特表 2023-521017 食品着色剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-05-23

(54)【発明の名称】食品着色剤

(51)【国際特許分類】

   A23L 5/46 20160101AFI20230516BHJP

   A23L 13/00 20160101ALI20230516BHJP

   A23L 17/00 20160101ALI20230516BHJP

   A23J 3/00 20060101ALI20230516BHJP

   A23J 3/16 20060101ALI20230516BHJP

   A23J 3/18 20060101ALI20230516BHJP

   A23J 3/20 20060101ALI20230516BHJP

【ＦＩ】

A23L5/46

A23L13/00 D

A23L17/00

A23J3/00 507

A23J3/00 505

A23J3/00 502

A23J3/16

A23J3/18

A23J3/20

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022560043

(86)(22)【出願日】2021-03-31

(85)【翻訳文提出日】2022-11-22

(86)【国際出願番号】 AU2021050296

(87)【国際公開番号】W WO2021195708

(87)【国際公開日】2021-10-07

(31)【優先権主張番号】2020900989

(32)【優先日】2020-03-31

(33)【優先権主張国・地域又は機関】AU

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522385485

【氏名又は名称】ブイ２フード・プロプライエタリー・リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ｖ２ｆｏｏｄ Ｐｔｙ Ｌｔｄ

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100122301

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 憲史

(74)【代理人】

【識別番号】100157956

【弁理士】

【氏名又は名称】稲井 史生

(74)【代理人】

【識別番号】100170520

【弁理士】

【氏名又は名称】笹倉 真奈美

(74)【代理人】

【識別番号】100221545

【弁理士】

【氏名又は名称】白江 雄介

(72)【発明者】

【氏名】レイネス，ジャレッド

(72)【発明者】

【氏名】ヘイゼル，ニコラス

(72)【発明者】

【氏名】ラルフ，ピーター

(72)【発明者】

【氏名】ペルニス，マチュー

【テーマコード（参考）】

4B018

4B042

【Ｆターム（参考）】

4B018LB05

4B018LB06

4B018LE01

4B018LE06

4B018MA08

4B018MC01

4B018MD20

4B018MD57

4B018MF01

4B018MF04

4B018MF07

4B042AC02

4B042AD20

4B042AD36

4B042AE02

4B042AE03

4B042AG02

4B042AG03

4B042AG07

4B042AH01

4B042AK06

4B042AK07

4B042AK10

4B042AK13

4B042AK16

4B042AK20

4B042AP02

4B042AP15

4B042AP21

4B042AP22

(57)【要約】

本開示は、食品着色剤に関する。特に、本開示は、擬似肉および代用肉食品などの食品に使用される着色剤および／または金属イオン担体として、並びにそのための成分として、フィコビリタンパク質、例えば、フィコエリスリンなどの直鎖状テトラピロール含有化合物を使用することに関する。本開示はまた、前記着色剤および／または金属担体を含む、擬似肉および代用肉食品などの食品、並びにそのための成分にも関する。
【選択図】図５

【特許請求の範囲】

【請求項1】

一つ以上のフィコビリタンパク質を含む擬似肉食品であって、前記一つ以上のフィコビリタンパク質が前記食品にピンクまたは赤色を視覚的に与えるのに十分な量であり、前記食品が、約５０～９５℃の範囲の内部温度への前記食品の調理時に視覚的色変化をもたらす、食品。

【請求項2】

前記視覚的色変化が、約６０～８５℃の範囲の内部温度への、前記食品の調理時に生じる、請求項１に記載の擬似肉食品。

【請求項3】

前記一つ以上のフィコビリタンパク質が、ｗ／ｗベースで、すべてのフィコビリタンパク質の、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％もしくは少なくとも９０％、または少なくとも９９％の量で、フィコエリスリンを含む、請求項１または２に記載の擬似肉食品。

【請求項4】

前記一つ以上のフィコビリタンパク質が、藻類原料からの抽出物、精製されたか、または少なくとも部分的に精製された分離物の形態で存在する、請求項１から３のいずれか１項に記載の擬似肉食品。

【請求項5】

前記藻類原料が、紅藻綱（Rhodophyceae）、藍藻綱（Cyanophyceae）およびクリプト藻綱（Cryptophyceae）から選択される種である、請求項４に記載の擬似肉食品。

【請求項6】

前記フィコビリタンパク質が、鉄にキレートしている、好ましくは鉄にキレートしたフィコエリスリンである、請求項１から５のいずれか１項に記載の擬似肉食品。

【請求項7】

前記一つ以上のフィコビリタンパク質が、全藻または粉砕された藻類の形態で存在する、請求項１から３のいずれか１項に記載の擬似肉食品。

【請求項8】

前記藻類が、紅藻綱（Rhodophyceae）、藍藻綱（Cyanophyceae）およびクリプト藻綱（Cryptophyceae）から選択される種である、請求項７に記載の擬似肉食品。

【請求項9】

前記藻類原料または藻類が、チノリモ属の種（Porphyridium sp.）、ロドカエテ属の種（Rhodochaete sp.）、ベニマダラ属の種（Hildenbrandia sp.）、ホシノイト属の種（Erythrotrichia sp.）、ロデラ属の種（Rhodella sp.）、ロドソルス属の種（Rhodosorus sp.）、アルスロスピラ属の種（Arthrospira sp.）、フレミエラ属の種（Fremyella sp.）またはロドモナス属の種（Rhodomonas sp.）から選択される、請求項５から８のいずれか１項に記載の擬似肉食品。

【請求項10】

前記藻類原料または藻類が、ロドモナス・サリナ（Rhodomonas salina）、好ましくはロドモナス・サリナ ＣＳ－１７４（Rhodomonas salina, CS-174）である、請求項９に記載の擬似肉食品。

【請求項11】

前記フィコビリタンパク質が、約５０～９５℃の範囲でλ_ｍａｘの５０％吸光度減少を示す、請求項１から１０のいずれか１項に記載の擬似肉食品。

【請求項12】

前記フィコビリタンパク質が、約６０～８５℃の範囲でλ_ｍａｘの５０％吸光度減少を示す、請求項１１に記載の、生の擬似肉食品。

【請求項13】

λ_ｍａｘが、約５４０～５７０ｎｍの範囲内である、請求項１１または１２に記載の擬似肉食品。

【請求項14】

前記フィコビリタンパク質が、フィコエリスリンであって、少なくとも１：１、好ましくは少なくとも３：１、または少なくとも７：１、あるいは少なくとも１０：１の５４０～５７０ｎｍ対４９５～５０３ｎｍ ＵＶ／可視吸光度ピーク比を示し、好ましくは５４０～５７０ｎｍの、より好ましくは５５０～５６５ｎｍのシングルピークのみを示す、請求項１から１３のいずれか１項に記載の擬似肉食品。

【請求項15】

前記藻類が、乾燥重量ベースで０．１から２０％ ｗ／ｗ、好ましくは０．１から１０％ ｗ／ｗ、より好ましくは約０．１から５％ ｗ／ｗの量で含まれる、請求項７から１４のいずれか１項に記載の擬似肉食品。

【請求項16】

前記藻類が、約１～１５０ｍｇ／ｇ乾燥重量、好ましくは５～５０ｍｇ／ｇでフィコエリスリンを含有する、請求項７から１５のいずれか１項に記載の擬似肉食品。

【請求項17】

前記藻類が、湿っていても乾燥していてもよい、全藻または粉砕された藻類として含まれる、請求項１５または１６に記載の擬似肉食品。

【請求項18】

前記藻類が、約０．１％ ｗ／ｗから約９５％ ｗ／ｗの水または培地中濃度を有する湿潤バイオマスとして添加される、請求項１７に記載の擬似肉食品。

【請求項19】

非動物性タンパク質源、一つ以上の炭水化物、一つ以上の油脂、一つ以上の香味成分および水を含む、請求項１から１８のいずれか１項に記載の擬似肉食品。

【請求項20】

タンパク質源が、ダイズ、ソラマメ、エンドウ、コムギ、ヒヨコマメおよびリョクトウタンパク質から選択される植物性タンパク質であることを特徴とする、請求項１から２０のいずれか１項に記載の擬似肉食品。

【請求項21】

鶏肉、牛肉、ラム、子牛肉、豚肉、ヤギ肉、カンガルー肉または魚肉／シーフード擬似食品である、請求項１から１９のいずれか１項に記載の擬似肉食品。

【請求項22】

ひき肉もしくは刻み肉食品、または成型肉もしくは成形肉食品である、請求項１から２１のいずれか１項に記載の擬似肉食品。

【請求項23】

約５０～９５℃、好ましくは６０～８５℃の範囲の内部温度に調理された、請求項１から２２のいずれか１項に記載の擬似肉食品。

【請求項24】

請求項１から２３のいずれか１項に記載の擬似肉食品の調製における、一つ以上のフィコビリタンパク質の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、食品着色剤に関する。特に、本開示は、擬似肉および代用肉食品などの食品に使用される着色剤および／または金属イオン担体として、並びにそのための成分として、フィコビリタンパク質、例えば、フィコエリスリンなどの直鎖状テトラピロール含有化合物を使用することに関する。本開示はまた、前記着色剤を含む、擬似肉および代用肉食品などの食品、並びにそのための成分にも関する。

【背景技術】

【0002】

２０５０年までに９７億人に到達すると推定される、増え続ける世界人口に食料を提供する必要に伴って、世界の食料源の動物由来成分のバランスを取り戻し、持続可能なフードシステムおよび食料の増加ならびに栄養安全保障を達成する必要がある。肉食品の植物由来代替品は、消費者の食習慣の変化により、市場の成長を見せる。ますます、消費者は、食料生産システムが環境、気候変動および動物倫理に及ぼす影響に関心を持ち、このことは、彼らが食料購入について行う選択に影響を与える。ヴィーガン、ベジタリアン、および動物性の肉を食べるが、その消費を減らしている人（リデュースタリアンまたはフレキシタリアン）は、完全にまたは実質的に非動物性食品で作られた代替肉の需要を掻き立てている。

【0003】

１９６０年代以来、押出技術を用いて大豆粉または大豆濃縮物から調製される組織化大豆タンパク質食品は、ミンチ肉またはひき肉に取って代わって普及してきた。さらに最近では、他の非動物性タンパク質源、例えばマイコプロテイン、きのこ、マメ科植物（例えばエンドウ、ルピナス、マメ）およびコムギなどもまた、代用肉または擬似肉食品に加工されている。

【0004】

しかしながら、動物性の肉は、タンパク質構造および線維の複雑なマトリックスを含み、その中に脂質、炭水化物、水および他の分子が閉じ込められ、それらは、生の状態および調理された状態のどちらにおいても、肉を含む食品の感覚的、触感的および構造的特徴（例えば外観、風味、噛み応え、ジューシーさ）に寄与する。消費者は、環境保護または倫理上の理由のために、肉の消費を進んで削減するか、または減らしているかもしれないが、多くの人は、「肉の体験」を再現する、すなわち外観、風味および食感などの感覚的観点においてだけでなく、保存、処理および調理などの物理的観点においても動物性の肉のように見せ、振る舞う代用肉食品をいまだに好む。調理および食事の準備の方法は、深く文化的に根付いており、急激な変化に対して非常に抵抗性がある。動物性の肉が持つ複雑な構造的および分子的組成を考えると、非動物由来の代用肉食品が生および調理された動物性の肉の特徴を模倣または再現できるように様々な特徴を再構築することは、困難なままである。

【0005】

再現することが望ましい特徴の１つは、生（未調理）および調理済みの状態の両方における、代用肉または擬似肉食品の外観、特に色に関連する。生の動物性の肉、例えば鶏肉、牛肉、ラムまたは豚肉などは、ヘモグロビンおよびミオグロビン（脊椎動物の血液中の酸素運搬を担う、鉄と酸素が結合する複合タンパク質）の存在により、一般にピンク色または赤色をしている。しかしながら、調理時、例えば、約６０～８０℃の温度で、これらのタンパク質は変性し、肉は色が変化し、生の状態のピンクまたは赤色を失って、一般に白色、褐色および／または灰色になる。これは、料理をする人にとっての視覚的な指標を提供し、調理済みの製品の望ましい風味および／または食感を達成するための加熱時間を導く助けとなり、状況によっては、熱処理に関連する食品の安全性の指標になる。

【0006】

ピンクまたは赤色を擬似肉または代用肉食品につけるために現在使用されている１つの選択肢は、ビートルートおよびラディッシュ抽出物などの植物由来の着色剤である。しかしながら、これにより、生の状態の擬似肉または代用肉食品については、動物性の肉に似たピンクまたは赤色を呈する食品が得られるが、調理したときに白色/褐色/灰色に変化する、代用肉または擬似肉食品の視覚的体験は達成されない。調理時に認識可能な色変化がないため、料理をする人が、望ましい調理済みの色を達成しようとして肉を焼き過ぎることがある。動物性の肉を調理したときに見られる色変化に似た視覚的な振る舞いをする、代用肉および擬似肉食品の着色剤が、依然として求められる。

