特表 2023-521870 改変ＩＬ－１２及びＩＬ－２３ポリペプチドとその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-05-25

(54)【発明の名称】改変ＩＬ－１２及びＩＬ－２３ポリペプチドとその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/24 20060101AFI20230518BHJP

   C07K 14/54 20060101ALI20230518BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20230518BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20230518BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20230518BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20230518BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230518BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20230518BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20230518BHJP

   C07K 16/00 20060101ALI20230518BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20230518BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20230518BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20230518BHJP

   C07K 14/76 20060101ALI20230518BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230518BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20230518BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20230518BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20230518BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20230518BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20230518BHJP

   A61P 7/06 20060101ALI20230518BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20230518BHJP

   A61P 21/04 20060101ALI20230518BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20230518BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20230518BHJP

   A61P 17/14 20060101ALI20230518BHJP

   A61P 17/06 20060101ALI20230518BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20230518BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20230518BHJP

   A61P 1/18 20060101ALI20230518BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230518BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20230518BHJP

   A61K 38/20 20060101ALI20230518BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20230518BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20230518BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20230518BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20230518BHJP

【ＦＩ】

C12N15/24 ZNA

C07K14/54

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/02 C

C07K19/00

C07K16/00

C12N15/13

C12N15/62 Z

C12N15/12

C07K14/76

A61P35/00

A61P37/02

A61P31/00

A61P29/00 101

A61P19/02

A61P3/10

A61P7/06

A61P1/04

A61P21/04

A61P13/12

A61P1/16

A61P17/14

A61P17/06

A61P17/00

A61P25/00

A61P1/18

A61P43/00 121

A61K45/00

A61K38/20

A61K31/7088

A61K35/12

A61K48/00

A61P35/02

A61P43/00 111

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022562584

(86)(22)【出願日】2021-04-16

(85)【翻訳文提出日】2022-12-12

(86)【国際出願番号】 US2021027838

(87)【国際公開番号】W WO2021212083

(87)【国際公開日】2021-10-21

(31)【優先権主張番号】63/150,451

(32)【優先日】2021-02-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/011,742

(32)【優先日】2020-04-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】503115205

【氏名又は名称】ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(72)【発明者】

【氏名】ケナン クリストファー ガルシア

(72)【発明者】

【氏名】ケイレブ アール．グラスマン

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C084

4C086

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG03

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA87X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065AC20

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA44

4C084AA02

4C084AA03

4C084AA13

4C084AA19

4C084BA44

4C084DA12

4C084MA02

4C084NA14

4C084ZA01

4C084ZA55

4C084ZA66

4C084ZA81

4C084ZA89

4C084ZA94

4C084ZA96

4C084ZB07

4C084ZB11

4C084ZB15

4C084ZB26

4C084ZB27

4C084ZB31

4C084ZC35

4C084ZC41

4C084ZC751

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA03

4C086MA05

4C086NA14

4C086ZA01

4C086ZA55

4C086ZA66

4C086ZA81

4C086ZA89

4C086ZA94

4C086ZA96

4C086ZB07

4C086ZB11

4C086ZB15

4C086ZB26

4C086ZB27

4C086ZB31

4C086ZC35

4C086ZC41

4C086ZC75

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB63

4C087MA02

4C087NA14

4C087ZA01

4C087ZA55

4C087ZA66

4C087ZA81

4C087ZA89

4C087ZA94

4C087ZA96

4C087ZB07

4C087ZB11

4C087ZB15

4C087ZB26

4C087ZB27

4C087ZB31

4C087ZC35

4C087ZC41

4C087ZC75

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045BA57

4H045CA40

4H045DA02

4H045DA70

4H045DA75

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本開示は、一般に、インターロイキン１２及びインターロイキン２３によって媒介されるシグナル伝達を調節するための組成物及び方法に関する。特に、本開示は、ＩＬ－１２Ｒβ１に対する結合親和性が低下したインターロイキン１２サブユニットｐ４０の新規バリアントを提供する。そのようなＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドバリアントを産生するために有用な組成物及び方法、並びにＩＬ－１２ｐ４０媒介シグナル伝達を調節するため方法、及び／又はＩＬ－１２ｐ４０によって媒介されるシグナル伝達の混乱に関連する状態の治療のための方法もまた提供される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

