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特表2023-521356ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって標的核酸を検出する方法及びそのキット
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-05-24
(54)【発明の名称】ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって標的核酸を検出する方法及びそのキット
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6841 20180101AFI20230517BHJP
C12Q 1/6806 20180101ALI20230517BHJP
C12Q 1/6813 20180101ALI20230517BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20230517BHJP
C12N 15/113 20100101ALN20230517BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6841 Z
C12Q1/6806 Z
C12Q1/6813 Z
C12Q1/02
C12N15/113 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022561088
(86)(22)【出願日】2021-04-05
(85)【翻訳文提出日】2022-11-16
(86)【国際出願番号】 US2021025749
(87)【国際公開番号】W WO2021207062
(87)【国際公開日】2021-10-14
(31)【優先権主張番号】63/006,600
(32)【優先日】2020-04-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】521361338
【氏名又は名称】アドヴァンスド セル ダイアグノスティクス，インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】マタ，ミゲル エンジェル
(72)【発明者】
【氏名】サハジャン，アパルナ
(72)【発明者】
【氏名】マ，シャオ－ジュン
(72)【発明者】
【氏名】チャン，ビンチン
(72)【発明者】
【氏名】ワン，リ
(72)【発明者】
【氏名】ワン，リ－チョン
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA13
4B063QA19
4B063QQ02
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR32
4B063QR55
4B063QS10
4B063QS34
4B063QX01
(57)【要約】
細胞中の標的核酸、例えば、スモールノンコーディングＲＮＡ（ｓｎｃＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＰＩＷＩ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）分子などを検出する方法であって、初めの固定工程の後であり、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション前のアルデヒド含有固定液を用いた後固定工程を含む、方法。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用の生体試料を調製する方法であって、ｉ．薬剤で前記生体試料を固定することを含む第１の固定工程と、
ｉｉ．前記第１の固定工程の後であり、前記ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション前の、アルデヒド含有固定液で前記生体試料を固定することを含む後固定工程と、を含む、前記方法。
【請求項2】
前記ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが、ＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションまたはＤＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションである、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが、前記生体試料において、１００以下のヌクレオチドを含む核酸を検出する、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記ＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが、５０未満のヌクレオチドを含むＲＮＡを検出する、請求項２に記載の方法。
【請求項5】
前記ＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが、１５～４０のヌクレオチドを含むＲＮＡを検出する、請求項２に記載の方法。
【請求項6】
前記ＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが、スモールノンコーディングＲＮＡ（ｓｎｃＲＮＡ）を検出する、請求項２に記載の方法。
【請求項7】
前記ＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションまたは前記ＤＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＰＩＷＩ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）またはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）分子を検出し、前記ＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションまたは前記ＤＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが、内因性または外因性の核酸を検出する、請求項２に記載の方法。
【請求項8】
前記生体試料が組織検体である、または組織検体に由来する、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
前記生体試料が血液試料である、または血液試料に由来する、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
前記生体試料が細胞学的試料である、または細胞学的試料に由来する、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
前記生体試料が、培養細胞またはエクソソームを含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
前記第１の固定工程における前記薬剤が、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、メタノール、エタノール、及びアセトンからなる群から選択される、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項13】
前記後固定工程における前記アルデヒド含有固定液が、ホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒドを含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項14】
前記アルデヒド含有固定液が、約５％～約５０％のホルムアルデヒドを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記アルデヒド含有固定液が、約１２％未満のホルムアルデヒドを含み、前記後固定工程が、前記アルデヒド含有固定液で前記生体試料を、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８時間を超えて固定することを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項16】
前記アルデヒド含有固定液が少なくとも約１２％のホルムアルデヒドを含み、前記後固定工程が、前記アルデヒド含有固定液で前記生体試料を約２時間固定することを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項17】
前記アルデヒド含有固定液が約１２％～約３７％のホルムアルデヒドを含み、前記後固定工程が、前記アルデヒド含有固定液で前記生体試料を約２時間固定することを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項18】
前記後固定工程の前記アルデヒド含有固定液が、ホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒドに加えて追加の薬剤を含む、請求項１３～１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項19】
細胞中の標的核酸を検出する方法であって、（ｉ）請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法によって生体試料を調製することと、
（ｉｉ）前記標的核酸にハイブリダイズできる１つ以上の標的プローブ（複数可）の少なくとも１セットを提供することと、
（ｉｉｉ）前記１つ以上の標的プローブ（複数可）のセットにハイブリダイズできる、シグナル生成複合体を提供することであって、前記シグナル生成複合体が、前記１つ以上の標的プローブ（複数可）のセットにハイブリダイズできる核酸成分、及び標識プローブを含む、前記提供することと、
（ｉｖ）前記標的核酸を前記１つ以上の標的プローブ（複数可）のセットにハイブリダイズすることと、
（ｖ）前記シグナル生成複合体を前記１つ以上の標的プローブ（複数可）のセットに捕捉し、それによって前記シグナル生成複合体を前記標的核酸に捕捉することと、を含む、前記方法。
【請求項20】
前記標的プローブ（複数可）のそれぞれが、標的（Ｔ）セクションと標識（Ｌ）セクションとを備え、前記Ｔセクションは前記標的核酸上のセクションに相補的な核酸配列であり、前記Ｌセクションは前記シグナル生成複合体の前記核酸成分上のセクションに相補的な核酸配列であり、前記１つ以上の標的プローブ（複数可）の前記Ｔセクションは前記標的核酸の非重複領域に相補的であり、前記１つ以上の標的プローブ（複数可）の前記Ｌセクションは前記生成複合体の前記核酸成分の非重複領域に相補的である、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
前記標的核酸が、１００未満のヌクレオチドを含む、請求項１９～２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項22】
前記標的核酸が、５０未満のヌクレオチドを含むＲＮＡである、請求項１９～２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項23】
前記標的核酸が、１５～４０のヌクレオチドを含むＲＮＡである、請求項１９～２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項24】
前記標的核酸が、スモールノンコーディングＲＮＡ（ｓｎｃＲＮＡ）である、請求項１９～２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項25】
前記標的核酸が、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＰＩＷＩ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）分子であり、任意に前記ＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションまたは前記ＤＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが、内因性または外因性の核酸を検出するためのものである、請求項１９～２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項26】
組織または細胞型を識別するのに用いられる、請求項１～２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項27】
発生段階を決定するのに用いられる、請求項１～２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項28】
成人組織の特性決定に用いられる、請求項１～２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項29】
１つ以上の変性した低分子ＲＮＡの発現、または病原体由来の低分子ＲＮＡの存在に基づき、疾患または障害を診断するのに用いられる、請求項１～２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項30】
低分子ＲＮＡベースの治療の有効性を監視、または決定するために用いられる、請求項１～２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項31】
標的核酸のｉｎ ｓｉｔｕ検出のために、あらかじめ固定した試料中に前記標的核酸を保存する方法であって、前記標的核酸にハイブリダイズする１つ以上のプローブのセットを用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション検出アッセイ実施の前に、前記試料にアルデヒド含有固定液を適用することを含み、前記標的核酸が１００未満のヌクレオチドを含む、前記方法。
【請求項32】
あらかじめ固定した試料における標的核酸のｉｎ ｓｉｔｕ検出方法であって、（ｉ）前記試料にアルデヒド含有固定液を適用することと、
（ｉｉ）前記標的核酸にハイブリダイズする１つ以上のプローブのセットを用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション検出アッセイを実施することと、を含み、
前記標的核酸が１００未満のヌクレオチドを含む、前記方法。
【請求項33】
前記試料が組織検体である、または組織検体に由来する、請求項３１または請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
前記試料が血液試料である、または血液試料に由来する、請求項３１または請求項３２に記載の方法。
【請求項35】
前記試料が細胞学的試料である、または細胞学的試料に由来する、請求項３１または請求項３２に記載の方法。
【請求項36】
前記試料が、培養細胞またはエクソソームを含む、請求項３１または請求項３２に記載の方法。
【請求項37】
前記後固定工程の前記アルデヒド含有固定液が、ホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒドを含む、請求項３１～３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項38】
前記アルデヒド含有固定液が、約５％～約５０％のホルムアルデヒドを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項39】
前記アルデヒド含有固定液が、約１２％未満のホルムアルデヒドを含み、前記後固定工程が、前記アルデヒド含有固定液で前記試料を、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８時間を超えて固定することを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項40】
前記アルデヒド含有固定液が少なくとも約１２％のホルムアルデヒドを含み、前記後固定工程が、前記アルデヒド含有固定液で前記試料を約２時間固定することを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項41】
前記アルデヒド含有固定液が約１２％～約３７％のホルムアルデヒドを含み、前記後固定工程が、前記アルデヒド含有固定液で前記試料を約２時間固定することを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項42】
前記後固定工程の前記アルデヒド含有固定液が、ホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒドに加えて追加の薬剤を含む、請求項３７～４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項43】
前記プローブのセットが、前記標的核酸にハイブリダイズできる１つ以上の標的プローブ（複数可）を含み、前記方法が、（ａ）前記１つ以上の標的プローブ（複数可）のセットにハイブリダイズできる、シグナル生成複合体を提供することであって、前記シグナル生成複合体が、前記１つ以上の標的プローブ（複数可）のセットにハイブリダイズできる核酸成分、及び標識プローブを含む、前記提供することと、
（ｂ）前記標的核酸を前記１つ以上の標的プローブ（複数可）のセットにハイブリダイズすることと、
（ｃ）前記シグナル生成複合体を前記１つ以上の標的プローブ（複数可）のセットに捕捉し、それによって前記シグナル生成複合体を前記標的核酸に捕捉することと、をさらに含む、請求項３１～４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項44】
前記標的プローブ（複数可）のそれぞれが、標的（Ｔ）セクションと標識（Ｌ）セクションとを備え、前記Ｔセクションは前記標的核酸上のセクションに相補的な核酸配列であり、前記Ｌセクションは前記シグナル生成複合体の前記核酸成分上のセクションに相補的な核酸配列であり、前記１つ以上の標的プローブ（複数可）の前記Ｔセクションは前記標的核酸の非重複領域に相補的であり、前記１つ以上の標的プローブ（複数可）の前記Ｌセクションは前記生成複合体の前記核酸成分の非重複領域に相補的である、請求項４３に記載の方法。
【請求項45】
細胞中の標的核酸のｉｎ ｓｉｔｕ検出のためのキットであって、（ｉ）前記細胞を含む生体試料を固定する薬剤と、
（ｉｉ）前記生体試料を固定するアルデヒド含有固定液と、
（ｉｉｉ）ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを実施する薬剤と、
（ｉｖ）前記アルデヒド含有固定液が、要素（ｉ）の前記薬剤の後に使用されることを示す取扱い説明書と、を含む、前記キット。
【請求項46】
前記要素（ｉ）の前記薬剤が、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、メタノール、エタノール、及びアセトンからなる群から選択される、請求項４５に記載のキット。
【請求項47】
前記アルデヒド含有固定液が、ホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒドからなる群から選択される、請求項４５に記載のキット。
【請求項48】
前記アルデヒド含有固定液が、約５％～約５０％のホルムアルデヒドを含む、請求項４７に記載のキット。
【請求項49】
前記アルデヒド含有固定液が、少なくとも約１２％のホルムアルデヒドを含む、請求項４７に記載のキット。
【請求項50】
前記アルデヒド含有固定液が、約１２％～約３７％のホルムアルデヒドを含む、請求項４７に記載のキット。
【請求項51】
後固定工程の前記アルデヒド含有固定液が、ホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒドに加えて追加の剤を含む、請求項４７～５０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項52】
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを実施する前記薬剤が、前記標的核酸にハイブリダイズできる１つ以上の標的プローブ（複数可）の少なくとも１セットと、前記１つ以上の標的プローブ（複数可）のセットにハイブリダイズできるシグナル生成複合体と、を含み、前記シグナル生成複合体が、前記１つ以上の標的プローブ（複数可）のセットにハイブリダイズできる核酸成分、及び標識プローブを含む、請求項４５～５１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項53】
前記標的プローブ（複数可）のそれぞれが、標的（Ｔ）セクションと標識（Ｌ）セクションとを備え、前記Ｔセクションは前記標的核酸上のセクションに相補的な核酸配列であり、前記Ｌセクションは前記シグナル生成複合体の前記核酸成分上のセクションに相補的な核酸配列であり、前記１つ以上の標的プローブ（複数可）の前記Ｔセクションは前記標的核酸の非重複領域に相補的であり、前記１つ以上の標的プローブ（複数可）の前記Ｌセクションは前記生成複合体の前記核酸成分の非重複領域に相補的である、請求項５２に記載のキット。
【請求項54】
生体試料を得るためのツールをさらに含む、請求項４５～５３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項55】
前記生体試料が組織検体である、または組織検体に由来する、請求項５４に記載のキット。
【請求項56】
前記生体試料が血液試料である、または血液試料に由来する、請求項５４に記載のキット。
【請求項57】
前記生体試料が細胞学的試料である、または細胞学的試料に由来する、請求項５４に記載のキット。
【請求項58】
前記生体試料が、培養細胞またはエクソソームを含む、請求項５４に記載のキット。
【請求項59】
前記標的核酸が、１００未満のヌクレオチドを含む、請求項４５～５８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項60】
前記標的核酸が、５０未満のヌクレオチドを含むＲＮＡである、請求項４５～５８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項61】
前記標的核酸が、１５～４０のヌクレオチドを含むＲＮＡである、請求項４５～５８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項62】
前記標的核酸が、スモールノンコーディングＲＮＡ（ｓｎｃＲＮＡ）である、請求項４５～５８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項63】
前記標的核酸が、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＰＩＷＩ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）分子であり、前記ＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションまたは前記ＤＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが、内因性または外因性の核酸を検出する、請求項４５～５８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項64】
組織または細胞型を識別するのに用いられる、請求項４５～６３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項65】
発生段階を決定するのに用いられる、請求項４５～６３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項66】
成人組織の特性決定に用いられる、請求項４５～６３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項67】
１つ以上の変性した低分子ＲＮＡの発現、または病原体由来の低分子ＲＮＡの存在に基づき、疾患または障害を診断するのに用いられる、請求項４５～６３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項68】
低分子ＲＮＡベースの治療の有効性を監視、または決定するために用いられる、請求項４５～６３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項69】
請求項１～１８、または３１のいずれか１項に記載の方法によって調製される、生体試料。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【0001】
〔技術分野〕
いくつかの実施形態において、非限定的に、スモールノンコーディングＲＮＡ（ｓｎｃＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ＰＩＷＩ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）分子などを検出するための、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用の生体試料を調製する方法が、本明細書にて提供される。さらに、細胞中の標的核酸を検出する方法が提供される。また、本明細書では、特定の実施形態において、上記方法を実施するためのキット及び上記方法によって調製する生体試料が提供される。
いくつかの実施形態において、非限定的に、スモールノンコーディングＲＮＡ（ｓｎｃＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ＰＩＷＩ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）分子などを検出するための、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用の生体試料を調製する方法が、本明細書にて提供される。さらに、細胞中の標的核酸を検出する方法が提供される。また、本明細書では、特定の実施形態において、上記方法を実施するためのキット及び上記方法によって調製する生体試料が提供される。
【0002】
〔背景技術〕
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）は、組織学的切片内の核酸の特定セグメントを、精密に検出することを可能にする技術である。ＩＳＨの根底にある原理は、組織学的検体中に核酸が適切に保存されている場合、レポーター分子が結合されている相補的な核酸鎖を適用することで、保存された核酸を検出できるというものである。標的核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）であり得る。
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）は、組織学的切片内の核酸の特定セグメントを、精密に検出することを可能にする技術である。ＩＳＨの根底にある原理は、組織学的検体中に核酸が適切に保存されている場合、レポーター分子が結合されている相補的な核酸鎖を適用することで、保存された核酸を検出できるというものである。標的核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）であり得る。
【0003】
細胞内には異なる種類のＲＮＡ、すなわち（ｉ）ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、（ｉｉ）翻訳中にアミノ酸をリボソームに導くトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、（ｉｉｉ）ｍＲＮＡを翻訳する細胞小器官であるリボソームを構成するリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、及び（ｉｖ）様々なＲＮＡプロセシングに関与するｓｎｃＲＮＡ、などが存在する。特に、ｓｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ及びＡＳＯは、研究、診断及び医薬品開発において重要性が高い（例えば、Ｈａｎｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０，１－６，２０１９、Ｗａｔｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２２６（２），３６５－３７９，２０１２参照）。ＲＮＡ ＩＳＨ技術によって測定されるような、組織微小環境内でのＲＮＡ、特に低分子ＲＮＡの改善された検出感度を示す方法が必要である。
【0004】
多様な生物過程における低分子核酸の極めて重要な役割にもかかわらず、これらの種の検出には問題がある。組織病理学のための組織検体の保存は、化学的固定液を使用したタンパク質及び核酸の架橋に依存している。この固定戦略は、長鎖メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）種を検出するための、現在のＲＮＡ ＩＳＨ技術への適合性を有する。しかしながら、この手法は、低分子核酸を不適切に架橋することで、組織からこれらの種を発散及び分散させることにつながり、ＩＳＨアッセイによる検出の低下という結果をもたらす。したがって、ＩＳＨによってより広範囲の核酸分子を検出するための、新規の組成物及び方法が必要とされている。
【0005】
〔発明の概要〕
一態様では、本明細書において、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用の生体試料を調製する方法であって、ｉ．薬剤で生体試料を固定することを含む第１の固定工程と、ｉｉ．第１の固定工程の後であり、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション前の、アルデヒド含有固定液で生体試料を固定することを含む後固定工程と、を含む方法が提供される。
一態様では、本明細書において、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用の生体試料を調製する方法であって、ｉ．薬剤で生体試料を固定することを含む第１の固定工程と、ｉｉ．第１の固定工程の後であり、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション前の、アルデヒド含有固定液で生体試料を固定することを含む後固定工程と、を含む方法が提供される。
【0006】
いくつかの実施形態では、本方法は、ＲＮＡのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用の生体試料を調製するのに使用できる。いくつかの実施形態では、本方法は、ＤＮＡのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用の生体試料を調製するのに使用できる。
【0007】
いくつかの実施形態では、本開示のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法は、１００未満のヌクレオチドを含む核酸を検出するのに使用できる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法は、５０未満のヌクレオチドを含むＲＮＡを検出するのに使用できる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法は、１５～４０のヌクレオチドを含むＲＮＡを検出するのに使用できる。
【0008】
いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法は、スモールノンコーディングＲＮＡ（ｓｎｃＲＮＡ）を検出するのに使用できる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはＰＩＷＩ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）分子を検出するのに使用できる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法は、内因性ＲＮＡを検出するのに使用できる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法は、外因性ＲＮＡを検出するのに使用できる。
【0009】
いくつかの実施形態では、生体試料は組織検体である、または組織検体に由来する。その他の実施形態では、生体試料は血液試料である、または血液試料に由来する。その他の実施形態では、生体試料は細胞学的試料である、または細胞学的試料に由来する。その他の実施形態では、生体試料は培養細胞である。その他の実施形態では、生体試料はエクソソームである。
【0010】
いくつかの実施形態では、第１の固定工程における薬剤は、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、アルコール（メタノール、エタノール）、及びアセトンからなる群から選択される。
【0011】
その他の実施形態では、後固定工程におけるアルデヒド含有固定液は、ホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒドからなる群から選択される。
【0012】
いくつかの実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約５％～約５０％のホルムアルデヒドを含む。特定の実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約１２％未満のホルムアルデヒドを含む。いくつかの実施形態では、後固定工程は、アルデヒド含有固定液で生体試料を、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８時間を超えて固定することを含む。
【0013】
特定の実施形態では、アルデヒド含有固定液は少なくとも約１２％のホルムアルデヒドを含み、後固定工程はアルデヒド含有固定液で生体試料を約２時間固定することを含む。特定の実施形態では、アルデヒド含有固定液は約１２％～約３７％のホルムアルデヒドを含み、後固定工程はアルデヒド含有固定液で生体試料を約２時間固定することを含む。
【0014】
いくつかの実施形態では、生体試料は上記の方法に従って調製される。
【0015】
別の態様では、本開示の実施形態は、細胞中の標的核酸を検出する方法であって、（ｉ）生体試料を調製することと、（ｉｉ）上記標的核酸にハイブリダイズできる１つ以上の標的プローブ（複数可）の少なくとも１セットを提供することと、（ｉｉｉ）上記１つ以上の標的プローブ（複数可）のセットにハイブリダイズできる、シグナル生成複合体を提供することであって、上記シグナル生成複合体が、上記１つ以上の標的プローブ（複数可）のセットにハイブリダイズできる核酸成分、及び標識プローブを含む、提供することと、（ｉｖ）上記標的核酸を、上記１つ以上の標的プローブ（複数可）のセットにハイブリダイズすることと、（ｖ）シグナル生成複合体を上記１つ以上の標的プローブ（複数可）のセットに捕捉し、それによってシグナル生成複合体を上記標的核酸に捕捉することと、を含む方法を包含する。
【0016】
特定の実施形態では、各標的プローブ（複数可）は、標的（Ｔ）セクション、及び標識（Ｌ）セクションを含む。いくつかの実施形態では、Ｔセクションは標的核酸上のセクションに相補的な核酸配列であり、Ｌセクションはシグナル生成複合体の核酸成分上のセクションに相補的な核酸配列である。別の特定の実施形態では、１つ以上の標的プローブ（複数可）のＴセクションは、標的核酸の非重複領域に相補的であり、１つ以上の標的プローブ（複数可）のＬセクションは、生成複合体の核酸成分の非重複領域に相補的である。