【0007】

フィコビリタンパク質（ＰＢＰｓ）は、高い水溶性を持つ蛍光タンパク質で、シアノバクテリア（藍藻）、紅藻類（紅藻植物門）などの特定の真核微細藻類および大型藻類、いくつかのクリプト植物および渦鞭毛藻類に見られ、直鎖状テトラピロール発色団（ビリンとして知られる）に共有結合したタンパク質鎖を含む。それらはフィコビリソームと呼ばれる膜外超分子構造に会合し、光エネルギーの捕集および伝達のためのアンテナとして作用することで集光性色素としてはたらき、そうでなければクロロフィルに到達できない。

【0008】

フィコビリソームを構成するフィコビリタンパク質は、２つの構造的に異なるユニット：コアおよびロッドに配置され、それらはαβサブユニットの三量体（コア）または六量体（ロッド）のディスクが積み重なってできたシリンダーを含む。αβサブユニットは、それ自身が、吸光特性をもたらす直鎖状（非環状）テトラピロール発色団に共有結合しているαおよびβポリペプチド鎖（それぞれ、およそ１６０～１８０アミノ酸残基）から成るヘテロ二量体である。

【0009】

その吸収特性に基づき、フィコビリタンパク質は一般に、４つのサブクラス：青色のフィコシアニン（典型的なλ_ｍａｘ＝６１０～６２０ｎｍ）、深紅/ピンク色のフィコエリスリン（典型的なλ_ｍａｘ＝５４０～５７０ｎｍ）、青緑色のアロフィコシアニン（典型的なλ_ｍａｘ＝６５０～６５５ｎｍ）および頻繁には見られないがマゼンタ色のフィコエリスロシアニン（典型的なλ_ｍａｘ＝５６０～６００ｎｍ）に分類される。フィコビリタンパク質は、その由来に応じて、接頭辞によりさらに分類されることがあり、例えば、Ｃはシアノバクテリア、Ｒは紅藻植物門、Ｂはウシケノリ目であるが、特定のフィコビリタンパク質の種類が、常に特定の分類群に限定されるとは限らない。

【0010】

いくつかの典型的な吸光度および発光値の例が、以下の表１に示される。

【表1】

【0011】

これらの性質をもたらす４種類の発色団は、フィコエリスロビリン（ＰＥＢ）、フィコウロビリン（ＰＵＢ）、フィコシアノビリン（ＰＣＢ）およびフィコビリビオリン（ＰＸＢ）である（以下のスキーム１を参照－ジスルフィド結合を介してペプチドに結合している状態で図示）。π電子共役の違いが、その吸収特性および色に関与する。

【化1】

【0012】

科学文献にはフィコビリタンパク質の特徴が充実しており、いくつかの共通点が、サブクラスの間で見られることがある。フィコエリスロシアニンは、三量体（αβ）_３または六量体（αβ）_６型で存在し、ＰＸＢ発色団がαポリマー鎖に結合しており、２つのＰＣＢ発色団がβ鎖に結合している。アロフィコシアニンは三量体型であり、αおよびβサブユニットの両方が、それぞれ１つのＰＣＢ発色団を保持している。フィコシアニンは、三量体または六量体型で存在することがあり、αサブユニットが１つのＰＣＢ発色団を保持しており、種によって、βサブユニット上に２つのＰＣＢ発色団または１つのＰＣＢおよび１つのＰＥＢ発色団がある。ｂ－フィコエリスリンおよびＣ－フィコエリスリンは、αβサブユニットのオリゴマー型（ｎ、３または６）で存在し、αサブユニットが２つのＰＥＢ発色団を保持しており、βサブユニットが３（ｂ－）または４（Ｃ－）つのＰＥＢ発色団を有している。Ｒ－フィコエリスリンおよびＢ－フィコエリスリンは、紅藻類（紅色植物門）に見られる最も豊富な種類で、一般に六量体αβサブユニットおよびさらにγが結合したサブユニット：（αβ）_６γを含む。Ｒ－およびＢ－型の両方のαサブユニットは２つのＰＥＢ発色団を保持する一方で、βサブユニットは２つのＰＥＢ発色団および１つのＰＵＢ発色団（Ｒ－フィコエリスリン）または３つのＰＥＢ発色団（Ｂ－フィコエリスリン）を有する。Ｒ－フィコエリスリンのγサブユニットは２つのＰＥＢ発色団および２つのＰＵＢ発色団を有する一方で、Ｂ－フィコエリスリンのγサブユニットは４つのＰＵＢ発色団を有する。(Ｄｕｍａｙ, Ｊ. ｅｔ ａｌ, Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎｓ：Ｖａｌｕａｂｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｉｃ Ｐｉｇｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｒｅｄ Ｓｅａｗｅｅｄｓ、第１１章、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｂｏｔａｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第７１巻、３２１～３４３ページ、２０１４年、エルゼビア社、およびその中で引用される参考文献；並びにＪｉａｎｇ, Ｔ., ｅｔ ａｌ, ＰＲＯＴＥＩＮＳ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ, Ｆｕｎｃｔｉｏｎ, ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３４：２２４～２３１（１９９９）およびその中で引用される参考文献)。

【0013】

上記にかかわらず、分光学的な違いは、フィコエリスリンなどの、同じ種類のフィコビリタンパク質の間でさえ観察される。例えば、フィコエリスリン同士の分光学的な違いは、ＰＥＢおよびＰＵＢ発色団の含有量および比率を反映し（例えば、Ｋｌｏｔｚ Ａ. Ｖ., ａｎｄ Ｇｌａｚｅｒ, Ａ. Ｎ, Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ, ２６０, ４８５６－４８６３, １９８５を参照）、その他、様々な紅色植物門の種から精製してきたフィコエリスリンは、異なるＵＶ可視吸収スペクトル特性を示すことがあるということが示されている。（例えば、Ｒｅｎｎｉｓ, Ｄ. Ｓ., ａｎｄ Ｆｏｒｄ, Ｔ. Ｗ., Ａ ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎｓ ｏｆ ｖａｒｉｏｕｓ ｒｅｄ ａｌｇａｌ （Ｒｈｏｄｏｐｈｙｔａ） ｓｐｅｃｉｅｓ, Ｐｈｙｃｏｌｏｇｉｃａ, （１９９２）, ３１, １９２－２０４)；およびＭａ, Ｊ, ｅｔ ａｌ, Ｎａｔｕｒｅ, ２０２０, ５７９, １４６－１５１を参照）。特に、いくつかのフィコエリスリンは、およそ４９５～５０３ｎｍおよび５４０～５７０ｎｍで吸光度ピークを示す一方、いくつかの種から抽出してきたフィコエリスリンは、ＵＶ可視スペクトル中で、およそ４９５～５０３ｎｍにおけるピークの減少または消失を示すことが明らかになっている（Ｒｅｎｎｉｓ ａｎｄ Ｆｏｒｄ, ｓｕｐｒａ,１９７ページ、図１；およびＭａ ｅｔ ａｌ, ｓｕｐｒａ, Ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｄａｔａ 図１を参照）。フィコエリスリンなどのフィコビリタンパク質の、α、βおよびγサブユニットのそれぞれもまた、異なる吸光度特性を有することがあり（Ｔａｍａｒａ ｅｔ ａｌ, Ｃｈｅｍ ５, １３０２-１３１７, ２０１９を参照）、そのためフィコエリスリン同士の分光学的な違いに寄与することがある。その他、Ｃ－フィコエリスリン（Ｓｃｈｉｚｏｔｈｒｉｘ ｃａｌｉｃｏｌａ）は、可視領域中の５６５ｎｍ（ＰＥＢ）で大きな吸収極大を示し、Ｒ－フィコエリスリン（Ｃｅｒａｍｉｕｍ ｒｕｂｒｕｍ）は、可視領域中の５６７ｎｍ（ＰＥＢ）＞５３８ｎｍ（ＰＥＢ）＞４９８（ＰＵＢ）で大きな吸収極大を示し、Ｂ－フィコエリスリン（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ ｃｒｕｅｎｔｕｍ）は、可視領域中の５４５ｎｍ（ＰＥＢ）＞５６３ｎｍ（ＰＥＢ）＞４９８（Ｓ）（ＰＵＢ）で大きな吸収極大を示すことが報告されている（Ｇｌａｚｅｒ, Ａ. Ｎ., ａｎｄ Ｈｉｘｓｏｎ, Ｃ. Ｓ., Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ, ２５０, ５４８７－５４９５, １９７５）。

【0014】

それゆえ、フィコビリタンパク質のタンパク質サブユニットおよび発色団の正確な数および性質（それゆえ、フィコビリタンパク質の吸光度スペクトル特性）、ならびに産生量は、種に依存的であり、生育条件（例えば光、温度、栄養素、ｐＨなど）によりさらに影響されることがあり、したがって、単一のフィコビリタンパク質サブクラスの間でさえ、物理的および分光学的特性の違いが生じることがある。

【0015】

フィコビリタンパク質は強い蛍光特性を示し、蛍光ベースの技術およびイムノアッセイなど、バイオテクノロジーに多く応用される。それらは食品産業で食品着色剤としても使用され、スピルリナ（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）由来のフィコシアニンは、（例えばガム、ソルベ、アイスクリーム、キャンディ、ソフトドリンクおよび乳製品に）青色着色剤として使用され、Ｐ．ｃｒｕｅｎｔｕｍから抽出されるＢ－およびｂ－フィコエリスリンは、ゼリーデザートおよび乳製品に赤色着色剤として使用されると
報告されている（Ｄｕｍａｙ, Ｊ. ｅｔ ａｌ ｓｕｐｒａ）。

【発明の概要】

【0016】

現在、驚くべきことに、特定のフィコビリタンパク質、（例えばフィコエリスリン）は、擬似肉または代用肉食品などの調理される食品中に存在する場合、動物性の肉の調理中に生じるのと似た色変化、例えば赤色またはピンク色（「生」の状態）から白色、褐色および／または灰色（「調理済み」）への色変化を視覚的にもたらし得ることが発見されている。フィコビリタンパク質、例えばフィコエリスリンなどの、擬似肉および代用肉食品における着色剤としての使用は、それゆえ、動物性の肉の調理を模倣した視覚的な色の調理体験を消費者に提供し得る。

【0017】

第一の態様において、一つ以上のフィコビリタンパク質を含む擬似肉食品であって、前記一つ以上のフィコビリタンパク質が前記食品にピンクまたは赤色を視覚的に与えるのに十分な量であり、前記食品が、約５０～９５℃、例えば約６０～８５℃などの範囲の内部温度への前記食品の調理時に視覚的色変化をもたらす、食品が提供される。

【0018】

もう一つの態様は、擬似肉食品の製造における一つ以上のフィコビリタンパク質の使用であって、前記一つ以上のフィコビリタンパク質が、前記食品に視覚的なピンクまたは赤色を与え、その後、約５０～９５℃、例えば約６０～８５℃などの範囲の内部温度への前記食品の調理時に視覚的色変化をもたらすのに十分な量で前記食品中に含まれる、使用を提供する。

【0019】

もう一つの態様は、調理済みの、本開示の擬似肉食品を提供する。

【0020】

上記のいくつかの実施形態において、前記一つ以上のフィコビリタンパク質は、少なくともフィコエリスリン、例えばＲ－フィコエリスリンおよび／またはＢ－フィコエリスリンおよび／またはＣ－フィコエリスリンおよび／またはｂ－フィコエリスリンなどを含む。さらなる実施形態において、前記一つ以上のフィコビリタンパク質は、フィコシアニン、アロフィコシアニン、およびフィコエリスロシアニンのうちの一つ以上をさらに含む。さらなる実施形態において、フィコエリスリンは、前記一つ以上のフィコビリタンパク質の少なくとも重量５０％、例えば少なくとも８０％、９０％または９５％を含む。さらなる実施形態において、前記一つ以上のフィコビリタンパク質は、本質的にフィコエリスリンからなる。

【0021】

いくつかの実施形態において、λ_ｍａｘの５０％吸光度の減少がフィコビリタンパク質について認められる前記温度は、約５０～９５℃の範囲内であり、より好ましくは約６０～８５℃の範囲内である。さらなる実施形態において、前記λ_ｍａｘは、約５４０～５７０ｎｍ、例えば約５４５～５６５ｎｍ、または５５０～５６０ｎｍの範囲内である。他の実施形態において、前記λ_ｍａｘは、約４９５～５０３ｎｍの範囲内である。

