ホーム > 特許ランキング > ユニバーシティ オブ サリー
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-05-25
(54)【発明の名称】単球
(51)【国際特許分類】
G01N 33/53 20060101AFI20230518BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20230518BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20230518BHJP
C12N 5/0786 20100101ALI20230518BHJP
C12Q 1/04 20060101ALI20230518BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20230518BHJP
【ＦＩ】
G01N33/53 Y
C12N15/12
C07K16/28
C12N5/0786
C12Q1/04
C12N15/13 ZNA
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022561151
(86)(22)【出願日】2021-04-09
(85)【翻訳文提出日】2022-11-28
(86)【国際出願番号】 GB2021050869
(87)【国際公開番号】W WO2021205179
(87)【国際公開日】2021-10-14
(31)【優先権主張番号】2005274.2
(32)【優先日】2020-04-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】595042184
【氏名又は名称】ユニバーシティ オブ サリー
(74)【代理人】
【識別番号】110000671
【氏名又は名称】ＩＢＣ一番町弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】エストラーダ，フェルナンド オニッシー マルティネズ
(72)【発明者】
【氏名】コンベス，セオ ウィリアム
【テーマコード（参考）】
4B063
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B063QA18
4B063QQ02
4B063QQ08
4B063QQ79
4B063QR48
4B063QR72
4B063QR77
4B063QX02
4B065AA92X
4B065AA94X
4B065CA46
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA42
4H045DA76
4H045EA50
4H045EA60
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、新規なパン－単球(pan-monocyte)／パン－単球由来細胞(pan-monocyte-derived cell)バイオマーカー、および当該マーカーに免疫特異的な抗体の使用に関するものである。本発明は、上記マーカーおよび抗体に基づいて、血液などの生体試料からヒトの単球および単球由来細胞を単離、検出する方法にも及ぶ。
【選択図】図６Ｂ
【選択図】図６Ｂ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
生体試料から単球および／または単球由来細胞を単離するための、コロニー刺激因子１受容体（ＣＳＦ－１Ｒ）、またはその変異体もしくは断片に結合する、抗体もしくはその抗原結合断片の使用。
【請求項2】
前記生体試料がヒトまたはマウスの生体試料である、請求項１に記載の抗体もしくはその抗原結合断片の使用。
【請求項3】
前記生体試料が組織または生体液である、請求項１または２に記載の抗体もしくはその抗原結合断片の使用。
【請求項4】
前記生体試料が血液である、請求項１～３のいずれか１項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片の使用。
【請求項5】
前記単球由来細胞がマクロファージまたは骨髄系樹状細胞である。請求項１～４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項6】
前記単離は蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、磁気活性化細胞分離または浮力活性化細胞分離の使用を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項7】
前記磁気活性化細胞分離が免疫磁気細胞分離またはアフィニティー磁気細胞分離である、請求項６に記載の使用。
【請求項8】
前記ＣＳＦ－Ｒ１は、配列番号：１に実質的に記載されるアミノ酸配列、またはその変異体もしくは断片を含むまたはから構成される、請求項１～７のいずれか１項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片の使用。
【請求項9】
前記抗体またはその抗原結合断片は下記を単離するために使用される、請求項１～８のいずれか１項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片の使用：ｉ）ＣＤ１４陽性およびＣＤ１６陽性単球；
ｉｉ）ＣＤ１４陰性およびＣＤ１６陽性単球；
ｉｉｉ）ＣＤ１４陽性およびＣＤ１６陰性単球；および／または
ｉｖ）ＣＤ１４陰性およびＣＤ１６陰性単球由来骨髄系樹状細胞。
【請求項10】
前記抗体またはその抗原結合断片は下記を単離するために使用される、請求項１～９のいずれか１項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片の使用：ｉ）ＣＤ１４陽性およびＣＤ１６陽性単球；
ｉｉ）ＣＤ１４陰性およびＣＤ１６陽性単球；
ｉｉｉ）ＣＤ１４陽性およびＣＤ１６陰性単球；および
ｉｖ）ＣＤ１４陰性およびＣＤ１６陰性単球由来骨髄系樹状細胞。
【請求項11】
ｉ）単球および／または単球由来細胞を含む生体試料を、請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片と接触させ；さらにｉｉ）前記抗体またはその抗原結合断片に結合する生体試料中に存在する単球および／または単球由来細胞を回収することにより、単球および／または単球由来細胞を単離する、
ことを有する、生体試料から単球および／または単球由来細胞を単離する方法。
【請求項12】
前記方法は下記を単離するために使用される、請求項１１に記載の方法：ｉ）ＣＤ１４陽性およびＣＤ１６陽性単球；
ｉｉ）ＣＤ１４陰性およびＣＤ１６陽性単球；
ｉｉｉ）ＣＤ１４陽性およびＣＤ１６陰性単球；および／または
ｉｖ）ＣＤ１４陰性およびＣＤ１６陰性単球由来骨髄系樹状細胞。
【請求項13】
前記方法は下記を単離するために使用される、請求項１１または１２に記載の方法：ｉ）ＣＤ１４陽性およびＣＤ１６陽性単球；
ｉｉ）ＣＤ１４陰性およびＣＤ１６陽性単球；
ｉｉｉ）ＣＤ１４陽性およびＣＤ１６陰性単球；および
ｉｖ）ＣＤ１４陰性およびＣＤ１６陰性単球由来骨髄系樹状細胞。
【請求項14】
前記方法は蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、磁気活性化細胞分離または浮力活性化細胞分離の使用を含む、請求項１１～１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項15】
前記磁気活性化細胞分離が免疫磁気細胞分離またはアフィニティー磁気細胞分離である、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記方法はＦＡＣＳの使用を含み、前記方法は下記を有する、請求項１１～１４のいずれか１項に記載の方法：ｉ）単球および／または単球由来細胞を含む生体試料を、請求項１～１０のいずれか１項に記載の蛍光標識された抗体またはその抗原結合断片と接触させ；さらに
ｉｉ）前記生体試料中に存在する細胞をその蛍光に基づいて選別し；さらに
ｉｉｉ）前記蛍光標識された抗体に結合する前記生体試料中に存在する単球および／または単球由来細胞を回収することにより、前記生体試料中に存在する単球および／または単球由来細胞を単離する。
【請求項17】
前記生体試料が組織または生体液である、請求項１１～１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項18】
ｉ）単球および／または単球由来細胞を含む生体試料を、請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片と接触させ；さらにｉｉ）検出手段により前記生体試料中に存在する単球および／または単球由来細胞を検出する、
ことを有する、生体試料中に存在する単球および／または単球由来細胞を検出する方法。
【請求項19】
前記検出手段が免疫染色またはＦＡＣＳを含む、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、単球および単球由来細胞に関し、特に、下記に限定されるものではないが、新規なパン－単球／パン－単球由来細胞(pan-monocyte/pan-monocyte-derived cell)バイオマーカーおよび当該マーカーに免疫特異的な抗体の使用に関する。本発明は、上記マーカーおよび抗体に基づいて、血液などの生体試料のヒトの単球および単球由来細胞を単離および検出する方法にも及ぶ。
【背景技術】
【0002】
単球は、ヒトの白血球（すなわち、ロイコサイト）の約１０％を占め、マクロファージや骨髄系樹状細胞(myeloid lineage dendritic cells)へと分化することができる。ヒトの血液中の単球は、その表現型受容体に基づき、少なくとも３つのサブクラスが存在する。第一に、クラシカル単球(classical monocyte)は、ＣＤ１４細胞表面受容体の高発現によって特徴づけられる（すなわち、ＣＤ１４＋＋ＣＤ１６－単球）。第二に、ノンクラシカル単球(non-classical monocyte)は、ＣＤ１４の低レベル発現およびＣＤ１６受容体の追加の共発現(additional co-expression)を示す（すなわち、ＣＤ１４＋＋ＣＤ１６＋＋単球）。第三に、インターメディエイト単球(intermediate monocyte)は、ＣＤ１４の高レベル発現およびＣＤ１６の低レベル発現を示す（すなわち、ＣＤ１４＋＋ＣＤ１６＋単球）。
【0003】
単球数は、全血球数の一部であり、白血球中の単球の割合（％）としてまたは絶対数としてのいずれかで表される。どちらも有用であるが、これらの細胞は単球のサブセットを決定して初めて有効な診断手段となる。単球増加症は、末梢血中の単球が過剰な状態であり、慢性炎症、免疫介在性疾患、動脈硬化症等の様々な病態を示唆することがある。敗血症ではＣＤ１４＋＋ＣＤ１６＋＋の単球が多く見られ、動脈硬化の分野では、多数のＣＤ１４＋＋ＣＤ１６＋のインターメディエイト単球がリスクのある集団における心血管イベントの予測因子であることが示されている。
【0004】
現在、血液からパン－単球を分離するためには、ＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ５６、ＣＤ１２３、およびＧｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ Ａに結合する複数の異なる抗体を用いたネガティブセレクションの手法を使用する必要がある。
【0005】
ＣＤ１４及びＣＤ１６マーカーは、ゲノム中の系統決定サイトカイン受容体(lineage determining cytokine receptors)の近傍にある(Goyert et al., 1988; Mahaweni et al., 2018)。しかしながら、本発明者らは、それらは、実際には、単球の個体発生を完全に捕らえることができない下流マーカーであると考える。多数の研究が、この分類を使用して、これらの細胞のトランスクリプトーム、プロテオーム及び機能的特性を特徴付けている(Martinez, 2009)。単球のサブセットもまた、多くの病態で研究されている。サブセットを同定するために、ゲート戦略は、好中球を排除する単球の形状、ＣＤ１４およびＣＤ１６の発現、ならびにリンパ系細胞の排除に着目する。しかしながら、これらのゲートと除外基準との組み合わせは、臨床の場では大きな限界と再現性の低さをもたらしている。
【発明の概要】
【0006】
したがって、生体試料からの単球の分離および検出を容易にするまたは改善する、改良された単球マーカーや抗体が強く求められている。
【0007】
