特表 2023-521383 ＫＲＡＳの阻害のためのＲＮＡ干渉およびアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用する方法および組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-05-24

(54)【発明の名称】ＫＲＡＳの阻害のためのＲＮＡ干渉およびアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用する方法および組成物

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20230517BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20230517BHJP

   A61K 31/7125 20060101ALI20230517BHJP

   A61K 31/712 20060101ALI20230517BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20230517BHJP

   C12N 9/14 20060101ALN20230517BHJP

【ＦＩ】

C12N15/113 110Z

A61K31/713

A61K31/7125

A61K31/712

A61K48/00

C12N9/14 ZNA

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022561542

(86)(22)【出願日】2021-04-07

(85)【翻訳文提出日】2022-12-06

(86)【国際出願番号】 US2021026147

(87)【国際公開番号】W WO2021207339

(87)【国際公開日】2021-10-14

(31)【優先権主張番号】16/842,404

(32)【優先日】2020-04-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】500093834

【氏名又は名称】ザ・ユニヴァーシティ・オヴ・ノース・キャロライナ・アト・チャペル・ヒル

(74)【代理人】

【識別番号】100099623

【弁理士】

【氏名又は名称】奥山 尚一

(74)【代理人】

【識別番号】100125380

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 綾子

(74)【代理人】

【識別番号】100142996

【弁理士】

【氏名又は名称】森本 聡二

(74)【代理人】

【識別番号】100166268

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 祐

(74)【代理人】

【識別番号】100180231

【弁理士】

【氏名又は名称】水島 亜希子

(72)【発明者】

【氏名】ペコット，チャド

(72)【発明者】

【氏名】アザム，サルマ・エイチ．

【テーマコード（参考）】

4B050

4C084

4C086

【Ｆターム（参考）】

4B050DD11

4B050LL01

4C084AA13

4C084NA14

4C084ZB26

4C086AA01

4C086AA02

4C086AA03

4C086EA16

4C086NA14

4C086ZB26

(57)【要約】

本発明は、ＲＮＡ干渉、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび化学修飾オリゴヌクレオチドを使用する突然変異体ＫＲＡＳ配列の発現の阻害に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ミスセンス突然変異Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２ＤおよびＧ１３Ｄをコードする合成のヒトＫＲＡＳ－ｍＲＮＡへ標的化されたアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、長さが１６～２５ヌクレオチドであり、配列TCTTGCCTACGTCATA（配列番号１１４）を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド。

【請求項2】

長さが２０ヌクレオチドである、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

【請求項3】

配列CACTCTTGCCTACGTCATAA（配列番号１１５）からなる、請求項１または２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

【請求項4】

配列GCACTCTTGCCTACGTCATA（配列番号１１６）からなる、請求項１または２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

【請求項5】

少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

【請求項6】

ホスホロチオエート結合のみを含む、請求項５に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

【請求項7】

５’末端および／または３’末端において、またはその付近に、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１～６のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

【請求項8】

５’末端および３’末端の各々において、少なくとも３つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項７に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

【請求項9】

前記修飾ヌクレオチドが、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）修飾ヌクレオチドである、請求項７または８に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

【請求項10】

５’末端および／または３’末端の各々において、少なくとも３つの２’－ＭＯＥ修飾ヌクレオチドを含む、請求項９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

【請求項11】

【化1】

（配列中、＊は、ホスホロチオエート結合を示し、太字は、２’－ＭＯＥ修飾ヌクレオチドを示す）
から選択される配列からなる、請求項１０に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

【請求項12】

少なくとも１つの修飾ヌクレオチドが、ロックド核酸である、請求項７～９のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

【請求項13】

Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２ＶおよびＧ１３Ｄから選択される突然変異をコードする天然のヒトＫＲＡＳ－ｍＲＮＡへ標的化されたアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、長さが１６～２５ヌクレオチドであり、
ａ）Ｇ１２Ｃ突然変異をコードするヒトＫＲＡＳ－ｍＲＮＡへ標的化されたTCTTGCCTACGCCACA（配列番号１１７）、
ｂ）Ｇ１２Ｄ突然変異をコードするヒトＫＲＡＳ－ｍＲＮＡへ標的化されたTCTTGCCTACGCCATC（配列番号１１８）、
ｃ）Ｇ１２Ｖ突然変異をコードするヒトＫＲＡＳ－ｍＲＮＡへ標的化されたTCTTGCCTACGCCAAC（配列番号１１９）、
ｄ）Ｇ１３Ｄ突然変異をコードするヒトＫＲＡＳ－ｍＲＮＡへ標的化されたTCTTGCCTACGTCACC（配列番号１２０）、または
ｅ）ａ）～ｄ）のうちのいずれか１つと少なくとも９０％同一の配列
から選択される配列を含み、少なくとも１つの非天然化学修飾を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド。

【請求項14】

長さが２０ヌクレオチドである、請求項１３に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

【請求項15】

ａ）Ｇ１２Ｃ突然変異をコードするヒトＫＲＡＳ－ｍＲＮＡへ標的化されたGCACTCTTGCCTACGCCACA（配列番号１１７）、
ｂ）Ｇ１２Ｄ突然変異をコードするヒトＫＲＡＳ－ｍＲＮＡへ標的化されたGCACTCTTGCCTACGCCATC（配列番号１１８）、
ｃ）Ｇ１２Ｖ突然変異をコードするヒトＫＲＡＳ－ｍＲＮＡへ標的化されたGCACTCTTGCCTACGCCAAC（配列番号１１９）、または
ｄ）Ｇ１３Ｄ突然変異をコードするヒトＫＲＡＳ－ｍＲＮＡへ標的化されたGCACTCTTGCCTACGTCACC（配列番号１２０）
から選択される配列からなる、請求項１３または１４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

【請求項16】

少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含む、請求項１３～１５のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

【請求項17】

ホスホロチオエート結合のみを含む、請求項１６に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

【請求項18】

５’末端および／または３’末端において、またはその付近に、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１３～１７のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

【請求項19】

５’末端および３’末端の各々において、少なくとも３つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１８に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

【請求項20】

前記修飾ヌクレオチドが、２’－ＭＯＥ修飾ヌクレオチドである、請求項１８または１９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

【請求項21】

５’末端および／または３’末端の各々において、少なくとも３つの２’－ＭＯＥ修飾ヌクレオチドを含む、請求項２０に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

【請求項22】

【化2】

（配列中、＊は、ホスホロチオエート結合を示し、太字は、２’－ＭＯＥ修飾ヌクレオチドを示す）
から選択される配列からなる、請求項２１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

【請求項23】

少なくとも１つの修飾ヌクレオチドが、ロックド核酸である、請求項１８～２０のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

【請求項24】

【化3】

（配列中、＊は、ホスホロチオエート結合を示し、太字は、２’－メトキシメチル修飾ヌクレオチドを示し、＋は、その後続のヌクレオチドがロックド核酸であることを示す）
から選択される配列からなる、請求項２３に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

【請求項25】

請求項１～４または１３～１５のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む核酸構築物。

【請求項26】

請求項１～４または１３～１５のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする核酸分子。

【請求項27】

請求項２６に記載の核酸分子を含む核酸構築物。

【請求項28】

Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２ＶまたはＧ１３Ｄから選択される突然変異をコードする天然のヒトＫＲＡＳ－ｍＲＮＡへ標的化されたｓｉＲＮＡ分子であって、少なくとも１つの化学修飾を含み、
配列番号１２８のセンス鎖および配列番号１２９のアンチセンス鎖、
配列番号１３０のセンス鎖および配列番号１３１のアンチセンス鎖、
配列番号１３２のセンス鎖および配列番号１３３のアンチセンス鎖、
配列番号１３４のセンス鎖および配列番号１３５のアンチセンス鎖、
配列番号１３６のセンス鎖および配列番号１３７のアンチセンス鎖、
配列番号１３８のセンス鎖および配列番号１３９のアンチセンス鎖、
配列番号１４０のセンス鎖および配列番号１４１のアンチセンス鎖、
配列番号１４２のセンス鎖および配列番号１４３のアンチセンス鎖、
配列番号１４４のセンス鎖および配列番号１４５のアンチセンス鎖、
配列番号１４６のセンス鎖および配列番号１４７のアンチセンス鎖、
配列番号１４８のセンス鎖および配列番号１４９のアンチセンス鎖、
配列番号１５０のセンス鎖および配列番号１５１のアンチセンス鎖、
配列番号１５２のセンス鎖および配列番号１５３のアンチセンス鎖、
配列番号１５４のセンス鎖および配列番号１５５のアンチセンス鎖、
配列番号１５６のセンス鎖および配列番号１５７のアンチセンス鎖、もしくは
配列番号１５８のセンス鎖および配列番号１５９のアンチセンス鎖
の配列対のうちの１つ、またはこれらと少なくとも９０％同一の配列を含むｓｉＲＮＡ分子。

【請求項29】

完全に化学修飾されている、請求項２８に記載のｓｉＲＮＡ分子。

【請求項30】

前記ｓｉＲＮＡ分子における各ヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチル基または２’－フルオロ基により修飾されている、請求項２９に記載のｓｉＲＮＡ分子。

【請求項31】

少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含む、請求項２８～３０のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ分子。

【請求項32】

センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
配列番号７８のセンス鎖および配列番号７９のアンチセンス鎖、
配列番号８０のセンス鎖および配列番号８１のアンチセンス鎖、
配列番号８２のセンス鎖および配列番号８３のアンチセンス鎖、
配列番号８４のセンス鎖および配列番号８５のアンチセンス鎖、
配列番号８６のセンス鎖および配列番号８７のアンチセンス鎖、
配列番号８８のセンス鎖および配列番号８９のアンチセンス鎖、
配列番号９０のセンス鎖および配列番号９１のアンチセンス鎖、
配列番号９２のセンス鎖および配列番号９３のアンチセンス鎖、
配列番号９４のセンス鎖および配列番号９５のアンチセンス鎖、
配列番号９６のセンス鎖および配列番号９７のアンチセンス鎖、
配列番号９８のセンス鎖および配列番号９９のアンチセンス鎖、
配列番号１００のセンス鎖および配列番号１０１のアンチセンス鎖、
配列番号１０２のセンス鎖および配列番号１０３のアンチセンス鎖、
配列番号１０４のセンス鎖および配列番号１０５のアンチセンス鎖、
配列番号１０６のセンス鎖および配列番号１０７のアンチセンス鎖、
配列番号１０８のセンス鎖および配列番号１０９のアンチセンス鎖、
配列番号１６２のセンス鎖および配列番号１６３のアンチセンス鎖、
配列番号１６４のセンス鎖および配列番号１６５のアンチセンス鎖、
配列番号１６６のセンス鎖および配列番号１６７のアンチセンス鎖、
配列番号１６８のセンス鎖および配列番号１６９のアンチセンス鎖、
配列番号１７０のセンス鎖および配列番号１７１のアンチセンス鎖、
配列番号１７２のセンス鎖および配列番号１７３のアンチセンス鎖、
配列番号１７４のセンス鎖および配列番号１７５のアンチセンス鎖、
配列番号１７６のセンス鎖および配列番号１７７のアンチセンス鎖、
配列番号１７８のセンス鎖および配列番号１７９のアンチセンス鎖、
配列番号１８０のセンス鎖および配列番号１８１のアンチセンス鎖、
配列番号１８２のセンス鎖および配列番号１８３のアンチセンス鎖、または
配列番号１８４のセンス鎖および配列番号１８５のアンチセンス鎖
の配列対のうちの１つを含む、請求項２８から３１のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ分子。

【請求項33】

ヒトＫＲＡＳ－ｍＲＮＡへ標的化されたｓｉＲＮＡ分子であって、ｓｉＲＮＡのセンス鎖が、配列番号５０または配列番号５１の配列を含み、前記ｓｉＲＮＡが、少なくとも１つの非天然化学修飾を含む、ｓｉＲＮＡ分子。

【請求項34】

前記ｓｉＲＮＡが、化学修飾されている、請求項３３に記載のｓｉＲＮＡ分子。

【請求項35】

前記ｓｉＲＮＡが、完全に化学修飾されている、請求項３４に記載のｓｉＲＮＡ分子。

【請求項36】

前記ｓｉＲＮＡ分子における各ヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチル基または２’－フルオロ基により修飾されている、請求項３５に記載のｓｉＲＮＡ分子。

【請求項37】

少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含む、請求項３３～３６のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ分子。

【請求項38】

センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
配列番号１１０のセンス鎖および配列番号１１１のアンチセンス鎖、または
配列番号１１２のセンス鎖および配列番号１１３のアンチセンス鎖
の配列対の１つを含む、請求項３３～３７のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ分子。

【請求項39】

請求項１～２４のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは請求項２８～３８のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡを含む組成物。

【請求項40】

請求項１～２４のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは請求項２８～３８のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡのうちの２つまたはそれ以上を任意の組合せで含む組成物であって、２つまたはそれ以上の前記アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡ各々が異なる配列を含む、組成物。

【請求項41】

ナノ粒子をさらに含む、請求項３９または４０に記載の組成物。

【請求項42】

前記ナノ粒子が、ナノリポソームである、請求項４１に記載の組成物。

【請求項43】

請求項１～２４のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、請求項２５もしくは２７に記載の核酸構築物、請求項２８～３８のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ、および／または請求項３９～４２のいずれか１項に記載の組成物と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。

【請求項44】

細胞においてミスセンス突然変異Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２ＶおよびＧ１３Ｄのうちの１つまたは複数を含む変異ヒトＫＲＡＳ遺伝子の発現を阻害する方法であって、請求項１～２４のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、請求項２５もしくは２７に記載の核酸構築物、請求項２８～３８のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ、請求項３９～４２のいずれか１項に記載の組成物、および／または請求項４３に記載の医薬組成物と前記細胞を接触させるステップを含み、これによって、前記細胞において前記変異ヒトＫＲＡＳ遺伝子の発現を阻害する、方法。

【請求項45】

がんの処置を必要とする対象においてがんを処置する方法であって、前記がんが、ミスセンス突然変異Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２ＶおよびＧ１３Ｄのうちの１つまたは複数を含む変異ヒトＫＲＡＳ遺伝子を含み、前記方法が、請求項１から２４のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、請求項２５もしくは２７に記載の核酸構築物、請求項２８から３８のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ、請求項３９から４２のいずれか１項に記載の組成物、および／または請求項４３に記載の医薬組成物を前記対象へ送達するステップを含み、これによって、前記対象においてがんを処置する、方法。

【請求項46】

前記送達が、全身性送達である、請求項４５に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

［優先権についての記載］
本出願は、２０２０年４月７日出願の米国出願第１６／８４２，４０４号の利益を主張し、当該出願の全内容は、その全体を参照することにより本明細書の一部をなすものとする。

【0002】

本発明は、ＲＮＡ干渉、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび化学修飾オリゴヌクレオチドを使用する突然変異体ＫＲＡＳ配列の発現の阻害に関する。

【背景技術】

【0003】

１９８２年の発見以来、ＲＡＳファミリーの遺伝子は、重要なクラスのがん原遺伝子として特徴付けられている（Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．１３：８２８（２０１４））。３０年間の広範な研究を通して、ある特定のＲＡＳ遺伝子（ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳおよびＨＲＡＳ）の突然変異性活性化は、すべてのがんのほぼ３分の１において関係があるとされている（Ｐｅｃｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．１３：２８７６（２０１４））。特に、ＫＲＡＳ突然変異は、最も頻繁に、排他的にも、他のＲＡＳアイソフォームと関係しても、観察されている（Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．１３：８２８（２０１４））。さらに、この非常に優勢な突然変異についての阻害剤を開発しようとする努力にもかかわらず、強力な治療薬候補は出現しておらず、したがって、ＫＲＡＳ遺伝子は、とらえどころのない「新薬開発不可能な」標的と評されている。

【0004】

ＲＡＳ遺伝子は、下流のエフェクタータンパク質に対して作用して細胞生存、成長および増殖を促進させる、低分子量ＧＴＰアーゼファミリーをコードする（Ｋｈｏｓｒａｖｉ－Ｆａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ．１３：６７（１９９４））。ＲＡＳタンパク質の適切な機能は、グアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）を介したその活性ＧＴＰ結合型への活性化、およびＲＡＳ－ＧＴＰ複合体の膜会合に依存しており、それらの両方ともＫＲＡＳ阻害の標的として提案されている。しかしながら、ＫＲＡＳの直接的阻害において以前に提案された治療剤の低い有効性および標的特異性のために、ＫＲＡＳ経路を標的とする現在の手段は、下流のエフェクタータンパク質の阻害に主に集中している（Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．１３：８２８（２０１４））。それにもかかわらず、遺伝子活性を直接的にダウンレギュレートする低分子を開発することが困難であっても、ＫＲＡＳは、ヒトがんにおける駆動性突然変異としての普遍性により、依然として治療関連標的である。

【0005】

ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）における進歩は、ＫＲＡＳ発現をノックダウンする有効な手段としてのその可能性を示唆する。ＲＮＡｉ療法は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と呼ばれる、外因性低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と内因性酵素機構との相互作用を使用して、ｍＲＮＡレベルにおいて特定の遺伝子を選択的にサイレンシングする（Ｐｅｃｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ １１：５９（２０１１））。最近の研究により、ヒトがん患者において転移の退縮を誘導するための忍容性の高い治療としてのＲＮＡｉの有効性が明らかになっている（Ｔａｂｅｒｎｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ．３：４０６（２０１３））。加えて、私たちは、ナノリポソームを使用して、インビトロおよびインビボの両方で、様々な肺および結腸がんモデルにおいてヒトＫＲＡＳのノックダウンのためのｓｉＲＮＡ送達の有効性を最近確証した（Ｐｅｃｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．１３：２８７６（２０１４））。

【0006】

しかしながら、野生型（ＷＴ）対立遺伝子に優る、突然変異体ＫＲＡＳについての標的特異性を欠いたままである。突然変異体対立遺伝子の発がん特性にもかかわらず、ＷＴのＫＲＡＳは、非がん細胞において生存率を促進する、細胞外入力への適切な応答に必要である（Ｋｈｏｓｒａｖｉ－Ｆａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ．１３：６７（１９９４））。そのため、ＷＴ－ＫＲＡＳ（野生型ＫＲＡＳ）を温存し（ｓｐａｒｅ）ながら突然変異体ＫＲＡＳを標的とする阻害剤が必要とされている。

【0007】

したがって、本発明は、突然変異体ＫＲＡＳ配列の特異的阻害のためにＲＮＡ干渉を使用する組成物および方法を提供することによって当該技術分野における欠陥を克服する。

【発明の概要】

【0008】

本発明は、ＷＴ－ＫＲＡＳの発現を温存しながら突然変異体ＫＲＡＳ配列の発現を阻害するＲＮＡ分子の特定に基づく。したがって、本発明の一態様は、アンチセンス鎖およびセンス鎖を含む二本鎖ＲＮＡ分子であって、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列が、約１８～約２５個の連続ヌクレオチドから本質的になる領域である、ミスセンス突然変異Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２ＤおよびＧ１３Ｄ、またはミスセンス突然変異Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２ＶおよびＧ１３Ｄを含有する合成ヒトＫＲＡＳ遺伝子のヌクレオチド配列の領域に相補的であり、二本鎖ＲＮＡ分子が、ミスセンス突然変異Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２ＶおよびＧ１３Ｄのうちの１つまたは複数を含む変異ヒトＫＲＡＳ遺伝子の発現を阻害し、野生型ヒトＫＲＡＳの発現を最小限に阻害する、二本鎖ＲＮＡ分子に関する。

【0009】

本発明の別の態様は、本発明のＲＮＡ分子のうちの１つまたは複数を含む組成物、例えば医薬組成物に関する。

【0010】

本発明のさらなる態様は、細胞においてミスセンス突然変異Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２ＶおよびＧ１３Ｄのうちの１つまたは複数を含む変異ヒトＫＲＡＳ遺伝子の発現を阻害する方法であって、細胞を本発明のＲＮＡ分子と接触させ、これによって、細胞において変異ヒトＫＲＡＳ遺伝子の発現を阻害することを含む方法に関する。

【0011】

本発明の追加の態様は、がんの処置を必要とする対象においてがんを処置する方法であって、がんが、ミスセンス突然変異Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２ＶおよびＧ１３Ｄのうちの１つまたは複数を含む変異ヒトＫＲＡＳ遺伝子を含み、方法が、対象へ本発明のＲＮＡ分子を送達し、これによって、対象においてがんを処置することを含む、方法に関する。

【0012】

本発明の別の態様は、細胞においてミスセンス突然変異Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２ＶおよびＧ１３Ｄのうちの１つまたは複数を含む変異ヒトＫＲＡＳ遺伝子の発現を阻害するための、ならびにがんの処置を必要とする対象においてがんを処置するための本発明のＲＮＡ分子の使用であって、がんが、ミスセンス突然変異Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２ＶおよびＧ１３Ｄのうちの１つまたは複数を含む変異ヒトＫＲＡＳ遺伝子を含む、使用に関する。

【0013】

本発明のさらなる態様は、ミスセンス突然変異Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２ＤおよびＧ１３Ｄをコードする合成のヒトＫＲＡＳ－ｍＲＮＡへ標的化されたアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、長さが１６～２５ヌクレオチドであり、配列TCTTGCCTACGTCATA（配列番号１１４）を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。

【0014】

本発明の追加の態様は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２ＶおよびＧ１３Ｄから選択される突然変異をコードする天然のヒトＫＲＡＳ－ｍＲＮＡへ標的化されたアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、長さが１６～２５ヌクレオチドであり、
ａ）Ｇ１２Ｃ突然変異をコードするヒトＫＲＡＳ－ｍＲＮＡへ標的化されたTCTTGCCTACGCCACA（配列番号１１７）、
ｂ）Ｇ１２Ｄ突然変異をコードするヒトＫＲＡＳ－ｍＲＮＡへ標的化されたTCTTGCCTACGCCATC（配列番号１１８）、
ｃ）Ｇ１２Ｖ突然変異をコードするヒトＫＲＡＳ－ｍＲＮＡへ標的化されたTCTTGCCTACGCCAAC（配列番号１１９）、
ｄ）Ｇ１３Ｄ突然変異をコードするヒトＫＲＡＳ－ｍＲＮＡへ標的化されたTCTTGCCTACGTCACC（配列番号１２０）、または
ｅ）ａ）～ｄ）のいずれか１つと少なくとも９０％同一の配列
から選択される配列を含み、少なくとも１つの非天然化学修飾を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。

