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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-05-24
(54)【発明の名称】一本鎖ＲＮＡの精製方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/10 20060101AFI20230517BHJP
【ＦＩ】
C12N15/10 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022563099
(86)(22)【出願日】2021-04-16
(85)【翻訳文提出日】2022-10-17
(86)【国際出願番号】 EP2021059906
(87)【国際公開番号】W WO2021209597
(87)【国際公開日】2021-10-21
(31)【優先権主張番号】20170191.9
(32)【優先日】2020-04-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521262714
【氏名又は名称】ザルトリウス ビーアイエー セパレーションズ ディー．オー．オー．
(74)【代理人】
【識別番号】110001519
【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ペルシッチ、スペラ
(72)【発明者】
【氏名】チェルニゴイ、ウルフ
(72)【発明者】
【氏名】ドレンツ、ダルコ
(72)【発明者】
【氏名】ギャニオン、ピーター スタンリー
(57)【要約】
一本鎖ＲＮＡを含有する試料を、少なくとも主に前記一本鎖ＲＮＡを結合させるのに十分な条件下で、その表面上に第一級アミノ基及び第二級アミノ基の両方を主に担持する又は第一級アミノ基及び第二級アミノ基のみを担持する固相に適用するステップ、
二本鎖ＲＮＡを脱着するために必要とされるよりも高い濃度の可溶性ピロリン酸アニオンを含む溶出緩衝液を用いて、前記固相の表面上に吸着された前記一本鎖ＲＮＡを前記固相表面（solid surface）から溶出するステップ、
を含む、一本鎖ＲＮＡ精製の方法。
二本鎖ＲＮＡを脱着するために必要とされるよりも高い濃度の可溶性ピロリン酸アニオンを含む溶出緩衝液を用いて、前記固相の表面上に吸着された前記一本鎖ＲＮＡを前記固相表面（solid surface）から溶出するステップ、
を含む、一本鎖ＲＮＡ精製の方法。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
一本鎖ＲＮＡを含有する試料を、少なくとも主に前記一本鎖ＲＮＡを結合させるのに十分な条件下で、その表面上に第一級アミノ基及び第二級アミノ基の両方を主に担持する又は第一級アミノ基及び第二級アミノ基のみを担持する固相に適用するステップ、ピロリン酸（pyrophosphate）濃度が１ｍＭ～１０００ｍＭである溶出緩衝液を用いて、前記固相の表面上に吸着された前記一本鎖ＲＮＡを固相表面（solid surface）から溶出するステップ、
を含む、一本鎖ＲＮＡ精製の方法。
【請求項2】
前記試料を適用した後でありかつ前記一本鎖ＲＮＡを溶出するより前に、前記溶出緩衝液のイオン強度に比べてより高いイオン強度でピロリン酸塩ではないを含有する洗浄緩衝液を用いて前記固相を洗浄するステップが少なくとも１つ提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
第一級アミノ基対第二級アミノ基のモル比が、１／１０～１０／１、又は２／１０～１０／２、又は３／１０～１０／３、又は４／１０～１０／４、又は５／１０～１０／５の範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記固相の表面に吸着された二本鎖ＲＮＡの前記固相表面からの脱着が、一本鎖ＲＮＡを溶出するために必要とされるよりも低い濃度のピロリン酸アニオンを有する緩衝液によって達成される、請求項１～請求項３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記固相からの一本鎖ＲＮＡの溶出が１ｍＭ～５００ｍＭ、又は１ｍＭ～２００ｍＭの範囲、又は好ましくは１ｍＭ～１００ｍＭの範囲のピロリン酸（pyrophosphate）濃度で起こる、請求項１～請求項４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記ピロリン酸（pyrophosphate）が、より低い値からより高い濃度への勾配として緩衝液中で適用される、請求項１～請求項５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記試料中にキレート剤が存在する、請求項１～請求項６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記試料の接触前に、前記固相の表面の環境中にキレート剤が存在する、請求項１～請求項７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記キレート剤がエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコールビス（２－アミノエチルエーテル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸（ＥＧＴＡ）、トリス（２－アミノエチル）アミン、リン酸、クエン酸、及びそれらの組み合わせからなる群より独立して選択される、請求項７又は請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記洗浄緩衝液のイオン強度が、０．５Ｍ～１２Ｍ、又は１Ｍ～１２Ｍ、又は２Ｍ～１２Ｍ、又は４Ｍ～１２Ｍ、又は６Ｍ～１２Ｍの範囲である、請求項２～請求項９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記洗浄緩衝液がカオトロピック塩、特にグアニジニウム塩、チオシアネート、過塩素酸塩及びそれらの組み合わせからなる群より選択されるカオトロピック塩を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
所望される一本鎖ＲＮＡが１０００塩基～２５，０００塩基の範囲のサイズのものである、請求項１～請求項１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
一本鎖ＲＮＡ精製のための、その表面上に第一級アミノ基及び第二級アミノ基の両方を主に担持する又は第一級アミノ基及び第二級アミノ基のみを担持する固相の使用。
【請求項14】
一本鎖ＲＮＡと二本鎖ＲＮＡとの両方を含有する混合物中の一本鎖ＲＮＡから二本鎖ＲＮＡを分離するための、請求項１３に記載の使用、ここで分離には可溶性ピロリン酸アニオンを使用する。
【請求項15】
一本鎖ＲＮＡを含有する試料を、５．５～８．５の範囲のｐＨで、その表面上に第一級アミノ基及び第二級アミノ基の両方を主に担持する又は第一級アミノ基及び第二級アミノ基のみを担持する固相に適用するステップ、１０ｍＭ～１５０ｍＭの範囲のピロリン酸濃度を有する溶出緩衝液の上昇勾配を用いて、前記固相の表面上に吸着された前記一本鎖ＲＮＡを固相表面から溶出するステップ、
を含む、一本鎖ＲＮＡ精製の方法。
【請求項16】
前記試料よりも高いｐＨを有する溶出緩衝液を使用することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記試料を適用した後かつ前記一本鎖ＲＮＡの溶出の前に、前記溶出緩衝液のイオン強度に比べてより高いイオン強度でピロリン酸（pyrophosphate）ではない塩を含有する洗浄緩衝液により前記固相を洗浄するステップが少なくとも１つ提供される、請求項１５に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、二本鎖ｍＲＮＡと一本鎖ｍＲＮＡとの混合物から二本鎖ＲＮＡを除去する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
遺伝子治療用途のためのメッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)の合成は、所望の一本鎖(ｓｓ)ＲＮＡに加えて、二本鎖(ｄｓ)ＲＮＡの望ましくない亜集団を含有する調製物を生じる。これらのｄｓＲＮＡ種は、塩基鎖内の相補配列の鎖内相互作用によって合成後物（post-synthesis）を形成する。ｄｓＲＮＡ配列の形成はまた、隣接するｓｓＲＮＡ分子間における相補的配列との対合によっても起こり得、それによって、鎖内ｄｓ配列も含み得る非特異的鎖間二量体及びより高次の多量体を作出する。二本鎖ＲＮＡは、対象に注射されると、望ましくない潜在的に致死的な免疫応答を誘発するため、これを除去することは精製の格別な目標となる。
【0003】
メッセンジャーＲＮＡ調製物はまた、ｍＲＮＡを合成するために使用されるプラスミド鋳型からの残存ＤＮＡを含有する。ヌクレアーゼ酵素は一般に、ＤＮＡレベルを低下させるために転写後に添加されるが、それらは依然として様々なサイズの断片を残す。メッセンジャーＲＮＡ調製物はさらに、臨床対象が治療に対する免疫応答を開始する可能性を低減するために除去されなければならないタンパク質を含有する。これらのタンパク質には、ＲＮＡポリメラーゼ、及び転写後にＤＮＡプラスミド鋳型を分解するためのヌクレアーゼなどの酵素が含まれる。酵素調製物はさらにそれ自体が、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡ圧縮タンパク質、細胞培養及び宿主細胞タンパク質、酵素断片、酵素凝集体、並びにこれらの様々な種間の安定会合（複合体）を含む、それら自体の調製中に除去されない混入物質（contaminant）を提供する。
【0004】
ｍＲＮＡ調製物からのｄｓＲＮＡの含有量を減少させる方法は公知である。ｄｓＲＮＡ混入のレベルは、セルロースベースのクロマトグラフィー媒体［１～３］を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって低減することができる。吸着のメカニズムは定かではないが、ｄｓＲＮＡはある条件下で結合し、一方、ｓｓＲＮＡは通過する。この方法は実験室規模では有効であるが、容量が低いため負担がかかる。低容量は、製造スケールでは、製造設備の生産性を低下させる、大量の緩衝液、大量の製造領域、及び延長されたプロセス時間を必要とする、大きいカラムに関連する。この方法はまた、処理されたｓｓＲＮＡの希釈を引き起こし、これは、後続の精製工程に負担がかかる生成物体積の増加に関連する。
【0005】
あるいは、ｄｓＲＮＡのレベルは、スチレン－ジビニル－ベンゼン（ＳＤＶＢ）固相を使用するイオン対逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）によって減少させることができる［４－７］。ＲＰＣは、有毒な可燃性有機溶剤を使用するので、火災や爆発のリスクを軽減するために、工業規模では極めて高価な特殊機器を必要とする。ＲＰＣはまた、作業環境における有機溶剤毒性及び有害廃棄物処理問題に関連した安全の問題についてさらなる負担を課す。溶剤の問題に加えて、ＲＰＣ分離は、最良の結果を得るために高温を必要とするというさらなる負担をしばしば課す。
【0006】
アニオン交換クロマトグラフィーは、低分子ｍＲＮＡ（１０００塩基未満）の精製で有用性を示している［８］。今日までに評価されているアニオン交換媒体としては、第四級アミン（ＱＡ）アニオン交換体に言及する、いわゆる強アニオン交換体が挙げられる。いわゆる弱アニオン交換体、特に第三級アミン配位子を用いるジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）アニオン交換体も評価されている。
【0007】
ＤＮＡ及びタンパク質混入物質を大きなｍＲＮＡ(１０００～１００００塩基）から除去することにおいてはアニオン交換クロマトグラフィーの示す有用性は限られており、上昇した動作温度においてのみである［９］。６５℃まで昇温すると、塩化ナトリウム勾配中で大きなｍＲＮＡを溶出することができる。しかしながら、高温操作は、緩衝液、試料、及びカラムがすべて、プロセスの全期間にわたって、事前に平衡化され、特定の操作温度に正確に維持されなければならず、潜在的に数年間、製品の製造寿命の間、すべてのバッチにわたって再現可能に維持されなければならないので、複合的な物流負荷を課す。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
ｓｓＲＮＡとの混合調製物からｄｓＲＮＡを除去するための新規な方法が開発されており、これは公知の方法を超える改善をあらわす。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明によれば、一本鎖ＲＮＡ精製の方法が提供され、前記方法は、
一本鎖ＲＮＡを含有する試料を、少なくとも主に前記一本鎖ＲＮＡを結合させるのに十分な条件下で、その表面上に第一級アミノ基及び第二級アミノ基の両方を主に担持する又は第一級アミノ基及び第二級アミノ基のみを担持する固相に適用するステップ、
二本鎖ＲＮＡを脱着するために必要とされるよりも高い濃度の可溶性ピロリン酸アニオンを含む溶出緩衝液を用いて、前記固相の表面上に吸着された前記一本鎖ＲＮＡを固相表面（solid surface）から溶出するステップ、
を含む。
一本鎖ＲＮＡを含有する試料を、少なくとも主に前記一本鎖ＲＮＡを結合させるのに十分な条件下で、その表面上に第一級アミノ基及び第二級アミノ基の両方を主に担持する又は第一級アミノ基及び第二級アミノ基のみを担持する固相に適用するステップ、
二本鎖ＲＮＡを脱着するために必要とされるよりも高い濃度の可溶性ピロリン酸アニオンを含む溶出緩衝液を用いて、前記固相の表面上に吸着された前記一本鎖ＲＮＡを固相表面（solid surface）から溶出するステップ、
を含む。
【0010】
本発明の方法のある実施形態では、前記試料を適用した後かつ前記一本鎖ＲＮＡの溶出の前に、溶出緩衝液のイオン強度に比べてより高いイオン強度を有する洗浄緩衝液により周囲温度で前記固相を洗浄するステップが少なくとも１つ、提供され得る。
【0011】
本発明の方法のさらなる実施形態において、第一級アミノ基対第二級アミノ基のモル比は、１／１０～１０／１、又は２／１０～１０／２、又は３／１０～１０／３、又は４／１０～１０／４、又は５／１０～１０／５の範囲であり得る。
【0012】
本発明の方法のさらなる実施形態において、前記固相の表面に吸着された二本鎖ＲＮＡの前記固相表面からの脱着は、一本鎖ＲＮＡを溶出するために必要とされるよりも低い濃度のピロリン酸アニオンを有する緩衝液によって達成される。
【0013】
本発明の方法の別の実施形態では、前記固相からの一本鎖ＲＮＡの溶出が１ｍＭ～１０００ｍＭ、又は１ｍＭ～５００ｍＭ、又は１ｍＭ～２００ｍＭの範囲、又は好ましくは１ｍＭ～１００ｍＭの範囲のピロリン酸（pyrophosphate）濃度で起こり得る。
【0014】
特に、前記ピロリン酸（pyrophosphate）は、より低い値からより高い濃度への勾配として緩衝液中で適用され得る。
【0015】
本発明の方法のさらに別の実施形態では、本質的に水性の混合物中に、キレート剤が存在しうる。
【0016】
本発明の方法のさらに別の実施形態では、前記水性混合物の接触前に、前記固相の表面の環境中にキレート剤が存在する。典型的には、キレート剤はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸、エチレングリコールビス（２－アミノエチルエーテル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸（ＥＧＴＡ）、トリス（２－アミノエチル）アミン（ＴＲＥＮ）、リン酸、クエン酸、及びそれらの組み合わせからなる群より独立して選択することができる。
【0017】
