特表 2023-521519 キメラ抗原受容体を発現し低減した炎症性サイトカインシグナル伝達を有する遺伝子改変された免疫細胞

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-05-24

(54)【発明の名称】キメラ抗原受容体を発現し低減した炎症性サイトカインシグナル伝達を有する遺伝子改変された免疫細胞

(51)【国際特許分類】

   C07K 19/00 20060101AFI20230517BHJP

   C07K 14/725 20060101ALI20230517BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20230517BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230517BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230517BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20230517BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20230517BHJP

   A61K 31/7076 20060101ALI20230517BHJP

   A61K 31/675 20060101ALI20230517BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20230517BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20230517BHJP

   C12N 15/62 20060101ALN20230517BHJP

   C07H 19/19 20060101ALN20230517BHJP

【ＦＩ】

C07K19/00 ZNA

C07K14/725

C07K16/28

C12N5/10

A61P35/00

A61P35/02

A61K35/17

A61K31/7076

A61K31/675

C12N15/12

C12N15/13

C12N15/62 Z

C07H19/19

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023504152

(86)(22)【出願日】2021-04-06

(85)【翻訳文提出日】2022-11-25

(86)【国際出願番号】 US2021025906

(87)【国際公開番号】W WO2021207150

(87)【国際公開日】2021-10-14

(31)【優先権主張番号】63/005,684

(32)【優先日】2020-04-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522391822

【氏名又は名称】セレディット エルエルシー

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡 亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田 直

(74)【代理人】

【識別番号】100202751

【弁理士】

【氏名又は名称】岩堀 明代

(74)【代理人】

【識別番号】100208580

【弁理士】

【氏名又は名称】三好 玲奈

(74)【代理人】

【識別番号】100191086

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 香元

(72)【発明者】

【氏名】フー，ビリアング

【テーマコード（参考）】

4B065

4C057

4C086

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA93Y

4B065AA94X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

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4B065CA44

4C057CC03

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4C057LL34

4C057LL43

4C086AA01

4C086AA02

4C086DA35

4C086EA18

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4C086MA07

4C086NA05

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4C086ZB27

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB37

4C087BB65

4C087MA02

4C087NA05

4C087NA14

4C087ZB26

4C087ZB27

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA50

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

とりわけ、ＩＬ－２ＲβＩＢ－２Ｋβ細胞質シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体を共発現する改変された免疫細胞を含む、免疫細胞の集団。また、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）の低減された産生を有する、遺伝子操作された免疫細胞も本明細書に提供される。そのような遺伝子操作された免疫細胞は、破壊された内因性ＩＦＮγ遺伝子、破壊された内因性ＩＦＮγ受容体（ＩＦＮγＲ）遺伝子、又はそれらの両方を有し得る。代替的に、免疫細胞は、ＩＦＮγアンタゴニストを発現し得る。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、
（ａ）細胞外抗原結合ドメインと、
（ｂ）４－１ＢＢ共刺激ドメインと、
（ｃ）ＩＬ－２Ｒβ細胞質シグナル伝達ドメインと、
（ｄ）ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインと、を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。

【請求項2】

前記４－１ＢＢ共刺激シグナル伝達ドメインが、ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ（配列番号１）に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＣＡＲ。

【請求項3】

前記ＩＬ－２Ｒβ細胞質シグナル伝達ドメインが、ＮＣＲＮＴＧＰＷＬＫＫＶＬＫＣＮＴＰＤＰＳＫＦＦＳＱＬＳＳＥＨＧＧＤＶＱＫＷＬＳＳＰＦＰＳＳＳＦＳＰＧＧＬＡＰＥＩＳＰＬＥＶＬＥＲＤＫＶＴＱＬＬＰＬＮＴＤＡＹＬＳＬＱＥＬＱＧＱＤＰＴＨＬＶ（配列番号２）に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載のＣＡＲ。

【請求項4】

前記ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインが、ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＫＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号３）に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のＣＡＲ。

【請求項5】

前記細胞外抗原結合ドメインに対してＣ末端であり、前記４－１ＢＢ共刺激ドメインに対してＮ末端である、膜貫通ドメインを更に含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のＣＡＲ。

【請求項6】

前記膜貫通ドメインが、Ｔ細胞受容体、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＣＤ２７１、ＴＮＦＲＳＦ１９、及びキラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）のアルファ、ベータ、若しくはゼータ鎖、又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される細胞表面受容体に由来する、請求項５に記載のＣＡＲ。

【請求項7】

前記細胞外抗原結合ドメインの前記Ｃ末端、及び前記膜貫通ドメインの前記Ｎ末端に連結されたヒンジドメインを更に含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のＣＡＲ。

【請求項8】

前記ヒンジドメインが、ＣＤ２８、ＣＤ８、又は任意選択で、ＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４であるＩｇＧのものである、請求項７に記載のＣＡＲ。

【請求項9】

前記ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインのＣ末端に位置するＳＴＡＴ３結合モチーフを更に含む、請求項１～８のいずれか一項に記載のＣＡＲ。

【請求項10】

前記ＳＴＡＴ３結合モチーフが、ＹＸ_１Ｘ_２Ｑに記載のアミノ配列を含み、式中、Ｘ_１及びＸ_２が、各々独立して、アミノ酸である、請求項９に記載のＣＡＲ。

【請求項11】

前記ＳＴＡＴ３結合モチーフが、ＹＲＨＱ（配列番号４）に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載のＣＡＲ。

【請求項12】

前記ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン及び前記ＳＴＡＴ３結合モチーフを含むＣ末端断片を含み、前記Ｃ末端断片が、ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＫＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＹＲＨＱＡＬＰＰＲ（配列番号５）に記載のアミノ酸配列を含む、請求項９～１１のいずれか一項に記載のＣＡＲ。

【請求項13】

前記細胞外抗原結合ドメインが、任意選択で、５Ｔ４、ＣＤ２、ＣＤ５、ＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳ１、クローディン１８．２、ＢＣＭＡ、ＢＡＦＦ－Ｒ、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、デスモグレイン（Ｄｓｇ３）、ＨＥＲ－２、ＦＡＰ、ＦＳＨＲ、ＮＫＧ２Ｄ、ＧＤ２、ＥＧＦＲＶＩＩＩ、メソテリン、ＲＯＲ１、ＭＡＧＥ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＧＰＣ３、Ｌｅｗｉｓ Ｙ、及びＶＥＧＦＲＩＩからなる群から選択される腫瘍関連抗原に結合する、請求項１～１２のいずれか一項に記載のＣＡＲ。

【請求項14】

前記細胞外抗原結合ドメインが、一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）である、請求項１～１３のいずれか一項に記載のＣＡＲ。

【請求項15】

前記ｓｃＦｖが、ＣＤ１９に結合し、配列番号６、３９、４０、又は４１に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載のＣＡＲ。

【請求項16】

前記ｓｃＦｖが、ＢＣＭＡに結合し、配列番号７に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載のＣＡＲ。

【請求項17】

前記ＣＡＲのＮ末端に位置するシグナルペプチドを更に含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載のＣＡＲ。

【請求項18】

請求項１～１７のいずれか一項に記載のＣＡＲを発現する第１の複数の免疫細胞を含む、免疫細胞の集団。

【請求項19】

インターロイキン－６（ＩＬ－６）又はＩＬ－６受容体（ＩＬ－６Ｒ）に特異的な抗体を発現する第２の複数の免疫細胞を更に含む、請求項１８に記載の免疫細胞の集団。

【請求項20】

前記抗体が、参照抗体と同じ重鎖相補性決定ドメイン（ＣＤＲ）及び同じ軽鎖ＣＤＲを含み、前記参照抗体が、（ａ）配列番号１４、１６、１８、２０、２２、又は２４に記載の重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）アミノ酸配列、及び配列番号１５、１７、１９、２１、２３、又は２５に記載の軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）アミノ酸配列を含む、請求項１９に記載の免疫細胞の集団。

【請求項21】

前記ＩＬ－６又はＩＬ－６Ｒに特異的な抗体が、前記参照抗体と同じＶ_Ｈ及び同じＶ_Ｌを含む、請求項２０に記載の免疫細胞の集団。

【請求項22】

前記ＩＬ－６又はＩＬ－６Ｒに特異的な抗体が、ｓｃＦｖである、請求項１９～２１のいずれか一項に記載の免疫細胞の集団。

【請求項23】

前記ｓｃＦｖが、配列番号８、９、２６、又は２７に記載のアミノ酸配列を含む、請求項２２に記載の免疫細胞の集団。

【請求項24】

ＩＬ－１アンタゴニストを発現する第３の複数の免疫細胞を更に含む、請求項１８～２３のいずれか一項に記載の免疫細胞の集団。

【請求項25】

前記ＩＬ－１アンタゴニストが、ＩＬ－１ＲＡである、請求項２４に記載の免疫細胞の集団。

【請求項26】

前記第１の複数の免疫細胞、前記第２の複数の免疫細胞、及び前記第３の複数の免疫細胞のうちの少なくとも２つが、共通のメンバーを含む、請求項１９～２５のいずれか一項に記載の免疫細胞の集団。

【請求項27】

中の前記免疫細胞の少なくとも１０％が、前記ＣＡＲ、前記ＩＬ－６又はＩＬ－６Ｒに特異的な抗体、及び前記ＩＬ－１アンタゴニストを発現する、請求項２６に記載の免疫細胞の集団。

【請求項28】

前記細胞の約５０～７０％が、前記ＣＡＲ、前記ＩＬ－６又はＩＬ－６Ｒに特異的な抗体、及び前記ＩＬ－１アンタゴニストを発現する、請求項２７に記載の免疫細胞の集団。

【請求項29】

前記免疫細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、腫瘍浸潤リンパ球、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞、骨髄由来抑制細胞、間葉系幹細胞、それらの前駆体、又はそれらの組み合わせである、請求項１８～２８のいずれか一項に記載の免疫細胞の集団。

【請求項30】

前記免疫細胞が、Ｔ細胞であり、前記Ｔ細胞の少なくとも一部が、内因性Ｔ細胞受容体、ＣＤ５２、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）、ベータ－２マイクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、及び顆粒球マクロファージ－コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）のうちの１つ以上を発現しない、請求項１８～２９のいずれか一項に記載の免疫細胞の集団。

【請求項31】

前記Ｔ細胞の前記一部が、ＩＦＮ－γを発現しない、請求項３０に記載の免疫細胞の集団。

【請求項32】

改変された免疫細胞の集団を産生する方法であって、前記方法が、
（ａ）免疫細胞の集団を提供することと、
（ｂ）前記免疫細胞に、請求項１～１７のいずれか一項に記載のＣＡＲをコードする第１の核酸を導入することと、を含む、方法。

【請求項33】

前記免疫細胞に、インターロイキン－６（ＩＬ－６）又はＩＬ－６受容体（ＩＬ－６Ｒ）に特異的な抗体をコードする第２の核酸を導入することを更に含み、前記抗体が、請求項１９～２３のいずれか一項に記載されている、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

前記第１の核酸及び前記第２の核酸が、同じベクター中に位置する、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

前記第１の核酸及び前記第２の核酸が、異なるベクター中に位置する、請求項３３に記載の方法。

【請求項36】

前記免疫細胞に、任意選択で、ＩＬ－１ＲＡであるＩＬ－１アンタゴニストをコードする第３の核酸を導入することを更に含む、請求項３２～３５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項37】

前記第１の核酸及び前記第３の核酸が、同じベクター中に位置する、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

前記第２の核酸及び前記第３の核酸が、同じベクター中に位置する、請求項３６に記載の方法。

【請求項39】

前記第１の核酸、前記第２の核酸、及び前記第３の核酸が、異なるベクター中に位置する、請求項３６に記載の方法。

【請求項40】

前記免疫細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、腫瘍浸潤リンパ球、樹状細胞、マクログラフ（ｍａｃｒｏｇｒａｐｈ）、Ｂ細胞、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞、骨髄由来抑制細胞、間葉系幹細胞、それらの前駆体、又はそれらの組み合わせであり、任意選択で、前記免疫細胞が、ヒト免疫細胞である、請求項３２～３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

疾患を治療する細胞療法に基づく方法であって、それを必要とする対象に、請求項１８～３１のいずれか一項に記載の免疫細胞の集団を投与することを含む、方法。

【請求項42】

前記対象が、ヒト患者である、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

前記疾患が、がん、感染性疾患、又は免疫障害である、請求項４１又は４２に記載の方法。

【請求項44】

前記疾患が、がんであり、前記細胞療法の前に、前記ヒト患者が前記がんに対する療法を受けて腫瘍負荷を低減させる、請求項４２に記載の方法。

【請求項45】

前記療法が、化学療法、免疫療法、放射線療法、又は手術である、請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

前記細胞療法の前に、前記対象が、前記細胞療法のために前記対象を調整するために、リンパ枯渇治療を受けた、請求項４１～４５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項47】

前記リンパ枯渇治療が、前記対象に、フルダラビン及びシクロホスファミドのうちの１つ以上を投与することを含む、請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

前記ＣＡＲが、ＣＤ１９に結合し、前記対象が、リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ芽球性白血病、マントル細胞リンパ腫、大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、又は非ホジキンリンパ腫を有するヒト患者である、請求項４１～４７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項49】

前記ＣＡＲが、ＢＣＭＡに結合し、前記対象が、多発性骨髄腫、再発性多発性骨髄腫、又は難治性多発性骨髄腫を有するヒト患者である、請求項４１～４７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項50】

第１の複数の遺伝子操作された免疫細胞を含む免疫細胞の集団であって、前記遺伝子操作された免疫細胞が、
（ａ）破壊された内因性インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）遺伝子又はＩＦＮγ受容体（ＩＦＮγＲ）遺伝子を含み、かつ／又は
（ｂ）ＩＦＮγアンタゴニストを発現する、免疫細胞の集団。

【請求項51】

前記遺伝子操作された免疫細胞が、前記破壊された内因性ＩＦＮγ又はＩＦＮγＲ遺伝子を含む、請求項５０に記載の免疫細胞の集団。

【請求項52】

前記破壊された内因性ＩＦＮγ又はＩＦＮγＲ遺伝子が、遺伝子編集によって産生され、任意選択で、前記遺伝子編集が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システムによって媒介される、請求項５１に記載の免疫細胞の集団。

【請求項53】

前記遺伝子操作された細胞が、前記ＩＦＮγアンタゴニストを発現する、請求項５０～５２のいずれか一項に記載の免疫細胞の集団。

【請求項54】

前記遺伝子操作された細胞が、前記ＩＦＮγアンタゴニストを分泌する、請求項５３に記載の免疫細胞の集団。

【請求項55】

前記ＩＦＮγアンタゴニストが、抗ＩＦＮγ抗体、分泌型ＩＦＮγ受容体、及び抗ＩＦＮγＲ抗体からなる群から選択され、任意選択で、前記抗ＩＦＮγ抗体及び／又は前記抗ＩＦＮγＲ抗体が、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、請求項５０～５４のいずれか一項に記載の免疫細胞の集団。

【請求項56】

前記ＩＦＮγアンタゴニストが、抗ＩＦＮγ ｓｃＦｖである、請求項５５に記載の免疫細胞の集団。

【請求項57】

前記抗ＩＦＮγ ｓｃＦｖが、（ａ）配列番号５３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号５２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、（ｂ）配列番号５６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号５５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、又は（ｃ）配列番号５９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号５８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項５６に記載の免疫細胞の集団。

【請求項58】

前記抗ＩＦＮγ ｓｃＦｖが、配列番号５４、５７、又は６０のアミノ酸配列を含む、請求項５７に記載の免疫細胞の集団。

【請求項59】

前記ＩＦＮγアンタゴニストが、分泌型ＩＦＮγＲである、請求項５５に記載の免疫細胞の集団。

【請求項60】

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を更に含む、請求項５０～５９のいずれか一項に記載の免疫細胞の集団。

【請求項61】

前記ＣＡＲが、
（ａ）細胞外抗原結合ドメインと、
（ｂ）共刺激ドメインと、
（ｃ）細胞質シグナル伝達ドメインと、任意選択で、
（ｄ）膜貫通ドメインとを含む、請求項６０に記載の免疫細胞の集団。

【請求項62】

前記細胞外抗原結合ドメインが、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む、請求項６１に記載の免疫細胞の集団。

【請求項63】

前記細胞外抗原結合ドメインが、任意選択で、５Ｔ４、ＣＤ２、ＣＤ５、ＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳ１、クローディン１８．２、ＢＣＭＡ、ＢＡＦＦ－Ｒ、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、デスモグレイン（Ｄｓｇ３）、ＨＥＲ－２、ＦＡＰ、ＦＳＨＲ、ＮＫＧ２Ｄ、ＧＤ２、ＥＧＦＲＶＩＩＩ、メソテリン、ＲＯＲ１、ＭＡＧＥ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＧＰＣ３、Ｌｅｗｉｓ Ｙ、及びＶＥＧＦＲＩＩからなる群から選択される腫瘍関連抗原に結合する、請求項６１又は６２に記載の免疫細胞の集団。

【請求項64】

前記腫瘍関連抗原が、ＣＤ１９であり、前記細胞外抗原結合ドメインが、ＣＤ１９に結合するｓｃＦｖを含む、請求項６３に記載の免疫細胞の集団。

【請求項65】

前記ＣＤ１９に結合するｓｃＦｖが、配列番号６、３９、４０、又は４１のアミノ酸配列を含む、請求項６４に記載の免疫細胞の集団。

【請求項66】

前記腫瘍関連抗原が、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）であり、前記細胞外抗原結合ドメインが、ＢＣＭＡに結合するｓｃＦｖを含む、請求項６３に記載の免疫細胞の集団。

【請求項67】

前記ＢＣＭＡに結合するｓｃＦｖが、配列番号７のアミノ酸を含む、請求項６６に記載の免疫細胞の集団。

【請求項68】

前記共刺激ドメインが、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ７０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＤＡＰ１０、及びＤＡＰ１２、又はそれらの任意の組み合わせに由来する共刺激ドメインである、請求項６１～６７のいずれか一項に記載の免疫細胞の集団。

【請求項69】

前記細胞質シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）シグナル伝達ドメイン、インターロイキン２受容体ベータサブユニット（ＩＬ－２Ｒβ）細胞質シグナル伝達ドメイン、又はそれらの組み合わせである、請求項６１～６８のいずれか一項に記載の免疫細胞の集団。

【請求項70】

前記膜貫通ドメインが、Ｔ細胞受容体、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＣＤ２７１、ＴＮＦＲＳＦ１９、及びキラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）のアルファ、ベータ、若しくはゼータ鎖、又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される細胞表面受容体からのものである、請求項６１～６９のいずれか一項に記載の免疫細胞の集団。

【請求項71】

前記ＣＡＲが、（ａ）～（ｄ）の機能ドメインを接続するためのヒンジ若しくはスペーサー、又はその両方の組み合わせを更に含む、請求項６１～７０のいずれか一項に記載の免疫細胞の集団。

【請求項72】

前記ＣＡＲが、前記細胞外抗原結合ドメインのＣ末端、及び前記膜貫通ドメインのＮ末端に連結されたヒンジドメインを含む、請求項７１に記載の免疫細胞の集団。

【請求項73】

前記ヒンジドメインが、ＣＤ２８、ＣＤ８、又は任意選択で、ＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４であるＩｇＧのものである、請求項７１又は７２に記載の免疫細胞の集団。

【請求項74】

前記ＣＡＲが、前記細胞質シグナル伝達ドメインの前記Ｃ末端に位置する、ＳＴＡＴ３結合モチーフを更に含む、請求項６１～７３のいずれか一項に記載の免疫細胞の集団。

【請求項75】

前記ＳＴＡＴ３結合モチーフが、ＹＸ_１Ｘ_２Ｑに記載のアミノ酸配列を含み、式中、Ｘ_１及びＸ_２が、各々独立して、アミノ酸であり、任意選択で、前記ＳＴＡＴ３結合モチーフが、ＹＲＨＱ（配列番号４）に記載のアミノ酸配列を含む、請求項７４に記載の免疫細胞の集団。

【請求項76】

前記ＩＦＮγアンタゴニストが、前記Ｎ末端に位置するシグナルペプチドを更に含み、任意選択で、前記シグナルペプチドが、アルブミン、ＣＤ８、成長ホルモン、ＩＬ－２、抗体軽鎖、及びＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼに由来するシグナルペプチドから選択される、請求項５０～７５のいずれか一項に記載の免疫細胞の集団。

【請求項77】

前記免疫細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、腫瘍浸潤リンパ球、樹状細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞、骨髄由来抑制細胞、間葉系幹細胞若しくはそれらの前駆体、又はそれらの組み合わせを含み、任意選択で、前記免疫細胞がヒト免疫細胞である、請求項５０～７６のいずれか一項に記載の免疫細胞の集団。

【請求項78】

インターロイキン－６（ＩＬ－６）又はＩＬ－６受容体（ＩＬ－６Ｒ）に特異的な抗体を発現する第２の複数の免疫細胞を更に含む、請求項５０～７７のいずれか一項に記載の免疫細胞の集団。

【請求項79】

前記ＩＬ－６又はＩＬ－６Ｒに特異的な抗体が、ｓｃＦｖである、請求項７８に記載の免疫細胞の集団。

【請求項80】

ＩＬ－１アンタゴニストを発現する第３の複数の免疫細胞を更に含む、請求項５０～７９のいずれか一項に記載の免疫細胞の集団。

【請求項81】

前記ＩＬ－１アンタゴニストが、ＩＬ－１ＲＡである、請求項８０に記載の免疫細胞の集団。

【請求項82】

請求項５０～８１のいずれか一項に記載の免疫細胞の集団と、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物。

【請求項83】

対象における望ましくない細胞を低減又は排除するための方法であって、前記方法が、それを必要とする対象に、治療有効量の、請求項５０～８１のいずれか一項に記載の免疫細胞の集団又は請求項８２に記載の薬学的組成物を投与することを含む、方法。

【請求項84】

前記対象が、ヒトがん患者であり、前記遺伝子操作された免疫細胞が、腫瘍関連抗原に特異的である前記ＣＡＲを発現し、任意選択で、前記腫瘍関連抗原が、５Ｔ４、ＣＤ２、ＣＤ５、ＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳ１、クローディン１８．２、ＢＣＭＡ、ＢＡＦＦ－Ｒ、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、デスモグレイン（Ｄｓｇ３）、ＨＥＲ－２、ＦＡＰ、ＦＳＨＲ、ＮＫＧ２Ｄ、ＧＤ２、ＥＧＦＲＶＩＩＩ、メソテリン、ＲＯＲ１、ＭＡＧＥ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＧＰＣ３、Ｌｅｗｉｓ Ｙ、及びＶＥＧＦＲＩＩからなる群から選択される、請求項８３に記載の方法。

