特表2023-521345ＳＡＧＡ（ＳＰＴ－ＡＤＡ－ＧＣＮ５－アセチルトランスフェラーゼ）複合体の破壊による、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の活性化及び細胞溶解活性を向上させるための組成物及び方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-05-24
(54)【発明の名称】ＳＡＧＡ（ＳＰＴ－ＡＤＡ－ＧＣＮ５－アセチルトランスフェラーゼ）複合体の破壊による、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の活性化及び細胞溶解活性を向上させるための組成物及び方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/10 20060101AFI20230517BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20230517BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20230517BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20230517BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230517BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230517BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230517BHJP
【ＦＩ】
C12N5/10
C12N5/0783
A61K35/17
A61K45/00
A61P43/00 121
A61K39/395 T
A61P35/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022561057
(86)(22)【出願日】2021-04-07
(85)【翻訳文提出日】2022-12-02
(86)【国際出願番号】 CA2021050464
(87)【国際公開番号】W WO2021203200
(87)【国際公開日】2021-10-14
(31)【優先権主張番号】63/006,455
(32)【優先日】2020-04-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】507148294
【氏名又は名称】ユニバーシティー ヘルス ネットワーク
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100106518
【弁理士】
【氏名又は名称】松谷 道子
(74)【代理人】
【識別番号】100138911
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻井 陽子
(74)【代理人】
【識別番号】100218268
【弁理士】
【氏名又は名称】及川 健太郎
(72)【発明者】
【氏名】ジニス ジ カルヴァーリョ，ダニエル
(72)【発明者】
【氏名】ホァ，ホウシェン
(72)【発明者】
【氏名】エッタイェビ，イリアス
(72)【発明者】
【氏名】ソアレス，フレイザー
(72)【発明者】
【氏名】ルー ヤウ，ヘレン
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C085
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065CA24
4B065CA44
4C084AA19
4C084NA14
4C084ZB26
4C084ZC75
4C085AA14
4C085BB11
4C085EE01
4C085EE03
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB44
4C087BB65
4C087NA14
4C087ZB26
4C087ZC75
(57)【要約】
Ｔ細胞集団のＳＡＧＡ（Ｓｐｔ－Ａｄａ－Ｇｃｎ５－アセチルトランスフェラーゼ）遺伝子制御複合体の１つ以上の遺伝サブユニットを阻害することを伴う、Ｔ細胞集団における、Ｔ細胞エフェクター機能を増加させる方法を提供する。がん患者の治療における、そのようなＴ細胞集団の使用方法もまた提供する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｔ細胞集団における、Ｔ細胞エフェクター機能を増加させる方法であって、前記方法が、前記Ｔ細胞集団のＴ細胞内で、ＳＡＧＡ（Ｓｐｔ－Ａｄａ－Ｇｃｎ５－アセチルトランスフェラーゼ）遺伝子制御複合体の発現または機能を阻害することを含む、前記方法。
【請求項2】
Ｔ細胞集団における、Ｔ細胞エフェクター機能を増加させる方法であって、前記方法が、前記Ｔ細胞集団のＴ細胞内で、ＳＡＧＡ（Ｓｐｔ－Ａｄａ－Ｇｃｎ５－アセチルトランスフェラーゼ）遺伝子制御複合体の１つ以上の遺伝サブユニットを阻害することを含む、前記方法。
【請求項3】
前記１つ以上の遺伝サブユニットが、ＡＤＡ２Ｂ、ＣＣＤＣ１０１、ＴＡＤＡ１、ＴＡＦ５Ｌ、ＴＡＦ６Ｌ、ＴＡＦ１０、ＳＵＰＴ７Ｌ、及びＴＲＲＡＰから選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
対象における、Ｔ細胞エフェクター機能を増加させる方法であって、前記方法が、Ｔ細胞集団を、エクスビボで、前記ＳＡＧＡ遺伝子制御複合体の阻害剤を含む組成物と接触させることと、治療に有効な量の前記Ｔ細胞集団を前記対象に投与することと、を含む、前記方法。
【請求項5】
前記対象が、がんと診断された患者である、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記方法が、前記対象にがん療法を投与することをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記がん療法が免疫療法である、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記対象に免疫チェックポイント阻害剤を投与することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記Ｔ細胞が活性化ＣＤ８＋ Ｔ細胞である、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
前記方法が、前記Ｔ細胞内での前記ＳＡＧＡ遺伝子制御複合体の活性を、前記ＳＡＧＡ遺伝子制御複合体が阻害されていないＴ細胞集団と比較して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９９％低下させる、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
前記Ｔ細胞が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
前記阻害剤が低分子である、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項13】
前記阻害剤が、前記ＳＡＧＡ遺伝子制御複合体の遺伝サブユニットをコードする核酸とハイブリダイズして、前記サブユニットの発現を阻害することができる核酸を含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項14】
前記阻害剤が、Ｃａｓ９タンパク質、または、前記Ｃａｓ９タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び、ＣＲＩＳＰＲ－ｃａｓシステムガイドＲＮＡポリヌクレオチドを含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項15】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現し、ＳＡＧＡ（Ｓｐｔ－Ａｄａ－Ｇｃｎ５－アセチルトランスフェラーゼ）遺伝子制御複合体のサブユニットのうちの１つ異常の発現または機能が阻害される、修飾Ｔ細胞。
【請求項16】
複数の、請求項１５に記載の修飾Ｔ細胞を含む、細胞集団。
【請求項17】
Ｔ細胞集団を含むがん治療方法で使用するための細胞集団であって、ＳＡＧＡ（Ｓｐｔ－Ａｄａ－Ｇｃｎ５－アセチルトランスフェラーゼ）遺伝子制御複合体の１つ以上の遺伝サブユニットが、前記Ｔ細胞集団内で阻害される、前記細胞集団。
【請求項18】
前記Ｔ細胞が活性化ＣＤ８＋ Ｔ細胞である、請求項１６または１７のいずれか１項に記載の細胞集団。
【請求項19】
前記１つ以上の遺伝サブユニットが、ＡＤＡ２Ｂ、ＣＣＤＣ１０１、ＴＡＤＡ１、ＴＡＦ５Ｌ、ＴＡＦ６Ｌ、ＴＡＦ１０、ＳＵＰＴ７Ｌ、及びＴＲＲＡＰから選択される、請求項１６～１８のいずれか１項に記載の細胞集団。
【請求項20】
前記Ｔ細胞内での前記ＳＡＧＡ遺伝子制御複合体の活性が、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９９％阻害される、請求項１６～１９のいずれか１項に記載の細胞集団。
【請求項21】
前記阻害剤が、前記ＳＡＧＡ遺伝子制御複合体の遺伝サブユニットをコードする核酸とハイブリダイズして、前記サブユニット、または、Ｃａｓ９タンパク質、または、前記Ｃａｓ９タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び、ＣＲＩＳＰＲ－ｃａｓ９システムガイドＲＮＡポリヌクレオチドの発現を阻害することができる核酸を含む、請求項１６～２０のいずれか１項に記載の集団。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本特許出願は、２０２０年４月７日に出願された、米国仮特許出願６３／００６，４５５号の優先権を主張する。
【0002】
本出願は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の活性化、増殖、または細胞溶解活性を増加させる方法に関する。
【背景技術】
【0003】
ＳＡＧＡ複合体
ＳＡＧＡ（Ｓｐｔ－Ａｄａ－Ｇｃｎ５－アセチルトランスフェラーゼ）複合体は、１９個のサブユニットを含む、進化の過程で保存された、多機能同時活性因子である［１］。ＳＡＧＡは、異なる活性を有する個別のモジュール内に組織化され、構造コア、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）、ヒストン脱ユビキチン化酵素（ＤＵＢ）、及び、活性化結合分子を含有する［２］。大部分は、２つのクロマチン修飾酵素分子を介する転写の刺激により、及び、タンパク質コード遺伝子の発現における中心的な事象である、ＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）を送達して、ＤＮＡ上に開始前複合体を核形成することにより、ＳＡＧＡ、及びその関連する複合体は、いくつかの異なるシグナル伝達経路に関与する［１］。
ＳＡＧＡ（Ｓｐｔ－Ａｄａ－Ｇｃｎ５－アセチルトランスフェラーゼ）複合体は、１９個のサブユニットを含む、進化の過程で保存された、多機能同時活性因子である［１］。ＳＡＧＡは、異なる活性を有する個別のモジュール内に組織化され、構造コア、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）、ヒストン脱ユビキチン化酵素（ＤＵＢ）、及び、活性化結合分子を含有する［２］。大部分は、２つのクロマチン修飾酵素分子を介する転写の刺激により、及び、タンパク質コード遺伝子の発現における中心的な事象である、ＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）を送達して、ＤＮＡ上に開始前複合体を核形成することにより、ＳＡＧＡ、及びその関連する複合体は、いくつかの異なるシグナル伝達経路に関与する［１］。
【0004】
タンパク質コード遺伝子の転写は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩと、複数の一般的な転写因子とを含む開始前複合体（ＰＩＣ）の形成により開始する。ＳＡＧＡに加えて、別の多タンパク質複合体である転写因子ＩＩＤ（ＴＦＩＩＤ）は、ＴＢＰを遺伝子プロモーターに送達することができ、酵母菌における全体的な遺伝子発現に必要である。最近の研究では、ＴＦＩＩＤに対してではなく、ＳＡＧＡに対するより特定の役割が示されている。例えば、ＳＡＧＡ優先プロモーターは、コンセンサスＴＡＴＡボックスを有する傾向にあり、よりストレス制御された／誘発可能な遺伝子であり、より厳しく制御される傾向にある［３］。ＴＢＰが相互作用するＳＡＧＡのサブユニットであるＳＰＴ３の欠失時に、Ｈｕｉｓｉｎｇａ ｅｔ ａｌ．は、全ｍＲＮＡのレベルは、酵母菌遺伝子のおよそ９０％が低下した、ＴＦＩＩＤのサブユニットであるＴＢＰ関連因子１（Ｔａｆ１）により制御されるものと比較して、酵母菌遺伝子の約１０％のみが減少した［４］ことを示した。これにより、２つの異なる遺伝子クラス：（１）Ｓｐｔ３により正に制御されるが、Ｔａｆ１とは本質的に独立している、ＳＡＧＡ優先遺伝子、及び、（２）Ｓｐｔ３よりもＴａｆ１においてより依存的な、ＴＦＩＩＤ優先遺伝子の大きなクラス（９０％）における区別がもたらされた［４］。したがって、一般的なモデルとして、ＴＢＰの動員は主に、（［２］で確認されるように）ＴＡＴＡ含有プロモーターにおいてはＳＡＧＡに依存するが、ＴＡＴＡ様（または、ＴＡＴＡが少ない）プロモーターにおいてはＴＦＩＩＤにより支配されることが提案された。それにもかかわらず、中心モジュールは、構造的にＴＦＩＩＤに関連していることが示されており、ことことは、両複合体におけるＴＢＰ結合が、いくつかの共通の特徴を分かち合っていることを示唆している。