本発明の方法の別の実施形態において、前記洗浄緩衝液のイオン強度は、０．５Ｍ～１２Ｍ、又は１Ｍ～１２Ｍ、又は２Ｍ～１２Ｍ、又は４Ｍ～１２Ｍ、又は６Ｍ～１２Ｍの範囲であり得る。
【0018】
本発明の方法のさらなる実施形態では、前記洗浄緩衝液がカオトロピック塩、特にグアニジニウム塩、チオシアネート、過塩素酸塩及びそれらの組み合わせからなる群より選択されるカオトロピック塩を含む。
【0019】
典型的には、所望される一本鎖ＲＮＡは１０００塩基～２５，０００塩基の範囲のサイズのものである。
【0020】
本発明の主題は、一本鎖ＲＮＡ精製のため、特に、一本鎖ＲＮＡと二本鎖ＲＮＡとの両方を含有する混合物中の一本鎖ＲＮＡから二本鎖ＲＮＡを分離するための、その表面上に第一級アミノ基及び第二級アミノ基の両方を主に担持する又は第一級アミノ基及び第二級アミノ基のみを担持する固相の使用であって、分離に可溶性ピロリン酸アニオンを使用するものである。
【0021】
本発明の方法は全てのＲＮＡ調製物に関連するが、特に、大型及び非常に大型（例えば１，０００～２５，０００塩基のサイズ範囲など）のＲＮＡに関連する。この方法は、ピロリン酸アニオンの上昇勾配によって、第一級アミノ基と第二級アミノ基との混合物を担持する固相からのｓｓＲＮＡの溶出を可能にする。この方法は、有機溶媒又はカオトロピック剤の使用を必要とせずに、周囲温度で機能する。より具体的には、ｄｓＲＮＡがより低濃度のピロリン酸アニオンにおいてより早く溶出し、ｓｓＲＮＡはより高濃度のピロリン酸アニオンにおいてより遅く溶出する。ピロリン酸アニオンは、ピロリン酸四ナトリウム、又はピロリン酸四カリウムのような塩、又は異なるカチオンを有するピロリン酸アニオンから形成される塩、又は異なるカチオンとピロリン酸アニオンとを含む複数種類の塩の混合物の形で適用されてもよい。
【0022】
この方法の驚くべき性質は、それが先行技術の教示に反するものであるという事実によって強調される。本技術分野の既公開物では、周囲温度で正に荷電した固相（アニオン交換体）から塩勾配を用いて大型ｓｓＲＮＡを溶出することが不可能であると教示されている。本発明の驚くべき性質は、任意の所与の転写混合物中のｓｓＲＮＡ及びｄｓＲＮＡが組成的に同一であり、それが類似の挙動の期待を生み出すという事実によってさらに強調される。
【0023】
第一級アミノ基と第二級アミノ基との混合物を担持する固相を使用してｄｓＲＮＡからｄｓＲＮＡを分離するピロリン酸アニオンの予想外の能力は、塩化物（１－）のような一価イオンを含む塩と比較して、ピロリン酸（４－）がより高い静電（電荷）価を有することを反映するものと推測されるかもしれない。一価塩化物塩は、中性ｐＨ及び周囲温度では既知の強アニオン交換体又は弱アニオン交換体からｓｓＲＮＡを溶出することができない。また、硫酸塩又はリン酸塩などの中性ｐＨでは、二価のアニオン（２－）塩は溶出できない。弱アルカリ性ｐＨでは、クエン酸塩のような三価のアニオン（３－）塩は溶出できない。カオトロピック塩はいずれの電荷状態でも溶出できない。しかしながら、ピロリン酸（pyrophosphate）がそのより高い電荷価のために作用するという推測は、四価（４－）エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）が中性ｐＨで溶出を達成できないということによって、誤りであると証明される。実験データでは、ピロリン酸アニオンがＱＡなどの強アニオン交換体又はＤＥＡＥなどの弱アニオン交換体からｓｓＲＮＡを溶出することができないことがさらに示される。この化合物については、ピロリン酸アニオンが第一級アミノ基と第二級アミノ基との混合物を担持する固相上で、ｓｓＲＮＡからｄｓＲＮＡの分離をどのように達成するかについての理解が欠けている。したがって、ピロリン酸アニオンがｓｓＲＮＡからｄｓＲＮＡの分離を達成する特定の機構又は複数機構、ピロリン酸が大きなＲＮＡをどのように溶出するか、又は第一級及び第二級アミノ基の混合物を担持する固相上でのみそれが溶出する理由に関しては、理論は見いだされていない。
【0024】
本発明によって調製されるｓｓＲＮＡの品質を高めるためにキレート剤を使用することが推奨される。これは、それ自体がキレート剤である緩衝剤、例えばとりわけリン酸塩及びクエン酸塩を使用することによって、又はキレート剤、例えばとりわけＥＤＴＡ及びＥＧＴＡを添加することによって、達成され得る。
【0025】
本発明の別の予想外の特徴は、ピロリン酸アニオンの勾配を増加させることによってｓｓＲＮＡから残留微量レベルのｄｓＲＮＡを分離する前に、高濃度のピロリン酸（pyrophosphate）ではない塩を導入することによって、コンタミｄｓＲＮＡの大部分を本発明の固相から除去することができることである。このようなｄｓＲＮＡの高度な低減を行うための好ましい塩としては、特に、ＲＮＡの溶解性を維持する傾向があるカオトロピック塩が挙げられる。目的の生成物を溶出する前に混入物質の負荷を低減する技術は知られているが、目的の生成物を溶出するのに必要な塩の濃度よりも低い塩濃度に限られている。溶出前洗浄を使用する本バージョンはそれが、ｓｓＲＮＡからｄｓＲＮＡを分離するために使用されるピロリン酸（pyrophosphate）の濃度よりもはるかに高い濃度でピロリン酸（pyrophosphate）ではない塩を適用することによって機能するので、特異である。例えば、ｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡが、ピロリン酸（pyrophosphate）勾配（典型的には１００ｍＭピロリン酸（pyrophosphate）以下で終わる）で互いから分離される場合、カオトロピック塩での事前洗浄は、６Ｍまでのグアニジン－ＨＣｌ、又は１２Ｍグアニジンチオシアネートで実施され得る。
【0026】
ｃｓＲＮＡをピロリン酸アニオンで溶出する前にｄｓＲＮＡの大部分を単に退かせるだけでなく、高濃度のカオトロピック塩での洗浄を進めることは、さもなければ安定であるｓｓＲＮＡと混入物質との複合体を解離する独特の機会を提供する。これは、本分野において認識され始めたばかりの課題に対する解決策を提供する。核酸は、混入物質との安定な複合体中に存在することがしばしばある。これらの複合体のいくつかは、純粋な核酸と同じ又はほぼ同じ条件下で溶出する。したがって、これらの複合体は、混入物質が独立している場合の特性ではその可能性が排除されているはずであるにもかかわらず、純粋なｓｓＲＮＡ溶出画分であるべきものに該混入物質を持ち込む、トロイの木馬である。高濃度のカオトロピック洗浄液を用いた洗浄は、その混入経路を止める可能性を提供する。カオトロピック塩によるさらなる洗浄の錯体解離性は、キレート剤の存在によって増強することができる。
【0027】
高濃度のピロリン酸（pyrophosphate）ではない塩中の第一級アミノ基と第二級アミノ基の混合物を担持する固相にコンタミｄｓＲＮＡが結合できないことは、アフィニティークロマトグラフィーとして当技術分野で知られている技術に匹敵するワークフローの簡素化をも可能にする。アフィニティークロマトグラフィーは、抗体などの生体特異的リガンドを固相に共有結合させる技術である。抗体の標的を含んでいる混入された試料が固相に適用されると、標的分子のみが捕捉され、一方、混入物質はカラムを通って流れることによって除去される。微量レベルの非結合混入物質を洗い流すためにカラムを洗浄した後、標的分子は、単一の高度に精製された画分中に溶出される。本発明の固相は、正確にこの結果を達成する。ｄｓＲＮＡによって混入された試料は、中性ｐＨで高塩中にロードされる。ｄｓＲＮＡの大部分はカラム中を流れて通過し、それによって除去される。高度に精製されたｓｓＲＮＡは、ピロリン酸（pyrophosphate）での溶出によって濃縮画分中に溶出される。
【0028】
このワークフローの単純化は、本発明の基本的な構成において使用されるものと同じ原理を使用する、わずかにプロセスを変形させたものであり、その原理がｄｓＲＮＡが高濃度の塩の存在下で第一級アミノ固相によって結合されないことであることは、本技術分野の経験者によって認識されるであろう。
【0029】
本発明の最終的な驚くべき特徴は、ＲＮＡとは組成が異なる混入物質の溶出挙動が、ｄｓＲＮＡと同様に溶出するが、ｓｓＲＮＡの溶出とは異なる、ということである。そのような混入物質には、タンパク質及びＤＮＡが含まれ、その両方がｐＨ勾配においてｓｓＲＮＡよりも低い濃度のピロリン酸（pyrophosphate）で溶出する。それらの大部分はまた、ピロリン酸アニオンの上昇勾配によってｓｓＲＮＡからそれらの微量残基を分離する前に固相に適用される塩によっても除去される。
【0030】
発明に係る一般的記載
本発明は、一般的な態様においては、二本鎖メッセンジャーＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ）と一本鎖メッセンジャーＲＮＡ(ｓｓＲＮＡ)との混合物を含有する調製物からｄｓＲＮＡを除去するための固相抽出方法である。
本発明は、一般的な態様においては、二本鎖メッセンジャーＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ）と一本鎖メッセンジャーＲＮＡ(ｓｓＲＮＡ)との混合物を含有する調製物からｄｓＲＮＡを除去するための固相抽出方法である。
【0031】
具体的な態様では、本発明は、第一級アミノ基と第二級アミノ基との混合物を担持する固相からのｍＲＮＡの溶出に関するものであり、ｄｓＲＮＡがｓｓＲＮＡよりも低濃度のピロリン酸アニオンで溶出するという理由により、ｄｓＲＮＡはｓｓＲＮＡから分離される。
【0032】
より具体的な態様では、本発明は１ｍＭ～１０００ｍＭ、又は１ｍＭ～５００ｍＭ、又は１ｍＭ～２５０ｍＭ、又は１ｍＭ～２００ｍＭ、又は１ｍＭ～１００ｍＭ、又は５ｍＭ～１００ｍＭ、又は１０ｍＭ～１００ｍＭ、又は２０ｍＭ、又はより高い範囲、又はより低い範囲、又は中間範囲の濃度範囲にわたるピロリン酸アニオンによるｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡの分離に関する。特定のｓｓＲＮＡを溶出するのに必要な量はそのサイズに依存し、より小さいｓｓＲＮＡ分子は、より大きいｓｓＲＮＡ分子よりも低いピロリン酸濃度で溶出することから、ピロリン酸アニオンの範囲が特定される。
【0033】
別の具体的な態様では、ピロリン酸（pyrophosphate）勾配を用いての第一級アミノ基及び第二級アミノ基の混合物を担持する固相からの結合ｓｓＲＮＡの溶出は、ｐＨ ３．０未満からｐＨ １１．０超、又はｐＨ５．０からｐＨ１１．０、又はｐＨ６．０からｐＨ１１．０、又はｐＨ６．５からｐＨ１０．５、又はｐＨ７．０からｐＨ１０、又はｐＨ７．５からｐＨ９．５、又はｐＨ８．０からｐＨ９．０、又はより高い、より低い、又は中間の範囲で行われ得、好ましくはｐＨ５．５からｐＨ８．５の範囲、特にｐＨ６．５からｐＨ７．５の範囲で行われ得る。範囲が特定されるのは、ｐＨがピロリン酸（pyrophosphate）と相乗的に作用するものであり、ｐＨを増加させることによって、特定のサイズのｓｓＲＮＡを溶出するのに必要なピロリン酸（pyrophosphate）の量を減少させることができるためである。
【0034】
いくつかの実施形態では、ｐＨ及びピロリン酸（pyrophosphate）濃度を同時に変化させることができる。かかる実施形態のいくつかでは、ピロリン酸（pyrophosphate）及びｐＨを並行して増加させることができる。他のかかる実施形態では、ピロリン酸（pyrophosphate）及びｐＨが逆平行様式で増加させることができる。他のかかる実施形態では、ピロリン酸（pyrophosphate）濃度を増加させながら、ｐＨを一定に保つことができる。他のかかる実施形態では、ピロリン酸（pyrophosphate）濃度を一定に保ちながら、ｐＨを上昇させることができる。
【0035】
別の具体的な態様では、溶出中にピロリン酸（pyrophosphate）ではない塩をピロリン酸（pyrophosphate）と組み合わせることができる。いくつかの実施形態では、ピロリン酸（pyrophosphate）ではない塩が１０ｍＭ～２０００ｍＭ、又は５０ｍＭ～１０００ｍＭ、又は１００ｍＭ～５００ｍＭ、又はより高い、より低い、又は中間の範囲、好ましくは１００ｍＭ～１０００ｍＭの範囲の濃度の塩化物塩であり得る。他の実施形態では、ピロリン酸（pyrophosphate）ではない塩が飽和までの濃度で、硫酸塩、リン酸塩、又はカオトロピック塩、例えばグアニジン－ＨＣｌ、又はグアニジンチオシアネート、又はキレート塩であってもよい。
【0036】
別の態様では、本発明は、第一級アミノ基と第二級アミノ基との混合物を担持する固相に結合したｓｓＲＮＡを、ピロリン酸アニオンで溶出する前に、ピロリン酸（pyrophosphate）ではない塩で洗浄する方法に関する。ある実施形態では、ピロリン酸（pyrophosphate）ではない塩の種が好ましくは塩のカオトロピック種、例えば、１００ｍＭ～飽和、又は５００ｍＭ～飽和、又は１Ｍ～飽和、又は２Ｍ～飽和、又は４Ｍ～飽和、又は６Ｍ～飽和、又はより高い、より低い、又は中間の範囲の濃度の、塩、例えば、グアニジン塩酸塩、又はチオシアン酸カリウム、又はグアニジンチオシアネートである。
【0037】
別の態様では、本発明は、第一級アミノ基と第二級アミノ基との混合物を担持する固相に結合したｓｓＲＮＡを、ピロリン酸（pyrophosphate）で溶出する前に、キレート剤で、所望により前溶出塩洗浄と併せて、洗浄する方法に関する。ある実施形態では、キレート剤は、完全飽和までを含む任意の濃度の、任意の種類又は複数種類の混合物でありうる。このような実施形態の一つでは、キレート剤は２ｍＭ～２００ｍＭ、又は５ｍＭ～１００ｍＭ、又は１０ｍＭ～５０ｍＭ、又は２０ｍＭ～２５ｍＭ、又はより低い、又は中間の範囲、又は最大完全飽和までのより高い範囲の濃度のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）であり得る。密接に関連する実施態様において、キレート剤はエチレングリコールビス（２－アミノエチルエーテル）－Ｎ，Ｎ’、Ｎ’ －四酢酸（ＥＧＴＡ）の塩、又はトリス（２－アミノエチル）アミン（ＴＲＥＮ）、リン酸、クエン酸、又は別のキレート剤の塩であってもよく、又は、ＥＤＴＡについて説明したのと同じ範囲に渡る濃度のキレート剤の混合物であってもよい。
【0038】
ある実施形態において、ｓｓＲＮＡはピロリン酸アニオンの連続勾配によって、中性ｐＨで第一級アミノ基と第二級アミノ基との混合物を担持する固相から溶出され、これはピロリン酸（pyrophosphate）濃度の漸進的連続増加を指す線形勾配（linear gradient）としても当該技術分野において公知である。密接に関連する実施形態では、ピロリン酸アニオンの濃度は増分又はステップで変化させることができ、段階的勾配として当技術分野で知られているものを作り出す。別の密接に関連する実施形態では、ピロリン酸アニオンの濃度は単一工程で変化させることができる。
【0039】
本発明のある実施形態では、ピロリン酸（pyrophosphate）ではない塩での処理が以下のいずれかを含むことができる：試料に塩を添加すること、試料の緩衝液を塩含有緩衝液に交換すること、試料の緩衝液を塩含有緩衝液に交換すること、及びｓｓＲＮＡの溶出を含む前記方法の工程を実施するために塩含有緩衝液を使用すること。かかる実施形態のいくつかでは、塩の種類及び／又はそれらの濃度は、前記方法の各ステップで異なり得る。
【0040】
高濃度の、塩化ナトリウム、塩化カリウム、及び塩化リチウムを含むがこれらに限定されない、特定の非カオトロピック塩で、ＲＮＡが沈殿することは、当業者によって認識されるであろう。ＲＮＡを沈殿させる非カオトロピック塩濃度は、試料適用及びｓｓＲＮＡの溶出中に避けるべきであることが理解されよう。このような塩は、固相から非ｓｓＲＮＡ種を退かせるのに役立ち得るので、試料適用後の洗浄中に適用することが有用であり得る。しかしながら、このような場合では大概、所望であれば、カオトロピック塩を使用することが、ＲＮＡ沈殿を引き起こす傾向がより少なく、試料負荷及び／又は溶出におけるそれらの使用を適格とするものであるため、好ましいであろう。
