特表 2023-521772 操作されたトランスアミナーゼポリペプチド

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-05-25

(54)【発明の名称】操作されたトランスアミナーゼポリペプチド

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/54 20060101AFI20230518BHJP

   C12N 9/10 20060101ALI20230518BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20230518BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20230518BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20230518BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20230518BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230518BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20230518BHJP

【ＦＩ】

C12N15/54 ZNA

C12N9/10

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/02 C

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022561487

(86)(22)【出願日】2021-04-06

(85)【翻訳文提出日】2022-12-06

(86)【国際出願番号】 US2021025967

(87)【国際公開番号】W WO2021207200

(87)【国際公開日】2021-10-14

(31)【優先権主張番号】63/008,047

(32)【優先日】2020-04-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】502427921

【氏名又は名称】コデクシス， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ノヴィック， スコット ジェイ．

(72)【発明者】

【氏名】デラス， ニッキ

【テーマコード（参考）】

4B050

4B064

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B050CC03

4B050DD02

4B050FF01

4B050FF14C

4B050LL01

4B050LL10

4B064AE01

4B064CA02

4B064CA05

4B064CA06

4B064CA10

4B064CA19

4B064CA21

4B064CE09

4B064CE12

4B064DA01

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA87X

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA44

4B065CA49

4B065CA60

(57)【要約】

本開示は、工業的に妥当な条件下でキラルアミン化合物を合成するために有用な、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを提供する。本開示は、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、操作されたトランスアミナーゼを発現することが可能な宿主細胞、および、キラルアミン化合物を生成するために操作されたトランスアミナーゼを使用する方法も提供する。本開示は、トランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチド、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、当該ポリペプチドを作製する方法、および、アミノ受容体基質化合物（すなわち、ケト基を含有する化合物）のキラルアミン生成物である化合物への生体触媒変換のために当該ポリペプチドを使用する方法を提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号２、４、８、３６６、および／または６５０に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む操作されたトランスアミナーゼまたはその機能性断片であって、前記ポリペプチド配列内の少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸の位置が、配列番号２、４、８、３６６、および／または６５０を基準に番号付けされる、操作されたトランスアミナーゼ。

【請求項2】

前記ポリペプチド配列が、配列番号４に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有し、前記操作されたトランスアミナーゼが、前記ポリペプチド配列内の少なくとも１つの置換または置換セットを、２１／１６３／２８６／２９１／３１４／３１６／３２３／３８３／３８８／４０８／４１４／４１６、１８、２０、２１、２１／２３／５６／１４６、２１／２３／５６／１４６／４３２、２１／２３／１４６／４１７、２１／２３／３９５／４１７／４３２、２１／５３／５６、２１／５３／４１７、２１／５６／３９５、２１／４１７／４３２、２３、２３／５３、２３／５３／５６、２３／５３／５６／１４６／３９５、２３／５３／３９５、２３／５３／４１７、２３／５３／４３２、２３／５６、２３／５６／３９５、２３／５６／３９５／４１７、２３／３９５／４１７、２３／４１７、２３／４１７／４３２、５３、５３／５６、５３／１４６／４１７、５３／３９５、５６、５６／７４／２４１／２８６／３１４／３１６／３２３、５６／８６／１６３／３１４／３１６／３８３／４１４／４１６／４２２、５６／８６／２８６／３１４／４１４／４１６、５６／８６／３１４／３１６／３２３／３９４／４１４／４２２、５６／１４６／４１７、５６／１４６／４３２、５６／１４７、５６／１６３、５６／１６３／２８６／３１６／３２３／３８３／３９４、５６／２８６／３１４／３１６／３２３／４２２、５６／２８６／３８３、５６／３２３、５６／３２３／３８３、５６／３２３／３８３／３９４、５６／３８３、５６／３９５、７４／８１／２８６／３１６／３２３／３８３、７４／８５／８６／１６３／２８６／３１６／３２３／３９４、７４／８５／３１４／３１６／４１４／４１６、７４／８６／１６３／３１６、７４／８６／３１６／３２３／３８３／３９４、７４／８８／２８６／３１６／３２３／３８３、７４／８８／３２３／３８３、７４／１６３／２８６／３１６／３８３／３９４／４１６、７４／１６３／３１４／３１６、７４／１６３／３１４／３１６／３２３／３９４、７４／１６３／３１４／３２３／３８３／４１４／４１６、７４／２８６、７４／２８６／３１６／３２３、７４／２８６／３９４／４１６、７４／３１４／３２３／３８３／３９４／４１４、７４／３１６／３２３／３９４、８５／８６／８８／１６３／３２３／３８３／３９４、８５／８６／１６３／３１４／３２３／３９４／４１４、８５／２８６、８５／２８６／３２３、８６、８６／８８／１６３／３２３／３８３／４１４／４２２、８６／３８３／３９４、８８、８８／１６３／２８６／３８３、８８／２８６／３１６／３２３、８８／２８６／３１６／３２３／３８３／４１４／４１６、８８／３１６／３２３、１４６、１４６／１４７／３９５／４１７、１４６／３９５、１４６／３９５／４１７、１４６／４１７、１４７／３９５／４１７／４３２、１４７／４１７、１４９、１５７、１６３、１６３／２２２／２８６／３１６／３２３／３８３／３９４、１６３／２８６、１６３／２８６／３１４／３１６／３２３／４１４／４１６、１６３／２８６／３１４／３２３／３９４、１６３／２８６／３１６／３２３／３９４／４１６、１６３／２８６／４１４、１６３／３１４／３１６／３９４、１６３／３１４／３２３／３９４、１６３／３１４／３８３、１６３／３１４／４１４、１６３／３１６／３２３、１６３／３２３、１６３／３８３、１６４、１９９／４１７、２５９、２６０、２８４、２８６、２８６／３１４／３２３／３８３、２８６／３１４／３９４、２８６／３１６／３２３／３８３／４１４／４１６、２８６／３１６／３８３／３９４、２８６／３１６／３９４／４１４／４１６、２８６／３２３、２８６／３２３／３８３／４１４、２８６／３２３／４１６、２８６／３８３、２８６／４１６、３１４／３１６、３１４／３１６／３２３、３１４／３１６／３２３／３８３／４２２、３１４／３１６／３２３／３９４、３１４／３１６／３９４、３１４／３２３／３８３／３９４、３１４／３８３、３１４／３８３／４１４／４２２、３１５、３１６、３１６／３２３／３８３／３９４、３１６／３２３／３９４／４１４／４１６、３１６／４１４／４２２、３２３、３２３／３８３、３２３／３８３／３９４／４１４／４１６、３２３／３９４、３８３、３９５、３９５／４１７、３９５／４１７／４３２、４００、４０１、４０３、４０４、４０５、４０６、４０８、４１５、４１７、４１７／４３２、４２０、および４２２から選択される１つまたは複数の位置に含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸の位置が、配列番号４を基準に番号付けされる、請求項１に記載の操作されたトランスアミナーゼ。

【請求項3】

前記ポリペプチド配列が、配列番号４に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有し、前記操作されたトランスアミナーゼが、前記ポリペプチド配列内の少なくとも１つの置換または置換セットを、７４／８１／２８６／３１６／３２３／３８３、１６３／２８６／３１４／３１６／３２３／４１４／４１６、１６３／２８６／３１４／３２３／３９４、２８６／３１４／３２３／３８３、２８６／３１６／３２３／３８３／４１４／４１６、３１５、および４０８から選択される１つまたは複数の位置に含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸の位置が、配列番号４を基準に番号付けされる、請求項１に記載の操作されたトランスアミナーゼ。

【請求項4】

前記ポリペプチド配列が、配列番号８に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有し、前記操作されたトランスアミナーゼが、前記ポリペプチド配列内の少なくとも１つの置換または置換セットを、５、１８／２３／１４９／２６０／３８３／３９５／４０１／４１６、１８／２３／１４９／３８３、１８／１６３／１６４、２１、２１／１６３／３１５／３１６、２１／１６３／３２３／４０８、２１／４０８、２３／５６／８６／１４９／１６３／１６４／３８３／４０１／４１６、２３／８６、２３／１４９／２６０、２３／１４９／２８４／３８３／３９５、２３／１６３／１６４／３８３、２３／１６３／１６４／４０１／４１６、２４、４２、４２／１１０、４２／１８７／２７２、４２／１８７／３２４／３６３／３６６、４２／１８７／３５３、４２／２７２／２９１、４２／２７２／２９１／３６３、４２／２７２／３２４／３６３／３６６、４２／２７２／３６３／４１０、４２／２７２／４１０、４２／２９１／３１３／３６３／４１０、４２／２９１／３６３、４２／２９１／３６３／３６６、４２／３５３、４２／３６３、４６、６６、７７、８６／１４９／１６３／１６４／３８３／３９５／４０１、８６／１４９／３９５、８６／１６３／１６４／２６０／３８３、８６／３８３、１０７、１１０、１１０／１８７、１１０／１８７／２５３／４１０、１３４、１３８、１４９／１６４／２６０／３８３／３９５／４０１、１４９／２６０／３８３、１４９／４１６、１６３／２５９／３２３／４０８、１６３／２５９／４０８、１６３／３１５／３１６、１６４／２６０／４０１、１６４／３１６／３８３／４０１、１６７、１８６、１８７、１８７／２５３／３６３／３６６、１８７／２７２／３２４／３６３／４１０、１８７／２７２／３６３、１８７／２７２／３６３／３６６／４１０、１８７／２９１、１８９、１９１、１９５、１９９、２０３、２１０、２１１、２４８、２５９／３０７、２６０／３９５／４０１、２７２、２７２／３５３、２７２／３６３／３６６、２７２／４１０、２７７、２９１、３０５、３０９、３１５、３４２、３４３、３５１、３５４、３５８、３６１、３６２、３６３、３６３／３６６、３６５、３６７、３８３、３８３／４０１、３８３／４１６／４２２、３８５、３８８、３８９、３９２、３９５、３９６、４０１、４０４、４０５、４０８、４１０、４１６、４１７、４３９、４４３、４４７、４５０、および４５１から選択される１つまたは複数の位置に含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸の位置が、配列番号８を基準に番号付けされる、請求項１に記載の操作されたトランスアミナーゼ。

【請求項5】

前記ポリペプチド配列が、配列番号８に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有し、前記操作されたトランスアミナーゼが、前記ポリペプチド配列内の少なくとも１つの置換または置換セットを、１８／２３／１４９／３８３、２１／１６３／３２３／４０８、２７２、２９１、および３８３から選択される１つまたは複数の位置に含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸の位置が、配列番号８を基準に番号付けされる、請求項１に記載の操作されたトランスアミナーゼ。

【請求項6】

前記ポリペプチド配列が、配列番号３６６に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有し、前記操作されたトランスアミナーゼが、前記ポリペプチド配列内の少なくとも１つの置換または置換セットを、２４、２４／４２／６６／２９１、２４／４２／２９１／３６２、２４／６６／１６３／１９１／３６２／３８３／３８８、２４／６６／１９１／１９９／２６０／２９１／３５１、２４／６６／１９１／１９９／２９１、２４／６６／１９１／２６０／４０８、２４／６６／２６０／２９１／３８３／３８８／４０８、２４／６６／２９１／３４２／３８３、２４／６６／２９１／３６５、２４／６６／３４２／３６５／３８８／４０８、２４／７７／２９１、２４／１０７／１６３／１９１／２９１／３５１／３８３／３８８、２４／１０７／２９１／３５１／３６５／３８８、２４／１６３／３５１／３８３、２４／１９１／２９１／３６５、２４／１９９／２６０／３５１／３６２／３８３、２４／１９９／２６０／３６２／３８３／３８８、２４／２６０／３６２／３８３／３８８、２４／２９１、２４／２９１／３４２／３５１／３８３、２４／２９１／３６２／３８８、２４／２９１／４０８、２４／３８３／３８８、２４／３８８、２５、２８、３３、４２／１９１／４０８、４２／１９９／２９１／３８３、４２／２９１／３５１／３６２／３６５／３８３／３８８、４２／２９１／３５１／３６２／３８３／４０８、４２／２９１／３８３／３８８、６６／８２／２９１／３８３、６６／１６３／１９１／３６５／３８３、６６／１９９／３５１／３８３、６６／２９１、６６／２９１／３６２／３６５／３８３、６６／２９１／３８３／３８８、６６／３８３、７７／２９１、７７／３８３／３８８、８６、１０７／１９１／１９９／３６５／３８３／３８８、１０７／１９１／２９１／３８３、１４８、１５３、１６３／２９１／３６２／３６５／３８３／３８８、１６３／２９１／３８３／３８８、１６３／３８３、１９１／１９９／３６５／３８３／３８８、１９１／２６０／３８８、１９１／２９１、１９１／２９１／３４２／３６２／３６５、１９１／３５１／３８３／３８８、１９９／２６０／３８３、１９９／２９１、２６０、２６０／２９１／３６５／３８３／４０８、２６０／３６５／３８３、２９１、２９１／３５１／３８３／３８８、２９１／３５１／３８３／３８８／４０８、２９１／３６２／３６５、２９１／３６５／３８８、２９１／３８３、３１４、３１５、３１６、３１９、３４２／３６２、３５１／３８３／３８８、３６２、３６２／３８８、３８３、３８３／３８８、３９６、３９７、４０５、４０６、４１３、４１９、および４２３から選択される１つまたは複数の位置に含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸の位置が、配列番号３６６を基準に番号付けされる、請求項１に記載の操作されたトランスアミナーゼ。

【請求項7】

前記ポリペプチド配列が、配列番号３６６に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも大きな配列同一性を有し、前記操作されたトランスアミナーゼが、前記ポリペプチド配列内の少なくとも１つの置換または置換セットを、２４／６６／１９１／１９９／２９１、２４／６６／２９１／３６５、１６３／２９１／３６２／３６５／３８３／３８８、１６３／２９１／３８３／３８８、１９１／２９１／３４２／３６２／３６５、２９１、および２９１／３８３から選択される１つまたは複数の位置に含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸の位置が、配列番号３６６を基準に番号付けされる、請求項１に記載の操作されたトランスアミナーゼ。

【請求項8】

前記ポリペプチド配列が、配列番号６５０に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有し、前記操作されたトランスアミナーゼが、前記ポリペプチド配列内の少なくとも１つの置換または置換セットを、１０、１３、１３／２４／１０８／１６３、１３／２４／１０８／１６３／３１１、１３／２４／１３３／１９９／３１１、１３／２４／１６３、１３／２４／１９９／３１１、１３／１０８、１３／１０８／１９９、１３／１０８／３１１、１３／１９９、１３／３１１、１４、１４／２４／１０８、１４／２４／１０８／１３３、１４／２４／１０８／１９９、１４／２４／１９９、１４／１０８、１４／１０８／１３３／３１１、１４／１０８／３１１、１４／３１１、２４、２４／１６３、２４／１６３／１９９、３５、７２、７３、７８、９５、１０１、１０８、１０８／１９９、１１４、１５４、１６３、１６９、１７５／３１６、１９９、１９９／３１１、２２６、２９３、３１１、３１６、３８２、３８３、および３８６から選択される１つまたは複数の位置に含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸の位置が、配列番号６５０を基準に番号付けされる、請求項１に記載の操作されたトランスアミナーゼ。

【請求項9】

前記ポリペプチド配列が、配列番号６５０に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有し、前記操作されたトランスアミナーゼが、前記ポリペプチド配列内の少なくとも１つの置換または置換セットを、１４／１０８／１３３／３１１、２４／１６３／１９９、７２、７８、３１６、および３８３から選択される１つまたは複数の位置に含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸の位置が、配列番号６５０を基準に番号付けされる、請求項１に記載の操作されたトランスアミナーゼ。

【請求項10】

前記操作されたトランスアミナーゼが、表２－１、２－２、３－１、３－２、４－１、４－２、５－１、および／または５－２に記載されている少なくとも１つの操作されたトランスアミナーゼバリアントの配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の操作されたトランスアミナーゼ。

【請求項11】

表２－１、２－２、３－１、３－２、４－１、４－２、５－１、および／または５－２に提示されている操作されたトランスアミナーゼバリアントである、請求項１に記載の操作されたトランスアミナーゼ。

【請求項12】

配列番号２、４、８、３６６、および／または６５０に記載されている操作されたトランスアミナーゼバリアントである、請求項１に記載の操作されたトランスアミナーゼ。

【請求項13】

配列番号６～９３６の偶数の配列に記載されている少なくとも１つの操作されたトランスアミナーゼバリアントの配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の操作されたトランスアミナーゼ。

【請求項14】

配列番号６～９３６の偶数の配列に記載されているポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の操作されたトランスアミナーゼ。

【請求項15】

野生型Ｖ．ｆｌｕｖｉａｌｉｓトランスアミナーゼと比較して少なくとも１つの特性の改善を含む、請求項１から１４までのいずれかに記載の操作されたトランスアミナーゼ。

【請求項16】

前記特性の改善が、基質に対する活性の改善を含む、請求項１５に記載の操作されたトランスアミナーゼ。

【請求項17】

前記基質が、化合物（１）を含む、請求項１６に記載の操作されたトランスアミナーゼ。

【請求項18】

前記特性の改善が、熱安定性の改善を含む、請求項１５のいずれかに記載の操作されたトランスアミナーゼ。

【請求項19】

精製されたものである、請求項１から１８までのいずれかに記載の操作されたトランスアミナーゼ。

【請求項20】

請求項１から１９までのいずれかに記載の操作されたトランスアミナーゼを含む組成物。

【請求項21】

請求項１から１９までのいずれかに記載の少なくとも１つの操作されたトランスアミナーゼをコードするポリヌクレオチド配列。

【請求項22】

請求項１から１９までのいずれかに記載の少なくとも１つの操作されたトランスアミナーゼをコードするポリヌクレオチド配列であって、配列番号１、３、７、３６５、および／または６４９に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも大きな配列同一性を含み、１つまたは複数の位置における少なくとも１つの置換を含む、ポリヌクレオチド配列。

【請求項23】

配列番号２、４、８、３６６、および／または６５０に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも大きな配列同一性を含む少なくとも１つの操作されたトランスアミナーゼまたはその機能性断片をコードするポリヌクレオチド配列。

【請求項24】

制御配列に作動可能に連結している、請求項２１から２３までのいずれかに記載のポリヌクレオチド配列。

【請求項25】

コドン最適化されたものである、請求項２１から２４までのいずれかに記載のポリヌクレオチド配列。

【請求項26】

請求項２１から２５までのいずれかに記載の少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター。

【請求項27】

請求項２６に記載の少なくとも１つの発現ベクターを含む宿主細胞。

【請求項28】

請求項２１から２５までのいずれかに記載の少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞。

【請求項29】

操作されたトランスアミナーゼを宿主細胞において産生させる方法であって、請求項２７および／または２８に記載の宿主細胞を、少なくとも１つの操作されたトランスアミナーゼが産生されるように適切な条件下で培養するステップを含む、方法。

【請求項30】

少なくとも１つの操作されたトランスアミナーゼを培養物および／または宿主細胞から回収するステップをさらに含む、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

前記少なくとも１つの操作されたトランスアミナーゼを精製するステップをさらに含む、請求項２９および／または３０に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、あらゆる目的に関してその全体が参照によって援用される、２０２０年４月１０日出願の米国仮特許出願第６３／００８，０４７号に基づく優先権を主張している。
配列表、表またはコンピュータプログラムへの言及

【0002】

配列表の公式コピーがＡＳＣＩＩフォーマットのテキストファイルとしてＥＦＳ－Ｗｅｂを介して本明細書と同時に提出される。ファイル名は「ＣＸ２－１９７ＷＯ１＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」、作成日は２０２１年４月５日、およびサイズは２．５３メガバイトである。ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して出願される配列表は本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に援用される。

【0003】

発明の分野
本開示は、工業プロセス条件下で医薬品およびファインケミカルアミン化合物を生成するために有用な操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを提供する。

【背景技術】

【0004】

背景
トランスアミナーゼ（Ｅ．Ｃ．２．６．１）は、アミノ供与体化合物からアミノ受容体化合物のケト基へのアミノ基、電子対、およびプロトンの転位を触媒する。トランスアミナーゼ反応により、キラルアミン生成物である化合物の形成がもたらされ得る。スキーム１に示されている通り、アミノ受容体化合物（Ｂ）（所望のキラルアミン生成物（Ｄ）のケト基質前駆体）とアミノ供与体化合物（Ａ）をトランスアミナーゼの存在下で反応させる。トランスアミナーゼは、アミノ供与体化合物（Ａ）の第一級アミン基の、アミノ受容体化合物（Ｂ）のケト基への転移を触媒する。トランスアミナーゼ反応により、キラルアミン生成物である化合物（Ｄ）（Ｒ^３はＲ^４と同じではないと仮定する）、および、ケト基を有する新しいアミノ受容体副生成物（または「カルボニル副生成物」）化合物（Ｃ）がもたらされる。

【化1】

【0005】

キラルアミン化合物は、医薬品産業、農芸化学産業および化学産業において、セファロスポリンまたはピロリジン誘導体などの、広範囲にわたる商業的に所望の化合物を調製するための中間体またはシントンとして頻繁に使用される。一般には、キラルアミン化合物のこれらの工業的適用では、分子の１つの特定のステレオマーの形態のみを使用することが必要になる（例えば、（Ｒ）または（Ｓ）鏡像異性体のみが生理的に活性である）。トランスアミナーゼは、高度に立体選択的であり、光学的に純粋なキラルアミン化合物の合成に関して多くの潜在的な産業上の用途がある。

【0006】

キラルアミン化合物を作製するためのトランスアミナーゼの使用の例としては、アミノ酸の鏡像異性富化（例えば、Ｓｈｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６５： １７８２－１７８８ ［２００１］；Ｉｗａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｌｅｔｔ．， ２５： １８４３－１８４６ ［２００３］；Ｉｗａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈ．， ６９： ４９９－５０５ ［２００４］；Ｙｕｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ７０： ２５２９－２５３４ ［２００４］；およびＨｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｅｎｚ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｔｅｃｈｎｏｌ．， ３４： ４２９－４２６ ［２００４］を参照されたい）；プレガバリンの中間体および前駆体の調製（例えば、ＷＯ２００８／１２７６４６）；シクロパミン類似体の酵素的アミノ基転移（例えば、ＷＯ２０１１／０１７５５１）；β－アミノ酸の立体特異的合成および鏡像異性富化（例えば、ＷＯ２００５／００５６３３）；アミンの鏡像異性富化（例えば、米国特許第ＵＳ４，９５０，６０６号；米国特許第５，３００，４３７号；および米国特許第５，１６９，７８０号を参照されたい）；アミノ酸および誘導体の生成（例えば、米国特許第５，３１６，９４３号；米国特許第４，５１８，６９２号；米国特許第４，８２６，７６６号；米国特許第６，１９７，５５８号；および米国特許第４，６００，６９２号を参照されたい）；ならびに医薬化合物、シタグリプチン、リバスチグミン、およびベルナカラントの生成（例えば、米国特許第８，２９３，５０７号；Ｓａｖｉｌｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉ．， ３２９： ３０５－９ ［２０１０］；ＷＯ２０１１／１５９９１０；およびＷＯ２０１２／０２４１０４を参照されたい）が挙げられる。

【0007】

スキーム１の反応を触媒する能力を有する野生型トランスアミナーゼは、これだけに限定されないが、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｍａｌｌｅ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ、Ｏｃｅａｎｉｃｏｌａ ｇｒａｎｕｌｏｓｕｓ ＨＴＣＣ２５１６、Ｏｃｅａｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ． ＲＥＤ６５、Ｏｃｅａｎｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｐ． ＭＥＤ９２、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．（ＮＧＲ２３４株）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｅｎｓｉｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ（例えば、Ｓｈｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６５： １７８２－１７８８ ［２００１］を参照されたい）、およびＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＫＮＫ１６８（例えば、Ｉｗａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ６９： ４９９－５０５ ［２００６］；および米国特許第７，１６９，５９２号を参照されたい）を含めた種々の微生物から単離されている。これらの野生型トランスアミナーゼ遺伝子およびコードされるポリペプチドのうちのいくつかが配列決定されている（例えば、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ［Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＹＰ＿００２２５７８１３．１、ＧＩ：２０７７３９４２０］、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ １７１０ｂ［Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＢＡ４７７３８．１、ＧＩ：７６５７８２６３］、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｔｒｉｉ［Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＭ９０２７１６．１、ＧＩ：１６３２５８０３２］、Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ ＪＳ１７［Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＥＡ３９１８３．１、ＧＩ：３２７２０７０６６］、およびＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ． ＫＮＫ１６８［ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＡＫ３９７５３．１、ＧＩ：３３６０８８３４１］）。ＥＣ２．６．１．１８クラスおよびＥＣ２．６．１－１９クラスの少なくとも２種の野生型トランスアミナーゼが結晶化され、構造的に特徴付けられている（例えば、Ｙｏｎａｈａ ｅｔ ａｌ．， Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ４７： ２２５７－２２６５ ［１９８３］を参照されたい）。

【0008】

トランスアミナーゼは、（Ｒ）選択的または（Ｓ）選択的立体選択性を有することが分かっている。例えば、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＫＮＫ１６８由来の野生型トランスアミナーゼは、（Ｒ）選択的であり、ある特定の基質から主に（Ｒ）－アミン化合物を生成させると考えられ（例えば、Ｉｗａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ６９： ４９９－５０５ ［２００６］；および米国特許第７，１６９，５９２号を参照されたい）、一方、Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ ＪＳ１７由来の野生型トランスアミナーゼは、（Ｓ）選択的であり、ある特定の基質から主に（Ｓ）－アミン化合物を生成させると考えられる（例えば、Ｓｈｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ６１： ４６３－４７１ ［２００３］を参照されたい）。
［０００９］
（Ｒ）選択性を有する天然に存在しないトランスアミナーゼにより、溶媒および熱安定性（ｔｈｅｒｍａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）の増大、ならびに広範囲のアミノ受容体基質の変換に関する他の改善された特性が、野生型および他の操作されたトランスアミナーゼ骨格配列の突然変異誘発および／または定向進化によって引き起こされている（例えば、米国特許第８，２９３，５０７ Ｂ２号；ＷＯ２０１１／００５４７７Ａ１；ＷＯ２０１２／０２４１０４；およびＳａｖｉｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉ．， ３２９： ３０５－９ ［２０１０］を参照されたい）。
［００１０］
しかし、トランスアミナーゼは、一般に、例えば、工業的に有用なプロセス条件（例えば、溶媒、温度）に対する不安定性、商業的に有用なアミノ受容体および／またはアミノ供与体基質の認識およびそれに対する立体選択性が乏しいこと、ならびに、好ましくない反応平衡に起因して生成収率が低いことなど、キラルアミン化合物の調製における商業的適用には望ましくない特性を有する。したがって、キラルアミン化合物を光学的に活性な形態で調製するための工業プロセスに使用することができる、操作されたトランスアミナーゼが必要とされている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【特許文献1】国際公開第２００８／１２７６４６号

【特許文献2】国際公開第２０１１／０１７５５１号

【特許文献3】国際公開第２００５／００５６３３号

【非特許文献】

【0010】

【非特許文献1】Ｓｈｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６５： １７８２－１７８８ ［２００１］

【非特許文献2】Ｉｗａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｌｅｔｔ．， ２５： １８４３－１８４６ ［２００３］

【非特許文献3】Ｉｗａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈ．， ６９： ４９９－５０５ ［２００４］

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0011】

発明の要旨
本開示は、トランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチド、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、当該ポリペプチドを作製する方法、および、アミノ受容体基質化合物（すなわち、ケト基を含有する化合物）のキラルアミン生成物である化合物への生体触媒変換のために当該ポリペプチドを使用する方法を提供する。本開示のトランスアミナーゼポリペプチドは、事前に操作されたトランスアミナーゼポリペプチド（配列番号４のアミノ酸配列のもの）と比較した１つまたは複数の残基の差異、ならびに、関連する、配列番号４のトランスアミナーゼおよび配列番号２の野生型トランスアミナーゼと比べた溶媒および熱安定性（ｔｈｅｒｍａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）の増強を有するように操作されている。アミノ酸残基の差異は、とりわけ、活性、立体選択性、安定性、発現、および生成物耐性を含めた種々の酵素特性の改善がもたらされる残基の位置に位置する。

【0012】

特に、本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、スキーム２に示されている、基質である（Ｒ）－２^１－（ジフルオロメチル）－５－メチル－２^１Ｈ－３－アザ－１（４，２）－ピリジナ－２（２，３）－ピロールアシクロノナファン－４，９－ジオン（本明細書では「化合物（１）」と称される）の、その対応するキラルアミン生成物である化合物、（５Ｒ，９Ｓ）－９－アミノ－２^１－（ジフルオロメチル）－５－メチル－２^１Ｈ－３－アザ－１（４，２）－ピリジナ－２（２，３）－ピロールアシクロノナファン－４－オン（本明細書では「化合物（２）」と称される）への効率的な変換のために操作されている。

【化2】

【0013】

一部の実施形態では、本開示は、配列番号４、８、３６６、および／または６５０に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも大きな配列同一性を有するポリペプチド配列を含む操作されたトランスアミナーゼまたはその機能性断片であって、前記ポリペプチド配列内の少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸の位置が、配列番号２、４、８、３６６、および／または６５０を基準に番号付けされる、操作されたトランスアミナーゼを提供する。一部の実施形態では、操作されたトランスアミナーゼは、配列番号４に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも大きな配列同一性を含むポリペプチド配列を含み、ここで、前記操作されたトランスアミナーゼは、前記ポリペプチド配列内の少なくとも１つの置換または置換セットを、１８、２０、２１、２１／２３／５６／１４６、２１／２３／５６／１４６／４３２、２１／２３／１４６／４１７、２１／２３／３９５／４１７／４３２、２１／５３／５６、２１／５３／４１７、２１／５６／３９５、２１／４１７／４３２、２３、２３／５３、２３／５３／５６、２３／５３／５６／１４６／３９５、２３／５３／３９５、２３／５３／４１７、２３／５３／４３２、２３／５６、２３／５６／３９５、２３／５６／３９５／４１７、２３／３９５／４１７、２３／４１７、２３／４１７／４３２、５３、５３／５６、５３／１４６／４１７、５３／３９５、５６、５６／７４／２４１／２８６／３１４／３１６／３２３、５６／８６／１６３／３１４／３１６／３８３／４１４／４１６／４２２、５６／８６／２８６／３１４／４１４／４１６、５６／８６／３１４／３１６／３２３／３９４／４１４／４２２、５６／１４６／４１７、５６／１４６／４３２、５６／１４７、５６／１６３、５６／１６３／２８６／３１６／３２３／３８３／３９４、５６／２８６／３１４／３１６／３２３／４２２、５６／２８６／３８３、５６／３２３、５６／３２３／３８３、５６／３２３／３８３／３９４、５６／３８３、５６／３９５、７４／８１／２８６／３１６／３２３／３８３、７４／８５／８６／１６３／２８６／３１６／３２３／３９４、７４／８５／３１４／３１６／４１４／４１６、７４／８６／１６３／３１６、７４／８６／３１６／３２３／３８３／３９４、７４／８８／２８６／３１６／３２３／３８３、７４／８８／３２３／３８３、７４／１６３／２８６／３１６／３８３／３９４／４１６、７４／１６３／３１４／３１６、７４／１６３／３１４／３１６／３２３／３９４、７４／１６３／３１４／３２３／３８３／４１４／４１６、７４／２８６、７４／２８６／３１６／３２３、７４／２８６／３９４／４１６、７４／３１４／３２３／３８３／３９４／４１４、７４／３１６／３２３／３９４、８５／８６／８８／１６３／３２３／３８３／３９４、８５／８６／１６３／３１４／３２３／３９４／４１４、８５／２８６、８５／２８６／３２３、８６、８６／８８／１６３／３２３／３８３／４１４／４２２、８６／３８３／３９４、８８、８８／１６３／２８６／３８３、８８／２８６／３１６／３２３、８８／２８６／３１６／３２３／３８３／４１４／４１６、８８／３１６／３２３、１４６、１４６／１４７／３９５／４１７、１４６／３９５、１４６／３９５／４１７、１４６／４１７、１４７／３９５／４１７／４３２、１４７／４１７、１４９、１５７、１６３、１６３／２２２／２８６／３１６／３２３／３８３／３９４、１６３／２８６、１６３／２８６／３１４／３１６／３２３／４１４／４１６、１６３／２８６／３１４／３２３／３９４、１６３／２８６／３１６／３２３／３９４／４１６、１６３／２８６／４１４、１６３／３１４／３１６／３９４、１６３／３１４／３２３／３９４、１６３／３１４／３８３、１６３／３１４／４１４、１６３／３１６／３２３、１６３／３２３、１６３／３８３、１６４、１９９／４１７、２５９、２６０、２８４、２８６、２８６／３１４／３２３／３８３、２８６／３１４／３９４、２８６／３１６／３２３／３８３／４１４／４１６、２８６／３１６／３８３／３９４、２８６／３１６／３９４／４１４／４１６、２８６／３２３、２８６／３２３／３８３／４１４、２８６／３２３／４１６、２８６／３８３、２８６／４１６、３１４／３１６、３１４／３１６／３２３、３１４／３１６／３２３／３８３／４２２、３１４／３１６／３２３／３９４、３１４／３１６／３９４、３１４／３２３／３８３／３９４、３１４／３８３、３１４／３８３／４１４／４２２、３１５、３１６、３１６／３２３／３８３／３９４、３１６／３２３／３９４／４１４／４１６、３１６／４１４／４２２、３２３、３２３／３８３、３２３／３８３／３９４／４１４／４１６、３２３／３９４、３８３、３９５、３９５／４１７、３９５／４１７／４３２、４００、４０１、４０３、４０４、４０５、４０６、４０８、４１５、４１７、４１７／４３２、４２０、および４２２から選択される１つまたは複数の位置に含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸の位置は、配列番号４を基準に番号付けされる。一部の追加的な実施形態では、操作されたトランスアミナーゼは、配列番号４に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも大きな配列同一性を含むポリペプチド配列を含み、ここで、前記操作されたトランスアミナーゼは、前記ポリペプチド配列内の少なくとも１つの置換または置換セットを、７４／８１／２８６／３１６／３２３／３８３、１６３／２８６／３１４／３１６／３２３／４１４／４１６、１６３／２８６／３１４／３２３／３９４、２８６／３１４／３２３／３８３、２８６／３１６／３２３／３８３／４１４／４１６、３１５、および４０８から選択される１つまたは複数の位置に含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸の位置は、配列番号４を基準に番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、操作されたトランスアミナーゼは、配列番号８に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも大きな配列同一性を含むポリペプチド配列を含み、ここで、前記操作されたトランスアミナーゼは、前記ポリペプチド配列内の少なくとも１つの置換または置換セットを、５、１８／２３／１４９／２６０／３８３／３９５／４０１／４１６、１８／２３／１４９／３８３、１８／１６３／１６４、２１、２１／１６３／３１５／３１６、２１／１６３／３２３／４０８、２１／４０８、２３／５６／８６／１４９／１６３／１６４／３８３／４０１／４１６、２３／８６、２３／１４９／２６０、２３／１４９／２８４／３８３／３９５、２３／１６３／１６４／３８３、２３／１６３／１６４／４０１／４１６、２４、４２、４２／１１０、４２／１８７／２７２、４２／１８７／３２４／３６３／３６６、４２／１８７／３５３、４２／２７２／２９１、４２／２７２／２９１／３６３、４２／２７２／３２４／３６３／３６６、４２／２７２／３６３／４１０、４２／２７２／４１０、４２／２９１／３１３／３６３／４１０、４２／２９１／３６３、４２／２９１／３６３／３６６、４２／３５３、４２／３６３、４６、６６、７７、８６／１４９／１６３／１６４／３８３／３９５／４０１、８６／１４９／３９５、８６／１６３／１６４／２６０／３８３、８６／３８３、１０７、１１０、１１０／１８７、１１０／１８７／２５３／４１０、１３４、１３８、１４９／１６４／２６０／３８３／３９５／４０１、１４９／２６０／３８３、１４９／４１６、１６３／２５９／３２３／４０８、１６３／２５９／４０８、１６３／３１５／３１６、１６４／２６０／４０１、１６４／３１６／３８３／４０１、１６７、１８６、１８７、１８７／２５３／３６３／３６６、１８７／２７２／３２４／３６３／４１０、１８７／２７２／３６３、１８７／２７２／３６３／３６６／４１０、１８７／２９１、１８９、１９１、１９５、１９９、２０３、２１０、２１１、２４８、２５９／３０７、２６０／３９５／４０１、２７２、２７２／３５３、２７２／３６３／３６６、２７２／４１０、２７７、２９１、３０５、３０９、３１５、３４２、３４３、３５１、３５４、３５８、３６１、３６２、３６３、３６３／３６６、３６５、３６７、３８３、３８３／４０１、３８３／４１６／４２２、３８５、３８８、３８９、３９２、３９５、３９６、４０１、４０４、４０５、４０８、４１０、４１６、４１７、４３９、４４３、４４７、４５０、および４５１から選択される１つまたは複数の位置に含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸の位置は、配列番号８を基準に番号付けされる。さらに追加的な一部の実施形態では、操作されたトランスアミナーゼは、配列番号８に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも大きな配列同一性を含むポリペプチド配列を含み、ここで、前記操作されたトランスアミナーゼは、前記ポリペプチド配列内の少なくとも１つの置換または置換セットを、１８／２３／１４９／３８３、２１／１６３／３２３／４０８、２７２、２９１、および３８３から選択される１つまたは複数の位置に含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸の位置は、配列番号８を基準に番号付けされる。一部の追加的な実施形態では、操作されたトランスアミナーゼは、配列番号３６６に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも大きな配列同一性を含むポリペプチド配列を含み、ここで、前記操作されたトランスアミナーゼは、前記ポリペプチド配列内の少なくとも１つの置換または置換セットを、２４、２４／４２／６６／２９１、２４／４２／２９１／３６２、２４／６６／１６３／１９１／３６２／３８３／３８８、２４／６６／１９１／１９９／２６０／２９１／３５１、２４／６６／１９１／１９９／２９１、２４／６６／１９１／２６０／４０８、２４／６６／２６０／２９１／３８３／３８８／４０８、２４／６６／２９１／３４２／３８３、２４／６６／２９１／３６５、２４／６６／３４２／３６５／３８８／４０８、２４／７７／２９１、２４／１０７／１６３／１９１／２９１／３５１／３８３／３８８、２４／１０７／２９１／３５１／３６５／３８８、２４／１６３／３５１／３８３、２４／１９１／２９１／３６５、２４／１９９／２６０／３５１／３６２／３８３、２４／１９９／２６０／３６２／３８３／３８８、２４／２６０／３６２／３８３／３８８、２４／２９１、２４／２９１／３４２／３５１／３８３、２４／２９１／３６２／３８８、２４／２９１／４０８、２４／３８３／３８８、２４／３８８、２５、２８、３３、４２／１９１／４０８、４２／１９９／２９１／３８３、４２／２９１／３５１／３６２／３６５／３８３／３８８、４２／２９１／３５１／３６２／３８３／４０８、４２／２９１／３８３／３８８、６６／８２／２９１／３８３、６６／１６３／１９１／３６５／３８３、６６／１９９／３５１／３８３、６６／２９１、６６／２９１／３６２／３６５／３８３、６６／２９１／３８３／３８８、６６／３８３、７７／２９１、７７／３８３／３８８、８６、１０７／１９１／１９９／３６５／３８３／３８８、１０７／１９１／２９１／３８３、１４８、１５３、１６３／２９１／３６２／３６５／３８３／３８８、１６３／２９１／３８３／３８８、１６３／３８３、１９１／１９９／３６５／３８３／３８８、１９１／２６０／３８８、１９１／２９１、１９１／２９１／３４２／３６２／３６５、１


９１／３５１／３８３／３８８、１９９／２６０／３８３、１９９／２９１、２６０、２６０／２９１／３６５／３８３／４０８、２６０／３６５／３８３、２９１、２９１／３５１／３８３／３８８、２９１／３５１／３８３／３８８／４０８、２９１／３６２／３６５、２９１／３６５／３８８、２９１／３８３、３１４、３１５、３１６、３１９、３４２／３６２、３５１／３８３／３８８、３６２、３６２／３８８、３８３、３８３／３８８、３９６、３９７、４０５、４０６、４１３、４１９、および４２３から選択される１つまたは複数の位置に含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸の位置は、配列番号３６６を基準に番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、操作されたトランスアミナーゼは、配列番号３６６に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも大きな配列同一性を含むポリペプチド配列を含み、ここで、前記操作されたトランスアミナーゼは、前記ポリペプチド配列内の少なくとも１つの置換または置換セットを、２４／６６／１９１／１９９／２９１、２４／６６／２９１／３６５、１６３／２９１／３６２／３６５／３８３／３８８、１６３／２９１／３８３／３８８、１９１／２９１／３４２／３６２／３６５、２９１、および２９１／３８３から選択される１つまたは複数の位置に含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸の位置は、配列番号３６６を基準に番号付けされる。その上さらなる一部の実施形態では、操作されたトランスアミナーゼは、配列番号６５０に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも大きな配列同一性を含むポリペプチド配列を含み、ここで、前記操作されたトランスアミナーゼは、前記ポリペプチド配列内の少なくとも１つの置換または置換セットを、１０、１３、１３／２４／１０８／１６３、１３／２４／１０８／１６３／３１１、１３／２４／１３３／１９９／３１１、１３／２４／１６３、１３／２４／１９９／３１１、１３／１０８、１３／１０８／１９９、１３／１０８／３１１、１３／１９９、１３／３１１、１４、１４／２４／１０８、１４／２４／１０８／１３３、１４／２４／１０８／１９９、１４／２４／１９９、１４／１０８、１４／１０８／１３３／３１１、１４／１０８／３１１、１４／３１１、２４、２４／１６３、２４／１６３／１９９、３５、７２、７３、７８、９５、１０１、１０８、１０８／１９９、１１４、１５４、１６３、１６９、１７５／３１６、１９９、１９９／３１１、２２６、２９３、３１１、３１６、３８２、３８３、および３８６から選択される１つまたは複数の位置に含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸の位置は、配列番号６５０を基準に番号付けされる。さらに追加的な一部の実施形態では、操作されたトランスアミナーゼは、配列番号６５０に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも大きな配列同一性を含むポリペプチド配列を含み、ここで、前記操作されたトランスアミナーゼは、前記ポリペプチド配列内の少なくとも１つの置換または置換セットを、１４／１０８／１３３／３１１、２４／１６３／１９９、７２、７８、３１６、および３８３から選択される１つまたは複数の位置に含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸の位置は、配列番号６５０を基準に番号付けされる。

【0014】

一部のさらなる実施形態では、操作されたトランスアミナーゼは、表２－１、２－２、３－１、３－２、４－１、４－２、５－１、および／または５－２に記載されている少なくとも１つの操作されたトランスアミナーゼバリアントの配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも大きく同一であるポリペプチド配列を含む。さらに追加的な一部の実施形態では、操作されたトランスアミナーゼは、表２－１、２－２、３－１、３－２、４－１、４－２、５－１、および／または５－２に提示されている操作されたトランスアミナーゼバリアントである。一部のさらなる実施形態では、操作されたトランスアミナーゼは、配列番号２、４、８、３６６、および／または６５０に記載されている少なくとも１つの操作されたトランスアミナーゼバリアントの配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも大きく同一であるポリペプチド配列を含む。一部のさらなる実施形態では、操作されたトランスアミナーゼは、配列番号２、４、８、３６６、および／または６５０を含むポリペプチド配列を含む。一部のさらなる実施形態では、操作されたトランスアミナーゼは、配列番号６～９３６の偶数の配列に記載されている少なくとも１つの操作されたトランスアミナーゼバリアントの配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも大きく同一であるポリペプチド配列を含む。さらに追加的な一部の実施形態では、操作されたトランスアミナーゼは、配列番号６～９３６の偶数の配列に記載されているポリペプチド配列を含む。一部のさらなる実施形態では、操作されたトランスアミナーゼは、野生型Ｖ．ｆｌｕｖｉａｌｉｓトランスアミナーゼと比較して少なくとも１つの特性の改善を含む。一部の追加的な実施形態では、操作されたトランスアミナーゼの特性の改善は、基質に対する活性の改善を含む。一部の追加的な実施形態では、基質は、化合物（１）を含む。さらに追加的な一部の実施形態では、操作されたトランスアミナーゼの特性の改善は、熱安定性（ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ）の改善を含む。一部の追加的な実施形態では、操作されたトランスアミナーゼは、精製されたものである。本開示は、本明細書に提示される操作されたトランスアミナーゼを含む組成物も提供する。一部の実施形態では、組成物は、１つよりも多くの本明細書に提示される操作されたトランスアミナーゼを含む。

【0015】

本開示は、本明細書に提示される少なくとも１つの操作されたトランスアミナーゼをコードするポリヌクレオチド配列も提供する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、少なくとも１つの操作されたトランスアミナーゼをコードし、前記ポリヌクレオチド配列は、配列番号３、７、３６５、および／または６４９に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも大きな配列同一性を有し、ここで、前記操作されたトランスアミナーゼのポリヌクレオチド配列は、１つまたは複数の位置における少なくとも１つの置換を含む。一部のさらなる実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、配列番号２、４、８、３６６、および／または６５０に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも大きな配列同一性を含む少なくとも１つの操作されたトランスアミナーゼまたはその機能性断片をコードする。さらに追加的な一部の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、制御配列に作動可能に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）連結している。なおさらなる一部の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、コドン最適化されたものである。

【0016】

本開示は、本明細書に提示される操作されたトランスアミナーゼをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターも提供する。一部の実施形態では、発現ベクターは、配列番号３、７、３６５、および／または６４９に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも大きな配列同一性を含む少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含み、ここで、前記操作されたトランスアミナーゼのポリヌクレオチド配列は、１つまたは複数の位置における少なくとも１つの置換を含む。一部の実施形態では、発現ベクターは、配列番号３、７、３６５、および／または６４９に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも大きな配列同一性を含む少なくとも１つの操作されたトランスアミナーゼまたはその機能性断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む。

【0017】

本開示は、本明細書に提示される少なくとも１つの発現ベクターを含む宿主細胞も提供する。一部の実施形態では、宿主細胞は、本明細書に提示される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、配列番号３、７、３６５、および／または６４９に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも大きな配列同一性を含む少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含み、ここで、操作されたトランスアミナーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、１つまたは複数の位置における少なくとも１つの置換を含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、配列番号２、４、８、３６６、および／または６５０に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも大きな配列同一性を含む少なくとも１つの操作されたトランスアミナーゼまたはその機能性断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、操作されたトランスアミナーゼをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列は少なくとも１つの発現ベクター内に存在する。

【0018】

本開示は、操作されたトランスアミナーゼを宿主細胞において産生させる方法であって、本明細書に提示される宿主細胞を、少なくとも１つの操作されたトランスアミナーゼが産生されるように、適切な条件下で培養するステップを含む、方法も提供する。一部の実施形態では、方法は、少なくとも１つの操作されたトランスアミナーゼを培養物および／または宿主細胞から回収するステップをさらに含む。一部の追加的な実施形態では、方法は、前記少なくとも１つの操作されたトランスアミナーゼを精製するステップをさらに含む。

【0019】

一部の実施形態では、トランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを固体支持体に固定化し、必要に応じて、固体支持体は、エポキシド官能基を有するポリメタクリレート、アミノエポキシド官能基を有するポリメタクリレート、スチレン／ＤＶＢ共重合体またはオクタデシル官能基を有するポリメタクリレートを含むビーズまたは樹脂から選択される。

【0020】

一部の実施形態では、トランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、適切な反応条件下で化合物（１）である基質を化合物（２）である生成物に変換することが可能である。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、適切な反応条件下で、参照配列である配列番号２、４、８、３６６、および／または６５０）の少なくとも１．２倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍、７５倍，１００倍、またはそれよりも大きな活性で、化合物（１）を化合物（２）に変換することが可能である。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、参照配列（例えば、配列番号２、４、８、３６６、および／または６５０）と比べて増大した活性で化合物（１）を化合物（２）に変換することが可能であり、ここで、適切な反応条件は、少なくとも１００ｇ／Ｌの負荷の化合物（１）、約１ｇ／Ｌの操作されたポリペプチド、約０．５ｇ／ＬのＰＬＰ、約１Ｍのイソプロピルアミン、約ｐＨ９、および約５０℃を含む。

【0021】

一部の実施形態では、本開示は、化合物（２）

【化3】

を調製するプロセスであって、化合物（１）である基質

【化4】

と、本明細書に開示される操作されたポリペプチドをアミノ基供与体の存在下、適切な反応条件下で接触させるステップを含む、方法を提供する。

【0022】

一部の実施形態では、本明細書に開示される操作されたポリペプチドを使用するプロセスを行うことができ、ここで、化合物（２）は、少なくとも９０％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも大きな鏡像異性およびジアステレオマー過剰で生成される。

