2023-521785 肺線維症の治療のためのマクロファージへのｍｉＲ－２１阻害剤の標的送達

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-05-25

(54)【発明の名称】肺線維症の治療のためのマクロファージへのｍｉＲ－２１阻害剤の標的送達

(51)【国際特許分類】

   A61K 45/08 20060101AFI20230518BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20230518BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20230518BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20230518BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20230518BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20230518BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230518BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20230518BHJP

   A61K 47/66 20170101ALI20230518BHJP

   A61K 9/127 20060101ALI20230518BHJP

   A61K 9/14 20060101ALI20230518BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20230518BHJP

   A61K 31/712 20060101ALI20230518BHJP

   A61K 31/7125 20060101ALI20230518BHJP

   A61K 47/54 20170101ALI20230518BHJP

   C12N 15/113 20100101ALN20230518BHJP

【ＦＩ】

A61K45/08

A61P11/00

A61P31/14

A61P9/00

A61P9/10

A61P29/00

A61P43/00 105

A61K47/68

A61K47/66

A61K9/127

A61K9/14

A61K31/7105

A61K31/712

A61K31/7125

A61K47/54

C12N15/113 Z ZNA

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022561618

(86)(22)【出願日】2021-04-09

(85)【翻訳文提出日】2022-10-07

(86)【国際出願番号】 EP2021059360

(87)【国際公開番号】W WO2021205032

(87)【国際公開日】2021-10-14

(31)【優先権主張番号】20169160.7

(32)【優先日】2020-04-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】517068553

【氏名又は名称】テクニッシェ ウニベルシタット ミュンヘン

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(74)【代理人】

【識別番号】100166165

【弁理士】

【氏名又は名称】津田 英直

(72)【発明者】

【氏名】シュテファン エンゲルハルト

(72)【発明者】

【氏名】ディーパク プラブー ラマヌジャン

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C076AA19

4C076AA31

4C076AA95

4C076CC41

4C076EE59

4C084AA17

4C084AA27

4C084MA13

4C084MA22

4C084MA24

4C084MA41

4C084MA57

4C084NA13

4C084ZA361

4C084ZA362

4C084ZA591

4C084ZA592

4C084ZB111

4C084ZB112

4C084ZB211

4C084ZB212

4C084ZB331

4C084ZB332

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA13

4C086MA24

4C086MA41

4C086MA57

4C086NA13

4C086ZA36

4C086ZA59

4C086ZB11

4C086ZB21

4C086ZB33

(57)【要約】

本発明は、ｍｉＲ－２１阻害剤と、前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する部分とを含む、対象の肺線維症の治療に使用するための組成物に関する。さらに、前記組成物は、肺投与によって投与されてもよい。特定の態様では、前記治療対象は肺線維症に罹患しており、さらに肺疾患又は肺障害を有し、肺疾患又は肺障害はコロナウイルス疾患であってもよい。さらに、本発明は、ｍｉＲ－２１阻害剤と、前記ｍｉＲ－２１阻害剤を肺マクロファージに送達する部分とを含む、組成物に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

肺線維症の治療に使用するための組成物であって、ｍｉＲ－２１阻害剤と、前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する部分とを含む、組成物。

【請求項2】

前記部分が前記ｍｉＲ－２１阻害剤を線維芽細胞にさらに送達する、請求項１に記載の使用のための組成物。

【請求項3】

前記部分が前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに選択的に送達する、又は前記部分が前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージ及び線維芽細胞に選択的に送達する、請求項１又は２に記載の使用のための組成物。

【請求項4】

前記ｍｉＲ－２１阻害剤が、肺マクロファージに、又は肺マクロファージ及び肺線維芽細胞に送達される、請求項１～４のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項5】

前記組成物が、肺投与によって投与される、特に、前記組成物が、エアロゾル化された組成物によって、吸入によって対象の肺に投与されるか又は肺、気管支、及び／若しくは気道への局所投与の他の手段によって前記肺に投与される。請求項１～４のいずれか１項に記載の使用のための組成物。

【請求項6】

肺線維症に罹患している前記対象が、肺疾患又は肺障害をさらに有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項7】

前記肺疾患又は肺障害が、線維症を引き起こすか又は線維症に関連しており、好ましくは、前記肺疾患又は肺障害が、ウイルス及び／若しくは細菌によって引き起こされるか、慢性閉塞性肺疾患であるか、又は特発性肺線維症であり、より好ましくは、前記肺疾患又は肺障害が、コロナウイルス疾患であり、さらにより好ましくは、前記肺疾患又は肺障害が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１によって引き起こされる、請求項６に記載の使用のための組成物。

【請求項8】

前記肺線維症が、特に成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）に続いて、肺補助法又は人工呼吸によって引き起こされるか又は関連する、請求項１～７のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項9】

前記対象がさらに心疾患又は心障害に罹患しており、特に、前記心疾患又は心障害が、線維症を引き起こすか又は線維症に関連しており、特に、前記心疾患又は心障害が、心不全、虚血、虚血後心不全、心肥大、高血圧性心不全、拡張期心不全、収縮期心不全、心臓関連蓄積症、心筋症、収縮性心膜炎、冠動脈疾患、急性心筋梗塞、慢性心筋梗塞、右心不全、心不整脈、心筋炎関連線維症、及び心臓弁膜症からなる群から選択される、請求項６に記載の使用のための組成物。

【請求項10】

前記組成物が、マクロファージの炎症誘発性極性化を防止し、炎症、筋線維芽細胞の形質転換、及び／又は線維症を防止する、請求項１～９のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項11】

前記組成物が、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）の少なくとも約５日後に前記対象に投与され、及び特に、前記組成物はさらに、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）の少なくとも約１９日後に対象に投与される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項12】

前記組成物が、動脈内投与、好ましくは心臓内投与、好ましくは肺への投与、より好ましくは冠動脈内投与及び／又は吸入による投与によって投与される、請求項１又は１１のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項13】

前記組成物が、約１０ｍｇの前記ｍｉＲ－２１阻害剤を含むか、又は約１０ｍｇ未満の前記ｍｉＲ－２１阻害剤を含む単回用量で投与される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項14】

前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する前記部分が、前記マクロファージの細胞表面で濃縮を示す、請求項１～１３のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項15】

前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する部分が、ナノ粒子、リポソーム、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、メソポーラスシリカナノ粒子（ＭＳＮ）、抗体又はその機能的断片、細胞型特異的標的化部分、低分子リガンド、及び（タンパク質性）リガンド又はその機能的断片からなる群から選択される、請求項１～１４のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項16】

前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する前記部分が、排他的に又は主に以下の表面に見られる少なくとも１つの抗原に特異的に結合する、請求項１～１４のいずれか一項に記載の使用のための組成物：
ａ）マクロファージ、
ｂ）線維芽細胞及びマクロファージ、
ｃ）肺マクロファージ、又は
ｄ）肺線維芽細胞及び肺マクロファージ。

【請求項17】

前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する前記部分が、１又は複数のアンタゴニスト、１又は複数のアゴニスト、１又は複数のβアドレナリン受容体、１又は複数のＧタンパク質共役受容体、及び１又は複数の受容体に結合する１又は複数のサイトカインからなる群から選択される１又は複数の細胞表面受容体に結合及び／又は相互作用する、低分子リガンド、細胞型特異的標的化部分及び／又はリガンド、好ましくは、タンパク質性リガンド又はその機能的断片である、請求項１～１６のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項18】

前記抗体又は前記機能的結合断片は、以下の表から選択される１又は複数の細胞面受容体上に含まれる少なくとも１つの抗原に特異的に結合する、及び／又は前記低分子リガンド及び／又は前記タンパク質性リガンドは、以下の表から選択される少なくとも１つの細胞表面受容体に結合及び／又は相互作用する、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の使用のための組成物：

【表1-1】

【表1-2】

【請求項19】

前記ｍｉＲ－２１阻害剤は、前記抗体又はその機能的断片に結合されている、前記細胞型特異的標的化部分に結合されている、前記低分子リガンドに結合されている、及び／又は前記リガンド若しくはその機能的断片に結合されている、請求項１５～１８のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項20】

前記ｍｉＲ－２１阻害剤が、前記ナノ粒子、前記リポソーム、前記脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、及び／又は前記メソポーラスシリカナノ粒子（ＭＳＮ）に含まれる、請求項１５に記載の使用のための組成物。

【請求項21】

前記ｍｉＲ－２１阻害剤が、ｍｉＲ－２１の標的を抑制解除又は過剰発現する、請求項１～２０のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項22】

前記ｍｉＲ－２１阻害剤が、アンチセンスｍｉＲＮＡ－２１を含むか又はアンチセンスｍｉＲＮＡ－２１である、請求項１～２１のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項23】

前記アンチセンスｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ－２１に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドである、請求項１～２２のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項24】

前記アンチセンスｍｉＲＮＡ－２１が、ロックド核酸であるか又は好ましくはホスホロチオエート化ＬＮＡ／ＤＮＡミックスマーである、請求項１～２３のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項25】

ｍｉＲ－２１阻害剤と、前記ｍｉＲ－２１阻害剤を肺マクロファージに送達する部分とを含む組成物。

【請求項26】

前記組成物がエアロゾル形態である、請求項２５に記載の組成物。

【請求項27】

医薬に使用するための、請求項２５又は２６に記載の組成物。

【請求項28】

肺線維症の治療における、請求項２５～２７のいずれか一項に記載の組成物の使用。

【請求項29】

肺線維症を治療するための医薬品を製造するための組成物の使用であって、前記組成物が、ｍｉＲ－２１阻害剤と、前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する部分とを含む、使用。

【請求項30】

請求項２５～２６のいずれか一項に記載の組成物の製造方法。

【請求項31】

前記方法が、前記ｍｉＲ－２１阻害剤を、前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する前記部分に結合することを含み、前記方法が、前記ｍｉＲ－２１阻害剤を、前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する部分に導入することを含む、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

前記方法が、前記ｍｉＲ－２１阻害剤を、前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する前記部分と結合することを含む、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

肺線維症の治療方法であって、そのような治療を必要とする対象に、ｍｉＲ－２１阻害剤と、前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する部分とを含む組成物を投与すること、を含む、方法。

【請求項34】

前記ｍｉＲ－２１阻害剤と、前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する前記部分とがリンカーを介して連結され、前記リンカーが、Ｃ_10-40アルキレン、Ｃ_10-40アルケニレン、及びＣ_10-40アルキニレンから選択される基Ｌを含むか又はからなり、前記アルキレン、前記アルケニレン、及び前記アルキニレンが、それぞれ、ハロゲン、Ｃ_1-5ハロアルキル、-Ｏ（Ｃ_1-5ハロアルキル）、-ＣＮ、-ＯＲ²¹、-ＮＲ²¹Ｒ²¹、-ＮＲ²¹ＯＲ²¹、-ＣＯＲ²¹、-ＣＯＯＲ²¹，-ＯＣＯＲ²¹、-ＣＯＮＲ²¹Ｒ²¹、-ＮＲ²¹ＣＯＲ²¹、-ＮＲ²¹ＣＯＯＲ²¹、-ＯＣＯＮＲ²¹Ｒ²¹、-ＳＲ²¹、-ＳＯＲ²¹、-ＳＯ₂Ｒ²¹、-ＳＯ₂ＮＲ²¹Ｒ²¹、-ＮＲ²¹ＳＯ₂Ｒ²¹、-ＳＯ₃Ｒ²¹、及び-ＮＯ₂から独立して選択される１又は複数の基で所望により置換され、さらに、前記アルキレン、前記アルケニレン、又は前記アルキニレンに含まれる１又は複数の-ＣＨ₂－単位が、それぞれ、－Ｏ－、-ＮＲ²¹－、-ＣＯ－、-Ｓ－、－ＳＯ－、-ＳＯ₂－、アリーレン、ヘテロアリーレン、シクロアルキレン、及びヘテロシクロアルキレンから独立して選択される基によって所望により置換され、前記アリーレン、前記ヘテロアリーレン、前記シクロアルキレン、及び前記ヘテロシクロアルキレンが、それぞれ、Ｃ_1-5アルキル、Ｃ_2-5アルケニル、Ｃ_2-5アルキニル、ハロゲン、Ｃ_1-5ハロアルキル、-ＣＮ、-ＯＨ、-Ｏ（Ｃ_1-5アルキル）、-ＳＨ、-Ｓ（Ｃ_1-5アルキル）、-ＮＨ₂、-ＮＨ（Ｃ_1-5アルキル）、及び-Ｎ（Ｃ_1-5アルキル）（Ｃ_1-5アルキル）から独立して選択される１又は複数の基で所望により置換され、
各Ｒ²¹は、水素、Ｃ_1-5アルキル、Ｃ_2-5アルケニル、Ｃ_2-5アルキニル、カルボシクリル、及びヘテロシクリルから独立して選択され、前記アルキル、前記アルケニル、及び前記アルキニルが、それぞれ、１又は複数の基Ｒ^Alkで所望により置換され、さらに、前記カルボシクリル及び前記ヘテロシクリルが、それぞれ、１又は複数の基Ｒ^Cycで所望により置換され、
任意の２つのＲ²¹が結合して環を所望により形成し、
各Ｒ^Alkは、-ＯＨ、-Ｏ（Ｃ_1-5アルキル）、-Ｏ（Ｃ_1-5アルキレン）－ＯＨ、-Ｏ（Ｃ_1-5アルキレン）-Ｏ（Ｃ_1-5アルキル）、-ＳＨ、-Ｓ（Ｃ_1-5アルキル）、-Ｓ（Ｃ_1-5アルキレン）-ＳＨ、-Ｓ（Ｃ_1-5アルキレン）-Ｓ（Ｃ_1-5アルキル）、-ＮＨ₂、-ＮＨ（Ｃ_1-5アルキル）、-Ｎ（Ｃ_1-5アルキル）（Ｃ_1-5アルキル）、-ＮＨ－ＯＨ、-Ｎ（Ｃ_1-5アルキル）-ＯＨ、-ＮＨ－Ｏ（Ｃ_1-5アルキル）、-Ｎ（Ｃ_1-5アルキル）-Ｏ（Ｃ_1-5アルキル）、ハロゲン、Ｃ_1-5ハロアルキル、-Ｏ（Ｃ_1-5ハロアルキル）、-ＣＮ、-ＮＯ₂、-ＣＨＯ、-ＣＯ（Ｃ_1-5アルキル）、-ＣＯＯＨ、-ＣＯＯ（Ｃ_1-5アルキル）、-Ｏ－ＣＯ（Ｃ_1-5アルキル）、-ＣＯ-ＮＨ₂、-ＣＯ-ＮＨ（Ｃ_1-5アルキル）、-ＣＯ-Ｎ（Ｃ_1-5アルキル）（Ｃ_1-5アルキル）、-ＮＨ-ＣＯ（Ｃ_1-5アルキル）、-Ｎ（Ｃ_1-5アルキル）-ＣＯ（Ｃ_1-5アルキル）、-ＮＨ-ＣＯＯ（Ｃ_1-5アルキル）、-Ｎ（Ｃ_1-5アルキル）-ＣＯＯ（Ｃ_1-5アルキル）、-Ｏ-ＣＯ－ＮＨ（Ｃ_1-5アルキル）、-Ｏ-ＣＯ－Ｎ（Ｃ_1-5アルキル）（Ｃ_1-5アルキル）、-ＳＯ₂-ＮＨ₂、-ＳＯ₂-ＮＨ（Ｃ_1-5アルキル）、-ＳＯ₂-Ｎ（Ｃ_1-5アルキル）（Ｃ_1-5アルキル）、-ＮＨ-ＳＯ₂-（Ｃ_1-5アルキル）、-Ｎ（Ｃ_1-5アルキル）-ＳＯ₂-（Ｃ_1-5アルキル）、-ＳＯ₂-（Ｃ_1-5アルキル）、-ＳＯ-（Ｃ_1-5アルキル）、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、及びヘテロシクロアルキルから独立して選択され、前記アリール、前記ヘテロアリール、前記シクロアルキル、及び前記ヘテロシクロアルキルが、それぞれ、Ｃ_1-5アルキル、Ｃ_2-5アルケニル、Ｃ_2-5アルキニル、ハロゲン、Ｃ_1-5ハロアルキル、-ＣＮ、-ＯＨ、-Ｏ（Ｃ_1-5アルキル）、-ＳＨ、-Ｓ（Ｃ_1-5アルキル）、-ＮＨ₂、-ＮＨ（Ｃ_1-5アルキル）、及び-Ｎ（Ｃ_1-5アルキル）（Ｃ_1-5アルキル）から独立して選択される１又は複数の基で所望により置換され、
各Ｒ^Cycは、Ｃ_1-5アルキル、Ｃ_2-5アルケニル、Ｃ_2-5アルキニル、-ＯＨ、-Ｏ（Ｃ_1-5アルキル）、-Ｏ（Ｃ_1-5アルキレン）－ＯＨ、-Ｏ（Ｃ_1-5アルキレン）-Ｏ（Ｃ_1-5アルキル）、-ＳＨ、-Ｓ（Ｃ_1-5アルキル）、-Ｓ（Ｃ_1-5アルキレン）-ＳＨ、-Ｓ（Ｃ_1-5アルキレン）-Ｓ（Ｃ_1-5アルキル）、-ＮＨ₂、-ＮＨ（Ｃ_1-5アルキル）、-Ｎ（Ｃ_1-5アルキル）（Ｃ_1-5アルキル）、-ＮＨ－ＯＨ、-Ｎ（Ｃ_1-5アルキル）-ＯＨ、-ＮＨ－Ｏ（Ｃ_1-5アルキル）、-Ｎ（Ｃ_1-5アルキル）-Ｏ（Ｃ_1-5アルキル）、ハロゲン、Ｃ_1-5ハロアルキル、-Ｏ（Ｃ_1-5ハロアルキル）、-ＣＮ、-ＮＯ₂、-ＣＨＯ、-ＣＯ（Ｃ_1-5アルキル）、-ＣＯＯＨ、-ＣＯＯ（Ｃ_1-5アルキル）、-Ｏ－ＣＯ（Ｃ_1-5アルキル）、-ＣＯ-ＮＨ₂、-ＣＯ-ＮＨ（Ｃ_1-5アルキル）、-ＣＯ-Ｎ（Ｃ_1-5アルキル）（Ｃ_1-5アルキル）、-ＮＨ-ＣＯ（Ｃ_1-5アルキル）、-Ｎ（Ｃ_1-5アルキル）-ＣＯ（Ｃ_1-5アルキル）、-ＮＨ-ＣＯＯ（Ｃ_1-5アルキル）、-Ｎ（Ｃ_1-5アルキル）-ＣＯＯ（Ｃ_1-5アルキル）、-Ｏ-ＣＯ－ＮＨ（Ｃ_1-5アルキル）、-Ｏ-ＣＯ－Ｎ（Ｃ_1-5アルキル）（Ｃ_1-5アルキル）、-ＳＯ₂-ＮＨ₂、-ＳＯ₂-ＮＨ（Ｃ_1-5アルキル）、-ＳＯ₂-Ｎ（Ｃ_1-5アルキル）（Ｃ_1-5アルキル）、-ＮＨ-ＳＯ₂-（Ｃ_1-5アルキル）、-Ｎ（Ｃ_1-5アルキル）-ＳＯ₂-（Ｃ_1-5アルキル）、-ＳＯ₂-（Ｃ_1-5アルキル）、-ＳＯ-（Ｃ_1-5アルキル）、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、及びヘテロシクロアルキルから独立して選択され、前記アリール、前記ヘテロアリール、前記シクロアルキル、及び前記ヘテロシクロアルキルが、それぞれ、Ｃ_1-5アルキル、Ｃ_2-5アルケニル、Ｃ_2-5アルキニル、ハロゲン、Ｃ_1-5ハロアルキル、-ＣＮ、-ＯＨ、-Ｏ（Ｃ_1-5アルキル）、-ＳＨ、-Ｓ（Ｃ_1-5アルキル）、-ＮＨ₂、-ＮＨ（Ｃ_1-5アルキル）、及び-Ｎ（Ｃ_1-5アルキル）（Ｃ_1-5アルキル）から独立して選択される１又は複数の基で所望により置換されている、請求項１～２４、２８、及び３０のいずれか一項に記載の使用のための組成物、請求項２５～２７のいずれか一項に記載の組成物、請求項３０～３２のいずれか一項に記載の製造方法、又は請求項３３に記載の治療方法。

【請求項35】

前記ｍｉＲ－２１阻害剤と、前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する２つ以上の部分とが、分岐リンカーを介して連結されており、前記リンカーの枝のそれぞれが、請求項３４で定義された基Ｌであり、前記リンカーの主鎖は、請求項３４で定義された１つ又は２つの基Ｌを含むか又はそれらからなり、好ましくは、前記主鎖は前記ｍｉＲ－２１阻害剤に結合し、前記枝は前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する前記部分に結合する、請求項１～２４、２８、３０、及び３４のいずれか一項に記載の使用のための組成物、請求項２５～２７及び３４のいずれか一項に記載の組成物、請求項３０～３２及び３４のいずれか一項に記載の製造方法、又は請求項３３及び３４に記載の治療方法。

【請求項36】

各基Ｌが、Ｃ_10-40アルキレンから選択され、前記アルキレンが、ハロゲン、Ｃ_1-5ハロアルキル、-Ｏ（Ｃ_1-5ハロアルキル）、-ＣＮ、-ＯＲ²¹、-ＮＲ²¹Ｒ²¹、-ＮＲ²¹ＯＲ²¹、-ＣＯＲ²¹、-ＣＯＯＲ²¹，-ＯＣＯＲ²¹、-ＣＯＮＲ²¹Ｒ²¹、-ＮＲ²¹ＣＯＲ²¹、-ＮＲ²¹ＣＯＯＲ²¹、-ＯＣＯＮＲ²¹Ｒ²¹、-ＳＲ²¹、-ＳＯＲ²¹、-ＳＯ₂Ｒ²¹、-ＳＯ₂ＮＲ²¹Ｒ²¹、-ＮＲ²¹ＳＯ₂Ｒ²¹、-ＳＯ₃Ｒ²¹、及び-ＮＯ₂から独立して選択される１又は複数の基で所望により置換され、さらに、前記アルキレンに含まれる１又は複数の-ＣＨ₂－単位が、それぞれ独立して、－Ｏ－、-ＮＲ²¹－、-ＣＯ－、-Ｓ－、－ＳＯ－、-ＳＯ₂－、アリーレン、ヘテロアリーレン、シクロアルキレン、及びヘテロシクロアルキレンから選択される基によって置換されており、前記アリーレン、前記ヘテロアリーレン、前記シクロアルキレン、及び前記ヘテロシクロアルキレンが、それぞれ、Ｃ_1-5アルキル、Ｃ_2-5アルケニル、Ｃ_2-5アルキニル、ハロゲン、Ｃ_1-5ハロアルキル、-ＣＮ、-ＯＨ、-Ｏ（Ｃ_1-5アルキル）、-ＳＨ、-Ｓ（Ｃ_1-5アルキル）、-ＮＨ₂、-ＮＨ（Ｃ_1-5アルキル）、及び-Ｎ（Ｃ_1-5アルキル）（Ｃ_1-5アルキル）から独立して選択される１又は複数の基で所望により置換されている、請求項３４～３５のいずれか一項に記載の使用のための組成物、組成物、製造方法、又は治療方法。

【請求項37】

前記リンカーが、以下の化学式

【化1】

で表される（式中「＊」は、前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する部分への結合を表し、「＊＊」は、ｍｉＲ－２１阻害剤への結合を表す）、請求項３４～３６のいずれか一項に記載の使用のための組成物、組成物、製造方法、又は治療方法。

【請求項38】

前記ｍｉＲ－２１阻害剤が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、及び配列番号９から選択される、並びに前記ｍｉＲ－２１阻害剤が、好ましくは、末端ホスホロチオエート基のリン原子を介してリンカーに結合している、請求項１～３７のいずれか一項に記載の使用のための組成物、組成物、製造方法、又は治療方法。

【請求項39】

前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する１又は複数の前記部分が糖を含み、好ましくはマンノース及びＮ－アセチルガラクトサミンから選択される１又は複数を含むか又はそれらからなり、より好ましくはマンノース、ジマンノシルマンノース、及びＮ－アセチルガラクトサミンからなる、請求項１～３８のいずれか一項に記載の使用のための組成物、組成物、製造方法、又は治療方法。

【請求項40】

前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する１又は複数の前記部分が、以下から選択される：

【化2】

前記リンカーが、各構造の右下部分のアノマー炭素に結合している、請求項１～３９のいずれか一項に記載の使用のための組成物、組成物、製造方法、又は治療方法。

【請求項41】

前記組成物が、図２３Ｂで定義される化合物の１つ若しくは両方及び／又は以下の化合物の１つ若しくは両方を含む、請求項１～４０のいずれか一項に記載の使用のための組成物、組成物、製造方法、又は治療方法：

【化3】

【化4】

【化5】

【化6】

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ｍｉＲ－２１阻害剤と、前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する部分とを含む、対象の肺線維症の治療に使用するための組成物に関する。さらに、前記組成物は、肺投与によって投与されてもよい。特定の態様では、前記治療対象は肺線維症に罹患しており、さらに肺疾患又は肺障害を有し、肺疾患又は肺障害はコロナウイルス疾患であり得る。さらに、本発明は、ｍｉＲ－２１阻害剤と、前記ｍｉＲ－２１阻害剤を肺マクロファージに送達する部分とを含む、組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

臓器線維症、例えば、肺線維症の治療に高いニーズがある。肺線維症に関しては、ＣＯＶＩＤ－１９のようなコロナウイルス感染などのウイルス感染の後に、肺の硬化及び線維症が続くことがよくある（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．， ２０２０）。肺線維症は肺機能を著しく損ない、現在の治療及び治療レジメンではほとんど治療不可能である（Ｓｇａｌｌａ ｅｔ ａｌ．， ２０１８）。したがって、肺線維症に関与する代替メカニズムと分子とを標的とする新しい治療戦略にも緊急のニーズがある。

【0003】

さらに、線維症は、心疾患又は心障害などのさらなる疾患の病状においてさらに重要な役割を果たす。心筋梗塞後の急性生存率は、過去数十年で大幅に改善されたが（Ｂａｈｉｔ ｅｔ ａｌ．， ２０１８）、虚血後心不全（ＨＦ）は依然として非常に高い頻度（約５０％）のままであり、入院及び死亡の最も一般的な原因の１つとなっている（Ｂａｈｉｔ ｅｔ ａｌ．， ２０１８）。心不全の現在の医学的管理は、血管拡張剤と神経液性活性化の阻害剤に大きく依存しているが、これらの治療原則の臨床的有効性は、臨床的利益のさらなる増加を達成することがますます困難になるレベルに達したことが示唆されている（Ｐｅｌｌｉｃｏｒｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１９）。それでも、心不全の病状に関与する代替メカニズムと分子とを標的とする新しい治療戦略にも緊急のニーズがある。

【0004】

マイクロリボ核酸（ｍｉＲＮＡ又はｍｉＲ）は、タンパク質をコードするｍＲＮＡの大部分の３’非翻訳領域にあるアンチセンス相補領域に結合する、約２０～２２ヌクレオチド長のＲＮＡ分子である（Ｂａｒｔｅｌ， ２０１８）。これまでに検討されたほぼ全ての細胞プロセスにおける極めて重要な役割に加えて、それらは、癌、免疫疾患、及び心血管疾患を含む、増大する多数の疾病実体のリストにおける重要な調節因子である（Ｍｅｎｄｅｌｌ ＆ Ｏｌｓｏｎ， ２０１２）。

【0005】

これまでｍｉＲ－２１阻害剤、特にオリゴヌクレオチドに基づく治療法の臨床開発を妨げてきた主な障害は、全身送達時にこれらの分子が細胞に入る程度が比較的低いことである。一貫して、先行技術は、２～８０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内の比較的高用量のオリゴヌクレオチドを使用することを示唆している。そのような用量は、経済的理由及びそのような高い物質負荷で予想される副作用の両方のために、人体の規模に合わせることはできない（Ｌｉ ＆ Ｒａｎａ， ２０１４； Ｌｕ ＆ Ｔｈｕｍ， ２０１９）。

【0006】

したがって、根本的な技術的課題は、肺線維症の改善された治療法を提供することである。

【0007】

技術的課題は、以下に提示され、添付の特許請求の範囲で特徴付けられる実施形態の提供によって解決される。

【0008】

特に、添付の実施例に記載されているように、驚くべきことに、ｍｉＲ－２１の阻害が、罹患した及び／又は損傷した肺における肺のリモデリング及び／又は機能不全を軽減することが見出された。したがって、本発明は、肺疾患、肺損傷、及び／若しくは肺障害の治療並びに／又は改善におけるｍｉＲ－２１阻害剤の医学的及び／若しくは薬学的使用に関する。前記肺疾患、前記肺損傷、及び／又は前記肺障害は、肺線維症である可能性があり、肺線維症の原因である可能性があり、及び／又は肺線維症を伴う可能性がある。特定の実施形態では、本発明は、ｍｉＲ－２１阻害剤と、前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する部分とを含む、肺線維症の治療に使用するための組成物に関する。本発明の文脈において、「組成物」という用語は、化合物も含み、前記「化合物」は、少なくとも２つの機能的部分／部位を有する単一分子であり得る、すなわち、（ａ）ｍｉＲ－２１阻害剤である機能的部分／部位、及び（ｂ）前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する機能的部分／部位であり得る。本発明の文脈において、組成物及び化合物という用語は交換可能に使用され得る。したがって、一実施形態では、前記ｍｉＲ－２１阻害剤を含み、前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する部分を含む組成物は、単一分子、すなわち「阻害剤」であってもよく、１又は複数のマクロファージへの「標的化部分」は、例えば共有結合、共役結合及び同種のものによって物理的に結合されてもよい。そのような化合物／分子はまた、前記「ｍｉＲ２１阻害剤」と前記ｍｉＲ－２１の阻害剤をマクロファージに送達する前記部分とを連結する「リンカー」構造を含んでいてもよい。対応する例示的かつ非限定的なリンカーが本明細書に提供される。また、本発明の組成物／化合物は、例えば、前記ｍｉＲ－２１阻害剤を他の標的細胞、特に（及び一実施形態では）線維芽細胞に標的化することができる、本明細書の以下に定義される部分／部位を含む。

【0009】

したがって、特定の実施形態では、本発明はまた、組成物／化合物であって、ｍｉＲ－２１阻害剤と、前記ｍｉＲ－２１阻害剤を好ましくは肺マクロファージに送達する部分とを含む組成物／化合物に関する。本発明のさらなる実施形態は、組成物／化合物であって、前記組成物／化合物は、ｍｉＲ－２１阻害剤、前記ｍｉＲ－２１阻害剤を（肺）マクロファージに送達する部分、及び前記ｍｉＲ－２１阻害剤を線維芽細胞、好ましくは肺線維芽細胞に送達するさらなる部分を含む。本発明の文脈において、「前記ｍｉＲ－２１阻害剤を…に送達する」という用語は、「前記ｍｉＲ－２１阻害剤を…に標的化する」ことも意味する。そのような「部分」の対応する非限定的な例を以下に提供し、添付の非限定的な例にも示す。したがって、本発明の文脈において、本発明の医学的手段及び方法で使用される組成物／化合物は、前記ｍｉＲ－２１阻害剤が、前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージ及び／又は線維芽細胞に送達する１又は複数の部分に結合されている組成物／化合物であることが理解される。したがって、「化合物」及び「組成物」という用語は、互換的に使用することができ、本発明の好ましい実施形態において、前記化合物／組成物は、前記ｍｉＲ－２１阻害剤及び前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージ及び／又は線維芽細胞に送達する前記部分を含むという事実に関連する。好ましい実施形態では、前記ｍｉＲ－２１阻害剤と、前記阻害剤をマクロファージ及び／又は線維芽細胞に送達する前記部分とは、結合／共有結合される。

【0010】

本明細書で詳述するように、前記ｍｉＲ－２１阻害剤は、前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する部分に結合され得る。例えば、限定されるが、前記ｍｉＲ－２１阻害剤は、好ましくはマクロファージ上の（特異的な）細胞表面受容体に結合／相互作用する抗体又はその機能的断片に結合され得る。前記ｍｉＲ－２１阻害剤はまた、本発明の文脈において、細胞型特異的標的化部分に結合され得る。また、本明細書の添付の実施例で想定及び示されるように、前記ｍｉＲ－２１阻害剤は、前記細胞表面マーカー／受容体の「リガンド」に結合され得る。そのような細胞マーカー／受容体の非限定的な例を、本明細書の表３に提供する。そのような「リガンド」は、対応する所望の標的細胞上のそれらの対応する「受容体」と相互作用することができる低分子リガンド及び／若しくは（タンパク質性）リガンド又はその機能的断片を含み得る。そのような「リガンド受容体」相互作用の例は、本明細書で使用され例示される「マンノース」（標的マクロファージ上のＭＲＣＩ１との「低分子リガンド」の例）の相互作用であり得る。タンパク質性リガンドの例は、ＭＲＣ１、すなわちマクロファージ上の細胞表面受容体に対する相互作用ペプチドである、以下にも記載されるペプチドＣＳＰＧＡＫＶＲＣ（配列番号６）であってもよい。

【0011】

本発明者らは、驚くべきことに、本発明に関連して、ｍｉＲ－２１が肺及び心臓組織の特定の細胞型において強く発現されるｍｉＲＮＡであること、特に心疾患若しくは障害又は肺疾患若しくは障害などの病理学的条件下でそうであることを見出した。

【0012】

特に、先行技術に基づいて、本発明者らは、心筋又は肺への送達は困難であり、したがってｍｉＲＮＡに基づく治療の使用を妨げていると考えた。したがって、本発明者らは、この不確実な科学的及び医学的分野において、マクロファージ及び／又は線維芽細胞、特に肺胞マクロファージ及び／又は間質マクロファージなどの心臓及び／又は肺に存在するマクロファージ及び／又は線維芽細胞に対する（ａｎｔｉ－）ｍｉＲＮＡに基づく医学的介入の適用可能性及び治療効果を解明した。したがって、肺胞マクロファージ及び／又は間質マクロファージのような肺組織に存在する及び／又は見出されるそのようなマクロファージは、本発明の文脈において「肺マクロファージ」である。「肺（ｌｕｎｇ）マクロファージ」という用語は、「肺（の）（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ）マクロファージ」という用語も含む。実験部分で説明したように、本発明者らは、肺マクロファージの表面受容体／表面マーカーも解明した。「肺マクロファージ」に特異的なこれらの受容体／マーカーは、例えば、マンノース受容体Ｃ型１（ＭＲＣ１：ＥＮＳＧ０００００２６０３１４）、コラーゲン構造を有するマクロファージ受容体（ＭＡＲＣＯ：ＥＮＳＧ００００００１９１６９）、ＣＤ６８抗原（ＣＤ６８：ＥＮＳＧ０００００１２９２２６）、接着Ｇタンパク質共役受容体Ｅ１（ＡＤＧＲＥ１：ＥＮＳＧ０００００１７４８３７）、Ｃ－Ｃモチーフケモカイン受容体２（一過性）（ＣＣＲ２：ＥＮＳＧ０００００１２１８０７）、インテグリンサブユニットαＭ（ＩＴＧＡＭ：ＥＮＳＧ０００００１６９８９６）、及びＦｃｇｒ１（Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ， ＩｇＧ， ｈｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｉ）（ＦＣＧＲ１Ａ：ＥＮＳＧ０００００１５０３３７）を含むが、これらに限定されない。

【0013】

肺胞マクロファージに特異的なマーカーは、シアル酸結合Ｉｇ様レクチン１（ＳＩＧＬＥＣ１：ＥＮＳＧ００００００８８８２７）及びコラーゲン構造を有するマクロファージ受容体（ＭＡＲＣＯ：ＥＮＳＧ００００００１９１６９）であり得る。間質マクロファージに特異的なマーカーは、ＣＤ１６３分子（ＣＤ１６３：ＥＮＳＧ０００００１７７５７５）であってもよい。線維芽細胞に特異的な受容体／マーカーは、例えば、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲＡ：ＥＮＳＧ０００００１３４８５３）、転写因子２１（ＴＣＦ２１：ＥＮＳＧ０００００１１８５２６）、ペリオスチン（ＰＯＳＴＮ：ＥＮＳＧ０００００１３３１１０）、及びアクチンα２（ＡＣＴＡ２：ＥＮＳＧ０００００１０７７９６）を含むが、これらに限定されない。本発明の文脈において特に有用なマクロファージの表面上の受容体／マーカーも提供され、ＥＮＳ形式（Ｅｎｓｅｍｂｌ Ｇｅｎｅ ＩＤ）におけるそれらの安定した識別子によって以下に識別される。表３も参照。表３はまた、マクロファージ及び／又は線維芽細胞上のさらなる受容体／マーカーを含み、これらは、本明細書で定義される「ｍｉＲ－２１阻害剤を１又は複数のマクロファージに（所望により、１又は複数の線維芽細胞にも）送達する部分」の相互作用パートナーとして、本発明の文脈において特に有用である。上記の「マーカー」は、それぞれマクロファージ及び／又は線維芽細胞で主に発現されるマーカーに関するが、本明細書で定義される「ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージ（及び／又は線維芽細胞）に送達する部分」の最も好ましい「標的」は、これらの細胞の表面マーカー／受容体である。好ましい実施形態では、これらの表面マーカー／受容体は、上記「ｍｉＲ－２１阻害剤を送達する部分」と相互作用すると、エンドサイトーシスを媒介する。

【0014】

したがって、前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージ（及び所望により線維芽細胞）に送達する前記部分／部位は、とりわけ、前記受容体／マーカーと特異的に相互作用することができるリガンド（例えば、低分子リガンド又はタンパク質性リガンド）を含み得る。さらに、本発明の文脈において、「ｍｉＲ－２１阻害剤」が、前記受容体／マーカーと（特異的に）相互作用することができる（特異的）結合分子を介して、前記マクロファージ、好ましくは肺マクロファージに送達されることも想定される。そのような結合分子は、例えば、特異的抗体（前記受容体／マーカー上に含まれる抗原に結合する）及びその機能的断片を含み得るが、これらに限定されない。最も好ましくは、前記受容体／マーカーは、前記マクロファージ（及び／又は線維芽細胞）上の細胞表面受容体である。本明細書の以下及び添付の実施例に示すように、本発明の文脈における有用な「受容体／マーカー」は、ＭＲＣ１遺伝子によってコードされ、主にマクロファージの表面に発現する膜受容体であり、マクロファージによる糖タンパク質のエンドサイトーシスを媒介する、マンノース受容体Ｃ型１であり得る。マンノース受容体Ｃ型１は、糖構造、特に（高）マンノース構造に好ましく結合することが公知である。したがって、本発明の文脈において、「ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する部分」は、マンノース受容体Ｃ型１と相互作用するリガンドであり得る。そのようなリガンドは、糖分子又はその誘導体、例えばマンノース（以下、分岐トリマンノース構造も含む）、ジマンノシルマンノース、又はガラクトースのアミノ糖誘導体（ＧａｌＮＡｃ：Ｎ－アセチルガラクトサミン）のような低分子であり得る。添付の実施例に記載されているように、本発明者らは、ｍｉＲ－２１「ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１」の阻害剤を（特に吸入を介して）、マンノース構造（ここでは、例えばトリマンノース）を介して並びに「ｍｉＲ－２１の阻害剤をマクロファージに送達する部分」としてＧａｌＮＡｃを介して、（肺）マクロファージに首尾よく送達することができた。

【0015】

本発明者らは驚くべきことに、例えば、特に実施例３及び実施例５に示されるように、ｍｉＲ－２１が肺マクロファージにおいて最も豊富で濃縮されたマイクロＲＮＡであることを見出した。特に、ｍｉＲ－２１は、肺胞マクロファージで発現される全ｍｉＲの約２０％を含むｍｉＲの最も豊富な画分を表すことが本明細書の以下に記載されている。例えば、添付の図１２Ｂを参照。したがって、ｍｉＲ－２１は肺マクロファージで最も豊富なｍｉＲである。このような高いレベルは、肺間質マクロファージでも見られ、全てのｍｉＲＮＡ読み取りの１０％以上がｍｉＲ－２１に起因する場合がある。したがって、マクロファージ、特に肺マクロファージは、本明細書で提供される医学的介入／治療の手段及び方法における標的細胞として使用される。以下にも示されるように、驚くべきことに、肺線維症様の構造的損傷を示すヒト肺組織においてｍｉＲ－２１が劇的に増加することも、本発明に関連して見出された。これに関連して、例えば、ｍｉＲ－２１は、ＣＯＶＩＤ－１９犠牲者の肺でアップレギュレートされたｍｉＲＮＡの上位にあることがわかった。理論に拘束されることなく、本発明の文脈において、本明細書で提供される科学的証拠に基づいて、肺マクロファージのｍｉＲ－２１は、例えば、特に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２／ＣＯＶＩＤ－１９による肺損傷による感染によって引き起こされる肺の損傷など、感染症で見られる肺損傷の病態生理学において重要な役割を果たす。この科学的証拠に基づいて、本発明は、ｍｉＲ－２１阻害剤と、前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージ、好ましくは（肺）マクロファージに送達する部分とを含む組成物に関する。本発明の好ましいが限定されない実施形態では、本明細書で提供される化合物、すなわち、ｍｉＲ－２１阻害剤と、前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する部分とを含む組成物／化合物が、吸入を介して病気の肺組織に送達される。したがって、前記化合物／組成物は、医薬組成物のような吸入可能な組成物に含まれ得る。したがって、ｍｉＲ－２１阻害剤と、前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する部分とを含む（医療用の）組成物は、例えば、エアロゾル形態であり得る。添付の実施例には、インビボ研究も含まれている。肺線維症のモデルでは、肺のマクロファージへのｍｉＲ－２１阻害剤の標的送達（吸入による）は、肺機能障害及び肺線維症に対しても（標的対照及び不活性（ミスマッチ）ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１と比較しても）有意に有効であった。