組換えポリペプチドであって、
配列番号１のアミノ酸配列を有するインターロイキン１２サブユニットｐ４０（ＩＬ－１２ｐ４０）ポリペプチドと少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
及び配列番号１のＸ３７、Ｘ３９、Ｘ４０、Ｘ４１、Ｘ８０、Ｘ８１、Ｘ８２、Ｘ１０６、Ｘ１０８、Ｘ１１５、Ｘ２１６、Ｘ２１７、Ｘ２１８、及びＸ２１９からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置に１つ又は複数のアミノ酸置換をさらに含む、組換えポリペプチド。

【請求項2】

前記１つ又は複数のアミノ酸置換が、配列番号１のＸ３７、Ｘ３９、Ｘ４０、Ｘ８１、Ｘ８２、Ｘ１０６、Ｘ２１７、及びＸ２１９からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置にある、請求項１に記載の組換えポリペプチド。

【請求項3】

前記１つ又は複数のアミノ酸置換が、アラニン（Ａ）置換、アルギニン（Ｒ）置換、アスパラギン（Ｎ）置換、アスパラギン酸（Ｄ）置換、ロイシン（Ｌ）置換、リジン（Ｋ）置換、フェニルアラニン（Ｆ）置換、リジン置換、グルタミン（Ｑ）置換、グルタミン酸（Ｅ）置換、セリン（Ｓ）置換、及びスレオニン（Ｔ）置換からなる群から独立して選択される、請求項１又は２に記載の組換えポリペプチド。

【請求項4】

前記１つ又は複数のアミノ酸置換が、配列番号１のＷ３７、Ｐ３９、Ｄ４０、Ａ４１、Ｋ８０、Ｅ８１、Ｆ８２、Ｋ１０６、Ｅ１０８、Ｄ１１５、Ｈ２１６、Ｋ２１７、Ｌ２１８、及びＫ２１９からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置にある、請求項１～３のいずれか１項に記載の組換えポリペプチド。

【請求項5】

前記１つ又は複数のアミノ酸置換が、配列番号１のＷ３７、Ｐ３９、Ｄ４０、Ｅ８１、Ｆ８２、Ｋ１０６、Ｋ２１７、及びＫ２１９からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置にある、請求項１～４のいずれか１項に記載の組換えポリペプチド。

【請求項6】

配列番号１と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ以下のアミノ酸置換：
ａ）Ｗ３７Ａ；
ｂ）Ｐ３９Ａ；
ｃ）Ｄ４０Ａ；
ｄ）Ｅ８１Ａ；
ｅ）Ｆ８２Ａ；
ｆ）Ｋ１０６；
ｇ）Ｄ１０９Ａ；
ｈ）Ｋ２１７Ａ；
ｉ）Ｋ２１９Ａ；
ｊ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ；
ｋ）Ｗ３７Ａ／Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ；
ｌ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ａ；
ｍ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ａ／Ｋ２１９Ａ；
ｎ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ａ／Ｋ２１７Ａ；
ｏ）８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ａ／Ｅ１０８Ａ／Ｄ１１５Ａ；
ｐ）Ｅ８１Ｆ／Ｆ８２Ａ；
ｑ）Ｅ８１Ｋ／Ｆ８２Ａ；
ｒ）Ｅ８１Ｌ／Ｆ８２Ａ；
ｓ）Ｅ８１Ｈ／Ｆ８２Ａ；
ｔ）Ｅ８１Ｓ／Ｆ８２Ａ；
ｕ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ｎ；
ｖ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ｑ；
ｗ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ｔ；
ｘ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ｒ；又は
ｙ）Ｐ３９Ａ／Ｄ４０Ａ／Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ、
に対応するアミノ酸置換をさらに含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の組換えポリペプチド。