【0017】
いくつかの実施形態では、標的核酸は約１００未満のヌクレオチドを含む。その他の実施形態では、標的核酸は、約５０未満のヌクレオチドを含むＲＮＡである。その他の実施形態では、標的核酸は、約１５～約４０のヌクレオチドを含むＲＮＡである。
【0018】
いくつかの実施形態では、標的核酸はｓｎｃＲＮＡである。いくつかの実施形態では、標的核酸は、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡまたはＡＳＯである。いくつかの実施形態では、標的核酸は内因性の核酸である。その他の実施形態では、標的核酸は外因性の核酸である。
【0019】
いくつかの実施形態では、本方法は、組織または細胞型を識別するのに使用される。その他の実施形態では、本方法は、発生段階を決定するのに使用される。その他の実施形態では、本方法は、成人組織の特性決定に使用される。その他の実施形態では、本方法は、１つ以上の変性した低分子ＲＮＡの発現、または病原体由来の低分子ＲＮＡの存在に基づき、疾患または障害を診断するのに使用される。その他の実施形態では、本方法は、低分子ＲＮＡまたはオリゴヌクレオチドベースの治療の有効性を監視する、または決定するのに使用される。
【0020】
別の態様では、本開示の実施形態は、標的核酸のｉｎ ｓｉｔｕ検出のために、あらかじめ固定した試料中に標的核酸を保存する方法であって、上記標的核酸にハイブリダイズする１つ以上のプローブのセットを用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション検出アッセイ実施の前に、上記試料にアルデヒド含有固定液を適用すること、を含む方法を包含する。
【0021】
別の態様では、本明細書において、あらかじめ固定した試料中の標的核酸のｉｎ ｓｉｔｕ検出方法であって、（ｉ）試料にアルデヒド含有固定液を適用することと、（ｉｉ）上記標的核酸にハイブリダイズする１つ以上のプローブのセットを用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション検出アッセイを実施することと、を含む検出方法が提供される。
【0022】
いくつかの実施形態では、標的核酸は約１００未満のヌクレオチドを含む。その他の実施形態では、標的核酸は、約５０未満のヌクレオチドを含むＲＮＡである。その他の実施形態では、標的核酸は、約１５～約４０のヌクレオチドを含むＲＮＡである。
【0023】
いくつかの実施形態では、生体試料は組織検体である、または組織検体に由来する。その他の実施形態では、生体試料は血液試料である、または血液試料に由来する。その他の実施形態では、生体試料は細胞学的試料である、または細胞学的試料に由来する。その他の実施形態では、生体試料は培養細胞である。その他の実施形態では、生体試料はエクソソームである。
【0024】
その他の実施形態では、後固定工程におけるアルデヒド含有固定液は、ホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒドを含む。
【0025】
いくつかの実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約５％～約５０％のホルムアルデヒドを含む。特定の実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約１２％未満のホルムアルデヒドを含み、後固定工程は、アルデヒド含有固定液で生体試料を、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８時間を超えて固定することを含む。特定の実施形態では、アルデヒド含有固定液は少なくとも約１２％のホルムアルデヒドを含み、後固定工程はアルデヒド含有固定液で生体試料を約２時間固定することを含む。特定の実施形態では、アルデヒド含有固定液は約１２％～約３７％のホルムアルデヒドを含み、後固定工程はアルデヒド含有固定液で生体試料を約２時間固定することを含む。
【0026】
いくつかの実施形態では、プローブのセットは、上記標的核酸にハイブリダイズできる１つ以上の標的プローブ（複数可）を含み、また本方法は、（ａ）上記１つ以上の標的プローブ（複数可）のセットにハイブリダイズできる、シグナル生成複合体を提供することであって、上記シグナル生成複合体が、上記１つ以上の標的プローブ（複数可）のセットにハイブリダイズできる核酸成分、及び標識プローブを含む、提供することと、（ｂ）上記標的核酸を、上記１つ以上の標的プローブ（複数可）のセットにハイブリダイズすることと、（ｃ）シグナル生成複合体を上記１つ以上の標的プローブ（複数可）のセットに捕捉し、それによってシグナル生成複合体を上記標的核酸に捕捉することと、をさらに含む。
【0027】
いくつかの実施形態では、標的プローブ（複数可）のそれぞれは、標的（Ｔ）セクション及び標識（Ｌ）セクションを含む。特定の実施形態では、Ｔセクションは標的核酸上のセクションに相補的な核酸配列であり、Ｌセクションはシグナル生成複合体の核酸成分上のセクションに相補的な核酸配列である。特定の実施形態では、１つ以上の標的プローブ（複数可）のＴセクションは、標的核酸の非重複領域に相補的であり、１つ以上の標的プローブ（複数可）のＬセクションは、生成複合体の核酸成分の非重複領域に相補的である。
【0028】
別の態様では、細胞中の標的核酸のｉｎ ｓｉｔｕ検出のためのキットは、（ｉ）細胞を含む生体試料を固定する薬剤と、（ｉｉ）生体試料を固定するアルデヒド含有固定液と、（ｉｉｉ）ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを実施する薬剤と、（ｉｖ）アルデヒド含有固定液が、要素（ｉ）の薬剤の後に使用されることを示す取扱い説明書と、を含む。いくつかの実施形態では、細胞中の標的核酸をｉｎ ｓｉｔｕ検出するためのキットは、生体試料を固定するアルデヒド含有固定液と、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを実施する薬剤と、を含む。
【0029】
いくつかの実施形態では、要素（ｉ）の薬剤は、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、アルコール（メタノール、エタノール）、及びアセトンからなる群から選択される。その他の実施形態では、アルデヒド含有固定液は、ホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒドを含む。
【0030】
いくつかの実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約５％～約５０％のホルムアルデヒドを含む。特定の実施形態では、アルデヒド含有固定液は、少なくとも約１２％のホルムアルデヒドを含む。特定の実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約１２％～約３７％のホルムアルデヒドを含む。
【0031】
いくつかの実施形態では、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを実施する薬剤は、上記標的核酸にハイブリダイズできる１つ以上の標的プローブ（複数可）の少なくとも１セットと、上記１つ以上の標的プローブ（複数可）のセットにハイブリダイズできるシグナル生成複合体と、を含む。特定の実施形態では、上記シグナル生成複合体は、上記１つ以上の標的プローブ（複数可）のセットにハイブリダイズできる核酸成分、及び標識プローブを含む。
【0032】
いくつかの実施形態では、標的プローブ（複数可）のそれぞれは、標的（Ｔ）セクション及び標識（Ｌ）セクションを含む。特定の実施形態では、Ｔセクションは標的核酸上のセクションに相補的な核酸配列であり、Ｌセクションはシグナル生成複合体の核酸成分上のセクションに相補的な核酸配列である。特定の実施形態では、１つ以上の標的プローブ（複数可）のＴセクションは、標的核酸の非重複領域に相補的であり、１つ以上の標的プローブ（複数可）のＬセクションは、生成複合体の核酸成分の非重複領域に相補的である。
【0033】
いくつかの実施形態では、本キットは、生体試料を得るためのツールをさらに含む。特定の実施形態では、生体試料は組織検体である、または組織検体に由来する。特定の実施形態では、生体試料は血液試料である、または血液試料に由来する。特定の実施形態では、生体試料は細胞学的試料である、または細胞学的試料に由来する。特定の実施形態では、生体試料は培養細胞である。特定の実施形態では、生体試料はエクソソームである。
【0034】
いくつかの実施形態では、標的核酸は約１００未満のヌクレオチドを含む。その他の実施形態では、標的核酸は、５０未満のヌクレオチドを含むＲＮＡである。その他の実施形態では、標的核酸は、約１５～約４０のヌクレオチドを含むＲＮＡである。いくつかの実施形態では、標的核酸はｓｎｃＲＮＡである。その他の実施形態では、標的核酸は、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡまたはＡＳＯである。その他の実施形態では、標的核酸は内因性または外因性である。
【0035】
いくつかの実施形態では、本キットは、組織または細胞型を識別するのに使用される。その他の実施形態では、本キットは、発生段階を決定するのに使用される。その他の実施形態では、本キットは、成人組織の特性決定に使用される。その他の実施形態では、本キットは、１つ以上の変性した低分子ＲＮＡの発現、または病原体由来の低分子ＲＮＡの存在に基づき、疾患または障害を診断するのに使用される。その他の実施形態では、本方法は、低分子ＲＮＡベースの治療の有効性を監視する、または決定するのに使用される。
【0036】
〔図面の簡単な説明〕
［図１］標準的なＲＮＡ ＩＳＨワークフローにおける、後固定工程の組み込みを示す。標準的なＲＮＡ ＩＳＨワークフローに存在しない後固定工程は、二重囲みボックスでラベルをつけている。
［図１］標準的なＲＮＡ ＩＳＨワークフローにおける、後固定工程の組み込みを示す。標準的なＲＮＡ ＩＳＨワークフローに存在しない後固定工程は、二重囲みボックスでラベルをつけている。
【0037】
［図２Ａ］１２％に等しい、またはより高いホルムアルデヒドを用いた後固定によって、ｍｉＲＮＡ喪失が最小限となり、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）ＩＳＨによる検出感度が向上したことを示す。マウスのホルマリン固定パラフィン包埋組織切片を未処理にした、または１２％～３７％の範囲の濃度のホルムアルデヒドで後固定した。ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）２．５ Ｈｉｇｈ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ（ＨＤ）－Ｒｅｄ Ａｓｓａｙを使用して、ホルマリン固定パラフィン包埋組織処理用の確立された条件に従って、２種のｍｉＲＮＡを検出した。ＩＳＨシグナルは斑点として現れ、ヘマトキシリンは個々の細胞核を染色する。後固定工程後の、心臓に豊富に発現するｍｉＲ－１ａ－３ｐの検出を示す図である。
【0038】
［図２Ｂ］１２％に等しい、またはより高いホルムアルデヒドを用いた後固定によって、ｍｉＲＮＡ喪失が最小限となり、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）ＩＳＨによる検出感度が向上したことを示す。マウスのホルマリン固定パラフィン包埋組織切片を未処理にした、または１２％～３７％の範囲の濃度のホルムアルデヒドで後固定した。ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）２．５ Ｈｉｇｈ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ（ＨＤ）－Ｒｅｄ Ａｓｓａｙを使用して、ホルマリン固定パラフィン包埋組織処理用の確立された条件に従って、２種のｍｉＲＮＡを検出した。ＩＳＨシグナルは斑点として現れ、ヘマトキシリンは個々の細胞核を染色する。脳に豊富に発現するｍｉＲ－１３２－３ｐの検出を示す図である。
【0039】
［図３Ａ］約４％のホルムアルデヒド含有量を有する、１０％中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）を用いた後固定によって、ｍｉＲＮＡ喪失が最小限となり、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）ＩＳＨによる検出感度が向上したことを示す。マウスのホルマリン固定パラフィン包埋組織切片を未処理にした、または１０％ＮＢＦで後固定した。ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）２．５ Ｈｉｇｈ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ（ＨＤ）－Ｒｅｄ Ａｓｓａｙを使用して、ホルマリン固定パラフィン包埋組織処理用の確立された条件に従って、複数種のｍｉＲＮＡを検出した。ＩＳＨシグナルは斑点として現れ、ヘマトキシリンは個々の細胞核を染色する。後固定工程後の、心臓に豊富に発現するｍｉＲ－１ａ－３ｐの検出を示す図である。
【0040】
［図３Ｂ］約４％のホルムアルデヒド含有量を有する、１０％中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）を用いた後固定によって、ｍｉＲＮＡ喪失が最小限となり、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）ＩＳＨによる検出感度が向上したことを示す。マウスのホルマリン固定パラフィン包埋組織切片を未処理にした、または１０％ＮＢＦで後固定した。ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）２．５ Ｈｉｇｈ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ（ＨＤ）－Ｒｅｄ Ａｓｓａｙを使用して、ホルマリン固定パラフィン包埋組織処理用の確立された条件に従って、複数種のｍｉＲＮＡを検出した。ＩＳＨシグナルは斑点として現れ、ヘマトキシリンは個々の細胞核を染色する。後固定工程後の、脳に豊富に発現するｍｉＲ－１３２－３ｐの検出を示す図である。
【0041】
［図３Ｃ］約４％のホルムアルデヒド含有量を有する、１０％中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）を用いた後固定によって、ｍｉＲＮＡ喪失が最小限となり、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）ＩＳＨによる検出感度が向上したことを示す。マウスのホルマリン固定パラフィン包埋組織切片を未処理にした、または１０％ＮＢＦで後固定した。ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）２．５ Ｈｉｇｈ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ（ＨＤ）－Ｒｅｄ Ａｓｓａｙを使用して、ホルマリン固定パラフィン包埋組織処理用の確立された条件に従って、複数種のｍｉＲＮＡを検出した。ＩＳＨシグナルは斑点として現れ、ヘマトキシリンは個々の細胞核を染色する。後固定工程後の、肝臓に豊富に発現するｍｉＲ－１２２－５ｐの検出を示す図である。
【0042】
［図３Ｄ］約４％のホルムアルデヒド含有量を有する、１０％中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）を用いた後固定によって、ｍｉＲＮＡ喪失が最小限となり、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）ＩＳＨによる検出感度が向上したことを示す。マウスのホルマリン固定パラフィン包埋組織切片を未処理にした、または１０％ＮＢＦで後固定した。ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）２．５ Ｈｉｇｈ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ（ＨＤ）－Ｒｅｄ Ａｓｓａｙを使用して、ホルマリン固定パラフィン包埋組織処理用の確立された条件に従って、複数種のｍｉＲＮＡを検出した。ＩＳＨシグナルは斑点として現れ、ヘマトキシリンは個々の細胞核を染色する。後固定工程後の、偏在して発現するｌｅｔ－７の検出を示す図である。
【0043】
［図４Ａ］後固定ワークフローが、長鎖ＲＮＡ種の検出への完全な適合性があったことを示す。ヒト及びマウスのホルマリン固定パラフィン包埋組織を未処理とした、または１０％ＮＢＦによって後固定し、図１に概説した汎用ＩＳＨワークフローを用いて処理を続けた。ヒト皮膚Ａ４３１細胞において、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）２．５ Ｈｉｇｈ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ（ＨＤ）－Ｒｅｄ Ａｓｓａｙを使用して、ヒトＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）ｍＲＮＡを検出したことを示す図である。
【0044】
［図４Ｂ］後固定ワークフローが、長鎖ＲＮＡ種の検出への完全な適合性があったことを示す。ヒト及びマウスのホルマリン固定パラフィン包埋組織を未処理とした、または１０％ＮＢＦによって後固定し、図１に概説した汎用ＩＳＨワークフローを用いて処理を続けた。マウスの腸試料での、マウスポリメラーゼＲＮＡ ＩＩポリペプチドＡ（ＰＯＬＲ２Ａ）ｍＲＮＡの検出を示す図である。
【0045】
［図４Ｃ］後固定ワークフローが、長鎖ＲＮＡ種の検出への完全な適合性があったことを示す。ヒト及びマウスのホルマリン固定パラフィン包埋組織を未処理とした、または１０％ＮＢＦによって後固定し、図１に概説した汎用ＩＳＨワークフローを用いて処理を続けた。脳組織での、マウスポリメラーゼＲＮＡ ＩＩポリペプチドＡ（ＰＯＬＲ２Ａ）ｍＲＮＡの検出を示す図である。
【0046】
〔発明を実施するための形態〕
本明細書において提供される方法は、一部には、第１の固定工程の後であるが、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの前に行う後固定工程により、低分子標的核酸、例えば生体試料中の低分子ＲＮＡ種のより良好な保持が得られ、そして標的核酸、例えば低分子ＲＮＡ種の検出感度が改善され、さらにこの方法が長鎖核酸種、例えば長鎖ＲＮＡ種への完全な適合性を有していた、という予想外の発見に基づいている。本明細書で提供される方法は、天然の組織微小環境において低分子核酸分子を保存し、より高い検出感度を提供する。喪失を最小化するために、あらかじめ固定した生物検体をアルデヒド含有固定液を用いて後固定し、その後、試料をＩＳＨアッセイ（図１参照）のために処理し、それによって確実に生体試料内での低分子核酸の保存を行う。この実用的かつ信頼性が高い戦略は、標準的なＩＳＨアッセイへの完全な適合性があり（図２、図３及び図４参照）、低分子核酸の検出感度を高め、ｓｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ及びＡＳＯなどの標的核酸の空間的識別を可能とする。
本明細書において提供される方法は、一部には、第１の固定工程の後であるが、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの前に行う後固定工程により、低分子標的核酸、例えば生体試料中の低分子ＲＮＡ種のより良好な保持が得られ、そして標的核酸、例えば低分子ＲＮＡ種の検出感度が改善され、さらにこの方法が長鎖核酸種、例えば長鎖ＲＮＡ種への完全な適合性を有していた、という予想外の発見に基づいている。本明細書で提供される方法は、天然の組織微小環境において低分子核酸分子を保存し、より高い検出感度を提供する。喪失を最小化するために、あらかじめ固定した生物検体をアルデヒド含有固定液を用いて後固定し、その後、試料をＩＳＨアッセイ（図１参照）のために処理し、それによって確実に生体試料内での低分子核酸の保存を行う。この実用的かつ信頼性が高い戦略は、標準的なＩＳＨアッセイへの完全な適合性があり（図２、図３及び図４参照）、低分子核酸の検出感度を高め、ｓｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ及びＡＳＯなどの標的核酸の空間的識別を可能とする。
【0047】
５．１ 定義
本明細書で使用される場合、用語「固定」または「固定すること」は、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション工程において生体試料を固定することに関するとき、例えば、自己分解または腐敗による崩壊から生体試料を守る手順を意味する。この手順は、あらゆる進行中の生化学反応を停止させ、さらに処理した組織の機械的強度または安定性を向上させ得る。
本明細書で使用される場合、用語「固定」または「固定すること」は、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション工程において生体試料を固定することに関するとき、例えば、自己分解または腐敗による崩壊から生体試料を守る手順を意味する。この手順は、あらゆる進行中の生化学反応を停止させ、さらに処理した組織の機械的強度または安定性を向上させ得る。
【0048】
本明細書で使用される場合、用語「１つ以上」とは、例えば、１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０個以上、２０個以上、３０個以上、４０個以上、５０個以上、または特定の用途のために所望の場合、より大きな数を意味する。
【0049】
本明細書で使用される用語「検出する」とは、通常、任意の形態の測定を意味し、ある成分が存在するかどうかの決定を含む。この用語には、定量的及び／または定性的決定が含まれる。
【0050】
用語「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は、本明細書において、ヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド）で構成される任意の長さの高分子、または２つの天然に存在する核酸が配列特異的にハイブリダイズするのと同様に、天然に存在する核酸と配列特異的にハイブリダイズすることができる、合成的に生成される化合物、例えば、ワトソン・クリック塩基対相互作用に関与し得る化合物を指す目的で同義的に使用される。用語「複数の塩基」（または「塩基」）は、ポリヌクレオチド配列との関係で本明細書で使用される場合、「複数のヌクレオチド」（または「ヌクレオチド」）、すなわち、ポリヌクレオチドのモノマーサブユニットと同義である。用語「ヌクレオシド」及び「ヌクレオチド」は、既知のプリン塩基及びピリミジン塩基を含有する部分のみならず、修飾された他の複素環式塩基を含有する部分も包含することが意図される。このような修飾には、メチル化プリンもしくはメチル化ピリミジン、アシル化プリンもしくはアシル化ピリミジン、アルキル化リボース、または他の複素環が含まれる。さらに、用語「ヌクレオシド」及び「ヌクレオチド」は、従来のリボース糖及びデオキシリボース糖を含有する部分のみならず、他の糖を含有する部分も包含する。修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドはまた、糖部分に対する修飾を含み、例えば、ヒドロキシル基のうちの１つ以上がハロゲン原子または脂肪族基で置き換えられているか、エーテルまたはアミンなどに官能化されている。「類似体」は、模倣体、誘導体である、類似の構造を有する、または他の同様の用語として文献で認識されている構造的特徴を有する分子を指し、例えば、非天然ヌクレオチドが組み込まれたポリヌクレオチド、ヌクレオチド模倣体（２’－修飾ヌクレオシドなど）、ペプチド核酸、オリゴマーヌクレオシドホスホネート、及び置換基（保護基または連結部分など）が付加されている任意のポリヌクレオチドを含む。
【0051】
「相補的」という用語は、ポリヌクレオチドの配列に基づく、ポリヌクレオチド間の特異的な結合を指す。本明細書で使用される場合、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドは、ストリンジェントな条件でのハイブリダイゼーションアッセイにおいて、互いに結合し合う場合、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイにおいて、所定のレベルまたは検出可能なレベルのシグナルを生成する場合、相補的である。ポリヌクレオチドの部分は、従来の塩基対形成規則（例えば、ＡはＴ（またはＵ）と対になり、ＧはＣと対になる）に従う場合、互いに相補的であるが、ミスマッチ、挿入、または欠失された配列の小さな領域（例えば、約３塩基未満）が存在してもよい。
【0052】
本明細書で使用される用語「試料」は、関心対象である１種以上の成分を含有する物質または物質の混合物に関するものである。用語「試料」は、「生体試料」を包含し、生体試料は、生物学的対象から得られた試料、例えばｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｓｉｔｕで得た、到達した、もしくは採取した生物組織または流体由来の試料などを意味する。生体試料として同じく、前がん細胞、がん細胞、前がん組織、またはがん組織を含有する生物学的対象の領域由来の試料を含む。このような試料は、哺乳動物から分離した器官、組織、細胞及びエクソソームであることができるが、これらに限定されない。例示的な生体試料としては、細胞溶解液、細胞培養物、細胞株、組織、口腔組織、胃腸組織、器官、細胞小器官、生体液、血液試料、尿試料、皮膚試料などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい生体試料としては、全血、部分精製血液、ＰＢＭＣ、組織生検体などが挙げられるが、これらに限定されない。
【0053】
本明細書で使用される「プローブ」という用語は、特定の標的のｍＲＮＡ配列に向けられた捕捉物質を指す。したがって、プローブのセットの各プローブは、それぞれの標的ｍＲＮＡ配列を有する。いくつかの実施形態では、本明細書において提供されるプローブは、「核酸プローブ」または「オリゴヌクレオチドプローブ」であり、これらは相補的配列を有する標的核酸、例えば本明細書において提供されるｍＲＮＡバイオマーカーと、通常、水素結合の形成による相補的塩基対形成を通じて結合できる核酸を指す。本明細書で使用される場合、プローブは、天然塩基（例えば、Ａ、Ｇ、ＣまたはＴ）または修飾塩基（７－デアザグアノシン、イノシンなど）を含み得る。加えて、プローブ内の塩基は、ハイブリダイゼーションに干渉しない限り、ホスホジエステル結合以外の結合によって連結されていてもよい。プローブは、タグ、例えば発色団、発光団（ｌｕｍｉｐｈｏｒｅ）、または色素体で、直接または間接的に標識されることができる。プローブの有無についてアッセイすることによって、目的の標的ｍＲＮＡバイオマーカーの有無を検出することができる。
【0054】
本明細書で使用される場合、用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）分子」または「ＡＳＯ」は、メッセンジャーＲＮＡと相互作用して標的遺伝子の翻訳を防ぐ、短い、１本鎖の分子を意味する。
【0055】
本明細書で使用される場合、用語「内因性」は、生体内から生じる物質を意味する。本明細書で使用される場合、用語「外因性」は、生体外から生じる物質を意味する。
【0056】
本開示及び特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、文脈によってそうでない旨が明確に示されない限り、複数の指示対象が含まれる。
【0057】
実施形態が、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とともに本明細書に記載される場合、それ以外の、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」及び／または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という観点から記載された、類似の実施形態もまた提供されると理解される。また、実施形態が「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という表現とともに本明細書に記載される場合、それ以外の、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という観点から記載された、類似の実施形態もまた提供されると理解される。
【0058】
「ＡとＢの間（ｂｅｔｗｅｅｎ Ａ ａｎｄ Ｂ）」または「Ａ－Ｂ間（ｂｅｔｗｅｅｎ Ａ－Ｂ）」などの表現において用いられる用語「の間（ｂｅｔｗｅｅｎ）」は、Ａ及びＢを包含する範囲を示す。
【0059】
本明細書における「Ａ及び／またはＢ」のような表現において用いられるような用語「及び／または」は、Ａ及びＢ、ＡまたはＢ、Ａのみ、ならびにＢのみ、を含むと意図される。同様に、「Ａ、Ｂ及び／またはＣ」のような表現において用いられるような用語「及び／または」は、次の各具体例：Ａ、Ｂ及びＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａのみ；Ｂのみ；ならびにＣのみ、を包含すると意図される。
【0060】
５．２ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのための後固定
固定は、生体試料を、例えば自己分解または腐敗による崩壊から保存するために広く使用される。固定は、あらゆる進行中の生化学反応を停止させ、処理した組織の力学的強度または安定性を向上させ得る。しかし、標準的な固定工程では、生体試料中の核酸、ＤＮＡまたはＲＮＡの質が損なわれることが多いと、長年にわたって知られている。臨床の世界における分子検査の使用増加に伴い、このような制約は、これらの検査の利用をいたずらに制限している可能性がある。したがって、この点に関して、組織構造中のＤＮＡ及びＲＮＡの検出を最適化する必要がある。
固定は、生体試料を、例えば自己分解または腐敗による崩壊から保存するために広く使用される。固定は、あらゆる進行中の生化学反応を停止させ、処理した組織の力学的強度または安定性を向上させ得る。しかし、標準的な固定工程では、生体試料中の核酸、ＤＮＡまたはＲＮＡの質が損なわれることが多いと、長年にわたって知られている。臨床の世界における分子検査の使用増加に伴い、このような制約は、これらの検査の利用をいたずらに制限している可能性がある。したがって、この点に関して、組織構造中のＤＮＡ及びＲＮＡの検出を最適化する必要がある。
【0061】
ＲＮＡ種、特に低分子ＲＮＡの目録を作る試みは、マイクロアレイ、定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、及びシークエンシング手法に大きく依存している。これらの方法によってバルクの発現レベルを得られる一方で、特定のｍｉＲＮＡに関する詳細な空間的発現情報は、その過程で失われてしまう。このことは、組織または細胞型固有の発現様式に基づいてｍｉＲＮＡを検出し、目録を作る必要性を強調している。関心対象である遺伝子の発現を、細胞の微小環境内で視覚化するのに一般に使用される方法が、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）である。メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を検出するためには、多くのＩＳＨ法を利用できる一方で、低分子核酸の検出には、その発現を再現性高く検出し、定量化するための問題が残っている。
【0062】
１０％のホルマリンを使用する従来の組織固定法は、ｍＲＮＡなどの長鎖の核酸種にとっては最適な保存をもたらすが、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、及びＡＳＯなどの低分子核酸種の固定には不十分である。近年、架橋剤であるホルムアルデヒド、続いて化学的固定液１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を利用して、組織学的試料からｍｉＲＮＡの喪失を防ぐ固定手法が導入され、ハプテン標識プローブ及び比色抗体に基づくＲＮＡ ＩＳＨによって視覚化するとき、組織微小環境内のｍｉＲＮＡが保持される結果となった（Ｐｅｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，６（２），１３９－１４１，２０１０）。この戦略は有用であるが、いくつかの課題を呈する。第１に、ＥＤＣとの架橋プロセスはｐＨに非常に敏感であり、それによって様々なｍｉＲＮＡ保持プロファイルができ、アッセイごとに潜在的なばらつきが増加することとなる。第２に、試薬が不安定であるため、ＥＤＣは新しく調製され、安定化剤と混合することで固定液特性を維持している（Ｒｅｎｗｉｃｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，１２３（６），２６９４－２７０２，２０１３）。それゆえ、これらの制約のために、低分子ＲＮＡ種を検出するためのこれらの方法の実用的な適用、特に大規模なプロジェクトにおける適用が妨げられている。したがって、ＩＳＨアッセイでの低分子核酸の喪失を最小化し、低分子核酸の検出感度を向上させるより実用的かつ安定な方法が必要である。
【0063】
したがって、本開示の実施形態は、生体試料内に低分子核酸分子を保存するための、確立されたＩＳＨアッセイへの完全な適合性がある、汎用性及び信頼性が高い方法を包含する。核酸種の保持は、ＩＳＨの前に、あらかじめ固定した生体試料をアルデヒド含有固定液に曝露することによって達成される。この戦略によって、不安定な化学化合物を調製する必要性が排除され、組織内に核酸を保持するための信頼性が高い手法が提供され、検出感度の向上につながる。
【0064】
本開示の方法は、あらかじめ固定した試料に、アルデヒド含有固定液を適用することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書において、標的核酸のｉｎ ｓｉｔｕ検出のために、あらかじめ固定した試料中に標的核酸を保存する方法であって、標的核酸にハイブリダイズする１つ以上のプローブのセットを用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション検出アッセイ実施の前に、試料にアルデヒド含有固定液を適用すること、を含む方法が提供される。
【0065】
いくつかの実施形態では、試料は、固定液（複数可）を用いた化学的固定によってあらかじめ固定した。いくつかの実施形態では、試料は、固定液（複数可）中に生体試料を浸漬することによって、固定液（複数可）を用いて生体試料を灌流することによって、または生体試料に蒸気状の固定液（複数可）を適用することによってあらかじめ固定した。その他の実施形態では、試料は、物理的な固定、例えば加熱、マイクロ波への曝露、凍結保存または凍結乾燥によってあらかじめ固定した。
【0066】
