特表 2023-521409 インビボ遺伝子治療のための前処理レジメン

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-05-24

(54)【発明の名称】インビボ遺伝子治療のための前処理レジメン

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/761 20150101AFI20230517BHJP

   A61K 38/20 20060101ALI20230517BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20230517BHJP

   A61K 31/573 20060101ALI20230517BHJP

   A61K 31/439 20060101ALI20230517BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20230517BHJP

   A61K 35/28 20150101ALI20230517BHJP

   A61P 7/00 20060101ALI20230517BHJP

   A61P 7/06 20060101ALI20230517BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20230517BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230517BHJP

   C12N 15/86 20060101ALI20230517BHJP

   C12N 15/861 20060101ALI20230517BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20230517BHJP

   C07K 14/715 20060101ALI20230517BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20230517BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20230517BHJP

   C07K 16/24 20060101ALI20230517BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20230517BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20230517BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20230517BHJP

【ＦＩ】

A61K35/761

A61K38/20

A61K39/395 U

A61K31/573

A61K31/439

A61K48/00

A61K35/28

A61P7/00

A61P7/06

A61P37/06

A61P43/00 105

A61P43/00 121

C12N15/86 Z ZNA

C12N15/861 Z

C12N7/01

C07K14/715

C07K16/28

C07K19/00

C07K16/24

C12N15/62 Z

C12N15/13

C12N15/12

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022562075

(86)(22)【出願日】2021-04-12

(85)【翻訳文提出日】2022-12-09

(86)【国際出願番号】 US2021026873

(87)【国際公開番号】W WO2021211450

(87)【国際公開日】2021-10-21

(31)【優先権主張番号】63/009,218

(32)【優先日】2020-04-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/121,777

(32)【優先日】2020-12-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522176001

【氏名又は名称】フレッド ハッチンソン キャンサー センター

(71)【出願人】

【識別番号】517075883

【氏名又は名称】ユニバーシティ オブ ワシントン

【氏名又は名称原語表記】Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ

【住所又は居所原語表記】４５４５ Ｒｏｏｓｅｖｅｌｔ Ｗａｙ ＮＥ， Ｓｕｉｔｅ ４００， Ｓｅａｔｔｌｅ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ９８１０５ ＵＳ

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】リーバー， アンドレ

(72)【発明者】

【氏名】キエム， ハンス－ピーター

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C085

4C086

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA95X

4B065AB01

4B065AC14

4B065AC20

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA44

4B065CA46

4C084AA02

4C084AA13

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA22

4C084BA23

4C084CA53

4C084DA13

4C084DA59

4C084MA02

4C084MA66

4C084NA05

4C084ZA511

4C084ZA551

4C084ZB082

4C084ZB211

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4C084ZC751

4C085AA14

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4C085DD62

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4C085GG02

4C086AA01

4C086AA02

4C086CB22

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4C086MA02

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4C086NA05

4C086ZB08

4C086ZC75

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB44

4C087BC83

4C087CA12

4C087MA02

4C087MA66

4C087NA05

4C087ZA51

4C087ZA55

4C087ZB21

4C087ZC75

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045DA51

4H045DA76

4H045EA24

4H045FA74

(57)【要約】

本開示は、とりわけ、インビボ遺伝子治療のための免疫抑制レジメン、及びその使用を提供する。本開示のさまざまな実施形態において、インビボ遺伝子治療は、対象の幹細胞への少なくとも１つの外来性コード核酸配列の送達を含む。インビボ遺伝子治療の成功は、免疫毒性によって阻害または低減され得る。本開示は、インビボ遺伝子治療、例えば、対象へのウイルス遺伝子治療ベクターの投与を含むインビボ遺伝子治療の免疫毒性を低減させる免疫抑制レジメンをとりわけ含む、組成物及び方法を提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

哺乳動物対象におけるインビボ遺伝子治療の方法であって、
（ｉ）炎症性シグナル阻害剤を含む免疫抑制レジメンを前記対象に投与すること、及び
（ｉｉ）ウイルス遺伝子治療ベクターの少なくとも１用量を前記対象に投与すること
を含む、方法。

【請求項2】

哺乳動物対象から幹細胞を取り出すことなく、前記対象の幹細胞を形質導入する方法であって、炎症性シグナル阻害剤を含む免疫抑制レジメンを投与された対象にウイルス遺伝子治療ベクターを送達することを含む、方法。

【請求項3】

前記炎症性シグナル阻害剤が、インターロイキン－１（ＩＬ－１）シグナル阻害剤であり、必要に応じて、前記ＩＬ－１シグナル阻害剤が、ＩＬ－１受容体（ＩＬ－１Ｒ）アンタゴニストである、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記ＩＬ－１Ｒアンタゴニストが、アナキンラである、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記免疫抑制レジメンが、インターロイキン６（ＩＬ－６）受容体アンタゴニストをさらに含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

前記ＩＬ－６受容体アンタゴニストが、トシリズマブである、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記免疫抑制レジメンが、コルチコステロイドをさらに含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

前記コルチコステロイドが、デキサメタゾンである、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記免疫抑制レジメンが、カルシニューリン阻害剤をさらに含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

前記カルシニューリン阻害剤が、タクロリムスである、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記免疫抑制レジメンが、ＴＮＦ－αシグナル阻害剤をさらに含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

前記ＴＮＦ－αシグナル阻害剤が、エタネルセプト、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、及びゴリムマブからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記免疫抑制レジメンが、ＪＡＫシグナル阻害剤をさらに含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項14】

前記ＪＡＫシグナル阻害剤が、バリシチニブ、トファシチニブ、ルキソリチニブ、及びフィルゴチニブからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記免疫抑制レジメンの前記投与が、
（ｉ）前記ベクターの第１の用量の投与の前の日に、
（ｉｉ）ＩＬ－１受容体アンタゴニストの少なくとも１用量を必要に応じて含む、前記ベクターの第１の用量の投与の日に、前記ベクターの前記第１の用量の投与の１～３時間前に、
（ｉｉｉ）ＩＬ－１受容体アンタゴニストの少なくとも１用量を必要に応じて含む、前記ベクターの１つまたは複数の後続用量の投与の日に、前記ベクターの前記１つまたは複数の後続用量の投与の１～３時間前に、
（ｉｖ）前記ベクターの第１の用量の投与の日と前記ベクターの最後の用量の投与の日との間の毎日に、及び／または
（ｖ）前記ベクターの最後の用量の投与の日の後の１日、２日もしくはそれよりも多い日数の毎日に、
ＩＬ－１受容体アンタゴニストを前記対象に投与することを含み、
必要に応じて、前記ＩＬ－１受容体アンタゴニストが、アナキンラである、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項16】

前記免疫抑制レジメンの前記投与が、１日あたりＩＬ－１受容体アンタゴニストの単一用量または１日あたりＩＬ－１受容体アンタゴニストの複数用量を前記対象に投与することを含み、必要に応じて、前記ＩＬ－１受容体アンタゴニストが、アナキンラである、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項17】

前記免疫抑制レジメンの前記投与が、０．０１～２０ｍｇ／ｋｇ／日のアナキンラを前記対象に投与することを含み、必要に応じて、前記投与が、静脈内または皮下である、請求項１５に記載の方法。

【請求項18】

前記免疫抑制レジメンの前記投与が、１０～２００ｍｇ／日のアナキンラを前記対象に投与することを含み、必要に応じて、前記投与が、静脈内または皮下である、請求項１５に記載の方法。

【請求項19】

前記免疫抑制レジメンの前記投与が、
（ｉ）前記ベクターの第１の用量の投与の前の日に、
（ｉｉ）ＩＬ－６受容体アンタゴニストの少なくとも１用量を必要に応じて含む、前記ベクターの第１の用量の投与の日に、前記ベクターの前記第１の用量の投与前の１時間以内に、
（ｉｉｉ）ＩＬ－６受容体アンタゴニストの少なくとも１用量を必要に応じて含む、前記ベクターの１つまたは複数の後続用量の投与の日に、前記ベクターの前記１つまたは複数の後続用量の投与前の１時間以内に、
（ｉｖ）前記ベクターの第１の用量の投与の日と前記ベクターの最後の用量の投与の日との間の毎日に、及び／または
（ｖ）前記ベクターの最後の用量の投与の日の後の１日、２日もしくはそれよりも多い日数の毎日に、
ＩＬ－６受容体アンタゴニストを前記対象に投与することを含み、
必要に応じて、前記ＩＬ－６受容体アンタゴニストが、トシリズマブである、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項20】

前記免疫抑制レジメンの前記投与が、１日あたりＩＬ－６受容体アンタゴニストの単一用量または１日あたりＩＬ－６受容体アンタゴニストの複数用量を前記対象に投与することを含み、必要に応じて、前記ＩＬ－６受容体アンタゴニストが、トシリズマブである、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項21】

前記免疫抑制レジメンの前記投与が、１～１５ｍｇ／ｋｇ／日のトシリズマブまたは５～２００ｍｇ／日のトシリズマブを前記対象に投与することを含み、必要に応じて、前記投与が、静脈内である、請求項１９または２０に記載の方法。

【請求項22】

前記免疫抑制レジメンの前記投与が、
（ｉ）前記ベクターの第１の用量の投与の前の日に、
（ｉｉ）前記ベクターの第１の用量の投与の日に、
（ｉｉｉ）前記ベクターの１つまたは複数の後続用量の投与の日に、
（ｉｖ）前記ベクターの第１の用量の投与の日と前記ベクターの最後の用量の投与の日との間の毎日に、及び／または
（ｖ）前記ベクターの最後の用量の投与の日の後の１日、２日もしくはそれよりも多い日数の毎日に、
コルチコステロイドを前記対象に投与することを含み、
必要に応じて、前記コルチコステロイドが、デキサメタゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロン、パラメタゾン、またはベタメタゾンである、請求項１～２１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項23】

前記免疫抑制レジメンの前記投与が、１日あたりコルチコステロイドの単一用量または１日あたりコルチコステロイドの複数用量を前記対象に投与することを含み、必要に応じて、前記コルチコステロイドが、デキサメタゾンである、請求項１１～２２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項24】

前記免疫抑制レジメンの前記投与が、０．１～１０ｍｇ／ｋｇ／日のデキサメタゾンを前記対象に投与することを含み、必要に応じて、前記投与が、静脈内、経口、または筋肉内である、請求項２２または２３に記載の方法。

【請求項25】

前記免疫抑制レジメンの前記投与が、
（ｉ）前記ベクターの第１の用量の投与前の４日間の毎日に、
（ｉｉ）前記ベクターの第１の用量の投与の日に、
（ｉｉｉ）前記ベクターの１つまたは複数の後続用量の投与の日に、及び／または
（ｉｖ）前記ベクターの第１の用量の投与の日と前記ベクターの最後の用量の投与の日との間の毎日に、及び／または
（ｖ）前記ベクターの最後の用量の投与の日の後の１日、２日もしくはそれよりも多い日数の毎日に、
カルシニューリン阻害剤を前記対象に投与することを含み、
必要に応じて、前記カルシニューリン阻害剤が、タクロリムスである、請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項26】

前記免疫抑制レジメンの前記投与が、１日あたりカルシニューリン阻害剤の単一用量または１日あたりカルシニューリン阻害剤の複数用量を前記対象に投与することを含み、必要に応じて、前記カルシニューリン阻害剤が、タクロリムスである、請求項１～２５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項27】

前記免疫抑制レジメンの前記投与が、０．００１～０．１ｍｇ／ｋｇ／日のタクロリムスを前記対象に投与することを含み、必要に応じて、前記投与が、皮下である、請求項２５または２６に記載の方法。

【請求項28】

前記方法が、１つまたは複数の免疫抑制剤を含まない対照と比較して、（ｉ）ＩＦＮ－ｇ、ＴＮＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、もしくはＩＬ－６のうちの１つまたは複数の量の有意な増加を引き起こさないか、または（ｉｉ）ＩＦＮ－ｇ、ＴＮＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、もしくはＩＬ－６のうちの１つまたは複数の量の有意に小さい増加を引き起こし、必要に応じて、前記対照が、（ａ）前記炎症性シグナル阻害剤、（ｂ）前記ＩＬ－６受容体アンタゴニスト、（ｃ）前記コルチコステロイド、及び（ｄ）前記カルシニューリン阻害剤から選択される１つまたは複数の免疫抑制剤を含まず、必要に応じて、前記量が、ＥＬＩＳＡまたはサイトカインビーズアレイによって測定される、請求項１～２７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項29】

幹細胞動員レジメンを前記対象に投与することをさらに含む、請求項１～２８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項30】

前記ベクターが、選択可能マーカーをコードする核酸配列を含み、必要に応じて、前記選択可能マーカーが、ＭＧＭＴ^{Ｐ１４０Ｋ}である、請求項１～２９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項31】

前記方法が、選択剤を前記対象に投与することを含み、必要に応じて、前記選択可能マーカーが、ＭＧＭＴ^{Ｐ１４０Ｋ}であり、前記選択剤が、Ｏ^６ＢＧ／ＢＣＮＵである、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

前記選択剤が、１つまたは複数の用量において前記対象に投与され、必要に応じて、前記選択剤の第１の用量が、前記対象への前記ベクターの第１の用量の投与の約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約５週間、約６週間、約７週間、約８週間、約９週間、及び／または約１０週間後に、前記対象に投与される、請求項３０または３１に記載の方法。

【請求項33】

前記ベクターが、注射によって前記対象に投与され、必要に応じて、前記注射が、静脈内または皮下である、請求項１～３２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項34】

前記ベクターの少なくとも第１の用量が、１キログラムあたり少なくとも１Ｅ１０個、少なくとも１Ｅ１１個、または少なくとも１Ｅ１２個のウイルス粒子（ｖｐ／ｋｇ）を含む、請求項１～３３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項35】

前記ベクターが、少なくとも１Ｅ１０ｖｐ／ｋｇ、少なくとも１Ｅ１１ｖｐ／ｋｇ、少なくとも１Ｅ１２ｖｐ／ｋｇ、少なくとも２Ｅ１２ｖｐ／ｋｇ、または少なくとも３Ｅ１２ｖｐ／ｋｇの総投薬量で投与される、請求項１～３４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項36】

前記ベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アルファウイルスベクター、フラビウイルスベクター、ラブドウイルスベクター、麻疹ウイルスベクター、ニューカッスル病ウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、またはピコルナウイルスベクターである、請求項１～３５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項37】

前記ベクターが、アデノウイルスベクターである、請求項１～３６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項38】

前記ベクターが、Ｂ群アデノウイルスベクターである、請求項１～３７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項39】

前記ベクターが、Ａｄ５／３５またはＡｄ３５アデノウイルスベクターであるか、またはこれに由来し、必要に応じて、前記ベクターが、Ａｄ３５^＋＋またはＡｄ５／３５^＋＋アデノウイルスベクターである、請求項１～３８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項40】

前記ベクターが、複製能力がないベクターであり、必要に応じて、前記複製能力がないベクターが、ヘルパー依存型アデノウイルスベクターである、請求項１～３９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項41】

ウイルス遺伝子治療ベクターが、治療ペイロードを含む核酸を含み、前記方法が、標的細胞ゲノムへの前記治療ペイロードの組み込みを容易にする薬剤をコードするサポートベクターを前記対象に投与することをさらに含む、請求項１～４０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項42】

前記サポートベクターが、前記ウイルス遺伝子治療ベクターと共に前記対象に投与される、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

前記サポートベクターが、１キログラムあたり１Ｅ９～１Ｅ１４個のウイルス粒子（ｖｐ／ｋｇ）の総投薬量で投与される、請求項４１または４２に記載の方法。

【請求項44】

前記ウイルス遺伝子治療ベクターが、治療ペイロードを含む核酸を含み、前記方法が、幹細胞への前記治療ペイロードの送達を引き起こし、必要に応じて、前記治療ペイロードの送達が、前記幹細胞のゲノムへの前記治療ペイロードの組み込みを含む、請求項１～４３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項45】

前記ウイルス遺伝子治療ベクターが、タンパク質コード治療ペイロードを含む核酸を含み、前記対象への前記ベクターの投与後に、前記対象のＰＢＭＣの少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％が、前記タンパク質を発現する、請求項１～４４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項46】

前記対象が、ヒト対象である、請求項１～４５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項47】

前記ヒト対象が、鎌状赤血球貧血、サラセミア、中間型サラセミア、血友病Ａ、血友病Ｂ、フォン・ヴィレブランド病、第Ｖ因子欠乏症、第ＶＩＩ因子欠乏症、第Ｘ因子欠乏症、第ＸＩ因子欠乏症、第ＸＩＩ因子欠乏症、第ＸＩＩＩ因子欠乏症、ベルナール・スーリエ症候群、灰色血小板症候群を罹患している、請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

前記免疫抑制レジメンの１つまたは複数の免疫抑制剤の前記投薬レジメンが、前記ウイルス遺伝子治療ベクターの少なくとも１用量の投与後に、前記対象または前記対象由来の試料における免疫毒性バイオマーカーの測定されたレベルに基づき、単位用量、１日用量、総用量、用量の頻度、及び／または用量の総数が増加され、前記測定されたレベルが、免疫毒性を指し示す場合、前記１つまたは複数の免疫抑制剤の前記投薬レジメンが増加される、請求項１～４７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項49】

前記免疫毒性バイオマーカーが、ＩＬ－Ιβ、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－２３、ＩＬ－２７、ＩＬ－３０、ＩＬ－３６、ＩＬ－１Ｒａ、ＩＬ－２Ｒ、ＩＦＮ－ａ、ＩＦＮ－ｂ、ＩＦＮ－γ、ＭＩＰ－Ｉａ、ΜΙΡ－Ιβ、ＭＣＰ－１、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＶＥＧＦ、ＲＡＮＴＥＳ、ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＦＧＦ－β、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、Ｃ反応性タンパク質、プロカルシトニン、フェリチン、Ｄダイマー、リンパ球の総集団、リンパ球の亜集団、対象温度、及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項４８に記載の方法。

【請求項50】

前記免疫抑制レジメンの１つまたは複数の免疫抑制剤の前記投薬レジメンが、前記ウイルス遺伝子治療ベクターの少なくとも１用量の投与後に、前記対象または前記対象由来の試料における前記ウイルス遺伝子治療ベクターに対する抗体の前記測定されたレベルに基づき、単位用量、１日用量、総用量、用量の頻度、及び／または用量の総数が増加され、前記測定されたレベルが、免疫毒性を指し示す場合、前記１つまたは複数の免疫抑制剤の前記投薬レジメンが増加され、必要に応じて、前記測定されたレベルが、抗体価であり、必要に応じて、前記抗体が、中和抗体である、請求項１～４９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項51】

前記免疫抑制レジメンの前記１つまたは複数の免疫抑制剤の前記投薬レジメンが、
（ｉ）インターロイキン－１（ＩＬ－１）シグナル阻害剤であって、必要に応じてアナキンラである前記ＩＬ－１シグナル阻害剤、
（ｉｉ）ＩＬ－６シグナル阻害剤であって、必要に応じてトシリズマブである前記ＩＬ－６シグナル阻害剤、
（ｉｉｉ）コルチコステロイドであって、必要に応じてデキサメタゾンである前記コルチコステロイド、及び
（ｉｖ）カルシニューリン阻害剤であって、必要に応じてタクロリムスである前記カルシニューリン阻害剤
のうちの１つまたは複数の投薬レジメンを含む、請求項４８～５０のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１２月４日出願の米国仮出願第６３／１２１，７７７号；及び２０２０年４月１３日出願の米国仮出願第６３／００９，２１８号のより早い出願日に基づく優先権及びその利益を主張している。これらの先行出願のそれぞれは、その全体が参考として援用される。

【0002】

政府による支援
本発明は、国立衛生研究所によって付与されたＨＬ１３６１３５、ＨＬ１２８２８８、及びＨＬ１３００４０の下で政府の支援を受けてなされたものである。政府は、本発明に一定の権利を有する。

【背景技術】

【0003】

背景
多くの既存遺伝子治療は、エクスビボで操作された細胞を経由して、目的の核酸配列を対象に送達する。ある特定のそのような方法は、エクスビボで操作された細胞を単離し、修飾し、増やし、単離するための精巧な施設の必要性を含む、エクスビボで操作された細胞に基づく治療のコスト及び技術的な複雑さを限定することなく含む、さまざまな弱点を有する。エクスビボで操作された細胞に基づくある特定の治療の追加的な課題は、レシピエントにおける生着を達成することの困難を含む。一例を挙げると、操作された細胞の生着を容易にするために高用量化学療法を含むエクスビボ治療は、異常ヘモグロビン症の処置に特に不適である。少なくともこれらの理由から、インビボ遺伝子治療の安全性及び／または有効性を増強する、インビボ遺伝子治療の戦略及びプロトコールの必要性が存在する。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0004】

要旨
本開示は、とりわけ、インビボ遺伝子治療のための免疫抑制レジメン、及びその使用を提供する。本明細書に開示されている通り、インビボ遺伝子治療は、少なくとも１つの外来性コード核酸配列が、対象から細胞を取り出すことなく対象の細胞に送達される、治療を含む。本開示のさまざまな実施形態では、インビボ遺伝子治療は、対象の幹細胞への少なくとも１つの外来性コード核酸配列の送達を含む。本開示のさまざまな実施形態では、インビボ遺伝子治療は、外来性コード核酸配列をコードする核酸配列を含むウイルスベクターを対象に投与することを含む。インビボ遺伝子治療の成功は、免疫毒性によって、すなわち、対象における免疫応答の、ウイルス遺伝子治療ベクターを含む治療剤またはレジメンなどの治療剤またはレジメンによる誘導によって阻害または低減され得、これは対象の処置及び／または福祉にとって逆効果である。場合によっては、免疫毒性は、炎症応答及び／またはサイトカイン応答を含む。本開示は、とりわけ、インビボ遺伝子治療、例えば、対象へのウイルス遺伝子治療ベクターの投与を含むインビボ遺伝子治療の免疫毒性を低減させる免疫抑制レジメンを含む、組成物及び方法を提供する。

【0005】

特定の実施形態は、哺乳動物対象から幹細胞を取り出すことなく、対象の幹細胞を形質導入する方法であって、炎症性シグナル阻害剤を含む免疫抑制レジメンを投与された対象にウイルス遺伝子治療ベクターを送達することを含む、方法を含む。

【0006】

特定の実施形態は、哺乳動物対象におけるインビボ遺伝子治療の方法であって、（ｉ）炎症性シグナル阻害剤を含む免疫抑制レジメンを対象に投与すること、及び（ｉｉ）ウイルス遺伝子治療ベクターの少なくとも１用量を対象に投与することを含む方法を含む。

【0007】

態様の中でもとりわけ、アナキンラ（Ｋｉｎｅｒｅｔ（登録商標））及びトシリズマブ（Ａｃｔｅｍｒａ（登録商標））とデキサメタゾンの組合せが、ＨＤＡｄ５／３５＋＋に対する自然免疫応答を十分に鈍らせることができたという最初の実証が本明細書に提供される。このことは、このようなベクターに対する自然応答の駆動における、ＩＬ－１及びＩＬ－６の役割を考証する。

【0008】

少なくとも１つの態様では、本開示は、哺乳動物対象におけるインビボ遺伝子治療の方法であって、（ｉ）炎症性シグナル阻害剤を含む免疫抑制レジメンを対象に投与すること、及び（ｉｉ）ウイルス遺伝子治療ベクターの少なくとも１用量を対象に投与することを含む方法を提供する。

【0009】

少なくとも１つの態様では、本開示は、哺乳動物対象から幹細胞を取り出すことなく、対象の幹細胞を形質導入する方法であって、炎症性シグナル阻害剤を含む免疫抑制レジメンを投与された対象にウイルス遺伝子治療ベクターを送達することを含む方法を提供する。

【0010】

種々の実施形態では、炎症性シグナル阻害剤は、インターロイキン－１（ＩＬ－１）シグナル阻害剤であり、必要に応じて、ＩＬ－１シグナル阻害剤は、ＩＬ－１受容体（ＩＬ－１Ｒ）アンタゴニストである。

【0011】

種々の実施形態では、ＩＬ－１Ｒアンタゴニストは、アナキンラである。

【0012】

種々の実施形態では、免疫抑制レジメンは、インターロイキン６（ＩＬ－６）受容体アンタゴニストをさらに含む。

【0013】

種々の実施形態では、ＩＬ－６受容体アンタゴニストは、トシリズマブである。

【0014】

種々の実施形態では、免疫抑制レジメンは、コルチコステロイドをさらに含む。

【0015】

種々の実施形態では、コルチコステロイドは、デキサメタゾンである。

【0016】

種々の実施形態では、免疫抑制レジメンは、カルシニューリン阻害剤をさらに含む。

【0017】

種々の実施形態では、カルシニューリン阻害剤は、タクロリムスである。

【0018】

種々の実施形態では、免疫抑制レジメンは、ＴＮＦ－αシグナル阻害剤をさらに含む。

【0019】

種々の実施形態では、ＴＮＦ－αシグナル阻害剤は、エタネルセプト、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、及びゴリムマブを含む群から選択される。

【0020】

種々の実施形態では、免疫抑制レジメンは、ＪＡＫシグナル阻害剤をさらに含む。

【0021】

種々の実施形態では、ＪＡＫシグナル阻害剤は、バリシチニブ、トファシチニブ、ルキソリチニブ、及びフィルゴチニブを含む群から選択される。

【0022】

種々の実施形態では、免疫抑制レジメンの投与は、（ｉ）ベクターの第１の用量の投与の前の日に、（ｉｉ）ＩＬ－１受容体アンタゴニストの少なくとも１用量を必要に応じて含む、ベクターの第１の用量の投与の日に、ベクターの第１の用量の投与の１～３時間前に、（ｉｉｉ）ＩＬ－１受容体アンタゴニストの少なくとも１用量を必要に応じて含む、ベクターの１つまたは複数の後続用量の投与の日に、ベクターの１つまたは複数の後続用量の投与の１～３時間前に、（ｉｖ）ベクターの第１の用量の投与の日とベクターの最後の用量の投与の日との間の毎日に、及び／または（ｖ）ベクターの最後の用量の投与の日の後の１日、２日もしくはそれよりも多い日数の毎日に、ＩＬ－１受容体アンタゴニストを対象に投与することを含み、必要に応じて、ＩＬ－１受容体アンタゴニストは、アナキンラである。

【0023】

種々の実施形態では、免疫抑制レジメンの投与は、１日あたりＩＬ－１受容体アンタゴニストの単一用量または１日あたりＩＬ－１受容体アンタゴニストの複数用量を対象に投与することを含み、必要に応じて、ＩＬ－１受容体アンタゴニストは、アナキンラである。

【0024】

種々の実施形態では、免疫抑制レジメンの投与は、０．０１～２０ｍｇ／ｋｇ／日のアナキンラを対象に投与することを含み、必要に応じて、投与は、静脈内または皮下である。

【0025】

種々の実施形態では、免疫抑制レジメンの投与は、１０～２００ｍｇ／日のアナキンラを対象に投与することを含み、必要に応じて、投与は、静脈内または皮下である。

【0026】

種々の実施形態では、免疫抑制レジメンの投与は、（ｉ）ベクターの第１の用量の投与の前の日に、（ｉｉ）ＩＬ－６受容体アンタゴニストの少なくとも１用量を必要に応じて含む、ベクターの第１の用量の投与の日に、ベクターの第１の用量の投与前の１時間以内に、（ｉｉｉ）ＩＬ－６受容体アンタゴニストの少なくとも１用量を必要に応じて含む、ベクターの１つまたは複数の後続用量の投与の日に、ベクターの１つまたは複数の後続用量の投与前の１時間以内に、（ｉｖ）ベクターの第１の用量の投与の日とベクターの最後の用量の投与の日との間の毎日に、及び／または（ｖ）ベクターの最後の用量の投与の日の後の１日、２日もしくはそれよりも多い日数の毎日に、ＩＬ－６受容体アンタゴニストを対象に投与することを含み、必要に応じて、ＩＬ－６受容体アンタゴニストは、トシリズマブである。

【0027】

種々の実施形態では、免疫抑制レジメンの投与は、１日あたりＩＬ－６受容体アンタゴニストの単一用量または１日あたりＩＬ－６受容体アンタゴニストの複数用量を対象に投与することを含み、必要に応じて、ＩＬ－６受容体アンタゴニストは、トシリズマブである。

【0028】

種々の実施形態では、免疫抑制レジメンの投与は、１～１５ｍｇ／ｋｇ／日のトシリズマブまたは５～２００ｍｇ／日のトシリズマブを対象に投与することを含み、必要に応じて、投与は、静脈内である。

【0029】

種々の実施形態では、免疫抑制レジメンの投与は、（ｉ）ベクターの第１の用量の投与の前の日に、（ｉｉ）ベクターの第１の用量の投与の日に、（ｉｉｉ）ベクターの１つまたは複数の後続用量の投与の日に、（ｉｖ）ベクターの第１の用量の投与の日とベクターの最後の用量の投与の日との間の毎日に、及び／または（ｖ）ベクターの最後の用量の投与の日の後の１日、２日もしくはそれよりも多い日数の毎日に、コルチコステロイドを対象に投与することを含み、必要に応じて、コルチコステロイドは、デキサメタゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロン、パラメタゾン、またはベタメタゾンである。

【0030】

種々の実施形態では、免疫抑制レジメンの投与は、１日あたりコルチコステロイドの単一用量または１日あたりコルチコステロイドの複数用量を対象に投与することを含み、必要に応じて、コルチコステロイドは、デキサメタゾンである。

【0031】

種々の実施形態では、免疫抑制レジメンの投与は、０．１～１０ｍｇ／ｋｇ／日のデキサメタゾンを対象に投与することを含み、必要に応じて、投与は、静脈内、経口、または筋肉内である。

【0032】

種々の実施形態では、免疫抑制レジメンの投与は、（ｉ）ベクターの第１の用量の投与前の４日間の毎日に、（ｉｉ）ベクターの第１の用量の投与の日に、（ｉｉｉ）ベクターの１つまたは複数の後続用量の投与の日に、及び／または（ｉｖ）ベクターの第１の用量の投与の日とベクターの最後の用量の投与の日との間の毎日に、及び／または（ｖ）ベクターの最後の用量の投与の日の後の１日、２日もしくはそれよりも多い日数の毎日に、カルシニューリン阻害剤を対象に投与することを含み、必要に応じて、カルシニューリン阻害剤は、タクロリムスである。

【0033】

種々の実施形態では、免疫抑制レジメンの投与は、１日あたりカルシニューリン阻害剤の単一用量または１日あたりカルシニューリン阻害剤の複数用量を対象に投与することを含み、必要に応じて、カルシニューリン阻害剤は、タクロリムスである。

【0034】

種々の実施形態では、免疫抑制レジメンの投与は、０．００１～０．１ｍｇ／ｋｇ／日のタクロリムスを対象に投与することを含み、必要に応じて、投与は、皮下である。

【0035】

種々の実施形態では、方法は、１つまたは複数の免疫抑制剤を含まない対照と比較して、（ｉ）ＩＦＮ－ｇ、ＴＮＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、もしくはＩＬ－６のうちの１つまたは複数の量の有意な増加を引き起こさないか、または（ｉｉ）ＩＦＮ－ｇ、ＴＮＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、もしくはＩＬ－６のうちの１つまたは複数の量の有意に小さい増加を引き起こし、必要に応じて、対照は、（ａ）炎症性シグナル阻害剤、（ｂ）ＩＬ－６受容体アンタゴニスト、（ｃ）コルチコステロイド、及び（ｄ）カルシニューリン阻害剤から選択される１つまたは複数の免疫抑制剤を含まず、必要に応じて、量は、ＥＬＩＳＡまたはサイトカインビーズアレイによって測定される。

【0036】

種々の実施形態では、方法は、幹細胞動員レジメンを対象に投与することをさらに含む。

【0037】

種々の実施形態では、ベクターは、選択可能マーカーをコードする核酸配列を含み、必要に応じて、選択可能マーカーは、ＭＧＭＴ^{Ｐ１４０Ｋ}である。

【0038】

種々の実施形態では、方法は、選択剤を対象に投与することを含み、必要に応じて、選択可能マーカーは、ＭＧＭＴ^{Ｐ１４０Ｋ}であり、選択剤は、Ｏ^６ＢＧ／ＢＣＮＵである。

【0039】

種々の実施形態では、選択剤は、１つまたは複数の用量において対象に投与され、必要に応じて、選択剤の第１の用量は、対象へのベクターの第１の用量の投与の約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約５週間、約６週間、約７週間、約８週間、約９週間、及び／または約１０週間後に、対象に投与される。

【0040】

種々の実施形態では、ベクターは、注射によって対象に投与され、必要に応じて、注射は、静脈内または皮下である。

【0041】

種々の実施形態では、ベクターの少なくとも第１の用量は、１キログラムあたり少なくとも１Ｅ１０個、少なくとも１Ｅ１１個、または少なくとも１Ｅ１２個のウイルス粒子（ｖｐ／ｋｇ）を含む。

【0042】

種々の実施形態では、ベクターは、少なくとも１Ｅ１０ｖｐ／ｋｇ、少なくとも１Ｅ１１ｖｐ／ｋｇ、少なくとも１Ｅ１２ｖｐ／ｋｇ、少なくとも２Ｅ１２ｖｐ／ｋｇ、または少なくとも３Ｅ１２ｖｐ／ｋｇの総投薬量で投与される。

【0043】

種々の実施形態では、ベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アルファウイルスベクター、フラビウイルスベクター、ラブドウイルスベクター、麻疹ウイルスベクター、ニューカッスル病ウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、またはピコルナウイルスベクターである。

【0044】

種々の実施形態では、ベクターは、アデノウイルスベクターである。

【0045】

種々の実施形態では、ベクターは、Ｂ群アデノウイルスベクターである。

【0046】

種々の実施形態では、ベクターは、Ａｄ５／３５またはＡｄ３５アデノウイルスベクターであるか、またはこれに由来し、必要に応じて、ベクターは、Ａｄ３５^＋＋またはＡｄ５／３５^＋＋アデノウイルスベクターである。

【0047】

種々の実施形態では、ベクターは、複製能力がないベクターであり、必要に応じて、複製能力がないベクターは、ヘルパー依存型アデノウイルスベクターである。

【0048】

種々の実施形態では、ウイルス遺伝子治療ベクターは、治療ペイロードを含む核酸を含み、方法は、標的細胞ゲノムへの治療ペイロードの組み込みを容易にする薬剤をコードするサポートベクターを対象に投与することをさらに含む。

【0049】

種々の実施形態では、サポートベクターは、ウイルス遺伝子治療ベクターと共に対象に投与される。

【0050】

種々の実施形態では、サポートベクターは、１キログラムあたり１Ｅ９～１Ｅ１４個のウイルス粒子（ｖｐ／ｋｇ）の総投薬量で投与される。

【0051】

種々の実施形態では、ウイルス遺伝子治療ベクターは、治療ペイロードを含む核酸を含み、方法は、幹細胞への治療ペイロードの送達を引き起こし、必要に応じて、治療ペイロードの送達は、幹細胞のゲノムへの治療ペイロードの組み込みを含む。

【0052】

種々の実施形態では、ウイルス遺伝子治療ベクターは、タンパク質コード治療ペイロードを含む核酸を含み、対象へのベクターの投与後に、対象のＰＢＭＣの少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％は、タンパク質を発現する。

【0053】

種々の実施形態では、対象は、ヒト対象である。

【0054】

種々の実施形態では、ヒト対象は、鎌状赤血球貧血、サラセミア、中間型サラセミア、血友病Ａ、血友病Ｂ、フォン・ヴィレブランド病、第Ｖ因子欠乏症、第ＶＩＩ因子欠乏症、第Ｘ因子欠乏症、第ＸＩ因子欠乏症、第ＸＩＩ因子欠乏症、第ＸＩＩＩ因子欠乏症、ベルナール・スーリエ症候群、灰色血小板症候群を罹患している。

【0055】

種々の実施形態では、免疫抑制レジメンの１つまたは複数の免疫抑制剤の投薬レジメンは、ウイルス遺伝子治療ベクターの少なくとも１用量の投与後に、対象または対象由来の試料における免疫毒性バイオマーカーの測定されたレベルに基づき、単位用量、１日用量、総用量、用量の頻度、及び／または用量の総数が増加され、測定されたレベルが、免疫毒性を指し示す場合、１つまたは複数の免疫抑制剤の投薬レジメンが増加される。

【0056】

種々の実施形態では、免疫毒性バイオマーカーは、ＩＬ－Ιβ、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－２３、ＩＬ－２７、ＩＬ－３０、ＩＬ－３６、ＩＬ－１Ｒａ、ＩＬ－２Ｒ、ＩＦＮ－ａ、ＩＦＮ－ｂ、ＩＦＮ－γ、ＭＩＰ－Ｉａ、ΜΙΡ－Ιβ、ＭＣＰ－１、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＶＥＧＦ、ＲＡＮＴＥＳ、ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＦＧＦ－β、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、Ｃ反応性タンパク質、プロカルシトニン、フェリチン、Ｄダイマー、リンパ球の総集団、リンパ球の亜集団、対象温度、及びこれらの組合せを含む群から選択される。

【0057】

種々の実施形態では、免疫抑制レジメンの１つまたは複数の免疫抑制剤の投薬レジメンは、ウイルス遺伝子治療ベクターの少なくとも１用量の投与後に、対象または対象由来の試料におけるウイルス遺伝子治療ベクターに対する抗体の測定されたレベルに基づき、単位用量、１日用量、総用量、用量の頻度、及び／または用量の総数が増加され、測定されたレベルが、免疫毒性を指し示す場合、１つまたは複数の免疫抑制剤の投薬レジメンが増加され、必要に応じて、測定されたレベルが、抗体価であり、必要に応じて、抗体が、中和抗体である。

【0058】

種々の実施形態では、免疫抑制レジメンの１つまたは複数の免疫抑制剤の投薬レジメンは、（ｉ）インターロイキン－１（ＩＬ－１）シグナル阻害剤であって、必要に応じてアナキンラであるＩＬ－１シグナル阻害剤、（ｉｉ）ＩＬ－６シグナル阻害剤であって、必要に応じてトシリズマブであるＩＬ－６シグナル阻害剤、（ｉｉｉ）コルチコステロイドであって、必要に応じてデキサメタゾンであるコルチコステロイド、及び（ｉｖ）カルシニューリン阻害剤であって、必要に応じてタクロリムスであるカルシニューリン阻害剤のうちの１つまたは複数の投薬レジメンを含む。

【0059】

定義
約：本明細書で使用される「約」という用語は、値に関して使用される場合、言及される値に照らして同様である値を指す。一般に、当業者なら、文脈を加味して、その文脈中の「約」によって包含される適切な変動度を理解するであろう。例えば、いくつかの実施形態では、「約」という用語は、言及される値の２５％以内、２０％以内、１９％以内、１８％以内、１７％以内、１６％以内、１５％以内、１４％以内、１３％以内、１２％以内、１１％以内、１０％以内、９％以内、８％以内、７％以内、６％以内、５％以内、４％以内、３％以内、２％以内、１％以内、またはそれ未満に収まる値の変動範囲を包含し得る。

【0060】

投与：本明細書で使用される「投与」という用語は、典型的には、組成物である薬剤または組成物に含められる薬剤の送達を達成するために組成物を対象または系に投与することを指す。

【0061】

親和性：本明細書で使用される「親和性」は、特定の結合薬剤（例えば、ウイルスベクター）及び／またはその結合部分と結合標的（例えば、細胞）との間で生じる非共有結合性相互作用の総和の強度を指す。別段の指定がない限り、本明細書で使用される「結合親和性」は、結合薬剤とその結合標的との間の１：１の相互作用（例えば、ウイルスベクターとウイルスベクターの標的細胞との間の１：１の相互作用）を指す。親和性の変化は、参照との比較（例えば、参照に対する増加もしくは減少）によって説明され得るか、または数値的に説明され得ることを当業者なら理解するであろう。親和性は、平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）及び／または平衡結合定数（Ｋ_Ａ）を含めて、当該技術分野で知られる多くの方法で測定及び／または表現され得る。Ｋ_Ｄは、ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎの商であり、Ｋ_Ａは、ｋ_ｏｎ／ｋ_ｏｆｆの商であり、ここで、ｋ_ｏｎは、結合速度定数（例えば、ウイルスベクターと標的細胞との結合速度定数）を指し、ｋ_ｏｆｆは、解離速度定数（例えば、標的細胞からのウイルスベクターの解離速度定数）を指す。ｋ_ｏｎ及びｋ_ｏｆｆは、当業者に知られる手法によって決定され得る。

【0062】

薬剤：本明細書で使用される「薬剤」という用語は、任意の化学物質を指し得、こうした化学物質には、限定されないが、原子、分子、化合物、アミノ酸、ポリペプチド、ヌクレオチド、核酸、タンパク質、タンパク質複合体、液体、溶液、糖、多糖、脂質、またはそれらの組み合わせもしくは複合体、のうちの１つ以上のいずれも含まれる。