【0041】
前記
本発明のある実施形態では、キレート剤での処理は、ｓｓＲＮＡの溶出を含む方法のステップを実施するために、以下のいずれかを含むことができる：試料へのキレート剤の添加、試料の緩衝液を金属イオン非含有緩衝液へと交換すること、試料の緩衝液をキレート化緩衝液へと交換すること、及び、金属イオン非含有又はキレート化緩衝液を使用すること。かかる実施形態のいくつかでは、キレート剤の種類及び／又はそれらの濃度は、前記方法の各ステップで異なり得る。
本発明のある実施形態では、キレート剤での処理は、ｓｓＲＮＡの溶出を含む方法のステップを実施するために、以下のいずれかを含むことができる：試料へのキレート剤の添加、試料の緩衝液を金属イオン非含有緩衝液へと交換すること、試料の緩衝液をキレート化緩衝液へと交換すること、及び、金属イオン非含有又はキレート化緩衝液を使用すること。かかる実施形態のいくつかでは、キレート剤の種類及び／又はそれらの濃度は、前記方法の各ステップで異なり得る。
【0042】
本発明のある実施形態では、ピロリン酸（pyrophosphate）ではない塩及び／又はキレート剤での処理は、以下のいずれかを含むことができる：試料への塩及びキレート剤の添加、試料の緩衝液を塩及び／又はキレート剤含有緩衝液へと交換すること、試料の緩衝液を塩及び／又はキレート剤含有緩衝液へと交換すること、並びに、ｓｓＲＮＡの溶出を含む前記方法のステップを実施するために塩含有緩衝液及び／又はキレート剤含有緩衝液を使用すること。かかる実施形態のいくつかでは、塩の種類、キレート剤、及びそれらのそれぞれの濃度は、前記方法の各ステップで異なり得る。
【0043】
本発明の方法は当技術分野で慣用の任意の装置を用いて実施することができ、例えば、第一級アミノ基と第二級アミノ基との混合物を担持する固相をクロマトグラフィー装置に配置することができる。クロマトグラフィー装置は、モノリス、充填粒子のカラム、充填ナノファイバーのカラム、織られたナノファイバー、膜吸着剤、又はヒドロゲルであり得る。
【0044】
本発明の方法は、分析用途又は準備（preparative）用途で実施する目的で使用することができる。これはすべてのｍＲＮＡに適用可能であるが、特に、１０００を超える塩基及び潜在的に最大２５，０００塩基を含有するｍＲＮＡに有用である。具体的なクロマトグラフィー条件は、ＲＮＡのサイズ及び適用された試料中の混入物質分布に応じて変化し得る。任意の特定のｓｓＲＮＡ種について最良の分析又は準備結果を達成するために具体的条件を調整することは、数十年間、クロマトグラフィーの技術の実務者に知られているのと同じ実験技能を使用する。
【0045】
この方法の後に、残留ピロリン酸（pyrophosphate）を除去するための様々な方法のいずれかを行うことができる。かかる方法としては、ピロホスファターゼ酵素で試料を処理して、ピロホスフェートを単純な有機ホスフェート化合物に分解することが挙げられよう。しかしながら、精製された又は部分的に精製された生成物に添加された試薬は、それ自体が最終製剤に存在していてはならない。したがって、ほとんどの場合では、ｓｓＲＮＡの純度を増加させる効果も有する後続の方法を用いて、残留ピロリン酸を除去することが好ましかろう。かかる実施形態の一つでは、本発明の方法に続いて、ｓｓＲＮＡ調製物中の混入物質負荷を低減するための有用性を提供することが知られている他の処理方法を行うことができる。候補としては特に、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、セルロースアフィニティークロマトグラフィー、オリゴｄＴリガンドを用いるアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、透析、及び透析濾過が挙げられるが、これらに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【0046】
【図1】中性ｐＨ及び周囲温度でのピロリン酸（pyrophosphate）勾配におけるエチレンジアミンモノリスからのｓｓＲＮＡの溶出を示す。
【図2】中性ｐＨ及び周囲温度でのピロリン酸（pyrophosphate）勾配におけるエチレンジアミンモノリス上のｓｓＲＮＡからのｄｓＲＮＡの分離を示す。
【図3】中性ｐＨ及び周囲温度でのピロリン酸（pyrophosphate）勾配中でのエチレンジアミンモノリス上でのｓｓＲＮＡからのプラスミドＤＮＡの分離を示す。
【図4】中性ｐＨ及び周囲温度でのピロリン酸（pyrophosphate）勾配中のエチレンジアミンモノリス上でのインビトロ転写混合物からのｓｓＲＮＡの分画を示す。
【図5】周囲温度でのピロリン酸（pyrophosphate）勾配におけるエチレンジアミンモノリスによるｄｓＲＮＡとｓｓＲＮＡとの分離に対する、ピロリン酸（pyrophosphate）、ピロリン酸（pyrophosphate）ではない塩、及びｐＨの相乗効果を示す。
【図6】ピロリン酸（pyrophosphate）勾配における、小型～大型のｓｓＲＮＡからの非常に大型のｄｓＲＮＡの分離を示す。
【図7】第一級－第二級アミン混合固相からｓｓＲＮＡを溶出する能力が代替的な四価アニオンには無いことを示す。
【図8】ピロリン酸（pyrophosphate）ではない塩洗浄によるさらなるＤＮＡ除去を、ピロリン酸（pyrophosphate）勾配による溶出と比較する。
【発明を実施するための形態】
【0047】
「第一級アミノ基」という用語は、２個の水素原子の各々に単一共有結合によって連結され、また、炭素原子に単一共有結合によって連結された正に荷電した窒素原子を表す。「第一級アミン」及び「第一級アミン残基」及び「第一級アミンリガンド」という用語は、「第一級アミノ基」という用語と互換的に使用され得る。
【0048】
用語「第二級アミノ基」は、１個の水素原子に単一共有結合によって連結され、また２個の炭素原子のそれぞれに単一共有結合によって連結された正に荷電した窒素原子を表す。用語「第二級アミン」及び「第二級アミン残基」及び「第二級アミンリガンド」は、用語「第二級アミノ基」と交換可能に使用され得る。
【0049】
「第一級アミノ基と第二級アミノ基との混合物を担持する固相」という用語は、第一級アミノ基と第二級アミノ基とが共有結合した固体表面を指す。第三級アミノ基及び第四級アミノ基は、好ましくは存在しないか、又は少数のアミノ基である。負に荷電した残基は存在せざるべきである。非荷電疎水性残基又は水素結合残基が存在してもよい。
【0050】
アミノ基は、リガンド炭素原子を介して固相に直接共有結合されてもよい。あるいはアミノ基は、固相に共有結合しているいわゆるスペーサーアームへの共有結合によって、固相に間接的に結合していてもよい。アミノ基はまた、ジアミノ基、トリアミノ基、テトラアミノ基などのより複雑な構造、又は繰り返しアミノ基を有するポリマーの一部であってもよい。
【0051】
「固相」という用語は、１つ若しくは複数の多孔質膜、１つ若しくは複数の繊維、１つ若しくは複数の多孔質若しくは非多孔質の粒子、モノリス固相（単一のポリマー混合物から合成されたモノリスを含む）、又は、マクロ骨格として最初に合成されたモノリスの上に合成された第二級次リガンド担持ポリマー相を有するいわゆるヒドロゲルの形態である、クロマトグラフィー固相を指し得る。クロマトグラフィーの実施を容易にするために、ハウジング内に固相材料を設けることができる。ハウジング内のクロマトグラフィー固体相は、一般にクロマトグラフィー装置と称され、クロマトグラフィーカラム、又は単にカラムと称されることが多い。
【0052】
第一級アミノ基と第二級アミノ基との混合物を有するクロマトグラフィー固相は公知であり、市販されている。その一例は、東ソー・バイオサイエンス社が製造するトヨパールＮＨ２－７５０Ｆという名称で販売されているものであり、ここで「ＮＨ２」とは第一級アミノ基を指す［www.separations.eu.tosohbioscience.com/solutions/process-media-products/by-mode/ion-exchange/anion-exchange/toyopearl-nh2-750f］。販売資料によれば第一級アミノ基はポリアミンの形態であり、これは、それが固相に共有結合的に固定された反復第一級アミンサブユニットを有するポリマーであることを意味する。そのようなポリマーは、典型的にはその第一級アミノ基のうち１つ以上を介して固相の表面に連結される。この結合は連結アミノ残基を第一級アミノ基から第二級アミノ基に変換し、それによって固相の表面上に第一級アミノ基と第二級アミノ基の混合物を生成する効果を有する。
【0053】
別の例はＳａｒｔｏｒｉｕｓによってSartobind STIC PAの名称で製造されており、ここで「ＰＡ」は第一級アミンを指す［www.sartorius.com/shop/ww/en/usd/sartobind-stic（R）-pa/c/M_Sartobind_STIC_PA］。販売資料によれば第一級アミノ基はポリマー、具体的にはポリアリルアミンの形態であり、固相に共有結合された反復第一級アミノサブユニットを有することを示す。上述のように、第一級アミノポリマーの固相への共有結合は、連結アミノ残基を第一級アミノ基から第二級アミノ基に変換し、それによって固相の表面上に第一級アミノ基と第二級アミノ基との混合物を生成する効果を有する。
【0054】
別の例は、Ｊ．Ｔ．ＢａｋｅｒによってBakerbond PolyPEIの名称で製造されており、ＶＷＲによって販売されている[in.vwr.com/store/product/21666435/ion-exchange-chromatography-media-j-t-baker-bakerbond］。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を担持する固相表面は、第二級アミノ基が優先的だが依然として第一級アミノ基も含んでいる固相の例を表す。直鎖状ＰＥＩポリマーはその末端に第一級アミノ基を有するが、直鎖状ポリマーの各反復ノードに第二級アミノ基を有する。分岐ＰＥＩポリマーは、各分岐の末端に第一級アミノ基１つが存在するので、より高い割合の第一級アミノ基を有するが、各分岐の塩基には第三級アミンも存在する。
【0055】
別の例は、ＢＩＡ ＳｅｐａｒａｔｉｏｎｓによってCIMmultus EDAの名称で製造されており、ここで、ＥＤＡはエチレンジアミンを指す［www.biaseparations.com/en/products/monolithic-columns/products-for-preparative-applications/111/eda-aex-activated］。ＥＤＡを有する固相表面は、第二級アミンがわずかに多くなっている第一級アミノ基と第二級アミノ基とのバランスを表している。
【0056】
クロマトグラフィー固相のすべての主要な商業的製造者は、その表面上にアミノ誘導体を有する製品（アニオン交換体を含む）を製造しており、定期的又は実験的なベースで第一級アミン含有固相を製造するために必要な知識及び資源を示している。
【0057】
クロマトグラフィー固相が、その組成を明確に表す方法で命名されない場合、所与の固相が本発明を実施するのに適切な特性を有するかどうかを決定するための分析方法を有することが有用である。この決定を行うための１つの簡単な方法は問題のクロマトグラフィー固相を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５などの緩衝液で平衡化し、次いで１０００塩基を超える特定のサイズのｓｓＲＮＡ又は１０００塩基以上のサイズの種を含む複数のサイズの組合せからなる試料を注入することである。この性質のリファレンス物質は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ及びＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓなどの一般的な供給業者から商業的に入手可能である。試料注入及び平衡化緩衝液での簡単な洗浄で未結合の試料成分を退かせた後、０ｍＭピロリン酸四カリウムから１００ｍＭピロリン酸四カリウムに向かう線形勾配でクロマトグラフィー装置を溶出に供する。本発明を実施するのに適したクロマトグラフィー装置は、前記ピロリン酸（pyrophosphate）勾配内でｓｓＲＮＡを溶出する。これについては、実施例１で説明し、図１に示す。
【0058】
「ＲＮＡサイズ」又は「ＲＮＡのサイズ」という用語は、ヌクレオチド鎖中のヌクレオチド塩基の数を指す。塩基は、一般に「ｂ」と称される。したがって、１００ｂという呼称は、１００塩基のＲＮＡストランドを指す。ＲＮＡサイズは、一本鎖（ｓｓＲＮＡ）及び二本鎖（ｄｓＲＮＡ）を指すＲＮＡコンホメーションとは無関係である。所与のインビトロ転写混合物とは、試薬と、ＤＮＡ鋳型からのｍＲＮＡの転写中に生成される生成物及び副生成物と、の混合物を指し、ｓｓＲＮＡ及びｄｓＲＮＡの両方を含有し得るが、これらは両方とも同じＤＮＡプラスミドに由来するので、塩基の数に関して両方とも同じサイズである。
【0059】
「ピロリン酸」又は「ピロリン酸アニオン」という用語は、Ｐ－Ｏ－Ｐ結合中に２個のリン原子を含有するリンオキシアニオンを指す。ピロリン酸（pyrophosphate）は、しばしば第二級リン酸塩と称される。ピロリン酸アニオンの構造を以下に示す。ピロリン酸（pyrophosphate）の一般的な例としては、ピロリン酸四ナトリウム（Ｎａ4Ｐ2Ｏ7）及びピロリン酸四カリウム（Ｋ4Ｐ2Ｏ7）が挙げられる。
【0060】
【化1】
【0061】
「平衡化された」又は「平衡化」という用語は、特定の化学的環境を作り出すために固相及び／又は試料に対して行われた化学的コンディショニングステップを指す。固相は、通常、所望のｐＨ及び塩組成を具体化する緩衝液にそれらを曝露することによって調整される。試料は、通常、ｐＨの滴定によって、時には塩濃度を低下させるための希釈によって、時にはクロマトグラフィーを含む緩衝液交換技術によって、又は透析によって、又はタンジェンシャルフロー濾過膜を用いた透析濾過によって、調整される。これらの方法及び１つ又は別のものを選択するための基準はすべて、何十年もの間、当技術分野で知られている。
【0062】
用語「ロードする」又は「試料適用」は、平衡化された試料を平衡化された固相と接触させるプロセスを指す。これは、通常、クロマトグラフィー装置を用い、重力又はポンピングなどの外力によって試料を装置に通過させることによって行われる。
【0063】
用語「吸着（adsorption）」は、生物学的産物を化学的に相補的な（chemically complementary）表面に結合させるプロセスを指す。吸着は毛管現象の物理的作用を介したスポンジによる水の取り込みと同様であるが、化学的相互作用を伴わない「吸収（absorption）」とは異なる。この場合の相補性は、静電荷を包含するものと解される。ＲＮＡの表面上の負の静電荷は、その表面上の第一級アミノ基によって電気的に陽性にされた固相の表面へのその吸着を媒介する。生物学的生成物の吸着は、多くの場合、より一般的な用語「結合（binding）」によって言及される。
【0064】
用語「選択的吸着」は１種以上の他の種の吸着を防止しながら、少なくとも１種の吸着を可能にする条件を指す。本件の場合、操作条件は、ｓｓＲＮＡの結合を可能にしながら、ｄｓＲＮＡの大部分の結合を防止するように調整され得る。
【0065】
用語「脱着（desorption）」は、生物学的生成物を、それが以前に吸着されている化学的に相補的な表面から放出するプロセスを指す。本発明の方法では特定のｓｓＲＮＡ分子を脱着するのに必要なピロリン酸の濃度が該分子のサイズに依存し、大きいサイズがより大きければより高い濃度のピロリン酸を必要とする。ｐＨの上昇は、より低濃度のピロリン酸（pyrophosphate）で脱着を引き起こす効果を有する。ピロリン酸（pyrophosphate）ではない塩の含有もまた、より低濃度のピロリン酸（pyrophosphate）で脱着を引き起こす効果を有する。しかしながら、ピロリン酸（pyrophosphate）ではない塩は、ピロリン酸（pyrophosphate）の非存在下ではｓｓＲＮＡを溶出することができない。