いくつかの実施形態では、試料は、凝固性の固定液（複数可）によってあらかじめ固定した。その他の実施形態では、試料は、非凝固性の固定液（複数可）によってあらかじめ固定した。いくつかの実施形態では、生体試料から水分を除去する変性特性を有する固定液（複数可）によって、試料をあらかじめ固定した。その他の実施形態では、生体試料の分子間に化学的結合を形成する、架橋性の固定液（複数可）によって、試料をあらかじめ固定した。いくつかの実施形態では、添加剤である固定液（複数可）によって、試料をあらかじめ固定した（すなわち、固定液（複数可）は、組織学的プロトコルの後続の工程において処理される、生体試料の一部となる）。その他の実施形態では、添加剤でない固定液（複数可）によって、試料をあらかじめ固定した（すなわち、固定液（複数可）は、一旦固定が実行され完了すると、組織学的プロトコルの後続の工程において生体試料から除去されることになる）。
【0067】
一実施形態では、エタノールによって試料をあらかじめ固定した。一実施形態では、メタノールによって試料をあらかじめ固定した。一実施形態では、アセトンによって試料をあらかじめ固定した。一実施形態では、酢酸によって試料をあらかじめ固定した。一実施形態では、塩化亜鉛によって試料をあらかじめ固定した。一実施形態では、硫酸亜鉛によって試料をあらかじめ固定した。一実施形態では、ピクリン酸によって試料をあらかじめ固定した。一実施形態では、ホルムアルデヒドによって試料をあらかじめ固定した。一実施形態では、グルタルアルデヒドによって試料をあらかじめ固定した。一実施形態では、四酸化オスミウムによって試料をあらかじめ固定した。いくつかの特定の実施形態では、カルボジイミドによって試料をあらかじめ固定した。いくつかの特定の実施形態では、ジイミドエステルによって試料をあらかじめ固定した。一実施形態では、クロロ－ｓ－トリアジド（塩化シアヌル）によって試料をあらかじめ固定した。いくつかの特定の実施形態では、ジイソシアネートによって試料をあらかじめ固定した。一実施形態では、ジエチルピロカルボネート（ＤＰＣ）によって試料をあらかじめ固定した。いくつかの特定の実施形態では、マレイミドによって試料をあらかじめ固定した。一実施形態では、ベンゾキノンによって試料をあらかじめ固定した。一実施形態では、塩化水銀によって試料をあらかじめ固定した。一実施形態では、二クロム酸カリウムによって試料をあらかじめ固定した。一実施形態では、過マンガン酸カリウムによって試料をあらかじめ固定した。一実施形態では、クロム酸によって試料をあらかじめ固定した。
【0068】
一実施形態では、ピクリン酸、ホルムアルデヒド、及び酢酸の溶液であるＢｏｕｉｎ固定液によって、試料をあらかじめ固定した。一実施形態では、エタノール及び酢酸の溶液であるＣｌａｒｋｅ固定液によって、試料をあらかじめ固定した。一実施形態では、エタノール、クロロホルム、及び酢酸の溶液であるＣａｒｎｏｙ固定液によって、試料をあらかじめ固定した。一実施形態では、ホルムアルデヒド及びグルタルアルデヒドの混合物溶液によって、試料をあらかじめ固定した。一実施形態では、エタノール、酢酸、及びホルムアルデヒドの溶液であるＦＡＡによって、試料をあらかじめ固定した。一実施形態では、パラホルムアルデヒド、Ｌリジン、及びＩＮａＯ４の溶液である過ヨウ素酸－リジン－パラホルムアルデヒド（ＰＬＰ）によって、試料をあらかじめ固定した。一実施形態では、リン酸緩衝ホルマリン（ＰＢＦ）によって、試料をあらかじめ固定した。一実施形態では、ホルムアルデヒド及び塩化カルシウムの溶液であるホルマール・カルシウムによって、試料をあらかじめ固定した。一実施形態では、ホルムアルデヒド及び塩化ナトリウムの溶液であるホルマール・生理食塩水液によって、試料をあらかじめ固定した。一実施形態では、ホルムアルデヒド及び硫酸亜鉛の溶液である亜鉛ホルマリンによって、試料をあらかじめ固定した。一実施形態では、塩化水銀、二クロム酸カリウム、及び氷酢酸の溶液であるＺｅｎｋｅｒ固定液によって、試料をあらかじめ固定した。一実施形態では、ホルムアルデヒド、二クロム酸カリウム、硫酸ナトリウム、及び塩化水銀の溶液であるＨｅｌｌｙ固定液によって、試料をあらかじめ固定した。一実施形態では、Ｂ－５固定液、ｃ塩化水銀（ｃ ｍｅｒｃｕｒｉｃ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）及び酢酸ナトリウムによって、試料をあらかじめ固定した。一実施形態では、ホルムアルデヒド、酢酸銅、ピクリン酸、及び酢酸の溶液であるＨｏｌｌａｎｄｅ固定液によって、試料をあらかじめ固定した。一実施形態では、ホルムアルデヒド、エタノール、ピクリン酸、及び氷酢酸の溶液であるＧｅｎｄｒｅ溶液によって、試料をあらかじめ固定した。一実施形態では、メタノール、クロロホルム、及び氷酢酸の溶液であるＭｅｔｈａｃａｒｎ固定液によって、試料をあらかじめ固定した。一実施形態では、ホルムアルデヒド、エタノール、及び酢酸カルシウムの溶液であるアルコール・ホルマリンによって、試料をあらかじめ固定した。一実施形態では、ホルムアルデヒド、氷酢酸、及びエタノールの溶液であるホルモール酢酸アルコールによって、試料をあらかじめ固定した。
【0069】
いくつかの実施形態では、エタノール、メタノール、アセトン、酢酸、塩化亜鉛、硫酸亜鉛、ピクリン酸、四酸化オスミウム、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、ジイミドエステル、クロロ－ｓ－トリアジド（塩化シアヌル）、ジイソシアネート、ジエチルピロカルボネート（ＤＰＣ）、マレイミド、ベンゾキノン、塩化水銀、二クロム酸カリウム、過マンガン酸カリウム及びクロム酸を含む一覧から選択される、２、３、４、または５種以上の固定液の混合物溶液によって、試料をあらかじめ固定した。
【0070】
いくつかの実施形態では、同時ではないが、逐次的に適用される２種以上の固定液によって、試料をあらかじめ固定した。２種以上の固定液は、エタノール、メタノール、アセトン、酢酸、塩化亜鉛、硫酸亜鉛、ピクリン酸、四酸化オスミウム、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、ジイミドエステル、クロロ－ｓ－トリアジド（塩化シアヌル）、ジイソシアネート、ジエチルピロカルボネート（ＤＰＣ）、マレイミド、ベンゾキノン、塩化水銀、二クロム酸カリウム、過マンガン酸カリウム及びクロム酸を含む一覧から選択される。
【0071】
いくつかの実施形態では、核酸を保存するのに好適な固定液（複数可）によって、試料をあらかじめ固定した。一実施形態では、固定液は、ＦｉｎｅＦｉｘ（Ｋｏｔｈｍａｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．１３５：７４４－７５２，２０１１参照）である。一実施形態では、固定液は、Ｇｌｙｏ－ｆｉｘ（Ｌｙｋｉｄｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３５：ｅ８５，２００７参照）である。一実施形態では、固定液は、Ｈｉｓｔｏｃｈｏｉｃｅ（Ｖｉｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐａｔｈｏｌ．１５：１１９－１２９，１９９７参照）である。一実施形態では、固定液は、ＨＯＰＥ（Ｋｏｔｈｍａｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．１３５：７４４－７５２，２０１１参照）である。一実施形態では、固定液は、Ｎｅｏ－Ｆｉｘ（Ｐａａｖｉｌａｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．：Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．５８：２３７－２４６，２０１０参照）である。一実施形態では、固定液は、ＰＡＸｇｅｎｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｎｉｅｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．４６１：２５９－２６９，２０１２参照）である。一実施形態では、固定液は、ＲＣＬ２（ｖａｎ Ｅｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．６３：１０９０－１０９４，２０１０参照）である。一実施形態では、固定液は、Ｓｔｒｅｃｋ’ｓ Ｔｉｓｓｕｅ Ｆｉｘａｔｉｖｅ（Ｂｕｒｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．５７：２５７－２６４，２００９参照）である。一実施形態では、固定液は、ＵＭＦＩＸ（Ｎａｄｊｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｍｏｒｐｈｏｌ．１３：２７７－２８２，２００５参照）である。一実施形態では、固定液は、Ｚ７（Ｌｙｋｉｄｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３５：ｅ８５，２００７参照）である。一実施形態では、固定液は、ＺＢＦ（Ｐａａｖｉｌａｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．：Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．５８：２３７－２４６，２０１０参照）である。
【0072】
本明細書にて提供される、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用の生体試料を調製する方法は、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの前に、あらかじめ固定した試料に、アルデヒド含有固定液（複数可）を適用することを含む。一実施形態では、アルデヒド含有固定液はホルムアルデヒドを含む。一実施形態では、アルデヒド含有固定液はグルタルアルデヒドを含む。一実施形態では、アルデヒド含有固定液は、ピクリン酸、ホルムアルデヒド、及び酢酸の溶液である、Ｂｏｕｉｎ固定液を含む。一実施形態では、アルデヒド含有固定液は、ホルムアルデヒド及びグルタルアルデヒドの混合物を含む。一実施形態では、アルデヒド含有固定液は、エタノール、酢酸、及びホルムアルデヒドの溶液である、ＦＡＡを含む。一実施形態では、アルデヒド含有固定液は、パラホルムアルデヒド、Ｌリジン及びＩＮａＯ４の溶液である、過ヨウ素酸－リジン－パラホルムアルデヒド（ＰＬＰ）を含む。一実施形態では、アルデヒド含有固定液は、リン酸緩衝ホルマリン（ＰＢＦ）を含む。一実施形態では、アルデヒド含有固定液は、ホルムアルデヒド及び塩化カルシウムの溶液である、ホルマール・カルシウムを含む。一実施形態では、アルデヒド含有固定液は、ホルムアルデヒド及び塩化ナトリウムの溶液である、ホルマール生理食塩水液を含む。一実施形態では、アルデヒド含有固定液は、ホルムアルデヒド及び硫酸亜鉛の溶液である、亜鉛ホルマリンを含む。一実施形態では、アルデヒド含有固定液は、ホルムアルデヒド、二クロム酸カリウム、硫酸ナトリウム、及び塩化水銀の溶液である、Ｈｅｌｌｙ固定液を含む。一実施形態では、アルデヒド含有固定液は、ホルムアルデヒド、酢酸銅、ピクリン酸、及び酢酸の溶液である、Ｈｏｌｌａｎｄｅ固定液を含む。一実施形態では、アルデヒド含有固定液は、ホルムアルデヒド、エタノール、ピクリン酸、及び氷酢酸の溶液である、Ｇｅｎｄｒｅ溶液を含む。一実施形態では、アルデヒド含有固定液は、ホルムアルデヒド、エタノール、及び酢酸カルシウムの溶液である、アルコール・ホルマリンを含む。一実施形態では、アルデヒド含有固定液は、ホルムアルデヒド、氷酢酸、及びエタノールの溶液である、ホルモール酢酸アルコールを含む。一実施形態では、アルデヒド含有固定液は固定液の混合物を含み、混合物の少なくとも１種の固定液は、ホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒドである。一実施形態では、アルデヒド含有固定液は、同時に使用されないが逐次的に使用される固定液を含み、少なくとも１種の固定液は、ホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒドである。
【0073】
いくつかの実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約５％～約５０％のホルムアルデヒドを含む。いくつかの実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約１０％～約４０％のホルムアルデヒドを含む。いくつかの実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約１２％～約３７％のホルムアルデヒドを含む。
【0074】
いくつかの実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約５％のホルムアルデヒドを含む。いくつかの実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約６％のホルムアルデヒドを含む。いくつかの実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約７％のホルムアルデヒドを含む。いくつかの実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約８％のホルムアルデヒドを含む。いくつかの実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約９％のホルムアルデヒドを含む。いくつかの実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約１０％のホルムアルデヒドを含む。いくつかの実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約１１％のホルムアルデヒドを含む。いくつかの実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約１２％のホルムアルデヒドを含む。いくつかの実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約１３％のホルムアルデヒドを含む。いくつかの実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約１４％のホルムアルデヒドを含む。いくつかの実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約１５％のホルムアルデヒドを含む。いくつかの実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約１６％のホルムアルデヒドを含む。いくつかの実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約１７％のホルムアルデヒドを含む。いくつかの実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約１８％のホルムアルデヒドを含む。いくつかの実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約１９％のホルムアルデヒドを含む。いくつかの実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約２０％のホルムアルデヒドを含む。いくつかの実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約３０％のホルムアルデヒドを含む。いくつかの実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約３５％のホルムアルデヒドを含む。いくつかの実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約４０％のホルムアルデヒドを含む。いくつかの実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約５０％のホルムアルデヒドを含む。
【0075】
いくつかの実施形態では、試料は、アルデヒド含有固定液で約２時間～約３０時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、アルデヒド含有固定液で約２時間～約２５時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、アルデヒド含有固定液で約２時間～約２０時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、アルデヒド含有固定液で約２時間～約１８時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、アルデヒド含有固定液で約２時間～約１５時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、アルデヒド含有固定液で約２時間～約１０時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、アルデヒド含有固定液で約２時間～約５時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、アルデヒド含有固定液で約２時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、アルデヒド含有固定液で約３時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、アルデヒド含有固定液で約４時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、アルデヒド含有固定液で約５時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、アルデヒド含有固定液で約６時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、アルデヒド含有固定液で約７時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、アルデヒド含有固定液で約８時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、アルデヒド含有固定液で約９時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、アルデヒド含有固定液で約１０時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、アルデヒド含有固定液で約１１時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、アルデヒド含有固定液で約１２時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、アルデヒド含有固定液で約１３時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、アルデヒド含有固定液で約１４時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、アルデヒド含有固定液で約１５時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、アルデヒド含有固定液で約１６時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、アルデヒド含有固定液で約１７時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、アルデヒド含有固定液で約１８時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、アルデヒド含有固定液で約１９時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、アルデヒド含有固定液で約２０時間処理する。
【0076】
いくつかの実施形態では、試料は、ホルムアルデヒドで約２時間～約３０時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、ホルムアルデヒドで約２時間～約２５時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、ホルムアルデヒドで約２時間～約２０時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、ホルムアルデヒドで約２時間～約１８時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、ホルムアルデヒドで約２時間～約１５時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、ホルムアルデヒドで約２時間～約１０時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、ホルムアルデヒドで約２時間～約５時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、ホルムアルデヒドで約２時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、ホルムアルデヒドで約３時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、ホルムアルデヒドで約４時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、ホルムアルデヒドで約５時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、ホルムアルデヒドで約６時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、ホルムアルデヒドで約７時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、ホルムアルデヒドで約８時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、ホルムアルデヒドで約９時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、ホルムアルデヒドで約１０時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、ホルムアルデヒドで約１１時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、ホルムアルデヒドで約１２時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、ホルムアルデヒドで約１３時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、ホルムアルデヒドで約１４時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、ホルムアルデヒドで約１５時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、ホルムアルデヒドで約１６時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、ホルムアルデヒドで約１７時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、ホルムアルデヒドで約１８時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、ホルムアルデヒドで約１９時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、ホルムアルデヒドで約２０時間処理する。
【0077】
いくつかの特定の実施形態では、試料は、約１２％未満のホルムアルデヒドを含むアルデヒド含有固定液で、約１５時間を超えて処理する。いくつかの特定の実施形態では、試料は、約１２％未満のホルムアルデヒドを含むアルデヒド含有固定液で、約１８時間処理する。いくつかの特定の実施形態では、試料は、約１２％未満のホルムアルデヒドを含むアルデヒド含有固定液で、約１９時間処理する。いくつかの特定の実施形態では、試料は、約１２％未満のホルムアルデヒドを含むアルデヒド含有固定液で、約２０時間処理する。いくつかの特定の実施形態では、試料は、約１２％未満のホルムアルデヒドを含むアルデヒド含有固定液で、約２５時間処理する。
【0078】
その他の特定の実施形態では、試料は、約１２％以上のホルムアルデヒドを含むアルデヒド含有固定液で、約１０時間未満処理する。その他の特定の実施形態では、試料は、約１２％以上のホルムアルデヒドを含むアルデヒド含有固定液で、約１０時間処理する。その他の特定の実施形態では、試料は、約１２％以上のホルムアルデヒドを含むアルデヒド含有固定液で、約９時間処理する。その他の特定の実施形態では、試料は、約１２％以上のホルムアルデヒドを含むアルデヒド含有固定液で、約８時間処理する。その他の特定の実施形態では、試料は、約１２％以上のホルムアルデヒドを含むアルデヒド含有固定液で、約７時間処理する。その他の特定の実施形態では、試料は、約１２％以上のホルムアルデヒドを含むアルデヒド含有固定液で、約６時間処理する。その他の特定の実施形態では、試料は、約１２％以上のホルムアルデヒドを含むアルデヒド含有固定液で、約５時間処理する。その他の特定の実施形態では、試料は、約１２％以上のホルムアルデヒドを含むアルデヒド含有固定液で、約４時間処理する。その他の特定の実施形態では、試料は、約１２％以上のホルムアルデヒドを含むアルデヒド含有固定液で、約３時間処理する。その他の特定の実施形態では、試料は、約１２％以上のホルムアルデヒドを含むアルデヒド含有固定液で、約２時間処理する。
【0079】
いくつかの特定の実施形態では、アルデヒド含有固定液は、ｐＨ約６の緩衝液中にある。いくつかの特定の実施形態では、アルデヒド含有固定液は、ｐＨ約６．５の緩衝液中にある。いくつかの特定の実施形態では、アルデヒド含有固定液は、ｐＨ約７の緩衝液中にある。いくつかの特定の実施形態では、アルデヒド含有固定液は、ｐＨ約７．５の緩衝液中にある。いくつかの特定の実施形態では、アルデヒド含有固定液は、ｐＨ約８の緩衝液中にある。いくつかの特定の実施形態では、アルデヒド含有固定液は、ｐＨ約８．５の緩衝液中にある。いくつかの特定の実施形態では、アルデヒド含有固定液は、ｐＨ約９の緩衝液中にある。
【0080】
いくつかの実施形態では、固定は、約４～５０℃の温度で実施する。いくつかの実施形態では、固定は、約４℃の温度で実施する。いくつかの実施形態では、固定は、約１０℃の温度で実施する。いくつかの実施形態では、固定は、約２０℃の温度で実施する。いくつかの実施形態では、固定は、約２５℃の温度で実施する。いくつかの実施形態では、固定は、約３０℃の温度で実施する。いくつかの実施形態では、固定は、約４０℃の温度で実施する。いくつかの実施形態では、固定は、約５０℃の温度で実施する。いくつかの実施形態では、固定は、周囲温度で実施する。
【0081】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、あらかじめ固定した試料をアルデヒド含有固定液で処理することを含み、アルデヒド含有固定液はｐＨ約６の等張緩衝液中にあり、アルデヒド含有固定液のアルデヒドのパーセンテージは約１２％に等しい、またはより高く、固定は約４℃の温度で実施する。一実施形態では、固定は約１時間続く。一実施形態では、固定は約１．５時間続く。一実施形態では、固定は約２時間続く。一実施形態では、固定は約２．５時間続く。一実施形態では、固定は約３時間続く。一実施形態では、固定は約３．５時間続く。一実施形態では、固定は約４時間続く。
【0082】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、あらかじめ固定した試料をアルデヒド含有固定液で処理することを含み、アルデヒド含有固定液はｐＨ約７の等張緩衝液中にあり、アルデヒド含有固定液のアルデヒドのパーセンテージは約１２％に等しい、またはより高く、固定は約４℃の温度で実施する。一実施形態では、固定は約１時間続く。一実施形態では、固定は約１．５時間続く。一実施形態では、固定は約２時間続く。一実施形態では、固定は約２．５時間続く。一実施形態では、固定は約３時間続く。一実施形態では、固定は約３．５時間続く。一実施形態では、固定は約４時間続く。
【0083】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、あらかじめ固定した試料をアルデヒド含有固定液で処理することを含み、アルデヒド含有固定液はｐＨ約８の等張緩衝液中にあり、アルデヒド含有固定液のアルデヒドのパーセンテージは約１２％に等しい、またはより高く、固定は約４℃の温度で実施する。一実施形態では、固定は約１時間続く。一実施形態では、固定は約１．５時間続く。一実施形態では、固定は約２時間続く。一実施形態では、固定は約２．５時間続く。一実施形態では、固定は約３時間続く。一実施形態では、固定は約３．５時間続く。一実施形態では、固定は約４時間続く。
【0084】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、あらかじめ固定した試料をアルデヒド含有固定液で処理することを含み、アルデヒド含有固定液はｐＨ約６の等張緩衝液中にあり、アルデヒド含有固定液のアルデヒドのパーセンテージは約１２％に等しい、またはより高く、固定は周囲温度で実施する。一実施形態では、固定は約１時間続く。一実施形態では、固定は約１．５時間続く。一実施形態では、固定は約２時間続く。一実施形態では、固定は約２．５時間続く。一実施形態では、固定は約３時間続く。一実施形態では、固定は約３．５時間続く。一実施形態では、固定は約４時間続く。
【0085】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、あらかじめ固定した試料をアルデヒド含有固定液で処理することを含み、アルデヒド含有固定液はｐＨ約７の等張緩衝液中にあり、アルデヒド含有固定液のアルデヒドのパーセンテージは約１２％に等しい、またはより高く、固定は周囲温度で実施する。一実施形態では、固定は約１時間続く。一実施形態では、固定は約１．５時間続く。一実施形態では、固定は約２時間続く。一実施形態では、固定は約２．５時間続く。一実施形態では、固定は約３時間続く。一実施形態では、固定は約３．５時間続く。一実施形態では、固定は約４時間続く。
【0086】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、あらかじめ固定した試料をアルデヒド含有固定液で処理することを含み、アルデヒド含有固定液はｐＨ約８の等張緩衝液中にあり、アルデヒド含有固定液のアルデヒドのパーセンテージは約１２％に等しい、またはより高く、固定は周囲温度で実施する。一実施形態では、固定は約１時間続く。一実施形態では、固定は約１．５時間続く。一実施形態では、固定は約２時間続く。一実施形態では、固定は約２．５時間続く。一実施形態では、固定は約３時間続く。一実施形態では、固定は約３．５時間続く。一実施形態では、固定は約４時間続く。
【0087】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、あらかじめ固定した試料をアルデヒド含有固定液で処理することを含み、アルデヒド含有固定液はｐＨ約６の等張緩衝液中にあり、アルデヒド含有固定液のアルデヒドのパーセンテージは約１２％に等しい、またはより高く、固定は約５０℃の温度で実施する。一実施形態では、固定は約１時間続く。一実施形態では、固定は約１．５時間続く。一実施形態では、固定は約２時間続く。一実施形態では、固定は約２．５時間続く。一実施形態では、固定は約３時間続く。一実施形態では、固定は約３．５時間続く。一実施形態では、固定は約４時間続く。
【0088】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、あらかじめ固定した試料をアルデヒド含有固定液で処理することを含み、アルデヒド含有固定液はｐＨ約７の等張緩衝液中にあり、アルデヒド含有固定液のアルデヒドのパーセンテージは約１２％に等しい、またはより高く、固定は約５０℃の温度で実施する。一実施形態では、固定は約１時間続く。一実施形態では、固定は約１．５時間続く。一実施形態では、固定は約２時間続く。一実施形態では、固定は約２．５時間続く。一実施形態では、固定は約３時間続く。一実施形態では、固定は約３．５時間続く。一実施形態では、固定は約４時間続く。
【0089】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、あらかじめ固定した試料をアルデヒド含有固定液で処理することを含み、アルデヒド含有固定液はｐＨ約８の等張緩衝液中にあり、アルデヒド含有固定液のアルデヒドのパーセンテージは約１２％に等しい、またはより高く、固定は約５０℃の温度で実施する。一実施形態では、固定は約１時間続く。一実施形態では、固定は約１．５時間続く。一実施形態では、固定は約２時間続く。一実施形態では、固定は約２．５時間続く。一実施形態では、固定は約３時間続く。一実施形態では、固定は約３．５時間続く。一実施形態では、固定は約４時間続く。
【0090】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、あらかじめ固定した試料をアルデヒド含有固定液で処理することを含み、アルデヒド含有固定液はｐＨ約６の等張緩衝液中にあり、アルデヒド含有固定液のアルデヒドのパーセンテージは約１２％未満であり、固定は約４℃の温度で実施する。一実施形態では、固定は約２時間続く。一実施形態では、固定は約３時間続く。一実施形態では、固定は約４時間続く。一実施形態では、固定は約５時間続く。一実施形態では、固定は約６時間続く。一実施形態では、固定は約７時間続く。一実施形態では、固定は約８時間続く。一実施形態では、固定は約９時間続く。一実施形態では、固定は約１０時間続く。一実施形態では、固定は約１１時間続く。一実施形態では、固定は約１２時間続く。一実施形態では、固定は約１３時間続く。一実施形態では、固定は約１４時間続く。一実施形態では、固定は約１５時間続く。一実施形態では、固定は約１６時間続く。一実施形態では、固定は約１６時間続く。一実施形態では、固定は約１７時間続く。一実施形態では、固定は約１８時間続く。一実施形態では、固定は約２４時間続く。一実施形態では、固定は約３６時間続く。一実施形態では、固定は約４８時間続く。
【0091】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、あらかじめ固定した試料をアルデヒド含有固定液で処理することを含み、アルデヒド含有固定液はｐＨ約７の等張緩衝液中にあり、アルデヒド含有固定液のアルデヒドのパーセンテージは約１２％未満であり、固定は約４℃の温度で実施する。一実施形態では、固定は約２時間続く。一実施形態では、固定は約３時間続く。一実施形態では、固定は約４時間続く。一実施形態では、固定は約５時間続く。一実施形態では、固定は約６時間続く。一実施形態では、固定は約７時間続く。一実施形態では、固定は約８時間続く。一実施形態では、固定は約９時間続く。一実施形態では、固定は約１０時間続く。一実施形態では、固定は約１１時間続く。一実施形態では、固定は約１２時間続く。一実施形態では、固定は約１３時間続く。一実施形態では、固定は約１４時間続く。一実施形態では、固定は約１５時間続く。一実施形態では、固定は約１６時間続く。一実施形態では、固定は約１６時間続く。一実施形態では、固定は約１７時間続く。一実施形態では、固定は約１８時間続く。一実施形態では、固定は約２４時間続く。一実施形態では、固定は約３６時間続く。一実施形態では、固定は約４８時間続く。
