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特表2023-521598ＬＰＣ－ＤＨＡおよびＬＰＣ－ＥＰＡが豊富なクリルオイル組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-05-25
(54)【発明の名称】ＬＰＣ－ＤＨＡおよびＬＰＣ－ＥＰＡが豊富なクリルオイル組成物
(51)【国際特許分類】
A23L 33/115 20160101AFI20230518BHJP
A61K 35/612 20150101ALI20230518BHJP
A61K 31/683 20060101ALI20230518BHJP
A61K 31/23 20060101ALI20230518BHJP
A61K 31/20 20060101ALI20230518BHJP
A61K 31/047 20060101ALI20230518BHJP
A61K 31/122 20060101ALI20230518BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20230518BHJP
A61P 25/18 20060101ALI20230518BHJP
A61P 25/16 20060101ALI20230518BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20230518BHJP
A23D 9/02 20060101ALI20230518BHJP
【ＦＩ】
A23L33/115
A61K35/612
A61K31/683
A61K31/23
A61K31/20
A61K31/047
A61K31/122
A61P27/02
A61P25/18
A61P25/16
A61P25/28
A23D9/02
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022559535
(86)(22)【出願日】2021-03-31
(85)【翻訳文提出日】2022-11-29
(86)【国際出願番号】 US2021025110
(87)【国際公開番号】W WO2021202680
(87)【国際公開日】2021-10-07
(31)【優先権主張番号】63/002,425
(32)【優先日】2020-03-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/113,908
(32)【優先日】2020-11-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】520223572
【氏名又は名称】エーケル バイオマリーン アンタークティク エーエス
(71)【出願人】
【識別番号】513158117
【氏名又は名称】ザ ボード オブ トラスティース オブ ザ ユニバーシティー オブ イリノイ
【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｔｒｕｓｔｅｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｌｌｉｎｏｉｓ
【住所又は居所原語表記】３５２ Ｈｅｎｒｙ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ，５０６ Ｓｏｕｔｈ Ｗｒｉｇｈｔ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｕｒｂａｎａ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ ６１８０１，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】マイレン，フィン
(72)【発明者】
【氏名】ハルス，ペッター－アルヌト
(72)【発明者】
【氏名】ホエム，ニルス
(72)【発明者】
【氏名】シュトルスフェ，アンドレアス ベルク
(72)【発明者】
【氏名】サバイア，パパサニ ヴィー．
(72)【発明者】
【氏名】ヤラガラ，プールナ
(72)【発明者】
【氏名】ドハヴァマニ，スガシニ
(72)【発明者】
【氏名】タイ，レオン
【テーマコード（参考）】
4B018
4B026
4C086
4C087
4C206
【Ｆターム（参考）】
4B018LB08
4B018LB10
4B018LE01
4B018LE02
4B018LE05
4B018MD08
4B018MD11
4B018MD12
4B018MD14
4B018MD17
4B018MD18
4B018MD90
4B018ME14
4B018MF12
4B026DG14
4B026DH10
4B026DL09
4B026DP10
4C086AA01
4C086AA02
4C086DA41
4C086MA02
4C086MA03
4C086MA04
4C086MA52
4C086MA66
4C086NA14
4C086ZA02
4C086ZA15
4C086ZA16
4C086ZA18
4C086ZA33
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB20
4C087CA06
4C087CA19
4C087CA43
4C087MA02
4C087MA52
4C087MA66
4C087NA14
4C087ZA02
4C087ZA15
4C087ZA16
4C087ZA18
4C087ZA33
4C206AA01
4C206AA02
4C206CA13
4C206CB15
4C206DA03
4C206DB06
4C206DB43
4C206DB48
4C206MA02
4C206MA03
4C206MA04
4C206MA72
4C206MA86
4C206NA14
4C206ZA02
4C206ZA15
4C206ZA16
4C206ZA18
4C206ZA33
(57)【要約】
本発明は、オメガ－３脂肪酸を保有するホスファチジルコリン由来化合物を含む組成物を提供し、これは、予防または治療において、特に全身投与される場合に使用される。本発明はさらに、ＬＰＣ－ＤＨＡおよびＬＰＣ－ＥＰＡが豊富な改良されたクリルオイル組成物、製造方法、ならびに神経障害および眼の障害を治療するための使用方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
被験体における網膜障害を治療または予防する方法であって、ＬＰＣ－ＤＨＡおよびＬＰＣ－ＥＰＡが豊富なクリルオイル組成物の有効量を被験体に投与する工程を含む、方法。
【請求項2】
前記網膜障害が、加齢黄斑変性、糖尿病性網膜症およびドライアイ疾患から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
ＬＰＣ－ＤＨＡおよびＬＰＣ－ＥＰＡが豊富な前記クリルオイル組成物が、リパーゼ処理クリルオイルである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
ＬＰＣ－ＤＨＡおよびＬＰＣ－ＥＰＡが豊富な前記クリルオイル組成物が、機能性食品組成物である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記投与が経口である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
被験体における網膜障害の治療または予防に使用するための、ＬＰＣ－ＤＨＡおよびＬＰＣ－ＥＰＡが豊富なクリルオイル。
【請求項7】
前記網膜障害が、加齢黄斑変性、糖尿病性網膜症およびドライアイ疾患から選択される、請求項６に記載の使用。
【請求項8】
ＬＰＣ－ＤＨＡおよびＬＰＣ－ＥＰＡが豊富な前記クリルオイル組成物が、リパーゼ処理クリルオイルである、請求項６または７に記載の使用。
【請求項9】
ＬＰＣ－ＤＨＡおよびＬＰＣ－ＥＰＡが豊富な前記クリルオイル組成物が、機能性食品組成物である、請求項６～８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項10】
ＬＰＣ－ＤＨＡおよびＬＰＣ－ＥＰＡが豊富な前記クリルオイル組成物が経口投与用に製剤化されている、請求項６～９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項11】
眼の疾患または状態の１つ以上の症状および／または徴候を治療、予防および／または軽減するための方法であって、それらを必要とする被験体に、製剤の有効量を投与する工程を含み、
前記製剤は、式１～８のいずれか１つからなる群から選択されるＬＰＣ化合物を含むリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）組成物、およびそれらの任意の組み合わせを含み、
疾患または状態の症状を改善、制御、低減または緩和する、
方法：
【化1】
式中、
Ｒ１は、ＯＨまたはＯ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＨ３であり；
Ｒ２は、ＯＨまたはＯ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＨ３であり；および
ｎは、０、１または２である。
【請求項12】
Ｒ１がＯＨであり、かつ、Ｒ２がＯＨである、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記ＬＰＣ組成物がｉ）Ｒ２がＯＨである式１による化合物；および／または
ｉｉ）Ｒ１がＯＨである式３による化合物
を含む場合、
当該ＬＰＣ組成物は、請求項１７で言及される他のＬＰＣ化合物の少なくとも１つをさらに含むという条件を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項14】
１つ以上の前記ＬＰＣ化合物が式１による化合物；および／または式３による化合物；
ならびに
式２による化合物；および／または式４による化合物である、
請求項１１に記載の方法。
【請求項15】
Ｒ１およびＲ２がＯＨであり；ならびにリゾＰＣ－ＤＨＡ：リゾＰＣ－ＥＰＡのモル比が１：１～３：１の範囲であるか；またはリゾＰＣ－ＥＰＡ：リゾＰＣ－ＤＨＡのモル比が１：１～５：１の範囲であり；
ただし、ｉ）リゾＰＣ－ＥＰＡのモル数は１－リゾＰＣ－ＥＰＡのモル数＋２－リゾＰＣ－ＥＰＡのモル数であり；かつｉｉ）リゾＰＣ－ＤＨＡのモル数は、１－リゾＰＣ－ＤＨＡのモル数＋２－リゾＰＣ－ＤＨＡのモル数である、請求項１１に記載の方法。
【請求項16】
前記疾患または状態が、眼の炎症、角膜神経異常、および眼の表面上の擦過傷からなる群より選択されるドライアイ疾患などのドライアイである、請求項１１～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記疾患または状態が、眼の神経変性疾患である、請求項１１～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記眼の神経変性疾患が、加齢黄斑変性、糖尿病性網膜症、非増殖性網膜症、増殖性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、網膜色素変性症、中心静脈閉塞症および緑内障からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記投与が、経口投与および血管内投与からなる群から選択される様式による、請求項１１～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
前記投与の様式が、経口投与である、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
前記投与の様式が、血管内投与である、請求項１９に記載の方法。
【請求項22】
前記製剤中の前記ＬＰＣ組成物が、当該ＬＰＣ組成物の１０重量％～１００重量％の量の総ＬＰＣを含む、請求項１１～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
前記ＬＰＣ組成物が、ＬＰＣとは異なる追加の脂質を含む、請求項１１～２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
前記追加の脂質が、トリグリセリド、遊離脂肪酸、エチルエステル、ならびにホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルコリンなどのリン脂質からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
前記ＬＰＣ組成物が、ホスファチジルコリンの量と比較して多くの量の前記ＬＰＣ化合物を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
前記製剤が、ルテイン、アスタキサンチン、ゼアキサンチンおよびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される成分をさらに含む、請求項１１～２５いずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
前記被験体が、哺乳動物被験体である、請求項１１～２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
前記被験体が、ヒト被験体である、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
式１～８のいずれか１つからなる群から選択されるＬＰＣ化合物を含むリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）組成物を含む、製剤であり：【化2】
式中、
Ｒ１は、ＯＨまたはＯ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＨ３であり；
Ｒ２は、ＯＨまたはＯ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＨ３であり；および
ｎは、０、１または２であり；
眼の疾患または状態の１つ以上の症状および／または徴候を治療、予防および／または軽減する工程において使用するための、製剤。
【請求項30】
Ｒ１がＯＨであり、かつ、Ｒ２がＯＨである、請求項２９に記載の使用。
【請求項31】
前記ＬＰＣ組成物がｉ）Ｒ２がＯＨである式１による化合物；および／または
ｉｉ）Ｒ１がＯＨである式３による化合物
を含む場合、
当該ＬＰＣ組成物は、請求項３５で言及される他のＬＰＣ化合物の少なくとも１つをさらに含むという条件を有する、請求項２９に記載の使用。
【請求項32】
１つ以上の前記ＬＰＣ化合物が式１による化合物；および／または式３による化合物；
ならびに
式２による化合物；および／または式４による化合物である、請求項２９に記載の使用。
【請求項33】
Ｒ１およびＲ２がＯＨであり；ならびにリゾＰＣ－ＤＨＡ：リゾＰＣ－ＥＰＡのモル比が１：１～３：１の範囲であるか；またはリゾＰＣ－ＥＰＡ：リゾＰＣ－ＤＨＡのモル比が１：１～５：１の範囲であり；
ただし、ｉ）リゾＰＣ－ＥＰＡのモル数は１－リゾＰＣ－ＥＰＡのモル数＋２－リゾＰＣ－ＥＰＡのモル数であり；かつｉｉ）リゾＰＣ－ＤＨＡのモル数は、１－リゾＰＣ－ＤＨＡのモル数＋２－リゾＰＣ－ＤＨＡのモル数である、請求項２９に記載の使用。
【請求項34】
前記疾患または状態が、眼の炎症、角膜神経異常、および眼の表面上の擦過傷からなる群より選択されるドライアイ疾患などのドライアイである、請求項２９～３３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項35】
前記疾患または状態が、眼の神経変性疾患である、請求項２９～３４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項36】
前記眼の神経変性疾患が、加齢黄斑変性、糖尿病性網膜症、非増殖性網膜症、増殖性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、網膜色素変性症、中心静脈閉塞症および緑内障からなる群から選択される、請求項３５に記載の使用。
【請求項37】
前記製剤中の前記ＬＰＣ組成物が、当該ＬＰＣ組成物の１０重量％～１００重量％の量の総ＬＰＣを含む、請求項２９～３６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項38】
前記ＬＰＣ組成物が、ＬＰＣとは異なる追加の脂質を含む、請求項２９～３７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項39】
前記追加の脂質が、トリグリセリド、遊離脂肪酸、エチルエステル、ならびにホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルコリンなどのリン脂質からなる群から選択される、請求項３８に記載の使用。
【請求項40】
前記ＬＰＣ組成物が、ホスファチジルコリンの量と比較して多くの量の前記ＬＰＣ化合物を含む、請求項３９に記載の使用。
【請求項41】
前記製剤が、ルテイン、アスタキサンチン、ゼアキサンチンおよびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される成分をさらに含む、請求項３９または４０に記載の使用。
【請求項42】
前記被験体が、哺乳動物被験体である、請求項３９～４１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項43】
前記被験体が、ヒト被験体である、請求項４２に記載の使用。
【請求項44】
ＬＰＣ－ＤＨＡおよびＬＰＣ－ＥＰＡが豊富なクリルオイル組成物を調製する方法であって、前記クリルオイル中、ＤＨＡ含有リン脂質およびＥＰＡ含有リン脂質のｓｎ－１位に特異的なリパーゼを用いてクリルオイルを処理する工程を含む、方法。
【請求項45】
前記リパーゼが、ムコール・ミエヘイ(Mucor meihei)由来のリパーゼを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項46】
前記リパーゼが、ムコール・ミエヘイ(Mucor meihei)由来の固定化リパーゼを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項47】
前記クリルオイル組成物が、約８０重量パーセント超のＬＰＣ－ＤＨＡおよびＬＰＣ－ＥＰＡを含むリゾホスファチジルコリンを含む、請求項４４～４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項48】
請求項４４～４７のいずれか一項に記載の方法に従って調製された、ＬＰＣ－ＤＨＡおよびＬＰＣ－ＥＰＡが豊富な、リパーゼ処理クリルオイル組成物。
【請求項49】
約８０重量パーセント超のＬＰＣ－ＤＨＡおよびＬＰＣ－ＥＰＡを含むリゾホスファチジルコリンを含む、リパーゼ処理クリルオイル組成物。
【請求項50】
請求項４８に記載のクリルオイル組成物を含む、機能性食品組成物。
【請求項51】
請求項４９に記載のクリルオイル組成物を含む、機能性食品組成物。
【請求項52】
被験体における神経障害を治療または予防する方法であって、ＬＰＣ－ＤＨＡおよびＬＰＣ－ＥＰＡが豊富なクリルオイル組成物の有効量を被験体に投与する工程を含む、方法。
【請求項53】
前記神経障害が、パーキンソン病、統合失調症、外傷性脳損傷、脳卒中およびアルツハイマー病から選択される、請求項５２に記載の方法。
【請求項54】
前記神経障害がアルツハイマー病である、請求項５３に記載の方法。
【請求項55】
肝臓のＤＨＡを豊富にすることによって和らげられる肝臓疾患を治療または予防する方法であって、ＬＰＣ－ＤＨＡおよびＬＰＣ－ＥＰＡが豊富なクリルオイル組成物の有効量を、治療を必要とする被験体に投与する工程を含む、方法。
【請求項56】
前記肝臓疾患が、非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬＤ）および非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）から選択される、請求項５５に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【0001】
〔関連出願への相互参照〕
本出願は、２０２０年３月３１日に出願された米国仮特許出願第６３／００２，４２５号、および２０２０年１１月１５日に出願された米国仮特許出願第６３／１１３，９０８号の利益を主張し、これらの仮特許出願の両方はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年３月３１日に出願された米国仮特許出願第６３／００２，４２５号、および２０２０年１１月１５日に出願された米国仮特許出願第６３／１１３，９０８号の利益を主張し、これらの仮特許出願の両方はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
〔技術分野〕
本発明は、オメガ－３脂肪酸を保有するホスファチジルコリン由来化合物を含む組成物を提供し、これは、予防または治療において、特に全身投与される場合に使用される。本発明はさらに、ＬＰＣ－ＤＨＡおよびＬＰＣ－ＥＰＡが豊富な改良されたクリルオイル組成物、製造方法、ならびに神経障害および眼の障害を治療するための使用方法に関する。
本発明は、オメガ－３脂肪酸を保有するホスファチジルコリン由来化合物を含む組成物を提供し、これは、予防または治療において、特に全身投与される場合に使用される。本発明はさらに、ＬＰＣ－ＤＨＡおよびＬＰＣ－ＥＰＡが豊富な改良されたクリルオイル組成物、製造方法、ならびに神経障害および眼の障害を治療するための使用方法に関する。
【0003】
〔発明の背景〕
脳は、脳の発達および機能において重要な役割を果たすオメガ３脂肪酸ＤＨＡを、非常に高濃度で有している。脳ＤＨＡの欠損は、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症、およびうつ病を含むいくつかの神経疾患と関連している（１～３）。ＤＨＡはまた、脳卒中（４）および外傷性脳損傷（５）の合併症に対して防御的であることが示されている。食品性ＤＨＡの有益な効果が神経変性疾患の様々な動物モデルにおいて報告されているが（６～９）、現在入手可能なサプリメント（魚油、藻類油、クリルオイル、エチルエステル）を用いる臨床試験はアルツハイマー病（１０～１２）、ハンチントン病（１３）、および統合失調症（１４）を患っている患者において期待外れの結果を提供している。これらの試験の失敗は、これらのサプリメントに由来するＤＨＡが主にトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の形態で吸収される一方で、ＢＢＢでのトランスポーターはＤＨＡ（ＬＰＣ－ＤＨＡ）のリゾホスファチジルコリンの形態を必要とするため、前記サプリメントが脳のＤＨＡを豊富にすることができないことに起因すると提言されている（１５）。実際、ＬＰＣ形態のＤＨＡを与えることは正常な成体マウスにおいて脳のＤＨＡを１００％まで増加させたが、同じ用量の遊離ＤＨＡは効果を有さなかったことが最近実証された（１６）。また、ラットの脳のＤＨＡを豊富にすることにおいて、ＬＰＣ－ＤＨＡは、ＰＣ－ＤＨＡまたはＴＡＧ－ＤＨＡのいずれよりも優れていることが示された（１７）。ＤＨＡとは対照的に、脳は非常に少ないＥＰＡを有し、ＥＰＡが豊富なサプリメントは脳のＥＰＡ含有量を有意には増加させない（１８～２１）が、食品性ＥＰＡはうつ病の予防および治療に対してＤＨＡよりも有益であることが示されている（２２～２４）。脳のＥＰＡが豊富にならないことは、脳内でそれが急速に酸化することに起因すると提言されている（２５）。しかしながら、脳のＥＰＡは、ＬＰＣ形態の食品性ＥＰＡを提供することによって実際に１００倍まで増加することができることが実証されており（２６）、このことは、低レベルのＥＰＡは血漿中の低レベルのＬＰＣ－ＥＰＡが主に原因であることを示している。
脳は、脳の発達および機能において重要な役割を果たすオメガ３脂肪酸ＤＨＡを、非常に高濃度で有している。脳ＤＨＡの欠損は、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症、およびうつ病を含むいくつかの神経疾患と関連している（１～３）。ＤＨＡはまた、脳卒中（４）および外傷性脳損傷（５）の合併症に対して防御的であることが示されている。食品性ＤＨＡの有益な効果が神経変性疾患の様々な動物モデルにおいて報告されているが（６～９）、現在入手可能なサプリメント（魚油、藻類油、クリルオイル、エチルエステル）を用いる臨床試験はアルツハイマー病（１０～１２）、ハンチントン病（１３）、および統合失調症（１４）を患っている患者において期待外れの結果を提供している。これらの試験の失敗は、これらのサプリメントに由来するＤＨＡが主にトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の形態で吸収される一方で、ＢＢＢでのトランスポーターはＤＨＡ（ＬＰＣ－ＤＨＡ）のリゾホスファチジルコリンの形態を必要とするため、前記サプリメントが脳のＤＨＡを豊富にすることができないことに起因すると提言されている（１５）。実際、ＬＰＣ形態のＤＨＡを与えることは正常な成体マウスにおいて脳のＤＨＡを１００％まで増加させたが、同じ用量の遊離ＤＨＡは効果を有さなかったことが最近実証された（１６）。また、ラットの脳のＤＨＡを豊富にすることにおいて、ＬＰＣ－ＤＨＡは、ＰＣ－ＤＨＡまたはＴＡＧ－ＤＨＡのいずれよりも優れていることが示された（１７）。ＤＨＡとは対照的に、脳は非常に少ないＥＰＡを有し、ＥＰＡが豊富なサプリメントは脳のＥＰＡ含有量を有意には増加させない（１８～２１）が、食品性ＥＰＡはうつ病の予防および治療に対してＤＨＡよりも有益であることが示されている（２２～２４）。脳のＥＰＡが豊富にならないことは、脳内でそれが急速に酸化することに起因すると提言されている（２５）。しかしながら、脳のＥＰＡは、ＬＰＣ形態の食品性ＥＰＡを提供することによって実際に１００倍まで増加することができることが実証されており（２６）、このことは、低レベルのＥＰＡは血漿中の低レベルのＬＰＣ－ＥＰＡが主に原因であることを示している。