【0015】

本発明の別の態様は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２ＶおよびＧ１３Ｄから選択される突然変異をコードする天然のヒトＫＲＡＳ－ｍＲＮＡへ標的化されたｓｉＲＮＡ分子であって、少なくとも１つの化学修飾を含み、
配列番号１２８のセンス鎖および配列番号１２９のアンチセンス鎖、
配列番号１３０のセンス鎖および配列番号１３１のアンチセンス鎖、
配列番号１３２のセンス鎖および配列番号１３３のアンチセンス鎖、
配列番号１３４のセンス鎖および配列番号１３５のアンチセンス鎖、
配列番号１３６のセンス鎖および配列番号１３７のアンチセンス鎖、
配列番号１３８のセンス鎖および配列番号１３９のアンチセンス鎖、
配列番号１４０のセンス鎖および配列番号１４１のアンチセンス鎖、
配列番号１４２のセンス鎖および配列番号１４３のアンチセンス鎖、
配列番号１４４のセンス鎖および配列番号１４５のアンチセンス鎖、
配列番号１４６のセンス鎖および配列番号１４７のアンチセンス鎖、
配列番号１４８のセンス鎖および配列番号１４９のアンチセンス鎖、
配列番号１５０のセンス鎖および配列番号１５１のアンチセンス鎖、
配列番号１５２のセンス鎖および配列番号１５３のアンチセンス鎖、
配列番号１５４のセンス鎖および配列番号１５５のアンチセンス鎖、
配列番号１５６のセンス鎖および配列番号１５７のアンチセンス鎖もしくは
配列番号１５８のセンス鎖および配列番号１５９のアンチセンス鎖
の配列対の１つ、またはこれらと少なくとも９０％同一の配列を含むｓｉＲＮＡ分子に関する。

【0016】

本発明の追加の態様は、ヒトＫＲＡＳ－ｍＲＮＡへ標的化されたｓｉＲＮＡ分子であって、ｓｉＲＮＡのセンス鎖が、配列番号５０または配列番号５１の配列を含み、ｓｉＲＮＡが、少なくとも１つの非天然化学修飾を含む、ｓｉＲＮＡ分子に関する。

【0017】

本発明の別の態様は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡ分子のうちの１つまたは複数を含む組成物、例えば医薬組成物に関する。

【0018】

本発明のさらなる態様は、細胞においてミスセンス突然変異Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２ＶおよびＧ１３Ｄのうちの１つまたは複数を含む変異ヒトＫＲＡＳ遺伝子の発現を阻害する方法であって、細胞を本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡ分子と接触させ、これによって、細胞において変異ヒトＫＲＡＳ遺伝子の発現を阻害することを含む方法に関する。

【0019】

本発明の追加の態様は、がんの処置を必要とする対象においてがんを処置する方法であって、がんが、ミスセンス突然変異Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２ＶおよびＧ１３Ｄのうちの１つまたは複数を含む変異ヒトＫＲＡＳ遺伝子を含み、方法が、対象へ本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡ分子を送達し、これによって、対象においてがんを処置することを含む、方法に関する。

【0020】

本発明の別の態様は、細胞においてミスセンス突然変異Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２ＶおよびＧ１３Ｄのうちの１つまたは複数を含む変異ヒトＫＲＡＳ遺伝子の発現を阻害するための、ならびにがんの処置を必要とする対象においてがんを処置するための本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡ分子の使用であって、がんが、ミスセンス突然変異Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２ＶおよびＧ１３Ｄのうちの１つまたは複数を含む変異ヒトＫＲＡＳ遺伝子を含む、使用に関する。

【0021】

本発明のこれらおよび他の態様は、以下の本発明の説明においてより詳細に示される。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1】ＫＲＡＳ－ｓｉＲＮＡ配列（配列番号４０～５１）を示す。ＴＭＳ－ｓｉＲＮＡ配列を、コドン１２および１３においてヒトＫＲＡＳ遺伝子のＧドメインに結合し、３点突然変異（各々アステリスクにより示される）を標的とするように設計した。下線は、ｓｉＲＮＡ（センス）によって標的化される残りの塩基対を示す。Ｇ１２ＣおよびＧ１２Ｄ ｓｉＲＮＡについての配列は、Ｆｌｅｍｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．３：４１３（２００５）から得た。陽性対照ｓｉＲＮＡ（Ｓｅｑ２およびＳｅｑ３）は、Ｐｅｃｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．１３：２８７６（２０１４）から得、ＫＲＡＳ－ｍＲＮＡの下流コード領域を標的とした。

【図2A】突然変異体特異的（ＭＳ）ｓｉＲＮＡのＫＲＡＳ発現レベルを示す。ヒトＷＴ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２ＶまたはＧ１３ＤのＫＲＡＳを感染させたＮＩＨ３Ｔ３細胞に、ＭＳ－ｓｉＲＮＡ配列（１２ＣＤ１３Ｄ＿１、１２ＣＤ１３Ｄ＿２、１２ＣＤ１３Ｄ＿３、１２ＣＤ１３Ｄ＿４、１２ＣＶ１３Ｄ＿１および１２ＣＶ１３Ｄ＿２）または非特異的配列を逆トランスフェクトした。

【図2B】対照ｓｉＲＮＡのＫＲＡＳ発現レベルを示す。ヒトＷＴ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２ＶまたはＧ１３ＤのＫＲＡＳを感染させたＮＩＨ３Ｔ３細胞に、対照突然変異体特異的ｓｉＲＮＡまたは非特異的配列を逆トランスフェクトした。

【図3】ＫＲＡＳ－Ｇ１２Ｄ突然変異体肺がん細胞株におけるカスタムＫＲＡＳ－ｓｉＲＮＡ配列１２ＣＤ１３Ｄ＿１および１２ＣＤ１３Ｄ＿４の試験を示す。

【図4】カスタムｓｉＲＮＡ配列間のすべての可能なｓｉＲＮＡ配列の並べ替えを試験するために使用したｓｉＲＮＡ配列のライブラリー（配列番号４５～５１）を示す。

【図5】３Ｔ３細胞における野生型および突然変異体ＫＲＡＳ－ｍＲＮＡの相対的発現を示す。

【図6】合成ＫＲＡＳ遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドスクリーニングの概略図を示す（配列番号５２および５３）。

【図7】１６個のアンチセンスオリゴヌクレオチドの、Ａ４３１細胞において突然変異体ＫＲＡＳ発現を阻害する能力を示す。Ａ４３１細胞は、ＫＲＡＳ野生型対立遺伝子を除去するように遺伝子操作されており、個々のＡ４３１クローンは、ＫＲＡＳ－Ｇ１２Ｃ、ＫＲＡＳ－Ｇ１２Ｄ、ＫＲＡＳ－Ｇ１２ＶまたはＫＲＡＳ－Ｇ１３Ｄ（示される通り）のいずれかのヒトＫＲＡＳ突然変異体対立遺伝子を発現し、したがって、ジムノシス（ｇｙｍｎｏｓｉｓ）送達機構、オリゴヌクレオチド輸送およびＲＮアーゼＨサイレンシング活性について制御するように作出された。

【図8】異なる濃度の６つのアンチセンスオリゴヌクレオチドの、遺伝子操作されたＡ４３１細胞において突然変異体ＫＲＡＳ発現を阻害する能力を示す。

【図9】化学修飾ＡＳＯ１６アンチセンスオリゴヌクレオチドの、遺伝子操作されたＡ４３１細胞において突然変異体ＫＲＡＳ発現を阻害する能力を示す。

【図10】ＫＲＡＳ－Ｇ１２Ｃ特異的ＡＳＯの用量応答を示す。

【図11】Ｇ１２Ｃ特異的ＡＳＯによる野生型ＫＲＡＳ温存における改善を示す。

【図12】ＫＲＡＳ－Ｇ１２Ｃを発現する遺伝子操作されたＡ４３１細胞における、ＫＲＡＳ－Ｇ１２Ｃ突然変異へ標的とした完全修飾ｓｉＲＮＡの活性を示す。

【図13】ＫＲＡＳ－Ｇ１２Ｃを発現する遺伝子操作されたＡ４３１細胞における、ＫＲＡＳ－Ｇ１２Ｃ突然変異へ標的とした完全修飾ｓｉＲＮＡの活性を示す。

【図14】ＫＲＡＳ－Ｇ１２Ｄを発現する遺伝子操作されたＡ４３１細胞における、ＫＲＡＳ－Ｇ１２Ｄ突然変異へ標的とした完全修飾ｓｉＲＮＡの活性を示す。

【図15】ＫＲＡＳ－Ｇ１２Ｄを発現する遺伝子操作されたＡ４３１細胞における、ＫＲＡＳ－Ｇ１２Ｄ突然変異へ標的とした完全修飾ｓｉＲＮＡの活性を示す。

【図16】ＫＲＡＳ－Ｇ１２Ｖを発現する遺伝子操作されたＡ４３１細胞における、ＫＲＡＳ－Ｇ１２Ｖ突然変異へ標的とした完全修飾ｓｉＲＮＡの活性を示す。

【図17】ＫＲＡＳ－Ｇ１２Ｖを発現する遺伝子操作されたＡ４３１細胞における、ＫＲＡＳ－Ｇ１２Ｖ突然変異へ標的とした完全修飾ｓｉＲＮＡの活性を示す。

【図18】ＫＲＡＳ－Ｇ１３Ｄを発現する遺伝子操作されたＡ４３１細胞における、ＫＲＡＳ－Ｇ１３Ｄ突然変異へ標的とした完全修飾ｓｉＲＮＡの活性を示す。

【図19】ＫＲＡＳ－Ｇ１３Ｄを発現する遺伝子操作されたＡ４３１細胞における、ＫＲＡＳ－Ｇ１３Ｄ突然変異へ標的とした完全修飾ｓｉＲＮＡの活性を示す。

【図20】Ｇ１２Ｄ標的化ｓｉＲＮＡによる細胞生存率実験の結果を示す。

【図21】Ｇ１２Ｄ標的化ｓｉＲＮＡによる細胞生存率実験の結果を示す。

【図22】Ｇ１３Ｄ標的化ｓｉＲＮＡによる細胞生存率実験の結果を示す。

【図23】Ｇ１３Ｄ標的化ｓｉＲＮＡによる細胞生存率実験の結果を示す。

【図24】ＨＣＴ１１６腫瘍におけるＫＲＡＳサイレンシングについてのインビボでの証拠を示す。

【図25】Ｇ１２Ｖ標的化ｓｉＲＮＡによる細胞生存率実験の結果を示す。

【図26】Ｇ１２Ｖ標的化ｓｉＲＮＡによる細胞生存率実験の結果を示す。

【図27】ＥＦＴＸ－Ｄ１ ｓｉＲＮＡによる突然変異体ＫＲＡＳ発現の阻害および野生型温存を示す。

【図28】ＨＣＴ１１６（ＫＲＡＳ－Ｇ１３Ｄ突然変異体）細胞およびＬＵ６５（ＫＲＡＳ－Ｇ１２Ｃ突然変異体）細胞における、ＫＲＡＳへ標的とした完全修飾ｓｉＲＮＡの活性を示す。

【発明を実施するための形態】

【0023】

本発明は、ここで、本発明の好ましい実施形態が示される附属の図面を参照して、より詳細に説明される。しかしながら、本発明は、様々な形態で具体化することができ、本明細書で示される実施形態に限定されるとは解釈すべきでない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が徹底的および完全であるように、かつ本発明の範囲を当業者に完全に伝えるように提供される。

【0024】

別に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で本発明の説明において使用される用語は、特定の実施形態を説明する目的のためのみであり、本発明の限定であるとは意図されない。本明細書で引用されるすべての出版物、特許出願、特許、特許公開公報および他の参考文献は、参考文献が示される文および／または節に関する教示についてそれらを全体として参照により組み込まれる。

【0025】

ヌクレオチド配列は、別に特に示されない限り、本明細書では一本鎖のみにより、左から右へ５’から３’方向に示される。ヌクレオチドおよびアミノ酸は、本明細書では、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名法委員会により推奨される様式で、または（アミノ酸について）３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２および確立された使用法に従う一文字表記または三文字表記のいずれかにより表される。

【0026】

別に示される場合を除いて、当業者に公知の標準法は、遺伝子をクローニングするため、核酸を増幅および検出するためなどに使用することができる。そのような技法は、当業者に公知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照されたい。

【0027】

文脈が別に示さない限り、本明細書で説明される本発明の様々な特色は、任意の組合せにおいて使用することができることが明確に意図される。

【0028】

さらに、また、本発明は、本発明の一部の実施形態において、本明細書で示される任意の特色または特色の組合せを除外または省略することができることを企図する。

【0029】

例示するために、明細書により、複合体が構成成分Ａ、ＢおよびＣを含むと言及される場合、Ａ、ＢもしくはＣのうちのいずれかまたはこれらの組合せは、単独でまたは任意の組合せにおいて省略および放棄され得ることが特に意図される。

【0030】

［定義］
本発明の説明および附属の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに別に示さない限り、複数形も含むと意図される。

【0031】

また、本明細書で使用される場合、「および／または」とは、関連する列挙される項目のうちの１つまたは複数の任意のおよびすべての可能な組合せ、ならびに択一で（「または」）解釈される場合組合せの欠如を指し、包含する。

【0032】

「約」という用語は、本明細書で使用される場合、ポリペプチドの量、用量、時間、温度、酵素活性または他の生物学的活性などの測定可能な値について言及するとき、特定の量の±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％またはさらには±０．１％の変動を包含することを意味する。

【0033】

本明細書で使用される場合、「から本質的になること（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という移行句（および文法的変形）は、列挙される材料またはステップ、および特許請求の範囲の発明の基本的かつ新規特徴に実質的に影響を及ぼさない材料またはステップを包含すると解釈されるべきである。したがって、本明細書で使用される場合「から本質的になること」という用語は、「を含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と同等であると解釈されるべきでない。

【0034】

「から本質的になる」という用語（および文法的変形）は、本発明のポリヌクレオチド配列に適用される場合、列挙される配列（例えば配列番号）、ならびにポリヌクレオチドの機能が実質的に変更されないような列挙される配列の５’および／または３’末端の全部で１０個またはそれ未満（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個）の追加のヌクレオチドの両方からなるポリヌクレオチドを意味する。全部で１０個またはそれ未満の追加のヌクレオチドは、両方の末端の追加のヌクレオチドを一緒に合わせた総数を含む。「実質的に変更される」という用語は、本発明のポリヌクレオチドに適用される場合、列挙される配列からなるポリヌクレオチドの発現レベルと比較して少なくとも約５０％またはそれ以上の、標的ｍＲＮＡの発現を阻害する能力における増大または減少を指す。

【0035】

「向上させる」または「増大させる」という用語は、少なくとも約１．２５倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、８倍、１０倍、１２倍またはさらには１５倍の特定のパラメーターにおける増大を指す。

【0036】

「阻害する」もしくは「低減させる」という用語またはそれらの文法的変形は、本明細書で使用される場合、少なくとも約１５％、２５％、３５％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上の、特定のレベルまたは活性における減少または減弱を指す。特定の実施形態において、阻害または低減は、ほとんどまたは本質的にまったく検出可能な活性をもたらさない（多くてもわずかな量、例えば約１０％またはさらには５％未満）。

【0037】

「治療有効」量とは、本明細書で使用される場合、対象にいくらかの改善または利点を提供する量である。言い換えると、「治療有効」量とは、対象において少なくとも１つの臨床症状のいくらかの軽減、緩和または減少を提供する量である（例えばがんの場合、腫瘍量の低減、さらなる腫瘍増殖の防止、転移の防止、または生存時間の増加）。当業者は、いくらかの利点が対象へと提供される限り、治療効果は、完全または治癒的である必要はないことを理解するだろう。

【0038】

「処置（治療）する」、「処置（治療）すること」または「の処置（治療）」という用語によって、対象の状態の重症度が低減または少なくとも部分的に改善もしくは改変されること、および少なくとも１つの臨床症状のいくらかの軽減、緩和または減少が達成されることが意図される。

【0039】

「防止（予防）する」または「防止（予防）すること」または「防止（予防）」とは、本発明の方法の非存在下において進行し得る重症度と比較した、対象における障害の開始の防止もしくは遅延、および／または障害の重症度の減少を指す。防止は、完全な防止、例えば対象におけるがんの完全な非存在であり得る。また、防止は、対象におけるがんの発生または重症度が、本発明なしで起こり得るよりも少ないような、部分的な防止であってもよい。

【0040】

本明細書で使用される場合、「核酸」、「ヌクレオチド配列」および「ポリヌクレオチド」は互換的に使用され、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、合成（例えば化学合成）ＤＮＡまたはＲＮＡ、ならびにＲＮＡおよびＤＮＡのキメラを含む、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方を包含する。ポリヌクレオチド、ヌクレオチド配列または核酸という用語は、鎖の長さにかかわらず、ヌクレオチドの鎖を指す。核酸は、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。一本鎖である場合、核酸は、センス鎖であっても、アンチセンス鎖であってもよい。核酸は、オリゴヌクレオチドアナログまたは誘導体（例えば、イノシンまたはホスホロチオエートヌクレオチド）を使用して合成することができる。そのようなオリゴヌクレオチドは、例えば、塩基対形成能力が変更された、またはヌクレアーゼに対する抵抗性が増大した核酸を調製するために使用することができる。本発明は、本発明の核酸、ヌクレオチド配列またはポリヌクレオチドの相補体である核酸（完全な相補体または部分的な相補体のいずれかであり得る）をさらに提供する。ｄｓＲＮＡが合成産生される場合、イノシン、５－メチルシトシン、６－メチルアデニン、ヒポキサンチンおよびその他などのあまり一般的でない塩基もまた、アンチセンス、ｄｓＲＮＡおよびリボザイム対形成のために使用してもよい。例えば、ウリジンおよびシチジンのＣ－５プロピンアナログを含有するポリヌクレオチドは、ＲＮＡに高親和性で結合すること、および遺伝子発現の強力なアンチセンス阻害剤であることが示されている。ホスホジエステル骨格、またはＲＮＡのリボース糖基の２’－ヒドロキシへの修飾などの他の修飾もまた、行ってもよい。

【0041】

「単離されたポリヌクレオチド」とは、それが由来する生物の天然ゲノムにおいてそれが直接隣接する（１箇所は５’末端、および１箇所は３’末端）ヌクレオチド配列と直接隣接していないヌクレオチド配列（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）である。したがって、一実施形態において、単離された核酸は、コード配列と直接隣接する５’非コード（例えばプロモーター）配列の一部またはすべてを含む。それゆえ、この用語は、他の配列とは独立して、例えば、ベクターへ、自律複製プラスミドもしくはウイルスへ、または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡへと組み込まれた、または別の分子として存在する組換えＤＮＡ（例えば、ＰＣＲまたは制限エンドヌクレアーゼ処理によって産生されるｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ断片）を含む。また、それは、追加のポリペプチドまたはペプチド配列をコードするハイブリッド核酸の部分である組換えＤＮＡを含む。遺伝子を含む単離されたポリヌクレオチドは、そのような遺伝子を含む染色体の断片ではなく、むしろ、遺伝子と関連付けられるコード領域および調節領域を含むが、染色体において天然に見出される追加の遺伝子を含まない。

【0042】

「単離された」という用語は、細胞物質、ウイルス物質および／または培養培地（組換えＤＮＡ技法によって産生された場合）または化学前駆体もしくは他の化学物質（化学合成された場合）を実質的に含まない核酸、ヌクレオチド配列またはポリペプチドを意味し得る。さらに、「単離された断片」とは、断片として天然に存在せず、天然状態で見出されない核酸、ヌクレオチド配列またはポリペプチドの断片である。「単離された」とは、調製物が技術的に純粋（均一）であることを意味しないが、調製物は、それが意図された目的に使用され得る形態においてポリペプチドまたは核酸を提供するのに十分に純粋である。

【0043】

「単離された細胞」とは、それがその天然状態において通常関連する他の構成成分から分離された細胞を指す。例えば、単離された細胞とは、培養培地中の細胞および／または本発明の薬学的に許容される担体中の細胞であり得る。したがって、単離された細胞は、対象に送達および／または導入され得る。一部の実施形態において、単離された細胞は、対象から除去され、エクスビボで本明細書で説明されるように操作され、その後対象へ戻される細胞であり得る。

【0044】

「断片」という用語は、ポリヌクレオチドに適用される場合、参照核酸またはヌクレオチド配列と比較して長さが減縮しており、参照核酸またはヌクレオチド配列と同一のまたはほとんど同一の（例えば、９０％、９２％、９５％、９８％、９９％同一の）連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、から本質的になる、および／またはからなるヌクレオチド配列を意味すると理解されるだろう。本発明によるそのような核酸断片は、適切な場合、それが構成要素であるより大きなポリヌクレオチドに含まれ得る。一部の実施形態において、そのような断片は、少なくとも約８、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１５０、２００個またはそれ以上の連続ヌクレオチドの長さの本発明による核酸またはヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを含み、から本質的になり、および／またはからなり得る。

【0045】

「断片」という用語は、ポリペプチドに適用される場合、参照ポリペプチドまたはアミノ酸配列と比較して長さが減縮しており、参照ポリペプチドまたはアミノ酸配列と同一のまたはほとんど同一の（例えば、９０％、９２％、９５％、９８％、９９％同一の）連続アミノ酸のアミノ酸配列を含む、から本質的になる、および／またはからなるアミノ酸配列を意味すると理解されるだろう。本発明によるそのようなポリペプチド断片は、適切な場合、それが構成要素であるより大きなポリペプチドに含まれ得る。一部の実施形態において、そのような断片は、少なくとも約４、６、８、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１５０、２００個またはそれ以上の連続アミノ酸の長さの本発明によるポリペプチドまたはアミノ酸配列を有するペプチドを含み、から本質的になり、および／またはからなり得る。

【0046】

「ベクター」とは、核酸のクローニングおよび／または核酸の細胞への移行のための任意の核酸分子である。ベクターは、別のヌクレオチド配列が結合されて、結合したヌクレオチド配列の複製を可能にし得るレプリコンであり得る。「レプリコン」とは、インビボで核酸複製の自律的単位として機能する、すなわち、それ自体の制御下で複製することができる任意の遺伝子エレメント（例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルスゲノム）であり得る。「ベクター」という用語は、インビトロ、エクスビボおよび／またはインビボで核酸を細胞へ導入するためのウイルスおよび非ウイルス（例えばプラスミド）核酸分子の両方を含む。当該技術分野において公知の多数のベクターを使用して、核酸を操作したり、応答エレメントおよびプロモーターを遺伝子へ組み込みこんだりすることなどができる。例えば、応答エレメントおよびプロモーターに対応する核酸断片の、好適なベクターへの挿入は、適切な核酸断片を、相補的付着端を有する選択されたベクターへライゲートすることによって達成することができる。あるいは、核酸分子の末端を酵素改変してもよく、またはヌクレオチド配列（リンカー）を核酸末端へライゲートすることによって任意の部位を産生してもよい。そのようなベクターは、ベクターを含有し、および／またはベクターの核酸を細胞ゲノムへ組み込んだ細胞の選択を提供する選択可能なマーカーをコードする配列を含有するように操作してもよい。そのようなマーカーは、マーカーによってコードされるタンパク質を組み込み、発現する宿主細胞の特定および／または選択を可能にする。「組換え」ベクターとは、１つまたは複数の異種のヌクレオチド配列（すなわち、導入遺伝子）、例えば、２、３、４、５つまたはそれ以上の異種のヌクレオチド配列を含むウイルスまたは非ウイルスベクターを指す。

【0047】

ウイルスベクターは、細胞および生存している動物対象における多様な遺伝子送達アプリケーションにおいて使用されている。使用され得るウイルスベクターには、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、エプスタイン・バーウイルスおよび／またはアデノウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。非ウイルスベクターには、プラスミド、リポソーム、帯電脂質（サイトフェクチン（ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ））、核酸－タンパク質複合体およびバイオポリマーが含まれるが、これらに限定されない。目的の核酸に加えて、また、ベクターは、１つまたは複数の調節領域、ならびに／または選択、測定および核酸移行結果（特定の組織への送達、発現の持続期間など）のモニタリングに有用な選択可能なマーカーを含み得る。

