特表2023-521685ＤＮＡを回復する及びＤＮＡ損傷を防止する組成物及び方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-05-25
(54)【発明の名称】ＤＮＡを回復する及びＤＮＡ損傷を防止する組成物及び方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/85 20060101AFI20230518BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20230518BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20230518BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20230518BHJP
A61K 38/17 20060101ALI20230518BHJP
A61P 17/02 20060101ALI20230518BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230518BHJP
A61K 47/64 20170101ALI20230518BHJP
A61K 9/107 20060101ALI20230518BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20230518BHJP
C07K 19/00 20060101ALN20230518BHJP
C07K 14/47 20060101ALN20230518BHJP
C12Q 1/6851 20180101ALN20230518BHJP
【ＦＩ】
C12N15/85 Z
C12Q1/686 Z
A61K31/7088
A61K35/12
A61K38/17
A61P17/02
A61P43/00 111
A61K47/64
A61K9/107
C12N15/12 ZNA
C07K19/00
C07K14/47
C12Q1/6851 Z
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022560900
(86)(22)【出願日】2020-04-22
(85)【翻訳文提出日】2022-10-05
(86)【国際出願番号】 TH2020000026
(87)【国際公開番号】W WO2021242180
(87)【国際公開日】2021-12-02
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】505456104
【氏名又は名称】チュラーロンコーン ユニバーシティー
(74)【代理人】
【識別番号】100121728
【弁理士】
【氏名又は名称】井関 勝守
(74)【代理人】
【識別番号】100165803
【弁理士】
【氏名又は名称】金子 修平
(74)【代理人】
【識別番号】100170900
【弁理士】
【氏名又は名称】大西 渉
(72)【発明者】
【氏名】ムティラングラ，アピワット
【テーマコード（参考）】
4B063
4C076
4C084
4C086
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
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4B063QA19
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4H045AA10
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4H045BA41
4H045CA40
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4H045FA74
(57)【要約】
本開示は、細胞の核内におけるＤＮＡの回復及び／又はＤＮＡ損傷の防止のための方法に関する。該方法は、一般に、ペプチドをコードする配列番号１又は配列番号２のポリヌクレオチド配列を含むベクターを有する試薬を細胞に投与することと、コードされたペプチドを過剰発現することとを含み、前記ベクターはコードされたペプチドを細胞内に発現をするように構成され、前記過剰発現されたペプチドは、細胞の核内におけるＤＮＡを回復、及びＤＮＡ損傷を防止できる１つ以上の複合体を細胞内で形成する。
【選択図】図１４
【選択図】図１４
【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞の核内におけるＤＮＡの損傷を防止するために、細胞内にペプチドを発現することができるベクターであって、前記ペプチドをコードする配列番号１又は配列番号２のポリヌクレオチド配列を含む、ベクター。
【請求項2】
細胞の核内においてＤＮＡを回復、及び／又はＤＮＡ損傷を防止する方法であって、配列番号３のペプチドを含む試薬、及び／又は前記ペプチドをコードする配列番号１若しくは配列番号２のポリヌクレオチド配列を含むベクターを細胞内にトランスフェクションするステップを含み、
前記ベクターは、前記トランスフェクションするステップの後に、コードされた前記ペプチドを前記細胞に発現するように構成されており、
コードされた前記ペプチドは、前記細胞の核内におけるＤＮＡを回復、及び／又はＤＮＡ損傷を防止できる１つ以上の複合体を細胞内で形成する、方法。
【請求項3】
前記トランスフェクションされたベクターに含まれる前記ポリヌクレオチド配列によりコードされたペプチドを過剰発現するステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
ＤＮＡ損傷の防止は、ＤＮＡ損傷反応を抑制することによってなされる、請求項２に記載の方法。
【請求項5】
ＤＮＡ損傷の防止は、ＤＮＡ損傷因子に対する細胞耐性を増大することによりなされる、請求項２に記載の方法。
【請求項6】
対象の創傷組織の治癒を改善する方法であって、配列番号３のペプチドを含む試薬、及び／又は前記ペプチドをコードする配列番号１のポリヌクレオチド配列を含むベクターを複数の細胞からなる創傷組織に接触させるステップと、
前記創傷組織の細胞に前記ペプチド及び／又は前記ベクターをトランスフェクションするステップとを含み、
前記ベクターは、前記トランスフェクションするステップの後に、コードされた前記ペプチドを前記細胞に発現するように構成されており、
コードされた前記ペプチドは、前記細胞の増殖を増強することにより前記創傷組織の治癒を改善できる１つ以上の複合体を細胞内で形成する、方法。
【請求項7】
前記対象は、糖尿病患者である、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記創傷組織は、熱傷により生じたものである、請求項６に記載の方法。
【請求項9】
哺乳動物におけるＤＮＡの回復及び／又はＤＮＡ損傷の防止のための医薬組成物であって、ペプチドをコードして発現可能な配列番号１若しくは配列番号２のポリヌクレオチド配列を含むベクター、又は配列番号３のペプチドのうちの１つの生物学的成分と、
細胞に前記生物学的成分を接触させる際に前記生物学的成分の細胞内への導入を促進するために、前記生物学的成分に化学的に結合されたキャリアシステムとを含み、
前記キャリアシステムは、細胞透過性ペプチド又はナノエマルジョンである、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、細胞内においてＤＮＡを回復する及びＤＮＡ損傷を防止するための組成物及び方法に関する。より詳細には、開示された組成物及び方法は、細胞内、好ましくは核内の１つ以上の生物学的複合体の形成を促進して、核内におけるＤＮＡ損傷因子に対する耐性につながる又はＤＮＡ損傷を制限する顕著なＤＮＡの安定性を生成する。上述の生物学的複合体は、一般に高齢者において加齢により減少される。また、本開示は、核内におけるＨＭＧＢ１ペプチドのボックスＡの産生又は核内へのＨＭＧＢ１のボックスＡの輸送を促進して、宿主ゲノムにＤＮＡ損傷に対する増強された耐性を与える生理的複製に依存しない内因性ＤＮＡ二本鎖切断（Ｐｈｙ－ＲＩＮＤ－ＥＤＳＢ）又は若年関連ゲノム安定化ＤＮＡギャップ（Ｙｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰ）を生成する人工手段のいずれかを含む。
【背景技術】
【0002】
エピジェネティックマークの欠損に関する内因性ＤＮＡ損傷は、高齢者及び多くの非感染性疾患（ＮＣＤ）患者における健康状態の悪化を引き起こすと考えられている（１）。さらに、ＤＮＡ損傷は、熱、紫外線、フリーラジカル、メチル化剤及び他の変異性化合物等の外部及び内部に存在する種々の因子によっても引き起こされ得る。ＤＮＡ損傷は、発癌又は先天性異常の原因となる変異を引き起こし得る。突然変異を防ぐために、細胞はＤＮＡ損傷を検出し、シグナルを送り、増殖を止め、及び／又は細胞のＤＮＡ損傷を修復するための細胞のＤＮＡ損傷応答（ＤＤＲ）を有する。しかし、ＤＤＲからの過度の干渉は、細胞を代謝異常、成長不良、老化及び死を含む細胞老化、又はアポトーシスに追いやる可能性がある（２、３）。
【0003】
多くの研究が、細胞内のＤＮＡ修復の操作を介して種々の疾患を治療することを目的として、世界中で行われている。例えば、米国特許第９３５９６０５号は、ＤＮＡ二本鎖切断修復タンパク質であるＢＲＣＡ２及びＲＡＤ５１を阻害することにより、固形癌の肺癌を治療する方法を教示する。同様に、国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０５７９０４号は、癌の治療においてポリ－（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）機構を阻害することができるポリヌクレオチドに基づく分子を記載している。さらに、Ａｄａｍらは、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０１５１１０号において、Ｅｌａｅｉｓ属の果実の抽出物を投与することにより、ヒト対象におけるミトコンドリア機能不全を防止できる可能性を示唆する。
【0004】
細胞におけるゲノムの不安定性はエピゲノム修飾の減少によっても引き起こされ得る（１）ことを考慮すると、細胞内にエピゲノムマークを加えるようなエピゲノム編集を促進する試みは、ＤＮＡ損傷を低減し得る。適切なエピジェネティック修飾により、細胞機能の低下を回復し得る（１）。ＤＮＡ損傷に対して有効であると知られているエピジェネティックマークの１つは、Ｐｈｙ－ＲＩＮＤ－ＥＤＳＢ又はＹｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰである（１、４）。従って、Ｙｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰの形成を促進する方法を見出す必要性があり、それにより、生物学的老化ＤＮＡ及び／又はＤＮＡ損傷の蓄積に関連する疾患の病態を必然的に改善できると考えられる。
【発明の概要】
【0005】
本開示は、細胞を若返らせる及び／又は細胞内ＤＮＡの損傷を防止することができる組成物を提供することを目的とする。より詳細には、開示された組成物は、開示された組成物を投与された細胞におけるＨＭＧＢ１タンパク質のボックスＡの発現又はトランスフェクションを促進して、改善されたゲノム安定化効果を達成する。
【0006】
本開示の更なる目的は、生物学的老化細胞を若返らせ、熱傷等の潜在的ＤＮＡ損傷に苦しむ、又は高齢者や糖尿病（ＤＭ）患者を含むＹｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰのレベルが低い対象の細胞増殖及び治癒プロセスを回復させるための組成物に向けられる。
【0007】