本発明は、従来技術の問題を克服しようとする本発明者らの研究に起因する。
【0008】
本発明者らは、ヒト血液中の系統決定受容体(lineage determining receptors)の共発現(co-expression)を調査した。その結果、驚くべきことに、ＣＳＦ－１Ｒがパン－単球マーカーとして使用できる可能性があることを見出した。本発明者らはＣＳＦ－１Ｒ抗体を用いてすべての単球を分離することができたが、これは、ＣＤ１４またはＣＤ１６というマーカーだけでは達成できず、また、追加の抗体を必要としなかった。本発明者らは、ＣＳＦ－１Ｒが、正確な単離、定量を可能にする主な単球マーカーとして使用できること、また、個体発生の観点から新規の単球を見ることができることを示した。さらに、本発明者らは、ＣＤ１４またはＣＤ１６を発現せず、したがって現在の単離および検出アプローチを用いては検出されないであろうＣＳＦ１Ｒ＋細胞の第４のサブセットを同定した。
【0009】
ＣＳＦ－１Ｒに結合する抗体は公知である。例えば、エマクトズマブ(emactuzumab)は、ＵＳ ２０１１／０１６５１５６号に記載されているようなヒト化モノクローナル抗体であり、ＣＳＦ－１Ｒに結合し、多くの症状の治療に利用されてきた。しかしながら、今日まで、単球の検出および単離にこの抗体を使用した記録はない。本発明者らは、驚くべきことに、ＣＳＦ－１Ｒのみに結合する抗体を用いて、生体試料中に存在するすべての単球集団をプルダウンすることができ、したがって、他の抗体や単離工程の使用を必要としないパン－単球単離抗体として使用することができることを示した。
【0010】
したがって、本発明の第１の側面によれば、生体試料から単球および／または単球由来細胞を単離するための、コロニー刺激因子１受容体(colony stimulating factor 1 receptor)（ＣＳＦ－１Ｒ）、またはその変異体もしくは断片に結合する抗体またはその抗原結合断片の使用が提供される。
【0011】
単球由来細胞は、マクロファージおよび／または骨髄系樹状細胞(myeloid lineage dendritic cell)であってもよい。好ましくは、単球由来細胞は、マクロファージである。好ましくは、単球由来細胞は、骨髄系樹状細胞である。
【0012】
好ましくは、生体試料は、ヒトまたはマウスの生体試料である。最も好ましくは、生体試料は、ヒトの生体試料である。
【0013】
生体試料は、組織であってもよいし、生体液(biological fluid)であってもよい。
【0014】
生体試料は、単球が得られる対象から得られるものであれば、どのようなものであってもよい。さらに、試料は、血液、血漿、血清、髄液、尿、汗、唾液、涙、乳房吸引液、母乳、前立腺液、精液、膣液、便、頸部擦過、サイテ(cytes)、羊水、眼内液、粘液、呼気中の水分、動物組織、細胞溶解液、腫瘍組織、毛髪、皮膚、頬擦り片(buccal scrapings)、リンパ、間質液、爪、骨髄、軟骨、プリオン、骨粉、耳垢、リンパ、肉芽、癌生検またはそれらの組合せであってもよい。
【0015】
試料は、液体吸引物であってもよい。例えば、試料は、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）、腹水、胸膜洗浄液、腹膜洗浄液または心嚢洗浄液であってもよい。
【0016】
一実施形態では、生体試料は、組織、例えば、癌生検または肉芽腫などを含む。組織は、本方法を実施する前にさらに処理されてもよい。例えば、組織は、ＣＳＦ－Ｒ１を分解することなく、酵素的に消化されてもよい。
【0017】
好ましい一実施形態では、生体試料は、血液試料を含む。血液は、静脈血または動脈血であってよい。血液サンプルは、直ちにアッセイされてもよい。または、血液サンプルは、本方法を実施する前に、低温で、例えば、冷蔵庫でまたは凍結して保存されてもよい。または、血液サンプルは、本方法が実施される前に、室温、例えば、１８～２２℃の間で保存されてもよい。血液サンプルは、血清を含むものであってもよい。血液サンプルは、血漿を含むものであってもよい。しかしながら、好ましくは、検出は全血で実施され、最も好ましくは、血液サンプルは末梢血である。本方法は、少なくとも１ｍｌの血液、少なくとも５００μｌの血液、少なくとも４００μｌの血液、少なくとも４００μｌの血液、少なくとも３００μｌの血液、少なくとも２００μｌの血液、少なくとも１００μｌの血液、または少なくとも５０μｌの血液で実施されてもよい。
【0018】
第１の側面の使用が実行される前に、血液をさらに処理してもよい。例えば、クエン酸塩（クエン酸ナトリウムなど）、ヒルジン、ヘパリン、ＰＰＡＣＫ、またはフッ化ナトリウムなどの抗凝固剤を添加してもよい。このように、試料採取容器は、血液サンプルが凝固するのを防ぐために、抗凝固剤を含んでもよい。
【0019】
一実施形態では、細胞が単球である場合、好ましくは、試料は血液サンプルである。一実施形態では、細胞が単球由来細胞である場合、好ましくは、試料は組織サンプルである。
【0020】
当業者は、コロニー刺激因子１受容体（ＣＳＦ－Ｒ１）が、Ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ １１５(Cluster of Differentiation 115)（ＣＤ１１５）またはマクロファージコロニー刺激因子受容体(macrophage colony-stimulating factor receptor)（Ｍ－ＣＳＦＲ）とも呼ばれ得ることを理解するであろう。
【0021】
一実施形態では、ＣＳＦ－Ｒ１は、本明細書において配列番号：１として提供される、ＧｅｎｅＢａｎｋ ＩＤ １４３６によって、以下のように提供される：
【0022】
【化1】
【0023】
したがって、ＣＳＦ－Ｒ１は、好ましくは、実質的に配列番号：１に示されるようなアミノ酸配列、またはその変異体もしくは断片を含む、またはこれから構成される。
【0024】
単球は、ＣＤ１４陽性および／またはＣＤ１６陽性であってもよい。
【0025】
好ましくは、抗体は、すべてのサブクラスの単球を単離することができる。
【0026】
本発明者らは、特に驚くべきことに、単球由来の骨髄系樹状細胞である、ＣＤ１４陰性およびＣＤ１６陰性の細胞が、抗体を用いて単離または検出され得ることを観察した。それゆえ、好ましくは、抗体またはその抗原結合断片は、ＣＤ１４陰性およびＣＤ１６陰性の単球由来骨髄系樹状細胞を単離するために使用され得る。
【0027】
ＣＤ１４陰性およびＣＤ１６陰性の単球由来の骨髄系樹状細胞は、ＣＤ１Ｃの発現によって定義することができる。
【0028】
ＣＤ１Ｃは、皮質胸腺細胞抗原(Cortical Thymocyte Antigen)とも呼ばれることがある。
【0029】
したがって、好ましくは、抗体、またはその抗原結合断片は、以下の単離のために使用されてもよい：
ｉ）ＣＤ１４陽性およびＣＤ１６陽性単球；
ｉｉ）ＣＤ１４陰性およびＣＤ１６陽性単球；
ｉｉｉ）ＣＤ１４陽性およびＣＤ１６陰性単球；および／または
ｉｖ）ＣＤ１４陰性およびＣＤ１６陰性単球由来骨髄系樹状細胞。
ｉ）ＣＤ１４陽性およびＣＤ１６陽性単球；
ｉｉ）ＣＤ１４陰性およびＣＤ１６陽性単球；
ｉｉｉ）ＣＤ１４陽性およびＣＤ１６陰性単球；および／または
ｉｖ）ＣＤ１４陰性およびＣＤ１６陰性単球由来骨髄系樹状細胞。
【0030】
好ましくは、抗体、またはその抗原結合断片は、以下の単離のために使用されてもよい：
ｉ）ＣＤ１４陽性およびＣＤ１６陽性単球；
ｉｉ）ＣＤ１４陰性およびＣＤ１６陽性単球；
ｉｉｉ）ＣＤ１４陽性およびＣＤ１６陰性単球；および
ｉｖ）ＣＤ１４陰性およびＣＤ１６陰性単球由来骨髄系樹状細胞。
ｉ）ＣＤ１４陽性およびＣＤ１６陽性単球；
ｉｉ）ＣＤ１４陰性およびＣＤ１６陽性単球；
ｉｉｉ）ＣＤ１４陽性およびＣＤ１６陰性単球；および
ｉｖ）ＣＤ１４陰性およびＣＤ１６陰性単球由来骨髄系樹状細胞。
【0031】
ゆえに、好ましくは、抗体、またはその抗原結合断片は、以下の単離のために使用されてもよい：
ｉ）ＣＤ１４陽性およびＣＤ１６陽性単球；
ｉｉ）ＣＤ１４陰性およびＣＤ１６陽性単球；
ｉｉｉ）ＣＤ１４陽性およびＣＤ１６陰性単球；および／または
ｉｖ）ＣＤ１４陰性、ＣＤ１６陰性およびＣＤ１Ｃ単球由来骨髄系樹状細胞(CD1C monocyte-derived myeloid lineage dendritic cell)。
ｉ）ＣＤ１４陽性およびＣＤ１６陽性単球；
ｉｉ）ＣＤ１４陰性およびＣＤ１６陽性単球；
ｉｉｉ）ＣＤ１４陽性およびＣＤ１６陰性単球；および／または
ｉｖ）ＣＤ１４陰性、ＣＤ１６陰性およびＣＤ１Ｃ単球由来骨髄系樹状細胞(CD1C monocyte-derived myeloid lineage dendritic cell)。
【0032】
ゆえに、好ましくは、抗体、またはその抗原結合断片は、以下の単離のために使用されてもよい：
ｉ）ＣＤ１４陽性およびＣＤ１６陽性単球；
ｉｉ）ＣＤ１４陰性およびＣＤ１６陽性単球；
ｉｉｉ）ＣＤ１４陽性およびＣＤ１６陰性単球；および
ｉｖ）ＣＤ１４陰性、ＣＤ１６陰性およびＣＤ１Ｃ陽性単球由来系骨髄樹状細胞(CD1C positive monocyte-derived lineage myeloid dendritic cell)。
ｉ）ＣＤ１４陽性およびＣＤ１６陽性単球；
ｉｉ）ＣＤ１４陰性およびＣＤ１６陽性単球；
ｉｉｉ）ＣＤ１４陽性およびＣＤ１６陰性単球；および
ｉｖ）ＣＤ１４陰性、ＣＤ１６陰性およびＣＤ１Ｃ陽性単球由来系骨髄樹状細胞(CD1C positive monocyte-derived lineage myeloid dendritic cell)。
【0033】
好ましくは、この使用は、他の抗体、またはその抗原結合断片の使用を含まない。
【0034】
第１の側面の使用は、蛍光活性化細胞選別(florescence-activated cell sorting)（ＦＡＣＳ）、磁気活性化細胞分離(magnetic activated cell separation)または浮力活性化細胞分離(buoyancy activated cell separation)によって実施されてもよい。このような方法は、当業者に知られているであろう。
【0035】
したがって、本使用は、蛍光体、磁性粒子、またはガラスマイクロバブルに結合された(conjugated)、抗体またはその抗原結合断片の使用を含んでいてもよい。
【0036】
好ましくは、本使用は、磁性粒子に結合した(conjugated)抗体またはその抗原結合断片の使用を含んでいてもよい。したがって、好ましくは、本使用は、免疫磁気細胞分離(immunomagnetic cell separation)またはアフィニティー磁気細胞分離(affinity magnetic cell separation)などの磁気活性化細胞分離を含んでいてもよい。このような方法は、当業者に知られているであろう。
【0037】
当業者であれば、免疫磁気分離が体液や培養細胞から効率的に細胞を分離できる実験ツールであることを理解するであろう。ＤＮＡ解析では、この技術とポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の併用が支持されているため、本技術はＰＣＲと組み合わせて使用することができる。適切な免疫磁気分離システムには、Ｄｙｎａｌシステム(Dynal [UK] Ltd., Wirral, Mersyside, UK; Dynal, Inc., Lake Success, NY)およびMiltenyi Biotech (Miltenyi Biotech Ltd., Bisley, Surrey, UK; Miltenyi Biotech Inc., Auburn, CA)によって製造されるＭＡＣＳシステムがある。
【0038】
当業者であれば、免疫磁気分離を用いて、抗体やレクチンを含む小さな磁化粒子、ビーズを付着させて生体分子を特異的に捕捉することにより、細胞培養液や体液中の細胞、タンパク質、および核酸を単離することができることを理解するだろう。これらのビーズは、標的生体分子に結合するようにコーティングされ、穏やかに分離され、洗浄を何度も繰り返すことで、磁場の強さと標的分子に基づいて区別できる超常磁性ビーズに結合した標的分子を得ることができる。次に、このビーズを溶出させて上清を回収した後、特異的標的生体分子の濃度を測定することができる。
【0039】
細胞集団の混合物を磁場中に置くと、細胞は超常磁性ビーズ、一例としてDynabeads（４．５－μｍ）に付着し、過剰な基質が除去されると標的抗原に結合して残る。Dynabeadsは、鉄を含むコアが生体分子の吸収を可能にするポリマーシェルの薄い層でコーティングされて構成される。上記ビーズは、第一の態様による抗体または抗原結合断片でコーティングされていてもよい；磁化ビーズコート材料間の結合は、細胞の培養がより望ましい場合にビーズから細胞を分離できるように、切断可能なＤＮＡリンカーであってよい。