【請求項85】

前記がんが、固形腫瘍がんである、請求項８４に記載の方法。

【請求項86】

前記がんが、乳がん、肺がん、膵臓がん、肝臓がん、神経膠芽腫（ＧＢＭ）、前立腺がん、卵巣がん、中皮腫、結腸がん、及び胃がんからなる群から選択される、請求項８５に記載の方法。

【請求項87】

前記がんが、血液がんである、請求項８４に記載の方法。

【請求項88】

前記血液がんが、白血病、リンパ腫、又は多発性骨髄腫であり、任意選択で、前記白血病が、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄白血病（ＡＭＬ）、又は慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）であり、任意選択で、前記リンパ腫が、マントル細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫又はホジキンリンパ腫である、請求項８７に記載の方法。

【請求項89】

前記ＣＡＲが、ＣＤ１９に結合し、前記対象が、リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ芽球性白血病、マントル細胞リンパ腫、大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、又は非ホジキンリンパ腫を有するヒト患者である、請求項８８に記載の方法。

【請求項90】

前記ＣＡＲが、ＢＣＭＡに結合し、前記対象が、多発性骨髄腫、再発性多発性骨髄腫、又は難治性多発性骨髄腫を有するヒト患者である、請求項８８に記載の方法。

【請求項91】

前記細胞療法の前に、前記対象が、細胞療法のために前記対象を調整するためのリンパ枯渇治療を受けた、請求項８３～９０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項92】

前記リンパ枯渇治療が、前記対象に、フルダラビン及びシクロホスファミドのうちの１つ以上を投与することを含む、請求項９１に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年４月６日に出願された米国仮出願第６３／００５，６８４号の米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき利益を主張し、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含有する。当該ＡＳＣＩＩコピーは、２０２１年４月５日に作成され、名称が１１２１２６－００２５－７０００３ＷＯ００＿ＳＥＱ．ｔｘｔであり、サイズが５９，２５１バイトである。

【背景技術】

【0003】

養子細胞移入療法は、自己免疫細胞又は同種免疫細胞のエクスビボ増殖及びその後の患者への注入を伴う免疫療法の一種である。免疫細胞は、悪性細胞を特異的に標的とするようにエクスビボで改変されてもよい。改変には、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するために、Ｔ細胞の操作が含まれる。ＣＡＲ Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）療法などの養子細胞移入療法の有望性は、しばしば毒性（例えば、サイトカイン関連毒性）によって制限される。例えば、養子細胞移入免疫療法は、サイトカインレベルの非生理学的上昇（サイトカイン放出症候群）を引き起こし得、これは、レシピエントの死亡につながり得る（例えば、Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １８（４）：８４３－８５１，２０１０を参照されたい）。更に、改変された免疫細胞は、患者ではうまく拡大しない場合がある。

【0004】

したがって、治療的有効性を維持又は増強しながら、改変された免疫細胞の増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を改善し、ＣＡＲ－Ｔ療法に関連する毒性を低減するためのアプローチを開発することが大変興味深い。

【発明の概要】

【0005】

本開示は、共刺激シグナル伝達及び細胞質シグナル伝達ドメインと組み合わせたＩＬ－２Ｒβ細胞質シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の開発に少なくとも部分的に基づいている。そのようなＣＡＲ構築物を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞、及び任意選択で内因性インターフェロンγ遺伝子のノックアウトを有するＣＡＲ－Ｔ細胞は、腫瘍標的細胞による活性化、及び／又はサイトカイン毒性の低下時に、より効果的なＴ細胞の増殖を示すことが予想され、それによって、ＣＡＲ－Ｔ治療有効性、安全性、又はそれらの組み合わせを向上させる。

【0006】

したがって、本開示の一態様は、（ａ）細胞外抗原結合ドメインと、（ｂ）４－１ＢＢ共刺激ドメインなどの共刺激ドメインと、（ｃ）ＩＬ－２Ｒβ細胞質シグナル伝達ドメインと、（ｄ）ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインと、を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を特徴とする。

【0007】

いくつかの実施形態では、４－１ＢＢ共刺激シグナル伝達ドメインは、ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ（配列番号１）に記載のアミノ酸配列を含む。代替的又は追加的に、ＩＬ－２Ｒβ細胞質シグナル伝達ドメインは、ＮＣＲＮＴＧＰＷＬＫＫＶＬＫＣＮＴＰＤＰＳＫＦＦＳＱＬＳＳＥＨＧＧＤＶＱＫＷＬＳＳＰＦＰＳＳＳＦＳＰＧＧＬＡＰＥＩＳＰＬＥＶＬＥＲＤＫＶＴＱＬＬＰＬＮＴＤＡＹＬＳＬＱＥＬＱＧＱＤＰＴＨＬＶ（配列番号２）に記載のアミノ酸配列を含み得る。代替的又は追加的に、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは、ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＫＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号３）に記載のアミノ酸配列を含む。

【0008】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＣＡＲのうちのいずれかは、膜貫通ドメインを更に含んでもよく、膜貫通ドメインは、細胞外抗原結合ドメインに対してＣ末端であり、４－１ＢＢ共刺激ドメインに対してＮ末端である。そのような膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＣＤ２７１、ＴＮＦＲＳＦ１９、及びキラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）のアルファ、ベータ又はゼータ鎖、又はそれらの任意の組み合わせであり得る、細胞表面受容体に由来し得る。

【0009】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＣＡＲは、ヒンジドメインを更に含んでもよく、ヒンジドメインは、細胞外抗原結合ドメインのＣ末端、及び膜貫通ドメインのＮ末端に連結されてもよい。例示的なヒンジドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ８、又は任意選択で、ＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４であるＩｇＧのものであってもよい。

【0010】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＣＡＲは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインのＣ末端に位置することができるＳＴＡＴ３結合モチーフを更に含んでもよい。一例では、ＳＴＡＴ３結合モチーフは、ＹＸ_１Ｘ_２Ｑに記載のアミノ酸配列を含み、式中、Ｘ_１及びＸ_２は、各々独立してアミノ酸である。例えば、ＳＴＡＴ３結合モチーフは、ＹＲＨＱ（配列番号４）に記載のアミノ酸配列を含む。一例では、本明細書に開示されるＣＡＲは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン及びＳＴＡＴ３結合モチーフを含むＣ末端断片を含み得、Ｃ末端断片は、ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＫＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＹＲＨＱＡＬＰＰＲ（配列番号５）に記載のアミノ酸配列を含む。

【0011】

本明細書に開示されるＣＡＲにおける細胞外抗原結合ドメインは、腫瘍関連抗原に結合し得る。例としては、５Ｔ４、ＣＤ２、ＣＤ５、ＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳ１、クローディン１８．２、ＢＣＭＡ、ＢＡＦＦ－Ｒ、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、デスモグレイン（Ｄｓｇ３）、ＨＥＲ－２、ＦＡＰ、ＦＳＨＲ、ＮＫＧ２Ｄ、ＧＤ２、ＥＧＦＲＶＩＩＩ、メソテリン、ＲＯＲ１、ＭＡＧＥ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＧＰＣ３、Ｌｅｗｉｓ Ｙ、及びＶＥＧＦＲＩＩが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）である。いくつかの例では、ＣＡＲにおける細胞外抗原結合ドメインは、ＣＤ１９に結合するｓｃＦｖ（抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ）である。そのような抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖは、配列番号６のアミノ酸配列を含み得る。代替的に、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖは、配列番号３９のアミノ酸配列を含み得る。別の例では、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖは、配列番号４０のアミノ酸配列を含み得る。更に別の例では、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖは、配列番号４１のアミノ酸配列を含み得る。他の例では、ＣＡＲにおける細胞外抗原結合ドメインは、ＢＣＭＡに結合するｓｃＦｖ（抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ）である。一例では、抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖは、配列番号７に記載のアミノ酸配列を含み得る。

【0012】

本明細書に開示されるＣＡＲのうちのいずれかは、ＣＡＲのＮ末端に位置するシングルペプチドを更に含んでもよい。

【0013】

別の態様では、本明細書に開示されるＣＡＲのうちのいずれかを発現する第１の複数の免疫細胞を含む免疫細胞集団が本明細書に提供される。そのような免疫細胞集団は、インターロイキン－６（ＩＬ－６）又はＩＬ－６受容体（ＩＬ－６Ｒ）に特異的な抗体を発現する第２の複数の免疫細胞を更に含んでよい。いくつかの実施形態では、抗ＩＬ６又は抗ＩＬ６Ｒ抗体は、参照抗体と同じ重鎖相補性決定ドメイン（ＣＤＲ）及び同じ軽鎖ＣＤＲを含んでもよい。参照抗体は、以下のうちの１つであり得る：
（ａ）配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）と、配列番号１５に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）と、を含む、参照抗体、
（ｂ）配列番号１６に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）と、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）と、を含む、参照抗体、
（ｃ）配列番号１８に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と、を含む、参照抗体、
（ｄ）配列番号２０に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、配列番号２１に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と、を含む、参照抗体、
（ｅ）配列番号２２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と、を含む、参照抗体、及び
（ｆ）配列番号２４記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と、を含む、参照抗体。

【0014】

場合によっては、ＩＬ－６又はＩＬ－６Ｒに特異的な抗体は、参照抗体と同じＶ_Ｈ及び同じＶ_Ｌを含む。ＩＬ－６又はＩＬ－６Ｒに特異的な抗体のうちのいずれかは、ｓｃＦｖであり得る。一例では、ｓｃＦｖは、配列番号８のアミノ酸配列を含み得る。別の例では、ｓｃＦｖは、配列番号９のアミノ酸配列を含み得る。更に別の例では、ｓｃＦｖは、配列番号２６のアミノ酸配列を含み得る。更に別の例では、ｓｃＦｖは、配列番号２７のアミノ酸配列を含み得る。

【0015】

本明細書に開示される免疫細胞の集団は、ＩＬ－１アンタゴニストを発現する第３の複数の免疫細胞を更に含み得る。いくつかの例では、ＩＬ－１アンタゴニストは、ＩＬ－１ＲＡである。

【0016】

場合によっては、免疫細胞集団における第１の複数の免疫細胞、第２の複数の免疫細胞、及び第３の複数の免疫細胞のうちの少なくとも２つは、共通のメンバーを含む。例えば、中の免疫細胞の少なくとも１０％は、ＣＡＲ、ＩＬ－６又はＩＬ－６Ｒに特異的な抗体、及びＩＬ－１アンタゴニストを発現する。別の例では、細胞の約５０～７０％は、ＣＡＲ、ＩＬ－６又はＩＬ－６Ｒに特異的な抗体、及びＩＬ－１アンタゴニストを発現する。

【0017】

免疫細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、腫瘍浸潤リンパ球、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞、骨髄由来抑制細胞、間葉系幹細胞、それらの前駆体、又はそれらの組み合わせであってもよい。場合によっては、免疫細胞はＴ細胞である。いくつかの例では、Ｔ細胞の少なくとも一部（例えば、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％以上）は、内因性Ｔ細胞受容体、ＣＤ５２、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）、ベータ－２マイクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、及び顆粒球マクロファージ－コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）のうちの少なくとも１つ以上を発現しない。特定の一例では、Ｔ細胞の少なくとも一部（例えば、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％％以上）は、ＩＦＮ－γを発現しない。目的のタンパク質を発現しない細胞は、タンパク質の発現が検出されないか、又は発現のバックグラウンドレベルのみが従来の方法（例えば、ＥＬＩＳＡ又はＦＡＣＳ）によって検出され得ることを意味する。

【0018】

更に、改変された免疫細胞の集団を産生するための方法が本明細書に提供され、本方法は、（ａ）免疫細胞集団（例えば、本明細書に開示されるもの）を提供することと、（ｂ）免疫細胞に、本明細書に開示されるものなどのＣＡＲをコードする第１の核酸を導入することと、を含む。そのような方法は、（ｃ）免疫細胞に、インターロイキン－６（ＩＬ－６）又はＩＬ－６受容体（ＩＬ－６Ｒ）に特異的な抗体をコードする第２の核酸、例えば、本明細書に開示されるものを導入することを更に含み得る。場合によっては、第１の核酸及び第２の核酸は、同じベクター中に位置する。他の例では、第１の核酸及び第２の核酸は、異なるベクター中に位置する。

【0019】

いくつかの実施形態では、この方法は、免疫細胞に、ＩＬ－１アンタゴニスト、例えば、ＩＬ－１ＲＡをコードする第３の核酸を導入することを更に含み得る。場合によっては、第１の核酸及び第３の核酸は、同じベクター中に位置する。他の例では、第２の核酸及び第３の核酸は、同じベクター中に位置する。代替的に、第１の核酸、第２の核酸、及び第３の核酸は、異なるベクター中に位置する。

【0020】

更に、本開示は、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法を受ける患者において、低減されたＩＦＮγシグナル伝達を有する（例えば、ＩＦＮＧ遺伝子をノックアウトするか、又はＩＦＮγアンタゴニストを発現することによって）を有する遺伝子操作された免疫細胞が、堅牢なＴ細胞細胞傷害性を維持し、またサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）を大幅に低減させたという予期せぬ発見に少なくとも部分的に基づいている。ある特定の実施形態では、内因性ＩＦＮＧ遺伝子の低減した発現は、野生型ＩＦＮＧ遺伝子を有する同じタイプの免疫細胞と比較して５％～７０％の範囲である。

【0021】

したがって、本開示はまた、（ａ）破壊された内因性インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）遺伝子又はＩＦＮγ受容体（ＩＦＮγＲ）遺伝子を含み、かつ／又は（ｂ）ＩＦＮγアンタゴニストを発現する、第１の複数の遺伝子操作された免疫細胞を含む免疫細胞の集団を提供する。

【0022】

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された免疫細胞は、破壊された内因性ＩＦＮγ又はＩＦＮγＲ遺伝子を含む。いくつかの例では、破壊された内因性ＩＦＮγ又はＩＦＮγＲ遺伝子は、遺伝子編集によって産生され、例えば、遺伝子編集が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システムによって媒介される。

【0023】

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細胞は、ＩＦＮγアンタゴニストを発現する。例えば、遺伝子操作された細胞は、ＩＦＮγアンタゴニストを分泌する。場合によっては、ＩＦＮγアンタゴニストは、抗ＩＦＮγ抗体、分泌型ＩＦＮγ受容体、又は抗ＩＦＮγＲ抗体であり得る。いくつかの例では、ＩＦＮγアンタゴニストは、抗ＩＦＮγ抗体又は抗ＩＦＮγＲ抗体であり得る。具体的な例では、抗体は、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。

【0024】

いくつかの例では、ＩＦＮγアンタゴニストは、抗ＩＦＮγ ｓｃＦｖである。一例では、抗ＩＦＮγ ｓｃＦｖは、配列番号５３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む。別の例では、抗ＩＦＮγ ｓｃＦｖは、配列番号５６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む。更に別の例では、抗ＩＦＮγ ｓｃＦｖは、配列番号５９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む。具体的な例では、抗ＩＦＮγ ｓｃＦｖは、配列番号５４のアミノ酸配列を含む。別の具体的な例では、抗ＩＦＮγ ｓｃＦｖは、配列番号５７のアミノ酸配列を含む。更に別の具体的な例では、抗ＩＦＮγ ｓｃＦｖは、配列番号６０のアミノ酸配列を含む。

【0025】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される免疫細胞の集団は、（ａ）細胞外抗原結合ドメインと、（ｂ）共刺激ドメイン（例えば、４－１ＢＢ又はＣＤ２８共刺激ドメイン）と、（ｃ）細胞質シグナル伝達ドメインと、任意選択で、（ｄ）膜貫通及び／又はヒンジドメインとを含み得る、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現し得る。いくつかの例では、細胞外抗原結合ドメインは、腫瘍関連抗原、例えば、本明細書に開示されるものに結合し得る、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含み得る。いくつかの例では、腫瘍関連抗原はＣＤ１９であり、細胞外抗原結合ドメインは、ＣＤ１９、例えば、本明細書に開示される抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ抗体のうちのいずれかに結合するｓｃＦｖを含む。他の例では、腫瘍関連抗原は、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）であり、細胞外抗原結合ドメインは、ＢＣＭＡ、例えば、本明細書に開示される抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ抗体のうちのいずれかに結合するｓｃＦｖを含む。

【0026】

本明細書に開示されるＣＡＲに使用される共刺激ドメインは、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ７０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＤＡＰ１０、及びＤＡＰ１２、又はそれらの任意の組み合わせからのものであり得る。代替的又は追加的に、細胞質シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）シグナル伝達ドメイン、インターロイキン２受容体ベータサブユニット（ＩＬ－２Ｒβ）細胞質シグナル伝達ドメイン、又はそれらの組み合わせを含み得る。代替的又は追加的に、膜貫通ドメインは、存在する場合、Ｔ細胞受容体ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＣＤ２７１、ＴＮＦＲＳＦ１９、及びキラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）のアルファ、ベータ、若しくはゼータ鎖、又はそれらの任意の組み合わせであり得る、細胞表面受容体からのものであり得る。場合によっては、ＣＡＲは、（ａ）～（ｄ）の機能ドメインを接続するために、ヒンジ若しくはスペーサー、又は両方の組み合わせを更に含み得る。

【0027】

代替的又は追加的に、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインのＣ末端、及び膜貫通ドメインのＮ末端に連結されたヒンジドメインを含み得る。例としては、ＣＤ２８、ＣＤ８、又は任意選択で、ＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４であるＩｇＧからのヒンジドメインが挙げられる。

【0028】

場合によっては、ＣＡＲは、ＩＬ－２Ｒβ）細胞質シグナル伝達ドメインを含む、本明細書に開示されるＣＡＲのうちのいずれかであり得る。そのようなＣＡＲは、Ｎ末端に位置するシグナルペプチドを更に含んでもよい。例としては、アルブミン、ＣＤ８、成長ホルモン、ＩＬ－２、抗体軽鎖、又はＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼに由来するシグナルペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。

【0029】

免疫細胞の集団は、インターロイキン－６（ＩＬ－６）若しくはＩＬ－６受容体（ＩＬ－６Ｒ）に特異的な抗体を発現する第２の複数の免疫細胞、及び／又はＩＬ－１アンタゴニスト、例えば、本明細書に開示されるものを発現する第３の複数の免疫細胞を更に含み得る。場合によっては、第１の複数の免疫細胞、第２の複数の免疫細胞、及び／又は第３の複数の免疫細胞は、共通のメンバーを含む。いくつかの例では、免疫細胞の集団は、減少したＩＦＮγシグナル伝達を有し、ＣＡＲを発現し、ＩＬ－６アンタゴニストを発現し、ＩＬ－１アンタゴニストを発現する遺伝子操作された細胞（例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％以上）を含む。他の例では、免疫細胞の集団は、今述べたような遺伝子改変のうちの２つ以上を示す遺伝子操作された細胞を含む。

【0030】

また、本明細書に開示される遺伝子改変のうちの１つ以上を含む、例えば、ＣＡＲを発現し、低減されたＩＦＮγシグナル伝達を有し、ＩＬ－６アンタゴニストを発現し、及び／又はＩＬ－１アンタゴニストを発現する免疫細胞集団のうちのいずれかと、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物も本開示の範囲内である。

【0031】

加えて、本明細書では、対象における望ましくない細胞を低減又は排除するための方法が提供され、本方法は、治療有効量の本明細書に開示される免疫細胞の集団又は薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトがん患者である。遺伝子操作された免疫細胞は、腫瘍関連抗原に特異的であるＣＡＲを発現する。例としては、５Ｔ４、ＣＤ２、ＣＤ５、ＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳ１、クローディン１８．２、ＢＣＭＡ、ＢＡＦＦ－Ｒ、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、デスモグレイン（Ｄｓｇ３）、ＨＥＲ－２、ＦＡＰ、ＦＳＨＲ、ＮＫＧ２Ｄ、ＧＤ２、ＥＧＦＲＶＩＩＩ、メソテリン、ＲＯＲ１、ＭＡＧＥ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＧＰＣ３、Ｌｅｗｉｓ Ｙ、及びＶＥＧＦＲＩＩが挙げられるが、これらに限定されない。

【0032】

場合によっては、がんは固形腫瘍がんである。例としては、乳がん、肺がん、膵臓がん、肝臓がん、膠芽腫（ＧＢＭ）、前立腺がん、卵巣がん、中皮腫、結腸がん、及び胃がんが挙げられるが、これらに限定されない。場合によっては、がんは、血液がんである。例としては、白血病、リンパ腫、又は多発性骨髄腫が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な白血病としては、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄白血病（ＡＭＬ）、又は慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）が挙げられる。例示的なリンパ腫としては、マントル細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫又はホジキンリンパ腫が挙げられる。

【0033】

いくつかの例では、遺伝子操作された免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）は、ＣＤ１９に結合するＣＡＲ（例えば、本明細書に開示されるもの）を発現する。対象は、リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ芽球性白血病、マントル細胞リンパ腫、大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、又は非ホジキンリンパ腫を有するヒト患者である。他の例では、遺伝子操作された免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）は、ＢＣＭＡに結合するＣＡＲ（例えば、本明細書に開示されるもの）を発現する。対象は、多発性骨髄腫、再発性多発性骨髄腫、又は難治性多発性骨髄腫を有するヒト患者である。

【0034】

本明細書に開示される方法のうちのいずれかは、細胞療法の前に、細胞療法のために対象を調製するために、対象に対してリンパ枯渇治療を実施することを含んでもよい。場合によっては、リンパ枯渇治療は、フルダラビン及びシクロホスファミドのうちの１つ以上を対象に投与することを含む。

【0035】

代替的又は追加的に、ヒト患者は、細胞療法の前に、腫瘍負荷を低減させるために、がんに対する療法を受けた。例示的な先行療法には、化学療法、免疫療法、放射線療法、又は手術が含まれる。

【0036】

場合によっては、対象は、感染性疾患、又は免疫障害を有し得る。

【0037】

本明細書にも開示される標的疾患（例えば、がん）のいずれかの治療で使用するための本明細書に開示される遺伝子操作された免疫細胞のうちのいずれか、並びに標的疾患の治療のための医薬品を製造するためのそのような遺伝子操作された免疫細胞の使用も本開示の範囲内である。

【0038】

本明細書にも開示される標的疾患の治療で使用するための本明細書に記載される免疫細胞集団、及び標的疾患の治療に使用するための医薬品を製造するためのそのような免疫細胞集団の使用も本開示の範囲内である。

【0039】

本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、以下の説明に記載されている。本発明の他の特徴又は利点は、以下の図面及びいくつかの実施形態の詳細な説明、及び添付の特許請求の範囲からも明らかであろう。