【0066】
「選択的脱着」という用語は、１つ以上の他の種が依然として吸着されたままとなる条件の変化によって、１つ以上の吸着された種が固相表面から放出される状況を指す。次いで、固相表面から異なる種のサブセットを放出するために、さらに異なる条件のセットを適用することができる。１つのそのような例では、中性又は中性に近いｐＨで高濃度の塩を適用することによって、ｓｓＲＮＡは結合したままでありながら、混入タンパク質及びｄｓＲＮＡは固相から溶出され得る。これらの混入物質は、選択的に脱着されたと言われる。ｓｓＲＮＡはおそらくピロリン酸（pyrophosphate）ではない塩の存在下で、おそらくｐＨの変化と同時に、ピロリン酸（pyrophosphate）との後続において選択的に脱着される。
【0067】
「洗浄（washed）」という用語は、装置内の細孔又はチャネルから非結合種を退かせる目的で、ロードされたカラムを洗浄緩衝液に曝露するプロセスを指す。用語「すすぎ（rinsed）」は、本文脈において、同じ意味を有する。最も基本的な場合、洗浄緩衝液は、平衡緩衝液と同じ組成を有する。より複雑な構成では、洗浄緩衝液は、所望の生成物を溶出するより前に、弱く結合している混入物質のサブセットが化学的に除去されるように、該サブセットを化学的に放出するという追加の役割を有し得る。あるいは１回目には平衡緩衝液と同一の条件を用いるが、２回目には溶出前の弱く結合した混入物質のサブセットの除去が可能なように、該サブセットを固相から退かせる条件を用いる、２回以上の洗浄工程があってもよい。洗浄はまた、異なる又はより制御された条件のセット下で溶出を可能にする緩衝液に移行するために使用され得る。例えば、混入物質を退かせるピロリン酸（pyrophosphate）ではない塩での洗浄後、無塩洗浄を実施して、ピロリン酸（pyrophosphate）勾配でｓｓＲＮＡを溶出する条件を設定することが望ましい場合がある。その洗浄がないと、デフォルトで高濃度のピロリン酸（pyrophosphate）ではない塩で溶出が始まり、ピロリン酸（pyrophosphate）の濃度が上昇する間にピロリン酸（pyrophosphate）ではない塩の濃度が下降する勾配が作り出される。
【0068】
用語「溶出」は、クロマトグラフィーの分野に関連する用語「脱着」の特別な場合を表す。これは、固相が存在する化学環境を変化させて、第一級アミノ固相と、装填及び洗浄工程後に結合したままである種との間の相互作用の解離を引き起こすプロセスを指す。ｄｓＲＮＡ及びタンパク質が固相から除去されれば、ｓｓＲＮＡは、ピロリン酸（pyrophosphate）濃度を単純に増加させることによって溶出することができる
【0069】
溶出は、各工程が固相とｓｓＲＮＡとの間の相互作用の強度を低下させる１つ又は一連の工程で行うことができる。条件の変化はまた、連続的又は線形的な様式でなされ得、弱く結合した種が連続工程の初期に脱着される一方で、強く結合した種は連続工程の後期に溶出する。段階的形式であろうと線形形式であろうと、操作条件の変化は、一般に勾配と称され、特に溶出勾配と称される。段階的勾配は多くの場合、より便利であると考えられるが、線形勾配の方が典型的にはより良好な再現性を支持する。
【0070】
「周囲温度」という用語は一般に、「室温」又は「常温」という表現に類似していると考えられる。それは典型的には約２０～２２℃の範囲の温度に対応するが、約１８～２５℃などのより広い範囲を含んでもよい。
【0071】
用語「カオトロピック塩」は、その構成イオンの少なくとも１つが、リオトロピック及びカオトロピックイオンのＨｏｆｍｅｉｓｔｅｒ系列において高いカオトロピック順位を有する塩種を指す。リオトロピックイオンは、Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒ系列の一端に存在する。カオトロピックイオンは、シリーズの反対側の端部に存在する。カオトロピックイオンは、多くの場合、生体分子によって優先的に結合されると記載される。カオトロピック塩は生体分子内及び生体分子間の非共有結合性相互作用を緩和する効果を有し、時には、多成分非共有結合性混合物中のそれぞれの要素間の相互作用を不安定化し、相互作用を解離させる程度まで緩和する効果を有する。それらは、通常、溶解度を増加させる効果を有する。カオトロピック塩の例としては、とりわけグアニジニウム塩、チオシアネート、及び過塩素酸塩が挙げられる。ある場合には、グアニジンチオシアネートの場合のように、特定の塩のアニオン及びカチオンの両方が強くカオトロピックである。このような塩は、カオトロピックアニオン又はカオトロピックカチオンのみを含む塩よりもカオトロピック電位が高い。リオトロピックイオンはＨｏｆｍｅｉｓｔｅｒ系列の反対側の端に存在する。それらは、しばしば、生体分子によって優先的に排除されると記載される。リオトロピックイオンは生体分子を安定化させる効果を有し、混合物の個々の要素間の非特異的会合を促進する。強力なリオトロピックイオンは、通常、大きな生体分子の溶解度を低下させる。リオトロピック塩の例としては、とりわけ、硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、及びクエン酸ナトリウムが挙げられる。ピロリン酸アニオンはリオトロピックである。Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒ系列における中間体を表す塩は、安定性、会合－解離、又は生体分子に対する溶解性に中程度又はほとんど影響を及ぼさない傾向がある。例としては、塩化ナトリウム及び塩化カリウムなどのいわゆる中性塩が挙げられる。そのような塩が安定性、会合－解離、又は溶解性に影響を及ぼし得る程度まで、それらの影響は、主にクーロン（静電）力を介して媒介される。
【0072】
「多価金属カチオン」という用語は、金属の正に帯電したイオン形態であって、イオンの正味電荷が２以上であるものを指す。多価金属カチオンとしては、類似の又は異なる原子価を有する他の金属種の中でも特に、カルシウム、マグネシウム、及び亜鉛（これらは全て２＋の正味電荷を有する）、及び３＋の正味電荷を有する第二級鉄が挙げられる。これらのイオンはすべて、配位結合を介して結合する核酸に対して親和性を有する。配位結合はイオン結合よりも１５～６０倍強く、これは、多価金属カチオンの核酸又は他の生体分子への結合が塩の飽和濃度でも持続することを意味する。多価金属カチオンは、ｄｓＲＮＡ配列の形成を促進し得、又は既存のｄｓＲＮＡ配列を安定化し得るため、ＲＮＡの精製において問題となり得る。それらはまた、複数のＲＮＡ分子の間、ＲＮＡとＤＮＡ分子の間、及びＲＮＡ、ＤＮＡ、及び混入物質であるタンパク質の間における、複合体の形成を促進し得、又は既存の該複合体（会合体）を安定化し得る。
【0073】
用語「キレート剤」は、本発明の方法の文脈においては、従前存在していた多価金属カチオンとｍＲＮＡを含む核酸を含む生体分子との会合体から、金属イオンを競合的に除去することができるような、多価金属カチオンとの強い配位結合を形成する能力を有する分子を指す。
【0074】
「ヌクレアーゼ」又は「ヌクレアーゼ酵素」という用語は、核酸の鎖を切断して本質的に小さな断片、理想的には個々のヌクレオチド、ダブレット、又はトリプレットに切断する能力を有するタンパク質を指す。それらは３つの主要なクラス、すなわちＤＮＡを溶解するＤＮＡｓｅ酵素、ＲＮＡを溶解するＲＮＡａｓｅ酵素、及びＤＮＡとＲＮＡの両方を溶解する一般的なヌクレアーゼ、に分類することができる。一般的なヌクレアーゼ及びＲＮＡｓｅは、ｓｓＲＮＡ産物を破壊するので、厳密に避けるべきである。ＤＮＡｓｅは、ｍＲＮＡを産生するために使用されるＤＮＡプラスミド鋳型を破壊することによってＲＮＡ精製を単純化するためにしばしば使用される。ほとんどのＤＮＡｓｅ酵素は、適切に機能するために多価金属カチオン補因子の使用を必要とする。多価金属カチオンは、上記のようにＲＮＡ精製を妨害しうる。
【0075】
「プロテアーゼ」又は「プロテイナーゼ」又は「タンパク質分解酵素」という用語は、他のタンパク質を切断して断片にする能力を有するタンパク質を指す。これは、タンパク質混入によって負担を被る可能性があるクロマトグラフィー工程の前にそのような混入を低減する方法として使用されることがある。トリプシンなどの多くのプロテアーゼは、適切に機能するために多価金属カチオン補因子を必要とする。多価金属カチオンは、上記のようにＲＮＡ精製を妨害しうる。タンパク質を分解する目的で一般に使用されるプロテアーゼには、多価金属カチオン補因子の非存在下でさえ良好な結果を提供するプロテイナーゼＫが含まれる。
【0076】
以下の基本的な方法オプションに係る一連の一般的な非限定的な説明は、本方法がどのように実行され得るかの変形例を示し、操作変数のより詳細な議論のためのプラットフォームを提供する。これらのシナリオの各々において言及される緩衝液条件は、本方法がどのように実践され得るかの一般的な概念を提供することが意図されることが理解される。異なるサイズのｓｓＲＮＡ種を収容し、異なる混入物質負荷を有するためには緩衝液製剤の最適化が必要とされることが理解される。
【0077】
ある実施形態では、モノリスなどのクロマトグラフィー装置の形態である、第一級アミノ基と第二級アミノ基との混合物を担持する固相を、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．０±０．５などの中性に近いｐＨ値に平衡化する。ｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡの混合物を含有する試料を、緩衝液交換によって５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．０±０．５に平衡化する。次いで、クロマトグラフィー装置を、平衡化緩衝液から、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１００ｍＭピロリン酸四カリウム、ｐＨ７．０±０．５の終点緩衝液に向かう線形勾配で、１００装置容量にわたって溶出する。このアプローチは、異なるクロマトグラフィー媒体の適合性を確認するため、又は複数のサイズのｓｓＲＮＡを分離するために特に有用であり得る。それはまた、ｓｓＲＮＡに対するｄｓＲＮＡ、ＤＮＡ断片、及びタンパク質の溶出挙動を明らかにするために有用である。このアプローチはまた、予備的分離の条件の開発のための出発点として使用され得る。この最初の実験からの結果は目的のｓｓＲＮＡを溶出するのに必要な最低ピロリン酸濃度を同定し、混入物質からのｓｓＲＮＡの最良の分離を支援する勾配の事前推定を提供する。
【0078】
関連する実施形態では、第一級アミノ基と第二級アミノ基との混合物を担持する固相に同じ条件でロードし、次いで、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、３Ｍグアニジン－ＨＣｌ、ｐＨ７．０±０．５の溶液で洗浄して、所望のｓｓＲＮＡ産物を溶出する前に、ｄｓＲＮＡ、ＤＮＡ、及び混入タンパク質の大部分をより効果的に排除することができる。ｄｓＲＮＡ、ＤＮＡ、及びタンパク質を除去した後、それらの除去を増強するために添加されたグアニジン－ＨＣｌは、グアニジン－ＨＣｌを欠く後続の洗浄によってそれ自体除去され、その結果、過剰な塩の非存在下でｓｓＲＮＡのピロリン酸（pyrophosphate）勾配溶出が開始される。密接に関連する実施形態において、グアニジンの濃度は、６Ｍに増加され得る。別の密接に関連する実施形態では、３Ｍのグアニジン－ＨＣｌを、２Ｍのグアニジンチオシアネート又は１２Ｍまでのより高濃度のグアニジンチオシアネートで置き換えてもよい。前述の実施形態との結果の比較は、カオトロピック洗浄がｓｓＲＮＡの純度を改善する程度を評価することを可能にする。
【0079】
上記連続処理を拡張した関連実施形態では、金属安定化複合体を解離させ、ｓｓＲＮＡを溶出する前に非ｓｓＲＮＡ種の大部分を固相から退かせることを意図して、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などであるがこれらに限定されないキレート剤を２ｍＭ～１００ｍＭの濃度で、グアニジンと組み合わせてもよい。ｄｓＲＮＡ、ＤＮＡ、及びタンパク質の大部分を除去した後、それらの除去を増強するために添加されたグアニジン－ＥＤＴＡは、過剰な塩を欠く後続の洗浄によってそれ自体除去され、その結果、過剰な塩の非存在下でｓｓＲＮＡのピロリン酸（pyrophosphate）勾配溶出が開始される。前述の２つの実施形態との結果の比較は、カオトロープ－キレート剤洗浄がｓｓＲＮＡの純度を改善する程度を評価することを可能にする。密接に関連する実施形態において、カオトロープは、ＥＤＴＡの代わりにクエン酸塩と、又はＥＧＴＡと、又はキレート剤の組み合わせと、組み合わせることができる。
【0080】
他の関連する実施形態では、タンパク質及びｄｓＲＮＡのクリアランスを最大にするために、ｓｓＲＮＡの溶出に先立って、種々のｐＨ値での他の塩種又は複数塩種の組合せを用いた洗浄を評価することができる。基礎となる概念は、ｓｓＲＮＡの溶出を引き起こさない最高ｐＨにおける最もカオトロピック性の高い塩の濃度という条件は、所望のｓｓＲＮＡの溶出に先立って望ましくない混入物質の最も大きなサブセットを除去する可能性が高い、という考えのもと、かかる条件を適用する、というものである。所望であれば、より低いカオトロープ濃度をその後の実験において評価することができる。
【0081】
いくつかの実施形態では、線状であるピロリン酸（pyrophosphate）勾配は、その勾配で溶出する種間の分離の程度を変更するために、又は特にサイズの異なるｓｓＲＮＡ分子間の分画を改善するために、改変され得る。１０装置容量のｐＨ勾配で溶出することが、所望の程度の分離を生じない場合、その持続時間は２０装置容量、又は５０装置容量、若しくは１００装置容量、又はそれ以上に延長され得る。
【0082】
いくつかの実施形態では、所望のｓｓＲＮＡを溶出して他の混入物質から分離するため、ピロリン酸アニオンの増加が段階的に実施され得る。先の洗浄工程において混入物質が十分に低減されている場合、方法を単純化し、可能な限り最高の濃度及び可能な限り最低の容積で溶出されたｓｓＲＮＡを得るために、ｓｓＲＮＡを単一工程で溶出することができる。代替的には、ピロリン酸（pyrophosphate）を増加させるステップの連続において段階的溶出が行われてもよい。個々のステップは、比較的穏和であってもよく、又は特定の調製物の必要性に応じて大きくてもよい。いくつかの実施形態では、勾配が単一のステップで行われてもよい。
【0083】
ある実施形態では、ｄｓＲＮＡの大部分が装置を通って流れ、より高濃度のピロリン酸（pyrophosphate）によりｓｓＲＮＡを溶出する前にｄｓＲＮＡの大部分が排除されるように、試料及びクロマトグラフィー装置は、ｄｓＲＮＡの大部分が結合するのを防げられるピロリン酸アニオンの濃度で平衡化される。
【0084】
クロマトグラフィーカラムに試料をロードするための条件に試料を平衡化する多くの方法は、当業者に公知である。これらの方法のいずれも、方法の真の性質を変更することなく使用することができる。これらの方法の中には、実験室規模の透析方法、タンジェンシャルフロー濾過膜による透析濾過方法、及び緩衝液交換クロマトグラフィーの方法がある。場合によっては、試料を目標ｐＨまで滴定し、必要であれば、試料を水又は低塩若しくは非塩含有緩衝液で希釈することによって、適切な試料平衡化が達成され得る。
【0085】
ｍＲＮＡを含む核酸は、多価金属カチオンに対して高い親和性を有することが知られている。それらは、主に、金属イオンと、核酸の骨格に沿った負に荷電したホスファチジン酸残基との間の配位結合によって、互いに強い会合を形成する。カルシウム及びマグネシウムは両方ともこのような相互作用に関与することが知られており、両方とも２＋の電荷を有する二価の金属カチオンである。３＋の電荷をもつ３価のカチオンである第二級鉄は、核酸とより積極的に相互作用する。これらのイオンのいずれか１つが核酸と相互作用する各時点で、それは、同等数の負電荷を中和する。これは、所与のｍＲＮＡ分子上の負電荷が減少し、アニオン交換体とのｍＲＮＡの相互作用を弱めるという表面的な予想を作り出す。実験データは、この予想が当たらないことを示す。代わりに、多価金属カチオンの添加は典型的には非特異的架橋の形成をもたらし、これは、ｓｓＲＮＡに、クロマトグラフィー装置から溶出しない大きな凝集体を形成させる。