【0005】
Ｂａｐｔｉｓｔａ ｅｔ ａｌ．による最近の研究では、ＳＡＧＡ枯渇時に、大部分のｍＲＮＡの半減期の代償的増加が観察され、異なるＳＡＧＡ変異体株における、定常状態でのｍＲＮＡレベルの変化が限定的であることを説明している［５］。したがって、ＳＡＧＡ枯渇後の、Ｐｏｌ ＩＩ転写における減少は、Ｐｏｌ ＩＩ及びメディエーターにおける変異、または、ＴＦＩＩＨにおけるキナーゼ活性の阻害に関して以前に報告されたように、ｍＲＮＡ半減期を増加させることにより補償された。これらの研究は、転写の開始におけるＳＡＧＡの重要性、及び、ＳＡＧＡ複合体の構成要素がいつ喪失されるかという、代償メカニズムのポイントを示している［５］。
【0006】
ＣＤ８＋ Ｔ細胞の活性化
ＣＤ８＋ Ｔ細胞は、適応免疫系の細胞である。適応免疫系の鍵となる特徴は、特異的抗原（または、外来病原体）に対して免疫応答を発揮し、抗原の記憶を保持する能力である。ＣＤ８＋ Ｔ細胞は、腫瘍監視のための免疫防御に非常に重要であるだけでなく、細胞毒性剤を送達して、感染細胞、及び腫瘍細胞を殺傷可能でもある［６］。
ＣＤ８＋ Ｔ細胞は、適応免疫系の細胞である。適応免疫系の鍵となる特徴は、特異的抗原（または、外来病原体）に対して免疫応答を発揮し、抗原の記憶を保持する能力である。ＣＤ８＋ Ｔ細胞は、腫瘍監視のための免疫防御に非常に重要であるだけでなく、細胞毒性剤を送達して、感染細胞、及び腫瘍細胞を殺傷可能でもある［６］。
【0007】
活性化されて、そのエフェクター機能を発揮するためには、ナイーブな抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞には、最適な活性化のための２つのシグナルが必要である：
【0008】
シグナル１－抗原認識
このシグナルは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と共に、ペプチド：ＭＨＣクラスＩ複合体抗原保持細胞による抗原提示により送達され、免疫応答の特異性を確保する。ＴＣＲは特異性をもたらすものの、細胞内シグナル伝達のための能力は有しない。しかし、シグナル形質導入は、ＴＣＲと関連するＣＤ３分子を介して送達される。ＣＤ３分子は、シグナルを形質導入するために、その細胞質テール内に、免疫受容体のチロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。コグネートＭＨＣクラスＩによるＴＣＲのライゲーションにより、ＳｒｃファミリーのキナーゼであるＬｃＫ及びＦｙｎによるＩＴＡＭのリン酸化がもたらされる。リン酸化ＩＴＡＭは、Ｌｃｋ及びＦｙｎ、ならびに、ζ関連プロテインキナーゼ７０（ＺＡＰ－７０）と呼ばれるＳｋｙファミリーキナーゼで構成される、近位シグナル伝達複合体を形成するためのドッキング部位としての役割を果たす。これらの通路を介しての下流シグナル伝達は、カルシウムイオンの細胞内上昇を引き起こし、最終的に、ホスファターゼカルシニューリンの活性化をもたらす。活性化されたカルシニューリンは、転写因子の活性化Ｔ細胞（ＮＦＡＴ）ファミリーの核因子のメンバーの脱リン酸化を促進する。最終的に、ＴＣＲの関与が、下流でのシグナル伝達カスケードをトリガーし、最終的に、転写因子であるＮＦｋＢ、ＮＦＡＴ、ＡＰ１の核内への活性化に収束する。合わせると、これらは、特定の遺伝子転写プログラムを誘発し、細胞増殖及び分化をもたらす［７］。
このシグナルは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と共に、ペプチド：ＭＨＣクラスＩ複合体抗原保持細胞による抗原提示により送達され、免疫応答の特異性を確保する。ＴＣＲは特異性をもたらすものの、細胞内シグナル伝達のための能力は有しない。しかし、シグナル形質導入は、ＴＣＲと関連するＣＤ３分子を介して送達される。ＣＤ３分子は、シグナルを形質導入するために、その細胞質テール内に、免疫受容体のチロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。コグネートＭＨＣクラスＩによるＴＣＲのライゲーションにより、ＳｒｃファミリーのキナーゼであるＬｃＫ及びＦｙｎによるＩＴＡＭのリン酸化がもたらされる。リン酸化ＩＴＡＭは、Ｌｃｋ及びＦｙｎ、ならびに、ζ関連プロテインキナーゼ７０（ＺＡＰ－７０）と呼ばれるＳｋｙファミリーキナーゼで構成される、近位シグナル伝達複合体を形成するためのドッキング部位としての役割を果たす。これらの通路を介しての下流シグナル伝達は、カルシウムイオンの細胞内上昇を引き起こし、最終的に、ホスファターゼカルシニューリンの活性化をもたらす。活性化されたカルシニューリンは、転写因子の活性化Ｔ細胞（ＮＦＡＴ）ファミリーの核因子のメンバーの脱リン酸化を促進する。最終的に、ＴＣＲの関与が、下流でのシグナル伝達カスケードをトリガーし、最終的に、転写因子であるＮＦｋＢ、ＮＦＡＴ、ＡＰ１の核内への活性化に収束する。合わせると、これらは、特定の遺伝子転写プログラムを誘発し、細胞増殖及び分化をもたらす［７］。
【0009】
シグナル２－同時刺激
ＴＣＲシグナル伝達を支持するための、第２の同時刺激シグナルが、Ｔ細胞の生残及び拡大を促進する役割を果たす。Ｔ細胞で発見された典型的な同時刺激性受容体はＣＤ２８であり、大部分のナイーブＴ細胞で構造的に発現している。ＣＤ２８のリガンドは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面で発現するＣＤ８０及びＣＤ８６である。ＣＤ２８は、免疫学的シナプスの中央領域内でＴＣＲと同時局在化して発見されてるために、ＴＣＲのライゲーション後の、近位でのシグナル伝達複合体における事象を向上させる。したがって、ＴＣＲシグナル伝達と共に、ＣＤ２８は、サイトカイン産生、細胞サイクリング、生残、及び分化を促進することができる［７、８］。
ＴＣＲシグナル伝達を支持するための、第２の同時刺激シグナルが、Ｔ細胞の生残及び拡大を促進する役割を果たす。Ｔ細胞で発見された典型的な同時刺激性受容体はＣＤ２８であり、大部分のナイーブＴ細胞で構造的に発現している。ＣＤ２８のリガンドは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面で発現するＣＤ８０及びＣＤ８６である。ＣＤ２８は、免疫学的シナプスの中央領域内でＴＣＲと同時局在化して発見されてるために、ＴＣＲのライゲーション後の、近位でのシグナル伝達複合体における事象を向上させる。したがって、ＴＣＲシグナル伝達と共に、ＣＤ２８は、サイトカイン産生、細胞サイクリング、生残、及び分化を促進することができる［７、８］。
【0010】
ＣＤ８＋ Ｔ細胞は、同時刺激性シグナル伝達のために、ＣＤ２８以外の多種多様な受容体もまた表示する。プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）及び細胞毒性Ｔ－リンパ球抗原４（ＣＴＬＡ－４）などの他の受容体分子は代わりに、阻害シグナルを提供することができ、これは、活性化以外のＴ細胞阻害を促進することができる［９］。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のシグナル伝達の機能的アウトカムを測定し、また、ホメオスタシスを維持するのに重要でもあることから、同時刺激性及び同時阻害性受容体の両方が、Ｔ細胞の生物学において本質的な役割を有している［１０］。
【発明の概要】
【0011】
一態様では、Ｔ細胞集団における、Ｔ細胞エフェクター機能を増加させる方法であって、上記方法が、Ｔ細胞集団のＴ細胞内で、ＳＡＧＡ（Ｓｐｔ－Ａｄａ－Ｇｃｎ５－アセチルトランスフェラーゼ）遺伝子制御複合体の発現または機能を阻害することを含む、上記方法を提供する。
【0012】
一態様では、Ｔ細胞集団における、Ｔ細胞エフェクター機能を増加させる方法であって、上記方法が、Ｔ細胞集団のＴ細胞内で、ＳＡＧＡ遺伝子制御複合体の１つ以上の遺伝サブユニットを阻害することを含む、上記方法を提供する。１つ以上の遺伝サブユニットは、ＡＤＡ２Ｂ、ＣＣＤＣ１０１、ＴＡＤＡ１、ＴＡＦ５Ｌ、ＴＡＦ６Ｌ、ＴＡＦ１０、ＳＵＰＴ７Ｌ、及びＴＲＲＡＰから選択することができる。
【0013】
一態様では、対象における、Ｔ細胞エフェクター機能を増加させる方法であって、上記方法が、Ｔ細胞集団を、エクスビボで、ＳＡＧＡ遺伝子制御複合体の阻害剤を含む組成物と接触させることと、治療に有効な量の上記Ｔ細胞集団を上記対象に投与することと、を含む、上記方法を提供する。一実施形態では、対象は、がんと診断された患者である。いくつかの実施形態では、がんは、血液学的である。いくつかの実施形態では、がんは白血病、リンパ腫、または骨髄腫である。いくつかの実施形態では、方法は、免疫療法であることができるがん療法を対象に投与することをさらに含む。一実施形態では、方法は、対象に免疫チェックポイント阻害剤を投与することを含む。
【0014】
上記方法の全てにおいて、Ｔ細胞は、活性化ＣＤ８＋ Ｔ細胞であり得る。
【0015】
様々な実施形態では、方法は、Ｔ細胞内でのＳＡＧＡ遺伝子制御複合体の活性を、ＳＡＧＡ遺伝子制御複合体が阻害されていないＴ細胞集団と比較して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９９％低下させる。
【0016】
上記方法のいくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する。
【0017】
様々な実施形態では、阻害剤は、低分子；ＳＡＧＡ遺伝子制御複合体の遺伝サブユニットをコードする核酸とハイブリダイズして、サブユニットの発現を阻害することができる核酸；ならびに、Ｃａｓ９タンパク質、または、Ｃａｓ９タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び、ＣＲＩＳＰＲ－ｃａｓシステムガイドＲＮＡポリヌクレオチドから選択することができる。
【0018】
別の態様では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する修飾Ｔ細胞を提供し、ＳＡＧＡ遺伝子制御複合体のサブユニットのうちの１つ以上の発現または機能が阻害される。複数の、これらの修飾Ｔ細胞を含む細胞集団もまた提供する。別の態様では、Ｔ細胞集団を含むがん治療方法で使用するための細胞集団を提供し、ＳＡＧＡ遺伝子制御複合体の１つ以上の遺伝サブユニットは、Ｔ細胞集団内で阻害される。これらの細胞集団のＴ細胞は、適切に活性化されたＣＤ８＋ Ｔ細胞である。１つ以上の遺伝サブユニットは、ＡＤＡ２Ｂ、ＣＣＤＣ１０１、ＴＡＤＡ１、ＴＡＦ５Ｌ、ＴＡＦ６Ｌ、ＴＡＦ１０、ＳＵＰＴ７Ｌ、及びＴＲＲＡＰから選択することができる。様々な実施形態では、これらのＴ細胞集団内での、ＳＡＧＡ遺伝子制御複合体の活性は、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９９％阻害される。いくつかの実施形態では、阻害剤は、ＳＡＧＡ遺伝子制御複合体の遺伝サブユニットをコードする核酸とハイブリダイズして、サブユニットの発現を阻害することができる核酸、または、Ｃａｓ９タンパク質、もしくは、Ｃａｓ９タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び、ＣＲＩＳＰＲ－ｃａｓシステムガイドＲＮＡポリヌクレオチドを含む。
【0019】
開示した実施形態は、以下を含む：
【0020】
１．Ｔ細胞集団を含む療法で使用するための組成物であって、ＳＡＧＡ（Ｓｐｔ－Ａｄａ－Ｇｃｎ５－アセチルトランスフェラーゼ）遺伝子制御複合体の発現または機能が、上記Ｔ細胞集団内で阻害されている、上記組成物。
【0021】
２．Ｔ細胞集団を含む療法で使用するための組成物であって、上記ＳＡＧＡ遺伝子制御複合体の１つ以上の遺伝サブユニットが、上記Ｔ細胞集団内で阻害され、好ましくは、上記１つ以上の遺伝サブユニットが、ＡＤＡ２Ｂ、ＣＣＤＣ１０１、ＴＡＤＡ１、ＴＡＦ５Ｌ、ＴＡＦ６Ｌ、ＴＡＦ１０、ＳＵＰＴ７Ｌ、及びＴＲＲＡＰから選択される、上記組成物。
【0022】
３．上記ＳＡＧＡ遺伝子制御複合体の上記１つ以上の遺伝サブユニットのうちの少なくとも１つが、上記ＳＡＧＡ遺伝子制御複合体の上記遺伝サブユニットをコードする核酸とハイブリダイズして、上記サブユニットの発現を阻害することができる核酸により阻害される、実施形態２に記載の組成物。
【0023】
４．上記ＳＡＧＡ遺伝子制御複合体の上記１つ以上の遺伝サブユニットのうちの少なくとも１つが、遺伝子編集分子、場合により、Ｃａｓ９タンパク質、または、Ｃａｓ９タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び、ＣＲＩＳＰＲ－ｃａｓシステムガイドＲＮＡポリヌクレオチドにより阻害される、実施形態２に記載の組成物。
【0024】
５．上記療法が同種異系細胞療法である、実施形態１～４のいずれか１つに記載の組成物。
【0025】
６．上記Ｔ細胞が活性化ＣＤ８＋ Ｔ細胞である、実施形態１～５のいずれか１つに記載の組成物。
【0026】
７．上記ＳＡＧＡ遺伝子制御複合体が阻害されていないＴ細胞集団と比較して、上記Ｔ細胞内での上記ＳＡＧＡ遺伝子制御複合体の活性が、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９９％低下する、実施形態１～６のいずれか１つに記載の組成物。
【0027】
８．上記Ｔ細胞が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する、実施形態１～７のいずれか１つに記載の組成物。
【0028】
９．上記ＳＡＧＡ遺伝子制御複合体の１つ以上のサブユニットの阻害剤をさらに含む、実施形態１～８のいずれか１つに記載の組成物。
【0029】
１０．上記阻害剤が低分子である、実施形態９に記載の組成物。