本開示のさらに別の目的は、細胞の核のＤＮＡ損傷を防止するための方法を提供することである。より詳細には、その方法は、１つ以上のＹｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰがゲノム内に形成されてＤＮＡ損傷形成に対する耐性を有するように、分子設計されたＨＭＧＢ１タンパク質、特にボックスＡドメインの発現及び／又は提示を含む。
【0008】
本開示の一態様は、ペプチドをコードする配列番号１又は配列番号２に記載のポリヌクレオチド配列を含む細胞の核におけるＤＮＡの損傷を防止するための、細胞内でペプチドを発現できるベクターに関する。
【0009】
本開示の主要な一態様は、配列番号３に記載のペプチドを含む試薬、及び／又は該ペプチドをコードする配列番号１若しくは配列番号２に記載のポリヌクレオチド配列を含むベクターを、細胞にトランスフェクションすることを含む、細胞の核内におけるＤＮＡ損傷を防止するためのＹｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰを生成する方法に関する。好ましくは、ベクターは、コードされたペプチドが細胞の核におけるＤＮＡ損傷を防止できる細胞内のＹｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰを含む１つ以上の複合体を形成するトランスフェクションステップの後に、細胞内でコードされたペプチドを発現するように構成されている。
【0010】
従って、開示された方法は、トランスフェクションされたベクターに存在するポリヌクレオチド配列によってコードされたペプチドを過剰発現させることをさらに含んでもよい。
【0011】
開示された方法の更なる実施形態によると、ＤＮＡ損傷の防止は、ＤＮＡ損傷応答を抑制する方法によって得られる。
【0012】
いくつかの実施形態において、ＤＮＡ損傷の防止は、ＤＮＡ損傷因子に対する細胞抵抗性を増大させる方法により得られる。
【0013】
本開示の他の態様は、配列番号３に記載されたペプチドを含む試薬、及び／又は該ペプチドをコードする配列番号１に記載されたポリヌクレオチド配列を含むベクターを、複数の細胞からなる創傷組織に接触させるステップと、前記ペプチド及び／又はベクターを創傷組織の細胞にトランスフェクションするステップとを含む、対象の創傷組織の治癒を改善する方法に関し、前記ベクターは、トランスフェクションステップの後に細胞内でコードされたペプチドを発現するように構成され、前記コードされたペプチドは、細胞内で細胞増殖を増強することによって創傷組織の治癒を改善できる１つ以上の複合体を形成する。
【0014】
多くの実施形態において、対象はＤＭ患者であり、一般に、細胞内に形成されるＹｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰが低い傾向にあり、このため、創傷組織の治癒速度が低下していることに苦しんでいる。開示された方法は、Ｙｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰを形成することにより、これらの対象における創傷組織の治癒速度を向上する。
【0015】
より多くの実施形態において、創傷組織は火傷によるものである。
【0016】
本開示の更なる態様は、ＤＮＡ損傷を抑制するために、ＤＮＡを回復するための局所又は全身に適用可能な医薬組成物に向けられる。その組成物は、一般に、ペプチドをコードする配列番号１又は配列番号２に記載のポリヌクレオチド配列を含むベクターを含む。
【0017】
本開示の他の態様によると、老化細胞を若返らせる、ＤＮＡ損傷を防止する、及び哺乳動物の治癒プロセスを増強する方法が開示される。好ましくは、その方法は、ペプチドをコードする配列番号１又は配列番号２に記載のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを有する試薬を局所又は全身に投与することを含む。標的細胞による発現ベクターの挿入又は取り込みを増強するために、発現ベクターは、細胞透過性ペプチド、ナノエマルジョン等のキャリアに結合されてもよい。
【0018】
本開示の多くの態様は、（ｉ）ペプチドをコードする配列番号１若しくは配列番号２に記載の発現可能なポリヌクレオチド配列を含むベクター、又は（ｉｉ）配列番号３に記載のペプチドのうちの１つである生物学的成分と、組成物を細胞に接触させたときに前記生物学的成分が細胞内に入ることを促進するために前記生物学的成分に化学的に結合されたキャリアシステムとを含む、哺乳細胞内のＤＮＡを回復する及び／又はＤＮＡ損傷を抑制するための医薬組成物を含み、前記キャリアシステムは、細胞透過性ペプチド、ナノエマルジョン等である。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1】図１は、高齢者及び生物学的に老化した細胞、例えばＤＭ患者の細胞における低レベルのＹｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰ、ＥＤＳＢを示すグラフであり、（Ａ）はＥＤＳＢと年齢との間の相関を示し、（Ｂ）はＤＭがない個体とＤＭがある個体とのそれぞれのＥＤＳＢのレベルを示し、（Ｃ）はＤＭがない（正常）個体とＤＭがある個体との間で年齢及び性別のマッチングの対でＥＤＳＢのレベルを示し、ＥＤＳＢの平均レベルがＳＥＭを示すエラーバーと共にヒストグラムで示されている。
【図2】図２は、ＨＭＧＢ１の制限酵素活性によるＤＳＢ生成の結果であるＹｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰを生成するＨＭＧＢ１のボックスＡを説明する図である。（Ａ）は、Ｔ４ポリメラーゼの存在下又は非存在下で種々の割合でＨＭＧＢ１と反応されたＨｅＬａのＤＮＡのＥＤＳＢ割合の増大を示すグラフである。（Ｂ）は、ＨＭＧＢ１により生成したＥＤＳＢに反応されたＨＫ２及びＨｅＬａ細胞のＨＭＤＮＡを示すグラフであり、ＨＭＧＢ１と共にインキュベートされたＤＮＡにおいてより多くのＥＤＳＢが生成されている。実験は、トリプリケートで行われ、スケールバーは標準誤差を示す。
【図3】図３は、Ｙｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰを生成するＨＭＧＢ１のボックスＡを示す写真である。ＨＫ－２細胞の電子顕微鏡写真は、ＤＮＡ損傷インサイチュライゲーション後の近接ライゲーションアッセイ（ＤＩ－ＰＬＡ）の結果を示し、（Ａ）ＨＭＧＢ１及び（Ｂ）ボックスＡをトランスフェクションした細胞は陽性シグナルを発し、（Ｃ）ボックスＢをトランスフェクションした、（Ｄ）ボックスＢＣをトランスフェクションした、（Ｅ）スクランブル配列のコントロールプラスミドをトランスフェクションした、及び（Ｆ）何もトランスフェクションしない場合のいずれの細胞もシグナルを示さない。
【図4】図４は、ＨＭＧＢ１のボックスＡを介したＨＭＧＢ１によるＹｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰの生成を示すグラフであり、ＤＮＡ免疫沈降（ＤＩＰ）におけるＥＤＳＢインプットの割合に関する結果を示し、（Ａ）は８－ヒドロキシ－２’－デオキシグアノシン（８－ＯＨｄＧ）の存在下でのＨＥＫ２９３及びＨｅＬａ細胞株に関し、（Ｂ）は８－ＯＨｄＧの存在下でボックスＡ、ＨＭＧＢ１及びコントロールプラスミドをトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞に関し、また、（Ｃ）は７－メチルグアノシンの存在下でボックスＡ、ＨＭＧＢ１及びコントロールプラスミドをトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞に関し、値は箱ひげ図で示され、箱は四分位範囲（２５～７５％）、中央線は５０％（ひげは最小値及び最大値を表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。
【図5】図５は、ＨＭＧＢ１のボックスＡのＤＮＡ損傷の抑制への適用可能性を示すグラフであり、ＨＭＧＢ１及びボックスＡを過剰発現させたＨＥＫ２９３及びＨＫ－２細胞（それぞれｎ＝９）における８－ＯＨｄＧレベル（８－ＯＨｄＧｓ ｎｇ／ｍｌ）及びアプリニック／アピリミジニックサイト（ＡＰサイト）レベル（ＡＰサイト／１０００００ｂｐ）に関する結果を示し、ＨＭＧＢ１及びボックスＡの過剰発現細胞において（Ａ）は８－ＯＨｄＧ、及び（Ｂ）はＡＰサイトを過剰発現させた細胞に関する結果をそれぞれ示す（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。
【図6】図６は、抑制下のＨＭＧＢ１のボックスＡの結果を示し、（Ａ）はＨＭＧＢ１、ボックスＡ又はＰＣを２５００ｎｇ／μｌで４８時間処理したＨＫ２細胞のｐ－ＡＴＭ（Ｓｅｒ１９８１）、ｐ５３、ｐ２１、ｐ１６ＩＮＫ４Ａ及びγＨ２ＡＸの発現レベルをそれぞれ示すウエスタンブロットのゲル写真であり（ブロットはβ－アクチンで再プローブし、サンプルローディングが同じことを確認した）、（Ｂ）は（Ａ）に対応する結果を示すグラフであり、タンパク質の種類は相対的なタンパク質レベルに対してプロットした（データは、一元配置分散分析及びダネットの多重比較検定で比較した、＊Ｐ値＜０．０５、＊＊Ｐ値＜０．０１、＊＊＊Ｐ値＜０．００１）。
【図7】図７は、ボックスＡ及び／又はＨＭＧＢ１の存在下におけるＤＮＡ損傷因子に対する細胞耐性を促進するＨＭＧＢ１のボックスＡに関する結果を示すグラフであり、（Ａ）はＨ２Ｏ２で２４時間処理したスクランブルプラスミド、ボックスＡ及びＨＭＧＢ１でトランスフェクションされた細胞について得られた結果であり、（Ｂ）はＭＭＳで２４時間処理したスクランブルプラスミド、ボックスＡ及びＨＭＧＢ１でトランスフェクションされた細胞について得られた結果であり、値は１２回の独立したアッセイの平均値±ＳＤである。値は、一元配置分散分析及びダネットの多重比較検定で比較した（＊Ｐ値＜０．０５、＊＊Ｐ値＜０．０１、＊＊＊Ｐ値＜０．００１）。
【図8】図８は、細胞増殖促進におけるＨＭＧＢ１のボックスＡの効果についての結果を示し、（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）のそれぞれのグラフは、ＨＥＫ２９３細胞におけるボックスＡ、ＨＥＫ２９３細胞におけるＨＭＧＢ１、ＨＫ－２細胞におけるボックスＡ、及びＨＫ－２細胞におけるＨＭＧＢ１（各ｎ＝９）の過剰発現下での４日間のＭＴＴアッセイによる細胞増殖についてのデータを示す（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。
【図9】図９は、糖尿病のラットを群に分け、創傷閉鎖の治癒促進におけるＨＭＧＢ１のボックスＡの効果についての結果を示す（Ａ）写真及び（Ｂ）グラフであり、各群の創傷領域は３、５、７、１０及び１４日目にＮＩＨのＩｍａｇｅＪ分析ツールを用いて測定し、０日目に得られた測定値と比較し、ＨＭＧＢ１のボックスＡプラスミド処理群ではプラスミドコントロール処理群又はＮＳＳ処理したコントロール群と比較して、創傷閉鎖率が顕著に増強された（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、各群ｎ＝８）。
【図10】図１０は、ＩＩ度熱傷からの傷の治癒及び収縮を促進するＨＭＧＢ１のボックスＡの効果についての結果を示し、（Ａ）はＨＭＧＢ１のボックスＡで毎日処理されたラット、及び通常の生理食塩水で処理されたコントロールラットのＩＩ度熱傷の画像であり、ＨＭＧＢ１のボックスＡ処理された傷は、コントロール群よりも大きな収縮及び少ない炎症を示し、（Ｂ）はコントロール群と比較して処理群のＩＩ度熱傷に対するＨＭＧＢ１のボックスＡの治癒効果がさらに顕著に増強されることを示すグラフである。Ｐ＜０．０００１、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、各群ｎ＝８である。