【0022】

いくつかの実施形態において、フィコエリスリンは、一つ以上の適当な藻類種から得られることがあり、前記食品中に、抽出されたか、精製されたか（例えば少なくとも純度９０％、９５％または９９％）、または少なくとも部分的に精製された形態（例えば純度５０％以上、例えば純度６０％、７０％または８０％以上）で含まれる。いくつかの実施形態において、前記一つ以上のフィコビリタンパク質は、前記食品中に藻類形態として含まれ、全藻として含まれていても粉砕された藻類として含まれていてもよく、湿っていても（例えば水中、液体中または凍結状態の、ペースト、懸濁液またはスラリーとして）乾燥していても（例えば熱、蒸発または凍結乾燥により乾燥させた）よい。

【0023】

上に記載される任意の一つ以上の態様または実施形態において、前記擬似肉食品は、非動物性タンパク質源、一つ以上の炭水化物、一つ以上の油脂（好ましくは植物由来、すなわち非動物性）、一つ以上の香味成分および水を含む。他の成分、例えば増粘剤、結合剤および防腐剤などが添加されることがある。さらなるその実施形態において、前記擬似肉食品は、組織化大豆タンパク質などの大豆タンパク質またはソラマメ、エンドウ、コムギ、ヒヨコマメおよびリョクトウなどの他の植物性タンパク質を含む。

【0024】

上に記載される任意の一つ以上の態様または実施形態において、前記擬似肉食品は、鳥肉（例えば鶏肉）、牛肉、子牛肉、ラム、豚肉、ヤギ肉、カンガルー肉、または魚肉/シーフード擬似肉食品であることがある。いくつかのさらなる実施形態において、前記肉食品は、ひき肉の擬似肉食品である。

【0025】

特定のフィコビリタンパク質、例えばフィコエリスリンなどは、鉄（Ｆｅ）などの金属イオンとキレートし、フェリチン産生を上昇させる能力を有し、それゆえ食品における金属イオン送達、特に栄養的利点としての鉄送達の簡便な機構を提供することもあることが発見されている。それゆえ、上に記載される、一つ以上の態様または実施形態において、前記一つ以上のフィコビリタンパク質は、鉄Ｆｅ^２＋またはＦｅ^３＋などの金属イオンにキレートしているか、または配位していることがある。いくつかの実施形態において、前記金属イオンは、前記擬似肉食品混合物に添加する前に、前記金属イオン（例えば、溶液として）を前記フィコビリタンパク質と予混合することで、前記少なくとも一つのフィコビリタンパク質と予め配位されることがある。他の実施形態において、前記金属イオン（例えば、溶液として）および前記一つ以上のフィコビリタンパク質は、前記擬似肉食品混合物に別々の成分として、同時にまたは連続的に添加されることがある。

【図面の簡単な説明】

【0026】

【図1】図１は、１００μＬの精製したフィコエリスリンサンプルを２５～９５℃で加熱することで得た、ＤＳＦ蛍光シグナルを示す。

【図2】図２は、９５℃で６分間加熱する前後における、フィコエリスリン抽出物のＵＶ/ＶＩＳ吸光度スペクトルを示す。

【図3】図３は、チノリモ、カギケノリ、カギノリおよび野生の紅藻から得た、精製したフィコエリスリン抽出物のＵＶ/ＶＩＳ吸光度スペクトルを示す。

【図4】図４は、２０～９５℃、５３６ｎｍにおける、チノリモ、カギケノリ、カギノリおよび野生の紅藻から得たフィコエリスリン抽出物の熱変性を示す。

【図5】図５は、培地中で培養したロドモナス・サリナ微細紅藻類バイオマスから調製したフィコエリスリン抽出物（２０℃から９５℃で加熱する前後）の室温におけるＵＶ/ＶＩＳ吸光度スペクトルを示す。

【図6】図６は、培地中で培養したロドモナス・サリナ微細紅藻類から得たフィコエリスリン抽出物の、２０～９５℃、５５０ｎｍにおける温度走査を示す。

【図7】図７は、塩化鉄（ＩＩ）濃度を増加させたフィコエリスリン抽出物の蛍光発光スペクトルを示す。

【発明を実施するための形態】

【0027】

本明細書および添付の請求項を通して、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「含む（comprise）」という語、並びに「含む（comprises）」および「含む（comprising）」などのバリエーションは、示される整数またはステップまたは整数群の包含を意味するが、任意の他の整数またはステップまたは整数群または一群のステップの除外を意味しないと理解されるであろう。

【0028】

本明細書および添付の請求項を通して、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「本質的に～からなる（consisting essentially of）」という言葉、および「本質的に～からなる（consists essentially of）」などのバリエーションは、列挙される要素が本質的である、すなわち本発明の必要な要素であることを示すと理解されるであろう。その言葉は、本発明の特徴に実質的に影響を及ぼさない、他の列挙されていない要素の存在を許容するが、定義される発明の基本的かつ新規の特徴に影響を及ぼすであろう追加の不特定要素を除外する。

【0029】

本明細書における、任意の先行出版物（もしくはそこから得られる情報）、または既知である任意の事柄への参照は、その先行出版物（もしくはそこから得られる情報）または既知の事柄が、本明細書が関連する試みの範囲における通常の一般的知識の一部を形成することの認容または承認またはいかなる形の示唆であると解釈されないし、されるべきでない。

【0030】

「一つの（a）」、「一つの（an）」および「その（the）」という単数形は、文脈上明らかに別段の指示がない限り、複数形の態様を包含する。

【0031】

「発明」という用語は、本明細書に記載されるように、すべての態様、実施形態および実施例を包含する。

【0032】

本明細書で使用されるとき、「約」は、示される量、値またはパラメーターの２５％、２０％、１５％、１０％、５％または１～２％変化することがある量、値またはパラメーターについて言及し、少なくとも当技術分野の範囲内で受容される許容範囲を包含する。列挙される値の範囲または一覧を前置きする場合、それは、その範囲の上限および下限の両方ならびにその一覧の各要素に適用するよう意図されている。

【0033】

文脈上別段の指示がない限り、以下に記載される特徴は、本発明の任意の態様または実施形態に独立して適用することがある。

【0034】

本明細書で使用されるとき、擬似肉食品（ミートアナログ、代替肉または代用肉としても知られる）は、外観、味、食感、口当たり（湿り気、噛み応え、脂肪感など）、匂い、または構造、組織、保存、処理、および／もしくは調理などの他の物理的性質に関するものを含む、任意の一つ以上の物理的または感覚的因子において、動物由来の肉食品を模倣しているか、似ているか、または同じように振る舞う、非動物性タンパク質を含む食品を指す。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は植物由来であっても真菌由来であってもよい。いくつかの実施形態において、前記擬似肉食品は植物由来の食品である。

【0035】

いくつかの実施形態において、前記擬似肉食品は、非動物性タンパク質源を含み、動物源に由来するか、またはから得られる任意の成分を含有もしくは包含しないか、または実質的に含有もしくは包含しない（すなわち、約５％ ｗ/ｗ未満、例えば約４％ ｗ/ｗ未満、または約３％ ｗ/ｗ未満または約２％ ｗ/ｗ未満または約１％ ｗ/ｗ未満）。しかしながら、本開示はそのように限定されず、他の実施形態において、擬似肉食品またはそのための成分は、卵、カゼイン、乳清、筋肉、脂質、軟骨および結合組織、内臓または血液、あるいはその構成成分のうちのいずれか一つ以上を含む、一つ以上の動物由来成分をある割合で、例えば、食品成分または擬似肉食品の重量約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％または５０％の量で含有することがあるということが理解されるべきである。これは、幹細胞培養から培養させた細胞ベース肉を含有する培養擬似肉食品を包含することがある。

【0036】

本明細書で使用されるとき、「ピンク」または「赤」色は、生または未調理の擬似肉食品に関して使用される場合、鶏肉、豚肉、子牛肉またはヤギ肉などに対応するピンク色；サケ肉などに対応するピンク/橙色または赤/橙色；ラム、マトン、牛肉またはカンガルー肉などに対応する赤色など、対応する動物性の肉の形態に視覚的に類似するピンクまたは赤色を指す。

【0037】

本明細書で使用されるとき、「色変化」は、擬似肉食品の調理に関連して使用される場合、食品のピンク/赤みの視覚的な減少、および一つ以上のフィコビリタンパク質の変性を反映する、対応する白色、褐色、または灰色の出現を指す。

【0038】

「調理」および「調理済みの」という用語は、例えば、揚げる、オーブンで焼く、ローストする、網焼きにする、直火で焼く、ソテーする、丸焼きにする、蒸す、煮る、茹でる、電子レンジにかけるなどによる加熱を指す。いくつかの有利な実施形態において、前記少なくとも一つのフィコビリタンパク質は、同様の色変化が動物性の肉で生じる温度または温度範囲におおよそ対応する温度で、ピンクまたは赤色から白色、褐色、または灰色への色変化が観察されるように、熱的に変性する。いくつかの実施形態において、前記食品（例えば擬似肉または代用肉）は、少なくとも約５０～９５℃、例えば約５５～９０℃または約６０～８５℃などの範囲の内部温度に調理される。いくつかのさらなる実施形態において、前記食品は、約６０～６５℃、または約６５～７０℃、または約７０～７５℃または約７５～８０℃の範囲の内部温度に調理される。さらなる実施形態において、前記食品は、約６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４または８５℃の内部温度に調理されることがある。

【0039】

本開示において単独で、または一緒に使用される一つ以上のフィコビリタンパク質は、ピンクまたは赤の着色を生または未調理の擬似肉食品にもたらす。有利に、少なくとも一つ以上のフィコビリタンパク質は、視覚的にピンクまたは赤色である。それゆえ、上記のいくつかの実施形態において、前記一つ以上のフィコビリタンパク質は、少なくとも、一般に約５４０～５７０ｎｍの範囲で、例えば約５４０、５４５、５５０、５５５、５６０、５６５または５７０ｎｍなどでλ_ｍａｘを示し（ＰＥＢ発色団に起因する）、約４９５～５０３ｎｍの範囲で、例えば約４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０１、５０２または５０３ｎｍなどでピークまたはショルダーを適宜示す（ＰＵＢ発色団に起因する）フィコエリスリンを含む（Ｋｌｏｔｚ Ａ. Ｖ., ａｎｄ Ｇｌａｚｅｒ, Ａ. Ｎ., ｓｕｐｒａ）。フィコエリスリンの例には、Ｒ－フィコエリスリンおよび／またはＢ－フィコエリスリンおよび／またはＣ－フィコエリスリンおよび／またはｂ－フィコエリスリンが挙げられる。

【0040】

さらなる実施形態において、前記一つ以上のフィコビリタンパク質は、フィコエリスリンを包含し、フィコシアニン、アロフィコシアニン、およびフィコエリスロシアニンのうちの一つ以上をさらに含むことがある。それゆえ、いくつかの実施形態において、前記一つ以上のフィコビリタンパク質は、フィコエリスリンおよび少なくともフィコシアニンを包含することがある。いくつかの実施形態において、前記一つ以上のフィコビリタンパク質は、フィコエリスリンおよび少なくともアロフィコシアニンを包含することがある。いくつかの実施形態において、前記一つ以上のフィコビリタンパク質は、フィコエリスリンおよび少なくともフィコエリスロシアニンを包含することがある。いくつかのさらなる実施例において、前記一つ以上のフィコビリタンパク質は、フィコエリスリンおよび少なくとも２つの他のフィコビリタンパク質を包含することがある。そのいくつかの実施形態において、フィコエリスリンは、任意の他のフィコビリタンパク質、または全ての他のフィコビリタンパク質と比較して、（ｗ/ｗベースで）支配的な量で存在し、例えば前記一つ以上のフィコビリタンパク質は、少なくとも５０％、または少なくとも５５％、または少なくとも６０％、または少なくとも６５％、または少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％または１００％のフィコエリスリンを含む。

【0041】

微細（単細胞）および大型（多細胞）藻類は、都合の良いフィコビリタンパク質の源を提供し得る。適当な源は、例えば：アルスロスピラ属（スピルリナ属）の種、およびアナベナ属の種（Anabaena sp）などのシアノバクテリア（藍藻綱）；オゴノリ属の種（Gracilaria sp）およびチノリモ属の種などの紅藻（紅藻類－紅藻綱）；並びにロドモナス属の種（例えばロドモナス・サリナ）などのクリプト植物（クリプト藻綱）であることがある。フィコビリタンパク質、例えばフィコエリスリンなどの源は、天然に存在する種または遺伝子組み換えの種を包含する。フィコビリタンパク質、例えばフィコエリスリンなどは、組み換え技術および当技術分野で既知の方法によって得られることもある。大量のフィコエリスリンを天然に産生しない藻類種は、それでもフィコエリスリンの適当な源を提供することがある。例えば、アルスロスピラ属の種などの種は、適切な生育条件とともに突然変異誘発および指向性進化によって、フィコエリスリンの産生量が上昇する。