【0023】

化合物（２）を調製するために操作されたポリペプチドを使用する、本明細書に開示されるプロセスのいずれも、これだけに限定されないが、アミン供与体、ｐＨ、温度、緩衝剤、溶媒系、基質負荷、ポリペプチド負荷、補助因子負荷、圧力、および反応時間の範囲を含めた、ある範囲の適切な反応条件下で行うことができる。例えば、一部の実施形態では、化合物（２）の調製を行うことができ、ここで、適切な反応条件は、（ａ）約１０～３００ｇ／Ｌの基質化合物（例えば、５０ｇ／Ｌまたは２００ｇ／Ｌの化合物（１））という基質負荷；（ｂ）約０．５ｇ／Ｌ～６０ｇ／Ｌの操作されたポリペプチド；（ｃ）約０．５～２ＭのＩＰＭ濃度；（ｄ）約０．１～１ｇ／ＬのＰＬＰ補助因子濃度；（ｅ）約０％（ｖ／ｖ）～約２０％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯ濃度；（ｆ）ｐＨ約８．５～１１．５；および（ｇ）約４５℃～６５℃の温度を含む。一部の実施形態では、適切な反応条件は、（ａ）約１００ｇ／Ｌの基質化合物（例えば、化合物（１））；（ｂ）約１ｇ／Ｌの操作されたポリペプチド；（ｃ）約１Ｍのイソプロピルアミン（ＩＰＭ）；（ｄ）約０．５ｇ／Ｌのピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）；（ｅ）約ｐＨ９；および（ｇ）約５０℃を含む。

【0024】

一部の実施形態では、本明細書に開示される操作されたポリペプチドを使用するプロセスを行うことができ、ここで、アミノ基供与体は、イソプロピルアミン、アラニン、３－アミノ酪酸、またはメチルベンジルアミンから選択される。一部の実施形態では、アミノ基供与体は、イソプロピルアミンである。

【発明を実施するための形態】

【0025】

発明の説明
本明細書に提示される説明に関して、他に特に指定がなければ、単数形の使用は複数形を含む（逆もまた同である）。例えば、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」という単数形は、文脈によりそうでないことが明白に示されない限り複数の指示対象を包含する。同様に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、互換的であり、限定的なものではない。

【0026】

種々の実施形態の記載に「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語が使用されている場合、一部の特定の場合では、実施形態が、その代わりに、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）または「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という言葉を使用して記載され得ることが当業者には理解されることがさらに理解されるべきである。

【0027】

図を含めた前述の一般的な説明、および以下の詳細な説明はどちらも単に例示的かつ説明的なものであり、本発明を制限するものではない。さらに、本明細書で使用される節の見出しは、単に組織化を目的とするものであり、記載されている主題を限定するものとは解釈されない。
定義

【0028】

本明細書で使用される場合、以下の用語は以下の意味を有することが意図されている。本発明に関して、本明細書の記載に使用されている科学技術用語は、他に特に定義されていなければ当業者に一般に理解されている意味を有する。したがって、以下の用語は以下の意味を有することが意図されている。さらに、本明細書で言及される特許および刊行物は全て、そのような特許および刊行物に開示されている全ての配列を含め、明白に参照により組み込まれる。

【0029】

別段の指定がない限り、本開示の実施には、当業者に公知である、分子生物学、発酵、微生物学、および関連する分野で一般に使用される従来の技法が伴う。本明細書において別段の定義のない限り、本明細書において使用される全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載の方法および材料と類似した、またはそれと等しい任意の方法および材料を本開示の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法および材料が記載されている。実際に、本明細書に記載されている特定の方法体系、プロトコール、および試薬は、使用される状況に応じて変動し得るので、本発明はこれらに限定されないものとする。本明細書に提示される表題は、本明細書全体を参照することにより得られる本発明の種々の態様または実施形態を限定するものではない。したがって、以下に定義される用語は、本明細書全体を参照することによってより詳細に定義される。

【0030】

それにもかかわらず、本開示の理解を容易にするために、いくつかの用語を以下に定義する。数値範囲は、その範囲を規定する数値を含む。したがって、本明細書に開示される全ての数値範囲は、そのような広範な数値範囲内に入るあらゆる狭い数値範囲を、そのような狭い数値範囲が本明細書において全て明確に記載されているものと同じく包含することが意図されている。本明細書に開示される全ての最大の（または最小の）数値限定は、あらゆるより低い（またはより高い）数値限定を、そのようなより低い（またはより高い）数値限定が本明細書に明白に書かれているものと同じく包含することも意図されている。

【0031】

本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語およびその同族語は、それらの包括的な意味で使用される（すなわち、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語およびその対応する同族語と等価である）。

【0032】

本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」という単数形は、文脈により明確に別段の規定がなされない限り、複数の参照を包含する。したがって、例えば、１つの「宿主細胞」（ａ ”ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ”）への言及は、複数のそのような宿主細胞を包含する。

【0033】

別段の指定がない限り、それぞれ、核酸は、左から右に、５’から３’への向きで記載されており、アミノ酸配列は、左から右に、アミノからカルボキシへの向きで記載されている。

【0034】

本明細書で使用される場合、「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」という用語は、本明細書では、長さまたは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、リン酸化、脂質付加、ミリストイル化、ユビキチン化など）にかかわらず、アミド結合によって共有結合により連結した少なくとも２つのアミノ酸のポリマーを示すために互換的に使用される。Ｄ－アミノ酸およびＬ－アミノ酸、およびＤ－アミノ酸とＬ－アミノ酸の混合物がこの定義に含まれる。

【0035】

遺伝子によりコードされるアミノ酸に対して使用される略語は従来のものであり、以下の通りである：

【表A】

【0036】

３文字略語が使用されている場合、前に「Ｌ」もしくは「Ｄ」がある場合、またはその略語が使用されている文脈から明らかな場合を除き、アミノ酸は、α炭素（Ｃ_α）に関してＬ－立体配置またはＤ－立体配置のいずれであってもよい。例えば、「Ａｌａ」は、α炭素に関する立体配置を指定せずにアラニンを示すが、一方、「Ｄ－Ａｌａ」および「Ｌ－Ａｌａ」は、それぞれＤ－アラニンおよびＬ－アラニンを示す。１文字略語が使用されている場合、大文字はα炭素に関してＬ－立体配置にあるアミノ酸を示し、小文字はα炭素に関してＤ－立体配置にあるアミノ酸を示す。例えば、「Ａ」はＬ－アラニンを示し、「ａ」はＤ－アラニンを示す。ポリペプチド配列が１文字または３文字略語（またはそれらの混合）のひと続きとして示されている場合、その配列は、一般慣習に従ってアミノ（Ｎ）からカルボキシ（Ｃ）への方向で示されている。

【0037】

本明細書で使用される場合、「親水性アミノ酸または残基」は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇらによる標準化されたコンセンサス共通疎水性尺度（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １７９： １２５－１４２ ［１９８４］）に従ってゼロ未満の疎水性を示す側鎖を有するアミノ酸または残基を指す。遺伝子によりコードされる親水性アミノ酸としては、Ｌ－Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｌ－Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｌ－Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｌ－Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｌ－Ａｓｎ（Ｎ）、Ｌ－Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｌ－Ａｓｐ（Ｄ）、Ｌ－Ｌｙｓ（Ｋ）およびＬ－Ａｒｇ（Ｒ）が挙げられる。

【0038】

本明細書で使用される場合、「酸性アミノ酸または残基」は、アミノ酸がペプチドまたはポリペプチドに含まれる場合に約６未満のｐＫ値を示す側鎖を有する親水性アミノ酸または残基を指す。酸性アミノ酸は、一般には、生理的ｐＨにおいて、水素イオンの喪失に起因して、負に荷電した側鎖を有する。遺伝子によりコードされる酸性アミノ酸としては、Ｌ－Ｇｌｕ（Ｅ）およびＬ－Ａｓｐ（Ｄ）が挙げられる。

【0039】

本明細書で使用される場合、「塩基性アミノ酸または残基」は、アミノ酸がペプチドまたはポリペプチドに含まれる場合に約６よりも大きいｐＫ値を示す側鎖を有する親水性アミノ酸または残基を指す。塩基性アミノ酸は、一般には、生理的ｐＨにおいて、ヒドロニウムイオンとの会合に起因して、正に荷電した側鎖を有する。遺伝子によりコードされる塩基性アミノ酸としては、Ｌ－Ａｒｇ（Ｒ）およびＬ－Ｌｙｓ（Ｋ）が挙げられる。

【0040】

本明細書で使用される場合、「極性アミノ酸または残基」は、生理的ｐＨにおいて非荷電であるが、２つの原子によって共有される電子対がそれらの原子の一方によってより密接に保持されている少なくとも１つの結合を有する側鎖を有する親水性アミノ酸または残基を指す。遺伝子によりコードされる極性アミノ酸としては、Ｌ－Ａｓｎ（Ｎ）、Ｌ－Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｌ－Ｓｅｒ（Ｓ）およびＬ－Ｔｈｒ（Ｔ）が挙げられる。

【0041】

本明細書で使用される場合、「疎水性アミノ酸または残基」は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇらによる標準化された共通疎水性尺度（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １７９： １２５－１４２ ［１９８４］）に従ってゼロよりも大きな疎水性を示す側鎖を有するアミノ酸または残基を指す。遺伝子によりコードされる疎水性アミノ酸としては、Ｌ－Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｌ－Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌ－Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｌ－Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ－Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｌ－Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｌ－Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｌ－Ａｌａ（Ａ）およびＬ－Ｔｙｒ（Ｙ）が挙げられる。

【0042】

本明細書で使用される場合、「芳香族アミノ酸または残基」は、少なくとも１つの芳香族または複素芳香族環を有する側鎖を有する親水性または疎水性アミノ酸または残基を指す。遺伝子によりコードされる芳香族アミノ酸としては、Ｌ－Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｌ－Ｔｙｒ（Ｙ）およびＬ－Ｔｒｐ（Ｗ）が挙げられる。Ｌ－Ｈｉｓ（Ｈ）は、時にはその複素芳香族窒素原子のｐＫａから塩基性残基と分類されるか、またはその側鎖が複素芳香族環を含むことから芳香族残基と分類されるが、本発明では、ヒスチジンは、親水性残基または「拘束（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ）残基」（以下を参照されたい）に分類される。

【0043】

本明細書で使用される場合、「拘束アミノ酸または残基」は、拘束された幾何学的配置を有するアミノ酸または残基を指す。本発明では、拘束残基として、Ｌ－Ｐｒｏ（Ｐ）およびＬ－Ｈｉｓ（Ｈ）が挙げられる。ヒスチジンは、比較的小さなイミダゾール環を有するので、拘束された幾何学的配置を有する。プロリンは、同様に５員環を有することから拘束された幾何学的配置を有する。

【0044】

本明細書で使用される場合、「非極性アミノ酸または残基」は、生理的ｐＨにおいて非荷電であり、２つの原子によって共有される電子対が一般にそれらの２つの原子のそれぞれによって等しく保持される結合を有する側鎖を有する（すなわち、側鎖が極性ではない）疎水性アミノ酸または残基を指す。遺伝子によりコードされる非極性アミノ酸としては、Ｌ－Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｌ－Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｌ－Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ－Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌ－Ｍｅｔ（Ｍ）およびＬ－Ａｌａ（Ａ）が挙げられる。

【0045】

本明細書で使用される場合、「脂肪族アミノ酸または残基」は、脂肪族炭化水素側鎖を有する疎水性アミノ酸または残基を指す。遺伝子によりコードされる脂肪族アミノ酸としは、Ｌ－Ａｌａ（Ａ）、Ｌ－Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ－Ｌｅｕ（Ｌ）およびＬ－Ｉｌｅ（Ｉ）が挙げられる。システイン（または「Ｌ－Ｃｙｓ」または「［Ｃ］」）は、他のＬ－Ｃｙｓ（Ｃ）アミノ酸または他のスルファニル含有アミノ酸またはスルフヒドリル含有アミノ酸とジスルフィド架橋を形成し得るという点で、普通ではないことに留意されたい。「システイン様残基」は、システインおよびジスルフィド架橋の形成のために利用可能なスルフヒドリル部分を含有する他のアミノ酸を包含する。Ｌ－Ｃｙｓ（Ｃ）（および他の－ＳＨ含有側鎖を有するアミノ酸）がペプチド内に還元型遊離－ＳＨまたは酸化型ジスルフィド架橋形態のいずれでも存在できることは、Ｌ－Ｃｙｓ（Ｃ）が、ペプチドに対して正味の疎水性または親水性の性質に寄与するかどうかに影響を及ぼす。Ｌ－Ｃｙｓ（Ｃ）は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇによる標準化された共通尺度（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， １９８４、上記）に従って０．２９の疎水性を示すが、本開示の目的に関しては、Ｌ－Ｃｙｓ（Ｃ）は独自の群にカテゴリー化されることが理解されるべきである。

【0046】

本明細書で使用される場合、「小さなアミノ酸または残基」は、全部で３個またはそれよりも少ない炭素および／またはヘテロ原子（α炭素および水素は除く）で構成される側鎖を有するアミノ酸または残基を指す。小さなアミノ酸または残基は、上記の定義に従って脂肪族、非極性、極性または酸性の小さなアミノ酸または残基にさらにカテゴリー化することができる。遺伝子によりコードされる小さなアミノ酸としては、Ｌ－Ａｌａ（Ａ）、Ｌ－Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ－Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｌ－Ａｓｎ（Ｎ）、Ｌ－Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｌ－Ｔｈｒ（Ｔ）およびＬ－Ａｓｐ（Ｄ）が挙げられる。

【0047】

本明細書で使用される場合、「ヒドロキシル含有アミノ酸または残基」は、ヒドロキシル（－ＯＨ）部分を含有するアミノ酸を指す。遺伝子によりコードされるヒドロキシル含有アミノ酸としては、Ｌ－Ｓｅｒ（Ｓ）Ｌ－Ｔｈｒ（Ｔ）およびＬ－Ｔｙｒ（Ｙ）が挙げられる。

【0048】

本明細書で使用される場合、「アミノ酸の差異」および「残基の差異」は、ポリペプチド配列のある位置におけるアミノ酸残基の、参照配列内の対応する位置におけるアミノ酸残基と比べた差異を指す。アミノ酸の差異の位置は、本明細書では、一般に、「Ｘｎ」と称され、ここで、ｎは、残基の差異が基づく参照配列内の対応する位置を指す。例えば、「配列番号２と比較したＸ４０位の残基の差異」は、配列番号２の４０位に対応するポリペプチドの位置におけるアミノ酸残基の差異を指す。したがって、参照ポリペプチドである配列番号２の４０位がヒスチジンである場合、「配列番号２と比較したＸ４０位における残基の差異」は、配列番号２の４０位に対応するポリペプチドの位置におけるヒスチジン以外の任意の残基によるアミノ酸置換を指す。本明細書ではほとんどの場合、ある位置における特定のアミノ酸残基の差異は「ＸｎＹ」と表され、ここで、「Ｘｎ」は上記の通り対応する位置を指定し、「Ｙ」は操作されたポリペプチド内に見出されるアミノ酸（すなわち、参照ポリペプチドと異なる残基）の１文字識別子である。一部の場合では、本開示は、従来の表示法「ＡｎＢ」によって示される特定のアミノ酸の差異も提供し、ここで、Ａは参照配列内の残基の１文字識別子であり、「ｎ」は参照配列内の残基の位置番号であり、Ｂは操作されたポリペプチドの配列内の置換残基の１文字識別子である。一部の場合では、本開示のポリペプチドは、参照配列と比べて１つまたは複数のアミノ酸残基の差異を含み得、これは、参照配列と比べて残基の差異が存在する特定の位置の一覧によって示される。一部の実施形態では、ポリペプチドの特定の残基の位置に１つよりも多くのアミノ酸が使用され得る場合、使用され得る種々のアミノ酸残基は「／」で区切られる（例えば、Ｘ１９２Ａ／Ｇ）。複数の置換を有するバリアントが存在する一部の実施形態では、置換はセミコロン（；）またはスラッシュ（／）のいずれかで区切られる（例えば、Ｙ１７Ｖ；Ｉ２５９Ｔ；Ｅ３４７ＫまたはＹ１７Ｖ／Ｉ２５９Ｔ／Ｅ３４７Ｋ）。

【0049】

本開示は、保存的アミノ酸置換および非保存的アミノ酸置換のいずれか／または両方を含む１つまたは複数のアミノ酸の差異を含む操作されたポリペプチド配列を包含する。本開示の配列表に含まれる特定の組換え炭酸脱水素酵素ポリペプチドのアミノ酸配列は、開始メチオニン（Ｍ）残基を含む（すなわち、Ｍが残基１位を表す）。しかし、この開始メチオニン残基が、例えば宿主細胞またはｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系において生物学的プロセシング機構によって除去されて、開始メチオニン残基を欠くが、他の点では酵素の特性を保持する成熟タンパク質が生じる可能性があることが当業者には理解される。したがって、「Ｘｎ位における配列番号２と比べたアミノ酸残基の差異」という用語は、本明細書で使用される場合、出発メチオニンを欠くようにプロセシングされた参照配列内の「Ｘｎ」位または対応する位置（例えば、（Ｘ－１）ｎ位）を指し得る。

【0050】

本明細書で使用される場合、「保存的アミノ酸置換」という語句は、同様の側鎖を有する残基の互換性を指し、したがって、一般には、ポリペプチド内のアミノ酸の、定義されたアミノ酸のクラスが同じまたは同様であるアミノ酸による置換を伴う。例として、限定するものではなく、一部の実施形態では、脂肪族側鎖を有するアミノ酸が別の脂肪族アミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン）で置換される；ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸がヒドロキシル側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、セリンおよびトレオニン）で置換される；芳香族側鎖を有するアミノ酸が芳香族側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、およびヒスチジン）で置換される；塩基性側鎖を有するアミノ酸が塩基性側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、リシンおよびアルギニン）で置換される；酸性側鎖を有するアミノ酸が酸性側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）で置換される；ならびに／または疎水性または親水性アミノ酸がそれぞれ別の疎水性または親水性アミノ酸で置き換えられる。例示的な保存的置換を表１に提示する。

【表1】

【0051】

本明細書で使用される場合、「非保存的置換」という語句は、ポリペプチド内のアミノ酸の、側鎖特性が著しく異なるアミノ酸による置換を指す。非保存的置換では、定義された群内ではなく、群間のアミノ酸が使用され得、（ａ）置換の領域内のペプチド骨格の構造（例えば、グリシンに代わってプロリン）（ｂ）電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のかさに影響を及ぼす。例として、限定するものではなく、例示的な非保存的置換は、酸性アミノ酸の塩基性または脂肪族アミノ酸での置換；芳香族アミノ酸の小さなアミノ酸での置換；および親水性アミノ酸の疎水性アミノ酸での置換であり得る。

【0052】

本明細書で使用される場合、「欠失」は、参照ポリペプチドから１個または複数のアミノ酸が除去されることによるポリペプチドの改変を指す。欠失は、１個またはそれよりも多くのアミノ酸、２個またはそれよりも多くのアミノ酸、５個またはそれよりも多くのアミノ酸、１０個またはそれよりも多くのアミノ酸、１５個またはそれよりも多くのアミノ酸、または２０個またはそれよりも多くのアミノ酸、ポリペプチドを構成するアミノ酸の総数の１０％まで、またはアミノ酸の総数の２０％までの除去を含み得るが、一方で、操作された酵素の酵素活性が保持され、かつ／または特性の改善が保持される。欠失は、ポリペプチドの内部の位置および／または末端の位置を対象とし得る。種々の実施形態では、欠失は、連続したセグメントを含んでもよく、不連続であってもよい。

【0053】

本明細書で使用される場合、「挿入」は、参照ポリペプチドに１個または複数のアミノ酸が付加されることによるポリペプチドの改変を指す。一部の実施形態では、改善された操作されたトランスアミナーゼ酵素は、天然に存在するトランスアミナーゼポリペプチドに対する１個または複数のアミノ酸の挿入、ならびに操作されたトランスアミナーゼポリペプチドに対する１個または複数のアミノ酸の挿入を含む。挿入は、ポリペプチドの内部部分へのものであってもカルボキシ末端またはアミノ末端へのものであってもよい。挿入は、本明細書で使用される場合、当技術分野で公知の融合タンパク質を包含する。挿入は、アミノ酸の連続的なセグメントであってもよく、天然に存在するポリペプチド内のアミノ酸の１個または複数によって分離されていてもよい。

【0054】

「アミノ酸置換セット」または「置換セット」という用語は、参照配列と比較したポリペプチド配列内のアミノ酸置換の群を指す。置換セットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれよりも多くのアミノ酸置換を有し得る。一部の実施形態では、置換セットは、実施例に提示される表に列挙されているバリアントトランスアミナーゼのいずれかに存在するアミノ酸置換のセットを指す。「置換セット」という用語は、参照配列と比較したポリヌクレオチド配列内のヌクレオチド置換の群に関しても使用される。

【0055】

本明細書で使用される場合、「断片」は、アミノ末端および／またはカルボキシ末端の欠失を有するが、残りのアミノ酸配列は配列内の対応する位置と同一であるポリペプチドを指す。断片は、一般には、全長トランスアミナーゼポリペプチド、例えば、配列番号２のポリペプチドの約８０％、約９０％、約９５％、約９８％、または約９９％を有し得る。一部の実施形態では、断片は、「生物活性を有する」（すなわち、全長配列と同じ酵素活性を示す）。

【0056】

本明細書で使用される場合、「単離されたポリペプチド」は、天然にはそれに付随する他の夾雑物（例えば、タンパク質、脂質、およびポリヌクレオチド）から実質的に分離されたポリペプチドを指す。この用語は、それらの天然に存在する環境または発現系（例えば、宿主細胞またはｉｎ ｖｉｔｒｏ合成）から取り出されたまたは精製されたポリペプチドを包含する。改善されたトランスアミナーゼ酵素は、細胞内に存在し得る、細胞培地中に存在し得る、または、例えば、溶解物もしくは単離された調製物など、様々な形態で調製することができる。したがって、一部の実施形態では、本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、単離されたポリペプチドであり得る。

【0057】

本明細書で使用される場合、「実質的に純粋なポリペプチド」は、ポリペプチド種が、存在する優勢な種である（すなわち、モル基準または重量基準で、組成物中のあらゆる他の個々の高分子種よりも豊富である）組成物を指し、一般に、目的種が、モルまたは重量％で、存在する高分子種の少なくとも約５０パーセントを構成する場合、実質的に精製された組成物である。一般に、実質的に純粋な操作されたトランスアミナーゼポリペプチド組成物は、モルまたは重量％で、組成物中に存在する全ての高分子種の約６０％またはそれよりも多く、約７０％またはそれよりも多く、約８０％またはそれよりも多く、約９０％またはそれよりも多く、約９１％またはそれよりも多く、約９２％またはそれよりも多く、約９３％またはそれよりも多く、約９４％またはそれよりも多く、約９５％またはそれよりも多く、約９６％またはそれよりも多く、約９７％またはそれよりも多く、約９８％またはそれよりも多く、または約９９％を構成する。溶媒種、小分子（＜５００ダルトン）、および元素として存在するイオン種は高分子種とみなされない。一部の実施形態では、単離された改善されたトランスアミナーゼポリペプチドは、実質的に純粋なポリペプチド組成物である。

【0058】

本明細書で使用される場合、「実質的に純粋なポリヌクレオチド」は、ポリヌクレオチド種が、存在する優勢な種である（すなわち、モル基準または重量基準で、組成物中のあらゆる他の個々の高分子種よりも豊富である）組成物を指し、一般に、目的種が、モルまたは重量％で、存在する高分子種の少なくとも約５０パーセントを構成する場合、実質的に精製された組成物である。一般に、実質的に純粋な操作されたトランスアミナーゼポリヌクレオチド組成物は、モルまたは重量％で、組成物中に存在する全ての高分子種の約６０％またはそれよりも多く、約７０％またはそれよりも多く、約８０％またはそれよりも多く、約９０％またはそれよりも多く、約９１％またはそれよりも多く、約９２％またはそれよりも多く、約９３％またはそれよりも多く、約９４％またはそれよりも多く、約９５％またはそれよりも多く、約９６％またはそれよりも多く、約９７％またはそれよりも多く、約９８％またはそれよりも多く、または約９９％を構成する。一部の実施形態では、単離された改善されたトランスアミナーゼポリペプチドは、実質的に純粋なポリヌクレオチド組成物である。

【0059】

本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、共有結合により連結した２つまたはそれよりも多くのヌクレオシドを指す。ポリヌクレオチドは、完全にリボヌクレオシドで構成されるもの（すなわちＲＮＡ）であってもよく、完全に２’デオキシリボヌクレオチドで構成されるもの（すなわちＤＮＡ）であってもよく、リボヌクレオシドと２’デオキシリボヌクレオシドの混合物であってもよい。ヌクレオシドは、一般には、標準のリン酸ジエステル連結を介して連結するが、ポリヌクレオチドは、１つまたは複数の非標準の連結を含んでもよい。ポリヌクレオチドは、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、あるいは一本鎖領域と二本鎖領域の両方を含んでもよい。さらに、ポリヌクレオチドは、一般には、天然に存在するコード核酸塩基（すなわち、アデニン、グアニン、ウラシル、チミン、およびシトシン）で構成されるが、１つまたは複数の修飾および／または合成核酸塩基（例えば、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチンなど）を含んでもよい。そのような修飾または合成核酸塩基は核酸塩基をコードするものであることが好ましい。

【0060】

遺伝子によりコードされるヌクレオシドに使用される略語は従来のものであり、以下の通りである：アデノシン（Ａ）；グアノシン（Ｇ）；シチジン（Ｃ）；チミジン（Ｔ）；およびウリジン（Ｕ）。特に記載がなければ、略されたヌクレオチドは、リボヌクレオシドまたは２’－デオキシリボヌクレオシドのいずれかであり得る。ヌクレオシドがリボヌクレオシドまたは２’－デオキシリボヌクレオシドのいずれであるかは、個々にまたは全体として特定される。核酸配列が１文字略語のひと続きとして示されている場合、その配列は、一般慣習に従って５’から３’への方向で示されており、また、リン酸は示されていない。

【0061】

本明細書で使用される場合、「ハイブリダイゼーションストリンジェンシー」は、核酸のハイブリダイゼーションにおける洗浄条件などのハイブリダイゼーション条件に関する。一般に、ハイブリダイゼーション反応は、低ストリンジェンシー条件下で実施され、その後、変動するがより高いストリンジェンシーでの洗浄が行われる。「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション」という用語は、標的ＤＮＡが、標的ＤＮＡに対して約６０％同一性、好ましくは約７５％同一性、約８５％同一性を有する；標的ポリヌクレオチドに対して約９０％よりも大きな同一性を有する相補的な核酸と結合することを可能にする条件を指す。例示的な中程度にストリンジェントな条件は、５０％ホルムアミド、５×デンハート液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ、４２℃でのハイブリダイゼーション、その後、０．２×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ、４２℃での洗浄と同等の条件である。「高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション」は、一般に、規定のポリヌクレオチド配列についての溶液条件下で決定された熱的融解温度Ｔ_ｍから約１０℃またはそれ未満である条件を指す。一部の実施形態では、高ストリンジェンシー条件は、６５℃で０．０１８ＭのＮａＣｌの下で安定なハイブリッドを形成する核酸配列のみのハイブリダイゼーションを可能にする条件を指す（すなわち、本明細書において意図されている通り、ハイブリッドが６５℃で０．０１８ＭのＮａＣｌの下で安定でない場合、そのハイブリッドは高ストリンジェンシー条件下で安定ではない）。高ストリンジェンシー条件は、例えば、５０％ホルムアミド、５×デンハート液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ、４２℃と同等の条件でのハイブリダイゼーション、その後、０．１×ＳＳＰＥ、および０．１％ＳＤＳ、６５℃での洗浄によってもたらすことができる。別の高ストリンジェンシー条件は、０．１％（ｗ：ｖ）ＳＤＳを含有する５×ＳＳＣ、６５℃でのハイブリダイゼーション、および０．１％ＳＤＳを含有する０．１×ＳＳＣ、６５℃での洗浄と同等の条件下でのハイブリダイゼーションである。他の高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、ならびに中程度にストリンジェントな条件は当業者に公知である。

【0062】

本明細書で使用される場合、「コード配列」は、タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸（例えば、遺伝子）の部分を指す。

【0063】

本明細書で使用される場合、「コドン最適化された」とは、タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコドンが、コードされるタンパク質が目的の生物体において効率的に発現されるように、特定の生物体において優先的に使用されるコドンに変えられたことを指す。一部の実施形態では、トランスアミナーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドを、発現のために選択された宿主生物体による最適な産生のためにコドン最適化することができる。大多数のアミノ酸が、「シノニム」または「同義」コドンと称されるいくつかのコドンで表されるという点で遺伝暗号は縮重するが、特定の生物体によるコドン使用はランダムではなく、特定のコドントリプレットに偏ることが周知である。このコドン使用の偏りは、所与の遺伝子、機能または祖先の起源が共通の遺伝子、低コピー数のタンパク質に対して高度に発現されるタンパク質、および生物体のゲノムの凝集タンパク質コード領域に関してより大きい可能性がある。一部の実施形態では、トランスアミナーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドを、発現のために選択された宿主生物体による最適な産生のためにコドン最適化することができる。

【0064】

本明細書で使用される場合、「好ましい、最適な、高いコドン使用の偏りのコドン」は、互換的に、タンパク質コード領域において同じアミノ酸をコードする他のコドンよりも高い頻度で使用されるコドンを指す。好ましいコドンは、単一の遺伝子、機能または起源が共通する遺伝子のセット、高度に発現される遺伝子、全生物体の凝集タンパク質コード領域におけるコドン頻度、関連する生物体の凝集タンパク質コード領域におけるコドン頻度、またはこれらの組合せにおけるコドン使用との関連で決定することができる。遺伝子発現のレベルと共に頻度が増大するコドンが一般には発現のために最適なコドンである。例えばクラスター解析またはコレスポンデンス分析を使用する多変量解析を含めた、特定の生物体におけるコドン頻度（例えば、同義のコドン使用と比べたコドン使用）およびコドン選好を決定するための、ならびに遺伝子において使用されるコドンの有効数を決定するための、種々の方法が公知である（例えば、ＧＣＧ ＣｏｄｏｎＰｒｅｆｅｒｅｎｃｅ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ；ＣｏｄｏｎＷ， Ｊｏｈｎ Ｐｅｄｅｎ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ； ＭｃＩｎｅｒｎｅｙ， Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ．， １４： ３７２－７３ ［１９９８］；Ｓｔｅｎｉｃｏ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２２２： ４３７－４６ ［１９９４］；およびＷｒｉｇｈｔ、Ｇｅｎｅ ８７： ２３－２９ ［１９９０］を参照されたい）。増え続ける生物体の一覧についてのコドン使用表が入手可能である（例えば、Ｗａｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２０： ２１１１－２１１８ ［１９９２］；Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２８： ２９２ ［２０００］；Ｄｕｒｅｔ， ｅｔ ａｌ．， 上記；Ｈｅｎａｕｔ ａｎｄ Ｄａｎｃｈｉｎ， ”Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ，” Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ， ｅｔ ａｌ ．（ｅｄｓ．）， ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．， ［１９９６］， ｐ． ２０４７－２０６６を参照されたい。コドン使用を得るためのデータソースは、タンパク質をコードすることが可能な任意の使用可能なヌクレオチド配列に依拠するものであってよい。これらのデータセットは、発現されるタンパク質（例えば、完全なタンパク質コード配列－ＣＤＳ）、発現される配列タグ（ＥＳＴＳ）、または予測されるゲノム配列のコード領域をコードすることが実際に分かっている核酸配列を含む（例えば、Ｕｂｅｒｂａｃｈｅｒ， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．， ２６６： ２５９－２８１ ［１９９６］；Ｔｉｗａｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｍｐｕｔ． Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｓｃｉ．， １３： ２６３－２７０ ［１９９７］を参照されたい）。

【0065】

本明細書で使用される場合、「制御配列」は、本明細書では、本開示のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現のために必要であるまたは有利である全ての成分を含むものと定義される。各制御配列は、目的のポリヌクレオチドに対してネイティブなものであっても外来のものであってもよい。そのような制御配列としては、これだけに限定されないが、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列、および転写ターミネーターが挙げられる。

【0066】

本明細書で使用される場合、「作動可能に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）連結した」とは、本明細書では、制御配列により目的のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現が方向づけられるまたは調節されるように、制御配列が目的のポリヌクレオチドに対する位置に適切に置かれた（すなわち、機能的に関連する）立体配置と定義される。

【0067】

本明細書で使用される場合、「プロモーター配列」は、コード配列などの目的のポリヌクレオチドの発現のために宿主細胞によって認識される核酸配列を指す。制御配列は、適当なプロモーター配列を含み得る。プロモーター配列は、目的のポリヌクレオチドの発現を媒介する転写制御配列を含有する。プロモーターは、突然変異体、短縮型、およびハイブリッドプロモーターを含めた、選択された宿主細胞において転写活性を示す任意の核酸配列であってよく、宿主細胞に対して同種または異種のいずれかの細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。

【0068】

本明細書で使用される場合、「天然に存在する」および「野生型」は、天然に見出される形態を指す。例えば、天然に存在するまたは野生型ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然の供給源から単離することができ、人間による操作によって意図的に改変されていない、生物体内に存在する配列である。

【0069】

本明細書で使用される場合、「天然に存在しない」、「操作された」、および「組換え」とは、本開示において、（例えば、細胞、核酸、またはポリペプチド）を参照して使用される場合、材料、または、そうでなければ天然には存在しない様式で改変された天然のもしくはネイティブな形態の材料に対応する材料を指す。一部の実施形態では、材料は、天然に存在する材料と同一であるが、合成材料からおよび／または組換え技法を使用した操作によって作製されたまたは引き出されたものである。非限定的な例としては、とりわけ、ネイティブな（非組換え）形態の細胞内には見出されない遺伝子を発現する、またはそうでなければ異なるレベルで発現されるネイティブな遺伝子を発現する組換え細胞が挙げられる。

【0070】

本明細書で使用される場合、「配列同一性のパーセンテージ」、「同一性パーセント」、および「同一パーセント」は、ポリヌクレオチド配列間またはポリペプチド配列間の比較を指し、比較ウィンドウにわたって最適にアラインメントされた２つの配列を比較することによって決定され、ここで、２つの配列を最適にアラインメントするために、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の一部に参照配列と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含めることができる。パーセンテージは、両方の配列内に同一の核酸塩基もしくはアミノ酸残基が存在する位置の数、または核酸塩基もしくはアミノ酸残基がギャップにアラインメントされる位置の数のいずれかを決定して、マッチする位置の数を得、マッチする位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で割り、結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって算出される。最適なアラインメントおよび配列同一性パーセントの決定は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムを使用して実施される（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５： ４０３－４１０ ［１９９０］；およびＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２５： ３３８９－３４０２ ［１９７７］を参照されたい）。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアはＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのウェブサイトを通じて公的に入手可能である。

【0071】

簡単に述べると、ＢＬＡＳＴ分析には、まず、高スコア配列対（ＨＳＰ）を、データベース配列内の同じ長さのワードとアラインメントした場合にいくつかの正の値をとる閾値スコアＴとマッチするかまたはそれを満たす、クエリ配列内の長さＷの短いワードを同定することによって同定することを伴う。Ｔは、近傍ワードスコア閾値と称される（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， 上記）。これらの最初の近傍ワードヒットは、それらを含有するより長いＨＳＰを見出すための検索を開始するためのシードとしての機能を果たす。次いで、累積アラインメントスコアが増大し得る限りは、ワードヒットを各配列に沿って両方向に伸長させる。累積スコアを、ヌクレオチド配列についてはパラメータＭ（マッチする残基の対についてのリワードスコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基についてのペナルティスコア；常に＜０）を使用して算出する。アミノ酸配列については、スコアリング行列を使用して累積スコアを算出する。累積アラインメントスコアがその最大達成値から数量Ｘだけ減少した時；１つもしくは複数の負のスコア残基アラインメントの蓄積により累積スコアがゼロもしくはそれ未満になった時；またはいずれかの配列の末端に達した時に、各方向へのワードヒットの伸長を停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、およびＸにより、アラインメントの感度およびスピードが決定される。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）では、デフォルトとしてワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムで、デフォルトとしてワード長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列を使用する（例えば、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９： １０９１５ ［１９８９］を参照されたい）。

【0072】

２つの配列についての同一性パーセントをもたらすことに関してＢＬＡＳＴと同様に機能する多数の他のアルゴリズムが当技術分野において利用可能であり、公知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、当技術分野で公知の任意の適切な方法を使用し（例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ， Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ．， ２： ４８２ ［１９８１］の局所相同性アルゴリズムによって；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ４８： ４４３ ［１９７０］の相同性アラインメントアルゴリズムによって；Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：２４４４ ［１９８８］の類似性の検索法によって；ならびに／または、これらのアルゴリズムのコンピュータ化されたインプリメンテーションによって［ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ］のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、または当技術分野で一般に知られている方法を使用した視覚的検査によって実施することができる。さらに、配列アラインメントおよび配列同一性パーセントの決定には、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅパッケージ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）内のＢＥＳＴＦＩＴまたはＧＡＰプログラムを、提供されるデフォルトパラメータを使用して、使用することができる。

【0073】

本明細書で使用される場合、「実質的な同一性」は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が、少なくとも２０残基位置の比較ウィンドウにわたって、頻繁には少なくとも３０～５０残基のウィンドウにわたって参照配列と比較して、少なくとも８０パーセントの配列同一性、少なくとも８５パーセント同一性および８９～９５パーセントの配列同一性、通常は少なくとも９９パーセントの配列同一性を有することを指し、ここで、配列同一性のパーセンテージは、参照配列と、参照配列に対して全部で２０パーセントまたはそれ未満の欠失または付加を含む配列を、比較ウィンドウにわたって比較することによって算出される。ポリペプチドに適用される特定の実施形態では、「実質的な同一性」という用語は、２つのポリペプチド配列が、例えばプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴによって、デフォルトのギャップ重みづけを使用して最適にアラインメントされた場合、少なくとも８０パーセントの配列同一性、好ましくは少なくとも８９パーセントの配列同一性、少なくとも９５パーセントの配列同一性またはそれよりも大きな配列同一性（例えば、９９パーセントの配列同一性）を共有することを意味する。一部の好ましい実施形態では、同一ではない残基の位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。

【0074】

本明細書で使用される場合、「参照配列」は、別の配列が比較される規定の配列を指す。参照配列は、より大きな配列のサブセット、例えば、全長の遺伝子またはポリペプチド配列のセグメントであってよい。一般に、参照配列は、少なくとも２０ヌクレオチドまたはアミノ酸残基長、少なくとも２５残基長、少なくとも５０残基長、または全長の核酸もしくはポリペプチドである。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、それぞれ（１）２つの配列間で同様である配列（すなわち、完全な配列の一部）を含み得、（２）２つの配列間で異なる配列をさらに含み得るので、２つ（またはそれよりも多く）のポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の配列の比較は、一般には、２つのポリヌクレオチドの配列を比較ウィンドウにわたって比較して、局所的な配列類似性の領域を同定し、比較することによって実施される。「参照配列」という用語は、野生型配列に限定することが意図されるのではなく、操作されたまたは変更された配列を含み得る。例えば、一部の実施形態では、「参照配列」は、事前に操作されたまたは変更されたアミノ酸配列であり得る。

【0075】

本明細書で使用される場合、「比較ウィンドウ」とは、少なくとも約２０個の連続的なヌクレオチド位置またはアミノ酸残基の概念的なセグメントを指し、ここで、配列を少なくとも２０個の連続的なヌクレオチドまたはアミノ酸の参照配列と比較することができ、また、２つの配列を最適にアラインメントするために、配列の比較ウィンドウ内の部分に参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して２０パーセントまたはそれ未満の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含めることができる。比較ウィンドウは、２０個の連続的な残基よりも長くてよく、必要に応じて、３０、４０、５０、１００、またはそれより長いウィンドウが含まれる。

【0076】

本明細書で使用される場合、「に対応する」、「を基準に」、および「と比べて」とは、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列の番号付けに関して使用される場合、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列を参照配列と比較する際の指定された参照配列の残基の番号付けを指す。言い換えれば、所与のポリマーの残基の番号または残基の位置は、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列内の実際の数値的な残基の位置によってではなく、参照配列を基準に示される。例えば、操作されたトランスアミナーゼのアミノ酸配列などの所与のアミノ酸配列を、参照配列と、２つの配列間の残基のマッチを最適化するためにギャップを導入することによりアラインメントすることができる。これらの場合では、ギャップが存在するが、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列内の残基の番号付けは、当該配列がアラインメントされた参照配列を基準になされる。本明細書で使用される場合、例えば「Ｘｎ」など、残基の位置への言及は、下にさらに記載されている通り、特に他に指示がなければ、「に対応する残基」を指すものと解釈されるべきである。したがって、例えば、「Ｘ９４」は、ポリペプチド配列の９４位にある任意のアミノ酸を指す。

【0077】

本明細書で使用される場合、核酸またはポリペプチドに関して使用される場合、「異種」という用語は、生物体（例えば、野生型生物体）によって通常は発現されず分泌されない配列を指す。一部の実施形態では、この用語は、通常天然に見出されるものと同じ互いとの関連性では見出されない、または組換えによって操作されたものであり、したがって、細胞または構造におけるその発現のレベルまたは他の核酸もしくは他の分子との物理的関連性が通常は天然に見出されない、２つまたはそれよりも多くの部分配列を含む配列を包含する。例えば、異種核酸は、一般には、組換えによって作製され、天然に見出されない様式で配置された無関連の遺伝子由来の２つまたはそれよりも多くの配列を有する（例えば、本開示の核酸オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）がベクターなどの発現カセットに挿入されたプロモーター配列に作動可能に（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ）連結している）。一部の実施形態では、「異種ポリヌクレオチド」は、実験室での技法によって宿主細胞に導入される任意のポリヌクレオチドを指し、宿主細胞から取り出され、実験室での操作に供され、次いで、宿主細胞に再導入されるポリヌクレオチドを包含する。

【0078】

本明細書で使用される場合、「酵素特性の改善」は、参照トランスアミナーゼと比較して任意の酵素特性に改善を示すトランスアミナーゼを指す。本明細書に記載の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドに関しては、比較は、一般に野生型トランスアミナーゼ酵素に対してなされるが、一部の実施形態では、参照トランスアミナーゼは、別の改善された操作されたトランスアミナーゼであり得る。改善が望ましい酵素特性としては、これだけに限定されないが、酵素活性（指定量のトランスアミナーゼを使用した指定反応時間における基質の変換パーセントとして表され得る）、化学的選択性、熱安定性（ｔｈｅｒｍａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）、溶媒安定性、ｐＨ活性プロファイル、補助因子要件、阻害因子（例えば、生成物による阻害）に対する不応性、立体特異性、および立体選択性（エナンチオ選択性を含む）が挙げられる。

【0079】

本明細書で使用される場合、「酵素活性の増大」および「活性の増大」は、操作された酵素の特性の改善を指し、本明細書に記載の参照酵素と比較した比活性（例えば、生成される生成物／時間／タンパク質の重量）の増大または基質の生成物への変換パーセント（例えば、指定量のトランスアミナーゼを使用して指定期間での、出発量の基質の生成物への変換パーセント）の増大によって表すことができる。その変化により酵素活性の増大が導かれ得る古典的な酵素特性であるＫ_ｍ、Ｖ_ｍａｘまたはｋ_ｃａｔを含めた、酵素活性に関する任意の特性が影響を受け得る。酵素活性の比較は、本明細書においてさらに詳細に記載されている通り、酵素の規定の調製物、設定された条件下での規定のアッセイ、および１つまたは複数の規定の基質を使用して行う。一般に、細胞溶解物中の酵素を比較する場合、アッセイされる細胞の数およびタンパク質の量を決定するだけでなく、宿主細胞によって産生され、溶解物中に存在する酵素の量の変動を最小限にするために同一の発現系および同一の宿主細胞を使用する。

【0080】

本明細書で使用される場合、「変換」は、基質の対応する生成物への酵素的転換を指す。

【0081】

本明細書で使用される場合、「変換パーセント」は、ある期間内に指定条件下で生成物に変換される基質のパーセントを指す。したがって、例えば、トランスアミナーゼポリペプチドの「酵素活性」または「活性」を基質の生成物への「変換パーセント」として表すことができる。

【0082】

本明細書で使用される場合、「化学的選択性」は、化学反応または酵素反応において１つの生成物が別の生成物よりも優先的に形成されることを指す。

【0083】

本明細書で使用される場合、「熱安定性（ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ）」および「熱に対して安定（ｔｈｅｒｍａｌ ｓｔａｂｌｅ）」は、互換的に使用され、一連の温度条件（例えば、４０～８０℃）にある期間（例えば、０．５～２４時間）にわたって曝露した場合に、未処理酵素と比較して、不活化に対する抵抗性を有し、したがって、温度の上昇への曝露後にある特定のレベルの残留活性（例えば、６０％超～８０％）を保持するポリペプチドを指す。

【0084】

本明細書で使用される場合、「溶媒に対して安定」とは、ポリペプチドの、種々の濃度（例えば、５～９９％）の溶媒（例えば、イソプロピルアルコール、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、アセトン、トルエン、酢酸ブチル、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルなど）へのある期間（例えば、０．５～２４時間）にわたる曝露後に、未処理酵素と比較して同様の活性（例えば、６０％超～８０％）を維持する能力を指す。

【0085】

本明細書で使用される場合、「ｐＨに対して安定」とは、トランスアミナーゼポリペプチドが、高ｐＨまたは低ｐＨ（例えば、４．５～６または８～１２）へのある期間（例えば、０．５～２４時間）にわたる曝露後に、未処理酵素と比較して同様の活性（例えば、６０％超～８０％）を維持することを指す。

【0086】

本明細書で使用される場合、「熱および溶媒に対して安定」とは、トランスアミナーゼポリペプチドが熱安定性（ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ）であり、かつ溶媒に対して安定であることを指す。

【0087】

本明細書で使用される場合、「適切な反応条件」は、本開示のトランスアミナーゼポリペプチドによるアミノ基転移が可能である、生体触媒反応溶液における条件（例えば、酵素負荷、基質負荷、補助因子負荷、温度、ｐＨ、緩衝剤、共溶媒などの範囲）を指す。例示的な「適切な反応条件」は、本開示に提示され、実施例によって例示される。

【0088】

本明細書で使用される場合、「化合物負荷」、「酵素負荷」または「補助因子負荷」におけるものなどの「負荷」は、反応の開始時の反応混合物中の成分の濃度または量を指す。

【0089】

本明細書で使用される場合、「基質」は、生体触媒媒介性プロセスに関しては、生体触媒が作用する化合物または分子を指す。

【0090】

本明細書で使用される場合、「生成物」は、生体触媒媒介性プロセスに関しては、生体触媒の作用によって生じた化合物または分子を指す。

【0091】

本明細書で使用される場合、「平衡化」は、本明細書で使用される場合、立体異性体の相互変換を含めた、化学反応または酵素反応において化学種の定常状態の濃度をもたらすプロセス（例えば、ＡとＢの２つの種の相互変換）を指し、化学反応または酵素反応の正の速度定数および逆の速度定数によって決定される。

【0092】

「トランスアミナーゼ」または「アミノトランスフェラーゼ」は、本明細書では、互換的に使用され、アミノ基（－ＮＨ_２）、電子対、およびプロトンをアミン供与体化合物の第一級アミンからアミン受容体化合物のカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）に転移させ、それにより、アミン供与体化合物をその対応するカルボニル化合物に変換し、カルボニル受容体化合物をその対応する第一級アミン化合物に変換する酵素能を有するポリペプチドを指す（例えば、スキーム１を参照されたい）。トランスアミナーゼは、本明細書で使用される場合、天然に存在する（野生型）トランスアミナーゼならびに人間による操作によって作出された天然に存在しない操作されたポリペプチドを包含する。

【0093】

「アミノ基供与体」または「アミノ供与体」は、本明細書では互換的に使用され、受容体であるカルボニル化合物（すなわち、アミノ基受容体）にアミノ基を供与することが可能であり、それにより、カルボニル副生成物になる、アミノ基含有化合物を指す。アミノ基供与体は、一般構造式

