特表2023-521797新規の抗菌ペプチドまたはペプチド類似体およびこの用途
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-05-25
(54)【発明の名称】新規の抗菌ペプチドまたはペプチド類似体およびこの用途
(51)【国際特許分類】
C07K 4/00 20060101AFI20230518BHJP
A61K 38/10 20060101ALI20230518BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20230518BHJP
A61K 47/64 20170101ALI20230518BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230518BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20230518BHJP
【ＦＩ】
C07K4/00 ZNA
A61K38/10
A61P31/04
A61K47/64
A61P43/00 121
A61K45/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022561680
(86)(22)【出願日】2021-04-05
(85)【翻訳文提出日】2022-12-06
(86)【国際出願番号】 KR2021004232
(87)【国際公開番号】W WO2021206397
(87)【国際公開日】2021-10-14
(31)【優先権主張番号】10-2020-0042340
(32)【優先日】2020-04-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522395082
【氏名又は名称】キャンプ セラピューティクス インク
(74)【代理人】
【識別番号】100112737
【弁理士】
【氏名又は名称】藤田 考晴
(74)【代理人】
【識別番号】100136168
【弁理士】
【氏名又は名称】川上 美紀
(74)【代理人】
【識別番号】100196117
【弁理士】
【氏名又は名称】河合 利恵
(72)【発明者】
【氏名】ソン－シル ヒュン
(72)【発明者】
【氏名】ユン－ファ チョイ
(72)【発明者】
【氏名】ソル－ア チョー
(72)【発明者】
【氏名】テ－ウ パク
(72)【発明者】
【氏名】ジェ－フン ユ
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076CC32
4C076EE41
4C076EE59
4C084AA01
4C084AA02
4C084AA19
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA18
4C084BA23
4C084CA59
4C084DA42
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZB351
4C084ZB352
4C084ZC751
4H045AA10
4H045BA17
4H045BA55
4H045BA72
4H045EA20
4H045EA29
4H045FA33
(57)【要約】
本発明は新規の抗菌ペプチドまたはペプチド類似体およびこのバクテリア感染治療用途に関し、具体的には、疏水性アミノ酸および親水性アミノ酸で構成されたアルファ螺旋状両親媒性ペプチドが折れた構造を有し、Ｎ－末端に脂肪酸が結合されたペプチドまたはペプチド類似体、バクテリア感染、特にグラム陰性菌による感染の治療用途に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記の化学式１で表示される、ペプチドまたはペプチド類似体：＜化学式１＞
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５
前記化学式１において、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ５、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１２、およびＸ１５はそれぞれ独立的に親水性アミノ酸または非タンパク質構成アミノ酸（ｎｏｎ－ｐｒｏｔｅｉｎｏｇｅｎｉｃ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ）であり、ただし、これらのうち一つ以上はＡｌａまたはＳｅｒであり得、
Ｘ３、Ｘ４、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ１１、Ｘ１３またはＸ１４それぞれ独立的に疏水性アミノ酸またはこれらの混合物であり、
Ｘ１０はＰｒｏであり、
Ｘ１～Ｘ１５のうちいずれか一つの位置でＣ６～Ｃ１６脂肪酸が結合され得、
Ｘ１はＮ－末端であり、Ｘ１５はＣ－末端である。
【請求項2】
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ５、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１２、およびＸ１５はそれぞれ独立的にＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、およびこの誘導体から選択される親水性アミノ酸または２，３－ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、２，４－ジアミノブタン酸（Ｄａｂ）、またはオルニチン（Ｏｒｎ）であり、ただし、これらのうち一つ以上はＡｌａまたはＳｅｒであり得；Ｘ３、Ｘ４、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ１１、Ｘ１３およびＸ１４はそれぞれ独立的にＬｅｕ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒから選択される疏水性アミノ酸またはＨｄｆであり、ここでＨｄｆはＬｅｕ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、およびＰｈｅを同じ量で含むアミノ酸混合物である、請求項１に記載のペプチドまたはペプチド類似体。
【請求項3】
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ５、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１２、およびＸ１５はそれぞれ独立的にＬｙｓ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、または２，４－ジアミノブタン酸（Ｄａｂ）である、請求項２に記載のペプチドまたはペプチド類似体。
【請求項4】
Ｘ３、Ｘ４、Ｘ６、およびＸ７はそれぞれ独立的にＬｅｕ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、またはＨｄｆである、請求項２に記載のペプチドまたはペプチド類似体。
【請求項5】
Ｘ１１、Ｘ１３、およびＸ１４はそれぞれ独立的にＬｅｕまたはＡｌａである、請求項２に記載のペプチドまたはペプチド類似体。
【請求項6】
Ｘ１の位置でＣ６～Ｃ１２脂肪酸が結合されているものである、請求項２に記載のペプチドまたはペプチド類似体。
【請求項7】
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ５、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１２、およびＸ１５はそれぞれ独立的にＬｙｓであり、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ１１、Ｘ１３およびＸ１４はそれぞれ独立的にＬｅｕである、請求項２に記載のペプチドまたはペプチド類似体。
【請求項8】
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ５、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１２、およびＸ１５はそれぞれ独立的にＬｙｓまたはＡｌａであり、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ１１、Ｘ１３およびＸ１４はそれぞれ独立的にＬｅｕ、ＡｌａまたはＶａｌであり、ただし、Ｘ１０を除いたＸ１～Ｘ１５のうち一つ以上はＡｌａまたはＶａｌである、請求項２に記載のペプチドまたはペプチド類似体。
【請求項9】
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ５、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１２、およびＸ１５はそれぞれ独立的にＬｙｓであり、Ｘ３、Ｘ７、およびＸ１１はそれぞれ独立的にＬｅｕ、Ａｌａ、またはＶａｌであり、
Ｘ４、Ｘ６、Ｘ１３、およびＸ１４はそれぞれ独立的にＬｅｕであり、
Ｘ１の位置でＣ６～Ｃ１２脂肪酸が結合されているものである、請求項２に記載のペプチドまたはペプチド類似体。
【請求項10】
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ５、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１２、およびＸ１５はそれぞれ独立的にＤａｂであり、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ６、およびＸ７はそれぞれ独立的にＬｅｕ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、またはＨｄｆであり、このときＸ３、Ｘ４、Ｘ６、およびＸ７のうち二つ以上はそれぞれ独立的にＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、またはＨｄｆであり、
Ｘ１１、Ｘ１３、およびＸ１４はそれぞれ独立的にＬｅｕであり、
Ｘ１の位置でＣ８またはＣ１２脂肪酸が結合されているものである、請求項２に記載のペプチドまたはペプチド類似体。
【請求項11】
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ５、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１２、およびＸ１５はそれぞれ独立的にＤａｂであり、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ６、およびＸ７はそれぞれ独立的にＬｅｕ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、またはＶａｌであり、このときＸ３、Ｘ４、Ｘ６、およびＸ７のうち三つ以上はそれぞれ独立的にＡｌａ、Ｐｈｅ、またはＶａｌであり、
Ｘ１１、Ｘ１３、およびＸ１４はそれぞれ独立的にＬｅｕであり、
Ｘ１の位置でＣ８脂肪酸が結合されているものである、請求項２に記載のペプチドまたはペプチド類似体。
【請求項12】
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ５、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１２、およびＸ１５はそれぞれ独立的にＤａｂまたはＳｅｒであり、このときＸ１、Ｘ２、Ｘ５、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１２、およびＸ１５のうち一つ以上はそれぞれ独立的にＳｅｒであり、Ｘ３およびＸ７はそれぞれ独立的にＡｌａであり、
Ｘ４およびＸ６はそれぞれ独立的にＬｅｕ、ＰｈｅまたはＶａｌであり、
Ｘ１１、Ｘ１３、およびＸ１４はそれぞれ独立的にＬｅｕであり、
Ｘ１の位置でＣ８脂肪酸が結合されているものである、請求項２に記載のペプチドまたはペプチド類似体。
【請求項13】
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ５、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１２、およびＸ１５はそれぞれ独立的にＬｙｓ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、またはＤａｂであり、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ６、およびＸ７はそれぞれ独立的にＬｅｕ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、またはＨｄｆであり、
Ｘ１０はＰｒｏであり、
Ｘ１１、Ｘ１３、およびＸ１４はそれぞれ独立的にＬｅｕまたはＡｌａであり、
Ｘ１の位置でＣ６～Ｃ１２脂肪酸が結合され得るもおである、請求項２に記載のペプチドまたはペプチド類似体。
【請求項14】
配列番号１～６７のうちいずれか一つのアミノ酸配列を含むことを特徴とする、ペプチドまたはペプチド類似体。
【請求項15】
請求項１～請求項１４のいずれか一項に記載されたペプチドまたはペプチド類似体および薬物を含む、抗菌用薬学組成物。
【請求項16】
前記薬学組成物はグラム陰性菌に対する抗菌活性を示すものである、請求項１５に記載の抗菌用薬学組成物。
【請求項17】
前記グラム陰性菌はＥ．ｃｏｌｉ、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、シュードモナス エルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）、シトロバクター・フレウンデー（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）からなる群から選択された一つ以上である、請求項１６に記載の抗菌用薬学組成物。