【図面の簡単な説明】

【0040】

【図1A-1E】図１Ａ～１Ｅは、本明細書に開示される例示的なＣＡＲ構築物を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞によって達成される抗腫瘍効率を示す図を含む。図１Ａは、Ｔ細胞注入後に示されるように異なる時点でのヒト患者における白血球（ＷＢＣ）及びリンパ球の数を示すチャートである。図１Ｂは、Ｔ細胞注入後に示されるように異なる時点でのヒト患者の体温（℃）を示すチャートである。図１Ｃは、Ｔ細胞注入後に示されるように異なる時点でのヒト患者におけるＩＦＮγ及びＩＬ－６のレベルを示すチャートである。図１Ｄは、Ｔ細胞注入後に示されるように異なる時点でのヒト患者におけるＣＲＰ（Ｃ反応性タンパク質）のレベルを示すチャートである。図１Ｅは、Ｔ細胞注入後に示されるように異なる時点でのヒト患者におけるフェリチンのレベルを示すチャートである。

【図2】図２は、内因性ＩＦＮ－γが、ＩＦＮγエクソン１を標的とし、ＣＲＩＳＰＲシステムを使用して異なるｓｇＲＮＡ候補で遺伝子編集されたＴ細胞におけるＩＦＮγのレベルを要約するチャートである。ＩＦＮγのレベルは、Ｔ細胞の細胞内染色によって決定された。

【図3】図３は、処置された多発性骨髄腫（ＭＭ）患者における注入後のＣＡＲ＋Ｔ細胞の頻度を示す。患者＃１（円）に、４１ＢＢ、ＩＬ－２Ｒβ受容体及びＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインを有する抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞を注入した。患者＃２（四角）に、ＩＬ－２Ｒβ受容体共刺激シグナル伝達ドメインなしで、４１ＢＢ及びＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインを有する抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞を注入した。

【図4】図４は、４１ＢＢ、ＩＬ－２Ｒβ、及びＣＤ３ζシグナル伝達を有する抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞を注入した３人の患者、Ｐｔ＃１、Ｐｔ＃２、及びＰｔ＃３の末梢血中のＣＤ１９^＋細胞及びＣＡＲ^＋／ＣＤ３^＋細胞の変化を示す。

【図5】図５は、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）並びにリンパ腫患者における抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞、並びに多発性骨髄腫（ＭＭ）患者における抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞のピーク頻度を示す。

【図6A】図６Ａは、ＩＦＮγシグナル伝達の阻害に対する種々の抗ＩＦＮγ ｓｃＦｖ抗体の効率を示す。１、Ａｍｇ－ＬＨ；２、Ｆｏｎ－ＬＨ；３、Ｅｍａ－ＬＨ；４、Ａｍｇ－ＨＬ；５、Ｆｏｎ－ＨＬ；及び６、Ｅｍａ－ＨＬ（ＬＨは、軽鎖可変領域の重鎖可変領域への配向を意味し、ＨＬは、重鎖可変領域の軽鎖可変領域への配向を意味する）。Ａｍｇ＝ＡＭＧ ８１１（米国特許出願第ＵＳ２０１３／０１４２８０９号）；Ｆｏｎ＝フォンツリズマブ；及びＥｍａ＝エマパルマブ

【図6B】図６Ｂは、ＩＦＮγシグナル伝達を阻害するための、Ａｍｇ由来ｓｃＦｖに対する異なるシグナルペプチドの効率を示す。１、アルブミン由来のシグナルペプチド（配列番号４７）；２、ＣＤ８由来のシグナルペプチド（配列番号４４）；３、成長ホルモン由来のシグナルペプチド（配列番号２９）；４、アルブミン由来の改変シグナルペプチド（配列番号４８）；５、ＩＬ－２由来の改変シグナルペプチド（配列番号４９）；６、抗体軽鎖由来のシグナルペプチド（配列番号４５）；及び７、ＧＬ（Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ）由来のシグナルペプチド（配列番号４６）。

【図7】図７は、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）を罹患し、４１ＢＢ－ＩＬ２Ｒβ－ＣＤ３ζシグナル伝達、ＣＲＩＳＰＲ編集ＩＦＮγノックアウト（ＫＯ）、並びに共発現ＩＬ６及びＩＬ１ブロッカーを有する抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞で処置した患者の末梢血中のＩＦＮγの変化を示す。

【図8A】図８Ａは、難治性及び再発性多発性骨髄腫（ＭＭ）と診断され、４１ＢＢ－ＩＬ２Ｒβ－ＣＤ３ζシグナル伝達、ＣＲＩＳＰＲ編集ＩＦＮγ ＫＯ、並びに共発現ＩＬ６及びＩＬ１ブロッカーを有する抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞で処置した患者の末梢血中のＩＦＮγの変化を示す。

【図8B】図８Ｂは、治療後の同じ患者の末梢血中のＩｇＧレベルの経時的変化を示す。

【図9】図９は、難治性及び再発性リンパ腫と診断され、４１ＢＢ－ＩＬ２Ｒβ－ＣＤ３ζシグナル伝達、並びに共発現エマパルマブに由来するＩＦＮγ遮断ｓｃＦｖ及びシルクマブに由来するＩＬ６遮断ｓｃＦｖを有する抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞で処置された患者の末梢血中のＩＦＮγの変化を示す。

【図10A】図１０Ａは、難治性及び再発性ＭＭと診断され、４１ＢＢ－ＩＬ２Ｒβ－ＣＤ３ζシグナル伝達、並びに共発現エマパルマブに由来するＩＦＮγ遮断ｓｃＦｖ及びシルクマブに由来するＩＬ６遮断ｓｃＦｖを有する抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞で処置された患者＃１の末梢血中のＩＦＮγの変化を示す。

【図10B】図１０Ｂは、難治性及び再発性ＭＭと診断され、４１ＢＢ－ＩＬ２Ｒβ－ＣＤ３ζシグナル伝達、並びに共発現エマパルマブに由来するＩＦＮγ遮断ｓｃＦｖ及びシルクマブに由来するＩＬ６遮断ｓｃＦｖを有する抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞で処置された患者＃２の同じ患者の末梢血中のＩＦＮγの変化及びＩｇＧレベルの変化を示す。

【発明を実施するための形態】

【0041】

養子細胞移入免疫療法は、疾患細胞を排除するために免疫細胞活性化及びサイトカイン分泌に依存する。しかしながら、ＣＡＲ－Ｔは、患者において常に十分に拡大するとは限らない。本開示は、低下した炎症特性を有する免疫細胞の開発を介して、この制限を部分的に克服することを目的とする。本開示は、ＩＬ２Ｒβシグナル伝達ドメインを含むＣＡＲの開発に少なくとも部分的に基づいている。このＣＡＲ構築物は、腫瘍標的細胞による活性化の際にＴ細胞のより効果的な増殖を誘導することによって、優れた治療効果を達成することが予想される。

【0042】

したがって、ＩＬ２Ｒβシグナル伝達ドメインを含むＣＡＲ、そのようなＣＡＲを発現する改変された免疫細胞、及びその治療用途（ＣＡＲ－Ｔ療法を含む）が本明細書に提供される。理論によって束縛されるものではないが、（１）ＩＬ２Ｒβシグナル伝達ドメインを含むＣＡＲ、（２）ＩＬ－６若しくはＩＬ－６Ｒに特異的な拮抗抗体、及び／又は（３）ＩＬ－１α若しくはＩＬ－１βに特異的なＩＬ－１アンタゴニスト又は拮抗抗体を発現する改変された免疫細胞は、これらの細胞で処置された患者において、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）を著しく低下させた。これらの患者におけるＣＲＳを予防又は抑制するために、追加の抗ＩＬ－６の投薬は必要なかった。ＩＬ２Ｒβシグナル伝達ドメインがＣＡＲ内に存在することで、ＩＬ２Ｒβシグナル伝達ドメインを有さないＣＡＲを有するＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、処置された患者におけるインビボでのＣＡＲ－Ｔ細胞の持続性が促進された。

【0043】

ＩＦＮγは、Ｔ細胞細胞傷害性に関与する最も必須のサイトカインのうちの１つであり、したがって、ＩＦＮγの分泌は、ＣＡＲ－Ｔ療法の効力を反映する主要なパラメータである。ＣＡＲ－Ｔ療法中に、ＩＦＮγは、ＣＲＳ中に最も上昇したサイトカインのうちの１つである。ＣＡＲＴが腫瘍標的細胞を殺傷することに重要な役割を果たすため、ＩＦＮγシグナル伝達を遮断することは、ＣＡＲ－Ｔ治療有効性を著しく損なうことが予想された。驚くべきことに、本開示では、例えば、内因性ＩＦＮγ遺伝子をノックアウトすることによって、又は抗ＩＦＮγ ｓｃＦｖ（例えば、分泌型ｓｃＦｖ）を発現することによって、ＩＦＮγの産生が低減されたＣＡＲ－Ｔ細胞は、患者で観察される低レベルのＩＦＮγにもかかわらず、堅牢な臨床応答を達成することができることが報告されている。これらの結果は、ＩＦＮγレベルを低下させることが、堅牢かつ安全な免疫細胞療法（例えば、ＣＡＲ－Ｔ療法）を達成するためのアプローチであることを示唆している。

【0044】

したがって、（１）内因性ＩＦＮγ又はＩＦＮγＲの発現が低減されるように破壊されたゲノムＩＦＮγ遺伝子又はＩＦＮγＲ遺伝子を有する、（２）ＩＦＮγアンタゴニストを発現するか、又はそれらの両方の組み合わせを有する、遺伝子操作された免疫細胞が本明細書で提供される。細胞は、腫瘍関連抗原を特異的に標的化し、それに結合するＣＡＲを更に含み得る。本明細書に記載の遺伝子操作された免疫細胞はまた、ＩＬ－６及びＩＬ－１アンタゴニストの発現を介して、ＩＬ－６若しくはＩＬ－１、又はＩＬ－６及びＩＬ－１シグナル伝達の両方をインビボで阻害することができる。

【0045】

本明細書で使用される場合、「内因性」という用語は、生物体内から自然に由来することを指す。

【0046】

本開示の目的のために、「アンタゴニスト」という用語は、標的タンパク質自体、標的タンパク質の生物学的活性、又は生物学的活性の結果が、任意の有意義な程度、例えば、少なくとも２０％、５０％、７０％、８５％、９０％、又はそれ以上で実質的に無効化、減少、又は中和される、全ての識別された用語、タイトル、及び機能的状態並びに特徴を包含することが明確に理解されるであろう。

【0047】

Ｉ．ＩＬ２Ｒβシグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体
本開示の一態様は、とりわけ、ＩＬ２Ｒβシグナル伝達ドメインを含む、キメラ抗原受容体を提供する。本明細書に開示されるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、目的の標的抗原（例えば、腫瘍細胞抗原）に対する結合特異性を有し、そのような標的抗原への結合の際に免疫発現において免疫応答を引き起こすことができる、人工的（非自然発生の）受容体である。ＣＡＲは、多くの場合、少なくとも細胞内シグナル伝達ドメインに融合された細胞外抗原結合ドメインを含む。Ｃａｒｔｅｌｌｉｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０１０：９５６３０４，２０１０。本明細書に開示されるＣＡＲは、ＩＬ２Ｒβシグナル伝達ドメインを含み、これは、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメイン及び／又はＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン（ＣＤ３ｚとも称される）などの免疫受容体チロシン依存性活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む細胞質シグナル伝達ドメインなどの他の細胞内シグナル伝達ドメインと組み合わせてもよい。ＣＡＲはまた、膜貫通ドメイン、ヒンジドメイン、及び／又はＳＴＡＴ３結合部位を有してもよい。膜貫通ドメインは、細胞外抗原結合ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとの間に位置する。ヒンジドメインは、細胞外抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとの間、膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとの間、及び細胞内シグナル伝達ドメインが１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメイン及び／又は細胞質シグナル伝達ドメインの組み合わせを含む場合、細胞内シグナル伝達ドメイン内に位置し得る。

【0048】

一実施形態では、ＩＬ２Ｒβシグナル伝達ドメイン、ＩＴＡＭ含有細胞質シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン、及び４－１ＢＢからのものなどの追加の共刺激ドメインを含む細胞内ドメインを有するＣＡＲが本明細書に提供される。理論に束縛されるものではないが、ＩＬ２Ｒβシグナル伝達ドメインの存在は、ＣＡＲを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞のインビボでの持続性を大幅に改善した。ＩＬ２Ｒβシグナル伝達ドメインはまた、処置された患者においてインビボで持続可能なＢ細胞無形成を誘導した。

【0049】

（Ａ）ＩＬ２Ｒβシグナル伝達ドメイン
ＩＬ２Ｒβは、インターロイキン－２受容体（ＩＬ－２Ｒ）のβ鎖である。ＩＬ－２Ｒβシグナル伝達ドメインは、ＩＬ－２／ＩＬ－２Ｒ相互作用によって媒介されるシグナル伝達経路を引き起こすことができるＩＬ２Ｒβポリペプチド内の断片（例えば、ヒトなどの好適な種の）を指す。ＩＬ－２ポリペプチド及びそのシグナル伝達ドメインは、当該技術分野において既知である。例えば、例示的なヒトＩＬ２Ｒβポリペプチドは、ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＮＰ＿０００８６９．１（その内容が、参照により本明細書に組み込まれる）に提供されている。他の種に由来するＩＬ２Ｒβポリペプチドは、ＧＥＮＢＡＮＫなどの公に利用可能な遺伝子データベースから得ることができる。

【0050】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＣＡＲ構築物において使用されるＩＬ２Ｒβシグナル伝達ドメインは、ＮＣＲＮＴＧＰＷＬＫＫＶＬＫＣＮＴＰＤＰＳＫＦＦＳＱＬＳＳＥＨＧＧＤＶＱＫＷＬＳＳＰＦＰＳＳＳＦＳＰＧＧＬＡＰＥＩＳＰＬＥＶＬＥＲＤＫＶＴＱＬＬＰＬＮＴＤＡＹＬＳＬＱＥＬＱＧＱＤＰＴＨＬＶ（配列番号２）のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％以上）同一のアミノ酸配列を含む。

【0051】

２つのアミノ酸配列の「同一性パーセント」は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－７７，１９９３の場合のように修正された、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４－６８，１９９０のアルゴリズムを使用して決定される。そのようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０，１９９０のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワードレングス＝３を用いてＢＬＡＳＴタンパク質検索を行い、目的のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得ることができる。２つの配列間にギャップが存在する場合、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９－３４０２，１９９７に記載されるように利用することができる。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムの利用時には、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）の初期設定パラメータを使用することができる。

【0052】

代替的又は追加的に、ＣＡＲ構築物で使用されるＩＬ２Ｒβシグナル伝達ドメインは、野生型の対応物、例えば、配列番号２のアミノ酸と比較して、１つ以上の変異（例えば、アミノ酸残基置換）を含有し得る。いくつかの例では、ＩＬ２Ｒβシグナル伝達ドメインは、野生型の対応物（例えば、配列番号２）と比較して、最大１５個（例えば、最大１２、１０、８、６、５、４、３、２、又は１個）のアミノ酸残基置換を含有し得る。いくつかの例では、１つ以上のアミノ酸残基の置換は、保存的アミノ酸残基の置換である。

【0053】

本明細書で使用される場合、「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸置換が行われるタンパク質の相対的な電荷又はサイズ特性を変化させないアミノ酸置換を指す。バリアントは、そのような方法をコンパイルする参照文献、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９、又はＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに見出されるような、当業者に既知のポリペプチド配列を改変するための方法に従って調製することができる。アミノ酸の保存的置換には、以下の群内のアミノ酸間で行われる置換が含まれる：（（ａ）Ａ→Ｇ、Ｓ；（ｂ）Ｒ→Ｋ、Ｈ；（ｃ）Ｎ→Ｑ、Ｈ；（ｄ）Ｄ→Ｅ、Ｎ；（ｅ）Ｃ→Ｓ、Ａ；（ｆ）Ｑ→Ｎ；（ｇ）Ｅ→Ｄ、Ｑ；（ｈ）Ｇ→Ａ；（ｉ）Ｈ→Ｎ、Ｑ；（Ｊ）Ｉ→Ｌ、Ｖ；（ｋ）Ｌ→Ｉ、Ｖ；（ｌ）Ｋ→Ｒ、Ｈ；（ｍ）Ｍ→Ｌ、Ｉ、Ｙ；（ｎ）Ｆ→Ｙ、Ｍ、Ｌ；（ｏ）Ｐ→Ａ；（ｐ）Ｓ→Ｔ；（ｑ）Ｔ→Ｓ；（ｒ）Ｗ→Ｙ、Ｆ；（ｓ）Ｙ→Ｗ、Ｆ；及び（ｔ）Ｖ→Ｉ、Ｌ。

【0054】

具体的な例では、本明細書に開示されるＣＡＲ構築物で使用されるＩＬ２Ｒβシグナル伝達ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を含む（例えば、それからなる）。

【0055】

（Ｂ）細胞外抗原結合ドメイン
本明細書に開示されるＣＡＲ構築物で使用される細胞外抗原結合ドメインは、目的の抗原（例えば、がん抗原などの病理学的抗原）に特異的である。場合によっては、それは、典型的には、ペプチドリンカーによって接続された重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）及び軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）を含む、一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）であり得る。ｓｃＦｖ構築物で使用されるペプチドリンカーは、当技術分野において周知である。いくつかの実施形態では、本明細書で使用される細胞外抗原結合ドメインは、ＣＤ１９又はＢＣＭＡなどの腫瘍抗原を標的とする。

【0056】

いくつかの例では、細胞外抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、ＣＤ１９に結合する。そのような抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖは、配列番号６のアミノ酸配列を含み得る。代替的に、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖは、配列番号６に由来するバリアント、例えば、配列番号６におけるものと同じ重鎖及び軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有するバリアントであり得る。代替的に、バリアントは、配列番号６と同じＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ並びに異なるペプチドリンカーを有してもよい。他の場合では、バリアントは、配列番号６におけるものとは異なるＶ_Ｈ→Ｖ_Ｌ配向を有し得る。

【0057】

いくつかの例では、細胞外抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に結合する。そのような抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖは、配列番号７のアミノ酸配列を含み得る。代替的に、抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖは、配列番号７に由来するバリアント、例えば、配列番号７におけるものと同じ重鎖及び軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有するバリアントであり得る。代替的に、バリアントは、配列番号７と同じＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ並びに異なるペプチドリンカーを有してもよい。他の場合では、バリアントは、配列番号７におけるものとは異なるＶ_Ｈ→Ｖ_Ｌ配向を有し得る。

【0058】

同じＣＤＲ又は同じＶ_Ｈ／Ｖ_Ｌを有する２つの抗体は、２つの抗体が同じ方法によって決定されるそのＣＤＲの同じアミノ酸配列を有することを意味する。

【0059】

（Ｃ）その他のＣＡＲ構成成分
上記に開示されるＩＬ２Ｒβシグナル伝達ドメイン及び細胞外抗原結合ドメインに加えて、本明細書に開示されるＣＡＲ構築物のうちのいずれかは、１つ以上の共刺激ドメイン、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインなどのＩＴＡＭを含む細胞質シグナル伝達ドメイン、又はそれらの組み合わせを更に含み得る。場合によっては、ＣＡＲは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインに対してＣ末端に位置し得るＳＴＡＴ３結合部位を更に含んでもよい。

【0060】

いくつかの例では、本明細書に開示されるＣＡＲは、例えば、ヒト４－１ＢＢからの共刺激受容体４－１ＢＢ（別名ＣＤ１３７）からの共刺激ドメインを含み得る。共刺激ドメインのための非限定的な供給源としては、ＯＸ４０、ＣＤ７０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＤＡＰ１０、及びＤＡＰ１２が挙げられる。したがって、ＣＡＲは、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ７０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＤＡＰ１０、及びＤＡＰ１２、又はそれらの任意の組み合わせに由来する共刺激ドメインを有し得る。一例には、４－１ＢＢの共刺激シグナル伝達ドメインが含まれ、これはアミノ酸配列：ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ（配列番号１）を含む。代替的又は追加的に、ＣＡＲは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含み得、これは、アミノ酸配列：ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＫＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号３）を含み得る。

【0061】

いくつかの例では、本明細書に開示されるＣＡＲ構築物は、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインに（そのＣ末端に）連結されたＳＴＡＴ３結合モチーフを含有する。ＳＴＡＴ３結合モチーフは、アミノ酸配列ＹＸ_１Ｘ_２Ｑを有してよく、Ｘ_１及びＸ_２は、各々独立してアミノ酸である。特に、ＹＸ_１Ｘ_２Ｑモチーフは、ＹＲＨＱ（配列番号４）であり得る。いくつかの例では、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン及びＳＴＡＴ３結合モチーフを含有するＣＡＲ構築物中の断片は、アミノ酸配列：
ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＫＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＹＲＨＱＡＬＰＰＲ（配列番号５）を含み得る。

【0062】

加えて、本明細書に開示されるＣＡＲ構築物は、膜貫通ドメイン、ヒンジドメイン、又はそれら両方を更に含み得、これらは、細胞外抗原結合ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとの間に位置し得る。ＣＡＲ構築物で一般的に使用されるいかなる膜貫通ドメイン及び／又はヒンジドメインも、ここで使用することができる。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＣＤ２７１、ＴＮＦＲＳＦ１９、及びキラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）のアルファ、ベータ又はゼータ鎖の細胞表面受容体の膜貫通ドメインなどの好適な細胞表面受容体から得ることができる。いくつかの例では、ヒンジドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ８、又はＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４などのＩｇＧのものであり得る。

【0063】

具体的な例では、本明細書に開示されるＣＡＲ構築物は、細胞外抗原結合ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、ＩＬ－２Ｒβ細胞質シグナル伝達ドメイン、及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含み得る。上記ドメインは、それぞれ、ＣＡＲのＮ末端からＣ末端に向かって配置され得る。ＣＡＲは、膜貫通ドメインを更に含んでもよく、これは、細胞外抗原結合ドメインに対してＣ末端であり得、４－１ＢＢ共刺激ドメインに対してＮ末端であり得る。他の例では、本明細書に開示されるＣＡＲは、ヒンジドメインを更に含んでもよく、ヒンジドメインは、細胞外抗原結合ドメインのＣ末端、及び膜貫通ドメインのＮ末端に連結されてもよい。いくつかの例では、ＣＡＲは、ＣＡＲのＮ末端にシグナルペプチドを含み得る。

【0064】

例示的なＣＡＲ構築物を構築するための、抗原結合ｓｃＦｖ、ＩＬ２Ｒβシグナル伝達ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、シグナルペプチド、及びＣＤ３ζシグナルドメインなどのＣＡＲ構成成分のアミノ酸配列を以下に提供する。更に、例示的なＣＡＲ構築物が以下に開示される。企図されるＣＡＲ構築物は、当技術分野において既知の任意の方法、例えば、分子クローニング方法を使用して作製することができる。
抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ：

【化1】

【化2】

【化3】

（配列番号４０、ＷＯ２０２０／１３５３３５に開示されているような抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）

【化4】

（配列番号４１、ＷＯ２０２０／１３５３３５に開示されているような抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）
抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ：