【0063】

抗体：本明細書で使用される「抗体」という用語は、特定の標的抗原への特異的結合を付与するのに十分な標準免疫グロブリン配列エレメントを含むポリペプチドを指す。当該技術分野で公知の通り、天然において産生されるインタクトな抗体は、互いと結び付いて、「Ｙ字形」構造と一般的に称されるものになる、２つの同一重鎖ポリペプチド（それぞれ約５０ｋＤ）及び２つの同一軽鎖ポリペプチド（それぞれ約２５ｋＤ）で構成されている１５０ｋＤ四量体薬剤である。各重鎖は、少なくとも４つのドメイン（それぞれ約１１０アミノ酸長） － アミノ末端可変（ＶＨ）ドメイン（Ｙ構造の先端に位置する）と、それに続く３つの定常ドメイン：ＣＨ１、ＣＨ２、及びカルボキシ末端ＣＨ３（Ｙの幹部分の基部に位置する）で構成されている。「スイッチ」として公知の短い領域は、重鎖可変及び定常領域を接続する。「ヒンジ」は、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインを抗体の残部に接続する。このヒンジ領域における２つのジスルフィド結合は、インタクトな抗体において２つの重鎖ポリペプチドを互いに接続する。各軽鎖は、別の「スイッチ」によって互いに分離された、２つのドメイン － アミノ末端可変（ＶＬ）ドメインと、それに続くカルボキシ末端定常（ＣＬ）ドメインで構成されている。インタクトな抗体四量体は、２つの重鎖－軽鎖二量体で構成されており、この構成において、重鎖及び軽鎖が、単一のジスルフィド結合によって互いに連結され、２つの他のジスルフィド結合が、重鎖ヒンジ領域を互いに接続することにより、二量体は互いに接続され、四量体が形成される。天然に産生された抗体はまた、典型的にはＣＨ２ドメインにおいて、グリコシル化されている。天然抗体における各ドメインは、圧縮逆平行ベータバレルで互いに充填された２つのベータシート（例えば、３鎖シート、４鎖シート、または５鎖シート）から形成される「免疫グロブリンフォールド」によって特徴付けられる構造を有する。各可変ドメインは、「相補性決定領域」として公知の３つの高頻度可変ループ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）及び４つの若干不変の「フレームワーク」領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４）を含有する。天然抗体がフォールドすると、ＦＲ領域が、ドメインに構造的フレームワークを提供するベータシートを形成し、重鎖及び軽鎖の両方に由来するＣＤＲループ領域が、三次元空間で一緒になることにより、Ｙ構造の先端に位置する単一の高頻度可変抗原結合部位を創出する。天然に存在する抗体のＦｃ領域は、補体系のエレメントに、また、例えば、細胞傷害性を媒介するエフェクター細胞を含むエフェクター細胞上の受容体にも結合する。当該技術分野で公知の通り、Ｆｃ受容体に対するＦｃ領域の親和性及び／または他の結合特質は、グリコシル化または他の修飾を介して調節することができる。いくつかの実施形態では、本発明に従って産生された及び／または利用される抗体は、そのようなグリコシル化が修飾または操作されたＦｃドメインを含むグリコシル化Ｆｃドメインを含む。本発明の目的のため、ある特定の実施形態では、天然抗体において見出される十分な免疫グロブリンドメイン配列を含む、いかなるポリペプチドまたはポリペプチドの複合体も、そのようなポリペプチドが天然に産生された（例えば、抗原に対して反応する生物によって生成された）か、あるいは組換え操作、化学合成または他の人工の系もしくは方法論によって産生されたかにかかわらず、「抗体」と称することができる及び／または「抗体」として使用することができる。いくつかの実施形態では、抗体は、ポリクローナルである；いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナルである。いくつかの実施形態では、抗体は、マウス、ウサギ、霊長類、またはヒト抗体に特徴的な定常領域配列を有する。いくつかの実施形態では、抗体配列エレメントは、当該技術分野で公知の通り、ヒト化、霊長類化（primatized）、キメラなどである。さらに、用語「抗体」は、本明細書で使用される場合、適切な実施形態では（他に記述がなければまたは文脈から明らかでなければ）、代替的な提示で抗体の構造的及び機能的特色を利用するための、当該技術分野で公知のまたは開発された構築物またはフォーマットのいずれかを指すことができる。例えば、いくつかの実施形態では、本発明に従って利用される抗体は、インタクトなＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ抗体；二特異性または多特異性抗体（例えば、Ｚｙｂｏｄｉｅｓ（登録商標）など）；Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ’断片、Ｆｄ断片、及び単離されたＣＤＲまたはそのセットなどの抗体断片；単鎖Ｆｖ；ポリペプチド－Ｆｃ融合体；単一ドメイン抗体（例えば、ＩｇＮＡＲまたはその断片などのサメ単一ドメイン抗体）；ラクダ（cameloid）抗体；マスク抗体（例えば、Ｐｒｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標））；小モジュラー免疫薬（Small Modular ImmunoPharmaceutical）（「ＳＭＩＰｓ（商標）」）；単鎖またはタンデムダイアボディ（diabody）（ＴａｎｄＡｂ（登録商標））；ＶＨＨ；Ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ（登録商標）；Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）ミニボディ（minibody）；ＢｉＴＥ（登録商標）；アンキリンリピートタンパク質またはＤＡＲＰＩＮｓ（登録商標）；Ａｖｉｍｅｒｓ（登録商標）；ＤＡＲＴｓ；ＴＣＲ様抗体；Ａｄｎｅｃｔｉｎｓ（登録商標）；Ａｆｆｉｌｉｎｓ（登録商標）；Ｔｒａｎｓ－ｂｏｄｉｅｓ（登録商標）；Ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ（登録商標）；ＴｒｉｍｅｒＸ（登録商標）；ＭｉｃｒｏＰｒｏｔｅｉｎｓ；Ｆｙｎｏｍｅｒｓ（登録商標）；Ｃｅｎｔｙｒｉｎｓ（登録商標）；ならびにＫＡＬＢＩＴＯＲ（登録商標）から選択されるフォーマットである。いくつかの実施形態では、抗体は、天然に産生された場合であればあるはずの、共有結合による修飾（例えば、グリカンの結合）を欠如する場合がある。いくつかの実施形態では、抗体は、共有結合による修飾（例えば、グリカン、治療剤、融合ポリペプチド、またはポリエチレングリコールなどの他のペンダント基の結合）を含有することができる。

【0064】

抗体断片：本明細書で使用される「抗体断片」は、本明細書に記載されている抗体または抗体薬剤の部分を指し、典型的には、抗原結合性部分またはその可変領域を含む部分を指す。抗体断片は、いずれかの手段によって産生することができる。例えば、いくつかの実施形態では、抗体断片は、インタクトな抗体または抗体薬剤の断片化によって酵素によりまたは化学的に産生することができる。あるいは、いくつかの実施形態では、抗体断片は、組換えにより産生することができる（すなわち、操作された核酸配列の発現によって）。いくつかの実施形態では、抗体断片は、全体的にまたは部分的に合成により産生することができる。いくつかの実施形態では、抗体断片（特に、抗原結合性抗体断片）は、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約１１０、少なくとも約１２０、少なくとも約１３０、少なくとも約１４０、少なくとも約１５０、少なくとも約１６０、少なくとも約１７０、少なくとも約１８０、少なくとも約１９０アミノ酸の長さ、またはそれよりも多いアミノ酸の長さ、いくつかの実施形態では、少なくとも約２００アミノ酸の長さを有することができる。

【0065】

～と関連した／結び付いた（Associated with）：２つの事象または実体が、互いと「関連」しているとは、当該用語が本明細書で使用される場合、一方の存在、レベル及び／または形態が、他方のそれと相関する場合である。例えば、特定の実体（例えば、ポリペプチド、遺伝的シグネチャー、代謝物、微生物など）は、その存在、レベル及び／または形態が、疾患、障害または状態の発生率及び／またはそれに対する感受性と相関する場合（例えば、関連性がある集団にわたり）、特定の疾患、障害または状態と関連すると考えられる。いくつかの実施形態では、２つまたはそれよりも多い実体は、互いと物理的に近接した状態になる及び／またはその状態を維持するように直接的にまたは間接的に相互作用する場合、互いと物理的に「結び付いている」。いくつかの実施形態では、互いと物理的に結び付いた２つまたはそれよりも多い実体は、互いに共有結合により連結している；いくつかの実施形態では、互いと物理的に結び付いた２つまたはそれよりも多い実体は、互いに共有結合により連結していないが、例えば、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、磁性及びこれらの組合せを用いて、非共有結合により結び付いている。

【0066】

間またはから：本明細書で使用される「間」という用語は、文脈内容が、示される上限と下限との間に入るものであるか、または第１の境界と第２の境界との間（境界を含む）に入るものであることを指す。同様に、「から」という用語は、値の範囲の文脈で使用される場合、そうした範囲が含む文脈内容が、示される上限と下限との間に入るものであるか、または第１の境界と第２の境界との間（境界を含む）に入るものであることを示す。

【0067】

結合：本明細書で使用される「結合」という用語は、２つ以上の薬剤の間での非共有結合性の結び付きを指す。「直接的な」結合は、薬剤間の物理的接触を伴い、間接的な結合は、１つ以上の中間薬剤との物理的接触によって生じる物理的相互作用を伴う。２つ以上の薬剤の間での結合は、さまざまな状況のいずれかにおいて生じ、及び／または評価され得るものであり、こうした状況には、相互作用薬剤が単離状態で試験される場合、あるいは相互作用薬剤が、より複雑な系の状況（例えば、担体薬剤と共有結合もしくはその他の結合で結び付いており、及び／または生物学的系中もしくは細胞中に存在する状況）で試験される場合が含まれる。

【0068】

バイオマーカー：本明細書で使用される「バイオマーカー」という用語は、当該技術分野におけるその使用と一貫して、その存在、レベルまたは形態が、目的の特定の生物学的事象または状態と相関することにより、当該事象または状態の「マーカー」であると考えられる、実体、状態または活性を指す。バイオマーカーのほんの数例を挙げると、いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、特定の疾患、障害もしくは状態のマーカーであるか、もしくはこれを含み得る、または特定の疾患、障害もしくは状態が、例えば、対象において発症、発生もしくは再発し得る定性的もしくは定量的確率のマーカーであり得る。いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、特定の治療成績、またはその定性的もしくは定量的確率のマーカーであるか、またはこれを含み得る。したがって、さまざまな実施形態において、バイオマーカーは、目的の関連性がある生物学的事象または状態を予測、予後及び／または診断することができる。バイオマーカーは、いずれかの化学的クラスの実体であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、核酸、ポリペプチド、脂質、炭水化物、小分子、無機薬剤（例えば、金属またはイオン）またはこれらの組合せであるか、またはこれを含み得る。いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、細胞表面マーカーである。いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、細胞内にある。いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、細胞の外側に見出される（例えば、細胞の外側に、例えば、血液、尿、涙、唾液、脳脊髄液、及び同様のものなどの体液中に分泌されるまたは他の仕方で生成されるもしくは存在する）。いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、遺伝子によってコードされる産物の発現または生物学的経路を介したシグナル伝達などの活性である。当業者であれば、バイオマーカーが個々に、目的の特定の生物学的事象もしくは状態に決定的であり得ること、または目的の特定の生物学的事象もしくは状態の統計的確率の決定を表すもしくはこれに寄与し得ることを理解するであろう。いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、目的の生物学的事象または状態の特定の状況の高い確率を反映するという点において、高度に特異的である。場合によっては、特異度増加が、感度を犠牲にして得られ得るように、または感度増加が、特異度を犠牲にして得られ得るように、特異度と感度との間には反比例関係がある。当業者であれば、有用なバイオマーカーが、１００％特異度及び／または１００％精度を有する必要はなく、これらの均衡または他の考慮を反映することができることを理解するであろう。当業者であれば、マーカーが、目的の特定の生物学的事象または状態に関係して、その特異度及び／または感度において異なっていてよいことを理解するであろう。場合によっては、バイオマーカーは、「マーカー」と称することができる。

【0069】

同等の：本明細書で使用される「同等の」という用語は、当業者が、観察された差または類似性に基づき結論を合理的に引き出すことができることを理解するような、互いに同一でなくてよいが、その間の比較を可能にするほど十分に類似している、２つまたはそれより多くの状態、環境、薬剤、実体、集団などのセット内のメンバーを指す。いくつかの実施形態では、状態、環境、薬剤、実体、集団などの同等のセットは典型的に、複数の実質的に同一の特色、及びゼロ、１、または複数の異なる特色によって特徴付けられる。当業者は、文脈において、セットのメンバーが同等であるために、いかなる程度の同一性が要求されるか理解するであろう。例えば、当業者であれば、観察された差が、全体的にまたは部分的に、その非同一の特色に起因し得るという合理的な結論を保証するために、十分な数及び種類の実質的に同一の特色によって特徴付けられた場合に、状態、環境、薬剤、実体、集団などのセットのメンバーが、互いに同等であることを理解するであろう。

【0070】

発現または活性の制御：本明細書で使用されるように、少なくとも１組の条件の下で第１のエレメント（例えば、タンパク質（転写因子など）または核酸配列（プロモーターなど））の状況（例えば、存在、不在、立体構造、化学的修飾、相互作用、または他の活性）に第２のエレメント（例えば、タンパク質、または薬剤（タンパク質など）をコードする核酸）の発現または活性が完全または部分的に依存するのであれば、第１のエレメントは、第２のエレメントの発現または活性を「制御」または「促進」する。発現または活性の制御は、例えば、少なくとも１組の条件の下で、第１のエレメントの状況が変化する結果、参照対照と比較して第２のエレメントの発現または活性が少なくとも１０％（例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、１００％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍）変化し得るという点において、発現または活性の実質的な制御であり得る。

【0071】

に対応する：本明細書で使用される「に対応する」という用語は、適切な参照化合物または参照組成物との比較を通じて化合物中または組成物中の構造エレメントの位置／同一性を指定するために使用され得る。例えば、いくつかの実施形態では、ポリマー中の単量体残基（例えば、ポリペプチド中のアミノ酸残基またはポリヌクレオチド中の核酸残基）は、適切な参照ポリマー中の残基「に対応する」と特定され得る。例えば、提供されるポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列の中の残基は、関連参照配列のスキームに従って指定（例えば、番号付けまたは標識化）されることが多い（仮に、例えば、そのような指定が、提供される配列の文献上の番号付けを反映しないものだとしてもそうされることが多い）ことを当業者なら理解するであろう。例として、参照配列が位置１００～１１０に特定のアミノ酸モチーフを含み、第２の関連配列が位置１１０～１２０に同じモチーフを含む場合、第２の関連配列のモチーフ位置は、参照配列の位置１００～１１０「に対応する」と言われ得る。対応位置は容易に特定することができ（例えば、配列のアライメントをとることによって特定される）、そのようなアライメントは、さまざまな既知のツール、方針、及び／またはアルゴリズムのいずれかによって一般に達成されることを当業者なら理解するであろう。こうしたツール、方針、及び／またはアルゴリズムには、限定されないが、ソフトウェアプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＣＳ－ＢＬＡＳＴ、ＣＵＤＡＳＷ＋＋、ＤＩＡＭＯＮＤ、ＦＡＳＴＡ、ＧＧＳＥＡＲＣＨ／ＧＬＳＥＡＲＣＨ、Ｇｅｎｏｏｇｌｅ、ＨＭＭＥＲ、ＨＨｐｒｅｄ／ＨＨｓｅａｒｃｈ、ＩＤＦ、Ｉｎｆｅｒｎａｌ、ＫＬＡＳＴ、ＵＳＥＡＲＣＨ、ｐａｒａｓａｉｌ、ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ－Ｓｅａｒｃｈ、ＳｃａｌａＢＬＡＳＴ、Ｓｅｑｕｉｌａｂ、ＳＡＭ、ＳＳＥＡＲＣＨ、ＳＷＡＰＨＩ、ＳＷＡＰＨＩ－ＬＳ、ＳＷＩＭＭ、またはＳＷＩＰＥなど）が含まれる。

【0072】

剤形または単位剤形：当業者であれば、「剤形」という用語を使用して、対象への投与のための活性薬剤（例えば、治療または診断剤）の物理的に別々の単位を指すことができることを理解するであろう。典型的には、そのような単位はそれぞれ、所定量の活性薬剤を含有する。いくつかの実施形態では、そのような量は、関連性がある集団に投与されたときに所望のまたは有益な成績と相関すると決定されている投薬レジメンに従った（すなわち、治療的投薬レジメンによる）投与に適切な単位投薬量（またはその全部分）である。当業者であれば、特定の対象に投与される治療組成物または薬剤の総量または自由な（free）量が、１人または複数の担当医によって決定され、複数剤形の投与が関与し得ることを理解する。

【0073】

投薬レジメン：本明細書で使用される「投薬レジメン」という用語は、１つ以上の同じまたは異なる単位用量のセットを対象に投与することを指し得、こうした投与は、典型的には、各投与がその他の投与と期間によって分離された複数の単位用量の投与を含む。さまざまな実施形態において、投薬レジメンの単位用量の１つ以上またはすべてが同じであり得るか、あるいは異なり得る（例えば、経時的に増やされるか、経時的に減らされるか、あるいは対象及び／または医師の決定に従って調整され得る）。さまざまな実施形態において、各用量の間の期間の１つ以上またはすべてが同じであり得るか、あるいは異なり得る（例えば、経時的に長期化されるか、経時的に短期化されるか、あるいは対象及び／または医師の決定に従って調整され得る）。いくつかの実施形態では、所与の治療剤は推奨投薬レジメンを有し、こうした推奨投薬レジメンは、１つ以上の用量を含み得る。典型的には、市販薬物には当業者に知られる推奨投薬レジメンが少なくとも１つは存在する。いくつかの実施形態では、投薬レジメンは、関連集団にわたって投与された場合、所望の転帰または有益な転帰と相関する（すなわち、治療的投薬レジメンである）。

【0074】

下流及び上流：本明細書で使用される「下流」という用語は、第１のＤＮＡ領域及び第２のＤＮＡ領域を含む核酸の３’末端に、第２のＤＮＡ領域と比較して第１のＤＮＡ領域の方が近いことを意味する。本明細書で使用される「上流」という用語は、第１のＤＮＡ領域及び第２のＤＮＡ領域を含む核酸の５’末端に、第２のＤＮＡ領域と比較して第１のＤＮＡ領域の方が近いことを意味する。

【0075】

操作された：本明細書で使用される「操作された」という用語は、人工的に処理されているという側面を指す。例えば、２つ以上の配列が、天然ではその順序で一緒に連結されないものであり、人工的に処理されることで、操作されるポリヌクレオチドにおいて互いに連結される場合、そのポリヌクレオチドは、「操作された」と見なされる。「操作された」核酸配列または「操作された」アミノ酸配列は、組換え核酸配列または組換えアミノ酸配列であり得ることを当業者なら理解するであろう。いくつかの実施形態では、第１の配列とは作動可能に連結された状態で天然に見られるが、第２の配列とは作動可能に連結された状態で天然に見られないコード配列及び／または制御配列を、操作されたポリヌクレオチドは含み、このコード配列及び／または制御配列は、この操作されたポリヌクレオチド中にありかつ人工的に第２の配列と作動可能に連結された状態で存在する。いくつかの実施形態では、細胞または生物は、その遺伝情報が変化するように処理されている場合（例えば、それまでは存在しなかった新たな遺伝物質が導入されている場合（この導入は、例えば、形質転換、交配、体細胞交雑、トランスフェクション、形質導入、もしくは他の機構によって行われる）、または既に存在した遺伝物質が改変もしくは除去されている場合（この改変もしくは除去は、例えば、置換、欠失、もしくは交配によって行われる））、「操作された」と見なされる。一般的に行われることであり、当業者なら理解していることであるが、操作されたポリヌクレオチドまたは細胞の子孫またはコピー（完全なものまたは不完全なもの）は、直接的な処理が前の実体に対して行われたものであったとしても、典型的には、依然として「操作された」と称される。

【0076】

添加物：本明細書で使用される「添加物」は、医薬組成物に含められ得る非治療剤を指し、こうした非治療剤を医薬組成物に含めることで、例えば、所望の一貫性または安定化効果が得られるか、またはその一助となる。いくつかの実施形態では、適切な医薬品添加物には、例えば、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脂肪粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール、または同様のものが含まれ得る。

【0077】

発現：本明細書で使用される「発現」は、コードされる薬剤（ポリペプチドなど）がその核酸配列から生じる１つ以上の生物学的プロセスを個々及び／または累積的に指す。発現は、具合的には、転写及び翻訳の一方または両方を含む。

【0078】

遺伝子または導入遺伝子：本明細書で使用される「遺伝子」という用語は、コード配列（すなわち、発現産物（ＲＮＡ産物及び／またはポリペプチド産物など）をコードするＤＮＡ配列）であるＤＮＡ配列を指すか、またはコード配列を含むＤＮＡ配列を指し、こうしたコード配列は、任意選択で、こうしたコード配列の発現を制御する制御配列のいくつかまたはすべてと一緒になったものである。いくつかの実施形態では、遺伝子は、非コード配列（限定されないが、イントロンなど）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子は、コード配列（例えば、エクソン配列）及び非コード配列（例えば、イントロン配列）の両方を含み得る。いくつかの実施形態では、遺伝子は、プロモーターである制御配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子は、（ｉ）参照環境（起源ゲノムなど）中でコード配列の所定ヌクレオチド数分上流に伸びているＤＮＡヌクレオチド、及び（ｉｉ）参照環境（起源ゲノムなど）中でコード配列の所定ヌクレオチド数分下流に伸びているＤＮＡヌクレオチド、の一方または両方を含む。さまざまな実施形態において、所定ヌクレオチド数は、５００ｂｐ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、１０ｋｂ、２０ｋｂ、３０ｋｂ、４０ｋｂ、５０ｋｂ、７５ｋｂ、または１００ｋｂであり得る。本明細書で使用される「導入遺伝子」は、参照環境中に存在するか、または操作によって参照環境に配置されるが、参照環境に内在するものではないか、または参照環境に元から存在するものではない遺伝子を指す。

【0079】

遺伝子産物または発現産物：本明細書で使用される「遺伝子産物」または「発現産物」という用語は、一般に、遺伝子から転写されるＲＮＡ（プロセシング前及び／またはプロセシング後）を指すか、あるいは遺伝子から転写されるＲＮＡによってコードされるポリペプチド（修飾前及び／または修飾後）を指す。

【0080】

宿主細胞／標的細胞：本明細書で使用される「宿主細胞」は、外来性核酸（組換えまたはその他のもの）（導入遺伝子など）が導入されている細胞を指す。「宿主細胞」は、外来性核酸が最初に導入された細胞及び／またはその完全もしくは不完全な子孫もしくはコピーであり得ることを当業者なら理解するであろう。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、１つ以上のウイルス遺伝子または導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、所期の宿主細胞または潜在的な宿主細胞は、「標的細胞」と称され得る。

【0081】

同一性：本明細書で使用される「同一性」という用語は、ポリマー分子間（例えば、核酸分子間（例えば、ＤＮＡ分子間及び／またはＲＮＡ分子間）及び／またはポリペプチド分子間）の全体的な関連性を指す。当該技術分野では、提供される２つの配列の間での同一性パーセントを計算するための方法が知られている。２つの核酸配列またはポリペプチド配列の同一性パーセントの計算は、例えば、最適な比較を目的として２つの配列（または一方もしくは両方の配列の相補配列）のアライメントをとることによって実施され得る（例えば、アライメントが最適化するように第１の配列及び第２の配列の一方または両方にギャップが導入される可能性があり、非同一配列は比較目的では無視され得る）。その後、対応位置でヌクレオチドまたはアミノ酸の比較が行われる。第１の配列中のある位置が第２の配列中の対応位置のものと同じ残基（例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸）によって占有されている場合、これらの分子は当該位置で同一である。２つの配列の間の同一性パーセントは、それらの配列によって共有される同一位置の数の関数であり、任意選択で、ギャップの数及び各ギャップの長さを考慮して、こうしたギャップは、２つの配列の間のアライメントが最適化するように導入される必要があり得る。２つの配列の間の配列比較及び同一性パーセントの決定は、計算アルゴリズム（ＢＬＡＳＴ（基本的局所アライメント検索ツール）など）を使用して達成され得る。

【0082】

改善する、増加させる、阻害する、および低減する：本明細書で使用される「改善する」、「増加させる」、「阻害する」、及び「低減する」という用語、ならびにその文法的同等形態は、参照との定性的または定量的な差異を生じさせることを示す。

【0083】

阻害性薬剤：本明細書で使用される「阻害性薬剤」という用語は、その存在、レベルまたは程度が、標的の減少したレベル、発現または活性と相関する、実体、状態または事象を指す。いくつかの実施形態では、阻害性薬剤は、直接的に（この場合、これは、例えば、標的に結合することにより、その標的において直接的にその影響を発揮する）作用することができる；いくつかの実施形態では、阻害性薬剤は、間接的に（この場合、これは、標的のレベル及び／または活性が低減されるように、標的の制御因子と相互作用することにより、及び／またはそれを他の仕方で変更することにより、その影響を発揮する）作用することができる。いくつかの実施形態では、阻害性薬剤は、その存在またはレベルが、特定の参照レベルまたは活性（例えば、公知阻害性薬剤の存在または問題になっている阻害性薬剤の非存在など、適切な参照条件下で観察されるもの）と比べて低減された標的レベルまたは活性と相関する薬剤である。

【0084】

単離された：本明細書で使用される「単離された」は、物質及び／または実体が、（ａ）それが最初に生じたとき（天然及び／または実験的状況でのことであるかは無関係である）にはそれに付随していた成分の少なくともいくつかから分離されており、及び／または（ｂ）人工的に設計、生成、調製、及び／または製造されたものであることを指す。単離された物質及び／または実体は、それに最初に付随したその他の成分の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％超が分離されたものであり得る。いくつかの実施形態では、単離された薬物の純度は約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％超である。本明細書で使用されるように、物質は、それが他の成分を実質的に含まないのであれば、「純粋」である。いくつかの実施形態では、当業者なら理解するであろうが、物質は、ある特定の他の成分（例えば、１つ以上の担体または添加物（例えば、緩衝剤、溶媒、水など）など）と組み合わさった後でも依然として「単離された」と見なされるか、または「純粋」であるとさえ見なされ得る。そのような実施形態では、物質の単離パーセントまたは純度は、そのような担体または添加物を含めずに計算される。一例を挙げるにすぎないが、いくつかの実施形態では、天然に生じる生物学的ポリマー（ポリペプチドまたはポリヌクレオチドなど）は、（ｉ）その起源または由来元の理由で、天然におけるその天然状態ではそれに付随する成分のいくつかまたはすべてがそれに伴わない場合、（ｉｉ）天然においてそれを産生する種と同じ種の他のポリペプチドまたは核酸をそれが実質的に含まない場合、（ｉｉｉ）天然においてそれを産生する種のものではない細胞もしくは他の発現系によってそれが発現するか、または当該細胞もしくは他の発現系に由来する成分がその他の様式でそれに付随する場合、「単離された」と見なされる。したがって、例えば、いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、化学的に合成されたものであるか、またはそれを天然に産生するものとは異なる細胞系において合成されたものである場合、「単離された」ポリペプチドであると見なされる。代替的または付加的に、いくつかの実施形態では、１つ以上の精製手法に供されているポリペプチドは、（ｉ）天然ではそれに付随し、及び／または（ｉｉ）それが最初に産生されたときにそれに付随した他の成分からそれが分離されている限りにおいては、「単離された」ポリペプチドであると見なされ得る。

【0085】

作動可能に連結された：本明細書で使用される「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」は、少なくとも第１のエレメントと第２のエレメントとが結び付いており、その結果、これらの構成エレメントが、それらの所期の様式でそれらが機能することが可能になる関係性にあることを指す。例えば、核酸制御配列によって核酸コード配列の発現制御が可能になる様式で当該制御配列と当該コード配列とが結び付いている場合、当該制御配列は、当該コード配列と「作動可能に連結されている」。いくつかの実施形態では、「作動可能に連結された」制御配列は、（例えば、単一の核酸において）コード配列と直接的または間接的に共有結合で結び付いている。いくつかの実施形態では、制御配列は、トランスでコード配列の発現を制御し、コード配列の核酸と同じ核酸の中に制御配列が含まれることが機能可能な連結の要件ではない。

【0086】

医薬的に許容可能な：本明細書で使用される「医薬的に許容可能な」という用語は、本明細書に開示の組成物の製剤の構成成分（複数可）の１つ以上またはすべてに適用される場合、各構成成分が組成物のその他の成分と適合し、そのレシピエントに無害でなくてはならないことを意味する。

【0087】

医薬的に許容可能な担体：本明細書で使用される「医薬的に許容可能な担体」という用語は、薬剤（例えば、医薬物質）の製剤化を促進するか、薬剤のバイオアベイラビリティを改変するか、または対象の１つの臓器もしくは一部分から別の臓器もしくは一部分への薬剤の輸送を促進する医薬的に許容可能な物質、組成物、または媒体（液体または固体の増量剤、希釈剤、添加物、または溶媒封入物質など）を指す。医薬的に許容可能な担体として働き得る物質のいくつかの例としては、糖（ラクトース、グルコース、及びスクロースなど）、デンプン（コーンスターチ及びジャガイモデンプンなど）、セルロース及びその誘導体（カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、及び酢酸セルロースなど）、粉末トラガカント、麦芽、ゼラチン、タルク、添加物（ココアバター及び坐剤ワックスなど）、油（ピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、及び大豆油など）、グリコール（プロピレングリコールなど）、ポリオール（グリセリン、ソルビトール、マンニトール、及びポリエチレングリコールなど）、エステル（オレイン酸エチル及びラウリン酸エチルなど）、寒天、緩衝剤（水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムなど）、アルギン酸、パイロジェンフリー水、等張生理食塩水、リンゲル液、エチルアルコール、ｐＨ緩衝液、ポリエステル、ポリカーボネート、及び／またはポリ酸無水物、ならびに医薬製剤において用いられる他の無毒な適合物質が挙げられる。

【0088】

医薬組成物：本明細書で使用される「医薬組成物」という用語は、活性薬剤が１つ以上の医薬的に許容可能な担体と一緒に製剤化された組成物を指す。

【0089】

ポリペプチド：本明細書で使用される「ポリペプチド」は、いずれかのアミノ酸ポリマー鎖を指す。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、天然に生じるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、天然に生じないアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、人工的な作用を介して設計及び／または産生されたという点において操作されたアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、またはその両方を含むことができる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、天然アミノ酸のみ、または非天然アミノ酸のみを含むことができる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、Ｄ－アミノ酸、Ｌ－アミノ酸、またはその両方を含むことができる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、Ｌ－アミノ酸のみを含むことができる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、１つまたは複数のペンダント基または他の修飾、例えば、１つまたは複数のアミノ酸側鎖を、例えば、ポリペプチドのＮ末端、ポリペプチドのＣ末端、非末端アミノ酸またはそれらのいずれかの組合せに含むことができる。いくつかの実施形態では、そのようなペンダント基または修飾は、アセチル化、アミド化、脂質化、メチル化、リン酸化、グリコシル化、糖化、硫酸化、マンノシル化、ニトロシル化、アシル化、パルミトイル化、プレニル化、ペグ化などを、これらの組合せを含めて含む群から選択することができる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、環状であってもよく、及び／または環状部分を含んでいてもよい。

【0090】

いくつかの実施形態では、用語「ポリペプチド」は、参照ポリペプチド、活性または構造の名称に付け加えて、関連性がある活性または構造を共有するポリペプチドのクラスを指し示すことができる。そのようなクラスについて、本明細書は、そのアミノ酸配列及び／または機能が公知であるクラス内の例示的なポリペプチドを提供し、及び／または当業者であれば、それに気づくであろう。いくつかの実施形態では、ポリペプチドクラスまたはファミリーのメンバーは、当該クラスの参照ポリペプチドと有意な配列相同性もしくは同一性を示し、それと共通配列モチーフ（例えば、特徴的な配列エレメント）を共有し、及び／またはそれと共通活性（いくつかの実施形態では、同等のレベルでまたは指定の範囲内で）を共有する。例えば、いくつかの実施形態では、メンバーポリペプチドは、少なくとも約３０～４０％であり、多くの場合、約５０％超、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれを超える％、参照ポリペプチドとの配列相同性もしくは同一性の全体的な程度を示し、及び／または多くの場合、９０％超のまたはさらには９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の、非常に高い配列同一性を示す少なくとも１つの領域（例えば、いくつかの実施形態では、特徴的な配列エレメントであるか、またはこれを含み得る、保存領域）を含む。そのような保存領域は通常、少なくとも３～４個の、いくつかの実例では、最大２０個、またはそれよりも多い数のアミノ酸を包含する；いくつかの実施形態では、保存領域は、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、またはそれよりも多い数の連続したアミノ酸の少なくとも１つのストレッチを包含する。いくつかの実施形態では、関連性があるポリペプチドは、親ポリペプチドの断片を含むことができる。いくつかの実施形態では、有用なポリペプチドは、複数の断片を含むことができ、これら断片のそれぞれは、目的のポリペプチドがその親ポリペプチドの派生物となるように、同じ親ポリペプチドにおいて、互いと比べて、目的のポリペプチドにおいて見出される配置とは異なる空間的配置で見出される（例えば、親において直接的に連結された断片は、目的のポリペプチドにおいて空間的に分離され得る、もしくはその逆もまた同じであり、及び／または断片は、目的のポリペプチドにおいて、親とは異なる順序で存在し得る）。

【0091】

予防するまたは予防：「予防する」及び「予防」という用語は、疾患、障害または状態の発生に関連して本明細書で使用される場合、疾患、障害もしくは状態を発症するリスクの低減；疾患、障害もしくは状態の開始の遅延；疾患、障害もしくは状態の１つまたは複数の特徴もしくは症状の開始の遅延；ならびに／または疾患、障害もしくは状態の１つまたは複数の特徴もしくは症状の頻度及び／もしくは重症度の低減を指す。予防は、特定の対象における予防、または対象の集団における統計的影響を指すことができる。疾患、障害または状態の開始が、予め定義された期間または当業者によって理解される期間にわたり遅延された場合、予防が発生したと考えることができる。

【0092】

プロモーター：本明細書で使用される「プロモーター」または「プロモーター配列」は、コード配列の転写の開始及び／または処理能力に直接的または間接的に（例えば、プロモーターに結合するタンパク質または物質を介して）関与するＤＮＡ制御領域であり得る。プロモーターは、１つ以上の転写因子及び／または制御部分が当該プロモーターと結合するとコード配列の転写を適切な条件の下で開始し得る。コード配列の転写の開始に関与するプロモーターは、コード配列と「作動可能に連結された」ものであり得る。ある特定の場合、プロモーターは、ＤＮＡ制御領域（このＤＮＡ制御領域は、（その３’末端に位置する）転写開始部位から上流（５’方向）位置へと伸びており、その結果、そのように呼ばれる配列は、転写事象の開始に必要な最小数の塩基もしくはエレメントの一方もしくは両方を含む）であるか、または当該ＤＮＡ制御領域を含み得る。プロモーターは、発現制御配列（エンハンサー配列及びリプレッサー配列など）であるか、発現制御配列（エンハンサー配列及びリプレッサー配列など）を含むか、または発現制御配列（エンハンサー配列及びリプレッサー配列など）と機能可能なように結び付けられるか、もしくは作動可能に連結され得る。

【0093】

参照：本明細書で使用される「参照」は、比較の実施対象である基準または対照を指す。例えば、いくつかの実施形態では、薬剤、試料、配列、対象、動物、もしくは個体、またはその集団、あるいはその尺度または特徴的代表は、参照である薬剤、試料、配列、対象、動物、もしくは個体、またはその集団、あるいはその尺度または特徴的代表と比較される。いくつかの実施形態では、参照は、測定値である。いくつかの実施形態では、参照は、確立基準または予測値である。いくつかの実施形態では、参照は、歴史的参照である。参照は、定量的または定性的であり得る。典型的には、当業者なら理解するであろうが、参照及びその比較対象値は、同等の条件の下での尺度となる。信頼性及び／または比較の正当化に十分な類似性が存在する場合を当業者なら理解するであろう。いくつかの実施形態では、適切な参照は、薬剤、試料、配列、対象、動物、もしくは個体、またはその集団（（例えば、１つ以上の特定の変数（例えば、薬剤または条件の存在有無）を評価する目的について）当業者が同等であると認識するであろう条件の下にあるもの）、あるいはその尺度または特徴的代表であり得る。

【0094】

制御配列：核酸コード配列の発現の文脈において本明細書で使用される制御配列は、コード配列の発現を制御する核酸配列である。いくつかの実施形態では、制御配列は、遺伝子発現の１つ以上の側面（例えば、細胞型特異的発現、系譜特異的発現、誘導性発現など）を制御するか、またはそれに影響を与え得る。

【0095】

試料：本明細書で使用される「試料」という用語は典型的に、本明細書に記載されている通り、目的の生物学的供給源（例えば、組織または生物または細胞培養物）から得られるまたはこれに由来する試料を指す。いくつかの実施形態では、生物学的供給源は、動物またはヒトなどの生物であるか、またはこれを含む。いくつかの実施形態では、試料は、生物学的組織または液であるか、またはこれを含む。いくつかの実施形態では、試料は、細胞、組織または体液であるか、またはこれを含み得る。いくつかの実施形態では、試料は、血液、血液細胞、無細胞ＤＮＡ、浮遊性核酸、腹水、生検試料、外科的検体、細胞含有体液、痰、唾液、糞便、尿、脳脊髄液、腹膜水、胸水、リンパ液、婦人科系の液（gynecological fluid）、分泌物、排泄物、皮膚スワブ、腟スワブ、口腔スワブ、鼻スワブ、管洗浄液もしくは気管支肺胞上皮洗浄液などの洗液もしくは洗浄液、吸引液、擦過物、または骨髄であるか、またはこれを含み得る。いくつかの実施形態では、試料は、単一の対象または複数の対象から得られる細胞であるか、またはこれを含む。試料は、生物学的供給源から直接的に得られる「一次試料」であるか、または「加工された試料」（例えば、ｍＲＮＡ、ＤＮＡもしくはタンパク質の例えば、単離などのプロセスによって、一次試料の化学構造を修飾するプロセスによって、及び／または一次試料の１つまたは複数の構成成分もしくは特性を表す新たなもしくは異なる組成物を産生するプロセスによって、例えば、一次試料から調製された試料）であり得る。

【0096】

対象：本明細書で使用される「対象」という用語は、生物、典型的には哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、またはマウス）を指す。いくつかの実施形態では、対象は、疾患、障害、または状態を患っている。いくつかの実施形態では、対象は、疾患、障害、または状態に易罹患性である。いくつかの実施形態では、対象は、疾患、障害、または状態の症状または特徴を１つ以上示す。いくつかの実施形態では、対象は、疾患、障害、または状態を患っていない。いくつかの実施形態では、対象は、疾患、障害、または状態の症状または特徴をいずれも示さない。いくつかの実施形態では、対象は、疾患、障害、もしくは状態への易罹患性またはそのリスクに特徴的な特徴を１つ以上有する。いくつかの実施形態では、対象は、疾患、障害、または状態について検査されており、及び／または治療が施されている対象である。場合によっては、ヒト対象は、「患者」または「個体」と互換的に称され得る。

【0097】

治療剤：本明細書で使用される「治療剤」という用語は、対象に投与されると所望の薬理学的作用を誘発する任意の薬剤を指す。いくつかの実施形態では、薬剤は、適切な集団にわたって統計的に有意な作用を示す場合、治療剤と見なされる。いくつかの実施形態では、適切な集団は、モデル生物集団またはヒト集団であり得る。いくつかの実施形態では、適切な集団は、さまざまな基準（ある特定の年齢層、性別、遺伝的背景、持病など）によって定義され得る。いくつかの実施形態では、治療剤は、疾患、障害、または状態の治療に使用され得る物質である。いくつかの実施形態では、治療剤は、ヒトへの投与を目的として市販され得る前に政府機関によって承認されているまたは承認される必要がある薬剤である。いくつかの実施形態では、治療剤は、ヒトに投与する上で医学的な処方が必要な薬剤である。

【0098】

治療的に有効な量：本明細書で使用される「治療的に有効な量」は、その投与目的である所望の作用が得られる量を指す。いくつかの実施形態では、この用語は、疾患、障害、及び／または状態の罹患集団または易罹患性集団に対して治療的投薬レジメンに従って投与された場合に疾患、障害、及び／または状態を治療する上で十分な量を指す。いくつかの実施形態では、治療的に有効な量は、疾患、障害、及び／または状態の症状の１つ以上の発症率及び／または重症度を低減し、及び／またはその発症を遅延させる量である。「治療的に有効な量」が、あらゆる特定の処置された個体において成功裏の治療を必ずしも達成するものではないことを当業者なら理解するであろう。むしろ、治療的に有効な量は、そのような治療を必要とする患者に投与されると顕著な数の対象において特定の所望の薬理学的応答が得られる量であり得る。いくつかの実施形態では、治療的に有効な量に対する言及は、１つ以上の特定の組織（例えば、疾患、障害、もしくは状態の患部組織）または体液（例えば、血液、唾液、血清、汗、涙、尿など）において測定される量に対する言及であり得る。いくつかの実施形態では、特定の薬剤または治療の治療的に有効な量は、単回用量において製剤化及び／または投与され得ることを当業者なら理解するであろう。いくつかの実施形態では、治療的に有効な薬剤は、（例えば、投薬レジメンの一部として）複数回用量において製剤化及び／または投与され得る。

