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特表2023-521759ヒトＦＵＳタンパク質をコードする核酸及び筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の治療における使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-05-25
(54)【発明の名称】ヒトＦＵＳタンパク質をコードする核酸及び筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の治療における使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/12 20060101AFI20230518BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230518BHJP
C12N 15/861 20060101ALI20230518BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230518BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20230518BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230518BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230518BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20230518BHJP
A61P 25/02 20060101ALI20230518BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230518BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230518BHJP
A61K 35/761 20150101ALI20230518BHJP
A61K 38/17 20060101ALN20230518BHJP
A61K 47/59 20170101ALN20230518BHJP
【ＦＩ】
C12N15/12 ZNA
C12N15/63 Z
C12N15/861 Z
C12N5/10
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
A61P21/00
A61P25/02
A61P43/00 111
A61K48/00
A61K35/761
A61K38/17
A61K47/59
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022561410
(86)(22)【出願日】2021-04-09
(85)【翻訳文提出日】2022-10-07
(86)【国際出願番号】 EP2021059322
(87)【国際公開番号】W WO2021205010
(87)【国際公開日】2021-10-14
(31)【優先権主張番号】20315141.0
(32)【優先日】2020-04-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】511074305
【氏名又は名称】インセルム（インスティチュート ナショナル デ ラ サンテ エ デ ラ リシェルシェ メディカル）
(71)【出願人】
【識別番号】500262120
【氏名又は名称】ユニヴェルシテ・ドゥ・ストラスブール
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＤＥ ＳＴＲＡＳＢＯＵＲＧ
(74)【代理人】
【識別番号】110002860
【氏名又は名称】弁理士法人秀和特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ドゥピュイ，リュック
(72)【発明者】
【氏名】サンファン ルイス，イマクラーダ
(72)【発明者】
【氏名】ピッキアレッリ，ジーナ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C076
4C084
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA83X
4B065AA86X
4B065AA87X
4B065AA87Y
4B065AA88X
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA44
4B065CA46
4C076AA95
4C076CC01
4C076CC09
4C076CC29
4C076CC41
4C076EE59
4C084AA13
4C084BA42
4C084BA44
4C084DC50
4C084NA05
4C084NA07
4C084NA13
4C084NA14
4C084ZA221
4C084ZA941
4C084ZC411
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BC83
4C087CA12
4C087NA14
4C087ZA22
4C087ZA94
4C087ZC41
(57)【要約】
発明は、イントロン６の配列番号１の配列と少なくとも６９％の配列同一性を有する配列及び／又はイントロン７の配列番号２の配列と少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含む、ヒトＦＵＳタンパク質をコードする核酸であって、当該配列が、エクソン７のいずれかの側に位置する、核酸、ヒトＦＵＳタンパク質をコードする当該核酸を含む組換えベクター、並びに筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の治療及び／又は予防における医薬品としてのそれらの使用に関する。発明は更に、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の予防及び／若しくは治療のための当該核酸並びに／又はベクターを含む薬学的組成物に関する。本発明は、治療的、獣医学的、及び診断的医療技術分野における用途を見出す。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
イントロン６の配列番号１の配列と少なくとも６９％の配列同一性を有する配列及び／若しくはイントロン７の配列番号２の配列と少なくとも６０％の配列同一性を有する配列、並びに／又はヒトＦＵＳタンパク質に結合することが可能な、配列番号１若しくは配列番号２の配列内の少なくとも１つの保存されたＲＮＡモチーフを含む、ヒトＦＵＳタンパク質をコードする核酸であって、前記配列が、エクソン７のいずれかの側に位置する、
核酸。
【請求項2】
配列番号１の配列と少なくとも６９％の配列同一性を有する前記配列が、配列番号３、配列番号４、又は配列番号１９の配列からなる群から選択される、請求項１に記載の核酸。
【請求項3】
配列番号２の配列と少なくとも６０％の配列同一性を有する前記配列が、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、又は配列番号２０の配列からなる群から選択される、請求項１に記載の核酸。
【請求項4】
ヒトＦＵＳタンパク質に結合することが可能な、配列番号１の配列内のモチーフを有する前記配列が、配列番号５４及び配列番号５５の配列からなる群から選択される、請求項１に記載の核酸。
【請求項5】
ヒトＦＵＳタンパク質に結合することが可能な、配列番号２の配列内のモチーフを有する前記配列が、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、及び配列番号５９の配列からなる群から選択される、請求項１に記載の核酸。
【請求項6】
前記配列が、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、及び配列番号５３の配列からなる群から選択される配列である、請求項１～５のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項7】
請求項１～６のいずれか一項に記載の核酸を含む、組換えベクター。
【請求項8】
アデノウイルス、プラスミド、ＹＡＣ（酵母人工染色体）、又はＢＡＣ（細菌人工染色体）であることを特徴とする、請求項７に記載のベクター。
【請求項9】
アデノウイルスであることを特徴とする、請求項７又は８に記載のベクター。
【請求項10】
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の治療及び／又は予防における医薬品として使用するための、請求項１～６のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項11】
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の治療及び／又は予防における医薬品として使用するための、請求項７～９のいずれか一項に記載の組換えベクター。
【請求項12】
治療有効量の、請求項１～６のいずれか一項に記載の核酸、及び／又は請求項７～９のいずれか一項に記載の担体を含む、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の予防及び／又は治療のための、薬学的組成物。
【請求項13】
請求項１～４のいずれか一項に記載の核酸、及び／又は請求項５～７のいずれか一項に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明は、イントロン６の配列番号１の配列と少なくとも６９％の配列同一性を有する配列及び／又はイントロン７の配列番号２の配列と少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含むヒトＦＵＳタンパク質をコードする核酸であって、当該配列が、エクソン７のいずれかの側に位置する、核酸、ヒトＦＵＳタンパク質をコードする当該核酸を含む組換えベクター、及び筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、ＡＬＳ）の治療並びに／又は予防における医薬品としてのそれらの使用に関する。発明はまた、当該核酸及び／又はベクターを含む宿主細胞に関する。発明は更に、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の予防及び／若しくは治療のための当該核酸並びに／又はベクターを含む薬学的組成物に関する。
【0002】
本発明は、治療的、獣医学的、及び診断的医療技術分野における用途を見出す。
【0003】
以下の説明では、角括弧（［］）内の参照は、本文書の終わりの参照文献のリストを指す。
【背景技術】
【0004】
運動ニューロン疾患（ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ、ＭＮＤ）又はＬｏｕ Ｇｅｈｒｉｇ病としても引用される筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、６０歳頃に発症する、脳幹、脊髄、及び運動皮質における運動ニューロンの変性が関与する。運動ニューロン喪失の結果としては、筋力低下及び筋肉萎縮が挙げられる。主要な症状は、発症部位に応じて、上肢、下肢、又は顔及び首の筋肉に影響を与える。言い換えれば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）に罹患している人々は、効率的な動きを誘発する能力が徐々に失われ、これが最高潮に達すると、死亡を引き起こす呼吸能力を喪失する。
【0005】
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）に関与する原因及び生物学的機序は、分かっていない。しかしながら、この疾患は、遺伝的及び環境的寄与の両方が関与すると思われる。具体的には、ＡＬＳ症例のサブセットは優勢遺伝であり、これらのいわゆる家族性ＡＬＳ症例（ｆａｍｉｌｉａｌ ＡＬＳ、ｆＡＬＳ）における遺伝的寄与を実証している。ｆＡＬＳ患者は、通常、早期には運動症状を発症し、平均余命は、非家族性（いわゆる孤発性）患者よりも短い。罹患した人々のうちのほとんどは、約５０～６０歳で運動症状を発症するが、４０歳未満で発症する症例もある。欧州では、疾患は、１年につき１００，０００人当たり約２～３人の人々が新たに罹患する。
【0006】
罹患すると、平均生存時間は、約２～６年である。今日まで、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の病因を治療するための治療及び／又は手段は存在しない。現在、２つの治療のみが規制機関によって承認されている。リルゾールは、機能は改善されないが、寿命を延長するのに適度な効果を有する一方で、エダラボンは、患者の小サブセットにおいて中等度に防御活性を示している。ＡＬＳ患者はまた、快適なケアとみなすことができる、症状の進行を管理するためのいくつかの治療を受けている。新しい効率的な薬物を開発することが失敗する理由は、ＡＬＳがむしろ、完全に異なる原因を有し、かつ最終段階で同様の臨床的状況に収束する機序を有する複数の疾患の大要であるという事実に依拠し得る。したがって、例えば、病因学的機序を標的とする新しい治療戦略を開発することが非常に必要である。
【0007】
したがって、従来技術の短所、欠点、及び障害を克服する化合物及び／又は方法、特に
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を治療及び／若しくは予防するための化合物並びに／又は方法に対する現実的な必要性が存在する。
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を治療及び／若しくは予防するための化合物並びに／又は方法に対する現実的な必要性が存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【特許文献1】国際公開第８３／００４２６１号
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】Ｓｃｅｋｉｃ－Ｚａｈｉｒｏｖｉｃ Ｊ，Ｓｅｎｄｓｃｈｅｉｄ Ｏ，Ｅｌ Ｏｕｓｓｉｎｉ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｔｏｘｉｃ ｇａｉｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｍｕｔａｎｔ ＦＵＳ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓ ｃｒｕｃｉａｌ ｔｏ ｔｒｉｇｇｅｒ ｃｅｌｌ ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎ ｌｏｓｓ．ＥＭＢＯ Ｊ ２０１６；３５（１０）：１０７７－９７
【非特許文献2】Ｍｉｔｃｈｅｌｌ ＪＣ，２０１３「Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ ＦＵＳ ｃａｕｓｅｓ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ａｎ ａｇｅ－ａｎｄ ｄｏｓｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｆａｓｈｉｏｎ」Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ ｖｏｌｕｍｅ １２５，ｐａｇｅｓ２７３－２８８（２０１３ ＤＯＩ：１０．１００７／ｓ００４０１－０１２－１０４３－ｚ
【非特許文献3】Ｍｕｒｒａｙ Ｅ．Ｊ．（ｅｄ．），Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（１９９１）
【非特許文献4】Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，３４６：７７６－７７７（１９９０）
【非特許文献5】Ｂｒａｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，７：２０３１－２０３４（１９８７）
【非特許文献6】Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，２：４８２（１９８１）
【非特許文献7】Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３（１９７０）
【非特許文献8】Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５：２４４４（１９８８）
【非特許文献9】カタログｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｍｅｇａ．ｃｏｍ／ｖｅｃｔｏｒｓ／ｍａｍｍａｌｉａｎ＿ｅｘｐｒｅｓｓ＿ｖｅｃｔｏｒｓ．ｈｔｍ
【非特許文献10】ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｑｉａｇｅｎ．ｃｏｍ／ｐｅｎｄａｎｔｖｉｅｗ／ｑｉａｇｅｎｅｓ．ａｓｐｘ？ｇａｗ＝ＰＲＯＴＱＩＡｇｅｎｅｓ０８０７＆ｇｋｗ＝ｍａｍｍａｌｉａｎ＋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
【非特許文献11】ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｃｂｔ．ｃｏｍ／ｃｈａｐ＿ｅｘｐ＿ｖｅｃｔｏｒｓ．ｐｈｐ？ｔｙｐｅ＝ｐＣｒｕｚＴＭ％２０Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ％２０Ｖｅｃｔｏｒｓ
【非特許文献12】Ｎａｓｏ ｅｔ ａｌ ２０１７，「Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）ａｓ ａ Ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ」，ＢｉｏＤｒｕｇｓ．２０１７ Ａｕｇ；３１（４）：３１７－３３４．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ４０２５９－０１７－０２３４－５