【0016】

したがって、本発明の特定の局面において、前記ｍｉＲ－２１阻害剤は、1又は複数の肺マクロファージに送達されるものである。すなわち、本明細書に記載の組成物／化合物に含まれる（及びｍｉＲ－２１阻害剤も含む）「部分」は、前記ｍｉＲ－２１阻害剤を１又は複数のマクロファージ、特に１又は複数の肺マクロファージに送達／標的化する。さらに特定の態様では、組成物に含まれる前記部分は、前記ｍｉＲ－２１阻害剤を１又は複数の肺胞マクロファージ及び／又は１又は複数の間質マクロファージに送達／標的化する。本明細書の以下に提供されるように、前記組成物に含まれる前記部分は、前記ｍｉＲ－２１阻害剤を排他的に又は主に標的細胞型に、例えば、排他的に又は主に１又は複数のマクロファージに、好ましくは排他的に又は主に１又は複数の肺マクロファージに、又は特定の態様では排他的に又は主に１又は複数の肺胞マクロファージ及び／又は１又は複数の間質性マクロファージに送達し得る。当技術分野で公知のように、生体分子の結合に関して本明細書で使用される「排他的に」は、その部分が標的分子／細胞に検出可能にのみ結合することを示すものではない。むしろ、アッセイ系に依存して、前記部分が無関係な分子へのいくらかの（弱い）結合を示し得ることが周知である。したがって、「排他的に」は、その部分が主に標的細胞型に結合すること、すなわち結合が選択的であること（選択的結合）を示す。すなわち、前記部分は、非標的細胞、例えばＴ細胞又は好中球、上皮細胞などよりも、標的細胞、すなわちマクロファージ及び所望により線維芽細胞に選択的かつ優先的に結合する。本発明の例示された化合物は、マクロファージを選択的に標的とすることが記載されている（例えば、Ｔ細胞、上皮細胞、好中球などではない）添付の図２４（Ｃ）も参照。以下でも議論されるように、そのような選択的かつ優先的な結合は、前記標的細胞上の本明細書で定義される１又は複数の細胞表面受容体と特異的に相互作用及び／又は特異的に結合する部分を用いて達成され得る。

【0017】

マクロファージへの前記ｍｉＲ－２１阻害剤の送達は、本明細書において最も好ましい。したがって、本明細書で提供される組成物／化合物は、肺線維症の治療に使用され得る。本明細書で提供される組成物／化合物は、肺におけるマクロファージ関連線維症の治療だけでなく、心疾患の治療にも使用することができる本発明は、ｍｉＲ－２１が圧過負荷による心機能障害に供されたマウス（ＴＡＣモデル、ヒト心疾患／障害に関連する動物モデル）の心臓組織マクロファージにおいて（心臓の他の全ての細胞型と比較して）最も高い発現を有することを記載している。添付の実施例に記載されているように、ｍｉＲ－２１のマクロファージ特異的欠失を有するマウスは、心肥大及び機能不全から保護されることが見出された。肺線維症に罹患している対象はさらに、肺疾患又は肺障害を有する／罹患している／診断されていてもよい。これらのデータに基づいて、本発明者らは、ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１に基づく治療法（ｍｉＲ－２１阻害剤による治療法）は、主にマクロファージにおけるｍｉＲ－２１阻害を通じて、関連する重要な治療効果を発揮し得ると推測した。実施例はまた、マクロファージ中のｍｉＲ－２１が、心臓以外の他の臓器、すなわち肺における線維症事象も決定し、特にＣＯＶＩＤ－１９犠牲者の肺では、ｍｉＲ－２１は（特に肺マクロファージでも）アップレギュレートされたｍｉＲＮＡの１つであるという新規かつ発明的な知見をも提供する。これらの驚くべき知見に基づいて、本発明者らは、ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１（ｍｉＲ－２１に対する阻害剤）のマクロファージへの特異的送達が優れた抗線維症療法を提供するという当技術分野への貢献をここに提供し、このような特定の送達は、治療を受ける患者にとって利点がある、例えば、望ましくない副作用の少ない治療が実現可能であり、ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに標的化する本発明の組成物／化合物の吸入投与を介して、肺の好ましい治療を得ることができると推測される。

【0018】

本発明の好ましい態様において、本発明の組成物／化合物は肺線維症の治療に使用され、前記組成物／化合物は、前記ｍｉＲ－２１阻害剤と、前記ｍｉＲ－２１阻害剤を肺マクロファージ及び／又は肺線維芽細胞に送達する部分との両方を含む。最も好ましい態様では、前記組成物は、肺線維症の治療に使用される組成物であって、前記ｍｉＲ－２１阻害剤と、前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する部分とを含む。さらに好ましい態様では、前記ｍｉＲ－２１阻害剤は、肺マクロファージ及び／又は肺線維芽細胞に送達され、より好ましくは前記ｍｉＲ－２１阻害剤は肺マクロファージに送達される。

【0019】

本明細書で提供されるｍｉＲ２１のマクロファージ標的阻害剤は、マクロファージ及び／又は線維芽細胞が疾患状態に寄与する様々な種類の肺疾患を予防又は治療するために使用され得る。このような肺疾患には、有毒物質（ＳＭＯＧ、タバコの煙などを含む）、薬物（ブレオマイシン、ブスルファン、アミオダロンなど）、結合組織疾患、間質性肺疾患、並びに、特に感染症（ＣＯＶＤ－１９などのＳＡＲＳ感染症を含む）によって引き起こされる（線維性）肺疾患が含まれますが、これらに限定されない。これに関連して、本発明は、ＣＯＶＩＤ－１９犠牲者の肺（死後に採取）で、ｍｉＲ－２１がアップレギュレートされたｍｉＲＮＡの上位にあることを初めて記載している。したがって、本発明は、コロナウイルス、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる肺疾患又は障害の治療において、ｍｉＲ－２１阻害剤を含み、前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する部分を含む、本明細書に記載の組成物／化合物の医学的／薬学的使用にも関する。したがって、また、本明細書で提供される技術情報に基づいて、及び添付の科学的エビデンス／実験データに基づいて、本発明者らは、肺線維症を想定している。特に、ウイルス感染及び／又は細菌感染（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又は別のコロナウイルスによって引き起こされる又は誘発される）に関連するか又はそれらによって引き起こされる場合、そのような罹患した対象は、肺のｍｉＲ－２１レベルが増加しているため、本明細書で提供される手段及び方法で治療することができる。上述のように、また本発明の一実施形態に関して、本発明者らは驚くべきことに、ｍｉＲ－２１は、ＣＯＶＩＤ－１９犠牲者の肺でアップレギュレートされたｍｉＲＮＡの上位にあることを見出した。これは、とりわけ、ＣＯＶＩＤ－１９感染症により及び／又はＣＯＶＩＤ－１９感染症を伴って死亡した患者から死後に採取されたヒト肺の小さなＲＮＡｏｍｅを分析することによって示されている。例えば、実施例５及び図１９を参照。

【0020】

これらの驚くべき結果は、肺、特に肺マクロファージにおけるｍｉＲ－２１発現が、肺線維症の病態生理学において重要な役割を果たしていることを示している。特に、本発明の驚くべき知見に基づいて、ｍｉＲ－２１（及び／又はマクロファージ、すなわち肺のマクロファージにおけるその発現）は、肺疾患、肺損傷、又は肺障害をさらに患う患者、特にヒトの肺線維症の病態生理学において実質的な役割を果たし、前記線維症は、前記肺疾患、肺損傷、又は肺障害の結果であることが本明細書に記載されている。また、本明細書の以下で説明するように、肺線維症の治療におけるｍｉＲ－２１阻害剤の医学的及び／又は薬学的使用に関する本医学的発明は、ｍｉＲ－２１の発現が、罹患組織及び／又は損傷組織内の内部又はその組織のマクロファージにおいて特に高いという驚くべき知見に部分的に基づいている。したがって、本発明は、特定の実施形態において、肺線維症の治療のための手段及び方法の提供に関し、前記治療は、マクロファージ、特に本発明に関連して、肺中又は肺のマクロファージにおいてｍｉＲ－２１を阻害する組成物の投与を含む。さらに、本明細書にも示されているように、疾患又は損傷した肺のような疾患又は損傷した組織の線維芽細胞でｍｉＲ－２１が阻害される場合も有益である。したがって、本発明は、一態様において、ｍｉＲ－２１阻害剤と、前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する部分とを含む化合物及び／又は組成物の医学的及び／又は薬学的使用に関する。一態様では、医学的及び／又は薬学的使用のための前記化合物及び／又は組成物は、前記ｍｉＲ－２１阻害剤を線維芽細胞に送達できる／送達する部分をさらに含み得る。前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する部分と、前記ｍｉＲ－２１阻害剤を線維芽細胞に送達する部分とは、同じ部分であっても異なっていてもよい。したがって、本明細書で提供される肺線維症の治療のための手段及び方法のさらなる態様では、前記部分が前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに選択的に送達する、又は前記部分が前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージ及び線維芽細胞に選択的に送達する。本明細書で上述したように、「選択的送達」／「選択的標的化」は、前記部分が、非標的細胞、例えばＴ細胞又は好中球、上皮細胞などよりも、標的細胞、すなわちマクロファージ及び所望により線維芽細胞に選択的かつ優先的に結合することを意味する。

【0021】

本明細書の以下に示され、添付の実施例で証明されるように、本発明の手段及び方法、すなわち、ｍｉＲ－２１阻害剤と、前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する部分とを含む化合物及び／又は組成物の医学的及び／又は薬学的使用は、肺線維症に罹患し、肺疾患又は肺障害をさらに有する対象の治療において特に想定される。本発明の好ましい実施形態では、前記肺疾患又は障害は、線維症を引き起こし得るか又はそれに関連し得、好ましくは、前記肺疾患又は障害は、ウイルス及び／又は細菌によって引き起こされ得る。本明細書に示されるように、本発明の手段及び方法はまた、驚くべきことに、肺疾患、肺損傷、及び／又は肺障害の医学的介入においても有用であり、治療される肺疾患、肺損傷、及び／又は肺障害が、コロナウイルス疾患などのウイルス感染によって引き起こされる。本発明の好ましい実施形態において、前記ｍｉＲ－２１阻害剤は、肺線維症の治療において、並びに／又は、疾患又は損傷状態の基礎がウイルス又は細菌による感染である肺疾患、肺損傷、若しくは肺疾患に関連する及び／又はそれらによって引き起こされる肺線維症の治療において使用されるものである。本発明の好ましい実施形態では、（ヒト）患者における肺線維症並びに／又は肺線維症及びさらなる肺疾患、肺損傷、若しくは肺障害を患っている（ヒト）患者における肺線維症が、本明細書で提供される手段及び方法によって治療されるものである。前記（ヒト）患者における前記肺線維症はまた、前記（さらなる）肺疾患、肺損傷、若しくは肺障害によって引き起こされ得る。本明細書で提供される手段及び方法は、特に、ｍｉＲ－２１阻害剤の医学的及び／又は薬学的使用に関する。好ましい実施形態では、前記医学的及び／又は薬学的使用は、そのような医学的介入を必要とする（ヒト患者）、すなわち、本明細書で定義される肺線維症に罹患している又は罹患しやすい（ヒト）患者へのｍｉＲ－２１阻害剤の投与を含む。さらなる実施形態において、本発明は、化合物及び／又は組成物が前記患者に投与されるものであり、前記化合物及び／又は組成物は、ｍｉＲ－２１阻害剤と、前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する部分とを含む、前記医学的及び／又は薬学的使用に関する。本発明の文脈において、前記ｍｉＲ－２１阻害剤はまた、前記ｍｉＲ－２１阻害剤を線維芽細胞に送達するさらなる部分も含むことが想定される。したがって、本発明はまた、ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージのみに送達する部分も含む、ｍｉＲ－２１阻害剤（及び／又はそれを含む化合物／組成物）の本明細書で定義される医学的及び／又は薬学的使用に関する。以下に詳述するように、本発明に関連して使用される前記化合物／組成物は、ｍｉＲ－２１阻害剤を含み、部分はｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージ及び線維芽細胞に選択的に送達することも想定される。

【0022】

特に添付の実施例に関連して、前記ｍｉＲ－２１阻害剤は、肺線維症の医学的介入、特に、肺疾患、肺損傷、又は肺障害によって引き起こされるか、又はそれに関連する肺線維症の医学的介入において使用されることが想定される。前記肺疾患、肺損傷、又は肺障害は、肺の感染症、特に細菌及び／又はウイルスによって引き起こされる感染症であり得る。本明細書に記載されているように、前記ウイルスは、ＭＥＲＳ又はＳＡＲＳ、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１などのコロナウイルスであってもよい。本発明の手段及び方法で治療される他の肺疾患、肺損傷、又は肺障害は、限定されるものではないが、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、その他のコロナウイルス（例えば、ＣｏＶ－２２９、ＣｏＶ－ＮＬ６３、ＣｏＶ－ＯＣ４３、又はＣｏＶ－ＨＫＵ１）、ライノウイルス、パラインフルエンザウイルス、アデノウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ヒトメタニューモウイルス、又はヒトボカウイルスによる感染であってもよい。本発明のさらなる文脈において、及び添付の実施例に照らして、治療される肺疾患／損傷／障害、すなわち肺線維症は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２／ＣＯＶＩＤ－１９誘発性肺損傷であってもよい。さらに、本明細書に記載されているように、マクロファージを標的とするａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１（すなわち、ｍｉＲ－２１阻害剤）は、そのような肺損傷を引き起こす感染体による感染によって誘発される肺損傷を予防又は治癒するための優れた治療原理をさらに構成し得る。本明細書で提供される実施例は、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に関するものである。さらに、本発明の手段及び方法で治療される前記肺疾患／損傷／障害は、例えば、慢性閉塞性肺疾患又は特発性肺線維症などのような別の肺疾患であってもよい。

【0023】

本明細書に記載されているように、本発明者らは、驚くべきことに、肺疾患又は障害に罹患している対象の肺でｍｉＲ－２１が増加していることも見出した。以下の図１３Ａ及び図１３Ｂを参照。ｍｉＲ－２１阻害剤による治療は、肺線維症を軽減した。以下に示すように、マクロファージ又は線維芽細胞におけるｍｉＲ－２１の阻害は、線維症を減少及び／又は予防する。したがって、マクロファージ及び／又は線維芽細胞へのｍｉＲ－２１の阻害剤の送達は妥当性があるものとなる。したがって、本明細書で提供される組成物及びその使用は、例えば、ウイルス性及び／又は細菌性肺感染症などの肺疾患又は障害によって引き起こされる及び／又はそれらに関連する肺線維症の治療に使用することができる。本発明で治療される肺線維症は、肺補助法又は人工呼吸によって引き起こされるか又はそれらに関連している場合がある。感染症（細菌及び／又はウイルス）、圧力及び／又は（人工）呼吸は、ＡＲＤＳ（急性呼吸窮迫症候群）を引き起こし、その後に肺線維症を引き起こす場合がある。よって、本明細書で提供される組成物及び組成物の使用は、肺線維症の予防又は治療に適し得る。本明細書で提供される組成物は、肺線維症の予防又は治療にも適し得る。前記組成物は、肺線維症を発症していない対象の治療に使用してもよい。例えば、本明細書で定義されるｍｉＲ－２１阻害剤、本明細書で提供される組成物／化合物は、肺疾患、肺障害、肺損傷、及び／又はＡＲＤＳの治療にも使用され得る。本明細書で提供される手段及び方法は、肺疾患、肺損傷、及び／又はＡＲＤＳの発現前の予防に使用されることも想定される。例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症のような「コロナウイルス感染症」も、肺線維症に関連している。これは実際に添付の実施例に記載されている。驚くべきことに、ｍｉＲ－２１は、罹患／損傷した肺からの（肺胞／肺）マクロファージに濃縮されているだけでなく、さらに驚くべきことに、ｍｉＲ－２１は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した個人、つまりヒトＣＯＶＩＤ－１９患者から得られた肺組織でアップレギュレートされていることが見いだされた。したがって、本明細書で定義されるｍｉＲ－２１阻害剤、特に、ｍｉＲ－２１の阻害剤と、ｍｉＲ－２１の前記阻害剤を（肺）マクロファージに送達する部分とを含む、本明細書で定義される化合物／組成物は、とりわけ、インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス、ライノウイルス、パラインフルエンザウイルス、アデノウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ヒトメタニューモウイルス又はヒトボカウイルス、ＭＥＲＳ又はＳＡＲＳ、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、その他のコロナウイルス（例えば、ＣｏＶ－２２９、ＣｏＶ－ＮＬ６３、ＣｏＶ－ＯＣ４３、又はＣｏＶ－ＨＫＵ１）によって引き起こされる又は誘発される感染症の治療に使用され得る。本明細書で提供される組成物／化合物は、そのような（ウイルス）感染症に関連する肺線維性疾患の治療及び／又は予防にも使用され得る。しかし、本発明は、ウイルス感染症に関連する肺線維性疾患の治療に限定されないことに留意されたい。本明細書で論じたように、本発明の驚くべき知見に基づいて、ｍｉＲ－２１阻害剤は、特に、罹患／損傷／感染した組織（すなわち、罹患／損傷／感染した肺）のマクロファージに、及び一実施形態では線維芽細胞にも送達する部分に連結された場合、細菌感染症に関連する肺線維症、又は慢性閉塞性肺疾患、特発性肺線維症などの他の肺線維症の治療に医学的／薬学的に有用であることも妥当に記載されている。本明細書で提供されるｍｉＲ－２１阻害剤を含む化合物及び組成物は、例えば、特に成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）に続く肺補助法／人工呼吸など、肺補助法又は人工呼吸に関する、それらによって引き起こされる又は関連する線維性イベントの医学的／薬学的介入において、特に有用であることが、本発明から明らかである。したがって、本発明はまた、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）の治療における、前記ｍｉＲ－２１阻害剤を含む、本明細書に記載される化合物／組成物の医学的／薬学的使用に関する。

【0024】

本明細書で使用される「肺（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ）線維症」又は「肺（ｌｕｎｇ）線維症」という用語は、交換可能に使用することができる。

【0025】

本明細書の添付の実施例及び科学的データで驚くべきことに示されるように、心疾患の大型動物モデルにおけるｍｉＲ－２１阻害剤の血管内（冠動脈内）適用も肺線維症を減少させた。以下図１３Ｄを参照。したがって、特定の態様では、前記ｍｉＲ－２１阻害剤を含む本発明の化合物／組成物は、心臓病に罹患している対象の肺線維症／肺線維症の治療に使用するためのものである。したがって、本発明はまた、心疾患又は障害に罹患している対象である、対象の肺線維症の治療における、本明細書で提供される組成物／化合物の医学的／薬学的使用にも関する。一実施形態では、前記心疾患又は心障害が、線維症を引き起こすか又は線維症に関連している。そのような心疾患又は障害は、前記心疾患又は心障害が、心不全、虚血、虚血後心不全、心肥大、高血圧性心不全、拡張期心不全、収縮期心不全、心臓関連蓄積症、心筋症、収縮性心膜炎、冠動脈疾患、急性心筋梗塞、慢性心筋梗塞、右心不全、心不整脈、心筋炎関連線維症、及び心臓弁膜症からなる群から選択され得るが、これらに限定されない。

【0026】

上記で検討し、添付の実施例によって妥当に記載されているように、肺線維症は人工呼吸関連肺線維症でもあり得る。さらにより好ましい態様では、治療される肺線維症は、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）における人工呼吸関連肺線維症及び／又は肺補助法関連肺線維症であり得る。これは、ＣＯＶＩＤ－１９患者のように、ウイルス感染症に罹患し、人工呼吸を必要としている対象にも特に関連がある。

【0027】

さらなるインビボ実験において、本発明者らは、線維芽細胞におけるｍｉＲ－２１の特異的阻害も分析した。添付の非限定的な実施例４及び図１４を参照。本発明者らは、線維芽細胞におけるｍｉＲ－２１の阻害が、心臓のリモデリング及び機能不全を防止することを示した。図１４を参照。添付の実施例にも示されているように、肺損傷モデルにおけるｍｉＲ－２１の特異的阻害は、望ましくない肺のリモデリング及び機能不全を軽減した。例えば、添付の非限定的な実施例６及び図２６を参照。したがって、本発明の組成物／化合物は、前記ｍｉＲ－２１阻害剤と、前記阻害剤を１又は複数のマクロファージ及び／又は１又は複数の線維芽細胞に送達する部分とを含み、本明細書に記載及び記載されている通り有益な治療用途を提供する。上記のように、前記組成物に含まれる前記部分は、前記ｍｉＲ－２１阻害剤を標的細胞型のみに、例えば、１又は複数のマクロファージ及び／又は１又は複数の線維芽細胞のみに、好ましくは１又は複数の肺マクロファージ及び／又は１又は複数の線維芽細胞のみに、又は特定の態様では、１又は複数の肺胞マクロファージ及び／又は１又は複数の線維芽細胞並びに／又は１又は複数の間質マクロファージ及び／又は１又は複数の線維芽細胞のみに送達することができる。さらに、本発明者らは、肺線維症に罹患していない対象と比較して、肺線維症に罹患している対象においてｍｉＲ－２１が増加していることを見出した。図１３Ａ及び図１３Ｂを参照。ｍｉＲ－２１がヒト被験体（図１３Ｂ）及び肺線維症に罹患している動物モデルにおいても増加することは、本明細書の以下に記載されている。

【0028】

本発明者らはまた、ｍｉＲ－２１阻害剤、特にアンチセンス（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）－ｍｉＲ－２１（例えば、添付の実施例でも使用及び採用されているＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１）を、肺線維症に罹患した動物モデルに投与した。本発明者らは驚くべきことに、ｍｉＲ－２１阻害剤が肺線維症（又は肺の線維症）を軽減、予防、及び／又は改善することを見出した。この有益な治療効果は非常に強力であった。したがって、本明細書で提供される組成物及び治療的使用／方法は、本明細書で以下にさらに示されるように、有利で安全かつ効果的な治療を提供する。

【0029】

以下にさらに記載するように、大型動物モデルにおけるｍｉＲ－２１阻害剤の投与は、マクロファージ浸潤並びに線維芽細胞増殖の減少をもたらした。したがって、本明細書で提供されるインビボデータは、前記ｍｉＲ－２１阻害剤が線維芽細胞及びマクロファージにおけるその活性を通じて線維症を減少させることを示している。実施例１を参照。さらなるインビボ研究は、本明細書において以下に記載される。予想外に、ｍｉＲ－２１は全てのｍｉＲＮＡの中で心臓マクロファージにおいて最も強力に発現していることが示された。以下図８Ｂを参照。

【0030】

これらの実験結果を考慮して、本発明者らは、マクロファージにおけるｍｉＲ－２１の特異的阻害が線維症における有益な治療であるかどうかをさらに分析した。実施例２を参照。マクロファージ及び／又は線維芽細胞に送達されるｍｉＲ－２１阻害剤の典型として、ｍｉＲ－２１は動物疾患モデルのマクロファージ又は線維芽細胞で欠失された。上記及び下記を参照。マクロファージでのｍｉＲ－２１阻害は、マクロファージでの炎症誘発性極性化を防ぎ、炎症を防ぐ。さらに、マクロファージにおけるｍｉＲ－２１阻害は、線維症、特に、例えば圧力過負荷によって誘発される線維症などの心臓線維症を減少させる。さらに、マクロファージにおけるｍｉＲ－２１阻害が、例えば心機能不全などの臓器の機能不全を改善することを以下に示す。マクロファージにおけるｍｉＲ－２１阻害が、心疾患又は障害における心機能を改善することも示されている。さらに、インビボ動物モデルにおいて、マクロファージにおけるｍｉＲ－２１阻害が、肥大関連遺伝子及び線維症関連遺伝子を減少させることを以下に示す。また、マクロファージ依存性の筋線維芽細胞の形質転換が、マクロファージにおけるｍｉＲ－２１阻害によって減少することが本明細書において示される。添付の実施例に示すように、線維芽細胞は、マクロファージからの細胞間シグナル伝達の主要なレシピエントである。したがって、線維芽細胞は、マクロファージに含まれる／発現されるｍｉＲ－２１によって制御される。よって、マクロファージにおけるｍｉＲ－２１阻害剤は、線維芽細胞に対する傍分泌線維化促進性シグナル伝達を制御する。添付の実施例に記載されているように、マクロファージ由来の線維化促進性分泌シグナルは、病的線維症を制御するのに充分強力である。

【0031】

上記及び下記に示されるように、線維芽細胞におけるｍｉＲ－２１阻害は、心臓のリモデリング及び機能障害を防止する。添付の図１４を参照。

【0032】

したがって、マクロファージ又は線維芽細胞におけるｍｉＲ－２１の排他的阻害は、線維症、特に肺線維症の治療において強力な医学的可能性を提供する。

【0033】

マクロファージ及び／又は線維芽細胞に含まれるｍｉＲ－２１の特異的標的化／阻害は、ｍｉＲ－２１の全身阻害と比較して有利であると考えられる。例えば、ｍｉＲ－２１の阻害剤の特異的送達、したがってマクロファージ及び／又は線維芽細胞におけるｍｉＲ－２１の特異的阻害は、筋細胞又は非筋細胞などの全ての細胞型における全体的な阻害のリスクを低減する。例えば、筋細胞における阻害は、特に急性疾患状態において有害である。したがって、添付の実施例に記載され、本明細書で説明されるように、ｍｉＲ－２１阻害剤と、前記ｍｉＲ－２１阻害剤を１又は複数のマクロファージに、所望によりさらに可能性のある１又は複数の線維芽細胞に送達する部分とを含む本発明の組成物／化合物を用いたマクロファージ及び／又は線維芽細胞におけるｍｉＲ－２１の特異的阻害による線維症の予防及び軽減は、線維症の有利な治療をもたらす。添付の実施例に記載されているように、マクロファージへのｍｉＲ－２１阻害剤の標的送達は、驚くほど高い抗線維症効果をもたらす（非標的ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１／非標的ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１阻害剤による以前に記載された効果よりも高い）。これは、本発明の予想外の知見である。実験の部分に記載されているように、マクロファージへのｍｉＲ－２１阻害剤（ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１）の優先的送達／優先的標的化及び線維芽細胞からのその相対的排除は、従来技術で提供されたｍｉＲ－２１の作用部位の線維芽細胞仮説に基づいて、あまり顕著な抗線維症効果をもたらさないと予想された。この「線維芽細胞仮説」は、ｍｉＲ－２１の発現は、ブレオマイシン処理肺の肺筋線維芽細胞並びに特発性肺線維症に罹患している患者の線維芽細胞病巣で増加したと考えたＬｉｕ （２０１０）（Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ． ２０７：１５８９-９７）により提唱された。前記著者ら（Ｌｉｕ（２０１０）（上記引用文））は、ブレオマイシン投与後に腹腔内にｍｉＲ－２１アンチセンスプローブを投与したところ、肺における減弱したコラーゲン沈着が観察された。しかしながら、線維症への直接的な影響は記載されておらず、前記著者らは、ブレオマイシンを投与した肺の（筋）線維芽細胞並びに特発性肺線維症に罹患している患者の線維芽細胞病巣でのｍｉＲ－２１発現の増加を確認した。Ｌｉｕ（２０１０）（上記引用文）によるこれらの知見とは対照的に、本発明者らは、とりわけ、疾患組織（肺だけでなく心臓においても）のマクロファージにおけるｍｉＲ－２１のさらに関連性の高い発現を記載している。特に、本発明者らは驚くべきことに、ｍｉＲ－２１がＣＯＶＩＤ－１９犠牲者の肺でアップレギュレートされたｍｉＲＮＡの上位にあることを見出した。添付の図１９を参照。ブレオマイシン投与後の肺については、添付の図２１を参照。前記ｍｉＲ－２１は、予想外にも、肺マクロファージにおいて最も豊富で濃縮されたマイクロＲＮＡでもある。添付の図１２及び図２０を参照。哺乳動物の肺におけるマクロファージの存在量が非常に高いため、発明者らは、肺のｍｉＲ－２１の大部分が肺マクロファージに由来すると結論付けた。したがって、本発明の驚くべき知見の１つは、マクロファージで特異的にｍｉＲ－２１を標的とすること（前記マクロファージに特異的に送達されるｍｉＲ－２１の阻害剤を介して）は、肺損傷、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症などウイルスによる感染などの感染症によって誘発される肺損傷を予防又は治療するための優れた治療原理を構成することである。添付の実施例にも記載されているように、驚くべきことに、（エアロゾル化）吸入を介したマクロファージへの特異的なｍｉＲ－２１の阻害剤の送達は、肺線維症を効率的に軽減し、肺機能の低下はｍｉＲ－２１のマクロファージ特異的阻害によって防止されたことがわかった。例えば、図２６を参照。本発明の組成物／化合物のこの高い効率は、先行技術から予見も予想もされていなかった。添付の実施例で提供され、本明細書で検討されるように、本発明者らは、高度に発現され、この細胞型に対して比較的選択的であり、その特定の受容体に対する（特定の）リガンドの取り込みに適した肺マクロファージの表面受容体を同定した。そのようなリガンドは、低分子リガンドであってもよく、タンパク質性リガンド（又はその機能的断片）も含み得る。前記低分子リガンド、前記タンパク質性リガンド（又はその機能的断片）は、好ましくは、マクロファージの細胞表面（及び所望により線維芽細胞上）の（表面）分子と特異的に相互作用することができる。一実施形態では、そのような相互作用はまた、例えばエンドサイトーシスを介して、本発明の組成物／化合物の内在化をもたらし得る。前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する部分としての抗体（又はｓｃＦｖなどのその機能的断片）の使用も本明細書で想定される。そのような抗体（又はその機能的断片）は、マクロファージ（及び所望により線維芽細胞）上の（表面）マーカー／受容体に特異的に結合し得る。添付の実施例では、肺及び心臓の初代細胞の単一細胞配列決定並びに選別され精製された細胞画分のディープＲＮＡシーケンシングを実施した。これらのデータのバイオインフォマティクス分析により、上記の基準を満たすいくつかの表面分子が得られた（添付の表３を参照）。その中で、ＭＲＣ１（マクロファージ受容体Ｃ型１）は、肺マクロファージで高度に特異的かつ高度に発現されることが証明された。肺マクロファージ上のマンノース受容体Ｃ型１の発現は、肺組織の免疫蛍光染色によってさらに検証された。添付の非限定的な実施例５及び図２２を参照。添付の図２７からも、心臓マクロファージでのマンノース受容体Ｃ型１の高発現が確認される。

【0034】

本発明者らは、ＭＲＣ１を使用して、ｍｉＲ－２１阻害剤を（ヒト）マクロファージに特異的に送達した。さらに、本発明者らは、吸入による局所送達と組み合わされたｍｉＲ－２１阻害剤のマクロファージ特異的標的化が、肺線維症を予防又は治療するための優れた治療原理を構成することを認識した。以下に示すように、本発明者らは、ｍｉＲ－２１阻害剤への化学リンカーを用いて、ＭＲＣ１（ここでは、トリマンノース、ＧａｌＮＡｃ）のリガンドを結合した（添付の非限定的な実施例５及び図２３を参照）。

【0035】

インビボ実験において、本発明者らは、これらの化合物の肺への送達を確認し、それらの動態を、蛍光標識とその後の蛍光細胞サイトメトリーによる検出によって追跡した。ｍｉＲ－２１の非標識阻害剤を含む組成物と比較して、ｍｉＲ－２１のマンノース共役阻害剤を含む組成物は、肺胞マクロファージのより高い画分割合へ送達され、マクロファージにおいてより高いレベルに達し、内皮細胞などの非マクロファージ細胞型ではより低いレベルに達した。実施例５並びに図２４及び図２５を参照。

【0036】

さらなるインビボ実験において、本発明者らは、ｍｉＲ－２１のマクロファージ標的化マンノース共役阻害剤を含む組成物の効率を試験した。この目的のために、肺線維症のマウスモデルを使用した。マウスは、肺傷害誘導の４日後に吸入によりエアロゾル化された組成物を投与された。以下の実施例５及び図２６に示されるように、前記組成物を投与されたマウスでは肺線維症が軽減された。したがって、この治療原理は、最も関連する機能的及び構造的パラメーターによって決定されるように、肺機能障害及び肺線維症に対しても有意に有効であった。

【0037】

本明細書及び特定の態様で提供される科学的エビデンスに従って、本発明は、本明細書で定義される組成物／化合物、すなわち、ｍｉＲ－２１阻害剤を含み、ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する部分を含む組成物／化合物に関する。これらの本発明の組成物／化合物は、特に肺線維症の医学的介入において使用される。ｍｉＲ－２１阻害剤と、前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する部分とを含む組成物／化合物は、肺線維症の予防にも使用され得る。例えば、本発明の化合物／組成物は、肺の損傷につながる可能性のある障害／疾患の初期段階、例えば肺補助法又は人工呼吸を必要とする感染の初期段階及び／又は疾患の段階で使用されることが想定される。したがって、本発明はまた、医学的介入並びに例えば成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）に続く肺線維症の予防においても有用である。

【0038】

ある態様では、本発明は、組成物、及び肺線維症の治療におけるその使用に関し、前記組成物は、ｍｉＲ－２１阻害剤と、前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージ及び／又は線維芽細胞に送達する部分とを含む。

【0039】

本明細書の上記及び下記で提供される定義及び説明は、線維症、特に肺線維症の治療に使用するための組成物／化合物、本明細書で提供される組成物／化合物、前記組成物／化合物の製造方法、肺線維症の治療における前記組成物／化合物の使用、及び本明細書で提供される治療方法に適用される。

【0040】

本明細書で使用する「ｍｉＲ」という用語は、「マイクロリボ核酸」又は「ｍｉＲＮＡ」という用語と交換可能に使用することができる。

【0041】

本明細書で使用される場合、ｍｉＲ－２１は、ｍｉＲＮＡ－２１、特に、以下の添付の図１Ｂに示されるｍｉＲ－２１ａ－５ｐ又はｍｉＲ－２１－５ｐを指す。

【0042】

本明細書で使用される場合、「ｍｉＲ－２１阻害剤」は、内因性ｍｉＲ－２１に特異的に結合して阻害する分子を指す。したがって、ｍｉＲ－２１阻害剤の標的はｍｉＲ－２１であり得る。ｍｉＲ－２１の標的はまた、ｍｉＲ－２１の下流の標的を包含すると理解され得る。前記ｍｉＲ－２１阻害剤は、ｍｉＲ－２１の標的ｍＲＮＡ及び／又は少なくとも１つの標的ｍＲＮＡのレベルを上昇させる。例えば、ｍｉＲ－２１に少なくとも相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを介したｍｉＲ－２１の阻害は、Ｓｐｒｏｕｔｙ（細胞シグナル伝達に関与する発生タンパク質）及び同種のものであるｍｉＲ－２１の標的の抑制解除又は過剰発現にさえ至る。ｍｉＲ－２１阻害剤の投与後のｍｉＲ－２１阻害効果は、当技術分野で公知の様々な方法によって評価することができる。例えば、ｍｉＲＮＡレベルは、インビトロ又はインビボで細胞又は組織において定量化／決定することができる。ｍｉＲＮＡレベルの変化は、マイクロアレイ解析によって測定できる。ｍｉＲＮＡレベルの変化は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ａｓｓａｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）などのいくつかの市販のＰＣＲアッセイのいずれかで測定できる。例えば、ｍｉＲ－２１阻害剤の投与によるｍｉＲ－２１阻害は、ｍｉＲＮＡの標的のｍＲＮＡ及び／又はタンパク質レベルを測定することによって評価される。添付の実施例で示されるように、ｍｉＲ－２１の欠失により誘導されるｍｉＲ－２１の阻害は、ｍｉＲ－２１のレベルの約＞９０％の劇的な減少をもたらした。さらに、阻害剤は当技術分野において公知である。例えば、Ｔｈｕｍ（２００８）（Ｎａｔｕｒｅ ４５６：９８０-９８４）、Ｚｈａｎｇ（２０１５）（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７５（９）：１-９）、又はＡｒｄｉｔｅ（２０１２）（Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９６（１）：１６３-１７５）を参照。また、ｍｉＲ－２１阻害剤は、さらに試行錯誤することなく特定できる。ｍｉＲ－２１に少なくとも部分的に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドから構成されるｍｉＲ－２１阻害剤の例は、本明細書で証明されている。例えば、添付の図１Ｂ（ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１オリゴヌクレオチドを示す）、添付の図２３Ｂ（「ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１部分」（ｍｉＲ－２１阻害剤）を含む本発明の２つの例示的な化合物／構築物並びに前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する部分、すなわちここではトリマンノース又はＮ－アセチルガラクトサミンを示す）、又は添付の図２６Ａ（とりわけ、「ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１リンカー－マンノース」の形式であり、添付の配列番号３にも示されるオリゴヌクレオチドを含む本発明の例示的な構築物を示す）を参照。したがって、例示される「ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１」オリゴヌクレオチドは、限定されないが、アンチセンス－ｍｉＲ－２１ ３´－ｔＣｇＡａＴａＧｔＣｔＧａＣＴ－５´（配列番号１）及び／又はアンチセンス－ｍｉＲ－２１ ３´－ＴＣｇＡａＴａｇＴＣｔｇＡｃＴ－５´（配列番号２）を含み、それにより本明細書ではＬＮＡ－ＤＮＡコンストラクトが示される（本明細書では「ミックスマー（ｍｉｘｍｅｒ）」と称される）。大文字はロックド（ｌｏｃｋｅｄ）核酸ヌクレオチド（ＬＮＡ）を表し、小文字はＤＮＡ塩基を表し、全ての大文字の「Ｃ」は本明細書では５－メチル－シトシンを表す。したがって、これらの２つの配列３´－ｔＣｇＡａＴａＧｔＣｔＧａＣＴ－５´及び３´－ＴＣｇＡａＴａｇＴＣｔｇＡｃＴ－５´は、「ミックスマー」、すなわちＬＮＡヌクレオチド及びＤＮＡヌクレオチドを含むコンストラクトを構成する－配列番号３は、ＬＮＡオリゴヌクレオチドを表す有用な「ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１」も表す（したがって、例示される配列番号３は、配列番号１及び配列番号２と同じヌクレオチド配列を含むが、全てのロックドヌクレオチド、５’－メチル－シトシン修飾、及びホスホロチオエート骨格を有するＬＮＡコンストラクトを表す）。さらに有用であるが非限定的な「ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１」オリゴヌクレオチドは、配列番号７～９を含む。配列番号７は、配列番号１及び配列番号２と同じヌクレオチド配列を含むが、全てのロックドヌクレオチド及び５’－メチル－シトシン修飾を有し、ホスホロチオエート骨格を有さないＬＮＡコンストラクトである。配列番号８は、配列番号１及び配列番号２と同じヌクレオチド配列を含むが、全てのロックドヌクレオチド及びホスホロチオエート骨格を有し、５’－メチル－シトシン修飾を有さないＬＮＡコンストラクトである。配列番号９は、配列番号１及び配列番号２と同じヌクレオチド配列を含むが、全てのロックドヌクレオチドを有し、任意の５’－メチル－シトシン修飾及びホスホロチオエート骨格を有さないＬＮＡコンストラクトである。上記と同様に、本明細書で提供される配列において、大文字はＬＮＡを指し、小文字はＤＮＡ塩基を指す。全ての大文字のＣは、５－メチル－シトシンを表す。ｍｉＲ－２１に対するアンチセンスｍｉＲは、完全なＰＳ（ホスホロチオエート）骨格を有し得る。配列番号１も参照。また、本明細書の以下で説明するように、特に有用なアンチセンス－ｍｉＲ－２１分子は、配列番号１及び配列番号２で提供され、最も好ましいのは、添付の実施例に示されるように、以下の「ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１」：３´－ｔＣｇＡａＴａＧｔＣｔＧａＣＴ－５´（配列番号１）である。しかし、本発明は決してこれらの特定のオリゴヌクレオチドに限定されない。当業者は、さらなる「ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１」コンストラクト／オリゴヌクレオチドも本発明の文脈で使用できることを承知している。そのような「ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１」コンストラクト／オリゴヌクレオチドは、例えば、ＲＮＡコンストラクト、ＰＮＡ（ペプチド核酸）及び同種のものを含み得る。また、ａｎｔｉ－マイクロＲＮＡオリゴヌクレオチドのモルホリノオリゴマー（ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー）、アンタゴマー（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）／ブロックマー（ｂｌｏｃｋｍｉｒ）、ＺＥＮ（Ｎ，Ｎ－ジエチル－４－（４－ニトロナフタレン－１－イルアゾ）－フェニルアミン）－修飾などの、前記ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１オリゴヌクレオチドのさらなる修飾も想定される。さらに有用な修飾については、とりわけＫｈｖｏｒｏｖａ （２０１７） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ ３５， ２３８－２４８のレビューにも記載されている。

【0043】

Ｓｕｎ（２０１９）（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１５５／２０１９／６７８２６５３）において論じられているように、ｍｉＲ－２１の阻害は、ｍｉＲＮＡスポンジ、ｍｉＲＮＡマスクなどの手段によっても、本明細書で詳述されるようにａｎｔｉ－ｍｉＲＮＡオリゴヌクレオチド（ａｎｔｉ－ｍｉＲ）によっても達成できる。ａｎｔｉ－ｍｉＲは、目的の内因性ｍｉＲＮＡに直接結合し、ｍｉＲＩＳＣ複合体の破壊を通じてｍｉＲＮＡによるｍＲＮＡ翻訳の抑制をブロックするように設計された一本鎖合成オリゴヌクレオチドである。

【0044】

ｍｉＲＮＡスポンジは、内因性標的からｍｉＲＮＡを隔離するおとりとして機能する複数の結合部位を有する転写産物である。それらは、単一の特定のｍｉＲＮＡ又は共通のシード領域を共有する関連ｍｉＲＮＡのファミリー全体を標的化にするように設計できる。

【0045】

ｍｉＲＮＡマスクは、標的ｍＲＮＡの３ＵＴＲにある早期ｍｉＲＮＡ結合部位と完全に塩基対形成する一本鎖修飾オリゴヌクレオチドである。本発明の文脈において、「ｍｉＲＮＡスポンジ」又は「ｍｉＲＮＡマスク」を用いてｍｉＲ－２１を阻害することが想定されるが、本発明の文脈におけるｍｉＲ－２１を特異的に標的とするａｎｔｉ－ｍｉＲＮＡオリゴヌクレオチド（ａｎｔｉ－ｍｉＲ）を使用することが好ましい。