【0040】
他の多くの市販のビーズは、分離の原理が同じである；しかしながら、磁場の存在および異なる強さは、細胞集団の分離の影響に基づいて、特定のサイズのビーズを必要とする可能性があるが、これは当業者には知られていることであろう。
【0041】
好ましくは、本使用は、ＦＡＣＳの使用を含み、ここで、前記使用は、以下を含む：
ｉ）単球および／または単球由来細胞を含む生体試料(biological sample)を、第１の態様の蛍光標識抗体またはその抗原結合断片と接触させ；および
ｉｉ）前記生体試料中に存在する細胞を、その蛍光に基づいて選別し；および
ｉｉｉ）前記蛍光標識された抗体に結合する前記生体試料中に存在する単球および／または単球由来細胞を回収し、それによって前記生体試料中に存在する単球および／または単球由来細胞を単離する。
ｉ）単球および／または単球由来細胞を含む生体試料(biological sample)を、第１の態様の蛍光標識抗体またはその抗原結合断片と接触させ；および
ｉｉ）前記生体試料中に存在する細胞を、その蛍光に基づいて選別し；および
ｉｉｉ）前記蛍光標識された抗体に結合する前記生体試料中に存在する単球および／または単球由来細胞を回収し、それによって前記生体試料中に存在する単球および／または単球由来細胞を単離する。
【0042】
当業者であれば、蛍光発光プロファイルおよび／または蛍光強度に基づいて細胞を選別することができ、これは使用する蛍光標識に依存し、当技術分野において既知であることを理解するであろう。
【0043】
好ましくは、本使用は、磁気細胞ソーティング(magnetic cell sorting)の使用を含み、前記使用は、以下を含む：
ｉ）単球および／または単球由来細胞を含む生体試料を、第１の態様の抗体またはその抗原結合断片で被覆された磁気ビーズと接触させ；および
ｉｉ）前記ｉ）から得られた試料を磁場中に置き、磁気ビーズに結合した単球および／または単球由来細胞を試料中に存在する他の細胞から分離し；
ｉｉｉ）前記試料を洗浄して、前記試料から他の細胞を除去し；および
ｉｉｉ）磁気ビーズに結合する前記生体試料中に存在する単球および／または単球由来細胞を回収し、それによって前記生体試料中に存在する単球および／または単球由来細胞を単離する。
ｉ）単球および／または単球由来細胞を含む生体試料を、第１の態様の抗体またはその抗原結合断片で被覆された磁気ビーズと接触させ；および
ｉｉ）前記ｉ）から得られた試料を磁場中に置き、磁気ビーズに結合した単球および／または単球由来細胞を試料中に存在する他の細胞から分離し；
ｉｉｉ）前記試料を洗浄して、前記試料から他の細胞を除去し；および
ｉｉｉ）磁気ビーズに結合する前記生体試料中に存在する単球および／または単球由来細胞を回収し、それによって前記生体試料中に存在する単球および／または単球由来細胞を単離する。
【0044】
本発明は、ＣＳＦ－１Ｒに対して免疫特異性を有する全抗体（すなわち、免疫グロブリン）、およびＣＳＦ－１Ｒに結合する対応する全長抗体の抗原結合断片または領域の双方に及ぶものである。
【0045】
好ましい実施形態では、抗体はハイブリドーマクローン番号９－４Ｄ２－１Ｅ４由来のもしくは誘導可能な抗体(an antibody derived or derivable from)である、または、抗体はハイブリドーマクローン番号１２－３Ａ３－１Ｂ１０由来のもしくは誘導可能な抗体(an antibody derived or derivable from)である。
【0046】
好ましい実施形態では、ヒト抗体は、エマクトズマブ(emactuzumab)であり、これは、ＲＧ７１５５とも呼ばれ、ＵＳ ２０１１／０１６５１５６号に定義されるＣＤ１１５結合抗体でありうる。
【0047】
好ましくは、抗体は、本明細書において以下のように提供される、配列番号：２の重鎖可変ドメインを含む。
【0048】
【化2】
【0049】
したがって、好ましくは、抗体またはその抗原結合断片は、実質的に配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン、またはその変異体もしくは断片を有する、または上記から構成される。
【0050】
好ましくは、抗体またはその抗原結合断片は、本明細書において以下のように提供される、配列番号：３のＣＤＲ３領域を有する重鎖可変ドメインを含む。
【0051】
【化3】
【0052】
したがって、好ましくは、抗体またはその抗原結合断片は、実質的に配列番号：３に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３領域を有する重鎖可変ドメイン、またはその変異体もしくは断片を有する、または上記から構成される。
【0053】
好ましくは、抗体またはその抗原結合断片は、本明細書において以下のように提供される、配列番号：４のＣＤＲ２領域を有する重鎖可変ドメインを含む。
【0054】
【化4】
【0055】
したがって、好ましくは、抗体またはその抗原結合断片は、実質的に配列番号：４に記載のアミノ酸配列を有するもしくは当該アミノ酸配列から構成されるＣＤＲ３領域を有する重鎖可変ドメイン、またはその変異体もしくは断片を有する、または上記から構成される。
【0056】
好ましくは、抗体またはその抗原結合断片は、本明細書において以下のように提供される、配列番号：５のＣＤＲ１領域を有する重鎖可変ドメインを含む。
【0057】
【化5】
【0058】
したがって、好ましくは、抗体またはその抗原結合断片は、実質的に配列番号：５に記載のアミノ酸配列を有するもしくは当該アミノ酸配列から構成されるＣＤＲ１領域を有する重鎖可変ドメイン、またはその変異体もしくは断片を有する、または上記から構成される。
【0059】
好ましくは、抗体は、本明細書において以下のように提供される、配列番号：６の軽鎖可変ドメインＶＬを含む。
【0060】
【化6】
【0061】
したがって、好ましくは、抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変ドメインは、実質的に配列番号：６に記載のアミノ酸配列、またはその変異体もしくは断片を有する、または上記から構成される。
【0062】
好ましくは、抗体またはその抗原結合断片は、本明細書において以下のように提供される、配列番号：７のＣＤＲ３領域を有する軽鎖可変ドメインを含む。
【0063】
【化7】
【0064】
したがって、好ましくは、抗体またはその抗原結合断片は、実質的に配列番号：７に記載のアミノ酸配列を有するもしくは当該アミノ酸配列から構成されるＣＤＲ３領域を有する軽鎖可変ドメイン、またはその変異体もしくは断片を有する。
【0065】
好ましくは、抗体またはその抗原結合断片は、本明細書において以下のように提供される、配列番号：８のＣＤＲ２領域を有する軽鎖可変ドメインを含む。
【0066】
【化8】
【0067】
したがって、好ましくは、抗体またはその抗原結合断片は、実質的に配列番号：８に記載のアミノ酸配列を有するもしくは当該アミノ酸配列から構成されるＣＤＲ２領域を有する軽鎖可変ドメイン、またはその変異体もしくは断片を有する。
【0068】
好ましくは、抗体またはその抗原結合断片は、本明細書において以下のように提供される、配列番号：９のＣＤＲ１領域を有する軽鎖可変ドメインを含む。
【0069】
【化9】
【0070】
したがって、好ましくは、抗体またはその抗原結合断片は、実質的に配列番号：９に記載のアミノ酸配列を有するもしくは当該アミノ酸配列から構成されるＣＤＲ１領域を有する軽鎖可変ドメイン、またはその変異体もしくは断片を有する。
【0071】
したがって、好ましい一実施形態では、抗体、またはその抗原結合断片は、本明細書において以下のように提供される、配列番号：１０の重鎖を含む。
【0072】
【化10】
【0073】
したがって、好ましくは、抗体、またはその抗原結合断片は、実質的に配列番号：１０に記載のアミノ酸配列を有するもしくは当該アミノ酸配列から構成される重鎖領域、またはその変異体もしくは断片を含む。
【0074】
したがって、好ましい一実施形態では、抗体、またはその抗原結合断片は、本明細書において以下のように提供される、配列番号：１１の軽鎖を含む。
【0075】
【化11】
【0076】
したがって、好ましくは、抗体、またはその抗原結合断片は、実質的に配列番号：１１に記載のアミノ酸配列を有するもしくは当該アミノ酸配列から構成される重鎖領域、またはその変異体もしくは断片を含む。
【0077】
本発明は、ＣＳＦ－１Ｒに対して免疫特異性を有する全抗体（すなわち、免疫グロブリン）、および対応する全長抗体の抗原結合断片または領域の双方に及ぶものである。
【0078】
抗体またはその抗原結合断片は、１価、２価または多価のいずれであってもよい。
【0079】
１価抗体は、重鎖（Ｈ）が軽鎖（Ｌ）とジスルフィド架橋(disulphide bridge)により結合した(associated)２量体（ＨＬ）である。２価抗体は、２つの二量体が少なくとも１つのジスルフィド架橋で結合した４量体（Ｈ２Ｌ２）である。また、例えば、複数の二量体を連結することにより、多価抗体を作製することも可能である。抗体分子の基本構造は、２本の同一の軽鎖と２本の同一の重鎖からなり、これらは非共有結合で結合し、ジスルフィド結合で連結することも可能である。各重鎖および軽鎖は、アミノ末端に約１１０アミノ酸の可変領域を有し、鎖の残りの部分に定常配列がある。可変領域は、いくつかの超可変領域、または相補性決定領域(Complementarity Determining Regions)（ＣＤＲｓ）を含み、これは、抗体分子の抗原結合部位を形成し、抗原、すなわちＣＳＦ－１Ｒ、またはその変異体もしくは断片（例えば、エピトープ）に対する特異性を決定する。重鎖と軽鎖のＣＤＲのいずれか側には、ＣＤＲを固定し方向付ける比較的保存されたアミノ酸の配列である、フレームワーク領域がある。抗体断片としては、二重特異性抗体(bi-specific antibody)（ＢｓＡｂ）またはキメラ抗原受容体(chimeric antigen receptor)（ＣＡＲ）がありえる。
【0080】
定常領域は、５つの重鎖配列（μ、γ、ζ、αまたはε）のうちの１つおよび２つの軽鎖配列（κまたはλ）のうちの１つから構成される。重鎖の定常領域配列は、抗体のアイソタイプおよび分子のエフェクター機能を決定する。
【0081】
好ましくは、抗体またはその抗原結合断片は、単離または精製される。
【0082】
好ましい一実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ポリクローナル抗体、またはその抗原結合断片を含む。抗体またはその抗原結合断片は、ウサギ、マウスまたはラットで作製されてもよい。
【0083】
他の好ましい実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片を含む。好ましくは、本発明の抗体は、ヒト抗体である。
【0084】
本明細書で使用する場合、「ヒト抗体」という用語は、ＣＳＦ－Ｒ１に対して免疫特異性を示す特定のヒト抗体に見られるのと実質的に同じ重鎖および軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列、またはその変異体もしくは断片を含む、モノクローナル抗体などの、抗体を意味し得る。重鎖または軽鎖ＣＤＲと実質的に同一のアミノ酸配列は、参照配列と比較した場合、かなりの量の配列同一性を示す。このような同一性は、特定のヒト抗体のアミノ酸配列を表すものとして明確に知られているかまたは認識可能である。実質的に同じ重鎖および軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列は、例えば、アミノ酸のわずかな修飾または保存的置換を有することができる。このようなヒト抗体は、ＣＳＦ－Ｒ１またはその変異体もしくは断片に選択的に結合するという機能を維持する。
【0085】
「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、例えば、ファージライブラリーによる、リンパ球による、またはハイブリドーマ細胞による生産などの組換え法によって生産された、実質的にまたは完全にヒトのＣＤＲアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体を含むことができる。
【0086】
「ヒト化抗体」という用語は、ヒトで自然に産生される抗体との類似性を高めるためにタンパク質配列が改変された非ヒト種（例えば、マウスやウサギ）由来の抗体を意味することができる。
