特表 2023-521545 修飾マクロファージ、組成物およびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-05-25

(54)【発明の名称】修飾マクロファージ、組成物およびその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/0786 20100101AFI20230518BHJP

   A61K 35/15 20150101ALI20230518BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20230518BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20230518BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20230518BHJP

   C12N 5/00 20060101ALN20230518BHJP

【ＦＩ】

C12N5/0786

A61K35/15

A61P19/02

A61P29/00

A61K45/00

C12N5/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022551557

(86)(22)【出願日】2021-04-19

(85)【翻訳文提出日】2022-08-30

(86)【国際出願番号】 JP2021015925

(87)【国際公開番号】W WO2021215410

(87)【国際公開日】2021-10-28

(31)【優先権主張番号】2020901243

(32)【優先日】2020-04-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】AU

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522228528

【氏名又は名称】デュオジェニック ステムセルズ コーポレーション

【氏名又は名称原語表記】Ｄｕｏｇｅｎｉｃ ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ

【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．１８， Ｌｎ．１０， Ｔａｉｐｉｎｇ ２１ｓｔ Ｓｔ．， Ｔａｉｐｉｎｇ Ｄｉｓｔ．， Ｔａｉｃｈｕｎｇ Ｃｉｔｙ ４１１０２１ Ｔａｉｗａｎ

(71)【出願人】

【識別番号】522338034

【氏名又は名称】清河 雅孝

(74)【代理人】

【識別番号】100130580

【弁理士】

【氏名又は名称】小山 靖

(72)【発明者】

【氏名】清河 雅孝

(72)【発明者】

【氏名】スー，ホンリン

(72)【発明者】

【氏名】シェン，チンイ

(72)【発明者】

【氏名】ワン，フーフイ

(72)【発明者】

【氏名】シェ，チアイン

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065BB19

4B065BB23

4B065BD39

4B065BD42

4B065CA44

4C084AA19

4C084NA05

4C084ZA96

4C084ZB11

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB37

4C087CA04

4C087MA66

4C087NA14

4C087ZA96

4C087ZB11

(57)【要約】

本願発明は、修飾単球、修飾マクロファージ、本明細書に記載される修飾単球または修飾マクロファージと、薬学的に許容される少なくとも一種の担体または添加剤とを含む医薬組成物を提供するものである。軟骨の形成の誘導を含む筋骨格系疾患の治療を目的とする修飾単球または修飾マクロファージの使用を提供するものである。また、本明細書に修飾マクロファージを生成するためのインビトロ培養法を開示する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＣＤ１４^＋ＣＤ２０６^＋により特徴付けられたマクロファージの表現型；および
ＩＩ型コラーゲン
を含む修飾マクロファージ。

【請求項2】

前記ＩＩ型コラーゲンが前記修飾マクロファージ内で発現している請求項１に記載の修飾マクロファージ。

【請求項3】

前記ＩＩ型コラーゲンが前記修飾マクロファージの表面に発現している請求項１に記載の修飾マクロファージ。

【請求項4】

ＣＤ１４^＋により特徴付けられた単球の表現型；および
ＩＩ型コラーゲン
を含む修飾単球。

【請求項5】

前記ＩＩ型コラーゲンが前記修飾単球内で発現している請求項４に記載の修飾単球。

【請求項6】

（ａ）請求項１に記載の修飾マクロファージまたは請求項４に記載の修飾単球；および
（ｂ）薬学的に許容される担体または添加剤
を含む医薬組成物。

【請求項7】

約０．０１％～９９．９％の前記修飾マクロファージまたは前記修飾単球を含む、請求項６に記載の医薬組成物。

【請求項8】

筋骨格系疾患を治療するために、有効量の請求項１に記載の修飾マクロファージまたは有効量の請求項４に記載の修飾単球を、それを必要とする被験体に投与することを含む筋骨格系疾患の治療法。

【請求項9】

前記筋骨格系疾患が関節炎である請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記関節炎が、変形性関節症、自己免疫性関節炎または外傷性関節炎である請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記筋骨格系疾患が、変形性椎間板疾患または椎間板変性症である請求項８に記載の方法。

【請求項12】

前記椎間板が、関節軟骨の軟骨組織部位、半月板の軟骨組織部位および椎間板の軟骨組織部位からなる群より選ばれるものである請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記筋骨格系疾患が腱炎である請求項８に記載の方法。

【請求項14】

前記修飾単球または前記修飾マクロファージを関節内注射により投与する請求項８に記載の方法。

【請求項15】

さらにヒアルロン酸またはその誘導体若しくは塩、成長因子、軟骨形成剤、ビタミンＤ３（コレカルシフェロール）、加水分解コラーゲン、ルサラチドアセタート、アボカド大豆不ケン化物（ＡＳＵ）、ステロイド、および非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）から選択される薬剤を、前記被験体に投与することを含む請求項８に記載の方法。

【請求項16】

請求項１に記載の修飾マクロファージまたは請求項４に記載の修飾単球を、それを必要とする被験体の身体部位に投与する工程を含む、被験体の体内の一部で軟骨形成を誘導する方法。

【請求項17】

（ａ）細胞培養培地；および
（ｂ）ＩＬ－４、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦまたはＭ－ＣＳＦのうち少なくとも一つを含む分極化混合物
を含む有効量の組成物に、末梢血単球が接触することを含む、
単球を請求項１に記載の修飾マクロファージに分化誘導するインビトロ方法。

【請求項18】

前記細胞培養培地が、ＲＰＭＩ－１６４０またはイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）である請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記修飾マクロファージと前記組成物の接触時間を約２時間～約７日間とする請求項１７に記載の方法。

【請求項20】

前記分極化混合物が、ＩＬ－４およびＭ－ＣＳＦである請求項１７に記載の方法。

【請求項21】

前記分極化混合物が、実質的にＩＬ－１０、ＩＬ－１３およびＴＧＦ－βを含有しない請求項１７に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【関連出願の相互参照】

【0001】

本出願は、２０２０年４月２０日に出願された豪州仮出願第２０２０９０１２４３号の優先権の利益を主張するものであり、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。

【技術分野】

【0002】

本発明は、修飾マクロファージ、それを含む医薬組成物およびその使用に関する。また、本明細書に開示する修飾マクロファージの製造方法も提供する。

【背景技術】

【0003】

変形性関節症（ＯＡ）は、最も多くみられる筋骨格系疾患である。２０２０年の米国人におけるＯＡ罹患数は５，０００万人を上回っており、高齢化と寿命の延長によって、今後２０年以内に７，０００万人まで増加し、４番目に多い障害の原因となることが予想されている。ＯＡは、滑膜の炎症（滑膜炎）および関節面への新生血管の浸潤を伴う関節軟骨の進行性変形を特徴とする。重度のＯＡは、進行性の軟骨下骨損傷、骨棘形成、骨髄リモデリングおよび半月板損傷を伴う。

【0004】

蓄積された証拠によると、マクロファージがＯＡの発症に重要な役割を担っていることが示唆されている。正常な滑膜において、マクロファージは主要な免疫細胞であり、関節の損傷に最前線で応答する細胞である。しかし、ＯＡの滑膜におけるマクロファージは、マトリックスメタロプロテアーゼ、ならびにＩＬ－１βおよびＴＮＦ－αなどの炎症性サイトカインを産生することにより、軟骨組織を破壊する。ＯＡの滑膜におけるマクロファージの増加は、滑膜血管新生および滑膜炎の程度と相関する。ｖａｎ ｄｅｒ Ｈｅｉｊｄｅｎらの最近の研究によると、葉酸受容体βをベースとする製剤を用いた非侵襲的画像検査により、活性化マクロファージの数がＯＡの重症度および疾患の進行と正の相関があることが示されている。

