(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-05-25
(54)【発明の名称】抗ＣＤ４７抗体およびその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20230518BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20230518BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230518BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20230518BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230518BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230518BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230518BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230518BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20230518BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230518BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20230518BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20230518BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20230518BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20230518BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20230518BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13
C07K16/28 ZNA
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A61P35/00
A61P35/02
A61K39/395 T
A61K39/395 E
A61K31/7088
A61K45/00
A61K35/76
A61K35/12
A61K47/68
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022561627
(86)(22)【出願日】2021-04-11
(85)【翻訳文提出日】2022-12-07
(86)【国際出願番号】 CN2021086339
(87)【国際公開番号】W WO2021204281
(87)【国際公開日】2021-10-14
(31)【優先権主張番号】202010282924.0
(32)【優先日】2020-04-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】512278054
【氏名又は名称】ハチソン メディファーマ リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100120031
【弁理士】
【氏名又は名称】宮嶋 学
(74)【代理人】
【識別番号】100120617
【弁理士】
【氏名又は名称】浅野 真理
(74)【代理人】
【識別番号】100126099
【弁理士】
【氏名又は名称】反町 洋
(72)【発明者】
【氏名】ツァイ、ユイ
(72)【発明者】
【氏名】ヤン、イーチェン
(72)【発明者】
【氏名】リー、シオン
(72)【発明者】
【氏名】ヤン、シエンウェン
(72)【発明者】
【氏名】レン、ヨンシン
(72)【発明者】
【氏名】スー、ウェイクオ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C076
4C084
4C085
4C086
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA83X
4B065AA86X
4B065AA87X
4B065AA87Y
4B065AA88X
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
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4B065CA46
4C076AA95
4C076CC41
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4C084AA13
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4C085AA13
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4C085BB31
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4C085CC23
4C085DD61
4C085EE01
4C085GG01
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA02
4C086MA05
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4C086ZB26
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4C087AA01
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4C087BB63
4C087BC83
4C087CA12
4C087ZB26
4C087ZB27
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA50
4H045DA75
4H045DA76
4H045EA20
4H045EA50
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片、それらの調製方法、およびＣＤ４７関連疾患を治療または予防するためのそれらの使用を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
単離された抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片であって、（１）重鎖可変領域（ＶＨ）のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３から選択される１～３個であって、前記ＶＨのアミノ酸配列が配列番号１、３、５、６または７に示される通りである；および／または
（２）軽鎖可変領域（ＶＬ）のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３から選択される１～３個であって、前記ＶＬのアミノ酸配列が配列番号２、４、８、９または１０に示される通りである
を含む、前記抗体またはその抗原結合断片。
【請求項2】
ＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、およびＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３
を含み、
前記ＶＨおよびＶＬが：
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（２）配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（３）配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号８、９または１０に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（４）配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号９または１０に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ；および
（５）配列番号７に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号８、９または１０に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ
から選択される、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項3】
単離された抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片であって、（１）重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３から選択される１～３個であって、前記ＨＣＤＲ１が配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含み、かつＨＣＤＲ３が配列番号１３または１７または２１に示されるアミノ酸配列を含む；および／または
（２）軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３から選択される１～３個であって、前記ＬＣＤＲ１が配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が配列番号１５または１８または２２に示されるアミノ酸配列を含み、かつＬＣＤＲ３が配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含む
を含む、前記抗体またはその抗原結合断片。
【請求項4】
（１）重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３であって、前記ＨＣＤＲ１が配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含み、かつ前記ＨＣＤＲ３が配列番号１３または１７または２１に示されるアミノ酸配列を含む；および／または（２）軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３であって、前記ＬＣＤＲ１は配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ２が配列番号１５または１８または２２に示されるアミノ酸配列を含み、かつ前記ＬＣＤＲ３が配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含む
を含む、請求項３に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項5】
（１）前記ＨＣＤＲ１が配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含み、かつ前記ＨＣＤＲ３が配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含み；かつ／または（２）前記ＬＣＤＲ１が配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ２が配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含み、かつ前記ＬＣＤＲ３が配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含む
を含む請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項6】
（１）配列番号１、３、５、６または７に示されるアミノ酸配列と同一であるかまたは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；および／または（２）配列番号２、４、８、９または１０に示されるアミノ酸配列と同一であるかまたは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項7】
前記ＶＨが配列番号１、３、５、６および７のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが配列番号２、４、８、９および１０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項8】
重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、前記ＶＨおよびＶＬが（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ；および配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（２）配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ；および配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（３）配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ；および配列番号８、９または１０に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（４）配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ；および配列番号９または１０に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ；および
（５）配列番号７に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ；および配列番号８、９または１０に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ
から選択される、請求項７に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項9】
重鎖可変領域（ＶＨ）および／または軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、前記ＶＨが配列番号７に示されるアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＬが配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項10】
ヒトＩｇＧ１定常領域、ヒトＩｇＧ１ＴＭ定常領域、ヒトＩｇＧ４定常領域またはヒトＩｇＧ４Ｐ定常領域等の重鎖定常領域を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項11】
ヒトκ軽鎖定常領域等の軽鎖定常領域を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項12】
マウス抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項13】
完全長抗体、一本鎖抗体、ＶＨＨ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ－ＳＨ、（Ｆａｂ’）２等の単一ドメイン抗体、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ（ドメイン抗体）またはビス（マルチ）特異的抗体等の一本鎖抗体である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項14】
請求項１～１３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片をコードする、単離された核酸。
【請求項15】
請求項１～１３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片の組換え産生に適した、１つ以上の請求項１４に記載の核酸を含む組換えベクターまたは発現ベクター。
【請求項16】
１つ以上の請求項１５に記載の組換えベクターまたは発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項17】
請求項１～１３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む、免疫複合体または免疫融合体。
【請求項18】
請求項１～１３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片、請求項１４に記載の核酸、請求項１５に記載のベクター、請求項１６に記載の宿主細胞、または請求項１７に記載の免疫複合体もしくは免疫融合体、ならびに任意に薬学的に許容可能な賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項19】
請求項１～１３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片、請求項１４に記載の核酸、請求項１５に記載のベクター、請求項１６に記載の宿主細胞、請求項１７に記載の免疫複合体もしくは免疫融合体、または請求項１８に記載の医薬組成物の有効量を個体に投与することを含む、癌を治療または予防する方法。。
【請求項20】
前記癌が、膀胱癌、膵臓癌、リンパ腫、白血病、多発性骨髄腫、（慢性）黒色腫、平滑筋腫、平滑筋肉腫、神経膠腫、神経膠芽腫、骨髄腫、子宮内膜癌、腎臓癌、（良性）黒色腫、前立腺癌、甲状腺癌、子宮頸癌、胃癌、肝臓癌、結腸癌、卵巣癌、尿路上皮癌等の血液癌および固形腫瘍を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
ＣＤ４７タンパク質を検出する方法であって：（ａ）試料と請求項１～１３のいずれか一項に記載の単離された抗体もしくはその抗原結合断片、または請求項１７に記載の免疫複合体もしくは免疫融合体とを接触させること；および
（ｂ）前記抗体もしくはその抗原結合断片、または免疫複合体もしくは免疫融合体とＣＤ４７タンパク質との間の複合体の形成を検出すること
を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の参照】
【0001】
本出願は、すべての目的で参照により完全に本明細書に組み込まれる、２０２０年４月１０日に出願されたＣＮ２０２０１０２８２９２４．０に基づくものであり、同出願に対する優先権を主張する。
【技術分野】
【0002】
本発明は、抗体、特に抗ＣＤ４７抗体、およびＣＤ４７関連疾患の治療または予防のための薬剤を調製するためのその使用に関する。
【背景技術】
【0003】
ＣＤ４７（Ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ４７）は、１９８０年代にヒト卵巣癌の腫瘍抗原として初めて同定された。インテグリン関連タンパク質（ＩＡＰ）、卵巣癌抗原ＯＡ３、Ｒｈ関連抗原およびＭＥＲ６としても知られるＣＤ４７は、単一の免疫グロブリン様ドメインおよび５つの膜貫通領域を有する免疫グロブリンスーパーファミリーに属する多重膜受容体である。シグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰα）のリガンドとして、ＣＤ４７はＳＩＲＰαのＮＨ２末端にあるＶ様ドメインに結合する。ＳＩＲＰαは主に、マクロファージ、顆粒球、樹状細胞（ＤＣ）、マスト細胞、およびそれらの前駆細胞、例えば造血幹細胞を含む骨髄細胞において発現する。正常細胞上のＣＤ４７は、マクロファージ上のＳＩＲＰαに結合し、「私を食べないで」シグナルを放出し、それによってマクロファージの食細胞機能を阻害する。これは、自然免疫系においてマクロファージが自己と非自己を区別する重要なメカニズムである。ＣＤ４７は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性顆粒球性白血病、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、膀胱癌およびその他の固形腫瘍を含むヒトの腫瘍細胞および組織において広く発現している。腫瘍細胞は、高度に発現されるＣＤ４７が、腫瘍の増殖を促進するＳＩＲＰαとマクロファージの表面において結合することにより、マクロファージの食作用を回避する。免疫チェックポイントＣＤ４７は、潜在的に効果的であり、腫瘍免疫療法に広く用いることができる標的であると考えられている。現在、ＣＤ４７／ＳＩＲＰα相互作用を標的とする様々な特異的遮断剤が開発されている。びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、急性骨髄性白血病および進行性固形腫瘍の治療のための抗ＣＤ４７抗体およびＳＩＲＰα融合タンパク質を含む薬剤に関連する数多くの前臨床試験および臨床試験が行われている。これらの薬剤は、単独で、または他の抗腫瘍薬と組み合わせて投与される。Ｆｏｒｔｙ Ｓｅｖｅｎ社が開発した抗ＣＤ４７抗体Ｈｕ５Ｆ９を例にとると、リンパ腫患者２２人の治療におけるＨｕ５Ｆ９の効果を評価する第Ｉ相臨床試験において、Ｈｕ５Ｆ９とリツキシマブとの併用により、リツキシマブ単独では反応しなかった患者の５０％において客観的寛解が得られる可能性があった。２０１９年に発表された臨床データによると、Ｈｕ５Ｆ９とアザシチジンとを併用して治療された再発性／難治性急性骨髄性白血病患者１４人の完全寛解率は最大３６％であり、Ｈｕ５Ｆ９とアザシチジンとを併用して治療された骨髄抑制症候群の患者１１人の寛解率は最大５５％であった。
【0004】
本発明によれば、高い抗腫瘍活性を有し、赤血球の顕著な凝集を引き起こさない、新規の抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片が提供される。したがって、本発明は、より多くの臨床的要求を満たすことができる。
【発明の概要】
【0005】
本発明によれば、ＣＤ４７またはその断片に結合する抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片、ならびにその調製方法、およびＣＤ４７関連疾患の治療方法を含むその使用方法が提供される。
【0006】
一つの態様において、本発明によれば、重鎖可変領域（ＶＨ）のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３から選択される１～３個を含み、上記ＶＨのアミノ酸配列が配列番号１、３、５、６または７に示される通りである抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片が提供される。
【0007】
一つの態様において、本発明により提供される抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片は、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３から選択される１～３個を含み、上記ＨＣＤＲ１は配列番号１１で示されるアミノ酸配列を含み、上記ＨＣＤＲ２は配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含み、かつ上記ＨＣＤＲ３は配列番号１３または１７または２１に示されるアミノ酸配列を含む。
【0008】