【0099】

治療：本明細書で使用される「治療／処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」（「治療する（ｔｒｅａｔ）」または「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」とも称される）という用語は、特定の疾患、障害、及び／または状態の１つ以上の症状、特徴、及び／または原因の軽減、軽快、緩和、抑制、発症遅延、重症度低減、及び／または発症率低減を部分的または完全に生じさせる治療を施すこと、あるいはいずれかのそのような結果を達成することを目的として施される治療を施すこと、を指す。いくつかの実施形態では、そのような治療は、関連する疾患、障害、及び／または状態の徴候を示さない対象に対するものであり、及び／または疾患、障害、または状態の初期徴候のみを示す対象に対するものであり得る。代替的または付加的に、そのような治療は、関連する疾患、障害、及び／または状態の確立された徴候を１つ以上示す対象に対するものであり得る。いくつかの実施形態では、治療は、関連する疾患、障害、及び／または状態を患っていると診断された対象に対するものであり得る。いくつかの実施形態では、治療は、関連する疾患、障害、または状態の発症リスクの上昇と統計的に相関する１つ以上の易罹患性因子を有することが判明している対象に対するものであり得る。

【0100】

単位用量：本明細書で使用される「単位用量」という用語は、医薬組成物の単回用量及び／または物理的に個別の単位として投与される量を指す。多くの実施形態では、単位用量は、所定量の活性薬剤を含む。いくつかの実施形態では、単位用量は、全単回用量の薬剤を含む。いくつかの実施形態では、総単回用量を達成するために複数の単位用量が投与される。いくつかの実施形態では、所期の効果を達成するためには、複数の単位用量の投与が必要であるか、または必要であると予想される。単位用量は、例えば、１つ以上の治療剤を所定量で含む一定体積の液体（例えば、許容可能な担体）、１つ以上の治療剤を所定量で含む固体形態、１つ以上の治療剤を所定量で含む持続放出製剤または薬物送達デバイスなどであり得る。単位用量が存在し得る製剤には、治療剤（複数可）に加えてさまざまな成分が任意に含められることが理解されよう。例えば、許容可能な担体（例えば、医薬的に許容可能な担体）、希釈剤、安定化剤、緩衝剤、保存剤などが含められ得る。多くの実施形態では、特定の治療剤の適切な日々の総用量は、一部または複数の単位用量を含み得、例えば、健全な医学的判断の範囲内で主治医によって決定され得ることを当業者なら理解するであろう。いくつかの実施形態では、任意の特定の対象または生物に対する特定の有効用量レベルは、さまざまな要因に依存し得、こうした要因には、治療される障害及び障害の重症度、用いられる特定の治療剤（複数可）の活性、用いられる特定の組成物、対象の年齢、体重、総体的な健康、性別、及び食事、用いられる特定の治療剤（複数可）の投与時間及び排泄速度、治療期間、用いられる特定の治療剤（複数可）と併用または同時使用される薬物及び／または追加の治療、ならびに医学分野でよく知られる同様の要因が含まれる。

【図面の簡単な説明】

【0101】

【図1】図１は、ヘルパー依存型アデノウイルス（ＨＤＡｄ）サポートベクターの例（上）及びＨＤＡｄウイルス遺伝子治療ベクターの例（下）の模式図である。サポートベクターは、アデノウイルス逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）の間に位置する、（ｉ）ＥＦ１αプロモーターと作動可能に連結されたＦｌｐｅリコンビナーゼ及び（ｉｉ）ＰＧＫプロモーターと作動可能に連結されたトランスポゼース（ＳＢ１００ｘ）をコードする。スタッファーは、アデノウイルスによって効率的にパッケージングされるサイズのウイルスベクターゲノムを生成するために、サポートベクターにも含まれる。ウイルス遺伝子治療ベクターは、β－グロビンプロモーターとβ－グロビン遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）の両方と作動可能に連結され、かつ３’ＵＴＲ及びニワトリ高感受性部位４（ｃＨＳ４；ニワトリβ様グロビン遺伝子クラスター）制御領域と機能可能なようにさらに連結された治療用タンパク質（ｒｈ γ－グロビン）をコードする核酸配列を含む治療用ペイロードを含む。ウイルス遺伝子治療ベクターは、ＰＧＫプロモーター及びポリＡ配列（ＰＡ）と作動可能に連結されたＭＧＭＴ^{Ｐ１４０Ｋ}選択可能マーカーをコードする核酸配列をさらに（必要に応じて）含む。治療用ペイロードは、転位のためのＳＢ１００ｘ標的である逆方向反復配列（ＩＲ）と隣接し、それによって、治療用ペイロードは、宿主細胞ゲノムに組み込まれ得る。ＩＲは、Ｆｌｐｅに曝露された際に、隣接した核酸を環状化するｆｒｔ部位と順番に隣接し、治療用ペイロードの転位を促進する。ウイルス遺伝子治療ベクターは、アデノウイルスＩＴＲをさらに含む。

【0102】

【図2】図２は、本開示の免疫抑制レジメンと組み合わせて使用されるウイルス遺伝子治療ベクターを含むウイルス遺伝子治療方法の例の模式図である。この模式図では、日数は、ウイルスベクターが対象に投与される最終日に関して特定される。

【0103】

【図3】図３は、Ｏ^６ＢＧ／ＢＣＮＵでの選択により、組み込まれた選択可能マーカーを発現する及び／または有する細胞を選択するように、ＭＧＭＴ^{Ｐ１４０Ｋ}選択可能マーカーを含むウイルス遺伝子治療ベクターを含むウイルス遺伝子治療のための選択レジメンの例の模式図である。

【0104】

【図4】図４は、幹細胞動員レジメンの例の模式図である。この模式図では、日数は、ウイルスベクターが対象に投与される最終日に関して特定される。

【0105】

【図5】図５は、免疫抑制レジメン、選択レジメン、及び幹細胞動員レジメンと組み合わせてウイルス遺伝子治療ベクターを含むウイルス遺伝子治療方法の例の模式図である。

【0106】

【図6】図６は、ヘルパー依存型アデノウイルス（ＨＤＡｄ）サポートベクターの例（上）及びＨＤＡｄウイルス遺伝子治療ベクターの例（下）の模式図である。サポートベクターは、アデノウイルス逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）の間に位置する、（ｉ）ＥＦ１αプロモーターと作動可能に連結されたＦｌｐｅリコンビナーゼ及び（ｉｉ）ＰＧＫプロモーターと作動可能に連結されたトランスポゼース（ＳＢ１００ｘ）をコードする。スタッファーは、アデノウイルスによって効率的にパッケージングされるサイズのウイルスベクターゲノムを生成するために、サポートベクターにも含まれる。ウイルス遺伝子治療ベクターは、β－グロビンプロモーターとβ－グロビン遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）の両方と作動可能に連結され、かつ３’ＵＴＲ及びニワトリ高感受性部位４（ｃＨＳ４；ニワトリβ様グロビン遺伝子クラスター）制御領域と機能可能なようにさらに連結された治療用タンパク質（ｒｈ γ－グロビン）をコードする核酸配列を含む治療用ペイロードを含む。ウイルス遺伝子治療ベクターは、ＥＦ１αプロモーターと作動可能に連結されたＭＧＭＴ^{Ｐ１４０Ｋ}選択可能マーカーをコードする核酸配列をさらに（必要に応じて）含む。治療用ペイロードは、転位のためのＳＢ１００ｘ標的である逆方向反復配列（ＩＲ）と隣接し、それによって、治療用ペイロードは、宿主細胞ゲノムに組み込まれ得る。ＩＲは、Ｆｌｐｅに曝露された際に、隣接した核酸を環状化するｆｒｔ部位と順番に隣接し、治療用ペイロードの転位を促進する。ウイルス遺伝子治療ベクターは、プロモーター及び塩基編集ＣＲＩＳＰＲ系をコードする核酸配列と共に別々のカセットをさらに含む。ウイルス遺伝子治療ベクターは、アデノウイルスＩＴＲをさらに含む。

【0107】

【図7A-B】図７Ａ－７Ｄ。インビボでのＨＳＣ遺伝子治療。図７Ａは、インビボ形質導入により、代表的な実施形態では、ＨＳＣ収集及びエクスビボ操作が回避され；骨髄破壊的前処理、移植前処理、または移植が必要とされず；低コストなベクター製造を提供することを示す。図７Ｂは、２６週の研究を通じて示される時点で６匹の動物におけるＰＭＢＣ中のＧＦＰ＋細胞のパーセンテージを示すグラフであり；赤色の矢印は、Ｏ^６ＢＧ／ＢＣＮＵ投与を示す（図７Ｄに示されている投薬スケジュール）。図７Ｃは、ＨＤＡｄ－ｍｇｍｔ／ＧＦＰ／ＨＤＡｄ－ＳＢベクター系の例を示し；ｍｇｍｔ^{Ｐ１４０Ｋ}は、遺伝子改変細胞が薬物耐性を有し、選択的に増殖するための機構を与える。図７Ｄは、インビボでのＨＳＣ遺伝子治療と関連して使用するための代表的投薬スケジュールである。ＡＭＤ３１００＝プレリキサホル。

【図7C-D】図７Ａ－７Ｄ。インビボでのＨＳＣ遺伝子治療。図７Ａは、インビボ形質導入により、代表的な実施形態では、ＨＳＣ収集及びエクスビボ操作が回避され；骨髄破壊的前処理、移植前処理、または移植が必要とされず；低コストなベクター製造を提供することを示す。図７Ｂは、２６週の研究を通じて示される時点で６匹の動物におけるＰＭＢＣ中のＧＦＰ＋細胞のパーセンテージを示すグラフであり；赤色の矢印は、Ｏ^６ＢＧ／ＢＣＮＵ投与を示す（図７Ｄに示されている投薬スケジュール）。図７Ｃは、ＨＤＡｄ－ｍｇｍｔ／ＧＦＰ／ＨＤＡｄ－ＳＢベクター系の例を示し；ｍｇｍｔ^{Ｐ１４０Ｋ}は、遺伝子改変細胞が薬物耐性を有し、選択的に増殖するための機構を与える。図７Ｄは、インビボでのＨＳＣ遺伝子治療と関連して使用するための代表的投薬スケジュールである。ＡＭＤ３１００＝プレリキサホル。

【0108】

【図8A】図８Ａ～８Ｄ。図８Ａは、ベクターの例の模式図である。（図８Ｂ）ＮＨＰ＃１のためのベクター設計：ＨＤＡｄ５／３５＋＋組合せ。ＣＤ４６ｔｇ及びＴｏｗｎｅｓモデル：相加的ＨｂＦ発現（＞２０％）における検証。示されたＡｄ５／３５「組合せ」ドナーベクターは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用して、ｈｕ－γ－グロビン及び ＭＧＭＴ^{Ｐ１４０Ｋ}をコードするトランスポゾンの組み込みのためのＢＣＬ１１ａＥ 及びＨＢＧ１／２ ＢＣＬ１１ａリプレッサータンパク質結合部位及びＳＢ１００ｘを標的とする。（図８Ｃ）ＮＨＰ＃２のためのベクター設計：示されたドナーベクターは、（ｉ）γ－グロビン及びＭＧＭＴ^{Ｐ１４０Ｋ}選択可能マーカーを含むペイロードをＡＡＶＳ１遺伝子座に標的として挿入するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９；ならびに（ｉｉ）ＨＢＧ１／２ ＢＣＬ１１ａリプレッサータンパク質結合部位及びＢＣＬ１１ａＥを標的とするためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を含む。（図８Ｄ）ＮＨＰ＃３のためのベクター設計：ＨＤＡｄ－ｒｈ－組合せ。示されたＡｄ５／３５「組合せ」ドナーベクターは、（ｉ）ＨＢＧ１／２ ＢＣＬ１１ａリプレッサータンパク質結合部位を標的とするためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９；ならびに（ｉｉ）ｒｈ－γ－グロビン及びＭＧＭＴ^{Ｐ１４０Ｋ}選択可能マーカーをコードするペイロードを組み込むためのＳＢ１００ｘを含む。示されたドナーベクターは、ｍｇｍｔ^{Ｐ１４０ｋ}、ＬＣＲ β－グロビンプロモーター促進性に外来性γ－グロビンを発現させる形質導入細胞のインビボでの選択、及びγ－グロビンプロモーターのリプレッサー結合領域をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９介在性に破壊することによる内在性γ－グロビンの再活性化を許容する。

【図8B】図８Ａ～８Ｄ。図８Ａは、ベクターの例の模式図である。（図８Ｂ）ＮＨＰ＃１のためのベクター設計：ＨＤＡｄ５／３５＋＋組合せ。ＣＤ４６ｔｇ及びＴｏｗｎｅｓモデル：相加的ＨｂＦ発現（＞２０％）における検証。示されたＡｄ５／３５「組合せ」ドナーベクターは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用して、ｈｕ－γ－グロビン及び ＭＧＭＴ^{Ｐ１４０Ｋ}をコードするトランスポゾンの組み込みのためのＢＣＬ１１ａＥ 及びＨＢＧ１／２ ＢＣＬ１１ａリプレッサータンパク質結合部位及びＳＢ１００ｘを標的とする。（図８Ｃ）ＮＨＰ＃２のためのベクター設計：示されたドナーベクターは、（ｉ）γ－グロビン及びＭＧＭＴ^{Ｐ１４０Ｋ}選択可能マーカーを含むペイロードをＡＡＶＳ１遺伝子座に標的として挿入するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９；ならびに（ｉｉ）ＨＢＧ１／２ ＢＣＬ１１ａリプレッサータンパク質結合部位及びＢＣＬ１１ａＥを標的とするためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を含む。（図８Ｄ）ＮＨＰ＃３のためのベクター設計：ＨＤＡｄ－ｒｈ－組合せ。示されたＡｄ５／３５「組合せ」ドナーベクターは、（ｉ）ＨＢＧ１／２ ＢＣＬ１１ａリプレッサータンパク質結合部位を標的とするためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９；ならびに（ｉｉ）ｒｈ－γ－グロビン及びＭＧＭＴ^{Ｐ１４０Ｋ}選択可能マーカーをコードするペイロードを組み込むためのＳＢ１００ｘを含む。示されたドナーベクターは、ｍｇｍｔ^{Ｐ１４０ｋ}、ＬＣＲ β－グロビンプロモーター促進性に外来性γ－グロビンを発現させる形質導入細胞のインビボでの選択、及びγ－グロビンプロモーターのリプレッサー結合領域をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９介在性に破壊することによる内在性γ－グロビンの再活性化を許容する。

【図8C】図８Ａ～８Ｄ。図８Ａは、ベクターの例の模式図である。（図８Ｂ）ＮＨＰ＃１のためのベクター設計：ＨＤＡｄ５／３５＋＋組合せ。ＣＤ４６ｔｇ及びＴｏｗｎｅｓモデル：相加的ＨｂＦ発現（＞２０％）における検証。示されたＡｄ５／３５「組合せ」ドナーベクターは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用して、ｈｕ－γ－グロビン及び ＭＧＭＴ^{Ｐ１４０Ｋ}をコードするトランスポゾンの組み込みのためのＢＣＬ１１ａＥ 及びＨＢＧ１／２ ＢＣＬ１１ａリプレッサータンパク質結合部位及びＳＢ１００ｘを標的とする。（図８Ｃ）ＮＨＰ＃２のためのベクター設計：示されたドナーベクターは、（ｉ）γ－グロビン及びＭＧＭＴ^{Ｐ１４０Ｋ}選択可能マーカーを含むペイロードをＡＡＶＳ１遺伝子座に標的として挿入するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９；ならびに（ｉｉ）ＨＢＧ１／２ ＢＣＬ１１ａリプレッサータンパク質結合部位及びＢＣＬ１１ａＥを標的とするためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を含む。（図８Ｄ）ＮＨＰ＃３のためのベクター設計：ＨＤＡｄ－ｒｈ－組合せ。示されたＡｄ５／３５「組合せ」ドナーベクターは、（ｉ）ＨＢＧ１／２ ＢＣＬ１１ａリプレッサータンパク質結合部位を標的とするためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９；ならびに（ｉｉ）ｒｈ－γ－グロビン及びＭＧＭＴ^{Ｐ１４０Ｋ}選択可能マーカーをコードするペイロードを組み込むためのＳＢ１００ｘを含む。示されたドナーベクターは、ｍｇｍｔ^{Ｐ１４０ｋ}、ＬＣＲ β－グロビンプロモーター促進性に外来性γ－グロビンを発現させる形質導入細胞のインビボでの選択、及びγ－グロビンプロモーターのリプレッサー結合領域をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９介在性に破壊することによる内在性γ－グロビンの再活性化を許容する。

【図8D】図８Ａ～８Ｄ。図８Ａは、ベクターの例の模式図である。（図８Ｂ）ＮＨＰ＃１のためのベクター設計：ＨＤＡｄ５／３５＋＋組合せ。ＣＤ４６ｔｇ及びＴｏｗｎｅｓモデル：相加的ＨｂＦ発現（＞２０％）における検証。示されたＡｄ５／３５「組合せ」ドナーベクターは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用して、ｈｕ－γ－グロビン及び ＭＧＭＴ^{Ｐ１４０Ｋ}をコードするトランスポゾンの組み込みのためのＢＣＬ１１ａＥ 及びＨＢＧ１／２ ＢＣＬ１１ａリプレッサータンパク質結合部位及びＳＢ１００ｘを標的とする。（図８Ｃ）ＮＨＰ＃２のためのベクター設計：示されたドナーベクターは、（ｉ）γ－グロビン及びＭＧＭＴ^{Ｐ１４０Ｋ}選択可能マーカーを含むペイロードをＡＡＶＳ１遺伝子座に標的として挿入するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９；ならびに（ｉｉ）ＨＢＧ１／２ ＢＣＬ１１ａリプレッサータンパク質結合部位及びＢＣＬ１１ａＥを標的とするためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を含む。（図８Ｄ）ＮＨＰ＃３のためのベクター設計：ＨＤＡｄ－ｒｈ－組合せ。示されたＡｄ５／３５「組合せ」ドナーベクターは、（ｉ）ＨＢＧ１／２ ＢＣＬ１１ａリプレッサータンパク質結合部位を標的とするためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９；ならびに（ｉｉ）ｒｈ－γ－グロビン及びＭＧＭＴ^{Ｐ１４０Ｋ}選択可能マーカーをコードするペイロードを組み込むためのＳＢ１００ｘを含む。示されたドナーベクターは、ｍｇｍｔ^{Ｐ１４０ｋ}、ＬＣＲ β－グロビンプロモーター促進性に外来性γ－グロビンを発現させる形質導入細胞のインビボでの選択、及びγ－グロビンプロモーターのリプレッサー結合領域をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９介在性に破壊することによる内在性γ－グロビンの再活性化を許容する。

【0109】

【図9A-B】図９Ａ～９Ｄ。ＨＤＡｄ５／３５＋＋ベクターは、ＨＳＣを選択的に形質導入する（ＣＤ４６を介して）。

【図9C-D】図９Ａ～９Ｄ。ＨＤＡｄ５／３５＋＋ベクターは、ＨＳＣを選択的に形質導入する（ＣＤ４６を介して）。

【0110】

【図10A】図１０Ａ～１０Ｄ。Ｇ－ＣＳＦ／ＡＭＤ３１００によるアカゲザルにおける効率的なＨＳＣ動員。動員処理したアカゲザルへのＨＤＡｄ注射。（図１０Ａ）ＧＣＳＦ、ＡＭＤ３１００及びＨＤＡｄの注射のタイミング。図１０Ｂ～１０Ｄ 末梢血中の未分化（ＣＤ３４＋／ＣＤ４５ＲＡ－／ＣＤ９０＋）ＨＳＣの数。ＨＤＡｄを動員の２回のピークで注射した。（図１０Ｂ）ＮＨＰ＃１におけるベクター投薬は保存的であった（０．５～１．６５×１０^１２ ｖｐ／ｋｇ）。（図１０Ｃ）ＮＨＰ＃２のためのＨＤＡｄ用量は、いずれも１．６×１０^１２ ｖｐ／ｋｇであった。（図１０Ｄ）ＮＨＰ＃３におけるＨＤＡｄの用量は、ＨＤＡｄの２回目の用量が低減したことを示すが、この低減は、後に誤りであることが判明した好中球数に基づくものであった。

【図10B】図１０Ａ～１０Ｄ。Ｇ－ＣＳＦ／ＡＭＤ３１００によるアカゲザルにおける効率的なＨＳＣ動員。動員処理したアカゲザルへのＨＤＡｄ注射。（図１０Ａ）ＧＣＳＦ、ＡＭＤ３１００及びＨＤＡｄの注射のタイミング。図１０Ｂ～１０Ｄ 末梢血中の未分化（ＣＤ３４＋／ＣＤ４５ＲＡ－／ＣＤ９０＋）ＨＳＣの数。ＨＤＡｄを動員の２回のピークで注射した。（図１０Ｂ）ＮＨＰ＃１におけるベクター投薬は保存的であった（０．５～１．６５×１０^１２ ｖｐ／ｋｇ）。（図１０Ｃ）ＮＨＰ＃２のためのＨＤＡｄ用量は、いずれも１．６×１０^１２ ｖｐ／ｋｇであった。（図１０Ｄ）ＮＨＰ＃３におけるＨＤＡｄの用量は、ＨＤＡｄの２回目の用量が低減したことを示すが、この低減は、後に誤りであることが判明した好中球数に基づくものであった。

【図10C-D】図１０Ａ～１０Ｄ。Ｇ－ＣＳＦ／ＡＭＤ３１００によるアカゲザルにおける効率的なＨＳＣ動員。動員処理したアカゲザルへのＨＤＡｄ注射。（図１０Ａ）ＧＣＳＦ、ＡＭＤ３１００及びＨＤＡｄの注射のタイミング。図１０Ｂ～１０Ｄ 末梢血中の未分化（ＣＤ３４＋／ＣＤ４５ＲＡ－／ＣＤ９０＋）ＨＳＣの数。ＨＤＡｄを動員の２回のピークで注射した。（図１０Ｂ）ＮＨＰ＃１におけるベクター投薬は保存的であった（０．５～１．６５×１０^１２ ｖｐ／ｋｇ）。（図１０Ｃ）ＮＨＰ＃２のためのＨＤＡｄ用量は、いずれも１．６×１０^１２ ｖｐ／ｋｇであった。（図１０Ｄ）ＮＨＰ＃３におけるＨＤＡｄの用量は、ＨＤＡｄの２回目の用量が低減したことを示すが、この低減は、後に誤りであることが判明した好中球数に基づくものであった。

【0111】

【図11A】図１１Ａ～１１Ｃ。図１１Ａは、アデノウイルスベクターの静脈内注射及び薬理学的介入後の自然免疫応答を示す。図１１Ｂは、投薬スケジュールであり；図１１Ｃは、マウスにおけるデキサメタゾン処理がサイトカイン応答を鈍化させることを示すグラフである。

【図11B-C】図１１Ａ～１１Ｃ。図１１Ａは、アデノウイルスベクターの静脈内注射及び薬理学的介入後の自然免疫応答を示す。図１１Ｂは、投薬スケジュールであり；図１１Ｃは、マウスにおけるデキサメタゾン処理がサイトカイン応答を鈍化させることを示すグラフである。

【0112】

【図12A-B】図１２Ａ－１２Ｅ。サイトカイン予防：サイトメトリックビーズアレイを使用して、アカゲザルの血清中サイトカインレベルを測定した。ＩＬ－６（図１２Ａ～１２Ｃ）及びＴＮＦα（図１２Ｄ、１２Ｅ）のみが検出可能であった。トシリズマブ（抗ＩＬ６Ｒ）及びアナキンラ（ＩＬ１Ｒ－アンタゴニスト）の追加は、血清中ＩＬ－６及びＴＮＦαをさらに低下させる。（図１２Ａ～１２Ｃ）血清中ＩＬ－６。（図１２Ｄ、１２Ｅ）血清中ＴＮＦα。ＴＮＦαはＮＨＰ＃２において検出不能であった（＋Ｔｏｃｉ、＋アナキンラ）。

【図12C】図１２Ａ－１２Ｅ。サイトカイン予防：サイトメトリックビーズアレイを使用して、アカゲザルの血清中サイトカインレベルを測定した。ＩＬ－６（図１２Ａ～１２Ｃ）及びＴＮＦα（図１２Ｄ、１２Ｅ）のみが検出可能であった。トシリズマブ（抗ＩＬ６Ｒ）及びアナキンラ（ＩＬ１Ｒ－アンタゴニスト）の追加は、血清中ＩＬ－６及びＴＮＦαをさらに低下させる。（図１２Ａ～１２Ｃ）血清中ＩＬ－６。（図１２Ｄ、１２Ｅ）血清中ＴＮＦα。ＴＮＦαはＮＨＰ＃２において検出不能であった（＋Ｔｏｃｉ、＋アナキンラ）。

【図12D-E】図１２Ａ－１２Ｅ。サイトカイン予防：サイトメトリックビーズアレイを使用して、アカゲザルの血清中サイトカインレベルを測定した。ＩＬ－６（図１２Ａ～１２Ｃ）及びＴＮＦα（図１２Ｄ、１２Ｅ）のみが検出可能であった。トシリズマブ（抗ＩＬ６Ｒ）及びアナキンラ（ＩＬ１Ｒ－アンタゴニスト）の追加は、血清中ＩＬ－６及びＴＮＦαをさらに低下させる。（図１２Ａ～１２Ｃ）血清中ＩＬ－６。（図１２Ｄ、１２Ｅ）血清中ＴＮＦα。ＴＮＦαはＮＨＰ＃２において検出不能であった（＋Ｔｏｃｉ、＋アナキンラ）。

【0113】

【図13A-B】図１３Ａ～１３Ｄ。（図１３Ａ、１３Ｂ）マウスまたは（図１３Ｃ、１３Ｄ）アカゲザルにおいて、ＨＤＡｄ５／３５＋＋の静脈内注射後に肝毒性は存在しない。マウスではＨＤＡｄ５／３５＋＋による肝臓の形質導入はほとんどまたは全く示されず、マウス及びＮＨＰでは肝臓の酵素であるＡＳＴ及びＡＬＴの血清中レベルの上昇は示されない。これは、重要な毒性読み取りデータであり、ＨＤＡｄ５／３５＋＋が肝毒性をほとんど有さないことを示す。ＨＤＡｄ５／３５＋＋では、Ａｄ３５の短いファイバーシャフトが第Ｘ因子がヘキソンに結合するのを妨げるため、肝細胞形質導入が妨げられる。

【図13C-D】図１３Ａ～１３Ｄ。（図１３Ａ、１３Ｂ）マウスまたは（図１３Ｃ、１３Ｄ）アカゲザルにおいて、ＨＤＡｄ５／３５＋＋の静脈内注射後に肝毒性は存在しない。マウスではＨＤＡｄ５／３５＋＋による肝臓の形質導入はほとんどまたは全く示されず、マウス及びＮＨＰでは肝臓の酵素であるＡＳＴ及びＡＬＴの血清中レベルの上昇は示されない。これは、重要な毒性読み取りデータであり、ＨＤＡｄ５／３５＋＋が肝毒性をほとんど有さないことを示す。ＨＤＡｄ５／３５＋＋では、Ａｄ３５の短いファイバーシャフトが第Ｘ因子がヘキソンに結合するのを妨げるため、肝細胞形質導入が妨げられる。

【0114】

【図14A】図１４Ａ～１４Ｃ。未分化ＨＳＣ（ＣＦＵ）の５％が、インビボでの選択の前に安定して形質導入された（ＮＨＰ＃３）。図１４Ａは、ＣＦＵアッセイのためのプロトコールの概略である。未分化ＨＳＣをＨＤＡｄ５／３５＋＋によって形質導入すると（初期のすべてのエピソーム）、４週目の選択の直前には未分化ＨＳＣの５％が形質導入され（安定な組み込み）、アカゲザル（ＮＨＰ＃３）における１回目のＯ^６ＢＧ及びＢＣＮＵによる処置後８週目には１０％まで増加する。

【図14B-C】図１４Ａ～１４Ｃ。未分化ＨＳＣ（ＣＦＵ）の５％が、インビボでの選択の前に安定して形質導入された（ＮＨＰ＃３）。図１４Ａは、ＣＦＵアッセイのためのプロトコールの概略である。未分化ＨＳＣをＨＤＡｄ５／３５＋＋によって形質導入すると（初期のすべてのエピソーム）、４週目の選択の直前には未分化ＨＳＣの５％が形質導入され（安定な組み込み）、アカゲザル（ＮＨＰ＃３）における１回目のＯ^６ＢＧ及びＢＣＮＵによる処置後８週目には１０％まで増加する。

【0115】

【図15A】図１５Ａ～１５Ｃ。インビボでの選択後：末梢赤血球における９０％のγ－グロビンマーキング（ＮＨＰ＃１）。（図１５Ａ、１５Ｂ）末梢ＲＢＣのγ－グロビン（アカゲザル＋ヒト）（図１５Ａ）及び骨髄穿刺液（ＢＭＡ）における赤血球前駆細胞（図１５Ｂ）に関するフローサイトメトリー。下向きの矢印はＯ^６ＢＧ／ＢＣＮＵ処理を示す。図１５Ｃは、３回のＯ^６ＢＧ及びＢＣＮＵ（ＮＨＰ＃１）後のヒトガンマグロビンによるアカゲザルＲＢＣの１００％マーキングを示す。これらの結果は、選択プロトコールが有効であることを実証している。

【図15B】図１５Ａ～１５Ｃ。インビボでの選択後：末梢赤血球における９０％のγ－グロビンマーキング（ＮＨＰ＃１）。（図１５Ａ、１５Ｂ）末梢ＲＢＣのγ－グロビン（アカゲザル＋ヒト）（図１５Ａ）及び骨髄穿刺液（ＢＭＡ）における赤血球前駆細胞（図１５Ｂ）に関するフローサイトメトリー。下向きの矢印はＯ^６ＢＧ／ＢＣＮＵ処理を示す。図１５Ｃは、３回のＯ^６ＢＧ及びＢＣＮＵ（ＮＨＰ＃１）後のヒトガンマグロビンによるアカゲザルＲＢＣの１００％マーキングを示す。これらの結果は、選択プロトコールが有効であることを実証している。

【図15C】図１５Ａ～１５Ｃ。インビボでの選択後：末梢赤血球における９０％のγ－グロビンマーキング（ＮＨＰ＃１）。（図１５Ａ、１５Ｂ）末梢ＲＢＣのγ－グロビン（アカゲザル＋ヒト）（図１５Ａ）及び骨髄穿刺液（ＢＭＡ）における赤血球前駆細胞（図１５Ｂ）に関するフローサイトメトリー。下向きの矢印はＯ^６ＢＧ／ＢＣＮＵ処理を示す。図１５Ｃは、３回のＯ^６ＢＧ及びＢＣＮＵ（ＮＨＰ＃１）後のヒトガンマグロビンによるアカゲザルＲＢＣの１００％マーキングを示す。これらの結果は、選択プロトコールが有効であることを実証している。

【0116】

【図16A-B】図１６Ａ－１６Ｉ。ＨＤＡｄ５／３５＋＋ベクター及び導入遺伝子産物に対する抗体応答。ＮＨＰ＃１（図１６Ａ）及びＮＨＰ＃３（図１６Ｂ）に関するＨＤＡｄ５／３５＋＋に対する血清抗体。ゲノム編集酵素（図１６Ｇ ＳＢ１００ｘ；図１６Ｈ Ｆｌｐｅ；図１６Ｉ Ｃａｓ９）及びＧＦＰ＋（図１６Ｃ）に対するのと同様に、これらの酵素に対する血清抗体（図１６Ｄ 抗Ｆｌｐｅ抗体；図１６Ｅ 抗ＳＢ１００ｘ抗体；及び図１６Ｆ 抗Ｃａｓ９血清抗体）のｍＲＮＡレベル（ＮＨＰ＃１）。発現と免疫応答キネティクスの両方は、ＮＨＰ＃３（非掲載）と同様であった。これらのデータは、導入遺伝子によってコードされるウイルス遺伝子治療カプシド及び外来性ＧＦＰリポーターに対する典型的な周知の抗体応答を示す。対照的に、この系において安全性及び長期間の導入遺伝子発現をさらにサポートするＦｌｐｅ、ＳＢ、またはＣａｓ９に対する抗体応答はほとんどまたは全く見られなかった。

【図16C-D】図１６Ａ－１６Ｉ。ＨＤＡｄ５／３５＋＋ベクター及び導入遺伝子産物に対する抗体応答。ＮＨＰ＃１（図１６Ａ）及びＮＨＰ＃３（図１６Ｂ）に関するＨＤＡｄ５／３５＋＋に対する血清抗体。ゲノム編集酵素（図１６Ｇ ＳＢ１００ｘ；図１６Ｈ Ｆｌｐｅ；図１６Ｉ Ｃａｓ９）及びＧＦＰ＋（図１６Ｃ）に対するのと同様に、これらの酵素に対する血清抗体（図１６Ｄ 抗Ｆｌｐｅ抗体；図１６Ｅ 抗ＳＢ１００ｘ抗体；及び図１６Ｆ 抗Ｃａｓ９血清抗体）のｍＲＮＡレベル（ＮＨＰ＃１）。発現と免疫応答キネティクスの両方は、ＮＨＰ＃３（非掲載）と同様であった。これらのデータは、導入遺伝子によってコードされるウイルス遺伝子治療カプシド及び外来性ＧＦＰリポーターに対する典型的な周知の抗体応答を示す。対照的に、この系において安全性及び長期間の導入遺伝子発現をさらにサポートするＦｌｐｅ、ＳＢ、またはＣａｓ９に対する抗体応答はほとんどまたは全く見られなかった。

【図16E-F】図１６Ａ－１６Ｉ。ＨＤＡｄ５／３５＋＋ベクター及び導入遺伝子産物に対する抗体応答。ＮＨＰ＃１（図１６Ａ）及びＮＨＰ＃３（図１６Ｂ）に関するＨＤＡｄ５／３５＋＋に対する血清抗体。ゲノム編集酵素（図１６Ｇ ＳＢ１００ｘ；図１６Ｈ Ｆｌｐｅ；図１６Ｉ Ｃａｓ９）及びＧＦＰ＋（図１６Ｃ）に対するのと同様に、これらの酵素に対する血清抗体（図１６Ｄ 抗Ｆｌｐｅ抗体；図１６Ｅ 抗ＳＢ１００ｘ抗体；及び図１６Ｆ 抗Ｃａｓ９血清抗体）のｍＲＮＡレベル（ＮＨＰ＃１）。発現と免疫応答キネティクスの両方は、ＮＨＰ＃３（非掲載）と同様であった。これらのデータは、導入遺伝子によってコードされるウイルス遺伝子治療カプシド及び外来性ＧＦＰリポーターに対する典型的な周知の抗体応答を示す。対照的に、この系において安全性及び長期間の導入遺伝子発現をさらにサポートするＦｌｐｅ、ＳＢ、またはＣａｓ９に対する抗体応答はほとんどまたは全く見られなかった。

【図16G-H】図１６Ａ－１６Ｉ。ＨＤＡｄ５／３５＋＋ベクター及び導入遺伝子産物に対する抗体応答。ＮＨＰ＃１（図１６Ａ）及びＮＨＰ＃３（図１６Ｂ）に関するＨＤＡｄ５／３５＋＋に対する血清抗体。ゲノム編集酵素（図１６Ｇ ＳＢ１００ｘ；図１６Ｈ Ｆｌｐｅ；図１６Ｉ Ｃａｓ９）及びＧＦＰ＋（図１６Ｃ）に対するのと同様に、これらの酵素に対する血清抗体（図１６Ｄ 抗Ｆｌｐｅ抗体；図１６Ｅ 抗ＳＢ１００ｘ抗体；及び図１６Ｆ 抗Ｃａｓ９血清抗体）のｍＲＮＡレベル（ＮＨＰ＃１）。発現と免疫応答キネティクスの両方は、ＮＨＰ＃３（非掲載）と同様であった。これらのデータは、導入遺伝子によってコードされるウイルス遺伝子治療カプシド及び外来性ＧＦＰリポーターに対する典型的な周知の抗体応答を示す。対照的に、この系において安全性及び長期間の導入遺伝子発現をさらにサポートするＦｌｐｅ、ＳＢ、またはＣａｓ９に対する抗体応答はほとんどまたは全く見られなかった。

【図16I】図１６Ａ－１６Ｉ。ＨＤＡｄ５／３５＋＋ベクター及び導入遺伝子産物に対する抗体応答。ＮＨＰ＃１（図１６Ａ）及びＮＨＰ＃３（図１６Ｂ）に関するＨＤＡｄ５／３５＋＋に対する血清抗体。ゲノム編集酵素（図１６Ｇ ＳＢ１００ｘ；図１６Ｈ Ｆｌｐｅ；図１６Ｉ Ｃａｓ９）及びＧＦＰ＋（図１６Ｃ）に対するのと同様に、これらの酵素に対する血清抗体（図１６Ｄ 抗Ｆｌｐｅ抗体；図１６Ｅ 抗ＳＢ１００ｘ抗体；及び図１６Ｆ 抗Ｃａｓ９血清抗体）のｍＲＮＡレベル（ＮＨＰ＃１）。発現と免疫応答キネティクスの両方は、ＮＨＰ＃３（非掲載）と同様であった。これらのデータは、導入遺伝子によってコードされるウイルス遺伝子治療カプシド及び外来性ＧＦＰリポーターに対する典型的な周知の抗体応答を示す。対照的に、この系において安全性及び長期間の導入遺伝子発現をさらにサポートするＦｌｐｅ、ＳＢ、またはＣａｓ９に対する抗体応答はほとんどまたは全く見られなかった。

【0117】

【図17A】図１７Ａ－１７Ｆ。導入遺伝子産物に対する免疫応答によって、形質導入細胞（ＮＨＰ＃３）が失われる。γ－グロビン発現をフローサイトメトリーによって分析した。（図１７Ａ）ＲＢＣ。（図１７Ｂ）骨髄穿刺液。（図１７Ｃ）代表的なプロットを示す。矢印はＯ^６ＢＧ／ＢＣＮＵ処理を示す。（図１７Ｅ、１７Ｆ）より高レベルの導入遺伝子発現がＮＨＰ＃３に存在した。これらのデータは、アカゲザルモデルにおいて、ＰＢＭＣにおいてヒトＭＧＭＴ^{ｐ１４０Ｋ}の発現が失われたことと関連して、ヒトガンマグロビンを発現するアカゲザルＲＢＣが失われたことを示し、これは、ヒトＭＧＭＴ^{Ｐ１４０Ｋ}に対する抗体応答に起因すると考えられる。これは、おそらく、ＮＨＰ＃１と比較してＮＨＰ＃３において、ガンマグロビン及びＭＧＭＴが高レベルで発現することに起因する。ガンマグロビン及びＭＧＭＴの発現の喪失は、ＮＨＰ＃１において見られなかった。

【図17B-C】図１７Ａ－１７Ｆ。導入遺伝子産物に対する免疫応答によって、形質導入細胞（ＮＨＰ＃３）が失われる。γ－グロビン発現をフローサイトメトリーによって分析した。（図１７Ａ）ＲＢＣ。（図１７Ｂ）骨髄穿刺液。（図１７Ｃ）代表的なプロットを示す。矢印はＯ^６ＢＧ／ＢＣＮＵ処理を示す。（図１７Ｅ、１７Ｆ）より高レベルの導入遺伝子発現がＮＨＰ＃３に存在した。これらのデータは、アカゲザルモデルにおいて、ＰＢＭＣにおいてヒトＭＧＭＴ^{ｐ１４０Ｋ}の発現が失われたことと関連して、ヒトガンマグロビンを発現するアカゲザルＲＢＣが失われたことを示し、これは、ヒトＭＧＭＴ^{Ｐ１４０Ｋ}に対する抗体応答に起因すると考えられる。これは、おそらく、ＮＨＰ＃１と比較してＮＨＰ＃３において、ガンマグロビン及びＭＧＭＴが高レベルで発現することに起因する。ガンマグロビン及びＭＧＭＴの発現の喪失は、ＮＨＰ＃１において見られなかった。

【図17D】図１７Ａ－１７Ｆ。導入遺伝子産物に対する免疫応答によって、形質導入細胞（ＮＨＰ＃３）が失われる。γ－グロビン発現をフローサイトメトリーによって分析した。（図１７Ａ）ＲＢＣ。（図１７Ｂ）骨髄穿刺液。（図１７Ｃ）代表的なプロットを示す。矢印はＯ^６ＢＧ／ＢＣＮＵ処理を示す。（図１７Ｅ、１７Ｆ）より高レベルの導入遺伝子発現がＮＨＰ＃３に存在した。これらのデータは、アカゲザルモデルにおいて、ＰＢＭＣにおいてヒトＭＧＭＴ^{ｐ１４０Ｋ}の発現が失われたことと関連して、ヒトガンマグロビンを発現するアカゲザルＲＢＣが失われたことを示し、これは、ヒトＭＧＭＴ^{Ｐ１４０Ｋ}に対する抗体応答に起因すると考えられる。これは、おそらく、ＮＨＰ＃１と比較してＮＨＰ＃３において、ガンマグロビン及びＭＧＭＴが高レベルで発現することに起因する。ガンマグロビン及びＭＧＭＴの発現の喪失は、ＮＨＰ＃１において見られなかった。