【0030】
１１．がん（例えば、白血病、リンパ腫、または骨髄腫）の治療方法で使用するための、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の組成物。
【0031】
１２．上記療法が、上記対象にがん療法を投与することをさらに含む、実施形態１～１１のいずれか１つに記載の組成物。
【0032】
１３．上記がん療法が、上記対象に免疫チェックポイント阻害剤を投与することを好ましくは含む、免疫療法である、実施形態１２に記載の組成物。
【0033】
１４．Ｔ細胞集団（好ましくは、活性化ＣＤ８＋ Ｔ細胞）における、Ｔ細胞エフェクター機能を増加させる方法であって、上記方法が、上記Ｔ細胞集団のＴ細胞内における、ＳＡＧＡ（Ｓｐｔ－Ａｄａ－Ｇｃｎ５－アセチルトランスフェラーゼ）遺伝子制御複合体の機能及び／または発現を阻害することを含む、上記方法。
【0034】
１５．Ｔ細胞集団（好ましくは、活性化ＣＤ８＋ Ｔ細胞）における、Ｔ細胞エフェクター機能を増加させる方法であって、上記ＳＡＧＡ遺伝子制御複合体の１つ以上の遺伝サブユニットの発現を阻害することを含み、好ましくは、上記１つ以上の遺伝サブユニットが、ＡＤＡ２Ｂ、ＣＣＤＣ１０１、ＴＡＤＡ１、ＴＡＦ５Ｌ、ＴＡＦ６Ｌ、ＴＡＦ１０、ＳＵＰＴ７Ｌ、及びＴＲＲＡＰから選択され、場合により、
上記ＳＡＧＡ遺伝子制御複合体の上記１つ以上の遺伝サブユニットのうちの少なくとも１つの発現が、上記ＳＡＧＡ遺伝子制御複合体の上記遺伝サブユニットをコードする核酸とハイブリダイズして、上記サブユニットの発現を阻害することができる核酸により阻害され、及び／または
上記ＳＡＧＡ遺伝子制御複合体の上記１つ以上の遺伝サブユニットのうちの少なくとも１つの発現が、遺伝子編集分子、場合により、Ｃａｓ９タンパク質、または、Ｃａｓ９タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び、ＣＲＩＳＰＲ－ｃａｓ９システムガイドＲＮＡポリヌクレオチドにより阻害され、場合により、
上記Ｔ細胞集団の上記Ｔ細胞の少なくともいくつかが、ＣＡＲポリペプチドを含むか、または、上記方法が、上記Ｔ細胞を組み換えて、ＣＡＲポリペプチドを発現させることを含む、上記方法。
上記ＳＡＧＡ遺伝子制御複合体の上記１つ以上の遺伝サブユニットのうちの少なくとも１つの発現が、上記ＳＡＧＡ遺伝子制御複合体の上記遺伝サブユニットをコードする核酸とハイブリダイズして、上記サブユニットの発現を阻害することができる核酸により阻害され、及び／または
上記ＳＡＧＡ遺伝子制御複合体の上記１つ以上の遺伝サブユニットのうちの少なくとも１つの発現が、遺伝子編集分子、場合により、Ｃａｓ９タンパク質、または、Ｃａｓ９タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び、ＣＲＩＳＰＲ－ｃａｓ９システムガイドＲＮＡポリヌクレオチドにより阻害され、場合により、
上記Ｔ細胞集団の上記Ｔ細胞の少なくともいくつかが、ＣＡＲポリペプチドを含むか、または、上記方法が、上記Ｔ細胞を組み換えて、ＣＡＲポリペプチドを発現させることを含む、上記方法。
【図面の簡単な説明】
【0035】
【図1A】実施例１に関する、プールしたＣＲＩＳＰＲスクリーンは、ＣＤ８＋ Ｔ細胞増殖の負の制御因子を同定する。ＣＲＩＳＰＲスクリーンタイムラインの概略図。
【図1B】実施例１に関する、プールしたＣＲＩＳＰＲスクリーンは、ＣＤ８＋ Ｔ細胞増殖の負の制御因子を同定する。受容体（ＴＣＲ）刺激後の、高カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）（低増殖）及び低ＣＦＳＥ（高増殖）細胞のソート方法。
【図1C】実施例１に関する、プールしたＣＲＩＳＰＲスクリーンは、ＣＤ８＋ Ｔ細胞増殖の負の制御因子を同定する。高ＣＦＳＥ（低増殖）集団において濃縮されたｓｇＲＮＡ標的を示す、ボルケーノプロット。
【図1D】実施例１に関する、プールしたＣＲＩＳＰＲスクリーンは、ＣＤ８＋ Ｔ細胞増殖の負の制御因子を同定する。高ＣＦＳＥ（低増殖）集団において濃縮されたｓｇＲＮＡ標的のＧＳＥＡ。濃縮された遺伝子は、ＣＤ２４７、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｇ、及びＬＣＫである。
【図1E】実施例１に関する、プールしたＣＲＩＳＰＲスクリーンは、ＣＤ８＋ Ｔ細胞増殖の負の制御因子を同定する。トップヒット（ＩＲＦ４）の認証。ＩＲＦ４遺伝子に対する、２つのｓｇＲＮＡによるＩＲＦ４の完全なノックアウトを示すウエスタンブロット。
【図1F】実施例１に関する、プールしたＣＲＩＳＰＲスクリーンは、ＣＤ８＋ Ｔ細胞増殖の負の制御因子を同定する。トップヒット（ＩＲＦ４）の認証。ＩＲＦ４遺伝子に対する、２つのｓｇＲＮＡによるＩＲＦ４のノックアウトを示すフローサイトメトリー。
【図1G】実施例１に関する、プールしたＣＲＩＳＰＲスクリーンは、ＣＤ８＋ Ｔ細胞増殖の負の制御因子を同定する。トップヒット（ＩＲＦ４）の認証。ＴＣＲ刺激後の、野生型及びＩＲＦ４ノックアウトＴ細胞のＣＦＳＥ染色。
【図2A】実施例２に関する、プールしたＣＲＩＳＰＲスクリーンは、ＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化の正及び負の制御因子を同定する。Ａ）ＣＲＩＳＰＲスクリーンタイムラインの概略図。
【図2B】実施例２に関する、プールしたＣＲＩＳＰＲスクリーンは、ＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化の正及び負の制御因子を同定する。ライブラリー内のガイドに関して、低ＣＤ２５細胞に対する、高ＣＤ２５のｌｏｇ２倍数変化（ＬＦＣ）値の分布。下：分布全体を表す灰色の勾配に重ねた、高ＣＤ２５細胞（濃い）及び枯渇遺伝子（薄い）において濃縮された遺伝子を標的にする、４つ全てのｓｇＲＮＡに対するＬＦＣ。
【図2C】実施例２に関する、プールしたＣＲＩＳＰＲスクリーンは、ＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化の正及び負の制御因子を同定する。高ＣＤ２５（高活性化）集団において濃縮されたｓｇＲＮＡ標的を示すボルケーノプロット。
【図2D】実施例２に関する、プールしたＣＲＩＳＰＲスクリーンは、ＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化の正及び負の制御因子を同定する。低ＣＤ２５（低活性化）集団において濃縮されたｓｇＲＮＡ標的を示すボルケーノプロット。
【図2E】実施例２に関する、プールしたＣＲＩＳＰＲスクリーンは、ＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化の正及び負の制御因子を同定する。高ＣＤ２５（高活性化）集団において濃縮されたｓｇＲＮＡ標的の、遺伝子オントロジー（ＧＯ）濃縮分析。
【図2F】実施例２に関する、プールしたＣＲＩＳＰＲスクリーンは、ＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化の正及び負の制御因子を同定する。低ＣＤ２５（低活性化）集団において濃縮されたｓｇＲＮＡ標的の、遺伝子オントロジー（ＧＯ）濃縮分析。
【図2G】実施例２に関する、プールしたＣＲＩＳＰＲスクリーンは、ＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化の正及び負の制御因子を同定する。トップヒットのＳＴＲＩＮＧ ＤＰネットワーク分析。
【図2H】実施例２に関する、プールしたＣＲＩＳＰＲスクリーンは、ＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化の正及び負の制御因子を同定する。ＣＤ２５のトップヒットとＣＦＳＥスクリーンのトップヒットの間の相関関係。
【図3A】実施例３に関する、プールしたＣＲＩＳＰＲスクリーンは、ＣＤ８＋ Ｔ細胞脱顆粒の正及び負の制御因子を同定する。Ａ）ＣＲＩＳＰＲスクリーンタイムラインの概略図。
【図3B】実施例３に関する、プールしたＣＲＩＳＰＲスクリーンは、ＣＤ８＋ Ｔ細胞脱顆粒の正及び負の制御因子を同定する。ライブラリー内のガイドに関して、低ＣＤ１０７Ａ細胞に対する、高ＣＤ１０７Ａのｌｏｇ２倍数変化（ＬＦＣ）値の分布。下：分布全体を表す灰色の勾配に重ねた、高ＣＤ１０７Ａ細胞（濃い）及び枯渇遺伝子（薄い）において濃縮された遺伝子を標的にする、４つ全てのｓｇＲＮＡに対するＬＦＣ。
【図3C】実施例３に関する、プールしたＣＲＩＳＰＲスクリーンは、ＣＤ８＋ Ｔ細胞脱顆粒の正及び負の制御因子を同定する。高ＣＤ１０７Ａ（高活性化）集団において濃縮されたｓｇＲＮＡ標的を示すボルケーノプロット。
【図3D】実施例３に関する、プールしたＣＲＩＳＰＲスクリーンは、ＣＤ８＋ Ｔ細胞脱顆粒の正及び負の制御因子を同定する。低ＣＤ１０７Ａ（低活性化）集団において濃縮されたｓｇＲＮＡ標的を示すボルケーノプロット。
【図3E】実施例３に関する、プールしたＣＲＩＳＰＲスクリーンは、ＣＤ８＋ Ｔ細胞脱顆粒の正び負の制御因子を同定する。高ＣＤ１０７Ａ（高活性化）集団において濃縮されたｓｇＲＮＡ標的の、ＧＯ濃縮分析。
【図3F】実施例３に関する、プールしたＣＲＩＳＰＲスクリーンは、ＣＤ８＋ Ｔ細胞脱顆粒の正び負の制御因子を同定する。低ＣＤ１０７Ａ（低活性化）集団において濃縮されたｓｇＲＮＡ標的の、ＧＯ濃縮分析。
【図3G】実施例３に関する、プールしたＣＲＩＳＰＲスクリーンは、ＣＤ８＋ Ｔ細胞脱顆粒の正び負の制御因子を同定する。トップヒットのＳＴＲＩＮＧ ＤＰネットワーク分析。
【図3H】実施例３に関する、プールしたＣＲＩＳＰＲスクリーンは、ＣＤ８＋ Ｔ細胞脱顆粒の正び負の制御因子を同定する。ＣＤ１０７ＡのトップヒットとＣＦＳＥスクリーンのトップヒットの間の相関関係。
【図4】ＣＲＩＳＰＲスクリーンのために使用したレンチウイルス－ＲＮＰエレクトロポレーションの確認。初代ヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞における、候補遺伝子標的であるＣＤ４５のノックアウトにおいて効果的である。Ｃａｓ９を有しないＣＤ４５対照は、ノックアウトは、形質導入の４８時間後にＣａｓ９と複合体化した、ＣＤ４５標的化ガイドを形質導入した細胞に対して特異的であることを示した。
【図5A】ＳＡＧＡ ＣＲＩＳＰＲスクリーン結果の一覧。ＣＲＩＳＰＲスクリーンで発見されたＳＡＧＡ複合体の構成要素。
【図5B】ＳＡＧＡ ＣＲＩＳＰＲスクリーン結果の一覧。全ＣＲＩＰＳＲスクリーン間で重なり合う標的。
【図5C】ＳＡＧＡ ＣＲＩＳＰＲスクリーン結果の一覧。全分布を表す灰色の勾配に重ねた、ＣＦＳＥ ＣＲＩＳＰＲスクリーンにおける、ＳＡＧＡ複合体（有色の線は、ＳＡＧＡ複合体のモジュールに対応する）の構成要素を標的にする全ｓｇＲＮＡに対するＬＦＣ。トップランクの標的は、ＴＡＤＡ２Ｂ、ＴＡＦ６Ｌ、ＴＡＤＡ１である。
【図5D】ＳＡＧＡ ＣＲＩＳＰＲスクリーン結果の一覧。全分布を表す灰色の勾配に重ねた、ＣＤ２５ ＣＲＩＳＰＲスクリーンにおける、ＳＡＧＡ複合体（有色の線は、ＳＡＧＡ複合体のモジュールに対応する）の構成要素を標的にする全ｓｇＲＮＡに対するＬＦＣ。トップランクの標的は、ＴＡＤＡ２Ｂ、ＳＵＰＴ７Ｌ、ＴＡＦ１０、ＴＡＦ６Ｌ、ＴＡＤＡ１である。
【図5E】ＳＡＧＡ ＣＲＩＳＰＲスクリーン結果の一覧。全分布を表す灰色の勾配に重ねた、ＣＤ１０７Ａ ＣＲＩＳＰＲスクリーンにおける、ＳＡＧＡ複合体（有色の線は、ＳＡＧＡ複合体のモジュールに対応する）の構成要素を標的にする全ｓｇＲＮＡに対するＬＦＣ。トップランクの標的は、ＳＧＦ２９（またはＣＣＤＣ１０１）、ＴＡＤＡ３、ＴＡＤＡ２Ｂ、ＳＵＰＴ７Ｌ、ＴＡＦ１０、ＴＡＦ６Ｌ、ＴＡＤＡ１、ＴＡＤ５Ｌ、ＴＲＲＡＰ、ＵＳＰ２２である。
【図6A】ＣＤ２５ ＣＲＩＳＰＲスクリーンＩの認証。ＴＣＲ刺激後の、高ＣＤ２５（低活性化）及び低ＣＤ２５（高活性化）のソート方法。
【図6B】ＣＤ２５ ＣＲＩＳＰＲスクリーンＩの認証。低ＣＤ２５集団におけるトップヒットとしてＣＤ２５（ＩＬ２ＲＡ）を示す、ボルケーノプロット。
【図6C】ＣＤ２５ ＣＲＩＳＰＲスクリーンＩの認証。ＴＣＲ刺激後にＣＤ２５発現を低下させるＩＲＦ４ノックアウトＣＤ８ Ｔ細胞の認証。
【図6D】ＣＤ２５ ＣＲＩＳＰＲスクリーンＩの認証。ＳＡＧＡ標的ノックアウトの７日後に測定した、ＴＣＲ刺激後にＣＤ２５発現（及びＭＦＩ）を増加させるＳＡＧＡ複合体の構成要素の、最初の認証。
【図6E】ＣＤ２５ ＣＲＩＳＰＲスクリーンＩの認証。ＣＤ８ Ｔ細胞上でＣＤ２５、ＣＤ６９、及びＨＬＡ－ＤＲを測定するための、ＳＡＧＡ標的認証に最適化したタイムラインの概略図。
【図6F】ＣＤ２５ ＣＲＩＳＰＲスクリーンＩの認証。対照（Ｎ＝２、２つの異なる生体サンプル、平均±ＳＥＭ）と比較して、ＳＡＧＡ標的ノックアウトを有するＣＤ８ Ｔ細胞における、ＣＤ２５、ＣＤ６９、及びＨＬＡ－ＤＲの倍率変化発現。静止状態、及び、２４時間の再刺激。
【図7A】ＣＤ１０７Ａ ＣＲＩＳＰＲスクリーンの認証。ＴＣＲ刺激後の、高ＣＤ１０７Ａ（低活性化）及び低ＣＤ１０７Ａ（高活性化）のソート方法。
【図7B】ＣＤ１０７Ａ ＣＲＩＳＰＲスクリーンの認証。標的ノックの５日後に測定した、ＴＣＲ刺激後の、ＣＤ１０７Ａ発現を増加させるＳＡＧＡ複合体の構成要素の初期認証のためのゲート方法。
【図7C】ＣＤ１０７Ａ ＣＲＩＳＰＲスクリーンの認証。ＣＤ８ Ｔ細胞上でＣＤ１０７ａ、グランザイムＢ（ＧＺＭＢ）、及びパーフォリン（ＰＲＦ１）を測定するための、ＳＡＧＡ標的認証のために最適化されたタイムラインの概略図。
【図7D】ＣＤ１０７Ａ ＣＲＩＳＰＲスクリーンの認証。対照（Ｎ＝２、２つの異なる生体サンプル、平均±ＳＥＭ）と比較して、ＳＡＧＡ標的ノックアウトを有するＣＤ８ Ｔ細胞における、ＣＤ１０７ａ、グランザイムＢ（ＧＺＭＢ）、及びパーフォリン（ＰＲＦ１）の倍率変化発現。