【0087】
抗体は、組換え抗体であってもよい。「組換えヒト抗体」という用語は、組換えDNA技術を使用して製造されたヒト抗体を含み得る。
【0088】
「抗原結合領域」という用語は、その標的抗原、例えば、ＣＳＦ－Ｒ１、またはその変異体もしくは断片に対して特異的な結合親和性を有する抗体の領域を意味し得る。好ましくは、断片はエピトープである。結合領域は、超可変ＣＤＲまたはその機能的部分であってもよい。ＣＤＲの「機能的部分」という用語は、標的抗原に対して特異的な親和性を示すＣＤＲ内の配列を意味し得る。ＣＤＲの機能的部分は、ＣＳＦ－Ｒ１またはその断片に特異的に結合するリガンドを含んでいてもよい。
【0089】
「ＣＤＲ」という用語は、重鎖および軽鎖の可変領域における超可変領域を意味し得る。抗体の重鎖および軽鎖のそれぞれには、１、２、３、またはそれ以上のＣＤＲが存在する可能性がある。通常、各鎖には少なくとも３つのＣＤＲが存在し、これらが一緒に構成されると、抗原結合部位、すなわち抗原が結合するまたは特異的に反応する三次元結合部位が形成される。しかしながら、一部の抗体では、重鎖に４つのＣＤＲが存在する可能性が指摘されている。
【0090】
ＣＤＲの定義は、互いに比較した場合のアミノ酸残基の重複やサブセットを包含する。特定のＣＤＲまたはその機能的部分を包含する正確な残基番号は、ＣＤＲの配列やサイズに依存して変化するであろう。当業者は、抗体の可変領域アミノ酸配列が与えられれば、どの残基が特定のＣＤＲを構成しているかを日常的に決定することができる。
【0091】
抗体の「機能的断片」という用語は、機能的活性を保持する抗体の一部を意味し得る。機能的活性は、例えば、抗原結合活性または特異性であり得る。また、機能的活性は、例えば、抗体定常領域によって提供されるエフェクター機能であり得る。また、「機能的断片(functional fragment)」という用語は、例えば、ヒトモノクローナル抗体のプロテアーゼ消化または還元によって、および当業者に既知の組換えＤＮＡ法によって製造される断片を含むことを意図している。ヒトモノクローナル抗体の機能的断片としては、例えば、ＶＬ、ＶＨ、Ｆｄなどの個々の重鎖または軽鎖およびその断片；Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’などの１価の断片；Ｆ（ａｂ’）２などの２価の断片；単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）；およびＦｃ断片などがある。
【0092】
「ＶＬ断片」という用語は、ＣＤＲを含む、軽鎖可変領域の全部または一部を含むヒトモノクローナル抗体の軽鎖の断片を意味し得る。ＶＬ断片は、さらに軽鎖定常領域配列を含むことができる。
【0093】
「ＶＨ断片」という用語は、ＣＤＲを含む、重鎖可変領域の全部または一部を含むヒトモノクローナル抗体の重鎖の断片を意味し得る。
【0094】
「Ｆｄ断片」という用語は、第１の重鎖定常領域、すなわちＶＨおよびＣＨ－１に結合した重鎖可変領域を意味し得る。「Ｆｄ断片」は、軽鎖、または重鎖の第２および第３の定数領域を含まない。
【0095】
「Ｆｖ断片」という用語は、重鎖及び軽鎖の可変領域の全部または一部を含み、重鎖及び軽鎖の定常領域を含まない、ヒトモノクローナル抗体の１価の抗原結合断片を意味し得る。重鎖及び軽鎖の可変領域は、例えば、ＣＤＲを含む。例えば、Ｆｖ断片は、重鎖および軽鎖の双方の約１１０アミノ酸のアミノ末端可変領域の全部または一部を含む。
【0096】
「Ｆａｂ断片」という用語は、Ｆｖ断片よりも大きいヒトモノクローナル抗体の１価の抗原結合断片を意味し得る。例えば、Ｆａｂ断片は、重鎖および軽鎖の可変領域、ならびに第１定常ドメインの全部または一部を含む。したがって、Ｆａｂ断片は、例えば、重鎖および軽鎖の約１１０から約２２０のアミノ酸残基をさらに含む。
【0097】
「Ｆａｂ’断片」という用語は、Ｆａｂ断片よりも大きなヒトモノクローナル抗体の１価の抗原結合断片を意味し得る。例えば、Ｆａｂ’断片は、軽鎖の全て、重鎖の可変領域の全て、ならびに重鎖の第１および第２の定常ドメインの全てまたは一部を含む。例えば、Ｆａｂ’断片は、さらに、重鎖のアミノ酸残基２２０から３３０の一部または全部を含むことができる。
【0098】
「Ｆ（ａｂ’）２断片」という用語は、ヒトモノクローナル抗体の２価の抗原結合断片を意味し得る。Ｆ（ａｂ’）２断片は、例えば、２つの重鎖および２つの軽鎖の可変領域の全部または一部を含み、さらに、２つの重鎖および２つの軽鎖の第１定常ドメインの全部または一部を含むことができる。
【0099】
「単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）」という用語は、重鎖（ＶＨ）と軽鎖（ＶＬ）の可変領域が短いリンカーペプチドで連結された融合体(fusion)を意味し得る。
【0100】
「二重特異性抗体(bispecific antibody)（ＢｓＡｂ）」という用語は、２つのｓｃＦｖがより短い連結ペプチドによって互いに連結されてなる二重特異性抗体を意味し得る。
【0101】
当業者は、抗体の断片が機能的活性を維持する限り、その正確な境界は重要でないことを知っている。周知の組換え方法を用いれば、当業者は、特定の用途に望まれる任意のエンドポイントを有する機能的断片を発現するようにポリヌクレオチド配列を操作することができる。抗体の機能的断片は、ヒト抗体と実質的に同じ重鎖および軽鎖可変領域を有する断片を含むものであっても、またはそれから構成されるものであってもよい。
【0102】
好ましくは、本発明の第１の側面に関して、その抗原結合断片は、ＣＳＦ－Ｒ１－特異的である、またはＣＳＦ－Ｒ１内のエピトープに対して免疫特異的である。その抗原結合断片は、ＶＨ、ＶＬ、Ｆｄ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｃ断片からなる群から選択される断片のいずれかを含むものであっても、またはそれから構成されるものであってもよい。
【0103】
その抗原結合断片は、ヒト抗体の、ＶＬの抗原結合領域配列のいずれか１つ、ＶＨの抗原結合領域配列のいずれか１つ、またはＶＬおよびＶＨ抗原結合領域の組み合わせを含むものであっても、または上記から構成されるものであってもよい。ＶＨおよびＶＬ抗原結合領域配列の適切な数および組み合わせは、所望の親和性および特異性ならびに抗原結合断片の意図する用途に応じて、当業者によって決定され得る。抗体の機能的断片または抗原結合断片は、当業者に既知の方法を用いて容易に製造および単離することができる。このような方法としては、例えば、タンパク質分解法、組換え法、化学合成法などが挙げられる。機能的断片を単離するためのタンパク質分解法は、出発物質としてヒト抗体を使用することを有する。ヒト免疫グロブリンのタンパク質分解に適した酵素としては、例えば、パパイン、及びペプシンを挙げることができる。適切な酵素は、例えば、１価または２価の断片のどちらが必要であるかに応じて、当業者によって容易に選択され得る。例えば、パパイン切断により、抗原と結合する２つの１価のＦａｂ’断片およびＦｃ断片が得られる。ペプシン切断により、例えば、２価のＦ（ａｂ’）断片が得られる。本発明のＦ（ａｂ’）２断片は、例えば、ＤＴＴや２－メルカプトエタノールなどを用いてさらに還元され、２つの１価のＦａｂ’断片を製造してもよい。
【0104】
タンパク質分解によって生じた抗体の機能的または抗原結合断片は、アフィニティークロマトグラフィー法やカラムクロマトグラフィー法によって精製されてもよい。例えば、未消化の抗体およびＦｃ断片は、プロテインＡとの結合により除去することができる。さらに、機能的断片は、例えば、イオン交換およびゲルろ過クロマトグラフィーなどを用いて、その電荷およびサイズにより精製することができる。このような方法は、当業者にはよく知られている。
【0105】
抗体またはその抗原結合断片は、組換え手法によって製造されてもよい。好ましくは、最初に、抗体の重鎖および軽鎖の所望の領域をコードするポリヌクレオチドを単離する。このような領域は、例えば、重鎖および軽鎖の可変領域の全部または一部を含むことができる。好ましくは、このような領域は、特に重鎖および軽鎖の抗原結合領域、好ましくは抗原結合部位、最も好ましくはＣＤＲを含むことができる。
【0106】
本発明に係る抗体またはその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドは、当業者に公知の方法を用いて製造することができる。抗体またはその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドは、当該分野で公知のオリゴヌクレオチド合成の方法によって直接合成されてもよい。または、当該分野で公知の組換え方法を用いて、より小さな断片を合成、結合して、より大きな機能的断片を形成してもよい。
【0107】
本明細書で使用する場合、「免疫特異性(immunospecificity)」という用語は、結合領域が、ＣＳＦ－Ｒ１、またはその変異体もしくは断片と特異的に結合することにより免疫反応することができることを意味し得る。抗体またはその抗原結合断片は、約１０－５～１０－１３Ｍ－１、好ましくは１０－６～１０－９Ｍ－１、さらに好ましくは１０－１０～１０－１２Ｍ－１の親和定数で抗原（例えば、ＣＳＦ－Ｒ１またはその変異体もしくは断片）と選択的に相互作用することができる。
【0108】
「免疫反応する(immunoreact)」という用語は、結合領域がＣＳＦ－Ｒ１またはそのエピトープとの結合時に免疫反応を惹起することができることを意味し得る。
【0109】
「エピトープ」という用語は、抗体またはその抗原結合断片の結合領域を惹起し(elicit)、結合することができる抗原の任意の領域を意味し得る。
【0110】
好適には、本発明者らは、第１の側面のＣＳＦ－１Ｒ抗体を用いて試料中に存在する全ての単球型(monocyte types)および単球由来細胞(monocyte-derived cells)（即ち、ＣＤ１４陽性、ＣＤ１６陽性単球；ＣＤ１４陰性、ＣＤ１６陽性単球；ＣＤ１４陽性、ＣＤ１６陰性単球；およびＣＤ１４陰性、ＣＤ１６陰性単球由来の骨髄系樹状細胞）を単離することができたが、これはマーカーＣＤ１４および／またはＣＤ１６単独の使用では不可能であり、いかなる追加の抗体または単離工程の使用も必要としない。
【0111】
したがって、本発明の第２の側面によれば、下記を有する、生体試料から単球および／または単球由来細胞を単離する方法が提供される：
ｉ）単球および／または単球由来細胞を含む生体試料を、第１の側面に係る抗体またはその抗原結合断片と接触させ；および
ｉｉ）前記抗体に結合する生体試料中に存在する単球および／または単球由来細胞を回収することにより、単球および／または単球由来細胞を単離する。
ｉ）単球および／または単球由来細胞を含む生体試料を、第１の側面に係る抗体またはその抗原結合断片と接触させ；および
ｉｉ）前記抗体に結合する生体試料中に存在する単球および／または単球由来細胞を回収することにより、単球および／または単球由来細胞を単離する。
【0112】
単球、単球由来細胞、生体試料、および単離手段は、第１の側面で定義したのと同じでありえる。
【0113】
ゆえに、好ましくは、本方法は、ＣＤ１４陰性およびＣＤ１６陰性の単球由来骨髄系樹状細胞(monocyte-derived myeloid lineage dendritic cells)を単離するために使用され得る。
【0114】
好ましくは、本方法は、下記を単離するために使用され得る：
ｉ）ＣＤ１４陽性およびＣＤ１６陽性単球；
ｉｉ）ＣＤ１４陰性およびＣＤ１６陽性単球；
ｉｉｉ）ＣＤ１４陽性およびＣＤ１６陰性単球；および／または
ｉｖ）ＣＤ１４陰性およびＣＤ１６陰性単球由来骨髄系樹状細胞。
ｉ）ＣＤ１４陽性およびＣＤ１６陽性単球；
ｉｉ）ＣＤ１４陰性およびＣＤ１６陽性単球；
ｉｉｉ）ＣＤ１４陽性およびＣＤ１６陰性単球；および／または
ｉｖ）ＣＤ１４陰性およびＣＤ１６陰性単球由来骨髄系樹状細胞。
【0115】
好ましくは、本方法は、下記を単離するために使用され得る：
ｉ）ＣＤ１４陽性およびＣＤ１６陽性単球；
ｉｉ）ＣＤ１４陰性およびＣＤ１６陽性単球；
ｉｉｉ）ＣＤ１４陽性およびＣＤ１６陰性単球；および
ｉｖ）ＣＤ１４陰性およびＣＤ１６陰性単球由来骨髄系樹状細胞。
ｉ）ＣＤ１４陽性およびＣＤ１６陽性単球；
ｉｉ）ＣＤ１４陰性およびＣＤ１６陽性単球；
ｉｉｉ）ＣＤ１４陽性およびＣＤ１６陰性単球；および
ｉｖ）ＣＤ１４陰性およびＣＤ１６陰性単球由来骨髄系樹状細胞。
【0116】
好ましくは、本方法は、下記を単離するために使用され得る：
ｉ）ＣＤ１４陽性およびＣＤ１６陽性単球；
ｉｉ）ＣＤ１４陰性およびＣＤ１６陽性単球；