【0046】

本明細書で使用される「ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する部分」又はその文法的変形は、担体、及び／又はｍｉＲ－２１の阻害剤をマクロファージに送達する部分を指す。担体及び／又は部分は、マクロファージ又は標的細胞でｍｉＲ－２１の阻害剤を濃縮する。本明細書で使用されるように、前記標的細胞は１又は複数のマクロファージ及び／又は１又は複数の線維芽細胞であり、好ましくは、標的細胞は１又は複数のマクロファージである。好ましい態様において、前記マクロファージ及び／又は線維芽細胞は、肺マクロファージ及び／又は肺線維芽細胞である。より好ましい態様では、前記マクロファージ及び／又は線維芽細胞は、肺胞マクロファージ及び／若しくは肺胞線維芽細胞並びに／又は間質マクロファージ及び／若しくは間質線維芽細胞である。ある態様では、担体及び／又は部分は、ｍｉＲ－２１の阻害剤のエンドサイトーシスをもたらす。エンドサイトーシスは、ｍｉＲ－２１阻害剤の取り込みを増加させることができる。特定の態様では、前記組成物に含まれる部分及び／又は担体は、前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージ又は複数のマクロファージに送達する。前記組成物に含まれる部分及び／又は担体は、前記ｍｉＲ－２１阻害剤を１又は複数の線維芽細胞にさらに送達し得る。以下に示すように、線維芽細胞におけるｍｉＲ－２１の欠失は、有益な効果を提供する。したがって、前記組成物に含まれる部分及び／又は担体は、前記ｍｉＲ－２１阻害剤を１又は複数のマクロファージ及び／又は１又は複数の線維芽細胞に送達し得る。特定の態様では、前記組成物に含まれる部分及び／又は担体は、前記ｍｉＲ－２１阻害剤を１又は複数のマクロファージ及び１又は複数の線維芽細胞に送達する。好ましい局面において、前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する担体及び／又は部分は、前記ｍｉＲ－２１阻害剤、すなわち本発明の化合物の両方の部位に連結される、すなわち「ｍｉＲ－２１阻害剤」と「ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する部分」とが１つの分子に含まれている。前記分子はまた、「リンカー」及び／又は「マーカー」（蛍光マーカーなど）などの追加の「部分」及び／又は部位を含んでいてもよい。そのようなマーカーは、「リンカー」構造の一部であってもよい。対応する例を以下に提供し、一例を添付の図２３Ｂの上部に示す（「リンカー」が「フルオレセインアミダイト誘導体」／ＦＡＭを含むＧａｌＮＡｃ結合ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１－ＦＡＭ）。

【0047】

特定の好ましい態様では、前記組成物に含まれる担体及び／又は部分は、関連する標的細胞、本明細書では特にマクロファージのみに前記ｍｉＲ－２１阻害剤を送達する。したがって、特定の態様では、前記組成物に含まれる担体及び／又は部分は、前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージ及び／又は線維芽細胞のみに送達する。添付の例では、ｍｉＲ－２１はマクロファージ又は線維芽細胞で欠失された。したがって、添付の実施例は、マクロファージにおけるｍｉＲ－２１の特異的な欠失／阻害を示す。よって、本明細書で使用される場合、「ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージのみに送達する」という用語は、前記阻害剤がマクロファージのみに送達されることを意味する。本明細書で使用される場合、「ｍｉＲ－２１阻害剤を繊維芽細胞のみに送達する」という用語は、前記阻害剤が繊維芽細胞のみに送達されることを意味する。したがって、前記部分及び／又は担体は、前記ｍｉＲ－２１阻害剤を、マクロファージ及び／又は線維芽細胞ではない他の細胞型に送達しない。特に、本発明の組成物に含まれる部分及び／又は担体は、前記ｍｉＲ－２１阻害剤を筋細胞に送達しない。よって、特定の態様では、前記組成物に含まれる担体及び／又は部分は、前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージのみに送達し、前記部分及び／又は担体は、前記ｍｉＲ－２１阻害剤を筋細胞に送達しない。添付の実施例及び本明細書で説明される通り、マクロファージにおけるｍｉＲ－２１阻害剤は、線維芽細胞に対する傍分泌線維化促進性シグナル伝達を制御することが記載されている。よって、特定の態様では、前記部分及び／又は担体は、前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージ及び線維芽細胞のみに送達する。ある態様では、前記部分及び／又は担体は、前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージ及び線維芽細胞に送達し、前記部分及び／又は担体は、前記ｍｉＲ－２１阻害剤を筋細胞に送達しない。

【0048】

特定の態様では、前記ｍｉＲ－２１阻害剤は、肺マクロファージ及び／又は肺線維芽細胞に送達される。特定の態様では、前記ｍｉＲ－２１阻害剤は肺細胞に送達される。最も好ましい局面において、前記ｍｉＲ－２１阻害剤は、肺マクロファージに送達される。本明細書で提供される組成物の投与は、肺又は肺標的細胞への送達を提供する。特定の態様では、前記ｍｉＲ－２１阻害剤は、肺マクロファージ及び肺線維芽細胞に送達される。好ましい局面において、肺細胞への送達は、肺への組成物の投与によって提供される。よって、前記組成物は、肺投与によって投与されるものである。例えば、前記組成物はエアロゾル化された組成物によって対象の肺に投与されるものである。特に、前記組成物が、エアロゾル化された組成物によって、吸入により対象の肺に投与されるか又は肺、気管支、及び／若しくは気道への局所投与の他の手段によって肺に投与される。特定の実施形態において、組成物は、吸入による投与のために調製される。吸入用のそのような組成物のいくつかは、加圧パック又はネブライザー内のエアロゾルスプレーの形態で調製される。このような組成物のいくつかは、噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、又は他の適切なガスを含む。加圧エアロゾルを使用する特定の実施形態では、投薬単位は、計量された量を送達するバルブで決定され得る。特定の実施形態では、吸入器（ｉｎｈａｌｅｒ）又は注入器（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｏｒ）で使用するためのカプセル及びカートリッジを処方することができる。このような製剤のいくつかは、組成物とラクトース又はデンプンなどの適切な粉末基剤との粉末混合物を含む。気道及び肺の特定の部分を標的とするネブライザー装置を使用して液滴のサイズを調節するための製剤及び方法は、当業者に周知である。追加の適切な装置には、乾燥粉末吸入器又は定量吸入器が含まれる。

【0049】

本明細書で提供される組成物はまた、動脈内投与によって、好ましくは心臓内投与によって、より好ましくは冠動脈内投与によって投与することができる。以下に示すように、前記ｍｉＲ－２１阻害剤の冠動脈内投与は肺線維症を軽減する。したがって、特定の実施形態では、対象への投与は、動脈内投与を含む。特定の実施形態において、対象への投与は、心臓内投与を含む。心臓内投与のための適切な手段には、カテーテルの使用又は開心術中の投与が含まれる。

【0050】

さらに、前記ｍｉＲ－２１阻害剤はまた、１又は複数の心臓マクロファージに送達されていてもよい。添付の実施例に示されるように、心臓マクロファージへのｍｉＲ－２１阻害剤の送達は、肺線維症を減少させた。図１３Ｄを参照。したがって、前記ｍｉＲ－２１阻害剤は、特定の態様において１又は複数の心臓マクロファージに送達される。さらなる特定の態様では、前記ｍｉＲ－２１阻害剤は、１又は複数の肺マクロファージ及び／又は１又は複数の心臓マクロファージに送達される。さらなる特定の態様では、前記ｍｉＲ－２１阻害剤は、１又は複数の肺マクロファージ及び／又は１又は複数の肺線維芽細胞へ、並びに／又は１又は複数の心臓マクロファージ及び／又は１又は複数の心臓線維芽細胞へ送達される。しかし、本発明の文脈において、ｍｉＲ－２１阻害剤と、前記ｍｉＲ－２１阻害剤を心臓マクロファージに送達する部分とを含む本発明のそのような化合物／組成物は、肺線維症の医学的介入だけでなく、例えば、心臓の線維症などの他の線維症事象においても使用されることも想定される。

【0051】

以下に示すように、ｍｉＲ－２１阻害剤の心臓投与は肺線維症を減少させた。以下例えば添付の図１３Ｄを参照。本明細書で使用される「肺（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ）線維症」又は「肺（ｌｕｎｇ）線維症」という用語は、交換可能に使用することができる。したがって、特定の態様では、前記化合物は、対象の肺（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ）線維症／肺（ｌｕｎｇ）線維症の治療に使用するためのものである。より具体的な態様では、肺線維症は人工呼吸関連肺線維症であり得る。さらにより好ましい態様では、肺線維症は、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）における人工呼吸関連肺線維症であり得る。本明細書で提供される組成物は、ＡＲＤＳ（急性呼吸窮迫症候群）が続き、その後線維症が続く肺損傷（例えば、感染、圧力及び／又は換気によって誘発される）の治療の使用に特に適し得る。本明細書で提供される組成物は、線維症の予防又は治療にも適し得る。したがって、本明細書で提供される組成物は、肺線維症の発症に先立つ肺損傷及び／又はＡＲＤＳの治療における治療又は予防にも適し得る。

【0052】

肺線維症に罹患している対象はさらに、肺疾患又は肺障害を有する／罹患している／診断されていてもよい。肺疾患又は肺障害は、線維症、好ましくは肺線維症を引き起こすか又はそれに関連している可能性がある。好ましい態様では、前記肺疾患又は肺障害が、ウイルス及び／若しくは細菌によって引き起こされるか、炎症に関連しているか、慢性閉塞性肺疾患であるか、又は特発性肺線維症である。線維症も炎症を引き起こす場合があり、本明細書で提供される組成物は、そのような炎症の治療に使用することができる。より好ましい態様では、肺疾患又は肺障害は、ウイルス感染であり、及び／又は肺疾患又は肺障害は、ウイルス感染に基づく又は関連している。さらなる態様において、肺疾患又は肺障害は、ウイルス感染及び／又は細菌感染である。したがって、本発明に従って治療される対象は、ウイルス感染及び／又は細菌感染に関連する肺疾患／障害に罹患している可能性がある。すなわち、前記対象は、両方の種類の感染症にも罹患している可能性がある。より好ましい局面において、肺疾患又は肺障害は、ウイルス性肺炎感染症である。より好ましい態様では、肺疾患又は肺障害は、コロナウイルス疾患である。より好ましい態様では、肺疾患又は肺障害は、ＣＯＶＩＤであり、及び／又はＳＡＲＳ又はＭＥＲＳを引き起こしている又はそれらに関連している。より好ましい態様では、前記肺疾患又は肺障害が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１によって引き起こされる又は誘発される。特に好ましい態様において、肺疾患又は肺障害は、ＣＯＶＩＤ－１９である。本発明者らは、そのような罹患した対象はｍｉＲ－２１レベルが増加しているため、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１によって引き起こされる又は誘発されるウイルス感染及び／又は細菌感染に関連するか又はそれらによって引き起こされる肺線維症を治療することができると想定した。本発明者らは、驚くべきことに、肺疾患又は肺障害に罹患している対象の肺でｍｉＲ－２１が増加していることを見出した。以下の図１３Ａ及び図１３Ｂを参照。ｍｉＲ－２１阻害剤による治療は、肺線維症を軽減した。以下に示すように、マクロファージ又は線維芽細胞におけるｍｉＲ－２１の阻害は、線維症を減少及び／又は予防する。したがって、マクロファージ及び／又は線維芽細胞へのｍｉＲ－２１の阻害剤の送達は妥当性があるものとなる。したがって、本明細書で提供される組成物及びその使用は、肺疾患又は肺障害によって引き起こされる及び／又はそれらに関連する肺線維症の治療に使用することができる。特定の態様では、本発明は、対象の肺線維症の治療における組成物の使用に関し、前記対象は、肺疾患又は肺障害に罹患しており、並びに前記組成物は、ｍｉＲ－２１阻害剤と、前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する部分とを含む。さらに特定の態様では、本発明は、対象の肺線維症の治療における前記組成物の使用に関し、前記対象は、肺疾患又は肺障害に罹患しており、並びに前記医薬組成物は、ｍｉＲ－２１阻害剤と、前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージ及び／又は線維芽細胞に送達する部分とを含む。

【0053】

さらにより好ましい態様では、前記肺疾患又は肺障害が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１によって引き起こされる又は関連している。

【0054】

特定の態様では、本発明で治療される肺線維症は、肺補助法又は人工呼吸によって引き起こされるか又はそれらに関連している。さらなる態様において、本発明において治療される肺線維症は、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）に続くか、又はそれに関連している。

【0055】

さらなる態様では、本明細書で提供される組成物は、心臓線維症、肺線維症、肝線維症、腎線維症、皮膚線維症、加齢性線維症、及び／又は脾臓線維症からなる群から選択される線維症の治療に使用することができる。例えば、本明細書で提供される組成物は、肺線維症及び／又は心臓線維症の治療に使用することができる。本明細書の以下に示すように、ｍｉＲ－２１阻害剤による心臓線維症の治療は、肺線維症をさらに減少／緩和した。ある態様では、本明細書で提供される組成物は、マクロファージ関連線維症の治療に使用することができる。

【0056】

本明細書で提供される治療はまた、線維症、好ましくは肺線維症に罹患し、肺疾患又は肺障害、心疾患又は心障害、及び肝疾患又は肝障害から選択される少なくとも１つの疾患又は障害をさらに有する対象に実施されてもよい。特に、線維症、好ましくは、肺線維症は肺疾患又は肺障害及び／又は心疾患又は心障害に関連している。特定の態様では、前記対象は、肺疾患又は肺障害を有し、さらに心疾患又は心障害、及び／又は肝疾患又は肝障害を有する。

【0057】

本明細書で使用される場合、治療される対象は、好ましくはヒト、すなわちヒト患者である。

【0058】

ある態様では、前記心疾患又は心障害は、線維症、例えば肺線維症を引き起こすか又はそれに関連している。さらなる態様では、前記心疾患又は心障害が、心不全、虚血、虚血後心不全、心肥大、高血圧性心不全、拡張期心不全、収縮期心不全、心臓関連蓄積症、心筋症、収縮性心膜炎、冠動脈疾患、急性心筋梗塞、慢性心筋梗塞、右心不全、心不整脈、心筋炎関連線維症、及び心臓弁膜症からなる群から選択される。したがって、本明細書で提供される肺線維症の治療を受ける対象は、肺線維症を引き起こすか又はそれに関連する任意のさらなる疾患又は障害／状態に罹患している可能性がある。

【0059】

特定の態様では、本明細書で提供される組成物／本発明に関連して本明細書に記載される化合物は、線維症、特に肺線維症を予防及び／又は軽減する。さらに特定の態様では、本明細書で提供される組成物／化合物は、マクロファージの炎症誘発性極性化を予防又は低減し、炎症、筋線維芽細胞の形質転換、及び／又は肺の線維症（すなわち、肺線維症）を予防する。したがって、治療される肺線維症は、マクロファージから分泌される線維芽細胞活性化因子及び／又は線維芽細胞阻害因子の調節によっても刺激され得る。

【0060】

特定の態様では、本発明に関連して本明細書に記載される組成物／化合物は、急性傷害／疾患／障害の少なくとも約５日後に対象／患者に投与される。特定の態様では、前記組成物は、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）の少なくとも約５日後に対象に投与される。しかし、医学的介入を必要とする患者は、可能な限り早い時点で本発明の化合物／組成物を投与されることが想定される。さらなる特定の態様において、前記組成物は、虚血の少なくとも約５日後に対象に投与されるものである。以下に示すように、虚血（心臓）の少なくとも５日後に前記ｍｉＲ－２１阻害剤を投与すると、虚血後の心筋における取り込み及び治療効果が予想外に増加した。ｍｉＲ－２１阻害剤の取り込みの増加は、虚血直後にのみ予想されため、ｍｉＲ－２１阻害剤の取り込みが増加したという知見は、虚血の５日後では予想外であった。急性傷害／疾患／障害の状況では、前記ｍｉＲ－２１の阻害剤、特にアンチセンスｍｉＲ－２１の取り込みが増加する。これは、内皮漏出及び細胞外マトリックスの溶解が原因である場合がある（理論に拘束されるものではない）。よって、驚くべきことに、前記ｍｉＲ－２１阻害剤の投与により、急性傷害／疾患／障害（例えば、虚血又はＡＲＤＳ）の約５日後であっても、前記ｍｉＲ－２１阻害剤の取り込みが増加することが本明細書に記載されている。したがって、急性傷害／疾患／障害（例えば、虚血又はＡＲＤＳ）の少なくとも約５日後の前記ｍｉＲ－２１阻害剤の投与は、急性傷害／疾患／障害（例えば、虚血又はＡＲＤＳ）での投与と比較してより安全であり得る。そのような遅延投与は、急性環境における有害な影響を回避するためである。本明細書において、急性傷害／疾患／障害とは、傷害／疾患／障害により対象において前記ｍｉＲ－２１阻害剤の取り込みが亢進している状況をいう。したがって、急性時は、前記ｍｉＲ－２１阻害剤の取り込みは、対象が傷害／疾患／障害に罹患していない状態と比較して増加する。

【0061】

ある態様では、本発明の組成物／化合物は、前記対象／患者に、急性傷害／疾患／障害、特に成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）又は虚血の少なくとも約３日、少なくとも約４日、少なくとも約５日、少なくとも約６日、少なくとも約７日、少なくとも約８日、少なくとも約９日、少なくとも約１０日、少なくとも約１１日、少なくとも約１２日、少なくとも約１３日、少なくとも約１４日、少なくとも約１５日、少なくとも約１６日、少なくとも約１７日、少なくとも約１８日、又は少なくとも約１９日後に投与されるものである。特に、前記組成物は、さらに成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）の少なくとも約１９日後に対象に投与される。ある態様では、前記組成物は、急性傷害／疾患／障害、特に成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）又は虚血の少なくとも約１９日、２０日、３０日、又は４０日後に前記対象に投与されるものである。概して、本明細書では、驚くべきことに、遅延投与、すなわち、例えば虚血又はＡＲＤＳなどの急性事象の後の投与が、有益な治療効果を提供することが実証された。したがって、急性事象後のそのような投与は、急性疾患又は障害時における投与と比較して有利である。したがって、特定の態様では、本明細書で提供される組成物／化合物は、例えば、急性心疾患若しくは心障害及び／又は急性肺疾患若しくは肺障害などの急性疾患又は障害時に投与されない。したがって、前記ｍｉＲ－２１阻害剤と、前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージ及び／又は線維芽細胞に送達する部分とを含む組成物／化合物は、前記肺疾患若しくは肺障害及び／又は前記心疾患若しくは心傷害の慢性期に投与されることが好ましい。したがって、一例として、本発明の化合物／組成物を必要とする患者に、前記ｍｉＲ－２１阻害剤を含み、前記ｍｉＲ－２１阻害剤を、例えば肺線維症などの慢性期のマクロファージに送達する部分を含む組成物／化合物を提供することが想定される。対応するシナリオは、例えば、感染体が患者においてもはや検出可能ではないが、（肺）損傷が持続する又は悪化することさえある場合に、感染（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２など）によって引き起こされる肺線維症における本発明の化合物／組成物の医学的／薬学的使用である。これは、例えば、いわゆる「ロングＣＯＶＩＤ」患者の場合に当てはまる場合がある。しかし、例えば、感染によって引き起こされる肺線維症のような肺損傷の予防においてさえも、投薬を必要とする患者に可能な限り早い時点で同じものが提供されることが想定されることに留意されたい。

【0062】

驚くべきことに、約１０ｍｇの前記ｍｉＲ－２１阻害剤を含む単回用量での組成物の投与は、治療効果及び線維症の低下を提供し、例えば、前記ｍｉＲ－２１阻害剤の単回投与は、ｍｉＲ－２１及びとｍｉＲ－２１によって引き起こされる負担を軽減したことが本明細書の以下にも示されている。したがって、特定の態様では、前記組成物は、約１０ｍｇの前記ｍｉＲ－２１阻害剤を含む単回用量で投与される。さらに特定の態様では、前記組成物は、約１０ｍｇ以下の前記ｍｉＲ－２１阻害剤を含む単回用量で投与される。例えば、前記組成物は、約１ｍｇ、約２ｍｇ、約３ｍｇ、約４ｍｇ、約５ｍｇ、約６ｍｇ、約７ｍｇ、約８ｍｇ、又は約９ｍｇのｍｉＲ－２１阻害剤を含む単回用量で投与される。本発明者らは、前記組成物の肺投与は、１０ｍｇ未満の前記ｍｉＲ－２１阻害剤を必要とすることを想定している。さらなる態様において、本発明の組成物／化合物は、本発明の組成物／化合物の約１ｍｇ～約１ｇを含む用量で、医学的介入を必要とする患者に投与されるものである。投与される前記用量は、単回用量であり得る。投与は、例えば、吸入による／エアロゾルとしてあり得る。さらに特定の態様では、前記組成物／化合物は、本発明の組成物／化合物を約１０ｍｇ～約９００ｍｇ含む単回用量で投与されるものである。例えば、前記組成物／化合物は、約１００ｍｇ～約８００ｍｇの前記組成物を含む単回用量で投与することができる。したがって、本発明者らは、前記組成物／化合物の肺投与は、個々の用量当たり約１ｍｇ～約１ｇの本発明の組成物／化合物を必要とすることを想定している。前記肺投与は、吸入を介して、例えばエアロゾルの形態で達成することができる。

【0063】

本明細書の上記及び下記に提供されるように、前記組成物は、前記ｍｉＲ－２１阻害剤と、前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する部分とを含む。上記のように、担体及び／又は部分は、マクロファージ又は標的細胞でｍｉＲ－２１の阻害剤を濃縮する。したがって、前記担体及び／又は部分は、マクロファージ又は標的細胞で前記組成物を濃縮する、例えば、前記担体及び／又は部分は、マクロファージ及び線維芽細胞で前記組成物を濃縮する。ある態様では、前記組成物に含まれる部分及び／又は担体は、前記組成物を１又は複数の線維芽細胞に送達し得る。さらなる特定の態様では、前記組成物に含まれる部分及び／又は担体は、前記組成物を１又は複数のマクロファージ及び／又は１又は複数の線維芽細胞に送達することができる。さらなる特定の態様では、前記組成物に含まれる部分及び／又は担体は、前記組成物を１又は複数のマクロファージ及び１又は複数の線維芽細胞に送達する。したがって、特定の態様は、前記ｍｉＲ－２１阻害剤が標的細胞に送達されることである。例えば、前記ｍｉＲ－２１阻害剤を標的に送達する担体及び／又は部分は、必ずしも標的細胞に入るわけではない。この場合好ましくは標的細胞がマクロファージ及び／又は線維芽細胞であり、又はより好ましくは標的細胞がマクロファージである。

【0064】

本明細書で使用される場合、前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する「担体」、「部分」、又は「部位」は、それら「担体」、「部分」、又は「部位」が標的細胞の細胞表面での前記ｍｉＲ－２１阻害剤の濃縮を示す限り、必ずしも限定されない。この場合好ましくは標的細胞がマクロファージ及び／又は線維芽細胞であり、又はより好ましくは標的細胞がマクロファージである。マクロファージ及び／又は線維芽細胞の標的化は、当技術分野で公知である。より好ましくは、前記「担体」又は「部分」は、標的細胞の細胞表面で前記ｍｉＲ－２１阻害剤の濃縮を示し、前記ｍｉＲ－２１阻害剤が標的細胞に入る。この場合好ましくは標的細胞がマクロファージ及び／又は線維芽細胞であり、又はより好ましくは標的細胞がマクロファージである。さらにより好ましくは、前記「担体」、「部分」、又は「部位」は、標的細胞の細胞表面で前記ｍｉＲ－２１阻害剤の濃縮を示し、前記ｍｉＲ－２１阻害剤が標的細胞に入り、前記ｍｉＲ－２１阻害剤はｍｉＲ－２１の標的を抑制又は過剰発現する。この場合好ましくは標的細胞がマクロファージ及び／又は線維芽細胞であり、又はより好ましくは標的細胞がマクロファージである。

【0065】

特定の態様では、前記部分又は担体は、ナノ粒子、リポソーム、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、メソポーラスシリカナノ粒子（ＭＳＮ）、抗体又はその機能的断片、及び低分子リガンド（添付の実施例のように、糖又は修飾された糖部分がリガンドとして使用される）並びに（タンパク質性）リガンド又はその機能的断片からなる群から選択される。（低分子）リガンドはまた、マクロファージの表面（及び所望により線維芽細胞の表面）上のマーカー／受容体と相互作用することができる化学物質及び／又は医薬品を含み得る。

【0066】

マクロファージ（及び所望により線維芽細胞）の表面上の対応する（表面）マーカー／受容体と相互作用することができる（タンパク質性）リガンド又は１又は複数のその機能的断片についても、必要により修正を加えて、同様である。例えば、そのような「タンパク質性リガンド」は、本明細書で定義される１又は複数の細胞表面受容体と特異的に相互作用及び／又は特異的に結合する抗体（又はその機能的断片）も含み得る。さらに、「リガンド」という用語は、より小さなペプチド又はペプチド構造も含む。そのような「ペプチドリガンド」の例は、Ｓｃｏｄｅｌｌｅｒ（２０１７）（Ｓｃｉ Ｒｅｐ ７：１４６５５）に開示されるように、ペプチド「Ｃ－Ｓ－Ｐ－Ｇ－Ａ－Ｋ－Ｖ－Ｒ－Ｃ」（配列番号６：ＣＳＰＧＡＫＶＲＣ）であり得る。前記ペプチドは、ＭＲＣ１、すなわちマクロファージ上の細胞表面受容体に対する相互作用ペプチドである。前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する「部分」は、マクロファージ上の関連する細胞表面受容体（及び／又は所望により線維芽細胞）と相互作用／結合できる脂質構造だけでなく、ナノボディ及び同種のものも含み得る。

【0067】

マクロファージへの阻害剤の送達は、当業者に公知である。例えば、（Ｊｕｌｉａｎｏ， ２０１６） Ｊｕｌｉａｎｏ ＲＬ； Ｔｈｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０１６ Ａｕｇ １９；４４（１４）：６５１８－４８． ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｗ２３６． Ｅｐｕｂ ２０１６ Ａｐｒ １５）。以下の非限定的な例では、ｍｉＲ－２１阻害剤の標的細胞への送達が提供される。さらなる態様において、前記部分は、マクロファージ、線維芽細胞及びマクロファージ、肺マクロファージ、又は肺線維芽細胞及び肺マクロファージ上に見出される少なくとも１つの抗原に結合する。

【0068】

さらなる特定の態様では、前記部分は、マクロファージ、線維芽細胞及びマクロファージ、肺マクロファージ、又は肺線維芽細胞及び肺マクロファージ上のみに見出される少なくとも１つの抗原に結合する。さらなる特定態様において、前記部分は、マクロファージ、線維芽細胞及びマクロファージ、肺マクロファージ、又は肺線維芽細胞及び肺マクロファージ上のみに見出される少なくとも１つの抗原に特異的に結合する。本明細書で使用される「特異的に結合する」及び／又は「特異的に及び／又は主に結合するか相互作用する」という用語は、前記部分が、標的細胞の表面上（すなわち、ここでは特にマクロファージ上）の少なくとも１つの抗原及び／又は受容体／マーカーに対して、他のペプチド又はポリペプチドよりも強い結合親和性を有することを意味する。

【0069】

例えば、部分は、１又は複数のアンタゴニスト、１又は複数のアゴニスト、１又は複数のβアドレナリン受容体、１又は複数のＧタンパク質共役受容体、及び１又は複数の受容体に結合する１又は複数のサイトカインからなる群から選択される１又は複数の細胞表面受容体に（特異的に及び／又は主に）結合する低分子リガンド又はタンパク質性リガンド若しくはその機能的断片であり得る。本明細書で検討されるように、「低分子リガンド」はまた、マクロファージ（及び／又は線維芽細胞並びにマクロファージ及び線維芽細胞）のそのような１又は複数の細胞表面受容体に（特異的に又は主に）結合するか、又は（特異的に又は主に）相互作用する化学物質又は医薬品を含み得る。前記「低分子リガンド」又は前記「タンパク質性リガンド若しくはその機能的断片」は、対応する（細胞表面）受容体の天然リガンドであり得る。本明細書に一例を示す：ここでは、１又は複数の糖又は修飾糖部分が「送達部分」として使用される（この例示の場合、例えば、トリマンノース又はＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）であり、「標的構造」はマクロファージ上のそのような糖／修飾糖部分の表面受容体である、マンノース受容体Ｃ型１である。

【0070】

表３では、例えば、マクロファージ、線維芽細胞、並びにマクロファージ及び線維芽細胞などの、示された標的細胞への送達を提供することができる例示的な表面受容体／マーカーが提供される。これらの表面受容体／マーカーはまた、「ｍｉＲ－２１の前記阻害剤をマクロファージに、線維芽細胞及びマクロファージに、肺マクロファージ及び／又は肺線維芽細胞に、並びに肺マクロファージに送達する部分」として本発明の文脈において使用され得る、抗体（又はその機能的断片）の標的であってもよい。

【0071】

表３。精製された初代細胞画分のＲＮＡ配列決定によって特定されたヒト肺及び心臓組織のマクロファージ及び／又は線維芽細胞にｍｉＲ－２１阻害剤を標的化／送達するための受容体／マーカーの例選択は、存在量、細胞型特異性、及び受容体の特性に基づく。

【0072】

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【表1-4】

【表1-5】

【表1-6】

【0073】

上記の表３に示される受容体又は細胞表面分子は、前記ｍｉＲ－２１阻害剤を送達する部分の結合、又は前記ｍｉＲ－２１阻害剤の標的化に適し得る。したがって、組成物に含まれる部分は、上記の表３に示されるように、１又は複数の受容体又は細胞表面分子に結合し得る。表３に示される受容体又は細胞表面分子は、ヒト肺又は心臓組織のマクロファージ及び／又は線維芽細胞に含まれると本明細書の以下で同定された。さらに、受容体又は細胞表面分子は、精製初代細胞画分のＲＮＡ配列決定によって同定され得る。添付の実施例に示されているように、マンノース受容体Ｃ型１（Ｍｒｃ１）はマクロファージで強く発現している。これにより、ＭＲＣ１は、「ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する」部分の特に望ましく好ましい標的となる。したがって、対応する部分は、ＭＲＣ１／マンノース受容体リガンドに結合するリガンドである。そのようなリガンドは、マンノースのような対応する糖を含み得る。ＭＲＣ１の他のリガンドは、当技術分野で公知であり、限定されないが、例えば、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を含む。これは、添付の図２２にも示されている。図２２は、マンノース受容体Ｃ型１（ＭＲＣ１）は、肺組織のマクロファージによって発現されることを記載している。添付の図２３は、マンノース受容体１リガンドの化学構造を示し、（Ａ）は、リガンド結合及びｍｉＲ－２１阻害剤、本明細書で定義される「ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１」の非限定的であるが例示的な設計のスキームを示す。

【0074】

図２３（Ｂ）は、ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１分子に結合されたマンノース受容体リガンドの例示的で非限定的な化学構造を提供する。Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）（上）又はマンノース（本明細書ではトリマンノース、図の下を参照）リガンドを、（ＬＮＡ－）ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１（ｍｉＲ２１阻害剤）の５’末端に結合させた。当技術分野で公知のように、例えば、Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｐｏｍａｒｅｓ， Ｌ．， （２０１２）では、マンノース及びＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）リガンドのＭＲＣ１への結合が報告されている。マンノース受容体１（Ｍｒｃ１）のさらなる例示的なリガンドは、ＭＲＣ１の細胞外部分に向けられた特異的抗体を含むが、これらに限定されない。

【0075】

したがって、添付の図２３（Ａ）に示されるように、本発明の文脈で使用される化合物の一般構造は、以下のような形式を有し得る：
ｍｉＲ－２１阻害剤－（リンカー）－結合／標的化／送達部分；又は
結合／標的化／送達部分－（リンカー）－ｍｉＲ－２１阻害剤。
マクロファージへの結合／標的化／送達部分を含む後者の非限定的な例は、図２３（Ａ）のスキームに示される前記コンストラクトであり、
- 「マクロファージを標的とする／送達する結合部分」としてのマンノース受容体Ｃ型１（ＭＲＣ１）のリガンド、その後に
- （所望の）リンカー／（リンカー）、その後に
- 「ｍｉＲ－２１阻害剤」としてのＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１である。
有用な（生物学的）リンカー構造は、当技術分野で非常に周知であり、クリックケミストリーリンカー（例えば、ＤＢＣＯ、テトラジン、ＴＣＯ、ＢＣＮ、カルボキシルリンカー（５’－ＣＯＯＨ－Ｃ５、３’－ＣＯＯＨ－Ｃ６）、アルデヒド／ヒドラジド、モノメトキシトリチルリンカー、ペプチドリンカー、β－グルクロニドリンカー、スペーサー修飾子（例えば、スペーサーＣ３、スペーサーＣ１２など）、芳香族リンカー、二官能性リンカーなど）を含むが、これらに限定されない。当業者は、マクロファージ及び／又は線維芽細胞特異的リガンドをリンカー部分の中間を介してａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１オリゴヌクレオチドに結合するために、様々な「結合／リンカー化学手段及び方法」が利用可能であることを承知している。そのような「付着／リンカー化学手段及び方法」は、オリゴヌクレオチドの５’位への第一級アミノ基の付加を含むが、これに限定されない。このような手段及び方法の例には、オリゴヌクレオチドの５’位への第一級アミンの付加に使用される５’－アミノヘキシルリンカー及びＴＦＡ－アミノリンカーホスホロアミダイトの修飾が含まれる。それは、例えば、「ペプチドリンカー」が、本明細書の以下で論じる本発明の文脈で使用されることも想定され、ペプチドは「リンカー基」としても開示される。さらに、「切断可能なリンカー」を使用できることも想定され、当業者の知識の範囲内である。当業者は、ｍｉＲ－２１阻害剤及び前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する部分を含む本明細書で定義された本発明の化合物を構築するために、そのような「切断可能なリンカー」も容易に使用できる立場にある。このような（１又は複数の）「切断可能なリンカー」は、とりわけ、Ｘｕｅ Ｙ ｅｔ ａｌ． Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｒｅｖ ２０２１ （ＤＯＩ：１０．１０３９／ｄ０ｃｓ０１０６１ｈ）、Ｂｅｎｉｚｒｉ （２０１９） Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ２０１９， ３０， ３６６－３８３（特にオリゴヌクレオチドの場合）、又はＪｏｎａｔｈａｎ （２０１９）． Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｒｅｖ ４８， ４３６１に記載されている。

【0076】

本発明の化合物において、本明細書で例示される１又は複数の糖又は修飾糖部分、１又は複数の（タンパク質性）リガンド（又はその機能的断片）、又は１又は複数の抗体（又はその機能的断片）などの（例えば）（低分子）リガンドなどの前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する１又は複数の部分を、ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１オリゴヌクレオチドなどの前記ｍｉＲ－２１阻害剤に、好ましくは、オリゴヌクレオチドの末端ホスホロチオエート基に、直接又はリンカー基（以下、単に「リンカー」という場合がある）を介して連結してもよい。再び、本明細書で指摘されるように、「リンカー」構造を介してマクロファージ（及び／又は所望により線維芽細胞）へのｍｉＲ－２１の前記阻害剤に結合される、前記ｍｉＲ－２１の阻害剤を送達するさらなる部分も使用することができる。

【0077】

理解されるように、前記リンカーは特に限定されず、本発明に関連する有益な効果を保持しながら、かなりの程度まで変更することができる。

【0078】

例えば、リンカー基は、直鎖状又は分枝状であり得ることが理解される。特に、リンカー基が分岐している場合、前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する２つ以上の部分（例えば、糖又は修飾糖部分）がリンカー基に結合され得る。

【0079】

リンカー基は、各糖又は修飾糖部分とオリゴヌクレオチドの末端ホスホロチオエート基との間の各リンカー鎖に２０個を超え１００個未満の非水素原子（好ましくは６０個未満の非水素原子）を含有することが好ましいが、これらに限定されない。リンカー基全体における非水素原子の数は、好ましくは２０原子を超え２００原子未満（好ましくは１５０原子未満）である。非水素原子は、好ましくは、炭素、窒素、及び酸素から選択される。リンカー中の非水素原子の１５原子％以下が芳香族基の一部であることがさらに好ましい。

【0080】

より具体的には、前記リンカーが、Ｃ_10-40アルキレン、Ｃ_10-40アルケニレン、及びＣ_10-40アルキニレンから選択される基Ｌであってもよく、前記アルキレン、前記アルケニレン、及び前記アルキニレンが、それぞれ、ハロゲン、Ｃ_1-5ハロアルキル、-Ｏ（Ｃ_1-5ハロアルキル）、-ＣＮ、-ＯＲ²¹、-ＮＲ²¹Ｒ²¹、-ＮＲ²¹ＯＲ²¹、-ＣＯＲ²¹、-ＣＯＯＲ²¹，-ＯＣＯＲ²¹、-ＣＯＮＲ²¹Ｒ²¹、-ＮＲ²¹ＣＯＲ²¹、-ＮＲ²¹ＣＯＯＲ²¹、-ＯＣＯＮＲ²¹Ｒ²¹、-ＳＲ²¹、-ＳＯＲ²¹、-ＳＯ₂Ｒ²¹、-ＳＯ₂ＮＲ²¹Ｒ²¹、-ＮＲ²¹ＳＯ₂Ｒ²¹、-ＳＯ₃Ｒ²¹、及び-ＮＯ₂から独立して選択される１又は複数の基で所望により置換され、及びさらに、前記アルキレン、前記アルケニレン、又は前記アルキニレンに含まれる１又は複数の-ＣＨ₂－単位が、それぞれ、－Ｏ－、-ＮＲ²¹－、-ＣＯ－、-Ｓ－、－ＳＯ－、及び-ＳＯ₂－から独立して選択される基によって所望により置換され、さらに、前記アルキレン、前記アルケニレン、又は前記アルキニレンに含まれる１又は複数の-ＣＨ₂－単位が、それぞれ、アリーレン、ヘテロアリーレン、シクロアルキレン、及びヘテロシクロアルキレンから独立して選択される基によって所望により置換されることがと想定され、前記アリーレン、前記ヘテロアリーレン、前記シクロアルキレン、及び前記ヘテロシクロアルキレンが、それぞれ、Ｃ_1-5アルキル、Ｃ_2-5アルケニル、Ｃ_2-5アルキニル、ハロゲン、Ｃ_1-5ハロアルキル、-ＣＮ、-ＯＨ、-Ｏ（Ｃ_1-5アルキル）、-ＳＨ、-Ｓ（Ｃ_1-5アルキル）、-ＮＨ₂、-ＮＨ（Ｃ_1-5アルキル）、及び-Ｎ（Ｃ_1-5アルキル）（Ｃ_1-5アルキル）から独立して選択される１又は複数の基で所望により置換され、前記アリーレン、ヘテロアリーレン、シクロアルキレン、及びヘテロシクロアルキレンの中で、アリーレンが好ましく、フェニレンがより好ましい。
各Ｒ²¹は、水素、Ｃ_1-5アルキル、Ｃ_2-5アルケニル、Ｃ_2-5アルキニル、カルボシクリル、及びヘテロシクリルから独立して選択され、前記アルキル、前記アルケニル、及び前記アルキニルが、それぞれ、１又は複数の基Ｒ^Alkで所望により置換され、さらに、前記カルボシクリル及び前記ヘテロシクリルが、それぞれ、１又は複数の基Ｒ^Cycで所望により置換される。
任意の２つのＲ²¹が結合して環を所望により形成する。
各Ｒ^Alkは、-ＯＨ、-Ｏ（Ｃ_1-5アルキル）、-Ｏ（Ｃ_1-5アルキレン）－ＯＨ、-Ｏ（Ｃ_1-5アルキレン）-Ｏ（Ｃ_1-5アルキル）、-ＳＨ、-Ｓ（Ｃ_1-5アルキル）、-Ｓ（Ｃ_1-5アルキレン）-ＳＨ、-Ｓ（Ｃ_1-5アルキレン）-Ｓ（Ｃ_1-5アルキル）、-ＮＨ₂、-ＮＨ（Ｃ_1-5アルキル）、-Ｎ（Ｃ_1-5アルキル）（Ｃ_1-5アルキル）、-ＮＨ－ＯＨ、-Ｎ（Ｃ_1-5アルキル）-ＯＨ、-ＮＨ－Ｏ（Ｃ_1-5アルキル）、-Ｎ（Ｃ_1-5アルキル）-Ｏ（Ｃ_1-5アルキル）、ハロゲン、Ｃ_1-5ハロアルキル、-Ｏ（Ｃ_1-5ハロアルキル）、-ＣＮ、-ＮＯ₂、-ＣＨＯ、-ＣＯ（Ｃ_1-5アルキル）、-ＣＯＯＨ、-ＣＯＯ（Ｃ_1-5アルキル）、-Ｏ－ＣＯ（Ｃ_1-5アルキル）、-ＣＯ-ＮＨ₂、-ＣＯ-ＮＨ（Ｃ_1-5アルキル）、-ＣＯ-Ｎ（Ｃ_1-5アルキル）（Ｃ_1-5アルキル）、-ＮＨ-ＣＯ（Ｃ_1-5アルキル）、-Ｎ（Ｃ_1-5アルキル）-ＣＯ（Ｃ_1-5アルキル）、-ＮＨ-ＣＯＯ（Ｃ_1-5アルキル）、-Ｎ（Ｃ_1-5アルキル）-ＣＯＯ（Ｃ_1-5アルキル）、-Ｏ-ＣＯ－ＮＨ（Ｃ_1-5アルキル）、-Ｏ-ＣＯ－Ｎ（Ｃ_1-5アルキル）（Ｃ_1-5アルキル）、-ＳＯ₂-ＮＨ₂、-ＳＯ₂-ＮＨ（Ｃ_1-5アルキル）、-ＳＯ₂-Ｎ（Ｃ_1-5アルキル）（Ｃ_1-5アルキル）、-ＮＨ-ＳＯ₂-（Ｃ_1-5アルキル）、-Ｎ（Ｃ_1-5アルキル）-ＳＯ₂-（Ｃ_1-5アルキル）、-ＳＯ₂-（Ｃ_1-5アルキル）、-ＳＯ-（Ｃ_1-5アルキル）、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、及びヘテロシクロアルキルから独立して選択され、前記アリール、前記ヘテロアリール、前記シクロアルキル、及び前記ヘテロシクロアルキルが、それぞれ、Ｃ_1-5アルキル、Ｃ_2-5アルケニル、Ｃ_2-5アルキニル、ハロゲン、Ｃ_1-5ハロアルキル、-ＣＮ、-ＯＨ、-Ｏ（Ｃ_1-5アルキル）、-ＳＨ、-Ｓ（Ｃ_1-5アルキル）、-ＮＨ₂、-ＮＨ（Ｃ_1-5アルキル）、及び-Ｎ（Ｃ_1-5アルキル）（Ｃ_1-5アルキル）から独立して選択される１又は複数の基で所望により置換される。
各Ｒ^Cycは、Ｃ_1-5アルキル、Ｃ_2-5アルケニル、Ｃ_2-5アルキニル、-ＯＨ、-Ｏ（Ｃ_1-5アルキル）、-Ｏ（Ｃ_1-5アルキレン）－ＯＨ、-Ｏ（Ｃ_1-5アルキレン）-Ｏ（Ｃ_1-5アルキル）、-ＳＨ、-Ｓ（Ｃ_1-5アルキル）、-Ｓ（Ｃ_1-5アルキレン）-ＳＨ、-Ｓ（Ｃ_1-5アルキレン）-Ｓ（Ｃ_1-5アルキル）、-ＮＨ₂、-ＮＨ（Ｃ_1-5アルキル）、-Ｎ（Ｃ_1-5アルキル）（Ｃ_1-5アルキル）、-ＮＨ－ＯＨ、-Ｎ（Ｃ_1-5アルキル）-ＯＨ、-ＮＨ－Ｏ（Ｃ_1-5アルキル）、-Ｎ（Ｃ_1-5アルキル）-Ｏ（Ｃ_1-5アルキル）、ハロゲン、Ｃ_1-5ハロアルキル、-Ｏ（Ｃ_1-5ハロアルキル）、-ＣＮ、-ＮＯ₂、-ＣＨＯ、-ＣＯ（Ｃ_1-5アルキル）、-ＣＯＯＨ、-ＣＯＯ（Ｃ_1-5アルキル）、-Ｏ－ＣＯ（Ｃ_1-5アルキル）、-ＣＯ-ＮＨ₂、-ＣＯ-ＮＨ（Ｃ_1-5アルキル）、-ＣＯ-Ｎ（Ｃ_1-5アルキル）（Ｃ_1-5アルキル）、-ＮＨ-ＣＯ（Ｃ_1-5アルキル）、-Ｎ（Ｃ_1-5アルキル）-ＣＯ（Ｃ_1-5アルキル）、-ＮＨ-ＣＯＯ（Ｃ_1-5アルキル）、-Ｎ（Ｃ_1-5アルキル）-ＣＯＯ（Ｃ_1-5アルキル）、-Ｏ-ＣＯ－ＮＨ（Ｃ_1-5アルキル）、-Ｏ-ＣＯ－Ｎ（Ｃ_1-5アルキル）（Ｃ_1-5アルキル）、-ＳＯ₂-ＮＨ₂、-ＳＯ₂-ＮＨ（Ｃ_1-5アルキル）、-ＳＯ₂-Ｎ（Ｃ_1-5アルキル）（Ｃ_1-5アルキル）、-ＮＨ-ＳＯ₂-（Ｃ_1-5アルキル）、-Ｎ（Ｃ_1-5アルキル）-ＳＯ₂-（Ｃ_1-5アルキル）、-ＳＯ₂-（Ｃ_1-5アルキル）、-ＳＯ-（Ｃ_1-5アルキル）、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、及びヘテロシクロアルキルから独立して選択され、前記アリール、前記ヘテロアリール、前記シクロアルキル、及び前記ヘテロシクロアルキルが、それぞれ、Ｃ_1-5アルキル、Ｃ_2-5アルケニル、Ｃ_2-5アルキニル、ハロゲン、Ｃ_1-5ハロアルキル、-ＣＮ、-ＯＨ、-Ｏ（Ｃ_1-5アルキル）、-ＳＨ、-Ｓ（Ｃ_1-5アルキル）、-ＮＨ₂、-ＮＨ（Ｃ_1-5アルキル）、及び-Ｎ（Ｃ_1-5アルキル）（Ｃ_1-5アルキル）から独立して選択される１又は複数の基で所望により置換されている。