一つの態様において、本発明によれば、軽鎖可変領域（ＶＬ）のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３から選択される１～３個を含み、上記ＶＬのアミノ酸配列が配列番号２、４、８、９または１０に示される通りである抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片が提供される。
【0009】
一つの態様において、本発明によれば、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３から選択される１～３個を含む抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片であって、上記ＬＣＤＲ１が配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含み、上記ＬＣＤＲ２が配列番号１５または１８または２２に示されるアミノ酸配列を含み、かつＬＣＤＲ３が配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含む抗体またはその抗原結合断片が提供される。
【0010】
いくつかの実施形態において、本発明によれば、重鎖可変領域（ＶＨ）の３個のＣＤＲ、すなわちＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、ならびに軽鎖可変領域（ＶＬ）の３個のＣＤＲ、すなわちＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片であって、上記ＶＨのアミノ酸配列が配列番号１、３、５、６または７に示される通りであり、上記ＶＬのアミノ酸配列が配列番号２、４、８、９または１０に示される通りである抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片が提供される。
【0011】
いくつかの実施形態において、本発明によれば、重鎖可変領域（ＶＨ）の３個のＣＤＲ、すなわちＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、ならびに軽鎖可変領域ＶＬ）の３個のＣＤＲ、すなわちＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片であって、上記ＶＨおよびＶＬが：
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（２）配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（３）配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号８、９または１０に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（４）配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号９または１０に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ；および
（５）配列番号７に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号８、９または１０に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ
から選択される抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片が提供される。
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（２）配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（３）配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号８、９または１０に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（４）配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号９または１０に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ；および
（５）配列番号７に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号８、９または１０に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ
から選択される抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片が提供される。
【0012】
いくつかの実施形態において、本発明によれば、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、ならびに軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片であって、上記ＨＣＤＲ１が配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含み、上記ＨＣＤＲ２が配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含み、上記ＨＣＤＲ３が配列番号１３または１７または２１に示されるアミノ酸配列を含み、上記ＬＣＤＲ１が配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が配列番号１５または１８または２２に示されるアミノ酸配列を含み、上記ＬＣＤＲ３が配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含む抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片が提供される。
【0013】
いくつかの実施形態において、本発明により提供される抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片は、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、ならびに軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み、上記ＨＣＤＲ１は配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含み、上記ＨＣＤＲ２は配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含み、上記ＨＣＤＲ３は配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含み、上記ＬＣＤＲ１は配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含み、上記ＬＣＤＲ２は配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含み、かつ上記ＬＣＤＲ３は配列番号１６のアミノ酸配列を含む。
【0014】
いくつかの実施形態において、本発明により提供される抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片は重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、該ＶＨは、配列番号１、３、５、６または７に示されるアミノ酸配列と同一であるかまたは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0015】
いくつかの実施形態において、本発明により提供される抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片は軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、該ＶＬは、配列番号２、４、８、９または１０に示されるアミノ酸配列と同一であるかまたは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0016】
いくつかの実施形態において、本発明により提供される抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片は重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、該ＶＨは、配列番号１、３、５、６または７に示されるアミノ酸配列と同一であるかまたは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、該ＶＬは、配列番号２、４、８、９または１０に示されるアミノ酸配列と同一であるかまたは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0017】
いくつかの実施形態において、本発明により提供される抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片は重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、該ＶＨは、配列番号７に示されるアミノ酸配列と同一であるかまたは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、該ＶＬは、配列番号８に示されるアミノ酸配列と同一であるかまたは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0018】
いくつかの実施形態において、本発明により提供される抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片は重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、該ＶＨおよびＶＬは、
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（２）配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（３）配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号８、９または１０に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（４）配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号９または１０に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ；および
（５）配列番号７に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号８、９または１０に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ
から選択される。
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（２）配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（３）配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号８、９または１０に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（４）配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号９または１０に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ；および
（５）配列番号７に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号８、９または１０に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ
から選択される。
【0019】
いくつかの実施形態において、本発明により提供される抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片は重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、該ＶＨは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含み、該ＶＬは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む。
【0020】
いくつかの実施形態において、本発明により提供される抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片は重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、該ＶＨは、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含み、該ＶＬは、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む。
【0021】
いくつかの実施形態において、本発明により提供される抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片は重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、該ＶＨは、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含み、該ＶＬは、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む。
【0022】
いくつかの実施形態において、本発明により提供される抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片は重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、該ＶＨは、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含み、該ＶＬは、配列番号９に示されるアミノ酸配列を含む。
【0023】
いくつかの実施形態において、本発明により提供される抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片は重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、該ＶＨは、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含み、該ＶＬは、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む。
【0024】
いくつかの実施形態において、本発明により提供される抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片は重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、該ＶＨは、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含み、該ＶＬは、配列番号９に示されるアミノ酸配列を含む。
【0025】
いくつかの実施形態において、本発明により提供される抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片は重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、該ＶＨは、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含み、該ＶＬは、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む。
【0026】
いくつかの実施形態において、本発明により提供される抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片は重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、該ＶＨは、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含み、該ＶＬは、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む。
【0027】
いくつかの実施形態において、本発明により提供される抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片は重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、該ＶＨは、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含み、該ＶＬは、配列番号９に示されるアミノ酸配列を含む。
【0028】
いくつかの実施形態において、本発明により提供される抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片は重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、該ＶＨは、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含み、該ＶＬは、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む。
【0029】
いくつかの実施形態において、本発明により提供される抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片は重鎖定常領域を含み、該重鎖定常領域は、例えばヒトＩｇＧ１定常領域、ヒトＩｇＧ４定常領域、ヒトＩｇＧ４Ｐ 定常領域またはヒトＩｇＧ１ＴＭ定常領域である。本発明のヒトＩｇＧ４Ｐ定常領域は、Ｓ２２８Ｐ（ＥＵに従った番号付け）のアミノ酸置換を有する変異型ヒトＩｇＧ４である。いくつかの実施形態において、ヒトＩｇＧ１ＴＭ定常領域は、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５ＥおよびＰ３３１Ｓ（ＥＵに従った番号付け）のアミノ酸置換を有する変異型ヒトＩｇＧ１定常領域である。
【0030】
いくつかの実施形態において、本発明により提供される抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片は、ヒトのκまたはλ定常領域等の軽鎖定常領域を含む。
【0031】
いくつかの実施形態において、本発明により提供される抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片はモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態において、本発明により提供される抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片は、マウス抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体である。いくつかの実施形態において、本発明により提供される抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片のフレームワーク配列の少なくとも一部は、ヒトコンセンサスフレームワーク配列である。一つの実施形態において、本発明により提供される抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片は、完全長抗体、ＶＨＨ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、（Ｆａｂ’）２等の単一ドメイン抗体、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ（ドメイン抗体）またはビス（マルチ）特異的抗体等の一本鎖抗体である。
【0032】
別の態様において、本発明によれば、本発明により提供される任意の抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片をコードする単離された核酸が提供され、好ましくは該核酸は、本発明の抗体の重鎖もしくは軽鎖、または重鎖可変領域もしくは軽鎖可変領域をコードする。
【0033】
別の態様において、本発明によれば、本発明により提供される１つ以上の核酸を含む組換えベクターまたは発現ベクターが提供され、該ベクターは、本発明により提供される任意の抗体またはその抗原結合断片の組換え産生に適している。いくつかの実施形態において、上記ベクターは発現ベクターである。
【0034】
別の態様において、本発明によれば、本発明により提供される１つ以上の核酸、または組換えベクターもしくは発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。
【0035】
別の態様において、本発明によれば、本発明により提供される抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片を含む免疫複合体または免疫融合体が提供される。
【0036】
別の態様において、本発明によれば、本発明により提供される抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片、本発明により提供される核酸、ベクターまたは宿主細胞を含み、任意に担体または賦形剤等の少なくとも１種の薬学的に許容可能な薬学的賦形剤を含む。
【0037】
別の態様において、本発明によれば、ＣＤ４７関連疾患を治療または予防する方法が提供され、該方法は、本明細書に記載の任意の抗体またはその抗原結合断片、本発明により提供される核酸、ベクターまたは宿主細胞、本発明により提供される免疫複合体もしくは免疫融合体、または本発明により提供される医薬組成物の有効量を対象に投与することを含む。
【0038】
別の態様において、本発明によれば、ＣＤ４７関連疾患を治療または予防のための薬剤の調製における、本発明の抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片の使用も提供される。
【0039】
いくつかの実施形態において、上記ＣＤ４７関連疾患としては、限定されないが、膀胱癌、結腸直腸癌、膵臓癌、リンパ腫、白血病、多発性骨髄腫、（慢性）黒色腫、平滑筋腫（liomyoma）、平滑筋肉腫、神経膠腫、神経膠芽腫、骨髄腫、子宮内膜癌、腎臓癌、（良性）黒色腫、前立腺癌、甲状腺癌、子宮頸癌、胃癌および肝臓癌を含む、血液癌および固形腫瘍が挙げられる。
【0040】
本発明のＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片はまた、ＣＤ４７関連疾患を治療または予防するために、他の治療剤または治療様式と組み合わせることができる。
【0041】
いくつかの実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、試料中のＣＤ４７タンパク質の検出、またはＣＤ４７関連疾患の診断／検出のために使用することができる。
【0042】