【0092】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、あらかじめ固定した試料をアルデヒド含有固定液で処理することを含み、アルデヒド含有固定液はｐＨ約８の等張緩衝液中にあり、アルデヒド含有固定液のアルデヒドのパーセンテージは約１２％未満であり、固定は約４℃の温度で実施する。一実施形態では、固定は約２時間続く。一実施形態では、固定は約３時間続く。一実施形態では、固定は約４時間続く。一実施形態では、固定は約５時間続く。一実施形態では、固定は約６時間続く。一実施形態では、固定は約７時間続く。一実施形態では、固定は約８時間続く。一実施形態では、固定は約９時間続く。一実施形態では、固定は約１０時間続く。一実施形態では、固定は約１１時間続く。一実施形態では、固定は約１２時間続く。一実施形態では、固定は約１３時間続く。一実施形態では、固定は約１４時間続く。一実施形態では、固定は約１５時間続く。一実施形態では、固定は約１６時間続く。一実施形態では、固定は約１６時間続く。一実施形態では、固定は約１７時間続く。一実施形態では、固定は約１８時間続く。一実施形態では、固定は約２４時間続く。一実施形態では、固定は約３６時間続く。一実施形態では、固定は約４８時間続く。
【0093】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、あらかじめ固定した試料をアルデヒド含有固定液で処理することを含み、アルデヒド含有固定液はｐＨ約６の等張緩衝液中にあり、アルデヒド含有固定液のアルデヒドのパーセンテージは約１２％未満であり、固定は周囲温度で実施する。一実施形態では、固定は約２時間続く。一実施形態では、固定は約３時間続く。一実施形態では、固定は約４時間続く。一実施形態では、固定は約５時間続く。一実施形態では、固定は約６時間続く。一実施形態では、固定は約７時間続く。一実施形態では、固定は約８時間続く。一実施形態では、固定は約９時間続く。一実施形態では、固定は約１０時間続く。一実施形態では、固定は約１１時間続く。一実施形態では、固定は約１２時間続く。一実施形態では、固定は約１３時間続く。一実施形態では、固定は約１４時間続く。一実施形態では、固定は約１５時間続く。一実施形態では、固定は約１６時間続く。一実施形態では、固定は約１６時間続く。一実施形態では、固定は約１７時間続く。一実施形態では、固定は約１８時間続く。一実施形態では、固定は約２４時間続く。一実施形態では、固定は約３６時間続く。一実施形態では、固定は約４８時間続く。
【0094】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、あらかじめ固定した試料をアルデヒド含有固定液で処理することを含み、アルデヒド含有固定液はｐＨ約７の等張緩衝液中にあり、アルデヒド含有固定液のアルデヒドのパーセンテージは約１２％未満であり、固定は周囲温度で実施する。一実施形態では、固定は約２時間続く。一実施形態では、固定は約３時間続く。一実施形態では、固定は約４時間続く。一実施形態では、固定は約５時間続く。一実施形態では、固定は約６時間続く。一実施形態では、固定は約７時間続く。一実施形態では、固定は約８時間続く。一実施形態では、固定は約９時間続く。一実施形態では、固定は約１０時間続く。一実施形態では、固定は約１１時間続く。一実施形態では、固定は約１２時間続く。一実施形態では、固定は約１３時間続く。一実施形態では、固定は約１４時間続く。一実施形態では、固定は約１５時間続く。一実施形態では、固定は約１６時間続く。一実施形態では、固定は約１６時間続く。一実施形態では、固定は約１７時間続く。一実施形態では、固定は約１８時間続く。一実施形態では、固定は約２４時間続く。一実施形態では、固定は約３６時間続く。一実施形態では、固定は約４８時間続く。
【0095】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、あらかじめ固定した試料をアルデヒド含有固定液で処理することを含み、アルデヒド含有固定液はｐＨ約８の等張緩衝液中にあり、アルデヒド含有固定液のアルデヒドのパーセンテージは約１２％未満であり、固定は周囲温度で実施する。一実施形態では、固定は約２時間続く。一実施形態では、固定は約３時間続く。一実施形態では、固定は約４時間続く。一実施形態では、固定は約５時間続く。一実施形態では、固定は約６時間続く。一実施形態では、固定は約７時間続く。一実施形態では、固定は約８時間続く。一実施形態では、固定は約９時間続く。一実施形態では、固定は約１０時間続く。一実施形態では、固定は約１１時間続く。一実施形態では、固定は約１２時間続く。一実施形態では、固定は約１３時間続く。一実施形態では、固定は約１４時間続く。一実施形態では、固定は約１５時間続く。一実施形態では、固定は約１６時間続く。一実施形態では、固定は約１６時間続く。一実施形態では、固定は約１７時間続く。一実施形態では、固定は約１８時間続く。一実施形態では、固定は約２４時間続く。一実施形態では、固定は約３６時間続く。一実施形態では、固定は約４８時間続く。
【0096】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、あらかじめ固定した試料をアルデヒド含有固定液で処理することを含み、アルデヒド含有固定液はｐＨ約６の等張緩衝液中にあり、アルデヒド含有固定液のアルデヒドのパーセンテージは約１２％未満であり、固定は約５０℃の温度で実施する。一実施形態では、固定は約２時間続く。一実施形態では、固定は約３時間続く。一実施形態では、固定は約４時間続く。一実施形態では、固定は約５時間続く。一実施形態では、固定は約６時間続く。一実施形態では、固定は約７時間続く。一実施形態では、固定は約８時間続く。一実施形態では、固定は約９時間続く。一実施形態では、固定は約１０時間続く。一実施形態では、固定は約１１時間続く。一実施形態では、固定は約１２時間続く。一実施形態では、固定は約１３時間続く。一実施形態では、固定は約１４時間続く。一実施形態では、固定は約１５時間続く。一実施形態では、固定は約１６時間続く。一実施形態では、固定は約１６時間続く。一実施形態では、固定は約１７時間続く。一実施形態では、固定は約１８時間続く。一実施形態では、固定は約２４時間続く。一実施形態では、固定は約３６時間続く。一実施形態では、固定は約４８時間続く。
【0097】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、あらかじめ固定した試料をアルデヒド含有固定液で処理することを含み、アルデヒド含有固定液はｐＨ約７の等張緩衝液中にあり、アルデヒド含有固定液のアルデヒドのパーセンテージは約１２％未満であり、固定は約５０℃の温度で実施する。一実施形態では、固定は約２時間続く。一実施形態では、固定は約３時間続く。一実施形態では、固定は約４時間続く。一実施形態では、固定は約５時間続く。一実施形態では、固定は約６時間続く。一実施形態では、固定は約７時間続く。一実施形態では、固定は約８時間続く。一実施形態では、固定は約９時間続く。一実施形態では、固定は約１０時間続く。一実施形態では、固定は約１１時間続く。一実施形態では、固定は約１２時間続く。一実施形態では、固定は約１３時間続く。一実施形態では、固定は約１４時間続く。一実施形態では、固定は約１５時間続く。一実施形態では、固定は約１６時間続く。一実施形態では、固定は約１６時間続く。一実施形態では、固定は約１７時間続く。一実施形態では、固定は約１８時間続く。一実施形態では、固定は約２４時間続く。一実施形態では、固定は約３６時間続く。一実施形態では、固定は約４８時間続く。
【0098】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、あらかじめ固定した試料をアルデヒド含有固定液で処理することを含み、アルデヒド含有固定液はｐＨ約８の等張緩衝液中にあり、アルデヒド含有固定液のアルデヒドのパーセンテージは約１２％未満であり、固定は約５０℃の温度で実施する。一実施形態では、固定は約２時間続く。一実施形態では、固定は約３時間続く。一実施形態では、固定は約４時間続く。一実施形態では、固定は約５時間続く。一実施形態では、固定は約６時間続く。一実施形態では、固定は約７時間続く。一実施形態では、固定は約８時間続く。一実施形態では、固定は約９時間続く。一実施形態では、固定は約１０時間続く。一実施形態では、固定は約１１時間続く。一実施形態では、固定は約１２時間続く。一実施形態では、固定は約１３時間続く。一実施形態では、固定は約１４時間続く。一実施形態では、固定は約１５時間続く。一実施形態では、固定は約１６時間続く。一実施形態では、固定は約１６時間続く。一実施形態では、固定は約１７時間続く。一実施形態では、固定は約１８時間続く。一実施形態では、固定は約２４時間続く。一実施形態では、固定は約３６時間続く。一実施形態では、固定は約４８時間続く。
【0099】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、あらかじめ固定した試料を、中性または中性に近いｐＨの等張緩衝液中で、約１２％に等しい、またはより高いホルムアルデヒドで処理することを含み、固定は周囲温度で実施する。一実施形態では、固定は約０．５時間続く。一実施形態では、固定は約１時間続く。一実施形態では、固定は約１．５時間続く。一実施形態では、固定は約２時間続く。一実施形態では、固定は約２．５時間続く。一実施形態では、固定は約３時間続く。一実施形態では、固定は約３．５時間続く。
【0100】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、あらかじめ固定した試料を、中性または中性に近いｐＨの等張緩衝液中で、約１２％未満のホルムアルデヒドで処理することを含み、固定は周囲温度で実施する。一実施形態では、固定は約１２時間続く。一実施形態では、固定は約１４時間続く。一実施形態では、固定は約１６時間続く。一実施形態では、固定は約１８時間続く。一実施形態では、固定は約２０時間続く。一実施形態では、固定は約２２時間続く。一実施形態では、固定は約２４時間続く。
【0101】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、あらかじめ固定した試料を、リン酸緩衝食塩水中で、約１２％のホルムアルデヒドで処理することを含み、固定は周囲温度で実施する。一実施形態では、固定は約１時間続く。一実施形態では、固定は約１．５時間続く。一実施形態では、固定は約２時間続く。一実施形態では、固定は約２．５時間続く。一実施形態では、固定は約３時間続く。一実施形態では、固定は約３．５時間続く。
【0102】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、あらかじめ固定した試料を、リン酸緩衝食塩水中で、約２４％のホルムアルデヒドで処理することを含み、固定は周囲温度で実施する。一実施形態では、固定は約１時間続く。一実施形態では、固定は約１．５時間続く。一実施形態では、固定は約２時間続く。一実施形態では、固定は約２．５時間続く。一実施形態では、固定は約３時間続く。一実施形態では、固定は約３．５時間続く。
【0103】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、あらかじめ固定した試料を、リン酸緩衝食塩水中で、約３７％のホルムアルデヒドで処理することを含み、固定は周囲温度で実施する。一実施形態では、固定は約１時間続く。一実施形態では、固定は約１．５時間続く。一実施形態では、固定は約２時間続く。一実施形態では、固定は約２．５時間続く。一実施形態では、固定は約３時間続く。一実施形態では、固定は約３．５時間続く。
【0104】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、あらかじめ固定した試料を約１０％中性緩衝ホルマリンで処理することを含み、固定は周囲温度で実施する。一実施形態では、固定は約１２時間続く。一実施形態では、固定は約１４時間続く。一実施形態では、固定は約１６時間続く。一実施形態では、固定は約１８時間続く。一実施形態では、固定は約２０時間続く。一実施形態では、固定は約２２時間続く。一実施形態では、固定は約２４時間続く。
【0105】
その他の実施形態では、本明細書において、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用の生体試料を調製する方法であって、薬剤で生体試料を固定することを含む第１の固定工程と、第１の固定工程の後であり、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション前に、アルデヒド含有固定液で生体試料を固定することを含む後固定工程と、を含む方法が提供される。
【0106】
いくつかの実施形態では、第１の固定工程は物理的固定である。一実施形態では、第１の固定工程は加熱である。一実施形態では、第１の固定工程はマイクロ波への曝露である。一実施形態では、第１の固定工程は凍結保存または凍結乾燥である。その他の実施形態では、第１の固定工程は、固定液（複数可）を用いた化学的固定である。いくつかの実施形態では、第１の固定工程は、固定液（複数可）中に生体試料を浸漬することによる化学的固定である。いくつかの実施形態では、第１の固定工程は、固定液（複数可）を用いて生体試料を灌流することによる化学的固定である。いくつかの実施形態では、第１の固定工程は、蒸気状の固定液（複数可）を生体試料に適用することによる化学的固定である。
【0107】
いくつかの実施形態では、第１の固定工程は、凝固性の固定液（複数可）を用いた化学的固定である。その他の実施形態では、第１の固定工程は、非凝固性の固定液（複数可）を用いた化学的固定である。いくつかの実施形態では、第１の固定工程は、生体試料から水分を除去する変性特性を有する固定液（複数可）を用いた化学的固定である。その他の実施形態では、第１の固定工程は、生体試料の分子間に化学的結合を形成する、架橋性の固定液（複数可）を用いた化学的固定である。いくつかの実施形態では、第１の固定工程は、添加剤である固定液（複数可）を用いた化学的固定である（すなわち、固定液（複数可）は、組織学的プロトコルの後続の工程において処理される、生体試料の一部となる）。その他の実施形態では、第１の固定工程は、添加剤でない固定液（複数可）を用いた化学的固定である（すなわち、固定液（複数可）は、一旦固定が実行され完了すると、組織学的プロトコルの後続の工程において生体試料から除去されることになる）。
【0108】
一実施形態では、第１の固定工程は、エタノールによる化学的固定である。一実施形態では、第１の固定工程は、メタノールによる化学的固定である。一実施形態では、第１の固定工程は、アセトンによる化学的固定である。一実施形態では、第１の固定工程は、酢酸による化学的固定である。一実施形態では、第１の固定工程は、塩化亜鉛による化学的固定である。一実施形態では、第１の固定工程は、硫酸亜鉛による化学的固定である。一実施形態では、第１の固定工程は、ピクリン酸による化学的固定である。一実施形態では、第１の固定工程は、ホルムアルデヒドによる化学的固定である。一実施形態では、第１の固定工程は、グルタルアルデヒドによる化学的固定である。一実施形態では、第１の固定工程は、四酸化オスミウムによる化学的固定である。いくつかの実施形態では、第１の固定工程は、カルボジイミドによる化学的固定である。いくつかの実施形態では、第１の固定工程は、ジイミドエステルによる化学的固定である。一実施形態では、第１の固定工程は、クロロ－ｓ－トリアジド（塩化シアヌル）による化学的固定である。いくつかの実施形態では、第１の固定工程は、ジイソシアネートによる化学的固定である。一実施形態では、第１の固定工程は、ジエチルピロカルボネート（ＤＰＣ）による化学的固定である。いくつかの実施形態では、第１の固定工程は、マレイミドによる化学的固定である。一実施形態では、第１の固定工程は、ベンゾキノンによる化学的固定である。一実施形態では、第１の固定工程は、塩化水銀による化学的固定である。一実施形態では、第１の固定工程は、二クロム酸カリウムによる化学的固定である。一実施形態では、第１の固定工程は、過マンガン酸カリウムによる化学的固定である。一実施形態では、第１の固定工程は、クロム酸による化学的固定である。
【0109】
一実施形態では、第１の固定工程は、ピクリン酸、ホルムアルデヒド、及び酢酸の溶液であるＢｏｕｉｎ固定液による化学的固定である。一実施形態では、第１の固定工程は、エタノール及び酢酸の溶液であるＣｌａｒｋｅ固定液による化学的固定である。一実施形態では、第１の固定工程は、エタノール、クロロホルム、及び酢酸の溶液であるＣａｒｎｏｙ固定液による化学的固定である。一実施形態では、第１の固定工程は、ホルムアルデヒド及びグルタルアルデヒドの混合物溶液による化学的固定である。一実施形態では、第１の固定工程は、エタノール、酢酸、及びホルムアルデヒドの溶液であるＦＡＡによる化学的固定である。一実施形態では、第１の固定工程は、パラホルムアルデヒド、Ｌリジン、及びＩＮａＯ４の溶液である過ヨウ素酸－リジン－パラホルムアルデヒド（ＰＬＰ）による化学的固定である。一実施形態では、第１の固定工程は、リン酸緩衝ホルマリン（ＰＢＦ）による化学的固定である。一実施形態では、第１の固定工程は、ホルムアルデヒド及び塩化カルシウムの溶液であるホルマール・カルシウムによる化学的固定である。一実施形態では、第１の固定工程は、ホルムアルデヒド及び塩化ナトリウムの溶液であるホルマール生理食塩水液による化学的固定である。一実施形態では、第１の固定工程は、ホルムアルデヒド及び硫酸亜鉛の溶液である、亜鉛ホルマリンによる化学的固定である。一実施形態では、第１の固定工程は、塩化水銀、二クロム酸カリウム、及び氷酢酸の溶液であるＺｅｎｋｅｒ固定液による化学的固定である。一実施形態では、第１の固定工程は、ホルムアルデヒド、二クロム酸カリウム、硫酸ナトリウム、及び塩化水銀の溶液であるＨｅｌｌｙ固定液による化学的固定である。一実施形態では、第１の固定工程は、Ｂ－５固定液、ｃ塩化水銀（ｃ ｍｅｒｃｕｒｉｃ ｃｈｌｏｒｉｄ）及び酢酸ナトリウムによる化学的固定である。一実施形態では、第１の固定工程は、ホルムアルデヒド、酢酸銅、ピクリン酸、及び酢酸の溶液である、Ｈｏｌｌａｎｄｅ固定液による化学的固定である。一実施形態では、第１の固定工程は、ホルムアルデヒド、エタノール、ピクリン酸、及び氷酢酸の溶液である、Ｇｅｎｄｒｅ溶液による化学的固定である。一実施形態では、第１の固定工程は、メタノール、クロロホルム、及び氷酢酸の溶液であるＭｅｔｈａｃａｒｎ固定液による化学的固定である。一実施形態では、第１の固定工程は、ホルムアルデヒド、エタノール、及び酢酸カルシウムの溶液であるアルコール・ホルマリンによる化学的固定である。一実施形態では、第１の固定工程は、ホルムアルデヒド、氷酢酸、及びエタノールの溶液であるホルモール酢酸アルコールによる化学的固定である。
【0110】
いくつかの実施形態では、第１の固定工程は、エタノール、メタノール、アセトン、酢酸、塩化亜鉛、硫酸亜鉛、ピクリン酸、四酸化オスミウム、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、ジイミドエステル、クロロ－ｓ－トリアジド（塩化シアヌル）、ジイソシアネート、ジエチルピロカルボネート（ＤＰＣ）、マレイミド、ベンゾキノン、塩化水銀、二クロム酸カリウム、過マンガン酸カリウム及びクロム酸を含む一覧から選択される、２、３、４、または５種以上の固定液の混合物溶液による化学的固定である。
【0111】
いくつかの実施形態では、第１の固定工程は、同時ではないが、逐次的に適用される２種以上の固定液による化学的固定である。２種以上の固定液は、エタノール、メタノール、アセトン、酢酸、塩化亜鉛、硫酸亜鉛、ピクリン酸、四酸化オスミウム、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、ジイミドエステル、クロロ－ｓ－トリアジド（塩化シアヌル）、ジイソシアネート、ジエチルピロカルボネート（ＤＰＣ）、マレイミド、ベンゾキノン、塩化水銀、二クロム酸カリウム、過マンガン酸カリウム及びクロム酸を含む一覧から選択される。
【0112】
いくつかの実施形態では、第１の固定工程は、核酸を保存するのに好適な固定液（複数可）による化学的固定である。一実施形態では、第１の固定工程は、ＦｉｎｅＦｉｘ（Ｋｏｔｈｍａｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．１３５：７４４－７５２，２０１１参照）による化学的固定である。一実施形態では、第１の固定工程は、Ｇｌｙｏ－ｆｉｘ（Ｌｙｋｉｄｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３５：ｅ８５，２００７参照）による化学的固定である。一実施形態では、第１の固定工程は、Ｈｉｓｔｏｃｈｏｉｃｅ（Ｖｉｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐａｔｈｏｌ．１５：１１９－１２９，１９９７参照）による化学的固定である。一実施形態では、第１の固定工程は、ＨＯＰＥ（Ｋｏｔｈｍａｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．１３５：７４４－７５２，２０１１参照）による化学的固定である。一実施形態では、第１の固定工程は、Ｎｅｏ－Ｆｉｘ（Ｐａａｖｉｌａｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．：Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．５８：２３７－２４６，２０１０参照）による化学的固定である。一実施形態では、第１の固定工程は、ＰＡＸｇｅｎｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｎｉｅｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．４６１：２５９－２６９，２０１２参照）による化学的固定である。一実施形態では、第１の固定工程は、ＲＣＬ２（ｖａｎ Ｅｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．６３：１０９０－１０９４，２０１０参照）による化学的固定である。一実施形態では、第１の固定工程は、Ｓｔｒｅｃｋ’ｓ Ｔｉｓｓｕｅ Ｆｉｘａｔｉｖｅ（Ｂｕｒｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．５７：２５７－２６４，２００９参照）による化学的固定である。一実施形態では、第１の固定工程は、ＵＭＦＩＸ（Ｎａｄｊｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｍｏｒｐｈｏｌ．１３：２７７－２８２，２００５参照）による化学的固定である。一実施形態では、第１の固定工程は、Ｚ７（Ｌｙｋｉｄｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３５：ｅ８５，２００７参照）による化学的固定である。一実施形態では、第１の固定工程は、ＺＢＦ（Ｐａａｖｉｌａｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．：Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．５８：２３７－２４６，２０１０参照）による化学的固定である。
【0113】
特定の実施形態では、本明細書で提供されるｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用の生体試料を調製する方法は、第１の固定工程の後であり、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション前の、アルデヒド含有固定液（複数可）による後固定工程を含む。一実施形態では、後固定工程は、ホルムアルデヒドによる化学的固定である。一実施形態では、後固定工程は、グルタルアルデヒドによる化学的固定である。一実施形態では、後固定工程は、ピクリン酸、ホルムアルデヒド、及び酢酸の溶液であるＢｏｕｉｎ固定液による化学的固定である。一実施形態では、後固定工程は、ホルムアルデヒド及びグルタルアルデヒドの混合物による化学的固定である。一実施形態では、後固定工程は、エタノール、酢酸、及びホルムアルデヒドの溶液であるＦＡＡによる化学的固定である。一実施形態では、後固定工程は、パラホルムアルデヒド、Ｌリジン、及びＩＮａＯ４の溶液である過ヨウ素酸－リジン－パラホルムアルデヒド（ＰＬＰ）による化学的固定である。一実施形態では、後固定工程は、リン酸緩衝ホルマリン（ＰＢＦ）による化学的固定である。一実施形態では、後固定工程は、ホルムアルデヒド及び塩化カルシウムの溶液であるホルマール・カルシウムによる化学的固定である。一実施形態では、後固定工程は、ホルムアルデヒド及び塩化ナトリウムの溶液であるホルマール生理食塩水液による化学的固定である。一実施形態では、後固定工程は、ホルムアルデヒド及び硫酸亜鉛の溶液である、亜鉛ホルマリンによる化学的固定である。一実施形態では、後固定工程は、ホルムアルデヒド、二クロム酸カリウム、硫酸ナトリウム、及び塩化水銀の溶液であるＨｅｌｌｙ固定液による化学的固定である。一実施形態では、後固定工程は、ホルムアルデヒド、酢酸銅、ピクリン酸、及び酢酸の溶液である、Ｈｏｌｌａｎｄｅ固定液による化学的固定である。一実施形態では、後固定工程は、ホルムアルデヒド、エタノール、ピクリン酸、及び氷酢酸の溶液である、Ｇｅｎｄｒｅ溶液による化学的固定である。一実施形態では、後固定工程は、ホルムアルデヒド、エタノール、及び酢酸カルシウムの溶液であるアルコール・ホルマリンによる化学的固定である。一実施形態では、後固定工程は、ホルムアルデヒド、氷酢酸、及びエタノールの溶液であるホルモール酢酸アルコールによる化学的固定である。一実施形態では、後固定工程は、固定液の混合物による化学的固定であり、混合物の少なくとも１種の固定液は、ホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒドである。一実施形態では、後固定工程は、同時に使用されないが逐次的に使用される固定液であり、少なくとも１種の固定液は、ホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒドである、固定液による化学的固定である。
【0114】
いくつかの実施形態では、アルデヒド含有固定液は、ホルムアルデヒドを含む。その他の実施形態では、アルデヒド含有固定液は、グルタルアルデヒドを含む。
【0115】
いくつかの実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約５％～約５０％のホルムアルデヒドを含む。いくつかの実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約１０％～約４０％のホルムアルデヒドを含む。いくつかの実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約１２％～約３７％のホルムアルデヒドを含む。
【0116】
いくつかの実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約５％のホルムアルデヒドを含む。いくつかの実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約６％のホルムアルデヒドを含む。いくつかの実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約７％のホルムアルデヒドを含む。いくつかの実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約８％のホルムアルデヒドを含む。いくつかの実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約９％のホルムアルデヒドを含む。いくつかの実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約１０％のホルムアルデヒドを含む。いくつかの実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約１１％のホルムアルデヒドを含む。いくつかの実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約１２％のホルムアルデヒドを含む。いくつかの実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約１３％のホルムアルデヒドを含む。いくつかの実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約１４％のホルムアルデヒドを含む。いくつかの実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約１５％のホルムアルデヒドを含む。いくつかの実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約１６％のホルムアルデヒドを含む。いくつかの実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約１７％のホルムアルデヒドを含む。いくつかの実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約１８％のホルムアルデヒドを含む。いくつかの実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約１９％のホルムアルデヒドを含む。いくつかの実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約２０％のホルムアルデヒドを含む。いくつかの実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約３０％のホルムアルデヒドを含む。いくつかの実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約３５％のホルムアルデヒドを含む。いくつかの実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約４０％のホルムアルデヒドを含む。いくつかの実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約５０％のホルムアルデヒドを含む。
【0117】
いくつかの実施形態では、試料は、後固定工程において、アルデヒド含有固定液で約２時間～約３０時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、後固定工程において、アルデヒド含有固定液で約２時間～約２５時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、後固定工程において、アルデヒド含有固定液で約２時間～約２０時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、後固定工程において、アルデヒド含有固定液で約２時間～約１８時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、後固定工程において、アルデヒド含有固定液で約２時間～約１５時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、後固定工程において、アルデヒド含有固定液で約２時間～約１０時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、後固定工程において、アルデヒド含有固定液で約２時間～約５時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、後固定工程において、アルデヒド含有固定液で約２時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、後固定工程において、アルデヒド含有固定液で約３時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、後固定工程において、アルデヒド含有固定液で約４時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、後固定工程において、アルデヒド含有固定液で約５時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、後固定工程において、アルデヒド含有固定液で約６時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、後固定工程において、アルデヒド含有固定液で約７時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、後固定工程において、アルデヒド含有固定液で約８時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、後固定工程において、アルデヒド含有固定液で約９時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、後固定工程において、アルデヒド含有固定液で約１０時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、後固定工程において、アルデヒド含有固定液で約１１時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、後固定工程において、アルデヒド含有固定液で約１２時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、後固定工程において、アルデヒド含有固定液で約１３時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、後固定工程において、アルデヒド含有固定液で約１４時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、後固定工程において、アルデヒド含有固定液で約１５時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、後固定工程において、アルデヒド含有固定液で約１６時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、後固定工程において、アルデヒド含有固定液で約１７時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、後固定工程において、アルデヒド含有固定液で約１８時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、後固定工程において、アルデヒド含有固定液で約１９時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、後固定工程において、アルデヒド含有固定液で約２０時間処理する。
【0118】
