(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-05-24
(54)【発明の名称】効率的な核酸送達のための担体
(51)【国際特許分類】
A61K 47/34 20170101AFI20230517BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20230517BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20230517BHJP
A61K 31/711 20060101ALI20230517BHJP
A61K 39/00 20060101ALI20230517BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230517BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20230517BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230517BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20230517BHJP
A61P 37/08 20060101ALI20230517BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230517BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20230517BHJP
A61K 9/16 20060101ALI20230517BHJP
A61K 47/10 20170101ALI20230517BHJP
A61K 47/24 20060101ALI20230517BHJP
A61K 47/28 20060101ALI20230517BHJP
【ＦＩ】
A61K47/34
A61K31/7088
A61K31/7105
A61K31/711
A61K39/00 H
A61P43/00 105
A61P31/00
A61P35/00
A61P37/06
A61P37/08
A61K48/00
A61K31/713
A61K9/16
A61K47/10
A61K47/24
A61K47/28
A61P43/00 171
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023504149
(86)(22)【出願日】2021-04-02
(85)【翻訳文提出日】2022-12-05
(86)【国際出願番号】 US2021025542
(87)【国際公開番号】W WO2021207020
(87)【国際公開日】2021-10-14
(31)【優先権主張番号】63/005,853
(32)【優先日】2020-04-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/145,086
(32)【優先日】2021-02-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】522392944
【氏名又は名称】ティバ バイオテック エルエルシー
(74)【代理人】
【識別番号】100120891
【弁理士】
【氏名又は名称】林 一好
(74)【代理人】
【識別番号】100165157
【弁理士】
【氏名又は名称】芝 哲央
(74)【代理人】
【識別番号】100205659
【弁理士】
【氏名又は名称】齋藤 拓也
(74)【代理人】
【識別番号】100126000
【弁理士】
【氏名又は名称】岩池 満
(74)【代理人】
【識別番号】100185269
【弁理士】
【氏名又は名称】小菅 一弘
(72)【発明者】
【氏名】タルクダー ポウラミ
(72)【発明者】
【氏名】チャハル ジャスデイヴ
(72)【発明者】
【氏名】ファン ジン
(72)【発明者】
【氏名】ルピン カール
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C085
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C076AA31
4C076CC03
4C076CC06
4C076CC07
4C076CC27
4C076CC31
4C076DD63
4C076DD70
4C076EE23
4C076EE24
4C084AA13
4C084MA41
4C084NA10
4C084ZB081
4C084ZB131
4C084ZB211
4C084ZB261
4C084ZB321
4C084ZC611
4C085AA03
4C085EE01
4C085EE05
4C086AA01
4C086EA16
4C086MA02
4C086MA05
4C086MA41
4C086NA10
4C086ZB08
4C086ZB13
4C086ZB21
4C086ZB26
4C086ZB32
4C086ZC61
(57)【要約】
ポリエステル（ＰＥ）デンドリマー又はデンドロンを含む担体と、ＰＥ内に封入された治療的又は免疫原性核酸剤とを含む、核酸の対象への送達のためのナノ粒子組成物が記載されている。免疫応答と相乗的治療又は予防効果を提供するナノ粒子組成物を投与することにより、対象の疾患又は病気を治療又は予防する方法が提供されている。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
式Ｉａ又は式Ｉｂで表される構造を有する核酸担体であって、【化1】
【請求項2】
ＰＥは、式ＩＩを有し、［（コア）ｃ－Ｇｎ－Ｏ］ ＩＩ
式中、ｃは、コア多重度又は前記コア由来のウェッジ数であり、その値が独立して１～６の範囲にあり、Ｇは、デンドリマー又はデンドロンの層又は世代であり、ｎは世代数であり、１～１０の範囲にある、請求項１に記載の核酸担体。
【請求項3】
前記複数のモノマーポリエステル単位は、２，２－ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸又は２，２－ビス（ヒドロキシメチル）酪酸である、請求項１に記載の核酸担体。
【請求項4】
ｚは、式ＩＩＩを有し、ｚ＝ｃｂｎ ＩＩＩ
式中、ｂは、分岐点多重度又は各分岐点における分岐数であり、ｃは、コア多重度又は前記コア由来のウェッジ数であり、１～６の範囲にあり、ｎは世代数であり、１～１０の範囲にある、請求項１に記載の核酸担体。
【請求項5】
ｃは１であり、前記コアは１方向コアである、請求項２に記載の核酸担体。
【請求項6】
前記１方向コアは、カルボン酸又はその誘導体である、請求項５に記載の核酸担体。
【請求項7】
前記コアは、【化2】
式中、Ｙは、メチル、イソプロピル、ｓｅｃ－ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、イソペンチル、ネオペンチル、３－メチルヘキシル、２，２－ジメチルペンチル、２，３－ジメチルペンチル、アジド（Ｎ３）、ハロゲン（Ｃｌ、Ｂｒ若しくはＩ）、アセチレン（Ｃ２Ｈ２）、ヒドロキシル（－ＯＨ）、又はチオール（－ＳＨ）、－ピラノシル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール及び複素環から選択され、Ａはアミンリンカーであり、Ｂは疎水性単位であり、ｍは１～２０である、請求項５に記載の核酸担体。
【請求項8】
前記シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール及び複素環は、ハロゲン基、ヒドロキシル基（－ＯＨ）及びアルキル基から選択される少なくとも１つの基で置換される、請求項７に記載の核酸。
【請求項9】
ｃは３であり、前記コアは３方向コアである、請求項２に記載の核酸担体。
【請求項10】
前記３方向コアは、トリメチロールプロパン、又は１，１，１－トリス（ヒドロキシフェニルエタン）であり、かつ、それぞれ【化3】
【請求項11】
ｃは４であり、前記コアは４方向コアである、請求項２に記載の核酸担体。
【請求項12】
前記４方向コアは、ペンタエリスリトール、アダマンタン－１，３，５，７－テトラオール又は５，１０，１５，２０－テトラキス（４－ヒドロキシフェニル）－２１Ｈ，２３Ｈ－ポルフィン、［１，１’－ビフェニル］－３，３’，５，５’－テトラオール、２，３，６，７－テトラヒドロキシ－９，１０－ジメチル－アントラセン、３．９，１０－ジメチル－９，１０－ジヒドロ－９，１０－エタノアントラセン－２，３，６，７－テトラオール、４．６，１３－ジヒドロペンタセン－５，７，１２，１４－テトラオール、ヘキサヒドロ－［１，４］ジオキシノ［２，３－ｂ］［１，４］ジオキシン－２，３，６，７－テトラオール、アントラセン－１，４，９，１０－テトラオール、ピレン－１，３，６，８－テトラオール及び３，３，３’，３’－テトラメチル－２，２’，３，３’－テトラヒドロ－１－１’－スピロビ［インデン］－５，５’，６，６’－テトラオールからなる群から選択され、かつ、それぞれ【化4】
【化5】
【請求項13】
Ａは、Ｎ１－（２－アミノエチル）エタン－１，２－ジアミン、Ｎ１－（２－アミノエチル）プロパン－１，３－ジアミン、Ｎ１－（３－アミノプロピル）プロパン－１，３－ジアミン、Ｎ１，Ｎ１’－（エタン－１，２－ジイル）ビス（エタン－１，２－ジアミン）、Ｎ１，Ｎ１’－（エタン－１，２－ジイル）ビス（Ｎ２－（２－アミノエチル）エタン－１，２－ジアミン）、Ｎ１－（２－（４－（２－アミノエチル）ピペラジン－１－イル）エチル）エタン－１，２－ジアミン、Ｎ１－（２－アミノエチル）－Ｎ１－メチルエタン－１，２－ジアミン、Ｎ１－（３－アミノプロピル）－Ｎ１－メチルプロパン－１，３－ジアミン、Ｎ１－（３－アミノプロピル）－Ｎ１－エチルプロパン－１，３－ジアミン、３－（（３－アミノプロピル）（メチル）アミノ）プロパン－１－オール、３，３’－（メチルアザンジイル）ビス（プロパン－１－オール）、Ｎ１－（３－アミノプロピル）－Ｎ１－メチルブタン－１，４－ジアミン、４－（（３－アミノプロピル）（メチル）アミノ）ブタン－１－オール、４－（（３－ヒドロキシプロピル）（メチル）アミノ）ブタン－１－オール、４－（（３－ヒドロキシプロピル）（メチル）アミノ）ブタン－１－オール、Ｎ１－（４－アミノブチル）－Ｎ１－メチルブタン－１，４－ジアミン、４－（（４－アミノブチル）（メチル）アミノ）ブタン－１－オール、４，４’－（メチルアザンジイル）ビス（ブタン－１－オール）、３－（（３－アミノプロピル）（エチル）アミノ）プロパン－１－オール、３，３’－（エチルアザンジイル）ビス（プロパン－１－オール）、Ｎ１－（３－アミノプロピル）－Ｎ１－エチルブタン－１，４－ジアミン、４－（（３－アミノプロピル）（エチル）アミノ）ブタン－１－オール、４－（エチル（３－ヒドロキシプロピル）アミノ）ブタン－１－オール、Ｎ１－（２－アミノエチル）－Ｎ１－メチルプロパン－１，３－ジアミン、Ｎ１－（４－アミノブチル）－Ｎ１－エチルブタン－１，４－ジアミン、４，４’－（エチルアザンジイル）ビス（ブタン－１－オール）、３－（（３－アミノプロピル）アミノ）プロパン－１－オール、Ｎ１－（３－アミノプロピル）ブタン－１，４－ジアミン、４－（（３－ヒドロキシプロピル）アミノ）ブタン－１－オール、Ｎ１－（４－アミノブチル）ブタン－１，４－ジアミン、３，３’－アザンジイルビス（プロパン－１－オール）、４－（（３－アミノプロピル）アミノ）ブタン－１－オール、４，４’－アザンジイルビス（ブタン－１－オール）及びＮ１，Ｎ１’－（ブタン－１，４－ジイル）ビス（プロパン－１，３－ジアミン）からなる群に由来し、かつ、それぞれ【化6】
【化7】
【化8】
【化9】
【請求項14】
Ｂは、Ｃ１－Ｃ２２アルキル基又はＣ２－Ｃ２２アルケニル基である、請求項１に記載の核酸担体。
【請求項15】
前記Ｃ１－Ｃ２２アルキル基又はＣ２－Ｃ２２アルケニル基は、ハロゲン、－ＣＮ、－ＮＯ２、－Ｎ３、Ｃ１－Ｃ６アルキル、ハロ（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、－ＯＲ、－ＮＲ２、－ＣＯ２Ｒ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＯＮ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（ＮＨ）Ｎ（Ｒ）２、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、Ｃ３－Ｃ８シクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール及び複素環からなる群から選択された１～４個の置換基で置換され、Ｒは、水素、Ｃ１－Ｃ６アルキル、ハロ（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、Ｃ３－Ｃ８シクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール及び複素環からなる群から選択される、請求項１４に記載の核酸担体。
【請求項16】
前記１～４個の置換基は、ＯＲ、－ＮＲ２、－ＣＯ２Ｒ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＯＮ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２及び－ＮＨＣ（ＮＨ）Ｎ（Ｒ）２から選択される、請求項１５に記載の核酸担体。
【請求項17】
各シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール及び複素環は、さらにＲ’で置換され、Ｒ’は、独立して、ハロゲン、－ＣＮ、－ＮＯ２、－Ｎ３、Ｃ１－Ｃ６アルキル及びハロ（Ｃ１－Ｃ６アルキル）からなる群から選択される、請求項１６に記載の核酸担体。
【請求項18】
Ｂは不飽和アルキル基である、請求項１に記載の核酸担体。
【請求項19】
Ｂは、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、デシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ブト－３－エン－１－イル、オクト－７－エン－１－イル、１２－トリデセニル、１４－ペンタデセニル、１７－オクタデセニル、オレイル、リノレイル及びアラキドニルからなる群から選択される、請求項１に記載の核酸担体。
【請求項20】
Ｂは、脂肪酸又はその誘導体に由来する、請求項１に記載の核酸担体。
【請求項21】
前記脂肪酸は、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸及びエイコサペンタン酸からなる群から選択される、請求項２０に記載の核酸担体。
【請求項22】
前記脂肪酸の誘導体は、１２－ヒドロキシ－９－シス－オクタデセン酸、１２－メチルテトラデカン酸、１２－メチルトリデカン酸、１４－メチルヘキサデカン酸、１４－メチルヘキサデカン酸、１８－メチルノナデカン酸、１９－メチルアラキドン酸、イソパルミチン酸、イソステアリン酸、フィタン酸、（±）－２－ヒドロキシオクタン酸、（±）－３－ヒドロキシデカン酸、（±）－３－ヒドロキシオクタン酸、１０－ヒドロキシデカン酸、１２－ヒドロキシオクタデカン酸、１５－ヒドロキシペンタデカン酸、１６－ヒドロキシヘキサデカン酸、２－ヒドロキシヘキサデカン酸、２－ヒドロキシテトラデカン酸、２－ヒドロキシドデカン酸、ＤＬ－α－ヒドロキシステアリン酸、ＤＬ－β－ヒドロキシラウリン酸、ＤＬ－β－ヒドロキシミリスチン酸及びＤＬ－β－ヒドロキシパルミチン酸からなる群から選択される、請求項２１に記載の核酸担体。
【請求項23】
前記脂肪酸は、１つ以上の安定同位体を含む、請求項２０に記載の核酸担体。
【請求項24】
前記安定同位体は炭素又は水素の安定同位体である、請求項２３に記載の核酸担体。
【請求項25】
前記炭素の安定同位体は１３Ｃである、請求項２４に記載の核酸担体。
【請求項26】
前記水素の安定同位体は２Ｈである、請求項２４に記載の核酸担体。
【請求項27】
前記安定同位体を含む前記脂肪酸は、オクタン酸－１－１３Ｃ、オクタン酸－８－１３Ｃ、オクタン酸－８，８，８－ｄ３、オクタン－２Ｈ１５酸、デカン酸－１－１３Ｃ、デカン酸－１０－１３Ｃ、デカン－１０，１０，１０－ｄ３酸、デカン－ｄ１９酸、ウンデカン酸－１－１３Ｃ、ラウリン酸－１２，１２，１２－２Ｈ３、ラウリン－２Ｈ２３酸、ラウリン酸－１－１３Ｃ、ラウリン酸－１，１２－１３Ｃ２、トリデカン－２，２－２Ｈ２酸、ミリスチン酸－１４－１３Ｃ、ミリスチン酸－１－１３Ｃ、ミリスチン酸－１４，１４，１４－２Ｈ３、ミリスチン－２Ｈ２７酸、パルミチン酸－１－１３Ｃ、パルミチン酸－１６－１３Ｃ、パルミチン酸－１６－１３Ｃ，１６，１６，１６－２Ｈ３、パルミチン酸－２Ｈ３１、ステアリン酸－１－１３Ｃ、ステアリン酸－１８－１３Ｃ、ステアリン酸－１８，１８，１８－２Ｈ３、ステアリン－２Ｈ３５酸、オレイン酸－１－１３Ｃ、オレイン酸－２Ｈ３４、リノレン酸－１－１３Ｃ、リノール酸－２Ｈ３２、アラキドン－５，６，８，９，１１，１２，１４，１５－２Ｈ８酸及びエイコサン－２Ｈ３９酸からなる群から選択される、請求項２３に記載の核酸担体。
【請求項28】
Ｐは、２つのアジド基を有するホモ二官能性リンカーであり、式ＩＶで表される構造を有し、【化10】
【請求項29】
請求項１～２８のいずれか１項に記載の核酸担体と、該核酸担体に封入された治療的又は免疫原性核酸剤とを含む、ナノ粒子組成物。
【請求項30】
前記治療的又は免疫原性核酸剤は、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｒｅｐＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ及びｍＲＮＡからなる群から選択される、請求項２９に記載のナノ粒子組成物。
【請求項31】
前記治療的又は免疫原性核酸剤は、感染症、病原体、癌、自己免疫疾患及びアレルギー疾患からなる群より選択される１つ以上の抗原をコードする、請求項２９に記載のナノ粒子組成物。
【請求項32】
前記治療的又は免疫原性核酸剤は、遺伝子の活性をサイレンシングするか、抑制するか又は改変することができるＲＮＡ又はＤＮＡを含む、請求項２９に記載のナノ粒子組成物。
【請求項33】
ＰＥＧ－脂質をさらに含む、請求項２９に記載のナノ粒子組成物。
【請求項34】
前記ＰＥＧ－脂質は、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリ－エチレングリコール）－２０００］又は１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００である、請求項３３に記載のナノ粒子組成物。
【請求項35】
ナノ粒子組成物当たり前記ＰＥＧ－脂質を１モル％～１０モル％の範囲で含む、請求項３３に記載のナノ粒子組成物。
【請求項36】
リン脂質及びコレステロール又はその誘導体をさらに含む、請求項３３に記載のナノ粒子組成物。
【請求項37】
前記リン脂質は、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）又はジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）である、請求項３６に記載のナノ粒子組成物。
【請求項38】
ナノ粒子組成物当たり前記リン脂質を１０モル％～１５モル％の範囲で含む、請求項３６に記載のナノ粒子組成物。
【請求項39】
ナノ粒子組成物当たり前記コレステロール又はその誘導体を５０モル％～７５モル％の範囲で含む、請求項３６に記載のナノ粒子組成物。
【請求項40】
対象の疾患又は病気を治療又は予防する方法であって、治療有効量の請求項２９に記載のナノ粒子組成物を、必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項41】
治療有効量の前記ナノ粒子組成物は、前記対象のｋｇ体重当たり前記治療的又は免疫原性核酸剤を０．０１ｍｇ核酸～１０ｍｇ核酸の範囲で含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項42】
前記対象は哺乳動物である、請求項４０に記載の方法。
【請求項43】
前記哺乳動物は、ニワトリ、齧歯動物、イヌ、霊長類動物、ウマ、高価値の農業動物及びヒトからなる群から選択される、請求項４２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本願は、２０２０年４月６日に出願した、発明の名称が「ＣＡＲＲＩＥＲＳ ＦＯＲ ＥＦＦＩＣＩＥＮＴ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＤＥＬＩＶＥＲＹ（効率的な核酸送達のための担体）」である米国特許仮出願第６３／００５，８５３号と、２０２１年２月３日に出願した、発明の名称が「ＣＡＲＲＩＥＲＳ ＦＯＲ ＥＦＦＩＣＩＥＮＴ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＤＥＬＩＶＥＲＹ（効率的な核酸送達のための担体）」である米国特許仮出願第６３／１４５，０８６号との優先権を主張するものであり、これらの全ての内容は参照により本明細書に組み込まれるものとする。
本願は、２０２０年４月６日に出願した、発明の名称が「ＣＡＲＲＩＥＲＳ ＦＯＲ ＥＦＦＩＣＩＥＮＴ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＤＥＬＩＶＥＲＹ（効率的な核酸送達のための担体）」である米国特許仮出願第６３／００５，８５３号と、２０２１年２月３日に出願した、発明の名称が「ＣＡＲＲＩＥＲＳ ＦＯＲ ＥＦＦＩＣＩＥＮＴ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＤＥＬＩＶＥＲＹ（効率的な核酸送達のための担体）」である米国特許仮出願第６３／１４５，０８６号との優先権を主張するものであり、これらの全ての内容は参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【0002】
技術分野
本開示は、疾患及び／又は障害を治療又は予防するための、核酸の対象への効率的な送達のための担体と、担体及び核酸を含むナノ粒子組成物に関する。また、本開示は、ナノ粒子組成物の製剤化方法と、そのようなナノ粒子組成物で対象の疾患及び／又は障害を治療する方法に関する。
本開示は、疾患及び／又は障害を治療又は予防するための、核酸の対象への効率的な送達のための担体と、担体及び核酸を含むナノ粒子組成物に関する。また、本開示は、ナノ粒子組成物の製剤化方法と、そのようなナノ粒子組成物で対象の疾患及び／又は障害を治療する方法に関する。
【背景技術】
【0003】
近年、核酸ワクチン及び核酸治療薬は、遺伝子療法用途を含む、いくつかの疾患又は病気を予防及び治療する有望なアプローチとして、登場している。しかしながら、核酸は、細胞膜を貫通することができず、血流中の酵素分解を受けやすい大きな親水性分子である。（Ｍｅｎｄｅｓら、２０１７、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２２（９）、１４０１；Ｊｏｎｅｓら、２０１３、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ １０、４０８２－４０９８；並びにＮｉｓｈｉｋａｗａ及びＨｕａｎｇ、２００１ Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １２、８６１－８７０）。
【0004】
したがって、提案されている核酸戦略の大部分は、理想的には、できるだけ少ない毒性で細胞に効率的に核酸を送達するために、細胞外と細胞内の異なる障壁を克服する必要がある送達ベクターに依存する（Ｊｏｎｅｓら、２０１３、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ １０、４０８２－４０９８；Ｇｏｍｅｓら、２０１４ ＭＲＳ Ｂｕｌｌ． ３９、６０－７０；並びにＮｉｓｈｉｋａｗａ及びＨｕａｎｇ、２００１ Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １２、８６１－８７０）。
【0005】
成功した核酸療法に向けた障害としては、エンドヌクレアーゼによる核酸分解、細胞内在化、エンドソーム脱出、ベクターからのペイロード放出及び所望のターゲットへのアクセス、ベクターの細胞内及び細胞外への蓄積が挙げられる。（Ｊｏｎｅｓら、２０１３、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ １０、４０８２－４０９８；Ｎｉｓｈｉｋａｗａ及びＨｕａｎｇ、２００１ Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １２、８６１－８７０；Ｇｏｍｅｓら、２０１４ ＭＲＳ Ｂｕｌｌ． ３９、６０－７０；並びにＤｕｆｅｓら、２００５、Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ． ５７、２１７７－２２０２）。
【0006】
近年、脂質、ポリマー及びデンドリマーなどの非ウイルス性ベクターが大いに注目されている（Ｊｏｎｅｓら、２０１３、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ １０、４０８２－４０９８；Ｎｉｓｈｉｋａｗａ及びＨｕａｎｇ、２００１ Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １２、８６１－８７０；並びにＭｉｎｔｚｅｒ及びＳｉｍａｎｅｋ、２００９、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ． １０９、２５９－３０２）。これらの共通の特徴は、カチオン性又はイオン化性質である。非ウイルスベクターの中で、デンドリマーベースのベクターは、潜在的な核酸送達媒体として２０年以上にわたって大きな関心を集めてきた。しかしながら、生分解性の単分子担体へのアクセスは課題のままである（Ｍｉｎｔｚｅｒ及びＧｒｉｎｓｔａｆｆ、２０１０、Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ． ４０、１７３－１９０；Ｒａｖｉｎａら、２０１０、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ４３、６９５３－６９６１；Ｎｏｕｒｉら、２０１２、Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｍａｔｅｒ．Ｍｅｄ． ２３、２９６７－２９８０；Ｐａｎｄｉｔａら、２０１１、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ １２、４７２－４８１；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓら、２０１１、Ｎｅｗ Ｊ．Ｃｈｅｍ． ３５、１９３８－１９４３；Ｓａｎｔｏｓら、２０１０、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １４４、５５－６４；Ｓａｎｔｏｓら、２００９、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １３４、１４１－１４８；Ｓａｎｔｏｓら、２０１０、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ７、７６３－７７４；並びにＤｕｎｃａｎ及びＩｚｚｏ、２００５、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ． ５７、２２１５－２２３７）。