【0086】
多価カチオンは一般にｍＲＮＡ調製物中に存在するので、全ての実施形態において、クロマトグラフィー装置上に装填する前に、その含量を減少させ、好ましくは多価金属カチオンを試料から完全に排除する工程を行うこと；又は装置がピロリン酸（pyrophosphate）勾配での溶出に供される前に、多価金属カチオンを除去するための工程を少なくとも行うこと、が推奨される。多価金属カチオンを事前に除去することにはさらなる理由が少なくとも２つある。第１の理由は、多価金属カチオンには鎖内ｄｓＲＮＡ配列及び鎖間ｄｓＲＮＡ配列の形成又は安定化を促進する傾向があり得ることである。第２の理由は、金属イオンが核酸とタンパク質との間の非特異的会合を安定化し、それらの間に安定な架橋を本質的に形成することである。配位結合はイオン結合よりも１５～６０倍強いので、配位錯体は、飽和レベルのＮａＣｌ及びグアニジニウム塩を含む非金属塩への曝露にも容易に耐える。このことは、本発明の方法から最高のｓｓＲＮＡ純度及び回収率を得るために、多価金属カチオンを可能な限り抽出することを必須にする。多価金属カチオンの効果的な抽出を考慮すると、核酸－タンパク質複合体の効果的な解離は、グアニジニウム塩などの高濃度のカオトロピック塩で、及びより低い程度で、ＮａＣｌなどの高濃度の非カオトロピック塩で、達成されうる。リオトロピック塩は、逆の影響を与える可能性が高い。一般的に、カオトロピック塩は、ｓｓＲＮＡが成分である沈殿物を含む沈殿物を形成しにくいので、好ましい。
【0087】
核酸－金属－混入物質複合体のキレート剤による解離又はキレート剤－高塩による解離が試料調製中に実施され、及び／又はキレート化洗浄又はキレート化－高塩洗浄が実施されるいくつかの実施形態では、その後、ｐＨ制御を提供するために使用される薬剤を超えて塩を用いない洗浄工程が実施され得る。
【0088】
他の実施形態では、ピロリン酸（pyrophosphate）濃度を増加させることによって、ｓｓＲＮＡの溶出中にキレート剤濃度及び高塩濃度が維持され得る。他の実施形態では、高塩が維持されている間、キレート剤は排除されていてもよく又は低減された濃度で使用されてもよい。他の実施形態では、キレート剤が維持されている間、高塩は低減された濃度で使用されてもよく又は除去されていてもよい。
【0089】
本発明の特に利益のある点は、ｓｓＲＮＡ調製物からＤＮＡプラスミドを除去するその能力が、インビトロ転写混合物又は部分的に精製されたインビトロ転写混合物のヌクレアーゼ消化の実施を不要にすることである。このことは、ヌクレアーゼ消化では酵素を活性とするためにマグネシウムイオン（多価金属カチオン）の添加を必要とすることからして、不釣り合いに高い価値を有する。該マグネシウムイオンは所望のｓｓＲＮＡの、それ自体及び他の試料成分との架橋に潜在的に寄与し、実際的な結果として、所望のｓｓＲＮＡ産物の回収を低減させる。ヌクレアーゼ消化を不要にすることにより、マグネシウムイオンの添加が不要となり、ｓｓＲＮＡの収率が損なわれることがなくなる。
【0090】
本発明の方法がｓｓＲＮＡからプラスミドＤＮＡを分離する能力にかかわらず、望まれる程度までヌクレアーゼ消化が行われ、次いで、クロマトグラフィー装置を装填する前に、過剰のキレート剤が試料に添加されてもよい。装置は、試料適用後に過剰のキレート剤で洗浄されてもよい。このような実施形態では、５ｍＭヌクレアーゼ酵素の存在下でのプラスミドＤＮＡのヌクレアーゼ消化の後、１０ｍＭ～５０ｍＭのＥＤＴＡを試料に添加することができる。カラムを平衡化及び洗浄するために使用される緩衝液はまた、１０ｍＭ～５０ｍＭのＥＤＴＡを含み得る。かかる実施形態のいくつかでは、ＥＤＴＡの濃度が１ｍＭ～１００ｍＭ、５ｍＭ～７５ｍＭ、又は１０ｍＭ～５０ｍＭ、又は２０ｍＭ～２５ｍＭ、又はより高い、より低い、若しくは中間の範囲であり得る。
【0091】
ＤＮＡｓｅで消化されていないインビトロ転写混合物で始まる、ある実施形態では、ＥＤＴＡを最終濃度である１０ｍＭまで添加する。必要に応じて試料ｐＨを中和し、必要に応じて試料を濾過して固体を除去する。次いで、それを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５に平衡化された第一級アミノ基及び第二級アミノ基の混合物を担持する固相にロードする。試料をロードした後、装置を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１．５Ｍ グアニジンチオシアネート、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５にて１０～２０装置容量で洗浄する。次いで、カラムを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５で洗浄して、グアニジンチオシアネート及びＥＤＴＡを装置から洗い流し、ｓｓＲＮＡの溶出の準備をする。次いで、ｓｓＲＮＡを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１００ｍＭピロリン酸、ｐＨ７．５に向かう５０装置容量の線形勾配で溶出する。ある密接に関連する実施形態においては、ＥＤＴＡはクエン酸塩で置き換えられる。別の密接に関連する実施形態においては、１．５Ｍのグアニジンチオシアネートは３．０Ｍのグアニジン－ＨＣｌで置き換えられる。
【0092】
上記の実施形態を拡張したある実施形態では、本発明の方法によって調製されたｓｓＲＮＡが、最終精製で残留ピロリン酸を除去するためにオリゴｄＴアフィニティークロマトグラフィー装置に適用される。
【0093】
上記実施形態を拡張した別の実施形態では、本発明の方法によって調製されたｓｓＲＮＡが、最終精製で残留ピロリン酸を除去するために疎水性相互作用クロマトグラフィー装置に適用される。
【0094】
インビトロ転写混合物で始まる、ある実施形態では、混合物が最終濃度が２．０Ｍ～２．５Ｍになるように塩化リチウム（ＬｉＣｌ）を添加することによって沈殿させられる。上清を廃棄し、沈殿物を５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０で再懸濁し、必要に応じて濾過して濁りを除去する。次いで、試料を、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０に平衡化された第一級アミノ基及び第二級アミノ基の混合物を担持する固相にロードする。試料をロードした後、装置を５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、３Ｍグアニジン－ＨＣｌ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０にて１０～２０装置容量で洗浄する。次いで、カラムを５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．０で洗浄して、グアニジン及びＥＤＴＡを装置から洗い流し、ｓｓＲＮＡの溶出の準備をする。次いで、ｓｓＲＮＡを、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１００ｍＭピロリン酸、ｐＨ７．０に向かう５０装置容量の線形勾配で溶出する。密接に関連する実施形態では、ＬｉＣｌの代わりにＮａＣｌ又は別の塩でｍＲＮＡが沈殿される。別の密接に関連する実施形態では、ＬｉＣｌ沈殿は、エタノール沈殿、例えば、約２．５％の最終割合までエタノールを添加することによって、置き換えられる。
【0095】
工業プロセスの開発者はしばしば、酵素の使用を避けることを好む。これは、酵素の使用でプロセスの費用が増加するためであり、また、製品に添加されるものは、後で除去されなければならず、そして、それが除去されたことを文書化するために試験を実施しなければならないからである。しかし、開発プログラムの初期段階での酵素の使用は企業がより早く臨床試験に参加することを可能にする便利なショートカットであり得、酵素の使用を必要としないプロセスのより進んだバージョンはその後に開発される。上記のように、インビトロ転写混合物は一般に、ｍＲＮＡの産生のための鋳型として使用されるＤＮＡプラスミドを排除するために、ＤＮＡアーゼ酵素で処理される。ＲＮＡ精製では、所与のインビトロ転写混合物中のタンパク質混入物質負荷を減少させるために、タンパク質分解酵素を用いることができる。いくつかの実施形態では、インビトロ転写混合物をまずＤＮＡｓｅで処理してプラスミドの大部分を除去し、次いでプロテイナーゼＫなどのタンパク質分解酵素で処理して、本発明の方法を実施する前にＤＮＡｓｅ及び大量の他のタンパク質混入物質を除去することができる。他の実施形態では、本発明の方法がＤＮＡｓｅを使用することを不要にするので、インビトロ転写混合物はプロテイナーゼＫ又は別のタンパク質分解酵素のみで処理され得る。
【0096】
ある実施形態では、インビトロ転写混合物をプロテイナーゼＫで処理して、本発明の方法を実施する前にタンパク質混入物質負荷を減少させる。試料を膜フィルターで濾過して粒子を除去し、次いで、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０に平衡化した第一級アミノ基と第二級アミノ基の混合物を担持する固相にロードする。試料をロードした後、装置を５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、４．０Ｍ塩化カリウム、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５にて１０～２０装置容量で洗浄する。次いで、カラムを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５で洗浄して、塩化カリウム及びＥＤＴＡを装置から洗い流し、ｓｓＲＮＡの溶出の準備をする。次いで、ｓｓＲＮＡを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１００ｍＭピロリン酸、ｐＨ７．５に向かう５０装置容量の線形勾配で溶出する。
【0097】
ある実施形態では、インビトロ転写混合物を、１．５Ｍのグアニジンチオシアネート及び２０ｍＭのＥＤＴＡで処理する。必要であればｐＨを７．０±０．５に調整し、必要であれば試料を濾過して固体を除去する。第一級アミノ基と第二級アミノ基の混合物を担持する固相を、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０に平衡化する。試料をロードした後、装置を５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１．５Ｍグアニジンチオシアネート、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０で１０～２０装置容量で洗浄する。次いで、カラムを５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．０で洗浄して、グアニジンチオシアネート及びＥＤＴＡを装置から洗い流し、ｓｓＲＮＡの溶出の準備をする。次いで、ｓｓＲＮＡを、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１００ｍＭピロリン酸、ｐＨ７．０に向かう５０装置容量の線形勾配で溶出する。勾配は、単一ステップで、一連の複数ステップで、又は連続（線形）勾配フォーマットで実行されうる。
【0098】
ｓｓＲＮＡが１００ｍＭピロリン酸（pyrophosphate）中に溶出しないある実施形態では、ピロリン酸（pyrophosphate）の濃度を飽和まで増加させることができる。ピロリン酸四ナトリウムは約１．５１Ｍで飽和する。ピロリン酸四カリウムは約５．６６Ｍで飽和する。より穏和なアプローチが好ましい場合もある。例えば、１００ｍＭでは不十分である場合、それをさらに５０ｍＭ増加させるか、又はそれをさらに１００ｍＭ増加させ、必要な場合にのみそれをさらに増加させる。
【0099】
ある実施形態では、ｓｓＲＮＡがピロリン酸（pyrophosphate）勾配中の第一級アミノ基と第二級アミノ基との混合物を担持する固相から溶出しない場合、ｐＨはｐＨ８．０～ｐＨ１１．０、又はｐＨ８．５～１０．５、又はｐＨ９～ｐＨ１０、又はｐＨのより高い、より低い、又は中間の範囲の値まで上昇させうる。溶出中にｐＨを増加させることの実際的な利点は、最終的に除去する必要があるピロリン酸の量を最小限にすることである。
【0100】
本発明の方法はｓｓＲＮＡを溶出するために高温で実施される必要はないが、そうすることを禁止するものではない。
【0101】
いくつかの実施形態では、周囲温度で方法を実施する前に、３７℃、４５℃、５６℃、６０℃、７０℃、又は中間、より高い、若しくはより低い温度などの高温に、試料が平衡化されてもよい。
【0102】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は３７℃、４５℃、５６℃、６０℃、７０℃、又は中間、より高い、若しくはより低い温度などの高温で実施され得る。このような実施形態では、ｓｓＲＮＡが周囲温度で溶出するよりも低いｐＨで溶出する。
【0103】
いくつかの実施形態では試料が高温に平衡化され、一方、方法は周囲温度又は高温のいずれかで実施されてもよい。
【0104】
ある実施形態では、ｓｓＲＮＡと固相の第一級アミノ基との間の水素結合と競合する糖の存在により、ピロリン酸アニオンを添加することによるｄｓＲＮＡからのｄｓＲＮＡの分離が増強されて、糖の非存在下よりも低いｐＨでｓｓＲＮＡを溶出させる、という結果が予想される。かかる実施形態の一つにおいて、糖は、ソルビトール、又はキシリトール、又はマンニトール、トレハロース、又はスクロース、又は別の糖、又は糖の組み合わせである。かかる実施形態のいくつかでは、糖の濃度は、０．１％～２０％、又は１％～２０％、又は５％～２０％、又は１０％～２０％、又はより高い、より低い、又は中間の範囲内の値の範囲であり得る。
【0105】
関連する実施形態では、ｓｓＲＮＡと固相の第一級アミノ基との間の水素結合と競合するカオトロープの存在により、ピロリン酸アニオンを添加することによるｄｓＲＮＡからのｄｓＲＮＡの分離が増強されて、カオトロープの非存在下よりも低いｐＨでｓｓＲＮＡを溶出させる、という結果が予想される。かかる実施形態の一つにおいて、カオトロープは尿素である。かかる実施形態のいくつかでは、尿素の濃度が０．１Ｍ～１０Ｍ、又は１Ｍ～９Ｍ、又は２Ｍ～８Ｍ、又は４Ｍ～６Ｍ、又はより高い、より低い、又は中間の範囲内の値の範囲であり得る。
【0106】
別の実施形態では、アルカリ性アミノ酸の存在により、ピロリン酸アニオンを添加することによるｄｓＲＮＡからのｄｓＲＮＡの分離が増強されて、アルカリ性アミノ酸の非存在下よりも低いｐＨでｓｓＲＮＡを溶出させる、という結果が予想される。かる実施形態の一つにおいて、アルカリ性アミノ酸は、ヒスチジン、又はヒスタミン、又はリジン、又はアルギニン、又は別のアルカリ性アミノ酸、又はアルカリ性アミノ酸の混合物である。かかる実施形態の一つにおいて、ヒスチジンの濃度は１ｍＭ～２５０ｍＭ、又は１０ｍＭ～２５０ｍＭ、又は２０ｍＭ～２５０ｍＭ、又は５０ｍＭ～２５０ｍＭ、又は１００ｍＭ～２５０ｍＭの範囲、又はより高い、より低い、又は中間の範囲内の値であり得る。別のかかる実施形態では、リジンの濃度は１ｍＭ～１０Ｍ、又は１０ｍＭ～１０Ｍ、又は１００ｍＭ～１０Ｍ、又は１Ｍ～１０Ｍ、又はより高い、より低い、又は中間の範囲内の値であり得る。別のかかる実施形態では、アルギニンの濃度は１ｍＭ～８５０ｍＭ、又は１０ｍＭ～８５０ｍＭ、又は１００ｍＭ～８５０ｍＭ、又は４２５ｍＭ～８５０ｍＭの範囲、又はより高い、より低い、又は中間の範囲内の値であり得る。
【0107】