【0004】
さらに、網膜は、体内で最も高い濃度のＤＨＡを有する。それはまた、ＥＰＡおよびＤＨＡ（３２～３６ ｎ－３）に由来する非常に長鎖の脂肪酸の大部分を有し、ｓｎ－１位およびｓｎ－２位の両方にオメガ３脂肪酸を含有するリン脂質を有する。これらの脂肪酸および特有のリン脂質は、光受容体細胞の完全性を維持する上で重要な機能を果たす（４１）。
【0005】
ＤＨＡは網膜における抗炎症、抗血管新生、およびホメオスタシス促進の役割を有し、ＤＨＡの欠損は、黄斑変性、および他の網膜症に関連する（４２）。いくつかの疫学的研究は、様々な網膜症の予防におけるオメガ３脂肪酸摂取の有益な効果を示した（４２）（４３）。さらに、Tikhonenkho et al.（４４）は、実験動物において、食餌中にＤＨＡを提供することによって糖尿病性網膜症が予防され得ることを報告した。ＤＨＡはまた、動物モデルにおいて、ドライアイ疾患（４５）および加齢黄斑変性（４６）に対して防御的であることが示されている。しかしながら、疫学的および実験的研究の肯定的な結果にも関わらず、食品性のサプリメントを使用する患者における介入研究は明らかな利益を示さず（４７）（４８）、これはおそらく、網膜による従来のＤＨＡサプリメントの吸収が非効率的であることによる。Nishizawa et al.（４９）が、成長中のラットにおいて網膜ＤＨＡを増加させることはできるが、高ＤＨＡ用量（８．５％カロリー）であったとしても、成体の網膜ＤＨＡ含有量を増加させることはできないことを報告したことは注目されるべきである。これは、以前の臨床試験の失敗の説明となり得る。
【0006】
眼の感染症および炎症には、原発性または原発性疾患に続発し得る広範囲の病理学的状態が含まれる。
【0007】
一例としてドライアイ疾患（ＤＥＤ）があり、これは高度に蔓延している、涙液膜および眼表面の多因子性疾患であり、眼痛および視力障害をもたらす。一時的な症状緩和を提供するための潤滑用点眼薬の点眼を含むＤＥＤの治療の中心は、治療的ではなく補助的である。炎症はＤＥＤの病因における中心機序であり、涙液の高浸透圧性および不安定性が炎症反応に寄与する。これは、ＤＥＤに苦しむ人が経験する慢性的な刺激および痛みを負う。コルチコステロイドなどの局所抗炎症剤がＤＥＤを対処するために現在使用されているが、潜在的な長期の副作用がそれらの使用を制限する。
【0008】
オメガ－３（ｎ－３）長鎖多価不飽和脂肪酸（ＬＣ－ＰＵＦＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、２０：５ｎ－３）およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、２２：６ｎ－３）は、健康的でバランスのとれた食事の必須成分である、発達に対して有益な影響を有する、および眼の病状（例えば網膜疾患および加齢黄斑変性（ＡＭＤ）など）を含む様々な病理学的状態を和らげるとして、十分に受け入れられている。
【0009】
Querques et al.によって概説されているように、網膜は体内で最も高濃度のＤＨＡを有し、いくつかの研究は、オメガ－３多価不飽和脂肪酸が網膜疾患の発症および進行の低減において防御的役割を有し得ることを示唆している（Querques et al., J Nutr Metab. 2011; 2011: 748361）。高濃度のＤＨＡは、光受容体膜の流動性、網膜の完全性、および視覚機能を最適化することが示唆されている。さらに、多くの研究は、ＤＨＡが網膜において防御的な、例えば、抗アポトーシスの役割を有することを実証した。ＤＨＡとは対照的に、脳、神経組織および網膜はエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）をほとんど含まないが、ＥＰＡが神経変性の予防において防御的役割を有し得ることが示されている（Yalagala et al J Lipid Res. 2019 Mar;60(3):566-578. doi: 10.1194/jlr.M090464. Epub 2018 Dec 10）。栄養学的観点から、西洋の人々、特に高齢の人が、最適なオメガ－６／オメガ－３比よりも高い比で有しており、炎症に関連する病因を改善するために、より多くのオメガ－３多価不飽和脂肪酸で食事を豊かにした方がよいことが知られている。
【0010】
ドライアイは、一般的な眼の疾患である。これは、対象とする集団に応じて、ある程度、５～３４％の人々に影響を及ぼす。高齢者では、最大７０％に影響する。いくつかの眼疾患の予防および治療のために食品性のオメガ－３サプリメントが提案されているが、魚油およびリン脂質が豊富なクリルオイルに由来するオメガ－３を用いた、ＤＥＤを治療するためのある臨床試験は、潤滑用点眼薬の使用頻度の有意な変化を実証しなかった（Deinema et al. Ophthalmology. 2017 Jan;124(1):43-52）。
【0011】
この分野での取り組みにも関わらず、ドライアイの問題は依然として非常に広がっており、未解決のままであり、満たされていない医学的なニーズである。したがって、ドライアイのための新しい改善された治療を提供することが望ましい。
【0012】
そのような治療が症状的緩和および治療的緩和の両方を提供できれば、好ましいであろう。
【0013】
特に、そのような改善された治療が、眼組織および網膜の変性を防御することによって、緑内障、ＡＭＤ、糖尿病性網膜症および神経障害などの眼の病状を予防することができれば好ましいであろう。
【0014】
〔発明の概要〕
脳のＤＨＡの欠損はいくつかの神経変性疾患に関連するが、現在のサプリメントは、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ－ＤＨＡ）のための血液脳関門におけるトランスポーターが必要であるため、脳のＤＨＡを豊富にしない。クリルオイルリン脂質はｓｎ－２位にＤＨＡおよびＥＰＡを含有するが、膵臓ホスホリパーゼＡ２が遊離酸としてそれらを放出するので、ＬＰＣ－ＤＨＡおよびＬＰＣ－ＥＰＡを生成しない。
脳のＤＨＡの欠損はいくつかの神経変性疾患に関連するが、現在のサプリメントは、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ－ＤＨＡ）のための血液脳関門におけるトランスポーターが必要であるため、脳のＤＨＡを豊富にしない。クリルオイルリン脂質はｓｎ－２位にＤＨＡおよびＥＰＡを含有するが、膵臓ホスホリパーゼＡ２が遊離酸としてそれらを放出するので、ＬＰＣ－ＤＨＡおよびＬＰＣ－ＥＰＡを生成しない。
【0015】
しかしながら、本発明者らは、食品性クリルオイルをｓｎ－１に特異的なリパーゼを用いて前処理する場合、ＬＰＣ－ＤＨＡおよびＬＰＣ－ＥＰＡが生成され、したがって脳のＤＨＡおよびＥＰＡが豊富になるはずであることを発見した。本発明者らは、未処理クリルオイル（ＵＴＫＯ）およびリパーゼ処理クリルオイル（ＬＴＫＯ）を正常マウスに与え、脳および他の組織の脂肪酸組成を測定することにより、この仮説を試験した。ＵＴＫＯは脳のＤＨＡおよびＥＰＡをわずかに増加させたが、ＬＴＫＯは脳のＤＨＡおよびＥＰＡを豊富にすることにおいて、それぞれ５倍および７０倍効果的であり、脳のＢＤＮＦを増加させた。対照的に、魚油（リン脂質を含まない）は、リパーゼ処理の有無にかかわらず、脳のＤＨＡまたはＥＰＡのいずれにも影響を及ぼさなかった。ＬＴＫＯはまた、肝臓のＤＨＡおよびＥＰＡを豊富にすることにおいては魚油またはＵＴＫＯより効果的であったが、脂肪組織および心臓にて豊富にすることにおいては魚油またはＵＴＫＯのいずれよりも効果的でなかった。これらの結果は、脳を食品性ＤＨＡおよびＥＰＡの標的とし、アルツハイマー病などの神経疾患を予防および治療する、新規の戦略を提供する。
【0016】
したがって、第１の態様において、本発明は、眼の疾患または状態の１つ以上の症状および／または徴候を治療、予防および／または軽減するための方法であって、それらを必要とする被験体に製剤の有効量を投与する工程を含み、前記製剤は式１～８のいずれか１つからなる群から選択されるＬＰＣ化合物を含むリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）組成物、およびそれらの任意の組み合わせを含み、疾患または状態の症状を改善、制御、低減または緩和する方法に関する：
【0017】
【化1】
【0018】
式中、
Ｒ１は、ＯＨまたはＯ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＨ３であり；
Ｒ２は、ＯＨまたはＯ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＨ３であり；および
ｎは、０、１または２である。
Ｒ１は、ＯＨまたはＯ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＨ３であり；
Ｒ２は、ＯＨまたはＯ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＨ３であり；および
ｎは、０、１または２である。
【0019】
第１の態様の一実施形態では、Ｒ１はＯＨであり、かつ、Ｒ２はＯＨである。
【0020】
第１の態様の一実施形態では、ＬＰＣ組成物がｉ）Ｒ２がＯＨである式１による化合物；および／またはｉｉ）Ｒ１がＯＨである式３による化合物を含む場合、当該ＬＰＣ組成物は他のＬＰＣ化合物の少なくとも１つをさらに含むという条件を有する。
【0021】
第１の態様の一実施形態では、１つ以上のＬＰＣ化合物は：
式１による化合物；および／または式３による化合物；
ならびに
式２による化合物；および／または式４による化合物である。
式１による化合物；および／または式３による化合物；
ならびに
式２による化合物；および／または式４による化合物である。
【0022】
第１の態様の一実施形態では、
Ｒ１およびＲ２がＯＨであり；ならびに
リゾＰＣ－ＤＨＡ：リゾＰＣ－ＥＰＡのモル比が１：１～３：１の範囲であるか；またはリゾＰＣ－ＥＰＡ：リゾＰＣ－ＤＨＡのモル比が１：１～５：１の範囲であり；
ただし、ｉ）リゾＰＣ－ＥＰＡのモル数は１－リゾＰＣ－ＥＰＡのモル数＋２－リゾＰＣ－ＥＰＡのモル数であり；かつｉｉ）リゾＰＣ－ＤＨＡのモル数は、１－リゾＰＣ－ＤＨＡのモル数＋２－リゾＰＣ－ＤＨＡのモル数である。
Ｒ１およびＲ２がＯＨであり；ならびに
リゾＰＣ－ＤＨＡ：リゾＰＣ－ＥＰＡのモル比が１：１～３：１の範囲であるか；またはリゾＰＣ－ＥＰＡ：リゾＰＣ－ＤＨＡのモル比が１：１～５：１の範囲であり；
ただし、ｉ）リゾＰＣ－ＥＰＡのモル数は１－リゾＰＣ－ＥＰＡのモル数＋２－リゾＰＣ－ＥＰＡのモル数であり；かつｉｉ）リゾＰＣ－ＤＨＡのモル数は、１－リゾＰＣ－ＤＨＡのモル数＋２－リゾＰＣ－ＤＨＡのモル数である。
【0023】
第１の態様の一実施形態では、疾患または状態は、眼の炎症、角膜神経異常、および眼の表面上の擦過傷からなる群より選択されるドライアイ疾患などのドライアイである。
【0024】
第１の態様の一実施形態では、疾患または状態は、眼の神経変性疾患である。
【0025】
第１の態様の一実施形態では、眼の神経変性疾患は、加齢黄斑変性、糖尿病性網膜症、非増殖性網膜症、増殖性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、網膜色素変性症、中心静脈閉塞症および緑内障からなる群から選択される。
【0026】
第１の態様の一実施形態では、投与は、経口投与、および血管内または静脈内投与からなる群から選択される様式による。
【0027】
第１の態様の一実施形態では、投与の様式は、経口投与である。
【0028】
第１の態様の一実施形態では、投与の様式は、血管内または静脈内投与である。
【0029】
第１の態様の一実施形態では、製剤中のＬＰＣ組成物は、式１～８のいずれか１つからなる群から選択されるＬＰＣ化合物を含み、前記ＬＰＣ組成物は当該ＬＰＣ組成物の１０重量％～１００重量％に相当する量の総ＬＰＣを含む。
【0030】
第１の態様の一実施形態では、ＬＰＣ組成物は、ＬＰＣとは異なる追加の脂質を含む。
【0031】
第１の態様の一実施形態では、ＬＰＣ組成物は、５重量％～１２重量％のＤＨＡを含み、当該ＤＨＡは遊離脂肪酸もしくはエチルエステルであるか、またはＬＰＣ組成物中の脂質である。
【0032】
第１の態様の一実施形態では、ＬＰＣ組成物は、１０重量％～２４重量％のＥＰＡを含み、当該ＥＰＡは遊離脂肪酸もしくはエチルエステルであるか、またはＬＰＣ組成物中の任意の脂質に結合している。
【0033】
第１の態様の一実施形態では、ＬＰＣ組成物は、パルミトレイン酸および／またはパルミチン酸をさらに含む。
【0034】
第１の態様の一実施形態では、ＬＰＣ組成物は、２重量％～５重量％のパルミトレイン酸を含み、当該パルミトレイン酸はＬＰＣ組成物中の任意の脂質に結合している。
【0035】
第１の態様の一実施形態では、ＬＰＣ組成物は、１０重量％～１５重量％のパルミチン酸を含み、当該パルミチン酸はＬＰＣ組成物中の任意の脂質に結合している。
【0036】
第１の態様の一実施形態では、ＬＰＣとは異なる追加の脂質は、トリグリセリド、エチルエステル、遊離脂肪酸、ならびにホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルコリンなどのリン脂質からなる群から選択される。
【0037】
第１の態様の一実施形態では、ＬＰＣ組成物は、当該ＬＰＣ組成物の少なくとも３５重量％に相当する量の総リン脂質を含む。
【0038】
第１の態様の一実施形態では、ＬＰＣ組成物は、当該ＬＰＣ組成物の少なくとも２３重量％に相当する量の総ＬＰＣを含む。
【0039】
第１の態様の一実施形態では、ＬＰＣ組成物は、当該ＬＰＣ組成物の少なくとも４０重量％に相当する量の総ＬＰＣを含む。
【0040】
第１の態様の一実施形態では、ＬＰＣ組成物は、当該ＬＰＣ組成物の少なくとも６０重量％に相当する量の総ＬＰＣを含む。
【0041】
第１の態様の一実施形態では、ＬＰＣ組成物は、当該ＬＰＣ組成物の少なくとも９０重量％に相当する量の総ＬＰＣを含む。
【0042】
第１の態様の一実施形態では、ＬＰＣ組成物は、当該ＬＰＣ組成物の少なくとも９０重量％～９８重量％に相当する量の総ＬＰＣを含む。
【0043】
第１の態様の一実施形態では、ＬＰＣ組成物は、当該ＬＰＣ組成物の少なくとも９５重量％に相当する量の総ＬＰＣを含む。
【0044】
第１の態様の一実施形態では、製剤は、１重量％～３５重量％のＬＰＣ組成物を含む。
【0045】
第１の態様の一実施形態では、製剤は、２５重量％のＬＰＣ組成物を含む。
【0046】
第１の態様の一実施形態では、製剤は、４０重量％のＬＰＣ組成物を含む。
【0047】
第１の態様の一実施形態では、ＬＰＣ組成物は、ホスファチジルコリンの量と比較して多くの量のＬＰＣ化合物を含む。
【0048】
第１の態様の一実施形態では、ＬＰＣ化合物は、ＬＰＣ－ＥＰＡ、ＬＰＣ－ＤＨＡおよびそれらの任意の組み合わせから選択される。
【0049】
第１の態様の一実施形態では、ＬＰＣ組成物は、ホスファチジルコリンの量と比較して多くの量のＬＰＣ化合物を含む。
【0050】
第１の態様の一実施形態では、製剤は、ルテイン、アスタキサンチン、ゼアキサンチンおよびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される成分をさらに含む。
【0051】
第１の態様の一実施形態では、被験体は哺乳動物被験体である。
【0052】
第１の態様の一実施形態では、被験体はヒト被験体である。
【0053】
第２の態様において、本発明は、ＬＰＣ－ＤＨＡおよびＬＰＣ－ＥＰＡが豊富なクリルオイル組成物を調製する方法であって、前記クリルオイル中、ＤＨＡ含有リン脂質およびＥＰＡ含有リン脂質のｓｎ－１位に特異的なリパーゼを用いてクリルオイルを処理する工程を含む方法に関する。
【0054】
第２の態様の一実施形態では、本発明は、前記クリルオイル中、ＤＨＡ含有リン脂質およびＥＰＡ含有リン脂質のｓｎ－１位に特異的なリパーゼを用いてクリルオイルを処理することにより調製される、ＬＰＣ－ＤＨＡおよびＬＰＣ－ＥＰＡが豊富なクリルオイル組成物である。
【0055】
第２の態様の一実施形態では、リパーゼは、ムコール・ミエヘイ(Mucor meihei)由来のリパーゼを含む。他の実施形態では、リパーゼは、ムコール・ミエヘイ(Mucor meihei)由来の固定化リパーゼを含む。他の実施形態では、クリルオイル組成物は、約８０重量パーセント超のＬＰＣ－ＤＨＡおよびＬＰＣ－ＥＰＡを含むリゾホスファチジルコリンを含む。
【0056】
第２の態様の一実施形態では、リゾホスファチジルコリンを含むクリルオイル組成物は、約８０重量パーセント超のＬＰＣ－ＤＨＡおよびＬＰＣ－ＥＰＡを含む。
【0057】
第２の態様の一実施形態では、リゾホスファチジルコリンを含むクリルオイル組成物は、約７０重量パーセント超のＬＰＣ－ＤＨＡおよびＬＰＣ－ＥＰＡを含む。
【0058】
第２の態様の一実施形態では、リゾホスファチジルコリンを含むクリルオイル組成物は、約６０重量パーセント超のＬＰＣ－ＤＨＡおよびＬＰＣ－ＥＰＡを含む。
【0059】
第２の態様の一実施形態では、リゾホスファチジルコリンを含むクリルオイル組成物は、約５０重量パーセント超のＬＰＣ－ＤＨＡおよびＬＰＣ－ＥＰＡを含む。
【0060】
第２の態様の一実施形態では、リゾホスファチジルコリンを含むクリルオイル組成物は、約４０重量パーセント超のＬＰＣ－ＤＨＡおよびＬＰＣ－ＥＰＡを含む。
【0061】
第２の態様の一実施形態では、リゾホスファチジルコリンを含むクリルオイル組成物は、約３０重量パーセント超のＬＰＣ－ＤＨＡおよびＬＰＣ－ＥＰＡを含む。
【0062】
第２の態様の一実施形態では、リゾホスファチジルコリンを含むクリルオイル組成物は、約２０重量パーセント超のＬＰＣ－ＤＨＡおよびＬＰＣ－ＥＰＡを含む。
【0063】
第２の態様の一実施形態では、リゾホスファチジルコリンを含むクリルオイル組成物は、約１０重量パーセント超のＬＰＣ－ＤＨＡおよびＬＰＣ－ＥＰＡを含む。
【0064】
第２の態様の一実施形態では、本発明は、上記クリルオイル組成物を含む、機能性食品組成物を提供する。
【0065】
第２の態様の一実施形態では、本発明は、上記クリルオイル組成物を含む、薬学的組成物を提供する。
【0066】
第３の態様において、本発明は、被験体における神経疾患または神経障害を治療または予防する方法であって、ＬＰＣ－ＤＨＡおよびＬＰＣ－ＥＰＡが豊富なクリルオイル組成物の有効量を被験体に投与する工程を含む方法に関する。ある実施形態では、神経疾患または神経障害は、パーキンソン病、統合失調症、外傷性脳損傷、脳卒中およびアルツハイマー病から選択される。特定の実施形態では、神経疾患または神経障害は、アルツハイマー病である。
【0067】
本発明者らはさらに、本発明によるＬＰＣ－ＤＨＡおよびＬＰＣ－ＥＰＡが豊富なクリルオイル組成物を正常マウスに与えると、網膜ＥＰＡおよびＤＨＡが有意に増加することを発見した。トリグリセリド形態のみのＥＰＡおよびＤＨＡを含有する魚油による同様の処置は、網膜ＥＰＡまたはＤＨＡのいずれにも影響を及ぼさなかった。
【0068】
したがって、別の態様では、本発明は、被験体における網膜の疾患または障害を治療または予防する方法であって、ＬＰＣ－ＤＨＡおよびＬＰＣ－ＥＰＡが豊富なクリルオイル組成物の有効量を被験体に投与する工程を含む方法に関する。ある実施形態では、網膜の疾患または障害は、加齢黄斑変性、糖尿病性網膜症およびドライアイ疾患から選択される。
【0069】
加えて、リパーゼ処理クリルオイルは魚油で未処理クリルオイルよりも、肝臓のオメガ３脂肪酸を豊富にすることにおいて優れているため、本発明の組成物は、肝臓のＤＨＡを豊富にすることによって和らげられることが知られている非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬＤ）および非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）などの肝臓疾患の治療において有用である。
【0070】
したがって、別の態様において、本発明は、肝臓のＤＨＡを豊富にすることによって和らげられる肝臓疾患を治療または予防する方法であって、ＬＰＣ－ＤＨＡおよびＬＰＣ－ＥＰＡが豊富なクリルオイル組成物の有効量を、治療を必要とする被験体に投与する工程を含む方法に関する。ある実施形態では、肝臓疾患は、非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬＤ）および非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）から選択される。
【0071】
〔図面の簡単な説明〕
図１は、試験終了時の網膜ＥＰＡ含有量（ＡＵＣ／ｍｇ 乾燥組織）を示す。
図１は、試験終了時の網膜ＥＰＡ含有量（ＡＵＣ／ｍｇ 乾燥組織）を示す。
【0072】
図２は、試験終了時の網膜ＥＰＡ／ＥＴＡ比を示す。
【0073】
図３は、０週間（Ｔ０、ベースライン）、２週間（Ｔ１）および３週間（Ｔ２）の強制経口投与後に採取された血漿ＬＰＣ－ＥＰＡ（ｎｇ／ｍｌ）を示す。
【0074】
図４は、試験終了時の網膜ＤＨＡ／ＥＴＡ比を示す。
【0075】
図５は、０週間（Ｔ０、ベースライン）、２週間（Ｔ１）および３週間（Ｔ２）の強制経口投与後に採取された血漿ＬＰＣ－ＤＨＡ（ｎｇ／ｍｌ）を示す。
【0076】
図６は、６つの実験群の網膜ＥＰＡ濃度を総脂肪酸に対する％として表したものを示す。
【0077】
図７は、６つの実験群の各々について、網膜ＡＲＡ（２０：４ ｎ－６）濃度とＤＨＡ用量との間の関係を示す。
【0078】
図８は、経口およびｉ．ｖ．投与後の眼の組織の濃度時間曲線下面積を示す。
【0079】
図９は、ＬＰＣ－ＥＰＡおよびＬＰＣ－ＤＨＡを最初の２４時間、経口およびｉ．ｖ．投与した後の眼の組織（全眼）の濃度時間曲線下面積を示す。
【0080】
図１０は、ＬＰＣ－ＥＰＡおよびＬＰＣ－ＤＨＡを最初の７２時間、経口およびｉ．ｖ．投与した後の眼の組織（全眼）の時間濃度曲線下面積を示す。
【0081】
図１１は、クリルオイルがＰＣのｓｎ－２位にＥＰＡおよびＤＨＡを含有するため、膵臓ホスホリパーゼＡ２による分解の間に遊離脂肪酸としてＥＰＡおよびＤＨＡが放出されることを示す。放出されたＥＰＡおよびＤＨＡはその後、ＴＡＧとして吸収され、これは脳への輸送に必要なＬＰＣ－ＥＰＡまたはＬＰＣ－ＤＨＡのいずれも生成しない。したがって、クリルオイルを与えることは、脳内のＥＰＡおよびＤＨＡが有意に豊富になることをもたらさない。しかしながら、クリルオイルをｓｎ－１エステル結合に特異的なリパーゼを用いて前処理した場合、ＬＰＣ－ＥＰＡおよびＬＰＣ－ＤＨＡが生成される。この改良されたクリルオイルを与えることは、リン脂質形態のＥＰＡおよびＤＨＡの吸収をもたらし、脳において、それらが豊富になることをもたらすはずである。一方、魚油のリパーゼ処理は、ＬＰＣ－ＥＰＡまたはＬＰＣ－ＤＨＡのいずれも生成せず、したがって、ＥＰＡおよびＤＨＡが脳で豊富になることをもたらさない（図示せず）。
【0082】
図１２は、長鎖ＰＵＦＡの血漿レベルに対する食餌処置の影響を示す。空腹時血漿の総脂質を、本文に記載されるように抽出し、トランスメチル化し、ＧＣ／ＭＳによって脂肪酸組成について分析した。示される値は、各群の５匹の動物の平均値±標準偏差である。統計的有意性は、事後Tukey多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡによって決定した（GraphPad Prism 8.0ソフトウェア）。対照群と比較して、＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【0083】
図１３は、血漿ＬＰＣ種に対する、天然のクリルオイルおよび魚油、ならびにリパーゼ処理クリルオイルおよび魚油を与えることの影響を示す。血漿サンプルを、本明細書に記載されるように酸性化メタノールを用いて抽出し、ＨＩＬＩＣカラムを用いてＬＣ／ＭＳにより分析し、濃度、ならびオメガ３ＬＰＣ種の異性体の組成を分析した。ＬＰＣ濃度は、内部標準として１７：０ ＬＰＣを用いて決定した。１７：０ＬＰＣおよび２２：６ＬＰＣの標準の強度値は使用される条件下でこの量によって異なるため、補正係数（×０．２３３）を適用して値を計算した。事後Tukey多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡによって決定されるように、同一でない上付き文字を有するバーは、互いに有意に異なる（総ＬＰＣ）。
【0084】
図１４は、前頭前皮質のＰＵＦＡ組成物を示す。ＧＣ／ＭＳによって総脂肪酸組成を分析し、２０：４（ＡＲＡ）、２０：５（ＥＰＡ）、２２：５（ＤＰＡ）、および２２：６（ＤＨＡ）のみの割合組成を示す。示される値は、各群の５匹の動物の平均値±標準偏差である。統計的有意性は一元配置ＡＮＯＶＡによって決定され、記号は上記図１２の下と同じである。
【0085】
【0086】