【0007】
理想的な核酸送達媒体は、蓄積及びその後の細胞毒性を防止するために生分解性であることが必要である（Ｄｕｎｃａｎ及びＩｚｚｏ、２００５、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ． ５７、２２１５－２２３７）。生体適合性又は生体内での天然代謝物への分解性を有することが知られている構成単位を有する「バイオデンドリマー」と呼ばれるポリエステルデンドリマーが報告されている（Ｃａｒｎａｈａｎ及びＧｒｉｎｓｔａｆｆ、２００１、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． １２３、２９０５；Ｃａｒｎａｈａｎ及びＧｒｉｎｓｔａｆｆ、２００１、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ３４、７６４８；並びにＣａｒｎａｈａｎ及びＧｒｉｎｓｔａｆｆ、２００６、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ３９、６０９）。ポリエステルデンドリマーは、小分子送達用の媒体として確認されているが、核酸送達に適していない。他の要件の中でも、効率的な核酸送達担体とするために、デンドリマーは、核酸との複合体を形成することが必要であり、細胞への輸送を確保しつつ核酸を分解から保護するナノ粒子組成物に自己組織化することが好ましい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】Ｍｅｎｄｅｓら、２０１７、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２２（９）、１４０１
【非特許文献2】Ｊｏｎｅｓら、２０１３、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ １０、４０８２－４０９８
【非特許文献3】Ｎｉｓｈｉｋａｗａ及びＨｕａｎｇ、２００１ Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １２、８６１－８７０
【非特許文献4】Ｇｏｍｅｓら、２０１４ ＭＲＳ Ｂｕｌｌ． ３９、６０－７０
【非特許文献5】Ｄｕｆｅｓら、２００５、Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ． ５７、２１７７－２２０２
【非特許文献6】Ｍｉｎｔｚｅｒ及びＳｉｍａｎｅｋ、２００９、Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ． １０９、２５９－３０２
【非特許文献7】Ｍｉｎｔｚｅｒ及びＧｒｉｎｓｔａｆｆ、２０１０、Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ． ４０、１７３－１９０
【非特許文献8】Ｒａｖｉｎａら、２０１０、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ４３、６９５３－６９６１
【非特許文献9】Ｎｏｕｒｉら、２０１２、Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｍａｔｅｒ．Ｍｅｄ． ２３、２９６７－２９８０
【非特許文献10】Ｐａｎｄｉｔａら、２０１１、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ １２、４７２－４８１
【非特許文献11】Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓら、２０１１、Ｎｅｗ Ｊ．Ｃｈｅｍ． ３５、１９３８－１９４３
【非特許文献12】Ｓａｎｔｏｓら、２０１０、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １４４、５５－６４
【非特許文献13】Ｓａｎｔｏｓら、２００９、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １３４、１４１－１４８
【非特許文献14】Ｓａｎｔｏｓら、２０１０、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ７、７６３－７７４
【非特許文献15】Ｄｕｎｃａｎ及びＩｚｚｏ、２００５、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ． ５７、２２１５－２２３７
【非特許文献16】Ｃａｒｎａｈａｎ及びＧｒｉｎｓｔａｆｆ、２００１、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． １２３、２９０５
【非特許文献17】Ｃａｒｎａｈａｎ及びＧｒｉｎｓｔａｆｆ、２００１、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ３４、７６４８
【非特許文献18】Ｃａｒｎａｈａｎ及びＧｒｉｎｓｔａｆｆ、２００６、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ３９、６０９
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0009】
一態様において、本発明は、式Ｉａ又は式Ｉｂで表される核酸担体であって、
式中、ＰＥは、コアと、１世代以上形成する複数のモノマーポリエステル単位とを含むポリエステルデンドリマー又はデンドロンであり、Ａは、アミンリンカーであり、Ｂは、疎水性単位であり、ｚは、表面基の数であり、Ｐは、２つのポリエステルデンドロンを連結するリンカーである、核酸担体に関する。
【化1】
【0010】
一態様において、本発明は、本明細書に開示されるいずれかの核酸担体と、該核酸担体に封入された治療的又は免疫原性核酸剤と、共役脂質とを含むナノ粒子組成物に関する。
【0011】
一態様において、本発明は、細胞内送達及び生体内でのナノ粒子安定性を向上させるための、本明細書に開示されるいずれかの核酸担体と、該核酸担体に封入された治療的又は免疫原性核酸剤と、本明細書に開示される１つの共役脂質（例えば、ＰＥＧ－脂質）と、リン脂質及びコレステロール又はその誘導体の混合物とを含むナノ粒子組成物に関する。
【0012】
一態様において、本発明は、対象の疾患又は病気を治療又は予防する方法に関する。該方法は、本明細書に開示されるいずれかのナノ粒子組成物を提供することと、治療有効量の該ナノ粒子組成物を対象に投与することを伴う。
【図面の簡単な説明】
【0013】
本発明の好ましい実施形態の以下の詳細な説明は、添付図面と合わせて読むとよりよく理解されるであろう。本発明を説明するために、具体的な実施形態が図面に示されている。しかしながら、本発明は、図示された正確な配置と手段に限定されないことを理解すべきである。
【0014】
【図1】修飾に使用された脂肪酸側鎖（Ｂ）を有する世代１の修飾ポリエステルデンドリマーの概略図である。該図において、脂肪酸側鎖Ｂは、Ｃ４－Ｃ２８脂肪酸のいずれかから選択することができる。
【図2】修飾デンドリマー（ＰＥ－ステアリン）、１，２ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］及びｍＲＮＡを含有する、改善された自己組織化のために設計されたナノ粒子組成物の調製プロセスを示す。
【図3】ナノ粒子のサイズ（ｄ）に基づいて強度として測定されたナノ粒子組成物の分布を示す。
【図4】修飾デンドリマーとＲＮＡとの結合を示すアガロースゲルの写真を示す。ゲルを臭化エチジウム（ＥＢ）で染色し、ゲル画像をＳｙｎｇｅｎｅ Ｇ Ｂｏｘイメージングシステム（Ｓｙｎｇｅｎｅ、米国）で撮影した。
【図5】ＲＮＡの製剤化プロセスに使用された中性ｐＨ及びｐＨ５．０のデンドリマーの安定性を示す。
【図6A】図６Ａ～６Ｅは、ＤＬＳ及びアガロースゲル保持アッセイにより測定されたＰＢＳにおけるＲＮＡ－ＰＥステアリンナノ粒子の安定性を示す。図６Ａは、ナノ粒子のサイズ（ｄ）に基づいて強度として測定された（透析直後）ナノ粒子組成物の分布を示す。
【図6B】図６Ａ～６Ｅは、ＤＬＳ及びアガロースゲル保持アッセイにより測定されたＰＢＳにおけるＲＮＡ－ＰＥステアリンナノ粒子の安定性を示す。図６Ｂは、４℃で３週間保存後にＤＬＳにより測定されたＰＥ－ステアリン ＰＲ８ ＨＡ ｍＲＮＡの安定性を示す。
【図6C】図６Ａ～６Ｅは、ＤＬＳ及びアガロースゲル保持アッセイにより測定されたＰＢＳにおけるＲＮＡ－ＰＥステアリンナノ粒子の安定性を示す。図６Ｃは、室温（ＲＴ）で３日間保存後にＤＬＳにより測定されたＰＥ－ステアリン ＰＲ８ ＨＡ ｍＲＮＡの安定性を示す。
【図6D】図６Ａ～６Ｅは、ＤＬＳ及びアガロースゲル保持アッセイにより測定されたＰＢＳにおけるＲＮＡ－ＰＥステアリンナノ粒子の安定性を示す。図６Ｄは、３７℃で２時間保存後にＤＬＳにより測定されたＰＥ－ステアリン ＰＲ８ ＨＡ ｍＲＮＡの安定性を示す。
【図6E】図６Ａ～６Ｅは、ＤＬＳ及びアガロースゲル保持アッセイにより測定されたＰＢＳにおけるＲＮＡ－ＰＥステアリンナノ粒子の安定性を示す。図６Ｅは、レーン１－ＰＲ８ ＨＡ ｍＲＮＡ、レーン２－ＰＥ－ステアリン ＰＲ８ ＨＡ ｍＲＮＡ、４°、３週間、レーン３－ＰＥ－ステアリン ＰＲ８ ＨＡ ｍＲＮＡ、ｒｔ、３日、レーン４－ＰＥ－ステアリン ＰＲ８ ＨＡ ｍＲＮＡ、３７℃、１時間、レーン５－ＰＥ－ステアリン ＰＲ８ ＨＡ ｍＲＮＡ、３７℃、２時間というゲル保持アッセイに基づく安定性の結果を示す。
【図7A】修飾ポリエステルデンドリマーベースのナノ粒子により哺乳類細胞に送達され、発光アッセイを使用した細胞内ルシフェラーゼ活性の定量化により測定されたルシフェラーゼｍＲＮＡからの細胞培養におけるルシフェラーゼ発現を示す。図７Ａは、裸のルシフェラーゼｍＲＮＡ（陰性対照）と比較して、ＰＥ－リノール、ＰＥ－ステアリン及びＰＥ－パルミチンを含有するナノ粒子により送達されたルシフェラーゼｍＲＮＡの細胞培養発現を示す。
【図7B】修飾ポリエステルデンドリマーベースのナノ粒子により哺乳類細胞に送達され、発光アッセイを使用した細胞内ルシフェラーゼ活性の定量化により測定されたルシフェラーゼｍＲＮＡからの細胞培養におけるルシフェラーゼ発現を示す。図７Ｂは、裸のルシフェラーゼｍＲＮＡと比較して、ＰＥ－ヘプタデカン、ＰＥ－ステアリン、ＰＥ－オレイン及びＰＥ－１６－ヒドロキシパルミチンを含有するナノ粒子によって送達されたルシフェラーゼｍＲＮＡの細胞培養発現を示す。
【図8】修飾ポリエステルデンドリマーベースのナノ粒子におけるＰＲ８ ＨＡ ｍＲＮＡの送達後の細胞培養におけるＨＡ発現のウエスタンブロット分析を示す。
【図9】ＰＲ８ ＨＡ ｍＲＮＡ含有ナノ粒子の筋肉内注射により誘導され、ヘマグルチニン阻害アッセイ（ＨＡＩ）によりアッセイされたＨＡ特異的抗体を示す。
【図10】ナノ粒子のサイズ（ｄ）に基づいて強度として測定されたＤＮＡナノ粒子組成物の分布を示す。
【図11】ＤＮＡ及び修飾ポリエステルデンドリマーを含有するナノ粒子のためのｑｕａｎｔｉｂｌｕｅアッセイを介した生体外のＳＥＡＰ発現を示す。
【図12】ｐＨ４．０又は５．０で修飾ポリエステルデンドロンナノ粒子に製剤化されたＳＥＡＰを発現するレプリコンＲＮＡのＳＥＡＰ比色信号を示す。
【図13】ポリエステルデンドリマー及びデンドロンベースのナノ粒子におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクレプリコンＲＮＡの送達後の細胞培養におけるスパイク発現のウエスタンブロット分析を示す。
【図14】ＰＥデンドロン－Ｇ２－リシノール送達材料で製剤化されたレプリコンスパイクＲＮＡを使用したワクチン接種に応答した、ＣＯＶＩＤ－１９スパイクタンパク質に特異的なマウスＩｇＧのエンドポイント希釈血清の力価を示す。
【図15】ＰＥデンドロンＧ２－５Ａ２－５リシノールで製剤化された７．２μｇのルシフェラーゼコードレプリコンＲＮＡ又は脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）として製剤化された３１．４μｇの同じＲＮＡを注射したマウスを治療してから６、１６及び４２時間後の心臓と脾臓の相対発光量（ＲＬＵ）で測定された相対ルシフェラーゼ発現を示す。
【図16】ナノ粒子のサイズ（ｄ）に基づいて強度として測定されたナノ粒子組成物の分布を示す。
【図17】ＰＥデンドロン＿Ｇ２－Ａ１－リシノールと（ＰＥデンドロン＿Ｇ２－Ａ１－リシノール）２ ＰＥＧ ２００ナノ粒子に製剤化されたＳＥＡＰを発現するレプリコンＲＮＡに対するＳＥＡＰ比色信号を示す。
【発明を実施するための形態】
【0015】
以下の説明において、特定の用語は、便宜上のためにのみ使用され、限定的ではない。
【0016】
「ナノ粒子組成物」は、修飾デンドリマーと該修飾デンドリマーに封入された核酸ペイロード分子とを含む組成物を指す。
【0017】
「置換」という用語は、親構造上の全原子の原子価が維持されているという条件で、１つの官能基又は該官能基に含まれる部分を、他の官能基又は該他の官能基に含まれる部分に変更する能力を指す。置換した基は、本明細書において、「置換」又は「置換基」と互換的に呼ばれる。任意の所与の構造中の複数の位置が特定の基から選択された複数の置換基で置換される場合、置換基は、全ての位置で同じであっても異なってもよい。
【0018】
本明細書で使用される場合、「アミンリンカー」という用語は、疎水性尾部（本明細書において、便宜上、成分「Ｂ」と記載されている）をデンドリマー又はデンドロン表面に存在する末端化学基にリンクするか又は連結する、アミン含有リンカーを指す。アミンリンカーに存在するアミンは、孤立電子対を持つ塩基性窒素原子を含有する官能基である。アミンは、形式的にアンモニアの誘導体であり、１つ以上の水素原子がアルキル基などの置換基で置換されたものである。
【0019】
本明細書で使用される場合、「アルキル」という用語は、特に指定されていない限り、１～２８、好ましくは、１～２０の炭素原子を含有する直鎖又は分岐鎖の炭化水素を意味する。アルキル鎖の長さは、核酸担体の疎水性と自己組織化特性を制御するために使用されてもよい。アルキルの代表的な例としては、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ－ヘキシル、３－メチルヘキシル、２，２－ジメチルペンチル、２，３－ジメチルペンチル、ｎ－ヘプチル、ｎ－オクチル、ｎ－ノニル及びｎ－デシルが挙げられるが、これらに限定されない。「アルキル基」は、他の２つの部分間の連結基である場合、直鎖又は分岐鎖であってもよい。アルキル基の例としては、－ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２－、－ＣＨＣＨＣＨＣ（ＣＨ）及びＣＨＣＨ（ＣＨＣＨ）ＣＨ－が挙げられるが、これらに限定されない。
【0020】
本明細書で使用される場合、「表面基」という用語は、核酸担体の表面にある末端基を意味する。本明細書の核酸担体の表面は、自己組織化特性を支援するために、疎水性尾部（本明細書において、成分「Ｂ」と記載されている）で修飾される。
【0021】
特許請求の範囲及び明細書の対応する部分で使用される「ａ」と「ｏｎｅ」という単語は、特に明記されていない限り、１つ以上の参照される項目を含むものとして定義される。この用語には、上述した具体的に言及された単語、それらの派生語及び類義語が含まれる。「Ａ、Ｂ若しくはＣ」又は「Ａ、Ｂ及びＣ」などの２つ以上の項目のリストに続く「少なくとも１つ」という語句は、Ａ、Ｂ又はＣのうちのいずれか１つ、及びこれらの任意の組み合わせを意味する。
【0022】
一実施形態において、式Ｉａ又はＩｂで表される核酸担体が提供される。
式中、ＰＥは、コアと、ツリー状構造を形成するために該コアの周りに階層化したモノマーポリエステル単位とを含むポリエステルデンドリマー又はデンドロンであり、ここで、各層が世代（Ｇ）と呼ばれ、Ａは、アミンリンカーであり、Ｂは、疎水性単位であり、ｚは、表面基の数であり、Ｐは、２つのポリエステルデンドロンを連結するリンカーである。アミンリンカーは、生理学的ｐＨでプロトン化され、帯電したアミン基を含有してもよい。
【化2】
【0023】
一実施形態において、ＰＥは、式ＩＩを有してもよく、
［（コア）ｃ－Ｇｎ－Ｏ］ 式ＩＩ
式中、ｃは、コア多重度又はコア由来のウェッジ数であり、ｃの値は１～６の範囲にある。デンドロンは、本明細書においてコアとも呼ばれる、化学的にアドレス指定可能な単一の焦点から生じる超分岐ウェッジからなってもよい。したがって、１方向コアを有するデンドロンの場合、ｃは１に等しい。Ｇは、デンドリマー又はデンドロンの層又は世代であり、ｎは世代数であり、その値は１～１０の範囲にあり、モノマーポリエステル単位は、２，２－ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸又は２，２－ビス（ヒドロキシメチル）酪酸であってもよく、ｚは、式ＩＩＩを有し、
ｚ＝ｃｂｎ 式ＩＩＩ
式中、ｂは、分岐点多重度又は各分岐点における分岐数であり、ｃは、１～６の範囲にあり、ｎは、世代数である。
［（コア）ｃ－Ｇｎ－Ｏ］ 式ＩＩ
式中、ｃは、コア多重度又はコア由来のウェッジ数であり、ｃの値は１～６の範囲にある。デンドロンは、本明細書においてコアとも呼ばれる、化学的にアドレス指定可能な単一の焦点から生じる超分岐ウェッジからなってもよい。したがって、１方向コアを有するデンドロンの場合、ｃは１に等しい。Ｇは、デンドリマー又はデンドロンの層又は世代であり、ｎは世代数であり、その値は１～１０の範囲にあり、モノマーポリエステル単位は、２，２－ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸又は２，２－ビス（ヒドロキシメチル）酪酸であってもよく、ｚは、式ＩＩＩを有し、
ｚ＝ｃｂｎ 式ＩＩＩ
式中、ｂは、分岐点多重度又は各分岐点における分岐数であり、ｃは、１～６の範囲にあり、ｎは、世代数である。
【0024】
モノマーポリエステル単位として２，２－ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸又は２，２－ビス（ヒドロキシメチル）酪酸を含む核酸担体では、分岐点多重度又は各分岐点における分岐数ｂは、２である。
【0025】
コアの構造は、担体の物理化学的特性、核酸との相互作用、遺伝子導入活性を調節してもよい得られる核酸担体の表面の官能基数、アミン及び／又は電荷密度、直径及び柔軟性に影響を与えてもよい。
【0026】
一実施形態において、コアは１方向であってもよく、この場合、式ＩＩでは、ｃは１である。１方向コアは、カルボン酸又はその誘導体であってもよい。
【0027】
１方向コアは、以下の足場から選択されてもよく、
式中、Ｙは、メチル、イソプロピル、ｓｅｃ－ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、イソペンチル、ネオペンチル、３－メチルヘキシル、２，２－ジメチルペンチル、２，３－ジメチルペンチル、アジド（Ｎ３）、ハロゲン（Ｃｌ、Ｂｒ若しくはＩ）、アセチレン（Ｃ２Ｈ２）、ヒドロキシル（－ＯＨ）、又はチオール（－ＳＨ）、ピラノシル、シクロアルキル、アリール、ヘテロリル及び複素環から選択され、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール及び複素環のそれぞれは、ハロゲン、ヒドロキシル（－ＯＨ）及びアルキル基で置換されてもよく、Ａは、アミンリンカーであり、Ｂは、疎水性単位であり、ｍは、１～２０である。
【化3】
【0028】
一実施形態において、コアは３方向コアであってもよく、この場合、式ＩＩでは、ｃは３である。３方向コアは、トリメチロールプロパン又は１，１，１－トリス（ヒドロキシフェニルエタン）であってもよい。参照のために、上記コアの構造は、次の足場として絵で提示される。
【化4】
【0029】
一実施形態において、コアは４方向コアであってもよく、この場合、式ＩＩでは、ｃは４である。
【0030】
４方向コアは、ペンタエリスリトール、アダマンタン－１，３，５，７－テトラオール又は５，１０，１５，２０－テトラキス（４－ヒドロキシフェニル）－２１Ｈ，２３Ｈ－ポルフィン、［１，１’－ビフェニル］－３，３’，５，５’－テトラオール、２，３，６，７－テトラヒドロキシ－９，１０－ジメチル－アントラセン、９，１０－ジメチル－９，１０－ジヒドロ－９，１０－エタノアントラセン－２，３，６，７－テトラオール、６，１３－ジヒドロペンタセン－５，７，１２，１４－テトラオール、ヘキサヒドロ－［１，４］ジオキシノ［２，３－ｂ］［１，４］ジオキシン－２，３，６，７－テトラオール、アントラセン－１，４，９，１０－テトラオール、ピレン－１，３，６，８－テトラオール又は３，３，３’，３’－テトラメチル－２，２’，３，３’－テトラヒドロ－１－１’－スピロビ［インデン］－５，５’，６，６’－テトラオールであってもよいが、これらに限定されない。これらの４方向コアは、以下の足場として例示される。
【化5】
【0031】
アミンリンカーＡは、孤立電子対を持つ窒素原子を１つ以上含有することにより、核酸担体分子にプロトン受容機能性を付与する部分である。したがって、アミンリンカーは、酸性条件下で遊離プロトン（Ｈ＋）を受容することができる。好ましい実施形態において、窒素原子は、第２級又は第３級アミンの形で存在する。アミンリンカーは、Ｎ１－（２－アミノエチル）エタン－１，２－ジアミン、Ｎ１－（２－アミノエチル）プロパン－１，３－ジアミン、Ｎ１－（３－アミノプロピル）プロパン－１，３－ジアミン、Ｎ１，Ｎ１’－（エタン－１，２－ジイル）ビス（エタン－１，２－ジアミン）、Ｎ１，Ｎ１’－（エタン－１，２－ジイル）ビス（Ｎ２－（２－アミノエチル）エタン－１，２－ジアミン）、Ｎ１－（２－（４－（２－アミノエチル）ピペラジン－１－イル）エチル）エタン－１，２－ジアミン、Ｎ１－（２－アミノエチル）－Ｎ１－メチルエタン－１，２－ジアミン、Ｎ１－（３－アミノプロピル）－Ｎ１－メチルプロパン－１，３－ジアミン、Ｎ１－（３－アミノプロピル）－Ｎ１－エチルプロパン－１，３－ジアミン、３－（（３－アミノプロピル）（メチル）アミノ）プロパン－１－オール、３，３’－（メチルアザンジイル）ビス（プロパン－１－オール）、Ｎ１－（３－アミノプロピル）－Ｎ１－メチルブタン－１，４－ジアミン、４－（（３－アミノプロピル）（メチル）アミノ）ブタン－１－オール、４－（（３－ヒドロキシプロピル）（メチル）アミノ）ブタン－１－オール、４－（（３－ヒドロキシプロピル）（メチル）アミノ）ブタン－１－オール、Ｎ１－（４－アミノブチル）－Ｎ１－メチルブタン－１，４－ジアミン、４－（（４－アミノブチル）（メチル）アミノ）ブタン－１－オール、４，４’－（メチルアザンジイル）ビス（ブタン－１－オール）、３－（（３－アミノプロピル）（エチル）アミノ）プロパン－１－オール、３，３’－（エチルアザンジイル）ビス（プロパン－１－オール）、Ｎ１－（３－アミノプロピル）－Ｎ１－エチルブタン－１，４－ジアミン、４－（（３－アミノプロピル）（エチル）アミノ）ブタン－１－オール、４－（エチル（３－ヒドロキシプロピル）アミノ）ブタン－１－オール、Ｎ１－（２－アミノエチル）－Ｎ１－メチルプロパン－１，３－ジアミン、Ｎ１－（４－アミノブチル）－Ｎ１－エチルブタン－１，４－ジアミン、４，４’－（エチルアザンジイル）ビス（ブタン－１－オール）、３－（（３－アミノプロピル）アミノ）プロパン－１－オール、Ｎ１－（３－アミノプロピル）ブタン－１，４－ジアミン、４－（（３－ヒドロキシプロピル）アミノ）ブタン－１－オール、Ｎ１－（４－アミノブチル）ブタン－１，４－ジアミン、３，３’－アザンジイルビス（プロパン－１－オール）、４－（（３－アミノプロピル）アミノ）ブタン－１－オール、４，４’－アザンジイルビス（ブタン－１－オール）又はＮ１，Ｎ１’－（ブタン－１，４－ジイル）ビス（プロパン－１，３－ジアミン）に由来してもよい。参照のために、上記アミンの構造は、次の構造として絵で提示される。
【0032】
【化6】
【化7】
【0033】
上述したように、プロトン化可能なデンドリマー／デンドロンは、約３．３～約１０．４の範囲のプロトン化可能な基の酸解離定数（ｐＫａ）を有してもよい。これらの送達分子は、酸性ｐＨ条件下での核酸との製剤化中にカチオン性となる。このような条件下では、イオン相互作用により、これらの送達分子は、負に帯電した核酸と縮合される。イオン化可能なポリエステルデンドリマー／デンドロン分子の構造活性関係を分析したところ、イオン化可能な送達分子のｐＫａと、機能的に活性なレプリコンＲＮＡを送達するナノ粒子の能力との間の予期しない関係が発見された。一例として、以下に示す、予測ｐＫａ値がそれぞれ６．７と７．７であるアミン１とアミン２を含有する送達分子は、ｍＲＮＡを細胞に送達することができた（図１２のＳＥＡＰ発現から分かるように）のに対し、アミン３（予測ｐＫａ３．３）を含有するデンドリマー分子は、ペイロードを送達することができなかった。ｐＫａの値は、ＡＣＤ／パーセプターｐＫａ予測ツールを用いて計算された。
【化8】
【0034】
疎水性単位Ｂは、Ｃ１－Ｃ２２アルキル基又はＣ２－Ｃ２２アルケニル基であってもよい。Ｃ１－Ｃ２２アルキル基又はＣ２－Ｃ２２アルケニル基のそれぞれは、任意に、ハロゲン、－ＣＮ、－ＮＯ２、－Ｎ３、Ｃ１－Ｃ６アルキル、ハロ（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、－ＯＲ、－ＮＲ２、－ＣＯ２Ｒ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＯＮ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（ＮＨ）Ｎ（Ｒ）２、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、Ｃ３－Ｃ８シクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール又は複素環から選択された１～４個の置換基で置換されてもよい。各Ｒは、独立して、水素、Ｃ１－Ｃ６アルキル、ハロ（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、Ｃ３－Ｃ８シクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール又は複素環から選択されてもよい。各シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール及び複素環は、さらに、任意に、Ｒ’で置換されてもよく、Ｒ’は、独立して、ハロゲン、－ＣＮ、－ＮＯ２、－Ｎ３、Ｃ１－Ｃ６アルキル及びハロ（Ｃ１－Ｃ６アルキル）から選択されてもよい。