【化5】

を有し、式中、Ｒ^１、およびＲ^２はそれぞれ、独立に考えると、置換されていないまたは１つもしくは複数の酵素を阻害しない基で置換されたアルキル、アルキルアリール基、またはアリール基である。Ｒ^１は、Ｒ^２と構造またはキラリティーが同じであっても異なってもよい。Ｒ^１基およびＲ^２基は、まとめて考えると、置換されていない、置換された、または他の環と縮合した環を形成し得る。典型的なアミノ基供与体としては、キラルおよびアキラルアミノ酸、ならびにキラルおよびアキラルアミンが挙げられる。

【0094】

「キラルアミン」は、一般構造式、

【化6】

を有する化合物を含有するアミノ基を指し、式中、Ｒ^１、およびＲ^２のそれぞれは、独立に考えると、置換されていないまたは１つもしくは複数の基で置換されたアルキル、アルキルアリール基、またはアリール基である。Ｒ^１はＲ^２と構造が異なり、アミノ基を負う炭素（＊で示される）が立体中心になる。Ｒ^１基およびＲ^２基は、まとめて考えると、置換されていない、置換された、または他の環と縮合した環を形成し得るが、他の点では対称的ではない。

【0095】

「カルボニル副生成物」は、アミノ基供与体から、アミノ基転移反応においてアミノ基供与体のアミノ基がアミノ基受容体に転移されると形成されるカルボニル化合物を指す。カルボニル副生成物は、一般構造式、

【化7】

を有し、式中、Ｒ^１およびＲ^２はアミノ基供与体に関して上で定義されている。

【0096】

「アミノ受容体」および「アミン受容体」、「ケト基質」は、本明細書では、互換的に使用され、トランスアミナーゼによって媒介される反応においてアミノ基供与体からアミノ基を受容するカルボニル基含有化合物を指す（例えば、スキーム１を参照されたい）。本開示に関しては、トランスアミナーゼに対するアミノ受容体化合物として、とりわけ、化合物（２）が挙げられる。

【0097】

「補助因子」は、本明細書で使用される場合、触媒反応において酵素と組み合わさって作動する非タンパク質化合物を指す。本明細書で使用される場合、「補助因子」は、時には補酵素とも称される、ビタミンＢ_６ファミリー化合物であるＰＬＰ、ＰＮ、ＰＬ、ＰＭ、ＰＮＰ、およびＰＭＰを包含することが意図されている。

【0098】

「ピリドキサール－リン酸」、「ＰＬＰ」、「ピリドキサール－５’－リン酸」、「ＰＹＰ」、および「Ｐ５Ｐ」は、本明細書では、互換的に使用され、トランスアミナーゼ反応において補助因子として作用する化合物を指す。一部の実施形態では、ピリドキサールリン酸は、構造１－（４’－ホルミル－３’－ヒドロキシ－２’－メチル－５’－ピリジル）メトキシホスホン酸、ＣＡＳ番号［５４－４７－７］によって定義される。ピリドキサール－５’－リン酸は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ピリドキソール（ビタミンＢ_６としても公知）のリン酸化および酸化によって生成される。トランスアミナーゼ酵素を使用したアミノ基転移反応では、アミノ供与体のアミン基が補助因子に転移されてケト副生成物が生成し、一方、ピリドキサール－５’－リン酸がピリドキサミンリン酸に変換される。ピリドキサール－５’－リン酸は異なるケト化合物（アミノ受容体）との反応によって再生される。ピリドキサミンリン酸からアミノ受容体生成物へのアミン基の転移によりアミンが生成し、補助因子が再生される。一部の実施形態では、ピリドキサール－５’－リン酸を、ピリドキシン（ＰＮ）、ピリドキサール（ＰＬ）、ピリドキサミン（ＰＭ）を含めたビタミンＢ_６ファミリーの他のメンバー、ならびにそれらのリン酸化された対応物；ピリドキシンリン酸（ＰＮＰ）、およびピリドキサミンリン酸（ＰＭＰ）で置き換えることができる。

【0099】

「アルキル」は、直鎖または分枝のいずれかの炭素原子１～１８個、特に炭素原子１～８個、より詳細には炭素原子１～６個の基を指す。指定数の炭素原子を有するアルキルは括弧内に示される（例えば、（Ｃ１～Ｃ４）アルキルは、炭素原子１～４個のアルキルを指す）。

【0100】

「アルケニル」は、少なくとも１つの二重結合を含有するが、必要に応じて１つよりも多くの二重結合を含有する直鎖または分枝のいずれかの、炭素原子２～１２個の基を指す。

【0101】

「アルキニル」は、少なくとも１つの三重結合を含有するが、必要に応じて１つよりも多くの三重結合を含有し、必要に応じて、１つまたは複数の二重結合部分を含有する、直鎖または分枝のいずれかの炭素原子２～１２個の基を指す。

【0102】

「アリール」は、単一の環（例えば、フェニル）または複数の縮合環（例えば、ナフチルまたはアントリル）を有する炭素原子５～１４個の不飽和型の芳香族炭素環基を指す。複数の縮合環に関しては、環のうちの少なくとも１つは芳香族である。代表的なアリールとしては、フェニル、ピリジル、ナフチルなどが挙げられる。

【0103】

「アリールアルキル」は、アリール部分による置換を有するアルキルを指す。代表的なアリールアルキル基としては、ベンジル、フェネチルなどが挙げられる。

【0104】

「アリールアルケニル」は、アリール基による置換を有する、本明細書で定義されているアルケニルを指す。

【0105】

「アリールアルキニル」は、アリール基による置換を有する、本明細書で定義されているアルキニルを指す。

【0106】

「ヘテロアリール」は、環内に酸素、窒素および硫黄から選択される環ヘテロ原子を１～４個含有する、環原子５～１４個の芳香族複素環基を指す。ヘテロアリール基は、単一の環（例えば、ピリジルまたはフリル）または複数の縮合環（例えば、インドリジニルまたはベンゾチエニル）を有し得る。複数の縮合環に関しては、環のうちの少なくとも１つは芳香族である。

【0107】

「ヘテロアリールアルキル」は、本明細書で定義されているヘテロアリール部分による置換を有するアルキルを指す。

【0108】

「ヘテロアリールアルケニル」は、本明細書で定義されているヘテロアリール基による置換を有するアルケニルを指す。

【0109】

「ヘテロアリールアルキニル」は、本明細書で定義されているヘテロアリール部分による置換を有するアルキニルを指す。

【0110】

「シクロアルキル」は、単一の環または複数の縮合環を有する炭素原子３～１２個の環状アルキル基を指す。代表的なシクロアルキル基としては、例として、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロオクチル、１－メチルシクロプロピル、２－メチルシクロペンチル、２－メチルシクロオクチルなどの単一の環構造、またはアダマンチルなどの架橋した環系を含めた複数の環構造が挙げられる。

【0111】

「複素環」および互換的に「ヘテロシクロアルキル」は、環内に窒素、硫黄または酸素から選択されるヘテロ原子を１～４個有する、環原子３～１４個の単一の環または複数の縮合環を有する飽和または不飽和基を指す。複素環基は、単一の環（例えば、ピペリジニルまたはテトラヒドロフリル）または複数の縮合環（例えば、インドリニル、ジヒドロベンゾフランまたはキヌクリジニル）を有し得る。代表的な複素環およびヘテロアリールとしては、これだけに限定されないが、フラン、チオフェン、チアゾール、オキサゾール、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドリジン、イソインドール、インドール、インダゾール、プリン、キノリジン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチルピリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、プテリジン、カルバゾール、カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、フェナントロリン、イソチアゾール、フェナジン、イソキサゾール、フェノキサジン、フェノチアジン、イミダゾリジン、イミダゾリン、ピペリジン、ピペラジン、ピロリジン、インドリンなどが挙げられる。

【0112】

「シクロアルキルアルキル」は、本明細書で定義されているシクロアルキル部分による置換を有するアルキルを指す。

【0113】

「シクロアルキルアルケニル」は、本明細書で定義されているシクロアルキル部分による置換を有するアルケニルを指す。

【0114】

「シクロアルキルアルキニル」は、本明細書で定義されているシクロアルキル部分による置換を有するアルキニルを指す。

【0115】

「ヘテロシクロアルキルアルキル」は、本明細書で定義されているヘテロシクロアルキル部分による置換を有するアルキルを指す。

【0116】

「ヘテロシクロアルケニル（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｏａｌｋｅｎｙｌ）」は、本明細書で定義されているヘテロシクロアルキル部分による置換を有するアルケニルを指す。

【0117】

「ヘテロシクロアルキルアルキニル」は、本明細書で定義されているヘテロシクロアルキル部分による置換を有するアルキニルを指す。

【0118】

「アルコキシ」または「アルキルオキシ」は、アルキル－Ｏ－基を指し、ここで、アルキル基は上で定義されており、必要に応じて、同じく上で定義されている置換アルキル基を含む。

【0119】

「アミノ」は、－ＮＨ_２基を指す。置換アミノは、－ＮＨＲ’、ＮＲ’Ｒ’、およびＮＲ’Ｒ’Ｒ’基を指し、ここで、各Ｒ’は、他とは独立に、置換または非置換アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキルアルキル、アルキルオキシ、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、アシル、アルキルオキシカルボニル、スルファニル、スルフィニル、スルホニルなどから選択される。典型的なアミノ基としては、これだけに限定されないが、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、トリメチルアンモニウム、トリエチルアンモニウム、メチルスルホニルアミノ、フラニル－オキシ－スルフアミノなどが挙げられる。

【0120】

「カルボキシ」は、－ＣＯＯＨを指す。

【0121】

「カルボニル」は、－Ｃ（Ｏ）－を指し、種々の置換基を有して、酸、酸ハロゲン化物、アルデヒド、アミド、エステル、およびケトンを含めた異なるカルボニル基を形成していてもよい。

【0122】

「ヒドロキシ」は、－ＯＨを指す。

【0123】

「シアノ」は、－ＣＮを指す。

【0124】

「ハロゲン」または「ハロ」は、フルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードを指す。

【0125】

「スルホニル」は、－ＳＯ_２－を指す。置換スルホニルは、－ＳＯ_２Ｒ’を指し、ここで、Ｒ’は下記の適切な置換基である。

【0126】

融合アリールまたは融合ヘテロアリールなどの「融合（ｆｕｓｅｄ）」または「融合環（ｆｕｓｅｄ ｒｉｎｇ）」は、少なくとも２つの共通する環原子を有するように接合した２つまたはそれよりも多くの環を指す。縮合アリールは、環のうちの少なくとも１つがアリールである融合環（ｆｕｓｅｄ ｒｉｎｇ）を指す。融合ヘテロアリールは、環のうちの少なくとも１つがヘテロアリールである融合環（ｆｕｓｅｄ ｒｉｎｇ）を指す。

【0127】

「置換」は、別段の指定がない限り、前の基で水素に占有されていた位置の、これだけに限定されないが、ヒドロキシ、オキソ、ニトロ、メトキシ、エトキシ、アルキルオキシ、置換アルキルオキシ、トリフルオロメトキシ、ハロアルキルオキシ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、ハロ、メチル、エチル、プロピル、ブチル、アルキル、アルケニル、アルキニル、置換アルキル、トリフルオロメチル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルキルオキシアルキル、チオ、アルキルチオ、アシル、カルボキシ、アルキルオキシカルボニル、カルボキシアミド、置換カルボキシアミド、アルキルスルホニル、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニルアミノ、スルホンアミド、置換スルホンアミド、シアノ、アミノ、置換アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、アシルアミノ、アミジノ、アミドキシム、ヒドロキサモイル、フェニル、アリール、置換アリール、アリールオキシ、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ピリジル、イミダゾリル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルキルオキシ、ピロリジニル、ピペリジニル、モルホリノ、複素環、（複素環）オキシ、および（複素環）アルキルによって例示される置換基での置換えを指し、好ましいヘテロ原子は、酸素、窒素、および硫黄である。これらの置換基に開放原子価が存在する場合、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、および／または複素環基でさらに置換することができること、これらの開放原子価が炭素に存在する場合、ハロゲンによって、および酸素結合置換基、窒素結合置換基、または硫黄結合置換基によってさらに置換することができること、ならびに、そのような開放原子価が複数存在する場合、これらの基を、直接の結合の形成によってか、または新しいヘテロ原子、好ましくは酸素、窒素、もしくは硫黄との結合の形成によって接合して、環を形成することができることが理解される。さらに、上記の置換は、水素を置換基で置き換えることにより、本開示の分子に許容されない不安定性が導入されないこと、および、他の点では化学的に合理的であることを条件として行うことができることが理解される。

【0128】

「必要に応じた」または「必要に応じて」は、その後に記載される事象または状況が存在しても存在しなくてもよいこと、および前記事象または状況が存在する場合および前記事象または状況が存在しない場合が記載に含まれることを意味する。１つまたは複数の必要に応じた置換基を含有すると記載されている任意の分子に関して、立体的に実用的かつ／または合成的に実行可能な化合物のみが含まれることが意図されていることが当業者には理解されよう。「必要に応じて置換された」は、用語または一連の化学基におけるその後の全ての修飾語を指す。例えば、「必要に応じて置換されたアリールアルキル」という用語に関しては、分子の「アルキル」部分および「アリール」部分が置換されていてもよく、置換されていなくてもよく、また、一連の「必要に応じて置換されたアルキル、シクロアルキル、アリールおよびヘテロアリール」については、アルキル基、シクロアルキル基、アリール基、およびヘテロアリール基が、他とは独立に、置換されていてもよく、置換されていなくてもよい。

【0129】

「保護基」は、分子内の反応性官能基に付着させた場合に官能基の反応性を遮蔽する、低下させるまたは妨げる原子の群を指す。一般には、保護基は、合成の過程中、所望の通り選択的に除去することができる。保護基の例は当技術分野で公知である（例えば、Ｗｕｔｓ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｅ， ”Ｇｒｅｅｎｅ’ｓ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，” ４^ｔｈ Ｅｄ．， Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ ［２００６］、およびＨａｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ， Ｖｏｌｓ． １－８， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ＮＹ ［１９７１－１９７６］）。保護基を有し得る官能基としては、これだけに限定されないが、ヒドロキシ基、アミノ基、およびカルボキシ基が挙げられる。代表的なアミノ保護基としては、これだけに限定されないが、ホルミル、アセチル、トリフルオロアセチル、ベンジル、ベンジルオキシカルボニル（「ＣＢＺ」）、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル（「Ｂｏｃ」）、トリメチルシリル（「ＴＭＳ」）、２－トリメチルシリル－エタンスルフォニル（「ＳＥＳ」）、トリチルおよび置換トリチル基、アリルオキシカルボニル、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル（「ＦＭＯＣ」）、ニトロ－ベラトリロキシカルボニル（「ＮＶＯＣ」）などが挙げられる。代表的なヒドロキシル保護基としては、これだけに限定されないが、ヒドロキシル基をアシル化する場合（例えば、メチルおよびエチルエステル、酢酸もしくはプロピオン酸基もしくはグリコールエステル）、または、例えば、ベンジルおよびトリチルエーテル、ならびにアルキルエーテル、テトラヒドロピラニルエーテル、トリアルキルシリルエーテル（例えば、ＴＭＳまたはＴＩＰＰＳ基）およびアリルエーテルなど、アルキル化する場合が挙げられる。他の保護基は、本明細書で言及されている参考文献に見出すことができる。

【0130】

「脱離基」とは、一般に、化学反応において別の原子または部分によって除くことが可能な任意の原子または部分を指す。より詳細には、脱離基は、求核剤（例えば、アミン、チオール、アルコール、またはシアン化物）によって容易に除かれ、置換される原子または部分を指す。そのような脱離基は周知であり、それらとして、カルボン酸、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（「ＮＨＳ」）、Ｎ－ヒドロキシベンゾトリアゾール、ハロゲン（フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素）、およびアルキルオキシ基が挙げられる。脱離基の非限定的な特徴および例は当技術分野で公知であり、また、種々の化学テキストに記載されている。
操作されたトランスアミナーゼポリペプチド

【0131】

本開示は、一部の実施形態では化合物（２）を含み得るキラルアミン生成物を生成するためのアミノ受容体基質化合物の選択的アミノ基転移に有用な、トランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチド（本明細書では「操作されたトランスアミナーゼポリペプチド」とも称される）を提供する。したがって、一態様では、本開示は、スキーム２に示されている通り基質化合物（１）を生成物である化合物（２）に変換することが可能な、トランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。さらに、本開示は、操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドを含む関連するベクターおよび宿主細胞、操作されたポリペプチドを作製する方法、ならびに、適切な反応条件を含めた、操作されたポリペプチドを使用するための方法を提供する。

【0132】

本開示の操作されたポリペプチドは、Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ ＪＳ１７の野生型トランスアミナーゼポリペプチド（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＥＡ３９１８３．１、ＧＩ：３２７２０７０６６；配列番号２）と比較して、および、本開示の操作されたポリペプチドの定向進化のための出発骨格配列として使用した配列番号４の参照の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドと比較しても、酵素特性の改善（例えば、立体選択性の増大など）を有するように操作された、天然に存在しないトランスアミナーゼである。配列番号４の参照の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ ＪＳ１７の野生型トランスアミナーゼ（配列番号２）と比べて以下の１１個のアミノ酸の差異を有する：Ａ９Ｔ、Ｎ４５Ｈ、Ｗ５７Ｌ、Ｆ８６Ｓ、Ｒ８８Ｈ、Ｖ１５３Ａ、Ｖ１７７Ｌ、Ｒ２１１Ｋ、Ｍ２９４Ｖ、Ｓ３２４Ｇ、およびＴ３９１Ａ。

【0133】

本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、配列番号４ある特定の工業的に妥当な条件下での化合物（１）の化合物（２）への効率的な変換のために定向進化によって作出されたものであり、参照の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドと比較して１つまたは複数の残基の差異を有する。これらの残基の差異は、種々の酵素特性の改善、特に、活性の増大、立体選択性の増大、安定性の増大、および基質および／または生成物濃度の上昇に対する耐性（例えば、生成物による阻害の低減）に関連する。したがって、一部の実施形態では、トランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、適切な反応条件下で、参照ポリペプチド（例えば、配列番号２、４、８、３６６、および／または６５０）の活性と比べて少なくとも約１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、またはそれよりも大きな活性で、基質化合物（１）を化合物（２）に変換することができる。一部の実施形態では、トランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、適切な反応条件下、約４８時間、約３６時間、約２４時間、またはさらにはより短い時間の長さの反応時間で、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の変換パーセントで、化合物（１）である基質を化合物（２）に変換することができる。一部の実施形態では、トランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、適切な反応条件下、少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも大きなジアステレオマー過剰で、化合物（１）を化合物（２）に変換することができる。

【0134】

本開示は、偶数の配列識別子配列番号６～９３６のアミノ酸配列を含む多数の例示的な操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを提供する。これらの例示的な操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、参照配列（例えば、配列番号２、４、８、３６６、および／または６５０）と比較した、化合物（１）の化合物（２）への変換に関する特性の改善に関連する以下の残基の差異のうちの１つまたは複数を含むアミノ酸配列を含む。

【0135】

一部の場合では、例示的な操作されたポリペプチドは、参照配列（例えば、配列番号２、４、８、３６６、および／または６５０）と比較して１つまたは複数の残基の差異をさらに含むアミノ酸配列を有する。一部の場合では、例示的な操作されたポリペプチドは、参照配列（例えば、配列番号２、４、８、３６６、および／または６５０）と比較して１つまたは複数の残基の差異をさらに含むアミノ酸配列を有する。

【0136】

一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、配列番号２、４、８、３６６、および／または６５０から選択される参照配列と少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも大きく同一であるアミノ酸配列を含み、ここで、ポリペプチドは、トランスアミナーゼ活性、および、本明細書に記載の特性の改善のうちの１つまたは複数、例えば、参照配列（例えば、配列番号２、４、８、３６６、および／または６５０のポリペプチド）と比較して増大した活性で、化合物（１）を生成物である化合物（２）に変換する能力、を有する。一部の実施形態では、参照配列は配列番号２である。一部の実施形態では、参照配列は配列番号４である。一部の実施形態では、参照配列は配列番号８である。一部の実施形態では、参照配列は配列番号３６６である。一部の実施形態では、参照配列は配列番号６５０である。

【0137】

一部の実施形態では、アミノ酸配列を含む操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、配列番号２、４、８、３６６、および／または６５０と比較して１つまたは複数のアミノ酸残基の差異を有する。一部の実施形態では、本開示は、参照配列である配列番号２、４、８、３６６、および／または６５０に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも大きな配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに（ａ）本明細書に提示される置換から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基の差異（例えば、表２－１、２－２、３－１、３－２、４－１、４－２、５－１、および／または５－２を参照されたい）を含む、トランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。

【0138】

一部の実施形態では、本開示は、１８、２０、２１、２１／２３／５６／１４６、２１／２３／５６／１４６／４３２、２１／２３／１４６／４１７、２１／２３／３９５／４１７／４３２、２１／５３／５６、２１／５３／４１７、２１／５６／３９５、２１／４１７／４３２、２３、２３／５３、２３／５３／５６、２３／５３／５６／１４６／３９５、２３／５３／３９５、２３／５３／４１７、２３／５３／４３２、２３／５６、２３／５６／３９５、２３／５６／３９５／４１７、２３／３９５／４１７、２３／４１７、２３／４１７／４３２、５３、５３／５６、５３／１４６／４１７、５３／３９５、５６、５６／７４／２４１／２８６／３１４／３１６／３２３、５６／８６／１６３／３１４／３１６／３８３／４１４／４１６／４２２、５６／８６／２８６／３１４／４１４／４１６、５６／８６／３１４／３１６／３２３／３９４／４１４／４２２、５６／１４６／４１７、５６／１４６／４３２、５６／１４７、５６／１６３、５６／１６３／２８６／３１６／３２３／３８３／３９４、５６／２８６／３１４／３１６／３２３／４２２、５６／２８６／３８３、５６／３２３、５６／３２３／３８３、５６／３２３／３８３／３９４、５６／３８３、５６／３９５、７４／８１／２８６／３１６／３２３／３８３、７４／８５／８６／１６３／２８６／３１６／３２３／３９４、７４／８５／３１４／３１６／４１４／４１６、７４／８６／１６３／３１６、７４／８６／３１６／３２３／３８３／３９４、７４／８８／２８６／３１６／３２３／３８３、７４／８８／３２３／３８３、７４／１６３／２８６／３１６／３８３／３９４／４１６、７４／１６３／３１４／３１６、７４／１６３／３１４／３１６／３２３／３９４、７４／１６３／３１４／３２３／３８３／４１４／４１６、７４／２８６、７４／２８６／３１６／３２３、７４／２８６／３９４／４１６、７４／３１４／３２３／３８３／３９４／４１４、７４／３１６／３２３／３９４、８５／８６／８８／１６３／３２３／３８３／３９４、８５／８６／１６３／３１４／３２３／３９４／４１４、８５／２８６、８５／２８６／３２３、８６、８６／８８／１６３／３２３／３８３／４１４／４２２、８６／３８３／３９４、８８、８８／１６３／２８６／３８３、８８／２８６／３１６／３２３、８８／２８６／３１６／３２３／３８３／４１４／４１６、８８／３１６／３２３、１４６、１４６／１４７／３９５／４１７、１４６／３９５、１４６／３９５／４１７、１４６／４１７、１４７／３９５／４１７／４３２、１４７／４１７、１４９、１５７、１６３、１６３／２２２／２８６／３１６／３２３／３８３／３９４、１６３／２８６、１６３／２８６／３１４／３１６／３２３／４１４／４１６、１６３／２８６／３１４／３２３／３９４、１６３／２８６／３１６／３２３／３９４／４１６、１６３／２８６／４１４、１６３／３１４／３１６／３９４、１６３／３１４／３２３／３９４、１６３／３１４／３８３、１６３／３１４／４１４、１６３／３１６／３２３、１６３／３２３、１６３／３８３、１６４、１９９／４１７、２５９、２６０、２８４、２８６、２８６／３１４／３２３／３８３、２８６／３１４／３９４、２８６／３１６／３２３／３８３／４１４／４１６、２８６／３１６／３８３／３９４、２８６／３１６／３９４／４１４／４１６、２８６／３２３、２８６／３２３／３８３／４１４、２８６／３２３／４１６、２８６／３８３、２８６／４１６、３１４／３１６、３１４／３１６／３２３、３１４／３１６／３２３／３８３／４２２、３１４／３１６／３２３／３９４、３１４／３１６／３９４、３１４／３２３／３８３／３９４、３１４／３８３、３１４／３８３／４１４／４２２、３１５、３１６、３１６／３２３／３８３／３９４、３１６／３２３／３９４／４１４／４１６、３１６／４１４／４２２、３２３、３２３／３８３、３２３／３８３／３９４／４１４／４１６、３２３／３９４、３８３、３９５、３９５／４１７、３９５／４１７／４３２、４００、４０１、４０３、４０４、４０５、４０６、４０８、４１５、４１７、４１７／４３２、４２０、および４２２から選択される、配列番号４と比較した１つまたは複数のアミノ酸残基の差異を有するアミノ酸配列を含む、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを提供し、ここで、位置は、配列番号４を基準に番号付けされる。一部の実施形態では、アミノ酸の差異は、置換１８Ａ、２０Ｃ、２１Ｈ、２１Ｐ／２３Ｓ／５６Ｃ／１４６Ｈ、２１Ｐ／２３Ｓ／５６Ｃ／１４６Ｈ／４３２Ｖ、２１Ｐ／２３Ｓ／１４６Ｈ／４１７Ｖ、２１Ｐ／２３Ｓ／３９５Ｄ／４１７Ｓ／４３２Ｖ、２１Ｐ／５３Ｃ／５６Ｃ、２１Ｐ／５３Ｃ／４１７Ｓ、２１Ｐ／５６Ｃ／３９５Ｄ、２１Ｐ／４１７Ｓ／４３２Ｖ、２１Ｒ、２３Ａ、２３Ｒ、２３Ｓ／５３Ｃ、２３Ｓ／５３Ｃ／５６Ｃ、２３Ｓ／５３Ｃ／５６Ｃ／１４６Ｈ／３９５Ｄ、２３Ｓ／５３Ｃ／３９５Ｄ、２３Ｓ／５３Ｃ／４１７Ｓ、２３Ｓ／５３Ｃ／４３２Ｖ、２３Ｓ／５６Ｃ、２３Ｓ／５６Ｃ／３９５Ｄ、２３Ｓ／５６Ｃ／３９５Ｄ／４１７Ｖ、２３Ｓ／３９５Ｄ／４１７Ｓ、２３Ｓ／４１７Ｓ、２３Ｓ／４１７Ｖ、２３Ｓ／４１７Ｖ／４３２Ｖ、５３Ｃ、５３Ｃ／５６Ｃ、５３Ｃ／１４６Ｈ／４１７Ｓ、５３Ｃ／３９５Ｄ、５６Ａ、５６Ａ／７４Ｔ／２４１Ｖ／２８６Ｓ／３１４Ｒ／３１６Ｗ／３２３Ｔ、５６Ａ／８６Ａ／１６３Ｆ／３１４Ｒ／３１６Ｗ／３８３Ｖ／４１４Ｖ／４１６Ａ／４２２Ａ、５６Ａ／８６Ａ／２８６Ｓ／３１４Ｒ／４１４Ｖ／４１６Ａ、５６Ａ／８６Ａ／３１４Ｒ／３１６Ｗ／３２３Ｔ／３９４Ｇ／４１４Ｖ／４２２Ａ、５６Ａ／１６３Ｆ、５６Ａ／１６３Ｆ／２８６Ｓ／３１６Ｗ／３２３Ｔ／３８３Ｖ／３９４Ｇ、５６Ａ／２８６Ｓ／３１４Ｒ／３１６Ｗ／３２３Ｔ／４２２Ａ、５６Ａ／２８６Ｓ／３８３Ｖ、５６Ａ／３２３Ｔ、５６Ａ／３２３Ｔ／３８３Ｖ、５６Ａ／３２３Ｔ／３８３Ｖ／３９４Ｇ、５６Ａ／３８３Ｖ、５６Ｃ、５６Ｃ／１４６Ｈ／４１７Ｖ、５６Ｃ／１４６Ｈ／４３２Ｖ、５６Ｃ／１４７Ｒ、５６Ｃ／３９５Ｄ、５６Ｔ、５６Ｖ、７４Ｔ／８１Ｓ／２８６Ｓ／３１６Ｗ／３２３Ｔ／３８３Ｖ、７４Ｔ／８５Ｖ／８６Ａ／１６３Ｆ／２８６Ｓ／３１６Ｗ／３２３Ｔ／３９４Ｇ、７４Ｔ／８５Ｖ／３１４Ｒ／３１６Ｗ／４１４Ｖ／４１６Ａ、７４Ｔ／８６Ａ／１６３Ｆ／３１６Ｗ、７４Ｔ／８６Ａ／３１６Ｗ／３２３Ｔ／３８３Ｖ／３９４Ｇ、７４Ｔ／８８Ｒ／２８６Ｓ／３１６Ｗ／３２３Ｔ／３８３Ｖ、７４Ｔ／８８Ｒ／３２３Ｔ／３８３Ｖ、７４Ｔ／１６３Ｆ／２８６Ｓ／３１６Ｗ／３８３Ｖ／３９４Ｇ／４１６Ａ、７４Ｔ／１６３Ｆ／３１４Ｒ／３１６Ｗ、７４Ｔ／１６３Ｆ／３１４Ｒ／３１６Ｗ／３２３Ｔ／３９４Ｇ、７４Ｔ／１６３Ｆ／３１４Ｒ／３２３Ｔ／３８３Ｖ／４１４Ｖ／４１６Ａ、７４Ｔ／２８６Ｓ、７４Ｔ／２８６Ｓ／３１６Ｗ／３２３Ｔ、７４Ｔ／２８６Ｓ／３９４Ｇ／４１６Ａ、７４Ｔ／３１４Ｒ／３２３Ｔ／３８３Ｖ／３９４Ｇ／４１４Ｖ、７４Ｔ／３１６Ｗ／３２３Ｔ／３９４Ｇ、８５Ｖ／８６Ａ／８８Ｒ／１６３Ｆ／３２３Ｔ／３８３Ｖ／３９４Ｇ、８５Ｖ／８６Ａ／１６３Ｆ／３１４Ｒ／３２３Ｔ／３９４Ｇ／４１４Ｖ、８５Ｖ／２８６Ｓ、８５Ｖ／２８６Ｓ／３２３Ｔ、８６Ａ／８８Ｒ／１６３Ｆ／３２３Ｔ／３８３Ｖ／４１４Ｖ／４２２Ａ、８６Ａ／３８３Ｖ／３９４Ｇ、８６Ｇ、８８Ｒ／１６３Ｆ／２８６Ｓ／３８３Ｖ、８８Ｒ／２８６Ｓ／３１６Ｗ／３２３Ｔ、８８Ｒ／２８６Ｓ／３１６Ｗ／３２３Ｔ／３８３Ｖ／４１４Ｖ／４１６Ａ、８８Ｒ／３１６Ｗ／３２３Ｔ、８８Ｓ、８８Ｔ、１４６Ｈ、１４６Ｈ／１４７Ｒ／３９５Ｄ／４１７Ｓ、１４６Ｈ／３９５Ｄ、１４６Ｈ／３９５Ｄ／４１７Ｓ、１４６Ｈ／４１７Ｓ、１４６Ｈ／４１７Ｖ、１４７Ｒ／３９５Ｄ／４１７Ｓ／４３２Ｖ、１４７Ｒ／４１７Ｓ、１４９Ｓ、１５７Ａ、１６３Ｆ、１６３Ｆ／２２２Ｖ／２８６Ｓ／３１６Ｗ／３２３Ｔ／３８３Ｖ／３９４Ｇ、１６３Ｆ／２８６Ｓ、１６３Ｆ／２８６Ｓ／３１４Ｒ／３１６Ｗ／３２３Ｔ／４１４Ｖ／４１６Ａ、１６３Ｆ／２８６Ｓ／３１４Ｒ／３２３Ｔ／３９４Ｇ、１６３Ｆ／２８６Ｓ／３１６Ｗ／３２３Ｔ／３９４Ｇ／４１６Ａ、１６３Ｆ／２８６Ｓ／４１４Ｖ、１６３Ｆ／３１４Ｒ／３１６Ｗ／３９４Ｇ、１６３Ｆ／３１４Ｒ／３２３Ｔ／３９４Ｇ、１６３Ｆ／３１４Ｒ／３８３Ｖ、１６３Ｆ／３１４Ｒ／４１４Ｖ、１６３Ｆ／３１６Ｗ／３２３Ｔ、１６３Ｆ／３２３Ｔ、１６３Ｆ／３８３Ｖ、１６３Ｌ、１６３Ｍ、１６４Ａ、１６４Ｄ、１６４Ｑ、１６４Ｓ、１９９Ｖ／４１７Ｓ、２５９Ｖ、２６０Ｔ、２８４Ａ、２８６Ｓ、２８６Ｓ／３１４Ｒ／３２３Ｔ／３８３Ｖ、２８６Ｓ／３１４Ｒ／３９４Ｇ、２８６Ｓ／３１６Ｗ／３２３Ｔ／３８３Ｖ／４１４Ｖ／４１６Ａ、２８６Ｓ／３１６Ｗ／３８３Ｖ／３９４Ｇ、２８６Ｓ／３１６Ｗ／３９４Ｇ／４１４Ｖ／４１６Ａ、２８６Ｓ／３２３Ｔ、２８６Ｓ／３２３Ｔ／３８３Ｖ／４１４Ｖ、２８６Ｓ／３２３Ｔ／４１６Ａ、２８６Ｓ／３８３Ｖ、２８６Ｓ／４１６Ａ、３１４Ｒ／３１６Ｗ、３１４Ｒ／３１６Ｗ／３２３Ｔ、３１４Ｒ／３１６Ｗ／３２３Ｔ／３８３Ｖ／４２２Ａ、３１４Ｒ／３１６Ｗ／３２３Ｔ／３９４Ｇ、３１４Ｒ／３１６Ｗ／３９４Ｇ、３１４Ｒ／３２３Ｔ／３８３Ｖ／３９４Ｇ、３１４Ｒ／３８３Ｖ、３１４Ｒ／３８３Ｖ／４１４Ｖ／４２２Ａ、３１５Ｇ、３１５Ｒ、３１６Ａ、３１６Ｆ、３１６Ｇ、３１６Ｈ、３１６Ｌ、３１６Ｎ、３１６Ｒ、３１６Ｖ、３１６Ｗ／３２３Ｔ／３８３Ｖ／３９４Ｇ、３１６Ｗ／３２３Ｔ／３９４Ｇ／４１４Ｖ／４１６Ａ、３１６Ｗ／４１４Ｖ／４２２Ａ、３２３Ｃ、３２３Ｓ、３２３Ｔ、３２３Ｔ／３８３Ｖ、３２３Ｔ／３８３Ｖ／３９４Ｇ／４１４Ｖ／４１６Ａ、３２３Ｔ／３９４Ｇ、３８３Ｖ、３９５Ｄ、３９５Ｄ／４１７Ｓ、３９５Ｄ／４１７Ｓ／４３２Ｖ、３９５Ｄ／４１７Ｖ、４００Ｄ、４０１Ａ、４０１Ｋ、４０１Ｓ、４０３Ｖ、４０４Ｓ、４０５Ｈ、４０５Ｗ、４０６Ｓ、４０８Ｆ、４０８Ｌ、４０８Ｗ、４１５Ｇ、４１５Ｗ、４１７Ａ、４１７Ｓ、４１７Ｓ／４３２Ｖ、４１７Ｖ、４１７Ｖ／４３２Ｖ、４２０Ｇ、４２２Ｌ、および４２２Ｔ、ならびに４２４Ｒを含み、ここで、位置は、配列番号４を基準に番号付けされる。一部の追加的な実施形態では、アミノ酸の差異は、置換Ｇ１８Ａ、Ｔ２０Ｃ、Ｄ２１Ｈ、Ｄ２１Ｐ／Ｐ２３Ｓ／Ｌ５６Ｃ／Ｒ１４６Ｈ、Ｄ２１Ｐ／Ｐ２３Ｓ／Ｌ５６Ｃ／Ｒ１４６Ｈ／Ａ４３２Ｖ、Ｄ２１Ｐ／Ｐ２３Ｓ／Ｒ１４６Ｈ／Ｌ４１７Ｖ、Ｄ２１Ｐ／Ｐ２３Ｓ／Ｇ３９５Ｄ／Ｌ４１７Ｓ／Ａ４３２Ｖ、Ｄ２１Ｐ／Ｎ５３Ｃ／Ｌ５６Ｃ、Ｄ２１Ｐ／Ｎ５３Ｃ／Ｌ４１７Ｓ、Ｄ２１Ｐ／Ｌ５６Ｃ／Ｇ３９５Ｄ、Ｄ２１Ｐ／Ｌ４１７Ｓ／Ａ４３２Ｖ、Ｄ２１Ｒ、Ｐ２３Ａ、Ｐ２３Ｒ、Ｐ２３Ｓ／Ｎ５３Ｃ、Ｐ２３Ｓ／Ｎ５３Ｃ／Ｌ５６Ｃ、Ｐ２３Ｓ／Ｎ５３Ｃ／Ｌ５６Ｃ／Ｒ１４６Ｈ／Ｇ３９５Ｄ、Ｐ２３Ｓ／Ｎ５３Ｃ／Ｇ３９５Ｄ、Ｐ２３Ｓ／Ｎ５３Ｃ／Ｌ４１７Ｓ、Ｐ２３Ｓ／Ｎ５３Ｃ／Ａ４３２Ｖ、Ｐ２３Ｓ／Ｌ５６Ｃ、Ｐ２３Ｓ／Ｌ５６Ｃ／Ｇ３９５Ｄ、Ｐ２３Ｓ／Ｌ５６Ｃ／Ｇ３９５Ｄ／Ｌ４１７Ｖ、Ｐ２３Ｓ／Ｇ３９５Ｄ／Ｌ４１７Ｓ、Ｐ２３Ｓ／Ｌ４１７Ｓ、Ｐ２３Ｓ／Ｌ４１７Ｖ、Ｐ２３Ｓ／Ｌ４１７Ｖ／Ａ４３２Ｖ、Ｎ５３Ｃ、Ｎ５３Ｃ／Ｌ５６Ｃ、Ｎ５３Ｃ／Ｒ１４６Ｈ／Ｌ４１７Ｓ、Ｎ５３Ｃ／Ｇ３９５Ｄ、Ｌ５６Ａ、Ｌ５６Ａ／Ａ７４Ｔ／Ａ２４１Ｖ／Ｎ２８６Ｓ／Ｉ３１４Ｒ／Ｅ３１６Ｗ／Ａ３２３Ｔ、Ｌ５６Ａ／Ｓ８６Ａ／Ｋ１６３Ｆ／Ｉ３１４Ｒ／Ｅ３１６Ｗ／Ａ３８３Ｖ／Ｃ４１４Ｖ／Ｐ４１６Ａ／Ｖ４２２Ａ、Ｌ５６Ａ／Ｓ８６Ａ／Ｎ２８６Ｓ／Ｉ３１４Ｒ／Ｃ４１４Ｖ／Ｐ４１６Ａ、Ｌ５６Ａ／Ｓ８６Ａ／Ｉ３１４Ｒ／Ｅ３１６Ｗ／Ａ３２３Ｔ／Ｄ３９４Ｇ／Ｃ４１４Ｖ／Ｖ４２２Ａ、Ｌ５６Ａ／Ｋ１６３Ｆ、Ｌ５６Ａ／Ｋ１６３Ｆ／Ｎ２８６Ｓ／Ｅ３１６Ｗ／Ａ３２３Ｔ／Ａ３８３Ｖ／Ｄ３９４Ｇ、Ｌ５６Ａ／Ｎ２８６Ｓ／Ｉ３１４Ｒ／Ｅ３１６Ｗ／Ａ３２３Ｔ／Ｖ４２２Ａ、Ｌ５６Ａ／Ｎ２８６Ｓ／Ａ３８３Ｖ、Ｌ５６Ａ／Ａ３２３Ｔ、Ｌ５６Ａ／Ａ３２３Ｔ／Ａ３８３Ｖ、Ｌ５６Ａ／Ａ３２３Ｔ／Ａ３８３


Ｖ／Ｄ３９４Ｇ、Ｌ５６Ａ／Ａ３８３Ｖ、Ｌ５６Ｃ、Ｌ５６Ｃ／Ｒ１４６Ｈ／Ｌ４１７Ｖ、Ｌ５６Ｃ／Ｒ１４６Ｈ／Ａ４３２Ｖ、Ｌ５６Ｃ／Ｗ１４７Ｒ、Ｌ５６Ｃ／Ｇ３９５Ｄ、Ｌ５６Ｔ、Ｌ５６Ｖ、Ａ７４Ｔ／Ｇ８１Ｓ／Ｎ２８６Ｓ／Ｅ３１６Ｗ／Ａ３２３Ｔ／Ａ３８３Ｖ、Ａ７４Ｔ／Ｆ８５Ｖ／Ｓ８６Ａ／Ｋ１６３Ｆ／Ｎ２８６Ｓ／Ｅ３１６Ｗ／Ａ３２３Ｔ／Ｄ３９４Ｇ、Ａ７４Ｔ／Ｆ８５Ｖ／Ｉ３１４Ｒ／Ｅ３１６Ｗ／Ｃ４１４Ｖ／Ｐ４１６Ａ、Ａ７４Ｔ／Ｓ８６Ａ／Ｋ１６３Ｆ／Ｅ３１６Ｗ、Ａ７４Ｔ／Ｓ８６Ａ／Ｅ３１６Ｗ／Ａ３２３Ｔ／Ａ３８３Ｖ／Ｄ３９４Ｇ、Ａ７４Ｔ／Ｈ８８Ｒ／Ｎ２８６Ｓ／Ｅ３１６Ｗ／Ａ３２３Ｔ／Ａ３８３Ｖ、Ａ７４Ｔ／Ｈ８８Ｒ／Ａ３２３Ｔ／Ａ３８３Ｖ、Ａ７４Ｔ／Ｋ１６３Ｆ／Ｎ２８６Ｓ／Ｅ３１６Ｗ／Ａ３８３Ｖ／Ｄ３９４Ｇ／Ｐ４１６Ａ、Ａ７４Ｔ／Ｋ１６３Ｆ／Ｉ３１４Ｒ／Ｅ３１６Ｗ、Ａ７４Ｔ／Ｋ１６３Ｆ／Ｉ３１４Ｒ／Ｅ３１６Ｗ／Ａ３２３Ｔ／Ｄ３９４Ｇ、Ａ７４Ｔ／Ｋ１６３Ｆ／Ｉ３１４Ｒ／Ａ３２３Ｔ／Ａ３８３Ｖ／Ｃ４１４Ｖ／Ｐ４１６Ａ、Ａ７４Ｔ／Ｎ２８６Ｓ、Ａ７４Ｔ／Ｎ２８６Ｓ／Ｅ３１６Ｗ／Ａ３２３Ｔ、Ａ７４Ｔ／Ｎ２８６Ｓ／Ｄ３９４Ｇ／Ｐ４１６Ａ、Ａ７４Ｔ／Ｉ３１４Ｒ／Ａ３２３Ｔ／Ａ３８３Ｖ／Ｄ３９４Ｇ／Ｃ４１４Ｖ、Ａ７４Ｔ／Ｅ３１６Ｗ／Ａ３２３Ｔ／Ｄ３９４Ｇ、Ｆ８５Ｖ／Ｓ８６Ａ／Ｈ８８Ｒ／Ｋ１６３Ｆ／Ａ３２３Ｔ／Ａ３８３Ｖ／Ｄ３９４Ｇ、Ｆ８５Ｖ／Ｓ８６Ａ／Ｋ１６３Ｆ／Ｉ３１４Ｒ／Ａ３２３Ｔ／Ｄ３９４Ｇ／Ｃ４１４Ｖ、Ｆ８５Ｖ／Ｎ２８６Ｓ、Ｆ８５Ｖ／Ｎ２８６Ｓ／Ａ３２３Ｔ、Ｓ８６Ａ／Ｈ８８Ｒ／Ｋ１６３Ｆ／Ａ３２３Ｔ／Ａ３８３Ｖ／Ｃ４１４Ｖ／Ｖ４２２Ａ、Ｓ８６Ａ／Ａ３８３Ｖ／Ｄ３９４Ｇ、Ｓ８６Ｇ、Ｈ８８Ｒ／Ｋ１６３Ｆ／Ｎ２８６Ｓ／Ａ３８３Ｖ、Ｈ８８Ｒ／Ｎ２８６Ｓ／Ｅ３１６Ｗ／Ａ３２３Ｔ、Ｈ８８Ｒ／Ｎ２８６Ｓ／Ｅ３１６Ｗ／Ａ３２３Ｔ／Ａ３８３Ｖ／Ｃ４１４Ｖ／Ｐ４１６Ａ、Ｈ８８Ｒ／Ｅ３１６Ｗ／Ａ３２３Ｔ、Ｈ８８Ｓ、Ｈ８８Ｔ、Ｒ１４６Ｈ、Ｒ１４６Ｈ／Ｗ１４７Ｒ／Ｇ３９５Ｄ／Ｌ４１７Ｓ、Ｒ１４６Ｈ／Ｇ３９５Ｄ、Ｒ１４６Ｈ／Ｇ３９５Ｄ／Ｌ４１７Ｓ、Ｒ１４６Ｈ／Ｌ４１７Ｓ、Ｒ１４６Ｈ／Ｌ４１７Ｖ、Ｗ１４７Ｒ／Ｇ３９５Ｄ／Ｌ４１７Ｓ／Ａ４３２Ｖ、Ｗ１４７Ｒ／Ｌ４１７Ｓ、Ａ１４９Ｓ、Ｓ１５７Ａ、Ｋ１６３Ｆ、Ｋ１６３Ｆ／Ａ２２２Ｖ／Ｎ２８６Ｓ／Ｅ３１６Ｗ／Ａ３２３Ｔ／Ａ３８３Ｖ／Ｄ３９４Ｇ、Ｋ１６３Ｆ／Ｎ２８６Ｓ、Ｋ１６３Ｆ／Ｎ２８６Ｓ／Ｉ３１４Ｒ／Ｅ３１６Ｗ／Ａ３２３Ｔ／Ｃ４１４Ｖ／Ｐ４１６Ａ、Ｋ１６３Ｆ／Ｎ２８６Ｓ／Ｉ３１４Ｒ／Ａ３２３Ｔ／Ｄ３９４Ｇ、Ｋ１６３Ｆ／Ｎ２８６Ｓ／Ｅ３１６Ｗ／Ａ３２３Ｔ／Ｄ３９４Ｇ／Ｐ４１６Ａ、Ｋ１６３Ｆ／Ｎ２８６Ｓ／Ｃ４１４Ｖ、Ｋ１６３Ｆ／Ｉ３１４Ｒ／Ｅ３１６Ｗ／Ｄ３９４Ｇ、Ｋ１６３Ｆ／Ｉ３１４Ｒ／Ａ３２３Ｔ／Ｄ３９４Ｇ、Ｋ１６３Ｆ／Ｉ３１４Ｒ／Ａ３８３Ｖ、Ｋ１６３Ｆ／Ｉ３１４Ｒ／Ｃ４１４Ｖ、Ｋ１６３Ｆ／Ｅ３１６Ｗ／Ａ３２３Ｔ、Ｋ１６３Ｆ／Ａ３２３Ｔ、Ｋ１６３Ｆ／Ａ３８３Ｖ、Ｋ１６３Ｌ、Ｋ１６３Ｍ、Ｐ１６４Ａ、Ｐ１６４Ｄ、Ｐ１６４Ｑ、Ｐ１６４Ｓ、Ａ１９９Ｖ／Ｌ４１７Ｓ、Ｉ２５９Ｖ、Ｃ２６０Ｔ、Ｓ２８４Ａ、Ｎ２８６Ｓ、Ｎ２８６Ｓ／Ｉ３１４Ｒ／Ａ３２３Ｔ／Ａ３８３Ｖ、Ｎ２８６Ｓ／Ｉ３１４Ｒ／Ｄ３９４Ｇ、Ｎ２８６Ｓ／Ｅ３１６Ｗ／Ａ３２３Ｔ／Ａ３８３Ｖ／Ｃ４１４Ｖ／Ｐ４１６Ａ、Ｎ２８６Ｓ／Ｅ３１６Ｗ／Ａ３８３Ｖ／Ｄ３９４Ｇ、Ｎ２８６Ｓ／Ｅ３１６Ｗ／Ｄ３９４Ｇ／Ｃ４１４Ｖ／Ｐ４１６Ａ、Ｎ２８６Ｓ／Ａ３２３Ｔ、Ｎ２８６Ｓ／Ａ３２３Ｔ／Ａ３８３Ｖ／Ｃ４１４Ｖ、Ｎ２８６Ｓ／Ａ３２３Ｔ／Ｐ４１６Ａ、Ｎ２８６Ｓ／Ａ３８３Ｖ、Ｎ２８６Ｓ／Ｐ４１６Ａ、Ｉ３１４Ｒ／Ｅ３１６Ｗ、Ｉ３１４Ｒ／Ｅ３１６Ｗ／Ａ３２３Ｔ、Ｉ３１４Ｒ／Ｅ３１６Ｗ／Ａ３２３Ｔ／Ａ３８３Ｖ／Ｖ４２２Ａ、Ｉ３１４Ｒ／Ｅ３１６Ｗ／Ａ３２３Ｔ／Ｄ３９４Ｇ、Ｉ３１４Ｒ／Ｅ３１６Ｗ／Ｄ３９４Ｇ、Ｉ３１４Ｒ／Ａ３２３Ｔ／Ａ３８３Ｖ／Ｄ３９４Ｇ、Ｉ３１４Ｒ／Ａ３８３Ｖ、Ｉ３１４Ｒ／Ａ３８３Ｖ／Ｃ４１４Ｖ／Ｖ４２２Ａ、Ｅ３１５Ｇ、Ｅ３１５Ｒ、Ｅ３１６Ａ、Ｅ３１６Ｆ、Ｅ３１６Ｇ、Ｅ３１６Ｈ、Ｅ３１６Ｌ、Ｅ３１６Ｎ、Ｅ３１６Ｒ、Ｅ３１６Ｖ、Ｅ３１６Ｗ／Ａ３２３Ｔ／Ａ３８３Ｖ／Ｄ３９４Ｇ、Ｅ３１６Ｗ／Ａ３２３Ｔ／Ｄ３９４Ｇ／Ｃ４１４Ｖ／Ｐ４１６Ａ、Ｅ３１６Ｗ／Ｃ４１４Ｖ／Ｖ４２２Ａ、Ａ３２３Ｃ、Ａ３２３Ｓ、Ａ３２３Ｔ、Ａ３２３Ｔ／Ａ３８３Ｖ、Ａ３２３Ｔ／Ａ３８３Ｖ／Ｄ３９４Ｇ／Ｃ４１４Ｖ／Ｐ４１６Ａ、Ａ３２３Ｔ／Ｄ３９４Ｇ、Ａ３８３Ｖ、Ｇ３９５Ｄ、Ｇ３９５Ｄ／Ｌ４１７Ｓ、Ｇ３９５Ｄ／Ｌ４１７Ｓ／Ａ４３２Ｖ、Ｇ３９５Ｄ／Ｌ４１７Ｖ、Ｓ４００Ｄ、Ｅ４０１Ａ、Ｅ４０１Ｋ、Ｅ４０１Ｓ、Ｉ４０３Ｖ、Ａ４０４Ｓ、Ｎ４０５Ｈ、Ｎ４０５Ｗ、Ｔ４０６Ｓ、Ｔ４０８Ｆ、Ｔ４０８Ｌ、Ｔ４０８Ｗ、Ｒ４１５Ｇ、Ｒ４１５Ｗ、Ｌ４１７Ａ、Ｌ４１７Ｓ、Ｌ４１７Ｓ／Ａ４３２Ｖ、Ｌ４１７Ｖ、Ｌ４１７Ｖ／Ａ４３２Ｖ、Ｓ４２０Ｇ、Ｖ４２２Ｌ、およびＶ４２２Ｔを含み、ここで、位置は、配列番号４を基準に番号付けされる。