【図8A】ＳＡＧＡ標的ノックアウトにより多重化された抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞による、標的殺傷能の認証。ＵＳＰ２２遺伝子ノックアウト（ＳＡＧＡ標的）及びＣＢＬＢ遺伝子ノックアウト（陽性対照）を有するＣＤ８＋ Ｔ細胞による、標的細胞殺傷のルシフェラーゼルミネセンス測定（Ｎ＝３、単一生体サンプル、平均±ＳＥＭ）。
【図8B】ＳＡＧＡ標的ノックアウトにより多重化された抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞による、標的殺傷能の認証。ＣＤ８＋ Ｔ細胞におけるＵＳＰ２２遺伝子ノックアウトの際に増加したＨ２ＢＫ１２０－ｕｂのレベルを表すウエスタンブロットによる、機能的認証（Ｎ＝２、２つの異なる生体サンプル）。
【発明を実施するための形態】
【0036】
がんでは、抗原特異的ＣＤ８＋細胞は、腫瘍抗原により活性化され、増殖し、エフェクター機能を得て、がん細胞にて抗腫瘍形成効果を発揮する。細胞毒性表現型を有する腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）は、投与された療法の種類にかかわらず、患者由来の様々ながん組織で発見され、良好な生残と相関している［１１］。エフェクターサイトカインは、これらの抗腫瘍効果を媒介し、イムノサーベイランス及び腫瘍除去に重要である。
【0037】
免疫細胞内でのＳＡＧＡ複合体の役割は、十分に研究されていない。最近、ＳＡＧＡ複合体の特定のモジュールを特性決定するいくつかの研究が存在する。例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．は、ＳＡＧＡ複合体のヒストン脱ユビキチン化酵素（ＤＵＢ）モジュールの構成要素の１つである、ユビキチン特異的ペプチダーゼ２２（ＵＳＰ２２）は、それらの初期成長段階１の間に、ｉＮＫＴ細胞で非常に発現し、ＵＳＰ２２欠損が、細胞固有の様式で、ｉＮＫＴ細胞成長の間に、段階１～２からの移行をブロックしたことを発見した［１２］。機械論的には、ＵＳＰ２２は、ｉＮＫＴ細胞の成長に関与する転写同時活性化因子である、メディエーター複合体サブユニット１（ＭＥＤ１）と相互作用し、ヒストンＨ２Ａモノユビキチン化の脱ユビキチン化により、ＩＬ－２Ｒβ及びＴ－ｂｅｔ遺伝子発現のＭＥＤ１機能を向上させる。より最近では、マウス制御性Ｔ細胞機能における、ＳＡＧＡ複合体の役割について、報告は行われなれていない。
【0038】
ゲノムワイドプールＣＲＩＳＰＲスクリーンを使用して、Ｓａｎ Ｌｏｏ ｅｔ ａｌ．は、ＨＡＴモジュール内でのＣｃｄｃ１０１、Ｔａｄａ２ｂ、及びＴａｄａ３、ＤＵＢモジュールでのＵｓｐ２２、ならびに、正のＦｏｘｐ３制御因子としてのコア構造モジュールからの、Ｔａｄａ１、Ｔａｆ６ｌ、Ｓｕｐｔ５、及びＳｕｐｔ２０を含む、ＳＡＧＡ複合体の様々な構成要素を同定した［１３］。同様に、Ｃｏｒｔｅｚ ｅｔ ａｌ．は、Ｕｓｐ２２、Ａｔｘｎ７ｌ３を含む、Ｆｏｘｐ３の類似のＳＡＧＡ制御因子を発見した［１４］。これらの結果は、制御性免疫細胞及びそれらの機能の調節における、ＳＡＧＡ複合体の重要な役割を指摘しているが、他のＴ細胞集団におけるＳＡＧＡの役割、及び、本メカニズムがどのように生じているのかは、確立されていない。
【0039】
ヒトＳＡＧＡ複合体の遺伝サブユニット、及びそれらの配列は、当該技術分野において既知であり（例えば、ＨＵＧＯ Ｇｅｎｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの関連するエントリーを参照されたい）、アタキシン７（ＡＴＡＸｎ７）；アタキシン７様３（ＡＴＸＮ７Ｌ３）；ＥＮＹ２転写及びレポート複合体２サブユニット（ＥＮＹ２）；リジンアセチルトランスフェラーゼ２Ａ（ＫＡＴ２Ａ）；リジンアセチルトランスフェラーゼ２Ｂ（ＫＡＴ２Ｂ）；ＳＡＧＡ複合体関連因子２９（ＳＧＦ２９）；Ｓｐｔ３ホモログのＳＡＧＡ及びＳＴＡＧＡ複合体構成要素（ＳＵＰＴ３Ｈ）；ＳＰＴ７様のＳＴＡＧＡ複合体サブユニットγ（ＳＵＰＴ７Ｌ）；ＳＰＴ２０ホモログのＳＡＧＡ複合体構成要素（ＳＵＰＴ２０Ｈ）；転写アダプター１（ＴＡＤＡ１）；転写アダプター２Ｂ（ＴＡＤＡ２Ｂ）；転写アダプター３（ＴＡＤＡ３）；ＴＡＴＡ－ボックス結合タンパク質関連因子５様（ＴＡＦ５Ｌ）；ＴＡＴＡ－ボックス結合タンパク質関連因子６様（ＴＡＦ６Ｌ）；ＴＡＴＡ－ボックス結合タンパク質関連因子１０（ＴＡＦ１０）；ＴＡＴＡ－ボックス結合タンパク質関連因子１２（ＴＡＦ１２）；形質転換／転写ドメイン関連タンパク質（ＴＲＲＡＰ）；ユビキチン特異的ペプチダーゼ２２（ＵＳＰ２２）を含む。アミノ酸、及びコードするヌクレオチド配列は、ＮＣＢＩウェブサイト（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から入手可能な、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）ＣＣＤＳデータベースを通して、当業者には利用可能となっている。
【0040】
いくつかの実施形態では、方法は、遺伝サブユニットのＴＡＤＡ２Ｂ（ＡＤＡ２Ｂ）、ＳＧＦ２９（ＣＣＤＣ１０１）、ＴＡＤＡ１、ＴＡＦ５Ｌ、ＴＡＦ６Ｌ、ＴＡＦ１０、ＳＵＰＴ７Ｌ、及びＴＲＲＡＰのうちの１つ以上を阻害することを伴う。
【0041】
以下の実施例は、ＳＡＧＡ複合体が、ヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞増殖、活性化、及び、ＴＣＲ刺激後の細胞溶解能を調節するという、重要な役割を果たすという証拠を提供する。構造コア、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）、ヒストン脱ユビキチン化酵素（ＤＵＢ）、及び活性化結合モジュールを含む、ＳＡＧＡ複合体の様々な構成要素のノックアウトは、ＣＤ８＋ Ｔ細胞増殖の増加、活性化、及び活発な脱顆粒をもたらした。
【0042】
本明細書で使用する場合、「Ｔ細胞エフェクター機能の増加」とは、Ｔ細胞集団が、標的細胞を認識して、及び／または、標的細胞に対する細胞毒性効果を増加させる能力を向上させることを意味し、これは、Ｔ細胞集団の増殖、発現の増加、及び／または、Ｔ細胞集団による、細胞毒性分子（例えば、パーフォリン、グランザイム、グラニュリシン、Ｆａｓリガンド）、またはサイトカイン（例えば、ＴＮＦ－α及びＩＦＮ－γ）の排出を含むことができる。
【0043】
本明細書で使用する場合、用語「対象」とは、哺乳類を含む、動物界の全ての構成要素を含み、特に、ヒトを含む。
【0044】
いくつかの実施形態では、対象は、がんと診断されている。
【0045】
本明細書で使用する場合、用語「がん」とは、分化の喪失、増殖速度の増加、周囲組織の侵入とによる特徴的な退形成を受けており、転移可能な、悪性腫瘍を意味し得る。転移性がんとは、その転移性がんが由来する元の（原発性）がんの起源部位以外の、体内の１つ以上の部位におけるがんである。
【0046】
本明細書で使用する場合、用語「腫瘍」とは、予め存在する組織の細胞から生じる、腫瘍、または、炎症性ではない異常質量の組織を意味する。腫瘍は、良性（非がん性）または悪性（がん性）のいずれかであることができる。腫瘍は、充実性または血液学的であることができる。
【0047】
血液腫瘍の例としては、白血病、リンパ腫、骨髄腫が挙げられるが、これらに限定されない。充実性腫瘍の例としては、肉腫及びがん腫が挙げられる。
【0048】
本明細書で提供するＴ細胞エフェクター機能の増加方法は、様々な形態のがんと診断されたがん患者に、幅広く適用することができる。
【0049】
いくつかの実施形態では、対象は、膀胱癌、脳腫瘍、乳癌、子宮頚癌、結腸直腸癌、食道癌、頭頸癌、腎臓癌、白血病、肝癌、肺癌、リンパ腫、黒色腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、膵癌、または前立腺癌と診断されている。
【0050】
本明細書で使用する場合、「治療に有効な量」とは、投与時、及び、必要な特定の期間における、所望の治療結果を実現するのに効果的な量を意味する。治療に有効な量の薬理学的剤は、個体の病状、年齢、性別、及び体重、ならびに、薬理学的剤が、個体において所望の応答を誘発する能力に従い変化し得る。治療的有効量とは、治療の有益な効果が、薬理学的剤の任意の毒性または有害作用にまさる量でもある。
【0051】
本明細書で使用され、また、当該技術分野において十分に理解される用語「治療すること」または「治療」は、臨床的結果を含む、有益な、または所望の結果を得るためのアプローチを意味する。有益な、または所望の臨床的結果としては、検出可能であるか検出不可能であるかにかかわらず、１つ以上の症状または病状の軽減または寛解、疾患の程度の減少、疾患の状態の安定化（即ち、悪化しないこと）（例えば、患者の寛解の維持）、疾患の予防または疾患の拡大の予防、疾患の伝播の遅延または低速化、病状の寛解または緩和、疾患の再発の減少、及び、（部分的または完全）寛解を挙げることができるが、これらに限定されない。「治療すること」及び「治療」はまた、治療を受けない場合の予測生存期間と比較して生存期間を延長することも意味し得る。
【0052】
一実施形態では、Ｔ細胞集団における、Ｔ細胞エフェクター機能を増加させる方法であって、上記方法が、Ｔ細胞集団のＴ細胞内で、ＳＡＧＡ遺伝子制御複合体の１つ以上の遺伝サブユニットを阻害することを含む、上記方法を提供する。
【0053】
本明細書で使用する場合、用語「免疫療法」とは、免疫系により、がん細胞の標的化または破壊を誘発する、または向上させる方法及び組成物を意味する。免疫療法としては、免疫チェックポイント阻害剤、モノクローナル抗体、Ｔ細胞療法（例えば、ＣＡＲ－Ｔ）、腫瘍崩壊ウイルス療法、及びがんワクチンが挙げられる。
【0054】
既知の免疫チェックポイント阻害剤としては、イピリムマブ、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、及びデュルバルマブが挙げられるが、これらに限定されない。
【0055】
免疫チェックポイント遮断薬（ＩＣＢ）は、いくつかの種類のがんにおいて、改善された臨床的アウトカムをもたらされた。しかし、ＩＣＢで治療された患者の大部分は応答せず、全体の奏効率は２０％～４０％となった。抑制性細胞と細胞傷害性Ｔ細胞の相対量が、併用免疫療法の有効性を決定することを、前臨床試験は示した。さらに、Ｔ細胞炎症性腫瘍は、Ｔ細胞非炎症性腫瘍よりもＩＣＢに対する感受性が高いため、腫瘍浸潤Ｔ細胞の量は、免疫療法に対する応答を予想する主たる因子である。したがって、免疫腫瘍微小環境（ＴＭＥ）の制御方法は、利用して、免疫療法に対する奏効率を改善することができる、有望な治療機会である。
【0056】
本明細書で提供する方法の臨床用途としては、養子細胞療法の分野（例えば、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）療法、組み換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）療法、及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法）が挙げられ、ここでは、これらは、エクスビボでヒト初代ＣＤ８＋ Ｔ細胞にて阻害可能であり、ＣＤ８＋ Ｔ細胞は、がんを有する患者の全体の奏効率を改善する手段として、患者に再導入される。細胞療法は、自己または同種異系であることができる。
【0057】
本明細書で使用する場合、用語「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」とは、免疫細胞に人工特異性をグラフトするために組み換えられたＴ細胞受容体を意味する。例えば、養子細胞移入で使用するために、ＣＡＲを使用して、Ｔ細胞にモノクローナル抗体の特異性を付与することができる。特定の実施形態では、ＣＡＲは、腫瘍関連抗原に細胞の特異性を向ける。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、細胞内活性化ドメインと、膜貫通ドメインと、腫瘍関連抗原結合領域を含む細胞外ドメインと、を含む。
【0058】
これらの標的の阻害方法は、低分子によるもの、ＣＲＩＳＰＲノックアウトまたはＲＮＡ干渉ノックダウンなどの遺伝組み換えが挙げられる。
【0059】
本明細書で提供する方法で使用するための低分子阻害剤としては、ＧＳＫ４０２７、及びＬ－Ｍｏｓｅ阻害剤（ＫＡＴ２Ａの阻害剤）が挙げられるが、これらに限定されない。広域スペクトルのヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であるトリコスタチンＡ、及び抗悪性腫瘍薬であるピラルビシンは、がん細胞（ＰＭＩＤ：３１００７７５４、ＰＭＩＤ：２５３２３６９２）内で、ＵＳＰ２２発現に影響を及ぼすことが報告されている。低分子阻害剤の活性の確認方法は、当業者に既知であり、本明細書でさらに記載される。具体的には、図６及び７に示し、実施例にて詳述する方法論に従ってよい。
【0060】