【0035】
式Ｉａ及び式Ｉｂの疎水性単位Ｂは、ＰＥデンドリマー又はデンドロンと脂肪酸又はその誘導体などの機能性試薬とを接触させることにより導入されてもよい。脂肪酸は、Ｃ４－Ｃ２８鎖を有する飽和脂肪酸であってもよく、不飽和脂肪酸であってもよい。脂肪酸は、アラキドン酸、オレイン酸、エイコサペンタン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸又はリノレン酸であってもよいが、これらに限定されない。脂肪酸の誘導体は、１２－ヒドロキシ－９－シス－オクタデセン酸、１２－メチルテトラデカン酸、１２－メチルトリデカン酸、１４－メチルヘキサデカン酸、１４－メチルヘキサデカン酸、１８－メチルノナデカン酸、１９－メチルアラキドン酸、イソパルミチン酸、イソステアリン酸、フィタン酸、（±）－２－ヒドロキシオクタン酸、（±）－３－ヒドロキシデカン酸、（±）－３－ヒドロキシオクタン酸、１０－ヒドロキシデカン酸、１２－ヒドロキシオクタデカン酸、１５－ヒドロキシペンタデカン酸、１６－ヒドロキシヘキサデカン酸、２－ヒドロキシヘキサデカン酸、２－ヒドロキシテトラデカン酸、２－ヒドロキシドデカン酸、ＤＬ－α－ヒドロキシステアリン酸、ＤＬ－β－ヒドロキシラウリン酸、ＤＬ－β－ヒドロキシミリスチン酸又はＤＬ－β－ヒドロキシパルミチン酸であってもよいが、これらに限定されない。
【0036】
疎水性単位Ｂは、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ブト－３－エン－１－イル基、オクト－７－エン－１－イル基、１２－トリデセニル基、１４－ペンタデセニル基、１７－オクタデセニル基、オレイル基、リノレイル基、アラキドニル基又は１６－ヒドロキシヘキサデシル基であってもよい。
【0037】
式Ｉの核酸担体の疎水性単位Ｂは、不飽和アルキル基であってもよい。核酸担体に不飽和アルキル基が存在することにより、担体がナノ粒子組成物に製剤化されるとき、ナノ粒子のリサイクルを防止してもよい。不飽和アルキル基は、飽和アルキル基に比べて流動性がより高くてもよく、結晶化温度が低くてもよいため、細胞膜のリン脂質二重層と相互作用し、エンドソームを破裂させるとき、核酸担体を含有するナノ粒子を融合形態へと形態的に変化させる能力を有してもよい。したがって、ナノ粒子は、制限され、注射部位のみに細胞内に残存し、他の場所へ移動しない場合がある。
【0038】
一実施形態において、核酸担体は、生体外及び生体内で送達材料を追跡するのに適した官能基を含んでもよい。核酸担体は、１３Ｃ又は２Ｈ（本明細書において、重水素、Ｄ又はｄとも呼ばれる）などの炭素（Ｃ）又は水素（Ｈ）の安定同位体を含有する脂肪酸を有してもよい。レプリコンＲＮＡなどの核酸とともに核酸担体をナノ粒子に製剤化する場合、ナノ粒子は、質量分析又は核磁気共鳴画像法などの技術により、投与後に生体外及び生体内で追跡されてもよい。これらの安定同位体が組織で豊富な１２Ｃ及び１Ｈ同位体とは異なるため、安定性同位体を含有することは、送達分子の同定に有益である場合がある。追跡は、投与後のナノ粒子の生体分布、物質クリアランス及び分子安定性の同定と、関連する問題とに有用である。同位体標識された脂肪酸は、オクタン酸－１－１３Ｃ、オクタン酸－８－１３Ｃ、オクタン酸－８，８，８－２Ｈ３、オクタン－２Ｈ１５酸、デカン酸－１－１３Ｃ、デカン酸－１０－１３Ｃ、デカン－１０，１０，１０－２Ｈ３酸、デカン－２Ｈ１９酸、ウンデカン酸－１－１３Ｃ、ラウリン酸－１２，１２，１２－２Ｈ３、ラウリン－２Ｈ２３酸、ラウリン酸－１－１３Ｃ、ラウリン酸－１，１２－１３Ｃ２、トリデカン－２，２－２Ｈ２酸、ミリスチン酸－１４－１３Ｃ、ミリスチン酸－１－１３Ｃ、ミリスチン酸－１４，１４，１４－２Ｈ３、ミリスチン－ｄ２７酸、パルミチン酸－１－１３Ｃ、パルミチン酸－１６－１３Ｃ、パルミチン酸－１６－１３Ｃ，１６，１６，１６－２Ｈ３、パルミチン酸－２Ｈ３１、ステアリン酸－１－１３Ｃ、ステアリン酸－１８－１３Ｃ、ステアリン酸－１８，１８，１８－２Ｈ３、ステアリン－２Ｈ３５酸、オレイン酸－１－１３Ｃ、オレイン酸－２Ｈ３４、リノレン酸－１－１３Ｃ、リノール酸－２Ｈ３２、アラキドン－５，６，８，９，１１，１２，１４，１５－２Ｈ８酸又はエイコサン－２Ｈ３９酸であってもよいが、これらに限定されない。
【0039】
式ＩＢのリンカー単位Ｐは、２つのアジド基を有するホモ二官能性リンカーであってもよい。リンカー単位Ｐは、二量体分子の合成に使用することができる。一実施形態において、Ｐは、式ＩＶを有してもよく、
式中、ｍは、１～２０の範囲である。
【化9】
【0040】
一実施形態において、本明細書に記載のいずれかの核酸担体を含むナノ粒子組成物が提供される。本明細書におけるナノ粒子組成物は、細胞内に薬剤を導入するのに有用であってもよい。薬剤は、核酸であってもよい。本明細書におけるナノ粒子組成物は、トランスフェクション剤として有用であってもよい。本明細書におけるナノ粒子組成物は、治療方法に有用であってもよい。
【0041】
一実施形態において、ナノ粒子組成物は、それぞれが異なるアミン密度又は側鎖を含む核酸担体の混合物を含んでもよい。これらの核酸担体は、一定の比率で混合されてもよい。また、３つのデンドリマーとの混合物の例としては、第１核酸担体と第２核酸担体と第３核酸担体との比率は、ｉ：ｊ：ｋであってもよい（ｉ、ｊ、ｋは、独立して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０、又はこれらのうちのいずれか２つの間の値であってもよいから選択される）。
【0042】
一実施形態において、ナノ粒子組成物は、１つ以上の治療的又は免疫原性核酸剤を含んでもよい。本明細書で使用される場合、「核酸」という用語は、天然又は合成ＤＮＡ又はＲＮＡ分子を指す。本明細書における組成物の治療的又は免疫原性核酸剤は、ナノ粒子組成物の核酸担体と複合化されてもよく、それにカプセル化されてもよい。
【0043】
一実施形態において、治療的又は免疫原性核酸剤は、ＲＮＡ又はＤＮＡ分子であってもよい。「ＤＮＡ」又は「ＤＮＡ分子」又は「デオキシリボ核酸分子」という用語は、デオキシリボヌクレオチドのポリマーを指す。ＤＮＡ分子は、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ又はｃＤＮＡであってもよい。ＤＮＡ分子は、抗原などの野生型又は遺伝子組換えタンパク質、ペプチド又はポリペプチドをコードしてもよい。「ＲＮＡ」又は「ＲＮＡ分子」又は「リボ核酸分子」という用語は、リボヌクレオチド（例えば、２個、３個、４個、５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個又はそれ以上のリボヌクレオチド）のポリマーを指す。ＲＮＡ分子は、レプリコンＲＮＡ（ｒｅｐＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ、一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）又は転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）であってもよい。レプリコンＲＮＡ（ｒｅｐＲＮＡ）は、感染性子孫ビリオンを産生できない複製可能な子孫に欠陥のあるＲＮＡウイルスゲノムを指す。通常、ｒｅｐＲＮＡとして使用するために修飾されたウイルスゲノムには、「陽性鎖」ＲＮＡウイルスが含まれる。修飾されたウイルスゲノムは、ｍＲＮＡと複製のテンプレートとの両方として機能する。低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉を指示又は媒介できる約１０～５０ヌクレオチド（又はヌクレオチド類似体）を含むＲＮＡ（又はＲＮＡ類似体）を指す。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、コードｍＲＮＡの安定性と翻訳のいずれか又は両方に影響を与えることにより真核生物の遺伝子発現の転写後調節に関与する小さな（２０～２４ｎｔ）調節的な非コードＲＮＡを指す。メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、通常、一本鎖ＲＮＡであり、１つ以上のポリペプチド鎖のアミノ酸配列を定義する。この情報は、リボソームがｍＲＮＡと結合した場合、タンパク質合成の際に翻訳される。ＤＮＡ又はＲＮＡ分子は、化学的に修飾されてもよい。
【0044】
ＲＮＡ分子は、モノシストロン性又はポリシストロン性ｍＲＮＡであってもよい。モノシストロン性ｍＲＮＡは、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドをコードする１つの配列のみを含むｍＲＮＡを指す。ポリシストロン性ｍＲＮＡは、通常、２つ以上のタンパク質、ポリペプチド又はペプチドをコードする２つ以上の配列を指す。ｍＲＮＡは、抗原として作用するタンパク質、ポリペプチド又はペプチドをコードしてもよい。
【0045】
一実施形態において、ＤＮＡ分子は、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ又はｃＤＮＡであってもよい。ＲＮＡ分子は、レプリコンＲＮＡ（ｒｅｐＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ、一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）又は転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）であってもよい。治療的又は免疫原性核酸剤は、核酸担体に非共有結合又は共有結合されてもよい。治療的又は免疫原性核酸剤は、イオン結合を介して帯電した核酸担体に静電的に結合されてもよい。
【0046】
一実施形態において、本明細書に記載のナノ粒子組成物は、抗原をコードする免疫原性又は治療的核酸剤を含んでもよい。
【0047】
本明細書で使用される場合、「カプセル化」は、完全なカプセル化、部分的なカプセル化又はその両方を伴う、核酸（例えば、メッセンジャーＲＮＡ）などの活性剤又は治療剤を提供するナノ粒子を指すことができる。好ましい実施形態において、核酸は、ナノ粒子に完全にカプセル化される。核酸治療剤の場合、完全なカプセル化は、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ（登録商標）アッセイによって決定されてもよい。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ（登録商標）は、溶液中のオリゴヌクレオチドと一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡを定量化するための超高感度の蛍光核酸染色である（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）－米国から入手可能）。
【0048】
本明細書で使用される場合、「抗原」は、免疫応答を引き起こす分子として定義される。免疫応答は、抗体産生、又は特定の免疫学的活性細胞の活性化、又はその両方に関してもよい。抗原は、タンパク質、ペプチド又はポリペプチドなどの高分子を含む、免疫応答を刺激できる任意の分子を指してもよい。抗原は、病原体の構造成分又は癌細胞であってもよい。抗原は、合成され、宿主で組み換えて産生されてもよいし、又は組織サンプル、細胞若しくは体液が挙げられるがこれらに限定されない生体サンプルに由来してもよい。
【0049】
抗原は、ワクチン抗原、寄生虫抗原、細菌抗原、腫瘍抗原、環境抗原、治療抗原又はアレルゲンであってもよいが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、ヌクレオチドワクチンは、抗原を送達することにより、対象の体の適応免疫応答を刺激することができるＤＮＡ又はＲＮＡベースの予防又は治療組成物である。ワクチン接種によって誘導される免疫応答は、通常、免疫学的記憶の発達をもたらし、その後に生物が抗原又は感染剤に遭遇したときに迅速に反応する能力をもたらす。
【0050】
本明細書において、核酸の担体として「核酸担体」を用いることが好ましく、そのため、「核酸担体」という名称を付している。しかしながら、実施形態には、本明細書における核酸担体と、負又は部分的に負の電荷を含有する薬剤との組み合わせも含まれる。薬剤は、薬物、タンパク質又は脂質複合体であってもよい。
【0051】
一実施形態において、ナノ粒子組成物は、負又は部分的に負の電荷を含有する薬物を含有するように製剤化されてもよい。ナノ粒子は、核酸担体内のプロトン化アミン基の負の電荷と正の電荷との静電結合を介して製剤化されてもよい。負に帯電した薬物は、イオン薬であってもよい。「イオン薬」という用語は、水溶性で蒸留水の溶液においてイオン化可能な電気的非対称分子を指す。イオン薬は、リン酸塩、ホスホン酸塩又はホスフィン酸塩の官能基を含有してもよい。リン酸基を含む薬物は、癌の治療及びウイルス化学療法に使用される薬物などの、リン酸塩含有ヌクレオチド類似体であってもよい。リン酸塩含有薬物は、プリン及びピリミジンヌクレオシド類似体、アラビノシルシトシン（ａｒａ－Ｃ）、Ａｒａ－Ｃ一リン酸（ａｒａ－ＣＭＰ）、アジドチミジン（ＡＺＴ）、ＡＺＴ一リン酸（ＡＺＴＭＰ）、２’３’－ジデオキシシチジン（ｄｄＣＤ）、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、テノフォビル又はアデホビルであってもよいが、これらに限定されない。
【0052】
一実施形態において、ナノ粒子組成物は、１つ以上のタンパク質を含んでもよい。１つ以上のタンパク質の非制限例としては、抗体又は抗体断片、インターフェロン（ＩＦＮ）α若しくはインターロイキン（ＩＬ）－２などのサイトカイン、ＳＡＲＳ－ＣｏＶスパイクタンパク質若しくはその受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）などの病原体由来の抗原、カーステンラット肉腫２ウイルス癌遺伝子ホモログ（Ｋｉｒｓｔｅｎ ｒａｔ ｓａｒｃｏｍａ ２ ｖｉｒａｌ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｈｏｍｏｌｏｇ、ＫＲＡＳ）の突然変異体などの癌由来の抗原、又はインスリン、第ＶＩＩＩ因子若しくはエリスロポエチンなどの他の治療的生物製剤が挙げられる。本明細書における組成物中のタンパク質は、バルク組成物中に含まれ、及び／又はナノ粒子組成物の核酸担体と複合化されてもよく、若しくはそれにカプセル化されてもよい。
【0053】
一実施形態において、本明細書に記載のナノ粒子組成物は、脂質複合体を含んでもよい。脂質複合体は、粒子の凝集を防止できる点で有用である場合がある。本明細書における組成物中に存在してもよい脂質複合体としては、ＰＥＧ－脂質複合体が挙げられるが、これに限定されない。ＰＥＧ－脂質の非制限例としては、ＤＭＧ－ＰＥＧ ２０００などの脂質に結合したＰＥＧ、ホスファチジルエタノールアミンなどのリン脂質に結合したＰＥＧ（ＰＥＧ－ＰＥ）、コレステロール又はその誘導体に結合したＰＥＧ及びこれらの混合物が挙げられる。ある場合において、ＰＥＧは、必要に応じて、アルキル基、アルコキシ基、アシル基又はアリール基で置換されてもよい。
【0054】
ＰＥＧは、２つの末端ヒドロキシル基を有するエチレンＰＥＧ繰り返し単位の直鎖状の水溶性ポリマーである。ＰＥＧは、分子量で分類され、例えば、ＰＥＧ２０００は、約２０００ダルトンの平均分子量を有し、ＰＥＧ５０００は、約５０００ダルトンの平均分子量を有する。ＰＥＧは、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（アバンティ・ポーラ・リピッド）から市販されている。本明細書に記載のＰＥＧ－脂質複合体のＰＥＧ部分は、約５５０ダルトン～約１０，０００ダルトンの範囲の平均分子量を含んでもよい。
【0055】
鎖の長さと飽和度の異なる様々なアシル鎖基を有するホスファチジルエタノールアミンが、脂質複合体を形成するためにＰＥＧに結合されてもよい。ホスファチジルエタノールアミンは、市販されているか、又は従来の技術を用いて単離されるか又は合成されてもよい。ホスファチジルエタノールアミンは、炭素鎖長がＣ１０－Ｃ２０の範囲にある飽和又は不飽和の脂肪酸を含んでもよい。ホスファチジルエタノールアミンは、１価又は多価の不飽和脂肪酸と、飽和脂肪酸及び不飽和脂肪酸の混合物とを含んでもよい。想到されるホスファチジルエタノールアミンとしては、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）及びジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0056】
ＰＥＧ－脂質は、コレステロール又はコレステロールの誘導体に結合したＰＥＧを含んでもよい。コレステロールの誘導体の例としては、コレスタノール、コレスタノン、コレステノン、コプロスタノール、コレステリル－２’－ヒドロキシエチルエーテル、コレステリル－４’－ヒドロキシブチルエーテル及びこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【0057】
ナノ粒子組成物に含まれるＰＥＧ－脂質のサイズ、相対量及び分布は、ナノ粒子組成物の物理的特性に影響を与えてもよい。制御可能な物理的特性は、ナノ粒子の直径、ナノ粒子の凝集する傾向、各ナノ粒子内の核酸分子の数、ナノ粒子組成物中のナノ粒子の濃度、治療的及び免疫原性核酸剤の細胞内送達の有効性及び／又は細胞によるナノ粒子の取り込みの有効性であってもよいが、これらに限定されない。
【0058】
ナノ粒子組成物は、ナノ粒子組成物当たりＰＥＧ－脂質を１０モル％以下で含有してもよい。ナノ粒子組成物は、ナノ粒子組成物当たり、ＰＥＧ－脂質を、約１０モル％、約９モル％、約８モル％、約７モル％、約６モル％、約５モル％、約４モル％、約３モル％、約２モル％又は約１モル％で含んでもよく、上記のいずれか２つの整数の間の任意の量で含んでもよい。ＰＥＧ－脂質を含むナノ粒子組成物は、ＰＥＧ－脂質を欠く組成物のナノ粒子よりも直径が小さいナノ粒子を含んでもよい。ナノ粒子組成物は、ＰＥＧ－脂質を欠く組成物のナノ粒子よりも、ナノ粒子の凝集する傾向が高いナノ粒子を含んでもよい。
【0059】
ナノ粒子組成物は、「両親媒性脂質」を含有してもよい。本明細書で使用される場合、「両親媒性脂質」は、非極性疎水性「尾部」と極性「頭部」を有する任意の材料を指す。極性基としては、リン酸基、カルボキシル基、スルファト基、アミノ基、スルフヒドリル基、ニトロ基、ヒドロキシル基又は他の基を挙げてもよい。非極性基としては、長鎖飽和及び不飽和脂肪族炭化水素基と、１つ以上のシクロアルキル基、シクロアルケニル基、アリール基、ヘテロアリール基、複素環基で置換されたそのような基とを挙げてもよいが、これらに限定されない。両親媒性脂質の例としては、リン脂質、アミノ脂質及びスフィンゴ脂質が挙げられるが、これらに限定されない。リン脂質の代表的な例としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、パルミトイルオレイルホスファチジルコリン、リソホスファチジルコリン、リソホスファチジルエタノールアミン、ジパリミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン及びジリノレオイルホスファチジルコリンが挙げられるが、これらに限定されない。
【0060】
ナノ粒子組成物は、ナノ粒子組成物当たり両親媒性脂質を１０モル％～１５モル％の範囲の量で含有してもよい。
【0061】
一実施形態において、ナノ粒子組成物は、コレステロール又はコレステロールの誘導体を含んでもよい。コレステロールの誘導体の例としては、コレスタノール、５，６－エポキシコレスタノール、コレスタノン、コレステノン、コプロスタノール、コレステリル－２’－ヒドロキシエチルエーテル、コレステリル－４’－ヒドロキシブチルエーテル、２４－エチルコレステロール、２４－メチルコレステロール、コレン酸、３－ヒドロキシ－５－コレステン酸、パルミチン酸コレステリル、アラキドン酸コレステリル、アラキジン酸コレステリル、ミリスチン酸コレステリル、パルミトレイン酸コレステリル、リグノセリン酸コレステリル、オレイン酸コレステリル、ステアリン酸コレステリル、エルカ酸コレステリル、α－リノレン酸コレステロール、リノール酸コレステリル、ホモ－γ－リノレン酸コレステリル、４－ヒドロキシコレステロール、６－ヒドロキシコレステロール、７－ヒドロキシコレステロール、１９－ヒドロキシコレステロール、２０－ヒドロキシコレステロール、２２－ヒドロキシコレステロール、２４－ヒドロキシコレステロール、２５－ヒドロキシコレステロール、２７－ヒドロキシコレステロール、２７－アルキンコレステロール、７－ケトコレステロール、７－デヒドロコレステロール、８－デヒドロコレステロール、２４－デヒドロコレステロール、５α－ヒドロキシ－６－ケトコレステロール、２０，２２－ジヒドロキシコレステロール、７，２５－ジヒドロキシコレステロール、７，２７－ジヒドロキシコレステロール、７－ケト－２５－ヒドロキシコレステロール、フコステロール、フィトステロール、１１，１４－エイコサジエン酸コレステリル、ジメチルヒドロキシエチルアミノプロパンカルバモイルコレステロールヨウ化物及びそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。コレステロールの誘導体は、マンノース、ガラクトースなどの糖成分を含んでもよい。コレステロールの誘導体は、糖成分及び／又はセリン、スレオニン、リジン、ヒスチジン、アルギニン若しくはそれらの誘導体などのアミノ酸を含んでもよい。ナノ粒子組成物は、ナノ粒子組成物当たりコレステロール又はコレステロールの誘導体を５０モル％～７５モル％の範囲の量で含んでもよい。
【0062】
本明細書における医薬組成物は、従来の周知の滅菌技術により滅菌されてもよい。水溶液は、使用のためにパッケージ化されてもよいし又は凍結乾燥されてもよい。凍結乾燥製剤は、投与前に滅菌水溶液と組み合わせられてもよい。
【0063】
一実施形態において、ナノ粒子組成物は、薬学的に許容される担体を含んでもよい。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、対象化合物を一方の臓器若しくは身体の一部から他方の臓器若しくは身体の一部へ運搬若しくは輸送する際に関与する、医薬的に許容される材料、組成物又はビヒクル、例えば、液体若しくは固体充填剤、希釈剤、賦形剤、製造助剤（例えば、滑剤、タルク（滑石）、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム若しくはステアリン酸亜鉛若しくはステアリン酸）、又は溶媒カプセル化材料を意味する。各担体は、製剤の他の成分に適合的であり、かつ、それが患者に対して傷害性でないという意味において「許容可能」である。薬学的に許容される担体となる材料としては、（１）ラクトース、グルコース、マンノース及び／若しくはスクロース等の糖類、（２）コーンスターチ及び／若しくはポテトスターチ等の澱粉、（３）カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、微結晶セルロース及び／若しくは酢酸セルロースなどのセルロース、並びにその誘導体、（４）トラガント粉、（５）麦芽、（６）ゼラチン、（７）ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム及び／若しくはタルク等の潤滑剤、（Ｓ）ココアバター及び／若しくは坐剤用ワックス等の賦形剤、（９）ピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油及び／若しくは大豆油等の油、（１０）プロピレングリコールなどのグリコール、（１１）グリセリン、ソルビトール、及び／若しくはマンニトールなどのポリオール、（１２）グリセリド、エチルオレイン酸、及び／若しくはラウリン酸エチルなどのエステル、（１３）寒天、（１４）水酸化マグネシウム及び／若しくは水酸化アルミニウムなどの緩衝剤、（１５）アルギン酸、（１６）パイロゲンフリー水、（１７）等張食塩水及び／若しくはＰＥＧ４００などの希釈剤、（１８）リンゲル液、（１９）エタノールなどのＣ２－Ｃ１２アルコール、（２０）脂肪酸、（２１）ｐＨ緩衝液、（２２）ポリペプチド及び／若しくはアミノ酸などの増量剤、（２３）血清アルブミン、ＨＤＬ、ＬＤＬなどの血清成分、（２４）ポリソルベート（Ｔｗｅｅｎ ８０）及び／若しくはポロキサマーなどの界面活性剤、並びに／又は、（２５）充填剤、バインダー、湿潤剤、着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤、芳香剤、防腐剤及び／又は酸化防止剤などの医薬製剤に使用される他の非毒性の適合性物質が挙げられる。本明細書において、「賦形剤」、「担体」、「薬学的に許容される担体」などという用語は交換可能に使用される。
【0064】
一実施形態は、対象の疾患又は病気を治療又は予防する方法を含む。この方法は、本明細書に記載のナノ粒子組成物のいずれかを提供することを含んでもよい。この方法は、治療有効量のナノ粒子組成物を対象に投与することを含んでもよい。
【0065】
本明細書で使用される場合、「治療有効量」という用語は、所望の治療効果を達成するのに効果的なナノ粒子組成物の量を指す。治療効果は、少なくとも動物の細胞の一部の集団にあってもよい。治療効果は、治療に適用可能な合理的な利益／リスク比で達成されてもよい。「治療有効量」は、血清中に抗原特異的抗体が出現するのに十分な量を指してもよい。「治療有効量」は、疾患の症状を軽減するのに十分な量を指してもよい。「治療有効量」は、疾患の症状を消失させるのに十分な量を指してもよい。ウイルス感染症を治療する場合、糞便、体液又は分泌物中のウイルスの減少により疾患の症状の軽減を評価してもよい。ナノ粒子組成物は、免疫応答を生じさせるのに有効な投与量及び投与経路で投与されてもよい。
【0066】
治療有効性は、所望の結果を達成するために必要な活性剤の有効量及び投与時間に依存してもよい。ナノ粒子組成物の投与は、予防手段であってもよい。ナノ粒子組成物の投与は、感染剤に対する免疫を促進して、特に免疫系が弱い患者、高齢者又は乳幼児における免疫のゆっくりした発達に関連する合併症を最小限に抑える治療手段であってもよい。
【0067】