【0139】

一部の実施形態では、本開示は、７４／８１／２８６／３１６／３２３／３８３、１６３／２８６／３１４／３１６／３２３／４１４／４１６、１６３／２８６／３１４／３２３／３９４、２８６／３１４／３２３／３８３、２８６／３１６／３２３／３８３／４１４／４１６、３１５、および４０８から選択される、配列番号４と比較した１つまたは複数のアミノ酸残基の差異を有するアミノ酸配列を含む、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを提供し、ここで、位置は、配列番号４を基準に番号付けされる。一部の実施形態では、アミノ酸の差異は、置換７４Ｔ／８１Ｓ／２８６Ｓ／３１６Ｗ／３２３Ｔ／３８３Ｖ、１６３Ｆ／２８６Ｓ／３１４Ｒ／３１６Ｗ／３２３Ｔ／４１４Ｖ／４１６Ａ、１６３Ｆ／２８６Ｓ／３１４Ｒ／３２３Ｔ／３９４Ｇ、２８６Ｓ／３１４Ｒ／３２３Ｔ／３８３Ｖ、２８６Ｓ／３１６Ｗ／３２３Ｔ／３８３Ｖ／４１４Ｖ／４１６Ａ、３１５Ｇ、および４０８Ｆを含み、ここで、位置は、配列番号４を基準に番号付けされる。一部の追加的な実施形態では、アミノ酸の差異は、置換Ａ７４Ｔ／Ｇ８１Ｓ／Ｎ２８６Ｓ／Ｅ３１６Ｗ／Ａ３２３Ｔ／Ａ３８３Ｖ、Ｋ１６３Ｆ／Ｎ２８６Ｓ／Ｉ３１４Ｒ／Ｅ３１６Ｗ／Ａ３２３Ｔ／Ｃ４１４Ｖ／Ｐ４１６Ａ、Ｋ１６３Ｆ／Ｎ２８６Ｓ／Ｉ３１４Ｒ／Ａ３２３Ｔ／Ｄ３９４Ｇ、Ｎ２８６Ｓ／Ｉ３１４Ｒ／Ａ３２３Ｔ／Ａ３８３Ｖ、Ｎ２８６Ｓ／Ｅ３１６Ｗ／Ａ３２３Ｔ／Ａ３８３Ｖ／Ｃ４１４Ｖ／Ｐ４１６Ａ、Ｅ３１５Ｇ、およびＴ４０８Ｆを含み、ここで、位置は、配列番号４を基準に番号付けされる。

【0140】

一部の実施形態では、本開示は、５、１８／２３／１４９／２６０／３８３／３９５／４０１／４１６、１８／２３／１４９／３８３、１８／１６３／１６４、２１、２１／１６３／３１５／３１６、２１／１６３／３２３／４０８、２１／４０８、２３／５６／８６／１４９／１６３／１６４／３８３／４０１／４１６、２３／８６、２３／１４９／２６０、２３／１４９／２８４／３８３／３９５、２３／１６３／１６４／３８３、２３／１６３／１６４／４０１／４１６、２４、４２、４２／１１０、４２／１８７／２７２、４２／１８７／３２４／３６３／３６６、４２／１８７／３５３、４２／２７２／２９１、４２／２７２／２９１／３６３、４２／２７２／３２４／３６３／３６６、４２／２７２／３６３／４１０、４２／２７２／４１０、４２／２９１／３１３／３６３／４１０、４２／２９１／３６３、４２／２９１／３６３／３６６、４２／３５３、４２／３６３、４６、６６、７７、８６／１４９／１６３／１６４／３８３／３９５／４０１、８６／１４９／３９５、８６／１６３／１６４／２６０／３８３、８６／３８３、１０７、１１０、１１０／１８７、１１０／１８７／２５３／４１０、１３４、１３８、１４９／１６４／２６０／３８３／３９５／４０１、１４９／２６０／３８３、１４９／４１６、１６３／２５９／３２３／４０８、１６３／２５９／４０８、１６３／３１５／３１６、１６４／２６０／４０１、１６４／３１６／３８３／４０１、１６７、１８６、１８７、１８７／２５３／３６３／３６６、１８７／２７２／３２４／３６３／４１０、１８７／２７２／３６３、１８７／２７２／３６３／３６６／４１０、１８７／２９１、１８９、１９１、１９５、１９９、２０３、２１０、２１１、２４８、２５９／３０７、２６０／３９５／４０１、２７２、２７２／３５３、２７２／３６３／３６６、２７２／４１０、２７７、２９１、３０５、３０９、３１５、３４２、３４３、３５１、３５４、３５８、３６１、３６２、３６３、３６３／３６６、３６５、３６７、３８３、３８３／４０１、３８３／４１６／４２２、３８５、３８８、３８９、３９２、３９５、３９６、４０１、４０４、４０５、４０８、４１０、４１６、４１７、４３９、４４３、４４７、４５０、および４５１から選択される、配列番号８と比較した１つまたは複数のアミノ酸残基の差異を有するアミノ酸配列を含む、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを提供し、ここで、位置は、配列番号８を基準に番号付けされる。一部の実施形態では、アミノ酸の差異は、置換５Ｅ、５Ｇ、１８Ａ／２３Ｒ／１４９Ｓ／２６０Ｔ／３８３Ｖ／３９５Ｄ／４０１Ｓ／４１６Ｐ、１８Ａ／２３Ｒ／１４９Ｓ／３８３Ｖ、１８Ａ／１６３Ｍ／１６４Ｑ、２１Ｈ、２１Ｈ／１６３Ｌ／３１５Ｇ／３１６Ｆ、２１Ｈ／１６３Ｌ／３２３Ｃ／４０８Ｆ、２１Ｈ／４０８Ｆ、２３Ｒ／５６Ｃ／８６Ｇ／１４９Ｓ／１６３Ｍ／１６４Ｄ／３８３Ｖ／４０１Ｓ／４１６Ｐ、２３Ｒ／８６Ｇ、２３Ｒ／１４９Ｓ／２６０Ｔ、２３Ｒ／１４９Ｓ／２８４Ａ／３８３Ｖ／３９５Ｄ、２３Ｒ／１６３Ｍ／１６４Ｑ／３８３Ｖ、２３Ｒ／１６３Ｍ／１６４Ｓ／４０１Ｓ／４１６Ｐ、２４Ｋ、２４Ｒ、４２Ｆ、４２Ｆ／１１０Ｋ、４２Ｆ／１８７Ｅ／２７２Ｅ、４２Ｆ／１８７Ｅ／３２４Ｓ／３６３Ｌ／３６６Ｈ、４２Ｆ／１８７Ｅ／３５３Ｔ、４２Ｆ／２７２Ｅ／２９１Ｙ、４２Ｆ／２７２Ｅ／２９１Ｙ／３６３Ｌ、４２Ｆ／２７２Ｅ／３２４Ｓ／３６３Ｌ／３６６Ｈ、４２Ｆ／２７２Ｅ／３６３Ｌ／４１０Ｈ、４２Ｆ／２７２Ｅ／４１０Ｈ、４２Ｆ／２９１Ｙ／３１３Ｖ／３６３Ｌ／４１０Ｈ、４２Ｆ／２９１Ｙ／３６３Ｌ、４２Ｆ／２９１Ｙ／３６３Ｌ／３６６Ｈ、４２Ｆ／３５３Ｔ、４２Ｆ／３６３Ｌ、４６Ｓ、６６Ａ、７７Ｍ、８６Ｇ／１４９Ｓ／１６３Ｍ／１６４Ｓ／３８３Ｖ／３９５Ｄ／４０１Ｓ、８６Ｇ／１４９Ｓ／３９５Ｄ、８６Ｇ／１６３Ｍ／１６４Ｓ／２６０Ｔ／３８３Ｖ、８６Ｇ／３８３Ｖ、１０７Ｌ、１０７Ｓ、１０７Ｙ、１１０Ｋ、１１０Ｋ／１８７Ｅ、１１０Ｋ／１８７Ｅ／２５３Ｌ／４１０Ｈ、１３４Ｖ、１３８Ｒ、１４９Ｓ／１６４Ｓ／２６０Ｔ／３８３Ｖ／３９５Ｄ／４０１Ａ、１４９Ｓ／２６０Ｔ／３８３Ｖ、１４９Ｓ／４１６Ｐ、１６３Ｌ／２５９Ｖ／３２３Ｃ／４０８Ｆ、１６３Ｌ／２５９Ｖ／４０８Ｆ、１６３Ｌ／３１５Ｇ／３１６Ｆ、１６４Ｄ／３１６Ｈ／３８３Ｖ／４０１Ｓ、１６４Ｓ／２６０Ｔ／４０１Ｓ、１６７Ｎ、１８６Ｑ、１８７Ｅ、１８７Ｅ／２５３Ｌ／３６３Ｌ／３６６Ｈ、１８７Ｅ／２７２Ｅ／３２４Ｓ／３６３Ｌ／４１０Ｈ、１８７Ｅ／２７２Ｅ／３６３Ｌ、１８７Ｅ／２７２Ｅ／３６３Ｌ／３６６Ｈ／４１０Ｈ、１８７Ｅ／２９１Ｙ、１８９Ｆ、１８９Ｓ、１８９Ｖ、１８９Ｗ、１９１Ｄ、１９１Ｆ、１９５Ｗ、１９９Ｑ、２０３Ｌ、２１０Ａ、２１０Ｌ、２１０Ｍ、２１０Ｖ、２１０Ｙ、２１１Ｒ、２４８Ｇ、２５９Ｖ／３０７Ｍ、２６０Ｔ／３９５Ｄ／４０１Ｓ、２７２Ｅ、２７２Ｅ／３５３Ｔ、２７２Ｅ／３６３Ｌ／３６６Ｈ、２７２Ｅ／４１０Ｈ、２７７Ｓ、２９１Ｙ、３０５Ｅ、３０９Ａ、３０９Ｆ、３０９Ｒ、３１５Ｇ、３４２Ｔ、３４３Ｇ、３５１Ｌ、３５４Ｓ、３５８Ｌ、３６１Ｒ、３６２Ｑ、３６２Ｖ、３６３Ｌ、３６３Ｌ／３６６Ｈ、３６５Ｌ、３６５Ｑ、３６５Ｒ、３６５Ｓ、３６７Ｔ、３８３Ｖ、３８３Ｖ／４０１Ａ、３８３Ｖ／４１６Ｐ／４２２Ｔ、３８５Ｌ、３８５Ｔ、３８８Ｄ、３８８Ｌ、３８８Ｐ、３８９Ｄ、３９２Ａ、３９２Ｌ、３９５Ｒ、３９６Ｐ、３９６Ｙ、４０１Ｑ、４０１Ｓ、４０４Ｍ、４０５Ｗ、４０８Ａ、４０８Ｅ、４０８Ｗ、４１０Ｈ、４１６Ｐ、４１７Ｓ、４３９Ｌ、４３９Ｓ、４４３Ｌ、４４３Ｓ、４４７Ｓ、４４７Ｔ、４５０Ｄ、および４５１Ｓを含み、ここで、位置は、配列番号８を基準に番号付けされる。一部の追加的な実施形態では、アミノ酸の差異は、置換Ｑ５Ｅ、Ｑ５Ｇ、Ｇ１８Ａ／Ｐ２３Ｒ／Ａ１４９Ｓ／Ｃ２６０Ｔ／Ａ３８３Ｖ／Ｇ３９５Ｄ／Ｅ４０１Ｓ／Ａ４１６Ｐ、Ｇ１８Ａ／Ｐ２３Ｒ／Ａ１４９Ｓ／Ａ３８３Ｖ、Ｇ１８Ａ／Ｆ１６３Ｍ／Ｐ１６４Ｑ、Ｄ２１Ｈ、Ｄ２１Ｈ／Ｆ１６３Ｌ／Ｅ３１５Ｇ／Ｗ３１６Ｆ、Ｄ２１Ｈ／Ｆ１６３Ｌ／Ｔ３２３Ｃ／Ｔ４０８Ｆ、Ｄ２１Ｈ／Ｔ４０８Ｆ、Ｐ２３Ｒ／Ｌ５６Ｃ／Ｓ８６Ｇ／Ａ１４９Ｓ／Ｆ１６３Ｍ／Ｐ１６４Ｄ／Ａ３８３Ｖ／Ｅ４０１Ｓ／Ａ４１６Ｐ、Ｐ２３Ｒ／Ｓ８６Ｇ、Ｐ２３Ｒ／Ａ１４９Ｓ／Ｃ２６０Ｔ、Ｐ２３Ｒ／Ａ１４９Ｓ／Ｓ２８４Ａ／Ａ３８３Ｖ／Ｇ３９５Ｄ、Ｐ２３Ｒ／Ｆ１６３Ｍ／Ｐ１６４Ｑ／Ａ３８３Ｖ、Ｐ２３Ｒ／Ｆ１６３Ｍ／Ｐ１６４Ｓ／Ｅ４０１Ｓ／Ａ４１６Ｐ、Ｓ２４Ｋ、Ｓ２４Ｒ、Ｖ４２Ｆ、Ｖ４２Ｆ／Ｒ１１０Ｋ、Ｖ４２Ｆ／Ｙ１８７Ｅ／Ｖ２７２Ｅ、Ｖ４２Ｆ／Ｙ１８７Ｅ／Ｇ３２４Ｓ／Ｉ３６３Ｌ／Ｒ３６６Ｈ、Ｖ４２Ｆ／Ｙ１８７Ｅ／Ａ３５３Ｔ、Ｖ４２Ｆ／Ｖ２７２Ｅ／Ｆ２９１Ｙ、Ｖ４２Ｆ／Ｖ２７２Ｅ／Ｆ２９１Ｙ／Ｉ３６３Ｌ、Ｖ４２Ｆ／Ｖ２７２Ｅ／Ｇ３２４Ｓ／Ｉ３６３Ｌ／Ｒ３６６Ｈ、Ｖ４２Ｆ／Ｖ２７２Ｅ／Ｉ３６３Ｌ／Ｌ４１０Ｈ、Ｖ４２Ｆ／Ｖ２７２Ｅ／Ｌ４１０Ｈ、Ｖ４２Ｆ／Ｆ２９１Ｙ／Ａ３１３Ｖ／Ｉ３６３Ｌ／Ｌ４１０Ｈ、Ｖ４２Ｆ／Ｆ２９１Ｙ／Ｉ３６３Ｌ、Ｖ４２Ｆ／Ｆ２９１Ｙ／Ｉ３６３Ｌ／Ｒ３６６Ｈ、Ｖ４２Ｆ／Ａ３５３Ｔ、Ｖ４２Ｆ／Ｉ３６３Ｌ、Ｇ４６Ｓ、Ｋ６６Ａ、Ｅ７７Ｍ、Ｓ８６Ｇ／Ａ１４９Ｓ／Ｆ１６３Ｍ／Ｐ１６４Ｓ／Ａ３８３Ｖ／Ｇ３９５Ｄ／Ｅ４０１Ｓ、Ｓ８６Ｇ／Ａ１４９Ｓ／Ｇ３９５Ｄ、Ｓ８６Ｇ／Ｆ１６３Ｍ／Ｐ１６４Ｓ／Ｃ２６０Ｔ／Ａ３８３Ｖ、Ｓ８６Ｇ／Ａ３８３Ｖ、Ｄ１０７Ｌ、Ｄ１０７Ｓ、Ｄ１０７Ｙ、Ｒ１１０Ｋ、Ｒ１１０Ｋ／Ｙ１８７Ｅ、Ｒ１１０Ｋ／Ｙ１８７Ｅ／Ｖ２５３Ｌ／Ｌ４１０Ｈ、Ａ１３４Ｖ、Ｐ１３８Ｒ、Ａ１４９Ｓ／Ｐ１６４Ｓ／Ｃ２６０Ｔ／Ａ３８３Ｖ／Ｇ３９５Ｄ／Ｅ４０１Ａ、Ａ１４９Ｓ／Ｃ２６０Ｔ／Ａ３８３Ｖ、Ａ１４９Ｓ／Ａ４１６Ｐ、Ｆ１６３Ｌ／Ｉ２５９Ｖ／Ｔ３２３Ｃ／Ｔ４０８Ｆ、Ｆ１６３Ｌ／Ｉ２５９Ｖ／Ｔ４０８Ｆ、Ｆ１６３Ｌ／Ｅ３１５Ｇ／Ｗ３１６Ｆ、Ｐ１６４Ｄ／Ｗ３１６Ｈ／Ａ３８３Ｖ／Ｅ４０１Ｓ、Ｐ１６４Ｓ／Ｃ２６０Ｔ／Ｅ４０１Ｓ、Ｓ１６７Ｎ、Ｒ１８６Ｑ、Ｙ１８７Ｅ、Ｙ１８７Ｅ／Ｖ２５３Ｌ／Ｉ３６３Ｌ／Ｒ３６６Ｈ、Ｙ１８７Ｅ／Ｖ２７２Ｅ／Ｇ３２４Ｓ／Ｉ３６３Ｌ／Ｌ４１０Ｈ、Ｙ１８７Ｅ／Ｖ２７２Ｅ／Ｉ３６３Ｌ、Ｙ１８７Ｅ／Ｖ２７２Ｅ／Ｉ３６３Ｌ／Ｒ３６６Ｈ／Ｌ４１０Ｈ、Ｙ１８７Ｅ／Ｆ２９１Ｙ、Ｅ１８９Ｆ、Ｅ１８９Ｓ、Ｅ１８９Ｖ、Ｅ１８９Ｗ、Ｇ１９１Ｄ、Ｇ１９１Ｆ、Ｅ１９５Ｗ、Ａ１９９Ｑ、Ｒ２０３Ｌ、Ｑ２１０Ａ、Ｑ２１０Ｌ、Ｑ２１０Ｍ、Ｑ２１０Ｖ、Ｑ２１０Ｙ、Ｋ２１１Ｒ、Ｋ２４８Ｇ、Ｉ２５９Ｖ／Ｌ３０７Ｍ、Ｃ２６０Ｔ／Ｇ３９５Ｄ／Ｅ４０１Ｓ、Ｖ２７２Ｅ、Ｖ２７２Ｅ／Ａ３５３Ｔ、Ｖ２７２Ｅ／Ｉ３６３Ｌ／Ｒ３６６Ｈ、Ｖ２７２Ｅ／Ｌ４１０Ｈ、Ｔ２７７Ｓ、Ｆ２９１Ｙ、Ｋ３０５Ｅ、Ｔ３０９Ａ、Ｔ３０９Ｆ、Ｔ３０９Ｒ、Ｅ３１５Ｇ、Ｎ３４２Ｔ、Ｅ３４３Ｇ、Ｒ３５１Ｌ、Ｐ３５４Ｓ、Ｅ３５８Ｌ、Ｋ３６１Ｒ、Ｈ３６２Ｑ、Ｈ３６２Ｖ、Ｉ３６３Ｌ、Ｉ３６３Ｌ／Ｒ３６６Ｈ、Ｅ３６５Ｌ、Ｅ３６５Ｑ、Ｅ３６５Ｒ、Ｅ３６５Ｓ、Ｐ３６７Ｔ、Ａ３８３Ｖ、Ａ３８３Ｖ／Ｅ４０１Ａ、Ａ３８３Ｖ／Ａ４１６Ｐ／Ｖ４２２Ｔ、Ｋ３８５Ｌ、Ｋ３８５Ｔ、Ａ３８８Ｄ、Ａ３８８Ｌ、Ａ３８８Ｐ、Ｓ３８９Ｄ、Ｐ３９２Ａ、Ｐ３９２Ｌ、Ｇ３９５Ｒ、Ｎ３９６Ｐ、Ｎ３９６Ｙ、Ｅ４０１Ｑ、Ｅ４０１Ｓ、Ａ４０４Ｍ、Ｎ４０５Ｗ、Ｔ４０８Ａ、Ｔ４０８Ｅ、Ｔ４０８Ｗ、Ｌ４１０Ｈ、Ａ４１６Ｐ、Ｌ４１７Ｓ、Ｄ４３９Ｌ、Ｄ４３９Ｓ、Ｋ４４３Ｌ、Ｋ４４３Ｓ、Ｋ４４７Ｓ、Ｋ４４７Ｔ、Ａ４５０Ｄ、およびＥ４５１Ｓを含み、ここで、位置は、配列番号８を基準に番号付けされる。

【0141】

一部の実施形態では、本開示は、１８／２３／１４９／３８３、２１／１６３／３２３／４０８、２７２、２９１、および３８３から選択される、配列番号８と比較した１つまたは複数のアミノ酸残基の差異を有するアミノ酸配列を含む、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを提供し、ここで、位置は、配列番号８を基準に番号付けされる。一部の実施形態では、アミノ酸の差異は、置換１８Ａ／２３Ｒ／１４９Ｓ／３８３Ｖ、２１Ｈ／１６３Ｌ／３２３Ｃ／４０８Ｆ、２７２Ｅ、２９１Ｙ、および３８３Ｖを含み、ここで、位置は、配列番号８を基準に番号付けされる。一部の追加的な実施形態では、アミノ酸の差異は、置換Ｇ１８Ａ／Ｐ２３Ｒ／Ａ１４９Ｓ／Ａ３８３Ｖ、Ｄ２１Ｈ／Ｆ１６３Ｌ／Ｔ３２３Ｃ／Ｔ４０８Ｆ、Ｖ２７２Ｅ、Ｆ２９１Ｙ、およびＡ３８３Ｖを含み、ここで、位置は、配列番号８を基準に番号付けされる。

【0142】

一部の実施形態では、本開示は、２４、２４／４２／６６／２９１、２４／４２／２９１／３６２、２４／６６／１６３／１９１／３６２／３８３／３８８、２４／６６／１９１／１９９／２６０／２９１／３５１、２４／６６／１９１／１９９／２９１、２４／６６／１９１／２６０／４０８、２４／６６／２６０／２９１／３８３／３８８／４０８、２４／６６／２９１／３４２／３８３、２４／６６／２９１／３６５、２４／６６／３４２／３６５／３８８／４０８、２４／７７／２９１、２４／１０７／１６３／１９１／２９１／３５１／３８３／３８８、２４／１０７／２９１／３５１／３６５／３８８、２４／１６３／３５１／３８３、２４／１９１／２９１／３６５、２４／１９９／２６０／３５１／３６２／３８３、２４／１９９／２６０／３６２／３８３／３８８、２４／２６０／３６２／３８３／３８８、２４／２９１、２４／２９１／３４２／３５１／３８３、２４／２９１／３６２／３８８、２４／２９１／４０８、２４／３８３／３８８、２４／３８８、２５、２８、３３、４２／１９１／４０８、４２／１９９／２９１／３８３、４２／２９１／３５１／３６２／３６５／３８３／３８８、４２／２９１／３５１／３６２／３８３／４０８、４２／２９１／３８３／３８８、６６／８２／２９１／３８３、６６／１６３／１９１／３６５／３８３、６６／１９９／３５１／３８３、６６／２９１、６６／２９１／３６２／３６５／３８３、６６／２９１／３８３／３８８、６６／３８３、７７／２９１、７７／３８３／３８８、８６、１０７／１９１／１９９／３６５／３８３／３８８、１０７／１９１／２９１／３８３、１４８、１５３、１６３／２９１／３６２／３６５／３８３／３８８、１６３／２９１／３８３／３８８、１６３／３８３、１９１／１９９／３６５／３８３／３８８、１９１／２６０／３８８、１９１／２９１、１９１／２９１／３４２／３６２／３６５、１９１／３５１／３８３／３８８、１９９／２６０／３８３、１９９／２９１、２６０、２６０／２９１／３６５／３８３／４０８、２６０／３６５／３８３、２９１、２９１／３５１／３８３／３８８、２９１／３５１／３８３／３８８／４０８、２９１／３６２／３６５、２９１／３６５／３８８、２９１／３８３、３１４、３１５、３１６、３１９、３４２／３６２、３５１／３８３／３８８、３６２、３６２／３８８、３８３、３８３／３８８、３９６、３９７、４０５、４０６、４１３、４１９、および４２３から選択される、配列番号３６６と比較した１つまたは複数のアミノ酸残基の差異を有するアミノ酸配列を含む、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを提供し、ここで、位置は、配列番号３６６を基準に番号付けされる。一部の実施形態では、アミノ酸の差異は、置換２４Ｅ、２４Ｋ、２４Ｋ／４２Ｆ／６６Ａ／２９１Ｙ、２４Ｋ／４２Ｆ／２９１Ｙ／３６２Ｑ、２４Ｋ／６６Ａ／１６３Ｍ／１９１Ｄ／３６２Ｑ／３８３Ｖ／３８８Ｄ、２４Ｋ／６６Ａ／１９１Ｄ／１９９Ｑ／２６０Ｔ／２９１Ｙ／３５１Ｌ、２４Ｋ／６６Ａ／１９１Ｄ／１９９Ｑ／２９１Ｙ、２４Ｋ／６６Ａ／１９１Ｄ／２６０Ｔ／４０８Ａ、２４Ｋ／６６Ａ／２６０Ｔ／２９１Ｙ／３８３Ｖ／３８８Ｄ／４０８Ａ、２４Ｋ／６６Ａ／２９１Ｙ／３４２Ｔ／３８３Ｖ、２４Ｋ／６６Ａ／２９１Ｙ／３６５Ｓ、２４Ｋ／６６Ａ／３４２Ｔ／３６５Ｓ／３８８Ｄ／４０８Ｅ、２４Ｋ／７７Ｍ／２９１Ｙ、２４Ｋ／１０７Ｌ／１６３Ｍ／１９１Ｄ／２９１Ｙ／３５１Ｌ／３８３Ｖ／３８８Ｄ、２４Ｋ／１０７Ｌ／２９１Ｙ／３５１Ｌ／３６５Ｓ／３８８Ｄ、２４Ｋ／１６３Ｍ／３５１Ｌ／３８３Ｖ、２４Ｋ／１９１Ｄ／２９１Ｙ／３６５Ｓ、２４Ｋ／１９９Ｑ／２６０Ｔ／３５１Ｌ／３６２Ｑ／３８３Ｖ、２４Ｋ／１９９Ｑ／２６０Ｔ／３６２Ｑ／３８３Ｖ／３８８Ｄ、２４Ｋ／２６０Ｔ／３６２Ｑ／３８３Ｖ／３８８Ｄ、２４Ｋ／２９１Ｙ、２４Ｋ／２９１Ｙ／３４２Ｔ／３５１Ｌ／３８３Ｖ、２４Ｋ／２９１Ｙ／３６２Ｑ／３８８Ｄ、２４Ｋ／２９１Ｙ／４０８Ａ、２４Ｋ／３８３Ｖ／３８８Ｄ、２４Ｋ／３８８Ｄ、２５Ｈ、２５Ｖ、２８Ｓ、２８Ｔ、３３Ｔ、４２Ｆ／１９１Ｄ／４０８Ｅ、４２Ｆ／１９９Ｑ／２９１Ｙ／３８３Ｖ、４２Ｆ／２９１Ｙ／３５１Ｌ／３６２Ｑ／３６５Ｓ／３８３Ｖ／３８８Ｄ、４２Ｆ／２９１Ｙ／３５１Ｌ／３６２Ｑ／３８３Ｖ／４０８Ａ、４２Ｆ／２９１Ｙ／３８３Ｖ／３８８Ｄ、６６Ａ／８２Ｈ／２９１Ｙ／３８３Ｖ、６６Ａ／１６３Ｍ／１９１Ｄ／３６５Ｓ／３８３Ｖ、６６Ａ／１９９Ｑ／３５１Ｌ／３８３Ｖ、６６Ａ／２９１Ｙ、６６Ａ／２９１Ｙ／３６２Ｑ／３６５Ｓ／３８３Ｖ、６６Ａ／２９１Ｙ／３８３Ｖ／３８８Ｄ、６６Ａ／３８３Ｖ、７７Ｍ／２９１Ｙ、７７Ｍ／３８３Ｖ／３８８Ｄ、８６Ｔ、１０７Ｌ／１９１Ｄ／１９９Ｑ／３６５Ｓ／３８３Ｖ／３８８Ｄ、１０７Ｌ／１９１Ｄ／２９１Ｙ／３８３Ｖ、１４８Ｇ、１５３Ｓ、１６３Ｍ／２９１Ｙ／３６２Ｑ／３６５Ｓ／３８３Ｖ／３８８Ｄ、１６３Ｍ／２９１Ｙ／３８３Ｖ／３８８Ｄ、１６３Ｍ／３８３Ｖ、１９１Ｄ／１９９Ｑ／３６５Ｓ／３８３Ｖ／３８８Ｄ、１９１Ｄ／２６０Ｔ／３８８Ｄ、１９１Ｄ／２９１Ｙ、１９１Ｄ／２９１Ｙ／３４２Ｔ／３６２Ｑ／３６５Ｓ、１９１Ｄ／３５１Ｌ／３８３Ｖ／３８８Ｄ、１９９Ｑ／２６０Ｔ／３８３Ｖ、１９９Ｑ／２９１Ｙ、２６０Ｔ、２６０Ｔ／２９１Ｙ／３６５Ｓ／３８３Ｖ／４０８Ａ、２６０Ｔ／３６５Ｓ／３８３Ｖ、２９１Ｙ、２９１Ｙ／３５１Ｌ／３８３Ｖ／３８８Ｄ、２９１Ｙ／３５１Ｌ／３８３Ｖ／３８８Ｄ／４０８Ａ、２９１Ｙ／３６２Ｑ／３６５Ｓ、２９１Ｙ／３６５Ｓ／３８８Ｄ、２９１Ｙ／３８３Ｖ、３１４Ｋ、３１５Ｓ、３１６Ｖ、３１９Ｓ、３４２Ｔ／３６２Ｑ、３５１Ｌ／３８３Ｖ／３８８Ｄ、３６２Ｑ、３６２Ｑ／３８８Ｄ、３８３Ｖ、３８３Ｖ／３８８Ｄ、３９６Ｒ、３９７Ｍ、４０５Ａ、４０６Ｈ、４１３Ｌ、４１９Ｓ、および４２３Ｖを含み、ここで、位置は、配列番号３６６を基準に番号付けされる。一部の追加的な実施形態では、アミノ酸の差異は、置換Ｓ２４Ｅ、Ｓ２４Ｋ、Ｓ２４Ｋ／Ｖ４２Ｆ／Ｋ６６Ａ／Ｆ２９１Ｙ、Ｓ２４Ｋ／Ｖ４２Ｆ／Ｆ２９１Ｙ／Ｈ３６２Ｑ、Ｓ２４Ｋ／Ｋ６６Ａ／Ｌ１６３Ｍ／Ｇ１９１Ｄ／Ｈ３６２Ｑ／Ａ３８３Ｖ／Ａ３８８Ｄ、Ｓ２４Ｋ／Ｋ６６Ａ／Ｇ１９１Ｄ／Ａ１９９Ｑ／Ｃ２６０Ｔ／Ｆ２９１Ｙ／Ｒ３５１Ｌ、Ｓ２４Ｋ／Ｋ６６Ａ／Ｇ１９１Ｄ／Ａ１９９Ｑ／Ｆ２９１Ｙ、Ｓ２４Ｋ／Ｋ６６Ａ／Ｇ１９１Ｄ／Ｃ２６０Ｔ／Ｆ４０８Ａ、Ｓ２４Ｋ／Ｋ６６Ａ／Ｃ２６０Ｔ／Ｆ２９１Ｙ／Ａ３８３Ｖ／Ａ３８８Ｄ／Ｆ４０８Ａ、Ｓ２４Ｋ／Ｋ６６Ａ／Ｆ２９１Ｙ／Ｎ３４２Ｔ／Ａ３８３Ｖ、Ｓ２４Ｋ／Ｋ６６Ａ／Ｆ２９１Ｙ／Ｅ３６５Ｓ、Ｓ２４Ｋ／Ｋ６６Ａ／Ｎ３４２Ｔ／Ｅ３６５Ｓ／Ａ３８８Ｄ／Ｆ４０８Ｅ、Ｓ２４Ｋ／Ｅ７７Ｍ／Ｆ２９１Ｙ、Ｓ２４Ｋ／Ｄ１０７Ｌ／Ｌ１６３Ｍ／Ｇ１９１Ｄ／Ｆ２９１Ｙ／Ｒ３５１Ｌ／Ａ３８３Ｖ／Ａ３８８Ｄ、Ｓ２４Ｋ／Ｄ１０７Ｌ／Ｆ２９１Ｙ／Ｒ３５１Ｌ／Ｅ３６５Ｓ／Ａ３８８Ｄ、Ｓ２４Ｋ／Ｌ１６３Ｍ／Ｒ３５１Ｌ／Ａ３８３Ｖ、Ｓ２４Ｋ／Ｇ１９１Ｄ／Ｆ２９１Ｙ／Ｅ３６５Ｓ、Ｓ２４Ｋ／Ａ１９９Ｑ／Ｃ２６０Ｔ／Ｒ３５１Ｌ／Ｈ３６２Ｑ／Ａ３８３Ｖ、Ｓ２４Ｋ／Ａ１９９Ｑ／Ｃ２６０Ｔ／Ｈ３６２Ｑ／Ａ３８３Ｖ／Ａ３８８Ｄ、Ｓ２４Ｋ／Ｃ２６０Ｔ／Ｈ３６２Ｑ／Ａ３８３Ｖ／Ａ３８８Ｄ、Ｓ２４Ｋ／Ｆ２９１Ｙ、Ｓ２４Ｋ／Ｆ２９１Ｙ／Ｎ３４２Ｔ／Ｒ３５１Ｌ／Ａ３８３Ｖ、Ｓ２４Ｋ／Ｆ２９１Ｙ／Ｈ３６２Ｑ／Ａ３８８Ｄ、Ｓ２４Ｋ／Ｆ２９１Ｙ／Ｆ４０８Ａ、Ｓ２４Ｋ／Ａ３８３Ｖ／Ａ３８８Ｄ、Ｓ２４Ｋ／Ａ３８８Ｄ、Ｌ２５Ｈ、Ｌ２５Ｖ、Ｒ２８Ｓ、Ｒ２８Ｔ、Ｖ３３Ｔ、Ｖ４２Ｆ／Ｇ１９１Ｄ／Ｆ４０８Ｅ、Ｖ４２Ｆ／Ａ１９９Ｑ／Ｆ２９１Ｙ／Ａ３８３Ｖ、Ｖ４２Ｆ／Ｆ２９１Ｙ／Ｒ３５１Ｌ／Ｈ３６２Ｑ／Ｅ３６５Ｓ／Ａ３８３Ｖ／Ａ３８８Ｄ、Ｖ４２Ｆ／Ｆ２９１Ｙ／Ｒ３５１Ｌ／Ｈ３６２Ｑ／Ａ３８３Ｖ／Ｆ４０８Ａ、Ｖ４２Ｆ／Ｆ２９１Ｙ／Ａ３８３Ｖ／Ａ３８８Ｄ、Ｋ６６Ａ／Ｙ８２Ｈ／Ｆ２９１Ｙ／Ａ３８３Ｖ、Ｋ６６Ａ／Ｌ１６３Ｍ／Ｇ１９１Ｄ／Ｅ３６５Ｓ／Ａ３８３Ｖ、Ｋ６６Ａ／Ａ１９９Ｑ／Ｒ３５１Ｌ／Ａ３８３Ｖ、Ｋ６６Ａ／Ｆ２９１Ｙ、Ｋ６６Ａ／Ｆ２９１Ｙ／Ｈ３６２Ｑ／Ｅ３６５Ｓ／Ａ３８３Ｖ、Ｋ６６Ａ／Ｆ２９１Ｙ／Ａ３８３Ｖ／Ａ３８８Ｄ、Ｋ６６Ａ／Ａ３８３Ｖ、Ｅ７７Ｍ／Ｆ２９１Ｙ、Ｅ７７Ｍ／Ａ３８３Ｖ／Ａ３８８Ｄ、Ｓ８６Ｔ、Ｄ１０７Ｌ／Ｇ１９１Ｄ／Ａ１９９Ｑ／Ｅ３６５Ｓ／Ａ３８３Ｖ／Ａ３８８Ｄ、Ｄ１０７Ｌ／Ｇ１９１Ｄ／Ｆ２９１Ｙ／Ａ３８３Ｖ、Ｎ１４８Ｇ、Ａ１５３Ｓ、Ｌ１６３Ｍ／Ｆ２９１Ｙ／Ｈ３６２Ｑ／Ｅ３６５Ｓ／Ａ３８３Ｖ／Ａ３８８Ｄ、Ｌ１６３Ｍ／Ｆ２９１Ｙ／Ａ３８３Ｖ／Ａ３８８Ｄ、Ｌ１６３Ｍ／Ａ３８３Ｖ、Ｇ１９１Ｄ／Ａ１９９Ｑ／Ｅ３６５Ｓ／Ａ３８３Ｖ／Ａ３８８Ｄ、Ｇ１９１Ｄ／Ｃ２６０Ｔ／Ａ３８８Ｄ、Ｇ１９１Ｄ／Ｆ２９１Ｙ、Ｇ１９１Ｄ／Ｆ２９１Ｙ／Ｎ３４２Ｔ／Ｈ３６２Ｑ／Ｅ３６５Ｓ、Ｇ１９１Ｄ／Ｒ３５１Ｌ／Ａ３８３Ｖ／Ａ３８８Ｄ、Ａ１９９Ｑ／Ｃ２６０Ｔ／Ａ３８３Ｖ、Ａ１９９Ｑ／Ｆ２９１Ｙ、Ｃ２６０Ｔ、Ｃ２６０Ｔ／Ｆ２９１Ｙ／Ｅ３６５Ｓ／Ａ３８３Ｖ／Ｆ４０８Ａ、Ｃ２６０Ｔ／Ｅ３６５Ｓ／Ａ３８３Ｖ、Ｆ２９１Ｙ、Ｆ２９１Ｙ／Ｒ３５１Ｌ／Ａ３８３Ｖ／Ａ３８８Ｄ、Ｆ２９１Ｙ／Ｒ３５１Ｌ／Ａ３８３Ｖ／Ａ３８８Ｄ／Ｆ４０８Ａ、Ｆ２９１Ｙ／Ｈ３６２Ｑ／Ｅ３６５Ｓ、Ｆ２９１Ｙ／Ｅ３６５Ｓ／Ａ３８８Ｄ、Ｆ２９１Ｙ／Ａ３８３Ｖ、Ｒ３１４Ｋ、Ｅ３１５Ｓ、Ｗ３１６Ｖ、Ｈ３１９Ｓ、Ｎ３４２Ｔ／Ｈ３６２Ｑ、Ｒ３５１Ｌ／Ａ３８３Ｖ／Ａ３８８Ｄ、Ｈ３６２Ｑ、Ｈ３６２Ｑ／Ａ３８８Ｄ、Ａ３８３Ｖ、Ａ３８３Ｖ／Ａ３８８Ｄ、Ｎ３９６Ｒ、Ｌ３９７Ｍ、Ｎ４０５Ａ、Ｔ４０６Ｈ、Ｉ４１３Ｌ、Ｑ４１９Ｓ、およびＬ４２３Ｖを含み、ここで、位置は、配列番号３６６を基準に番号付けされる。

【0143】

一部の実施形態では、本開示は、２４／６６／１９１／１９９／２９１、２４／６６／２９１／３６５、１６３／２９１／３６２／３６５／３８３／３８８、１６３／２９１／３８３／３８８、１９１／２９１／３４２／３６２／３６５、２９１、および２９１／３８３から選択される、配列番号３６６と比較した１つまたは複数のアミノ酸残基の差異を有するアミノ酸配列を含む、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを提供し、ここで、位置は、配列番号３６６を基準に番号付けされる。一部の実施形態では、アミノ酸の差異は、置換２４Ｋ／６６Ａ／１９１Ｄ／１９９Ｑ／２９１Ｙ、２４Ｋ／６６Ａ／２９１Ｙ／３６５Ｓ、１６３Ｍ／２９１Ｙ／３６２Ｑ／３６５Ｓ／３８３Ｖ／３８８Ｄ、１６３Ｍ／２９１Ｙ／３８３Ｖ／３８８Ｄ、１９１Ｄ／２９１Ｙ／３４２Ｔ／３６２Ｑ／３６５Ｓ、２９１Ｙ、および２９１Ｙ／３８３Ｖを含み、ここで、位置は、配列番号３６６を基準に番号付けされる。一部の追加的な実施形態では、アミノ酸の差異は、置換Ｓ２４Ｋ／Ｋ６６Ａ／Ｇ１９１Ｄ／Ａ１９９Ｑ／Ｆ２９１Ｙ、Ｓ２４Ｋ／Ｋ６６Ａ／Ｆ２９１Ｙ／Ｅ３６５Ｓ、Ｌ１６３Ｍ／Ｆ２９１Ｙ／Ｈ３６２Ｑ／Ｅ３６５Ｓ／Ａ３８３Ｖ／Ａ３８８Ｄ、Ｌ１６３Ｍ／Ｆ２９１Ｙ／Ａ３８３Ｖ／Ａ３８８Ｄ、Ｇ１９１Ｄ／Ｆ２９１Ｙ／Ｎ３４２Ｔ／Ｈ３６２Ｑ／Ｅ３６５Ｓ、Ｆ２９１Ｙ、およびＦ２９１Ｙ／Ａ３８３Ｖを含み、ここで、位置は、配列番号３６６を基準に番号付けされる。

【0144】

一部の実施形態では、本開示は、１０、１３、１３／２４／１０８／１６３、１３／２４／１０８／１６３／３１１、１３／２４／１３３／１９９／３１１、１３／２４／１６３、１３／２４／１９９／３１１、１３／１０８、１３／１０８／１９９、１３／１０８／３１１、１３／１９９、１３／３１１、１４、１４／２４／１０８、１４／２４／１０８／１３３、１４／２４／１０８／１９９、１４／２４／１９９、１４／１０８、１４／１０８／１３３／３１１、１４／１０８／３１１、１４／３１１、２４、２４／１６３、２４／１６３／１９９、３５、７２、７３、７８、９５、１０１、１０８、１０８／１９９、１１４、１５４、１６３、１６９、１７５／３１６、１９９、１９９／３１１、２２６、２９３、３１１、３１６、３８２、３８３、および３８６から選択される、配列番号６５０と比較した１つまたは複数のアミノ酸残基の差異を有するアミノ酸配列を含む、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを提供し、ここで、位置は、配列番号６５０を基準に番号付けされる。一部の実施形態では、アミノ酸の差異は、置換１０Ｅ、１３Ａ、１３Ａ／２４Ｅ／１０８Ｒ／１６３Ｌ／３１１Ｓ、１３Ａ／２４Ｅ／１３３Ｒ／１９９Ｑ／３１１Ｓ、１３Ａ／２４Ｅ／１６３Ｌ、１３Ａ／２４Ｋ／１０８Ｒ／１６３Ｌ、１３Ａ／２４Ｋ／１９９Ｑ／３１１Ｓ、１３Ａ／１０８Ｒ、１３Ａ／１０８Ｒ／１９９Ｑ、１３Ａ／１０８Ｒ／３１１Ｓ、１３Ａ／１９９Ｑ、１３Ａ／３１１Ｓ、１４Ａ、１４Ｇ、１４Ｈ、１４Ｈ／２４Ｅ／１０８Ｒ／１３３Ｒ、１４Ｈ／２４Ｋ／１０８Ｒ、１４Ｈ／２４Ｋ／１０８Ｒ／１９９Ｑ、１４Ｈ／２４Ｋ／１９９Ｑ、１４Ｈ／１０８Ｒ、１４Ｈ／１０８Ｒ／１３３Ｒ／３１１Ｓ、１４Ｈ／１０８Ｒ／３１１Ｓ、１４Ｈ／３１１Ｓ、２４Ｅ、２４Ｅ／１６３Ｌ、２４Ｅ／１６３Ｌ／１９９Ｑ、３５Ｅ、７２Ｇ、７３Ｒ、７３Ｓ、７８Ａ、９５Ｉ、１０１Ｌ、１０８Ｒ、１０８Ｒ／１９９Ｑ、１１４Ａ、１５４Ｓ、１６３Ｈ、１６３Ｓ、１６３Ｖ、１６９Ｃ、１６９Ｖ、１７５Ｄ／３１６Ｆ、１９９Ｑ、１９９Ｑ／３１１Ｓ、２２６Ｑ、２９３Ａ、３１１Ｋ、３１６Ｄ、３１６Ｅ、３１６Ｆ、３１６Ｇ、３１６Ｈ、３１６Ｉ、３１６Ｌ、３１６Ｎ、３１６Ｓ、３１６Ｖ、３１６Ｙ、３８２Ｄ、３８３Ｌ、および３８６Ａを含み、ここで、位置は、配列番号６５０を基準に番号付けされる。一部の追加的な実施形態では、アミノ酸の差異は、置換Ｒ１０Ｅ、Ｔ１３Ａ、Ｔ１３Ａ／Ｓ２４Ｅ／Ｓ１０８Ｒ／Ｍ１６３Ｌ／Ｉ３１１Ｓ、Ｔ１３Ａ／Ｓ２４Ｅ／Ａ１３３Ｒ／Ａ１９９Ｑ／Ｉ３１１Ｓ、Ｔ１３Ａ／Ｓ２４Ｅ／Ｍ１６３Ｌ、Ｔ１３Ａ／Ｓ２４Ｋ／Ｓ１０８Ｒ／Ｍ１６３Ｌ、Ｔ１３Ａ／Ｓ２４Ｋ／Ａ１９９Ｑ／Ｉ３１１Ｓ、Ｔ１３Ａ／Ｓ１０８Ｒ、Ｔ１３Ａ／Ｓ１０８Ｒ／Ａ１９９Ｑ、Ｔ１３Ａ／Ｓ１０８Ｒ／Ｉ３１１Ｓ、Ｔ１３Ａ／Ａ１９９Ｑ、Ｔ１３Ａ／Ｉ３１１Ｓ、Ｙ１４Ａ、Ｙ１４Ｇ、Ｙ１４Ｈ、Ｙ１４Ｈ／Ｓ２４Ｅ／Ｓ１０８Ｒ／Ａ１３３Ｒ、Ｙ１４Ｈ／Ｓ２４Ｋ／Ｓ１０８Ｒ、Ｙ１４Ｈ／Ｓ２４Ｋ／Ｓ１０８Ｒ／Ａ１９９Ｑ、Ｙ１４Ｈ／Ｓ２４Ｋ／Ａ１９９Ｑ、Ｙ１４Ｈ／Ｓ１０８Ｒ、Ｙ１４Ｈ／Ｓ１０８Ｒ／Ａ１３３Ｒ／Ｉ３１１Ｓ、Ｙ１４Ｈ／Ｓ１０８Ｒ／Ｉ３１１Ｓ、Ｙ１４Ｈ／Ｉ３１１Ｓ、Ｓ２４Ｅ、Ｓ２４Ｅ／Ｍ１６３Ｌ、Ｓ２４Ｅ／Ｍ１６３Ｌ／Ａ１９９Ｑ、Ｈ３５Ｅ、Ａ７２Ｇ、Ｋ７３Ｒ、Ｋ７３Ｓ、Ｒ７８Ａ、Ｍ９５Ｉ、Ｖ１０１Ｌ、Ｓ１０８Ｒ、Ｓ１０８Ｒ／Ａ１９９Ｑ、Ｔ１１４Ａ、Ｔ１５４Ｓ、Ｍ１６３Ｈ、Ｍ１６３Ｓ、Ｍ１６３Ｖ、Ｆ１６９Ｃ、Ｆ１６９Ｖ、Ｇ１７５Ｄ／Ｗ３１６Ｆ、Ａ１９９Ｑ、Ａ１９９Ｑ／Ｉ３１１Ｓ、Ｍ２２６Ｑ、Ｐ２９３Ａ、Ｉ３１１Ｋ、Ｗ３１６Ｄ、Ｗ３１６Ｅ、Ｗ３１６Ｆ、Ｗ３１６Ｇ、Ｗ３１６Ｈ、Ｗ３１６Ｉ、Ｗ３１６Ｌ、Ｗ３１６Ｎ、Ｗ３１６Ｓ、Ｗ３１６Ｖ、Ｗ３１６Ｙ、Ｅ３８２Ｄ、Ｖ３８３Ｌ、およびＤ３８６Ａを含み、ここで、位置は、配列番号６５０を基準に番号付けされる。