【0042】

少なくとも一つ以上のフィコビリタンパク質は、単一の源、または源の組み合わせに由来することがある。一例として、赤色のフィコエリスリンは、一つ以上の紅藻および／またはシアノバクテリアおよび／またはクリプト植物の源から得られることがあり、異なる源から得た一つ以上の他の、同一のまたは異なるフィコビリタンパク質と適宜組み合わせられることがある。

【0043】

フィコビリタンパク質産生生物、例えば、クリプト植物、シアノバクテリアおよび／または紅藻により産生されるフィコビリタンパク質の量および種類は、培養条件、例えば、栄養素、炭素源、ｐＨ、温度および異なる光条件への曝露により操作され、例えば、産生されるフィコビリタンパク質の総量を増加させる、および／または一つ以上のフィコビリタンパク質/発色団の産生を他のものと比べて歪めることがある。例えば、フィコエリスリン産生は、緑色光下での藻類の培養により上昇し得る一方、いくつかの実施形態において、赤色光下での培養ではより多くのフィコシアニンが産生される。そのための方法は、例えば上記の参考文献のうちのいくつか、およびＨｓｉｅｈ－Ｌｏ, Ｍ., ｅｔ ａｌ, Ａｌｇａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ, ４２ (２０１９) １０１６００； Ｆｅｒｒｅｉｒａ, Ｒ., ｅｔ ａｌ, Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ. Ｔｅｃｈｎｏｌ, Ｃａｍｐｉｎａｓ ３５（２）： ２４７～２５２, Ａｂｒ.－Ｊｕｎ.２０１５； Ｏｏｓｔｌａｎｄｅｒ, Ｐ.Ｃ., ｅｔ ａｌ, Ａｌｇａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ, ４７ (２０２０), １０１８９；およびＭｉｎｈ Ｔｈｉ Ｔｈｕｙ Ｖｕ, ｅｔ ａｌ, Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ, ２８, １４８５～１５００ (２０１６)、並びにその中で引用される参考文献で記載されるように、当技術分野で既知であり、それらの内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0044】

いくつかの実施形態において、前記藻類バイオマスは、望ましいフィコビリタンパク質、例えばフィコエリスリンなどが豊富であるか、または高い割合を示す。それゆえ、いくつかの実施形態において、前記藻類原料バイオマスは、乾燥重量１ｇあたり約５ｍｇから約１５０ｍｇのフィコエリスリン、例えば、乾燥重量１ｇあたり約５～５０ｍｇのフィコエリスリンを含有する。さらなる実施例において、前記藻類原料バイオマスは、乾燥重量１ｇあたり約１０ｍｇ、または約１５ｍｇまたは約２０ｍｇ、または約２５ｍｇまたは約３０ｍｇ、または約３５ｍｇまたは約４０ｍｇ、または約４５ｍｇまたは約５０ｍｇ、または約５５ｍｇまたは約６０ｍｇ、または約６５ｍｇまたは約７０ｍｇ、または約７５ｍｇまたは約８０ｍｇ、または約８５ｍｇまたは約９０ｍｇ、または約９５ｍｇまたは約１００ｍｇ、または約１０５ｍｇまたは約１１０ｍｇ、または約１１５ｍｇまたは約１２０ｍｇ、または約１２５ｍｇまたは約１３０ｍｇ、または約１３５ｍｇ、または約１４０ｍｇ、または約１４５ｍｇのフィコエリスリンを含有する。

【0045】

藻類のフィコエリスリン含有量は、当技術分野で既知の方法を用いて測定され得る（例えば、Ｇｎａｔｔ Ｅ., ａｎｄ Ｌｉｐｓｃｈｕｌｔｚ Ｃ.Ａ., Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ, １９７４, １３, ２９６０－２９６６；Ｋｕｒｓａｒ Ｔ.Ａ., ＆ Ａｌｂｅｒｔｅ Ｒ.Ｓ., Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ, １９８３, ７２, ４０９－４１４；Ｓｏｂｉｅｃｈｏｗｓｋａ－Ｓａｓｉｍ, Ｍ., ｅｔ ａｌ, Ｊ Ａｐｐｌ Ｐｈｙｃｏｌ (２０１４) ２６：２０６５－２０７４；およびＳａｌｕｒｉ Ｍ., ｅｔ ａｌ, Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ, ３２, １４２１－１４２８, ２０２０を参照されたい）。いくつかの実施形態において、Ｒ－フィコエリスリン含有量は、Ｊ. Ｄｕｍａｙ ｅｔ ａｌ, ”Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒ－ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ ｆｒｏｍ Ｍａｒｉｎｅ Ｒｅｄ Ａｌｇａｅ” ｂｙ Ｊｕｓｔｉｎｅ Ｄｕｍａｙ, Ｍｉｃｈｅｌｅ Ｍｏｒａｎｃａｉｓ, Ｈｕｕ Ｐｈｕｏ Ｔｒａｎｇ Ｎｇｕｙｅｎ, ａｎｄ Ｊｏｅｌ Ｆｌｅｕｒｅｎｃｅ ｉｎ ”Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｆｒｏｍ Ｍａｒｉｎｅ ＡＬＧＡＥ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ, Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ, ｖｏｌ. １３０８”, ｂｙ Ｄａｇｍａｒ Ｂ. Ｓｔｅｎｇｅｌ ａｎｄ Ｓｏｅｎｅ Ｃｏｎｎａｎ (ｅｄｓ.), Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｍｅｄｉａ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ２０１５の方法を用いても定量化され得る。

【0046】

一つ以上のフィコビリタンパク質は、対応する生の動物性の肉、例えば、牛肉、子牛肉、ラム、豚肉、ヤギ肉、カンガルー肉、魚肉（例えばサケ肉、マス肉、マグロ肉）および家禽肉（例えば鶏肉、アヒル肉、ガチョウ肉、七面鳥肉、および狩猟鳥肉）の色を模倣する望ましい色、好ましくは赤またはピンク色を提供する任意の量および組み合わせで、擬似肉食品に添加されるか、または存在する。

【0047】

一つ以上の実施形態において、前記一つ以上のフィコビリタンパク質は、藻類原料から得た抽出物または少なくとも部分的に精製された形態として、前記擬似肉食品に組み込まれる。

【0048】

フィコビリタンパク質含有抽出物、例えばフィコエリスリン含有抽出物などを得るいくつかの代表的な方法は、ＲＵ ２５４８１１１Ｃ１、ＣＮ１０１１３９５８７Ａ、ＪＰ２０１７５３２０６０Ａ、ＣＮ１７９６４０５Ａ、ＣＮ１０１６１７７８４Ａ、ＣＮ１６１８８０３Ａ、ＣＮ１０１９４２０１４Ａ、ＷＯ２００３０９９０３９Ａ１、並びに本明細書に引用される参考文献に記載され、それらの内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0049】

フィコビリタンパク質（例えばフィコエリスリン）の正確な色は、それが得られた種、タンパク質サブユニットの数および性質、並びに存在する発色団の数および性質によって決まる。さらなる化合物、例えば他のフィコビリタンパク質（例えばアロフィコシアニンおよび／またはフィコシアニン）などの有無もまた、全体的な視覚的な色に影響を与えることがある。

【0050】

本開示の着色剤を調製する一つの代表的な一般的方法は、フィコビリタンパク質含有バイオマス、例えば紅藻または藍藻（シアノバクテリア）、またはクリプト植物などを、水溶液（例えば水または緩衝液）中で均質化する段階を含む。適宜、抽出された一つ以上のフィコビリタンパク質を含む液体は、固形物から分離されることがある。適宜、均質化されたバイオマスまたは分離されたフィコビリタンパク質含有水性懸濁液もしくは水溶液は、濃縮および／または乾燥させられることがある。プロセスは、フィコビリタンパク質の水相への抽出を高めるためのさらなる任意の段階、例えば均質化されたバイオマスの超音波処理（ソニケーション）などを含むことがある。

【0051】

いくつかの好ましい実施形態において、前記フィコビリタンパク質は、少なくとも一つの抽出または分離段階によって、フィコビリタンパク質含有バイオマス、例えばクリプト植物、シアノバクテリア（藍藻）、または大型もしくは微細紅藻類（紅藻植物門）などから得た、抽出されたフィコビリタンパク質である。

【0052】

それゆえ、いくつかの実施形態において、前記少なくとも一つのフィコビリタンパク質は、粉砕されたバイオマスの形態で、例えば、フィコビリタンパク質が水または水溶液中に抽出できるような、シアノバクテリアおよび／または紅藻などの適切なバイオマスが、前記水または水溶液（例えば、約６．５から約７．５の範囲のｐＨの、例えば約６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３または７．４のｐＨの緩衝液（例えばリン酸ナトリウムもしくはカリウムまたは酢酸ナトリウムもしくはカリウム溶液））中で均質化された形態で、前記食品（例えば擬似肉食品）に添加されることがある。いくつかの実施形態において、得られた懸濁液またはスラリー（適宜、超音波でさらに処理されていてもよい）は、前記食品、例えばミンチ肉またはひき肉の擬似肉/代用肉混合物などの成分に直接添加され得る。さらなる実施形態において、前記均質化されたスラリーまたは懸濁液（適宜、超音波でさらに処理されていてもよい）は、前記食品への添加前に、さらに濃縮または乾燥させられることがある。これらの実施形態のうちのいくつかにおいて、バイオマス固形物の、前記食品への添加は、前記食品の栄養価を有利に高める、および／またはその後の前記擬似肉の調理時に、調理済みの肉の香味を生み出すのを助ける香味成分（例えばグルタミン酸の存在に起因するうま味）、もしくは香味前駆体（例えばグルタチオンまたは他のアミノ酸）を、最終的な香味特性に導入することがある。

【0053】

いくつかの実施形態において、前記均質化された原料（適宜、超音波でさらに処理されてもよい）は、任意の一つ以上の適当な分離技術、例えばふるい分け、遠心分離、沈殿、濾過、限外濾過、精密濾過、ナノ濾過、ダイアフィルトレーション、逆浸透、およびクロマトグラフィーなどを用いて、いくつかのまたはすべての固形物を分離および除去することにより、望ましい水準の純度にさらに精製され、一つ以上のフィコビリタンパク質の水性懸濁液または水溶液が得られる。得られた溶液は、前記食品に添加される前に、適宜、目的の濃度にさらに濃縮されることがある。

【0054】

いくつかの実施形態において、一つ以上のフィコビリタンパク質を含む抽出物溶液は、存在する任意の金属および／または他の不純物を除去するために、適切な分離段階、例えば透析または逆浸透処理などに、さらにさらされることがある。

【0055】

一つ以上の実施形態において、前記フィコビリタンパク質抽出物懸濁液または溶液は、例えば約－１０℃以下、例えば約－１５℃以下、または約－２０℃以下、または－２５℃以下などでの、一つ以上の凍結段階にさらされることがある。

【0056】

いくつかのさらなる実施形態において、一つ以上のフィコビリタンパク質を含む水溶液は、任意の適当な乾燥技術、例えば蒸発、凍結乾燥、噴霧乾燥または超臨界乾燥などにより、乾燥させられて、固形物を形成することがある。いくつかの実施形態において、前記少なくとも一つのフィコビリタンパク質は、食品、例えば擬似肉または代用肉などに、乾燥した形態で、すなわち約０．５ｍｇ/ｇから約２５ｍｇ/ｇ、例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４ｍｇ/ｇなどの乾燥重量で、添加されることがある。

【0057】

液体フィコエリスリン抽出物は、液体を、タンパク質が変性し、色が変化するより低い温度、例えば約８０℃未満、または約７７℃未満、または約７５℃未満または約７０℃未満に加熱することにより、適宜低温殺菌されることがある。

【0058】

いくつかの実施形態において、一つ以上のフィコビリタンパク質は、前記食品中に藻類形態（例えば紅藻植物門、シアノバクテリアまたはクリプト植物の種）として含まれ、全藻バイオマスとして、適宜（例えば一つ以上の凍結融解サイクルにより、および／またはホモジナイザーで）粉砕されて添加されることがある。いくつかの実施形態において、前記藻類は微細藻類である。前記藻類は、水切りおよび／または濾過され、湿った状態で（例えば水/培地中のペースト、懸濁液またはスラリーとして）、例えば約０．１％ ｗ/ｗバイオマス、または約０．５％ ｗ/ｗバイオマス、または約１％ ｗ/ｗバイオマス、約５％ ｗ/ｗバイオマス、または約１０％ ｗ/ｗバイオマスまたは約２０％ ｗ/ｗバイオマス、または約３０％ ｗ/ｗバイオマス、または約４０％ ｗ/ｗバイオマスまたは約５０％ ｗ/ｗバイオマス、または約６０％ ｗ/ｗバイオマス、または約７０％ ｗ/ｗバイオマス、または約８０％ ｗ/ｗバイオマスまたは約８５％ ｗ/ｗバイオマス、または約９０％ ｗ/ｗバイオマス、または約９５％ ｗ/ｗバイオマス、またはそれ以上で使用されることがある。前記藻類バイオマスは、直接使用してもよく、さらなる使用前に適宜、冷やす、凍らせる、および／または低温殺菌してもよい。他の実施形態において、前記藻類バイオマスは、乾燥していてもよい（例えば熱、蒸発または凍結乾燥により乾燥させられる）。