正確な投与量は、様々な要因に基づいて、個々の患者を考慮して医師によって選択されてもよい。投与量と投与は、十分なレベルの活性剤若しくは薬剤を提供するか、又は所望の効果を維持するために調整されてもよい。例えば、考慮される可能性のある要因としては、疾患の種類及び重症度、患者の年齢及び性別、薬物の組み合わせ並びに療法に対する個別の反応が挙げられてもよい。
【0068】
ナノ粒子組成物における活性剤の治療有効性及び毒性は、標準的な製薬手順により、例えば、生体外で培養した細胞又は実験動物において集団の５０％に対する治療有効量（ＥＤ５０）と集団の５０％に対する致死投与量（ＬＤ５０）とを決定することにより、決定されてもよい。ナノ粒子組成物は、治療指標と呼ばれる毒性と治療効果との用量比（ＬＤ５０／ＥＤ５０）に基づいて評価されてもよく、治療指標の大きな値が評価に使用されてもよい。細胞及び動物の研究から得られたデータは、ヒト用の投与量の定式化に使用されてもよい。
【0069】
治療有効用量は、最初に細胞培養アッセイから推定されてもよい。細胞培養で決定された、ＩＣ５０（すなわち、症状の半値阻害を達成する治療薬の濃度）を含有する循環血漿濃度範囲を達成するために、動物モデルで治療有効用量が定式化されてもよい。血漿中レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定されてもよい。任意の特定の投与量の効果は、適切なバイオアッセイにより監視されてもよい。
【0070】
治療有効用量は、対象の１ｋｇ体重当たり、０．０００１μｇ～１ｍｇの治療的若しくは免疫原性核酸であってもよいし、又は０．００００１μｇ～１ｍｇ（μｇ）単位／投与量／対象であってもよく、毎日投与されてもよい。しかしながら、１ｍｇを超える投与量を提供してもよい。例えば、投与量は、少なくとも１ミリグラム、又は約３×１ｍｇ、又は約１０×１ｍｇの核酸単位／投与量／対象であってもよい。ナノ粒子ワクチンは、製造が容易であり、かつ、加工、設計及び保管が安価である可能性があることから、大型動物対象に対するより多くの用量が経済的に実現されてもよい。本明細書における実施例で用いた実験動物よりも数桁大きい動物対象の場合、投与量は、調整しやすく、例えば、投与量は、ヒト又は小農業動物などの動物の場合、約３×１０×１μｇ、約３×２０×１μｇ、又は約３×３０×１μｇであってもよい。しかしながら、投与量は、例えば、ゾウなどの高価値の動物園動物又は農業動物の場合、約３×４０×１μｇであっても、約３×５０×１μｇであっても、又はさらには約３×６０×１μｇであってもよい。予防免疫、定期的な治療又は小野生動物の治療の場合、投与量は、投与量当たり、約３×１μｇ未満、約１μｇ未満、約５００ｎｇ未満、約２５０ｎｇ未満、約１００ｎｇ未満、約５０ｎｇ未満、約２５ｎｇ未満、約１０ｎｇ未満、約５ｎｇ未満、約１ｎｇ未満、約５００ｐｇ未満、約２５０ｐｇ未満、約１００ｐｇ未満、又は上記のいずれかの間の範囲であってもよい。治療的及び免疫原性核酸は、治療投与量ごとに使用された異なる核酸の組み合わせであってもよい。本明細書における「対象」と「個体」は、互いに交換可能に使用され、ヒト又は動物を意味する。好ましくは、動物は、霊長類動物、齧歯動物、家畜又は狩猟動物などの脊椎動物である。霊長類動物としては、チンパンジー、カニクイザル、クモザル、及びアカゲザルなどのマカクが挙げられる。齧歯動物は、マウス、ラット、モルモット、ウッドチャック、フェレット、ウサギ、ハムスターから選択されてもよい。家畜又は狩猟動物は、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、バッファロー、飼いネコなどのネコ種、イヌなどのイヌ種、キツネ、オオカミ、ニワトリ、エミュー、ダチョウなどのトリ種、及びトラウト、ナマズ、サーモンなどの魚類から選択されてもよい。患者又は対象は、前述の患者又は上記サブセットから選択されてもよい。患者又は対象は、上記の全てから選択されてもよいが、もっぱらヒト、霊長類動物、齧歯動物などの１つ以上の群又は種から選択されてもよい。一実施形態において、患者又は対象は、霊長類動物、ヒトなどの哺乳動物であってもよい。本明細書では「患者」及び「対象」という用語は交換可能に使用される。本明細書では「患者」及び「対象」という用語は交換可能に使用される。
【0071】
好ましくは、対象は哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類動物、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ又はウシであってもよいが、これらの例に限定されない。ヒト以外の哺乳動物は、疾患又は障害を有する動物モデルを表す対象であってもよい。加えて、本明細書に記載の方法は、家畜及び／又はペットの治療を目的とするものであってもよい。対象は、雄（男性）であっても雌（女性）であってもよい。
【0072】
本明細書で使用される場合、「投与する」、「投与すること」、「投与」などの用語は、対象への組成物の配置を意味する。投与は、所望の効果を達成するように、組成物を所望の部位に少なくとも部分的に局在させる方法又は経路で実行されてもよい。本明細書に記載のナノ粒子組成物は、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、気道（エアロゾル）、肺、鼻、直腸、又は局所（口腔内及び舌下を含む）投与を含む経口又は非経口経路を含むが、これらに限定されない本分野において公知の任意の適切な経路により投与されてもよい。
【0073】
例示的な投与形態としては、注射、輸液、点滴、吸入又は摂取が挙げられるが、これらに限定されない。「注射」としては、静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、心室内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内、脳内及び胸骨内の注射及び輸液が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、組成物は、静脈輸液又は静脈内注射により投与されてもよい。
【0074】
ナノ粒子組成物は、遺伝子標的化のための治療的又は免疫原性核酸の送達に使用されてもよい。治療的又は免疫原性核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）又は二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）であってもよい。通常、ｓｉＲＮＡは、２１～２３ヌクレオチドの長さである。ｓｉＲＮＡは、宿主細胞内で発現されたときに、標的遺伝子のｍＲＮＡ転写産物に含まれる配列と相補的な配列を含んでもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドであってもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的遺伝子のｍＲＮＡ転写産物に含まれる配列と相補的な配列を含んでもよい。治療的又は免疫原性核酸は、特定の標的生物内の特定の標的遺伝子に対する干渉ＲＮＡ（ｉＲＮＡ）であってもよい。ｉＲＮＡは、標的ポリヌクレオチドの発現又は翻訳の配列特異的なサイレンシングを誘導することにより、遺伝子の発現をダウンレギュレートするか又は防止してもよい。ｉＲＮＡは、標的遺伝子の発現を完全に阻害してもよい。ｉＲＮＡは、未処置の対照の発現レベルと比較して、標的遺伝子の発現レベルを低下させてもよい。治療的又は免疫原性核酸は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）であってもよい。ｍｉＲＮＡは、ヘアピンＲＮＡ（ｈｐＲＮＡ）などの短いＲＮＡであってもよい。ｍｉＲＮＡは、内因性細胞酵素の活性により、標的細胞内の生物学的活性ｄｓＲＮＡに切断されてもよい。ＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）であってもよい。ｄｓＲＮＡは、２５ヌクレオチド以上の長さであってもよいし、又はより長くてもよい。ｄｓＲＮＡは、標的遺伝子（複数種可）の配列と相補的な配列を含んでもよい。
【0075】
一実施形態において、治療的又は免疫原性核酸は、標的タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子の活性又は合成を完全に又は部分的に減少させ、阻害し、妨害するか、又は調節する薬剤であってもよいし、又は該薬剤をコードしてもよい。標的遺伝子は、宿主生物のゲノムに含まれるいずれの遺伝子であってもよい。治療的又は免疫原性核酸の配列は、標的遺伝子の核酸配列に対して１００％相補的でなくてもよい。
【0076】
一実施形態において、ナノ粒子組成物は、対象における遺伝情報の標的化された特異的変化に使用されてもよい。一実施形態は、本明細書におけるナノ粒子組成物の投与を含む、対象における遺伝情報の標的化された特異的変化を含む。本明細書で使用される場合、「変化」という用語は、対象の細胞におけるゲノムの変更を指す。変化は、標的遺伝子の配列におけるヌクレオチドの挿入又は欠失であってもよい。「挿入」は、標的遺伝子の配列に１つ以上のヌクレオチドを添加することを指す。「欠失」という用語は、標的遺伝子の配列における１つ以上のヌクレオチドの喪失又は除去を指す。変化は、標的遺伝子の配列の修正であってもよい。「修正」は、宿主生物の遺伝子型及び／又は表現型の改善によって顕在化された遺伝子のより好ましい発現をもたらし得る、例えば、挿入、欠失又は置換による標的遺伝子の配列における１つ以上のヌクレオチドの変化を指す。
【0077】
遺伝情報の変化は、ゲノム編集技術を介して達成されてもよい。本明細書で使用される場合、「ゲノム編集」は、ゲノムのヌクレオチド配列を正確又は制御された方法で改変するプロセスを指す。
【0078】
例示的なゲノム編集システムは、例えば、２０１８年８月３０日に公開され、本明細書に完全に記載されているように参照によって組み込まれる国際公開第２０１８／１５４３８７号パンフレットで記載されているように、クラスター化された規則的な配置の短い回文配列リピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ、ＣＲＩＳＰＲ）システムである。一般的に、「ＣＲＩＳＰＲシステム」は、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列、ｔｒａｃｒメイト配列、ガイド配列、又はＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からの他の配列及び転写産物を含む、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子の発現に関与する転写産物及び他のエレメントを指す。１つ以上のｔｒａｃｒメイト配列は、プロセシング前のガイド配列、又はプロセシング後のｃｒＲＮＡにヌクレアーゼにより操作可能に連結されていてもよい。本明細書に完全に記載されているように参照によって組み込まれるＣｏｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１５：３３９（６１２１）：８１９－８２３（２０１３）及びＪｉｎｅｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３３７（６０９６）：８１６－２１（２０１２）で記載されているように、ｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡは、連結されてもよく、成熟したｃｒＲＮＡが部分的なｔｒａｃｒＲＮＡに合成ステムループを介して融合され天然のｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖を模倣したキメラ型ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドを形成してもよい。本明細書において、単一の融合ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡコンストラクトは、ガイドＲＮＡ、ｇＲＮＡ又はシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）とも呼ばれる。ｓｇＲＮＡ内で、ｃｒＲＮＡ部分は、「標的配列」と同定され、ｔｒａｃｒＲＮＡは、多くの場合、「足場」と呼ばれる。一実施形態において、本明細書に記載のナノ粒子組成物は、ｓｇＲＮＡの送達に使用されてもよい。
【0079】
一実施形態において、ナノ粒子組成物は、メガヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮベースのシステム又はジンクフィンガーヌクレアーゼを含む他の例示的なゲノム編集システムを適用するために使用されてもよい。ナノ粒子組成物は、これらの遺伝子編集ツールの配列をコードする核酸（ＲＮＡ及び／若しくはＤＮＡ）、並びに実際の遺伝子産物、タンパク質、又は他の分子の送達に使用されてもよい。
【0080】
一実施形態において、ナノ粒子組成物は、例えば、対象から細胞を単離し、遺伝子を編集し、編集された細胞を対象に移植することにより、生体内又は生体外で対象での遺伝子標的化に使用されてもよい。一実施形態は、本明細書におけるナノ粒子組成物を対象から単離した細胞に投与することを含む方法を含む。この方法は、遺伝子標的化を含んでもよい。この方法は、編集された細胞を対象に移植することを含んでもよい。
【0081】
一実施形態は、薬剤を細胞に導入する方法を含む。この方法は、細胞を本明細書におけるナノ粒子組成物に曝露することを含んでもよい。薬剤は、核酸であってもよい。薬剤は、上述したものであってもよい。この方法は、薬剤が核酸である場合、トランスフェクションを行う方法であってもよい。薬剤は、本明細書に記載されているように構成されたナノ粒子の溶液を、細胞が培養される液体培地と混合することにより、細胞に導入されてもよい。実施例が以下に提供される。
【0082】
以下の実施形態リストは、本発明の具体的な実施形態を含む。しかし、このリストは、限定するものではなく、代替の実施形態又は別途本明細書に記載された実施形態を排除するものではない。
【0083】
実施形態リスト
１． 式Ｉａ又は式Ｉｂで表される構造を有する核酸担体であって、
式中、ＰＥは、コアと、１世代以上形成する複数のモノマーポリエステル単位とを含むポリエステルデンドリマー又はデンドロンであり、Ａは、アミンリンカーであり、Ｂは、疎水性単位であり、ｚは、表面基の数である、核酸担体。
１． 式Ｉａ又は式Ｉｂで表される構造を有する核酸担体であって、
【化10】
【0084】
２． ＰＥは、式ＩＩを有し、
［（コア）ｃ－Ｇｎ－Ｏ］ ＩＩ
式中、ｃは、コア多重度又は上記コア由来のウェッジ数であり、その値が独立して１～６の範囲にあり、Ｇは、デンドリマー又はデンドロンの層又は世代であり、ｎは、世代数であり、１～１０の範囲にある、実施形態１に記載の核酸担体。
［（コア）ｃ－Ｇｎ－Ｏ］ ＩＩ
式中、ｃは、コア多重度又は上記コア由来のウェッジ数であり、その値が独立して１～６の範囲にあり、Ｇは、デンドリマー又はデンドロンの層又は世代であり、ｎは、世代数であり、１～１０の範囲にある、実施形態１に記載の核酸担体。
【0085】
３． 上記複数のモノマーポリエステル単位は、２，２－ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸又は２，２－ビス（ヒドロキシメチル）酪酸である、請求項１又は２に記載の核酸担体。
【0086】
４． ｚは、式ＩＩＩを有し、
ｚ＝ｃｂｎ ＩＩＩ
式中、ｂは、分岐点多重度又は各分岐点における分岐数であり、ｃは、コア多重度又は上記コア由来のウェッジ数であり、１～６の範囲にあり、ｎは、世代数であり、１～１０の範囲にある、実施形態１～３のいずれか１つ以上に記載の核酸担体。
ｚ＝ｃｂｎ ＩＩＩ
式中、ｂは、分岐点多重度又は各分岐点における分岐数であり、ｃは、コア多重度又は上記コア由来のウェッジ数であり、１～６の範囲にあり、ｎは、世代数であり、１～１０の範囲にある、実施形態１～３のいずれか１つ以上に記載の核酸担体。
【0087】
５． ｃは１であり、上記コアは１方向コアである、実施形態１～４のいずれか１つ以上に記載の核酸担体。
【0088】
６． 上記１方向コアは、カルボン酸又はその誘導体である、実施形態５に記載の核酸担体。
【0089】
７． 上記コアは、
からなる群から選択され、
式中、Ｙは、メチル、イソプロピル、ｓｅｃ－ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、イソペンチル、ネオペンチル、３－メチルヘキシル、２，２－ジメチルペンチル、２，３－ジメチルペンチル、アジド（Ｎ３）、ハロゲン（Ｃｌ、Ｂｒ若しくはＩ）、アセチレン（Ｃ２Ｈ２）、ヒドロキシル（－ＯＨ）、又はチオール（－ＳＨ）、－ピラノシル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール及び複素環から選択され、Ａは、アミンリンカーであり、Ｂは、疎水性単位であり、ｍは、１～２０である、実施形態５に記載の核酸担体。
【化11】
式中、Ｙは、メチル、イソプロピル、ｓｅｃ－ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、イソペンチル、ネオペンチル、３－メチルヘキシル、２，２－ジメチルペンチル、２，３－ジメチルペンチル、アジド（Ｎ３）、ハロゲン（Ｃｌ、Ｂｒ若しくはＩ）、アセチレン（Ｃ２Ｈ２）、ヒドロキシル（－ＯＨ）、又はチオール（－ＳＨ）、－ピラノシル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール及び複素環から選択され、Ａは、アミンリンカーであり、Ｂは、疎水性単位であり、ｍは、１～２０である、実施形態５に記載の核酸担体。
【0090】
８． 上記シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール及び複素環は、ハロゲン基、ヒドロキシル基（－ＯＨ）及びアルキル基から選択される少なくとも１つの基で置換される、実施形態７に記載の核酸。
【0091】
９． ｃは３であり、上記コアは３方向コアである、実施形態１～５のいずれか１つ以上に記載の核酸担体。
【0092】
１０． 上記３方向コアは、トリメチロールプロパン、又は１，１，１－トリス（ヒドロキシフェニルエタン）であり、かつ、それぞれ
で表される構造を有する、実施形態９に記載の核酸担体。
【化12】
【0093】
１１． ｃは４であり、上記コアは４方向コアである、実施形態１～５のいずれか１つ以上に記載の核酸担体。
【0094】
１２． 上記４方向コアは、ペンタエリスリトール、アダマンタン－１，３，５，７－テトラオール又は５，１０，１５，２０－テトラキス（４－ヒドロキシフェニル）－２１Ｈ，２３Ｈ－ポルフィン、［１，１’－ビフェニル］－３，３’，５，５’－テトラオール、２，３，６，７－テトラヒドロキシ－９，１０－ジメチル－アントラセン、３．９，１０－ジメチル－９，１０－ジヒドロ－９，１０－エタノアントラセン－２，３，６，７－テトラオール、４．６，１３－ジヒドロペンタセン－５，７，１２，１４－テトラオール、ヘキサヒドロ－［１，４］ジオキシノ［２，３－ｂ］［１，４］ジオキシン－２，３，６，７－テトラオール、アントラセン－１，４，９，１０－テトラオール、ピレン－１，３，６，８－テトラオール及び３，３，３’，３’－テトラメチル－２，２’，３，３’－テトラヒドロ－１－１’－スピロビ［インデン］－５，５’，６，６’－テトラオールからなる群から選択され、かつ、それぞれ
で表される構造を有する、実施形態１１に記載の核酸担体。
【化13】
【化14】
【0095】
１３． Ａは、Ｎ１－（２－アミノエチル）エタン－１，２－ジアミン、Ｎ１－（２－アミノエチル）プロパン－１，３－ジアミン、Ｎ１－（３－アミノプロピル）プロパン－１，３－ジアミン、Ｎ１，Ｎ１’－（エタン－１，２－ジイル）ビス（エタン－１，２－ジアミン）、Ｎ１，Ｎ１’－（エタン－１，２－ジイル）ビス（Ｎ２－（２－アミノエチル）エタン－１，２－ジアミン）、Ｎ１－（２－（４－（２－アミノエチル）ピペラジン－１－イル）エチル）エタン－１，２－ジアミン、Ｎ１－（２－アミノエチル）－Ｎ１－メチルエタン－１，２－ジアミン、Ｎ１－（３－アミノプロピル）－Ｎ１－メチルプロパン－１，３－ジアミン、Ｎ１－（３－アミノプロピル）－Ｎ１－エチルプロパン－１，３－ジアミン、３－（（３－アミノプロピル）（メチル）アミノ）プロパン－１－オール、３，３’－（メチルアザンジイル）ビス（プロパン－１－オール）、Ｎ１－（３－アミノプロピル）－Ｎ１－メチルブタン－１，４－ジアミン、４－（（３－アミノプロピル）（メチル）アミノ）ブタン－１－オール、４－（（３－ヒドロキシプロピル）（メチル）アミノ）ブタン－１－オール、４－（（３－ヒドロキシプロピル）（メチル）アミノ）ブタン－１－オール、Ｎ１－（４－アミノブチル）－Ｎ１－メチルブタン－１，４－ジアミン、４－（（４－アミノブチル）（メチル）アミノ）ブタン－１－オール、４，４’－（メチルアザンジイル）ビス（ブタン－１－オール）、３－（（３－アミノプロピル）（エチル）アミノ）プロパン－１－オール、３，３’－（エチルアザンジイル）ビス（プロパン－１－オール）、Ｎ１－（３－アミノプロピル）－Ｎ１－エチルブタン－１，４－ジアミン、４－（（３－アミノプロピル）（エチル）アミノ）ブタン－１－オール、４－（エチル（３－ヒドロキシプロピル）アミノ）ブタン－１－オール、Ｎ１－（２－アミノエチル）－Ｎ１－メチルプロパン－１，３－ジアミン、Ｎ１－（４－アミノブチル）－Ｎ１－エチルブタン－１，４－ジアミン、４，４’－（エチルアザンジイル）ビス（ブタン－１－オール）、３－（（３－アミノプロピル）アミノ）プロパン－１－オール、Ｎ１－（３－アミノプロピル）ブタン－１，４－ジアミン、４－（（３－ヒドロキシプロピル）アミノ）ブタン－１－オール、Ｎ１－（４－アミノブチル）ブタン－１，４－ジアミン、３，３’－アザンジイルビス（プロパン－１－オール）、４－（（３－アミノプロピル）アミノ）ブタン－１－オール、４，４’－アザンジイルビス（ブタン－１－オール）及びＮ１，Ｎ１’－（ブタン－１，４－ジイル）ビス（プロパン－１，３－ジアミン）からなる群に由来し、かつ、それぞれ
で表される構造を有する、実施形態１～１２のいずれか１つ以上に記載の核酸担体。
【化15】
【化16】
【化17】
【化18】
【0096】
１４． Ｂは、Ｃ１－Ｃ２２アルキル基又はＣ２－Ｃ２２アルケニル基である、実施形態１～１２のいずれか１つ以上に記載の核酸担体。
【0097】
１５． 上記Ｃ１－Ｃ２２アルキル基又はＣ２－Ｃ２２アルケニル基は、ハロゲン、－ＣＮ、－ＮＯ２、－Ｎ３、Ｃ１－Ｃ６アルキル、ハロ（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、－ＯＲ、－ＮＲ２、－ＣＯ２Ｒ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＯＮ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（ＮＨ）Ｎ（Ｒ）２、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、Ｃ３－Ｃ８シクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール及び複素環からなる群から選択された１～４個の置換基で置換され、Ｒは、水素、Ｃ１－Ｃ６アルキル、ハロ（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、Ｃ３－Ｃ８シクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール及び複素環からなる群から選択される、実施形態１４に記載の核酸担体。
【0098】
１６． 上記１～４個の置換基は、ＯＲ、－ＮＲ２、－ＣＯ２Ｒ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＯＮ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２及び－ＮＨＣ（ＮＨ）Ｎ（Ｒ）２から選択される、請求項１５に記載の核酸担体。
【0099】
１７． 各シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール及び複素環は、さらにＲ’で置換され、Ｒ’は、独立して、ハロゲン、－ＣＮ、－ＮＯ２、－Ｎ３、Ｃ１－Ｃ６アルキル及びハロ（Ｃ１－Ｃ６アルキル）からなる群から選択される、請求項１５に記載の核酸担体。
【0100】
１８． Ｂは不飽和アルキル基である、実施形態１～１７のいずれか１つ以上に記載の核酸担体。
【0101】
１９． Ｂは、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、デシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ブト－３－エン－１－イル、オクト－７－エン－１－イル、１２－トリデセニル、１４－ペンタデセニル、１７－オクタデセニル、オレイル、リノレイル及びアラキドニルからなる群から選択される、請求項１に記載の核酸担体。
【0102】
２０．Ｂは、脂肪酸又はその誘導体に由来する、実施形態１～１７のいずれか１つ以上に記載の核酸担体。
【0103】
２１． 上記脂肪酸は、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸及びエイコサペンタン酸からなる群から選択される、実施形態２０に記載の核酸担体。
【0104】
２２． 上記脂肪酸の誘導体は、１２－ヒドロキシ－９－シス－オクタデセン酸、１２－メチルテトラデカン酸、１２－メチルトリデカン酸、１４－メチルヘキサデカン酸、１４－メチルヘキサデカン酸、１８－メチルノナデカン酸、１９－メチルアラキドン酸、イソパルミチン酸、イソステアリン酸、フィタン酸、（±）－２－ヒドロキシオクタン酸、（±）－３－ヒドロキシデカン酸、（±）－３－ヒドロキシオクタン酸、１０－ヒドロキシデカン酸、１２－ヒドロキシオクタデカン酸、１５－ヒドロキシペンタデカン酸、１６－ヒドロキシヘキサデカン酸、２－ヒドロキシヘキサデカン酸、２－ヒドロキシテトラデカン酸、２－ヒドロキシドデカン酸、ＤＬ－α－ヒドロキシステアリン酸、ＤＬ－β－ヒドロキシラウリン酸、ＤＬ－β－ヒドロキシミリスチン酸及びＤＬ－β－ヒドロキシパルミチン酸からなる群から選択される、実施形態２０に記載の核酸担体。
【0105】
２３． 上記脂肪酸は、１つ以上の安定同位体を含む、実施形態２０～２２のいずれか１つ以上に記載の核酸担体。
【0106】
２４． 上記安定同位体は炭素又は水素の安定同位体である、実施形態２３に記載の核酸担体。
【0107】
２５． 上記炭素の安定同位体は１３Ｃである、実施形態２４に記載の核酸担体。
【0108】
２６． 上記水素の安定同位体は２Ｈである、請求項２４に記載の核酸担体。
【0109】