【0048】

ベクターは、当該技術分野において公知の方法、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション（リソソーム融合）、遺伝子銃の使用または核酸ベクタートランスポーターによって所望の細胞へ導入され得る（例えば、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３（１９９２）；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１（１９８８）；およびＨａｒｔｍｕｔら、１９９０年３月１５日出願のカナダ特許出願第２，０１２，３１１号を参照されたい）。

【0049】

一部の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、リポフェクションによってインビボで細胞へ送達され得る。リポソーム媒介トランスフェクションで遭遇される困難および危険を制限するように設計された合成カチオン性脂質を使用して、本発明のヌクレオチド配列のインビボトランスフェクションのためのリポソームを調製することができる（Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３（１９８７）；Ｍａｃｋｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：８０２７（１９８８）；およびＵｌｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４５（１９９３））。カチオン性脂質の使用は、負帯電核酸の被包を促進し、また、負帯電細胞膜との融合を促進し得る（Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：３８７（１９８９））。核酸の移行に特に有用な脂質化合物および組成物は、国際特許公開公報ＷＯ第９５／１８８６３号およびＷＯ第９６／１７８２３号において、ならびに米国特許第５，４５９，１２７号において説明されている。外因性ヌクレオチド配列をインビボで特定の器官へ導入するためのリポフェクションの使用は、ある特定の実用的な利点を有する。リポソームの特定の細胞への分子ターゲティングは、ある範囲の利点を示す。トランスフェクションを特定の細胞種へ方向付けることは、膵臓、肝臓、腎臓および脳などの細胞異種性を有する組織において特に好ましい場合があることは明らかである。脂質は、ターゲティングの目的のために他の分子に化学的にカップリングされ得る（Ｍａｃｋｅｙ，ｅｔ ａｌ．，１９８８、上記）。標的化されたペプチド、例えばホルモンもしくは神経伝達物質、および抗体などのタンパク質、または非ペプチド分子は、リポソームに化学的にカップリングされ得る。

【0050】

様々な実施形態において、カチオン性オリゴペプチド（例えばＷＯ９５／２１９３１）、核酸結合タンパク質に由来するペプチド（例えばＷＯ９６／２５５０８）および／またはカチオン性ポリマー（例えばＷＯ９５／２１９３１）などの他の分子は、インビボでの核酸の送達を促進するために使用することができる。

【0051】

また、インビボでネイキッド核酸としてベクターを導入することが可能である（米国特許第５，６９３，６２２号、同第５，５８９，４６６号および同第５，５８０，８５９号を参照されたい）。また、受容体媒介核酸送達手法を使用してもよい（Ｃｕｒｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：１４７（１９９２）；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９（１９８７））。

【0052】

本明細書で使用される場合、「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、別に示されない限り、互換的に使用され、ペプチドおよびタンパク質の両方を包含する。

【0053】

「融合タンパク質」とは、天然において共に融合されていることが見出されない２つの（またはそれ以上の）異なるポリペプチドをコードする２つの異種のヌクレオチド配列またはその断片が、正しい翻訳リーディングフレームにおいて共に融合されている場合に産生されるポリペプチドである。例示的な融合ポリペプチドは、本発明のポリペプチド（またはその断片）の、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質、またはレポータータンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、β－グルクロニダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなど）、ヘマグルチニン、ｃ－ｍｙｃ、ＦＬＡＧエピトープなどのすべてまたは部分への融合を含む。

【0054】

ポリヌクレオチドコード配列「を発現する」またはポリヌクレオチドコード配列の「発現」という用語によって、配列が転写され、場合により翻訳されることを意味する。典型的に、本発明により、本発明のコード配列の発現は、本発明のポリペプチドの産生をもたらす。また、発現されるポリペプチド全体または断片は、精製なしでインタクトな細胞において機能することができる。

【0055】

本明細書で使用される場合、「遺伝子」という用語は、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどを産生するために使用することができる核酸分子を指す。遺伝子は、機能タンパク質を産生するために使用することが可能であっても、そうでなくてもよい。遺伝子は、コード領域ならびに非コード領域（例えば、イントロン、調節エレメント、プロモーター、エンハンサー、停止配列ならびに５’および３’非翻訳領域）の両方を含み得る。遺伝子は、「単離され」ていてもよく、これによって、その天然状態において核酸と関連して通常見出される構成成分を実質的にまたは本質的に含有しない核酸を意味する。そのような構成成分は、他の細胞物質、組換え産生からの培養培地、および／または核酸の化学合成において使用された様々な化学物質を含む。

【0056】

本明細書で使用される場合、「相補的」ポリヌクレオチドは、標準のワトソン・クリック相補規則に従って塩基対形成することができるポリヌクレオチドである。特に、プリンはピリミジンと塩基対形成して、シトシンと対形成したグアニン（Ｇ：Ｃ）と、ＤＮＡの場合チミンと対形成したアデニン（Ａ：Ｔ）、またはＲＮＡの場合ウラシルと対形成したアデニン（Ａ：Ｕ）との組合せを形成する。例えば、配列「Ａ－Ｇ－Ｔ」は、相補配列「Ｔ－Ｃ－Ａ」に結合する。２つのポリヌクレオチドが互いに完全に相補的でない場合でさえも、各々が他方に実質的に相補的な少なくとも１つの領域を有する限り、それらは互いにハイブリダイズし得ることが理解される。

【0057】

「相補的」または「相補性」という用語は、本明細書で使用される場合、塩基対形成による、許容される塩および温度条件下でのポリヌクレオチドの天然結合を指す。２つの一本鎖分子間の相補性は、ヌクレオチドの一部のみが結合する「部分的」であってもよく、または完全な相補性が一本鎖分子間に存在する場合、相補性は完全であり得る。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率および強度に顕著な効果を有する。

【0058】

本明細書で使用される場合、「実質的に相補的な」または「部分的に相補的な」という用語は、２つの核酸配列が、それらのヌクレオチドの少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％または９０％相補的であることを意味する。一部の実施形態において、２つの核酸配列は、それらのヌクレオチドの少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上相補的であり得る。また、「実質的に相補的な」および「部分的に相補的な」という用語は、２つの核酸配列が、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができることを意味する場合があり、そのような条件は当該技術分野において周知である。

【0059】

本明細書で使用される場合、「異種の」とは、別の種が起源であるか、または同じ種もしくは生物が起源であるが、その元の形態もしくは細胞において主に発現される形態から改変されている核酸配列を指す。したがって、ヌクレオチド配列が導入される細胞の生物または種とは異なる生物または種に由来するヌクレオチド配列は、その細胞および細胞の子孫について異種である。加えて、異種のヌクレオチド配列は、同じ天然の元の細胞種に由来し、それに挿入されるが、非天然状態、例えば天然に見出されるコピー数とは異なるコピー数において、および／または天然に見出される調節配列とは異なる調節配列の制御下で存在するヌクレオチド配列を含む。

【0060】

本明細書で使用される場合、「接触させる」、「導入する」および「投与する」という用語は、互換的に使用され、標的遺伝子の発現を阻害または変更もしくは改変するために本発明のｄｓＲＮＡまたは本発明のｄｓＲＮＡをコードする核酸分子が細胞に送達されるプロセスを指す。ｄｓＲＮＡは、非限定的に、細胞への（すなわち、細胞内への）直接導入および／または生物の腔、間質腔への、もしくは循環中への細胞外導入を含むいくつかの方法において投与することができる。

【0061】

細胞または生物の文脈における「導入する」とは、核酸分子が細胞の内部へアクセスすることができるような様式で核酸分子を生物および／または細胞へ提示することを意味する。２つ以上の核酸分子が導入される予定である場合、これらの核酸分子は、単一のポリヌクレオチドまたは核酸構築物の部分としてアセンブルしても、別々のポリヌクレオチドまたは核酸構築物としてアセンブルしてもよく、同じ核酸構築物に位置しても、異なる核酸構築物に位置してもよい。したがって、これらのポリヌクレオチドは、単一の形質転換事象において細胞に導入しても、別々の形質転換事象において細胞に導入してもよい。したがって、「形質転換」という用語は、本明細書で使用される場合、異種の核酸の、細胞への導入を指す。細胞の形質転換は、安定性または一過性であり得る。

【0062】

ポリヌクレオチドの文脈における「一過性形質転換」とは、ポリヌクレオチドが細胞に導入され、細胞のゲノムへ組み込まれないことを意味する。

【0063】

細胞へ導入されるポリヌクレオチドの文脈における「安定に導入する」または「安定に導入された」によって、導入されたポリヌクレオチドが細胞のゲノムへ安定に組み込まれ、したがって、細胞がポリヌクレオチドにより安定に形質転換されることを意図する。

【0064】

「安定な形質転換」または「安定に形質転換された」とは、本明細書で使用される場合、核酸分子が、細胞へ導入され、細胞のゲノムへ組み込まれることを意味する。そのため、組み込まれた核酸分子は、その後代によって、より特に、多数の逐次的世代の後代によって受け継がれることが可能である。「ゲノム」とは、本明細書で使用される場合、核およびミトコンドリアゲノムを含み、それゆえ、核酸の、例えばミトコンドリアゲノムへの、組込みを含む。また、安定な形質転換は、本明細書で使用される場合、染色体外で、例えばミニ染色体として維持される導入遺伝子を指し得る。

【0065】

一過性形質転換は、例えば、生物へ導入された１つまたは複数の導入遺伝子によってコードされるペプチドまたはポリペプチドの存在を検出し得る酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）またはウェスタンブロットによって検出され得る。細胞の好適な形質転換は、例えば、生物へ導入された導入遺伝子のヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズする核酸配列による、細胞のゲノムＤＮＡのサザンブロットハイブリダイゼーションアッセイによって検出することができる。細胞の安定な形質転換は、例えば、生物へ導入された導入遺伝子のヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズする核酸配列による、細胞のＲＮＡのノザンブロットハイブリダイゼーションアッセイによって検出することができる。また、細胞の安定な形質転換は、例えば、導入遺伝子の標的配列（単数または複数）とハイブリダイズする特異的プライマー配列を用いて導入遺伝子配列の増幅をもたらし、それが標準法に従って検出され得る、当該技術分野において周知であるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または他の増幅反応によって検出することができる。また、形質転換は、当該技術分野において周知の直接的シークエンシングおよび／またはハイブリダイゼーションプロトコールによって検出することができる。

【0066】

本発明の実施形態は、本発明の核酸を発現するように設計された発現カセットを対象とする。本明細書で使用される場合、「発現カセット」とは、目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結された少なくとも１つの制御配列を有する核酸分子を意味する。この様式において、例えば、本発明のｓｉＲＮＡについてのヌクレオチド配列と作動可能に相互作用するプロモーターは、生物または細胞における発現のための発現カセットにおいて提供される。

【0067】

本明細書で使用される場合、「プロモーター」という用語は、コード配列の効率的な発現に必要なシグナルを組み込んでいるヌクレオチド配列の領域を指す。これは、ＲＮＡポリメラーゼが結合する配列を含み得るが、そのような配列に限定されず、他の調節タンパク質が結合する領域、およびタンパク質翻訳の制御に関与する領域を含む場合があり、また、コード配列を含み得る。

【0068】

さらに、本発明の「プロモーター」は、生物の細胞において転写を開始することができるプロモーターである。そのようなプロモーターは、ヌクレオチド配列の発現を構成的に駆動するプロモーター、誘導されたとき発現を駆動するプロモーター、および組織特異的または発達特異的様式で発現を駆動するプロモーターを含み、これらの様々な種類のプロモーターは、当該技術分野において公知である。

【0069】

本発明の目的のために、調節領域（すなわち、プロモーター、転写調節領域および翻訳停止領域）は、生物もしくは細胞にとってネイティブ／アナログである場合があり、かつ／または調節領域は、他の調節領域にとってネイティブ／アナログである場合がある。あるいは、調節領域は、生物もしくは細胞にとって、および／または互いに（すなわち、調節領域にとって）異種であってもよい。したがって、例えば、プロモーターが、ポリヌクレオチドが由来する種とは異なる種からのポリヌクレオチドに作動可能に連結されている場合、プロモーターは異種であり得る。あるいは、また、プロモーターが、ポリヌクレオチドが由来する種と同じ／類似する種からのプロモーターであるが、１つもしくは両方（すなわち、プロモーターおよびポリヌクレオチド）がそれらの元の形態および／もしくはゲノム遺伝子座から実質的に改変されているか、またはプロモーターが、作動可能に連結されたポリヌクレオチドについてネイティブプロモーターではない場合、プロモーターは、選択されたヌクレオチド配列にとって異種であり得る。

【0070】

使用するプロモーターの選択は、非限定的に、細胞特異的または組織特異的発現、所望の発現レベル、効率、誘導可能性および選択可能性を含むいくつかの因子に依存する。例えば、特異的組織または器官における発現が所望される場合、組織特異的プロモーターを使用することができる。対照的に、刺激に応答した発現が所望される場合、誘導性プロモーターを使用することができる。生物の細胞全体を通した連続的発現が所望される場合、構成的プロモーターを使用することができる。ヌクレオチド配列に対してプロモーターおよび他の調節領域を適切に選択および位置付けることによって、ヌクレオチド配列の発現をモジュレートすることは当業者にとってルーチン事項である。

【0071】

上記に説明されるプロモーターに加えて、また、発現カセットが、他の調節配列を含む場合がある。本明細書で使用される場合、「調節配列」とは、コード配列の上流（５’非コード配列）、中または下流（３’非コード配列）に位置し、転写、ＲＮＡプロセッシングもしくは安定性、または関連するコード配列の翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を意味する。調節配列には、エンハンサー、イントロン、翻訳リーダー配列およびポリアデニル化シグナル配列が含まれるが、これらに限定されない。

【0072】

また、発現カセットは、生物において機能的である転写および／または翻訳停止領域（すなわち、停止領域）を場合により含み得る。様々な転写ターミネーターは、発現カセットにおける使用に使用可能であり、導入遺伝子を過ぎたところでの転写停止、および正確なｍＲＮＡポリアデニル化の要因である。停止領域は、転写開始領域にとってネイティブであってもよく、作動可能に連結された目的のヌクレオチド配列にとってネイティブであってもよく、宿主にとってネイティブであってもよく、別の供給源に由来してもよい（すなわち、プロモーター、目的のヌクレオチド配列、宿主またはそれらの任意の組合せにとって外来性または異種）。

【0073】

シグナル配列は、ヌクレオチド配列を細胞区画へと方向付けるために、本発明の核酸に作動可能に連結され得る。この様式において、発現カセットは、シグナル配列についての核酸配列に作動可能に連結された、ｓｉＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む。シグナル配列は、ｓｉＲＮＡのＮまたはＣ末端において作動可能に連結され得る。

【0074】

使用される調節配列（単数または複数）の種類にかかわらず、それらは、ｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る。本明細書で使用される場合、「作動可能に連結される」とは、発現カセットなどの核酸構築物のエレメントがそれらの通常の機能を行うように構成されることを意味する。したがって、目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結された調節または制御配列（例えばプロモーター）は、目的のヌクレオチド配列の発現に影響を及ぼすことができる。制御配列が目的のヌクレオチド配列の発現を方向付けるように機能する限り、制御配列は目的のヌクレオチド配列と隣接している必要はない。したがって、例えば、介在性の、翻訳されないが転写される配列が、プロモーターとコード配列との間に存在する場合があり、それでもプロモーター配列は、コード配列に「作動可能に連結されている」と考えることができる。本発明のヌクレオチド配列（すなわち、ｓｉＲＮＡ）は、調節配列に作動可能に連結され、これによって、細胞および／または対象においてその発現を可能にし得る。

【0075】

また、発現カセットは、形質転換された生物または細胞を選択するために使用することができる選択可能なマーカーについてのヌクレオチド配列を含み得る。本明細書で使用される場合、「選択可能なマーカー」とは、発現された場合、マーカーを発現する生物または細胞に明確な表現型を与え、したがって、そのような形質転換された生物または細胞がマーカーを有しない生物または細胞から区別されることを可能する核酸を意味する。そのような核酸は、マーカーが、化学的手段によって、例えば選択剤（例えば抗生物質その他）を使用することによって選択され得る特質を与えるかどうかによって、またはマーカーが単純に観察もしくはスクリーニングによる試験などの試験を通して特定することができる特質であるかどうかによって、選択可能なマーカーまたはスクリーニング可能なマーカーのいずれかをコードしてもよい（もちろん、好適な選択可能なマーカーの多くの例は、当該技術分野において公知であり、本明細書で説明される発現カセットにおいて使用することができる）。

【0076】

本発明の一部の実施形態において、発現カセットは、ｄｓＲＮＡの一方または両方の鎖の鋳型であるヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現制御配列を含み得る。さらなる実施形態において、プロモーターは、鋳型ヌクレオチド配列のいずれかの末端に隣接してもよく、ここで、プロモーターは、各個々のＤＮＡ鎖の発現を駆動し、これによって、ハイブリダイズしてｄｓＲＮＡを形成する２つの相補的（または実質的に相補的な）ＲＮＡを生成する。代替の実施形態において、ヌクレオチド配列は、１つの転写ユニットにおいてｄｓＲＮＡの両方の鎖へ転写され、ここで、センス鎖は転写ユニットの５’末端から転写され、アンチセンス鎖は３’末端から転写され、２つの鎖は約３～約５００塩基対離れており、転写後にＲＮＡ転写産物はそれ自体で折り畳んで低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子を形成する。

【0077】

本明細書で使用される場合、「配列同一性」とは、２つの最適に整列したポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が、構成成分、例えばヌクレオチドまたはアミノ酸の整列ウィンドウ全体を通して不変である、程度を指す。「同一性」は、非限定的に、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．） Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．） Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．） Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ（１９９４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，ｅｄ．） Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８７）；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．） Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）において説明される方法を含む公知の方法によって容易に計算することができる。

【0078】

本明細書で使用される場合、「実質的に同一の」または「に対応する」という用語は、２つの核酸配列が少なくとも６０％、７０％、８０％または９０％の配列同一性を有することを意味する。一部の実施形態において、２つの核酸配列は、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有し得る。

【0079】

試験配列および参照配列の整列したセグメントについての「同一性分率」は、２つの整列した配列によって共有される同一の構成成分の数を、参照配列セグメント、すなわち、参照配列全体または参照配列のより小さい規定された部分における構成成分の総数で割った数である。

【0080】

本明細書で使用される場合、「配列同一性パーセント」または「同一性パーセント」という用語は、２つの配列が最適に整列された場合（合計が比較ウィンドウにわたり参照配列の２０％未満である適切なヌクレオチド挿入、欠失またはギャップを伴って）、試験（「サブジェクト」）ポリヌクレオチド分子（またはその相補鎖）と比較した、参照（「クエリー」）ポリヌクレオチド分子（またはその相補鎖）の直鎖状ポリヌクレオチド配列における同一のヌクレオチドの割合を指す。一部の実施形態において、「同一性パーセント」とは、アミノ酸配列における同一のアミノ酸の割合を指す場合がある。

【0081】

比較ウィンドウを整列させるための配列の最適整列は、当業者に周知であり、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのローカルホモロジーアルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのホモロジー整列アルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの類似性検索法などのツールによって、ならびに場合によりＧＣＧ（登録商標）Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ（登録商標）（Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｉｎｃ．、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、Ｍａｓｓ．）の部分として使用可能なＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡなどのこれらのアルゴリズムの電算実行によって行うことができる。配列同一性パーセントは、同一性分率に１００を掛けたものとして表される。１つまたは複数のポリヌクレオチド配列の比較は、全長ポリヌクレオチド配列もしくはその部分に対して、またはより長いポリヌクレオチド配列に対しての比較であり得る。また、本発明の目的のために、「同一性パーセント」は、翻訳されたヌクレオチド配列についてＢＬＡＳＴＸ ２．０版、およびポリヌクレオチド配列についてＢＬＡＳＴＮ ２．０版を使用して決定することができる。

【0082】

配列同一性のパーセントは、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ（商標）（１０版；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）の「Ｂｅｓｔ Ｆｉｔ」または「Ｇａｐ」プログラムを使用して決定することができる。「Ｇａｐ」は、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３，１９７０）を利用して、マッチ数を最大限にし、ギャップ数を最小限にする２つの配列の整列を見出す。「Ｂｅｓｔ Ｆｉｔ」は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのローカルホモロジーアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，２：４８２－４８９，１９８１、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１１：２２０５－２２２０，１９８３）を使用して、２つの配列間の最も類似性の高いセグメントの最適整列を行い、マッチ数を最大限にするようにギャップを挿入する。

【0083】

また、配列同一性を決定するための有用な方法は、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｈｕｇｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ（Ｍａｒｔｉｎ Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（１９９４））およびＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，ａｎｄ Ｌｉｐｔｏｎ，Ｄ．，（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８：１０７３（１９８８））において開示されている。より特には、配列同一性を決定するために好ましいコンピュータープログラムには、米国国立衛生研究所（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．２０８９４）の国立医学図書館の国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）から公に利用可能なＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）プログラムが含まれるが、これらに限定されず；ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，ＮＣＢＩ，ＮＬＭ，ＮＩＨ；（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０））を参照されたく；ＢＬＡＳＴプログラムの２．０版またはそれ以降の版は、整列へのギャップ（欠失または挿入）の導入を可能にし；ペプチド配列については、ＢＬＡＳＴＸを使用して、配列同一性を決定することができ；ポリヌクレオチド配列については、ＢＬＡＳＴＮを使用して、配列同一性を決定することができる。

【0084】

本明細書で使用される場合、「ＲＮＡｉ」または「ＲＮＡ干渉」とは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって媒介される、配列特異的転写後遺伝子サイレンシングのプロセスを指す。本明細書で使用される場合、「ｄｓＲＮＡ」とは、部分的にまたは完全に二本鎖であるＲＮＡを指す。また、二本鎖ＲＮＡは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）などと称される。ＲＮＡｉプロセスにおいて、標的遺伝子の一部に相補的な第１の（アンチセンス）鎖、および第１のアンチセンス鎖に完全にまたは部分的に相補的な第２の（センス）鎖を含むｄｓＲＮＡが、生物に導入される。生物への導入後、標的遺伝子特異的ｄｓＲＮＡは、比較的小さい断片にプロセスされ（ｓｉＲＮＡ）、次に生物全体を通して分布するようになり、１世代の期間にわたり、標的遺伝子の完全なまたは部分的な欠失から生ずる表現型と酷似するようになり得る表現型を有する機能欠損突然変異をもたらし得る。