ｉｉｉ）ＣＤ１４陽性およびＣＤ１６陰性単球；および／または
ｉｖ）ＣＤ１４陰性、ＣＤ１６陰性およびＣＤ１Ｃ陽性単球由来骨髄系樹状細胞。
ｉ）ＣＤ１４陽性およびＣＤ１６陽性単球；
ｉｉ）ＣＤ１４陰性およびＣＤ１６陽性単球；
ｉｉｉ）ＣＤ１４陽性およびＣＤ１６陰性単球；および／または
ｉｖ）ＣＤ１４陰性、ＣＤ１６陰性およびＣＤ１Ｃ陽性単球由来骨髄系樹状細胞。
【0117】
好ましくは、本方法は、下記を単離するために使用され得る：
ｉ）ＣＤ１４陽性およびＣＤ１６陽性単球；
ｉｉ）ＣＤ１４陰性およびＣＤ１６陽性単球；
ｉｉｉ）ＣＤ１４陽性およびＣＤ１６陰性単球；および
ｉｖ）ＣＤ１４陰性、ＣＤ１６陰性およびＣＤ１Ｃ陽性単球由来骨髄系樹状細胞。
ｉ）ＣＤ１４陽性およびＣＤ１６陽性単球；
ｉｉ）ＣＤ１４陰性およびＣＤ１６陽性単球；
ｉｉｉ）ＣＤ１４陽性およびＣＤ１６陰性単球；および
ｉｖ）ＣＤ１４陰性、ＣＤ１６陰性およびＣＤ１Ｃ陽性単球由来骨髄系樹状細胞。
【0118】
第２の側面の方法は、蛍光活性化細胞選別(florescence-activated cell sorting)（ＦＡＣＳ）、磁気活性化細胞分離(magnetic activated cell separation)または浮力活性化細胞分離(buoyancy activated cell separation)によって実施されてもよい。このような方法は、当業者に知られているだろうし、第１の側面で定義されたのと同様でありえる。
【0119】
好ましくは、本方法は、ＦＡＣＳの使用を含み、下記を有する：
ｉ）単球および／または単球由来細胞を含む生体試料を、蛍光標識された、第１の側面の抗体またはその抗原結合断片と接触させ；および
ｉｉ）生体試料中に存在する細胞を、その蛍光に基づいて選別し；および
ｉｉｉ）蛍光標識された抗体に結合する生体試料中に存在する単球および／または単球由来細胞を回収することにより、生体試料中に存在する単球および／または単球由来細胞を単離する。
ｉ）単球および／または単球由来細胞を含む生体試料を、蛍光標識された、第１の側面の抗体またはその抗原結合断片と接触させ；および
ｉｉ）生体試料中に存在する細胞を、その蛍光に基づいて選別し；および
ｉｉｉ）蛍光標識された抗体に結合する生体試料中に存在する単球および／または単球由来細胞を回収することにより、生体試料中に存在する単球および／または単球由来細胞を単離する。
【0120】
当業者であれば、蛍光発光プロファイルおよび／または蛍光強度に基づいて細胞を選別することができることを理解するであろうが、これは使用する蛍光標識に依存し、当該分野でよく知られている。
【0121】
好ましくは、本方法は、磁気細胞選別(magnetic cell sorting)の使用を含み、下記を有する：
ｉ）単球および／または単球由来細胞を含む生体試料を、第１の側面の抗体またはその抗原結合断片でコーティングされた磁気ビーズと接触させ；および
ｉｉ）ステップｉ）から得られる組成物を磁場中に置き、磁性ビーズに結合した単球および／または単球由来細胞を試料中に存在する他の細胞から分離し；
ｉｉｉ）前記試料から前記他の細胞を除去し；および
ｉｉｉ）磁気ビーズに結合する生体試料中に存在する単球および／または単球由来細胞を回収することにより、生体試料中に存在する単球および／または単球由来細胞を単離する。
ｉ）単球および／または単球由来細胞を含む生体試料を、第１の側面の抗体またはその抗原結合断片でコーティングされた磁気ビーズと接触させ；および
ｉｉ）ステップｉ）から得られる組成物を磁場中に置き、磁性ビーズに結合した単球および／または単球由来細胞を試料中に存在する他の細胞から分離し；
ｉｉｉ）前記試料から前記他の細胞を除去し；および
ｉｉｉ）磁気ビーズに結合する生体試料中に存在する単球および／または単球由来細胞を回収することにより、生体試料中に存在する単球および／または単球由来細胞を単離する。
【0122】
一実施形態では、細胞が単球である場合、好ましくは、試料は血液試料である。一実施形態では、細胞が単球由来細胞である場合、好ましくは、試料は組織試料である。
【0123】
単球および／または単球由来細胞の単離に加えて、本発明は単球および／または単球由来細胞の検出方法にも及ぶものである。
【0124】
本発明の第３の側面によれば、下記を有する、生体試料中に存在する単球および／または単球由来細胞を検出する方法が提供される：
ｉ）単球を含む生体試料を、第１の側面の抗体またはその抗原結合断片と接触させ；および
ｉｉ）検出手段により、生体試料中に存在する単球および／または単球由来細胞を検出する。
ｉ）単球を含む生体試料を、第１の側面の抗体またはその抗原結合断片と接触させ；および
ｉｉ）検出手段により、生体試料中に存在する単球および／または単球由来細胞を検出する。
【0125】
単球、単球由来細胞および生体試料は、第１の側面で定義されたのと同様でありえる。検出手段は、第１及び第２の側面で定義されるのと同様、ＦＡＣＳを含んでもよい。
【0126】
一実施形態では、細胞が単球である場合、好ましくは、試料は血液試料である。一実施形態では、細胞が単球由来細胞である場合、好ましくは、試料は組織試料である。
【0127】
または、検出手段は、免疫染色を含んでいてもよい。好ましくは、検出手段は、免疫組織化学または免疫細胞化学を含む。
【0128】
このような検出技術は、当業者にはよく知られている。
【0129】
検出は、生体試料中に存在する単球の数を測定することを含んでもよい。検出は、生体試料中に存在する単球由来細胞の数を測定することを含んでもよい。
【0130】
本方法は、ＣＤ１４陰性及びＣＤ１６陰性の単球由来細胞を検出するために使用されてもよい。
【0131】
好ましくは、本方法は、下記を検出するために使用され得る：
ｉ）ＣＤ１４陽性およびＣＤ１６陽性単球；
ｉｉ）ＣＤ１４陰性およびＣＤ１６陽性単球；
ｉｉｉ）ＣＤ１４陽性およびＣＤ１６陰性単球；および／または
ｉｖ）ＣＤ１４陰性およびＣＤ１６陰性単球由来骨髄系樹状細胞。
ｉ）ＣＤ１４陽性およびＣＤ１６陽性単球；
ｉｉ）ＣＤ１４陰性およびＣＤ１６陽性単球；
ｉｉｉ）ＣＤ１４陽性およびＣＤ１６陰性単球；および／または
ｉｖ）ＣＤ１４陰性およびＣＤ１６陰性単球由来骨髄系樹状細胞。
【0132】
好ましくは、本方法は、下記を検出するために使用され得る：
ｉ）ＣＤ１４陽性およびＣＤ１６陽性単球；
ｉｉ）ＣＤ１４陰性およびＣＤ１６陽性単球；
ｉｉｉ）ＣＤ１４陽性およびＣＤ１６陰性単球；および
ｉｖ）ＣＤ１４陰性およびＣＤ１６陰性単球由来骨髄系樹状細胞。
ｉ）ＣＤ１４陽性およびＣＤ１６陽性単球；
ｉｉ）ＣＤ１４陰性およびＣＤ１６陽性単球；
ｉｉｉ）ＣＤ１４陽性およびＣＤ１６陰性単球；および
ｉｖ）ＣＤ１４陰性およびＣＤ１６陰性単球由来骨髄系樹状細胞。
【0133】
好ましくは、本方法は、下記を単離するために使用され得る：
ｉ）ＣＤ１４陽性およびＣＤ１６陽性単球；
ｉｉ）ＣＤ１４陰性およびＣＤ１６陽性単球；
ｉｉｉ）ＣＤ１４陽性およびＣＤ１６陰性単球；および／または
ｉｖ）ＣＤ１４陰性、ＣＤ１６陰性およびＣＤ１Ｃ陽性単球由来骨髄系樹状細胞。
ｉ）ＣＤ１４陽性およびＣＤ１６陽性単球；
ｉｉ）ＣＤ１４陰性およびＣＤ１６陽性単球；
ｉｉｉ）ＣＤ１４陽性およびＣＤ１６陰性単球；および／または
ｉｖ）ＣＤ１４陰性、ＣＤ１６陰性およびＣＤ１Ｃ陽性単球由来骨髄系樹状細胞。
【0134】
好ましくは、本方法は、下記を単離するために使用され得る：
ｉ）ＣＤ１４陽性およびＣＤ１６陽性単球；
ｉｉ）ＣＤ１４陰性およびＣＤ１６陽性単球；
ｉｉｉ）ＣＤ１４陽性およびＣＤ１６陰性単球；および
ｉｖ）ＣＤ１４陰性、ＣＤ１６陰性およびＣＤ１Ｃ陽性単球由来骨髄系樹状細胞。
ｉ）ＣＤ１４陽性およびＣＤ１６陽性単球；
ｉｉ）ＣＤ１４陰性およびＣＤ１６陽性単球；
ｉｉｉ）ＣＤ１４陽性およびＣＤ１６陰性単球；および
ｉｖ）ＣＤ１４陰性、ＣＤ１６陰性およびＣＤ１Ｃ陽性単球由来骨髄系樹状細胞。
【0135】
本発明は、その変異体または断片などの、本明細書で言及されるいずれかの配列のアミノ酸または核酸配列を実質的に有する任意の核酸もしくはペプチドまたはその変異体、誘導体もしくはアナログに及ぶことが理解されよう。「実質的にアミノ酸／ヌクレオチド／ペプチド配列」、「変異体(variant)」および「断片(fragment)」という用語は、本明細書に記載されるいずれかの配列のアミノ酸／ヌクレオチド／ペプチド配列と少なくとも４０％の配列同一性、例えば、配列番号１～１１などとして特定される配列と４０％の同一性を有する配列であり得る。
【0136】
参照される配列のいずれかに対して６５％を超える、より好ましくは７０％を超える、さらに好ましくは７５％を超える、さらに好ましくは８０％を超える配列同一性である配列同一性を有するアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列もまた想定される。好ましくは、アミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列は、本明細書で言及される配列のいずれかに対して少なくとも８５％の同一性、参照される配列のいずれかに対して、より好ましくは少なくとも９０％の同一性、さらに好ましくは少なくとも９２％の同一性、さらに好ましくは少なくとも９５％の同一性、さらに好ましくは少なくとも９７％の同一性、さらに好ましくは少なくとも９８％の同一性、および最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する。
【0137】
当業者であれば、２つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列間の同一性（％）を算出する方法を理解できるであろう。２つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列間の同一性（％）を算出するためには、まず２つの配列のアラインメント(alignment)を作成し、その後、配列同一性値を計算する必要がある。２つの配列の同一性（％）は、（ｉ）配列のアライメントする(align)のに使用する方法、例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ（異なるプログラムで実装）、または３次元比較からの構造アライメント(structural alignment from 3D comparison)、および（ｉｉ）アライメント法に使用されるパラメータ、例えば、ローカル対グローバルアライメント(local vs global alignment)、使用されるペアスコアマトリックス(pair-score matrix)（例えば、ＢＬＯＳＵＭ６２、ＰＡＭ２５０、Ｇｏｎｎｅｔなど）およびギャップペナルティ(gap-penalty)、例えば、機能形態および定数(functional form and constants)によって異なる値になる場合があり得る。
【0138】
アラインメントを作成したら、２つの配列間の同一性（％）を計算する方法は様々である。例えば、（ｉ）最短の配列の長さ；（ｉｉ）アラインメントの長さ；（ｉｉｉ）配列の平均長；（ｉｖ）ノンギャップ位置(non-gap positions)の数；または（ｖ）オーバーハングを除く同等位置の数で、同一性の数を割ってもよい。さらに、同一性（％）は長さにも強く依存することが理解されよう。したがって、一対の配列が短いほど、偶然に生じる配列の同一性が高くなると予想できる。
【0139】
したがって、タンパク質またはＤＮＡ配列の正確なアラインメントは、複雑なプロセスであることが理解されよう。人気のある多重アラインメントプログラム(popular multiple alignment program)ＣｌｕｓｔａｌＷ（Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research, 22, 4673-4680; Thompson et al., 1997, Nucleic Acids Research, 24, 4876-4882）は、本発明に係るタンパク質またはＤＮＡの多重アラインメントの作成に好ましい方法である。ＣｌｕｓｔａｌＷの好適なパラメータは、以下の通りであってよい：ＤＮＡアラインメントの場合：Gap Open Penalty = 15.0、Gap Extension Penalty = 6.66、およびMatrix = Identity。タンパク質アラインメントの場合：Gap Open Penalty = 10.0、Gap Extension Penalty = 0.2、およびMatrix = Gonnet。ＤＮＡおよびタンパク質のアラインメントの場合：ENDGAP = -1、およびGAPDIST = 4。当業者であれば、最適な配列アライメントのために、これらのパラメータおよび他のパラメータを変化させることが必要であることを認識するであろう。