【図17E-F】図１７Ａ－１７Ｆ。導入遺伝子産物に対する免疫応答によって、形質導入細胞（ＮＨＰ＃３）が失われる。γ－グロビン発現をフローサイトメトリーによって分析した。（図１７Ａ）ＲＢＣ。（図１７Ｂ）骨髄穿刺液。（図１７Ｃ）代表的なプロットを示す。矢印はＯ^６ＢＧ／ＢＣＮＵ処理を示す。（図１７Ｅ、１７Ｆ）より高レベルの導入遺伝子発現がＮＨＰ＃３に存在した。これらのデータは、アカゲザルモデルにおいて、ＰＢＭＣにおいてヒトＭＧＭＴ^{ｐ１４０Ｋ}の発現が失われたことと関連して、ヒトガンマグロビンを発現するアカゲザルＲＢＣが失われたことを示し、これは、ヒトＭＧＭＴ^{Ｐ１４０Ｋ}に対する抗体応答に起因すると考えられる。これは、おそらく、ＮＨＰ＃１と比較してＮＨＰ＃３において、ガンマグロビン及びＭＧＭＴが高レベルで発現することに起因する。ガンマグロビン及びＭＧＭＴの発現の喪失は、ＮＨＰ＃１において見られなかった。

【0118】

【図18A】図１８Ａ－１８Ｃ。ＮＨＰ＃３（図１８Ａ）及びＮＨＰ＃１（図１８Ｂ）における組換えヒトＭＧＭＴタンパク質に対する血清抗体（ＩｇＧ及びＩｇＭ）の力価。（図１８Ｃ）次のベクター：アカゲザルγ－グロビン及びｍｇｍｔ^{Ｐ１４０Ｋ}。ＮＨＰ＃１では、研究を通じて、免疫抑制剤に対する連続曝露によって、抗ＭＧＭＴ応答が鈍化した。タクロリムスを停止した場合に、ＮＨＰ＃３において抗ＭＧＭＴ抗体が増加した。

【図18B】図１８Ａ－１８Ｃ。ＮＨＰ＃３（図１８Ａ）及びＮＨＰ＃１（図１８Ｂ）における組換えヒトＭＧＭＴタンパク質に対する血清抗体（ＩｇＧ及びＩｇＭ）の力価。（図１８Ｃ）次のベクター：アカゲザルγ－グロビン及びｍｇｍｔ^{Ｐ１４０Ｋ}。ＮＨＰ＃１では、研究を通じて、免疫抑制剤に対する連続曝露によって、抗ＭＧＭＴ応答が鈍化した。タクロリムスを停止した場合に、ＮＨＰ＃３において抗ＭＧＭＴ抗体が増加した。

【図18C】図１８Ａ－１８Ｃ。ＮＨＰ＃３（図１８Ａ）及びＮＨＰ＃１（図１８Ｂ）における組換えヒトＭＧＭＴタンパク質に対する血清抗体（ＩｇＧ及びＩｇＭ）の力価。（図１８Ｃ）次のベクター：アカゲザルγ－グロビン及びｍｇｍｔ^{Ｐ１４０Ｋ}。ＮＨＰ＃１では、研究を通じて、免疫抑制剤に対する連続曝露によって、抗ＭＧＭＴ応答が鈍化した。タクロリムスを停止した場合に、ＮＨＰ＃３において抗ＭＧＭＴ抗体が増加した。

【0119】

【図19A-C】血液からのベクタークリアランス。血清試料中のベクターゲノムをｑＰＣＲによって測定した。

【0120】

【図20A】図２０Ａ－２０Ｂ。重量及び血液学的データ。血液データでは、正常範囲は、透明な灰色で示される。

【図20B】図２０Ａ－２０Ｂ。重量及び血液学的データ。血液データでは、正常範囲は、透明な灰色で示される。

【0121】

【図21A-C】骨髄細胞組成。（図２１Ａ、２１Ｂ）：系譜＋細胞（ＣＤ２０、ＣＤ３、ＣＤ１４）及びＨＳＣ（ＣＤ３４）におけるパーセンテージ。ＣＤ３４細胞（ＮＨＰ＃３）は、図２１Ｃに別に示されている。

【0122】

【図22】細胞当たりのベクターコピー数（ヒトｍｇｍｔＰ１４０Ｋプライマーを用いるｑＰＣＲによって測定した）。最後のＨＤＡｄ注射後３日目に、組織を収集した。胆嚢、空腸、肺、及び肝臓は、多量の血液を含有した。

【0123】

【図23A-C】ＮＨＰ＃１（図２３Ａ）、ＮＨＰ＃２（図２３Ｂ）、及びＮＨＰ＃３（図２３Ｃ）における、ＰＢＭＣ中のベクターコピー数。

【0124】

【図24A-D】ＣＤ３４＋細胞の選択的形質導入。ＨＤＡｄ注射後３日目及び８日目の全骨髄単核細胞（ＭＮＣ）及び骨髄ＣＤ３４＋細胞からのＶＣＮ／細胞が示されている。右のパネルは、ｍｇｍｔ^{Ｐ１４０Ｋ} ｍＲＮＡレベルを示す。（ｍｇｍｔ遺伝子は、遍在性に活性なＥＦ１αプロモーターの制御下にある）。

【0125】

【図25】ベクター陽性前駆細胞コロニーのパーセンテージ。ＣＤ３４＋細胞を前駆細胞コロニーアッセイのために播種した。播種の１２日後に、約１００の単一コロニーを収集し、ｍｇｍｔ^{Ｐ１４０Ｋ}特異的プライマーを使用するｑＰＣＲによってゲノムＤＮＡを分析した。

【0126】

【図26A】図２６Ａ－２６Ｃ。ヒトγ－グロビン及びｍｇｍｔ^{Ｐ１４０Ｋ}導入遺伝子の発現。（図２６Ａ）ＨＰＬＣによって測定したヒトγ－グロビンレベル。ＨＰＬＣは、アカゲザルγ－グロビン鎖とヒトγ－グロビン鎖の間を識別することができる。（図２６Ｂ）代表的なＨＰＬＣ。（図２６Ｃ）ｑＲＴ－ＰＣＲによって測定したヒトｍｇｍｔ^{Ｐ１４０Ｋ} ｍＲＮＡ発現。同様のキネティクスに留意されたい。

【図26B】図２６Ａ－２６Ｃ。ヒトγ－グロビン及びｍｇｍｔ^{Ｐ１４０Ｋ}導入遺伝子の発現。（図２６Ａ）ＨＰＬＣによって測定したヒトγ－グロビンレベル。ＨＰＬＣは、アカゲザルγ－グロビン鎖とヒトγ－グロビン鎖の間を識別することができる。（図２６Ｂ）代表的なＨＰＬＣ。（図２６Ｃ）ｑＲＴ－ＰＣＲによって測定したヒトｍｇｍｔ^{Ｐ１４０Ｋ} ｍＲＮＡ発現。同様のキネティクスに留意されたい。

【図26C】図２６Ａ－２６Ｃ。ヒトγ－グロビン及びｍｇｍｔ^{Ｐ１４０Ｋ}導入遺伝子の発現。（図２６Ａ）ＨＰＬＣによって測定したヒトγ－グロビンレベル。ＨＰＬＣは、アカゲザルγ－グロビン鎖とヒトγ－グロビン鎖の間を識別することができる。（図２６Ｂ）代表的なＨＰＬＣ。（図２６Ｃ）ｑＲＴ－ＰＣＲによって測定したヒトｍｇｍｔ^{Ｐ１４０Ｋ} ｍＲＮＡ発現。同様のキネティクスに留意されたい。

【0127】

【図27】アカゲザルγ－グロビンの発現及び標的部位のＣＲＩＳＰＲ切断。

【0128】

【図28A】図２８Ａ－２８Ｃ。アカゲザル赤血球に存在するＣＤ４６によるＨＤＡｄ５／３５＋＋の潜在的隔絶。（図２８Ａ）フローサイトメトリーの結果は、ＣＤ４６ｔｇマウス及びアカゲザルが、Ａｄ３５ベースのベクターの形質導入を評価するために適切なモデルであることをサポートする。（図２８Ｂ）この仮説を検証するために、Ａｄ５／３５＋＋ ＧＦＰベクターならびに異なる動物種及びモデルからの全血の追加により、インビトロ形質導入研究を実施した。簡潔に記載すると、ヒト、アカゲザル、ＣＤ４６ｔｇマウス及びＣ５７Ｂｌ／６マウスから、ＥＤＴＡ中に全血を採取した。その後に、ＥＤＴＡ全血をＰＢＳで洗浄し、ペレット化させ、細胞培養培地（ダルベッコの改変イーグル培地［ＤＭＥＭ］／ウシ胎仔血清［ＦＣＳ］）中に再懸濁させた。全血をＨＥＫ２９３細胞に添加し、以下のＭＯＩ：０、１０、１００、２５０、５００及び１０００で、Ａｄ５／３５＋＋ ＧＦＰベクターにより細胞を形質導入した。１時間後に、２９３細胞をＰＢＳで洗浄し、新しい培地を添加した。ベクターの形質導入効率を、２４時間の時点でフローサイトメトリーによってＧＦＰ陽性細胞について分析した。（図２８Ｃ）ＮＨＰ＃２及びＮＨＰ＃３におけるＨＤＡｄ５／３５＋＋のＩＶ注射後の血清中の可溶性／排出ＣＤ４６レベル。

【図28B-C】図２８Ａ－２８Ｃ。アカゲザル赤血球に存在するＣＤ４６によるＨＤＡｄ５／３５＋＋の潜在的隔絶。（図２８Ａ）フローサイトメトリーの結果は、ＣＤ４６ｔｇマウス及びアカゲザルが、Ａｄ３５ベースのベクターの形質導入を評価するために適切なモデルであることをサポートする。（図２８Ｂ）この仮説を検証するために、Ａｄ５／３５＋＋ ＧＦＰベクターならびに異なる動物種及びモデルからの全血の追加により、インビトロ形質導入研究を実施した。簡潔に記載すると、ヒト、アカゲザル、ＣＤ４６ｔｇマウス及びＣ５７Ｂｌ／６マウスから、ＥＤＴＡ中に全血を採取した。その後に、ＥＤＴＡ全血をＰＢＳで洗浄し、ペレット化させ、細胞培養培地（ダルベッコの改変イーグル培地［ＤＭＥＭ］／ウシ胎仔血清［ＦＣＳ］）中に再懸濁させた。全血をＨＥＫ２９３細胞に添加し、以下のＭＯＩ：０、１０、１００、２５０、５００及び１０００で、Ａｄ５／３５＋＋ ＧＦＰベクターにより細胞を形質導入した。１時間後に、２９３細胞をＰＢＳで洗浄し、新しい培地を添加した。ベクターの形質導入効率を、２４時間の時点でフローサイトメトリーによってＧＦＰ陽性細胞について分析した。（図２８Ｃ）ＮＨＰ＃２及びＮＨＰ＃３におけるＨＤＡｄ５／３５＋＋のＩＶ注射後の血清中の可溶性／排出ＣＤ４６レベル。

【0129】

【図29】サイトメトリックビーズアレイを使用して、アカゲザルの血清中サイトカインレベルを測定した。血清中ＩＬ－６（ｐｇ／ｍＬ）レベルをＮＨＰ＃４について示す。相対的な日付、及び時間をＸ軸に沿って示す。矢印は、アデノウイルスベクターの投与を示す。

【0130】

【図30】サイトメトリックビーズアレイを使用して、アカゲザルの血清中サイトカインレベルを測定した。ＴＮＦα（ｐｇ／ｍＬ）レベルをＮＨＰ＃４について示す。相対的な日付、及び時間をＸ軸に沿って示す。矢印は、アデノウイルスベクターの投与を示す。

【0131】

【図31】サイトメトリックビーズアレイを使用して、アカゲザルの血清中サイトカインレベルを測定した。血清中ＩＬ－６（ｐｇ／ｍＬ）レベルをＮＨＰ＃５について示す。相対的な日付、及び時間をＸ軸に沿って示す。矢印は、アデノウイルスベクターの投与を示す。

【0132】

【図32】サイトメトリックビーズアレイを使用して、アカゲザルの血清中サイトカインレベルを測定した。ＴＮＦα（ｐｇ／ｍＬ）レベルをＮＨＰ＃５について示す。相対的な日付、及び時間をＸ軸に沿って示す。矢印は、アデノウイルスベクターの投与を示す。

【発明を実施するための形態】

【0133】

詳細な説明
インビボ治療の課題。ウイルス遺伝子治療は、哺乳動物において逆効果の免疫応答を誘導する場合がある。例えば、ウイルスベクターは、病原体関連分子パターンの検出を含む多くの経路のいずれかを介して、自然免疫応答を引き起こすことができる。ウイルスベクターを検出する自然免疫センサーは、細胞の細胞質、エンドソームまたは表面において見出すことができ、カプシド、エンベロープ、ウイルスＤＮＡまたはウイルスＲＮＡなどのウイルス特色を認識する。典型的な自然免疫応答は、対象へのウイルス遺伝子治療ベクターの投与の１時間以内に誘導されるサイトカイン応答を含む。抗ウイルスサイトカインは、形質細胞様樹状細胞（ＤＣ）、通常型ＤＣ、マクロファージ及びＢ細胞を限定することなく含む、抗原提示細胞（ＡＰＣ）などの細胞によって産生することができる。自然免疫応答は、エフェクターリンパ球を動員し、遺伝子治療ベクターによる標的細胞の形質導入を阻害し、逆効果の適応免疫系活性を容易にする、炎症促進性効果を含むことができる。

【0134】

外来性コード核酸配列の発現が、対象において非ネイティブ抗原である、または他の理由から適応免疫系によって異物として認識される抗原である産物を産生する場合、適応免疫は、問題になることが判明する場合もある。そのような場合には、適応免疫系は、外来性コード核酸配列を発現する対象細胞の破壊を媒介することができる。

【0135】

一部のアデノウイルスベクターは、自然免疫応答及び適応免疫応答の両方を誘導することが示されている。アデノウイルスベクターは、補体活性化を含むさまざまな経路を介して自然免疫応答を誘導することができる。アデノウイルスベクターは、例えば、アデノウイルス遺伝子治療ベクターの投与の１時間以内に、炎症促進性サイトカインの産生を急速に誘導することができる。ある特定の共通アデノウイルスについて、多くのヒトが、アデノウイルス遺伝子治療ベクターの投与に先立ち、既存の中和抗体を有する。

【0136】

本開示は、とりわけ、ウイルスベクターの投与及び／またはウイルス遺伝子治療ベクターを使用した遺伝子治療、例えば、インビボ遺伝子治療に起因する免疫毒性を低減させる免疫抑制レジメンを提供する。本開示は、とりわけ、炎症性シグナル阻害剤を含む免疫抑制レジメンであって、必要に応じて、炎症性シグナルが、ＩＬ－１受容体（ＩＬ－１Ｒ）シグナル阻害剤などのインターロイキン－１（ＩＬ－１）シグナル阻害剤である、免疫抑制レジメンを提供する。

【0137】

免疫抑制剤。本開示は、ウイルス遺伝子治療ベクターを投与することを含む遺伝子治療、例えば、インビボ遺伝子治療の免疫毒性を低減させる免疫抑制レジメンを含む。本開示の免疫抑制レジメンは、炎症性シグナル阻害剤を含む１つまたは複数の免疫抑制剤を含むことができる。本開示の免疫抑制レジメンは、次のうちの１つまたは複数のいずれかを含む１つまたは複数の免疫抑制剤を含むことができる：
（ｉ）インターロイキン－１（ＩＬ－１）シグナル阻害剤などの炎症性シグナル阻害剤；
（ｉｉ）ＩＬ－６シグナル阻害剤；
（ｉｉｉ）コルチコステロイド；
（ｉｖ）カルシニューリン阻害剤；
（ｖ）ＴＮＦ－αシグナル阻害剤；
（ｖｉ）ＪＡＫシグナル阻害剤；及び
（ｖｉｉ）Ｔ細胞活性化における共刺激シグナル伝達の阻害剤。

【0138】

本開示のある特定の免疫抑制レジメンは、次のうちの１つまたは複数のいずれかを含む１つまたは複数の免疫抑制剤を含むことができる：
（ｉ）インターロイキン－１（ＩＬ－１）シグナル阻害剤；
（ｉｉ）ＩＬ－６シグナル阻害剤；
（ｉｉｉ）コルチコステロイド；
（ｉｖ）カルシニューリン阻害剤、及び
（ｖｉｉ）Ｔ細胞活性化における共刺激シグナル伝達の阻害剤。

【0139】

さまざまな実施形態において、遺伝子治療、例えば、インビボ遺伝子治療の免疫毒性を低減させる免疫抑制レジメンは、次のものから選択される１つまたは複数のウイルスベクター剤を含むウイルス遺伝子治療レジメンと併せて対象に投与される：
（ｉ）ウイルス遺伝子治療ベクター；及び
（ｉｉ）サポートベクター。

【0140】

さまざまな実施形態において、免疫抑制剤のいずれかは、単一用量または複数用量で対象に投与することができる。さまざまな実施形態において、免疫抑制剤のいずれかは、１日でまたは数日で対象に投与することができる。さまざまな実施形態において、免疫抑制剤のいずれかは、単一用量または複数の別々の用量で対象に投与される１日用量で投与することができる。さまざまな実施形態において、免疫抑制剤のいずれかの用量は、用量全体及び／または１日用量全体を含む単一単位用量で、または用量全体及び／または１日用量全体を合わせて提供する複数の単位用量で投与することができる。

【0141】

さまざまな実施形態において、剤形は、免疫抑制剤である１つまたは複数の薬剤のそれぞれの量を含むことができる。さまざまな実施形態において、剤形は、同じ免疫抑制剤クラスまたは複数の免疫抑制剤クラスのものである免疫抑制剤である２つまたはそれよりも多い薬剤のそれぞれの量を含むことができる。さまざまな実施形態において、剤形は、第１の免疫抑制剤クラスの少なくとも１つの免疫抑制剤、及び第１の免疫抑制剤クラスとは異なる免疫抑制剤クラスである第２の免疫抑制剤クラスの少なくとも１つの免疫抑制剤を含むことができる。

【0142】

炎症性シグナル阻害剤。例えば、ウイルス遺伝子治療ベクターなどの外来性薬剤の対象への投与後の炎症応答に寄与し得る、多種多様なシグナルが同定されている。炎症性シグナルを伝達する経路は典型的に、少なくとも一部には、炎症促進性シグナル伝達剤と、炎症促進性シグナル伝達剤がリガンドとして作用する炎症促進性シグナル伝達受容体とを含む。さまざまな場合において、炎症促進性シグナル伝達受容体及び炎症促進性シグナル伝達受容体の結合は、免疫学的応答及び／または炎症応答を媒介する。

【0143】

炎症促進性シグナル伝達剤の例としては、サイトカインＩＬ－１β、ＩＬ－１α、ＩＬ－６、ＴＮＦ－α、ＴＧＦ－β、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－８（ＣＸＣＬ８とも当該技術分野で称される）、ＩＬ－１２、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１５、及びＣＣＬ２が挙げられる。

【0144】

炎症促進性シグナル伝達受容体（及びそのリガンド）の例としては、ＩＬ－１Ｒ（ＩＬ－１β、ＩＬ－１α）、ＩＬ－３Ｒ、ＩＬ－４Ｒａ、ＩＬ－５Ｒ、ＩＬ－６Ｒα（ＩＬ－６）、ＩＬ－３６Ｒ、ＴＮＦＲ１（ＴＮＦ－α）、ＴＧＦβＲ１／ＴＧＦβＲ２（ＴＧＦ－β）、ＩＦＮＧＲ（ＩＦＮ－γ）、インターフェロン－α／β受容体、ＩＬ－８Ｒ（ＣＸＣＲ１及びＣＸＣＲ２型とも称される、ＩＬ－８ＲＡ及びＩＬ－８ＲＢ型を含む）（ＩＬ－８／ＣＸＣＬ８）、ＩＬ－１２Ｒ（ＩＬ－１２）、ＧＭ－ＣＳＦＲ（ＧＭ－ＣＳＦ）、ＩＬ－１５Ｒ（ＩＬ－１５）、ＣＣＲ２（ＣＣＬ２）、及びＣＣＲ４（ＣＣＬ２）が挙げられる。

【0145】

さまざまな実施形態において、炎症性シグナル阻害剤は、炎症促進性シグナル伝達剤が炎症促進性シグナル伝達受容体に結合することができないように、炎症促進性シグナル伝達剤に結合するかまたはこれを修飾する薬剤であり得る。さまざまな実施形態において、炎症性シグナル阻害剤は、炎症促進性シグナル伝達剤が、例えば、遮断剤を限定することなく含む阻害剤に曝露されていない参照炎症促進性シグナル伝達剤と比較して、低減された親和性、アビディティーまたは頻度で炎症促進性シグナル伝達受容体に結合するように、炎症促進性シグナル伝達剤に結合するかまたはこれを修飾する薬剤であり得る。さまざまな実施形態において、炎症性シグナル阻害剤は、炎症促進性シグナル伝達剤が、例えば、阻害剤に曝露されていない参照炎症促進性シグナル伝達剤と比較して、減少された半減期を有するように、炎症促進性シグナル伝達剤に結合するかまたはこれを修飾する薬剤であり得る。さまざまな実施形態において、炎症促進性シグナル伝達剤の阻害剤である薬剤は、炎症促進性シグナル伝達剤のアンタゴニストと称することができる。したがって、例えば、受容体の阻害剤は、受容体アンタゴニストと称することができる（例えば、アナキンラは、例示的なＩＬ－１受容体アンタゴニストである）。

【0146】

さまざまな実施形態において、炎症性シグナル阻害剤は、炎症促進性シグナル伝達受容体が炎症促進性シグナル伝達剤に結合することができないように、炎症促進性シグナル伝達受容体に結合するかまたはこれを修飾する薬剤であり得る。さまざまな実施形態において、炎症性シグナル阻害剤は、炎症促進性シグナル伝達受容体が、例えば、遮断剤を限定することなく含む阻害剤に曝露されていない参照炎症促進性シグナル伝達受容体と比較して、低減された親和性、アビディティーまたは頻度で炎症促進性シグナル伝達剤に結合するように、炎症促進性シグナル伝達受容体に結合するかまたはこれを修飾する薬剤であり得る。さまざまな実施形態において、炎症性シグナル阻害剤は、炎症促進性シグナル伝達受容体が、例えば、阻害剤に曝露されていない参照炎症促進性シグナル伝達受容体と比較して、減少された半減期を有するように、炎症促進性シグナル伝達受容体に結合するかまたはこれを修飾する薬剤であり得る。さまざまな実施形態において、炎症促進性シグナル伝達受容体の阻害剤である薬剤は、炎症促進性シグナル伝達受容体のアンタゴニストと称することができる。

【0147】

さまざまな実施形態において、炎症促進性シグナル伝達受容体のリン酸化が、炎症を引き起こすか、または炎症と正に関連する場合、対象への炎症性シグナル阻害剤の送達は、炎症性シグナル阻害剤に曝露されない参照と比較して、対象における炎症促進性シグナル伝達受容体のリン酸化低減を引き起こす。さまざまな実施形態において、炎症促進性シグナル伝達受容体の脱リン酸化が、炎症を引き起こすか、または炎症と正に関連する場合、対象への炎症性シグナル阻害剤の送達は、炎症性シグナル阻害剤に曝露されない参照と比較して、対象における炎症促進性シグナル伝達受容体の脱リン酸化低減を引き起こす。

【0148】

さまざまな実施形態において、対象への炎症性シグナル阻害剤の送達は、炎症性シグナル阻害剤に曝露されない参照と比較して、炎症低減を引き起こす。さまざまな実施形態において、対象への炎症性シグナル阻害剤の送達は、炎症性シグナル阻害剤に曝露されない参照と比較して、炎症を指し示すバイオマーカーの低減を引き起こす。さまざまな実施形態において、炎症を指し示すバイオマーカーは、免疫活性化を指し示すサイトカイン、ならびに／またはＩＬ－Ιβ、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－２３、ＩＬ－２７、ＩＬ－３０、ＩＬ－３６、ＩＬ－１Ｒａ、ＩＬ－２Ｒ、ＩＦＮ－ａ、ＩＦＮ－ｂ、ＩＦＮ－γ、ＭＩＰ－Ｉａ、ΜΙΡ－Ιβ、ＭＣＰ－１、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＶＥＧＦ、ＲＡＮＴＥＳ、ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＦＧＦ－β、ＣＤ４０、及びＣＤ４０Ｌのうちの１つまたは複数のいずれかであり得る。他の例示的なバイオマーカーは、インビボ遺伝子治療レジメン（regiment）において対象に投与されたベクターに対する中和抗体などの、対象に投与された薬剤に対する抗体の濃度または量の尺度を含むことができる。

【0149】

いくつかの実施形態では、炎症性シグナル阻害剤は、タンパク質、例えば、炎症促進性シグナル伝達剤または炎症促進性シグナル伝達受容体に結合するタンパク質であり得る。さまざまな実施形態において、炎症性シグナル阻害剤は、抗体、例えば、炎症促進性シグナル伝達剤または炎症促進性シグナル伝達受容体に結合する抗体または抗体断片であり得る。さまざまな実施形態において、炎症性シグナル阻害剤は、炎症促進性シグナル伝達剤または炎症促進性シグナル伝達受容体の小分子阻害剤など、タンパク質性でない分子であり得る。

【0150】

炎症性シグナル阻害剤のいくつかの非限定的な例を提供するために、さまざまな実施形態において、炎症性シグナル阻害剤は、抗ＩＬ－８／ＣＤＣＬ８抗体または抗ＣＣＬ２抗体であり得る。

【0151】

いくつかの実施形態では、炎症性シグナル阻害剤は、イノシン５’一リン酸デヒドロゲナーゼの阻害剤、例えば、ミコフェノール酸（ＭＰＡ）である。ＭＰＡを対象に送達する例示的な炎症性シグナル阻害剤は、ＭＰＡのプロドラッグであるミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）である。

【0152】

当業者であれば、炎症性シグナル阻害剤が、他に特に指定のない限り、本開示において提供される１つまたは複数の他のクラスの薬剤を含むことができることを理解するであろう。当業者であれば、本明細書で使用される場合、炎症性シグナル伝達の低減が、炎症の低減または処置、例えば、対象における炎症の臨床的に関連性がある低減または処置を含み、これを包含し、これを暗示し、及び／またはこれと互換的であることが理解されることを認めるであろう。

【0153】

対象における炎症を測定する方法は、当業者にとって公知である。例えば、さまざまなバイオマーカーを使用して、試料、対象もしくは状態における炎症または試料間、対象間もしくは状態間の炎症を定量的に測定する、定性的に測定する、定量的に比較する、または定性的に比較することができる。例示的なバイオマーカーは、Ｃ反応性タンパク質（ｈｓ－ＣＲＰ）、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－２３、ＩＬ－２７、ＩＬ－３０、ＩＬ－３６、ＩＬ－１Ｒａ、ＩＬ－２Ｒ、ＩＦＮ－ａ、ＩＦＮ－ｂ、ＩＦＮ－γ、ＭＩＰ－Ｉａ、ΜΙΡ－Ιβ、ＭＣＰ－１、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＶＥＧＦ、ＲＡＮＴＥＳ、ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＦＧＦ－β、ＣＤ４０、及びＣＤ４０Ｌのうちの１つまたは複数のいずれかを限定することなく含む。他の例示的なバイオマーカーは、インビボ遺伝子治療レジメン（regiment）において対象に投与されたベクターに対する中和抗体などの、対象に投与された薬剤に対する抗体の濃度または量の尺度を含むことができる。

【0154】

ＩＬ－１シグナル阻害剤。さまざまな実施形態において、炎症性シグナル阻害剤は、炎症促進性シグナル伝達剤ＩＬ－１β及び／もしくはＩＬ－１αまたは炎症促進性シグナル伝達受容体ＩＬ－１Ｒの阻害剤である薬剤であり得、この場合、そのような炎症性シグナル阻害剤は累積的に、ＩＬ－１シグナル阻害剤と称することができる。さまざまな実施形態において、ＩＬ－１シグナル阻害剤は、ＩＬ－１ＲによるＩＬ－１β及び／またはＩＬ－１αの結合を競合的に阻害する薬剤であり得る。例えば、カナキヌマブ（ＡＣＺ８８５）は、ＩＬ－１ＲによるＩＬ－１βの結合を阻害し、したがって、炎症性シグナル伝達を低減させる、ヒト抗ＩＬ－１βモノクローナル抗体である。

【0155】

炎症性シグナル阻害剤の別の例は、ＩＬ－１シグナル阻害剤リロナセプトである。リロナセプトは、（ｉ）ヒトＩＬ－１受容体（ＩＬ－１Ｒ１）の細胞外部分、及び（ｉｉ）ＩＬ－１受容体アクセサリータンパク質（ＩＬ－１ＲＡｃＰ）のリガンド結合ドメインを含む可溶性薬剤であり、このリガンド結合ドメインは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に連結されている。リロナセプトは、デコイ受容体として作用することができ、及び／またはＩＬ－１活性化をアンタゴナイズすることができる。

【0156】

炎症性シグナル阻害剤の別の例は、ＩＬ－１β及び／またはＩＬ－１αに結合するが、炎症促進性シグナルを伝達しないように操作された、ＩＬ－１受容体（ＩＬ－１Ｒ）薬剤であるＩＬ－１シグナル阻害剤である。ＩＬ－１β及び／またはＩＬ－１αに結合するが、炎症促進性シグナルを伝達しない、操作されたＩＬ－１Ｒ薬剤は、ＩＬ－１Ｒアンタゴニストと称することができる。炎症性シグナル阻害剤の別の例は、ＩＬ－１Ｒに結合し、ＩＬ－１β及び／またはＩＬ－１αによるＩＬ－１Ｒの結合を遮断するが、炎症促進性シグナルを伝達しないように操作された、ＩＬ－１Ｒａ薬剤であるＩＬ－１シグナル阻害剤である。アナキンラは、ＩＬ－１Ｒに競合的に結合することにより、ヒトにおけるＩＬ－１β及び／またはＩＬ－１αによるＩＬ－１Ｒを介したシグナル伝達を阻害する、操作されたヒトＩＬ－１受容体アンタゴニスト（ＩＬ－１Ｒａ）薬剤である。アナキンラは、配列番号１に示す通り、典型的なヒトＩＬ－１Ｒａアミノ酸配列に類似しているが、少なくとも、そのアミノ末端にメチオニン残基を含むという点において典型的なヒトＩＬ－１Ｒａアミノ酸配列とは異なる、アミノ酸配列を有する。加えて、アナキンラは、配列番号１をコードする核酸配列の発現によってＥ．ｃｏｌｉから典型的に産生される組換えタンパク質であり、グリコシル化されていない。

【0157】

配列番号１（１５３ａａ；アナキンラ）
ＭＲＰＳＧＲＫＳＳＫＭＱＡＦＲＩＷＤＶＮＱＫＴＦＹＬＲＮＮＱＬＶＡＧＹＬＱＧＰＮＶＮＬＥＥＫＩＤＶＶＰＩＥＰＨＡＬＦＬＧＩＨＧＧＫＭＣＬＳＣＶＫＳＧＤＥＴＲＬＱＬＥＡＶＮＩＴＤＬＳＥＮＲＫＱＤＫＲＦＡＦＩＲＳＤＳＧＰＴＴＳＦＥＳＡＡＣＰＧＷＦＬＣＴＡＭＥＡＤＱＰＶＳＬＴＮＭＰＤＥＧＶＭＶＴＫＦＹＦＱＥＤＥ

【0158】

さまざまな実施形態において、本開示の炎症性シグナル阻害剤は、配列番号１との配列同一性％が少なくとも８０％、例えば、配列番号１との同一性％が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％である分子である。さまざまな実施形態において、本開示の炎症性シグナル阻害剤は、配列番号１のアミノ酸２～１５３との配列同一性％が少なくとも８０％、例えば、配列番号１のアミノ酸２～１５３との同一性％が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％である分子である。さまざまな実施形態において、配列番号１との配列同一性％が少なくとも８０％である炎症性シグナル阻害剤は、アミノ末端メチオニン残基を含む。

【0159】

ＩＬ－６シグナル阻害剤。さまざまな実施形態において、炎症性シグナル阻害剤は、炎症促進性シグナル伝達剤ＩＬ－６または炎症促進性シグナル伝達受容体ＩＬ－６Ｒの阻害剤である薬剤であり得、この場合、そのような炎症性シグナル阻害剤は累積的に、ＩＬ－６シグナル阻害剤と称することができる。さまざまな実施形態において、ＩＬ－６シグナル阻害剤は、ＩＬ－６ＲによるＩＬ－６の結合を競合的に阻害する薬剤であり得る。例示的なＩＬ－６シグナル阻害剤は、バゼドキシフェン、ラロキシフェン、サリルマブ、及びトシリズマブを含む。

【0160】

バゼドキシフェンは、シグナル伝達能力があるＩＬ－６受容体複合体の形成に干渉することが理解される、ＩＬ－６シグナル伝達の小分子阻害剤である。ＩＬ－６及びＩＬ－６Ｒαは、バイナリ複合体を形成し、これは、ＧＰ１３０とさらに複合体形成し、２個のそのような三元複合体のヘテロ二量体化は、炎症促進性シグナルを含むシグナルを伝達することができる。バゼドキシフェンは、ＩＬ－６／ＧＰ１３０相互作用の阻害剤であり、したがって、ＩＬ－６シグナルの伝達を阻害することができる。

【0161】

ラロキシフェンは、シグナル伝達能力があるＩＬ－６受容体複合体の形成に干渉することが理解される、ＩＬ－６シグナル伝達の小分子阻害剤である。ラロキシフェンは、ＩＬ－６／ＧＰ１３０相互作用の阻害剤であり、したがって、ＩＬ－６シグナルの伝達を阻害することができる。

【0162】

サリルマブは、ＩＬ－６受容体に結合しこれを遮断することによりインターロイキン－６（ＩＬ－６）経路を阻害する、完全ヒトモノクローナル抗体である。サリルマブは、ＩＬ－６受容体（可溶型及び膜結合型の両方；ｓＩＬ－６Ｒ及びｍＩＬ－６Ｒ）に結合し、これにより、ＩＬ－６介在性シグナルの伝達を阻害する。

【0163】

トシリズマブは、ＩＬ－６Ｒの８０ｋＤ構成成分に対し高い親和性でＩＬ－６受容体に結合するヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体である。この結合はその後、膜結合ｇｐ１３０とＩＬ－６／ＩＬ－６Ｒ複合体の二量体化を阻害し、シグナル伝達を防止する。これにより、トシリズマブは、ＩＬ－６介在性シグナルの伝達を阻害する。

【0164】

コルチコステロイド。１つまたは複数のコルチコステロイドが、本開示の免疫抑制レジメンに含まれてもよい。コルチコステロイドは、ホルモンコルチゾールとの構造的類似性を有する抗炎症剤である。コルチゾン及びヒドロコルチゾンは、ヒト副腎皮質によって天然に産生されるコルチコステロイド薬剤、またはその合成により産生されるアナログを指すことができる。コルチコステロイドの例としては、ベタメタゾン（bethamethasone）、プレドニゾン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、メチルプレドニゾロン、パラメタゾン、デキサメタゾン、エタメタソネブ（ethamethasoneb）、フルドロコルチゾン、及びブデソニドも挙げられる。当業者であれば、これらがコルチコステロイドの代表例であり、コルチコステロイドの多くの例が、当該技術分野で周知であることを理解するであろう。いくつかの実施形態では、コルチコステロイドは、グルココルチコイドである。いくつかの実施形態では、コルチコステロイドは、ミネラルコルチコイドである。ある特定の実施形態では、コルチコステロイドは、デキサメタゾンである。

【0165】

カルシニューリン阻害剤。ホスファターゼカルシニューリンの阻害剤は、例えば、リンパ球増殖を減少させることにより、免疫毒性を抑制することができる。例示的なカルシニューリン阻害剤は、タクロリムス及びシクロスポリン（ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ）（あるいは、ｃｉｃｌｏｓｐｏｒｉｎまたはｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎと綴る）である。カルシニューリン阻害剤は、同種移植片拒絶を処置または低減させるために、臓器移植において免疫抑制性薬剤として使用されている。シクロスポリンは、環状ウンデカペプチド（endecapeptide）であり、一方、タクロリムスは、大環状ラクトンである。

【0166】

ＴＮＦ－αシグナル阻害剤。さまざまな実施形態において、炎症性シグナル阻害剤は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）－αのアンタゴニストであり、及び／またはＴＮＦ－αシグナル伝達の阻害剤である薬剤であり得る。ＴＮＦは、炎症及び免疫応答に関与することができ、ＴＮＦ受容体１（ＴＮＦＲ１）またはＴＮＦ受容体２（ＴＮＦＲ２）に結合することができる。その受容体のうちの少なくともいくつかに結合すると、ＴＮＦは、多数の炎症性サイトカインの産生を増加させることができる、ＮＦｋＢ及びＭＡＰＫ経路を含む経路を誘発することができる。ある特定のＴＮＦ－αシグナル阻害剤は、サイトカインＴＮＦに直接的に結合し、ＴＮＦ受容体とのＴＮＦの相互作用を阻害する。

【0167】

ＴＮＦ－αシグナル阻害剤は、エタネルセプト、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、及びゴリムマブを含む。エタネルセプトは、２個のＴＮＦＲ２受容体細胞外ドメイン及びヒトＩｇＧ１のＦｃ断片の融合タンパク質である。エタネルセプトは、ＴＮＦＲへのＴＮＦ－α及び／またはＴＮＦ－βの結合を阻害することができる。インフリキシマブは、可溶型及び膜貫通型のＴＮＦ－αに結合し、ＴＮＦＲへのＴＮＦ－αの結合を阻害するキメラモノクローナル抗体である。アダリムマブ及びゴリムマブは、ＴＮＦ－αに対する完全ヒトモノクローナル抗体であり、インフリキシマブと同様に、ＴＮＦ－αに結合し、及び／またはＴＮＦＲへのＴＮＦ－αの結合を阻害する。セルトリズマブは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）にコンジュゲートされたヒト化Ｆａｂ断片である。

【0168】

ＪＡＫシグナル阻害剤。さまざまな実施形態において、炎症性シグナル阻害剤は、ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）のアンタゴニストであり、及び／またはＪＡＫシグナル伝達の阻害剤である薬剤であり得る。ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、及びＴＹＫ２を含むＪＡＫは、炎症性機能を含むサイトカイン機能に関連する細胞質チロシンキナーゼである。ＪＡＫは、例えば、シグナル伝達因子及び転写活性化因子（ＳＴＡＴ）などの分子の自己リン酸化及び／またはトランスリン酸化により、シグナルの伝達を媒介する。

【0169】

１つまたは複数のＪＡＫのシグナル伝達を阻害する２０種を超える阻害剤が、当該技術分野で公知である。すべてのＪＡＫ阻害剤が、ＪＡＫの同じサブセットをアンタゴナイズするとは限らない。例えば、限定することなく、本開示のいくつかのＪＡＫシグナル阻害剤は、ＪＡＫ１／２シグナル阻害剤である。例示的なＪＡＫ阻害剤は、バリシチニブ（ＪＡＫ１及びＪＡＫ２を阻害する）、トファシチニブ（ＪＡＫ３、ＪＡＫ１、及びより少ない程度だがＪＡＫ２を阻害する）、ルキソリチニブ（ＪＡＫ１及びＪＡＫ２を阻害する）、及びフィルゴチニブ（ＪＡＫ１を阻害する）を含む。追加的なＪＡＫシグナル阻害剤（例えば、ＪＡＫ１／２シグナル阻害剤）は、当該技術分野で公知である。少なくともいくつかのさらなるＪＡＫシグナル阻害剤は、ＪＡＫ阻害剤に関して参照により本明細書に組み込まれる、Fragoulis (2019 Rheumatology 58(Suppl 1): i43-i54)に提供されている。

【0170】

Ｔ細胞活性化における共刺激シグナル伝達の阻害剤。さまざまな実施形態において、Ｔ細胞活性化における共刺激シグナル伝達の阻害剤は、アバタセプトである。アバタセプトは、ヒト細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４の細胞外ドメイン、及びヒトＩｇＧ１のＦｃドメインの断片を含む組換え融合タンパク質である。アバタセプトは、少なくとも一部には、ＣＤ８０／ＣＤ８６への結合についてＣＤ２８と競合することにより作用し、完全なＴ細胞活性化に要求される第２の共刺激シグナルを調節する。アバタセプトは、少なくとも一部には、Ｔ細胞活性化のためのＣＤ８０／ＣＤ８６－ＣＤ２８共刺激シグナルを防止することにより作用する。
ウイルスベクター剤