本発明には、本明細書に記載される任意の実施形態の任意の組み合わせも包含される。本明細書に記載の任意の実施形態またはその任意の組み合わせは、本明細書に記載される本発明の任意のおよびすべての抗ＣＤ４７抗体またはその断片、方法および使用に適用可能である。
【図面の簡単な説明】
【0043】
【発明の詳細な説明】
【0044】
本発明によれば、ＣＤ４７とＳＩＲＰαとの間の相互作用を遮断することができ、高い抗腫瘍活性を有し、かつ赤血球の顕著な凝集反応を誘発しない抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片が提供される。
【0045】
本発明により提供される抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片は、ＣＤ４７の発現の阻害（細胞表面におけるＣＤ４７の発現の阻害等）、ＣＤ４７の活性および／またはシグナル伝達等の阻害活性、またはＣＤ４７とＳＩＲＰαとの間の相互作用の遮断等の阻害活性を示す。本発明により提供されるＣＤ４７抗体は、ＣＤ４７（ヒトＣＤ４７等）と結合または相互作用した後に、ＣＤ４７の発現または活性を完全にまたは部分的に低下または調節する。抗体とヒトＣＤ４７ポリペプチドおよび／またはペプチドとの相互作用の後、ＣＤ４７の生物学的機能は完全に、著しくまたは部分的に減少または調節される。本明細書に記載される抗ＣＤ４７抗体との相互作用（例えば、結合）を伴わないＣＤ４７の発現または活性のレベルと比較して、抗ＣＤ４７抗体の存在下でのＣＤ４７の発現または活性のレベルが少なくとも９５％低下する（例えば、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％低下する）場合、抗体はＣＤ４７の発現または活性を完全に阻害することができると考えられる。本明細書に記載される抗ＣＤ４７抗体との相互作用（例えば、結合）を伴わないＣＤ４７の発現または活性のレベルと比較して、抗ＣＤ４７抗体の存在下でのＣＤ４７の発現または活性のレベルが少なくとも５０％減少する（例えば、５５％、６０％、７５％、８０％、８５％または９０％減少する）場合、ＣＤ４７抗体はＣＤ４７の発現または活性を有意に阻害することができると考えられる。本明細書に記載される抗ＣＤ４７抗体との相互作用（例えば、結合）を伴わないＣＤ４７の発現または活性のレベルと比較して、抗ＣＤ４７抗体の存在下でのＣＤ４７の発現または活性のレベルが９５％未満低下する（例えば、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、８５％または９０％低下する）場合、抗体はＣＤ４７の発現または活性を部分的に阻害することができると考えられる。
【0046】
本発明により提供される抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片の存在下でのＣＤ４７とＳＩＲＰαとの間の相互作用のレベルと、本発明に記載される抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片の非存在下でのＣＤ４７とＳＩＲＰαとの間の相互作用のレベルとを比較すると、本発明の抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片はＣＤ４７とＳＩＲＰαとの間の相互作用を少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％遮断する。
【0047】
本発明の抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片は、有意なレベルの細胞凝集を誘導せず、例えば、本発明のＣＤ４７抗体は有意なレベルの赤血球凝集を誘導しない。いくつかの実施形態において、ＣＤ４７抗体であるＨｕ５Ｆ９の存在下での赤血球凝集のレベルと比較した場合、本発明のＣＤ４７抗体の存在下での赤血球凝集のレベルは少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９９％低下し、これは本発明のＣＤ４７抗体が有意なレベルの赤血球凝集を誘導しないことを示すものである。
【0048】
当技術分野で知られている抗体と比較して、本発明により提供される抗体は、腫瘍モデルにおいても有意に有効である。いくつかの実施形態において、本発明により提供される抗体は、腫瘍増殖を有意に阻害することができる。いくつかの実施形態において、本抗体の非存在下での腫瘍体積と比較した場合、本発明の抗体の存在下での腫瘍体積は少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９９％、または１００％阻害される。例えば、従来技術におけるＣＤ４７抗体の存在下と比較した場合、本発明のＣＤ４７抗体の存在下でマクロファージが腫瘍細胞を貪食する能力は少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９９％増大する。
【0049】
本発明によれば、抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片を調製する方法、および癌等の治療または予防のための抗体またはその抗原結合断片の使用も提供される。
【0050】
定義
特に明記しない限り、本発明は、当技術分野の技術的範囲内である分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学における従来技術を用いて行われる。
特に明記しない限り、本発明は、当技術分野の技術的範囲内である分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学における従来技術を用いて行われる。
【0051】
本発明をより容易に理解できるようにするために、いくつかの科学用語および技術用語を以下のように定義する。本明細書の別の場所で明確に定義されていない限り、本明細書において用いられるすべての科学用語および技術用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。当技術分野における定義および用語に関しては、様々な専門家たちによるCurrent Protocols in Molecular Biology（Ausubel）を参照することができる。アミノ酸残基の略語は、一般的に用いられる２０種のＬ－アミノ酸の１つを指すために当技術分野で用いられる標準的な３文字コードおよび／または１文字コードである。本明細書（特許請求の範囲を含む）で用いられる単数形は、特に断りのない限り、対応する複数形を含む。
【0052】
「約」という用語は、当業者によって決定される特定の値または組成についての許容される誤差範囲を含む値または組成を意味し、これは当該値または組成がどのように測定されるかまたは決定されるか、すなわち測定システムの限界に一部依存するものである。例えば、「約」は、当技術分野の慣例に従って、１または１を超える標準偏差内の範囲を指すことができる。あるいは、「約」は、最大５％、１０％または２０％（すなわち、±５％、±１０％または±２０％）の範囲を指すことができる。
【0053】
２つ以上の任意項目を接続するために用いられる場合、「および／または」という用語は、当該任意項目のいずれか１つまたは当該任意項目の任意の２つ以上を意味すると理解されるべきである。
【0054】
本明細書で用いられる「含む（comprise）」または「含む（include）」という用語は、言及された要素、整数または工程を含むことを意味するが、他の要素、整数または工程を排除するものではない。本明細書で用いられる場合、「含む（comprise）」または「含む（include）」という用語が使用される場合、特段の指示がない限り、言及された要素、整数または工程から構成される実例も包含される。例えば、特定の配列を「含む（comprising）」抗体可変領域に言及する場合、当該特定の配列から構成される抗体可変領域を包含することも意図される。
【0055】
「インテグリン関連タンパク質（ＩＡＰ）」または「ＣＤ４７」という用語は、本明細書で用いられる場合、特に明記しない限り、哺乳類（霊長類（例えば、ヒト）および齧歯類（例えば、マウスおよびラット）等）を含む任意の脊椎動物源からの任意の天然ＣＤ４７を指す。この用語には、「完全長」の未プロセシングＣＤ４７および任意の形態のＣＤ４７または細胞内プロセシングによって生成されるその任意の断片が包含される。この用語には、スプライスバリアントや対立遺伝子バリアント等、天然に存在するＣＤ４７バリアントも包含される。いくつかの実施形態において、ＣＤ４７は、ヒト由来の完全長ＣＤ４７またはその断片（シグナルペプチドを欠くその成熟断片等）を指す。いくつかの実施形態において、ヒトＣＤ４７は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００１７６８．１に示されるアミノ酸配列またはその断片と同一のＣＤ４７を指す。いくつかの実施形態において、この用語には、ＣＤ４７またはその断片を含む融合タンパク質も包含される。
【0056】
「ＳＩＲＰα」とは、野生型シグナル調節タンパク質α、または野生型シグナル調節タンパク質αのアミノ酸配列を含む組換えもしくは非組換えポリペプチド、またはシグナル調節タンパク質αの天然もしくは天然に存在する対立遺伝子バリアントを意味する。
【0057】
「抗ＣＤ４７抗体」、「抗ＣＤ４７」、「ＣＤ４７抗体」または「ＣＤ４７に結合する抗体」という用語は、該抗体がＣＤ４７を標的とする診断剤および／または治療剤として有用であるのに十分な親和性をもってＣＤ４７タンパク質またはその断片に結合することができる抗体またはその抗原結合断片を指す。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抗ＣＤ４７抗体は、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦５ｎＭ、≦４ｎＭ、≦３ｎＭ、≦２ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．９ｎＭまたは≦０．８ｎＭの解離定数（ＫＤ）を有する。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、完全長ヒトＣＤ４７またはその断片（特にその細胞外結合断片）に結合する。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、完全長ＣＤ４７またはその断片を含むタンパク質に結合する。いくつかの他の実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、細胞表面に発現するＣＤ４７またはその断片に結合する。
【0058】
本明細書で用いられる「親和性」という用語は、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間のすべての非共有相互作用の合計の強度を指す。特に指示がない限り、本明細書で用いられる「結合親和性」とは、結合対のメンバー（例えば、抗体と抗原）の間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。パートナーＹに対する分子Ｘの親和性は、一般に解離定数（ＫＤ）で表すことができる。結合親和性を決定するための当技術分野で知られている分析の例としては、表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ）または類似の技術（例えば、ＦｏｒｔｅＢｉｏ）が挙げられる。
【0059】
本明細書で用いられる「ＣＤ４７関連疾患」という用語は、ＣＤ４７の発現または機能または活性に関連する非生理学的状態、または限定されないが癌を含むＣＤ４７によって媒介されるシグナル伝達の活性に関連する非生理学的状態を指す。いくつかの実施形態において、疾患は、ＣＤ４７関連シグナル伝達の遮断により恩恵を受ける。
【0060】
「免疫応答」または「免疫反応」という用語は、本明細書においては互換的に用いることができ、リンパ球、抗原提示細胞、食細胞、顆粒球等の効果、および可溶性高分子（抗体、サイトカインおよび補体を含む）を産生するこれらの細胞または肝臓の効果を指す。この効果は、侵襲性病原体、病原体に感染した細胞または組織、癌細胞、または人体からの自己免疫または病的炎症の場合には正常なヒト細胞または組織の選択的な損傷、破壊または排除をもたらす。
【0061】
本明細書で用いられる「シグナル伝達」という用語は、一般にＣＤ４７とその受容体との結合等のタンパク質間相互作用によって開始される生化学的因果関係を指し、この関係は、細胞の一つの部分から細胞の別の部分へのシグナルの伝達をもたらす。一般に、伝達には、シグナル伝達を引き起こす一連の反応における１種以上のタンパク質の１つ以上のチロシン、セリンまたはスレオニン残基の特異的リン酸化が含まれる。最後から２番目のプロセスは一般に核イベントを含み、それによって遺伝子発現の変化が引き起こされる。
【0062】
本明細書で用いられる「活性」および「生物学的活性」という用語、または「生物学的特性」および「生物学的特徴」という用語は、本明細書において互換的に用いられ、限定されないが、エピトープ／抗原の親和性および特異性、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＣＤ４７活性を中和または拮抗する能力、ＣＤ４７活性、ＩＣ５０、抗体のｉｎ ｖｉｖｏでの安定性および抗体の免疫原性の増強または活性化を含む。当技術分野で知られている抗体の他の同定可能な生物学的特性または特徴としては、例えば、交差反応性（すなわち、一般に標的ペプチドの非ヒトホモログとの交差反応性、または他のタンパク質もしくは組織との交差反応性）、および哺乳類細胞における高レベルの抗体発現を維持する能力が挙げられる。上述した特性または特徴は、限定されないが、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳまたはＢＩＡＣＯＲＥプラズモン共鳴アッセイ、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏの中和アッセイ、受容体結合、サイトカインまたは成長因子の産生および／または分泌、シグナル伝達、および様々なソース（ヒト、霊長類またはその他のソースを含む）からの組織切片の免疫組織化学を含む等技術分野において知られている技術を用いて観察、決定または評価することができる。
【0063】
本明細書で用いられる「抗体」という用語は、望ましい生物活性を有する任意の形態の抗体を指す。したがって、抗体という用語は最も広い意味で用いられ、限定されないが、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、マルチスペシフィック抗体（バイスペシフィック抗体等）、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ＣｒｏｓｓＭａｂ抗体またはラクダ化単一ドメイン抗体を含む。
【0064】
「全抗体」、「完全長抗体」および「完全抗体」という用語は、本明細書において互換的に用いられ、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重鎖（Ｈ）および２つの軽鎖（Ｌ）を含む糖タンパク質を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（以下、ＶＨと略す）と重鎖定常領域とからなる。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３の３つのドメインで構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（以下、ＶＬと略す）と軽鎖定常領域とからなる。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬで構成される。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、超可変領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）である）にさらに分けることができ、その中にはより保存的な領域（フレームワーク領域（ＦＲ）である）が散在している。「相補性決定領域」または「ＣＤＲ領域」または「ＣＤＲ」は、抗体可変ドメイン内の領域であり、配列が超可変であり、構造的に確立されたループ（「超可変ループ」）を形成し、かつ／または抗原接触残基（「抗原接触点」）を含む。ＣＤＲは主に抗原エピトープへの結合を担っている。重鎖および軽鎖のＣＤＲは、一般にＮ末端から順に番号付けされているＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と呼ばれる。抗体重鎖可変ドメインに位置するＣＤＲはそれぞれＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３と呼ばれ、抗体軽鎖可変ドメインに位置するＣＤＲはそれぞれＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と呼ばれる。各ＶＨまたはＶＬは、３つのＣＤＲと４つのＦＲとで構成され、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって下記の順序で配置される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４。定常領域は抗体と抗原との結合に直接関与していないが、複数のエフェクター機能を示す。
【0065】
所定のＶＨまたはＶＬのアミノ酸配列において、各ＣＤＲの正確なアミノ酸配列境界は、例えば、Ｃｈｏｔｈｉａスキーム（Chothia et al., Canonical Structures for the Hypervariable Regions of Immunoglobulins”, Journal of Molecular Biology, 196, 901-917 (1987)）；Ｋａｂａｔスキーム（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th edition, U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)）、ＡｂＭ（バース大学）およびＣｏｎｔａｃｔ（ロンドン大学）；Ｎｏｒｔｈスキーム（North et al., A New Clustering of Antibody CDR Loop Conformations”, Journal of Molecular Biology, 406, 228-256 (2011)）を含むよく知られた様々なスキームまたはそれらの組合せを用いることによって決定することができる。本発明における抗ＣＤ４７抗体のＣＤＲの境界は、当技術分野における任意のスキームまたはそれらの組み合わせおよび個人的評価に従って決定することができる。
【0066】
抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、２つのタイプ（カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる）のいずれかに分類することができる。抗体の重鎖は、その重鎖定常領域に依存するアミノ酸配列に従って主に５つの異なるタイプ：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭに分類することができ、これらのタイプのいくつかはサブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２等にさらに分けることができる。
【0067】
「ＩｇＧの形態の抗体」とは、ＩｇＧ形態の抗体の重鎖定常領域を指す。例えば、ＩｇＧ４の形態の抗体とは、その重鎖定常領域がＩｇＧ４由来であることを意味する。
【0068】
本明細書において用いられる「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち集団を構成する様々な抗体は、少量で存在し得る天然に存在する変異体を除いて同一である。モノクローナル抗体は特異性が高く、単一のエピトープに対するものである。対照的に、従来の（ポリクローナル）抗体調製物は、一般に、異なるエピトープに対する（または異なるエピトープに特異的な）多数の抗体を含む。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体の集団から得られるという抗体の特徴を示し、抗体を産生するために特定の方法を必要とするように構築されるべきではない。
【0069】
本明細書において用いられる抗体の「抗原結合断片」という用語は、抗体の断片または誘導体を含む。一般に、抗原結合断片は、抗体の抗原結合領域または可変領域の少なくとも１つの断片（１つ以上のＣＤＲ等）を含み、抗体の結合特性の少なくとも一部を維持する。抗原結合断片の例としては、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片；ダイアボディ；線形抗体；一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃ－Ｆｖ）；および抗体断片から形成されたナノボディおよびマルチスペシフィック抗体が挙げられる。抗原結合活性がモル濃度ベースで表される場合、結合断片または誘導体は、一般に、それらが由来する抗体の抗原結合活性の少なくとも１０％を維持する。好ましくは、結合断片または誘導体は、それらが由来する抗体の抗原結合活性の少なくとも２０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％またはそれ以上を維持する。
【0070】
抗体またはその抗原結合断片は、その生物学的活性を有意に変化させない保存的または非保存的アミノ酸置換（抗体の「保存された変異体」または「機能的に保存された変異体」と呼ばれる）を含み得ることが予想される。好ましい態様において、保存的置換は、以下の表Ａに示される保存的置換残基、好ましくは表Ａに示される好ましい保存的アミノ酸置換残基に由来する。
【0071】
【表1】
【0072】
エピトープは、抗体が結合する抗原の領域である。エピトープは、タンパク質の三次フォールディングによって並置される連続アミノ酸または非連続アミノ酸から形成することができる。
【0073】
本明細書において用いられる「単離された抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片」という用語は、抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片の精製された状態を指す。例えば、「単離された」とは、分子が、核酸、タンパク質、脂質、糖、または細胞破片および増殖培地等の他の物質等の他の生体分子を実質的に含有しないことを意味し得る。しかしながら、当業者に知られているように、「単離された」という用語は、そのような物質が完全に存在しないこと、または本明細書に記載される抗体の実験的または治療的な適用を著しく妨げる量で存在しない限り、水、緩衝液もしくは塩が存在しないことを意味するものではない。いくつかの実施形態において、単離された抗体または抗原結合断片は、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超または９９％超の純度を有し得、純度は、例えば電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフィー（例えば、イオン交換または逆相ＨＰＬＣ）により決定される。抗体の純度を評価する方法の概説については、例えば、Flatman, S. et al., J. Chrom. B 848 (2007) 79-87を参照されたい。