【非特許文献13】Ｚｉｎｃａｒｅｌｌｉ ２００８「Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＡＡＶ Ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ １－９ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒｏｐｉｓｍ ｉｎ Ｍｉｃｅ Ａｆｔｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ」Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００８ Ｊｕｎ；１６（６）：１０７３－８０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔ．２００８．７６．Ｅｐｕｂ ２００８ Ａｐｒ １５
【非特許文献14】Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ Ｊ１，Ｂｌａｘｔｅｒ Ｍ．「Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇｓ：ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ．」Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００９；５３３：１－１２．ｄｏｉ：１０．１００７／９７８－１－６０３２７－１３６－３＿１
【非特許文献15】Ｋｒｕｔｚｆｅｌｄｔ Ｊ，Ｒａｊｅｗｓｋｙ Ｎ，Ｂｒａｉｃｈ Ｒ，Ｒａｊｅｅｖ ＫＧ，Ｔｕｓｃｈｌ Ｔ，Ｍａｎｏｈａｒａｎ Ｍ，Ｓｔｏｆｆｅｌ Ｍ．Ｎａｔｕｒｅ．２００５ Ｄｅｃ １；４３８（７０６８）：６８５－９．Ｅｐｕｂ ２００５ Ｏｃｔ ３０
【非特許文献16】Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．（「ＡＬＳ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＦＵＳ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｒｅｓｕｌｔ ｉｎ ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ ＦＵＳ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ａｎｄ ａｕｔｏｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ」．Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１３，Ｖｏｌｕｍｅ ９，Ｉｓｓｕｅ １０，ｅ１００３８９５）
【非特許文献17】Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ：ｐｏｗｅｒｆｕｌ ｔｏｏｌｓ ｉｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｏｍｉｃｓ．Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ．２００３ Ｎｏｖ；３１（１１）：１００７－１４．Ｋｉｔａｍｕｒａ Ｔ，Ｋｏｓｈｉｎｏ Ｙ，Ｓｈｉｂａｔａ Ｆ，Ｏｋｉ Ｔ，Ｎａｋａｊｉｍａ Ｈ，Ｎｏｓａｋａ Ｔ，Ｋｕｍａｇａｉ Ｈ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｆｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ
【非特許文献18】Ｓｃｅｋｉｃ－Ｚａｈｉｒｏｖｉｃ Ｊ，Ｏｕｓｓｉｎｉ ＨＥ，Ｍｅｒｓｍａｎｎ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎ ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ａｎｄ ｅｘｔｒｉｎｓｉｃ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ ｔｏ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ＦＵＳ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ ２０１７；１３３（６）：８８７－９０６
【非特許文献19】Ｊｅｌｅｎａ Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ ２０１７
【非特許文献20】Ｖａｎｄｅｓｏｍｐｅ ｅｔ ａｌ ２００２
【非特許文献21】Ｌｏｐｅｚ－Ｅｒａｕｓｋｉｎ Ｊ，Ｔａｄｏｋｏｒｏ Ｔ，Ｂａｕｇｈｎ ＭＷ，ｅｔ ａｌ．ＡＬＳ／ＦＴＤ－Ｌｉｎｋｅｄ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ＦＵＳ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ Ｉｎｔｒａ－ａｘｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｄｒｉｖｅｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｗｉｔｈｏｕｔ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｌｏｓｓ－ｏｆ－Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ＦＵＳ．Ｎｅｕｒｏｎ ２０１８；１００（４）：８１６－３０ ｅ７
【発明の概要】
【0010】
本発明は、イントロン６の配列番号１の配列と少なくとも６９％の配列同一性を有する配列及び／若しくはイントロン７の配列番号２の配列と少なくとも６０％の配列同一性を有する配列、並びに／又はヒトＦＵＳタンパク質に結合することが可能な、配列番号１若しくは配列番号２の配列内の少なくとも１つの保存されたＲＮＡモチーフを含む、ヒトＦＵＳタンパク質をコードする核酸を提供することによって、従来技術の欠点及び不便を克服することを可能にする。
【0011】
発明者らは、驚くべきことにかつ予想外に、発明による核酸が、ＡＬＳに罹患している人々を治療するのに有用であることを実証した。具体的には、発明者らは、驚くべきことに、本発明の核酸が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、具体的には、ＦＵＳ遺伝子における変異に関連するＡＬＳの重度の若年性形態を罹患している患者の筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を治療及び治癒を可能にすることを実証した。
【0012】
具体的には、発明者らは驚くべきことに、発明が、野生型タンパク質の過剰な毒性産生を回避しながら、変異体タンパク質を減少させ、同時に正常な生理学的に活性な野生型タ
ンパク質で十分に満たすことが可能であることを実証した。
ンパク質で十分に満たすことが可能であることを実証した。
【0013】
具体的には、ＦＵＳ遺伝子における変異は、生理学的に核変異したＦＵＳタンパク質の細胞質蓄積をもたらすことが知られている。ＦＵＳの細胞質蓄積は、生殖細胞系変異に関連しないが、ほとんどのＡＬＳ症例（Ｔｙｚａｃｋ ２０１９）及び前頭側頭型認知症に罹患している症例の大サブセット（Ｕｒｗｉｎ ２０１０）において広汎な現象である。生殖細胞系変異に関連する場合、変異の毒性は、細胞質ＦＵＳの蓄積及び核ＦＵＳの同時喪失の両方に由来することが実証されている。実際、細胞質ＦＵＳの毒性は、繰り返し実証されており（例えば、非特許文献１［１０］）、核ＦＵＳの喪失は、ニューロン及びシナプスに対して全体的に毒性であるいくつかの転写異常をもたらす。
【0014】
発明者らは、ＦＵＳ変異によって媒介されるＡＬＳの効率的な治療が、核機能の喪失を補正するだけでなく、細胞質蓄積の増加を予防するであろうことを実証した。ｃＤＮＡが推進する過剰発現系を通じたＦＵＳタンパク質の単純な過剰発現は、原則的に、機能の喪失を救済し得るが、変異体対立遺伝子からの毒性細胞質ＦＵＳの蓄積を回避することは予想されず、最も重要なことに、ニューロンに対して非常に毒性が高いことが示されている（非特許文献２［１２］）。
【0015】
発明者らは、驚くべきことに、ヒトＦＵＳ遺伝子をコードする核酸、好ましくはヒトＦＵＳ遺伝子をコードする完全長核酸が、毒性を全く伴わずに相乗的に、変異したＦＵＳの細胞質蓄積を予防し、核内にＦＵＳを回復させることが可能であることを実証した。具体的には、本発明は、従来より使用されている過剰発現系とは対照的に毒性を全く誘発しない。
【0016】
発明者らは、驚くべきことに、核酸を提供することが、相同的なＦｕｓ変異を担持するマウスの出生周辺期の致死性を完全に救済し（図１）、ヘテロ接合型Ｆｕｓ変異体マウスにおいて観察される運動欠陥を救済する（図２）のに十分であることを実証した。驚くべきことにかつ有利なことに、救済は、核及び細胞質画分の生化学的分別、免疫組織化学、並びに免疫蛍光から判断して、細胞質ＦＵＳ蓄積の完全な逆転と関連する（図３）。ｃＤＮＡによって推進される野生型ＦＵＳタンパク質過剰発現自体は非常に毒性が高いため、２年齢まで、毒性が治療されたトランスジェニックマウスにおいて全く観察されなかったことは、特に衝撃的かつ驚くべきことである（非特許文献２［１２］）。発明者らは、提供される核酸がゲノム構築物を含むという事実に起因して毒性がなく、ＦＵＳ遺伝子の自己調節を可能にし、制御されないＦＵＳレベルの有害な影響を回避することを実証した。
【0017】
本発明において、発明によるヒトＦＵＳタンパク質をコードする核酸は、イントロン６の配列番号１の配列と、少なくとも６９％ ７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含み得る。それは、例えば、配列番号３、配列番号４、又は配列番号１９の配列の核酸であり得る。
【0018】
本発明において、発明によるヒトＦＵＳタンパク質をコードする核酸が、イントロン６の配列番号１の配列と、少なくとも６９％ ７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む場合、イントロン６の配列番号１の配列と同一性を有する当該配列は、エクソン７の前に位置し得る。
【0019】
本発明において、発明によるヒトＦＵＳタンパク質をコードする核酸は、配列番号２の配列と、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又
は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含み得る。それは、例えば、配列番号５，配列番号６、配列番号７、配列番号８、又は配列番号２０の配列の核酸であり得る。
は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含み得る。それは、例えば、配列番号５，配列番号６、配列番号７、配列番号８、又は配列番号２０の配列の核酸であり得る。
【0020】
本発明において、発明によるヒトＦＵＳタンパク質をコードする核酸が、配列番号２の配列と、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む場合、配列番号２の配列と同一性を有する当該配列は、エクソン７の後に位置し得る。
【0021】
本発明において、発明によるヒトＦＵＳタンパク質をコードする核酸は、ヒトＦＵＳタンパク質に結合することが可能な、配列番号１又は配列番号２の配列内の少なくとも１つの保存されたＲＮＡモチーフを含み得る。有利なことに、少なくとも１つの保存されたＲＮＡモチーフは、エクソン７の前又は後に位置し得る。２つ以上の保存されたＲＮＡモチーフが存在する場合、少なくとも１つの保存されたＲＮＡモチーフは、エクソン７の前に位置し得、少なくとも１つの保存されたＲＮＡモチーフは、エクソン７の後に位置し得る。モチーフは、約１８０個の核酸～約４５０個の核酸の配列を有する核酸であり得る。それは、例えば、約１９８～３９６個の核酸の配列を有する核酸であり得る。例えば、モチーフが、イントロン６の配列番号１の配列内である場合、配列番号５４及び配列番号５５の配列、又は配列がヒトＦＵＳタンパク質に結合する能力を保持する限り、当該配列と少なくとも９０％の同一性を有する配列からなる群から選択され得る。モチーフが、イントロン７の配列番号２の配列内である場合、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、及び配列番号５９の配列、又は配列がヒトＦＵＳタンパク質に結合する能力を保持する限り、当該配列と少なくとも９０％の同一性を有する配列からなる群から選択され得る。発明の核酸におけるモチーフの数は、１、又は２、又は３、又は４、又は５、又は６、又は７、又は８、又は９、又は１０、又はそれ以上であり得る。有利なことに、発明の核酸におけるモチーフの数は、１～６で構成される。
【0022】
有利なことに、発明によるヒトＦＵＳタンパク質をコードする核酸は、ＦＵＳが結合するＲＮＡモチーフに加えて、エクソンの両側のいくつかの配列、例えば、イントロン６の始めの９９個のヌクレオチド、及び／又はイントロン６の末端の１３６個のヌクレオチド、及び／又はイントロン７の始めの７６個のヌクレオチド、及び／又はイントロン７の末端の１２５個のヌクレオチドを含み得る。特定の作用機序に束縛されることを望むものではないが、これらの配列は、その自己調節に重要なものであり得るＦＵＳの調節配列であり得る。
【0023】
本発明において、発明によるヒトＦＵＳタンパク質をコードする核酸は、イントロン６の配列番号１の配列と少なくとも６９％の配列同一性を有する配列、イントロン７の配列番号２の配列と少なくとも６０％の配列同一性を有する配列、及びヒトＦＵＳタンパク質に結合することが可能な、配列番号１又は配列番号２の配列内の少なくとも１つの保存されたＲＮＡモチーフの中から選択される少なくとも１つの配列を含み得、当該少なくとも１つの配列が、エクソン７のいずれかの側に位置する。
【0024】
本発明において、発明によるヒトＦＵＳタンパク質をコードする核酸は、イントロン６の配列番号１の配列と少なくとも６９％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は１００％の配列同一性を有する配列、及びイントロン７の配列番号２の配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は１００％の配列同一性を有する配列、及びヒトＦＵＳタンパク質に結合することが可能な、配列番号１又は配列番号２の配列内の少なくとも１つの保存されたＲＮＡモチーフを含み得、当該配列が、エクソン７のいずれかの側に位置する。それは、例えば、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、及び配列番号５３の配列の、ヒトＦＵＳタンパク質をコードする核酸であり得る。
【0025】
本発明において、ヒトＦＵＳタンパク質をコードする核酸における核酸配列、例えば配列番号１及び／又は２の配列の位置は、５’から３’の方向への配列の位置を指し得る。
【0026】
本発明において、ヒトＦＵＳをコードする遺伝子は、ＦＵＳの変異していないヒト遺伝子及び／又は野生型ヒト遺伝子を意味する。染色体１６（遺伝子ＩＤ：２５２１）に位置する、Ｉ配列番号１０の配列。本明細書で使用される場合、「野生型」という用語は、天然に存在する供給源から単離される場合、その遺伝子又は遺伝子産生物の特徴を有する遺伝子又は遺伝子産生物を指す。野生型遺伝子又は遺伝子産生物（例えば、ポリペプチド）は、集団で最も頻繁に観察され、したがって、遺伝子の「正常」又は「野生型」形態に任意に設計されている。
【0027】
本発明において、ヒトＦＵＳをコードする変異した遺伝子は、野生型形態と比較して任意の変形を有する一次配列を担持するヒトＦＵＳタンパク質をコードする遺伝子の任意の形態を意味する。それは、変異したヒトタンパク質ＦＵＳ、例えば、疾患に関連する、例えば、タンパク質のＣ末端領域における変異を有するヒトタンパク質ＦＵＳタをもたらし得る任意の変異であり得る。
【0028】
別段文脈が必要としない限り、本明細書及び特許請求の範囲を通じて、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのその変形は、「限定されないが、含む」のようなものである、開放的な包含する意味として解釈されるものである。
【0029】
「からなる」は、「からなる」という語句に続くものを含み、それらに限定されることを意味する。したがって、「からなる」という語句は、列挙された要素が、必要又は必須であり、他の要素が全く存在しなくてもよいことを示す。
【0030】
「本質的にからなる」は、語句の後に列挙され、列挙された要素に対する開示において指定された活性又は作用に干渉しないか又は寄与しない他の要素に限定される任意の要素を含むことを意味する。したがって、「本質的にからなる」という語句は、列挙された要素が必要又は必須であるが、他の要素が任意選択的であり、列挙された要素の活性又は作用に影響を与えるかどうかに応じて存在しても存在しなくてもよいことを示す。
【0031】
現在では、本明細書で使用される「単離された」という用語及びその文法的同等物は、その天然環境からの核酸の除去を指す。
【0032】
現在では、本明細書で使用される「精製された」という用語及びその文法的同等物は、純度が増加されている、天然から除去された（ゲノムＤＮＡ及びｍＲＮＡを含む）、又は合成された（ｃＤＮＡを含む）、及び／又は実験室条件下で増幅された分子又は組成物を指し、「純度」が、比較条件であり、「絶対純度」ではない。しかしながら、核酸及びタンパク質は、希釈剤又はアジュバントと共に製剤化され得、依然として実用的な目的のために単離され得ることが理解されるものである。例えば、核酸は、細胞への導入に使用される場合、許容可能な担体又は希釈剤と混合され得る。
【0033】
現在では、本明細書で使用される「実質的に精製された」という用語及びその文法的同等物は、核酸、ポリペプチド、タンパク質、又は他の化合物が天然に関連する、ポリヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチド、及び他の分子を実質的に含まない、すなわち、約５０％超、約７０％超、約９０％超含まない、核酸配列、ポリペプチド、タンパク質、又は他の化合物を指す。
【0034】
