い抗体は、オフターゲット効果が低いか、全くないことが予想される。ここで提供される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、ヒトＴＭＰＲＳＳ６（マトリプターゼ－２）に対して高い特異性を示し、それにより標的組成物及び方法への使用に適している。実施例５に開示され、図５Ａ～Ｒに示される例示的な実施形態によって実証されるように、モノクローナル抗体ＭＷＴｘ－００１、ＭＷＴｘ－００２、及びＭＷＴｘ－００３、並びにそれらのヒト化バリアントｈｚＭＷＴｘ－００１Ｖａｒ、ｈｚＭＷＴｘ－００２Ｖａｒ、及びｈｚＭＷＴｘ－００３ＶａｒはヒトＴＭＰＲＳＳ６（マトリプターゼ２）への結合を特異的に示し、同種のヒトマトリプターゼとの交差反応性は示さなかった。すなわち、これらの抗体は、マトリプターゼ－１（ＳＴ１４）やマトリプターゼ－３（ＴＭＰＲＳＳ７）に対して検出可能な結合を示さなかった。
鉄過剰症に関連するホルモン及び症状に対するｉｎ ｖｉｖｏ投与量依存的な効果を有する抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体

【0061】

鉄の吸収と貯蔵鉄からの移動を制御するホルモンである血清ヘプシジンの濃度を増加させることができる抗体は、鉄過剰症の症状の軽減、改善、又は予防、特に血清鉄濃度の上昇の症状の軽減、改善、又は予防が期待される。実施例６に示す例示的な実施形態によって実証されるように、抗ＴＭＰＲＳＳ６モノクローナル抗体ＭＷＴｘ－００３又はヒト化バリアントｈｚＭＷＴｘ－００３Ｖａｒを野生型の対象、すなわち、鉄過剰症であることが知られていない又は疑われていない対象に投与すると、アイソタイプ対照と比較して、血清ヘプシジン濃度の増加（図６Ａ～６Ｃ）、血清鉄濃度の減少（図６Ｄ～６Ｆ）、及び肝臓ヘプシジンＲＮＡ濃度の増加（図６Ｇ～６Ｉ）がもたらされることを示した。これらの効果は用量依存的であり、これは、作用機序にとらわれることなく、抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の用量依存的なｉｎ ｖｉｖｏ効果が、当業者が所定の対象に対して有効量（投与量）を決定できることを示していると解釈することができる。
βサラセミア病モデルにおいてｉｎ ｖｉｖｏで有効な抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体

【0062】

鉄過剰症の動物モデルを示す対象、すなわち鉄過剰症であることが知られている、又は疑われている対象に投与することにより、ｉｎ ｖｉｖｏで鉄過剰症の症状を緩和することができる抗体および抗体フラグメントは、臨床における治療効果が期待されるものである。βサラセミアのＴｈ３／＋マウスモデルを用いた実施例７に示す例示的な実施形態によって実証されるように、アイソタイプコントロールと比較して、抗ＴＭＰＲＳＳ６モノクローナル抗体ＭＷＴｘ－００３を投与することにより、肝臓非ヘム鉄の減少、血清ヘプシジンの増加、肝臓ヘプシジンＲＮＡの増加、脾臓肥大の抑制、赤血球数（ＲＢＣ）の増加、ヘマトクリット（ＨＣＴ）の増加、赤血球分布幅（ＲＤＷ）の減少、成熟赤血球の産生増加（赤血球造血の増加）などの複数の効果が生じた。これらの効果は、それぞれ障害の症状の改善として理解することができる。本疾患の症状は、限定されないが、肝臓（肝臓非ヘム鉄、肝臓ヘプシジンＲＮＡへの影響）、血液（血清鉄濃度、循環ホルモン濃度、特に血清ヘプシジン濃度、ＲＢＣ、ＨＣＴ、ＲＤＷへの影響）、脾臓の大きさ及び機能（脾腫）、並びに、限定されないが、骨髄及び脾臓を含む複数の部位における赤血球生成（赤血球生成部位における異なる前駆細胞型の存在量及び成熟赤血球の存在量に対する影響）などを含む複数の生体系で発現する。抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の投与により、疾患モデル対象の複数の症状が改善され、測定された症状レベルは、疾患モデルのアイソタイプ対照（未治療疾患）に見られるレベルから、疾患であることが知られていない、又は疑われていない遺伝的に類似した対象の正常レベルを示す野生型同腹子に見られるレベルへと移行した。理論や作用機序にとらわれることなく、無効造血は、鉄吸収の増加や鉄過剰症をもたらすヘプシジンの異常抑制の原動力であり、赤芽細胞の分化や赤血球への成熟を改善する治療は、鉄過剰症治療のために治療的に有益であると理解される。非限定的な本例示的実施形態は、赤芽球の分化及び赤血球への成熟を増加させ、さらに鉄の負荷を減少させる抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体療法を開示する。
組成

【0063】

本発明の抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の安全かつ有効な量と、各組成物の使用目的に適した薬学的に許容される担体又は賦形剤（複数可）とを含む組成物が提供される。このような担体としては、生理食塩水、緩衝液、グルコース、水、グリセロール、エタノール、賦形剤、安定剤、防腐剤、又はそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。医薬製剤は投与形態に合わせるべきと理解される。

【0064】

本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、限定されないが注射又は非経口注入などの任意の適切な手段によって投与することができる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下投与、又は肝臓への非経口投与が含まれ得る。本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、標的組織に局所的に送達するために、肝組織又は血管系への導入のために処方することができる。本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、デバイスを使用して、又はデポとして、あるいは徐放性製剤（例えば、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックス、又はマイクロカプセル）で投与することができ、遅い、及び／又は測定された、及び／又は局所的に送達することが可能である。本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、コロイド薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）を使用して又はマクロエマルジョン中において、処方及び投与することができる。
方法

【0065】

本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の有効量を用いる、鉄代謝の障害を治療するための方法が提供される。特定の作用機序に拘束されることを望むことなく、本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体を用いてＴＭＰＲＳＳ６を標的とするために提供される方法は、複数の下流効果、特に鉄代謝及び赤血球生成に関与する成分（分子、システム、プロセス）に対する効果をもたらす。特定の作用機序に拘束されることを望むことなく、鉄代謝に関与する成分の活性を調節するために、本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の有効量を用いる、鉄代謝の障害を治療するための方法が提供される。特に、βサラセミア、特に、限定されないが、非輸血依存性サラセミア、ＭＤＳ（骨髄異形成症候群）、赤芽球性貧血、及び鉄芽球性貧血を含み得る無効造血に関連するかそれによって特徴付けられる障害を含む、組織及び器官の鉄過剰蓄積に伴う鉄過剰障害の治療のための方法が提供されている。単一の作用機序に限定されることなく、ヘプシジン発現を増加させることができる抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体を投与することにより、ヘプシジン低値を伴う鉄過剰症、特にヘプシジン発現抑制を伴う疾患（ヘプシジン発現の異常抑制が関与している疾患又は状態を含む）を治療する方法が提供される。