【0171】

ウイルス遺伝子治療ベクター。本開示のウイルス遺伝子治療ベクターは、ウイルスベクターゲノムを含むビリオンを含み、このウイルスベクターゲノムは、外来性コード核酸配列を含むことができ、必要に応じて、外来性コード核酸配列は、治療ペイロード中に存在する。対象へのウイルス遺伝子治療ベクターの投与は、ウイルス遺伝子治療ベクターのウイルスベクターゲノムを、対象に、例えば、対象の１つまたは複数の細胞に送達することができる。さまざまな実施形態において、ウイルスベクターゲノムまたはその治療ペイロードは、対象の１つまたは複数の細胞において発現され、及び／または対象の１つまたは複数の細胞のゲノム中に取り込まれる、外来性コード核酸配列を含む。さまざまな実施形態において、外来性コード核酸配列は、対象の疾患、障害または状態の処置を含む、対象における所望の治療効果を達成することができるタンパク質などのタンパク質をコードする。さまざまな実施形態において、外来性コード核酸配列は、対象の疾患、障害または状態の処置を含む、対象における所望の治療効果を達成することができる低分子干渉ＲＮＡなどの低分子干渉ＲＮＡをコードし、必要に応じて、治療効果は、タンパク質の発現の阻害によって媒介される。さまざまな実施形態において、外来性コード核酸配列は、対象の疾患、障害または状態の処置を含む、対象における所望の治療効果を達成することができるｍｉＲＮＡなどのｍｉＲＮＡをコードし、必要に応じて、治療効果は、タンパク質の発現の阻害によって媒介される。さまざまな実施形態において、外来性コード核酸配列は、対象の疾患、障害または状態の処置を含む、対象における所望の治療効果を達成することができる長鎖非コードＲＮＡなどの長鎖非コードＲＮＡをコードし、必要に応じて、治療効果は、発現制御クロマチン効果によって媒介される。さまざまな実施形態において、外来性コード核酸配列は、対象の疾患、障害または状態の処置を含む、対象における所望の治療効果を達成することができるシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）などのｓｇＲＮＡをコードし、必要に応じて、治療効果は、少なくとも一部には、エンドヌクレアーゼ活性、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の活性によって媒介される。さまざまな実施形態において、外来性コード核酸配列は、対象の疾患、障害または状態の処置を含む、対象における所望の治療効果を達成することができるエンハンサーＲＮＡなどのエンハンサーＲＮＡをコードし、必要に応じて、治療効果は、遺伝子の発現増加によって媒介される。

【0172】

さまざまな実施形態において、ウイルスベクターゲノム及び／または治療ペイロードは、プロモーターまたは他の制御領域を含み、プロモーターまたは他の制御領域は、外来性コード核酸配列と作動可能に連結されている。さまざまな実施形態において、外来性コード核酸配列は、対象の疾患、障害または状態の処置を含む、対象における所望の治療効果を達成することができる、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａもしくはＣａｓ１４タンパク質を含むＩＩ型もしくはＶ型Ｃａｓタンパク質、またはＣａｓ１３などのＶＩ型Ｃａｓタンパク質）及びガイドＲＮＡ分子などのＣＲＩＳＰＲ系をコードする。さまざまな実施形態において、ウイルスベクターゲノム及び／または治療ペイロードは、１つまたは複数のプロモーターまたは他の制御領域を含み、プロモーター（複数可）または他の制御領域（複数可）は、外来性コード核酸配列と作動可能に連結されている。

【0173】

さまざまな実施形態において、外来性コード核酸配列またはこれを含む治療ペイロードは、例えば、造血幹細胞における、β－グロビン及び／もしくはγ－グロビンまたはそれらの機能的置換えの発現増加を引き起こす薬剤をコードすることができる。さまざまな実施形態において、外来性コード核酸配列またはこれを含む治療ペイロードは、造血幹細胞における第ＶＩＩＩ因子またはその機能的置換え（例えば、ＥＴ３）の発現増加を引き起こす薬剤をコードすることができる。さまざまな実施形態において、外来性コード核酸配列またはこれを含む治療ペイロードは、遺伝子編集、例えば、所望の遺伝的病変補正を達成することができる、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２ａタンパク質を含むＩＩ型またはＶ型Ｃａｓタンパク質）及びガイドＲＮＡ分子などのＣＲＩＳＰＲ系によって、鎌状赤血球貧血を引き起こす遺伝的病変の補正を引き起こす薬剤をコードすることができる。ウイルス遺伝子治療ベクターの例示的な適用は、例えば、特に、ウイルス遺伝子治療ベクター及びウイルス遺伝子治療の適用に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１９年７月２日出願の米国仮特許出願第６２／８６９，９０７号にさらに開示されている。

【0174】

下記の参考文献は、機能的グロビンアミノ酸配列、核酸配列、及び提供される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列の特定の例示的な配列を提供する。参考文献１～４は、α型グロビン配列に関し、参考文献４～１２は、β型グロビン配列に関する（β及びγグロビン配列を含む）：（１）ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｚ８４７２１（１９９７年３月１９日）；（２）ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿０００５１７（２０００年１０月３１日）；（３）Hardison et al., J. Mol. Biol. 222(2):233-249, 1991；（４）A Syllabus of Human Hemoglobin Variants (1996)（Titus et al.による）（The Sickle Cell Anemia Foundation in Augusta, GAによって公開）（globin.cse.psu.eduでオンライン入手可）；（５）ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｊ００１７９（１９９３年８月２６日）；（６）Tagle et al., Genomics 13(3):741-760, 1992；（７）Grovsfeld et al., Cell 51(6):975-985, 1987；（８）Li et al., Blood 93(7):2208-2216, 1999；（９）Gorman et al., J. Biol. Chem .275(46):35914-35919, 2000；（１０）Slightom et al., Cell 21(3):627-638, 1980；（１１）Fritsch et al., Cell 19(4): 959-972, 1980；（１２）Marotta et al., J. Biol. Chem. 252(14):5040-5053, 1977。グロビンをコードする遺伝子のコード領域及び非コード領域の追加の情報については、例えば、Ｍａｒｏｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９，１６５－１７５，１９７６、Ｌａｗｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ２１（３），６４７－６５１，１９８０、及びＳａｄｅｌａｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ．９２：６７２８－６７３２，１９９５を参照のこと。ヘモグロビンβサブユニットのアミノ酸配列の例は、例えば、ＮＣＢＩ受入番号Ｐ６８８７１にて提供されている。β－グロビンのアミノ酸配列の例は、例えば、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿０００５０９にて提供されている。本開示は、本明細書に提供されるグロビンタンパク質のアミノ酸配列とのアミノ酸同一性％が少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％であるバリアントを含む、本明細書に提供されるグロビンタンパク質のバリアントを含む。

【0175】

さまざまな実施形態において、外来性コード核酸配列またはこれを含む治療ペイロードは、γＣ、ＪＡＫ３、ＩＬ７ＲＡ、ＲＡＧ１、ＲＡＧ２、ＤＣＬＲＥ１Ｃ、ＰＲＫＤＣ、ＬＩＧ４、ＮＨＥＪ１、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｚ、ＣＤ３Ｇ、ＰＴＰＲＣ、ＺＡＰ７０、ＬＣＫ、ＡＫ２、ＡＤＡ、ＰＮＰ、ＷＨＮ、ＣＨＤ７、ＯＲＡＩ１、ＳＴＩＭ１、ＣＯＲＯ１Ａ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＭＲＰ、ＤＫＣ１、ＴＥＲＴ、ＴＩＮＦ２、ＤＣＬＲＥ１Ｂ、及びＳＬＣ４６Ａ１；ＦａｎｃＡ、ＦａｎｃＢ、ＦａｎｃＣ、ＦａｎｃＤ１（ＢＲＣＡ２）、ＦａｎｃＤ２、ＦａｎｃＥ、ＦａｎｃＦ、ＦａｎｃＧ、ＦａｎｃＩ、ＦａｎｃＪ（ＢＲＩＰ１）、ＦａｎｃＬ、ＦａｎｃＭ、ＦａｎｃＮ（ＰＡＬＢ２）、ＦａｎｃＯ（ＲＡＤ５１Ｃ）、ＦａｎｃＰ（ＳＬＸ４）、ＦａｎｃＱ（ＥＲＣＣ４）、ＦａｎｃＲ（ＲＡＤ５１）、ＦａｎｃＳ（ＢＲＣＡ１）、ＦａｎｃＴ（ＵＢＥ２Ｔ）、ＦａｎｃＵ（ＸＲＣＣ２）、ＦａｎｃＶ（ＭＡＤ２Ｌ２）、及びＦａｎｃＷ（ＲＦＷＤ３）を含むＦＡＮＣファミリー遺伝子；可溶性ＣＤ４０；ＣＴＬＡ；Ｆａｓ Ｌ；ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ５２などに対する抗体；ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ６に対する抗体；自己反応性Ｔ細胞上に特異的に存在するＴＣＲに対する抗体；ＩＬ４；ＩＬ１０；ＩＬ１２；ＩＬ１３；ＩＬ１Ｒａ、ｓＩＬ１ＲＩ、ｓＩＬ１ＲＩＩ；ｓＴＮＦＲＩ；ｓＴＮＦＲＩＩ；ＴＮＦに対する抗体；Ｐ５３、ＰＴＰＮ２２、及びＤＲＢ１＊１５０１／ＤＱＢ１＊０６０２；グロビンファミリー遺伝子；ＷＡＳ；ｐｈｏｘ；ジストロフィン；ピルビン酸キナーゼ；ＣＬＮ３；ＡＢＣＤ１；アリールスルファターゼＡ；ＳＦＴＰＢ；ＳＦＴＰＣ；ＮＬＸ２．１；ＡＢＣＡ３；ＧＡＴＡ１；リボソームタンパク質遺伝子；ＴＥＲＴ；ＴＥＲＣ；ＤＫＣ１；ＴＩＮＦ２；ＣＦＴＲ；ＬＲＲＫ２；ＰＡＲＫ２；ＰＡＲＫ７；ＰＩＮＫ１；ＳＮＣＡ；ＰＳＥＮ１；ＰＳＥＮ２；ＡＰＰ；ＳＯＤ１；ＴＤＰ４３；ＦＵＳ；ユビキリン（ubiquilin）２；ならびにＣ９ＯＲＦ７２から選択されるタンパク質をコードすることができる。

【0176】

さまざまな実施形態において、外来性コード核酸配列に作動可能に連結したプロモーター及び／または他の制御領域（複数可）を含む治療ペイロード、ならびにウイルス遺伝子治療は、外来性コード核酸配列が染色体外で発現されるように、患者に治療ペイロードを送達する。さまざまな実施形態において、外来性コード核酸配列に作動可能に連結したプロモーター及び／または他の制御領域（複数可）を含む治療ペイロード、ならびにウイルス遺伝子治療は、治療ペイロードが標的細胞のゲノム中に組み込まれるように、患者に治療ペイロードを送達する。

【0177】

ヒトウイルス遺伝子治療を含むウイルス遺伝子治療のためのさまざまなベクターは、当該技術分野で公知である。例示的なベクターは、アデノウイルス（Ａｄ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、単純ヘルペスウイルス（例えば、ＨＳＶ、ＨＳＶ１）、レトロウイルス（例えば、ＭＬＶ、ＭＭＳＶ、ＭＳＣＶ）、レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２）、アルファウイルス（例えば、ＳＦＶ、ＳＩＮ、ＶＥＥ、Ｍ１）、フラビウイルス（例えば、クンジン、ウエストナイル、デングウイルス）、ラブドウイルス（例えば、狂犬病、ＶＳＶ）、麻疹ウイルス（例えば、ＭＶ－Ｅｄｍ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、ポックスウイルス、及びピコルナウイルス（例えば、コクサッキーウイルス）を含む。

【0178】

アデノウイルス遺伝子治療ベクターは、当該技術分野で公知のさまざまな血清型のいずれかのものであり得る。アデノウイルス遺伝子治療ベクターの例としては、ＣＤ４６を標的とするアデノウイルスベクターが挙げられる。アデノウイルス遺伝子治療ベクターの例としては、Ａｄ５及びＡｄ３５が挙げられる。アデノウイルス遺伝子治療ベクターは、Ａｄ５／３５などの偽型アデノウイルスベクターであってもよい。アデノウイルス遺伝子治療ベクターは、ＣＤ４６への結合が増強されたベクター、例えば、Ａｄ３５^＋＋またはＡｄ５／３５^＋＋アデノウイルスベクターであり得る。アデノウイルス遺伝子治療ベクターの例としては、アデノウイルス遺伝子治療ベクターに関して参照により本明細書に組み込まれる、２０１９年７月２日出願の米国出願第６２／８６９，９０７号、及び２０２０年７月２日出願の国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０４０７５６号にさらに開示されている。

【0179】

ＡＡＶ遺伝子治療ベクターは、当該技術分野で公知のさまざまな血清型のいずれかのものであり得る。場合によっては、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９から選択される。ある特定の場合では、ベクターが、ヒト細胞に感染することができる偽型ベクター、例えば、ＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／２、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／７、ＡＡＶ２／８、及びＡＡＶ２／９から選択される偽型ベクターであるという点において、ＡＡＶ遺伝子治療ベクターは、偽型ＡＡＶベクターであってもよい。

【0180】

さまざまな実施形態において、ウイルス遺伝子治療ベクターは、ヘルパー依存型（ＨＤ）ウイルス遺伝子治療ベクターである。当該技術分野で周知の通り、天然ウイルスのゲノムに基づく遺伝子治療に適したウイルスベクターを操作する手段の１つは、複製欠損ウイルスを産生することである。複製欠損ウイルスは、対象に感染することができるが、その毒性は、自身が複製できないことによって限定され、対象における使用に特に適したものとなる。ウイルスベクターが対象に投与される場合、ウイルスベクター複製は望ましくない可能性があるが、複製は、治療的に有用な量のウイルスベクターの生成に要求されることがある。解決策の１つは、ＨＤウイルス遺伝子治療ベクターまたはウイルスベクター治療のレシピエントのゲノムによってコードされないある特定のタンパク質の存在下でしか複製することができない、ＨＤウイルス遺伝子治療ベクターの使用である。その代わりに、ＨＤウイルス遺伝子治療ベクターの複製に要求される追加的なタンパク質は、ヘルパーウイルス、プラスミド、または他のヘルパー核酸からの発現によって提供される。パッケージングの方向付けの原因となるウイルスゲノムの領域（複数可）は、パッケージング配列もしくはシグナル（ψ）またはカプシド形成配列（Ｅ）と称することができる。ヘルパーゲノム、プラスミド、または他のヘルパー核酸は、パッケージングシグナルを含まないため、または条件的なパッケージングシグナルを含むため、ヘルパーは、ビリオン内にパッケージングされない。しかし、機能的なパッケージングシグナルを含むＨＤウイルスベクターゲノムは、ＨＤウイルス遺伝子治療ベクター内にパッケージングされる。したがって、ヘルパーを使用して、追加的なタンパク質は、第１の文脈における（例えば、インビトロでの、例えば、細胞培養における）ＨＤウイルス遺伝子治療ベクターの産生のために提供することができるが、ＨＤウイルス遺伝子治療ベクター産物が対象に投与される場合には提供されない。

【0181】

ヘルパー依存型アデノウイルス（ＨＤＡｄ）ベクターは、ＨＤウイルス遺伝子治療ベクターの例である。いくつかのＨＤＡｄベクター系では、１つのウイルスゲノム（ヘルパー）が複製に必要なタンパク質をすべてコードするが、パッケージング配列が条件的不完全化するものであり、これによって自体がビリオンにパッケージングされる可能性が低減されている。第２のウイルスゲノムは、ウイルス逆位末端反復配列（ＩＴＲ）、治療ペイロード、及び正常パッケージング配列のみを含み、この正常パッケージング配列によって、この第２のウイルスゲノムをＨＤＡｄウイルスベクターへと選択的にパッケージングし、産生細胞から単離することが可能になる。ＨＤＡｄウイルスベクターは、物理的手段によってヘルパーベクターからさらに精製され得る。一般に、ＨＤＡｄウイルスベクター及びＨＤＡｄウイルスベクター製剤にはヘルパーベクター及び／またはヘルパーゲノムがいくらか混入し得るが、こうした混入は許容され得る。

【0182】

いくつかのＨＤＡｄベクター系では、ヘルパーゲノムにおいてＣｒｅ／ｌｏｘＰ系が利用される。ある特定のそのようなＨＤＡｄベクター系では、ＨＤＡｄウイルス遺伝子治療ベクターゲノムは、ベクターゲノム複製に必要なアデノウイルスＩＴＲと、カプシドへのベクターゲノムのカプシド形成に必要なパッケージング配列であるψと、を含む５００ｂｐの非コードアデノウイルスＤＮＡを含む。ＨＤＡｄウイルス遺伝子治療ベクターゲノムは、その全長が約２７．７ｋｂ～約３７ｋｂである場合に最も効率的にパッケージングされ得ることも観察されており、この全長は、例えば、治療ペイロード及び／または「スタッファー」配列から構成され得る。ＨＤＡｄウイルス遺伝子治療ベクターゲノムは、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現する２９３細胞などの細胞に送達することができ、この場合、必要に応じて、ＨＤＡｄウイルス遺伝子治療ベクターゲノムは、細菌プラスミド形態などの非ウイルスベクター形態で細胞に送達される（例えば、ＨＤＡｄウイルス遺伝子治療ベクターゲノムは、細菌プラスミド（ｐＨＤＡｄ）として構築され、制限酵素消化によって遊離される）。同じ細胞を、ｌｏｘＰ部位によって隣接されたパッケージング配列を有するＥ１欠失型アデノウイルスベクターを含むことができるヘルパーゲノムで形質導入することができ、これにより、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現する２９３細胞の感染後に、パッケージング配列が、ｌｏｘＰ部位間でのＣｒｅ介在性の部位特異的組換えによってヘルパーゲノムから切除される。したがって、ＨＤＡｄウイルス遺伝子治療ベクターゲノムを、Ｃｒｅを発現し、ｌｏｘＰ部位によって隣接されたパッケージングシグナル（ψ）を有するヘルパーゲノムまたはベクターで形質導入またはトランスフェクトされた２９３細胞にトランスフェクトすることができ、その結果、ψのＣｒｅ介在性の切除によってヘルパーウイルスゲノムは被パッケージング能力を有さなくなるが、依然として、ＨＤＡｄの増殖に必要なトランス作用性因子のすべてを提供することができる。パッケージング配列の切除後に、ヘルパーゲノムは被パッケージング能力を有さないが、依然としてＤＮＡ複製を受けることができるため、ＨＤＡｄウイルス遺伝子治療ベクターゲノムの複製及びカプシド形成をトランスで補完する（trans-complement）ことができる。いくつかの実施形態では、２９３細胞内に存在するヘルパーゲノムとＨＤＡｄウイルス遺伝子治療ベクターゲノムとの間の相同組換えの結果として、複製能力があるＡｄ（ＲＣＡ；Ｅ１^＋）の生成を防止するために、「スタッファー」配列をＥ３領域に挿入して、いかなるＥ１^＋組換え体も、パッケージングされるには大きすぎるものにすることができる。ＦＬＰ（例えば、ＦＬＰｅ）／ｆｒｔ部位特異的組換えを使用することで、類似のＨＤＡｄ産生系が開発されており、それによると、ヘルパーゲノムのパッケージングシグナルに隣接するｆｒｔ部位間のＦＬＰ介在性の組換えが生じることで、ＦＬＰ（例えば、ＦＬＰｅ）を発現する２９３細胞におけるヘルパーゲノムのカプシド形成に対する選択が生じる。ヘルパーベクターに対して選択するための代替戦略が開発されている。

【0183】

ウイルス遺伝子治療選択可能マーカー。さまざまな実施形態において、ウイルス遺伝子治療ベクターは、例えば、治療ペイロードに選択可能マーカーを含むウイルス遺伝子治療ベクターゲノムを含む。ウイルス遺伝子治療と組み合わせた選択可能マーカーの使用によって、ウイルス遺伝子治療ベクターで形質導入されており、及び／または遺伝子治療ベクターのゲノムによってコードされる少なくとも１つの選択可能マーカーを発現し、及び／または遺伝子治療ベクターのゲノムの治療ペイロードが宿主細胞のゲノムに組み込まれている、宿主細胞の選択が可能となり、この場合、治療ペイロードは、選択可能マーカーをコードする核酸を含む。

【0184】

さまざまな実施形態において、ウイルス遺伝子治療ベクターゲノムは、対象におけるインビボ選択に適した選択可能マーカーを含む。選択は、対象における宿主細胞の集団を、例えば、標的細胞集団の少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％まで増加させることができる。インビボ選択可能マーカーとしての薬物耐性遺伝子を含むことは、グラフトにおける改変されていない細胞に対し毒性がある薬物への曝露後の、遺伝子改変されたＨＳＣの生着を増加させることができる。そのようなインビボ選択可能マーカーは、多剤耐性（ＭＤＲ－１）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、及びＯ^６－メチルグアニン－ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）の遺伝子を含む。単なる一例を挙げると、ＭＧＭＴ^{Ｐ１４０Ｋ}選択可能マーカーを含むウイルス遺伝子治療ベクターによるウイルスベクター遺伝子治療は、Ｏ^６－ベンジルグアニン（Ｏ^６ＢＧ）及び１，３－ビス（２－クロロエチル）－１－ニトロソ尿素（ＢＣＮＵ）（Ｏ^６ＢＧ／ＢＣＮＵ）、またはテモゾロミド（tremozolomide）の投与後に、マークされた宿主細胞の増加を実証する。

【0185】

さまざまな実施形態において、ＭＧＭＴ^{Ｐ１４０Ｋ}選択可能マーカーを含むウイルス遺伝子治療ベクターと組み合わせたＯ^６ＢＧなどの選択剤は、例えば、ウイルス遺伝子治療ベクターの対象への投与後に、対象に投与することができる。さまざまな実施形態において、選択剤は、対象へのウイルス遺伝子治療ベクターの投与から、例えば、対象へのウイルス遺伝子治療ベクターの第１の用量の投与から、または対象へのウイルス遺伝子治療ベクターの最後の用量の投与から、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、または約１５週間後のうちの１つまたは複数のいずれかに、対象に投与することができる。

【0186】

さまざまな実施形態において、造血幹細胞などの標的細胞集団のマーク（形質導入）が、１０％未満、２０％未満、３０％未満、４０％未満、５０％未満、６０％未満、７０％未満、７５％未満、８０％未満、８５％未満、９０％未満、９５％未満、または１００％未満である場合、選択剤が対象に投与される。さまざまな実施形態において、造血幹細胞などの標的細胞集団のマークが、１０％超、２０％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、または１００％超の場合、選択剤は対象に投与されず、及び／または選択剤の投与は中断される。さまざまな実施形態において、マークされた造血幹細胞のパーセンテージの数字は、骨髄吸引液におけるマークされたＣＤ３４^＋細胞の分率に対して決定される。

【0187】

少なくとも、上述または本明細書の他の箇所に示すウイルス遺伝子治療ベクターの型のいずれかの対象への投与を含む、対象へのウイルス遺伝子治療ベクターの投与は、免疫毒性を引き起こすことができるため、当業者であれば、本明細書に開示されている免疫抑制レジメンが、対象に投与されるウイルス遺伝子治療ベクターの型に関係なく、一般にインビボ遺伝子治療の方法における使用に適用可能であることを認めるであろう。

【0188】

サポートベクター。ウイルス遺伝子治療ベクターは、宿主細胞ゲノムへの組み込みにトランスポゼースを必要とせず、単一のウイルスベクターゲノムに、標的細胞における外来性コード核酸配列の組み込み及び／もしくは発現に対する所望の、必要な及び／もしくは十分なすべての配列を含むベクターであり得る（「自給自足型（self-sufficient）ウイルス遺伝子治療ベクター」）、または単一のウイルスベクターゲノムに、標的細胞における外来性コード核酸配列の組み込み及び／もしくは発現に対する所望の、必要な及び／または十分なすべての配列を含まないベクターであり得る（「サポートを受けるウイルス遺伝子治療ベクター」）。さまざまな場合では、サポートを受けるウイルス遺伝子治療ベクターは、標的細胞におけるサポートを受けるウイルス遺伝子治療ベクターのウイルスベクターゲノムの外来性コード核酸配列の組み込み及び／または発現を容易にする薬剤をコード及び／または発現するサポートベクターと組み合わせて、対象に投与される。

【0189】

いくつかの実施形態では、サポートを受けるウイルス遺伝子治療ベクターは、標的細胞ゲノムへのウイルスベクターゲノムの外来性コード核酸配列の組み込みに必要な少なくとも１つの薬剤を含まないウイルスベクターゲノムを有するウイルス遺伝子治療ベクターである。非限定的な一例を挙げると、いくつかの実施形態では、サポートを受けるウイルス遺伝子治療ベクターのウイルスベクターゲノムは、治療ペイロードを含み、対応するトランスポゼースの存在が、宿主細胞ゲノムへの治療ペイロードの組み込みを媒介することができるように、外来性コード核酸コード配列を含む核酸は、トランスポゼース逆方向反復配列によって隣接される。しかし、ある特定のそのような実施形態では、サポートを受けるウイルス遺伝子治療ベクターのウイルスベクターゲノムは、トランスポゼースをコードせず、トランスポゼース（transpose）は、宿主細胞において操作を行わなければまたは天然には存在しない。ある特定のそのような実施形態では、サポートを受けるウイルス遺伝子治療ベクターと組み合わせて対象に投与されるサポートベクターは、宿主細胞ゲノムへの治療ペイロードの組み込みを引き起こすことができる対応するトランスポゼースをコードするウイルスベクターゲノムを含むことができる。

【0190】

ある特定の特異的な実施形態では、サポートを受けるウイルス遺伝子治療ベクターゲノムは、治療ペイロードをトランスポゾンにする、ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）トランスポゼース逆方向反復配列により隣接された治療ペイロードを含み、サポートベクターは、宿主ゲノムへの治療ペイロードの組み込みを引き起こすＳＢトランスポゼースをコード及び発現する。さまざまな実施形態において、ＳＢトランスポゼース逆方向反復配列を含む治療ペイロードトランスポゾンは、組換え部位により隣接され、この組換え部位は、リコンビナーゼに曝露されると、治療ペイロードトランスポゾンを含む核酸の環状化を引き起こし、この環状化は、ＳＢトランスポゼースが宿主細胞ゲノムへの治療ペイロードの組み込みを媒介することができる効率を増加させる。さまざまな実施形態において、ＳＢトランスポゼースは、ＳＢ１０、ＳＢ１１、ＳＢ１００、またはＳＢ１００ｘである。

【0191】

例えば、別々のベクターにおいてコードされる薬剤の独立した用量設定が望まれる場合、またはベクター容量限界が、単一のベクターゲノムにおけるあらゆる所望の薬剤をコードする核酸配列を含むことを阻害する場合、サポートを受けるウイルス遺伝子治療ベクター及びサポートベクターを含むウイルスベクター遺伝子治療が有用であり得る。サポートを受けるウイルス遺伝子治療ベクター及びサポートベクターを含むウイルスベクター遺伝子治療を施すことは、例えば、ある期間にわたる（例えば、単一の投与、時間、日または処置レジメンにおける）総用量として、単一のベクター種のみを利用するウイルスベクター遺伝子治療よりも高い投薬量の、サポートを受けるウイルス遺伝子治療ベクターが必要となり得る。当業者によって理解される通り、より高い用量（例えば、単位用量または総用量）のウイルスベクターは、より低い用量（例えば、単位用量または総用量）のウイルスベクター（例えば、同じベクター（単数または複数）の）の投与を含む参照と比較して、対象（複数可）に投与されたときに、より急速な、より重篤な、及び／またはより持続した免疫毒性応答の誘導をもたらすことができる。したがって、ウイルスベクター遺伝子治療による使用のための免疫抑制レジメンの一般的な必要性に加えて、サポートを受けるウイルス遺伝子治療ベクター及びサポートベクターを含むウイルスベクター遺伝子治療における使用のための免疫抑制レジメンの特別な必要性がある。

【0192】

サポートベクターは、上に示すもの、例えば、アデノウイルス（Ａｄ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、単純ヘルペスウイルス（例えば、ＨＳＶ、ＨＳＶ１）、レトロウイルス（例えば、ＭＬＶ、ＭＭＳＶ、ＭＳＣＶ）、レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２）、アルファウイルス（例えば、ＳＦＶ、ＳＩＮ、ＶＥＥ、Ｍ１）、フラビウイルス（例えば、クンジン、ウエストナイル、デングウイルス）、ラブドウイルス（例えば、狂犬病、ＶＳＶ）、麻疹ウイルス（例えば、ＭＶ－Ｅｄｍ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、ポックスウイルス、またはピコルナウイルス（例えば、コクサッキーウイルス）を限定することなく含む、いずれかの型のウイルスベクターであり得る。したがって、サポートベクターは、例えば、Ａｄ５、Ａｄ３５、Ａｄ５／３５、Ａｄ３５＋＋、またはＡｄ５／３５＋＋ベクターを限定することなく含む、当該技術分野で公知のさまざまな血清型及び偽型のいずれかのＡＡＶ遺伝子治療ベクターまたはアデノウイルス遺伝子治療ベクターであり得る。

【0193】

さまざまな実施形態において、ウイルスベクター遺伝子治療は、サポートを受けるウイルス遺伝子治療ベクター及びサポートベクターを含み、この場合、サポートを受けるウイルス遺伝子治療ベクター及びサポートベクターは、同じウイルス型、クラス、血清型、または偽型のものである。さまざまな実施形態において、ウイルスベクター遺伝子治療は、サポートを受けるウイルス遺伝子治療ベクター及びサポートベクターを含み、この場合、サポートを受けるウイルス遺伝子治療ベクター及びサポートベクターは、２種の異なるウイルス型、クラス、血清型、または偽型のものである。少なくとも上述及び本明細書の他の箇所に示す理由のため、当業者であれば、本明細書に開示されている免疫抑制レジメンが、サポートを受けるウイルス遺伝子治療ベクター及びサポートベクターのウイルス型、クラス、血清型、または偽型に関係なく、同じであるか異なっているかにかかわらず、一般にサポートを受けるウイルス遺伝子治療ベクター及びサポートベクターを含むインビボ遺伝子治療の方法における使用に適用可能であることを理解するであろう。

【0194】

インビボ遺伝子治療レジメン。本開示のさまざまな実施形態では、インビボ遺伝子治療は、少なくとも１つの免疫抑制レジメンと組み合わせて少なくとも１つのウイルス遺伝子治療ベクターを対象に投与することを含む。複数のベクター種を含むインビボ遺伝子治療（サポートを受けるウイルス遺伝子治療ベクターである第１のベクターと、サポートベクターである第２のベクターとを組み合わせて行うものなど）では、第１のベクター及び第２のベクターは、単一の製剤もしくは剤形において投与されるか、または２つの別々の製剤もしくは剤形において投与され得る。さまざまな実施形態において、第１のベクター及び第２のベクターは、同じ時刻または異なる時刻（例えば、同じ１時間の間または重複しない１時間の間）に投与され得る。さまざまな実施形態において、第１のベクター及び第２のベクターは、（例えば、同じ日または異なる日に）同じ時刻または異なる時刻に投与され得る。さまざまな実施形態において、第１のベクター及び第２のベクターは、同じ用量または異なる用量で投与することができ、例えば、この用量は、ウイルス粒子の総数または対象のキログラム当たりのウイルス粒子数として測定される。さまざまな実施形態において、第１のベクター及び第２のベクターは、予め定義された比で投与され得る。さまざまな実施形態において、この比は、２：１～１：２の範囲内のもの（例えば、１：１）である。

【0195】

さまざまな実施形態において、ベクターは、１日に単一の総用量で対象に投与される。さまざまな実施形態において、ベクターは、総用量を一緒に構成する２つ、３つ、４つ、またはそれを超える数の単位用量で投与される。さまざまな実施形態において、１日、２日、３日、４日、またはそれを超える連続日数の各日に、１日につき１単位用量のベクターが対象に投与される。さまざまな実施形態において、１日、２日、３日、４日、またはそれを超える連続日数の各日に、１日につき２単位用量のベクターが対象に投与される。したがって、さまざまな実施形態において、１日用量は、１日を通じて対象に投与されるベクターの用量を指し得る。さまざまな実施形態において、日という用語は、２４時間（最初のカレンダー日付の午前０時から次のカレンダー日付の午前０時までの２４時間など）を指す。

【0196】

さまざまな実施形態において、ベクター（ウイルス遺伝子治療ベクターまたはサポートベクターなど）の単位用量、１日用量、もしくは総用量、またはウイルス遺伝子治療ベクター及びサポートベクターの総統合用量は、キログラム当たりのウイルス粒子数（ｖｐ／ｋｇ）で、少なくとも１Ｅ８、少なくとも５Ｅ８、少なくとも１Ｅ９、少なくとも５Ｅ９、少なくとも１Ｅ１０、少なくとも５Ｅ１０、少なくとも１Ｅ１１、少なくとも５Ｅ１１、少なくとも１Ｅ１２、少なくとも５Ｅ１２、少なくとも１Ｅ１３、少なくとも５Ｅ１３、少なくとも１Ｅ１４、または少なくとも１Ｅ１５であり得る。さまざまな実施形態において、ベクター（ウイルス遺伝子治療ベクターまたはサポートベクターなど）の単位用量、１日用量、もしくは総用量、またはウイルス遺伝子治療ベクター及びサポートベクターの総統合用量は、１Ｅ８、５Ｅ８、１Ｅ９、５Ｅ９、１Ｅ１０、５Ｅ１０、１Ｅ１１、５Ｅ１１、１Ｅ１２、５Ｅ１２、１Ｅ１３、５Ｅ１３、１Ｅ１４、または１Ｅ１５から選択される下限（ｖｐ／ｋｇ）及び１Ｅ８、５Ｅ８、１Ｅ９、５Ｅ９、１Ｅ１０、５Ｅ１０、１Ｅ１１、５Ｅ１１、１Ｅ１２、５Ｅ１２、１Ｅ１３、５Ｅ１３、１Ｅ１４、または１Ｅ１５から選択される上限（ｖｐ／ｋｇ）を有する範囲に入るものであり得る。

【0197】

さまざまな実施形態において、ウイルス遺伝子治療ベクターは、少なくとも１Ｅ１０ｖｐ／ｋｇ、少なくとも５Ｅ１０ｖｐ／ｋｇ、少なくとも１Ｅ１１ｖｐ／ｋｇ、少なくとも５Ｅ１１ｖｐ／ｋｇ、少なくとも１Ｅ１２ｖｐ／ｋｇ、少なくとも５Ｅ１２ｖｐ／ｋｇ、少なくとも１Ｅ１３ｖｐ／ｋｇ、少なくとも５Ｅ１３ｖｐ／ｋｇ、少なくとも１Ｅ１４ｖｐ／ｋｇ、または少なくとも１Ｅ１５ｖｐ／ｋｇの単位用量、１日用量、または総用量で投与され、サポートベクターは、少なくとも１Ｅ８ｖｐ／ｋｇ、少なくとも５Ｅ８ｖｐ／ｋｇ、少なくとも１Ｅ９ｖｐ／ｋｇ、少なくとも５Ｅ９ｖｐ／ｋｇ、少なくとも１Ｅ１０ｖｐ／ｋｇ、少なくとも５Ｅ１０ｖｐ／ｋｇ、少なくとも１Ｅ１１ｖｐ／ｋｇ、及び少なくとも５Ｅ１１ｖｐ／ｋｇの単位用量、１日用量、または総用量で投与され、必要に応じて、ウイルス遺伝子治療ベクターの単位用量、１日用量、もしくは総用量は、１Ｅ１０、５Ｅ１０、１Ｅ１１、５Ｅ１１、１Ｅ１２、及び５Ｅ１２から選択される下限（ｖｐ／ｋｇ）ならびに１Ｅ１１、５Ｅ１１、１Ｅ１２、５Ｅ１２、１Ｅ１３、５Ｅ１３、１Ｅ１４、及び１Ｅ１５から選択される上限（ｖｐ／ｋｇ）を有する範囲に入り、ならびに／またはサポートベクターの単位用量、１日用量、もしくは総用量は、１Ｅ８、５Ｅ８、１Ｅ９、５Ｅ９、１Ｅ１０、及び５Ｅ１０から選択される下限（ｖｐ／ｋｇ）ならびに１Ｅ９、５Ｅ９、１Ｅ１０、５Ｅ１０、１Ｅ１１、及び５Ｅ１１から選択される上限（ｖｐ／ｋｇ）を有する範囲に入る。

【0198】

さまざまな実施形態において、サポートベクターは、少なくとも１Ｅ１０ｖｐ／ｋｇ、少なくとも５Ｅ１０ｖｐ／ｋｇ、少なくとも１Ｅ１１ｖｐ／ｋｇ、少なくとも５Ｅ１１ｖｐ／ｋｇ、少なくとも１Ｅ１２ｖｐ／ｋｇ、少なくとも５Ｅ１２ｖｐ／ｋｇ、少なくとも１Ｅ１３ｖｐ／ｋｇ、少なくとも５Ｅ１３ｖｐ／ｋｇ、少なくとも１Ｅ１４ｖｐ／ｋｇ、または少なくとも１Ｅ１５ｖｐ／ｋｇの単位用量、１日用量、または総用量で投与され、サポートを受けるウイルス遺伝子治療ベクターは、少なくとも１Ｅ８ｖｐ／ｋｇ、少なくとも５Ｅ８ｖｐ／ｋｇ、少なくとも１Ｅ９ｖｐ／ｋｇ、少なくとも５Ｅ９ｖｐ／ｋｇ、少なくとも１Ｅ１０ｖｐ／ｋｇ、少なくとも５Ｅ１０ｖｐ／ｋｇ、少なくとも１Ｅ１１ｖｐ／ｋｇ、及び少なくとも５Ｅ１１ｖｐ／ｋｇの単位用量、１日用量、または総用量で投与され、必要に応じて、サポートベクターの単位用量、１日用量、もしくは総用量は、１Ｅ１０、５Ｅ１０、１Ｅ１１、５Ｅ１１、１Ｅ１２及び５Ｅ１２から選択される下限（ｖｐ／ｋｇ）ならびに１Ｅ１１、５Ｅ１１、１Ｅ１２、５Ｅ１２、１Ｅ１３、５Ｅ１３、１Ｅ１４、及び１Ｅ１５から選択される上限（ｖｐ／ｋｇ）を有する範囲に入り、ならびに／またはサポートを受けるウイルス遺伝子治療ベクターの単位用量、１日用量、もしくは総用量は、１Ｅ８、５Ｅ８、１Ｅ９、５Ｅ９、１Ｅ１０及び５Ｅ１０から選択される下限（ｖｐ／ｋｇ）ならびに１Ｅ９、５Ｅ９、１Ｅ１０、５Ｅ１０、１Ｅ１１、及び５Ｅ１１から選択される上限（ｖｐ／ｋｇ）を有する範囲に入る。さまざまな実施形態において、サポートを受けるウイルス遺伝子治療ベクター及びサポートベクターは、予め定義された比で投与される。さまざまな実施形態において、この比は、２：１～１：２の範囲内のもの、例えば、１：１である。

【0199】

さまざまな実施形態において、免疫抑制レジメンが対象に施され、この対象には、少なくとも１つのウイルス遺伝子治療ベクターの投与も行われ、この免疫抑制レジメンは、少なくとも１つの免疫抑制剤を対象に投与することを含み、この投与の実施日は、（ｉ）ウイルス遺伝子治療ベクターの第１の用量が対象に投与される前の１日もしくは複数日；（ｉｉ）ウイルス遺伝子治療ベクターの第１の用量の投与と同じ日；（ｉｉｉ）ウイルス遺伝子治療ベクターの第２の用量もしくは他の後続用量の１つまたは複数が投与される日と同じ日；及び／または（ｉｖ）ウイルス遺伝子治療ベクターの第１の用量の対象への投与と、ウイルス遺伝子治療ベクターの第２の用量もしくは他の後続用量の１つまたは複数のいずれかもしくはそうした用量のすべての投与と、の間に介在する日の１日もしくは複数日のいずれかもしくはそうした介在日のすべて、である。

【0200】

ウイルスベクター遺伝子治療と併せて対象に投与される免疫抑制レジメンは、炎症性シグナル阻害剤であるいずれかの薬剤を含む免疫抑制レジメンを含むことができる。ウイルスベクター遺伝子治療と併せて対象に投与される免疫抑制レジメンは、（ｉ）インターロイキン－１（ＩＬ－１）シグナル阻害剤などの炎症性シグナル阻害剤；（ｉｉ）ＩＬ－６シグナル阻害剤；（ｉｉｉ）コルチコステロイド；（ｉｖ）カルシニューリン阻害剤；（ｖ）ＴＮＦ－αシグナル阻害剤；及び（ｖｉ）ＪＡＫシグナル阻害剤のうちの１種、２種、３種、４種、５種、または６種のいずれかから選択される免疫抑制剤を含むことができ；これらのうちのいずれかまたはすべては、存在する場合、別個の免疫抑制剤レジメンに従って投与することができる。ある特定の実施形態では、ウイルスベクター遺伝子治療と併せて対象に投与される免疫抑制レジメンは、（ｉ）インターロイキン－１（ＩＬ－１）シグナル阻害剤；（ｉｉ）ＩＬ－６シグナル阻害剤；（ｉｉｉ）コルチコステロイド；及び（ｉｖ）カルシニューリン阻害剤のうちの１種、２種、３種、または４種のいずれかから選択される免疫抑制剤を含むことができ；これらのうちのいずれかまたはすべては、存在する場合、別個の免疫抑制剤レジメンに従って投与することができる。