【0074】
本明細書において用いられる「キメラ抗体」という用語は、第１の抗体の可変ドメインおよび第２の抗体の定常ドメインを有し、該第１の抗体および第の２抗体が異なる種に由来する抗体を指す。一般に、可変ドメインは齧歯類等の実験動物の抗体から得られ、定常ドメイン配列はヒト抗体から得られるため、得られるキメラ抗体は、実験動物の抗体よりもヒト対象において有害な免疫反応を誘発しにくい。
【0075】
本明細書において用いれる「ヒト化抗体」という用語は、ヒトおよび非ヒト（例えば、マウス、ラット）の抗体に由来する配列を含む抗体形態を指す。一般に、ヒト化抗体は、すべてまたは実質的にすべての超可変ループが非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、かつすべてまたは実質的にすべてのフレームワーク（ＦＲ）領域がヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域に対応する、少なくとも１つ、一般に２つの可変ドメインを含む。ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリンに由来する定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を任意に含み得る。場合によっては、当業者に知られているように、アミノ酸変異をヒト化抗体（例えば、可変ドメイン、フレームワーク領域および／または定常領域（存在する場合））に導入して、例えば、抗体の特定の特性を改善することができ；そのような抗体形態も、本発明の「ヒト化抗体」の範囲に含まれる。
【0076】
当業者に知られているように、抗体は、抗体を産生する細胞の糖鎖を有していてもよい。例えば、マウス、マウス細胞、またはマウス細胞由来のハイブリドーマにおいて産生される抗体は、マウス糖鎖を含んでいてもよい。あるいは、ラット、ラット細胞、またはラット細胞由来のハイブリドーマで産生される抗体は、ラット糖鎖を含んでいてもよい。
【0077】
本明細書において用いられる「Ｆｃ領域」という用語は、定常領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために用いられる。この用語には、天然配列のＦｃ領域およびバリアントＦｃ領域が含まれる。天然配列のＦｃ領域には、様々なＩｇサブタイプおよびその同種異系Ｆｃ領域等の様々な天然免疫グロブリンＦｃ配列が含まれる（Gestur Vidarsson et al., IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions, 20 October 2014, doi: 10.3389/fimmu.2014.00520.）。一つの実施形態において、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は、Ｃｙｓ２２６またはＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端まで延びる。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端のリジン（Ｌｙｓ４４７）は存在してもよく、存在しなくてもよい。本明細書において特に明記しない限り、Ｆｃ領域または定常領域のアミノ酸残基は、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edition Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されているように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされる。
【0078】
「Ｆｃ領域バリアント」または「バリアントＦｃ領域」という用語は、本明細書においては互換的に用いられ、天然配列のＦｃ領域に対して改変Ｆｃ領域が含まれることを意味する。本発明のＦｃ領域バリアントは、それらを構成するアミノ酸へのアミノ酸の改変に従って定義される。
【0079】
「薬学的賦形剤」という用語は、活性物質と共に投与される希釈剤、アジュバント（例えば、フロイントのアジュバント（完全および不完全））、賦形剤、担体または安定剤等を指す。
【0080】
「医薬組成物」という用語は、その中に含有される有効成分の生物学的活性を有効にする形態で存在し、組成物が投与される対象に対して許容できない毒性を有する追加の成分を含有しないような組成物を指す。
【0081】
本明細書において用いられる場合、「免疫複合体」とは、限定されないが、細胞毒性剤または標識を含む、１種以上の他の物質に結合した抗体である。「免疫融合体」とは、１つ以上の他のペプチドまたはポリペプチドと共有結合することによって融合される抗体である。
【0082】
本明細書に記載される「治療剤」という用語は、癌等の関連疾患の予防または治療に有効な任意の任意の物質を包含する。
【0083】
本発明において用いられる「細胞傷害剤」という用語は、細胞の機能を阻害するおよび／または細胞の死または破壊を引き起こす物質を指す。
【0084】
「化学療法剤」としては、癌または免疫系疾患の治療に有用な化学小分子薬が挙げられる。
【0085】
「小分子薬」という用語は、生物学的プロセスを調節することができる低分子量の有機化合物を指す。「小分子」とは、分子量が１０ｋＤ未満、一般に２ｋＤ未満、好ましくは１ｋＤ未満の分子として定義される。小分子としては、限定されないが、無機分子、有機分子、無機成分を含む有機分子、放射性原子を含む分子、合成分子、ペプチド模倣体および抗体模倣体が挙げられる。治療剤としては、小さな分子は大きな分子よりも細胞への浸透に優れており、分解を受けにくく、免疫反応を引き起こす可能性が低くなる。
【0086】
本明細書において用いられる「免疫調節剤」という用語は、免疫応答を調節する（抑制または増強する）天然または合成の活性剤または薬剤を指す。免疫応答は、体液性応答または細胞性応答であり得る。免疫調節剤としては免疫抑制剤が挙げられる。いくつかの実施形態において、免疫調節剤は、免疫応答を増強する活性剤または薬剤、例えば、癌治療において抗癌免疫応答を増強するのに有益な活性剤または薬剤を含む。
【0087】
本明細書において用いられる「免疫抑制剤（immunosuppressant）」、「免疫抑制薬（immunosuppressive drug）」または「免疫抑制剤（immuno-suppressor）」とは、免疫抑制療法において免疫系の活動を阻害または予防するための治療剤である。
【0088】
「癌腫」および「癌」という用語は、一般に無秩序な細胞増殖によって特徴付けられる、哺乳動物における生理学的障害を指す、または説明するものである。この定義には、良性および悪性の癌、および休止期の腫瘍または微小転移が含まれる。「癌」としては、限定されないが、固形腫瘍および血液癌が挙げられる。様々な癌の例としては、限定されないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫および白血病が含まれる。
【0089】
本明細書において用いられる「ベクター」という用語は、形質転換（すなわち、宿主細胞への異種ＤＮＡの導入）の目的で用いることができる任意の組換えポリヌクレオチド構築物を指す。ベクターの１つのタイプは「プラスミド」であり、これは環状二本鎖ＤＮＡループであり、追加のＤＮＡセグメントを該ループに連結することができる。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントを該ウイルスゲノムに連結することができる。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞内で自律複製が可能である（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによって宿主ゲノムと共に複製される。さらに、一部のベクターは、作動可能に連結された遺伝子の発現を誘導することができる。このようなベクターは、本明細書においては「発現ベクター」と呼ばれる。発現ベクターは、ベクターが宿主細胞に形質転換、トランスフェクトまたは形質導入された場合に、標的遺伝子を複製および発現することができる核酸を指す。発現ベクターは、１つ以上の表現型選択マーカーおよび複製起点を含み、必要に応じて宿主内でベクターを確実に維持し、増幅を引き起こす。
【0090】
本明細書において「対象」または「患者」または「個体」という用語は、任意のヒトまたは非ヒト動物を含む。「非ヒト動物」という用語には、哺乳類および非ヒト哺乳類、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類等の非哺乳類等のすべての脊椎動物が含まれる。
【0091】
本明細書における「治療上有効量」、「治療上有効用量」および「有効量」という用語は、細胞、組織または対象に単独でまたは他の治療剤と組み合わせて投与された場合に、１つ以上の疾患もしくは症状の兆候、または疾患もしくは症状の発症を効果的に予防または改善する本発明の抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片の量を指す。治療上有効用量はまた、関連する病状を治療する、治癒する、予防するまたは改善する量、そのような症状の治療、治癒、予防または改善の速度を上げる量等の、症状の改善をもたらすのに十分な抗体またはその抗原結合断片の量を指す。活性成分のみが個体に投与される場合、治療上有効用量とは成分のみを指す。組み合わせて投与される場合、治療上有効用量とは、組み合わせて、順次または同時に投与されるかどうかに関係なく、治療効果に寄与する活性成分の包括的な量を指す。治療剤の有効量は、診断の基準またはパラメータを少なくとも１０％、一般に少なくとも２０％、好ましくは少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも４０％、最も好ましくは少なくとも５０％増大させる。
【0092】
本明細書において用いられる場合、「治療」には、１）診断された病状または疾患の症状を治癒、軽減（alleviate）および緩和（relive）する、および／または診断された病状または疾患の進行を停止する治療手段、および２）病状または疾患の発症を予防および／または軽減する予防（preventive）または予防（prophylactic）手段が含まれる。したがって、治療を受ける対象には、病気に罹患したことがある個体、病気に罹患しやすい個体、病気を予防したい個体が含まれる。いくつかの実施形態において、本発明は、疾患または状態の治療に関する。いくつかの他の実施形態において、本発明は、疾患または状態の予防に関する。
【0093】
本発明のいくつかの実施形態において、疾患または状態の「治療」とは、疾患または状態の改善を指す（すなわち、疾患またはその臨床症状の少なくとも１つの進行を緩和または予防または軽減する）。別のいくつかの実施形態において、「治療」とは、患者により認識されない身体的パラメータを含む、少なくとも１つの身体的パラメータを軽減または改善することを指す。別のいくつかの実施形態において、「治療」とは、物理的（例えば、識別可能な症状の安定化）、生理学的（例えば、身体的パラメータの安定化）またはそれらの両方での疾患または状態を調節することを指す。疾患の治療および／または予防を評価する方法は、本明細書に明示的に記載されていない限り、一般に当技術分野において知られているものである。
【0094】
本発明のさらに別の実施形態において、疾患または状態の「予防」は、疾患または状態の発生または進行、または特定の疾患または状態の症状の阻害を含む。いくつかの実施形態において、癌の家族歴を有する対象は、予防レジメンの候補である。一般に、癌の文脈において、「予防」という用語は、癌の状態または症状の発症前の対象、特に癌のリスクのある対象への薬剤の投与を指す。
【0095】
いくつかの実施形態において、本発明の方法によって癌を「治療」した後、個々の患者が以下の１つ以上を示す場合、その患者は治療に成功したとみなされる：癌細胞の数の減少、または癌細胞の完全な消失；腫瘍サイズの減少；例えば、軟組織や骨への癌細胞の拡散を含む癌細胞の末梢器官への浸潤の抑制または不存在；腫瘍転移の抑制または不存在；腫瘍の成長の抑制または不存在；特定の癌に関連する１つ以上の症状の緩和；発生率や死亡率の減少；生活の質の向上；腫瘍の発生率、頻度または腫瘍形成性の減少；腫瘍内の癌幹細胞の数または頻度の減少；腫瘍細胞の非腫瘍形成状態への分化；またはそれらの効果のいくつかの組み合わせ。
【0096】
「腫瘍増殖の阻害」とは、腫瘍細胞の増殖を阻害することができる任意の機序を指す。いくつかの実施形態において、腫瘍細胞の増殖は、腫瘍細胞の増殖を遅らせることによって阻害される。いくつかの実施形態において、腫瘍細胞の増殖は、腫瘍細胞の増殖を停止することによって阻害される。いくつかの実施形態において、腫瘍細胞の増殖は、腫瘍細胞を死滅させることによって阻害される。いくつかの実施形態において、腫瘍細胞の増殖は、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導することによって阻害される。いくつかの実施形態において、腫瘍細胞の増殖は、腫瘍細胞の分化を誘導することによって阻害される。いくつかの実施形態において、腫瘍細胞の増殖は、腫瘍細胞から栄養素を失わせることによって阻害される。いくつかの実施形態において、腫瘍細胞の増殖は、腫瘍細胞の遊走を防止することによって阻害される。いくつかの実施形態において、腫瘍細胞の増殖は、腫瘍細胞の浸潤を防止することによって阻害される。
【0097】
本明細書において用いられる場合、「配列同一性」は、比較ウィンドウにおいて比較する１つずつのヌクレオチドまたはアミノ酸に基づく配列の同一性の程度を指す。「（パーセンテージ）配列同一性」は、以下のように計算することができる：比較ウィンドウにおいて最適に整列された２つの配列を比較し、２つの配列において同じ核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）または同じアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＣｙｓおよびＭｅｔ）を有する位置の数を決定して一致する位置の数を得、一致する位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数（つまり、ウィンドウサイズ）で除し、その結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを求める。配列同一性のパーセンテージを決定するための最適なアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮまたはＭＥＧＡＬＩＧＮ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア等の公的に入手可能なコンピューターソフトウェアを用いて、当技術分野において知られている様々な方法により達成することができる。当業者であれば、配列の完全長または比較される標的配列の領域にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインメントするための適切なパラメーターを決定することができる。本発明において、抗体配列について、アミノ酸配列の同一性のパーセンテージは、候補抗体配列と参照抗体配列とを最適に整列させ、次いで好ましい実施形態においてはｋａｂａｔ番号付け規則にしたがって最適な配列を行うことによって決定される。
【0098】
本明細書において用いられる「凝集」という用語は、細胞の凝集を指し、「赤血球凝集」という用語は、特定のクラスの細胞（すなわち、赤血球）の凝集を指す。したがって、血球凝集は凝集の一種である。
【0099】
本明細書において、対照抗体「Ｈｕ５Ｆ９」とは、特許ＵＳ２０１５／０１８３８７４Ａ１に開示される５Ｆ９の可変領域配列に従って、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔによる組換え発現によって形成されたＩｇＧ４Ｐの形態の抗ＣＤ４７抗体である。対照抗体「ＳＲＦ２３１」とは、特許ＵＳ２０１８０２０１６７７Ａ１に開示される２．３Ｄ１１の可変領域配列に従って、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔによる組換え発現によって形成されたＩｇＧ４Ｐの形態の抗ＣＤ４７抗体である。
【0100】
抗ＣＤ４７抗体およびその作製
本発明の抗体は、抗体を産生するための任意の適切な方法によって産生され得る。任意の適切な形態のＣＤ４７を、抗体を産生するための免疫原（抗原）として用いることができる。限定ではなく一つの例として、任意のＣＤ４７バリアントまたはその断片を免疫原として用いることができる。いくつかの実施形態において、マウスモノクローナル抗ヒトＣＤ４７抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、当技術分野において周知の方法によって産生され得る。これらの方法としては、限定されないが、Kohler et al., (1975) (Nature 256: 495-497)によって最初に開発されたハイブリドーマ技術が挙げられる。好ましくは、標準プロトコルに従って、マウス脾臓細胞を単離し、ＰＥＧまたは電気融合によってマウスミエローマ細胞株と融合させた。次いで、ＣＤ４７結合活性を有する抗体を分泌するハイブリドーマ細胞をスクリーニングした。本発明のハイブリドーマ細胞の免疫グロブリン可変領域のＤＮＡ配列は、縮重プライマーＰＣＲに基づく方法により検出することができる。
本発明の抗体は、抗体を産生するための任意の適切な方法によって産生され得る。任意の適切な形態のＣＤ４７を、抗体を産生するための免疫原（抗原）として用いることができる。限定ではなく一つの例として、任意のＣＤ４７バリアントまたはその断片を免疫原として用いることができる。いくつかの実施形態において、マウスモノクローナル抗ヒトＣＤ４７抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、当技術分野において周知の方法によって産生され得る。これらの方法としては、限定されないが、Kohler et al., (1975) (Nature 256: 495-497)によって最初に開発されたハイブリドーマ技術が挙げられる。好ましくは、標準プロトコルに従って、マウス脾臓細胞を単離し、ＰＥＧまたは電気融合によってマウスミエローマ細胞株と融合させた。次いで、ＣＤ４７結合活性を有する抗体を分泌するハイブリドーマ細胞をスクリーニングした。本発明のハイブリドーマ細胞の免疫グロブリン可変領域のＤＮＡ配列は、縮重プライマーＰＣＲに基づく方法により検出することができる。
【0101】
齧歯類（マウス等）からの抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏで治療剤として用いる場合、望ましくない抗体免疫原性を引き起こす可能性がある。繰り返し用いることにより、ヒトにおいて治療用抗体に対する免疫反応が引き起こされる。この種の免疫反応は、少なくとも治療効果の喪失につながり、重症の場合、致命的なアレルギー反応につながり得る。齧歯類の抗体の免疫原性を低減させる１つの方法としては、マウス抗体可変領域とヒト定常領域とが融合されたキメラ抗体の産生が挙げられる（Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439-43）。しかしながら、キメラ抗体に完全な齧歯類可変領域が保持されていると、依然として患者に有害な免疫原性を引き起こし得る。
【0102】
齧歯類可変領域からヒトフレームワークへのＣＤＲの移植（すなわち、ヒト化）は、齧歯類配列をさらに最小化するために用いられる。本発明のヒト化抗体については、当技術分野において公知の方法を用いてマウスＣＤＲ領域をヒト生殖系列フレームワークに挿入することができる。Winter et al.の米国特許第５，２２５，５３９号およびQueen et al.の米国特許第５，５３０，１０１号；同第５，５８５，０８９号；同第５，６９３，７６２号および同第６，１８０，３７０号を参照されたい。しかしながら、ＣＤＲループ交換によっては、元の抗体と同じ結合特性を有する抗体を作製することはできない。ヒト化抗体においては、抗原結合親和性を維持するために、フレームワーク残基（ＦＲ）（ＣＤＲループの支持に関与する残基）をさらに変更する必要がある場合が多くある。Kabat et al. (1991) J. Immunol. 147: 170。端的には、ヒト化形質転換プロセスは、以下の工程を含む：Ａ．各候補抗体の遺伝子配列とヒト胚性抗体の遺伝子配列とを整列させて高い相同性を有する配列を見つける；Ｂ．ＨＬＡ－ＤＲ親和性を分析および調査して親和性の低いヒト胚性フレームワーク配列を選択する；Ｃ．可変領域とその周辺領域のフレームワークアミノ酸配列をコンピューターシミュレーション技術と分子ドッキングとを用いて解析してそれらの空間的立体結合様式を調べる。静電力、ファンデルワールス力、親水性およびエントロピーを計算することにより、ＣＤ４７と相互作用し、候補抗体遺伝子配列における空間フレームワークを維持すし得る重要なアミノ酸個体が分析され、選択されたヒト胚遺伝子フレームワークに移植され、これに基づいてフレームワーク領域で確保しなければならないアミノ酸酸の位置がマークされ、ヒト化抗体が合成される。
【0103】
本発明の抗体の可変領域ＣＤＲの正確なアミノ酸配列境界は、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ、ＣｏｎｔａｃｔまたはＮｏｒｔｈ等の多くの周知のスキームのいずれかを用いて決定することができる。異なる定義系によって得られる同じ抗体の可変領域のＣＤＲの境界は異なる場合があることに注意すべきである。すなわち、異なる割り当てシステムによって定義された同じ抗体の可変領域のＣＤＲ配列は異なる。したがって、本発明において定義される特定のＣＤＲ配列を有する抗体を定義することになると、抗体の範囲は、その可変領域配列が特定のＣＤＲ配列を含む抗体も包含する。しかしながら、異なるスキーム（異なる割り当てシステムまたは組み合わせ等）の適用により、請求されたＣＤＲ境界は、本発明で定義される特定のＣＤＲ境界とは異なる。
【0104】
いくつかの実施形態において、本発明により提供される抗ＣＤ４７抗体分子のＣＤＲ境界は、Ｋａｂａｔ割り当てシステムに基づいて決定される。
【0105】
異なる特異性（すなわち、異なる抗原に対する異なる結合部位）を有する抗体は、異なるＣＤＲを有する。しかしながら、ＣＤＲは抗体ごとに異なるものの、ＣＤＲ内の限られた数のアミノ酸位置のみが抗原結合に直接関与している。最小重複領域はＫａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭおよびＮｏｒｔｈ法の少なくとも２つを用いて決定することができ、抗原結合のための「最小結合単位」が提供される。最小結合単位は、ＣＤＲのサブセットであり得る。当業者に理解されるように、ＣＤＲ配列の残りの残基は、抗体の構造およびタンパク質フォールディングに従って決定することができる。したがって、本発明によれば、本明細書に示されるＣＤＲの任意の変異体も企図される。いくつかの実施形態において、本発明の抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片のＣＤＲのバリアントにおいて、最小結合単位のアミノ酸残基は変化しないままであり得るが、ＫａｂａｔまたはＩＭＧＴに従って定義されるＣＤＲの残りの残基は、保存的アミノ酸残基によって置換することがでる。
【0106】