【0066】

本開示にて提示される鉄代謝障害の治療方法は、有効量の本開示に開示する抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体を、それを必要とする対象に投与することを含み、抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の有効量の投与により、鉄代謝に関与する生物学的作用（症状）の少なくとも一つが改善される。抑制されたヘプシジン濃度に関連する鉄代謝の障害を治療するための方法が提供され、それを必要とする対象に本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の有効量を投与すると、ヘプシジンプロモーター活性の増加、ヘプシジン転写の増加、ヘプシジンＲＮＡ濃度の増加、及びヘプシジン濃度（特に血清ヘプシジン濃度）の増加の少なくとも１つがもたらされる。鉄過剰症を有することが知られている又は疑われている対象を治療するための方法が提供され、ここで有効量の抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体を投与することにより、限定されないが、肝臓非ヘム鉄の減少、血清ヘプシジンの増加、肝臓ヘプシジンＲＮＡの増加、脾腫の減少、赤血球数（ＲＢＣ）の増加、ヘマトクリット（ＨＣＴ）の増加、赤血球分布幅（ＲＤＷ）の減少、成熟赤血球の生成の増加（赤血球造血の増加）などの１以上の生物学的効果をもたらす。無効造血によって特徴付けられる、鉄過剰症を有することが知られている又は疑われている対象を治療するための方法が提供され、ここで有効量の抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体を投与することにより、限定されないが、肝臓非ヘム鉄の減少、血清ヘプシジンの増加、肝臓ヘプシジンＲＮＡの増加、脾腫の減少、赤血球数（ＲＢＣ）の増加、ヘマトクリット（ＨＣＴ）の増加、赤血球分布幅（ＲＤＷ）の減少、成熟赤血球の生成の増加（赤血球造血の増加）などの１以上の生物学的効果をもたらす。

【0067】

鉄代謝の障害、特に鉄過剰障害、さらに特に無効造血によって特徴付けられる鉄過剰障害を治療するための方法及び組成物が提供され、ここで有効量の抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の投与により、障害に関連する１つ以上の生物学的効果又は症状を治療又は改善する結果が得られる。理論や作用機序にとらわれることなく、赤血球前駆体のアポトーシスにより骨髄で産生される成熟赤血球が少ないということで特徴付けられる無効造血が、鉄吸収量の増加や鉄過剰を引き起こすヘプシジンの異常抑制の原動力になると理解される。この理解によれば、赤芽球の分化と赤血球への成熟を改善する治療は、鉄過剰症の治療に有益であると考えられる。赤芽球の分化と赤血球への成熟の増加、鉄負荷の減少、ヘプシジン発現の増加等に対する抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体療法の有効性は、本開示にて開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体を用いる方法及び組成物の治療上の利点を最大化する。

【0068】

以下の実施例は、特許請求の範囲の発明を説明するために提供されるものであり、特許請求の範囲の発明を限定するものではない。

【実施例】

【0069】

実施例１：抗体の作製とＴＭＰＲＳＳ６と結合する抗体の同定
ＴＭＰＲＳＳ６に対する新規モノクローナル抗体の作製は、ＬａｋｅＰｈａｒｍａ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙグループ（ＬａｋｅＰｈａｒｍａ， Ｉｎｃ． Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ，ＣＡ）の委託により、ｉｎ ｖｉｖｏ齧歯類免疫化及びハイブリドーマ技術を用いて行われた。ｐＬＥＶ１１３＿ｈｕＴＭＰＲＳＳ６およびｐＬＥＶ１１３＿ｍｏＴＭＰＲＳＳ６－ＴＣＥプラスミドＤＮＡ（ＬａｋｅＰｈａｒｍａ，Ｉｎｃでクローニング）の混合物を用いて、Ｂ６；ＳＪＬマウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に流体力学的遺伝子導入尾静脈注射によるＤＮＡベースの免疫化を実施した。蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）により十分な血漿中力価が得られたため、下流の抗体回収及びスクリーニング活動を開始した。ＮＥＰＡ ＧＥＮＥ ＥＣＦＧ２１ Ｓｕｐｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｆｕｓｉｏｎ Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ（ネッパジーン株式会社、千葉県市川市）を用いて、免疫化されたマウス２匹と骨髄腫融合パートナーからプールした脾臓細胞で電融を行った。融合材料は、未融合の骨髄腫パートナー細胞よりもハイブリドーマを特異的に選択するヒポキサンチン－アミノプテリン－チミジン培地の３８４ウェルプレート合計１０枚にプレーティングされた。ハイブリドーマ上清は、最初にＦＡＣＳ測定によりＨｕＴＭＰＲＳＳ６反応性をスクリーニングし、融合後１０日目にＴＭＰＲＳＳ６発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ｈｕＴＭＰＲＳＳ６－（Ｈｉｓ）_６（配列番号９７）をコードするプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、ＴＭＰＲＳＳ６発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を選択した）上で陽性染色シグナルを与え、親核（ＨＥＫ２９３Ｔ）で陰性染色を与える上清を検出した。ＴＭＰＲＳＳ６を発現するＨＥＫ２９３細胞で陽性染色シグナルを与え、親細胞で陰性染色シグナルを与えるハイブリドーマ上清を「ヒット」とし、さらなるスクリーニングを行った。１次ＦＡＣＳスクリーニングで１９２のヒットが確認され、２次、３次ＦＡＣＳスクリーニングで１４３のヒットが確認された。

【0070】

実施例２：抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の機能スクリーニング、モノクローナル抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体及びヒト化バリアントの同定、作製、及び配列決定。
ＨＡＭＰ－ルシフェラーゼレポーターアッセイ

【0071】

ヘプシジンプロモーター・ルシフェラーゼレポーターアッセイを用いて、様々な抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体に対するＨＡＭＰプロモーターの応答を測定した（Ｄｕ，Ｘ．ら、２００８．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２０：１０８８－１０９２；当初開示されたようにマウスＨＡＭＰプロモーターの代わりにヒトＨＡＭＰプロモーターを使用するように改変された）。ＨＡＭＰ－ルシフェラーゼ報告アッセイのために、２．５ｋｂのＨＡＭＰプロモーターフラグメント（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｇｅｎｏｍｅ ＧＲＣｈ３８）を、ホタル・ルシフェラーゼをコードする配列の上流でスプライシングした。チミジンキナーゼプロモーター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｅ６９３１）で駆動するＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼをコードするコントロールコンストラクトを内部コントロールとして使用した。これらのコンストラクトを、ＴＭＰＲＳＳ６をコードするコンストラクトとともに、ＨｅｐＧ２細胞（ＡＴＣＣ、ＨＢ－８０６５）に共導入した。ＴＭＰＲＳＳ６を発現するトランスフェクトされたＨｅｐＧ２細胞を、最小必須培地（ＭＥＭ、ＡＴＣＣ）＋１％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）＋１ｍＭピルビン酸ナトリウム＋非必須アミノ酸溶液（Ｇｉｂｃｏ）＋１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ）＋１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ）を含む飢餓培地で希釈した種々の濃度の精製ｍＡｂで約３時間前処理を行ってから、ＢＭＰ－ＳＭＡＤ仲介シグナルを誘発するために最終濃度２５～６０ｎｇ／ｍｌの組換えｈＢＭＰ６（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて処理した。精製マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）又はヒトＩｇＧ１（ＢｉｏＸｃｅｌｌ）を対照として使用した。ｈＢＭＰ６を一晩処理した後、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ基質を添加した。ホタル・ルシフェラーゼとレニラ・ルシフェラーゼの発光測定値は、それぞれ総発光量を測定することで記録された。活性は、レニラ・ルシフェラーゼ発光（コントロール）に対するホタル・ルシフェラーゼ発光の比率として算出した。これらのアッセイの結果は、図２Ａ～２Ｆに示されている。
試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での機能スクリーニング