現在では、本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」、「ヌクレオチド」、「ポリ核酸」、又は任意の文法的同等物は、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチド又は核酸、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのいずれかを指す。この用語は、分子の一次構造のみを指す。したがって、この用語は、二本鎖及び一本鎖ＤＮＡ、三本鎖ＤＮＡ、並びに二本鎖及び一本鎖ＲＮＡを含む。それはまた、例えば、メチル化によって、及び／又はキャッピングによって修飾されたポリヌクレオチド、並びに非修飾形態のポリヌクレオチドを含む。この用語はまた、非天然に生じるヌクレオチド、又は合成ヌクレオチド、並びにヌクレオチド類似体を含む分子を含むことを意味する。本明細書で開示又は企図される核酸配列及びベクターは、例えば、トランスフェクション、形質転換、又は形質導入によって細胞に導入され得る。
【0035】
現在では、「トランスフェクション」、「形質転換」、又は「形質導入」は、物理的又は化学的方法を使用することによって、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを宿主細胞へ導入することを指す。それは、当業者に既知の適合させた、任意のトランスフェクション及び／又は形質転換及び／又は形質導入方法であり得る。それは、例えば、リン酸カルシウムＤＮＡ共沈（例えば、非特許文献３［１］を参照されたい）、ＤＥＡＥ－デキストラン、電気穿孔法、カチオン性リポソームによって媒介されるトランスフェクション、タングステン粒子によって促進されるパーティクルガン方法（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）（非特許文献４［２］）、及びストロンチウムリン酸ＤＮＡ共沈（非特許文献５）であり得る。ファージ、ウイルス、又は非ウイルスベクターは、好適なパッケージング細胞における感染性粒子の成長後に宿主細胞に導入され得、それらのうちの多くが市販されている。いくつかの実施形態では、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するために、リポフェクション、ヌクレオフェクション、又は一時的な膜破壊（例えば、電気穿孔法又は変形）が使用され得る。
【0036】
現在では、本明細書で使用される「保存されたＲＮＡモチーフ」は、ヒトＦＵＳ遺伝子と同一の配列を示し、ヒトＦＵＳタンパク質に結合することが可能な配列を指す。
【0037】
現在では、本明細書で使用される「ポリペプチド」、「ペプチド」、及びそれらの文法的同等物は、アミノ酸残基のポリマーを指す。
【0038】
現在では、「機能性タンパク質」は、生物学的に活性であり、任意選択的に、所与の細胞環境において、タンパク質には典型的なグリコシル化又は他の修飾を含むタンパク質である。
【0039】
本明細書に開示のポリペプチド及びタンパク質（機能性部分及びその機能性バリアントを含む）は、１つ以上の天然に存在するアミノ酸の代わりに合成アミノ酸を含み得る。それは、当業者に既知の任意の合成アミノ酸であり得、例えば、アミノシクロヘキサンカルボン酸、ノルロイシン、ａ－アミノｎ－デカン酸、ホモセリン、Ｓ－アセチルアミノメチル－システイン、トランス－３－及びトランス－４－ヒドロキシプロリン、４－アミノフェニルアラニン、４－ニトロフェニルアラニン、４－クロロフェニルアラニン、４－カルボキシフェニルアラニン、β－フェニルセリンβ－ヒドロキシフェニルアラニン、フェニルグリシン、ａ－ナフチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルグリシン、インドリン－２－カルボン酸、１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－３－カルボン酸、アミノマロン酸、アミノマロン酸モノアミド、Ｎ’－ベンジル－Ｎ’－メチル－リジン、Ν’，Ν’－ジベンジル－リジン、６－ヒドロキシリジン、オルニチン、ａ－アミノシクロペンタンカルボン酸、ａ－アミノシクロヘキサンカルボン酸、ａ－アミノシクロヘプタンカルボン酸、ａ－（２－アミノ－２－ノルボルナン）－カルボン酸、α，γ－ジアミノ酪酸、α，β－ジアミノプロピオン酸、ホモフェニルアラニン、並びにａ－ｔｅｒｔ－ブチルグリシンであり得る。
【0040】
現在では、ポリペプチド及びタンパク質は、当業者に既知の任意の翻訳後修飾を含み得る。それは、例えば、翻訳後修飾を有する１つ以上のアミノ酸を含み得る。１つ以上のアミノ酸の翻訳後修飾は、例えば、リン酸化、アセチル化及びホルミル化を含むアシル化、グリコシル化（Ｎ結合及びＯ結合を含む）、アミド化、ヒドロキシル化、メチル化及びエチル化を含むアルキル化、ユビキチン化、ピロリドンカルボン酸の付加、ジスルフィド架橋の形成、硫酸化、ミリストイル化、パルミトイル化、イソプレニル化、ファルネシル化、ゲラニル化、グリピエーション、リポイル化、並びにヨウ素化であり得る。
【0041】
現在では、核酸及び／又は核酸配列は、天然に又は人工的に核酸配列に由来する場合、「相同」とみなされ得る。
【0042】
現在では、タンパク質及び／又はタンパク質配列は、それらがコードするＤＮＡが天然に又は人工的に核酸配列に由来する場合、「相同」である。例えば、本明細書に記載のタンパク質は、当業者に既知の任意の利用可能な適合させた変異誘発方法によって修飾され得る。例えば、発現する場合、変異誘発された核酸は、元の核酸によってコードされるタンパク質に相同であるポリペプチドをコードする。相同性は、一般に、２つ以上の核酸又はタンパク質（又はそれらの配列）間の配列同一性から推測される。相同性を確立するのに有用である配列間の同一性の正確なパーセンテージは、本発明の核酸及びタンパク質によって変動し、例えば、少なくとも２５％、例えば、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性のパーセンテージであり得る。
【0043】
配列同一性のパーセンテージは、当業者に既知の任意の方法によって決定され得る。それは、例えば、デフォルトパラメータを使用して、例えば、ＢＬＡＳＴＰ及びＢＬＡＳＴＮの使用によって決定され得る。
【0044】
現在では、相同分子は、ホモログとも呼ばれ得る。
【0045】
現在では、本明細書で使用される「同一」及びその文法的同等物、並びに／又は２つの核酸配列若しくはポリペプチドの２つのアミノ酸配列の文脈における「配列同一性」という用語は、最大に対応するように整列された時に少なくとも２０個の連続する核酸又はアミノ酸の配列長にわたって同じである配列である、残基を指す。それは、例えば、少なくとも約５０個少なくとも２００個の連続する核酸又はアミノ酸の配列長にわたって最大に対応するように整列された時に同じである、２つの配列であり得る。配列の同一性は、２つの配列を最適に整列させた後に、同じ数の連続する位置の参照配列に対して配列を比較することによって決定され得る。
【0046】
参照配列に対する配列の同一性の決定及び／又は比較は、当業者に既知の任意の適合させた方法及び／又はプロセスを用いて実行され得る。それは、例えば、比較のために配列を整列させる方法、例えば、非特許文献６［４］の局所相同性アルゴリズムを使用する；非特許文献７［５］の整列アルゴリズムを使用する；非特許文献８［６］の同様の方法の検索を使用する；これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装、例えば、Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ ＣａｌｉｆによるＰＣ／Ｇｅｎｅプ
ログラムでのＣＬＵＳＴＡＬ、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．）のＴＦＡＳＴＡを使用する、配列を整列させる方法であり得るまた、整列は、多くの場合、検査及び手動整列によって実施される。
ログラムでのＣＬＵＳＴＡＬ、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．）のＴＦＡＳＴＡを使用する、配列を整列させる方法であり得るまた、整列は、多くの場合、検査及び手動整列によって実施される。
【0047】
現在では、核酸は、当業者に既知である任意の適合させた方法によって産生及び／又は得ることができる。例えば、核酸は、ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、４３３７４５４）を使用して合成され得る。
【0048】
本発明の別の目的は、上に説明されるように、イントロン６の配列番号１の配列と少なくとも６９％の配列同一性を有する配列及び／若しくはイントロン７の配列番号２の配列と少なくとも６０％の配列同一性を有する配列、並びに／又はヒトＦＵＳタンパク質に結合することが可能な、配列番号１若しくは配列番号２の配列内の少なくとも１つの保存されたＲＮＡモチーフを含む、ヒトＦＵＳタンパク質をコードする核酸を含む、組換えベクターである。
【0049】
発明によれば、ベクターは、核酸の発現に適合させた、当業者に既知の任意のベクターであり得る。それは、例えば、非特許文献９［１０］、又は非特許文献１０［１１］、又は他非特許文献１１［１２］に列挙されているベクターから選択される任意のベクターであり得る。それは、例えば、文書特許文献１［１３］に記載の発現ベクターであり得る。ベクターは、例えば、アデノ随伴ウイルス（Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ、ＡＡＶ）ベクター、プラスミド、酵母人工染色体（Ｙｅａｓｔ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ、ＹＡＣ）、又は細菌人工染色体（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ、ＢＡＣ）であり得る。
【0050】
ベクターは、当業者に既知の任意の適合させた及び／又は市販の適合させたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであり得る。それは、例えば、非特許文献１２、及び／又は非特許文献１３に開示の任意の適合させたＡＡＶであり得る。それは、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、又はＡＡＶ１０（ＡＡＶｒｈ．１０）を含む群から選択されるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター。好ましくはＡＡＶ９であり得る。
【0051】
ベクターは、当業者に既知の任意の適合させた及び／又は市販のプラスミドであり得る。それは、例えば、ｐＭＸ、ｐＵＣ１９、ｐＨＰ４５－ＣｍＲ、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）、ｐｃＤＮＡ３．３－ＴＯＰＯ、ｐｃＤＮＡ３．４－ＴＯＰＯ、ｐＦａｓｔＢａｃ１、ｐＥＴ１００／Ｄ－ＴＯＰＯ、ｐＥＴ１５１／Ｄ－ＴＯＰＯ、ｐＲＳＥＴ Ａ、ｐＹｅｓ２．１Ｖ５－Ｈｉｓ ＴＯＰＯ、ｐＤＯＮＲ２２１、ｐＧＥＸ－３Ｘ、好ましくはｐｃＤＮＡ３．１（＋）を含む群から選択されるプラスミドであり得る。
【0052】
ベクターは、当業者に既知の任意の適合させた酵母人工染色体であり得る。それは、例えば、ｐＹＡＣ－ＲＣ、ｐＹＡＣ３を含む群から選択される酵母人工染色体であり得る。
【0053】
ベクターは、当業者に既知の任意の適合させた細菌人工染色体であり得る。それは、例えば、ｐＵｖＢＢＡＣ、ｐＣＣ１ＢＡＣ、ｐＢＡＣ １０８Ｌを含む群から選択される細菌人工染色体であり得る。
【0054】
ベクターは、ポリヌクレオチド配列、例えば、以下を５’から３’の順序で、
プロモーター配列、
発明のヒトＦＵＳをコードする核酸配列、及び
ポリアデニル化（ポリＡ）配列を含む、発現カセットを含み得る。
プロモーター配列、
発明のヒトＦＵＳをコードする核酸配列、及び
ポリアデニル化（ポリＡ）配列を含む、発現カセットを含み得る。
【0055】
プロモーターは、当業者に既知の任意のプロモーターであり得る。それは、例えば、ハウスキーピング遺伝子のプロモーター、ウイルス遺伝子のプロモーター、組織特異的プロモーター、ニューロンを標的とするプロモーター、筋肉を標的とするプロモーターであり得る。
【0056】
それは、例えば、を含む群から選択されるハウスキーピング遺伝子のプロモーターであり得る。
【0057】
それは、例えば、ＣＭＶプロモーターを含む群から選択されるウイルス遺伝子のプロモーターであり得る。
【0058】
それは、例えば、組織特異的プロモーター、例えば神経組織及び／又は神経細胞特異的プロモーターであり得る。それは、例えば、ＮＳＥ、Ｃａｍｋ２ａ、Ｔｈｙ１、Ｆｅｚｆ２、Ｃｒｙｍプロモーターを含む群から選択されるプロモーターであり得る。それは、例えば、組織特異的プロモーター、例えば筋肉組織及び／又は筋肉細胞特異的プロモーターであり得る。それは、例えば、ｍｙｏＤ、ｍｙｆ５、ＭｙｏＧ、Ｄｅｓｍｉｎプロモーターを含む群から選択されるプロモーターであり得る。
【0059】
ベクターは、タグタンパク質をコードする核酸配列を更に含み得る。それは、例えば、当業者に既知のタグタンパク質をコードする任意の核酸配列であり得る。それは、例えば、非特許文献１４に開示の任意のタグであり得る。
【0060】
ベクターは、トランスジェニックタンパク質、例えば、別名タグを選択的に標識し得る追加の配列、例えば、ＨＡの産生を可能にする配列（配列：ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ配列番号３９）、ｍｙｃ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ配列番号４０）、又はＦＬＡＧ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ配列番号４１）タグを更に含み得る
【0061】
ベクターは、選択された宿主細胞に従って選択され得る。当業者は、その技術的知識を考慮して、宿主細胞に照らしてベクターを適合させるであろう。
【0062】
宿主細胞は、発明の核酸又はベクターの発現に好適な任意の宿主であり得る。それは、例えば、哺乳類細胞、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｐｉｓｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、又は昆虫細胞、例えば昆虫細胞－バキュロウイルス系、例えばバキュロウイルス発現系で使用されるＳＦ９昆虫細胞であり得る。
【0063】
本発明の別の目的は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の治療及び／又は予防における医薬品として使用するための核酸及び／又は組換えベクター及び／又は宿主細胞である。
【0064】
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の治療及び／又は予防における医薬品として使用するための核酸は、上に定義された発明の任意の核酸であり得る。
【0065】
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の治療及び／又は予防における医薬品として使用するためのベクターは、上に定義された発明の任意のベクターであり得る。
【0066】
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の治療及び／又は予防における医薬品として使用するための宿主細胞は、上に定義された発明の任意の宿主細胞であり得る。
【0067】
現在では、「治療」、「治療する」、「治療される」、又は「治療すること」という用語は、予防及び／又は治療を指し、特に、目的が、筋肉障害の発症及び／若しくは進行、並びに／又は運動ニューロンの不活性化及び／若しくは破壊などの望ましくない生理学的変化又は障害を予防又は遅らせる（軽減する）ことである。有益な又は所望の臨床的結果としては、限定されないが、検出可能であるか又は検出不可能であるかにかかわらず、症状の緩和、疾患の程度の減少、疾患状態の安定化（すなわち、悪化しないこと）、疾患の進行の遅延又は遅らせること、疾患状態の改善又は緩和、並びに寛解（部分的又は完全にかかわらず）が挙げられる。「治療」はまた、治療を受けていない場合予想される生存及び／又は生活の質と比較して、生存の延長及び／又は生活の質の増加を意味し得る。有利なことに、治療としては、以下のうちのいずれか：運動ニューロンの変化、例えば、運動ニューロンの不活性化及び／若しくは低下の減少、筋力の改善、筋肉サイズの改善、歩行する、話す、及び／若しくは呼吸する能力の変化の減少、線維束性筋収縮及び／若しくは痙攣の減少、並びに／又は歩行する、話す、体温を高める（ｈｅａｔｉｎｇ）、及び／若しくは呼吸する能力の改善、体重減少、痙性、反射亢進、情動不安定などの上位運動ニューロン症状の減少を挙げることができる。
【0068】
「対象」としては、疾患若しくは障害を有すると診断された、又は疾患若しくは障害を発症するリスクがあると決定された哺乳類などの、疾患又は障害の治療を必要とする哺乳類を含む、哺乳類、例えばヒトが挙げられる。
【0069】
本発明の別の目的は、本発明の核酸及び／又はベクター及び／又は宿主細胞を含む薬学的組成物である。
【0070】
薬学的組成物中の核酸は、上で定義された発明の任意の核酸であり得る。
【0071】
薬学的組成物中のベクターは、上で定義された発明の任意のベクターであり得る。
【0072】
薬学的組成物中の宿主細胞は、上で定義された発明の任意の宿主細胞であり得る。
【0073】
薬学的組成物は、ヒト又は動物に投与することができる任意の形態であり得る。
【0074】
投与は、本発明の核酸及び／若しくはベクター及び／若しくは宿主細胞を直接、すなわち純粋若しくは実質的に純粋である状態で、又は薬学的に許容される担体及び／若しくは培地と混合した後に実行され得る。本発明によれば、薬学的組成物は、シロップ又は注射可能な溶液であり得る。本発明によれば、薬学的組成物は、液体製剤、経口発泡剤形、経口粉末、多粒子系、口内分散性剤形を含む群から選択される、経口投与用の薬学的組成物であり得る。例えば、薬学的組成物が、経口投与用である場合、溶液、シロップ、懸濁液、エマルション、及び経口ドロップを含む群から選択される液体製剤の形態であり得る。薬学的組成物が、経口発泡剤形の形態である場合、錠剤、顆粒、及び粉末を含む群から選択される形態であり得る。薬学的組成物が、経口粉末又は多粒子系の形態である場合、ビーズ、顆粒、ミニ錠剤、及び微粒剤を含む群から選択される形態であり得る。薬学的組成物が、口内分散性剤形の形態である場合、口内分散性錠剤、凍結乾燥ウェハース、薄膜、チュアブル錠、錠剤、及びカプセル、医療用チューインガムを含む群から選択される形態であり得る。本発明によれば、薬学的組成物は、例えば、頬側又は舌下錠剤、粘膜付着性調製物、トローチ、口腔用ドロップ、及びスプレーを含む群から選択される、頬側及び舌下経路用であり得る。本発明によれば、薬学的組成物は、例えば、軟膏、クリーム、ゲル、ローション、パッチ、及びフォームを含む群から選択される、局所－経皮投与用であり得る。