【図11】図１１は、ＨＭＧＢ１のボックスＡが老化プロセスを逆転させる効果についての結果を示し、ＨＫ－２細胞は２．５μＭのエトポシドによる７２時間の前処理で細胞老化が誘導され、その後にボックスＡ及びスクランブルのコントロールプラスミドをトランスフェクションし、４８時間インキュベートした。（Ａ）は細胞の形態及び密度を示すために捕捉した明視野画像（スケールバー＝５０μｍ）であり、（Ｂ）は異なる前処理がなされたＨＫ－２細胞におけるｐ１６ＩＮＫ４Ａ及びγＨ２ＡＸの発現レベルを示すウエスタンブロットのゲル写真であり、β－アクチンが等しいサンプルローディングを確認するための再プローブに用いられた。
【発明を実施するための形態】
【0020】
本開示は、本明細書に広く記載され、以下で請求されるようなその構造、方法又は他の本質的な特徴から逸脱することなく、他の特定の形態で具体化され得る。記載された実施形態は、全ての点で単に例示として考慮され、限定的なものではない。従って、本開示の範囲は、上記説明によってではなく、添付の特許請求の範囲により示される。特許請求の範囲の意味及び均等の範囲内に入る全ての変更は、その範囲内に包含される。
【0021】
本明細書で用いられる「ポリヌクレオチド」又は「核酸」の用語は、ｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ｃＤＮＡ又はＤＮＡを示す。その用語は、通常、３０ヌクレオチド残基の長さよりも大きいオリゴヌクレオチドを意味する。
【0022】
本明細書で用いられる「遺伝子」の用語は、機能的な意味をもつＤＮＡ配列を意味し得る。それは、ネガティブ核酸配列、又は天然起源若しくは合成コンストラクトに由来する組換え核酸配列であり得る。「遺伝子」の用語は、例えば、以下に限定されないが、ゲノムＤＮＡ配列に直接的又は間接的にコードされた又は由来するｃＤＮＡ及び／又はｍＲＮＡを指すためにも用いられ得る。
【0023】
「複合体」、「生物学的複合体」及び「Ｙｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰ」の用語は、他に言及しない限り、ゲノム安定性のためのエピジェネティックバイオマーカーを示し、本明細書を通じて互換的に用いられる。
【0024】
本明細書で用いられる「老化細胞」及び「複数の老化細胞」の用語は、加齢プロセス、老化誘導又はＤＮＡ損傷による機能的特性が低下した細胞を指し得る。より具体的には、「老化細胞」及び「複数の老化細胞」は、Ｙｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰがコントロールの０．３％ＥＤＳＢ ＰＣＲよりも低い、及び／又は老化関連β－ガラクトシダーゼ細胞の蓄積が５０％よりも多い細胞、及び／又はγ－Ｈ２ＡＸ ｆｏｃｉ／ｃｅｌｌが３．５よりも大きい若しくは８－ＯＨｄＧ／１０６ｄＧが７よりも大きい細胞を意味する。
【0025】
本開示の一態様によると、細胞の核内のＤＮＡ損傷を防止するための方法が開示される。好ましくは、本方法は、ペプチドをコードする配列番号１又は配列番号２に記載のポリヌクレオチド配列を含むベクターを有する試薬を細胞に投与するステップであって、そのベクターは細胞内でコードされたペプチドを発現するように構成されているステップと、細胞内でコードされたペプチドを過剰発現させるステップとを含む。好ましくは、過剰発現されたペプチドは、細胞内で、細胞の核内におけるＤＮＡの損傷を防止できる１つ以上の複合体（又はＹｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰ）を形成する。より具体的には、配列番号１又は配列番号２によりそれぞれコードされたペプチドは、ＨＭＧＢ１タンパク質のボックスＡ及びＨＭＧＢ１タンパク質である。関連分野の１つは、配列番号１及び配列番号２に記載のポリヌクレオチド配列がより良好な発現の増強又は特定の宿主細胞タイプとの適合性の向上のためにさらに改変され得るという事実が理解され得る。これらの改変は、配列番号１及び配列番号２に記載された配列の７０～９０％程度のみを保持する改変ポリヌクレオチド配列となり得る。好ましくは、そのような改変は、ＤＮＡ損傷の防止、外傷の治癒の促進、対象におけるＹｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰの低収量に関する非感染性疾患の治療等のための、ＨＭＧＢ１のボックスＡ及び／若しくはＨＭＧＢ１ベースの組成物、方法又は試薬に関する本開示がカバーする範囲から逸脱してはならない。
【0026】
多くの実施形態において、投与ステップは、局所、経腸及び／又は非経口経路を介して対象に試薬を適用することを意味し得るが、局所適用は侵襲性が低いためより好ましい。本開示の試薬は、所望の結果を達成するために投与経路に応じて異なる形態に適応し得る。試薬が局所投与されるこれらの実施形態において、試薬は、ＨＭＧＢ１タンパク質のボックスＡのペプチド又はＨＭＧＢ１タンパク質をそれぞれコードする配列番号１又は配列番号２に記載のポリヌクレオチド配列を含むベクターを含む。特に、用いられる発現プラスミドに関して、そのベクターは、外傷周辺の細胞又は組織への吸着を容易にするために、ナノエマルジョンの形態に名のコーティングされることが好ましく、これにより、細胞内のベクターを介してＨＭＧＢ１タンパク質のボックスＡ又はＨＭＧＢ１タンパク質を発現し、その後、ＤＮＡ損傷を防止できる複合体を形成する。より具体的には、本開示は、ＨＭＧＢ１又はＨＭＧＢ１のボックスＡが、細胞内にＹｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰを生成でき、広範囲のＤＮＡ損傷因子に対して大きな耐性を細胞に与えることを発見した。既知のＨＭＧＢ１タンパク質のデオキシリボースリン酸リアーゼ活性及びＤＮＡを曲げる能力は、Ｙｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰの生成において役割を果たし得る。ＨＭＧＢ１遺伝子は、２つのＤＮＡ結合ドメイン（ボックスＡ及びボックスＢ）と酸性テイルを含む。このように、本開示は、ボックスＡタンパク質又はボックスＡドメインを有するＨＭＧＢ１タンパク質がＤＮＡ損傷因子に対する耐性を細胞に付与し、ＤＮＡ損傷を制限する能力を有すると考えられることを単に見出した。従って、細胞の核内のＤＮＡ損傷を防止する開示された方法に用いられるベクターは、配列番号１又は配列番号２と作動可能な１つ以上の調節配列を含み得る。多くの実施形態において、細胞透過性ペプチド等のペプチドトランスフェクションシステムは、細胞内へのベクターの輸送のためによく用いられ得る。
【0027】
本開示の更なる態様によると、細胞の核内のＤＮＡ損傷を防止するための方法が開示される。その方法は、配列番号３に記載されるペプチド、及び／又はそのペプチドをコードする配列番号１又は配列番号２に記載のポリヌクレオチド配列を含むベクターを含む試薬を細胞にトランスフェクションするステップを本質的に含む。好ましくは、ベクターは、トランスフェクションステップの後に、コードされたペプチドを細胞内で発現するように構成されている。より好ましくは、コードされたペプチドは、細胞の核内におけるＤＮＡ損傷を防止できる、すなわちＹｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰを含む１つ以上の複合体を細胞内で形成する。いくつかの実施形態において、ベクターは、ペプチドの発現が所定の時間、期間、レベル及び／又は特定の組織の細胞で制御され得るように、促進物質の存在下でコードされたペプチドの転写及び翻訳を単に開始するプロモーター領域を有し得る。
【0028】
多くの実施形態において、ＤＮＡ損傷を防止する方法は、所定数の発現ベクターを細胞にトランスフェクションすることによってコードされたペプチドを過剰発現すること、又は所定濃度の促進物質を用いてペプチドの発現をアップレギュレートすることをさらに含み得る。また、いくつかの実施形態において、ＤＮＡ損傷の防止及びＤＮＡ損傷応答の抑制は、以下に示すいくつかの実施例に示されるように、Ｙｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰを生成する方法によって得られる。あるいは、ＤＮＡ損傷因子に対する細胞耐性の増大も、Ｙｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰの産生によって促進され得る。
【0029】
他の態様において、本開示は、配列番号３に記載のペプチド、及び／又は該ペプチドをコードする配列番号１若しくは配列番号２に記載のポリヌクレオチド配列を含むベクターを含む試薬を複数の細胞からなる創傷組織に接触させるステップと、前記ペプチド及び／又は前記ベクターを創傷組織の細胞にトランスフェクションするステップとを含む、対象の創傷組織の治癒を改善するための方法に関する。同様に、ベクターは、トランスフェクションステップの後に、コードされたペプチドを細胞内で発現するように構成されている。特に、コードされたペプチドは、ＤＮＡ損傷細胞又は生物学的老化細胞における治癒の遅延を正す方法によって、創傷組織の治癒を改善できる１つ以上の複合体を細胞内で形成する。この開示された方法は、対象が糖尿病哺乳動物又はＤＭ患者である場合、傷ついた対象の治癒速度を顕著に向上できる。いくつかの実施形態において、創傷組織は熱傷によって生じたものである。
【0030】
本開示の更なる態様に従い、ＤＮＡ損傷を防止するための医薬組成物が開示される。その組成物は、ボックスＡタンパク質又はＨＭＧＢ１をコードする配列番号１又は配列番号２に記載鎖r多ポリヌクレオチド配列を含むベクターを含む。そのベクターには、コードされたタンパク質の発現を制御するための調節配列又は領域が組み込まれ得る。そのベクターは、該ベクターを細胞内に効率的に輸送するための細胞透過性ペプチド又はナノエマルジョン等のキャリアシステムでカプセル化又は結合され得る。本組成物は、適応される実施形態に依存して局所又は全身のいずれかに投与され得る。本開示は、Ｙｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰと、生物学的に老化ＤＮＡを有することが共に知られている高齢者又はＤＭ患者との間に顕著な逆相関があることを見出した。そして、ＤＮＡ損傷は、加齢に関連する非感染性疾患（ＮＣＤ）において一般的に見られる。具体的に、Ｙｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰはＤＮＡ損傷を防ぐ。高齢者及び糖尿病対象におけるＹｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰの低減に伴い、これらの対象は、内因性ＤＮＡ損傷の増大及びＤＤＲの上昇を被り、不健康な細胞機能をもたらす。開示された組成物は、細胞内でＹｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰを生成するための手段であることが見出されたＨＭＧＢ１タンパク質のボックスＡ及び／又はＨＭＧＢ１タンパク質を発現する、又は好ましくは過剰発現するためのプラスミド又はベクターを導入する。
【0031】