【請求項7】

配列番号３～８及び１３～１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の組換えポリペプチド。

【請求項8】

組換えポリペプチドであって、
配列番号２のアミノ酸配列を有するインターロイキン１２サブユニットｐ４０（ＩＬ－１２ｐ４０）ポリペプチドと、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
及び配列番号２のＸ３７、Ｘ３９、Ｘ４０、Ｘ４１、Ｘ８０、Ｘ８１、Ｘ８２、Ｘ１０６、Ｘ１０８、Ｘ１１５、Ｘ２１６、Ｘ２１７、Ｘ２１８、及びＸ２１９からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置に１つ又は複数のアミノ酸置換をさらに含む、組換えポリペプチド。

【請求項9】

前記１つ又は複数のアミノ酸置換が、配列番号２のＸ３７、Ｘ３９、Ｘ４０、Ｘ８１、Ｘ８２、Ｘ１０６、Ｘ２１７、及びＸ２１９からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置にある、請求項８に記載の組換えポリペプチド

【請求項10】

前記１つ又は複数のアミノ酸置換が、アラニン（Ａ）置換、アルギニン（Ｒ）置換、アスパラギン（Ｎ）置換、アスパラギン酸（Ｄ）置換、ロイシン（Ｌ）置換、リジン（Ｋ）置換、フェニルアラニン（Ｆ）置換、リジン置換、グルタミン（Ｑ）置換、グルタミン酸（Ｅ）置換、セリン（Ｓ）置換、及びスレオニン（Ｔ）置換からなる群から独立して選択される、請求項８又は９に記載の組換えポリペプチド。

【請求項11】

前記１つ又は複数のアミノ酸置換が、配列番号２のＷ３７、Ｐ３９、Ｄ４０、Ａ４１、Ｋ８０、Ｅ８１、Ｆ８２、Ｋ１０６、Ｅ１０８、Ｄ１１５、Ｈ２１６、Ｋ２１７、Ｌ２１８、及びＥ２１９からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置にある、請求項８～１０のいずれか１項に記載の組換えポリペプチド。

【請求項12】

前記１つ又は複数のアミノ酸置換が、配列番号２のＰ３９、Ｄ４０、Ｅ８１、Ｆ８２、Ｋ１０６、Ｋ２１７、及びＥ２１９からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置にある、請求項８～１１のいずれか１項に記載の組換えポリペプチド。

【請求項13】

配列番号２と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ以下のアミノ酸置換：
ａ）Ｗ３７Ａ；
ｂ）Ｐ３９Ａ；
ｃ）Ｄ４０Ａ；
ｄ）Ｅ８１Ａ；
ｅ）Ｆ８２Ａ；
ｆ）Ｋ１０６；
ｇ）Ｄ１０９Ａ；
ｈ）Ｋ２１７Ａ；
ｉ）Ｅ２１９Ａ；
ｊ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ；
ｋ）Ｗ３７Ａ／Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ；
ｌ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ａ；
ｍ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ａ／Ｋ２１７Ａ；
ｎ）Ｅ８１Ｆ／Ｆ８２Ａ；
ｏ）Ｅ８１Ｋ／Ｆ８２Ａ；
ｐ）Ｅ８１Ｌ／Ｆ８２Ａ；
ｑ）Ｅ８１Ｈ／Ｆ８２Ａ；
ｒ）Ｅ８１Ｓ／Ｆ８２Ａ；
ｓ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ｎ；
ｔ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ｑ；
ｕ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ｔ；
ｖ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ｒ；又は
ｗ）Ｐ３９Ａ／Ｄ４０Ａ／Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ、
に対応するアミノ酸置換をさらに含む、請求項８～１２のいずれか１項に記載の組換えポリペプチド。

【請求項14】

配列番号９～１１及び１７～２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項８～１３のいずれか１項に記載の組換えポリペプチド。