【0075】
本発明によれば、薬学的組成物は、例えば、鼻滴、鼻スプレー、経鼻粉末を含む群から
選択される、経鼻投与用であり得る。本発明によれば、薬学的組成物は、直腸投与用、例えば、坐剤又は硬ゼラチンカプセルであり得る。本発明によれば、薬学的組成物は、非経口投与、例えば、皮下、筋肉内、静脈内投与用であり得る。当業者は、本明細書で使用される「形態」という用語が、その実用的な使用のための薬学的製剤を指すことを明確に理解する。
選択される、経鼻投与用であり得る。本発明によれば、薬学的組成物は、直腸投与用、例えば、坐剤又は硬ゼラチンカプセルであり得る。本発明によれば、薬学的組成物は、非経口投与、例えば、皮下、筋肉内、静脈内投与用であり得る。当業者は、本明細書で使用される「形態」という用語が、その実用的な使用のための薬学的製剤を指すことを明確に理解する。
【0076】
薬学的に許容される担体は、対象に応じて、ヒト又は動物へのオリゴヌクレオチド／ベクター及び／又は宿主細胞の投与に使用される任意の既知の薬学的担体であり得る。例えば、薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤としては、限定されないが、任意のアジュバント、担体、賦形剤、流動促進剤、甘味剤、希釈剤、防腐剤、染料／着色料、香味向上剤、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、懸濁剤、安定剤、等張剤、溶媒、又は乳化剤が挙げられる。例えば、この担体は、非特許文献１５［７］に記載の群から選択され得る。
【0077】
薬学的組成物の形態は、治療されるヒト又は動物に対して選択され得る。
【0078】
別の態様では、本発明は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、具体的には若年性筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）に罹患している対象を治療する方法を提供する。この方法は、発明の核酸及び／又はベクター及び／又は宿主細胞を当該対象に投与するステップを含み得る。
【0079】
発明の核酸及び／又はベクター及び／又は宿主細胞、並びに使用可能な製剤は、上で定義された通りである。投与は、当業者に既知であり、かつ核酸及び／又はベクター及び／又は宿主細胞を投与するのに有用な任意の薬学的方式を使用することによって行われ得る。投与可能な形態の医薬品の例は、上に提供されている。
【0080】
他の特色及び利点は、添付の図面を参照しながら、非限定的な説明として与えられている以下の実施例を閲読することによって、当業者に更に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0081】
【図1A】図１Ａは、繁殖戦略のスキームであり、スキームＦｕｓ＋／＋は、Ｆｕｓ遺伝子の野生型コピーを含むマウスを意味し、Ｆｕｓ ΔＮＬＳ／＋は、核局在配列を含まない（ΔＮＬＳ）Ｆｕｓ遺伝子のコピー及びＦｕｓ遺伝子のｗｔコピーを含むマウスを意味し、ｈＦＵＳは、ヒト野生型ＦＵＳ遺伝子のコピーを発現しているマウスを意味する。
【図1B】図１Ｂは、Ｆｕｓ＋／＋マウス、Ｆｕｓ ΔＮＬＳ／＋マウス、ヒト野生型ＦＵＳ遺伝子（ｈＦＵＳ）のコピーを発現しているか又は発現していないＦｕｓ ΔＮＬＳ／ΔＮＬＳマウスのウエスタンブロットの写真である。この写真において、ΔＮＬＳは、ΔＮＬＳタンパク質の移行線を示し、ｗｔは、野生型マウスＦｕｓタンパク質の移行線を示し、ｈＦＵＳは、野生型ヒトＦｕｓタンパク質の移行線を示す。
【図1C】図１Ｃは、異なるマウス遺伝子型：Ｆｕｓ＋／＋マウス、Ｆｕｓ ΔＮＬＳ／＋、及びＦｕｓ ΔＮＬＳ／＋、ｈＦＵＳのカプランマイヤー生存曲線を表す図であり、縦座標が生存パーセンテージを表し、横座標が日数を表す。
【図1D】図１Ｄは、異なるマウス遺伝子型：Ｆｕｓ＋／＋マウス、Ｆｕｓ ΔＮＬＳ／ΔＮＬＳ、及びＦｕｓ ΔＮＬＳ／ΔＮＬＳ、ｈＦＵＳのカプランマイヤー生存曲線を表す図であり、縦座標が生存パーセンテージを表し、横座標が日数を表す。
【図2A】Ｆｕｓ＋／＋、及びｈＦＵＳ導入遺伝子を有するか又は有しないＦｕｓ ΔＮＬＳ／＋マウスを用いた、四肢金網反転試験（ｆｏｕｒ－ｌｉｍｂ ｗｉｒｅ ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｇｒｉｄ ｔｅｓｔ）における、平均ぶら下がり時間の年齢依存的変化を表す曲線を含む図を表す。
【図2B】Ｆｕｓ＋／＋、及びｈＦＵＳ導入遺伝子を有するか又は有しないＦｕｓ ΔＮＬＳ／＋マウスを用いた、四肢金網反転試験（ｆｏｕｒ－ｌｉｍｂ ｗｉｒｅ ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｇｒｉｄ ｔｅｓｔ）における、把持力積（Ｎｓ）の年齢依存的変化を表す曲線を含む図を表す。
【図3A】ＦＵＳタンパク質の細胞局在の分析を表す。図３Ａは、１か月齢のＦｕｓ＋／＋（＋／＋）、及び（ｈＦＵＳ）を有するか又はｈＦＵＳ導入遺伝子を有しない（Ｎｏ Ｔｇ）Ｆｕｓ ΔＮＬＳ／＋（Δ／＋）マウスの、及びｈＦＵＳ導入遺伝子を有するＦｕｓ ΔＮＬＳ／ΔＮＬＳ（Δ／Δ）マウスの皮質における、ＦＵＳタンパク質細胞内局在の免疫ブロット分析の写真を表す。ＦＵＳのＮ末端部分（Ｎ－ｔｅｒ）（Ｎ－ｔｅｒＦＵＳ）、Ｃ末端（Ｃ－Ｔｅｒ）ＮＬＳ ＦＵＳ（Ｃ－Ｔｅｒ ＦＵＳ）、マウスＦＵＳ、又はヒトＦＵＳを標的とする異なる抗体を使用した代表的な結果。ＳＯＤ１及びＨＤＡＣ１を、それぞれ細胞質及び核タンパク質抽出物画分のローディング対照として使用する。
【図3B】ＦＵＳタンパク質の細胞局在の分析を表す。図３Ｂは、Ｆｕｓ＋／＋（＋／＋）、及び（ｈＦＵＳ）を有するか又はｈＦＵＳ導入遺伝子を有しない（Ｎｏ Ｔｇ）Ｆｕｓ ΔＮＬＳ／＋（Δ／＋）マウス、及びｈＦＵＳ導入遺伝子を有するＦｕｓ ΔＮＬＳ／ΔＮＬＳ（Δ／Δ）マウスにおける細胞質及び核画分中の、Ｎ－ｔｅｒ ＦＵＳ、Ｃ－ｔｅｒ ＦＵＳ、マウスＦＵＳ、及びヒトＦＵＳタンパク質レベルの定量化を表すヒストグラムを表し、図の、＊は、ｐ＜０．０５を意味し、＊＊＊は、Ｆｕｓ＋／＋マウスに対してｐ＜０．００１を意味し、＃は、ｐ＜０．０５を意味し、＃＃＃は、分散分析、続いてＴｕｋｅｙによって示されたマウス遺伝子型に対してｐ＜０．００１を意味する。
【図3C】ＦＵＳタンパク質の細胞局在の分析を表す。図３Ｃは、Ｆｕｓ＋／＋（＋／＋）、及び（ｈＦＵＳ）を有するか又はｈＦＵＳ導入遺伝子を有しない（Ｎｏ Ｔｇ）Ｆｕｓ ΔＮＬＳ／＋（Δ／＋）マウス、及びｈＦＵＳ導入遺伝子を有するＦｕｓ ΔＮＬＳ／ΔＮＬＳ（Δ／Δ）マウスの２２か月齢での脊髄前角におけるＵＳ免疫組織化学の写真を表す。
【図3D】ＦＵＳタンパク質の細胞局在の分析を表す。図３Ｄは、抗ＦＵＳ及び抗ＣｈＡＴ抗体を使用した、２２か月齢のマウスの脊髄前角における運動ニューロンマーカーＣｈＡＴ及びＦＵＳ（Ｎ末端部分）の二重免疫染色の写真を表す。
【図4A】細胞質及び核画分における、細胞質の非対称的な脱メチル化した（ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃａｌｌｙ ｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ、ＡＤＭＡ）ＦＵＳの蓄積、並びにＡＤＭＡ－ＦＵＳタンパク質レベルの定量化の分析を表す。図４Ａは、非対称的なアルギニン脱メチル化されたＦＵＳ（ＡＤＭＡ－ＦＵＳ）を認識する抗体を使用して、１か月齢のＦｕｓ＋／＋（＋／＋）、及びｈＦＵＳ導入遺伝子を有するか又は有しないＦｕｓ ΔＮＬＳ／＋（Δ／＋）マウスの、及びｈＦＵＳ導入遺伝子を有するＦｕｓ ΔＮＬＳ／ΔＮＬＳマウスの皮質の細胞質及び核画分に対する非対称的なアルギニン脱メチル化されたＦＵＳの免疫ブロット分析の写真を表し、抗ＨＤＡＣ１抗体を、核画分のローディング対照として使用し、抗ＳＯＤ１抗体を、細胞質画分の核画分のローディング対照として使用する。
【図4B】細胞質及び核画分における、細胞質の非対称的な脱メチル化した（ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃａｌｌｙ ｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ、ＡＤＭＡ）ＦＵＳの蓄積、並びにＡＤＭＡ－ＦＵＳタンパク質レベルの定量化の分析を表す。図４Ｂは、Ｆｕｓ＋／＋（＋／＋）、及びｈＦＵＳ導入遺伝子を有するか又は有しないＦｕｓ ΔＮＬＳ／＋（Δ／＋）マウス、及びｈＦＵＳ導入遺伝子を有するＦｕｓ ΔＮＬＳ／ΔＮＬＳマウスの細胞質及び核画分におけるＡＤＭＡ－ＦＵＳタンパク質レベルの定量化に対応するヒストグラムを表す。図では、＊＊は、Ｆｕｓ＋／＋に対してｐ＜０．０１を意味し、＃は、分散分析、続いてＴｕｋｅｙによって示された遺伝子型に対してｐ＜０．０５を意味する。
【図4C】細胞質及び核画分における、細胞質の非対称的な脱メチル化した（ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃａｌｌｙ ｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ、ＡＤＭＡ）ＦＵＳの蓄積、並びにＡＤＭＡ－ＦＵＳタンパク質レベルの定量化の分析を表す。図４Ｃは、Ｆｕｓ＋／＋（＋／＋）、及びｈＦＵＳ導入遺伝子を有するか又は有しないＦｕｓ ΔＮＬＳ／＋（Δ／＋）マウス、及びｈＦＵＳ導入遺伝子を有するＦｕｓ ΔＮＬＳ／ΔＮＬＳマウスの脊髄前角における、運動ニューロンマーカーＣｈＡＴ（赤色）及び／又はＡＤＭＡ－ＦＵＳ（Ｃ、緑色）での免疫染色の写真を表す表す。
【図4D】細胞質及び核画分における、細胞質の非対称的な脱メチル化した（ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃａｌｌｙ ｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ、ＡＤＭＡ）ＦＵＳの蓄積、並びにＡＤＭＡ－ＦＵＳタンパク質レベルの定量化の分析を表す。図４Ｄは、Ｆｕｓ＋／＋（＋／＋）、及びｈＦＵＳ導入遺伝子を有するか又は有しないＦｕｓ ΔＮＬＳ／＋（Δ／＋）マウス、及びｈＦＵＳ導入遺伝子を有するＦｕｓ ΔＮＬＳ／ΔＮＬＳマウスの脊髄前角における、運動ニューロンマーカーＣｈＡＴ（赤色）及び／又はユビキチン（Ｄ、→）での免疫染色の写真を表す表す。
【図5A】ＲＴ－ｑＰＣＲで決定した、脊髄における遺伝子発現を表すヒストグラムを表す。図５Ａは、１か月齢の脊髄における、内因性マウスＦｕｓ ｍＲＮＡ（左）、ヒトＦＵＳ導入遺伝子（中間）、及びエクソン７が欠失した内因性Ｆｕｓ ｍＲＮＡ（右）の発現の結果を表すヒストグラムである。
【図5B】ＲＴ－ｑＰＣＲで決定した、脊髄における遺伝子発現を表すヒストグラムを表す。図５Ｂは、２２か月齢の脊髄における、内因性マウスＦｕｓ ｍＲＮＡ（左）、ヒトＦＵＳ導入遺伝子（中間）、及びエクソン７が欠失した内因性Ｆｕｓ ｍＲＮＡ（右）の発現の結果を表すヒストグラムである。
【図6A】Ｆｕｓ＋／＋、ｈＦＵＳ導入遺伝子を有するか又は有しないＦｕｓ ΔＮＬＳ／＋マウス、及びｈＦＵＳを有するＦｕｓ ΔＮＬＳ／ΔＮＬＳマウスを用いた、四肢金網反転試験における、平均ぶら下がり時間の年齢依存的変化を表す曲線を含む図を表す。
【図6B】Ｆｕｓ＋／＋、ｈＦＵＳ導入遺伝子を有するか又は有しないＦｕｓ ΔＮＬＳ／＋マウス、及びｈＦＵＳを有するＦｕｓ ΔＮＬＳ／ΔＮＬＳマウスを用いた、四肢金網反転試験における、把持力積（Ｎｓ）の年齢依存的変化を表す曲線を含む図を表す。
【図7A】ＲＴ－ｑＰＣＲで決定した、前頭皮質における遺伝子発現を表すヒストグラムを表す。図７Ａは、１か月齢の脊髄における、内因性マウスＦｕｓ ｍＲＮＡ（左）、ヒトＦＵＳ導入遺伝子（中間）、及びエクソン７が欠失した内因性Ｆｕｓ ｍＲＮＡ（右）の発現の結果を表すヒストグラムである。
【図7B】ＲＴ－ｑＰＣＲで決定した、前頭皮質における遺伝子発現を表すヒストグラムを表す。図７Ｂは、２２か月齢の脊髄における、内因性マウスＦｕｓ ｍＲＮＡ（左）、ヒトＦＵＳ導入遺伝子（中間）、及びエクソン７が欠失した内因性Ｆｕｓ ｍＲＮＡ（右）の発現の結果を表すヒストグラムである。
【図8A】１か月齢～２２か月齢の脊髄における、ｈＦＵＳマウスを有するＦｕｓ ＮＬＳ／＋マウスのエクソン７が欠失した内因性Ｆｕｓ ｍＲＮＡのレベルと比較した、ヒトＦＵＳ導入遺伝子（縦座標）の発現レベルに対応する図を表す。
【図8B】１か月齢～２２か月齢の前頭皮質における、ｈＦＵＳマウスを有するＦｕｓ ＮＬＳ／＋マウスのエクソン７が欠失した内因性Ｆｕｓ ｍＲＮＡのレベルと比較した、ヒトＦＵＳ導入遺伝子（縦座標）の発現レベルに対応する図を表す。
【図9】プラスミドベクターｐＭＸの概略図である。
【図10A】イントロン６又は７の挿入によって、トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞におけるＦＵＳ自己調節が可能になることを示す。図１０Ａ：使用したＤＮＡ構築物：Ｍｙｃ－エクソンは、ＭｙｃエピトープによってＮ末端タグ付けされた、中断されていないヒトＦＵＳ ＯＲＦ（エクソン１～１５：Ｅ１～１５）をコードする発現プラスミドであり、ＨＡ－ｉ６は、ＨＡエピトープでＮ末端タグ付けされ、エクソン６（エクソン１～６：Ｅ１～６）とエクソン７（エクソン７～１５：Ｅ７～１５）との間をヒトイントロン６によって中断された、ヒトＦＵＳ ＯＲＦをコードする発現プラスミドであり、ＨＡ－ｉ７は、ＨＡエピトープでＮ末端タグ付けされ、エクソン７（エクソン１～７：Ｅ１～７）とエクソン８（エクソン８～１５：Ｅ８～１５）との間をヒトイントロン７によって中断された、ヒトＦＵＳ ＯＲＦをコードする発現プラスミドである。
【図10B】イントロン６又は７の挿入によって、トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞におけるＦＵＳ自己調節が可能になることを示す。図１０Ｂ：空のプラスミド又はＭｙｃ－エクソン、ＨＡ－ｉ６、及びＨＡ－ｉ７構築物でトランスフェクトし、トランスフェクションの２４時間後に採取したＨＥＫ２９３細胞。ＦＵＳタンパク質（［００８２］ＦＵＳ）、ＨＡエピトープ（［００８３］ＨＡ）、及びＭｙｃエピトープ（［００８４］Ｍｙｃ）の代表的な免疫ブロット。等しいローディングを実証するためのタンパク質ローディングは、対応するウエスタンブロットの合計タンパク質株として示される。第１のウェルは、分子量マーカーを示す。３つ全てのトランスジェニックタンパク質は、高レベルで発現する。合計ＦＵＳタンパク質レベルは、Ｍｙｃエクソントランスフェクト細胞で増加するが、ＨＡ－ｉ６及びＨＡ－ｉ７構築物をトランスフェクションするとＦＵＳレベルの変化はない。
【図11A】ＨＡ－ｉ７は、トランスフェクションの４８時間後に内因性ＦＵＳイントロン６保持を誘発することを示す。図１１Ａ：Ｍｙｃ－エクソン又はＨＡ－ｉ７ベクターで２４時間又は４８時間トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞における、イントロン６を保持する内因性Ｆｕｓ ｍＲＮＡ。
【図11B】ＨＡ－ｉ７は、トランスフェクションの４８時間後に内因性ＦＵＳイントロン６保持を誘発することを示す。図１１Ｂ：Ｍｙｃ－エクソン、ＨＡ－ｉ６ベクターで、２４時間又は４８時間トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞における、イントロン６を保持する内因性Ｆｕｓ ｍＲＮＡ。
【図12A】トランスフェクションの２４時間及び４８時間後に、ＨＥＫ２９３細胞において、ＦＵＳの予想分子量で代替ＨＡプラスミド構築物が翻訳されることを示す。使用したＤＮＡ構築物：ＨＡ－１、２、及び７は、中断されていないヒトＦＵＳ ＯＲＦ（エクソン１～１５：Ｅ１～１５）をコードし、ＨＡエピトープによってＮ末端タグ付けされ、エクソン６と７との間のイントロン６においてヒトＲＮＡ保存モチーフによって中断されている、発現プラスミドである。ＨＡ－３～６及びＨＡ－８は、中断されていないヒトＦＵＳ ＯＲＦ（エクソン１～１５：Ｅ１～１５）をコードし、ＨＡエピトープによってＮ末端タグ付けされ、エクソン７と８との間のイントロン７においてヒトＲＮＡ保存モチーフによって中断されている、発現プラスミドである。ＨＡ－９～１２は、中断されていないヒトＦＵＳ ＯＲＦ（エクソン１～１５：Ｅ１～１５）をコードし、ＨＡエピトープによってＮ末端タグ付けされ、イントロン６及び７においてヒトＲＮＡ保存モチーフによって中断されている、発現プラスミドである。ＲＮＡ保存モチーフは、ＦＵＳイントロン６－エクソン７－イントロン７領域におけるＣＬＩＰタグのマッピングを示す、非特許文献１６に基づく。
【図12B】トランスフェクションの２４時間及び４８時間後に、ＨＥＫ２９３細胞において、ＦＵＳの予想分子量で代替ＨＡプラスミド構築物が翻訳されることを示す。２４時間及び４８時間の間の３つの独立した時間、空のＭｙｃ－エクソン及びＨＡ－１～１２ベクターでトランスフェクトした、ＨＥＫ２９３細胞におけるＨＡタンパク質レベル。
【0082】
同等物
以下の代表的な実施例は、発明の説明を援助することを意図しており、発明の範囲を限定することを意図するものでなく、また限定すると解釈されるべきではない。実際、本明細書に示され記載されるものに加えて、発明の様々な修正及びそれらの多くの更なる実施形態は、以下の実施例、並びに本明細書で引用される科学的文献及び特許文献に対する参照文献を含む本文書の全内容から当業者に明らかになるであろう。これらの引用された参照文献の内容は、当該技術分野の状態の説明を補助するために、参照により本明細書に組み込まれることが更に理解されるべきである。
以下の代表的な実施例は、発明の説明を援助することを意図しており、発明の範囲を限定することを意図するものでなく、また限定すると解釈されるべきではない。実際、本明細書に示され記載されるものに加えて、発明の様々な修正及びそれらの多くの更なる実施形態は、以下の実施例、並びに本明細書で引用される科学的文献及び特許文献に対する参照文献を含む本文書の全内容から当業者に明らかになるであろう。これらの引用された参照文献の内容は、当該技術分野の状態の説明を補助するために、参照により本明細書に組み込まれることが更に理解されるべきである。
【0083】
以下の実施例は、その様々な実施形態及びそれらの同等物における本発明の実施に適合させることができる重要な追加の情報、例示、及びガイダンスを含有する。