【0081】

基Ｌにおいて、Ｃ_10-40アルキレン、Ｃ_10-40アルケニレン、及びＣ_10-40アルキニレンは、それぞれ、好ましくはＣ_20-35アルキレン、Ｃ_20-35アルケニレン、及びＣ_20-35アルキニレンであり、前記アルキレン、アルケニレン、及びアルキニレンは、それぞれ、上記のように修飾されていてもよい。さらに、前記リンカーが、Ｃ_10-40アルキレン及びＣ_10-40アルケニレン、より好ましくはＣ_20-35アルキレン又はＣ_20-35アルケニレン、さらにより好ましくはＣ_20-35アルキレンから選択されることがさらに好ましく、前記アルキレン及びアルケニレンは、それぞれ、上記のように修飾されていてもよい。

【0082】

分岐リンカーの場合、リンカーの分岐のそれぞれが上記で定義した基Ｌであり得、リンカーの主鎖が上記で定義した１つ又は２つの基Ｌからなり得ることが想定される。リンカーの主鎖が２つの基Ｌからなる場合、これらは連続して結合していることが好ましく、－（基Ｌ）－（基Ｌ）－であり、互いに独立して選択され得る。

【0083】

理解されるように、リンカーの枝におけるＣ_10-40アルキレン、Ｃ_10-40アルケニレン、及びＣ_10-40アルキニレン（－ＣＨ₂－単位の所望の置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ／ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）を含む）の鎖長は、Ｃ_10-40に限定される必要はないが、Ｃ_4-9アルキレン、Ｃ_4-9アルケニレン、及びＣ_4-9アルキニレン（－ＣＨ₂－単位の所望の置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ／ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）を含む）についても包含し得る。

【0084】

よって、分岐リンカーの例は、以下に示すような構造を有していてもよい：
＊-（基Ｌ）
｜
＊-（基Ｌ）-（基Ｌ）－（基Ｌ）-＊＊
｜
＊-（基Ｌ）
式中、「＊」は、前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する部分の結合点を示し、「＊＊」は、ｍｉＲ－２１阻害剤の結合点を示す。

【0085】

前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する前記部分が、例えば、糖又は修飾糖部分などの低分子であり得る場合、「送達部分」が糖又は修飾糖部分である場合、前記リンカーは、そのような糖のアノマー酸素を介して前記糖又は修飾糖部分に結合していることが好ましい。

【0086】

前記「ｍｉＲ－２阻害剤」がオリゴヌクレオチドである場合、前記リンカーはオリゴヌクレオチドの末端ホスホロチオエート基を介してオリゴヌクレオチドに結合していることが好ましい。

【0087】

リンカーの２つの非限定的な例を以下に示す。一方は分岐しており、もう一方は分岐していない。

【0088】

第１の例では、リンカーは分岐しており、３つの糖又は修飾糖部分が（好ましくはアノマー酸素を介して）第１のアミド含有部分を介してトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンのヒドロキシ基に結合しており、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンのアミノ基は、第２のアミド含有部分を介して、オリゴヌクレオチド（又はｍｉＲ－２１の任意の他の阻害剤）、好ましくはオリゴヌクレオチドの末端ホスホロチオエート基に連結される。前記リンカーには、所望によりマーカー又は標識が含まれる。好ましくは、第１のアミド含有部分はそれぞれ脂肪族であり、鎖中にそれぞれ１０～１５個の原子を含む。より好ましくは、この分岐リンカー基は、図２３Ｂの第１の構造に示される通りであり、Ｎ－アセチルガラクトサミン基は独立して他の糖又は修飾糖部分（又は前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する他の部分）によって置換され得、オリゴヌクレオチドは変化し得る（及びｍｉＲ－２１阻害剤の例として存在する）ことが理解される。本発明に関連して、これらの糖又は修飾された糖部分は、「ｍｉＲ－２１の阻害剤」が（本実施例及び本発明の文脈において、マクロファージ及び／又は線維芽細胞に並びにマクロファージに）送達されるものである「標的細胞」の表面上の細胞表面タンパク質／受容体／マーカーと相互作用できる（低分子）リガンドの例示的な例として単に意味されていることも理解される。

【0089】

第２の例では、リンカーは分岐しておらず、炭素、窒素、及び酸素から選択される２０～４０個の原子を含む。好ましくは、リンカーは、－フェニレン-ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ₂ＣＨ₂-（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）₄-ＯＣＨ₂ＣＨ₂－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－（ＣＨ₂）₆-基を含むか又はそれからなり、フェニレン基が、好ましくは糖のアノマー酸素とフェニレン基との間の結合により、糖又は修飾糖部分に結合しており、前記（ＣＨ₂）₆-基は、好ましくはオリゴヌクレオチドの末端ホスホロチオエート基を介して、オリゴヌクレオチドに連結している。好ましくは、このリンカー基は、図２３Ｂの第２の構造に示される通りであり、ジ（マンノシル）マンノース基は、他の糖又は修飾糖部分（又は前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージ並びに／又は線維芽細胞及びマクロファージに送達する他の部分）によって置換され得、オリゴヌクレオチドは変化し得る（及びｍｉＲ－２１阻害剤の例として存在する）ことが理解される。

【0090】

ｍｉＲ－２１阻害剤と、前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する部分とを含む組成物は、所望によりさらに（例えば、蛍光）マーカー又は標識を含む。このマーカーは、前記ｍｉＲ－２１阻害剤、前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する前記部分、又はリンカーに存在し得る。リンカー中のそのようなマーカー又は標識の例は、図２３Ｂの最初の式に示されている。

【0091】

「リンカー」構造の検討において本明細書の上記で使用されるように、「炭化水素基」という用語は、炭素原子及び水素原子からなる基を指す。

【0092】

「脂環式」という用語は、環状基に関連して使用され、対応する環状基が非芳香族であることを示す。

【0093】

本明細書で使用される場合、用語「アルキル」は、直鎖状又は分枝状であり得る一価の飽和非環式（すなわち、非環状）炭化水素基を指す。したがって、「アルキル」基は、炭素－炭素二重結合又は任意の炭素－炭素三重結合を全く含まない。「Ｃ_1-5アルキル」は、１～５個の炭素原子を有するアルキル基を意味する。好ましい例示的なアルキル基は、メチル、エチル、プロピル（例えば、ｎ－プロピル又はイソプロピル）、又はブチル（例えば、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、又はｔｅｒｔ－ブチル）である。別段の定義がない限り、「アルキル」という用語は、好ましくはＣ_1-4アルキルを指し、より好ましくはメチル又はエチルを指し、さらに好ましくはメチルを指す。

【0094】

本明細書で使用される場合、「アルケニル」という用語は、直鎖状又は分枝状であってもよく、１又は複数（例えば、１個又は２個）の炭素間二重結合を含むが、炭素間三重結合を全く含まない一価の不飽和非環式炭化水素基を指す。「Ｃ_2-5アルケニル」という用語は、２～５個の炭素原子を有するアルケニル基を意味する。好ましい例示的なアルケニル基は、エテニル、プロペニル（例えば、プロプ－１－エン－１－イル、プロプ－１－エン－２－イル、又はプロプ－２－エン－１－イル）、ブテニル、ブタジエニル（例えば、ブタ－１，３－ジエン－１－イル又はブタ－１，３－ジエン－２－イル）、ペンテニル、又はペンタジエニル（例えば、イソプレニル）である。別段の定義がない限り、「アルケニル」という用語は、好ましくはＣ_2-4アルケニルを指す。

【0095】

本明細書で使用される場合、「アルキニル」という用語は、直鎖状又は分枝状であってもよく、１又は複数（例えば、１個又は２個）の炭素間三重結合及び所望により１又は複数の炭素間二重結合を含む一価の不飽和非環式炭化水素基を指す。「Ｃ_2-5アルキニル」という用語は、２～５個の炭素原子を有するアルキニル基を意味する。好ましい例示的なアルキニル基は、エチニル、プロピニル（例えば、プロパルギル）、又はブチニルである。別段の定義がない限り、「アルキニル」という用語は、好ましくはＣ_2-4アルキニルを指す。

【0096】

本明細書で使用される「アルキレン」という用語は、アルカンジイル基、すなわち、直鎖状又は分枝状であり得る二価の飽和非環式炭化水素基を指す。「Ｃ_1-5アルキレン」という用語は、１～５個の炭素原子を有するアルキレン基を意味し、「Ｃ_0-3アルキレン」という用語は、共有結合（所望の「Ｃ₀アルキレン」に対応する）又はＣ_1-3アルキレンが存在することを示す。アルキレン基の好ましい例は、メチレン（－ＣＨ₂－）、エチレン（例えば、－ＣＨ₂－ＣＨ₂－又は-ＣＨ（－ＣＨ₃）－）、プロピレン（例えば、－ＣＨ₂－ＣＨ₂－ＣＨ₂－、-ＣＨ（－ＣＨ₂－ＣＨ₃）－、－ＣＨ₂－ＣＨ（－ＣＨ₃）－、又は－ＣＨ（－ＣＨ₃）－ＣＨ₂－）、又はブチレン（例えば、－ＣＨ₂－ＣＨ₂－ＣＨ₂－ＣＨ₂－）である。別段の定義がない限り、「アルキレン」という用語は、好ましくはＣ_1-4アルキレン（特に直鎖Ｃ_1-4アルキレンを含む）を指し、より好ましくはメチレン又はエチレンを指し、さらにより好ましくはメチレンを指す。

【0097】

本明細書で使用する「アルコキシ」という用語は、-Ｏ-アルキル基を指し、この基に含まれるアルキル部分は上記で定義した通りである。

【0098】

本明細書で使用される場合、「カルボシクリル」という用語は、単環式環並びに架橋環、スピロ環、及び／又は縮合環系（例えば、２つ又は３つの環から構成され得る）を含む炭化水素環基を指す。前記環基は、飽和、部分不飽和（すなわち、不飽和であるが芳香族ではない）又は芳香族であり得る。別段の定義がない限り、「カルボシクリル」は、好ましくは、アリール、シクロアルキル、又はシクロアルケニルを指す。

【0099】

本明細書で使用される場合、「ヘテロシクリル」という用語は、単環式環並びに架橋環、スピロ環、及び／又は縮合環系（例えば、２つ又は３つの環から構成され得る）を含む環基を指す。前記環基は、Ｏ、Ｓ、及びＮから独立して選択される１又は複数（例えば、１、２、３、又は４など）の環ヘテロ原子を含み、残りの環原子は炭素原子であり、１又は複数のＳ環原子（存在する場合）及び／又は１又は複数のＮ環原子（存在する場合）は、所望により酸化されていてもよく、１又は複数の炭素環原子は所望により酸化されてもよく（すなわち、オキソ基を形成するために）、さらに前記環基は、飽和、部分不飽和（すなわち、不飽和であるが芳香族ではない）又は芳香族であってもよい。例えば、前記環基に含まれる各ヘテロ原子含有環は、１個又は２個のＯ原子及び／又は１個又は２個のＳ原子（所望により酸化されていてもよい）及び／又は１個、２個、３個、４個のＮ原子（所望により酸化されていてもよい）を含有してもよいが、対応するヘテロ原子含有環中のヘテロ原子の総数は１～４であり、対応するヘテロ原子含有環中に少なくとも１個の炭素環原子（所望により酸化されていてもよい）が存在する。別段の定義がない限り、「ヘテロシクリル」は、好ましくは、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、又はヘテロシクロアルケニルを指す。

【0100】

本明細書で使用される場合、「シクリル」という用語は、本明細書で上に定義されたカルボシクリル又はヘテロシクリルを指す。

【0101】

本明細書で使用する場合、「アリール」という用語は、単環式芳香環並びに架橋環及び／又は少なくとも１つの芳香環を含む縮合環系を含む芳香族炭化水素環基を指す（例えば、２つ又は３つの縮合環で構成される環系であって、これらの縮合環の少なくとも１つは芳香族であるか２つ又は３つ環で構成される架橋環系であり、これらの架橋環の少なくとも１つは芳香族である）。「アリール」は、例えば、フェニル、ナフチル、ジアリニル（すなわち、１，２－ジヒドロナフチル）、テトラリニル（すなわち、１，２，３，４－テトラヒドロナフチル）、インダニル、インデニル（例えば、１Ｈ－インデニル）、アントラセニル、フェナントレニル、９Ｈ－フルオレニル、又はアズレニルであってもよい。別段の定義がない限り、「アリール」は、好ましくは６～１４個の環原子、より好ましくは６～１０個の環原子を有し、さらにより好ましくはフェニル又はナフチルを指し、最も好ましくはフェニルを指す。

【0102】

本明細書で使用する場合、「ヘテロアリール」という用語は、単環式芳香環並びに架橋環及び／又は少なくとも１つの芳香環を含む縮合環系を含む芳香族環基を指す（例えば、２つ又は３つの縮合環で構成される環系であって、これらの縮合環の少なくとも１つは芳香族であるか２つ又は３つ環で構成される架橋環系であり、これらの架橋環の少なくとも１つは芳香族である）。前記芳香族環基は、Ｏ、Ｓ、及びＮから独立して選択される１又は複数（例えば、１個、２個、３個、又は４個）の環ヘテロ原子を含み、残りの環原子は炭素原子であり、１又は複数のＳ環原子（存在する場合）及び／又は１又は複数のＮ環原子（存在する場合）は、所望により酸化されていてもよく、さらに１又は複数の炭素環原子は、所望により酸化されてもよい（すなわち、オキソ基を形成するために）。例えば、前記芳香族環基に含まれる各ヘテロ原子含有環は、１個又は２個のＯ原子及び／又は１個又は２個のＳ原子（所望により酸化されていてもよい）及び／又は１個、２個、３個、４個のＮ原子（所望により酸化されていてもよい）を含有してもよいが、対応するヘテロ原子含有環中のヘテロ原子の総数は１～４であり、対応するヘテロ原子含有環中に少なくとも１個の炭素環原子（所望により酸化されていてもよい）が存在する。「ヘテロアリール」は、例えば、チエニル（すなわち、チオフェニル）、ベンゾ［ｂ］チエニル、ナフト［２，３－ｂ］チエニル、チアントレニル、フリル（すなわち、フラニル）、ベンゾフラニル、イソベンゾフラニル、クロマニル、クロメニル（例えば、２Ｈ－１－ベンゾピラニル又は４Ｈ－１－ベンゾピラニル）、イソクロメニル（例えば、１Ｈ－２－ベンゾピラニル）、クロモニル、キサンテニル、フェノキサチイニル、ピロリル（例えば、１Ｈ－ピロリル）、イミダゾリル、ピラゾリル、ピリジル（例えば、ピリジニル、例えば、２－ピリジル、３－ピリジル、又は４－ピリジル）、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、インドリル（例えば、３Ｈ－インドリル）、イソインドリル、インダゾリル、インドリジニル、プリニル、キノリル、イソキノリル、フタラジニル、ナフチリジニル、キノキサリニル、シンノリニル、プテリジニル、カルバゾリル、β－カルボリニル、フェナントリジニル、アクリジニル、ペリミジニル、フェナントロリニル（例えば、［１，１０］フェナントロリニル、［１，７］フェナントロリニル、又は［４，７］フェナントロリニル）、フェナジニル、チアゾリル、イソチアゾリル、フェノチアジニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル（例えば、１，２，４－オキサジアゾリル、１，２，５－オキサジアゾリル（すなわち、フラザニル）、又は１，３，４－オキサジアゾリル）、チアジアゾリル（例えば、１，２，４－チアジアゾリル、１，２，５－チアジアゾリル、又は１，３，４－チアジアゾリル）、フェノキサジニル、ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジニル（例えば、ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－イル）、１，２－ベンゾイソオキサゾール－３－イル、ベンゾチアゾリル、ベンゾチアジアジアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンズイソキサゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾ［ｂ］チオフェニル（すなわち、ベンゾチエニル）、トリアゾリル（例えば、１Ｈ－１，２，３－トリアゾリル、２Ｈ－１，２，３－トリアゾリル、１Ｈ－１，２，４－トリアゾリル、又は４Ｈ－１，２，４－トリアゾリル）、ベンゾトリアゾリル、１Ｈ－テトラゾリル、２Ｈ－テトラゾリル、トリアジニル（例えば、１，２，３－トリアジニル、１，２，４－トリアジニル、又は１，３，５－トリアジニル）、フロ［２，３－ｃ］ピリジニル、ジヒドロフロピリジニル（例えば、２，３－ジヒドロフロ［２，３－ｃ］ピリジニル又は１，３－ジヒドロフロ［３，４－ｃ］ピリジニル）、イミダゾピリジニル（例えば、イミダゾ［１，２－ａ］ピリジニル又はイミダゾ［３，２－ａ］ピリジニル）、キナゾリニル、チエノピリジニル、テトラヒドロチエノピリジニル（例えば、４，５，６，７－テトラヒドロチエノ［３，２－ｃ］ピリジニル）、ジベンゾフラニル、１，３－ベンゾジオキソリル、ベンゾジオキサニル（例えば、１，３－ベンゾジオキサニル又は１，４－ベンゾジオキサニル）、又はクマリニルを指す場合がある。別段の定義がない限り、「ヘテロアリール」という用語は、Ｏ、Ｓ、及びＮから独立して選択される１又は複数（例えば、１個、２個、３個、又は４個）の環ヘテロ原子を含む５～１４員（より好ましくは５～１０員）の単環式環又は縮合環系を指す。１又は複数のＳ環原子（存在する場合）及び／又は１又は複数のＮ環原子（存在する場合）は、所望により酸化され、並びに１又は複数の炭素環原子は、所望により酸化され、さらにより好ましくは、「ヘテロアリール」は、Ｏ、Ｓ、及びＮから独立して選択される１又は複数（例えば、１個、２個、又は３個）の環ヘテロ原子を含む５員又は６員の単環式環を指し、１又は複数のＳ環原子（存在する場合）及び／又は１又は複数のＮ環原子（存在する場合）は、所望により酸化され、並びに１又は複数の炭素環原子は、所望により酸化される。さらに、別段の定義がない限り、「ヘテロアリール」という用語は、特に好ましくは、ピリジニル（例えば、２-ピリジル、３－ピリジル、又は４-ピリジル）、イミダゾリル、チアゾリル、１Ｈ-テトラゾリル、２Ｈ-テトラゾリル、チエニル（すなわち、チオフェニル）、又はピリミジニルを指す。

【0103】

本明細書で使用される場合、「シクロアルキル」という用語は、単環式環並びに架橋環、スピロ環、及び／又は縮合環系（例えば、２個又は３個の環から構成され得る、例えば、２個又は３個の縮合環からなる縮合環系）を指す。「シクロアルキル」は、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、デカリニル（すなわち、デカヒドロナフチル）、又はアダマンチルを指す場合がある。別段の定義がない限り、「シクロアルキル」は、好ましくはＣ_3-11シクロアルキルを指し、より好ましくはＣ_3-7シクロアルキルを指す。特に好ましい「シクロアルキル」は、環員数３～７の単環式飽和炭化水素環である。さらに、別段の定義がない限り、「シクロアルキル」という用語は、より好ましくはシクロヘキシル又はシクロプロピルを指し、さらにより好ましくはシクロヘキシルを指す。

【0104】

本明細書で使用される場合、「ヘテロシクロアルキル」という用語は、単環式環並びに架橋環、スピロ環、及び／又は縮合環系（例えば、２個又は３個の環から構成され得る、例えば、２個又は３個の縮合環からなる縮合環系）を含む飽和環基を指し、前記環基は、Ｏ、Ｓ、及びＮから独立して選択される１又は複数（例えば、１、２、３、又は４など）の環ヘテロ原子を含み、残りの環原子は炭素原子であり、１又は複数のＳ環原子（存在する場合）及び／又は１又は複数のＮ環原子（存在する場合）は、所望により酸化されていてもよく、さらに１又は複数の炭素環原子は、所望により酸化されてもよい（すなわち、オキソ基を形成するために）。例えば、前記飽和環基に含まれる各ヘテロ原子含有環は、１個又は２個のＯ原子及び／又は１個又は２個のＳ原子（所望により酸化されていてもよい）及び／又は１個、２個、３個、４個のＮ原子（所望により酸化されていてもよい）を含有してもよいが、対応するヘテロ原子含有環中のヘテロ原子の総数は１～４であり、対応するヘテロ原子含有環中に少なくとも１個の炭素環原子（所望により酸化されていてもよい）が存在する。「ヘテロシクロアルキル」は、例えば、アジリジニル、アゼチジニル、ピロリジニル、イミダゾリジニル、ピラゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、アゼパニル、ジアゼパニル（例えば、１，４－ジアゼパニル）、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、モルホリニル（例えば、モルホリン－４－イル）、チオモルホリニル（例えば、チオモルホリン－４－イル）、オキサゼパニル、オキシラニル、オキセタニル、テトラヒドロフラニル、１，３－ジオキソラニル、テトラヒドロピラニル、１，４－ジオキサニル、オキセパニル、チイラニル、チエタニル、テトラヒドロチオフェニル（すなわち、チオラニル）、１，３－ジチオラニル、チアニル、チエパニル、デカヒドロキノリニル、デカヒドロイソキノリニル、又は２－オキサ－５－アザ－ビシクロ［２．２．１］ヘプト－５－イルを指す場合がある。別段の定義がない限り、「ヘテロシクロアルキル」は、好ましくは、単環式環又は縮合環系（例えば、２個の縮合環から構成される縮合環系）である、３～１１員飽和環基を指す。前記芳香族環基は、Ｏ、Ｓ、及びＮから独立して選択される１又は複数（例えば、１個、２個、３個、又は４個）の環ヘテロ原子を含み、１又は複数のＳ環原子（存在する場合）及び／又は１又は複数のＮ環原子（存在する場合）は、所望により酸化され、並びに１又は複数の炭素環原子は、所望により酸化され、さらにより好ましくは、「ヘテロシクロアルキル」は、Ｏ、Ｓ、及びＮから独立して選択される１又は複数（例えば、１個、２個、又は３個）の環ヘテロ原子を含む５～７員飽和単環式環基を指し、１又は複数のＳ環原子（存在する場合）及び／又は１又は複数のＮ環原子（存在する場合）は、所望により酸化され、並びに１又は複数の炭素環原子は、所望により酸化される。さらに、別段の定義がない限り、「ヘテロシクロアルキル」は、さらにより好ましくは、テトラヒドロピラニル、ピペリジニル、ピペラジニル、モルホリニル、ピロリジニル、又はテトラヒドロフラニルを指す。

【0105】

本明細書で使用される場合、「シクロアルケニル」という用語は、単環式環並びに架橋環、スピロ環、及び／又は縮合環系（例えば、２個又は３個の環から構成され得る、例えば、２個又は３個の縮合環からなる縮合環系）を含む不飽和脂環式（非芳香族）炭化水素環基を指し、前記炭化水素環基は、１又は複数（例えば、１個又は２個）の炭素間二重結合を含むが、炭素間三重結合を全く含まない。「シクロアルケニル」は、例えば、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘキサジエニル、シクロヘプテニル、又はシクロヘプタジエニルを指す場合がる。別段の定義がない限り、「シクロアルケニル」は、好ましくはＣ_3-11シクロアルケニルを指し、より好ましくはＣ_3-7シクロアルケニルを指す。特に好ましい「シクロアルケニル」は、３～７個の環員を有し、１又は複数（例えば、１個又は２個、好ましくは１個）の炭素－炭素二重結合を含む単環式不飽和脂環式炭化水素環である。

【0106】

本明細書で使用される場合、「ヘテロシクロアルケニル」という用語は、単環式環並びに架橋環、スピロ環、及び／又は縮合環系（例えば、２個又は３個の環から構成され得る、例えば、２個又は３個の縮合環からなる縮合環系）を含む不飽和脂環式（非芳香族）環基を指し、前記環基は、Ｏ、Ｓ、及びＮから独立して選択される１又は複数（例えば、１、２、３、又は４など）の環ヘテロ原子を含み、残りの環原子は炭素原子であり、１又は複数のＳ環原子（存在する場合）及び／又は１又は複数のＮ環原子（存在する場合）は、所望により酸化されていてもよく、１又は複数の炭素環原子は、所望により酸化されていてもよく（すなわち、オキソ基を形成するために）、並びにさらに前記環基は、隣接する環原子間に少なくとも１つの二重結合を含み、隣接する環原子間に三重結合を含まない。例えば、前記不飽和脂環式環基に含まれる各ヘテロ原子含有環は、１個又は２個のＯ原子及び／又は１個又は２個のＳ原子（所望により酸化されていてもよい）及び／又は１個、２個、３個、４個のＮ原子（所望により酸化されていてもよい）を含有してもよいが、対応するヘテロ原子含有環中のヘテロ原子の総数は１～４であり、対応するヘテロ原子含有環中に少なくとも１個の炭素環原子（所望により酸化されていてもよい）が存在する。「ヘテロシクロアルケニル」は、例えば、イミダゾリニル（例えば、２－イミダゾリニル（すなわち、４，５－ジヒドロ－１Ｈ－イミダゾリル）、３－イミダゾリニル、又は４－イミダゾリニル）、テトラヒドロピリジニル（例えば、１，２，３，６－テトラヒドロピリジニル）、ジヒドロピリジニル（例えば、１，２－ジヒドロピリジニル又は２，３－ジヒドロピリジニル）、ピラニル（例えば、２Ｈ－ピラニル又は４Ｈ－ピラニル）、チオピラニル（例えば、２Ｈ－チオピラニル又は４Ｈ-チオピラニル）、ジヒドロピラニル、ジヒドロフラニル、ジヒドロピラゾリル、ジヒドロピラジニル、ジヒドロイソインドリル、オクタヒドロキノリニル（例、１，２，３，４，４ａ，５，６，７－オクタヒドロキノリニル）、又はオクタヒドロイソキノリニル（例えば、１，２，３，４，５，６，７，８－オクタヒドロイソキノリニル）を指す場合がある。別段の定義がない限り、「ヘテロシクロアルケニル」は、好ましくは、単環式環又は縮合環系（例えば、２個の縮合環から構成される縮合環系）である、３～１１員不飽和脂環式環基を指す。前記芳香族環基は、Ｏ、Ｓ、及びＮから独立して選択される１又は複数（例えば、１個、２個、３個、又は４個）の環ヘテロ原子を含み、１又は複数のＳ環原子（存在する場合）及び／又は１又は複数のＮ環原子（存在する場合）は、所望により酸化され、１又は複数の炭素環原子は、所望により酸化され、並びに前記環基は、隣接する環原子間に少なくとも１つの二重結合を含み、隣接する環原子間に三重結合を含まず、より好ましくは、「ヘテロシクロアルケニル」は、Ｏ、Ｓ、及びＮから独立して選択される１個以上（例えば、１個、２個、又は３個）の環ヘテロ原子を含有する５～７員単環式不飽和非芳香族環基を指し、１又は複数のＳ環原子（存在する場合）及び／又は１又は複数のＮ環原子（存在する場合）は、所望により酸化され、１又は複数の炭素環原子は、所望により酸化され、並びに前記環基は、隣接する環原子間に少なくとも１つの二重結合を含み、隣接する環原子間に三重結合を含まない。

【0107】

本明細書で使用される「ハロゲン」という用語は、フルオロ（-Ｆ）、クロロ（-Ｃｌ）、ブロモ（-Ｂｒ）、又はヨード（-Ｉ）を指す。

【0108】

本明細書で使用する「ハロアルキル」という用語は、フルオロ、クロロ、ブロモ、及びヨードから独立して選択され、好ましくは全てがフッ素原子である１又は複数（好ましくは１～６個、より好ましくは１～３個）のハロゲン原子で置換されたアルキル基を指す。ハロゲン原子の最大数は、利用可能な結合部位の数によって制限され、したがって、ハロアルキル基のアルキル部分に含まれる炭素原子の数によって決定されることが理解される。「ハロアルキル」は、例えば、-ＣＦ₃、-ＣＨＦ₂、-ＣＨ₂Ｆ、-ＣＦ₂-ＣＨ₃、-ＣＨ₂-ＣＦ₃、-ＣＨ₂-ＣＨＦ₂、-ＣＨ₂-ＣＦ₂-ＣＨ₃、-ＣＨ₂-ＣＦ₂-ＣＦ₃、又は-ＣＨ（ＣＦ₃）₂を指す。特に好ましい「ハロアルキル」基は、-ＣＦ₃である。

【0109】

本明細書で使用される場合、用語「所望の」、「所望により」、及び「～して（も）よい（～できる）」は、示された特徴が存在してもよいが、存在しなくてもよいことを意味する。「所望の」、「所望により」、及び「～して（も）よい（～できる）」という用語が使用されるときは常に、本発明は特に両方の可能性、すなわち、対応する特徴が存在するか、あるいは対応する特徴が存在しないという可能性に関連する。例えば、「ＸはＹで所望により置換されている」（又は「ＸはＹで置換されていてもよい」）という表現は、ＸがＹで置換されているか又は置換されていないことを意味する。同様に、組成物の成分が「所望」であると示される場合、本発明は、具体的には、対応する成分が存在する（組成物に含まれる）か、又は対応する成分が組成物に存在しないという両方の可能性に関する。

【0110】

本明細書では、様々な基が「所望により置換されている」と称される。概して、これらの基は、例えば、１個、２個、３個、又は４個の置換基などの１又は複数の置換基を有し得る。置換基の最大数は、置換部分で利用可能な結合部位の数によって制限されることが理解されるであろう。別段の定義がない限り、本明細書で言及される「所望により置換される」基は、好ましくは２個以下の置換基を有し、特に１個のみの置換基を有し得る。さらに、別段の定義がない限り、所望の置換基が存在しない、すなわち、対応する基が置換されていないことが好ましい。

【0111】

前記リンカー基はまた、ペプチドを含むか又はそれからなり得る。このようなペプチドは、好ましくは、１～１００個のアミノ酸、例えば１～２５個のアミノ酸、より好ましくは１２～２０個のアミノ酸、さらにより好ましくは１２～１６個又は１５～２０個のアミノ酸を含む。前記ペプチドリンカーは、１又は複数の（Ｇ３Ｓ）及び／又は（Ｇ４Ｓ）モチーフ、特に１、２、３、４、５、又は６個の（Ｇ３Ｓ）及び／又は（Ｇ４Ｓ）モチーフ、好ましくは３又は４個の（Ｇ３Ｓ）及び／又は（Ｇ４Ｓ）モチーフ、より好ましくは３個又は４個の（Ｇ４Ｓ）モチーフを含み得る。

【0112】

他の例では、前記リンカーは、１２～２５個のアミノ酸、好ましくは配列（Ｇ３Ｓ）３、（Ｇ３Ｓ）４、（Ｇ４Ｓ）３、又は（Ｇ４Ｓ）４を含む。別のペプチドリンカーは、ＧＥＧＴＳＴＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＡＤモチーフ（配列番号１０を参照）からなるか又はそれを含み得る。ペプチドリンカーは、当業者に公知の任意の手段によって、そのＣ末端又はそのＮ末端のいずれかを介して前記ｍｉＲ－２１阻害剤に連結され得る。例えば、Ｃ末端の酸は、アミノプロパノールなどのアミノアルコールと反応してアミド結合を形成し得る。アミノプロパノールのアルコール基は、前記ｍｉＲ－２１阻害剤の末端ホスホロチオエート基の蛍光体に結合し得る。あるいは、ペプチドリンカーのＮ末端は、ヒドロキシプロパン酸などの（所望により保護された）ヒドロキシ基含有酸（又はその無水物、ラクトン、若しくは酸塩化物）と反応することができ、（所望によりヒドロキシ基から保護基を除去した後）ヒドロキシ基含有カルボン酸のヒドロキシ基を介して、前記ｍｉＲ－２１阻害剤の末端ホスホロチオエート基のリンに結合する。

【0113】

さらに、ペプチドリンカーは、当業者に公知の任意の手段によって、そのＣ末端又はそのＮ末端を介して、前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する部分に連結され得る。例えば、Ｃ末端酸は、アミノプロパノールなどのアミノアルコールと反応してアミド結合を形成することができ、アミノプロパノールのアルコール基は、前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する部分の糖基のアノマー炭素に結合し得る。あるいは、ペプチドリンカーのＮ末端は、ヒドロキシプロパン酸などの（所望により保護された）ヒドロキシ基含有酸（又はその無水物、ラクトン、若しくは酸塩化物）と反応することができ、（所望によりヒドロキシ基から保護基を除去した後）ヒドロキシ基含有カルボン酸のヒドロキシ基を介して、前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する前記部分の糖基のアノマー炭素に結合する。

【0114】

当業者は、ペプチドリンカーがそのＣ末端を介して前記ｍｉＲ－２１阻害剤に連結される場合、そのＮ末端を介して前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する前記部分に連結されること（逆もまた同様）が好ましいことを理解するであろう。

【0115】

適切に保護されたペプチドは、当業者に公知の任意の方法によって調製することができる。これらには、固体ペプチド合成が含まれるが、これらに限定されない。適切なプロトコルは当業者に公知であり、例えば、「Ｓｏｌｉｄ－ｐｈａｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ｆｒｏｍ ｓｔａｎｄａｒｄ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｄｉｆｆｉｃｕｌｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」（Ｃｏｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ２００７， Ｖｏｌ． ２， ｐｐ． ３２４７－３２５６）において言及されている。固体ペプチド合成を使用する場合、ペプチドの側鎖に保護基を残したまま、ペプチドを固相から切断できる。この状態で、前記ｍｉＲ－２１阻害剤及び／又は前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する前記部分への結合のための上記の操作は、最も適切に行うことができる。

【0116】

上記のように、用語「部分」又は「担体」は交換可能である。特定の態様では、この部分は、前記ｍｉＲ－２１阻害剤に、例えば、共有結合によって結合されてもよい。担体は、特定の態様において、前記ｍｉＲ－２１阻害剤を含み得る。例えば、担体は、前記ｍｉＲ－２１阻害剤を含む（標的化）リポソーム、ナノ粒子、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、メソポーラスシリカナノ粒子（ＭＳＮ）などから選択され得る。本発明のある文脈において、「部分」という用語は、例えば、本発明の化合物の文脈において、「部」という用語と交換可能に使用することができ、前記化合物の「部」の１つはｍｉＲ－２１を阻害することができ、別の「部」は前記ｍｉＲ－２１阻害部を標的細胞、好ましくはマクロファージ及び／又は線維芽細胞に結合、標的化、及び／又は送達することができる。

【0117】

マクロファージ及び／又は線維芽細胞への結合／標的化／送達部分は、（特異的）受容体マクロファージ及び／又は線維芽細胞と相互作用する特異的タンパク質リガンドでもあり得る。

【0118】

マクロファージ及び／又は線維芽細胞への結合／標的化／送達部分は、マクロファージ、線維芽細胞及びマクロファージ、肺マクロファージ、又は肺線維芽細胞及び肺マクロファージ上に見られる少なくとも１つの抗原に特異的に結合する抗体又は機能的結合断片であってもよい。そのような特定の態様では、前記部分は、マクロファージ、線維芽細胞及びマクロファージ、肺マクロファージ、又は肺線維芽細胞及び肺マクロファージ上のみに見出される少なくとも１つの抗原に特異的に結合する抗体又は機能的結合断片であってもよい。本明細書で使用される場合、抗体の機能的結合断片は、抗体の抗原結合断片であってもよい。

【0119】

抗体又は機能的結合断片は、上の表に提示された抗原の少なくとも１つに（特異的に結合し）得る。少なくとも１つの抗原に（特異的に）結合することができる抗体又はその抗体断片を同定する方法は、当業者に公知である。さらに、抗体及びその断片は、上記の表３に示した抗原の１つに結合することが当業者に公知である。したがって、前記組成物は、抗体又はその結合断片に結合された前記ｍｉＲ－２１阻害剤を含んでいてもよく、抗体又はその結合断片は、例えば、表３に示される抗原の少なくとも１つに結合することにより、前記ｍｉｒＲ－２１阻害剤をマクロファージ及び／又は線維芽細胞に送達する。上記の抗原に結合する抗体又はその抗体断片は、先行技術で公知である。例えば、前記ｍｉＲ－２１阻害剤を送達するための抗体は、ＭＲＣ１（例えば、Ａｂｃａｍ社カタログ番号：ａｂ６４６９３）、ＡＤＧＲＥ１（例えば、ＢｉｏＲＡＤ社カタログ番号：ＭＣＡ ２６７４）、ＣＤ１４（例えば、Ａｂｃａｍ社カタログ番号：ａｂ１８２０３２）、ＦＣＧＲ３Ａ（例えば、Ａｂｃａｍ社カタログ番号：ａｂ８９２０７）、及びＰＤＧＦＲＡ（例えば、Ａｂｃａｍ社カタログ番号：ａｂ９６５６９）に対する抗体からなる群から選択されてもよい。