【請求項15】

前記１つ又は複数のアミノ酸配列を欠く参照ポリペプチドの結合親和性と比較して、インターロイキン－１２受容体、サブユニットベータ１（ＩＬ－１２Ｒβ１）に対して改変された結合親和性を有する、請求項１～１４のいずれか１項に記載の組換えポリペプチド。

【請求項16】

前記１つ又は複数のアミノ酸置換を欠く参照ポリペプチドの結合親和性と比較して、ＩＬ－１２Ｒβ１に対して低下した結合親和性を有する、請求項１５に記載の組換えポリペプチド。

【請求項17】

表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した場合、前記１つ又は複数のアミノ酸置換を欠く参照ポリペプチドの結合親和性と比較して、ＩＬ－１２Ｒβ１に対して約１０％～約１００％低下した結合親和性を有する、請求項１５～１５のいずれか１項に記載の組換えポリペプチド。

【請求項18】

インターロイキン１２サブユニットｐ３５（ＩＬ－１２ｐ３５）ポリペプチドと組み合わされた場合、前記１つ又は複数のアミノ酸置換を欠く参照ポリペプチドと比較して、ＳＴＡＴ４シグナル伝達を刺激する能力が低下している、請求項１５～１７のいずれか１項に記載の組換えポリペプチド。

【請求項19】

インターロイキン２３サブユニットｐ１９（ＩＬ－２３ｐ１９）ポリペプチドと組み合わされた場合、前記１つ又は複数のアミノ酸置換を欠く参照ポリペプチドと比較して、ＳＴＡＴ３シグナル伝達を刺激する能力が低下している、請求項１５～１８のいずれか１項に記載の組換えポリペプチド。

【請求項20】

ＳＴＡＴ３シグナル伝達及び／又はＳＴＡＴ４シグナル伝達が、遺伝子発現アッセイ、ホスホフローシグナル伝達アッセイ、及び酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）からなる群から選択されるアッセイによって決定される、請求項１８又は１９に記載の組換えポリペプチド。

【請求項21】

前記１つ又は複数のアミノ酸置換が、前記１つ又は複数のアミノ酸置換を欠く参照ポリペプチドと比較して、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）及び／又はインターロイキン－２３（ＩＬ－２３）を介して媒介される下流のシグナル伝達の細胞型に偏ったシグナル伝達をもたらす、請求項１５～２０のいずれか１項に記載の組換えポリペプチド。

【請求項22】

前記細胞型に偏ったシグナル伝達が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞におけるＩＬ－１２媒介シグナル伝達を刺激する組換えポリペプチドの能力の低下を含む、請求項２１に記載の組換えポリペプチド。

【請求項23】

前記細胞型に偏ったシグナル伝達が、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＩＬ－１２シグナル伝達を刺激する組換えポリペプチドの能力が実質的に変化していないことを含む、請求項２１又は２２に記載の組換えポリペプチド。

【請求項24】

前記１つ又は複数のアミノ酸置換が、ＮＫ細胞においてＩＬ－１２シグナル伝達を刺激する組換えポリペプチドの能力の低下をもたらすが、ＣＤ８＋Ｔ細胞においてＩＬ－１２シグナル伝達を刺激するその能力は実質的に保持する、請求項２１～２３のいずれか１項に記載の組換えポリペプチド。

【請求項25】

請求項１～２４のいずれか１項に記載のポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換え核酸分子。

【請求項26】

前記核酸配列が異種核酸配列に作動可能に連結されている、請求項２５に記載の核酸分子。

【請求項27】

発現カセット又は発現ベクターとしてさらに定義される、請求項２５～２６のいずれか１項に記載の核酸分子。

【請求項28】

以下：
ａ）請求項１～２４のいずれか１項に記載の組換えポリペプチド；及び／又は
ｂ）請求項２５～２７のいずれか１項に記載の組換え核酸、
を含む、組換え細胞。

【請求項29】

前記組換え細胞が真核細胞である、請求項２８に記載の組換え細胞。

【請求項30】

前記真核細胞が哺乳動物細胞である、請求項２９に記載の組換え細胞。

【請求項31】

請求項２８～３０のいずれか１項に記載の少なくとも１つの組換え細胞と培地とを含む細胞培養物。

【請求項32】

以下：
ａ）請求項２８～３０のいずれか１項に記載の１つ又は複数の組換え細胞を提供すること；及び
ｂ）前記細胞が、前記組換え核酸分子によってコードされるポリペプチドを産生するように、１つ又は複数の組換え細胞を培地中で培養すること、
を含む、組換えポリペプチドを生成するための方法。