【0005】

ＯＡの動物モデルでは、マクロファージが喪失すると骨棘の形成が顕著に低減したが、このような喪失によって滑膜の炎症も促進される。この結果はおそらく、機能が異なるマクロファージのサブタイプであるＭ１およびＭ２により引き起こされたものである。Ｍ１マクロファージは炎症誘発性であり、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）によって分極化され得る。これとは対照的に、Ｍ２マクロファージは抗炎症性であり、滑膜炎の軽減のために、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）によって分極化され得る。これらの結果は、ＯＡの処置では、最適な分極化アプローチがマクロファージの重要な役割であることを示唆している。

【0006】

ＩＩ型コラーゲン（Ｃｏｌ ＩＩ）などのヒトコラーゲン基質は、成人の関節軟骨の重要かつ再生不可能な成分である。Ｃｏｌ ＩＩは、動物モデルにおいて、軟骨細胞による軟骨グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の分泌を刺激し、軟骨の修復を促進する。しかし、Ｃｏｌ ＩＩは、ＯＡの有無を問わず、成人の生涯において非常に少ないターンオーバしか示さない。

【0007】

現在のＯＡ治療は、経口ＮＳＡＩＤまたは選択的シクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ－２）阻害薬、コルチコステロイドおよびヒアルロン酸などの関節内（ＩＡ）注射、ならびに外科的アプローチによる疼痛緩和を含む。ヒアルロン酸は、損傷した関節を潤滑化するために使用するが、この治療は硝子軟骨を再生したり、または疾患の進行を変えたりするものではない。ＯＡやその他の筋骨格系疾患の生物学に対する理解が深まり、筋骨格系疾患を治療する新たな治療法も利用できるようになったが、損傷若しくは欠損した腱または関節の治癒の促進が求められている。

【0008】

本発明は、これらのニーズ等を満たすために、Ｃｏｌ ＩＩを発現している修飾マクロファージ集団を提供する。前記修飾マクロファージは、自家療法または非自家療法に使用され得る。

【発明の概要】

【0009】

一実施形態において、本発明は、ＣＤ１４およびＣＤ２０６の表現型（すなわち、ＣＤ１４^＋ＣＤ２０６^＋）を含み、かつＩＩ型コラーゲン（Ｃｏｌ ＩＩ）を発現している、一種類以上の表現型的に特徴のある修飾マクロファージを提供する。

【0010】

別の実施形態において、本発明は、単球を含み、ＣＤ１４の表現型（すなわち、ＣＤ１４）を呈し、かつ、ＩＩ型コラーゲン（Ｃｏｌ ＩＩ）を発現している、一種類以上の表現型的に特徴のある修飾単球を提供する。

【0011】

いくつかの実施形態は、本明細書に記載の修飾マクロファージまたは修飾単球と、薬学的に許容される担体または添加剤とを含有する医薬組成物を提供する。

【0012】

他の実施形態は、本明細書に記載の修飾マクロファージまたは修飾単球の有効量を、それを必要とする被験体に投与し、これにより、筋骨格系疾患の症状および徴候を低減する、筋骨格系疾患の治療方法を提供する。

【0013】

また、本明細書で開示する修飾マクロファージまたは修飾単球を、それを必要とする被験体の身体部位に投与する工程を含む、被検体の体内の一部で軟骨形成を誘導する方法を提供する。

【0014】

本明細書に記載の修飾マクロファージは、（ａ）細胞培養培地および（ｂ）分極化混合物を含有する組成物に、少なくとも一個の単球をインビトロで接触させることにより作製され得る。本発明の方法で培養または分極化した前記修飾マクロファージは、Ｍ２マクロファージ（すなわち、ＣＤ１４^＋ＣＤ２０６^＋）の特徴的な表現型を呈し、Ｃｏｌ ＩＩを発現している。

【0015】

本明細書に記載の培養法によって、既定量のサンプル（例えば、１０ｍＬの末梢血単球（ＰＢＭＮＣｓ））から修飾マクロファージを作製することができる。

【0016】

本特許で使用される用語「発明」、「本発明」、「この発明」および「本願発明」は、本特許の主題および以下の請求項の全てに広く言及することが意図されている。これらの用語を含む記述は、本明細書に記載の主題を限定したり、または本特許の以下の請求項の意義若しくは範囲を限定したりするものではないと理解されるべきである。本特許に含まれる本発明の実施形態は、本概要ではなく以下の請求項によって定義される。本概要は、本発明の様々な態様の概観的な要約であり、以下の「発明の詳細な説明」に詳述する概念の一部を示すものである。本概要は、クレームされた主題の基本的または本質的特長を特定することを意図したものではなく、クレームされた主題の範囲を定めるために他と切り離して使用することも意図していない。本主題は、本明細書の様々な箇所、一部または全ての図面および各請求項を参照して理解されるべきである。

【0017】

本発明は、以下の添付図および詳細な説明を合わせて読むことにより明らかになるだろう。

【図面の簡単な説明】

【0018】

本特許または本特許出願は、カラーを付して作成された少なくとも１枚の図面を含む。カラー図面が添付された本特許または本特許出願の写しは、請求および必要な手数料の納付により庁によって提供される。

【0019】

以下、本発明の例示的な実施形態について、以下の図面を参照して詳細に説明する。

【0020】

図１のパネルＡは、３日目に種々の分極化混合物を用いて培養し発現したＰＢＭＮＣｓ内のＣｏｌ ＩＩの免疫細胞化学的蛍光染色画像を集めたものである。培養ＰＢＭＮＣｓを染色し、細胞質内および細胞膜上に発現したＣｏｌ ＩＩを緑色で示した。核は、ＤＡＰＩで青色に染色した。パネルＢは、異なるタイプの分極化混合物で培養した培養ＰＢＭＮＣｓでの発現したコラーゲンの％を示す棒グラフである。

【0021】

図２は、ヒトＣｏｌ ＩＩに対して特異的なモノクローナルおよびポリクローナル抗体で確認した、培養ＰＢＭＮＣｓの細胞質内および細胞膜上に発現したＣｏｌ ＩＩの免疫細胞化学的蛍光染色画像をまとめたものである。核は、ＤＡＰＩで青色に染色した。

【0022】

図３は、培養ＰＢＭＮＣｓのＦＳＣ／ＳＳＣスペクトラムおよびＣＤ１４－ＦＩＴＣヒストグラム（パネルＡ）のフローサイトメトリーを用いた解析画像をまとめたものであり、ゲート細胞集団がＣＤ１４^＋単球集団と相関することを示したものである。３日目に異なるタイプの分極化混合物で培養したＰＢＭＮＣｓのＣｏｌ ＩＩ（パネルＢ）の発現を分析した。パネルＣは、異なるタイプの分極化混合物で培養したＰＢＭＮＣｓ由来のゲートＣＤ１４^＋単球で発現したＣｏｌ ＩＩの％を示す。

【0023】

図４のパネルＡは、３日目および７日目にＭ－ＣＳＦ処理をしたＰＢＭＮＣｓ由来のＣＤ１４^＋単球（赤色）で発現したＣｏｌ ＩＩ（緑色）の免疫細胞化学的蛍光染色画像を一つにまとめたものである。パネルＢは、０～７日間、Ｍ－ＣＳＦで培養したＰＢＭＮＣｓ由来のＣＤ１４^＋単球におけるＣＤ２０６の発現プロファイルを示す。パネルＣは、５日目のＣＤ１４^＋単球におけるＣＤ２０６およびＣｏｌ ＩＩの共発現（すなわち、修飾マクロファージの表現型）を示す。ＣＤ２０６の存在は、培養したＣＤ１４^＋単球が修飾マクロファージに成熟したことを示している。

【0024】

図５のパネルＡは、異なるタイプの分極化混合物で培養したＰＢＭＮＣｓにおけるＣｏｌ ＩＩ（赤色）およびＣＤ２０６（緑色）発現の免疫細胞化学的蛍光染色画像を一つにまとめたものである。パネルＢは、異なるタイプの分極化混合物で培養したＰＢＭＮＣｓにおけるＣｏｌ ＩＩ／ＣＤ２０６（すなわち、修飾マクロファージの表現型）の共発現の割合を示す。