さらに、本開示は、ＨＭＧＢ１のボックスＡがＨＭＧＢ１よりもヒトゲノムを安定化させることを実証する。本開示の発明者らは、ＨＭＧＢ１のボックスＡペプチドが核内に入り、そのＹｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰを形成できると考えている。ＨＭＧＢ１のボックスＡペプチドは、Ｙｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰの形成に必要なＨＭＧＢ１の既知の役割を全て有する。核への侵入及びＹｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰの生成に加えて、ＨＭＧＢ１は、ボックスＡにおいて、細胞外及び細胞内の種々の酵素及び成分と相互作用する役割が知られている。本開示は、ＨＭＧＢ１タンパク質の分割された役割が複合体又はＹｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰの生成効率の低下をもたらしたと仮定する。これに関連して、本開示の種々の態様のいくつかの実施形態はｋ、ＨＭＧＢ１タンパク質のボックスＣ及びＣ末端の発現を意図的に除外し、むしろＨＭＧＢ１タンパク質のボックスＡの細胞外の役割に加えてＤＮＡ損傷及び／又は損傷細胞の若返りにＨＭＧＢ１のボックスＡを特に利用する。
【0032】
上述の説明のように、本発明者らは、さらに、形成された複合体が多くの疾患状態における健康悪化の原因であるゲノムの不安定性のモニタリング及び防止に利用できることを明らかにした。従って、本開示の更なる態様は、ペプチドをコードする配列番号１又は配列番号２に記載されたポリヌクレオチド配列を含むベクターを有する試薬を局所又は全身に投与することを含む、生物学的に老化した対象における細胞の若返り及び創傷治癒速度を向上する方法について記載される。好ましくは、試薬は、生物学的に老化した細胞においてコードされたペプチドの過剰発現を開始し、過剰発現されたペプチドは、その後にＹｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰ又は複合体の形成を引き起こし、影響を受けた細胞におけるゲノム安定性を改善し、少なくとも１つ以上のＤＤＲ酵素反応を阻害する。特に、Ｐｈｙ－ＲＩＮＤ－ＥＤＳＢ又はＹｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰは、高齢者及びＤＭ患者において徐々に低減するヒトにおいて特有のエピゲノムマーカーである。本開示は、ＨＭＧＢ１又はＨＭＧＢ１のボックスＡが細胞内でＹｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰを生成する有効なツールであることを明らかにした。Ｙｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰの形成に伴い、局所適用組成物は、長距離シスにおけるＤＮＡ鎖の安定性を向上でき、内因性ＤＮＡ損傷及びＤＤＲを抑制し、ＤＮＡ損傷因子に対する細胞耐性を改善できる。このように、開示された組成物は、ＨＭＧＢ１のボックスＡ及び／又はＨＭＧＢ１を過剰発現することにより、生物学的に老化した対象における細胞を若返らせ、創傷の治癒を促進する。好ましくは、対象は生物学的に老化した哺乳動物である。開示された組成物は、高齢者及び糖尿病の対象を含む加齢関連ＮＣＤにおける細胞増殖不良、細胞老化及び治癒遅延に関する健康問題に対処するために用いられ得る。
【0033】
本開示の発明者らは、ＨＭＧＢ１タンパク質又はＨＭＧＢ１タンパク質のボックスＡの存在下で潜在的に形成されるゲノム安定化バイオマーカー、Ｙｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰ又は複合体を発見した。Ｙｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰはエピジェネティックマークであり、ＤＮＡ損傷でないことに留意することが重要である。エピジェネティックマークは、細胞内の酵素活性により生成される。Ｙｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰ等のエピジェネティックマークは、創傷細胞及び／又は老化細胞に有益であることが以下の実施例により示される。開示された実施例は、ＨＭＧＢ１又はＨＭＧＢ１のボックスＡによって生成されるＹｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰがゲノムを安定化することも実証し、従って、Ｙｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰはエピジェネティックマークである。
【0034】
さらに、本開示の他の態様は、哺乳動物において、ＤＮＡ損傷を防止する、ＤＮＡ損傷に対する耐性を増大する、細胞増殖を向上する、創傷組織の治癒を改善する、内因性ＤＮＡ損傷を抑制する及び／又はＤＮＡ損傷応答を抑制するＹｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰを生成するための医薬組成物について開示される。その組成物は、配列番号３に記載のアミノ酸配列の少なくとも７０％を含むペプチドと、該ペプチドに化学的に結合され、該結合ペプチドを哺乳動物の所定の組織型の細胞にもたらして、設定に記載の哺乳動物に対する有益な結果を達成するように構成されたキャリアを含む。キャリアは、発現ベクターを用いる他の開示された実施形態と比較して、開示された組成物と接触させた細胞において、結合されたペプチドが即時又はほぼ即時の様式で上述の１つ以上の有益な結果を発揮することができる細胞透過性ペプチド、ナノエマルジョン等であってもよい。
【0035】
以下の実施例は、本開示をさらに説明するためのものであり、本開示がそこに記載された特定の実施形態に限定されることを意図するものではない。
【実施例】
【0036】
実施例１
低レベルのＹｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰは、生物学的に加齢した個人、高齢者及びＤＭ患者において報告されている。特に、ヘモグロビンＡ１Ｃ（ＨｂＡ１Ｃ）レベルを、非ＤＭ（８０サンプル）及びＤＭ（４０サンプル）群に分類した１２０人の患者で評価した。全ての対象は、２０１５年から２０１６年においてタイのＮａｋｈｏｎ Ｓｉ ＴｈａｍｍａｒａｔのＴａｍｂｏｎ Ｈｅａｌｔｈ Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｓｅｒｖｉｃｅで募集された。参加者の年齢は１５～８０歳であった。全ての対象は、研究に自発的に参加した。本研究は、タイのＮａｋｈｏｎ Ｓｉ ＴｈａｍｍａｒａｔにおけるＷａｌａｉｌａｋ大学のヒト対象の研究の人権に関する倫理クリアランス委員会により審査及び承認された。各参加者から書面のインフォームドコンセントを得た。酵母において、Ｙｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰは老化した酵母では経時的に減少し、Ｙｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰの減少は生物学的老化プロセスを促進する（４）。本開示では、高齢の参加者においてＹｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰレベルが低いことを発見した（ｒ＝－０．４７２６、Ｐ＜０．０００１）（図１Ａ）。糖尿病患者は、細胞の老化プロセスが加速することが知られていた（５）。また、本開示は、糖尿病患者のＷＢＣでは、非糖尿病患者のＷＢＣよりもＹｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰレベルが低いことを見出した（図１Ｂ及び性別と年齢の調整済みの図１Ｃ）。従って、ヒトにおけるＹｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰレベルの低減は、ＤＮＡの生物学的老化を有することが知られている群で見られた。これらのデータから、本開示では、酵母と同様に、Ｙｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰレベルの減少はＤＮＡ損傷及びそれに続く細胞機能の劣化を促進するという仮説を立てた。
低レベルのＹｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰは、生物学的に加齢した個人、高齢者及びＤＭ患者において報告されている。特に、ヘモグロビンＡ１Ｃ（ＨｂＡ１Ｃ）レベルを、非ＤＭ（８０サンプル）及びＤＭ（４０サンプル）群に分類した１２０人の患者で評価した。全ての対象は、２０１５年から２０１６年においてタイのＮａｋｈｏｎ Ｓｉ ＴｈａｍｍａｒａｔのＴａｍｂｏｎ Ｈｅａｌｔｈ Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｓｅｒｖｉｃｅで募集された。参加者の年齢は１５～８０歳であった。全ての対象は、研究に自発的に参加した。本研究は、タイのＮａｋｈｏｎ Ｓｉ ＴｈａｍｍａｒａｔにおけるＷａｌａｉｌａｋ大学のヒト対象の研究の人権に関する倫理クリアランス委員会により審査及び承認された。各参加者から書面のインフォームドコンセントを得た。酵母において、Ｙｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰは老化した酵母では経時的に減少し、Ｙｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰの減少は生物学的老化プロセスを促進する（４）。本開示では、高齢の参加者においてＹｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰレベルが低いことを発見した（ｒ＝－０．４７２６、Ｐ＜０．０００１）（図１Ａ）。糖尿病患者は、細胞の老化プロセスが加速することが知られていた（５）。また、本開示は、糖尿病患者のＷＢＣでは、非糖尿病患者のＷＢＣよりもＹｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰレベルが低いことを見出した（図１Ｂ及び性別と年齢の調整済みの図１Ｃ）。従って、ヒトにおけるＹｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰレベルの低減は、ＤＮＡの生物学的老化を有することが知られている群で見られた。これらのデータから、本開示では、酵母と同様に、Ｙｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰレベルの減少はＤＮＡ損傷及びそれに続く細胞機能の劣化を促進するという仮説を立てた。
【0037】
実施例２
本開示は、ＨＭＧＢ１タンパク質がリアーゼ活性を有するため、ＨＭＧＢ１がＹｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰを生成することを見出した。ＨＭＧＢ１タンパク質を生成するために、ｐＲＳＥＴ Ａベクター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＭＡ，ＵＳＡ）内のＨＭＧＢ１ ｃＤＮＡ（ＮＭ＿００１３１３８９３．１）を生成した（６）。ベクター構築は、ＧｅｎｅＡｒｔ Ｇｅｎｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＭＡ，ＵＳＡ)により行った。配列の忠実度は、サンガーシークエンスで確認した。ＨＭＧＢ１ベクターは、タンパク質産生のために、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳコンピテントセル（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ，ＵＳＡ）に形質転換された。