ある実施形態では、本発明の方法は、オリゴｄＴ(ＯｄＴ)リガンドを使用するアフィニティークロマトグラフィーの方法と組み合わせることができる。かかる実施形態の一つでは、本発明の方法はまず、ＯｄＴ親和性ステップがその最良の結果を達成する能力を妨害し得る混入物質を除去するように、また本発明の方法の後に残存するピロリン酸（pyrophosphate）を除去するように、実施される。
【0108】
ある実施形態では、本発明の方法は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）の方法と組み合わせることができる。かかる実施形態の一つでは、ＲＮＡが保持されている間にピロリン酸（pyrophosphate）がＨＩＣカラムを通って流れることによってピロリン酸（pyrophosphate）を除去することができるように、ＨＩＣ工程は本発明の方法の後に実施される。このような実施形態では、ＨＩＣ固相上の疎水性リガンドはフェニル基からなり得る。別のかかる実施形態では、ＨＩＣ固相上の疎水性リガンドはブチル基からなり得る。別のかかる実施形態では、ＨＩＣ固相上の疎水性リガンドはヘキシル基からなり得る。他のかかる実施形態では、ＨＩＣ固相上の疎水性リガンドは異なる脂肪族基若しくは芳香族基、又は脂肪族特性及び芳香族特性の両方を具現化する基からなり得る。
【0109】
ある実施形態では、本発明の方法は、逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）の方法と組み合わせることができる。かかる実施形態の一つでは、ＲＮＡが保持されている間にピロリン酸がＲＰＣカラムを通って流れることによってピロリン酸（pyrophosphate）を除去することができるように、ＲＰＣ工程は本発明の方法の後に実施される。
このような実施形態では、固相表面の疎水性は、固相を合成するために使用されるスチレンジビニルベンゼン（ＳＤＶＢ）ポリマーの本来の疎水性によって付与され得る。別のかかる実施形態では、固相表面の疎水性は、固相の表面に固定されたリガンドの疎水性によって付与され得、ここで該リガンドは脂肪族炭化水素、若しくは芳香族炭化水素、又は脂肪族特性及び芳香族特性の混合を有するリガンドを表す。
このような実施形態では、固相表面の疎水性は、固相を合成するために使用されるスチレンジビニルベンゼン（ＳＤＶＢ）ポリマーの本来の疎水性によって付与され得る。別のかかる実施形態では、固相表面の疎水性は、固相の表面に固定されたリガンドの疎水性によって付与され得、ここで該リガンドは脂肪族炭化水素、若しくは芳香族炭化水素、又は脂肪族特性及び芳香族特性の混合を有するリガンドを表す。
【0110】
ある実施形態では、本発明の方法は、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの方法と組み合わせることができる。かかる実施形態の一つにおいて、ヒドロキシアパタイト工程は本発明の方法の後に実施され、その結果、ピロリン酸（pyrophosphate）をＲＮＡよりも強くヒドロキシアパタイトに結合させ、その結果、ピロリン酸（pyrophosphate）が結合したままである間にＲＮＡを選択的溶出によって回収しうることで、ピロリン酸（pyrophosphate）を除去することができる。そのような実施形態では、ヒドロキシアパタイトは明らかにピロリン酸アニオンをリン酸アニオンと交換するために使用され、ピロリン酸（pyrophosphate）を含有する試料はヒドロキシアパタイトにロードされ、その後、リン酸アニオンで溶出される。同じアプローチが、フッ素アパタイト及びヒドロキシアパタイトとフッ素アパタイトとのハイブリッドを含む他のアパタイト、並びにカルシウム以外の金属を含むアパタイトを使って用いられてもよい。ある実施形態では、ピロリン酸アニオンを含有するｓｓＲＮＡが、ｓｓＲＮＡの結合を防止するのに十分なリン酸塩の溶液中で、ヒドロキシアパタイト粒子に添加される。該溶液はピロリン酸（pyrophosphate）が粒子に結合することを可能にするために混合され、次いで、粒子は濾過又は沈降によって除去され、ピロリン酸（pyrophosphate）を含まないｓｓＲＮＡを残す。
【0111】
ある実施形態では、本発明の方法は、オリゴｄＴリガンドを使用するアフィニティークロマトグラフィー及びＲＰＣと組み合わせることができる。かかる実施形態の一つでは、その後の精製ステップ２つの過程を通してピロリン酸（pyrophosphate）レベルを低下させることができるように、本発明の方法は最初に実施される。
【0112】
ある実施形態では、本発明の方法は、ピロリン酸（pyrophosphate）レベルをその後の精製工程によって低下させることができるように、他の２つの精製工程に続いてもよい。
【0113】
ある実施形態では、本発明の方法の後に、ピロリン酸（pyrophosphate）を除去するためのタンジェンシャルフロー透析濾過ステップが続いてもよい。派生的な実施形態において、透析濾過されたＲＮＡは、残留ピロリン酸（pyrophosphate）をさらに除去するために、１つ、又は２つ、又は３つ、又はそれ以上の他の方法によって処理されてもよい。
【0114】
ある実施形態では、ピロホスフェートをリン酸に加水分解するために、本発明の方法によって調製されたＲＮＡにピロホスファターゼ酵素が添加されてもよい。部分的に精製されたＲＮＡへの酵素の添加は、酵素を除去するために後続の処理工程の実施を必要とすることに留意されたい。派生的な実施形態では、ピロホスファターゼ処理ｓｓＲＮＡは、１つ、又は２つ、又は３つ、又はそれ以上のかかる他処理方法によって処理されてもよい。
【0115】
ピロリン酸含量を測定するための分析キットは市販されている。
【0116】
ある実施形態では、本発明の方法は、試料中のｓｓＲＮＡの量を定量するための分析ツールとして使用することができる。このような実施形態では、酸性から中性のｐＨの試料を高濃度のピロリン酸（pyrophosphate）ではない塩と混合して、ほとんどの非ＲＮＡ種が結合できないようにすることができる。次いで、固相は、ピロリン酸（pyrophosphate）勾配を増すことによって溶出に供され得る。このような実施形態では、試料を固相上にロードした後、ＲＮＡと相互作用して蛍光を生成する色素を注入し、蛍光色素－ＲＮＡ複合体を溶出中に蛍光モニタに通してアッセイの感度を増幅することができる。このような実施形態では、色素はリボグリーンでありうる。
【0117】
ある実施形態において、本発明の方法は、その実施を容易にするためのキットの形態で提供され得る。キットは２つ以上の固相を含み得、そのうちの少なくとも１つは主に第１級アミノ基及び／又は第２級アミノ基を担持する正に荷電した固相であり、キットはまた本発明の方法を説明する説明書を含みうる。このような実施形態では、第２の固相はオリゴｄＴクロマトグラフィー装置である。別のかかる実施形態では、第２の固相は疎水性相互作用クロマトグラフィー装置である。別のかかる実施形態では、第２の固相はオリゴｄＴクロマトグラフィー装置であり、第３の固相は疎水性相互作用クロマトグラフィー装置である。別の実施形態では、第２の装置及び／又は第３の装置は、ＲＮＡの精製のための代替化学物質でコーティングされた固相を使用しうる。
【0118】
本発明は、以下の非限定的な実施例によってさらに説明される。
【実施例】
【0119】
実施例１．
中性ｐＨ及び周囲温度でのピロリン酸（pyrophosphate）勾配におけるエチレンジアミンモノリスからのｓｓＲＮＡの溶出
エチレンジアミンモノリスを５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．０で平衡化した。５００塩基のサイズを有する精製ｓｓＲＮＡの試料を適用した。カラムを平衡化緩衝液で洗浄し、次いで、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１００ｍＭピロリン酸四カリウム、ｐＨ７．０に向かう線形勾配で溶出に供した。ｓｓＲＮＡは単一のピークに溶出した（図１）。その後、カラムを１Ｍ水酸化ナトリウムで洗浄した（図示せず）。ジエチルアミノエチルアニオン交換体及び第四級アミンアニオン交換体を用いて実験を繰り返した。両方の場合において、ｓｓＲＮＡの大部分はアニオン交換体に結合したままであり、１Ｍ ＮａＯＨ洗浄工程中に除去された。
中性ｐＨ及び周囲温度でのピロリン酸（pyrophosphate）勾配におけるエチレンジアミンモノリスからのｓｓＲＮＡの溶出
エチレンジアミンモノリスを５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．０で平衡化した。５００塩基のサイズを有する精製ｓｓＲＮＡの試料を適用した。カラムを平衡化緩衝液で洗浄し、次いで、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１００ｍＭピロリン酸四カリウム、ｐＨ７．０に向かう線形勾配で溶出に供した。ｓｓＲＮＡは単一のピークに溶出した（図１）。その後、カラムを１Ｍ水酸化ナトリウムで洗浄した（図示せず）。ジエチルアミノエチルアニオン交換体及び第四級アミンアニオン交換体を用いて実験を繰り返した。両方の場合において、ｓｓＲＮＡの大部分はアニオン交換体に結合したままであり、１Ｍ ＮａＯＨ洗浄工程中に除去された。
【0120】
実施例２．
中性ｐＨ及び周囲温度でのピロリン酸（pyrophosphate）勾配中でのエチレンジアミンモノリス上でのｓｓＲＮＡからのｄｓＲＮＡの分離
エチレンジアミンモノリスを５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．０で平衡化した。５００塩基のサイズを有する精製ｓｓＲＮＡ及びｄｓＲＮＡサイズラダー（２１ｂ～５００ｂ）の混合物を含有する試料を適用した。カラムを平衡化緩衝液で洗浄し、次いで、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１００ｍＭピロリン酸四カリウム、ｐＨ７．０に向かう線形勾配で溶出に供した。すべてのｄｓＲＮＡ種はｓｓＲＮＡの前に溶出した（図２）。
中性ｐＨ及び周囲温度でのピロリン酸（pyrophosphate）勾配中でのエチレンジアミンモノリス上でのｓｓＲＮＡからのｄｓＲＮＡの分離
エチレンジアミンモノリスを５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．０で平衡化した。５００塩基のサイズを有する精製ｓｓＲＮＡ及びｄｓＲＮＡサイズラダー（２１ｂ～５００ｂ）の混合物を含有する試料を適用した。カラムを平衡化緩衝液で洗浄し、次いで、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１００ｍＭピロリン酸四カリウム、ｐＨ７．０に向かう線形勾配で溶出に供した。すべてのｄｓＲＮＡ種はｓｓＲＮＡの前に溶出した（図２）。
【0121】
実施例３．
中性ｐＨ及び周囲温度でのピロリン酸（pyrophosphate）勾配中でのエチレンジアミンモノリス上でのｓｓＲＮＡからのプラスミドＤＮＡの分離
エチレンジアミンモノリスを５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．０で平衡化した。６０００塩基対のサイズを有する精製スーパーコイル（ｓｃ）ｄｓＤＮＡプラスミドと精製ｓｓＲＮＡとの混合物を含有する試料を適用した。カラムを平衡化緩衝液で洗浄し、次いで、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１００ｍＭピロリン酸四カリウム、ｐＨ７．０に向かう線形勾配で溶出に供した。ＤＮＡはｓｓＲＮＡの前に溶出し、ｓｓＲＮＡから十分に分離された（図３）。
中性ｐＨ及び周囲温度でのピロリン酸（pyrophosphate）勾配中でのエチレンジアミンモノリス上でのｓｓＲＮＡからのプラスミドＤＮＡの分離
エチレンジアミンモノリスを５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．０で平衡化した。６０００塩基対のサイズを有する精製スーパーコイル（ｓｃ）ｄｓＤＮＡプラスミドと精製ｓｓＲＮＡとの混合物を含有する試料を適用した。カラムを平衡化緩衝液で洗浄し、次いで、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１００ｍＭピロリン酸四カリウム、ｐＨ７．０に向かう線形勾配で溶出に供した。ＤＮＡはｓｓＲＮＡの前に溶出し、ｓｓＲＮＡから十分に分離された（図３）。
【0122】
実施例４．
中性ｐＨ及び周囲温度でのピロリン酸（pyrophosphate）勾配におけるエチレンジアミンモノリス上のインビトロ転写混合物からのｓｓＲＮＡの分画
ｓｓＲＮＡを含有するインビトロ転写混合物をプロテイナーゼＫで処理して、混入タンパク質を減少させた。アガロース電気泳動の結果を示す図４の挿入図では、試料（元の材料をＯＭと標示）が３つのサイズのｍＲＮＡを含有し、ゲルの上部付近の三重線（triplet）として見える。ゲルの底部付近には小ＲＮＡ断片の大集団が明らかに見える。エチレンジアミンモノリスを５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．０で平衡化した。試料を適用した。カラムを平衡化緩衝液で洗浄し、次いで、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１００ｍＭピロリン酸四カリウム、ｐＨ７．０に向かう線形勾配で溶出に供した（図４）。分析的アガロース電気泳動は、ほとんどのｓｓＲＮＡトリプレットがＥ５と標示された鋭い溶出ピークにあることを示した。他の画分は主に小ＲＮＡで占められていた。この分析方法は、タンパク質を検出せず、ＲＮＡ－タンパク質凝集体をＲＮＡと区別しないことに留意されたい。
中性ｐＨ及び周囲温度でのピロリン酸（pyrophosphate）勾配におけるエチレンジアミンモノリス上のインビトロ転写混合物からのｓｓＲＮＡの分画
ｓｓＲＮＡを含有するインビトロ転写混合物をプロテイナーゼＫで処理して、混入タンパク質を減少させた。アガロース電気泳動の結果を示す図４の挿入図では、試料（元の材料をＯＭと標示）が３つのサイズのｍＲＮＡを含有し、ゲルの上部付近の三重線（triplet）として見える。ゲルの底部付近には小ＲＮＡ断片の大集団が明らかに見える。エチレンジアミンモノリスを５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．０で平衡化した。試料を適用した。カラムを平衡化緩衝液で洗浄し、次いで、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１００ｍＭピロリン酸四カリウム、ｐＨ７．０に向かう線形勾配で溶出に供した（図４）。分析的アガロース電気泳動は、ほとんどのｓｓＲＮＡトリプレットがＥ５と標示された鋭い溶出ピークにあることを示した。他の画分は主に小ＲＮＡで占められていた。この分析方法は、タンパク質を検出せず、ＲＮＡ－タンパク質凝集体をＲＮＡと区別しないことに留意されたい。
【0123】
実施例５．
周囲温度でのピロリン酸（pyrophosphate）勾配中におけるエチレンジアミンモノリスによるｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡの分離に及ぼす、ピロリン酸（pyrophosphate）、ピロリン酸（pyrophosphate）ではない塩、及びｐＨの相乗効果。