【0025】

図６のパネルＡはフローサイトメトリー画像をまとめたものであり、パネルＢは異なるタイプの分極化混合物で培養した修飾マクロファージのＣｏｌ ＩＩおよびＣＤ２０６の発現に関し、様々なサイトカインの影響を示す棒グラフである。

【0026】

図７は、フローサイトメトリーの解析画像を一つにまとめたものであり、３日目の修飾マクロファージでのＣｏｌ ＩＩの発現に関し、Ｍ－ＣＳＦ（パネルＡ）およびＧＭ－ＣＳＦ（パネルＢ）の用量効果を示す。パネルＣおよびＤは、修飾マクロファージにおけるＣｏｌ ＩＩの発現に関し、Ｍ－ＣＳＦ（パネルＣ）およびＧＭ－ＣＳＦ（パネルＤ）の用量効果を示す棒グラフである。

【0027】

図８は、３日目に行った免疫細胞化学染色の結果に基づいて、ＩＬ－４および／またはＭ－ＣＳＦ（パネルＡ）ならびにＩＬ－４および／またはＧＭ－ＣＳＦ（パネルＢ）を用いて培養したＰＢＭＮＣｓでの修飾マクロファージにおけるＣｏｌ ＩＩ／ＣＤ２０６の割合を示す棒グラフである。

【0028】

図９のパネルＡは、ＣＤ１４抗体コンジュゲート結合磁気ビーズで選別した単球において、ＰＢＳ（モック処理済み）またはＭ－ＣＳＦ＋ＩＬ－４の組合せを添加後、０．５、１、２、４および６時間での、定量的リアルタイムＲＴ－ＰＣＲで分析したＣｏｌ ＩＩ ｍＲＮＡの発現を示す棒グラフである。Ｃｏｌ ＩＩ ｍＲＮＡの発現は、ハウスキーピング遺伝子であるグリセルアルデヒド３－リン酸（ＧＡＰＤＨ）の発現を正規化し、指定した時間での倍率変化で示した。ＣＤ１４^＋単球は、Ｍ－ＣＳＦ＋ＩＬ－４処理前（パネルＣ～Ｄ）または後（パネルＡ～Ｂ）にＰＢＭＮＣｓから選別されたものである。

【0029】

図１０は、本願発明の修飾マクロファージの一実施形態による関節炎部位に対する治療効果を示す写真を集めたものである。パネルＡの左側は、修飾マクロファージで治療されたラットの後肢膝関節（細胞）、および修飾マクロファージを用いずに治療された後肢膝関節（ＰＢＳ）を示す。パネルＡの右側は、修飾マクロファージで治療された、アジュバント（完全フロイントアジュバント、ＣＦＡ））誘発関節炎を有するラットの後肢膝関節（細胞）、および修飾マクロファージを用いずに治療された後肢膝関節（ＰＢＳ）を示す。パネルＢ及びＣは、本願発明の修飾マクロファージで治療されたＯＡ罹患ラット（パネルＣ）およびＯＡ非罹患ラット（パネルＢ）の膝腫脹部位の厚さを示す折れ線グラフである。

【0030】

図１１は、投与患者の膝関節損傷および変形性関節症転帰スコア（Ｋｎｅｅ Ｉｎｊｕｒｙ ａｎｄ Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｏｕｔｃｏｍｅ Ｓｃｏｒｅ：ＫＯＯＳ）に関し、本願発明の修飾マクロファージの影響を示す折れ線グラフである。ＡＤＬは日常生活動作、ＱＯＬは膝に関連する生活の質を示す。

【0031】

図１２は、本願発明の修飾マクロファージで治療され（パネルＢおよびＤ）または治療されていない（パネルＡおよびＣ）、コラーゲン誘発関節リウマチを有するＣ５７ＢＬ／６マウス（パネルＡおよびＢ）およびＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ系ラット（パネルＣおよびＤ）の足の直径を示す折れ線グラフを含む。

【0032】

図１３は、本願発明の修飾マクロファージが、外傷性関節炎における関節可動域を有意に増加させたことを示す。

【0033】

図１４は、免疫不全マウスを対象とした修飾マクロファージ投与後２ヵ月時点の関節腔の軟骨表面を覆い（パネルＡ）、かつ骨内（パネルＢ）に、軟骨状の膜または構造物が形成されたことを示す蛍光免疫細胞化学的染色画像をまとめたものである。パネルＣは、免疫不全マウスに本願発明の修飾マクロファージを注射しなかったときの骨のバックグラウンドシグナルを示す。

【0034】

図１５は、修飾マクロファージにおける、ＣＤ２０６のｍＲＮＡ遺伝子発現（パネルＡ）、ＨＭＯＸ１（ヘムオキシゲナーゼ１）およびＦＤＸ１Ｌ（フェレドキシン１様、ＦＤＸ２）（パネルＢ）などの抗酸化物質（スカベンジャー）の遺伝子発現、ならびにＶ型コラーゲン（Ｖ型コラーゲンα－１：Ｃｏｌ５Ａ１）、プロコラーゲンＣ－エンドペプチダーゼエンハンサー２（ＰＣＯＬＣＥ２）およびヘパラン硫酸グルコサミン３－Ｏ－スルホトランスフェラーゼ１（ＨＳ３ＳＴ１）（パネルＣ）の遺伝子発現に関し、Ｍ－ＣＳＦの影響を示す棒グラフをまとめたものである。

【発明の詳細な説明】

【0035】

本明細書で使用する冠詞の「a」及び「an」は、文法的に冠詞が付くものが一つ以上（少なくとも一つ）であることを示す。例として、「a modified macrophage（修飾マクロファージ）」とは、一つの修飾マクロファージ、またはそれより多い修飾マクロファージであることを意味する。

【0036】

本明細書で使用される「有効量」は、軟骨の形成又は筋骨格系疾患の一つ以上の症状および徴候の改善をもたらすのに十分な、本明細書に開示する修飾マクロファージまたは薬学的組成物の投与量を指し、これには、関節の可動域制限として臨床的に、又は様々の画像化手段を通じて放射線学的に検出可能な、疼痛、関節の膨張および硬直が含まれるが、これらに限定されるものではい。

【0037】

本明細書で使用される用語「治療する」、「治療した」または「治療」は、緩和的な使用若しくは結果、および／または、筋骨格系疾患の進行の遅延若しくは阻害または軟骨の形成をいう。

【0038】

用語「被験体」は、筋骨格系疾患を有すると疑われる脊椎動物、または筋骨格系疾患の治療が必要とみなされる脊椎動物をいうことができる。被験体には、哺乳類および霊長類などの恒温動物、より好ましくはヒトが含まれる。ヒト以外の霊長類も被験体である。用語「被験体」は、ネコ、イヌ、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ等）および実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、スナネズミ、モルモット等）などの家畜化された動物を含む。したがって、本明細書では、獣医学的用途および医療用製剤が意図されている。

【0039】

修飾マクロファージの表面における、ＣＤ２０６などの表面マーカーの発現量または面内密度は、表面マーカーの発現が従来の方法で検出可能である限り「＋」とする。一つの例示的な実施形態において、「＋」は、蛍光活性化セルソーティング若しくは磁気ビーズにおいて、アイソタイプコントロールを超えて検出可能に存在すること；または定量的若しくは半定量的ＲＴ－ＰＣＲにおいて、バックグラウンドを超えて検出可能であること、を意味する。

【0040】

用語「修飾マクロファージ」および「分極Ｍ２マクロファージ」は、同義的に使用される。

【0041】

本明細書で使用される「実質的に含有しない」とは、組成物が、例えば特定のサイトカインなどの特定物質を５％、４％、３％、２％、１％または０．５％未満で含むことを意味する。いくつかの実施形態では、当該組成物は特定物質を含有しない。