本開示は、ＨＭＧＢ１タンパク質がリアーゼ活性を有するため、ＨＭＧＢ１がＹｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰを生成することを見出した。ＨＭＧＢ１タンパク質を生成するために、ｐＲＳＥＴ Ａベクター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＭＡ，ＵＳＡ）内のＨＭＧＢ１ ｃＤＮＡ（ＮＭ＿００１３１３８９３．１）を生成した（６）。ベクター構築は、ＧｅｎｅＡｒｔ Ｇｅｎｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＭＡ，ＵＳＡ)により行った。配列の忠実度は、サンガーシークエンスで確認した。ＨＭＧＢ１ベクターは、タンパク質産生のために、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳコンピテントセル（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ，ＵＳＡ）に形質転換された。
【0038】
２種類のヒト不死化腎臓細胞株であるＨＥＫ２９及びＨＫ－２、並びに子宮頸がん細胞株であるＨｅＬａ細胞のＤＮＡを、２μｇのＨＭＧＢ１タンパク質を含む１×ＣｕｔＳｍａｒｔ（登録商標）バッファー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，ＭＡ，ＵＳＡ）中において、総量５０μｌで３７℃１６時間、インキュベートした。精製ＥＧＦＰタンパク質又はＡｌｕＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）とともにインキュベートされた２μｇのＨｅＬａのＤＮＡをコントロールとして用いた。さらに、ＤＮＡとＨＭＧＢ１タンパク質との比率を５：１、４：１、３：１、２：１及び１：１と変化させた。
【0039】
ＨＭＧＢ１リアーゼ活性により生じるＰｈｙ－ＲＩＮＤ－ＥＤＳＢ又はＹｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰを測定するために、ＥＤＳＢ ＰＣＲを以前に記載したように行った（７）。本開示は、精製ＨＭＧＢ１タンパク質が用量依存的にＤＮＡを切断できることを見出した（図２Ａ～Ｄ）。ＨＭＧＢ１が生成したＤＳＢの末端の大部分は、平滑であった（図２Ｃ）。
【0040】
実施例３
本開示は、ＨＭＧＢ１のボックスＡがＹｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰを生成し、その結果、Ｙｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰと共局在化することを見出した。本開示は、Ｙｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰとＤＩ－ＰＬＡを含む発現プラスミドからのタンパク質との共局在を決定した（８）。本研究において、全長ヒトＨＭＧＢ１、ボックスＡ、ボックスＢ、ボックスＢＣ及びスクランブル配列コントロール（ＰＣ）の発現プラスミドを用いた。本開示では、市販のｐｃＤＮＡ３．１Ｆｌａｇインサート発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を大腸菌（ＤＨ５α）宿主細胞へ形質転換させた。プラスミドＤＮＡの単離は、Ｑｉａｇｅｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、製造者の説明書に従って行った。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（トランスフェクション試薬）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて、細胞にプラスミドをトランスフェクションし（プラスミドの最終濃度が２５００ｎｇ／ｍｌ）、細胞をインキュベーターで２４～４８時間インキュベートした。
本開示は、ＨＭＧＢ１のボックスＡがＹｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰを生成し、その結果、Ｙｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰと共局在化することを見出した。本開示は、Ｙｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰとＤＩ－ＰＬＡを含む発現プラスミドからのタンパク質との共局在を決定した（８）。本研究において、全長ヒトＨＭＧＢ１、ボックスＡ、ボックスＢ、ボックスＢＣ及びスクランブル配列コントロール（ＰＣ）の発現プラスミドを用いた。本開示では、市販のｐｃＤＮＡ３．１Ｆｌａｇインサート発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を大腸菌（ＤＨ５α）宿主細胞へ形質転換させた。プラスミドＤＮＡの単離は、Ｑｉａｇｅｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、製造者の説明書に従って行った。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（トランスフェクション試薬）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて、細胞にプラスミドをトランスフェクションし（プラスミドの最終濃度が２５００ｎｇ／ｍｌ）、細胞をインキュベーターで２４～４８時間インキュベートした。
【0041】
さらに、本開示では、以前に記載したようにＦｌａｇとＤＳＢとの間のＤＩ－ＰＬＡを行った（８）。ＤＩ－ＰＬＡは、Ｄｕｏｌｉｎｋ Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｏｒａｎｇｅ Ｓｔａｒｔｅｒ Ｋｉｔ Ｍｏｕｓｅ／Ｒａｂｂｉｔ（ＤＵＯ９２１０２）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）により、製造者のプロトコールに従って行った。サンプルを２０倍及び４０倍の対物レンズを用いた蛍光顕微鏡又は共焦点顕微鏡で分析する前に、室温で１５分間インキュベートした。
【0042】
ＤＳＢにおけるプラスミドタンパク質の局在を、ＤＩ－ＰＬＡ技術を用いて各赤色スポットで観察した（図３）。ＤＩ－ＰＬＡの結果、ＨＭＧＢ１及びボックスＡはそれぞれのＹｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰ付近のＤＮＡに結合したが、ボックスＢ及びボックスＢＣ分子は結合しないことを示した（図３Ａ）。ＨＭＧＢ１（図３Ａ）及びボックスＡ（図３Ｂ）プラスミドを含む細胞は、陽性シグナルが観察された。ボックスＢ（図３Ｃ）、ボックスＢＣ（図３Ｄ）、コントロールプラスミド（図３Ｅ）をトランスフェクションした細胞及び非トランスフェクション細胞（図３Ｆ）では、ＤＩ－ＰＬＡシグナルは見られなかった。
【0043】
実施例４
本開示は、ＨＭＧＢ１のボックスＡがＹｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰを生成してＤＮＡ損傷を防止することを結論付ける。Ｙｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰがＤＮＡ損傷を防止するのであれば、Ｙｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰ及びＤＮＡ損傷が共存することはほぼ無いはずである。本開示では、ＤＮＡ損傷に対する抗体を用いたＤＩＰ（９）を行い、ＤＩＰ ＤＮＡのＥＤＳＢの濃度をインプットＤＮＡの濃度と比較した。まず、完全長ヒトＨＭＧＢ１、ボックスＡ、ボックスＢ、ボックスＢＣ及びＰＣ発現プラスミドをトランスフェクションした細胞からＨＭＷＤＮＡを調製した。次に、ＥＤＳＢリンカーとライゲーションされたＨＭＷＤＮＡを、以前に記載したように調製した（７）。次に、ＤＩＰ ＤＮＡのＥＤＳＢを、以前に記載したようにＥＤＳＢＰＣＲプロトコールを用いてインプットＤＮＡと比較した（７）。図４Ａは、ＨｅＬａ及びＨＥＫ２９３細胞株のインプットの％ＥＤＳＢＰＣＲを示す。そして、本開示では、ＨＭＧＢ１のボックスＡ及びＨＭＧＢ１の発現プラスミド並びに陰性コントロールプラスミドをトランスフェクションされた細胞の８－ＯＨｄＧ又は７－メチルグアノシンとＥＤＳＢとの間のシスでの共存を測定した（図４Ｂ及びＣ）。試験した全ての細胞のＤＮＡ損傷を含むゲノムはＥＤＳＢを顕著に欠いていたが、ＨＭＧＢ１のボックスＡ及びＨＭＧＢ１をトランスフェクションされた細胞のＤＮＡ損傷を含むゲノムは、陰性コントロールプラスミドをトランスフェクションされた細胞のＤＮＡ損傷を含むゲノムよりもＥＤＳＢが少なかった（図４Ｂ及びＣ）。従って、ＨＭＧＢ１のボックスＡ及びＨＭＧＢ１の発現プラスミドは、細胞内のＹｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰの割合を増加させた。
本開示は、ＨＭＧＢ１のボックスＡがＹｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰを生成してＤＮＡ損傷を防止することを結論付ける。Ｙｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰがＤＮＡ損傷を防止するのであれば、Ｙｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰ及びＤＮＡ損傷が共存することはほぼ無いはずである。本開示では、ＤＮＡ損傷に対する抗体を用いたＤＩＰ（９）を行い、ＤＩＰ ＤＮＡのＥＤＳＢの濃度をインプットＤＮＡの濃度と比較した。まず、完全長ヒトＨＭＧＢ１、ボックスＡ、ボックスＢ、ボックスＢＣ及びＰＣ発現プラスミドをトランスフェクションした細胞からＨＭＷＤＮＡを調製した。次に、ＥＤＳＢリンカーとライゲーションされたＨＭＷＤＮＡを、以前に記載したように調製した（７）。次に、ＤＩＰ ＤＮＡのＥＤＳＢを、以前に記載したようにＥＤＳＢＰＣＲプロトコールを用いてインプットＤＮＡと比較した（７）。図４Ａは、ＨｅＬａ及びＨＥＫ２９３細胞株のインプットの％ＥＤＳＢＰＣＲを示す。そして、本開示では、ＨＭＧＢ１のボックスＡ及びＨＭＧＢ１の発現プラスミド並びに陰性コントロールプラスミドをトランスフェクションされた細胞の８－ＯＨｄＧ又は７－メチルグアノシンとＥＤＳＢとの間のシスでの共存を測定した（図４Ｂ及びＣ）。試験した全ての細胞のＤＮＡ損傷を含むゲノムはＥＤＳＢを顕著に欠いていたが、ＨＭＧＢ１のボックスＡ及びＨＭＧＢ１をトランスフェクションされた細胞のＤＮＡ損傷を含むゲノムは、陰性コントロールプラスミドをトランスフェクションされた細胞のＤＮＡ損傷を含むゲノムよりもＥＤＳＢが少なかった（図４Ｂ及びＣ）。従って、ＨＭＧＢ１のボックスＡ及びＨＭＧＢ１の発現プラスミドは、細胞内のＹｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰの割合を増加させた。
【0044】
実施例５
本開示は、ＨＭＧＢ１のボックスＡが内因性ＤＮＡ損傷を低減できることを発見した。具体的に、全長ヒトＨＭＧＢ１、ボックスＡ及びＰＣ発現プラスミドをトランスフェクションされた細胞からのＤＮＡをフェノールクロロホルム法により抽出し、滅菌されたｄＨ２Ｏに再懸濁した。その後、ＤＮＡ中の８－ＯＨｄＧレベルを、ＯｘｉＳｅｌｅｃｔ Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ＤＮＡ Ｄａｍａｇｅ ＥＬＩＳＡキット（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて測定した。ＡＰサイトレベルを、ＯｘｉＳｅｌｅｃｔ Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ＤＮＡ Ｄａｍａｇｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎキット（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）により測定した。本開示では、ＨＥＫ２９３及びＨＫ－２細胞株にＨＭＧＢ１及びボックスＡ発現プラスミドをトランスフェクションし、両プラスミドが８－ＯＨｄＧ及びＡＰサイトを含むいくつかの型の内因性ＤＮＡ損傷の低減を引き起こすことを見出した（図５Ａ～４Ｄ）。従って、ＨＭＧＢ１の内因性ＤＮＡ損傷抑制の役割は、ボックスＡドメインに属する。