いくつかの実施形態において、本発明により提供される抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片は、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３から選択される１～３個を含み、上記ＨＣＤＲ１は配列番号１１のアミノ酸配列と同一であるかまたは配列番号１１のアミノ酸配列と比較して少なくとも１個かつ３個以下、２個以下または１個以下のアミノ酸の変更（好ましくはアミノ酸の置換、好ましくは保存的置換）を有するアミノ酸配列を含み、上記ＨＣＤＲ２は配列番号１２のアミノ酸配列と同一であるか、または配列番号１２のアミノ酸配列と比較して少なくとも１個かつ３個以下、２個以下または１個以下のアミノ酸の変更（好ましくはアミノ酸の置換、好ましくは保存的置換）を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記ＨＣＤＲ３は配列番号１３または配列番号１７または配列番号２１のアミノ酸配列と同一であるかまたは配列番号１３または配列番号１７または配列番号２１のアミノ酸配列と比較して、少なくとも１個かつ３個以下、２個以下または１個以下のアミノ酸の変更（好ましくはアミノ酸の置換、好ましくは保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。
【0107】
いくつかの実施形態において、本発明により提供される抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片は、軽鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３から選択される１～３個を含み、上記ＬＣＤＲ１は配列番号１４のアミノ酸配列と同一であるかまたは配列番号１４のアミノ酸配列と比較して少なくとも１個かつ３個以下、２個以下または１個以下のアミノ酸の変更（好ましくはアミノ酸の置換、好ましくは保存的置換）を有するアミノ酸配列を含み、上記ＬＣＤＲ２は配列番号１５または配列番号１８または配列番号２２のアミノ酸配列と同一であるか、または配列番号１５または配列番号１８または配列番号２２のアミノ酸配列と比較して少なくとも１個かつ３個以下、２個以下または１個以下のアミノ酸の変更（好ましくはアミノ酸の置換、好ましくは保存的置換）を有するアミノ酸配列を含み、上記ＬＣＤＲ３は配列番号１６のアミノ酸配列と同一であるかまたは配列番号１６のアミノ酸配列と比較して少なくとも１個かつ３個以下、２個以下または１個以下のアミノ酸の変更（好ましくはアミノ酸の置換、好ましくは保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。
【0108】
いくつかの実施形態において、本発明により提供される抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片は、本明細書において具体的に開示される３個のＣＤＲと比較して、重鎖可変領域の３個のＣＤＲにおいて全部で少なくとも１個かつ５個以下、４個以下、３個以下、２個以下または１個以下のアミノ酸の変更（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換）が含まれ、かつ／または軽鎖可変領域の３個のＣＤＲにおいて全部で少なくとも１個かつ５個以下、４個以下、３個以下、２個以下または１個以下のアミノ酸の変更（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換）が含まれる抗体またはその抗原結合断片が包含される。
【0109】
いくつかの実施形態において、本発明により提供される抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片は、本明細書において具体的に開示される抗体の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域と比較して、重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域に１個以上（好ましくは１０個以下、より好ましくは６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下または１個以下）のアミノ酸の変更（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくはアミノ酸保存的置換）を有するそのような抗体またはその抗原結合断片が包含され、好ましくは上述したアミノ酸の変更はＣＤＲ領域で生じるものではない。
【0110】
いくつかの実施形態において、本発明により提供される抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１、３、５、６または７から選択されるアミノ酸配列と同一であるかまたは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。いくつかの実施形態において、本発明により提供される抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２、４、８、９または１０から選択されるアミノ酸配列と同一であるかまたは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
【0111】
本発明の一つの実施形態において、本明細書に記載されるアミノ酸の変更としては、アミノ酸の置換、挿入または欠失が挙げられる。好ましくは、本明細書に記載されるアミノ酸の変更はアミノ酸の置換、好ましくは保存的置換である。
【0112】
好ましい実施形態において、本発明のアミノ酸の変更は、ＣＤＲの外側の領域（例えば、ＦＲ）で起こる。より好ましくは、本発明のアミノ酸の変更は、重鎖可変領域の外側および／または軽鎖可変領域の外側の領域で起こる。いくつかの実施形態において、アミノ酸の変更は、重鎖定常領域および／または軽鎖定常領域において起こる。
【0113】
いくつかの実施形態において、アミノ酸の変更を含む本発明の抗体は、本明細書に開示される特定の抗体と同等または類似の特性を有する。
【0114】
いくつかの実施形態において、本発明の抗ＣＤ４７抗体は、ＣＤＲ、軽鎖可変領域、重鎖可変領域、軽鎖または重鎖に対する翻訳後修飾を含む。
【0115】
いくつかの実施形態において、本発明により提供される抗ＣＤ４７抗体は、完全長抗体、ＶＨＨ、Ｆａｂ抗体、Ｆａｂ’抗体、Ｆａｂ’－ＳＨ、（Ｆａｂ’）２抗体等の単一ドメイン抗体、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ（ドメイン抗体）またはビス（マルチ）特異的抗体等の一本鎖抗体である。
【0116】
いくつかの実施形態において、本発明により提供される抗ＣＤ４７抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４の形態の抗体等、ＩｇＧの形態の任意の抗体である。いくつかの実施形態において、本発明の抗ＣＤ４７抗体は、ＩｇＧ４Ｐの形態の抗体であり、すなわちヒトＩｇＧ４定常領域のヒンジ領域において改変、Ｓｅｒ２２８Ｐｒｏ（Ｓ２２８Ｐ、ＥＵに従った番号付け）が行われて鎖の交換が回避または低減されている。
【0117】
いくつかの実施形態において、本発明により提供される抗体のＦｃ領域に１つ以上のアミノ酸改変を導入して、Ｆｃ領域バリアントを生成することができる。Ｆｃ領域バリアントは、１つ以上のアミノ酸位置におけるアミノ酸の改変を含むヒトＦｃ領域配列（ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のＦｃ領域等）を含み得、例えば、ＦｃγＲとの結合を増強または低減して対応する機能を増強または低減するヒトＩｇＧ１に対する改変の数は、論文Bruhns and Jonsson published in Immunol Rev. 2015 Nov; 268 (1): 25-51, page 44に要約されている。
【0118】
いくつかの実施形態において、本発明により提供される抗ＣＤ４７抗体は、ＦｃγＲ結合活性が低減または欠損しているＦｃ領域バリアントを含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域バリアントはアミノ酸置換を有し、特に、アミノ酸置換は免疫グロブリン重鎖の位置Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７およびＰ３３１における他のアミノ酸への置換から選択される。いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域バリアントのアミノ酸置換は、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７ＤまたはＰ３３１Ｓである。
【0119】
いくつかの実施形態において、本明細書において提供される抗体は改変されて抗体のグリコシル化の程度が増大または減少される。抗体のグリコシル化部位の付加または欠失は、アミノ酸配列を変化させて、１つ以上のグリコシル化部位を生成または除去することによって適宜達成することができる。グリコシル化は、例えば、「抗原」に対する抗体の親和性を高めるために変更され得る。この改変は、例えば、抗体配列内の１つ以上のグリコシル化部位を変更することによって達成することができる。例えば、１つ以上のアミノ酸置換を行うことができ、その結果、１つ以上の可変領域フレームワークのグリコシル化部位が除去され、それによってこの部位におけるグリコシル化が除去される。このアグリコシル化によって、抗原に対する抗体の親和性を高めることができる。このような方法は、例えば、米国特許第５，４２６，３００号に記載されている。抗体がＦｃ領域を含む場合、それに結合した糖類を変更することができる。いくつかの用途において、フコースモジュールを除去して抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）機能を改善する等、望ましくないグリコシル化部位を除去する改変が有用である。他の用途においては、ガラクトシル化改変を行って、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を改変することができる。
【0120】
いくつかの実施形態において、システイン改変抗体、例えば、抗体の１つ以上の残基がシステイン残基で置換されている「ｔｈｉｏＭＡｂｓ」を作製することが望ましい場合がある。
【0121】
いくつかの実施形態において、本明細書において提供される抗体は、当技術分野で知られており、容易に入手できる追加の非タンパク質部分を含むようにさらに改変され得る。非タンパク質部分としては、限定されないが、水溶性ポリマーが挙げられる。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジアルカン、ポリ－１，３，６－トリアルカン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、およびデキストランまたはポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコールおよびそれらの混合物が挙げられる。
【0122】
抗体発現
本発明は、１つ以上の発現ベクターを含む宿主細胞、および本発明の任意の抗体またはその抗原結合断片を産生する方法であって、宿主細胞を培養すること、抗体または抗原結合断片を精製および回収することを含む方法に関する。
本発明は、１つ以上の発現ベクターを含む宿主細胞、および本発明の任意の抗体またはその抗原結合断片を産生する方法であって、宿主細胞を培養すること、抗体または抗原結合断片を精製および回収することを含む方法に関する。
【0123】
一つの態様において、本発明によれば、上述した抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片のいずれかをコードする核酸が提供される。例えば、本発明によれば、本明細書に記載される重鎖、軽鎖、可変領域または相補性決定領域をコードする核酸が提供される。いくつかの態様において、重鎖可変領域をコードする核酸は、配列番号１９に示される核酸に対して少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。いくつかの態様において、軽鎖可変領域をコードする核酸は、配列番号２０に示される核酸に対して少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。
【0124】
一つの態様において、核酸を含む１つ以上のベクターが提供される。いくつかの実施形態において、ベクターは発現ベクターである。発現ベクターの選択は、ベクターが発現することが意図される宿主細胞に依存する。一般に、発現ベクターは、抗ＣＤ４７抗体鎖またはその抗原結合断片をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターおよび他の調節配列（例えば、エンハンサー）を含む。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、抗体定常領域をコードする配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、ＰＴＴ５ベクターまたはｐＣＤＮＡ３．４等のｐＣＤＮＡベクターである。
【0125】
一つの態様において、本発明によれば、原核細胞または真核細胞を含む、本発明の組換え抗体を発現するための宿主細胞が提供される。いくつかの実施形態において、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）は、本発明のポリヌクレオチドをクローニングおよび発現するために用いることができる原核宿主である。他の適切な微生物宿主としては、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）等のバチルス属、およびサルモネア属、セラチア属および様々なシュードモナス属等の腸内細菌科が挙げられる。これらの原核宿主においては、一般に宿主細胞と適合する発現制御配列（例えば、複製起点）を含む発現ベクターも調製することができる。いくつかの実施形態において、哺乳動物宿主細胞を用いて、本発明の抗ＣＤ４７抗体ポリペプチドが発現および産生される。例えば、哺乳動物宿主細胞は、内因性免疫グロブリン遺伝子を発現するハイブリドーマ細胞株、または正常なヒト細胞、または不死化された動物細胞もしくはヒト細胞を含む、外因性発現ベクターを有する哺乳動物細胞株であり得る。例えば、ＣＨＯ細胞株、様々なＣＯＳ細胞株、Ｅｘｐｉｒｅ２９３細胞、ＨＥＫ２９３細胞、骨髄腫細胞株、形質転換Ｂ細胞およびハイブリドーマを含む、完全な免疫グロブリンを分泌することができる多くの適切な宿主細胞株が開発されている。
【0126】
一つの態様において、本発明によれば、抗ＣＤ４７抗体を調製する方法が提供され、該方法は、哺乳動物宿主細胞に発現ベクターを導入すること、および該宿主細胞を十分な時間培養することにより宿主細胞内で抗体を発現させること、またはより好ましくは宿主細胞を増殖させて抗体を産生させる培地に抗体を分泌することを含む。標準的なタンパク質精製方法を用いて、培地から抗体を回収することができる。本明細書に記載されるように調製された抗体分子は、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー等の既知の利用可能な技術によって精製することができる。特定のタンパク質を精製するために用いられる実際の条件は、当業者には自明である正味の電荷、疎水性および親水性等の要因にも依存する。本発明の抗体分子の純度は、サイズ排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、高速液体クロマトグラフィー等を含む様々な周知の分析方法のいずれかによって決定することができる。
【0127】
異なる細胞株によって発現された抗体、またはトランスジェニック動物で発現された抗体は、互いに異なるグリコシル化を有し得る。しかしながら、抗体のグリコシル化に関係なく、本明細書において提供される核酸によってコードされるすべての抗体、または本明細書において提供されるアミノ酸配列を含むすべての抗体は、本発明の構成要素である。
【0128】
決定方法
本明細書において提供される抗ＣＤ４７抗体の物理的／化学的特性および／または生物学的活性は、当技術分野において知られている様々な決定方法によって同定、スクリーニングまたは特性化することができる。一つの態様において、本発明の抗体の抗原結合活性は、例えば、ＥＬＩＳＡやウエスタンブロット等の公知の方法により試験される。当技術分野において知られている方法を用いてＣＤ４７への結合を決定することができ、例示的な方法が本明細書に開示されている。
本明細書において提供される抗ＣＤ４７抗体の物理的／化学的特性および／または生物学的活性は、当技術分野において知られている様々な決定方法によって同定、スクリーニングまたは特性化することができる。一つの態様において、本発明の抗体の抗原結合活性は、例えば、ＥＬＩＳＡやウエスタンブロット等の公知の方法により試験される。当技術分野において知られている方法を用いてＣＤ４７への結合を決定することができ、例示的な方法が本明細書に開示されている。
【0129】
本発明によれば、生物学的活性を有する抗ＣＤ４７抗体を同定するための決定方法も提供される。生物学的活性としては、例えば、ＣＤ４７と結合（例えば、ヒトＣＤ４７と結合）、細胞表面上のＣＤ４７と結合、ＣＤ４７とそのリガンドとの結合の遮断、赤血球凝集促進における活性への影響、およびヒトマクロファージによる腫瘍細胞の食作用への影響等が含まれ得る。ｉｎ ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ ｖｉｔｒｏでそのような生物学的活性を有する抗体もまた提供される。特定の実施形態において、本発明の抗体は、そのような生物学的活性について試験される。
【0130】
上述したｉｎ ｖｉｔｒｏでの決定方法のいずれかにおいて用いるための細胞としては、腫瘍細胞株等のＣＤ４７を自然に発現する細胞株、またはＣＤ４７を発現するように操作された細胞株が挙げられる。このような細胞としては、ＣＤ４７を発現する細胞株、および異常な状況下でＣＤ４７を発現するＣＤ４７をコードするＤＮＡでトランスフェクトされた細胞株も含まれる。
【0131】
本発明の免疫複合体または免疫融合体は、抗ＣＤ４７抗体を置換または補足して上述した決定方法のいずれかを行うために用いられ得る。
【0132】
抗ＣＤ４７抗体と他の活性剤との組み合わせを用いて、上述した決定方法のいずれかを行うことが理解され得る。
【0133】
免疫複合体と免疫融合体
いくつかの実施形態において、本発明によれば、本発明により提供される任意の抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片および他の物質を含む免疫複合体が提供される。一つの実施形態において、他の物質は、例えば、細胞に有害な任意の薬剤を含む細胞傷害剤である。
いくつかの実施形態において、本発明によれば、本発明により提供される任意の抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片および他の物質を含む免疫複合体が提供される。一つの実施形態において、他の物質は、例えば、細胞に有害な任意の薬剤を含む細胞傷害剤である。
【0134】
いくつかの実施形態において、本明細書において提供される任意の抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片を含む免疫融合体が提供される。
【0135】
いくつかの実施形態において、免疫複合体および免疫融合体は、ＣＤ４７関連疾患を予防または治療するために用いられる。
【0136】
医薬組成物
「医薬組成物」という用語は、その中に含有される有効成分の生物学的活性を有効にする形態で存在することを可能にし、調製物／製剤が投与される対象に対して許容できない毒性を有する追加の成分を含有しないような調製物／製剤を指す。
「医薬組成物」という用語は、その中に含有される有効成分の生物学的活性を有効にする形態で存在することを可能にし、調製物／製剤が投与される対象に対して許容できない毒性を有する追加の成分を含有しないような調製物／製剤を指す。
【0137】
「薬学的賦形剤」という用語は、治療剤と共に投与される薬学的担体、希釈剤、アジュバント（例えば、フロイントのアジュバント（完全および不完全））または賦形剤を指す。
【0138】
本発明の医薬組成物は、本発明の抗体および薬学的賦形剤を含み得る。これらの医薬組成物は、診断キット等のキットに含めることができる。
【0139】
本明細書において用いられる場合、「薬学的担体」には、生理学的に適合するあらゆる溶媒、分散媒、等張剤、吸収遅延剤等が含まれる。本発明に適した薬学的担体は、水および油等の無菌液体であり得、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油等の石油由来、動物由来、植物由来または合成由来のものが含まれる。医薬組成物が静脈内投与される場合、水が好ましい担体である。特に注射溶液用の液体担体としては、生理食塩水、水性デキストロースおよびグリセロール溶液を用いることも可能である。
【0140】
適切な薬学的賦形剤としては、デンプン、ブドウ糖、乳糖、ショ糖、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、ジオール、水、エタノール等が挙げられる。賦形剤の適用およびその使用については、“Handbook of Pharmaceutical Excipients”, fifth edition, R.C. Rowe, P.J. Seskey and S.C. Owen, Pharmaceutical Press, London, Chicagoも参照されたい。組成物はまた、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有してもよい。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸薬、カプセル、粉末、徐放剤等の形態であり得る。経口製剤は、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリン等の標準的な担体を含有してもよい。
【0141】
本発明によれば、ＣＤ４７またはその抗原結合断片に結合する１種以上のモノクローナル抗体、および本発明の核酸、ベクターもしくは宿主細胞、または免疫複合体もしくは免疫融合体を含有する医薬組成物が提供される。本発明により提供される抗ＣＤ４７抗体、または抗原結合断片、核酸、ベクター、またはその宿主細胞、または免疫複合体、または免疫融合体、またはそれらの医薬組成物は、輸送、送達、耐性等を改善するために、同時投与の調製物において適切な薬学的担体、賦形剤およびその他の試薬と統合され得る。
【0142】
本明細書に記載される抗ＣＤ４７抗体を含む医薬調製物／製剤は、所望の純度を有する本発明の抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片と１種以上の任意の薬学的賦形剤とを混合することにより、好ましくは水溶液または凍結乾燥製剤の形態で調製される。例示的な凍結乾燥抗体調製物／製剤は、米国特許第６，２６７，９５８号に記載されている。水性抗体調製物／製剤は、米国特許第６，１７１，５８６号およびＷＯ２００６／０４４９０８に記載されているものを含み、後者の調製物／製剤はヒスチジン酢酸緩衝剤を含む。
【0143】
本発明の医薬組成物または調製物／製剤はまた、特定の疾患の治療に必要な１種以上の他の有効成分、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない補完的な活性を有する有効成分を含有してもよい。例えば、他の治療剤も含まれることが望ましい。いくつかの実施形態において、他の治療剤は、化学療法剤、放射線治療剤、サイトカイン、ワクチン、他の抗体、免疫調節剤、または他の生体高分子薬である。