【化5】

ＣＤ８ヒンジドメイン：
ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤ（配列番号１０）
ＣＤ８膜貫通ドメイン：
ＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣ（配列番号１１）
ＣＤ８ヒンジドメイン及びＣＤ８膜貫通：
ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣ（配列番号４２）
４－１ＢＢ共刺激ドメイン：
ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ（配列番号１）
ＩＬ－２Ｒβドメイン（ＩＬ－２Ｒβ細胞質ドメインの切断型：
ＮＣＲＮＴＧＰＷＬＫＫＶＬＫＣＮＴＰＤＰＳＫＦＦＳＱＬＳＳＥＨＧＧＤＶＱＫＷＬＳＳＰＦＰＳＳＳＦＳＰＧＧＬＡＰＥＩＳＰＬＥＶＬＥＲＤＫＶＴＱＬＬＰＬＮＴＤＡＹＬＳＬＱＥＬＱＧＱＤＰＴＨＬＶ（配列番号２）
ＣＤ３ζシグナルドメイン：
ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＫＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＹＲＨＱＡＬＰＰＲ（配列番号５）
ＣＤ８シグナルペプチド：
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ（配列番号４４）
抗ＣＤ１９ ＣＡＲ：

【化6】

抗ＣＤ１９ ＣＡＲ：

【化7】

抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ：

【化8】

【0065】

ＩＩ．遺伝子改変された免疫細胞
別の態様では、本開示は、任意選択で他の遺伝子編集と組み合わせて、本明細書に開示されるＣＡＲ構築物のうちのいずれかを発現する遺伝子改変された免疫細胞を提供する。そのような改変された免疫細胞は、目的の抗原（例えば、がん抗原）に特異的であるＣＡＲ構築物を含み、それによって、例えば、免疫細胞のエフェクター活性を介して標的疾患細胞を排除する。別の態様では、本開示は、抗原特異的ＴＣＲを発現する遺伝子改変された免疫細胞を提供する。ＴＣＲは、目的の抗原（例えば、がん抗原）に特異的であり、それによって、例えば、免疫細胞のエフェクター活性を介して標的疾患細胞を排除する。本明細書に開示の改変された免疫細胞はまた、本明細書に開示の１つ以上のＩＬ－６拮抗抗体を含み得る。場合によっては、改変された免疫細胞は、１つ以上のＩＬ－１アンタゴニスト、例えば、ＩＬ－１ＲＡ又は当該技術分野において既知であるか、又は本明細書に開示されている他のものを更に含み得る。いくつかの実施形態では、改変された免疫細胞は、１つ以上のＩＦＮγアンタゴニスト、例えば、拮抗ＩＦＮγ抗体又は当該技術分野において既知であるか、又は本明細書に開示されている他のものを更に含み得る。これらのＣＡＲ、ＴＣＲ、ＩＬ－６拮抗抗体、ＩＦＮγアンタゴニスト、又はＩＬ－１アンタゴニストは、改変された細胞におけるノックイン改変であり得る。いくつかの実施形態では、改変された免疫細胞は、内因性遺伝子（例えば、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＣＲ、ＩＦＮγ、又はＢ２Ｍ）の１つ以上のノックアウト改変を更に含み得る。内因性ＩＦＮγ遺伝子のノックアウトが好ましい。

【0066】

（ｉ）拮抗ＩＬ－６抗体
ＩＬ－６は、膜糖タンパク質ｇｐ１３０及びＩＬ－６受容体（ＩＬ－６Ｒ）を含む複合体を通してシグナル伝達する（例えば、Ｈｉｂｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，６３（６）：１１４９－５７，１９９０を参照されたい）。標的細胞上のＩＬ－６Ｒに結合するＩＬ－６は、ｇｐ１３０ホモ二量体化及びその後のシグナル伝達を促進する。本明細書で使用される場合、ＩＬ－６Ｒは、ＩＬ－６Ｒの膜結合形態及び可溶性形態（ｓＩＬ－６Ｒ）の両方を含む。ＩＬ－６に結合した場合、可溶性ＩＬ－６Ｒ（ｓＩＬ－６Ｒ）は、アゴニストとして作用し、ｇｐ１３０の二量体化及びシグナル伝達を促進することもできる。トランスシグナル伝達（ｔｒａｎｓ－ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）は、特定の細胞型によるｓＩＬ－６Ｒ分泌が、ｇｐ１３０のみを発現してＩＬ－６に応答する細胞を誘導することによって生じ得る（例えば、Ｔａｇａｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５：７９７－８１９，１９９７、及びＲｏｓｅ－Ｊｏｈｎ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．，３００（Ｐｔ２）：２８１－９０，１９９４を参照されたい）。一例では、ｓＩＬ－６Ｒは、ヒトＩＬ－６Ｒの細胞外ドメインを含む（例えば、Ｐｅｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．，１８３（４）：１３９９－４０６，１９９６を参照されたい）。

【0067】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される改変された免疫細胞は、ＩＬ－６又はＩＬ－６受容体（ＩＬ－６Ｒ）に結合する抗体であり得るＩＬ－６アンタゴニストを発現する。そのような抗体（拮抗抗体）は、免疫細胞上のＩＬ－６／ＩＬ－６Ｒの結合を妨げ、それによってＩＬ－６によって媒介される細胞シグナル伝達を抑制することができる。

【0068】

典型的な抗体分子は、通常抗原結合に関与する重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）及び軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）を含む。Ｖ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域は、「フレームワーク領域」（「ＦＲ」）として知られる、より保存された領域が点在する「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）としても知られる超可変領域へと更に細分することができる。各Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌは、典型的には、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成される。フレームワーク領域及びＣＤＲの範囲は、当該技術分野において既知の方法論を使用して、例えば、当該技術分野において周知であるＫａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、ＡｂＭ定義、及び／又は接触定義によって正確に特定することができる。例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７、Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７、Ａｌ－ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７－９４８、及びＡｌｍａｇｒｏ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１７：１３２－１４３（２００４）を参照されたい。また、英国の医療研究評議会（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）におけるヒトゲノムマッピングプロジェクトリソース（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）、並びにＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｌｏｎｄｏｎのバイオインフォマティクス及び計算生物学グループのウェブサイト（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｇｒｏｕｐ ｗｅｂｓｉｔｅ）に記載されている抗体ルールも参照されたい。

【0069】

本明細書で使用される抗体（複数形で互換的に使用される）は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介して、標的タンパク質、例えば、ＩＬ－６又はＩＬ－６Ｒに特異的に結合することができる免疫グロブリン分子である。本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、インタクト（例えば、完全長）抗体及び重鎖抗体（例えば、アルパカ重鎖ＩｇＧ抗体）だけでなく、その抗原結合断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなど）、一本鎖（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ；ＶＨＨ）（ナノボディとしても知られている）、その変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、ダイアボディ、線形抗体、単鎖抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、並びに抗体のグリコシル化バリアント、抗体のアミノ酸配列バリアント、及び共有結合改変抗体を含む、必要な特異性の抗原認識部位を含む任意の他の改変された構成も包含する。抗体は、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、又はＩｇＭ（若しくはそのサブクラス）などの任意のクラスの抗体を含み、抗体は、任意の特定のクラスである必要はない。その重鎖の定常ドメインの抗体アミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは、異なるクラスに割り当てられ得る。免疫グロブリンには、５つの主要な分類：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２に更に分けられ得る。免疫グロブリンの種々のクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、及びミューと呼ばれる。免疫グロブリンの種々の分類のサブユニット構造及び三次元構造は、周知である。

【0070】

いくつかの実施形態では、標的タンパク質又はその受容体に「結合する」本明細書に記載の抗体は、標的タンパク質又は受容体に特異的に結合し得る。標的又はエピトープに「特異的に結合する」（本明細書で互換的に使用される）抗体は、当該技術分野においてよく理解されている用語であり、かかる特異的結合を決定する方法も当該技術分野において周知である。分子は、代替の標的と比較して、より頻繁に、より迅速に、より長い持続時間で、及び／又は特定の標的抗原とより高い親和性で反応又は会合する場合、「特異的結合」を示すと言われている。抗体は、他の物質と結合するよりも、より大きい親和性、結合活性で、より容易に、及び／又はより長い持続時間で結合する場合、標的サイトカインと「特異的に結合する」。例えば、ＩＬ－６又はＩＬ－６Ｒエピトープに特異的に（又は優先的に）結合する抗体は、他のＩＬ－６エピトープ、非ＩＬ－６エピトープ、他のＩＬ－６Ｒエピトープ、又は非ＩＬ－６Ｒエピトープに結合するよりも、より大きい親和性、結合活性で、より容易に、及び／又はより長い持続時間で、このＩＬ－６エピトープ又はＩＬ－６Ｒエピトープに結合する抗体である。また、この定義を読むことによって、例えば、第１の標的抗原に特異的に結合する抗体は、第２の標的抗原に特異的若しくは優先的に結合し得るか、又は結合しない場合があることも理解される。したがって、「特異的結合」又は「優先的結合」は、必ずしも排他的結合を必要としない（ただし、それを含むことができる）。一般に、しかし必ずしもそうではないが、結合への言及は、優先的結合を意味する。

【0071】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の標的タンパク質の拮抗抗体は、標的タンパク質（例えば、ヒトＩＬ－６若しくはヒトＩＬ－６Ｒ）又はその抗原エピトープに対して好適な結合親和性を有する。本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、見かけの会合定数又はＫＡを指す。ＫＡは、解離定数（ＫＤ）の逆数である。本明細書に記載の拮抗抗体は、標的抗原又は抗原エピトープに対して少なくとも１０^－５、１０^－６、１０^－７、１０^－８、１０^－９、１０^－１０Ｍ以下の結合親和性（ＫＤ）を有し得る。増加した結合親和性は、減少したＫＤに対応する。第２の抗原と比較して、第１の抗原に対する抗体の高い親和性結合は、第２の抗原に結合するためのＫＡ（又はＫＤの数値）よりも、第１の抗原に結合するためのより高いＫＡ（又はＫＤのより小さい数値）によって示され得る。そのような場合、抗体は、第２の抗原（例えば、第２のコンフォメーション又はその模倣物中の同じ第１のタンパク質、又は第２のタンパク質）と比較して、第１の抗原（例えば、第１のコンフォメーション又はその模倣物中の第１のタンパク質）に対する特異性を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の拮抗抗体は、前駆体形態の標的タンパク質又は別のタンパク質、例えば、標的タンパク質と同じファミリーの炎症性タンパク質への結合親和性と比較して、成熟形態の標的タンパク質へのより高い結合親和性（より高いＫＡ又はより小さなＫＤ）を有する。（例えば、特異性又は他の比較のための）結合親和性の差は、少なくとも１．５、２、３、４、５、１０、１５、２０、３７．５、５０、７０、８０、９１、１００、５００、１０００、１０，０００、又は１０^５倍であり得る。

【0072】

結合親和性（又は結合特異性）は、平衡透析、平衡結合、ゲル濾過、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴、又は分光法（例えば、蛍光アッセイを使用する）を含む、様々な方法によって決定することができる。結合親和性を評価するための例示的な条件は、ＨＢＳ－Ｐ緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．００５％（ｖ／ｖ）の界面活性剤Ｐ２０）中である。これらの技術は、標的タンパク質濃度の関数として結合した結合タンパク質の濃度を測定するために使用することができる。結合した結合タンパク質（［Ｂｏｕｎｄ］）の濃度は、一般に、以下の方程式：
［Ｂｏｕｎｄ］＝［Ｆｒｅｅ］／（Ｋｄ＋［Ｆｒｅｅ］）によって遊離標的タンパク質（［Ｆｒｅｅ］）の濃度に関連付けられる。

【0073】

しかし、時には、例えば、ＥＬＩＳＡ又はＦＡＣＳ分析などの方法を使用して決定される、ＫＡに比例する親和性の定量的測定値を得ることで十分であり、したがって、より高い親和性が、例えば、２倍高いかどうかを決定するなどの比較に使用して、親和性の定性的測定値を取得するか、又は例えば、機能アッセイ、例えば、インビトロ又はインビボアッセイにおける活性によって、親和性の推論を取得することができるために、ＫＡの正確な決定は必ずしも必要ではない。

【0074】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＩＬ－６拮抗抗体は、ＩＬ－６シグナル伝達に結合し、それを少なくとも５０％（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又はそれ以上）阻害することができる。本明細書に記載のＩＬ－６拮抗抗体の阻害活性は、当該技術分野において既知の日常的な方法によって決定することができる。

【0075】

本明細書に記載の抗体は、マウス、ラット、ヒト、又は任意の他の起源（キメラ若しくはヒト化抗体を含む）であり得る。そのような抗体は、非自然発生であり、例えば、ヒトによる行為（例えば、そのような動物に所望の抗原又はその断片を免疫化すること）がなければ、動物において産生されないであろう。

【0076】

本明細書に記載の抗体のうちのいずれかは、モノクローナル又はポリクローナルのいずれかであり得る。「モノクローナル抗体」は、均質な抗体集団を指し、「ポリクローナル抗体」は、不均一な抗体集団を指す。これらの２つの用語は、抗体の供給源又はそれが作製される様式を限定しない。

【0077】

一例では、本明細書に記載の方法で使用される抗体は、ヒト化抗体である。ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含有する、特異的キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、又はその抗原結合断片である非ヒト（例えば、ネズミ）抗体の形態を指す。ほとんどの場合、ヒト化抗体はヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基は、所望の特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、又はウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基によって置き換えられる。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲ又はフレームワーク配列にも見られない残基を含み得るが、抗体の性能を更に精製及び最適化するために含まれる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ＣＤＲ領域の全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンの領域に対応し、ＦＲ領域の全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列の領域である。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域又はドメイン（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンの免疫グロブリン定常領域又はドメインの少なくとも一部も含むであろう。抗体は、ＷＯ９９／５８５７２に記載されるように改変されたＦｃ領域を有し得る。他の形態のヒト化抗体は、１つ以上のＣＤＲ（１、２、３、４、５、及び／又は６つ）を有し、これは元の抗体に関して変化させられ、これは、元の抗体からの１つ以上のＣＤＲに「由来する」１つ以上のＣＤＲとも称される。ヒト化抗体はまた、親和性成熟を伴い得る。

【0078】

例示的な抗ＩＬ－６抗体及び抗ＩＬ－６Ｒ抗体の重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）及び軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）は、太字で示されるＣＤＲ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｌｏｎｄｏｎのバイオインフォマティクス及び計算生物学グループのウェブサイトによって記載される抗体ルールに従って決定される）を伴って以下に提供される（参照抗体１～６）。
抗体１（ＩＬ－６Ｒに結合する）：

【化9】

【化10】

抗体２（ＩＬ－６に結合する）：

【化11】

【化12】

抗体３（ＩＬ－６に結合する）：

【化13】

【化14】

抗体４（ＩＬ－６Ｒに結合する）：

【化15】

【化16】

抗体５（ＩＬ－６に結合する）：

【化17】

【化18】

抗体６（ｇｐ１３０に結合する）：

【化19】

【化20】

【0079】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＩＬ－６拮抗抗体は、本明細書に提供される参照抗体（例えば、抗体１又は抗体２）のうちの１つと同じＩＬ－６抗原（例えば、ヒトＩＬ－６）若しくはＩＬ－６Ｒ（例えば、ヒトＩＬ－６Ｒ）内の同じエピトープに結合するか、又はＩＬ－６若しくはＩＬ－６Ｒ抗原への結合から参照抗体と競合する。本明細書で提供される参照抗体としては、抗体１～６が挙げられ、これらのそれぞれの構造的特徴及び結合活性が本明細書で提供される。本明細書に記載される参照抗体と同じエピトープに結合する抗体は、参照抗体と全く同じエピトープ又は実質的に重複するエピトープ（例えば、３つ未満の非重複アミノ酸残基、２つ未満の非重複アミノ酸残基、又は１つのみの非重複アミノ酸残基を含有する）に結合し得る。２つの抗体が、同族抗原への結合から互いに競合するかどうかは、当技術分野において周知である競合アッセイによって決定することができる。そのような抗体は、当業者に既知であると、例えば、実質的に類似した構造的特徴（例えば、相補性決定領域）を有するもの、及び／又は当技術分野において既知のアッセイによって特定されるものとして特定され得る。例えば、競合アッセイは、参照抗体のうちの１つを使用して実施して、候補抗体が参照抗体と同じエピトープに結合するか、又はＩＬ－６若しくはＩＬ－６Ｒ抗原へのその結合と競合するかを決定することができる。

【0080】

場合によっては、本明細書に開示されるＩＬ－６拮抗抗体は、本明細書に開示される参照抗体（例えば、抗体１又は抗体２）と同じ重鎖ＣＤＲ及び／又は同じ軽鎖ＣＤＲを含み得る。重鎖及び／又は軽鎖ＣＤＲは、抗原結合を担う領域／残基であり、そのような領域／残基は、当該技術分野において既知である方法によって、参照抗体（上に示す）の重鎖／軽鎖配列のアミノ酸配列から特定することができる。例えば、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｌｏｎｄｏｎのバイオインフォマティクス及び計算生物学グループのウェブサイト、Ａｌｍａｇｒｏ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１７：１３２－１４３（２００４）、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７９９－８１７（１９８７）、並びに当該技術分野において既知であるか、又は本明細書に開示されている他のものに記載される抗体ルールを参照されたい。抗体におけるＣＤＲ領域の決定は、当業者の技術範囲内で十分であり、例えば、本明細書に開示される方法、例えば、Ｋａｂａｔ法（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，（５ｔｈ ｅｄ．，１９９１，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｍｄ．））又はＣｈｏｔｈｉａ法（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７、Ａｌ－ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７－９４８））である。本明細書で使用されるとき、ＣＤＲは、当該技術分野において既知である任意の方法によって定義されるＣＤＲを指し得る。同じＣＤＲを有する２つの抗体は、２つの抗体が同じ方法によって決定されるそのＣＤＲの同じアミノ酸配列を有することを意味する。

【0081】

本明細書に開示される例示的な抗ＩＬ－６又は抗ＩＬ－６Ｒ抗体（例えば、抗体１又は抗体２）のうちのいずれかの機能的バリアントも本開示の範囲内である。機能的バリアントは、参照抗体と実質的に類似した結合活性及び生物活性（例えば、実質的に類似した結合親和性、結合特異性、阻害活性、又はそれらの組み合わせ）を保持しながら、参照抗体と比較して、Ｖ_Ｈ及び／若しくはＶ_Ｌ、又はＨＣ ＣＤＲのうちの１つ以上及び／若しくはＬＣ ＣＤＲのうちの１つ以上において１つ以上のアミノ酸残基変異を含有してよい。

【0082】

いくつかの例では、本明細書に開示されるＩＬ－６拮抗抗体は、抗体１又は抗体２などの参照抗体のＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、及びＨＣ ＣＤＲ３と比較して、１０個以下のアミノ酸変異（例えば、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個以下のアミノ酸変異）を集合的に含有するＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、及びＨＣ ＣＤＲ３を含む。「集合的」とは、３つのＨＣ ＣＤＲの全てにおけるアミノ酸変異の総数が、規定の範囲内であることを意味する。代替的又は追加的に、抗ＩＬ－６又は抗ＩＬ－６Ｒ抗体は、参照抗体のＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、及びＬＣ ＣＤＲ３と比較して、１０個以下のアミノ酸変異（例えば、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個以下のアミノ酸変異）を集合的に含有するＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、及びＬＣ ＣＤＲ３を含み得る。

【0083】

いくつかの例では、本明細書に開示されるＩＬ－６拮抗抗体は、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、及びＨＣ ＣＤＲ３を含み得、それらのうちの少なくとも１つは、抗体１又は抗体２などの参照抗体の対応物のＨＣ ＣＤＲと比較して、５個以下のアミノ酸変異（例えば、４、３、２、又は１個以下のアミノ酸変異）を含有する。具体的な例では、本抗体は、抗体１又は抗体２などの参照抗体のＨＣ ＣＤＲ３と比べて５個以下のアミノ酸変異（例えば、４、３、２、又は１個以下のアミノ酸変異）を含有するＨＣ ＣＤＲ３を含む。代替的又は追加的に、ＩＬ－６拮抗抗体は、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、及びＬＣ ＣＤＲ３を含み得、それらのうちの少なくとも１つは、参照抗体の対応物のＬＣ ＣＤＲと比較して、５個以下のアミノ酸変異（例えば、４、３、２、又は１個以下のアミノ酸変異）を含有する。具体的な例では、本抗体は、参照抗体のＬＣ ＣＤＲ３と比べて、５個以下のアミノ酸変異（例えば、４、３、２、又は１個以下のアミノ酸変異）を含有するＬＣ ＣＤＲ３を含む。

【0084】

場合によっては、アミノ酸残基変異は、保存的アミノ酸残基置換であり得る。本明細書の開示を参照されたい。

【0085】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＩＬ－６拮抗抗体は、抗体１又は抗体２などの参照抗体の重鎖ＣＤＲと集合的に少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、又は９８％）同一である重鎖ＣＤＲを含んでもよい。代替的又は追加的に、本抗体は、参照抗体の軽鎖ＣＤＲと集合的に少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％又は９８％）同一である軽鎖ＣＤＲを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ＩＬ－６拮抗抗体は、抗体１又は抗体２などの参照抗体の重鎖可変領域と少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、若しくは９８％）同一である重鎖可変領域、及び／又は参照抗体の軽鎖可変領域と少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、若しくは９８％）同一である軽鎖可変領域を含んでもよい。

【0086】

本開示はまた、本明細書に開示される参照ＩＬ－６拮抗抗体のうちのいずれかの生殖細胞系バリアントも提供する。生殖細胞系バリアントは、フレームワーク領域内で、対応する生殖細胞系列配列に対するその親抗体と比較して１つ以上の変異を含有する。生殖細胞系バリアントを作製するために、親抗体若しくはその一部の重鎖又は軽鎖可変領域配列（例えば、フレームワーク配列）は、抗体生殖細胞系列配列データベース（例えば、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｌｏｎｄｏｎのバイオインフォマティクス及び計算生物学グループのウェブサイト、ｖｂａｓｅ２ウェブサイト、又はＩＭＧＴ（登録商標）、国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ情報システム（登録商標）のウェブサイトに記載される抗体ルール）に対するクエリとして使用して、生殖細胞系列配列と親抗体との間のフレームワーク領域のうちの１つ以上において親抗体によって使用される対応する生殖細胞系配列及びアミノ酸残基変異を識別することができる。次いで、生殖細胞系列配列に基づいて１つ以上のアミノ酸置換を親抗体に導入し、生殖細胞系バリアントを生成することができる。