本開示は、ＨＭＧＢ１のボックスＡが内因性ＤＮＡ損傷を低減できることを発見した。具体的に、全長ヒトＨＭＧＢ１、ボックスＡ及びＰＣ発現プラスミドをトランスフェクションされた細胞からのＤＮＡをフェノールクロロホルム法により抽出し、滅菌されたｄＨ２Ｏに再懸濁した。その後、ＤＮＡ中の８－ＯＨｄＧレベルを、ＯｘｉＳｅｌｅｃｔ Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ＤＮＡ Ｄａｍａｇｅ ＥＬＩＳＡキット（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて測定した。ＡＰサイトレベルを、ＯｘｉＳｅｌｅｃｔ Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ＤＮＡ Ｄａｍａｇｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎキット（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）により測定した。本開示では、ＨＥＫ２９３及びＨＫ－２細胞株にＨＭＧＢ１及びボックスＡ発現プラスミドをトランスフェクションし、両プラスミドが８－ＯＨｄＧ及びＡＰサイトを含むいくつかの型の内因性ＤＮＡ損傷の低減を引き起こすことを見出した（図５Ａ～４Ｄ）。従って、ＨＭＧＢ１の内因性ＤＮＡ損傷抑制の役割は、ボックスＡドメインに属する。
【0045】
実施例６
本開示は、ＨＭＧＢ１のボックスＡがＤＤＲを減少することを見出した。特に、全長ヒトＨＭＧＢ１、ボックスＡ及びＰＣ発現プラスミドをトランスフェクションされた細胞からのタンパク質ライセートを、ＲＩＰＡバッファー（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）及びプロテアーゼ阻害剤混合物（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）を用いて調製し、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）からのＢＣＡタンパク質測定キットにより分析した。標準ウエスタンブロットを調製し、ｐ－ＡＴＭ（Ｓｅｒ１９８１）、ｐ５３、ｐ２１、ｐ１６ＩＮＫ４Ａ、蛍光体－γ－Ｈ２ＡＸ（Ｓｅｒ１３９）及びβ－アクチンに対する特異的一次抗体と共に一晩インキュベートした。免疫複合体を、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ＨＲＰ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｍｅｒｃｋ，ＤＡ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって検出し、Ａｚｕｒｅ ｃ３００ ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｚｕｒｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）によって露光した。
本開示は、ＨＭＧＢ１のボックスＡがＤＤＲを減少することを見出した。特に、全長ヒトＨＭＧＢ１、ボックスＡ及びＰＣ発現プラスミドをトランスフェクションされた細胞からのタンパク質ライセートを、ＲＩＰＡバッファー（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）及びプロテアーゼ阻害剤混合物（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）を用いて調製し、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）からのＢＣＡタンパク質測定キットにより分析した。標準ウエスタンブロットを調製し、ｐ－ＡＴＭ（Ｓｅｒ１９８１）、ｐ５３、ｐ２１、ｐ１６ＩＮＫ４Ａ、蛍光体－γ－Ｈ２ＡＸ（Ｓｅｒ１３９）及びβ－アクチンに対する特異的一次抗体と共に一晩インキュベートした。免疫複合体を、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ＨＲＰ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｍｅｒｃｋ，ＤＡ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって検出し、Ａｚｕｒｅ ｃ３００ ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｚｕｒｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）によって露光した。
【0046】
ＤＮＡ損傷に対する細胞応答は、ＤＤＲネットワーク内のリン酸化を促進するタンパク質キナーゼカスケードからなるＤＤＲシグナル伝達経路により制御されている（１０）。ＨＭＧＢ１及びボックスＡプラスミドのＤＤＲにおける影響を決定するために、本開示では、γＨ２ＡＸ、ｐ－ＡＴＭ（Ｓｅｒ１９８１）、ｐ５３、ｐ２１及びｐ１６ＩＮＫ４Ａのタンパク質発現レベルを評価した（１１、１２）。本開示は、ＤＤＲシグナル伝達経路タンパク質の発現レベルが、ＨＭＧＢ１及びボックスＡをトランスフェクションされた細胞で低減していることを見出した（図６）。
【0047】
実施例７
本開示は、ＨＭＧＢ１のボックスＡが細胞増殖を促進することを明らかにした。ＨＭＧＢ１及びボックスＡプラスミドをトランスフェクションした後の細胞増殖を調べるために、トランスフェクションされた細胞株を、４日間毎日播種後にＭＴＴ試薬（５ｍｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）を用いて評価し、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて５７０ｎｍで測定した。ＨＭＧＢ１及びボックスＡを過剰発現させたＨＥＫ２９３及びＨＫ－２細胞では、コントロール細胞よりも優位に高い細胞増殖率が観察された（図７）。
本開示は、ＨＭＧＢ１のボックスＡが細胞増殖を促進することを明らかにした。ＨＭＧＢ１及びボックスＡプラスミドをトランスフェクションした後の細胞増殖を調べるために、トランスフェクションされた細胞株を、４日間毎日播種後にＭＴＴ試薬（５ｍｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）を用いて評価し、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて５７０ｎｍで測定した。ＨＭＧＢ１及びボックスＡを過剰発現させたＨＥＫ２９３及びＨＫ－２細胞では、コントロール細胞よりも優位に高い細胞増殖率が観察された（図７）。
【0048】
実施例８
また、本開示は、ボックスＡ及びＨＭＧＢ１遺伝子の過剰発現がＤＮＡ損傷に対する細胞の耐性を増大させるであろうという仮説を立てた。この可能性を証明するために、ＨＭＧＢ１のボックスＡ、ＨＭＧＢ１及びスクランブルプラスミドをトランスフェクションされた細胞を、Ｈ２Ｏ２及びメチルメタンスルホン酸（ＭＭＳ）を含むＤＮＡ損傷剤で処理した。特に、ＤＮＡ損傷剤処理下での細胞生存率を評価するために、ＭＴＴアッセイを用いた。細胞は、９６ウェルプレートに１００μｌで４０００個（４００００ｃｅｌｌ／ｍｌ）播種した。２４時間後にプラスミドをトランスフェクションした後、細胞をＣＯ２インキュベーターにおいて、濃度を上げたＭＭＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）（０～２ｍＭ）を含む培地で１時間処理し、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）（０～２５０μＭ）で２４時間処理した。その後、ＭＭＳ又はＨ２Ｏ２を含む培地を、通常の作業用培地に交換した。細胞増殖は、処理後４８時間目にＭＴＴアッセイで測定した。データは、コントロール（ＤＮＡ損傷剤を含まない培地）の生存率を任意に１００％とし、細胞生存率で示した。ＤＮＡ損傷剤での細胞の処理は、ボックスＡ及びＨＭＧＢ１を過剰発現した細胞の細胞生存率がスクランブル細胞の生存率よりも顕著に高いことを示した（図７Ａ～Ｂ）。興味深いことに、ボックスＡの過剰発現は、ＨＭＧＢ１よりも細胞を保護した（図７Ａ～Ｂ）。さらに、ＭＴＴ及び細胞カウンティングアッセイは、ＨＭＧＢ１のボックスＡの細胞内での発現の増大がＤＮＡ損傷の防止の効果的且つ安全な方法であることを示唆した。
また、本開示は、ボックスＡ及びＨＭＧＢ１遺伝子の過剰発現がＤＮＡ損傷に対する細胞の耐性を増大させるであろうという仮説を立てた。この可能性を証明するために、ＨＭＧＢ１のボックスＡ、ＨＭＧＢ１及びスクランブルプラスミドをトランスフェクションされた細胞を、Ｈ２Ｏ２及びメチルメタンスルホン酸（ＭＭＳ）を含むＤＮＡ損傷剤で処理した。特に、ＤＮＡ損傷剤処理下での細胞生存率を評価するために、ＭＴＴアッセイを用いた。細胞は、９６ウェルプレートに１００μｌで４０００個（４００００ｃｅｌｌ／ｍｌ）播種した。２４時間後にプラスミドをトランスフェクションした後、細胞をＣＯ２インキュベーターにおいて、濃度を上げたＭＭＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）（０～２ｍＭ）を含む培地で１時間処理し、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）（０～２５０μＭ）で２４時間処理した。その後、ＭＭＳ又はＨ２Ｏ２を含む培地を、通常の作業用培地に交換した。細胞増殖は、処理後４８時間目にＭＴＴアッセイで測定した。データは、コントロール（ＤＮＡ損傷剤を含まない培地）の生存率を任意に１００％とし、細胞生存率で示した。ＤＮＡ損傷剤での細胞の処理は、ボックスＡ及びＨＭＧＢ１を過剰発現した細胞の細胞生存率がスクランブル細胞の生存率よりも顕著に高いことを示した（図７Ａ～Ｂ）。興味深いことに、ボックスＡの過剰発現は、ＨＭＧＢ１よりも細胞を保護した（図７Ａ～Ｂ）。さらに、ＭＴＴ及び細胞カウンティングアッセイは、ＨＭＧＢ１のボックスＡの細胞内での発現の増大がＤＮＡ損傷の防止の効果的且つ安全な方法であることを示唆した。
【0049】
実施例９
本開示は、ボックスＡ及びＨＭＧＢ１遺伝子の過剰発現がＤＭ患者等の加速された生物学的老化に苦しむ個体の治癒プロセスを改善するであろうという仮説を立てた。動物使用プロトコールは、チュラーロンコーン大学医学部のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）により承認された（承認番号：００６／２５６１、２０１８年９月）。Ｗｉｓｔａｒ系雄ラット（６週齢、１５０～１８０ｇ）を無作為に２群に分け、５０ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ，ＵＳＡ）に溶解されたＳＴＺ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ－Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）を６５ｍｇ／ｋｇ体重の単回用量で、及び５０ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー（２ｍＬ／ｋｇ体重）を腹腔内投与した（１３）。ＳＴＺ誘導７日後、ＦＢＳが２５０ｍｇ／ｄＬを超えたＳＴＺ誘導ラットを糖尿病群とし、ＦＢＳが１５０ｍｇ／ｄＬ以下のラットを非糖尿病群とした。