【0072】

機能的に活性なハイブリドーマをスクリーニングするために、上述のＨＡＭＰ－ルシフェラーゼレポーターアッセイを使用して、１４３のＨｕＴＭＰＲＳＳ６結合ハイブリドーマ（「ヒット」）をすべて試験した。ＨｕＴＭＰＲＳＳ６結合ハイブリドーマ１４３個のうち１０個の上清がＨＡＭＰプロモーター活性を増加させ（データは示していない）、さらなる試験を受けるための「活性クローン」と同定された。これらの１０個の活性クローンを、以下の実施例４に記載したように、ネズミの標的ＭｏＴＭＰＲＳＳ６に対する交差反応性について試験すると、ＦＡＣＳによって測定したところ、３個がＨｕＴＭＰＲＳＳ６及びＭｏＴＭＰＲＳＳ６の両方に対して結合を示した。これら３つの交差反応性クローンをさらに３８４ウェルプレートの１９２ウェルに１細胞／ウェルの密度でプレーティングしてモノクローナルハイブリドーマクローンを生成し、得られたサブクローンのうち、非ヒト標的、例えばマウスＴＭＰＲＳＳ６（ｍｏＴＭＰＲＳＳ６）やカニクイザルＴＭＰＲＳＳ６（ｃｙｎｏＴＭＰＲＳＳ６）に対して望ましい機能活性及び交差反応性を示したものをＭＷＴｘ－００１、ＭＷＴｘ－００２、及びＭＷＴｘ－００３と同定した。
抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体ＭＷＴｘ－００１、ＭＷＴｘ－００２、及びＭＷＴｘ－００３の配列

【0073】

ＭＷＴｘ－００１、ＭＷＴｘ－００２、及びＭＷＴｘ－００３の配列は、各ハイブリドーマサンプルからｍＲＮＡを分離し、独自のマウスＩｇＧ特異的プライマーセットで逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を行って標的可変領域を増幅し、配列決定することにより決定した。それぞれの抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体について、固有の重鎖と軽鎖が同定された。各重鎖と各軽鎖のヌクレオチド配列が決定された。ヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列を決定し、ＣＤＲ領域をカバット（Ｋａｂａｔ）の番号付けシステムを用いて同定した。表１は、ＭＷＴｘ－００１、ＭＷＴｘ－００２、及びＭＷＴｘ－００３のそれぞれについて、重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列、並びに（カバット（Ｋａｂａｔ）の番号に基づく）同定したＣＤＲのアミノ酸配列、重鎖及び軽鎖可変領域のヌクレオチド配列を示す。

ヒト化抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体バリアントの作製とスクリーニング

【0074】

親抗体のヒト化は、ヒト抗体フレームワークへのＣＤＲグラフト化により実施した。まず、親抗体の３次元構造のホモロジーモデリングを行い、親抗体の構造モデルを確立した。可変フラグメントフレームワークのアミノ酸配列は、全体的な配列の同一性、ＶＨ－ＶＬ界面の位置の一致性、同様に分類されたＣＤＲの正規位置、Ｎ－グリコシル化候補部位の除去に基づいて同定された。ヒト化抗体は、親抗体の配列の選択された部分とヒトのフレームワーク配列を融合させたハイブリッド配列を複数作成することにより設計した。ヒト化抗体をフォーマットするために選択されたアイソタイプは、重鎖がＩｇＧ１、軽鎖がＩｇＧ１カッパであった。３Ｄモデルを用いて、これらのヒト化配列を目視とコンピュータモデリングにより方法論的に解析し、抗原結合を保持できる可能性の高い配列を単離した。最終的なヒト化抗体では、元の抗体の特異性を維持したまま、ヒト配列の量を最大化することを目標とした。その後、ヒト化ＶＨとＶＬを対にしたヒト化バリアントを発現させ、親和性分析のために精製した。

【0075】

親和性分析の一部としてバリアントを設計、生成、及び試験する１ラウンドにおいて、親抗体ＭＷＴＸ－００３のＶＨ－ＣＤＲを４つの異なるヒトＩｇＧ１由来のフレームワークの対応する位置に配置して４つのＶＨバリアントを作成し（配列番号８９～９２）、親抗体ＭＷＴＸ－００３のＶＬ－ＣＤＲを４つの異なるヒトＩｇＧ１カッパ由来のフレームワークの対応する位置に配置して４つのＶＬ（ＶＫ）バリアントを作成した（配列番号９３～９６）。ＶＨとＶＬ（ＶＫ）バリアントのあらゆる組み合わせを代表する合計１６のヒト化バリアントを４ＶＨｘ４ＶＫマトリックスに従って調製し、抗原結合特性（ｋ_ｏｎ、ｋ_ｏｆｆ、ＫＤ）を評価したところ、ＫＤ値は４．１６Ｅ－０７（～１．０９Ｅ－０８）とナノモルレンジにあることが判明した。

【0076】

望ましい抗原結合親和性を示すバリアントが選択され、評価と開発が更に行われた。場合によっては、アスパラギン酸異性化などの潜在的な望ましくない事象を避けるために、親側のＣＤＲ配列を変更した。

【0077】

抗体のエフェクター機能、特に抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を抑制するために、Ｆｃ領域の重要なアミノ酸残基を特定し、すべてのヒト化抗体バリアントについて変異（置換）させた。ＡＤＣＣ廃止の目標を達成するためのＦｃ変異に関する刊行物で得られる指針が今回の変異、例えば、（Ｔａｍｍ Ａ，Ｓｃｈｍｉｄｔ ＲＥ． ＩｇＧ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ｏｎ ｈｕｍａｎ Ｆｃ ｇａｍｍａ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ． Ｉｎｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７；１６（１－２）：５７－８５．ｄｏｉ：１０．３１０９／０８８３０１８９７０９０４５７０３；Ｊｅｆｆｅｒｉｓ Ｒ，Ｌｕｎｄ Ｊ．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ ｏｎ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ－Ｆｃ ｆｏｒ ＦｃｇａｍｍａＲ： ｃｕｒｒｅｎｔ ｍｏｄｅｌｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ．２００２ Ｊｕｎ ３；８２（１－２）：５７－６５．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｓ０１６５－２４７８（０２）０００１９－６）に説明されているｈＩｇＧ１におけるネイティブなＦｃ Ｎ－結合グリコシル化部位の除去（Ｎ２９７Ａ変異）、又はＦｃにおける下部ヒンジ領域の２３４位及び２３５位のロイシンの置換（ＬＡＬＡ二重変異）などの変位を知らせるために使用されている。本変形例では、ｈｚＭＷＴｘ－００１Ｖａｒ抗体及びｈｚＭＷＴｘ－００２Ｖａｒ抗体のＦｃにＮ２９７Ａ変異を導入し、ｈｚＭＷＴｘ－００３Ｖａｒ抗体のＦｃにＬＡＬＡ変異を導入し、ＡＤＣＣの低下又は抑制という同じ目標を達成した（表３、配列番号７３、７７、８１）。

【0078】

評価の結果、ヒト化抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体バリアントｈｚＭＷＴｘ－００１Ｖａｒ、ｈｚＭＷＴｘ－００２Ｖａｒ及びｈｚＭＷＴｘ－００３Ｖａｒがさらなる試験に選ばれた。ヒト化バリアントの配列と特徴を以下の表２及び表３に示す。
ヒト化抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体バリアントの組み換えによる作製

【0079】

ヒト化抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体バリアントの発現コンストラクトは、ＬＣ－コードＤＮＡ配列とＨＣ－コードＤＮＡ配列との間に内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を設けて設計し、Ｇｅｎｅａｒｔ ＤＮＡ合成によりコドンを最適化し、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳類発現ベクター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）にクローン化した。挿入されたＤＮＡの配列はシークエンシングによって確認された。組換え抗体作製には、ＥｘｐｉＣＨＯ発現システム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて、製造者の指示に従い、発現コンストラクトを一過性トランスフェクションに使用した。発現した抗体は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーで精製した。一過性トランスフェクションからの抗体産生量は１リットルあたり５０ｍｇから３００ｍｇで、純度は９５％以上、エンドトキシン値は１ＥＵ／ｍｌ以下であった。
ヒト化抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体バリアントｈｚＭＷＴｘ－００１Ｖａｒ、ｈｚＭＷＴｘ－００２Ｖａｒ、及びｈｚＭＷＴｘ－００３Ｖａｒの配列