【0042】

本明細書に示す全ての数値は、「約」によって修正されて理解することができる。本明細書で使用される用語「約」は、±１０％の変動を含むことを意味する。

【0043】

修飾単球およびマクロファージ
本願発明の修飾単球は、約１時間～１２時間、細胞培養培地とマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、ＩＬ－４またはそれらの組み合わせを含む分極化混合物との存在下でＰＢＭＮＣｓから得られ、修飾単球の分極化を導く。一実施形態において、修飾単球は表面マーカーＣＤ１４を発現している。別の実施形態では、本願発明の培養方法の結果として、修飾単球はＣＤ１４の表現型（すなわち、ＣＤ１４^＋）を呈し、かつ、タンパク質またはＲＮＡレベルでＩＩ型コラーゲン（Ｃｏｌ ＩＩ）を発現している。別の実施形態において、ＰＢＭＮＣｓと細胞培養培地と分極化混合物との接触時間は、約１時間～４時間である。

【0044】

本願発明の修飾マクロファージは、約１２時間～７日間、細胞培養培地とＭ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－４またはそれらの組み合わせを含む分極化混合物との存在下でＰＢＭＮＣｓから得られ、Ｍ２マクロファージの分極化を導く。一実施形態において、ＰＢＭＮＣｓと細胞培養培地と分極化混合物との接触時間は、約４時間～７日である。

【0045】

表１や図４のパネルＢに示すとおり、いわゆる分極Ｍ２マクロファージまたは修飾マクロファージの表現型特性は、ＣＤ１４^＋ＣＤ２０６^＋である。一実施形態において、修飾マクロファージは表面マーカーＣＤ１４を発現している。別の実施形態において、修飾マクロファージは表面マーカーＣＤ２０６を発現している。また別の一実施形態において、修飾マクロファージは表面マーカーＣＤ１４およびＣＤ２０６を発現している。

【0046】

一実施形態では、本願発明の培養方法の結果として、修飾マクロファージはＣＤ１４およびＣＤ２０６の表現型（すなわち、ＣＤ１４^＋ＣＤ２０６^＋）を呈し、かつタンパク質またはＲＮＡレベルでＩＩ型コラーゲン（Ｃｏｌ ＩＩ）を発現している。

【0047】

表１：修飾単球および修飾マクロファージの表現型特性

【表1】

【0048】

本願発明の修飾単球および修飾マクロファージは、自然発生しない。修飾単球または修飾マクロファージは、修飾単球または修飾マクロファージの細胞質内や細胞膜上にＣｏｌ ＩＩを有する。一実施形態において、本願発明の修飾マクロファージは、Ｍ１マクロファージからＭ２マクロファージへの転換を促進し、Ｍ１マクロファージの機能を抑制し、軟骨細胞のアポトーシスを低減し、軟骨病変を低下し、かつ軟骨形成を促進する。

【0049】

修飾マクロファージは、単一個体（すなわち、自家）から、または複数個体のプール（非自家同種）から入手することができる。

【0050】

一実施形態において、本願発明は、本明細書に記載の少なくとも一つの修飾単球または修飾マクロファージと、薬学的に許容される溶媒、担体または添加剤とを含有する医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、約０．０１％から９９．９％の修飾マクロファージまたは修飾単球と、約０．１％から９９．９９％の薬学的に許容される担体または添加剤とを含有する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、約１％から９０％の修飾マクロファージまたは修飾単球と、約１０％から９９％の薬学的に許容される担体または添加剤とを含有する。

【0051】

好適な溶媒は、例えば、水、生理食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組み合わせである。好適な添加剤は、例えば、湿潤剤、乳化剤またはｐＨ緩衝剤である。薬学的に許容される担体は、例えば、本発明の医薬組成物の安定化、または吸収若しくはクリアランス速度の増加若しくは低下に作用する、生理学的に許容される化合物を含有することができる。生理学的に許容される化合物には、例えば、グルコース、ショ糖およびデキストランなどの炭水化物、アスコルビン酸およびグルタチオンなどの抗酸化物質、キレート剤、低分子量タンパク質、界面活性剤、リポソームキャリア、ならびに、その他の安定剤および／または緩衝剤を含む。その他の生理学的に許容される化合物は、湿潤剤、乳化剤、分散剤および防腐剤を含む。添加剤は、非イオン性界面活性剤、ポリビニルピロリドン、ヒト血清アルブミン、水酸化アルミニウム、麻酔作用を有する薬剤、ならびに種々の非修飾かつ誘導体化されたシクロデキストリンであり得る。一実施形態において、非イオン性界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０およびポリソルベート８０を含むことができる。ポリビニルピロリドンは、医薬品グレードのポリビニルピロリドンであるプラスドンＣ１５であることが好ましい。これらの添加剤または担体を含有する医薬組成物は、周知の従来方法により作製される。

【0052】

例示的な実施形態において、医薬組成物は骨髄由来間葉系間質細胞を実質的に含有しない。

【0053】

また、本発明は、本明細書に記載の修飾マクロファージ、修飾単球または医薬組成物を、それを必要とする被験体に、筋骨格系疾患の症状または徴候を軽減するのに有効な量で投与することにより、筋骨格系疾患を抑制する方法を提供する。さらに本発明は、軟骨を形成するために本願発明の修飾マクロファージ、修飾単球または医薬組成物の有効量を、それを必要とする被験体に投与することにより、被験体の体のある部位に軟骨を形成する方法を提供する。修飾マクロファージまたは修飾単球は、特定の理論に拘束されることなく、以下のメカニズムのいずれか一つ以上により、筋骨格系疾患の症状および徴候を緩和すると考えられる：Ｍ１マクロファージからＭ２マクロファージへの転換の促進、Ｍ１マクロファージの機能の抑制、軟骨細胞のアポトーシスの低減、軟骨病変の低減および軟骨の形成の増加。ＯＡおよび関節リウマチ（ＲＡ）などの筋骨格系疾患の多くは、関節軟骨の変性が進行し、疼痛の増加、ロッキングおよび膝くずれなどの症状に至ることを特徴とすることから、患部の関節または部位への軟骨の形成により、軟骨の変性による症状および徴候が大幅に軽減される。

【0054】

本願発明のさらなる実施形態では、筋骨格系疾患の治療用医薬品の製造のために、本明細書に記載の修飾単球または修飾マクロファージの使用が提供される。

【0055】

筋骨格系疾患には、自己免疫性関節炎、変形性関節症（ＯＡ）および外傷性関節炎などの関節炎、椎間板変性疾患、または、筋捻挫および腱炎などの筋肉、腱若しくは靭帯に影響を及ぼす状態が含まれるが、これらに限定されない。

【0056】

自己免疫性関節炎には、関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬性関節炎および強直性脊椎炎が含まれるが、これらに限定されない。椎間板変性疾患には、椎間板変性が含まれるが、これに限定されない。

【0057】

本医薬組成物、修飾単球または修飾マクロファージの投与経路としては、静脈内、筋肉内、皮下、経口、局所、皮下、皮内、経皮、真皮下、非経口、直腸、脊髄、髄腔内、脳室内、関節内および椎間投与が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、修飾マクロファージは静脈内注射または注入により投与される。

【0058】

本願発明の修飾単球または修飾マクロファージは、筋骨格系疾患の治療のために、一種類以上の治療薬と共に投与することもできる。筋骨格系疾患を治療するための治療薬としては、ヒアルロン酸またはやその誘導体若しくは塩、成長因子、軟骨形成剤、ビタミンＤ３（コレカルシフェロール）、加水分解コラーゲン、ルサラチドアセタート、アボカド大豆不ケン化物（ＡＳＵ）、ステロイド、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）およびそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。修飾マクロファージは、筋骨格系疾患を治療するための治療薬と同時、投与前または投与後に投与することができる。