ＲＮＡ干渉を使用して、デュプレックス構造に存在するリボ核酸低分子を使用することにより、標的遺伝子の発現を調節することができる。ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドのサイトゾル送達、またはｓｈＲＮＡのウイルス一体化により、それぞれ、遺伝子発現の一過的な、及び安定した下方制御がもたらされる。ＲＮＡｉのメカニズムは、標的配列に同一な二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の細胞質送達による、宿主ｍＲＮＡの配列特異的分解に基づく［１５］。標的遺伝子発現の分解は、内部ＲＮＡ誘発サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）が関与する酵素経路により実現される。ｓｉＲＮＡデュプレックス（ガイド鎖）のうちの１本の鎖は、アルゴノート（ＡＧＯ）タンパク質、及び、二本鎖ＲＮＡ結合タンパク質の補助により、ＲＩＳＣ内にロードされる。ＲＩＳＣは次に、ガイド鎖を相補性ｍＲＮＡ分子に局在化させ、これが続いて、ハイブリッドの中心付近で、ＡＧＯにより切断される［１６］。あるいは、プログラム可能なＲＮＡ標的化酵素であるＣａｓ１３ｄを用いて、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）を利用することにより、標的遺伝子の発現を操作することができる［１７］。Ｃａｓ１３ｄは、宿主ｍＲＮＡで発見される相補性スペーサー配列（ガイド）を含有するｃＲＮＡによりＲＮＡにガイドされる。宿主ｍＲＮＡの分解は、Ｃａｓ１３ｄが媒介する、ＲＮＡ－ＲＮＡハイブリダイゼーションの切断により生じる。
【0061】
いくつかの実施形態では、任意の好適な遺伝子編集技術を使用して、Ｔ細胞／Ｔ細胞集団内での、ＳＡＧＡ複合体の発現を阻害することができる。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを使用して、Ｔ細胞集団内における、ＳＡＧＡ複合体の１つ以上のサブユニットの発現を阻害することができる。一実施形態では、これらのＴ細胞は患者から入手される。当業者には既知となろうが、ＣＲＩＳＰＲシステムは、細胞内で、標的ヌクレオチド配列に対して相補性を有するように設計されたガイド配列を伴う。標的配列とガイド配列とのハイブリダイゼーションは、標的配列にハイブリダイゼーションし、１つ以上のＣａｓタンパク質と複合体化したガイド配列のＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を容易にし、これは転じて、標的配列内、または標的配列付近での、ポリヌクレオチドの鎖の片方または両方の切断を引き起こす。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓゲノム編集に必要な機能的構成要素を発現させるためのベクターシステムは、当業者に既知であり、民間の供給元から購入することができる。さらに、真核細胞での適用を含む、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの説明は、ＷＯ２０１４／２０４７２７に見出すことができる。マウス及びヒトＴ細胞内を含む、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの使用に関するさらなる説明は、例えば、参照により本明細書に組み込まれている、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｎｒｉｋｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｈｉｆｒｕｔ ｅｔ ａｌ．，及びＳｕ ｅｔ ａｌ．，［１８，１９，２０，２１］に見出すことができる。
【0062】
ＲＮＰを使用して、初代Ｔ細胞において遺伝子をノックアウトする。前述したように、２成分ｓｇＲＮＡをＣａｓ９に複合体化することで、ＲＮＰを作製する。簡潔に述べると、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡが化学的に合成され、組み換えＣａｓ９－ＮＬＳ、Ｄ１０Ａ－ＮＬＳが組み換えによって作製され、精製される。ＲＮＰは、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体による最初のＴ細胞の活性化の２日後にエレクトロポレーションされ、培養培地で維持される［２２］。
【0063】
好適なベクターは当業者に既知であり、ベクターは民間の供給元から入手可能であり、プラスミド及びウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター）が挙げられる。
【0064】
核酸用の送達ビヒクルは当業者に既知であり、リポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子が挙げられる。
【0065】
Ｔ細胞集団内でのＳＡＧＡ遺伝子制御複合体の活性の低下を評価し定量化する方法は、当業者に既知であろう。
【0066】
好適には、健常なドナーから単離されたＴ細胞は、個別のＣａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）によるエレクトロポレーションに供され、Ｔ細胞内での単一標的遺伝子ノックアウトが達成される。単一標的遺伝子ノックアウトは、遺伝サブユニットのＴＡＤＡ２Ｂ（ＡＤＡ２Ｂ）、ＳＧＦ２９（ＣＣＤＣ１０１）、ＴＡＤＡ１、ＴＡＦ５Ｌ、ＴＡＦ６Ｌ、ＴＡＦ１０、ＳＵＰＴ７Ｌ、及びＴＲＲＡＰのうちの１つを含む。野生型対照と比較しての、これら標的のタンパク質レベルを測定するために、ノックアウトの効率及びレベルは、ウエスタンブロット及びフローサイトメトリー（可能な場合）により評価することができる。ＳＡＧＡ活性は、ウエスタンブロットにより全体的なＨ２Ｂユビキチン化及びＨ３アセチル化レベルを測定することにより評価される。いくつかの実施形態では、ＳＡＧＡ遺伝子制御複合体の活性は、本明細書に記載する方法に従って治療されるＴ細胞集団内で、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９９％低下することができる。これらの標的の単一標的遺伝子ノックアウトは、ＣＤ２５及びＣＤ１０７ａ発現の発現、ならびに、Ｔ細胞全体の細胞溶解能を正に制御する。様々な細胞外Ｔ細胞活性化マーカーの発現、加えて、編集したＴ細胞由来の細胞溶解タンパク質及びサイトカインの、細胞内発現及び分泌を測定することができる。
【0067】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、単一標的遺伝子ノックアウトによるエレクトロポレーションの前に、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体により活性化される。Ｔ細胞は、ＩＬ－２、ＩＬ－７、及びＩＬ－１５サイトカインを含有する培養培地で増殖して維持される。これは、患者に注入し戻す前に、組み換え抗原特異的Ｔ細胞が製造される［２３］プロセスと同じである。
【0068】
Ｓｔａｄｔｍａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，による最近の研究では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を使用する多重ヒトゲノム組み換えが安全であり実行可能であることが示された［２３］。本研究では、自己Ｔ細胞は、遺伝子配列のＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、及びＰＤＣＤ１を標的にするＣａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）によるＣＲＩＳＰＲノックアウトであった。Ｔ細胞は、ＩＬ－７及びＩＬ－１５を補充した培地で培養された。培養の２日後、これらのＴ細胞を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体コンジュゲート常磁性マイクロビーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して活性化し、増殖させる。翌日、ＨＬＡ－Ａ＊０２０１－制限ＮＹ－ＥＳＯ－１（ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ）－特異的ＴＣＲを発現するレンチウイルスベクターをＴ細胞に形質導入する。本方法により、α及びβＴＣＲドメイン遺伝子（それぞれ、ＴＲＡＣ及びＴＲＢＣを欠失することにより）、ならびに、ＰＤ１タンパク質（ＰＤＣＤ１を欠失することにより）の内部発現がなされない、ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ発現組み換えＴ細胞の製造が可能となった。
【0069】
実施例は、遺伝編集（ＣＲＩＳＰＲなど）により、または、薬理学的（低分子阻害剤もしくは分解因子）によりＳＡＧＡ複合体を破壊することにより、Ｔ細胞エフェクター機能（Ｔ細胞集団の増殖を増加させること、細胞毒性分子またはサイトカインの発現及び／または排出を増加させることを含むことができる。）を増加させることを証明し、本発明は、利用可能な他の細胞療法アプローチ：ＴＩＬ、組み換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）療法、ＣＡＲ－Ｔ細胞などと組み合わせて使用することができる。これらの療法アプローチは、Ｔ細胞（増殖）の数の増加に焦点を当てており、がん標的またはがん抗原に対する特異性を誘発するが、これらの細胞が標的がん細胞を殺傷する能力（殺傷能）を向上させることには焦点を当てていない。ＳＡＧＡ複合体を破壊することにより、これらの免疫細胞療法の殺傷能を向上させる新規の方法を本明細書において提供する。
【0070】
がん細胞療法を投与する方法及びプロトコルは、当業者に既知である。
【0071】
いくつかの実施形態では、がん患者には、がん療法がさらに投与される。がん療法は当該技術分野において既知であり、手術、化学療法、放射線療法、骨髄移植、免疫療法、及びホルモン療法が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、がん患者には免疫療法治療が投与される。
【0072】
本明細書で参照される文書は全て参照により組み込まれているが、本明細書で参照により組み込まれている、任意の特許、公報、または他の開示資料は、全体が、または部分的に、当該組み込まれている資料が、本開示で説明される定義、記述、または他の開示資料と矛盾しない程度にのみに組み込まれることが理解されなければならない。したがって、また必要な範囲まで、本明細書に明確に記載されている開示は、参照により本明細書に組み込まれたいかなる矛盾する資料に対して優先される。
【0073】
本発明の利点は、以下の実施例によってさらに例示される。本明細書で説明される実施例、及びそれらの具体的な詳細は説明のためだけに提示され、本発明の特許請求の範囲を限定するものと解釈されてはならない。
【実施例】
【0074】
実施例１
プールしたＣＲＩＳＰＲスクリーンは、ヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞増殖の負の制御因子を明らかにする
プールしたＣＲＩＳＰＲスクリーンを使用して、本発明者らは、ヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞の正及び負の制御因子、ならびに、これらの機能活性を同定しようとした。第１の工程として、スクリーンを行い、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）刺激に応答してＴ細胞増殖を制御する遺伝子標的を同定した。本発明者らは、ＦＤＡが認可した薬剤（既知の薬理活性を有する）、３３４個のエピジェネティック制御因子（多くは標的可能である。）、及び、ＴＣＲシグナル伝達経路のいくつかの標準メンバーにより、６５７個の遺伝子を標的にするｓｇＲＮＡプラスミドのカスタムＥｐｉ－ＣＲＩＳＰＲライブラリーを考案した。図１Ａを参照すると、健常なヒトドナーから単離されたＣＤ８＋ Ｔ細胞に、このｓｇＲＮＡライブラリーをコードするレンチウイルスを形質導入し、Ｃａｓ９をエレクトロポレーションして、エレクトロポレーションの後１０日間培養し、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識して細胞分裂を追跡した後、ＴＣＲ刺激をした。図１Ｂを参照すると、細胞をＦＡＣＳにより、２つの集団：未増殖細胞（高ＣＦＳＥ）、及び高増殖細胞（低ＣＦＳＥ）にソートした。図１Ｃ～１Ｇに示す結果を参照すると、予想通り、ＣＤ３Ｇ、ＬＣＫ、及びＣＤ２４７などのＴＣＲシグナル伝達の必須成分を標的にするｓｇＲＮＡは、細胞増殖を阻害した。高ＣＦＳＥ集団で同定された遺伝子を、ＴＣＲ刺激と関連するアノテーション経路で濃縮した。遺伝子設定濃縮分析（ＧＳＥＡ）は、ＴＣＲシグナル伝達経路内で、増殖細胞から枯渇した遺伝子標的の、著しい過剰提示を明らかにした。加えて、ＩＲＦ４などの、ＴＣＲシグナル伝達の非必須成分を標的にするが、Ｔ細胞増殖で重要であることが以前に示されているｓｇＲＮＡが発見された。トップランクの負の制御因子は、Ｃａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）による個別のＣＲＩＳＰＲノックアウトにより認証された。まとめると、これらの結果は、標的化してプールしたＣＲＩＳＰＲスクリーンが、以前の増殖に基づくＣＲＩＳＰＲスクリーンと強力に一致することを示し、これを使用して、初代ヒトＴ細胞の活性化及び機能の、正及び負の制御因子を発見することができる。
プールしたＣＲＩＳＰＲスクリーンは、ヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞増殖の負の制御因子を明らかにする