【0080】

ヒト化抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体バリアントｈｚＭＷＴｘ－００１Ｖａｒ、ｈｚＭＷＴｘ－００２Ｖａｒ及びｈｚＭＷＴｘ－００３Ｖａｒがさらなる試験に選ばれた。各可変領域の配列を以下の表２に示す。ここで、同定されたＣＤＲは下線で示され、親抗体と比較してヒト化バリアントＣＤＲ配列に加えられた変更が示され、考察されている。

【0081】

表３は、抗ＴＭＰＲＳＳ６モノクローナル抗体ＭＷＴｘ－００１、ＭＷＴｘ－００２、及びＭＷＴｘ－００３、並びにヒト化抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体バリアントｈｚＭＷＴｘ－００１Ｖａｒ、ｈｚＭＷＴｘ－００２Ｖａｒ、及びｈｚＭＷＴｘ－００３Ｖａｒの重鎖及び軽鎖タンパク質並びにヌクレオチド配列の完全版を示している。ヒト化抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体バリアントｈｚＭＷＴｘ－００１Ｖａｒ、ｈｚＭＷＴｘ－００２Ｖａｒ、及びｈｚＭＷＴｘ－００３Ｖａｒの重鎖タンパク質配列は、上述のようにＡＤＣＣを低下させるために導入された変異（変化）の位置を示している。

抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体のＨＡＭＰプロモーター活性に対する用量依存的な影響

【0082】

図２Ａ～２Ｆは、ＭＷＴｘ－００１、ＭＷＴｘ－００２、ＭＷＴｘ－００３及びそれらのヒト化バリアントｈｚＭＷＴｘ－００１Ｖａｒ、ｈｚＭＷＴｘ－００２Ｖａｒ、ｈｚＭＷＴｘ－００３Ｖａｒをそれぞれ示した濃度で試験するために上述のＨＡＭＰルシフェラーゼ報告アッセイを用いた結果を示している。ＭＷＴｘ－００１（図２Ａ）、ＭＷＴｘ－００２（図２Ｂ）、ＭＷＴｘ－００３（図２Ｃ）及びヒト化バリアントｈｚＭＷＴｘ－００１Ｖａｒ（図２Ｄ）、ｈｚＭＷＴｘ－００２Ｖａｒ（図２Ｅ）、ｈｚＭＷＴｘ－００３Ｖａｒ（図２Ｆ）は、用量依存的にＨＡＭＰプロモーター活性を増加させる。ＭＷＴｘ－００１のＥＣ_５０は３μｇ／ｍｌと算出された（図２Ａ）。ＭＷＴｘ－００２のＥＣ_５０は１μｇ／ｍｌと算出された（図２Ｂ）。ＭＷＴｘ－００３のＥＣ_５０は２μｇ／ｍｌと算出された（図２Ｃ）。ｈｚＭＷＴｘ－００１ＶａｒのＥＣ_５０は０．８μｇ／ｍｌと算出された（図２Ｄ）。ｈｚＭＷＴｘ－００２ＶａｒのＥＣ_５０は０．３μｇ／ｍｌと算出された（図２Ｅ）。ｈｚＭＷＴｘ－００３ＶａｒのＥＣ_５０は０．３μｇ／ｍｌと算出された（図２Ｆ）。

【0083】

実施例３：抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の結合親和性
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞上に発現したヒトＴＭＰＲＳＳ６に対する様々な抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の結合親和性を、３つの異なる方法：細胞表面ＥＬＩＳＡ（図３Ａ～３Ｃ）、ＦＡＣＳ（図３Ｄ～３Ｆ）、及びバイオレイヤー干渉法（図３Ｇ～３Ｍ）を使用して測定した。
細胞表面ＥＬＩＳＡを用いた抗ＴＭＰＲＳＳ６ ｍＡｂの結合親和性測定

【0084】

ヒトＴＭＰＲＳＳ６（上述のようにＬａｋｅＰｈａｒｍａ Ｉｎｃによって生成された；配列番号９７）を安定的に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定し、ｄＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝食塩水、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｅｌｌｇｒｏ）で洗浄してからＢＳＡ培地（ＤＭＥＭ＋１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ＋１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ＋１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ））で希釈した種々の濃度の抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体とともにインキュベートした。コントロールとして精製マウスＩｇＧを使用した（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）。インキュベーション後、細胞をＢＳＡ培地で洗浄し、続いて２°抗体としてＨＲＰを結合したヤギ抗マウスＩｇＧでインキュベーションした（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。最後に、細胞をｄＰＢＳで洗浄して未結合の抗体を除去し、ＥＬＩＳＡ液体基質（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で発色させ、その後、同量の１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４のＥＬＩＳＡ液体基質を加えて反応を停止させた。結合した抗体はＯＤ_{４５０ｎｍ}の吸光度で測定した。これらのアッセイの結果を図３Ａ～３Ｃに示す。
ＦＡＣＳを用いた抗ＴＭＰＲＳＳ６ ｍＡｂの結合親和性測定

【0085】

ヒトＴＭＰＲＳＳ６を安定的に発現しているＨＥＫ２９３Ｔ細胞を回収し、ｄＰＢＳ＋３％ＢＳＡでブロッキングしてから、ｄＰＢＳ＋３％ＢＳＡで希釈した様々な濃度の抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体とインキュベートした。コントロールとして精製マウスＩｇＧを使用した。インキュベーション後、細胞をｄＰＢＳで洗浄し、続いて２°抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ）としてＡＰＣを結合したヤギ抗マウスＩｇＧでインキュベーションした。最後に、細胞をｄＰＢＳで洗浄して未結合の抗体を除去し、ｄＰＢＳ＋１ｍＭ ＥＤＴＡで再懸濁した後、ＮＯＶＯＣＹＴＥ（登録商標）Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）を用いてＦＡＣＳ分析を実施した。結合した抗体は、６４０ｎｍで励起し、６７５ｎｍで発光（蛍光）させた後、平均ＡＰＣ強度を測定することにより決定した。これらのアッセイの結果を図３Ｄ～３Ｆに示す。
Ｂｉｏ－Ｌａｙｅｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙを用いた抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体のアフィニティ及び結合速度の測定

【0086】

抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体のアフィニティ測定及び結合速度測定には、Ｏｃｔｅｔ（登録商標） ＲＥＤ９６ｅ ｓｙｓｔｅｍ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ＡＧ）を用いたＢｉｏ－Ｌａｙｅｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ技術が使用された。予め水和させた抗マウスＩｇＧＦｃ捕捉（ＡＭＣ）バイオセンサー（ＭＷＴｘ－００１、ＭＷＴｘ－００２、ＭＷＴｘ－００３抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体用、図３Ｇ～３Ｉ）又は抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ捕捉（ＡＨＣ）バイオセンサー（ｈｚＭＷＴｘ－００１Ｖａｒ、ｈｚＭＷＴｘ－００２Ｖａｒ及びｈｚＭＷＴｘ－００３Ｖａｒ抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体用、図３Ｊ～３Ｌ）をまず１ｘＫＢ（キネティック緩衝液、１ｘＰＢＳ ｐＨ７．４＋０．０２％Ｔｗｅｅｎ－２０＋０．１％ＢＳＡ）中で１２０秒間平衡化し、最初のベースラインとし、その後、１０ｍｇ／ｍｌ抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体（ＭＷＴｘ－００１、図３Ｇ；ＭＷＴｘ－００２、図３Ｈ；ＭＷＴｘ－００３、図３Ｉ；ｈｚＭＷＴｘ－００１Ｖａｒ、図３Ｊ；ｈｚＭＷＴｘ－００２Ｖａｒ、図３Ｋ；ｈｚＭＷＴｘ－００３Ｖａｒ、図３Ｌ）ＡＭＣ又はＡＨＣバイオセンサーに２４０秒間ローディングした。次に、１２０秒間のセカンドベースラインシグナルを確立した後、様々な濃度のｈｕｍａｎ ｅｃｔｏ－ＴＭＰＲＳＳ６－ＦＬＡＧ（配列番号１０２）（ヒトＴＭＰＲＳＳ６の細胞外ドメインを、Ｃ末端でＦＬＡＧタグと融合させることにより内製した）と２４０秒間会合させた。最後に、１ｘＫＢで３６０秒間、分析物を溶解した。データ解析は、Ｏｃｔｅｔ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ＨＴ Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて行った。ＫＤ、ｋ_ｏｎ、ｋ_ｏｆｆ及びＲ^２を図３Ｍにまとめた。