【0145】

一部の実施形態では、本開示は、１４／１０８／１３３／３１１、２４／１６３／１９９、７２、７８、３１６、および３８３から選択される、配列番号６５０と比較した１つまたは複数のアミノ酸残基の差異を有するアミノ酸配列を含む、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを提供し、ここで、位置は、配列番号６５０を基準に番号付けされる。一部の実施形態では、アミノ酸の差異は、置換１４Ｈ／１０８Ｒ／１３３Ｒ／３１１Ｓ、２４Ｅ／１６３Ｌ／１９９Ｑ、７２Ｇ、７８Ａ、３１６Ｌ、３１６Ｎ、３１６Ｓ、および３８３Ｌを含み、ここで、位置は、配列番号６５０を基準に番号付けされる。一部の追加的な実施形態では、アミノ酸の差異は、置換Ｙ１４Ｈ／Ｓ１０８Ｒ／Ａ１３３Ｒ／Ｉ３１１Ｓ、Ｓ２４Ｅ／Ｍ１６３Ｌ／Ａ１９９Ｑ、Ａ７２Ｇ、Ｒ７８Ａ、Ｗ３１６Ｌ、Ｗ３１６Ｎ、Ｗ３１６Ｓ、およびＶ３８３Ｌを含み、ここで、位置は、配列番号６５０を基準に番号付けされる。

【0146】

一部の実施形態では、トランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、適切な反応条件下、参照ポリペプチド（例えば、配列番号２、４、８、３６６、および／または６５０）の基質耐性と比べて増大した、基質の存在に対する耐性で、化合物（１）を化合物（２）に変換することができる。したがって、一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、適切な反応条件下、少なくとも約１ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、約３０ｇ／Ｌ、約４０ｇ／Ｌ、約５０ｇ／Ｌ、約７０ｇ／Ｌ、約７５ｇ／Ｌ、約１００ｇ／Ｌの基質負荷濃度の存在下で、約７２時間、約４８時間、約３６時間、約２４時間、またはさらにはより短い時間の長さの反応時間内に、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の変換パーセントで、化合物（１）である基質を化合物（２）に変換することができる。

【0147】

操作されたポリペプチドの上記の特性の改善を、ポリペプチドの濃度または量、基質、アミン供与体、補助因子、緩衝剤、共溶媒、ｐＨ、ならびに／または、温度および反応時間を含む条件に関して決定することができるいくつかの適切な反応条件が本明細書に提示される。一部の実施形態では、適切な反応条件には、下および実施例に記載されているＨＴＰ、ＳＦＰ、またはＤＳＰアッセイ条件が含まれる。

【0148】

当業者には明らかになるように、前述の残基の位置および各残基の位置の特定のアミノ酸残基を個別にまたは種々の組合せで使用して、とりわけ、酵素活性、基質／生成物選好、立体選択性、基質／生成物耐性、ならびに温度、溶媒、および／またはｐＨの増大などの種々の条件下での安定性を含めた、所望の特性の改善を有するトランスアミナーゼポリペプチドを合成することができる。

【0149】

一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドのいずれかの、その操作されたトランスアミナーゼポリペプチドの機能的なトランスアミナーゼ活性および／または特性の改善を保持する断片を含む、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドも提供する。したがって、一部の実施形態では、本開示は、トランスアミナーゼ活性を有する（例えば、適切な反応条件下で化合物（１）を化合物（２）に変換することが可能である）ポリペプチド断片であって、配列番号６～９３６の偶数の配列識別子を有する例示的な操作されたポリペプチドなどの本開示の操作されたポリペプチドの全長アミノ酸配列の少なくとも約８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％を含む、断片を提供する。

【0150】

一部の実施形態では、本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、配列番号６～９３６の偶数の配列識別子を有する例示的な操作されたポリペプチド配列などの、本明細書に記載の操作されたトランスアミナーゼポリペプチド配列のいずれか１つと比較して欠失を含むアミノ酸配列を含む。したがって、本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドの実施形態の各々について、アミノ酸配列は、トランスアミナーゼポリペプチドの１個またはそれよりも多くのアミノ酸、２個またはそれよりも多くのアミノ酸、３個またはそれよりも多くのアミノ酸、４個またはそれよりも多くのアミノ酸、５個またはそれよりも多くのアミノ酸、６個またはそれよりも多くのアミノ酸、８個またはそれよりも多くのアミノ酸、１０個またはそれよりも多くのアミノ酸、１５個またはそれよりも多くのアミノ酸、または２０個またはそれよりも多くのアミノ酸、アミノ酸の総数の１０％まで、アミノ酸の総数の１０％まで、アミノ酸の総数の２０％まで、またはアミノ酸の総数の３０％まで欠失を含み得、ここで、本明細書に記載の関連する操作されたトランスアミナーゼの機能活性および／または特性の改善は維持される。一部の実施形態では、欠失は、１～２個、１～３個、１～４個、１～５個、１～６個、１～７個、１～８個、１～９個、１～１０個、１～１５個、１～２０個、１～２１個、１～２２個、１～２３個、１～２４個、１～２５個、１～３０個、１～３５個、１～４０個、１～４５個、１～５０個、１～５５個、または１～６０個のアミノ酸残基を含み得る。一部の実施形態では、欠失の数は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、３０個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、または６０個のアミノ酸残基であり得る。一部の実施形態では、欠失は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１８個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個または３０個のアミノ酸残基の欠失を含み得る。

【0151】

一部の実施形態では、本開示は、配列番号６～９３６の偶数の配列識別子を有する例示的な操作されたポリペプチド配列などの本明細書に記載の操作されたトランスアミナーゼポリペプチド配列のいずれか１つと比較して挿入を含むアミノ酸配列を有する操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを提供する。したがって、本開示のトランスアミナーゼポリペプチドの実施形態の各々について、挿入は、１個またはそれよりも多くのアミノ酸、２個またはそれよりも多くのアミノ酸、３個またはそれよりも多くのアミノ酸、４個またはそれよりも多くのアミノ酸、５個またはそれよりも多くのアミノ酸、６個またはそれよりも多くのアミノ酸、８個またはそれよりも多くのアミノ酸、１０個またはそれよりも多くのアミノ酸、１５個またはそれよりも多くのアミノ酸、または２０個またはそれよりも多くのアミノ酸を含み得、ここで、本明細書に記載の関連する操作されたトランスアミナーゼの機能活性および／または特性の改善は維持される。挿入は、トランスアミナーゼポリペプチドのアミノ末端もしくはカルボキシ末端、または内部部分へのものであり得る。

【0152】

一部の実施形態では、本開示のポリペプチドは、操作されたポリペプチドと、他のポリペプチド、例として、限定するものではなく、抗体タグ（例えば、ｍｙｃエピトープ）、精製用配列（例えば、金属に結合させるためのＨｉｓタグ）、および細胞局在シグナル（例えば、分泌シグナル）などと融合した、融合ポリペプチドの形態である。したがって、本明細書に記載の操作されたポリペプチドを、他のポリペプチドとの融合を伴ってまたは伴わずに使用することができる。

【0153】

本明細書に記載の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、遺伝子によりコードされるアミノ酸に制限されない。したがって、本明細書に記載のポリペプチドは、遺伝子によりコードされるアミノ酸に加えて、全体的にまたは部分的に、天然に存在するおよび／または合成のコードされないアミノ酸で構成され得る。本明細書に記載のポリペプチドを構成し得るある特定の一般に見られるコードされないアミノ酸としては、これだけに限定されないが、遺伝子によりコードされるアミノ酸のＤ－立体異性体；２，３－ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）；α－アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）；ε－アミノヘキサン酸（Ａｈａ）；δ－アミノバレリン酸（Ａｖａ）；Ｎ－メチルグリシンまたはサルコシン（ＭｅＧｌｙまたはＳａｒ）；オルニチン（Ｏｒｎ）；シトルリン（Ｃｉｔ）；ｔ－ブチルアラニン（Ｂｕａ）；ｔ－ブチルグリシン（Ｂｕｇ）；Ｎ－メチルイソロイシン（ＭｅＩｌｅ）；フェニルグリシン（Ｐｈｇ）；シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）；ノルロイシン（Ｎｌｅ）；ナフチルアラニン（Ｎａｌ）；２－クロロフェニルアラニン（Ｏｃｆ）；３－クロロフェニルアラニン（Ｍｃｆ）；４－クロロフェニルアラニン（Ｐｃｆ）；２－フルオロフェニルアラニン（Ｏｆｆ）；３－フルオロフェニルアラニン（Ｍｆｆ）；４－フルオロフェニルアラニン（Ｐｆｆ）；２－ブロモフェニルアラニン（Ｏｂｆ）；３－ブロモフェニルアラニン（Ｍｂｆ）；４－ブロモフェニルアラニン（Ｐｂｆ）；２－メチルフェニルアラニン（Ｏｍｆ）；３－メチルフェニルアラニン（Ｍｍｆ）；４－メチルフェニルアラニン（Ｐｍｆ）；２－ニトロフェニルアラニン（Ｏｎｆ）；３－ニトロフェニルアラニン（Ｍｎｆ）；４－ニトロフェニルアラニン（Ｐｎｆ）；２－シアノフェニルアラニン（Ｏｃｆ）；３－シアノフェニルアラニン（Ｍｃｆ）；４－シアノフェニルアラニン（Ｐｃｆ）；２－トリフルオロメチルフェニルアラニン（Ｏｔｆ）；３－トリフルオロメチルフェニルアラニン（Ｍｔｆ）；４－トリフルオロメチルフェニルアラニン（Ｐｔｆ）；４－アミノフェニルアラニン（Ｐａｆ）；４－ヨードフェニルアラニン（Ｐｉｆ）；４－アミノメチルフェニルアラニン（Ｐａｍｆ）；２，４－ジクロロフェニルアラニン（Ｏｐｅｆ）；３，４－ジクロロフェニルアラニン（Ｍｐｃｆ）；２，４－ジフルオロフェニルアラニン（Ｏｐｆｆ）；３，４－ジフルオロフェニルアラニン（Ｍｐｆｆ）；ピリド－２－イルアラニン（２ｐＡｌａ）；ピリド－３－イルアラニン（３ｐＡｌａ）；ピリド－４－イルアラニン（４ｐＡｌａ）；ナフト－１－イルアラニン（１ｎＡｌａ）；ナフト－２－イルアラニン（２ｎＡｌａ）；チアゾイルアラニン（ｔａＡｌａ）；ベンゾチエニルアラニン（ｂＡｌａ）；チエニルアラニン（ｔＡｌａ）；フリルアラニン（ｆＡｌａ）；ホモフェニルアラニン（ｈＰｈｅ）；ホモチロシン（ｈＴｙｒ）；ホモトリプトファン（ｈＴｒｐ）；ペンタフルオロフェニルアラニン（５ｆｆ）；スチリルアラニン（ｓｔｙｒｙｌｋａｌａｎｉｎｅ）（ｓＡｌａ）；アウトリルアラニン（ａｕｔｈｒｙｌａｌａｎｉｎｅ）（ａＡｌａ）；３，３－ジフェニルアラニン（Ｄｆａ）；３－アミノ－５－フェニルペンタン酸（Ａｆｐ）；ペニシラミン（Ｐｅｎ）；１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－３－カルボン酸（Ｔｉｃ）；β－２－チエニルアラニン（Ｔｈｉ）；メチオニンスルホキシド（Ｍｓｏ）；Ｎ（ｗ）－ニトロアルギニン（ｎＡｒｇ）；ホモリシン（ｈＬｙｓ）；ホスホノメチルフェニルアラニン（ｐｍＰｈｅ）；ホスホセリン（ｐＳｅｒ）；ホスホスレオニン（ｐＴｈｒ）；ホモアスパラギン酸（ｈＡｓｐ）；ホモグルタミン酸（ｈＧｌｕ）；１－アミノシクロペンタ－（２または３）－エン－４カルボン酸；ピペコリン酸（ＰＡ）、アゼチジン－３－カルボン酸（ＡＣＡ）；１－アミノシクロペンタン－３－カルボン酸；アリルグリシン（ａＯｌｙ）；プロパルギルグリシン（ｐｇＧｌｙ）；ホモアラニン（ｈＡｌａ）；ノルバリン（ｎＶａｌ）；ホモロイシン（ｈＬｅｕ）、ホモバリン（ｈＶａｌ）；ホモイソロイシン（ｈＩｌｅ）；ホモアルギニン（ｈＡｒｇ）；Ｎ－アセチル リシン（ＡｃＬｙｓ）；２，４－ジアミノ酪酸（Ｄｂｕ）；２，３－ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）；Ｎ－メチルバリン（ＭｅＶａｌ）；ホモシステイン（ｈＣｙｓ）；ホモセリン（ｈＳｅｒ）；ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）およびホモプロリン（ｈＰｒｏ）が挙げられる。本明細書に記載のポリペプチドを構成し得る追加的なコードされないアミノ酸は当業者には明らかになろう。これらのアミノ酸は、Ｌ－立体配置またはＤ－立体配置のいずれであってもよい。

【0154】

側鎖保護基を有するアミノ酸または残基も本明細書に記載のポリペプチドを構成し得ることが当業者には理解されよう。この場合は芳香族カテゴリーに属する、そのような保護されたアミノ酸の非限定的な例としては、これだけに限定されないが、以下が挙げられる（保護基を括弧内に列挙する）：Ａｒｇ（ｔｏｓ）、Ｃｙｓ（メチルベンジル）、Ｃｙｓ（ニトロピリジンスルフェニル）、Ｇｌｕ（δ－ベンジルエステル）、Ｇｌｎ（キサンチル）、Ａｓｎ（Ｎ－δ－キサンチル）、Ｈｉｓ（ｂｏｍ）、Ｈｉｓ（ベンジル）、Ｈｉｓ（ｔｏｓ）、Ｌｙｓ（ｆｍｏｃ）、Ｌｙｓ（ｔｏｓ）、Ｓｅｒ（Ｏ－ベンジル）、Ｔｈｒ（Ｏ－ベンジル）およびＴｙｒ（Ｏ－ベンジル）。

【0155】

本明細書に記載のポリペプチドを構成し得るコンフォメーション的に束縛されているコードされないアミノ酸としては、これだけに限定されないが、Ｎ－メチルアミノ酸（Ｌ－立体配置）；１－アミノシクロペンタ－（２または３）－エン－４－カルボン酸；ピペコリン酸；アゼチジン－３－カルボン酸；ホモプロリン（ｈＰｒｏ）；および１－アミノシクロペンタン－３－カルボン酸が挙げられる。

【0156】

一部の実施形態では、操作されたポリペプチドを膜、樹脂、固体担体、または他の固相材料などの固体支持体上にある状態で提供することができる。固体支持体は、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシ、およびポリアクリルアミドなどの有機ポリマー、ならびにこれらの共重合体およびグラフトで構成されるものであってよい。固体支持体はまた、ガラス、シリカ、制御細孔ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）（ＣＰＧ）、逆相シリカまたは金もしくは白金などの金属などの無機物であってもよい。固体支持体の構成は、ビーズ、球体、粒子、顆粒、ゲル、膜または表面の形態であってよい。表面は、平面、実質的に平面、または非平面であってよい。固体支持体は、多孔質または非多孔質であってよく、また、膨潤または非膨潤特徴を有してよい。固体支持体は、ウェル、くぼみ、または他のコンテナ、容器、特徴、または場所の形態に構成されたものであってよい。

【0157】

一部の実施形態では、トランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを、参照ポリペプチド（例えば、配列番号２、４、８、３６６、および／または６５０）と比べたそれらの改善された活性、エナンチオ選択性、立体選択性、および／または他の改善された特性が保持されるように、固体支持体に結合させるまたは固定化する。そのような実施形態では、固定化されたポリペプチドにより、基質化合物の所望の生成物への生体触媒変換を容易にすることができ、また、固定化されたポリペプチドは、反応の完了後に容易に保持し（例えば、ポリペプチドを固定化したビーズを保持することによって）、次いで、次の反応に再使用または再利用することができる。そのような酵素を固定化したプロセスにより、さらなる効率および費用削減が可能になる。したがって、さらに、本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを使用する任意の方法を、固体支持体に結合させたまたは固定化した同じトランスアミナーゼポリペプチドを使用して行うことができることが意図されている。

【0158】

操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、非共有結合によりまたは共有結合により結合させることができる。酵素を固体支持体（例えば、樹脂、膜、ビーズ、ガラスなど）にコンジュゲートおよび固定化するための様々な方法が当技術分野で周知である。特に、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１２／１７７５２７Ａ１には、化合物（２）を化合物（１）に変換することが可能な固定化された操作されたトランスアミナーゼポリペプチド、および、固定化されたポリペプチドを調製する方法が開示されており、ここで、ポリペプチドは、樹脂に疎水性相互作用または共有結合のいずれかによって物理的に付着しており、少なくとも最大１００％の有機溶媒を含む溶媒系で安定である。酵素を固体支持体（例えば、樹脂、膜、ビーズ、ガラスなど）にコンジュゲートおよび固定化するための他の方法は当技術分野で周知である（例えば、Ｙｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ４２： ８９５－８９８ ［２００７］；Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ７６： ８４３－８５１ ［２００７］；Ｋｏｓｚｅｌｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｃａｔ． Ｂ： Ｅｎｚ．， ６３： ３９－４４ ［２０１０］；Ｔｒｕｐｐｏ ｅｔ ａｌ．， Ｏｒｇ． Ｐｒｏｃ． Ｒｅｓ． Ｄｅｖｅｌｏｐ．， ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ： ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ｏｐ２００１５７ｃ；およびＭａｔｅｏ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｐｒｏｇ．， １８： ６２９－３４ ［２００２］などを参照されたい）。

【0159】

本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを固定化するために有用な固体支持体としては、これだけに限定されないが、エポキシド官能基を有するポリメタクリレート、アミノエポキシド官能基を有するポリメタクリレート、スチレン／ＤＶＢ共重合体またはオクタデシル官能基を有するポリメタクリレートを含むビーズまたは樹脂が挙げられる。本開示の操作されたトランスアミナーゼを固定化するために有用な例示的な固体支持体としては、これだけに限定されないが、キトサンビーズ、Ｅｕｐｅｒｇｉｔ Ｃ、ならびに、以下の異なる型のＳＥＰＡＢＥＡＤ：ＥＣ－ＥＰ、ＥＣ－ＨＦＡ／Ｓ、ＥＸＡ２５２、ＥＸＥ１１９およびＥＸＥ１２０を含めたＳＥＰＡＢＥＡＤ（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ）が挙げられる。

【0160】

一部の実施形態では、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを、ポリペプチドが位置的に別個の場所に配置されたアレイの形態で提供することができる。一部の実施形態では、位置的に別個の場所は、９６ウェルプレートなどの固体支持体中のウェルである。複数の支持体を、アレイ上の、試薬のロボットによる送達のためにまたは検出方法および／もしくは機器によってアドレス可能な種々の場所に構成することができる。そのようなアレイを使用して、種々の基質化合物をポリペプチドによる変換について試験することができる。

【0161】

一部の実施形態では、本明細書に記載の操作されたポリペプチドをキットの形態で提供することができる。キット内のポリペプチドは、個別に存在してもよく、複数のポリペプチドとして存在してもよい。キットは、酵素反応を行うための試薬、ポリペプチドの活性を評価するための基質、ならびに生成物を検出するための試薬をさらに含み得る。キットは、試薬ディスペンサーおよびキットの使用に関する指示も含み得る。一部の実施形態では、本開示のキットは、複数の異なる操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを異なるアドレス可能な位置に含むアレイを含み、ここで、異なるポリペプチドは、それぞれが少なくとも１つの異なる酵素特性の改善を有する、参照配列の異なるバリアントである。複数の操作されたポリペプチドを含むそのようなアレイおよびそれらの使用方法は公知である（例えば、ＷＯ２００９／００８９０８Ａ２を参照されたい）。
操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを調製するために有用なポリヌクレオチド、制御配列、発現ベクター、および宿主細胞

【0162】

別の態様では、本開示は、トランスアミナーゼ活性を有する本明細書に記載の操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドを、ポリペプチドを発現することが可能な組換えポリヌクレオチドが創出されるように遺伝子発現制御する１つまたは複数の異種調節配列に作動可能に（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ）連結することができる。操作されたトランスアミナーゼをコードする異種ポリヌクレオチドを含有する発現構築物を適当な宿主細胞に導入して、対応する操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを発現させることができる。

【0163】

一部の実施形態では、改善されたトランスアミナーゼポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを、様々なやり方で操作して、ポリペプチドの活性および／または発現の改善をもたらす。発現ベクターに応じて、単離されたポリヌクレオチドを、ベクターへの挿入前に操作することが望ましいまたは必要な場合がある。組換えＤＮＡ法を利用してポリヌクレオチドおよび核酸配列を改変するための技法は当技術分野で周知である。

【0164】

遺伝暗号の縮重に起因して、本開示のバリアントトランスアミナーゼアシラーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が多数存在することが当業者には理解される。例えば、コドンＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、およびＣＧＵは全てアミノ酸アルギニンをコードする。したがって、ある１つのコドンによってアルギニンが指定される、本開示の核酸の全ての位置において、そのコドンを、コードされるポリペプチドを変更することなく、上記の対応するコドンのいずれかに変更することができる。ＲＮＡ配列内の「Ｕ」はＤＮＡ配列内の「Ｔ」に対応することが理解される。本開示は、可能性のあるコドン選択に基づいた組合せの選択によって作製することができる、本開示のポリペプチドをコードする核酸配列のありとあらゆる可能性のあるバリエーションを意図しており、それを提供する。

【0165】

上記の通り、トランスアミナーゼをコードするＤＮＡ配列を、コドン使用の傾向が大きいコドン（同じアミノ酸をコードする他のコドンよりも高い頻度でタンパク質コード領域内に使用されるコドン）について設計することもできる。好ましいコドンは、単一の遺伝子におけるコドン使用、機能もしくは起源が共通する遺伝子のセットにおけるコドン使用、高度に発現される遺伝子におけるコドン使用、生物体全体の凝集タンパク質コード領域におけるコドン頻度、関連する生物体の凝集タンパク質コード領域におけるコドン頻度、またはこれらの組合せとの関連で決定することができる。遺伝子発現のレベルと共に頻度が増大するコドンが一般には発現のために最適なコドンである。特に、ＤＮＡ配列を特定の宿主生物体における発現のために最適化することができる。多変量解析（例えば、クラスター解析またはコレスポンデンス分析を使用する）を含めた、特定の生物体におけるコドン頻度（例えば、同義のコドン使用と比べたコドン使用）およびコドン選好を決定するための、ならびに遺伝子において使用されるコドンの有効数を決定するための、種々の方法が当技術分野で周知である。コドン使用を得るためのデータソースは、タンパク質をコードすることが可能な任意の利用可能なヌクレオチド配列に依拠するものであってよい。これらのデータセットは、当技術分野で周知の通り、発現されるタンパク質（例えば、完全なタンパク質コード配列－ＣＤＳ）、発現される配列タグ（ＥＳＴ）、または予測されるゲノム配列のコード領域をコードすることが実際に分かっている核酸配列を含む。バリアントトランスアミナーゼをコードするポリヌクレオチドは、任意の適切な当技術分野で公知の方法を使用して調製することができる。一般には、オリゴヌクレオチドを個別に合成し、次いで、接合して（例えば、酵素的もしくは化学的ライゲーション法、またはポリメラーゼにより媒介される方法によって）、基本的にあらゆる所望の連続した配列を形成する。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドを、これだけに限定されないが、自動化された合成方法を含めた任意の適切な当技術分野で公知の方法を使用した化学合成によって調製する。例えば、ホスホラミダイト法では、オリゴヌクレオチドを合成し（例えば、自動ＤＮＡ合成機で）、精製し、アニーリングし、ライゲーションし、適当なベクターにクローニングする。一部の実施形態では、次いで、相補鎖を合成し、それらの鎖を適当な条件下でアニーリングすることによって、またはＤＮＡポリメラーゼを使用し、適当なプライマー配列を用いて相補鎖を付加することによってのいずれかで、二本鎖ＤＮＡ断片を得る。当業者に周知である本開示において有用な方法を提供する一般的な標準のテキストが多数存在する。

【0166】

例えば、突然変異誘発および定向進化方法をポリヌクレオチドに容易に適用して、発現させ、スクリーニングし、アッセイすることができるバリアントライブラリーを作出することができる。突然変異誘発および定向進化方法は当技術分野で周知である（例えば、全てが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，６０５，７９３号、同第５，８１１，２３８号、同第５，８３０，７２１号、同第５，８３４，２５２号、同第５，８３７，４５８号、同第５，９２８，９０５号、同第６，０９６，５４８号、同第６，１１７，６７９号、同第６，１３２，９７０号、同第６，１６５，７９３号、同第６，１８０，４０６号、同第６，２５１，６７４号、同第６，２６５，２０１号、同第６，２７７，６３８号、同第６，２８７，８６１号、同第６，２８７，８６２号、同第６，２９１，２４２号、同第６，２９７，０５３号、同第６，３０３，３４４号、同第６，３０９，８８３号、同第６，３１９，７１３号、同第６，３１９，７１４号、同第６，３２３，０３０号、同第６，３２６，２０４号、同第６，３３５，１６０号、同第６，３３５，１９８号、同第６，３４４，３５６号、同第６，３５２，８５９号、同第６，３５５，４８４号、同第６，３５８，７４０号、同第６，３５８，７４２号、同第６，３６５，３７７号、同第６，３６５，４０８号、同第６，３６８，８６１号、同第６，３７２，４９７号、同第６，３３７，１８６号、同第６，３７６，２４６号、同第６，３７９，９６４号、同第６，３８７，７０２号、同第６，３９１，５５２号、同第６，３９１，６４０号、同第６，３９５，５４７号、同第６，４０６，８５５号、同第６，４０６，９１０号、同第６，４１３，７４５号、同第６，４１３，７７４号、同第６，４２０，１７５号、同第６，４２３，５４２号、同第６，４２６，２２４号、同第６，４３６，６７５号、同第６，４４４，４６８号、同第６，４５５，２５３号、同第６，４７９，６５２号、同第６，４８２，６４７号、同第６，４８３，０１１号、同第６，４８４，１０５号、同第６，４８９，１４６号、同第６，５００，６１７号、同第６，５００，６３９号、同第６，５０６，６０２号、同第６，５０６，６０３号、同第６，５１８，０６５号、同第６，５１９，０６５号、同第６，５２１，４５３号、同第６，５２８，３１１号、同第６，５３７，７４６号、同第６，５７３，０９８号、同第６，５７６，４６７号、同第６，５７９，６７８号、同第６，５８６，１８２号、同第６，６０２，９８６号、同第６，６０５，４３０号、同第６，６１３，５１４号、同第６，６５３，０７２号、同第６，６８６，５１５号、同第６，７０３，２４０号、同第６，７１６，６３１号、同第６，８２５，００１号、同第６，９０２，９２２号、同第６，９１７，８８２号、同第６，９４６，２９６号、同第６，９６１，６６４号、同第６，９９５，０１７号、同第７，０２４，３１２号、同第７，０５８，５１５号、同第７，１０５，２９７号、同第７，１４８，０５４号、同第７，２２０，５６６号、同第７，２８８，３７５号、同第７，３８４，３８７号、同第７，４２１，３４７号、同第７，４３０，４７７号、同第７，４６２，４６９号、同第７，５３４，５６４号、同第７，６２０，５００号、同第７，６２０，５０２号、同第７，６２９，１７０号、同第７，７０２，４６４号、同第７，７４７，３９１号、同第７，７４７，３９３号、同第７，７５１，９８６号、同第７，７７６，５９８号、同第７，７８３，４２８号、同第７，７９５，０３０号、同第７，８５３，４１０号、同第７，８６８，１３８号、同第７，７８３，４２８号、同第７，８７３，４７７号、同第７，８７３，４９９号、同第７，９０４，２４９号、同第７，９５７，９１２号、同第７，９８１，６１４号、同第８，０１４，９６１号、同第８，０２９，９８８号、同第８，０４８，６７４号、同第８，０５８，００１号、同第８，０７６，１３８号、同第８，１０８，１５０号、同第８，１７０，８０６号、同第８，２２４，５８０号、同第８，３７７，６８１号、同第８，３８３，３４６号、同第８，４５７，９０３号、同第８，５０４，４９８号、同第８，５８９，０８５号、同第８，７６２，０６６号、同第８，７６８，８７１号、同第９，５９３，３２６号、および全ての関連するＵＳ以外の対応物；Ｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ２５４ （２）： １５７－７８ ［１９９７］；Ｄａｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ５７： ３６９－７４ ［１９９６］；Ｓｍｉｔｈ， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ．， １９： ４２３－４６２ ［１９８５］；Ｂｏｔｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２９： １１９３－１２０１ ［１９８５］；Ｃａｒｔｅｒ， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．， ２３７： １－７ ［１９８６］；Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， ３８： ８７９－８８７ ［１９８４］；Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ， ３４： ３１５－３２３ ［１９８５］；Ｍｉｎｓｈｕｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ．， ３： ２８４－２９０ ［１９９９］；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １７： ２５９－２６４ ［１９９９］；Ｃｒａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３９１： ２８８－２９１ ［１９９８］；Ｃｒａｍｅｒｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １５： ４３６－４３８ ［１９９７］；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ９４： ４５０４－４５０９ ［１９９７］；Ｃｒａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １４： ３１５－３１９ ［１９９６］；Ｓｔｅｍｍｅｒ， Ｎａｔｕｒｅ， ３７０： ３８９－３９１ ［１９９４］；Ｓｔｅｍｍｅｒ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９１： １０７４７－１０７５１ ［１９９４］；ＷＯ９５／２２６２５；ＷＯ９７／００７８；ＷＯ９７／３５９６６；ＷＯ９８／２７２３０；ＷＯ００／４２６５１；ＷＯ０１／７５７６７；およびＷＯ２００９／１５２３３６を参照されたい）。

【0167】

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２、４、８、３６６、および／または６５０の偶数の配列識別子から選択される参照配列と少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも大きく同一であるアミノ酸配列を含むトランスアミナーゼポリペプチドをコードし、ここで、ポリペプチドは、トランスアミナーゼ活性、ならびに、本明細書に記載の特性の改善のうちの１つまたは複数、例えば、参照配列（例えば、配列番号２、４、８、３６６、および／または６５０のポリペプチド）と比較して増大した活性で、化合物（１）を生成物である化合物（２）に変換する能力を有する。一部の実施形態では、参照配列は、配列番号２、４、８、３６６、および／または６５０から選択される。一部の実施形態では、参照配列は配列番号２である。一部の実施形態では、参照配列は配列番号４である。一部の実施形態では、参照配列は配列番号８である。一部の実施形態では、参照配列は配列番号３６６である。一部の実施形態では、参照配列は配列番号６５０である。

【0168】

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２、４、８、３６６、および／または６５０と比較して、上記のパーセント同一性を有し、（ａ）１つまたは複数のアミノ酸残基の差異を有するアミノ酸配列を含む操作されたトランスアミナーゼポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、本開示は、参照配列である配列番号２、４、８、３６６、および／または６５０に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも大きな配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに（ａ）本明細書に提示される置換から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基の差異（例えば、表２－１、２－２、３－１、３－２、４－１、４－２、５－１、および／または５－２を参照されたい）を含む、トランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。

【0169】

一部の実施形態では、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号５～９３５の奇数の配列識別子から選択される配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、配列番号１、３、７、３６５および／または９３５から選択される。一部の実施形態では、本開示は、トランスアミナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチドを提供し、ここで、操作されたポリペプチドは、配列番号１、３、７、３６５および／または９３５から選択される少なくとも１つの参照配列に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも大きな配列同一性を有する。

【0170】

一部の実施形態では、本開示は、中程度にストリンジェントなまたは高度にストリンジェントな条件などの規定の条件下で、本開示の操作されたトランスアミナーゼをコードするポリヌクレオチド配列（またはその相補物）とハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５～９３５の奇数の配列識別子を有する配列から選択されるポリヌクレオチドまたはその相補物と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能であり、トランスアミナーゼ活性を有し、本明細書に記載の特性の改善のうちの１つまたは複数を有するポリペプチドをコードする。

【0171】

一部の実施形態では、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドは、１８、２０、２１、２１／２３／５６／１４６、２１／２３／５６／１４６／４３２、２１／２３／１４６／４１７、２１／２３／３９５／４１７／４３２、２１／５３／５６、２１／５３／４１７、２１／５６／３９５、２１／４１７／４３２、２３、２３／５３、２３／５３／５６、２３／５３／５６／１４６／３９５、２３／５３／３９５、２３／５３／４１７、２３／５３／４３２、２３／５６、２３／５６／３９５、２３／５６／３９５／４１７、２３／３９５／４１７、２３／４１７、２３／４１７／４３２、５３、５３／５６、５３／１４６／４１７、５３／３９５、５６、５６／７４／２４１／２８６／３１４／３１６／３２３、５６／８６／１６３／３１４／３１６／３８３／４１４／４１６／４２２、５６／８６／２８６／３１４／４１４／４１６、５６／８６／３１４／３１６／３２３／３９４／４１４／４２２、５６／１４６／４１７、５６／１４６／４３２、５６／１４７、５６／１６３、５６／１６３／２８６／３１６／３２３／３８３／３９４、５６／２８６／３１４／３１６／３２３／４２２、５６／２８６／３８３、５６／３２３、５６／３２３／３８３、５６／３２３／３８３／３９４、５６／３８３、５６／３９５、７４／８１／２８６／３１６／３２３／３８３、７４／８５／８６／１６３／２８６／３１６／３２３／３９４、７４／８５／３１４／３１６／４１４／４１６、７４／８６／１６３／３１６、７４／８６／３１６／３２３／３８３／３９４、７４／８８／２８６／３１６／３２３／３８３、７４／８８／３２３／３８３、７４／１６３／２８６／３１６／３８３／３９４／４１６、７４／１６３／３１４／３１６、７４／１６３／３１４／３１６／３２３／３９４、７４／１６３／３１４／３２３／３８３／４１４／４１６、７４／２８６、７４／２８６／３１６／３２３、７４／２８６／３９４／４１６、７４／３１４／３２３／３８３／３９４／４１４、７４／３１６／３２３／３９４、８５／８６／８８／１６３／３２３／３８３／３９４、８５／８６／１６３／３１４／３２３／３９４／４１４、８５／２８６、８５／２８６／３２３、８６、８６／８８／１６３／３２３／３８３／４１４／４２２、８６／３８３／３９４、８８、８８／１６３／２８６／３８３、８８／２８６／３１６／３２３、８８／２８６／３１６／３２３／３８３／４１４／４１６、８８／３１６／３２３、１４６、１４６／１４７／３９５／４１７、１４６／３９５、１４６／３９５／４１７、１４６／４１７、１４７／３９５／４１７／４３２、１４７／４１７、１４９、１５７、１６３、１６３／２２２／２８６／３１６／３２３／３８３／３９４、１６３／２８６、１６３／２８６／３１４／３１６／３２３／４１４／４１６、１６３／２８６／３１４／３２３／３９４、１６３／２８６／３１６／３２３／３９４／４１６、１６３／２８６／４１４、１６３／３１４／３１６／３９４、１６３／３１４／３２３／３９４、１６３／３１４／３８３、１６３／３１４／４１４、１６３／３１６／３２３、１６３／３２３、１６３／３８３、１６４、１９９／４１７、２５９、２６０、２８４、２８６、２８６／３１４／３２３／３８３、２８６／３１４／３９４、２８６／３１６／３２３／３８３／４１４／４１６、２８６／３１６／３８３／３９４、２８６／３１６／３９４／４１４／４１６、２８６／３２３、２８６／３２３／３８３／４１４、２８６／３２３／４１６、２８６／３８３、２８６／４１６、３１４／３１６、３１４／３１６／３２３、３１４／３１６／３２３／３８３／４２２、３１４／３１６／３２３／３９４、３１４／３１６／３９４、３１４／３２３／３８３／３９４、３１４／３８３、３１４／３８３／４１４／４２２、３１５、３１６、３１６／３２３／３８３／３９４、３１６／３２３／３９４／４１４／４１６、３１６／４１４／４２２、３２３、３２３／３８３、３２３／３８３／３９４／４１４／４１６、３２３／３９４、３８３、３９５、３９５／４１７、３９５／４１７／４３２、４００、４０１、４０３、４０４、４０５、４０６、４０８、４１５、４１７、４１７／４３２、４２０、および４２２から選択される、配列番号４と比較した１つまたは複数のアミノ酸残基の差異を有するアミノ酸配列を含む、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドをコードし、ここで、位置は、配列番号４を基準に番号付けされる。一部の実施形態では、アミノ酸の差異は、置換１８Ａ、２０Ｃ、２１Ｈ、２１Ｐ／２３Ｓ／５６Ｃ／１４６Ｈ、２１Ｐ／２３Ｓ／５６Ｃ／１４６Ｈ／４３２Ｖ、２１Ｐ／２３Ｓ／１４６Ｈ／４１７Ｖ、２１Ｐ／２３Ｓ／３９５Ｄ／４１７Ｓ／４３２Ｖ、２１Ｐ／５３Ｃ／５６Ｃ、２１Ｐ／５３Ｃ／４１７Ｓ、２１Ｐ／５６Ｃ／３９５Ｄ、２１Ｐ／４１７Ｓ／４３２Ｖ、２１Ｒ、２３Ａ、２３Ｒ、２３Ｓ／５３Ｃ、２３Ｓ／５３Ｃ／５６Ｃ、２３Ｓ／５３Ｃ／５６Ｃ／１４６Ｈ／３９５Ｄ、２３Ｓ／５３Ｃ／３９５Ｄ、２３Ｓ／５３Ｃ／４１７Ｓ、２３Ｓ／５３Ｃ／４３２Ｖ、２３Ｓ／５６Ｃ、２３Ｓ／５６Ｃ／３９５Ｄ、２３Ｓ／５６Ｃ／３９５Ｄ／４１７Ｖ、２３Ｓ／３９５Ｄ／４１７Ｓ、２３Ｓ／４１７Ｓ、２３Ｓ／４１７Ｖ、２３Ｓ／４１７Ｖ／４３２Ｖ、５３Ｃ、５３Ｃ／５６Ｃ、５３Ｃ／１４６Ｈ／４１７Ｓ、５３Ｃ／３９５Ｄ、５６Ａ、５６Ａ／７４Ｔ／２４１Ｖ／２８６Ｓ／３１４Ｒ／３１６Ｗ／３２３Ｔ、５６Ａ／８６Ａ／１６３Ｆ／３１４Ｒ／３１６Ｗ／３８３Ｖ／４１４Ｖ／４１６Ａ／４２２Ａ、５６Ａ／８６Ａ／２８６Ｓ／３１４Ｒ／４１４Ｖ／４１６Ａ、５６Ａ／８６Ａ／３１４Ｒ／３１６Ｗ／３２３Ｔ／３９４Ｇ／４１４Ｖ／４２２Ａ、５６Ａ／１６３Ｆ、５６Ａ／１６３Ｆ／２８６Ｓ／３１６Ｗ／３２３Ｔ／３８３Ｖ／３９４Ｇ、５６Ａ／２８６Ｓ／３１４Ｒ／３１６Ｗ／３２３Ｔ／４２２Ａ、５６Ａ／２８６Ｓ／３８３Ｖ、５６Ａ／３２３Ｔ、５６Ａ／３２３Ｔ／３８３Ｖ、５６Ａ／３２３Ｔ／３８３Ｖ／３９４Ｇ、５６Ａ／３８３Ｖ、５６Ｃ、５６Ｃ／１４６Ｈ／４１７Ｖ、５６Ｃ／１４６Ｈ／４３２Ｖ、５６Ｃ／１４７Ｒ、５６Ｃ／３９５Ｄ、５６Ｔ、５６Ｖ、７４Ｔ／８１Ｓ／２８６Ｓ／３１６Ｗ／３２３Ｔ／３８３Ｖ、７４Ｔ／８５Ｖ／８６Ａ／１６３Ｆ／２８６Ｓ／３１６Ｗ／３２３Ｔ／３９４Ｇ、７４Ｔ／８５Ｖ／３１４Ｒ／３１６Ｗ／４１４Ｖ／４１６Ａ、７４Ｔ／８６Ａ／１６３Ｆ／３１６Ｗ、７４Ｔ／８６Ａ／３１６Ｗ／３２３Ｔ／３８３Ｖ／３９４Ｇ、７４Ｔ／８８Ｒ／２８６Ｓ／３１６Ｗ／３２３Ｔ／３８３Ｖ、７４Ｔ／８８Ｒ／３２３Ｔ／３８３Ｖ、７４Ｔ／１６３Ｆ／２８６Ｓ／３１６Ｗ／３８３Ｖ／３９４Ｇ／４１６Ａ、７４Ｔ／１６３Ｆ／３１４Ｒ／３１６Ｗ、７４Ｔ／１６３Ｆ／３１４Ｒ／３１６Ｗ／３２３Ｔ／３９４Ｇ、７４Ｔ／１６３Ｆ／３１４Ｒ／３２３Ｔ／３８３Ｖ／４１４Ｖ／４１６Ａ、７４Ｔ／２８６Ｓ、７４Ｔ／２８６Ｓ／３１６Ｗ／３２３Ｔ、７４Ｔ／２８６Ｓ／３９４Ｇ／４１６Ａ、７４Ｔ／３１４Ｒ／３２３Ｔ／３８３Ｖ／３９４Ｇ／４１４Ｖ、７４Ｔ／３１６Ｗ／３２３Ｔ／３９４Ｇ、８５Ｖ／８６Ａ／８８Ｒ／１６３Ｆ／３２３Ｔ／３８３Ｖ／３９４Ｇ、８５Ｖ／８６Ａ／１６３Ｆ／３１４Ｒ／３２３Ｔ／３９４Ｇ／４１４Ｖ、８５Ｖ／２８６Ｓ、８５Ｖ／２８６Ｓ／３２３Ｔ、８６Ａ／８８Ｒ／１６３Ｆ／３２３Ｔ／３８３Ｖ／４１４Ｖ／４２２Ａ、８６Ａ／３８３Ｖ／３９４Ｇ、８６Ｇ、８８Ｒ／１６３Ｆ／２８６Ｓ／３８３Ｖ、８８Ｒ／２８６Ｓ／３１６Ｗ／３２３Ｔ、８８Ｒ／２８６Ｓ／３１６Ｗ／３２３Ｔ／３８３Ｖ／４１４Ｖ／４１６Ａ、８８Ｒ／３１６Ｗ／３２３Ｔ、８８Ｓ、８８Ｔ、１４６Ｈ、１４６Ｈ／１４７Ｒ／３９５Ｄ／４１７Ｓ、１４６Ｈ／３９５Ｄ、１４６Ｈ／３９５Ｄ／４１７Ｓ、１４６Ｈ／４１７Ｓ、１４６Ｈ／４１７Ｖ、１４７Ｒ／３９５Ｄ／４１７Ｓ／４３２Ｖ、１４７Ｒ／４１７Ｓ、１４９Ｓ、１５７Ａ、１６３Ｆ、１６３Ｆ／２２２Ｖ／２８６Ｓ／３１６Ｗ／３２３Ｔ／３８３Ｖ／３９４Ｇ、１６３Ｆ／２８６Ｓ、１６３Ｆ／２８６Ｓ／３１４Ｒ／３１６Ｗ／３２３Ｔ／４１４Ｖ／４１６Ａ、１６３Ｆ／２８６Ｓ／３１４Ｒ／３２３Ｔ／３９４Ｇ、１６３Ｆ／２８６Ｓ／３１６Ｗ／３２３Ｔ／３９４Ｇ／４１６Ａ、１６３Ｆ／２８６Ｓ／４１４Ｖ、１６３Ｆ／３１４Ｒ／３１６Ｗ／３９４Ｇ、１６３Ｆ／３１４Ｒ／３２３Ｔ／３９４Ｇ、１６３Ｆ／３１４Ｒ／３８３Ｖ、１６３Ｆ／３１４Ｒ／４１４Ｖ、１６３Ｆ／３１６Ｗ／３２３Ｔ、１６３Ｆ／３２３Ｔ、１６３Ｆ／３８３Ｖ、１６３Ｌ、１６３Ｍ、１６４Ａ、１６４Ｄ、１６４Ｑ、１６４Ｓ、１９９Ｖ／４１７Ｓ、２５９Ｖ、２６０Ｔ、２８４Ａ、２８６Ｓ、２８６Ｓ／３１４Ｒ／３２３Ｔ／３８３Ｖ、２８６Ｓ／３１４Ｒ／３９４Ｇ、２８６Ｓ／３１６Ｗ／３２３Ｔ／３８３Ｖ／４１４Ｖ／４１６Ａ、２８６Ｓ／３１６Ｗ／３８３Ｖ／３９４Ｇ、２８６Ｓ／３１６Ｗ／３９４Ｇ／４１４Ｖ／４１６Ａ、２８６Ｓ／３２３Ｔ、２８６Ｓ／３２３Ｔ／３８３Ｖ／４１４Ｖ、２８６Ｓ／３２３Ｔ／４１６Ａ、２８６Ｓ／３８３Ｖ、２８６Ｓ／４１６Ａ、３１４Ｒ／３１６Ｗ、３１４Ｒ／３１６Ｗ／３２３Ｔ、３１４Ｒ／３１６Ｗ／３２３Ｔ／３８３Ｖ／４２２Ａ、３１４Ｒ／３１６Ｗ／３２３Ｔ／３９４Ｇ、３１４Ｒ／３１６Ｗ／３９４Ｇ、３１４Ｒ／３２３Ｔ／３８３Ｖ／３９４Ｇ、３１４Ｒ／３８３Ｖ、３１４Ｒ／３８３Ｖ／４１４Ｖ／４２２Ａ、３１５Ｇ、３１５Ｒ、３１６Ａ、３１６Ｆ、３１６Ｇ、３１６Ｈ、３１６Ｌ、３１６Ｎ、３１６Ｒ、３１６Ｖ、３１６Ｗ／３２３Ｔ／３８３Ｖ／３９４Ｇ、３１６Ｗ／３２３Ｔ／３９４Ｇ／４１４Ｖ／４１６Ａ、３１６Ｗ／４１４Ｖ／４２２Ａ、３２３Ｃ、３２３Ｓ、３２３Ｔ、３２３Ｔ／３８３Ｖ、３２３Ｔ／３８３Ｖ／３９４Ｇ／４１４Ｖ／４１６Ａ、３２３Ｔ／３９４Ｇ、３８３Ｖ、３９５Ｄ、３９５Ｄ／４１７Ｓ、３９５Ｄ／４１７Ｓ／４３２Ｖ、３９５Ｄ／４１７Ｖ、４００Ｄ、４０１Ａ、４０１Ｋ、４０１Ｓ、４０３Ｖ、４０４Ｓ、４０５Ｈ、４０５Ｗ、４０６Ｓ、４０８Ｆ、４０８Ｌ、４０８Ｗ、４１５Ｇ、４１５Ｗ、４１７Ａ、４１７Ｓ、４１７Ｓ／４３２Ｖ、４１７Ｖ、４１７Ｖ／４３２Ｖ、４２０Ｇ、４２２Ｌ、および４２２Ｔを含み、ここで、位置は、配列番号４を基準に番号付けされる。一部の追加的な実施形態では、アミノ酸の差異は、置換Ｇ１８Ａ、Ｔ２０Ｃ、Ｄ２１Ｈ、Ｄ２１Ｐ／Ｐ２３Ｓ／Ｌ５６Ｃ／Ｒ１４６Ｈ、Ｄ２１Ｐ／Ｐ２３Ｓ／Ｌ５６Ｃ／Ｒ１４６Ｈ／Ａ４３２Ｖ、Ｄ２１Ｐ／Ｐ２３Ｓ／Ｒ１４６Ｈ／Ｌ４１７Ｖ、Ｄ２１Ｐ／Ｐ２３Ｓ／Ｇ３９５Ｄ／Ｌ４１７Ｓ／Ａ４３２Ｖ、Ｄ２１Ｐ／Ｎ５３Ｃ／Ｌ５６Ｃ、Ｄ２１Ｐ／Ｎ５３Ｃ／Ｌ４１７Ｓ、Ｄ２１Ｐ／Ｌ５６Ｃ／Ｇ３９５Ｄ、Ｄ２１Ｐ／Ｌ４１７Ｓ／Ａ４３２Ｖ、Ｄ２１Ｒ、Ｐ２３Ａ、Ｐ２３Ｒ、Ｐ２３Ｓ／Ｎ５３Ｃ、Ｐ２３Ｓ／Ｎ５３Ｃ／Ｌ５６Ｃ、Ｐ２３Ｓ／Ｎ５３Ｃ／Ｌ５６Ｃ／Ｒ１４６Ｈ／Ｇ３９５Ｄ、Ｐ２３Ｓ／Ｎ５３Ｃ／Ｇ３９５Ｄ、Ｐ２３Ｓ／Ｎ５３Ｃ／Ｌ４１７Ｓ、Ｐ２３Ｓ／Ｎ５３Ｃ／Ａ４３２Ｖ、Ｐ２３Ｓ／Ｌ５６Ｃ、Ｐ２３Ｓ／Ｌ５６Ｃ／Ｇ３９５Ｄ、Ｐ２３Ｓ／Ｌ５６Ｃ／Ｇ３９５Ｄ／Ｌ４１７Ｖ、Ｐ２３Ｓ／Ｇ３９５Ｄ／Ｌ４１７Ｓ、Ｐ２３Ｓ／Ｌ４１７Ｓ、Ｐ２３Ｓ／Ｌ４１７Ｖ、Ｐ２３Ｓ／Ｌ４１７Ｖ／Ａ４３２Ｖ、Ｎ５３Ｃ、Ｎ５３Ｃ／Ｌ５６Ｃ、Ｎ５３Ｃ／Ｒ１４６Ｈ／Ｌ４１７Ｓ、Ｎ５３Ｃ／Ｇ３９５Ｄ、Ｌ５６Ａ、Ｌ５６Ａ／Ａ７４Ｔ／Ａ２４１Ｖ／Ｎ２８６Ｓ／Ｉ３１４Ｒ／Ｅ３１６Ｗ／Ａ３２３Ｔ、Ｌ５６Ａ／Ｓ８６Ａ／Ｋ１６３Ｆ／Ｉ３１４Ｒ／Ｅ３１６Ｗ／Ａ３８３Ｖ／Ｃ４１４Ｖ／Ｐ４１６Ａ／Ｖ４２２Ａ、Ｌ５６Ａ／Ｓ８６Ａ／Ｎ２８６Ｓ／Ｉ３１４Ｒ／Ｃ４１４Ｖ／Ｐ４１６Ａ、Ｌ５６Ａ／Ｓ８６Ａ／Ｉ３１４Ｒ／Ｅ３１６Ｗ／Ａ３２３Ｔ／Ｄ３９４Ｇ／Ｃ４１４Ｖ／Ｖ４２２Ａ、Ｌ５６Ａ／Ｋ１６３Ｆ、Ｌ５６Ａ／Ｋ１６３Ｆ／Ｎ２８６Ｓ／Ｅ３１６Ｗ／Ａ３２３Ｔ／Ａ３８３Ｖ／Ｄ３９４Ｇ、Ｌ５６Ａ／Ｎ２８６Ｓ／Ｉ３１４Ｒ／Ｅ３１６Ｗ／Ａ３２３Ｔ／Ｖ４２２Ａ、Ｌ５６Ａ／Ｎ２８６Ｓ／Ａ３８３Ｖ、Ｌ５６Ａ／Ａ３２３Ｔ、Ｌ５６Ａ