プールしたＣＲＩＳＰＲスクリーンを使用して、本発明者らは、ヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞の正及び負の制御因子、ならびに、これらの機能活性を同定しようとした。第１の工程として、スクリーンを行い、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）刺激に応答してＴ細胞増殖を制御する遺伝子標的を同定した。本発明者らは、ＦＤＡが認可した薬剤（既知の薬理活性を有する）、３３４個のエピジェネティック制御因子（多くは標的可能である。）、及び、ＴＣＲシグナル伝達経路のいくつかの標準メンバーにより、６５７個の遺伝子を標的にするｓｇＲＮＡプラスミドのカスタムＥｐｉ－ＣＲＩＳＰＲライブラリーを考案した。図１Ａを参照すると、健常なヒトドナーから単離されたＣＤ８＋ Ｔ細胞に、このｓｇＲＮＡライブラリーをコードするレンチウイルスを形質導入し、Ｃａｓ９をエレクトロポレーションして、エレクトロポレーションの後１０日間培養し、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識して細胞分裂を追跡した後、ＴＣＲ刺激をした。図１Ｂを参照すると、細胞をＦＡＣＳにより、２つの集団：未増殖細胞（高ＣＦＳＥ）、及び高増殖細胞（低ＣＦＳＥ）にソートした。図１Ｃ～１Ｇに示す結果を参照すると、予想通り、ＣＤ３Ｇ、ＬＣＫ、及びＣＤ２４７などのＴＣＲシグナル伝達の必須成分を標的にするｓｇＲＮＡは、細胞増殖を阻害した。高ＣＦＳＥ集団で同定された遺伝子を、ＴＣＲ刺激と関連するアノテーション経路で濃縮した。遺伝子設定濃縮分析（ＧＳＥＡ）は、ＴＣＲシグナル伝達経路内で、増殖細胞から枯渇した遺伝子標的の、著しい過剰提示を明らかにした。加えて、ＩＲＦ４などの、ＴＣＲシグナル伝達の非必須成分を標的にするが、Ｔ細胞増殖で重要であることが以前に示されているｓｇＲＮＡが発見された。トップランクの負の制御因子は、Ｃａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）による個別のＣＲＩＳＰＲノックアウトにより認証された。まとめると、これらの結果は、標的化してプールしたＣＲＩＳＰＲスクリーンが、以前の増殖に基づくＣＲＩＳＰＲスクリーンと強力に一致することを示し、これを使用して、初代ヒトＴ細胞の活性化及び機能の、正及び負の制御因子を発見することができる。
【0075】
実施例２
プールしたＣＲＩＳＰＲスクリーンは、ヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化の正及び負の制御因子を明らかにする
Ｔ細胞の活性化の制御因子を調査するために、ヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞を刺激して、Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ２５（ＩＬ２ＲＡ）のＣＲＩＳＰＲスクリーンソートを行った（ＣＲＩＳＰＲスクリーンの概略図を図２Ａに示す）。細胞を、ＦＡＣＳにより２つの集団；非常に活性化された細胞（高ＣＤ２５）、及びわずかに活性化された細胞（低ＣＤ２５）にソートした。図２Ｂ～２Ｈに示す結果を参照すると、予想通り、ｓｇＲＮＡ標的化が確立した、ＣＤ２５（ＩＬ２ＲＡ）自身、ＣＤ３Ｄ、ＬＣＫ、ＣＤ２４７、及び（ＩＲＦ４）を含むＴ細胞の活性化の制御因子が同定された。Ｃａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）による個別のＣＲＩＳＰＲノックアウトによりＩＲＦ４を確認し、ＣＤ２５発現における強力な低下が、ＩＲＦ４ノックアウト後に観察された。非常に活性化されたＴ細胞（高ＣＤ２５）にて濃縮されたｓｇＲＮＡを、次に調査した。興味深いことに、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の活性化の負の制御因子の中の、ＴＡＤＡ２Ｂ（ＨＡＴ分子）及びＴＡＤＡ１、ＴＡＦ６Ｌ、ＴＡＦ１０（コア構造分子）を含む、ＳＡＧＡ（Ｓｐｔ－Ａｄａ－Ｇｃｎ５－アセチルトランスフェラーゼ）複合体の様々な構成要素が同定された。さらに、遺伝子オントロジー分析は、ヒストンアセチルトランスフェラーゼにおける遺伝子標的の著しい過剰提示、及び、高ＣＤ２５発現を有するＴ細胞中のＳＡＧＡ複合体を明らかにした。まとめると、これらのデータは、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の活性化の正の制御因子に関する以前の文献と一致し、ＳＡＧＡ複合体がＣＤ８＋ Ｔ細胞の活性化の調節において果たす、真価を認められていない役割を示す。
プールしたＣＲＩＳＰＲスクリーンは、ヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化の正及び負の制御因子を明らかにする
Ｔ細胞の活性化の制御因子を調査するために、ヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞を刺激して、Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ２５（ＩＬ２ＲＡ）のＣＲＩＳＰＲスクリーンソートを行った（ＣＲＩＳＰＲスクリーンの概略図を図２Ａに示す）。細胞を、ＦＡＣＳにより２つの集団；非常に活性化された細胞（高ＣＤ２５）、及びわずかに活性化された細胞（低ＣＤ２５）にソートした。図２Ｂ～２Ｈに示す結果を参照すると、予想通り、ｓｇＲＮＡ標的化が確立した、ＣＤ２５（ＩＬ２ＲＡ）自身、ＣＤ３Ｄ、ＬＣＫ、ＣＤ２４７、及び（ＩＲＦ４）を含むＴ細胞の活性化の制御因子が同定された。Ｃａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）による個別のＣＲＩＳＰＲノックアウトによりＩＲＦ４を確認し、ＣＤ２５発現における強力な低下が、ＩＲＦ４ノックアウト後に観察された。非常に活性化されたＴ細胞（高ＣＤ２５）にて濃縮されたｓｇＲＮＡを、次に調査した。興味深いことに、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の活性化の負の制御因子の中の、ＴＡＤＡ２Ｂ（ＨＡＴ分子）及びＴＡＤＡ１、ＴＡＦ６Ｌ、ＴＡＦ１０（コア構造分子）を含む、ＳＡＧＡ（Ｓｐｔ－Ａｄａ－Ｇｃｎ５－アセチルトランスフェラーゼ）複合体の様々な構成要素が同定された。さらに、遺伝子オントロジー分析は、ヒストンアセチルトランスフェラーゼにおける遺伝子標的の著しい過剰提示、及び、高ＣＤ２５発現を有するＴ細胞中のＳＡＧＡ複合体を明らかにした。まとめると、これらのデータは、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の活性化の正の制御因子に関する以前の文献と一致し、ＳＡＧＡ複合体がＣＤ８＋ Ｔ細胞の活性化の調節において果たす、真価を認められていない役割を示す。
【0076】
実験例３
プールしたＣＲＩＳＰＲスクリーンは、ヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞細胞溶解活性の正及び負の制御因子を明らかにする
Ｔ細胞の活性化に加えて、本発明者らは、ＣＤ８＋ Ｔ細胞細胞溶解活性の正及び負の制御因子を同定しようとした（図３）。ＣＤ８＋ Ｔ細胞により、その標的細胞を殺傷するために使用される、鍵となる経路は、グランザイムが媒介する致死的送達に基づく。ＣＤ８＋ Ｔ細胞は、Ｔ細胞と標的細胞との間の免疫学的シナプスにて、グランザイムＢ及びパーフォリン（孔形成糖タンパク質）を含有する顆粒を送達し、カスパーゼ及び下流プロアポトーシス経路を活性化することで、ＤＮＡの断片化、及び、膜一体性の急速な喪失をもたらす［２４］。Ｔ細胞細胞溶解活性におけるその重要性により、ＴＣＲ刺激後に、高グランザイムＢ及び低グランザイムＢ集団をソートするＦＡＣＳを、まず試験した。しかし、細胞内染色中の固定プロセスにより、ソートした集団からの良質なゲノムＤＮＡ収率及び純度は、維持することができなかった。細胞溶解活性のサロゲートとして、本発明者らは、活性脱顆粒の間に発現した細胞表面マーカーであるＣＤ１０７ａにより、ＴＣＲ刺激細胞を染色した［２５］。本ＣＲＩＳＰＲスクリーンタイムラインの概略図を図３Ａに示す。細胞をＦＡＣＳにより、２つの集団；活性脱顆粒細胞（高ＣＤ１０７ａ）、及び、非脱顆粒細胞（低ＣＤ１０７ａ）にソートした。ＣＦＳＥ ＣＲＩＳＰＲスクリーンにより観察されるように、ＣＤ３Ｄ、ＬＣＫ、ＣＤ２４７、及びＣＤ３Ｇを含む、ｓｇＲＮＡ標的化により確立されたＴ細胞シグナル伝達の制御因子を同定した。興味深いことに、ある発現はＩＲＦ４であり、ＣＤ８＋ Ｔ細胞増殖及び活性化において重要な役割を果たしたが、脱顆粒を制限した。本発明者らは、Ｃａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）によるＩＲＦ４の個別のＣＲＩＳＰＲノックアウトを検証し、ＩＲＦ４ノックアウト後にグランザイムＢ発現の増加を観察した。活発に脱顆粒するＴ細胞（高ＣＤ１０７ａ）にて濃縮したｓｇＲＮＡを、次に調査した。驚くべきことに、ＣＤ８＋ Ｔ細胞脱顆粒の負の制御因子の中でも、ＴＡＤＡ２Ｂ及びＣＣＤＣ１０１（ＨＡＴモジュール）、ＴＡＤＡ１、ＴＡＦ５Ｌ、ＴＡＦ６Ｌ、ＴＡＦ１０、及びＳＵＰＴ７Ｌ（コア構造モジュール）、ならびにＴＲＲＡＰ（ＴＦ結合モジュール）を含む、ＳＡＧＡ（Ｓｐｔ－Ａｄａ－Ｇｃｎ５－アセチルトランスフェラーゼ）合体の要素が再び同定された。Ｃａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）とのＳＡＧＡ複合体の構成要素を個別にノックアウトすることでスクリーンを検証し、およそ２倍の、ＣＤ１０７ａ発現の増加が観察された。さらに、遺伝子オントロジー分析は、ヒストンアセチルトランスフェラーゼにおける遺伝子標的の著しい過剰提示、及び、高ＣＤ１０７ａ発現を有するＴ細胞中のＳＡＧＡ複合体を明らかにした。まとめると、これらのデータは、ＣＤ８＋ Ｔ細胞細胞溶解活性の制御における、ＳＡＧＡ複合体の、真価を認められていない役割を示す。
プールしたＣＲＩＳＰＲスクリーンは、ヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞細胞溶解活性の正及び負の制御因子を明らかにする
Ｔ細胞の活性化に加えて、本発明者らは、ＣＤ８＋ Ｔ細胞細胞溶解活性の正及び負の制御因子を同定しようとした（図３）。ＣＤ８＋ Ｔ細胞により、その標的細胞を殺傷するために使用される、鍵となる経路は、グランザイムが媒介する致死的送達に基づく。ＣＤ８＋ Ｔ細胞は、Ｔ細胞と標的細胞との間の免疫学的シナプスにて、グランザイムＢ及びパーフォリン（孔形成糖タンパク質）を含有する顆粒を送達し、カスパーゼ及び下流プロアポトーシス経路を活性化することで、ＤＮＡの断片化、及び、膜一体性の急速な喪失をもたらす［２４］。Ｔ細胞細胞溶解活性におけるその重要性により、ＴＣＲ刺激後に、高グランザイムＢ及び低グランザイムＢ集団をソートするＦＡＣＳを、まず試験した。しかし、細胞内染色中の固定プロセスにより、ソートした集団からの良質なゲノムＤＮＡ収率及び純度は、維持することができなかった。細胞溶解活性のサロゲートとして、本発明者らは、活性脱顆粒の間に発現した細胞表面マーカーであるＣＤ１０７ａにより、ＴＣＲ刺激細胞を染色した［２５］。本ＣＲＩＳＰＲスクリーンタイムラインの概略図を図３Ａに示す。細胞をＦＡＣＳにより、２つの集団；活性脱顆粒細胞（高ＣＤ１０７ａ）、及び、非脱顆粒細胞（低ＣＤ１０７ａ）にソートした。ＣＦＳＥ ＣＲＩＳＰＲスクリーンにより観察されるように、ＣＤ３Ｄ、ＬＣＫ、ＣＤ２４７、及びＣＤ３Ｇを含む、ｓｇＲＮＡ標的化により確立されたＴ細胞シグナル伝達の制御因子を同定した。興味深いことに、ある発現はＩＲＦ４であり、ＣＤ８＋ Ｔ細胞増殖及び活性化において重要な役割を果たしたが、脱顆粒を制限した。本発明者らは、Ｃａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）によるＩＲＦ４の個別のＣＲＩＳＰＲノックアウトを検証し、ＩＲＦ４ノックアウト後にグランザイムＢ発現の増加を観察した。活発に脱顆粒するＴ細胞（高ＣＤ１０７ａ）にて濃縮したｓｇＲＮＡを、次に調査した。驚くべきことに、ＣＤ８＋ Ｔ細胞脱顆粒の負の制御因子の中でも、ＴＡＤＡ２Ｂ及びＣＣＤＣ１０１（ＨＡＴモジュール）、ＴＡＤＡ１、ＴＡＦ５Ｌ、ＴＡＦ６Ｌ、ＴＡＦ１０、及びＳＵＰＴ７Ｌ（コア構造モジュール）、ならびにＴＲＲＡＰ（ＴＦ結合モジュール）を含む、ＳＡＧＡ（Ｓｐｔ－Ａｄａ－Ｇｃｎ５－アセチルトランスフェラーゼ）合体の要素が再び同定された。Ｃａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）とのＳＡＧＡ複合体の構成要素を個別にノックアウトすることでスクリーンを検証し、およそ２倍の、ＣＤ１０７ａ発現の増加が観察された。さらに、遺伝子オントロジー分析は、ヒストンアセチルトランスフェラーゼにおける遺伝子標的の著しい過剰提示、及び、高ＣＤ１０７ａ発現を有するＴ細胞中のＳＡＧＡ複合体を明らかにした。まとめると、これらのデータは、ＣＤ８＋ Ｔ細胞細胞溶解活性の制御における、ＳＡＧＡ複合体の、真価を認められていない役割を示す。
【0077】
実施例４
Ａ）ＵＳＰ２２遺伝子ノックアウト（ＳＡＧＡ標的）、及び、ＣＢＬＢ遺伝子ノックアウト（陽性対照）を有する、ＮＹ－ＥＳＯ－１特異的初代ＣＤ８＋ Ｔ細胞による、標的細胞の殺傷。生物学的重要性を示すために、ルシフェラーゼ発現標的細胞（ＮＹ－ＥＳＯ－１＋黒色腫細胞株Ａ３７５）を、対照の野生型ＣＤ８＋ Ｔ細胞、または、ＣＢＬＢ遺伝子ノックアウト（陽性対照）もしくはＵＳＰ２２遺伝子ノックアウト（ＳＡＧＡ標的）を有するＮＹ－ＥＳＯ－１特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の比率を増加させながらインキュベートした。ルミネセンスを測定して、Ａ３７５標的細胞を殺傷するレベルを測定した（Ｎ＝３、単一生体サンプル、平均±ＳＥＭ）。ＵＳＰ２２のノックアウトは、陽性対照と同様に、標的細胞の殺傷において効果的であった。