【0085】

マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、一般的に長さが約１８～約２５ヌクレオチドの、非タンパク質コードＲＮＡである。これらのｍｉＲＮＡは、標的転写産物のｔｒａｎｓにおいて切断を指示し、様々な調節および発達経路に関与する遺伝子の発現を負に調節する（Ｂａｒｔｅｌ，Ｃｅｌｌ，１１６：２８１－２９７（２００４）；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２８９：３－１６（２００６））。そのため、ｍｉＲＮＡは、成長および発達の様々な態様、ならびにシグナル伝達およびタンパク質分解に関与することが示されている。最初のｍｉＲＮＡが植物において発見されて以来（Ｒｅｉｎｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１６：１６１６－１６２６（２００２）、Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１２：１４８４－１４９５（２００２））、何百も特定されている。多くのマイクロＲＮＡ遺伝子（ＭＩＲ遺伝子）が特定されており、データベースにおいて公に使用可能になっている（ｍｉＲＢａｓｅ；ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）。また、ｍｉＲＮＡは、米国特許公開公報第２００５／０１２０４１５号および同第２００５／１４４６６９Ａ１号において説明されており、当該公開公報の全内容が、参照により本明細書に組み込まれる。

【0086】

ｍｉＲＮＡをコードする遺伝子は、不完全なステム－ループ構造を形成し得る長さが７０～３００ｂｐのプライマリーｍｉＲＮＡ（「ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ」と称される）を産生する。単一のｐｒｉ－ｍｉＲＮＡは、１つ～いくつかのｍｉＲＮＡ前駆体を含有し得る。動物において、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡは、核内でＲＮアーゼＩＩＩ酵素ドローシャおよびそのコファクターＤＧＣＲ８／Ｐａｓｈａによって約６５ｎｔのより短いヘアピン型ＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）にプロセスされる。その後、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは細胞質へエクスポートされ、そこで、それは別のＲＮアーゼＩＩＩ酵素Ｄｉｃｅｒによってさらにプロセスされ、サイズが約２２ｎｔのｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ＊二本鎖を放出する。マイクロＲＮＡ生物発生および機能についての多くの概要は入手可能であり、例えば、Ｂａｒｔｅｌ Ｃｅｌｌ １１６：２８１－２９７（２００４）、Ｍｕｒｃｈｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１６：２２３－２２９（２００４）、Ｄｕｇａｓ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ．７：５１２－５２０（２００４）およびＫｉｍ Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．６：３７６－３８５（２００５）を参照されたい。

【0087】

＜ＲＮＡ分子＞
本発明は、ＷＴ－ＫＲＡＳの発現を温存しながら突然変異体ＫＲＡＳ配列の発現を阻害するＲＮＡ分子の特定に基づく。したがって、本発明の一態様は、アンチセンス鎖およびセンス鎖を含む二本鎖ＲＮＡ分子であって、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列が、約１８～約２５個の連続ヌクレオチドから本質的になる領域である、ミスセンス突然変異Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２ＤおよびＧ１３Ｄ、またはミスセンス突然変異Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２ＶおよびＧ１３Ｄを含有する合成ヒトＫＲＡＳ遺伝子のヌクレオチド配列の領域に相補的であり、二本鎖ＲＮＡ分子が、ミスセンス突然変異Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２ＶおよびＧ１３Ｄのうちの１つまたは複数を含む変異ヒトＫＲＡＳ遺伝子の発現を阻害し、野生型ヒトＫＲＡＳの発現を最小限に阻害する、二本鎖ＲＮＡ分子に関する。ＲＮＡ分子によって標的化されるＫＲＡＳ遺伝子の領域は、残基１２および１３をコードするヌクレオチドを含む。ＲＮＡ分子は、細胞の野生型種（例えば、対照細胞または非形質転換細胞）と比較して、細胞において突然変異体ＫＲＡＳの発現の減少を提供する。一部の実施形態において、突然変異体ＫＲＡＳの発現は、少なくとも約５０％、例えば少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上阻害される。

【0088】

ミスセンス突然変異Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２ＤおよびＧ１３Ｄ、またはミスセンス突然変異Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２ＶおよびＧ１３Ｄを含有するヒトＫＲＡＳ遺伝子は、天然に存在しない。そのような人工的な遺伝子配列の領域の例には、配列番号３７および３８が含まれ、対応するＷＴ－ＫＲＡＳ配列（配列番号３９）と比較した突然変異を下線で示す。
配列番号３７
ACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTTATGACGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAG
配列番号３８
ACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTTTTGACGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAG
配列番号３９
ACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAG

【0089】

二本鎖ＲＮＡ分子は、約１８～約２５個のヌクレオチド（例えば、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４もしくは２５個またはその中の任意の範囲）を含むか、から本質的になるか、またはからなり得る。追加のヌクレオチドを、３’末端、５’末端、または３’および５’末端の両方に付加して、ＲＮＡ分子の操作を促進することができるが、それは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）における二本鎖ＲＮＡ分子の基本的特徴または機能に実質的に影響を及ぼさない。加えて、１つまたは２つのヌクレオチドを、本明細書で開示される配列のうちのいずれかの１つの末端または両方の末端から欠失してもよく、それは、ＲＮＡｉにおける二本鎖ＲＮＡ分子の基本的特徴または機能に実質的に影響を及ぼさない。「実質的に影響を及ぼす」という用語は、本明細書で使用される場合、ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質（例えばＷＴ－ＫＲＡＳ）の発現を、約５０％以下、例えば約５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％以下またはそれ未満だけ阻害する能力における変化を指す。そのような追加のヌクレオチドは、当業者に公知であり得る通り、標的配列に沿ってアンチセンス鎖の相補性を延長するヌクレオチドであってもよく、かつ／またはそのようなヌクレオチドは、ＲＮＡ分子もしくはＲＮＡ分子をコードする核酸分子の操作を促進するヌクレオチドであってもよい。例えば、３’末端のＴＴオーバーハングが存在してもよく、これは、ｓｉＲＮＡ二本鎖を安定化させるために使用され、ｓｉＲＮＡの特異性に影響を及ぼさない。

【0090】

本発明のｄｓＲＮＡは、いずれかの末端または両方の末端において一本鎖オーバーハングを場合により含み得る。二本鎖構造は、単一の自己相補性ＲＮＡ鎖（すなわち、ヘアピンループを形成する）によって形成してもよく、２つの相補性ＲＮＡ鎖によって形成してもよい。ＲＮＡ二本鎖形成は、細胞の内側または外側のいずれかで開始され得る。本発明のｄｓＲＮＡがヘアピンループを形成する場合、それは、細胞においてヘアピン配列を安定化させるための、相補性ＲＮＡ鎖間のヌクレオチドの範囲であるイントロンおよび／またはヌクレオチドスペーサーを場合により含み得る。ＲＮＡは、１細胞当たり少なくとも１つのコピーの送達を可能にする量で導入され得る。より高用量の二本鎖材料は、より有効な阻害を産生し得る。

【0091】

特定の実施形態において、本発明は、阻害のための標的遺伝子の領域に完全に相補的なヌクレオチド配列を含有する二本鎖ＲＮＡを提供する。しかしながら、二本鎖ＲＮＡ分子のアンチセンス鎖と標的配列との間の１００％の相補性は、本発明を実施するために必要とされないことを理解すべきである。したがって、遺伝子突然変異、株多型性または進化分岐のために予測され得る配列変動は、許容され得る。標的配列と比較して挿入、欠失および単一の点突然変異を有するＲＮＡ配列もまた、阻害に有効であり得る。

【0092】

ある特定の実施形態において、ＲＮＡ分子がＷＴ－ＫＲＡＳを標的とせず、ＷＴ－ＫＲＡＳの発現を最小限にしか阻害しないように、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、野生型ヒトＫＲＡＳのヌクレオチド配列との少なくとも３つのミスマッチを含有する。本明細書で使用される場合、「発現を最小限に阻害する」とは、ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質（例えばＷＴ－ＫＲＡＳ）の発現が、約５０％以下、例えば約５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％以下またはそれ未満だけ阻害されることを意味する。

【0093】

ある特定の実施形態において、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ミスセンス突然変異Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２ＶおよびＧ１３Ｄのうちの１つまたは複数を含む変異ヒトＫＲＡＳ遺伝子のヌクレオチド配列との２つ以下のミスマッチを含有する。一部の実施形態において、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、野生型ヒトＫＲＡＳのヌクレオチド配列との少なくとも３つのミスマッチを含有し、かつミスセンス突然変異Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２ＶおよびＧ１３Ｄのうちの１つまたは複数を含む変異ヒトＫＲＡＳ遺伝子のヌクレオチド配列との２つ以下のミスマッチを含有する。

【0094】

一部の実施形態において、センス鎖のヌクレオチド配列は、配列番号１～９のうちのいずれかのヌクレオチド配列と少なくとも約８０％同一である、例えば配列番号１～９のうちのいずれかのヌクレオチド配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、センス鎖のヌクレオチド配列は、配列番号１～９のうちのいずれかのヌクレオチド配列を含むか、から本質的になるか、またはからなる。
配列番号１ GAGCUUAUGACGUAGGCAA
配列番号２ AGUUGGAGCUUAUGACGUA
配列番号３ GGUAGUUGGAGCUUAUGAC
配列番号４ GUAGUUGGAGCUUAUGACG
配列番号５ UAGUUGGAGCUUAUGACGU
配列番号６ GUUGGAGCUUAUGACGUAG
配列番号７ UUGGAGCUUAUGACGUAGG
配列番号８ UGGAGCUUAUGACGUAGGC
配列番号９ GGAGCUUAUGACGUAGGCA

【0095】

一部の実施形態において、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、配列番号１９～２７のうちのいずれかのヌクレオチド配列と少なくとも約８０％同一である、例えば配列番号１９～２７のうちのいずれかのヌクレオチド配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、配列番号１９～２７のうちのいずれかのヌクレオチド配列を含むか、から本質的になるか、またはからなる。
配列番号１９ UUGCCUACGUCAUAAGCUC
配列番号２０ UACGUCAUAAGCUCCAACU
配列番号２１ GUCAUAAGCUCCAACUACC
配列番号２２ CGUCAUAAGCUCCAACUAC
配列番号２３ ACGUCAUAAGCUCCAACUA
配列番号２４ CUACGUCAUAAGCUCCAAC
配列番号２５ CCUACGUCAUAAGCUCCAA
配列番号２６ GCCUACGUCAUAAGCUCCA
配列番号２７ UGCCUACGUCAUAAGCUCC

【0096】

一部の実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖のうちの１つまたは両方は、３’末端においてＴＴオーバーハングを含む。したがって、一部の実施形態において、センス鎖は、配列番号１０～１８のうちのいずれかのヌクレオチド配列と少なくとも約８０％同一である、例えば配列番号１０～１８のうちのいずれかのヌクレオチド配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、センス鎖のヌクレオチド配列は、配列番号１０～１８のうちのいずれかのヌクレオチド配列を含むか、から本質的になるか、またはからなる。
配列番号１０ GAGCUUAUGACGUAGGCAAdTdT
配列番号１１ AGUUGGAGCUUAUGACGUAdTdT
配列番号１２ GGUAGUUGGAGCUUAUGACdTdT
配列番号１３ GUAGUUGGAGCUUAUGACGdTdT
配列番号１４ UAGUUGGAGCUUAUGACGUdTdT
配列番号１５ GUUGGAGCUUAUGACGUAGdTdT
配列番号１６ UUGGAGCUUAUGACGUAGGdTdT
配列番号１７ UGGAGCUUAUGACGUAGGCdTdT
配列番号１８ GGAGCUUAUGACGUAGGCAdTdT

【0097】

一部の実施形態において、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、配列番号２８～３６のうちのいずれかのヌクレオチド配列と少なくとも約８０％同一である、例えば配列番号２８～３６のうちのいずれかのヌクレオチド配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、配列番号２８～３６のうちのいずれかのヌクレオチド配列を含むか、から本質的になるか、またはからなる。
配列番号２８ UUGCCUACGUCAUAAGCUCdTdT
配列番号２９ UACGUCAUAAGCUCCAACUdTdT
配列番号３０ GUCAUAAGCUCCAACUACCdTdT
配列番号３１ CGUCAUAAGCUCCAACUACdTdT
配列番号３２ ACGUCAUAAGCUCCAACUAdTdT
配列番号３３ CUACGUCAUAAGCUCCAACdTdT
配列番号３４ CCUACGUCAUAAGCUCCAAdTdT
配列番号３５ GCCUACGUCAUAAGCUCCAdTdT
配列番号３６ UGCCUACGUCAUAAGCUCCdTdT

【0098】

本発明の一部の実施形態において、二本鎖ＲＮＡ分子のセンス鎖は、アンチセンス鎖に完全に相補的であってもよく、またはセンス鎖は、アンチセンス鎖に実質的に相補的もしくは部分的に相補的であってもよい。実質的または部分的に相補的によって、センス鎖およびアンチセンス鎖が、約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のヌクレオチド対形成においてミスマッチを有し得ることを意味する。そのようなミスマッチは、当業者に公知であり得る通り、センス鎖配列に、例えば３’末端付近に、導入して、Ｄｉｃｅｒによる二本鎖ＲＮＡ分子のプロセッシングを向上させたり、本発明のキメラ核酸分子または人工マイクロＲＮＡ前駆体分子に挿入されたｓｉＲＮＡ分子においてミスマッチのパターンを複製したりすることができる。そのような改変は、二本鎖の１つの末端における塩基対形成を弱め、鎖不斉を生成し、それゆえ、センス鎖の代わりにアンチセンス鎖が、プロセスされ、意図する遺伝子をサイレンシングする機会を向上させる（Ｇｅｎｇ ａｎｄ Ｄｉｎｇ “Ｄｏｕｂｌｅ－ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄ ｓｉＲＮＡｓ ｅｎｈａｎｃｅ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ａ ｍｕｔａｎｔ ＡＬＳ－ｃａｕｓｉｎｇ Ａｌｌｅｌｅ１” Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｉｎ．２９：２１１－２１６（２００８）；Ｓｃｈｗａｒｚ ｅｔ ａｌ． “Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ ｉｎ ｔｈｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｔｈｅ ＲＮＡｉ ｅｎｚｙｍｅ ｃｏｍｐｌｅｘ” Ｃｅｌｌ １１５：１９９－２０８（２００３））。

【0099】

本発明の二本鎖ＲＮＡ分子は、当該技術分野において公知のいかなる種類のＲＮＡ干渉分子の形態であってもよい。一部の実施形態において、二本鎖ＲＮＡ分子は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子である。他の実施形態において、二本鎖ＲＮＡ分子は、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子である。他の実施形態において、二本鎖ＲＮＡ分子は、マイクロＲＮＡ前駆体分子の部分である。

【0100】

＜アンチセンスオリゴヌクレオチド＞
本発明の一態様は、ミスセンス突然変異Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２ＤおよびＧ１３Ｄをコードする合成のヒトＫＲＡＳ－ｍＲＮＡへ標的としたアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）であって、長さが１６～２５ヌクレオチドであり、配列TCTTGCCTACGTCATA（配列番号１１４）を含むか、またはから本質的になる、ＡＳＯに関する。一部の実施形態において、ＡＳＯは、長さが１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４もしくは２５ヌクレオチドまたはその中の任意の範囲である。一部の実施形態において、ＡＳＯは、長さが２０、２１または２２ヌクレオチドである。一部の実施形態において、ＡＳＯは、長さが２０ヌクレオチドである。ある特定の実施形態において、ＡＳＯにおける特定されていないヌクレオチドの少なくとも８０％は、野生型ヒトＫＲＡＳ遺伝子に、例えば少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％相補的である。ある特定の実施形態において、ＡＳＯにおける特定されていないヌクレオチドの少なくとも８０％は、変異ヒトＫＲＡＳ遺伝子に、例えば少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％相補的である。ある特定の実施形態において、ＡＳＯは、長さが１７～２５ヌクレオチドであり、配列CTCTTGCCTACGTCATA（配列番号１２１）；長さが１８～２５ヌクレオチドであり、ACTCTTGCCTACGTCATA（配列番号１２２）；または長さが１９～２５ヌクレオチドであり、CACTCTTGCCTACGTCATA（配列番号１２３）を含むか、またはから本質的になる。

【0101】

一部の実施形態において、ＡＳＯは、配列CACTCTTGCCTACGTCATAA（配列番号１１５）またはそれと少なくとも９０％同一の、例えば少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一の配列を含むか、から本質的になるか、またはからなる。一部の実施形態において、ＡＳＯは、配列GCACTCTTGCCTACGTCATA（配列番号１１６）またはそれと少なくとも９０％同一の、例えば少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一の配列を含むか、から本質的になるか、またはからなる。

【0102】

ＡＳＯは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはそれらの組合せからなり得る。

【0103】

一部の実施形態において、ＡＳＯは、少なくとも１つの非天然化学修飾を含む。ある特定の実施形態において、ヌクレオチド結合のうちの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９個は、化学修飾されている。一部の実施形態において、ＡＳＯは、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含む。一部の実施形態において、ＡＳＯは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９個のホスホロチオエート結合を含む。一部の実施形態において、ＡＳＯは、ホスホロチオエート結合のみを含む（すべてホスホロチオエート結合である）。

【0104】

ある特定の実施形態において、ヌクレオチドのうちの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９個は、化学修飾されている。一部の実施形態において、ＡＳＯは、５’末端および／または３’末端においてまたはその付近に、例えば５’末端および／または３’末端の５ヌクレオチド内に、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド、例えば少なくとも１、２、３、４または５つの修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、ＡＳＯは、５’末端および３’末端の各々において少なくとも３つの、例えば少なくとも４つまたは少なくとも５つの、修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、修飾ヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）修飾ヌクレオチドである。一部の実施形態において、修飾ヌクレオチドのすべては、２’－ＭＯＥ修飾ヌクレオチドである。一部の実施形態において、ＡＳＯは、５’末端および／または３’末端の各々において少なくとも３つの、例えば少なくとも４つまたは少なくとも５つの２’－ＭＯＥ修飾ヌクレオチドを含む。

【0105】

一部の実施形態において、ＡＳＯは、

【化1】

から選択される配列を含むか、から本質的になるか、またはからなり、ここで、＊は、ホスホロチオエート結合を示し、太字は、２’－ＭＯＥ修飾ヌクレオチドを示す。一部の実施形態において、ＡＳＯは、配列番号６８および配列番号６９のうちの１つと少なくとも９０％同一の、例えば少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一の配列を含むか、から本質的になるか、またはからなる。

【0106】

本発明の別の態様は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２ＶおよびＧ１３Ｄから選択される突然変異をコードする天然のヒトＫＲＡＳ－ｍＲＮＡへ標的化されたＡＳＯであって、長さが１６～２５ヌクレオチドであり、
ａ）Ｇ１２Ｃ突然変異をコードするヒトＫＲＡＳ－ｍＲＮＡへ標的化されたTCTTGCCTACGCCACA（配列番号１１７）、
ｂ）Ｇ１２Ｄ突然変異をコードするヒトＫＲＡＳ－ｍＲＮＡへ標的化されたTCTTGCCTACGCCATC（配列番号１１８）、
ｃ）Ｇ１２Ｖ突然変異をコードするヒトＫＲＡＳ－ｍＲＮＡへ標的化されたTCTTGCCTACGCCAAC（配列番号１１９）、
ｄ）Ｇ１３Ｄ突然変異をコードするヒトＫＲＡＳ－ｍＲＮＡへ標的化されたTCTTGCCTACGTCACC（配列番号１２０）、または
ｅ）ａ）～ｄ）のいずれか１つと少なくとも９０％同一の配列
から選択される配列を含むか、またはから本質的になり、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの非天然化学修飾を含む、ＡＳＯに関する。

【0107】

一部の実施形態において、ＡＳＯは、配列番号１１７～１２０のうちの１つと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。

【0108】

一部の実施形態において、ＡＳＯは、長さが１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４もしくは２５ヌクレオチドまたはその中の任意の範囲である。一部の実施形態において、ＡＳＯは、長さが２０、２１または２２ヌクレオチドである。一部の実施形態において、ＡＳＯは、長さが２０ヌクレオチドである。ある特定の実施形態において、ＡＳＯにおける特定されていないヌクレオチドのうちの少なくとも８０％は、野生型ヒトＫＲＡＳ遺伝子に、例えば少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％相補的である。ある特定の実施形態において、ＡＳＯにおける特定されていないヌクレオチドのうちの少なくとも８０％は、変異ヒトＫＲＡＳ遺伝子に、例えば少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％相補的である。ある特定の実施形態において、ＡＳＯは、長さが１７～２５ヌクレオチドであり、配列番号１１７～１２０のうちの１つの配列の５’末端において追加のヌクレオチドＣを含む。ある特定の実施形態において、ＡＳＯは、長さが１８～２５ヌクレオチドであり、配列番号１１７～１２０のうちの１つの配列の５’末端において追加のヌクレオチドＡＣを含む。ある特定の実施形態において、ＡＳＯは、長さが１９～２５ヌクレオチドであり、配列番号１１７～１２０のうちの１つの配列の５’末端において追加のヌクレオチドＣＡＣを含む。ある特定の実施形態において、ＡＳＯは、長さが２０～２５ヌクレオチドであり、配列番号１１７～１２０のうちの１つの配列の５’末端において追加のヌクレオチドＧＣＡＣを含む。

【0109】

一部の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、
ａ）Ｇ１２Ｃ突然変異をコードするヒトＫＲＡＳ－ｍＲＮＡへ標的化されたGCACTCTTGCCTACGCCACA（配列番号１２４）、
ｂ）Ｇ１２Ｄ突然変異をコードするヒトＫＲＡＳ－ｍＲＮＡへ標的化されたGCACTCTTGCCTACGCCATC（配列番号１２５）、
ｃ）Ｇ１２Ｖ突然変異をコードするヒトＫＲＡＳ－ｍＲＮＡへ標的化されたGCACTCTTGCCTACGCCAAC（配列番号１２６）、または
ｄ）Ｇ１３Ｄ突然変異をコードするヒトＫＲＡＳ－ｍＲＮＡへ標的化されたGCACTCTTGCCTACGTCACC（配列番号１２７）
から選択される配列からなる。

【0110】

ＡＳＯは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはそれらの組合せからなり得る。

【0111】

一部の実施形態において、ＡＳＯは、少なくとも１つの非天然化学修飾を含む。ある特定の実施形態において、ヌクレオチド結合のうちの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９個は、化学修飾されている。一部の実施形態において、ＡＳＯは、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含む。一部の実施形態において、ＡＳＯは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９個のホスホロチオエート結合を含む。一部の実施形態において、ＡＳＯは、ホスホロチオエート結合のみを含む。

【0112】

ある特定の実施形態において、ヌクレオチドのうちの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９個は、化学修飾されている。一部の実施形態において、ＡＳＯは、５’末端および／または３’末端においてまたはその付近に、例えば５’末端および／または３’末端の５ヌクレオチド内に、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド、例えば少なくとも１、２、３、４または５つの修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、ＡＳＯは、５’末端および３’末端の各々において少なくとも５つの修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、修飾ヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、２’－ＭＯＥ修飾ヌクレオチドである。一部の実施形態において、修飾ヌクレオチドのすべては、２’－ＭＯＥ修飾ヌクレオチドである。一部の実施形態において、ＡＳＯは、５’末端および／または３’末端の各々において少なくとも３つの、例えば少なくとも４つまたは少なくとも５つの２’－ＭＯＥ修飾ヌクレオチドを含む。

【0113】

ある特定の実施形態において、ＡＳＯは、

【化2】

から選択される配列からなり、ここで、＊は、ホスホロチオエート結合を示し、太字は、２’－ＭＯＥ修飾ヌクレオチドを示す。一部の実施形態において、ＡＳＯは、配列番号７０～７３のうちの１つと少なくとも９０％同一の、例えば少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一の配列を含むか、から本質的になるか、またはからなる。