／Ａ３２３Ｔ／Ａ３８３Ｖ、Ｌ５６Ａ／Ａ３２３Ｔ／Ａ３８３Ｖ／Ｄ３９４Ｇ、Ｌ５６Ａ／Ａ３８３Ｖ、Ｌ５６Ｃ、Ｌ５６Ｃ／Ｒ１４６Ｈ／Ｌ４１７Ｖ、Ｌ５６Ｃ／Ｒ１４６Ｈ／Ａ４３２Ｖ、Ｌ５６Ｃ／Ｗ１４７Ｒ、Ｌ５６Ｃ／Ｇ３９５Ｄ、Ｌ５６Ｔ、Ｌ５６Ｖ、Ａ７４Ｔ／Ｇ８１Ｓ／Ｎ２８６Ｓ／Ｅ３１６Ｗ／Ａ３２３Ｔ／Ａ３８３Ｖ、Ａ７４Ｔ／Ｆ８５Ｖ／Ｓ８６Ａ／Ｋ１６３Ｆ／Ｎ２８６Ｓ／Ｅ３１６Ｗ／Ａ３２３Ｔ／Ｄ３９４Ｇ、Ａ７４Ｔ／Ｆ８５Ｖ／Ｉ３１４Ｒ／Ｅ３１６Ｗ／Ｃ４１４Ｖ／Ｐ４１６Ａ、Ａ７４Ｔ／Ｓ８６Ａ／Ｋ１６３Ｆ／Ｅ３１６Ｗ、Ａ７４Ｔ／Ｓ８６Ａ／Ｅ３１６Ｗ／Ａ３２３Ｔ／Ａ３８３Ｖ／Ｄ３９４Ｇ、Ａ７４Ｔ／Ｈ８８Ｒ／Ｎ２８６Ｓ／Ｅ３１６Ｗ／Ａ３２３Ｔ／Ａ３８３Ｖ、Ａ７４Ｔ／Ｈ８８Ｒ／Ａ３２３Ｔ／Ａ３８３Ｖ、Ａ７４Ｔ／Ｋ１６３Ｆ／Ｎ２８６Ｓ／Ｅ３１６Ｗ／Ａ３８３Ｖ／Ｄ３９４Ｇ／Ｐ４１６Ａ、Ａ７４Ｔ／Ｋ１６３Ｆ／Ｉ３１４Ｒ／Ｅ３１６Ｗ、Ａ７４Ｔ／Ｋ１６３Ｆ／Ｉ３１４Ｒ／Ｅ３１６Ｗ／Ａ３２３Ｔ／Ｄ３９４Ｇ、Ａ７４Ｔ／Ｋ１６３Ｆ／Ｉ３１４Ｒ／Ａ３２３Ｔ／Ａ３８３Ｖ／Ｃ４１４Ｖ／Ｐ４１６Ａ、Ａ７４Ｔ／Ｎ２８６Ｓ、Ａ７４Ｔ／Ｎ２８６Ｓ／Ｅ３１６Ｗ／Ａ３２３Ｔ、Ａ７４Ｔ／Ｎ２８６Ｓ／Ｄ３９４Ｇ／Ｐ４１６Ａ、Ａ７４Ｔ／Ｉ３１４Ｒ／Ａ３２３Ｔ／Ａ３８３Ｖ／Ｄ３９４Ｇ／Ｃ４１４Ｖ、Ａ７４Ｔ／Ｅ３１６Ｗ／Ａ３２３Ｔ／Ｄ３９４Ｇ、Ｆ８５Ｖ／Ｓ８６Ａ／Ｈ８８Ｒ／Ｋ１６３Ｆ／Ａ３２３Ｔ／Ａ３８３Ｖ／Ｄ３９４Ｇ、Ｆ８５Ｖ／Ｓ８６Ａ／Ｋ１６３Ｆ／Ｉ３１４Ｒ／Ａ３２３Ｔ／Ｄ３９４Ｇ／Ｃ４１４Ｖ、Ｆ８５Ｖ／Ｎ２８６Ｓ、Ｆ８５Ｖ／Ｎ２８６Ｓ／Ａ３２３Ｔ、Ｓ８６Ａ／Ｈ８８Ｒ／Ｋ１６３Ｆ／Ａ３２３Ｔ／Ａ３８３Ｖ／Ｃ４１４Ｖ／Ｖ４２２Ａ、Ｓ８６Ａ／Ａ３８３Ｖ／Ｄ３９４Ｇ、Ｓ８６Ｇ、Ｈ８８Ｒ／Ｋ１６３Ｆ／Ｎ２８６Ｓ／Ａ３８３Ｖ、Ｈ８８Ｒ／Ｎ２８６Ｓ／Ｅ３１６Ｗ／Ａ３２３Ｔ、Ｈ８８Ｒ／Ｎ２８６Ｓ／Ｅ３１６Ｗ／Ａ３２３Ｔ／Ａ３８３Ｖ／Ｃ４１４Ｖ／Ｐ４１６Ａ、Ｈ８８Ｒ／Ｅ３１６Ｗ／Ａ３２３Ｔ、Ｈ８８Ｓ、Ｈ８８Ｔ、Ｒ１４６Ｈ、Ｒ１４６Ｈ／Ｗ１４７Ｒ／Ｇ３９５Ｄ／Ｌ４１７Ｓ、Ｒ１４６Ｈ／Ｇ３９５Ｄ、Ｒ１４６Ｈ／Ｇ３９５Ｄ／Ｌ４１７Ｓ、Ｒ１４６Ｈ／Ｌ４１７Ｓ、Ｒ１４６Ｈ／Ｌ４１７Ｖ、Ｗ１４７Ｒ／Ｇ３９５Ｄ／Ｌ４１７Ｓ／Ａ４３２Ｖ、Ｗ１４７Ｒ／Ｌ４１７Ｓ、Ａ１４９Ｓ、Ｓ１５７Ａ、Ｋ１６３Ｆ、Ｋ１６３Ｆ／Ａ２２２Ｖ／Ｎ２８６Ｓ／Ｅ３１６Ｗ／Ａ３２３Ｔ／Ａ３８３Ｖ／Ｄ３９４Ｇ、Ｋ１６３Ｆ／Ｎ２８６Ｓ、Ｋ１６３Ｆ／Ｎ２８６Ｓ／Ｉ３１４Ｒ／Ｅ３１６Ｗ／Ａ３２３Ｔ／Ｃ４１４Ｖ／Ｐ４１６Ａ、Ｋ１６３Ｆ／Ｎ２８６Ｓ／Ｉ３１４Ｒ／Ａ３２３Ｔ／Ｄ３９４Ｇ、Ｋ１６３Ｆ／Ｎ２８６Ｓ／Ｅ３１６Ｗ／Ａ３２３Ｔ／Ｄ３９４Ｇ／Ｐ４１６Ａ、Ｋ１６３Ｆ／Ｎ２８６Ｓ／Ｃ４１４Ｖ、Ｋ１６３Ｆ／Ｉ３１４Ｒ／Ｅ３１６Ｗ／Ｄ３９４Ｇ、Ｋ１６３Ｆ／Ｉ３１４Ｒ／Ａ３２３Ｔ／Ｄ３９４Ｇ、Ｋ１６３Ｆ／Ｉ３１４Ｒ／Ａ３８３Ｖ、Ｋ１６３Ｆ／Ｉ３１４Ｒ／Ｃ４１４Ｖ、Ｋ１６３Ｆ／Ｅ３１６Ｗ／Ａ３２３Ｔ、Ｋ１６３Ｆ／Ａ３２３Ｔ、Ｋ１６３Ｆ／Ａ３８３Ｖ、Ｋ１６３Ｌ、Ｋ１６３Ｍ、Ｐ１６４Ａ、Ｐ１６４Ｄ、Ｐ１６４Ｑ、Ｐ１６４Ｓ、Ａ１９９Ｖ／Ｌ４１７Ｓ、Ｉ２５９Ｖ、Ｃ２６０Ｔ、Ｓ２８４Ａ、Ｎ２８６Ｓ、Ｎ２８６Ｓ／Ｉ３１４Ｒ／Ａ３２３Ｔ／Ａ３８３Ｖ、Ｎ２８６Ｓ／Ｉ３１４Ｒ／Ｄ３９４Ｇ、Ｎ２８６Ｓ／Ｅ３１６Ｗ／Ａ３２３Ｔ／Ａ３８３Ｖ／Ｃ４１４Ｖ／Ｐ４１６Ａ、Ｎ２８６Ｓ／Ｅ３１６Ｗ／Ａ３８３Ｖ／Ｄ３９４Ｇ、Ｎ２８６Ｓ／Ｅ３１６Ｗ／Ｄ３９４Ｇ／Ｃ４１４Ｖ／Ｐ４１６Ａ、Ｎ２８６Ｓ／Ａ３２３Ｔ、Ｎ２８６Ｓ／Ａ３２３Ｔ／Ａ３８３Ｖ／Ｃ４１４Ｖ、Ｎ２８６Ｓ／Ａ３２３Ｔ／Ｐ４１６Ａ、Ｎ２８６Ｓ／Ａ３８３Ｖ、Ｎ２８６Ｓ／Ｐ４１６Ａ、Ｉ３１４Ｒ／Ｅ３１６Ｗ、Ｉ３１４Ｒ／Ｅ３１６Ｗ／Ａ３２３Ｔ、Ｉ３１４Ｒ／Ｅ３１６Ｗ／Ａ３２３Ｔ／Ａ３８３Ｖ／Ｖ４２２Ａ、Ｉ３１４Ｒ／Ｅ３１６Ｗ／Ａ３２３Ｔ／Ｄ３９４Ｇ、Ｉ３１４Ｒ／Ｅ３１６Ｗ／Ｄ３９４Ｇ、Ｉ３１４Ｒ／Ａ３２３Ｔ／Ａ３８３Ｖ／Ｄ３９４Ｇ、Ｉ３１４Ｒ／Ａ３８３Ｖ、Ｉ３１４Ｒ／Ａ３８３Ｖ／Ｃ４１４Ｖ／Ｖ４２２Ａ、Ｅ３１５Ｇ、Ｅ３１５Ｒ、Ｅ３１６Ａ、Ｅ３１６Ｆ、Ｅ３１６Ｇ、Ｅ３１６Ｈ、Ｅ３１６Ｌ、Ｅ３１６Ｎ、Ｅ３１６Ｒ、Ｅ３１６Ｖ、Ｅ３１６Ｗ／Ａ３２３Ｔ／Ａ３８３Ｖ／Ｄ３９４Ｇ、Ｅ３１６Ｗ／Ａ３２３Ｔ／Ｄ３９４Ｇ／Ｃ４１４Ｖ／Ｐ４１６Ａ、Ｅ３１６Ｗ／Ｃ４１４Ｖ／Ｖ４２２Ａ、Ａ３２３Ｃ、Ａ３２３Ｓ、Ａ３２３Ｔ、Ａ３２３Ｔ／Ａ３８３Ｖ、Ａ３２３Ｔ／Ａ３８３Ｖ／Ｄ３９４Ｇ／Ｃ４１４Ｖ／Ｐ４１６Ａ、Ａ３２３Ｔ／Ｄ３９４Ｇ、Ａ３８３Ｖ、Ｇ３９５Ｄ、Ｇ３９５Ｄ／Ｌ４１７Ｓ、Ｇ３９５Ｄ／Ｌ４１７Ｓ／Ａ４３２Ｖ、Ｇ３９５Ｄ／Ｌ４１７Ｖ、Ｓ４００Ｄ、Ｅ４０１Ａ、Ｅ４０１Ｋ、Ｅ４０１Ｓ、Ｉ４０３Ｖ、Ａ４０４Ｓ、Ｎ４０５Ｈ、Ｎ４０５Ｗ、Ｔ４０６Ｓ、Ｔ４０８Ｆ、Ｔ４０８Ｌ、Ｔ４０８Ｗ、Ｒ４１５Ｇ、Ｒ４１５Ｗ、Ｌ４１７Ａ、Ｌ４１７Ｓ、Ｌ４１７Ｓ／Ａ４３２Ｖ、Ｌ４１７Ｖ、Ｌ４１７Ｖ／Ａ４３２Ｖ、Ｓ４２０Ｇ、Ｖ４２２Ｌ、およびＶ４２２Ｔを含み、ここで、位置は、配列番号４を基準に番号付けされる。

【0172】

一部の実施形態では、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドは、７４／８１／２８６／３１６／３２３／３８３、１６３／２８６／３１４／３１６／３２３／４１４／４１６、１６３／２８６／３１４／３２３／３９４、２８６／３１４／３２３／３８３、２８６／３１６／３２３／３８３／４１４／４１６、３１５、および４０８から選択される、配列番号４と比較した１つまたは複数のアミノ酸残基の差異を有するアミノ酸配列を含む、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドをコードし、ここで、位置は、配列番号４を基準に番号付けされる。一部の実施形態では、アミノ酸の差異は、置換７４Ｔ／８１Ｓ／２８６Ｓ／３１６Ｗ／３２３Ｔ／３８３Ｖ、１６３Ｆ／２８６Ｓ／３１４Ｒ／３１６Ｗ／３２３Ｔ／４１４Ｖ／４１６Ａ、１６３Ｆ／２８６Ｓ／３１４Ｒ／３２３Ｔ／３９４Ｇ、２８６Ｓ／３１４Ｒ／３２３Ｔ／３８３Ｖ、２８６Ｓ／３１６Ｗ／３２３Ｔ／３８３Ｖ／４１４Ｖ／４１６Ａ、３１５Ｇ、および４０８Ｆを含み、ここで、位置は、配列番号４を基準に番号付けされる。一部の追加的な実施形態では、アミノ酸の差異は、置換Ａ７４Ｔ／Ｇ８１Ｓ／Ｎ２８６Ｓ／Ｅ３１６Ｗ／Ａ３２３Ｔ／Ａ３８３Ｖ、Ｋ１６３Ｆ／Ｎ２８６Ｓ／Ｉ３１４Ｒ／Ｅ３１６Ｗ／Ａ３２３Ｔ／Ｃ４１４Ｖ／Ｐ４１６Ａ、Ｋ１６３Ｆ／Ｎ２８６Ｓ／Ｉ３１４Ｒ／Ａ３２３Ｔ／Ｄ３９４Ｇ、Ｎ２８６Ｓ／Ｉ３１４Ｒ／Ａ３２３Ｔ／Ａ３８３Ｖ、Ｎ２８６Ｓ／Ｅ３１６Ｗ／Ａ３２３Ｔ／Ａ３８３Ｖ／Ｃ４１４Ｖ／Ｐ４１６Ａ、Ｅ３１５Ｇ、およびＴ４０８Ｆを含み、ここで、位置は、配列番号４を基準に番号付けされる。

【0173】

一部の実施形態では、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドは、５、１８／２３／１４９／２６０／３８３／３９５／４０１／４１６、１８／２３／１４９／３８３、１８／１６３／１６４、２１、２１／１６３／３１５／３１６、２１／１６３／３２３／４０８、２１／４０８、２３／５６／８６／１４９／１６３／１６４／３８３／４０１／４１６、２３／８６、２３／１４９／２６０、２３／１４９／２８４／３８３／３９５、２３／１６３／１６４／３８３、２３／１６３／１６４／４０１／４１６、２４、４２、４２／１１０、４２／１８７／２７２、４２／１８７／３２４／３６３／３６６、４２／１８７／３５３、４２／２７２／２９１、４２／２７２／２９１／３６３、４２／２７２／３２４／３６３／３６６、４２／２７２／３６３／４１０、４２／２７２／４１０、４２／２９１／３１３／３６３／４１０、４２／２９１／３６３、４２／２９１／３６３／３６６、４２／３５３、４２／３６３、４６、６６、７７、８６／１４９／１６３／１６４／３８３／３９５／４０１、８６／１４９／３９５、８６／１６３／１６４／２６０／３８３、８６／３８３、１０７、１１０、１１０／１８７、１１０／１８７／２５３／４１０、１３４、１３８、１４９／１６４／２６０／３８３／３９５／４０１、１４９／２６０／３８３、１４９／４１６、１６３／２５９／３２３／４０８、１６３／２５９／４０８、１６３／３１５／３１６、１６４／２６０／４０１、１６４／３１６／３８３／４０１、１６７、１８６、１８７、１８７／２５３／３６３／３６６、１８７／２７２／３２４／３６３／４１０、１８７／２７２／３６３、１８７／２７２／３６３／３６６／４１０、１８７／２９１、１８９、１９１、１９５、１９９、２０３、２１０、２１１、２４８、２５９／３０７、２６０／３９５／４０１、２７２、２７２／３５３、２７２／３６３／３６６、２７２／４１０、２７７、２９１、３０５、３０９、３１５、３４２、３４３、３５１、３５４、３５８、３６１、３６２、３６３、３６３／３６６、３６５、３６７、３８３、３８３／４０１、３８３／４１６／４２２、３８５、３８８、３８９、３９２、３９５、３９６、４０１、４０４、４０５、４０８、４１０、４１６、４１７、４３９、４４３、４４７、４５０、および４５１から選択される、配列番号８と比較した１つまたは複数のアミノ酸残基の差異を有するアミノ酸配列を含む、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドをコードし、ここで、位置は、配列番号８を基準に番号付けされる。一部の実施形態では、アミノ酸の差異は、置換５Ｅ、５Ｇ、１８Ａ／２３Ｒ／１４９Ｓ／２６０Ｔ／３８３Ｖ／３９５Ｄ／４０１Ｓ／４１６Ｐ、１８Ａ／２３Ｒ／１４９Ｓ／３８３Ｖ、１８Ａ／１６３Ｍ／１６４Ｑ、２１Ｈ、２１Ｈ／１６３Ｌ／３１５Ｇ／３１６Ｆ、２１Ｈ／１６３Ｌ／３２３Ｃ／４０８Ｆ、２１Ｈ／４０８Ｆ、２３Ｒ／５６Ｃ／８６Ｇ／１４９Ｓ／１６３Ｍ／１６４Ｄ／３８３Ｖ／４０１Ｓ／４１６Ｐ、２３Ｒ／８６Ｇ、２３Ｒ／１４９Ｓ／２６０Ｔ、２３Ｒ／１４９Ｓ／２８４Ａ／３８３Ｖ／３９５Ｄ、２３Ｒ／１６３Ｍ／１６４Ｑ／３８３Ｖ、２３Ｒ／１６３Ｍ／１６４Ｓ／４０１Ｓ／４１６Ｐ、２４Ｋ、２４Ｒ、４２Ｆ、４２Ｆ／１１０Ｋ、４２Ｆ／１８７Ｅ／２７２Ｅ、４２Ｆ／１８７Ｅ／３２４Ｓ／３６３Ｌ／３６６Ｈ、４２Ｆ／１８７Ｅ／３５３Ｔ、４２Ｆ／２７２Ｅ／２９１Ｙ、４２Ｆ／２７２Ｅ／２９１Ｙ／３６３Ｌ、４２Ｆ／２７２Ｅ／３２４Ｓ／３６３Ｌ／３６６Ｈ、４２Ｆ／２７２Ｅ／３６３Ｌ／４１０Ｈ、４２Ｆ／２７２Ｅ／４１０Ｈ、４２Ｆ／２９１Ｙ／３１３Ｖ／３６３Ｌ／４１０Ｈ、４２Ｆ／２９１Ｙ／３６３Ｌ、４２Ｆ／２９１Ｙ／３６３Ｌ／３６６Ｈ、４２Ｆ／３５３Ｔ、４２Ｆ／３６３Ｌ、４６Ｓ、６６Ａ、７７Ｍ、８６Ｇ／１４９Ｓ／１６３Ｍ／１６４Ｓ／３８３Ｖ／３９５Ｄ／４０１Ｓ、８６Ｇ／１４９Ｓ／３９５Ｄ、８６Ｇ／１６３Ｍ／１６４Ｓ／２６０Ｔ／３８３Ｖ、８６Ｇ／３８３Ｖ、１０７Ｌ、１０７Ｓ、１０７Ｙ、１１０Ｋ、１１０Ｋ／１８７Ｅ、１１０Ｋ／１８７Ｅ／２５３Ｌ／４１０Ｈ、１３４Ｖ、１３８Ｒ、１４９Ｓ／１６４Ｓ／２６０Ｔ／３８３Ｖ／３９５Ｄ／４０１Ａ、１４９Ｓ／２６０Ｔ／３８３Ｖ、１４９Ｓ／４１６Ｐ、１６３Ｌ／２５９Ｖ／３２３Ｃ／４０８Ｆ、１６３Ｌ／２５９Ｖ／４０８Ｆ、１６３Ｌ／３１５Ｇ／３１６Ｆ、１６４Ｄ／３１６Ｈ／３８３Ｖ／４０１Ｓ、１６４Ｓ／２６０Ｔ／４０１Ｓ、１６７Ｎ、１８６Ｑ、１８７Ｅ、１８７Ｅ／２５３Ｌ／３６３Ｌ／３６６Ｈ、１８７Ｅ／２７２Ｅ／３２４Ｓ／３６３Ｌ／４１０Ｈ、１８７Ｅ／２７２Ｅ／３６３Ｌ、１８７Ｅ／２７２Ｅ／３６３Ｌ／３６６Ｈ／４１０Ｈ、１８７Ｅ／２９１Ｙ、１８９Ｆ、１８９Ｓ、１８９Ｖ、１８９Ｗ、１９１Ｄ、１９１Ｆ、１９５Ｗ、１９９Ｑ、２０３Ｌ、２１０Ａ、２１０Ｌ、２１０Ｍ、２１０Ｖ、２１０Ｙ、２１１Ｒ、２４８Ｇ、２５９Ｖ／３０７Ｍ、２６０Ｔ／３９５Ｄ／４０１Ｓ、２７２Ｅ、２７２Ｅ／３５３Ｔ、２７２Ｅ／３６３Ｌ／３６６Ｈ、２７２Ｅ／４１０Ｈ、２７７Ｓ、２９１Ｙ、３０５Ｅ、３０９Ａ、３０９Ｆ、３０９Ｒ、３１５Ｇ、３４２Ｔ、３４３Ｇ、３５１Ｌ、３５４Ｓ、３５８Ｌ、３６１Ｒ、３６２Ｑ、３６２Ｖ、３６３Ｌ、３６３Ｌ／３６６Ｈ、３６５Ｌ、３６５Ｑ、３６５Ｒ、３６５Ｓ、３６７Ｔ、３８３Ｖ、３８３Ｖ／４０１Ａ、３８３Ｖ／４１６Ｐ／４２２Ｔ、３８５Ｌ、３８５Ｔ、３８８Ｄ、３８８Ｌ、３８８Ｐ、３８９Ｄ、３９２Ａ、３９２Ｌ、３９５Ｒ、３９６Ｐ、３９６Ｙ、４０１Ｑ、４０１Ｓ、４０４Ｍ、４０５Ｗ、４０８Ａ、４０８Ｅ、４０８Ｗ、４１０Ｈ、４１６Ｐ、４１７Ｓ、４３９Ｌ、４３９Ｓ、４４３Ｌ、４４３Ｓ、４４７Ｓ、４４７Ｔ、４５０Ｄ、および４５１Ｓを含み、ここで、位置は、配列番号８を基準に番号付けされる。一部の追加的な実施形態では、アミノ酸の差異は、置換Ｑ５Ｅ、Ｑ５Ｇ、Ｇ１８Ａ／Ｐ２３Ｒ／Ａ１４９Ｓ／Ｃ２６０Ｔ／Ａ３８３Ｖ／Ｇ３９５Ｄ／Ｅ４０１Ｓ／Ａ４１６Ｐ、Ｇ１８Ａ／Ｐ２３Ｒ／Ａ１４９Ｓ／Ａ３８３Ｖ、Ｇ１８Ａ／Ｆ１６３Ｍ／Ｐ１６４Ｑ、Ｄ２１Ｈ、Ｄ２１Ｈ／Ｆ１６３Ｌ／Ｅ３１５Ｇ／Ｗ３１６Ｆ、Ｄ２１Ｈ／Ｆ１６３Ｌ／Ｔ３２３Ｃ／Ｔ４０８Ｆ、Ｄ２１Ｈ／Ｔ４０８Ｆ、Ｐ２３Ｒ／Ｌ５６Ｃ／Ｓ８６Ｇ／Ａ１４９Ｓ／Ｆ１６３Ｍ／Ｐ１６４Ｄ／Ａ３８３Ｖ／Ｅ４０１Ｓ／Ａ４１６Ｐ、Ｐ２３Ｒ／Ｓ８６Ｇ、Ｐ２３Ｒ／Ａ１４９Ｓ／Ｃ２６０Ｔ、Ｐ２３Ｒ／Ａ１４９Ｓ／Ｓ２８４Ａ／Ａ３８３Ｖ／Ｇ３９５Ｄ、Ｐ２３Ｒ／Ｆ１６３Ｍ／Ｐ１６４Ｑ／Ａ３８３Ｖ、Ｐ２３Ｒ／Ｆ１６３Ｍ／Ｐ１６４Ｓ／Ｅ４０１Ｓ／Ａ４１６Ｐ、Ｓ２４Ｋ、Ｓ２４Ｒ、Ｖ４２Ｆ、Ｖ４２Ｆ／Ｒ１１０Ｋ、Ｖ４２Ｆ／Ｙ１８７Ｅ／Ｖ２７２Ｅ、Ｖ４２Ｆ／Ｙ１８７Ｅ／Ｇ３２４Ｓ／Ｉ３６３Ｌ／Ｒ３６６Ｈ、Ｖ４２Ｆ／Ｙ１８７Ｅ／Ａ３５３Ｔ、Ｖ４２Ｆ／Ｖ２７２Ｅ／Ｆ２９１Ｙ、Ｖ４２Ｆ／Ｖ２７２Ｅ／Ｆ２９１Ｙ／Ｉ３６３Ｌ、Ｖ４２Ｆ／Ｖ２７２Ｅ／Ｇ３２４Ｓ／Ｉ３６３Ｌ／Ｒ３６６Ｈ、Ｖ４２Ｆ／Ｖ２７２Ｅ／Ｉ３６３Ｌ／Ｌ４１０Ｈ、Ｖ４２Ｆ／Ｖ２７２Ｅ／Ｌ４１０Ｈ、Ｖ４２Ｆ／Ｆ２９１Ｙ／Ａ３１３Ｖ／Ｉ３６３Ｌ／Ｌ４１０Ｈ、Ｖ４２Ｆ／Ｆ２９１Ｙ／Ｉ３６３Ｌ、Ｖ４２Ｆ／Ｆ２９１Ｙ／Ｉ３６３Ｌ／Ｒ３６６Ｈ、Ｖ４２Ｆ／Ａ３５３Ｔ、Ｖ４２Ｆ／Ｉ３６３Ｌ、Ｇ４６Ｓ、Ｋ６６Ａ、Ｅ７７Ｍ、Ｓ８６Ｇ／Ａ１４９Ｓ／Ｆ１６３Ｍ／Ｐ１６４Ｓ／Ａ３８３Ｖ／Ｇ３９５Ｄ／Ｅ４０１Ｓ、Ｓ８６Ｇ／Ａ１４９Ｓ／Ｇ３９５Ｄ、Ｓ８６Ｇ／Ｆ１６３Ｍ／Ｐ１６４Ｓ／Ｃ２６０Ｔ／Ａ３８３Ｖ、Ｓ８６Ｇ／Ａ３８３Ｖ、Ｄ１０７Ｌ、Ｄ１０７Ｓ、Ｄ１０７Ｙ、Ｒ１１０Ｋ、Ｒ１１０Ｋ／Ｙ１８７Ｅ、Ｒ１１０Ｋ／Ｙ１８７Ｅ／Ｖ２５３Ｌ／Ｌ４１０Ｈ、Ａ１３４Ｖ、Ｐ１３８Ｒ、Ａ１４９Ｓ／Ｐ１６４Ｓ／Ｃ２６０Ｔ／Ａ３８３Ｖ／Ｇ３９５Ｄ／Ｅ４０１Ａ、Ａ１４９Ｓ／Ｃ２６０Ｔ／Ａ３８３Ｖ、Ａ１４９Ｓ／Ａ４１６Ｐ、Ｆ１６３Ｌ／Ｉ２５９Ｖ／Ｔ３２３Ｃ／Ｔ４０８Ｆ、Ｆ１６３Ｌ／Ｉ２５９Ｖ／Ｔ４０８Ｆ、Ｆ１６３Ｌ／Ｅ３１５Ｇ／Ｗ３１６Ｆ、Ｐ１６４Ｄ／Ｗ３１６Ｈ／Ａ３８３Ｖ／Ｅ４０１Ｓ、Ｐ１６４Ｓ／Ｃ２６０Ｔ／Ｅ４０１Ｓ、Ｓ１６７Ｎ、Ｒ１８６Ｑ、Ｙ１８７Ｅ、Ｙ１８７Ｅ／Ｖ２５３Ｌ／Ｉ３６３Ｌ／Ｒ３６６Ｈ、Ｙ１８７Ｅ／Ｖ２７２Ｅ／Ｇ３２４Ｓ／Ｉ３６３Ｌ／Ｌ４１０Ｈ、Ｙ１８７Ｅ／Ｖ２７２Ｅ／Ｉ３６３Ｌ、Ｙ１８７Ｅ／Ｖ２７２Ｅ／Ｉ３６３Ｌ／Ｒ３６６Ｈ／Ｌ４１０Ｈ、Ｙ１８７Ｅ／Ｆ２９１Ｙ、Ｅ１８９Ｆ、Ｅ１８９Ｓ、Ｅ１８９Ｖ、Ｅ１８９Ｗ、Ｇ１９１Ｄ、Ｇ１９１Ｆ、Ｅ１９５Ｗ、Ａ１９９Ｑ、Ｒ２０３Ｌ、Ｑ２１０Ａ、Ｑ２１０Ｌ、Ｑ２１０Ｍ、Ｑ２１０Ｖ、Ｑ２１０Ｙ、Ｋ２１１Ｒ、Ｋ２４８Ｇ、Ｉ２５９Ｖ／Ｌ３０７Ｍ、Ｃ２６０Ｔ／Ｇ３９５Ｄ／Ｅ４０１Ｓ、Ｖ２７２Ｅ、Ｖ２７２Ｅ／Ａ３５３Ｔ、Ｖ２７２Ｅ／Ｉ３６３Ｌ／Ｒ３６６Ｈ、Ｖ２７２Ｅ／Ｌ４１０Ｈ、Ｔ２７７Ｓ、Ｆ２９１Ｙ、Ｋ３０５Ｅ、Ｔ３０９Ａ、Ｔ３０９Ｆ、Ｔ３０９Ｒ、Ｅ３１５Ｇ、Ｎ３４２Ｔ、Ｅ３４３Ｇ、Ｒ３５１Ｌ、Ｐ３５４Ｓ、Ｅ３５８Ｌ、Ｋ３６１Ｒ、Ｈ３６２Ｑ、Ｈ３６２Ｖ、Ｉ３６３Ｌ、Ｉ３６３Ｌ／Ｒ３６６Ｈ、Ｅ３６５Ｌ、Ｅ３６５Ｑ、Ｅ３６５Ｒ、Ｅ３６５Ｓ、Ｐ３６７Ｔ、Ａ３８３Ｖ、Ａ３８３Ｖ／Ｅ４０１Ａ、Ａ３８３Ｖ／Ａ４１６Ｐ／Ｖ４２２Ｔ、Ｋ３８５Ｌ、Ｋ３８５Ｔ、Ａ３８８Ｄ、Ａ３８８Ｌ、Ａ３８８Ｐ、Ｓ３８９Ｄ、Ｐ３９２Ａ、Ｐ３９２Ｌ、Ｇ３９５Ｒ、Ｎ３９６Ｐ、Ｎ３９６Ｙ、Ｅ４０１Ｑ、Ｅ４０１Ｓ、Ａ４０４Ｍ、Ｎ４０５Ｗ、Ｔ４０８Ａ、Ｔ４０８Ｅ、Ｔ４０８Ｗ、Ｌ４１０Ｈ、Ａ４１６Ｐ、Ｌ４１７Ｓ、Ｄ４３９Ｌ、Ｄ４３９Ｓ、Ｋ４４３Ｌ、Ｋ４４３Ｓ、Ｋ４４７Ｓ、Ｋ４４７Ｔ、Ａ４５０Ｄ、およびＥ４５１Ｓを含み、ここで、位置は、配列番号８を基準に番号付けされる。

【0174】

一部の実施形態では、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドは、１８／２３／１４９／３８３、２１／１６３／３２３／４０８、２７２、２９１、および３８３から選択される、配列番号８と比較した１つまたは複数のアミノ酸残基の差異を有するアミノ酸配列を含む、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドをコードし、ここで、位置は、配列番号８を基準に番号付けされる。一部の実施形態では、アミノ酸の差異は、置換１８Ａ／２３Ｒ／１４９Ｓ／３８３Ｖ、２１Ｈ／１６３Ｌ／３２３Ｃ／４０８Ｆ、２７２Ｅ、２９１Ｙ、および３８３Ｖを含み、ここで、位置は、配列番号８を基準に番号付けされる。一部の追加的な実施形態では、アミノ酸の差異は、置換Ｇ１８Ａ／Ｐ２３Ｒ／Ａ１４９Ｓ／Ａ３８３Ｖ、Ｄ２１Ｈ／Ｆ１６３Ｌ／Ｔ３２３Ｃ／Ｔ４０８Ｆ、Ｖ２７２Ｅ、Ｆ２９１Ｙ、およびＡ３８３Ｖを含み、ここで、位置は、配列番号８を基準に番号付けされる。

【0175】

一部の実施形態では、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドは、２４、２４／４２／６６／２９１、２４／４２／２９１／３６２、２４／６６／１６３／１９１／３６２／３８３／３８８、２４／６６／１９１／１９９／２６０／２９１／３５１、２４／６６／１９１／１９９／２９１、２４／６６／１９１／２６０／４０８、２４／６６／２６０／２９１／３８３／３８８／４０８、２４／６６／２９１／３４２／３８３、２４／６６／２９１／３６５、２４／６６／３４２／３６５／３８８／４０８、２４／７７／２９１、２４／１０７／１６３／１９１／２９１／３５１／３８３／３８８、２４／１０７／２９１／３５１／３６５／３８８、２４／１６３／３５１／３８３、２４／１９１／２９１／３６５、２４／１９９／２６０／３５１／３６２／３８３、２４／１９９／２６０／３６２／３８３／３８８、２４／２６０／３６２／３８３／３８８、２４／２９１、２４／２９１／３４２／３５１／３８３、２４／２９１／３６２／３８８、２４／２９１／４０８、２４／３８３／３８８、２４／３８８、２５、２８、３３、４２／１９１／４０８、４２／１９９／２９１／３８３、４２／２９１／３５１／３６２／３６５／３８３／３８８、４２／２９１／３５１／３６２／３８３／４０８、４２／２９１／３８３／３８８、６６／８２／２９１／３８３、６６／１６３／１９１／３６５／３８３、６６／１９９／３５１／３８３、６６／２９１、６６／２９１／３６２／３６５／３８３、６６／２９１／３８３／３８８、６６／３８３、７７／２９１、７７／３８３／３８８、８６、１０７／１９１／１９９／３６５／３８３／３８８、１０７／１９１／２９１／３８３、１４８、１５３、１６３／２９１／３６２／３６５／３８３／３８８、１６３／２９１／３８３／３８８、１６３／３８３、１９１／１９９／３６５／３８３／３８８、１９１／２６０／３８８、１９１／２９１、１９１／２９１／３４２／３６２／３６５、１９１／３５１／３８３／３８８、１９９／２６０／３８３、１９９／２９１、２６０、２６０／２９１／３６５／３８３／４０８、２６０／３６５／３８３、２９１、２９１／３５１／３８３／３８８、２９１／３５１／３８３／３８８／４０８、２９１／３６２／３６５、２９１／３６５／３８８、２９１／３８３、３１４、３１５、３１６、３１９、３４２／３６２、３５１／３８３／３８８、３６２、３６２／３８８、３８３、３８３／３８８、３９６、３９７、４０５、４０６、４１３、４１９、および４２３から選択される、配列番号３６６と比較した１つまたは複数のアミノ酸残基の差異を有するアミノ酸配列を含む、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドをコードし、ここで、位置は、配列番号３６６を基準に番号付けされる。一部の実施形態では、アミノ酸の差異は、置換２４Ｅ、２４Ｋ、２４Ｋ／４２Ｆ／６６Ａ／２９１Ｙ、２４Ｋ／４２Ｆ／２９１Ｙ／３６２Ｑ、２４Ｋ／６６Ａ／１６３Ｍ／１９１Ｄ／３６２Ｑ／３８３Ｖ／３８８Ｄ、２４Ｋ／６６Ａ／１９１Ｄ／１９９Ｑ／２６０Ｔ／２９１Ｙ／３５１Ｌ、２４Ｋ／６６Ａ／１９１Ｄ／１９９Ｑ／２９１Ｙ、２４Ｋ／６６Ａ／１９１Ｄ／２６０Ｔ／４０８Ａ、２４Ｋ／６６Ａ／２６０Ｔ／２９１Ｙ／３８３Ｖ／３８８Ｄ／４０８Ａ、２４Ｋ／６６Ａ／２９１Ｙ／３４２Ｔ／３８３Ｖ、２４Ｋ／６６Ａ／２９１Ｙ／３６５Ｓ、２４Ｋ／６６Ａ／３４２Ｔ／３６５Ｓ／３８８Ｄ／４０８Ｅ、２４Ｋ／７７Ｍ／２９１Ｙ、２４Ｋ／１０７Ｌ／１６３Ｍ／１９１Ｄ／２９１Ｙ／３５１Ｌ／３８３Ｖ／３８８Ｄ、２４Ｋ／１０７Ｌ／２９１Ｙ／３５１Ｌ／３６５Ｓ／３８８Ｄ、２４Ｋ／１６３Ｍ／３５１Ｌ／３８３Ｖ、２４Ｋ／１９１Ｄ／２９１Ｙ／３６５Ｓ、２４Ｋ／１９９Ｑ／２６０Ｔ／３５１Ｌ／３６２Ｑ／３８３Ｖ、２４Ｋ／１９９Ｑ／２６０Ｔ／３６２Ｑ／３８３Ｖ／３８８Ｄ、２４Ｋ／２６０Ｔ／３６２Ｑ／３８３Ｖ／３８８Ｄ、２４Ｋ／２９１Ｙ、２４Ｋ／２９１Ｙ／３４２Ｔ／３５１Ｌ／３８３Ｖ、２４Ｋ／２９１Ｙ／３６２Ｑ／３８８Ｄ、２４Ｋ／２９１Ｙ／４０８Ａ、２４Ｋ／３８３Ｖ／３８８Ｄ、２４Ｋ／３８８Ｄ、２５Ｈ、２５Ｖ、２８Ｓ、２８Ｔ、３３Ｔ、４２Ｆ／１９１Ｄ／４０８Ｅ、４２Ｆ／１９９Ｑ／２９１Ｙ／３８３Ｖ、４２Ｆ／２９１Ｙ／３５１Ｌ／３６２Ｑ／３６５Ｓ／３８３Ｖ／３８８Ｄ、４２Ｆ／２９１Ｙ／３５１Ｌ／３６２Ｑ／３８３Ｖ／４０８Ａ、４２Ｆ／２９１Ｙ／３８３Ｖ／３８８Ｄ、６６Ａ／８２Ｈ／２９１Ｙ／３８３Ｖ、６６Ａ／１６３Ｍ／１９１Ｄ／３６５Ｓ／３８３Ｖ、６６Ａ／１９９Ｑ／３５１Ｌ／３８３Ｖ、６６Ａ／２９１Ｙ、６６Ａ／２９１Ｙ／３６２Ｑ／３６５Ｓ／３８３Ｖ、６６Ａ／２９１Ｙ／３８３Ｖ／３８８Ｄ、６６Ａ／３８３Ｖ、７７Ｍ／２９１Ｙ、７７Ｍ／３８３Ｖ／３８８Ｄ、８６Ｔ、１０７Ｌ／１９１Ｄ／１９９Ｑ／３６５Ｓ／３８３Ｖ／３８８Ｄ、１０７Ｌ／１９１Ｄ／２９１Ｙ／３８３Ｖ、１４８Ｇ、１５３Ｓ、１６３Ｍ／２９１Ｙ／３６２Ｑ／３６５Ｓ／３８３Ｖ／３８８Ｄ、１６３Ｍ／２９１Ｙ／３８３Ｖ／３８８Ｄ、１６３Ｍ／３８３Ｖ、１９１Ｄ／１９９Ｑ／３６５Ｓ／３８３Ｖ／３８８Ｄ、１９１Ｄ／２６０Ｔ／３８８Ｄ、１９１Ｄ／２９１Ｙ、１９１Ｄ／２９１Ｙ／３４２Ｔ／３６２Ｑ／３６５Ｓ、１９１Ｄ／３５１Ｌ／３８３Ｖ／３８８Ｄ、１９９Ｑ／２６０Ｔ／３８３Ｖ、１９９Ｑ／２９１Ｙ、２６０Ｔ、２６０Ｔ／２９１Ｙ／３６５Ｓ／３８３Ｖ／４０８Ａ、２６０Ｔ／３６５Ｓ／３８３Ｖ、２９１Ｙ、２９１Ｙ／３５１Ｌ／３８３Ｖ／３８８Ｄ、２９１Ｙ／３５１Ｌ／３８３Ｖ／３８８Ｄ／４０８Ａ、２９１Ｙ／３６２Ｑ／３６５Ｓ、２９１Ｙ／３６５Ｓ／３８８Ｄ、２９１Ｙ／３８３Ｖ、３１４Ｋ、３１５Ｓ、３１６Ｖ、３１９Ｓ、３４２Ｔ／３６２Ｑ、３５１Ｌ／３８３Ｖ／３８８Ｄ、３６２Ｑ、３６２Ｑ／３８８Ｄ、３８３Ｖ、３８３Ｖ／３８８Ｄ、３９６Ｒ、３９７Ｍ、４０５Ａ、４０６Ｈ、４１３Ｌ、４１９Ｓ、および４２３Ｖを含み、ここで、位置は、配列番号３６６を基準に番号付けされる。一部の追加的な実施形態では、アミノ酸の差異は、置換Ｓ２４Ｅ、Ｓ２４Ｋ、Ｓ２４Ｋ／Ｖ４２Ｆ／Ｋ６６Ａ／Ｆ２９１Ｙ、Ｓ２４Ｋ／Ｖ４２Ｆ／Ｆ２９１Ｙ／Ｈ３６２Ｑ、Ｓ２４Ｋ／Ｋ６６Ａ／Ｌ１６３Ｍ／Ｇ１９１Ｄ／Ｈ３６２Ｑ／Ａ３８３Ｖ／Ａ３８８Ｄ、Ｓ２４Ｋ／Ｋ６６Ａ／Ｇ１９１Ｄ／Ａ１９９Ｑ／Ｃ２６０Ｔ／Ｆ２９１Ｙ／Ｒ３５１Ｌ、Ｓ２４Ｋ／Ｋ６６Ａ／Ｇ１９１Ｄ／Ａ１９９Ｑ／Ｆ２９１Ｙ、Ｓ２４Ｋ／Ｋ６６Ａ／Ｇ１９１Ｄ／Ｃ２６０Ｔ／Ｆ４０８Ａ、Ｓ２４Ｋ／Ｋ６６Ａ／Ｃ２６０Ｔ／Ｆ２９１Ｙ／Ａ３８３Ｖ／Ａ３８８Ｄ／Ｆ４０８Ａ、Ｓ２４Ｋ／Ｋ６６Ａ／Ｆ２９１Ｙ／Ｎ３４２Ｔ／Ａ３８３Ｖ、Ｓ２４Ｋ／Ｋ６６Ａ／Ｆ２９１Ｙ／Ｅ３６５Ｓ、Ｓ２４Ｋ／Ｋ６６Ａ／Ｎ３４２Ｔ／Ｅ３６５Ｓ／Ａ３８８Ｄ／Ｆ４０８Ｅ、Ｓ２４Ｋ／Ｅ７７Ｍ／Ｆ２９１Ｙ、Ｓ２４Ｋ／Ｄ１０７Ｌ／Ｌ１６３Ｍ／Ｇ１９１Ｄ／Ｆ２９１Ｙ／Ｒ３５１Ｌ／Ａ３８３Ｖ／Ａ３８８Ｄ、Ｓ２４Ｋ／Ｄ１０７Ｌ／Ｆ２９１Ｙ／Ｒ３５１Ｌ／Ｅ３６５Ｓ／Ａ３８８Ｄ、Ｓ２４Ｋ／Ｌ１６３Ｍ／Ｒ３５１Ｌ／Ａ３８３Ｖ、Ｓ２４Ｋ／Ｇ１９１Ｄ／Ｆ２９１Ｙ／Ｅ３６５Ｓ、Ｓ２４Ｋ／Ａ１９９Ｑ／Ｃ２６０Ｔ／Ｒ３５１Ｌ／Ｈ３６２Ｑ／Ａ３８３Ｖ、Ｓ２４Ｋ／Ａ１９９Ｑ／Ｃ２６０Ｔ／Ｈ３６２Ｑ／Ａ３８３Ｖ／Ａ３８８Ｄ、Ｓ２４Ｋ／Ｃ２６０Ｔ／Ｈ３６２Ｑ／Ａ３８３Ｖ／Ａ３８８Ｄ、Ｓ２４Ｋ／Ｆ２９１Ｙ、Ｓ２４Ｋ／Ｆ２９１Ｙ／Ｎ３４２Ｔ／Ｒ３５１Ｌ／Ａ３８３Ｖ、Ｓ２４Ｋ／Ｆ２９１Ｙ／Ｈ３６２Ｑ／Ａ３８８Ｄ、Ｓ２４Ｋ／Ｆ２９１Ｙ／Ｆ４０８Ａ、Ｓ２４Ｋ／Ａ３８３Ｖ／Ａ３８８Ｄ、Ｓ２４Ｋ／Ａ３８８Ｄ、Ｌ２５Ｈ、Ｌ２５Ｖ、Ｒ２８Ｓ、Ｒ２８Ｔ、Ｖ３３Ｔ、Ｖ４２Ｆ／Ｇ１９１Ｄ／Ｆ４０８Ｅ、Ｖ４２Ｆ／Ａ１９９Ｑ／Ｆ２９１Ｙ／Ａ３８３Ｖ、Ｖ４２Ｆ／Ｆ２９１Ｙ／Ｒ３５１Ｌ／Ｈ３６２Ｑ／Ｅ３６５Ｓ／Ａ３８３Ｖ／Ａ３８８Ｄ、Ｖ４２Ｆ／Ｆ２９１Ｙ／Ｒ３５１Ｌ／Ｈ３６２Ｑ／Ａ３８３Ｖ／Ｆ４０８Ａ、Ｖ４２Ｆ／Ｆ２９１Ｙ／Ａ３８３Ｖ／Ａ３８８Ｄ、Ｋ６６Ａ／Ｙ８２Ｈ／Ｆ２９１Ｙ／Ａ３８３Ｖ、Ｋ６６Ａ／Ｌ１６３Ｍ／Ｇ１９１Ｄ／Ｅ３６５Ｓ／Ａ３８３Ｖ、Ｋ６６Ａ／Ａ１９９Ｑ／Ｒ３５１Ｌ／Ａ３８３Ｖ、Ｋ６６Ａ／Ｆ２９１Ｙ、Ｋ６６Ａ／Ｆ２９１Ｙ／Ｈ３６２Ｑ／Ｅ３６５Ｓ／Ａ３８３Ｖ、Ｋ６６Ａ／Ｆ２９１Ｙ／Ａ３８３Ｖ／Ａ３８８Ｄ、Ｋ６６Ａ／Ａ３８３Ｖ、Ｅ７７Ｍ／Ｆ２９１Ｙ、Ｅ７７Ｍ／Ａ３８３Ｖ／Ａ３８８Ｄ、Ｓ８６Ｔ、Ｄ１０７Ｌ／Ｇ１９１Ｄ／Ａ１９９Ｑ／Ｅ３６５Ｓ／Ａ３８３Ｖ／Ａ３８８Ｄ、Ｄ１０７Ｌ／Ｇ１９１Ｄ／Ｆ２９１Ｙ／Ａ３８３Ｖ、Ｎ１４８Ｇ、Ａ１５３Ｓ、Ｌ１６３Ｍ／Ｆ２９１Ｙ／Ｈ３６２Ｑ／Ｅ３６５Ｓ／Ａ３８３Ｖ／Ａ３８８Ｄ、Ｌ１６３Ｍ／Ｆ２９１Ｙ／Ａ３８３Ｖ／Ａ３８８Ｄ、Ｌ１６３Ｍ／Ａ３８３Ｖ、Ｇ１９１Ｄ／Ａ１９９Ｑ／Ｅ３６５Ｓ／Ａ３８３Ｖ／Ａ３８８Ｄ、Ｇ１９１Ｄ／Ｃ２６０Ｔ／Ａ３８８Ｄ、Ｇ１９１Ｄ／Ｆ２９１Ｙ、Ｇ１９１Ｄ／Ｆ２９１Ｙ／Ｎ３４２Ｔ／Ｈ３６２Ｑ／Ｅ３６５Ｓ、Ｇ１９１Ｄ／Ｒ３５１Ｌ／Ａ３８３Ｖ／Ａ３８８Ｄ、Ａ１９９Ｑ／Ｃ２６０Ｔ／Ａ３８３Ｖ、Ａ１９９Ｑ／Ｆ２９１Ｙ、Ｃ２６０Ｔ、Ｃ２６０Ｔ／Ｆ２９１Ｙ／Ｅ３６５Ｓ／Ａ３８３Ｖ／Ｆ４０８Ａ、Ｃ２６０Ｔ／Ｅ３６５Ｓ／Ａ３８３Ｖ、Ｆ２９１Ｙ、Ｆ２９１Ｙ／Ｒ３５１Ｌ／Ａ３８３Ｖ／Ａ３８８Ｄ、Ｆ２９１Ｙ／Ｒ３５１Ｌ／Ａ３８３Ｖ／Ａ３８８Ｄ／Ｆ４０８Ａ、Ｆ２９１Ｙ／Ｈ３６２Ｑ／Ｅ３６５Ｓ、Ｆ２９１Ｙ／Ｅ３６５Ｓ／Ａ３８８Ｄ、Ｆ２９１Ｙ／Ａ３８３Ｖ、Ｒ３１４Ｋ、Ｅ３１５Ｓ、Ｗ３１６Ｖ、Ｈ３１９Ｓ、Ｎ３４２Ｔ／Ｈ３６２Ｑ、Ｒ３５１Ｌ／Ａ３８３Ｖ／Ａ３８８Ｄ、Ｈ３６２Ｑ、Ｈ３６２Ｑ／Ａ３８８Ｄ、Ａ３８３Ｖ、Ａ３８３Ｖ／Ａ３８８Ｄ、Ｎ３９６Ｒ、Ｌ３９７Ｍ、Ｎ４０５Ａ、Ｔ４０６Ｈ、Ｉ４１３Ｌ、Ｑ４１９Ｓ、およびＬ４２３Ｖを含み、ここで、位置は、配列番号３６６を基準に番号付けされる。