いくつかの実施形態では、試料は、後固定工程において、ホルムアルデヒドで約２時間～約３０時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、後固定工程において、ホルムアルデヒドで約２時間～約２５時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、後固定工程において、ホルムアルデヒドで約２時間～約２０時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、後固定工程において、ホルムアルデヒドで約２時間～約１８時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、後固定工程において、ホルムアルデヒドで約２時間～約１５時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、後固定工程において、ホルムアルデヒドで約２時間～約１０時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、後固定工程において、ホルムアルデヒドで約２時間～約５時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、後固定工程において、ホルムアルデヒドで約２時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、後固定工程において、ホルムアルデヒドで約３時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、後固定工程において、ホルムアルデヒドで約４時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、後固定工程において、ホルムアルデヒドで約５時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、後固定工程において、ホルムアルデヒドで約６時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、後固定工程において、ホルムアルデヒドで約７時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、後固定工程において、ホルムアルデヒドで約８時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、後固定工程において、ホルムアルデヒドで約９時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、後固定工程において、ホルムアルデヒドで約１０時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、後固定工程において、ホルムアルデヒドで約１１時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、後固定工程において、ホルムアルデヒドで約１２時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、後固定工程において、ホルムアルデヒドで約１３時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、後固定工程において、ホルムアルデヒドで約１４時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、後固定工程において、ホルムアルデヒドで約１５時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、後固定工程において、ホルムアルデヒドで約１６時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、後固定工程において、ホルムアルデヒドで約１７時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、後固定工程において、ホルムアルデヒドで約１８時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、後固定工程において、ホルムアルデヒドで約１９時間処理する。いくつかの実施形態では、試料は、後固定工程において、ホルムアルデヒドで約２０時間処理する。
【0119】
いくつかの特定の実施形態では、試料は、後固定工程において、約１２％未満のホルムアルデヒドを含むアルデヒド含有固定液で、１５時間を超えて処理する。いくつかの特定の実施形態では、試料は、後固定工程において、約１２％未満のホルムアルデヒドを含むアルデヒド含有固定液で、約１８時間処理する。いくつかの特定の実施形態では、試料は、後固定工程において、約１２％未満のホルムアルデヒドを含むアルデヒド含有固定液で、約１９時間処理する。いくつかの特定の実施形態では、試料は、後固定工程において、約１２％未満のホルムアルデヒドを含むアルデヒド含有固定液で、約２０時間処理する。いくつかの特定の実施形態では、試料は、後固定工程において、約１２％未満のホルムアルデヒドを含むアルデヒド含有固定液で、約２５時間処理する。
【0120】
その他の特定の実施形態では、試料は、後固定工程において、約１２％以上のホルムアルデヒドを含むアルデヒド含有固定液で、１０時間未満処理する。その他の特定の実施形態では、試料は、後固定工程において、約１２％以上のホルムアルデヒドを含むアルデヒド含有固定液で、約１０時間処理する。その他の特定の実施形態では、試料は、後固定工程において、約１２％以上のホルムアルデヒドを含むアルデヒド含有固定液で、約９時間処理する。その他の特定の実施形態では、試料は、後固定工程において、約１２％以上のホルムアルデヒドを含むアルデヒド含有固定液で、約８時間処理する。その他の特定の実施形態では、試料は、後固定工程において、約１２％以上のホルムアルデヒドを含むアルデヒド含有固定液で、約７時間処理する。その他の特定の実施形態では、試料は、後固定工程において、約１２％以上のホルムアルデヒドを含むアルデヒド含有固定液で、約６時間処理する。その他の特定の実施形態では、試料は、後固定工程において、約１２％以上のホルムアルデヒドを含むアルデヒド含有固定液で、約５時間処理する。その他の特定の実施形態では、試料は、後固定工程において、約１２％以上のホルムアルデヒドを含むアルデヒド含有固定液で、約４時間処理する。その他の特定の実施形態では、試料は、後固定工程において、約１２％以上のホルムアルデヒドを含むアルデヒド含有固定液で、約３時間処理する。その他の特定の実施形態では、試料は、後固定工程において、約１２％以上のホルムアルデヒドを含むアルデヒド含有固定液で、約２時間処理する。
【0121】
いくつかの特定の実施形態では、アルデヒド含有固定液は、ｐＨ約６の緩衝液中にある。いくつかの特定の実施形態では、アルデヒド含有固定液は、ｐＨ約６．５の緩衝液中にある。いくつかの特定の実施形態では、アルデヒド含有固定液は、ｐＨ約７の緩衝液中にある。いくつかの特定の実施形態では、アルデヒド含有固定液は、ｐＨ約７．５の緩衝液中にある。いくつかの特定の実施形態では、アルデヒド含有固定液は、ｐＨ約８の緩衝液中にある。いくつかの特定の実施形態では、アルデヒド含有固定液は、ｐＨ約８．５の緩衝液中にある。いくつかの特定の実施形態では、アルデヒド含有固定液は、ｐＨ約９の緩衝液中にある。
【0122】
いくつかの実施形態では、後固定工程は、約４～５０℃の温度で実施する。いくつかの実施形態では、後固定工程は、約４℃の温度で実施する。いくつかの実施形態では、後固定工程は、約１０℃の温度で実施する。いくつかの実施形態では、後固定工程は、約２０℃の温度で実施する。いくつかの実施形態では、後固定工程は、約２５℃の温度で実施する。いくつかの実施形態では、後固定工程は、約３０℃の温度で実施する。いくつかの実施形態では、後固定工程は、約４０℃の温度で実施する。いくつかの実施形態では、後固定工程は、約５０℃の温度で実施する。いくつかの実施形態では、後固定工程は、周囲温度で実施する。
【0123】
特定の実施形態では、本明細書にて提供されるｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用の生体試料を調製する方法は、アルデヒド含有固定液による後固定工程を含み、アルデヒド含有固定液はｐＨ約６の等張緩衝液中にあり、アルデヒド含有固定液のアルデヒドのパーセンテージは約１２％に等しい、またはより高く、後固定工程は約４℃の温度で実施する。一実施形態では、後固定工程は約１時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１．５時間続く。一実施形態では、後固定工程は約２時間続く。一実施形態では、後固定工程は約２．５時間続く。一実施形態では、後固定工程は約３時間続く。一実施形態では、後固定工程は約３．５時間続く。一実施形態では、後固定工程は約４時間続く。
【0124】
特定の実施形態では、本明細書にて提供されるｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用の生体試料を調製する方法は、アルデヒド含有固定液による後固定工程を含み、アルデヒド含有固定液はｐＨ約７の等張緩衝液中にあり、アルデヒド含有固定液のアルデヒドのパーセンテージは約１２％に等しい、またはより高く、後固定工程は約４℃の温度で実施する。一実施形態では、後固定工程は約１時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１．５時間続く。一実施形態では、後固定工程は約２時間続く。一実施形態では、後固定工程は約２．５時間続く。一実施形態では、後固定工程は約３時間続く。一実施形態では、後固定工程は約３．５時間続く。一実施形態では、後固定工程は約４時間続く。
【0125】
特定の実施形態では、本明細書にて提供されるｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用の生体試料を調製する方法は、アルデヒド含有固定液による後固定工程を含み、アルデヒド含有固定液はｐＨ約８の等張緩衝液中にあり、アルデヒド含有固定液のアルデヒドのパーセンテージは約１２％に等しい、またはより高く、後固定工程は約４℃の温度で実施する。一実施形態では、後固定工程は約１時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１．５時間続く。一実施形態では、後固定工程は約２時間続く。一実施形態では、後固定工程は約２．５時間続く。一実施形態では、後固定工程は約３時間続く。一実施形態では、後固定工程は約３．５時間続く。一実施形態では、後固定工程は約４時間続く。
【0126】
特定の実施形態では、本明細書にて提供されるｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用の生体試料を調製する方法は、アルデヒド含有固定液による後固定工程を含み、アルデヒド含有固定液はｐＨ約６の等張緩衝液中にあり、アルデヒド含有固定液のアルデヒドのパーセンテージは約１２％に等しい、またはより高く、後固定工程は周囲温度で実施する。一実施形態では、後固定工程は約１時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１．５時間続く。一実施形態では、後固定工程は約２時間続く。一実施形態では、後固定工程は約２．５時間続く。一実施形態では、後固定工程は約３時間続く。一実施形態では、後固定工程は約３．５時間続く。一実施形態では、後固定工程は約４時間続く。
【0127】
特定の実施形態では、本明細書にて提供されるｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用の生体試料を調製する方法は、アルデヒド含有固定液による後固定工程を含み、アルデヒド含有固定液はｐＨ約７の等張緩衝液中にあり、アルデヒド含有固定液のアルデヒドのパーセンテージは約１２％に等しい、またはより高く、後固定工程は周囲温度で実施する。一実施形態では、後固定工程は約１時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１．５時間続く。一実施形態では、後固定工程は約２時間続く。一実施形態では、後固定工程は約２．５時間続く。一実施形態では、後固定工程は約３時間続く。一実施形態では、後固定工程は約３．５時間続く。一実施形態では、後固定工程は約４時間続く。
【0128】
特定の実施形態では、本明細書にて提供されるｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用の生体試料を調製する方法は、アルデヒド含有固定液による後固定工程を含み、アルデヒド含有固定液はｐＨ約８の等張緩衝液中にあり、アルデヒド含有固定液のアルデヒドのパーセンテージは約１２％に等しい、またはより高く、後固定工程は周囲温度で実施する。一実施形態では、後固定工程は約１時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１．５時間続く。一実施形態では、後固定工程は約２時間続く。一実施形態では、後固定工程は約２．５時間続く。一実施形態では、後固定工程は約３時間続く。一実施形態では、後固定工程は約３．５時間続く。一実施形態では、後固定工程は約４時間続く。
【0129】
特定の実施形態では、本明細書にて提供されるｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用の生体試料を調製する方法は、アルデヒド含有固定液による後固定工程を含み、アルデヒド含有固定液はｐＨ約６の等張緩衝液中にあり、アルデヒド含有固定液のアルデヒドのパーセンテージは約１２％に等しい、またはより高く、後固定工程は約５０℃の温度で実施する。一実施形態では、後固定工程は約１時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１．５時間続く。一実施形態では、後固定工程は約２時間続く。一実施形態では、後固定工程は約２．５時間続く。一実施形態では、後固定工程は約３時間続く。一実施形態では、後固定工程は約３．５時間続く。一実施形態では、後固定工程は約４時間続く。
【0130】
特定の実施形態では、本明細書にて提供されるｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用の生体試料を調製する方法は、アルデヒド含有固定液による後固定工程を含み、アルデヒド含有固定液はｐＨ約７の等張緩衝液中にあり、アルデヒド含有固定液のアルデヒドのパーセンテージは約１２％に等しい、またはより高く、後固定工程は約５０℃の温度で実施する。一実施形態では、後固定工程は約１時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１．５時間続く。一実施形態では、後固定工程は約２時間続く。一実施形態では、後固定工程は約２．５時間続く。一実施形態では、後固定工程は約３時間続く。一実施形態では、後固定工程は約３．５時間続く。一実施形態では、後固定工程は約４時間続く。
【0131】
特定の実施形態では、本明細書にて提供されるｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用の生体試料を調製する方法は、アルデヒド含有固定液による後固定工程を含み、アルデヒド含有固定液はｐＨ約８の等張緩衝液中にあり、アルデヒド含有固定液のアルデヒドのパーセンテージは約１２％に等しい、またはより高く、後固定工程は約５０℃の温度で実施する。一実施形態では、後固定工程は約１時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１．５時間続く。一実施形態では、後固定工程は約２時間続く。一実施形態では、後固定工程は約２．５時間続く。一実施形態では、後固定工程は約３時間続く。一実施形態では、後固定工程は約３．５時間続く。一実施形態では、後固定工程は約４時間続く。
【0132】
特定の実施形態では、本明細書にて提供されるｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用の生体試料を調製する方法は、アルデヒド含有固定液による後固定工程を含み、アルデヒド含有固定液はｐＨ約６の等張緩衝液中にあり、アルデヒド含有固定液のアルデヒドのパーセンテージは約１２％未満であり、後固定工程は約４℃の温度で実施する。一実施形態では、後固定工程は約２時間続く。一実施形態では、後固定工程は約３時間続く。一実施形態では、後固定工程は約４時間続く。一実施形態では、後固定工程は約５時間続く。一実施形態では、後固定工程は約６時間続く。一実施形態では、後固定工程は約７時間続く。一実施形態では、後固定工程は約８時間続く。一実施形態では、後固定工程は約９時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１０時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１１時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１２時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１３時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１４時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１５時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１６時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１６時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１７時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１８時間続く。一実施形態では、後固定工程は約２４時間続く。一実施形態では、後固定工程は約３６時間続く。一実施形態では、後固定工程は約４８時間続く。
【0133】
特定の実施形態では、本明細書にて提供されるｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用の生体試料を調製する方法は、アルデヒド含有固定液による後固定工程を含み、アルデヒド含有固定液はｐＨ約７の等張緩衝液中にあり、アルデヒド含有固定液のアルデヒドのパーセンテージは約１２％未満であり、後固定工程は約４℃の温度で実施する。一実施形態では、後固定工程は約２時間続く。一実施形態では、後固定工程は約３時間続く。一実施形態では、後固定工程は約４時間続く。一実施形態では、後固定工程は約５時間続く。一実施形態では、後固定工程は約６時間続く。一実施形態では、後固定工程は約７時間続く。一実施形態では、後固定工程は約８時間続く。一実施形態では、後固定工程は約９時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１０時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１１時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１２時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１３時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１４時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１５時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１６時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１６時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１７時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１８時間続く。一実施形態では、後固定工程は約２４時間続く。一実施形態では、後固定工程は約３６時間続く。一実施形態では、後固定工程は約４８時間続く。
【0134】
特定の実施形態では、本明細書にて提供されるｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用の生体試料を調製する方法は、アルデヒド含有固定液による後固定工程を含み、アルデヒド含有固定液はｐＨ約８の等張緩衝液中にあり、アルデヒド含有固定液のアルデヒドのパーセンテージは約１２％未満であり、後固定工程は約４℃の温度で実施する。一実施形態では、後固定工程は約２時間続く。一実施形態では、後固定工程は約３時間続く。一実施形態では、後固定工程は約４時間続く。一実施形態では、後固定工程は約５時間続く。一実施形態では、後固定工程は約６時間続く。一実施形態では、後固定工程は約７時間続く。一実施形態では、後固定工程は約８時間続く。一実施形態では、後固定工程は約９時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１０時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１１時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１２時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１３時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１４時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１５時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１６時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１６時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１７時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１８時間続く。一実施形態では、後固定工程は約２４時間続く。一実施形態では、後固定工程は約３６時間続く。一実施形態では、後固定工程は約４８時間続く。
【0135】
特定の実施形態では、本明細書にて提供されるｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用の生体試料を調製する方法は、アルデヒド含有固定液による後固定工程を含み、アルデヒド含有固定液はｐＨ約６の等張緩衝液中にあり、アルデヒド含有固定液のアルデヒドのパーセンテージは約１２％未満であり、後固定工程は周囲温度で実施する。一実施形態では、後固定工程は約２時間続く。一実施形態では、後固定工程は約３時間続く。一実施形態では、後固定工程は約４時間続く。一実施形態では、後固定工程は約５時間続く。一実施形態では、後固定工程は約６時間続く。一実施形態では、後固定工程は約７時間続く。一実施形態では、後固定工程は約８時間続く。一実施形態では、後固定工程は約９時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１０時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１１時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１２時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１３時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１４時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１５時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１６時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１６時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１７時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１８時間続く。一実施形態では、後固定工程は約２４時間続く。一実施形態では、後固定工程は約３６時間続く。一実施形態では、後固定工程は約４８時間続く。
【0136】
特定の実施形態では、本明細書にて提供されるｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用の生体試料を調製する方法は、アルデヒド含有固定液による後固定工程を含み、アルデヒド含有固定液はｐＨ約７の等張緩衝液中にあり、アルデヒド含有固定液のアルデヒドのパーセンテージは約１２％未満であり、後固定工程は周囲温度で実施する。一実施形態では、後固定工程は約２時間続く。一実施形態では、後固定工程は約３時間続く。一実施形態では、後固定工程は約４時間続く。一実施形態では、後固定工程は約５時間続く。一実施形態では、後固定工程は約６時間続く。一実施形態では、後固定工程は約７時間続く。一実施形態では、後固定工程は約８時間続く。一実施形態では、後固定工程は約９時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１０時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１１時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１２時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１３時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１４時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１５時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１６時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１６時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１７時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１８時間続く。一実施形態では、後固定工程は約２４時間続く。一実施形態では、後固定工程は約３６時間続く。一実施形態では、後固定工程は約４８時間続く。
【0137】
特定の実施形態では、本明細書にて提供されるｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用の生体試料を調製する方法は、アルデヒド含有固定液による後固定工程を含み、アルデヒド含有固定液はｐＨ約８の等張緩衝液中にあり、アルデヒド含有固定液のアルデヒドのパーセンテージは約１２％未満であり、後固定工程は周囲温度で実施する。一実施形態では、後固定工程は約２時間続く。一実施形態では、後固定工程は約３時間続く。一実施形態では、後固定工程は約４時間続く。一実施形態では、後固定工程は約５時間続く。一実施形態では、後固定工程は約６時間続く。一実施形態では、後固定工程は約７時間続く。一実施形態では、後固定工程は約８時間続く。一実施形態では、後固定工程は約９時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１０時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１１時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１２時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１３時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１４時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１５時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１６時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１６時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１７時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１８時間続く。一実施形態では、後固定工程は約２４時間続く。一実施形態では、後固定工程は約３６時間続く。一実施形態では、後固定工程は約４８時間続く。
【0138】
特定の実施形態では、本明細書にて提供されるｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用の生体試料を調製する方法は、アルデヒド含有固定液による後固定工程を含み、アルデヒド含有固定液はｐＨ約６の等張緩衝液中にあり、アルデヒド含有固定液のアルデヒドのパーセンテージは約１２％未満であり、後固定工程は約５０℃の温度で実施する。一実施形態では、後固定工程は約２時間続く。一実施形態では、後固定工程は約３時間続く。一実施形態では、後固定工程は約４時間続く。一実施形態では、後固定工程は約５時間続く。一実施形態では、後固定工程は約６時間続く。一実施形態では、後固定工程は約７時間続く。一実施形態では、後固定工程は約８時間続く。一実施形態では、後固定工程は約９時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１０時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１１時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１２時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１３時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１４時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１５時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１６時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１６時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１７時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１８時間続く。一実施形態では、後固定工程は約２４時間続く。一実施形態では、後固定工程は約３６時間続く。一実施形態では、後固定工程は約４８時間続く。
【0139】
特定の実施形態では、本明細書にて提供されるｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用の生体試料を調製する方法は、アルデヒド含有固定液による後固定工程を含み、アルデヒド含有固定液はｐＨ約７の等張緩衝液中にあり、アルデヒド含有固定液のアルデヒドのパーセンテージは約１２％未満であり、後固定工程は約５０℃の温度で実施する。一実施形態では、後固定工程は約２時間続く。一実施形態では、後固定工程は約３時間続く。一実施形態では、後固定工程は約４時間続く。一実施形態では、後固定工程は約５時間続く。一実施形態では、後固定工程は約６時間続く。一実施形態では、後固定工程は約７時間続く。一実施形態では、後固定工程は約８時間続く。一実施形態では、後固定工程は約９時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１０時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１１時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１２時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１３時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１４時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１５時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１６時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１６時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１７時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１８時間続く。一実施形態では、後固定工程は約２４時間続く。一実施形態では、後固定工程は約３６時間続く。一実施形態では、後固定工程は約４８時間続く。
【0140】
特定の実施形態では、本明細書にて提供されるｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用の生体試料を調製する方法は、アルデヒド含有固定液による後固定工程を含み、アルデヒド含有固定液はｐＨ約８の等張緩衝液中にあり、アルデヒド含有固定液のアルデヒドのパーセンテージは約１２％未満であり、後固定工程は約５０℃の温度で実施する。一実施形態では、後固定工程は約２時間続く。一実施形態では、後固定工程は約３時間続く。一実施形態では、後固定工程は約４時間続く。一実施形態では、後固定工程は約５時間続く。一実施形態では、後固定工程は約６時間続く。一実施形態では、後固定工程は約７時間続く。一実施形態では、後固定工程は約８時間続く。一実施形態では、後固定工程は約９時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１０時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１１時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１２時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１３時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１４時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１５時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１６時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１６時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１７時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１８時間続く。一実施形態では、後固定工程は約２４時間続く。一実施形態では、後固定工程は約３６時間続く。一実施形態では、後固定工程は約４８時間続く。
【0141】
特定の実施形態では、本明細書にて提供されるｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用の生体試料を調製する方法は、中性または中性に近いｐＨの等張緩衝液中での、約１２％に等しい、またはより高いホルムアルデヒドによる後固定工程を含み、後固定工程は周囲温度で実施する。一実施形態では、後固定工程は約０．５時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１．５時間続く。一実施形態では、後固定工程は約２時間続く。一実施形態では、後固定工程は約２．５時間続く。一実施形態では、後固定工程は約３時間続く。一実施形態では、後固定工程は約３．５時間続く。