図１６は、線条体のＰＵＦＡ組成物を示す。本文に記載されるように、ＰＵＦＡ組成物を分析した。示される値は、各群の５匹のマウスの平均値±標準偏差である。対照飼料と実験飼料との間の統計的有意性は、事後Tukey多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡによって決定した。有意性に関する記号は、上記図１２の下と同じである。
【0087】
図１７は、小脳におけるＰＵＡ組成物を示す。本文に記載されるように、ＧＣ／ＭＳによって脂肪酸組成を分析した。示される値は、各群の６匹のマウスの平均値±標準偏差である。対照飼料と実験飼料との間の統計的有意性は、事後Tukey多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡによって決定した。有意性に関する記号は、上記図１２の下と同じである。
【0088】
図１８は、前頭前皮質および海馬におけるＢＤＮＦレベルに対する食餌処置の効果を示す。ＢＤＮＦレベルの免疫測定は、内部標準としてβ－アクチンを用いて、本文に記載されるように行った。示されるＢＤＮＦ／β－アクチン比は、各群の３匹のマウスの平均値±標準偏差である。挿入図は、代表的な免疫ブロットを示す。対照飼料と実験飼料との間の統計的有意性は、事後Tukey多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡによって決定した。＊＊＊ｐ＜０．００１ＶＳ対照；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１ＶＳ対照。
【0089】
図１９は、性腺周囲脂肪組織のＰＵＦＡ組成物を示す。示される百分率値は、各群について５匹のマウスの平均値±標準偏差である。統計的有意性の値（一元配置ＡＮＯＶＡ）は、対照飼料と実験飼料との間のものであり、記号は上記図１２の下と同じである。
【0090】
図２０は、鼠径部脂肪組織のＰＵＦＡ組成物を示す。示される百分率値は、各群について５匹のマウスの平均値±標準偏差である。統計的有意性の値（一元配置ＡＮＯＶＡ）は、対照飼料と実験飼料との間のものであり、記号は上記図１２の下と同じである。
【0091】
図２１は、肝臓の脂肪酸組成に対する飼料の脂肪の影響を示す。ＧＣ／ＭＳによる総脂質の脂肪酸分析は、本文に記載されている通りであった。示される値は、各群の５匹のマウスの平均値±標準偏差である。対照飼料と実験飼料との間の統計的有意性は、事後Tukey多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡによって決定した。有意性に関する記号は、上記図１２の下と同じである。
【0092】
図２２は、心臓の脂肪酸組成に対する飼料の脂肪の影響を示す。心臓の総脂質を抽出し、本文に記載されるようにＧＣ／ＭＳによって脂肪酸組成について分析した。示される値は、各群の５匹のマウスの平均値±標準偏差である。対照飼料と実験飼料との間の統計的有意性は、事後Tukey多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡによって決定した。有意性に関する記号は、上記図１２の下と同じである。
【0093】
図２３は、ｓｎ－１脂肪酸を特異的に加水分解するリパーゼを用いて処理したＰＣのｓｎ－２位においてＥＰＡおよびＤＨＡを含むクリルオイルが、ＬＰＣ－ＥＰＡおよびＬＰＣ－ＤＨＡを生成することを示す。この調製物を正常マウスに与えると、網膜ＥＰＡおよびＤＨＡが有意に増加した。トリグリセリド形態のみのＥＰＡおよびＤＨＡを含有する魚油の同様の処置は、網膜ＥＰＡまたはＤＨＡのいずれにも影響を及ぼさなかった。
【0094】
図２４は、ＰＣ、ＴＡＧ、またはＬＰＣ形態で与えられた、飼料のＤＨＡのラットの網膜の脂質への取り込みを示す。正常な雄のＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット（８週齢；各群ｎ＝５）に、ＴＡＧ－ＤＨＡ、ジ－ＤＨＡ ＰＣ、またはＬＰＣ－ＤＨＡの形態で２５０μＬのトウモロコシ油中に含まれる１０ｍｇＤＨＡを３０日間毎日強制経口投与した。加えて、半分の用量のＬＰＣ－ＤＨＡ（５ｍｇのＤＨＡ）を、消化中にジ－ＤＨＡ ＰＣによって生成されると予想されるＬＰＣ－ＤＨＡの量に匹敵するように使用した。ＤＨＡを含有しないが、固形飼料１ｇ当たり１７．４ｍｇのα－リノレン酸（１８：３、ｎ－３）を含有する、通常のげっ歯類固形飼料を、全ての動物に与えた。本文に記載されるように、網膜ＦＡをＧＣ／ＭＳによって分析した。２０：４（ｎ－６）、２０：５（ｎ－３）、２２：５（ｎ－３）、および２２：６（ｎ－３）の割合組成をここに示す。総ＦＡ組成物を表１に示す。処置群間の差異の有意性は、事後Tukey多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡによって決定した（GraphPad Prism 8.0ソフトウェア）。共通の文字が上に付いていないバーは、互いに有意に異なる（ｐ＜０．０５）。ＴＧ：トリアシルグリセロール；ＰＣ：ホスファチジルコリン；ＬＰＣ：リゾホスファチジルコリン；ＦＡ：脂肪酸；ＧＣ／ＭＳ：ガスクロマトグラフィー／質量分析。
【0095】
図２５は、マウスの網膜ＦＡに対する、飼料の遊離（エステル化されていない）ＤＨＡ、ｓｎ－１ ＤＨＡ－ＬＰＣ、およびｓｎ－２ ＤＨＡ ＬＰＣの影響を示す。正常な雄マウス（Ｃ５７ ＢＬ／Ｊ６、１６週齢）に、８０μＬのトウモロコシ油中に遊離ＤＨＡ、ｓｎ－１ ＤＨＡ ＬＰＣ、またはｓｎ－２ ＤＨＡ ＬＰＣ形態で含まれる１ｍｇのＤＨＡを３０日間毎日強制経口投与した。網膜のＦＡ組成物をＧＣ／ＭＳにより分析した。アラキドン酸およびオメガ－３ ＦＡに関する値のみをここに示す（平均値±標準偏差、８匹の動物／群）。総ＦＡ組成を表２に示す。事後Tukey補正を用いた一元配置ＡＮＯＶＡにより、共通の文字が上に付いていないバーは互いに有意に異なる（ｐ＜０．０５）。ＳＤ：標準偏差；ｓｎ－１およびｓｎ－２：立体特異的番号付けそれぞれ１および２；ＬＰＣ：リゾホスファチジルコリン；ＤＨＡ：ドコサヘキサエン酸。
【0096】
図２６は、ＤＨＡを含有するマウスの網膜のリン脂質の分子種を示す。図２に記載されているように、遊離（エステル化されていない）ＤＨＡ、またはＬＰＣ－ＤＨＡの２つの異性体を、動物に強制経口投与した。１７：０ ＬＰＣ、１７：０－１７：０ ＰＣ、および１７：０－１７：０ ＰＥを内部標準として用いて、本文に記載されているようにＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる多重反応モニタリングを使用して、ＤＨＡを含有するＰＣ（Ａ）およびＰＥ（Ｂ）の分子種を分析した。一元配置ＡＮＯＶＡ、および事後Tukey多重比較検定により、共通の文字が上に付いていないバーは互いに有意に異なる（平均値±標準偏差、６匹の動物／群）。ＰＥ：ホスファチジルエタノールアミン；ＰＣ：ホスファチジルコリン；ｓｎ－１およびｓｎ－２：立体特異的番号付けそれぞれ１および２；ＤＨＡ：ドコサヘキサエン酸；ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ：液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析；ＳＤ：標準偏差；ＬＰＣ：リゾホスファチジルコリン；ＤＨＡ：ドコサヘキサエン酸。
【0097】
図２７は、マウスの網膜ＦＡに対する、未処理またはリパーゼ処理魚油およびクリルオイルを与えることによる影響を示す。７％の総脂肪を含有する食餌（ＡＩＮ９３Ｇ）を正常な雄のマウス（８週齢）に与え、ムコールのリパーゼを用いて処理した（または未処理の）魚油またはクリルオイルの形態の０．２６４％ＥＰＡ＋ＤＨＡを補った。マウスに食餌を３０日間自由摂食させ、網膜ＦＡをＧＣ／ＭＳによって分析した。２０：４（ｎ－６）、２０：５（ｎ－３）、２２：５（ｎ－３）および２２：６（ｎ－３）の割合組成をここに示す（平均値±標準偏差、５匹のマウス／群）。総ＦＡ組成物を表３に示す。一元配置ＡＮＯＶＡ、および事後Tukey多重比較検定により、共通の文字が上に付いていないバーは互いに有意に異なる。ＫＯ：クリルオイル；ＦＯ：魚油；ＦＡ：脂肪酸；ＥＰＡ：エイコサペンタエン酸；ＧＣ／ＭＳ：ガスクロマトグラフィー／質量分析；ＤＨＡ：ドコサヘキサエン酸。
【0098】
〔定義〕
本開示を通して、関連用語は関連技術分野、すなわち、薬化学、医学、生物学、生化学および生理学の分野において確立されたそれらの典型的な意味と一貫して理解されるべきである。
本開示を通して、関連用語は関連技術分野、すなわち、薬化学、医学、生物学、生化学および生理学の分野において確立されたそれらの典型的な意味と一貫して理解されるべきである。
【0099】
しかしながら、以下に記載される特定の用語について、さらなる説明および記載を提供する。
【0100】
以下の略語は、ＡＲＡ：アラキドン酸（２０：４、ｎ－６）；ＢＢＢ：血液脳関門；ＢＤＮＦ：脳由来神経栄養因子；ＤＨＡ：ドコサヘキサエン酸（２２：６、ｎ－３）；ＤＰＡ：ドコサペンタエン酸（２２：５、ｎ－３）；ＥＰＡ：エイコサペンタエン酸（２０：５、ｎ－３）；ＦＡ：脂肪酸（複数可）；ＦＯ：魚油；ＧＣ／ＭＳ：ガスクロマトグラフィー／質量分析；ＫＯ：クリルオイル；ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ：液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析；ＬＰＣ：リゾホスファチジルコリン；ＰＣ：ホスファチジルコリン、ＴＡＧ：トリアシルグリセロールを示す。
【0101】
「クリルオイル」は、ナンキョクオキアミ（Euphausia superba）の種から調製された抽出物を指す。クリルオイル中の最も重要な成分の２つは、ＤＨＡおよびＥＰＡの形態のオメガ－３脂肪酸、ならびにリン脂質由来脂肪酸（ＰＬＦＡ）、主にホスファチジルコリン（あるいは海洋レシチンと呼ばれる）である。クリルオイルは市販されている。
【0102】
【化2】
【0103】
用語「２－リゾＰＣ－ＤＨＡ」および「２－ＬＰＣ－ＤＨＡ」は、本明細書において互換的に使用され、Ｒ２がＯＨである式１による化合物を指す。
【0104】
用語「２－リゾＰＣ－ＥＰＡ」および「２－ＬＰＣ－ＥＰＡ」は、本明細書において互換的に使用され、Ｒ２がＯＨである式２による化合物を指す。
【0105】
用語「２－リゾＰＣ－ＤＰＡ」および「２－ＬＰＣ－ＤＰＡ」は、本明細書において互換的に使用され、Ｒ２がＯＨである式５による化合物を指す。
用語「２－リゾＰＣ－ＳＤＡ」および「２－ＬＰＣ－ＳＤＡ」は、本明細書において互換的に使用され、Ｒ２がＯＨである式６による化合物を指す。
用語「２－リゾＰＣ－ＳＤＡ」および「２－ＬＰＣ－ＳＤＡ」は、本明細書において互換的に使用され、Ｒ２がＯＨである式６による化合物を指す。
【0106】
用語「１－リゾＰＣ－ＤＨＡ」および「１－ＬＰＣ－ＤＨＡ」は、本明細書において互換的に使用され、Ｒ１がＯＨである式３による化合物を指す。
【0107】
用語「１－リゾＰＣ－ＥＰＡ」および「１－ＬＰＣ－ＥＰＡ」は、本明細書において互換的に使用され、Ｒ１がＯＨである式４による化合物を指す。
【0108】
用語「１－リゾＰＣ－ＤＰＡ」および「１－ＬＰＣ－ＤＰＡ」は、本明細書において互換的に使用され、Ｒ１がＯＨである式７による化合物を指す。
【0109】
用語「１－リゾＰＣ－ＳＤＡ」および「１－ＬＰＣ－ＳＤＡ」は、本明細書において互換的に使用され、Ｒ１がＯＨである式８による化合物を指す。
【0110】
用語「リゾＰＣ－ＤＨＡ」および「ＬＰＣ－ＤＨＡ」は、本明細書において互換的に使用され、１－リゾＰＣ－ＤＨＡおよび２－リゾＰＣ－ＤＨＡの両方を含む。
【0111】
用語「リゾＰＣ－ＥＰＡ」および「ＬＰＣ－ＥＰＡ」は、本明細書において互換的に使用され、１－リゾＰＣ－ＥＰＡおよび２－リゾＰＣ－ＥＰＡの両方を含む。
【0112】
用語「リゾＰＣ－ＤＰＡ」および「ＬＰＣ－ＤＰＡ」は、本明細書において互換的に使用され、１－リゾＰＣ－ＤＰＡおよび２－リゾＰＣ－ＤＰＡの両方を含む。
【0113】
用語「リゾＰＣ－ＳＤＡ」および「ＬＰＣ－ＳＤＡ」は、本明細書において互換的に使用され、１－リゾＰＣ－ＳＤＡおよび２－リゾＰＣ－ＳＤＡの両方を含む。
【0114】
用語「ＥＰＡ」は、エイコサペンタエン酸を指す。
【0115】
用語「ＤＨＡ」は、ドコサヘキサエン酸を指す。
【0116】
用語「ＤＰＡ」は、ｎ３－ドコサペンタエン酸を指す。用語「ｎ３」は、化合物がオメガ－３脂肪酸であることを明記する。
【0117】
用語「ＳＤＡ」は、ステアリドン酸を指す。
【0118】
ＥＰＡ、ＤＨＡ、ＤＰＡ、ＳＤＡは本発明の組成物に関連して本明細書で使用される場合、脂質骨格、例えば、リン脂質、リゾリン脂質、トリアシルグリセリド、ジアシルグリセリド、モノアシルグリセリドまたは任意の他の脂質骨格に結合することができる脂肪酸鎖を指し、あるいはそれは、遊離脂肪酸またはエチルエステルとして組成物中に存在することができる。
【0119】
用語「総ＬＰＣ」は、本明細書において、組成物中のリゾホスファチジルコリンの総含有量を記載するために使用される。
【0120】
用語「総リン脂質」は、本明細書において、組成物中のリゾリン脂質を含むリン脂質の総含有量を記載するために使用される。
【0121】
用語「静脈内投与」は、本明細書で使用される場合、液体物質が静脈内に直接送達される投与様式を指す。投与の静脈内経路は、注射（より高い圧力のシリンジを用いる）または注入（典型的には重力によって供給される圧力のみを用いる）に使用することができる。
【0122】
用語「薬学的に許容される賦形剤」は、特許請求の範囲で言及されるＬＰＣ組成物の成分とは異なる物質を指し、これは油性医薬品と共に一般に使用される。そのような賦形剤としては、トリオレイン、大豆油、ベニバナ油、ゴマ油、ヒマシ油、ココナッツ油、トリグリセリド、トリブチリン、トリカプロイン、トリカプリリン、ビタミンＥ、抗酸化剤、α－トコフェロール、アスコルビン酸、メシル酸デフェロキサミン、チオグリコール酸、乳化剤、レシチン、ポリソルベート８０、メチルセルロース、ゼラチン、血清アルブミン、ラウリン酸ソルビタン、オレイン酸ソルビタン、トリオレイン酸ソルビタン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＥＧ ４００、ポリエチレングリコール修飾ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）、ポロキサマー、グリセリン、ソルビトール、キシリトール、ｐＨ調整剤；水酸化ナトリウム、抗菌剤ＥＤＴＡ、安息香酸ナトリウム、ベンジルアルコール、およびアルブミンなどのタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。薬学的に許容される賦形剤は、組成物の他の構成要素と相性がよいという意味で許容されるべきであり、その受容者に有害であってはならない。
【0123】
本明細書で使用される用語「薬学的に許容される塩」は、当技術分野で周知の様々な有機および無機対イオンから誘導される薬学的に許容される塩を指し、ほんの一例として、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム、およびテトラアルキルアンモニウムが挙げられ、分子が塩基性官能基を含む場合、塩酸塩、臭化水素酸塩、酒石酸塩、メシラート、酢酸塩、マレイン酸塩、およびシュウ酸塩などの有機酸または無機酸の塩が挙げられる。適切な塩としては、P. Heinrich Stahl, Camille G. Wermuth (Eds.), Handbook of pharmaceutical salts properties, Selection, and Use; 2002に記載されているものが挙げられる。
【0124】
用語「予防(prophylaxis)」は、疾患または状態を治療するのではなく、それらを防ぐためにとられる手段を意味する。
【0125】
用語「有効量」は、細胞、組織、系、動物、またはヒトの有益なもしくは所望の生物学的、情緒的、医学的、または臨床的応答に影響するのに十分な、本明細書で提供される、開示されている化合物または組成物の量を指す。有効量は、１回以上の投与、適用、または投薬で投与し得る。この用語はまた、その範囲内に、実質的に正常な生理学的機能を増強または回復するのに有効な量を含み得る。
【0126】
用語「治療的有効量」は、当技術分野で認識されている用語である。ある実施形態では、当該用語は医学的治療に適用可能で妥当な利益／リスク比で何らかの所望の効果をもたらす、本明細書に開示される組成物の量を指す。ある実施形態では、当該用語は、ある期間の間、医学的症状を排除、減少または緩和するのに必要または十分な量を指す。有効量は、治療される疾患もしくは状態、投与される特定の組成物、被験体のサイズ、または疾患もしくは状態の重症度などの因子に応じて変動し得る。当業者は、過度の実験を必要とすることなく、特定の組成物の有効量を経験的に決定することができる。
【0127】
例えば、所望の治療効果を達成するために必要とされるレベルよりも低いレベルで化合物の投与を始め、所望の効果が達成されるまで用量を漸増することは、十分に当業者の技術の範囲内である。所望に応じて、有効な１日あたりの用量は、投与の目的のために複数の用量に分割され得る。したがって、単回投薬組成物は、１日あたりの用量を構成するための、それらのそのような量、または約数分を含有し得る。用量は、あらゆる禁忌の事象において個々の医師によって調節され得る。本発明の薬理学的剤の最大用量を（単独で、または他の治療剤と組み合わせて）使用する、すなわち、健全な医学的判断に従った最高安全用量を使用することが一般に好ましい。しかしながら、患者は医学的理由、心理学的理由、または事実上任意の他の理由のために、より低い用量または耐容できる用量を要求できることは、当業者によって理解されるであろう。
【0128】
例えば、開示されている化合物および／または薬学的組成物の治療的有効量に対する応答は、治療または薬物の生理学的作用（治療または薬理学的剤の投与後の疾患の症状の低下または欠如など）を判断することによって測定し得る。他のアッセイは当業者に公知であり、応答のレベルを測定するために採用され得る。治療の量は、例えば、開示されている化合物および／または薬学的組成物の量を増減することによって、投与する開示されている化合物および／または薬学的組成物を変更することによって、投与経路を変更することによって、投薬のタイミングを変更することなどによって変化し得る。用量は変動し得、１日または数日間、１日あたり１回以上の用量投与で投与し得る。所定の分類の医薬品に関する適切な用量についての文献にて、ガイダンスを見つけることができる。
【0129】
用語「治療する」は当技術分野で認識されており、疾患、障害、または状態にかかりやすいかもしれないが、それにかかっているとはまだ診断されていない被験体において、疾患、障害、または状態が生じることを防止すること；疾患、障害、または状態を阻害する（例えば、進行を防ぐ）こと；ならびに疾患、障害、または状態を軽減すること（例えば、疾患、障害、および／または状態の後退を引き起こすこと）を含む。疾患または状態を治療すること（眼の炎症、角膜神経異常および眼の表面上の擦過傷から選択されるドライアイ疾患、または、加齢黄斑変性、糖尿病性網膜症、非増殖性網膜症、増殖性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、網膜色素変性症、中心静脈閉塞症および緑内障から選択される眼の神経変性疾患、ならびに他の関連疾患または任意の他の医学的状態を治療することなど）は、潜在する病状が影響を受けない場合であっても、特定の疾患または状態の少なくとも１つの症状を改善することを含むことが当該技術分野において十分に理解されており、組成物を受容していない被験体と比較して被験体における医学的状態の症状の頻度を減少させるか、または発症を遅らせる、組成物の投与を含む。
【0130】
〔発明の詳細な説明〕
本明細書で具体的に定義されない限り、使用されるすべての技術用語および科学用語は、医学、薬理学、薬化学、生物学、生化学および生理学の分野において当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
本明細書で具体的に定義されない限り、使用されるすべての技術用語および科学用語は、医学、薬理学、薬化学、生物学、生化学および生理学の分野において当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
【0131】
本明細書に記載されるものと類似または同等のすべての方法および材料を、本発明の実施または試験において使用することができ、好適な方法および材料は本明細書に記載される。本明細書で言及されている全ての出版物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によってそれらの全体が取り込まれる。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が優先される。
【0132】
数値の限定または範囲が本明細書で述べられる場合、終点が含まれる。また、数値の限定内または範囲内の全ての値および部分範囲は、明示的に記載されているかのように具体的に含まれる。
【0133】
前述のように、ドライアイ疾患（ＤＥＤ）を含む多くの医学的状態が存在し(Deinema et al., American Academy of Ophthalmology 2016, ISSN 0161-6420)、それらは低い網膜オメガ－３レベルに関連するか、または網膜長鎖オメガ－３レベルの増加したレベルから利益を得る。ＤＨＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＳＤＡが、この点で特に興味深いオメガ－３脂肪酸である。
【0134】
したがって、網膜中のオメガ－３脂肪酸のレベルを増加させるため、特に網膜中のＤＨＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡおよび／またはＳＤＡのレベルを増加させるための手段が必要とされている。
【0135】
他の組織とは異なり、オメガ－３の取り込みは、網膜中のリポタンパク質受容体を介しては起こらない。動物モデルにおける以前の研究は、ＬＰＣ形態のＤＨＡが、ＤＨＡおよび他の長鎖脂肪酸を含有するＬＰＣを輸送する、ナトリウム依存性リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）共輸送体であるＭｆｓｄ２ａを介して、血液網膜関門を通過することを報告している。
【0136】
杆体視細胞の外節における眼の光受容体膜ディスクは、視覚色素ロドプシンおよびオメガ３脂肪酸ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）が非常に豊富である。眼は血液からＤＨＡを獲得し、眼におけるＤＨＡ取り込みおよび光受容体膜ディスクの発達のために重要な経路として、Ｍｆｓｄ２ａを介したＬＰＣ輸送が実証されている。
【0137】
さらに、Ｍｆｓｄ２ａは、光受容体の発達前に胚眼の網膜色素上皮において大いに発現し、胚眼の網膜色素上皮は眼におけるＭｆｓｄ２ａ発現の主要部位であることが実証されている。
【0138】
Querquesらによって概説されているように、網膜は体内で最も高い濃度のＤＨＡを有し、いくつかの研究は、オメガ－３多価不飽和脂肪酸が網膜疾患の発症および進行の低減において防御的役割を有し得ることを示唆している(Querques et al., J Nutr Metab. 2011; 2011: 748361)。高濃度のＤＨＡは、光受容体膜の流動性、網膜の完全性、および視覚機能を最適化することが示唆されている。さらに、多くの研究は、ＤＨＡが網膜において、防御的（例えば、抗アポトーシスの）役割を有することを実証した。このレビューでは、オメガ－３を食品で取り込むことがＡＭＤの発症率に影響を及ぼすことが開示されている。
【0139】
さらに、クリルオイルのサプリメントを用いた研究は、主に（クリルオイルのような）リン脂質形態におけるオメガ－３ ＥＦＡを３か月間、適度に毎日投薬することが、ＤＥＤを発症している人々において、涙液浸透圧の低下および涙液安定性の増加をもたらしたことを実証した。また、クリルオイルに由来するリン脂質は、プラセボと比較して、ＤＥＤの症状の改善およびインターロイキン１７Ａの基礎涙液レベルの低下とともに、さらなる治療的利益を与え得ることも実証された(Deinema et al, 2017)。
【0140】
オメガ－３ ＥＦＡを含有する、食品性のサプリメントは一般に、眼の疾患の流行に影響を及ぼし、そのような疾患の治療において潜在性を有すると思われるが、オメガ－３が輸送される形態によって、取り込みおよび効果が影響を受けると思われる。
【0141】
このことは、実施例において実証される。例えば、実施例４は、網膜ＥＰＡおよびＤＨＡの両方の含有量は、リパーゼ処理クリルオイル由来の方が、通常のクリルオイルおよび魚油由来よりも豊富であることを説明する。結果の観点から、本発明の目的の一つは、眼の組織および網膜におけるＥＰＡおよびＤＨＡの取り込みを増加させるとともに、眼の組織におけるオメガ－６／オメガ－３比を最適化することである。理論に束縛されるものではないが、オメガ－３必須脂肪酸の取り込みの増加は、サイトカイン産生を調節することによって眼の炎症状態を変化させ、したがって、炎症の治療および予防を助けると考えられる。オメガ－６脂肪酸経路に由来するほとんどのエイコサノイドは炎症誘発性であるので、オメガ－３ＥＦＡはプロスタグランジン代謝を抗炎症性エイコサノイドの産生に偏らせ、炎症を制限し、消散させる。
【0142】