【請求項33】

前記生成されたポリペプチドを単離及び／又は精製することをさらに含む、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

前記産生されたポリペプチドを構造的に修飾して半減期を延長させることをさらに含む、請求項３２又は３３に記載の方法。

【請求項35】

前記修飾が、ヒトＦｃ抗体断片への融合、アルブミンへの融合、及びＰＥＧ化からなる群から選択される１つ又は複数の改変を含む、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

請求項３２～３５のいずれか１項に記載の方法によって産生される組換えポリペプチド。

【請求項37】

以下：
ａ）請求項１～２４及び３６のいずれか１項に記載の組換えポリペプチド；
ｂ）請求項２５～２７のいずれか１項に記載の組換え核酸；
ｃ）請求項２８～３０のいずれか１項に記載の組換え細胞；及び／又は
ｃ）医薬的に許容し得る担体、
を含む、医薬組成物。

【請求項38】

請求項１～２４及び３６のいずれか１項に記載の組換えポリペプチドと、医薬的に許容し得る担体とを含む、請求項３７に記載の医薬組成物。

【請求項39】

請求項２５～２７のいずれか１項に記載の組換え核酸と、医薬的に許容し得る担体とを含む、請求項３７に記載の医薬組成物。

【請求項40】

対象におけるＩＬ－１２媒介シグナル伝達を調節する方法であって、以下：
ａ）請求項１～２４及び３６のいずれか１項に記載の組換えＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチド；
ｂ）請求項２５～２７のいずれか１項に記載の組換え核酸；
ｃ）請求項２８～３０のいずれか１項に記載の組換え細胞；及び／又は
ｄ）請求項３７～３９に記載の医薬組成物、
を含む組成物を対象に投与することを含む、方法。

【請求項41】

対象に、ＩＬ－１２ｐ３５ポリペプチド、又はＩＬ－１２ｐ３５ポリペプチドをコードする核酸を投与することをさらに含む、請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

対象におけるＩＬ－２３媒介シグナル伝達を調節する方法であって、以下：
ａ）請求項１～２４及び３６のいずれか１項に記載の組換えＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチド；
ｂ）請求項２５～２７のいずれか１項に記載の組換え核酸；
ｃ）請求項２８～３０のいずれか１項に記載の組換え細胞；及び／又は
ｄ）請求項３７～３９に記載の医薬組成物、
を含む組成物を対象に投与することを含む、方法。

【請求項43】

ＩＬ－１２ｐ３５ポリペプチド、又はＩＬ－２３ｐ１９ポリペプチドをコードする核酸を対象に投与することをさらに含む、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

それを必要とする対象における状態の治療のための方法であって、以下：
ａ）請求項１～２４及び３６のいずれか１項に記載の組換えＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチド；
ｂ）請求項２５～２７のいずれか１項に記載の組換え核酸；
ｃ）請求項２８～３０のいずれか１項に記載の組換え細胞；及び／又は
ｄ）請求項３７～３９に記載の医薬組成物、
を含む組成物を対象に投与することを含む、方法。

【請求項45】

以下：
ａ）ＩＬ－１２ｐ３５ポリペプチド；
ｂ）ＩＬ－２３ｐ１９ポリペプチド；及び／又は
ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）をコードする核酸、
を対象に投与することをさらに含む、請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