【0087】

いくつかの例では、本明細書に記載の拮抗抗体は、ヒト抗体又はヒト化抗体である。代替的又は追加的に、拮抗抗体は、ｓｃＦｖである。例示的なｓｃＦｖ抗体を、以下に提供する。
ＩＬ－６／ＩＬ－６Ｒ ｓｃＦｖ １：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＳＳＷＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＧＡＳＳＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＳＹＹＣＱＱＡＮＳＦＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＲＦＴＦＤＤＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＧＩＳＷＮＳＧＲＩＧＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＥＮＳＬＦＬＱＭＮＧＬＲＡＥＤＴＡＬＹＹＣＡＫＧＲＤＳＦＤＩＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ（配列番号８）
ＩＬ－６／ＩＬ－６Ｒ ｓｃＦｖ ２：
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＳＡＳＩＳＶＳＹＭＹＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＭＳＮＬＡＳＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＭＱＷＳＧＹＰＹＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＰＦＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＫＩＳＰＧＧＳＷＴＹＹＳＤＴＶＴＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＱＬＷＧＹＹＡＬＤＩＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号９）
ＩＬ－６／ＩＬ－６Ｒ ｓｃＦｖ ３：
ＱＩＶＬＩＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＹＷＹＱＱＫＰＧＳＳＰＲＬＬＩＹＤＴＳＮＬＡＳＧＶＰＶＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＲＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＧＹＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＫＬＬＫＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＡＭＳＷＦＲＱＳＰＥＫＲＬＥＷＶＡＥＩＳＳＧＧＳＹＴＹＹＰＤＴＶＴＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＥＭＳＳＬＲＳＥＤＴＡＭＹＹＣＡＲＧＬＷＧＹＹＡＬＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ（配列番号２６）
ＩＬ－６／ＩＬ－６Ｒ ｓｃＦｖ ４：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＲＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＹＳＩＴＳＤＨＡＷＳＷＶＲＱＰＰＧＲＧＬＥＷＩＧＹＩＳＹＳＧＩＴＴＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＭＬＲＤＴＳＫＮＱＦＳＬＲＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＬＡＲＴＴＡＭＤＹＷＧＱＧＳＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＲＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＹＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＧＮＴＬＰＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２７）

【0088】

（ｉｉ）ＩＬ－１アンタゴニスト
インターロイキン－１は、当該技術分野において既知のサイトカインであり、２つのアイソフォーム、ＩＬ－１α及びＩＬ－１βを含む。ＩＬ－１は、急性炎症のアップレギュレーション及びダウンレギュレーション、並びに他の生物学的経路において重要な役割を果たす。

【0089】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される改変された免疫細胞において発現されるＩＬ－１アンタゴニストは、インターロイキン－１受容体アンタゴニスト（ＩＬ－１ＲＡ）であり得る。ＩＬ－１ＲＡは、免疫細胞、上皮細胞、及び脂肪細胞などの様々な種類の細胞によって分泌され得る、天然に存在するポリペプチドである。それは細胞表面のＩＬ－１Ｒ受容体に結合し、それによってＩＬ－１／ＩＬ－１Ｒ相互作用によって引き起こされる細胞シグナル伝達を防止する。ヒトＩＬ－１ＲＡは、ＩＬ１ＲＮ遺伝子によってコードされる。以下は、ヒトＩＬ－１ＲＡの例示的なアミノ酸配列である。

【化21】

【0090】

太字及び斜体のＮ末端断片は、天然ＩＬ－１ＲＡにおけるシグナルペプチドを指す。本出願で使用するＩＬ－１ＲＡは、上記ヒトＩＬ－１ＲＡの成熟ポリペプチドに対応するアミノ酸配列を含んでよい（シグナルペプチドを除く）。
ＲＰＳＧＲＫＳＳＫＭＱＡＦＲＩＷＤＶＮＱＫＴＦＹＬＲＮＮＱＬＶＡＧＹＬＱＧＰＮＶＮＬＥＥＫＩＤＶＶＰＩＥＰＨＡＬＦＬＧＩＨＧＧＫＭＣＬＳＣＶＫＳＧＤＥＴＲＬＱＬＥＡＶＮＩＴＤＬＳＥＮＲＫＱＤＫＲＦＡＦＩＲＳＤＳＧＰＴＴＳＦＥＳＡＡＣＰＧＷＦＬＣＴＡＭＥＡＤＱＰＶＳＬＴＮＭＰＤＥＧＶＭＶＴＫＦＹＦＱＥＤＥ（配列番号５１）

【0091】

場合によっては、このシグナルペプチドは、異なるシグナル配列、例えば、ＭＡＴＧＳＲＴＳＬＬＬＡＦＧＬＬＣＬＰＷＬＱＥＧＳＡ（配列番号２９）で置き換えられ得る。得られたＩＬ－１ＲＡは、次の全配列を有する。

【化22】

【0092】

他のＩＬ－１アンタゴニストとしては、抗ＩＬ－１α又は抗ＩＬ－１β抗体が挙げられる（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋｓ ＺＬ，ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ．１７（１）：９５－１０６）；米国特許第７，５３１，１６６号及び同第８，３８３，７７８号を参照されたい（これらの内容はそれらの全体が本明細書に組み込まれる））。

【0093】

（ｉｉｉ）インターフェロンガンマの改変
場合によっては、本開示は、ＩＦＮγの産生が低下した遺伝子改変された免疫細胞を提供する。そのような遺伝子改変された免疫細胞は、改変されていないそれらの野生型の対応物の細胞と比較して、ＩＦＮγを産生しないか又はより少ないＩＦＮγを産生する。患者の培養物中又はインビボにおけるＩＦＮγの量は、当該技術分野において既知の任意の方法によって、例えば、細胞培養培地のＥＬＩＳＡアッセイ又はそのような改変された細胞で処置された患者の血液ＩＦＮγレベルによって決定され得る。より少ないＩＦＮγとは、ＩＦＮγ発現を低下させるように改変されていないそれらの野生型の対応物の細胞と比較して、少なくとも１０％低いことを意味する。他の実施形態では、より少ないＩＦＮγは、ＩＦＮγ発現を低減するように改変されていない、それらの野生型の対応物の細胞と比較して、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％低いことを意味する。一実施形態では、ＩＦＮγの発現が低下した遺伝子改変された免疫細胞は、例えば、遺伝子編集によって、内因性ＩＦＮγ遺伝子をノックアウトしてもよい。いくつかの実施形態では、ＩＦＮγ発現が低下した遺伝子改変された免疫細胞は、細胞外抗原結合ドメイン、共刺激ドメイン、細胞質シグナル伝達ドメイン、又はそれらの組み合わせ、及び任意選択で膜貫通ドメインを含むＣＡＲを含んでもよい。遺伝子改変された免疫細胞は、ＩＬ－６アンタゴニストを更に含み得る。ＩＦＮγの産生が低下した遺伝子改変された免疫細胞のＣＡＲは、ＩＬ－２Ｒβ細胞質シグナル伝達ドメインを含んでよい。追加的又は代替的に、ＩＦＮγの産生が低下した遺伝子改変された免疫細胞は、ＩＬ－１アンタゴニストを含んでもよい。

【0094】

他の例では、本開示は、ＩＦＮγＲの発現が低下した遺伝子改変された免疫細胞を提供する。好ましくは、ＩＦＮγＲ１である。そのような遺伝子改変された免疫細胞は、それらの野生型の対応物と比べて、ＩＦＮγＲを発現しないか、ほとんど発現しないか、又はより少ないＩＦＮγＲを発現する。ＩＦＮγＲの量は、当技術分野において既知の任意の方法によって、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイによって決定され得る。より少ないＩＦＮγＲとは、ＩＦＮγＲ発現を低下させるように改変されていないそれらの野生型の対応物の細胞と比較して、少なくとも１０％低いことを意味する。一実施形態では、ＩＦＮγＲの発現が低下した遺伝子改変された免疫細胞は、例えば、遺伝子編集によって、内因性ＩＦＮγＲ遺伝子をノックアウトしてもよい。いくつかの実施形態では、ＩＦＮγＲ発現が低下した遺伝子改変された免疫細胞は、細胞外抗原結合ドメイン、共刺激ドメイン、細胞質シグナル伝達ドメイン、又はそれらの組み合わせ、及び任意選択で膜貫通ドメインを含むＣＡＲを含んでもよい。遺伝子改変された免疫細胞は、ＩＬ－６アンタゴニストを更に含み得る。ＣＡＲは、ＩＬ－２Ｒβ細胞質シグナル伝達ドメインを含み得る。

【0095】

一態様では、インビボでインターフェロンガンマ遮断をもたらすことができる遺伝子改変された免疫細胞も本明細書で提供される。インビボでのインターフェロンガンマ遮断は、ＩＦＮγ又はＩＦＮγＲ遺伝子のゲノム遺伝子編集を介して、又はＩＦＮγアンタゴニストを発現及び分泌することによって実現される。いくつかの実施形態では、遺伝子改変された免疫細胞は、インビボでインターフェロンガンマ遮断をもたらすことができ、細胞外抗原結合ドメイン、共刺激ドメイン、細胞質シグナル伝達ドメイン、又はそれらの組み合わせ、及び任意選択で膜貫通ドメインを含むＣＡＲを含んでもよい。遺伝子改変された免疫細胞は、ＩＬ－６アンタゴニストを更に含み得る。ＣＡＲは、ＩＬ－２Ｒβ細胞質シグナル伝達ドメインを含み得る。

【0096】

（ａ）ＩＦＮγ若しくはＩＦＮγＲ遺伝子ノックアウトを介したＩＦＮγシグナル伝達の遮断
ＩＦＮγ若しくはＩＦＮγＲ（例えば、Ｒ１サブユニット）遺伝子のゲノム遺伝子編集は、ＩＦＮγ若しくはＩＦＮγＲ遺伝子のいずれか、又はそれらの両方をノックアウトすることを目的とする。これにより、ＩＦＮγシグナル伝達によって開始される任意のＣＲＳが、利用可能なＩＦＮγリガンド若しくはＩＦＮγＲが少ない場合に、インビボで制限されることが想定される。

【0097】

したがって、破壊された内因性ＩＦＮγ若しくはＩＦＮγＲ遺伝子、又はそれらの両方を含む遺伝子改変された免疫細胞を本明細書で提供する。いくつかの実施形態では、内因性ＩＦＮγ若しくはＩＦＮγＲ遺伝子、又はそれらの両方が破壊された遺伝子改変された免疫細胞は、細胞外抗原結合ドメイン、共刺激ドメイン、細胞質シグナル伝達ドメイン、又はそれらの組み合わせ、及び任意選択で膜貫通ドメインを含むＣＡＲを含んでもよい。遺伝子改変された免疫細胞は、ＩＬ－６アンタゴニストを更に含み得る。代替的又は追加的に、遺伝子改変された免疫細胞は、ＩＦＮγアンタゴニストを更に含み得る。これらの改変された細胞におけるＣＡＲは、ＩＬ－２Ｒβ細胞質シグナル伝達ドメインを含んでもよい。

【0098】

宿主細胞における内因性遺伝子の発現をダウンレギュレートするための当該技術分野において既知の任意の方法を使用して、本明細書に記載のＩＦＮγ若しくはＩＦＮγＲの発現レベルを低下させることができる。ヒトＩＦＮγ及びＩＦＮγＲ１のゲノム情報は、ＧＥＮＢＡＮＫ遺伝子ＩＤ：３４５８及び遺伝子ＩＤ：３４５９にそれぞれ見出される。任意の遺伝子編集方法は、内因性対立遺伝子における標的領域を切断することができるエンドヌクレアーゼの使用を伴ってもよい。鋳型核酸の非相同末端結合は、ゲノム中の二本鎖切断を修復し、変異（例えば、挿入、欠失、及び／又はフレームシフト）を標的部位に導入し得る。

【0099】

いくつかの例では、ノックアウトイベントは、ノックインイベントと結合することができ、所望の分子（例えば、本明細書に記載のＩＬ－１ＲＡ）をコードする外因性核酸は、遺伝子編集を介してＩＦＮγ又はＩＦＮγＲ遺伝子のゲノム遺伝子座に挿入することができ、それによって、挿入の結果としての遺伝子発現を妨害する。

【0100】

場合によっては、ノックアウト改変のうちのいずれかは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、ｓｈＲＮＡ若しくはｓｉＲＮＡなどの干渉ＲＮＡ）又はリボザイムを使用して、当該技術分野において既知の方法を介して達成され得る。標的サイトカイン／タンパク質に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、サイトカインの内因性遺伝子の標的領域に相補的若しくは部分的に相補的であるオリゴヌクレオチド、又はそのようなものをコードするｍＲＮＡを指す。そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、従来の方法によって標的細胞に送達され得る。代替的に、レンチウイルスベクター又はその等価物などの発現ベクターを使用して、そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現することができる。

【0101】

代替的に、内因性ＩＦＮγ又はＩＦＮγＲ遺伝子のノックアウトは、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を用いたＣＲＩＳＰＲ技術などの遺伝子編集方法を用いて達成することができる。ＩＦＮγ遺伝子を破壊するために、ヒトＩＦＮγ遺伝子内のプロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を標的とするシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムとともに使用してもよい。ｓｇＲＮＡ分子は、スキャフォールド（ｓｃａｆｆｏｌｄ）ｔｒａｃｒＲＮＡ配列に融合したカスタム設計の短いｃｒＲＮＡ配列の両方を含有する。ＩＦＮγ ｓｇＲＮＡのインビトロ転写に使用されるＤＮＡ配列が本明細書に提供される。太字の配列は、ヒトＩＦＮγ遺伝子の第１のエクソンにおける標的ＰＡＭ配列である。

【化23】

【化24】

【化25】

【化26】

【化27】

【化28】

【化29】

【化30】

【0102】

ＩＦＮγＲ遺伝子を破壊するために、市販のＯｒｉＧＥＮＥからのＩＦＮγＲ１ヒト遺伝子ノックアウトキット（ＣＲＩＳＰＲ）カタログ番号ＫＮ２０２７６１を使用してもよい。そのようなキットを使用する方法は、当該技術分野において既知である。

【0103】

（ｂ）ＩＦＮγアンタゴニストを介したＩＦＮγシグナル伝達の遮断
本明細書に記載の遺伝子操作された免疫細胞のいくつかの実施形態では、細胞は、ＩＦＮγアンタゴニストを含む。他の実施形態では、ＩＦＮγアンタゴニストを含む遺伝子改変された免疫細胞が、本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、ＩＦＮγアンタゴニストを含む遺伝子組換え免疫細胞は、細胞外抗原結合ドメインを含むＣＡＲ、共刺激ドメイン、細胞質シグナル伝達ドメイン、又はそれらの組み合わせ、及び所望により膜貫通ドメインを含んでもよい。遺伝子改変された免疫細胞は、ＩＬ－６アンタゴニストを更に含み得る。代替的又は追加的に、遺伝子改変された免疫細胞は、破壊された内因性ＩＦＮγ若しくはＩＦＮγＲ遺伝子、又はそれらの両方を有し得る。これらの改変された細胞におけるＣＡＲは、ＩＬ－２Ｒβ細胞質シグナル伝達ドメインを含んでもよい。

【0104】

ＩＦＮγアンタゴニストは、三元ＩＦＮγ／ＩＦＮγＲ１／ＩＦＮγＲ２の形成を遮断する。ＩＦＮγ Ｒ１は、リガンド結合及びシグナル伝達に必要である。ＩＦＮγアンタゴニストは、拮抗性抗ＩＦＮγ抗体又はその抗原結合断片、分泌型ＩＦＮγ受容体又は受容体のリガンド結合断片、及び拮抗性抗ＩＦＮγＲ抗体又はその抗原結合断片であってもよく、それにより、ＩＦＮγアンタゴニストは、ＩＦＮγ／ＩＦＮγＲ相互作用及び下流シグナル伝達を遮断する。一実施形態では、ＩＦＮγアンタゴニストは、分泌される。拮抗性抗ＩＦＮγ抗体又はその抗原結合断片は、インビボで放出されるＩＦＮγリガンドに結合し、したがって、ＩＦＮγリガンドは、細胞表面上に発現するその天然受容体であるＩＦＮγＲ１と相互作用することができない。分泌型ＩＦＮγ受容体又はリガンド結合断片は、デコイ受容体として機能し、インビボで放出されるＩＦＮγリガンドを捕捉し、したがって、ＩＦＮγリガンドは、細胞表面上に発現されるその天然受容体であるＩＦＮγＲ１と相互作用することもできない。一実施形態では、分泌型ＩＦＮγＲ又はリガンド結合断片は、天然ヒトＩＦＮγ受容体の細胞外部分である。抗ＩＦＮγＲ抗体又はその抗原結合断片は、細胞上に発現されるＩＦＮγ受容体に結合し、ＩＦＮγリガンドと、２つのＩＦＮγＲ１及び２つのＩＦＮγＲ２サブユニットを含有する完全な受容体複合体の受容体並びに結果として生じるリガンド誘導アセンブリとの相互作用を防止する。完全受容体複合体は、ＩＦＮγシグナル伝達経路に必要である。

【0105】

一実施形態では、拮抗性抗ＩＦＮγ抗体又はその抗原結合断片は、抗ＩＦＮγ ｓｃＦｖなどの抗体のｓｃＦｖである。ＳｃＦｖは、ペプチドリンカーと連結された可変重鎖（Ｖ_Ｈ）及び可変軽鎖（Ｖ_Ｌ）抗体からなる。抗ＩＦＮγ ｓｃＦｖを構築するための抗ＩＦＮγ抗体からのＶ_Ｈ及びＶ_Ｌの非限定的な例は以下の通りである：
Ｖ_Ｌ：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＴＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＥＮＶＤＴＹＶＳＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＧＡＳＮＲＹＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＡＴＹＹＣＧＱＳＹＮＹＰＦＴＦＧＱＧＴＫＶＥＶＫＲ（配列番号５２）
Ｖ_Ｈ：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＬＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＩＦＴＳＳＷＩＮＷＶＫＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＲＩＤＰＳＤＧＥＶＨＹＮＱＤＦＫＤＫＡＴＬＴＶＤＫＳＴＮＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＦＬＰＷＦＡＤＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号５３）
Ｖ_Ｌ：
ＮＦＭＬＴＱＰＨＳＶＳＥＳＰＧＫＴＶＴＩＳＣＴＲＳＳＧＳＩＡＳＮＹＶＱＷＹＱＱＲＰＧＳＳＰＴＴＶＩＹＥＤＮＱＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＩＤＳＳＳＮＳＡＳＬＴＩＳＧＬＫＴＥＤＥＡＤＹＹＣＱＳＹＤＧＳＮＲＷＭＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ（配列番号５５）
Ｖ_Ｈ：
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＤＧＳＳＧＷＹＶＰＨＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号５６）
Ｖ_Ｌ：
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＲＳＧＧＳＳＦＴＦＧＰＧＴＫＶＤＩＫ（配列番号５８）
Ｖ_Ｈ：
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＩＳＣＫＧＳＧＹＮＦＴＳＹＷＩＧＷＶＲＱＭＰＧＫＧＬＥＬＭＧＩＩＹＰＧＤＳＤＴＲＹＳＰＳＦＱＧＱＶＴＩＳＡＤＫＳＩＳＴＡＹＬＱＷＳＳＬＫＡＳＤＴＡＭＹＹＣＧＳＧＳＹＦＹＦＤＬＷＧＲＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号５９）

【0106】

抗ＩＦＮγ ｓｃＦｖの非限定的な例は、以下の通りであり、柔軟性グリシン－セリンペプチドリンカーは太字で示されている。

【化31】

【化32】

【化33】

【0107】

いくつかの実施形態では、抗ＩＦＮΓ ＳＣＦＶは、配列番号５３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号５２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むか、又は配列番号５６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号５５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むか、又は配列番号５９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号５８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。更なる実施形態では、抗ＩＦＮΓ ＳＣＦＶは、配列番号５４、５７、又は６０のアミノ酸配列を含む。

【0108】

他の拮抗性抗ＩＦＮγ抗体又はその抗原結合断片は、参照によりその全体が組み込まれる米国特許第９，６８２，１４２号に見出すことができる。

【0109】

可溶性ＩＦＮγＲ断片は、当該技術分野において既知であり、例えば、天然ヒトＩＦＮγ受容体の細胞外部分は、米国特許第５，５７８，７０７号及び同第７，４４９，１７６号に記載されている。高親和性ＩＦＮγ受容体複合体は、Ｉ型膜タンパク質であるＩＦＮγＲ１（ＩＦＮγＲα）及びＩＦＮγＲ２（ＩＦＮγＲβ）の２つの型で構成されている。両方のタンパク質は、ＩＩ型サイトカイン受容体ファミリーのメンバーであり、全体の配列同一性の約５２％を共有する。ＩＦＮγＲ１は、ＩＦＮγ結合及び受容体の内在化に必要かつ十分であるリガンド結合サブユニットである。ＩＦＮγＲ２は、ＩＦＮγシグナル伝達に必要とされるが、それ自体ではＩＦＮγとは結合しない。ヒトＩＦＮγＲ１ ｃＤＮＡは、１７ａａのシグナルペプチド、２２８ａａの細胞外ドメイン、２３ａａの膜貫通ドメイン、及び２２１ａａの細胞内ドメインを有する４９９個のアミノ酸（ａａ）残基のタンパク質をコードする。ＩＦＮγシグナル伝達に拮抗する可溶性ＩＦＮγＲ断片は、２２８ａａの細胞外ドメインを含み得る。

【0110】

米国特許第４，８９７，２６４号及び同第７，４４９，１７６号に記載される拮抗性抗ＩＦＮγＲ抗体又はその抗原結合断片。これらの特許の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0111】

本明細書に記載のＩＦＮγアンタゴニストのいくつかの実施形態では、ＩＦＮγアンタゴニストは、ＩＦＮγアンタゴニストのＮ末端に位置するシグナルペプチドを更に含んでもよく、任意選択で、シグナルペプチドは、アルブミン、ＣＤ８、成長ホルモン、ＩＬ－２、抗体軽鎖、及びＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼ、又はその改変バージョンから選択される。例えば、以下の通りである：ＣＤ８シグナルペプチド、ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ（配列番号４４）；抗体軽鎖シグナルペプチド、ＭＫＹＬＬＰＴＡＡＡＧＬＬＬＬＡＡＱＰＡＭＡ（配列番号４５）；Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼシグナルペプチド、ＭＧＶＫＶＬＦＡＬＩＣＩＡＶＡＥＡ（配列番号４６）；ヒトアルブミンシグナルペプチド、ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳ（配列番号４７）；改変されたヒトアルブミンシグナルペプチド、ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＳＳＲＡ（配列番号４８）；改変されたＩＬ２シグナルペプチド、ＭＲＲＭＱＬＬＬＬＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号４９）；成長ホルモンシグナルペプチド、ＭＡＴＧＳＲＴＳＬＬＬＡＦＧＬＬＣＬＰＷＬＱＥＧＳＡ（配列番号２９）；及び天然ＩＬ－ＩＲＡシグナルペプチドで、ＭＡＬＥＴＩＣ（配列番号５０）。