【0142】
特定の実施形態では、本明細書にて提供されるｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用の生体試料を調製する方法は、中性または中性に近いｐＨの等張緩衝液中での、約１２％未満のホルムアルデヒドによる後固定工程を含み、後固定工程は周囲温度で実施する。一実施形態では、後固定工程は約１２時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１４時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１６時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１８時間続く。一実施形態では、後固定工程は約２０時間続く。一実施形態では、後固定工程は約２２時間続く。一実施形態では、後固定工程は約２４時間続く。
【0143】
特定の実施形態では、本明細書にて提供されるｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用の生体試料を調製する方法は、リン酸緩衝食塩水中での、約１２％のホルムアルデヒドによる後固定工程を含み、後固定工程は周囲温度で実施する。一実施形態では、後固定工程は約１時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１．５時間続く。一実施形態では、後固定工程は約２時間続く。一実施形態では、後固定工程は約２．５時間続く。一実施形態では、後固定工程は約３時間続く。一実施形態では、後固定工程は約３．５時間続く。
【0144】
特定の実施形態では、本明細書にて提供されるｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用の生体試料を調製する方法は、リン酸緩衝食塩水中での、約２４％のホルムアルデヒドによる後固定工程を含み、後固定工程は周囲温度で実施する。一実施形態では、後固定工程は約１時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１．５時間続く。一実施形態では、後固定工程は約２時間続く。一実施形態では、後固定工程は約２．５時間続く。一実施形態では、後固定工程は約３時間続く。一実施形態では、後固定工程は約３．５時間続く。
【0145】
特定の実施形態では、本明細書にて提供されるｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用の生体試料を調製する方法は、リン酸緩衝食塩水中での、約３７％のホルムアルデヒドによる後固定工程を含み、後固定工程は周囲温度で実施する。一実施形態では、後固定工程は約１時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１．５時間続く。一実施形態では、後固定工程は約２時間続く。一実施形態では、後固定工程は約２．５時間続く。一実施形態では、後固定工程は約３時間続く。一実施形態では、後固定工程は約３．５時間続く。
【0146】
特定の実施形態では、本明細書にて提供されるｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用の生体試料を調製する方法は、１０％中性緩衝ホルマリンによる後固定工程を含み、後固定工程は周囲温度で実施する。一実施形態では、後固定工程は約１２時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１４時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１６時間続く。一実施形態では、後固定工程は約１８時間続く。一実施形態では、後固定工程は約２０時間続く。一実施形態では、後固定工程は約２２時間続く。一実施形態では、後固定工程は約２４時間続く。
【0147】
本明細書で提供される各種方法のいくつかの実施形態では、試料は、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用に調製した。いくつかの実施形態では、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、１００未満のヌクレオチドを含む標的核酸を検出するためのものである。いくつかの実施形態では、標的核酸は１５～１００のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は１５～８０のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は１５～６０のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は１５～５０のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は１５～４０のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は９０未満のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は８０未満のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は７０未満のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は６０未満のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は５０未満のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は４０未満のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は３０未満のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は２０未満のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は１６未満のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、ＤＮＡを検出するためのものである。いくつかの実施形態では、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、ＲＮＡを検出するためのものである。また、本明細書に提供される方法を使用して、より長い核酸、例えば１００、２００、３００、５００または１，０００以上のヌクレオチドを含む核酸を検出することもできる。
【0148】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される生体試料を調製する方法は、ＲＮＡのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用である。いくつかの実施形態では、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用の生体試料を調製する方法は、低分子ＲＮＡ種を検出するためのものである。一実施形態では、検出するＲＮＡのヌクレオチドは、１００未満である。一実施形態では、検出するＲＮＡのヌクレオチドは、５０未満である。一実施形態では、検出するＲＮＡのヌクレオチドは、４０未満である。一実施形態では、検出するＲＮＡのヌクレオチドは、１０～４０である。一実施形態では、検出するＲＮＡのヌクレオチドは、１５～４０である。一実施形態では、検出するＲＮＡのヌクレオチドは、３０～４０である。
【0149】
一実施形態では、本方法は、ｓｎｃＲＮＡを検出するためのものである。一実施形態では、本方法は、ｍｉＲＮＡを検出するためのものである。一実施形態では、本方法は、ｓｉＲＮＡを検出するためのものである。一実施形態では、本方法は、ｐｉＲＮＡを検出するためのものである。一実施形態では、本方法は、内因性のＲＮＡを検出するためのものである。別の実施形態では、本方法は、外因性のＲＮＡを検出するためのものである。ｓｎｃＲＮＡは、疾患医療処置の有益な治療として、臨床的に関連するモデル系で遺伝子発現を効率的に調節する能力を有することが明らかになっている（Ｗａｔｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２２６（２），３６５－３７９，２０１２、Ｓｃｈｏｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ Ｒｅｖｉｅｗ，９４，１０５６－１０７０，２０１７）。ｍｉＲＮＡは、天然に存在する低分子（約２２ヌクレオチド）制御性ＲＮＡ（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ＲＮＡ）であり、全ての多細胞生物、単細胞の藻類、及びいくつかのウイルス中に存在する（Ｍｏｌｎａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４４７（７１４８），２００７、Ｂａｒｔｅｌ，Ｃｅｌｌ，１７３，２０－５１，２０１８）。現在に至るまで、動物、植物及びウイルスからの１５，０００種を超えるｍｉＲＮＡが登録され（ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ）、多くが組織、細胞型、及び細胞状態に特異的な様式で発現した。ｍｉＲＮＡ発現の制御不全は、重篤な状態、例えば神経障害、不妊症、免疫不全またはがんをもたらし得る。
【0150】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、天然に存在する低分子核酸を検出するためのものである。天然に存在する低分子核酸は、転写及びＲＮＡプロセシングから翻訳に至るまでの極めて重要かつ多様な細胞機能を担う。これらのＲＮＡの共通の特性は、１５～４０の範囲のヌクレオチド長という大きさである。その他の実施形態では、本明細書で提供される方法は、合成の低分子核酸を検出するためのものである。
【0151】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用の生体試料を調製する方法は、様々な起源の生体試料を含む。一実施形態では、生体試料は組織検体である、または組織検体に由来する。一実施形態では、生体試料は血液試料である、または血液試料に由来する。一実施形態では、生体試料は細胞学的試料である、または細胞学的試料に由来する。一実施形態では、生体試料は培養細胞である。別の実施形態では、生体試料はエクソソームである。
【0152】
組織検体としては、例えば、組織生検試料が挙げられる。血液試料としては、例えば、診断目的で採取した血液試料が挙げられる。血液試料の場合、血液塗抹標本におけるように、血液を直接解析でき、あるいは、血液を処理して、例えば、赤血球細胞の溶解、ＰＢＭＣまたは白血球の単離、標的細胞の単離などを行って、本開示の方法によって解析される試料中の細胞が、血液試料中に存在するように、または血液試料から抽出されるようにできる。同様に、組織検体の処理を行うことができ、例えば、組織検体を細かく切断し、物理的または酵素的に処理して、組織を破壊して、個々の細胞または細胞クラスターの状態にすることができる。加えて、望ましい場合には、細胞学的試料を処理して、細胞を単離するか、または細胞クラスターを破壊することができる。したがって、当該技術分野において周知の方法を用いて、組織、血液、及び細胞学的試料を入手及び処理することができる。本開示の方法は、病態を示すバイオマーカーである核酸標的の有無に基づき、病的細胞の有無を確認する診断用途で用いることができる。
【0153】
本明細書で提供される方法を用いて標的核酸を検出する際には、いずれかの数の好適な細胞を使用できることが、当業者には理解される。本明細書で提供される方法で用いる試料は概して、生体試料または組織試料である。このような試料は、生体対象から得ることができ、個体または何らかの他の生体物質源（生検体、剖検体または鑑定物質など）から採取される生体組織または体液由来の試料を含む。生体試料には、前がん細胞、がん細胞、前がん組織もしくはがん組織を含むか、またはその細胞もしくは組織を含む疑いのある、生体対象の領域から得た試料、例えば組織生検体（細針吸引物、血液試料または細胞学的検体が挙げられる）も含まれる。このような試料は、哺乳動物のような生物から単離した器官、組織、組織断片、細胞及び／またはエクソソームであることができるが、これらに限定されない。例示的な生体試料としては、細胞培養物（初代細胞培養物を含む）、細胞株、組織、器官、細胞小器官、生体液などが挙げられるが、これらに限定されない。追加の生体試料としては、皮膚試料、組織生検体（細針吸引物を含む）、細胞学的試料、便、体液（血液及び／または血清の試料、唾液、精液を含む）などが挙げられるが、これらに限定されない。このような試料は、医学または獣医学における診断目的で用いることができる。
【0154】
本明細書で提供される方法による解析用の細胞学的試料を採取することは、当該技術分野において周知である（例えば、Ｄｅｙ，“Ｃｙｔｏｌｏｇｙ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｏｃｕｒｅｍｅｎｔ，Ｆｉｘａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ”ｉｎ Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｃｙｔｏｌｏｇｙ ｐｐ．１２１－１３２，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ（２０１８）、“Ｎｏｎ－Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｙｔｏｌｏｇｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ”Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ａｄｏｐｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ＡＳＣ ｅｘｅｃｕｔｉｖｅ ｂｏａｒｄ Ｍａｒｃｈ ２，２００４参照）。
【0155】
例えば、子宮頸部組織の解析用に、試料（組織生検体及び細胞学的試料を含む）を処理する方法は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｃｅｃｉｌ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂｅｎｎｅｔｔ ａｎｄ Ｐｌｕｍ，ｅｄｓ．，２０ｔｈ ｅｄ．，ＷＢ Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９９６）、Ｃｏｌｐｏｓｃｏｐｙ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｅｒｖｉｃａｌ Ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｎｅｏｐｌａｓｉａ：Ａ Ｂｅｇｉｎｎｅｒ’ｓ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｌｌｏｒｓ ａｎｄ Ｓａｎｋａｒａｎａｒａｙａｎａｎ，ｅｄｓ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｇｅｎｃｙ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ（２００３）、Ｋａｌａｆ ａｎｄ Ｃｏｏｐｅｒ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．６０：４４９－４５５（２００７）、Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｔｒｉｍｂｌｅ，Ｂｅｓｔ Ｐｒａｃｔ．Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎａｅｃｏｌ．２６：２３３－２４２（２０１２）、Ｗａｘｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．１２０：１４６５－１４７１（２０１２）、Ｃｅｒｖｉｃａｌ Ｃｙｔｏｌｏｇｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ＴＯＣ，Ａｐｐｒｏｖｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ（ＡＳＣ）Ｅｘｅｃｕｔｉｖｅ Ｂｏａｒｄ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １０，２０００参照）。
【0156】
特定の実施形態では、試料は、組織検体であるか、または組織検体に由来するものである。いくつかの実施形態では、組織検体は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）である。いくつかの実施形態では、組織検体は新鮮凍結である。いくつかの実施形態では、組織検体は、ホルマリン以外の固定液によって調製される。いくつかの実施形態では、ホルマリン以外の固定液は、エタノール、メタノール、Ｂｏｕｉｎ固定液、Ｂ５、及びＩ．Ｂ．Ｆからなる群から選択される。その他の特定の実施形態では、試料は、血液試料である、または血液試料に由来する。さらに別の特定の実施形態では、試料は、細胞学的試料である、または細胞学的試料に由来するものである。
【0157】
５．３ 標的核酸の検出方法
別の態様では、本明細書において、細胞中の標的核酸を検出する方法であって、例えば、上記のセクション５．２に記載されているように、本明細書において提供される方法に従って、生体試料を調製することと、標的核酸にハイブリダイズする１つ以上のプローブのセットを用いてｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション検出アッセイを実行することと、を含む方法が提供される。
別の態様では、本明細書において、細胞中の標的核酸を検出する方法であって、例えば、上記のセクション５．２に記載されているように、本明細書において提供される方法に従って、生体試料を調製することと、標的核酸にハイブリダイズする１つ以上のプローブのセットを用いてｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション検出アッセイを実行することと、を含む方法が提供される。
【0158】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される、あらかじめ固定した試料において標的核酸をｉｎ ｓｉｔｕ検出する方法は、アルデヒド含有固定液を試料に適用することと、標的核酸にハイブリダイズする１つ以上のプローブのセットを用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション検出アッセイを実行することと、を含む。
【0159】
いくつかの実施形態では、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、ＤＮＡを検出するためのものである。いくつかの実施形態では、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、ＲＮＡを検出するためのものである。
【0160】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、比較的短い核酸を検出する。例えば、いくつかの実施形態では、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、１００未満のヌクレオチドを含む標的核酸を検出するためのものである。いくつかの実施形態では、標的核酸は１５～１００のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は１５～８０のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は１５～６０のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は１５～５０のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は１５～４０のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は９０未満のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は８０未満のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は７０未満のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は６０未満のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は５０未満のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は４０未満のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は３０未満のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は２０未満のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は１６未満のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、低分子ＲＮＡ種を検出するためのものである。一実施形態では、検出するＲＮＡのヌクレオチドは、１００未満である。一実施形態では、検出するＲＮＡのヌクレオチドは、５０未満である。一実施形態では、検出するＲＮＡのヌクレオチドは、４０未満である。一実施形態では、検出するＲＮＡのヌクレオチドは、１０～４０である。一実施形態では、検出するＲＮＡのヌクレオチドは、１５～４０である。一実施形態では、検出するＲＮＡのヌクレオチドは、３０～４０である。一実施形態では、本方法は、ｓｎｃＲＮＡを検出するためのものである。一実施形態では、本方法は、ｍｉＲＮＡを検出するためのものである。一実施形態では、本方法は、ｓｉＲＮＡを検出するためのものである。一実施形態では、本方法は、ｐｉＲＮＡを検出するためのものである。一実施形態では、本方法は、ＡＳＯを検出するためのものである。一実施形態では、本方法は、内因性のＲＮＡを検出するためのものである。一実施形態では、本方法は、外因性のＲＮＡを検出するためのものである。
【0161】
また、本明細書に提供される方法を使用して、比較的長い核酸、例えば１００、２００、３００、５００、または１，０００以上のヌクレオチドを含む核酸を検出することもできる。
【0162】
核酸のｉｎ ｓｉｔｕ検出方法は、当業者には周知である（例えば、ＵＳ２００８／００３８７２５、ＵＳ２００９／００８１６８８、Ｈｉｃｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｈｉｓｔｏｌ．３５：５９５－６０１（２００４）参照）。本明細書で使用される場合、「ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション」または「ＩＳＨ」とは、直接または間接的に標識した相補的なＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖（プローブなど）を用いて、試料、具体的には、組織または細胞の一部または切片（ｉｎ ｓｉｔｕ）における所定の核酸に結合して、その核酸の位置を特定するタイプのハイブリダイゼーションを指す。そのプローブの種類は、２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、１本鎖相補的ＲＮＡ（ｓｓｃＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ、ミトコンドリアＲＮＡ、及び／または合成オリゴヌクレオチドであることができる。
【0163】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、上記標的核酸にハイブリダイズできる１つ以上の標的プローブ（複数可）を少なくとも１セット提供することと、上記１つ以上の標的プローブ（複数可）のセットにハイブリダイズできる、シグナル生成複合体を提供することであって、上記シグナル生成複合体が、上記１つ以上の標的プローブ（複数可）のセットにハイブリダイズできる核酸成分、及び標識プローブを含む、提供することと、上記標的核酸を、上記１つ以上の標的プローブ（複数可）のセットにハイブリダイズすることと、シグナル生成複合体を上記１つ以上の標的プローブ（複数可）のセットに捕捉し、それによってシグナル生成複合体を上記標的核酸に捕捉することと、を含む。
【0164】
いくつかの実施形態では、１つ以上の標的プローブ（複数可）の各セットは、単一のプローブを含む。その他の実施形態では、１つ以上の標的プローブ（複数可）の各セットは、２つのプローブを含む。さらにその他の実施形態では、１つ以上の標的プローブ（複数可）の各セットは、３つ以上のプローブを含む。
【0165】
いくつかの実施形態では、標的プローブの各セットが、単一の標的プローブを含む場合、単一の標的プローブが標的核酸に結合するときに、シグナル生成複合体が形成される。その他の実施形態では、標的プローブの各セットが２つの標的プローブを含む場合、標的プローブ対の両方のメンバーが標的核酸に結合するときに、シグナル生成複合体が形成される。
【0166】
いくつかの特定の実施形態では、本明細書で使用されるＲＮＡ ＩＳＨは、例えば、米国特許第７，７０９，１９８号、同第８，６０４，１８２号、及び同第８，９５１，７２６号により詳細に記載されている、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）である。具体的には、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）に関しては、特別に設計されたオリゴヌクレオチドプローブを、分枝状のＤＮＡ様シグナル生成複合体と組み合わせて用いて、標準的な明視野顕微鏡の下、単分子の感度で、１キロベースほどの小ささのＲＮＡを確実に検出することが記載されている（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１７（１０）：２２０１－２２０８（２０１６）、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．１４（１）：２２－２９（２０１２））。
【0167】
いくつかの実施形態では、各標的プローブは標的（Ｔ）セクションと標識（Ｌ）セクションとを備え、Ｔセクションは標的核酸上のセクションに相補的な核酸配列であり、Ｌセクションはシグナル生成複合体の核酸成分上のセクションに相補的な核酸配列であり、１つ以上の標的プローブ（複数可）のＴセクションは標的核酸の非重複領域に相補的であり、１つ以上の標的プローブ（複数可）のＬセクションは生成複合体の核酸成分の非重複領域に相補的である。
【0168】
いくつかの実施形態では、１つ以上の標的プローブ（複数可）１セットを使用して、標的核酸を検出する。その他の実施形態では、１つ以上の標的プローブ（複数可）２セット以上を使用して、標的核酸を検出する。いくつかの実施形態では、１つ以上の標的プローブ（複数可）２セットを使用して、標的核酸を検出する。いくつかの実施形態では、１つ以上の標的プローブ（複数可）３セットを使用して、標的核酸を検出する。いくつかの実施形態では、１つ以上の標的プローブ（複数可）４セットを使用して、標的核酸を検出する。いくつかの実施形態では、１つ以上の標的プローブ（複数可）５セットを使用して、標的核酸を検出する。いくつかの実施形態では、１つ以上の標的プローブ（複数可）６セットを使用して、標的核酸を検出する。いくつかの実施形態では、１つ以上の標的プローブ（複数可）７セットを使用して、標的核酸を検出する。いくつかの実施形態では、１つ以上の標的プローブ（複数可）８セットを使用して、標的核酸を検出する。いくつかの実施形態では、１つ以上の標的プローブ（複数可）９セットを使用して、標的核酸を検出する。いくつかの実施形態では、１つ以上の標的プローブ（複数可）１０セットを使用して、標的核酸を検出する。いくつかの実施形態では、１つ以上の標的プローブ（複数可）１１セット以上を使用して、標的核酸を検出する。いくつかの実施形態では、１つ以上の標的プローブ（複数可）１６セット以上を使用して、標的核酸を検出する。いくつかの実施形態では、１つ以上の標的プローブ（複数可）２１セット以上を使用して、標的核酸を検出する。いくつかの実施形態では、１つ以上の標的プローブ（複数可）３１セット以上を使用して、標的核酸を検出する。
【0169】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、複数の核酸標的を検出するためのものである。いくつかの実施形態では、複数の核酸標的は全て、１００未満のヌクレオチドを含む。その他の実施形態では、核酸標的の一部は１００未満のヌクレオチドを含み、一方でその他の標的は１００を超えるヌクレオチドを含む。
【0170】
本明細書で使用される場合、「標的プローブ」は、標的核酸にハイブリダイゼーションして、標識プローブまたはシグナル生成複合体（ＳＧＣ）の成分をその標的核酸に捕捉または結合させることができるポリヌクレオチドである。標的プローブは、標識プローブに直接ハイブリダイゼーションできるか、または標識プローブに逐次にハイブリダイゼーションする１つ以上の核酸にハイブリダイゼーションでき、例えば、標的プローブは、ＳＧＣにおける増幅剤、プレ増幅剤またはプレ－プレ増幅剤にハイブリダイゼーションできる。すなわち、標的プローブは、標的核酸のポリヌクレオチド配列と相補的である第１のポリヌクレオチド配列と、標識プローブ、増幅剤、プレ増幅剤、またはプレ－プレ増幅剤などのポリヌクレオチド配列と相補的である第２のポリヌクレオチド配列とを含む。標的プローブは概して１本鎖であり、上記の相補的配列が、対応する標的核酸、標識プローブ、増幅剤、プレ増幅剤またはプレ－プレ増幅剤とハイブリダイゼーションするのに利用可能なようになっている。いくつかの実施形態では、標的プローブは、対として供給される。
【0171】
本明細書で使用される場合、「標識プローブ」という用語は、標的分子に直接または間接的に、概ね間接的に結合して、標的を検出可能にする物体を指す。標識プローブ（または「ＬＰ」）は、直接または間接的に検出可能なシグナルを供給する標識を１つ以上含む、典型的には１本鎖のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドである核酸結合部分を含む。その標識が、そのポリヌクレオチドに共有結合していることもできるし、またはそのポリヌクレオチドが、その標識に結合するように構成されていることもできる。例えば、ビオチン化ポリヌクレオチドは、ストレプトアビジン結合標識と結合できる。標識プローブは例えば、標的核酸に直接ハイブリダイゼーションできる。概して、標識プローブは、標的核酸に逐次にハイブリダイゼーションしている核酸、または標的核酸にハイブリダイゼーションしている１つ以上の他の核酸にハイブリダイゼーションできる。すなわち、標識プローブは、標的核酸のポリヌクレオチド配列、特に、標的核酸の一部分と相補的であるポリヌクレオチド配列を含むことができる。あるいは、標識プローブは、増幅剤、プレ増幅剤、またはＳＧＣにおけるプレ－プレ増幅剤におけるポリヌクレオチド配列と相補的であるポリヌクレオチド配列を少なくとも１つ含むことができる。
【0172】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＳＧＣは、このような増幅剤、プレ増幅剤、及び／またはプレ－プレ増幅剤に関して、追加の説明を含む。
【0173】
本明細書で使用される場合、「増幅剤」は、複数の標識プローブにハイブリダイゼーションできる分子、典型的にはポリヌクレオチドである。典型的には、増幅剤は、複数の同一の標識プローブにハイブリダイゼーションする。増幅剤は、標的核酸、標的プローブ対の少なくとも１つの標的プローブ、標的プローブ対の両方の標的プローブ、または標的プローブに結合した核酸（増幅剤、プレ増幅剤もしくはプレ－プレ増幅剤など）にハイブリダイゼーションすることもできる。例えば、増幅剤は、少なくとも１つの標的プローブ及び複数の標識プローブ、またはプレ増幅剤及び複数の標識プローブにハイブリダイゼーションできる。増幅剤は例えば、直鎖状、フォーク状、櫛状または分岐状の核酸であることができる。全てのポリヌクレオチドについて本明細書で記載されているように、増幅剤は、修飾ヌクレオチド及び／または非標準的なヌクレオチド間結合、ならびに標準的なデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド及び／またはホスホジエステル結合を含むことができる。好適な増幅剤は例えば、米国特許第５，６３５，３５２号、同第５，１２４，２４６号、同第５，７１０，２６４号、同第５，８４９，４８１号、及び同第７，７０９，１９８号、ならびに米国公開第２００８／００３８７２５号及び同第２００９／００８１６８８号に記載されており、これらはそれぞれ、参照により援用される。
【0174】
本明細書で使用される場合、「プレ増幅剤」は、１つ以上の標的プローブと１つ以上の増幅剤の間の中間結合成分としての役割を果たす分子、典型的にはポリヌクレオチドである。典型的には、プレ増幅剤は、１つ以上の標的プローブ及び複数の増幅剤に同時にハイブリダイゼーションする。例示的なプレ増幅剤は例えば、米国特許第５，６３５，３５２号、同第５，６８１，６９７号及び同第７，７０９，１９８号、ならびに米国公開第２００８／００３８７２５号、同第２００９／００８１６８８号及び同第２０１７／０１０１６７２号に記載されており、これらはそれぞれ、参照により援用される。
【0175】
本明細書で使用される場合、「プレ－プレ増幅剤」は、１つ以上の標的プローブと１つ以上のプレ増幅剤の間の中間結合成分としての役割を果たす分子、典型的にはポリヌクレオチドである。典型的には、プレ－プレ増幅剤は、１つ以上の標的プローブ及び複数のプレ増幅剤に同時にハイブリダイゼーションする。例示的なプレ－プレ増幅剤は例えば、２０１７／０１０１６７２に記載されており、これは、参照により援用される。
【0176】
標識は典型的には、ＲＮＡのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションで、標的核酸を検出するために使用される。本明細書で使用される場合、「標識」とは、分子の検出を促す部分である。一般的な標識には、蛍光標識、発光標識、光散乱標識、及び／または比色標識が含まれる。好適な標識としては、酵素、ならびに蛍光部分及び発色部分、また放射性核種、基質、補因子、阻害剤、化学発光部分、磁性粒子、希土類金属、金属同位体などが挙げられる。特定の実施形態では、標識は、酵素である。例示的な酵素標識としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、β－ガラクトシダーゼ、及びグルコースオキシダーゼなど、ならびに各種プロテアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。他の標識としては、フルオロフォア及びジニトロフェニル（ＤＮＰ）などが挙げられるが、これらに限定されない。標識は、例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（１９９６）、ならびに米国特許第３，８１７，８３７号、同第３，８５０，７５２号、同第３，９３９，３５０号、同第３，９９６，３４５号、同第４，２７７，４３７号、同第４，２７５，１４９号及び同第４，３６６，２４１号に記載されているように、当業者には周知である。検出可能な酵素／基質の組み合わせ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ ＩＬ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｌｌａｓ ＴＸ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）を含め、多くの標識が市販されており、本開示の方法及びアッセイで使用できる。本開示の特定の実施形態では、酵素は、発色基質または蛍光基質を利用して、本明細書に記載されているように、検出可能なシグナルを生成できる。例示的な標識は、本明細書に記載されている。