１４個以上の炭素原子の長さが、Ｍｆｓｄ２Ａ輸送体による血液脳関門（ＢＢＢ）または血液網膜関門（ＢＲＢ）を通過する輸送に不可欠であることが先行技術において示されている。ＤＨＡ、ＥＰＡ、ＳＤＡおよびＤＰＡは、ヒトにおける肯定的な健康影響に関して非常に重要であると考えられており、これらの全てが１４個を超える炭素原子を有する。したがって、本発明者らが現時点で有する情報に基づくと、ＬＰＣに結合した場合、これらの脂肪酸のそれぞれおよびすべては、血中網膜関門を通過して効率的に輸送されるはずである。それゆえ、ＬＰＣ－ＤＨＡおよびＬＰＣ－ＥＰＡは、本研究（実施例２～４）においてモデル分子として選択されたが、眼への取り込みに関する本明細書で提供される全てのデータはまた、上記で言及された他の２つのオメガ－３脂肪酸、すなわちＳＤＡおよびＤＰＡの予想される取り込みプロファイルも示すと考えられる。
【0143】
ＬＰＣ－ＤＨＡおよびＬＰＣ－ＥＰＡは、研究において経口投与および静脈内投与の両方によって投与されることになった。静脈内投与に関して、ＬＰＣ－ＤＨＡおよびＬＰＣ－ＥＰＡを１つ以上の薬学的に許容される賦形剤と混合することを決定した。Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈによって提供されるＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ（ＩＶ）は油性物質と適合性があり、そのため、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤として選択された。実施例２～４で使用された薬学的組成物についてのさらなる詳細は、実施例１を参考にする。
【0144】
３２匹の雄のＳｐｒａｇｕｅ ＤａｗｌｅｙラットにＬＰＣ－ＤＨＡまたはＬＰＣ－ＥＰＡのいずれかを経口投与または単回静脈内投与した。静脈内用量は、３０秒間にわたって緩徐なボーラスとして尾静脈に直接投与された。それぞれのラットを以下の時間：投薬後０．５、３、８、２４、７２、９６、１６８および３３６時間のそれぞれにおいて、二酸化炭素ガスの過量投与によって安楽死させた。各屠体を回収直後にヘキサン／固体二酸化炭素混合物中で急速凍結し、その後、さらなる分析まで約－２０℃で保存した。
【0145】
実施例２に詳述されるように、凍結された屠体を定量的な眼のオートラジオグラフィーに供して、投薬後０．５、３、８、２４、７２、９６、１６８および３３６時間でのＤＨＡおよびＥＰＡの眼組織への取り込みを研究した。
【0146】
【0147】
腸への最初の曝露を避けるために血管内投与される場合、ＤＨＡおよび驚くべきことに、そのＬＰＣ形態のＥＰＡ（それらのそれぞれの１４Ｃ放射性標識カルボン酸残基によって測定される）も、眼組織への非常に迅速かつ持続的な取り込みおよび大量の蓄積を示す。短時間の血管内（ｉ．ｖ．）ボーラスとして与えられるＬＰＣ－ＥＰＡについて、最初の２４時間の濃度時間曲線下面積（ＡＵＣ）は、経口投薬ＬＰＣについての等価測定値よりも５倍超大きいことが実証された。短時間の血管内（ｉ．ｖ．）ボーラスとして与えられるＬＰＣ－ＤＨＡについて、最初の２４時間の濃度時間曲線下面積（ＡＵＣ）は、経口投薬ＬＰＣ－ＤＨＡの等価測定値よりも４０倍超高いことが実証された。これは、腸への最初の曝露を回避し得る投与経路が、眼の組織へのＬＰＣ－ＥＰＡおよびＬＰＣ－ＤＨＡの非常に迅速かつ持続的な取り込みをもたらすことを実証する。
【0148】
実施例３は、ＬＰＣ－ＥＰＡおよびＬＰＣ－ＤＨＡを含む様々なクリルオイルリゾリン脂質を３週間毎日投薬したデータを提供する。２４匹の雄ラットを群に分け、オリーブ油、異なる用量のＬＰＣ組成物およびＳｕｐｅｒｂａ Ｂｏｏｓｔクリルオイルを含む強制経口投与を３週間毎日行った。網膜ＦＡを抽出し分析した。
【0149】
ＥＰＡの結果を図１と図２に示す。強い用量－応答関係があり、より高い用量のＥＰＡは、より高い網膜ＥＰＡ濃度（図１）およびＥＰＡ／ＥＴＡ（２０：４）比の増加（図２）と関連することが示されている（図２）。エイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）の１つの異性体は、オメガ－６脂肪酸であるアラキドン酸である。ＥＰＡ／ＥＴＡ比は、オメガ－３ＰＵＦＡの取り込みが増強されて生じるオメガ－３／オメガ－６シフトのインジケータである。説明したように、眼の炎症状態に肯定的な影響を及ぼすと考えられている。導入部分に記載されているように、オメガ－６脂肪酸は炎症に関連しており、一方、ＥＰＡおよびＤＨＡなどのオメガ－３脂肪酸は抗炎症シグナルに関連している。図１５からわかるように、粗製リゾリン脂質組成物を与えられたラットは、同様の用量でＳｕｐｅｒｂａ Ｂｏｏｓｔクリルオイルを与えられたラットよりも高い網膜ＥＰＡ／ＥＴＡ比を示す。これは、ＬＰＣ組成物を与えられたラットがＳｕｐｅｒｂａ Ｂｏｏｓｔクリルオイルおよびオリーブ油を与えられたラットと比較して、網膜においてより好ましいＥＰＡプロファイルを示し、さらに、より高用量のリゾリン脂質組成物が網膜においてより好ましいＥＰＡプロファイルと関連することを意味する。
【0150】
図３の検査は、網膜ＥＰＡプロファイルの改善が血漿中に存在するより多量のＬＰＣ－ＥＰＡ、およびｍｆｓｄ２ａを介したその後の網膜へのＥＰＡ取り込みの増加に関連する可能性が高いことを示唆している。高用量で提供された実施例の粗製（群４）は、血漿中のＬＰＣ－ＥＰＡの最高レベル、ならびに最高の網膜ＥＰＡ含量および改善されたＥＰＡ対ＥＴＡ比の両方を示した。
【0151】
図４および図５は、ＤＨＡの結果に関連している。ＤＨＡについて、それはまた、強い用量－応答関係を示し、より高用量のリゾリン脂質組成物は、より高いＤＨＡ／ＥＴＡ比、および粗製高用量群における特に顕著なＤＨＡ／ＥＴＡ比の増加と関連している。これは、ＤＨＡがリゾリン脂質生成物の純度の違いに関係なく、リゾリン脂質組成物から網膜に用量依存的に取り込まれることを示唆する。
【0152】
図５は、粗製高用量群（群４）が研究期間の終わり（Ｔ２）にＬＰＣ－ＤＨＡの最高レベルを示すことをさらに示し、これは血液網膜関門を横切るＤＨＡ取り込みがＭｆｓｄ２ａを介して起こるという概念を支持する。
【0153】
【0154】
図７は、アラキドン酸（ＡＲＡ；２０：４ ｎ－６）、ＤＨＡ用量および試験製品の間の関係を示す。図７は、より高用量の「粗製」ＤＨＡ／ＥＰＡリゾリン脂質組成物は、総脂肪酸と比較してより低いレベルの網膜ＡＲＡ濃度と関連し、粗製リゾリン脂質組成物が同等の用量でＳｕｐｅｒｂａ Ｂｏｏｓｔと比較してより顕著なＡＲＡ減少を示したことを示す。このことは、リゾリン脂質組成物の用量の増加が網膜におけるより有益な脂肪酸プロファイルと関連することを再度示唆する。
【0155】
それゆえに、実施例３は経口投与経路が網膜の好ましい脂肪酸含量をもたらし得、これは網膜の炎症状態に肯定的な影響を有することを実証する。これらの結果に基づいて、本発明者らは、本明細書に開示される眼の疾患の予防療法などの治療に使用するための、本明細書に記載のＬＰＣ－組成物を含む経口食品性サプリメントを提案する。
【0156】
したがって、第１の態様において、本発明は、眼の疾患または状態の１つ以上の症状および／または徴候を治療、予防および／または軽減するための方法であって、それらを必要とする被験体に製剤の有効量を投与する工程を含み、当該製剤が式１～８のいずれか１つからなる群から選択されるＬＰＣ化合物を含むリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）組成物、およびそれらの任意の組み合わせを含むことによって、疾患または状態の症状を改善、制御、低減または緩和する方法に関する：
【0157】
【化3】
【0158】
式中、
Ｒ１は、ＯＨまたはＯ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＨ３であり；
Ｒ２は、ＯＨまたはＯ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＨ３であり；および
ｎは、０、１または２である。
Ｒ１は、ＯＨまたはＯ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＨ３であり；
Ｒ２は、ＯＨまたはＯ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＨ３であり；および
ｎは、０、１または２である。
【0159】
本発明に係る一実施形態では、Ｒ１はＯＨであり、かつ、Ｒ２はＯＨである。
【0160】
本発明に係る代替の態様は、Ｒ１がＯＨまたは保護基であり、かつ、Ｒ２がＯＨまたは保護基である本発明の第１の態様に関する。保護基の一例は、ｎが０、１または２であるＯ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＨ３である。
【0161】
保護基は好ましくはＭｆｓｄ２ａ輸送体への結合を妨害せず、同時にオメガ－３（すなわち、ＤＨＡ、ＥＰＡ、ＳＤＡおよびＤＰＡ）アシル基の移動を阻害する基である。オメガ－３脂肪酸部分（例えば、ＤＨＡ部分、ＥＰＡ部分、ＳＤＡ部分およびＤＰＡ部分）がグリセロール骨格のｓｎ－１位に位置する場合、保護基は典型的にはｓｎ－１位からｓｎ－２位へのオメガ－３脂肪酸部分の移動を阻害する。オメガ－３脂肪酸部分（例えば、ＤＨＡ部分）がグリセロール骨格のｓｎ－２位に位置する場合、保護基は典型的にはｓｎ－２位からｓｎ－１位へのオメガ－３脂肪酸部分の移動を阻害する。
【0162】
式１および３は、ＤＨＡ部分が結合した化合物を指す。式２および４は、ＥＰＡ部分が結合した化合物を指す。式５および７は、ｎ－３ＤＰＡ部分が結合した化合物を指す。式６および８は、ＳＤＡ部分が結合した化合物を指す。実際には、オメガ－３脂肪酸が１４個以上のＣ原子を有する限り、ＤＨＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＳＤＡ部分は原則として任意のオメガ－３脂肪酸によって置き換えられ得る。しかしながら、ＤＨＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＳＤＡは、ヒトの眼の健康に関して最も関連性があると考えられている。
【0163】
本発明に係る代替の態様は、任意のオメガ－３部分；少なくとも、ｉ）鎖中に１４個以上のＣ原子を有する任意のオメガ－３部分、またはｉｉ）１４個以上のＣ原子の鎖長に相当する長さを有する任意のオメガ－３部分によって、ＤＨＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＳＤＡ部分が置き換えられている、本発明の第１の態様に関する。
【0164】
本発明に係る代替の態様は、ＤＨＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＳＤＡ部分がＤＨＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、ＡＬＡおよびＳＤＡ部分によって置き換えられている、本発明の第１の態様に関する。
【0165】
本出願を通して、用語ＬＰＣ化合物および用語「活性成分」／「活性構成要素」は全て、式１～８の化合物を指す。
【0166】
本発明の第１の態様において言及される、Ｒ１がＯＨであり、かつ、Ｒ２がＯＨである１つ以上の活性成分は、ＬＰＣのトリアシルグリセロール部分に結合したＤＨＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡまたはＳＤＡ分子のいずれかを有する全てのＬＰＣ分子である。ＬＰＣ－ＤＨＡおよびＬＰＣ－ＥＰＡについて技術的効果が実証されている。ＷＯ２０１８１６２６１７およびＷＯ２００８０６８４１３に提示されたデータに基づいて、本発明の第１の態様において言及される、Ｒ１がＯ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＨ３であり、かつ、Ｒ２がＯ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＨ３であり；およびｎが０、１または２であり、特にｎ＝０である、１つ以上の活性成分についても同様の効果が得られると考えられる。
【0167】
本明細書に提示される結果はＬＰＣ組成物を含有する製剤の静脈内投与に印象的であるが、例えば、薬学的に許容される担体を含めることによって、効果をさらに改善することができる。例えば、リポソームは、油性物質に関する疎水性内部と、親水性環境に面する親水性外部とを提供することによって、本発明の油性構成物質に関する好適な担体であり得る。さらに、ＬＰＣは典型的には、アルブミンなどの血中のタンパク質と関連し、ＬＰＣの有効濃度を低下させることも知られている。
【0168】
本発明のＬＰＣ組成物を含む製剤は、エタノールおよび／または水などの１種以上の溶媒を含んでも、含まなくてもよい。組成物が１種以上の溶媒を含む場合、組成物中の１種以上の活性成分の量は、組成物の乾燥重量％として言及され得る。しかしながら、組成物が１種以上の溶媒を含まない場合、組成物中の１種以上の活性成分の量は、組成物の重量％として言及され得る。
【0169】
本発明に係る一実施形態では、ＬＰＣ組成物を含有する製剤は、１種以上の活性成分のうちの２種以上の組合せを含み得る。活性成分の１つはグリセロール骨格に結合したＤＨＡ部分を有し得、別の活性成分はグリセロール骨格に結合したＥＰＡ部分を有し得る。
【0170】
したがって、本発明に係る一実施形態では、ＬＰＣ組成物を含む製剤は、１種以上の活性成分のうちの２種以上の組合せを含む。活性成分の１つはグリセロール骨格に結合したＤＨＡ部分を有し、他の活性成分はグリセロール骨格に結合したＥＰＡ部分を有する。好ましい実施形態では、グリセロール骨格に結合したＤＨＡ部分を有する活性成分と、グリセロール骨格に結合したＥＰＡ部分を有する活性成分との特定のモル比が存在する。グリセロール骨格に結合したＤＨＡ部分を有する活性成分：グリセロール骨格に結合したＥＰＡ部分を有する活性成分のモル比は、好ましくは１：１～１０：１の範囲、例えば１：１～７：１の範囲、または１：１～５：１の範囲、または１：１～３：１の範囲などである。本発明の別の実施形態では、グリセロール骨格に結合したＥＰＡ部分を有する活性成分：グリセロール骨格に結合したＤＨＡ部分を有する活性成分のモル比は、好ましくは１：１～１０：１の範囲、例えば１：１～７：１の範囲、または１：１～５：１の範囲、または１：１～３：１の範囲などである。
【0171】
モル比を計算する方法を説明する以下の例が参照される。組成物が１０モルのＬＰＣ－ＤＨＡおよび２モルのＬＰＣ－ＥＰＡを含む場合、グリセロール骨格に結合したＤＨＡ部分を有する活性成分と、グリセロール骨格に結合したＥＰＡ部分を有する活性成分とのモル比は、１０：２、すなわち５：１である。特に断らない限り、ＬＰＣ－ＥＰＡのモル数は、１－ＬＰＣ－ＥＰＡのモル数＋２－ＬＰＣ－ＥＰＡのモル数であり、ＬＰＣ－ＤＨＡのモル数は、１－ＬＰＣ－ＤＨＡのモル数＋２－ＬＰＣ－ＤＨＡのモル数である。
【0172】
グリセロール骨格上のオメガ－３脂肪酸部分の位置は、その脂肪酸の眼への取り込みに影響を及ぼし得ることが、これまで議論されてきた。したがって、本発明に係る一実施形態では、列挙したオメガ－３脂肪酸部分がグリセロール骨格のｓｎ－１位に結合している。本発明に係る別の実施形態では、列挙したオメガ－３脂肪酸部分は、グリセロール骨格のｓｎ－２位に結合している。発明に係る代替の実施形態では、グリセロール骨格のｓｎ－１位に結合したオメガ－３脂肪酸部分を有する活性成分と、グリセロール骨格のｓｎ－１位に結合したオメガ－３脂肪酸部分を有する活性成分との特定のモル比が存在する。グリセロール骨格のｓｎ－２位に結合したオメガ－３脂肪酸部分を有する活性成分：グリセロール骨格のｓｎ－１位に結合したオメガ－３脂肪酸部分を有する活性成分とのモル比は、好ましくは１：８～１８：１の範囲、例えば１：８～１５：１の範囲、または１：８～１０：１の範囲などである。
【0173】
モル比を計算する方法を説明する以下の例が参照される。組成物が５モルの２－ＬＰＣ－ＤＨＡ、５モルの２－ＬＰＣ－ＥＰＡおよび２モルの１－ＬＰＣ－ＤＨＡを含む場合、グリセロール骨格のｓｎ－１位に結合したオメガ－３脂肪酸部分を有する活性成分：グリセロール骨格のｓｎ－２位に結合したオメガ－３脂肪酸部分を有する活性成分のモル比は、１０：２、すなわち５：１である。
【0174】
本発明に係る第２の態様は、ＬＰＣ－ＤＨＡおよびＬＰＣ－ＥＰＡが豊富なクリルオイル組成物に関する。クリルオイルはかなりの量のＥＰＡおよびＤＨＡをリン脂質の形態で含有するが、これらの脂肪酸はリン脂質のｓｎ－２位にあり、消化中に遊離酸として膵臓ＰＬＡ２によって放出され、次いでＴＡＧとして吸収され、それゆえに脳内に効率的には輸送されない（１６）。しかしながら、ｓｎ－１位に特異的なリパーゼを用いてクリルオイルを前処理すると、ＥＰＡおよびＤＨＡはＬＰＣとして放出され、リン脂質として吸収され、脳に取り込まれる可能性が高くなる（図１１）。
【0175】
一方で、魚油はリン脂質を含有しないので、リパーゼを用いた魚油の処理はＬＰＣ－ＥＰＡまたはＬＰＣ－ＤＨＡのいずれも生成しないが、遊離酸またはモノアシルグリセロールのいずれかとしてオメガ３脂肪酸を放出し、これらはＴＡＧとして吸収され、したがって脳のオメガ３脂肪酸を豊富にしない。本研究では、リパーゼを用いた処理の前後の魚油およびクリルオイルが正常マウスの脳のオメガ３脂肪酸を豊富にする能力を比較した。結果は、クリルオイルのリパーゼ処理は脳のＥＰＡおよびＤＨＡを豊富にするが、魚油のリパーゼ処理はＥＰＡまたはＤＨＡのいずれを増加させる能力に対しても影響を示さなかったことを、明らかに示す。
【0176】
本発明のいくつかのさらなる実施形態のクリルオイル組成物は、約４０℃～約５０℃の温度で不活性雰囲気下において、クリルオイルリン脂質のｓｎ－１位に特異的なリパーゼの過剰な存在下で、ｓｎ－１エステル結合の実質的に完全な加水分解を確実にするのに十分な時間、クリルオイルを加水分解することによって調製される。好適なリパーゼとしては、ムコール・ミエヘイ(Mucor meihei)由来のリパーゼ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅリパーゼ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ ４３５（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐ由来）およびＬｉｐｏｚｙｍｅ ＴＬＩＭ（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｓｐ由来）などが挙げられる。いくつかの実施形態では、リパーゼは、ムコール・ミエヘイ(Mucor meihei)由来のリパーゼを含む。いくつかの実施形態では、５０重量パーセント超までのリパーゼを使用して、クリルオイルを加水分解する。いくつかの実施形態では、リパーゼは固定化される。
【0177】
特定の実施形態では、９５％エタノール中のクリルオイルの溶液を、１．３３倍の重量のムコール・ミエヘイ(Mucor meihei)由来のリパーゼを用いて、４０℃で７２時間攪拌することにより処理し、その後、エタノールを蒸発させて、リパーゼ処理クリルオイル組成物を提供する。
【0178】
本明細書に記載されるように調製された、リパーゼ処理クリルオイルは、食品添加物としての使用、または機能性食品組成物もしくは薬学的組成物への組み込みのためにさらに精製してもよい。クリルオイル組成物を精製するための方法は当技術分野において公知であり、該方法は溶媒抽出、クロマトグラフィーなどを含み得る。クロマトグラフィー精製は典型的にはシリカゲルカラムに脂質抽出物を充填し、極性が増加する溶媒を用いて溶出することを含む。中性脂質および未処理のリン脂質を除去した後、メタノールを用いてリゾＰＣを溶出して、約８５％のＥＰＡおよびＤＨＡを含有する純粋な化合物を得た。
【0179】
本発明のリパーゼ処理クリルオイルを含む組成物も本明細書に開示される。本発明の製剤、組成物、または物質は、乾燥粉末として、カプセルとして、すぐに飲めるジュースとして、または食品添加物としてなど、多くの方法で調製し得る。あるいは、製剤をまた、醸造、発酵、煮沸することにより、アルコールまたは水抽出物として調製されたコンポートを作製してもよい。一般に、本明細書に記載の抽出物を任意の様式で使用する任意の製剤は、本発明の意図される範囲内である。
【0180】
一実施形態では、リパーゼ処理クリルオイル組成物は、粉末として包装され、販売され得る。次いで、粉末は、水で再構成され得るか、または食品とブレンドされ得、医薬、予防、栄養、または他の健康関連の目的のために摂取され得る。あるいは、粉末はカプセル化されてもよい。その後、カプセルを飲み込む、または壊して開いて上述の粉末として使用することができる。最後に、粉末は、固体の丸薬に形成することができる。固体の丸薬は、摂取のために水に溶解する、上記のように粉末に粉砕する、または飲み込むことができる。
【0181】
リパーゼ処理クリルオイルは、固体組成物に組み込むことができる。固体組成物としては、例えば、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどを含む従来の非毒性の固体担体が挙げられる。
【0182】
例えば、本明細書に記載のリパーゼ処理クリルオイルおよび任意のアジュバントを、例えば水、生理食塩水、デキストロース水溶液、グリセロール、エタノールなどの賦形剤などに溶解、分散などして、溶液または懸濁液を形成することによって、液体組成物を調製することができる。また、所望に応じて、液体組成物は、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤などの非毒性助剤（例えば、酢酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、酢酸トリエタノールアミンナトリウム、オレイン酸トリエタノールアミンなど）を少量含むこともできる。そのような剤形を調製する実際の方法は当業者に公知であるか、または明らかである；例えば、上記で参照されているRemington’s Pharmaceutical Sciencesを参照されたい。
【0183】
他の実施形態は、ポリカチオン（キトサンおよびその第四級アンモニウム誘導体、ポリ－Ｌ－アルギニン、アミノ化ゼラチン）；ポリアニオン（Ｎ－カルボキシメチルキトサン、ポリ－アクリル酸）；およびチオール化ポリマー（カルボキシメチルセルロース－システイン、ポリカルボフィル－システイン、キトサン－チオブチルアミジン、キトサン－チオグリコール酸、キトサン－グルタチオンのコンジュゲート）などのポリマーを含む透過促進剤賦形剤の使用を含む。
【0184】
経口投与の場合、組成物は一般に、錠剤、カプセル、ソフトゲルカプセルの形態をとるか、または水溶液もしくは非水溶液、懸濁液もしくはシロップであり得る。経口使用のための錠剤およびカプセルは、ラクトースおよびトウモロコシデンプンなどの１つ以上の一般的に使用される担体を含むことができる。ステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤もまた、典型的に添加される。典型的には、本開示の組成物は、ラクトース、デンプン、スクロース、グルコース、メチルセルロース、ヒプロメロース、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、マンニトール、ソルビトールなどの経口の非毒性の薬学的に許容される不活性担体と組み合わせることができる。さらに、所望または必要に応じて、適切な結合剤、滑沢剤、崩壊剤、および着色剤を混合物に組み込むこともできる。適切な結合剤としては、デンプン、ゼラチン、天然の糖類（例えば、グルコースまたはβ乳糖）、トウモロコシ由来甘味料、天然および合成のガム類（例えば、アカシア、トラガカント、またはアルギン酸ナトリウム）、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ワックスなどが挙げられる。これらの投薬で使用される滑沢剤としては、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどが挙げられる。崩壊剤としては、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガムなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【0185】
口腔投与のための製剤としては、錠剤、トローチ、ゲルなどが挙げられる。あるいは、口腔投与は、当業者に公知の経粘膜送達システムを用いて行うことができる。本開示の抽出物は、従来の経粘膜送達システムすなわち、経皮「パッチ」を使用して、皮膚または粘膜組織を通して送達することができ、この場合、薬剤は、典型的には体表面に固定される薬物送達デバイスとして働く積層構造内に含まれる。そのような構造では、薬物組成物は典型的には、層、または上側のバッキング層の下にある層「リザーバ」に含まれる。積層デバイスは単一のリザーバを含むことができる、または複数のリザーバを含むことができる。一態様では、リザーバは薬物送達中に皮膚にシステムを固定する働きをする薬学的に許容される接触接着材料のポリマーマトリックスを含む。適切な皮膚接触接着剤材料の例としては、ポリエチレン、ポリシロキサン、ポリイソブチレン、ポリアクリレート、ポリウレタンなどが挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、薬物含有リザーバおよび皮膚接触接着剤が、分かれた別個の層として存在し（リザーバの下に接着剤がある）、この場合、リザーバは上記のようなポリマーマトリックスであり得るか、または液体もしくはゲルリザーバであり得るか、または何らかの他の形態をとり得る。これらの積層体におけるバッキング層はデバイスの上側の表面としての役割を果たし、積層構造の主要な構造要素として機能し、デバイスに高い柔軟性を提供する。バッキング層に選択される材料は、活性剤および存在する任意の他の材料に対して実質的に不透過性であるべきである。