【0112】

本明細書に開示される改変された免疫細胞は、１つ以上の炎症性タンパク質（例えば、炎症性サイトカイン若しくはその可溶性受容体、炎症性成長因子若しくは細胞傷害性分子）のノックアウト、炎症性タンパク質若しくは免疫抑制性サイトカインの１つ以上のアンタゴニストのノックイン、又はそれらの組み合わせを更に含んでもよい。

【0113】

例示的な炎症性サイトカイン又はその可溶性受容体としては、インターロイキン１アルファ（ＩＬ１α）、インターロイキン１ベータ（ＩＬ１β）、インターロイキン２（ＩＬ－２）、インターロイキン５（ＩＬ－５）、インターロイキン６（ＩＬ－６）、インターロイキン７（ＩＬ－７）、インターロイキン８（ＩＬ－８）、インターロイキン９（ＩＬ－９）、インターロイキン（ＩＬ－１２）、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）、インターロイキン１７（ＩＬ－１７）、インターロイキン１８（ＩＬ－１８）、インターロイキン２１（ＩＬ－２１）、インターロイキン２３（ＩＬ－２３）、ｓＩＬ－１ＲＩ、ｓＩＬー２Ｒα、可溶性ＩＬ－６受容体（ｓＩＬ－６Ｒ）、インターフェロンα（ＩＦＮα）、インターフェロンβ（ＩＦＮβ）、マクロファージ炎症性タンパク質（例えば、ＭＩＰα及びＭＩＰβ）、マクロファージコロニー刺激因子１（ＣＳＦ１）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカインリガンド１０（ＣＸＣＬ１０）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド５（ＣＣＬ５）、エオタキシン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ１）、インターフェロンガンマ誘導性モノカイン（ＭＩＧ）、終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、アンジオポイエチン－２、及びヴォン・ヴィレブランド因子（ＶＷＦ）が挙げられる。

【0114】

標的炎症性タンパク質の例としては、炎症性サイトカイン又はその可溶性受容体（例えば、ＩＬ２、ＩＬ１α、ＩＬ１β、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ｓＩＬ－１ＲＩ、ｓＩＬ－２Ｒα、ｓＩＬ－６Ｒ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＭＩＰα、ＭＩＰβ、ＣＳＦ１、ＬＩＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ５、エオタキシン、ＴＮＦ、ＭＣＰ１、ＭＩＧ、ＲＡＧＥ、ＣＲＰ、アンジオポエチン－２、及びＶＷＦ）、炎症性増殖因子（例えば、ＴＧＦα、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＨＧＦ、及びＦＧＦ）、並びに細胞傷害性分子（例えば、パーフォリン、グランザイム、及びフェリチン）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0115】

（ｉｖ）改変された免疫細胞の集団
また、ＣＡＲを含む改変された免疫細胞、ＩＬ－６拮抗性抗体（例えば、ｓｃＦｖ１又はｓｃＦｖ２）を含む改変された免疫細胞、ＩＬ－１アンタゴニストを含む改変された免疫細胞、破壊されたＩＦＮγ遺伝子を含む改変された免疫細胞、ＩＦＮγアンタゴニストを含む改変された免疫細胞、又は本明細書に記載されるそれらの組み合わせの１つ以上の集団が本明細書に提供される。ＩＬ－６アンタゴニスト、ＩＦＮγアンタゴニスト、及びＩＬ－１アンタゴニストのうちの１つ以上は、免疫細胞のノックイン改変であり得る。

【0116】

一実施形態では、少なくとも１つの免疫細胞の集団は、ＣＡＲを含む。別の実施形態では、少なくとも１つの免疫細胞の集団は、抗原特異的ＴＣＲを含む。そのようなＴＣＲの作製方法は、米国特許第１０，１１７，９１８号、及び米国特許公開第２０１９／０１６９２６１号に記載されており、その内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、遺伝子改変された免疫細胞は、ＩＬ－６アンタゴニスト（例えば、ｓｃＦｖ１若しくはｓｃＦｖ２などの抗ＩＬ－６アンタゴニスト抗体）、ＩＦＮγアンタゴニスト（例えば、ＡｍＧ８１１などの抗ＩＦＮγアンタゴニスト抗体）、及び／又はＩＬ－１ＲＡなどのＩＬ－１アンタゴニストのノックイン改変を含んでもよい。本明細書に記載される免疫細胞は、ＴＣＲ、ＣＤ５２、ＩＦＮγ、Ｂ２Ｍ、及びＧＭ－ＣＳＦのうちの１つ以上を発現しない場合がある。免疫細胞における発現の欠如は、それぞれの内因性遺伝子（複数可）の破壊（例えば、ノックアウト）に起因し得る。ＣＤ５２は、ＵＣＡＲＴを産生するための重要なマーカーである。免疫細胞における改変の組み合わせの例としては、Ｂ２Ｍノックアウト及びＩＬ－１アンタゴニスト、ＧＭ－ＣＳＦノックアウト及びＩＬ－１アンタゴニスト、ＣＤ５２ノックアウト及びＩＬ－１アンタゴニスト、ＴＣＲノックアウト及びＩＬ－１アンタゴニスト、ＧＭ－ＣＳＦノックアウト及びＩＬ－６アンタゴニスト、Ｂ２Ｍノックアウト及びＩＬ－６アンタゴニスト、ＣＤ５２ノックアウト及びＩＬ－６アンタゴニスト、並びにＴＣＲノックアウト及びＩＬ－６アンタゴニストが挙げられる。

【0117】

本明細書に開示される改変された免疫細胞は、ＣＡＲ、拮抗性ＩＬ－６抗体、ＩＬ－１アンタゴニスト、ＩＦＮγアンタゴニスト、又はそれらの組み合わせを発現するためのノックイン改変を含む。ノックイン改変は、宿主細胞（例えば、本明細書に記載される免疫細胞）に、本明細書に開示されるＣＡＲ、ＩＬ－６アンタゴニスト抗体、ＩＬ－１アンタゴニスト若しくはＩＦＮγアンタゴニスト、又はそれらの組み合わせをコードする１つ以上の外因性核酸を送達することを含み得る。外因性核酸は、コードされたタンパク質（例えば、サイトカインアンタゴニスト及び／又は免疫抑制性サイトカイン）が宿主細胞で発現され得るように、好適なプロモーターに作動可能に連結している。場合によっては、ＣＡＲ、ＩＬ－６拮抗性抗体、ＩＦＮγアンタゴニスト及びＩＬ－１アンタゴニスト、又はそれらの組み合わせをコードする外因性核酸は、宿主細胞のゲノムに組み込まれ得る。他の場合では、外因性核酸は、染色体外のままであってもよい（ゲノムに組み込まれていない）。

【0118】

１つ以上のノックイン改変を含む改変された免疫細胞は、本明細書に記載される１つ以上の標的炎症性タンパク質の免疫抑制性サイトカイン及び／又はアンタゴニストを発現するための１つ以上の外因性核酸（例えば、外因性発現カセット）を含み得る。本開示の目的のために、「アンタゴニスト」という用語は、標的タンパク質自体、標的タンパク質の生物学的活性、又は生物学的活性の結果が、任意の有意義な程度、例えば、少なくとも２０％、５０％、７０％、８５％、９０％、又はそれ以上で実質的に無効化、減少、又は中和される、全ての以前に識別された用語、タイトル、及び機能的状態並びに特徴を包含することが明確に理解されるであろう。

【0119】

改変された免疫細胞の集団は、ＣＡＲ、ＩＬ－６アンタゴニスト、及びＩＬ－１アンタゴニストを含む免疫細胞の１つ以上の集団を含んでもよい。１つ以上の集団は、重複し得る。一例では、免疫細胞の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、又は８０％、又は前述の量のうちの２つの間の範囲は、ＣＡＲ又は抗原特異的ＴＣＲ、ＩＬ－６アンタゴニスト、及びＩＬ－１アンタゴニストを発現する。例えば、免疫細胞の少なくとも１０％は、ＩＬ－６アンタゴニスト、及びＩＬ－１アンタゴニストを発現し得る。別の実施形態では、免疫細胞の約５０～７０％は、ＣＡＲ、ＩＬ－６アンタゴニスト、及びＩＬ－１アンタゴニストを発現し得る。別の例では、免疫細胞の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、又は８０％、又は前述の量のうちの２つの間の範囲は、ＣＡＲ又は抗原特異的ＴＣＲ、ＩＬ－６アンタゴニスト、及びＩＦＮγアンタゴニストを発現する。例えば、免疫細胞の少なくとも１０％は、ＩＬ－６アンタゴニスト、及びＩＦＮγアンタゴニストを発現し得る。別の実施形態では、免疫細胞の約５０～７０％は、ＣＡＲ、又は抗原特異的ＴＣＲ、ＩＬ－６アンタゴニスト、及びＩＦＮγアンタゴニストを発現し得る。ＣＡＲ又は抗原特異的ＴＣＲを含み、インビボでインターフェロン遮断をもたらすことができる改変された免疫細胞の集団も企図される。例えば、改変された免疫細胞は、ＩＦＮγアンタゴニストを有するか、又は破壊されたＩＦＮγ遺伝子を有するか、又はその両方の組み合わせを有する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ又は抗原特異的ＴＣＲ、及びＩＦＮγアンタゴニスト、又は破壊されたＩＦＮγ遺伝子、又はその両方の組み合わせを含む免疫細胞の１つ以上の集団を含む改変された免疫細胞集団が、本明細書で提供される。

【0120】

いくつかの実施形態では、本開示は、遺伝子操作された免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団であって、免疫細胞の約５～５０％が、ＣＡＲ又は抗原特異的ＴＣＲ（例えば、本明細書に開示される任意のＣＡＲ構築物）、及びＩＬ－１アンタゴニストを発現し、免疫細胞の少なくとも５０％（例えば、７０％）が、破壊された内在性ＩＦＮγ及び／又はＧＭ－ＣＳＦ遺伝子を有する、集団を提供する。代替的又は追加的に、免疫細胞の約５～５０％は、本明細書に開示されるものなどの抗ＩＬ６拮抗性抗体及び／又は抗ＩＦＮγ拮抗性抗体を発現し得る。更に追加的に、これらの遺伝子操作された免疫細胞の集団は、免疫細胞の約５～５０％の細胞がＩＬ－１アンタゴニストを発現してもよく、又は免疫細胞の約５～５０％の細胞が、ＧＭ－ＣＳＦアンタゴニストを発現してもよいことを含み得る。

【0121】

本明細書に記載の免疫細胞集団は、外因性サイトカイン、キメラｓｙｎＮｏｔｃｈ受容体、キメラ免疫受容体、キメラ共刺激性受容体、キメラキラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、及び／又は外因性Ｔ細胞受容体を発現するように更に改変され得る。これは、ノックイン及び／又はノックアウト改変の前に、後に、又は同時に行うことができる。そのような受容体は、日常的な組換え技術を使用して、クローニングされ、任意の好適な発現ベクターに組み込まれ得る。キメラ抗原受容体の設計に関する考慮事項も当該技術分野において既知である例えば、Ｓａｄｅｌａｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ，Ｄｉｓｃｏｖ．，３（４）：３８８－９８，２０１３を参照されたい。

【0122】

いくつかの実施形態では、免疫細胞は、例えば、限定されないが、幹細胞に由来し得る。幹細胞は、成体幹細胞、非ヒト胚性幹細胞、より具体的には、非ヒト幹細胞、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髄幹細胞、人工多能性幹細胞、全能性幹細胞又は造血幹細胞であり得る。代表的なヒト細胞は、ＣＤ３４＋細胞である。本明細書に開示される免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞、骨髄由来抑制細胞、間葉系幹細胞、それらの前駆体、又はそれらの組み合わせであってもよい。Ｔ細胞は、炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、制御性Ｔリンパ球、又はヘルパーＴリンパ球からなる群から選択され得る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔリンパ球及びＣＤ８＋Ｔリンパ球からなる群に由来し得る。

【0123】

ＩＬ－６アンタゴニスト及びＩＬ－１アンタゴニストを含む、ＣＡＲ－Ｔ細胞に対する特定のノックイン及びノックアウト遺伝子組換えは、ＷＯ２０１９／１７８２５９及びＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０１２３２９に見出すことができ、これらの各々の関連開示は、本明細書に開示される目的及び主題のために参照により組み込まれる。

【0124】

具体的には、本明細書には、（ａ）破壊された内因性ＩＦＮγ遺伝子若しくはＩＦＮγＲ遺伝子、又は（ｂ）ＩＦＮγアンタゴニスト、若しくはそれらの両方の組み合わせを含み、それにより、細胞がインビボでのインターフェロンガンマシグナル伝達を阻害する、遺伝子操作された免疫細胞が提供される。遺伝子操作された細胞は、ＩＦＮγシグナル遮断に加えて、ＣＡＲ又は抗原特異的ＴＣＲを更に含み得る。ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメイン、共刺激シグナル伝達、細胞質シグナル伝達ドメインであり得る細胞質ドメイン、又はそれらの組み合わせを含み得る。ＣＡＲは、共刺激シグナル伝達を伴うＩＬ－２Ｒβ細胞質シグナル伝達ドメインを含み得る。例えば、ＣＡＲは、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、ＩＬ－２Ｒβ細胞質シグナル伝達ドメイン、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン、及び任意選択に、膜貫通ドメイン、ヒンジドメイン、並びに／又はＳＴＡＴ３結合部位を含み得る。例えば、遺伝子操作された免疫細胞は、ＣＡＲ、ＩＦＮγアンタゴニスト、及びＩＬ－６アンタゴニストを含み得る。遺伝子操作された免疫細胞は、ＩＬ－１アンタゴニストを更に含み得る。代替的に、遺伝子操作された免疫細胞は、ＣＡＲ、破壊された内因性ＩＦＮγ遺伝子若しくはＩＦＮγＲ遺伝子、ＩＦＮγアンタゴニスト、及びＩＬ－６アンタゴニストを含んでよい。遺伝子操作された免疫細胞は、ＩＬ－１アンタゴニストを更に含み得る。別の実施形態では、遺伝子操作された免疫細胞は、ＣＡＲ、破壊された内因性ＩＦＮγ遺伝子又はＩＦＮγＲ遺伝子、及びＩＬ－６アンタゴニストを含み得る。遺伝子操作された免疫細胞は、ＩＬ－１アンタゴニストを更に含み得る。

【0125】

ＩＩＩ．改変された免疫細胞を調製する方法
ノックイン及びノックアウト改変のうちのいずれかは、本明細書に記載の日常的な方法及び／又はアプローチによって、好適な免疫細胞に導入することができる。典型的には、そのような方法は、標的内因性炎症性タンパク質の発現をダウンレギュレートするか、目的のサイトカインアンタゴニストを発現させるか、又は目的の免疫抑制性サイトカインを発現させるかのいずれかを行うために、好適な免疫細胞内への遺伝物質の送達を伴う。

【0126】

（Ａ）ノックイン改変
本明細書に記載の１つ以上のＣＡＲ、ＩＬ－６アンタゴニスト、ＩＦＮγアンタゴニスト、及びＩＬ－１アンタゴニストのノックインを生成するために、１つ以上のＣＡＲ、ＩＬ－６アンタゴニスト、ＩＦＮγアンタゴニスト、及びＩＬ－１アンタゴニストのコード配列を、好適な発現ベクター（例えば、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクター、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクター、及びＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンベクターが、挙げられるが、これらに限定されない）にクローニングし、従来の組換え技術を使用して宿主免疫細胞に導入され得る。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ。その結果、本開示の改変された免疫細胞は、少なくとも１つのＣＡＲ、ＩＬ－６アンタゴニスト、ＩＦＮγアンタゴニスト又はＩＬ－１アンタゴニストをコードする１つ以上の外因性核酸を含み得る。場合によっては、そのような分子のコード配列は、細胞のゲノムに組み込まれる。場合によっては、そのような分子のコード配列は、細胞のゲノムには組み込まれない。

【0127】

目的のコード配列を含む外因性核酸は、更に、コード配列に作動可能に連結し得る好適なプロモーターを含み得る。本明細書で使用される場合、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼが結合して（例えば、サイトカインアンタゴニストのために）コードＤＮＡのｍＲＮＡへの転写を開始することができる核酸上のヌクレオチド配列（部位）を指し、その後、それは対応するタンパク質に翻訳される（例えば、遺伝子の発現）。プロモーターは、コード配列に対して正しい機能的位置及び方向にあり、そのコード配列の転写開始及び発現を制御する（「駆動する」）（対応するタンパク質分子を生成する）場合、コード配列に「作動可能に連結されている」とみなされる。場合によっては、本明細書に記載のプロモーターは、他の調節因子に依存しない転写を開始する、構成的であり得る。いくつかの例では、本明細書に記載のプロモーターは、転写の調節因子に依存する、誘導性であり得る。例示的なプロモーターとしては、ユビキチン、ＲＳＶ、ＣＭＶ、ＥＦ１α、及びＰＧＫ１が挙げられるが、これらに限定されない。一例では、本明細書に記載の１つ以上の炎症性サイトカインの１つ以上のアンタゴニストをコードする１つ以上の核酸を、１つ以上の好適なプロモーターに作動可能に連結して、従来の方法を介して免疫細胞に導入して、１つ以上のアンタゴニストの発現を駆動させることができる。

【0128】

更に、本明細書に記載の外因性核酸は、例えば、哺乳動物細胞における安定又は一過性のトランスフェクタントの選択のためのネオマイシン遺伝子などの選択可能なマーカー遺伝子、高レベルの転写のためのヒトＣＭＶの最初期遺伝子からのエンハンサー／プロモーター配列、ｍＲＮＡ安定性のための転写終結及びＲＮＡプロセシングシグナル、複製のＳＶ４０ポリオーマ起点及び適切なエピソーム複製のためのＣｏｌＥ１、汎用性の高い複数のクローニング部位、並びにセンス及びアンチセンスＲＮＡのインビトロ転写のためのＴ７及びＳＰ６ ＲＮＡプロモーターのうちのいくつか又は全てを更に含有してもよい。導入遺伝子を含有するベクターを産生するための好適な方法は、当該技術分野において周知であり、かつ利用可能である。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ。

【0129】

場合によっては、１つ以上のＣＡＲ、ＩＬ－６アンタゴニスト、ＩＦＮγアンタゴニスト、又はＩＬ－１アンタゴニストは、様々な分子が別個のポリペプチドとして発現されるように、マルチシストロン様式で、１つの発現カセット内に構築され得る。いくつかの例では、内部リボソーム侵入部位を２つのコード配列の間に挿入して、この目標を達成することができる。代替的に、自己切断ペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、Ｔ２Ａ又はＰ２Ａ）を、２つのコード配列の間に挿入することができる。そのようなマルチシストロン発現カセットの例示的な設計を以下の実施例に提供する。

【0130】

（Ｂ）ノックアウト改変
宿主細胞における内因性遺伝子の発現をダウンレギュレートするための当該技術分野において既知の任意の方法を使用して、本明細書に記載の標的内因性サイトカイン／タンパク質の産生のレベルを低下させることができる。遺伝子編集方法は、内因性対立遺伝子における標的領域を切断することができるエンドヌクレアーゼの使用を伴ってもよい。鋳型核酸の非相同末端結合は、ゲノム中の二本鎖切断を修復し、変異（例えば、挿入、欠失、及び／又はフレームシフト）を標的部位に導入し得る。遺伝子編集方法は、一般に、標的核酸における二本鎖切断の生成に関与するエンドヌクレアーゼの種類に基づいて分類される。例としては、クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）／エンドヌクレアーゼ系、転写活性化因子様エフェクターベースヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、エンドヌクレアーゼ（例えば、ＡＲＣホーミングエンドヌクレアーゼ）、メガヌクレアーゼ（例えば、メガ－ＴＡＬ）、又はそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

【0131】

改変メガヌクレアーゼを含む、メガヌクレアーゼを使用する種々の遺伝子編集システムが、当該技術分野に記載されており、例えば、Ｓｔｅｅｎｔｏｆｔ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２４（８）：６６３－８０，２０１４、Ｂｅｌｆｏｒｔ ａｎｄ Ｂｏｎｏｃｏｒａ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１１２３：１－２６，２０１４、Ｈａｆｅｚ ａｎｄ Ｈａｕｓｎｅｒ，Ｇｅｎｏｍｅ５５（８）：５５３－６９，２０１２によるレビュー及びそれらに引用される参考文献を参照されたい。いくつかの例では、ノックアウトイベントはノックインイベントと結合することができ、本明細書に記載されるものなどの所望の分子をコードする外因性核酸は、遺伝子編集を介して目的の標的内因性遺伝子の遺伝子座に挿入することができる。

【0132】

場合によっては、内在性遺伝子のノックアウトは、ＣＲＩＳＰＲ技術を使用して達成され得る。例示的な標的内因性遺伝子は、ＴＣＲ、ＣＤ５２、ＩＦＮ－γ、Ｂ２Ｍ、及びＧＭ－ＣＳＦのうちの１つ以上を含む。

【0133】

代替的に、ノックアウト改変うちのいずれかは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、ｓｈＲＮＡ若しくはｓｉＲＮＡなどの干渉ＲＮＡ）又はリボザイムを使用して、当該技術分野において既知の方法を介して達成され得る。標的サイトカイン／タンパク質に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、サイトカインの内因性遺伝子の標的領域に相補的若しくは部分的に相補的であるオリゴヌクレオチド、又はそのようなものをコードするｍＲＮＡを指す。そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、従来の方法によって標的細胞に送達され得る。代替的に、レンチウイルスベクター又はその等価物などの発現ベクターを使用して、そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現することができる。

【0134】

（Ｃ）改変された免疫細胞を含む免疫細胞集団の調製
本明細書に記載の改変された免疫細胞、又はそれらの組み合わせのうちのいずれかを含む免疫細胞の集団は、宿主免疫細胞の集団に、ノックイン改変、ノックアウト改変、又はそれらの組み合わせの１つ以上を導入することによって調製され得る。ノックイン及びノックアウト改変は、任意の順序で宿主細胞に導入され得る。

【0135】

場合によっては、１つ以上の改変は、前の改変イベントの後、及び次の改変イベントの前に、改変された細胞の単離及び／又は濃縮を伴わずに、順次、宿主細胞に導入される。その場合、得られる免疫細胞集団は、異なる改変又は異なる改変の組み合わせを有する細胞を含む、不均一であり得る。そのような免疫細胞集団は、非改変免疫細胞も含み得る。免疫細胞集団で生じる各改変イベントのレベルは、宿主免疫細胞の総数に対して、そのような改変を誘導する遺伝物質の量によって制御することができる。また、上記の議論も参照されたい。