【0114】

一部の実施形態において、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドは、ロックド核酸ヌクレオチド、例えば少なくとも１、２、３、４または５つの修飾ヌクレオチドである。ロックド核酸は、非限定的に、リボースの２’酸素と４’炭素とを接続して、リボースを３’－エンド（Ｎｏｒｔｈ）コンフォメーションにロックするメチレン架橋であり得る。

【0115】

ある特定の実施形態において、ＡＳＯは、

【化3】

から選択される配列からなり、ここで、＊は、ホスホロチオエート結合を示し、太字は、２’－メトキシメチル修飾ヌクレオチドを示し、＋は、その後続のヌクレオチドがロックド核酸であることを示す。一部の実施形態において、ＡＳＯは、配列番号７４～７７、１６０または１６１のうちの１つと少なくとも９０％同一の、例えば少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一の配列を含むか、から本質的になるか、またはからなる。

【0116】

＜化学修飾ｓｉＲＮＡ＞
本発明の一態様は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２ＶおよびＧ１３Ｄから選択される突然変異をコードする天然のヒトＫＲＡＳ－ｍＲＮＡへ標的化されたｓｉＲＮＡ分子であって、ｓｉＲＮＡが、少なくとも１つの化学修飾を含む、ｓｉＲＮＡ分子に関する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子は、完全に化学修飾されている。「完全に化学修飾された」という用語は、ｓｉＲＮＡにおけるどのヌクレオチドも、化学修飾を含有することを意味する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子における各ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル基または２’－フルオロ基により修飾されている。

【0117】

ある特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡにおけるヌクレオチド結合のうちの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９個は、化学修飾されている。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含む。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９個のホスホロチオエート結合を含む。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ホスホロチオエート結合のみを含む。

【0118】

ある特定の実施形態において、少なくとも１つの化学修飾を含むｓｉＲＮＡ分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ここで、ｓｉＲＮＡ分子は、
配列番号１２８のセンス鎖および配列番号１２９のアンチセンス鎖、
配列番号１３０のセンス鎖および配列番号１３１のアンチセンス鎖、
配列番号１３２のセンス鎖および配列番号１３３のアンチセンス鎖、
配列番号１３４のセンス鎖および配列番号１３５のアンチセンス鎖、
配列番号１３６のセンス鎖および配列番号１３７のアンチセンス鎖、
配列番号１３８のセンス鎖および配列番号１３９のアンチセンス鎖、
配列番号１４０のセンス鎖および配列番号１４１のアンチセンス鎖、
配列番号１４２のセンス鎖および配列番号１４３のアンチセンス鎖、
配列番号１４４のセンス鎖および配列番号１４５のアンチセンス鎖、
配列番号１４６のセンス鎖および配列番号１４７のアンチセンス鎖、
配列番号１４８のセンス鎖および配列番号１４９のアンチセンス鎖、
配列番号１５０のセンス鎖および配列番号１５１のアンチセンス鎖、
配列番号１５２のセンス鎖および配列番号１５３のアンチセンス鎖、
配列番号１５４のセンス鎖および配列番号１５５のアンチセンス鎖、
配列番号１５６のセンス鎖および配列番号１５７のアンチセンス鎖、または
配列番号１５８のセンス鎖および配列番号１５９のアンチセンス鎖
の配列対の１つを含む。

【0119】

一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、配列番号１２８～１５９のうちの１つと少なくとも９０％同一の、例えば少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一の配列を含むか、から本質的になるか、またはからなる。

【0120】

【表1】

S -センス鎖
AS -アンチセンス鎖

【0121】

ある特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子は、完全に化学修飾されており、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ここで、ｓｉＲＮＡ分子は、
配列番号７８のセンス鎖および配列番号７９のアンチセンス鎖、
配列番号８０のセンス鎖および配列番号８１のアンチセンス鎖、
配列番号８２のセンス鎖および配列番号８３のアンチセンス鎖、
配列番号８４のセンス鎖および配列番号８５のアンチセンス鎖、
配列番号８６のセンス鎖および配列番号８７のアンチセンス鎖、
配列番号８８のセンス鎖および配列番号８９のアンチセンス鎖、
配列番号９０のセンス鎖および配列番号９１のアンチセンス鎖、
配列番号９２のセンス鎖および配列番号９３のアンチセンス鎖、
配列番号９４のセンス鎖および配列番号９５のアンチセンス鎖、
配列番号９６のセンス鎖および配列番号９７のアンチセンス鎖、
配列番号９８のセンス鎖および配列番号９９のアンチセンス鎖、
配列番号１００のセンス鎖および配列番号１０１のアンチセンス鎖、
配列番号１０２のセンス鎖および配列番号１０３のアンチセンス鎖、
配列番号１０４のセンス鎖および配列番号１０５のアンチセンス鎖、
配列番号１０６のセンス鎖および配列番号１０７のアンチセンス鎖、
配列番号１０８のセンス鎖および配列番号１０９のアンチセンス鎖、
配列番号１６２のセンス鎖および配列番号１６３のアンチセンス鎖、
配列番号１６４のセンス鎖および配列番号１６５のアンチセンス鎖、
配列番号１６６のセンス鎖および配列番号１６７のアンチセンス鎖、
配列番号１６８のセンス鎖および配列番号１６９のアンチセンス鎖、
配列番号１７０のセンス鎖および配列番号１７１のアンチセンス鎖、
配列番号１７２のセンス鎖および配列番号１７３のアンチセンス鎖、
配列番号１７４のセンス鎖および配列番号１７５のアンチセンス鎖、
配列番号１７６のセンス鎖および配列番号１７７のアンチセンス鎖、
配列番号１７８のセンス鎖および配列番号１７９のアンチセンス鎖、
配列番号１８０のセンス鎖および配列番号１８１のアンチセンス鎖、
配列番号１８２のセンス鎖および配列番号１８３のアンチセンス鎖、または
配列番号１８４のセンス鎖および配列番号１８５のアンチセンス鎖
の配列対のうちの１つを含む。

【0122】

一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、配列番号７８～１０９または１６２～１８５のうちの１つと少なくとも９０％同一の、例えば少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一の配列を含むか、から本質的になるか、またはからなる。

【0123】

本発明の別の態様は、ヒトＫＲＡＳ－ｍＲＮＡへ標的化されたｓｉＲＮＡ分子であって、ｓｉＲＮＡのセンス鎖が、配列番号５０または配列番号５１の配列を含むか、から本質的になるか、またはからなり、ｓｉＲＮＡが、少なくとも１つの非天然化学修飾を含む、ｓｉＲＮＡ分子に関する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡにおけるヌクレオチドの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個は、化学修飾されている。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、完全に化学修飾されている。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子における各ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル基または２’－フルオロ基により修飾されている。

【0124】

ある特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡにおけるヌクレオチド結合のうちの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９個は、化学修飾されている。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含む。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９個のホスホロチオエート結合を含む。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ホスホロチオエート結合のみを含む。

【0125】

ある特定の実施形態において、完全化学修飾ｓｉＲＮＡ分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ここで、ｓｉＲＮＡ分子は、
配列番号１１０のセンス鎖および配列番号１１１のアンチセンス鎖、または
配列番号１１２のセンス鎖および配列番号１１３のアンチセンス鎖
の配列対のうちの１つを含む。

【0126】

一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、配列番号１１０～１１３のうちの１つと少なくとも９０％同一の、例えば少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一の配列を含むか、から本質的になるか、またはからなる。

【0127】

二本鎖ＲＮＡ分子、ＡＳＯまたは化学修飾ｓｉＲＮＡ分子は、当該技術分野において公知の手技による化学合成および酵素ライゲーション反応を使用して構築され得る。例えば、二本鎖ＲＮＡ、ＡＳＯまたは化学修飾ｓｉＲＮＡ分子は、天然ヌクレオチド、または分子の生物学的安定性を増大させるようにもしくは二本鎖ＲＮＡ、ＡＳＯもしくは化学修飾ｓｉＲＮＡ分子と標的ヌクレオチド配列との間に形成された二重鎖の物理的安定性を増大させるように設計された様々な修飾ヌクレオチドを使用して化学合成してもよく、例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを使用することができる。二本鎖ＲＮＡ、ＡＳＯまたは化学修飾ｓｉＲＮＡ分子を生成するために使用され得る修飾ヌクレオチドの例には、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、５－ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４－アセチルシトシン、５－（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ－Ｄ－ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデニン、１－メチルグアニン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアニン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、Ｎ６－アデニン、７－メチルグアニン、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、ベータ－Ｄ－マンノシルキューオシン、５’－メトキシカルボキシメチルウラシル、５－メトキシウラシル、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、シュードウラシル、キューオシン、２－チオシトシン、５－メチル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、５－メチル－２－チオウラシル、３－（３－アミノ－３－Ｎ－２－カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗおよび２，６－ジアミノプリンが含まれるが、これらに限定されない。あるいは、二本鎖ＲＮＡまたはＡＳＯは、二本鎖ＲＮＡまたはＡＳＯをコードする核酸がクローニングされている発現ベクターを使用して産生することができる。

【0128】

二本鎖ＲＮＡ、ＡＳＯまたは化学修飾ｓｉＲＮＡ分子は、ヌクレオチド間架橋ホスフェート残基のうちの少なくとも１つまたはすべてが修飾ホスフェート、例えばメチルホスホネート、メチルホスホノチオエート、ホスホロモルホリデート、ホスホロピペラジデートおよびホスホルアミデートである、ヌクレオチド配列をさらに含み得る。例えば、ヌクレオチド間架橋ホスフェート残基のうちのいずれも、または１つおきのいずれも、説明される通りに修飾することができる。別の非限定的な例において、二本鎖ＲＮＡ、ＡＳＯまたは化学修飾ｓｉＲＮＡ分子は、ヌクレオチドのうちの少なくとも１つまたはすべてが、２’低級アルキル部分（例えば、Ｃ_１～Ｃ_４直鎖または分岐鎖、飽和または不飽和アルキル、例えば、メチル、エチル、エテニル、プロピル、１－プロペニル、２－プロペニルおよびイソプロピル）を含有する、ヌクレオチド配列である。別の例において、ヌクレオチドのうちの１つまたは複数は、２’－フルオロヌクレオチド、２－Ｏ－メチルヌクレオチドまたはロックド核酸ヌクレオチドであり得る。例えば、ヌクレオチドのうちのいずれも、または１つおきのいずれも、説明される通りに修飾することができる。また、Ｆｕｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：９１９３（１９８９）；Ａｇｒａｗａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１４０１（１９９０）；Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：３５３７（１９９０）；Ｓｐｒｏａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：３３７３（１９８９）；Ｗａｌｄｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｄｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５０１１（１９８８）を参照されたく、当該文献は、修飾ヌクレオチド塩基を含有するポリヌクレオチド分子を含むポリヌクレオチド分子の製造方法のそれらの教示について、それらを全体として参照により本明細書に組み込まれる。

【0129】

本発明は、本発明のＲＮＡ分子またはＡＳＯを含む核酸構築物にさらに関する。本発明は、本発明のＲＮＡ分子またはＡＳＯをコードする核酸構築物、およびＲＮＡ分子またはＡＳＯをコードする核酸分子を含む核酸構築物にさらに関する。これらの実施形態の各々において、核酸構築物は、ベクターまたはプラスミド、例えば発現ベクターであり得る。

【0130】

本発明の別の態様は、本発明のＲＮＡ分子、ＡＳＯ、化学修飾ｓｉＲＮＡ分子または核酸構築物と、別の構成成分、例えば好適な担体とを含む組成物に関する。一部の実施形態において、組成物は、本発明のＲＮＡ分子、ＡＳＯ、化学修飾ｓｉＲＮＡ分子または核酸構築物のうちの２つまたはそれ以上を含み、ここで、２つまたはそれ以上のＲＮＡ分子、ＡＳＯまたは化学修飾ｓｉＲＮＡ分子は各々、異なるアンチセンス鎖を含む。ある特定の実施形態において、２つまたはそれ以上のＲＮＡ分子は、同じ核酸構築物に、異なる核酸構築物に、またはそれらの任意の組合せに存在する。一部の実施形態において、組成物は、本発明のＲＮＡ分子、ＡＳＯ、化学修飾ｓｉＲＮＡ分子または核酸構築物と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物である。

【0131】

本発明の組成物は、ＲＮＡ分子、ＡＳＯ、化学修飾ｓｉＲＮＡ分子および核酸構築物のうちのいずれかを、任意の組合せで、かつ互いに対して任意の比で、含むか、から本質的になるか、またはからなり得る。さらに、「２つまたはそれ以上」によって、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個などの最大で全数の、本発明のＲＮＡ分子、ＡＳＯ、化学修飾ｓｉＲＮＡ分子および核酸構築物を意味する。一部の実施形態において、組成物は、配列番号１および配列番号３のＲＮＡ分子を含むか、から本質的になるか、またはからなる。

【0132】

本発明の一部の態様において、組成物または医薬組成物は、例えば本発明のＲＮＡ分子、ＡＳＯ、化学修飾ｓｉＲＮＡ分子または核酸構築物の安定性を向上させることによって、ＲＮＡ分子、ＡＳＯ、化学修飾ｓｉＲＮＡ分子または核酸構築物の、対象への送達を向上させる追加の構成成分をさらに含む。一部の実施形態において、追加の構成成分は、粒子、例えば微粒子またはナノ粒子であり得る。一部の実施形態において、粒子は、脂質粒子、例えばリポソーム、例えばマイクロリポソームまたはナノリポソームである。リポソーム、マイクロリポソームまたはナノリポソームは、リポソームを調製するために好適であるように当該技術分野において公知の任意の構成成分を含有し得る。一部の実施形態において、リポソームは、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）を含む。リポソームは、当該技術分野において公知の方法によって、例えばその全体が参照により本明細書の一部をなすＰｅｃｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．１３：２８７６（２０１４）において説明されるように、調製され得る。一部の実施形態において、ＲＮＡ分子は、例えばＡｒｂｕｔｕｓ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ（Ｄｏｙｌｅｓｔｏｗｎ、ＰＡ）によって提供される粒子などの粒子を使用して、安定な核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）に形成される。ある特定の実施形態において、脂質粒子は、コレステロール、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、ＰＥＧ－ｃＤＭＡまたはＰＥＧ－ｃＤＳＡおよび１，２－ジリノレイルオキシ－３－（Ｎ，Ｎ－ジメチル）アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）を含むか、から本質的になるか、またはからなる（Ｊｕｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１９：６６１（２００９）を参照されたい）。一部の実施形態において、脂質粒子は、本発明のＲＮＡ分子、ＡＳＯまたは化学修飾ｓｉＲＮＡ分子のうちの２つまたはそれ以上、例えば配列番号１および配列番号３のＲＮＡ分子を含む。一部の実施形態において、追加の構成成分は、ＲＮＡ分子、ＡＳＯ、化学修飾ｓｉＲＮＡ分子または核酸構築物が共有結合的もしくは非共有結合的にコンジュゲートされている、標的化された送達部分、例えばリガンド、アプタマーまたはモノクローナル抗体である。

【0133】

本発明は、本発明のＲＮＡ分子および／または核酸構築物を含む細胞を包含する。したがって、一部の実施形態において、本発明は、本発明のＲＮＡ分子および／または核酸構築物および／または組成物を含む形質転換された細胞であって、対照細胞と比較して突然変異体ＫＲＡＳの発現が低減している、形質転換された細胞を提供する。

【0134】

＜方法＞
本発明の核酸分子、核酸構築物および／または組成物を用いる様々な方法が、本明細書で提供される。したがって、一態様において、本発明は、細胞においてミスセンス突然変異Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２ＶおよびＧ１３Ｄのうちの１つまたは複数を含む変異ヒトＫＲＡＳ遺伝子の発現を阻害する方法であって、細胞を本発明のＲＮＡ分子、ＡＳＯ、化学修飾ｓｉＲＮＡ分子、核酸構築物、組成物および／または医薬組成物と接触させ、これによって、細胞において変異ヒトＫＲＡＳ遺伝子の発現を阻害することを含む方法を提供する。

【0135】

また、がんの処置を必要とする対象においてがんを処置する方法であって、がんが、ミスセンス突然変異Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２ＶおよびＧ１３Ｄのうちの１つまたは複数を含む変異ヒトＫＲＡＳ遺伝子を含み、本発明のＲＮＡ分子、ＡＳＯ、化学修飾ｓｉＲＮＡ分子、核酸構築物、組成物および／または医薬組成物を対象へ送達し、これによって、対象においてがんを処置することを含む、方法が本明細書で提供される。ミスセンス突然変異Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２ＶおよびＧ１３Ｄのうちの１つまたは複数を含む変異ヒトＫＲＡＳ遺伝子を含むがんは、１つまたは複数の細胞が突然変異体ＫＲＡＳ遺伝子を発現するがん、例えば腫瘍である。

【0136】

これらの態様のうちの各々の一実施形態において、対象は、がんと診断された対象であり得る。別の実施形態において、対象は、がんを発症するリスクにある（例えば遺伝的因子、喫煙、ウイルス感染、化学物質への曝露などのためにかかりやすくなっている）対象であり得る。さらなる実施形態において、対象は、突然変異体ＫＲＡＳ遺伝子を有することが特定され、かつがんと診断されたまたは診断されていない対象であり得る。

【0137】

本発明の二本鎖ＲＮＡ、ＡＳＯまたは化学修飾ｓｉＲＮＡ分子は、当該技術分野において公知の任意の方法によって、例えばトランスフェクションまたはマイクロインジェクションによって、例えば脂質粒子を含む組成物の部分として、細胞へ直接的に送達され得る。他の実施形態において、二本鎖ＲＮＡまたはＡＳＯは、対象の細胞内で二本鎖ＲＮＡまたはＡＳＯの発現を産生する、ＲＮＡまたはＡＳＯをコードするポリヌクレオチドの形態で対象へ送達され得る。当業者は、本発明のＲＮＡまたはＡＳＯをコードする単離されたポリヌクレオチドは、典型的に、適切な発現制御配列、例えば転写／翻訳制御シグナルおよびポリアデニル化シグナルを伴うことを理解するだろう。

【0138】

様々なプロモーター／エンハンサーエレメントが、所望のレベルおよび組織特異的発現によって使用され得ることがさらに理解されるだろう。プロモーターは、所望の発現パターンによって構成的または誘導性であり得る。プロモーターは、ネイティブであっても、外来性であってもよく、天然配列であっても、合成配列であってもよい。外来性によって、転写開始領域が導入される野生型宿主において、その転写開始領域が見出されないことを意図する。プロモーターは、それが目的の標的細胞（単数または複数）において機能するように選択される。

【0139】

例示すると、ＲＮＡまたはＡＳＯコード配列は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）主要最初期プロモーター、アルブミンプロモーター、伸長因子１－α（ＥＦ１－α）プロモーター、ＰγＫプロモーター、ＭＦＧプロモーターまたはラウス肉腫ウイルスプロモーターを作動可能に伴い得る。

【0140】

誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントは、非限定的に、ジンク誘導性メタロチオネイン（ＭＴ）プロモーター、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）誘導性マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系（ＷＯ ９８／１００８８を参照されたい）；エクジソン昆虫プロモーター（Ｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：３３４６（１９９６））；テトラサイクリン抑制系（Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：５５４７（１９９２））；テトラサイクリン誘導系（Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８：１７６６（１９９５）；また、Ｈａｒｖｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：５１２（１９９８）を参照されたい）；ＲＵ４８６誘導系（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：２３９（１９９７）；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，４：４３２（１９９７））；およびラパマイシン誘導系（Ｍａｇａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００：２８６５（１９９７））を含む、ホルモン誘導性および金属誘導性エレメント、ならびに外因的に供給される化合物によって調節される他のプロモーターを含む。

【0141】

他の組織特異的プロモーターまたは調節プロモーターとしては、典型的にはニューロンにおいて組織特異性を与えるプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。これらは、シナプシン１、チューブリンα１、血小板由来増殖因子Ｂ鎖、チロシンヒドロキシラーゼ、ニューロン特異的エノラーゼおよびニューロフィラメントについてのプロモーターを含むが、これらに限定されない。骨格筋細胞プロモーターには、β－アクチン、Ｐｉｔｘ３、クレアチンキナーゼおよびミオシン軽鎖についてのプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。心筋細胞プロモーターには、心臓アクチン、心臓トロポニンＴ、トロポニンＣ、ミオシン軽鎖－２およびα－ミオシン重鎖についてのプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。膵島（ベータ）細胞プロモーターには、グルコキナーゼ、ガストリン、インスリンおよび膵島アミロイドポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。

【0142】

さらに、特異的開始シグナルは、一般的に、挿入されたＲＮＡまたはＡＳＯコード配列の効率的な翻訳に必要とされる。ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含み得るこれらの翻訳制御配列は、天然および合成両方の、様々な起源の翻訳制御配列であってもよい。

【0143】

二本鎖ＲＮＡまたはＡＳＯをコードする単離された核酸は、発現ベクターへ組み込まれ得る。様々な宿主細胞と適合性の発現ベクターは、当該技術分野において周知であり、核酸の転写および翻訳のための好適なエレメントを含有する。典型的には、発現ベクターは、５’から３’方向へ、プロモーターと、プロモーターを作動可能に伴う二本鎖ＲＮＡをコードするコード配列と、場合によりＲＮＡポリメラーゼのための停止シグナルおよびポリアデニラーゼのためのポリアデニル化シグナルを含む停止配列とを含む「発現カセット」を含有する。

【0144】

当該技術分野において公知の動物および哺乳動物プロモーターの非限定的な例には、ＳＶ４０初期（ＳＶ４０ｅ）プロモーター領域、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の３’末端反復配列（ＬＴＲ）に含有されるプロモーター、アデノウイルス（Ａｄ）のＥ１Ａまたは主要後期プロモーター（ＭＬＰ）遺伝子のプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期プロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター、バキュロウイルスＩＥ１プロモーター、伸長因子１アルファ（ＥＦ１）プロモーター、ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ユビキチン（Ｕｂｃ）プロモーター、アルブミンプロモーター、マウスメタロチオネイン－Ｌプロモーターの調節配列および転写制御領域、遍在性プロモーター（ＨＰＲＴ、ビメンチン、α－アクチン、チューブリンなど）、中間径フィラメントのプロモーター（デスミン、ニューロフィラメント、ケラチン、ＧＦＡＰなど）、治療用遺伝子のプロモーター（ＭＤＲ、ＣＦＴＲまたは第ＶＩＩＩ因子タイプなどのプロモーター）、ならびに病因および／または疾患関連プロモーターが含まれるが、これらに限定されない。加えて、本発明のこれらの発現配列のうちのいずれかは、エンハンサーおよび／または調節配列などの付加によって改変され得る。

【0145】

本発明の実施形態において使用され得るエンハンサーには、ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー、伸長因子Ｉ（ＥＦ１）エンハンサー、酵母エンハンサー、ウイルス遺伝子エンハンサーなどが含まれるが、これらに限定されない。