【0177】
酵素活性標識または非酵素標識が、それぞれ検出できるものである限りは、いずれの数の酵素標識または非酵素標識も使用できる。本酵素は、それによって検出可能なシグナルを生成し、そのシグナルを利用して、標的核酸を検出できる。特に有用である検出可能なシグナルは、発色シグナルまたは蛍光シグナルである。したがって、標識として用いるのに特に有用な酵素には、発色基質または蛍光基質が利用可能である酵素が含まれる。このような発色基質または蛍光基質を酵素反応によって容易に検出可能な発色生成物または蛍光生成物に変換し、この生成物は、顕微鏡法または分光法を用いて、容易に検出及び／または定量できる。このような酵素は、当業者に周知であり、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼなどが挙げられるが、これらに限定されない（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（１９９６）参照）。周知の発色基質または蛍光基質を有する他の酵素には、様々なペプチダーゼが含まれ、その発色ペプチド基質または蛍光ペプチド基質を用いて、タンパク質切断反応を検出できる。発色基質及び蛍光基質の利用は、細菌の診断でも周知であり、α－ガラクトシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、β－グルクロニダーゼ、６－ホスホ－β－Ｄ－ガラクトシド６－ホスホガラクトヒドロラーゼ、β－グルコシダーゼ、α－グルコシダーゼ、アミラーゼ、ノイラミニダーゼ、エステラーゼ、及びリパーゼなどの利用が挙げられるが、これらに限らず（Ｍａｎａｆｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５５：３３５－３４８（１９９１））、既知の発色基質または蛍光基質を有するこのような酵素は、本明細書で提供される方法で用いるのに容易に適合させることができる。
【0178】
検出可能なシグナルを生成させるための様々な発色基質または蛍光基質は、当業者に周知であり、市販されている。検出可能なシグナルを生成させるのに利用できる例示的な基質としては、西洋ワサビペルオキシダーゼに対する３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、クロロナフトール（４－ＣＮ）（４－クロロ－１－ナフトール）、２，２’－アジノ－ビス（３－エチルベンゾチアゾリン－６－スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、ｏ－フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）、及び３－アミノ－９－エチルカルバゾール（ＡＥＣ）、アルカリホスファターゼに対する５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－１－リン酸（ＢＣＩＰ）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、Ｆａｓｔ Ｒｅｄ（Ｆａｓｔ Ｒｅｄ ＴＲ／ＡＳ－ＭＸ）、及びｐ－ニトロフェニルリン酸（ＰＮＰＰ）、β－ガラクトシダーゼに対する１－メチル－３－インドリル－β－Ｄ－ガラクトピラノシド及び２－メトキシ－４－（２－ニトロビニル）フェニルβ－Ｄ－ガラクトピラノシド、ならびにβ－グルコシダーゼに対する２－メトキシ－４－（２－ニトロビニル）フェニルβ－Ｄ－グルコピラノシドなどが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な蛍光基質としては、アルカリホスファターゼに対する４－（トリフルオロメチル）ウンベリフェリルリン酸、ホスファターゼに対する４－メチルウンベリフェリルリン酸ビス（２－アミノ－２－メチル－１，３－プロパンジオール）、４－メチルウンベリフェリルリン酸ビス（シクロヘキシルアンモニウム）及び４－メチルウンベリフェリルリン酸、西洋ワサビペルオキシダーゼに対するＱｕａｎｔａＢｌｕ（商標）及びＱｕｉｎｔｏｌｅｔ、β－ガラクトシダーゼに対する４－メチルウンベリフェリルβ－Ｄ－ガラクトピラノシド、フルオレセインジ（β－Ｄ－ガラクトピラノシド）及びナフトフルオレセインジ－（β－Ｄ－ガラクトピラノシド）、β－グルコシダーゼに対する３－アセチルウンベリフェリルβ－Ｄ－グルコピラノシド及び４－メチルウンベリフェリル－β－Ｄ－グルコピラノシド、ならびにα－ガラクトシダーゼに対する４－メチルウンベリフェリル－α－Ｄ－ガラクトピラノシドが挙げられるが、これらに限定されない。検出可能なシグナルを生成させる例示的な酵素及び基質は例えば、米国公開第２０１２／０１００５４０号にも記載されている。発色基質または蛍光基質を含む様々な検出可能な酵素基質は、周知であり、市販されている（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ ＩＬ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｌｌａｓ ＴＸ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ、４２ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｂｉｏｃａｒｅ）。概して、基質は、標的核酸の部位で沈着する沈殿物を形成する生成物に変換される。その他の例示的な基質としては、ＨＲＰ－Ｇｒｅｅｎ（４２ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｂｅｔａｚｏｉｄ ＤＡＢ、Ｃａｒｄａｓｓｉａｎ ＤＡＢ、Ｒｏｍｕｌｉｎ ＡＥＣ、Ｂａｊｏｒａｎ Ｐｕｒｐｌｅ、Ｖｉｎａ Ｇｒｅｅｎ、Ｄｅｅｐ Ｓｐａｃｅ Ｂｌａｃｋ（商標）、Ｗａｒｐ Ｒｅｄ（商標）、Ｂｉｏｃａｒｅ製のＶｕｌｃａｎ Ｆａｓｔ Ｒｅｄ及びＦｅｒａｎｇｉ Ｂｌｕｅ（Ｃｏｎｃｏｒｄ ＣＡ；ｂｉｏｃａｒｅ．ｎｅｔ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ／ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0179】
検出可能な標識として適する例示的な希土類金属及び金属同位体としては、１４１Ｐｒ、１４２Ｎｄ、１４３Ｎｄ、１４４Ｎｄ、１４５Ｎｄ、１４６Ｎｄ、１４７Ｓｍ、１４８Ｎｄ、１４９Ｓｍ、１５０Ｎｄ、１５１Ｅｕ、１５２Ｓｍ、１５３Ｅｕ、１５４Ｓｍ、１５５Ｇｄ、１５６Ｇｄ、１５８Ｇｄ、１５９Ｔｂ、１６０Ｇｄ、１６１Ｄｙ、１６２Ｄｙ、１６３Ｄｙ、１６４Ｄｙ、１６５Ｈｏ、１６６Ｅｒ、１６７Ｅｒ、１６８Ｅｒ、１６９Ｔｍ、１７０Ｅｒ、１７１Ｙｂ、１７２Ｙｂ、１７３Ｙｂ、１７４Ｙｂ、１７５Ｌｕ、及び１７６Ｙｂのようなランタニド（ＩＩＩ）同位体が挙げられるが、これらに限定されない。金属同位体は、例えば、飛行時間型質量分析（ＴＯＦ－ＭＳ）（例えば、ＦｌｕｉｄｉｇｍのＨｅｌｉｏｓ及びＨｙｐｅｒｉｏｎシステム、ｆｌｕｉｄｉｇｍ．ｃｏｍ／ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を用いて検出できる。
【0180】
ビオチン－アビジン（またはビオチン－ストレプトアビジン）は、それらの２つの分子の相互の親和性が非常に高いとともに、１つのアビジン／ストレプトアビジン分子が４つのビオチン分子と結合できるという知見に基づく、周知のシグナル増幅システムである。抗体は、免疫組織化学法及びＩＳＨでのシグナル増幅に広く用いられている。チラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）は、ペルオキシダーゼ活性によって、多数のハプテン化チラミド分子が沈着することに基づいている。チラミンは、フェノール化合物である。固定化された西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）は、少量の過酸化水素の存在下で、標識基質を、極めて反応性の高い短命な中間体に変換する。続いて、活性化した基質分子は、ペルオキシダーゼ結合部位またはペルオキシダーゼ結合部位の近くで、電子の豊富なタンパク質部分（チロシンなど）と非常に速やかに反応して、その部分に共有結合する。この方法で、チラミドにコンジュゲートした多くのハプテン分子をハイブリダイゼーション部位で、ｉｎ ｓｉｔｕに導入できる。その後、沈着したチラミド－ハプテン分子を直接または間接的に可視化できる。このような検出システムは例えば、米国公開第２０１２／０１００５４０号にさらに詳細に記載されている。
【0181】
本明細書に記載されている実施形態では、酵素を利用して、適切な発色基質または蛍光基質を用いる検出可能なシグナルを生成できる。あるいは、標識プローブは、その標識プローブの核酸部分に直接結合された検出可能な標識を有することができることが理解される。例示的な検出可能な標識は、当業者に周知であり、発色標識または蛍光標識が挙げられるが、これらに限定されない（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（１９９６）参照）。例示的な、標識として有用なフルオロフォアとしては、ローダミン誘導体、例えばテトラメチルローダミン、ローダミンＢ、ローダミン６Ｇ、スルホローダミンＢ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（スルホローダミン１０１）、ローダミン１１０、及びそれらの誘導体、例えばテトラメチルローダミン－５－（または６）、リサミンローダミンＢなど；７－ニトロベンズ－２－オキサ－１，３－ジアゾール（ＮＢＤ）；フルオレセイン及びその誘導体；ナフタレン、例えばダンシル（５－ジメチルアミノナフタレン－１－スルホニル）；クマリン誘導体、例えば７－アミノ－４－メチルクマリン－３－酢酸（ＡＭＣＡ）、７－ジエチルアミノ－３－［（４’－（ヨードアセチル）アミノ）フェニル］－４－メチルクマリン（ＤＣＩＡ）、Ａｌｅｘａ蛍光色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）など；４，４－ジフルオロ－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン（ＢＯＤＩＰＹ（商標））及びその誘導体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ；Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）；ピレン及びスルホン化ピレン、例えばＣａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ（商標）及びその誘導体、例えば８－メトキシピレン－１，３，６－トリスルホン酸など；ピリジルオキサゾール誘導体及びダポキシル（ｄａｐｏｘｙｌ）誘導体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）；Ｌｕｃｉｆｅｒ Ｙｅｌｌｏｗ（３，６－ジスルホネート－４－アミノ－ナフタルイミド）及びその誘導体；ＣｙＤｙｅ（商標）蛍光色素（Ａｍｅｒｓｈａｍ／ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ ＮＪ）、ＡＴＴＯ ３９０、ＤｙＬｉｇｈｔ ３９５ＸＬ、ＡＴＴＯ ４２５、ＡＴＴＯ ４６５、ＡＴＴＯ ４８８、ＡＴＴＯ ４９０ＬＳ、ＡＴＴＯ ４９５、ＡＴＴＯ ５１４、ＡＴＴＯ ５２０、ＡＴＴＯ ５３２、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ６Ｇ、ＡＴＴＯ ５４２、ＡＴＴＯ ５５０、ＡＴＴＯ ５６５、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ３Ｂ、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１１、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１２、ＡＴＴＯ Ｔｈｉｏ１２、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１０１、ＡＴＴＯ ５９０、ＡＴＴＯ ５９４、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１３、ＡＴＴＯ ６１０、ＡＴＴＯ ６２０、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１４、ＡＴＴＯ ６３３、ＡＴＴＯ ６４３、ＡＴＴＯ ６４７、ＡＴＴＯ ６４７Ｎ、ＡＴＴＯ ６５５、ＡＴＴＯ Ｏｘａ１２、ＡＴＴＯ ６６５、ＡＴＴＯ ６８０、ＡＴＴＯ ７００、ＡＴＴＯ ７２５、ＡＴＴＯ ７４０、Ｃｙａｎ ５００ ＮＨＳ－Ｅｓｔｅｒ（ＡＴＴＯ－ＴＥＣＨ，Ｓｉｅｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）などが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な発色団としては、フェノールフタレイン、マラカイトグリーン、芳香族ニトロ化合物（ニトロフェニルなど）、ジアゾ色素、ダブシル（４－ジメチルアミノアゾベンゼン－４’－スルホニル）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【0182】
本明細書で開示されているように、本明細書で提供される方法は、複数の標的核酸の同時検出に利用できる。フルオロフォアを標識として用いる場合には、複数の標的核酸の検出に用いるフルオロフォアは、標的核酸の同時検出の場合に、各フルオロフォアが識別可能であるとともに、フルオロフォアを蛍光顕微鏡で同時に検出できるように選択する。このようなフルオロフォアは、標的核酸の別個の標識を同時に検出できるように、発光線のスペクトルが分離されるように選択する。本開示の方法で用いるのに適する識別可能なフルオロフォアを選択する方法は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｓｐｅｎｃｅ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，”１１ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（２０１０）を参照されたい）。
【0183】
顕微鏡、サイトメトリー（例えば、マスサイトメトリー、飛行時間法によるサイトメトリー（ＣｙＴＯＦ）、フローサイトメトリー）または分光法のような周知の方法を用いて、それぞれの標的核酸と関連する検出可能な発色シグナル、蛍光シグナルまたは金属シグナルを可視化できる。概して、同じ試料中の核酸標的の検出に、１種類の計器を使用できるように、同じアッセイで、それぞれ異なる標識を使用する場合には、特定のアッセイに合わせて、発色基質もしくは蛍光基質、または発色標識もしくは蛍光標識、あるいは希土類金属同位体のいずれかを使用する。
【0184】
本明細書で開示されているように、標識は、標識が任意に切断可能となるように設計できる。本明細書で使用される場合、切断可能な標識とは、例えば、標的核酸を標識及び検出する２回目以降のラウンドで、同じ標識を使用するために、標識を除去できるように、標識プローブに結合またはコンジュゲートされている標識を指す。概して、標識は、切断可能である化学リンカーによって、標識プローブにコンジュゲートされている。標識が切断可能となるように、標識を標識プローブにコンジュゲートする方法は、当業者に周知である（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（１９９６）、Ｄａｎｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４（３）：４８４－４８９（１９９８）参照）。オリゴヌクレオチドを標識する具体的システムの１つは、ＦａｓｔＴａｇ（商標）システムである（上記のＤａｎｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９８、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｈａｍｅ ＣＡ）。様々な切断可能な部分をリンカーに含めて、標識を標識プローブから切断されるようにできる。このような切断可能な部分は、化学的、光化学的または酵素的に切断できる基を含む。切断可能な化学リンカーは、還元によって切断できるジスルフィド、過ヨウ素酸塩によって切断できるグリコールまたはジオール、亜ジチオン酸塩によって切断できるジアゾ結合、ヒドロキシルアミンによって切断できるエステル、塩基によって切断できるスルホンなどのような切断可能な化学的部分を含むことができる（上記のＨｅｒｍａｎｓｏｎ，１９９６参照）。特に有用である切断可能なリンカーの１つは、ジスルフィド結合を還元することによって切断できるジスルフィド結合を含むリンカーである。別の実施形態では、リンカーは、酵素によって切断するための部位を含むことができる。例えば、リンカーは、タンパク質切断部位を含むことができる。概して、このような切断部位は、配列特異的なプロテアーゼに対するものである。このようなプロテアーゼとしては、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ（切断部位：ＬＥＶＬＦＱ／ＧＰ）、エンテロキナーゼ（切断部位：ＤＤＤＤＫ／）、第Ｘａ因子（切断部位：ＩＥＧＲ／）、タバコエッチウイルスプロテアーゼ（切断部位：ＥＮＬＹＦＱ／Ｇ）及びトロンビン（切断部位：ＬＶＰＲ／ＧＳ）が挙げられる（例えばＯｘｆｏｒｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ参照）が、これらに限定されない。別の切断可能な部分は例えば、ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＮＧ）によって切断できるウラシル－ＤＮＡ（ウラシルを含むＤＮＡ）であることができる（例えば、Ｓｉｄｏｒｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５８２（３）：４１０－４０４（２００８）参照）。
【0185】
切断可能な標識は、その標識を切断し、その標識を標識プローブから解離する目的で、化学的な薬剤のような薬剤または光を適用することによって除去することができる。上で論じたように、化学的な切断に有用な切断剤としては、還元剤、過ヨウ素酸、亜ジチオン酸塩、ヒドロキシルアミン、及び塩基などが挙げられるが、これらに限定されない（上記のＨｅｒｍａｎｓｏｎ，１９９６参照）。ジスルフィド結合を含むリンカーを切断するのに有用な方法の１つは、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を利用することである（Ｍｏｆｆｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １１３：１１０４６－１１０５１（２０１６）参照）。一実施形態では、標識を標識プローブから切断する薬剤として、ＴＣＥＰを使用する。
【0186】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される細胞中の標的核酸を検出する方法は、標的プローブ（複数可）のハイブリダイゼーションの前に前処理工程を含む。いくつかの実施形態では、前処理工程はブロッキング工程を含み、その工程で特定のブロッキング剤（複数可）を適用して細胞の特定の内因性成分をブロックし、それによってアッセイのバックグラウンドを低減させる。例えば、後工程で西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を検出酵素として使用する場合、過酸化水素がブロッキング剤である。過酸化水素を添加して、試料中の内因性ＨＲＰ活性を不活性化し、それによってアッセイのバックグラウンドを低減させる。特定の実施形態では、このブロッキング工程は、脱パラフィン直後の、前処理の第１の工程として追加される。いくつかの実施形態では、前処理工程はエピトープ抗原賦活化工程を含み、特定のエピトープ抗原賦活化バッファー（複数可）を添加して、標的核酸を露出させることができる。いくつかの実施形態では、エピトープ抗原賦活化工程は、試料を加熱することを含む。いくつかの実施形態では、エピトープ抗原賦活化工程は、試料を５０℃～１００℃に加熱することを含む。一実施形態では、エピトープ抗原賦活化工程は、試料を約８８℃に加熱することを含む。いくつかの実施形態では、前処理工程は、細胞中の核酸標的を保持し、標的プローブ（複数可）、シグナル生成複合体などが細胞に入ることを許容する透過化処理工程を含む。いくつかの実施形態では、透過化処理工程は、プロテアーゼによる消化を含む。界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００またはＳＤＳ）及びＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋもまた、固定した細胞の透過性を高めるのに使用することができる。通常、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００またはＳＤＳを用いる界面活性剤処理は、脂質を抽出して細胞膜を透過させるために、頻繁に使用される。Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋは、広範囲のｐＨにわたって活性であり、容易に不活性化されない、非特異的プロテアーゼである。Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋは、標的ｍＲＮＡを取り囲むタンパク質を消化するのに用いられる。処理の最適な濃度及び持続時間は、当該技術分野において周知のように、実験に基づいて決定できる。続いて、細胞の洗浄工程を行い、前処理工程の任意の工程で生成された溶解物質を除去することができる。いくつかの実施形態では、試料はホルマリン固定パラフィン包埋組織中にあり、パラフィンを除去するとき、脱パラフィン工程が必要である。
【0187】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される細胞中の標的核酸を検出する方法は、特定のタイミングで、後固定工程を含む。一実施形態では、後固定工程は、（ｉ）第１の固定工程の後であり、（ｉｉ）標的核酸にハイブリダイズできる、１つ以上の標的プローブ（複数可）の少なくとも１セットを適用する前である。一実施形態では、後固定工程は、（ｉ）第１の固定工程の後であり、（ｉｉ）直前の段落に記載される前処理工程の前である。一実施形態では、後固定工程は、（ｉ）第１の固定工程の後であり、（ｉｉ）直前の段落に記載されるブロッキング工程の前である。一実施形態では、後固定工程は、（ｉ）第１の固定工程の後であり、（ｉｉ）直前の段落に記載されるエピトープ抗原賦活化工程の前である。一実施形態では、後固定工程は、（ｉ）第１の固定工程の後であり、（ｉｉ）直前の段落に記載される透過化処理工程の前である。一実施形態では、後固定工程は、（ｉ）脱パラフィン工程の後であり、（ｉｉ）標的核酸にハイブリダイズできる、１つ以上の標的プローブ（複数可）の少なくとも１セットを適用する前である。一実施形態では、後固定工程は、（ｉ）脱パラフィン工程の後であり、（ｉｉ）直前の段落に記載される前処理工程の前である。一実施形態では、後固定工程は、（ｉ）脱パラフィン工程の後であり、（ｉｉ）直前の段落に記載されるブロッキング工程の前である。一実施形態では、後固定工程は、（ｉ）脱パラフィン工程の後であり、（ｉｉ）直前の段落に記載されるエピトープ抗原賦活化工程の前である。一実施形態では、後固定工程は、（ｉ）脱パラフィン工程の後であり、（ｉｉ）直前の段落に記載される透過化処理工程の前である。
【0188】
本明細書において提供される方法は、研究及び診断におけるいくつかの適用を有する（Ｈａｎｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０，１－６，２０１９、Ｗａｔｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２２６（２），３６５－３７９，２０１２）。本明細書において提供される方法は、天然の状況でのｓｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、及びＡＳＯなどの低分子核酸、ならびに様々な健康の過程及び疾患の過程が関与する、これらの低分子核酸が関連する遺伝子制御ネットワークについての理解を向上させ得る。
【0189】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、時間的及び空間的分解能によって低分子ＲＮＡを検出できる。一実施形態では、本明細書において提供される方法は、組織及び細胞型の識別に使用できる。一実施形態では、本明細書において提供される方法は、発生の異なる段階の識別に使用できる。一実施形態では、本明細書において提供される方法は、成人組織の特性決定に使用できる。
【0190】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、変性した低分子ＲＮＡの発現、または病原体由来の低分子ＲＮＡの存在を検出するのに使用できる。一実施形態では、本明細書で提供される方法は、疾患または障害を診断するのに使用できる。一実施形態では、本明細書で提供される方法は、病原体を診断するのに使用できる。
【0191】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、低分子ＲＮＡベースの治療の有効性を監視するためのものである。一実施形態では、本明細書において提供される方法は、ｓｉＲＮＡベースの治療の有効性を監視するためのものである。一実施形態では、本明細書において提供される方法は、ＡＳＯベースの治療の有効性を監視するためのものである。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、低分子ＲＮＡベースの治療の有効性を決定するためのものである。一実施形態では、本明細書において提供される方法は、ｓｉＲＮＡベースの治療の有効性を決定するためのものである。一実施形態では、本明細書において提供される方法は、ＡＳＯベースの治療の有効性を決定するためのものである。
【0192】
特定の実施形態では、疾患モデルへのｓｉＲＮＡの送達に続いて、ｓｉＲＮＡの存在を検出するために本方法を使用できる。特定の実施形態では、疾患モデルへのｓｉＲＮＡの送達に続いて、ｓｉＲＮＡを局在化させるために本方法を使用できる。特定の実施形態では、疾患モデルへのｓｉＲＮＡの送達に続いて、ｓｉＲＮＡを定量化するために本方法を使用できる。特定の実施形態では、疾患モデルへのｓｉＲＮＡの送達に続いて、ｓｉＲＮＡが標的とするＲＮＡを定量化するために本方法を使用できる。
【0193】
特定の実施形態では、疾患モデルへのＡＳＯの送達に続いて、ＡＳＯの存在を検出するために本方法を使用できる。特定の実施形態では、疾患モデルへのＡＳＯの送達に続いて、ＡＳＯを局在化させるために本方法を使用できる。特定の実施形態では、疾患モデルへのＡＳＯの送達に続いて、ＡＳＯを定量化するために本方法を使用できる。特定の実施形態では、疾患モデルへのＡＳＯの送達に続いて、ＡＳＯが標的とするＲＮＡを定量化するために本方法を使用できる。
【0194】
５．４ 標的核酸のｉｎ ｓｉｔｕ検出用のキット
また別の態様では、本明細書において、本明細書に記載の各種方法を実行するためのキットが提供される。
また別の態様では、本明細書において、本明細書に記載の各種方法を実行するためのキットが提供される。
【0195】
いくつかの実施形態では、本明細書において、細胞中の標的核酸のｉｎ ｓｉｔｕ検出のためのキットであって、（ｉ）細胞を含む生体試料を固定する薬剤と、（ｉｉ）生体試料を固定するアルデヒド含有固定液と、（ｉｉｉ）ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを実施する薬剤と、（ｉｖ）アルデヒド含有固定液が、要素（ｉ）の薬剤の後に使用されることを示す取扱い説明書と、を含むキットが提供される。
【0196】
その他の実施形態では、本明細書において、細胞中の標的核酸のｉｎ ｓｉｔｕ検出のためのキットであって、（ｉ）あらかじめ固定した、細胞を含む生体試料を固定するアルデヒド含有固定液と、（ｉｉ）ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを実施する薬剤と、を含むキットが提供される。
【0197】
一実施形態では、キット中の生体試料を固定するために使用する薬剤は、エタノールである。一実施形態では、キット中の生体試料を固定するために使用する薬剤は、メタノールである。一実施形態では、キット中の生体試料を固定するために使用する薬剤は、アセトンである。一実施形態では、キット中の生体試料を固定するために使用する薬剤は、酢酸である。一実施形態では、キット中の生体試料を固定するために使用する薬剤は、塩化亜鉛である。一実施形態では、キット中の生体試料を固定するために使用する薬剤は、硫化亜鉛である。一実施形態では、キット中の生体試料を固定するために使用する薬剤は、ピクリン酸である。一実施形態では、キット中の生体試料を固定するために使用する薬剤は、ホルムアルデヒドである。一実施形態では、キット中の生体試料を固定するために使用する薬剤は、グルタルアルデヒドである。一実施形態では、キット中の生体試料を固定するために使用する薬剤は、四酸化オスミウムである。いくつかの特定の実施形態では、キット中の生体試料を固定するために使用する薬剤は、１種のカルボジイミドである。いくつかの特定の実施形態では、キット中の生体試料を固定するために使用する薬剤は、１種のジイミドエステルである。一実施形態では、キット中の生体試料を固定するために使用する薬剤は、クロロ－ｓ－トリアジド（塩化シアヌル）である。いくつかの特定の実施形態では、キット中の生体試料を固定するために使用する薬剤は、１種のジイソシアネートである。一実施形態では、キット中の生体試料を固定するために使用する薬剤は、ジエチルピロカルボネート（ＤＰＣ）である。いくつかの特定の実施形態では、キット中の生体試料を固定するために使用する薬剤は、１種のマレイミドである。一実施形態では、キット中の生体試料を固定するために使用する薬剤は、ベンゾキノンである。一実施形態では、キット中の生体試料を固定するために使用する薬剤は、塩化水銀である。一実施形態では、キット中の生体試料を固定するために使用する薬剤は、二クロム酸カリウムである。一実施形態では、キット中の生体試料を固定するために使用する薬剤は、過マンガン酸カリウムである。一実施形態では、キット中の生体試料を固定するために使用する薬剤は、クロム酸である。
【0198】
一実施形態では、キット中の生体試料を固定するために使用する薬剤は、ピクリン酸、ホルムアルデヒド、及び酢酸の溶液であるＢｏｕｉｎ固定液である。一実施形態では、キット中の生体試料を固定するために使用する薬剤は、エタノール及び酢酸の溶液であるＣｌａｒｋｅ固定液である。一実施形態では、キット中の生体試料を固定するために使用する薬剤は、エタノール、クロロホルム、及び酢酸の溶液であるＣａｒｎｏｙ固定液である。一実施形態では、キット中の生体試料を固定するために使用する薬剤は、ホルムアルデヒド及びグルタルアルデヒドの混合物溶液である。一実施形態では、キット中の生体試料を固定するために使用する薬剤は、エタノール、酢酸、及びホルムアルデヒドの溶液であるＦＡＡである。一実施形態では、キット中の生体試料を固定するために使用する薬剤は、パラホルムアルデヒド、Ｌリジン、及びＩＮａＯ４の溶液である、過ヨウ素酸－リジン－パラホルムアルデヒド（ＰＬＰ）である。一実施形態では、キット中の生体試料を固定するために使用する薬剤は、リン酸緩衝ホルマリン（ＰＢＦ）である。一実施形態では、キット中の生体試料を固定するために使用する薬剤は、ホルムアルデヒド及び塩化カルシウムの溶液であるホルマール・カルシウムである。一実施形態では、キット中の生体試料を固定するために使用する薬剤は、ホルムアルデヒド及び塩化ナトリウムの溶液であるホルマール生理食塩水液である。一実施形態では、キット中の生体試料を固定するために使用する薬剤は、ホルムアルデヒド及び硫酸亜鉛の溶液である亜鉛ホルマリンである。一実施形態では、キット中の生体試料を固定するために使用する薬剤は、塩化水銀、二クロム酸カリウム、及び氷酢酸の溶液であるＺｅｎｋｅｒ固定液である。一実施形態では、キット中の生体試料を固定するために使用する薬剤は、ホルムアルデヒド、二クロム酸カリウム、硫酸ナトリウム、及び塩化水銀の溶液であるＨｅｌｌｙ固定液である。一実施形態では、キット中の生体試料を固定するために使用する薬剤は、Ｂ－５固定液、ｃ塩化水銀（ｃ ｍｅｒｃｕｒｉｃ ｃｈｌｏｒｉｄ）及び酢酸ナトリウムである。一実施形態では、キット中の生体試料を固定するために使用する薬剤は、ホルムアルデヒド、酢酸銅、ピクリン酸、及び酢酸の溶液であるＨｏｌｌａｎｄｅ固定液である。一実施形態では、キット中の生体試料を固定するために使用する薬剤は、ホルムアルデヒド、エタノール、ピクリン酸、及び氷酢酸の溶液であるＧｅｎｄｒｅ溶液である。一実施形態では、キット中の生体試料を固定するために使用する薬剤は、メタノール、クロロホルム、及び氷酢酸の溶液であるＭｅｔｈａｃａｒｎ固定液である。一実施形態では、キット中の生体試料を固定するために使用する薬剤は、ホルムアルデヒド、エタノール、及び酢酸カルシウムの溶液であるアルコール・ホルマリンである。一実施形態では、キット中の生体試料を固定するために使用する薬剤は、ホルムアルデヒド、氷酢酸、及びエタノールの溶液であるホルモール酢酸アルコールである。
【0199】
いくつかの実施形態では、キット中の生体試料を固定するために使用する薬剤は、エタノール、メタノール、アセトン、酢酸、塩化亜鉛、硫酸亜鉛、ピクリン酸、四酸化オスミウム、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、ジイミドエステル、クロロ－ｓ－トリアジド（塩化シアヌル）、ジイソシアネート、ジエチルピロカルボネート（ＤＰＣ）、マレイミド、ベンゾキノン、塩化水銀、二クロム酸カリウム、過マンガン酸カリウム、及びクロム酸を含む一覧から選択される、２、３、４、または５種以上の固定液の混合物溶液である。
【0200】
いくつかの実施形態では、キット中の生体試料を固定するために使用する薬剤は、同時ではないが、逐次的に適用される２種以上の固定液であり、２種以上の固定液は、エタノール、メタノール、アセトン、酢酸、塩化亜鉛、硫酸亜鉛、ピクリン酸、四酸化オスミウム、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、ジイミドエステル、クロロ－ｓ－トリアジド（塩化シアヌル）、ジイソシアネート、ジエチルピロカルボネート（ＤＰＣ）、マレイミド、ベンゾキノン、塩化水銀、二クロム酸カリウム、過マンガン酸カリウム、及びクロム酸を含む一覧から選択される。