【0186】
液体懸濁液が使用される場合、活性剤は任意の経口の非毒性の薬学的に許容される不活性担体（エタノール、グリセロール、水など）、ならびに乳化剤および懸濁化剤と組み合わせることができる。所望に応じて、香味剤、着色剤および／または甘味剤も添加することができる。本明細書の経口製剤に組み込むための他の任意の成分としては、防腐剤、懸濁化剤、増粘剤などが挙げられるが、これらに限定されない。
【0187】
リパーゼ処理クリルオイルは、軟膏またはクリームとして製剤化することができる。軟膏は、典型的にはワセリンまたは他のワセリン誘導体をベースとする半固体調製物である。選択された活性剤を含有するクリームは、当技術分野で知られているように、水中油型または油中水型のいずれかの粘性液体または半固体エマルジョンである。クリーム基剤は、水洗性であり、油相、乳化剤および水相を含有する。「内部」相とも呼ばれる油相は一般に、ワセリン、およびセチルまたはステアリルアルコールなどの脂肪アルコールから構成され；水相は必ずしもそうではないが、通常、体積で油相を超え、一般に湿潤剤を含有する。クリーム製剤中の乳化剤は一般に、非イオン性、アニオン性、カチオン性または両性界面活性剤である。使用される具体的な軟膏またはクリーム基剤は、当業者によって理解されるように、最適な薬物送達を提供するものである。他の担体またはビヒクルと同様に、軟膏基剤は、不活性、安定、非刺激性および非感作性であるべきである。
【0188】
本発明の別の態様は、本発明のリパーゼ処理クリルオイルを含む食品組成物を提供する。特定の実施形態では、本発明によるリパーゼ処理クリルオイルは、健康機能食品または一般的な食品中の活性材料として使用することができる。本発明の食品組成物は、アルツハイマー病などの神経疾患を予防または治療するために使用されてもよい。この場合、本発明のリパーゼ処理クリルオイルは、さらに加工することなく添加してもよいし、当技術分野で公知の方法に従って他の食品または食品材料と一緒に使用してもよい。活性材料の量は、予防、健康管理または治療目的など、その意図される目的に応じて適切に決定され得る。本発明の食品組成物は、栄養素、ビタミン、電解質、香味剤、着色剤、ペクチン酸およびその塩、アルギン酸およびその塩、有機酸、保護コロイド状増粘剤、ｐＨ調整剤、安定剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、ならびに炭酸飲料用炭酸添加剤から選択される１種以上の添加剤をさらに含有してもよい。本発明の食品組成物は、天然果汁、果汁飲料、および野菜飲料を製造するための果肉または植物の果肉をさらに含有してもよい。そのような材料は、独立して、またはそれらの混合物として使用することができる。このような添加剤の割合は限定されるものではないが、典型的には本発明の組成物１００重量部に対して、０．０１～０．１重量部の範囲から選択される。
【0189】
食品または飲料を製造することが意図される場合、本発明のリパーゼ処理クリルオイルは、典型的には食品または飲料の原料１００重量部に対して１５重量部以下、好ましくは１０重量部以下の量で添加される。食品または飲料が、健康目的、および衛生または健康管理のために長期間摂取される場合、ブロッコリーまたは抽出物の量は、上記で定義された下限未満に調整され得る。本発明の食品組成物は、天然物、または天然に存在する化学物質のみからなるブロッコリー植物抽出物を使用するため、安全に関連する問題がない。したがって、ブロッコリーまたは抽出物はまた、上記で定義された上限値を超える量で使用され得る。
【0190】
食品の種類に特に制限はない。リパーゼ処理クリルオイルを添加することができる食品の例としては、肉、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンディー、スナック、クッキー、ピザ、インスタントヌードル、他の麺類、チューインガム、アイスクリームを含む乳製品、スープ、飲料、茶、飲み物、アルコール飲料、およびビタミン複合体などの一般的な食品が挙げられる。
【0191】
飲料には、一般的な飲料のように、香味剤または天然炭水化物などの、１つ以上の追加の材料を含有していてもよい。天然炭水化物は、グルコースおよびフルクトースなどの単糖類、マルトースおよびスクロースなどの二糖類、デキストリンおよびシクロデキストリンなどの多糖類、ならびにキシリトール、ソルビトール、およびエリスリトールなどの糖アルコールであってもよい。飲料は、１つ以上の甘味剤を含有してもよい。甘味剤としては、例えば、タウマチンおよびステビア抽出物などの天然甘味剤、ならびにサッカリンおよびアスパルテームなどの合成甘味剤を使用することができる。
【0192】
本発明の第３の態様は、予防および／または治療に使用するための、本発明の第１または第２の態様によるＬＰＣ組成物を含む製剤に関する。いくつかの好ましい実施形態において、製剤は、経口投与または血管内投与されるべきである。
【0193】
眼表面は、ドライアイ（１）および角膜損傷（２）などの特定の障害の対象になり得る。
【0194】
眼周囲領域（３）の正しい衛生は、眼表面および眼全体の健康にとって不可欠である。
【0195】
本発明の第４の態様による好ましい実施形態では、網膜ＤＨＡおよび／またはＥＰＡレベルの増加レベルによる利益を受ける状態は、眼表面障害である。
【0196】
ドライアイ疾患（ＤＥＤ）は世界中で最も一般的な眼の状態のうちの１つであり、眼科医を受診する主な理由である。
【0197】
ＤＥＤは、涙液膜および眼表面に影響を及ぼし、涙液膜浸透圧および眼表面炎症の増加を併発する、眼表面への潜在的な損傷を伴う、涙液膜の不快感、視覚障害および涙液膜の不安定性の症状を引き起こす、多因子性疾患である（ＤＥＷＳ ＩＩ－２０１７による定義）。
【0198】
本発明の第４の態様による好ましい実施形態では、網膜ＤＨＡおよび／またはＥＰＡレベルの増加レベルによる利益を受ける状態は、ドライアイ疾患である。
【0199】
角膜損傷
角膜は虹彩の前に位置する透明な膜であり、ヒトの眼の最も強力な収束レンズとして機能する。
角膜は虹彩の前に位置する透明な膜であり、ヒトの眼の最も強力な収束レンズとして機能する。
【0200】
角膜に影響を及ぼす損傷は非常に頻繁であり、通常、次に続く炎症の発症に関連する。
【0201】
角膜損傷としては、擦過傷（眼表面に限定された、かすり傷または引掻き傷など）、化学的損傷（眼に入る流体によって引き起こされる）、コンタクトレンズまたは異物による損傷が挙げられる。
【0202】
また、眼の前眼部が関与する外科的治療による角膜損傷も存在する。
【0203】
緑内障は、視神経に影響を及ぼす慢性変性疾患であり、それを構成する神経線維へのダメージおよびその結果として生じる視野の喪失を特徴とする。治療しないまま放置すると、視野の漸進的な減少が失明につながることがある。
【0204】
緑内障は、主要な社会問題であり：それは世界中で失明の２番目の原因であり、約６０００万人が罹患し、８００万人を超える失明者を生じさせる。加えて、緑内障を患っている被験体の約５０％は、緑内障に罹患していることに気付いていない。
【0205】
それは、視力の変化がすでに非常に進んでいるが、症状に気付く前に疾患を発見することが多いため、潜行性疾患である。しかしながら、早期に診断され、適切に治療されれば、それは効果的に制御され得、患者の残りの人生のために良好な視覚を可能にする。
【0206】
疾患の発症に関連する多くの危険因子が存在する。主なものは：
－高い眼内圧（ＩＯＰ）
－高齢
－家族性素因
である。
－高い眼内圧（ＩＯＰ）
－高齢
－家族性素因
である。
【0207】
ＩＯＰ値は、眼の内部を循環する液体、すなわち房水によって決定される。健康な眼において、生成された房水と排出された房水との間の比は、一定の眼内圧、典型的には１１～２０ｍｍＨｇを維持するようなものである。緑内障の存在下では、この比が小柱網（眼からのこの流体の流出を可能にする構造）のレベルで生じる房水の排出流出の減少により変化する。
【0208】
緑内障はいくつかの方法で分類することができる：
－病因によれば、緑内障は、他の眼もしくは全身性疾患の非存在下で起こる場合には原発性であり得、または既存の状態と組み合わされる場合には続発性であり得る；
－房水の流出の変化に応じて、小柱網への房水の到達を妨げるという解剖学的問題がある、小柱網および閉塞隅角緑内障のレベルでの流出抵抗の増加に起因する開放隅角緑内障を区別する；
－主要危険因子であるＩＯＰの値に基づいて、高圧緑内障と正常圧緑内障を区別する。
－病因によれば、緑内障は、他の眼もしくは全身性疾患の非存在下で起こる場合には原発性であり得、または既存の状態と組み合わされる場合には続発性であり得る；
－房水の流出の変化に応じて、小柱網への房水の到達を妨げるという解剖学的問題がある、小柱網および閉塞隅角緑内障のレベルでの流出抵抗の増加に起因する開放隅角緑内障を区別する；
－主要危険因子であるＩＯＰの値に基づいて、高圧緑内障と正常圧緑内障を区別する。
【0209】
そして、生後にＩＯＰが正常より高くなった場合は先天性または後天性緑内障であり、生後数年間に発症した場合は乳児緑内障である。
【0210】
本発明の好ましい実施形態では、第１または第２の態様によるＬＰＣ組成物を含む製剤が、緑内障を阻害、予防、または治療するための使用のために提供される。
【0211】
網膜障害
網膜の特殊な光受容体、錐体および杆体が光刺激を電気刺激に変換し、電気刺激が視神経を介して脳に伝達され、そこで視覚画像の処理および知覚が生じるため、健康な網膜は視力に不可欠である。
網膜の特殊な光受容体、錐体および杆体が光刺激を電気刺激に変換し、電気刺激が視神経を介して脳に伝達され、そこで視覚画像の処理および知覚が生じるため、健康な網膜は視力に不可欠である。
【0212】
以下のような多くの重篤な病状は、網膜に影響を与える：
－加齢黄斑変性（ＡＭＤ）は網膜の中心および最も重要な領域である黄斑に進行性のダメージを引き起こし、中心視力の漸進的な消失をもたらす。
－加齢黄斑変性（ＡＭＤ）は網膜の中心および最も重要な領域である黄斑に進行性のダメージを引き起こし、中心視力の漸進的な消失をもたらす。
【0213】
－糖尿病性網膜症（ＤＲＰ）：糖尿病の主要かつ最も一般的な眼の合併症。ＤＲＰは、１型または２型糖尿病（ＤＭ）の両方に罹患している患者における網膜毛細血管に影響を及ぼす損傷を特徴とする。未診断および未治療のまま放置すると、失明を引き起こすことがある。
【0214】
－糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）は、ＤＲＰと共に糖尿病の主要な合併症のうちの１つであり、未治療の場合、中心視力を著しく妨げる可能性がある。ＤＭＥを発症する可能性は、糖尿病の長さおよび重症度と共に増加する：２０年を超えてＤＭに罹患している患者の約３０％がＤＭＥを発症する。
【0215】
上記の態様のいずれかによる好ましい実施形態では、網膜ＤＨＡおよび／またはＥＰＡレベルの増加レベルから利益を得る状態は、眼の炎症、角膜神経異常、および眼の表面上の擦過傷などのドライアイ疾患である。
【0216】
いくつかの実施形態では、眼の炎症性疾患としては、角膜ジストロフィー、トラコーマ、オンコセルカ症、ブドウ膜炎、交感性眼炎および眼内炎が挙げられる。
【0217】
上記の態様のいずれかによる代替の実施形態では、網膜ＤＨＡおよび／またはＥＰＡレベルの増加レベルから利益を得る状態は、加齢黄斑変性、糖尿病性網膜症、非増殖性網膜症、増殖性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、網膜色素変性症、中心静脈閉塞症および緑内障からなる群から選択される眼の神経変性疾患である。
【0218】
ＬＰＣ組成物
いくつかの好ましい実施形態では、ＬＰＣ組成物は、ＷＯ２０１９／１２３０１５（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載される方法に従って分析される。
いくつかの好ましい実施形態では、ＬＰＣ組成物は、ＷＯ２０１９／１２３０１５（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載される方法に従って分析される。
【0219】
上記の態様のいずれかによるいくつかの実施形態では、ＬＰＣ組成物は、式１～８のＬＰＣ化合物のうちの少なくとも１つ、およびそれらの任意の組み合わせを含む：
【0220】
【化4】
【0221】
いくつかの実施形態では、ＬＰＣ組成物は、トリグリセリド、エチルエステル、遊離脂肪酸、ならびにホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルコリンなどのリン脂質からなる群から選択される、ＬＰＣとは異なる脂質をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＬＰＣとは異なる脂質は、非クリル供給源などの異なる供給源に由来する。
【0222】
いくつかの実施形態では、ＬＰＣ組成物は、ＬＰＣ組成物の１０～１００重量％（ＬＰＣ組成物の１０～１００重量％、好ましくはＬＰＣ組成物の１５～１００重量％、より好ましくはＬＰＣ組成物の２０～１００重量％、さらに好ましくはＬＰＣ組成物の３０～１００重量％、最も好ましくはＬＰＣ組成物の５０～１００重量％など）に相当する量の総ＬＰＣを含む。
【0223】
いくつかの実施形態では、ＬＰＣ組成物は、ＤＨＡの量が組成物の５重量％～１２重量％に相当する脂肪酸プロファイルを含み、ここでＤＨＡは遊離脂肪酸として、もしくはエチルエステルとして存在するか、またはＬＰＣ組成物中の任意の脂質に結合している。
【0224】
一実施形態では、ＬＰＣ組成物は、ＥＰＡの量が組成物の１０重量％～２４重量％に相当する脂肪酸プロファイルを含み、ここでＥＰＡは遊離脂肪酸として、もしくはエチルエステルとして存在するか、またはＬＰＣ組成物中の任意の脂質に結合している。
【0225】
一実施形態では、ＬＰＣ組成物は、パルミトレイン酸および／またはパルミチン酸をさらに含む。
【0226】
一実施形態では、ＬＰＣ組成物は、パルミトレイン酸の量が組成物の２重量％～５重量％に相当する脂肪酸プロファイルを含み、ここでパルミトレイン酸は遊離脂肪酸として、もしくはエチルエステルとして存在するか、またはＬＰＣ組成物中の任意の脂質に結合している。
【0227】
一実施形態では、ＬＰＣ組成物は、組成物の１０重量％～１５重量％の量の脂肪酸プロファイルを含み、ここでパルミチン酸は遊離脂肪酸として、もしくはエチルエステルとして存在するか、またはＬＰＣ組成物中の任意の脂質に結合している。
【0228】
一実施形態では、ＬＰＣ組成物は、ＬＰＣ組成物の少なくとも３５重量％に相当する量の総リン脂質を含む。
【0229】
さらなる実施形態では、ＬＰＣ組成物は、ホスファチジルコリンの量と比較して、多くの量または大部分に匹敵する少なくとも１つの本発明によるＬＰＣ化合物を含む。
【0230】
一実施形態では、ＬＰＣ組成物は、ＬＰＣ組成物の少なくとも２３、２４、２５、２６、２７または２８重量％に相当する量の総ＬＰＣを含む。
【0231】
一実施形態では、ＬＰＣ組成物は、ＬＰＣ組成物の少なくとも６０重量％に相当する量の総ＬＰＣの量を含む。
【0232】
第１の態様の一実施形態では、ＬＰＣ組成物は、ＬＰＣ組成物の少なくとも９０重量％に相当する量の総ＬＰＣを含む。
【0233】
第１の態様の一実施形態では、ＬＰＣ組成物は、ＬＰＣ組成物の９０重量％～９８重量％に相当する量の総ＬＰＣを含む。
【0234】
第１の態様の一実施形態では、ＬＰＣ組成物は、ＬＰＣ組成物の約９５重量％に相当する量の総ＬＰＣを含む。
【0235】
例えば、一実施形態では、ＬＰＣ組成物は、６０重量％～１００重量％の総ＬＰＣ（約６０重量％～９５重量％の総ＬＰＣなど）を含む。
【0236】
本発明のいくつかの実施形態では、ＬＰＣ化合物は、Ａｋｅｒ Ｂｉｏｍａｒｉｎｅによって製造されたＰＣと比較して非常に多くの量のＬＰＣを含有する、任意のクリル由来の加工されたリン脂質生成物である。
【0237】
上記態様のいずれかのさらなる実施形態では、ＬＰＣ化合物は、ＬＰＣ－ＥＰＡ、ＬＰＣ－ＤＨＡおよびそれらの任意の組み合わせから選択される。
【0238】
上記態様のいずれかのさらなる実施形態では、ＬＰＣ組成物は、クリルオイルＬＰＣ組成物である。いくつかの好ましい実施形態では、クリルオイルＬＰＣ組成物はＬＰＣ－ＥＰＡおよびＬＰＣ－ＤＨＡが豊富である。いくつかの好ましい実施形態では、クリルオイル組成物は、リパーゼ処理クリルオイルである。いくつかの実施形態では、リパーゼ処理クリルオイルは、実施例４に記載されるように作られる。いくつかの好ましい実施形態では、リパーゼ処理クリルオイルは、少なくとも８０重量％のＬＰＣ－ＤＨＡおよびＬＰＣ－ＥＰＡを含む。いくつかの好ましい実施形態では、リパーゼは、ムコール・ミエヘイ(Mucor meihei)由来のリパーゼである。いくつかの好ましい実施形態では、リパーゼは固定化されている。
【0239】
その他の治療的使用
第６の態様において、本発明は、神経障害を治療するための、上記第１および第２の態様に記載された組成物および製剤の使用に関する。いくつかの実施形態では、神経障害は、パーキンソン病、統合失調症、外傷性脳損傷、脳卒中およびアルツハイマー病から選択される。いくつかの特に好ましい実施形態では、神経障害は、アルツハイマー病である。
第６の態様において、本発明は、神経障害を治療するための、上記第１および第２の態様に記載された組成物および製剤の使用に関する。いくつかの実施形態では、神経障害は、パーキンソン病、統合失調症、外傷性脳損傷、脳卒中およびアルツハイマー病から選択される。いくつかの特に好ましい実施形態では、神経障害は、アルツハイマー病である。
【0240】
第７の態様では、本発明は、肝臓のＤＨＡを豊富にすることによって和らげられる肝臓疾患を治療するための、上記第１および第２の態様に記載の組成物および製剤の使用に関する。いくつかの好ましい実施形態では、肝臓疾患は、非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬＤ）および非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）から選択される。
【0241】
本発明を一般的に説明したが、特定の具体的な実施例を参照することにより、さらなる理解を得ることができ、当該実施例が例示のためにのみ本明細書に提供されるが、別段の指定がない限り、限定することは意図されない。
【0242】
〔実験〕
実施例１：実施例２～４で使用した経口製剤および静脈内製剤の調製
（材料）
実施例１：実施例２～４で使用した経口製剤および静脈内製剤の調製
（材料）
【0243】
【表1】
【0244】
【表2】
【0245】
【表3】
【0246】
【表4】
【0247】
（［１４Ｃ］－ＬＰＣ－ＤＨＡ製剤、本明細書において製剤Ａと称する）
後に静脈内投与された製剤は、以下の目標仕様に従って調製された：
後に静脈内投与された製剤は、以下の目標仕様に従って調製された：
【0248】
【表5】
【0249】
［１４Ｃ］－ＬＰＣ－ＤＨＡをイントラリピッド製剤と混合して、以下のように、最終濃度１９０ｍｇ／ｋｇのリン脂質および濃度約１．５ｍｇ／ｋｇ（１５５μＣｉ／ｋｇ）の［１４Ｃ］－ＬＰＣ－ＤＨＡを含む投薬製剤を得た：
０．３９４ｍＬのエタノール性［１４Ｃ］－ＬＰＣ－ＤＨＡ（２３６１μＣｉ／ｍＬ）を２０ｍＬのガラスバイアルに分注し、窒素気流下、周囲温度で最終容量約０．３０ｍＬに減量した。５．７０ｍＬの２０％イントラリピッドを、濃縮したエタノール性［１４Ｃ］－ＬＰＣ－ＤＨＡ溶液に加え、穏やかにボルテックス混合して均一性を確保した。
０．３９４ｍＬのエタノール性［１４Ｃ］－ＬＰＣ－ＤＨＡ（２３６１μＣｉ／ｍＬ）を２０ｍＬのガラスバイアルに分注し、窒素気流下、周囲温度で最終容量約０．３０ｍＬに減量した。５．７０ｍＬの２０％イントラリピッドを、濃縮したエタノール性［１４Ｃ］－ＬＰＣ－ＤＨＡ溶液に加え、穏やかにボルテックス混合して均一性を確保した。
【0250】
（［１４Ｃ］－ＬＰＣ－ＥＰＡ製剤、本明細書において製剤Ｂと称する）
後に静脈内投与された製剤は、以下の目標仕様に従って調製された：
後に静脈内投与された製剤は、以下の目標仕様に従って調製された：
【0251】
【表6】
【0252】
［１４Ｃ］－ＬＰＣ－ＥＰＡをイントラリピッド製剤と混合して、最終濃度１９０ｍｇ／ｋｇのリン脂質および濃度約１．５ｍｇ／ｋｇ（１５５μＣｉ／ｋｇ）の［１４Ｃ］－ＬＰＣ－ＥＰＡを含む投薬製剤を以下のように得た：
０．３９４ｍＬのエタノール性［１４Ｃ］－ＬＰＣ－ＥＰＡ（２３６１μＣｉ／ｍＬ）を２０ｍＬのガラスバイアルに分注し、窒素気流下、周囲温度で最終容量約０．３０ｍＬに減量した。５．７０ｍＬの２０％イントラリピッドを、濃縮したエタノール性［１４Ｃ］－ＬＰＣ－ＥＰＡ溶液に加え、穏やかにボルテックス混合して均一性を確保した。
０．３９４ｍＬのエタノール性［１４Ｃ］－ＬＰＣ－ＥＰＡ（２３６１μＣｉ／ｍＬ）を２０ｍＬのガラスバイアルに分注し、窒素気流下、周囲温度で最終容量約０．３０ｍＬに減量した。５．７０ｍＬの２０％イントラリピッドを、濃縮したエタノール性［１４Ｃ］－ＬＰＣ－ＥＰＡ溶液に加え、穏やかにボルテックス混合して均一性を確保した。
【0253】
（［１４Ｃ］－ＬＰＣ－ＥＰＡおよび［１４Ｃ］－ＬＰＣ－ＤＨＡの経口投薬製剤）
［１４Ｃ］－ＬＰＣ－ＥＰＡおよび［１４Ｃ］－ＬＰＣ－ＤＨＡの経口投薬製剤は、それぞれの放射性標識化合物のエタノール性溶液を、１０：９０ｖ／ｖの放射性標識エタノール：改変クリルオイルの濃度比で改変クリルオイルＬＰＣ製剤へと添加することによって調製された。
［１４Ｃ］－ＬＰＣ－ＥＰＡおよび［１４Ｃ］－ＬＰＣ－ＤＨＡの経口投薬製剤は、それぞれの放射性標識化合物のエタノール性溶液を、１０：９０ｖ／ｖの放射性標識エタノール：改変クリルオイルの濃度比で改変クリルオイルＬＰＣ製剤へと添加することによって調製された。
【0254】
後に経口投与された各製剤は、以下の目標仕様に従って調製された：
【0255】
【表7】
【0256】
［１４Ｃ］－ＬＰＣ－ＥＰＡをリン脂質製剤と混合して、最終濃度８５５ｍｇ／ｍＬのリン脂質および最終濃度約１．５ｍｇ／ｋｇ（１５５μＣｉ／ｋｇ）の［１４Ｃ］－ＬＰＣ－ＥＰＡを含む投薬製剤を以下のように得た：
製剤中のエタノールの最終総濃度は約１０％であった。
製剤中のエタノールの最終総濃度は約１０％であった。
【0257】
０．３２８ｍＬのエタノール性［１４Ｃ］－ＬＰＣ－ＥＰＡ（２３６１μＣｉ／ｍＬ）を２０ｍＬのガラスバイアルに分注した。０．１７２ｍＬのエタノールを加えた（１０体積％になるまで）。４．５ｍＬの改質クリルオイルＬＰＣ製剤（３７℃）を、濃縮したエタノール性［１４Ｃ］－ＬＰＣ－ＥＰＡ溶液に加え、ボルテックスミキサーおよび激しいピペッティングにより混合し、均一性を確保した。
【0258】
上記［１４Ｃ］－ＬＰＣ－ＥＰＡについて記載したように、［１４Ｃ］－ＬＰＣ－ＤＨＡ製剤をリン脂質製剤に添加した。
【0259】
実施例２：眼組織におけるＬＰＣの取り込み－経口投与および静脈内投与
用量を投与した時の体重が２１３～２８９ｇ、約７～８週齢の３２匹の雄のSprague Dawleyラットをポリプロピレンケージに収容し、投薬中の短期間を除いてそのままにした。動物が位置する部屋をサーモスタットでモニタリングし、データを連続的に記録し（一般に温度範囲は２１±２℃、湿度範囲は５５±１０％）、１日あたり１２時間の蛍光灯および１２時間の暗所にさらした。動物は、使用前に最低３日間、標準的な動物飼育条件下で平衡化された。動物の健康状態をこの期間を通してモニタリングし、実験的使用に対する各動物の適性を使用前に確認した。
用量を投与した時の体重が２１３～２８９ｇ、約７～８週齢の３２匹の雄のSprague Dawleyラットをポリプロピレンケージに収容し、投薬中の短期間を除いてそのままにした。動物が位置する部屋をサーモスタットでモニタリングし、データを連続的に記録し（一般に温度範囲は２１±２℃、湿度範囲は５５±１０％）、１日あたり１２時間の蛍光灯および１２時間の暗所にさらした。動物は、使用前に最低３日間、標準的な動物飼育条件下で平衡化された。動物の健康状態をこの期間を通してモニタリングし、実験的使用に対する各動物の適性を使用前に確認した。
【0260】
ペレット飼料（RM1 (E) SQC, Special Diets Services, Witham, Essex, UK）および水（家庭用水供給から）は、保持期間、馴化期間および投薬後期間を通して自由に利用可能であった。
【0261】
１６匹のラットに、実施例１に特定されている投薬仕様に従って、製剤Ａまたは製剤Ｂのいずれか（製剤あたり８匹）を単回静脈内投与した。用量を投与する前に各ラットの体重を測定し、投与された個々の用量を体重および特定の投薬体積に基づいて計算した。
【0262】
経口投与のために選択された１６匹のラットを一晩絶食させ、用量を飼料の再導入の１時間後に投与した。経口投与のための投薬器具は、シリンジおよび強制経口投与チューブから構成されていた。用量を投与する間、胃に製剤を直接投与することができるように、経管栄養を食道に供給した。
【0263】
静脈内投与のための投薬器具は、皮下注射器および針から構成されていた。用量は、３０秒間にわたって緩徐なボーラスとして尾静脈に直接投与した。
【0264】
雄ラットへの製剤の投与後、投薬後０．５、３、８、２４、７２、９６、１６８および３３６時間のそれぞれの時間で１匹のラットを二酸化炭素ガスの過量投与により安楽死させた。
【0265】