２７． 上記安定同位体を含む上記脂肪酸は、オクタン酸－１－１３Ｃ、オクタン酸－８－１３Ｃ、オクタン酸－８，８，８－ｄ３、オクタン－２Ｈ１５酸、デカン酸－１－１３Ｃ、デカン酸－１０－１３Ｃ、デカン－１０，１０，１０－ｄ３酸、デカン－ｄ１９酸、ウンデカン酸－１－１３Ｃ、ラウリン酸－１２，１２，１２－２Ｈ３、ラウリン－２Ｈ２３酸、ラウリン酸－１－１３Ｃ、ラウリン酸－１，１２－１３Ｃ２、トリデカン－２，２－２Ｈ２酸、ミリスチン酸－１４－１３Ｃ、ミリスチン酸－１－１３Ｃ、ミリスチン酸－１４，１４，１４－２Ｈ３、ミリスチン－２Ｈ２７酸、パルミチン酸－１－１３Ｃ、パルミチン酸－１６－１３Ｃ、パルミチン酸－１６－１３Ｃ，１６，１６，１６－２Ｈ３、パルミチン酸－２Ｈ３１、ステアリン酸－１－１３Ｃ、ステアリン酸－１８－１３Ｃ、ステアリン酸－１８，１８，１８－２Ｈ３、ステアリン－２Ｈ３５酸、オレイン酸－１－１３Ｃ、オレイン酸－２Ｈ３４、リノレン酸－１－１３Ｃ、リノール酸－２Ｈ３２、アラキドン－５，６，８，９，１１，１２，１４，１５－２Ｈ８酸及びエイコサン－２Ｈ３９酸からなる群から選択される、実施形態２３～２６のいずれか１つ以上に記載の核酸担体。
【0110】
２８． Ｐは、２つのアジド基を有するホモ二官能性リンカーであり、式ＩＶで表される構造を有し、
式中、ｍが１～２０の範囲の数である、実施形態１～２７のいずれか１つ以上に記載の核酸担体。
【化19】
【0111】
２９． 実施形態１～２９のいずれか１つに記載の核酸担体と、該核酸担体に封入された治療的又は免疫原性核酸剤とを含む、ナノ粒子組成物。
【0112】
３０． 上記治療的又は免疫原性核酸剤は、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｒｅｐＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ及びｍＲＮＡからなる群から選択される、実施形態２９に記載のナノ粒子組成物。
【0113】
３１． 上記治療的又は免疫原性核酸剤は、感染症、病原体、癌、自己免疫疾患及びアレルギー疾患からなる群より選択される１つ以上の抗原をコードする、実施形態２９又は３０に記載のナノ粒子組成物。
【0114】
３２． 上記治療的又は免疫原性核酸剤は、遺伝子の活性をサイレンシングするか、抑制するか又は改変することができるＲＮＡ又はＤＮＡを含む、実施形態２９又は３０に記載のナノ粒子組成物。
【0115】
３３． ＰＥＧ－脂質をさらに含む、実施形態２９～３２のいずれか１つに記載のナノ粒子組成物。
【0116】
３４． 上記ＰＥＧ－脂質は、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリ－エチレングリコール）－２０００］又は１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００である、実施形態３３に記載のナノ粒子組成物。
【0117】
３５． ナノ粒子組成物当たり上記ＰＥＧ－脂質を１モル％～１０モル％の範囲で含む、実施形態３３又は３４に記載のナノ粒子組成物。
【0118】
３６． リン脂質及びコレステロール又はその誘導体をさらに含む、実施形態３３～３５のいずれか１つに記載のナノ粒子組成物。
【0119】
３７． 上記リン脂質は、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）又はジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）である、実施形態３６に記載のナノ粒子組成物。
【0120】
３８． ナノ粒子組成物当たり上記リン脂質を１０モル％～１５モル％の範囲で含む、実施形態３７に記載のナノ粒子組成物。
【0121】
３９． ナノ粒子組成物当たり上記コレステロール又はその誘導体を５０モル％～７５モル％で含有する、実施形態３６に記載のナノ粒子組成物。
【0122】
４０． 対象の疾患又は病気を治療又は予防する方法であって、治療有効量の実施形態２９～３９のいずれか１つに記載のナノ粒子組成物を、必要とする対象に投与することを含む、方法。
【0123】
４１． 治療有効量の上記ナノ粒子組成物は、上記対象の１ｋｇ体重当たり上記治療的又は免疫原性核酸剤を０．０１ｍｇ核酸～１０ｍｇ核酸の範囲で含む、実施形態４０に記載の方法。
【0124】
４２． 上記対象は哺乳動物である、実施形態４１に記載の方法。
【0125】
４３． 上記哺乳動物は、ニワトリ、齧歯動物、イヌ、霊長類動物、ウマ、高価値の農業動物及びヒトからなる群から選択される、実施形態４２に記載の方法。
【実施例】
【0126】
以下の非限定的な実施例は、特定の実施形態を例示するためのものである。実施形態全体は、以下の１つ以上の実施例から１つ以上の詳細で補足されてもよく、及び／又は実施形態の１つ以上の要素は、以下の１つ以上の実施例から１つ以上の詳細で置換されてもよい。
【0127】
実施例１． 脂肪酸で修飾された生分解性デンドリマーを含有するナノ粒子組成物
デンドリマーの表面基の特性は、それらの物理化学的特性、生物学的活性及び生体適合性を決定する。理想的な遺伝子送達媒体は、生物蓄積及びその後の細胞毒性を予防するために生分解性であるべきである。大きなデンドリマーは、パッケージ性が高いため、生分解しにくい。生分解性を維持し、細胞毒性を回避しながら、核酸と複合化し、細胞膜を横切って移動することができる低世代のデンドリマーが必要とされている。
デンドリマーの表面基の特性は、それらの物理化学的特性、生物学的活性及び生体適合性を決定する。理想的な遺伝子送達媒体は、生物蓄積及びその後の細胞毒性を予防するために生分解性であるべきである。大きなデンドリマーは、パッケージ性が高いため、生分解しにくい。生分解性を維持し、細胞毒性を回避しながら、核酸と複合化し、細胞膜を横切って移動することができる低世代のデンドリマーが必要とされている。
【0128】
好ましくは、モノマー単位に存在する化学結合は、エステル結合であり、低世代ポリエステルデンドリマーの末端層は、アミド結合を介して内因性／必須脂肪酸側鎖で置換され、エステラーゼ及びアミダーゼによる血漿中の加水分解の影響を受けやすいため、生分解性を有する。脂肪酸鎖を有するこのような低世代デンドリマーは、核酸と非共有結合して、それらの動的均衡の性質を介してナノ粒子を形成することができる。
【0129】
本実施例の修飾デンドリマーは、以下のように、（１）トリメチロールプロパンコア（世代１、２）を有するビス－ＭＰＡ－ＯＨ若しくは２，２－ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸デンドリマー、（２）ペンタエリスリトールコア（世代１、２）を有するビス－ＭＰＡ－ＯＨデンドリマー、（３）１，１，１－トリス（ヒドロキシフェニルエタン）コアを有するビス－ＭＰＡ－ＯＨデンドリマー、又は（４）アダマンタンコアを有するビス－ＭＰＡ－ＯＨデンドリマーからなるものであった。
【0130】
（１）トリメチロールプロパンコアを有するビス－ＭＰＡ－ＯＨデンドリマー
（世代１、２）
（世代１、２）
【化20】
【0131】
（２）ペンタエリスリトールコアを有するビス－ＭＰＡ－ＯＨデンドリマー
（世代１、２）
（世代１、２）
【化21】
【0132】
（３）１，１，１－トリス（ヒドロキシフェニルエタン）コアを有するビス－ＭＰＡ－ＯＨデンドリマー（世代１、２）
【化22】
【0133】
（４）アダマンタンコアを有するビス－ＭＰＡ－ＯＨデンドリマー
（世代１、２）
（世代１、２）
【化23】
【0134】
図１は、世代１の修飾ポリエステルデンドリマー及び修飾に使用できる脂肪酸側鎖（Ｂ）の概略図である。該図において、脂肪酸側鎖Ｂは、Ｃ４－Ｃ２８脂肪酸のいずれかから選択することができる。
【0135】
ＰＥ－リノールの合成例は、以下のとおりである。
【化24】
【0136】
【化25】
【0137】
【化26】
【0138】
【化27】
【0139】
化合物１：出発原料であるビス－ＭＰＡ－ＯＨデンドリマートリメチロールプロパンコア、世代１（３００ｍｇ、０．６２ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＣＭ（６ｍＬ）に溶解し、ピリジン（０．９ｍＬ、４．９６ｍｍｏｌ）を加えた後、乾燥ＤＣＭ（２５ｍＬ）に溶解したｐ－ニトロフェニルクロロホルメート（２．１ｇ、１０ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を０℃～室温（２３℃）で一晩（１６時間）撹拌した。翌日、ＴＬＣは、生成物の形成を示す。反応混合物を１．３３ＭのＮａＨＳＯ４で希釈し、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を塩水で洗浄し、蒸発させた。粗反応混合物を４０ｇシリカゲルカラムに充填した。次に、ＤＣＭ／ＥｔＯＡｃを使用したフラッシュクロマトグラフィーにより、充填された化合物を精製した。この化合物を８％ＥｔＯＡｃで溶出し始め、所望の生成物を淡黄色オイル（８７０ｍｇ、６５％）として得た。１Ｈ ＮＭＲ（３０１ＭＨｚ、クロロホルム－ｄ）δ ｐｐｍ ０．９３－１．０２（ｍ，３Ｈ），１．３４－１．４２（ｍ，９Ｈ），１．５４－１．６５（ｍ，２Ｈ），４．１９－４．２５（ｍ，６Ｈ），４．４２－４．５６（ｍ，１２Ｈ），７．２７－７．３７（ｍ，１２Ｈ），８．１５－８．２４（ｍ，１２Ｈ）。
【0140】
化合物２：乾燥ＤＣＭ（６ｍＬ）に溶解した化合物１、ＰＮＰカーボネート（４５０ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）の溶液を乾燥ＤＣＭ（６ｍＬ）に溶解した過剰のモノ－Ｂｏｃ－ＤＡＰＭＡ（４５３ｍｇ、１．８５ｍｍｏｌ）に加えた。乾燥ＤＣＭ（４ｍＬ）中のＤＭＡＰ（７６ｍｇ、０．６２ｍｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（０．３２ｍｌ、１．８６ｍｍｏｌ）の溶液を加え、アルゴン雰囲気下で、反応混合物を２３℃で一晩１６時間撹拌した。ＴＬＣにより反応終了を確認した。次に、粗生成物を、移動相ａ（ＤＣＭ）／移動相ｂ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨａｑ）を使用したフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。化合物を４０％移動相ｂ（Ｒｆ＝０．１（１：１移動相ａ／移動相ｂ）で溶出し始め、所望の生成物を淡黄色オイル（４００ｍｇ、６２％）として得た。１Ｈ ＮＭＲ（３０１ＭＨｚ、クロロホルム－ｄ）δ ｐｐｍ ０．６６－０．７８（ｍ，３Ｈ），０．９８－１．０７（ｍ，９Ｈ），１．１８－１．２８（ｍ，５４Ｈ），１．３８－１．５２（ｍ，２４Ｈ），１．９７－２．０６（ｍ，１８Ｈ），２．１２－２．２４（ｍ，２４Ｈ），２．８５－３．００（ｍ，２４Ｈ），３．１７－３．２５（ｍ，１２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（７６ＭＨｚ、メタノール－ｄ４）δ ｐｐｍ １７．９２，２７．９５，２８．０４，２８．７１，３９．５８，４０．１１，４２．１８，４２．５９，４８．０１，５４．６９，５６．０１，５６．０８，６４．７６，６６．７２，７９．６６，１５８．０３，１５８．２５，１７４．０８。
【0141】
化合物５：１７１ｍｇの化合物４（０．０８２ｍｍｏｌ）を３ｍｌのＭｅＯＨに溶解した後、この化合物を３４当量のＡｃＣｌ（０．２ｍｌ）で処理し、反応物を０～２３℃で１６時間撹拌した後、乾固するまで蒸発させ、２ｍｌのＤＭＦに溶解し、０．１ｍｌのＥｔ３Ｎ（０．７３ｍｍｏｌ、９当量）を加えた後、２ｍｌのＤＭＦに溶解した３６５ｍｇのリノール－ＮＨＳ（本明細書に完全に記載されているように参照によって組み込まれる公開された手順：Ｔａｌｕｋｄｅｒら、国際公開第２０２０／１３２１９６号パンフレットに従って合成した）を加えた。反応混合物を２３℃で２４時間撹拌した後、減圧下でＧｅｎｅｖａｃで濃縮し、４０分間にわたる１００％ＣＨ２Ｃｌ２から７５：２２：３のＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨａｑ（体積）への勾配溶出によりシリカカラム上でのフラッシュクロマトグラフィーで精製した。所望の生成物を５０：７：１のＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨａｑで溶出した。生成物を含有する画分を合わせ、勾配的な高真空下で１２時間乾燥し、所望の生成物を淡黄色オイル（４０ｍｇ、１６％）として得て、使用するまで４℃で保存した。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、クロロホルム－ｄ）δ ｐｐｍ ０．８５－０．９４（ｍ，２１Ｈ），１．１３－１．４０（ｍ，９３Ｈ），１．４４－１．５１（ｍ，２Ｈ），１．５１－１．７１（ｍ，４３Ｈ），１．９４－２．０６（ｍ，２４Ｈ），２．０９－２．２２（ｍ，３４Ｈ），２．３４－２．４４（ｍ，２４Ｈ），２．６９－２．７９（ｍ，９Ｈ），３．０９－３．３３（ｍ，２６Ｈ），３．９７－４．２６（ｍ，１７Ｈ），５．２２－５．４６（ｍ，２２Ｈ）。
【0142】
実施例２． 式（Ｉ）の化合物
以下の化合物は、上述した手順に従って製造されてもよく、所望の生成物を提供するために必要な場合には出発材料は変更される。
以下の化合物は、上述した手順に従って製造されてもよく、所望の生成物を提供するために必要な場合には出発材料は変更される。
【化28】
【0143】
【化29】
【0144】
【化30】
【0145】
【化31】
【0146】
【化32】
【0147】
【化33】
【0148】
【化34】
【0149】
【化35】
【0150】
【化36】
【0151】
【化37】
【0152】
【化38】
【0153】
【化39】
【0154】
【化40】
【0155】
【化41】
【0156】
【化42】
【0157】
【化43】
【0158】
【化44】
【0159】
【化45】
【0160】
【化46】
【0161】
【化47】
【0162】
実施例３． ナノ粒子製剤
図２は、改善された自己組織化のために設計したナノ粒子組成物の調製方法を示す。１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＰＥＧ－脂質、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄ）と組み合わせた修飾デンドリマー（ＰＥ－ステアリン）を含有する３０μｌのエタノール相と、９０μｌの超純粋、ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅフリー及びエンドトキシンフリー蒸留水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（インビトロジェン））で希釈したルシフェラーゼｍＲＮＡと、滅菌した１００ｍＭ（ｐＨ５．０）ＱＢクエン酸緩衝液（Ｔｅｋｎｏｖａ（テクノバ））とを直接混合することにより、最終的なクエン酸濃度が１０ｍＭとなるようにナノ粒子を製剤化した。得られたナノ粒子では、修飾デンドリマー：ＰＥＧ－脂質：ＲＮＡの質量比が６：１：２であった。Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ（マルバーン・パナリティカル））を使用して粒径分布、Ｚ平均及び誘導計数率を分析するために、製剤を１０００倍希釈した。
図２は、改善された自己組織化のために設計したナノ粒子組成物の調製方法を示す。１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＰＥＧ－脂質、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄ）と組み合わせた修飾デンドリマー（ＰＥ－ステアリン）を含有する３０μｌのエタノール相と、９０μｌの超純粋、ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅフリー及びエンドトキシンフリー蒸留水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（インビトロジェン））で希釈したルシフェラーゼｍＲＮＡと、滅菌した１００ｍＭ（ｐＨ５．０）ＱＢクエン酸緩衝液（Ｔｅｋｎｏｖａ（テクノバ））とを直接混合することにより、最終的なクエン酸濃度が１０ｍＭとなるようにナノ粒子を製剤化した。得られたナノ粒子では、修飾デンドリマー：ＰＥＧ－脂質：ＲＮＡの質量比が６：１：２であった。Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ（マルバーン・パナリティカル））を使用して粒径分布、Ｚ平均及び誘導計数率を分析するために、製剤を１０００倍希釈した。
【0163】
実施例４． 流体力学的サイズの測定
図３は、ナノ粒子のサイズ（ｄ．ｎｍ、ｎｍ単位の直径）に基づいて強度として測定したナノ粒子組成物の分布を示す。図３を参照すると、「Ｚ平均」は、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した粒子の全体の集合の強度重み付け平均流体力学的サイズである。図３を参照すると、サイズが２４８．４ｄ．ｎｍのナノ粒子の最も強い強度が観察された。
図３は、ナノ粒子のサイズ（ｄ．ｎｍ、ｎｍ単位の直径）に基づいて強度として測定したナノ粒子組成物の分布を示す。図３を参照すると、「Ｚ平均」は、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した粒子の全体の集合の強度重み付け平均流体力学的サイズである。図３を参照すると、サイズが２４８．４ｄ．ｎｍのナノ粒子の最も強い強度が観察された。
【0164】
実施例５． ゲル遅延アッセイ
アガロースゲル電気泳動を実行して、修飾デンドリマーとＲＮＡとの結合を公知の方法（Ｇｅａｌｌら、１０．１０７３／ｐｎａｓ．１２０９３６７１０９、本明細書に完全に記載されているように参照によって組み込まれる）に従って評価した。図４は、修飾デンドリマーとＲＮＡとの結合を示すアガロースゲルの写真である。ゲルを臭化エチジウム（ＥＢ）で染色し、ゲル画像をＳｙｎｇｅｎｅ Ｇ Ｂｏｘイメージングシステム（Ｓｙｎｇｅｎｅ（シンジーン）、米国）で撮影した。図４を参照すると、レーン１は、非製剤化ルシフェラーゼｍＲＮＡを含有し、レーン２は、ＰＥ－パルミチンデンドリマーとルシフェラーゼｍＲＮＡの製剤物を含有し、レーン３は、ＰＥ－ヘプタデカンとルシフェラーゼｍＲＮＡの製剤物を含有し、レーン４は、ＰＥ－ステアリンとルシフェラーゼｍＲＮＡの製剤物を含有し、レーン５は、ＰＥ－オレイン及びルシフェラーゼｍＲＮＡの製剤物を含有し、レーン６は、ＰＥ－リノールとルシフェラーゼｍＲＮＡの製剤物を含有した。ローディングする前に、サンプルをホルムアルデヒドローディング染料でインキュベートし、６５℃で１０分間変性させ、室温まで冷却した。ゲルを９０Ｖで実行し、ゲル画像をＳｙｎｇｅｎｅ Ｇ Ｂｏｘイメージングシステム（Ｓｙｎｇｅｎｅ、米国）で撮影した。ＲＮＡ検出のために、ゲルを臭化エチジウムで染色した。図４を参照すると、下側バンドは、小さなサイズのフリーＲＮＡ（レーン１）に対応し、上側バンドは、該ＲＮＡをデンドリマー担体に結合して形成された大きなサイズのナノ粒子を示す。
アガロースゲル電気泳動を実行して、修飾デンドリマーとＲＮＡとの結合を公知の方法（Ｇｅａｌｌら、１０．１０７３／ｐｎａｓ．１２０９３６７１０９、本明細書に完全に記載されているように参照によって組み込まれる）に従って評価した。図４は、修飾デンドリマーとＲＮＡとの結合を示すアガロースゲルの写真である。ゲルを臭化エチジウム（ＥＢ）で染色し、ゲル画像をＳｙｎｇｅｎｅ Ｇ Ｂｏｘイメージングシステム（Ｓｙｎｇｅｎｅ（シンジーン）、米国）で撮影した。図４を参照すると、レーン１は、非製剤化ルシフェラーゼｍＲＮＡを含有し、レーン２は、ＰＥ－パルミチンデンドリマーとルシフェラーゼｍＲＮＡの製剤物を含有し、レーン３は、ＰＥ－ヘプタデカンとルシフェラーゼｍＲＮＡの製剤物を含有し、レーン４は、ＰＥ－ステアリンとルシフェラーゼｍＲＮＡの製剤物を含有し、レーン５は、ＰＥ－オレイン及びルシフェラーゼｍＲＮＡの製剤物を含有し、レーン６は、ＰＥ－リノールとルシフェラーゼｍＲＮＡの製剤物を含有した。ローディングする前に、サンプルをホルムアルデヒドローディング染料でインキュベートし、６５℃で１０分間変性させ、室温まで冷却した。ゲルを９０Ｖで実行し、ゲル画像をＳｙｎｇｅｎｅ Ｇ Ｂｏｘイメージングシステム（Ｓｙｎｇｅｎｅ、米国）で撮影した。ＲＮＡ検出のために、ゲルを臭化エチジウムで染色した。図４を参照すると、下側バンドは、小さなサイズのフリーＲＮＡ（レーン１）に対応し、上側バンドは、該ＲＮＡをデンドリマー担体に結合して形成された大きなサイズのナノ粒子を示す。
【0165】
実施例６． 材料安定性
ポリエステルデンドリマーは、エステル結合の加水分解感受性により分解しやすいため、特有の材料クラスを構成する。しかしながら、理想的な核酸担体は、製剤ｐＨだけでなく、保存ｐＨにおいても安定であるべきである。したがって、デンドリマー材料の安定性を異なるｐＨで確認した。図５は、中性ｐＨ及びｐＨ５でのデンドリマーのＬＣＭＳクロマトグラムを示す。室温での中性ｐＨ及びｐＨ５の両方で単一のピーク（溶出時間１３．４２分）を示すクロマトグラムは、ｐＨ５でＲＮＡを製剤化しながら、ポリエステルデンドリマー構造が無傷であることを示す。
ポリエステルデンドリマーは、エステル結合の加水分解感受性により分解しやすいため、特有の材料クラスを構成する。しかしながら、理想的な核酸担体は、製剤ｐＨだけでなく、保存ｐＨにおいても安定であるべきである。したがって、デンドリマー材料の安定性を異なるｐＨで確認した。図５は、中性ｐＨ及びｐＨ５でのデンドリマーのＬＣＭＳクロマトグラムを示す。室温での中性ｐＨ及びｐＨ５の両方で単一のピーク（溶出時間１３．４２分）を示すクロマトグラムは、ｐＨ５でＲＮＡを製剤化しながら、ポリエステルデンドリマー構造が無傷であることを示す。
【0166】
実施例７． 脂肪酸で修飾したポリエステルデンドリマーを含有するナノ粒子組成物のコロイド安定性
製剤化及び４℃での保存の２１日後の粒径分布と２時間の透析直後に測定した粒径分布とを比較することによりナノ粒子の安定性を決定した。同じポリエステルデンドリマーは、室温だけでなく３７℃でも十分に凝集することなくＰＢＳ中で良好な安定性を示した。図６Ａ～６Ｅは、ＤＬＳ及びアガロースゲル電気泳動により測定したＰＢＳにおけるＲＮＡ－ＰＥステアリンナノ粒子の安定性を示す。図６Ａは、ナノ粒子のサイズ（ｄ）に基づいて強度として測定した透析後のナノ粒子組成物の分布を示す。図６Ｂは、４℃で３週間保存後にＤＬＳにより測定したＰＥ－ステアリン ＰＲ８ ＨＡ ｍＲＮＡの安定性を示す。図６Ｃは、室温（ＲＴ）で３日間保存後にＤＬＳにより測定したＰＥ－ステアリン ＰＲ８ ＨＡ ｍＲＮＡの安定性を示す。図６Ｄは、３７℃で２時間保存後にＤＬＳにより測定したＰＥ－ステアリン ＰＲ８ ＨＡ ｍＲＮＡの安定性を示す。図６Ｅは、レーン１－ＰＲ８ ＨＡ ｍＲＮＡ、レーン２－ＰＥ－ステアリン ＰＲ８ ＨＡ ｍＲＮＡ、４°、３週間、レーン３－ＰＥ－ステアリン ＰＲ８ ＨＡ ｍＲＮＡ、ｒｔ、３日、レーン４－ＰＥ－ステアリン ＰＲ８ ＨＡ ｍＲＮＡ、３７℃、１時間、レーン５－ＰＥ－ステアリン ＰＲ８ ＨＡ ｍＲＮＡ、３７℃、２時間というゲル保持アッセイに基づく安定性の結果を示す。粒径分布が同じであり、これらの保存条件下で安定性を示すことが観察された。
製剤化及び４℃での保存の２１日後の粒径分布と２時間の透析直後に測定した粒径分布とを比較することによりナノ粒子の安定性を決定した。同じポリエステルデンドリマーは、室温だけでなく３７℃でも十分に凝集することなくＰＢＳ中で良好な安定性を示した。図６Ａ～６Ｅは、ＤＬＳ及びアガロースゲル電気泳動により測定したＰＢＳにおけるＲＮＡ－ＰＥステアリンナノ粒子の安定性を示す。図６Ａは、ナノ粒子のサイズ（ｄ）に基づいて強度として測定した透析後のナノ粒子組成物の分布を示す。図６Ｂは、４℃で３週間保存後にＤＬＳにより測定したＰＥ－ステアリン ＰＲ８ ＨＡ ｍＲＮＡの安定性を示す。図６Ｃは、室温（ＲＴ）で３日間保存後にＤＬＳにより測定したＰＥ－ステアリン ＰＲ８ ＨＡ ｍＲＮＡの安定性を示す。図６Ｄは、３７℃で２時間保存後にＤＬＳにより測定したＰＥ－ステアリン ＰＲ８ ＨＡ ｍＲＮＡの安定性を示す。図６Ｅは、レーン１－ＰＲ８ ＨＡ ｍＲＮＡ、レーン２－ＰＥ－ステアリン ＰＲ８ ＨＡ ｍＲＮＡ、４°、３週間、レーン３－ＰＥ－ステアリン ＰＲ８ ＨＡ ｍＲＮＡ、ｒｔ、３日、レーン４－ＰＥ－ステアリン ＰＲ８ ＨＡ ｍＲＮＡ、３７℃、１時間、レーン５－ＰＥ－ステアリン ＰＲ８ ＨＡ ｍＲＮＡ、３７℃、２時間というゲル保持アッセイに基づく安定性の結果を示す。粒径分布が同じであり、これらの保存条件下で安定性を示すことが観察された。
【0167】
実施例８． 細胞ベースのルシフェラーゼｍＲＮＡの発現分析
５’ＵＴＲ、ルシフェラーゼＯＲＦ、３’ＵＴＲ及びポリＡ末端からなるルシフェラーゼｃＤＮＡ発現カセットを設計した。ＧｅｎＳｃｒｉｐｔにより、このカセットを合成し、Ｔ７プロモーター下流のＮｈｅｌ／ＫｐｎｌサイトでｐｃＤＮＡ３．１ベクターにクローニングした。誘導された発現ベクターを、生体外でのＴ７ベースの転写（Ｈｏｎｇｅｎｅ（ホンジーン）、＃ＯＮ－０４０）及びワクシニアウキャッピング系（Ｈｏｎｇｅｎｅ、＃ＯＮ－０２８）によりルシフェラーゼｍＲＮＡを合成するＤＮＡテンプレートとして使用した。塩化リチウム沈殿による精製後、さらなる分析のために、ルシフェラーゼｍＲＮＡをポリエステルデンドリマーで製剤化してナノ粒子を形成した。ＡＴＣＣから取得したＲＡＷ２６４．７（ＡＴＣＣ、ＴＩＢ－７１）及びＡ５４９（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ－１８５）細胞を、ＡＴＣＣにより提案されるプロトコルに従って成長させ、維持した。新たに製剤化したナノ粒子のｍＲＮＡを哺乳動物細胞に送達してタンパク質を発現させる能力をテストするために、９６ウェルプレートで成長させたＲＡＷ２６４．７細胞又はＡ５４９細胞の単層を５０μｌのＰＢＳで１ウェル当たり５０ｎｇのルシフェラーゼｍＲＮＡナノ粒子でトランスフェクトした。３７℃で１時間インキュベートした後、成長培地をウェル当たり５０μｌ加えた。トランスフェクション後の指定された時間点で、細胞を溶解し、ルシフェラーゼワンステップグローアッセイキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（サーモフィッシャー）、＃８８２６３）を使用してルシフェラーゼ活性を測定した。図７Ａ及び図７Ｂは、修飾ポリエステルデンドリマーベースのナノ粒子により哺乳類細胞に送達され、発光アッセイを使用した細胞内ルシフェラーゼ活性の定量化により測定したルシフェラーゼｍＲＮＡからの細胞培養におけるルシフェラーゼ発現を示す。図７Ａは、裸のルシフェラーゼｍＲＮＡと比較して、ＰＥ－リノール、ＰＥ－ステアリン及びＰＥ－パルミチンを含有するナノ粒子により送達されたルシフェラーゼｍＲＮＡの細胞培養発現を示す。図７Ｂは、裸のルシフェラーゼｍＲＮＡと比較して、ＰＥ－ヘプタデカン、ＰＥ－ステアリン、ＰＥ－オレイン及びＰＥ－１６－ヒドロキシパルミチンを含有するナノ粒子によって送達されるルシフェラーゼｍＲＮＡの細胞培養発現を示す。これらの図を参照すると、全てのＲＮＡナノ粒子がＲＡＷ２６４．７細胞によって取り込まれることが可能であり、遺伝子発現につながることが観察された。