【0146】

停止制御領域、すなわち、ターミネーターまたはポリアデニル化配列は、好ましい宿主にネイティブである様々な遺伝子に由来し得る。本発明の一部の実施形態において、停止制御領域は、合成配列、合成ポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ウイルスターミネーター配列その他を含むか、またはこれらに由来し得る。

【0147】

細胞または対象へポリヌクレオチドを送達するために、任意の好適なベクターが使用され得ることが、当業者に明らかであろう。ベクターは、インビボで細胞へ送達され得る。他の実施形態において、ベクターは、エクスビボで細胞へ送達される場合があり、その後、ベクターを含有する細胞は、対象へ送達される。送達ベクターの選択は、標的宿主の年齢および種、インビトロ対インビボ送達、所望の発現のレベルおよび持続性、意図される目的（例えば治療用またはスクリーニング用）、標的細胞または器官、送達経路、単離されたポリヌクレオチドのサイズ、安全性考慮などを含む当該技術分野において公知のいくつかの因子に基づいて行われ得る。

【0148】

好適なベクターには、プラスミドベクター、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、アルファウイルス；ワクシニアウイルス；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよび他のパルボウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルスまたは単純ヘルペスウイルス）、脂質ベクター、ポリリジンベクター、合成ポリアミノポリマーベクターなどが含まれるが、これらに限定されない。

【0149】

当該技術分野において公知の任意のウイルスベクターを、本発明において使用することができる。組換えウイルスベクターを産生するためのプロトコールおよび核酸送達にウイルスベクターを使用するためのプロトコールは、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）および他の標準的な研究室マニュアル（例えば、Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｉｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．：１９９７）において見出すことができる。

【0150】

非ウイルス移行法を用いることもできる。多くの核酸移行の非ウイルス法は、高分子の取り込みおよび細胞内輸送のための哺乳動物細胞により使用される通常の機構に頼る。特定の実施形態において、非ウイルス核酸送達系は、標的化された細胞による核酸分子の取り込みのためのエンドサイトーシス経路に頼る。この種類の例示的な核酸送達系は、リポソーム由来系、ポリリジンコンジュゲートおよび人工ウイルスエンベロープを含む。

【0151】

特定の実施形態において、プラスミドベクターが本発明の実施において使用される。例えば、ネイキッドプラスミドは、組織への注射によって筋細胞へ導入され得る。陽性細胞数は典型的に低いが、発現は何ヶ月間にもわたり延長することができる（Ｗｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：２４７（１９８９））。カチオン性脂質は、培養物中の一部の細胞への核酸の導入において補助となることが実証されている（Ｆｅｌｇｎｅｒ ａｎｄ Ｒｉｎｇｏｌｄ，Ｎａｔｕｒｅ ３３７：３８７（１９８９））。カチオン性脂質プラスミドＤＮＡ複合体の、マウスの循環への注射は、肺におけるＤＮＡの発現をもたらすことが示されている（Ｂｒｉｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．２９８：２７８（１９８９））。プラスミドＤＮＡの１つの利点は、それが非複製細胞へ導入され得ることである。

【0152】

代表的な実施形態において、核酸分子（例えばプラスミド）は、表面上に正電荷を有する脂質粒子へ捕捉され、場合により、標的組織の細胞表面抗原に対する抗体によりタグ付けされ得る（Ｍｉｚｕｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｏ Ｓｈｉｎｋｅｉ Ｇｅｋａ ２０：５４７（１９９２）；ＰＣＴ公開公報ＷＯ第９１／０６３０９号；日本特許出願第１０４７３８１号；および欧州特許公開公報第ＥＰ－Ａ－４３０７５号）。

【0153】

両親媒性カチオン性分子からなるリポソームは、インビトロおよびインビボでの核酸送達のための非ウイルスベクターとして有用である（Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４（１９９５）；Ｂｌａｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：２９１（１９９５）；Ｂｅｈｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：３８２（１９９４）；Ｒｅｍｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：６４７（１９９４）；およびＧａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７１０（１９９５）において概略される）。正帯電リポソームは、静電相互作用を介して負帯電核酸と複合体を形成して、脂質：核酸複合体を形成すると考えられる。脂質：核酸複合体は、核酸移行ベクターとしていくつかの利点を有する。ウイルスベクターとは異なり、脂質：核酸複合体は、本質的にサイズに制限がない発現カセットを移行するために使用することができる。複合体はタンパク質を欠くので、それらは、免疫原性応答および炎症応答の誘起がより少ない場合がある。さらに、それらは、複製または組み換えて感染性病原体を形成することができず、低い組込み頻度を有する。いくつかの公開公報から、両親媒性カチオン性脂質がインビボおよびインビトロで核酸送達を媒介し得ることが実証されている（Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３（１９８７）；Ｌｏｅｆｆｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５９９（１９９３）；Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５５０（１９９４））。

【0154】

いくつかのグループにより、動物およびヒトの両方におけるインビボトランスフェクションのための両親媒性カチオン性脂質：核酸複合体の使用が報告されている（Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７１０（１９９５）；Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：２０９（１９９３）；およびＴｈｉｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：９７４２（１９９５）において概略される）。米国特許第６，４１０，０４９号は、延長された貯蔵寿命を有するカチオン性脂質：核酸複合体を調製する方法を説明している。

【0155】

また、核局在化シグナルは、二本鎖ＲＮＡまたは発現ベクターの、核の近位へのターゲティング、および／または核へのその進入を向上させるために使用することができる。そのような核局在化シグナルは、タンパク質またはペプチド、例えばＳＶ４０ラージＴａｇ ＮＬＳまたはヌクレオプラスミンＮＬＳであり得る。これらの核局在化シグナルは、ＮＬＳ受容体（カリオフェリンアルファ）などの様々な核輸送因子と相互作用し、ＮＬＳ受容体はその後カリオフェリンベータと相互作用する。

【0156】

発現ベクターは、原核細胞または真核細胞における鎖ＲＮＡまたはＡＳＯの発現のために設計され得る。例えば、鎖ＲＮＡまたはＡＳＯは、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）などの細菌細胞、昆虫細胞（例えばバキュロウイルス発現系）、酵母細胞、植物細胞または哺乳動物細胞において発現され得る。一部の好適な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）においてさらに説明されている。細菌ベクターの例には、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ－９（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＢＳ、ｐＤ１０、ファージスクリプト（ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ）、ｐｓｉＸ１７４、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３－３、ｐＫＫ２３３－３、ｐＤＲ５４０およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が含まれるが、これらに限定されない。酵母サッカロミセス・セレビシア（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現のためのベクターの例には、ｐＹｅｐＳｅｃｌ（Ｂａｌｄａｒｉ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．６：２２９（１９８７））、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎ ａｎｄ Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，Ｃｅｌｌ ３０：９３３（１９８２））、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ５４：１１３（１９８７））およびｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）が含まれる。培養昆虫細胞（例えばＳｆ ９細胞）においてタンパク質を産生するための核酸の発現に使用可能なバキュロウイルスベクターの非限定的な例には、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６（１９８３））およびｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１（１９８９））が含まれる。

【0157】

哺乳動物発現ベクターの例には、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＶＫ３、ＰＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ＰＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０（１９８７））およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．６：１８７（１９８７））が含まれる。哺乳動物細胞において使用される場合、発現ベクターの制御機能は、多くの場合、ウイルス調節エレメントによって提供される。例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびサルウイルス４０に由来する。

【0158】

ウイルスベクターは、細胞および生きている動物対象における広範な遺伝子送達適用において使用されている。使用され得るウイルスベクターには、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、エプスタイン・バーウイルス、アデノウイルス、ジェミニウイルスおよびカリモウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。非ウイルスベクターの非限定的な例には、プラスミド、リポソーム、帯電脂質（サイトフェクチン）、核酸－タンパク質複合体およびバイオポリマーが含まれる。目的の核酸に加えて、また、ベクターは、１つもしくは複数の調節領域、ならびに／または選択、測定および核酸移行結果（特定の組織への送達、発現持続期間など）のモニタリングに有用な選択可能なマーカーを含み得る。

【0159】

上記に説明される調節制御配列に加えて、組換え発現ベクターは、追加のヌクレオチド配列を含有し得る。例えば、組換え発現ベクターは、ベクターを組み込んだ宿主細胞を特定するための選択可能なマーカー遺伝子をコードし得る。

【0160】

ベクターＤＮＡは、従来型形質転換またはトランスフェクション技法を介して原核細胞または真核細胞に導入することができる。本明細書で使用される場合、「形質転換」および「トランスフェクション」という用語は、外来性核酸（例えばＤＮＡおよびＲＮＡ）を宿主細胞へ導入するための様々な当該技術分野において認識される技法を指し、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、ＤＮＡをロードしたリポソーム、リポフェクタミン－ＤＮＡ複合体、細胞超音波処理、高速微粒子銃を使用する遺伝子ボンバードメント、およびウイルス媒介トランスフェクションを含むが、これらに限定されない。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするために好適な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）および他の研究室マニュアルにおいて見出すことができる。

【0161】

安定な組込みが所望される場合、多くの場合、低分率の細胞のみ（特に哺乳動物細胞）が、外来性ＤＮＡをそれらのゲノムに組み込む。組込み体を特定および選択するために、選択可能なマーカー（例えば抗生物質への抵抗性）をコードする核酸を、目的の核酸と共に宿主細胞へ導入してもよい。好ましい選択可能なマーカーには、Ｇ４１８、ハイグロマイシンおよびメトトレキセートなどの薬物への抵抗性を与えるマーカーが含まれる。選択可能なマーカーをコードする核酸は、目的の核酸を含むベクターと同じベクターで宿主細胞へ導入してもよく、または別々のベクターで導入してもよい。導入された核酸により安定にトランスフェクトされた細胞は、薬物選択によって特定することができる（例えば、選択可能なマーカー遺伝子を組み込んだ細胞は生存し、一方で、他の細胞は死滅する）。

【0162】

一実施形態において、本発明の二本鎖ＲＮＡ、ＡＳＯまたは化学修飾ｓｉＲＮＡ分子は、対象へ直接的に投与される。一般的に、本発明の化合物は、薬学的に許容される担体（例えば生理食塩水）中に懸濁され、経口で、局所的にもしくは静脈内点滴により投与されるか、または皮下に、筋内に、頭蓋内に、くも膜下腔内に、腹腔内に、直腸内に、膣内に、鼻内に、胃内に、気管内にもしくは肺内に注射される。それらは、好ましくは、肺、腸または膵臓などの疾患または障害の部位へ直接的に送達される。必要とされる投与量は、投与経路の選択；製剤の性質；患者の病気の性質；患者の大きさ、体重、表面積、年齢および性別；投与される他の薬物；ならびに主治医の判断に依存する。好適な投与量は、０．０１～１００．０μｇ／ｋｇの範囲内である。様々な投与経路の異なる効率の観点から、必要とされる投与量における広い変動を予測すべきである。例えば、経口投与は、ｉ．ｖ．注射による投与よりも高い投与量を必要とすることが予測され得る（例えば、２、３、４、６、８、１０、２０、５０、１００、１５０倍またはそれ以上）。これらの投与量レベルにおける変動は、当該技術分野において十分に理解される通り、最適化のための標準の経験的ルーチンを使用して調節することができる。投与は、１回であっても、多数回であってもよい。好適な送達媒体（例えばポリマー微粒子または埋め込み可能なデバイス）への阻害剤の被包は、送達、特に経口送達の効率を増大し得る。

【0163】

ある特定の実施形態に従って、二本鎖ＲＮＡ、ＡＳＯまたは化学修飾ｓｉＲＮＡ分子は、インビボで特定の細胞または組織へ標的化され得る。リポソームおよびウイルスベクター系を含むターゲティング送達媒体は、当該技術分野において公知である。例えば、リポソームは、リポソームに組み込まれた抗体、可溶性受容体またはリガンドなどのターゲティング剤を使用して、ターゲティング分子が結合し得る特定の細胞または組織を標的とすることにより、特定の標的細胞または組織へ方向付けることができる。ターゲティングリポソームは、例えば、Ｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５：５５００（１９８６）；Ｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１３９７９（１９８７）；Ｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１３９７３（１９８７）；およびＨｕａｎｇらの米国特許第４，９５７，７３５号において説明されており、これらの各々は、その全体が参照により本明細書の一部をなす。ウイルスが特定の細胞種に感染するようにエンベロープタンパク質を改変または置換することにより、エンベロープウイルスベクターを改変して、核酸分子を標的細胞へ送達することができる。アデノウイルスベクターにおいて、付着線維をコードする遺伝子を、細胞特異的受容体に結合するタンパク質ドメインをコードするように改変してもよい。ヘルペスウイルスベクターは、中枢および末梢神経系の細胞を天然に標的とする。あるいは、投与経路は、特定の細胞または組織を標的とするために使用することができる。例えば、アデノウイルスベクターの冠内投与は、遺伝子の心筋細胞への送達に有効であることが示されている（Ｍａｕｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０４：２１（１９９９））。コレステロール含有カチオン性リポソームの静脈内送達は、肺組織を優先的に標的とし（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：１６７（１９９７））、インビボで遺伝子の移行および発現を有効に媒介することが示されている。核酸分子の標的化されたインビボ送達の他の成功例は、当該技術分野において公知である。最後に、標的細胞において選択的に誘導され、非標的細胞においては実質的に不活性なままである転写制御配列および好ましくはプロモーターを選択することによって、組換え核酸分子は、標的細胞において選択的に（すなわち、優先的に、実質的排他的に）発現され得る。

【0164】

本発明の二本鎖ＲＮＡ、ＡＳＯまたは化学修飾ｓｉＲＮＡ分子は、場合により、他の治療剤と共に送達され得る。追加の治療剤は、本発明の二本鎖ＲＮＡ、ＡＳＯまたは化学修飾ｓｉＲＮＡ分子と同時発生的に送達され得る。本明細書で使用される場合、「同時発生的に（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔｌｙ）」という語は、組み合わせた効果を産生するのに十分に時間が近いことを意味する（すなわち、同時発生的に（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔｌｙ）は、同時に（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ）であってもよく、またはそれは互いに前後の短期間内に起こる２つもしくはそれ以上の事象であってもよい）。一実施形態において、本発明の二本鎖ＲＮＡ、ＡＳＯまたは化学修飾ｓｉＲＮＡ分子は、がんを処置するために有用な剤、例えば、１）ビンカアルカロイド（例えばビンブラスチン、ビンクリスチン）、２）エピポドフィロトキシン（例えばエトポシドおよびテニポシド）、３）抗生物質（例えばダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ダウノルビシン（ダウノマイシン、ルビドマイシン）、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）およびマイトマイシン（マイトマイシンＣ））、４）酵素（例えばＬ－アスパラギナーゼ）、５）生物学的応答改変剤（例えばインターフェロン－アルファ）、６）プラチナ配位複合体（例えばシスプラチンおよびカルボプラチン）、７）アントラセンジオン（例えばミトキサントロン）、８）置換された尿素（例えばヒドロキシウレア）、９）メチルヒドラジン誘導体（例えばプロカルバジン（Ｎ－メチルヒドラジン、ＭＩＨ））、１０）副腎皮質性抑制剤（例えばミトタン（ｏ，ｐ’－ＤＤＤ）およびアミノグルテチミド）、１１）副腎皮質ステロイド（例えばプレドニゾン）、１２）プロゲスチン（例えばカプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロンおよび酢酸メゲストロール）、１３）エストロゲン（例えばジエチルスチルベストロールおよびエチニルエストラジオール）、１４）抗エストロゲン薬（例えばタモキシフェン）、１５）アンドロゲン（例えばプロピオン酸テストステロンおよびフルオキシメステロン）、１６）抗アンドロゲン薬（例えばフルタミド）ならびに１７）ゴナドトロピン放出ホルモンアナログ（例えばリュープロリド）と共に投与される。別の実施形態において、本発明の化合物は、抗血管新生剤、例えば、ＶＥＧＦに対する抗体（例えばベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ）、ラニビズマブ（ＬＵＣＥＮＴＩＳ））および血管新生の他のプロモーター（例えばｂＦＧＦ、アンジオポエチン－１）に対する抗体、アルファ－ｖ／ベータ－３血管インテグリンに対する抗体（例えばＶＩＴＡＸＩＮ）、アンジオスタチン、エンドスタチン、ダルテパリン、ＡＢＴ－５１０、ＣＮＧＲＣペプチドＴＮＦアルファコンジュゲート、シクロホスファミド、コンブレタスタチンＡ４ホスフェート、ジメチルキサンテノン酢酸、ドセタキセル、レナリドミド、エンザスタウリン、パクリタキセル、パクリタキセルアルブミン安定化ナノ粒子製剤（Ａｂｒａｘａｎｅ）、大豆イソフラボン、（Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）、クエン酸タモキシフェン、サリドマイド、ＡＤＨ－１（ＥＸＨＥＲＩＮ）、ＡＧ－０１３７３６、ＡＭＧ－７０６、ＡＺＤ２１７１、トシル酸ソラフェニブ、ＢＭＳ－５８２６６４、ＣＨＩＲ－２６５、パゾパニブ、ＰＩ－８８、バタラニブ、エベロリムス、スラミン、リンゴ酸スニチニブ、ＸＬ１８４、ＺＤ６４７４、ＡＴＮ－１６１、シレンジタイドならびにセレコキシブ、またはそれらの任意の組合せと共に投与される。

【0165】

「がん」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞の任意の良性または悪性異常増殖を指す。例には、乳がん、前立腺がん、リンパ腫、皮膚がん、膵がん、結腸がん、黒色腫、悪性黒色腫、卵巣がん、脳がん、原発性脳癌腫、頭頸部がん、神経膠腫、神経膠芽腫、肝がん、膀胱がん、非小細胞肺がん、頭頸部癌腫、乳癌腫、卵巣癌腫、肺癌腫、小細胞肺癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌腫、精巣癌腫、膀胱癌腫、膵癌腫、胃癌腫、結腸癌腫、前立腺癌腫、泌尿生殖器癌腫、甲状腺癌腫、食道癌腫、骨髄腫、多発性骨髄腫、副腎癌腫、腎細胞癌腫、子宮内膜癌腫、副腎皮質癌腫、悪性膵性インスリノーマ、悪性カルチノイド癌腫、絨毛癌腫、菌状息肉腫、悪性高カルシウム血症、子宮頸部過形成、白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性顆粒球性白血病、急性顆粒球性白血病、有毛細胞白血病、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、カポジ肉腫、真性多血症、本態性血小板増加症、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、軟部組織肉腫、骨肉腫、原発性マクログロブリン血症および網膜芽細胞腫が含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態において、がんは、腫瘍形成がんの群から選択される。

【0166】

＜医薬組成物＞
さらなる態様として、本発明は、医薬製剤、および上記に説明される治療効果（例えばがんの処置）のいずれかを達成するためにそれを投与する方法を提供する。医薬製剤は、薬学的に許容される担体中に上記に説明される試薬のうちのいずれかを含み得る。

【0167】

「薬学的に許容される」によって、生物学的にまたは他の点で望ましくないものではない材料を意味する、すなわち、材料は、毒性などの任意の望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく対象へ投与され得る。

【0168】

本発明の製剤は、場合により、薬用剤、医薬剤、担体、補助剤、分散剤、希釈剤などを含み得る。

【0169】

本発明の二本鎖ＲＮＡ、ＡＳＯ、化学修飾ｓｉＲＮＡ分子または核酸構築物は、公知の技法に従って医薬担体中での投与のために製剤化され得る。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ （９^ｔｈ Ｅｄ．１９９５）を参照されたい。本発明による医薬製剤の製造において、二本鎖ＲＮＡ、ＡＳＯまたは化学修飾ｓｉＲＮＡ分子（それらの生理学的に許容される塩を含む）は、典型的に、特に、許容される担体と混合される。担体は、固体もしくは液体またはそれらの両方であってもよく、好ましくは０．０１または０．５重量％～９５重量％または９９重量％の二本鎖ＲＮＡ、ＡＳＯまたは化学修飾ｓｉＲＮＡ分子を含有し得る単位用量製剤、例えば錠剤として、二本鎖ＲＮＡ、ＡＳＯまたは化学修飾ｓｉＲＮＡ分子と製剤化される。１つまたは複数の二本鎖ＲＮＡ、ＡＳＯまたは化学修飾ｓｉＲＮＡ分子を、本発明の製剤中に組み込んでもよく、それは、周知の製薬技法のいずれかによって調製することができる。

【0170】

本発明のさらなる態様は、インビボで対象を処置する方法であって、対象へ、薬学的に許容される担体中の本発明の二本鎖ＲＮＡ、ＡＳＯまたは化学修飾ｓｉＲＮＡ分子を含む医薬組成物を投与することを含み、医薬組成物が、治療有効量で投与される、方法である。投与を必要とするヒト対象または動物への本発明の二本鎖ＲＮＡ、ＡＳＯまたは化学修飾ｓｉＲＮＡ分子の投与は、化合物を投与するための当該技術分野において公知の任意の手段によって行われ得る。

【0171】

本発明の製剤の非限定的な例には、経口、直腸、口腔（例えば舌下）、膣、非経口（例えば皮下；骨格筋、心筋、横隔膜筋および平滑筋を含む筋内；皮内；静脈内；腹腔内）、外用（すなわち、皮膚、および気道表面を含む粘膜表面両方）、鼻内、経皮、関節内、頭蓋内、くも膜下腔内および吸入投与、門脈内送達による肝臓への投与、ならびに直接的器官注射（例えば肝臓への、四肢への、中枢神経系への送達のために脳もしくは脊髄への、膵臓への、または腫瘍もしくは腫瘍の周囲組織への）に好適な製剤が含まれる。任意の所与の場合において最も好適な経路は、処置される状態の性質および重症度に、ならびに使用される特定の化合物の性質に依存する。一部の実施形態において、全身性投与に伴う任意の副作用を避けるために、製剤を局所的に送達することが望ましい場合がある。例えば、局所投与は、所望の処置部位における直接的注射によって、所望の処置部位付近の部位における（例えば処置部位に供給する血管への）静脈内導入によって達成され得る。一部の実施形態において、製剤は、虚血組織へ局所的に送達され得る。ある特定の実施形態において、製剤は、緩効性製剤、例えば緩効性デポー剤の形態であり得る。

【0172】

注射のために、担体は、典型的に、液体、例えば滅菌パイロジェンフリー水、パイロジェンフリーリン酸緩衝食塩水、静菌水またはＣｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ［Ｒ］（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）である。他の投与方法のために、担体は、固体または液体のいずれかであり得る。

【0173】

経口投与のために、化合物は、カプセル、錠剤および粉末などの固体剤形で、またはエリキシル剤、シロップ剤および懸濁液などの液体剤形で投与され得る。化合物は、グルコース、ラクトース、スクロース、マンニトール、デンプン、セルロースまたはセルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、サッカリンナトリウム、タルカン、炭酸マグネシウムなどの不活性成分および粉末化担体と共にゼラチンカプセル内に被包され得る。望ましい色、味、安定性、緩衝能、分散または他の公知の望ましい特色を提供するために添加され得る追加の不活性成分の例は、赤色酸化鉄、シリカゲル、ラウリル硫酸ナトリウム、二酸化チタン、食用白色インクなどである。同様の希釈剤は、圧縮錠剤を製造するために使用され得る。錠剤およびカプセルの両方は、数時間の期間にわたり薬物の連続放出を提供する徐放性製品として製造してもよい。圧縮錠剤は、任意の不快な味を隠し、大気から錠剤を保護するために糖衣をかけるか、もしくはフィルムコーティングしてもよく、または消化管内の選択的崩壊のために腸溶性コーティングしてもよい。経口投与のための液体剤形は、患者許容性を増大させるために着色料および香味料を含有し得る。