【0136】

他の場合には、改変された免疫細胞は、第２の改変イベントを実行する前に、第１の改変イベントの後に単離され、濃縮され得る。このアプローチは、細胞に導入された全てのノックイン及び／又はノックアウト改変を有する実質的に均質な免疫細胞集団の生成をもたらすであろう。

【0137】

いくつかの例では、ノックイン改変及びノックアウト改変は、宿主免疫細胞に別々に導入される。例えば、ノックアウト改変は、標的サイトカインの内因性遺伝子をノックアウトするための遺伝子編集を介して行われ、ノックイン改変は、１つ以上のサイトカインアンタゴニストを産生するための別個の外因性発現カセットを宿主免疫細胞に送達することによって行われる。場合によっては、ノックイン及びノックアウトイベントは同時に発生することができ、例えば、ノックインカセットは、ノックアウトされる標的遺伝子の遺伝子座に挿入され得る。

【0138】

ＩＶ．治療的用途
本明細書に記載の改変された免疫細胞を含む免疫細胞集団のうちのいずれかは、白血病又はリンパ腫などの標的疾患を治療するための養子免疫細胞療法（例えば、ＣＡＲ－Ｔ）で使用され得る。免疫細胞、特にＣＡＲのノックイン、ＩＬ－６拮抗性抗体のノックイン、ＩＦＮγアンタゴニスト、ＩＬ－１アンタゴニスト、又はこれらの組み合わせに導入されたノックイン及びノックアウト改変により、そのような治療的用途は、治療中の患者において治療細胞の増殖を改善する、及び／又はサイトカイン毒性を低減すると同時に、同じ若しくはより良好な治療効果を達成することが期待される。

【0139】

本明細書に記載の治療方法を実施するために、本明細書に記載の改変された免疫細胞のうちのいずれかを含む有効量の免疫細胞集団を、好適な経路（例えば、静脈内注入）を介して治療を必要とする対象に投与することができる。１つ以上の免疫細胞集団を薬学的に許容される担体と混合して、投与前に薬学的組成物を形成することができ、これも本開示の範囲内である。免疫細胞は、対象に対して自己由来であってもよく、例えば、免疫細胞は、治療を必要とする対象から得られ、本明細書に記載の１つ以上のサイトカインアンタゴニストを発現させるために、ＣＡＲ構築物及び／若しくは外因性ＴＣＲ、又はそれらの組み合わせを発現するために、１つ以上の標的サイトカイン／タンパク質（例えば、本明細書に記載されるもの）の発現を低減させるように改変される。次いで、得られた改変された免疫細胞を、同じ対象に投与することができる。対象への自己細胞の投与は、非自己細胞の投与と比較して、免疫細胞の拒絶反応の低減をもたらし得る。代替的に、免疫細胞は、同種異系細胞であってもよく、例えば、細胞は、第１の対象から得られ、本明細書に記載されるように改変され、第１の対象とは異なるが同じ種の第２の対象に投与される。例えば、同種異系免疫細胞は、ヒトドナーに由来し、ドナーとは異なるヒトレシピエントに投与され得る。

【0140】

処置される対象は、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ブタ、ウシ、ラット、イヌ、モルモット、ウサギ、ハムスター、ネコ、ヤギ、ヒツジ、又はサル）であり得る。対象は、がんに罹患している、感染症を有しているか、又は免疫障害を有し得る。例示的ながんとしては、血液悪性腫瘍（例えば、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病、及び多発性骨髄腫）が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な感染症としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）感染症、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染症、デングウイルス感染症、マラリア、敗血症及び大腸菌感染症が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な免疫疾患としては、関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発性ニューロパシー、乾癬、グレイブス病、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、及び血管炎などの自己免疫疾患が挙げられるが、これらに限定されない。

【0141】

いくつかの例では、本明細書で開示される方法で治療される対象は、ヒトがん患者であり得る。いくつかの例では、がんは、リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ芽球性白血病、マントル細胞リンパ腫、大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、又は非ホジキンリンパ腫であり得る。特に、そのようながんを治療するために、免疫細胞は、ＣＤ１９に結合するＣＡＲを発現し得る。いくつかの例では、がんは、多発性骨髄腫、再発性多発性骨髄腫、又は難治性多発性骨髄腫であり得る。特に、そのようながんを治療するために、免疫細胞は、ＢＣＭＡに結合するＣＡＲを発現し得る。代替的に、ヒト患者は、乳がん、胃がん、神経芽腫、又は骨肉腫を有し得る。

【0142】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞は、Ｂ細胞関連がんの治療に有用である。非限定的なＢ細胞関連がんとしては、多発性骨髄腫、悪性形質細胞腫瘍、ホジキンリンパ腫、結節性リンパ球優性ホジキンリンパ腫、ケーラー病及び骨髄腫症、形質細胞白血病、形質細胞腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、有毛細胞白血病、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性骨髄白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、濾胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、辺縁帯リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、大細胞リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、骨髄性白血病、ヴァルデンストロームマクログロブリン血症、大細胞拡散性Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫、小細胞リンパ球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、原発性縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、リンパ形質形成性リンパ腫、ヴァルデンストロームマクログロブリン血症、結節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾縁帯リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性浸潤リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症、Ｔ細胞／組織球豊富な大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性皮膚びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（脚型）、高齢者のＥＢＶ陽性びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、炎症に伴うびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、大細胞型ＡＬＫ陽性リンパ腫Ｂ細胞リンパ腫、形質芽球性リンパ腫、ＨＨＶ８関連多中心性キャッスルマン病に起因する大Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫とバーキットリンパ腫との間の特徴を有する未分類Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫と古典的ホジキンリンパ腫との間の中間的な特徴を有する未分類Ｂ細胞リンパ腫、及び他のＢ細胞関連リンパ腫が挙げられる。

【0143】

本明細書で使用される「有効量」という用語は、対象に治療効果を付与するために必要な各活性剤の、単独の量又は１つ以上の活性剤を組み合わせた量を指す。有効量は、治療される特定の状態、状態の重症度、年齢、体調、サイズ、性別並びに体重を含む個々の患者パラメータ、治療期間、投与経路、賦形剤の使用、他の活性薬剤（もしあれば）との共用、及び医療従事者の知識並びに専門知識内の同様の要因に応じて、当業者によって認識されるように変化する。投与される量は、治療される対象に依存し、例えば、個体の免疫系が細胞媒介性免疫応答を産生する能力が含まれる。投与される必要がある有効成分の正確なマウント（ｍｏｕｎｔｓ）は、施術者の判断に依存する。しかしながら、好適な投与範囲は当業者によって容易に決定可能である。

【0144】

本明細書で使用される「治療する」という用語は、標的疾患、標的疾患の症状、又は標的疾患に対する素因を有する対象に、疾患、疾患の症状、又は疾患に対する素因を治し、癒し、緩和し、軽減し、変化させ、直し、改善し、改良し、又は影響を与えることを目的として、１つ以上の活性剤を含む組成物を適用又は投与することを指す。

【0145】

有効量の免疫細胞は、適切な経路、例えば、静脈内注入を介して治療を必要とするヒト患者に投与され得る。場合によっては、約１×１０^６～約１×１０^８個のＣＡＲ＋Ｔ細胞が、ヒト患者（例えば、白血病患者、リンパ腫患者、又は多発性骨髄腫患者）に与えられてもよい。いくつかの例では、ヒト患者は、複数回用量の免疫細胞を受容することができる。例えば、患者は、２日連続で、２つの用量の免疫細胞を受けてもよい。場合によっては、第１の用量は、第２の用量と同じである。他の場合では、第１の用量は、第２の用量よりも低いか、又は逆もまた同様である。

【0146】

免疫細胞の使用を伴う本明細書に開示される治療方法のうちのいずれにおいても、対象は、細胞療法と同時にＩＬ－２を投与され得る。より具体的には、有効量のＩＬ－２は、細胞療法の前、その間、又はその後に、好適な経路を介して対象に与えられ得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２は、免疫細胞の投与後に対象に与えられる。

【0147】

代替的又は追加的に、本明細書に開示される細胞療法によって治療される対象は、免疫細胞注入後にＩＬ－６アンタゴニスト（細胞療法で使用される免疫細胞によって産生されるＩＬ－６アンタゴニストを除く）を伴う治療を受けない場合がある。

【0148】

本明細書に記載される改変された免疫細胞を含む免疫細胞集団は、化学療法、手術、放射線、遺伝子療法等の他の種類のがん療法と組み合わせて利用され得る。そのような療法は、本明細書に記載の免疫療法と同時に、又は順次（任意の順番で）投与することができる。追加の治療薬と同時投与される場合、相加作用又は相乗作用により、各薬剤に対する適切な治療有効用量が低減され得る。

【0149】

治療される対象はまた、本明細書に開示される免疫細胞の注入と併せて、メチルプレドニゾロン及びデキサメタゾンなどの免疫抑制ステロイドを受けてもよい。

【0150】

いくつかの例では、対象は、本明細書に開示されるＣＡＲ－Ｔ療法の前に、腫瘍量を低減するための好適な抗がん療法（例えば、本明細書に開示されるもの）に供される。例えば、対象（例えば、ヒトがん患者）は、腫瘍負荷を実質的に低減する用量で化学療法（例えば、単一の化学療法剤又は２つ以上の化学療法剤の組み合わせを含む）に供されてもよい。場合によっては、化学療法は、対象における白血球総数を、１０^８／Ｌ未満、例えば、１０^７／Ｌ未満に低下させ得る。初期抗がん療法後、及び／又は本明細書に開示されるＣＡＲ－Ｔ細胞療法後の患者の腫瘍負荷は、日常的な方法を介してモニタリングされ得る。患者が、最初の抗がん療法の後に、かつ／又はＣＡＲ－Ｔ療法の後に、がん細胞の高い増殖速度を示した場合、患者は、腫瘍負荷を低減するための新しいラウンドの化学療法に供され、続いて本明細書に開示されるＣＡＲ－Ｔ療法のうちのいずれかに供されてもよい。

【0151】

本明細書に記載の改変された免疫細胞との組み合わせに有用な他の抗がん治療薬の非限定的な例としては、免疫チェックポイント阻害剤（例えば、ＰＤＬ１、ＰＤ１、及びＣＴＬＡ４阻害剤）、抗血管新生剤（例えば、ＴＮＰ－４７０、血小板第４因子、トロンボスポンジン－１、組織性メタロプロテイナーゼ阻害因子、プロラクチン、アンジオスタチン、エンドスタチン、ｂＦＧＦ可溶性受容体、形質転換成長因子ベータ、インターフェロンアルファ、インターフェロンガンマ、可溶性ＫＤＲ及びＦＬＴ－１受容体、及び胎盤プロリフェリン関連タンパク質）、ＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体、ＶＥＧＦバリアント、可溶性ＶＥＧＦ受容体断片）、化学療法剤化合物が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な化学療法用化合物としては、ピリミジン類似体（例えば、５－フルオロウラシル、フロクスウリジン、カペシタビン、ゲムシタビン、及びシタラビン）；プリン類似体（例えば、フルダラビン）；葉酸アンタゴニスト（例えば、メルカプトプリン及びチオグアニン）；抗増殖剤又は抗有糸分裂剤、例えば、ビンカアルカロイド、タキサンなどの微小管破壊剤（例えば、パクリタキセル、ドセタキセル）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ノコダゾール、エポチロン及びナベルビン、並びにエピポドフィロコキシン；ＤＮＡ損傷剤（例えば、アクチノマイシン、アムサクリン、アントラサイクリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カンプトテシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、シトキサン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルブシン、エピルビシン、ヘキサメチネラミンオキサリプラチン（ｈｅｘａｍｅｔｈｙｈｎｅｌａｍｉｎｅｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）、イホスファミド、メルファラン、メルクロレタミン（ｍｅｒｃｈｌｏｒｅｈｔａｍｉｎｅ）、マイトマイシン、ミトキサントロン、ニトロソウレア、プリカマイシン、プロカルバジン、タキソール、タキソテール、テニポシド、トリエチレンチオホスホルアミド、並びにエトポシド）が挙げられる。

【0152】

いくつかの実施形態では、放射線又は放射線及び化学療法は、本明細書に記載の改変された免疫細胞を含む細胞集団と組み合わせて使用される。追加の有用な薬剤及び療法は、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，５９．ｓｕｐ．ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，（２００５），Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｐ Ｄ Ｒ，Ｍｏｎｔｖａｌｅ Ｎ．Ｊ．、Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２０．ｓｕｐ．ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（２０００），Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ Ｍｄ．、Ｂｒａｕｎｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１５．ｓｕｐ．ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，（２００１），ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ，ＮＹ、Ｂｅｒｋｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，（１９９２），Ｍｅｒｃｋ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒａｈｗａｙ Ｎ．Ｊに見出すことができる。

【0153】

Ｖ．治療的使用及び改変された免疫細胞の作製のためのキット
本開示はまた、本明細書に記載される免疫細胞集団のうちの１つ以上を含む本明細書に記載される標的疾患のうちのいずれかの使用のためのキット及び本明細書に記載される改変された免疫細胞の作製に使用するためのキットも提供する。

【0154】

本明細書に記載の治療的使用のためのキットは、医薬組成物を形成するように製剤化され得る免疫細胞集団を含む１つ以上の容器を含み得る。免疫細胞集団は、本明細書に記載の改変された免疫細胞のうちのいずれか又はそれらの組み合わせを含む。本明細書に記載のＴリンパ球、ＮＫ細胞などの免疫細胞の集団は、本明細書に記載のＣＡＲ構築物及び／又は外因性ＴＣＲ、及び／又は抗原特異的ＴＣＲを更に発現し得る。

【0155】

いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載の方法のうちのいずれかにおける免疫細胞集団の使用のための説明書を追加的に含むことができる。含まれる説明書は、対象において意図する活性を達成するための、対象への免疫細胞集団又はそのようなものを含む薬学的組成物の投与の説明を含み得る。キットは、対象が治療を必要としているかどうかを識別することに基づいて、治療に適した対象を選択する説明を更に含み得る。いくつかの実施形態では、説明書は、免疫細胞集団又はそれを含む薬学的組成物を、治療を必要とする対象に投与することの説明を含む。

【0156】

本明細書に記載されるものなどを含む免疫細胞集団又は薬学的薬組成物の使用に関する説明書は、一般に、意図される処置のための投薬量、投薬スケジュール、及び投与経路に関する情報を含む。容器は、１回投与用、バルクパッケージ（例えば、複数回投与用パッケージ）又はサブユニット投与用であり得る。本開示のキットに提供される説明書は、典型的には、ラベル又は添付文書に書かれた説明書である。ラベル又は添付文書は、薬学的組成物が、対象における疾患又は障害の治療、発症の遅延、及び／又は緩和のために使用されることを示す。

【0157】

本明細書に提供されるキットは、好適なパッケージング内に存在する。好適なパッケージングとしては、バイアル、ボトル、瓶、柔軟なパッケージングなどが挙げられるが、これらに限定されない。吸入器、経鼻投与装置、又は注入装置などの特定の装置と組み合わせて使用するためのパッケージも企図される。キットは、無菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有するバイアルであり得る）。容器はまた、無菌アクセスポートを有し得る。薬学的組成物中の少なくとも１つの活性剤は、改変された免疫細胞又はそれらの組み合わせのうちのいずれかを含む免疫細胞（例えば、Ｔリンパ球又はＮＫ細胞）の集団である。

【0158】

キットは、任意に、緩衝液及び解釈情報などの追加の成分を提供し得る。通常、キットは、容器と、容器上の又は容器に関連するラベル若しくは添付文書を含む。いくつかの実施形態において、本開示は、上述のキットの内容物を含む製造物品を提供する。

【0159】

本明細書に記載の改変された免疫細胞を作製する際に使用するためのキットもまた、本明細書に提供される。そのようなキットは、免疫細胞にノックイン及び／又はノックアウト改変を導入する際に使用するための試薬をそれぞれ含有する１つ以上の容器を含み得る。例えば、キットは、本明細書に記載されるような１つ以上のノックアウト改変を行うための遺伝子編集システムの１つ以上の構成要素を含み得る。代替的又は追加的に、キットは、本明細書にも記載されるサイトカインアンタゴニストを発現するための１つ以上の外因性核酸と、外因性核酸を宿主免疫細胞に送達するための試薬とを含み得る。そのようなキットは、宿主免疫細胞に対して所望の改変を行うための説明書を更に含み得る。

【0160】

ＶＩ．一般的な手技
本開示の実践には、別段の指示がない限り、当該技術分野の技能内である分子生物学（組換え技法を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、及び免疫学の従来の技法が用いられる。そのような技術は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．１９８４）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ，ｅｄ．，１９８９）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．１９８７）、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ ａｎｄ Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄ Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．１９９３－８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）：Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．１９８７）、ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．１９９４）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９９）、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ ａｎｄ Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．，ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８８－１９８９）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ｃ．Ｄｅａｎ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０００）、Ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９）、Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．Ｚａｎｅｔｔｉ ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｃａｐｒａ，ｅｄｓ．Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８５）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８６、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ｌＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）、Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）；Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＣＡＲ）Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ（Ｄ．Ｗ．Ｌｅｅ ａｎｄ Ｎ．Ｎ．Ｓｈａｈ，ｅｄｓ．， Ｅｌｓｅｒｖｉｅｒ，２０１９，ＩＳＢＮ：９７８０３２３６６１８１２）、Ｂａｓｉｃｓ ｏｆ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＣＡＲ）Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ（Ｍ．Ｙ．Ｂａｌｋｈｉ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１９，ＩＳＢＮ：９７８０１２８１９７４７９）、Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ（Ｖ．Ｐｉｃａｎｃｏ－Ｃａｓｔｒｏ，Ｋ．Ｃ．Ｒ．Ｍａｌｍｅｇｒｉｍ，Ｋ．Ｓｗｉｅｃｈ，ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ ＵＳ，２０２０，ＩＳＢＮ：９７８１０７１６０１４８８）、Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ（Ｃ．Ｂｏｌｌａｒｄ，Ｓ．Ａ．Ａｂｕｔａｌｉｂ，Ｍ．－Ａ．Ｐｅｒａｌｅｓｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，２０１８；ＩＳＢＮ：９７８３３１９５４３６８０）及びＤｅｖｅｌｏｐｉｎｇ Ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅｓ（Ｍ．Ａ．Ｍｉｒ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１５，ＩＳＢＮ：９７８０１２８０２６７５５）などの文献に完全に説明されている。

【0161】

本開示は、本明細書の説明に記載される、又は図面に示される構成要素の詳細及び構成要素の配置に限定されない。本開示は、他の実施形態が可能であり、様々な方法で実施されることが可能である。また、本明細書で使用される用語及び用語は、記載の目的であり、限定するものとみなされるべきではない。本明細書における「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、又は「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「関与する（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、及びそれらの変形の使用は、その後に列挙される項目及びそれらの等価物、並びに追加の項目を包含することを意味する。本明細書及び添付の特許請求の範囲でも使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、複数の言及を含む。

【0162】

更に詳述することなく、当業者は、上記の説明に基づいて、本発明を最大限に利用することができると考えられる。したがって、以下の特定の実施形態は、単なる例示として解釈されるべきであり、いかなる方法においても本開示の残りの部分を限定するものではない。本明細書で引用された全ての刊行物は、本明細書で参照される目的又は主題のために参照により組み込まれる。

【実施例】

【0163】

実施例１：ＣＡＲ－Ｔ治療を使用したがんの治療
この実施例は、本明細書に記載されるＣＡＲ構築物を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞が、重い腫瘍負荷を有する患者においてがんを治療するのに有効である一方で、ＣＡＲ－Ｔ療法中に比較的低いＩＦＮ－γ産生をもたらすことも実証する。マントル細胞リンパ腫と診断されたヒト患者を、抗ＣＤ１９／ＩＬ－６／ＩＬ－１ ＣＡＲ－Ｔ細胞で以下のように処置した。抗ＣＤ１９ ＣＡＲ、ＩＬ－６アンタゴニスト、及びＩＬ－１アンタゴニストの構造的特徴は、本明細書で提供される通りである。ヒト患者を腫瘍負荷を低下させるために化学療法で治療し、続いてフルダラビン／シクロホスファミドで前処置して内因性リンパ球を枯渇させ、患者をＣＡＲ－Ｔ細胞移植のための状態にした。その後、患者は、本明細書に開示される０．２×１０^８個の（Ｄ０）抗ＣＤ１９／ＩＬ－６／ＩＬ－１ ＣＡＲ－Ｔ細胞（野生型ＧＭ－ＣＳＦ及びＴＣＲ遺伝子を伴う）を受けた。治療中に、患者に組換えＩＬ－２を注射した。処置後、末梢血中のＤ０での膨大な数のリンパ球（１３．０２×１０^９／Ｌ）は、Ｄ１９で正常レベル（０．４４×１０^９／Ｌ）まで減少し（図１Ａ）、完全な応答が達成された。処置中、患者は、低血圧、低酸素又は神経毒性を伴わない軽度の発熱（図１Ｂ）及びグレード１のサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）のみを経験した。処置中、患者は、ＩＬ－６の受容体に結合する拮抗性モノクローナル抗体であるトシリズマブを受けなかった。サイトカインレベルの分析は、Ｔ細胞注入後の患者における非常に低いレベルのＩＬ－６（図１Ｃ）及び低いレベルのピークＩＦＮγ（図１Ｃ）を明らかにした。図１Ｄ及び１Ｅは、Ｔ細胞注入後のＣＲＰ及びフェリチンのレベルを示す。要約すると、これらの結果は、ＣＡＲ－Ｔ細胞が膨大な数の腫瘍細胞を根絶している間に、ＩＦＮγ産生の比較的低いレベルを明らかにし、ＩＦＮγがＣＡＲ－Ｔ治療中に分配可能であり得、ＩＦＮγをノックアウトすることが、ＣＡＲ－Ｔ治療に関連するサイトカイン毒性を最小限に抑える魅力的な方法であり得ることを示唆した。

【0164】

実施例２：ＩＦＮ－γノックアウト
この例では、ＩＦＮ－γノックアウトについて説明する。正常ドナーからのＴ細胞を刺激し、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ダイナビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ）によって活性化した。３日後、Ｔ細胞を、ヒトＩＦＮ－γ遺伝子の第１のエクソンのプロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を標的とするＣａｓ９タンパク質（ｔｈｅｒｍｏ）及び単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）候補のリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体でエレクトロポレーションした。Ｂ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡを対照として含めた。

【0165】

ＩＦＮ－γ ｓｇＲＮＡのインビトロ転写に使用したＤＮＡ配列は、次の通りであった。
ＩＦＮγ ｓｇＲＮＡのインビトロ転写のためのＤＮＡ配列

【化34】

【化35】

【化36】

【化37】

【化38】

【化39】

【化40】

【化41】

【0166】

エレクトロポレーションの２日後、Ｔ細胞をＩＦＮ－γの細胞内染色によって分析し、結果は、ｓｇＲＮＡ４がＩＦＮ－γ産生を低減するのに最も効果的であることを示した（図２）。