各屠体を回収直後にヘキサン／固体二酸化炭素混合物中で急速凍結し、その後、ＱＷＢＡ（定量的全身オートラジオグラフィー）による分析まで、約－２０℃で保存した。
【0266】
凍結した屠体を、Ullbergの研究（Acta. Radiol. Suppl 118, 22 31, 1954）に基づく手順を用いてＱＷＢＡに供した。３０～４０個の組織（十分な放射能の存在下にさらされている）を含むように、ラットの体の最大５つの異なるレベルで切片を提示し、その脳、血液、腎臓および脾臓における取り込みを本明細書に開示する。
【0267】
凍結乾燥された全身オートラジオグラフィー切片を蛍光体蓄積イメージングプレートにさらし、暗所で最低５日間、周囲温度でインキュベートした。
【0268】
既知量の放射能を含む一連の較正されたオートラジオグラフィー［１４Ｃ］マイクロスケール（ｎＣｉ／ｇ、Perkin Elmer製）を、それぞれのプレート上の動物切片に沿ってさらした。
【0269】
放射能の分布を眼サンプルおよびマイクロスケールにおいて測定し、Fuji FLA-5100蛍光画像分析システムならびに関連するTina（バージョン２．０９）ソフトウェアおよびSeeScan（バージョン２．０）ソフトウェアを用いて定量した。
【0270】
使用した各曝露プレートについて代表的なバックグラウンド放射能測定を行った。正確な定量化の限界は、可視で最も低い［１４Ｃ］マイクロスケールであると考えられた。Seescanを用いてマイクロスケールから標準曲線を作成し、そこから放射能の組織濃度を決定した（ｎＣｉ／ｇ）。重量当量／ｇデータの計算のために、ｎＣｉ／ｇデータを関連する比活性（ｎＣｉ／μｇ）で割った。
【0271】
表１ａは、雄アルビノラットに平均１．５５１０ｍｇ／ｋｇの［１４Ｃ］－ＬＰＣ－ＤＨＡを単回静脈内投与した後の眼組織中の放射能の総量を示す。
【0272】
表１ｂは、１ａと同じデータをモル濃度で提示し、２．８０マイクロモル／ｋｇ（１．５９４９ｍｇ／ｋｇ）の用量に標準化されている。
【0273】
表２ａは、雄アルビノラットに平均１．４９６８ｍｇ／ｋｇの［１４Ｃ］－ＬＰＣ－ＥＰＡを単回静脈内投与した後の眼内の放射能の総量を示す。
【0274】
表２ｂは、２ａと同じデータをモル濃度で提示し、２．８０マイクロモル／ｋｇ（１．５２１８ｍｇ／ｋｇ）の用量に標準化されている。
【0275】
表３ａは、雄アルビノラットに平均１．６９１４ｍｇ／ｋｇの［１４Ｃ］－ＬＰＣ－ＤＨＡを単回経口投薬した後の眼内の放射能の総量を示す。
【0276】
表３ｂは、３ａと同じデータをモル濃度で提示し、２．８０マイクロモル／ｋｇ（１．５９４９ｍｇ／ｋｇ）の用量に標準化されている。
【0277】
表４ａは、雄アルビノラットに平均１．６７５９ｍｇ／ｋｇの［１４Ｃ］－ＬＰＣ－ＥＰＡを単回経口投薬した後の眼内の放射能の総量を示す。
【0278】
表４ｂは、４ａと同じデータをモル濃度で提示し、２．８０マイクロモル／ｋｇ（１．５２１８ｍｇ／ｋｇ）の用量に標準化されている。
【0279】
結果を、図８～１０にも提示する。
【0280】
【表8】
【0281】
【表9】
【0282】
【表10】
【0283】
【表11】
【0284】
口および腸における最初の曝露および分解を避けるために経口外投与される場合、ＤＨＡおよび驚くべきことに、そのＬＰＣ形態のＥＰＡ（それらのそれぞれの１４Ｃ放射性標識カルボン酸残基によって測定される）も、表１～４および図８～１０に示されるように、眼組織への非常に迅速かつ持続的な取り込みおよび大量の蓄積を示す。
【0285】
短時間の血管内（ｉ．ｖ．）ボーラスとして与えられたＬＰＣ－ＥＰＡについて、最初の２４時間の濃度時間曲線下面積（ＡＵＣ）は、経口投薬ＬＰＣについての等価測定値よりも５倍超大きいことが実証された（図９）
短時間の血管内（ｉ．ｖ．）ボーラスとして与えられるＬＰＣ－ＤＨＡについて、最初の２４時間の濃度時間曲線下面積（ＡＵＣ）は、経口投薬ＬＰＣ－ＤＨＡの等価測定値よりも４０倍超高いことが実証された（図９）。
短時間の血管内（ｉ．ｖ．）ボーラスとして与えられるＬＰＣ－ＤＨＡについて、最初の２４時間の濃度時間曲線下面積（ＡＵＣ）は、経口投薬ＬＰＣ－ＤＨＡの等価測定値よりも４０倍超高いことが実証された（図９）。
【0286】
実施例３：ＬＰＣ ＥＰＡおよびＬＰＣ ＤＨＡの組合せを含む組成物の効果。
【0287】
この実施例は、ＬＰＣ－ＥＰＡおよびＬＰＣ－ＤＨＡを含む様々なクリルオイルリゾリン脂質を３週間毎日投薬したデータを提供する。クリルオイルリゾリン脂質組成物が網膜ＥＰＡおよびＤＨＡの含有量の増加を引き起こすか否かを調べることは興味深かった。これらの油のＥＰＡ、ＤＨＡおよび総オメガ－３の含有量を以下の表５に示す。様々な純度のクリルオイルリゾリン脂質組成物およびこれらの生成は、以前に詳細に記載されている（ＷＯ２０１９／１２３０１５）。
【0288】
【表12】
【0289】
２４匹の雄ラットを６群に分け、３週間毎日強制経口投与した：群１）オリーブ油（０ｍｇ／ｋｇ／日のＥＰＡおよび０ｍｇ／ｋｇ／日のＤＨＡ）；群２）粗製（２７％ＬＰＣ）、低用量（１８５ｍｇ／ｋｇ／日のＥＰＡおよび１０８ｍｇ／ｋｇ／日のＤＨＡ）、３）粗製（２７％ＬＰＣ）、中用量（３７０ｍｇ／ｋｇ／日のＥＰＡおよび２１７ｍｇ／ｋｇ／日のＤＨＡ）、４）粗製（２７％ＬＰＣ）、高用量（９２６ｍｇ／ｋｇ／日のＥＰＡおよび５４３ｍｇ／ｋｇ／日のＤＨＡ）、５）純粋（８９％ＬＰＣ）、中用量（３２４ｍｇ／ｋｇ／日のＥＰＡおよび１６０ｍｇ／ｋｇ／日のＤＨＡ）；６）Ｓｕｐｅｒｂａ Ｂｏｏｓｔクリルオイル、中用量（３７９ｍｇ／ｋｇ／日のＥＰＡおよび２１９ｍｇ／ｋｇ／日のＤＨＡ）。
【0290】
組織のホモジナイズ後、網膜ＦＡを抽出し、ＨＰＬＣによって分析した。図１および図２に見られるように、強い用量－応答関係があり、より高い用量のＥＰＡは、より高い網膜ＥＰＡ濃度（図１）およびＥＰＡ／ＥＴＡ（２０：４）比の増加（図２）と関連している。驚くべきことに、図１は、「粗製」クリルオイルリゾリン脂質組成物と「純粋」クリルオイルリゾリン脂質組成物との間の網膜ＥＰＡ濃度の差異を示していない。しかしながら、粗製リゾリン脂質組成物を与えられたラットは、同様の用量でＳｕｐｅｒｂａ Ｂｏｏｓｔクリルオイルを与えられたラットよりも高い網膜ＥＰＡ／ＥＴＡ比を示す。これは、ＬＰＣ組成物を与えられたラットがＳｕｐｅｒｂａ Ｂｏｏｓｔクリルオイルおよびオリーブ油を与えられたラットと比較して、網膜においてより好ましいＥＰＡプロファイルを示し、さらに、より高用量のリゾリン脂質組成物が網膜においてより好ましいＥＰＡプロファイルと関連することを意味する。図３の検査は網膜ＥＰＡプロファイルの改善が血漿中に存在するより多量のＬＰＣ－ＥＰＡ（およびｍｆｓｄ２ａを介したその後のＥＰＡ取り込みの増加）に関連する可能性が高いことを示唆し、粗製高用量は血漿中のＬＰＣ－ＥＰＡの最高レベルならびに最高の網膜ＥＰＡ含有量およびＥＰＡ／ＥＴＡ比の両方を示す。
【0291】
図４は、より高い用量のリゾリン脂質組成物がより高いＤＨＡ／ＥＴＡ比、および粗製高用量群における特に顕著なＤＨＡ／ＥＴＡ比の増加と関連する、強い用量－応答関係を示す。これは、ＤＨＡがリゾリン脂質生成物の純度の違いに関係なく、リゾリン脂質組成物から網膜に用量依存的に取り込まれることを示唆する。図５は粗製高用量群が研究期間の終わり（Ｔ２）にＬＰＣ－ＤＨＡの最高レベルを示すことをさらに示し、これは血液網膜関門を横切るＤＨＡ取り込みがＭｆｓｄ２ａを介して起こるという概念を支持する。
【0292】
ＧＣ－ＦＩＤによる脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）の分析を用いて、総脂肪酸に関連する脳ＥＰＡ濃度（図６）、ならびにアラキドン酸（ＡＲＡ；２０：４ ｎ－６）、ＤＨＡ用量および試験生成物の間の関係（図７）をさらに評価した。ＧＣ－ｆｉｄはさらに、ＨＰＬＣデータを支持し、より高用量の「粗製」リゾリン脂質組成物は、総脂肪酸と比較してより高い網膜ＥＰＡ濃度と関連していた（図６）。さらに、図７は、より高用量の「粗製」ＤＨＡ／ＥＰＡリゾリン脂質組成物は、総脂肪酸と比較してより低いレベルの網膜ＡＲＡ濃度と関連し、粗製リゾリン脂質組成物が同等の用量でＳｕｐｅｒｂａ Ｂｏｏｓｔと比較してより顕著なＡＲＡ減少を示したことを示す。このことは、リゾリン脂質組成物の用量の増加が網膜におけるより有益な脂肪酸プロファイルと関連することを再度示唆する。
【0293】
実施例４：脳、網膜および肝臓へのＥＰＡおよびＤＨＡの送達のためのクリルリゾリン脂質の使用。
【0294】
〔材料および方法〕
クリルオイルおよび魚油は、Bioriginal Food & Science Corporation, Saskatoon, Canadaからの寛大な贈り物であった。ＢＤＮＦに対する抗体は、Abcam, Cambridge, MAから入手した。１７：０ ＬＰＣ、２２：６ ＬＰＣの標準は、Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL)から購入した。ムコール・ミエヘイ(Mucor meihei)由来の固定化リパーゼは、Creative enzyme (Shirley, NY)から購入した。クリルオイルおよび魚油を以下のようにリパーゼで処理した：油（１５ｇ）を３００ｍＬの９５％エタノール水溶液（ｖ／ｖ）に溶解し、２０ｇの固定化リパーゼを加えた。反応混合物を、オービタルインキュベーター中、１７５ｒｐｍ、４０℃、暗所で７２時間、窒素下で振盪した。エタノールを真空下で蒸発させ、ＴＬＣおよびＧＣ／ＭＳによって脂質および脂肪酸の組成についてサンプルを分析した。対照およびリパーゼ処理クリルオイルのサンプルを、クロロホルム：メタノール：水（６５：２５：４、体積比）の溶媒系を用いてＴＬＣにより分析した。ＬＰＣ、ＰＣ、およびＰＥに対応するスポットを掻き取り、ＧＣ／ＭＳによって脂肪酸組成について分析した。対照およびリパーゼ処理魚油サンプルを、ヘキサン：ジエチルエーテル：酢酸（９０：１０：１、体積比）の溶媒系を用いてＴＬＣプレート上で分離し、ＭＡＧ、ＤＡＧ、遊離脂肪酸、およびＴＡＧに対応するスポットをＧＣ／ＭＳによって分析した。
クリルオイルおよび魚油は、Bioriginal Food & Science Corporation, Saskatoon, Canadaからの寛大な贈り物であった。ＢＤＮＦに対する抗体は、Abcam, Cambridge, MAから入手した。１７：０ ＬＰＣ、２２：６ ＬＰＣの標準は、Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL)から購入した。ムコール・ミエヘイ(Mucor meihei)由来の固定化リパーゼは、Creative enzyme (Shirley, NY)から購入した。クリルオイルおよび魚油を以下のようにリパーゼで処理した：油（１５ｇ）を３００ｍＬの９５％エタノール水溶液（ｖ／ｖ）に溶解し、２０ｇの固定化リパーゼを加えた。反応混合物を、オービタルインキュベーター中、１７５ｒｐｍ、４０℃、暗所で７２時間、窒素下で振盪した。エタノールを真空下で蒸発させ、ＴＬＣおよびＧＣ／ＭＳによって脂質および脂肪酸の組成についてサンプルを分析した。対照およびリパーゼ処理クリルオイルのサンプルを、クロロホルム：メタノール：水（６５：２５：４、体積比）の溶媒系を用いてＴＬＣにより分析した。ＬＰＣ、ＰＣ、およびＰＥに対応するスポットを掻き取り、ＧＣ／ＭＳによって脂肪酸組成について分析した。対照およびリパーゼ処理魚油サンプルを、ヘキサン：ジエチルエーテル：酢酸（９０：１０：１、体積比）の溶媒系を用いてＴＬＣプレート上で分離し、ＭＡＧ、ＤＡＧ、遊離脂肪酸、およびＴＡＧに対応するスポットをＧＣ／ＭＳによって分析した。
【0295】
飼料および処理。同等量の総ＥＰＡおよびＤＨＡ（約１．２μｍｏｌ／ｇ飼料）を含有する処理および未処理クリルオイルおよび魚油をトウモロコシ油と混合して、飼料中の総脂肪を７％にし、ＡＩＮ９３Ｇげっ歯類飼料とブレンドし、Diets Inc.によってペレット化および真空封止した。対照飼料はトウモロコシ油のみを含み、飼料は－２０℃で保存し、毎週使用前に解凍した。食用油（混合トウモロコシ油を含む）の脂肪酸組成を表６に示す。予想通り、リパーゼ処理は、ＥＰＡおよびＤＨＡに富むＬＰＣの生成をもたらした。未処理クリルオイルのＬＰＣにおけるＥＰＡ＋ＤＨＡの割合は１８％であったが、リパーゼ処理クリルオイルでは＞８０％であった。表７は、食用油の主要脂質画分の間のオメガ３脂肪酸（ＥＰＡ＋ＤＨＡ）の分布を示す。ＰＣは未処理クリルオイル中の総ＥＰＡ＋ＤＨＡの最大の割合を含み、一方、ＬＰＣは、リパーゼ処理クリルオイル中の最大の割合を含んでいた。魚油のリパーゼ処理は、ＴＡＧから遊離脂肪酸およびＭＡＧへのＥＰＡおよびＤＨＡのシフトをもたらした。
【0296】
全ての実験は、UIC Institutional Animal Care and Use Committeeプロトコルからの倫理的承認の下で行った。雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（齢、２ヶ月）は、Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME)から購入した。マウスをそれぞれ５匹ずつ５群に無作為に分け、３０日間、自由に餌を与えた。体重を毎週測定した。３０日間の期間後、マウスをケタミン（９０ｍｇ／ｍｌ）およびキシラジン（１０ｍｇ／ｍｌ）で麻酔した。ヘパリン化注射器を用いて心臓穿刺により血液を採取し、１５００×ｇで１５分間の遠心分離により血漿を調製した。次いで、マウスに氷冷１００ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を経心的に潅流し、肝臓、心臓、脳、および脂肪組織を採取した。脳をさらに切開して、前頭前皮質、海馬、線条体、および小脳を分離した。全てのサンプルを液体窒素中で急速凍結し、分析まで８０℃で保存した。
【0297】
統計 統計解析は、GraphPad Prism 8.0ソフトウェア（La Jolla, CA）を用いて行った。処置間の有意性は、事後Tukey多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡにより決定した。
【0298】
脂質抽出および脂肪酸分析 ＬＰＣ種および異性体のＬＣ／ＭＳ分析のための血漿サンプルを、Ivanova et al.（２７）によって記載されているように本質的に抽出した。血漿サンプル（１００μｌ）を、１７：０ ＬＰＣ（１０μｇ）の内部標準を添加した後、９００μｌの酸性化メタノール（０．０１Ｎ ＨＣｌ、ｐＨ４．０）を用いてタンパク質を除去した。サンプルをＢｒａｎｓｏｎ超音波処理器で３分間超音波処理し、２１，５００×ｇで１０分間、４℃で遠心分離した。上清を回収し、１０μｌをＨＰＬＣシステムに注入した。ＬＰＣ異性体の分析は、以前に記載されたように（２８）、Atlantis (Waters Corp., Milford, MA)ＨＩＬＩＣカラムを使用して、およびポジティブモードエレクトロスプレー質量分析における多重反応モニタリングによって実施した。内部標準１７：０でＬＰＣ種の定量化を行い、補正係数（×０．２３３）を適用して、既知の標準で別々に決定した１７：０のＬＰＣおよび２２：６のＬＰＣ種のイオン強度の差を説明した。我々の以前の研究はこの補正係数を含まず、したがって、以前に報告されたオメガ３ ＬＰＣ種の血漿値（１６、１７、２９）はここで報告されたものよりも約４倍高かった。
【0299】
脂肪酸分析のために、脂質をBligh and Dyerの手順（３０）によって抽出し、脂肪酸メチルエステルを、メタノール性ＨＣｌを用いて調製し、以前に記載されたようにＧＣ／ＭＳによって分析した（１６）。
【0300】
ウエスタンブロット分析 脳画分中のＢＤＮＦレベルをウエスタンブロット分析により決定した。簡単に説明すると、組織を溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、２５ｍＭ ＫＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ－４０、０．１ｍＭ ＥＧＴＡ、１０μＬ／ｍＬアプロチニン、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ Ｎａ４Ｐ２Ｏ７、１ｍＭ Ｎａ４ＭＯ４、１％プロテアーゼインヒビターカクテル、１ｍＭフェニルスルホニルフルオリド、１０ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭ ＮａＶ）中でホモジナイズし、懸濁液を氷上に３０分間放置し、１３０００×ｇで４℃で１０分間遠心分離した。上清（２０μｇタンパク質）を、８０Ｖで２時間、１０％ＳＤＳゲル上で電気泳動に供した。分離されたタンパク質をメタノールですすいだポリビニリデンジフルオリド膜（Millipore, Burlington, MA）に移し、０．１％のｔｗｅｅｎ２０を含有するトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳＴ）中、５％（ｗ／ｖ）無脂肪乾燥ミルクで膜を４℃で１時間ブロックした。膜を、４℃で一晩、ＴＢＳＴ中の一次抗体（ＢＤＮＦ、ＥＰＲ１２９２、Abcam, Cambridge, MA）でプローブした。膜をＴＢＳＴで３回洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗ウサギＩｇＧ（Cell Signaling Technologies, Danvers, MA）と共に室温で１時間インキュベートした。最後に、膜をＴＢＳＴで３回洗浄し、増強化学発光（ＥＣＬ）検出キット（Bio-Rad, Hercules, CA）で１分間現像し、それぞれのタンパク質をBio-Rad ChemiDoc MP Imaging Systemによって定量し、結果をＢＤＮＦ／β－アクチンの比として表した。
【0301】
〔結果〕
異なる飼料で処置されたマウスの食物摂取または体重に有意差はなかった（結果は示さず）。
異なる飼料で処置されたマウスの食物摂取または体重に有意差はなかった（結果は示さず）。
【0302】
血漿 ＡＲＡ（２０：４）、ＥＰＡ（２０：５）、ＤＰＡ（２２：５）およびＤＨＡ（２２：６）の割合組成を図１２に示す。未処理の魚油およびクリルオイルではＥＰＡおよびＤＨＡの穏やかな増加のみであったが、魚油およびクリルオイルのリパーゼ処理は血漿中のＥＰＡおよびＤＨＡのより高い蓄積をもたらした。リパーゼ処理は、血漿ＥＰＡおよびＤＨＡの増加に関して、魚油よりもクリルオイルの効力を増加させた（クリルオイルの場合、ＥＰＡで９倍の増加およびＤＨＡで３倍の増加、これに対し魚油の場合、ＥＰＡで２．２倍の増加およびＤＨＡで７０％の増加）。これらの結果は、リパーゼ処理が魚油よりクリルオイルの全体的吸収を増加させることを示唆する。アラキドナート含有量は、未処理クリルオイルまたはリパーゼ処理魚油を与えたマウスでのみ有意に減少した。
【0303】
ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡを含むＬＰＣ種の濃度および異性体組成をＬＣ／ＭＳにより測定した（図１３）。３つのＬＰＣは全ての飼料によって増加したが、リパーゼ処理クリルオイルを与えた後の増加は他の飼料より４～５倍大きかった。さらに、増加の大部分は、全ての場合においてｓｎ－２アシル異性体によるものであった。リパーゼ処理クリルオイルはｓｎ－２アシルＬＰＣ異性体を含んでいたが、血漿sｎ－２アシルＬＰＣもＬＰＣを含まない魚油を与えた後にわずかに増加したので、血漿中に見出されたＬＰＣは全てが最近吸収されたＬＰＣによるものではないかもしれない。さらに、ＬＰＣ－ＤＨＡ／ＬＰＣ－ＥＰＡ比は、飼料における比と比較して、血漿においてはるかに高く、ＥＰＡのＤＨＡへのいくらかの変換がおそらく肝臓において起こったことを示唆する。クリルオイルのリパーゼ処理は未処理クリルオイルと比較してオメガ－３ ＬＰＣの血漿レベルにおいて４倍の増加をもたらしたが、魚油のリパーゼ処理による増加はなかった。
【0304】
脳領域のＰＵＦＡ 脳の４つに分けた領域を、脂肪酸組成について分析した。前頭前皮質では（図１４）、ＥＰＡ含有量は未処理クリルオイルによって有意に増加した（総ＦＡに対する０．２３％から１．６６％）。しかしながら、クリルオイルのリパーゼ処理は、未処理クリルオイルと比較して、皮質ＥＰＡのさらなる３倍の増加をもたらした。対照的に、魚油は、リパーゼによる処理の有無にかかわらず、ＥＰＡ含有量に効果を示さなかった。皮質のＤＨＡ含有量は未処理クリルオイルを与えた後に２５％増加したが、クリルオイルのリパーゼ処理は１１８％の増加をもたらし、リパーゼ処理による４．７倍の刺激を示した。魚油は、リパーゼ処理の前後で皮質のＤＨＡ含有量に効果を示さなかった。ＤＰＡ（２２：５）はリパーゼ処理クリルオイルにより４．５倍に増加したが、他の調製物では増加しなかった。クリルオイルの調製物およびリパーゼ処理魚油の両方による皮質のＡＲＡ（２０：４）含有量の有意な減少があったが、未処理魚油によるものではなかった。ＡＲＡの減少は明らかにＥＰＡまたはＤＨＡによるその置換のためであるが、リパーゼ処理魚油の場合、オメガ３脂肪酸の正味の増加はなかった。
【0305】
海馬では（図１５）、ＥＰＡ含有量はリパーゼ処理クリルオイルによってのみ有意に増加した（対照と比較して１２．５倍の増加）。ＤＨＡ含有量は未処理クリルオイルによって１５％増加したが、リパーゼ処理は４６％の増加をもたらした（リパーゼ処理による３倍の刺激）。ＡＲＡ含有量は、未処理魚油では他の調製物より減少が少なかったが、全ての調製物により有意に減少した。いずれの飼料もＤＰＡに変化はなかった。
【0306】
線条体では（図１６）、ＥＰＡ含有量はリパーゼ処理クリルオイルによって増加したが（７０倍）、未処理クリルオイルでは増加しなかった。興味深いことに、リパーゼ処理魚油もＥＰＡ含有量を増加させたが（１２倍）、未処理魚油は効果がなかった。ＤＨＡ含有量は未処理クリルオイルにより２３％増加し、リパーゼ処理クリルオイルにより１０７％増加した（リパーゼ処理による４．７倍の刺激）。線条体のＤＨＡ含有量には、未処理または処理魚油による影響はなかった。ＤＰＡの割合は、リパーゼ処理クリルオイルによってのみ有意に増加した（０．１４％から１．４５％）。ＡＲＡ含有量は、未処理クリルオイル（－５１％）および未処理魚油（－２７％）によってのみ有意に減少した。
【0307】
小脳では、リパーゼ処理クリルオイルのみがＥＰＡ含有量を有意に増加させた（１１倍）（図１７）。ＤＨＡ含有量は未処理およびリパーゼ処理クリルオイルの両方によって増加したが、増加はリパーゼ処理後でより大きかった（リパーゼ処理による１２％の刺激）。魚油は、リパーゼ処理の有無にかかわらず、有意な効果を示さなかった。ＡＲＡ含有量の有意な減少は、リパーゼ処理クリルオイルで生じた。オメガ３脂肪酸の有意な増加はなかったが、ＡＲＡはまた、リパーゼ処理魚油によって減少した。
【0308】
これらの結果は、全ての脳領域においてＥＰＡおよびＤＨＡの累積はクリルオイルの部分的脂肪分解によって数倍まで増加したが、魚油の効果はリパーゼ処理後でも最小であったことを示している。これらの結果は、ＬＰＣ－ＥＰＡおよびＬＰＣ－ＤＨＡの生成が脳によるオメガ３脂肪酸の累積に必須であるという結論を支持する。ＬＰＣ－ＥＰＡ量は血漿中のＬＰＣ－ＤＨＡ量よりも高かったが、脳ＤＨＡの増加はＥＰＡよりも大きかったことから、ＥＰＡは脳内でＤＨＡに変換されるか、脳に入る前にＬＰＣ－ＤＨＡに変換されることが示唆された。
【0309】
脳におけるＢＤＮＦ：我々の以前の研究は、ＬＰＣ－ＤＨＡおよびＬＰＣ－ＥＰＡによる脳のＤＨＡまたはＥＰＡの増加が、ニューロン生存および認知機能に必須のニューロトロフィンである脳ＢＤＮＦの増加をもたらすことを示した（１６、２６）。クリルオイルおよび魚油を与えた後に同様の変化が生じたか否かを決定するために、ウエスタンブロットによって前頭前皮質および海馬におけるＢＤＮＦのレベルを決定した。図１８に示されるように、両方の脳領域のＢＤＮＦレベルは、未処理および処理クリルオイルの両方によって有意に増加したが、リパーゼ処理クリルオイルの場合の増加は、未処理クリルオイルの場合よりも３倍大きかった。魚油飼料による海馬のＢＤＮＦのわずかではあるが有意な増加があったが、皮質では認められず、リパーゼ処理はさらなる増加を示さなかった。
【0310】
脂肪組織 脳領域とは対照的に、リパーゼ処理クリルオイルは、性腺周囲（図１９）または鼠径部脂肪組織（図２０）のＥＰＡまたはＤＨＡの含有量に効果を示さなかった。しかし、未処理および処理魚油、ならびに未処理クリルオイルは全て、両方のタイプの脂肪組織のＥＰＡおよびＤＨＡの含有量を増加させた。いずれの調製も鼠径部脂肪組織のＡＲＡ濃度に効果を示さなかった。ここで、オメガ３脂肪酸の増加は脳領域で生じたように、ＡＲＡを置き換えるのではなく、１８：１および１８：２を犠牲にして生じた（図示せず）。しかしながら、性腺周囲脂肪組織では、リパーゼ処理クリルオイルを除く全ての調製物が、オメガ３脂肪酸の増加に対応してＡＲＡ含有量を減少させた。
【0311】
肝臓 肝臓において、ＥＰＡ含有量は、未処理およびリパーゼ処理のクリルオイルの両方によって有意に増加した（図２１）。しかし、リパーゼ処理後の増加は６倍大きかった。ＤＨＡレベルはリパーゼ処理クリルオイルによってのみ有意に増加した。ＥＰＡおよびＤＨＡの増加は１６：０の犠牲で起こり、リパーゼ処理クリルオイル群では、対照の２８．８％から２５．５％に減少した。魚油は、リパーゼ処理の有無にかかわらず、ＥＰＡまたはＤＨＡのいずれにも効果を示さなかった。しかし、リパーゼ処理魚油群では１８：０の減少が認められた（８．３％ｖｓ対照群１０．６％）。いずれの調製物においても、肝臓のＡＲＡまたはＤＰＡの含有量に有意な変化は生じなかった。