【0174】

口腔（舌下）投与のために好適な製剤は、香味付けした基剤、通常スクロースおよびアカシアまたはトラガカント中の化合物を含むロゼンジ；ならびにゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアカシアなどの不活性基剤中の化合物を含むパステル剤を含む。

【0175】

非経口投与に好適な本発明の製剤は、化合物の滅菌水性および非水性注射溶液を含み、その調製物は、好ましくは意図されるレシピエントの血液と等張である。これらの調製物は、抗酸化物質、緩衝液、静菌薬、および製剤を意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質を含有し得る。水性および非水性滅菌懸濁液は、懸濁剤および増粘剤を含み得る。製剤は、単位／用量または多用量容器、例えば密閉アンプルおよびバイアルにおいて提示してもよく、使用直前の滅菌液体担体、例えば食塩水または注射用水の添加のみを必要とする冷凍乾燥（凍結乾燥）状態において保存してもよい。

【0176】

即時注射溶液および懸濁液は、以前に説明される種類の滅菌粉末、顆粒および錠剤から調製することができる。例えば、本発明の一態様において、密閉容器中の単位剤形の本発明の化合物を含む注射用安定滅菌組成物が提供される。化合物または塩は、好適な薬学的に許容される担体と再構成されて、対象への注射に好適な液体組成物を形成することができる凍結乾燥物の形態において提供される。単位剤形は、典型的に、約１０ｍｇ～約１０グラムの化合物または塩を含む。化合物または塩が実質的に水不溶性である場合、十分な量の薬学的に許容される乳化剤を、十分な量で用いて、水性担体中において化合物または塩を乳化してもよい。１つのそのような有用な乳化剤は、ホスファチジルコリンである。

【0177】

直腸投与に好適な製剤は、好ましくは、単位用量坐剤として提示される。これらは、化合物を１つまたは複数の従来型固体担体、例えば、ココアバターと混合され、その後、生ずる混合物を成型することによって調製することができる。

【0178】

皮膚への外用適用に好適な製剤は、好ましくは、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、ゲル、スプレー、エアロゾルまたはオイルの形態をとる。使用され得る担体には、黄色ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、アルコール、経皮エンハンサーおよびそれらの２つまたはそれ以上の組合せが含まれる。

【0179】

経皮投与に好適な製剤は、長期間レシピエントの表皮と密着したままであるように適合させた別個のパッチとして提示され得る。また、経皮投与に好適な製剤は、イオントフォレーシスによって送達することができ（例えば、Ｔｙｌｅ，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．３：３１８（１９８６）を参照されたい）、典型的に、場合により緩衝された化合物の水溶液の形態をとる。好適な製剤は、クエン酸塩もしくはビス／トリス緩衝液（ｐＨ６）またはエタノール／水を含み、０．１～０．２Ｍの化合物を含有する。

【0180】

化合物は、あるいは、経鼻投与のために製剤化されるか、またはそうでなければ、任意の好適な手段によって対象の肺へ投与され、例えば化合物を含む呼吸用粒子の、対象が吸入するエアロゾル懸濁液によって投与され得る。呼吸用粒子は、液体または固体であり得る。「エアロゾル」という用語は、細気管支または鼻道へ吸入することができる、任意のガス中懸濁相を含む。特に、エアロゾルは、定量吸入器もしくは噴霧器中、またはミスト噴霧器中において産生され得るような、ガス中懸濁液の小滴を含む。また、エアロゾルは、空気または他の担体気体中に懸濁される乾燥粉末組成物を含み、これは、例えば吸入デバイスからの吹送によって送達され得る。Ｇａｎｄｅｒｔｏｎ ＆ Ｊｏｎｅｓ，Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ ｔｈｅ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｔｒａｃｔ，Ｅｌｌｉｓ Ｈｏｒｗｏｏｄ（１９８７）；Ｇｏｎｄａ（１９９０） Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ ６：２７３－３１３；およびＲａｅｂｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｍｅｔｈ．２７：１４３（１９９２）を参照されたい。化合物を含む液体粒子のエアロゾルは、当業者に公知である通り、圧力駆動エアロゾル噴霧器または超音波噴霧器による手段などの、任意の好適な手段によって産生され得る。例えば、米国特許第４，５０１，７２９号を参照されたい。化合物を含む固体粒子のエアロゾルは、同様に、製薬分野において公知の技法によって、任意の固体微粒子医薬エアロゾル発生器により産生され得る。

【0181】

あるいは、化合物を、全身性様式ではなく局所様式において、例えば、デポー剤または徐放性製剤において投与してもよい。

【0182】

さらに、本発明は、本明細書で開示される化合物およびその塩のリポソーム製剤を提供する。リポソーム懸濁液を形成するための技術は、当該技術分野において周知である。化合物またはその塩が水溶性塩である場合、従来型リポソーム技術を使用して、化合物またはその塩は、脂質小胞に組み込むことができる。そのような場合、化合物または塩の水溶性のために、化合物または塩は、リポソームの親水性中心またはコア内に実質的に取り込まれる。用いられる脂質層は、任意の従来型組成物の層であってもよく、コレステロールを含有し得るか、またはコレステロール非含有であり得る。目的の化合物または塩が水不溶性である場合、ここでもまた従来型リポソーム形成技術を用いて、塩は、リポソームの構造を形成する疎水性脂質二重層内に実質的に取り込まれ得る。いずれの場合でも、産生されるリポソームは、標準超音波技法およびホモジナイゼーション技法の使用を通して、大きさを低減させることができる。

【0183】

本明細書で開示される化合物またはその塩を含有するリポソーム製剤を、凍結乾燥して凍結乾燥物を産生してもよく、これは、水などの薬学的に許容される担体により再構成されてリポソーム懸濁液を再生し得る。

【0184】

水不溶性化合物の場合、例えば、水性基剤エマルション中などの、水不溶性化合物を含有する医薬組成物が調製され得る。そのような場合、組成物は、所望の量の化合物を乳化するために十分な量の薬学的に許容される乳化剤を含有する。特に有用な乳化剤には、ホスファチジルコリンおよびレシチンが含まれる。

【0185】

特定の実施形態において、化合物は、治療有効量において対象に投与され、治療有効量の用語は、上記に定義される通りである。薬学的に活性な化合物の投与量は、当該技術分野において公知の方法によって決定することができ、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ）を参照されたい。任意の特定の化合物の治療有効投与量は、化合物毎および患者毎にいくらか変動し、患者の状態および送達経路に依存する。一般的な提案として、約０．００１～約５０ｍｇ／ｋｇの投与量は、治療有効性を有し、すべての重量は、塩が用いられる場合を含み、化合物の重量に基づいて計算される。より高レベルでの毒性の懸念のために、静脈内投与量は、最高で約１０ｍｇ／ｋｇなどのより低レベルに制限される場合があり、すべての重量は、塩が用いられる場合を含み、化合物の重量に基づいて計算される。約１０ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇの投与量は、経口投与に用いられ得る。典型的に、約０．５ｍｇ／ｋｇ～５ｍｇ／ｋｇの投与量は、筋内注射に用いることができる。特定の投与量は、静脈内または経口投与ために、それぞれ、約１μｍｏｌ／ｋｇ～５０μｍｏｌ／ｋｇ、特に約２２μｍｏｌ／ｋｇ～３３μｍｏｌ／ｋｇの化合物である。

【0186】

本発明の特定の実施形態において、治療効果を達成するために、２回以上の投与（例えば、２、３、４回またはそれ以上の投与）を、様々な時間間隔で（例えば、毎時、毎日、毎週、毎月など）用いてもよい。

【0187】

本発明は、獣医学的適用および医療適用において使用を見出す。好適な対象は、鳥類および哺乳動物の両方を含み、哺乳動物は好ましい。「鳥類」という用語は、本明細書で使用される場合、ニワトリ、カモ、ガチョウ、ウズラ、シチメンチョウおよびキジを含むが、これらに限定されない。「哺乳動物」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒト、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギ類などを含むが、これらに限定されない。ヒト対象には、新生児、幼児、児童および成人が含まれる。他の実施形態において、対象は、がんの動物モデルである。ある特定の実施形態において、対象は、がんを有するか、またはがんについてのリスクを有する。

【0188】

以下の実施例は、本発明の特許請求の範囲を限定するとは意図されず、むしろ、ある特定の実施形態の例示であると意図される。当業者に想起される例示される方法における任意の変動は、本発明の範囲内に入ることが意図される。当業者によって理解される通り、請求される発明の各態様についていくつかの実施形態および要素が存在し、異なる要素のすべての組合せはこれにより予期され、そのため、本明細書で例示される特定の組合せは、請求される本発明の範囲における限定として解釈すべきでない。特定の要素が組合せで使用可能な要素の群から除去されるかまたはこれに付加される場合、要素の群は、そのような変化を組み込んだものとして解釈すべきである。

【実施例】

【0189】

［実施例１］突然変異体ＫＲＡＳ特異的ｓｉＲＮＡ
＜方法＞
新規突然変異体特異的ｓｉＲＮＡ（ＭＳ－ｓｉＲＮＡ）を、１９ヌクレオチドｓｉＲＮＡ有効性についての３ミスマッチ耐性閾値を示唆する以前の文献に基づいて設計した（Ｎａｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３２：Ｗ１２４（２００４））。配列と標的遺伝子との間の２つまたはそれ以下のミスマッチにより、ｓｉＲＮＡは、目的の遺伝子に結合でき、その発現をノックダウンすることに成功することができる。しかしながら、３ミスマッチ閾値およびそれ以上では、ｓｉＲＮＡは、標的を認識することができず、したがって、コードされたタンパク質の発現を許容する。Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓおよびＤｈａｒｍａｃｏｎにより提供されるオープンソースソフトウェアを使用して、最も一般に存在するＫＲＡＳ突然変異体（Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２ＤまたはＧ１２ＶおよびＧ１３Ｄ）の各々に対応するちょうど３つの点突然変異を有する、天然に実際に発生することのないＷＴ－ＫＲＡＳ遺伝子の人工的な超突然変異バージョンのアンチセンスになるように、カスタムＭＳ－ｓｉＲＮＡを生成した。３０個の隣接ヌクレオチドを、人工超突然変異ｍＲＮＡ入力におけるこれらの部位の上流および下流に含めた（図１）。ｓｉＲＮＡ配列を、２つの異なる人工ｍＲＮＡ配列を標的とするように設計し、１つは、コドン１２（Ｇ１２ＣおよびＧ１２Ｄ）および１３（Ｇ１３Ｄ）において特定のミスセンス突然変異を同時に含有し、もう１つは、コドン１２（Ｇ１２ＣおよびＧ１２Ｖ）および１３（Ｇ１３Ｄ）において特定のミスセンス突然変異を同時に含有したことに留意すべきである（図１）。生成される配列は、したがって、ＷＴ－ＫＲＡＳについては３つのミスマッチエラーを有するが、３つの突然変異体ＫＲＡＳ対立遺伝子の各々については２つのミスマッチエラーのみを有する、アンチセンスである。その結果、この配列は突然変異体ＫＲＡＳについての３ミスマッチ閾値未満であり、かつＷＴ－ＫＲＡＳ対立遺伝子について閾値超であるので、これらのＭＳ－ｓｉＲＮＡは、突然変異体ＫＲＡＳを標的とするタスクを最適化する一方で、ＷＴ－ＫＲＡＳ対立遺伝子を温存すると仮定された。加えて、カスタム配列設計において３つの異なる優勢なＫＲＡＳ突然変異体の各々からの１つの突然変異を導入することによって、生ずるｓｉＲＮＡは、１つではなく、いくつかのＫＲＡＳ突然変異体を同時に標的とする付加された潜在的利点を有する。

【0190】

ｐＢＡＢＥ－ｐｕｒｏレトロウイルス発現ベクターに挿入されたＷＴ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２ＶまたはＧ１３Ｄ－ＫＲＡＳ遺伝子を含有する構築物を調製した。ベクター構築物を拡張するために、プラスミドを、高効率コンピテント大腸菌細胞に添加し、振盪機上のＳ．Ｏ．Ｃ．培地中で３７℃にてインキュベートした。その後、細胞を、アンピシリンアガロースプレートに播種し、３７℃で一晩インキュベートした。一晩培養プレートから細菌コロニーを採り、１μｌ／ｍｌカルボサイクリン（ｃａｒｂｏｃｙｃｌｉｎ）を含むＬＢ培地に入れ、振盪機上で３７℃にて一晩インキュベートすることにより、液体培養物を調製した。液体培養物は、３組で行った。生ずる濁った培養物からのプラスミドＤＮＡを、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを使用する制限酵素消化ならびにゲル電気泳動により、プラスミド拡張の成功を確認した。Ｍｉｎｉｐｒｅｐからの消化していないプラスミドを、０．１μｌ／ｍｌのカルボサイクリンを含むＬＢ培地中でさらに拡張し、その後、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍａｘｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。

【0191】

ｐＢＡＢＥ－ｐｕｒｏ－ＫＲＡＳプラスミドを含有するレトロウイルスを産生するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞９×１０^６個を、２９３Ｔ培地（１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン－ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ）中において６ｃｍ細胞培養プレート上に播種し、３７℃、５％ＣＯ_２においてインキュベートした。２４時間後、ＯｐｔｉＭＥＭ培地に０．０１μｇ／μｌのプラスミド構築物および０．０１μｇ／μｌのＰＣＬ１０Ａパックベクタープラスミドの混合物を作出することによって、各ｐＢＡＢＥ－ｐｕｒｏ－ＫＲＡＳプラスミドについてプラスミドＤＮＡ混合物を調製した。加えて、ＯｐｔｉＭＥＭ培地中の０．０５μｇ／μｌのリポフェクタミン２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加し、室温で５分間インキュベートすることによって、Ｌ２Ｋ混合物を調製した。その後、Ｌ２Ｋ混合物を、各プラスミドＤＮＡ混合物と１：１で混合し、室温で２０分間インキュベートした。インキュベートした細胞から培地を除去し、その後、２ｍｌの２９３Ｔ培地を、２５０μｌのプラスミドＤＮＡ／Ｌ２Ｋ混合物と共に各ウェルに添加した。さらなる２４時間後、プラスミドＤＮＡ／Ｌ２Ｋ培地を、２９３Ｔ培地で置換した。さらなる２４時間後、生ずるウイルス培地を、ウェルから収集し、新鮮な２９３Ｔ培地で置換した。ウイルス培地を４℃の氷上で一晩保存した。さらなる２４時間後、培地をウェルから再び収集し、以前に保存したウイルスに添加した。混合物を室温で遠心分離し、その後、上清を収集した。このプロセスを、プラスミド構築物の代わりにｍＣｈｅｒｒｙおよび２９３Ｔ培地を使用して反復して、ｍＣｈｅｒｒｙおよび空のベクターウイルスをそれぞれ産生した。

【0192】

細胞にＫＲＡＳプラスミドを感染させるために、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を回収し、完全培地（１０％コロラドウシ血清および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ）中において６ウェルプレート中に１ウェル当たり１００，０００個で播種した。４～６時間後かつ細胞が付着したら、培地を吸引し、２５０μｌのウイルス培地（ＷＴ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｄ、ｍＣｈｅｒｒｙおよび空のベクター）または完全培地（陰性対照）と共に１０μｌ／ｍｌポリブレンを含む２ｍｌの完全培地を、各ウェルに添加した。細胞を、１５００ｇにおいて３０℃にて６０分間遠心分離し、その後、３７℃において一晩インキュベートした。２４時間後、ウェルを吸引し、完全培地を各ウェルに添加した。さらなる２４時間後、ウェルを吸引し、２μｇ／ｍｌのピューロマイシンを含む完全培地を添加した。陰性対照ウェルに生細胞がなくなるまで２４時間毎に培地をピューロマイシン培地により置換した。感染の成功を、ｍＣｈｅｒｒｙ発現を使用してさらに確証した。

【0193】

２４ウェルプレートにおいて１ウェル当たり５００μｌの完全培地当たり細胞６０，０００個の密度で播種したＫＲＡＳ感染ＮＩＨ３Ｔ３細胞において、ＲＮＡｉノックダウンを誘導した。スクランブルした対照ｓｉＲＮＡの配列、ならびに野生型および突然変異体ＫＲＡＳを強力にサイレンシングすることが以前に見出された陽性対照（Ｓｅｑ２番および３番、Ｇ１２ＣおよびＧ１２Ｄ ｓｉＲＮＡ）を、図１に示される通りに使用した（Ｆｌｅｍｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．３：４１３（２００５）；Ｐｅｃｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．１３：２８７６（２０１４））。細胞を、２０ｎＭ ｓｉＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）およびリポフェクタミン（Ｒ）ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、体積で２：１の比のトランスフェクション試薬対ｓｉＲＮＡ）と共に、完全培地および血清非含有培地の５：１混合物中で３７℃において５％ＣＯ_２にて５時間インキュベートした。培地を除去し、細胞を完全培地のみにおいてさらなる１９時間インキュベートし、その後ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔを使用して、ＲＮＡを収集および精製した。

【0194】

ｓｉＲＮＡ処理からの精製ＲＮＡを分光光度計を使用して定量し、その後、ｉＳｃｒｉｐｔ（商標）ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用してｃＤＮＡに逆転写した。ＫＲＡＳの相対的発現レベルを定量するために、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（商標）Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）においてＳＹＢＲグリーンの蛍光強度の実時間変化をモニタリングすることによって、ＲＴ－ＰＣＲ反応を行った。各試料を３反復で行った。また、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（商標）を使用して、ＫＲＡＳの周期閾値（Ｃｔ値）を標的参照遺伝子１８ｓのＣｔ値と比較することによってΔＣｔ値を計算し、その後、各ｓｉＲＮＡについてのΔＣｔ値をＮＣ ｓｉＲＮＡのΔＣｔ値と比較するΔΔＣＴ分析を使用して、ＲＱ値を得た。エラーバーは、１標準偏差を表す。データは、ＷＴおよびＧ１２Ｄについての２組の生物学的反復の１回の試験、ならびにＧ１２Ｃ、Ｇ１２ＶおよびＧ１３Ｄについての２組の生物学的反復の２回の試験の結果を表す。逆トランスフェクション実験を、各細胞株について各ｓｉＲＮＡについて２組行った。

【0195】

＜結果＞
インビトロでの突然変異体特異的ＫＲＡＳサイレンシングの有効性を試験するために、１パネルの候補ＭＳ ＫＲＡＳのｓｉＲＮＡ配列を、ＷＴおよび標的突然変異体ＫＲＡＳ発現細胞の両方においてＫＲＡＳ発現をノックダウンするそれらの能力について試験した。１２ＣＤ１３Ｄ＿１配列は、Ｇ１２Ｃ（５０％）、Ｇ１２Ｄ（８２％）およびＧ１３Ｄ突然変異体ＫＲＡＳ（６６％）をノックダウンする一方で、ＷＴ－ＫＲＡＳ発現の温存（陰性対照ｓｉＲＮＡと比較して４％のみのノックダウン）を呈することが観察された（図２Ａ）。また、この配列は、予想外に、Ｇ１２Ｖ発現をノックダウンすること（５８％）が記録された。加えて、また、１２ＣＤ１３Ｄ＿２および１２ＣＤ１３Ｄ＿４は、ＷＴ温存および突然変異体ノックダウンを呈することが分かった。しかしながら、前者は、１２ＣＤ１３Ｄ＿１よりも低いＷＴ温存を呈するように見え、後者は、すべての細胞株においてより少ないＫＲＡＳノックダウンを呈するように見えた（図２Ａ）。残りの配列は、突然変異体ＫＲＡＳに対して低い効力、ＷＴ－ＫＲＡＳ細胞株において高いＫＲＡＳノックダウン、またはこれらの両方を呈した（図２Ａ）。

【0196】

加えて、ＭＳ－ｓｉＲＮＡ配列の有効性を、標的特異性を呈することが以前に実証された配列と比較するために、Ｇ１２Ｃ特異的およびＧ１２Ｄ特異的ｓｉＲＮＡ配列（Ｆｌｅｍｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．３：４１３（２００５））を試験した。しかしながら、これらの配列の突然変異体特異性は確認されず、これらの配列は、それぞれ、ＷＴまたは他の突然変異体対立遺伝子に優る、Ｇ１２ＣおよびＧ１２Ｄ突然変異体ＫＲＡＳの期待される優先的ノックダウンを呈しなかった（図２Ｂ）。

【0197】

ＫＲＡＳ－ｓｉＲＮＡ配列１２ＣＤ１３Ｄ＿１および１２ＣＤ１３Ｄ＿４を、ＫＲＡＳ－Ｇ１２Ｄ突然変異体肺がん細胞株において試験した。対照ｓｉＲＮＡ（Ｓｃｒ）および２つの以前に確証されたＫＲＡＳ－ｓｉＲＮＡ（Ｓｅｑ２番および３番）を使用して、カスタマイズした突然変異体特異的ＫＲＡＳ－ｓｉＲＮＡ配列１２ＣＤ１３Ｄ＿１および１２ＣＤ１３Ｄ＿４は、ＫＲＡＳタンパク質発現のサイレンシングに非常に有効であることが実証された（図３）。

【0198】

私たちのカスタムｓｉＲＮＡ配列間のすべての可能なｓｉＲＮＡ配列の並べ替えを試験する。最も優れた可能なカスタムＫＲＡＳ－ｓｉＲＮＡ配列（リード配列は１２ＣＤ１３Ｄ＿１および１２ＣＤ１３Ｄ＿４）を確証するために、１２ＣＤ１３Ｄ＿１と１２ＣＤ１３Ｄ＿４との間で徐々に下流へ移動する配列ライブラリー（１２ＣＤ１３Ｄ＿Ａ～１２ＣＤ１３Ｄ＿Ｆ）を試験した（図４）。

【0199】

野生型（ＷＴ）または突然変異体Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２ＶおよびＧ１３ＤヒトＫＲＡＳ配列のいずれかの３Ｔ３細胞への安定な形質導入後、細胞に、図５において列挙されるＫＲＡＳ－ｓｉＲＮＡ配列をトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を溶解し、ＲＮＡを収集し、ｃＤＮＡを作製した。１８ｓをハウスキーピング遺伝子として使用してＫＲＡＳについて定量的ｑＰＣＲを行った。リード１２ＣＤ１３Ｄ＿１および１２ＣＤ１３Ｄ＿４カスタム配列が、やはり、突然変異体ＫＲＡＳのサイレンシングにおいて全体的に最も優れており、一方で、他の可能なＫＲＡＳ－ｓｉＲＮＡ配列（「Ａ」～「Ｆ」）は、様々なＫＲＡＳ－ｍＲＮＡ配列のサイレンシングにおいて全体的にあまり強力でないことが見出された。この実験において、カスタムＫＲＡＳ－ｓｉＲＮＡ １２ＣＤ１３Ｄ＿４配列が、ＷＴ配列の温存において最も優れていた。