【0087】

実施例４：交差反応性：ヒトＴＭＰＲＳＳ６及び非ヒトＴＭＰＲＳＳ６に対する抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の結合
ＦＡＣＳによる交差反応性判定

【0088】

選択した抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体が、マウス及び／又はカニクイザル由来のＴＭＰＲＳＳ６に結合できるかどうかをテストした。ヒトＴＭＰＲＳＳ６（ＨｕＴＭＰＲＳＳ６－（Ｈｉｓ）_６）を安定的に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞（上述のようにＬａｋｅＰｈａｒｍａ Ｉｎｃによって生成）、マウスＴＭＰＲＳＳ６（ＭｏＴＭＰＲＳＳ６－（Ｈｉｓ_）６）を安定的に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞（配列番号９８）（上述のようにＬａｋｅＰｈａｒｍａ Ｉｎｃにより生成）、及びカニクイザルＴＭＰＲＳＳ６（ＣｙｎｏＴＭＰＲＳＳ６－（Ｈｉｓ_）６）（配列番号９９）（内製）を一過性に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を収集した。ヒトＴＭＰＲＳＳ６を安定発現しているＨＥＫ２９３Ｔ細胞を陽性対照として、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を陰性対照として使用した（上述）。細胞をｄＰＢＳ＋３％ＢＳＡでブロッキングしてから、ｄＰＢＳ＋３％ＢＳＡで希釈した抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体とインキュベートした。インキュベーション後、細胞をｄＰＢＳで洗浄し、続いて２°抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）としてＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ－４８８を結合したヤギ抗マウスＩｇＧで再度インキュベーションした。最後に、細胞をｄＰＢＳで洗浄して未結合の抗体を除去し、ｄＰＢＳ＋１ｍＭ ＥＤＴＡで再懸濁した後、ＮＯＶＯＣＹＴＥ（登録商標） Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）を用いてＦＡＣＳ分析を実施した。結合した抗体は、４８８ｎｍで励起し、５３０ｎｍで発光（ＦＩＴＣ－Ａ）を測定することにより決定された。これらのアッセイの結果を図４Ａ～４Ｉのヒストグラムプロットに示す。マウスＴＭＰＲＳＳ６との交差反応性は、ＭＷＴｘ－００１（図４Ｄ）及びＭＷＴｘ－００３（図４Ｆ）で観察されたが、ＭＷＴｘ－００２（図４Ｅ）はマウスＴＭＰＲＳＳ６との検出可能な交差反応性を示さなかった。カニクイザルＴＭＰＲＳＳ６との交差反応性は、ＭＷＴｘ－００１（図４Ｇ）、ＭＷＴｘ－００２（図４Ｈ）及びＭＷＴｘ－００３（図４Ｉ）について観察された。
細胞表面ＥＬＩＳＡ法による交差反応性判定

【0089】

マウスＴＭＰＲＳＳ６（上述のようにＬａｋｅＰｈａｒｍａ Ｉｎｃにより生成された。図４Ｊ、４Ｌ、４Ｎ、４Ｐ、４Ｒ、４Ｔ）又はカニクイザル（上述のように内製した。図４Ｋ、４Ｍ、４Ｏ、４Ｑ、４Ｓ、４Ｕ）を安定的に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞をメタノール（１００％）で固定し、ｄＰＢＳ（ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｅｌｌｇｒｏ）で洗浄してから、ＢＳＡ培地（ＤＭＥＭ＋１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ＋１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ＋１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ））で希釈した種々の濃度の抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体及びそれらのヒト化バリアントとインキュベーションした。精製マウスＩｇＧ（図４Ｊ～４Ｏ）又はヒトＩｇＧ１（図４Ｐ～４Ｕ）を対照として使用した。インキュベーション後、細胞をＢＳＡ培地で洗浄し、次に２°抗体としてＨＲＰで結合したヤギ抗マウス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、図４Ｊ～４Ｏ）又は抗ヒト（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、図４Ｐ～４Ｕ）ＩｇＧと共にインキュベートした。最後に、細胞をｄＰＢＳで洗浄して未結合の抗体を除去し、ＥＬＩＳＡ液体基質（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で発色させ、その後、同量の１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４のＥＬＩＳＡ液体基質を加えて反応を停止させた。結合した抗体はＯＤ_{４５０ｎｍ}の吸光度で測定した。これらのアッセイの結果を図４Ｊ～４Ｕに示す。ＭＷＴｘ－００１（図４Ｊ）及びＭＷＴｘ－００３（図４Ｎ）抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体並びにそれらのヒト化バリアントｈｚＭＷＴｘ－００１Ｖａｒ（図４Ｐ）、及びｈｚＭＷＴｘ－００３Ｖａｒ（図４Ｔ）抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体でマウスＴＭＰＲＳＳ６との交差反応性が観察されたが一方、ＭＷＴｘ－００２（図４Ｌ）抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体又はそのヒト化バリアントｈｚＭＷＴｘ－００２Ｖａｒ（図４Ｒ）抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体がマウスＴＭＰＲＳＳ６と検出可能な交差反応性を示さなかった。ＭＷＴｘ－００１（図４Ｋ）、ＭＷＴｘ－００２（図４Ｍ）、及びＭＷＴｘ－００３（図４Ｏ）抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体、及びそれらのヒト化バリアントｈｚＭＷＴｘ－００１Ｖａｒ（図４Ｑ）、ｈｚＭＷＴｘ－００２Ｖａｒ（図４Ｓ）、及びｈｚＭＷＴｘ－００３Ｖａｒ（図４Ｕ）抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体でカニクイザルＴＭＰＲＳＳ６との交差反応性が観察された。