【0167】

実施例３：インビボでのＣＡＲ－Ｔの持続性の改善
この実施例は、ＣＡＲ－Ｔ細胞移植後の患者における細胞内ＩＬ－２Ｒβシグナル伝達によるＣＡＲ－Ｔの改善された持続性を説明する。難治性又は再発性多発性骨髄腫（ＭＭ）と診断された患者は、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞による治療を受けた。２つのタイプの抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞を使用した。患者＃１に、４１ＢＢ、ＩＬ－２Ｒβ及びＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインを有する抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞を注入した。患者＃２に、ＩＬ－２Ｒβ共刺激シグナル伝達ドメインなしで、４１ＢＢ及びＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインを有する抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞を注入した。ヒト患者を、フルダラビン／シクロホスファミドで前処置して内因性リンパ球を枯渇させ、患者をＣＡＲ－Ｔ細胞移植のための状態にした。結果は、ＣＡＲ＋Ｔ細胞の頻度が、患者＃１において注入後３１日目で約４０％、患者＃２において注入後１６日目で約３７％と維持されたことを示し、これは、ＩＬ２Ｒβシグナル伝達の添加が、患者におけるＣＡＲ＋Ｔ細胞の長期持続性を改善することを示す。図３を参照されたい。

【0168】

実施例４：インビボでの細胞ベースの療法に対する持続的な臨床応答
この実施例は、患者における４１ＢＢ、ＩＬ－２Ｒβ、ＣＤ３ζからのドメインを含む細胞内シグナル伝達を有する抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞による持続的な臨床応答を説明する。難治性及び再発急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）と診断された患者を、４１ＢＢ、ＩＬ－２Ｒβ及びＣＤ３ζシグナル伝達を有する抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞で処置した。処置後、３人の患者は、治療前と比較してＣＡＲ－Ｔ治療後の循環中のＣＤ１９＋Ｂ細胞の非常に低い数又は検出不能によって決定される完全な応答を達成した。より重要なことに、ＩＬ－２Ｒβシグナル伝達を動力源とするＣＡＲＴ細胞は、処置された患者において、ＣＡＲ＋Ｔ細胞の長期持続性を示し、持続可能なＢ細胞異形成を誘導した。図４を参照されたい。

【0169】

実施例５：患者における４１ＢＢ、ＩＬ－２Ｒβ、及びＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達によるＣＡＲ－Ｔ細胞の拡張。
この実施例は、４１ＢＢ、ＩＬ－２Ｒβ、ＣＤ３ζを含む細胞内シグナル伝達ドメインを有するＣＡＲ－Ｔ細胞のインビボ拡張を説明する。難治性又は再発性ＡＬＬ（急性リンパ芽球性白血病）、リンパ腫又はＭＭ（多発性骨髄腫）と診断された患者は、４１ＢＢ、ＩＬ－２Ｒβ、ＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達を有する抗ＣＤ１９又は抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞による治療を受けた。ヒト患者を、フルダラビン／シクロホスファミドで処置して内因性リンパ球を枯渇させ、患者をＣＡＲ－Ｔ細胞移植のための状態にした。その後、患者は、本明細書に開示されるそれぞれのＣＡＲ－Ｔ細胞（４１ＢＢ、ＩＬ－２Ｒβ、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを有する）を受けた。図５は、Ｔ細胞集団における抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞のピーク頻度中央値が約６０％であり、Ｔ細胞集団における抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞のピーク頻度中央値が約１０％であることを示した。この結果は、４１ＢＢ、ＩＬ－２Ｒβ、及びＣＤ３ζシグナル伝達の組み合わせが、患者において抗ＣＤ１９及び抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の両方の有意な拡張を誘導することを示した。

【0170】

実施例６：２９３Ｔ細胞で発現したインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）拮抗性抗体が、細胞においてＩＦＮγシグナル伝達を阻害する効果。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって、ＩＦＮγを標的とする、本明細書に開示される参照抗体Ａｍｇ（ＡＭＧ８１１）、Ｆｏｎ（フォンツリズマブ）、及びＥｍａ（エマパルマブ）に由来する、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）抗体をコードする第３世代自己不活性化（ＳＩＮ）レンチウイルス伝達ベクターでトランスフェクトした。成長ホルモン（ＧＨ）先導配列（分泌される運命にあるタンパク質の発現のための単一のペプチド配列が分泌経路を通って移動する）は、抗ＩＦＮγ ｓｃＦｖ構築物の前に位置する。トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞によって発現された分泌型ｓｃＦｖ抗体を含有するトランスフェクトされた細胞の上清を収集し、希釈し、２ｎｇ／ｍｌのヒトＩＦＮγの存在下で、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＦＮγレポーター細胞（ＩＮＶＩＶＯＧＥＮ）に添加した。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＦＮγレポーター細胞は、ヒトＩＦＮγ刺激時に分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を産生することが可能であるため、使用した。一晩のインキュベーション後、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＦＮγ細胞の上清を収集し、Ｑｕａｎｔ－Ｂｌｕｅ基質溶液とインキュベーションした。ＳＥＡＰ産生は、分光光度計を通じて、６５０ｎｍの波長での変換基質Ｑｕａｎｔ Ｂｌｕｅ（ＩＮＶＩＶＯＧＥＮ）の光学吸光度を測定することによって定量化した。

【0171】

様々な抗ＩＦＮγ ｓｃＦｖ－ＣＡＲの構築に使用される、Ａｍｇ、Ｆｏｎ、及びＥｍａのＶ_Ｌ及びＶ_Ｈのアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号５２～６０）：
フォンツリズマブのＶ_Ｌ（配列番号５２）：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＴＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＥＮＶＤＴＹＶＳＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＧＡＳＮＲＹＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＡＴＹＹＣＧＱＳＹＮＹＰＦＴＦＧＱＧＴＫＶＥＶＫＲ
フォンツリズマブのＶ_Ｈ（配列番号５３）：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＬＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＩＦＴＳＳＷＩＮＷＶＫＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＲＩＤＰＳＤＧＥＶＨＹＮＱＤＦＫＤＫＡＴＬＴＶＤＫＳＴＮＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＦＬＰＷＦＡＤＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
フォンツリズマブからの抗ＩＦＮγ ｓｃＦｖ（配列番号５４）

【化42】

エマパルマブのＶ_Ｌ（配列番号５５）：
ＮＦＭＬＴＱＰＨＳＶＳＥＳＰＧＫＴＶＴＩＳＣＴＲＳＳＧＳＩＡＳＮＹＶＱＷＹＱＱＲＰＧＳＳＰＴＴＶＩＹＥＤＮＱＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＩＤＳＳＳＮＳＡＳＬＴＩＳＧＬＫＴＥＤＥＡＤＹＹＣＱＳＹＤＧＳＮＲＷＭＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
エマパルマブのＶ_Ｈ（配列番号５６）：
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＤＧＳＳＧＷＹＶＰＨＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
エマパルマブからの抗ＩＦＮγ ｓｃＦｖ（配列番号５７）：

【化43】

【0172】

抗ヒトＩＦＮ－γＡＭＧ８１１のアミノ酸配列は、米国特許出願第２０１３／０１４２８０９号及び米国特許第７，３３５，７４３号に記載されており、その関連部分は参照により本明細書に組み込まれる。
ＡＭＧ８１１のＶ_Ｌ（配列番号５８）：
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＲＳＧＧＳＳＦＴＦＧＰＧＴＫＶＤＩＫ
ＡＭＧ８１１のＶ_Ｈ（配列番号５９）：
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＩＳＣＫＧＳＧＹＮＦＴＳＹＷＩＧＷＶＲＱＭＰＧＫＧＬＥＬＭＧＩＩＹＰＧＤＳＤＴＲＹＳＰＳＦＱＧＱＶＴＩＳＡＤＫＳＩＳＴＡＹＬＱＷＳＳＬＫＡＳＤＴＡＭＹＹＣＧＳＧＳＹＦＹＦＤＬＷＧＲＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＡＭＧ８１１からの抗ＩＦＮγ ｓｃＦｖ（配列番号６０）

【化44】

【0173】

図６Ａに示すように、ｓｃＦｖ抗体１及び４は、レポーター細胞におけるＩＦＮγシグナル伝達を阻害することができる。試験した６つのｓｃＦｖ抗体のうち、抗体Ａｍｇ８１１（Ａｍｇ）に由来するｓｃＦｖ抗体は、参照抗体フォンツリズマブ（Ｆｏｎ）及びエマパルマブ（Ｅｍａ）に由来するｓｃＦｖ抗体と比較して、ＩＦＮγシグナル伝達を阻害することにおいてより高い効率を示した。例えば、参照Ａｍｇに由来するｓｃＦｖ抗体は、０．５の希釈でＩＦＮγシグナル伝達の８０％近くの阻害を示したが、参照抗体Ｆｏｎ及びＥｍａに由来するものは、同じ希釈で非常に低い阻害効率を示した。この結果は、抗体Ａｍｇ由来のｓｃＦｖが、レンチベクター系の自己分泌様式におけるＩＦＮγシグナル伝達を遮断することでより効果的であることを示した。

【0174】

これらのインビトロデータ（図６Ａ）は、エマパルマブからの抗ＩＦＮγ ｓｃＦｖをコードするＣＡＲベクターが、ＩＦＮγシグナル伝達を阻害するＡｍｇ８１１からの抗ＩＦＮγ ｓｃＦｖほど有効ではないことを示した。しかしながら、エマパルマブからの抗ＩＦＮγ ｓｃＦｖを共発現するＣＡＲＴで処置した患者の臨床データは、ＣＡＲＴ療法中に非常に低レベルのＩＦＮγが観察されたことを示した。以下の更なる実施例、図９及び１０を参照されたい。１つの考えられる理由は、エマパルマブからの合成されたＣＡＲＴ抗ＩＦＮγ ｓｃＦｖが、効率的に分泌されず、細胞内に閉じ込められていたことであろう。

【0175】

様々なタンパク質からのいくつかのシグナルペプチド配列を試験して、細胞からのＩＦＮγ ｓｃＦｖの発現及び分泌に対するそれらの効果、したがって、インビボでのＩＦＮγシグナル伝達を阻害するために利用可能な分泌型抗ＩＦＮγ ｓｃＦｖの有効量を探索した。Ａｍｇ－ＬＨ ｓｃＦｖによるＩＦＮγシグナル伝達の阻害に対するシグナルペプチドの影響を図６Ｂに示す：１、アルブミンからのシグナルペプチド（配列番号４７）；２、ＣＤ８からのシグナルペプチド（配列番号４４）；３、成長ホルモンからのシグナルペプチド（配列番号２９）；４、アルブミンからの改変されたシグナルペプチド（配列番号４８）、ＩＬ２からの改変シグナルペプチド（配列番号４９）；６、抗体軽鎖からのシグナルペプチド（配列番号４５）、及び７、ＧＬ（Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ）（配列番号４６）。結果は、ＣＤ８からのシグナルペプチドが、ＩＦＮγシグナル伝達の阻害に利用可能な分泌型抗ＩＦＮγ ｓｃＦｖを産生するのに最も効果的であることを明らかにした。

【0176】

実施例７：ＩＦＮγシグナル伝達の阻害は、がんに対するＣＡＲ－Ｔ療法で処置された患者における重篤なサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）を予防する。
次に、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法を受ける患者におけるインビボでのＩＦＮγシグナル伝達を低下させるためのいくつかのアプローチを試験した。驚くべきことに、ＩＦＮγ遺伝子ノックアウト又はＩＦＮγアンタゴニスト発現を介して達成された比較的低いＩＦＮγシグナル伝達では、ＣＡＲ－Ｔ細胞は依然として有効であり、標的細胞に対して細胞傷害性活性をもたらした。

【0177】

Ａ．患者を処置するために使用したＣＡＲ－Ｔ細胞における内因性ＩＦＮγの発現の低下。
ＩＦＮγノックアウト（ＫＯ）ＣＡＲ－Ｔ細胞で治療された急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）患者
難治性及び再発性ＡＬＬと診断された患者を、４１ＢＢ－ＩＬ－２Ｒβ－ＣＤ３ζシグナル伝達、ＣＲＩＳＰＲ編集されたＩＦＮγ ＫＯ、並びにＩＬ－６アンタゴニスト及びＩＬ－１アンタゴニストの両方を共発現する抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞で処置した。処置後、この患者は完全奏効を達成し、ＩＦＮγのピークレベルが低く（図７）、ＩＦＮγ ＫＯを有する抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞が臨床的有効性において完全奏効を誘導することができることを示している。患者では、ＣＡＲＴ注入後１４日目にＢ細胞異形成が認められ、骨髄検査結果から腫瘍細胞は検出されず、治療後の完全奏効が示唆された。処置中、グレード２のＣＲＳのみが観察された。

【0178】

ＩＦＮγ ＫＯのＣＡＲ－Ｔ細胞で処置した多発性骨髄腫（ＭＭ）患者
難治性及び再発性ＭＭと診断された患者を、４１ＢＢ－ＩＬ－２Ｒβ－ＣＤ３ζシグナル伝達、ＣＲＩＳＰＲ編集されたＩＦＮγ ＫＯ、並びにＩＬ－６アンタゴニスト及びＩＬ－１アンタゴニストの両方を共発現する抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞で処置した。処置後、この患者は完全奏効を達成し、ＩＦＮγのピークレベルが中程度であり（図８Ａ）、抗ＢＣＭＡ ＩＦＮγ ＫＯを有するＣＡＲ－Ｔ細胞が臨床的有効性において完全奏効を誘導することができることを示している。処置中、グレード１のＣＲＳ（発熱、低酸素及び低血圧）のみが観察された。他の患者と比較して、この患者は、おそらく非常に高い腫瘍負荷のために、比較的高いＩＦＮγピークを有していた。しかしながら、発熱、低酸素及び低血圧のＣＲＳ症状は軽度であった。図８Ｂにおいて、患者のＩｇＧレベルは、処置後に非常に低レベルに低下した。経過観察中の更なる免疫固定電気泳動（ｉｍｍｕｎｏｆｉｘａｔｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）は、モノクローナルタンパク質（Ｍタンパク質）の陰性結果を示し、完全奏効を示唆した。

【0179】

Ｂ．患者を処置するために使用したＣＡＲ－Ｔ細胞中の共発現可溶性アンタゴニスト抗ＩＦＮγ ｓｃＦｖ。
拮抗性抗ＩＦＮγ ｓｃＦｖを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞で処置したリンパ腫患者
難治性及び再発性リンパ腫と診断された患者を、４１ＢＢ－ＩＬ－２Ｒβ－ＣＤ３ζシグナル伝達、並びに共発現エマパルマブに由来するＩＦＮγ遮断ｓｃＦｖ及びシルクマブに由来するＩＬ６遮断ｓｃＦｖを有する抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞で処置した。処置後、この患者は完全奏効を達成し、ＩＦＮγのピークの非常に低いレベルを検出し（図９）、Ｅｍａ ｓｃＦｖの共発現を有する抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞が臨床的有効性において完全奏効を誘導することができることを示している。処置中、グレード０のＣＲＳのみが観察された。フォローアップ中のＰＥＴ－ＣＴスキャン結果は、処置後１０６日目に腫瘍斑が消失したことを示した。

【0180】

拮抗性抗ＩＦＮγ ｓｃＦｖを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞で処置したＭＭ患者
難治性及び再発性ＭＭと診断された２人の患者を、４１ＢＢ－ＩＬ－２Ｒβ－ＣＤ３ζシグナル伝達、並びに共発現エマパルマブに由来するＩＦＮγ遮断ｓｃＦｖ及びシルクマブに由来するＩＬ６遮断ｓｃＦｖを有する抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞で処置した。処置後、患者は非常に良好な部分奏効を達成し、非常に低レベルのＩＦＮγのピークが検出され（図１０Ａ及び１０Ｂ）、Ｅｍａ ｓｃＦｖの共発現を有する抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞が臨床有効性において非常に良好な部分奏効を誘導することができることを示した。処置中、グレード１のＣＲＳのみが観察された。患者＃１について、フォローアップ中の免疫固定電気泳動は、治療後１０２日目のモノクローナルタンパク質（Ｍタンパク質）の残存レベルのみを示した。患者＃２について、ＩｇＧレベルは、処置後３９日目に正常レベルまで低下した。

【表1】

【0181】

他の実施形態
本明細書に開示される特徴はいずれも、任意の組み合わせで組み合わせ得る。本明細書に開示される各特徴は、同じ、同等の、又は同様の目的に適う代替的特徴に置き換え得る。したがって、別途明記されない限り、開示される各特徴は、全般的な一連の同等の、又は同様の特徴の一例に過ぎない。

【0182】

当業者には上の記載から、本発明に不可欠な特徴を容易に確認することが可能であり、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、本発明の様々な改変及び修正を施して、様々な使用及び条件に適合させることが可能である。したがって、他の実施形態も請求項の範囲内にある。

【0183】

等価物
いくつかの本発明の実施形態が本明細書に記載され、図示されているが、当業者には、機能を実施し、かつ／又は本明細書に記載される結果及び／又は１つ若しくは複数の利点を得るための様々な他の手段及び／又は構成が容易に想像され、このような変形及び／又は修正はそれぞれ、本明細書に記載される本発明の実施形態の範囲に内にあるとみなされる。より一般的に、本明細書に記載されるパラメータ、寸法、材料、及び配置はいずれも例示を意図するものであり、実際のパラメータ、寸法、材料、及び／又は構成は、本発明の教示を用いる具体的な１つ又は複数の用途によって決まることが当業者に容易に理解されよう。当業者には、ルーチンの実験を用いて、本明細書に記載される具体的な本発明の実施形態の均等物が多数認識される、又は確認することが可能であろう。したがって、上記の実施形態が単なる例として示されるものであり、添付の請求項及びその均等物の範囲内において、具体的に記載及び特許請求される以外の方法で、諸実施形態を実施し得ることが理解されるべきである。本開示の本発明の実施形態は、本明細書に記載される個々のそれぞれの特徴、システム、物品、材料、キット、及び／又は方法に関するものである。更に、２つ以上のこのような特徴、システム、物品、材料、キット、及び／又は方法が互いに相容れないものでなければ、そのような特徴、システム、物品、材料、キット、及び／又は方法の任意の組み合わせが本開示の本発明の範囲内に含まれる。

【0184】

本明細書で定義及び使用される定義はいずれも、定義される用語の辞書での定義、参照により組み込まれる文献での定義、及び／又は通常の意味に対して支配的な位置にあることが理解されるべきである。

【0185】

本明細書に開示される参考文献、特許、及び特許出願はいずれも、それが引用される主題に関して参照により組み込まれ、場合によっては、文献全体がそれに包含されることもある。

【0186】

本明細書及び請求項で使用される不定冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、そうでないことが示されない限り、「少なくとも１つ」を意味するものと理解されるべきである。

【0187】

本明細書及び請求項で使用される「及び／又は」という語句は、そのように等位結合される要素の「一方又は両方」、すなわち、いくつかの場合には接続的に存在し、別の場合には選言的に存在する要素を意味するものであると理解されるべきである。「及び／又は」用いて列挙される複数の要素も同じように、すなわち、「１つ以上の」要素がそのように等位結合されていると解釈されるべきである。「及び／又は」節によって具体的に特定される要素以外にも、具体的に特定されるその要素と関係があるか、無関係であるかを問わず、任意選択で他の要素が存在してもよい。したがって、非限定的な例として、「含む」などの制限のない言葉とともに「Ａ及び／又はＢ」と言う場合、それは、一実施形態ではＡのみ（任意選択でＢ以外の要素を含む）；別の実施形態ではＢのみ（任意選択でＡ以外の要素を含む）；更に別の実施形態ではＡとＢの両方（任意選択で他の要素を含む）などを指し得る。

【0188】

本明細書及び請求項で使用される「又は」は、上で定義される「及び／又は」と同じ意味を有するものと理解されるべきである。例えば、１つのリストのなかの項目を分ける場合、「又は」又は「及び／又は」は、包括的なものである、すなわち、多数の要素又は要素のリストのうち少なくとも１つの要素を含むだけでなく、２つ以上の要素、及び任意選択で、列挙されていない他の項目を含むものと解釈されるべきである。「のうちの１つのみ」若しくは「のうちのちょうど１つ」、又は請求項で使用される「よりなる」など、そうでないことが明記される用語に限り、多数の要素又は要素のリストのうちちょうど１つの要素が含まれることを指す。一般に、本明細書で使用される「ｏｒ」という用語は、「いずれか」、「のうちの１つ」、「のうちの１つのみ」、又は「のうちのちょうど１つ」などの排他的用語が先行する場合、排他的選択肢（すなわち、「一方又は他方であるが、両方ではない」）を示すものとのみ解釈されるべきである。「から本質的になる」は、特許請求の範囲で使用される場合、特許法の分野で使用されるその通常の意味を有するものとする。

【0189】

本明細書及び請求項で１つ又は複数の要素のリストを指して使用される「少なくとも１つ」という語句は、要素のリストのなかの要素のうちの任意の１つ又は複数のものから選択される、少なくとも１つの要素を意味するが、要素のリストのなかに具体的に列挙されている少なくとも１つの要素及び全要素を必ずしも含むものではなく、要素のリストのなかの要素の任意の組み合わせを除外するものではないことが理解されるべきである。この定義はまた、任意選択で、「少なくとも１つ」という語句が指す要素のリストのなかで具体的に特定される要素以外の要素が、具体的に特定される要素と関係があるか、無関係であるかを問わず存在し得ることを認めるものである。したがって、非限定的な例として、「Ａ及びＢのうちの少なくとも１つ」（又は、「Ａ又はＢのうちの少なくとも１つ」も同様に、若しくは「Ａ及び／又はＢのうちの少なくとも１つ」も同様に）一実施形態では、任意選択で２つ以上を含む少なくとも１つのＡが存在し、Ｂは存在しないこと（及び任意選択で、Ｂ以外の要素を含む）；別の実施形態では、任意選択で２つ以上を含む少なくとも１つのＢが存在し、Ａは存在しないこと（及び任意選択で、Ａ以外の要素を含む）；更に別の実施形態では、任意選択で２つ以上を含む少なくとも１つのＡと、任意選択で２つ以上を含む少なくとも１つのＢ（及び任意選択で、他の要素を含む）などを指し得る。

【0190】

また、本明細書で特許請求され、２つ以上の段階又は行為を含む方法ではいずれも、そうでないことが明記されない限り、その方法の段階又は行為の順序は、必ずしもその方法の段階又は行為が記載されている順序に限定されないことが理解されるべきである。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【手続補正書】

【提出日】2022-12-09

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】配列表

【補正方法】追加

【補正の内容】

【配列表】

2023521519000001.app

【国際調査報告】