【0084】
例示
本発明及びその用途は、発明の製品及び医薬的使用が実施されるために低減され得る実施形態のうちのいくつかを説明する実施例によって更に理解され得る。しかしながら、こ
れらの実施例は発明を限定するものではないことが理解されるであろう。現在既知であるか又は更に開発される発明の変形は、本明細書に記載され以下特許請求される本発明の範囲内にあるとみなされる。
本発明及びその用途は、発明の製品及び医薬的使用が実施されるために低減され得る実施形態のうちのいくつかを説明する実施例によって更に理解され得る。しかしながら、こ
れらの実施例は発明を限定するものではないことが理解されるであろう。現在既知であるか又は更に開発される発明の変形は、本明細書に記載され以下特許請求される本発明の範囲内にあるとみなされる。
【実施例】
【0085】
実施例１：核酸及び当該核酸を含むベクター
ＧｅｎｅＡｒｔ Ｇｅｎｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ製品及びサービス形態サーモフィッシャーサイエンティフィック（ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に開示されているように、核酸及び組換えベクターを、調製し、得る。
ＧｅｎｅＡｒｔ Ｇｅｎｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ製品及びサービス形態サーモフィッシャーサイエンティフィック（ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に開示されているように、核酸及び組換えベクターを、調製し、得る。
【0086】
使用した核酸は、配列番号１～２０であった。必要に応じて、プラスミドとの訴訟の制限部位Ｎｏｔ１（ＧＣＧＧＣＣＧＣ）及びＸｂａ１（ＴＣＴＡＧＡ）の配列を含んで、核酸を調製した。調製した核酸は、５μｇの凍結乾燥プラスミドＤＮＡである。
【0087】
使用したベクターは、図９に表され、非特許文献１７に記載のプラスミドベクターｐＭＸである。ｐＭＸベクターは、ＭＭＬＶの５つの長末端反復（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ、ＬＴＲ）、及びＭＦＧに由来する伸長パッケージングシグナル、続いて、ｃＤＮＡライブラリ構築に好適なマルチクローニング部位（ｍｕｌｔｉ－ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅ、ＭＳＣ）、及び３つのＬＴＲを有する。
【0088】
１０ｎｇのＤＮＡを、５０μｌのコンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１８２６５－０１７）と共に氷上で３０分インキュベートした。４２℃の水浴中で２０秒間、ヒートショックを実施した。次いでチューブを氷上に２分間置き、次いで３７℃で１時間培地と共に２２５ｒｐｍでインキュベートした。その後、抗生物質を含む寒天培養を３７℃で一晩実施した。単一コロニーを、３７℃で一晩、２２５ｒｐｍで抗生物質を含む液体培養物に接種し、次いで、製造業者の推奨事項（Ｑｉａｇｅｎ、１２６４３）を使用して、プラスミドミジキット（ｍｉｄｉ ｋｉｔ）を実施した。
【0089】
実施例２：ヒトＦＵＳタンパク質イントロン６及び／又は配列イントロン７をコードする核酸を用いたＦＵＳ－ＡＬＳのマウスモデルのインビボ治療
材料及び方法
マウスモデル及び遺伝子型決定
マウス実験は、参照番号２０１６１１１７１６４３９３９５にてＳｔｒａｓｂｏｕｒｇ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＣＲＥＭＥＡＳ）からの地方倫理委員会によって承認された。
材料及び方法
マウスモデル及び遺伝子型決定
マウス実験は、参照番号２０１６１１１７１６４３９３９５にてＳｔｒａｓｂｏｕｒｇ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＣＲＥＭＥＡＳ）からの地方倫理委員会によって承認された。
【0090】
使用したベクターは、配列番号１０のヒトＦＵＳをコードする核酸配列を含むＢＡＣである。トランスジェニックマウスを非特許文献１［１０］及び非特許文献１８［１１］に記載のように生成し、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ動物施設で繁殖させ、Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの医学部において、１２／１２時間の光／暗サイクル（午前７：００に明所）で一定条件下（２１±１℃、６０％の湿度）、及び餌及び水へのアクセスを制限せずに収容した。
【0091】
尾部生検からのＰＣＲによって、マウスを２１日目に離乳させ、遺伝子型決定した。以下のプライマー配列を使用して、マウスを遺伝子型決定した：
ｈＴＬＳ ＦＵＳ－Ｆｏｒ：ＧＡＡＴＴＣＧＴＧＧＡＣＣＡＧＧＡＡＧＧＴＣ（配列番号２１）
ｈＴＬＳ ＦＵＳ－Ｒｅｖ：ＣＡＣＧＴＧＴＧＡＡＣＴＣＡＣＣＧＧＡＧＴＣＡ（配列番号２２）
ＦＵＳ－Ｆｏｒ：ＧＡＴＴＴＧＡＡＧＴＧＧＧＴＡＧＡＴＡＧＴＧＣＡＧＧ（配列番号２３）
ＦＵＳ－Ｒｅｖ：ＣＣＴ－ＴＴＣ－ＣＡＣ－ＡＣＴ－ＴＴＡ－ＧＴＴ－ＴＡＧ－ＴＣＡ－ＣＡＧ（配列番号２４）
ｈＴＬＳ ＦＵＳ－Ｆｏｒ：ＧＡＡＴＴＣＧＴＧＧＡＣＣＡＧＧＡＡＧＧＴＣ（配列番号２１）
ｈＴＬＳ ＦＵＳ－Ｒｅｖ：ＣＡＣＧＴＧＴＧＡＡＣＴＣＡＣＣＧＧＡＧＴＣＡ（配列番号２２）
ＦＵＳ－Ｆｏｒ：ＧＡＴＴＴＧＡＡＧＴＧＧＧＴＡＧＡＴＡＧＴＧＣＡＧＧ（配列番号２３）
ＦＵＳ－Ｒｅｖ：ＣＣＴ－ＴＴＣ－ＣＡＣ－ＡＣＴ－ＴＴＡ－ＧＴＴ－ＴＡＧ－ＴＣＡ－ＣＡＧ（配列番号２４）
【0092】
ＰＹ－ＮＬＳを欠くヘテロ接合型Ｆｕｓノックインマウスを、完全な自己調節コンピテントのヒト遺伝子からヒト野生型ＦＵＳを発現しているマウスと交配させて、以下の遺伝子型：Ｆｕｓ＋／＋、ＦｕｓΔＮＬＳ／＋、ＦｕｓΔＮＬＳ／ΔＮＬＳ、Ｆｕｓ＋／＋：ｈＦＵＳ、ＦｕｓΔＮＬＳ／＋：ｈＦＵＳ、ＦｕｓΔＮＬＳ／ΔＮＬＳ：ｈＦＵＳを得た。この研究で使用した全てのマウスの遺伝的背景は、Ｃ５７Ｂｌ６／Ｊである。
【0093】
マウスの挙動
生存率
生後１時間から生存率を研究し、死亡した新生児マウスを遺伝子型決定した。他のマウスは２１日目に遺伝子型決定し、死亡するまで、又は以下のエンドポイント：自傷、初期体重の１０％超の体重減少に到達した場合、及び横向きに寝かせた後１０秒以内に起き上がることができない場合にケタミン－キシラジンを使用して殺害するまで弱く追跡調査した。
生存率
生後１時間から生存率を研究し、死亡した新生児マウスを遺伝子型決定した。他のマウスは２１日目に遺伝子型決定し、死亡するまで、又は以下のエンドポイント：自傷、初期体重の１０％超の体重減少に到達した場合、及び横向きに寝かせた後１０秒以内に起き上がることができない場合にケタミン－キシラジンを使用して殺害するまで弱く追跡調査した。
【0094】
反転金網
先述（非特許文献１９［８］）のように、運動性能を弱く実施した。金網ぶら下がり時間（又は「ぶら下がり時間」）は、反転させた金網からマウスが落下するのにかかる時間の量として定義し、ストップウォッチを用いて視覚的に測定した。手順を５分の間に３回繰り返した。把持力積は、マウスの体重及び重力で正規化したぶら下がり時間に対応する。
先述（非特許文献１９［８］）のように、運動性能を弱く実施した。金網ぶら下がり時間（又は「ぶら下がり時間」）は、反転させた金網からマウスが落下するのにかかる時間の量として定義し、ストップウォッチを用いて視覚的に測定した。手順を５分の間に３回繰り返した。把持力積は、マウスの体重及び重力で正規化したぶら下がり時間に対応する。
【0095】
組織学的技法
マウスを、１００ｍｇ／ｋｇのケタミン塩酸塩及び５ｍｇ／ｋｇのキシラジンの腹腔内注射で麻酔し、次いで４％のＰＦＡで灌流した。切開後、４％の寒天に脊髄を含め、ビブラトームで４０μｍの厚さの連続切片を作製した。
マウスを、１００ｍｇ／ｋｇのケタミン塩酸塩及び５ｍｇ／ｋｇのキシラジンの腹腔内注射で麻酔し、次いで４％のＰＦＡで灌流した。切開後、４％の寒天に脊髄を含め、ビブラトームで４０μｍの厚さの連続切片を作製した。
【0096】
ペルオキシダーゼ免疫組織化学
ペルオキシダーゼ免疫組織化学については、内因性ペルオキシダーゼを、３％のＨ２Ｏ２と共に１０分間不活性化し、次いでスライドをＰＢＳで１回洗浄し、ウサギ抗ＦＵＳ抗体（ＰｒｏｔｅｉｎＴｅｃｈ、１１５７０－１－ＡＰ、１：１００）と共に室温で一晩インキュベートした。ＰＢＳですすいだ後、抗ウサギビオチン化（Ｊａｃｋｓｏｎ、７１１－０６７－００３、１／５００）を室温で２時間インキュベートした。ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣキット、ＰＫ－６１００、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）を使用して１時間の間に染色が現れた。リン酸緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓａｌｉｎ、ＰＢＳ）で３回洗浄した後、スライドを水ですすぎ、ＤＰＸ（Ｓｉｇｍａ、Ｏ６５２２）に取り付けた。
ペルオキシダーゼ免疫組織化学については、内因性ペルオキシダーゼを、３％のＨ２Ｏ２と共に１０分間不活性化し、次いでスライドをＰＢＳで１回洗浄し、ウサギ抗ＦＵＳ抗体（ＰｒｏｔｅｉｎＴｅｃｈ、１１５７０－１－ＡＰ、１：１００）と共に室温で一晩インキュベートした。ＰＢＳですすいだ後、抗ウサギビオチン化（Ｊａｃｋｓｏｎ、７１１－０６７－００３、１／５００）を室温で２時間インキュベートした。ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣキット、ＰＫ－６１００、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）を使用して１時間の間に染色が現れた。リン酸緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓａｌｉｎ、ＰＢＳ）で３回洗浄した後、スライドを水ですすぎ、ＤＰＸ（Ｓｉｇｍａ、Ｏ６５２２）に取り付けた。
【0097】
免疫蛍光
切片を、室温、すなわち２５℃で遮断溶液（８％のヤギ血清、０．３％のウシ血清アルブミン、０．３％のＴｒｉｔｏｎ、ＰＢＳ－０．０２％のＴｈｉｍｅｒｏｓａｌ）でインキュベートし、次いで一次抗体：ウサギ抗ＦＵＳ抗体（ＰｒｏｔｅｉｎＴｅｃｈ、１１５７０－１－ＡＰ、１：１００）、ヤギ抗ＣｈＡＴ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｔ、ＡＢ１４４Ｐ、１／５０）、ラット抗ＡＤＭＡ（自社製、Ｇｅｒｍａｎｙ、１／１００）、又はウサギ抗Ｕｂｉ（Ａｂｃａｍ、ａｂ１７９４３４、１／１００）で、４℃で一晩インキュベートした。３回ＰＢＳですすいた後、切片を、Ｈｏｅｃｈｓｔ（Ｓｉｇｍａ、Ｂ２２６１、１／５０．０００）、及び二次抗体：Ａｌｅｘａ－４８８－コンジュゲート抗ウサギ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ、７１１－５４７－００３、１／５００）又はＡｌｅｘａ－５９４－コ
ンジュゲート抗ヤギ二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ａ １１０５８、１／５００）と共に室温、すなわち２５℃で２時間インキュベートした。最終的に、その後切片をＰＢＳで洗浄し（３×１０分）、ＤＰＸ（Ｓｉｇｍａ、Ｏ６５２２）に取り付けた。
切片を、室温、すなわち２５℃で遮断溶液（８％のヤギ血清、０．３％のウシ血清アルブミン、０．３％のＴｒｉｔｏｎ、ＰＢＳ－０．０２％のＴｈｉｍｅｒｏｓａｌ）でインキュベートし、次いで一次抗体：ウサギ抗ＦＵＳ抗体（ＰｒｏｔｅｉｎＴｅｃｈ、１１５７０－１－ＡＰ、１：１００）、ヤギ抗ＣｈＡＴ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｔ、ＡＢ１４４Ｐ、１／５０）、ラット抗ＡＤＭＡ（自社製、Ｇｅｒｍａｎｙ、１／１００）、又はウサギ抗Ｕｂｉ（Ａｂｃａｍ、ａｂ１７９４３４、１／１００）で、４℃で一晩インキュベートした。３回ＰＢＳですすいた後、切片を、Ｈｏｅｃｈｓｔ（Ｓｉｇｍａ、Ｂ２２６１、１／５０．０００）、及び二次抗体：Ａｌｅｘａ－４８８－コンジュゲート抗ウサギ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ、７１１－５４７－００３、１／５００）又はＡｌｅｘａ－５９４－コ
ンジュゲート抗ヤギ二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ａ １１０５８、１／５００）と共に室温、すなわち２５℃で２時間インキュベートした。最終的に、その後切片をＰＢＳで洗浄し（３×１０分）、ＤＰＸ（Ｓｉｇｍａ、Ｏ６５２２）に取り付けた。
【0098】
電子顕微鏡法
マウスを、１００ｍｇ／ｋｇのケタミン塩酸塩及び５ｍｇ／ｋｇのキシラジンの腹腔内注射で麻酔し、グルタルアルデヒド（ｐＨ７．４の０．１Ｍのカコジル酸緩衝液中２．５％）で経心灌流した。脳を解剖し、同じ固定液、すなわちグルタルアルデヒドに一晩、すなわち１２時間浸漬させた。カコジル酸緩衝液（ＥＭＳ、１１６５０）で３回すすいだ後、室温のカコジル酸緩衝液中０．５％のオスミウム及び０．８％のフェロシアン化カリウムで１時間、筋肉を事後固定した。最後に、組織を一連の勾配をつけたエタノール（２５％、５０％、７０％、９５％、１００％）で脱水し、Ｅｍｂｅｄ８１２（ＥＭＳ、１３９４０）に埋め込んだ。ウルトラミクロトーム（Ｌｅｉｃａ、ＥＭ ＵＣ７）でごく薄い切片（５０ｎｍ）を切り出し、酢酸ウラニル（５０％のエタノール中１％（ｗ／ｖ））で対比染色し、ＡＭＴ Ｈａｍａｍａｔｓｕデジタルカメラ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ、Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｃｉｔｙ，Ｊａｐａｎ）を備えたＨｉｔａｃｈｉ７５００透過型電子顕微鏡（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｈｉｇｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で観察した。
マウスを、１００ｍｇ／ｋｇのケタミン塩酸塩及び５ｍｇ／ｋｇのキシラジンの腹腔内注射で麻酔し、グルタルアルデヒド（ｐＨ７．４の０．１Ｍのカコジル酸緩衝液中２．５％）で経心灌流した。脳を解剖し、同じ固定液、すなわちグルタルアルデヒドに一晩、すなわち１２時間浸漬させた。カコジル酸緩衝液（ＥＭＳ、１１６５０）で３回すすいだ後、室温のカコジル酸緩衝液中０．５％のオスミウム及び０．８％のフェロシアン化カリウムで１時間、筋肉を事後固定した。最後に、組織を一連の勾配をつけたエタノール（２５％、５０％、７０％、９５％、１００％）で脱水し、Ｅｍｂｅｄ８１２（ＥＭＳ、１３９４０）に埋め込んだ。ウルトラミクロトーム（Ｌｅｉｃａ、ＥＭ ＵＣ７）でごく薄い切片（５０ｎｍ）を切り出し、酢酸ウラニル（５０％のエタノール中１％（ｗ／ｖ））で対比染色し、ＡＭＴ Ｈａｍａｍａｔｓｕデジタルカメラ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ、Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｃｉｔｙ，Ｊａｐａｎ）を備えたＨｉｔａｃｈｉ７５００透過型電子顕微鏡（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｈｉｇｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で観察した。
【0099】
組織分別及びウエスタンブロッティング
組織をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄し、製造業者の指示に従ってＳｙｎ－ＰＥＲ Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、８７７９３）に溶解させた。ＢＣＡアッセイ（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ、ＵＰ９５４２４Ａ、ＵＰ９５４２５Ａ）によって、タンパク質抽出物を投与した。その後、タンパク質を変性させ、（細胞質タンパク質では）１０及び（核タンパク質では）３０μｇのタンパク質を用いて、４～２０％のＴＧＸ染色遊離ゲル（Ｂｉｏｒａｄ、５６７８０９４）の基準でＳＤＳ ｐａｇｅを実施した。タンパク質を、半乾式Ｔｒａｎｓｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用してニトロセルロース膜上にブロットし、１時間の間に１０％の無脂肪乳で遮断した。一次抗体（ウサギ抗ｈＦＵＳ（自社製、＃１４０８０、１／２０００）、ウサギ抗ｍＦＵＳ（自社製、＃１４０８２、１／４０００）、ラット抗ＦＵＳ ＡＤＭＡ（自社製、Ｇｅｒｍａｎｙ、１／５００）、ウサギ抗ＦＵＳ２９３（Ｂｅｔｈｙｌ、Ａ－３００－２９３Ａ、１／２０００）、ウサギ抗ＦＵＳ２９４（Ｂｅｔｈｙｌ、Ａ３００－２９４Ａ、１／２０００）、ヒツジ抗ＳＯＤ１（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、５７４５９７、１／１０００）、ウサギ抗ＨＤＡＣ１（Ｂｅｔｈｙｌ、Ａ３００－７１３Ａ、１／１０００）を、３％の無脂肪乳中、４℃で一晩、すなわち１２時間インキュベートした。洗浄緩衝液（１ＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４、５ＭのＮａＣｌ、１００％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０）で洗浄を進め、二次抗体（抗ウサギＨＲＰ（ＰＡＲＩＳ、ＢＩ２４０７，１／５０００）、抗ヒツジＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ、７１３－０３５－１４７、１／５０００）を室温、すなわち２５℃で１時間３０分インキュベートした。１倍のＰＢＳで連続して洗浄、すなわち３回洗浄した後、ＥＣＬ Ｌｕｍｉｎａ Ｆｏｒｔｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｆｒａｎｃｅ）及び化学発光検出器（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用する化学発光でタンパク質を可視化した。正規化するために、染色遊離ゲル能力（Ｂｉｏｒａｄ、５６７８０９４）で合計タンパク質を検出し、使用した。