図５は、４つの異なるクロマトグラフィー実行の結果を重ね合わせたものを示す。２つの試料を、２つの異なる条件のそれぞれの下で実行した。試料は、５０００ｂのサイズを有する精製ｓｓＲＮＡ及び２０～５００ｂのサイズ範囲を有するｄｓＲＮＡラダーであった。１対のクロマトグラフィー実験（ｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡ）はｐＨ８．０で行い、ここでは５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ８．０でエチレンジアミンカラムを平衡化し、ロードし、次いで平衡化緩衝液で洗浄し、その後、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１００ｍＭピロリン酸四カリウム、５００ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ８．０に向かう線形勾配で溶出に供した。並行する実験はｐＨ６．０で行い、ここではエチレンジアミンカラムを５０ｍＭ ＭＥＳ、５００ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ６．０で平衡化し、ロードし、次いで平衡化緩衝液で洗浄し、その後、５０ｍＭ ＭＥＳ、１００ｍＭピロリン酸四カリウム、５００ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ６．０に向かう線形勾配で溶出に供した。結果を図５に示す。どちらの場合も、ｄｓＲＮＡはｓｓＲＮＡに先立って溶出した。ｐＨ８．０の５００ｍＭ ＮａＣｌ中でのｄｓＲＮＡとｓｓＲＮＡとの間の分離は、ＮａＣｌの非存在下でのｐＨ７．０で得られたものよりわずかに良好であった。また、ｄｓＲＮＡサイズラダーが、ＮａＣｌの非存在下にてｐＨ７．０では複数の集団に分離されるところ、５０ｍＭ ＮａＣｌ中にてｐＨ８．０ではｄｓＲＮＡサブセットの大部分が単一のピークで溶出し、２つの微量成分のみが後に溶出することに留意されたい。さらに、ｓｓＲＮＡは２つの見かけのピークに分離され、先に出た方のピークはより小さいサイズの分布を示すことに留意されたい。ｓｓＲＮＡからのｄｓＲＮＡの分離は、ＮａＣｌ中のｐＨ６．０で有意に改善された。ｄｓＲＮＡは、ｓｓＲＮＡから遠く離れた単一ピークで溶出した。ｐＨ６．０でのｓｓＲＮＡプロファイルは、ｐＨ８．０での溶出プロファイルによって示唆されたよりも、ｓｓＲＮＡ溶出内に多くの亜集団が存在したことを示唆する。これらの結果は、いくつかの重要なプロセスの影響（process ramifications）を有する。それらは、ｄｓＲＮＡとｓｓＲＮＡとの間の分離の程度を増すために、ｐＨ７又は８を超えるｐＨである６を推奨する。これらは、ｓｓＲＮＡサブセットのより良好な分離を達成するために、ピロリン酸（pyrophosphate）勾配中におけるピロリン酸（pyrophosphate）ではない塩の使用を推奨する。それらはさらに、ピロリン酸（pyrophosphate）溶出の前に高塩洗浄を適用して、ピロリン酸（pyrophosphate）溶出の前にタンパク質、ＤＮＡ、及びｄｓＲＮＡ混入物質の大部分を除去することの有用性を示唆している。そのような高塩洗浄は、１Ｍ～４Ｍの塩化ナトリウム若しくは塩化カリウム、又は１Ｍ～４Ｍのグアニジン－ＨＣｌ若しくはグアニジンイソチオシアネートを含み得る。
周囲温度でのピロリン酸（pyrophosphate）勾配中におけるエチレンジアミンモノリスによるｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡの分離に及ぼす、ピロリン酸（pyrophosphate）、ピロリン酸（pyrophosphate）ではない塩、及びｐＨの相乗効果。
図５は、４つの異なるクロマトグラフィー実行の結果を重ね合わせたものを示す。２つの試料を、２つの異なる条件のそれぞれの下で実行した。試料は、５０００ｂのサイズを有する精製ｓｓＲＮＡ及び２０～５００ｂのサイズ範囲を有するｄｓＲＮＡラダーであった。１対のクロマトグラフィー実験（ｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡ）はｐＨ８．０で行い、ここでは５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ８．０でエチレンジアミンカラムを平衡化し、ロードし、次いで平衡化緩衝液で洗浄し、その後、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１００ｍＭピロリン酸四カリウム、５００ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ８．０に向かう線形勾配で溶出に供した。並行する実験はｐＨ６．０で行い、ここではエチレンジアミンカラムを５０ｍＭ ＭＥＳ、５００ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ６．０で平衡化し、ロードし、次いで平衡化緩衝液で洗浄し、その後、５０ｍＭ ＭＥＳ、１００ｍＭピロリン酸四カリウム、５００ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ６．０に向かう線形勾配で溶出に供した。結果を図５に示す。どちらの場合も、ｄｓＲＮＡはｓｓＲＮＡに先立って溶出した。ｐＨ８．０の５００ｍＭ ＮａＣｌ中でのｄｓＲＮＡとｓｓＲＮＡとの間の分離は、ＮａＣｌの非存在下でのｐＨ７．０で得られたものよりわずかに良好であった。また、ｄｓＲＮＡサイズラダーが、ＮａＣｌの非存在下にてｐＨ７．０では複数の集団に分離されるところ、５０ｍＭ ＮａＣｌ中にてｐＨ８．０ではｄｓＲＮＡサブセットの大部分が単一のピークで溶出し、２つの微量成分のみが後に溶出することに留意されたい。さらに、ｓｓＲＮＡは２つの見かけのピークに分離され、先に出た方のピークはより小さいサイズの分布を示すことに留意されたい。ｓｓＲＮＡからのｄｓＲＮＡの分離は、ＮａＣｌ中のｐＨ６．０で有意に改善された。ｄｓＲＮＡは、ｓｓＲＮＡから遠く離れた単一ピークで溶出した。ｐＨ６．０でのｓｓＲＮＡプロファイルは、ｐＨ８．０での溶出プロファイルによって示唆されたよりも、ｓｓＲＮＡ溶出内に多くの亜集団が存在したことを示唆する。これらの結果は、いくつかの重要なプロセスの影響（process ramifications）を有する。それらは、ｄｓＲＮＡとｓｓＲＮＡとの間の分離の程度を増すために、ｐＨ７又は８を超えるｐＨである６を推奨する。これらは、ｓｓＲＮＡサブセットのより良好な分離を達成するために、ピロリン酸（pyrophosphate）勾配中におけるピロリン酸（pyrophosphate）ではない塩の使用を推奨する。それらはさらに、ピロリン酸（pyrophosphate）溶出の前に高塩洗浄を適用して、ピロリン酸（pyrophosphate）溶出の前にタンパク質、ＤＮＡ、及びｄｓＲＮＡ混入物質の大部分を除去することの有用性を示唆している。そのような高塩洗浄は、１Ｍ～４Ｍの塩化ナトリウム若しくは塩化カリウム、又は１Ｍ～４Ｍのグアニジン－ＨＣｌ若しくはグアニジンイソチオシアネートを含み得る。
【0124】
実施例６．
ピロリン酸（pyrophosphate）勾配中における小～大ｓｓＲＮＡからの巨大ｄｓＲＮＡの分離
巨大ｄｓＲＮＡと小型～大型ｓｓＲＮＡとの間で得られた分離の程度を比較することによって、極度の最悪の場合の条件をシミュレートした。本物のインビトロ転写混合物において、ｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡは、同数の塩基を含有する。塩基の数が多いほど、ｄｓＲＮＡはより後に溶出すると予想され、これにより、ｄｓＲＮＡはｓｓＲＮＡにより近く溶出するはずである。エチレンジアミンモノリスを５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．０で平衡化した。１つの実験では、１３．３ｋＢのサイズを有するｄｓＲＮＡを適用した。別の実験では、１７００ｂのサイズを有するｓｓＲＮＡを適用した。別の実験では、２００ｂ～６ｋｂの範囲のサイズを有する亜集団を含有するｓｓＲＮＡラダーを適用した。したがって、ｄｓＲＮＡのサイズはｓｓＲＮＡにおける塩基の数のわずかに２倍を超える数（１３．３ｋｂ対６ｋｂ）から、より多くの塩基の１５倍（１３．３ｋｂ対２００ｂ）までの範囲であった。試料適用後、カラムを平衡化緩衝液で洗浄し、次いで、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１００ｍＭピロリン酸四カリウム、ｐＨ７．０に向かう線形勾配で溶出に供した。結果を図６に示す。すべてのｓｓＲＮＡサイズはほぼ同じ位置に溶出し、ｄｓＲＮＡピークの本体から十分に分離された。
ピロリン酸（pyrophosphate）勾配中における小～大ｓｓＲＮＡからの巨大ｄｓＲＮＡの分離
巨大ｄｓＲＮＡと小型～大型ｓｓＲＮＡとの間で得られた分離の程度を比較することによって、極度の最悪の場合の条件をシミュレートした。本物のインビトロ転写混合物において、ｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡは、同数の塩基を含有する。塩基の数が多いほど、ｄｓＲＮＡはより後に溶出すると予想され、これにより、ｄｓＲＮＡはｓｓＲＮＡにより近く溶出するはずである。エチレンジアミンモノリスを５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．０で平衡化した。１つの実験では、１３．３ｋＢのサイズを有するｄｓＲＮＡを適用した。別の実験では、１７００ｂのサイズを有するｓｓＲＮＡを適用した。別の実験では、２００ｂ～６ｋｂの範囲のサイズを有する亜集団を含有するｓｓＲＮＡラダーを適用した。したがって、ｄｓＲＮＡのサイズはｓｓＲＮＡにおける塩基の数のわずかに２倍を超える数（１３．３ｋｂ対６ｋｂ）から、より多くの塩基の１５倍（１３．３ｋｂ対２００ｂ）までの範囲であった。試料適用後、カラムを平衡化緩衝液で洗浄し、次いで、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１００ｍＭピロリン酸四カリウム、ｐＨ７．０に向かう線形勾配で溶出に供した。結果を図６に示す。すべてのｓｓＲＮＡサイズはほぼ同じ位置に溶出し、ｄｓＲＮＡピークの本体から十分に分離された。
【0125】
実施例７．
混合された第一級－第二級アミン固相からｓｓＲＮＡを溶出するための代替的四価アニオンの不能性
１７００Ｂのサイズを有するｓｓＲＮＡを、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．０に平衡化したエチレンジアミン（混合第一級－第二級アミノ）固相に適用した。カラムを、平衡化した試料の適用後に洗浄し、次いで、１Ｍエチレンジアミン四酢酸に向かう線形勾配で溶出に供した。その後、固相を１Ｍ水酸化ナトリウム（ｐＨ１３）で洗浄消毒した。図７に示すように、ｓｓＲＮＡは勾配中に溶出しなかった。水酸化ナトリウムのみによってカラムから除去された。これらの結果は、第一級－第二級アミン固相からｓｓＲＮＡを溶出するピロリン酸（pyrophosphate）の能力が、四価であることに依拠するものではないことを実証する。さもなければ、エチレンジアミン四酢酸は、ピロホスフェートと同じくらい効果的にｓｓＲＮＡを溶出すると予想されていたであろう。
混合された第一級－第二級アミン固相からｓｓＲＮＡを溶出するための代替的四価アニオンの不能性
１７００Ｂのサイズを有するｓｓＲＮＡを、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．０に平衡化したエチレンジアミン（混合第一級－第二級アミノ）固相に適用した。カラムを、平衡化した試料の適用後に洗浄し、次いで、１Ｍエチレンジアミン四酢酸に向かう線形勾配で溶出に供した。その後、固相を１Ｍ水酸化ナトリウム（ｐＨ１３）で洗浄消毒した。図７に示すように、ｓｓＲＮＡは勾配中に溶出しなかった。水酸化ナトリウムのみによってカラムから除去された。これらの結果は、第一級－第二級アミン固相からｓｓＲＮＡを溶出するピロリン酸（pyrophosphate）の能力が、四価であることに依拠するものではないことを実証する。さもなければ、エチレンジアミン四酢酸は、ピロホスフェートと同じくらい効果的にｓｓＲＮＡを溶出すると予想されていたであろう。
【0126】
実施例８．
ピロリン酸（pyrophosphate）ではない塩洗浄によるさらなるＤＮＡ除去を、ピロリン酸（pyrophosphate）勾配中における溶出と比較する
ピロリン酸（pyrophosphate）勾配におけるｓｓＲＮＡからのＤＮＡの分離は価値ある形質であるが、ピロリン酸（pyrophosphate）勾配に先立ってＤＮＡを除去することは分離の程度を増加させるので、おそらくさらに価値がある。ＤＮＡプラスミドをエチレンジアミン（混合第一級－第二級アミン）固相からピロリン酸（pyrophosphate）線形勾配で溶出させる対照実験を行った。カラムを５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．０に平衡化した。試料を注入した。試料適用後、カラムを平衡化緩衝液で洗浄し、次いで、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１００ｍＭピロリン酸四カリウム、ｐＨ７．０に向かう線形勾配で溶出に供した。カラムを平衡化し、試料を適用し、カラムを対照実験と同様に洗浄する別の実験を行った。５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、３Ｍ塩化カリウム、ｐＨ７．０の第２の洗浄液を適用し、次いで、平衡化緩衝液で第３の洗浄を行って、過剰の塩化カリウムを除去した。次いで、カラムを対照実験と同様に溶出に供した。ＤＮＡは対照実験で予想されたようにピロリン酸（pyrophosphate）勾配で溶出したが、塩洗浄によって事前に除去されていたので、ピロリン酸（pyrophosphate）勾配プロファイルにはほとんど存在しなかった（図８）。他の実験では、ｄｓＲＮＡ及びタンパク質はＤＮＡと同じように挙動した。他の実験では、塩化カリウムをグアニジン－ＨＣｌで置換した場合、同様の結果が得られた。他の実験では、１Ｍ塩化カリウムはＤＮＡ又はｄｓＲＮＡのさらなる除去を完全には達成しなかった。
ピロリン酸（pyrophosphate）ではない塩洗浄によるさらなるＤＮＡ除去を、ピロリン酸（pyrophosphate）勾配中における溶出と比較する
ピロリン酸（pyrophosphate）勾配におけるｓｓＲＮＡからのＤＮＡの分離は価値ある形質であるが、ピロリン酸（pyrophosphate）勾配に先立ってＤＮＡを除去することは分離の程度を増加させるので、おそらくさらに価値がある。ＤＮＡプラスミドをエチレンジアミン（混合第一級－第二級アミン）固相からピロリン酸（pyrophosphate）線形勾配で溶出させる対照実験を行った。カラムを５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．０に平衡化した。試料を注入した。試料適用後、カラムを平衡化緩衝液で洗浄し、次いで、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１００ｍＭピロリン酸四カリウム、ｐＨ７．０に向かう線形勾配で溶出に供した。カラムを平衡化し、試料を適用し、カラムを対照実験と同様に洗浄する別の実験を行った。５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、３Ｍ塩化カリウム、ｐＨ７．０の第２の洗浄液を適用し、次いで、平衡化緩衝液で第３の洗浄を行って、過剰の塩化カリウムを除去した。次いで、カラムを対照実験と同様に溶出に供した。ＤＮＡは対照実験で予想されたようにピロリン酸（pyrophosphate）勾配で溶出したが、塩洗浄によって事前に除去されていたので、ピロリン酸（pyrophosphate）勾配プロファイルにはほとんど存在しなかった（図８）。他の実験では、ｄｓＲＮＡ及びタンパク質はＤＮＡと同じように挙動した。他の実験では、塩化カリウムをグアニジン－ＨＣｌで置換した場合、同様の結果が得られた。他の実験では、１Ｍ塩化カリウムはＤＮＡ又はｄｓＲＮＡのさらなる除去を完全には達成しなかった。
【0127】
実施例９
ピロリン酸（pyrophosphate）ではない塩及びｐＨの、ピロリン酸（pyrophosphate）勾配との併用