【0144】
いくつかの実施形態において、本発明の医薬組成物はまた、抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸を含有してもよい。
【0145】
方法および用途
一つの態様において、本発明によれば、対象におけるＣＤ４７関連疾患を予防、診断または治療する方法が提供される。この方法は、それを必要とする患者に、本明細書に記載される抗ＣＤ４７抗体もしくはその抗原結合断片、または免疫複合体もしくは免疫融合体またはそれらを含む医薬組成物、または本明細書に記載される核酸、ベクターもしくは宿主細胞の有効量を投与することを含む。
一つの態様において、本発明によれば、対象におけるＣＤ４７関連疾患を予防、診断または治療する方法が提供される。この方法は、それを必要とする患者に、本明細書に記載される抗ＣＤ４７抗体もしくはその抗原結合断片、または免疫複合体もしくは免疫融合体またはそれらを含む医薬組成物、または本明細書に記載される核酸、ベクターもしくは宿主細胞の有効量を投与することを含む。
【0146】
一つの態様において、本発明によれば、対象におけるＣＤ４７関連疾患の予防、診断または治療のための薬剤の製造または調製における抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片の使用が提供される。
【0147】
一つの態様において、本発明により提供される抗ＣＤ４７抗体およびその抗原結合断片、ならびにそれを含有する医薬組成物は、対象におけるＣＤ４７関連疾患を予防または治療するための治療剤として用いることができる。標準的な方法を用いて同定される対象におけるＣＤ４７関連疾患については、抗ＣＤ４７抗体およびその抗原結合断片、ならびにそれを含む本発明で開示される医薬組成物または免疫複合体もしくは免疫融合体、または核酸、ベクターまたは宿主細胞を投与することができる。
【0148】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法および使用は、少なくとも１種の追加の治療剤または治療様式の有効量を個体に投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、治療剤は、例えば、化学療法剤、放射線治療剤、サイトカイン、ワクチン、他の抗体、免疫調節剤、または他の生体高分子薬である。いくつかの実施形態において、治療モードには手術；および放射線療法、局所照射または焦点照射等が含まれる。
【0149】
上述した併用療法には、（２種以上の治療剤が同一のまたは別個の調製物／製剤中に含有される）組み合わせ投与、および個別投与が含まれ、本発明の抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片の投与は、追加の治療剤および／またはアジュバントおよび／または治療よりも前、それと同時、またはそれの後に行うことができる。
【0150】
いくつかの実施形態において、本発明のＣＤ４７関連疾患は、対象における異常なＣＤ４７発現、活性および／またはシグナル伝達に関連する疾患を指し、限定されないが、癌を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ４７関連疾患において、ＣＤ４７をコードする核酸の（レベルまたは含有量）が増大するか、またはＣＤ４７の発現が増大するか、またはＣＤ４７タンパク質のレベルが増大するかもしくは活性が増大するか、または活性シグナル伝達が増大する。
【0151】
いくつかの実施形態において、疾患の治療は、核酸またはタンパク質レベルでのＣＤ４７の阻害により利益を得るか、またはＣＤ４７とそのリガンドとの結合またはＣＤ４７媒介シグナル伝達の遮断により利益を得る。
【0152】
いくつかの実施形態において、対象は、哺乳動物、例えば霊長類、好ましくは高等霊長類、例えばヒト（例えば、本明細書に記載される疾患に罹患している個体、または本明細書に記載される疾患に罹患するリスクを有する個体）であり得る。一つの実施形態において、対象は、本明細書に記載される疾患（例えば、癌）に罹患しているか、または罹患するリスクを有する。特定の実施形態において、対象は、化学療法および／または放射線療法等の他の治療を受けているか、または受けたことがある。
【0153】
いくつかの実施形態において、癌には、様々な血液癌および固形腫瘍、ならびに転移病変が含まれる。一つの実施形態において、固形腫瘍の例としては、悪性腫瘍が挙げられる。癌は、初期段階、中期段階もしくは後期段階であり得、または転移性癌であり得る。癌は、例えば、膀胱癌、膵臓癌、リンパ腫、白血病、多発性骨髄腫、（悪性）黒色腫、平滑筋腫、平滑筋肉腫、神経膠腫、神経膠芽腫、骨髄腫、子宮内膜癌、腎臓癌、（良性）黒色腫、前立腺癌、甲状腺癌、子宮頸癌、胃癌、肝臓癌である。いくつかの実施形態において、リンパ腫は、バーキットリンパ腫、びまん性大型細胞リンパ腫またはマントル細胞リンパ腫から選択される。いくつかの実施形態において、白血病は前骨髄球性白血病である。
【0154】
本発明の抗体または抗原結合断片は、経口投与、非経口投与、肺内投与および鼻腔内投与を含む任意の適切な方法で投与することができ、局所治療が必要な場合、病巣内に投与することができる。非経口注入としては、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与または皮下投与が挙げられる。投与は、投与が短期間であるか長期間であるかに部分的に依存して、任意の適切な経路、例えば静脈内注射または皮下注射等の注射によって行うことができる。本明細書において、限定されないが、様々な時点における単回または複数回の投与、ボーラス投与、およびパルス注入を含む様々な投与レジメンが企図される。
【0155】
本発明の抗体または抗原結合断片は、良好な医療行為と一致する方法で処方および投与される。必ずしも必要ではないが、場合により、抗体は、疾患を予防または治療するために現在用いられている１種以上の薬剤と共に製剤化される。これらの他の薬剤の有効量は、調製物／製剤中に存在する抗体の量、治療される状態または疾患の種類、および上述した他の要因に依存する。抗体が予防または治療の目的であるかどうか、以前の治療、患者の病歴および抗体に対する反応、ならびに主治医の判断に関わらず、疾患を予防または治療するために、本発明の抗体または抗原結合断片は、治療される疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度および経過に応じて適切な用量で投与される。抗体は、一度にまたは一連の治療にわたって患者に適切に投与される。
【0156】
特定の実施形態において、本明細書において提供される任意の抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片を用いて、サンプル中のＣＤ４７の存在を検出することができる。いくつかの実施形態において、検出方法は：
（ａ）サンプルと本発明の抗体もしくはその抗原結合断片、またはコンジュゲート、または融合体とを接触させること；および
（ｂ）上記抗体もしくはその抗原結合断片、またはコンジュゲート、または融合体とＣＤ４７タンパク質との複合体の形成を検出すること
を含む。
（ａ）サンプルと本発明の抗体もしくはその抗原結合断片、またはコンジュゲート、または融合体とを接触させること；および
（ｂ）上記抗体もしくはその抗原結合断片、またはコンジュゲート、または融合体とＣＤ４７タンパク質との複合体の形成を検出すること
を含む。
【0157】
本明細書において用いられる「検出」という用語には、定量的または定性的な検出が含まれる。特定の実施形態において、サンプルは、生物学的起源の血液、血清または他の液体サンプルである。特定の実施形態において、サンプルは細胞または組織を含む。いくつかの実施形態において、サンプルは、過剰増殖性または癌性病巣関連病巣からのものである。
【0158】
一つの実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合断片を用いて、癌等のＣＤ４７関連疾患を診断することができ、例えば、本明細書に記載される疾患の治療または進行を評価（例えば、モニタリング）し、個体におけるその診断および／または病期分類をすることができる。特定の実施形態において、標識された抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片が提供される。標識としては、限定されないが、直接検出される標識または部分（蛍光標識、発色団標識、高電子密度標識、化学発光標識および放射性標識等）、および例えば、酵素反応または分子間相互作用により間接的に検出される酵素またはリガンド等の部分が挙げられる。いくつかの実施形態において、本明細書においてＣＤ４７関連疾患を診断するためのキットが提供され、該キットは本発明の抗体またはその抗原結合断片を含む。
【0159】
本明細書において提供されるいくつかの実施形態において、サンプルは、抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合断片で処理する前に得られる。いくつかの実施形態において、サンプルは、他の療法による治療の前に得られる。いくつかの実施形態において、サンプルは、他の療法による治療中または治療後に得られる。
【0160】
本発明は、本明細書に記載される特定の実施形態の任意の組み合わせを含む。特定の内容および例は、本発明の好ましい実施形態を説明するために記載されているが、これらは単なる例示であり、例として用いられていることを理解されたい。本発明は、当業者に自明である本発明の好ましい実施形態に基づいて変更される実施形態をさらに包含する。すべての目的のために、引用を含め、本明細書に引用されるすべての刊行物、特許および特許出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【0161】
実施例１ ハイブリドーマ由来抗体の作製とスクリーニング
抗ＣＤ４７抗体は、ハイブリドーマ技術によって得られた。Ｆｃタグを有するヒトＣＤ４７の細胞外ドメインを含む組換えタンパク質ＣＤ４７－Ｆｃ（ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、カタログ番号ＣＤ７－Ｈ５２５６）を、マウスを免疫化するための抗原として用いた。組換えタンパク質ＣＤ４７－Ｆｃと完全または不完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）とを混合および乳化した後、ＳＪＬマウス（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）およびＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｙａｎｇｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ）を免疫した。マウスを１回の免疫（完全フロイントアジュバント）および２回の追加免疫（不完全フロイントアジュバント）に供し、各追加免疫後に採血した。免疫後のマウス血清と組換えヒトＣＤ４７－Ｆｃ（ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、カタログ番号ＣＤ７－Ｈ５２５６）タンパク質との結合活性をＥＬＩＳＡアッセイで検出し、同時に、マウス血清とヒトＣＤ４７を過剰発現するＣＨＯ細胞（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔにより構築）との結合能をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により検出した。より高い血清力価を有するマウスの脾臓細胞を選択して、骨髄腫細胞株ＳＰ２／０（ＡＴＣＣ）と融合させた。融合の４日前に、ヒトＣＤ４７細胞外ドメインの組換えタンパク質ＣＤ４７－Ｆｃを追加免疫のためにマウスに腹腔内注射した。融合当日、マウスを安楽死させ、次いで、マウス脾臓細胞をホモジナイズして単一細胞懸濁液を得た。マウス脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞株ＳＰ２／０とを（３：１）、電気融合装置によって融合した。融合細胞をＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンデオキシヌクレオチド、ＧＩＢＣＯ社、カタログ番号２１０６００１６）を含有する培地に再懸濁して、融合に成功したハイブリドーマ細胞をスクリーニングした。ハイブリドーマ細胞の上清を回収し、ヒトＣＤ４７に特異的に結合する抗体を分泌したハイブリドーマ細胞を２回のＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。次いで、ハイブリドーマの分泌上清の活性を、ＣＤ４７関連機能スクリーニング試験（ヒトＣＤ４７またはカニクイザルＣＤ４７との結合特異性；赤血球凝集誘導活性なし；マクロファージによる腫瘍細胞の食作用促進活性等）によりハイブリドーマの存在を確認し、次いで、陽性ハイブリドーマクローンを選択し、単一ラウンドまたは複数ラウンドのサブクローニングを行って単一クローンを得た。スクリーニング後、１２５Ｇ４Ａ４を最終的にハイブリドーマクローンとして選択した。
抗ＣＤ４７抗体は、ハイブリドーマ技術によって得られた。Ｆｃタグを有するヒトＣＤ４７の細胞外ドメインを含む組換えタンパク質ＣＤ４７－Ｆｃ（ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、カタログ番号ＣＤ７－Ｈ５２５６）を、マウスを免疫化するための抗原として用いた。組換えタンパク質ＣＤ４７－Ｆｃと完全または不完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）とを混合および乳化した後、ＳＪＬマウス（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）およびＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｙａｎｇｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ）を免疫した。マウスを１回の免疫（完全フロイントアジュバント）および２回の追加免疫（不完全フロイントアジュバント）に供し、各追加免疫後に採血した。免疫後のマウス血清と組換えヒトＣＤ４７－Ｆｃ（ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、カタログ番号ＣＤ７－Ｈ５２５６）タンパク質との結合活性をＥＬＩＳＡアッセイで検出し、同時に、マウス血清とヒトＣＤ４７を過剰発現するＣＨＯ細胞（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔにより構築）との結合能をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により検出した。より高い血清力価を有するマウスの脾臓細胞を選択して、骨髄腫細胞株ＳＰ２／０（ＡＴＣＣ）と融合させた。融合の４日前に、ヒトＣＤ４７細胞外ドメインの組換えタンパク質ＣＤ４７－Ｆｃを追加免疫のためにマウスに腹腔内注射した。融合当日、マウスを安楽死させ、次いで、マウス脾臓細胞をホモジナイズして単一細胞懸濁液を得た。マウス脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞株ＳＰ２／０とを（３：１）、電気融合装置によって融合した。融合細胞をＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンデオキシヌクレオチド、ＧＩＢＣＯ社、カタログ番号２１０６００１６）を含有する培地に再懸濁して、融合に成功したハイブリドーマ細胞をスクリーニングした。ハイブリドーマ細胞の上清を回収し、ヒトＣＤ４７に特異的に結合する抗体を分泌したハイブリドーマ細胞を２回のＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。次いで、ハイブリドーマの分泌上清の活性を、ＣＤ４７関連機能スクリーニング試験（ヒトＣＤ４７またはカニクイザルＣＤ４７との結合特異性；赤血球凝集誘導活性なし；マクロファージによる腫瘍細胞の食作用促進活性等）によりハイブリドーマの存在を確認し、次いで、陽性ハイブリドーマクローンを選択し、単一ラウンドまたは複数ラウンドのサブクローニングを行って単一クローンを得た。スクリーニング後、１２５Ｇ４Ａ４を最終的にハイブリドーマクローンとして選択した。
【0162】
候補ハイブリドーマ細胞１２５Ｇ４Ａ４を拡大培養し、７～１０日間培養した後、上清を回収し、遠心分離し、濾過して細胞および破片を除去した。上清をＰｒｏｔｅｉｎ Ａ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｃｏｌｕｍｎ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社）に通し、次いで０．０５ＭのＴｒｉｓおよび１．５ＭのＮａＣｌを含有するバッファー（ｐＨ８．０）で洗浄および平衡化し、次いで０．１Ｍのクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．５）で溶出し；溶出液を直ちに１／９容量の１ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９）で中和し、次いでＰＢＳ緩衝液で透析した。最終的にハイブリドーマ由来抗体１２５Ｇ４Ａ４が得られ、さらなる特性化を行った
【0163】
１．１ ヒトＣＤ４７タンパク質を過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞に対する抗体の結合活性のＦＡＣＳによる検出
ヒトＣＤ４７タンパク質（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＰ＿００１７６８．１）をハムスター卵巣細胞株ＣＨＯ－Ｋ１中で過剰発現させ、ヒトＣＤ４７タンパク質を過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞株を樹立した。細胞を、段階希釈した抗体１２５Ｇ４Ａ４および参照抗体Ｃ０７７４ＣＫ２３０－Ｃ（すなわち、Ｈｕ５Ｆ９）（最大濃度３００ｎＭ、３倍希釈、全部で１２の濃度点）と共に４℃で５０分間インキュベートした。氷冷ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞をｉＦｌｕｏｒ６４７標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社）と共に４℃の暗所で４０分間インキュベートした。細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、次いでＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）フローサイトメトリーにより蛍光シグナルを検出し、シグナルの平均蛍光強度（ＭＦＩ）に従って、ＧｒａｐｈＰａｄを用いて濃度依存曲線をフィッティングし、ＥＣ５０を計算した。表１に示すように、最終的に得られたハイブリドーマ由来抗体１２５Ｇ４Ａ４は、ヒトＣＤ４７タンパク質を過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１に対する高い結合活性を有し、ＥＣ５０は０．２２ｎＭであった。
ヒトＣＤ４７タンパク質（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＰ＿００１７６８．１）をハムスター卵巣細胞株ＣＨＯ－Ｋ１中で過剰発現させ、ヒトＣＤ４７タンパク質を過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞株を樹立した。細胞を、段階希釈した抗体１２５Ｇ４Ａ４および参照抗体Ｃ０７７４ＣＫ２３０－Ｃ（すなわち、Ｈｕ５Ｆ９）（最大濃度３００ｎＭ、３倍希釈、全部で１２の濃度点）と共に４℃で５０分間インキュベートした。氷冷ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞をｉＦｌｕｏｒ６４７標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社）と共に４℃の暗所で４０分間インキュベートした。細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、次いでＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）フローサイトメトリーにより蛍光シグナルを検出し、シグナルの平均蛍光強度（ＭＦＩ）に従って、ＧｒａｐｈＰａｄを用いて濃度依存曲線をフィッティングし、ＥＣ５０を計算した。表１に示すように、最終的に得られたハイブリドーマ由来抗体１２５Ｇ４Ａ４は、ヒトＣＤ４７タンパク質を過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１に対する高い結合活性を有し、ＥＣ５０は０．２２ｎＭであった。
【0164】
１．２ 腫瘍細胞表面におけるＣＤ４７に対する抗体の結合活性のＦＡＣＳによる検出
ヒトＣＤ４７は、ヒトバーキットリンパ腫細胞株Ｒａｊｉの細胞表面に内在的に発現していた。抗体１２５Ｇ４Ａ４および参照抗体Ｈｕ５Ｆ９を、２％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ社、カタログ番号１０１００１４７）を含有するＰＢＳで段階希釈した（最大濃度４６．３ｎＭ、３倍希釈、全部で８の濃度点）。希釈した抗体をＲａｊｉ細胞（ＡＴＣＣから購入）と混合し（５×１０５細胞／ウェル）、４℃で１時間共培養した。２％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するＰＢＳで３回洗浄した後、ＰＥ標識マウス抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、カタログ番号４０９３０４）を添加し、４℃の暗所で１時間インキュベートした。細胞を２％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するＰＢＳで３回洗浄し、次いで蛍光シグナルをＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）フローサイトメトリーで検出し、シグナルの平均蛍光強度（ＭＦＩ）に従って、ＧｒａｐｈＰａｄを用いて濃度依存曲線をフィッティングし、ＥＣ５０を計算した。表１に示すように、ハイブリドーマ由来抗体１２５Ｇ４Ａ４は、０．８４±０．０２ｎＭのＥＣ５０でＲａｊｉ細胞に対する結合活性を有していた。
ヒトＣＤ４７は、ヒトバーキットリンパ腫細胞株Ｒａｊｉの細胞表面に内在的に発現していた。抗体１２５Ｇ４Ａ４および参照抗体Ｈｕ５Ｆ９を、２％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ社、カタログ番号１０１００１４７）を含有するＰＢＳで段階希釈した（最大濃度４６．３ｎＭ、３倍希釈、全部で８の濃度点）。希釈した抗体をＲａｊｉ細胞（ＡＴＣＣから購入）と混合し（５×１０５細胞／ウェル）、４℃で１時間共培養した。２％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するＰＢＳで３回洗浄した後、ＰＥ標識マウス抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、カタログ番号４０９３０４）を添加し、４℃の暗所で１時間インキュベートした。細胞を２％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するＰＢＳで３回洗浄し、次いで蛍光シグナルをＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）フローサイトメトリーで検出し、シグナルの平均蛍光強度（ＭＦＩ）に従って、ＧｒａｐｈＰａｄを用いて濃度依存曲線をフィッティングし、ＥＣ５０を計算した。表１に示すように、ハイブリドーマ由来抗体１２５Ｇ４Ａ４は、０．８４±０．０２ｎＭのＥＣ５０でＲａｊｉ細胞に対する結合活性を有していた。