【0312】
心臓 心臓では、全ての調製物がＥＰＡおよびＤＨＡの両方を増加させた（図２２）。しかし、興味深いことに、魚油またはクリルオイルのリパーゼ処理は心臓のオメガ３脂肪酸を豊富にする能力の低下をもたらした。いずれの栄養補助食品についても、ＡＲＡまたはＤＰＡレベルに変化は観察されなかった。１６：０、１８：０、１８：１、または１８：２を含む他の主要な脂肪酸に有意な変化は生じなかった（図示せず）。
【0313】
〔考察〕
飼料のＥＰＡおよびＤＨＡは、ＴＡＧ（魚油、藻類油）またはリン脂質（クリルオイル）の形態で最も一般的に生じる。現在、サプリメントはＥＰＡおよびＤＨＡのエチルエステル（例えば、Lovaza、Vascepa）および遊離脂肪酸（例えば、Epanova）の形態としても利用可能である。しかしながら、これらの調製物のいずれも、ほとんどの他の組織のＥＰＡまたはＤＨＡを豊富にするが、推奨用量では脳ＥＰＡまたはＤＨＡを有意に豊富にしない。これは、これらのサプリメントが主にＴＡＧとして吸収されるのに対し（１６、３１）、ＢＢＢにおけるトランスポーターはＥＰＡまたはＤＨＡのＬＰＣ形態に特異的であること（１５）から明らかである。クリルオイルは約４０重量％のリン脂質を有するが、リン脂質中のＥＰＡおよびＤＨＡはｓｎ－２位に存在し、膵臓ＰＬＡ２による消化中に遊離脂肪酸として放出される。放出されたＥＰＡおよびＤＨＡは、その後、ＴＡＧとして吸収され、それゆえ脳オメガ３脂肪酸を豊富にしない。本研究の目的はクリルオイルのＰＣをｓｎ－１位に特異的なリパーゼを用いて予備消化し、これによりＬＰＣ－ＥＰＡおよびＬＰＣ－ＤＨＡを生成し、次いで、ＬＰＣ－ＥＰＡおよびＬＰＣ－ＤＨＡがリン脂質として吸収され、脳オメガ３脂肪酸を優先的に豊富にすることによって、脳ＥＰＡおよびＤＨＡを豊富にするクリルオイルの効力を増加できることを実証することである。比較のために、我々はまた、リン脂質を含有しない魚油をリパーゼを用いて処理し、したがってＬＰＣを生成しないが、ＭＡＧおよび遊離脂肪酸を生成する。ここに提示された結果は、クリルオイルのリパーゼ処理が未処理クリルオイルと比較して、脳ＥＰＡを１０～７０倍、脳ＤＨＡを１５～８３％豊富にするその能力を増強するが、魚油はリパーゼ処理の有無にかかわらず、脳オメガ３脂肪酸に影響を示さなかったことを表す。未処理クリルオイルによって、脳ＤＨＡのわずかではあるが有意な増加もあったことは、明らかに、その中に存在する少量のＬＰＣ－ＥＰＡおよびＬＰＣ－ＤＨＡのためであり、したがって、リパーゼ処理による刺激はあまり顕著ではないようであることが指摘されるべきである。さらに、リパーゼ処理は使用される条件下で全てのＰＣをＬＰＣには変換しなかったので、クリルオイルのリパーゼ処理によって脳オメガ３脂肪酸を増加させる可能性は本明細書に示されるものよりもさらに高い。
飼料のＥＰＡおよびＤＨＡは、ＴＡＧ（魚油、藻類油）またはリン脂質（クリルオイル）の形態で最も一般的に生じる。現在、サプリメントはＥＰＡおよびＤＨＡのエチルエステル（例えば、Lovaza、Vascepa）および遊離脂肪酸（例えば、Epanova）の形態としても利用可能である。しかしながら、これらの調製物のいずれも、ほとんどの他の組織のＥＰＡまたはＤＨＡを豊富にするが、推奨用量では脳ＥＰＡまたはＤＨＡを有意に豊富にしない。これは、これらのサプリメントが主にＴＡＧとして吸収されるのに対し（１６、３１）、ＢＢＢにおけるトランスポーターはＥＰＡまたはＤＨＡのＬＰＣ形態に特異的であること（１５）から明らかである。クリルオイルは約４０重量％のリン脂質を有するが、リン脂質中のＥＰＡおよびＤＨＡはｓｎ－２位に存在し、膵臓ＰＬＡ２による消化中に遊離脂肪酸として放出される。放出されたＥＰＡおよびＤＨＡは、その後、ＴＡＧとして吸収され、それゆえ脳オメガ３脂肪酸を豊富にしない。本研究の目的はクリルオイルのＰＣをｓｎ－１位に特異的なリパーゼを用いて予備消化し、これによりＬＰＣ－ＥＰＡおよびＬＰＣ－ＤＨＡを生成し、次いで、ＬＰＣ－ＥＰＡおよびＬＰＣ－ＤＨＡがリン脂質として吸収され、脳オメガ３脂肪酸を優先的に豊富にすることによって、脳ＥＰＡおよびＤＨＡを豊富にするクリルオイルの効力を増加できることを実証することである。比較のために、我々はまた、リン脂質を含有しない魚油をリパーゼを用いて処理し、したがってＬＰＣを生成しないが、ＭＡＧおよび遊離脂肪酸を生成する。ここに提示された結果は、クリルオイルのリパーゼ処理が未処理クリルオイルと比較して、脳ＥＰＡを１０～７０倍、脳ＤＨＡを１５～８３％豊富にするその能力を増強するが、魚油はリパーゼ処理の有無にかかわらず、脳オメガ３脂肪酸に影響を示さなかったことを表す。未処理クリルオイルによって、脳ＤＨＡのわずかではあるが有意な増加もあったことは、明らかに、その中に存在する少量のＬＰＣ－ＥＰＡおよびＬＰＣ－ＤＨＡのためであり、したがって、リパーゼ処理による刺激はあまり顕著ではないようであることが指摘されるべきである。さらに、リパーゼ処理は使用される条件下で全てのＰＣをＬＰＣには変換しなかったので、クリルオイルのリパーゼ処理によって脳オメガ３脂肪酸を増加させる可能性は本明細書に示されるものよりもさらに高い。
【0314】
リパーゼ処理クリルオイルは脳のＥＰＡおよびＤＨＡの増加において非常に効率的であったが、脂肪組織のオメガ３脂肪酸には影響を示さなかった。同様に、心臓では他の全ての調製物がリパーゼ処理クリルオイルよりも効率的にＥＰＡおよびＤＨＡを増加させたが、肝臓ではリパーゼ処理クリルオイルが他の全ての調製物よりも効率的であった。これらの結果は、先に提案したように（１７）、ＴＡＧまたはリン脂質のいずれかとして吸収されたオメガ３脂肪酸の異なる代謝運命を示す。カイロミクロンは残存物として肝臓に入る前に最初に脂肪組織、筋肉、および心臓を最初に通過するので、カイロミクロンＴＡＧ由来のオメガ３脂肪酸の大部分は脂肪組織、筋肉、および心臓におけるリポタンパク質リパーゼを介した取り込みによって取り込まれる。一方、リン脂質由来のオメガ３脂肪酸は、主にカイロミクロン残存物の形態で肝臓に取り込まれる。ＥＰＡおよびＤＨＡは、加水分解され、膜またはリポタンパク質に組み込まれ、ＬＰＣの形態で肝臓によって部分的に分泌され（３２～３４）、次いで、Ｍｆｓｄ２ａ経路を介して脳によって取り込まれる（１５）。リパーゼ処理クリルオイル中のＬＰＣ－ＥＰＡおよびＬＰＣ－ＤＨＡの一部はＬＰＣとして循環へと吸収され、肝臓を迂回し、脳に直接輸送される可能性もあるが、これについての直接的な証拠はない。
【0315】
魚油およびクリルオイルのオメガ３脂肪酸の相対的なバイオアベイラビリティに関しては、いくつかの議論がある。多くの研究はクリルオイル脂肪酸のより高いバイオアベイラビリティを主張しているが（３５、３６）、他の研究は比較のために使用された方法論のため、この結論に疑問を投げかけている（３７）。本研究におけるＥＰＡおよびＤＨＡの空腹時血漿値に基づいて、未処理の魚油およびクリルオイルは同様のバイオアベイラビリティを示した。しかしながら、リパーゼによる油の前処理は両方の場合において血漿ＥＰＡおよびＤＨＡを増加させたが、クリルオイルは魚油と比較してリパーゼ処理後により大きな増加を示した。これらの結果はリパーゼによる部分的加水分解が脳オメガ３脂肪酸を増加させるだけでなく、魚油およびクリルオイルから全ての組織へのオメガ３脂肪酸の全体的なバイオアベイラビリティに有益である可能性があり、これは、膵臓機能が損なわれた患者において特に重要であり得ることを示唆する。
【0316】
我々の研究はまた、リパーゼ処理クリルオイルが脳におけるＢＤＮＦレベルを有意に増加させることを示し、このことは脳におけるオメガ３脂肪酸を増加させる機能的効果を示している。クリルオイルによるＢＤＮＦの増加は、脳ＤＨＡおよびＥＰＡの増加と一致し、他の研究（３８、３９）によって報告されたように、ＢＤＮＦの発現に対するこれらの脂肪酸の直接的な効果を示した。興味深いことに、魚油はまた、ＤＨＡの増加はなかったが、海馬のＢＤＮＦのいくらかの増加を示した。ＢＤＮＦは、神経発生、神経可塑性、および神経保護において重要な役割を果たす。ＢＤＮＦは加齢において減少することが知られており、低レベルのＢＤＮＦは、様々な精神疾患および神経変性疾患と関連している（４０）。したがって、リパーゼ処理クリルオイルによる脳ＢＤＮＦの増加は、これらの疾患の予防および治療のための安全かつ効果的な機能性食品アプローチを潜在的に提供し得る。
【0317】
使用した油の脂肪酸分析は、ＧＣ／ＭＳによって行った。示される値（総脂肪酸に対する％）は、最終油混合物（トウモロコシ油および魚油またはクリルオイルのいずれか）についてのものである。ＬＰＣの脂肪酸の分析は、クリルオイル混合物のクロロホルム抽出物のＴＬＣ分離後に行った。
【0318】
【表13】
【0319】
飼料調製に用いた油（トウモロコシ油充填材を含む）を抽出し、クリルオイルのためのリン脂質溶媒系（クロロホルム：メタノール：水、６５：２５：４、体積比）、または魚油のための中性脂質溶媒系（ヘキサン：ジエチルエーテル：酢酸、７０：３０：１、体積比）を使用してＴＬＣにより分離した。以下に示される脂質のスポットを掻き取り、それらの脂肪酸組成を、本文に記載されるようにＧＣ／ＭＳによって決定した。示された値は所与の脂質中に回収された総ＥＰＡ＋ＤＰＡに対する割合であり、１つの代表的な調製物からのものである。魚油サンプル中に存在する少量のＤＡＧ、およびクリルサンプル中に存在するＰＥは、ここでは示されていない。
【0320】
【表14】
【0321】
実施例５：網膜中のＤＨＡ含有量を増加させるためのクリルオイルＬＰＣ組成物の使用
〔材料および方法〕
動物および飼料処置：本明細書に記載される動物における全ての研究は、シカゴのイリノイ大学のInstitutional Animal Care and Use Committeeによって承認された。網膜サンプルは、以前に公開されたマウスおよびラットにおけるＤＨＡの脳内沈着に関する以前の研究から得られた［１６、１７、６７］。雄Sprague-Dawleyラット（８週齢）をHarlan研究所（Indianapolis, IN, USA）から購入した。雄Ｃ５７ ＢＬ／Ｊ６マウス（２～４ヶ月齢）をJackson Laboratories（Bar Harbor. Maine）から購入した。
〔材料および方法〕
動物および飼料処置：本明細書に記載される動物における全ての研究は、シカゴのイリノイ大学のInstitutional Animal Care and Use Committeeによって承認された。網膜サンプルは、以前に公開されたマウスおよびラットにおけるＤＨＡの脳内沈着に関する以前の研究から得られた［１６、１７、６７］。雄Sprague-Dawleyラット（８週齢）をHarlan研究所（Indianapolis, IN, USA）から購入した。雄Ｃ５７ ＢＬ／Ｊ６マウス（２～４ヶ月齢）をJackson Laboratories（Bar Harbor. Maine）から購入した。
【0322】
第１の研究では、雄Sprague-Dawleyラット（各群ｎ＝５、８週齢）に、ＴＡＧ－ＤＨＡ（ＤＨＡＳＣＯ藻類油、DSM Nutritional Products, Columbia, MD, USA）、合成ジ－ＤＨＡ ＰＣ（ホスファチジルコリン）、または合成ＬＰＣ－ＤＨＡ（ｓｎ－１アシル）の形態で１０ｍｇのＤＨＡ（４０ｍｇ ＤＨＡ／ｋｇ体重）を３０日間、毎日強制経口投与した［１７］。ＤＨＡは、ＴＡＧ－ＤＨＡの３つの位置の間で等しく分布した［１７］。本研究では、消化中にジ－ＤＨＡ ＰＣから生成されるＬＰＣ－ＤＨＡの予想量に匹敵する半分の用量のＬＰＣ－ＤＨＡ（２０ｍｇ ＤＨＡ／ｋｇ）を強制経口投与した別の群のラットも含めた。第２の研究では、４ヶ月齢の雄Ｃ５７ ＢＬ／Ｊ６マウス（各群ｎ＝８）に、遊離（エステル化されていない）ＤＨＡ、ｓｎ－１アシルＬＰＣ－ＤＨＡ、またはｓｎ－２アシルＬＰＣ－ＤＨＡの形態で４０ｍｇ ＤＨＡ／ｋｇ体重を、以前に記載されているように３０日間毎日、強制経口投与した［１６］。第３の研究では、雄Ｃ５７ ＢＬ／Ｊ６マウス（２ヶ月齢、各群ｎ＝５）に、天然またはリパーゼ処理の魚油またはクリルオイルを豊富にした飼料を３０日間与えた。オメガ－３ ＦＡの総量（エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）＋ＤＨＡ）は、全ての飼料において２．６４ｇ／ｋｇ飼料であった。未処理クリルオイルは、ＬＰＣとして総オメガ－３ ＦＡの１８％を含有し、一方、リパーゼ処理クリルオイルは、ＬＰＣとして総オメガ－３ ＦＡの８０％超を含有した。魚油飼料はＬＰＣ－ＥＰＡまたはＬＰＣ－ＤＨＡを含まなかった。動物を、麻酔下で氷冷リン酸緩衝生理食塩水を経心的に潅流し、網膜を採取し、分析まで－８０℃で凍結した。
【0323】
分析手順：網膜の総脂質をBligh and Dyerの手順［３０］によって抽出し、メタノール性ＨＣｌを用いて脂肪酸をメチル化した。脂肪酸分析は、以前に記載されているように［１６］、Supelco Omegawaxカラムを備えたShimadzu QP2010SEを使用して、ＧＣ／ＭＳ（ガスクロマトグラフィー／質量分析）によって実施した。メチルエステルの定量には、５０～４００ｍ／ｚの範囲の全イオン電流を用いた。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析）分析のために、脂質をIvanova et al.［２７］の手順により抽出した。Agilent 2600 UPLCシステム（Santa Clara, CA, USA）と結合したABSciex QTRAP質量分析計（Redwood City, CA, USA）で、多重反応モニタリング［３１］によってリン脂質の分子種の分析を行った。内部標準１７：０ＬＰＣ、ジ１７：０ＰＣ、およびジ１７：０ＰＥ（ホスファチジルエタノールアミン）を、対応する分子種の定量のために使用したが、異なる分子種のイオン強度の差についての補正因子を適用しなかった。
【0324】
統計および相関：処置群間の差異の有意性は、Holm-Sidak法で調整した対照サンプルと処置サンプルとの間のTukeyの事後多重比較補正または対応のないｔ検定を用いて、一元配置ＡＮＯＶＡによって決定した（Graphpad Prism 8.0, San Diego, CA, USA）。
【0325】
〔結果〕
ラットにおけるＰＣ、ＴＡＧ、およびＬＰＣの形態の飼料のＤＨＡの比較効果
我々はラット脳ＤＨＡが飼料のＬＰＣ－ＤＨＡおよびジ－ＤＨＡ ＰＣによって効率的に豊富になるが、ＴＡＧ－ＤＨＡによっては豊富にならないことを以前に実証した［１７］。ＤＨＡ取り込みのメカニズムは脳および網膜について類似しているようなので［６６］、我々は同じ動物群における網膜ＤＨＡの豊富さを決定した。正常ラットに、ＴＡＧ－ＤＨＡ、ジ－ＤＨＡ ＰＣまたはＬＰＣ－ＤＨＡ（ｓｎ－１アシル）の形態で１０ｍｇ ＤＨＡ／日（４０ｍｇ ＤＨＡ／ｋｇ）を３０日間強制経口投与し、網膜のＦＡ組成をＧＣ／ＭＳによって決定した。さらに、膵臓ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）による腸管内のジ－ＤＨＡ ＰＣの消化によるＬＰＣ－ＤＨＡの予想される生成と同等とするために、半分の用量のＬＰＣ－ＤＨＡ（２０ｍｇ／ｋｇ）を使用した。オメガ－３ ＦＡおよびアラキドン酸の濃度を図２３に示し、一方、総ＦＡ組成を表８に示す。図２４に示すように、網膜におけるＤＨＡの割合はジ－ＤＨＡ ＰＣ（＋４５％）およびＬＰＣ－ＤＨＡ（＋１０１％）によって有意に増加したが、ＴＡＧ－ＤＨＡ（＋１３％、有意ではない）によっては増加しなかった。ＬＰＣ－ＤＨＡの半分の用量（５ｍｇ／ラット）はジ－ＤＨＡ ＰＣの総用量（＋４５％）よりも効率的（＋７５％）であり、膵臓ＰＬＡ２（ホスホリパーゼＡ２）によるジ－ＤＨＡ ＰＣの加水分解が効率的でない可能性があることを示した。注目すべきことに、正常なラットの網膜ＤＨＡ含有量は非常に高い（総ＦＡに対する１６．８８％）が、ＬＰＣ－ＤＨＡの総用量を与えることによって２倍になり（総ＦＡに対する３３．９８％まで）、飼料によって達成され得る網膜ＤＨＡ含有量が広範囲であることが示された。ＤＨＡの増加は我々が脳において見出したように、アラキドン酸を犠牲にして主に生じた［１７］。しかしながら、ＤＨＡはまた、網膜における飽和ＦＡ（１６：０および１８：０）に置き換わった（表８）。いずれの処置によっても、網膜ＥＰＡ（２０：５（ｎ－３））またはＤＰＡ（２２：５（ｎ－３））のいずれにおいても変化はなかった。
ラットにおけるＰＣ、ＴＡＧ、およびＬＰＣの形態の飼料のＤＨＡの比較効果
我々はラット脳ＤＨＡが飼料のＬＰＣ－ＤＨＡおよびジ－ＤＨＡ ＰＣによって効率的に豊富になるが、ＴＡＧ－ＤＨＡによっては豊富にならないことを以前に実証した［１７］。ＤＨＡ取り込みのメカニズムは脳および網膜について類似しているようなので［６６］、我々は同じ動物群における網膜ＤＨＡの豊富さを決定した。正常ラットに、ＴＡＧ－ＤＨＡ、ジ－ＤＨＡ ＰＣまたはＬＰＣ－ＤＨＡ（ｓｎ－１アシル）の形態で１０ｍｇ ＤＨＡ／日（４０ｍｇ ＤＨＡ／ｋｇ）を３０日間強制経口投与し、網膜のＦＡ組成をＧＣ／ＭＳによって決定した。さらに、膵臓ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）による腸管内のジ－ＤＨＡ ＰＣの消化によるＬＰＣ－ＤＨＡの予想される生成と同等とするために、半分の用量のＬＰＣ－ＤＨＡ（２０ｍｇ／ｋｇ）を使用した。オメガ－３ ＦＡおよびアラキドン酸の濃度を図２３に示し、一方、総ＦＡ組成を表８に示す。図２４に示すように、網膜におけるＤＨＡの割合はジ－ＤＨＡ ＰＣ（＋４５％）およびＬＰＣ－ＤＨＡ（＋１０１％）によって有意に増加したが、ＴＡＧ－ＤＨＡ（＋１３％、有意ではない）によっては増加しなかった。ＬＰＣ－ＤＨＡの半分の用量（５ｍｇ／ラット）はジ－ＤＨＡ ＰＣの総用量（＋４５％）よりも効率的（＋７５％）であり、膵臓ＰＬＡ２（ホスホリパーゼＡ２）によるジ－ＤＨＡ ＰＣの加水分解が効率的でない可能性があることを示した。注目すべきことに、正常なラットの網膜ＤＨＡ含有量は非常に高い（総ＦＡに対する１６．８８％）が、ＬＰＣ－ＤＨＡの総用量を与えることによって２倍になり（総ＦＡに対する３３．９８％まで）、飼料によって達成され得る網膜ＤＨＡ含有量が広範囲であることが示された。ＤＨＡの増加は我々が脳において見出したように、アラキドン酸を犠牲にして主に生じた［１７］。しかしながら、ＤＨＡはまた、網膜における飽和ＦＡ（１６：０および１８：０）に置き換わった（表８）。いずれの処置によっても、網膜ＥＰＡ（２０：５（ｎ－３））またはＤＰＡ（２２：５（ｎ－３））のいずれにおいても変化はなかった。
【0326】
マウスにおける遊離ＤＨＡおよびＬＰＣ－ＤＨＡの異性体の比較効果
以前の研究は、脳によるＤＨＡの取り込みのためには、ＤＨＡがＬＰＣのｓｎ－２位置になければならず、それはインビボでのリン脂質の自然な位置であるためであることを示唆した［６８、６９］。しかしながら、我々の最近の研究は、ｓｎ－１ ＤＨＡ ＬＰＣおよびｓｎ－２ ＤＨＡ ＬＰＣが、マウスの脳ＤＨＡを豊富にすることおよび脳機能を改善することにおいて、等しく有効であることを示した［１６］。我々は遊離（エステル化されていない）ＤＨＡ、ｓｎ－１ ＤＨＡ ＬＰＣ、およびｓｎ－２ ＤＨＡ ＬＰＣを与えられたマウスにおける網膜のＦＡ組成を分析し、血液網膜関門を通る輸送のためのＬＰＣのｓｎ－２アシル異性体の優先性があるか否かを決定した。図２５および表９に示されるように、遊離ＤＨＡは、ラットにおけるＴＡＧ－ＤＨＡの効果と同様に、網膜ＤＨＡに対する効果を有さなかった。しかしながら、ＬＰＣ－ＤＨＡの両方の異性体は網膜ＤＨＡを８０％増加させ、このことは、網膜によるＤＨＡの取り込みが脳の取り込みと同様であり、他のものによって示されるようにＭｆｓｄ２ａトランスポーターと関係していることを示す［６６］。さらに、血液網膜関門のトランスポーターは、我々が脳について見出したように［１６］、ＬＰＣ－ＤＨＡの２つの異性体を区別しなかった。いずれのＤＨＡ処置によっても、ＥＰＡ（２０：５、ｎ－３）またはＤＰＡ（２２：５、ｎ－３）の含有量のいずれにも効果はなかった。ＬＰＣ－ＤＨＡの２つの異性体によるアラキドナートの有意な減少があったが、遊離ＤＨＡによる有意な減少はなかった。さらに、ＬＰＣ－ＤＨＡによる飽和脂肪酸（１６：０および１８：０）ならびに１８：１の有意な減少があったが、遊離ＤＨＡによる有意な減少はなかった。これらの結果はラットの結果と同様に、マウス網膜ＤＨＡの増加がアラキドナートだけでなく飽和ＦＡおよび１８：１の置換によって起こったことを示唆する。
以前の研究は、脳によるＤＨＡの取り込みのためには、ＤＨＡがＬＰＣのｓｎ－２位置になければならず、それはインビボでのリン脂質の自然な位置であるためであることを示唆した［６８、６９］。しかしながら、我々の最近の研究は、ｓｎ－１ ＤＨＡ ＬＰＣおよびｓｎ－２ ＤＨＡ ＬＰＣが、マウスの脳ＤＨＡを豊富にすることおよび脳機能を改善することにおいて、等しく有効であることを示した［１６］。我々は遊離（エステル化されていない）ＤＨＡ、ｓｎ－１ ＤＨＡ ＬＰＣ、およびｓｎ－２ ＤＨＡ ＬＰＣを与えられたマウスにおける網膜のＦＡ組成を分析し、血液網膜関門を通る輸送のためのＬＰＣのｓｎ－２アシル異性体の優先性があるか否かを決定した。図２５および表９に示されるように、遊離ＤＨＡは、ラットにおけるＴＡＧ－ＤＨＡの効果と同様に、網膜ＤＨＡに対する効果を有さなかった。しかしながら、ＬＰＣ－ＤＨＡの両方の異性体は網膜ＤＨＡを８０％増加させ、このことは、網膜によるＤＨＡの取り込みが脳の取り込みと同様であり、他のものによって示されるようにＭｆｓｄ２ａトランスポーターと関係していることを示す［６６］。さらに、血液網膜関門のトランスポーターは、我々が脳について見出したように［１６］、ＬＰＣ－ＤＨＡの２つの異性体を区別しなかった。いずれのＤＨＡ処置によっても、ＥＰＡ（２０：５、ｎ－３）またはＤＰＡ（２２：５、ｎ－３）の含有量のいずれにも効果はなかった。ＬＰＣ－ＤＨＡの２つの異性体によるアラキドナートの有意な減少があったが、遊離ＤＨＡによる有意な減少はなかった。さらに、ＬＰＣ－ＤＨＡによる飽和脂肪酸（１６：０および１８：０）ならびに１８：１の有意な減少があったが、遊離ＤＨＡによる有意な減少はなかった。これらの結果はラットの結果と同様に、マウス網膜ＤＨＡの増加がアラキドナートだけでなく飽和ＦＡおよび１８：１の置換によって起こったことを示唆する。
【0327】
網膜における２つのＬＰＣ異性体の代謝運命が互いに異なるか否かを決定するために、ＤＨＡを含むＰＣおよびＰＥの分子種をＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって分析した。図２６に示すように、ＬＰＣ－ＤＨＡの両異性体は、２０：４～２２：６のＰＣおよび２０：４～２２：６のＰＥを除いて、ＤＨＡを含む主要なＰＣおよびＰＥの大部分を増加させ、おそらくこれはＬＰＣ処置による網膜の２０：４の減少のためである。ＰＣまたはＰＥの分子種組成に対するＬＰＣの２つの異性体の効果の間に有意差はなかった。網膜の総ＤＨＡ含有量は遊離ＤＨＡによって有意に増加しなかったものの（図２７）、ＤＨＡを含有するＰＣおよびＰＥの少数の個々の種が増加した。しかし、この増加はＬＰＣ－ＤＨＡと比較してはるかに低いレベルであった。網膜ＬＰＣ－ＤＨＡは、飼料のＬＰＣ－ＤＨＡによる処置後に増加したが、ＬＰＥ－ＤＨＡでは増加しなかった。ＰＥ種においてＤＨＡがより優勢である脳［１６］とは異なり、網膜はＰＣ種においてより多くのＤＨＡを含有していた。ＰＥ：ホスファチジルエタノールアミン。
【0328】
マウスの網膜オメガ－３ ＦＡへの魚油およびクリルオイルの効果
魚油を用いた以前の研究は、成体動物において網膜ＤＨＡまたはＥＰＡが有意に豊富になることを示さなかったが［４９］、我々は、ＬＰＣ－ＥＰＡおよびＬＰＣ－ＤＨＡを生成するリパーゼによるクリルオイルの前処理が、成体マウスの脳におけるＤＨＡおよびＥＰＡの両方を有意に豊富にすることを可能にすることを最近実証した［６７］。一方、遊離のＥＰＡおよびＤＨＡまたはモノアシルグリセロールＥＰＡおよびＤＨＡを生成する魚油の同様の処理は、脳オメガ－３ ＦＡに対して何ら効果を有さなかった。リパーゼ処理クリルオイルが網膜ＤＨＡおよびＥＰＡを豊富にするためにも使用できるか否かを決定するために、リパーゼで処理された、または処理されていない、魚油およびクリルオイルで処理されたマウスにおける網膜のＦＡ組成を分析した。
魚油を用いた以前の研究は、成体動物において網膜ＤＨＡまたはＥＰＡが有意に豊富になることを示さなかったが［４９］、我々は、ＬＰＣ－ＥＰＡおよびＬＰＣ－ＤＨＡを生成するリパーゼによるクリルオイルの前処理が、成体マウスの脳におけるＤＨＡおよびＥＰＡの両方を有意に豊富にすることを可能にすることを最近実証した［６７］。一方、遊離のＥＰＡおよびＤＨＡまたはモノアシルグリセロールＥＰＡおよびＤＨＡを生成する魚油の同様の処理は、脳オメガ－３ ＦＡに対して何ら効果を有さなかった。リパーゼ処理クリルオイルが網膜ＤＨＡおよびＥＰＡを豊富にするためにも使用できるか否かを決定するために、リパーゼで処理された、または処理されていない、魚油およびクリルオイルで処理されたマウスにおける網膜のＦＡ組成を分析した。
【0329】
図２７および表１０に示されるように、網膜ＤＨＡは、未処理クリルオイルを与えた後に対照値より３３％増加しており、これはおそらくクリルオイル調製物中に少量のＬＰＣ－ＤＨＡが存在するためである［６７］。しかし、リパーゼ処理クリルオイルを与えると、網膜ＤＨＡが７６％増加し、リパーゼ処理によってＤＨＡを豊富にすることは２．３倍の刺激を示した。さらに、リパーゼ処理クリルオイルによる網膜ＥＰＡにおいて１００倍の増加があったが、未処理クリルオイルまたは魚油による増加はなかった。このことは、ＬＰＣ－ＥＰＡの給餌が脳および網膜におけるＥＰＡレベルを増加させるという、我々の以前の観察を支持しており、オメガ－３ ＦＡに富む飼料によってはこれらの組織におけるＥＰＡは豊富にならないという以前の報告に反していた［１８、１９、２０］。純粋なＬＰＣ－ＤＨＡの結果とは対照的に、我々は、リパーゼ処理クリルオイルで処置した後、ＤＨＡによる網膜アラキドナートの有意な変位を見出さなかった。代わりに、ＤＨＡおよびＥＰＡは、飽和ＦＡおよびオレイン酸（１８：１、ｎ－９）に置き換わるようであった。また、未処理クリルオイルを与えた動物では、飽和ＦＡおよび１８：１がいくらか減少した。しかし、これらの減少は統計的有意性に達しなかった（表１０）。