【請求項18】
前記薬物はエリスロマイシン（Ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ）、ノボビオシン（Ｎｏｖｏｂｉｏｃｉｎ）、フシジン酸（Ｆｕｓｉｄｉｃ ａｃｉｄ）、リファンピシン（Ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ）、リファミキシン（Ｒｉｆａｘｉｍｉｎ）、クロロキシン（Ｃｈｌｏｒｏｘｉｎｅ）、ガチフロキサシン（Ｇａｔｉｆｌｏｘａｃｉｎ）、ロメフロキサシン（Ｌｏｍｅｆｌｏｘａｃｉｎ）、リファブチン（Ｒｉｆａｂｕｔｉｎ）、リファペンチン（Ｒｉｆａｐｅｎｔｉｎｅ）、ダプトマイシン（Ｄａｐｔｏｍｙｃｉｎ）、ナイシン（Ｎｉｓｉｎ）、チゲサイクリン（Ｔｉｇｅｃｙｃｌｉｎｅ）、アズトレオナム（ａｚｔｒｅｏｎａｍ）、セフタジジム（Ｃｅｆｔａｚｉｄｉｍｅ）、ニトロフラントイン（Ｎｉｔｒｏｆｕｒａｎｔｏｉｎ）、クロラムフェニコール（Ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）、フィダキソマイシン（Ｆｉｄａｘｏｍｉｃｉｎ）、レタパムリン（Ｒｅｔａｐａｍｕｌｉｎ）、セフェピム（Ｃｅｆｅｐｉｍｅ）、メシリナム（Ｍｅｃｉｌｌｉｎａｍ）、メロペネム（Ｍｅｒｏｐｅｎｅｍ）、バンコマイシン（Ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ）、クラリスロマイシン（Ｃｌａｒｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ）、ホスホマイシン（Ｆｏｓｆｏｍｙｃｉｎ）、ラモプラニン（Ｒａｍｏｐｌａｎｉｎ）、シプロフロキサシン（Ｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ）、ゲンタマイシン（Ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ）、トブラマイシン（Ｔｏｂｒａｍｙｃｉｎ）、リネゾリド（Ｌｉｎｅｚｏｌｉｄ）、テリスロマイシン（Ｔｅｌｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ）、レボフロキサシン（Ｌｅｖｏｆｌｏｘａｃｉｎ）、トリメトプリム（Ｔｒｉｍｅｔｈｏｐｒｉｍ）、クリンダマイシン（Ｃｌｉｎｄａｍｙｃｉｎ）、ナリジクス酸（Ｎａｌｉｄｉｘｉｃ ａｃｉｄ）、アジスロマイシン（Ａｚｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ）、ムピロシン（Ｍｕｐｉｒｏｃｉｎ）、ダプトマイシン（ｄａｐｔｏｍｙｃｉｎ）、リネゾリド（Ｌｉｎｅｚｏｌｉｄ ）、ニトロフラントイン（Ｎｉｔｒｏｆｕｒａｎｔｏｉｎ）、フィダキソマイシン（Ｆｉｄａｘｏｍｉｃｉｎ）、アズトレオナム（Ａｚｔｒｅｏｎａｍ）、レタパムリン（Ｒｅｔａｐａｍｕｌｉｎ）、トブラマイシン（Ｔｏｂｒａｍｙｃｉｎ）、テジゾリド（Ｔｅｄｉｚｏｌｉｄ）、アルバマイシン（Ａｌｂａｍｙｃｉｎ）、オーラノフィン（Ａｕｒａｎｏｆｉｎ）、カピトロール（Ｃａｐｉｔｒｏｌ）、トリクロサン（Ｔｒｉｃｌｏｓａｎ）、ブトコナゾール（Ｂｕｔｏｃｏｎａｚｏｌｅ）、ミコナゾール（Ｍｉｃｏｎａｚｏｌｅ）、クリオキノール（Ｃｌｉｏｑｕｉｎｏｌ）、ラパチニブ（Ｌａｐａｔｉｎｉｂ）、ソラフェニブ（Ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）、ブレオマイシン（Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、キネストロール（Ｑｕｉｎｅｓｔｒｏｌ）、アズトレオナム（Ａｚｔｒｅｏｎａｍ）またはコリスチン（Ｃｏｌｉｓｔｉｎ）である、請求項１７に記載の抗菌用薬学組成物。
【請求項19】
前記ペプチドまたはペプチド類似体および薬物は、一つの製剤で同時に投与されるか、または別個の製剤で同時にまたは順次投与されるものである、請求項１５に記載の抗菌用薬学組成物。
【請求項20】
請求項１～請求項１４のいずれか一項に記載されたペプチドまたはペプチド類似体に薬物が連結された接合体。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は新規の抗菌ペプチドまたはペプチド類似体およびこのバクテリア感染治療用途または抗菌用途に関し、具体的には、疏水性アミノ酸および親水性アミノ酸で構成されたアルファ螺旋状両親媒性ペプチドが折れた構造を有し、Ｎ－末端に脂肪酸が結合されたペプチドまたはペプチド類似体、バクテリア感染、特にグラム陰性菌による感染の治療用途に関する。
【背景技術】
【0002】
グラム陽性菌に対する治療剤は非常に多く存在するのに反して、グラム陰性菌に対する治療剤はない状況である。これは抗生剤の候補物質がグラム陰性菌が構築した外膜を通過できないためであると知られている。
【0003】
グラム陰性菌でＬＰＳ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）層で始まった外膜はＬＰＳ層によって親水性および疏水性をすべて保有しているため、ほとんどの低分子薬物は膜を自由自在に通過することができない。グラム陽性菌にはよく聞きながらもグラム陰性菌には聞かない抗生剤の大部分が外膜を通過できないと知られている。代表的な薬物として、リネゾリドおよびクロキサシリンなどがある。
【0004】
抗菌ペプチドまたは膜活性ペプチド存在下でグラム陽性菌用抗菌剤、または既存にＦＤＡ許可を得た薬物をグラム陰性菌用抗菌剤として使おうとする努力が試みられてきた。
【0005】
グラム陰性菌を治療しようとする多くの試みのうち抗菌ペプチドが既存の抗菌剤の代用として提示され得る。これらは免疫体系の産物であってその種類も多様であり、菌膜を破壊させることによって菌を死滅させることができる。しかし、このような抗菌ペプチドの膜破壊能により、意図した菌死滅効果だけでなく宿主細胞に対する毒性が現れることになるので、宿主細胞に対する毒性を減らすためには膜破壊能を除去する必要がある。
【0006】
「ＫＬＬＫＬＬＫＫＰＬＫＬＬＫ」の総数１４個のアミノ酸からなるＫＬ－Ｌ９Ｐの膜活性ペプチド（「Ｌ９Ｐ」ともいう）が公知になっている（特許文献１）。膜破壊能はアルファ螺旋度に比例するため、折れたプロリン構造を有する両親媒性ペプチドは宿主細胞に対する毒性が軽減されることが期待された。実際に特許文献１で開発されたＬ９Ｐは宿主細胞に対する毒性が低いながらも、大腸菌に対しては弱い効能を有した膜再編ペプチドであることが明かされた。すなわち、上記ペプチドが存在する時、従来グラム陰性菌のＬＰＳ層に留まりながら、膜透過が不可能であるためグラム陰性菌に対して有効な治療効果を示すことができなかった薬物、すなわち、疏水性グラム陽性菌用抗菌剤または非抗菌剤薬物を感応させることによってグラム陰性菌を殺すことができるようになった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【特許文献1】韓国登録特許第１８１１４３７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
ただし、該当ペプチドを利用して効果的にグラム陰性菌を殺すためには４μｇ／ｍｌ（２．３μＭ）以上の高濃度が必要であり、実際に人体に投与するためには６００ｍｇという多くの量が必要である。これは普通人体に投与される薬物の容量と比較して５～１０倍多い量である。したがって、これらを実際に薬物として開発するためには投与量の減少等が要求される。
【0009】
また、菌を再編する能力を有するためには２０μｇ／ｍＬの比較的多量のペプチドが必要であり、これを使って感応する疏水性抗菌剤の種類も制限的である。また、グラム陰性菌のうちＥ．ｃｏｌｉやＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉの菌膜はよく再編する反面、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅまたはＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの菌膜はあまり再編させることができない傾向を有している。
【0010】
このような技術的背景下で、本出願発明者らは宿主細胞の毒性を減少させるとともに、感応効果を増進させ得るペプチドまたはペプチド類似体を開発したし、この用途を確認して本発明を完成した。
【0011】
本発明は、疏水性アミノ酸および親水性アミノ酸で構成されたアルファ螺旋状両親媒性ペプチドが折れた構造を有し、Ｎ－末端に脂肪酸が結合され得るペプチドまたはペプチド類似体を提供することを目的とする。
【0012】
本発明はまた、前記ペプチドまたはペプチド類似体を使って、特にグラム陰性菌の感染に関連した疾病を治療することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0013】
本発明は化学式１で表示されるペプチドまたはペプチド類似体を提供する：
【0014】
＜化学式１＞
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５
【0015】
上記式において、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ５、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１２、およびＸ１５はそれぞれ独立的に親水性アミノ酸または非タンパク質構成アミノ酸（ｎｏｎ－ｐｒｏｔｅｉｎｏｇｅｎｉｃ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ）であり、ただし、これらのうち一つ以上はＡｌａまたはＳｅｒであり得、
Ｘ３、Ｘ４、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ１１、Ｘ１３またはＸ１４はそれぞれ独立的に疏水性アミノ酸またはこれらの混合物であり、
Ｘ１０はＰｒｏであり、
Ｘ１～Ｘ１５のうちいずれか一つの位置でＣ６～Ｃ１６脂肪酸が結合され得、
Ｘ１はＮ－末端であり、Ｘ１５はＣ－末端である。
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ５、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１２、およびＸ１５はそれぞれ独立的に親水性アミノ酸または非タンパク質構成アミノ酸（ｎｏｎ－ｐｒｏｔｅｉｎｏｇｅｎｉｃ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ）であり、ただし、これらのうち一つ以上はＡｌａまたはＳｅｒであり得、
Ｘ３、Ｘ４、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ１１、Ｘ１３またはＸ１４はそれぞれ独立的に疏水性アミノ酸またはこれらの混合物であり、
Ｘ１０はＰｒｏであり、
Ｘ１～Ｘ１５のうちいずれか一つの位置でＣ６～Ｃ１６脂肪酸が結合され得、
Ｘ１はＮ－末端であり、Ｘ１５はＣ－末端である。
【0016】
本発明はまた、上記ペプチドまたはペプチド類似体；および薬物を含むバクテリア感染治療用または抗菌用薬学組成物を提供する。
【0017】
本発明はまた、上記ペプチドまたはペプチド類似体に薬物が連結された接合体を提供する。
【発明の効果】
【0018】
本発明の新規のペプチドは特異的にグラム陰性菌の外膜にのみ作用して膜を緩めることができるため、既存の抗菌剤に対する優秀な感応効果を示す。既存の抗菌剤はグラム陰性菌の外膜の硬直度のため膜を通過することができないため、グラム陰性菌に対して抗菌活性を示すことができなかったのであるが、本発明のペプチドと併用投与時、外膜を緩めることができるため、既存の抗菌剤がグラム陰性菌の外膜を通過してグラム陰性菌に対して抗菌活性を示す。特に本発明のペプチドは、既存に知られている感応性抗菌ペプチド（ＡＭＰ）に比べて低い濃度でも優秀な感応効果を示すため低濃度でもペプチドの感応能力が最大化され得、副作用も減らすことができ、かつ耐性菌の出現も遅らせ得る長所がある。
【0019】
毒性の側面においても、本発明のペプチドはグラム陰性菌特異的膜活性を示し、グラム陰性菌外膜の表面にあるＬＰＳ層と結合できる性質を有して外膜にのみ留まるだけであり、グラム陰性菌の外膜または内膜を崩壊しない効果を示す。
【0020】
また、本発明のペプチドを通じて、グラム陰性菌の外膜内に通過して抗菌剤として作用するかを正確にスクリーニングできるため、これを使って新規の抗菌剤の探索も可能である。
【図面の簡単な説明】
【0021】
【図1A】ペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図2A】ペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図3A】ペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図4A】ペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図5A】Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ ２５９２２で各種の再配置抗菌剤に対するＬ９Ｐ（ＣＭＰ１１０７）と本発明のペプチド（ＣＭＰ１４０１）の感応効果を比較したグラフである。
【図5B】Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ ２５９２２で各種の再配置抗菌剤に対する競争薬物ＳＰＲ７４１と本発明のペプチド（ＣＭＰ１４０１）の感応効果を比較したグラフである。