【0059】

前記藻類バイオマスは、前記擬似肉食品に、望ましいピンクまたは赤色を与えるのに適する量で添加されることがある。添加されるべき前記藻類バイオマスの量は、前記藻類のフィコエリスリン含有量によって決まることがある。いくつかの実施形態において、前記藻類バイオマスは、擬似肉食品の重量あたり約２０％ 乾燥重量以下の量で添加される。いくつかの実施形態において、前記藻類集団は、前記擬似肉食品に、食品の重量あたり約０．１％から約２０％ 乾燥重量の範囲内で、例えば前記食品の重量あたりの乾燥重量ベースで、約０．１～５％、例えば約０．１％、０．２５％、０．５％、０．７５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、または１４％または１５％、または１６％、または１７％または１８％または１９％などで添加されることがある。

【0060】

有利に、いくつかの実施形態において、藻類バイオマスは、前記望ましい赤またはピンクの着色を擬似肉食品に提供するのに十分であるが、好ましくない磯臭さを前記擬似肉食品に与えない（大抵は硫化ジメチルの存在に起因する）量で使用することができるようなフィコエリスリン含有量を有する。これは、フィコビリタンパク質成分を含むおよび含まない擬似肉サンプルの味を比較する味覚試験者により実施され得る官能評価により割り出され得る。そのための適当なフィコエリスリン含有量は、上に記載されるように、乾燥重量１ｇあたり５ｍｇから約１５０ｍｇのフィコエリスリンの範囲内、例えば約１０～５０ｍｇなどであることがある。いくつかのさらなる実施形態において、前記藻類バイオマスは、（単細胞）微細藻類である。適当な例には、チノリモ属の種(Porphyridium sp.)（例えばチノリモ(P. purpureum)およびポルフィリディウム・ソルディダム(P. sordidum)）、ロドカエテ属の種(Rhodochaete sp.)（例えばロドカエテ・パルブラ(R. parvula)）、ベニマダラ属の種(Hildenbrandia sp.)（例えばタンスイベニマダラ(H. rivularis)）、ホシノイト属の種(Erythrotrichia sp.)（例えばホシノイト(E. carnea)）、ロデラ属の種(Rhodella sp.)（例えばロデラ・ヴィオラセア(R. violacea)）、ロドソルス属の種(Rhodosorus sp.)（例えばロドソルス・マリヌス(R. marinus)）、アルスロスピラ属の種(Arthrospira sp.)（例えばアルスロスピラ・プラテンシス(A. platensis)）、フレミエラ属の種(Fremyella sp.)（例えばフレミエラ・ディプロシフォン(F. diplosiphon)）またはロドモナス属の種(Rhodomonas sp.)（例えばロドモナス・サリナ(R. salina)）が挙げられることがある。一つの好ましい藻類原料は、ロドモナス・サリナである。さらなる実施形態において、前記藻類は、ロドモナス・サリナＣＳ－１７４株である。

【0061】

藻類種および株は、商業的供給源およびカルチャーコレクション（例えばＣＳＩＲＯ Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ ＡＬＧＡＥ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＵＴＥＸ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ドイツのＣＣＡＣ、ノルウェーのＮＩＶＡ）から得られることがある。藻類、例えば上記の藻類種などの培養方法は、当技術分野で既知である。いくつかの方法は、Ｏｏｓｔｌａｎｄｅｒ, Ｐ. Ｐ., ｅｔ ａｌ, Ａｌｇａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ, ４７, １０１８８９, ２０２０； Ｍｉｎｈ Ｔｈｉ Ｔｈｕｙ Ｖｕ, ｅｔ ａl, Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ, ２８, １４８５～１５００（２０１６）；Ｇｕｅｖａｒａ, Ｍ., Ｊ. Ａｐｐｌ. Ｐｈｙｃｏｌ., ２８（５）, ２６５１～２６６０, ２０１６およびそれらで引用される参考文献に記載され、それらの内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0062】

いくつかの実施形態において、本開示で使用される前記少なくとも一つのフィコビリタンパク質（例えばフィコエリスリン）の適合性は、抽出または精製されたフィコビリタンパク質のＵＶ/ＶＩＳ吸光度スペクトルを評価すること、および／または前記フィコエリスリンが変性する温度を測定すること、例えばλ_ｍａｘの吸光度の５０％減少が観察される温度を測定することにより判断され得、望ましい温度は５０～９５℃の範囲である。

【0063】

例えば、フィコビリタンパク質抽出物は、本明細書に記載されるプロセスのうちのいずれか一つ、または当技術分野で既知の他の方法に従って得られ、そのＵＶ/ＶＩＳ吸光度スペクトルが得られ、特性ピークの存在、例えばフィコエリスリンについては、５４０～５７０ｎｍにおけるλ_ｍａｘ、および適宜、４９５～５０３ｎｍにおけるさらなるピークまたはショルダーについて評価される。

【0064】

それゆえ、望ましい赤またはピンク色を提供する藻類種の適合性は、少なくとも部分的に単離または精製されたフィコエリスリンの原料のいずれかとして使用するために、あるいは丸ごとまたは粉砕された形態で使用するために、抽出されたか、単離されたか、または少なくとも部分的に精製された、前記藻類種から得られるフィコエリスリンのサンプルについてのＵＶ/ＶＩＳ吸光度スペクトルによって判断されることがある。

【0065】

抽出されたか、単離されたか、または少なくとも部分的に精製されたフィコエリスリンの形態は、少なくとも１：１、例えば少なくとも１．５：１、または少なくとも２．０：１、または少なくとも２．５：１、または少なくとも３：１、または少なくとも４：１、または少なくとも５：１、または少なくとも６：１、または少なくとも７：１、または少なくとも８：１、または少なくとも９：１、または少なくとも１０：１などの、５４０～５７０ｎｍ対４９５～５０３ｎｍ ＵＶ/可視吸光度ピーク比を有利に示すことがある。いくつかの実施形態において、前記ＵＶ/ＶＩＳ吸光度スペクトルは、約５４０～５７０ｎｍ（ＰＥＢに対応）、例えば約５５０～５６５ｎｍなどにおける、および約２８０～２９０ｎｍ（タンパク質に対応）における最大ピーク/ショルダーのみを本質的に示し、それゆえフィコエリスリンサンプル中で高いＰＥＢ濃度を示す。

【0066】

本開示で使用される（抽出物または少なくとも部分的に精製された形態のいずれかとして、あるいは全藻または粉砕された藻類の形態で擬似肉食品に添加される）少なくとも一つのフィコビリタンパク質（例えばフィコエリスリン）の適合性は、加熱時のλ_ｍａｘの減少度を評価することにより判断されることがある。それゆえ、λ_ｍａｘ波長における吸光度の少なくとも約５０％の減少が観察される温度は、擬似肉食品の調理時に、対応する視覚的色変化が観察される可能性があるおよその温度を示すことがある。いくつかの好ましい実施形態において、λ_ｍａｘ（例えば５４０～５７０ｎｍにおける）の吸光度の５０％の減少が観察される前記温度は、約５０～９５℃の範囲であり、より好ましくは約６０～８５℃の範囲である。さらなる実施形態において、前記λ_ｍａｘは、約５４５～５６５ｎｍ、例えば約５５０～５６０ｎｍなどの範囲である。

【0067】

フィコビリタンパク質は、Ｆｅ^２＋などの金属イオンとキレートするか、または配位することが示されている（本明細書の実施例４、およびＳｏｎａｎｉ, Ｒ. Ｒ., ｅｔ ａｌ, Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４９ (２０１４) １７５７～１７６６を参照されたい）。フィコビリタンパク質、例えばフィコエリスリンなどの存在は、制御された方法で、体内で鉄を貯蔵し、それを全身に放出し、それにより、鉄欠乏および鉄過剰に対するバッファーとして作用するタンパク質であるフェリチンの産生を促進することにより、鉄などの金属イオンのバイオアベイラビリティを向上させ得ることが、現在示されている。擬似肉食品に使用される場合、これは、有用な鉄源を体に提供することがある食品をもたらし得る。

【0068】

したがって、いくつかの実施形態において、本開示に従って使用される一つ以上のフィコビリタンパク質は、Ｆｅ^２＋またはＦｅ^３＋などの金属イオン送達のための担体タンパク質として作用することもある。一つ以上の実施形態において、金属キレート（例えばＦｅ^２＋またはＦｅ^３＋）フィコビリタンパク質であって、前記金属キレートフィコビリタンパク質を含む擬似肉食品、並びに生または調理済みの擬似肉食品の調製に使用される、フィコビリタンパク質が提供される。

【0069】

いくつかの実施形態において、前記鉄は、その２＋酸化状態（例えば塩化第一鉄(ＦｅＣｌ_２)または硫酸鉄(例えばＦｅＳＯ_４、およびその水和物、例えばＦｅＳＯ_４．７Ｈ_２Ｏなど)として）で提供される。いくつかの実施形態において、前記鉄は、塩化第二鉄（ＦｅＣｌ_３）など、その３＋酸化状態で提供される。

【0070】

鉄化合物は、一つ以上のフィコビリタンパク質とともに、約１：１０から約３：１、例えば、約１：５、１：２、１：１．５、１：１、１．５：１または２：１のＦｅ：フィコビリタンパク質のモル比で使用されることがある。さらなる実施形態において、前記Ｆｅ：ＰＥのモル比は、約１：１０から約３：１、例えば、約１：５、１：２、１：１．５、１：１、１．５：１または２：１である。

【0071】

いくつかの実施形態において、前記少なくとも一つのフィコビリタンパク質着色剤は、前記食品に別々に添加するか、または前記一つ以上のフィコビリタンパク質と組み合わせて着色剤の混合物を形成し、その後前記食品に添加するかのいずれかで、一つ以上の追加の着色剤と併用されることもある。いくつかの実施形態において、前記一つ以上の追加の着色剤は、環状テトラピロール（およびピロール様）部分、例えばポルフィリン、クロリン、バクテリオクロリン、コロールおよびコリンなど、並びにその金属錯体、例えばプロトポルフィリンＩＸおよびヘム、ならびにそれらのタンパク質複合体を含む薬剤を除外する。いくつかの実施形態において、生および／または調理済みの形態にある前記擬似肉食品は、かかる別々に添加される環状テトラピロール含有化合物を除外する。藻類形態で添加されるフィコビリタンパク質は、天然または内因性環状クロロフィルを含むものであり、上記の特定の実施形態は、フィコエリスリンが由来する藻類種に内因的であり、もともと存在する環状テトラピロールおよびピロール様部分の存在を除外するものとして解釈されるべきではないということが理解されよう。

【0072】

いくつかの実施形態において、前記擬似肉食品の前記着色剤は、一つ以上のフィコビリタンパク質からなるか、または本質的にからなる。いくつかの実施形態において、前記着色剤は、フィコエリスリンからなるか、または本質的にからなる。

【0073】

いくつかの実施形態において、前記一つ以上の追加の着色剤は、非動物および非コール／タール由来であり、それゆえベジタリアンまたはヴィーガンの消費者に適している。適切な色には、赤、マゼンタ、紫／青紫、橙、黄、褐色、青および緑のうちの一つ以上が挙げられることがある。いくつかの代表的な植物由来の着色剤には、アントシアニン、ベタレイン、カロテノイド、フラボノイド、およびポリフェノールが挙げられる。いくつかの実施形態において、かかる着色剤は、植物、例えば液果、ブドウ、ビートルート、ラディッシュ、ターメリックおよびニンジンなどに由来するジュース、濃縮物、抽出物または乾燥粉末形態として添加されることがある。他の追加の着色剤には、褐色、例えばカラメル／焦がし砂糖などが挙げられることがある。