組織をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄し、製造業者の指示に従ってＳｙｎ－ＰＥＲ Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、８７７９３）に溶解させた。ＢＣＡアッセイ（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ、ＵＰ９５４２４Ａ、ＵＰ９５４２５Ａ）によって、タンパク質抽出物を投与した。その後、タンパク質を変性させ、（細胞質タンパク質では）１０及び（核タンパク質では）３０μｇのタンパク質を用いて、４～２０％のＴＧＸ染色遊離ゲル（Ｂｉｏｒａｄ、５６７８０９４）の基準でＳＤＳ ｐａｇｅを実施した。タンパク質を、半乾式Ｔｒａｎｓｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用してニトロセルロース膜上にブロットし、１時間の間に１０％の無脂肪乳で遮断した。一次抗体（ウサギ抗ｈＦＵＳ（自社製、＃１４０８０、１／２０００）、ウサギ抗ｍＦＵＳ（自社製、＃１４０８２、１／４０００）、ラット抗ＦＵＳ ＡＤＭＡ（自社製、Ｇｅｒｍａｎｙ、１／５００）、ウサギ抗ＦＵＳ２９３（Ｂｅｔｈｙｌ、Ａ－３００－２９３Ａ、１／２０００）、ウサギ抗ＦＵＳ２９４（Ｂｅｔｈｙｌ、Ａ３００－２９４Ａ、１／２０００）、ヒツジ抗ＳＯＤ１（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、５７４５９７、１／１０００）、ウサギ抗ＨＤＡＣ１（Ｂｅｔｈｙｌ、Ａ３００－７１３Ａ、１／１０００）を、３％の無脂肪乳中、４℃で一晩、すなわち１２時間インキュベートした。洗浄緩衝液（１ＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４、５ＭのＮａＣｌ、１００％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０）で洗浄を進め、二次抗体（抗ウサギＨＲＰ（ＰＡＲＩＳ、ＢＩ２４０７，１／５０００）、抗ヒツジＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ、７１３－０３５－１４７、１／５０００）を室温、すなわち２５℃で１時間３０分インキュベートした。１倍のＰＢＳで連続して洗浄、すなわち３回洗浄した後、ＥＣＬ Ｌｕｍｉｎａ Ｆｏｒｔｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｆｒａｎｃｅ）及び化学発光検出器（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用する化学発光でタンパク質を可視化した。正規化するために、染色遊離ゲル能力（Ｂｉｏｒａｄ、５６７８０９４）で合計タンパク質を検出し、使用した。
【0100】
使用した抗体は、以下であった：
－ウサギ抗ｈＦＵＳ（自社製、＃１４０８０、１／２０００）、
－ウサギ抗ｍＦＵＳ（自社製、＃１４０８２、１／４０００）
－ラット抗ＦＵＳ ＡＤＭＡ（自社製、Ｇｅｒｍａｎｙ、１／５００）
－ウサギ抗ＦＵＳ ２９３（Ｂｅｔｈｙｌ、Ａ－３００－２９３Ａ、１／２０００）
－ウサギ抗ＦＵＳ ２９４（Ｂｅｔｈｙｌ、Ａ３００－２９４Ａ、１／２０００）
－ヒツジ抗ＳＯＤ１（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、５７４５９７、１／１０００）
－ウサギ抗ＨＤＡＣ１（Ｂｅｔｈｙｌ、Ａ３００－７１３Ａ、１／１０００）
－抗ウサギＨＲＰ（ＰＡＲＩＳ、ＢＩ２４０７，１／５０００）
－抗ヒツジＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ、７１３－０３５－１４７、１／５０００）
－ウサギ抗ｈＦＵＳ（自社製、＃１４０８０、１／２０００）、
－ウサギ抗ｍＦＵＳ（自社製、＃１４０８２、１／４０００）
－ラット抗ＦＵＳ ＡＤＭＡ（自社製、Ｇｅｒｍａｎｙ、１／５００）
－ウサギ抗ＦＵＳ ２９３（Ｂｅｔｈｙｌ、Ａ－３００－２９３Ａ、１／２０００）
－ウサギ抗ＦＵＳ ２９４（Ｂｅｔｈｙｌ、Ａ３００－２９４Ａ、１／２０００）
－ヒツジ抗ＳＯＤ１（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、５７４５９７、１／１０００）
－ウサギ抗ＨＤＡＣ１（Ｂｅｔｈｙｌ、Ａ３００－７１３Ａ、１／１０００）
－抗ウサギＨＲＰ（ＰＡＲＩＳ、ＢＩ２４０７，１／５０００）
－抗ヒツジＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ、７１３－０３５－１４７、１／５０００）
【0101】
ＲＮＡ抽出及びＲＴ－ｑＰＣＲ
１００μｌのＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中のＴｉｓｓｕｅ Ｌｙｓｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、合計ＲＮＡを脊髄及び前頭皮質から抽出した。
１００μｌのＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中のＴｉｓｓｕｅ Ｌｙｓｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、合計ＲＮＡを脊髄及び前頭皮質から抽出した。
【0102】
製造業者の条件（Ｂｉｏｒａｄ、１７０８８４１）を使用して、１μｇのＲＮＡをｉＳｃｒｉｐｔ（商標）逆転写を用いて逆転写した。Ｓｓｏ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して定量ポリメラーゼ連鎖反応を実施し、製造業者の条件を使用してＢｉｏ－Ｒａｄソフトウェアで定量化した。ＧｅＮｏｒｍソフトウェアに従って、アクチン、ＴＢＰ、及びｐｏｌ２遺伝子を使用して正規化係数を計算することによって、遺伝子発現を正規化した（非特許文献２０）。
【0103】
プライマー配列は、以下の通りであった：
アクチン： Ｆ－ＣＣＡＣＣＡＧＴＴＣＧＣＣＡＴＧＧＡＴ（配列番号２５）、
Ｒ－ＧＧＣＴＴＴＧＣＡＣＡＴＧＣＣＧＧＡＧ（配列番号２６）
ＴＢＰ： Ｆ－ＣＣＡＡＴＧＡＣＴＣＣＴＡＴＧＡＣＣＣＣＴＡ（配列番号２７）、
Ｒ－ＣＡＧＣＣＡＡＧＡＴＴＣＡＣＧＧＴＡＧＡＴ（配列番号２８）
Ｐｏｌ２： Ｆ－ＧＣＴＧＧＧＡＧＡＣＡＴＡＧＡＣＣＡ（配列番号２９）、
Ｒ－ＴＴＡＣＴＣＣＣＣＴＧＣＡＴＧＧＴＣＴＣ（配列番号３０）
ｈＦＵＳ： Ｆ－ＧＣＣＡＧＡＡＣＡＣＡＧＧＣＴＡＴＧＧＡ（配列番号３１）、
Ｒ－ＣＧＡＴＴＧＧＧＡＧＣＴＣＴＧＧＣＴＡＣ（配列番号３２）
Ｔ－ＦＵＳ： Ｆ－ＴＴＡＴＧＧＡＣＡＧＡＣＣＣＡＡＡＡＡＣＡＣＡ（配列番号３３）
Ｒ－ＴＧＣＴＧＣＣＣＡＴＡＡＧＡＡＧＡＴＴＧ（配列番号３４）
ＦＵＳ ΔＮＬＳ：Ｆ－ＧＣＡＡＧＡＴＧＧＡＣＴＣＣＴＡＧＴＧＴＴＡＡＴ（配列番号３５）、
Ｒ－ＡＣＣＴＣＴＡＣＡＡＡＴＧＴＧＧＴＡＴＧＧＣ（配列番号３６）
Ｆｕｓ＿エクソン６－８：Ｆ－ＣＧＧＣＡＴＧＧＧＧＴＣＣＴＣＧＧ（配列番号３７）、
Ｒ－ＣＣＴＡＧＧＣＣＴＴＧＣＡＣＧＡＡＧＡＴ（配列番号３８）
アクチン： Ｆ－ＣＣＡＣＣＡＧＴＴＣＧＣＣＡＴＧＧＡＴ（配列番号２５）、
Ｒ－ＧＧＣＴＴＴＧＣＡＣＡＴＧＣＣＧＧＡＧ（配列番号２６）
ＴＢＰ： Ｆ－ＣＣＡＡＴＧＡＣＴＣＣＴＡＴＧＡＣＣＣＣＴＡ（配列番号２７）、
Ｒ－ＣＡＧＣＣＡＡＧＡＴＴＣＡＣＧＧＴＡＧＡＴ（配列番号２８）
Ｐｏｌ２： Ｆ－ＧＣＴＧＧＧＡＧＡＣＡＴＡＧＡＣＣＡ（配列番号２９）、
Ｒ－ＴＴＡＣＴＣＣＣＣＴＧＣＡＴＧＧＴＣＴＣ（配列番号３０）
ｈＦＵＳ： Ｆ－ＧＣＣＡＧＡＡＣＡＣＡＧＧＣＴＡＴＧＧＡ（配列番号３１）、
Ｒ－ＣＧＡＴＴＧＧＧＡＧＣＴＣＴＧＧＣＴＡＣ（配列番号３２）
Ｔ－ＦＵＳ： Ｆ－ＴＴＡＴＧＧＡＣＡＧＡＣＣＣＡＡＡＡＡＣＡＣＡ（配列番号３３）
Ｒ－ＴＧＣＴＧＣＣＣＡＴＡＡＧＡＡＧＡＴＴＧ（配列番号３４）
ＦＵＳ ΔＮＬＳ：Ｆ－ＧＣＡＡＧＡＴＧＧＡＣＴＣＣＴＡＧＴＧＴＴＡＡＴ（配列番号３５）、
Ｒ－ＡＣＣＴＣＴＡＣＡＡＡＴＧＴＧＧＴＡＴＧＧＣ（配列番号３６）
Ｆｕｓ＿エクソン６－８：Ｆ－ＣＧＧＣＡＴＧＧＧＧＴＣＣＴＣＧＧ（配列番号３７）、
Ｒ－ＣＣＴＡＧＧＣＣＴＴＧＣＡＣＧＡＡＧＡＴ（配列番号３８）
【0104】
統計
分析からの全ての結果を平均±標準誤差の平均（ＳＥＭ）として示し、ｐ＜０．０５の場合、差を有意であるとみなした。有意性を以下のように示す：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、及び＊＊＊ｐ＜０．００１。２つの群の比較のために、両側の独立スチューデントｔ検定をＦ検定と組み合わせて使用して、群間の変動が有意に異なっていないことを確認した。一元配置分散分析及びＴｕｋｅｙ又はＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較事後検定を使用して、３つ以上の群の比較を実施した。ＧｒａｐＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン６．０を使用することによって、データを分析した。
分析からの全ての結果を平均±標準誤差の平均（ＳＥＭ）として示し、ｐ＜０．０５の場合、差を有意であるとみなした。有意性を以下のように示す：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、及び＊＊＊ｐ＜０．００１。２つの群の比較のために、両側の独立スチューデントｔ検定をＦ検定と組み合わせて使用して、群間の変動が有意に異なっていないことを確認した。一元配置分散分析及びＴｕｋｅｙ又はＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較事後検定を使用して、３つ以上の群の比較を実施した。ＧｒａｐＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン６．０を使用することによって、データを分析した。
【0105】
結果
ヒト野生型ＦＵＳ導入遺伝子は、ホモ接合型ＦｕｓΔＮＬＳマウスにおける出生周辺期の
致死性を救済する
ＢＡＣから野生型ＦＵＳを発現するヒト野生型ＦＵＳトランスジェニックマウス（ｈＦＵＳマウス）は最近生成され、特徴評価されている（非特許文献２１［９］）。並行して生成及び特徴評価されたヒト変異体ＦＵＳトランスジェニック株とは対照的に、これらのマウスは、ほとんどがヒト起源のわずかに増加したＦＵＳレベルを発現し、ＡＬＳ関連表現型を示さない（非特許文献２１［９］）。ｈＦＵＳマウスをＦｕｓΔＮＬＳマウスと交配させ（非特許文献１［１０］）、ＦｕｓΔＮＬＳマウスは、ヘテロ接合型として軽度の後期発症型運動ニューロン疾患を発症し（非特許文献１８［１１］）、一方で、ホモ接合型ＦｕｓΔＮＬＳマウスは、出生周辺期に死亡する（非特許文献１［１０］）ことが以前示されている。２回の繁殖ステップの後、ｈＦＵＳ導入遺伝子を有するか又は有しないヘテロ接合型及びホモ接合型ＦｕｓΔＮＬＳマウスを含む、対象の遺伝子型を得た（図１Ａ）。注目すべきことに、全てのマウスはＣ５７Ｂｌ／６遺伝的背景であり、Ｆ２世代からのマウスのみをここで分析し、それによって遺伝的背景の不均一性の可能性のある交絡効果のうちのほとんどを回避した。１か月齢のマウス、又は１か月齢以前に発生する場合死亡時のマウスを遺伝子型決定した。図１に実証されるように、ｈＦＵＳを含まないＤ ＦｕｓΔＮＬＳ／ΔＮＬＳマウスは、生後１時間以内に死亡し、１か月齢でこの遺伝子型を有するマウスは観察されなかった（図１Ｃ）。対照的に、ヒト野生型ＦＵＳ導入遺伝子を追加することによって、ほとんどのホモ接合型ＦｕｓΔＮＬＳマウスの成体期までの生存が可能になった（図１Ｂ、Ｄ）。全てのＦｕｓΔＮＬＳ群の、野生型動物と比較してわずかではあるが非統計的な有意に増加した死亡率が観察された（図１Ｄ）。
ヒト野生型ＦＵＳ導入遺伝子は、ホモ接合型ＦｕｓΔＮＬＳマウスにおける出生周辺期の
致死性を救済する
ＢＡＣから野生型ＦＵＳを発現するヒト野生型ＦＵＳトランスジェニックマウス（ｈＦＵＳマウス）は最近生成され、特徴評価されている（非特許文献２１［９］）。並行して生成及び特徴評価されたヒト変異体ＦＵＳトランスジェニック株とは対照的に、これらのマウスは、ほとんどがヒト起源のわずかに増加したＦＵＳレベルを発現し、ＡＬＳ関連表現型を示さない（非特許文献２１［９］）。ｈＦＵＳマウスをＦｕｓΔＮＬＳマウスと交配させ（非特許文献１［１０］）、ＦｕｓΔＮＬＳマウスは、ヘテロ接合型として軽度の後期発症型運動ニューロン疾患を発症し（非特許文献１８［１１］）、一方で、ホモ接合型ＦｕｓΔＮＬＳマウスは、出生周辺期に死亡する（非特許文献１［１０］）ことが以前示されている。２回の繁殖ステップの後、ｈＦＵＳ導入遺伝子を有するか又は有しないヘテロ接合型及びホモ接合型ＦｕｓΔＮＬＳマウスを含む、対象の遺伝子型を得た（図１Ａ）。注目すべきことに、全てのマウスはＣ５７Ｂｌ／６遺伝的背景であり、Ｆ２世代からのマウスのみをここで分析し、それによって遺伝的背景の不均一性の可能性のある交絡効果のうちのほとんどを回避した。１か月齢のマウス、又は１か月齢以前に発生する場合死亡時のマウスを遺伝子型決定した。図１に実証されるように、ｈＦＵＳを含まないＤ ＦｕｓΔＮＬＳ／ΔＮＬＳマウスは、生後１時間以内に死亡し、１か月齢でこの遺伝子型を有するマウスは観察されなかった（図１Ｃ）。対照的に、ヒト野生型ＦＵＳ導入遺伝子を追加することによって、ほとんどのホモ接合型ＦｕｓΔＮＬＳマウスの成体期までの生存が可能になった（図１Ｂ、Ｄ）。全てのＦｕｓΔＮＬＳ群の、野生型動物と比較してわずかではあるが非統計的な有意に増加した死亡率が観察された（図１Ｄ）。
【0106】
ヒト野生型ＦＵＳ導入遺伝子は、ヘテロ接合型ＦｕｓΔＮＬＳマウスにおける後期発症型筋力低下を救済する
使用したマウスは、Ｆｕｓ＋／＋、ＦｕｓΔＮＬＳ／＋、及びＦｕｓΔＮＬＳ／＋発現Ｈ ＦＵＳマウスであった。使用したマウスの数は、群当たりＮ＝１０～２８匹であった。図２に示されるように、ＦｕｓΔＮＬＳ／＋マウスは、反転金網試験を使用して、容易に続けることができる軽度の後期発症型筋力低下を発症している。この試験を使用して、ＦｕｓΔＮＬＳ／＋マウスに生じる欠陥が、２か月齢後に観察され、年齢で安定であった（図２Ａ～図２Ｂ）。対照的に、ヒト野生型ＦＵＳ導入遺伝子を有するＦｕｓΔＮＬＳ／＋マウスは、この試験で野生型同腹子と区別することができず、野生型ＦＵＳ導入遺伝子が、神経及び筋肉表現型を救助するのに十分であったことを示唆している（図２Ａ～図２Ｂ）。
使用したマウスは、Ｆｕｓ＋／＋、ＦｕｓΔＮＬＳ／＋、及びＦｕｓΔＮＬＳ／＋発現Ｈ ＦＵＳマウスであった。使用したマウスの数は、群当たりＮ＝１０～２８匹であった。図２に示されるように、ＦｕｓΔＮＬＳ／＋マウスは、反転金網試験を使用して、容易に続けることができる軽度の後期発症型筋力低下を発症している。この試験を使用して、ＦｕｓΔＮＬＳ／＋マウスに生じる欠陥が、２か月齢後に観察され、年齢で安定であった（図２Ａ～図２Ｂ）。対照的に、ヒト野生型ＦＵＳ導入遺伝子を有するＦｕｓΔＮＬＳ／＋マウスは、この試験で野生型同腹子と区別することができず、野生型ＦＵＳ導入遺伝子が、神経及び筋肉表現型を救助するのに十分であったことを示唆している（図２Ａ～図２Ｂ）。
【0107】
ヒト野生型ＦＵＳ導入遺伝子は、ＦｕｓΔＮＬＳマウスにおけるＦＵＳタンパク質の細胞質誤局在を救済する
ＦｕｓΔＮＬＳマウスにおけるＦＵＳの細胞内局在に対するヒト野生型ＦＵＳ導入遺伝子の発現の効果を研究した。得られた結果を図３に表す。図３Ａ及び図３Ｂに実証されるように、ウエスタンブロッティングを使用して評価して、ＦｕｓΔＮＬＳ／＋マウスの大脳皮質の細胞質画分は、対応する野生型同腹子画分よりも高いレベルのＦＵＳを示した。ＦＵＳΔＮＬＳタンパク質には存在しないＮＬＳ配列を標的とする抗体を使用した場合、これは観察されず、この増加が変異体タンパク質の誤局在に関連することを実証している。重要なことに、マウス特異的ＦＵＳ抗体を使用して同定して、マウスＦＵＳは、ＦｕｓΔＮＬＳ／＋マウスの細胞質画分で増加し、これをヒト野生型ＦＵＳ導入遺伝子によって正規化した（図３Ａ～図３Ｂ）。重要なことに、核ＦＵＳレベルは、ＦｕｓΔＮＬＳ変異又はヒト野生型ＦＵＳ導入遺伝子の存在に関係なく、全ての遺伝子型で変化しなかった。ヒトＦＵＳレベルは、ヒトＦＵＳ導入遺伝子を担持するＦｕｓΔＮＬＳ／ΔＮＬＳマウスで増加し、マウス起源の核ＦＵＳの喪失を補填した可能性がある。導入遺伝子のこの救済効果を更に確認するために、２２か月齢のマウスの脊髄切片に対して免疫組織化学を実施した。図３Ｃに示されるように、ＦｕｓΔＮＬＳ／＋ニューロンは、ＦＵＳ染色において核濃縮の欠如を示し、これは、ＦｕｓΔＮＬＳ／＋マウス又はＦｕｓΔＮＬＳ／ΔＮＬＳマウスであるかどうかにかかわらず、ヒト野生型ＦＵＳ導入遺伝子によって完全に予防された。更に、ＦＵＳ及びＣｈＡＴ抗体を使用して運動ニューロンを明確に同定するための二重免疫蛍光によって、図３Ｄに実証され、示されるように、ヒト野生型ＦＵＳ導入遺伝子が、運動ニューロンにおけるＦＵＳ誤局在を救済したことを確認した。
ＦｕｓΔＮＬＳマウスにおけるＦＵＳの細胞内局在に対するヒト野生型ＦＵＳ導入遺伝子の発現の効果を研究した。得られた結果を図３に表す。図３Ａ及び図３Ｂに実証されるように、ウエスタンブロッティングを使用して評価して、ＦｕｓΔＮＬＳ／＋マウスの大脳皮質の細胞質画分は、対応する野生型同腹子画分よりも高いレベルのＦＵＳを示した。ＦＵＳΔＮＬＳタンパク質には存在しないＮＬＳ配列を標的とする抗体を使用した場合、これは観察されず、この増加が変異体タンパク質の誤局在に関連することを実証している。重要なことに、マウス特異的ＦＵＳ抗体を使用して同定して、マウスＦＵＳは、ＦｕｓΔＮＬＳ／＋マウスの細胞質画分で増加し、これをヒト野生型ＦＵＳ導入遺伝子によって正規化した（図３Ａ～図３Ｂ）。重要なことに、核ＦＵＳレベルは、ＦｕｓΔＮＬＳ変異又はヒト野生型ＦＵＳ導入遺伝子の存在に関係なく、全ての遺伝子型で変化しなかった。ヒトＦＵＳレベルは、ヒトＦＵＳ導入遺伝子を担持するＦｕｓΔＮＬＳ／ΔＮＬＳマウスで増加し、マウス起源の核ＦＵＳの喪失を補填した可能性がある。導入遺伝子のこの救済効果を更に確認するために、２２か月齢のマウスの脊髄切片に対して免疫組織化学を実施した。図３Ｃに示されるように、ＦｕｓΔＮＬＳ／＋ニューロンは、ＦＵＳ染色において核濃縮の欠如を示し、これは、ＦｕｓΔＮＬＳ／＋マウス又はＦｕｓΔＮＬＳ／ΔＮＬＳマウスであるかどうかにかかわらず、ヒト野生型ＦＵＳ導入遺伝子によって完全に予防された。更に、ＦＵＳ及びＣｈＡＴ抗体を使用して運動ニューロンを明確に同定するための二重免疫蛍光によって、図３Ｄに実証され、示されるように、ヒト野生型ＦＵＳ導入遺伝子が、運動ニューロンにおけるＦＵＳ誤局在を救済したことを確認した。