【図5C】Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ ２５９２２で各種の再配置抗菌剤に対する競争薬物ＳＰＲ７４１ＳＰＲ７４１と本発明のペプチド（ＣＭＰ１４０１、ＣＭＰ１５０１）の感応効果を比較したグラフである。
【図6】Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ臨床菌株でＲｉｆａｍｐｉｃｉｎ、Ｃｏｌｉｓｔｉｎ、Ｃｌａｒｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ、Ｔｅｄｉｚｏｌｉｄ、Ｌｉｎｅｚｏｌｉｄ単独およびＣＭＰ１４０１と併用で使った時のＭＩＣ５０、ＭＩＣ９０実験結果を示す。
【図7A】ペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図7C】ペプチドのアミノ酸配列およびこれらのＥ．Ｃｏｌｉ．ＡＴＣＣ ２５９２２でＬｉｎｅｚｏｌｉｄの感応効果を示す。
【図8A】ペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図9A】（ａ）グラム陰性菌株Ｅ．ｃ．ＡＴＣＣ ２５９２２でＲｉｆａｍｐｉｃｉｎに対するＬ９Ｐ（ＣＭＰ１１０７）、ＣＭＰ１４０１、ＣＭＰ１７０９の感応効果を比較したグラフを示す。表示された数字は４μｇ／ｍｌのペプチド濃度で減少したＲｉｆａｍｐｉｃｉｎのＭＩＣ値を意味する（下記の表Ａ参照。以下、図９Ｂから９Ｇまで同様）。
【表1】
【図9B】（ｂ）グラム陰性菌株Ａ．ｂ．ＡＴＣＣ １７９７８でＲｉｆａｍｐｉｃｉｎに対するＬ９Ｐ（ＣＭＰ１１０７）、ＣＭＰ１４０１、ＣＭＰ１７０９の感応効果を比較したグラフを示す。
【図9C】（ｃ）グラム陰性菌株Ｋ．ｐ．ＡＴＣＣ ７００６０３でＲｉｆａｍｐｉｃｉｎに対するＬ９Ｐ（ＣＭＰ１１０７）、ＣＭＰ１４０１、ＣＭＰ１７０９の感応効果を比較したグラフを示す。
【図9D】（ｄ）グラム陰性菌株Ｐ．ａ．ＡＴＣＣ ２７８５３でＲｉｆａｍｐｉｃｉｎに対するＬ９Ｐ（ＣＭＰ１１０７）、ＣＭＰ１４０１、ＣＭＰ１７０９の感応効果を比較したグラフを示す。
【図9E】（ｅ）Ｃａｒｂａｐｅｎｅｍ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ（ＣＲＥ）（Ｅ．ｃ．ＮＤＭ－１）でＲｉｆａｍｐｉｃｉｎに対するＬ９Ｐ（ＣＭＰ１１０７）、ＣＭＰ１４０１、ＣＭＰ１７０９の感応効果を比較したグラフを示す。
【図9F】（ｆ）ＣＲＥ（Ｋ．ｐ．ＮＤＭ－１）でＲｉｆａｍｐｉｃｉｎに対するＬ９Ｐ（ＣＭＰ１１０７）、ＣＭＰ１４０１、ＣＭＰ１７０９の感応効果を比較したグラフを示す。
【図9G】（ｇ）ＣＲＥ（Ｋ．ｐ．ＫＰＣ）でＲｉｆａｍｐｉｃｉｎに対するＬ９Ｐ（ＣＭＰ１１０７）、ＣＭＰ１４０１、ＣＭＰ１７０９の感応効果を比較したグラフを示す。
【図10A】（ａ）グラム陰性菌株Ｅ．ｃ．ＡＴＣＣ ２５９２２でＣｏｌｉｓｔｉｎに対するＬ９Ｐ（ＣＭＰ１１０７）、ＣＭＰ１４０１、ＣＭＰ１７０９の感応効果を比較したグラフを示す。表示された数字は４μｇ／ｍｌのペプチド濃度で減少したＣｏｌｉｓｔｉｎのＭＩＣ値を意味する（下記の表Ｂ参照。以下、図１０Ｂ，図１０Ｃで同様）。
【表2】
【図10B】（ｂ）グラム陰性菌株Ｐ．ａ．ＡＴＣＣ ２７８５３でＣｏｌｉｓｔｉｎに対するＬ９Ｐ（ＣＭＰ１１０７）、ＣＭＰ１４０１、ＣＭＰ１７０９の感応効果を比較したグラフを示す。
【図10C】（ｃ）グラム陰性菌株Ｋ．ｐ．ＫＰＣ（ＣＲＥ）でＣｏｌｉｓｔｉｎに対するＬ９Ｐ（ＣＭＰ１１０７）、ＣＭＰ１４０１、ＣＭＰ１７０９の感応効果を比較したグラフを示す。
【図11】Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ、Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉ、Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ臨床菌株でＲｉｆａｍｐｉｃｉｎ単独およびＣＭＰ１７０９と併用で使った時のＭＩＣ５０、ＭＩＣ９０実験結果を示す。
【図12A】Ｌ９Ｐ（ＣＭＰ１１０７）、ＣＭＰ１４０１、ＣＭＰ１４０７に対するＥｎｚｙｍｅ ａｓｓａｙ結果を示す。Ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅには、Ｅ．ｃｏｌｉ ＮＤＭ－１、Ｅｎｚｙｍｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅでＣＥＮＴＡを使った。
【図12B】Ｌ９Ｐ（ＣＭＰ１１０７）、ＣＭＰ１４０１、ＣＭＰ１４０７に対するＥｎｚｙｍｅ ａｓｓａｙ結果を示す。Ｉｎｎｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅに使われたには、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ ２５９２２、Ｅｎｚｙｍｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅとしてＯＮＰＧを使った。
【図13A】本発明のペプチドのｈＲＢＣｓに対するＨｅｍｏｌｙｓｉｓ ａｓｓａｙ結果を示す。ＭＥＬＩＴＴＩＮとＣＭＰ１４０７を除いた残りのグラフはｈｅｍｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙが非常に低いためグラフがほぼ重なっている。
【図13B】本発明のペプチドのｈＲＢＣｓに対するＨｅｍｏｌｙｓｉｓ ａｓｓａｙ結果を示す。図１３Ａにおけるｈｅｍｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙの０～１０％部分のみを拡大した図である。ＭＥＬＩＴＴＩＮ、ＣＭＰ１４０７、ＣＭＰ１４０６、ＣＭＰ１４０９、ＣＭＰ１２０３を除いた残りのグラフは０に近くほぼ重なっている。
【図14A】ＨｅＬａ ｃｅｌｌに対する本発明のペプチドのＷＳＴ－１ ａｓｓａｙ結果を示す。各グラフは２５６μＭのデータを基準として、上からＣＭＰ１２０３、ＣＭＰ１４０１、ＣＭＰ１４０７を示す。
【図14B】ＨＫ－２ ｃｅｌｌに対する本発明のペプチドのＷＳＴ－１ ａｓｓａｙ結果を示す。各グラフは６４μＭのデータを基準として、上からＣｏｌｉｓｔｉｎ、ＣＭＰ１７０９、ＣＭＰ１４０１、ＣＭＰ１５０１を示す。
【図15A】ＣＭＰ１４０１に対するマウス動物モデルでのＩｎ ｖｉｖｏデータであり、生存率分析における、免疫抑制マウスＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ８０１肺炎感染生存モデルでＲｉｆａｍｐｉｃｉｎとＣＭＰ１４０１ペプチドの併用投与効果を示す。
【図15B】ＣＭＰ１４０１に対するマウス動物モデルでのＩｎ ｖｉｖｏデータであり、コロニー数測定における、免疫抑制マウスＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ８０１肺炎感染生存モデルでＲｉｆａｍｐｉｃｉｎとＣＭＰ１４０１ペプチドの併用投与効果を示す。
【図15C】ＣＭＰ１４０１に対するマウス動物モデルでのＩｎ ｖｉｖｏデータであり、免疫抑制マウスＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＡＴＣＣ １７９７８太もも感染モデルでＲｉｆａｍｐｉｃｉｎとＣＭＰ１４０１ペプチドの併用投与効果を示す。
【図16】免疫抑制Ｒａｔ Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ８０１肺炎感染モデルでＣＭＰ１４０１とＲｉｆａｍｐｉｃｉｎの併用投与効果を示す。
【図17】免疫抑制マウスＥ．ｃｏｌｉ ＮＤＭ－１太もも感染モデルでＲｉｆａｍｐｉｃｉｎとＣＭＰ１７０９ペプチドの併用投与効果を示す。
【図18】Ｈｄｆが挿入された第５世代感応ペプチド配列を示す。Ｈｄｆは５種の疏水性アミノ酸Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｖａｌが同一の比率で該当箇所に挿入されていることを意味する。
【発明を実施するための形態】
【0022】
ペプチドまたはペプチド類似体
本発明は化学式１で表示されるペプチドまたはペプチド類似体：
本発明は化学式１で表示されるペプチドまたはペプチド類似体：
【0023】
＜化学式１＞
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５
【0024】
上記式において、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ５、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１２、およびＸ１５はそれぞれ独立的に親水性アミノ酸または非タンパク質構成アミノ酸（ｎｏｎ－ｐｒｏｔｅｉｎｏｇｅｎｉｃ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ）であり、ただし、これらのうち一つ以上はＡｌａまたはＳｅｒであり得、
Ｘ３、Ｘ４、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ１１、Ｘ１３またはＸ１４それぞれ独立的に疏水性アミノ酸またはこれらの混合物であり、
Ｘ１０はＰｒｏであり、
Ｘ１～Ｘ１５のうちいずれか一つの位置でＣ６～Ｃ１６脂肪酸が結合され得、
Ｘ１はＮ－末端であり、Ｘ１５はＣ－末端である。
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ５、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１２、およびＸ１５はそれぞれ独立的に親水性アミノ酸または非タンパク質構成アミノ酸（ｎｏｎ－ｐｒｏｔｅｉｎｏｇｅｎｉｃ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ）であり、ただし、これらのうち一つ以上はＡｌａまたはＳｅｒであり得、
Ｘ３、Ｘ４、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ１１、Ｘ１３またはＸ１４それぞれ独立的に疏水性アミノ酸またはこれらの混合物であり、
Ｘ１０はＰｒｏであり、
Ｘ１～Ｘ１５のうちいずれか一つの位置でＣ６～Ｃ１６脂肪酸が結合され得、
Ｘ１はＮ－末端であり、Ｘ１５はＣ－末端である。
【0025】
具体的には、上記Ｃ６～Ｃ１６脂肪酸は例えばｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ、ｈｅｐｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ、ｏｃｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ、ｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄまたはｌａｕｒｉｃ ａｃｉｄであり得るが、これに制限されるものではない。
【0026】
本発明のペプチドまたはペプチド類似体は疏水性アミノ酸および親水性アミノ酸で構成されたアルファ螺旋状両親媒性ペプチドが折れた構造を有し、Ｎ－末端に脂肪酸が結合され得る構造を有する。
【0027】
本明細書で「折れた」は明細書のうち「折られた、曲げられた、曲がったまたは切れた」と併用して同じ意味で使われ得、前記「折れた」構造は疏水性アミノ酸および親水性アミノ酸で構成されたアルファ螺旋状両親媒性ペプチドの疏水性アミノ酸の一部が置換されて形成された構造であり得、アルファ螺旋状両親媒性ペプチドでアミノ酸置換部分を中心にアルファ螺旋が曲がった形態であり得る。
【0028】
一具体的実施態様において、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ５、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１２、およびＸ１５はそれぞれ独立的に親水性アミノ酸、非タンパク質構成アミノ酸（ｎｏｎ－ｐｒｏｔｅｉｎｏｇｅｎｉｃ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ）、ＡｌａまたはＳｅｒであり得る。
【0029】
一具体的実施態様において、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ５、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１２、およびＸ１５はそれぞれ独立的にＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、およびこの誘導体から選択される親水性アミノ酸または２，３－ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、２，４－ジアミノブタン酸（Ｄａｂ）、またはオルニチン（Ｏｒｎ）であり、ただし、これらのうち一つ以上はＡｌａまたはＳｅｒであり得；
【0030】
Ｘ３、Ｘ４、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ１１、Ｘ１３およびＸ１４はそれぞれ独立的にＬｅｕ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒから選択される疏水性アミノ酸またはＨｄｆであり、ここでＨｄｆはＬｅｕ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、およびＰｈｅを同じ量で含むアミノ酸混合物であり得る。
【0031】