５’ＵＴＲ、ルシフェラーゼＯＲＦ、３’ＵＴＲ及びポリＡ末端からなるルシフェラーゼｃＤＮＡ発現カセットを設計した。ＧｅｎＳｃｒｉｐｔにより、このカセットを合成し、Ｔ７プロモーター下流のＮｈｅｌ／ＫｐｎｌサイトでｐｃＤＮＡ３．１ベクターにクローニングした。誘導された発現ベクターを、生体外でのＴ７ベースの転写（Ｈｏｎｇｅｎｅ（ホンジーン）、＃ＯＮ－０４０）及びワクシニアウキャッピング系（Ｈｏｎｇｅｎｅ、＃ＯＮ－０２８）によりルシフェラーゼｍＲＮＡを合成するＤＮＡテンプレートとして使用した。塩化リチウム沈殿による精製後、さらなる分析のために、ルシフェラーゼｍＲＮＡをポリエステルデンドリマーで製剤化してナノ粒子を形成した。ＡＴＣＣから取得したＲＡＷ２６４．７（ＡＴＣＣ、ＴＩＢ－７１）及びＡ５４９（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ－１８５）細胞を、ＡＴＣＣにより提案されるプロトコルに従って成長させ、維持した。新たに製剤化したナノ粒子のｍＲＮＡを哺乳動物細胞に送達してタンパク質を発現させる能力をテストするために、９６ウェルプレートで成長させたＲＡＷ２６４．７細胞又はＡ５４９細胞の単層を５０μｌのＰＢＳで１ウェル当たり５０ｎｇのルシフェラーゼｍＲＮＡナノ粒子でトランスフェクトした。３７℃で１時間インキュベートした後、成長培地をウェル当たり５０μｌ加えた。トランスフェクション後の指定された時間点で、細胞を溶解し、ルシフェラーゼワンステップグローアッセイキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（サーモフィッシャー）、＃８８２６３）を使用してルシフェラーゼ活性を測定した。図７Ａ及び図７Ｂは、修飾ポリエステルデンドリマーベースのナノ粒子により哺乳類細胞に送達され、発光アッセイを使用した細胞内ルシフェラーゼ活性の定量化により測定したルシフェラーゼｍＲＮＡからの細胞培養におけるルシフェラーゼ発現を示す。図７Ａは、裸のルシフェラーゼｍＲＮＡと比較して、ＰＥ－リノール、ＰＥ－ステアリン及びＰＥ－パルミチンを含有するナノ粒子により送達されたルシフェラーゼｍＲＮＡの細胞培養発現を示す。図７Ｂは、裸のルシフェラーゼｍＲＮＡと比較して、ＰＥ－ヘプタデカン、ＰＥ－ステアリン、ＰＥ－オレイン及びＰＥ－１６－ヒドロキシパルミチンを含有するナノ粒子によって送達されるルシフェラーゼｍＲＮＡの細胞培養発現を示す。これらの図を参照すると、全てのＲＮＡナノ粒子がＲＡＷ２６４．７細胞によって取り込まれることが可能であり、遺伝子発現につながることが観察された。
【0168】
実施例９． ＨＡ発現のウエスタンブロット分析
５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲに挟まれ、ポリＡ末端が続く全長ＨＡ ＯＲＦ（ＰＲ８ ＨＡ）からなるインフルエンザＨＡ発現カセットを合成し、Ｔ７プロモーターの下流でｐｃＤＮＡ３．１ベクターにクローニングした。このＨＡ発現ベクターを、生体外でのＴ７ベースの転写（Ｈｏｎｇｅｎｅ、＃ＯＮ－０４０）及びワクシニアウキャッピング系（Ｈｏｎｇｅｎｅ、＃ＯＮ－０２８）によりＨＡ ｍＲＮＡを合成するためのＤＮＡテンプレートとして使用した。塩化リチウム沈殿による精製後、ＨＡ ｍＲＮＡを製剤化し、デンドリマーベースのナノ粒子を形成した。ウエスタンブロット分析のために、１２ウェルプレートで成長したＡ５４９細胞を１ｍｌのＰＢＳでウェル当たり２μｇのＨＡ ｍＲＮＡナノ粒子でトランスフェクトした。３７℃で１時間インキュベートした後、各ウェルに１ｍｌの成長培地を加えた。トランスフェクション後の２４時間で、製造業者のプロトコルに従って、細胞を収集し、かつＲＩＰＡ緩衝液（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ（バイオビジョン）、＃２１１４）で溶解した。細胞溶解物をＬａｅｍｍｌｉ（レムリ）サンプル緩衝液と混合し、混合物をＳＤＳ－ＰＡＧＥ（１０％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｐｌｕｓ Ｇｅｌｓ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃ＮＷ００１００ＢＯＸ）により分析し、かつＰＶＤＦ転写膜（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃ＩＢ２４００２）にエレクトロブロットした。ＰＢＳ中の５％非脂肪乾燥ミルクと０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０で一晩ブロックした後、同じ緩衝液で希釈したインフルエンザＡウイルスＨ１Ｎ１ ＨＡ抗体（ＧｅｎｅＴｅｘ（ジーンテックス）、＃ＧＴＸ１２７３５７）で、膜を室温で１時間インキュベートした。図８は、ＨＡ発現のウエスタンブロット分析を示す。ＨＲＰ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃Ａ１２１７２）に結合したヒツジ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体を使用したＣｈｅｍｉ－ＸＲＳシステム（ＳｙｎＧｅｎｅ）と、化学発光検出システム（ＰｒｏＳｉｇｎａｌ（登録商標）Ｆｅｍｔｏ ＥＣＬ Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ ＃２０－３０２）とにより、ＨＡタンパク質（図８、矢印で示す）を可視化した。図８を参照すると、ＲＮＡナノ粒子の一部がＡ５４９細胞によって取り込まれることが可能であり、遺伝子発現につながることが観察された。
５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲに挟まれ、ポリＡ末端が続く全長ＨＡ ＯＲＦ（ＰＲ８ ＨＡ）からなるインフルエンザＨＡ発現カセットを合成し、Ｔ７プロモーターの下流でｐｃＤＮＡ３．１ベクターにクローニングした。このＨＡ発現ベクターを、生体外でのＴ７ベースの転写（Ｈｏｎｇｅｎｅ、＃ＯＮ－０４０）及びワクシニアウキャッピング系（Ｈｏｎｇｅｎｅ、＃ＯＮ－０２８）によりＨＡ ｍＲＮＡを合成するためのＤＮＡテンプレートとして使用した。塩化リチウム沈殿による精製後、ＨＡ ｍＲＮＡを製剤化し、デンドリマーベースのナノ粒子を形成した。ウエスタンブロット分析のために、１２ウェルプレートで成長したＡ５４９細胞を１ｍｌのＰＢＳでウェル当たり２μｇのＨＡ ｍＲＮＡナノ粒子でトランスフェクトした。３７℃で１時間インキュベートした後、各ウェルに１ｍｌの成長培地を加えた。トランスフェクション後の２４時間で、製造業者のプロトコルに従って、細胞を収集し、かつＲＩＰＡ緩衝液（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ（バイオビジョン）、＃２１１４）で溶解した。細胞溶解物をＬａｅｍｍｌｉ（レムリ）サンプル緩衝液と混合し、混合物をＳＤＳ－ＰＡＧＥ（１０％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｐｌｕｓ Ｇｅｌｓ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃ＮＷ００１００ＢＯＸ）により分析し、かつＰＶＤＦ転写膜（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃ＩＢ２４００２）にエレクトロブロットした。ＰＢＳ中の５％非脂肪乾燥ミルクと０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０で一晩ブロックした後、同じ緩衝液で希釈したインフルエンザＡウイルスＨ１Ｎ１ ＨＡ抗体（ＧｅｎｅＴｅｘ（ジーンテックス）、＃ＧＴＸ１２７３５７）で、膜を室温で１時間インキュベートした。図８は、ＨＡ発現のウエスタンブロット分析を示す。ＨＲＰ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃Ａ１２１７２）に結合したヒツジ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体を使用したＣｈｅｍｉ－ＸＲＳシステム（ＳｙｎＧｅｎｅ）と、化学発光検出システム（ＰｒｏＳｉｇｎａｌ（登録商標）Ｆｅｍｔｏ ＥＣＬ Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ ＃２０－３０２）とにより、ＨＡタンパク質（図８、矢印で示す）を可視化した。図８を参照すると、ＲＮＡナノ粒子の一部がＡ５４９細胞によって取り込まれることが可能であり、遺伝子発現につながることが観察された。
【0169】
実施例１０． ヘマグルチニン阻害アッセイ（ＨＡＩ）
標準的な推奨ＷＨＯプロトコル［Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（世界保健機関）．（２００２）． ＷＨＯ ｍａｎｕａｌ ｏｎ ａｎｉｍａｌ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ ２００２．５ Ｒｅｖ．１．２００２］に従って、ワクチン接種した動物血清に対してＨＡＩテストを実行した。血清を、受容体破壊酵素（デンカ生研株式会社、東京、日本）で３７℃で一晩処理し、５６℃で３０分間加熱不活性化した。ＲＴまで冷却した後、これらの血清サンプルを、２体積のシチメンチョウ赤血球（ＲＢＣ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（ロックランド・イムノケミカルズ））の２５％懸濁液と混合し、室温で２時間インキュベートした後、遠心分離してＲＢＣを除去した。１：１０の希釈度にあると考えられる処理した血清を連続希釈し、かつ４ＨＡ単位の不活性化インフルエンザＡウイルス（ＰＲ／８／３４、Ｖｉｒｕｓｙｓ（ウイルシス） ＃ＩＡＶ２１０）と室温で３０分間インキュベートした。等体積の０．５％シチメンチョウＲＢＣを各ウェルに加え、室温で３０分間インキュベートした。ＨＡＩ力価を、血球凝集を完全に阻害した血清の最高希釈度として読み取った。
標準的な推奨ＷＨＯプロトコル［Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（世界保健機関）．（２００２）． ＷＨＯ ｍａｎｕａｌ ｏｎ ａｎｉｍａｌ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ ２００２．５ Ｒｅｖ．１．２００２］に従って、ワクチン接種した動物血清に対してＨＡＩテストを実行した。血清を、受容体破壊酵素（デンカ生研株式会社、東京、日本）で３７℃で一晩処理し、５６℃で３０分間加熱不活性化した。ＲＴまで冷却した後、これらの血清サンプルを、２体積のシチメンチョウ赤血球（ＲＢＣ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（ロックランド・イムノケミカルズ））の２５％懸濁液と混合し、室温で２時間インキュベートした後、遠心分離してＲＢＣを除去した。１：１０の希釈度にあると考えられる処理した血清を連続希釈し、かつ４ＨＡ単位の不活性化インフルエンザＡウイルス（ＰＲ／８／３４、Ｖｉｒｕｓｙｓ（ウイルシス） ＃ＩＡＶ２１０）と室温で３０分間インキュベートした。等体積の０．５％シチメンチョウＲＢＣを各ウェルに加え、室温で３０分間インキュベートした。ＨＡＩ力価を、血球凝集を完全に阻害した血清の最高希釈度として読み取った。
【0170】
プライムワクチン接種後、ＰＥ－オレインを用いて製剤化した５μｇのナノ粒子ワクチンで免疫したＨＡ ｍＲＮＡ群には、ＨＩ力価で測定した体液性免疫応答が観察された（図９）。４週目に、この群の平均ＨＩ力価は４０であり、同じワクチンの投与量によるブースト免疫を行った１週間後、５週目に平均１９２まで上昇し続けた。これは、全ての時間点でＨＩ力価が基準線１０にとどまった裸のｍＲＮＡで免疫した群とは対照的である。
【0171】
実施例１１． ＤＮＡを含有するナノ粒子組成物
ＳＥＡＰ配列をｐｃＤＮＡ３プラスミドにクローニングすることによりＳＥＡＰ ＤＮＡを生成した。このプラスミドは、細菌培養における維持及び増殖に必要な複製及びアンピシリン耐性遺伝子の必要な起源と、組織培養における哺乳動物細胞の発現を駆動する遺伝子クローニング部位の上流の哺乳動物ＣＭＶプロモーターと、該ＣＭＶプロモーターの下流のバクテリオファージＴ７転写プロモーターとを含有することにより、ＢｓｐＱＩ制限部位で終結したクローニングした遺伝子配列をコードするｍＲＮＡを生体外で転写する。Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（クロンテック・ラボラトリーズ））クローニングキットを用いて、市販のＤＮＡ断片からプラスミドを構築した。
ＳＥＡＰ配列をｐｃＤＮＡ３プラスミドにクローニングすることによりＳＥＡＰ ＤＮＡを生成した。このプラスミドは、細菌培養における維持及び増殖に必要な複製及びアンピシリン耐性遺伝子の必要な起源と、組織培養における哺乳動物細胞の発現を駆動する遺伝子クローニング部位の上流の哺乳動物ＣＭＶプロモーターと、該ＣＭＶプロモーターの下流のバクテリオファージＴ７転写プロモーターとを含有することにより、ＢｓｐＱＩ制限部位で終結したクローニングした遺伝子配列をコードするｍＲＮＡを生体外で転写する。Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（クロンテック・ラボラトリーズ））クローニングキットを用いて、市販のＤＮＡ断片からプラスミドを構築した。
【0172】
１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＰＥＧ－脂質、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄ）と組み合わせた修飾デンドリマー（ＰＥ－リノール）を含有する２０μｌのエタノール相と、６０μｌの超純粋、ＤＮＡａｓｅ／ＲＮａｓｅフリー及びエンドトキシンフリー蒸留水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で希釈したＳＥＡＰ ＤＮＡと、滅菌した１００ｍＭ（ｐＨ５．０）ＱＢクエン酸緩衝液（Ｔｅｋｎｏｖａ）とを直接混合することにより、最終的なクエン酸濃度が１０ｍＭとなり、最終的なＤＮＡ濃度が０．３８ｍｇ／ｍＬとなるようにＰＥ－リノール－ＳＥＡＰ ＤＮＡナノ粒子を製剤化した。エタノールとクエン酸ストリームとを、エタノール体積：クエン酸体積＝１：３の比率で混合し、ナノ粒子を製造した。得られたナノ粒子では、修飾デンドリマー：ＰＥＧ－脂質：ＤＮＡの質量比が６：１：２であった。Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）を使用して粒径分布、Ｚ平均及び誘導計数率を分析するために、製剤を１０００倍希釈した。
【0173】
図１０は、ＰＥ－リノール修飾デンドリマーとＳＥＡＰ ＤＮＡとの混合により生成されたナノ粒子の粒径分布を示す。
【0174】
【表1】
【0175】
これらのナノ粒子が生体外でＳＥＡＰを発現する能力をテストするために、２９３Ｔ細胞をナノ粒子で処理した。２９３Ｔの９６ウェル皿の各ウェルを、１：１のＯｐｔｉｍｅｍ：ＰＢＳの混合物で２００μＬの最終体積に希釈した１０μＬ（約０．２５μｇ）の各製剤物で処理した。非処理ウェルは、２００μＬの５０／５０のＰＢＳ／ＯｐｔｉＭＥＭであった。処理又はトランスフェクションの２４時間後、各培養物から馴化された培地を収集した。ＱｕａｎｔｉＢｌｕｅアッセイ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を用いて培地を分析した。１８０μＬのＱｕａｎｔｉｂｌｕｅ試薬をウェルからの５０μＬの培地と組み合わせた。製造業者のプロトコルの指示に従って、６５０ｎｍで吸光度を測定することにより、４０分間後に測定値を読み取った。処理なしの陰性対照のために、ナノ粒子で処理していないウェルからの５０μＬの培地を１８０μＬのＱｕａｎｔｉＢｌｕｅ試薬に加えた。アッセイの全てのステップにおいて、これらのサンプルを他の全てのサンプルと同じ方法で処理した。
【0176】
図１１は、２９３Ｔ細胞の処理に使用した修飾デンドリマーによるナノ粒子製剤の生体外ＳＥＡＰ発現を示す。ＰＥ－ヘプタデカン、ＰＥ－オレイン及びＰＥ－リノールで製剤化したＳＥＡＰ ＤＮＡは、ＳＥＡＰ発現をもたらすナノ粒子を生成した。
【0177】
実施例１２． 脂肪酸で修飾したポリエステルデンドロンを含有するナノ粒子組成物
末端に脂肪酸尾部を含むように修飾したＰＥデンドロン（例えば、ＰＥデンドロン－Ｇ２－Ａ１－リシノール）：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋを１：０．５：２．４：０．０３５のモル比で含有するナノ粒子を、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ Ｂｅｎｃｈｔｏｐ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ（プレシジョン・ナノシステムズ）、バンクーバー、ブリティッシュコロンビア州、カナダ）を用いて製剤化した。ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅフリー及びエンドトキシンフリー蒸留水と滅菌したクエン酸緩衝液とでＲＮＡを最終的な所望のｐＨに希釈した。Ｂｅｎｃｈｔｏｐでの製剤化のために、総流量を、水相と有機相の３：１の比率で１分当たり１２ｍＬに維持した。エンドトキシン除去のために１．０ＭのＮａＯＨで２４時間洗浄し、蒸気オートクレーブで滅菌するか、又は２５０℃で２４時間加熱することにより脱発熱原化したガラス製品を使用して、２０，０００分子量のカットオフ透析を使用して、滅菌したエンドトキシンフリーＰＢＳに対してナノ粒子を透析した。透析したナノ粒子を、０．２ミクロンポリ（エーテルスルホン）フィルターで滅菌濾過し、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ＮａｎｏＺＳマシン（Ｍａｌｖｅｒｎ（マルバーン））で特性解析した。サイズ分布は、比較的単分散のサイズを示す多分散性指数の低い単一のピークを特徴としていた。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ（登録商標）アッセイ（本明細書に完全に記載されているように参照によって組み込まれるＧｅａｌｌら、１０．１０７３／ｐｎａｓ．１２０９３６７１０９）を使用して、カプセル化効率を、ＰＥデンドロン＿Ｇ２－Ａ１－リシノール及びＳＥＡＰレプリコンＲＮＡを含有するナノ粒子組成物（ｐＨ５で製剤化した）については９５％と測定した。
末端に脂肪酸尾部を含むように修飾したＰＥデンドロン（例えば、ＰＥデンドロン－Ｇ２－Ａ１－リシノール）：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋを１：０．５：２．４：０．０３５のモル比で含有するナノ粒子を、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ Ｂｅｎｃｈｔｏｐ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ（プレシジョン・ナノシステムズ）、バンクーバー、ブリティッシュコロンビア州、カナダ）を用いて製剤化した。ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅフリー及びエンドトキシンフリー蒸留水と滅菌したクエン酸緩衝液とでＲＮＡを最終的な所望のｐＨに希釈した。Ｂｅｎｃｈｔｏｐでの製剤化のために、総流量を、水相と有機相の３：１の比率で１分当たり１２ｍＬに維持した。エンドトキシン除去のために１．０ＭのＮａＯＨで２４時間洗浄し、蒸気オートクレーブで滅菌するか、又は２５０℃で２４時間加熱することにより脱発熱原化したガラス製品を使用して、２０，０００分子量のカットオフ透析を使用して、滅菌したエンドトキシンフリーＰＢＳに対してナノ粒子を透析した。透析したナノ粒子を、０．２ミクロンポリ（エーテルスルホン）フィルターで滅菌濾過し、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ＮａｎｏＺＳマシン（Ｍａｌｖｅｒｎ（マルバーン））で特性解析した。サイズ分布は、比較的単分散のサイズを示す多分散性指数の低い単一のピークを特徴としていた。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ（登録商標）アッセイ（本明細書に完全に記載されているように参照によって組み込まれるＧｅａｌｌら、１０．１０７３／ｐｎａｓ．１２０９３６７１０９）を使用して、カプセル化効率を、ＰＥデンドロン＿Ｇ２－Ａ１－リシノール及びＳＥＡＰレプリコンＲＮＡを含有するナノ粒子組成物（ｐＨ５で製剤化した）については９５％と測定した。
【0178】
修飾ＰＥデンドロンの製剤をテストするために、分泌された胚性アルカリホスファターゼＳＥＡＰレポーターシステムを使用した。生体内テストのために、マウスに５μｇのＳＥＡＰレプリコンＲＮＡの量でナノ粒子を注射し、１６時間後にマウスから血清を採取した。量を、ＳＥＡＰ検出用のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＮｏｖａＢｒｉｇｈｔ（商標） Ｐｈｏｓｐｈａ－Ｌｉｇｈｔ（商標） ＥＸＰ Ａｓｓａｙキットを使用して、製造業者のプロトコルに従って定量化した。ＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＴＸマイクロプレートリーダーで測定したマウス血清サンプルのＳＥＡＰの量を、任意単位（Ａ．Ｕ．）で報告する。エラーバーは、±Ｓ．Ｅ．Ｍである。図１２を参照すると、ＲＮＡは、結合力が弱いことによりｐＨ５．０製剤からより早く放出されたため、ｐＨ４．０と比較してｐＨ５．０製剤ではＳＥＡＰ量が高くなることが観察された。
【0179】
実施例１３． スパイク発現のウエスタンブロット分析
実施例１２に記載の方法を用いて、１２ウェル皿における約８０％コンフルエンシーのＢＨＫ細胞を、ポリエステルデンドロン及びデンドリマー分子で製剤化したスパイクレプリコンＲＮＡで処理した。培地を除去し、５μｇのナノ粒子で細胞を処理した。細胞を３７℃で一晩インキュベートし、掻き取りにより処理後の約１６時間後に収穫した。細胞ペレットを１３０００ｒｐｍで３分間遠心分離した後、（ＨＡＬＴ（商標）プロテアーゼ、ホスファターゼ阻害剤カクテル及びＰｉｅｒｃｅ（商標） Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｎｕｃｌｅａｓｅを補った）１００μＬのＲＩＰＡに再懸濁した後、２５μＬの６Ｘ ＳＤＳ Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液を添加した。サンプルを１０分間煮沸した後、遠心分離して微粒子を除去した。２０μＬの各サンプルを１０ウェルのＢｏｌｔ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で電気泳動により分離した。以前にスパイク発現の検証を行った非関連実験のサンプルを陽性対照として含めた。ｉＢｌｏｔ２乾式転写システムを使用して、タンパク質をゲルからＰＶＤＦ膜に転写した。転写後、ＴＢＳＴ＋１０％ミルク中に１：１０００の希釈度でウサギ抗スパイク抗体を添加する前に、ＴＢＳＴ＋１０％ミルクで膜を３０分間ブロックした。膜を室温で４５分間インキュベートした後、ＴＢＳＴで３回洗浄した。次に、膜をＴＢＳＴ＋１０％ミルク中に、１：２０００の希釈度で、ヒツジ抗ウサギＨＲＰ抗体とともに３０分間インキュベートした。膜をＴＢＳＴで３回洗浄した後、Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ（商標） ＰｒｏＳｉｇｎａｌ（商標） Ｄｕｒａ化学発光基質で現像した。ＧｅｎｅＳｙｓイメージングシステムを用いて化学発光反応を可視化した。図１３を参照すると、ＰＥデンドロン＿Ｇ２－Ａ１－リシノールを使用して製剤化したＲＮＡナノ粒子がＢＨＫ細胞によって取り込まれることが可能であり、遺伝子発現につながることが観察された。
実施例１２に記載の方法を用いて、１２ウェル皿における約８０％コンフルエンシーのＢＨＫ細胞を、ポリエステルデンドロン及びデンドリマー分子で製剤化したスパイクレプリコンＲＮＡで処理した。培地を除去し、５μｇのナノ粒子で細胞を処理した。細胞を３７℃で一晩インキュベートし、掻き取りにより処理後の約１６時間後に収穫した。細胞ペレットを１３０００ｒｐｍで３分間遠心分離した後、（ＨＡＬＴ（商標）プロテアーゼ、ホスファターゼ阻害剤カクテル及びＰｉｅｒｃｅ（商標） Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｎｕｃｌｅａｓｅを補った）１００μＬのＲＩＰＡに再懸濁した後、２５μＬの６Ｘ ＳＤＳ Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液を添加した。サンプルを１０分間煮沸した後、遠心分離して微粒子を除去した。２０μＬの各サンプルを１０ウェルのＢｏｌｔ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で電気泳動により分離した。以前にスパイク発現の検証を行った非関連実験のサンプルを陽性対照として含めた。ｉＢｌｏｔ２乾式転写システムを使用して、タンパク質をゲルからＰＶＤＦ膜に転写した。転写後、ＴＢＳＴ＋１０％ミルク中に１：１０００の希釈度でウサギ抗スパイク抗体を添加する前に、ＴＢＳＴ＋１０％ミルクで膜を３０分間ブロックした。膜を室温で４５分間インキュベートした後、ＴＢＳＴで３回洗浄した。次に、膜をＴＢＳＴ＋１０％ミルク中に、１：２０００の希釈度で、ヒツジ抗ウサギＨＲＰ抗体とともに３０分間インキュベートした。膜をＴＢＳＴで３回洗浄した後、Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ（商標） ＰｒｏＳｉｇｎａｌ（商標） Ｄｕｒａ化学発光基質で現像した。ＧｅｎｅＳｙｓイメージングシステムを用いて化学発光反応を可視化した。図１３を参照すると、ＰＥデンドロン＿Ｇ２－Ａ１－リシノールを使用して製剤化したＲＮＡナノ粒子がＢＨＫ細胞によって取り込まれることが可能であり、遺伝子発現につながることが観察された。
【0180】