【0090】

実施例５：標的特異性：相同マトリプターゼに結合する抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体。
抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体が相同マトリプターゼに結合するかどうかを決定するために、マトリプターゼ（ＳＴ１４）（配列番号１００）を過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞（図５Ｂ、５Ｅ、５Ｈ、５Ｋ、５Ｎ、５Ｑ）、及びマトリプターゼ－３（ＴＭＰＲＳＳ７）（配列番号１０１）（図５Ｃ、５Ｆ、５Ｉ、５Ｌ、５Ｏ、５Ｒ）を過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を回収した（内製した）。ヒトＴＭＰＲＳＳ６（マトリプターゼ－２）（配列番号９７）を安定的に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞（上述の通りＬａｋｅＰｈａｒｍａ Ｉｎｃによって生成された。図５Ａ、５Ｄ、５Ｇ、５Ｊ、５Ｍ、５Ｐ）を陽性対照として用い、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（図５Ａ～５Ｒ）を陰性対照（上述の通り）として使用した。ｄＰＢＳ＋３％ＢＳＡ＋０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０で希釈した様々な抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体とインキュベートする前に、細胞をｄＰＢＳ＋３％ＢＳＡ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０でブロッキングし透過処理した。細胞を抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体及びそのヒト化バリアントとともに、およそ１μｇ／ｍｌの濃度で１時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をｄＰＢＳで洗浄し、２°抗体としてＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ－４８８と結合したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、図５Ａ～５Ｉ）又はアロフィコシアニン（ＡＰＣ）と結合したヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、図５Ｊ～５Ｒ）でインキュベートした。最後に、細胞をｄＰＢＳで洗浄し、ｄＰＢＳ＋１ｍＭ ＥＤＴＡで再懸濁した後、ＮＯＶＯＣＹＴＥ（登録商標） Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを用いてＦＡＣＳ分析を行った。結合した抗体は、４８８ｎｍで励起し、５３０ｎｍで発光（ＦＩＴＣ－Ａ）を測定することにより（図５Ａ－５Ｉ）、又は６４０ｎｍで励起し、６７５ｎｍで発光（ＡＰＣ－Ａ）を測定することにより（図５Ｊ－５Ｒ）決定された。これらのアッセイの結果を図５Ａ～５Ｒのヒストグラムプロットに示す。全ての抗体がヒトＴＭＰＲＳＳ６（マトリプターゼ－２）（図５Ａ、５Ｄ、５Ｇ、５Ｊ、５Ｍ、５Ｐ）への結合を示し、どの抗体も相同マトリプターゼＳＴ１４（図５Ｂ、５Ｅ、５Ｈ、５Ｋ、５Ｎ、５Ｑ）又はＴＭＰＲＳＳ７（図５Ｃ、５Ｆ、５Ｉ、５Ｌ、５Ｏ、５Ｒ）への結合は示さなかった。ＭＷＴｘ－００１抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体及びそのヒト化バリアントｈｚＭＷＴｘ－００１Ｖａｒ抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、ヒトＴＭＰＲＳＳ６への結合を示し（図５Ａ、５Ｊ）、マトリプターゼ（ＳＴ１４）（図５Ｂ、５Ｋ）又はマトリプターゼ－３（ＴＭＰＲＳＳ７）（図５Ｃ、５Ｌ）への結合は示さなかった。ＭＷＴｘ－００２抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体及びそのヒト化バリアントｈｚＭＷＴｘ－００２Ｖａｒ抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、ヒトＴＭＰＲＳＳ６（マトリプターゼ－２）（図５Ｄ、５Ｍ）への結合を示し、マトリプターゼ（ＳＴ１４）（図５Ｅ、５Ｎ）又はマトリプターゼ－３（ＴＭＰＲＳＳ７）（図５Ｆ、５Ｏ）への結合は示さなかった。ＭＷＴｘ－００３抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体およびそのヒト化バリアントｈｚＭＷＴｘ－００３Ｖａｒ抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、ヒトＴＭＰＲＳＳ６（マトリプターゼ－２）への結合を示し（図５Ｇ、５Ｐ）、マトリプターゼ（ＳＴ１４）（図５Ｈ、５Ｑ）又はマトリターゼ－３（ＴＭＰＲＳＳ７）（図５Ｉ、５Ｒ）への結合は示さなかった。

【0091】

実施例６：マウス薬力学的モデルにおける抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体による治療
抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の ｉｎ ｖｉｖｏ薬力学的応答を研究するために、２～１０ｍｇ／ｋｇのＭＷＴｘ－００３抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体（図６Ａ～６Ｂ、６Ｄ～６Ｅ、６Ｇ～６Ｈ、６Ｊ～６Ｋ）又はそのヒト化バリアントｈｚＭＷＴｘ－００３Ｖａｒ抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体（図６Ｃ、６Ｆ、６Ｉ、６Ｌ）は野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに腹腔内注入された。マウスＩｇＧ２ｂ（ＢｉｏＸｃｅｌｌ、図６Ａ～６Ｂ、６Ｄ～６Ｅ、６Ｇ～６Ｈ、６Ｊ～６Ｋ）又はヒトＩｇＧ１（ＢｉｏＸｃｅｌｌ、図６Ｃ、６Ｆ、６Ｉ、６Ｌ）をアイソタイプコントロールとして使用した。注入後２０時間経過後に、５０μｇのＧＦＰ－ＴＭＰＲＳＳ６プラスミドＤＮＡ（ＧＦＰベクターにヒトＴＭＰＲＳＳ６を挿入して内製した）を流体力学的尾静脈注射により各マウスに送達した。ハイドロダイナミック注射の４４時間後にマウスを安楽死させ、肝組織と血液を採取した。肝臓ＲＮＡは、Ｂｉｏｍｉｇａ社（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）のＥＺｇｅｎｅ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｌｕｓにより、製造者の指示に従って精製した。マウス血清は、全血を１５００×ｇ、１０分間遠心分離することにより得た。
抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体による治療が血清鉄に及ぼす影響

【0092】

血清鉄は内製で開発した発色アッセイにより測定した（図６Ａ～６Ｃ）。簡単に説明すると、マウス血清又は標準鉄（３１－５００μｇ／ｄＬ）を混合酸溶液（０．６Ｍトリクロロ酢酸、０．４Ｍチオグリコール酸ナトリウム、１Ｍ ＨＣｌ）と３０秒間バーテックスして混合した。混合液を３７℃で１０分間インキュベートした後、１０，０００ｘｇで１０分間遠心分離し、Ｃｏｌｏｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１．５Ｍ酢酸ナトリウム、０．５ｍＭバソフェナントロリンジスルホン酸塩）で発色させた。その後、ＯＤ_{５３５ｎｍ}で吸光度を読み取った。血清鉄濃度は、直線鉄標準曲線から算出した。１０ｍｇ／ｋｇのＭＷＴｘ－００３抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体（図６Ａ～６Ｂ）及びそのヒト化バリアントｈｚＭＷＴｘ－００３Ｖａｒ抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体（図６Ｃ）の処置により、血清鉄を有意に減少させた。
抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体による治療が血清ヘプシジンに及ぼす影響

【0093】

血清ヘプシジンは、Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ社（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）から購入したＨｅｐｃｉｄｉｎ－Ｍｕｒｉｎｅ Ｃｏｍｐｅｔｅ ＥＬＩＳＡキットにより、製造者の指示に従って測定した（図６Ｄ～６Ｆ）。簡単に説明すると、希釈したマウス血清又はヘプシジン標準品をヘプシジンビオチン結合体と混合した後、抗マウスヘプシジン抗体をコートしたプレートに添加した。血清ヘプシジン又はヘプシジン標準品は、ヘプシジンビオチン結合体と競合し、コーティングされた抗ヘプシジン抗体と結合する。結合したヘプシジンビオチン結合体をストレプトアビジン結合西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で検出し、ＴＭＢで発色させ、ストップ液で停止した。その後、ＯＤ_{４５０ｎｍ}で吸光度を読み取った。データはＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ８で４パラメータ・ロジスティック（４－ＰＬ）カーブフィットを用いて解析し、血清ヘプシジン濃度を補間した。ＧＦＰ－ＴＭＰＲＳＳ６の流体力学的送達は、血清ヘプシジン濃度を有意に減少させたが（図６Ｄ）、１０ｍｇ／ｋｇのＭＷＴｘ－００３抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体（図６Ｄ～６Ｅ）及びそのヒト化バリアントｈｚＭＷＴｘ－００３Ｖａｒ抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体（図６Ｆ）による治療は、ヘプシジンの抑制を逆転させて血清ヘプシジン濃度を著しく増加させることがわかった。
抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体による治療が肝臓のヘプシジンＲＮＡに及ぼす影響