本開示は、ボックスＡ及びＨＭＧＢ１遺伝子の過剰発現がＤＭ患者等の加速された生物学的老化に苦しむ個体の治癒プロセスを改善するであろうという仮説を立てた。動物使用プロトコールは、チュラーロンコーン大学医学部のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）により承認された（承認番号：００６／２５６１、２０１８年９月）。Ｗｉｓｔａｒ系雄ラット（６週齢、１５０～１８０ｇ）を無作為に２群に分け、５０ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ，ＵＳＡ）に溶解されたＳＴＺ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ－Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）を６５ｍｇ／ｋｇ体重の単回用量で、及び５０ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー（２ｍＬ／ｋｇ体重）を腹腔内投与した（１３）。ＳＴＺ誘導７日後、ＦＢＳが２５０ｍｇ／ｄＬを超えたＳＴＺ誘導ラットを糖尿病群とし、ＦＢＳが１５０ｍｇ／ｄＬ以下のラットを非糖尿病群とした。
【0050】
８ｍｍの生検パンチを用いて、ラットの背部に２対の全層切除創を作り、シリコンリングで固定した（１４）。糖尿病及び非糖尿病ラットをさらに３群に分け、ナノコーティングされたＨＭＧＢ１のボックスＡプラスミド、ナノコーティングされたＰＣ、及びＮＳＳで処理した。ナノコーティングされたｐｃＤＮＡ３．１（＋）プラスミドコントロールを非処理コントロールとして用い、ＮＳＳをこの研究における標準的な創傷被覆材として示した。非糖尿病患者及び糖尿病患者の創傷に毎日被覆材を施し、１４日間それぞれの型の介入を行った。投与後０、３、５、７及び１４日目に創傷の面積を測定し、式：創傷閉鎖率＝［（創傷面積０日目－創傷面積ｎ日目）／創傷面積０日目］×１００（ｎ日目は３、５、７又は１４日目を表す）を用いて、創傷閉鎖率％で示した。完全治癒過程の１４日後、全てのラットを犠牲にし、創傷の領域を切除し、すぐに１０％ホルマリンバッファー内に採取し、組織学的及び免疫組織化学的な８－ＯＨｄＧの測定を行った。
【0051】
創傷の採取後、創傷を１０％中性緩衝ホルマリンで少なくとも４８時間固定した。その後、組織を脱水し、パラフィン包埋し、ミクロトームにより３μｍ厚の組織切片を作製した。その後、組織切片をＨ＆Ｅ及びギムザで染色し、それぞれ組織病理学的評価及び免疫細胞浸潤の評価を行った。病理組織学的評価は、２名の病理医により盲検で行われ、判断された。組織の肉芽形成及び再上皮化は、治癒した創傷の観察領域で調べられ、１＝正常組織、２＝成熟線維芽細胞、３＝未熟線維芽細胞、４＝軽い炎症、及び５＝肉芽組織を含む総合組織学スコアとして示した。
【0052】
３μｍのパラフィン包埋切片を脱パラフィンし、プロテイナーゼＫ（ＤＡＫＯ、ＣＡ）で２分間インキュベートすることにより抗原賦活を行った。組織切片を１：８０００希釈したポリクローナルヤギ抗８－ＯＨｄＧ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で処理し、次いでＨＲＰコンジュゲート抗ヤギ二次抗体（ＤＡＫＯ、ＣＡ）で処理した。また、創傷切片をヘマトキシリンで対比染色した。本開示は、マウスＤＭ創傷モデルの治癒プロセスの促進におけるＨＭＧＢ１のボックスＡプラスミド封入Ｃａ－Ｐナノ粒子の効果を試験した。マウスＤＭの試験結果を以下の表１に示す。
【0053】
糖尿病性創傷の閉鎖に対するＨＭＧＢ１のボックスＡプラスミド／Ｃａ－Ｐの効果を調べるために、固定した８ｍｍ切除創をＨＭＧＢ１のボックスＡプラスミド、ＰＣ又はＮＳＳのいずれかで１４日間毎日１回、局所的処理をした。プラスミドを標的細胞に送達するために、Ｚｈａｏらの以前の研究（２０１４）で行われたように、局所投与前に、各タイプのプラスミドをナノ粒子溶液でコーティングした（１５）。トランスフェクションに最も効果的なプラスミドとナノ粒子溶液との比率は、１０μｌのナノ粒子溶液に５μｇのプラスミドを入れたものであった。簡単に説明すると、０．５Ｍ塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）溶液（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳＡ）と５μｇのプラスミドＤＮＡとの混合溶液５０μｌからなるＣａ－Ｐナノ粒子溶液、及び０．０１Ｍ炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３）溶液（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳＡ）と０．０１Ｍリン酸二水素ナトリウム一水和物（ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ）溶液（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳＡ）との混合溶液５０μｌを調製した。３モル比のＣＯ３
２－／ＰＯ４（３１：１）を用いた。まず、１６μｌのＣａＣｌ２溶液とプラスミドＤＮＡを混合し、滅菌ｄＨ２Ｏを用いて最終容量を５０μｌに調整し、プラスミドＤＮＡ－カルシウム複合体を調製した。次に、プラスミドＤＮＡ－カルシウム複合体を、Ｎａ２ＣＯ３及びＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ溶液（１６μｌ）と滅菌ｄＨ２Ｏ（３４μｌ）の混合液５０μｌに添加した。ナノ粒子コーティングされたプラスミド溶液は、使用前に調製した。
【0054】
【表1】
【0055】
創傷後０、３、５、７、１０及び１４日目の糖尿病創傷の代表的な画像は、ＰＣ又はＮＳＳ処理の何れかと比較して、ＨＭＧＢ１のボックスＡプラスミドで処理した後の糖尿病創傷の面積がより小さいことを示した（図９Ａ）。コントロール処理群と比較して、ＨＭＧＢ１のボックスＡプラスミド処理は、特に５～７日目に創傷閉鎖の増大を示した（Ｐ＜０．０００１）（図９Ｂ）。ＨＭＧＢ１のボックスＡ処理では、成熟した線維芽細胞の数が多く、炎症が少なく（全体的等級付け）、ＰＣ処理又はＮＳＳ処理のレベルと比較して糖尿病創傷切片の免疫組織化学染色による８－ＯＨｄＧレベルが著しく低く（Ｐ＜０．００１）（表２）、平均組織学スコアを改善した。これらの試験は、ＨＭＧＢ１のボックスＡがＹｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰのレベルが低いＤＭ患者に特異的に創傷治癒を促進することを支持する。
【0056】
【表2】
【0057】
実施例１０
本開示は、ボックスＡ及びＨＭＧＢ１遺伝子の過剰発現が、過剰な熱等のＤＮＡ損傷因子に曝露された個体の治癒プロセスを改善すると仮定している。動物実験プロトコールは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎｉｍａｌｓ（ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｎｏ．８０２３，改訂１９７８）により発行されたＧｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓに従った。すべての動物実験は、チュラロンコン大学のＡｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（承認番号：０３／２０１９における００３／２５６２）に従って行った。この研究では、サンプルサイズの算出にプログラムＧ＊Ｐｏｗｅｒ３．１による一元配置分散分析（Ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）を用い、α誤差＝０．０５、パワー＝０．９５、エフェクトサイズｆ＝１、群数＝４とし、結果を、実験に用いた１６匹のラットからの約３２の創傷とした（１６）。１６匹の雄の８週齢Ｗｉｓｔａｒラット（１５０～１８０ｇ）を、Ｎａｍｕｒａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｎｔｅｒ （Ｂａｎｇｋｏｋ， Ｔｈａｉｌａｎｄ)から入手した。ラットは、１２時間の明暗周期で制御された環境下で７日間馴化され、標準的な餌と水を自由摂取させた。ＩＩ度熱傷の形成のために、ラットをイソフルランで麻酔し、背部皮膚を剃った。１００℃に加熱した幅１０ｍｍのアルミニウム棒を用いて、各ラットの背中に２つのＩＩ度熱傷を形成した。さらに、ラットを４群に分け、創傷に毎日、正常生理食塩水（ＮＳＳ）、スクランブル－ｆｌａｇプラスミド処理群（プラスミドコントロール群）、リン酸カルシウムナノ粒子処理群（コントロール群）、及びボックスＡプラスミド処理群で処理した。ナノコーティングｐｃＤＮＡ３．１（＋）（スクランブル）プラスミドコントロール及びリン酸カルシウムナノ粒子群は、非処理コントロールとして用い、ＮＳＳは本試験における標準創傷被覆材として示される。創傷面積は、ＮＩＨ ＩｍａｇｅＪ分析ツールを用いて、創傷後０、７、１４、２１及び２８日目に測定し、０日目に対する創傷収縮率として示した。全てのラットを２８日後に安楽死させ、創傷組織を切除し、更なる評価のために直ちに１０％ホルマリンバッファーに回収した。ＨＭＧＢ１のボックスＡタンパク質の群において、創傷後７日目から２８日目に、正常生理食塩水、スクランブルプラスミド及びリン酸カルシウムナノ粒子処理群と比較して、有意な熱傷の閉鎖率を示し、特に１０～２１日目に顕著な閉鎖率（Ｐ＜０．００１）を示した。一方、プラスミドコントロール処理された創傷、リン酸カルシウムナノ粒子処理された創傷及び正常生理食塩水処理された創傷の間では、各時点において顕著な差は見られなかった。
本開示は、ボックスＡ及びＨＭＧＢ１遺伝子の過剰発現が、過剰な熱等のＤＮＡ損傷因子に曝露された個体の治癒プロセスを改善すると仮定している。動物実験プロトコールは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎｉｍａｌｓ（ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｎｏ．８０２３，改訂１９７８）により発行されたＧｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓに従った。すべての動物実験は、チュラロンコン大学のＡｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（承認番号：０３／２０１９における００３／２５６２）に従って行った。この研究では、サンプルサイズの算出にプログラムＧ＊Ｐｏｗｅｒ３．１による一元配置分散分析（Ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）を用い、α誤差＝０．０５、パワー＝０．９５、エフェクトサイズｆ＝１、群数＝４とし、結果を、実験に用いた１６匹のラットからの約３２の創傷とした（１６）。１６匹の雄の８週齢Ｗｉｓｔａｒラット（１５０～１８０ｇ）を、Ｎａｍｕｒａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｎｔｅｒ （Ｂａｎｇｋｏｋ， Ｔｈａｉｌａｎｄ)から入手した。ラットは、１２時間の明暗周期で制御された環境下で７日間馴化され、標準的な餌と水を自由摂取させた。ＩＩ度熱傷の形成のために、ラットをイソフルランで麻酔し、背部皮膚を剃った。１００℃に加熱した幅１０ｍｍのアルミニウム棒を用いて、各ラットの背中に２つのＩＩ度熱傷を形成した。さらに、ラットを４群に分け、創傷に毎日、正常生理食塩水（ＮＳＳ）、スクランブル－ｆｌａｇプラスミド処理群（プラスミドコントロール群）、リン酸カルシウムナノ粒子処理群（コントロール群）、及びボックスＡプラスミド処理群で処理した。ナノコーティングｐｃＤＮＡ３．１（＋）（スクランブル）プラスミドコントロール及びリン酸カルシウムナノ粒子群は、非処理コントロールとして用い、ＮＳＳは本試験における標準創傷被覆材として示される。創傷面積は、ＮＩＨ ＩｍａｇｅＪ分析ツールを用いて、創傷後０、７、１４、２１及び２８日目に測定し、０日目に対する創傷収縮率として示した。全てのラットを２８日後に安楽死させ、創傷組織を切除し、更なる評価のために直ちに１０％ホルマリンバッファーに回収した。ＨＭＧＢ１のボックスＡタンパク質の群において、創傷後７日目から２８日目に、正常生理食塩水、スクランブルプラスミド及びリン酸カルシウムナノ粒子処理群と比較して、有意な熱傷の閉鎖率を示し、特に１０～２１日目に顕著な閉鎖率（Ｐ＜０．００１）を示した。一方、プラスミドコントロール処理された創傷、リン酸カルシウムナノ粒子処理された創傷及び正常生理食塩水処理された創傷の間では、各時点において顕著な差は見られなかった。