【0176】

一部の実施形態では、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドは、２４／６６／１９１／１９９／２９１、２４／６６／２９１／３６５、１６３／２９１／３６２／３６５／３８３／３８８、１６３／２９１／３８３／３８８、１９１／２９１／３４２／３６２／３６５、２９１、および２９１／３８３から選択される、配列番号３６６と比較した１つまたは複数のアミノ酸残基の差異を有するアミノ酸配列を含む、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドをコードし、ここで、位置は、配列番号３６６を基準に番号付けされる。一部の実施形態では、アミノ酸の差異は、置換２４Ｋ／６６Ａ／１９１Ｄ／１９９Ｑ／２９１Ｙ、２４Ｋ／６６Ａ／２９１Ｙ／３６５Ｓ、１６３Ｍ／２９１Ｙ／３６２Ｑ／３６５Ｓ／３８３Ｖ／３８８Ｄ、１６３Ｍ／２９１Ｙ／３８３Ｖ／３８８Ｄ、１９１Ｄ／２９１Ｙ／３４２Ｔ／３６２Ｑ／３６５Ｓ、２９１Ｙ、および２９１Ｙ／３８３Ｖを含み、ここで、位置は、配列番号３６６を基準に番号付けされる。一部の追加的な実施形態では、アミノ酸の差異は、置換Ｓ２４Ｋ／Ｋ６６Ａ／Ｇ１９１Ｄ／Ａ１９９Ｑ／Ｆ２９１Ｙ、Ｓ２４Ｋ／Ｋ６６Ａ／Ｆ２９１Ｙ／Ｅ３６５Ｓ、Ｌ１６３Ｍ／Ｆ２９１Ｙ／Ｈ３６２Ｑ／Ｅ３６５Ｓ／Ａ３８３Ｖ／Ａ３８８Ｄ、Ｌ１６３Ｍ／Ｆ２９１Ｙ／Ａ３８３Ｖ／Ａ３８８Ｄ、Ｇ１９１Ｄ／Ｆ２９１Ｙ／Ｎ３４２Ｔ／Ｈ３６２Ｑ／Ｅ３６５Ｓ、Ｆ２９１Ｙ、およびＦ２９１Ｙ／Ａ３８３Ｖを含み、ここで、位置は、配列番号３６６を基準に番号付けされる。

【0177】

一部の実施形態では、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドは、１０、１３、１３／２４／１０８／１６３、１３／２４／１０８／１６３／３１１、１３／２４／１３３／１９９／３１１、１３／２４／１６３、１３／２４／１９９／３１１、１３／１０８、１３／１０８／１９９、１３／１０８／３１１、１３／１９９、１３／３１１、１４、１４／２４／１０８、１４／２４／１０８／１３３、１４／２４／１０８／１９９、１４／２４／１９９、１４／１０８、１４／１０８／１３３／３１１、１４／１０８／３１１、１４／３１１、２４、２４／１６３、２４／１６３／１９９、３５、７２、７３、７８、９５、１０１、１０８、１０８／１９９、１１４、１５４、１６３、１６９、１７５／３１６、１９９、１９９／３１１、２２６、２９３、３１１、３１６、３８２、３８３、および３８６から選択される、配列番号６５０と比較した１つまたは複数のアミノ酸残基の差異を有するアミノ酸配列を含む、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドをコードし、ここで、位置は、配列番号６５０を基準に番号付けされる。一部の実施形態では、アミノ酸の差異は、置換１０Ｅ、１３Ａ、１３Ａ／２４Ｅ／１０８Ｒ／１６３Ｌ／３１１Ｓ、１３Ａ／２４Ｅ／１３３Ｒ／１９９Ｑ／３１１Ｓ、１３Ａ／２４Ｅ／１６３Ｌ、１３Ａ／２４Ｋ／１０８Ｒ／１６３Ｌ、１３Ａ／２４Ｋ／１９９Ｑ／３１１Ｓ、１３Ａ／１０８Ｒ、１３Ａ／１０８Ｒ／１９９Ｑ、１３Ａ／１０８Ｒ／３１１Ｓ、１３Ａ／１９９Ｑ、１３Ａ／３１１Ｓ、１４Ａ、１４Ｇ、１４Ｈ、１４Ｈ／２４Ｅ／１０８Ｒ／１３３Ｒ、１４Ｈ／２４Ｋ／１０８Ｒ、１４Ｈ／２４Ｋ／１０８Ｒ／１９９Ｑ、１４Ｈ／２４Ｋ／１９９Ｑ、１４Ｈ／１０８Ｒ、１４Ｈ／１０８Ｒ／１３３Ｒ／３１１Ｓ、１４Ｈ／１０８Ｒ／３１１Ｓ、１４Ｈ／３１１Ｓ、２４Ｅ、２４Ｅ／１６３Ｌ、２４Ｅ／１６３Ｌ／１９９Ｑ、３５Ｅ、７２Ｇ、７３Ｒ、７３Ｓ、７８Ａ、９５Ｉ、１０１Ｌ、１０８Ｒ、１０８Ｒ／１９９Ｑ、１１４Ａ、１５４Ｓ、１６３Ｈ、１６３Ｓ、１６３Ｖ、１６９Ｃ、１６９Ｖ、１７５Ｄ／３１６Ｆ、１９９Ｑ、１９９Ｑ／３１１Ｓ、２２６Ｑ、２９３Ａ、３１１Ｋ、３１６Ｄ、３１６Ｅ、３１６Ｆ、３１６Ｇ、３１６Ｈ、３１６Ｉ、３１６Ｌ、３１６Ｎ、３１６Ｓ、３１６Ｖ、３１６Ｙ、３８２Ｄ、３８３Ｌ、および３８６Ａを含み、ここで、位置は、配列番号６５０を基準に番号付けされる。一部の追加的な実施形態では、アミノ酸の差異は、置換Ｒ１０Ｅ、Ｔ１３Ａ、Ｔ１３Ａ／Ｓ２４Ｅ／Ｓ１０８Ｒ／Ｍ１６３Ｌ／Ｉ３１１Ｓ、Ｔ１３Ａ／Ｓ２４Ｅ／Ａ１３３Ｒ／Ａ１９９Ｑ／Ｉ３１１Ｓ、Ｔ１３Ａ／Ｓ２４Ｅ／Ｍ１６３Ｌ、Ｔ１３Ａ／Ｓ２４Ｋ／Ｓ１０８Ｒ／Ｍ１６３Ｌ、Ｔ１３Ａ／Ｓ２４Ｋ／Ａ１９９Ｑ／Ｉ３１１Ｓ、Ｔ１３Ａ／Ｓ１０８Ｒ、Ｔ１３Ａ／Ｓ１０８Ｒ／Ａ１９９Ｑ、Ｔ１３Ａ／Ｓ１０８Ｒ／Ｉ３１１Ｓ、Ｔ１３Ａ／Ａ１９９Ｑ、Ｔ１３Ａ／Ｉ３１１Ｓ、Ｙ１４Ａ、Ｙ１４Ｇ、Ｙ１４Ｈ、Ｙ１４Ｈ／Ｓ２４Ｅ／Ｓ１０８Ｒ／Ａ１３３Ｒ、Ｙ１４Ｈ／Ｓ２４Ｋ／Ｓ１０８Ｒ、Ｙ１４Ｈ／Ｓ２４Ｋ／Ｓ１０８Ｒ／Ａ１９９Ｑ、Ｙ１４Ｈ／Ｓ２４Ｋ／Ａ１９９Ｑ、Ｙ１４Ｈ／Ｓ１０８Ｒ、Ｙ１４Ｈ／Ｓ１０８Ｒ／Ａ１３３Ｒ／Ｉ３１１Ｓ、Ｙ１４Ｈ／Ｓ１０８Ｒ／Ｉ３１１Ｓ、Ｙ１４Ｈ／Ｉ３１１Ｓ、Ｓ２４Ｅ、Ｓ２４Ｅ／Ｍ１６３Ｌ、Ｓ２４Ｅ／Ｍ１６３Ｌ／Ａ１９９Ｑ、Ｈ３５Ｅ、Ａ７２Ｇ、Ｋ７３Ｒ、Ｋ７３Ｓ、Ｒ７８Ａ、Ｍ９５Ｉ、Ｖ１０１Ｌ、Ｓ１０８Ｒ、Ｓ１０８Ｒ／Ａ１９９Ｑ、Ｔ１１４Ａ、Ｔ１５４Ｓ、Ｍ１６３Ｈ、Ｍ１６３Ｓ、Ｍ１６３Ｖ、Ｆ１６９Ｃ、Ｆ１６９Ｖ、Ｇ１７５Ｄ／Ｗ３１６Ｆ、Ａ１９９Ｑ、Ａ１９９Ｑ／Ｉ３１１Ｓ、Ｍ２２６Ｑ、Ｐ２９３Ａ、Ｉ３１１Ｋ、Ｗ３１６Ｄ、Ｗ３１６Ｅ、Ｗ３１６Ｆ、Ｗ３１６Ｇ、Ｗ３１６Ｈ、Ｗ３１６Ｉ、Ｗ３１６Ｌ、Ｗ３１６Ｎ、Ｗ３１６Ｓ、Ｗ３１６Ｖ、Ｗ３１６Ｙ、Ｅ３８２Ｄ、Ｖ３８３Ｌ、およびＤ３８６Ａを含み、ここで、位置は、配列番号６５０を基準に番号付けされる。

【0178】

一部の実施形態では、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドは、１４／１０８／１３３／３１１、２４／１６３／１９９、７２、７８、３１６、および３８３から選択される、配列番号６５０と比較した１つまたは複数のアミノ酸残基の差異を有するアミノ酸配列を含む、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドをコードし、ここで、位置は、配列番号６５０を基準に番号付けされる。一部の実施形態では、アミノ酸の差異は、置換１４Ｈ／１０８Ｒ／１３３Ｒ／３１１Ｓ、２４Ｅ／１６３Ｌ／１９９Ｑ、７２Ｇ、７８Ａ、３１６Ｌ、３１６Ｎ、３１６Ｓ、および３８３Ｌを含み、ここで、位置は、配列番号６５０を基準に番号付けされる。一部の追加的な実施形態では、アミノ酸の差異は、置換Ｙ１４Ｈ／Ｓ１０８Ｒ／Ａ１３３Ｒ／Ｉ３１１Ｓ、Ｓ２４Ｅ／Ｍ１６３Ｌ／Ａ１９９Ｑ、Ａ７２Ｇ、Ｒ７８Ａ、Ｗ３１６Ｌ、Ｗ３１６Ｎ、Ｗ３１６Ｓ、およびＶ３８３Ｌを含み、ここで、位置は、配列番号６５０を基準に番号付けされる。

【0179】

一部の実施形態では、本開示のバリアントトランスアミナーゼは、コードされる酵素の活性を変更しない追加的な配列をさらに含む。例えば、一部の実施形態では、バリアントトランスアミナーゼは、エピトープタグまたは精製に有用な別の配列と連結している。

【0180】

一部の実施形態では、本開示のバリアントトランスアミナーゼポリペプチドは、それらが発現される宿主細胞（例えば、酵母または糸状菌宿主細胞）から分泌され、シグナルペプチド（すなわち、ポリペプチドのアミノ末端に連結しており、コードされるポリペプチドを細胞による分泌経路内に方向づけるアミノ酸配列）を含むタンパク質前駆体として発現される。

【0181】

操作されたポリペプチドの配列が分かっている場合、酵素をコードするポリヌクレオチドを、公知の合成方法に従って、標準の固相方法によって調製することができる。一部の実施形態では、最大約１００塩基の断片を個別に合成し、次いで、接合して（例えば、酵素的もしくは化学的ライゲーション法、またはポリメラーゼにより媒介される方法によって）、任意の所望の連続した配列を形成することができる。例えば、本開示のポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドを化学合成によって（例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔ． Ｌｅｔｔ．， ２２： １８５９－６９ ［１９８１］によって記載されている古典的なホスホラミダイト法、またはＭａｔｔｈｅｓ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ．， ３： ８０１－０５ ［１９８４］によって記載されている方法を使用して、一般には自動化された合成方法で実施される通り）調製することができる。ホスホラミダイト法によると、オリゴヌクレオチドを合成し（例えば、自動ＤＮＡ合成機で）、精製し、アニーリングし、ライゲーションし、適当なベクターにクローニングする。さらに、基本的にあらゆる核酸を種々の商業的な供給源（例えば、Ｔｈｅ Ｍｉｄｌａｎｄ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｍｉｄｌａｎｄ、ＴＸ、Ｔｈｅ Ｇｒｅａｔ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｇｅｎｅ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒａｍｏｎａ、ＣＡ、ＥｘｐｒｅｓｓＧｅｎ Ｉｎｃ． Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ、Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ、および多くの他の供給源）のいずれかから得ることができる。

【0182】

本開示は、本明細書に提示される少なくとも１つのバリアントトランスアミナーゼをコードする配列を含む組換え構築物も提供する。一部の実施形態では、本開示は、異種プロモーターに作動可能に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）連結したバリアントトランスアミナーゼポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。一部の実施形態では、本開示の発現ベクターを使用して、適当な宿主細胞を、宿主細胞がバリアントトランスアミナーゼタンパク質を発現することが可能になるように形質転換する。真菌および他の生物体においてタンパク質を組換え発現させるための方法は当技術分野で周知であり、いくつかの発現ベクターが入手可能である、または常套的な方法を使用して構築することができる。一部の実施形態では、本開示の核酸構築物は、本開示の核酸配列が挿入されたベクター、例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）などを含む。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドを、バリアントトランスアミナーゼポリペプチドの発現に適した種々の発現ベクターのいずれか１つに組み入れる。適切なベクターとしては、これだけに限定されないが、染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列（例えば、ＳＶ４０の誘導体）、ならびに細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージＤＮＡの組合せに由来するベクター、ウイルスＤＮＡ、例えば、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、および多くの他のベクターが挙げられる。遺伝子材料を細胞に形質導入し、かつ、複製が望まれる場合には関連性のある宿主において複製可能かつ生存可能である、任意の適切なベクターを本開示に使用する。

【0183】

一部の実施形態では、構築物は、これだけに限定されないが、タンパク質をコードする配列に作動可能に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）連結した、プロモーターを含めた調節配列をさらに含む。多数の適切なベクターおよびプロモーターが当業者に公知である。実際に、一部の実施形態では、特定の宿主において高レベルの発現を得るために、多くの場合、本開示のバリアントトランスアミナーゼを異種プロモーターの制御下で発現させることが有用である。一部の実施形態では、プロモーター配列をバリアントトランスアミナーゼコード配列の５’領域に当技術分野で公知の任意の適切な方法を使用して作動可能に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）連結する。バリアントトランスアミナーゼの発現のために有用なプロモーターの例としては、これだけに限定されないが、真菌由来のプロモーターが挙げられる。一部の実施形態では、真菌株におけるトランスアミナーゼ遺伝子以外の遺伝子の発現を駆動するプロモーター配列が利用される。非限定的な例として、エンドグルカナーゼをコードする遺伝子由来の真菌プロモーターを使用することができる。一部の実施形態では、トランスアミナーゼが由来する真菌株以外の真菌株におけるトランスアミナーゼ遺伝子の発現を駆動するプロモーター配列が利用される。糸状菌宿主細胞における本開示のヌクレオチド構築物の転写を方向づけるために有用な他の適切なプロモーターの例としては、これだけに限定されないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ中性アルファ－アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ酸安定アルファ－アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉリパーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅアルカリ性プロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅトリオースリン酸イソメラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓアセトアミダーゼ、およびＦｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得られるプロモーター（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ９６／００７８７を参照されたい）、ならびに、ＮＡ２－ｔｐｉプロモーター（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ中性アルファ－アミラーゼの遺伝子由来のプロモーターとＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子由来のプロモーターのハイブリッド）、ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１、ｅｇｌ２、ｐｅｐＡ、ｈｆｂ１、ｈｆｂ２、ｘｙｎ１、ａｍｙ、およびｇｌａＡなどのプロモーター（例えば、全てが参照により本明細書に組み込まれるＮｕｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， ４： ２３０６－２３１５ ［１９８４］；Ｂｏｅｌ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ．， ３： １５８１－８５ ［１９８４］；および欧州特許出願第１３７２８０号を参照されたい）、ならびにこれらの突然変異体、短縮型、およびハイブリッドプロモーターが挙げられる。

【0184】

酵母宿主細胞において有用なプロモーターとしては、これだけに限定されないが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ｅｎｏ－１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅガラクトキナーゼ（ｇａｌ１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド－３－リン酸脱水素酵素（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ３－ホスホグリセリン酸キナーゼの遺伝子に由来するプロモーターが挙げられる。酵母宿主細胞に有用な追加的な有用なプロモーターは、当技術分野で公知である（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＲｏｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．， Ｙｅａｓｔ ８： ４２３－４８８ ［１９９２］を参照されたい）。さらに、真菌におけるキチナーゼ産生に関連するプロモーターが本開示において使用される（例えば、どちらも参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｌａｉｓｅａｕ ａｎｄ Ｌａｆａｙ， Ｇｅｎｅ １２０２４３－２４８ ［１９９２］；およびＬｉｍｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｇｅｎｅｔ．， ２８： ４７８－８３ ［１９９５］を参照されたい）。

【0185】

細菌宿主細胞に関しては、本開示の核酸構築物の転写を方向づけるための適切なプロモーターとして、これだけに限定されないが、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃオペロン、Ｅ．ｃｏｌｉ ｔｒｐオペロン、バクテリオファージラムダ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒアガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓレバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓアルファ－アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓマルトース生成アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓアルファ－アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子、および原核生物ベータ－ラクタマーゼ遺伝子から得られるプロモーター（例えば、Ｖｉｌｌａ－Ｋａｍａｒｏｆｆ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７５： ３７２７－３７３１ ［１９７８］を参照されたい）、ならびにｔａｃプロモーター（例えば、ＤｅＢｏｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８０： ２１－２５ ［１９８３］を参照されたい）が挙げられる。

【0186】

一部の実施形態では、クローニングされた本開示のバリアントトランスアミナーゼは、適切な、宿主細胞によって認識されて転写を終結させる配列である、転写ターミネーター配列も有する。ターミネーター配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の３’末端に作動可能に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）連結される。選択された宿主細胞において機能的な任意のターミネーターが本開示において使用される。糸状菌宿主細胞のための例示的な転写ターミネーターとしては、これだけに限定されないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸シンターゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒアルファ－グルコシダーゼ、およびＦｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得られるものが挙げられる（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，３９９，６２７号を参照されたい）。一部の実施形態では、酵母宿主細胞のための例示的なターミネーターとして、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅシトクロムＣ（ＣＹＣ１）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅグリセルアルデヒド－３－リン酸脱水素酵素の遺伝子から得られるものが挙げられる。酵母宿主細胞のための他の有用なターミネーターは当業者に周知である（例えば、Ｒｏｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．， Ｙｅａｓｔ ８： ４２３－８８ ［１９９２］を参照されたい）。

【0187】

一部の実施形態では、クローニングされたバリアントトランスアミナーゼ配列の一部は適切なリーダー配列であり、これは、宿主細胞による翻訳に重要な、ｍＲＮＡの非翻訳領域である。リーダー配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の５’末端に作動可能に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）連結される。選択された宿主細胞において機能的な任意のリーダー配列が本開示において使用される。糸状菌宿主細胞のための例示的なリーダーとしては、これだけに限定されないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られるものが挙げられる。酵母宿主細胞のための適切なリーダーとしては、これだけに限定されないが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ－１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ３－ホスホグリセリン酸キナーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ因子、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド－３－リン酸脱水素酵素（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）の遺伝子から得られるものが挙げられる。

【0188】

一部の実施形態では、本開示の配列は、ポリアデニル化配列も含み、これは、核酸配列の３’末端に作動可能に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）連結され、転写されると、宿主細胞によってシグナルとして認識されて、転写されたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加する配列である。選択された宿主細胞において機能的な任意のポリアデニル化配列が本開示において使用される。糸状菌宿主細胞のための例示的なポリアデニル化配列としては、これだけに限定されないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸シンターゼ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒアルファ－グルコシダーゼの遺伝子から得られるものが挙げられる。酵母宿主細胞に有用なポリアデニル化配列は当技術分野で公知である（例えば、Ｇｕｏ ａｎｄ Ｓｈｅｒｍａｎ， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， １５： ５９８３－５９９０ ［１９９５］を参照されたい）。

【0189】

一部の実施形態では、制御配列は、ポリペプチドのアミノ末端に連結しており、コードされるポリペプチドを細胞の分泌経路内に方向づけるアミノ酸配列をコードするシグナルペプチドコード領域を含む。核酸配列のコード配列の５’末端は、翻訳読み枠内で、分泌されるポリペプチドをコードするコード領域のセグメントと天然に連結しているシグナルペプチドコード領域を本質的に含有し得る。あるいは、コード配列の５’末端は、コード配列に対して外来であるシグナルペプチドコード領域を含有し得る。外来シグナルペプチドコード領域は、コード配列が天然にはシグナルペプチドコード領域を含有しない場合に必要になり得る。

【0190】

あるいは、ポリペプチドの分泌を増強するために、外来シグナルペプチドコード領域で単に天然のシグナルペプチドコード領域を置き換えることができる。しかし、発現されたポリペプチドを選択された宿主細胞の分泌経路内に方向づける任意のシグナルペプチドコード領域を本開示において使用することができる。

【0191】

一部の実施形態では、シグナルペプチドは内在性Ｖ．ｆｌｕｖｉａｌｉｓトランスアミナーゼシグナルペプチドである。一部の追加的な実施形態では、他のＶ．ｆｌｕｖｉａｌｉｓ分泌型タンパク質由来のシグナルペプチドを使用する。一部の実施形態では、宿主細胞および他の因子に応じて他のシグナルペプチドを使用する。

【0192】

細菌宿主細胞のための効果的なシグナルペプチドコード領域としては、これだけに限定されないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ＮＣｌＢ １１８３７マルトース生成アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓアルファ－アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓスブチリシン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓベータ－ラクタマーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）、およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｐｒｓＡの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域が挙げられる。さらなるシグナルペプチドは当技術分野で公知である（例えば、Ｓｉｍｏｎｅｎ ａｎｄ Ｐａｌｖａ， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖ．， ５７： １０９－１３７ ［１９９３］を参照されたい）。

【0193】

糸状菌宿主細胞のための効果的なシグナルペプチドコード領域としては、これだけに限定されないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ中性アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓセルラーゼ、およびＨｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａリパーゼの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域が挙げられる。

【0194】

酵母宿主細胞のための有用なシグナルペプチドとしては、これだけに限定されないが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ因子およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼの遺伝子が挙げられる。他の有用なシグナルペプチドコード領域は当技術分野で公知である（例えば、Ｒｏｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．， ［１９９２］、上記を参照されたい）。

【0195】

一部の実施形態では、制御配列は、ポリペプチドのアミノ末端に位置付けられるアミノ酸配列をコードするプロペプチドコード領域を含む。得られるポリペプチドは、プロ酵素またはプロポリペプチド（または一部の場合ではチモーゲン）として公知である。プロポリペプチドは、一般に不活性であり、プロポリペプチドからプロペプチドへの触媒または自己触媒による切断により、成熟活性トランスアミナーゼポリペプチドに変換され得る。プロペプチドコード領域は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓアルカリ性プロテアーゼ（ａｐｒＥ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ因子、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、およびＭｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａラクターゼの遺伝子から得ることができる（例えば、ＷＯ９５／３３８３６を参照されたい）。

【0196】

シグナルペプチド領域およびプロペプチド領域の両方がポリペプチドのアミノ末端に存在する場合、プロペプチド領域はポリペプチドのアミノ末端の隣に位置付けられ、シグナルペプチド領域はプロペプチド領域のアミノ末端の隣に位置付けられる。

【0197】

一部の実施形態では、宿主細胞の成長に対するポリペプチドの発現の調節を可能にするために、調節配列も使用する。調節系の例は、調節化合物の存在を含めた化学的または物理的刺激に応答して遺伝子の発現がオンまたはオフになるようにするものである。原核生物宿主細胞における適切な調節配列としては、これだけに限定されないが、ｌａｃ、ｔａｃ、およびｔｒｐオペレーター系が挙げられる。酵母宿主細胞における適切な調節系としては、例として、ＡＤＨ２系またはＧＡＬ１系が挙げられる。糸状菌における適切な調節配列としては、ＴＡＫＡアルファ－アミラーゼプロモーター、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼプロモーター、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅグルコアミラーゼプロモーターが挙げられる。

【0198】

調節配列の他の例は、遺伝子増幅を可能にするものである。真核生物系では、これらとして、メトトレキサートの存在下で増幅するジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、および重金属で増幅するメタロチオネイン遺伝子が挙げられる。これらの場合では、本開示のトランスアミナーゼポリペプチドをコードする核酸配列を調節配列と作動可能に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）連結する。

【0199】

したがって、追加的な実施形態では、本開示は、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドまたはそのバリアントをコードするポリヌクレオチド、ならびに、それらが導入される宿主の型に応じて、プロモーターおよびターミネーターなどの１つまたは複数の発現調節領域、複製開始点（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｒｉｇｉｎ）などを含む、組換え発現ベクターを提供する。一部の実施形態では、上記の種々の核酸および制御配列を接合して、１つまたは複数の都合のよい制限部位におけるポリペプチドをコードする核酸配列の挿入または置換を可能にするためにそのような部位を含み得る組換え発現ベクターを作製する。あるいは、一部の実施形態では、核酸配列または配列を含む核酸構築物を発現のための適当なベクターに挿入することにより、核酸配列を発現させる。発現ベクターの創出に関して、コード配列は、ベクター内に、コード配列が発現のための適当な制御配列に作動可能に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）連結するように位置する。

【0200】

組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ手順に都合よく供することができ、ポリヌクレオチド配列の発現をもたらすことができる任意の適切なベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）を含む。ベクターの選択は、一般には、ベクターが導入される宿主細胞に対するベクターの適合性に依存する。一部の実施形態では、ベクターは、直鎖状または閉環状プラスミドである。

【0201】

一部の実施形態では、発現ベクターは、自律複製性ベクター（すなわち、染色体外実体として存在し、その複製が染色体複製とは独立しているベクター、例えば、プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、または人工染色体など）である。一部の実施形態では、ベクターは、自己複製を保証するための任意の手段を含有する。あるいは、一部の他の実施形態では、ベクターは、宿主細胞に導入されると、ゲノム内に組み込まれ、それが組み込まれた染色体と一緒に複製される。さらに、追加的な実施形態では、単一のベクターもしくはプラスミド、または宿主細胞内にゲノムに導入される総ＤＮＡを合わせて含有する２種もしくはそれよりも多くのベクターもしくはプラスミド、またはトランスポゾンを使用する。

【0202】

一部の実施形態では、本開示の発現ベクターは、形質転換された細胞の容易な選択を可能にする１種または複数種の選択マーカーを含有する。「選択マーカー」は、遺伝子であり、その産物により、殺生物またはウイルス耐性、抗菌薬または重金属に対する耐性、栄養要求株に対する原栄養性などがもたらされる。糸状菌宿主細胞において使用するための任意の適切な選択マーカーが本開示において使用され、それらとしては、これだけに限定されないが、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、バール（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｐｈ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸還元酵素）、ｐｙｒＧ（オロチジン－５’－リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、およびｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、ならびにこれらの等価物が挙げられる。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓなどの宿主細胞において有用な追加的なマーカーとしては、これだけに限定されないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅのａｍｄＳ遺伝子およびｐｙｒＧ遺伝子、ならびにＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓのｂａｒ遺伝子が挙げられる。酵母宿主細胞のための適切なマーカーとしては、これだけに限定されないが、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１、およびＵＲＡ３が挙げられる。細菌選択マーカーの例としては、これだけに限定されないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓもしくはＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のｄａｌ遺伝子、または、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、およびまたはテトラサイクリン耐性などの抗生物質耐性を付与するマーカーが挙げられる。

【0203】

一部の実施形態では、本開示の発現ベクターは、ベクターの宿主細胞のゲノム内への組込み、またはベクターの細胞におけるゲノムとは独立した自律複製を可能にするエレメントを含有する。宿主細胞のゲノム内への組込みを伴う一部の実施形態では、ベクターは、ゲノム内へのベクターの相同または非相同組換えによる組込みに関してポリペプチドをコードする核酸配列または任意の他のベクターのエレメントに依拠する。

【0204】

一部の代替的な実施形態では、発現ベクターは、宿主細胞のゲノム内への相同組換えによる組込みを方向づけるための追加的な核酸配列を含有する。追加的な核酸配列により、ベクターが、宿主細胞のゲノム内に、染色体内の正確な位置に組み込まれることが可能になる。正確な位置に組み込まれる可能性を増大させるために、相同組換えの確率を増強するために十分な数の、対応する標的配列と高度に相同なヌクレオチド、例えば、１００～１０，０００塩基対、好ましくは４００～１０，０００塩基対、最も好ましくは８００～１０，０００塩基対が組込みエレメントに含有されることが好ましい。組込みエレメントは、宿主細胞のゲノム内の標的配列と相同な任意の配列であり得る。さらに、組込みエレメントは、非コードまたはコード核酸配列であり得る。他方では、ベクターを宿主細胞のゲノム内に非相同組換えによって組み込むことができる。

【0205】

自律複製のために、ベクターは、ベクターが問題の宿主細胞において自律的に複製することを可能にする複製開始点をさらに含み得る。細菌複製開始点の例は、Ｐ１５Ａ ｏｒｉまたはプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣｌ７７の複製開始点（これらのプラスミドはＰ１５Ａ ｏｒｉを有する）、またはＥ．ｃｏｌｉにおける複製を可能にするｐＡＣＹＣ１８４、およびＢａｃｉｌｌｕｓにおける複製を可能にするｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＴＡ１０６０、もしくはｐＡＭβ１である。酵母宿主細胞において使用するための複製開始点の例は、２ミクロン複製開始点、ＡＲＳ１、ＡＲＳ４、ＡＲＳ１とＣＥＮ３の組合せ、およびＡＲＳ４とＣＥＮ６の組合せである。複製開始点は、宿主細胞におけるその機能を温度感受性にする突然変異を有するものであり得る（例えば、Ｅｈｒｌｉｃｈ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７５： １４３３ ［１９７８］を参照されたい）。

【0206】

一部の実施形態では、遺伝子産物の産生を増加させるために、本開示の核酸配列の１つよりも多くのコピーを宿主細胞に挿入する。核酸配列のコピー数の増加は、配列の少なくとも１つの追加的なコピーを宿主細胞のゲノム内に組み込むことによって得ることもでき、増幅可能な選択マーカー遺伝子を核酸配列と共に含めることによって得ることもでき、その場合、選択マーカー遺伝子の増幅されたコピー、およびしたがって核酸配列の追加的なコピーを含有する細胞を、適当な選択可能な作用剤の存在下で細胞を培養する（ｃｕｌｔｉｖａｔｅ）ことによって選択することができる。

【0207】

本開示において使用するための発現ベクターの多くが市販されている。適切な市販の発現ベクターとしては、これだけに限定されないが、ｐ３ｘＦＬＡＧＴＭ（商標）発現ベクター（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）が挙げられ、これは、哺乳動物宿主細胞における発現のためのＣＭＶプロモーターおよびｈＧＨポリアデニル化部位、ならびにＥ．ｃｏｌｉにおける増幅のためのｐＢＲ３２２複製開始点およびアンピシリン耐性マーカーを含む。他の適切な発現ベクターとしては、これだけに限定されないが、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（－）およびｐＢＫ－ＣＭＶ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、およびｐＢＲ３２２（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、ｐＵＣ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはｐＰｏｌｙに由来するプラスミドが挙げられる（例えば、Ｌａｔｈｅ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ５７： １９３－２０１ ［１９８７］を参照されたい）。

【0208】

したがって、一部の実施形態では、ベクターの伝播およびバリアントトランスアミナーゼの発現を可能にするために、少なくとも１つのバリアントトランスアミナーゼをコードする配列を含むベクターを宿主細胞に導入してそれを形質転換する。一部の実施形態では、バリアントトランスアミナーゼが翻訳後修飾されてシグナルペプチドが除去され、一部の場合では、分泌後に切断することができる。一部の実施形態では、上記の形質転換された宿主細胞を、バリアントトランスアミナーゼの発現を可能にする適切な栄養培地条件下で培養する。これだけに限定されないが、適当な補充物質を含有する最小または複合培地を含めた、宿主細胞を培養するために有用な任意の適切な培地が本開示において使用される。一部の実施形態では、宿主細胞をＨＴＰ培地中で成長させる。適切な培地は、種々の商業的な供給者から入手可能である、または公開された配合表（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログにおいて）に従って調製することができる。

【0209】

別の態様では、本開示は、本明細書に提示される改善されたトランスアミナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供し、ポリヌクレオチドは、トランスアミナーゼ酵素を宿主細胞において発現させるための１つまたは複数の制御配列に作動可能に（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ）連結している。本開示の発現ベクターによってコードされるトランスアミナーゼポリペプチドの発現に使用するための宿主細胞が当技術分野で周知であり、それらとして、これだけに限定されないが、細菌細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ細胞、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｆｉｒ細胞、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ細胞およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞など；真菌細胞、例えば、酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞またはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞（ＡＴＣＣ受託番号２０１１７８））など；昆虫細胞、例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞など；動物細胞、例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、２９３細胞、およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞など；ならびに植物細胞が挙げられる。上記の宿主細胞に対する適当な培養培地および成長条件は当技術分野で周知である。

【0210】

トランスアミナーゼを発現させるためのポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の様々な方法によって細胞に導入することができる。技法としては、とりわけ、電気穿孔、微粒子銃粒子衝撃、リポソーム媒介性トランスフェクション、塩化カルシウムトランスフェクション、およびプロトプラスト融合が挙げられる。ポリヌクレオチドを細胞に導入するための様々な方法が当業者に公知である。

【0211】

一部の実施形態では、宿主細胞は真核細胞である。適切な真核生物宿主細胞としては、これだけに限定されないが、真菌細胞、藻類細胞、昆虫細胞、および植物細胞が挙げられる。適切な真菌宿主細胞としては、これだけに限定されないが、Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ、Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ、Ｄｅｕｔｅｒｏｍｙｃｏｔａ、Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ、Ｆｕｎｇｉ ｉｍｐｅｒｆｅｃｔｉが挙げられる。一部の実施形態では、真菌宿主細胞は、酵母細胞および糸状菌細胞である。本開示の糸状菌宿主細胞は、ＥｕｍｙｃｏｔｉｎａおよびＯｏｍｙｃｏｔａ亜門の全ての糸状形態を含む。糸状菌は、キチン、セルロースおよび他の複合多糖で構成される細胞壁を有する栄養菌糸によって特徴付けられる。本開示の糸状菌宿主細胞は、酵母とは形態学的に別個である。

【0212】

本開示の一部の実施形態では、糸状菌宿主細胞は、これだけに限定されないが、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍｅｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、および／もしくはＶｏｌｖａｒｉｅｌｌａを含めた任意の適切な属および種のもの、ならびに／またはこれらのテレオモルフ、もしくはアナモルフ、およびシノニム、バソニム、もしくは分類学的等価物である。

【0213】

本開示の一部の実施形態では、宿主細胞は、これだけに限定されないが、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、またはＹａｒｒｏｗｉａ種の細胞を含めた酵母細胞である。本開示の一部の実施形態では、酵母細胞は、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｄａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ ｑｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ａｎｇｕｓｔａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、またはＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａである。

【0214】

本開示の一部の実施形態では、宿主細胞は、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ（例えば、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）およびＰｈｏｒｍｉｄｉｕｍ（例えば、Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ ｓｐ．ＡＴＣＣ２９４０９）などの藻類細胞である。

【0215】

一部の他の実施形態では、宿主細胞は、原核細胞である。適切な原核細胞としては、これだけに限定されないが、グラム陽性、グラム陰性およびグラム不定細菌細胞が挙げられる。これだけに限定されないが、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｎａｂａｅｎａ、Ａｎａｃｙｓｔｉｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ａｚｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ、Ｂｕｃｈｎｅｒａ、Ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ、Ｃａｍｐｌｙｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｙｎｅｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ、Ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、Ｘｙｌｅｌｌａ、ＹｅｒｓｉｎｉａおよびＺｙｍｏｍｏｎａｓを含めた任意の適切な細菌生物体が本開示において使用される。一部の実施形態では、宿主細胞は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｚｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｕｃｈｎｅｒａ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、またはＺｙｍｏｍｏｎａｓの種である。一部の実施形態では、細菌宿主株は、ヒトに対して非病原性である。一部の実施形態では、細菌宿主株は工業用株である。多数の細菌工業用株が公知であり、本開示に適している。本開示の一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種（例えば、Ａ．ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ、Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ、およびＡ．ｒｕｂｉ）である。本開示の一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ種（例えば、Ａ．ａｕｒｅｓｃｅｎｓ、Ａ．ｃｉｔｒｅｕｓ、Ａ．ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ、Ａ．ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｓ、Ａ．ｍｙｓｏｒｅｎｓ、Ａ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ、Ａ．ｐａｒａｆｆｉｎｅｕｓ、Ａ．ｐｒｏｔｏｐｈｏｎｎｉａｅ、Ａ．ｒｏｓｅｏｐａｒｑｆｆｉｎｕｓ、Ａ．ｓｕｌｆｕｒｅｕｓ、およびＡ．ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）である。本開示の一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種（例えば、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｅｎｓｉｓ、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ、Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂ．ｌａｕｔｕｓ、Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ、Ｂ．ｆｉｒｍｕｓ、Ｂ．ａｌｋａｏｐｈｉｕｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ、およびＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）である。一部の実施形態では、宿主細胞は、これだけに限定されないが、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、またはＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓを含めた工業用Ｂａｃｉｌｌｕｓ株である。一部の実施形態では、Ｂａｃｉｌｌｕｓ宿主細胞は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、および／またはＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓである。一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種（例えば、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃ．ｔｅｔａｎｉ Ｅ８８、Ｃ．ｌｉｔｕｓｅｂｕｒｅｎｓｅ、Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、およびＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）である。一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種（例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍおよびＣ．ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）である。一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ種（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）である。一部の実施形態では、宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０である。一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｅｒｗｉｎｉａ種（例えば、Ｅ．ｕｒｅｄｏｖｏｒａ、Ｅ．ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ、Ｅ．ａｎａｎａｓ、Ｅ．ｈｅｒｂｉｃｏｌａ、Ｅ．ｐｕｎｃｔａｔａ、およびＥ．ｔｅｒｒｅｕｓ）である。一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｐａｎｔｏｅａ種（例えば、Ｐ．ｃｉｔｒｅａ、およびＰ．ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）である。一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種（例えば、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐ．ｍｅｖａｌｏｎｉｉ、およびＰ．ｓｐ．Ｄ－０ｌ １０）である。一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種（例えば、Ｓ．ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｅｓ、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、およびＳ．ｕｂｅｒｉｓ）である。一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種（例えば、Ｓ．ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｓ．ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｓ．ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ、Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ、およびＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）である。一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ種（例えば、Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ、およびＺ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である。

【0216】

本開示において使用される多くの原核生物および真核生物株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（ＤＳＭ）、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ Ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）、およびＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｐａｔｅｎｔ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（ＮＲＲＬ）などのいくつかの微生物株保存機関から一般に容易に入手可能である。

【0217】

一部の実施形態では、宿主細胞を、タンパク質分泌、タンパク質安定性ならびに／またはタンパク質の発現および／もしくは分泌のために望ましい他の特性が改善される特徴を有するように遺伝子改変する。遺伝子改変は、遺伝子操作技法および／または古典的な微生物学的技法（例えば、化学的またはＵＶ突然変異誘発およびその後の選択）によって実現することができる。実際に、一部の実施形態では、組換えによる改変と古典的な選択技法の組合せを使用して、宿主細胞を作製する。組換え技術を使用して、宿主細胞内および／または培養培地中のトランスアミナーゼバリアントの収率の上昇がもたらされる様式で核酸分子を導入すること、欠失させること、阻害することまたは改変することができる。例えば、Ａｌｐ１機能をノックアウトすると、プロテアーゼ欠損細胞がもたらされ、ｐｙｒ５機能をノックアウトすると、ピリミジン欠損表現型を有する細胞がもたらされる。１つの遺伝子操作手法では、相同組換えを使用して、コードされるタンパク質の発現を抑制するためにｉｎ ｖｉｖｏで遺伝子を特異的に標的とすることによる標的化遺伝子改変を誘導する。代替手法では、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスおよび／またはリボザイム技術が遺伝子発現の阻害に使用される。これだけに限定されないが、遺伝子産物の発現または活性を妨害するためのタンパク質をコードする遺伝子の全部または一部の欠失および部位特異的突然変異誘発を含めた、細胞におけるタンパク質の発現を低減させるための種々の方法が当技術分野で公知である（例えば、全て参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｈａｖｅｒｏｃｈｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２８： ２２ ｅ９７ ［２０００］；Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｐｌａｎｔ Ｍｉｃ． Ｉｎｔｅｒａｃｔ．， １９： ７－１５ ［２００６］；Ｍａｒｕｙａｍａ ａｎｄ Ｋｉｔａｍｏｔｏ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｌｅｔｔ．， ３０： １８１１－１８１７ ［２００８］；Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｏｍ．， ２７２： ３４４－３５２ ［２００４］；およびＹｏｕ ｅｔ ａｌ．， Ａｒｃｈ． Ｍｉｃｒｉｏｂｉｏｌ．，１９１： ６１５－６２２ ［２００９］を参照されたい）。ランダム突然変異誘発、その後の所望の突然変異についてのスクリーニングも使用される（例えば、どちらも参照により組み込まれるＣｏｍｂｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ．， ２２０： １４１－８ ［２００３］；およびＦｉｒｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｋａｒｙ． Ｃｅｌｌ ２： ２４７－５５ ［２００３］を参照されたい）。