【0140】
好ましくは、２つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列間の同一性（％）の計算は、次に、このようなアラインメントから（Ｎ／Ｔ）＊１００として計算することができる。ここで、Ｎは配列が同一の残基を共有する位置の数であり、Ｔはギャップを含み、オーバーハングを含むか含まないかで比較した位置の全数である。好ましくは、オーバーハングは計算に含まれる。したがって、２つの配列間の同一性（％）を計算するための最も好ましい方法は、（ｉ）例えば、上記に示したような適切なパラメータのセットを用いてＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを用いて配列アライメントを準備し；および（ｉｉ）ＮおよびＴの値を以下の式：－配列の同一性＝（Ｎ／Ｔ）＊１００に挿入することを含む。
【0141】
類似の配列を同定するための別の方法は、当業者には既知であろう。例えば、実質的に類似したヌクレオチド配列は、ストリンジェントな条件下でＤＮＡ配列またはその相補体にハイブリダイズする配列によってコードされるであろう。ストリンジェントな条件とは、本発明者らは、ヌクレオチドが、約４５℃で３×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でフィルター結合したＤＮＡまたはＲＮＡにハイブリダイズし、その後約２０～６５℃で０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で少なくとも１回の洗浄を行うことを意味する。または、実質的に類似したポリペプチドは、例えば、配列番号１～１１に示される配列から少なくとも１、ただし、５、１０、２０、５０または１００未満のアミノ酸だけ異なっていてもよい。
【0142】
遺伝暗号の縮退(degeneracy)により、本明細書に記載される任意の核酸配列は、それによってコードされるタンパク質の配列に実質的に影響を与えることなく変化または変更されてその機能的変異体を提供し得ることは明らかである。好適なヌクレオチド変異体としては、配列内で同じアミノ酸をコードする異なるコドンの置換によって変化させて、サイレント（同義）変化(silent (synonymous) change)を生じさせる配列を有するものがある。他の好適な変異体としては、相同的なヌクレオチド配列を有するが、それが置換するアミノ酸と同様の生物物理的特性の側鎖を有するアミノ酸をコードする異なるコドンの置換によって変更されて保存的変化(conservative change)を生じさせる配列のすべて、または一部を有するものがある。例えば、小さな非極性で疎水性のアミノ酸には、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、およびメチオニンなどがある。大きな非極性で疎水性のアミノ酸としては、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンなどがある。極性の中性のアミノ酸には、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、およびグルタミンなどがある。正に帯電した（塩基性）アミノ酸としては、リジン、アルギニン、およびヒスチジンなどがある。負に帯電した（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸などがある。したがって、どのアミノ酸を同様の生物物理学的特性を有するアミノ酸で置換してもよいかは理解されるであろうし、当業者はこれらのアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を知っているであろう。
【0143】
本明細書（添付の請求項、要約および図面を含む）に記載された全ての特徴、および／またはこのように開示された任意の方法もしくはプロセスの全てのステップは、そのような特徴および／またはステップの少なくとも一部が相互に排他的である組み合わせを除いて、任意の組み合わせで上記の側面のいずれかと組み合わせることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【0144】
本発明をよりよく理解するために、また、本発明の実施形態がどのように実施され得るかを示すために、次に、例として、添付の図を参照されたい。
【図1A】図１Ａおよび図１Ｂは、ＣＳＦ－Ｒ１がヒト血液中の選択的な単球マーカーであることを示すものである。単球は骨髄性好中球(myeloid neutrophils)やリンパ球(lymphoid lymphocytes)に比べて有意により多くのＣＳＦ１Ｒを発現する。単球は、ラピッド染色プロトコル(rapid staining protocol)で全血中のＣＳＦ１Ｒを染色した。プロットされたデータは、５生物学的複製(biological replicates)のＳＤ付き平均値である。
【図1B】図１Ａおよび図１Ｂは、ＣＳＦ－Ｒ１がヒト血液中の選択的な単球マーカーであることを示すものである。単球は骨髄性好中球(myeloid neutrophils)やリンパ球(lymphoid lymphocytes)に比べて有意により多くのＣＳＦ１Ｒを発現する。単球は、ラピッド染色プロトコル(rapid staining protocol)で全血中のＣＳＦ１Ｒを染色した。プロットされたデータは、５生物学的複製(biological replicates)のＳＤ付き平均値である。
【図2A】図２Ａおよび図２Ｂは、ＣＳＦ－Ｒ１がすべての単球サブセットで高発現していることを示すものである。単球は全血でフローサイトメトリーで染色された。単球をサイズおよび粒度(granularity)（左側）に基づいて、次に従来の３つの単球サブセットに関するＣＤ１４ｖｓＣＤ１６セレクト(select)ならびにＣＳＦ－Ｒ１に対する蛍光強度の中央値が低い大きなダブルネガティブグループ(large double negative group)に基づいてゲーティングする(Gating)ことにより、この集団は主に汚染リンパ球であることが示唆される。しかしながら、右側では、ＣＳＦ－Ｒ１陽性に基づいて単球を選択すると、ＣＤ１４ｖｓＣＤ１６のペアワイズプロット(CD14 vs CD16 pairwise plot)がよりきれいになり、他の単球サブセットと同等のＣＳＦ－Ｒ１の蛍光強度の中央値を持っているダブルネガティブ集団（オレンジ）がより小さくなる。プロットされたデータは、５つの生物学的複製のＳＤ付き平均値である。
【図2B】図２Ａおよび図２Ｂは、ＣＳＦ－Ｒ１がすべての単球サブセットで高発現していることを示すものである。単球は全血でフローサイトメトリーで染色された。単球をサイズおよび粒度(granularity)（左側）に基づいて、次に従来の３つの単球サブセットに関するＣＤ１４ｖｓＣＤ１６セレクト(select)ならびにＣＳＦ－Ｒ１に対する蛍光強度の中央値が低い大きなダブルネガティブグループ(large double negative group)に基づいてゲーティングする(Gating)ことにより、この集団は主に汚染リンパ球であることが示唆される。しかしながら、右側では、ＣＳＦ－Ｒ１陽性に基づいて単球を選択すると、ＣＤ１４ｖｓＣＤ１６のペアワイズプロット(CD14 vs CD16 pairwise plot)がよりきれいになり、他の単球サブセットと同等のＣＳＦ－Ｒ１の蛍光強度の中央値を持っているダブルネガティブ集団（オレンジ）がより小さくなる。プロットされたデータは、５つの生物学的複製のＳＤ付き平均値である。
【図3】図３は、ＣＳＦ－Ｒ１が健常者におけるパン－単球マーカー(pan monocyte marker)であることを示すものである。本発明者らは、ＣＳＦ－Ｒ１が全血球から単球を引き離す(pull out)ことができるかどうかを検討した。蛍光セルソーターでは、細胞はＣＤ１４かＣＳＦ－Ｒ１のどちらかで選別された。ＣＤ１４選別(CD14 sort)では、単球サブセットのうち２つ（ＣＤ１４＋ＣＤ１６－およびＣＤ１４＋ＣＤ１６＋）しか捕らえられなかったが、ＣＳＦ１Ｒ選別(CSF1R sort)ではすべての単球サブセットが捕えられ、さらに健常者では少数派である第４の単球のダブルネガティブ集団も強調表示される。プロットは、３つの生物学的複製の代表である。特に、従来の方法では、単球を見逃すＣＤ１４ポジティブセレクションや、７種類の抗体からなるネガティブセレクションを利用していたため、このデータから、ＣＳＦ－Ｒ１が単球の単離に有効なツールであることが示される。
【図4】図４は、市販されている様々なＣＳＦ－Ｒ１抗体がＣＳＦ－Ｒ１単球の検出および単離に使用できることを示すものである。本発明者らは、ＣＳＦ－Ｒ１について、異なる抗体や蛍光色素を比較した。本発明者らは、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄからの９－４Ｄ２－１Ｅ４ラットモノクローナル抗体およびｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅからの１２－３Ａ３－１Ｂ１０ラットモノクローナル抗体の、２種類の抗体クローンを使用した。また、本発明者らは、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ抗体の３種類の蛍光色素（ＢＶ－４２１、ＰＥ、およびＡＰＣ）についても調べた。蛍光色素間で違いはないが、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ抗体はｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ抗体よりも親和性が高いように見える。滴定しても(Titrating)、抗体は陽性ＣＳＦ－Ｒ１集団にシフトしない。
【図5】図５は、ＣＳＦ１Ｒ＋ＣＤ１４－ＣＤ１６－細胞が主にＣＤ１Ｃ－ＤＣであることを示すものである。これらのデータは、ＰＢＭＣのＣＹＴＯＦ染色から作製された。血液中に存在する樹状細胞は、ＨＬＡ－ＤＲ＋ＣＤ１１ｃ＋細胞およびＨＬＡ－ＤＲ＋ＣＤ１１ｃ－細胞に分離することができる。ＨＬＡ－ＤＲ＋ＣＤ１１ｃ－細胞は、ＣＤ１２３＋形質細胞様樹状細胞(CD123+ Plasmacytoid dendritic cells)およびＣＤ１２３－集団になる。ＨＬＡ－ＤＲ＋ＣＤ１１ｃ＋細胞は、ＣＤ１４１＋ＤＣ、ＣＤ１４１－ＣＤ１ｃ＋細胞およびＣＤ１４１－ＣＤ１ｃ－細胞になる。上段は系統細胞(lineage- cells)（ＣＤ３－、ＣＤ２０－、ＣＤ５６－、ＣＤ１４－）のプロットを示している。下段はＣＳＦ１Ｒ＋細胞（ＣＤ３－、ＣＤ２０、ＣＤ５６－）を示している。ＣＳＦ１Ｒ細胞は樹状細胞集団が非常に少なく、ＣＤ１４１－ＣＤ１ｃ＋およびＣＤ１４１－ＣＤ１ｃ－サブセットに多数存在するのみである。
【実施例】
【0145】
実施例
本研究において、本発明者らは、単球において既に報告されている系統決定サイトカイン受容体(lineage determining cytokine receptors)を用いたマルチカラーフローサイトメトリーパネル(multicolour flow cytometry panel)を使用した。下記仮説に束縛されることを望まないが、本発明者らは、系統決定サイトカイン受容体は、個体発生と直接的に関連しており、したがって、現在の単球マーカーよりも情報量が多いと考えている。本発明者らは、ヒト単球およびマクロファージにおける発現の実験的証拠がある受容体に焦点を当て、受容体間の相互作用を確立してパン単球マーカー(pan monocyte marker)を同定した（表１参照）。
本研究において、本発明者らは、単球において既に報告されている系統決定サイトカイン受容体(lineage determining cytokine receptors)を用いたマルチカラーフローサイトメトリーパネル(multicolour flow cytometry panel)を使用した。下記仮説に束縛されることを望まないが、本発明者らは、系統決定サイトカイン受容体は、個体発生と直接的に関連しており、したがって、現在の単球マーカーよりも情報量が多いと考えている。本発明者らは、ヒト単球およびマクロファージにおける発現の実験的証拠がある受容体に焦点を当て、受容体間の相互作用を確立してパン単球マーカー(pan monocyte marker)を同定した（表１参照）。
【0146】
材料および方法
血球の調製およびフローサイトメトリー