【0165】
１．３ 抗ＣＤ４７抗体によるヒトＣＤ４７とＳＩＲＰαとの相互作用の遮断
１２５Ｇ４Ａ４がヒトＣＤ４７とＳＩＲＰαとの間の相互作用を遮断する能力を検出するために、ＥＬＩＳＡアッセイを行った。ヒトＩｇＧ Ｆｃ断片と融合したヒトＣＤ４７の細胞外ドメインを含む組換えタンパク質ｈＣＤ４７－Ｆｃ（ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、カタログ番号ＣＤ７－Ｈ５２５６）を９６ウェルプレートにコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートをＰＢＳＴ（０．５％のＴｗｅｅｎ－２０を含有するＰＢＳ）で３回洗浄した後、１％のＢＳＡを含有するＰＢＳＴを添加してプレートを２時間ブロッキングした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した後、段階希釈した抗体１２５Ｇ４Ａ４または参照抗体Ｈｕ５Ｆ９（最大濃度６６．７ｎＭ、３倍希釈、全部で８の濃度点）を、最終濃度２．５μｇ／ｍｌのＳＩＲＰα－Ｈｉｓ組換えタンパク質（ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、カタログ番号ＳＩＡ－５２２５）と共に添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗Ｈｉｓタグ二次抗体（ＣＷＢＩＯ社、カタログ番号ＣＷ０２８５Ｍ）を添加して、コーティングされたＣＤ４７タンパク質によって捕捉されたＳＩＲＰαを検出した。９６ウェルプレートを３７℃で３０分間インキュベートした後、プレートをＰＢＳＴで５回洗浄し、ＴＭＤ（Ｓｕｒｍｏｄｉｃｓ社、カタログ番号ＴＭＢＷ－１０００－０１）展開液を添加し、暗所で１５分間インキュベートした。２ＮのＨ２ＳＯ４を添加して発色反応を停止させた。マイクロプレートリーダーでＯＤ４５０を読み取った。吸光度の値は、ＣＤ４７に結合したＳＩＲＰαの量を反映していた。Ｇｒａｐｈｐａｄを用いて濃度依存曲線をフィッティングし、ＣＤ４７とＳＩＲＰαとの結合を遮断するための抗ＣＤ４７抗体のＩＣ５０を計算した。表１に示すように、１２５Ｇ４Ａ４は３．０６ｎＭのＩＣ５０でＣＤ４７／ＳＩＲＰα相互作用を効果的に遮断することができた。
１２５Ｇ４Ａ４がヒトＣＤ４７とＳＩＲＰαとの間の相互作用を遮断する能力を検出するために、ＥＬＩＳＡアッセイを行った。ヒトＩｇＧ Ｆｃ断片と融合したヒトＣＤ４７の細胞外ドメインを含む組換えタンパク質ｈＣＤ４７－Ｆｃ（ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、カタログ番号ＣＤ７－Ｈ５２５６）を９６ウェルプレートにコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートをＰＢＳＴ（０．５％のＴｗｅｅｎ－２０を含有するＰＢＳ）で３回洗浄した後、１％のＢＳＡを含有するＰＢＳＴを添加してプレートを２時間ブロッキングした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した後、段階希釈した抗体１２５Ｇ４Ａ４または参照抗体Ｈｕ５Ｆ９（最大濃度６６．７ｎＭ、３倍希釈、全部で８の濃度点）を、最終濃度２．５μｇ／ｍｌのＳＩＲＰα－Ｈｉｓ組換えタンパク質（ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、カタログ番号ＳＩＡ－５２２５）と共に添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗Ｈｉｓタグ二次抗体（ＣＷＢＩＯ社、カタログ番号ＣＷ０２８５Ｍ）を添加して、コーティングされたＣＤ４７タンパク質によって捕捉されたＳＩＲＰαを検出した。９６ウェルプレートを３７℃で３０分間インキュベートした後、プレートをＰＢＳＴで５回洗浄し、ＴＭＤ（Ｓｕｒｍｏｄｉｃｓ社、カタログ番号ＴＭＢＷ－１０００－０１）展開液を添加し、暗所で１５分間インキュベートした。２ＮのＨ２ＳＯ４を添加して発色反応を停止させた。マイクロプレートリーダーでＯＤ４５０を読み取った。吸光度の値は、ＣＤ４７に結合したＳＩＲＰαの量を反映していた。Ｇｒａｐｈｐａｄを用いて濃度依存曲線をフィッティングし、ＣＤ４７とＳＩＲＰαとの結合を遮断するための抗ＣＤ４７抗体のＩＣ５０を計算した。表１に示すように、１２５Ｇ４Ａ４は３．０６ｎＭのＩＣ５０でＣＤ４７／ＳＩＲＰα相互作用を効果的に遮断することができた。
【0166】
１．４ ヒト赤血球凝集の誘導における抗ＣＤ４７抗体の活性の検出
先行技術において、抗ＣＤ４７抗体のほとんどが赤血球凝集を誘導する特性を有することが知られている。この特性は、治療用抗ＣＤ４７抗体による治療に存在する貧血等の臨床的副作用と密接に関連していると広く信じられている。したがって、我々は、本発明における抗ＣＤ４７抗体をｉｎ ｖｉｔｒｏでの赤血球凝集実験により評価し、赤血球凝集を誘導する性質のない抗体をスクリーニングした。方法は以下のとおりである：健康なドナーの新鮮なヒト血液を採取し、細胞をＰＢＳで５回洗浄し、次いで細胞を希釈して１０％のヒト赤血球を含有する懸濁液を作製した；赤血球懸濁液と実験用抗体（抗体１２５Ｇ４Ａ４および参照抗体Ｈｕ５Ｆ９、最大濃度６６７ｎＭ、３倍希釈、全部で１２の濃度点）とを混合し、次いで混合物を丸底９６ウェルプレートに添加した；室温で１６時間インキュベートし、次いで写真を撮り、ウェル内の細胞の現象に従って結果を決定した。赤血球凝集が起こった場合、細胞を網のように各ウェルに播種し、ネガティブコントロールのウェルよりも大きな直径を有するウェルに、より大きなシート状の細胞層が現れたが；一方で、赤血球凝集が起こらなかった場合、赤血球はウェルの底に沈着し、小さな点状の細胞ペレットの沈殿物がウェルに現れた。１２５Ｇ４Ａ４は、実験において赤血球凝集を誘導する明らかな現象を示さなかった。
先行技術において、抗ＣＤ４７抗体のほとんどが赤血球凝集を誘導する特性を有することが知られている。この特性は、治療用抗ＣＤ４７抗体による治療に存在する貧血等の臨床的副作用と密接に関連していると広く信じられている。したがって、我々は、本発明における抗ＣＤ４７抗体をｉｎ ｖｉｔｒｏでの赤血球凝集実験により評価し、赤血球凝集を誘導する性質のない抗体をスクリーニングした。方法は以下のとおりである：健康なドナーの新鮮なヒト血液を採取し、細胞をＰＢＳで５回洗浄し、次いで細胞を希釈して１０％のヒト赤血球を含有する懸濁液を作製した；赤血球懸濁液と実験用抗体（抗体１２５Ｇ４Ａ４および参照抗体Ｈｕ５Ｆ９、最大濃度６６７ｎＭ、３倍希釈、全部で１２の濃度点）とを混合し、次いで混合物を丸底９６ウェルプレートに添加した；室温で１６時間インキュベートし、次いで写真を撮り、ウェル内の細胞の現象に従って結果を決定した。赤血球凝集が起こった場合、細胞を網のように各ウェルに播種し、ネガティブコントロールのウェルよりも大きな直径を有するウェルに、より大きなシート状の細胞層が現れたが；一方で、赤血球凝集が起こらなかった場合、赤血球はウェルの底に沈着し、小さな点状の細胞ペレットの沈殿物がウェルに現れた。１２５Ｇ４Ａ４は、実験において赤血球凝集を誘導する明らかな現象を示さなかった。
【0167】
１．５ ヒトマクロファージによる腫瘍細胞に対する食作用促進への抗ＣＤ４７抗体の効果の測定
マクロファージによる腫瘍細胞の食作用を促進する本発明の抗体１２５Ｇ４Ａ４の能力を、フローサイトメトリーに基づくアッセイによって検出した。ヒト血液を健康なドナーから新たに採取し、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、カタログ番号１７－１４４０－０２）を用いた密度勾配遠心分離によって末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離した。ヒト全単球分離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０－０９６－５３７）を用いて単球をさらに分離して得た。単球のマクロファージへの分化を誘導するために、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、カタログ番号２１６－ＭＣ）を添加し、単球を７日間連続して付着培養に供した。細胞の食作用実験の当日、上述した分化したマクロファージを無血清培地で２時間飢餓状態にした。同時に、標的腫瘍細胞Ｒａｊｉを指示により推奨される手順に従って、ＣＦＳＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、カタログ番号６５－０８５０－８５）により蛍光標識した。ＣＦＳＥで標識した腫瘍細胞とマクロファージとを４：１の比率で混合し、検出濃度の実験抗体を添加して３７℃で２時間インキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次いでトリプシン（Ｇｉｂｃｏ社、カタログ番号２５２０００７２）で消化し；ＡＰＣで標識した抗ＣＤ１４抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、カタログ番号３２５６０８）を添加し、２％のウシ胎児血清を含有するＰＢＳ中で、氷上の暗所で３０分間インキュベートした。細胞を２回洗浄し、フローサイトメトリーで分析した。ＣＤ１４陽性マクロファージ集団におけるＣＦＳＥ陽性細胞のパーセンテージを計算した。表１に示すように、１２５Ｇ４Ａ４は腫瘍細胞上のマクロファージの食細胞機能を効果的に促進することができた。
マクロファージによる腫瘍細胞の食作用を促進する本発明の抗体１２５Ｇ４Ａ４の能力を、フローサイトメトリーに基づくアッセイによって検出した。ヒト血液を健康なドナーから新たに採取し、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、カタログ番号１７－１４４０－０２）を用いた密度勾配遠心分離によって末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離した。ヒト全単球分離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０－０９６－５３７）を用いて単球をさらに分離して得た。単球のマクロファージへの分化を誘導するために、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、カタログ番号２１６－ＭＣ）を添加し、単球を７日間連続して付着培養に供した。細胞の食作用実験の当日、上述した分化したマクロファージを無血清培地で２時間飢餓状態にした。同時に、標的腫瘍細胞Ｒａｊｉを指示により推奨される手順に従って、ＣＦＳＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、カタログ番号６５－０８５０－８５）により蛍光標識した。ＣＦＳＥで標識した腫瘍細胞とマクロファージとを４：１の比率で混合し、検出濃度の実験抗体を添加して３７℃で２時間インキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次いでトリプシン（Ｇｉｂｃｏ社、カタログ番号２５２０００７２）で消化し；ＡＰＣで標識した抗ＣＤ１４抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、カタログ番号３２５６０８）を添加し、２％のウシ胎児血清を含有するＰＢＳ中で、氷上の暗所で３０分間インキュベートした。細胞を２回洗浄し、フローサイトメトリーで分析した。ＣＤ１４陽性マクロファージ集団におけるＣＦＳＥ陽性細胞のパーセンテージを計算した。表１に示すように、１２５Ｇ４Ａ４は腫瘍細胞上のマクロファージの食細胞機能を効果的に促進することができた。
【0168】
【表2】
【0169】
実施例２ ハイブリドーマ由来抗体のヒト化
２．１ ハイブリドーマ由来抗体の可変領域配列の決定
ハイブリドーマシーケンシングの方法に従って、ハイブリドーマクローン１２５Ｇ４Ａ４の細胞を拡大培養し；全ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ（Ａｍｂｉｏ社から購入）で抽出し、抗体特異的プライマー（Ｔａｋａｒａ社、ＰｒｉｍｅｒＳｃｒｉｐｔ １ｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ）でＤＮＡに逆転写し；マウス免疫グロブリンＶ領域をコードする遺伝子断片を抗体特異的プライマーによる増幅に供した。ハイブリドーマ由来抗体の可変領域配列を、シーケンシング分析によって得た。１２５Ｇ４Ａ４抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号１および２に示される通りであり、ヌクレオチド配列はそれぞれ配列番号１９および２０に示される通りであった。
２．１ ハイブリドーマ由来抗体の可変領域配列の決定
ハイブリドーマシーケンシングの方法に従って、ハイブリドーマクローン１２５Ｇ４Ａ４の細胞を拡大培養し；全ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ（Ａｍｂｉｏ社から購入）で抽出し、抗体特異的プライマー（Ｔａｋａｒａ社、ＰｒｉｍｅｒＳｃｒｉｐｔ １ｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ）でＤＮＡに逆転写し；マウス免疫グロブリンＶ領域をコードする遺伝子断片を抗体特異的プライマーによる増幅に供した。ハイブリドーマ由来抗体の可変領域配列を、シーケンシング分析によって得た。１２５Ｇ４Ａ４抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号１および２に示される通りであり、ヌクレオチド配列はそれぞれ配列番号１９および２０に示される通りであった。
【0170】
２．２ キメラ抗体の構築および発現
ＣＤ４７の作用機序に従って、本発明の特定の実施形態において、ヒトＩｇＧ４の定常領域（Ｓ２２８Ｐ）を抗体の重鎖定常領域として用い、ヒトκ軽鎖定常領域鎖を抗体の軽鎖定常領域として用いた。ＩｇＧ４コアヒンジ領域の２２８位のセリンからプロリンへの変異（Ｓ２２８Ｐ）は、コアヒンジ領域のジスルフィド結合接続を強化し、ＩｇＧ４のＦａｂアームの交換を低減し、それによって半分子の形成を大幅に低減することができる。重鎖定常領域および軽鎖定常領域をコードする遺伝子を合成した後、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の遺伝子を、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩによる二重酵素消化によりベクターＰＴＴ５に相同組換えした。正確に配列決定した後、抗体の重鎖と軽鎖とをモル比１．５：１でＨＥＫ２９３細胞に同時トランスフェクトした。１２０時間培養した後、遠心分離により上清を回収し、精製してキメラ抗体を得た。
ＣＤ４７の作用機序に従って、本発明の特定の実施形態において、ヒトＩｇＧ４の定常領域（Ｓ２２８Ｐ）を抗体の重鎖定常領域として用い、ヒトκ軽鎖定常領域鎖を抗体の軽鎖定常領域として用いた。ＩｇＧ４コアヒンジ領域の２２８位のセリンからプロリンへの変異（Ｓ２２８Ｐ）は、コアヒンジ領域のジスルフィド結合接続を強化し、ＩｇＧ４のＦａｂアームの交換を低減し、それによって半分子の形成を大幅に低減することができる。重鎖定常領域および軽鎖定常領域をコードする遺伝子を合成した後、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の遺伝子を、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩによる二重酵素消化によりベクターＰＴＴ５に相同組換えした。正確に配列決定した後、抗体の重鎖と軽鎖とをモル比１．５：１でＨＥＫ２９３細胞に同時トランスフェクトした。１２０時間培養した後、遠心分離により上清を回収し、精製してキメラ抗体を得た。
【0171】
ヒト化の設計の前に、ＣＤＲ領域のいくつかの翻訳後修飾（ＰＴＭ）部位を変異させて、タンパク質のコンフォメーションに影響を与えないようにし、それによってその機能に影響を与えないようにする必要がある。ＰＴＭ分析により、重鎖の１つのＮＳＳグリコシル化部位および軽鎖の１つのＤＧ異性化部位を含む、１２５Ｇ４Ａ４のＣＤＲの２つのＰＴＭ部位を特定した。ＮＳＳグリコシル化部位およびＤＧ異性化部位は、それぞれＱＳＳおよびＥＧに変異した。本実施例で精製して得られた変異キメラ抗体をＣｈ－１２５Ｇ４－ｍ３５と命名した。Ｃｈ－１２５Ｇ４－ｍ３５抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３および４に示される通りである。
【0172】
２．３ キメラ抗体のヒト化設計
ヒト化のためにキメラ抗体１２５Ｇ４Ａ４ｍと最も高い相同性を有するヒト抗体バックボーン配列を選択するために、キメラ抗体１２５Ｇ４Ａ４ｍの可変領域配列をＰＤＢ抗体データベースを用いてＢｌａｓｔアラインメントした。１２５Ｇ４Ａ４ｍの重鎖可変領域は生殖細胞系ＩＧＨＶ１－６９とより高い配列相同性を有し、その軽鎖可変領域はヒト生殖細胞系ＩＧＫＶ１－１６とより高い配列相同性を有していた。次いで、可変領域ＣＤＲのアミノ酸配列およびその正確な境界が、Ｋａｂａｔ割り当てシステムによって定義された。次いで、マウス抗体の可変領域のＣＤＲセグメントをヒト骨格配列に移植して、ヒト化抗体を得た。
ヒト化のためにキメラ抗体１２５Ｇ４Ａ４ｍと最も高い相同性を有するヒト抗体バックボーン配列を選択するために、キメラ抗体１２５Ｇ４Ａ４ｍの可変領域配列をＰＤＢ抗体データベースを用いてＢｌａｓｔアラインメントした。１２５Ｇ４Ａ４ｍの重鎖可変領域は生殖細胞系ＩＧＨＶ１－６９とより高い配列相同性を有し、その軽鎖可変領域はヒト生殖細胞系ＩＧＫＶ１－１６とより高い配列相同性を有していた。次いで、可変領域ＣＤＲのアミノ酸配列およびその正確な境界が、Ｋａｂａｔ割り当てシステムによって定義された。次いで、マウス抗体の可変領域のＣＤＲセグメントをヒト骨格配列に移植して、ヒト化抗体を得た。
【0173】
ヒト化抗体の活性を維持するために、可変領域とその周辺領域のフレームワークアミノ酸配列をコンピューターシミュレーション技術を用いた高分子ドッキング分析により分析し、それらの立体的な結合様式を調査した。静電力、ファンデルワールス力、親水性およびエントロピーを計算することにより、ＣＤ４７と相互作用し、候補抗体遺伝子配列の空間フレームワークを維持する可能性のある主要なアミノ酸個体を分析し、選択されたヒト抗体遺伝子フレームワークに移植した。一方、保存する必要があるフレームワーク領域のアミノ酸位置をマークした。以上の工程を経て、ヒト化抗体が合成された。抗体フレームワーク領域のいくつかの重要な部位を、キメラ抗体Ｃｈ－１２５Ｇ４－ｍ３５の抗体フレームワーク領域配列に復帰変異した。復帰変異の数および配置に応じて、多数の異なるヒト化重鎖可変領域（配列番号５、配列番号６、配列番号７）および軽鎖可変領域（配列番号８、配列番号９、配列番号１０）をそれぞれ設計した（表２を参照されたい）。最終的に決定された本発明のヒト化抗体Ｈｕ－１２５Ｇ４Ａ４－４８を、以下、ＨＭＡ０２ｈ１４－４８と命名した。抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号７および８に示される通りである。
【0174】
【表3】
【0175】
【表4】
【0176】
【表5】
【0177】
２．４ ヒト化抗体の発現
上述した設計されたヒト化重鎖および軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ断片を増幅し、ヒト抗体を発現する定常領域を含むベクターにクローニングして、抗体発現プラスミド（ｐＣＤＮＡ３．４、Ｔｈｅｒｍｏ社から購入、カタログ番号Ａ１４６９７）を構築した。重鎖および軽鎖の発現ベクターをＥｘｐｉｒｅ２９３細胞（Ｔｈｅｒｍｏ社、カタログ番号Ａ１４５２５）に共トランスフェクトした。３７℃で６日間培養した後、上清を回収した。上述した方法に従って、組み換え抗体を、抗体のさらなる特性化のためにＰｒｏｔｅｉｎ Ａ親和性精製によって得た。ヒト化抗体はＩｇＧ４のＳ２２８Ｐ（ＩｇＧ４Ｐ）サブタイプであった。
上述した設計されたヒト化重鎖および軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ断片を増幅し、ヒト抗体を発現する定常領域を含むベクターにクローニングして、抗体発現プラスミド（ｐＣＤＮＡ３．４、Ｔｈｅｒｍｏ社から購入、カタログ番号Ａ１４６９７）を構築した。重鎖および軽鎖の発現ベクターをＥｘｐｉｒｅ２９３細胞（Ｔｈｅｒｍｏ社、カタログ番号Ａ１４５２５）に共トランスフェクトした。３７℃で６日間培養した後、上清を回収した。上述した方法に従って、組み換え抗体を、抗体のさらなる特性化のためにＰｒｏｔｅｉｎ Ａ親和性精製によって得た。ヒト化抗体はＩｇＧ４のＳ２２８Ｐ（ＩｇＧ４Ｐ）サブタイプであった。
【0178】
実施例３ ヒト化抗体のスクリーニング
ヒト化抗体のカニクイザルＢ細胞への結合能、ヒトマクロファージの腫瘍細胞に対する食作用、および赤血球凝集誘導能を検出することにより、活性の高いヒト化抗体をスクリーニングした。
ヒト化抗体のカニクイザルＢ細胞への結合能、ヒトマクロファージの腫瘍細胞に対する食作用、および赤血球凝集誘導能を検出することにより、活性の高いヒト化抗体をスクリーニングした。
【0179】
カニクイザルＢ細胞に対するヒト化抗体の結合能力の検出：フローサイトメトリー法を用いて、カニクイザルＢ細胞の表面上におけるＣＤ４７に対する一連のヒト化１２５Ｇ４Ａ４抗体の結合を検出した。方法は以下の通りである：末Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、カタログ番号１７－１４４０－０２）を用いた密度勾配遠心分離によって、カニクイザルの血液（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｙｉｎｕｏｓｉ Ｂｉｏ－Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から提供された）から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離した。ＰＢＭＣを、２％のウシ胎児血清を含有するＰＢＳ中で、一連のヒト化１２５Ｇ４Ａ４抗体またはアイソタイプコントロール（ＩｇＧ４Ｐ）と共に、４℃で３０分間インキュベートした。次いで、細胞を３回洗浄し、２％のウシ胎児血清を含有するＰＢＳ中で、二次抗体（ＰＥ標識マウス抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、カタログ番号４０９３０４）と共に、４℃の暗所で３０分間インキュベートした。細胞を３回洗浄し、フローサイトメトリーで分析した。Ｂ細胞を、カニクイザルと交差反応性を有する抗ヒトＣＤ２０抗体（Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ４２１（商標）標識抗ヒトＣＤ２０抗体、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、カタログ番号３０２３３０）で標識し、Ｃａｎｔｏ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）のフローサイトメトリーで検出し、その平均蛍光強度（ＭＦＩ）を得た。