実施例１４． ＣＯＶＩＤ－１９スパイク三量体直接血清ＥＬＩＳＡ
実施例１２に記載の方法を用いて、ＰＥデンドロン－Ｇ２－リシノールで製剤化した１０μｇのスパイクレプリコンＲＮＡで、脚の筋肉の両側ＩＭ注射により、マウス（ＢＡＬＢ／ｃ）にワクチン接種した（総体積１００μＬのＰＢＳ）。注射後２１日及び２８日でマウスを出血させ、凝固したサンプルを１００００ＲＣＦで１．５分間遠心分離することにより、血清を全血から単離した。該血清については、直接ＥＬＩＳＡ法により抗スパイク抗体力価をアッセイした。Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ ＥＬＩＳＡプレートを、４℃で、組換えスパイク三量体タンパク質を含有するｐＨ９．５の炭酸水素塩コーティング緩衝液で一晩コーティングした。ＰＢＳ＋１％ＢＳＡでウェルをブロックした後、１：１００の希釈度から始めて血清をウェルに添加し、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ中、連続１：２溶液で１：１２８００まで希釈した。サンプルをＲＴで１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで３回洗浄した後、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ中に１：３０００の希釈度でヤギ抗マウスＩｇＧ ＨＲＰを加え、１時間インキュベートした。プレートを再びＰＢＳＴで５回洗浄し、発色性たＨＲＰ基質３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を使用して現像した。Ｈ２Ｓ０４の添加により反応を停止し、４５０ｎｍと５７０ｎｍで吸光度を測定した。終点力価は、４５０での吸光度－５７０での吸光度の値≧０．０８となる最も高い希釈度として指定した。３週目に、ＰＥデンドロン＿Ｇ２－Ａ１－リシノール（図１４）を使用して製剤化した１０μｇのナノ粒子ワクチンで免疫した群における終点希釈力価は、５１２～１０２４の間であり、４週目に２０４８を超える平均値まで上昇し続けた。これは、全ての時間点で力価が基準線１００に残存した、免疫しなかった血清陰性群とは対照的である。
実施例１２に記載の方法を用いて、ＰＥデンドロン－Ｇ２－リシノールで製剤化した１０μｇのスパイクレプリコンＲＮＡで、脚の筋肉の両側ＩＭ注射により、マウス（ＢＡＬＢ／ｃ）にワクチン接種した（総体積１００μＬのＰＢＳ）。注射後２１日及び２８日でマウスを出血させ、凝固したサンプルを１００００ＲＣＦで１．５分間遠心分離することにより、血清を全血から単離した。該血清については、直接ＥＬＩＳＡ法により抗スパイク抗体力価をアッセイした。Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ ＥＬＩＳＡプレートを、４℃で、組換えスパイク三量体タンパク質を含有するｐＨ９．５の炭酸水素塩コーティング緩衝液で一晩コーティングした。ＰＢＳ＋１％ＢＳＡでウェルをブロックした後、１：１００の希釈度から始めて血清をウェルに添加し、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ中、連続１：２溶液で１：１２８００まで希釈した。サンプルをＲＴで１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで３回洗浄した後、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ中に１：３０００の希釈度でヤギ抗マウスＩｇＧ ＨＲＰを加え、１時間インキュベートした。プレートを再びＰＢＳＴで５回洗浄し、発色性たＨＲＰ基質３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を使用して現像した。Ｈ２Ｓ０４の添加により反応を停止し、４５０ｎｍと５７０ｎｍで吸光度を測定した。終点力価は、４５０での吸光度－５７０での吸光度の値≧０．０８となる最も高い希釈度として指定した。３週目に、ＰＥデンドロン＿Ｇ２－Ａ１－リシノール（図１４）を使用して製剤化した１０μｇのナノ粒子ワクチンで免疫した群における終点希釈力価は、５１２～１０２４の間であり、４週目に２０４８を超える平均値まで上昇し続けた。これは、全ての時間点で力価が基準線１００に残存した、免疫しなかった血清陰性群とは対照的である。
【0181】
実施例１５． 心臓及び脾臓組織へのＲＮＡ送達
実験群当たり６匹のＢＡＬＢ／ｃマウスに、ルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードするレプリコンＲＮＡの提示されたナノ粒子製剤を静脈注射により投与した。ＤｌｉｎＭＣ３ＤＭＡ ＬＮＰ対照製剤の場合、３１．４μｇのＲＮＡを注射し、ＰＥデンドロンＧ２－５Ａ２－５リシノール製剤の場合、７．２μｇのＲＮＡを注射した。注射後の６、１６及び４２時間に２匹のマウスを屠殺し、心臓と脾臓を取り出し、全ての時間点が揃うまで液体窒素中に保存した。単離した心臓及び脾臓におけるルシフェラーゼ遺伝子の発現を定量するために、各臓器全体を、１ｍｌのＰＢＳ中にＶＷＲ（登録商標）Ｍｉｎｉ Ｂｅａｄ Ｍｉｌｌ Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒを用いて３０秒間均質化し、未加工ホモジネートを４℃で１６０００ ＲＣＦで１０分間遠心分離した。遠心分離後、１５０μＬの各上清（透明化したホモジネート）サンプルを白色壁の９６ウェルアッセイ用プレートに入れ、Ｐｉｅｒｃｅ（商標） Ｆｉｒｅｆｌｙ Ｌｕｃ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ Ｇｌｏｗ Ａｓｓａｙ試薬１５０μＬを加えた。各ウェルからの相対発光量（ＲＬＵ）を、ＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＴＸマイクロプレートリーダーで測定した。バックグラウンド信号値は、ＲＮＡ注射を受けていない同一の遺伝子型及び週齢の対照マウスの臓器について測定したＲＬＵとして定義した。画像化データは、静脈内注射したナノ粒子について心臓と脾臓における高いルシフェラーゼ発現を示す（図１５）。
実験群当たり６匹のＢＡＬＢ／ｃマウスに、ルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードするレプリコンＲＮＡの提示されたナノ粒子製剤を静脈注射により投与した。ＤｌｉｎＭＣ３ＤＭＡ ＬＮＰ対照製剤の場合、３１．４μｇのＲＮＡを注射し、ＰＥデンドロンＧ２－５Ａ２－５リシノール製剤の場合、７．２μｇのＲＮＡを注射した。注射後の６、１６及び４２時間に２匹のマウスを屠殺し、心臓と脾臓を取り出し、全ての時間点が揃うまで液体窒素中に保存した。単離した心臓及び脾臓におけるルシフェラーゼ遺伝子の発現を定量するために、各臓器全体を、１ｍｌのＰＢＳ中にＶＷＲ（登録商標）Ｍｉｎｉ Ｂｅａｄ Ｍｉｌｌ Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒを用いて３０秒間均質化し、未加工ホモジネートを４℃で１６０００ ＲＣＦで１０分間遠心分離した。遠心分離後、１５０μＬの各上清（透明化したホモジネート）サンプルを白色壁の９６ウェルアッセイ用プレートに入れ、Ｐｉｅｒｃｅ（商標） Ｆｉｒｅｆｌｙ Ｌｕｃ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ Ｇｌｏｗ Ａｓｓａｙ試薬１５０μＬを加えた。各ウェルからの相対発光量（ＲＬＵ）を、ＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＴＸマイクロプレートリーダーで測定した。バックグラウンド信号値は、ＲＮＡ注射を受けていない同一の遺伝子型及び週齢の対照マウスの臓器について測定したＲＬＵとして定義した。画像化データは、静脈内注射したナノ粒子について心臓と脾臓における高いルシフェラーゼ発現を示す（図１５）。
【0182】
実施例１６． 式［Ｉ］ｂの核酸担体を含有するナノ粒子組成物
樹状直鎖ブロック共重合体は、通常、樹状セグメントで末端官能化された直鎖であるハイブリッドである。いくつかのグループは、優れた収率で得られ、線状ポリマー（Ｐ）とともに２つのＭＰＡ樹状部分（ＰＥ）を含有するハイブリッド構造の送達のための容易な合成アプローチについて報告している。これらのＰＥＧに基づくハイブリッドは、ＣｕＡＡＣクリック化学を介して成功裏に構築されたものである。これらの材料については、コア中に単一の相補的クリック基を含むデンドロンへの収束性結合反応に、ＰＥＧ末端基含有する一級アジド中間体を使用した。これらのハイブリッドの代表的な構造を以下に示す。
Ａは、アミンリンカーであり、Ｂは、疎水性単位であり、ＰＥＧ２００は、２つのポリエステルデンドロンを連結するリンカーである。
樹状直鎖ブロック共重合体は、通常、樹状セグメントで末端官能化された直鎖であるハイブリッドである。いくつかのグループは、優れた収率で得られ、線状ポリマー（Ｐ）とともに２つのＭＰＡ樹状部分（ＰＥ）を含有するハイブリッド構造の送達のための容易な合成アプローチについて報告している。これらのＰＥＧに基づくハイブリッドは、ＣｕＡＡＣクリック化学を介して成功裏に構築されたものである。これらの材料については、コア中に単一の相補的クリック基を含むデンドロンへの収束性結合反応に、ＰＥＧ末端基含有する一級アジド中間体を使用した。これらのハイブリッドの代表的な構造を以下に示す。
【化48】
【0183】
ＰＥデンドロンＧ２ Ａ１リシ）２ ＰＥＧ ２００の合成例は、以下のとおりである。
【化49】
【0184】
【化50】
【0185】
【化51】
【0186】
【化52】
【0187】
化合物６：出発原料であるＰＥデンドロンＧ２アセチレン－ＯＨ（３００ｍｇ、０．６２ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＣＭ（６ｍＬ）に溶解し、ピリジン（０．９ｍｌ、４．９６ｍｍｏｌ）を加えた後、乾燥ＤＣＭ（１５ｍＬ）に溶解したｐ－ニトロフェニルクロロホルメート（２．１ｇ、１０ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を０℃～２３℃で１６時間撹拌した。翌日ＴＬＣは、生成物の形成を示す。反応混合物を１．３３ＭのＮａＨＳＯ４で希釈し、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を塩水で洗浄し、Ｒｏｔａｖａｐ中で蒸発させた。次に、ＤＣＭ／ＥｔＯＡｃを使用したフラッシュクロマトグラフィーにより、粗製物を精製した。この化合物は４５％ＥｔＯＡｃ（Ｒｆ＝０．９、１：９ＥｔＯＡｃ／ＤＣＭ）で溶出し始め、所望の生成物を淡黄色オイル（５５３ｍｇ、７０％）として与えた。
【0188】
化合物７：乾燥ＤＣＭ（６ｍＬ）に溶解した化合物６（４３８ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）の溶液を乾燥ＤＣＭ（６ｍＬ）に溶解した過剰のモノ－Ｂｏｃ－ＤＡＰＭＡ（０．４５ＭＬ、１．６４ｍｍｏｌ）に加えた。乾燥ＤＣＭ（１ｍＬ）中のＤＭＡＰ（１００ｍｇ、０．８２ｍｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（０．２９ｍｌ、１．６４ｍｍｏｌ）の溶液を加え、アルゴン雰囲気下で、反応混合物を２３℃で１６時間撹拌した。ＴＬＣにより反応終了を確認した。粗生成物を減圧下でＲｏｔａｖａｐで濃縮し、４０分間にわたる１００％ＣＨ２Ｃｌ２（移動相ａ）から７５：２２：３のＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨａｑ（体積、移動相ｂ）への勾配溶出によりシリカカラム上でのフラッシュクロマトグラフィーで精製した。所望の生成物を４５％移動相ｂ（Ｒｆ＝０．４、１：１移動相ａ／移動相ｂ）で溶出し、所望の生成物を淡黄色オイル（４０４ｍｇ、６６％）として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（３０１ＭＨｚ、クロロホルム－ｄ）δ ｐｐｍ １．１０－１．２７（ｍ，９Ｈ），１．３３－１．４３（ｍ，３６Ｈ），１．５２－１．６５（ｍ，１５Ｈ）２．０８－２．１６（ｍ，１２Ｈ），２．２６－２．３７（ｍ，１６Ｈ），２．５１－２．５４（ｍ，１Ｈ），３．０２－３．２０（ｍ，１５Ｈ），３．３６－３．４２（ｍ，３Ｈ），４．０１－４．２６（ｍ，１０Ｈ），４．６６－４．７０（ｍ，２Ｈ）５．２４－５．２７（ｍ，３Ｈ），５．２８－５．３９（ｍ，３Ｈ）５．８８－５．９７（ｍ，３Ｈ）。
１Ｈ ＮＭＲ（３０１ＭＨｚ、クロロホルム－ｄ）δ ｐｐｍ １．１０－１．２７（ｍ，９Ｈ），１．３３－１．４３（ｍ，３６Ｈ），１．５２－１．６５（ｍ，１５Ｈ）２．０８－２．１６（ｍ，１２Ｈ），２．２６－２．３７（ｍ，１６Ｈ），２．５１－２．５４（ｍ，１Ｈ），３．０２－３．２０（ｍ，１５Ｈ），３．３６－３．４２（ｍ，３Ｈ），４．０１－４．２６（ｍ，１０Ｈ），４．６６－４．７０（ｍ，２Ｈ）５．２４－５．２７（ｍ，３Ｈ），５．２８－５．３９（ｍ，３Ｈ）５．８８－５．９７（ｍ，３Ｈ）。
【0189】
化合物８：ＰＥＧ－２００－アジド（ＭＷ：２００、１１．４ｍｇ、５７μｍｏｌ）を５０ｍｌのＲＢＦに入れ、次いでＴＨＦ（０．６ｍＬ）に溶解した化合物７（ＭＷ：１４９０、１７０ｍｇ、１１４μｍｏｌ）を、ＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ（３ｍｇ、１１．４μｍｏｌ、１０モル％、ＭＷ２４９．６９）及びアスコルビン酸ナトリウム（４．５ｍｇ、２２．８μｍｏｌ、２０モル％、ＭＷ１９８．１１）及び脱気したＴＨＦ：Ｈ２Ｏ（２ｍＬ、１：１）と共に加えた。反応混合物を２３℃で１６時間撹拌した。翌日、ＴＬＣにより反応終了を確認した。反応混合物を、４０分間にわたる１００％ＣＨ２Ｃｌ２（移動相ａ）から７５：２２：３のＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨａｑ（体積、移動相ｂ）への勾配溶出によりシリカカラム上でのフラッシュクロマトグラフィーで精製した。所望の生成物を７６％移動相ｂ（Ｒｆ＝０．６５、７５：２２：３のＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨａｑ）で溶出し、所望の生成物を黄色オイル（７１ｍｇ、２０％）として得た。ＭＳ（ＥＳＩ） Ｃ１４６Ｈ２６８Ｎ３０Ｏ４６に対する計算値 ［Ｍ＋４Ｈ］４＋ ｍ／ｚ ７９５．５、実測値７９４．９、［Ｍ＋３Ｈ］３＋ ｍ／ｚ １０５９．９６、実測値１０６０．２。
【0190】
化合物９：７０ｍｇの化合物８（０．０２２ｍｍｏｌ）を３ｍｌのＭｅＯＨに溶解した後、この化合物を２０当量のＡｃＣｌ（０．０３ｍｌ、０．４４ｍｍｏｌ）で処理し、反応物を２３℃で５時間撹拌した後、乾固するまで蒸発させ、２ｍｌのＤＭＦに溶解し、０．０６ｍｌのＥｔ３Ｎ（０．４４ｍｍｏｌ）を加えた後、２ｍｌのＤＭＦに溶解した１０４ｍｇのリシノール－ＮＨＳ（本明細書に完全に記載されているように参照によって組み込まれる公開された手順：Ｔａｌｕｋｄｅｒら、国際公開第２０２０／１３２１９６号パンフレットに従って合成した）を加えた。反応混合物を２３℃で２４時間撹拌した後、４０分間にわたる１００％ＣＨ２Ｃｌ２（移動相ａ）から７５：２２：３のＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨａｑ（体積、移動相ｂ）への勾配溶出によりシリカカラム上でのフラッシュクロマトグラフィーで精製した。所望の生成物を５５％移動相ｂ（Ｒｆ＝０．８５、７０：２４：６のＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨａｑ）で溶出し、所望の生成物を黄色オイル（６０ｍｇ、４３％）として得た。１Ｈ ＮＭＲ（３０１ＭＨｚ、クロロホルム－ｄ）δ ｐｐｍ ０．７２－１．００（ｍ，２８Ｈ）１．０３－１．２２（ｍ，２６Ｈ），１．２２－１．４６（ｍ，１４８Ｈ），１．５１－１．５９（ｍ，１３Ｈ），１．９１－２．０７（ｍ，２０Ｈ），２．０８－２．２５（ｍ，６０Ｈ），２．３０－２．４６（ｍ，３３Ｈ），３．１１－３．３４（ｍ，３３Ｈ），３．４５（ｓ，３Ｈ），３．５２－３．７２（ｍ，１７Ｈ），３．８７（ｂｒ ｓ，４Ｈ），３．９８－４．３２（ｍ，２５Ｈ），４．５４（ｂｒ ｓ，３Ｈ），５．２２（ｓ，３Ｈ），５．３３－５．５８（ｍ，１６Ｈ），６．１２－６．３６（ｍ，７Ｈ），６．８６（ｂｒ ｓ，７Ｈ），７．８３（ｓ，２ Ｈ）。
【0191】
ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ Ｂｅｎｃｈｔｏｐ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ、バンクーバー、ブリティッシュコロンビア州、カナダ）を用いて、式Ｉｂの核酸担体（例えば、［ＰＥデンドロン＿Ｇ２－Ａ１－リシノール］２ ＰＥＧ ２００）：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋを１：０．５：２．４：０．０３５のモル比で含有するナノ粒子を製剤化した。ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅフリー及びエンドトキシンフリー蒸留水と滅菌したクエン酸緩衝液とでＲＮＡを最終的な所望のｐＨに希釈した。Ｂｅｎｃｈｔｏｐでの製剤化のために、総流量を、水相と有機相の３：１の比率で１分当たり１２ｍＬに維持した。エンドトキシン除去のために１．０ＭのＮａＯＨで２４時間洗浄し、蒸気オートクレーブで滅菌するか、又は２５０℃で２４時間加熱することにより脱発熱原化したガラス製品を使用して、２０，０００分子量のカットオフ透析を使用して、滅菌したエンドトキシンフリーＰＢＳに対してナノ粒子を透析した。透析したナノ粒子を、０．２ミクロンポリ（エーテルスルホン）フィルターで滅菌濾過し、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ＮａｎｏＺＳマシン（Ｍａｌｖｅｒｎ）で特性解析した。サイズ分布は、比較的単分散のサイズを示す多分散性指数の低い単一のピークを特徴としていた（図１６）。
【0192】
ＰＥデンドロンＧ２ Ａ１リシ）２ ＰＥＧ ２００の製剤をテストするために、分泌された胚性アルカリホスファターゼＳＥＡＰレポーターシステムを使用した。生体内テストのために、マウスに２．５μｇのＳＥＡＰレプリコンＲＮＡの量でナノ粒子を注射し、１日、３日、５日、７日後にマウスから血清を採取した。量を、ＳＥＡＰ検出用のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＮｏｖａＢｒｉｇｈｔ（商標） Ｐｈｏｓｐｈａ－Ｌｉｇｈｔ（商標） ＥＸＰ Ａｓｓａｙキットを使用して、製造業者のプロトコルに従って定量化した。ＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＴＸマイクロプレートリーダーで測定したマウス血清サンプルのＳＥＡＰの量を、任意単位（Ａ．Ｕ．）で報告する。エラーバーは、±Ｓ．Ｅ．Ｍである。図１７を参照すると、二量体ＰＥデンドロンＧ２ Ａ１リシ）２ ＰＥＧ ２００で、ＳＥＡＰの量は、単量体、ＰＥデンドロン＿Ｇ２－Ａ１－リシノールよりも高かったことが観察された。
【0193】
実施例１７． ナノ粒子組成物の追跡
生体外及び生体内での送達材料の追跡を容易にするために、修飾デンドリマーは、１３Ｃ又は２Ｈなどの炭素（Ｃ）又は水素（Ｈ）の安定同位体を含有するコアを有することができる。レプリコンＲＮＡなどの核酸とともに修飾デンドリマーをナノ粒子に製剤化する場合、ナノ粒子は、質量分析又は核磁気共鳴画像法などの公知の技術により、投与後に生体外及び生体内で追跡することができる。これらの安定同位体は組織において顕著に見出される豊富な１２Ｃ及び１Ｈ同位体とは異なるため、安定性同位体を含有することにより、送達分子の同定が容易となる。追跡は、投与後のナノ粒子の生体分布、物質クリアランス及び分子安定性の同定と、関連する問題とに有用である可能性がある。
生体外及び生体内での送達材料の追跡を容易にするために、修飾デンドリマーは、１３Ｃ又は２Ｈなどの炭素（Ｃ）又は水素（Ｈ）の安定同位体を含有するコアを有することができる。レプリコンＲＮＡなどの核酸とともに修飾デンドリマーをナノ粒子に製剤化する場合、ナノ粒子は、質量分析又は核磁気共鳴画像法などの公知の技術により、投与後に生体外及び生体内で追跡することができる。これらの安定同位体は組織において顕著に見出される豊富な１２Ｃ及び１Ｈ同位体とは異なるため、安定性同位体を含有することにより、送達分子の同定が容易となる。追跡は、投与後のナノ粒子の生体分布、物質クリアランス及び分子安定性の同定と、関連する問題とに有用である可能性がある。
【0194】
参考文献
本願全体にわたって引用される参考文献は、本明細書及びそれらの参考文献において明らかなあらゆる目的のために、それぞれの参考文献が完全に記載されているように、組み込まれる。説明のために、これらの参考文献の特定の１つは、本明細書において特定の位置に引用される。特定の位置での参考文献の引用は、参考文献の教示が組み込まれている態様を示す。しかしながら、特定の位置での参考文献の引用は、引用された参考文献の教示の全てがあらゆる目的のために組み込まれる態様を限定するものではない。
本願全体にわたって引用される参考文献は、本明細書及びそれらの参考文献において明らかなあらゆる目的のために、それぞれの参考文献が完全に記載されているように、組み込まれる。説明のために、これらの参考文献の特定の１つは、本明細書において特定の位置に引用される。特定の位置での参考文献の引用は、参考文献の教示が組み込まれている態様を示す。しかしながら、特定の位置での参考文献の引用は、引用された参考文献の教示の全てがあらゆる目的のために組み込まれる態様を限定するものではない。
【0195】
（１）（ａ）Ｊｏｎｅｓ，Ｃ．Ｈ．、Ｃｈｅｎ，Ｃ．－Ｋ，Ｒａｖｉｋｒｉｓｈｎａｎ，Ａ．、Ｒａｎｅ，Ｓ．、及びＰｆｅｉｆｅｒ，Ｂ．Ａ．（２０１３） Ｏｖｅｒｃｏｍｉｎｇ ｎｏｎｖｉｒａｌ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｂａｒｒｉｅｒｓ：ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ． Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ １０，４０８２－４０９８．（ｂ）Ｇｏｍｅｓ，Ｃ．Ｐ．、Ｌｏｐｅｓ，Ｃ．Ｄ．Ｆ．、Ｍｏｒｅｎｏ，Ｐ．Ｍ．Ｄ．、Ｖａｒｅｌａ－Ｍｏｒｅｉｒａ，Ａ．、Ａｌｏｎｓｏ，Ｍ．Ｊ．、及びＰｅｇｏ，Ａ．Ｐ．（２０１４） Ｔｒａｎｓｌａｔｉｎｇ ｃｈｉｔｏｓａｎ ｔｏ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ－ｂａｓｅｄ ｄｒｕｇｓ． ＭＲＳ Ｂｕｌｌ．３９，６０－７０．（ｃ）Ｍｅｎｄｅｓ，Ｌ．Ｐ．、Ｐａｎ，Ｊ．、Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ，Ｖ．Ｐ．（２０１７） Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｓ ａｓ Ｎａｎｏｃａｒｒｉｅｒｓ ｆｏｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ． Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２２（９）、１４０１．
（２）Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ｍ．、及びＨｕａｎｇ，Ｌ．（２００１） Ｎｏｎｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｎｅｗ ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ：ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｂａｒｒｉｅｒｓ ｉｎ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ． Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １２、８６１－８７０．
（３）Ｄｕｆｅｓ，Ｃ．、Ｕｃｈｅｇｂｕ，Ｌ、及びＳｃｈａｔｚｌｅｉｎ，Ａ．（２００５） Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｓ ｉｎ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ． Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ． ５７、２１７７－２２０２．
（４）Ｃｌａｒｅ，Ｅ．Ｔ．、Ａｎｊａ，Ｅ．、及びＭａｒｋ，Ａ．Ｋ．（２００３） Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ａｎｄ ｐｒｏｂｌｅｍｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ． Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ． ４、３４６－３５８．
（５）Ｍｉｎｔｚｅｒ，Ｍ．Ａ．、及びＳｉｍａｎｅｋ，Ｅ．Ｅ．（２００９） Ｎｏｎｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ． Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ． １０９、２５９－３０２．
（６）Ｍｉｎｔｚｅｒ，Ｍ．Ａ．、及びＧｒｉｎｓｔａｆｆ，Ｍ．Ｗ．（２０１０） Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｓ：ａ ｔｕｔｏｒｉａｌ． Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ． ４０、１７３－１９０．
（７）（ａ） Ｒａｖｉｎａ，Ｍ．、ｄｅ Ｉａ Ｆｕｅｎｔｅ，Ｍ．、Ｃｏｒｒｅａ，Ｊ．、Ｓｏｕｓａ－Ｈｅｒｖｅｓ，Ａ．、Ｐｉｎｔｏ，Ｊ．、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ－Ｍｅｇｉａ，Ｅ．、Ｒｉｇｕｅｒａ，Ｒ．、Ｓａｎｃｈｅｚ，Ａ．、及びＡｌｏｎｓｏ，Ｍ．Ｊ．（２０１０） Ｃｏｒｅ－ｓｈｅｌｌ ｄｅｎｄｒｉｐｌｅｘｅｓ ｗｉｔｈ ｓｔｅｒｉｃａｌｌｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｙ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ． Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ４３、６９５３－６９６１．