【0200】

＜考察＞
突然変異体ＫＲＡＳを標的とするために多くの努力が払われてきたが、現在、臨床使用において直接的阻害剤は存在しない。さらに、最近の小分子がん療法は、低い標的特異性を呈し、非がん細胞において有害な毒性をもたらす（Ｐｅｃｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ １１：５９（２０１１））。ＫＲＡＳシグナル伝達経路において下流エフェクターを阻害することにおける現在の進歩にもかかわらず、ＫＲＡＳは、薬物開発にとってとらえどころのない標的のままである（Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．１３：８２８（２０１４））。そのため、本研究は、突然変異体ＫＲＡＳの発現を選択的に阻害する手段としての新規ＭＳ－ｓｉＲＮＡの有効性を調査した。

【0201】

これらの予備的な発見に基づいて、１２ＣＤ１３Ｄ＿１および１２ＣＤ１３Ｄ＿２ ｓｉＲＮＡ配列を、それらの高い突然変異体特異性および効力のために、治療剤としてのさらなる調査のリード候補として選択した。より低い程度ではあるが、１２ＣＤ１３Ｄ＿４もまた有望な候補である。しかしながら、突然変異体標的においてＫＲＡＳ発現をノックダウンすることにおけるその低い効率から、それは臨床関連治療剤として有効でない場合があることが示唆される。対照的に、Ｇ１２Ｃ特異的およびＧ１２Ｄ特異的ｓｉＲＮＡは、ＷＴ－ＫＲＡＳ対立遺伝子の温存をまったく呈しないように見える。

【0202】

加えて、Ｇ１２Ｄ点突然変異よりもＧ１２Ｖを標的とするように設計した両方の配列の低い特異性は、Ｇ１２Ｖターゲティング配列におけるＷＴ－ＫＲＡＳについてのより大きな耐性を示唆する。

【0203】

これらの予備的な発見は集合的に、発がん性ＫＲＡＳをサイレンシングするための突然変異体特異的媒体としての、新規ＭＳ－ｓｉＲＮＡの実行可能性を示唆する。突然変異体ＫＲＡＳ特異性を有する有効なペイロードとしてのその可能性により、新規突然変異体特異的ｓｉＲＮＡは、以前は「新薬開発不可能」であったものについて薬物開発を探求するための有望な手段である。

【0204】

［実施例２］合成突然変異体ＫＲＡＳへ標的としたアンチセンスオリゴヌクレオチド
野生型ＫＲＡＳ配列（配列番号５２）に対して、突然変異Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２ＤおよびＧ１３Ｄを含む本発明の突然変異体ＫＲＡＳ（配列番号５３）を標的とする一連のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）配列を作出した（図６および表２）。図６において、黒色バーは、２’－メトキシ－エチル（ＭＯＥ）修飾を有するヌクレオチドを表し、一方で、灰色の領域は、ＤＮＡからなる「ギャップマー」を表す。模式図は、正確な縮尺率ではなく、黒色バーは、各側の５つの隣接ＭＯＥ修飾ヌクレオチドからなり、一方で、１０個のヌクレオチドギャップマーが存在する。ＡＳＯは、すべてのヌクレオチド間のホスホロチオエート結合（ＰＳ、「＊」により示される）、１０ｎｔのギャップマー（下線）および５つの隣接２’－ＭＯＥ（メトキシ－エチル）修飾（太字）を組み込む。ＡＳＯを試験して、いくつかのＫＲＡＳ突然変異をサイレンシングする能力を維持する一本鎖ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ配列を特定した。

【0205】

【表2】

【0206】

４つの別々のＡ４３１細胞株を操作して、野生型ＫＲＡＳの発現を除去し、突然変異Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１３ＤまたはＧ１２Ｖのいずれか１つを発現させた。各細胞株を、１．１μＭの遊離ＡＳＯにより４８時間処理し、ｑＰＣＲを行った。結果を図７に示す。ＡＳＯのうちのいくつかが、突然変異のうちの１つまたは複数をサイレンシングすることが実証された一方で、ＡＳＯ１５およびＡＳＯ１６は最も一般的な４つのＫＲＡＳ突然変異すべてをサイレンシングすることにおいて非常に強力であることが分かった。

【0207】

ヒットした上位のもののいくつかを再評価し、ここでもまたＡＳＯ１５およびＡＳＯ１６は、用量応答様式において４つのＫＲＡＳ突然変異のすべてを強力にサイレンシングすることが分かった（図８）。細胞を、１．１μＭおよび１０μＭの遊離ＡＳＯにより４８時間処理し、その後、突然変異体ＫＲＡＳについてｑＰＣＲを行った。

【0208】

［実施例３］修飾ＡＳＯ１６配列
ＡＳＯを、天然に存在する突然変異、例えば単一突然変異（Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２ＶまたはＧ１３Ｄ）を標的とすることによって突然変異特異性を増大させたＡＳＯを特定するために、強力なＡＳＯ１６で開始して、修飾バージョンを調製した。修飾は、塩基置換およびロックド核酸の使用を含んだ。修飾した配列を、表３に示す。ＡＳＯは、すべてのヌクレオチド間のホスホロチオエート結合（ＰＳ、「＊」により示される）、１０ｎｔのギャップマー（下線）および５つの隣接２’－ＭＯＥ（メトキシ－エチル）修飾（太字）を組み込む。最後の４つの配列は、特定の部位における融解温度を増大させるために、ＭＯＥの代わりに単一のロックド核酸（ＬＮＡ、塩基の前の「＋」により示される）を使用する。ＬＮＡは、２’および４’炭素を接続するメチレン架橋からなる。

【0209】

【表3】

【0210】

ＡＳＯを、上記に説明される通りに、Ａ４３１細胞株について試験した。結果を、図９に示す。各ＫＲＡＳ突然変異についての効力の改善は、１）ＡＳＯ１６－Ｇ１２ＣおよびＡＳＯ－Ｇ１２Ｃ－ＬＮＡを使用してＧ１２Ｃ、２）ＡＳＯ１６－Ｇ１２ＤおよびＡＳＯ１６－Ｇ１２Ｄ－ＬＮＡを使用してＧ１２Ｄ、３）ＡＳＯ１６－Ｇ１２ＶおよびＡＳＯ１６－Ｇ１２Ｖ－ＬＮＡを使用してＧ１２Ｖ、ならびに４）ＡＳＯ１６－Ｇ１３ＤおよびＡＳＯ１６－Ｇ１３Ｄ－ＬＮＡを使用してＧ１３Ｄについて見出された。これらの結果から、これらのＡＳＯ配列の突然変異特異性の増大は効力の増大をもたらしたことが示される。

【0211】

ＡＳＯ１６活性についてのＬＮＡの効果を試験した。ＫＲＡＳ－Ｇ１２Ｃ突然変異を発現するＭＩＡＰａＣａ－２膵がん細胞株を、遊離ＡＳＯ取り込みにより試験した。細胞株を、１μＭまたは５μＭの、ミスマッチの部位の周囲に１、２または３個のＬＮＡを有するＡＳＯ１６、ＡＳＯ１６ Ｃ１２ＣまたはＡＳＯ１６ Ｇ１２Ｃにより７２時間処理し、ｑＰＣＲを行った。結果を図１０に示す。結果は、ミスマッチ部位におけるＬＮＡの増大による、ＫＲＡＳサイレンシングにおける有意な改善を示す。

【0212】

野生型ＫＲＡＳ発現を温存する能力を、同じＡＳＯにより試験した。ＡＳＯについての競合を避けるために内因性ＫＲＡＳ野生型対立遺伝子が欠失されているＡ４３１細胞において、ルシフェラーゼレポーター系を使用した。その後、これらのＡ４３１－ＫＲＡＳヌル株を操作して、ホタルルシフェラーゼレポーターでタグ付けした野生型ＫＲＡＳまたはＫＲＡＳ－Ｇ１２Ｃのいずれかを発現させた。自由取り込みによる５μＭのＡＳＯへの７２時間の曝露に際して、ＡＳＯは、Ｇ１２Ｃサイレンシングと比較して有意な野生型温存を示し、ＬＮＡ修飾を有するＡＳＯ１６－Ｇ１２Ｃ ＡＳＯにおいて最も著しかった（図１１）。

【0213】

［実施例４］完全修飾ｓｉＲＮＡ配列
突然変異した配列の発現の低減を最大限にする一方で、野生型ＫＲＡＳ配列を温存する配列を特定しようとして、実施例３において説明される単一のＫＲＡＳ突然変異へ標的としたＡＳＯのうちのいくつかをｓｉＲＮＡ分子に変換した。その後、これらのｓｉＲＮＡを完全に修飾して（ＦＭ）、ヌクレアーゼ分解および免疫刺激を最小限にした。これらの種類の修飾は多くの場合、ｓｉＲＮＡのサイレンシング活性を減弱させるが、本発明者らは、非修飾ｓｉＲＮＡと比較して、ｓｉＲＮＡのサイレンシング活性のすべてまたはほとんどすべてを保持するいくつかの完全修飾ｓｉＲＮＡ配列を開発した。

【0214】

表４は、調製した完全修飾ｓｉＲＮＡ配列を列挙する。

【0215】

ｓｉＲＮＡの各々を、ＷＴまたは標的化されるＫＲＡＳ突然変異のいずれかを発現するように操作したＡ４３１細胞において試験した。突然変異体発現Ａ４３１細胞については、ＷＴ対立遺伝子を、ＣＲＩＳＰＲを介して欠失させたので、示される発現は、突然変異体ｍＲＮＡのみを反映する。細胞に、低用量（２０ｎＭ）の陰性対照（ＮＣ）またはＦＭ ＫＲＡＳ－ｓｉＲＮＡをトランスフェクトし、２４時間後に単離されたＲＮＡについて、ＫＲＡＳ発現についてのｑＰＣＲを行った。

【0216】

【表4】

【0217】

Ｇ１２Ｃ突然変異を標的とするｓｉＲＮＡについて、Ｄ１－Ｇ１２Ｃ－ＦＭおよびＤ２－Ｇ１２Ｃ－ＦＭは両方とも、野生型発現を温存しながら突然変異体ＫＲＡＳ－Ｇ１２Ｃを低減させることができることが見出された（図１２）。注目すべきことに、すべてのｓｉＲＮＡが、Ｇ１２Ｃ ＫＲＡＳを抑制すること、または野生型ＫＲＡＳを温存することにおいて同等というわけではなかった。図１３において示される通り、「親」Ｄ１（１２ＣＤ１３Ｄ＿１）、Ｄ２（１２ＣＤ１３Ｄ＿２）およびＤ４（１２ＣＤ１３Ｄ＿４）配列の一部の（斜線のバー）突然変異体特異的（ＭＳ）反復は、より強力であることが見出された（パネル１）。ＭＳ配列のうちのいくつかは、ｐａｎ－ＫＲＡＳ Ｓｅｑ２とは異なり、ＷＴ配列よりも突然変異体をより強力に低減させることが見出された（Ｄ１－Ｇ１２Ｃ、Ｄ２－Ｇ１２Ｃ、Ｄ４－Ｇ１２Ｃを参照されたい）（パネル２）。最後に、これらのＭＳ配列のＦＭ反復は、ＷＴ－ＫＲＡＳ発現よりも、突然変異体ＫＲＡＳに対するサイレンシング活性の保持を示すことが見出された（例えばＤ２－Ｇ１２Ｃ－ＦＭ－Ｆ）（パネル３）。

【0218】

Ｇ１２Ｄ突然変異を標的とするｓｉＲＮＡについて、Ｄ１－Ｇ１２Ｄ－ＦＭ、Ｄ２－Ｇ１２Ｄ－ＦＭおよびＤ２－Ｇ１２Ｄ－ＦＭ－Ｆはすべて、突然変異体ＫＲＡＳ－Ｇ１２Ｄを低減させることができることが見出された（図１４）。また、Ｄ１－Ｇ１２Ｄ－ＦＭおよびＤ２－Ｇ１２Ｄ－ＦＭは、ＷＴ発現を温存することができた（図１４）。注目すべきことに、すべてのｓｉＲＮＡが、Ｇ１２Ｄ ＫＲＡＳを抑制すること、または野生型ＫＲＡＳを温存することにおいて同等というわけではなかった。図１５において示される通り、「親」Ｄ１、Ｄ２およびＤ４配列の一部の（斜線のバー）突然変異体特異的（ＭＳ）反復は、より強力であることが見出された（パネル１）。ＭＳ配列のうちのいくつかは、ｐａｎ－ＫＲＡＳ Ｓｅｑ２とは異なり、ＷＴ配列よりも突然変異体をより強力に低減させることが見出された（Ｄ１－Ｇ１２Ｄを参照されたい）（パネル２）。最後に、これらのＭＳ配列のＦＭ反復は、ＷＴ－ＫＲＡＳ発現よりも、突然変異体ＫＲＡＳに対するサイレンシング活性の保持を示すことが見出された（例えばＤ１－Ｇ１２Ｄ－ＦＭおよびＤ２－Ｇ１２Ｄ－ＦＭ）（パネル３）。

【0219】

Ｇ１２Ｖ突然変異を標的とするｓｉＲＮＡについて、Ｖ１－Ｇ１２Ｖ－ＦＭおよびＶ２－Ｇ１２Ｄ－ＦＭは、突然変異体ＫＲＡＳ－Ｇ１２Ｖを低減させることができ、一方でまた、ＷＴ発現を温存することができることが見出された（図１６）。注目すべきことに、すべてのｓｉＲＮＡが、Ｇ１２Ｄ ＫＲＡＳを抑制すること、または野生型ＫＲＡＳを温存することにおいて同等というわけではなかった。図１７において示される通り、「親」Ｄ１、Ｄ２およびＤ４配列の一部の（斜線のバー）突然変異体特異的（ＭＳ）反復は、より強力であることが見出された（パネル１）。ＭＳ配列のうちのいくつかは、ｐａｎ－ＫＲＡＳ Ｓｅｑ２とは異なり、ＷＴ配列よりも突然変異体をより強力に低減させることが見出された（Ｄ２－Ｇ１２Ｖを参照されたい）（パネル２）。最後に、これらのＭＳ配列のＦＭ反復は、ＷＴ－ＫＲＡＳ発現よりも、突然変異体ＫＲＡＳに対するサイレンシング活性の保持を示すことが見出された（例えばＤ１－Ｇ１２Ｖ－ＦＭおよびＤ２－Ｇ１２Ｖ－ＦＭ）（パネル３）。

【0220】

Ｇ１３Ｄ突然変異を標的とするｓｉＲＮＡについて、Ｄ２－Ｇ１３Ｄ－ＦＭおよびＤ２－Ｇ１３Ｄ－ＦＭ－Ｆは、突然変異体ＫＲＡＳ－Ｇ１２Ｄを低減させることができることが見出された（図１８）。また、Ｄ２－Ｇ１２Ｄ－ＦＭ－Ｆは、ＷＴ発現を温存することができた（図１８）。注目すべきことに、すべてのｓｉＲＮＡが、Ｇ１２Ｄ ＫＲＡＳを抑制すること、または野生型ＫＲＡＳを温存することにおいて同等というわけではなかった。図１９において示される通り、「親」Ｄ１、Ｄ２およびＤ４配列の一部の（斜線のバー）突然変異体特異的（ＭＳ）反復は、より強力であることが見出された（パネル１）。ＭＳ配列のうちのいくつかは、ｐａｎ－ＫＲＡＳ Ｓｅｑ２とは異なり、ＷＴ配列よりも突然変異体をより強力に低減させることが見出された（Ｄ１－Ｇ１３ＤおよびＤ４－Ｇ１３Ｄを参照されたい）（パネル２）。最後に、これらのＭＳ配列のＦＭ反復は、ＷＴ－ＫＲＡＳ発現よりも、突然変異体ＫＲＡＳに対するサイレンシング活性の保持を示すことが見出された（例えばＤ２－Ｇ１３Ｄ－ＦＭおよびＤ２－Ｇ１３Ｄ－ＦＭ－Ｆ）（パネル３）。

【0221】

Ｇ１２Ｄ標的化ｓｉＲＮＡを、Ａ４２７（ＫＲＡＳ－Ｇ１２Ｄ）肺がん細胞を使用して細胞生存率に対する効果について試験した。細胞にｓｉＲＮＡをトランスフェクトし、５（Ｄ５）または８（Ｄ８）日後にＣＥＬＬＴＩＴＥＲ＿ＧＬＯ（登録商標）発光リードアウトを使用して細胞生存率を測定した。図２０において示される通り、結果から、Ｄ２－Ｇ１２Ｄ Ｈｉ２ＦおよびＤ４－Ｇ１２Ｄ Ｈｉ２Ｆ ｓｉＲＮＡは、Ｇ１２Ｄ株に対して非常に強力であることが明らかである。

【0222】

同様の実験を行って、ｓｉＲＮＡについてのＩＣ_５０（すなわち、ＧＩ５０）値を決定した。結果を、表５および図２１に示す。

【0223】

【表5】

【0224】

同様の細胞生存率研究を、ＨＣＴ１１６（ＫＲＡＳ－Ｇ１３Ｄ）結腸がん細胞においてＧ１３Ｄ標的化ｓｉＲＮＡにより行った。図２２に示される通り、結果から、Ｄ２－Ｇ１３Ｄ完全修飾ｓｉＲＮＡのすべてが、がん細胞生存率を阻害するのに非常に強力であることが明らかである。

【0225】

同様の実験を行って、ｓｉＲＮＡについてのＩＣ_５０値を決定した。結果を、図２３に示す。加えて、Ａ４３１ ＷＴおよびＫＲＡＳ－Ｇ１３ＤモデルにおいてｑＰＣＲ実験を行って、最も強力なｓｉＲＮＡであるＥＦＴＸ－Ｇ１３Ｄ－Ｆ２による最大で５倍の野生型ＫＲＡＳの温存を示した（図２３）。

【0226】

インビボ有効性を研究するために、胸腺欠損ヌードマウスにおける異種移植片として、ＨＣＴ１１６（ＫＲＡＳ－Ｇ１３Ｄ）腫瘍を、それらが約１２５ｍｍ^３の大きさに達するまで確立し、その後、ＰＢＳ、または示されるリンカーを伴うＤ２－Ｇ１３Ｄ－Ｈｉ２Ｆ ｓｉＲＮＡにコンジュゲートしたＥＧＦＲターゲティングリガンド（ＧＥ１１）のいずれかにより処理した（図２４）。マウスを、滅菌ＰＢＳ中に懸濁したＧＥ１１－ｓｉＲＮＡ（５ｍｇ／ｋｇ）により皮下処理した。結果は、示される時点での腫瘍におけるＫＲＡＳの最大で５０～７０％のサイレンシングを示した（図２４）。示される各群および時点は、５つの独立した腫瘍を表す。

【0227】

Ｇ１２Ｖ標的化ｓｉＲＮＡを、ＳＫＣ０１（ＫＲＡＳ－Ｇ１２Ｖ）結腸がん細胞を使用して細胞生存率に対する効果について試験した。細胞にｓｉＲＮＡをトランスフェクトし、５（Ｄ５）または８（Ｄ８）日後にＣＥＬＬＴＩＴＥＲ＿ＧＬＯ（登録商標）発光リードアウトを使用して細胞生存率を測定した。図２５において示される通り、結果から、Ｖ１－Ｇ１２ＶおよびＶ４－Ｇ１２Ｖ完全修飾ｓｉＲＮＡの両方による実質的な抗がん活性が明らかである。

【0228】

同様の実験を行って、ｓｉＲＮＡについてのＩＣ_５０値を決定した。結果を、図２６に示す。加えて、Ａ４３１ ＷＴおよびＫＲＡＳ－Ｇ１２ＶモデルにおいてｑＰＣＲ実験を行って、ＥＦＴＸ－３Ｇ１２Ｖ１およびＥＦＴＸ－３Ｇ１２Ｖ４による野生型ＫＲＡＳの温存を示した（図２６）。

【0229】

ＫＲＡＳ発現に対するＥＦＴＸ－Ｄ１の効果を、ＮＩＨ３Ｔ３細胞において試験した。図２７Ａは、ＨＡタグ付きＫＲＡＳ ＷＴまたはＧ１２Ｃを安定に発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞の、２０ｎＭのＮＣ ｓｉＲＮＡ、Ｓｅｑ２ ｓｉＲＮＡまたはＥＦＴＸ－Ｄ１ ｓｉＲＮＡによる一過性トランスフェクションの３６時間後のウェスタンブロットを示す。細胞溶解物を、ＨＡ（ＫＲＡＳ）およびβ－アクチン（ローディング対照）についてブロッティングした。濃度測定を右に示し、結果は、ＮＣ ｓｉＲＮＡトランスフェクションおよびβ－アクチン発現について正規化される。図２７Ｂは、ＨＡタグ付きＫＲＡＳ ＷＴ、Ｇ１２ＣまたはＧ１２Ｄを安定に発現するＡ４３１細胞の、２０ｎＭのＮＣ ｓｉＲＮＡ、Ｓｅｑ２ ｓｉＲＮＡまたはＥＦＴＸ－Ｄ１ ｓｉＲＮＡによる一過性トランスフェクションの４８時間後のウェスタンブロットを示す。細胞溶解物を、ＨＡ（ＫＲＡＳ）およびビンキュリン（ローディング対照）についてブロッティングした。濃度測定を右に示し、結果は、ＮＣ ｓｉＲＮＡトランスフェクションおよびビンキュリン発現について正規化し、結果から、ＥＦＴＸ－Ｄ１が突然変異体ＫＲＡＳ発現をより強力にサイレンシングし、野生型レベルを温存し得るタンパク質レベルが明らかである。

【0230】

［実施例５］追加の完全修飾ｓｉＲＮＡ配列
配列番号５０または配列番号５１の配列を含むｓｉＲＮＡを、実施例１において説明される実験において陽性対照として使用した。これらのｓｉＲＮＡの完全修飾バージョンを調製して、それらの特異性および効力を試験した。ＦＭ ｓｉＲＮＡの配列を、表４に示す。ＨＣＴ１１６（結腸がん、ＫＲＡＳ－Ｇ１３Ｄ）およびＬＵ６５（肺がん、ＫＲＡＳ－Ｇ１２Ｃ）細胞株に、２０ｎＭの非修飾Ｓｅｑ２もしくはＳｅｑ３、または完全化学修飾（ＦＭ）Ｓｅｑ２－ＦＭもしくはＳｅｑ３－ＦＭ ｓｉＲＮＡ配列のいずれかをトランスフェクトした。Ｓｅｑ２－ＦＭおよびＳｅｑ３－ＦＭの両方は、驚くべきことに、とりわけ処置の４８時間後に、ＫＲＡＳ活性の完全なサイレンシングを維持した（図２８）。

【0231】

すべての出版物、特許および特許出願は、各個々の出版物、特許または特許出願が参照により組み込まれていることが特にかつ個々に示されているのと同様に、参照により本明細書に組み込まれる。

【0232】

上記発明は、理解を明確にする目的のために例示および例の手段によっていくらか詳細に説明されたが、上記実施形態および附属の特許請求の範囲の列挙の範囲内においてある特定の変化および改変が実行され得ることが明らかであろう。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【配列表】

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【国際調査報告】