Ａ）ＵＳＰ２２遺伝子ノックアウト（ＳＡＧＡ標的）、及び、ＣＢＬＢ遺伝子ノックアウト（陽性対照）を有する、ＮＹ－ＥＳＯ－１特異的初代ＣＤ８＋ Ｔ細胞による、標的細胞の殺傷。生物学的重要性を示すために、ルシフェラーゼ発現標的細胞（ＮＹ－ＥＳＯ－１＋黒色腫細胞株Ａ３７５）を、対照の野生型ＣＤ８＋ Ｔ細胞、または、ＣＢＬＢ遺伝子ノックアウト（陽性対照）もしくはＵＳＰ２２遺伝子ノックアウト（ＳＡＧＡ標的）を有するＮＹ－ＥＳＯ－１特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の比率を増加させながらインキュベートした。ルミネセンスを測定して、Ａ３７５標的細胞を殺傷するレベルを測定した（Ｎ＝３、単一生体サンプル、平均±ＳＥＭ）。ＵＳＰ２２のノックアウトは、陽性対照と同様に、標的細胞の殺傷において効果的であった。
【0078】
Ｂ）初代ＣＤ８＋ Ｔ細胞におけるＵＳＰ２２遺伝子ノックアウトの機能検証。図８Ｂを参照すると、ウエスタンブロットを実施して、ＵＳＰ２２の遺伝子ノックアウトを検証した（Ｎ＝２２、２つの異なる生体サンプル）。ＵＳＰ２２の遺伝子ノックアウトは、リジン残基１２０において、ヒストンＨ２Ｂのユビキチン化の増加をもたらした。
【0079】
参考文献
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５ Ｂａｐｔｉｓｔａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．（２０１８） ＳＡＧＡ Ｉｓ ａ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｃｏｆａｃｔｏｒ ｆｏｒ ＲＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＩＩ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ７０，１１６３－１１６４
６ Ｕｚｈａｃｈｅｎｋｏ，Ｒ．Ｖ．ａｎｄ Ｓｈａｎｋｅｒ，Ａ．（２０１９） ＣＤ８＋ Ｔ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｎｄ ＮＫ Ｃｅｌｌ Ｎｅｔｗｏｒｋ： Ｃｉｒｃｕｉｔｒｙ ｉｎ ｔｈｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｄｏｍａｉｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １０，１９０６
７ Ｃａｎｔｒｅｌｌ，Ｄ．Ａ．（２００３） Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｒｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｎｅｔｗｏｒｋｓ ｉｎ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５，２９４－２９８
８ Ａｃｕｔｏ，Ｏ．ａｎｄ Ｍｉｃｈｅｌ，Ｆ．（２００３） ＣＤ２８－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ： ａ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｓｕｐｐｏｒｔ ｆｏｒ ＴＣＲ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３，９３９－９５１
９ Ｓｅｉｄｅｌ，Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（２０１８） Ａｎｔｉ－ＰＤ－１ ａｎｄ Ａｎｔｉ－ＣＴＬＡ－４ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ： Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ａｃｔｉｏｎ，Ｅｆｆｉｃａｃｙ，ａｎｄ Ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ．Ｆｒｏｎｔ．Ｏｎｃｏｌ．８，８６
１０ Ｃｈｅｎ，Ｌ．ａｎｄ Ｆｌｉｅｓ，Ｄ．Ｂ．（２０１３） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌ ｃｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏ－ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １３，２２７－２４２
１１ Ｇａｌｏｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２０１４） Ｔｏｗａｒｄｓ ｔｈｅ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ "Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｒｅ" ｉｎ ｔｈｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｔｕｍｏｕｒｓ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．２３２，１９９－２０９
１２ Ｚｈａｎｇ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．（２０２０） ＵＳＰ２２ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｉＮＫＴ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｔｈｒｏｕｇｈ ＭＥＤ１ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ２Ａ ｍｏｎｏｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２１７，９２４
１３ Ｌｏｏ，Ｃ．－Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２０２０） Ａ ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ＣＲＩＳＰＲ ｓｃｒｅｅｎ ｒｅｖｅａｌｓ ａ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ＢＲＤ９－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｎｏｎ－ｃａｎｏｎｉｃａｌ ＢＡＦ ｃｏｍｐｌｅｘ ｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ．ｂｉｏＲｘｉｖ ９，２０９５
１４ Ｃｏｒｔｅｚ，Ｊ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．（２０２０） ＣＲＩＳＰＲ Ｓｃｒｅｅｎ ｉｎ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｒｅｖｅａｌｓ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ ｏｆ Ｆｏｘｐ３．ｂｉｏＲｘｉｖ １１，５５５
１５ Ｆｉｒｅ，Ａ．ｅｔ ａｌ（１９９８） Ｐｏｔｅｎｔ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｅｔｉｃ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｂｙ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ ｉｎ Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ，１９：３９１（６６６９），８０６－１１
１６ Ｅｌｂａｓｈｉｒ Ｓ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２００１） ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ２１－ ａｎｄ ２２－ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ＲＮＡｓ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５；１５（２）： １８８－２００
１７ Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２０１８） Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｗｉｔｈ ＲＮＡ－Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｔｙｐｅ ＶＩ－Ｄ ＣＲＩＳＰＲ Ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ．Ｃｅｌｌ １７３，６６５－６７６
１８ Ｃｈｏｉ Ｂ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．（２０１９） ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ＰＤ－１ ｅｎｈａｎｃｅｓ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＣＡＲ Ｔ ｃｅｌｌ ｉｎ ａ ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ Ｃａｎｃｅｒ．１４；７（１）：３０４
１９ Ｈｅｎｒｉｋｓｓｏｎ Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２０１９） Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ＣＲＩＳＰＲ Ｓｃｒｅｅｎｓ ｉｎ Ｔ Ｈｅｌｐｅｒ Ｃｅｌｌｓ Ｒｅｖｅａｌ Ｐｅｒｖａｓｉｖｅ Ｃｒｏｓｓｔａｌｋ ｂｅｔｗｅｅｎ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ １７６（４），８８２－８９６
２０ Ｓｈｒｉｆｒｕｔ Ｅ．ｅｔ ａｌ．（２０１８） Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ＣＲＩＳＰＲ Ｓｃｒｅｅｎｓ ｉｎ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｒｅｖｅａｌ Ｋｅｙ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ １７５（７），１９５８－１９７１
２１ Ｓｕ Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２０１５），ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＰＤ－１ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ａｄｏｐｔｉｖｅ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ Ｃａｎｃｅｒ．３（Ｓｕｐｐｌ ２）： Ｐ５３
２２ Ｒｏｔｈ Ｔ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２０１８） Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｗｉｔｈ ｎｏｎ－ｖｉｒａｌ ｇｅｎｏｍｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ ５５９，４０５－４０９
２３ Ｓｔａｄｔｍａｕｅｒ Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（２０２０） ＣＲＩＳＰＲ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｔ Ｃｅｌｌ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｃａｎｃｅｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６７（６４８１）
２４ Ｓａｌｔｉ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２０１１） Ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８７，６３０１－６３０９
２５ Ａｌｔｅｒ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．（２００４） ＣＤ１０７ａ ａｓ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２９４，１５－２２
１ Ｐａｐａｉ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．（２０２０） Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＳＡＧＡ ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ＴＢＰ ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｎ ｇｅｎｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ ２０１１ ４７１：７３３７ ５７７，７１１－７１６
２ Ｈｅｌｍｌｉｎｇｅｒ，Ｄ．ａｎｄ Ｔｏｒａ，Ｌ．（２０１７） Ｓｈａｒｉｎｇ ｔｈｅ ＳＡＧＡ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．４２，８５０－８６１