【0074】

擬似肉食品には、非動物性タンパク質源、例えば大豆タンパク質（例えば組織化大豆タンパク質、大豆タンパク質分離物）、エンドウタンパク質、ソラマメタンパク質、ルピナスタンパク質、緑豆タンパク質、マメ科植物（例えばエンドウ、マメ(例えば黒豆、インゲンマメ、カネリーニ豆、ピント豆、緑豆など)、ルピナス、ヒヨコマメ、レンズマメ）、堅果、種子、きのこ、および他の真菌原料（例えばフザリウム・ベネナタム(Fusarium venenatum)）、並びに藻類および微生物原料などのうちの一つ以上；単糖および二糖（例えばグルコース、フルクトース、アラビノース、リボース、マルトース、スクロース、デキストロース、マルトデキストリン、キシロース、ラクトース、アラビノース）、オリゴ糖、多糖、デンプン、ガム、カラギナン、ペクチン、および食物繊維を含む、糖類などの一つ以上の炭水化物源；油脂（例えば植物由来の油、例えば菜種、ヒマワリ、オリーブ、ココナツ、植物、ヤシ、落花生、亜麻仁、綿実、トウモロコシ、ベニバナ、ぬか油など）、乳化剤（例えばレシチン、ポリソルベート(20、40、60 80)）のうちの一つ以上；結合剤および増粘剤（例えば、ガム(例えばアルギン酸、グアーガム、ローカストビーンガム、およびキサンタンガムなど)、ペクチン、セルロース(メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースなど)、デンプン、ポテトフレーク、ジャガイモ粉、製粉または粉砕された穀類およびマメ科植物で作られている粉(小麦、米、ライ麦、オート麦、大麦、ソバ、トウモロコシ、ルピナス、ヒヨコマメ、レンズマメ、マメなど)、抗酸化剤、界面活性剤、塩、および栄養剤、例えばアミノ酸、例えば必須アミノ酸(例えばヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、グリシン、セリン、プロリン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、およびバリン)など、ジおよびトリペプチド、ビタミン(例えばＡ、Ｂ(１、２、３、５、６、７、９、および１２)、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｋ)、ミネラル(カルシウム、リン、マグネシウム、ナトリウム、カリウム、亜鉛、ヨウ素、鉄、銅)、およびファイトニュートリエント、例えばカロテノイド(例えばα－およびβ－カロテン、β－クリプトキサンチン、リコピン、ルテイン)、フラボノイド(例えばフラバノール、フラボノール、フラボン、フラボノン(flavonones)、イソフラボン)、ポリフェノール(例えばアントシアニン、ケルセチン、エラグ酸)など）；香味剤、例えばハーブ、スパイス（例えばパセリ、ローズマリー、タイム、バジル、セージ、ミント）、野菜風味（例えばセロリ、タマネギ、ニンニク）、イースト抽出物、麦芽抽出物、天然および人工甘味剤、燻製風味、アミノ酸（例えばグルタミン酸ナトリウム）、ヌクレオシド、ヌクレオチドならびに水などが含まれることがある。一つ以上の成分は、一つ以上の機能を果たすことがある。

【0075】

鉄（Ｆｅ）は、一つ以上の香味前駆体分子が、望ましい風味および／または香り、例えば肉っぽい、香ばしいまたはうま味（例えば牛肉、鶏肉、豚肉、ベーコン、ハム、ラム）などを与えることがある香味剤を生成する化学反応を触媒することがある。したがって、Ｆｅ（Ｆｅ^２＋またはＦｅ^３＋）にキレートしているか、または配位している一つ以上のフィコビリタンパク質、例えばフィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニンおよびフィコエリスロシアニンなどが擬似肉食品中に存在すると、調理過程の間の変性時に、これもまた擬似肉食品中に存在する一つ以上の香味前駆体分子の、望ましい香りおよび風味を生み出す反応が有利に触媒されることがある。

【0076】

香味前駆体分子のいくつかの例には、（上記追加成分のいずれかに加えて）：糖類、糖アルコール、糖酸および誘導体（例えばグルコース、フルクトース、リボース、スクロース、アラビノース、イノシトール、マルトース、マルトデキストリン、ガラクトース、ラクトース、グルクロン酸、およびキシロース）；油、例えばナタネ、ヒマワリ、オリーブ、ココナツ、植物、ヤシ、落花生、亜麻仁、綿実、トウモロコシ、ベニバナ、ぬか油など；脂肪酸、例えばカプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸など；アミノ酸、例えばシステイン、シスチン、ロイシン、イソロイシン、バリン、リシン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、アルギニン、ヒスチジン、アラニン、グルタミン酸塩、アスパラギン、グリシン、プロリン、セリンおよびチロシンなど、並びにジおよびトリペプチド、例えばグルタチオンなど；ヌクレオシドおよびヌクレオチド、ならびにビタミンが挙げられることがある。

【0077】

いくつかの実施形態において、前記フィコビリタンパク質着色剤は、擬似肉食品、例えばひき肉または刻み肉食品、例えば、ハンバーガーのパティ、ケバブ、ミートボール、リッソール、ミートローフ、ソーセージ、ミートソースおよびフィリング（例えばチリ、ボロネーゼ、タコスフィリング、パイフィリング）、並びに他の成型肉または成形肉食品（適宜パン粉がまぶされる）など、例えばナゲット、ステーキ、カツレツ、シュニッツェル、フィンガーおよびストリップなどの調製に使用されることがある。いくつかのさらなる実施形態において、前記食品着色剤は、ハンバーガーのパティの調製に使用されることがある。いくつかの実施形態において、前記擬似肉食品は、アレルギー反応または不耐性反応を引き起こす一つ以上の物質、例えばＭＳＧ、グルテンまたは堅果などを含まないか、または実質的に含まない。

【0078】

本開示はすぐに以下の実施例を参照することによりさらに説明されるが、実施例は説明のみを目的とし、上に説明される一般論を限定するものとして解釈されるべきではない。

【実施例】

【0079】

予備的評価－ヘモグロビンおよびミオグロビンの、ハンバーガーの味および外観に及ぼす効果
ヘモグロビンおよびミオグロビンをＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ハンバーガー製剤は、約２０％の組織化大豆タンパク質、約１５％の植物性脂肪（製剤総重量の５％はココナツ脂肪である）、約２．５％の食物繊維、約５％の香味料（アミノ酸など）および約５７．５％の水を含んでいた。

【0080】

２００ｍｇ／１００ｇ ハンバーガー製剤の濃度で、ヘモグロビンおよびミオグロビンをハンバーガー製剤に、香味剤とともに個別に添加し、ヘモグロビンまたはミオグロビンを添加していないハンバーガーと比較した。ヘモグロビンまたはミオグロビンを添加していない生のハンバーガーは、薄茶色／ベージュ色であった一方、もう２つのハンバーガーは、生の状態で赤／褐色の外観であった。

【0081】

調理後、社内の記述的官能分析およびガスクロマトグラフィーによるフレーバー分析は、ハンバーガーが、評価されたほぼすべての側面において（例えば焦がしたときの外観、グリルした牛肉の匂い、燻製にして焦がしたときの後味、表面および内部の食感、脂肪質の口当たり、牛肉の後味、豆／植物の味、塩味、うま味、金属／血の味および全体的な牛肉っぽさ、並びに硫黄揮発性物質、アルデヒドおよびピラジンの存在）本質的に同じであることを示した。ハンバーガーの間で認められた大きな違いは、グリルした牛肉の外観および内部の赤い／血のような外観の側面に関するものであり、ヘモグロビンまたはミオグロビンを添加していないハンバーガーは、これらの側面において、もう２つのハンバーガーと比較して有意に低い点数を記録し、それによって、ヘモグロビンおよびミオグロビンは、ハンバーガーのピンク／赤い（すなわち「血のような」）外観に関与するが、フレーバー分析／官能分析に有意に寄与しないことを示した。

【0082】

実施例１
野生の紅藻からのフィコエリスリンの調達および抽出
６つの大型紅藻をビクトリア州ベラリン半島から、南緯３８度１６分１９．８秒、東経１４４度３８分２７．３秒で、２０１９年１１月３日に採集した。

【0083】

フィコエリスリンの抽出には、藻類をバッファー中で混合する、および遠心分離で大きな粒子を除去する段階が含まれた。

【0084】

抽出バッファー：２０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７、０．０２％ アジ化ナトリウム
１）１０ｇの紅藻を１００ｍＬ 抽出バッファー中に量り分ける。
２）Ｕｌｔｒａ－ｔｕｒｒｅｘを用いてサンプルをホモジナイズし、ふるいに流し込む。
３）１５，０００ＲＰＭで、Ｆ２１ｘ５０Ｙ固定角ローター付きＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＣ－５で、１５分間４度で精製する。
４）ＰＥＳ ２０ｍＬ １０ｋＤａカットオフを用いて濃縮する。
５）蒸留水に対して透析し、金属／夾雑物を除去する。
６）凍結乾燥させる。

【0085】

最初の紅藻のホモジナイズにより赤／橙色の液体を得た。遠心分離による精製時に、溶液は著しくより蛍光性の強いピンク色になり、これは濃縮時にさらにいっそう顕著であった。凍結乾燥により、より暗いピンク色の物質を得た。

【0086】

Ｒ－フィコエリスリンの熱特性評価
熱特性評価を行い、フィコエリスリンが加熱時に色変化を起こすかどうか確認した。最初に、ホモジナイズされた粗製フィコエリスリンを精製前に９５℃で５分間加熱し、色変化を可視化した。粗製サンプルは、赤から褐色に変化した。

【0087】

６０℃および７０℃で１時間加熱した後、サンプルは両方とも安定で色変化を示さなかった。したがって、フィコエリスリンの熱変性温度の正確な測定を行うために、示差走査蛍光光度法（ＤＳＦ）を、１００ｕＬの精製したフィコエリスリンを０．５℃／１０秒で温度を上昇させて、２５℃～９５℃で加熱することにより行った。

【0088】

図１に示すように、フィコエリスリンがその蛍光性を失い、それによって色変化を引き起こす熱変性温度は、７７℃である。

【0089】

超音波を用いる抽出試験
フィコエリスリン抽出物の収率を上げるために、超音波抽出を検討した。超音波は一般に、細菌細胞および酵母細胞からのタンパク質の回収率を高めるために適用される。藻類細胞の丈夫な性質のため、フィコエリスリン回収率を高めるために超音波を適用した。以下のプロトコルに従い抽出した。
１）２５ｇの紅藻（サンプル１）を１５０ｍＬ 抽出バッファー中に量り分ける。
２）２分間８０００（ｍｉｎ^－１）でホモジナイズする（Ｕｌｔｒａ－ｔｕｒｒｅｘ）。
３）１６０Ｗ、３．３秒オン９．９秒オフ、合計処理時間＝５分で超音波処理する。
４）１５，０００ＲＰＭで、Ｆ２１ｘ５０Ｙ固定角ローター付きＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＣ－５で、１５分間４℃で精製する。
５）ＰＥＳ ２０ｍＬ １０ｋＤａカットオフを用いて濃縮する。
６）１０Ｌ 蒸留水に対して、４時間透析する。
７）－８０℃で凍結させる。
８）３日間凍結乾燥させる。

【0090】

得られたサンプルは、以前の抽出で見られた蛍光性のピンクよりもむしろ精製および濃縮後のより一層濃い赤色であった。

【0091】

超音波処理抽出溶液の色が濃い赤であり、蛍光性のピンクではない理由を調べるために、吸光度スペクトル分析を行い、違いを検討した。およそ４９５、５４５、５６５ｎｍでの特徴的なフィコエリスリンピークに加えて、超音波処理段階を用いて得られた抽出物は、それぞれ、アロフィコシアニン（帯青／緑色）およびＲ－フィコシアニン（青色）を示す６７５ｎｍでのさらなる突出したピークおよび６２５ｎｍでの微小ピークの出現を示した。鮮やかなピンク／赤のフィコビリタンパク質（例えばフィコエリスリン）を一つ以上の緑／青のフィコビリタンパク質（例えばアロフィコシアニン、フィコシアニン）と混合すると濃い赤色の抽出物が得られることがある。

【0092】

実施例２
食品成分としての使用に適するフィコエリスリン抽出物の製造
大型紅藻からフィコエリスリンを得るための、簡便で拡張可能な食品等級の抽出方法をシミュレートするために、実施例１で構築したラボスケールの方法を用いる改良法を適用した。
１－水道水中、食品等級の２００ｍＭ ＮａＣｌ抽出バッファーを作成する。
２－２５ｇの海藻を１５０ｍＬ 抽出水中に量り分ける。
３－２分間、キッチン用ハンドブレンダーで混合する。
４－１６０Ｗ、３．３秒オン９．９秒オフ、合計処理時間＝５分で超音波処理する。
５－５０００ｇで、４．２ｒスイングローターで遠心分離して精製する。
６－ふるいに流し込み、あらゆる大きな海藻粒子を除去する。
７－－２０℃で凍結させる。
８－３日間および／または水が完全に除去されるまで凍結乾燥させる。

【0093】

液体抽出物の色の強度にばらつきが認められたが、すべて赤／ピンク色であった。海藻抽出物を遠心分離および濾過により精製したらすぐに、凍結乾燥させて粉末にした。

【0094】

モデルのひき肉食品におけるフィコエリスリン抽出物の使用
上記の予備的評価で用いたものと同じ製剤を使用してミニハンバーガーを作成し、各ハンバーガーは総重量１５ｇであった。着色剤（ビートルート、フィコエリスリン、ヘモグロビンまたはフェリチン）および凍結させてミンチにしたココナツ脂肪（５％ ｗ/ｗ）を残りの成分に添加し、混合した。