【0108】
この結果は、本発明の産生物、例えば、核酸及び／又はベクターが、野生型タンパク質ＦＵＳを提供することによって遺伝的変異を補填し、変異したタンパク質ＦＵＳの発現及び産生を下方調節し、野生型タンパク質ＦＵＳの発現及び産生を調節することを、同時にかつ相乗効果的に可能にすることを明確に実証している。
【0109】
ヒト野生型ＦＵＳ導入遺伝子は、ヘテロ接合型ＦｕｓΔＮＬＳマウスにおけるＡＬＳ関連病理を救済する
ヒト野生型ＦＵＳ導入遺伝子の保護効果を更に文書化するために、Ｆｕｓ＋／＋（＋／＋）、及び（ｈＦＵＳ）を有するか又はｈＦＵＳ導入遺伝子を有しない（Ｎｏ Ｔｇ）Ｆｕｓ ΔＮＬＳ／＋（Δ／＋）マウス、及びｈＦＵＳ導入遺伝子マウスを有するＦｕｓ ΔＮＬＳ／ΔＮＬＳ（Δ／Δ）マウスによって発症した病理学的特徴を分析した。使用したマウスの数は、群当たりＮ＝４～８匹であった。細胞質の非対称的な脱メチル化（ＡＤＭＡ）ＦＵＳの蓄積は、ＦＵＳ－ＡＬＳに典型的であり、ＦｕｓΔＮＬＳ／＋マウスで以前観察されている。実際、ＦｕｓΔＮＬＳ／＋細胞質画分におけるＡＤＭＡ－ＦＵＳの高い増加は、野生型ヒトＦＵＳ導入遺伝子を有するＦｕｓΔＮＬＳ／＋マウスにおいて大きく予防された（図４Ａ～図４Ｂ）。しかしながら、これは、高レベルの細胞質メチル化ＦＵＳを保持したｈＦＵＳ導入遺伝子を担持するＦｕｓΔＮＬＳ／ΔＮＬＳマウスの場合ではない。一貫して、ＡＤＭＡ－ＦＵＳ免疫応答性は、ＦｕｓΔＮＬＳ／＋マウスの運動ニューロンにおいて拡散し、ヒト野生型ＦＵＳ導入遺伝子は、ＦｕｓΔＮＬＳ／＋マウスにおいてより局在化された核周辺免疫応答性をもたらした（図４Ｃ）。更にまた、ＦｕｓΔＮＬＳ／＋運動ニューロンで観察された穿刺ユビキチン病理は、ヒト野生型ＦＵＳ導入遺伝子によって予防された（図４Ｄ）。したがって、ヒト野生型ＦＵＳ導入遺伝子は、ＦｕｓΔＮＬＳ／＋マウスにおいてＡＬＳ－ＦＵＳ病理の典型的な特徴を救済することが可能であった。
ヒト野生型ＦＵＳ導入遺伝子の保護効果を更に文書化するために、Ｆｕｓ＋／＋（＋／＋）、及び（ｈＦＵＳ）を有するか又はｈＦＵＳ導入遺伝子を有しない（Ｎｏ Ｔｇ）Ｆｕｓ ΔＮＬＳ／＋（Δ／＋）マウス、及びｈＦＵＳ導入遺伝子マウスを有するＦｕｓ ΔＮＬＳ／ΔＮＬＳ（Δ／Δ）マウスによって発症した病理学的特徴を分析した。使用したマウスの数は、群当たりＮ＝４～８匹であった。細胞質の非対称的な脱メチル化（ＡＤＭＡ）ＦＵＳの蓄積は、ＦＵＳ－ＡＬＳに典型的であり、ＦｕｓΔＮＬＳ／＋マウスで以前観察されている。実際、ＦｕｓΔＮＬＳ／＋細胞質画分におけるＡＤＭＡ－ＦＵＳの高い増加は、野生型ヒトＦＵＳ導入遺伝子を有するＦｕｓΔＮＬＳ／＋マウスにおいて大きく予防された（図４Ａ～図４Ｂ）。しかしながら、これは、高レベルの細胞質メチル化ＦＵＳを保持したｈＦＵＳ導入遺伝子を担持するＦｕｓΔＮＬＳ／ΔＮＬＳマウスの場合ではない。一貫して、ＡＤＭＡ－ＦＵＳ免疫応答性は、ＦｕｓΔＮＬＳ／＋マウスの運動ニューロンにおいて拡散し、ヒト野生型ＦＵＳ導入遺伝子は、ＦｕｓΔＮＬＳ／＋マウスにおいてより局在化された核周辺免疫応答性をもたらした（図４Ｃ）。更にまた、ＦｕｓΔＮＬＳ／＋運動ニューロンで観察された穿刺ユビキチン病理は、ヒト野生型ＦＵＳ導入遺伝子によって予防された（図４Ｄ）。したがって、ヒト野生型ＦＵＳ導入遺伝子は、ＦｕｓΔＮＬＳ／＋マウスにおいてＡＬＳ－ＦＵＳ病理の典型的な特徴を救済することが可能であった。
【0110】
この結果は、本発明の産生物、例えば、核酸及び／又はベクターが、変異したＦＵＳの細胞質蓄積を排除し、野生型タンパク質ＦＵＳを産生し、また野生型タンパク質ＦＵＳの産生を調節することを相乗効果的に可能にすることを明確に実証している。加えて、この結果は、本発明の産生物、例えば、核酸及び／又はベクターが、変異したＦＵＳタンパク質のｍＲＮＡの発現を減少させ、ＦＵＳタンパク質の機能を回復及び修正することを可能にすることを明確に実証している。
【0111】
ヒト野生型ＦＵＳ導入遺伝子は、内因性Ｆｕｓの過剰発現を逆転させ、エクソン７スキッピングを活性化する
Ｆｕｓ＋／＋（＋／＋）、及び（ｈＦＵＳ）を有するか又はｈＦＵＳ導入遺伝子を有しない（Ｎｏ Ｔｇ）Ｆｕｓ ΔＮＬＳ／＋（Δ／＋）マウス、及びｈＦＵＳ導入遺伝子を有するＦｕｓ ΔＮＬＳ／ΔＮＬＳ（Δ／Δ）マウスにおける内因性ＦＵＳ遺伝子の発現の調節に対するヒト野生型ＦＵＳ導入遺伝子の保護効果及び／又は治療効果を更に文書化するために、マウスを分析した。単一のヒト野生型ＦＵＳトランスジェニックマウスは、内因性Ｆｕｓ遺伝子１５の発現が低い一方で、ＦｕｓΔＮＬＳ／＋マウスは、脊髄（図５Ａ～図５Ｂ）及び前頭皮質（図７）において、１及び２２か月齢の両方でＦｕｓ ｍＲＮＡレベルのわずかではあるが有意な増加を示した。内因性マウス遺伝子のこの過剰発現は、ヒト野生型ＦＵＳ導入遺伝子によって完全に補正された。更に、ヒトＦＵＳ導入遺伝子の発現は、エクソン７を欠く基質のＦｕｓのｍＲＮＡの異常にスプライシングされたレベルを強く増加させて、ｍＲＮＡを消滅させることを伴う（図５Ａ～図５Ｂ）。実際、内因性マウスＦｕｓ ｍＲＮＡにおけるｈＦＵＳ発現とエクソン７の欠失との間に強い相関関係があった（補足図３）。したがって、ヒト野生型ＦＵＳ導入遺伝子を追加することによって、自己調節ループの活性化を通じた毒性タンパク質の発現の減少、その後、細胞質による誤局在ＦＵＳの発現の下流の結果の全ての緩和がもたらされる。
Ｆｕｓ＋／＋（＋／＋）、及び（ｈＦＵＳ）を有するか又はｈＦＵＳ導入遺伝子を有しない（Ｎｏ Ｔｇ）Ｆｕｓ ΔＮＬＳ／＋（Δ／＋）マウス、及びｈＦＵＳ導入遺伝子を有するＦｕｓ ΔＮＬＳ／ΔＮＬＳ（Δ／Δ）マウスにおける内因性ＦＵＳ遺伝子の発現の調節に対するヒト野生型ＦＵＳ導入遺伝子の保護効果及び／又は治療効果を更に文書化するために、マウスを分析した。単一のヒト野生型ＦＵＳトランスジェニックマウスは、内因性Ｆｕｓ遺伝子１５の発現が低い一方で、ＦｕｓΔＮＬＳ／＋マウスは、脊髄（図５Ａ～図５Ｂ）及び前頭皮質（図７）において、１及び２２か月齢の両方でＦｕｓ ｍＲＮＡレベルのわずかではあるが有意な増加を示した。内因性マウス遺伝子のこの過剰発現は、ヒト野生型ＦＵＳ導入遺伝子によって完全に補正された。更に、ヒトＦＵＳ導入遺伝子の発現は、エクソン７を欠く基質のＦｕｓのｍＲＮＡの異常にスプライシングされたレベルを強く増加させて、ｍＲＮＡを消滅させることを伴う（図５Ａ～図５Ｂ）。実際、内因性マウスＦｕｓ ｍＲＮＡにおけるｈＦＵＳ発現とエクソン７の欠失との間に強い相関関係があった（補足図３）。したがって、ヒト野生型ＦＵＳ導入遺伝子を追加することによって、自己調節ループの活性化を通じた毒性タンパク質の発現の減少、その後、細胞質による誤局在ＦＵＳの発現の下流の結果の全ての緩和がもたらされる。
【0112】
この実施例は、本発明の産生物、例えば核酸及び／又はベクターが、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、具体的には若年性筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を治療及び治癒することを可能にすることを明確に実証している。具体的には、この実施例は、本発明が、毒性タンパク質、すなわち、変異したＦＵＳの発現を減少させ、ヒトＦＵＳタンパク質の機能性タンパク質及び相同タンパク質を産生し、変異したＦＵＳの自己調節ループを活性化し、発明の核酸の発現の自己調節ループを活性化して、当該核酸の野生型発現を可能にし、変異したＦＵＳの細胞質及び／又は核蓄積／誤局在を排除することを同時に可能にすることを明確に実証している。したがって、この実施例は、驚くべきことにかつ予想外に、本発明が、生物学的な不足を「キャンセル」し、野生型生物学的機序を回復することを同時に可能にすることを明確に実証している。
【0113】
実施例３：哺乳類細胞におけるイントロン６、７又は代替ＦＵＳ ＤＮＡ構築物の挿入の効果
イントロン６又は７の挿入によって、トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞におけるＦＵＳ自己調節が可能になる
Ｉｎｔｒｏｎ６又はイントロン７を、ｍＲＮＡ前駆体におけるそれらの内因性位置（イントロン６ではエクソン６と７との間、及びイントロン７ではエクソン７と８との間）で、ＦＵＳ ＯＲＦに挿入した。Ｎ末端ＨＡタグを含めることによって、トランスジェニックタンパク質（ＨＡ－ｉ６及びＨＡ－ｉ７）の明確な検出を可能にし、陽性対照としてｍｙｃタグ付きＦＵＳ発現プラスミド（Ｍｙｃエクソン）と比較した（図１０Ａ）。
イントロン６又は７の挿入によって、トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞におけるＦＵＳ自己調節が可能になる
Ｉｎｔｒｏｎ６又はイントロン７を、ｍＲＮＡ前駆体におけるそれらの内因性位置（イントロン６ではエクソン６と７との間、及びイントロン７ではエクソン７と８との間）で、ＦＵＳ ＯＲＦに挿入した。Ｎ末端ＨＡタグを含めることによって、トランスジェニックタンパク質（ＨＡ－ｉ６及びＨＡ－ｉ７）の明確な検出を可能にし、陽性対照としてｍｙｃタグ付きＦＵＳ発現プラスミド（Ｍｙｃエクソン）と比較した（図１０Ａ）。
【0114】
トランスフェクションの２４時間後、ＨＡ－ｉ６及びＨＡ－ｉ７構築物の両方のＦＵＳの予想分子量でＨＡ免疫応答性タンパク質の強い発現が観察され（図１０Ｂ）、イントロンの挿入が、ｃＤＮＡのスプライシング及び適切な翻訳を損なわなかったことを示している。最も重要なことに、Ｍｙｃ－エクソン発現は、ＦＵＳレベルの劇的な上方制御をもたらした一方で、ＨＡ－ｉ６及びＨＡ－ｉ７トランスフェクト細胞は、トランスフェクションの２４時間又は４８時間後のいずれかで、正常なレベルのＦＵＳを示した（図１０Ｂ）。したがって、ＦＵＳ ＯＲＦにおけるイントロン６又はイントロン７の挿入は、中断されていないｃＤＮＡの発現時に観察された過剰発現を回避し、適切な自己調節を示唆している。
【0115】
ＨＡ－ｉ６は、トランスフェクションの４８時間後に内因性ＦＵＳイントロン７保持を誘発する
ＨＥＫ２９３細胞を、Ｍｙｃ－エクソン又はＨＡ－ｉ６のいずれかでトランスフェクトし、ＨＡ－ｉ６構築物に含まれていないイントロン７の保持を測定した。図１１Ａに示されるように、トランスフェクションの２４時間後のＨＡ－ｉ６トランスフェクト細胞における内因性イントロン７の保持は、Ｍｙｃ－エクソンと比較して同一であった。次いで、トランスフェクションの４８時間後のＨＡｉ６トランスフェクト細胞において、イントロン７保持レベルの増加が観察された。同様に、トランスフェクションの４８時間後のＭｙｃ－エクソントランスフェクト細胞と比較して、ＨＡ－ｉ７でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞における内因性イントロン６保持のレベルの増加が観察された（図１１Ｂ）。これらの結果は、ＨＡ－ｉ６及びＨＡ－ｉ７が、ＦＵＳの内因性ｍＲＮＡの自己調節に関与する原理の証拠を提供する。
ＨＥＫ２９３細胞を、Ｍｙｃ－エクソン又はＨＡ－ｉ６のいずれかでトランスフェクトし、ＨＡ－ｉ６構築物に含まれていないイントロン７の保持を測定した。図１１Ａに示されるように、トランスフェクションの２４時間後のＨＡ－ｉ６トランスフェクト細胞における内因性イントロン７の保持は、Ｍｙｃ－エクソンと比較して同一であった。次いで、トランスフェクションの４８時間後のＨＡｉ６トランスフェクト細胞において、イントロン７保持レベルの増加が観察された。同様に、トランスフェクションの４８時間後のＭｙｃ－エクソントランスフェクト細胞と比較して、ＨＡ－ｉ７でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞における内因性イントロン６保持のレベルの増加が観察された（図１１Ｂ）。これらの結果は、ＨＡ－ｉ６及びＨＡ－ｉ７が、ＦＵＳの内因性ｍＲＮＡの自己調節に関与する原理の証拠を提供する。
【0116】
代替ＦＵＳ ＤＮＡ構築物は、ＨＡタグ付きタンパク質の翻訳を可能にする
ＨＡ－ｉ６及びＨＡ－ｉ７の修飾に基づいて、一連の構築物を作製した。全てのこれらの構築物は、特に構築物＃９では、トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞におけるＦＵＳの予想分子量でのＨＡ免疫応答性バンドの発現を可能にした。したがって、ＦＵＳ遺伝子の操作は、ＦＵＳタンパク質の自己調節及び適切な発現を維持しながら、構築物の短縮を可能にするために実施することができる。
ＨＡ－ｉ６及びＨＡ－ｉ７の修飾に基づいて、一連の構築物を作製した。全てのこれらの構築物は、特に構築物＃９では、トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞におけるＦＵＳの予想分子量でのＨＡ免疫応答性バンドの発現を可能にした。したがって、ＦＵＳ遺伝子の操作は、ＦＵＳタンパク質の自己調節及び適切な発現を維持しながら、構築物の短縮を可能にするために実施することができる。
【0117】
方法
細胞培養
ＨＥＫ２９３細胞をＡＴＣＣ（登録商標）（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１５７３（商標））から購入した。５％のＣＯ２を含むインキュベーター内で、１０％のウシ胎仔血清（Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１１５３１８３１）、１％のペニシリン－ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ、Ｐ４３３３）を含有する３７℃のダルベッコ改変イーグル培地中で細胞を培養した。培養培地を２日ごとに交換し、５～２０継代でトランスフェクションを実施した。
細胞培養
ＨＥＫ２９３細胞をＡＴＣＣ（登録商標）（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１５７３（商標））から購入した。５％のＣＯ２を含むインキュベーター内で、１０％のウシ胎仔血清（Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１１５３１８３１）、１％のペニシリン－ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ、Ｐ４３３３）を含有する３７℃のダルベッコ改変イーグル培地中で細胞を培養した。培養培地を２日ごとに交換し、５～２０継代でトランスフェクションを実施した。
【0118】
トランスフェクション
２４ウェルプレート内で、Ｃ２Ｃ１２を８０％のコンフルエンシーまで培養した。製造業者の指示に従って、ＴｒａｎｓＩＴ－Ｘ２（ＭＩＲ６０００、Ｍｙｒｕｓ）を使用して、発現及びレポータープラスミドを含む分化培地中で、トランスフェクションを実施した。必要に応じて、プラスミドとの訴訟の制限部位Ｎｏｔ１（ＧＣＧＧＣＣＧＣ）及びＸｂａ１（ＴＣＴＡＧＡ）の配列を含んで、核酸を調製した。トランスフェクションに使用した発現ベクターは、以下であった：
－ｐＣＭＶ空プラスミド、
－イントロンを含まないＮ末端ｍｙｃタグ付きヒトＦＵＳを発現している、ｐＣＭＶ－Ｍｙｃ－ＦＵＳ、
－イントロン６を含むＨＡタグ付きヒトＦＵＳを発現している、ｐＣＭＶ－ＨＡ－ｉ６、
－イントロン７を含むＨＡタグ付きヒトＦＵＳを発現している、ｐＣＭＶ－ＨＡ－ｉ７、
２４ウェルプレート内で、Ｃ２Ｃ１２を８０％のコンフルエンシーまで培養した。製造業者の指示に従って、ＴｒａｎｓＩＴ－Ｘ２（ＭＩＲ６０００、Ｍｙｒｕｓ）を使用して、発現及びレポータープラスミドを含む分化培地中で、トランスフェクションを実施した。必要に応じて、プラスミドとの訴訟の制限部位Ｎｏｔ１（ＧＣＧＧＣＣＧＣ）及びＸｂａ１（ＴＣＴＡＧＡ）の配列を含んで、核酸を調製した。トランスフェクションに使用した発現ベクターは、以下であった：
－ｐＣＭＶ空プラスミド、
－イントロンを含まないＮ末端ｍｙｃタグ付きヒトＦＵＳを発現している、ｐＣＭＶ－Ｍｙｃ－ＦＵＳ、
－イントロン６を含むＨＡタグ付きヒトＦＵＳを発現している、ｐＣＭＶ－ＨＡ－ｉ６、
－イントロン７を含むＨＡタグ付きヒトＦＵＳを発現している、ｐＣＭＶ－ＨＡ－ｉ７、
【0119】
－配列番号４２に示されるイントロン６の保存されたＲＮＡモチーフを有するＨＡタグ付きヒトＦＵＳを発現している、ｐＣＭＶ－ＨＡ－１。構造は、以下の通りであった：Ｎｏｔ１－ＨＡ－エクソン１－エクソン２－エクソン３－エクソン４－エクソン５－エクソン６－モチーフ１－エクソン７－エクソン８－エクソン９－エクソン１０－エクソン１１－エクソン１２－エクソン１３－エクソン１４－エクソン１５－Ｘｂａ１。イントロン６のモチーフ１の配列は、配列番号５４；
－配列番号４３に示されるイントロン６の保存されたＲＮＡモチーフを有するＨＡタグ付きヒトＦＵＳを発現している、ｐＣＭＶ－ＨＡ－２に対応する。構造は、以下の通りであった：Ｎｏｔ１－ＨＡ－Ｅ１－Ｅ２－Ｅ３－Ｅ４－Ｅ５－Ｅ６－モチーフ２－Ｅ７－Ｅ８－Ｅ９－Ｅ１０－Ｅ１１－Ｅ１２－Ｅ１３－Ｅ１４－Ｅ１５－ｘｂａ１。イントロン６のモチーフ２の配列は、配列番号５５；
－配列番号４４に示されるイントロン７の保存されたＲＮＡモチーフを有するＨＡタグ付きヒトＦＵＳを発現している、ｐＣＭＶ－ＨＡ－３に対応する。構造は、以下の通りであった：Ｎｏｔ１－ＨＡ－Ｅ１－Ｅ２－Ｅ３－Ｅ４－Ｅ５－Ｅ６－Ｅ７－モチーフ３－Ｅ８－Ｅ９－Ｅ１０－Ｅ１１－Ｅ１２－Ｅ１３－Ｅ１４－Ｅ１５－ｘｂａ１。イントロン７のモチーフ３の配列は、配列番号５６；
－配列番号４５に示されるイントロン７の保存されたＲＮＡモチーフを有するＨＡタグ付きヒトＦＵＳを発現している、ｐＣＭＶ－ＨＡ－４に対応する。構造は、以下の通りであった：Ｎｏｔ１－ＨＡ－Ｅ１－Ｅ２－Ｅ３－Ｅ４－Ｅ５－Ｅ６－Ｅ７－モチーフ４－Ｅ８－Ｅ９－Ｅ１０－Ｅ１１－Ｅ１２－Ｅ１３－Ｅ１４－Ｅ１５－ｘｂａ１。イントロン７
のモチーフ４の配列は、配列番号５７；
－配列番号４６に示されるイントロン７の保存されたＲＮＡモチーフを有するＨＡタグ付きヒトＦＵＳを発現している、ｐＣＭＶ－ＨＡ－５に対応する。構造は、以下の通りであった：Ｎｏｔ１－ＨＡ－Ｅ１－Ｅ２－Ｅ３－Ｅ４－Ｅ５－Ｅ６－Ｅ７－モチーフ５－Ｅ８－Ｅ９－Ｅ１０－Ｅ１１－Ｅ１２－Ｅ１３－Ｅ１４－Ｅ１５－ｘｂａ１。イントロン７のモチーフ５の配列は、配列番号５８；
－配列番号４３に示されるイントロン６の保存されたＲＮＡモチーフを有するＨＡタグ付きヒトＦＵＳを発現している、ｐＣＭＶ－ＨＡ－２に対応する。構造は、以下の通りであった：Ｎｏｔ１－ＨＡ－Ｅ１－Ｅ２－Ｅ３－Ｅ４－Ｅ５－Ｅ６－モチーフ２－Ｅ７－Ｅ８－Ｅ９－Ｅ１０－Ｅ１１－Ｅ１２－Ｅ１３－Ｅ１４－Ｅ１５－ｘｂａ１。イントロン６のモチーフ２の配列は、配列番号５５；