３ Ｂａｓｅｈｏａｒ，Ａ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．（２００４） Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｙｅａｓｔ ＴＡＴＡ ｂｏｘ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｇｅｎｅｓ．Ｃｅｌｌ １１６，６９９－７０９
４ Ｈｕｉｓｉｎｇａ，Ｋ．Ｌ．ａｎｄ Ｐｕｇｈ，Ｂ．Ｆ．（２００４） Ａ ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ＴＦＩＩＤ ａｎｄ ａ ｈｉｇｈｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｓｔｒｅｓｓ－ｒｅｌａｔｅｄ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ＳＡＧＡ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ １３，５７３－５８５
５ Ｂａｐｔｉｓｔａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．（２０１８） ＳＡＧＡ Ｉｓ ａ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｃｏｆａｃｔｏｒ ｆｏｒ ＲＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＩＩ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ７０，１１６３－１１６４
６ Ｕｚｈａｃｈｅｎｋｏ，Ｒ．Ｖ．ａｎｄ Ｓｈａｎｋｅｒ，Ａ．（２０１９） ＣＤ８＋ Ｔ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｎｄ ＮＫ Ｃｅｌｌ Ｎｅｔｗｏｒｋ： Ｃｉｒｃｕｉｔｒｙ ｉｎ ｔｈｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｄｏｍａｉｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １０，１９０６
７ Ｃａｎｔｒｅｌｌ，Ｄ．Ａ．（２００３） Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｒｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｎｅｔｗｏｒｋｓ ｉｎ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５，２９４－２９８
８ Ａｃｕｔｏ，Ｏ．ａｎｄ Ｍｉｃｈｅｌ，Ｆ．（２００３） ＣＤ２８－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ： ａ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｓｕｐｐｏｒｔ ｆｏｒ ＴＣＲ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３，９３９－９５１
９ Ｓｅｉｄｅｌ，Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（２０１８） Ａｎｔｉ－ＰＤ－１ ａｎｄ Ａｎｔｉ－ＣＴＬＡ－４ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ： Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ａｃｔｉｏｎ，Ｅｆｆｉｃａｃｙ，ａｎｄ Ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ．Ｆｒｏｎｔ．Ｏｎｃｏｌ．８，８６
１０ Ｃｈｅｎ，Ｌ．ａｎｄ Ｆｌｉｅｓ，Ｄ．Ｂ．（２０１３） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌ ｃｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏ－ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １３，２２７－２４２
１１ Ｇａｌｏｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２０１４） Ｔｏｗａｒｄｓ ｔｈｅ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ "Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｒｅ" ｉｎ ｔｈｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｔｕｍｏｕｒｓ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．２３２，１９９－２０９
１２ Ｚｈａｎｇ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．（２０２０） ＵＳＰ２２ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｉＮＫＴ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｔｈｒｏｕｇｈ ＭＥＤ１ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ２Ａ ｍｏｎｏｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２１７，９２４
１３ Ｌｏｏ，Ｃ．－Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２０２０） Ａ ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ＣＲＩＳＰＲ ｓｃｒｅｅｎ ｒｅｖｅａｌｓ ａ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ＢＲＤ９－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｎｏｎ－ｃａｎｏｎｉｃａｌ ＢＡＦ ｃｏｍｐｌｅｘ ｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ．ｂｉｏＲｘｉｖ ９，２０９５
１４ Ｃｏｒｔｅｚ，Ｊ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．（２０２０） ＣＲＩＳＰＲ Ｓｃｒｅｅｎ ｉｎ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｒｅｖｅａｌｓ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ ｏｆ Ｆｏｘｐ３．ｂｉｏＲｘｉｖ １１，５５５
１５ Ｆｉｒｅ，Ａ．ｅｔ ａｌ（１９９８） Ｐｏｔｅｎｔ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｅｔｉｃ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｂｙ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ ｉｎ Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ，１９：３９１（６６６９），８０６－１１
１６ Ｅｌｂａｓｈｉｒ Ｓ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２００１） ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ２１－ ａｎｄ ２２－ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ＲＮＡｓ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５；１５（２）： １８８－２００
１７ Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２０１８） Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｗｉｔｈ ＲＮＡ－Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｔｙｐｅ ＶＩ－Ｄ ＣＲＩＳＰＲ Ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ．Ｃｅｌｌ １７３，６６５－６７６
１８ Ｃｈｏｉ Ｂ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．（２０１９） ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ＰＤ－１ ｅｎｈａｎｃｅｓ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＣＡＲ Ｔ ｃｅｌｌ ｉｎ ａ ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ Ｃａｎｃｅｒ．１４；７（１）：３０４
１９ Ｈｅｎｒｉｋｓｓｏｎ Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２０１９） Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ＣＲＩＳＰＲ Ｓｃｒｅｅｎｓ ｉｎ Ｔ Ｈｅｌｐｅｒ Ｃｅｌｌｓ Ｒｅｖｅａｌ Ｐｅｒｖａｓｉｖｅ Ｃｒｏｓｓｔａｌｋ ｂｅｔｗｅｅｎ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ １７６（４），８８２－８９６
２０ Ｓｈｒｉｆｒｕｔ Ｅ．ｅｔ ａｌ．（２０１８） Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ＣＲＩＳＰＲ Ｓｃｒｅｅｎｓ ｉｎ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｒｅｖｅａｌ Ｋｅｙ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ １７５（７），１９５８－１９７１
２１ Ｓｕ Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２０１５），ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＰＤ－１ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ａｄｏｐｔｉｖｅ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ Ｃａｎｃｅｒ．３（Ｓｕｐｐｌ ２）： Ｐ５３
２２ Ｒｏｔｈ Ｔ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２０１８） Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｗｉｔｈ ｎｏｎ－ｖｉｒａｌ ｇｅｎｏｍｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ ５５９，４０５－４０９
２３ Ｓｔａｄｔｍａｕｅｒ Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（２０２０） ＣＲＩＳＰＲ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｔ Ｃｅｌｌ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｃａｎｃｅｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６７（６４８１）
２４ Ｓａｌｔｉ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２０１１） Ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８７，６３０１－６３０９
２５ Ａｌｔｅｒ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．（２００４） ＣＤ１０７ａ ａｓ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２９４，１５－２２
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図1F】
【図1G】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図2F】
【図2G】
【図2H】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図3F】
【図3G】
【図3H】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E】
【図6F-1】
【図6F-2】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図8A】
【図8B】
【国際調査報告】