【0095】

製剤を表２－１に示す。

【表2】

【0096】

表２－１のハンバーガー製剤をホットプレート（Ｓｉｌｅｘ Ｅｌｅｃｔｒｏｇｅｒａｅｔｅ ＧｍｂＨ Ｇｅｒｍａｎｙ）で、各面、１８０℃で４分間、７２℃の内部温度に調理した。もう一つの実験では、ハンバーガーを各面６分、８０～８５℃の内部温度に調理した。デジタルＱＭ１６０１温度計を用いて内部温度を測定した。

【0097】

コントロールハンバーガーは、生の状態では白－黄色の外観をしており、調理時に外側が褐色になったが（メイラード反応およびカラメル化に起因する）、調理してもハンバーガーの内部の色は変化せず、生の食品と同じ白－黄色のままであった。ビートルート抽出物は、生および調理済みのハンバーガーの両方に赤い外観をもたらしたが、調理してもハンバーガーの内部の色は変化しなかった。フィコエリスリン抽出物は、生の食品の「血の」色（ピンク／赤）の外観、およびその後の調理時における内部の褐色への色変化をもたらした。調理中、赤い液体がハンバーガーの表面上にたまる様子は、牛肉などの動物性の肉を調理するときに典型的に見られる「出血」を再現した。Ｖｉｔａｆｉｔヘモグロビンは、生の状態では暗褐色の外観を、調理済みの状態ではほとんど黒色の外観をハンバーガーにもたらした。ＣＲフェリチン含有ハンバーガーは、コントロールハンバーガー（生および調理済み）と同じ外観であった。

【0098】

実施例３
フィコエリスリン抽出のスケールアップおよび特性評価
野生の大型紅藻（このプロジェクトのステージ１で予め採集される）からフィコエリスリンを得るための、簡便で拡張可能な食品等級の抽出方法をシミュレートするために、ステージ１で構築したラボスケールの方法を用いる改良法を適用した。
１－水道水中、食品等級の２０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．０抽出バッファーを作成する。
２－１０００ｇの海藻を５０００ｍＬ 抽出バッファー中に量り分ける。
３－１０分間８０００（ｍｉｎ^－１）で、Ｕｌｔｒａ－ｔｕｒｒｅｘで処理する（ホモジナイズ）。
４－１０，０００ＲＰＭで、Ｆ２１ｘ５００Ｙ固定角ローター付きＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＣ－５で、１５分間４℃で精製する。
５－ふるいに流し込み、あらゆる大きな海藻粒子を除去する。
６－ＳＭ－ＰＥＳ ２０，０００Ｄａ ＭＷＣＯ Ｓｙｎｄｅｒ限外濾過膜を用いて３．３Ｘ濃縮した後、ＭｉｌｌｉＱ水 ７Ｘでダイアフィルトレーションし、残存する海藻の臭いを除去する。
７－－２０℃で凍結させる。
８－３日間および／または水が完全に除去されるまで凍結乾燥させる。

【0099】

このプロセスのための野生の紅藻をオーストラリア、ビクトリア州ドロマーナ・ビーチで、２０１９年１２月３１日に採集した。限外濾過前および後のサンプルの吸光度スペクトルを分析すると、フィコエリスリンに特徴的なピークが見られ、濾過のプロセスは、２８０ｎｍにおけるタンパク質ピークと比較してフィコエリスリンを濃縮することがわかる。これらのサンプルをＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上に流してもまた、タンパク質バンドが１つだけ見られ、サンプルがフィコエリスリンタンパク質で純粋であることがわかる。

【0100】

スケールアップしたフィコエリスリン抽出物を９５℃で６分間加熱すると、鮮やかなピンクから褐色への色変化が認められた。２つのサンプルについての吸光度スペクトルは、加熱時にフィコエリスリンに特徴的なピークが大きく減少すること、およびピークが広幅化することを示し、色変化がフィコエリスリンのタンパク質構造における変化に起因することを指し示す（図２を参照）。

【0101】

実施例４
様々なフィコエリスリン抽出物の特性評価および比較
上の実施例１に記載される方法を用いて、Ｒ－フィコエリスリンを以下の藻類種から抽出した。
－（ａ）チノリモ（ＣＳ－２５株、シドニー工科大学）
－（ｂ）カギケノリ（ＣＨ４Ｇｌｏｂａｌ）
－（ｃ）カギノリ（ＣＨ４Ｇｌｏｂａｌ）
－（ｄ）ビーチから採集した野生の海藻サンプル

【0102】

ＵＶ吸光度スペクトルをそれぞれのフィコエリスリンサンプルについて記録した。結果を図３に示す。約４９５～５００ｎｍにおけるピークは、サンプル（ｂ）－（ｄ）のそれぞれについて観察され、フィコエリスリンに結合しているフィコウロビリン発色団と一致するが、このピークは、サンプル（ａ）については本質的に欠けていることが認められる。観察された違いは、自然界で見られるサブタイプを反映し、フィコエリスリンタンパク質を構成するタンパク質サブユニットの数、配列および種類に依存する。

【0103】

熱変性
それぞれのフィコエリスリンサンプル（ａ）－（ｄ）について熱変性を行った。結果を図４に示す。

【0104】

視覚的に、すべてのフィコエリスリンサンプルが９５℃への加熱時に色の消失を示した。しかしながら、チノリモから抽出したフィコエリスリンは、他と比較してその色をより保持した。これは、チノリモに見られるフィコエリスリンの特定のサブタイプに起因する可能性が最も高い。

【0105】

実施例５
食品成分としての使用に適する、培地中で培養した微細藻類からのフィコエリスリン抽出物の製造
培地中で培養した微細紅藻類のバイオマス（ＣＳ－１７４ ロドモナス・サリナ(シドニー工科大学)）からフィコエリスリンを得るための、簡便で拡張可能な食品等級の抽出方法をシミュレートするために、実施例２で構築したラボスケールの方法に基づく改良法を適用した。
１．冷凍バイオマス（藻類の乾燥重量＊含有率＝５０ｍｇ／湿潤バイオマス１ｇ）を解凍する。
２．バイオマス１ｇ（湿重量）あたり２．７５ｍＬの水の比率で水を培養バイオマスに添加する。
３．１分間、１０，０００ｒｐｍ（Ｕｌｔｒａ－ｔｕｒｒａｘ、モデルＴ８、ＩＫＡ／Ｊａｎｋｅ ＆ Ｋｕｎｅｌ ＧｍｂＨ Ｇｅｒｍａｎｙ）で混合する。
４．遠心分離：５分、４０００ｇ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｊ６－ＭＩ遠心分離機、ＪＳ ４．２ローター）により精製した。
５．透明な上清を粗製液体抽出物としてデカントする。
６．遠心分離：１５分 １０，０００ＲＰＭ、４℃により、粗製抽出物を精製する（Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＣ－５遠心分離機 Ｆ２１ｘ５００Ｙローター）。
７．透明な上清を水溶性の、食品等級のフィコエリスリン抽出物としてデカントする。
＊乾燥重量ベースとは、すべての水を除去した藻類を指す。

【0106】

実施例６
ＵＶ／分光法による、培地中で培養した微細藻類からのフィコエリスリン抽出物の特性評価
特定の抽出物が熱感受性食品着色剤としての使用に適切であるかどうか、および抽出物の相対的な純度を確認するために、典型的な実験装置を用いて、抽出物のＵＶ／可視スペクトルを得ることがある。興味のある化合物の熱感受性は、重要な波長における、抽出物の熱に対する応答を測定することにより得られることがある。色特性の変化を確認するために、抽出物を加熱した後、さらなるＵＶ／可視スペクトルを得ることがある。

【0107】

抽出物のＵＶ／可視スペクトルの同定
１．装置の動作範囲内で測定値を得るために、液体抽出物を水で希釈することにより試験溶液を調製した。この場合、１／１０希釈で十分であった。
２．ＵＶ分光計（ＵＶ－１７００ Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を準備し、以下の測定特性で波長走査を測定する。
ａ．波長範囲（ｎｍ）：２７０．００から７００．００
ｂ．走査速度：中
ｃ．抽出間隔：１．０秒
ｄ．自動サンプリング間隔：無効
ｅ．スキャンモード：単一波長範囲
３．スキャンを実行し、データを収集する。
４．ＵＶ分光計（ＵＶ－１７００ Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を準備し、ステップ３で同定された興味のある波長において、以下の測定特性で波長走査を測定する。
ａ．開始温度 ２０℃
ｂ．初期待ち時間 １０秒
ｃ．傾斜率 ２．０℃／分
ｄ．測定待ち時間 ５秒
ｅ．間隔 １℃
ｆ．終了温度（Ｃ） ９５
５．スキャンを実行し、データを収集する。
６．ステップ２で使用した設定で波長走査を再実行する。
７．スキャンを実行し、データを収集する。

【0108】

実施例６に記載される抽出物について得られたデータを図７（ＵＶ／ＶＩＳ吸光度スペクトル）および図８（温度走査）に示す。抽出物は、フィコエリスリンに特徴的である、およそ５５０ｎｍにおけるメジャーピークを示す。λ_ｍａｘピークにおける吸光度対２８０ｎｍにおける吸光度（タンパク質の吸光度に対応する）の比率は、２．７：１であり、フィコエリスリンとしての抽出タンパク質の割合が高いことを意味している。

【0109】

５５０ｎｍにおける温度走査は、およそ６３℃で吸光度の５０％減少を示し、全体的な色落ちは、最初の約２０％であった。加熱後の抽出物において波長走査を再実行したところ、小さな残存ピークが存在した。

【0110】

実施例７
培地中で培養した微細藻類からの「食品等級の」フィコエリスリン抽出物の擬似肉食品における適用：鶏肉などの白身肉食品および牛肉などの赤身肉食品を模倣したハンバーガーのパティ
実施例６からの水溶性フィコエリスリン抽出物を使用し、赤身および白身肉食品の性質を模倣したハンバーガーのパティを製剤化した。以下の表８－１に示す製剤を使用した。

【表3】

【0111】

白身擬似肉は、生の食品としての白身肉にとって適切な色を示した。生から調理済みの食品への移行に特有の色変化は、６８から７０℃の温度範囲において観察された。悪い風味の影響は官能評価において指摘されず、製剤は使用に適すると判断された。

【0112】

赤身擬似肉ハンバーガーに関して、適当な生の牛肉の色は、焦がし砂糖をさらに混入し、水溶性フィコエリスリン抽出物の割合を調製することで達成された。生から調理済みの食品への移行に特有の色変化は、６８から７０℃の温度範囲において観察された。悪い風味の影響は官能評価において指摘されず、製剤は使用に適すると判断された。

【0113】

実施例８
培地中で培養した微細藻類からの全バイオマスの擬似肉食品における適用：鶏肉などの白身肉食品および牛肉などの赤身肉食品を模倣したハンバーガーのパティ
全（解凍した冷凍の）微細藻類（ＣＳ－１７４ロドモナス・サリナ、(シドニー工科大学)）を使用し、以下の表８－１に示す製剤を用いて、赤身肉食品の性質を模倣したハンバーガーのパティを製剤化した。

【表4】

【0114】

赤身擬似肉は、生の食品として適切な色を示した。

【0115】

ハンバーガーのパティを市販のホットプレートで調理した。プローブ温度計を用いて内部温度をモニターし、色変化を視覚的に観察した。

【0116】

生から調理済みの食品への移行に特有の色変化は、６８から７０℃の温度範囲において観察された。官能評価は、うま味がわずかに増強されたことを示したが、好ましくない磯臭さによる汚染を示さなかった。

【0117】

実施例９
精製フィコエリスリン紅藻抽出物による鉄結合
実施例１（超音波処理を含む抽出）からのフィコエリスリン抽出物を２ｍｇ/ｍＬの濃度で、０．０２％ アジ化ナトリウムを含むｐＨ７の２０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液中に溶解した。塩化鉄（ＩＩ）を同じ緩衝液中に１００ｍＭの初期濃度で溶解した。溶解したフィコエリスリン抽出物を１：１で一連の濃度の塩化鉄とともに混合し、１ｍｇ/ｍＬの最終タンパク質濃度、並びに０、０．２５、０．５、１、２、４、８、１６および３２ｍＭの最終塩化鉄濃度を得た。