さらに他の実施態様において、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ５、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１２、およびＸ１５はそれぞれ独立的にＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、およびこの誘導体から選択される親水性アミノ酸または２，３－ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、２，４－ジアミノブタン酸（Ｄａｂ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、ＡｌａまたはＳｅｒであり；
【0032】
Ｘ３、Ｘ４、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ１１、Ｘ１３およびＸ１４はそれぞれ独立的にＬｅｕ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒから選択される疏水性アミノ酸またはＨｄｆであり、ここでＨｄｆはＬｅｕ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、およびＰｈｅを同じ量で含むアミノ酸混合物であり得る。
【0033】
さらに他の実施態様において、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ５、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１２、およびＸ１５はそれぞれ独立的にＬｙｓ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、または２，４－ジアミノブタン酸（Ｄａｂ）であり得る。
【0034】
さらに他の実施態様において、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ６、およびＸ７はそれぞれ独立的にＬｅｕ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、またはＨｄｆであり得る。
【0035】
さらに他の実施態様において、Ｘ１１、Ｘ１３、およびＸ１４はそれぞれ独立的にＬｅｕまたはＡｌａであり得る。
【0036】
さらに他の実施態様において、Ｘ１の位置でＣ６～Ｃ１２脂肪酸が結合されていてもよい。
【0037】
特許文献１では、グラム陰性菌などに対する既存薬物の感応効果を増進させる感応性ペプチドを開示している。しかし、これに開示されたペプチドだけでは感応効果と毒性減少効果が充分でないため、本発明者らはペプチドの毒性を減らすとともに感応効果を増進させる戦略として、抗菌剤併用投与療法で最も最適化された新規のペプチドまたはペプチド類似体を提供しようとした。
【0038】
本願で使われた用語「ペプチド」はアミノ酸重合体であって、天然アミノ酸だけでなく、非タンパク質構成アミノ酸も構成要素として含むことができる。
【0039】
本発明はまた、「ペプチド類似体」を含む。当該ペプチド類似体はアミノ酸の側鎖またはアルファ－アミノ酸バックボーンに対して一つ以上の他の機能基で置換された類似体を含むことができる。側鎖またはバックボーン改質化ペプチド類似体の例としては、ピロリジン環がヒドロキシ基で置換されたヒドロキシプロリンや、Ｎ－メチルグリシン「ペプトイド」が挙げられるが、これに制限されない。ペプチド類似体の種類については当業界で公知になっている。
【0040】
本願では「ペプチド」または「ペプチド類似体」を通称して「ペプチド」と指称したりもする。
【0041】
一具体的実施態様において、本発明のペプチドは化学式１で、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ５、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１２、およびＸ１５はそれぞれ独立的にＬｙｓであり、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ１１、Ｘ１３およびＸ１４はそれぞれ独立的にＬｅｕであり得る（化学式１ｂ）。このようなペプチド一般式（化学式１ｂ）に含まれる代表的なペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列からなるものであり得る。このようなペプチドは既に公知になっているＫＬ－Ｌ９Ｐペプチドと比較して、Ｅ．ｃｏｌｉを含んだ多くのスペクトルのグラム陰性菌のリン脂質層と相互作用する程度が増進される。ひいては、ペプチドの正電荷の個数が増えるため、さらに少ない濃度のペプチドがグラム陰性菌株の外膜に分布するＬＰＳとの相互作用にさらに有利に作用する。総数で１５個のアミノ酸の長さを選択することによって、膜活性ペプチドの長さが過度に長くなる場合、長さの増加による細胞膜崩壊を引き起こす恐れを減少させることができる。
【0042】
さらに他の具体的実施態様において、本発明のペプチドは化学式１で、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ５、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１２、およびＸ１５はそれぞれ独立的にＬｙｓまたはＡｌａであり、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ１１、Ｘ１３およびＸ１４はそれぞれ独立的にＬｅｕ、ＡｌａまたはＶａｌであり、ただしＸ１０を除いたＸ１～Ｘ１５のうち一つ以上はＡｌａまたはＶａｌであり得る（化学式１ｃ）。このようなペプチド一般式（化学式１ｃ）に含まれる代表的なペプチドは、配列番号２～１７および６１のうちいずれか一つのアミノ酸配列からなるものであり得る。
【0043】
化学式１ｃのペプチドのようにＡｌａまたはＶａｌを含む場合、特にＡｌａを含む場合、両親媒性ペプチドの全体的な疏水性が減り、疏水性側鎖残基の大きさが小さくなって膜活性ペプチドの疏水性面がグラム陰性菌外膜のリン脂質と結合する方式に影響を与え得るため、低濃度のペプチドにおいてもさらに強い膜活性を示すことができる。
【0044】
さらに他の具体的実施態様において、本発明のペプチドは化学式１で、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ５、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１２、およびＸ１５はそれぞれ独立的にＬｙｓであり、Ｘ３、Ｘ７、およびＸ１１はそれぞれ独立的にＬｅｕ、Ａｌａ、またはＶａｌであり、Ｘ４、Ｘ６、Ｘ１３、およびＸ１４はそれぞれ独立的にＬｅｕであり、Ｘ１の位置でＣ６～Ｃ１２脂肪酸が結合されているものであり得る（化学式１ｄ）。このようなペプチド一般式（化学式１ｄ）に含まれる代表的なペプチドは、配列番号１８～２６および６２～６３いずれか一つのアミノ酸配列からなるものであり得る。
【0045】
化学式１ｄのペプチドのように鎖を脂肪化させる場合、血漿または血液に存在するタンパク質と結合能力を高めてペプチドのＰＫを増やすと同時に感応能力を向上させることができる。ペプチドで脂肪化を多様な位置で可能であるが、好ましくはＮ－末端で脂肪化され得る。脂肪酸の長さはＣ６～Ｃ１６まで多様であり得るが、好ましくはＣ６～Ｃ１２であり得、特にＣ６～Ｃ８である場合、感応活性の変化が最も大きく現れ、溶血現象で測定された脂肪化によるペプチド毒性はほとんど増加しない。
【0046】
さらに他の具体的実施態様において、本発明のペプチドは化学式１で、Ｘ１、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ５、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１２、およびＸ１５はそれぞれ独立的にＤａｂであり、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ６、およびＸ７はそれぞれ独立的にＬｅｕ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、またはＨｄｆであり、このときＸ３、Ｘ４、Ｘ６、およびＸ７のうち二つ以上はそれぞれ独立的にＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、またはＨｄｆであり、Ｘ１１、Ｘ１３、およびＸ１４はそれぞれ独立的にＬｅｕであり、Ｘ１の位置でＣ８またはＣ１２脂肪酸が結合されているものであり得る（化学式１ｅ）。このようなペプチド一般式（化学式１ｅ）に含まれる代表的なペプチドは、配列番号２７～４８および６４～６６いずれか一つのアミノ酸配列からなるものであり得る。
【0047】
化学式１ｅは親水面と疎水面に多様性を帯びている。まず親水面で非自然的一次アミン残基を有するオルニチン（Ｏｒｎ）、ｄｉａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ（Ｄａｂ）、ｄｉａｍｉｎｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ（Ｄａｐ）等を含む場合、膜再編効果を保存または増進させることができ、Ｄａｂの場合、特にＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに対する感応効果を増進させることができる。特にＤａｂを含む場合、脂肪化で現れ得る溶血現象（ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を減少させて毒性を減少させることができる。
【0048】
疎水面で五個のアミノ酸Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｐｈｅを一度に混ぜて一度に混合物（Ｈｄｆ）として使う場合に、優秀な膜再編能を示す。
【0049】
さらに他の具体的実施態様において、本発明のペプチドは化学式１で、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ５、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１２、およびＸ１５はそれぞれ独立的にＤａｂであり、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ６、およびＸ７はそれぞれ独立的にＬｅｕ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、またはＶａｌであり、このときＸ３、Ｘ４、Ｘ６、およびＸ７のうち三つ以上はそれぞれ独立的にＡｌａ、Ｐｈｅ、またはＶａｌであり、Ｘ１１、Ｘ１３、およびＸ１４はそれぞれ独立的にＬｅｕであり、Ｘ１の位置でＣ８脂肪酸が結合されているものであり得る（化学式１ｆ）。このようなペプチド一般式（化学式１ｆ）に含まれる代表的なペプチドは、配列番号４９～５２いずれか一つのアミノ酸配列からなるものであり得る。
【0050】
さらに他の具体的実施態様において、本発明のペプチドは化学式１で、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ５、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１２、およびＸ１５はそれぞれ独立的にＤａｂまたはＳｅｒであり、このときＸ１、Ｘ２、Ｘ５、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１２、およびＸ１５のうち一つ以上はそれぞれ独立的にＳｅｒであり、Ｘ３およびＸ７はそれぞれ独立的にＡｌａであり、Ｘ４およびＸ６はそれぞれ独立的にＬｅｕ、ＰｈｅまたはＶａｌであり、Ｘ１１、Ｘ１３、およびＸ１４はそれぞれ独立的にＬｅｕであり、Ｘ１の位置でＣ８脂肪酸が結合されているものであり得る（化学式１ｇ）。このようなペプチド一般式（化学式１ｇ）に含まれる代表的なペプチドは、配列番号５３～６０および６７いずれか一つのアミノ酸配列からなるものであり得る。
【0051】
さらに他の実施態様において、本発明のペプチドは化学式１で、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ５、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１２、およびＸ１５はそれぞれ独立的にＬｙｓ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、またはＤａｂであり、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ６、およびＸ７はそれぞれ独立的にＬｅｕ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、またはＨｄｆであり、Ｘ１０はＰｒｏであり、Ｘ１１、Ｘ１３、およびＸ１４はそれぞれ独立的にＬｅｕまたはＡｌａであり、Ｘ１の位置でＣ６～Ｃ１２脂肪酸が結合され得るものであり得る。
【0052】
特定実施態様において、配列番号１～６７のうちいずれか一つのアミノ酸配列を含むことを特徴とする、ペプチドまたはペプチド類似体であり得る。
【0053】
本発明のペプチドまたはペプチド類似体は次の特性のうちいずれか一つを示すことができる。
【0054】
ｉ）宿主細胞に対する溶血活性やグラム陽性菌に対する活性が全くなく、かつグラム陰性菌に活性を有する；
【0055】
ｉｉ）グラム陰性菌外膜の表面にあるＬＰＳ層と結合できる性質を有する；
【0056】
ｉｉｉ）グラム陰性菌外膜の表面にあるＬＰＳ層と結合できる性質を有しつつ、外膜に入って外膜にのみ存在する；