【0218】

ベクターまたはＤＮＡ構築物の宿主細胞への導入は、これだけに限定されないが、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介性トランスフェクション、ＰＥＧ媒介性形質転換、電気穿孔、または他の当技術分野で公知の一般的な技法を含めた、当技術分野で公知の任意の適切な方法を使用して実現することができる。一部の実施形態では、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ発現ベクターｐＣＫ１００９００ｉ（これにより参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００６／０１９５９４７号を参照されたい）が使用される。

【0219】

一部の実施形態では、本開示の操作された宿主細胞（すなわち、本開示の「組換え宿主細胞」）を、必要に応じてプロモーターの活性化、形質転換体の選択、またはトランスアミナーゼポリヌクレオチドの増幅のために改変された従来の栄養培地で培養する。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞にかねて用いられているものであり、当業者には周知である。記載の通り、細菌起源、植物起源、動物（特に哺乳動物）起源および古細菌起源の細胞を含めた多くの細胞の培養および作製に関する多くの標準の参考文献およびテキストが入手可能である。

【0220】

一部の実施形態では、本開示のバリアントトランスアミナーゼポリペプチドを発現する細胞をバッチまたは連続発酵条件下で成長させる。古典的な「バッチ発酵」は、閉鎖系であり、培地の組成を発酵開始時に設定し、発酵中は人為的な交換に供さない。バッチ系の変形形態が「流加発酵」であり、これも本開示において使用される。この変形形態では、発酵が進むにつれて基質を徐々に添加する。流加系は、カタボライト抑制が細胞の代謝を阻害する可能性がある場合、および限られた培地中の基質の量を制限することが望ましい場合に有用である。バッチおよび流加発酵は、当技術分野で一般的であり、周知である。「連続発酵」は、開放系であり、規定の発酵培地をバイオリアクターに連続的に添加し、同時に等量の馴化培地を処理のために取り出す。連続発酵では、一般に、培養物を、細胞が主に対数成長期にある一定の高密度で維持する。連続発酵システムは、定常状態の成長条件を維持しようとするものである。連続発酵プロセスのための栄養分および増殖因子をモジュレートするための方法、ならびに産物の形成率を最大にするための技法は工業微生物学の分野で周知である。

【0221】

本開示の一部の実施形態では、バリアントトランスアミナーゼの作製に無細胞転写／翻訳系を使用する。いくつかの系が市販されており、方法は当業者には周知である。

【0222】

本開示は、バリアントトランスアミナーゼポリペプチドまたはその生物活性断片を作製する方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、配列番号２、４、８、３６６、および／または６５０に対して少なくとも約７０％（または少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％）の配列同一性を含み、本明細書に提示される少なくとも１つの突然変異を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを用いて形質転換した宿主細胞を準備するステップと；形質転換された宿主細胞を、宿主細胞がコードされるバリアントトランスアミナーゼポリペプチドを発現する培養培地条件下で培養するステップと；必要に応じて、発現されたバリアントトランスアミナーゼポリペプチドを回収もしくは単離するステップ、および／または発現されたバリアントトランスアミナーゼポリペプチドを含有する培養培地を回収もしくは単離するステップとを含む。一部の実施形態では、方法は、必要に応じて、コードされるトランスアミナーゼポリペプチドが発現された後、形質転換された宿主細胞を溶解させるステップと、必要に応じて、発現されたバリアントトランスアミナーゼポリペプチドを細胞溶解物から回収および／または単離するステップとをさらに提供する。本開示は、さらに、バリアントトランスアミナーゼポリペプチドを作製する方法であって、バリアントトランスアミナーゼポリペプチドを用いて形質転換した宿主細胞を、バリアントトランスアミナーゼポリペプチドの産生に適した条件下で培養するステップと、バリアントトランスアミナーゼポリペプチドを回収するステップとを含む、方法を提供する。一般には、トランスアミナーゼポリペプチドの回収または単離は、本明細書に記載のものを含めた当技術分野で周知のタンパク質回収技法を使用した、宿主細胞の培養培地から、宿主細胞から、またはその両方からのものである。一部の実施形態では、宿主細胞を、遠心分離によって収集し、物理的または化学的手段によって破壊し、得られた粗抽出物をさらなる精製のために保持する。タンパク質の発現に使用される微生物細胞は、これだけに限定されないが、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、および／または細胞溶解剤の使用、ならびに当業者に周知の多くの他の適切な方法を含めた任意の都合のよい方法によって破壊することができる。

【0223】

宿主細胞によって産生された操作されたトランスアミナーゼ酵素は、細胞および／または培養培地から、とりわけ、リゾチーム処理、超音波処理、濾過、塩析、超遠心分離、およびクロマトグラフィーを含めた、タンパク質精製のための当技術分野で公知の技法の任意の１つまたは複数を使用して回収することができる。Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌からのタンパク質の溶解および高効率での抽出に適した溶液は、商品名ＣｅｌＬｙｔｉｃ Ｂ（商標）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）の下で市販されている。したがって、一部の実施形態では、得られたポリペプチドを回収／単離し、必要に応じて、いくつかの当技術分野で公知の方法のうちのいずれかによって精製する。例えば、一部の実施形態では、ポリペプチドを栄養培地から、これだけに限定されないが、遠心分離、濾過、抽出、噴霧乾燥、蒸発、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、疎水性相互作用、クロマトフォーカシング、およびサイズ排除）、または沈殿を含めた従来の手順によって単離する。一部の実施形態では、所望の通り、成熟タンパク質の立体構造を完成させることにおいて、タンパク質リフォールディングステップを使用する。さらに、一部の実施形態では、最終的な精製ステップにおいて高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用する。例えば、一部の実施形態では、当技術分野で公知の方法が本開示において使用される（例えば、どちらも参照により本明細書に組み込まれるＰａｒｒｙ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．， ３５３： １１７ ［２００１］；およびＨｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ７３： １３３１ ［２００７］を参照されたい）。実際に、当技術分野で公知の任意の適切な精製方法が本開示において使用される。

【0224】

トランスアミナーゼポリペプチドを単離するためのクロマトグラフィー技法としては、これだけに限定されないが、逆相クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、およびアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。特定の酵素を精製するための条件は、正味の電荷、疎水性、親水性、分子量、分子形状などの因子に一部依存し、当業者には公知である。

【0225】

一部の実施形態では、改善されたトランスアミナーゼ酵素の単離に、親和性技法を使用する。アフィニティークロマトグラフィー精製に関しては、トランスアミナーゼポリペプチドに特異的に結合する任意の抗体を使用することができる。抗体を産生させるために、これだけに限定されないが、ウサギ、マウス、ラットなどを含めた種々の宿主動物を、トランスアミナーゼを用いた注射によって免疫化することができる。トランスアミナーゼポリペプチドをＢＳＡなどの適切な担体に側鎖官能基または側鎖官能基に付着させたリンカーによって付着させることができる。宿主種に応じて、これだけに限定されないが、フロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなどの無機ゲル、表面活性物質、例えば、リゾレシチン、プルロニック（登録商標）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ Ｇｕｅｒｉｎ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍなどの潜在的に有用なヒトアジュバントを含めた種々のアジュバントを使用して、免疫学的応答を増大させることができる。

【0226】

一部の実施形態では、トランスアミナーゼバリアントを、当該酵素を発現する細胞の形態で、粗抽出物として、または単離もしくは精製された調製物として調製し、使用する。一部の実施形態では、トランスアミナーゼバリアントを凍結乾燥物として、粉末形態（例えば、アセトン粉末）で調製する、または、酵素溶液として調製する。一部の実施形態では、トランスアミナーゼバリアントは、実質的に純粋な調製物の形態である。

【0227】

一部の実施形態では、トランスアミナーゼポリペプチドを任意の適切な固体基質に付着させる。固体基質としては、これだけに限定されないが、固相、表面、および／または膜が挙げられる。固体支持体としては、これだけに限定されないが、有機ポリマー、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシ、およびポリアクリルアミド、ならびにこれらの共重合体およびグラフトが挙げられる。固体支持体はまた、ガラス、シリカ、制御細孔ガラス（ＣＰＧ）、逆相シリカまたは金もしくは白金などの金属などの無機物であってもよい。基質の構成は、ビーズ、球体、粒子、顆粒、ゲル、膜または表面の形態であってよい。表面は、平面、実質的に平面、または非平面であってよい。固体支持体は、多孔質または非多孔質であってよく、また、膨潤または非膨潤特徴を有してよい。固体支持体は、ウェル、くぼみ、または他のコンテナ、容器、特徴、または場所の形態に構成されたものであってよい。複数の支持体を、アレイ上の、試薬のロボットによる送達のためにまたは検出方法および／もしくは機器によってアドレス可能な種々の場所に構成することができる。

【0228】

一部の実施形態では、免疫学的方法を使用してトランスアミナーゼバリアントを精製する。１つの手法では、従来の方法を使用して生じさせた、バリアントトランスアミナーゼポリペプチドに対する（例えば、これだけに限定されないが、配列番号２、４、８、３６６、および／もしくは６５０を含めた本明細書に提示される操作されたトランスアミナーゼバリアントを含むポリペプチド、ならびに／またはその免疫原性断片に対する）抗体を、ビーズ上に固定化し、細胞培養培地と、バリアントトランスアミナーゼが結合し、沈殿する条件下で混合する。関連する手法では、免疫クロマトグラフィーが使用される。

【0229】

一部の実施形態では、バリアントトランスアミナーゼを、非酵素部分を含む融合タンパク質として発現させる。一部の実施形態では、バリアントトランスアミナーゼ配列を、精製を容易にするドメインと融合する。本明細書で使用される場合、「精製を容易にするドメイン」という用語は、それが融合したポリペプチドの精製を媒介するドメインを指す。適切な精製ドメインとしては、これだけに限定されないが、金属キレート化ペプチド、固定化された金属での精製を可能にするヒスチジン－トリプトファンモジュール、グルタチオンに結合する配列（例えば、ＧＳＴ）、赤血球凝集素（ＨＡ）タグ（インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する；例えば、Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ３７： ７６７ ［１９８４］を参照されたい）、マルトース結合性タンパク質配列、ＦＬＡＧＳ伸長／アフィニティー精製系（例えば、Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐから入手可能な系）において使用されるＦＬＡＧエピトープなどが挙げられる。本明細書に記載の組成物および方法における使用が意図されている発現ベクターの１つは、本開示のポリペプチドとポリヒスチジン領域がエンテロキナーゼ切断部位によって隔てられて融合した融合タンパク質の発現をもたらすものである。ヒスチジン残基により、ＩＭＩＡＣ（固定化された金属イオンアフィニティークロマトグラフィー；例えば、Ｐｏｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔ． Ｅｘｐ． Ｐｕｒｉｆ．， ３： ２６３－２８１ ［１９９２］を参照されたい）での精製が容易になり、一方、エンテロキナーゼ切断部位により、バリアントトランスアミナーゼポリペプチドを融合タンパク質から分離するための手段がもたらされる。外来ポリペプチドをグルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現させるためにｐＧＥＸベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用することもできる。一般に、そのような融合タンパク質は、可溶性であり、溶解した細胞から、リガンド－アガロースビーズ（例えば、ＧＳＴ融合物の場合ではグルタチオン－アガロース）に吸着させ、その後、遊離のリガンドの存在下で溶出することによって容易に精製することができる。
操作されたトランスアミナーゼ酵素を使用する方法

【0230】

別の態様では、本明細書に開示される操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを、基質化合物（１）またはその構造類似体を化合物（２）である生成物または対応する構造類似体に変換するためのプロセスに使用することができる。

【0231】

本明細書に記載され、実施例に例示されている通り、本開示では、これだけに限定されないが、ｐＨ、温度、緩衝剤、溶媒系、基質負荷、基質化合物立体異性体の混合物、ポリペプチド負荷、補助因子負荷、圧力、および反応時間の範囲を含めた、本明細書のプロセスに使用することができる適切な反応条件の範囲が考慮される。本明細書に記載の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを使用して基質化合物の生成物である化合物への生体触媒変換のプロセスを実施するためのさらなる適切な反応条件は、これだけに限定されないが、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドと基質化合物を濃度、ｐＨ、温度、溶媒条件の実験反応条件下で接触させ、生成物である化合物を、例えば、本明細書に提示される実施例に記載の方法を使用して検出することを含む、常套的な実験によって容易に最適化することができる。

【0232】

上記の通り、本開示のプロセスに使用するための、トランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、一般に、配列番号６～９３６の偶数の配列のいずれか１つから選択される参照アミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも大きな同一性を有するアミノ酸配列を含み、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、参照配列（例えば、配列番号２、４、８、３６６、および／または６５０）と比較して（ａ）１つまたは複数のアミノ酸残基の差異を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドは、参照配列（例えば、配列番号２、４、８、３６６、および／または６５０）と比較して、上記の同一性パーセントおよび１つまたは複数の残基の差異を有するトランスアミナーゼポリペプチドをコードする。

【0233】

反応混合物中の基質化合物は、例えば、生成物である化合物の所望の量、酵素活性に対する基質濃度の影響、反応条件下での酵素の安定性、および基質の生成物への変換パーセントを考慮に入れて、変動させることができる。方法の一部の実施形態では、適切な反応条件は、少なくとも約０．５～約２００ｇ／Ｌ、１～約２００ｇ／Ｌ、５～約１５０ｇ／Ｌ、約１０～約１００ｇ／Ｌ、または約５０～約１００ｇ／Ｌの基質化合物負荷を含む。一部の実施形態では、適切な反応条件は、少なくとも約０．５ｇ／Ｌ、少なくとも約１ｇ／Ｌ、少なくとも約５ｇ／Ｌ、少なくとも約１０ｇ／Ｌ、少なくとも約１５ｇ／Ｌ、少なくとも約２０ｇ／Ｌ、少なくとも約３０ｇ／Ｌ、少なくとも約５０ｇ／Ｌ、少なくとも約７５ｇ／Ｌ、少なくとも約１００ｇ／Ｌ、少なくとも約１５０ｇ／Ｌまたは少なくとも約２００ｇ／Ｌ、またはさらにはそれよりも多くの基質化合物負荷を含む。本明細書に提示される基質負荷の値は、化合物（１）の分子量に基づくが、化合物（１）の種々の水和物および塩も等価のモル量でプロセスに使用できることも意図されている。

【0234】

本明細書に提示されるプロセスでは、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、アミノ供与体を使用して、生成物である化合物を形成する。一部の実施形態では、反応条件において、アミノ供与体は、イソプロピルアミン（本明細書では「ＩＰＭ」とも称される）から選択される化合物または目的の反応に適した任意の他のアミノ供与体を含む。一部の実施形態では、アミノ供与体はＩＰＭである。一部の実施形態では、適切な反応条件では、アミノ供与体、特にＩＰＭが少なくとも約０．１～約３．０Ｍ、０．２～約２．５Ｍ、約０．５～約２Ｍまたは約１～約２Ｍの濃度で存在する。一部の実施形態では、アミノ供与体は約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、１、１．５、２、２．５または３Ｍの濃度で存在する。

【0235】

プロセスに適した反応条件には、一般には、反応混合物中に補助因子が存在することも含まれる。操作されたトランスアミナーゼは、一般には、反応条件は、ビタミンＢ_６ファミリーのメンバーを使用するので、ピリドキサール－５’－リン酸（ピリドキサール－リン酸、ＰＬＰ、Ｐ５Ｐとしても公知）、ピリドキシン（ＰＮ）、ピリドキサール（ＰＬ）、ピリドキサミン（ＰＭ）、およびそれらのリン酸化された対応物；ピリドキシンリン酸（ＰＮＰ）、およびピリドキサミンリン酸（ＰＭＰ）から選択される補助因子を含み得る。一部の実施形態では、適切な反応条件は、ＰＬＰ、ＰＮ、ＰＬ、ＰＭ、ＰＮＰ、およびＰＭＰから選択される補助因子が、約０．１ｇ／Ｌ～約１０ｇ／Ｌ、約０．２ｇ／Ｌ～約５ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ～約２．５ｇ／Ｌの濃度で存在することを含み得る。一部の実施形態では、補助因子はＰＬＰである。したがって、一部の実施形態では、適切な反応条件は、補助因子のＰＬＰが、約０．１ｇ／Ｌ～約１０ｇ／Ｌ、約０．２ｇ／Ｌ～約５ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ～約２．５ｇ／Ｌの濃度で存在することを含み得る。一部の実施形態では、反応条件は、ＰＬＰ濃度が約１０ｇ／Ｌまたはそれ未満、約５ｇ／Ｌまたはそれ未満、約２．５ｇ／Ｌまたはそれ未満、約１．０ｇ／Ｌまたはそれ未満、約０．５ｇ／Ｌまたはそれ未満、または約０．２ｇ／Ｌまたはそれ未満であることを含む。

【0236】

プロセスの一部の実施形態（例えば、細胞全体または溶解物を使用する場合）では、補助因子は、細胞抽出物中に天然に存在し、補充する必要はない。プロセスの一部の実施形態（例えば、部分的に精製されたまたは精製されたトランスアミナーゼ酵素を使用する場合）では、プロセスは、補助因子を酵素反応混合物に添加するステップをさらに含み得る。一部の実施形態では、補助因子を反応の開始時に添加し、かつ／または追加的な補助因子を反応中に添加する。

【0237】

アミノ基転移反応の過程中、反応混合物のｐＨを変化させることができる。反応混合物のｐＨを、所望のｐＨに、または所望のｐＨ範囲内に維持することができる。これは、反応の前および／またはその過程中に酸または塩基を添加することによって行うことができる。あるいは、緩衝剤を使用することによってｐＨを制御することができる。したがって、一部の実施形態では、反応条件には緩衝剤が含まれる。所望のｐＨ範囲を維持するための適切な緩衝剤は当技術分野で公知であり、それらの例として、限定するものではなく、ホウ酸、炭酸、リン酸、トリエタノールアミン（ＴＥＡ）緩衝剤などが挙げられる。一部の実施形態では、緩衝剤はＴＥＡである。プロセスの一部の実施形態では、適切な反応条件はＴＥＡの緩衝液を含み、ここで、ＴＥＡ濃度は、約０．０１～約０．４Ｍ、０．０５～約０．４Ｍ、０．１～約０．３Ｍ、または約０．１～約０．２Ｍである。一部の実施形態では、反応条件は、約０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０７、０．１、０．１２、０．１４、０．１６、０．１８、０．２、０．３、または０．４ＭのＴＥＡ濃度を含む。一部の実施形態では、反応条件は、適切な溶媒として水を含み、緩衝剤は存在しない。

【0238】

プロセスの一部の実施形態では、反応条件は、適切なｐＨを含み得る。上記の通り、酸もしくは塩基、適当な緩衝剤、または緩衝と酸もしくは塩基の添加の組合せを使用して所望のｐＨまたは所望のｐＨ範囲を維持することができる。反応混合物のｐＨを反応の前および／またはその過程中に制御することができる。一部の実施形態では、適切な反応条件は、溶液のｐＨが約８～約１２．５であること、ｐＨ約８～約１２、ｐＨ約９．０～約１１．５、またはｐＨ約９．５～約１１．０であることを含む。一部の実施形態では、反応条件は、溶液のｐＨが約８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２または１２．５であることを含む。

【0239】

本明細書のプロセスの一部の実施形態では、例えば、より高い温度での反応速度の増大、反応の十分な持続時間にわたる酵素の活性を考慮して、および下にさらに記載されている通り、適切な温度を反応条件として使用することができる。例えば、本開示の操作されたポリペプチドは、天然に存在するトランスアミナーゼポリペプチドと比べて安定性が増大しており、それにより、本開示の操作されたポリペプチドを、反応について変換速度を増大させ、基質溶解性特徴を改善するために、より高い温度で使用することが可能になる。したがって、一部の実施形態では、適切な反応条件は、温度が約１０℃～約７０℃、約１０℃～約６５℃、約１５℃～約６０℃、約２０℃～約６０℃、約２０℃～約５５℃、約３０℃～約５５℃、または約４０℃～約５０℃であることを含む。一部の実施形態では、適切な反応条件は、温度が約１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、または７０℃であることを含む。一部の実施形態では、酵素反応中の温度を、反応の過程全体を通してある温度に維持することができる。一部の実施形態では、酵素反応中の温度を、反応の過程中、温度プロファイルに対して調整することができる。

【0240】

プロセスの一部の実施形態では、適切な反応条件は、トランスアミナーゼ酵素の不活化が限定されるように作用し得る、還元型補助因子であるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）が存在することをさらに含み得る（例えば、ｖａｎ Ｏｐｈｅｍ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ３７ （９）： ２８７９－８８ ［１９９８］を参照されたい）。そのような実施形態では、ＮＡＤＨが存在する場合、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）およびグルコースまたはギ酸デヒドロゲナーゼおよびギ酸などの補助因子再生系を使用して反応培地中でＮＡＤＨを再生することができる。

【0241】

操作されたトランスアミナーゼを使用するプロセスは、一般に、溶媒中で行われる。適切な溶媒としては、水、緩衝水溶液、有機溶媒、および／または、一般に水性溶媒と有機溶媒とを含む共溶媒系が挙げられる。水性溶媒（水または水性共溶媒系）は、ｐＨ緩衝されていてもよく、緩衝されていなくてもよい。一部の実施形態では、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを使用するプロセスは、一般に、有機溶媒（例えば、エタノール、イソプロパノール（ＩＰＡ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、酢酸エチル、酢酸ブチル、１－オクタノール、ヘプタン、オクタン、メチルｔ－ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）、トルエンなど）、イオン性液体（例えば、１－エチル４－メチルイミダゾリウムテトラフルオロボレート、１－ブチル－３－メチルイミダゾリウムテトラフルオロボレート、１－ブチル－３－メチルイミダゾリウムヘキサフルオロリン酸など）を含む水性共溶媒系において行われる。水性共溶媒系の有機溶媒成分は、水性成分と混和性であり、それにより単一の液相をもたらすものであってもよく、水性成分と部分的に混和性であるまたは不混和性であり、それにより、２つの液相をもたらすものであってもよい。例示的な水性共溶媒系は、水と１つまたは複数の有機溶媒とを含む。一般に、水性共溶媒系の有機溶媒成分は、それによってトランスアミナーゼ酵素が完全に不活化されることがないように選択される。適当な共溶媒系は、指定操作されたトランスアミナーゼ酵素の酵素活性を、候補溶媒系において、規定の目的の基質を用いて、本明細書に記載のものなどの酵素活性アッセイを使用して測定することにより、容易に同定することができる。プロセスの一部の実施形態では、適切な反応条件は、ＤＭＳＯを約１％～約８０％（ｖ／ｖ）、約１～約７０％（ｖ／ｖ）、約２％～約６０％（ｖ／ｖ）、約５％～約４０％（ｖ／ｖ）、１０％～約４０％（ｖ／ｖ）、１０％～約３０％（ｖ／ｖ）、または約１０％～約２０％（ｖ／ｖ）の濃度で含む水性共溶媒を含む。プロセスの一部の実施形態では、適切な反応条件は、ＤＭＳＯを少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または８０％（ｖ／ｖ）の濃度で含む水性共溶媒を含む。

【0242】

適切な反応条件は、基質化合物のその対応する生成物である化合物への生体触媒変換をもたらす反応パラメータの組合せを含み得る。例えば、一部の実施形態では、化合物（２）の調製を実施することができ、ここで、適切な反応条件は、（ａ）約１０～３００ｇ／Ｌの基質化合物（例えば、５０ｇ／Ｌまたは２００ｇ／Ｌの化合物（１））という基質負荷；（ｂ）約０．５ｇ／Ｌ～６０ｇ／Ｌの操作されたポリペプチド；（ｃ）約０．５～２ＭのＩＰＭ濃度；（ｄ）約０．１～１ｇ／ＬのＰＬＰ補助因子濃度；（ｅ）約０％（ｖ／ｖ）～約２０％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯ濃度；（ｆ）ｐＨ約８．５～１１．５；および（ｇ）約４５℃～６５℃の温度を含む。

【0243】

一部の実施形態では、適切な反応条件は、（ａ）約１００ｇ／Ｌの基質化合物（例えば、化合物（１））；（ｂ）約１ｇ／Ｌの操作されたポリペプチド；（ｃ）約１Ｍのイソプロピルアミン（ＩＰＭ）；（ｄ）約０．５ｇ／Ｌのピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）；（ｅ）約ｐＨ９；および（ｇ）約５０℃を含む。

【0244】

さらなる例示的な反応条件は、実施例に提示されるアッセイ条件を含む。本明細書に記載のアミノ基転移反応の実施において、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを、部分的に精製されたもしくは精製された酵素として、酵素をコードする遺伝子を有する形質転換された細胞全体として、ならびに／またはそのような細胞の細胞抽出物および／もしくは溶解物として、反応混合物に添加することができる。操作されたトランスアミナーゼ酵素をコードする遺伝子を有する形質転換された細胞全体またはその細胞抽出物、溶解物、および単離された酵素を、固体（例えば、凍結乾燥されたもの、噴霧乾燥されたものなど）または半固体（例えば、粗製ペースト）を含めた種々の異なる形態で使用することができる。細胞抽出物または細胞溶解物を、凍結乾燥前に、沈殿（例えば、硫酸アンモニウム、ポリエチレンイミン、加熱処理など）、その後、脱塩手順（例えば、限外濾過、透析など）によって部分的に精製することができる。酵素調製物はいずれも、例えば、グルタルアルデヒドなどの公知の架橋剤、または固定化された固相材料（例えば、樹脂、ビーズ、例えば、キトサン、Ｅｕｐｅｒｇｉｔ Ｃ、ＳＥＰＡＢＥＡＤなど）を使用した架橋結合によって安定化することができる。

【0245】

本明細書に記載のアミノ基転移反応の一部の実施形態では、反応を本明細書に記載の適切な反応条件下で実施し、ここで、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは固体支持体に固定化される。アミノ基転移反応を実施するための、操作されたトランスアミナーゼの固定化に有用な固体支持体としては、これだけに限定されないが、エポキシド官能基を有するポリメタクリレート、アミノエポキシド官能基を有するポリメタクリレート、スチレン／ＤＶＢ共重合体またはオクタデシル官能基を有するポリメタクリレートを含むビーズまたは樹脂が挙げられる。例示的な固体支持体としては、これだけに限定されないが、キトサンビーズ、Ｅｕｐｅｒｇｉｔ Ｃ、ならびに以下の異なる型のＳＥＰＡＢＥＡＤ：ＥＣ－ＥＰ、ＥＣ－ＨＦＡ／Ｓ、ＥＸＡ２５２、ＥＸＥ１１９およびＥＸＥ１２０を含めたＳＥＰＡＢＥＡＤ（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ）が挙げられる。

【0246】

操作されたポリペプチドが分泌型ポリペプチドの形態で発現され得る一部の実施形態では、分泌型ポリペプチドを含有する培養培地を本明細書のプロセスに使用することができる。

【0247】

一部の実施形態では、固体反応物（例えば、酵素、塩など）を、粉末（例えば、凍結乾燥されたもの、噴霧乾燥されたものなど）、溶液、エマルション、懸濁液などを含めた種々の異なる形態で反応に供給することができる。反応物を、当業者に公知の方法および設備を使用して容易に凍結乾燥または噴霧乾燥することができる。例えば、タンパク質溶液を小さな一定分量として－８０℃で凍結させ、次いで、予め冷却した凍結乾燥チャンバーに添加し、その後、真空を適用することができる。

【0248】

一部の実施形態では、反応物の添加順序は重要ではない。反応物を一緒に同時点で溶媒（例えば、単相溶媒、二相水性共溶媒系など）に添加することもでき、あるいは、反応物の一部を別々に添加することができ、一部を異なる時点において一緒に添加することができる。例えば、補助因子、トランスアミナーゼ、およびトランスアミナーゼ基質を最初に溶媒に添加することができる。水性共溶媒系を使用した際の混合効率を改善するために、トランスアミナーゼ、および補助因子を最初に水相に添加し、混合することができる。次いで、有機相を添加し、混合し、その後、トランスアミナーゼ基質を添加することができる。あるいは、トランスアミナーゼ基質を有機相に予備混合した後、水相に添加することができる。

【0249】

アミノ供与体の選択により、蒸気圧が水よりも高いカルボニル副生成物（例えば、揮発性有機カルボニル化合物などの、沸点が低い副生成物）がもたらされる一部の実施形態では、非反応性ガスを用いて反応溶液をスパージングすることによって、または、真空を適用して反応圧を低下させ、気相中に存在するカルボニル副生成物を除去することによって、カルボニル副生成物を除去することができる。非反応性ガスは、反応の成分と反応しない任意の気体である。種々の非反応性ガスとしては、窒素および希ガス（例えば、不活性ガス）が挙げられる。一部の実施形態では、非反応性ガスは窒素ガスである。一部の実施形態では、プロセスに使用されるアミノ供与体は、イソプロピルアミン（ＩＰＭ）であり、これは、アミノ基がアミノ基受容体に転移するとカルボニル副生成物であるアセトンを形成する。アセトンは、窒素ガスを用いてスパージングすること、または反応溶液に真空を適用し、凝縮器または他の低温トラップなどのアセトントラップによってアセトンを気相から除去することによって、除去することができる。あるいは、アセトンを、ケトレダクターゼを使用してイソプロパノールに還元することによって除去することができる。

【0250】

カルボニル副生成物が除去されるプロセスの一部の実施形態では、アミノ基転移反応中に、アミノ基供与体を補給し、かつ／または反応のｐＨを維持するために対応するアミノ基供与体を添加することができる。また、アミノ基供与体を補給することにより、平衡が生成物の形成に向かってシフトし、それにより、基質の生成物への変換が増加する。したがって、アミノ基供与体がＩＰＭであり、ｉｎ ｓｉｔｕでアセトン生成物を除去する一部の実施形態では、プロセスは、アセトン除去の間に失われたアミノ基供与体を補給するため、および反応のｐＨを（例えば、約８．５～約ｐＨ１１．５）に維持するためにＩＰＭを反応溶液に添加するステップをさらに含み得る。

【0251】

一部の実施形態では、本開示のトランスアミナーゼポリペプチドを使用したアミン受容体基質化合物のキラルアミン生成物である化合物への生体触媒変換のプロセスが、それぞれ様々な条件下で実施することができる、薬学的に許容される塩もしくは酸、薬学的に許容される製剤の形成、生成物のワークアップ、抽出、単離、精製、および／または結晶化ステップをさらに含み得ることも意図されている。

【0252】

一部の実施形態では、本明細書に開示される操作されたポリペプチドを使用するプロセスを実施することができ、ここで、アミノ基供与体は、イソプロピルアミン、アラニン、３－アミノ酪酸、またはメチルベンジルアミンから選択される。一部の実施形態では、アミノ基供与体は、イソプロピルアミンである。

【0253】

上記の開示されるプロセスによって生成されたアミノ化生成物である化合物または環化化合物を生体触媒反応混合物から抽出する、単離する、その塩を形成する、精製する、および／または結晶化するための方法、技法、およびプロトコールは、当業者には公知であり、かつ／または常套的な実験によって入手することができる。さらに、例示的な方法を下記の実施例に提示する。

【0254】

本発明の種々の特色および実施形態を以下の代表的な実施例に例示し、それらは、例示的なものであり、限定するものではない。

【実施例】

【0255】

実験
本発明の種々の特色および実施形態を以下の代表的な実施例に例示し、それらは、例示的なものであり、限定するものではない。

【0256】

以下の実験に関する開示では、以下の略語が適用される：ｐｐｍ（百万分率）；Ｍ（モル濃度）；ｍＭ（ミリモル）、ｕＭおよびμＭ（マイクロモル）；ｎＭ（ナノモル）；ｍｏｌ（モル）；ｇｍおよびｇ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；ｕｇおよびμｇ（マイクログラム）；Ｌおよびｌ（リットル）；ｍｌおよびｍＬ（ミリリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；ｕｍおよびμｍ（マイクロメーター）；ｓｅｃ．（秒）；ｍｉｎ（ｓ）（分）；ｈ（ｓ）およびｈｒ（ｓ）（時間）；Ｕ（単位）；ＭＷ（分子量）；ｒｐｍ（毎分回転数）；℃（摂氏度）；ＲＴ（室温）；ＣＤＳ（コード配列）；ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）；ＲＮＡ（リボ核酸）；ａａ（アミノ酸）；ＴＢ（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ；１２ｇ／Ｌ バクト－トリプトン、２４ｇ／Ｌの酵母抽出物、４ｍＬ／Ｌのグリセロール、６５ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７．０、１ｍＭのＭｇＳＯ_４）；ＬＢ（ルリア培地（Ｌｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ））；ＣＡＭ（クロラムフェニコール）；ＰＭＢＳ（硫酸ポリミキシンＢ）；ＩＰＴＧ（イソプロピル チオガラクトシド）；ＡＴＡ（オメガ－トランスアミナーゼ）；ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）；ＴＥｏＡ（トリエタノールアミン）；ホウ酸塩（四ホウ酸ナトリウム十水和物）；アセトニトリル（ＭｅＣＮ）；ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）；ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）；ＦＩＯＰ（陽性対照に対する改善倍率）；ＨＴＰ（ハイスループット）；ＭＷＤ（多波長検出器）；ＵＶ（紫外線）；Ｃｏｄｅｘｉｓ（Ｃｏｄｅｘｉｓ，Ｉｎｃ．、Ｒｅｄｗｏｏｄ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｃｏｒｐ．、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ ＭＡ）；Ｄｉｆｃｏ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＢＤ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）；Ｄａｉｃｅｌ（Ｄａｉｃｅｌ、Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ、ＰＡ）；Ｇｅｎｅｔｉｘ（Ｇｅｎｅｔｉｘ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．、Ｂｅａｖｅｒｔｏｎ、ＯＲ）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの部門、Ｃｏｒｐ．、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）、Ａｇｉｌｅｎｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）；Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの部門、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）；（Ｉｎｆｏｒｓ；Ｉｎｆｏｒｓ－ＨＴ、Ｂｏｔｔｍｉｎｇｅｎ／Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）；Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｉｎｃ．、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）；およびＢｉｏ－Ｒａｄ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）；Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｃｏｒｐ．、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）；Ｗａｔｅｒｓ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）。
（実施例１）
ｐＣＫ１１０９００における操作されたポリペプチドの作製

【0257】

トランスアミナーゼ活性を有するＶｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ由来のポリペプチド（配列番号２）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１）をｐＣＫ１１０９００ベクター系（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，７１４，４３７号を参照されたい）にクローニングし、続いて、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ｆｈｕＡにおいてｌａｃプロモーターの制御下で発現させた。

【0258】

９６ウェルフォーマットで、単一コロニーを選び取り、１％グルコースおよび３０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール（ＣＡＭ）を含有するＬＢ培地１９０μＬ中、３０℃、２００ｒｐｍ、および８５％の湿度で成長させた。一晩成長させた後、成長させた培養物２０μＬを、３０μｇ／ｍＬのＣＡＭを伴うＴＢ３８０μＬを含有するディープウェルプレートに移した。培養物を３０℃、２５０ｒｐｍ、８５％の湿度でおよそ２．５時間成長させた。培養物の光学濃度（ＯＤ_６００）が０．４～０．６に達したら、ＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭまで添加することによってトランスアミナーゼ遺伝子の発現を誘導した。誘導後、成長を３０℃、２５０ｒｐｍ、８５％の湿度で１８～２０時間継続した。４℃、４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することによって細胞を収集し、培地を廃棄した。細胞ペレットを、使用準備ができるまで－８０℃で保管した。アッセイを実施する前に、細胞ペレットを、５０ｍＭのトリエタノールアミン－ＨＣｌ、ｐＨ７．５を１ｇ／ＬのＰＬＰ、１ｇ／Ｌのリゾチーム、および０．５ｇ／ＬのＰＭＢＳと共に含有する溶解緩衝剤４００μＬ中に再懸濁させた。プレートを室温においてマイクロタイタープレート振とう機で中速の振とうで２時間撹拌した。次いで、プレートを４℃、４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、清澄化された上清を下記のＨＴＰアッセイ反応に使用した。

【0259】

振とうフラスコ手順を使用して、二次スクリーニングアッセイに有用であり、かつ／または本明細書に記載の生体触媒プロセスに使用される、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドの振とうフラスコ粉末（ＳＦＰ）が作出され得る。酵素の振とうフラスコ粉末調製により、ＨＴＰアッセイに使用した細胞溶解物と比較してより精製された操作された酵素の調製物がもたらされ（例えば、総タンパク質の３０％に至るまで）、また、より濃縮された酵素溶液の使用も可能になる。培養を開始するために、目的の操作されたポリペプチドをコードするプラスミドを含有するＥ．ｃｏｌｉの単一コロニーを、３０μｇ／ｍＬのＣＡＭおよび１％グルコースを伴うＬＢ５ｍＬに接種した。培養物を、インキュベーター中、３７℃、２５０ｒｐｍで振とうしながら一晩（少なくとも１６時間）成長させた。次いで、成長させた培養物を、１Ｌの振とうフラスコ中、３０μｇ／ｍＬのＣＡＭを伴うＴＢ２５０ｍＬに添加した。培養物２５０ｍＬを３０℃、２５０ｒｐｍで３．５時間、ＯＤ_６００が０．６～０．８に達するまで成長させた。ＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭまで添加することによってトランスアミナーゼ遺伝子の発現を誘導し、成長をさらに１８～２０時間継続した。培養物を予め秤量した遠心分離ビンに移し、次いで、４℃、４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離することによって細胞を収集した。上清を廃棄し、残りの細胞ペレットを秤量した。一部の実施形態では、細胞を使用する準備ができるまで－８０℃で保管した。溶解のために、細胞ペレットを、細胞湿重量１ｇ当たり６ｍＬの２５ｍＭのトリエタノールアミン－ＨＣｌ緩衝剤、ｐＨ７．５に再懸濁させ、ＭＩＣＲＯＦＬＵＩＤＩＺＥＲ（登録商標）ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）１１０Ｌを使用して溶解させた。４℃、１０，０００ｒｐｍで６０分間遠心分離することによって細胞片を除去した。清澄化された溶解物を採取し、－８０℃で凍結させ、次いで、当技術分野で公知の標準の方法を使用して凍結乾燥させた。凍結した清澄化溶解物の凍結乾燥により、粗製の操作されたポリペプチドを含む乾燥した振とうフラスコ粉末がもたらされる。
（実施例２）
化合物（２）の生成を改善するための配列番号４に由来する操作されたポリペプチドの進化およびスクリーニング

【0260】

配列番号４のトランスアミナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド（配列番号３）を使用して、表２－１の操作されたポリペプチドを作出した。これらのポリペプチドは、所望の条件下で、出発ポリペプチドと比較して、トランスアミナーゼ活性の改善、例えば、ケトン基質である化合物（１）からのアミン生成物である化合物（２）の形成の改善を示した。偶数の配列識別子のアミノ酸配列を有する操作されたポリペプチドの、配列番号４の「骨格」アミノ酸配列からの作出を、下記の通り、表６－１および６－２に記載のＨＴＰアッセイおよび分析方法と共に行った。

【0261】

定向進化を配列番号３に記載のポリヌクレオチドから開始した。操作されたポリペプチドのライブラリーを、種々の周知の技法（例えば、飽和突然変異誘発、事前に同定された有益なアミノ酸の差異の組換え）を使用して作出し、ポリペプチドの化合物（２）を生成させる能力を測定するＨＴＰアッセイおよび分析方法を使用してスクリーニングした。

【0262】

９６ウェル浅型ウェル（３００μＬ容積／ウェル）プレート中、総反応体積１００μＬ／ウェルで酵素アッセイを実施した。反応物は、６４倍希釈したＡＴＡ溶解物（５０ｍＭのトリエタノールアミン＋１ｇ／ＬのＰＬＰ、ｐＨ７．５中に希釈したもの）５５μＬ、４Ｍのイソプロピルアミン－ＨＣｌ、ｐＨ９、２５μＬ、およびＤＭＳＯに溶解させた１００ｇ／Ｌのケトン（１）２０μＬを含有した。反応プレートをヒートシールし、５０℃、６００ｒｐｍで２２時間振とうした。

【0263】

一晩（約２２時間）インキュベートした後、アセトニトリル中５０％ギ酸を反応プレートに１００μＬ／ウェルで添加し、十分に混合した。プレートを密封し、４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。クエンチしたプレートから２０μＬ／ウェルの一定分量を取り出し、１：１のアセトニトリル：水１８０μＬ中に希釈し、それぞれ表６－１および６－２に記載されている通り、活性および選択性を決定するためにＨＰＬＣによって分析した。

【0264】

ヒットバリアントを実施例１に記載の通り２５０ｍＬの振とうフラスコ中で増殖させて、凍結乾燥した酵素粉末を作出した。酵素粉末の活性を、上記と同様のアッセイを使用し、０～１０ｇ／ＬのＡＴＡ振とうフラスコ粉末、２０～１００ｇ／Ｌのケトン、１ＭのＩＰＭ（４Ｍ、ｐＨ９ストック）、０～４０％共溶媒（ＤＭＳＯまたはメタノール）、ｐＨ約９、５０℃で２０～２４時間にわたって評価した。ヒットバリアントを表２－２に列挙する。

【表2-1-1】

【表2-1-2】

【表2-1-3】

【表2-1-4】

【表2-1-5】

【表2-2-1】

【表2-2-2】

（実施例３）
化合物（２）の生成を改善するための配列番号８に由来する操作されたポリペプチドの進化およびスクリーニング

【0265】

配列番号８のトランスアミナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド（配列番号７）を使用して、表３－１の操作されたポリペプチドを作出した。これらのポリペプチドは、所望の条件下で、出発ポリペプチドと比較して、トランスアミナーゼ活性の改善、例えば、ケトン基質である化合物（１）からのアミン生成物である化合物（２）の形成の改善を示した。偶数の配列識別子のアミノ酸配列を有する操作されたポリペプチドの、配列番号８の「骨格」アミノ酸配列からの作出を、下記の通り行った。

【0266】

定向進化を配列番号７に記載のポリヌクレオチドから開始した。操作されたポリペプチドのライブラリーを、種々の周知の技法（例えば、飽和突然変異誘発、事前に同定された有益なアミノ酸の差異の組換え）を使用して作出し、ポリペプチドの化合物（２）を生成させる能力を測定するＨＴＰアッセイおよび分析方法を使用してスクリーニングした。

【0267】

酵素アッセイおよび分析を、溶解物を反応混合物に添加する前に５１２倍希釈したこと以外は実施例２に記載の通り実施した。

【0268】

ヒットバリアントを、２５０ｍＬの振とうフラスコ中で増殖させ、実施例１に記載の通り酵素粉末を作出した。酵素粉末の活性を、上記と同様のアッセイを使用し、０～３２ｇ／ＬのＡＴＡ振とうフラスコ粉末、２０～２００ｇ／Ｌのケトン、１～２．５ＭのＩＰＭ（４Ｍ、ｐＨ９ストック）、０．５ｇ／ＬのＰＬＰ、０～２０％ＤＭＳＯ、ｐＨ約９、４０～６０℃で２０～２４時間にわたって評価した。ヒットバリアントを表３－２に列挙する。

【表3-1-1】

【表3-1-2】

【表3-1-3】

【表3-1-4】

【表3-2】

（実施例４）
化合物（２）の生成を改善するための配列番号３６６に由来する操作されたポリペプチドの進化およびスクリーニング

【0269】

配列番号３６６のトランスアミナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド（配列番号３６５）を使用して、表４－１の操作されたポリペプチドを作出した。これらのポリペプチドは、所望の条件下で、出発ポリペプチドと比較して、トランスアミナーゼ活性の改善、例えば、ケトン基質（化合物（１））からの化合物（２）（アミン生成物）の形成の改善を示した。偶数の配列識別子のアミノ酸配列を有する操作されたポリペプチドの、配列番号３６６の「骨格」アミノ酸配列からの作出を、下記の通り、表６－１および６－２に記載のＨＴＰアッセイおよび分析方法と共に行った。

【0270】

酵素アッセイおよび分析を、溶解物を反応混合物に添加する前に１７００倍希釈したこと以外は実施例２に記載の通り実施した。

【0271】

ヒットバリアントを、２５０ｍＬの振とうフラスコ中で増殖させ、実施例１に記載の通り酵素粉末を作出した。酵素粉末の活性を、上記と同様のアッセイを使用し、０～６０ｇ／ＬのＡＴＡ振とうフラスコ粉末、２０～３００ｇ／Ｌのケトン、１ＭのＩＰＭ（４Ｍ、ｐＨ９ストック）、０．５ｇ／ＬのＰＬＰ、０～２０％ＤＭＳＯ、ｐＨ約９、４０～６０℃で２０～２４時間にわたって評価した。ヒットバリアントを表４－２に列挙する。

【表4-1-1】

【表4-1-2】

【表4-1-3】

【表4-2】

（実施例５）
化合物（２）の生成を改善するための配列番号６５０に由来する操作されたポリペプチドの進化およびスクリーニング

【0272】

配列番号６５０のトランスアミナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド（配列番号６４９）を使用して、表５－１の操作されたポリペプチドを作出した。これらのポリペプチドは、所望の条件下で、出発ポリペプチドと比較して、トランスアミナーゼ活性の改善、例えば、ケトン基質（化合物Ｖ）からの化合物（２）（アミン生成物）の形成の改善を示した。偶数の配列識別子のアミノ酸配列を有する操作されたポリペプチドの、配列番号６５０の「骨格」アミノ酸配列からの作出を、下記の通り、表６－１および６－２に記載のＨＴＰアッセイおよび分析方法と共に行った。

【0273】

定向進化を配列番号６４９に記載のポリヌクレオチドから開始した。操作されたポリペプチドのライブラリーを、種々の周知の技法（例えば、飽和突然変異誘発、事前に同定された有益なアミノ酸の差異の組換え）を使用して作出し、ポリペプチドの化合物（２）を生成させる能力を測定するＨＴＰアッセイおよび分析方法を使用してスクリーニングした。

【0274】

酵素アッセイおよび分析を、溶解物を反応混合物に添加する前に４０００倍希釈したこと以外は実施例２に記載の通り実施した。

【0275】

ヒットバリアントを、２５０ｍＬの振とうフラスコ中で増殖させ、酵素粉末を作出した。酵素粉末の活性を、上記と同様のアッセイを使用し、０～３ｇ／ＬのＡＴＡ振とうフラスコ粉末、２０～１００ｇ／Ｌのケトン、１ＭのＩＰＭ（４Ｍ、ｐＨ９ストック）、０．５ｇ／ＬのＰＬＰ、０～１８％ＤＭＳＯ共溶媒、ｐＨ約９、５０℃で２４時間にわたって評価した。ヒットバリアントを表５－２に列挙する。

【表5-1-1】

【表5-1-2】

【表5-2】

（実施例６）
化合物（１）の化合物（２）への変換の分析的検出

【0276】

表６－１および６－２に提示されている分析方法を使用して実施例２～５に記載されているデータを収集した。本明細書に提示される方法が、本発明を使用して生成されたバリアントを分析するために使用される。しかし、本明細書に提示されるおよび／または本明細書に提示される方法を使用して生成されたバリアントを分析するために適用可能な他の適切な方法が当技術分野で公知であるので、本発明は本明細書に記載の方法に限定されるものではない。

【表6-1】

【表6-2】

【0277】

本出願において引用されている刊行物、特許、特許出願および他の文書は全て、これにより、個々の刊行物、特許、特許出願または他の文書がそれぞれ個別に全ての目的に関して参照により組み込まれることが示されたものと同じ程度に、あらゆる目的に関してそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0278】

種々の特定の実施形態を例示し、記載したが、本発明の主旨および範囲から逸脱することなく種々の変化をなすことができることが理解されよう。

【配列表】

2023521772000001.app

【国際調査報告】