【0094】

肝臓ヘプシジンＲＮＡは、リアルタイムｑＰＣＲにより定量した（図６Ｇ～６Ｉ）。簡単に言うと、ｉＳｃｒｉｐｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて、製造者の指示に従い、肝臓のＲＮＡからｃＤＮＡをまず合成した。ヘプシジン転写産物を表４に示す特異的プライマーで増幅し、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ９６ ｑＰＣＲ装置で製造者の指示に従ってＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ（商標） Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて検出した。サンプルは３連で分析し、結果はβ－ａｃｔｉｎ ＲＮＡレベル（転写、表４記載のプライマーによる増幅、及び上述の定量化により測定）で正規化した。ＧＦＰ－ＴＭＰＲＳＳ６のハイドロダイナミックデリバリーは、肝臓のヘプシジンＲＮＡを有意に減少させた（図６Ｇ）。１０ｍｇ／ｋｇのＭＷＴｘ－００３抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体（図６Ｇ～６Ｈ）及びそのヒト化バリアントｈｚＭＷＴｘ－００３Ｖａｒ抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体（図６Ｉ）の治療により、Ｈａｍｐの抑制を逆転させて肝臓ヘプシジンＲＮＡ濃度を有意に増加させた。リアルタイムｑＰＣＲによるＲＮＡ定量には、以下のプライマーを用いた。ヘプシジンフォワードプライマー：５’－ＡＡＧ ＣＡＧ ＧＧＣ ＡＧＡ ＣＡＴ ＴＧＣ ＧＡＴ－３’（配列番号８５）； ヘプシジンリバースプライマー：５’－ＣＡＧ ＧＡＴ ＧＴＧ ＧＣＴ ＣＴＡ ＧＧＣ ＴＡＴ－３’（配列番号８６）；β－アクチンフォワードプライマー：５’－ＡＣＣ ＣＡＣ ＡＣＴ ＧＴＧ ＣＣＣ ＡＴＣ ＴＡ－３’（配列番号８７）；β－アクチンリバースプライマー：５’－ＣＡＣ ＧＣＴ ＣＧＧ ＴＣＡ ＧＧＡ ＴＣＴ ＴＣ－３’（配列番号８８）。

【0095】

ＭＷＴｘ－００３抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体又はそのヒト化バリアントｈｚＭＷＴｘ－００３Ｖａｒ抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の血清濃度は、内製で開発した細胞表面ＥＬＩＳＡによって定量した（上述、図６Ｊ～６Ｌ）。簡単に説明すると、希釈したマウス血清又は抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体標準品を、ヒトＴＭＰＲＳＳ６を安定発現している１００％メタノール固定ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞はバックグラウンドコントロールとして使用）とインキュベートした。結合したＭＷＴｘ－００３抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体はＨＲＰと結合したヤギ抗マウスＩｇＧで検出し、結合したｈｚＭＷＴｘ－００３Ｖａｒ抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体はＨＲＰと結合したヤギ抗ヒトＩｇＧで検出した。ＴＭＢで発色させた後、停止液で止めた。その後、ＯＤ_{４５０ｎｍ}で吸光度を読み取った。サンプルは３連で解析し、結果はＨＥＫ２９３Ｔコントロールに対して標準化されている。データはＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ８で４パラメータ・ロジスティック（４－ＰＬ）曲線フィットを用いて解析し、血清中の抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体濃度を補間した。

【0096】

実施例７：βサラセミアマウスモデルを用いた抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体のｉｎ ｖｉｖｏでの有効性
抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体のｉｎ ｖｉｖｏでの効果を調べるために、βサラセミアマウスモデル（Ｂ６．１２９Ｐ２－Ｈｂｂ－ｂ１^{ｔｍ１Ｕｎｃ}Ｈｂｂ－ｂ２^{ｔｍ１Ｕｎｃ}／Ｊ，ＪＡＸ Ｓｔｏｃｋ Ｎｏ： ００２６８３，Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ ＭＥ）を選択した。これを本書ではＴｈ３／＋マウスと称する。４－５週齢のＴｈ３／＋マウスとその野生型（ＷＴ）同腹子に鉄分十分な飼料（Ｔｅｋｌａｄ ＴＤ．８０３９４）を与え、Ｔｈ３／＋マウスに１０ｍｇ／ｋｇＭＷＴｘ－００３抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体又はマウスＩｇＧ２ｂアイソタイプコントロールを３日おきに４週間投与し、一方ＷＴ同腹子には投与しなかった。投与コース終了後、マウスを安楽死させ、脾臓、肝臓、大腿骨及び血液サンプルを採取した。肝臓のｔｏｔａｌ ＲＮＡを精製し、血清は上記と同様に採取した。

【0097】

血球数、脾臓腫大、血清鉄、血清ヘプシジン、肝臓ヘプシジンＲＮＡへの影響
全血球計算（ＣＢＣ）は、ＶＥＴＳＣＡＮ ＨＭ５自動血球計数装置により実施した（図７Ａ～７Ｄ）。ＭＷＴｘ－００３抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体による治療は、Ｔｈ３／＋マウスにおいて、赤血球数（ＲＢＣ、図７Ａ）及びヘマトクリット（ＨＣＴ、図７Ｃ）を有意に増加させ、赤血球分布幅（ＲＤＷ、図７Ｄ）を低減したが、ヘモグロビン（ＨＧＢ、図７Ｂ）には明らかな影響を与えなかった。

【0098】

脾臓重量を測定したところ、ＭＷＴｘ－００３抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体による治療により、Ｔｈ３／＋マウスの脾臓肥大が有意に抑制された（図７Ｅ）。

【0099】

血清鉄は上記と同様に測定した。ＭＷＴｘ－００３抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体で処理すると、血清鉄が有意に減少した（図７Ｆ）。肝臓の非ヘム鉄は、同様の発色アッセイを用いて測定した（図７Ｇ）。簡単に説明すると、ミンチにした小肝組織を６５℃で一晩乾燥させた後、混合酸（３Ｍ ＨＣｌ、１０％トリクロロ酢酸）で６５℃で２０時間消化した。その後、消化上清を回収し、Ｃｏｌｏｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１．５Ｍ酢酸トリウム、０．５ｍＭバソフェナントロリンジスルホン酸塩）で発色させた。その後、ＯＤ_{５３５ｎｍ}で吸光度を読み取った。ＭＷＴｘ－００３抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体で処理すると、肝臓の非ヘム鉄が有意に減少した（図７Ｇ）。

【0100】

血清ヘプシジンは、上記と同様にヘプシジン－ミュリンコンピテントＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。ＭＷＴｘ－００３抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体で処理すると、血清ヘプシジンが有意に増加した（図７Ｈ）。

【0101】

肝臓ヘプシジンＲＮＡは、リアルタイムｑＰＣＲにより定量した。ＭＷＴｘ－００３抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体で処理すると、肝臓のヘプシジンＲＮＡが有意に増加した（図７Ｉ）。

【0102】

ＭＷＴｘ－００３抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の血清濃度は、上記のように内製で開発した細胞表面ＥＬＩＳＡによって定量した（図７Ｊ）。
赤血球生成への影響