サリー大学の倫理承認 UEC/2017/052/FHMS に従い、健常ボランティアからインフォームドコンセントを得て末梢静脈血を採取した。血液は静脈穿刺後２時間以内に処理した。
血球の調製およびフローサイトメトリー
サリー大学の倫理承認 UEC/2017/052/FHMS に従い、健常ボランティアからインフォームドコンセントを得て末梢静脈血を採取した。血液は静脈穿刺後２時間以内に処理した。
【0147】
新鮮な全血 １００μｌのアリコート（１ｘ１０６細胞に相当）で、適切な抗体およびマッチしたアイソタイプコントロール(matched isotype controls)を用いて白血球を染色した。以下の抗体が使用され、１／１００希釈で添加された：ＢＶ４２１－ａｎｔｉ－ＣＳＦ１Ｒ；ＢＶ５１０－ａｎｔｉ－ＣＤ１６；ＢＶ６５０－ａｎｔｉ－ＣＤ１４；ＢＶ７８６－ａｎｔｉ－ＩＬ３ＲＡ；ＦＩＴＣ－ａｎｔｉ－ＣＳＦ２Ｒ；ＰＥ－ａｎｔｉ－ＩＬ１５ＲＡ；ＰＥ－Ｄａｚｚｌｅ－ａｎｔｉ－ＩＬ７Ｒ；ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５－ａｎｔｉ－ＦＬＴ３；ＡＰＣ－ａｎｔｉ－ＣＳＦ３Ｒ。すべての抗体はＢｉｏｌｅｇｅｎｄから購入した。抗体は全血と一緒に室温で２０分間インキュベートした。その後、細胞を固定し、ＲＢＣ ｆｉｘ／ｌｙｓｉｓバッファー（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を用いて赤血球を溶解した。細胞は、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含まないＰＢＳで洗浄した。
【0148】
トリプルレーザー方式のＢＤ ＦＡＣＳ Ｃｅｌｅｓｔａ(triple-laser BD FACS Celesta)（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）でフローサイトメトリーを実施した。細胞集団は、前方光散乱(forward light scatter)（ＦＳＣ－Ａ）ｖｓ側方光散乱(side light scatter)（ＳＳＣ－Ａ）を用いて区別した後、前方光散乱高さ(forward light scatter height)（ＦＳＣ－Ｈ）ｖｓ面積を用いて単一細胞を、生死染色Ｚｏｍｂｉｅ ＮＩＲ(live-dead stain Zombie NIR)（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を用いて生細胞をゲーティングした(gated)。製造元の説明書に従って、Ｚｏｍｂｉｅ ＮＩＲ染色を実施した。ソーターのチューニングおよび出力は、すべての測定で一定に保たれた。パネル補正(Panel compensation)は、単一染色細胞で行った。フローサイトメトリー解析は、オンラインソフトウェアＣｙｔｏｂａｎｋＴＭおよびＦｌｏｗｊｏＴＭを使用して行った。
【0149】
ＣＹＴＯＦ解析のための細胞の染色
材料：
・ＰＣＲチューブに入れた２０個のバーコード ３セット－各１０μｌ（－２０℃保存）－キットに含まれる
・ＭＡＸＰＡＲ Ｆｉｘ Ｉ ｂｕｆｆｅｒ（５×）－１５ｍｌ－キットに含まれる
・Ｍａｘｐａｒ細胞染色バッファー(Maxpar cell staining buffer)－５００ｍｌ－キットに含まれる
・Ｍａｘｐａｒ１０×バーコードパームバッファー(Maxpar 10x barcode perm buffer)５０ｍｌ－キットに含まれる
・Ｍａｘｐａｒ ＰＢＳ(Maxpar PBS)－５００ｍｌ－キットに含まれる
・Ｃｅｌｌ－ＩＤ シスプラチン(Cell-ID Cisplatin)
・Ｃｅｌｌ－ＩＤ インターカレーター－Ｉｒ(Cell-ID Intercalator-Ir)
ＣＹＴＯＦ 抗体パネル(CYTOF antibody panel): Pre-fix: CSF1R-163Dy; CD141-173Yb, CD40-142Nd, CD32-169Tm, CD16-145Nd, CD100-156Gd, CD127-165Ho
Post-fix: CD14-160Gd, CD64-146Nd, CD206-168Er, CD163-154Sm, CD34-148Nd, CD80-162Dy, CD86-150Nd, HLA-DR-170Er, CD3-141-Pr, CD123-151Eu, CD135-158Gd, CXC3R1-172Yb, CD303-153Eu, CD117-143Nd, CXCR4-175Lu, CD20-171Yb, CD11c-147Sm, CD197-159Tb, CD56-155Nd, CD1c-144Nd。
材料：
・ＰＣＲチューブに入れた２０個のバーコード ３セット－各１０μｌ（－２０℃保存）－キットに含まれる
・ＭＡＸＰＡＲ Ｆｉｘ Ｉ ｂｕｆｆｅｒ（５×）－１５ｍｌ－キットに含まれる
・Ｍａｘｐａｒ細胞染色バッファー(Maxpar cell staining buffer)－５００ｍｌ－キットに含まれる
・Ｍａｘｐａｒ１０×バーコードパームバッファー(Maxpar 10x barcode perm buffer)５０ｍｌ－キットに含まれる
・Ｍａｘｐａｒ ＰＢＳ(Maxpar PBS)－５００ｍｌ－キットに含まれる
・Ｃｅｌｌ－ＩＤ シスプラチン(Cell-ID Cisplatin)
・Ｃｅｌｌ－ＩＤ インターカレーター－Ｉｒ(Cell-ID Intercalator-Ir)
ＣＹＴＯＦ 抗体パネル(CYTOF antibody panel): Pre-fix: CSF1R-163Dy; CD141-173Yb, CD40-142Nd, CD32-169Tm, CD16-145Nd, CD100-156Gd, CD127-165Ho
Post-fix: CD14-160Gd, CD64-146Nd, CD206-168Er, CD163-154Sm, CD34-148Nd, CD80-162Dy, CD86-150Nd, HLA-DR-170Er, CD3-141-Pr, CD123-151Eu, CD135-158Gd, CXC3R1-172Yb, CD303-153Eu, CD117-143Nd, CXCR4-175Lu, CD20-171Yb, CD11c-147Sm, CD197-159Tb, CD56-155Nd, CD1c-144Nd。
【0150】
ＰＢＭＣｓを染色する手順
１．ＰＢＭＣｓを回収／収集し、ＭＡＸＰＡＲ染色バッファーに細胞を再懸濁した。細胞をカウントした。１００～３００万個細胞／試料の細胞数で実験を行った。
１．ＰＢＭＣｓを回収／収集し、ＭＡＸＰＡＲ染色バッファーに細胞を再懸濁した。細胞をカウントした。１００～３００万個細胞／試料の細胞数で実験を行った。
【0151】
２．バーコード固定により影響を受け得る表面マーカー（即ち、ＣＳＦ１Ｒ）を染色した。これは、一次抗体に対する二次抗体（即ち、ＣＳＦ１Ｒに対する抗ＡＰＣ）を用いた２段階プロセスを含んでもよい。まず、ＭＡＸＰＡＲ染色バッファー中でブロッキングするためにＴｒｕｓｔａｉｎ－ＦｃＸで染色した。次に、一次抗体を所望の濃度で添加した。一次抗体を洗い流し、必要であれば二次抗体を加えた。洗浄して、次のステップに進んだ。
【0152】
この段階で添加される抗体：ＣＳＦ１Ｒ；ＣＤ１４１，ＣＤ４０，ＣＤ３２，ＣＤ１６，ＣＤ１００，ＣＤ１２７。
【0153】
３．Ｃｅｌｌ－ＩＤ生存染色(Cell-ID viability staining)－１０μＭ Ｃｅｌｌ－ＩＤ シスプラチンのワーキング溶液（ＭＡＸＰＡＲ ＰＢＳで５００倍希釈）を調製し；５００μｌのＰＢＳにおける細胞に対して１０μＭ シスプラチンを１対１で添加した。５分間、室温でインキュベーションした。５～１０倍体積のＭＡＸＰＡＲ細胞染色バッファーで洗浄することによって、シスプラチンをクエンチした(quench)。８００ｇで遠心し、上清を除去した。
【0154】
４．細胞の固定、浸透化(Permeabilize)－バーコーディングキットの１×Ｆｉｘ Ｉ バッファー（ＭＡＸＰＡＲ ＰＢＳで１／５希釈）１ｍｌに試料を再懸濁した。室温で１０分間インキュベートした。１０００ｇで５分間遠心し、１ｍｌの１×Ｂａｒｃｏｄｅ Ｐｅｒｍバッファー（ＭＡＸＰＡＲ ＰＢＳで１０分の１に希釈）で２回洗浄した。
【0155】
５．バーコード－バーコード化する試料(sample to be barcoded)を８００μｌの１×Ｂａｒｃｏｄｅ Ｐｅｒｍバッファーに完全に懸濁し；各バーコードを１００μｌの１×Ｂａｒｃｏｄｅ Ｐｅｒｍバッファーに再懸濁し、適切なサンプルに移した。すぐに混合し、３０分（室温で）インキュベートした。途中、軽く混合した(mix halfway through)。１０００ｇで５分間遠心し、２ｍｌ ＭＡＸＰＡＲ細胞染色バッファーで２回洗浄した。１００μｌの細胞染色バッファーに再懸濁し、すべてのバーコード化試料(barcoded samples)を１本のチューブにまとめた（２０×１００μｌ＝合計２ｍｌ）。サンプルチューブを１００μｌ×２回でリンスすることを推奨した。１０００ｇで５分遠心した。バーコードセットは、６種類の異なるパラジウム同位体を２０種類の組み合わせで構成される。
【0156】
６．表面マーカーの染色－細胞をＭＡＸＰＡＲ染色バッファーに再懸濁し；Ｆｃブロック（Ｔｒｕｓｔａｉｎ ＦｃＸ、２０分の１希釈）を添加した。抗体パネルを加えた（１μｌの抗体／１００μｌ中に３００万個の細胞－したがって、細胞の総数／３００万個＝１μｌの抗体が必要な量となる）。例えば、バーコード化試料の場合、２ｍｌで６０００万個の細胞、１ｍｌで３０００万個、１００μｌで３００万個に相当します。１５分間細胞を染色し、混合し、さらに１５分間染色した。ＭＡＸＰＡＲ細胞染色バッファーでサンプルを２回洗浄し、１０００ｇで５分間遠心した。
【0157】
この段階で添加される抗体：ＣＤ１４，ＣＤ６４，ＣＤ２０６，ＣＤ１６３，ＣＤ３４，ＣＤ８０，ＣＤ８６，ＨＬＡ－ＤＲ，ＣＤ３，ＣＤ１２３，ＣＤ１３５，ＣＸＣ３Ｒ１，ＣＤ３０３，ＣＤ１１７，ＣＸＣＲ４，ＣＤ２０，ＣＤ１１ｃ，ＣＤ１９７，ＣＤ５６，ＣＤ１ｃ。
【0158】
７．細胞の新鮮な固定(Fresh fix of cells)－（バーコーディングプロトコルでは不要） １６％ストックアンプルから１．６％固定液を新たに調製した。ホルムアルデヒドをＭＡＸＰＡＲ ＰＢＳで１０分の１に希釈した。各試料に１ｍｌの１．６％溶液を加え、混合し、室温で１０分間インキュベートした。１０００ｇで５分間遠心した。
【0159】
８．Ｃｅｌｌ－ＩＤ インターカレーター－Ｉｒ染色－２ｍｌの溶液を細胞に加え、穏やかに混合した。１試料あたりの溶液は、１ｍｌで、１２５ｎＭのウオーキング濃度までストック濃度を１０００倍に希釈したものであった（１ｍｌのＭＡＸＰＡＲ ＦＩＸおよびＰＥＲＭバッファーにおいて１μｌのストック）。室温で１時間または４℃で一晩（最大４８時間）インキュベートした。２×ＭＡＸＰＡＲ細胞染色バッファーで１０００ｇで５分洗浄した。ＰＢＳで細胞を１０００ｇで５分洗浄した（この時点で細胞数カウントのためのアリコートを採取した）。１０００ｇで遠心し、ペレットを４℃で放置した。ＣＹＴＯＦに移した。
【0160】
その手順を図７に要約する。
【0161】
統計
統計解析をＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭ ８プログラムで行った。各比較のための具体的なテストは、対応する図の凡例(figure legends)に示される。グラフは、平均値および標準偏差のエラーバーを使って一貫してプロットした。
統計解析をＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭ ８プログラムで行った。各比較のための具体的なテストは、対応する図の凡例(figure legends)に示される。グラフは、平均値および標準偏差のエラーバーを使って一貫してプロットした。
【0162】
結果
実施例１－ヒト単球および好中球の系統決定サイトカイン受容体
単球およびマクロファージにおける系統決定発現を調べるために、本発明者らは、ＣＳＦ１Ｒ（ＣＤ１１５－ＭＣＳＦＲ）、ＣＳＦ２ＲＡ（ＣＤ１１６－ＧＭＣＳＦＲ）、ＣＳＦ３Ｒ（ＣＤ１１４－ＧＣＳＦＲ）、ＩＬ１５ＲＡ（ＣＤ１２５）、ＩＬ３ＲＡ（ＣＤ１２３）；ＩＬ７Ｒ（ＣＤ１２７）およびＦＬＴ３（ＣＤ１３５）に関する抗体による多色ＦＡＣＳパネル(multicolour FACS panel)を確立した。これ以降、受容体への言及はその認められた遺伝子名によって行われる。受容体は、ヒト単球またはマクロファージにおける発現の実験的証拠に基づいて選択された（表１参照）。
実施例１－ヒト単球および好中球の系統決定サイトカイン受容体