【0059】

本願発明の修飾単球または修飾マクロファージは、哺乳類の被験体に送達するための医薬組成物に製剤化される。医薬組成物は、単独で、および／または薬学的に許容される溶媒、添加剤または担体と混合して投与される。溶媒、添加剤または担体としては、併用薬の生物学的活性に影響を及ぼさないものが選択される。好適な溶媒としては、例えば、生理食塩水、デキストロース、グリセロール等、およびそれらの組み合わせである。さらに、溶媒は、湿潤剤または乳化剤などの補助的物質、ｐＨ緩衝剤、またはアジュバントを微量含むことができる。薬学的に許容される担体は、本発明の医薬組成物の安定化、または吸収若しくはクリアランス速度の増加若しくは低下に作用する、生理学的に許容される化合物を含有することができる。生理学的に許容される化合物には、例えば、グルコース、ショ糖およびデキストランなどの炭水化物、アスコルビン酸およびグルタチオンなどの抗酸化物質、キレート剤、低分子量タンパク質、界面活性剤、リポソームキャリア、ならびに、添加剤またはその他の安定剤および／または緩衝剤を含むことができる。その他の生理学的に許容される化合物には、湿潤剤、乳化剤、分散剤、または保存料を含む。The 21^st Edition of Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton, Pa.(Remington's)を参照。本願発明の医薬組成物は、薬剤、サイトカインまたはその他の生物応答調節物質などの補助的物質を含有することもできる。

【0060】

このような剤形の実際の製造方法は公知であるか、または当業者にとって明らかであろう。Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 21st editionを参照。

【0061】

修飾単球、修飾マクロファージまたは本医薬組成物は、修飾マクロファージまたは本医薬組成物が予防または治療のために使用されるか否かを問わず、計画通りに、かつ、被験体の年齢、体重および状態、使用される特定の組成物、ならびに投与経路に応じた期間にわたり、単回投与治療または反復投与治療で投与することができる。いくつかの実施形態において、修飾単球、修飾マクロファージまたは本医薬組成物は、１年ごと、６ヵ月ごと、４ヵ月ごと、３ヵ月ごと、１ヵ月ごと、月２回、月３回、隔週（ｑｏｗ）、週１回（ｑｗ）、週２回（ｂｉｗ）、週３回（ｔｉｗ）、週４回、週５回、週６回、隔日（ｑｏｄ）、連日（ｑｄ）、１日２回（ｑｉｄ）または１日３回（ｔｉｄ）投与される。

【0062】

細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータは、ヒトに使用する場合の投与量の範囲の設定に使用され得る。一実施形態において、修飾マクロファージの投与量は、ほとんどまたは全く毒性を伴わないＥＤ_５０を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、使用される剤形および採用される投与経路に応じて、この範囲内で変更することができる。別の実施形態では、治療上の有効な投与量は、細胞培養アッセイから最初に推定することができる。動物モデルでは、細胞培養で判定したＩＣ_５０（すなわち、症状の半数阻害を達成する修飾マクロファージの濃度）を含む循環血漿中濃度の範囲を達成するように用量を設定することができる。Sonderstrup, Springer, Sem. Immunopathol. 25: 35-45, 2003. Nikula et al., Inhal. Toxicol. 4(12): 123-53, 2000。

【0063】

医薬組成物は、本明細書に記載の修飾単球または修飾マクロファージの有効量を含むように製剤化され、その有効量は治療される被験体および治療される状態に依存する。特定の被験体のための特定の用量レベルは、特異的に修飾した単球または修飾マクロファージの活性、年齢、体重、全体的な健康状態、性別、食事、投与時間、投与経路、ならびに、排泄率、併用薬および治療対象の特定疾患の重症度を含む様々な要因に依存する。本願発明の修飾単球および修飾マクロファージの治療的または予防的な有効量の範囲は特に制限されないが、１回あたり少なくとも約１×１０^４個から１×１０^１０個の細胞数である。他の投与量も投与可能であり、１×１０^５個、１×１０^６個、１×１０^７個、２×１０^７個、１×１０^８個または１×１０^９個を含むが、これらに限定されない。

【0064】

修飾単球、修飾マクロファージまたは医薬組成物は、筋骨格系疾患の治療を目的に、単独で、あるいは、ヒアルロン酸又はその誘導体若しくは塩、成長因子、軟骨形成剤、ビタミンＤ３（コレカルシフェロール）、加水分解コラーゲン、ルサラチドアセタート、アボカド大豆不ケン化物（ＡＳＵ）、ステロイドおよび非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）のうちの一種類以上、あるいは任意の薬剤と併用して投与され得る。

【0065】

修飾マクロファージを作製するためのインビトロ培養方法
一実施形態において、修飾マクロファージを作製するインビトロ培養方法は以下の手順を含む。
（ａ）被験体からサンプルを採取する。サンプルには、末梢血、臍帯血および骨髄サンプルなど、一個以上の単核細胞を含有する体液が含まれるが、これらに限定されない。
（ｂ）密度勾配遠心分離法（例：Ｆｉｃｏｌｌ－ＰａｑｕｅＴＭ ＰＲＥＭＩＵＭ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＳＡ）を用いて、工程（ａ）のサンプル中の修飾マクロファージを他の種類の血液細胞から分離する。その他の単核細胞を分離する方法は、公知であるか、当業者にとって明らかであろう。
（ｃ）ＣＤ１４に対する抗体（例：ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（米国）が市販する抗ＣＤ１４ ＦＩＴＣコンジュゲート）を用いて工程（ｂ）の単核細胞を標識し、フローサイトメトリーを用いることにより、単球の％を判定する方法は、本技術分野において公知である。
（ｄ）精製した修飾マクロファージを、細胞培養培地と、Ｍ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－４またはそれらの組み合わせを含む分極化混合物とに接触させる方法。

【0066】

例示的な一実施形態において、分極化混合物は実質的にＩＬ－１０、ＩＬ－１３およびＴＧＦ－βを含有しない。別の例示的実施形態において、分極化混合物は約４０～６０重量％のＭ－ＣＳＦ、約４０～６０重量％のＩＬ－４、約５０重量％のＭ－ＣＳＦおよび約５０重量％のＩＬ－４を含有する。

【0067】

修飾マクロファージを作製するための、ＰＢＭＮＣｓと分極化混合物との接触時間の例示的な範囲は、例えば約４～１２時間、約１～３日、約２～５日、約１～６日、約１～７日、約１～８日、約１～９日、約１～１０日、少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日および少なくとも７日であるが、これらに限定されるものではない。一実施形態において、接触時間は約４～２４時間である。一実施形態において、接触時間は約４時間から約７日である。

【0068】

用語「細胞培養培地」は、哺乳動物細胞の培養に適切な培地をいう。培地は、固体、液体、気体、またはこれらの相と物質の混合であってもよい。培地は、液体培地、寒天、アガロース、ゼラチンおよびコラーゲン基質などのゲル状培地を含む。例示的な気体培地としては、例えばシャーレ、または他の固体若しくは半固体状の担体上で増殖する細胞が、曝される気相が挙げられる。細胞培養培地として特に制限はないが、ＲＰＭＩ－１６４０またはイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）が挙げられる。

【0069】

本願発明を実施するための具体的な態様である以下の例は、説明のためにのみ供され、いかなる意味でも本願発明の範囲を限定することを意図するものではない。

【実施例】

【0070】

実施例１：末梢血単核細胞（ＰＢＭＮＣｓ）の分離

【0071】

ドナーから末梢血サンプルを採取し、採取管にＥＤＴＡを保管した。末梢血サンプル１００ｍＬを、慎重に１００ｍＬのＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ｐｒｅｍｉｕｍの界面に添加した。７００ｘｇで１５分間の遠心分離後、採取管の上層にある細胞（すなわち、ＰＢＭＮＣｓ）を５０ｍＬ管に移した。５００ｘｇで５分間の遠心分離後、細胞ペレットを得て、抗ＣＤ１４ ＦＩＴＣ結合抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、米国）を用いたフローサイトメトリーで細胞ペレット中の単球の割合（％）を測定した。通常、１００ｍＬの血液から０．８～１．５×１０^８個のＰＢＭＮＣｓを回収することができる。