【0057】
ｉｖ）グラム陰性菌の外膜を突き抜けて入って外膜にのみ存在する性質を有しながらもグラム陰性菌の外膜または内膜を崩壊する能力はない；
【0058】
ｖ）Ｐｒｏによってアルファ螺旋が折れた構造をしているため、宿主細胞に対する毒性が最小化されながらもグラム陰性菌の外膜との認識が増加され得ること；
【0059】
ｖｉ）ペプチドが正に荷電されているとともに、疏水性を有し、グラム陰性菌外膜（ＬＰＳ層）の負電荷と疏水性認識を最大化できること；および
【0060】
ｖｉｉ）Ｎ－末端にｌｉｐｉｄａｔｉｏｎを通じて体内半減期を増やして、この部分と疏水性残基が調和して釣り合うことができること。
【0061】
本発明に係るペプチドは従来の公知の方法、例えばペプチド固相合成法により製造され得る。このような製造方法は追加的に本発明の一実施態様を形成する。
【0062】
抗菌用途
本発明のペプチドまたはペプチド類似体はバクテリア感染治療などの抗菌用途で使われ得る。
本発明のペプチドまたはペプチド類似体はバクテリア感染治療などの抗菌用途で使われ得る。
【0063】
これに伴い、一実施態様において、本発明は有効量のペプチドまたはペプチド類似体を対象体に投与することを含む、バクテリア感染の予防、改善または治療方法を提供する。本願で語句「バクテリア感染の予防、改善または治療」は「抗菌（ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ）」と互いに置換可能に使われ得る。
【0064】
さらに他の実施態様において、本発明はバクテリア感染の予防、改善または治療のための前記ペプチドまたはペプチド類似体の用途を提供する。
【0065】
さらに他の実施態様において、本発明は前記ペプチドまたはペプチド類似体を含む、バクテリア感染の予防、改善または治療用薬学組成物を提供する。
【0066】
本願で使われた用語「対象体」は、ヒトとヒト以外の霊長類の動物をすべて含む意味である。ヒト以外の霊長類の動物としては、すべての脊椎動物、例えば、哺乳動物と非哺乳動物例えば、ヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ、両生類および爬虫類を含むが、例えば、ヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシおよびウマのような哺乳動物が好ましい。好ましい対象体としては癌の予防または治療が要求されるヒトである。
【0067】
前記バクテリア感染は、好ましくは、グラム陰性菌感染であり得る。これに伴い、本発明のペプチドまたはペプチド類似体はグラム陰性菌に抗菌活性を示すために使われ得る。この時、前記グラム陰性菌は病原性微生物または耐性菌、好ましくはグラム陰性菌の病原性微生物または耐性菌を意味する。グラム陰性菌の例としては、Ｅ．ｃｏｌｉ、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、シュードモナス エルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）、シトロバクター・フレウンデー（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）等を含むがこれに制限されない。
【0068】
好ましい実施態様において、本発明のペプチドはさらに他の薬物と共に使われる。これに伴い、本発明は前記ペプチドまたはペプチド類似体；および薬物を含む、バクテリア感染の予防、改善または治療用薬学組成物または抗菌用薬学組成物を提供する。この時，前記ペプチドまたはペプチド類似体；および薬物は，一つの製剤で同時に投与されるか、または別個の製剤で同時にまたは順次投与され得る。具体的には、本発明のペプチドまたはペプチド類似体が他の薬物と共に使われる時、これらは別途に投与されるか複数の活性成分が一つの薬学的製剤に存在する組み合わせ製品の形態で適用され得る。これらが別途の製剤で投与される場合、二つの製剤は順次または同時に投与され得る。同時投与の場合、これらは患者に共に提供される。順次投与の場合、長くない時間で時間差をおいて提供され得、例えば１２時間以下、または６時間以下の期間内で患者に投与され得る。
【0069】
さらに他の実施態様において、本発明は有効量のペプチドまたはペプチド類似体を薬物と併用して投与することを含む、バクテリア感染の予防、改善または治療方法を提供する。前記実施態様はペプチドを他の薬物と一つの組成物に共に含んで同時に投与することはもちろん、これらそれぞれが別個で含まれた組成物を、これを必要とする患者に同時にまたは順次投与することを含む。
【0070】
さらに他の実施態様において、本発明はバクテリア感染の予防、改善または治療のために、薬物と併用するための前記ペプチドまたはペプチド類似体の用途を提供する。
【0071】
前記薬物は従来グラム陽性菌に対する抗菌剤として使われるものであってもよく、ＵＳ ＦＤＡなどで他の用途として許可されたが抗菌剤としては許可されていない薬物、またはグラム陰性菌に使われる薬物であってもよい。前記グラム陽性菌抗菌抗生剤は例えば、Ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ、Ｒｉｆａｂｕｔｉｎ、Ｒｉｆａｘｉｍｉｎ、Ｒｉｆａｐｅｎｔｉｎｅ、Ｔｅｄｉｚｏｌｉｄ、Ｌｉｎｅｚｏｌｉｄ、Ｃｌａｒｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ、Ｔｅｌｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ、Ｒｅｔａｐａｍｕｌｉｎ、Ｍｕｐｉｒｏｃｉｎ、Ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ、Ｆｕｓｉｄｉｃ ａｃｉｄ、またはＮｏｖｏｂｉｏｃｉｎであり得るが、これに制限されるものではない。前記グラム陰性菌抗生剤はＣｏｌｉｓｔｉｎ、Ａｚｅｔｒｅｏｎａｍ、Ａｚｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ、Ｃｅｆｔａｚｉｄｉｍｅ、Ｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ、Ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ、Ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ、Ｔｒｉｍｅｔｈｏｐｒｉｍ、Ｎａｌｉｄｉｘｉｃ ａｃｉｄ、Ｌｅｖｏｆｌｏｘａｃｉｎであり得るが、これに制限されるものではない。
【0072】
より具体的には、本発明のペプチドとともに使われ得る薬物としては、例えば、エリスロマイシン（Ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ）、ノボビオシン（Ｎｏｖｏｂｉｏｃｉｎ）、フシジン酸（Ｆｕｓｉｄｉｃ ａｃｉｄ）、リファンピシン（Ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ）、リファミキシン（Ｒｉｆａｘｉｍｉｎ）、クロロキシン（Ｃｈｌｏｒｏｘｉｎｅ）、ガチフロキサシン（Ｇａｔｉｆｌｏｘａｃｉｎ）、ロメフロキサシン（Ｌｏｍｅｆｌｏｘａｃｉｎ）、リファブチン（Ｒｉｆａｂｕｔｉｎ）、リファペンチン（Ｒｉｆａｐｅｎｔｉｎｅ）、ダプトマイシン（Ｄａｐｔｏｍｙｃｉｎ）、ナイシン（Ｎｉｓｉｎ）、チゲサイクリン（Ｔｉｇｅｃｙｃｌｉｎｅ）、アズトレオナム（ａｚｔｒｅｏｎａｍ）、セフタジジム（Ｃｅｆｔａｚｉｄｉｍｅ）、ニトロフラントイン（Ｎｉｔｒｏｆｕｒａｎｔｏｉｎ）、クロラムフェニコール（Ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）、フィダキソマイシン（Ｆｉｄａｘｏｍｉｃｉｎ）、レタパムリン（Ｒｅｔａｐａｍｕｌｉｎ）、セフェピム（Ｃｅｆｅｐｉｍｅ）、メシリナム（Ｍｅｃｉｌｌｉｎａｍ）、メロペネム（Ｍｅｒｏｐｅｎｅｍ）、バンコマイシン（Ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ）、クラリスロマイシン（Ｃｌａｒｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ）、ホスホマイシン（Ｆｏｓｆｏｍｙｃｉｎ）、ラモプラニン（Ｒａｍｏｐｌａｎｉｎ）、シプロフロキサシン（Ｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ）、ゲンタマイシン（Ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ）、トブラマイシン（Ｔｏｂｒａｍｙｃｉｎ）、リネゾリド（Ｌｉｎｅｚｏｌｉｄ）、テリスロマイシン（Ｔｅｌｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ）、レボフロキサシン（Ｌｅｖｏｆｌｏｘａｃｉｎ）、トリメトプリム（Ｔｒｉｍｅｔｈｏｐｒｉｍ）、クリンダマイシン（Ｃｌｉｎｄａｍｙｃｉｎ）、ナリジクス酸（Ｎａｌｉｄｉｘｉｃ ａｃｉｄ）、アジスロマイシン（Ａｚｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ）、ムピロシン（Ｍｕｐｉｒｏｃｉｎ）、ダプトマイシン（ｄａｐｔｏｍｙｃｉｎ）、リネゾリド（Ｌｉｎｅｚｏｌｉｄ）、ニトロフラントイン（Ｎｉｔｒｏｆｕｒａｎｔｏｉｎ）、フィダキソマイシン（Ｆｉｄａｘｏｍｉｃｉｎ）、アズトレオナム（Ａｚｔｒｅｏｎａｍ）、レタパムリン（Ｒｅｔａｐａｍｕｌｉｎ）、トブラマイシン（Ｔｏｂｒａｍｙｃｉｎ）、テジゾリド（Ｔｅｄｉｚｏｌｉｄ）、アルバマイシン（Ａｌｂａｍｙｃｉｎ）、オーラノフィン（Ａｕｒａｎｏｆｉｎ）、カピトロール（Ｃａｐｉｔｒｏｌ）、トリクロサン（Ｔｒｉｃｌｏｓａｎ）、ブトコナゾール（Ｂｕｔｏｃｏｎａｚｏｌｅ）、ミコナゾール（Ｍｉｃｏｎａｚｏｌｅ）、クリオキノール（Ｃｌｉｏｑｕｉｎｏｌ）、ラパチニブ（Ｌａｐａｔｉｎｉｂ）、ソラフェニブ（Ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）、ブレオマイシン（Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、キネストロール（Ｑｕｉｎｅｓｔｒｏｌ）、アズトレオナム（Ａｚｔｒｅｏｎａｍ）またはコリスチン（Ｃｏｌｉｓｔｉｎ）を含むが、これに制限されない。
【0073】
本発明で、「予防」とは、組成物の投与によって前記病原性微生物または耐性菌による感染疾患を抑制させるか発病を遅延させるすべての行為を意味し、「治療」とは、組成物の投与によって病原性微生物または耐性菌感染疾患による症状が好転するか有利に変更するすべての行為を意味し得る。
【0074】
前記組成物は薬学的に許容可能な坦体を追加的に含むことができる。前記「薬学的に許容可能な坦体」は任意の対象組成物または成分を一つの機関、または身体の部分から他の機関、または身体の部分への運搬または輸送することに関与する液体または固体充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒またはカプセル化物質のような制約上許容可能な物質、組成物またはビークルを指し示し、本発明の組成物は投与のために前記した有効性分以外に薬学的に許容可能な坦体、賦形剤または希釈剤をさらに含むことができる。前記坦体、賦形剤および希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアゴム、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱物油が挙げられる。
【0075】
また、本発明の組成物はそれぞれ常法により散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアゾールなどの経口型剤形、外用剤、座剤または滅菌注射溶液の形態で剤形化して使うことができる。詳細には剤形化する場合、通常使う充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使って調製され得る。経口投与のための固形製剤としては、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などを含むが、これに限定されるものではない。このような固形製剤は少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、デンプン、カルシウム カーボネート、スクロース、ラクトース、ゼラチンなどを混ぜて調製され得る。また、単純な賦形剤以外にステアリン酸マグネシウム、タルクのような潤滑剤も使われ得る。経口のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、油剤、シロップ剤などを含むが、これに限定されず、よく使われる単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に多様な賦形剤、例えば湿潤剤、甘美剤、芳香剤、保存剤などを添加して調製され得る。非経口投与のための製剤は、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、油剤、凍結乾燥製剤および座剤を含む。非水性溶剤および懸濁剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性オイル、エチロレートのような注射可能なエステルなどが使われ得る。座剤の基剤としては、ウィテプソル、マクロゴール、ツイン６１、カカオジ、ラウリンジ、グリセロゼラチンなどが使われ得る。
【0076】