【0120】

本明細書で使用される「抗体」という用語は、本発明によれば、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体、並びに結合特異性を依然として保持しているその誘導体又は断片を含む。抗体の産生技術は当技術分野で周知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅによる「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８８ （Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ， １９８８））及び「Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９９９ （Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ， １９９９））に記載されている。本発明による「抗体」という用語はまた、キメラ抗体、単鎖抗体、及びヒト化抗体、並びに、抗体断片、とりわけＦａｂ断片、Ｅｐｈ受容体からなる融合タンパク質、エフリン、又はホスファターゼ細胞外ドメイン及びＦｃのような抗体断片を含む。抗体断片又は誘導体は、Ｆ（ａｂ’）₂、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖｓ、単一ドメインＶ_H、又はＶｈＨドメイン若しくはＶ－ＮＡＲドメインなどのＶ様ドメイン、並びにミニボディ、ダイアボディ、トリボディ、テトラボディ、又は化学的に結合されたＦａｂ’マルチマーなどのマルチマー形態を含む。例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（１９８８及び１９９９）（Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ， １９８８， １９９９）、Ａｌｔｓｈｕｌｅｒ（２０１０）（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｍｏｓｃｏｗ）７５， １５８４－６０５（Ａｌｔｓｈｕｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１０））、又はＨｏｌｌｉｇｅｒ（２００５）（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３， １１２６－３６（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ＆ Ｈｕｄｓｏｎ， ２００５））を参照。様々な手順が当技術分野で公知であり、そのような抗体及び／又は断片の産生に使用することができる。よって、（抗体）誘導体は、ペプチドミメティクスによって産生することができる。さらに、単鎖抗体の産生について記載された技術を、本発明のポリペプチド及び融合タンパク質に特異的な単鎖抗体（例えば、とりわけ米国特許第４９４６７７８号明細書）を産生するように構成することができる。また、トランスジェニック動物を使用して、本発明のポリペプチド及び融合タンパク質に特異的なヒト化抗体を発現させてもよい。最も好ましくは、本明細書で使用される抗体はモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体の調製には、細胞株の連続培養によって産生される抗体を提供する任意の技術を使用することができる。そのような技術の例としては、当技術分野でさらに開発された独自のハイブリドーマ技術（Ｋoｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， １９７５）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ ＆ Ｒｏｄｅｒ， １９８３）、及びヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．， １９８５）が挙げられる。「抗体」という用語は、ヒト化抗体にも関連する。非ヒト（例えばマウス又はウサギ）抗体の「ヒト化」形態は、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はその断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、又は抗体の他の抗原結合部分配列など）であり、非ヒト免疫グロブリン由来の最小限の配列を含む。多くの場合、ヒト化抗体はヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、所望の特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、又はウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基に置換されている。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも移入されたＣＤＲ又はフレームワーク配列にも見出されない残基を含み得る。これらの変更は、抗体の性能をさらに改善及び最適化するために行われる。概して、ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域の全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域の全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を含んでいてもよい。詳細については、（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， １９８６）、（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， １９８８）、及び（Ｐｒｅｓｔａ， １９９２）を参照。抗体断片の産生のために様々な技術が開発されてきた。従来、これらの断片は、無処置抗体のタンパク質分解消化によって得られ（（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， １９９２）及び（Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．， １９８５）参照）。抗体断片は、組換え宿主細胞及び上記の抗体ファージライブラリーによって直接産生することもできる。Ｆａｂ’－ＳＨ断片は大腸菌から直接回収でき、化学結合してＦ（ａｂ’）２断片を形成できる（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９２）。別のアプローチによれば、Ｆ（ａｂ’）２断片は、組換え宿主細胞培養から直接単離することができる。抗体断片の産生のための他の技術は、当業者には明らかであろう。他の実施形態では、最適な抗体は単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。国際公開第９３／１６１８５号パンフレット、米国特許第５５７１８９４号明細書、及び米国特許第５５８７４５８号明細書を参照。抗体断片は、例えば、米国特許第５６４１８７０号明細書に記載される「線形抗体」であってもよい。そのような線形抗体断片は、単一特異性又は二重特異性であってもよい：少なくとも２つの異なる抗原又はエピトープに対する結合特異性を持つ二重特異性抗体（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ＆ Ｃｕｅｌｌｏ， １９８３）。例えば、二重特異性抗体又はその断片がマクロファージ及び線維芽細胞に結合するように、二重特異性抗体又はその断片を本発明で使用することができる（例えば、抗体又はその断片の一方の結合部位がマクロファージに結合し、抗体又はその断片の他方の結合部位が線維芽細胞に結合する）。抗体断片から二重特異性抗体を生成するための技術も記載されており、化学結合を使用して、無処置の抗体をタンパク質分解的に切断して、Ｆ（ａｂ’）２断片を生成する方法などがある（Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．， １９８５）。Ｆａｂ’－ＳＨ断片は大腸菌から回収でき、化学的に結合して二重特異性抗体を形成し得る（Ｓｈａｌａｂｙ ｅｔ ａｌ．， １９９２）。「ダイアボディ（二重特異性抗体）」技術は、二重特異性抗体断片を作成するための代替方法を提供する（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ＆ Ｈｕｄｓｏｎ， ２００５）。「Ｆａｂ断片」は、概ね１つの軽鎖と、１つの重鎖のＣ_H１及び可変領域とから構成される。Ｆａｂ分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成し得ない。「Ｆｃ」領域は、概ね抗体のＣ_H２ドメイン及びＣ_H３ドメインを含む２つの重鎖断片を含む。２つの重鎖断片は、２つ以上のジスルフィド結合によって及びＣ_H３ドメインの疎水性相互作用によって一緒に保持される。「Ｆａｂ’断片」は、概して、鎖間ジスルフィド結合が、２つのＦａｂ’断片の２つの重鎖間で形成され、Ｆ（ａｂ’）₂分子を形成し得るように、１つの軽鎖と、Ｖ_Hドメイン及びＣ_H１ドメイン、並びにＣ_H１ドメイン及びＣ_H２ドメインとの間の領域を含む１つの重鎖の一部とを含む。「Ｆ（ａｂ’）₂断片」は、概して、鎖間ジスルフィド結合が２つの重鎖間に形成されるように、２つの軽鎖と、Ｃ_H１ドメイン及びＣ_H２ドメイン間の定常領域の一部を含む２つの重鎖とを含む。したがって、Ｆ（ａｂ’）₂断片は、２つの重鎖間のジスルフィド結合によって一緒に保持された２つのＦａｂ’断片から構成される。「Ｆｖ領域」は、概して、重鎖及び軽鎖の両方からの可変領域を含むが、定常領域を欠いている。２価以上の抗体が考えられる。３つ以上の抗原結合部位と２つ以上の可変ドメインを有する多価「オクトパス」抗体は、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現によって容易に生成できる（米国特許出願公開第２００２／０００４５８６号明細書、国際公開第０１／７７３４２号パンフレット）。例えば、三重特異性抗体を調製することができる（Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．， １９９１）。

【0121】

前記ｍｉＲ－２１阻害剤は、抗体又はその機能的断片（例えば、本明細書で上記に例示した抗体又はその断片）に結合することができる。抗体又はその断片への結合は、以下の図１５に示されている。さらに、前記ｍｉＲ－２１阻害剤は、細胞型特異的標的化部分に結合できる。

【0122】

上述のように、前記ｍｉＲ－２１阻害剤はまた、「担体」、好ましくはマクロファージ及び／又は線維芽細胞に送達する「担体」に含まれていてもよい。そのような「担体」は、リポソーム、ＬＮＰ、ナノ粒子及び同種のものを含み得る。したがって、さらなる態様では、前記ｍｉＲ－２１阻害剤は、例えば、ナノ粒子に含まれていてもよい。そのようなナノ粒子は、ＰＥＧ化を伴う又は伴わない脂質ナノ粒子、オリゴヌクレオチド被覆を有する金ナノ粒子、又はオリゴヌクレオチド及び標的化リガンドが組み込まれたＤＮＡナノ構造であってもよい。さらなる様式は最先端のものであり、Ｊｕｌｉａｎｏ ＲＬ， Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２０１６（上記参照）に列挙されている。

【0123】

本発明はまた、特許請求の範囲の組成物の製造方法にも関する。示されるように、前記ｍｉＲ－２１阻害剤及び前記ｍｉＲ－２１阻害剤自体の製造方法は、当業者に公知である。例えば、アンチセンスｍｉＲ－２１は、オリゴヌクレオチド合成によって提供され得る。さらなる態様では、前記組成物を製造する方法は、前記ｍｉＲ－２１阻害剤を、前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する前記部分に結合することを含む。例示的な手順は、以下の図１５に示されている。例えば、前記ｍｉＲ－２１阻害剤は、低分子、又は抗体若しくはその機能的断片に結合され得る。例えば、前記アンチセンスｍｉＲ－２１又は前記ｍｉＲ－２１阻害剤は、標的細胞に前記阻害剤を送達する部分に結合するリンカー（例えば、アミノ酸リンカー）に結合され得る。あるいは、前記アンチセンスｍｉＲ－２１又は前記ｍｉＲ－２１阻害剤は、前記阻害剤を標的細胞に送達する部分に結合され得る。このような方法としてクリックケミストリー（Ｃｌｉｃｋ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を利用することができる。しかしながら、前記部分を、共有結合によって前記ｍｉＲ－２１阻害剤に結合するためのさらなる方法が公知である。特定の態様では、この方法は、前記アンチセンスｍｉＲＮＡ－２１を前記部分と結合することを含む。さらに、前記組成物を生成する方法は、前記ｍｉＲ－２１阻害剤を、前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する部分に導入することを含み得る。

【0124】

本明細書で使用される場合、前記ｍｉＲ２１阻害剤は、ｍｉＲ－２１の標的を抑制解除又は過剰発現する限り、任意の分子であってもよい。抑制解除又は過剰発現を測定する方法は、上記にも示されているように、当業者に公知である。好ましい態様では、前記ｍｉＲ－２１阻害剤は、アンチセンスｍｉＲＮＡ－２１を含むか、又はアンチセンスｍｉＲＮＡ－２１である（例として配列番号１～３及び７～９を含むが、これらに限定されない）。アンチセンスｍｉＲＮＡ－２１分子は当業者に公知である。例えば、その内容を参照により本明細書に援用されるＫｈｖｏｒｏｖａ ＆ Ｗａｔｔｓ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１７ （Ｋｈｖｏｒｏｖａ ＆ Ｗａｔｔｓ， ２０１７）及びＲｕｐａｉｍｏｏｌｅ ＆Ｓｌａｃｋ ＭｉｃｒｏＲＮＡ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：ｔｏｗａｒｄｓ ａ ｎｅｗ ｅｒａ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｄｉｓｅａｓｅｓ （Ｒｕｐａｉｍｏｏｌｅ ＆ Ｓｌａｃｋ， ２０１７）（Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ２０１７）を参照。さらに、アンチセンスｍｉＲＮＡ－２１は、その内容を参照により本明細書に援用される国際公開第２００９／１０６３６７（Ａ１）号パンフレット又は欧州特許第２２６０１０１（Ｂ１）号明細書にも開示されている。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、別の配列に相補的な特定の配列、特にｍｉＲ－２１に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドとして理解されるものである。ｍｉＲ－２１の標的はまた、ｍｉＲ－２１の下流の標的を包含すると理解され得る。例えば、ｍｉＲ－２１に少なくとも相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを介したｍｉＲ－２１の阻害は、ｍｉＲ－２１の標的（「標的」Ｓｐｒｏｕｔｙ（細胞シグナル伝達に関与する発生タンパク質）及び同種のもの）の抑制解除又は過剰発現にさえ至ることに留意することが重要である。以下の添付の実施例では、例示的なアンチセンスｍｉＲＮＡ－２１が提供される。概して、本発明の文脈において使用されるアンチセンスｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－２１に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドであり得る。本発明の１つの特定の実施形態では、アンチセンスｍｉＲＮＡ－２１はロックド核酸であってもよく、又は好ましくはホスホロチオエート化ＬＮＡ／ＤＮＡミックスマーである。例えば、前記ｍｉＲ－２１阻害剤は、３´－ｔＣｇＡａＴａＧｔＣｔＧａＣＴ－５´（配列番号１）及び／又は３´－ＴＣｇＡａＴａｇＴＣｔｇＡｃＴ－５´（配列番号２）であり得るアンチセンス－ｍｉＲ－２１であってもよい。さらに、有用なアンチセンスｍｉＲ－２１分子が、配列番号３（配列番号１及び配列番号２と同じヌクレオチド配列を含むが、全てのロックドヌクレオチド、５’－メチル－シトシン修飾、及びホスホロチオエート骨格を有するＬＮＡコンストラクト）、配列番号７（配列番号１及び配列番号２と同じヌクレオチド配列を含むが、全てのロックドヌクレオチド及び５’－メチル－シトシン修飾を有し、ホスホロチオエート骨格を有さないＬＮＡコンストラクト）、配列番号８（配列番号１及び配列番号２と同じヌクレオチド配列を含むが、全てのロックドヌクレオチド及びホスホロチオエート骨格を有し、５’－メチル－シトシン修飾を有さないＬＮＡコンストラクト）、及び配列番号９（配列番号１及び配列番号２と同じヌクレオチド配列を含むが、全てのロックドヌクレオチドを有し、任意の５’－メチル－シトシン修飾及びホスホロチオエート骨格を有さないＬＮＡコンストラクト）に提供されている。本明細書で提供される配列において、大文字はＬＮＡを指し、小文字はＤＮＡ塩基を指す。全ての大文字のＣは、５－メチル－シトシンを表す。ｍｉＲ－２１に対するアンチセンスｍｉＲは、完全なＰＳ（ホスホロチオエート）骨格を有し得る。配列番号１も参照。特に有用なアンチセンス－ｍｉＲ－２１分子は、配列番号１及び配列番号２で提供され、最も好ましいのは、添付の実施例に示されるように、以下の「ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１」：３´－ｔＣｇＡａＴａＧｔＣｔＧａＣＴ－５´（配列番号１）である。

【0125】

本明細書で論じるように、本発明は、ｍｉＲ－２１阻害剤を含み、前記ｍｉＲ－２１阻害剤を肺マクロファージなどのマクロファージに送達する部分を含む組成物を提供する。本明細書で上述したように、前記組成物はまた、少なくとも２つの機能的部分／部位を有する単一分子、すなわち、ｍｉＲ－２１阻害剤である機能的部分／部位及び前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する機能的部分／部位を含み得る。さらに、本明細書で上述したように、前記「化合物」並びに本明細書に記載の組成物は、さらなる官能基部分又は部位、例えば、前記ｍｉＲ－２１阻害剤を、例えば線維芽細胞などの他の標的細胞に標的化及び／又は送達する部分又は部位などを含むこともできる。したがって、本明細書で議論及び図示されるように、本発明に関連して、機能的特徴、すなわち、特徴（ａ）：ｍｉＲ－２１の阻害に関連する、及び特徴（ｂ）：所望の標的細胞への前記阻害部分／部位（「ｍｉＲ－２１の阻害剤」）の送達に関する（この送達は、標的化リポソーム、ナノ粒子、標的脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、標的メソポーラスシリカナノ粒子（ＭＳＮ）などの本明細書で定義される「担体」であってもよい）を少なくとも有する化合物／組成物が提供される。前記標的細胞は１又は複数のマクロファージ及び／又は１又は複数の線維芽細胞であり、好ましくは、標的細胞は１又は複数のマクロファージである。好ましい態様において、前記１又は複数のマクロファージ及び／又は１又は複数の線維芽細胞は、１又は複数の肺マクロファージ及び／又は１又は複数の肺線維芽細胞である。より好ましい態様では、前記マクロファージ及び／又は線維芽細胞は、肺胞マクロファージ及び／若しくは肺胞線維芽細胞並びに／又は間質マクロファージ及び／若しくは間質線維芽細胞である。したがって、本発明は、本明細書に記載の（医学的及び／又は薬学的）使用のための組成物／化合物並びに本発明の組成物／化合物自体、本発明の組成物／化合物を製造する方法並びに本明細書に開示される治療方法を提供し、前記組成物／化合物は、ｍｉＲ－２１阻害剤と、前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する部分とを含む。本発明の一実施形態では、上記で説明したように、本発明の組成物は、単一分子、すなわち、前記ｍｉＲ－２１阻害剤と、前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達でき、前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに標的化することができる部分／部位とを含む化合物であり得る。前記ｍｉＲ－２１阻害剤及び前記送達／標的化部分／部位は、「リンカー」（構造）を介して連結され得る。したがって、本発明はまた、ｍｉＲ－２１阻害剤を含み、前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する少なくとも１つの部分を含む組成物であって、
前記ｍｉＲ－２１阻害剤と、前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する前記部分とがリンカーを介して連結され、前記リンカーが、Ｃ_10-40アルキレン、Ｃ_10-40アルケニレン、及びＣ_10-40アルキニレンから選択される基Ｌを含むか又はからなり、前記アルキレン、前記アルケニレン、及び前記アルキニレンが、それぞれ、ハロゲン、Ｃ_1-5ハロアルキル、-Ｏ（Ｃ_1-5ハロアルキル）、-ＣＮ、-ＯＲ²¹、-ＮＲ²¹Ｒ²¹、-ＮＲ²¹ＯＲ²¹、-ＣＯＲ²¹、-ＣＯＯＲ²¹，-ＯＣＯＲ²¹、-ＣＯＮＲ²¹Ｒ²¹、-ＮＲ²¹ＣＯＲ²¹、-ＮＲ²¹ＣＯＯＲ²¹、-ＯＣＯＮＲ²¹Ｒ²¹、-ＳＲ²¹、-ＳＯＲ²¹、-ＳＯ₂Ｒ²¹、-ＳＯ₂ＮＲ²¹Ｒ²¹、-ＮＲ²¹ＳＯ₂Ｒ²¹、-ＳＯ₃Ｒ²¹、及び-ＮＯ₂から独立して選択される１又は複数の基で所望により置換され、さらに、前記アルキレン、前記アルケニレン、又は前記アルキニレンに含まれる１又は複数の-ＣＨ₂－単位が、それぞれ、－Ｏ－、-ＮＲ²¹－、-ＣＯ－、-Ｓ－、－ＳＯ－、-ＳＯ₂－、アリーレン、ヘテロアリーレン、シクロアルキレン、及びヘテロシクロアルキレンから独立して選択される基によって所望により置換され、前記アリーレン、前記ヘテロアリーレン、前記シクロアルキレン、及び前記ヘテロシクロアルキレンが、それぞれ、Ｃ_1-5アルキル、Ｃ_2-5アルケニル、Ｃ_2-5アルキニル、ハロゲン、Ｃ_1-5ハロアルキル、-ＣＮ、-ＯＨ、-Ｏ（Ｃ_1-5アルキル）、-ＳＨ、-Ｓ（Ｃ_1-5アルキル）、-ＮＨ₂、-ＮＨ（Ｃ_1-5アルキル）、及び-Ｎ（Ｃ_1-5アルキル）（Ｃ_1-5アルキル）から独立して選択される１又は複数の基で所望により置換され、
各Ｒ²¹は、水素、Ｃ_1-5アルキル、Ｃ_2-5アルケニル、Ｃ_2-5アルキニル、カルボシクリル、及びヘテロシクリルから独立して選択され、前記アルキル、前記アルケニル、及び前記アルキニルが、それぞれ、１又は複数の基Ｒ^Alkで所望により置換され、さらに、前記カルボシクリル及び前記ヘテロシクリルが、それぞれ、１又は複数の基Ｒ^Cycで所望により置換され、
任意の２つのＲ²¹が結合して環を所望により形成し、
各Ｒ^Alkは、-ＯＨ、-Ｏ（Ｃ_1-5アルキル）、-Ｏ（Ｃ_1-5アルキレン）－ＯＨ、-Ｏ（Ｃ_1-5アルキレン）-Ｏ（Ｃ_1-5アルキル）、-ＳＨ、-Ｓ（Ｃ_1-5アルキル）、-Ｓ（Ｃ_1-5アルキレン）-ＳＨ、-Ｓ（Ｃ_1-5アルキレン）-Ｓ（Ｃ_1-5アルキル）、-ＮＨ₂、-ＮＨ（Ｃ_1-5アルキル）、-Ｎ（Ｃ_1-5アルキル）（Ｃ_1-5アルキル）、-ＮＨ－ＯＨ、-Ｎ（Ｃ_1-5アルキル）-ＯＨ、-ＮＨ－Ｏ（Ｃ_1-5アルキル）、-Ｎ（Ｃ_1-5アルキル）-Ｏ（Ｃ_1-5アルキル）、ハロゲン、Ｃ_1-5ハロアルキル、-Ｏ（Ｃ_1-5ハロアルキル）、-ＣＮ、-ＮＯ₂、-ＣＨＯ、-ＣＯ（Ｃ_1-5アルキル）、-ＣＯＯＨ、-ＣＯＯ（Ｃ_1-5アルキル）、-Ｏ－ＣＯ（Ｃ_1-5アルキル）、-ＣＯ-ＮＨ₂、-ＣＯ-ＮＨ（Ｃ_1-5アルキル）、-ＣＯ-Ｎ（Ｃ_1-5アルキル）（Ｃ_1-5アルキル）、-ＮＨ-ＣＯ（Ｃ_1-5アルキル）、-Ｎ（Ｃ_1-5アルキル）-ＣＯ（Ｃ_1-5アルキル）、-ＮＨ-ＣＯＯ（Ｃ_1-5アルキル）、-Ｎ（Ｃ_1-5アルキル）-ＣＯＯ（Ｃ_1-5アルキル）、-Ｏ-ＣＯ－ＮＨ（Ｃ_1-5アルキル）、-Ｏ-ＣＯ－Ｎ（Ｃ_1-5アルキル）（Ｃ_1-5アルキル）、-ＳＯ₂-ＮＨ₂、-ＳＯ₂-ＮＨ（Ｃ_1-5アルキル）、-ＳＯ₂-Ｎ（Ｃ_1-5アルキル）（Ｃ_1-5アルキル）、-ＮＨ-ＳＯ₂-（Ｃ_1-5アルキル）、-Ｎ（Ｃ_1-5アルキル）-ＳＯ₂-（Ｃ_1-5アルキル）、-ＳＯ₂-（Ｃ_1-5アルキル）、-ＳＯ-（Ｃ_1-5アルキル）、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、及びヘテロシクロアルキルから独立して選択され、前記アリール、前記ヘテロアリール、前記シクロアルキル、及び前記ヘテロシクロアルキルが、それぞれ、Ｃ_1-5アルキル、Ｃ_2-5アルケニル、Ｃ_2-5アルキニル、ハロゲン、Ｃ_1-5ハロアルキル、-ＣＮ、-ＯＨ、-Ｏ（Ｃ_1-5アルキル）、-ＳＨ、-Ｓ（Ｃ_1-5アルキル）、-ＮＨ₂、-ＮＨ（Ｃ_1-5アルキル）、及び-Ｎ（Ｃ_1-5アルキル）（Ｃ_1-5アルキル）から独立して選択される１又は複数の基で所望により置換され、
各Ｒ^Cycは、Ｃ_1-5アルキル、Ｃ_2-5アルケニル、Ｃ_2-5アルキニル、-ＯＨ、-Ｏ（Ｃ_1-5アルキル）、-Ｏ（Ｃ_1-5アルキレン）－ＯＨ、-Ｏ（Ｃ_1-5アルキレン）-Ｏ（Ｃ_1-5アルキル）、-ＳＨ、-Ｓ（Ｃ_1-5アルキル）、-Ｓ（Ｃ_1-5アルキレン）-ＳＨ、-Ｓ（Ｃ_1-5アルキレン）-Ｓ（Ｃ_1-5アルキル）、-ＮＨ₂、-ＮＨ（Ｃ_1-5アルキル）、-Ｎ（Ｃ_1-5アルキル）（Ｃ_1-5アルキル）、-ＮＨ－ＯＨ、-Ｎ（Ｃ_1-5アルキル）-ＯＨ、-ＮＨ－Ｏ（Ｃ_1-5アルキル）、-Ｎ（Ｃ_1-5アルキル）-Ｏ（Ｃ_1-5アルキル）、ハロゲン、Ｃ_1-5ハロアルキル、-Ｏ（Ｃ_1-5ハロアルキル）、-ＣＮ、-ＮＯ₂、-ＣＨＯ、-ＣＯ（Ｃ_1-5アルキル）、-ＣＯＯＨ、-ＣＯＯ（Ｃ_1-5アルキル）、-Ｏ－ＣＯ（Ｃ_1-5アルキル）、-ＣＯ-ＮＨ₂、-ＣＯ-ＮＨ（Ｃ_1-5アルキル）、-ＣＯ-Ｎ（Ｃ_1-5アルキル）（Ｃ_1-5アルキル）、-ＮＨ-ＣＯ（Ｃ_1-5アルキル）、-Ｎ（Ｃ_1-5アルキル）-ＣＯ（Ｃ_1-5アルキル）、-ＮＨ-ＣＯＯ（Ｃ_1-5アルキル）、-Ｎ（Ｃ_1-5アルキル）-ＣＯＯ（Ｃ_1-5アルキル）、-Ｏ-ＣＯ－ＮＨ（Ｃ_1-5アルキル）、-Ｏ-ＣＯ－Ｎ（Ｃ_1-5アルキル）（Ｃ_1-5アルキル）、-ＳＯ₂-ＮＨ₂、-ＳＯ₂-ＮＨ（Ｃ_1-5アルキル）、-ＳＯ₂-Ｎ（Ｃ_1-5アルキル）（Ｃ_1-5アルキル）、-ＮＨ-ＳＯ₂-（Ｃ_1-5アルキル）、-Ｎ（Ｃ_1-5アルキル）-ＳＯ₂-（Ｃ_1-5アルキル）、-ＳＯ₂-（Ｃ_1-5アルキル）、-ＳＯ-（Ｃ_1-5アルキル）、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、及びヘテロシクロアルキルから独立して選択され、前記アリール、前記ヘテロアリール、前記シクロアルキル、及び前記ヘテロシクロアルキルが、それぞれ、Ｃ_1-5アルキル、Ｃ_2-5アルケニル、Ｃ_2-5アルキニル、ハロゲン、Ｃ_1-5ハロアルキル、-ＣＮ、-ＯＨ、-Ｏ（Ｃ_1-5アルキル）、-ＳＨ、-Ｓ（Ｃ_1-5アルキル）、-ＮＨ₂、-ＮＨ（Ｃ_1-5アルキル）、及び-Ｎ（Ｃ_1-5アルキル）（Ｃ_1-5アルキル）から独立して選択される１又は複数の基で所望により置換されている、組成物を提供する。

【0126】

本発明の組成物／化合物の一実施形態では、前記組成物／化合物は、マクロファージに対する前記ｍｉＲ－２１阻害剤部分を２つ以上含み得る。したがって、前記組成物（化合物でもある）は、前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する２つ以上の部分／部位を含む組成物が提供される。したがって、前記ｍｉＲ－２１阻害剤と、前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する２つ以上の部分／部位とが、分岐リンカーを介して連結されていてもよく、前記リンカーの枝のそれぞれが、請求項３４で定義された基Ｌであり、前記リンカーの主鎖は、請求項３４で定義された１つ又は２つの基Ｌを含むか又はそれらからなり、好ましくは、前記主鎖は前記ｍｉＲ－２１阻害剤に結合し、前記枝は前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する前記部分に結合する。

【0127】

各基Ｌが、Ｃ_10-40アルキレンから選択されていてもよく、前記アルキレンが、ハロゲン、Ｃ_1-5ハロアルキル、-Ｏ（Ｃ_1-5ハロアルキル）、-ＣＮ、-ＯＲ²¹、-ＮＲ²¹Ｒ²¹、-ＮＲ²¹ＯＲ²¹、-ＣＯＲ²¹、-ＣＯＯＲ²¹，-ＯＣＯＲ²¹、-ＣＯＮＲ²¹Ｒ²¹、-ＮＲ²¹ＣＯＲ²¹、-ＮＲ²¹ＣＯＯＲ²¹、-ＯＣＯＮＲ²¹Ｒ²¹、-ＳＲ²¹、-ＳＯＲ²¹、-ＳＯ₂Ｒ²¹、-ＳＯ₂ＮＲ²¹Ｒ²¹、-ＮＲ²¹ＳＯ₂Ｒ²¹、-ＳＯ₃Ｒ²¹、及び-ＮＯ₂から独立して選択される１又は複数の基で所望により置換され、さらに、前記アルキレンに含まれる１又は複数の-ＣＨ₂－単位が、それぞれ独立して、－Ｏ－、-ＮＲ²¹－、-ＣＯ－、-Ｓ－、－ＳＯ－、-ＳＯ₂－、アリーレン、ヘテロアリーレン、シクロアルキレン、及びヘテロシクロアルキレンから選択される基によって置換されており、前記アリーレン、前記ヘテロアリーレン、前記シクロアルキレン、及び前記ヘテロシクロアルキレンが、それぞれ、Ｃ_1-5アルキル、Ｃ_2-5アルケニル、Ｃ_2-5アルキニル、ハロゲン、Ｃ_1-5ハロアルキル、-ＣＮ、-ＯＨ、-Ｏ（Ｃ_1-5アルキル）、-ＳＨ、-Ｓ（Ｃ_1-5アルキル）、-ＮＨ₂、-ＮＨ（Ｃ_1-5アルキル）、及び-Ｎ（Ｃ_1-5アルキル）（Ｃ_1-5アルキル）から独立して選択される１又は複数の基で所望により置換されている。

【0128】

本発明の組成物／化合物の一実施形態では、前記リンカーは、

【0129】

【化1】

【0130】

で表されてもよい（式中「＊」は、前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する部分への結合を表し、「＊＊」は、ｍｉＲ－２１阻害剤への結合を表す）。

【0131】

本発明の組成物／化合物において、前記ｍｉＲ－２１阻害剤が、好ましくは、末端ホスホロチオエート基のリン原子を介してリンカーに結合していてもよい。

【0132】

前記ｍｉＲ－２１の阻害剤をマクロファージに送達する本発明の化合物／組成物における１又は複数の部分／部位が糖を含んでいてもよく、好ましくはマンノース及びＮ－アセチルガラクトサミンから選択される１又は複数を含むか又はそれらからなってもよく、より好ましくはマンノース、ジマンノシルマンノース、及びＮ－アセチルガラクトサミンからなってもよい。添付の非限定的な実施例で例示されるように、トリマンノースも使用して、前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに（マンノース受容体Ｃタイプ１との相互作用を介して）標的化した。

【0133】

前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する１又は複数の部分は、以下から選択されてもよい。

【0134】

【化2】

【0135】

前記リンカーは、各構造の右下部分のアノマー炭素に結合している。

【0136】

本発明の組成物は、図２３Ｂで定義される化合物の１つ若しくは両方及び／又は以下の化合物の１つ若しくは両方を含有するか又は含んでいてもよい。

【0137】

【化3】

【0138】

本明細書に示されるように、ｍｉＲ－２１阻害剤を含み、前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージ、好ましくは肺マクロファージに送達する部分を含む本発明の組成物／化合物は、医学環境において、とりわけ肺線維症の予防及び／又は治療に特に有用である。本明細書で上記及び下記に提供される本発明の組成物／化合物についての定義及び説明は、医薬品として使用されるこれらの組成物／化合物に適用され、及び／又は本明細書では、とりわけ肺線維症の治療において、線維性障害の治療方法を提供する。特定の態様では、本発明の化合物／組成物を含む対応する医薬組成物はエアロゾル形態である。薬学的組成物は、医薬及び／又は医薬品の使用のために有益に使用できる。限定するものではないが、好ましい実施形態では、肺線維症の治療において、本発明の組成物／化合物は、医学的介入を必要とする患者によって吸入されることが想定される。

【0139】

本明細書で使用される用語「治療」又はその文法的変形は、対象における疾患／病状／障害の任意の治療を範囲内とし、以下を含む：（ａ）疾患／病状／障害の素因となり得る対象の疾患／病状／障害を予防及び／又は改善する；（ｂ）疾患／病状／障害を阻害する、すなわち、その発症を阻止する；又は（ｃ）疾患／病状／障害を緩和する、すなわち、疾患／病状／障害の退行を引き起こす。例えば、本明細書で提供される組成物は、肺線維症の予防に使用できる。

【0140】

本明細書で提供される組成物は、医薬組成物と称される場合もある。前記医薬組成物は、ｍｉＲ－２１阻害剤と、前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する部分とを含む。前記ｍｉＲ－２１阻害剤及び前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する前記部分は、本明細書において例示及び説明されるように、連結／結合されてもよい。前記医薬組成物は、個々の患者の臨床状態、前記医薬組成物の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医師に公知の他の要因を考慮して、良好な医療行為と一致する様式で処方及び投薬できる。したがって、本明細書における目的のための医薬組成物の「有効量」は、そのような考慮事項によって決定される。特に医学的及び／又は薬学的用途について本明細書に記載される実施形態は、必要により修正を加えて、本明細書に記載される医薬組成物に適用される。

【0141】

本明細書で提供される組成物は、さらなる薬物／医薬品と組み合わせてもよい。例えば、本明細書で提供される組成物は、ウイルス及び／又は細菌感染の治療並びに抗炎症治療のための医薬組成物と組み合わせて治療において投与される。このような治療には、抗ウイルス剤（例えば、レムデシビル（Ｒｅｍｄｅｓｉｖｉｒ））、βアドレナリン受容体アゴニスト（例えば、サルブタモール（Ｓａｌｂｕｔａｍｏｌ））、及びグルココルチコイド（例えば、デキサメタソン（Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎ））が含まれるが、これらに限定されない。

【0142】

医薬組成物又は組成物は、薬学的に許容される担体を含んでいてもよい。「薬学的に許容される担体」とは、液体充填剤、希釈剤、カプセル化材料、又は任意の種類の製剤助剤である。

【0143】

本発明は、特に、肺線維症の治療におけるｍｉＲ－２１阻害剤並びに前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する部分を含む、本明細書で提供される組成物／化合物の使用に関する。本発明はさらに、肺線維症を治療するための医薬品を製造するための組成物の使用に関し、前記組成物は、前記ｍｉＲ－２１阻害剤と、前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する前記部分とを含む。本発明はまた、肺線維症の治療方法であって、そのような治療を必要とする対象に、前記ｍｉＲ－２１阻害剤と、前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージに送達する前記部分とを含む組成物／化合物を投与することを含む方法に関する。本発明に関連して、肺線維症の治療方法も提供される。前記治療方法は、そのような治療を必要とする対象、とりわけ肺線維症に罹患している又は肺線維症に罹患しやすいヒト患者に、ｍｉＲ－２１阻害剤と、前記ｍｉＲ－２１阻害剤をマクロファージ、好ましくは肺マクロファージに送達する部分とを含む、本明細書に記載の組成物／化合物投与することを含む。医学的及び／又は薬学的使用のために本明細書に記載される実施形態は、必要により修正を加えて、この発明の治療方法に適用される。また、本明細書で所望される肺線維症の治療方法は、線維性状態の改善及び／又は予防さえも目的としたさらなる薬物の（同時）投与を含んでいてもよいことに留意されたい。そのような薬物は、デキサメタゾンなどのグルココルチコイド、ニンテダニブ（Ｎｉｎｔｅｄａｎｉｂ）などのチロシンキナーゼ阻害剤、複数のチロシンキナーゼの受容体遮断薬、又はトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ－β）刺激コラーゲン合成を阻害する抗線維症薬であるピルフェニドン（Ｐｉｒｆｅｎｉｄｏｎｅ）を含んでいてもよいが、これらに限定されない。

【0144】

ここでもまた、特に医学的及び／又は薬学的用途について本明細書に記載される実施形態は、必要により修正を加えて、肺線維症及び／又は線維症に関連する若しくは線維症を引き起こす肺線維症の本明細書に記載された治療方法に適用される。本発明の特定の治療方法は、そのような治療を必要とする患者の治療であり、特に成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）に続いて、肺補助法又は人工呼吸によって引き起こされるか又は関連する前記肺線維症に、前記患者が罹患している。そのような患者はまた、ＣＯＶＤ－１９患者を含んでいてもよい。

【0145】

本明細書で使用される用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」又はその文法的変形は、記載された特徴、整数、工程、又は構成要素を指定するものとして解釈されるものであるが、１又は複数の追加の特徴、整数、工程、構成要素、又はそれらの群の追加を排除するものではない。この用語は、「～からなる」及び「本質的に～からなる」という用語を包含する。したがって、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」／「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」／「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語は、任意のさらなる構成要素（又は同様に特徴、整数、工程及び同種のもの）が存在し得る／存在してもよいことを意味する。

【0146】

「～からなる」という用語は、さらなる構成要素（又は同様に特徴、整数、工程及び同種のもの）が存在しないことを意味する。

【0147】

「約」という用語は、好ましくは示された数値の±１０％、より好ましくは示された数値の±５％、特に示された正確な数値を指す。

【0148】

本明細書で使用される用語「約」は、示された数値の±１０％、特に示された数値の±５％を指す。「約」という用語が使用される場合は常に、示された正確な数値への特定の参照も含まれる。「約」という用語が、特定の核酸内のヌクレオチド数など、整数で定量化されるパラメーターに関連して使用される場合、示された数値の±１０％又は±５％に対応する数値が、最も近い整数に四捨五入される。

【0149】

以下の非限定的な図及び実施例を参照して、本発明をさらに説明する。特に明記しない限り、例えば、その内容全体を参照により本明細書に援用されるＳａｍｂｒｏｏｋ， Ｒｕｓｓｅｌｌ“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎ．Ｙ． （２００１） （Ｓａｍｂｒｏｏｋ ＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ， ２００１））に記載されているように、組換え遺伝子技術の確立された方法を使用した。

【0150】

以下の非限定的な図及び実施例を参照して、本発明をさらに説明する。前記図を示す。

【図面の簡単な説明】

【0151】

【図1A-B】図１は、ロックド（ｌｏｃｋｅｄ）核酸修飾アンチセンスｍｉＲ－２１を使用したｍｉＲ－２１阻害の効率。（Ａ）虚血後の心筋におけるｍｉＲ－２１の発現。ＳＨＡＭ：ｎ＝３、Ｉ／Ｒ傷害：ｎ＝３～６。（Ｂ）実験戦略。ブタに、左前下行枝（ＬＡＤ）冠状動脈のバルーン閉塞によるカテーテル挿入を６０分間で実施し、続いて３３日間再灌流を行った。ｍｉＲ阻害剤であるロックド核酸修飾アンチセンスｍｉＲ－２１（ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１）を、再灌流傷害中の５日目及び１９日目にカテーテルで局所的に適用した。１０ｍｇのＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１を、左前下行枝（ＬＡＤ）及び左回旋動脈（ＬＣｘ）に３：２の比率で注入した。上パネル：ｍｉＲ－２１（配列番号４）、ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１（配列番号１）、及びＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－対照（配列番号５）の配列。灰色の領域はシード配列を示し、ｍｉＲ－２１に相補的な塩基は赤で表示される。

【図1C】図１は、ロックド（ｌｏｃｋｅｄ）核酸修飾アンチセンスｍｉＲ－２１を使用したｍｉＲ－２１阻害の効率。（Ｃ）ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１又はＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－対照の局所適用後のｍｉＲ－２１発現の定量分析。ＨＦ対照：ｎ＝４、ＨＦ ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－対照：ｎ＝３、ＨＦ ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１：ｎ＝５。データは平均値及び個々の値を示し、一元配置分散分析（Ｂ）又は二元配置分散分析（Ｃ）及びサイダック（Ｓｉｄａｋ）の事後検定を使用して分析した。＊＊Ｐ＜０．０１。（Ｃ）ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１又はＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－対照の局所適用後のｍｉＲ－２１発現の定量分析。ＨＦ対照：ｎ＝４、ＨＦ ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－対照：ｎ＝３、ＨＦ ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１：ｎ＝５。データは平均値及び個々の値を示し、一元配置分散分析（Ｂ）又は二元配置分散分析（Ｃ）及びサイダック（Ｓｉｄａｋ）の事後検定を使用して分析した。＊＊Ｐ＜０．０１。

【図2】図２は、ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１を使用したｍｉＲ－２１阻害後の、右心室、左心房、右心房、肝臓、肺、腎臓、及び脾臓におけるｍｉＲ－２１発現の定量化。ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１を、再灌流傷害中の５日目及び１９日目にカテーテルで局所的に適用した。心臓の他の領域 （左心房、右心房、及び右心室）及び他の臓器（腎臓、肝臓、肺、及び脾臓）でのｍｉＲ－２１の発現。ＨＦ対照：ｎ＝３、ＨＦ ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ対照：ｎ＝３、ＨＦ ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１：ｎ＝５。データは平均値及び個々の値を示し、一元配置分散分析及びサイダック（Ｓｉｄａｋ）の事後検定を使用して分析した。＊Ｐ＜０．０５。

【図3A】図３は、ｍｉＲ－２１の阻害は、ブタの心臓をＩ／Ｒ誘発性心肥大及び心筋線維症から保護することを示す図である。（Ａ）体重に対する心重量の比率（ＨＷ／ＢＷ）。

【図3B-E】図３は、ｍｉＲ－２１の阻害は、ブタの心臓をＩ／Ｒ誘発性心肥大及び心筋線維症から保護することを示す図である。（Ｂ）上：心臓の境界域の代表的な心筋切片における小麦胚芽凝集素染色。下：データの定量化。（Ｃ）上：シリウスレッド／ファストグリーンによる心筋試料の代表的な染色。下：データの定量化。（Ｄ）心臓の境界領域に対するビメンチン染色 （線維芽細胞マーカー）の定量分析。（Ｅ）心臓の境界領域に対するＣＤ６８染色（マクロファージマーカー）の定量分析。

【図3F-G】図３は、ｍｉＲ－２１の阻害は、ブタの心臓をＩ／Ｒ誘発性心肥大及び心筋線維症から保護することを示す図である。（Ｆ）毛細血管密度は、境界領域におけるＣＤ３１に対する抗体で心筋切片を染色することにより決定した。代表的な画像及び定量化。（Ｇ）コラーゲン遺伝子（Ｃｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ１ａ２、及びＣｏｌ３ａ１）、平滑筋アクチン（Ａｃｔａ２）、及び筋細胞肥大関連遺伝子（Ｎｐｐａ、Ｎｐｐｂ、及びＭｙｈ７）のｍＲＮＡレベルの定量的評価。スケールバー：５０μｍ（Ｂ）、５００μｍ（Ｃ）、及び（Ｄ）。ｎ＞心臓あたり３００個の中心核を有する細胞（Ｂ）。ｎ＞心臓あたり１００００個の細胞（Ｄ、Ｅ、及びＦ）。シャム（偽）対照：ｎ＝３、ＨＦ対照：ｎ＝４、ＨＦ ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ対照：ｎ＝３、ＨＦ ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１：ｎ＝５。データは平均値及び個々の値を示し、一元配置分散分析及びサイダック（Ｓｉｄａｋ）の事後検定を使用して分析した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、及び＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。

【図4A】図４は、ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１のカテーテルに基づく局所適用は、全体的及び局所的な心筋機能を改善することを示す図である。ブタは経皮的虚血／再灌流（６０分／３３日間）傷害を受け、ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１又はＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－対照を、再灌流傷害中の５日目及び１９日目にカテーテルで局所的に適用した。（Ａ）Ｉ／Ｒ後３３日目で得られた代表的な圧力－容積ループトレース。