【0118】

Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｖａｒｉｏｓｋａｎ Ｆｌａｓｈ（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ｖｅｒｓｉｏｎ ４．００.５２）を用いて、４９８ｎｍの励起波長を用いる５１５～７００ｎｍの蛍光発光走査をすべてのサンプルについて次に行った。Ｒ－フィコエリスリンは５７５ｎｍの発光極大を有し、したがって、鉄結合がタンパク質の直鎖状テトラピロール部分で起こる場合、蛍光の変化が観察されるであろう。図７は蛍光鉄結合の結果を示す。図に示すように、鉄濃度の上昇につれてフィコエリスリン蛍光が減少し、これは鉄がタンパク質の直鎖状テトラピロールに結合すること、およびフィコエリスリンが鉄と配位し、それゆえ鉄担体タンパク質であり得ることを示す。

【0119】

実施例１０
フィコエリスリンに結合した鉄のバイオアベイラビリティの評価
樹立ヒト腸管モデル－Ｃａｃｏ－２／ＨＴ２９－ＭＴＸ－Ｅ１２トランスウェルモデルを用いて、フィコエリスリン結合鉄のバイオアベイラビリティを評価した。フィコエリスリンがある場合およびない場合における鉄の腸管吸収をヒトフェリチンの形成によって測定した。
試験溶液
塩化鉄（ＩＩ）（塩化第一鉄、ＦｅＣｌ_２）、
塩化鉄（ＩＩＩ）（塩化第二鉄、ＦｅＣｌ_３）および
硫酸鉄（ＩＩ）（硫酸第一鉄、ＦｅＳＯ_４．７Ｈ_２Ｏ）
フィコエリスリン

【0120】

方法
半透膜上で培養したＨｕｍａｎ Ｃａｃｏ－２（腸細胞）およびＨＴ２９－ＭＴＸ－Ｅ１２（杯）細胞は、腸管バリアモデルを含む。インビボ腸管バリアはいくつかの異なる細胞型を含むので、単一細胞株の代わりに共培養を行った。腸管バリアモデルにおける任意の処理効果が細胞毒性に関連しないことを確かにするため、キーウィフルーツ消化物に対してＣａｃｏ－２／ＨＴ２９－ＭＴＸ－Ｅ１２細胞生存率を測定した。

【0121】

全サンプルに対してＣａｃｏ－２／ＨＴ２９－ＭＴＸ－Ｅ１２細胞生存率を測定し、腸管バリアモデルの処理濃度を決定した。非細胞毒性サンプル濃度を用いて、腸細胞アッセイにおける任意の処理効果が細胞毒性に関連しないことを確かにする。ＣｙＱＵＡＮＴ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙを用いて細胞生存率を測定し、下記の通りに細胞生存率を推定した。
・９ｘ１０^４ Ｃａｃｏ－２細胞および１ｘ１０^４ ＨＴ２９－ＭＴＸ－Ｅ１２細胞を９６ウェル黒色プレートに播種し、７日間、３７℃で、５％ＣＯ_２でインキュベートした。
・７日後、培地（ＤＭＥＭ、１０％ ウシ胎児血清）を除去し、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）緩衝液を用い、細胞を（ロボットによって）洗浄した。
・プロジェクトサンプルをＨＢＳＳ中で調製し、マルチチャンネルピペットを用いて細胞に添加した。細胞を終夜３７℃で、５％ＣＯ_２でインキュベートした。
・１６～１８時間後に処理液を除去し、ＨＢＳＳで洗浄した後、ＨＢＳＳ緩衝液中に希釈したＣｙＱＵＡＮＴ試薬を（ロボットを用いて）細胞に適用した。
・１時間後、蛍光を励起波長４８５ｎｍおよび発光波長５３０ｎｍで測定した。

【0122】

半透膜上で培養したＨｕｍａｎ Ｃａｃｏ－２（腸細胞）およびＨＴ２９－ＭＴＸ－Ｅ１２（杯）細胞は、腸管バリアモデルを含む。下記の通り、トランスウェル上で共培養を行った。
・Ｃａｃｏ－２細胞およびＨＴ２９－ＭＴＸ－Ｅ１２細胞フラスコは、～９０％コンフルエントになった時点で継代した。
・血球計算盤（またはコールター・カウンター）を用いて細胞を計数し、細胞数／ｍＬを割り出した。
・０．６ｍＬ 培地（細胞なし）をトランスウェルの基底外側チャンバーに添加した。
・０．２ｍＬ Ｃａｃｏ－２／ＨＴ２９－ＭＴＸ－Ｅ１２細胞溶液を注意深く頂端側チャンバー中に添加し、３．６ｘ１０^４ Ｃａｃｏ－２および４ｘ１０^３ ＨＴ２９－ＭＴＸ細胞とした。
・２～３日ごとに培地を交換しながら２１日間トランスウェル上で共培養を行った。
・２１日目に、Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ電圧抵抗計を用いて、頂端側から基底外側チャンバーまでの経上皮電気抵抗（またはＴＥＥＲ）を測定した（図１）。これらの測定は、細胞層の健全性を示し、細胞が分極していること、および無傷のバリアが実験可能な状態であることを保証する。すべてのＴＥＥＲ測定値は２８０Ω．ｃｍ^２を上回り、分化細胞および無傷のバリアを示した。無傷の腸細胞バリアの調製後、塩化第一鉄、塩化第二鉄、および硫酸第一鉄の効果を腸管バリア機能について、記載する通りに観察した。
・すべての経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）測定値は２１日目に測定され、サンプル処理液の適用前に記録された。
・鉄サンプルおよびフィコエリスリンをＨＢＳＳ中に非細胞毒性濃度で調製した。
・培地を細胞から取り除き、ＨＢＳＳに２時間置換し、ウシ胎児血清の細胞（培地中に存在する）を枯渇させた。
・ＨＢＳＳを除去し、サンプル処理液に２時間置換した。処理液を除去し、ＨＢＳＳに置換し、終夜インキュベートした。
・１６～１８時間後に（頂端側の）細胞をＰＢＳで洗浄した後、トリプシンを適用し、細胞をトランスウェル膜から取り除いた。
・５分間遠心することにより細胞を回収した。
・Ａｂｃａｍフェリチンアッセイを製造業者の説明書に従って行った。

【0123】

対応のないｔ検定を用いて、フェリチンアッセイからの結果を有意差について分析した。差は、Ｐ＜０．０５の場合に有意であると見なされた。全ての統計解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５ソフトウェアを用いて行われた。

【0124】

結果
細胞生存率は、８ｍｇ／ｍＬ フィコエリスリンを含むおよび含まない鉄溶液に対して測定された。８ｍｇ／ｍＬ フィコエリスリンを含む１００、５０、および２５ｍｍ鉄溶液は、８０％より大きい細胞生存率を示し、腸管モデルでテストされた。

【0125】

全てのサンプル処理は、８０μＭ アスコルビン酸の存在下で行われた。腸細胞モデルにおけるフェリチン形成に関する先行研究は、アスコルビン酸を使用し、鉄の腸管吸収を向上させたり（Ｍａｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ. Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｃｏ－２ ａｎｄ ＨＴ２９－ＭＴＸ ｃｏｃｕｌｔｕｒｅｓ ｉｎ ａｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ/ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｏｄｅｌ ｕｓｅｄ ｔｏ ｐｒｅｄｉｃｔ ｉｒｏｎ ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ, Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；２０：４９４－５０２, ２００９.）、通常ヒトに存在するアスコルビン酸塩の生物学的濃度（５０および１００μＭ）を模倣したりする（Ｂａｄｕ－Ｂｏａｔｅｎｇ, Ｃ. ａｎｄ Ｎａｆｔａｌｉｎ, Ｒ.Ｊ. Ａｓｃｏｒｂａｔｅ ａｎｄ ｆｅｒｒｉｔｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：Ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｆｏｒ ｉｒｏｎ ｒｅｌｅａｓｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｄ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ, Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ., １３３：７５－８７, ２０１９）。

【0126】

有意差は、１００μＭ 鉄溶液およびアスコルビン酸で処理した細胞と鉄溶液、アスコルビン酸、およびフィコエリスリンで処理した細胞との比較では認められなかったが、鉄がない場合、フィコエリスリン プラス アスコルビン酸は、他の全ての鉄溶液と比較して、同様のフェリチン産生量を示した。鉄（１００μＭ）およびフィコエリスリン（８ｍｇ／ｍＬ）の初期処理濃度が、２つの成分の相乗効果を観察するには高すぎであった可能性がある。

【0127】

２５μＭまたは５０μＭ 鉄溶液、および４または８ｍｇ／ｍＬ フィコエリスリンで細胞を処理した。結果を表１０－１に示す。

【表5】

【0128】

４ｍｇ／ｍＬ フィコエリスリンおよび５０μＭ 塩化第二鉄または硫酸第一鉄による細胞の共処理は、塩化第二鉄または硫酸第一鉄のみで処理した細胞と比較して、フェリチン産生を有意に向上させた。８ｍｇ／ｍＬ フィコエリスリンによる共処理は、硫酸第二鉄の存在下でフェリチン産生を有意に向上させた。

【0129】

４または８ｍｇ／ｍＬ フィコエリスリンおよび２５μＭ 塩化第一鉄、塩化第二鉄、または硫酸第一鉄による細胞の共処理は、種々の鉄溶液のみで処理した細胞と比較して、フェリチン産生を有意に向上させた。４ｍｇ／ｍＬ フィコエリスリンのみ（すなわち鉄が添加されていない）による処理もまた、鉄溶液による処理と比較してフェリチン産生を有意に増加させた。同様に、８ｍｇ／ｍＬ フィコエリスリンのみ（すなわち鉄が添加されていない）による処理は、塩化第二鉄による処理と比較した場合のみであるが、フェリチンを有意に増加させた。

【0130】

フィコエリスリンは、インビトロにおいて、鉄のバイオアベイラビリティを向上させ、フェリチンの産生を促進し得る。食品中にフィコエリスリンを含めることは、特に、より低濃度の鉄と組み合わせた場合に、鉄の腸管吸収およびフェリチン産生を向上させることがある。

【0131】

実施例１１
バイオマスのＲ－ＰＥ含有量の代表的な定量方法
方法は、書籍の章：”Extraction and Purification of R-phycoerythrin from Marine Red Algae” by Justine Dumay, Michele Morancais, Huu Phuo Trang Nguyen, and Joel Fleurence in ”Natural Products From Marine Algae：Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 1308”, by Dagmar B. Stengel and Solene Connan (eds.), Springer Science Business Media New York 2015, DOI 10.1007/978-1-4939-2684-8_5を参考にした。

【0132】

以下の方法は、４９５および５６５ｎｍにおける吸収ピークに基づく算出の実例を示すが、対応する算出が、４９５～５０３ｎｍ（例えば、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０１、５０２または５０３ｎｍ）および５４０～５７０ｎｍ（例えば、約５４０、５４５、５５０ ５５５、５６０、５６５、５７０ｎｍ）の範囲で対応するピークを示すＰＥサンプルについて行われ得るということを理解されたい。
１．およそ１ｇのバイオマスを１０ｍＬ 目盛り付き遠心チューブ中に正確に量り分ける。
２．脱イオン水をおよそ５ｍＬ添加する。
３．チューブを冷却（氷浴）したまま、３０秒間、高せん断ミキサー（ＵｌｔｒａＴｕｒｒａｘ Ｔ８ スピード６）でホモジナイズする。
４．１０ｍＬの目印まで脱イオン水で満たす。
５．３０分間、４度で混合する。
６．２０分、４０００ｇ、４度で遠心する。
７．上清を２５ｍＬ メスフラスコ中にデカントする。
８．脱イオン水をペレットにおよそ５ｍＬ添加する。
９．チューブを冷却（氷浴）したまま、３０秒間、高せん断ミキサー（ＵｌｔｒａＴｕｒｒａｘ Ｔ８ スピード６）でホモジナイズする。
１０．１０ｍＬの目印まで脱イオン水で満たす。
１１．３０分間、４度で混合する。
１２．２０分、４０００ｇ、４度で遠心する。
１３．上清を２５ｍＬ メスフラスコ中で最初の抽出物と合わせる。
１４．２５ｍＬの目印まで脱イオン水で満たす。
１５．３５０から７５０ｎｍまでの間で吸光度値を測定する。

【0133】

フィコエリスリン含有量（ｍｇ／ｍＬ）は、以下のＢｅｅｒ ａｎｄ Ｅｓｈｅｌ等式により推定可能である（Ｂｅｅｒ Ｓ., ａｎｄ Ｅｓｈｅｌ Ａ., （１９８５） Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ ａｎｄ ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ａｑｕｅｏｕｓ ｃｒｕｄｅ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｏｆ ｒｅｄ ａｌｇａｅ. Ａｕｓｔ Ｊ Ｍａｒ Ｆｒｅｓｈｗ Ｒｅｓ ３６：７８５－７９３）。
ＰＥ＝［（Ａ_５６５－Ａ_５９２）－（Ａ_４９５－Ａ_５９２） ｘ ０．２）］ ｘ ０．１２

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【国際調査報告】