【0201】

異なる免疫抑制剤クラスの第１の免疫抑制剤及び少なくとも第２の免疫抑制剤など、複数の免疫抑制剤を含む免疫抑制レジメンを含むインビボ遺伝子治療において、各免疫抑制剤は、１つまたは複数の他の免疫抑制剤と共に単一の製剤もしくは剤形において、または複数の別々の製剤もしくは剤形において投与することができる。さまざまな実施形態において、各免疫抑制剤は、１つまたは複数の他の免疫抑制剤と同じ時刻に、または異なる時刻に、例えば、同じ１時間の間または重複しない１時間の間に投与することができる。さまざまな実施形態において、各免疫抑制剤は、１つまたは複数の他の免疫抑制剤と同じ時刻または異なる時刻に、例えば、同じ日または異なる日に投与することができる。

【0202】

さまざまな実施形態において、免疫抑制剤は、１日に単一の総用量で対象に投与される。さまざまな実施形態において、免疫抑制剤は、総用量を一緒に構成する２つ、３つ、４つ、またはそれを超える数の単位用量で投与される。さまざまな実施形態において、１日、２日、３日、４日、またはそれを超える連続日数の各日に、１日につき１単位用量の免疫抑制剤が対象に投与される。さまざまな実施形態において、１日、２日、３日、４日、またはそれを超える連続日数の各日に、１日につき２単位用量の免疫抑制剤が対象に投与される。したがって、さまざまな実施形態において、１日用量は、１日を通じて対象に投与される免疫抑制剤の用量を指し得る。

【0203】

さまざまな実施形態において、免疫抑制レジメンは、ＩＬ－１受容体アンタゴニスト、例えば、アナキンラなどのインターロイキン－１（ＩＬ－１）シグナル阻害剤を含む。さまざまな実施形態において、ＩＬ－１受容体アンタゴニスト、例えば、アナキンラなどのインターロイキン－１（ＩＬ－１）シグナル阻害剤は、（ｉ）ベクターの第１の用量の投与に先立つ日に、（ｉｉ）ベクターの第１の用量の投与の日に、（ｉｉｉ）ベクターの１つまたは複数の後続用量の投与の日に、（ｉｖ）ベクターの第１の用量の投与の日とベクターの最後の用量の投与の日との間の毎日に、及び／または（ｖ）ベクターの最後の用量の投与の日の後の１、２、もしくはそれよりも多い日数の毎日に、対象に投与される。さまざまな実施形態において、ＩＬ－１受容体アンタゴニスト、例えば、アナキンラなどのインターロイキン－１（ＩＬ－１）シグナル阻害剤は、（ｉ）ベクターの第１の用量の投与の日に、及び（ｉｉ）ベクターの１つまたは複数の後続用量の投与の日に、対象に投与される。さまざまな実施形態において、ＩＬ－１シグナル阻害剤、例えば、アナキンラは、これらの日のそれぞれに２回、例えば、午前に１回と午後に１回、対象に投与される。

【0204】

さまざまな実施形態において、アナキンラまたは別のＩＬ－１シグナル阻害剤は、ベクターの１つまたは複数の用量の１～１０時間前に（例えば、ベクターの投与の約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０時間前に、例えば、ベクターの１つまたは複数の用量の約１～１０、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３、１～２、０～１、３～１０、３～９、３～８、３～７、３～６、３～５、３～４、または０～３時間前に）投与される。ある特定の実施形態では、アナキンラまたは別のＩＬ－１シグナル阻害剤の用量は、ベクターの第１の用量の投与の１～３時間前に投与される。ある特定の実施形態では、アナキンラまたは別のＩＬ－１シグナル阻害剤の用量は、ベクターの１つまたは複数の後続用量の投与の１～３時間前に投与される。

【0205】

さまざまな実施形態において、アナキンラまたは別のＩＬ－１シグナル阻害剤は、ベクターの１つまたは複数の用量の投与前の約１時間以内に（例えば、ベクターの１つまたは複数の用量の投与前約６０、４５、３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２、または１分以内に）投与される。さまざまな実施形態において、アナキンラまたは別のＩＬ－１シグナル阻害剤は、静脈内に投与される。さまざまな実施形態において、アナキンラまたは別のＩＬ－１シグナル阻害剤は、皮下に投与される。さまざまな実施形態において、アナキンラまたは別のＩＬ－１シグナル阻害剤は、ベクターの第１の用量の投与の約１～１０（例えば、約１～３）時間前に、皮下に投与される。さまざまな実施形態において、アナキンラまたは別のＩＬ－１シグナル阻害剤は、ベクターの１つまたは複数の用量の投与前約１時間以内に（例えば、ベクターの１つまたは複数の用量の投与前約６０、４５、３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２、または１分以内に）、静脈内に投与される。

【0206】

さまざまな実施形態において、ＩＬ－１シグナル阻害剤は、アナキンラまたは別のＩＬ－１Ｒアンタゴニストであり、アナキンラまたは別のＩＬ－１Ｒアンタゴニストの１日用量は、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、もしくは２０ｍｇ／ｋｇ／日であるか、または少なくともその値である。ある特定の実施形態では、アナキンラまたは別のＩＬ－１Ｒアンタゴニストの用量は、０．０１～２０、０．０１～１０、または００１～５ｍｇ／ｋｇ／日である。ある特定の実施形態では、アナキンラまたは別のＩＬ－１Ｒアンタゴニストの用量は、１～２、１～４、１～６、１～８、または１～１０ｍｇ／ｋｇ／日である。さまざまな実施形態において、ＩＬ－１シグナル阻害剤は、アナキンラまたは別のＩＬ－１Ｒアンタゴニストであり、アナキンラまたは別のＩＬ－１Ｒアンタゴニストの１日用量は、１～８ｍｇ／ｋｇ／日である。ある特定の実施形態では、アナキンラまたは別のＩＬ－１Ｒアンタゴニストの用量は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、もしくは２００ｍｇ／日であるか、または少なくともその値である。ある特定の実施形態では、アナキンラまたは別のＩＬ－１Ｒアンタゴニストの用量は、１０～２００、２０～２００、３０～１７５、４０～１７５、５０～１５０、６０～１５０、８０～１２５、９０～１２５、または１００ｍｇ／日である。さまざまな実施形態において、アナキンラまたは別のＩＬ－１Ｒアンタゴニストの１日用量は、下限が１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ｍｇ／日及び上限が１００、１２５、１５０、１７５、または２０ｍｇ／日である範囲を有する。さまざまな実施形態において、アナキンラまたは別のＩＬ－１Ｒアンタゴニストの１日用量は、１００ｍｇ／日である。さまざまな実施形態において、１日用量は、１日用量の半分をそれぞれ、２回の個別投与で、例えば、午前中に１回と午後に１回、対象に投与される。

【0207】

アナキンラ以外の他のＩＬ－１シグナル阻害剤は、例えば、ＡＤＣ－１００１（Ａｌｌｉｇａｔｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＦＸ－２０１（Ｆｌｅｘｉｏｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＧＱ－３０３（Ｇｅｎｅｑｕｉｎｅ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ＧｍｂＨ）、ＨＬ－２３５１（Ｈａｎｄｏｋ， Ｉｎｃ．）、ＭＢＩＬ－１ＲＡ（ＰｒｏｔｅｏＴｈｅｒａ， Ｉｎｃ．）、及びヒト免疫グロビンＧまたはＧｌｏｂｕｌｉｎ Ｓ（ＧＣ Ｐｈａｒｍａ）を含む。

【0208】

さまざまな実施形態において、免疫抑制レジメンは、ＩＬ－６シグナル阻害剤、例えば、トシリズマブを含む。さまざまな実施形態において、ＩＬ－６シグナル阻害剤、例えば、トシリズマブは、（ｉ）ベクターの第１の用量の投与に先立つ日に、（ｉｉ）ベクターの第１の用量の投与の日に、（ｉｉｉ）ベクターの１つまたは複数の後続用量の投与の日に、（ｉｖ）ベクターの第１の用量の投与の日とベクターの最後の用量の投与の日との間の毎日に、及び／または（ｖ）ベクターの最後の用量の投与の日の後の１、２、もしくはそれよりも多い日数の毎日に、対象に投与される。さまざまな実施形態において、ＩＬ－６シグナル阻害剤、例えば、トシリズマブは、（ｉ）ベクターの第１の用量の投与の日に、及び（ｉｉ）ベクターの１つまたは複数の後続用量の投与の日に、対象に投与される。さまざまな実施形態において、ＩＬ－６シグナル阻害剤、例えば、トシリズマブは、これらの日の毎日に２回、例えば、午前中に１回と午後に１回、対象に投与される。さまざまな実施形態において、トシリズマブまたは別のＩＬ－６シグナル阻害剤は、ベクターの１つまたは複数の用量の投与前約１時間以内に（例えば、ベクターの１つまたは複数の用量の投与前約６０、４５、３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２、または１分以内に）投与される。

【0209】

さまざまな実施形態において、ＩＬ－６シグナル阻害剤はトシリズマブであり、トシリズマブの１日用量は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、もしくは２００ｍｇ／日であるか、または少なくともその値である。さまざまな実施形態において、トシリズマブの１日用量は、下限が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０ｍｇ／日及び上限が１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００ｍｇ／日である範囲を有する。さまざまな実施形態において、ＩＬ－６シグナル阻害剤はトシリズマブであり、トシリズマブの１日用量は、０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、もしくは５０ｍｇ／ｋｇ／日であるか、または少なくともその値である。さまざまな実施形態において、トシリズマブの１日用量は、下限が０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０ｍｇ／ｋｇ／日及び上限が１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ｍｇ／ｋｇ／日である範囲を有する。さまざまな実施形態において、トシリズマブの１日用量は、１～１５、１～１２、１～１０、１～５、５～１０、５～１２、または５～１５ｍｇ／ｋｇ／日の範囲を有する。さまざまな実施形態において、トシリズマブの用量、例えば、１日用量または１週間用量は、１６２ｍｇである。さまざまな実施形態において、１日用量は、１日用量の半分をそれぞれ、２回の個別投与で、例えば、午前中に１回と午後に１回、対象に投与される。

【0210】

トシリズマブ以外の他のＩＬ－６シグナル阻害剤には、ＢＣＤ－０８９（Ｂｉｏｃａｄ）、ＨＳ－６２８（Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｈｉｓｕｎ Ｐｈａｒｍ）、及びＡＰＸ－００７（Ａｐｅｘｉｇｅｎ）が含まれる。

【0211】

さまざまな実施形態において、免疫抑制レジメンには、コルチコステロイド、例えば、デキサメタゾンが含まれる。さまざまな実施形態において、コルチコステロイド、例えば、デキサメタゾンは、（ｉ）ベクターの第１の用量の投与に先立つ日に、（ｉｉ）ベクターの第１の用量の投与の日に、（ｉｉｉ）ベクターの１つまたは複数の後続用量の投与の日に、（ｉｖ）ベクターの第１の用量の投与の日とベクターの最後の用量の投与の日との間の毎日に、及び／または（ｖ）ベクターの最後の用量の投与の日の後の１、２、もしくはそれよりも多い日数の毎日に、対象に投与される。さまざまな実施形態において、コルチコステロイド、例えば、デキサメタゾンは、（ｉ）ベクターの第１の用量の投与に先立つ日に、（ｉｉ）ベクターの第１の用量の投与の日に、及び（ｉｉｉ）ベクターの１つまたは複数の後続用量の投与の日に、対象に投与される。さまざまな実施形態において、コルチコステロイド、例えば、デキサメタゾンは、これらの日数の最初に１回、例えば、午後に及び他の日の毎日に２回、例えば、午前中に１回及び午後に１回、対象に投与される。

【0212】

さまざまな実施形態において、コルチコステロイドはデキサメタゾンであり、デキサメタゾンの１日用量は、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、１．５、２、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、７．５、１０．０、１２．５、もしくは１５ｍｇ／ｋｇ／日であるか、または少なくともその値である。さまざまな実施形態において、デキサメタゾンの１日用量は、下限が０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、１．５、２、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、または５．０ｍｇ／ｋｇ／日及び上限が５．０、７．５、１０．０、１２．５、または１５ｍｇ／ｋｇ／日である範囲を有する。さまざまな実施形態において、１日用量は、１日用量の半分をそれぞれ、２回の個別投与で、例えば、午前中に１回と午後に１回、対象に投与される。

【0213】

さまざまな実施形態において、免疫抑制レジメンには、カルシニューリン阻害剤、例えば、タクロリムスが含まれる。さまざまな実施形態において、カルシニューリン阻害剤、例えば、タクロリムスは、（ｉ）ベクターの第１の用量の投与に先立つ日に、（ｉｉ）ベクターの第１の用量の投与の日に、（ｉｉｉ）ベクターの１つまたは複数の後続用量の投与の日に、（ｉｖ）ベクターの第１の用量の投与の日とベクターの最後の用量の投与の日との間の毎日に、及び／または（ｖ）ベクターの最後の用量の投与の日の後の１、２、もしくはそれよりも多い日数の毎日に、対象に投与される。さまざまな実施形態において、カルシニューリン阻害剤、例えば、タクロリムスは、ベクターの第１の用量の投与の４日前に、（ｉｉ）ベクターの第１の用量の投与の日に、（ｉｉｉ）ベクターの１つまたは複数の後続用量の投与の日に、（ｉｖ）ベクターの最後の用量の投与後の２日間の毎日に、及び必要に応じて、（ｖ）１、２、またはそれよりも多い追加の日数の毎日に、対象に投与される。さまざまな実施形態において、カルシニューリン阻害剤、例えば、タクロリムスは、これらの日の毎日に２回、例えば、午前中に１回と午後に１回、対象に投与される。

【0214】

さまざまな実施形態において、カルシニューリン阻害剤はタクロリムスであり、タクロリムスの１日用量は、０．００１、０．００５、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、または０．５ｍｇ／ｋｇ／日であるか、または少なくともその値である。さまざまな実施形態において、タクロリムスの１日用量は、下限が、０．００１、０．００５、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、または０．０５ｍｇ／ｋｇ／日及び上限が０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、または０．５ｍｇ／ｋｇ／日である範囲を有する。さまざまな実施形態において、１日用量は、１日用量の半分をそれぞれ、２回の個別投与で、例えば、午前中に１回と午後に１回、対象に投与される。

【0215】

さまざまな実施形態において、免疫抑制レジメンは、本明細書に開示されるように、（ｉ）ＩＬ－１受容体アンタゴニストなどのインターロイキン－１（ＩＬ－１）シグナル阻害剤、（ｉｉ）ＩＬ－６シグナル阻害剤、（ｉｉｉ）コルチコステロイド、及び（ｉｖ）カルシニューリン阻害剤のそれぞれを含む。さまざまな実施形態において、免疫抑制レジメンは、本明細書に開示されるように、（ｉ）アナキンラ、（ｉｉ）トシリズマブ、（ｉｉｉ）デキサメタゾン、及び（ｉｖ）タクロリムスのそれぞれを含む。

【0216】

さまざまな実施形態において、免疫抑制レジメン、またはその免疫抑制剤の投与は、免疫毒性バイオマーカーの測定されたレベルに基づき、マーカーレベルが、参照（同じ対象からの初期試料におけるバイオマーカーの測定されたレベルなど）に対して免疫毒性及び／または免疫毒性の増加を指し示す場合、免疫抑制剤、または免疫抑制レジメンの１つまたは複数の免疫抑制剤の用量の量及び／または頻度は増加され（例えば、単位用量、１日用量、総用量、用量の頻度、及び／または用量の総数の増加）、マーカーレベルが、参照（同じ対象からの初期試料におけるバイオマーカーの測定されたレベルなど）に対して免疫毒性の不在及び／または免疫毒性の低下を指し示す場合、量及び／または頻度は減少される。免疫毒性バイオマーカーは、ＩＬ－Ιβ、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－２３、ＩＬ－２７、ＩＬ－３０、ＩＬ－３６、ＩＬ－１Ｒａ、ＩＬ－２Ｒ、ＩＦＮ－ａ、ＩＦＮ－ｂ、ＩＦＮ－γ、ＭＩＰ－Ｉａ、ΜΙΡ－Ιβ、ＭＣＰ－１、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＶＥＧＦ、ＲＡＮＴＥＳ、ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＦＧＦ－β、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、Ｃ反応性タンパク質、プロカルシトニン、フェリチン、Ｄダイマー、リンパ球の総集団、リンパ球の亜集団、対象温度、及びこれらの組合せのレベルの１つまたは複数のいずれかを含み得る。バイオマーカーは、ウイルス遺伝子治療ベクター及び／または免疫抑制剤の１つまたは複数の用量の投与前、投与中、または投与後に測定され得る。

【0217】

ある特定の実施形態では、免疫抑制レジメンの１つまたは複数の免疫抑制剤の投薬レジメンは、ウイルス遺伝子治療ベクターの少なくとも１用量の投与後に、対象または対象由来の試料における免疫毒性バイオマーカーの測定されたレベルに基づき、単位用量、１日用量、総用量、用量の頻度及び／または用量の総数が増加され、測定されたレベルが、有意な、高い、もしくは増加した免疫毒性（例えば、参照と比較した場合）を指し示す場合、１つまたは複数の免疫抑制剤の投薬レジメンが増加される、及び／または測定されたレベルが、低い、無い、または低下した免疫毒性（例えば、参照と比較した場合）を指し示す場合、減少される。いくつかの実施形態では、免疫毒性バイオマーカーは、ＩＬ－Ιβ、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－２３、ＩＬ－２７、ＩＬ－３０、ＩＬ－３６、ＩＬ－１Ｒａ、ＩＬ－２Ｒ、ＩＦＮ－ａ、ＩＦＮ－ｂ、ＩＦＮ－γ、ＭＩＰ－Ｉａ、ΜΙΡ－Ιβ、ＭＣＰ－１、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＶＥＧＦ、ＲＡＮＴＥＳ、ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＦＧＦ－β、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、Ｃ反応性タンパク質、プロカルシトニン、フェリチン、Ｄダイマー、リンパ球の総集団、リンパ球の亜集団、対象温度、及びこれらの組合せから選択される。

【0218】

ある特定の実施形態では、免疫抑制レジメンの１つまたは複数の免疫抑制剤の投薬レジメンは、ウイルス遺伝子治療ベクターの少なくとも１用量の投与後に、対象または対象由来の試料におけるウイルス遺伝子治療ベクターに対する抗体の測定されたレベルに基づき、単位用量、１日用量、総用量、用量の頻度及び／または用量の総数が増加され、測定されたレベルが、有意な、高い、もしくは増加した免疫毒性（例えば、参照と比較した場合）を指し示す場合、１つまたは複数の免疫抑制剤の投薬レジメンが増加される、及び／または測定されたレベルが、低い、無い、もしくは低下した免疫毒性（例えば、参照と比較した場合）を指し示す場合、減少され、必要に応じて、測定されたレベルが、抗体価であり、必要に応じて、抗体が、中和抗体である。抗体レベル（例えば、抗体力価）を測定する手段は当該技術分野で知られており、限定されないが、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を含む。

【0219】

さまざまな実施形態において、本開示のインビボ遺伝子治療レジメンは、幹細胞動員レジメンをさらに含み、幹細胞動員レジメンは、対象に、治療的に利用不可能な幹細胞を治療的に利用可能にする１つまたは複数の薬剤を投与することを含む。例えば、対象に幹細胞動員治療を投与することによって、造血幹細胞の循環が増加し、及び／または骨髄において隔絶された造血幹細胞が動員され、骨髄をコンパートメント中に排出し、これらは、ウイルス遺伝子治療ベクターによるインビボ形質導入に利用可能である。造血幹細胞は、ＣＤ４６に結合するアデノウイルス遺伝子治療ベクターなどの造血幹細胞に結合する、例えば、ウイルス遺伝子治療ベクターの、標的細胞であり得る。幹細胞動員剤の例には、限定されないが、幹細胞因子（ＳＣＦ）、小分子ＶＬＡ－４阻害剤ＢＩＯ５１９２、ＢＯＰ（Ｎ－（ベンゼンスルホニル）－Ｌ－プロリル－Ｌ－Ｏ－（１－ピロリジニルカルボニル）チロシン）、ヘパリン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、及びプレリキサホル／ＡＭＤ３１００が含まれる。

【0220】

さまざまな実施形態において、幹細胞動員レジメンは、Ｇ－ＣＳＦ及びプレリキサホル／ＡＭＤ３１００の投与を含む。さまざまな実施形態において、Ｇ－ＣＳＦは、（ｉ）ベクターの第１の用量の投与に先立つ４日間の毎日に、（ｉｉ）ベクターの第１の用量の投与の日に、及び（ｉｉｉ）ベクターの１つまたは複数の後続用量の投与の日に、対象に投与される。さまざまな実施形態において、プレリキサホル／ＡＭＤ３１００は、（ｉ）ベクターの第１の用量の投与に先立つ日に、及び（ｉｉ）ベクターの第１の用量の投与の日に、対象に投与される。さまざまな実施形態において、Ｇ－ＣＳＦは、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、もしくは２００ｕｇ／ｋｇであるか、または少なくともその値である用量で、１日に１回投与される。さまざまな実施形態において、Ｇ－ＣＳＦの１日用量は、下限が１０、２０、３０、４０、５０、または７５ｕｇ／ｋｇ／日及び上限が１００、１５０、または２００ｕｇ／ｋｇ／日である範囲を有する。さまざまな実施形態において、プレリキサホル／ＡＭＤ３１００は、１、２、３、４、５、７．５、１０、１５、もしくは２０ｍｇ／ｋｇであるか、または少なくともその値である用量で、１日に１回投与される。さまざまな実施形態において、Ｇ－ＣＳＦの１日用量は、下限が、１、２、３、４、５、または７．５ｍｇ／ｋｇ／日及び上限が１０、１５、または２０ｍｇ／ｋｇ／日である範囲を有する。

【0221】

さまざまな実施形態。本開示のさまざまな実施形態において、インビボ遺伝子治療は、本開示の少なくとも１つのウイルス遺伝子治療ベクター、例えば、アデノウイルス遺伝子治療ベクター（例えば、Ａｄ５、Ａｄ３５、Ａｄ５／３５、Ａｄ３５＋＋及びＡｄ５／３５＋＋などのＣＤ４６に結合する、本明細書に記載されるアデノウイルスサポートベクターと組み合わせたサポートを受けるアデノウイルス遺伝子治療ベクターなど（これらのヘルパー依存型バージョンを含む）で、例えば、２つのベクターが、２日の連続日数、例えば、これらの日数のそれぞれの午前中に、１：１の比で一緒に投与されるもの）の、以下のものと組み合わせた対象への投与を含む：（ａ）（ｉ）インターロイキン－１（ＩＬ－１）シグナル阻害剤などの炎症性シグナル阻害剤、例えば、アナキンラ（例えば、ベクターの第１の用量の投与の日に、及びベクターの１つまたは複数の後続用量の投与の日に、例えば、これらの日数のそれぞれに２回、例えば、午前中に１回及び午後に１回であって、投与される１日用量は本明細書に記載された通りである）；（ｉｉ）ＩＬ－６シグナル阻害剤、例えば、トシリズマブ（例えば、ベクターの第１の用量の投与の日に、及びベクターの１つまたは複数の後続用量の投与の日に、例えば、これらの日数のそれぞれに２回、例えば、午前中に１回及び午後に１回であって、投与される１日用量は本明細書に記載された通りである）；（ｉｉｉ）コルチコステロイド、例えば、デキサメタゾン（例えば、ベクターの第１の用量の投与に先立つ日に、ベクターの第１の用量の投与の日に、及びベクターの１つまたは複数の後続用量の投与の日に、例えば、これらの日数の最初に１回、例えば、午後に及び他の日数のそれぞれに２回、例えば、午前中に１回及び午後に１回であって、投与される１日用量は本明細書に記載された通りである）、及び（ｉｖ）カルシニューリン阻害剤、例えば、タクロリムス（例えば、ベクターの第１の用量の投与に先立つ４日間に、ベクターの第１の用量の投与の日に、ベクターの１つまたは複数の後続用量の投与の日に、ベクターの最後の用量の投与の後の２日間の毎日に、及び必要に応じて、１、２、またはそれよりも多い追加の日数の毎日にであって、例えば、これは、これらの日数のそれぞれに２回、例えば、午前中に１回及び午後に１回対象に投与され、投与される１日用量は本明細書に記載された通りである）を含む免疫抑制レジメン、（ｂ）造血幹細胞の循環を増加させる、及び／または骨髄において隔絶された造血幹細胞を動員して、骨髄をコンパートメント中に排出する（これらは、ベクターによるインビボ形質導入に利用可能である）レジメンなどの幹細胞動員レジメン、例えば、（ｉ）Ｇ－ＣＳＦが、ベクターの第１の用量の投与に先立つ４日間の毎日に、ベクターの第１の用量の投与の日に、及びベクターの１つまたは複数の後続用量の投与の日に、対象に投与され、例えば、Ｇ－ＣＳＦが、午前中になどのこれらの日数の毎日に１回投与され、投与される１日用量が本明細書に記載された通りである、ならびに（ｉｉ）プレリキサホル／ＡＭＤ３１００が、ベクターの第１の用量の投与に先立つ日に、及びベクターの第１の用量の投与の日に、対象に投与され、例えば、プレリキサホル／ＡＭＤ３１００が、午後になどのこれらの日数の毎日に１回（またはベクターの第１及び第２の用量の９～１１時間前に）投与され、投与される１日用量が本明細書に記載された通りである、レジメンなどの、Ｇ－ＣＳＦ及びプレリキサホル／ＡＭＤ３１００を含む幹細胞動員レジメン、ならびに（ｃ）ベクターによってインビボで形質導入された造血幹細胞を選択するレジメンなどの選択レジメン、例えば、Ｏ^６－ベンジルグアニン（Ｏ^６ＢＧ）及び１，３－ビス（２－クロロエチル）－１－ニトロソ－ウレア（ＢＣＮＵ）（Ｏ^６ＢＧ／ＢＣＮＵ）を含む選択レジメン、例えば、Ｏ^６ＢＧ／ＢＣＮＵが、ベクターの第１の用量の投与の日の後の４週目、６週目（必要に応じて）、及び８週目（必要に応じて）に（必要に応じて、形質導入細胞に関するさらなる選択が必要とされる場合は、その後に、追加の２週間間隔で）投与されるレジメン。

【0222】

製剤及び投与。ベクターは、細胞または動物（例えば、ヒト）に投与する上で医薬的に許容可能となるように製剤化され得る。ベクターは、インビボで投与され得る。さまざまな場合において、ベクターは、医薬的に許容可能な担体または添加物を含むように製剤化され得る。医薬的に許容可能な担体の例としては、限定されないが、いずれか及びすべての溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、ならびに生理学的に適合性の同様のものが挙げられる。本発明の組成物は、医薬的に許容可能な塩（例えば、酸付加塩または塩基付加塩）を含み得る。

【0223】

さまざまな実施形態において、本明細書に記載の免疫抑制剤を含む医薬組成物（例えば、注射用滅菌製剤）は、媒体として注射用蒸留水を使用する通常の薬務に従って製剤化され得る。例えば、生理食塩水、またはグルコース及び他の添加物質（Ｄ－ソルビトール、Ｄ－マンノース、Ｄ－マンニトール、及び塩化ナトリウムなど）を含む等張溶液を注射用水溶液として使用することができ、任意選択で、適切な可溶化剤（例えば、アルコール（エタノール及び多価アルコール（プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなど）など）ならびに非イオン性界面活性剤（ポリソルベート８０（商標）、ＨＣＯ－５０、及び同様のものなど））と組み合わせて使用することができる。

【0224】

本明細書に開示されるように、組成物は当該技術分野で知られる任意の形態で存在し得る。そのような形態には、例えば、液体剤形、半固体剤形、及び固体剤形（溶液（例えば、注射用溶液及び注入用溶液）、分散液または懸濁液、錠剤、丸剤、粉末、リポソーム、ならびに坐剤など）が含まれる。

【0225】

いずれかの具体的な形態の選択または使用は、部分的には、所期の投与様式及び治療用途に依存し得る。例えば、全身送達または局所送達が意図される組成物を含む組成物は、注射用溶液または注入用溶液の形態であり得る。したがって、ベクターは、非経口様式による投与（例えば、静脈内注射、皮下注射、腹腔内注射、または筋肉内注射）向けに製剤化され得る。本明細書で使用される非経口投与は、腸内投与及び局所投与以外の投与様式（通常は注射によるもの）を指し、非経口投与には、限定されないが、静脈内、鼻腔内、眼内、肺、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、関節包内、眼窩内、心臓内、皮内、肺内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、髄腔内、硬膜外、脳内、頭蓋内、頸動脈内、及び胸骨内（intrasternal）への注射及び注入が含まれる。非経口投与経路は、例えば、注射、経鼻投与、経肺動脈投与、または経皮投与による投与であり得る。投与は、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射による全身性または局所性のものであり得る。

【0226】

さまざまな実施形態において、本発明のベクターは、溶液、マイクロエマルション、分散液、リポソーム、または高濃度での安定保管に適した他の秩序構造として製剤化され得る。滅菌注射用溶液は、本明細書に記載の組成物を必要量で（必要に応じて、上に列挙した成分の１つまたは組み合わせと共に）適切な溶媒に含めた後にろ過滅菌することによって調製され得る。一般に、分散液は、基礎分散媒体及び上に列挙したものから選択される他の必要成分を含む滅菌媒体に本明細書に記載の組成物を含めることによって調製される。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合、調製方法には、本明細書に記載の組成物＋任意の所望の追加成分（以下を参照のこと）をその事前滅菌ろ過溶液から粉末にする真空乾燥及びフリーズドライが含まれる。溶液の適切な流動性は、例えば、コーティング剤（レシチンなど）を使用すること、分散液の場合は必要粒度を維持すること、及び界面活性剤を使用すること、によって維持され得る。注射用組成物の吸収の持続化は、吸収を遅延させる試薬（例えば、モノステアリン酸塩及びゼラチン）を組成物に含めることによって達成され得る。

【0227】

ベクターは、水または別の医薬的に許容可能な液体における滅菌溶液または滅菌懸濁液を含む注射用製剤の形態で非経口的に投与され得る。例えば、ベクターは、医薬的に許容可能な媒介物または媒体（滅菌水及び生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定化剤、香味付け用添加物、希釈剤、媒介物、保存剤、結合剤など）と治療用分子とを適切に組み合わせた後、一般的に認められた薬務に必要な単位剤形において混合することによって製剤化され得る。ベクターは、指定の範囲に入る適切な用量となる量で医薬調製物に含められる。油性液体の例としては、限定されないが、ゴマ油及び大豆油が挙げられ、油性液体は、可溶化剤としての安息香酸ベンジルまたはベンジルアルコールと混合され得る。含められ得る他の物品は緩衝剤であり、こうした緩衝剤は、リン酸緩衝剤または酢酸ナトリウム緩衝剤、無痛化剤（プロカイン塩酸塩など）、安定化剤（ベンジルアルコールまたはフェノールなど）、及び抗酸化剤などである。製剤化された注射用物は、適切なアンプル中に包装され得る。

【0228】

さまざまな実施形態において、皮下投与は、デバイスによって達成することができ、こうしたデバイスは、シリンジ、充填済みシリンジ、自己注射器（例えば、使い捨てまたは再利用が可能なもの）、ペン型注射器、パッチ注射器、ウェアラブル注射器、皮下注入セットを備えた携帯型シリンジ注入ポンプ、または他の皮下注射用デバイスなどである。

【0229】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のベクターは、局所投与によって対象に治療的に送達され得る。本明細書で使用される「局所投与」または「局所送達」は、ベクターがその所期の標的組織または標的部位へと血管系を介して輸送されることに依存しない送達を指し得る。例えば、ベクターは、組成物もしくは薬剤を注射もしくは埋め込むことによって送達されるか、または組成物もしくは薬剤を含むデバイスを注射もしくは埋め込むことによって送達され得る。ある特定の実施形態では、組成物もしくは薬剤またはその１つ以上の構成成分は、標的組織または標的部位の近傍への局所投与後に、投与部位ではない所期の標的組織または標的部位へと拡散し得る。

【0230】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は単位剤形中に存在し、この単位剤形は自己投与に適したものであり得る。そのような単位剤形は、容器に含めて提供することができ、この容器は、典型的には、例えば、バイアル、カートリッジ、充填済みシリンジ、または使い捨てペンである。ｄｏｓｅｒ（米国特許第６，３０２，８５５号に記載のｄｏｓｅｒデバイスなど）も（例えば、本明細書に記載の注射系と共に）使用され得る。

【0231】

注射に適した医薬形態のベクター製剤は、滅菌水溶液または滅菌分散液を含み得る。製剤は、滅菌されたものであり得、シリンジの内外で適切に流動することが可能な流体でなくてはならない。製剤は、製造及び保存の条件の下でも安定であり得る。担体は、溶媒または分散媒体であり得、こうした溶媒または分散媒体は、例えば、水及び生理食塩水または緩衝水溶液を含む。製剤中では、好ましくは、等張剤（例えば、糖または塩化ナトリウム）が使用され得る。

【0232】

さらに、当業者なら追加の送達方法も企図し得るであろう。こうした送達方法は、電気穿孔法によるもの、ソノフォレーシス法によるもの、骨内注入法によるもの、または遺伝子銃を使用することによるものであり得る。ベクターは、マイクロチップ、ナノチップ、またはナノ粒子にも埋め込まれ得る。

【0233】

本明細書に記載のベクターの適切な用量は、さまざまな要因に依存し得、こうした要因には、例えば、治療すべき対象の年齢、性別、及び体重、治療すべき状態または疾患、ならびに使用される特定のベクターが含まれる。対象に投与される用量に影響する他の要因には、例えば、状態または疾患の型または重症度が含まれる。他の要因には、例えば、対象が同時に罹患しているまたは以前に罹患していた他の医学的障害、対象の総体的な健康、対象の遺伝的素因、食事、投与時間、排泄速度、薬物併用、及び対象に施される他の追加の治療が含まれ得る。ベクターの適切な投与手段は、治療すべき状態または疾患及び対象の年齢及び状態に基づいて選択され得る。投与用量及び投与方法は、患者の体重、年齢、状態、及び同様のものによって異なり得、当業者によって必要に応じて適切に選択され得る。任意の特定の対象に対する具体的な用量及び治療レジメンは、医師の判断に基づいて調節され得る。

【0234】

ベクター溶液は、本明細書に記載の組成物を治療的に有効な量で含み得る。そのような有効量は、投与される組成物の作用、または複数の薬剤が使用される場合は組成物と１つ以上の追加の活性薬剤との複合作用に部分的には基づいて当業者によって容易に決定され得る。治療的に有効な量は、組成物の毒性作用または有害作用のいずれにも、治療的に有益な作用が勝る量であり得る。

【0235】

本開示の免疫抑制剤は、本明細書において提供されるさまざまな形態のいずれか、または当該技術分野で知られるその他の形態で、個々にまたは一緒に製剤化され得る。さまざまな実施形態において、本明細書に記載の免疫抑制剤は、医薬組成物において製剤化され得る。医薬組成物は、当業者に知られている方法によって製剤化することができる（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th edition, ed. Alfonso R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985)に記載される）。

【0236】

さまざまな場合において、ベクターは、医薬的に許容可能な担体または添加物を含むように製剤化され得る。医薬的に許容可能な担体の例としては、限定されないが、いずれか及びすべての溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、ならびに生理学的に適合性の同様のものが挙げられる。本発明の組成物は、医薬的に許容可能な塩（例えば、酸付加塩または塩基付加塩）を含み得る。

【0237】

さまざまな実施形態において、本明細書に記載の免疫抑制剤を含む医薬組成物（例えば、注射用滅菌製剤）は、媒体として注射用蒸留水を使用する通常の薬務に従って製剤化され得る。例えば、生理食塩水、またはグルコース及び他の添加物質（Ｄ－ソルビトール、Ｄ－マンノース、Ｄ－マンニトール、及び塩化ナトリウムなど）を含む等張溶液を注射用水溶液として使用することができ、任意選択で、適切な可溶化剤（例えば、アルコール（エタノール及び多価アルコール（プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなど）など）ならびに非イオン性界面活性剤（ポリソルベート８０（商標）、ＨＣＯ－５０、及び同様のものなど））と組み合わせて使用することができる。

【0238】

本明細書に開示のように、免疫抑制剤医薬組成物は、当該技術分野で知られる任意の形態であり得る。そのような形態には、例えば、液体剤形、半固体剤形、及び固体剤形（溶液（例えば、注射用溶液及び注入用溶液）、分散液または懸濁液、錠剤、丸剤、粉末、リポソーム、ならびに坐剤など）が含まれる。いずれかの具体的な形態の選択または使用は、部分的には、所期の投与様式及び治療用途に依存し得る。例えば、全身送達または局所送達が意図される組成物を含む組成物は、注射用溶液または注入用溶液の形態であり得る。したがって、組成物は、非経口様式による投与（例えば、静脈内注射、皮下注射、腹腔内注射、または筋肉内注射）向けに製剤化され得る。本明細書で使用される非経口投与は、腸内投与及び局所投与以外の投与様式（通常は注射によるもの）を指し、非経口投与には、限定されないが、静脈内、鼻腔内、眼内、肺、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、関節包内、眼窩内、心臓内、皮内、肺内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、髄腔内、硬膜外、脳内、頭蓋内、頸動脈内、及び胸骨内（intrasternal）への注射及び注入が含まれる。投与経路は、非経口であり得、例えば、注射、経鼻投与、経肺動脈投与、または経皮投与による投与であり得る。投与は、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射による全身性または局所性のものであり得る。

【0239】

さまざまな実施形態において、本発明の免疫抑制剤医薬組成物は、溶液、マイクロエマルション、分散液、リポソーム、または高濃度での安定保管に適した他の秩序構造として製剤化され得る。滅菌注射用溶液は、本明細書に記載の組成物を必要量で（必要に応じて、上に列挙した成分の１つまたは組み合わせと共に）適切な溶媒に含めた後にろ過滅菌することによって調製され得る。一般に、分散液は、基礎分散媒体及び上に列挙したものから選択される他の必要成分を含む滅菌媒体に本明細書に記載の組成物を含めることによって調製される。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合、調製方法には、本明細書に記載の組成物＋任意の所望の追加成分（以下を参照のこと）をその事前滅菌ろ過溶液から粉末にする真空乾燥及びフリーズドライが含まれる。溶液の適切な流動性は、例えば、コーティング剤（レシチンなど）を使用すること、分散液の場合は必要粒度を維持すること、及び界面活性剤を使用すること、によって維持され得る。注射用組成物の吸収の持続化は、吸収を遅延させる試薬（例えば、モノステアリン酸塩及びゼラチン）を組成物に含めることによって達成され得る。

【0240】

医薬組成物は、水または別の医薬的に許容可能な液体における滅菌溶液または滅菌懸濁液を含む注射用製剤の形態で非経口的に投与され得る。例えば、医薬組成物は、医薬的に許容可能な媒介物または媒体（滅菌水及び生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定化剤、香味付け用添加物、希釈剤、媒介物、保存剤、結合剤など）と免疫抑制剤とを適切に組み合わせた後、一般的に認められた薬務に必要な単位剤形において混合することによって製剤化され得る。免疫抑制剤は、指定の範囲に入る適切な用量となる量で医薬調製物に含められる。油性液体の例としては、限定されないが、ゴマ油及び大豆油が挙げられ、油性液体は、可溶化剤としての安息香酸ベンジルまたはベンジルアルコールと混合され得る。含められ得る他の物品は緩衝剤であり、こうした緩衝剤は、リン酸緩衝剤または酢酸ナトリウム緩衝剤、無痛化剤（プロカイン塩酸塩など）、安定化剤（ベンジルアルコールまたはフェノールなど）、及び抗酸化剤などである。製剤化された注射用物は、適切なアンプル中に包装され得る。

【0241】

本明細書に記載されている１つまたは複数の免疫抑制剤を含む組成物は、イムノリポソーム組成物において製剤化され得る。このような製剤は、当該技術分野で知られる方法によって調製することができる。増強された循環時間を有するリポソームが、例えば、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。

【0242】

ある特定の実施形態では、組成物は、埋め込み及びマイクロカプセル化された送達系を含む、制御放出製剤などの、迅速放出に対する免疫抑制剤を保護することになる担体と共に製剤化され得る。生分解性の生体適合性ポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸が使用され得る。このような製剤の調製のための多くの方法は当該技術分野で知られている。例えば、J. R. Robinson (1978) "Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems," Marcel Dekker, Inc., New Yorkを参照のこと。