【0072】

実施例２：ＰＢＭＮＣｓの修飾マクロファージへの活性化と分極化

【0073】

実施例１で得られたＰＢＭＮＣｓ（リンパ球、単球およびＮＫ細胞を含む）を、２．５μｇ／ｃｍ^２のフィブロネクチン（＃０７１５９、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）コートスライド上で、（ａ）ＲＰＭＩ－１６４０（＃３１８００、Ｇｉｂｃｏ）＋ヒト血小板由来ライセート（Ｃｏｍｐａｓｓ）（コントロール）、（ｂ）１００ｎｇ／ｍＬのＭ－ＣＳＦ（＃２１６－ＧＭＰ－５００、Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ）、（ｃ）１００ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ（＃３００－０３、ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ）、または（ｄ）１００ｎｇ／ｍＬのＧ－ＣＳＦ（＃３００－２３、ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ）と共に、３日間インキュベートした。培養ＰＢＭＮＣｓのうち、単球由来のマクロファージをスライドに接着し、固定バッファー（＃４２０８０１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を用いてインキュベートし、細胞内染色用膜透過処理試薬（＃４２１００２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を用いて透過化し、抗Ｃｏｌ ＩＩ抗体（＃ＡＢ７６１、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で１時間染色を行った。Ｃｏｌ ＩＩ発現細胞を、緑色のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８色素ヤギ抗ウサギ免疫グロブリンＧ抗体（＃Ａ１１００８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて可視化した。総細胞数は、核のＤＡＰＩ染色（青色）により推定した。図１は、Ｍ－ＣＳＦで培養したＰＢＭＮＣｓ（すなわち、培養した単球由来のマクロファージ）で発現したＣｏｌ ＩＩの％が約５５％であり、ＧＭ－ＣＳＦで培養したＰＢＭＮＣｓ（すなわち、培養した単球由来のマクロファージ）では約４０％であり、Ｇ－ＣＳＦで培養したＰＢＭＮＣｓ（すなわち、培養した単球由来のマクロファージ）では約２５％であることを示す。

【0074】

さらに単球由来のマクロファージ（Ｍ－ＣＳＦを用いて培養したＰＢＭＮＣｓから分離）でのＣｏｌ ＩＩの発現は、モノクローナル（＃ＭＡ５－１２７８９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびポリクローナル（＃ＡＢ７６１、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いた免疫細胞化学的蛍光染色法によって、さらに確認した。図２は、培養した単球由来のマクロファージの細胞質内および細胞膜上の両方で発現したＣｏｌ ＩＩを示す。

【0075】

ＰＢＭＮＣｓは、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅを用いて末梢血から精製され、フロー解析に供された。単球集団は、前方散乱（ＦＳＣ）および側方散乱（ＳＳＣ）のプロットにおける分布プロットと、ＣＤ１４表面抗原の発現により同定した。フロー解析の結果、末梢血サンプルには、ＦＳＣ／ＳＳＣプロットにより１８．６％の単球と、ＣＤ１４の表面免疫染色の使用により１８．８％の単球とが含まれていた（図３のパネルＡ）。この結果は、ＦＳＣ／ＳＳＣを用いたゲート戦略または免疫染色のいずれも、単球／マクロファージの細胞集団を忠実に検証できることを示している。

【0076】

ＰＢＭＮＣｓは、細胞の懸濁状態を維持するために、（ａ）ＲＰＭＩ－１６４０＋ヒト血小板由来ライセート（コントロール）、（ｂ）１００ｎｇ／ｍＬのＭ－ＣＳＦ、（ｃ）１００ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦまたは（ｄ）１００ｎｇ／ｍＬのＧ－ＣＳＦを用いて、低接着シャーレで培養した。３日間の培養後、生きた浮遊細胞を抗Ｃｏｌ ＩＩ抗体で１時間染色し、細胞質膜上のＣｏｌ ＩＩの発現を検出した。図３のパネルＢおよびＣは、処理された単球（パネルＡのＦＳＣ／ＳＳＣゲート細胞）のＣｏｌ ＩＩ発現の％が、Ｍ－ＣＳＦでは約１５％、ＧＭ－ＣＳＦでは約８％、Ｇ－ＣＳＦでは約６．５％であることを示している。

【0077】

培養したＰＢＭＮＣｓを、３日目と７日目に抗ＣＤ１４抗体と抗Ｃｏｌ ＩＩ抗体で共染色し（図４のパネルＡ）、Ｃｏｌ ＩＩを発現している細胞を同定した。培養したＰＢＭＮＣｓのほとんどは、ＣＤ１４^＋単球に変化しており、Ｃｏｌ ＩＩの発現は時間依存的様式であった。１００ｎｇ／ｍＬのＭ－ＣＳＦを４時間以上処理すると、ＣＤ１４^＋単球はＣＤ１４^＋ＣＤ２０６^＋Ｍ２マクロファージに分極した（図４のパネルＢ）。図４のパネルＣはさらに、５日目にＣｏｌ ＩＩ、ＣＤ１４およびＣＤ２０６タンパク質を発現する、この発明で修飾マクロファージと名付けられたＭ２マクロファージ集団の特徴的なサブグループを明らかにするものである。

【0078】

Ｃｏｌ ＩＩ発現細胞の細胞識別をさらに確認するため、Ｍ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦまたはＧ－ＣＳＦで処理したＰＢＭＮＣｓを、抗ＣＤ２０６抗体（＃５５５９５４、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ^ＴＭ、赤色）、特異的Ｍ２マクロファージマーカーおよび抗Ｃｏｌ ＩＩ抗体（緑色）を用いて、１時間二重染色した。総細胞数は、ＤＡＰＩ染色した核により解析した。図５のパネルＡは、Ｃｏｌ ＩＩおよびＣＤ２０６タンパク質の両方の発現が認められ、本願発明の修飾マクロファージであるＭ２マクロファージ集団の特徴的なサブグループを明らかにするものである。図５のパネルＢは、培養３日後の培養ＰＢＭＮＣｓにおける修飾マクロファージ（Ｃｏｌ ＩＩ／ＣＤ２０６二重陽性細胞）の割合が、Ｍ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦにより有意に誘導され、Ｇ－ＣＳＦにより中程度に誘導されたことを示している。

【0079】

実施例３：種々のサイトカインによるＣｏｌ ＩＩ発現への影響

【0080】

実施例２のＰＢＭＮＣｓを単離し、（ａ）ＲＰＭＩ－１６４０＋ヒト血小板溶解物（ネガティブコントロール）、（ｂ）１００ｎｇ／ｍＬのインターロイキン４（ＩＬ－４、＃２０４－ＧＭＰ－０１Ｍ）、（ｃ）２０ｎｇ／ｍＬのインターロイキン１０（ＩＬ－１０、＃２００－１０、ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ）、（ｄ）２０ｎｇ／ｍＬのインターロイキン１３（ＩＬ－１３、＃２００－１３、ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ）、（ｅ）２０ｎｇ／ｍＬのトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ－β、＃１００－２１、ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ）で１日間培養した。培養した細胞は、抗ＣＤ２０６抗体および抗Ｃｏｌ ＩＩ抗体を用いて１時間染色した。細胞集団はまず、ＦＳＣ／ＳＳＣおよび免疫染色法に基づいてゲーティングされ、Ｃｏｌ ＩＩとＣＤ２０６の発現に基づいて修飾マクロファージ集団を同定した。

【0081】

図６のパネルＡおよびＢは、ＩＬ－４が、試験したサイトカインのうち、ＰＢＭＮＣｓ集団全体でＣｏｌ ＩＩ／ＣＤ２０６の二重発現を有する修飾マクロファージの割合を最も高くすることを示している。