【図4B-C】図４は、ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１のカテーテルに基づく局所適用は、全体的及び局所的な心筋機能を改善することを示す図である。ブタは経皮的虚血／再灌流（６０分／３３日間）傷害を受け、ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１又はＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－対照を、再灌流傷害中の５日目及び１９日目にカテーテルで局所的に適用した。（Ｂ～Ｅ）ＰＶ分析によって測定された全体的な心筋機能の指標を示す。（Ｂ）左室拡張末期圧、（Ｃ）１回拍出量。

【図4D-E】図４は、ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１のカテーテルに基づく局所適用は、全体的及び局所的な心筋機能を改善することを示す図である。ブタは経皮的虚血／再灌流（６０分／３３日間）傷害を受け、ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１又はＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－対照を、再灌流傷害中の５日目及び１９日目にカテーテルで局所的に適用した。（Ｂ～Ｅ）ＰＶ分析によって測定された全体的な心筋機能の指標を示す。（Ｄ）収縮速度、（Ｅ）左心室の弛緩速度。

【図4F-G】図４は、ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１のカテーテルに基づく局所適用は、全体的及び局所的な心筋機能を改善することを示す図である。ブタは経皮的虚血／再灌流（６０分／３３日間）傷害を受け、ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１又はＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－対照を、再灌流傷害中の５日目及び１９日目にカテーテルで局所的に適用した。（Ｂ～Ｅ）ＰＶ分析によって測定された全体的な心筋機能の指標を示す。（Ｆ）局所心筋機能の尺度としてソノマイクロメトリーによって測定される心内膜下セグメントの短縮。分析は、虚血／再灌流傷害から３３日後に、安静下又は１２０ｂｐｍ及び１４０ｂｐｍでペーシングした後に行った。（Ｇ）Ｉ／Ｒ傷害前及び再灌流後３３日目に蛍光透視法によって測定された駆出率。ＨＦ対照：ｎ＝４、ＨＦ ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ対照：ｎ＝３、ＨＦ ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１：ｎ＝５。データは平均値及び個々の値を示し、二元配置分散分析及びサイダック（Ｓｉｄａｋ）の事後検定を使用して分析した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、及び＊＊＊Ｐ＜０．００１。

【図5A-B】図５は、ｍｉＲ－２１の阻害は、Ｉ／Ｒによる心機能の喪失を用量依存的に防止したことを示す図である。ブタは虚血／再灌流傷害を受け、手術後５日目及び１９日目に４ｍｇ又は１０ｍｇのＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１を投与された。この図は、図１Ｃのレベル４に示されたデータも参照して、４ｍｇのＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１投与量と１０ｍｇの投与量とを直接比較している。（Ａ）梗塞サイズの定量化。（Ｂ）ｍｉＲ－２１発現の定量分析。

【図5C-E】図５は、ｍｉＲ－２１の阻害は、Ｉ／Ｒによる心機能の喪失を用量依存的に防止したことを示す図である。ブタは虚血／再灌流傷害を受け、手術後５日目及び１９日目に４ｍｇ又は１０ｍｇのＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１を投与された。この図は、図１Ｃのレベル４に示されたデータも参照して、４ｍｇのＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１投与量と１０ｍｇの投与量とを直接比較している。（Ｃ）左室拡張末期圧の解析。（Ｄ）駆出率の定量化。（Ｅ）ソノマイクロメトリーを用いた局所心筋機能の解析。ＨＦ対照：ｎ＝４、ＨＦ ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－対照：ｎ＝３、ＨＦ ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１（４ｍｇ）：ｎ＝２、ＨＦ ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１（１０ｍｇ）：ｎ＝５。データは平均値及び個々の値を示し、対応なしの一元配置分散分析を使用して分析した。＊＊Ｐ＜０．０１及び＊＊＊Ｐ＜０．００１。

【図6A-B】図６は、差次的発現解析により、ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１適用後のｍｉＲ－２１標的の抑制解除が明らかになることを示す図である。（Ａ）ＲＮＡ配列決定のスキーム。ＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ ｍＲＮＡ試料調製キットを使用して、心筋虚血組織から単離した４μｇの全ＲＮＡ試料からＲＮＡ配列決定ライブラリーを生成した。配列決定は、ＨｉＳｅｑ４０００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で行い、分析は社内のＧａｌａｘｙプラットフォームを使用して実施した。ｎ＝群あたり３。（Ｂ）主成分分析。主成分１（ＰＣ１、ｘ軸）はデータの全変動の５９．５％を表し、ＰＣ２（ｙ軸）は４０．５％を表す（ＴＰＭ＞＝３、ｎ＝８４３２）。

【図6C】図６は、差次的発現解析により、ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１適用後のｍｉＲ－２１標的の抑制解除が明らかになることを示す図である。（Ｃ）全ての遺伝子及びＴａｒｇｅｔＳｃａｎ Ｈｕｍａｎ（バージョン７）によって予測された、８－ｍｅｒ結合部位、７－ｍｅｒ－ｍ８結合部位、又は７－ｍｅｒ－Ａ１結合部位を含む、広く保存されたｍｉＲ－２１標的の差次的発現の累積分布及び中央値変化プロット。棒グラフは、四分位範囲でのｍＲＮＡ倍数変化の中央値を示す。コルモゴロフ－スミルノフ（Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ－Ｓｍｉｒｎｏｖ）検定を使用してデータを分析した。＊＊＊Ｐ＜０．００１。

【図6D】図６は、差次的発現解析により、ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１適用後のｍｉＲ－２１標的の抑制解除が明らかになることを示す図である。（Ｄ）ＨＦ ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－対照とシャム（偽）との間（左）及びＨＦ ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１とＨＦ ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－対照との間（右）の高度に調節解除された遺伝子（２を超える又は－２未満の対数倍変化、調整されたＰ値＜０．０５）の生物学的プロセスの遺伝子オントロジー濃縮。灰色の点線は、ＧＯ用語のＰ＜０．０５を示す。

【図6E1】図６は、差次的発現解析により、ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１適用後のｍｉＲ－２１標的の抑制解除が明らかになることを示す図である。（Ｅ）調節解除された遺伝子とそれに関連する遺伝子オントロジー用語を示すコード図。

【図6E2】図６は、差次的発現解析により、ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１適用後のｍｉＲ－２１標的の抑制解除が明らかになることを示す図である。（Ｅ）調節解除された遺伝子とそれに関連する遺伝子オントロジー用語を示すコード図。

【図6F-G】図６は、差次的発現解析により、ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１適用後のｍｉＲ－２１標的の抑制解除が明らかになることを示す図である。（Ｆ）リン酸化ＥＲＫ（ｐ－ＥＲＫ）及び非リン酸化ＥＲＫ（ｔ－ＥＲＫ）に対する免疫ブロットを、心筋組織ライセートに対して行った。負荷対照としてＧＡＰＤＨを使用した。（Ｇ）ブタの心筋組織におけるリン酸化ＥＲＫ陽性心臓線維芽細胞の割合。リン酸ＥＲＫ、ビメンチン（ＶＩＭ；間葉細胞マーカー）及びＣＤ３１（内皮細胞マーカー）に対する心筋切片で免疫蛍光染色を行った。核はＤＡＰＩで染色した。ＶＩＭ陽性でＣＤ３１陰性の細胞を心臓線維芽細胞とみなした。スケールバー：５０μｍ。シャム（偽）対照：ｎ＝３、ＨＦ対照：ｎ＝４、ＨＦ ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－対照：ｎ＝３、ＨＦ ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１：ｎ＝５。データは平均値及び個々の値を示し、一元配置分散分析を使用して分析した。＊Ｐ＜０．０５。

【図7A】図７は、遺伝子デコンボリューションと組み合わせた次世代ＲＮＡ配列決定により、ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１で処理したブタの心筋におけるマクロファージ及び線維芽細胞の重要な役割が明らかになることを示す図である。（Ａ）遺伝子デコンボリューションの概要。（Ｂ）細胞型全体の遺伝子の存在量、特異性、及び濃縮に基づくコンセンサスランキングのための遺伝子間の交差。

【図7B】図７は、遺伝子デコンボリューションと組み合わせた次世代ＲＮＡ配列決定により、ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１で処理したブタの心筋におけるマクロファージ及び線維芽細胞の重要な役割が明らかになることを示す図である。（Ｂ）細胞型全体の遺伝子の存在量、特異性、及び濃縮に基づくコンセンサスランキングのための遺伝子間の交差。

【図7B-C】図７は、遺伝子デコンボリューションと組み合わせた次世代ＲＮＡ配列決定により、ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１で処理したブタの心筋におけるマクロファージ及び線維芽細胞の重要な役割が明らかになることを示す図である。（Ｂ）細胞型全体の遺伝子の存在量、特異性、及び濃縮に基づくコンセンサスランキングのための遺伝子間の交差。（Ｃ）マクロファージ、内皮細胞、及び線維芽細胞の特徴的なマトリックスの上位３つの濃縮された遺伝子のＵＭＡＰ機能及びバイオリンプロット。

【図7D】図７は、遺伝子デコンボリューションと組み合わせた次世代ＲＮＡ配列決定により、ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１で処理したブタの心筋におけるマクロファージ及び線維芽細胞の重要な役割が明らかになることを示す図である。（Ｄ）筋細胞、内皮細胞、線維芽細胞、及びマクロファージのバルク及び単一細胞ＲＮＡ発現からのブタ心筋の相対的な細胞型比率の推定。シャム対照：ｎ＝３、ＨＦ対照：ｎ＝３、ＨＦ ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１：ｎ＝５。データは平均値及び個々の値を示し、一元配置分散分析及びサイダック（Ｓｉｄａｋ）の事後検定を使用して分析した。＊Ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．０１。

【図8A】図８は、ｍｉＲ－２１は、心臓マクロファージで最も豊富で濃縮されたマイクロＲＮＡであることを示す図である。（Ａ）細胞単離のスキーム。

【図8B】図８は、ｍｉＲ－２１は、心臓マクロファージで最も豊富で濃縮されたマイクロＲＮＡであることを示す図である。（Ｂ）異なる心筋細胞型におけるｍｉＲＮＡ発現プロファイル。野生型マウスの心臓から単離された心臓マクロファージ及びその他の心筋細胞タイプ（筋細胞、線維芽細胞、及び内皮細胞）におけるｍｉＲＮＡの円グラフ表示。

【図8C-D】図８は、ｍｉＲ－２１は、心臓マクロファージで最も豊富で濃縮されたマイクロＲＮＡであることを示す図である。（Ｃ）異なる心筋細胞型におけるｍｉＲ－２１ａ－５ｐの発現。（Ｄ）野生型マウスは、横方向大動脈狭窄（ＴＡＣ）を受けるか、陰性対照として偽手術を受けた。圧力過負荷の６日後に野生型マウスの心臓から単離された心臓マクロファージのｍｉＲＮＡの円グラフ表現。ＴＡＣの６日後：ｎ＝５。

【図8E】図８は、ｍｉＲ－２１は、心臓マクロファージで最も豊富で濃縮されたマイクロＲＮＡであることを示す図である。（Ｅ）圧力過負荷の６日後又は２１日後に心臓から単離された心臓マクロファージにおけるＳＹＢＲ－ｇｒｅｅｎに基づく定量的リアルタイムＰＣＲによって決定されたｍｉＲ－２１－５ｐの相対的発現。シャム（偽）：ｎ＝６、ＴＡＣ後６日：ｎ＝５、ＴＡＣ後２１日：ｎ＝３。

【図8F-G】図８は、ｍｉＲ－２１は、心臓マクロファージで最も豊富で濃縮されたマイクロＲＮＡであることを示す図である。（Ｆ）ｍｉＲＮＡ（バー）及び対応する３’－ＵＴＲ標的プール（黒線）の測定されたコピーは、偽手術又はＴＡＣ手術後に野生型（ＷＴ）マウスから単離された心臓マクロファージで最も発現されたｍｉＲＮＡの１００万あたりの総読み取り数（ＴＰＭ）で示される。ｍｉＲ－２１は赤色で示されている。Ｙ軸は対数スケールである。ｎ＝群あたり３。（Ｇ）マクロファージ特異的ｍｉＲ－２１欠損（ｍｉＲ－２１ ｃＫＯ）マウスは、常在マクロファージで特異的に活性なＣｘ３ｃｒ１プロモーターによって駆動されるＣｒｅリコンビナーゼを発現するマウス系統とｍｉＲ－２１－ｆｌｏｘｅｄマウスを交配することによって生成した。心臓マクロファージにおけるｍｉＲ－２１の発現。データは平均値と個々の値を示し、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して分析した。ＷＴ：ｎ＝３、ｍｉＲ－２１ ｃＫＯ：ｎ＝５。データは平均値と個々の値を示し、スチューデント（Ｓｔｕｄｅｎｔ）のｔ検定を使用して分析した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、及び＊＊Ｐ＜０．００１。

【図9A-B】図９は、ｍｉＲ－２１のマクロファージ特異的欠失は、マウスの圧負荷による心筋リモデリングを防止することを示す図である。生後８週の野生型マウス及びｍｉＲ－２１ ｃＫＯマウスにＴＡＣ又は偽手術を施し、４週間後に心臓を採取した。心機能は、手術前、手術後２週間、及び実験終了時（手術後４週間）に実施される心エコー検査によってモニタリングした。（Ａ）実験戦略。（Ｂ）代表的な心筋切片のシリウスレッド／ファストグリーン染色及び細胞外マトリックスの定量化。

【図9C】図９は、ｍｉＲ－２１のマクロファージ特異的欠失は、マウスの圧負荷による心筋リモデリングを防止することを示す図である。生後８週の野生型マウス及びｍｉＲ－２１ ｃＫＯマウスにＴＡＣ又は偽手術を施し、４週間後に心臓を採取した。心機能は、手術前、手術後２週間、及び実験終了時（手術後４週間）に実施される心エコー検査によってモニタリングした。（Ｃ）小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ）で染色された代表的な心筋切片及び心筋細胞領域の定量化。

【図9D-E】図９は、ｍｉＲ－２１のマクロファージ特異的欠失は、マウスの圧負荷による心筋リモデリングを防止することを示す図である。生後８週の野生型マウス及びｍｉＲ－２１ ｃＫＯマウスにＴＡＣ又は偽手術を施し、４週間後に心臓を採取した。心機能は、手術前、手術後２週間、及び実験終了時（手術後４週間）に実施される心エコー検査によってモニタリングした。（Ｄ）コラーゲン遺伝子（Ｃｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ１ａ２）、Ａｃｔａ２、Ｍｙｈ７、及びＮｐｐａのｍＲＮＡレベルの定量的ＰＣＲ評価。（Ｅ）左心室駆出率によって測定される心機能の評価。

【図9F-G】図９は、ｍｉＲ－２１のマクロファージ特異的欠失は、マウスの圧負荷による心筋リモデリングを防止することを示す図である。生後８週の野生型マウス及びｍｉＲ－２１ ｃＫＯマウスにＴＡＣ又は偽手術を施し、４週間後に心臓を採取した。心機能は、手術前、手術後２週間、及び実験終了時（手術後４週間）に実施される心エコー検査によってモニタリングした。（Ｆ）収縮期及び拡張期にＶｅｖｏｓｔｒａｉｎソフトウェアを使用して測定された心臓の歪みの代表的なスペックルトレース。（Ｇ）ピーク半径方向歪み（％）、ピーク長手方向歪み（％）、及びピーク円周方向歪み（％）の定量化。スケールバーは２ｍｍ（Ｂ）及び１００ｍｍ（Ｃ）を表す。ＷＴシャム（偽）：ｎ＝６、ｍｉＲ－２１ ｃＫＯシャム（偽）：ｎ＝７、ＷＴ ＴＡＣ：ｎ＝１０、ｍｉＲ－２１ｃＫＯ ＴＡＣ：ｎ＝７。データは平均値と個々の値を示し、スチューデント（Ｓｔｕｄｅｎｔ）のｔ検定（Ａ）又は二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）のいずれか及びサイダック（Ｓｉｄａｋ）の事後検定（Ｂ～Ｇ）を使用して分析した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、及び＊＊＊Ｐ＜０．００１。

【図10A】図１０は、単一細胞配列決定により、心臓マクロファージでｍｉＲ－２１を特異的に欠失させた後、心臓に常在様マクロファージが蓄積していることが明らかになることを示す図である。（Ａ）ＴＡＣ手術の６日後に野生型マウス及びｍｉＲ－２１ ｃＫＯマウスの心臓から単離された非心筋細胞の単一細胞配列決定の実験ワークフロー。バーコード化されたｃＤＮＡライブラリーは、１０Ｘ Ｃｈｒｏｍｉｕｍ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ ３’－Ｌｉｂｒａｒｙキット試薬を使用して生成し、配列決定はＨｉＳｅｑ４０００を使用して行い、Ｃｅｌｌ Ｒａｎｇｅｒ及びＳｅｕｒａｔパッケージを使用して分析した。

【図10B】図１０は、単一細胞配列決定により、心臓マクロファージでｍｉＲ－２１を特異的に欠失させた後、心臓に常在様マクロファージが蓄積していることが明らかになることを示す図である。（Ｂ）野生型トランスクリプトーム及びｍｉＲ－２１ ｃＫＯ単一細胞トランスクリプトームの分布の次元削減、及びそれらの遺伝子発現に基づく細胞のグループ化を示す、ＵＭＡＰ分布プロット。

【図10C】図１０は、単一細胞配列決定により、心臓マクロファージでｍｉＲ－２１を特異的に欠失させた後、心臓に常在様マクロファージが蓄積していることが明らかになることを示す図である。（Ｃ）マクロファージ、常在様マクロファージ、及び炎症性マクロファージのマーカー遺伝子の発現を示すバイオリンプロット。

【図10D】図１０は、単一細胞配列決定により、心臓マクロファージでｍｉＲ－２１を特異的に欠失させた後、心臓に常在様マクロファージが蓄積していることが明らかになることを示す図である。（Ｄ）様々なマクロファージクラスターを表す円グラフ。

【図10E1】図１０は、単一細胞配列決定により、心臓マクロファージでｍｉＲ－２１を特異的に欠失させた後、心臓に常在様マクロファージが蓄積していることが明らかになることを示す図である。（Ｅ）ＷＴ ＴＡＣ対ＷＴシャム（偽）及びｍｉＲ－２１ ｃＫＯ ＴＡＣ対ＷＴ ＴＡＣにおける常在様マクロファージの上位２００個の調節解除された遺伝子の生物学的プロセスに関する遺伝子オントロジー（ＧＯ）濃縮分析。上位の大きな比率を占める遺伝子オントロジー用語に関連する遺伝子の関連付けを示すコードダイアグラム。

【図10E2】図１０は、単一細胞配列決定により、心臓マクロファージでｍｉＲ－２１を特異的に欠失させた後、心臓に常在様マクロファージが蓄積していることが明らかになることを示す図である。（Ｅ）ＷＴ ＴＡＣ対ＷＴシャム（偽）及びｍｉＲ－２１ ｃＫＯ ＴＡＣ対ＷＴ ＴＡＣにおける常在様マクロファージの上位２００個の調節解除された遺伝子の生物学的プロセスに関する遺伝子オントロジー（ＧＯ）濃縮分析。上位の大きな比率を占める遺伝子オントロジー用語に関連する遺伝子の関連付けを示すコードダイアグラム。

【図10F】図１０は、単一細胞配列決定により、心臓マクロファージでｍｉＲ－２１を特異的に欠失させた後、心臓に常在様マクロファージが蓄積していることが明らかになることを示す図である。（Ｆ）ＲＮＡ速度は、ＷＴ対照と比較して、ｍｉＲ－２１ ｃＫＯマウスのＭ１様マクロファージからＭ２様マクロファージへのより速いシフトを示している。

【図10E2】図１０は、単一細胞配列決定により、心臓マクロファージでｍｉＲ－２１を特異的に欠失させた後、心臓に常在様マクロファージが蓄積していることが明らかになることを示す図である。（Ｇ）ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１又はＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ対照での炎症誘発性遺伝子（Ｔｎｆ、Ｉｌ６、Ｎｏｓ２）の発現は、５ｎｇ／ｍＬのリポ多糖（ＬＰＳ）による刺激の有無にかかわらず、骨髄由来マクロファージを処理した。ｎ＝６。データは平均値及び個々の値を示し、二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）及びサイダック（Ｓｉｄａｋ）の事後検定を使用して分析した。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、及び＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。

【図11A】図１１は、単一細胞トランスクリプトミクスデータセットにおけるリガンド受容体ペアリングの分析により、心筋マクロファージが線維芽細胞活性化の主要なパラクリンインデューサーであることが特定されることを示す図である。（Ａ）ＷＴマウス及びｍｉＲ－２１ ｃＫＯマウスの異なる心臓細胞画分間でパラクリン及びオートクリン相互作用が有意にアップレギュレートされたことをまとめたコード図。線の色は、同じ色の細胞集団によって広められるリガンドを示す。線の太さは、同族受容体がレシピエント細胞集団に存在するリガンドの数に比例し、数字は各集団間リンクのリガンド－受容体ペアの量を示す。リガンド又は受容体は、細胞集団の少なくとも２０％で検出された場合に発現していると見なされる。最大数の相互作用は、ｍｉＲ－２１ ｃＫＯマウスで抑制された野生型で、Ｍ１様マクロファージから活性化線維芽細胞（Ｐｏｓｔｎ＋）に向かって生じた。

【図11B-C】図１１は、単一細胞トランスクリプトミクスデータセットにおけるリガンド受容体ペアリングの分析により、心筋マクロファージが線維芽細胞活性化の主要なパラクリンインデューサーであることが特定されることを示す図である。（Ｂ）Ｍ１様マクロファージから活性化線維芽細胞（Ｐｏｓｔｎ＋）細胞へのパラクリン相互作用の詳細図。（Ｃ）ＲＮＡ速度は、ＷＴ対照と比較して、ｍｉＲ－２１ ｃＫＯマウスにおける活性化線維芽細胞から筋線維芽細胞への分化の抑制を示している。

【図11D-E】図１１は、単一細胞トランスクリプトミクスデータセットにおけるリガンド受容体ペアリングの分析により、心筋マクロファージが線維芽細胞活性化の主要なパラクリンインデューサーであることが特定されることを示す図である。（Ｄ）様々なマクロファージクラスターを表す円グラフ。（Ｅ）成体マウス心臓線維芽細胞（ＡＭＣＦ）と骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）との共培養の実験戦略。マクロファージを骨髄前駆細胞から分化させ、１００ｎＭのＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１又はＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－対照をトランスフェクトし、ＬＰＳで刺激した。新たに単離したＡＭＣＦを、ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１で処理したＢＭＤＭ（ＰＢＳで洗浄後）と４８時間共培養した。ＡＭＣＦの単一培養は、陰性対照として機能した。免疫蛍光染色は、ビメンチン（ＶＩＭ；線維芽細胞のマーカー）及びβ－平滑筋アクチン（ＡＣＴＡ２；筋線維芽細胞のマーカー）に対して行った。核はＤＡＰＩで染色した。線維芽細胞の活性化を、ＡＣＴＡ２発現によって測定した。

【図11F】図１１は、単一細胞トランスクリプトミクスデータセットにおけるリガンド受容体ペアリングの分析により、心筋マクロファージが線維芽細胞活性化の主要なパラクリンインデューサーであることが特定されることを示す図である。（Ｆ）ＡＣＴＡ２陽性心臓線維芽細胞の割合。Ｎ＝４～６個の独立した実験を３連で実施。データは平均値及び個々の値であり、二元配置分散分析及びサイダック（Ｓｉｄａｋ）の事後検定を使用して分析した。＊＊＊Ｐ＜０．００１。

【図12A】図１２は、ｍｉＲ－２１は、肺マクロファージで最も豊富で濃縮されたマイクロＲＮＡであることを示す図である。（Ａ）肺胞マクロファージ及び間質マクロファージの単離のためのフローサイトメトリー戦略。

【図12B-C】図１２は、ｍｉＲ－２１は、肺マクロファージで最も豊富で濃縮されたマイクロＲＮＡであることを示す図である。（Ｂ）全肺細胞及びマクロファージ集団の低分子（ｓｍａｌｌ）ＲＮＡ配列決定によって決定されたマイクロＲＮＡ発現プロファイル。野生型マウスの肺から単離された全肺細胞、肺胞マクロファージ、及び間質マクロファージにおけるｍｉＲＮＡの円グラフ表示。ｎ＝群あたり３匹のマウス。（Ｃ）異なる肺細胞型における定量的リアルタイムＰＣＲによるｍｉＲ－２１の発現は、マクロファージ集団におけるｍｉＲ－２１の濃縮を示した。ｎ＝３。データは平均±標準誤差である。

【図13A】図１３は、ｍｉＲ－２１は、肺傷害後のマウス及びヒトでアップレギュレートされることを示す図である。（Ａ）ｍｉＲ－２１は、肺傷害後のマウスで上昇する。ＰＢＳ又はブレオマイシンのいずれかを投与してから１４日後にマウスから採取した肺組織におけるｍｉＲ－２１の発現。ＰＢＳ：ｎ＝８、Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ：ｎ＝９。

【図13B】図１３は、ｍｉＲ－２１は、肺傷害後のマウス及びヒトでアップレギュレートされることを示す図である。（Ｂ）ｍｉＲ－２１は、特発性肺線維症（ＩＰＦ）患者の肺組織で増加している。

【図13C-D】図１３は、ｍｉＲ－２１は、肺傷害後のマウス及びヒトでアップレギュレートされることを示す図である。（Ｃ～Ｄ）ｍｉＲ－２１の阻害は、ブタの心臓をＩ／Ｒ誘発性肺線維症から保護する。（Ｃ）ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１を、ブタでの虚血再灌流傷害中の５日目及び１９日目にカテーテルで局所的に適用した（図１も参照）。ブタの心臓に、ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１又はＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ対照を局所適用した後の肺組織におけるｍｉＲ－２１発現の定量分析。ＨＦ ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ対照：ｎ＝３、ＨＦ ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１：ｎ＝５。（Ｄ）Ｉ／Ｒ誘発性肺線維症の定量化。データは平均±標準誤差である。スチューデント（Ｓｔｕｄｅｎｔ）のｔ検定を使用して分析した。＊Ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．０１。

【図14A-B】図１４は、ｍｉＲ－２１の筋線維芽細胞特異的欠失は、マウスの圧誘発性心筋梗塞心筋リモデリングを防止することを示す図である。筋線維芽細胞特異的ｍｉＲ－２１欠損（Ｐｏｓｔｎ ｍｉＲ－２１ ｃＫＯ）マウスは、ｍｉＲ－２１ ｆｌｏｘｅｄマウスを、筋線維芽細胞で特に活性を有するペリオスチン（Ｐｏｓｔｎ）プロモーターによって駆動される誘導性ｍｅｒ－ｃｒｅ－ｍｅｒリコンビナーゼ（ＭＣＭ）を発現するマウス系統と交配することによって生成した。８週齢の野生型マウス及びｍｉＲ－２１ ｃＫＯマウスは、心筋梗塞（ＭＩ）又は偽手術のいずれかを受けた。心機能障害を評価するために手術の１週間後にマウスで心エコー検査を実施し、タモキシフェン（４０ｍｇ／ｋｇ／日）をマウスに５日間腹腔内投与して、筋線維芽細胞で特異的にｍｉＲ－２１を欠失させた。心臓を４週間後に採取した。（Ａ）実験戦略。（Ｂ）タモキシフェンの最終注射の２日後のマウスの心臓線維芽細胞におけるｍｉＲ－２１の発現。

【図14C-D】図１４は、ｍｉＲ－２１の筋線維芽細胞特異的欠失は、マウスの圧誘発性心筋梗塞心筋リモデリングを防止することを示す図である。筋線維芽細胞特異的ｍｉＲ－２１欠損（Ｐｏｓｔｎ ｍｉＲ－２１ ｃＫＯ）マウスは、ｍｉＲ－２１ ｆｌｏｘｅｄマウスを、筋線維芽細胞で特に活性を有するペリオスチン（Ｐｏｓｔｎ）プロモーターによって駆動される誘導性ｍｅｒ－ｃｒｅ－ｍｅｒリコンビナーゼ（ＭＣＭ）を発現するマウス系統と交配することによって生成した。８週齢の野生型マウス及びｍｉＲ－２１ ｃＫＯマウスは、心筋梗塞（ＭＩ）又は偽手術のいずれかを受けた。心機能障害を評価するために手術の１週間後にマウスで心エコー検査を実施し、タモキシフェン（４０ｍｇ／ｋｇ／日）をマウスに５日間腹腔内投与して、筋線維芽細胞で特異的にｍｉＲ－２１を欠失させた。心臓を４週間後に採取した。（Ｃ）脛骨長に対する心重量の比率（ＨＷ／ＴＬ）。（Ｄ）脛骨長に対する肺重量の比率（ＬＷ／ＴＬ）。

【図14E-F】図１４は、ｍｉＲ－２１の筋線維芽細胞特異的欠失は、マウスの圧誘発性心筋梗塞心筋リモデリングを防止することを示す図である。筋線維芽細胞特異的ｍｉＲ－２１欠損（Ｐｏｓｔｎ ｍｉＲ－２１ ｃＫＯ）マウスは、ｍｉＲ－２１ ｆｌｏｘｅｄマウスを、筋線維芽細胞で特に活性を有するペリオスチン（Ｐｏｓｔｎ）プロモーターによって駆動される誘導性ｍｅｒ－ｃｒｅ－ｍｅｒリコンビナーゼ（ＭＣＭ）を発現するマウス系統と交配することによって生成した。８週齢の野生型マウス及びｍｉＲ－２１ ｃＫＯマウスは、心筋梗塞（ＭＩ）又は偽手術のいずれかを受けた。心機能障害を評価するために手術の１週間後にマウスで心エコー検査を実施し、タモキシフェン（４０ｍｇ／ｋｇ／日）をマウスに５日間腹腔内投与して、筋線維芽細胞で特異的にｍｉＲ－２１を欠失させた。心臓を４週間後に採取した。（Ｅ）ＭＩ手術後２８日目に左心室駆出率によって測定される心機能の評価。（Ｆ）ＭＩ後２８日目の拡張末期容積及び収縮末期容積の定量化。

【図14G】図１４は、ｍｉＲ－２１の筋線維芽細胞特異的欠失は、マウスの圧誘発性心筋梗塞心筋リモデリングを防止することを示す図である。筋線維芽細胞特異的ｍｉＲ－２１欠損（Ｐｏｓｔｎ ｍｉＲ－２１ ｃＫＯ）マウスは、ｍｉＲ－２１ ｆｌｏｘｅｄマウスを、筋線維芽細胞で特に活性を有するペリオスチン（Ｐｏｓｔｎ）プロモーターによって駆動される誘導性ｍｅｒ－ｃｒｅ－ｍｅｒリコンビナーゼ（ＭＣＭ）を発現するマウス系統と交配することによって生成した。８週齢の野生型マウス及びｍｉＲ－２１ ｃＫＯマウスは、心筋梗塞（ＭＩ）又は偽手術のいずれかを受けた。心機能障害を評価するために手術の１週間後にマウスで心エコー検査を実施し、タモキシフェン（４０ｍｇ／ｋｇ／日）をマウスに５日間腹腔内投与して、筋線維芽細胞で特異的にｍｉＲ－２１を欠失させた。心臓を４週間後に採取した。（Ｇ）ピーク半径方向歪み（％）の定量化。ＷＴシャム（偽）：ｎ＝４、Ｐｏｓｔｎ ｍｉＲ－２１ｃＫＯシャム（偽）：ｎ＝５、ＷＴ ＭＩ：ｎ＝７、Ｐｏｓｔｎ ｍｉＲ－２１ｃＫＯ ＭＩ：ｎ＝８。データは平均値及び個々の値を示し、二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）及びサイダック（Ｓｉｄａｋ）の事後検定を使用して分析した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、及び＊＊＊Ｐ＜０．００１。

【図15】図１５は、抗体結合オリゴヌクレオチド。５’－アミン修飾オリゴヌクレオチドをリガンド又は抗体（又はその抗体断片）を、標的細胞型で特異的に濃縮された受容体に結合するための例示的な方法。抗体をペプシンで消化して、より小さな抗体断片を得ることができる。

【図16】図１６は、表１：肝機能及び腎機能の選択された生化学的パラメーターの血清学的分析。

【図17】図１７は、表２：心血管イベント。

【図18】図１８は、精製された初代細胞画分のＲＮＡ配列決定によって特定された、ヒト肺及び心臓組織のマクロファージ及び／又は線維芽細胞に対するａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１の標的化の受容体候補を示すヒートマップ。データは、トランスクリプトーム全体のディープＲＮＡシーケンシングからのものであり、細胞型特異性についてフィルター処理され、クラスター化されている。赤は相対的な濃縮を示し、青は描写されている他の細胞型と比較した相対的な欠乏を示している。左下隅には、マクロファージ標的化の標的候補を表す上位候補の表面受容体が列挙されている。本発明は、本発明及びその多くの利点のより良い理解を提供する以下の実例となる非限定的な実施例によってさらに説明される。

【図19】図１９は、ｍｉＲＮＡ－２１は、ＣＯＶＩＤ－１９患者から採取した肺組織でアップレギュレートされていることを示す図である。（Ａ）スキーム。ヒト肺組織を採取し、ＣＯＶＩＤ－１９患者及び対照被験者の左下葉の同様の領域をＲＮＡ抽出に使用した。低分子ＲＮＡライブラリーは、ＮＥＢ Ｎｅｘｔ Ｓｍａｌｌ ＲＮＡライブラリーキットを使用して生成し、試料はＭｉＳｅｑシーケンサーを使用して配列決定した。（Ｂ）肺組織におけるｍｉＲＮＡ発現プロファイル。ＣＯＶＩＤ－１９患者及び対照被験者の肺組織に豊富に存在する上位１０位のｍｉＲＮＡの円グラフ表示。対照被検体：ｎ＝３、ＣＯＶＩＤ－１９患者：ｎ＝３。

【図20】図２０は、ｍｉＲ－２１は、マウス肺のマクロファージで濃縮されていることを示す図である。ｍｉＲ－２１は、マウス肺の肺胞マクロファージ（ＡＭ）で濃縮されている。様々な細胞型の肺細胞型（各細胞型でｎ＝１～３）で示差的に発現するｍｉＲＮＡ（ｌｏｇ２倍変化＞＝１又はｌｏｇ２倍変化＜＝－１及びＰ値調整値＜＝０．０５）のヒートマップ表現：線維芽細胞（Ｆｂ）、内皮細胞（ＥＣ）、上皮細胞（ＥｐＣ）、好中球（ＮｅｕＴ）、Ｔ細胞（Ｔ）、間質マクロファージ（ＩＭ）。

【図21】図２１は、ｍｉＲ－２１は、肺線維症のマウスモデルの肺組織でアップレギュレートされていることを示す図である。マイクロ噴霧器を使用してブレオマイシンをマウスの肺に投与し、７日後に肺組織を採取した。全ＲＮＡを抽出し、ＮＥＢＮｅｘｔ Ｓｍａｌｌ ＲＮＡライブラリー調製キットを使用してｍｉＲＮＡライブラリーを調製し、ＭｉＳｅｑシーケンサーで配列決定した。ｍｉＲＤｅｅｐ２を使用して配列決定読み取りを分析し、発現差のあるｍｉＲＮＡをＤＥＳｅｑで特定した。大幅に調節解除されたマイクロＲＮＡ（ＦＤＲ＜０．０５）を赤色で示す。

【図22A】図２２は、マンノース受容体Ｃ型１（ＭＲＣ１）は、肺組織のマクロファージによって発現されることを示す図である。（Ａ）肺マクロファージで濃縮されている表面受容体候補を特定するための戦略。

【図22B-C】図２２は、マンノース受容体Ｃ型１（ＭＲＣ１）は、肺組織のマクロファージによって発現されることを示す図である。（Ｂ）肺胞マクロファージ及び間質マクロファージにおけるＭｒｃ１の相対的存在量。（Ｃ）異なる肺細胞型におけるＭｒｃ１の発現。

【図22D-E】図２２は、マンノース受容体Ｃ型１（ＭＲＣ１）は、肺組織のマクロファージによって発現されることを示す図である。（Ｄ）ブレオマイシンの１４日後にマウス肺から生成された単一細胞トランスクリプトームにおけるＭｒｃ１の発現を示す機能プロット（ＧＳＥ１４１２５９；ＰＢＳ：ｎ＝７；ブレオマイシン：ｎ＝４）。（Ｅ）ＭＲＣ１に対する抗体を使用した５μｍマウスブレオマイシン処理肺切片の代表的な免疫蛍光染色。核はＳｙｔｏｘ ｇｒｅｅｎで染色した。スケールバーは２００μｍを表す。

【図22F】図２２は、マンノース受容体Ｃ型１（ＭＲＣ１）は、肺組織のマクロファージによって発現されることを示す図である。（Ｆ）対照及びＩＰＦ（特発性肺線維症）ヒト肺から生成された単一細胞トランスクリプトームにおけるＭｒｃ１の発現を示す機能プロット（ＧＳＥ１３５８９３；対照：ｎ＝１０；ＩＰＦ：ｎ＝１２）。

【図23A-B】図２３は、マンノース受容体Ｃ型１リガンドの化学構造の例。（Ａ）配位子結合及びａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１のデザインを示すスキーム。（Ｂ）マンノース受容体リガンド結合ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１分子の例示的な化学構造。Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）（上）又はマンノース（下）リガンドをＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１（配列番号１）に結合させた。

【図23B】（Ｂ）マンノース受容体リガンド結合ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１分子の例示的な化学構造。Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）（上）又はマンノース（下）リガンドをＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１（配列番号１）に結合させた。

【図24A】図２４は、マクロファージへの標的化送達のためのリガンド結合ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１。（Ａ）実験戦略。野生型マウスに、ｆｌｅｘｉＶｅｎｔ（登録商標）噴霧ユニットを使用した吸入により、１．２５ｍｇ／ｋｇのマンノース、ＧａｌＮＡｃ、又は非結合ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１－ＦＡＭを投与した。ＰＢＳを投与されたマウスは、陰性対照の役割であった。２時間後、マウスを犠牲にし、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）を、２ｍＭ ＥＤＴＡ含有氷冷ＰＢＳの連続的な滴下及び吸引によって収集した。次に、肺を採取し、酵素消化に供し、磁気マイクロビーズ結合抗ＣＤ４５抗体によって免疫細胞を濃縮した。免疫細胞濃縮画分は、マクロファージ（ＭＰ）のＣＤ４５、Ｆ４／８０、及びＭＲＣ１に対する抗体、又はＴ細胞及び好中球（Ｎ）のＣＤ４５、ＣＤ３、及びＬｙ６Ｇに対する抗体で染色した。非免疫細胞画分が濃縮されたフロースルー細胞懸濁液をＣＤ４５、ＥＰＣＡＭ、ＣＤ１０５、及びＣＤ１４０ａに対する抗体で染色して、上皮細胞（Ｅｐ）、内皮細胞（ＥＣ）、及び線維芽細胞（ＦＢ）をそれぞれ分析した。白血球を除外するために、非免疫細胞画分に抗ＣＤ４５抗体を使用した。次いで、フローサイトメトリーを使用して細胞をＦＡＭシグナル強度について評価した。

【図24B】図２４は、マクロファージへの標的化送達のためのリガンド結合ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１。（Ｂ）ＢＡＬＦから単離されたＦＡＭ陽性マクロファージの割合。（Ｃ）肺の異なる細胞型におけるＦＡＭ陽性細胞の割合。非結合：ＰＢＳ：ｎ＝３、０．６２５ｍｇ／ｋｇ：ｎ＝３、１．２５ｍｇ／ｋｇ：ｎ＝３、２．５ｍｇ／ｋｇ：ｎ＝３。マンノース結合：ＰＢＳ：ｎ＝３、１．２５ｍｇ／ｋｇ：ｎ＝３。ＧａｌＮＡｃ結合：ＰＢＳ：ｎ＝２、０．６２５ｍｇ／ｋｇ：ｎ＝２、１．２５ｍｇ／ｋｇ：ｎ＝２、２．５ｍｇ／ｋｇ：ｎ＝２。データは平均値及び個々の値であり、二元配置分散分析及びテューキー（Ｔｕｋｅｙ）の事後検定を使用して分析した。非結合ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１－ＦＡＭ群及びマンノース結合ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１－ＦＡＭ群の間でのみ比較を行った。＊Ｐ＜０．０５。ＧａｌＮＡｃ：Ｎ－アセチルガラクトサミン。ＦＡＭ：フルオレセインアミダイト。

【図25】図２５は、フローサイトメトリーを使用した、ＢＡＬＦ及び肺組織からのマクロファージによるマンノース結合ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１－ＦＡＭ取り込みの評価。（Ａ）ＢＡＬＦ及び肺組織からのマクロファージにおけるＦＡＭシグナルの蛍光強度の中央値。（Ｂ）マクロファージサブセットの代表的なヒストグラム。非結合：ＰＢＳ：ｎ＝３、１．２５ｍｇ／ｋｇ：ｎ＝３。マンノース結合：ＰＢＳ：ｎ＝３、１．２５ｍｇ／ｋｇ：ｎ＝３。データは平均値と個々の値であり、スチューデント（Ｓｔｕｄｅｎｔ）のｔ検定を使用して分析した。＊Ｐ＜０．０５。ＦＡＭ：フルオレセインアミダイト。

【図26A-B】図２６は、ｍｉＲ－２１の阻害は、ブレオマイシン誘発性肺リモデリング及び肺機能障害を軽減したことを示す図である。（Ａ）実験戦略。マイクロ噴霧器を使用して、マウスの肺にＰＢＳ又はブレオマイシン（２Ｕ／ｋｇ）を投与した。マンノース結合マイクロリボ核酸（ｍｉＲ）阻害剤ロックド核酸（ＬＮＡ）修飾アンチセンスｍｉＲ－２１（２．５ｍｇ／ｋｇ）を、ブレオマイシン誘発性肺損傷後４日目にｆｌｅｘｉＶｅｎｔ（登録商標）ネブライザーを使用して吸入により適用した。ａｎｔｉ－ｍｉＲ適用の１０日後、ｆｌｅｘｉＶｅｎｔ（登録商標）を使用して肺機能を評価し、形態計測分析のために肺を採取した。（下）ｍｉＲ－２１配列（配列番号４）、ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１配列（配列番号１）、ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－ミスマッチ－２１配列（対照）（配列番号５）。（Ｂ）シリウスレッド／ファストグリーンを使用した肺組織の代表的な染色及びその定量化。スケールバーは１００μｍを表す。