単球およびマクロファージにおける系統決定発現を調べるために、本発明者らは、ＣＳＦ１Ｒ（ＣＤ１１５－ＭＣＳＦＲ）、ＣＳＦ２ＲＡ（ＣＤ１１６－ＧＭＣＳＦＲ）、ＣＳＦ３Ｒ（ＣＤ１１４－ＧＣＳＦＲ）、ＩＬ１５ＲＡ（ＣＤ１２５）、ＩＬ３ＲＡ（ＣＤ１２３）；ＩＬ７Ｒ（ＣＤ１２７）およびＦＬＴ３（ＣＤ１３５）に関する抗体による多色ＦＡＣＳパネル(multicolour FACS panel)を確立した。これ以降、受容体への言及はその認められた遺伝子名によって行われる。受容体は、ヒト単球またはマクロファージにおける発現の実験的証拠に基づいて選択された（表１参照）。
【0163】
【表1-1】
【0164】
【表1-2】
【0165】
本発明者らは、まず、全血中の細胞の表面染色性を評価した。このために、本発明者らは、赤血球溶解後のサイズおよび粒度(granularity)によって好中球、単球およびリンパ球をゲーティングした(gated)（図１Ａおよび１Ｂ参照）。
【0166】
単球での発現解析の結果、好中球やリンパ球と比較して最も豊富で選択的な受容体はＣＳＦ１Ｒであることが示された（図１Ａ～Ｂおよび図５を参照）。分析された残りの受容体は、マッチした抗体アイソタイプまたはＦＭＯコントロールよりもパン単球レベル(pan-monocyte level)で有意な膜発現を示さなかった（図５を参照）。
【0167】
実施例２－ＣＤ１４およびＣＤ１６単球サブセットにおけるパン－ヒト単球マーカー(pan-human monocyte marker)としてのＣＳＦ１Ｒ
ＣＤ１４＋単球は最も多く存在する集団であり、より少ないサブセットでの発現をマスクする可能性がある。そこで、本発明者らは、系統決定サイトカイン受容体とＣＤ１４およびＣＤ１６で定義される従来の単球サブセット：ＣＤ１４＋ＣＤ１６－単球、ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋単球、ＣＤ１４－ＣＤ１６＋単球との関係を調べた（図２Ａおよび２Ｂを参照）。ＣＤ１６ｖｓＣＤ１４のプロットにおいて、二重陰性細胞は、従来、単球をＴ細胞、ＮＫ細胞およびＢ細胞に割り当てらるＣＤ３、ＣＤ５６およびＣＤ１９(CD3, CD56 and CD19 expression assigning them to T cells, NK cells and B cells)の発現を通じて単球から除外されてきた(Marimuthu et al., 2018; Mukherjee et al., 2015; Passlick et al., 1989)。本発明者らは、従来から研究されているようなサブセットにおける受容体の発現を調べた。
ＣＤ１４＋単球は最も多く存在する集団であり、より少ないサブセットでの発現をマスクする可能性がある。そこで、本発明者らは、系統決定サイトカイン受容体とＣＤ１４およびＣＤ１６で定義される従来の単球サブセット：ＣＤ１４＋ＣＤ１６－単球、ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋単球、ＣＤ１４－ＣＤ１６＋単球との関係を調べた（図２Ａおよび２Ｂを参照）。ＣＤ１６ｖｓＣＤ１４のプロットにおいて、二重陰性細胞は、従来、単球をＴ細胞、ＮＫ細胞およびＢ細胞に割り当てらるＣＤ３、ＣＤ５６およびＣＤ１９(CD3, CD56 and CD19 expression assigning them to T cells, NK cells and B cells)の発現を通じて単球から除外されてきた(Marimuthu et al., 2018; Mukherjee et al., 2015; Passlick et al., 1989)。本発明者らは、従来から研究されているようなサブセットにおける受容体の発現を調べた。
【0168】
単球サブセットの表面発現解析から、ＣＳＦ１Ｒは３つのサブセットすべてで高発現していること（図２Ａ、２Ｂを参照）；この受容体はＣＤ１６の発現とともに増加することが示される。
【0169】
実施例３－ＣＳＦ１Ｒはソーティングによりパン－単球(pan-monocyte)の単離を可能にする
ＣＳＦ１Ｒのパン－単球(pan-monocyte)発現に基づき、本発明者らは、ＣＤ１４と比較することにより、ソーティングマーカー(sorting marker)としての実現可能性(feasibility)を検討することに着手した。染色は、抗ＣＤ１４、ＣＤ１６およびＣＳＦ１Ｒ抗体で行われた。ＣＤ１４ソーティングでは、単球を効率よく精製できるが、ＣＤ１４－ＣＤ１６＋集団は失われる（図３を参照）。一方、ＣＳＦ１Ｒソーティングでは、ＣＤ１４－ＣＤ１６＋単球を含むすべての単球が捕捉される（図３を参照）。約３％のＣＳＦ１Ｒ＋細胞の小さな集団は、ＣＤ１４およびＣＤ１６に対して陰性である（図３を参照）。この二重陰性集団はＣＤ１４＋ＣＤ１６－単球と同等のＣＦＳ１Ｒレベルを持ち、ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋およびＣＤ１４－ＣＤ１６＋単球よりもＣＦＳ１Ｒの発現が少ない（図２Ａおよび図２Ｂを参照）。また、ＣＳＦ２ＲＡは、ＣＤ１４－ＣＤ１６－、ＣＤ１４＋ＣＤ１６－単球とＣＤ１４＋ＣＤ１６＋単球との間でも同様であった。これらの二重陰性細胞は、単球と同様のマーカーを発現しているように見えるが、従来のＣＤ１４およびＣＤ１６の二分法(CD14 and CD16 dichotomy)では除外される。図６は、従来のＣＤ１４／ＣＤ１６／ＣＤ１ＣサブセットにおけるＣＳＦ－Ｒ１細胞の分布を要約するものである。
ＣＳＦ１Ｒのパン－単球(pan-monocyte)発現に基づき、本発明者らは、ＣＤ１４と比較することにより、ソーティングマーカー(sorting marker)としての実現可能性(feasibility)を検討することに着手した。染色は、抗ＣＤ１４、ＣＤ１６およびＣＳＦ１Ｒ抗体で行われた。ＣＤ１４ソーティングでは、単球を効率よく精製できるが、ＣＤ１４－ＣＤ１６＋集団は失われる（図３を参照）。一方、ＣＳＦ１Ｒソーティングでは、ＣＤ１４－ＣＤ１６＋単球を含むすべての単球が捕捉される（図３を参照）。約３％のＣＳＦ１Ｒ＋細胞の小さな集団は、ＣＤ１４およびＣＤ１６に対して陰性である（図３を参照）。この二重陰性集団はＣＤ１４＋ＣＤ１６－単球と同等のＣＦＳ１Ｒレベルを持ち、ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋およびＣＤ１４－ＣＤ１６＋単球よりもＣＦＳ１Ｒの発現が少ない（図２Ａおよび図２Ｂを参照）。また、ＣＳＦ２ＲＡは、ＣＤ１４－ＣＤ１６－、ＣＤ１４＋ＣＤ１６－単球とＣＤ１４＋ＣＤ１６＋単球との間でも同様であった。これらの二重陰性細胞は、単球と同様のマーカーを発現しているように見えるが、従来のＣＤ１４およびＣＤ１６の二分法(CD14 and CD16 dichotomy)では除外される。図６は、従来のＣＤ１４／ＣＤ１６／ＣＤ１ＣサブセットにおけるＣＳＦ－Ｒ１細胞の分布を要約するものである。
【0170】
図４に示されるように、本発明者らは、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄの９－４Ｄ２－１Ｅ４ラットモノクローナルおよびｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅの１２－３Ａ３－１Ｂ１０ラットモノクローナルという２種類の異なる抗体クローンを使用した。また、本発明者らは、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ抗体の３種類の異なる蛍光色素（ＢＶ－４２１、ＰＥ、ＡＰＣ）にも注目した。Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ抗体は、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ抗体よりも親和性が高いように見えるが、蛍光色素間に違いはない。滴定しても、抗体は、陽性ＣＳＦ－Ｒ１集団にシフトしない。
【0171】
ディスカッション
本発明者らは、ヒト単球および好中球におけるならびに単球許容サブセット分類(monocyte accepted subset classifications)内での系統決定サイトカインの発現を同時に対比、比較した。驚くべきことに、ＣＳＦ１Ｒが高発現したパン－単球マーカーである(highly expressed pan-monocyte marker)ことが判明した。ＣＤ１４やＣＤ１６とは異なり、ＣＳＦ１Ｒは血中のすべてのヒト単球の特徴を明らかにすることができる。単球によって発現される他の造血レセプターにはＩＬ３ＲＡとＣＳＦ３Ｒがある。本発明者らは、特定の仮説に縛られることは望まないものの、血中の単球を組織化する別の方法を提案するが、これは細胞発生の観点からより有益である可能性がある。
本発明者らは、ヒト単球および好中球におけるならびに単球許容サブセット分類(monocyte accepted subset classifications)内での系統決定サイトカインの発現を同時に対比、比較した。驚くべきことに、ＣＳＦ１Ｒが高発現したパン－単球マーカーである(highly expressed pan-monocyte marker)ことが判明した。ＣＤ１４やＣＤ１６とは異なり、ＣＳＦ１Ｒは血中のすべてのヒト単球の特徴を明らかにすることができる。単球によって発現される他の造血レセプターにはＩＬ３ＲＡとＣＳＦ３Ｒがある。本発明者らは、特定の仮説に縛られることは望まないものの、血中の単球を組織化する別の方法を提案するが、これは細胞発生の観点からより有益である可能性がある。
【0172】
本発明者らの多色解析(multicolour analysis)により、ＣＳＦ１Ｒ受容体が単球の重要なマーカーであることが示された。これは、ヒト単球のマーカーとして広く受け入れられていない受容体である。臨床では様々な抗ＣＳＦ１Ｒ薬(anti CSF1R tools)が試用されているのとは対照的に、ヒトＣＳＦ１Ｒ受容体は研究において広く応用されていない。ヒトＣＤ１１５で報告された最初の抗体は１９８０年代に作られた(Ashmun et al., 1989)。ちなみに、ＣＤ１４はその数ヶ月後に発表された(Wright et al., 1990)。ＣＤ１１５の原著は、発表以来１７回しか引用されていない。一方、ＣＤ１４はヒト単球のマーカーとして好まれるようになり、今日まで血液や体液から単球や骨髄系細胞を分離するために用いられる主要な抗原となっている。ＣＳＦ１Ｒ受容体は、種間の類似性およびサブセットの同一性を調査する最近の原稿で再記述され、言及されている(Ingersoll et al., 2010; Schmidl et al., 2014; Wong et al., 2011)。
【0173】
ＣＦＳ１Ｒは、ヒトにおける単球の定量・単離のための受容体であり、ツールであることが見過ごされている。今回、本発明者らは、ＣＳＦ１Ｒが血液中のパン－単球(pan-monocytes)の同定および分離を可能にすることを示した。このことは、臨床において、体液中の単球や単球関連細胞をより正確に測定するために、反響を呼び起こす可能性がある。ＣＤ１４およびＣＤ１６が単球の唯一のマーカーであると考えるべきではなく、これらのマーカーが陰性でありながら、従来の単球サブセットと受容体プロファイルを共有する、真にＣＳＦ１Ｒ陽性集団が存在する。この集団は選択的であり、単球ネットワークの一部であると考えるべきであろう。
【0174】
結論
本発明者らは、驚くべきことに、ＣＳＦ－１Ｒがパン－単球マーカー(pan-monocyte marker)として使用できることを示した。本発明者らは、ＣＤ１４またはＣＤ１６のマーカーだけではなしえない、ＣＳＦ－１Ｒ抗体を用いたＦＡＣＳソーティングにより、すべての単球を単離することができ、さらに抗体を必要としなかった。本発明者らは、ＣＳＦ－１Ｒが、正確な単離、定量を可能にする主な単球マーカーとして使用できること、また、個体発生学的な観点からの新規な単球の見方を示すことができることを明らかにした。
本発明者らは、驚くべきことに、ＣＳＦ－１Ｒがパン－単球マーカー(pan-monocyte marker)として使用できることを示した。本発明者らは、ＣＤ１４またはＣＤ１６のマーカーだけではなしえない、ＣＳＦ－１Ｒ抗体を用いたＦＡＣＳソーティングにより、すべての単球を単離することができ、さらに抗体を必要としなかった。本発明者らは、ＣＳＦ－１Ｒが、正確な単離、定量を可能にする主な単球マーカーとして使用できること、また、個体発生学的な観点からの新規な単球の見方を示すことができることを明らかにした。
【0175】
【化12】
【0176】
【化13】
【0177】
【化14】
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図7】
【配列表】
【国際調査報告】