【0082】

実施例４：Ｍ－ＣＳＦおよびＧＭ－ＣＳＦのさまざまな添加量がＣｏｌ ＩＩの発現に及ぼす影響

【0083】

実施例２のＰＢＭＮＣｓを、２、１０、２０、５０および１００ｎｇ／ｍＬの（Ａ）Ｍ－ＣＳＦまたは（Ｂ）ＧＭ－ＣＳＦを用いて３日間処理した。細胞は、抗Ｃｏｌ ＩＩ抗体で１時間染色した。フローサイトメトリー解析では、ゲーティング戦略を使用した。細胞集団はまず、単球の同定のために、ＦＳＣ－ＡおよびＳＳＣ－Ａに基づいてゲートされ、さらに単球はＣｏｌ ＩＩの発現に基づいて解析した。

【0084】

図７は、Ｍ－ＣＳＦおよびＧＭ－ＣＳＦがＣｏｌ ＩＩの発現を容量依存的様式で誘発すること示している。

【0085】

実施例５：Ｃｏｌ ＩＩの発現に対するＭ－ＣＳＦ／ＩＬ－４の併用およびＧＭ－ＣＳＦ／ＩＬ－４の併用の相乗効果

【0086】

実施例２のＰＢＭＮＣｓを、２．５ｕｇ／ｃｍ^２のフィブロネクチンコートスライド上において、（ａ）ＲＰＭＩ－１６４０＋ヒト血小板溶解物（コントロール）、（ｂ）１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－４、（ｃ）１００ｎｇ／ｍＬのＭ－ＣＳＦ、（ｄ）１００ｎｇ／ｍＬのＭ－ＣＳＦ＋１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－４で３日間培養した。

【0087】

実施例２の別のＰＢＭＮＣｓ集団は、２．５ｕｇ／ｃｍ^２のフィブロネクチンコートスライド上において、（ａ）ＲＰＭＩ－１６４０＋ヒト血小板溶解物（コントロール）、（ｂ）１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－４、（ｃ）１００ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ、（ｄ）１００ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ＋１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－４で、３日間培養した。

【0088】

培養したＰＢＭＮＣｓは固定バッファーで固定し、細胞内染色用膜透過処理試薬を用いて透過化し、細胞質膜に抗ＣＤ２０６抗体、細胞質に抗Ｃｏｌ ＩＩ抗体を用いて１時間染色した。細胞は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８色素ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体の染色で可視化した。総細胞数は、核のＤＡＰＩ染色により分析した。

【0089】

図８のパネルＡは、培養ＰＢＭＮＣｓからの修飾マクロファージ（Ｃｏｌ ＩＩ／ＣＤ２０６二重陽性細胞）誘導に対するＭ－ＣＳＦ／ＩＬ－４併用の相乗効果を示す。図８のパネルＢは、修飾マクロファージ誘導に対するＧＭ－ＣＳＦ／ＩＬ－４の併用の相乗効果を示す。

【0090】

実施例６：修飾マクロファージのＣｏｌ ＩＩの発現に対するインキュベーション時間の影響

【0091】

実施例２のＰＢＭＮＣｓを、（ａ）リン酸緩衝生理食塩水またはＰＢＳ（モック処理後）またはＭ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）と、ＩＬ－４（１００ｎｇ／ｍＬ）とを併用して、０．５、１、２、４または６時間培養した。培養したＰＢＭＮＣｓから単球を抗ＣＤ１４抗体結合磁気ビーズで選別し、全ＲＮＡを抽出した後、リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を用いて発現量を解析した。Ｃｏｌ ＩＩのＲＮＡ発現量は、グリセルアルデヒド３－リン酸（ＧＡＰＤＨ）を基準とし、倍率変化をＰＢＳコントロールと比較した。

【0092】

図９のパネルＡ～Ｄは、Ｍ－ＣＳＦ／ＩＬ－４の併用が、ＣＤ１４単球のＣｏｌ ＩＩの発現に対し、時間依存的様式に影響することを示している。Ｃｏｌ ＩＩのｍＲＮＡ発現は、２時間の誘導で約２倍の誘導となり、コントロールのそれよりも有意に高いことを示す（ｐ＜０．００１、＊＊＊）。ＣＤ１４^＋単球は、Ｍ－ＣＳＦ＋ＩＬ－４による処理前（パネルＣおよびＤ）および処理後（パネルＡおよびＢ）に、ＰＢＭＮＣｓから選別した。ＰＢＭＮＣｓから得られたＣＤ１４^＋単球は、サイトカイン処理の前後で、同様のＣｏｌ ＩＩ発現パターンを示したことから、ＰＢＭＮＣｓ中の非単球集団からの間接的経路ではなく、分極化因子が単球をＣｏｌ ＩＩ発現細胞に向けて直接活性化することが示された。

【0093】

実施例７：ＯＡラットにおける修飾マクロファージの影響に関するインビボ評価

【0094】

体重２００～２１０ｇの雄性成熟Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）系ラット１０匹を、温度（２４～２６℃）および湿度（４０～６０％）が一定の室内で飼育し、飼料および水を自由に摂取できるようにした。

【0095】

各ラットの後肢膝関節に０．２５ｍＬのフロイント完全アジュバント（ＣＦＡ、Ｓｉｇｍａの市販品、米国）を注射し、ＯＡを誘発させた。６日目に、同じ関節に０．０５ｍＬのＣＦＡを注射し、炎症を増強させた。関節炎が確立した７日目に、関節炎の膝関節に０．２ｍＬのＰＢＳ（コントロール）または２×１０^５のＭ－ＣＳＦ／ＩＬ－４誘導修飾マクロファージを０．２ｍＬのＰＢＳで治療した。細胞に結合していないサイトカインは、ＰＢＳ洗浄で２回行うことにより除去した。膝関節は、２週間、２～３日おきにバーニアを用いて測定した。

【0096】

雄性成熟ＳＤ系ラット４匹（健康コントロール）およびＣＦＡ誘発関節炎を有するラット１６匹を当該試験に組み入れた。関節炎誘発後７日目に、０．２ｍＬのＰＢＳ（モック）を８匹のラットに投与し、０．２ｍＬのＰＢＳで処理した細胞を他の８匹のラットに投与した。投与後の２５日間にわたって、各膝関節の直径を２～３日ごとに測定した。２５日目に、ＰＢＳを投与した全てのラットで、関節炎の古典的な症状（関節の腫れ）が見られた。注目すべきは、修飾マクロファージが、関節炎および関節の腫れの進行と重症度とを有意に低下させたことである（ｐ＜０．０１、図１０）。関節炎の抑制は、修飾マクロファージの注射前に、細胞を洗浄して当初の培養培地を完全に除去したため、分極化因子を介するものではなかった。これらの結果は、修飾マクロファージが、関節炎をコントロールするための治療上の有効な薬剤となり得ることを強く示唆している。

【0097】

実施例８：ＯＡに対する修飾マクロファージの影響を評価する臨床試験

【0098】

台湾・台中市にある中国医薬大学病院の研究倫理委員会（ＣＭＵＨ１０９－Ｒｅｃ１－０１２）により承認され、台湾・台中市のアジア大学病院で前向きな臨床研修が実施された。

【0099】

本研究は、慢性変形性関節症を有する患者を対象とし、腫瘍性疾患、重度の貧血、血小板減少症および感染症のいずれか１つでも有していれば、本研究から除外した。５名の患者を研究に登録し、登録した全ての患者からインフォームドコンセントが得られた。