【図26C-F】図２６は、ｍｉＲ－２１の阻害は、ブレオマイシン誘発性肺リモデリング及び肺機能障害を軽減したことを示す図である。（Ｃ）圧力－容積ループ曲線の平均トレース。曲線後部の灰色の陰影部分は、標準誤差の平均を示す。（Ｄ～Ｆ）準静的エラスタンス（Ｄ）、準静的コンプライアンス（Ｅ）、及び吸気量（Ｆ）によって示される肺機能。マンノース結合ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－ミスマッチ－２１：ＰＢＳ：ｎ＝３、ブレオマイシン：ｎ＝７。マンノース結合ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１：ＰＢＳ：ｎ＝３、ブレオマイシン：ｎ＝６。データは平均値及び個々の値であり、二元配置分散分析及びテューキー（Ｔｕｋｅｙ）の事後検定を使用して分析した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、及び＊＊＊Ｐ＜０．００１。

【図27A-C】図２７は、マンノース受容体Ｃ型１（ＭＲＣ１）は、マウス心臓のマクロファージによって発現されることを示す図である。（Ａ）心臓で濃縮されている表面受容体候補を特定するための戦略。（Ｂ）他の心筋細胞型と比較した、マクロファージにおける表面受容体の相対的な濃縮及び存在量。（Ｃ）異なる心筋細胞型におけるＭｒｃ１の発現。

【図27D-E】図２７は、マンノース受容体Ｃ型１（ＭＲＣ１）は、マウス心臓のマクロファージによって発現されることを示す図である。（Ｄ）圧力過負荷の６日後のマウス心臓から生成された単一細胞トランスクリプトームにおけるＭｒｃ１の発現を示す機能プロット。（Ｅ）他の心筋細胞型と比較した、線維芽細胞における表面受容体の相対的な濃縮及び存在量。

【実施例】

【0152】

実施例１
ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１の局所送達によるｍｉＲ－２１の阻害
心不全の大型動物モデルの左心室（ＬＶ）心筋におけるｍｉＲ－２１の発現を、すなわち、左前下行枝（ＬＡＤ）の一過性閉塞（６０分）を受けたブタにおいて決定した。パイロット実験では、安楽死の前に動物を１、７、又は２８日間経過観察し、さらなる分析のために心臓を除去した（図１Ａ）。ｍｉＲ－２１の発現は、ＬＶ心筋（図１Ａ）の遠隔領域及び境界領域の両方の領域で徐々にアップレギュレートされた。この発現動態及び急性虚血の心筋細胞におけるｍｉＲ－２１の報告された抗アポトーシスの役割（Ｓａｙｅｄ ｅｔ ａｌ．， ２０１０）から、以下の実験デザインを採用した：ブタをＩ／Ｒに供し、瘢痕形成を可能にするために５日間未処理のままとし、その後２回（Ｉ／Ｒ後５日目及び１９日目）ロックド核酸（ＬＮＡ）修飾ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１（ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１）を局所的に冠状動脈に投与した（図１Ｂ）。高い特異性及び有効性でｍｉＲ－２１を阻害するために、ホスホロチオエートで修飾した１５ヌクレオチドのＬＮＡ／ＤＮＡミックスマー（ｍｉｘｍｅｒ）型デザインを選択した。１０ｍｇのＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１（ホスホロチオエートで修飾した１５ヌクレオチド、ＬＮＡ／ＤＮＡミックスマー）又は対照を、左前下行枝（ＬＡＤ）及び左回旋動脈（ＬＣｘ）に３：２の比率で、血管形成バルーンによる血管の同時閉塞を伴う、血管当たり３分間の期間にわたって注入した（図１Ｂ）。Ｉ／Ｒ傷害の３３日後、ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１の冠動脈内送達により、左心室虚血心筋から調製したＲＮＡの定量的ＲＴ－ＰＣＲによって検出されるように、ｍｉＲ－２１が大幅に減少した（－６６％）（図１Ｃ）。興味深いことに、ｍｉＲ－２１の抑制は、心筋の遠隔領域に対して境界領域で優先的に発生するように見え、虚血組織への優先的な取り込みが示唆された。同様に、ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１を局所的に適用しても、心臓、右心室、左心房、及び右心房の他の領域のｍｉＲ－２１レベルは変化しなかった（図２）。ブタでのａｎｔｉ－ｍｉＲ局所適用の以前の結果（Ｈｉｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）と一致して、全身性オリゴヌクレオチド治療薬の非常に高い取り込みで知られている臓器である腎臓及び肺（図２）で、ｍｉＲ－２１の適度ではあるが有意な減少が観察された（Ｓｔｅｎｖａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１２）。腎機能及び肝機能の通常の臨床化学パラメーターの血清濃度は正常範囲内であり、腎機能及び肝機能が損なわれていないことを示している（表１）。また、ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１の適用時に、ａｎｔｉ－ｍｉＲ適用前にのみ発生した不整脈又は死亡のエピソードは観察されなかった（表２）。まとめると、ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１のカテーテルベースの局所送達は、心不全の大型動物モデルのＬＶ心筋におけるｍｉＲ－２１の長期抑制に効果的であった。

【0153】

表１。肝機能及び腎機能の選択された生化学的パラメーターの血清学的分析

【表2】

（ＭＥＡＮ±ＳＥＭ、Ｐ値：ＨＦ対照対ＨＦ ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１）
参考値：ＡＳＴ（ＧＯＴ）（＜５９Ｕ／Ｌ）；ＡＬＴ（ＧＰＴ）（＜６８Ｕ／Ｌ）；γ－ＧＴ（＜５４Ｕ／Ｌ）；クレアチニン（＜１６０μｍｏｌ／Ｌ）；ウレア（２．５～６．７ｍｍｏｌ／μＬ）。

【0154】

表２。心血管イベント

【表3】

（ＭＥＡＮ±ＳＥＭ、Ｐ値：ＨＦ対照対ＨＦ ＬＮＡ－抗ｍｉＲ－２１）

【0155】

ｍｉＲ－２１の阻害は、Ｉ／Ｒ誘発性の有害な心筋リモデリングを減少させる
さらに、心筋リモデリングに対するＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１の効果を決定した（図３）。Ｉ／Ｒの３３日後、２つの異なる処置群は同様の梗塞を示した。この時点で顕著な有害な心臓リモデリングが観察され、体重に対する心重量の有意な増加、心筋細胞肥大及び心臓線維症として明らかであり、それら全てはＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１投与ブタで大幅に減少した（図３Ａ～図３Ｃ）。次に、心筋のリモデリング、すなわち線維芽細胞の増殖、炎症、及び血管新生に関連している重要な病理過程を評価した（図３Ｄ～図３Ｆ）。ＬＶ心筋の免疫蛍光染色は、線維芽細胞の増殖及びマクロファージの浸潤を示し、どちらも対照処置動物と比較してＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１によって大幅に抑制された。対照的に、このモデルでは毛細血管密度の変化のエビデンスは認められず、ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１の影響も受けなかった（図３Ｆ）。ＱＲＴ－ＰＣＲによる心筋の全ＲＮＡの分析により、ヒトを含む他の種の心筋リモデリングを示す遺伝子発現シグネチャが得られ、ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１群では同様に大幅に逆転した（図３Ｇ）。遠隔ＬＶ心筋の比較分析は、心筋リモデリングを特徴付けるパラメーターの最小限の変化のみを示した。

【0156】

ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１のカテーテルに基づく局所送達は、全体的及び局所的な心筋機能を改善する
心機能に対するｍｉＲ－２１阻害の影響を評価するために、侵襲的血行動態測定（圧容積分析、ＰＶ分析）を、虚血前（０日目）、虚血後５日目（ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１投与前）、及び虚血後３３日目（速度・収縮関係を得るために心臓ペーシングを伴う３３日目）に実施した。これは、駆出率（ＥＦ）及び安静時の心筋灌流を決定する虚血前（０日目）及び虚血後（３３日目）の造影剤による蛍光透視法で補完された。３３日目に動物を犠牲にして組織を採取する前に、超音波結晶を境界領域（閉塞部位の１０ｍｍ遠位）及び遠隔心筋に移植する際に、心臓ペーシングを使用したソノマイクロメトリーを実施した（実験戦略の概要については、図１Ｂのスキームを参照）。

【0157】

対照処置動物は、ＬＶＥＤＰの増加、ＬＶ拍出量の減少、及び明らかな心不全を示す負の速度・収縮関係を示す、全体的な心筋機能の著しい低下を示した（図４Ａ～図４Ｅ）。対照的に、ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１による処置は心機能の低下を有意に防止した（図４Ａ～図４Ｅ）。一貫して、ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１適用は、正の速度・収縮関係によって示されるように、左心室の機能予備力の大幅な増加をもたらした（図４Ｄ及び図４Ｅ）。ＬＶ容積の分析も同様に、ＬＶ収縮末期容積の大幅な減少を示したが（ＨＦ：５８．５±３．４、ＨＦ ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－対照：５８±０．４、ＨＦ ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１：４０．２±５．３）、ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１で観察されたＬＶ拡張末期容積のわずかな減少は、統計的有意性に達しなかった（ＨＦ：１１２．７±３．５、ＨＦ ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－対照：１０７．６±３、ＨＦ ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１：１０３±２．７）。左室機能の独立した尺度として、ソノマイクロメトリーを使用して、心内膜下セグメントの短縮を決定した（図４Ｆ）。血行動態分析と一致して、ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１は、安静時及びペーシング（１４０ｂｐｍ）条件の両方で、ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ対照処置動物と比較して局所収縮性を改善した（図４Ｆ）。造影剤の注入時の蛍光透視法でも同様に、３３日目にＥＦの顕著な低下を示したが、これはＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１群では防止された（図４Ｇ）。本発明者らの研究デザインは、ＭＲＩ又はＰＥＴなどの組織灌流の定量的決定を目的としていなかったが、微小循環を含むＬＡＤの正常な灌流を示すＴＩＭＩ値が３で（造影剤注入による）冠動脈血流に関して群間の違いは観察されなかった。そして、ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１の効果は、１０ｍｇではなく４ｍｇのオリゴヌクレオチドでの処置から得られた現在のデータが示唆するように、用量依存的であるように見えた（図５）。要約すると、これらの知見は、ｍｉＲ－２１阻害剤の局所適用が虚血性心不全後のこのモデルで心機能を大幅に改善したことを示している。

【0158】

ＡｎｔｉｍｉＲ－２１は、機能不全ブタ心筋のトランスクリプトームシグネチャを正常化する
さらに、ｍｉＲ－２１への干渉が、この大型動物モデルにおける疾患関連遺伝子発現シグネチャに影響を与えるという結果が決定された。偽処置動物（ｎ＝各群から３）と同様にＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１又は対照で処理した左心室虚血性心筋（境界領域）から単離したｐｏｌｙＡ濃縮ＲＮＡのＴｒｕＳｅｑ Ｉｌｌｕｍｉｎａによる配列決定を使用して、アダプターを除去してフィルタリングした後、試料あたり約１億２，６６０万回の読み取りが得られた（読み取りの９９．９％が要件を満たした）。読み取りをブタのゲノム（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ ｖ１１．１）にマッピングすると、１億１，２００万の読み取りを正常にアラインメントさせることができた（図６Ａ）。これは、高い信頼性でアラインメントされた全ての読み取りの９５±０．４％に相当し、データセットの高いデータ品質を示している。これは、本発明者らの知る限り、成体ブタにおける心筋疾患の最初の大規模なディープシーケンシングデータセットである。

【0159】

主成分分析により、研究した３つの異なる実験群内での明確な分離と高い均一性が明らかになり、その後の分析に対するこのデータセットの有効性が強調された（図６Ｂ）。虚血は、ブタの心臓トランスクリプトームの顕著な調節解除に至るが、これはａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１処置によって部分的に元に戻った。

【0160】

これらのトランスクリプトームの変化が実際に心筋におけるｍｉＲ－２１活性の調節に関連しているかどうかを評価するために、全ての遺伝子のｍＲＮＡ倍数変化の分布を決定し、それらをＴａｒｇｅｔＳｃａｎ Ｈｕｍａｎ ７によって予測された保存されたｍｉＲ－２１標的の分布と比較した（図６Ｃ）。ｍｉＲ－２１の阻害は、ｍｉＲ－２１の部位を含まないｍＲＮＡと比較して、ｍｉＲ－２１標的の有意な抑制解除をもたらした（図６Ｃ）。

【0161】

ＡｎｔｉｍｉＲ－２１は、心筋不全における線維化促進性及び炎症性転写シグネチャを阻害する
次に、ＨＦ時に主に活性化され、ｍｉＲ－２１に干渉することによって調節される生物学的プロセスを特定することを試みた。ＨＦで調節解除された全てのｍＲＮＡの遺伝子オントロジー（ＧＯ）濃縮分析（対数倍変化＞２又は対数倍変化＜－２及びＰ値＜０．０５）は、細胞外マトリックスの組織化、細胞接着、骨芽細胞の分化、炎症応答などの組織リモデリングに関連するプロセスの濃縮を示した（図６Ｄ及び図６Ｅの左パネル）。ｍｉＲ－２１への干渉は、炎症応答及び免疫応答に最も強い影響を及ぼし、ＥＲＫ－ＭＡＰ－キナーゼの抑制がそれに続いた（図６Ｄ及び図６Ｅの右パネル）。後者をさらに検証し、この転写サインがＥＲＫ－ＭＡＰキナーゼのタンパク質活性の変化をもたらすかどうか決定するために、心臓組織で活性化ＭＡＰＫ３（ｐＥＲＫ）のウェスタンブロッティング及び免疫蛍光染色を行った（図６Ｆ及び図６Ｇ）。ＡｎｔｉｍｉＲ－２１は、ＨＦ誘導性ＥＲＫ－ＭＡＰキナーゼ活性の有意な阻害をもたらした（図６Ｆ）。リモデリングに関連するＥＲＫの活性化及びａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１によるその抑制は、主に心臓線維芽細胞で発生することがわかった（図６Ｇ）。

【0162】

ブタの遺伝子デコンボリューションアプローチは、ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１処置の影響を受ける主要な細胞型として心臓マクロファージ及び線維芽細胞を特定する。
心筋で観察される転写の変化は、細胞状態の変化に起因すると推定されるが、細胞型の比率の変動にも起因する可能性がある。後者を分析するために、ブタの遺伝子デコンボリューションアプローチを開発した。マウス心臓から選別された４つの主要な心筋細胞型（筋細胞、線維芽細胞、マクロファージ、及び内皮細胞）に由来するディープトランスクリプトームデータが含まれ、マウスｓｃＲＮＡ－Ｓｅｑデータセットに加えて使用された（Ｓｋｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ（Ｓｋｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．， ２０１８）によって報告された再処理されたデータ）（図７Ａ）。次に、対象となる各細胞型で最も濃縮され、非常に特異的で、最も豊富な遺伝子を特定し、これらを組み合わせてｓｃＲＮＡ－Ｓｅｑ及びディープＲＮＡ－Ｓｅｑデータセットを作成した（図７Ａ及び図７Ｂ）。そして、４つの細胞型全てについて、豊富で特異的で濃縮された上位のｍＲＮＡに関するオーバーラップを計算し（図７Ｂ）、これらのマーカーを使用して、デコンボリューション用のシグネチャマトリックスを構築した（図７Ｃ）。次に、この新しい遺伝子デコンボリューションアプローチを適用して、心不全時の心臓リモデリング及びａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１の効果について、偽条件下での相対的な細胞型比率を決定した（図７Ｄ）。機能低下心筋は、マクロファージ及び線維芽細胞の数の顕著な増加によって特徴付けられた。ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１による処置は、マクロファージの数及び線維芽細胞の数の増加を逆転させた。心臓組織からのＲＮＡ－Ｓｅｑデータを分析するこの不偏のアプローチは、定量的な方法で細胞画分を決定することができる。これは、ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１による処理が、マクロファージ及び線維芽細胞の増加した細胞数の正常化につながったことを示している（図７Ｄ）。

【0163】

特定の臓器を標的とする別のアプローチは、ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１の適用を局所化することである。心臓カテーテル検査は、急性冠症候群を呈する全患者の大多数がこの介入を受けている臨床心臓病学の日常的な手順になっている（Ｂａｓｈｏｒｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１２）。心臓カテーテル検査の合併症は非常に稀なイベントになっているため、その適用に向けた閾値が低くなり得る。ここでは、関連する冠状動脈を介してａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１を適用し、これにより、傷害を受けた組織が高濃度のａｎｔｉ－ｍｉＲに優先的に曝露されるという利点が得られる。興味深いことに、本発明者らのデータは、虚血後、潜在的に内皮の漏出及び細胞外マトリックスの溶解により、心筋へのａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１の取り込みが促進されたように見えることを示しており（図１Ｃ及び図２）、傷害部位でａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１がさらに濃縮される考えを支持する。

【0164】

虚血、特に心筋梗塞の少なくとも５日後にｍｉＲ－２１阻害剤を投与すると、予想外に、虚血後心筋における取り込みの増加と治療効果がもたらされた。

【0165】

虚血又は心筋梗塞の直後にのみｍｉＲ－２１阻害剤の取り込みが増加すると予想したため、ｍｉＲ－２１阻害剤の取り込みが増加したという知見は、虚血の５日後では予想外であった。したがって、驚くべきことに、虚血の５日後にａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１を投与すると、虚血の５日後に治療用ａｎｔｉ－ｍｉＲの取り込みが増加することが本明細書に記載されている。したがって、虚血の５日後のｍｉＲ－２１阻害剤の投与は、急性環境での有害な影響を回避するため、ａｎｔｉ－ｍｉＲの送達に安全である。

【0166】

最初の記述に続く数年間で、ｍｉＲ－２１のアップレギュレーションは、圧負荷、心筋梗塞、心房細動などの様々な原因に起因する心筋リモデリングの特徴として報告されている。その後、複数の研究により、それぞれの疾患モデルでｍｉＲ－２１を阻害する治療効果が示された（Ａｄａｍ ｅｔ ａｌ．， ２０１２； Ｃａｒｄｉｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１２； Ｔｈｕｍ ｅｔ ａｌ．， ２００８）。それでも、筋細胞におけるｍｉＲ－２１の過剰発現は、急性虚血中のアポトーシスから筋細胞を保護した（Ｓａｙｅｄ ｅｔ ａｌ．， ２０１０）。心筋細胞におけるｍｉＲ－２１のそのような有益ではとないかと思われる役割と一致して、ｍｉＲ－２１の網羅的な遺伝子欠失に対する中程度又は中立的な効果が観察された（Ｐａｔｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．， ２０１０； Ｒａｍａｎｕｊａｍ ｅｔ ａｌ．， ２０１６）（Ｐａｔｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．， ２０１０； Ｒａｍａｎｕｊａｍ ｅｔ ａｌ．， ２０１６）（Ｐａｔｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．， ２０１０； Ｒａｍａｎｕｊａｍ ｅｔ ａｌ．， ２０１６）（Ｐａｔｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．， ２０１０； Ｒａｍａｎｕｊａｍ ｅｔ ａｌ．， ２０１６）。しかしながら、筋細胞でのｍｉＲ－２１の欠失は有害であったが、非筋細胞でのｍｉＲ２１の欠失は心臓保護をもたらした（Ｒａｍａｎｕｊａｍ ｅｔ ａｌ．， ２０１６）。急性虚血環境においてａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１によって心臓マクロファージの死を促進することの潜在的な有害な結果を回避することは、本発明者らの独創的な考えであった。したがって、本発明者らは、５日目にｍｉＲ－２１阻害剤を投与した。以下に示されるように、虚血後５日目にｍｉＲ－２１阻害剤を投与しても、筋細胞の喪失は促進されない。心筋梗塞後に適用を遅らせるというこの戦略は、急性の有害な影響を回避し、後期の病状におけるアップレギュレートされたｍｉＲ－２１の有益な効果を充分に活用する。

【0167】

このモデルでは、ｍｉＲ－２１阻害により、治療開始から４週間後に心筋トランスクリプトームが持続的に再形成され、ｍｉＲ－２１活性が著しく長期間にわたって抑制されることが示唆された。偏りのない遺伝子オントロジー分析により、炎症関連及びＭＡＰキナーゼシグナル伝達がｍｉＲ－２１の操作によって最も大きく影響を受けることが特定された。この分析は、ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１がマクロファージ浸潤及び線維芽細胞増殖の減少をもたらすことを示した。これらのデータは、ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１が線維芽細胞での効果だけでなく、マクロファージでの作用を通じても抗線維化活性を発揮できることを示唆している。したがって、マクロファージ及び／又は線維芽細胞を標的とするａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１分子を適用することにより、治療効果をさらに高めることができる。

【0168】

したがって、本明細書で提供される実験データは、虚血後５日目まで遅延された局所送達が、虚血後の心筋において予想外に増加した取り込み及び治療効果をもたらしたことを示している。さらに、本明細書で提供されるＲＮＡ配列決定分析は、これがａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１の主要な標的として心臓マクロファージを指す、マクロファージの蓄積を予想外に妨害することを示した。

【0169】

実施例２
マクロファージの治療標的としてのｍｉＲ－２１
ｍｉＲ－２１は心臓マクロファージで高発現し、心不全を増加させる
マウス心臓の主要な細胞画分の低分子ＲＮＡトランスクリプトーム全体のリスト（ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ）を取得するため（図８）、単離した心臓の逆行性灌流（ランゲンドルフ調整物（Ｌａｎｇｅｎｄｏｒｆｆ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）から始まる細胞単離戦略、続いて磁気活性化細胞選別及び蛍光活性化細胞選別（ＭＡＣＳ及びＦＡＣＳ）を使用した筋細胞、内皮細胞、線維芽細胞、及びマクロファージへの分画を使用した（図８及び図８Ａのスキームを参照）。異なる心筋細胞画分（ｎ＝各群から３）の低分子ＲＮＡの配列決定により、アダプター配列を除去し、低品質（Ｐｈｒｅｄ Ｑ＜３０）かつ小さい読み取り（１２ヌクレオチド未満）をフィルタリングした後、試料あたり約１００万回の読み取り（約８５％の有効な読み取り）を得た。低分子ＲＮＡ参照ライブラリー（ｍｉＲＢａｓｅ ２１からのｍｉＲＮＡヘアピン）にマッピングされた高品質の読み取りは、少なくとも１つの細胞型の複製でゼロ以外の値を有し、全ての試料で１００万あたりの平均カウントが３より大きいｍｉＲＮＡ についてフィルター処理した。これらの基準を使用して、確信を持ってマイクロＲＮＡとして注釈を付した３０７個それぞれ特有の転写物を検出した（図８Ｂ）。異なる細胞型及び組織で得られた低分子ＲＮＡトランスクリプトームと一致して（Ｓｏｏｄ ｅｔ ａｌ．， ２００６； Ｗｅｓｓｅｌｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１９）、同様に、個々のｍｉＲＮＡ分子の絶対存在量の片側分布が観察され、ｍｉＲｎｏｍｅ全体の半分を構成するｍｉＲＮＡはほとんどなかった（図８Ｂ）。興味深いことに、発現スペクトルの上限にあるこれらのｍｉＲＮＡのいくつかは、他の心筋細胞型と比較して非常に顕著な細胞型特異性も示した（図１Ｃ）。ｍｉＲ－２１は、心臓マクロファージｃ（ＭＰ）で最も発現が高いｍｉＲであり、この細胞型の全てのマイクロＲＮＡ分子の約４分の１を構成することがわかった（図８Ｂ）。これは、線維芽細胞を含む他の心臓細胞画分よりもはるかに高い（図８Ｂ及び図８Ｃ）。この分子が心疾患の発症にも関与しているかどうかを調べるために、横方向大動脈狭窄（ＴＡＣ）によって誘発される左室圧過負荷の疾患モデルで試験した。興味深いことに、ｃＭＰでのｍｉＲ－２１の発現は、圧力過負荷の開始後６日目及び２１日目でさらに漸進的に増加した（図８Ｄ及び図８Ｅ）。マイクロＲＮＡを介した効果的な標的ｍＲＮＡの調節には、特定の細胞型におけるその濃度がその標的部位の濃度と一致することが必要である（すなわち、細胞内のターゲットーム全体）（Ｂｏｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１６； Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．， ２００７）。したがって、上位４０個の発現されたｍｉＲＮＡの基準となる標的部位を含む全てｍＲＮＡの絶対存在量を決定し、それぞれのｍｉＲＮＡの絶対コピー数に関連して設定した（図８Ｆ）。ｃＭＰターゲットームに一致するｍｉＲＮＡはごくわずかであったが、ｍｉＲ－２１はまた、偽条件及び疾患条件下の両方で、全てのマクロファージｍｉＲＮＡの中で最も高いｍｉＲＮＡ：標的比を発揮し、ｃＭＰにおけるこのｍｉＲ－２１の強力な調節効果を示唆している（図８Ｅ）。インビボでのｃＭＰにおけるｍｉＲ－２１の役割をさらに調べるために、マクロファージ（ＭＰ）特異的ｍｉＲ－２１欠損マウス（ｍｉＲ－２１ ｃＫＯ）を、ｍｉＲ－２１－ｆｌｏｘｅｄマウスを、マクロファージで特異的に活性なＣｘ３ｃｒ１－プロモーターによって駆動されるＣｒｅ－リコンビナーゼを発現するマウス系統と交配することによって生成した（Ｙｏｎａ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）。Ｃｘ３ｃｒ１－Ｃｒｅｔｇ／０； ｍｉＲ－２１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウス（ｍｉＲ－２１ ｃＫＯ）は、ｃＭＰでのｍｉＲ－２１レベルの大幅な低下を示し、他の心臓細胞型、骨髄細胞、及びリンパ球細胞ではｍｉＲ－２１レベルが維持された（図８Ｇ）。ｍｉＲ－２１－ｃＫＯが正常に発達することを見出し、ＷＴ同腹子対照と比較して心エコー検査によって決定されるように、それらは正常な心機能を示した。したがって、ｍｉＲ－２１－ｃＫＯマウスは、マクロファージ、特に心臓マクロファージにおけるｍｉＲ－２１の機能を研究するのに適したモデルである。

【0170】

特にＭＰにおけるｍｉＲ－２１の遺伝子欠失は、左心室の圧過負荷後の心機能を改善する（横方向大動脈狭窄、ＴＡＣによる）。
マクロファージｍｉＲ－２１の病理学的心臓リモデリング及び機能不全への寄与を検討するために、ＷＴマウス及びｍｉＲ－２１ ｃＫＯマウスをＴＡＣに供し、線維症及び心肥大の程度を測定した（図９Ａ）。心筋断面における細胞外マトリックスタンパク質の染色は、ｍｉＲ－２１ ｃＫＯ群の線維症がＴＡＣ処理ＷＴマウスと比較して有意に防止されたことを示した（図９Ｂ）。ｍｉＲ－２１ ｃＫＯマウスは、形態学的及び細胞レベルでＴＡＣ誘発性心肥大からも保護された（図９Ｃ）。これらの知見と一致して、肥大関連遺伝子（Ａｃｔａ１， Ｍｙｈ７， Ｎｐｐａ）及び線維症関連遺伝子（Ｃｏｌ１ａ１， Ｃｏｌ１ａ２）の発現は、ＷＴ同腹仔と比較してＴＡＣ処理ｍｉＲ－２１ ｃＫＯマウスで有意に減少した（図９Ｄ）。

【0171】

心機能を評価するために、手術前及び偽手術又はＴＡＣ手術の１４日目及び２８日目に実施した心エコー検査を使用した。偽手術群のＷＴマウス及びｍｉＲ－２１ ｃＫＯマウスは両方とも、ＴＡＣ処理ＷＴマウスでの明らかな心機能の典型的な障害とは対照的に、健康で正常であった（図９Ｅ及び図９Ｆ）。興味深いことに、ＴＡＣ処理ｍｉＲ－２１ ｃＫＯマウスは、ＷＴマウスと比較して有意に優れた左心室駆出率（ＬＶＥＦ）を示した（図９Ｅ）。これは、ＷＴ同腹仔と比較したＴＡＣ処理ｍｉＲ－２１ ｃＫＯマウスの左心室前壁の厚さなど、他の心エコー検査パラメーターにも反映されていた。さらに、二次元心エコー検査のスペックル追跡解析を使用してＬＶ歪みを評価することにより、左心室（ＬＶ）機能の非常に高感度で正確な測定を適用した（図９）。また、この分析は、ｍｉＲ－２１ ｃＫＯマウスの半径方向歪みのレベルが高いほど、ＬＶ機能が大幅に向上し、偽処置マウスで典型的に観察されるレベルにほぼ到達することを示した（図９Ｇ）。

【0172】

まとめると、これらの知見は、心臓のリモデリング及び機能不全におけるマクロファージｍｉＲ－２１の重要な役割を示唆している。

【0173】

単一細胞配列決定解析により、マクロファージでのｍｉＲ－２１の欠乏がＭ２極性化を支持することが明らかになった。
ｍｉＲ－２１が心臓マクロファージでその機能を発揮するメカニズムと、このメカニズムが他の心筋細胞画分での応答をどのように決定するかをよりよく理解するために、圧力過負荷の６日後に、野生型マウス又はｍｉＲ－２１ ｃＫＯマウスのいずれかから単離した非筋細胞集団を使用して、単一細胞配列決定を実施した（図１０Ａ）。単一細胞の転写プロファイルは、１０Ｘ Ｃｈｒｏｍｉｕｍプラットフォームを使用して得られ、品質管理に合格した８，３４３個の野生型細胞及び６，４２１個のノックアウト細胞を分析し、細胞あたり平均約２０００個の中央遺伝子を検出した（細胞型全体で合計２１，４３６個の遺伝子を検出）（図１０Ｂ）。

【0174】

一緒にプールしＳｅｕｒａｔパッケージによって分析した野生型マウス及びｍｉＲ－２１ ｃＫＯマウスの両方からの細胞を含むｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータセットの分析は、マクロファージの２つのクラスター（２及び４）、線維芽細胞の３つのクラスター（１、３、及び６）、内皮細胞の３つのクラスター（０、５、及び１２）、並びに他の心筋細胞も含めて示した。公知の遺伝子マーカーを使用して、マクロファージのサブセット分析により、この細胞型を２つの異なる細胞集団ーＭ２様マクロファージ及びＭ１様炎症誘発性マクロファージにさらに分類した（図１０Ｃ）。比較配列決定分析により、ＷＴバックグラウンドから単離されたマクロファージと比較して、マクロファージでｍｉＲ－２１を欠失させると、Ｍ１様マクロファージの数が減少することが明らかになった（図１０Ｄ）。

【0175】

マクロファージクラスターの遺伝子オントロジー分析により、炎症誘発性シグナル伝達に関連し、圧力過負荷後にアップレギュレートされる遺伝子は、ｍｉＲ－２１の欠失により大幅に抑制されることが明らかになった（図１０Ｅ）。これらの知見は、個々のマクロファージサブクラスターに対して個別に実施された対応する分析に対して確証され、ｍｉＲ－２１の欠失時にＭ１様マクロファージにおける疾患関連の炎症誘発性経路の抑制が主に確認された。同様に、Ｍ２様マクロファージ（クラスター２）は、ｍｉＲ－２１の欠失時に、圧力過負荷に関連する変化の顕著な逆転を示した。

【0176】

スプライシングされた読み取り対スプライシングされていない読み取りとのＲＮＡ速度分析により、ｃＭＰでのｍｉＲ－２１欠損により、非常に低いレベルのＩｌ１ｂを伴うＭｒｃ１発現によって示されるように、炎症誘発性Ｉｌ１ｂ発現（Ｍ１様）からＭ２様状態への細胞の極性化が生じることが確認された（図１０Ｆ）。インビトロでより明確な設定でこれらの知見を裏付けるために、ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－対照又はＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１で処理し、強力な炎症誘発性刺激であるリポ多糖（ＬＰＳ）で刺激した後の培養骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）における炎症誘発性シグナル伝達の程度を評価した。ｍｉＲ－２１ ｃＫＯマウスから得られた単一細胞データと一致して、炎症誘発性関連遺伝子（Ｔｎｆ、Ｉｌ６、Ｎｏｓ２）の発現は、ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－対照で処理したＢＭＤＭと比較して、ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１で処理したＢＭＤＭで有意に減少した（図１０Ｇ）。

【0177】

全体として、本発明者らのデータは、ｍｉＲ－２１が哺乳類の心臓におけるマクロファージの炎症誘発性活性化に必要な重要な分子であることを示唆している。

【0178】

単一細胞トランスクリプトミクスデータセットにおけるリガンド受容体ペアリングの分析により、心筋マクロファージが線維芽細胞活性化の主要なパラクリンインデューサーであることが特定される。

【0179】

ｍｉＲ－２１ ｃＫＯマウスの表現型の特徴付け（図９）により、圧負荷時の心筋リモデリングに対するマクロファージｍｉＲ－２１の顕著な効果が明らかになった。これには、心筋線維症の有意な予防が含まれる（図９Ｂ）。したがって、心臓マクロファージが疾患の誘発時に心臓線維芽細胞に直接シグナル伝達するかどうかを調べた。複雑な多細胞組織からの単一細胞のトランスクリプトームデータセットのバイオインフォマティクス解析における最近の進歩により、リガンド－受容体のペアリングに基づいてパラクリン細胞間コミュニケーションを体系的にマッピングすることができる（Ｒａｍｉｌｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１５）。

【0180】

これにより、細胞型内及び細胞型間で約２５００の検証済みリガンド－受容体相互作用ペアを分析し、最初に恒常性条件の細胞相互作用マップを作成した。次に、心臓の圧力過負荷への応答として発生する細胞相互作用の変化を、不偏な方法で、全ての可能性のあるリガンド・受容体相互作用ペアを組み込んで特定することを試みた（図１１Ａ）。興味深いことに、圧力過負荷の誘導時に、相互作用のほとんどの変化は、Ｍ１様マクロファージとＰｏｓｔｎ＋サブタイプの活性化線維芽細胞との間で観察された（図１１Ａ）。意外なことに、ＴＡＣに供したｍｉＲ－２１欠損マウスをＷＴマウスと比較したところ、Ｍ１様ＭＰからＰｏｓｔｎ＋線維芽細胞へのパラクリン相互作用が、Ｍ１様ＭＰに由来する全ての細胞間相互作用の中で最も有意に抑制されていることがわかった（図１１Ａの右パネル）。これらの変化の顕著な程度により、活性化されたＭＰが実際に心臓線維芽細胞の線維化促進活性化を媒介し得るという仮説を立てた。次に、これらのリガンド－受容体ペアを、このモデルにおける線維性応答の基礎であるシグナル伝達メカニズムの候補として、さらに詳細に調べ、ｍｉＲ－２１の欠失によるその阻害を検討した（図１１Ｂ）。意外なことに、活性化された線維芽細胞への受容体シグナル伝達が予測される上位のアップレギュレートされたリガンド候補が全て、記載されている線維化促進活性を示すことを見出した。圧力過負荷下のｍｉＲ－２１欠損マクロファージから発せられるシグナル伝達を分析したところ、これらの線維芽細胞活性化シグナル伝達経路は全てダウンレギュレートされていることがわかった（８つのうち４つが、図１１Ｂで適用されるレギュレーションの閾値を超えた）。さらに、圧力過負荷のｍｉＲ－２１ ｃＫＯマウスで単一のシグナル伝達経路、すなわちＬｒｐ１依存性シグナル伝達が活性化されることを見出した（図１１Ｂ）。タンパク質の低密度リポタンパク質受容体ファミリーのメンバーであるＬｒｐ１は、ＡｐｏＥやＣ１ｑｂなどの多様な抗線維症シグナルの強力なインテグレーターとして報告されている（Ｐｏｔｅｒｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１９）。まとめると、これらのデータは、心臓マクロファージが心臓の圧力過負荷時に強力な一連の線維化促進性メディエーターを心臓線維芽細胞に送ることを示唆している。心臓マクロファージの基礎となるＭ１様の分泌表現型の誘導は、ｍｉＲ－２１の機能に依存する。

【0181】

次に、心臓線維芽細胞に対するこれらのシグナルの効果の調査を試みた。この目的のために、圧力過負荷時の心臓線維芽細胞集団の動的転写応答及びその集団におけるｍｉＲ－２１の関連性を評価した。単一細胞配列決定データのＲＮＡ速度分析は、活性化線維芽細胞の画分（Ｐｏｓｔｎで示される）が、圧力過負荷時に筋線維芽細胞（Ａｃｔａ２存在量及びＰｏｓｔｎ存在量で示される）に向かって押し出されることを示した（図１１Ｃ）。将来の筋線維芽細胞の表現型に向けたこの転写応答は、ｍｉＲ－２１ ｃＫＯマウスでは大幅に消失した（図１１Ｃ）。これらの動的変化とよく一致して、圧力過負荷時に筋線維芽細胞の細胞数が増加することもわかった。繰り返すと、マクロファージのｍｉＲ－２の欠失はこれらの効果を逆転させた（図１１Ｄ）。そして、マクロファージのセクレトームが概ね筋線維芽細胞の分化及びそのｍｉＲ－２１への依存を提供するのに充分であるという証拠を得ることが考えられた。そうするために、活性化マクロファージ及び心臓線維芽細胞の明確な共培養設定を考案した（図１１Ｅ）。ＢＭＤＭ前駆細胞を成熟マクロファージに分化させ、ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１又はＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－対照をトランスフェクトし、ＬＰＳで刺激した。次に、これら＊マクロファージを９ウェル共培養スライドの中心を取り囲む８ウェルに加えて、線維芽細胞：マクロファージの比率が、インビボで心筋の細胞比率を厳密に模倣した３：１になるようにした。次に、Ａｃｔａ２（ＭｅｔａＭｏｒｐｈ（登録商標））免疫染色の自動化ハイコンテンツ画像解析を、筋線維芽細胞形成のパラメーターとして使用した（図１１Ｆ）。刺激されていない静止状態のマクロファージは、このアッセイで筋線維芽細胞の形質転換を誘発せず、ｍｉＲ－２１の阻害はこれらの条件下では検出可能な影響を与えなかった（図１１Ｆ）。ＬＰＳによる培養マクロファージの炎症誘発性極性化は、強力な筋線維芽細胞の形質転換を促進するようにそれらのセクレトームを調整した。ｍｉＲ－２１ ｃＫＯマウスから得られたデータと一致して、ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１でマクロファージを前処理すると、マクロファージ依存性筋線維芽細胞の形質転換が大幅に減少した（図１１Ｆ）。

【0182】

線維芽細胞におけるｍｉＲ－２１の調節的役割は、組織線維症及び疾患におけるｍｉＲ－２１の病理学的役割、したがってａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１（それぞれＲＧ－０１２）の治療効果の根底にある主要なメカニズムと見なされてきた。本明細書で提供される、精製心筋細胞画分の定量的低分子ＲＮＡ配列決定の実験結果は、ｍｉＲ－２１が全ての心筋細胞型の中で最も高発現を示し、全てのマイクロＲＮＡの中で１位にランクされる、心臓マクロファージにおける膨大な濃度のｍｉＲ－２１を明らかにした。この重要な知見は、本研究の出発点であり、組織線維症及び心機能に関するｃＭＰ ｍｉＲ－２１の寄与を記述することとなった。マクロファージｍｉＲ－２１によって媒介されると本発明者らが報告する効果は深遠であり、一次免疫機能をはるかに超えている。

【0183】

したがって、実験データは、第一に、ｍｉＲ－２１がマクロファージで非常に高濃度であり、疾患又は障害の心臓マクロファージ（ＭＰ）でさらにアップレギュレートされることを示している。これは、この細胞型で重要であることを示唆している。有病の心筋細胞あたりのｍｉＲ－２１分子の数が非常に多いことも、全身投与を使用して内因性ｍｉＲ－２１を抑制する従来の方法が効果がないとされる理由の１つである可能性がある。

【0184】

第二に、実験データは、ｍｉＲ－２１が炎症誘発性（Ｍ１様）マクロファージ極性化の重要な調節因子であることを示している。

【0185】

第三に、本明細書で提供される実験データは、心臓マクロファージ中のｍｉＲ－２１が、線維芽細胞に対する傍分泌線維化促進性シグナル伝達を制御することを示す。このマクロファージ由来の線維化促進性分泌シグナルは、病的な組織組織線維症を制御するのに充分強力である。したがって、マクロファージの標的化は、線維症の治療の改善された新しい概念を提供する。

【0186】

実施例３
低分子ＲＮＡ、特にマイクロＲＮＡの発現を調べるために、無処置のマウス肺から初代細胞画分を精製するフローサイトメトリーに基づく戦略を考案した。図１２に示す確率された細胞表面マーカーを使用した細胞選別後、標準的手順に従ってＲＮＡを調製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォームを使用して低分子ＲＮＡ配列決定を実施した。方法論の詳細は以下の通りである。