【0201】
いくつかの実施形態では、キット中の生体試料を固定するために使用する薬剤は、核酸を保存するのに好適な固定液（複数可）である。一実施形態では、固定液は、ＦｉｎｅＦｉｘ（Ｋｏｔｈｍａｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．１３５：７４４－７５２，２０１１参照）である。一実施形態では、固定液は、Ｇｌｙｏ－ｆｉｘ（Ｌｙｋｉｄｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３５：ｅ８５，２００７参照）である。一実施形態では、固定液は、Ｈｉｓｔｏｃｈｏｉｃｅ（Ｖｉｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐａｔｈｏｌ．１５：１１９－１２９，１９９７参照）である。一実施形態では、固定液は、ＨＯＰＥ（Ｋｏｔｈｍａｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．１３５：７４４－７５２，２０１１参照）である。一実施形態では、固定液は、Ｎｅｏ－Ｆｉｘ（Ｐａａｖｉｌａｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．：Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．５８：２３７－２４６，２０１０参照）である。一実施形態では、固定液は、ＰＡＸｇｅｎｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｎｉｅｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．４６１：２５９－２６９，２０１２参照）である。一実施形態では、固定液は、ＲＣＬ２（ｖａｎ Ｅｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．６３：１０９０－１０９４，２０１０参照）である。一実施形態では、固定液は、Ｓｔｒｅｃｋ’ｓ Ｔｉｓｓｕｅ Ｆｉｘａｔｉｖｅ（Ｂｕｒｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．５７：２５７－２６４，２００９参照）である。一実施形態では、固定液は、ＵＭＦＩＸ（Ｎａｄｊｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｍｏｒｐｈｏｌ．１３：２７７－２８２，２００５参照）である。一実施形態では、固定液は、Ｚ７（Ｌｙｋｉｄｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３５：ｅ８５，２００７参照）である。一実施形態では、固定液は、ＺＢＦ（Ｐａａｖｉｌａｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．：Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．５８：２３７－２４６，２０１０参照）である。
【0202】
本明細書で提供されるキットは、アルデヒド含有固定液を含む。一実施形態では、キット中のアルデヒド含有固定液は、ホルムアルデヒドである。一実施形態では、キット中のアルデヒド含有固定液は、グルタルアルデヒドである。一実施形態では、キット中のアルデヒド含有固定液は、ピクリン酸、ホルムアルデヒド、及び酢酸の溶液である、Ｂｏｕｉｎ固定液である。一実施形態では、キット中のアルデヒド含有固定液は、ホルムアルデヒド及びグルタルアルデヒドの混合物である。一実施形態では、キット中のアルデヒド含有固定液は、エタノール、酢酸、及びホルムアルデヒドの溶液である、ＦＡＡである。一実施形態では、キット中のアルデヒド含有固定液は、パラホルムアルデヒド、Ｌリジン、及びＩＮａＯ４の溶液である、過ヨウ素酸－リジン－パラホルムアルデヒド（ＰＬＰ）である。一実施形態では、キット中のアルデヒド含有固定液は、リン酸緩衝ホルマリン（ＰＢＦ）である。一実施形態では、キット中のアルデヒド含有固定液は、ホルムアルデヒド及び塩化カルシウムの溶液である、ホルマール・カルシウムである。一実施形態では、キット中のアルデヒド含有固定液は、ホルムアルデヒド及び塩化ナトリウムの溶液である、ホルマール生理食塩水液である。一実施形態では、キット中のアルデヒド含有固定液は、ホルムアルデヒド及び硫酸亜鉛の溶液である、亜鉛ホルマリンである。一実施形態では、キット中のアルデヒド含有固定液は、ホルムアルデヒド、二クロム酸カリウム、硫酸ナトリウム、及び塩化水銀の溶液である、Ｈｅｌｌｙ固定液である。一実施形態では、キット中のアルデヒド含有固定液は、ホルムアルデヒド、酢酸銅、ピクリン酸、及び酢酸の溶液である、Ｈｏｌｌａｎｄｅ固定液である。一実施形態では、キット中のアルデヒド含有固定液は、ホルムアルデヒド、エタノール、ピクリン酸、及び氷酢酸の溶液である、Ｇｅｎｄｒｅ溶液である。一実施形態では、キット中のアルデヒド含有固定液は、ホルムアルデヒド、エタノール、及び酢酸カルシウムの溶液である、アルコール・ホルマリンである。一実施形態では、キット中のアルデヒド含有固定液は、ホルムアルデヒド、氷酢酸、及びエタノールの溶液である、ホルモール酢酸アルコールである。一実施形態では、キット中のアルデヒド含有固定液は固定液の混合物であり、混合物の少なくとも１種の固定液は、ホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒドである。一実施形態では、キット中のアルデヒド含有固定液は、同時に使用されないが逐次的に使用される固定液であり、少なくとも１種の固定液は、ホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒドである。
【0203】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキット中のアルデヒド含有固定液は、約５％～約５０％のホルムアルデヒドを含む。その他の実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約１０％～約４０％のホルムアルデヒドを含む。さらにその他の実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約１２％～約３７％のホルムアルデヒドを含む。
【0204】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキット中のアルデヒド含有固定液は、様々な濃度のホルムアルデヒドを含む。一実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約５％のホルムアルデヒドを含む。一実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約６％のホルムアルデヒドを含む。一実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約７％のホルムアルデヒドを含む。一実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約８％のホルムアルデヒドを含む。一実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約９％のホルムアルデヒドを含む。一実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約１０％のホルムアルデヒドを含む。一実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約１１％のホルムアルデヒドを含む。一実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約１２％のホルムアルデヒドを含む。一実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約１３％のホルムアルデヒドを含む。一実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約１４％のホルムアルデヒドを含む。一実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約１５％のホルムアルデヒドを含む。一実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約１６％のホルムアルデヒドを含む。一実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約１７％のホルムアルデヒドを含む。一実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約１８％のホルムアルデヒドを含む。一実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約１９％のホルムアルデヒドを含む。一実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約２０％のホルムアルデヒドを含む。一実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約３０％のホルムアルデヒドを含む。一実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約３５％のホルムアルデヒドを含む。一実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約４０％のホルムアルデヒドを含む。一実施形態では、アルデヒド含有固定液は、約５０％のホルムアルデヒドを含む。
【0205】
いくつかの実施形態では、本キットは、対象から生体試料を得るためのツールをさらに含む。特定の実施形態では、生体試料は組織検体である、または組織検体に由来する。特定の実施形態では、生体試料は血液試料である、または血液試料に由来する。特定の実施形態では、生体試料は細胞学的試料である、または細胞学的試料に由来する。
【0206】
いくつかの実施形態では、標的核酸はＤＮＡである。いくつかの実施形態では、標的核酸はＲＮＡである。いくつかの実施形態では、標的核酸は長鎖ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、標的核酸は短鎖ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、標的核酸は、１００未満のヌクレオチドを含むＲＮＡである。その他の実施形態では、標的核酸は、５０未満のヌクレオチドを含むＲＮＡである。その他の実施形態では、標的核酸は、１５～４０のヌクレオチドを含むＲＮＡである。いくつかの実施形態では、標的核酸はｓｎｃＲＮＡである。その他の実施形態では、標的核酸は、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡまたはＡＳＯである。さらに他の実施形態では、標的核酸は、内因性ＲＮＡまたは外因性ＲＮＡである。
【0207】
特定の実施形態では、本明細書において提供されるキットは、例えば、米国特許第７，７０９，１９８号、同第８，６０４，１８２号、及び同第８，９５１，７２６号により詳細に記載されている、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）を実行するための薬剤を含む。いくつかの実施形態では、本キットは、標的核酸にハイブリダイズできる１つ以上の標的プローブ（複数可）の少なくとも１セットと、上記１つ以上の標的プローブ（複数可）のセットにハイブリダイズできるシグナル生成複合体とを含み、上記シグナル生成複合体は、標識プローブ、及び上記１つ以上の標的プローブ（複数可）のセットにハイブリダイズできる核酸成分を含む。
【0208】
いくつかの実施形態では、標的プローブ（複数可）は、標的（Ｔ）セクションと標識（Ｌ）セクションとを備え、Ｔセクションは標的核酸上のセクションに相補的な核酸配列であり、Ｌセクションはシグナル生成複合体の核酸成分上のセクションに相補的な核酸配列であり、１つ以上の標的プローブ（複数可）のＴセクションは標的核酸の非重複領域に相補的であり、１つ以上の標的プローブ（複数可）のＬセクションは生成複合体の核酸成分の非重複領域に相補的である。
【0209】
いくつかの実施形態では、本キットは、上記のセクション５．３に記載されるようなシグナル生成複合体をさらに含み、この複合体は標識プローブ、増幅剤、プレ増幅剤、及び／またはプレ－プレ増幅剤を含み得る。
【0210】
いくつかの実施形態では、本キットは、ハイブリダイゼーションの準備のために試料を処理する固定剤及び薬剤、ならびに試料を洗浄するための薬剤など、ＲＮＡ ＩＳＨを実行するためのその他の薬剤または材料をさらに含む。
【0211】
本キットは、本キットの構成成分を収容する物理構造を意味する「梱包材料」をさらに含んでもよい。梱包材料は、構成成分を無菌的に維持することができ、そのような目的のために通常用いられる材料で製造することができる（例えば紙、波形繊維、ガラス、プラスチック、ホイル、アンプル、バイアル、管など）。
【0212】
本明細書において提供されるキットは、ラベルまたは挿入紙を含むことができる。ラベルまたは挿入紙は、キット構成成分が使用される目的となり得る状態、障害、疾患、または症状についての情報を含む。ラベルまたは挿入紙は、臨床医または対象が、方法、治療プロトコル、または治療レジメンにおいて、キット構成成分のうちの１つ以上を使用するための取扱い説明書を含み得る。いくつかの実施形態では、本キットは、組織及び細胞型の識別に使用できる。いくつかの実施形態では、本キットは、発生の異なる段階の識別に使用できる。いくつかの実施形態では、本キットは、がんの臨床バイオマーカーの検出に使用できる。いくつかの実施形態では、本キットは、１つ以上の変性した低分子ＲＮＡの発現、または病原体由来の低分子ＲＮＡの存在に基づき、疾患または障害を診断するのに使用できる。いくつかの実施形態では、本キットは、成人組織の特性決定に使用できる。いくつかの実施形態では、本キットは、病原体診断用の臨床バイオマーカーの検出に使用できる。いくつかの実施形態では、本キットは、低分子ＲＮＡベースの治療の検出及び特性決定に使用できる。いくつかの実施形態では、本キットは、低分子ＲＮＡベースの治療の初期の有効性確認のために使用できる。いくつかの実施形態では、本キットは、低分子ＲＮＡベースの治療の有効性を監視し続けるために使用できる。いくつかの実施形態では、本キットは、低分子ＲＮＡベースの治療の有効性を決定するために使用できる。いくつかの実施形態では、本キットは、ｓｉＲＮＡの存在の検出、局在化及び定量化に使用できる。いくつかの実施形態では、本キットは、ＡＳＯ分子の存在の検出、局在化及び定量化に使用できる。いくつかの実施形態では、本キットは、病原体由来の低分子ＲＮＡの検出及び識別のために使用できる。
【0213】
〔実施例〕
以下は、研究に用いられる各種方法及び材料の記載であり、本発明をどのように作製及び使用するかの完全な開示及び説明を当業者に提供するように提示され、本発明者が自身の発明とみなすものの範囲を限定することを意図しておらず、また下記の実験が実施されたものであり、実施され得る実験の全てであると示すことを意図していない。現在形で書かれた例示的な記載は、必ずしも実行されたというわけではなく、むしろ、これらの記載を実行して、本開示の教示に関連するデータなどを作成することができると理解すべきである。使用される数値（例えば、量、パーセンテージなど）に対する正確さを確保する努力がなされているが、いくつかの実験誤差及びばらつきが考慮されるべきである。
以下は、研究に用いられる各種方法及び材料の記載であり、本発明をどのように作製及び使用するかの完全な開示及び説明を当業者に提供するように提示され、本発明者が自身の発明とみなすものの範囲を限定することを意図しておらず、また下記の実験が実施されたものであり、実施され得る実験の全てであると示すことを意図していない。現在形で書かれた例示的な記載は、必ずしも実行されたというわけではなく、むしろ、これらの記載を実行して、本開示の教示に関連するデータなどを作成することができると理解すべきである。使用される数値（例えば、量、パーセンテージなど）に対する正確さを確保する努力がなされているが、いくつかの実験誤差及びばらつきが考慮されるべきである。
【0214】
６．１ 標準的なＲＮＡ ＩＳＨワークフローにおける、低分子核酸保存のための後固定戦略の組み込み
従来通りに保存された生物検体は標準的な脱パラフィン工程に従っており、パラフィンワックスを溶解させるために試料を加熱し、続いて一連のキシレン及びエタノール洗浄を行い、全てのワックスの痕跡を除去する。この工程では、低分子核酸の喪失につながる。試料の前処理及びハイブリダイゼーション／洗浄工程の間の、拡散による喪失を最小限にするために、試料の前処理の前に、アルデヒド含有固定液を用いて、最低２時間、周囲温度にて検体を後固定する。２時間未満の時間、後固定した試料では、これらの核酸種の最小限の保持を観察した。最適な保持は、採用した固定液に応じて２～１８時間の後固定の間に観察した。約１２％に等しい、またはより高い濃度のホルムアルデヒドで後固定した生物検体は、短時間（２時間）の固定液への曝露のみを必要とし、一方で約１２％未満の濃度のホルムアルデヒド、例えば１０％中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）では、より長時間（１８時間）の処理を必要とした。後固定ワークフローに従った試料は、試料の前処理、標的プローブハイブリダイゼーション、及び検出を含む、概説される汎用ＩＳＨワークフローの後続の工程と、完全な適合性を有する。
従来通りに保存された生物検体は標準的な脱パラフィン工程に従っており、パラフィンワックスを溶解させるために試料を加熱し、続いて一連のキシレン及びエタノール洗浄を行い、全てのワックスの痕跡を除去する。この工程では、低分子核酸の喪失につながる。試料の前処理及びハイブリダイゼーション／洗浄工程の間の、拡散による喪失を最小限にするために、試料の前処理の前に、アルデヒド含有固定液を用いて、最低２時間、周囲温度にて検体を後固定する。２時間未満の時間、後固定した試料では、これらの核酸種の最小限の保持を観察した。最適な保持は、採用した固定液に応じて２～１８時間の後固定の間に観察した。約１２％に等しい、またはより高い濃度のホルムアルデヒドで後固定した生物検体は、短時間（２時間）の固定液への曝露のみを必要とし、一方で約１２％未満の濃度のホルムアルデヒド、例えば１０％中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）では、より長時間（１８時間）の処理を必要とした。後固定ワークフローに従った試料は、試料の前処理、標的プローブハイブリダイゼーション、及び検出を含む、概説される汎用ＩＳＨワークフローの後続の工程と、完全な適合性を有する。
【0215】
６．２ ｍｉＲＮＡ検出のための、１２％に等しい、またはより高い濃度のホルムアルデヒドによる後固定
ホルムアルデヒドによる後固定によって、ｍｉＲＮＡの喪失が最小限となり、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）ＩＳＨによる検出感度が向上する。マウスのホルマリン固定パラフィン包埋組織切片を未処理にした、または１Ｘ ＰＢＳ中で調製した約１２％～約３７％の範囲の濃度のホルムアルデヒドで、周囲温度にて２時間、後固定した。約１２％に等しい、またはより高い濃度のホルムアルデヒドで、２時間後固定したときに、ｍｉＲＮＡの保持が最大化するという結果になる。ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）２．５ Ｈｉｇｈ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ（ＨＤ）－Ｒｅｄ Ａｓｓａｙを使用して、ホルマリン固定パラフィン包埋組織処理用の確立された条件に従って、特定のｍｉＲＮＡを検出した。ＩＳＨシグナルは斑点として現れ、ヘマトキシリンは個々の細胞核を染色する。図２Ａに示すとおり、後固定処理の後に、心臓に豊富に発現するｍｉＲ－１ａ－３ｐを検出した。図２Ｂに示すとおり、後固定処理の後に、脳に豊富に発現するｍｉＲ－１３２－３ｐを検出した。後固定の不存在下では、ｍｉＲＮＡは組織から拡散して検出不可能であり、心臓及び脳組織において斑点が見られないことが証拠となっている。これに対して、後固定した組織内では斑点の形成が観察され、本明細書において、本開示の有効性を示している。ホルムアルデヒドの濃度を１２％から３７％に高めても、組織全体に同様の斑点の数が観察されたように、ｍｉＲＮＡ検出感度にさらなる利点は観察されなかった。
ホルムアルデヒドによる後固定によって、ｍｉＲＮＡの喪失が最小限となり、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）ＩＳＨによる検出感度が向上する。マウスのホルマリン固定パラフィン包埋組織切片を未処理にした、または１Ｘ ＰＢＳ中で調製した約１２％～約３７％の範囲の濃度のホルムアルデヒドで、周囲温度にて２時間、後固定した。約１２％に等しい、またはより高い濃度のホルムアルデヒドで、２時間後固定したときに、ｍｉＲＮＡの保持が最大化するという結果になる。ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）２．５ Ｈｉｇｈ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ（ＨＤ）－Ｒｅｄ Ａｓｓａｙを使用して、ホルマリン固定パラフィン包埋組織処理用の確立された条件に従って、特定のｍｉＲＮＡを検出した。ＩＳＨシグナルは斑点として現れ、ヘマトキシリンは個々の細胞核を染色する。図２Ａに示すとおり、後固定処理の後に、心臓に豊富に発現するｍｉＲ－１ａ－３ｐを検出した。図２Ｂに示すとおり、後固定処理の後に、脳に豊富に発現するｍｉＲ－１３２－３ｐを検出した。後固定の不存在下では、ｍｉＲＮＡは組織から拡散して検出不可能であり、心臓及び脳組織において斑点が見られないことが証拠となっている。これに対して、後固定した組織内では斑点の形成が観察され、本明細書において、本開示の有効性を示している。ホルムアルデヒドの濃度を１２％から３７％に高めても、組織全体に同様の斑点の数が観察されたように、ｍｉＲＮＡ検出感度にさらなる利点は観察されなかった。
【0216】
６．３ ｍｉＲＮＡ検出のための、１０％ＮＢＦによる後固定
マウスのホルマリン固定パラフィン包埋組織切片を未処理とした、または蒸留水及び中性ｐＨのためのリン酸ナトリウム中で調製した最も一般的に使用されている約４％のホルムアルデヒド含有量を有するアルデヒド含有固定液である１０％ＮＢＦによって、周囲温度で１８時間、後固定した。インキュベーション時間が短いと、組織でのｍｉＲＮＡ保持は最適状態に及ばないという結果になる。ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）２．５ Ｈｉｇｈ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ（ＨＤ）－Ｒｅｄ Ａｓｓａｙによって、ホルマリン固定パラフィン包埋組織処理用の確立された条件に従って、心臓に豊富に発現するｍｉＲ－１ａ－３ｐ（図３Ａ）、脳に豊富に発現するｍｉＲ－１３２－３ｐ（図３Ｂ）、肝臓に豊富に発現するｍｉＲ－１２２－５ｐ（図３Ｃ）及び偏在的に発現するｌｅｔ－７（図３Ｄ）を検出した。ＩＳＨアッセイに後固定工程を組み込むと、未処理のままにした組織と比較して、低分子核酸の優れた検出感度（斑点形成として示される）が得られる。
マウスのホルマリン固定パラフィン包埋組織切片を未処理とした、または蒸留水及び中性ｐＨのためのリン酸ナトリウム中で調製した最も一般的に使用されている約４％のホルムアルデヒド含有量を有するアルデヒド含有固定液である１０％ＮＢＦによって、周囲温度で１８時間、後固定した。インキュベーション時間が短いと、組織でのｍｉＲＮＡ保持は最適状態に及ばないという結果になる。ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）２．５ Ｈｉｇｈ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ（ＨＤ）－Ｒｅｄ Ａｓｓａｙによって、ホルマリン固定パラフィン包埋組織処理用の確立された条件に従って、心臓に豊富に発現するｍｉＲ－１ａ－３ｐ（図３Ａ）、脳に豊富に発現するｍｉＲ－１３２－３ｐ（図３Ｂ）、肝臓に豊富に発現するｍｉＲ－１２２－５ｐ（図３Ｃ）及び偏在的に発現するｌｅｔ－７（図３Ｄ）を検出した。ＩＳＨアッセイに後固定工程を組み込むと、未処理のままにした組織と比較して、低分子核酸の優れた検出感度（斑点形成として示される）が得られる。
【0217】
６．４ 長鎖ＲＮＡ種の検出のための、ホルムアルデヒドによる後固定
後固定ワークフローは、長鎖ＲＮＡ種の検出に完全な適合性があることが示されている。ヒト及びマウスのホルマリン固定パラフィン包埋組織を未処理とした、または１０％ＮＢＦによって後固定し、図１に概説した汎用ＩＳＨワークフローを用いて処理を続けた。図４Ａに示すとおり、未処理であった、またはＮＢＦの後固定を行ったヒト皮膚Ａ４３１細胞において、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）２．５ Ｈｉｇｈ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ（ＨＤ）－Ｒｅｄ Ａｓｓａｙを使用して、ヒトＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）ｍＲＮＡを検出した。ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）２．５ Ｈｉｇｈ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ（ＨＤ）－Ｒｅｄ Ａｓｓａｙを使用して、マウスの腸組織（図４Ｂ）及び脳組織（図４Ｃ）のそれぞれにおいて、マウスポリメラーゼＲＮＡ ＩＩポリペプチドＡ（ＰＯＬＲ２Ａ）ｍＲＮＡを検出した。未処理の組織と後固定した組織で長鎖ＲＮＡ種の類似した検出感度を観察した。これは低分子ＲＮＡ種は、この代替的なＩＳＨワークフローから好ましく利益を得られるが、長鎖ＲＮＡ種の検出は、この代替的なＩＳＨワークフローによって損なわれるわけではないことを示唆している。
後固定ワークフローは、長鎖ＲＮＡ種の検出に完全な適合性があることが示されている。ヒト及びマウスのホルマリン固定パラフィン包埋組織を未処理とした、または１０％ＮＢＦによって後固定し、図１に概説した汎用ＩＳＨワークフローを用いて処理を続けた。図４Ａに示すとおり、未処理であった、またはＮＢＦの後固定を行ったヒト皮膚Ａ４３１細胞において、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）２．５ Ｈｉｇｈ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ（ＨＤ）－Ｒｅｄ Ａｓｓａｙを使用して、ヒトＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）ｍＲＮＡを検出した。ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）２．５ Ｈｉｇｈ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ（ＨＤ）－Ｒｅｄ Ａｓｓａｙを使用して、マウスの腸組織（図４Ｂ）及び脳組織（図４Ｃ）のそれぞれにおいて、マウスポリメラーゼＲＮＡ ＩＩポリペプチドＡ（ＰＯＬＲ２Ａ）ｍＲＮＡを検出した。未処理の組織と後固定した組織で長鎖ＲＮＡ種の類似した検出感度を観察した。これは低分子ＲＮＡ種は、この代替的なＩＳＨワークフローから好ましく利益を得られるが、長鎖ＲＮＡ種の検出は、この代替的なＩＳＨワークフローによって損なわれるわけではないことを示唆している。
【0218】
前述から、具体的な実施形態を例示の目的で本明細書に記載してきたが、本明細書で提供されるものの趣旨及び範囲を逸脱することなく、種々の変更がなされ得ることを理解されたい。上記に言及される全ての参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【図面の簡単な説明】
【0219】
【図1】標準的なＲＮＡ ＩＳＨワークフローにおける、後固定工程の組み込みを示す。標準的なＲＮＡ ＩＳＨワークフローに存在しない後固定工程は、二重囲みボックスでラベルをつけている。
【図2A】１２％に等しい、またはより高いホルムアルデヒドを用いた後固定によって、ｍｉＲＮＡ喪失が最小限となり、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）ＩＳＨによる検出感度が向上したことを示す。マウスのホルマリン固定パラフィン包埋組織切片を未処理にした、または１２％～３７％の範囲の濃度のホルムアルデヒドで後固定した。ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）２．５ Ｈｉｇｈ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ（ＨＤ）－Ｒｅｄ Ａｓｓａｙを使用して、ホルマリン固定パラフィン包埋組織処理用の確立された条件に従って、２種のｍｉＲＮＡを検出した。ＩＳＨシグナルは斑点として現れ、ヘマトキシリンは個々の細胞核を染色する。後固定工程後の、心臓に豊富に発現するｍｉＲ－１ａ－３ｐの検出を示す図である。
【図2B】１２％に等しい、またはより高いホルムアルデヒドを用いた後固定によって、ｍｉＲＮＡ喪失が最小限となり、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）ＩＳＨによる検出感度が向上したことを示す。マウスのホルマリン固定パラフィン包埋組織切片を未処理にした、または１２％～３７％の範囲の濃度のホルムアルデヒドで後固定した。ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）２．５ Ｈｉｇｈ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ（ＨＤ）－Ｒｅｄ Ａｓｓａｙを使用して、ホルマリン固定パラフィン包埋組織処理用の確立された条件に従って、２種のｍｉＲＮＡを検出した。ＩＳＨシグナルは斑点として現れ、ヘマトキシリンは個々の細胞核を染色する。脳に豊富に発現するｍｉＲ－１３２－３ｐの検出を示す図である。
【図3A】約４％のホルムアルデヒド含有量を有する、１０％中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）を用いた後固定によって、ｍｉＲＮＡ喪失が最小限となり、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）ＩＳＨによる検出感度が向上したことを示す。マウスのホルマリン固定パラフィン包埋組織切片を未処理にした、または１０％ＮＢＦで後固定した。ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）２．５ Ｈｉｇｈ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ（ＨＤ）－Ｒｅｄ Ａｓｓａｙを使用して、ホルマリン固定パラフィン包埋組織処理用の確立された条件に従って、複数種のｍｉＲＮＡを検出した。ＩＳＨシグナルは斑点として現れ、ヘマトキシリンは個々の細胞核を染色する。後固定工程後の、心臓に豊富に発現するｍｉＲ－１ａ－３ｐの検出を示す図である。
【図3B】約４％のホルムアルデヒド含有量を有する、１０％中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）を用いた後固定によって、ｍｉＲＮＡ喪失が最小限となり、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）ＩＳＨによる検出感度が向上したことを示す。マウスのホルマリン固定パラフィン包埋組織切片を未処理にした、または１０％ＮＢＦで後固定した。ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）２．５ Ｈｉｇｈ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ（ＨＤ）－Ｒｅｄ Ａｓｓａｙを使用して、ホルマリン固定パラフィン包埋組織処理用の確立された条件に従って、複数種のｍｉＲＮＡを検出した。ＩＳＨシグナルは斑点として現れ、ヘマトキシリンは個々の細胞核を染色する。後固定工程後の、脳に豊富に発現するｍｉＲ－１３２－３ｐの検出を示す図である。
【図3C】約４％のホルムアルデヒド含有量を有する、１０％中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）を用いた後固定によって、ｍｉＲＮＡ喪失が最小限となり、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）ＩＳＨによる検出感度が向上したことを示す。マウスのホルマリン固定パラフィン包埋組織切片を未処理にした、または１０％ＮＢＦで後固定した。ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）２．５ Ｈｉｇｈ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ（ＨＤ）－Ｒｅｄ Ａｓｓａｙを使用して、ホルマリン固定パラフィン包埋組織処理用の確立された条件に従って、複数種のｍｉＲＮＡを検出した。ＩＳＨシグナルは斑点として現れ、ヘマトキシリンは個々の細胞核を染色する。後固定工程後の、肝臓に豊富に発現するｍｉＲ－１２２－５ｐの検出を示す図である。
【図3D】約４％のホルムアルデヒド含有量を有する、１０％中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）を用いた後固定によって、ｍｉＲＮＡ喪失が最小限となり、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）ＩＳＨによる検出感度が向上したことを示す。マウスのホルマリン固定パラフィン包埋組織切片を未処理にした、または１０％ＮＢＦで後固定した。ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）２．５ Ｈｉｇｈ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ（ＨＤ）－Ｒｅｄ Ａｓｓａｙを使用して、ホルマリン固定パラフィン包埋組織処理用の確立された条件に従って、複数種のｍｉＲＮＡを検出した。ＩＳＨシグナルは斑点として現れ、ヘマトキシリンは個々の細胞核を染色する。後固定工程後の、偏在して発現するｌｅｔ－７の検出を示す図である。
【図4A】後固定ワークフローが、長鎖ＲＮＡ種の検出への完全な適合性があったことを示す。ヒト及びマウスのホルマリン固定パラフィン包埋組織を未処理とした、または１０％ＮＢＦによって後固定し、図１に概説した汎用ＩＳＨワークフローを用いて処理を続けた。ヒト皮膚Ａ４３１細胞において、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）２．５ Ｈｉｇｈ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ（ＨＤ）－Ｒｅｄ Ａｓｓａｙを使用して、ヒトＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）ｍＲＮＡを検出したことを示す図である。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【国際調査報告】