【0330】
〔考察〕
網膜ＤＨＡは、年齢とともに［５４］、ならびに糖尿病において［５７、５８、５９］減少することが知られている。さらに、ＤＨＡレベルの低下はいくつかの網膜疾患と関連しており、最も顕著なものは糖尿病性網膜症（ＤＲ）である［５４、５６、４４］。ＤＲは世界中でほぼ１億人が罹患しており、成人集団における失明の最も一般的な原因である［７０］。高血糖によって誘導される酸化ストレスおよび慢性炎症は、ＤＲの主要な根本的原因であると考えられている［７１］。網膜に独特に濃縮されるＤＨＡは、抗酸化特性および抗炎症特性の両方を有することが示されている［５４、７２、７３］。ＤＲに加えて、ＤＨＡの欠損は、網膜色素変性症［７４］、緑内障［７５、７６］、加齢黄斑変性［５５］、ドライアイ疾患［７７］、およびアルツハイマー病関連失明［４１］を含む、眼の他の疾患にも関与している。これらの疾患の全ての共通要素は慢性炎症である。したがって、網膜ＤＨＡレベルが、成体哺乳動物における飼料を通して増加され得、それによってこれらの疾患を予防または治療し得るか否かを調査することが重要である。ここに提示された結果は、正常な網膜におけるＤＨＡの非常に高い初期レベルにもかかわらず、それは飼料のＬＰＣ－ＤＨＡを通して１００％までさらに増加され得るが、飼料の遊離ＤＨＡまたはＴＡＧ－ＤＨＡによっては増加され得ないことを示す。我々の知る限り、これは、正常な成体動物において、飼料補給により網膜ＤＨＡを最も豊富にすることが達成されている。以前の研究では、非常に高濃度の飼料のオメガ－３ ＦＡでの処置後でさえ、網膜オメガ－３レベルの増加は見られなかったか、またはわずかであった。例えば、Prokopiou et al.［７８］は、高齢（２歳）マウスに２００ｍｇ オメガ－３ ＦＡ／日を魚油の形態で６０日間与え、実際に網膜ＤＨＡの減少（－２１％）を見出したが、副成分である網膜ＥＰＡは４２％増加した。同様に、ＡＢＣＡ４－／－マウス（スタルガルト病）に２０６ｍｇ／日のオメガ－３ ＦＡ（１７２ｍｇ ＥＰＡ＋３４ｍｇ ＤＨＡ）を３ヶ月間強制経口投与したところ、網膜ＤＨＡに変化は認められなかったが、網膜ＥＰＡの６７％増加（全体の０．９３％から１．５６％へ）が認められた［７９］。Schnebelen et al.の研究［８０］は、２０％のオメガ－３ ＦＡを含む５％脂肪食を３週齢のラットに３ヶ月間与えたところ、網膜ＤＨＡが８％増加したに過ぎないことを示した。これらの研究とは対照的に、内因性オメガ－６ ＦＡをオメガ－３ ＦＡに変換するｆａｔ－１遺伝子を保有するトランスジェニックマウスを用いたSuh et al.［８２］およびTanito et al.［８１］は、野生型対照と比較して網膜ＤＨＡがほぼ倍増したことを報告した。しかし、これらの研究者らによって報告されているように、飼料よりも遺伝子操作による網膜ＤＨＡの増加は、異常な網膜電図および酸化ストレスに対する感受性を引き起こすようである。一方、Connor et al.［８３］は、新生児マウスにおける網膜ＤＨＡ含有量を飼料によって増加させることは病理学的新生血管形成を阻害することによって未熟児網膜症を予防することを報告した。さらに、Sapieha et al.［５６］は高濃度のオメガ－３ ＦＡ（飼料の２％）を含む飼料の補給が２型糖尿病のマウスモデルにおいて網膜機能を保存し、耐糖能を増強することを示したが、網膜ＤＨＡレベルの変化は報告されていなかった。糖尿病性網膜症に対する同様の利益が、ニシン油として５％カロリーを与えたTikhonenko et al.［４４］によってラットにおいて示された。しかしながら、これらの有益な効果を達成するために必要とされるオメガ－３ ＦＡの用量は、臨床設定では実用的ではない。なぜなら、ヒトでの等価用量は、アロメトリック計算［８４］を用いて、Sapieha et al.の研究に基づいて、７０ｋｇのヒトでは約１４ｇのオメガ－３ ＦＡ／日であり、またはTikhonenko et al.の研究によれば約１６ｍＬの魚油／日であるからである。対照的に、網膜ＤＨＡをほぼ２倍にするのに必要なＬＰＣ－ＤＨＡの用量は、上記の研究よりも約５０倍低く、したがって臨床条件に容易に適用可能である。
網膜ＤＨＡは、年齢とともに［５４］、ならびに糖尿病において［５７、５８、５９］減少することが知られている。さらに、ＤＨＡレベルの低下はいくつかの網膜疾患と関連しており、最も顕著なものは糖尿病性網膜症（ＤＲ）である［５４、５６、４４］。ＤＲは世界中でほぼ１億人が罹患しており、成人集団における失明の最も一般的な原因である［７０］。高血糖によって誘導される酸化ストレスおよび慢性炎症は、ＤＲの主要な根本的原因であると考えられている［７１］。網膜に独特に濃縮されるＤＨＡは、抗酸化特性および抗炎症特性の両方を有することが示されている［５４、７２、７３］。ＤＲに加えて、ＤＨＡの欠損は、網膜色素変性症［７４］、緑内障［７５、７６］、加齢黄斑変性［５５］、ドライアイ疾患［７７］、およびアルツハイマー病関連失明［４１］を含む、眼の他の疾患にも関与している。これらの疾患の全ての共通要素は慢性炎症である。したがって、網膜ＤＨＡレベルが、成体哺乳動物における飼料を通して増加され得、それによってこれらの疾患を予防または治療し得るか否かを調査することが重要である。ここに提示された結果は、正常な網膜におけるＤＨＡの非常に高い初期レベルにもかかわらず、それは飼料のＬＰＣ－ＤＨＡを通して１００％までさらに増加され得るが、飼料の遊離ＤＨＡまたはＴＡＧ－ＤＨＡによっては増加され得ないことを示す。我々の知る限り、これは、正常な成体動物において、飼料補給により網膜ＤＨＡを最も豊富にすることが達成されている。以前の研究では、非常に高濃度の飼料のオメガ－３ ＦＡでの処置後でさえ、網膜オメガ－３レベルの増加は見られなかったか、またはわずかであった。例えば、Prokopiou et al.［７８］は、高齢（２歳）マウスに２００ｍｇ オメガ－３ ＦＡ／日を魚油の形態で６０日間与え、実際に網膜ＤＨＡの減少（－２１％）を見出したが、副成分である網膜ＥＰＡは４２％増加した。同様に、ＡＢＣＡ４－／－マウス（スタルガルト病）に２０６ｍｇ／日のオメガ－３ ＦＡ（１７２ｍｇ ＥＰＡ＋３４ｍｇ ＤＨＡ）を３ヶ月間強制経口投与したところ、網膜ＤＨＡに変化は認められなかったが、網膜ＥＰＡの６７％増加（全体の０．９３％から１．５６％へ）が認められた［７９］。Schnebelen et al.の研究［８０］は、２０％のオメガ－３ ＦＡを含む５％脂肪食を３週齢のラットに３ヶ月間与えたところ、網膜ＤＨＡが８％増加したに過ぎないことを示した。これらの研究とは対照的に、内因性オメガ－６ ＦＡをオメガ－３ ＦＡに変換するｆａｔ－１遺伝子を保有するトランスジェニックマウスを用いたSuh et al.［８２］およびTanito et al.［８１］は、野生型対照と比較して網膜ＤＨＡがほぼ倍増したことを報告した。しかし、これらの研究者らによって報告されているように、飼料よりも遺伝子操作による網膜ＤＨＡの増加は、異常な網膜電図および酸化ストレスに対する感受性を引き起こすようである。一方、Connor et al.［８３］は、新生児マウスにおける網膜ＤＨＡ含有量を飼料によって増加させることは病理学的新生血管形成を阻害することによって未熟児網膜症を予防することを報告した。さらに、Sapieha et al.［５６］は高濃度のオメガ－３ ＦＡ（飼料の２％）を含む飼料の補給が２型糖尿病のマウスモデルにおいて網膜機能を保存し、耐糖能を増強することを示したが、網膜ＤＨＡレベルの変化は報告されていなかった。糖尿病性網膜症に対する同様の利益が、ニシン油として５％カロリーを与えたTikhonenko et al.［４４］によってラットにおいて示された。しかしながら、これらの有益な効果を達成するために必要とされるオメガ－３ ＦＡの用量は、臨床設定では実用的ではない。なぜなら、ヒトでの等価用量は、アロメトリック計算［８４］を用いて、Sapieha et al.の研究に基づいて、７０ｋｇのヒトでは約１４ｇのオメガ－３ ＦＡ／日であり、またはTikhonenko et al.の研究によれば約１６ｍＬの魚油／日であるからである。対照的に、網膜ＤＨＡをほぼ２倍にするのに必要なＬＰＣ－ＤＨＡの用量は、上記の研究よりも約５０倍低く、したがって臨床条件に容易に適用可能である。
【0331】
主にＭｆｓｄ２ａ経路を介してＤＨＡを獲得する脳とは異なり、網膜は、複数の経路を介してＤＨＡを獲得するようである。これは、Ｍｆｓ２ａの欠損が網膜ＤＨＡの４５％の減少、およびＶＬＣＦＡの５７％の減少をもたらすにすぎないためである［８５］。したがって、Bazan［４１］による研究は網膜ＤＨＡレベルを維持するためのアディポネクチン受容体の重要性を示したが、ＦＡ結合タンパク質およびリポタンパク質受容体の役割は他の研究によって提案されている［５４、６５］。これらの経路は、飼料の遊離ＤＨＡおよびＴＡＧによる網膜ＤＨＡのわずかな増加を説明し得る。網膜はまた、網膜色素上皮細胞の食作用によってＤＨＡを保持する効率的なリサイクル機構を有し［５２、４１］、おそらく、脳機能［１５］と比較して、網膜機能に対する先天性Ｍｆｓｄ２ａ欠損のより軽度の効果を説明する［６６、８５］。脳と網膜との間の別の違いは、脳内でＤＨＡは大部分がアラキドン酸に置き換わったのに対し［１６、１７、６７］、網膜内でＤＨＡはアラキドン酸よりも多くの飽和脂肪酸およびオレイン酸に置き換わったことであった。アラキドン酸の減少は炎症誘発性エイコサノイドの生成におけるその役割のために有益であると考えられるが、網膜中の飽和脂肪酸およびオレイン酸を減少させる生理学的効果は明らかではない。
【0332】
ＤＨＡとは対照的に、網膜ＥＰＡ含有量は非常に低く、ＥＰＡが豊富なサプリメントを与えた後でさえ実質的に増加しないが、ＤＨＡレベルはこれらの処置によって増加する［８０、８３］。したがって、ＥＰＡは、脳および網膜に入らず、ＤＨＡに急速に変換されず、または正味の蓄積なしに酸化されないと仮定されている［２５、８６］。本研究では純粋なＬＰＣ－ＤＨＡを与えた後に網膜ＥＰＡレベルは増加しなかったが、ＬＰＣ－ＥＰＡおよびＬＰＣ－ＤＨＡの両方を含むリパーゼ処理クリルオイルを与えた後に顕著な増加が生じた。したがって、我々は、以前の研究が脳または網膜ＥＰＡの増加を示すことができなかったのはインビボでＬＰＣ－ＥＰＡを生成するサプリメントができなかったためであることを示唆する。我々は、脳ＥＰＡおよび網膜ＥＰＡが同様に豊富になることが、純粋なＬＰＣ－ＥＰＡを与えた後に起こったことを以前に示した［２６］。ＤＨＡに加えて網膜ＥＰＡを増加させることは、そのＤＨＡ含有量のみを増加させることよりも有益である可能性があり、これはＥＰＡが、網膜において独特の機能的重要性を有する［８９］ＶＬＣＦＡの合成のための好ましい基質であるためである［８７、８８］。ＥＰＡはまた、アラキドナートに対してＤＨＡよりも効果的に競合し、それによって炎症誘発性プロスタグランジンの合成を阻害することが知られている。
【0333】
オメガ－３ ＦＡに関する研究の大部分は、組織のＥＰＡおよびＤＨＡのレベルのみを増加させることに焦点を当てている。しかし、飼料のＬＰＣ－ＥＰＡ／ＤＨＡの補助的な利点は、魚油またはエチルエステルと比較して、Ｍｆｓｄ２ａ経路を介して網膜および脳により取り込まれるＤＨＡまたはＥＰＡの各分子について、コリンの分子が同時に取り込まれることである。コリンはアセチルコリンならびに膜リン脂質の必須成分であり、視覚において重要な役割を果たす［９０］。実際、コリンリン脂質の前駆体であるシチコリン（ＣＤＰ－コリン）は、網膜症および緑内障の治療に臨床的に使用される［９０］。したがって、ＬＰＣ－ＥＰＡ／ＤＨＡは、単一の有効な調製物において、オメガ－３ ＦＡおよびシチコリンを組み合わせた利点を提供することができた。
【0334】
【表15】
【0335】
【0336】
【0337】
【0338】
【0339】
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【表16】
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上述の明細書に記載されている刊行物および特許は、全て参照として本明細書に組み込まれる。ここに記載した本発明の方法およびシステムの種々の改変および変更は、本発明の範囲および精神から垂離することなく当業者にとって自明のことであろう。本発明は特定の好ましい実施形態との関連において説明されているが、請求項に記載した本発明はそのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないと理解されるべきである。実際、関連分野の当業者に明らかである本発明を実施するために記載された態様の様々な改変は、以下の特許請求の範囲内であることが意図される。
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上述の明細書に記載されている刊行物および特許は、全て参照として本明細書に組み込まれる。ここに記載した本発明の方法およびシステムの種々の改変および変更は、本発明の範囲および精神から垂離することなく当業者にとって自明のことであろう。本発明は特定の好ましい実施形態との関連において説明されているが、請求項に記載した本発明はそのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないと理解されるべきである。実際、関連分野の当業者に明らかである本発明を実施するために記載された態様の様々な改変は、以下の特許請求の範囲内であることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【0351】
【図11】図１１は、クリルオイルがＰＣのｓｎ－２位にＥＰＡおよびＤＨＡを含有するため、膵臓ホスホリパーゼＡ２による分解の間に遊離脂肪酸としてＥＰＡおよびＤＨＡが放出されることを示す。放出されたＥＰＡおよびＤＨＡはその後、ＴＡＧとして吸収され、これは脳への輸送に必要なＬＰＣ－ＥＰＡまたはＬＰＣ－ＤＨＡのいずれも生成しない。したがって、クリルオイルを与えることは、脳内のＥＰＡおよびＤＨＡが有意に豊富になることをもたらさない。しかしながら、クリルオイルをｓｎ－１エステル結合に特異的なリパーゼを用いて前処理した場合、ＬＰＣ－ＥＰＡおよびＬＰＣ－ＤＨＡが生成される。この改良されたクリルオイルを与えることは、リン脂質形態のＥＰＡおよびＤＨＡの吸収をもたらし、脳において、それらが豊富になることをもたらすはずである。一方、魚油のリパーゼ処理は、ＬＰＣ－ＥＰＡまたはＬＰＣ－ＤＨＡのいずれも生成せず、したがって、ＥＰＡおよびＤＨＡが脳で豊富になることをもたらさない（図示せず）。
【図12】図１２は、長鎖ＰＵＦＡの血漿レベルに対する食餌処置の影響を示す。空腹時血漿の総脂質を、本文に記載されるように抽出し、トランスメチル化し、ＧＣ／ＭＳによって脂肪酸組成について分析した。示される値は、各群の５匹の動物の平均値±標準偏差である。統計的有意性は、事後Tukey多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡによって決定した（GraphPad Prism 8.0ソフトウェア）。対照群と比較して、＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図13】図１３は、血漿ＬＰＣ種に対する、天然のクリルオイルおよび魚油、ならびにリパーゼ処理クリルオイルおよび魚油を与えることの影響を示す。血漿サンプルを、本明細書に記載されるように酸性化メタノールを用いて抽出し、ＨＩＬＩＣカラムを用いてＬＣ／ＭＳにより分析し、濃度、ならびオメガ３ＬＰＣ種の異性体の組成を分析した。ＬＰＣ濃度は、内部標準として１７：０ ＬＰＣを用いて決定した。１７：０ＬＰＣおよび２２：６ＬＰＣの標準の強度値は使用される条件下でこの量によって異なるため、補正係数（×０．２３３）を適用して値を計算した。事後Tukey多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡによって決定されるように、同一でない上付き文字を有するバーは、互いに有意に異なる（総ＬＰＣ）。
【図14】図１４は、前頭前皮質のＰＵＦＡ組成物を示す。ＧＣ／ＭＳによって総脂肪酸組成を分析し、２０：４（ＡＲＡ）、２０：５（ＥＰＡ）、２２：５（ＤＰＡ）、および２２：６（ＤＨＡ）のみの割合組成を示す。示される値は、各群の５匹の動物の平均値±標準偏差である。統計的有意性は一元配置ＡＮＯＶＡによって決定され、記号は上記図１２の下と同じである。
【図15】図１５は、海馬のＰＵＦＡ組成物を示す。本文に記載されるように、脂肪酸組成を分析した。示される値は、各群の５匹の動物の平均値±標準偏差である。統計的有意性に関する記号は、上記図１２の下と同じである。
【図16】図１６は、線条体のＰＵＦＡ組成物を示す。本文に記載されるように、ＰＵＦＡ組成物を分析した。示される値は、各群の５匹のマウスの平均値±標準偏差である。対照飼料と実験飼料との間の統計的有意性は、事後Tukey多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡによって決定した。有意性に関する記号は、上記図１２の下と同じである。
【図17】図１７は、小脳におけるＰＵＡ組成物を示す。本文に記載されるように、ＧＣ／ＭＳによって脂肪酸組成を分析した。示される値は、各群の６匹のマウスの平均値±標準偏差である。対照飼料と実験飼料との間の統計的有意性は、事後Tukey多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡによって決定した。有意性に関する記号は、上記図１２の下と同じである。
【図18】図１８は、前頭前皮質および海馬におけるＢＤＮＦレベルに対する食餌処置の効果を示す。ＢＤＮＦレベルの免疫測定は、内部標準としてβ－アクチンを用いて、本文に記載されるように行った。示されるＢＤＮＦ／β－アクチン比は、各群の３匹のマウスの平均値±標準偏差である。挿入図は、代表的な免疫ブロットを示す。対照飼料と実験飼料との間の統計的有意性は、事後Tukey多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡによって決定した。＊＊＊ｐ＜０．００１ＶＳ対照；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１ＶＳ対照。
【図19】図１９は、性腺周囲脂肪組織のＰＵＦＡ組成物を示す。示される百分率値は、各群について５匹のマウスの平均値±標準偏差である。統計的有意性の値（一元配置ＡＮＯＶＡ）は、対照飼料と実験飼料との間のものであり、記号は上記図１２の下と同じである。
【図20】図２０は、鼠径部脂肪組織のＰＵＦＡ組成物を示す。示される百分率値は、各群について５匹のマウスの平均値±標準偏差である。統計的有意性の値（一元配置ＡＮＯＶＡ）は、対照飼料と実験飼料との間のものであり、記号は上記図１２の下と同じである。
【図21】図２１は、肝臓の脂肪酸組成に対する飼料の脂肪の影響を示す。ＧＣ／ＭＳによる総脂質の脂肪酸分析は、本文に記載されている通りであった。示される値は、各群の５匹のマウスの平均値±標準偏差である。対照飼料と実験飼料との間の統計的有意性は、事後Tukey多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡによって決定した。有意性に関する記号は、上記図１２の下と同じである。
【図22】図２２は、心臓の脂肪酸組成に対する飼料の脂肪の影響を示す。心臓の総脂質を抽出し、本文に記載されるようにＧＣ／ＭＳによって脂肪酸組成について分析した。示される値は、各群の５匹のマウスの平均値±標準偏差である。対照飼料と実験飼料との間の統計的有意性は、事後Tukey多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡによって決定した。有意性に関する記号は、上記図１２の下と同じである。
【図23】図２３は、ｓｎ－１脂肪酸を特異的に加水分解するリパーゼを用いて処理したＰＣのｓｎ－２位においてＥＰＡおよびＤＨＡを含むクリルオイルが、ＬＰＣ－ＥＰＡおよびＬＰＣ－ＤＨＡを生成することを示す。この調製物を正常マウスに与えると、網膜ＥＰＡおよびＤＨＡが有意に増加した。トリグリセリド形態のみのＥＰＡおよびＤＨＡを含有する魚油の同様の処置は、網膜ＥＰＡまたはＤＨＡのいずれにも影響を及ぼさなかった。
【図24】図２４は、ＰＣ、ＴＡＧ、またはＬＰＣ形態で与えられた、飼料のＤＨＡのラットの網膜の脂質への取り込みを示す。正常な雄のＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット（８週齢；各群ｎ＝５）に、ＴＡＧ－ＤＨＡ、ジ－ＤＨＡ ＰＣ、またはＬＰＣ－ＤＨＡの形態で２５０μＬのトウモロコシ油中に含まれる１０ｍｇＤＨＡを３０日間毎日強制経口投与した。加えて、半分の用量のＬＰＣ－ＤＨＡ（５ｍｇのＤＨＡ）を、消化中にジ－ＤＨＡ ＰＣによって生成されると予想されるＬＰＣ－ＤＨＡの量に匹敵するように使用した。ＤＨＡを含有しないが、固形飼料１ｇ当たり１７．４ｍｇのα－リノレン酸（１８：３、ｎ－３）を含有する、通常のげっ歯類固形飼料を、全ての動物に与えた。本文に記載されるように、網膜ＦＡをＧＣ／ＭＳによって分析した。２０：４（ｎ－６）、２０：５（ｎ－３）、２２：５（ｎ－３）、および２２：６（ｎ－３）の割合組成をここに示す。総ＦＡ組成物を表１に示す。処置群間の差異の有意性は、事後Tukey多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡによって決定した（GraphPad Prism 8.0ソフトウェア）。共通の文字が上に付いていないバーは、互いに有意に異なる（ｐ＜０．０５）。ＴＧ：トリアシルグリセロール；ＰＣ：ホスファチジルコリン；ＬＰＣ：リゾホスファチジルコリン；ＦＡ：脂肪酸；ＧＣ／ＭＳ：ガスクロマトグラフィー／質量分析。
【図25】図２５は、マウスの網膜ＦＡに対する、飼料の遊離（エステル化されていない）ＤＨＡ、ｓｎ－１ ＤＨＡ－ＬＰＣ、およびｓｎ－２ ＤＨＡ ＬＰＣの影響を示す。正常な雄マウス（Ｃ５７ ＢＬ／Ｊ６、１６週齢）に、８０μＬのトウモロコシ油中に遊離ＤＨＡ、ｓｎ－１ ＤＨＡ ＬＰＣ、またはｓｎ－２ ＤＨＡ ＬＰＣ形態で含まれる１ｍｇのＤＨＡを３０日間毎日強制経口投与した。網膜のＦＡ組成物をＧＣ／ＭＳにより分析した。アラキドン酸およびオメガ－３ ＦＡに関する値のみをここに示す（平均値±標準偏差、８匹の動物／群）。総ＦＡ組成を表２に示す。事後Tukey補正を用いた一元配置ＡＮＯＶＡにより、共通の文字が上に付いていないバーは互いに有意に異なる（ｐ＜０．０５）。ＳＤ：標準偏差；ｓｎ－１およびｓｎ－２：立体特異的番号付けそれぞれ１および２；ＬＰＣ：リゾホスファチジルコリン；ＤＨＡ：ドコサヘキサエン酸。
【図26A-B】図２６は、ＤＨＡを含有するマウスの網膜のリン脂質の分子種を示す。図２に記載されているように、遊離（エステル化されていない）ＤＨＡ、またはＬＰＣ－ＤＨＡの２つの異性体を、動物に強制経口投与した。１７：０ ＬＰＣ、１７：０－１７：０ ＰＣ、および１７：０－１７：０ ＰＥを内部標準として用いて、本文に記載されているようにＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる多重反応モニタリングを使用して、ＤＨＡを含有するＰＣ（Ａ）およびＰＥ（Ｂ）の分子種を分析した。一元配置ＡＮＯＶＡ、および事後Tukey多重比較検定により、共通の文字が上に付いていないバーは互いに有意に異なる（平均値±標準偏差、６匹の動物／群）。ＰＥ：ホスファチジルエタノールアミン；ＰＣ：ホスファチジルコリン；ｓｎ－１およびｓｎ－２：立体特異的番号付けそれぞれ１および２；ＤＨＡ：ドコサヘキサエン酸；ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ：液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析；ＳＤ：標準偏差；ＬＰＣ：リゾホスファチジルコリン；ＤＨＡ：ドコサヘキサエン酸。
【図27】図２７は、マウスの網膜ＦＡに対する、未処理またはリパーゼ処理魚油およびクリルオイルを与えることによる影響を示す。７％の総脂肪を含有する食餌（ＡＩＮ９３Ｇ）を正常な雄のマウス（８週齢）に与え、ムコールのリパーゼを用いて処理した（または未処理の）魚油またはクリルオイルの形態の０．２６４％ＥＰＡ＋ＤＨＡを補った。マウスに食餌を３０日間自由摂食させ、網膜ＦＡをＧＣ／ＭＳによって分析した。２０：４（ｎ－６）、２０：５（ｎ－３）、２２：５（ｎ－３）および２２：６（ｎ－３）の割合組成をここに示す（平均値±標準偏差、５匹のマウス／群）。総ＦＡ組成物を表３に示す。一元配置ＡＮＯＶＡ、および事後Tukey多重比較検定により、共通の文字が上に付いていないバーは互いに有意に異なる。ＫＯ：クリルオイル；ＦＯ：魚油；ＦＡ：脂肪酸；ＥＰＡ：エイコサペンタエン酸；ＧＣ／ＭＳ：ガスクロマトグラフィー／質量分析；ＤＨＡ：ドコサヘキサエン酸。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26A-B】
【図27】
【国際調査報告】