【0243】

さまざまな実施形態において、皮下投与は、デバイスによって達成することができ、こうしたデバイスは、シリンジ、充填済みシリンジ、自己注射器（例えば、使い捨てまたは再利用が可能なもの）、ペン型注射器、パッチ注射器、ウェアラブル注射器、皮下注入セットを備えた携帯型シリンジ注入ポンプ、または皮下注射のために免疫抑制剤と組み合わせるための他のデバイスなどである。

【0244】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、局所投与によって対象に治療的に送達され得る。本明細書で使用される「局所投与」または「局所送達」は、組成物または薬剤がその所期の標的組織または標的部位へと血管系を介して輸送されることに依存しない送達を指し得る。例えば、組成物は、組成物もしくは薬剤を注射もしくは埋め込むことによって送達され得るか、または組成物もしくは薬剤を含むデバイスを注射もしくは埋め込むことによって送達され得る。ある特定の実施形態では、組成物もしくは薬剤またはその１つ以上の構成成分は、標的組織または標的部位の近傍への局所投与後に、投与部位ではない所期の標的組織または標的部位へと拡散し得る。

【0245】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は単位剤形中に存在し、この単位剤形は自己投与に適したものであり得る。そのような単位剤形は、容器に含めて提供することができ、この容器は、典型的には、例えば、バイアル、カートリッジ、充填済みシリンジ、または使い捨てペンである。ｄｏｓｅｒ（米国特許第６，３０２，８５５号に記載のｄｏｓｅｒデバイスなど）も（例えば、本明細書に記載の注射系と共に）使用され得る。

【0246】

水剤は、本明細書に記載の組成物の治療的に有効な量を含み得る。このような有効な量は、投与される組成物の作用、または複数の薬剤が使用される場合は組成物と１つまたは複数の追加の活性薬剤との複合作用に部分的には基づいて当業者によって容易に決定され得る。本明細書に記載の組成物の治療的に有効な量はまた、個体において所望の応答、例えば、少なくとも１つの状態パラメーターの軽快、例えば、補体介在性障害の少なくとも１つの症状の軽快を誘発する、疾患状態、個体の年齢、性別、及び体重、ならびに組成物（及び１つまたは複数の追加の活性薬剤）の能力などの要因に従って異なり得る。例えば、本明細書に記載の組成物の治療的に有効な量は、当該技術分野で知られるかまたは本明細書に記載の特定の障害、及び／または特定の障害の症状のいずれか１つを阻害（その重症度の減弱化またはその発生の排除）及び／または予防することができる。治療的に有効な量は、組成物の毒性作用または有害作用のいずれにも、治療的に有益な作用が勝る量である。

【0247】

本明細書に記載の免疫抑制剤組成物の、対象における障害を処置または予防できる適切な用量は、さまざまな要因に依存し得、こうした要因には、例えば、治療すべき対象の年齢、性別、及び体重、ならびに使用される特定の阻害剤化合物が含まれる。対象に投与される用量に影響する他の要因には、例えば、障害の型または重症度が含まれる。他の要因には、例えば、対象が同時に罹患しているまたは以前に罹患していた他の医学的障害、対象の総体的な健康、対象の遺伝的素因、食事、投与時間、排泄速度、薬物併用、及び対象に施される任意の他の追加の治療薬が含まれ得る。任意の特定の対象に対する特定の用量及び処置レジメンは、治療する医師の判断に基づいて調整されてもよいことも理解されるべきである。

【0248】

さまざまな実施形態において、免疫抑制レジメンは、本明細書に開示されるように、（ｉ）ＩＬ－１受容体アンタゴニストなどのインターロイキン－１（ＩＬ－１）シグナル阻害剤、（ｉｉ）ＩＬ－６シグナル阻害剤、（ｉｉｉ）コルチコステロイド、及び（ｉｖ）カルシニューリン阻害剤のいずれかまたはすべてを含み、それぞれは、投与のために独立して製剤化されてもよい、及び／または注射、例えば、静脈内または皮下への注射によって投与されてもよい。さまざまな実施形態において、本明細書に開示されるように、免疫抑制レジメンは、（ｉ）アナキンラ、（ｉｉ）トシリズマブ、（ｉｉｉ）デキサメタゾン、及び（ｉｖ）タクロリムスのいずれかまたはすべてを含み、それぞれは、投与のために独立して製剤化されてもよい、及び／または注射、例えば、静脈内または皮下への注射によって投与されてもよい。誤解を避けるために記載すると、免疫抑制レジメンにおける本明細書において提供される複数の免疫抑制剤のいずれかの組合せについて、免疫抑制剤のぞれぞれは、投与のためにそれぞれ独立して製剤化されてもよい、及び／または注射、例えば、静脈内または皮下への注射によって投与されてもよい。

【0249】

免疫抑制レジメンの適用。当業者に認識されるように、遺伝子治療は、多くの使用に関するプラットホームであり、遺伝子治療のプラットホームは、遺伝子治療の技術分野における一般的な適用性と多くの個体適用に対する特異的適用性の両方を有することも理解されなければならない。限定されないが、法外なコスト及び技術的複雑性を含む遺伝子治療の方法において使用するための幹細胞を操作するエクスビボ方法の不利益によって、本明細書に記載されるインビボ遺伝子治療の改善された方法は、遺伝子治療の技術分野において、広範な変化する可能性のある価値を有する。遺伝子治療の技術分野に対する本開示の方法の既に明らかな一般的な適用性にもかかわらず、いくつかの特異的適用の例が本明細書に記載される。

【0250】

ある特定の適用の例では、免疫抑制レジメンは、造血幹細胞を形質導入するウイルス遺伝子治療ベクターと組み合わせて、必要に応じて、造血幹細胞を骨髄から動員する幹細胞動員レジメンとさらに組み合わせて、使用され得る。造血幹細胞は、例えば、アデノウイルス遺伝子治療ベクター、例えば、ＣＤ４６を標的とするアデノウイルス遺伝子治療ベクターによって形質導入され得る。さまざまな実施形態において、造血幹細胞の形質導入は、さまざまな特定の疾患、例えば、鎌状赤血球貧血、サラセミア、中間型サラセミア、血友病Ａ、血友病Ｂ、フォン・ヴィレブランド病、第Ｖ因子欠乏症、第ＶＩＩ因子欠乏症、第Ｘ因子欠乏症、第ＸＩ因子欠乏症、第ＸＩＩ因子欠乏症、第ＸＩＩＩ因子欠乏症、ベルナール・スーリエ症候群、または灰色血小板症候群を処置するための手段として使用することができる。例えば、ＣＤ４６を標的とするアデノウイルスベクターは、造血幹細胞に対してβ－グロビン及び／またはγ－グロビンを発現する、及び／またはその発現を増加させる治療用ペイロードを送達することによって、サラセミアまたは中間型サラセミアを処置するために使用することができる。別の例では、ＣＤ４６を標的とするアデノウイルスベクターは、造血幹細胞において第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子を発現させる、及び／またはその発現を増加させる治療用ペイロードを送達することによって、血友病（例えば、血友病Ａまたは血友病Ｂ）を処置するために使用することができる。別の例では、ＣＤ４６を標的とするアデノウイルスベクターは、遺伝子編集によって、鎌状赤血球貧血を引き起こす遺伝病変の修正のために治療用ペイロードを送達することによって、鎌状赤血球貧血を処置するために使用することができる。ウイルス遺伝子治療ベクターの適用の例は、例えば、２０１９年７月２日に出願された米国仮特許出願第６２／８６９，９０７号（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）に、ならびに特にウイルス遺伝子治療ベクター及びウイルス遺伝子治療の適用に関して、さらに開示されている。

【0251】

本開示は、本開示のウイルス遺伝子治療ベクター及び免疫抑制レジメンを含むウイルス遺伝子治療が、例えば、免疫抑制レジメンまたはその薬剤を含まない参照と比較して、ウイルス遺伝子治療を受ける対象において引き起こされる免疫毒性及び／または炎症を低下させるという理解を包含する。本開示のウイルス遺伝子治療ベクター及び免疫抑制レジメンを含むウイルス遺伝子治療によって引き起こされる低減された免疫毒性及び／または炎症が、例えば、免疫抑制レジメンまたはその薬剤を含まない参照と比較して、免疫毒性及び／または炎症の１つまたは複数のバイオマーカーのレベルの低下を含むという理解も本開示に含まれる。炎症のバイオマーカーには、限定されないが、ＩＦＮ－ｇ、ＴＮＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、及びＩＬ－６が含まれる。よって、本開示は、ＩＦＮ－ｇ、ＴＮＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、及びＩＬ－６のうちの１つまたは複数のいずれかが、ウイルス遺伝子治療ベクターを含むが、免疫抑制レジメンまたはその薬剤を含まないウイルス遺伝子治療を受けている対象などの参照と比較して、本開示のウイルス遺伝子治療ベクター及び免疫抑制レジメンを含むウイルス遺伝子治療を受けている対象において、低下（例えば、有意に低下、例えば、０．０５未満のｐ値によって）され得ることを包含する。さまざまな実施形態において、ＩＦＮ－ｇ、ＴＮＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、及びＩＬ－６のうちの１つまたは複数のいずれかのレベルの定性的または定量的な変化、レベルの変化の割合、またはレベルの変動性は、例えば、ＥＬＩＳＡまたはサイトカインビーズアレイを含む当該技術分野で知られる方法によって決定される。

【0252】

キット。さまざまな実施形態において、本開示は、本開示の方法に従ってインビボ遺伝子治療方法を実施するためのキットも提供する。例えば、キットは、（ｉ）インターロイキン－１（ＩＬ－１）シグナル阻害剤などの炎症性シグナル阻害剤、例えば、アナキンラ、（ｉｉ）ＩＬ－６シグナル阻害剤、例えば、トシリズマブ、（ｉｉｉ）コルチコステロイド、例えば、デキサメタゾン、（ｉｖ）カルシニューリン阻害剤、例えば、タクロリムス、（ｖ）ＴＮＦ－αシグナル阻害剤、及び（ｖｉ）ＪＡＫシグナル阻害剤の１、２、３、４、５、または６つのいずれかから選択される免疫抑制剤（それらのいずれかまたはすべてが、存在する場合、本明細書に記載される１日用量または他の用量、または半日用量に対応する単位剤形で提供され得る）を含む容器（必要に応じて、例えば、インビボ遺伝子治療において使用するための書面の使用説明書を含む）を含んでもよい。ある特定の例では、キットは、（ｉ）インターロイキン－１（ＩＬ－１）シグナル阻害剤、例えば、アナキンラ、（ｉｉ）ＩＬ－６シグナル阻害剤、例えば、トシリズマブ、（ｉｉｉ）コルチコステロイド、例えば、デキサメタゾン、及び（ｉｖ）カルシニューリン阻害剤、例えば、タクロリムスのうちの１、２、３、または４つのいずれかから選択される免疫抑制剤（それらのいずれかまたはすべてが、存在する場合、本明細書に記載される１日用量または他の用量、または半日用量に対応する単位剤形で提供され得る）を含む容器（必要に応じて、例えば、インビボ遺伝子治療において使用するための書面の使用説明書を含む）を含んでもよい。さまざまな実施形態において、キットは、造血幹細胞の循環を増加させる、及び／または骨髄において隔絶された造血幹細胞を動員して骨髄をコンパートメント中に排出する（これらは、ベクターによるインビボ形質導入に利用可能である）幹細胞動員剤、例えば、Ｇ－ＣＳＦ及びプレリキサホル／ＡＭＤ３１００（それらのいずれかまたはすべてが、存在する場合、本明細書に記載される１日用量または他の用量に対応する単位剤形で提供され得る）を含む容器も含んでもよい。さまざまな実施形態において、キットは、ベクターによってインビボで形質導入された造血幹細胞を選択するものなどの選択剤、例えば、Ｏ６－ベンジルグアニン（Ｏ^６ＢＧ）及び１，３－ビス（２－クロロエチル）－１－ニトロソ－ウレア （ＢＣＮＵ）（Ｏ^６ＢＧ／ＢＣＮＵ）（それらのいずれかまたはすべてが、存在する場合、本明細書に記載される１日用量または他の用量に対応する単位剤形で提供され得る）を含む容器も含んでもよい。

【0253】

実施形態例：
実施形態１． 哺乳動物対象におけるインビボ遺伝子治療の方法であって、炎症性シグナル阻害剤を含む免疫抑制レジメンを前記対象に投与すること、及びウイルス遺伝子治療ベクターの少なくとも１用量を前記対象に投与することを含む、方法。
実施形態２． 哺乳動物対象から幹細胞を取り出すことなく、前記対象の幹細胞を形質導入する方法であって、炎症性シグナル阻害剤を含む免疫抑制レジメンを投与された対象にウイルス遺伝子治療ベクターを送達することを含む、方法。
実施形態３． 前記炎症性シグナル阻害剤が、インターロイキン－１（ＩＬ－１）シグナル阻害剤を含み、必要に応じて、前記ＩＬ－１シグナル阻害剤が、ＩＬ－１受容体（ＩＬ－１Ｒ）アンタゴニストを含み、実施形態１または２に記載の方法。
実施形態４． 前記ＩＬ－１Ｒアンタゴニストが、アナキンラを含む、実施形態３に記載の方法。
実施形態５． 前記免疫抑制レジメンが、インターロイキン６（ＩＬ－６）受容体アンタゴニストをさらに含む、実施形態１～４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６． 前記ＩＬ－６受容体アンタゴニストが、トシリズマブを含む、実施形態５に記載の方法。
実施形態７． 前記免疫抑制レジメンが、コルチコステロイドをさらに含む、実施形態１～６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態８． 前記コルチコステロイドが、デキサメタゾンを含む、実施形態７に記載の方法。
実施形態９． 前記免疫抑制レジメンが、カルシニューリン阻害剤をさらに含む、実施形態１～８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１０． 前記カルシニューリン阻害剤が、タクロリムスを含む、実施形態９に記載の方法。
実施形態１１． 前記免疫抑制レジメンが、ＴＮＦ－αシグナル阻害剤をさらに含む、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１２． 前記ＴＮＦ－αシグナル阻害剤が、エタネルセプト、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、及び／又はゴリムマブを含む、実施形態１１に記載の方法。
実施形態１３． 前記免疫抑制レジメンが、ＪＡＫシグナル阻害剤をさらに含む、実施形態１～１２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１４． 前記ＪＡＫシグナル阻害剤が、バリシチニブ、トファシチニブ、ルキソリチニブ、及び／又はフィルゴチニブを含む、実施形態１３に記載の方法。
実施形態１５． 前記免疫抑制レジメンの前記投与が、前記ベクターの第１の用量の投与の前の日に；前記ベクターの第１の用量の投与の日に；前記ベクターの１つまたは複数の後続用量の投与の日に；前記ベクターの第１の用量の投与の日と前記ベクターの最後の用量の投与の日との間の毎日に；及び／または前記ベクターの最後の用量の投与の日の後の１日、２日もしくはそれよりも多い日数の毎日に、ＩＬ－１受容体アンタゴニストを前記対象に投与することを含み、必要に応じて、前記ＩＬ－１受容体アンタゴニストが、アナキンラを含む、実施形態１～１４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１６． 前記免疫抑制レジメンの前記投与が、１日あたりＩＬ－１受容体アンタゴニストの単一用量または１日あたりＩＬ－１受容体アンタゴニストの複数用量を前記対象に投与することを含み、必要に応じて、前記ＩＬ－１受容体アンタゴニストが、アナキンラを含む、実施形態１～１５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１７． 前記免疫抑制レジメンの前記投与が、０．０１～２０ｍｇ／ｋｇ／日のアナキンラを前記対象に投与することを含み、必要に応じて、前記投与が、静脈内投与を含む、実施形態１５または１６に記載の方法。
実施形態１８． 前記免疫抑制レジメンの前記投与が、１０～２００ｍｇ／日のアナキンラを前記対象に投与することを含み、必要に応じて、前記投与が、静脈内投与を含む、実施形態１５または１６に記載の方法。
実施形態１９． 前記免疫抑制レジメンの前記投与が、前記ベクターの第１の用量の投与の前の日に；前記ベクターの第１の用量の投与の日に；前記ベクターの１つまたは複数の後続用量の投与の日に；前記ベクターの第１の用量の投与の日と前記ベクターの最後の用量の投与の日との間の毎日に、及び／または前記ベクターの最後の用量の投与の日の後の１日、２日もしくはそれよりも多い日数の毎日に、ＩＬ－６受容体アンタゴニストを前記対象に投与することを含み、必要に応じて、前記ＩＬ－６受容体アンタゴニストが、トシリズマブを含む、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２０． 前記免疫抑制レジメンの前記投与が、１日あたりＩＬ－６受容体アンタゴニストの単一用量または１日あたりＩＬ－６受容体アンタゴニストの複数用量を前記対象に投与することを含み、必要に応じて、前記ＩＬ－６受容体アンタゴニストが、トシリズマブを含む、実施形態１～１９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２１． 前記免疫抑制レジメンの前記投与が、１～１５ｍｇ／ｋｇ／日のトシリズマブ、１～１２ｍｇ／ｋｇ／日のトシリズマブ、１～１０ｍｇ／ｋｇ／日のトシリズマブまたは５～２００ｍｇ／日のトシリズマブを前記対象に投与することを含み、必要に応じて、前記投与が、静脈内投与を含む、実施形態１９または２０に記載の方法。
実施形態２２． 前記免疫抑制レジメンの前記投与が、前記ベクターの第１の用量の投与の前の日に；前記ベクターの第１の用量の投与の日に；前記ベクターの１つまたは複数の後続用量の投与の日に；前記ベクターの第１の用量の投与の日と前記ベクターの最後の用量の投与の日との間の毎日に、及び／または前記ベクターの最後の用量の投与の日の後の１日、２日もしくはそれよりも多い日数の毎日に、コルチコステロイドを前記対象に投与することを含み、必要に応じて、前記コルチコステロイドが、デキサメタゾンを含む、実施形態１～２１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２３． 前記免疫抑制レジメンの前記投与が、１日あたりコルチコステロイドの単一用量または１日あたりコルチコステロイドの複数用量を前記対象に投与することを含み、必要に応じて、前記コルチコステロイドが、デキサメタゾンを含む、実施形態１～２２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２４． 前記免疫抑制レジメンの前記投与が、０．１～１０ｍｇ／ｋｇ／日のデキサメタゾンを前記対象に投与することを含み、必要に応じて、前記投与が、静脈内投与を含む、実施形態２２または２３に記載の方法。
実施形態２５． 前記免疫抑制レジメンの前記投与が、前記ベクターの第１の用量の投与前の４日間の毎日に；前記ベクターの第１の用量の投与の日に；前記ベクターの１つまたは複数の後続用量の投与の日に、及び／または前記ベクターの第１の用量の投与の日と前記ベクターの最後の用量の投与の日との間の毎日に、及び／または前記ベクターの最後の用量の投与の日の後の１日、２日もしくはそれよりも多い日数の毎日に、カルシニューリン阻害剤を前記対象に投与することを含み、必要に応じて、前記カルシニューリン阻害剤が、タクロリムスを含む、実施形態１～２４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２６． 前記免疫抑制レジメンの前記投与が、１日あたりカルシニューリン阻害剤の単一用量または１日あたりカルシニューリン阻害剤の複数用量を前記対象に投与することを含み、必要に応じて、前記カルシニューリン阻害剤が、タクロリムスを含む、実施形態１～２５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２７． 前記免疫抑制レジメンの前記投与が、０．００１～０．１ｍｇ／ｋｇ／日のタクロリムスを前記対象に投与することを含み、必要に応じて、前記投与が、皮下投与を含む、実施形態２５または２６に記載の方法。
実施形態２８． 前記方法が、１つまたは複数の免疫抑制剤を含まない対照と比較して、（ｉ）ＩＦＮ－ｇ、ＴＮＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、もしくはＩＬ－６のうちの１つまたは複数の量の有意な増加を引き起こさないか、または（ｉｉ）ＩＦＮ－ｇ、ＴＮＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、もしくはＩＬ－６のうちの１つまたは複数の量の有意に小さい増加を引き起こし、必要に応じて、前記対照が、（ａ）前記炎症性シグナル阻害剤、（ｂ）前記ＩＬ－６受容体アンタゴニスト、（ｃ）前記コルチコステロイド、及び（ｄ）前記カルシニューリン阻害剤から選択される１つまたは複数の免疫抑制剤を含まず、必要に応じて、前記量が、ＥＬＩＳＡ及び／またはサイトカインビーズアレイによって測定される、実施形態１～２７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２９． 幹細胞動員レジメンを前記対象に投与することをさらに含む、実施形態１～２８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３０． 前記ベクターが、選択可能マーカーをコードする核酸配列を含み、必要に応じて、前記選択可能マーカーが、ＭＧＭＴ^{Ｐ１４０Ｋ}を含む、実施形態１～２９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３１． 前記方法が、選択剤を前記対象に投与することを含み、必要に応じて、前記選択可能マーカーが、ＭＧＭＴ^{Ｐ１４０Ｋ}であり、前記選択剤が、Ｏ^６ＢＧ／ＢＣＮＵを含む、実施形態３０に記載の方法。
実施形態３２． 前記選択剤が、１つまたは複数の用量において前記対象に投与され、必要に応じて、前記選択剤の第１の用量が、前記対象への前記ベクターの第１の用量の投与の約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約５週間、約６週間、約７週間、約８週間、約９週間、及び／または約１０週間後に、前記対象に投与される、実施形態３０または３１に記載の方法。
実施形態３３． 前記ベクターが、注射によって前記対象に投与され、必要に応じて、前記注射が、静脈内または皮下投与を含む、実施形態１～３２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３４． 前記ベクターの少なくとも第１の用量が、１キログラムあたり少なくとも１Ｅ１０個、少なくとも１Ｅ１１個、または少なくとも１Ｅ１２個のウイルス粒子（ｖｐ／ｋｇ）を含む、実施形態１～３３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３５． 前記ベクターが、少なくとも１Ｅ１０ｖｐ／ｋｇ、少なくとも１Ｅ１１ｖｐ／ｋｇ、少なくとも１Ｅ１２ｖｐ／ｋｇ、少なくとも２Ｅ１２ｖｐ／ｋｇ、または少なくとも３Ｅ１２ｖｐ／ｋｇの総投薬量で投与される、実施形態１～３４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３６． 前記ベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アルファウイルスベクター、フラビウイルスベクター、ラブドウイルスベクター、麻疹ウイルスベクター、ニューカッスル病ウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、またはピコルナウイルスベクターを含む、実施形態１～３５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３７． 前記ベクターが、アデノウイルスベクターを含む、実施形態１～３５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３８． 前記ベクターが、Ｂ群アデノウイルスベクターを含む、実施形態１～３７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３９． 前記ベクターが、Ａｄ５／３５またはＡｄ３５アデノウイルスベクターを含むか、またはこれに由来し、必要に応じて、前記ベクターが、Ａｄ３５^＋＋またはＡｄ５／３５^＋＋アデノウイルスベクターを含む、実施形態１～３８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４０． 前記ベクターが、複製能力がないベクターを含み、必要に応じて、前記複製能力がないベクターが、ヘルパー依存型アデノウイルスベクターを含む、実施形態１～３９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４１． ウイルス遺伝子治療ベクターが、治療ペイロードを含む核酸を含み、前記方法が、標的細胞ゲノムへの前記治療ペイロードの組み込みを容易にする薬剤をコードするサポートベクターを前記対象に投与することをさらに含む、実施形態１～４０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４２． 前記サポートベクターが、前記ウイルス遺伝子治療ベクターと共に前記対象に投与される、実施形態４１に記載の方法。
実施形態４３． 前記サポートベクターが、１キログラムあたり１Ｅ９～１Ｅ１４個のウイルス粒子（ｖｐ／ｋｇ）の総投薬量で投与される、実施形態４１または４２に記載の方法。
実施形態４４． 前記ウイルス遺伝子治療ベクターが、治療ペイロードを含む核酸を含み、前記方法が、幹細胞への前記治療ペイロードの送達を引き起こし、必要に応じて、前記治療ペイロードの送達が、前記幹細胞のゲノムへの前記治療ペイロードの組み込みを含む、実施形態１～４３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４５． 前記ウイルス遺伝子治療ベクターが、タンパク質コード治療ペイロードを含む核酸を含み、前記対象への前記ベクターの投与後に、前記対象のＰＢＭＣの少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％が、前記タンパク質を発現する、実施形態１～４４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４６． 前記対象が、ヒト対象である、実施形態１～４５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４７． 前記ヒト対象が、鎌状赤血球貧血、サラセミア、中間型サラセミア、血友病Ａ、血友病Ｂ、フォン・ヴィレブランド病、第Ｖ因子欠乏症、第ＶＩＩ因子欠乏症、第Ｘ因子欠乏症、第ＸＩ因子欠乏症、第ＸＩＩ因子欠乏症、第ＸＩＩＩ因子欠乏症、ベルナール・スーリエ症候群、灰色血小板症候群を罹患している、実施形態４６に記載の方法。
実施形態４８． 前記免疫抑制レジメンの１つまたは複数の免疫抑制剤の前記投薬レジメンが、前記ウイルス遺伝子治療ベクターの少なくとも１用量の投与後に、前記対象または前記対象由来の試料における免疫毒性バイオマーカーの測定されたレベルに基づき、単位用量、１日用量、総用量、用量の頻度、及び／または用量の総数が増加され、前記測定されたレベルが、免疫毒性を指し示す場合、前記１つまたは複数の免疫抑制剤の前記投薬レジメンが増加される、実施形態１～４７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４９． 前記免疫毒性バイオマーカーが、ＩＬ－Ιβ、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－２３、ＩＬ－２７、ＩＬ－３０、ＩＬ－３６、ＩＬ－１Ｒａ、ＩＬ－２Ｒ、ＩＦＮ－ａ、ＩＦＮ－ｂ、ＩＦＮ－γ、ＭＩＰ－Ｉａ、ΜΙΡ－Ιβ、ＭＣＰ－１、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＶＥＧＦ、ＲＡＮＴＥＳ、ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＦＧＦ－β、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、Ｃ反応性タンパク質、プロカルシトニン、フェリチン、Ｄダイマー、リンパ球の総集団、リンパ球の亜集団、対象温度、及び／又はこれらの組合せを含む、実施形態４８に記載の方法。
実施形態５０． 前記免疫抑制レジメンの１つまたは複数の免疫抑制剤の前記投薬レジメンが、前記ウイルス遺伝子治療ベクターの少なくとも１用量の投与後に、前記対象または前記対象由来の試料における前記ウイルス遺伝子治療ベクターに対する抗体の前記測定されたレベルに基づき、単位用量、１日用量、総用量、用量の頻度、及び／または用量の総数が増加され、前記測定されたレベルが、免疫毒性を指し示す場合、前記１つまたは複数の免疫抑制剤の前記投薬レジメンが増加され、必要に応じて、前記測定されたレベルが、抗体価であり、必要に応じて、前記抗体が、中和抗体である、実施形態１～４９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５１． 前記免疫抑制レジメンの前記１つまたは複数の免疫抑制剤の前記投薬レジメンが、（ｉ）インターロイキン－１（ＩＬ－１）シグナル阻害剤（必要に応じて、前記ＩＬ－１シグナル阻害剤はアナキンラを含む）、（ｉｉ）ＩＬ－６シグナル阻害剤（必要に応じて、前記ＩＬ－６シグナル阻害剤はトシリズマブである）、（ｉｉｉ）コルチコステロイド（必要に応じて、前記コルチコステロイドはデキサメタゾンを含む）、及び（ｉｖ）カルシニューリン阻害剤（必要に応じて、前記カルシニューリン阻害剤がタクロリムスを含む）のうちの１つまたは複数の投薬レジメンを含む、実施形態４８～５０のいずれか１つに記載の方法。

【実施例】

【0254】

（実施例１）
ウイルスベクター、サポートベクター、及び免疫抑制レジメンを含むインビボ遺伝子治療のためのスキーム例。

【0255】

本実施例は、ウイルス遺伝子治療ベクター及びサポートベクターを含むインビボ遺伝子治療のためのプロトコールを提供する。図１に示されるように、ＨＤＡｄサポートベクターは、アデノウイルス逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）の間に位置する、（ｉ）ＥＦ１αプロモーターと作動可能に連結されたＦｌｐｅリコンビナーゼ及び（ｉｉ）ＰＧＫプロモーターと作動可能に連結されたトランスポゼース（ＳＢ１００ｘ）をコードする。スタッファーは、アデノウイルスによって効率的にパッケージングされるサイズのウイルスベクターゲノムを生成するために、サポートベクターにも含まれる。ＨＤＡｄウイルス遺伝子治療ベクターは、β－グロビンプロモーターとβ－グロビン遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）の両方と作動可能に連結され、かつ３’ＵＴＲ及びニワトリ高感受性部位４（ｃＨＳ４；ニワトリβ様グロビン遺伝子クラスター）制御領域と機能可能なようにさらに連結された治療用タンパク質（ｒｈ γ－グロビン）をコードする核酸配列を含む治療用ペイロードを含む。ウイルス遺伝子治療ベクターは、ＰＧＫプロモーターと作動可能に連結されたＭＧＭＴ^{Ｐ１４０Ｋ}選択可能マーカーをコードする核酸配列をさらに（必要に応じて）含む。治療用ペイロードは、転位のためのＳＢ１００ｘ標的である逆方向反復配列（ＩＲ）と隣接し、それによって、治療用ペイロードは、宿主細胞ゲノムに組み込まれ得る。ＩＲは、Ｆｌｐｅに曝露された際に、隣接した核酸を環状化するｆｒｔ部位と順番に隣接し、治療用ペイロードの転位を促進する。ウイルス遺伝子治療ベクターは、アデノウイルスＩＴＲをさらに含む。

【0256】

図２に示されるように、アデノウイルス遺伝子治療ベクターとサポートベクターが混合されて（１：１の比で）、対象に投与するための単一製剤となる。対象は、２日の連続日数のそれぞれにＨＤＡｄ組合せ製剤の２つの用量を受ける。第１の用量は、２０分を通じて対象に投与される５Ｅ１０ｖｐ／ｋｇの用量である。同じ日に後で投与される第２の用量は、３０分を通じて対象に投与される１．６Ｅ１２ｖｐ／ｋｇの用量である。したがって、組み合わせた２つのベクター（１：１の比で）の１日用量の合計は、１．６５Ｅ１２ｖｐ／ｋｇである。すべての用量を静脈内に投与し、続いて、生理食塩水ボーラスを静脈内投与する。図２に示されるウイルス遺伝子治療ベクターレジメンは、以下の表１にさらに記載される。

【0257】

免疫抑制レジメンは、ＨＤＡｄ投与のタイミングに基づいて投与される。図２に示される免疫抑制レジメンは、アナキンラ、トシリズマブ、タクロリムス、及びデキサメタゾンを含む。図２に示される免疫抑制レジメンは、表１にさらに記載される。

【表1】

【0258】

（実施例２）
ウイルスベクター、サポートベクター、免疫抑制レジメン、及び選択剤を含むインビボ遺伝子治療のためのスキーム例。

【0259】

本実施例を、実施例１に示されるプロトコールに加える。本実施例は、ＨＤＡｄウイルス遺伝子治療ベクターが、図１に示されている及び実施例１に選択的に示されているＭＧＭＴ^{Ｐ１４０Ｋ}選択可能マーカーを肯定的に含む。したがって、本実施例は、図３に示されるように、選択剤であるＯ^６ＢＧ／ＢＣＮＵを含む選択レジメンをさらに提供する。図３に示される選択レジメンは、表２にさらに記載される。

【表2】

【0260】

（実施例３）
ウイルスベクター、サポートベクター、免疫抑制レジメン、選択剤、及び幹細胞動員レジメンを含むインビボ遺伝子治療のためのスキーム例。

【0261】

本実施例を実施例１に示されるプロトコール及び／または実施例２に示されるプロトコールに加える。本実施例は、典型的には骨髄中に存在する、造血幹細胞を含む幹細胞の形質導入を改善するために、対象に投与され得る幹細胞動員レジメンを提供する。図４に示されるように、幹細胞動員レジメンの例は、Ｇ－ＣＳＦ及びＡＭＤ３１００を含む。図４に示される選択レジメンは、表３にさらに記載される。

【表3】

【0262】

（実施例４）
ウイルスベクター、サポートベクター、免疫抑制レジメン、選択剤、及び幹細胞動員レジメンを含むインビボ遺伝子治療のためのスキーム例。

【0263】

本実施例は、図５に示される、及び以下に記載される代替のスキームについて記載する。

【0264】

遺伝子導入ベクター。遺伝子導入ベクターである、ＨＤＡｄの組合せ（ＨＤＡｄ－統合）が使用されることになる：このベクターは、下記の導入遺伝子を含み、これらの導入遺伝子は、ＳＢ１００ｘトランスポゼース介在性に無作為にゲノムに組み込まれる：ｉ）赤血球における発現を効率化するための小型ＬＣＲの制御下にあるアカゲザルγ－グロビン遺伝子、ｉｉ）遍在性に活性なＥＦ１ａプロモーターの制御下にあり、Ｏ^６ＢＧ／ＢＣＮＵで形質導入した細胞のインビボでの選択を行うためのアカゲザルＭＧＭＴ^{Ｐ１４０Ｋ}、ｉｉｉ）遍在性に活性なＥＦ１ａプロモーターの制御下にあり、末梢血Ｔ細胞の形質導入試験及びベクターの生体内分布試験の分析を行うためのＧＦＰ。このベクターは、ＨＢＧプロモーター中のＢＣＬ１１ａリプレッサータンパク質結合部位を不活化することによって内在性γ－グロビンを再活性化すると共に、同時に赤血球ｂｃｌ１１ａエンハンサーを不活化する（これによって赤血球細胞におけるＢＣＬ１１ａリプレッサータンパク質の発現が低減される）ためのアデニン塩基エディターをさらに含むことになる。さらに、Ｆｌｐリコンビナーゼ介在性にトランスポゾンが切除されると塩基エディター発現カセットが除去されることになり、その結果、ｉＣａｓ－ＢＥの発現が一過性のものにとどまる。最後に、ＳＢ１００ｘトランスポゼース及びＦｌｐリコンビナーゼを含むベクターが組み込まれることはなく、このベクターは、ＨＳＣ細胞が増殖する間に消失することになる（図６）。

【0265】

処理プロトコール：
ＨＳＣ動員プロトコール及びＯ^６ＢＧ／ＢＣＮＵインビボ選択プロトコールを使用して３匹のＭａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａを用いて６ヶ月の試験を実施することになる（図５）。プロトコールは、１匹の動物の試験から開始されることになる。８週目（最後のインビボ選択サイクルの終了時点）までに重篤な合併症が生じない場合は残りの２匹の動物において試験が繰り返されることになる。

【0266】

動員：
午前中にＧＣＳＦ及びＳＣＦ（各５０μｇ／ｋｇ）が５日間皮下投与されることになる。最後の２日間はＧＣＳＦ／ＳＣＦおよびＡＭＤ３１００（５ｍｇ／ｋｇ）が、午後に皮下投与されることになる。

【0267】

前処理：
ＨＤＡｄ５／３５＋＋注射の１６時間前にデキサメタゾンが４ｍｇ／ｋｇで静脈内投与されることになる。ＨＤＡｄ５／３５＋＋注射の３０分前にメチルプレドニゾロン（２０ｍｇ／ｋｇ）及びデキサメタゾン（４ｍｇ／ｋｇ）が静脈内投与され、同時に、アナキンラ（１００ｍｇ）が皮下投与されることになる。

【0268】

ＨＤＡｄ注射：
ＨＤＡｄが２回静脈内注射されることになる：（ａ）－１日目に低用量（３Ｅ１１ｖｐ／ｋｇを含む２０ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水を２ｍＬ／分で注射）が投与され、（ｂ）０日目に２つの完全用量（１Ｅ１２ｖｐ／ｋｇを含む２０ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水を２ｍＬ／分で注射）が３０分の間隔を空けて投与されることになる。

【0269】

一過性の免疫抑制：
１日目から免疫抑制が開始され、Ｏ^６ＢＧ／ＢＣＮＵの第１の用量の投与（４週目）まで続き、必要に応じて、Ｏ^６ＢＧ／ＢＣＮＵの最後の用量の投与から２週間後まで継続されることになる。この免疫抑制は、０．２ｍｇ／ｋｇ／日のラパマイシン、３０ｍｇ／ｋｇ／日のミコフェノール酸モフェチル、及び０．２５ｍｇ／ｋｇ／日のタクロリムスを含むことになり、これらはすべて、食物を介して経口的に１日１回与えられる。

【0270】

Ｏ^６ＢＧ／ＢＣＮＵを用いるインビボでの選択：
Ｏ^６ＢＧ：１２０ｍｇ／ｍ^２のＯ^６ＢＧを含む２００ｍＬの生理食塩水が少なくとも３０分間にわたって動物に静脈内注入されることになる。Ｏ^６ＢＧの注入開始から６０分後にＢＣＮＵが投与されることになる。次に、ＢＣＮＵの投与から６～８時間後に別の用量のＯ^６ＢＧを含む２００ｍＬの生理食塩水が少なくとも３０分間にわたって動物に静脈内投与されることになる。この処理の１回目は、ＨＤＡｄ注射から４週間後に行われることになり、γ－グロビンマーキング及び血液学的分析に応じて、２週間の間隔を空けて２回目の処理及び３回目の処理（任意選択）が行われることになる。

【0271】

収集データ：
図５に示されるように血液試料が収集されることになる。１日に１回の物理的観察及び１週間に１回の体重測定が実施されることになる。

【0272】

血液試料：
２時間時点の血液試料及び６時間時点の血液試料については、下記のアッセイが実施されることになる：ＣＤ３４＋細胞におけるＧＦＰ＋細胞のパーセント、及びＣＤ３８－／Ｃｄ４５ＲＡ，ＣＤ９０＋細胞におけるＧＦＰ＋細胞のパーセントが定量化されることになり、コロニー形成単位アッセイを使用してＧＦＰ＋コロニーのパーセント、ＳＤＦ１－ａへの遊走、ならびにＣＸＣＲ４及び／またはＶＬＡ－４の発現パーセントが評価されることになる。他のすべての試料について、血液細胞数、化学、ｃ反応性タンパク質、及び炎症促進性サイトカインが測定されることになる。γ－グロビン発現はフローサイトメトリー（赤血球／非赤血球細胞）によって測定されることになり、γ－グロビンの再活性化レベル及びγ－グロビンの付加レベルはＨＰＬＣ及びｑＲＴ－ＰＣＲを使用して測定され、それらのレベルが比較されることになる。サイトスピン調製物を使用してγ－グロビンの免疫蛍光が評価されることになる。ベクターコピー数ならびにＣａｓ９、ＳＢ１００ｘ、及びＦｌｐｅのｍＲＮＡレベルが測定されることになる。白血球（ＣＤ４^＋、ＣＤ８^＋、ＣＤ２５、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＣＲ－７、ＣＤ６２Ｌ、ＦＯＸＰ３、インテグリンαｅβ７）におけるＧＦＰ発現が測定されることになる。

【0273】

骨髄試料：
４日目に骨髄試料が収集されることになり、その後は１ヶ月に１回収集される（図５を参照のこと）。フローサイトメトリーによって骨髄試料の系譜組成が評価されることになる。ＣＤ３４＋細胞中のベクターコピー数も測定されることになる。Ｔｅｒ１１９＋／Ｔｅｒ１１９－マーカーを用いて選別することによってフローサイトメトリーを使用してγ－グロビンが評価されることになる。ＨＰＬＣ及びｑＲＴ－ＰＣＲを使用してγ－グロビンの再活性化レベル及びγ－グロビンの付加レベルが測定され、これらのレベルが比較されることになる。こうした分析に加えて、剖検時にＣＤ３４＋細胞に対する全ゲノムシークエンシングが実施されてＳＢ１００×介在性の組み込み及び塩基エディターによるオフターゲット効果が同定されることになる。ＣＤ３４＋細胞に対してはＲＮＡシークエンシングも実施されて処理前と処理後との間でｍＲＮＡプロファイル及びｍｉＲＮＡプロファイルが比較されることになる。

【0274】

剖検から得られる組織（生殖系列組織及び精液を含む）：
所定の組織学的分析が実施されることになり、主要組織群に対してベクターコピー数の測定が行われることになる。組織切片でのγ－グロビン及びＧＦＰ免疫蛍光の評価が行われることになる。

【0275】

得られる結果：
この実験によってインビボでのＨＳＣの形質導入後に非ヒト霊長類においてＳＢ１００ｘ介在性の遺伝子付加及びＢＥ介在性の内在性γ－グロビンの再活性化の両方が有効であるかが検証されることになる。ＳＣＡ患者が治癒することになる赤血球中γ－グロビン発現レベル（すなわち、成体型アカゲザルグロビンに対するγ－グロビンのレベルが２０％超であるγ－グロビン^＋ＲＢＣが８０％超存在する）がベクターによって達成されることが実証されることになる。長期的な血液学的副作用が存在せず、望ましくないゲノム再編及びＨＳＣのトランスクリプトーム変化が生じないことも実証されることになる。最後に、ＨＤＡｄ５／３５＋＋ベクターの静脈内注射によってメモリーＴ細胞が形質導入されることが実証されることになる。