【0100】

ＯＡの重症度は、Ｘ線に基づくＫｅｌｌｇｒｅｎ－Ｌａｗｒｅｎｃｅ（Ｋ－Ｌ）試験を用いて評価した。治験責任医師によって、Ｍ－ＣＳＦで５日間培養した１×１０^８個の自家ＰＢＭＮＣｓ（本願発明の修飾マクロファージを１～３×１０^７個含む）の単回関節内注射が実施された。ＯＡの進行は、関節内注射の６ヵ月後に、膝関節損傷および変形性関節症転帰スコア（Ｋｎｅｅ Ｉｎｊｕｒｙ ａｎｄ Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｏｕｔｃｏｍｅ Ｓｃｏｒｅ：ＫＯＯＳ）、すなわち膝と特定の転帰（疼痛、その他の症状、日常生活動作、スポーツおよびレクリエーション機能、ならびに膝に関連する生活の質）を評価するために設計された質問票を用いて、ＯＡの進行を評価した。

【0101】

図１１は、本願発明の修飾マクロファージによって、疼痛、スポーツおよび膝に関連する生活の質が有意に改善したことを示す（ｐ＜０．０５）。

【0102】

実施例９：ＲＡラットに対する修飾マクロファージの影響に関するインビボ評価

【0103】

げっ歯類のコラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）は、ヒトＲＡの古典的モデルである。ＣＩＡが誘発されたＲＡは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ系ラットの両方に対し、ＩＩ型コラーゲン（２００μｇ）を尾静脈に皮下注射することにより確立させることに成功した。４０日目に顕著な足の腫れが観察され、１０５日目まで持続した。５０日目（投与１回目）および８０日目（投与２回目）に、本願発明の修飾マクロファージ２×１０^５個を各マウスおよびラットの左膝に関節内注射し、モック処理後のコントロールとして、各マウスおよびラットの右膝にＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を関節内注射した。図１２は、本願発明の修飾マクロファージによって、ＲＡマウスおよびＲＡラットの両方で足の腫れが有意に低減し、その効果が２回目の投与後も少なくとも２５日以上持続したことを示している。

【0104】

実施例１０：外傷性関節炎に対する修飾マクロファージの影響に関する臨床評価

【0105】

指節骨を骨折した４５歳の男性患者で右中指の近位指節間関節の外傷性関節炎が認められた。疼痛が持続し、患部の関節を曲げることができなかった（図１３の左側の矢印）。

【0106】

受傷から約４ヵ月後に、本願発明の３．５×１０^７個の修飾マクロファージ含む、Ｍ－ＣＳＦで５日間培養した１．５×１０^８個の自家ＰＢＭＮＣｓを、当該患者の患部関節に関節内注射により投与した。注射後１週間で関節痛が著しく改善し、治療３週間後には患部関節を完全に曲げられるようになった（図１３の右側の矢印）。

【0107】

実施例１１：関節表面および骨内の軟骨形成

【0108】

本願発明の修飾マクロファージ（２×１０^５個）を、免疫不全マウスの関節腔内および骨内に投与した。注射後２ヵ月の関節腔および骨の免疫化学染色を行ったところ、免疫不全マウスの関節腔内（パネルＡ）および骨内（パネルＢ）の軟骨表面に軟骨状の膜または軟骨状の構造物（細胞質は緑、核はＤＡＰＩで青に染色されたヒトＣｏｌ ＩＩ）の形成が確認された（図１４）。図１４のパネルＣは、本願発明の修飾マクロファージを注射しなかった、対応する骨／関節腔のバックグラウンドシグナルを示す。

【0109】

実施例１２：Ｍ－ＣＳＦがＣＤ２０６、抗酸化物質（スカベンジャー）および骨構成要素の形成に及ぼす影響

【0110】

ＰＢＭＮＣｓは、０、２、１０、５０および１００ｎｇ／ｍＬの濃度のＭ－ＣＳＦで２４時間かけて培養した。実施例６と同様に、抗ＣＤ１４抗体結合磁気ビーズを用いて選別した修飾マクロファージについては、Ｐｈａｌａｎｘ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏｍｐａｎｙ（台湾）の標準ＲＮＡ単離プロトコルに従って、トリゾールおよびクロロホルム溶液を用いて全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡサンプルは、ＯＤ２６０、ＯＤ２８０、ＯＤ２３０、アガロース電気泳動、ＲＮＡの定性および定量検査（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ、Ａｇｉｌｅｎｔ ＲＮＡ ６０００ Ｎａｎｏ／Ｐｉｃｏ Ａｓｓａｙ）により、検査された。純度および安全性の質は、Ｐｈａｌａｎｘ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏｍｐａｎｙ（台湾）により検査され合格であった。

【0111】

１μｇのＲＮＡサンプルから蛍光アンチセンスＲＮＡ（ＣｙＤｙｅ－ａＲＮＡ）ターゲットを調製し、ＯｎｅＡｒｒａｙ（登録商標）アミノアリルａＲＮＡ増幅キット（Ｐｈａｌａｎｘ Ｂｉｏｔｅｃｈ、台湾）を用いて、アミノアリル－ウリジン－５’－トリホスフェートおよびＮＨＳ－ＣｙｅＤｙｅを添加して合成した。蛍光ｃＤＮＡサンプルは、Ｈｕｍａｎ Ｗｈｏｌｅ Ｇｅｎｏｍｅ ＯｎｅＡｒｒａｙ（登録商標）にハイブリダイズし、Ｐｈａｌａｎｘ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏｍｐａｎｙのルーチンプロトコルに従って処理した。蛍光シグナルは、Ａｇｉｌｅｎｔマイクロアレイスキャナー（Ｇ２５０５Ｃ）でスキャンされ、各プローブの強度はＧｅｎｅＰｉｘ ４．０ソフトウェア（モレキュラーデバイス、米国）により求めた。

【0112】

チップの生強度は、データ解析を処理するためのＲｏｓｅｔｔａ Ｒｅｓｏｌｖｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）７．０（Ｒｏｓｅｔｔａ Ｂｉｏｓｏｆｔｗａｒｅ、メルク、米国）で解析した。基準を満たしていたプローブの強度は、５０％メジアンスケーリング正規化法により正規化した。繰り返し測定されたデータは、その再現性（Ｒ値＞０．９７５）を確認するために、ピアソン相関係数計算により検証した。正規化したスポット強度は、対照群と投与群の遺伝子発現ｌｏｇ_２比で示した。ｌｏｇ_２比≧１またはｌｏｇ_２比≦－１、およびｐ＜０．０５のプローブを差次的発現遺伝子として選択し、さらにシグナル伝達経路を分析した。

【0113】

図１５のパネルＡは、修飾マクロファージにおけるＣＤ２０６（マンノース受容体Ｃ１型（ＭＲＣ１）とも呼ばれる）の遺伝子発現が、Ｍ－ＣＳＦの濃度に関わらず４～６倍であることを示している。図１５のパネルＢは、Ｍ－ＣＳＦが、抗酸化物質（スカベンジャー）、すなわち修飾マクロファージにおけるＨＭＯＸ１（ヘムオキシゲナーゼ１）とＦＤＸ１Ｌ（フェレドキシン１様、ＦＤＸ２）の遺伝子の発現を、時間依存的様式で増加させることを示している。図１５のパネルＣは、Ｍ－ＣＳＦが、Ｖ型コラーゲン（Ｖ型コラーゲンα１、Ｃｏｌ５Ａ１）、プロコラーゲンＣ－内ペプチダーゼエンハンサー２（ＰＣＯＬＣＥ２）およびヘパラン硫酸グルコサミン３－Ｏ－スルホトランスフェラーゼ１（ＨＳ３ＳＴ１）など、修飾マクロファージでの骨構成要素形成遺伝子の発現を促進することを示している。Ｖ型コラーゲンは、骨－筋組織の主要構成成分であり、ＰＣＯＬＣＥ２はコラーゲンの成熟および線維性コラーゲンの沈着に必要不可欠である。ＨＳ３ＳＴ１は、骨、軟骨および腱の形成に重要な成分であるヘパラン硫酸の合成に関わる律速酵素である。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図9D】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図11】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図12D】

【図13】

【図14(A)】

【図14(B)】

【図14(C)】

【図15A】

【図15B】

【図15C】

【国際調査報告】