本発明に係る組成物は目的とする方法により経口投与したり非経口投与（例えば、静脈内、皮下、腹腔内または局所に適用）することができ、投与量は患者の状態および体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路および期間により異なるが、当業者によって適切に選択され得る。必要に応じて一日１回～数回に分けて投与することができ、病原性細菌および耐性菌に対する予防または治療のために、単独でまたは手術、ホルモン治療、薬物治療および生物学的反応調節剤を使う方法と併用して使うことができる。
【0077】
本明細書で前記併用投与は並行投与と交差して使うことができ、併用投与の形態はペプチドまたはペプチド類似体とその他の化合物を同時投与したり、または別途投与する形態をすべて含むことができる。この時、ｌｏｇＰ（ｐａｒｔｉｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）値が０．１９以上である疏水性化合物、生理的ｐＨ条件で陽イオンで荷電された化合物およびコリスチンで構成された群から選択された一つ以上と本発明に係るペプチドまたはペプチド類似体を併用投与することができる。
【0078】
前記ｌｏｐＰ（ｐａｒｔｉｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）値が０．１９以上である疏水性化合物は例えば、クロキサシリン、リネゾリド、レスベラトロール、クルクミン、ケルセチン、シンバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、カテキン、またはチモールであり得るが、これに制限されるものではない。
【0079】
前記生理的ｐＨ条件例えば、ｐＨ７．３～７．４で陽イオンで荷電された化合物は例えば、エリスロマイシン、リファンピシン、コリスチン、ポリミキシンーＢ、またはニコチンであり得るが、これに制限されるものではない。
【0080】
前記生理的ｐＨ条件例えば、ｐＨ７．３～７．４で陰イオンで荷電された化合物は例えば、イブプロフェン、アトバスタチン、フルバスタチン、プラバスタチン、カルプロフェン、トランスフェルラ酸、またはブロムフェナクなどであり得るが、これに制限されるものではない。
【0081】
一実施例において、本発明に係るペプチドまたはペプチド類似体との併用投与を通じてシナジー効果例えば、併用投与対象複数のペプチドまたはペプチド類似体または化合物から由来した効果が単に追加された場合に比べて、はるかに少ない濃度でも抗菌効果が現れる化合物は例えば、リネゾリド、エリスロマイシン、イブプロフェン、シンバスタチン、クルクミン、またはレスベラトロールであり得る。
【0082】
本発明はさらに他の観点で、ペプチド、またはペプチド類似体および前記ペプチドまたはペプチド類似体に薬物が連結された接合体に関する。
【0083】
前記薬物はｌｏｐＰ（ｐａｒｔｉｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）値が０．１９以上である疏水性化合物、生理的ｐＨ条件で陽イオンで荷電された化合物およびコリスチンであり得る。各構成の定義は前述した通りである。
【0084】
前記ペプチドまたはペプチド類似体と薬物は例えば、非共有結合または共有結合を通じて連結され得る。前記非共有結合は例えば、水素結合、静電気的な相互作用、疏水性相互作用、ファンデルワールス相互作用、パイ－パイ相互作用および陽イオン－パイ相互作用からなる群から選択された１種以上であり得る。前記共有結合は分解性または非分解性結合であり得、前記分解性結合は二硫化結合、酸分解性結合、エステル結合、アンハイドライド結合、生分解性結合または酵素分解性結合であり得、非分解性結合はアミド結合またはホスフェート結合であり得るが、これに制限されるものではない。
【0085】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明しようとする。これらの実施例は単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるものと解釈されはしないことは、当業界で通常の知識を有する者にとって自明であろう。
【実施例】
【0086】
＜製造例：ペプチド合成＞
配列番号１～６７のペプチドをペプチド固相合成法を利用して合成した。
配列番号１～６７のペプチドをペプチド固相合成法を利用して合成した。
【0087】
具体的には、ペプチドマイクロウエーブ合成機（ＣＥＭ）で標準ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｏｘｙ ｃａｒｂｏｎｙｌ（Ｆｍｏｃ）固体相ペプチドを使って合成した。Ｄｉｓｃｏｖｅｒ ＳＰＳでリンクアミドＭＢＨＡレジン（０．５９ｍｍｏｌ／ｇローディング、５０ｍｇ、２９．５μｍｏｌ）を使った。レジンはＤＭＦで２０％ピペリジンで脱保護基化させた。カップリング反応は各配列のアミノ酸、ＰｙＢＯＰおよびＮ－ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ（ＤＩＰＥＡ）を使って遂行された。ペプチドはｃｌｅａｖａｇｅカクテルを使って室温で２時間の間レジンで分離した（９５０μＬのＴｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ Ａｃｉｄ、２５μＬのＴｒｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｓｉｌａｎｅおよび２５μＬの水を使う）。分離したペプチドをｎ－ヘキサンおよびジエチルエーテル（ｖ／ｖ＝１／１）で沈殿させ、逆相クロマトグラフィーＨＰＬＣで精製した。ｚｏｒｂａｘ Ｃ１８コラム（３．５μｍ、４．６×１５０ｍｍ）を使ったＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣ １１００シリーズ）を使って精製した。
【0088】
ＨＰＬＣ条件：バッファーＡ（０．１％ｖ／ｖ ＴＦＡ含有水）およびバッファーＢ（０．１％ｖ／ｖ ＴＦＡ含有アセトニトリル）、流速１ｍＬ／ｍｉｎ；０分、０％Ｂの次に６０分に亘って線形勾配１００％Ｂとなるようにする。
【0089】
各ペプチドは表１のように命名された。
【0090】
【表3】
【0091】
これらペプチドの配列およびＭＡＬＤＩ ＴＯＦ Ｍａｓｓ理論値および測定値を表２に示した。Ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ ｌｉｂｒａｒｙに該当するＣＭＰ１５２４からＣＭＰ１５４３はＭａｓｓ値を範囲で表示した。（ＨＤｆ＝ｅｑｕａｌ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｆｉｖｅ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｌ ａｎｄ Ｖ）
【0092】
【表4】
【0093】
実施例１．ＣＭＰ１２０３およびＣＭＰ１３０１～ＣＭＰ１３１４ペプチドの感応効果確認（ＭＩＣ ａｓｓａｙ）
【0094】
本実施例ではＣＭＰ１２０３およびＣＭＰ１３０１～ＣＭＰ１３１４の感応効果を確認しようとした（図１Ａ：各ペプチドが記載される）。
【0095】
濃度０．４μＭの各ペプチドを２種のグラム陽性抗生剤Ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ、Ｎｏｖｏｂｉｏｃｉｎと共に使ってＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＡＴＣＣ １７９７８に対する効果を確認した（ＭＩＣ ａｓｓａｙ）。Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉは広範囲抗菌剤耐性を有しており、湿気が少ない環境でも長い間生き残ることができるため病院内で感染する確率が高いヒト感染菌であり、よく日和見感染菌に分類されるグラム陰性菌である。それぞれのグラム陽性抗生剤を単独で使った時の各抗生剤のＭＩＣと比較して、各ペプチドとともに使った時の各抗生剤のＭＩＣの減少程度（Ｆｏｌｄ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＭＩＣ）を測定した。
【0096】
すべてのＭＩＣ ａｓｓａｙ実験はＣＬＳＩ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｉｔｕｔｕｔｅ）指針を使って遂行された（Ｃｌｉｎｉｃａｌ ＆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＣＬＳＩ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ、２０１７）。一晩培養したバクテリア細胞をＭｕｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ ＩＩ Ｂｒｏｔｈ（陽イオン調節）（Ｄｉｆｃｏ）でＭｃＦａｒｌａｎｄ（Ｋｉｔ ｄｅｎｓｉｃｈｅｃｋ ｐｌｕｓ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ）を使って０．０５ ＭｃＦａｒｌａｎｄ標準に希釈させた。細胞を９６ウェルプレートで各ウェルの２００μＬ溶液当たり１．５×１０５ＣＦＵで接種した。２倍連続希釈された濃度を使ってペプチドと抗生剤を製造した。不溶性抗生剤の場合、２．５％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯを使ってバクテリアの成長に影響を与えない条件で実験を進めた。３７℃で１８時間培養した後、ＥＰＯＣＨ２マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＵＳＡ）を使って６００ｎｍで吸光度を測定してＭＩＣ値を計算した。ＭＩＣ値は陽性対照群の１０％成長より低いバクテリア成長を抑制する抗生剤またはペプチドの濃度と定義された。Ｆｏｌｄ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎは下記の式を利用して計算した。
【0097】
Ｆｏｌｄ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ＝抗生剤単独ＭＩＣ／感応ペプチド存在下で抗生剤のＭＩＣ
【0098】
その結果を図１に示した。
【0099】
Ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎと共に使用時、ＣＭＰ１２０３およびＣＭＰ１３０１～ＣＭＰ１３１４すべてＥｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎの使用量を２倍以上減少させることが確認された（図１Ｂ）。特にＣＭＰ１２０３と比較して、ロイシンをより疏水性が低いアラニンで置き換えた場合（ＣＭＰ１３０３、ＣＭＰ１３０４、ＣＭＰ１３０７、ＣＭＰ１３１０、ＣＭＰ１３１２、ＣＭＰ１３１３）、高い感応効果を示し、約４倍～８倍のＭＩＣ減少効果を示したし、特にＣＭＰ１３０３およびＣＭＰ１３０７は８倍の高い感応効果を示した。
【0100】
Ｎｏｖｏｂｉｏｃｉｎの場合にも、本発明のすべてのペプチドは、Ｎｏｖｏｂｉｏｃｉｎ単独使用時よりその使用量を減少させることが確認された（図１Ｃ）。特にＣＭＰ１２０３と比較してロイシンをアラニンで置き換えた場合、特にＣＭＰ１３０３とＣＭＰ１３０７で約７倍～１６倍の高い感応効果を示した。
【0101】
実施例２．ＣＭＰ１３０３、ＣＭＰ１３０７、ＣＭＰ１３１０、ＣＭＰ１３１５、ＣＭＰ１３１７ペプチドの感応効果確認（ＭＩＣ ａｓｓａｙ）
【0102】
本実施例では０．３１μＭ濃度での各ペプチドの感応効果を確認しようとした。ペプチドとしてＣＭＰ１３０３、ＣＭＰ１３０７、ＣＭＰ１３１０、ＣＭＰ１３１５、ＣＭＰ１３１７を選択した。特に実施例１ではペプチドＣＭＰ１３０１およびＣＭＰ１３０７がＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＡＴＣＣ １７９７８でＥｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ、Ｎｏｖｏｂｉｏｃｉｎ抗菌剤に対する感応能力が優秀であることが確認されたので、本実施例では追加的にペプチドＣＭＰ１３１５およびＣＭＰ１３１７を使ってこれらのＦｕｓｉｄｉｃ ａｃｉｄでの感応効果を確認しようとした。
【0103】
ペプチド濃度を０．３１μＭにしたことを除いては実施例１と同一のＭＩＣ ａｓｓａｙ方法を利用した。その結果を図２Ｂに示した。
【0104】
本発明のペプチドとＦｕｓｉｄｉｃ ａｃｉｄを共に使った場合、Ｆｕｓｉｄｉｃ ａｃｉｄを単独で使った場合と比較して、ＭＩＣ濃度がすべて減少した。
【0105】
実施例３．ＨｅｘＡで脂肪化されたペプチドの感応効果確認（ＭＩＣ ａｓｓａｙ）
【0106】
本実施例ではペプチドＮ－末端をＨｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ（ＨｅｘＡ）で脂肪化したペプチドを使って抗菌剤３種Ｎｏｖｏｂｉｏｃｉｎ、Ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ、またはＦｕｓｉｄｉｃ ａｃｉｄと共に使用時の感応効果を観察した。ペプチド濃度を０．３１μＭにしたことを除いては実施例１と同一のＭＩＣ ａｓｓａｙ方法を利用した。その結果を図３Ｂから図３Ｄに示した。
【0107】
本発明のペプチドと前記抗菌剤を共に使った場合、抗菌剤単独で使った場合と比較して、ＭＩＣ濃度がすべて減少した。特にペプチドＣＭＰ１４０６の場合、濃度０．３１μＭ（０．５６μｇ／ｍｌ）でＮｏｖｏｂｉｏｃｉｎの場合、８倍、Ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎの場合、８倍、Ｆｕｓｉｄｉｃ ａｃｉｄの場合３２倍さらに強い感応効果が観察された。