【0103】

Ｔｈ３／＋マウスの赤血球造血に対するＭＷＴｘ－００３抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の影響を調べるために、大腿骨から骨髄を採取し（図７Ｋ～７Ｍ参照）、脾臓から脾臓細胞を採取し（図７Ｎ～７Ｐ参照）、分析した。採取した細胞をラット抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で１５分間ブロックした後、ＦＩＴＣ結合ラット抗マウスＴＥＲ１１９（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＡＰＣ結合ラット抗マウスＣＤ４４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で３０分間氷上染色をした。洗浄した細胞を、ＮＯＶＯＣＹＴＥ（登録商標）Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを用いたＦＡＣＳ分析の前に、氷上で１０分間、生存率マーカー７－ＡＡＤ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色した。Ｔｅｒ１１９＋、７－ＡＤＤ－細胞を選択し、細胞サイズに抗マウスＣＤ４４で密度プロットをグラフ化した（ＦＳＣ－Ｈ）。プロットは、細胞タイプ（細胞クラスター）を特定し、各タイプ（クラスター）の存在量を決定するために分析された。図７Ｋ～７Ｐの代表的なプロットは、赤血球分化の連続した段階に対応する４つの異なる細胞クラスターが上から下に区別され、以下として識別されたことを示す：好塩基性赤芽球（クラスターＩ）、多色性赤芽球（クラスターＩＩ）、正染性赤芽球及び無核網状赤血球（クラスターＩＩＩ）及び成熟赤血球（クラスターＩＶ）。図７Ｋ－７Ｐに示すように、サンプル中の各クラスターのパーセンテージ（％）の値を、そのクラスター内の細胞タイプの豊富さを示す指標として算出した。各治療コースにおける各動物の各サンプル（骨髄、脾臓）について、各細胞クラスター（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）の％値を以下のように算出した。ＷＴ（無処理）Ｎ＝９；ＩｇＧ２ｂアイソタイプコントロールで処置した疾患モデルＴｈ３／＋マウス（Ｔｈ３＋ｗ／ＭｏＩｇＧ２ｂ）、Ｎ＝５；ＭＷＴｘ－００３抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体で処置した疾患モデルＴｈ３／＋マウス（Ｔｈ３＋ｗ／ＭＷＴｘ－００３）Ｎ＝７とし、平均値を算出した。骨髄細胞で４週間後に、平均して、好塩基性赤芽球（Ｉ）は７．５８％（Ｔｈ３＋ｗ／ＭｏＩｇＧ２ｂ）→６．５２％（Ｔｈ３＋ｗ／ＭＷＴｘ－００３）にシフトし（ＷＴに対して７．９６％）、多色性赤芽球（ＩＩ）は５４．２０％（Ｔｈ３＋ｗ／ＭｏＩｇＧ２ｂ）→４０．０１％（Ｔｈ３＋ｗ／ＭＷＴｘ－００３）（ＷＴに対して２８．５３％）にシフトし、、正染性赤芽球及び無核網状赤血球（ＩＩＩ）は２４．０６％（Ｔｈ３＋ｗ／ＭｏＩｇＧ２ｂ）→２９．７３％（Ｔｈ３＋ｗ／ＭＷＴｘ－００３）にシフトし（ＷＴに対して２６．６７％）、成熟赤血球（ＩＶ）は４．５４％（Ｔｈ３＋ｗ／ＭｏＩｇＧ２ｂ）→１６．４４％（ＷＴに対して２７．６６％）にシフトした。脾臓で４週間後に、平均して、好塩基性赤芽球（Ｉ）は０．７１％（Ｔｈ３＋ｗ／ＭｏＩｇＧ２ｂ）→０．９１％（Ｔｈ３＋ｗ／ＭＷＴｘ－００３）にシフトし（ＷＴに対して０．４６％）、多色性赤芽球（ＩＩ）は４５．７６％（Ｔｈ３＋ｗ／ＭｏＩｇＧ２ｂ）→１９．２５％（Ｔｈ３＋ｗ／ＭＷＴｘ－００３）（ＷＴに対して１２．２３％）にシフトし、、正染性赤芽球及び無核網状赤血球（ＩＩＩ）は３１．１６％（Ｔｈ３＋ｗ／ＭｏＩｇＧ２ｂ）→２８．７２％（Ｔｈ３＋ｗ／ＭＷＴｘ－００３）にシフトし（ＷＴに対して８．６７％）、成熟赤血球（ＩＶ）は１４．１３％（Ｔｈ３＋ｗ／ＭｏＩｇＧ２ｂ）→４４．３８％（Ｔｈ３＋ｗ／ＭＷＴｘ－００３）（Ｗｔに対して７２．１７％）にシフトした。これらの結果を、骨髄については図７Ｑに、脾臓については図７Ｒに、それぞれ棒グラフで示す。

【0104】

Ｔｈ３／＋マウスでは、ＭＷＴｘ－００３抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体による処置により、無効造血が改善し、かなりの割合の赤芽球が赤血球に分化・成熟した。

【0105】

実施例８：抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体エピトープビニング
ＭＷＴｘ－００１（図８Ａ）、ＭＷＴｘ－００２（図８Ｂ）及びＭＷＴｘ－００３（図８Ｃ）抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体のエピトープビニングにＯＣＴＥＴ（登録商標）ＲＥＤ９６ｅを使用した。まず、ｅｃｔｏ－ＴＭＰＲＳＳ６－ＦＬＡＧ（上述の通り）をＢｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｂｃａｍ）によりビオチンで標識した。事前に水和されたストレプトアビジン（ＳＡ）バイオセンサーを１ｘ ＫＢ（上述の通り）で６０秒間平衡化し第１のベースラインとした後、１０ｍｇ／ｍｌのビオチン化ｅｃｔｏ－ＴＭＰＲＳＳ６－ＦＬＡＧを３００秒間ＳＡバイオセンサーにロードした。次に、１ｘＫＢ中の５０ｍｇ／ｍｌの抗体（ＭＷＴｘ－００１、図８Ａ；ＭＷＴｘ－００２、図８Ｂ；ＭＷＴｘ－００３、図８Ｃ）で６００秒間飽和する前に、第２のベースライン信号を６０秒間確立させた。最後に、１ｘＫＢ中の５０μｇ／ｍｌのＭＷＴｘ－００１、ＭＷＴｘ－００２、又はＭＷＴｘ－００３で３００秒間飽和する前に、第３のベースライン信号を６０秒間確立させた。ＭＷＴｘ－００１抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体のｅｃｔｏ－ＴＭＰＲＳＳ６－ＦＬＡＧに対する結合は、ＭＷＴｘ－００２抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体又はＭＷＴｘ－００３抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体と競合しなかった（図８Ａ）。ＭＷＴｘ－００２抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体のｅｃｔｏ－ＴＭＰＲＳＳ６－ＦＬＡＧに対する結合は、ＭＷＴｘ－００１抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体と競合しなかったが、ＭＷＴｘ－００３抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体と競合した（図８Ｂ）。ＭＷＴｘ－００３抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体のｅｃｔｏ－ＴＭＰＲＳＳ６－ＦＬＡＧに対する結合は、ＭＷＴｘ－００１抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体と競合しなかったが、ＭＷＴｘ－００２抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体と競合した（図８Ｃ）。データ解析は、Ｏｃｔｅｔ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ＨＴ Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて行った。アソシエーションシグナルは図８Ｄにまとめられている。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図2F】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図3F】

【図3G】

【図3H】

【図3I】

【図3J】

【図3K】

【図3L】

【図3M】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図4F】

【図4G】

【図4H】

【図4I】

【図4J】

【図4K】

【図4L】

【図4M】

【図4N】

【図4O】

【図4P】

【図4Q】

【図4R】

【図4S】

【図4T】

【図4U】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図5E】

【図5F】

【図5G】

【図5H】

【図5I】

【図5J】

【図5K】

【図5L】

【図5M】

【図5N】

【図5O】

【図5P】

【図5Q】

【図5R】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図6E】

【図6F】

【図6G】

【図6H】

【図6I】

【図6J】

【図6K】

【図6L】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図7E】

【図7F】

【図7G】

【図7H】

【図7I】

【図7J】

【図7K】

【図7L】

【図7M】

【図7N】

【図7O】

【図7P】

【図7Q】

【図7R】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【配列表】

2023520969000001.app

【国際調査報告】