【0187】

肺組織のフローサイトメトリー／細胞選別：初代細胞は、野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスから抽出した肺から単離した。２０Ｇカニューレを気管に挿入し、ナイロン糸を使用して結紮した。次いで、肺に１ｍＬの氷冷２ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液を注入し、肺を一定に圧迫しながら５秒間インキュベートし、気管支肺胞液（ＢＡＬＦ）を１５ｍＬファルコンチューブに採取した。このプロセスを５回繰り返した。ＢＡＬＦ細胞の採取後、肺が完全に白くなるまで、５ｍＬの氷冷２ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）／ＰＢＳ溶液を左心室に灌流することにより、血液を体内から除去した。次に、マウスから肺を摘出し、コラゲナーゼタイプＩＩ（１ｍｇ／ｍＬ）、ＤＮａｓｅＩ（０．３ｍｇ／ｍＬ）、ディスパーゼ（５０Ｕ／ｍＬ）、及び塩化カルシウム（ＣａＣｌ₂）（０．０３容量％）を含有する３ｍＬのＤＭＥＭ系消化バッファーで剪刀を使用して非常に小さな断片に切り分けた。肺を３７℃のシェーカーで２５分間消化した後、細胞を４００ｇで７分間遠心分離した。次いで、細胞を赤血球溶解バッファー（１５５ｍＭ塩化アンモニウム（ＮＨ₄Ｃｌ）を９部及び０．１ｍＭトリス塩酸（Ｔｒｉｓ ＨＣＬ、ｐＨ７．６５）を１部）１ｍＬで室温で５分間処理した後、２ｍＬのＰＢＳで中和した。次いで細胞をＦＡＣＳバッファー（２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ＢＳＡ含有ＰＢＳ）で洗浄した。次に、初代細胞をラット抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２（クローン２．４Ｇ２）で４℃で１０分間処理した後、蛍光結合抗体と４℃で６０分間インキュベートした。その後、ＭＡＣＳカラムを用いて白血球画分を他の細胞画分から分離した。細胞を最初にビオチン結合ＣＤ４５抗体とともに４℃で３０分間インキュベートし、続いてストレプトアビジンマイクロビーズとともに４℃で１５分間インキュベートした。次に、フロースルー細胞及び白血球濃縮細胞の両方を、フローサイトメトリーに基づく細胞選別のために一次蛍光抗体で染色した。以下の抗体を使用した。白血球濃縮画分、抗ＣＤ４５－ＦＩＴＣ、抗ＣＤ１１ｂ－ＰＥ、抗ＣＤ２４－ＰＥ／Ｄａｚｚｌｅ５９４、抗ＣＤ１１ｃ－ＰＥＣｙ５、Ｌｙ６Ｇ－ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５、及びＦ４／８０－ＰＥＣｙ７。フロースルー：抗ＣＤ４５－ＦＩＴＣ、抗ＣＤ１０５－ＰＥ、抗Ｅｐｃａｍ－ＰＥ／Ｄａｚｚｌｅ５９４、及び抗ＰＤＧＦＲＡ－ＰＥＣｙ７。両方の細胞懸濁液を、４０μｍナイロンセルストレーナー（Ｆａｌｃｏｎ社）で粉砕し、Ｓｏｎｙ ＳＨ８００Ｓセルソーターを使用してＦＡＣＳ分析を行った。

【0188】

心臓組織のフローサイトメトリー／細胞選別：初代細胞は前述のように単離した（Ｒａｍａｎｕｊａｍ ｅｔ ａｌ．， ２０１６）。ＦＡＣＳ選別のために、心臓細胞懸濁液を遠心分離（９００×ｇで１分間）により、心筋細胞（ペレット）及び非筋細胞濃縮画分（上清）に分離した。心筋細胞は形態に基づいて選別されたが、非筋細胞画分はさらに抗体ベースのフローサイトメトリー手順に供した。非筋細胞濃縮上清を４００×ｇで５分間遠心分離し、ＦＡＣＳバッファー（２ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、０．５％ＢＳＡ含有ＰＢＳ）で洗浄した。次に、初代細胞をラット抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２（クローン２．４Ｇ２）で４℃で１０分間処理した後、蛍光結合抗体と４℃で６０分間インキュベートした。以下の抗体を使用した：抗ＰＤＧＦＲα－ＰＥＣｙ７（クローンＡＰＡ５）、抗ＣＤ１０５－ＰＥ（クローンＭＪ７／１８）、及び抗ＣＤ４５－ＦＩＴＣ（クローン３０－Ｆ１１）。色素ＤＲＡＱ７を使用して、生存率を制御した。細胞懸濁液を、４０μｍナイロンセルストレーナー（Ｆａｌｃｏｎ社、トゥックズベリー、米国）で粉砕し、Ｂｉｏｒａｄ Ｓ３セルソーターを使用してＦＡＣＳ分析を行った。

【0189】

ＲＮＡ配列決定：ｐｅｑＧＯＬＤ ＲＮＡＰｕｒｅ（商標）（Ｐｅｑｌａｂ社）を使用して組織から全ＲＮＡを抽出した。ライブラリーは、ＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ ｍＲＮＡ試料調製キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して、４μｇのＤＮａｓｅ処理ＲＮＡから鎖特異的に構築した。このキットには、ｍＲＮＡを濃縮するためのポリアデニル化選択が含まれる。次にＲＮＡを断片化し、２ラウンドのｃＤＮＡ合成を行い、アダプターを２本鎖（ｄｓ）ｃＤＮＡに連結した。全てのライブラリーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２０００で配列決定し、１００ｂｐのペアエンド読み取りを生成した。高品質の読み取りは、生の読み取りからアダプター配列、無効な低品質の読み取りをトリミングすることによって得られた。次に、デフォルトのパラメーターを使用して、ＨＩＳＡＴ２ソフトウェア（バージョン２．１．０）によってクリーンな読み取りをＳｕｓ ｓｃｒｏｆａ １１．１参照ゲノムにマッピングした。次に、ＳｔｒｉｎｇＴｉｅソフトウェア（バージョン１．３．６）を使用して転写アセンブリーを構築した。ＳｔｒｉｎｇＴｉｅマージソフトウェア（バージョン１．３．６）を使用して転写産物をマージし、ＤＥＳｅｑ２ソフトウェア（バージョン２．１１．４０．２）を使用して発現差を計算した。次に、遺伝子を、ＡＤＡＰＴＳ Ｒパッケージを使用して、存在量、細胞型特異性、及び受容体の特徴に基づいて選択した。

【0190】

ｍｉＲ－２１は、肺マクロファージにおいて最も豊富で濃縮されたマイクロＲＮＡであることが、本明細書で驚くべきことに見いだされた。本発明者らのデータは、マイクロＲＮＡ－２１が肺胞マクロファージで発現する全てのマイクロＲＮＡ分子の約２０％を表し、したがって、この細胞型で発現するマイクロＲＮＡ種の最上位であることを明らかにしている。同様の高い発現量が肺間質マクロファージ細胞集団で見られ、全てのｍｉＲＮＡ読み取りの１２％がｍｉＲ－２１に起因する可能性がある。ｍｉＲ－２１の相対的な発現は、様々な肺細胞型における定量的リアルタイムＰＣＲによってさらに検証され、マクロファージ集団におけるｍｉＲ－２１の相対的な濃縮が再び示された（図１２）。哺乳類の肺におけるマクロファージの非常に多い存在量を考慮すると、これらのデータは、肺のｍｉＲ－２１の大部分が肺マクロファージに由来することを示唆している。

【0191】

そこでｍｉＲ－２１が肺傷害後のマウス及びヒトでアップレギュレートされるかどうかについて調べた。したがって、ｍｉＲ－２１の発現が肺疾患で変化するかどうかを試験し、確立された肺線維症のモデル、すなわち化学療法剤であるブレオマイシンの適用によって誘発される肺線維症を採用した。対照溶液（ＰＢＳ）又はブレオマイシンのいずれかを投与してから１４日後にマウスから採取した肺組織におけるｍｉＲ－２１の発現を測定した。本発明者らは、ｍｉＲ－２１の発現が罹患した肺において強く増加することを見出した（図１３Ａ）。

【0192】

次に、特発性肺線維症患者の生検におけるｍｉＲ－２１の発現を研究した。再び、肺組織におけるｍｉＲ－２１の有意な増加が見出された（図１３Ｂ）。

【0193】

そして、ｍｉＲ－２１に対する合成オリゴヌクレオチド阻害剤（ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１）によるｍｉＲ－２１の阻害が、肺のｍｉＲ－２１を抑制するのに充分かどうか、及びこれが肺線維症に干渉するかどうかを試験した。ここでは、冠動脈内ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１を投与され（本出願の図１を参照）、中等度の肺硬化及び肺線維症を発症したブタを研究した。肺疾患は、心筋梗塞後の心機能障害に起因する肺うっ血の周知の帰結である。ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１の冠動脈内適用は、うっ血肺でｍｉＲ－２１を効果的に抑制した（図１３Ｃ）。重要なことに、ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１は、心不全に関連した肺うっ血及び肺線維症のこのモデルで肺線維症を有意に予防した。

【0194】

まとめると、これらのデータは、おそらく心臓マクロファージを含むマクロファージにおいてｍｉＲ－２１に影響を与えることにより、ｍｉＲ－２１の阻害が、肺に強力な抗線維症効果を有することを示唆している。以下に記載されているように、肺マクロファージで特異的にｍｉＲ－２１を阻害すると、実際に同様に強力な抗線維症効果がある。

【0195】

実施例４
活性化心臓線維芽細胞におけるｍｉＲ－２１の遺伝的欠失は、心臓のリモデリング及び機能不全を防止する。
ｍｉＲ－２１は、線維芽細胞の増殖、生存、及び筋線維芽細胞の形質転換を促進することが示されているが、今日まで、心臓線維芽細胞におけるｍｉＲ－２１の活性が、心不全で観察されるような組織リモデリング及び機能不全の決定要因であることは示されていない。確立されたＰｏｓｔｎ－ＭＣＭトランスジェニックマウス系統を採用することにより、活性化線維芽細胞でのＣｒｅリコンビナーゼの特異的発現が可能になり、それによってｌｏｘＰ部位に隣接する遺伝子座の組換えが可能となった。注記のうち、遺伝子導入Ｐｏｓｔｎ－ＭＣＭ系統は誘導性遺伝子導入系統である、すなわち、タモキシフェンの適用に応答してＣｒｅリコンビナーゼが発現する。次に、このマウス系統を、ｆｌｏｘｅｄ ｍｉＲ－２１遺伝子座を持つマウスと交配させ、活性化心臓線維芽細胞におけるｍｉＲ－２１の喪失を目指した。これらのマウスを、進行性心臓リモデリング及び機能障害を誘発する心筋梗塞（ＭＩ）に供した（図１４Ａ）。
ＭＩの４週間後、マウスを心エコー検査による心臓寸法及び機能の分析に供し、さらなる分析のために心臓と肺を採取した。活性化線維芽細胞集団におけるｍｉＲ－２１の遺伝的欠失は、心筋不全におけるｍｉＲ－２１の有意な減少をもたらし（図１４Ｂ）、線維芽細胞のｍｉＲ－２１が、心不全の全体的なｍｉＲ－２１含有量に大きく寄与していることを示唆している。ｍｉＲ－２１の線維芽細胞欠失は、心不全に関連する心筋量の増加（肥大と呼ばれる（図１４Ｃ））を有意に防止し、同様に肺重量対体重の増加を防止した（図１４Ｄ）。活性化心臓線維芽細胞集団におけるｍｉＲ－２１の欠失のこれらの有益な効果は、同様に、左心室駆出率によって決定される心機能の有意な改善に反映された（図１４Ｅ）。さらに、心エコー検査は、心臓の構造リモデリングに対する好ましい効果、すなわち心不全に関連する拡張終期容積及び収縮終期容積の増分の減少を示した（図１４Ｆ）。心機能の改善は、野生型群と比較して半径方向歪みピークの有意な増加によってさらに確認された（図１４Ｇ）。

【0196】

まとめると、これらのデータは、ｍｉＲ－２１の線維芽細胞特異的阻害も組織線維症を標的とする有効な治療戦略であることを示唆している。

【0197】

実施例５
ｍｉＲ－２１は、ＣＯＶＩＤ－１９患者から採取した肺組織及び肺線維症の動物モデルでアップレギュレートされている。
本発明者らは当初、ＣＯＶＩＤ－１９患者及び非線維症の対照被験者から採取した肺の低分子ＲＮＡトランスクリプトームプロファイルを得ようとした（図１９Ａ）。死後の肺組織は、ヒト肺のＣＯＶＩＤ－１９誘発リモデリングの好発部位である左下葉の領域から採取した。本発明者らは、ｍｉＲ－２１が、ヒト肺の全マイクロＲＮＡ分子の約５％を構成する、対照被験者からの肺において高度に発現されるマイクロＲＮＡであることを見出した（図１９Ｂ）。興味深いことに、ｍｉＲ－２１の発現は、ＣＯＶＩＤ－１９患者の肺でさらに増加し、上位１０個の発現されたｍｉＲＮＡの中で単一の最もアップレギュレートされたｍｉＲＮＡ（約２の倍率変化）であることがわかった（図１９Ｂ）。

【0198】

次に、様々な肺細胞型の低分子ＲＮＡ発現プロファイルを取得して、細胞型全体のｍｉＲ－２１発現を評価した。新たに単離された細胞の供給源として、１０週齢のマウスの肺を使用し、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）及び蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を含む戦略を使用して、マウス肺の様々な肺細胞型におけるｍｉＲ－２１発現を調べた。興味深いことに、ｍｉＲ－２１は、肺胞マクロファージで最も発現量の高い単一のマイクロＲＮＡであり、他の細胞型と比較してこの細胞型でも高度に濃縮されていた（図２０）。まとめると、このユニークな発現パターンは、肺マクロファージにおけるｍｉＲ－２１の強力な調節的役割を示唆している。

【0199】

肺線維症及び機能不全の発症に対するｍｉＲ－２１の寄与を検討するために、マイクロ噴霧器を使用してブレオマイシンを単回気管内投与することにより、野生型マウスに肺傷害を与えた。ｆｌｅｘｉＶｅｎｔ（登録商標）装置を使用して、ブレオマイシン適用の７日後に肺機能障害を確認した（データは示さず）。生理食塩水又はブレオマイシンで処理した肺から得られたマイクロＲＮＡ発現プロファイルは、ブレオマイシン投与の７日後にｍｉＲ－２１が有意にアップレギュレートされることを示した（図２１）。上位の発現されたｍｉＲＮＡの中で、ｍｉＲ－２１が最も強いアップレギュレーションを示した。

【0200】

マクロファージへの標的化送達のためのリガンド結合ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１
本発明者らは、マンノース受容体Ｃ型１（Ｍｒｃ１）がマクロファージで強く発現し、他の細胞型と比較して濃縮されていていることを特定するスクリーニング戦略を採用した。（上記の表３を参照）。

【0201】

肺及び心臓のマクロファージ又は線維芽細胞それぞれの細胞表面受容体を同定する試みにおいて、本発明者らは、マウス由来の肺細胞型及び心臓細胞型の偏りのないトランスクリプトーム配列決定を行い、これらの分析をヒトのトランスクリプトームデータに拡張した（図２２）。肺サブタイプのＲＮＡ配列決定により、全ての細胞型で１８，０００個を超える遺伝子が特定された。それらの中で、１０００個を超える表面受容体が検出され、そのうち１０６個がマクロファージで濃縮されている。後者のうち、１３個が非常に存在量が多く、マクロファージに特異的であることがわかった。ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１／ｍｉＲ－２１送達阻害剤に対するこれらマクロファージ特異的表面受容体候補には、特に以下が含まれる：

【0202】

【表4】

【0203】

次に、肺胞マクロファージ及び間質マクロファージ、並びに白血球、上皮細胞、及び内皮細胞における、上位の表面受容体ＭＲＣ１候補の相対存在量を比較したところ、マクロファージにおけるＭＲＣ１のはるかに強い発現を示した。対応するデータは、マクロファージを含む心臓細胞型について得られた。肺及び心臓からの線維芽細胞についても、対応するデータが得られた。

【0204】

次に、肺マクロファージでのＭＲＣの発現は、ＭＲＣ１に対する抗体を使用した免疫蛍光によるタンパク質レベルでの検出によって裏付けられた。ここでは、形態学的に肺マクロファージに似ている細胞でＭＲＣ１が明確に検出された。ブレオマイシンで処理したマウスに由来する肺組織では、マクロファージとして特定されるＭＲＣ１陽性細胞が大幅に増加した。

【0205】

次に、ブレオマイシンで治療した患者又は特発性肺線維症（ＩＰＦ）に罹患している患者の肺組織及びそれぞれの対照に由来する、公的に入手可能なヒト単一細胞データセットのバイオインフォマティクス分析により、これらのデータを検証することを試みた。これらのデータセットでヒトＭＲＣ１の発現をプロットしたところ、ヒト肺マクロファージでＭＲＣ１の強力かつほぼ排他的な発現が見られた。ＭＲＣ１陽性細胞の数は、ブレオマイシンで治療したヒトの肺及びＩＰＦ患者由来の組織で増加した。

【0206】

心臓マクロファージ及び線維芽細胞の表面受容体の候補を特定するために、肺について上記で説明したものと同様のアプローチを追求した。主要な心臓細胞型の配列決定を実施し、全ての細胞型で１４，０００個を超える遺伝子を特定した（１００万あたりの総読み取り数＞１）。それらの中で、マクロファージで濃縮された８９の表面受容体と、線維芽細胞で濃縮され発現される８６の表面受容体とをそれぞれ有する８００を超える表面受容体を特定した。さらに、マクロファージでのみ豊富で特異的に発現する１６の表面受容体と、線維芽細胞にのみ豊富で特異的に発現する１０の表面受容体を層別化した。心臓マクロファージの選択された１６の表面受容体の中で、やはりＭｒｃ１が最も豊富な単一の表面受容体候補として際立っていた。左心室の圧力過負荷に供されたマウス又は対照／シャム（偽）マウスの心臓から単離された初代細胞の単一細胞配列決定により、心臓マクロファージにおけるＭＲＣ１の高度に特異的な発現が裏付けられた。

【0207】

線維芽細胞表面受容体の同様の対応する分析により、最上位の候補分子としてＳｃａｒａ５が得られた。

【0208】

心臓マクロファージのさらなる表面受容体分子候補には、以下が含まれる。

【0209】

【表5】

【0210】

心臓線維芽細胞のさらなる表面受容体分子候補には、以下が含まれる。

【0211】

【表6】

【0212】

マンノース受容体Ｃ型１（ＭＲＣ１）に対する抗体を使用した肺組織の免疫蛍光染色を使用すると、マクロファージの形態学的特徴を示す細胞におけるマンノース受容体Ｃ型１（ＭＲＣ１）の強力かつ選択的な発現が示された（図２２）。

【0213】

いくつかの研究（例えば、Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｐｏｍａｒｅｓ， Ｌ．， ２０１２）では、マンノース及びＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）リガンドのマンノース受容体Ｃ型１（ＭＲＣ１）への結合が報告されている。次に、ｍｉＲ－２１に対するオリゴヌクレオチド（ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１）を、これらのリガンドと合成リンカー分子からなる部分と結合させた（図２３）。

【0214】

特に、炭水化物リガンド結合ＬＮＡオリゴヌクレオチドの調製は、以下のように行った。
市販の炭水化物４－アミノフェニル３，６－ジ－Ｏ－（α－Ｄ－マンノピラノシル）－α－Ｄ－マンノピラノシド（Ｓｙｎｔｈｏｓｅ社、トロント、カナダ、＃ＡＭ８５３、２４．８ｍｇ）を、４．４μＬのジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を含有する２４８μＬのＤＭＦ中の１８．１ｍｇのＡｃｉｄ－ＰＥＧ５－ＮＨＳエステル（Ｂｒｏａｄｐｈａｒｍ、カリフォルニア州サンディエゴ、＃ＢＰ－２２２２０）と反応させた。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）が出発炭水化物の消費を示した時点で、形成された生成物をエーテルの添加により沈殿させた。固形物を濾過によって回収し、ピリジン（５００μＬ）に再溶解した。無水酢酸（５００μＬ）を加えて、三糖の全ての遊離ヒドロキシル基をブロックした。溶液を蒸発乾固し、メタノール及びジクロロメタンの１：１混合物を使用してＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ２０カラムクロマトグラフィーにより精製した。

【0215】

【化4】

【0216】

得られた３０ｍｇの炭水化物カルボン酸を、３．７μＬのジイソプロピルカルボジイミド及び３０３μＬのＤＭＦの存在下で、２．９ｍｇのＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）によって活性化した。溶液を周囲温度で一晩撹拌し、さらに精製することなくオリゴヌクレオチドとのコンジュゲーション反応に使用した。

【0217】

完全にホスホロチオエート化されたＬＮＡ オリゴヌクレオチドを、固相上で従来のホスホロアミダイトオリゴマー化化学を使用して合成した。オリゴヌクレオチドは、リガンド結合の反応ハンドルとして機能するアミノヘキシルリンカーを５’末端に備えていた。オリゴヌクレオチドは次のように調製した。

【0218】

オリゴヌクレオチドは、Ｍｅｒｍａｄｅ １２シンセサイザー（ＬＧＣ Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ社、米国ミネソタ州アレクサンドリア）で構築した。合成は、８７μｍｏｌ／ｇの負荷を有する２’－デオキシ－チミジン（ＬＧＣ Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ社から入手）で誘導体化された制御多孔性ガラス（ＣＰＧ、６００Å）で作製した固体担体で実施した。必要な配列を構築するために、ホスホロアミダイト並びに補助試薬をＳＡＦＣ社（ハンブルグ、ドイツ）から購入した。具体的には、以下のロックド核酸（ＬＮＡ）及びＤＮＡホスホロアミダイトを使用した。

【0219】

（５’－Ｏ－ジメトキシトリチル－Ｎ⁶－（ベンゾイル）－（２’－Ｏ， ４’－Ｃメチレン）－アデノシン－３’－Ｏ－（２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルアミノ）ホスホロアミダイト、５’－Ｏ－ジメトキシトリチル－Ｎ⁴－（ベンゾイル）－（２’－Ｏ， ４’－Ｃメチレン）－５－メチルシチジン－３’－Ｏ－（２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルアミノ）ホスホロアミダイト、（５’－Ｏ－ジメトキシトリチル－Ｎ²－（ジメチルホルムアミジン）－（２’－Ｏ， ４’－Ｃメチレン）－グアノシン－３’－Ｏ－（２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルアミノ）ホスホロアミダイト、及び５’－Ｏ－ジメトキシトリチル－（２’－Ｏ， ４’－Ｃメチレン）－５－メチルウリジン－３’－Ｏ－（２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルアミノ）ホスホロアミダイト。５－メチルシチジンを含むＤＮＡホスホロアミダイトは、ＬＮＡホスホロアミダイトと同じ保護基を有していた。全てのアミダイトを無水アセトニトリル（１００ｍＭ）に溶解し、モレキュラーシーブ（３Å）を加えた。オリゴマーの５’末端にＣ６－アミノリンカーを導入するために、Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ社（米国マサチューセッツ州ウィルミントン）から入手可能な、対応するアミノヘキシルＮ－（トリフルオロアセチルアミド）－ホスホロアミダイを使用した。ＴＦＡ保護アミノリンカーは、省略されたキャッピング工程を除いて、合成サイクルの変更なしに導入した。５－エチルチオテトラゾール（ＥＴＴ、アセトニトリル中５００ｍＭ）を活性化剤溶液として使用した。ＤＮＡアミダイトを４分間で結合させ、他のアミダイトを６～８分間で結合させた。無水アセトニトリル／ピリジン（１：１容量／容量（ｖ／ｖ））中の３－（（ジメチルアミノ－メチリデン）アミノ）－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾール－３－チオン（ＤＤＴＴ、米国カリフォルニア州オーシャンサイドのＡＭ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社より入手）の５０ｍＭ溶液を使用して、ホスホロチオエート結合を生成した。

【0220】

固相合成の完了後、オリゴヌクレオチドを担体から切断することなく、アセトニトリル中の２０％ジエチルアミンで３０分間処理することにより、シアノエチル保護基を除去した。その後、乾燥した固体担体をポリプロピレンチューブに移し、５５℃で少なくとも１８時間濃アンモニア水（Ａｌｄｒｉｃｈ社）で処理した。遠心分離後、上清を新しいチューブに移し、ＣＰＧをアンモニア水で洗浄した。合わせた溶液を蒸発させ、残留物をバッファーＡで再構成した（下記参照）。

【0221】

粗オリゴヌクレオチドを、Ｗａｔｅｒｓ社（エシュボルン、ドイツ）のＣ１８ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｅｐカラム（５μｍ、１９×５０ｍｍ）並びにフラクションコレクター及びサンプルポンプを備えたＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ ＨＰＬＣシステム（ＧＥ Ｈｅｌｔｈｃａｒｅ社）を使用した逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣ によって精製した。バッファーＡは、１００ｍＭトリエチルアンモニウムアセテート（ＴＥＡＡｃ、ｐＨ７、Ｂｉｏｓｏｌｖｅ社（ファルケンスワールト、オランダ）より入手）であり、バッファーＢはバッファーＡ中に９５％アセトニトリルを含有したものであった。１５ｍＬ／分の流速を使用し、１２０カラム容量内で０～１００％Ｂの勾配を使用した。バッファーを６０℃に加熱し、カラムをカラムオーブン内で同じ温度に維持した。生成物の溶出を２８０ｎｍでモニターし、２ｍＬの画分を収集した。

【0222】

分画を含む生成物をプールし、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ２５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を充填したカラムを用いたサイズ排除を使用して脱塩した。

【0223】

【表7】

主要：ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、ｄＴ：ＤＮＡヌクレオチド
Ａｂ、Ｃｂ、Ｇｂ、Ｔｂ：ＬＮＡヌクレオチド
ｓ：ホスホロチオエート結合
（ＮＨ２Ｃ６）：アミノヘキシルリンカー

【0224】

精製オリゴヌクレオチドを、５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）及びＤＭＳＯに１：１．５の比率で７００ＯＤ／ｍＬのオリゴヌクレオチド濃度で溶解した。ＮＨＳ活性化炭水化物リガンドは、９０分間隔で２回に分けて添加した。

【0225】

【化5】

【0226】

オリゴヌクレオチドの精製について記載したのと同じ方法を用いて、反応混合物を逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣによって精製した。画分を含む生成物を一緒にプールし、エタノールの添加により沈殿させた。遠心分離によってペレットを回収した。上清を捨て、ペレットを５００ｍＭ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）で再構成した。この溶液を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ２５を固定相とし、水を溶離液とするサイズ排除クロマトグラフィーを用いて脱塩した。水溶液を含む生成物は、２６０ｎｍでの吸収を測定することによって定量化した。そして、溶液を凍結乾燥した。

【0227】

【表8】

【表9】

【0228】

本発明者らは次に、これらのリガンド共役オリゴヌクレオチドを含む組成物をエアロゾル化形態で吸入した際のマウス肺の細胞への送達について試験することを目的とした。この目的のために、ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１のロックド核酸（ＬＮＡ）／デオキシリボ核酸ミックスマー（ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１）を、その３’末端でフルオレセインアミダイト誘導体（ＦＡＭ）に結合し、その５’末端にリガンドを結合させた。この研究で使用したマンノースリガンド結合オリゴヌクレオチドの例示的な構造を図２３に示す。

【0229】

次に、専用のマウス吸入装置を使用したエアロゾル化された組成物の吸入により、指示用量のマンノース又はＧａｌＮＡｃ結合ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１－ＦＡＭを野生型マウスの肺に投与した（ｆｌｅｘｉＶｅｎｔ（登録商標）装置、ＳＣＩＲＥＱ社、カナダ；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１９）（図２４Ａ）。非結合ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１を対照として使用し、ＰＢＳ処理マウスの肺を陰性対照として使用した。ｍｉＲ－２１阻害剤を含む組成物の適用の２時間後、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液及び肺組織を、方法のセクションに記載されているように各動物から採取した。肺細胞型におけるＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１の取り込みは、フローサイトメトリーを使用してＦＡＭシグナル強度を決定することによって評価した（図２４Ａ）。ＦＡＭシグナルは、ＢＡＬＦ及び肺組織の両方から単離された細胞で検出され、ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１の濃度の増加と共に増加した（全群は図２４Ｂ及び図２４Ｃに記載）。

【0230】

次に、肺組織から単離された白血球及び非白血球の両方の画分における陽性細胞の割合を決定した。フローサイトメトリー分析は、マンノース結合ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１を含む組成物を投与すると、非結合ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１と比較して、ＦＡＭ陽性マクロファージの相対画分が増加したことを示した（図２４Ｃ）。次に、マクロファージ集団の蛍光強度の中央値を決定することにより、この細胞型に送達されたＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１分子の相対量を推定し、これをＰＢＳ投与肺から単離された細胞からのデータに正規化した。対照（非結合オリゴ処理群）と比較して、マンノース共役ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１処理ＢＡＬＦ又は肺から単離されたマクロファージにおいて有意に高いＦＡＭ蛍光強度の中央値が観察された（図２５Ａ及び図２５Ｂ）。

【0231】

要約すると、マンノース共役ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１を含む組成物のエアロゾル吸入は、肺マクロファージへのより高い送達をもたらした。

【0232】

実施例６
ｍｉＲ－２１の阻害はブレオマイシン誘発性肺リモデリング及び機能不全を減少させた
肺リモデリングに対する吸入マンノース結合ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１組成物の効果を決定するために、本発明者らは、野生型マウスをブレオマイシン誘発性肺傷害に供し、次いで、肺傷害後４日目にマンノース結合ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１組成物を吸入により肺に局所投与した（図２６Ａ）。肺切片の細胞外マトリックスタンパク質の染色は、ブレオマイシンを投与したマウスで線維症が増加することを示した。しかし、マンノース結合ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１組成物の吸入は、肺線維症の有意な減少をもたらした（図２６Ｂ）。

【0233】

次に、ｆｌｅｘｉＶｅｎｔ（登録商標）人工呼吸器を使用してマウスの肺を様々な呼吸摂動に供することにより、肺機能に対するｍｉＲ－２１阻害の影響を評価した。呼吸器系の固有の弾性特性（又は準静的な機械的特性）を決定するために、肺傷害後１４日目にＰＢＳ処理マウス及びブレオマイシン処理マウスから圧力－容積（ＰＶ）ループを得た。肺線維症を有するブレオマイシン曝露マウスからのＰＶループからのデータは、下向きのシフトを示し（図２６Ｃの灰色曲線及び黒色曲線を参照）、肺活量及びコンプライアンスの低下を示した。測定により、ＰＶループに由来する準静的エラスタンス、準静的コンプライアンス、及び吸気容量パラメーターが、ブレオマイシン曝露マンノース結合ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－ミスマッチ－２１マウスで有意に減少したことが明らかになった（図２６Ｄ～図２６Ｆ）。マンノース結合ＬＮＡ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ－ミスマッチ－２１処理マウスのエアロゾル吸入は、肺機能のこうした低下を防止した（図２６Ｃの赤い曲線を参照）。

【0234】

まとめると、これらのデータは、肺線維症のマウスモデルにおける吸入による、マクロファージを標的としたマンノース結合ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１組成物の局所送達の治療効果を示している。

【0235】

特に上記の実施例５及び実施例６の方法論的詳細は以下の通りである。
実験動物及び研究デザイン：全ての動物研究は、関連するガイドライン及び担当当局の規制に従って実施され、オーバーバイエルン州政府庁（Ｒｅｇｉｅｒｕｎｇ ｖｏｎ Ｏｂｅｒｂａｙｅｒｎ）の治験審査委員会（ＩＲＢ）から承認を得た（ＲＯＢ－５５．２－２５３２．Ｖｅｔ＿０２－１９－８２）。

【0236】

ブレオマイシンの気管内投与：生後１０週のＣ５７ＢＬ／６Ｎ野生型マウスに、５０μＬの滅菌ＰＢＳで希釈したブレオマイシン塩酸塩（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社、タウフキルヘン、ドイツ）を、マイクロ噴霧器を使用してマウスに２Ｕ／ｋｇ体重で投与した（ＢｉｏＪａｎｅ社（中国）により流通されるＰｅｎｎ Ｃｅｎｔｕｒｙ社の装置）。

【0237】

オリゴヌクレオチド阻害剤のエアロゾル適用：ａｎｔｉ－ｍｉＲは、完全にホスホロチオエート化されたロックド核酸（ＬＮＡ）／デオキシリボ核酸ミックスマーとして合成した（ＦＡＭ標識ａｎｔｉ－ｍｉＲ、ＢａｓｅＣｌｉｃｋ社、ミュンヘン、ドイツ；Ａｘｏｌａｂｓ社、クルムバッハ、ドイツ）。ａｎｔｉ－ｍｉＲは、前述のように、ネブライザーユニット（Ａｅｒｏｎｅｂ（登録商標）－小液滴径：２．５～４μｍ、アイルランド）に取り付けられたｆｌｅｘｉＶｅｎｔ（登録商標）げっ歯類人工呼吸器ＦＸ２（ＳｃｉＲｅｑ社、カナダ）を使用して適用した²。各マウスに対して、ネブライザーを２０μＬの２．５、５、又は１０ｍｇ／ｍＬのａｎｔｉ－ｍｉＲで満たし、ネブライザーを１分間に１５０回の呼吸、１５ｍＬ／ｋｇ体重の一回換気量で、吸気時間：呼気時間比率を２：１として動作させた。

【0238】

肺機能分析：肺機能を、マウス用のｆｌｅｘｉＶｅｎｔ（登録商標）げっ歯類人工呼吸器ＦＸ２を使用して評価した。マウスを深麻酔下で気管切開し、気管に挿入した２０Ｇの気管カニューレを４－０シルク縫合糸を使用してしっかりと固定し、漏れがなく信頼できる測定ができるようにした。次に、カニューレを人工呼吸用のｆｌｅｘｉＶｅｎｔ（登録商標）ユニットに接続した（毎分１５０回の呼吸、１５ｍＬ／Ｋｇ体重の１回換気量、０．６７：１ の吸気時間：呼気時間比率）。肺機能を、様々な呼吸操作（深い膨張、Ｐｒｉｍｅ－８、及び圧力駆動の傾斜型の圧力－容積摂動）で評価した。吸気量、準静的コンプライアンス、及び準静的エラスタンスのパラメーターは、ＰＶループから導出した。

【0239】

成体マウス肺からの初代細胞の単離：肺を採取する前に、気管にカニューレを挿入して２ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含有するＰＢＳを連続的に（約５回）注入及び吸引することにより、気管支肺胞洗浄液を採取した。肺を採取し、２ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含有する氷冷ＰＢＳで洗浄した。肺の右葉を、コラゲナーゼＩＩ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ社、ニュージャージー州レイクウッド）、ディスパーゼＩ（Ｇｉｂｃｏ社）、及びＤＮａｓｅＩ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、ベッドフォード、米国）を含有する３ｍＬの酵素消化溶液で非常に小さな断片に切断し、その後３７℃で２５分間インキュベートした。５００μＬのウシ胎児血清を添加して肺の酵素消化を停止し、１ｍＬシリンジを使用して上下にピペッティングすることにより、細胞懸濁液を混合した。細胞を１００μｍのセルストレーナーでろ過し、４００ｇ、４℃で７分間遠心分離した。次に、細胞を１ｍＬの赤血球溶解バッファー（９部の１５５ｍｍｏｌ／Ｌ塩化アンモニウム（ＮＨ₄Ｃｌ）及び１部の０．１ｍｏｌ／Ｌトリス塩酸（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．６５）で室温で約５分間処理した後、４ｍＬのＰＢＳで中和した。次に、細胞をＦＡＣＳバッファー（２ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及び０．５％ビオチン非含有ウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳ）で洗浄し、７０μｍのセルストレーナーでろ過した。

【0240】

フローサイトメトリー／細胞選別：次に、細胞ペレットを抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２で４℃で１５分間処理した後、磁気マイクロビーズ結合抗ＣＤ４５一次抗体と共に４℃で２０分間シェーカーでインキュベートした。ＡｕｔｏＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社、ベルギッシュ・グラートバッハ、ドイツ）を使用して、白血球画分を他の細胞画分から分離した。

【0241】

肺からの免疫細胞濃縮画分を、ＣＤ４５、Ｆ４／８０、ＳＩＧＬＥＣＦ、及びＭＲＣ１に対する抗体で染色してマクロファージを単離するか、ＣＤ４５、Ｌｙ６Ｇ、及びＣＤ３に対する抗体で染色して好中球及びＴ細胞を単離した。非免疫細胞画分が濃縮された肺細胞懸濁液を通過するフローを、ＣＤ４５、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１０５、及びＥＰＣＡＭに対する抗体で染色して、それぞれ線維芽細胞、内皮細胞、及び上皮細胞を分析した。白血球を除外するために、非免疫細胞画分に抗ＣＤ４５抗体を使用した。Ｓｏｎｙ ＳＨ８００ソーターを用いて細胞を分析した。

【0242】

ＰＢＳで処理したマウスを各実験日に含めて、バックグラウンドの蛍光を正規化し、異なる日に行った複製群及び処理群間の比較を容易にした。その後、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（バージョン１０．７．１）を使用してデータを分析し、ＦＡＭ陽性細胞の数及び蛍光強度の中央値を計算した。

【0243】

マイクロＲＮＡライブラリーの調製：次に、Ｔｒｉｚｏｌ試薬を使用して全ＲＮＡを抽出し、製造元のプロトコルに従って、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（ＮＥＢ）用のＮＥＢＮｅｘｔ低分子ＲＮＡライブラリー調製セットを使用して、低分子ＲＮＡライブラリーを調製した。増幅されたＰＣＲ産物を、Ｍｏｎａｒｃｈ（登録商標）キットを使用して精製し、増幅長に基づく選択のために６％尿素－ＰＡＧＥで実行した。ｍｉＲＮＡ（約１５０ｂｐ）に対応するバンドを切り出し、Ｌｅｘｏｇｅｎ社のゲル抽出モジュールキットを使用して一晩溶出した。ライブラリーを多重化及びプール化し、７５ｂｐ読み取り長のペア読み取りチップを使用して、ＭｉＳｅｑシーケンサーでディープシーケンシングランを実行した（５０サイクルのシングルラン）。

【0244】

バイオインフォマティクス：次に、シーケンサーからの生のＢＣＬ出力からＦＡＳＴＱファイルを生成した。低分子ＲＮＡの配列決定により、アダプター配列を除去し、低品質（Ｐｈｒｅｄ Ｑ＜２０）かつ小さい読み取り（１２ヌクレオチド未満）をフィルタリングした後、試料あたり約１５０万回の読み取り（約％の有効な読み取り）を得た。残りの高品質の読み取りを、ユニーク配列についてさらにフィルター処理し、各サンプルについてカウントし、低分子ＲＮＡ参照ライブラリー（ｍｉＲＢａｓｅ ｖ２２からのｍｉＲＮＡヘアピン）にアラインメントし、ｍｉＲＤｅｅｐ２ ツールを使用して１００万あたりのカウントに正規化された存在量を読み取った。次に、１００万あたり５カウントを超える全てのサンプルの平均検出範囲を示したマイクロＲＮＡをフィルター処理した。ＤＥＳｅｑ２を使用して試料間の低分子ＲＮＡの発現差を試験し、「ａｓｈｒ」適応収縮推定量（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ （２０１７）； Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ １８（２）：２７５－２９４）を対数倍率の変化に使用した。Ｒパッケージツール「ｐＨｅａｔｍａｐ」を使用して、試料間の低分子ＲＮＡの発現差を試験した。

【0245】

図６Ａの画像はＢｉｏＲｅｎｄｅｒオンラインツールを使用して生成し、化学構造はＣｈｅｍＤｒａｗ（登録商標）（ｖ２０．０）を使用して生成した。

【0246】

組織学：気管及びカニューレに接続されたままの左肺葉を、ＰＢＳ及び４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で灌流し、パラフィン包埋のために組織を４％ＰＦＡで２４時間保存した。コラーゲン沈着の分析のために、左心室心筋のパラフィン切片（８μｍ）をシリウスレッド及びファストグリーンで染色した。心臓全体の画像は、ＡｘｉｏＯｂｓｅｒｖｅｒ．Ｚ１（Ｚｅｉｓｓ社、イェーナ、ドイツ）電動走査ステージ顕微鏡（１３０ ｘ ８５； Ｍaｒｚｈaｕｓｅｒ社、ヴェツラー、ドイツ）を使用して１０倍の対物レンズで撮影し、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ（登録商標）ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を使用して分析した。線維症は、各切片におけるシリウスレッドからファストグリーンまでのシグナルの比率として定量化した。

【0247】

凍結ブロック（Ｋｒｙｏｂｌｏｃｋ）の場合、肺組織の一部（左葉）を、４％ＰＦＡでのインキュベーションの２時間後、３０％スクロース／ＰＢＳ溶液に４℃で一晩保持した。肺凍結切片（５μｍ）をメタノールで固定し（－２０℃で１０分間）、水道水で充分に洗浄し、アセトンで処理した（－２０℃で１分間）。次に、切片をＰＢＳで希釈した５％ヤギ血清でブロックし、ＭＲＣ１に対する一次抗体（＃ＡＢ６４６９３、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿１５２３９１０、Ａｂｃａｍ社）で４℃で一晩染色した。次に、切片をそれぞれの二次抗体で染色した。核はＳＹＴＯＸ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で染色した。画像は、６３倍グリセロール対物レンズ（Ｌｅｉｃａ ＳＰ５）を使用した共焦点顕微鏡によって取得した。

【0248】

統計分析：データは平均値及び個別値を示す。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアパッケージ（バージョン８）を使用して、統計分析を実行した。データ分布は、正規性についてシャピロ－ウィルク（Ｓｈａｐｉｒｏ－Ｗｉｌｋ）検定によって評価した。分散の等質性を試験するためにバートレット（Ｂａｒｔｌｅｔｔ）検定を実施し、異分散性を試験するためにスピアマン（Ｓｐｅａｒｍａｎ）の順位相関検定を実施した。２つの平均値の違いは、スチューデント（Ｓｔｕｄｅｎｔ）のｔ検定によって評価した。複数の平均値の違いは、二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）とそれに続くテューキー（Ｔｕｋｅｙ）の事後検定によって評価した。０．０５未満のＰ値は有意と見なした。

【0249】

本明細書で引用される全ての参考文献は、その内容全体を参照により援用される。ここまで本発明を充分に説明してきたが、当業者は、本発明の精神若しくは範囲又は任意の実施形態に影響を与えることなく、条件やパラメーター及び同種のものについて広くかつ同等の範囲内で本発明を実施できることを理解するであろう。
[先行技術文献]

【0250】

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【図1A-B】

【図1C】

【図2】

【図3A】

【図3B-E】

【図3F-G】

【図4A】

【図4B-C】

【図4D-E】

【図4F-G】

【図5A-B】

【図5C-E】

【図6A-B】

【図6C】

【図6D】

【図6E1】

【図6E2】

【図6F-G】

【図7A】

【図7B】

【図7B-C】

【図7D】

【図8A】

【図8B】

【図8C-D】

【図8E】

【図8F-G】

【図9A-B】

【図9C】

【図9D-E】

【図9F-G】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図10E1】

【図10E2】

【図10F】

【図10G】

【図11A】

【図11B-C】

【図11D-E】

【図11F】

【図12A】

【図12B-C】

【図13A】

【図13B】

【図13C-D】

【図14A-B】

【図14C-D】

【図14E-F】

【図14G】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19A-B】

【図20】

【図21】

【図22A】

【図22B-C】

【図22D-E】

【図22F】

【図23A-B】

【図23B】

【図24A】

【図24B-C】

【図25A-B】

【図26A-B】

【図26C-F】

【図27A-C】

【図27D-E】

【配列表】

2023521785000001.app

【国際調査報告】