－配列番号４４に示されるイントロン７の保存されたＲＮＡモチーフを有するＨＡタグ付きヒトＦＵＳを発現している、ｐＣＭＶ－ＨＡ－３に対応する。構造は、以下の通りであった：Ｎｏｔ１－ＨＡ－Ｅ１－Ｅ２－Ｅ３－Ｅ４－Ｅ５－Ｅ６－Ｅ７－モチーフ３－Ｅ８－Ｅ９－Ｅ１０－Ｅ１１－Ｅ１２－Ｅ１３－Ｅ１４－Ｅ１５－ｘｂａ１。イントロン７のモチーフ３の配列は、配列番号５６；
－配列番号４５に示されるイントロン７の保存されたＲＮＡモチーフを有するＨＡタグ付きヒトＦＵＳを発現している、ｐＣＭＶ－ＨＡ－４に対応する。構造は、以下の通りであった：Ｎｏｔ１－ＨＡ－Ｅ１－Ｅ２－Ｅ３－Ｅ４－Ｅ５－Ｅ６－Ｅ７－モチーフ４－Ｅ８－Ｅ９－Ｅ１０－Ｅ１１－Ｅ１２－Ｅ１３－Ｅ１４－Ｅ１５－ｘｂａ１。イントロン７
のモチーフ４の配列は、配列番号５７；
－配列番号４６に示されるイントロン７の保存されたＲＮＡモチーフを有するＨＡタグ付きヒトＦＵＳを発現している、ｐＣＭＶ－ＨＡ－５に対応する。構造は、以下の通りであった：Ｎｏｔ１－ＨＡ－Ｅ１－Ｅ２－Ｅ３－Ｅ４－Ｅ５－Ｅ６－Ｅ７－モチーフ５－Ｅ８－Ｅ９－Ｅ１０－Ｅ１１－Ｅ１２－Ｅ１３－Ｅ１４－Ｅ１５－ｘｂａ１。イントロン７のモチーフ５の配列は、配列番号５８；
【0120】
－配列番号４７に示されるイントロン７の保存されたＲＮＡモチーフを有するＨＡタグ付きヒトＦＵＳを発現している、ｐＣＭＶ－ＨＡ－６に対応する。構造は、以下の通りであった：Ｎｏｔ１－ＨＡ－Ｅ１－Ｅ２－Ｅ３－Ｅ４－Ｅ５－Ｅ６－Ｅ７－モチーフ６－Ｅ８－Ｅ９－Ｅ１０－Ｅ１１－Ｅ１２－Ｅ１３－Ｅ１４－Ｅ１５－Ｘｂａ１。イントロン７のモチーフ６の配列は、配列番号５９；
－配列番号４８に示されるイントロン６の保存された２つのＲＮＡモチーフ、及びイントロン７の保存された４つのＲＮＡモチーフを有するＨＡタグ付きヒトＦＵＳを発現している、ｐＣＭＶ－ＨＡ－７に対応する。構造は、以下の通りであった：Ｎｏｔ１－ＨＡ－Ｅ１－Ｅ２－Ｅ３－Ｅ４－Ｅ５－Ｅ６－モチーフ１－モチーフ２－Ｅ７－モチーフ３－モチーフ４－モチーフ５－モチーフ６－Ｅ８－Ｅ９－Ｅ１０－Ｅ１１－Ｅ１２－Ｅ１３－Ｅ１４－Ｅ１５－Ｘｂａ１；
－（配列番号４９に示されるイントロン６に強情な２つのＲＮＡモチーフを有するＨＡタグ付きヒトＦＵＳを発現している）ｐＣＭＶ－ＨＡ－８。構造は、以下の通りであった：Ｎｏｔ１－ＨＡ－Ｅ１－Ｅ２－Ｅ３－Ｅ４－Ｅ５－Ｅ６－モチーフ１－モチーフ２－Ｅ７－Ｅ８－Ｅ９－Ｅ１０－Ｅ１１－Ｅ１２－Ｅ１３－Ｅ１４－Ｅ１５－Ｘｂａ１；
－配列番号５０に示されるイントロン７に強情な４つのＲＮＡモチーフを有するＨＡタグ付きヒトＦＵＳを発現している、ｐＣＭＶ－ＨＡ－９。構造は、以下の通りであった：Ｎｏｔ１－ＨＡ－Ｅ１－Ｅ２－Ｅ３－Ｅ４－Ｅ５－Ｅ６－Ｅ７－モチーフ３－モチーフ４－モチーフ５－モチーフ６－Ｅ８－Ｅ９－Ｅ１０－Ｅ１１－Ｅ１２－Ｅ１３－Ｅ１４－Ｅ１５－Ｘｂａ１；
－配列番号５１に示されるイントロン６及び７の保存された６つのＲＮＡモチーフを有するＨＡタグ付きヒトＦＵＳを発現している、ｐＣＭＶ－ＨＡ－１０。構造は、以下の通りであった：Ｎｏｔ１－ＨＡ－Ｅ１－Ｅ２－Ｅ３－Ｅ４－Ｅ５－Ｅ６－モチーフ１－モチーフ２－Ｅ７－モチーフ３－モチーフ４－モチーフ５－モチーフ６－Ｅ８－Ｅ９－Ｅ１０－Ｅ１１－Ｅ１２－Ｅ１３－Ｅ１４－Ｅ１５－Ｘｂａ１；
－配列番号５２に示されるイントロン６及び７の保存された４つのＲＮＡモチーフを有するＨＡタグ付きヒトＦＵＳを発現している、ｐＣＭＶ－ＨＡ－１１。構造は、以下の通りであった：Ｎｏｔ１－ＨＡ－Ｅ１－Ｅ２－Ｅ３－Ｅ４－Ｅ５－Ｅ６－モチーフ３－モチーフ４－Ｅ７－モチーフ５－モチーフ６－Ｅ８－Ｅ９－Ｅ１０－Ｅ１１－Ｅ１２－Ｅ１３－Ｅ１４－Ｅ１５－Ｘｂａ１。
－配列番号４８に示されるイントロン６の保存された２つのＲＮＡモチーフ、及びイントロン７の保存された４つのＲＮＡモチーフを有するＨＡタグ付きヒトＦＵＳを発現している、ｐＣＭＶ－ＨＡ－７に対応する。構造は、以下の通りであった：Ｎｏｔ１－ＨＡ－Ｅ１－Ｅ２－Ｅ３－Ｅ４－Ｅ５－Ｅ６－モチーフ１－モチーフ２－Ｅ７－モチーフ３－モチーフ４－モチーフ５－モチーフ６－Ｅ８－Ｅ９－Ｅ１０－Ｅ１１－Ｅ１２－Ｅ１３－Ｅ１４－Ｅ１５－Ｘｂａ１；
－（配列番号４９に示されるイントロン６に強情な２つのＲＮＡモチーフを有するＨＡタグ付きヒトＦＵＳを発現している）ｐＣＭＶ－ＨＡ－８。構造は、以下の通りであった：Ｎｏｔ１－ＨＡ－Ｅ１－Ｅ２－Ｅ３－Ｅ４－Ｅ５－Ｅ６－モチーフ１－モチーフ２－Ｅ７－Ｅ８－Ｅ９－Ｅ１０－Ｅ１１－Ｅ１２－Ｅ１３－Ｅ１４－Ｅ１５－Ｘｂａ１；
－配列番号５０に示されるイントロン７に強情な４つのＲＮＡモチーフを有するＨＡタグ付きヒトＦＵＳを発現している、ｐＣＭＶ－ＨＡ－９。構造は、以下の通りであった：Ｎｏｔ１－ＨＡ－Ｅ１－Ｅ２－Ｅ３－Ｅ４－Ｅ５－Ｅ６－Ｅ７－モチーフ３－モチーフ４－モチーフ５－モチーフ６－Ｅ８－Ｅ９－Ｅ１０－Ｅ１１－Ｅ１２－Ｅ１３－Ｅ１４－Ｅ１５－Ｘｂａ１；
－配列番号５１に示されるイントロン６及び７の保存された６つのＲＮＡモチーフを有するＨＡタグ付きヒトＦＵＳを発現している、ｐＣＭＶ－ＨＡ－１０。構造は、以下の通りであった：Ｎｏｔ１－ＨＡ－Ｅ１－Ｅ２－Ｅ３－Ｅ４－Ｅ５－Ｅ６－モチーフ１－モチーフ２－Ｅ７－モチーフ３－モチーフ４－モチーフ５－モチーフ６－Ｅ８－Ｅ９－Ｅ１０－Ｅ１１－Ｅ１２－Ｅ１３－Ｅ１４－Ｅ１５－Ｘｂａ１；
－配列番号５２に示されるイントロン６及び７の保存された４つのＲＮＡモチーフを有するＨＡタグ付きヒトＦＵＳを発現している、ｐＣＭＶ－ＨＡ－１１。構造は、以下の通りであった：Ｎｏｔ１－ＨＡ－Ｅ１－Ｅ２－Ｅ３－Ｅ４－Ｅ５－Ｅ６－モチーフ３－モチーフ４－Ｅ７－モチーフ５－モチーフ６－Ｅ８－Ｅ９－Ｅ１０－Ｅ１１－Ｅ１２－Ｅ１３－Ｅ１４－Ｅ１５－Ｘｂａ１。
【0121】
－配列番号５３に示されるイントロン６及び７の保存された６つのＲＮＡモチーフを有するＨＡタグ付きヒトＦＵＳを発現している、ｐＣＭＶ－ＨＡ－１２。構造は、以下の通りであった：Ｎｏｔ１－ＨＡ－Ｅ１－Ｅ２－Ｅ３－Ｅ４－Ｅ５－Ｅ６－モチーフ３－モチーフ４－モチーフ１－Ｅ７－モチーフ５－モチーフ６－モチーフ２－Ｅ８－Ｅ９－Ｅ１０－Ｅ１１－Ｅ１２－Ｅ１３－Ｅ１４－Ｅ１５－Ｘｂａ１。
【0122】
トランスフェクションの２４時間又は４８時間後、タンパク質及びＲＮＡを抽出した。
【0123】
ウエスタンブロット
細胞をＰＢＳで１回洗浄し、製造業者の指示に従ってＳｙｎ－ＰＥＲ Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、８７７９３）に溶解させた。ＢＣＡアッセイ（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ、ＵＰ９５４２４Ａ、ＵＰ９５４２５Ａ）によって、タンパク質抽出物を投与した。その後、タンパク質を変性させ、（細胞質タンパク質では）１０及び（核タンパク質では）３０μｇのタンパク質を用いて、４～２０％のＴＧＸ染色遊離ゲル（Ｂｉｏｒａｄ、５６７８０９４）の基準でＳＤＳ ｐａｇｅを実施した。タンパク質を、半乾式Ｔｒａｎｓｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用してニトロセルロース膜上にブロットし、１時間の間に１０％の無脂肪乳で遮断した。一次抗体（ウサギ抗ＦＵＳ２９３（Ｂｅｔｈｙｌ、Ａ－３００－２９３Ａ、１／２０００）、ウサギ抗ＨＡ（細胞シグナル伝達、３７２４Ｓ、１／１０００）、マウス抗ＭＹＣ（Ｓｉｇｍａ、Ｍ４４３９、１／１０００）を４℃で一晩、３％の無脂肪乳中でインキュベートした。洗浄緩衝液（１ＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４、５ＭのＮａＣｌ、１００％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０）で洗浄を進め、二次抗体（抗ウサギＨＲＰ（ＰＡＲＩＳ、ＢＩ２４０７，１／５０００））、抗マウスＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ、１１５－０３５－００３、１／５０００））を室温で１時間３０分インキュベートした。連続して洗浄した後、ＥＣＬ Ｌｕｍｉｎａ Ｆｏｒｔｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｆｒａｎｃｅ）及び化学発光検出器（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用する化学発光でタンパク質を可視化した。正規化するために、染色遊離ゲル能力（Ｂｉｏｒａｄ、５６７８０９４）で合計タンパク質を検出し、使用した。
細胞をＰＢＳで１回洗浄し、製造業者の指示に従ってＳｙｎ－ＰＥＲ Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、８７７９３）に溶解させた。ＢＣＡアッセイ（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ、ＵＰ９５４２４Ａ、ＵＰ９５４２５Ａ）によって、タンパク質抽出物を投与した。その後、タンパク質を変性させ、（細胞質タンパク質では）１０及び（核タンパク質では）３０μｇのタンパク質を用いて、４～２０％のＴＧＸ染色遊離ゲル（Ｂｉｏｒａｄ、５６７８０９４）の基準でＳＤＳ ｐａｇｅを実施した。タンパク質を、半乾式Ｔｒａｎｓｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用してニトロセルロース膜上にブロットし、１時間の間に１０％の無脂肪乳で遮断した。一次抗体（ウサギ抗ＦＵＳ２９３（Ｂｅｔｈｙｌ、Ａ－３００－２９３Ａ、１／２０００）、ウサギ抗ＨＡ（細胞シグナル伝達、３７２４Ｓ、１／１０００）、マウス抗ＭＹＣ（Ｓｉｇｍａ、Ｍ４４３９、１／１０００）を４℃で一晩、３％の無脂肪乳中でインキュベートした。洗浄緩衝液（１ＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４、５ＭのＮａＣｌ、１００％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０）で洗浄を進め、二次抗体（抗ウサギＨＲＰ（ＰＡＲＩＳ、ＢＩ２４０７，１／５０００））、抗マウスＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ、１１５－０３５－００３、１／５０００））を室温で１時間３０分インキュベートした。連続して洗浄した後、ＥＣＬ Ｌｕｍｉｎａ Ｆｏｒｔｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｆｒａｎｃｅ）及び化学発光検出器（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用する化学発光でタンパク質を可視化した。正規化するために、染色遊離ゲル能力（Ｂｉｏｒａｄ、５６７８０９４）で合計タンパク質を検出し、使用した。
【0124】
抗体：
ウサギ抗ＦＵＳ２９３（Ｂｅｔｈｙｌ、Ａ－３００－２９３Ａ、１／２０００）
ウサギ抗ＨＡ（細胞シグナル伝達、３７２４Ｓ、１／１０００）
マウス抗ＭＹＣ（Ｓｉｇｍａ、Ｍ４４３９、１／１０００）
抗ウサギＨＲＰ（ＰＡＲＩＳ、ＢＩ２４０７，１／５０００）
抗マウスＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ、１１５－０３５－００３、１／５０００）
ウサギ抗ＦＵＳ２９３（Ｂｅｔｈｙｌ、Ａ－３００－２９３Ａ、１／２０００）
ウサギ抗ＨＡ（細胞シグナル伝達、３７２４Ｓ、１／１０００）
マウス抗ＭＹＣ（Ｓｉｇｍａ、Ｍ４４３９、１／１０００）
抗ウサギＨＲＰ（ＰＡＲＩＳ、ＢＩ２４０７，１／５０００）
抗マウスＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ、１１５－０３５－００３、１／５０００）
【0125】
ＲＴ－ｑＰＣＲ
ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、合計ＲＮＡを脊髄及び前頭皮質から抽出した。ｉＳｃｒｉｐｔ（商標）逆転写（Ｂｉｏｒａｄ、１７０８８４１）を用いて、１μｇのＲＮＡを逆転写した。Ｓｓｏ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して定量ポリメラーゼ連鎖反応を実施し、Ｂｉｏ－Ｒａｄソフトウェアで定量化した。ＧｅＮｏｒｍソフトウェアに従って、アクチン、ＴＢＰ、及びｐｏｌ２遺伝子を使用して正規化係数を計算することによって、遺伝子発現を正規化した（非特許文献２０）。
ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、合計ＲＮＡを脊髄及び前頭皮質から抽出した。ｉＳｃｒｉｐｔ（商標）逆転写（Ｂｉｏｒａｄ、１７０８８４１）を用いて、１μｇのＲＮＡを逆転写した。Ｓｓｏ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して定量ポリメラーゼ連鎖反応を実施し、Ｂｉｏ－Ｒａｄソフトウェアで定量化した。ＧｅＮｏｒｍソフトウェアに従って、アクチン、ＴＢＰ、及びｐｏｌ２遺伝子を使用して正規化係数を計算することによって、遺伝子発現を正規化した（非特許文献２０）。
【0126】
プライマー配列は、以下の通りであった：
ヒトアクチンＢ：Ｆ－ＧＧＧＣＡＴＧＧＧＴＣＡＧＡＡＧＧＡＴＴ（配列番号６０）、Ｒ－ＴＣＧＡＴＧＧＧＧＴＡＣＴＴＣＡＧＧＧＴ（配列番号６１）
ヒトＧＡＰＤＨ：Ｆ－ＴＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＡＧＧＣ（配列番号６２）、Ｒ－ＡＧＡＧＧＧＧＧＣＡＧＡＧＡＴＧＡＴＧＡ（配列番号６３）
ヒトＨＰＲＴ１：Ｆ－ＴＴＧＣＴＴＴＣＣＴＴＧＧＴＣＡＧＧＣＡ（配列番号６４）、Ｒ－ＡＴＣＣＡＡＣＡＣＴＴＣＧＴＧＧＧＧＴＣ（配列番号６５）
ＦＵＳｉ６ｅ７：Ｆ－ＣＣＧＴＴＧＧＡＡＧＣＴＴＣＡＴＧＴＣＣ（配列番号６６）、Ｒ－ＴＡＴＴＧＡＡＧＣＣＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣ（配列番号６７）
ＦＵＳｉ７ｅ８：Ｆ－ＣＴＧＴＧＡＧＣＡＣＴＴＡＣＴＴＧＡＴＡＴＴＴＴ（配列番号６８）、Ｒ－ＧＴＧＡＴＣＣＴＴＧＧＴＣＣＣＧＡ（配列番号６９）。
ヒトアクチンＢ：Ｆ－ＧＧＧＣＡＴＧＧＧＴＣＡＧＡＡＧＧＡＴＴ（配列番号６０）、Ｒ－ＴＣＧＡＴＧＧＧＧＴＡＣＴＴＣＡＧＧＧＴ（配列番号６１）
ヒトＧＡＰＤＨ：Ｆ－ＴＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＡＧＧＣ（配列番号６２）、Ｒ－ＡＧＡＧＧＧＧＧＣＡＧＡＧＡＴＧＡＴＧＡ（配列番号６３）
ヒトＨＰＲＴ１：Ｆ－ＴＴＧＣＴＴＴＣＣＴＴＧＧＴＣＡＧＧＣＡ（配列番号６４）、Ｒ－ＡＴＣＣＡＡＣＡＣＴＴＣＧＴＧＧＧＧＴＣ（配列番号６５）
ＦＵＳｉ６ｅ７：Ｆ－ＣＣＧＴＴＧＧＡＡＧＣＴＴＣＡＴＧＴＣＣ（配列番号６６）、Ｒ－ＴＡＴＴＧＡＡＧＣＣＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣ（配列番号６７）
ＦＵＳｉ７ｅ８：Ｆ－ＣＴＧＴＧＡＧＣＡＣＴＴＡＣＴＴＧＡＴＡＴＴＴＴ（配列番号６８）、Ｒ－ＧＴＧＡＴＣＣＴＴＧＧＴＣＣＣＧＡ（配列番号６９）。
【0127】
参照文献のリスト
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５． Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３（１９７０）
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ａｎｄ Ｄｒｉｖｅｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｗｉｔｈｏｕｔ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｌｏｓｓ－ｏｆ－Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ＦＵＳ．Ｎｅｕｒｏｎ ２０１８；１００（４）：８１６－３０ ｅ７
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１３．Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．：「ＡＬＳ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＦＵＳ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｒｅｓｕｌｔ ｉｎ ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ ＦＵＳ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ａｎｄ ａｕｔｏｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１３，Ｖｏｌｕｍｅ ９，Ｉｓｓｕｅ １０，ｅ１００３８９５。
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１３．Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．：「ＡＬＳ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＦＵＳ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｒｅｓｕｌｔ ｉｎ ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ ＦＵＳ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ａｎｄ ａｕｔｏｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１３，Ｖｏｌｕｍｅ ９，Ｉｓｓｕｅ １０，ｅ１００３８９５。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図4A】
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【図6A】
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【図8B】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図11A】
【図11B】
【図12A】
【図12B】
【配列表】
【国際調査報告】