モノリスなどのクロマトグラフィー装置の形態にある、第一級アミノ基と第二級アミノ基の混合物を担持する固相を、ｐＨ６．０±０．５で５０ｍＭ ＭＥＳ（モルホリノエタンスルホン酸）に平衡化する。ｓｓＲＮＡを含有するインビトロ転写混合物の試料を６．０±０．５に滴定し、濾過して濁りを除去する。試料をクロマトグラフィー装置に適用する。試料を、５０ｍＭ ＭＥＳ、２Ｍグアニジンチオシアネート、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．０±０．５で、１０装置容量に渡って洗浄し、ｄｓＲＮＡ、ＤＮＡ、及び混入タンパク質の大部分を除去した。グアニジン及びＥＤＴＡを、平衡化緩衝液で洗浄することによって除去する。クロマトグラフィー装置を、５０ｍＭ ＭＥＳ、１００ｍＭピロリン酸四ナトリウム、ｐＨ６．０に向かう線形勾配で溶出する。グアニジン－ＥＤＴＡ洗浄後に残っている微量のｄｓＲＮＡ、ＤＮＡ、及びタンパク質は、ｓｓＲＮＡの前に溶出する。所望により２Ｍ塩化ナトリウムと組み合わせた、１Ｍ水酸化ナトリウムによって、カラムを洗浄し消毒する。この方法は、第一級アミン又はポリエチレンイミンクロマトグラフィー装置上で並行して実施される。
ピロリン酸（pyrophosphate）ではない塩及びｐＨの、ピロリン酸（pyrophosphate）勾配との併用
モノリスなどのクロマトグラフィー装置の形態にある、第一級アミノ基と第二級アミノ基の混合物を担持する固相を、ｐＨ６．０±０．５で５０ｍＭ ＭＥＳ（モルホリノエタンスルホン酸）に平衡化する。ｓｓＲＮＡを含有するインビトロ転写混合物の試料を６．０±０．５に滴定し、濾過して濁りを除去する。試料をクロマトグラフィー装置に適用する。試料を、５０ｍＭ ＭＥＳ、２Ｍグアニジンチオシアネート、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．０±０．５で、１０装置容量に渡って洗浄し、ｄｓＲＮＡ、ＤＮＡ、及び混入タンパク質の大部分を除去した。グアニジン及びＥＤＴＡを、平衡化緩衝液で洗浄することによって除去する。クロマトグラフィー装置を、５０ｍＭ ＭＥＳ、１００ｍＭピロリン酸四ナトリウム、ｐＨ６．０に向かう線形勾配で溶出する。グアニジン－ＥＤＴＡ洗浄後に残っている微量のｄｓＲＮＡ、ＤＮＡ、及びタンパク質は、ｓｓＲＮＡの前に溶出する。所望により２Ｍ塩化ナトリウムと組み合わせた、１Ｍ水酸化ナトリウムによって、カラムを洗浄し消毒する。この方法は、第一級アミン又はポリエチレンイミンクロマトグラフィー装置上で並行して実施される。
【0128】
実施例１０．
ピロリン酸（pyrophosphate）ではない塩及びピロリン酸（pyrophosphate）の、ｐＨ勾配との併用
モノリスなどのクロマトグラフィー装置の形態にある、第一級アミノ基と第二級アミノ基の混合物を担持する固相を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２０ｍＭビス－トリス－プロパン、ｐＨ８．５で平衡化する。部分的に精製されたｓｓＲＮＡの試料をｐＨ８．５に滴定し、装置に注入する。試料を注入し、装置を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２０ｍＭ ビス－トリス－プロパン、３Ｍグアニジン－ＨＣｌ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．５で洗浄して、ｄｓＲＮＡ、ＤＮＡ、及び混入タンパク質の大部分を退かせる。装置を、グアニジン及びＥＤＴＡに対する平衡化緩衝液で洗浄する。ｓｓＲＮＡを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２０ｍＭビス－トリス－プロパン、１０ｍＭピロリン酸四カリウム、ｐＨ１０．５で終わる線形ｐＨ勾配で溶出する。グアニジン－ＥＤＴＡ洗浄後に残っている微量のｄｓＲＮＡ、ＤＮＡ、及びタンパク質は、ｓｓＲＮＡの前に溶出する。所望により２Ｍ塩化ナトリウムと組み合わせた、１Ｍ水酸化ナトリウムによって、カラムを洗浄し消毒する。
ピロリン酸（pyrophosphate）ではない塩及びピロリン酸（pyrophosphate）の、ｐＨ勾配との併用
モノリスなどのクロマトグラフィー装置の形態にある、第一級アミノ基と第二級アミノ基の混合物を担持する固相を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２０ｍＭビス－トリス－プロパン、ｐＨ８．５で平衡化する。部分的に精製されたｓｓＲＮＡの試料をｐＨ８．５に滴定し、装置に注入する。試料を注入し、装置を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２０ｍＭ ビス－トリス－プロパン、３Ｍグアニジン－ＨＣｌ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．５で洗浄して、ｄｓＲＮＡ、ＤＮＡ、及び混入タンパク質の大部分を退かせる。装置を、グアニジン及びＥＤＴＡに対する平衡化緩衝液で洗浄する。ｓｓＲＮＡを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２０ｍＭビス－トリス－プロパン、１０ｍＭピロリン酸四カリウム、ｐＨ１０．５で終わる線形ｐＨ勾配で溶出する。グアニジン－ＥＤＴＡ洗浄後に残っている微量のｄｓＲＮＡ、ＤＮＡ、及びタンパク質は、ｓｓＲＮＡの前に溶出する。所望により２Ｍ塩化ナトリウムと組み合わせた、１Ｍ水酸化ナトリウムによって、カラムを洗浄し消毒する。
【0129】
実施例１１．
ピロリン酸（pyrophosphate）ではない塩の、ピロリン酸（pyrophosphate）、ピロリン酸（pyrophosphate）ではない塩及びｐＨの勾配との併用
クロマトグラフィー装置の形態にある、第一級アミノ基と第二級アミノ基の混合物を担持する固相を、５０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．０±０．５で平衡化する。ｓｓＲＮＡを含有するインビトロ転写混合物の試料を６．０±０．５に滴定し、濾過して濁りを除去する。試料をクロマトグラフィー装置に適用する。試料を、５０ｍＭ ＭＥＳ、２Ｍグアニジンイソチオシアネート、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．０±０．５で、１０装置容量に渡って洗浄し、ｄｓＲＮＡ、ＤＮＡ、及び混入タンパク質の大部分を除去する。グアニジン及びＥＤＴＡを、平衡化緩衝液で洗浄することによって除去する。クロマトグラフィー装置を、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、５００ｍＭ塩化カリウム、１００ｍＭピロリン酸四カリウム、ｐＨ８．０±０．５に向かう線形勾配で溶出に供する。グアニジン－ＥＤＴＡ洗浄後に残っている微量のｄｓＲＮＡ、ＤＮＡ、及びタンパク質は、ｓｓＲＮＡの前に溶出する。所望により２Ｍの塩化ナトリウムと組み合わせた、１Ｍ水酸化ナトリウムによって、カラムを洗浄し消毒する。
ピロリン酸（pyrophosphate）ではない塩の、ピロリン酸（pyrophosphate）、ピロリン酸（pyrophosphate）ではない塩及びｐＨの勾配との併用
クロマトグラフィー装置の形態にある、第一級アミノ基と第二級アミノ基の混合物を担持する固相を、５０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．０±０．５で平衡化する。ｓｓＲＮＡを含有するインビトロ転写混合物の試料を６．０±０．５に滴定し、濾過して濁りを除去する。試料をクロマトグラフィー装置に適用する。試料を、５０ｍＭ ＭＥＳ、２Ｍグアニジンイソチオシアネート、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．０±０．５で、１０装置容量に渡って洗浄し、ｄｓＲＮＡ、ＤＮＡ、及び混入タンパク質の大部分を除去する。グアニジン及びＥＤＴＡを、平衡化緩衝液で洗浄することによって除去する。クロマトグラフィー装置を、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、５００ｍＭ塩化カリウム、１００ｍＭピロリン酸四カリウム、ｐＨ８．０±０．５に向かう線形勾配で溶出に供する。グアニジン－ＥＤＴＡ洗浄後に残っている微量のｄｓＲＮＡ、ＤＮＡ、及びタンパク質は、ｓｓＲＮＡの前に溶出する。所望により２Ｍの塩化ナトリウムと組み合わせた、１Ｍ水酸化ナトリウムによって、カラムを洗浄し消毒する。
【0130】
参照文献
本明細書に引用される全ての参考文献は、その組み込みが本明細書の明示的な教示と矛盾しない限り、参照により本明細書に組み込まれる。
[1] M Baiersdorfer, G Boros, H Murumatsu, A Mahini, I Vlatkovic, U Sahin, K Kari-ko, A fascile method for the removal of dsRNA contaminant from in vitro-transcribed mRNA, Molecular therapy: nucleic acids, 15 (2019)
[2] S. Urayama, Y. Yoshida-Takashima, M. Yoshida, Y. Tomaru, H. Moriyama, K. Takai, T. Nunoura, A New Fractionation and Recovery Method of Viral Genomes Based on Nucleic Acid Composition and Structure Using Tandem Column Chroma-tography. Microbes Environ. 30, (2015) 199-203.
[3] R. Franklin, Purification and properties of the replicative intermediate of the RNA bacteriophage R17. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 55, (1966) 1504-1511.
[4] A Nwokeoji, AW Kung, P Kilby, D Portwood, M Dickman, Purification and char-acterization of dsRNA using ion pair reverse phase chromatography and mass spectrometry, J. Chromatography A 1484 (2017) 14-25.
[5] A Nwokeoji, M Earll, P Kilby, D. Portwood, M. Dickman, High resolution finger-printing of double-stranded RNA using ion-pair reversed phase chromatography, J. Chromatography B 1104 (2019) 212-219.
本明細書に引用される全ての参考文献は、その組み込みが本明細書の明示的な教示と矛盾しない限り、参照により本明細書に組み込まれる。
[1] M Baiersdorfer, G Boros, H Murumatsu, A Mahini, I Vlatkovic, U Sahin, K Kari-ko, A fascile method for the removal of dsRNA contaminant from in vitro-transcribed mRNA, Molecular therapy: nucleic acids, 15 (2019)
[2] S. Urayama, Y. Yoshida-Takashima, M. Yoshida, Y. Tomaru, H. Moriyama, K. Takai, T. Nunoura, A New Fractionation and Recovery Method of Viral Genomes Based on Nucleic Acid Composition and Structure Using Tandem Column Chroma-tography. Microbes Environ. 30, (2015) 199-203.
[3] R. Franklin, Purification and properties of the replicative intermediate of the RNA bacteriophage R17. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 55, (1966) 1504-1511.
[4] A Nwokeoji, AW Kung, P Kilby, D Portwood, M Dickman, Purification and char-acterization of dsRNA using ion pair reverse phase chromatography and mass spectrometry, J. Chromatography A 1484 (2017) 14-25.
[5] A Nwokeoji, M Earll, P Kilby, D. Portwood, M. Dickman, High resolution finger-printing of double-stranded RNA using ion-pair reversed phase chromatography, J. Chromatography B 1104 (2019) 212-219.
【0131】
[6] K Kariko, H Muramatsu, J Ludwig, D. Weismann, Generating the optimal mRNA for therapy: HPLC purification eliminates immune activation and improves transla-tion of nucleoside-modified, protein-encoding mRNA, Nucleic acid research, 39 (2011) el42.
[7] D. Weismann, N. Pardi, H Murumatsu, K Kariko, HPLC purification of in vitro transcribed long RNA, Methods Molecular Biology, 969 (2013) 43-54.
[8] A Romanovskaya, LP Sarin, DH Bramford, MM Poranen, High-throughput puri-fication of double-stranded R.N.A. molecules using convective interaction media monolithic anion exchange columns, J. Chromatography A, 1278 (2013) 54-60.
[9] WO 2014/144767 A1
[7] D. Weismann, N. Pardi, H Murumatsu, K Kariko, HPLC purification of in vitro transcribed long RNA, Methods Molecular Biology, 969 (2013) 43-54.
[8] A Romanovskaya, LP Sarin, DH Bramford, MM Poranen, High-throughput puri-fication of double-stranded R.N.A. molecules using convective interaction media monolithic anion exchange columns, J. Chromatography A, 1278 (2013) 54-60.
[9] WO 2014/144767 A1
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【国際調査報告】