【0058】
実施例１１
本開示は、２．５μＭのエトポシドにより誘導された細胞の細胞老化に対するボックスＡの若返り効果を示すことによって、生物学的老化細胞を若返らせるＨＭＧＢ１のボックスＡの効果を示した。ＨＫ２細胞に対して２．５μＭのエトポシドで７２時間の前処理を行った。エトポシドを用いて以前に記載されているように（１７）、細胞老化を誘導した。７２時間後、リポフェクタミン３０００を用いて、ＨＭＧＢ１のボックスＡ又はＰＣプラスミド（プラスミドの最終濃度、２５００ｎｇ／ｍｌ）を細胞にトランスフェクションし、４８時間インキュベートした。エトポシドの前処理が、コントロール、スクランブル及びボックスＡのトランスフェクション群と比較して、細胞形状の肥大化及び扁平化、増殖能の低下等の老化細胞の特徴をもつ細胞密度に影響を与えることが代表的な細胞画像から示された。β－ガラクトシダーゼ（ＳＡ－β－ｇａｌ）は、製造者の指示に従って、ＳＡ－β－ｇａｌ染色キット（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて、以前に記載されているように評価した（１８）。ＳＡ－β－ｇａｌ陽性染色細胞は、ボックスＡプラスミドをトランスフェクションすると顕著に低減したが、β－ｇａｌ陽性細胞はスクランブルプラスミドで逆転させると高いレベルを維持した（図１１Ａ）。
本開示は、２．５μＭのエトポシドにより誘導された細胞の細胞老化に対するボックスＡの若返り効果を示すことによって、生物学的老化細胞を若返らせるＨＭＧＢ１のボックスＡの効果を示した。ＨＫ２細胞に対して２．５μＭのエトポシドで７２時間の前処理を行った。エトポシドを用いて以前に記載されているように（１７）、細胞老化を誘導した。７２時間後、リポフェクタミン３０００を用いて、ＨＭＧＢ１のボックスＡ又はＰＣプラスミド（プラスミドの最終濃度、２５００ｎｇ／ｍｌ）を細胞にトランスフェクションし、４８時間インキュベートした。エトポシドの前処理が、コントロール、スクランブル及びボックスＡのトランスフェクション群と比較して、細胞形状の肥大化及び扁平化、増殖能の低下等の老化細胞の特徴をもつ細胞密度に影響を与えることが代表的な細胞画像から示された。β－ガラクトシダーゼ（ＳＡ－β－ｇａｌ）は、製造者の指示に従って、ＳＡ－β－ｇａｌ染色キット（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて、以前に記載されているように評価した（１８）。ＳＡ－β－ｇａｌ陽性染色細胞は、ボックスＡプラスミドをトランスフェクションすると顕著に低減したが、β－ｇａｌ陽性細胞はスクランブルプラスミドで逆転させると高いレベルを維持した（図１１Ａ）。
【0059】
さらに、本開示は、ＨＫ２細胞において、老化関連細胞周期阻害因子であるｐ１６ＩＮＫ４Ａ及びγＨ２ＡＸのタンパク質発現を試験した（１９）。その結果、２．５μＭエトポシドは、ＰＣ、ＨＭＧＢ１のボックスＡをトランスフェクションした細胞、及びコントロールと比較して、ｐ１６ＩＮＫ４Ａ及びγＨ２ＡＸの発現を増大させることを示した。エトポシド処理後にＨＭＧＢ１のボックスＡを受けた細胞のｐ１６ＩＮＫ４Ａ及びγＨ２ＡＸのレベルは、エトポシド処理群よりも有意に低かった（図１１Ｂ）。
【0060】
実施例１２
ＨＭＧＢ１のボックスＡペプチドのゲノム安定化の役割を、細胞透過性ペプチド等のペプチド導入システムで実現した（２０）。ここで、ＩＭＴ－Ｐ８は細胞透過性ペプチドである（２１）。ＩＭＴ－Ｐ８－ボックスＡペプチド（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）の効果を評価するために、細胞を０．２５μＭの濃度のＩＭＴ－Ｐ８－ボックスＡペプチドを含む培地で２時間処理した。その後、１×ＰＢＳで洗浄し、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）で２４時間処理した。その後、通常の培地に交換し、細胞を３７℃で４８時間インキュベートした。最後に、細胞生存率をマイクロプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて測定した。図１９は、ＩＭＴ－Ｐ８－ボックスＡペプチドで処理された細胞がコントロール細胞よりもＨ２Ｏ２とのインキュベート後の細胞生存率を増大させることを示す。
ＨＭＧＢ１のボックスＡペプチドのゲノム安定化の役割を、細胞透過性ペプチド等のペプチド導入システムで実現した（２０）。ここで、ＩＭＴ－Ｐ８は細胞透過性ペプチドである（２１）。ＩＭＴ－Ｐ８－ボックスＡペプチド（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）の効果を評価するために、細胞を０．２５μＭの濃度のＩＭＴ－Ｐ８－ボックスＡペプチドを含む培地で２時間処理した。その後、１×ＰＢＳで洗浄し、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）で２４時間処理した。その後、通常の培地に交換し、細胞を３７℃で４８時間インキュベートした。最後に、細胞生存率をマイクロプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて測定した。図１９は、ＩＭＴ－Ｐ８－ボックスＡペプチドで処理された細胞がコントロール細胞よりもＨ２Ｏ２とのインキュベート後の細胞生存率を増大させることを示す。
【0061】
本開示では、多くの病態で健康悪化を引き起こすゲノム不安定性のモニタリング及び防止に有望な初めてのゲノム安定化バイオマーカーであるＹｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰと、医薬品であるＨＭＧＢ１のボックスＡとを報告した。まず、Ｐｈｙ－ＲＩＮＤ－ＥＤＳＢ又はＹｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰが高齢者及びＤＭ患者で減少するヒト特有のエピゲノムマーカーであることを報告した。第二に、我々は、ＨＭＧＢ１がＹｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰを生成することを証明した。第三に、Ｙｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰはＤＮＡ鎖の長距離シスでの安定性を増大するため、ＨＭＧＢ１のボックスＡが内因性ＤＮＡ損傷及びＤＤＲを低減でき、ＤＮＡ損傷因子に対する細胞耐性を増大できる。ＨＭＧＢ１のボックスＡは、ＤＭラット及び熱傷における創傷治癒の遅延を修正するために用いられた。最後に、ＨＭＧＢ１のボックスＡは、老化細胞を若返らせるために使用された。
【0062】
以前の研究で、Ｙｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰと生物学的老化との間の逆相関が酵母において非常に強いことが示された（４）。ここで、ヒトにおいても、生物学的老化ＤＮＡを有することが知られている高齢者及びＤＭ患者において、強い相関が証明された。ＤＮＡ損傷は、高齢者や加齢に伴うＮＣＤに共通して見られる（２２、２３）。従って、Ｙｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰは、ＮＣＤ患者の生物学的年齢を決定するための有効なバイオマーカーとなり得る。ここで、本開示は、ＨＭＧＢ１のゲノム安定化機能がＹｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰによって媒介されることを示した。ＨＭＧＢ１は、ＤＮＡを曲げ、二本鎖ＤＮＡを変性に対して安定化させる能力を有している（２４）。これらの２つの性質は、Ｙｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰがＨＭＧＢ１によって生成されるという本開示の知見を支持するものであった。さらに、トポイソメラーゼによって生成されるＥＤＳＢと同様に、Ｙｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰはねじれ力を緩和することにより真核生物のゲノムを安定化し、その結果、二本鎖ＤＮＡを変性に対して安定化させ得る。ＨＭＧＢ１のボックスＡは、内因性ＤＮＡ損傷を低減するだけでなく、ＤＮＡ損傷因子に対する細胞耐性を向上する。Ｙｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰのギャップ構造によってねじれ力を緩和することで、ＤＮＡの安定性を向上するはずである。ボックスＡがＨＭＧＢ１タンパク質全体よりも効率よくゲノムを安定化することは興味深い。一つの可能性として、ＨＭＧＢ１が核内と細胞外の両方で多機能なタンパク質であることが挙げられる（２６）。ボックスＢ及びＣの末端の存在は、炎症等の他の役割を果たすように分子が分離するはずである。それでも、ボックスＢ及びＣの末端の除外は、ゲノム安定化に対するＨＭＧＢ１のボックスＡの役割を特定する助けとなった。
【0063】
Ｙｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰは、ＤＳＢ誘導イベント後、グローバルＤＳＢ修復により減少することが知られている（４）。従って、ＤＮＡ損傷因子に曝露された細胞の遅延ゲノム不安定化機構は、Ｙｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰの減少が関与する可能性があり、これがＨＭＧＢ１のボックスＡが熱傷治癒を促進する理由を説明できる可能性がある。本開示は、分子設計されたＨＭＧＢ１のボックスＡがＹｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰの生成を介して真核生物のゲノムを安定化できることを示した。本開示は、ＨＭＧＢ１のボックスＡのゲノムを安定化特性が内因性ＤＮＡ損傷の低減、ＤＤＲの低減、ＤＮＡ損傷因子に対する細胞耐性の増大、細胞増殖の促進、ＤＭ患者の組織治癒プロセスの促進、熱傷の組織治癒プロセスの促進、及び老化細胞の若返りを含む多くの応用につながることを実証した。Ｙｏｕｔｈ－ＤＮＡ－ＧＡＰの低レベルにより引き起こされる他のＮＣＤの場合、本開示は、そのようなＮＣＤを治療するためのゲノム安定化分子としてＨＭＧＢ１のボックスＡを使用できる可能性がある。
【0064】
本開示は、他の特定の形態で具体化されてもよく、上述の唯一の実施形態に限定されないことが理解される。しかしながら、当業者が容易に想到するような開示された概念の変更及び均等物は、添付される特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
【0065】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【配列表】
【国際調査報告】