【0108】
実施例４．多様な脂肪酸で脂肪化されたペプチドの感応効果確認（ＭＩＣ ａｓｓａｙ）
【0109】
本実施例では実施例３で低濃度で優秀な感応効果を示すものと確認されたペプチドＣＭＰ１４０６と同一のアミノ酸配列を有し、かつＮ－末端に多様な長さの脂肪酸で脂肪化されたペプチドに対する感応効果を観察した。実施例３と同一のＭＩＣ ａｓｓａｙ方法を利用した。その結果を図４に示した。
【0110】
本発明のペプチドと前記抗菌剤を共に使った場合、抗菌剤単独で使った場合と比較して、ＭＩＣ濃度がすべて減少した。特にペプチドＣＭＰ１４０１の場合、抗菌剤単独で使った場合に比べてＮｏｖｏｂｉｏｃｉｎの場合、１６倍、Ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎの場合、６４倍、Ｆｕｓｉｄｉｃ ａｃｉｄの場合２５０倍のさらに強い反応が観察された。
【0111】
実施例５．公知の感応性ペプチドとＣＭＰ１４０１またはＣＭＰ１５０１の感応効果比較（ＭＩＣ ａｓｓａｙ）
【0112】
実施例１と同一のＭＩＣ ａｓｓａｙ方法を利用して、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ ２５９２２で既存の抗菌剤に対して既存感応性ＡＭＰで公知になっているペプチドＬ９Ｐ（ＣＭＰ１１０７、１μｇ／ｍｌ）とＣＭＰ１４０１（１μｇ／ｍｌ）の感応効果を比較した（図５Ａ）。
【0113】
また、ＭＩＣスクリーニングを通じて、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ ２５９２２で既存の抗菌剤に対する競争薬物ＳＰＲ７４１とペプチドＣＭＰ１４０１、ＣＭＰ１５０１の感応効果を比較した（図５Ｂおよび５Ｃ）。ＳＰＲ７４１は既に公知になっているｐｏｌｙｍｙｘｉｎ Ｂ（ＰＭＢ）類似体である感応性ＡＭＰであり、前臨床実験を通じて既存グラム陽性菌抗生剤とともに使用時、グラム陰性菌に効果があることが確認されたことがある薬物である。
【0114】
その結果、本発明のペプチドＣＭＰ１４０１は既に公知になっているペプチドＬ９Ｐに比べて非常に優秀な感応効果を示した（図５Ａ）。ひいては、ＳＰＲ７４１と比較してもこれと本発明のペプチドＣＭＰ１４０１またはＣＭＰ１５０１は、ほとんど同等またははるかに優秀な感応効果を示すことが確認された（図５Ｂおよび５Ｃ）。特にＳＲＰ７４１に比べて濃度を半分に減少させても、その効果は同等であるかさらに優れていることが確認された（図５Ｃ）。
【0115】
実施例６．臨床菌株でのＣＭＰ１４０１の感応効果（ＭＩＣ５０およびＭＩＣ９０）
【0116】
Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ臨床菌株で既存の抗菌剤Ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ、Ｃｏｌｉｓｔｉｎ、Ｃｌａｒｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ、Ｔｅｄｉｚｏｌｉｄ、またはＬｉｎｅｚｏｌｉｄを単独で使った場合とＣＭＰ１４０１ ４μｇ／ｍｌと併用で使った時のＭＩＣ５０およびＭＩＣ９０値を求めた。各抗菌剤グループ当たり１００個のＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ臨床菌株が使われたし、Ｃａｒｂａｐｅｎｅｍ抵抗性菌株と感受性菌株をそれぞれ５０菌株ずつ選別した。
【0117】
【0118】
これから本発明のペプチドＣＭＰ１４０１は抗菌剤単独使用と比較して最小４倍以上、最大１２８倍の感応効果を示したことが分かる。
【0119】
実施例７．ＣＭＰ１５０１、ＣＭＰ１６０１～ＣＭＰ１６０４のペプチドの感応効果（ＭＩＣ ａｓｓａｙ）
【0120】
実施例１と同一のＭＩＣ ａｓｓａｙ方法を利用して、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ ２５９２２でＲｉｆａｍｐｉｃｉｎおよびＬｉｎｅｚｏｌｉｄに対してＣＭＰ１５０１、ＣＭＰ１６０１～ＣＭＰ１６０４の感応効果を確認した（図７Ｂ，７Ｃ）。
【0121】
その結果、ＣＭＰ１５０１、ＣＭＰ１６０１～ＣＭＰ１６０４は０．５μｇ／ｍｌの低い濃度でも優秀な感応効果を示した。
【0122】
実施例８．ＣＭＰ１７０１～ＣＭＰ１７０９ペプチドの感応効果（ＭＩＣ ａｓｓａｙ）
【0123】
実施例１と同一のＭＩＣ ａｓｓａｙ方法を利用して、４種のグラム陰性菌株（Ａ．ｂ．ＡＴＣＣ １７９７８、Ｋ．ｐ．ＡＴＣＣ ７００６０３、Ｅ．ｃ．ＡＴＣＣ ２５９２２、Ｐ．ａ．ＡＴＣＣ ２７８５３）でのＲｉｆａｍｐｉｃｉｎに対するＣＭＰ１７０１～ＣＭＰ１７０９の感応効果を確認した（図８Ｂ，８Ｃ）。Ａ．ｂ．ＡＴＣＣ １７９７８、Ｋ．ｐ．ＡＴＣＣ ７００６０３、Ｅ．ｃ．ＡＴＣＣ ２５９２２に対して使われたペプチドの濃度は０．５μｇ／ｍＬ、Ｐ．ａ．ＡＴＣＣ ２７８５３に対して使われたペプチドの濃度は１．０μｇ／ｍＬであった。
【0124】
その結果、前記ペプチドはすべて低い濃度で優秀な感応効果を示すことが確認された。特にＣＭＰ１７０９の場合、４種のグラム陰性菌でＲｉｆａｍｐｉｃｉｎ単独使用と比較して約８倍～１２０倍以上の高い感応効果を示した。
【0125】
実施例９．公知の感応性ペプチドとＣＭＰ１４０１またはＣＭＰ１７０９の感応効果比較（ＭＩＣ ａｓｓａｙ）
【0126】
実施例１と同一のＭＩＣ ａｓｓａｙ方法を利用して、４種のグラム陰性菌株Ｅ．ｃ．ＡＴＣＣ ２５９２２、Ａ．ｂ．ＡＴＣＣ １７９７８、Ｋ．ｐ．ＡＴＣＣ ７００６０３、Ｐ．ａ．ＡＴＣＣ ２７８５３またはＣＲＥ（Ｅ．ｃ．ＮＤＭ－１、Ｋ．ｐ．ＮＤＭ－１、Ｋ．ｐ．ＫＰＣ）でＲｉｆａｍｐｉｃｉｎまたはＣｏｌｉｓｔｉｎに対する既存感応性ペプチドＡＭＰ Ｌ９Ｐ（ＣＭＰ１１０７）とＣＭＰ１４０１またはＣＭＰ１７０９の感応効果を比較した（図９Ａ～図９Ｇおよび図１０Ａ～図１０Ｃ）。
【0127】
その結果、本発明のペプチドＣＭＰ１４０１またはＣＭＰ１７０９は既に公知になっているペプチドＬ９Ｐに比べて非常に優れた感応効果を示した。
【0128】
実施例１０．臨床菌株でのＣＭＰ１７０９の感応効果（ＭＩＣ５０およびＭＩＣ９０）
【0129】
Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ、Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉ、Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ臨床菌株で既存の抗菌剤ＲｉｆａｍｐｉｃｉｎまたはＣｏｌｉｓｔｉｎを単独で使った場合とＣＭＰ１７０９ ４μｇ／ｍｌと併用で使った時のＭＩＣ５０およびＭＩＣ９０値を求めた。Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ、Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉ、Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ臨床菌株はすべてＣａｒｂａｐｅｎｅｍ抵抗性菌株を選別したし、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ臨床菌株はＩｍｉｐｅｎｅｍ、Ｍｅｒｏｐｅｎｅｍ抵抗性菌株４３菌株、感受性菌株６０菌株を選別した。
【0130】
その結果を図１１に示した（Ｃｏｌｉｓｔｉｎに対する結果未記載）。図１１で「Ｆｏｌｄ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＭＩＣ９０」は抗菌剤単独使用時のＭＩＣ９０と比較したＣＭＰ１７０９使用時のＭＩＣ９０の値を示す。これから本発明のペプチドＣＭＰ１７０９は抗菌剤単独使用と比較して最小２倍以上、最大１０２４倍の感応効果を示したことが分かる。Ｃｏｌｉｓｔｉｎを使った場合にも、Ｅ．Ｃｏｌｉ菌株、Ｅ．Ｃｌｏａｃａｅ菌株で２倍の感応効果を示した（図１１に結果未記載）。
【0131】
実施例１１．ペプチドの膜破壊能確認（Ｅｎｚｙｍｅ ａｓｓａｙ）
【0132】
Ｅｎｚｙｍｅ ａｓｓａｙを通じて感応性ペプチドがグラム陰性菌の外膜と内膜を破壊するかを観察した。感応性ペプチドの存在下で、Ｉｎｎｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅに対しては１．５ ｍＭ ＯＮＰＧとともにＥ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ ２５９２２からのβ－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ放出を観察したし、Ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅに対しては２００μＭ ＣＥＮＴＡとともにＥ．ｃｏｌｉ ＮＤＭ－１からのβ－ｌａｃｔａｍａｓｅ放出を観察した。
【0133】
具体的には、外膜のｌｅａｋａｇｅを決定するために、外膜から放出されたβ－ｌａｃｔａｍａｓｅの活性を評価した。ニューデリーメタロ－β－ラクタマーゼ－１（ＮＤｍ－１）生産大腸菌細胞をＤＰＢＳで３回洗浄して同じ緩衝液に懸濁させた。細胞を０．２のＯＤ６００で希釈し３７℃で１時間の間０．６３または１．３０μＭのペプチド濃度で処理した。遠心分離後、上層液を２００μＭのＣＥＮＴＡＴＭβ－ｌａｃｔａｍａｓｅ基質と共に３７℃で１時間の間培養した。光学密度はマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏ．、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ）を使って４０５ｎｍで酵素反応産物の吸光度を測定した。
【0134】
内膜ｌｅａｋａｇｅを決定するために細胞質酵素β－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅの放出を評価した。バクテリアをＯＤ６００＝１で希釈し１．５ ｍＭのＯＮＰＧ（Ｏ－ニトロフェニル－β－Ｄ－ガラクトピラノシド）を添加した。酵素反応産物の吸光度は４２０ｎｍで測定した。その他の過程は外膜破壊実験と同一に進めた。
【0135】
その結果を図１２Ａおよび１２Ｂに示した。ｙ軸は４０５ｎｍで測定された吸光度であり、膜が破壊されてβ－ｌａｃｔａｍａｓｅの放出が高いほど高い吸光度を示す。
【0136】
バクテリアのＩｎｎｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅとＯｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅをすべて破壊する作用メカニズムを有するものと知られているＭｅｌｉｔｔｉｎは、細菌のＩｎｎｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅとＯｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅをすべて破壊することが観察された。これに反し、ＣＭＰ１４０７とＣＭＰ１４０１は既に公知の感応性ペプチドとしてグラム陰性菌の膜を破壊しないものと知られているＬ９Ｐ（ＣＭＰ１１０７）と比較して、ほとんど同等な水準でこれら膜を破壊しないことが確認された。
【0137】
実施例１２．ペプチドの毒性分析（Ｈｅｍｏｌｙｓｉｓ ａｓｓａｙ）
【0138】
ペプチドの毒性を確認するためにヒト赤血球（ｈＲＢＣ）溶血活性分析（Ｈｅｍｏｌｙｓｉｓ ａｓｓａｙ）を実施した。
【0139】
具体的には、ヒト赤血球（ｈＲＢＣ）の溶血百分率は、陽性対照群として１００％脱イオン水（ＤＷ）で培養された細胞と陰性対照群としてペプチドがないＰＢＳと比較して決定された。ｈＲＢＣを５００ｇで５分の間遠心分離を使ってＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ緩衝液（Ｈｙｃｌｏｎｅ）に５％（ｖ／ｖ）ヘマトクリットを懸濁させた。ペプチドをＰＢＳで２倍連続希釈を使って希釈し２．５×１０８ｈＲＢＣを各ウェルに添加した。試料を３７℃で４時間の間培養した。１４００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、１８０μＬの上澄液を透明な平底９６ウェルプレートに移した。ペプチドによって放出されるヘモグロビンの量をＥＰＯＣＨ２マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＵＳＡ）を使って４０５ｎｍで吸光度で測定して決定した。
【0140】
溶血活性（％）＝（試料の吸光度－ＰＢＳの吸光度）／（１００％ＤＷの吸光度－ＰＢＳのＡ４０５）Ｘ１００
【0141】
その結果を図１３Ａおよび１３Ｂに示した。低い濃度からｈＲＢＣの溶血現象が現れたＭｅｌｉｔｔｉｎとは異なり、本発明のペプチドはＣＭＰ１４０７を除いてはその溶血の水準が非常に微小であった。
【0142】
実施例１３．ペプチドの毒性分析（ＷＳＴ－１ ａｓｓａｙ）
【0143】
本実施例では宿主細胞ＨｅＬａ ｃｅｌｌまたはＨＫ－２ ｃｅｌｌに対するＷＳＴ－１分析を通じて宿主細胞の生存率を測定してペプチドの毒性を確認した。
【0144】
具体的には、ＨｅＬａ ｃｅｌｌはＤＭＥＭで、ＨＫ－２ ｃｅｌｌはＲＰＭＩで３７℃、５％ＣＯ２条件で培養した。細胞培養龍プレートで細胞をそれぞれ培養した後、Ｔｒｙｐｓｉｎで引き離し、９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅにｗｅｌｌ当たりそれぞれ１ｘ１０４、７ｘ１０３個の細胞をシーディングした。２４時間後ｍｅｄｉａに２－ｆｏｌｄ ｄｉｌｕｔｉｏｎで希釈したペプチドを添加し、再び３７℃、５％ＣＯ２条件で２４時間の間培養した。ＷＳＴ－１試薬をｗｅｌｌ当たり１０μＬにいれて３７℃、５％ＣＯ２条件で３０分の間反応をさせた後、９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒでＵＶ吸光度を４５０／７００ｎｍで測定した。