前記組換えポリペプチドが、前記１つ又は複数のアミノ酸置換を欠く参照ポリペプチドの結合親和性と比較して、インターロイキン－１２受容体、ベータ１（ＩＬ－１２Ｒβ１）に対して改変された結合親和性を有する、請求項４０～４５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項47】

前記組換えポリペプチドが、前記１つ又は複数のアミノ酸置換を欠く参照ポリペプチドの結合親和性と比較して、ＩＬ－１２Ｒβ１に対して低下した結合親和性を有する、請求項４０～４６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項48】

表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した場合、前記組換えポリペプチドが、前記１つ又は複数のアミノ酸置換を欠く参照ポリペプチドの結合親和性と比較して、ＩＬ－１２Ｒβ１に対して約１０％～約１００％低下した結合親和性を有する、請求項４０～４７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項49】

ＩＬ－１２Ｒβ１受容体に対する組換えポリペプチドの結合親和性の低下が、前記１つ又は複数のアミノ酸置換を欠く参照ポリペプチドと比較して、ＳＴＡＴ４媒介シグナル伝達の低下をもたらす、請求項４０～４８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項50】

ＩＬ－１２Ｒβ１受容体に対する組換えポリペプチドの結合親和性の低下が、前記１つ又は複数のアミノ酸置換を欠く参照ポリペプチドと比較して、ＳＴＡＴ３媒介シグナル伝達の低下をもたらす、請求項４０～４９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項51】

前記ＳＴＡＴ３シグナル伝達及び／又はＳＴＡＴ４シグナル伝達が、遺伝子発現アッセイ、ホスホフローシグナル伝達アッセイ、及び酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）からなる群から選択されるアッセイによって決定される、請求項４９～５０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項52】

前記投与された組成物が、前記１つ又は複数のアミノ酸置換を欠く参照ポリペプチドと比較して、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）及び／又はインターロイキン２３（ＩＬ－２３）によって媒介される下流シグナル伝達の細胞型に偏ったシグナル伝達をもたらす、請求項４０～５１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項53】

前記細胞型に偏ったシグナル伝達が、ＮＫ細胞におけるＩＬ－１２媒介シグナル伝達を刺激する組換えポリペプチドの能力の低下を含む、請求項５２に記載の方法。

【請求項54】

前記細胞型に偏ったシグナル伝達が、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＩＬ－１２シグナル伝達を刺激する組換えポリペプチドの実質的に改変されていない能力を含む、請求項５２～５３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項55】

前記投与された組成物が、ＮＫ細胞においてＩＬ－１２シグナル伝達を刺激する組換えポリペプチドの能力の低下をもたらすが、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＩＬ－１２シグナル伝達を刺激するその能力は実質的に保持する、請求項４０～５４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項56】

前記投与された組成物が、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるインターフェロンガンマ（ＩＮＦγ）の発現を刺激する組換えポリペプチドの能力を実質的に保持する、請求項５５に記載の方法。

【請求項57】

前記投与された組成物が、腫瘍微小環境における抗腫瘍免疫を増強する、請求項４０～５６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項58】

前記対象が哺乳動物である、請求項４０～５７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項59】

前記哺乳動物がヒトである、請求項５８に記載の方法。

【請求項60】

前記対象が、ＩＬ－１２ｐ４０媒介シグナル伝達に関連する状態を有するか、又は有する疑いがある、請求項４０～５９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項61】

前記ＩＬ－１２ｐ４０媒介シグナル伝達がＩＬ－１２媒介シグナル伝達又はＩＬ－２３媒介シグナル伝達である、請求項６０に記載の方法。

【請求項62】

前記状態が、癌、免疫疾患、又は慢性感染症である、請求項６０に記載の方法。

【請求項63】

前記免疫疾患が自己免疫疾患である、請求項６２に記載の方法。

【請求項64】

前記自己免疫疾患が、関節リウマチ、インスリン依存性糖尿病、溶血性貧血、リウマチ熱、甲状腺炎、クローン病、重症筋無力症、糸球体腎炎、自己免疫性肝炎、多発性硬化症、円形脱毛症、乾癬、白斑、異栄養性表皮水疱症、全身性エリテマトーデス、中度から重度の尋常性乾癬、乾癬性関節炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、及び移植片対宿主病からなる群から選択される、請求項６３に記載の方法。