【0180】
実施例１．５および１．４に記載される方法に従って、マクロファージの腫瘍細胞に対する食作用および赤血球凝集誘導能をそれぞれ検出した。
【0181】
表５に示すように、一連のヒト化１２５Ｇ４Ａ４抗体は、試験した濃度でカニクイザルＢ細胞に発現したＣＤ４７に結合した。抗体は、マクロファージによる腫瘍細胞Ｒａｊｉの食作用を促進し、そのうちのＨｕ－１２５Ｇ４Ａ４ｍ－４８は３３ｎＭで最も強い食作用率を示した。Ｈｕ－１２５Ｇ４Ａ４ｍ－４８のその他の活性は、キメラ抗体Ｃｈ－１２５Ｇ４ｍ－ｍ３５と同様であった。さらに、復帰突然変異の数は少なかった。したがって、Ｈｕ－１２５Ｇ４Ａ４ｍ－４８をさらなる試験のために選択し、以下、ＨＭＡ０２ｈ１４－４８と命名した。
【0182】
【表6】
【0183】
実施例４ ＨＭＡ０２ｈ１４－４８の腫瘍細胞への結合活性のＦＡＣＳによる測定
ヒトＣＤ４７を、ヒトバーキットリンパ腫細胞株Ｒａｊｉ細胞（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＳＩＢＳ、ＣＣＬ－８６（商標）／ＡＴＣＣ）、ヒトびまん性大細胞型リンパ腫Ｔｏｌｅｄｏ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２６３１（商標））およびヒトマントル細胞リンパ腫ＲＥＣ－１細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－３００４（商標））の表面に内在的に発現する。上述した実施例１．２に記載される検出方法に従って、フローサイトメトリーを用いて、上述した腫瘍細胞株の表面におけるヒト化抗体ＨＭＡ０２ｈ１４－４８のＣＤ４７への結合を検出した。抗体の最大濃度は６６７ｎＭであり、抗体を段階希釈して、全部で８の濃度点で試験した。
ヒトＣＤ４７を、ヒトバーキットリンパ腫細胞株Ｒａｊｉ細胞（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＳＩＢＳ、ＣＣＬ－８６（商標）／ＡＴＣＣ）、ヒトびまん性大細胞型リンパ腫Ｔｏｌｅｄｏ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２６３１（商標））およびヒトマントル細胞リンパ腫ＲＥＣ－１細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－３００４（商標））の表面に内在的に発現する。上述した実施例１．２に記載される検出方法に従って、フローサイトメトリーを用いて、上述した腫瘍細胞株の表面におけるヒト化抗体ＨＭＡ０２ｈ１４－４８のＣＤ４７への結合を検出した。抗体の最大濃度は６６７ｎＭであり、抗体を段階希釈して、全部で８の濃度点で試験した。
【0184】
図１－３に示すように、ＨＭＡ０２ｈ１４－４８およびＨｕ５Ｆ９のいずれも、Ｒａｊｉ、ＴｏｌｅｄｏおよびＲＥＣ－１を含む腫瘍細胞の表面においてＣＤ４７に結合した。ＨＭＡ０２ｈ１４－４８が飽和に達したときの最大蛍光強度はＨｕ５Ｆ９より高く、ＥＣ５０および最大蛍光強度を表６に示す。
【0185】
【表7】
【0186】
本実施例および他の実施例において用いられたネガティブコントロールアイソタイプ抗体（アイソタイプ）は、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｃｈｅｍｐａｒｔｎｅｒ社から購入したヒトＩｇＧ４Ｐあった。
【0187】
実施例５ ヒトＣＤ４７に対する抗体ＨＭＡ０２ｈ１４－４８の結合親和性のＢｉａｃｏｒｅによる決定
Ｂｉａｃｏｒｅを用いて、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を測定することにより結合動力学パラメーターを決定した。この技術を用いて、抗体と抗原の結合（ｋａ）および解離（ｋｄ）の微視的な速度定数を検出した。ｋａおよびｋｄの値に基づいて、抗体と抗原との親和性値を得ることができた。Ｂｉａｃｏｒｅ機器（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００）および試薬は、いずれもＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社から購入した。抗ヒトＦｃ抗体をセンサーチップＣＭ５に固定化した。精製された抗体（ＨＭＡ０２Ｈ１４－４８およびＨｕ５Ｆ９）を移動相バッファー（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．４）で希釈し、抗ヒトＦｃ抗体でコーティングされたＣＭ５チップに流した。次いで、段階希釈したヒトＣＤ４７－Ｈｉｓ（ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、カタログ番号ＣＤ７－Ｈ５２２７）融合タンパク質を検出チップに流して、抗原と抗体との結合を測定し、次いで移動相バッファーをチップに流して、抗体からの抗原の解離を検出した。抗原と抗体との結合および解離のシグナルデータを異なる濃度で収集し、ラングミュアモデルによって１：１ でフィッティングして、抗原と抗体との親和性を計算した。
Ｂｉａｃｏｒｅを用いて、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を測定することにより結合動力学パラメーターを決定した。この技術を用いて、抗体と抗原の結合（ｋａ）および解離（ｋｄ）の微視的な速度定数を検出した。ｋａおよびｋｄの値に基づいて、抗体と抗原との親和性値を得ることができた。Ｂｉａｃｏｒｅ機器（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００）および試薬は、いずれもＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社から購入した。抗ヒトＦｃ抗体をセンサーチップＣＭ５に固定化した。精製された抗体（ＨＭＡ０２Ｈ１４－４８およびＨｕ５Ｆ９）を移動相バッファー（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．４）で希釈し、抗ヒトＦｃ抗体でコーティングされたＣＭ５チップに流した。次いで、段階希釈したヒトＣＤ４７－Ｈｉｓ（ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、カタログ番号ＣＤ７－Ｈ５２２７）融合タンパク質を検出チップに流して、抗原と抗体との結合を測定し、次いで移動相バッファーをチップに流して、抗体からの抗原の解離を検出した。抗原と抗体との結合および解離のシグナルデータを異なる濃度で収集し、ラングミュアモデルによって１：１ でフィッティングして、抗原と抗体との親和性を計算した。
【0188】
表７に示すように、ＨＭＡ０２ｈ１４－４８は、７．７７Ｅ－１０（Ｍ）のＫＤ値の高い親和性でヒトＣＤ４７に結合した。
【0189】
【表8】
【0190】
実施例６ ヒトＣＤ４７とＳＩＲＰαとの間の相互作用の遮断におけるＨＭＡ０２ｈ１４－４８の活性のＥＬＩＳＡによる検出
上述した実施例１．３に記載された方法に従って、ＥＬＩＳＡを用いて、ヒトＣＤ４７とＳＩＲＰαとの間の相互作用を遮断するＨＭＡ０２ｈ１４－４８の能力を検出した。抗体の最大濃度は６７ｎＭであり、抗体を段階希釈し、全部で８の濃度点で試験した。
上述した実施例１．３に記載された方法に従って、ＥＬＩＳＡを用いて、ヒトＣＤ４７とＳＩＲＰαとの間の相互作用を遮断するＨＭＡ０２ｈ１４－４８の能力を検出した。抗体の最大濃度は６７ｎＭであり、抗体を段階希釈し、全部で８の濃度点で試験した。
【0191】
図４に示されるように、本発明の抗体ＨＭＡ０２ｈ１４－４８は、ＩＣ５０＝１．５８ｎＭでヒトＣＤ４７とＳＩＲＰαとの間の相互作用を遮断した。
【0192】
実施例７ ヒトマクロファージによる腫瘍細胞の食作用に対するＨＭＡ０２ｈ１４－４８の効果
実施例１．５に記載される方法に従って、ヒトマクロファージによるヒトバーキットリンパ腫細胞株Ｒａｊｉ細胞、ヒトびまん性大細胞型リンパ腫Ｔｏｌｅｄｏ細胞、ヒトマントル細胞リンパ腫ＲＥＣ－１細胞およびヒト前骨髄球性白血病細胞株ＨＬ－６０の食作用の促進に対するＨＭＡ０２ｈ１４－４８の効果を検出した。抗体の最大濃度は１００μｇ／ｍＬであり、抗体を段階希釈し、全部で８の濃度点で試験した。
実施例１．５に記載される方法に従って、ヒトマクロファージによるヒトバーキットリンパ腫細胞株Ｒａｊｉ細胞、ヒトびまん性大細胞型リンパ腫Ｔｏｌｅｄｏ細胞、ヒトマントル細胞リンパ腫ＲＥＣ－１細胞およびヒト前骨髄球性白血病細胞株ＨＬ－６０の食作用の促進に対するＨＭＡ０２ｈ１４－４８の効果を検出した。抗体の最大濃度は１００μｇ／ｍＬであり、抗体を段階希釈し、全部で８の濃度点で試験した。
【0193】
結果は、参照抗体Ｈｕ５Ｆ９およびＳＲＦ２３１と比較して、ＨＭＡ０２ｈ１４－４８がマクロファージによるヒトバーキットリンパ腫細胞株Ｒａｊｉの食作用を効果的に促進できることを示す。最大の食作用率は３６．５％に達し、０．１～１００μｇ／ｍｌの異なる濃度における食作用率は、Ｈｕ５Ｆ９およびＳＲＦ２３１よりも高かった。ヒトマントル細胞リンパ腫ＲＥＣ－１に対するＨＭＡ０２ｈ１４－４８の最大の食作用率は８４．６％に達し、０．１μｇ／ｍｌの低濃度であっても約７０％の食作用率が維持され、これはＨｕ５Ｆ９およびＳＲＦ２３１よりも大きかった。ＨＭＡ０２ｈ１４－４８は、マクロファージによるＴｏｌｅｄｏ細胞の食作用を促進し、食作用率率は最大９４．２％であった。ＨＭＡ０２ｈ１４－４８は、マクロファージによる腫瘍細胞ＨＬ－６０の食作用を促進することができ、最大の食作用率は６５％に達した。
【0194】
【表9】
【0195】
実施例８ ｉｎ ｖｉｔｒｏでの赤血球凝集の誘導に対するＨＭＡ０２ｈ１４－４８の効果の検出
ヒト赤血球をＰＢＳで１０％に希釈し、丸底９６ウェルプレートに添加したＣＤ４７抗体と共に室温で１６時間インキュベートした。沈殿していない赤血球の存在は、赤血球凝集を証明する証拠である。非凝集赤血球の沈殿によって形成された白い点と比較して、非沈殿赤血球は、ネガティブコントロールアイソタイプ抗体の網状領域よりも大きい網状領域を形成した（図９を参照されたい）。ネガティブコントロールアイソタイプ抗体（アイソタイプ）の結果を、標準的な基準として用いた。
ヒト赤血球をＰＢＳで１０％に希釈し、丸底９６ウェルプレートに添加したＣＤ４７抗体と共に室温で１６時間インキュベートした。沈殿していない赤血球の存在は、赤血球凝集を証明する証拠である。非凝集赤血球の沈殿によって形成された白い点と比較して、非沈殿赤血球は、ネガティブコントロールアイソタイプ抗体の網状領域よりも大きい網状領域を形成した（図９を参照されたい）。ネガティブコントロールアイソタイプ抗体（アイソタイプ）の結果を、標準的な基準として用いた。
【0196】
実施例１．４に記載される方法に従って、抗体ＨＭＡ０２１４－４８が赤血球凝集を誘導するかどうかを調べるために試験を行った。抗体の最大濃度は６６７ｎＭであり、抗体を段階希釈して、全部で１２の濃度点で試験した。
【0197】
図９に示すように、ＣＤ４７抗体Ｈｕ５Ｆ９は、０．９ｎＭ以上の濃度である場合に赤血球凝集を有意に誘導できることが示された。対照的に、本発明の抗体ＨＭＡ０２ｈ１４－４８は、０．００４～６６７ｎＭの異なる濃度においてｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト赤血球の有意な赤血球凝集を誘導しなかった。
【0198】
実施例９ ＨＭＡ０２ｈ１４－４８のヒト赤血球に対する結合活性のＦＡＣＳによる検出
先行技術において、治療用抗ＣＤ４７抗体が臨床的に用いられる場合、貧血等の副作用がしばしば起こることが知られている。一般に、抗ＣＤ４７抗体は赤血球の表面にあるＣＤ４７に結合し、マクロファージによる赤血球の食作用を引き起こすと考えられている。これは、貧血の別の主要な原因である可能性がある。本発明においては、フローサイトメトリーを用いてＨＭＡ０２ｈ１４－４８のヒト赤血球への結合能を検出して、抗体のリスクを評価した。具体的には、健康なドナーからの赤血球を、２％のウシ胎児血清を含有するＰＢＳ中で、希釈したＨＭＡ０２ｈ１４－４８（最大濃度６６７ｎＭ、全部で８の試験濃度点）と共に４℃で３０分間インキュベートした。次いで、細胞を３回洗浄し、２％のウシ胎児血清を含有するＰＢＳ中で、二次抗体（ＰＥ標識マウス抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、カタログ番号４０９３０４）と共に４℃の暗所で３０分間インキュベートした。細胞を、２％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するＰＢＳで３回洗浄し、次いで蛍光シグナルをＣａｎｔｏ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）フローサイトメトリーで検出した。シグナルの平均蛍光強度（ＭＦＩ）に従って、ＧｒａｐｈＰａｄを用いて濃度依存曲線をフィッティングし、ＥＣ５０を計算した。
先行技術において、治療用抗ＣＤ４７抗体が臨床的に用いられる場合、貧血等の副作用がしばしば起こることが知られている。一般に、抗ＣＤ４７抗体は赤血球の表面にあるＣＤ４７に結合し、マクロファージによる赤血球の食作用を引き起こすと考えられている。これは、貧血の別の主要な原因である可能性がある。本発明においては、フローサイトメトリーを用いてＨＭＡ０２ｈ１４－４８のヒト赤血球への結合能を検出して、抗体のリスクを評価した。具体的には、健康なドナーからの赤血球を、２％のウシ胎児血清を含有するＰＢＳ中で、希釈したＨＭＡ０２ｈ１４－４８（最大濃度６６７ｎＭ、全部で８の試験濃度点）と共に４℃で３０分間インキュベートした。次いで、細胞を３回洗浄し、２％のウシ胎児血清を含有するＰＢＳ中で、二次抗体（ＰＥ標識マウス抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、カタログ番号４０９３０４）と共に４℃の暗所で３０分間インキュベートした。細胞を、２％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するＰＢＳで３回洗浄し、次いで蛍光シグナルをＣａｎｔｏ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）フローサイトメトリーで検出した。シグナルの平均蛍光強度（ＭＦＩ）に従って、ＧｒａｐｈＰａｄを用いて濃度依存曲線をフィッティングし、ＥＣ５０を計算した。
【0199】
図１０に示すように、ヒト赤血球の表面においてＣＤ４７に結合したＨＭＡ０２ｈ１４－４８の最大平均蛍光強度は、対照抗体Ｈｕ５Ｆ９よりも低かった。その最大平均蛍光強度とＥＣ５０を表９に示す。
【0200】
【表10】
【0201】
実施例１０ ヒト化抗体ＨＭＡ０２ｈ１４－４８によるＴｏｌｅｄｏ腫瘍増殖の阻害
目的：本発明の抗体の抗腫瘍活性を調査するために、ＮＯＤ－ＳｃｉｄマウスにおいてＴｏｌｅｄｏ皮下腫瘍モデルを確立した。
方法：ヒトびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫細胞Ｔｏｌｅｄｏ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２６３１（商標））を、１０％のウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ １６４０培地で培養した。腫瘍細胞をＲＰＭＩ １６４０に懸濁し、雄ＮＯＤ－Ｓｃｉｄマウス（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｌｉｎｇｃｈａｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）の右側腹部皮下に１×１０７細胞／マウスの用量で移植した。
目的：本発明の抗体の抗腫瘍活性を調査するために、ＮＯＤ－ＳｃｉｄマウスにおいてＴｏｌｅｄｏ皮下腫瘍モデルを確立した。
方法：ヒトびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫細胞Ｔｏｌｅｄｏ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２６３１（商標））を、１０％のウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ １６４０培地で培養した。腫瘍細胞をＲＰＭＩ １６４０に懸濁し、雄ＮＯＤ－Ｓｃｉｄマウス（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｌｉｎｇｃｈａｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）の右側腹部皮下に１×１０７細胞／マウスの用量で移植した。
【0202】
腫瘍細胞の接種の１５日後、マウスを腫瘍体積に応じて無作為に６つの群に分け、Ｈｕ５Ｆ９抗体およびＨＭＡ０２ｈ１４－４８抗体をそれぞれＰＢＳで希釈し、表１０に示すスケジュールに従って１０ｍｇ／ｋｇの用量でマウスに投与した。ネガティブコントロールアイソタイプ抗体（アイソタイプ）ＩｇＧ４Ｐは、Ｓｈａｎｇｈａｉ ＣｈｅｍＰａｒｔｎｅｒ社から購入した。
【0203】
【表11】
【0204】
腫瘍体積（腫瘍体積＝０．５×長径×短径２）およびマウスの体重を定期的に測定した。腫瘍体積および体重の変化を、Ｅｘｃｅｌソフトウェアのスチューデントｔ検定を用いて統計的に分析し、ｐ＜０．０５は有意な統計的差異を示す。投与後の各抗体治療群の腫瘍退縮率を計算した。
【0205】
各治療群における腫瘍退縮率を計算する式は、［（Ｄ０平均腫瘍体積－Ｄｔ平均腫瘍体積）／Ｄ０平均腫瘍体積］×１００％である。
【0206】
マウスの相対体重を計算する式は：（測定当日のマウスの体重／群分け時のマウスの体重）×１００％である。
【0207】
結果：
実験結果を表１１および図１１に示す。
実験結果を表１１および図１１に示す。
【0208】
コントロールアイソタイプ抗体群の腫瘍はよく成長したが、治療用抗体治療群においては、皮下腫瘍の体積が最初の体積と比較して完全に退縮するまで徐々に減少した。Ｈｕ５Ｆ９およびＨＭＡ０２ｈ１４－４８抗体を様々な用量で投与した群では、１１日目に測定した場合、コントロール群のコントロール抗体を投与した場合と比較して、完全な腫瘍退縮効果（退縮率１００％）が達成され、腫瘍体積の減少は統計的に有意であった。投与中止後、動物を６７日目まで観察したが、腫瘍の再増殖の徴候はまだ見られなかった。さらに、ＨＭＡ０２ｈ１４－４８を様々な用量で投与した群の動物の状態は良好であり、２１日目のマウスの体重は、投与前と比較して有意な差はなかった。Ｈｕ５Ｆ９の高用量群の２１日目のマウスの体重は、０日目と比較して約５％減少していたが、最初の体重と比較して統計的な差はなく（ｐ＞０．０５）；しかしながら、Ｈｕ５Ｆ９の低用量群においては体重減少はなく、体重に対するＨｕ５Ｆ９の用量相関効果の可能性が示唆された。
【0209】
上述したデータに基づいて、Ｈｕ５Ｆ９およびＨＭＡ０２ｈ１４－４８の両方による抗体治療が非常に有意な抗腫瘍効果を示した。いずれかの抗体を１０ｍｇ／ｋｇで単回投与することにより腫瘍が完全に退縮し、その期間は長くなった。
【0210】
【表12】
【0211】
実施例１１ ヒト化抗体ＨＭＡ０２ｈ１４－４８によるＲＥＣ－１腫瘍増殖の阻害
目的：本発明の抗体の抗腫瘍活性を調査するために、ＮＯＤ－ＳｃｉｄマウスにおいてＲＥＣ－１皮下腫瘍モデルを確立した。
方法：ヒトマントル細胞リンパ腫細胞ＲＥＣ－１（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－３００４（商標））を、１０％のウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ １６４０培地で培養しました。腫瘍細胞をＲＰＭＩ １６４０に懸濁し、雄ＮＯＤ－Ｓｃｉｄマウス（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｌｉｎｇｃｈａｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）の右側腹部皮下に５×１０６細胞／マウスの用量で移植した。
目的：本発明の抗体の抗腫瘍活性を調査するために、ＮＯＤ－ＳｃｉｄマウスにおいてＲＥＣ－１皮下腫瘍モデルを確立した。
方法：ヒトマントル細胞リンパ腫細胞ＲＥＣ－１（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－３００４（商標））を、１０％のウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ １６４０培地で培養しました。腫瘍細胞をＲＰＭＩ １６４０に懸濁し、雄ＮＯＤ－Ｓｃｉｄマウス（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｌｉｎｇｃｈａｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）の右側腹部皮下に５×１０６細胞／マウスの用量で移植した。
【0212】
腫瘍細胞の接種の１１日後、マウスを腫瘍体積に応じて無作為に５つの群に分け、Ｈｕ５Ｆ９およびＨＭＡ０２ｈ１４－４８抗体をＰＢＳで希釈し、表１２に示すスケジュールに従ってマウスに投与した。抗体Ｈｕ５Ｆ９をＧｅｎＳｃｒｉｐｔにより調製し、抗体ＨＭＡ０２ｈ１４－４８を実施例２の方法に従って調製した。コントロールアイソタイプ抗体（アイソタイプ）ＩｇＧ４ｐは、Ｓｈａｎｇｈａｉ ＣｈｅｍＰａｒｔｎｅｒ社から購入した。
【0213】
【表13】
【0214】
腫瘍体積（腫瘍体積＝０．５×長径×短径２）およびマウスの体重を定期的に測定した。投与後１２日目の抗体治療群の腫瘍阻害率および腫瘍退縮率を計算した。
【0215】
腫瘍阻害率を計算する式は、［（コントロール群の平均腫瘍体積変化－治療群の平均腫瘍体積変化）／コントロール群の平均腫瘍体積変化］×１００％である。腫瘍体積および体重の変化を、Ｅｘｃｅｌソフトウェアのスチューデントｔ検定を用いて統計的に分析し、ｐ＜０．０５は有意な統計的差異を示す。
【0216】
各治療群における腫瘍退縮率を計算する式は、［（Ｄ０平均腫瘍体積－Ｄｔ平均腫瘍体積）／Ｄ０平均腫瘍体積］×１００％である。
【0217】
マウスの相対体重を計算する式は、（測定当日のマウスの体重／群分け時のマウスの体重）×１００％である。
【0218】
結果：
実験結果を表１３および図１２に示す。
実験結果を表１３および図１２に示す。
【0219】
投与１２日後、アイソタイプ群と比較して、３ｍｇ／ｋｇのＨｕ５Ｆ９の単回投与で治療した群の腫瘍増殖阻害率は１６．７％（ｐ＞０．０５）であり；１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇのＨＭＡ０２ｈ１４－４８を単回投与した群の腫瘍増殖阻害率は、それぞれ３．８％（ｐ＞０．０５）、５４．７％（ｐ＜０．０１）および１０７．２％（ｐ＜０．００１）であった。高用量のＨＭＡ０２ｈ１４－４８抗体で治療した群では、１０日目に完全な腫瘍退縮（退縮率１００％）が達成された。さらに、異なる治療群のマウスの相対体重に有意差はなかった。
【0220】
まとめると、ＨＭＡ０２ｈ１４－４８抗体は、ＲＥＣ－１モデルにおいて用量依存的な効果を示し、１０ｍｇ／ｋｇの単回投与により完全な腫瘍退縮が得られた。
【0221】
【表14】
【表15-1】
【表15-2】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【配列表】
【国際調査報告】