（ｂ）Ｎｏｕｒｉ，Ａ．、Ｃａｓｔｒｏ，Ｒ．、Ｋａｉｒｙｓ，Ｖ．、Ｓａｎｔｏｓ，Ｊ．Ｌ．、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ，Ｊ．、Ｌｉ，Ｙ．、及びＴｏｍａｓ，Ｈ．（２０１２） Ｉｎｓｉｇｈｔ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ Ｎ，Ｎ－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ （ＤＭＡＥＭＡ） ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｏｎｔｏ ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ）：ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｓｔｕｄｉｅｓ． Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｍａｔｅｒ．Ｍｅｄ． ２３、２９６７－２９８０．
（ｃ）Ｐａｎｄｉｔａ，Ｄ．、Ｓａｎｔｏｓ，Ｊ．Ｌ．、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ，Ｊ．、Ｐｅｇｏ，Ａ．Ｐ．、Ｇｒａｎｊａ，Ｐ．Ｌ．、及びＴｏｍａｓ，Ｈ．（２０１１） Ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｉｎｔｏ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：ａ ｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈ ｕｓｉｎｇ ＲＧＤ ｎａｎｏｃｌｕｓｔｅｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｐｏｌｙ－（ａｍｉｄｏａｍｉｎｅ） ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｓ． Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ １２、４７２－４８１．
（ｄ）Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ，Ｊ．、Ｊａｒｄｉｍ，Ｍ．Ｇ．、Ｆｉｇｕｅｉｒａ，Ｊ．、Ｇｏｕｖｅｉａ，Ｍ．、Ｔｏｍａｓ，Ｈ．、及びＲｉｓｓａｎｅｎ，Ｋ．（２０１１） Ｐｏｌｙ（ａｌｋｙｌｉｄｅｎａｍｉｎｅｓ） ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｓ ａｓ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｏｗ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｒｕｔｈｅｎｉｕｍ ｂａｓｅｄ ｍｅｔａｌｌｏｄｅｎｄｒｉｍｅｒｓ． Ｎｅｗ Ｊ．Ｃｈｅｍ． ３５、１９３８－１９４３．
（ｅ）Ｓａｎｔｏｓ，Ｊ．Ｌ．、Ｏｌｉｖｅｉｒａ，Ｈ．、Ｐａｎｄｉｔａ，Ｄ．、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ，Ｊ．、Ｐｅｇｏ，Ａ．Ｐ．、Ｇｒａｎｊａ，Ｐ．Ｌ．、及びＴｏｍａｓ，Ｈ．（２０１０） Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙ（ａｍｉｄｏａｍｉｎｅ） ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｓ ｗｉｔｈ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｃｈａｉｎｓ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｉｎ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ． Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １４４、５５－６４．
（ｆ）Ｓａｎｔｏｓ，Ｊ．Ｌ．、Ｏｒａｍａｓ，Ｅ．、Ｐｅｇｏ，Ａ．Ｐ．、Ｇｒａｎｊａ，Ｐ．Ｌ．、及びＴｏｍａｓ，Ｈ．（２００９） Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ＰＡＭＡＭ ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｓ ａｓ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｖｅｃｔｏｒｓ． Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １３４、１４１－１４８．
（ｇ）Ｓａｎｔｏｓ，Ｊ．Ｌ．、Ｐａｎｄｉｔａ，Ｄ．、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ，Ｊ．、Ｐｅｇｏ，Ａ．Ｐ．、Ｇｒａｎｊａ，Ｐ．Ｌ．、Ｂａｌｉａｎ，Ｇ．、及びＴｏｍａｓ，Ｈ．（２０１０） Ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｕｓｉｎｇ ＰＡＭＡＭ ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｓ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ． Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ７、７６３－７７４．
（８）（ａ）Ｄｕｎｃａｎ，Ｒ．、及びＩｚｚｏ，Ｌ．（２００５） Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｔｏｘｉｃｉｔｙ． Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ． ５７、２２１５－２２３７．
（９）（ａ）Ｗｅｌｓｈ，Ｄ．Ｊ．、Ｊｏｎｅｓ，Ｓ．Ｐ．、及びＳｍｉｔｈ，Ｄ．Ｋ．（２００９） ”Ｏｎ－ｏｆｆ” ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ：ｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｄｅｎｄｒｏｎｓ ｆｏｒ ｔｅｍｐｏｒａｒｙ ｈｉｇｈａｆｆｉｎｉｔｙ ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ． Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ． ４８、４０４７－４０５１．
（ｂ）Ｂａｒｎａｒｄ，Ａ．、Ｐｏｓｏｃｃｏ，Ｐ．、Ｐｒｉｃｌ，Ｓ．、Ｃａｌｄｅｒｏｎ，Ｍ．、Ｈａａｇ，Ｒ．、Ｈｗａｎｇ，Ｍ．Ｅ．、Ｓｈｕｍ，Ｖ．Ｗ．、Ｐａｃｋ，Ｄ．Ｗ．、及びＳｍｉｔｈ，Ｄ．Ｋ．（２０１１） Ｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｓｅｌｆ ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ ｄｅｎｄｒｏｎｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ：ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｂａｒｒｉｅｒｓ ｔｏ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｕｐｔａｋｅ． Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． １３３、２０２８８－２０３００．
（１０）Ｍ．Ａ．Ｃａｒｎａｈａｎ、Ｍ．Ｗ．Ｇｒｉｎｓｔａｆｆ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． １２３（２００１） ２９０５． Ｍ．Ａ．Ｃａｒｎａｈａｎ、Ｍ．Ｗ．Ｇｒｉｎｓｔａｆｆ、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ３４（２００１） ７６４８． Ｍ．Ａ．Ｃａｒｎａｈａｎ、Ｍ．Ｗ．Ｇｒｉｎｓｔａｆｆ、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ３９（２００６） ６０９．
（１１）Ｏ．Ｂｏｕｓｓｉｆ、Ｆ．Ｌｅｚｏｕａｌｃ’ｈ、Ｍ．Ａ．Ｚａｎｔａ、Ｍ．Ｄ．Ｍｅｒｇｎｙ、Ｄ．Ｓｃｈｅｒｍａｎ、Ｂ．Ｄｅｍｅｎｅｉｘ，Ｊ．Ｂｅｈｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ９２（１９９５） ７２９７．
（１２）ＬＵＮＤＢＥＲＧ，Ａ．、ＫＵＬＫＡＲＮＩ，Ｓ．、ＫＬＥＩＮ，Ｌ、ＰＡＤＭＡＮＡＢＨＡＮ，Ｈ．Ｋ．、ＡＲＡＴＹＮ，Ｙ．Ｓ． ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＧＥＮＥ ＥＤＩＴＩＮＧ、国際公開第２０１８／１５４３８７号パンフレット．
（１３）Ｇｅａｌｌ ＡＪ、Ｖｅｒｍａ Ａ、Ｏｔｔｅｎ ＧＲ、Ｓｈａｗ ＣＡ、Ｈｅｋｅｌｅ Ａ、Ｂａｎｅｒｊｅｅ Ｋ、Ｃｕ Ｙ、Ｂｅａｒｄ ＣＷ、Ｂｒｉｔｏ ＬＡ、Ｋｒｕｃｋｅｒ Ｔ、Ｏ’Ｈａｇａｎ ＤＴ、Ｓｉｎｇｈ Ｍ、Ｍａｓｏｎ ＰＷ、Ｖａｌｉａｎｔｅ ＮＭ、Ｄｏｒｍｉｔｚｅｒ ＰＲ、Ｂａｒｎｅｔｔ ＳＷ、Ｒａｐｐｕｏｌｉ Ｒ、Ｕｌｍｅｒ ＪＢ、Ｍａｎｄｌ ＣＷ． Ｎｏｎｖｉｒａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｓｅｌｆ－ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ ＲＮＡ ｖａｃｃｉｎｅｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ２０１２年９月４日；１０９（３６）：１４６０４－９． ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１２０９３６７１０９． ２０１２年８月２０日電子公開． ＰＭＩＤ：２２９０８２９４；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ３４３７８６３．
（１４）Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ． （２００２）． ＷＨＯ ｍａｎｕａｌ ｏｎ ａｎｉｍａｌ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ２００２．５ Ｒｅｖ．１． ２００２．
（１５）Ｐｏｕｌａｍｉ Ｔａｌｕｋｄｅｒ、Ｊａｓｄａｖｅ Ｓ． Ｃｈａｈａｌ、Ｊｕｓｔｉｎｅ Ｓ． ＭｃＰａｒｔｌａｎ、Ｏｍａｒ Ｋｈａｎ、Ｋａｒｌ Ｒｕｐｉｎｇ． Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｍａｋｉｎｇ ａｎｄ Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｓａｍｅ． ＰＣＴ／ＵＳ１９／６７４０２．
（２）Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ｍ．、及びＨｕａｎｇ，Ｌ．（２００１） Ｎｏｎｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｎｅｗ ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ：ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｂａｒｒｉｅｒｓ ｉｎ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ． Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １２、８６１－８７０．
（３）Ｄｕｆｅｓ，Ｃ．、Ｕｃｈｅｇｂｕ，Ｌ、及びＳｃｈａｔｚｌｅｉｎ，Ａ．（２００５） Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｓ ｉｎ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ． Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ． ５７、２１７７－２２０２．
（４）Ｃｌａｒｅ，Ｅ．Ｔ．、Ａｎｊａ，Ｅ．、及びＭａｒｋ，Ａ．Ｋ．（２００３） Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ａｎｄ ｐｒｏｂｌｅｍｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ． Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ． ４、３４６－３５８．
（５）Ｍｉｎｔｚｅｒ，Ｍ．Ａ．、及びＳｉｍａｎｅｋ，Ｅ．Ｅ．（２００９） Ｎｏｎｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ． Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ． １０９、２５９－３０２．
（６）Ｍｉｎｔｚｅｒ，Ｍ．Ａ．、及びＧｒｉｎｓｔａｆｆ，Ｍ．Ｗ．（２０１０） Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｓ：ａ ｔｕｔｏｒｉａｌ． Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ． ４０、１７３－１９０．
（７）（ａ） Ｒａｖｉｎａ，Ｍ．、ｄｅ Ｉａ Ｆｕｅｎｔｅ，Ｍ．、Ｃｏｒｒｅａ，Ｊ．、Ｓｏｕｓａ－Ｈｅｒｖｅｓ，Ａ．、Ｐｉｎｔｏ，Ｊ．、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ－Ｍｅｇｉａ，Ｅ．、Ｒｉｇｕｅｒａ，Ｒ．、Ｓａｎｃｈｅｚ，Ａ．、及びＡｌｏｎｓｏ，Ｍ．Ｊ．（２０１０） Ｃｏｒｅ－ｓｈｅｌｌ ｄｅｎｄｒｉｐｌｅｘｅｓ ｗｉｔｈ ｓｔｅｒｉｃａｌｌｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｙ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ． Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ４３、６９５３－６９６１．
（ｂ）Ｎｏｕｒｉ，Ａ．、Ｃａｓｔｒｏ，Ｒ．、Ｋａｉｒｙｓ，Ｖ．、Ｓａｎｔｏｓ，Ｊ．Ｌ．、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ，Ｊ．、Ｌｉ，Ｙ．、及びＴｏｍａｓ，Ｈ．（２０１２） Ｉｎｓｉｇｈｔ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ Ｎ，Ｎ－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ （ＤＭＡＥＭＡ） ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｏｎｔｏ ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ）：ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｓｔｕｄｉｅｓ． Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｍａｔｅｒ．Ｍｅｄ． ２３、２９６７－２９８０．
（ｃ）Ｐａｎｄｉｔａ，Ｄ．、Ｓａｎｔｏｓ，Ｊ．Ｌ．、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ，Ｊ．、Ｐｅｇｏ，Ａ．Ｐ．、Ｇｒａｎｊａ，Ｐ．Ｌ．、及びＴｏｍａｓ，Ｈ．（２０１１） Ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｉｎｔｏ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：ａ ｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈ ｕｓｉｎｇ ＲＧＤ ｎａｎｏｃｌｕｓｔｅｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｐｏｌｙ－（ａｍｉｄｏａｍｉｎｅ） ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｓ． Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ １２、４７２－４８１．
（ｄ）Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ，Ｊ．、Ｊａｒｄｉｍ，Ｍ．Ｇ．、Ｆｉｇｕｅｉｒａ，Ｊ．、Ｇｏｕｖｅｉａ，Ｍ．、Ｔｏｍａｓ，Ｈ．、及びＲｉｓｓａｎｅｎ，Ｋ．（２０１１） Ｐｏｌｙ（ａｌｋｙｌｉｄｅｎａｍｉｎｅｓ） ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｓ ａｓ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｏｗ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｒｕｔｈｅｎｉｕｍ ｂａｓｅｄ ｍｅｔａｌｌｏｄｅｎｄｒｉｍｅｒｓ． Ｎｅｗ Ｊ．Ｃｈｅｍ． ３５、１９３８－１９４３．
（ｅ）Ｓａｎｔｏｓ，Ｊ．Ｌ．、Ｏｌｉｖｅｉｒａ，Ｈ．、Ｐａｎｄｉｔａ，Ｄ．、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ，Ｊ．、Ｐｅｇｏ，Ａ．Ｐ．、Ｇｒａｎｊａ，Ｐ．Ｌ．、及びＴｏｍａｓ，Ｈ．（２０１０） Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙ（ａｍｉｄｏａｍｉｎｅ） ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｓ ｗｉｔｈ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｃｈａｉｎｓ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｉｎ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ． Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １４４、５５－６４．
（ｆ）Ｓａｎｔｏｓ，Ｊ．Ｌ．、Ｏｒａｍａｓ，Ｅ．、Ｐｅｇｏ，Ａ．Ｐ．、Ｇｒａｎｊａ，Ｐ．Ｌ．、及びＴｏｍａｓ，Ｈ．（２００９） Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ＰＡＭＡＭ ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｓ ａｓ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｖｅｃｔｏｒｓ． Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １３４、１４１－１４８．
（ｇ）Ｓａｎｔｏｓ，Ｊ．Ｌ．、Ｐａｎｄｉｔａ，Ｄ．、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ，Ｊ．、Ｐｅｇｏ，Ａ．Ｐ．、Ｇｒａｎｊａ，Ｐ．Ｌ．、Ｂａｌｉａｎ，Ｇ．、及びＴｏｍａｓ，Ｈ．（２０１０） Ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｕｓｉｎｇ ＰＡＭＡＭ ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｓ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ． Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ７、７６３－７７４．
（８）（ａ）Ｄｕｎｃａｎ，Ｒ．、及びＩｚｚｏ，Ｌ．（２００５） Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｔｏｘｉｃｉｔｙ． Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ． ５７、２２１５－２２３７．
（９）（ａ）Ｗｅｌｓｈ，Ｄ．Ｊ．、Ｊｏｎｅｓ，Ｓ．Ｐ．、及びＳｍｉｔｈ，Ｄ．Ｋ．（２００９） ”Ｏｎ－ｏｆｆ” ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ：ｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｄｅｎｄｒｏｎｓ ｆｏｒ ｔｅｍｐｏｒａｒｙ ｈｉｇｈａｆｆｉｎｉｔｙ ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ． Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ． ４８、４０４７－４０５１．
（ｂ）Ｂａｒｎａｒｄ，Ａ．、Ｐｏｓｏｃｃｏ，Ｐ．、Ｐｒｉｃｌ，Ｓ．、Ｃａｌｄｅｒｏｎ，Ｍ．、Ｈａａｇ，Ｒ．、Ｈｗａｎｇ，Ｍ．Ｅ．、Ｓｈｕｍ，Ｖ．Ｗ．、Ｐａｃｋ，Ｄ．Ｗ．、及びＳｍｉｔｈ，Ｄ．Ｋ．（２０１１） Ｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｓｅｌｆ ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ ｄｅｎｄｒｏｎｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ：ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｂａｒｒｉｅｒｓ ｔｏ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｕｐｔａｋｅ． Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． １３３、２０２８８－２０３００．
（１０）Ｍ．Ａ．Ｃａｒｎａｈａｎ、Ｍ．Ｗ．Ｇｒｉｎｓｔａｆｆ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． １２３（２００１） ２９０５． Ｍ．Ａ．Ｃａｒｎａｈａｎ、Ｍ．Ｗ．Ｇｒｉｎｓｔａｆｆ、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ３４（２００１） ７６４８． Ｍ．Ａ．Ｃａｒｎａｈａｎ、Ｍ．Ｗ．Ｇｒｉｎｓｔａｆｆ、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ３９（２００６） ６０９．
（１１）Ｏ．Ｂｏｕｓｓｉｆ、Ｆ．Ｌｅｚｏｕａｌｃ’ｈ、Ｍ．Ａ．Ｚａｎｔａ、Ｍ．Ｄ．Ｍｅｒｇｎｙ、Ｄ．Ｓｃｈｅｒｍａｎ、Ｂ．Ｄｅｍｅｎｅｉｘ，Ｊ．Ｂｅｈｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ９２（１９９５） ７２９７．
（１２）ＬＵＮＤＢＥＲＧ，Ａ．、ＫＵＬＫＡＲＮＩ，Ｓ．、ＫＬＥＩＮ，Ｌ、ＰＡＤＭＡＮＡＢＨＡＮ，Ｈ．Ｋ．、ＡＲＡＴＹＮ，Ｙ．Ｓ． ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＧＥＮＥ ＥＤＩＴＩＮＧ、国際公開第２０１８／１５４３８７号パンフレット．
（１３）Ｇｅａｌｌ ＡＪ、Ｖｅｒｍａ Ａ、Ｏｔｔｅｎ ＧＲ、Ｓｈａｗ ＣＡ、Ｈｅｋｅｌｅ Ａ、Ｂａｎｅｒｊｅｅ Ｋ、Ｃｕ Ｙ、Ｂｅａｒｄ ＣＷ、Ｂｒｉｔｏ ＬＡ、Ｋｒｕｃｋｅｒ Ｔ、Ｏ’Ｈａｇａｎ ＤＴ、Ｓｉｎｇｈ Ｍ、Ｍａｓｏｎ ＰＷ、Ｖａｌｉａｎｔｅ ＮＭ、Ｄｏｒｍｉｔｚｅｒ ＰＲ、Ｂａｒｎｅｔｔ ＳＷ、Ｒａｐｐｕｏｌｉ Ｒ、Ｕｌｍｅｒ ＪＢ、Ｍａｎｄｌ ＣＷ． Ｎｏｎｖｉｒａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｓｅｌｆ－ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ ＲＮＡ ｖａｃｃｉｎｅｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ２０１２年９月４日；１０９（３６）：１４６０４－９． ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１２０９３６７１０９． ２０１２年８月２０日電子公開． ＰＭＩＤ：２２９０８２９４；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ３４３７８６３．
（１４）Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ． （２００２）． ＷＨＯ ｍａｎｕａｌ ｏｎ ａｎｉｍａｌ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ２００２．５ Ｒｅｖ．１． ２００２．
（１５）Ｐｏｕｌａｍｉ Ｔａｌｕｋｄｅｒ、Ｊａｓｄａｖｅ Ｓ． Ｃｈａｈａｌ、Ｊｕｓｔｉｎｅ Ｓ． ＭｃＰａｒｔｌａｎ、Ｏｍａｒ Ｋｈａｎ、Ｋａｒｌ Ｒｕｐｉｎｇ． Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｍａｋｉｎｇ ａｎｄ Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｓａｍｅ． ＰＣＴ／ＵＳ１９／６７４０２．
【0196】
したがって、本発明は、開示される特定の実施形態に限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲、上記明細書によって定義され、及び／又は添付の図面に示される本発明の趣旨及び範囲内にあるすべての変更形態を含むことを意図したものであるということが理解される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E】
【図7A】
【図7B】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【国際調査報告】