【0145】
その結果を図１４Ａおよび１４Ｂに示した。本発明のペプチドはすべて高い濃度でも高い細胞生存率を示した。
【0146】
実施例１４．ＲｉｆａｍｐｉｃｉｎとＣＭＰ１４０１の併用療法の生体内効能分析（ＣＭＰ１４０１のＩｎ ｖｉｖｏ ｔｅｓｔ）
【0147】
マウスモデルを利用してペプチドＣＭＰ１４０１およびＲｉｆａｍｐｉｃｉｎ（Ｒｉｆ）単独および併用療法の生体内効能を分析した。
【0148】
１４．１ Ｎｅｕｔｒｏｐｅｎｉｃ ｍｏｕｓｅ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅモデル（免疫抑制マウスＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ８０１肺炎感染生存モデル）を利用した実験
【0149】
体重が２３～２７ｇである６週齢の雌ＩＣＲ（ＣＤ－１）マウス（大韓民国、ソンナム、オリエントバイオ）を免疫抑制（ｎｅｕｔｒｏｐｅｎｉｃ）を誘導するために、肺炎感染４日および１日前にそれぞれ１５０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇのｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ（ＣＰ）で処理した（皮下注射）。生存率分析のためのマウスモデルの場合、１×１０８ＣＦＵ Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ８０１を、コロニー数の計数のためのマウスモデルの場合、１×１０６ＣＦＵ Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ８０１を鼻腔内で感染させた。
【0150】
生存率分析
Ｎｅｕｔｒｏｐｅｎｉｃ ｍｏｕｓｅ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅモデルでＲｉｆａｍｐｉｃｉｎ、ＣＭＰ１４０１ペプチドの併用投与効果を確認した。
Ｎｅｕｔｒｏｐｅｎｉｃ ｍｏｕｓｅ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅモデルでＲｉｆａｍｐｉｃｉｎ、ＣＭＰ１４０１ペプチドの併用投与効果を確認した。
【0151】
Ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎをキャリア（１０％ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０、５％ＤＭＳＯおよび８５％食塩水）に溶解させて使った。Ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎを２日間毎日２回ずつ皮下注射で投与した（２．５ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤ）。本発明の感応性ペプチドＣＭＰ１４０１を２日間毎日４回ずつ腹腔内注射で投与した（２５ｍｇ／ｋｇ ＱＩＤ）。各グループ当たり６匹のマウスが使われた。併用投与群とｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ単独投与群のｐ値を求めるためにＭａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ ｔｅｓｔが使われた。
【0152】
その結果は図１５Ａに示された通り、Ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ ２．５ｍｇ／ｋｇ単独処理群での生存率は約１６．７％であり、２．５ｍｇ／ｋｇのＲｉｆａｍｐｉｃｉｎと２５ｍｇ／ｋｇのペプチドＣＭＰ１４０１を併用投与した群の生存率は５０％であって、Ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ単独投与群より約３３．３％高かった。ペプチドＣＭＰ１４０１単独投与群はすべてのマウスが死んだのでいかなる抗菌活性も現れなかった。
【0153】
コロニー数測定
Ｎｅｕｔｒｏｐｅｎｉｃ ｍｏｕｓｅ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅモデルにおいて、生存率に加え、マウス肺でＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ８０１のコロニー数を測定した。マウスを安楽死させて肺を滅菌された食塩水で収穫した。肺を均質化して滅菌された食塩水に連続希釈した。均質化された肺をＴｒｙｐｔｉｃｓｏｙ寒天プレートに塗布し、３７℃で一晩中培養してコロニーを計数した。併用投与群とｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ単独投与群のｐ値を求めるために、ｔｗｏ－ｓｉｄｅｄ Ｍａｎ Ｗｈｉｔｅｎｙ Ｕ－ｔｅｓｔが使われた（＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．００５）。各グループ当たり６匹のマウスが使われた。
Ｎｅｕｔｒｏｐｅｎｉｃ ｍｏｕｓｅ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅモデルにおいて、生存率に加え、マウス肺でＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ８０１のコロニー数を測定した。マウスを安楽死させて肺を滅菌された食塩水で収穫した。肺を均質化して滅菌された食塩水に連続希釈した。均質化された肺をＴｒｙｐｔｉｃｓｏｙ寒天プレートに塗布し、３７℃で一晩中培養してコロニーを計数した。併用投与群とｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ単独投与群のｐ値を求めるために、ｔｗｏ－ｓｉｄｅｄ Ｍａｎ Ｗｈｉｔｅｎｙ Ｕ－ｔｅｓｔが使われた（＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．００５）。各グループ当たり６匹のマウスが使われた。
【0154】
その結果は図１５Ｂに示した通り、Ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ ２．５ｍｇ／ｋｇおよびペプチドＣＭＰ１４０１ ２５ｍｇ／ｋｇ併用投与群のコロニー数は、Ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ ２．５ｍｇ／ｋｇを単独で投与した群より約１２倍さらに低かった。また、ＲｉｆａｍｐｉｃｉｎとＣＭＰ１４０１の併用投与群は非処理群（ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べて約６０倍少ないコロニー数を示した。ＲｉｆａｍｐｉｃｉｎとＣＭＰ１４０１の併用投与群はＲｉｆａｍｐｉｃｉｎとＳＰＲ７４１の併用投与群に比べても３０倍さらに少ないコロニー数を示した。
【0155】
１４．２ Ｎｅｕｔｒｏｐｅｎｉｃ ｍｏｕｓｅ ｔｈｉｇｈモデルを利用した実験
【0156】
体重が２３～２７ｇである６週齢の雌ＩＣＲ（ＣＤ－１）マウス（大韓民国、ソンナム、オリエントバイオ）を免疫抑制（ｎｅｕｔｒｏｐｅｎｉｃ）を誘導するために、太もも感染５日および２日前にそれぞれ１５０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇのｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ（ＣＰ）で処理した（皮下注射）。Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＡＴＣＣ １７９７８を収穫し、洗浄し滅菌された食塩水に懸濁させた。マウスを麻酔させて右および左太ももで１×１０５ＣＦＵ Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＡＴＣＣ １７９７８で感染させた。Ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ ２０ｍｇ／ｋｇは感染後１時間および５時間に皮下注射で投与された。感応性ペプチドＣＭＰ１４０１は感染後１、３、５および７時間に腹腔内注射で投与された。マウスをバクテリア注入９時間後安楽死させ、両側の太ももを収穫し、滅菌された食塩水に懸濁させた。太ももを均質化し、滅菌食塩水で連続希釈した。均質化された太ももをＴｒｙｐｔｉｃｓｏｙ寒天プレートに塗布した後、３７℃で一晩中培養し、コロニーを計数した。併用投与群とｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ単独投与群のｐ値を求めるために、ｔｗｏ－ｓｉｄｅｄ Ｍａｎ Ｗｈｉｔｅｎｙ Ｕ－ｔｅｓｔが使用された。（＊：ｐ＜０．０５）
【0157】
その結果を図１５Ｃに示した。Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＡＴＣＣ １７９７８で感染したＮｅｕｔｒｏｐｅｎｉｃ ｍｏｕｓｅ ｔｈｉｇｈモデルでＲｉｆａｍｐｉｃｉｎとペプチドＣＭＰ１４０１併用療法は優秀な治療効能を示した。ペプチドＣＭＰ１４０１をＲｉｆａｍｐｉｃｉｎ ２０ｍｇ／ｋｇの存在下で１００ｍｇ／ｋｇで投与した時、コロニー数はＲｉｆａｍｐｉｃｉｎ単独投与に比べて１４倍減少した。また、２０ｍｇ／ｋｇのＲｉｆａｍｐｉｃｉｎ存在下で併用投与群でペプチドＣＭＰ１４０１の容量が変更された時、コロニー数の変化が観察された。ペプチドＣＭＰ１４０１を５０ｍｇ／ｋｇ単独投与した時、コロニー数の変化は観察されなかったし、これはペプチドＣＭＰ１４０１が自らの抗菌活性よりはＲｉｆａｍｐｉｃｉｎの抗菌能力を向上させるということを示す。
【0158】
実施例１５．ＲｉｆａｍｐｉｃｉｎまたはＣｏｌｉｓｔｉｎとＣＭＰ１４０１の併用療法の生体内効能分析（ＣＭＰ１４０１のＩｎ ｖｉｖｏ ｔｅｓｔ）
【0159】
本実施例では免疫抑制Ｒａｔ Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ８０１肺炎感染モデルでＲｉｆａｍｐｉｃｉｎまたはＣｏｌｉｓｔｉｎとの併用投与効果を確認しようとした。
【0160】
実施例１４．１でコロニー数計数実験方法を利用するものの、マウスの代わりにＳＤ ｍａｌ Ｒａｔを各グループ当たり３匹ずつ使い、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ８０１を気道で感染させた後、ＣｏｌｉｓｔｉｎまたはＲｉｆａｍｐｉｃｉｎは皮下注射でＣＭＰ１４０１は１時間静脈注射ｉｎｆｕｓｉｏｎで投与した。その結果を図１６に示した。
【0161】
Ｃｏｌｉｓｔｉｎ ３２ｍｇ／ｋｇはＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ８０１の治療のために使われる臨床容量として知られている。したがって、Ｃｏｌｉｓｔｉｎ ３２ｍｇ／ｋｇを単独で使った時に確認される効果は、本実施例でＣＭＰ１４０１と抗菌剤併用投与の有効性の有無を比較する基準となり得る。
【0162】
図１６の結果によると、ＲｉｆａｍｐｉｃｉｎとＣＭＰ１４０１を併用投与した場合、特にＲｉｆａｍｐｉｃｉｎ ５ｍｇ／ｋｇとＣＭＰ１４０１ ３ｍｇ／ｋｇまたは６ｍｇ／ｋｇを併用投与した場合、Ｃｏｌｉｓｔｉｎ ３２ｍｇ／ｋｇと匹敵するほどの効果を示すことが確認された。これに伴い、本発明のペプチドはＲｉｆａｍｐｉｃｉｎと共に使用時、臨床的に有効な効果を示すことが確認された。
【0163】
実施例１６．ＲｉｆａｍｐｉｃｉｎとＣＭＰ１７０９の併用療法の生体内効能分析（ＣＭＰ１７０９のＩｎ ｖｉｖｏ ｔｅｓｔ）
【0164】
Ｎｅｕｔｒｏｐｅｎｉｃ ｍｏｕｓｅ ｔｈｉｇｈモデル（免疫抑制マウスＥ．ｃｏｌｉ ＮＤＭ－１太もも感染モデル）を利用して、ペプチドＣＭＰ１４０１およびＲｉｆａｍｐｉｃｉｎ（Ｒｉｆ）単独および併用療法の生体内効能を分析した。実施例１４．２と同一の方法で実験した。
【0165】
その結果を図１７に示した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＮＤＭ－１で感染したＮｅｕｔｒｏｐｅｎｉｃ ｍｏｕｓｅ ｔｈｉｇｈモデルでＲｉｆａｍｐｉｃｉｎとペプチドＣＭＰ１７０９併用療法は優秀な治療効能を示した。ペプチドＣＭＰ１７０９をＲｉｆａｍｐｉｃｉｎ ２０ｍｇ／ｋｇの存在下で７５ｍｇ／ｋｇで投与した時、コロニー数はＲｉｆａｍｐｉｃｉｎ単独投与に比べて８．７倍減少した。また、２０ｍｇ／ｋｇのＲｉｆａｍｐｉｃｉｎ存在下で併用投与群でペプチドＣＭＰ１７０９の容量が変更された時、コロニー数の変化が観察された。ペプチドＣＭＰ１７０９を単独投与した時、コロニー数の変化は観察されなかったし、これはペプチドＣＭＰ１７０９が自らの抗菌活性よりはＲｉｆａｍｐｉｃｉｎの抗菌能力を向上させるということを示す。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図8E】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【図9E】
【図9F】
【図9G】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図11】
【図12A】
【図12B】
【図13A】
【図13B】
【図14A】
【図14B】
【図15A】
【図15B】
【図15C】
【図16】
【図17】
【図18】
【配列表】
【国際調査報告】