【0276】

（実施例５）
異常ヘモグロビン症のためのインビボＨＳＣ遺伝子治療：ウイルスベクター、サポートベクター、免疫抑制レジメン、選択剤、及び幹細胞動員レジメンを含むアカゲザルにおけるインビボ遺伝子治療。

【0277】

異常ヘモグロビン症に関する多くの遺伝子治療またはゲノム編集の研究には、造血幹細胞の収集／選択及び遺伝子改変を実施するために高度に洗練された医療施設が必要とされる。加えて、患者は、遺伝子改変細胞の生着を促進するために大量化学療法を受ける。よって、ある特定の遺伝子治療プロトコールは、異常ヘモグロビン症を患っている多くの患者に利用不可能である。この実施例の材料のいくつかは、Li et al. （Blood, 136(Supp. 1): 46-47, 2020; doi.org/10.1182/blood-2020-141468）として公開された。

【0278】

本実施例は、インビボでの造血幹細胞（ＨＳＣ）遺伝子治療を含み、これらの制限を克服する可能性のある高度にポータブルかつスケーラブルな遺伝子治療アプローチを含む。本発明のインビボでのＨＳＣ遺伝子治療アプローチでは、ＨＳＣは、骨髄から動員され、これらが末梢血中で多数循環する間に、静脈内注射されたＨＳＣ指向型のヘルパー依存型アデノウイルスＨＤＡｄ５／３５＋＋遺伝子治療ベクター系により形質導入される（図７Ａの模式図を参照のこと）。形質導入された細胞は骨髄に戻り、そこで長期的に存続する（図７Ｂにおける例示を参照のこと）。遺伝子治療ベクターによってコードされる治療用ペイロードの組み込みは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゼース（ＳＢ１００ｘ）によって無作為なパターンで、またはセーフゲノムハーバー部位への相同組換え修復によって、達成され得る。本実施例では、インビボ選択系の選択可能マーカー（低用量のＯ^６ＢＧ／ＢＣＮＵによる選択に関するｍｇｍｔ^{Ｐ１４０Ｋ}選択可能マーカー）を含むペイロードを含むベクターを用いて、末梢血液細胞において８０～１００％のマーキングレベルを達成する。ＨＤＡｄ５／３５＋＋ベクターの安全性及び効率性は、中間型サラセミア、鎌状赤血球貧血、及び血友病Ａに関するマウスモデルにおいて実証され、表現型の修正が達成された。アデノウイルスベクターの投与が自然免疫応答を誘導することが観察されている（例えば、本開示のある特定の免疫抑制剤をさらに示す図１１Ａの模式図を参照のこと）。マウスにおける観察によって、免疫抑制レジメンの投与がアデノウイルスベクター投与に対する免疫応答を鈍化させ得る可能性をサポートする（図１１Ｂ及び１１Ｃ）。

【0279】

本実施例は、新たな免疫抑制レジメン（デキサメタゾン、ＩＬ－６受容体アンタゴニスト、ＩＬ－１受容体アンタゴニスト、生理食塩水ボーラスＩＶ）が静脈内ＨＤＡｄ５／３５＋＋ベクター投与に関連する副作用を和らげることができたことを示す。３頭のアカゲザルにおけるデータが示される。Ｇ－ＣＳＦ／ＡＭＤ３１００による処置が血液循環中への効率的なＨＳＣ動員をもたらしたこと、及びＨＤＡｄ５／３５＋＋ベクター系（２つの用量で合計１～３×１０^１２ｖｐ／ｋｇ）の後続の静脈内注射の忍容性が良好であったことが示される。Ｏ^６ＢＧとある特定の自己移植プロトコールにおいて使用した用量よりも最大１００分の１低い用量である低用量（１０～２０ｍｇ／ｍ^２）のＢＣＮＵによるインビボ選択の後に、末梢赤血球のガンマ－グロビンマーキングは９０％まで上昇し、試験期間中安定であった（図１５Ａを参照のこと）。赤血球中のガンマ－グロビンレベルは、成体のアルファ１－グロビンの１８％であった（ＨＰＬＣによる）。３日目の骨髄の分析は、３０％の形質導入ＨＳＣを示した。ベクターＤＮＡ生体分布試験は、ほとんどの組織（精巣及びＣＮＳを含む）の非常に低い形質導入か、または形質導入の不在を実証した。骨髄の分析は、効率的で、選択的なＨＳＣの形質導入及び形質導入されたＣＤ３４＋／ＣＤ９０＋細胞の骨髄へのリホーミングを示した。４週目に、前駆細胞コロニー形成細胞の約５％が、組み込まれたベクターによる安定した形質導入を実証し、この頻度はインビボ選択開始後に増加した。ＰＢＭＣにおけるヒトｍｇｍｔ^{Ｐ１４０Ｋ} ｍＲＮＡ発現のレベルは、インビボ選択後にも増加した。

【0280】

結果の概要

【0281】

新たな、最適化された免疫抑制レジメンを使用すると、アデノウイルスベクター（ＨＤＡｄ５／３５＋＋が例として挙げられる）の静脈内投与は検出されたサイトカインの有意な活性化がなく忍容性が非常に良好であった。図１２Ａ～１２Ｃに示されるように、ＩＬ－６シグナル阻害剤（トシリズマブ）及びコルチコステロイド（デキサメタゾン）を含む免疫抑制レジメンで処置したＮＨＰは、アデノウイルスベクター投与の際に強固な免疫応答（血清中ＩＬ－６によって測定される）を経験し、ＩＬ－６シグナル阻害剤（トシリズマブ）、ＩＬ－１シグナル阻害剤（アナキンラ）、及びコルチコステロイド（デキサメタゾン）を含む免疫抑制レジメンを受けているＮＨＰは、同じ測定によって検出可能な免疫応答をほとんど実証しない。さらに、アナキンラのトシリズマブ及びデキサメタゾンとの組合せ（トシリズマブ及びデキサメタゾン単独ではない）は、血清中ＴＮＦαによって測定したアデノウイルスベクター投与に対する免疫応答を抑制した（図１２Ｄ及び１２Ｅ）。こうした結果が一緒になることで、アナキンラ及びアナキンラを含むレジメンによるアデノウイルスベクター投与に対する免疫応答の予期しない強固な調節が実証される。ＨＳＣの効率的な形質導入、低用量のＯ^６ＢＧ／ＢＣＮＵによる形質導入された前駆細胞の効率的なインビボ選択が実証された。本発明者らの知る限りでは、本実施例は、インビボＨＳＣ遺伝子治療が、高用量化学療法による前処理を必要とせず、かつ高度に特殊化された医療施設を必要とせずに、ヒトにおいて実行可能であるという最初の実証である。このアプローチによって、遺伝子治療及びゲノム編集の技術分野のための大きな進歩がもたらされ、限定された医療資源しかない場所に患者を到達させるのに必要なポータビリティ及びアクセシビリティを可能にする。

【0282】

方法の概要

【0283】

使用されるベクター：ＨＤＡｄ５／３５＋＋

【0284】

ベクターペイロード：投与されたベクターは、ＨＤＡｄ５／３５＋＋ドナーベクターとＨＤＡｄ５／３５＋＋サポートベクターとの１：１混合物を含んだ、すなわち、ここで、ドナーベクターは、トランスポゾン及びサポートベクターによってコードされるトランスポゾン組み込み機構を含んだ（図７Ｃ及び８Ａ～８Ｄにおけるドナーベクター及びサポートベクターの例示を参照のこと）。本明細書において提供される特定の例では、サポートベクターはＳＢ１００ｘトランスポゼース及びＦｌｐｅリコンビナーゼをコードし、ドナーベクターはＳＢ認識のためのＩＲを両側に有するトランスポゾン及びＦｌｐｅリコンビナーゼ認識のためのＦＲＴ部位をコードした。本明細書において提供されるある特定の例では、トランスポゾンは、β－グロビンプロモーター／ＬＣＲと作動可能に連結されたヒトガンマグロビンｃＤＮＡ、及びＰＧＫプロモーターと作動可能に連結されたＧＦＰ／ＭＧＭＴ^{ｐ１４０Ｋ}カセットを含んだ（図７Ｄの選択プロトコール例の模式図を参照のこと）。ある特定の例では、ドナーベクターペイロードは、トランスポゾンの外側に、それぞれがＵ６プロモーターの制御下にある、赤血球ｂｃｌ１１ａエンハンサーを標的とするガイド配列及びＨＢＧプロモーター内のＢＣＬ１１Ａ結合部位をコードするアカゲザルガンマグロビン再活性化ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９カセット、ならびにＥＦ１αプロモーターの制御下にあるｓｐＣａｓ９ ｃＤＮＡをさらに含んだ。ある特定の例では、ガンマグロビン再活性化カセットが、３’ ＩＲ（ＳＢ認識に関する）及びｆｒｔ部位（Ｆｌｐ介在性の組換え）の外側に挿入され、再活性化カセットの一過性発現を可能にする。ＨＤＡｄ５／３５＋＋ベクターは、ＨＳＣを選択的に形質導入する（図９Ａ～９Ｄのデータ例を参照のこと）。

【0285】

ＨＤＡｄ５／３５＋＋ベクターを２４時間空けて２回の注入（それぞれ４０分かけて）で投与した。最初の注入（－１日目）は、０．５～１．６５Ｅ１２ｖｐ／ｋｇの間であり；２回目のＨＤＡｄ５／３５＋＋注入（０日目）は、０．５～１．６Ｅ１２ｖｐ／ｋｇの間であった。

【0286】

動員レジメン：－５日目に開始し、０日目まで継続して（６日間の処理）、各動物は、５０μｇ／ｋｇの用量でＧ－ＣＳＦのＳＱ注射を受けた。ＡＭＤ３１００（５．０ｍｇ／ｋｇ）はＳＱで２回受け、１回目の注射は－２日目（１０ＰＭ）であり、２回目の注射は－１日目（１０ＰＭ）であった（図１０Ａ）。動員は、３つのＮＨＰのすべてで有効であった（図１０Ｂ、１０Ｃ、及び１０Ｄ）。

【0287】

免疫抑制レジメン：－２日目に開始し、０日目まで継続して、動物はデキサメタゾン（５．０ｍｇ／ｋｇ）のＩＶ用量を受けた。これに、－１日目に開始して２日目まで継続して８．０ｍｇ／ｋｇの用量でＩＶで与えたＡｃｔｅｍｒａ（登録商標）（トシリズマブ）単独（ＮＨＰ＃１）、または－１日目から開始して２日目まで継続してアナキンラと共にＡｃｔｅｍｒａ（登録商標）（ＩＶ ５０ｍｇ／動物、ＮＨＰ＃２及びＮＨＰ＃３）のいずれかを補充した。

【0288】

【表4】

【0289】

選択レジメン：２８日目と５７日目に、それぞれの動物は、３０分にわたって与えられるＢＣＮＵ（２０ｍｇ／ｍ^２）及びＯ^６ＢＧ（１２０ｍｇ／ｍ^２）のＩＶ注射を受けた。

【0290】

ＨＤＡｄ５／３５＋＋ベクター及びＮＨＰ研究の概観：

【0291】

３頭の雄性のアカゲザルを、使用したＨＤＡｄ５／３５＋＋ベクターあたりＮ＝１を用いるこれらの研究において治療した。ＮＨＰ＃１は、２つのペイロードモジュール：ｉ）ＥＦ１αプロモーターと作動可能に連結されたＭＧＭＴ^{Ｐ１４０Ｋ}選択マーカーと一緒に、小型β－グロビン ＬＣＲと作動可能に連結されたヒトγ－グロビン遺伝子を宿主細胞ゲノムに無作為に組み込むためのトランスポゾンモジュール、及びｉｉ）内在性アカゲザルγ－グロビン発現のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に介在される再活性化のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９モジュールを含有するドナーベクターを受けた（図８Ｂ）。この組合せドナーベクターを、活性の増強されたＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゼース（ＳＢ１００ｘ）（ＨＤＡｄ－ＳＢ）を発現するサポートベクター（その活性は、トランスポゾンを宿主細胞ゲノムに組み込むことによってγ－グロビン遺伝子の付加を介在し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９モジュールの破壊を誘発し、それによって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系の発現及び活性の持続期間を限定する）と同時に注射した（図８Ｂ）。γ－グロビンカセットをセーフゲノムハーバーであるＡＡＶＳ１遺伝子座に標的化して組み込むためのＨＤＡｄ５／３５＋＋ドナーベクターを、ＮＨＰ＃２に注射した（図８Ｃ）。ＮＨＰ＃３に注射したベクターは、ＮＨＰ＃１ベクターに類似したが、ヒトγ－グロビンの代わりにアカゲザルγ－グロビンをコードし、ＮＨＰの導入遺伝子産物に対する免疫応答を最小限にした（図８Ｄ）。

【0292】

３頭の動物のいずれも、登録の時点で検出可能な抗ベクター抗体を有さなかった。予期せずに、ＮＨＰ＃１は、隔離中に抗体を獲得した（力価１：６８０）。ＮＨＰ＃１及び＃３を６ヶ月間モニターした。ＮＨＰ＃２は、タクロリムスの過剰用量（胃カテーテルを介して５日間にわたり与えた）により、ＨＤＡｄ注射後３日目に安楽死させなければならなかった。これにもかかわらず、関連データのセットをこの動物から収集することができた。インビボＨＳＣ選択では、ＮＨＰ＃１は、３０ｍｇ／ｋｇのＯ^６ＢＧと、１０、２０、及び３０ｍｇ／ｋｇのＢＣＮＵとを、それぞれ、４、６、及び８週目に受けた。ＮＨＰ＃３を３０ｍｇ／ｋｇのＯ^６ＢＧと１０、２０、及び２０ｍｇ／ｋｇのＢＣＮＵとで、４、８、及び１３週目に処置した。

【0293】

ＨＳＣ動員。Ｇ－ＣＳＦを４回注射し（ＳＣ、ＡＭ）、それに続いてＡＭＤ３１００（ＳＣ ＰＭ）をＨＤＡｄ注射の１１時間前に与えることによって、ＨＳＣを動員させた。このタイミングで、ヒトでは、動員されたＨＳＣのピークがＡＭＤ３１００投与の１１時間後であると考えられた。以下に概説するように、ヒトとは異なり、ＮＨＰは、赤血球細胞でＣＤ４６（ＨＤＡｄ５／３５＋＋ベクターに対する標的受容体）を発現する。これは、注射したＨＤＡｄ５／３５＋＋粒子の隔絶のリスクを有する。これに対処するために、動員レジメンを修正し、ＨＤＡｄ５／３５＋＋の２回目の注射を与えた（図１０Ａ～１０Ｄ）。

【0294】

免疫抑制：アデノウイルスベクターへの曝露から得られる自然免疫活性化のホールマークは、炎症促進性サイトカインの上昇である。特に、ＩＬ－１及びＩＬ－６シグナル伝達は、アデノウイルスベクターの全身投与による有害作用を介在するのにきわめて重要であると考えられる（Shayakhmetov et al., J Immunol. 174(11): 7310-7319, 2005；Koizumi et al., J Immunol. 178(3): 1767-1773, 2007；Benihoud et al., J Gene Med. 2(3): 194-203, 2000）。ヒト導入遺伝子産物（ＭＧＭＴ^{Ｐ１４０Ｋ}及びγ－グロビン）に対する自然（サイトカイン）応答及び適応免疫応答を最小限にするレジメンは、研究中に進化した（表５）。デキサメタゾン（２ｍｇ／ｋｇ）及びトシリズマブ（８ｍｇ／ｋｇ）を含む予防的免疫抑制レジメンをＮＨＰ＃１に投与した。このレジメンは、ベクター投与の６時間後にピークに達したＩＬ－６及びＴＮＦ－ａの放出を完全に抑制するのに十分ではなかった（図１２Ａ～１２Ｅ）。血清中サイトカインは、２４時間までにベースラインに戻った。新たな免疫抑制レジメン（デキサメタゾン、ＩＬ－６Ｒアンタゴニスト、ＩＬ－１ｂＲアンタゴニスト、生理食塩水ボーラス ＩＶ）は、ＨＤＡｄ５／３５＋＋ベクターの静脈内投与に関連するすべての副作用を和らげた。ＩＶ液体ボーラスを含むことにより、低血圧とそれに続く吐き気が防止された。

【0295】

【表5】

【0296】

注目すべきことに、ＧＣＳＦ／ＡＭＤ３１００動員は、３頭の動物すべてにおいて、０日目から４日目に好中球数の重大な増加をもたらした（図２０も参照のこと）。好中球は、老化の間に放出され得る炎症促進性サイトカインを含有する。ＮＨＰ＃３に投与した免疫抑制レジメンは、１日目と２日目にもアナキンラ／トシリズマブを含むことによって、これを中和することを目的とした。

【0297】

適応免疫応答を抑制するために、ＮＨＰ＃１は、タクロリムス／シロリムス／ＭＭＦを毎日受けた。長期間にわたって与えられると、このレジメンは、胃腸管及び腎臓毒性をもたらした。ＮＨＰ＃３では、したがって、これが骨髄破壊／前処理済アカゲザルにおいて十分であったため、タクロリムス（ＳＣ）のみを投与することを決定した。しかし、本研究は、この研究における動物は十分に免疫応答性であるため、タクロリムス単独では、抗ヒトＭＧＭＴ^{Ｐ１４０Ｋ}抗体（及びＴ細胞応答）の発生を防止できなかったという観察も含んだ（図２１Ａ、２１Ｂも参照のこと）。ＭＭＦ及びＣＴＬＡ４－Ｉｇ（アバタセプト；Ｏｒｅｎｃｉａ（登録商標））による追加の処置によって、ＮＨＰ＃３の免疫抑制を高める試みは、部分的にのみ効果的であった。胃カテーテルを介して与えられた免疫抑制薬物は、重篤な副作用を引き起こし得る。

【0298】

ベクター血清クリアランス：１．６×１０^１２ｖｐ／細胞のＩＶ注射後の血液からのベクターのクリアランスは、２～３時間の半減期を有するＮＨＰ＃２及びＮＨＰ＃３に対して同様のキネティクスを示した（図１９Ａ～１９Ｃ）。ベクターは、注射の９～１０時間後には、もはや検出可能ではなかった。ＮＨＰ＃１では、ベクターゲノムは、注射の２４時間後も依然として検出可能であった。注目すべきことに、ＮＨＰ＃１は、隔離中に抗ＨＤＡｄ５／３５＋＋ ＩｇＧ抗体を獲得し、これにより、免疫複合体の形成と、影響を受けたベクタークリアランスがもたらされる場合があった。全体として、ＨＤＡｄ５／３５＋＋のクリアランスは、例えば、Ａｄ５ベクターのクリアランスよりもはるかにゆっくりであるようであった（Seshidhar et al., Virology. 311(2): 384-393, 2003）。

【0299】

身体の健康及び血液学：積極的な免疫抑制（タクロリムス＋シロリムス＋ＭＭＦ）及びインビボ選択（最後のＢＣＮＵ用量：３０ｍｇ／ｋｇ）によってＮＨＰ＃１において有害な副作用が観察されたが、ＮＨＰ＃３の安全性プロファイルはプロトコール調整（タクロリムスのみ、ＢＣＮＵの最大用量：２０ｍｇ／ｋｇ）後に優れていた（図２０Ａ～２０Ｂ）。臨床兆候も、異常な体重減少も、異常な血液細胞数も、異常な血液化学も観察されなかった。注目すべきことに、Ａｄ５ベクターを注射した動物について期待されるものとは全く対照的に、肝臓トランスアミナーゼは上昇しなかった（Seshidhar et al., Virology. 311(2): 384-393, 2003）（図１３Ａ～１３Ｄを参照のこと）。（ＨＤＡｄ５／３５＋＋ベクターは、肝細胞取込みを回避するよう設計された。）さらに、骨髄における系譜－陽性細胞及びＣＤ３４＋細胞の分析は、使用したＯ^６ＢＧ／ＢＣＮＵの用量が、ＮＨＰ＃３の骨髄及びＨＳＣに影響を与えないことを実証した（図２１Ａ～２１Ｃ）。

【0300】

編集酵素の発現及び抗体応答：ＨＤＡｄ－ＳＢベクターのエピソームの性質及びＣａｓ９自己破壊機構のために（図８Ａを参照のこと）、ゲノム編集酵素（ＳＢ１００ｘ、Ｆｌｐｅ、及びＣａｓ９）の発現は、対応するｍＲＮＡに対するｑＲＴ－ＰＣＲによって示されるように３週目までに失われた（図１６Ｇ～１６Ｉ）。結果として、Ｆｌｐｅ、ＳＢ１００ｘ、及びＣａｓ９ ｍＲＮＡは検出可能であったにもかかわらず、コードされたＦｌｐｅ、ＳＢ１００ｘ、及びＣａｓ９産物に対しては、有意なＩｇＭ及びＩｇＧ抗体の応答は観察されなかったが、ＧＦＰに対する応答は検出された（例えば、ＮＨＰ＃１からのデータに関する図１６Ｃ～１６Ｉを参照のこと）。しかし、期待されたように、ＨＤＡｄ５／３５＋＋の静脈内注射は、ＨＤＡｄウイルスカプシドタンパク質に対して指向化されたＩｇＭ及びＩｇＧ応答を誘発した（例えば、図１６Ａにおいて提供されたＮＨＰ＃１のデータ、図１６Ｂにおいて提供されたＮＨＰ＃３のデータを参照のこと）。これらの応答は、経時的に低下した。注目すべきことに、ＨＤＡｄ注射の時点で、ＮＨＰ＃１は、１：６８０の抗ＨＤＡｄ力価を有しており、これは、４週間の隔絶中にＡｄに曝露されたことに起因する可能性が最も高い。

【0301】

３日目のベクターの生体分布：動物＃２（タクロリムスの偶発的な過剰用量のために３日目に安楽死させた）からの血清及び組織の試料は、新たな免疫抑制レジメン（デキサメタゾン、ＩＬ－６Ｒ、ＩＬ－１ｂＲアンタゴニスト、生理食塩水ボーラスＩＶ）がＨＤＡｄ５／３５＋＋ベクター投与に関連するすべての副作用を和らげることを示した。ベクターＤＮＡ生体分布研究は、ほとんどの組織（精巣及びＣＮＳを含む）の非常に低い形質導入または形質導入の不在を実証した（図２２）。肺、肝臓、及び脾臓におけるベクターシグナルは、残留血液細胞に由来した（動物が組織収集前に５リットルのＰＢＳにより灌流された場合であっても）。２４週目の骨髄試料をＲＮＡ－ｓｅｑに対して使用して、トランスクリプトームへの遺伝子付加／編集の副作用の可能性を評価した（研究開始前に収集した骨髄試料と比較して）（エクセルファイルを参照のこと）。有意な異常は見られなかった。

【0302】

ＰＢＭＣの形質導入：ＰＢＭＣにおけるベクターコピー数（ＶＣＮ）をＨＤＡｄ注射後のさまざまな時点で測定した（図２３Ａ～２３Ｃ）。データは、ＰＢＭＣの初期形質導入を示す。しかし、ベクターシグナルは２週目までに喪失し、これは、分化した血液細胞の自然なターンオーバー及び／またはエピソームベクターのＤＮＡ分解に起因する可能性が最も高い。

【0303】

ＨＳＣの選択的形質導入：ＨＤＡｄ注射後３日目及び８日目の全骨髄単核細胞（ＭＮＣ）及び骨髄ＣＤ３４＋細胞の分析により、ベクター陽性細胞が示された。細胞当たりのベクターコピー数（ＶＣＮ）は、注射したウイルス用量に依存した。重要なことに、データは、動員されたＣＤ３４＋細胞が選択的に形質導入され、次いで、骨髄に戻ることを示した（図２４Ａ～２４Ｄ）。これらの初期の時点で検出されたベクターシグナルは、エピソームベクターのＤＮＡを起源とする可能性が最も高い。

【0304】

安定したＨＳＣ形質導入：導入遺伝子の組み込みを測定するために、骨髄細胞を播種して、ＣＦＵアッセイに供した。コロニー形成／細胞増殖中に、エピソームベクターのほとんどが喪失する（例えば、図１４Ａによって収集し、図１４Ｂ及び１４Ｃにおいて示されるＮＨＰ＃３からのデータを参照のこと）。ＶＣＮが１の単一コロニーからのＤＮＡ分析は、５～１０％の組み込み頻度を示唆した（図２５Ａ及び２５Ｂを参照のこと）。この頻度は、インビボ選択によって有意に増加しなかった。後者は、未分化のＨＳＣ／ＣＦＵのレベルではなく、前駆細胞のレベルで生じると考えられる。

【0305】

ＮＨＰ＃１からのデータ

【0306】

ＮＨＰ＃１は、既存の抗ＨＤＡｄ５／３５＋＋血清抗体を有し、－１日目に０．５×１０^１２ｖｐ／ｋｇのＨＤＡｄ及び０日目に１．２×１０^１２ｖｐ／ｋｇを受けた。このために、初期のＣＤ３４＋細胞の形質導入は、他の２つの動物におけるよりも効率が低かった（図２４Ａ～２４Ｄ、２５Ａ、及び２５Ｂを参照のこと）。それにもかかわらず、γ－グロビンは、２週目より後に末梢赤血球の２０％でフローサイトメトリーにより検出可能となった（図１５Ａ～１５Ｃ）。Ｏ^６ＢＧ／ＢＣＮＵによるインビボ選択によって、γ－グロビンマーキングが一時的に低下し、これは、赤血球前駆細胞への細胞毒性効果による可能性が最も高い。しかし、３回目のサイクルのＯ^６ＢＧ／ＢＣＮＵ処理の後には、γ－グロビン陽性ＲＢＣのパーセンテージが９０％まで上昇し、１８週目付近で一過的に低下した以外は、実験の終わりまで安定なままであった。同様のパターンは骨髄の赤血球前駆細胞においても見られた。ＲＢＣ溶解液のＨＰＬＣ分析によって、本発明者らは、アカゲザルの内在性γ－グロビンを添加したヒトγ－グロビンと識別することが可能になった。γ－グロビンレベルは、それらが結合してＨｂＦを形成するα１グロビン鎖に対して表した。ヒトγ－グロビン鎖は、インビボ選択の完了後にＨＰＬＣによって検出可能となり、１％のα１グロビンで２２週目まで比較的安定なままであった（図２６Ａ、２６Ｂ）。ヒトγ－グロビンに即して、他の導入遺伝子の発現キネティクスは、ヒトｍｇｍｔ^{Ｐ１４０Ｋ}である。インビボ選択によって、ｍｇｍｔ^{Ｐ１４０Ｋ} ｍＲＮＡのレベルは２桁まで増加し、ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡ発現と同等のレベルに達した（細胞当たり２０００のｍＲＮＡコピー）。これは、Ｏ^６ＢＧ／ＢＣＮＵ処理に対する抵抗性を付与し得る強固なレベルである。検出可能なｍｇｍｔ^{Ｐ１４０Ｋ} ｍＲＮＡは、１５週目に、ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの１０％まで低下した。１５週目以降、これは安定したままであった（図２６Ｃ）。インビボ選択は、アカゲザルのγ－グロビンの増加ももたらし、これは、１６週目に始まり、６％のα１グロビンで１５週目にピークに達した（図２７Ａ）。後続の下降は、有害なゲノム再配列によるＣＲＩＳＰＲにより編集された細胞の喪失によるものであり得る。これは、Ｔ７Ｅ１ミスマッチＰＣＲデータによって部分的にサポートされ、１４週目のＨＢＧ１／２プロモーター標的部位において２．５％のインデルを示したが、２１週目には検出不能な切断を示した（図２７Ｂ）。ヒト及びアカゲザルのｍＲＮＡの発現は、対応するタンパク質レベルの発現を反映した。全体として、ヒトのγ－グロビン及びｍｇｍｔ^{Ｐ１４０Ｋ}の発現データは、形質導入された前駆細胞／末梢血液細胞のインビボ選択／拡大を可能にするレベルでのベクターの組み込みを示す。１５週目以降はアカゲザルのγ－グロビンの発現は低下し、フローサイトメトリーにより１５週目以降にＲＢＣで検出された高いγ－グロビンマーキング（図２５Ａ）は、ヒトのγ－グロビン形態の発現に基づく可能性が最も高い。計画された剖検の時点で、ＮＨＰ＃１のゲノム及びトランスクリプトーム分析において異常は見られなかった。

【0307】

ＮＨＰ＃３からの有効性データ

【0308】

この動物は、ＮＨＰ＃１よりも１０分の１低い、１：６６の予備注射による抗ＨＤＡｄ抗体の力価を有した。２．１×１０^１２ｖｐ／ｋｇで注射したウイルス用量は、ＮＨＰ＃１よりも２０％高い。ＮＨＰ＃３は、１５週目までＳＣでタクロリムスを受けた。１８週目に、タクロリムス／ＭＭＦ／アバタセプトにより免疫抑制を再開した。

【0309】

初期ＣＤ３４＋形質導入（ｄ３及び８）及び安定して形質導入されたＣＦＵのパーセンテージは、ＮＨＰ＃１におけるよりも少なくとも２倍高かった（図２４Ａ～２４Ｄ、２５Ａ、及び２５Ｂ）。ＮＨＰ＃３において使用したベクターは、アカゲザルのγ－グロビン遺伝子を含有し、治療用タンパク質に対する免疫応答を低下させた。予期せぬことに、アカゲザルのγ－グロビンは、それをヒト－β－グロビン ＬＣＲと組み合わせた場合に、ヒトγ－グロビン遺伝子よりも低い効率でしか発現しなかった。したがって、ＲＢＣのγ－グロビンマーキング及び発現レベルは、インビボアプローチの可能性を過小評価するものである。３回目のサイクルのインビボ選択後に増加し始めたγ－グロビン－陽性ＲＢＣのパーセンテージは、１８週目には４５％に達したが、マーキングは２１週目までに７％まで低下し、研究の終わり（２８週目）まで比較的安定したままであった（図１７Ａ）。この下降は、骨髄単核細胞においてはあまり顕著ではなかった（図１７Ｂ、１７Ｃ）。ＮＨＰ＃１と同様に、フローサイトメトリーによって測定したγ－グロビンの大多数は、添加したアカゲザルのγ－グロビン遺伝子を起源とした。ＣＲＩＳＰＲにより編集された細胞は喪失したようであった（図２７Ｂ）。

【0310】

ＰＢＭＣにおけるヒトのｍｇｍｔ^{Ｐ１４０Ｋ} ｍＲＮＡ発現レベルも、１回目のインビボ選択の後に増加したが、しかし、２回目と３回目のサイクルの後の増加は鈍化した。ｍｇｍｔ^{Ｐ１４０Ｋ}発現は、タクロリムス＋ＭＭＦ＋アバタセプトによる免疫抑制の再開後にすぐに回復した（図１７Ｄ）。これは、末梢における、及び程度はより低いが骨髄における、導入遺伝子発現細胞を排除することが可能な抗ヒトＭＧＭＴ^{Ｐ１４０Ｋ}免疫応答、特にＴ細胞応答の役割を示す。ヒトＭＧＭＴに対する血清中ＩｇＧ抗体は、この仮説をサポートする（図１８Ａ及び１８Ｂ）。しかしながら、全体として、ＮＨＰ＃１におけるよりも、ＮＨＰ＃３において、より高い導入遺伝子の発現レベルが観察された（図１７Ｅ及び１７Ｆ）。ｍｇｍｔ^{Ｐ１４０Ｋ} ｍＲＮＡと抗体のデータをまとめると、ｍｇｍｔ^{Ｐ１４０Ｋ}レベルが増加する場合は常に（例えば、Ｏ^６ＢＧ／ＢＣＮＵの後）、タクロリムスによって完全に制御することができない免疫刺激がより多く存在すると推測され得る。タクロリムスが２週間中断されると（１５週目～１７週目）、抗ＭＧＭＴ抗体レベルは増加し、ＭＭＦとＣＴＬＡ４－Ｉｇ（アバタセプト）による追加処置のみが免疫応答を部分的に中和する。注目すべきことに、三重の免疫抑制処置が、γ－グロビンとｍｇｍｔ^{Ｐ１４０Ｋ}発現のさらなる下降を停止させた（２２週目～２８週目）。図１８Ａ及び１８Ｂは、ＮＨＰ＃１におけるより積極的な免疫抑制レジメン（タクロリムス／シロリムス／ＭＭＦ）が、抗ＭＧＭＴ免疫応答を和らげることができることも示す。

【0311】

この研究の将来的なＮＨＰでの実施形態は、ｉ）ヒトｍｇｍｔ^{Ｐ１４０Ｋ}遺伝子のこの変異体のアカゲザルバージョンによる置換え（例えば、図１８Ｃを参照のこと）、及びｉｉ）－１、７、１４日目に、及びその後は毎月、アバタセプトを投与し、外来導入遺伝子産物に対するいくらかのレベルの忍容性を誘発すること、のうちの１つまたは複数を含み得る。重要なことに、ヒトの導入遺伝子産物に対する免疫応答は、ヒトにおける問題であるべきではない。

【0312】

アカゲザル赤血球のＣＤ４６。ヒトにおけるのとは異なり、アカゲザル赤血球は、それらの表面にＣＤ４６を有する（図２８Ａ）。ＣＤ４６に対する、ＨＡｄ５／３５＋＋を含むリガンドの結合は、ＣＤ４６の細胞外ドメインの脱落をもたらす（Sakurai et al., Gene Ther. 14(11): 912-919, 2007）。血液中の赤血球がきわめて多いことを考慮すると、ＮＨＰにおける赤血球は、ＩＶ注射したＨＤＡｄ５／３５＋＋ベクター粒子の非特異的隔絶／喪失に関する主要なシンクを創出する。これは、「ベクター用量－応答」研究を困難にもする。アカゲザルの赤血球がインビトロでＨＤＡｄ５／３５＋＋注射をブロックし得ることをサポートするデータを図２８Ｂに示す。一方、Zafar et al.（Cancer Gene Therapy, 2020, doi.org/10.1038/s4147-020-00226-z）による最近のデータは、赤血球へのＡｄ結合は可逆性であることを示す。ＨＤＡｄゲノムの血清クリアランスが緩慢（二相）であること（図１９Ａ～１９Ｃ）、及びＨＤＡｄ注射後の血清中のｓＣＤ４６濃度の変化（図２８Ｃ）は、この観察が正しいことを示し得る。それにもかかわらず、赤血球のＣＤ４６を飽和させるために、高用量のベクターを２サイクルで注射した。急性応答を制御することができるため、これに即することになる。

【0313】

まとめると、この実施例は、とりわけ、ＩＬ－１シグナル阻害剤（例えば、アナキンラ）が、アデノウイルスベクター投与に対するインビボ免疫応答を抑制するのに強力な薬剤であること、ＩＬ－６シグナル阻害剤（例えば、トシリズマブ）及び／またはコルチコステロイド（例えば、デキサメタゾン）などの他の薬剤と組み合わせて使用され得ること、及びアデノウイルスベクターの例（ＨＤＡｄ５／３５＋＋）に対する自然免疫応答を完全に鈍化させ得ることを実証する。これは、これらのベクターに対する自然応答を駆動する際のＩＬ－１及び／またはＩＬ－６の役割を文書化するものである。この実施例は以下についてさらに実証する：ＨＤＡｄ５／３５＋＋によるインビボでのＨＳＣ形質導入は、適応免疫抑制を有する動員されたＮＨＰにおいて安全になされ得る；ＣＦＵの５％が安定して形質導入される（インビボ選択の前に）；末梢血液細胞における導入遺伝子のマーキング／発現がインビボ選択によって増加され得る；完全にインタクトな免疫系に関して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｓ９により編集された細胞は経時的に喪失され得る。

【0314】

（実施例６）
異常ヘモグロビン症のためのインビボＨＳＣ遺伝子治療：ウイルスベクター、サポートベクター、免疫抑制レジメン、選択剤、及び幹細胞動員レジメンを含むアカゲザルにおけるインビボ遺伝子治療。

【0315】

本実施例は、トシリズマブ、アナキンラ、及びデキサメタゾンを含む免疫抑制レジメンの使用をさらに例示する。試薬及び実験設計は、ここで別段に注記した以外は実施例５と同様であった。トシリズマブはＩＬ－６受容体アンタゴニストの例であり、アナキンラはＩＬ－１受容体アンタゴニストの例であり、デキサメタゾンはコルチコステロイドの例である。本開示は、ＩＬ－６受容体アンタゴニスト（例えば、トシリズマブ）とＩＬ－１受容体アンタゴニスト（例えば、アナキンラ）の組合せ、必要に応じてさらに、コルチコステロイド（例えば、デキサメタゾン）との組合せが、予期せぬことに、サイトカインレベル（特にＩＬ－６及び／またはＴＮＦ）の増加の抑制のための強力な組合せであり、そうでなければ、例えば、インビボ遺伝子治療のために哺乳動物に対するウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター）の投与から生じるという認識を含む。本開示の非ヒト霊長類に、トシリズマブ、アナキンラ、及びデキサメタゾンを投与した。追加の薬剤がＮＨＰに投与された程度に、当業者は、このような追加の薬剤は、ウイルスベクターの哺乳動物への投与と併せて、サイトカインレベルの有益な抑制に必要ではないことを認識するであろう。例えば、タクロリムスは、適応免疫応答を抑制するために投与される。

【0316】

ウイルスベクターを哺乳動物対象に全身投与する（例えば、アデノウイルスベクターの投与）ことに関する主要なリスクは、自然免疫系の活性化である。急性自然免疫応答は、ベクター送達の直後に起こり（すなわち、数分から数時間）、用量依存的である。例えば、血清中ＩＬ－６の上昇は、アデノウイルスベクターの全身投与の１時間後に生じ、投与後３～６時間の間にピークレベルに達する可能性がある。この自然免疫応答は、急性毒性を構成するかまたはそれをもたらす可能性があり、サイトカインレベルの上昇は、死をもたらし得るサイトカインストームを含み得る。

【0317】

この実施例は、アナキンラ、トシリズマブ、及びデキサメタゾンが自然免疫活性化を減弱化させ、Ａｄ５／３５＋＋の静脈内投与によってもたらされるサイトカイン放出を実質的に低減するという発見を含む。ＮＨＰ＃４及びＮＨＰ＃５に、トシリズマブ、アナキンラ、及びデキサメタゾンを含む免疫抑制レジメンを投与した（表６を参照のこと）。ＨＤＡｄ投薬の３０分前にアナキンラを投与した。血清中アナキンラ濃度がピークに達する時間は、利用可能な情報から推定すると、皮下投与後２．５～４．５時間の間である。ＮＨＰ＃４及びＮＨＰ＃５において測定したＩＬ－６レベルは、投与された薬剤によるＩＬ－６レベルの抑制を確認するものである（図２９及び３１）。ＮＨＰ＃４及びＮＨＰ＃５において測定したＴＮＦレベルは、投与された薬剤によるＴＮＦレベルの抑制を確認するものである（図３０及び３２）。よって、本実施例は、アナキンラ、トシリズマブ、及びデキサメタゾンの投与が、ＩＬ－６及び／またはＴＮＦレベルで測定した場合、自然免疫応答の抑制に対して有効であることを確認するものである。

【表6】

【0318】

他の実施形態。いくつかの実施形態が記載されたが、基本的開示及び実施例が、本明細書に記載の組成物及び方法を利用するか、またはそれによって包含される他の実施形態を提供し得ることは明らかである。したがって、範囲は、例として代表された特定の実施形態によるよりも、本開示及び添付の特許請求の範囲から理解され得るものによって定義されるべきであることが認識されるであろう。本明細書において引用されたすべての参照文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
配列の概要

【0319】

本明細書に記載の核酸配列及び／またはアミノ酸配列は、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ． §１．８２２に定義されるように、標準的な略語を使用して示される。４ＫＢのファイルサイズを有する、２０２１年４月９日、またはその付近で作成された「Ｆ０５３－０１３１ＰＣＴ＿ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ）」というタイトルのコンピューター可読テキストファイルは、本出願に関する配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0320】

添付の配列表において、配列番号１は、以下のようにアナキンラのアミノ酸配列である：
MRPSGRKSSKMQAFRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKIDVVPIEPHALFLGIHGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAVNITDLSENRKQDKRFAFIRSDSGPTTSFESAACPGWFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYFQEDE

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7A-B】

【図7C-D】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図9A-B】

【図9C-D】

【図10A】

【図10B】

【図10C-D】

【図11A】

【図11B-C】

【図12A-B】

【図12C】

【図12D-E】

【図13A-B】

【図13C-D】

【図14A】

【図14B-C】

【図15A】

【図15B】

【図15C】

【図16A-B】

【図16C-D】

【図16E-F】

【図16G-H】

【図16I】

【図17A】

【図17B-C】

【図17D】

【図17E-F】

【図18A】

【図18B】

【図18C】

【図19A-C】

【図20A】

【図20B】

【図21A-C】

【図22】

【図23A-C】

【図24A-D】

【図25】

【図26A】

【図26B】

【図26C】

【図27】

【図28A】

【図28B-C】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【配列表】

2023521409000001.app

【国際調査報告】