【請求項65】

前記状態が、急性骨髄腫性白血病、未分化リンパ腫、星状細胞腫、Ｂ細胞癌、乳癌、結腸癌、上衣腫、食道癌、神経膠芽腫、神経膠腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、肝臓癌、肺癌、マントル細胞リンパ腫、メラノーマ、神経芽細胞腫、非小細胞肺癌、乏突起膠腫、卵巣癌、膵臓癌、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、腎癌、肉腫、胃癌、癌腫、中皮腫、及び肉腫からなる群から選択される癌である、請求項６２に記載の方法。

【請求項66】

前記組成物が、第１の治療として個別に、又は第２の治療と組み合わせて、対象に投与される、請求項４０～６５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項67】

前記第２の治療が、化学療法、放射線療法、免疫療法、ホルモン療法、毒素療法、又は手術からなる群から選択される、請求項６６に記載の方法。

【請求項68】

前記第１の治療及び前記第２の治療が付随して投与される、請求項６６～６７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項69】

前記第１の治療が第２の治療と同時に投与される、請求項６６～６８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項70】

前記第１の治療及び第２の治療が連続して投与される、請求項６６～６８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項71】

前記第１の治療が第２の治療の前に投与される、請求項７０に記載の方法。

【請求項72】

前記第１の治療が第２の治療の後に投与される、請求項７０に記載の方法。

【請求項73】

前記第１の治療が第２の治療の前及び／又は後に投与される、請求項７０に記載の方法。

【請求項74】

前記第１の治療と第２の治療が順番に投与される、請求項６６～７３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項75】

前記第１の治療と第２の治療が単一の製剤で一緒に投与される、請求項６６又は６７に記載の方法。

【請求項76】

前記ＩＬ－１２ｐ４０媒介シグナル伝達を調節するための、ＩＬ－１２ｐ４０媒介シグナル伝達を調節するための、又はそれを必要とする対象の状態を治療するためのキットであって、以下：、
ａ）請求項１～２４及び３６のいずれか１項に記載の組換えポリペプチド；
ｂ）請求項２５～２７のいずれか１項に記載の組換え核酸；
ｃ）請求項２８～３１のいずれか１項に記載の組換え細胞；及び／又は
ｄ）請求項３７～３９のいずれか１項に記載の医薬組成物；及び
請求項４０～７５のいずれか１項に記載の方法を実施するための説明書、
を含む、キット。

【請求項77】

前記ＩＬ－１２－ｐ４０媒介シグナル伝達の混乱に関連する健康状態に関連する状態を治療及び／又は予防するための医薬品の製造のための、以下：
ａ）請求項１～２４及び３６のいずれか１項に記載の組換えポリペプチド；
ｂ）請求項２５～２７のいずれか１項に記載の組換え核酸；
ｃ）請求項２８～３１のいずれか１項に記載の組換え細胞；及び／又は
ｄ）請求項３７～３９のいずれか１項に記載の医薬組成物、
の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

連邦政府が支援する研究開発に関する声明
本発明は、国立衛生研究所によって授与された契約ＡＩ０５１３２１及びＣＡ１７７６８４の下で政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。

【0002】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年４月１７日に出願された米国仮特許出願第６３／０１１，７４２号、及び２０２１年２月１７日に出願された米国仮特許出願第６３／１５０，４５１号に対する優先権の利益を主張する。上で参照した出願の開示は、任意の図面を含め、その全体が参照により明示的に本明細書に取り込まれる。

【0003】

配列表の取り込み
添付の配列表の資料は、参照により本出願に取り込まれる。０７８４３０－５１７００１ＷＯ－Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔという名前の付随する配列表テキストファイルは、２０２１年４月１２日に作成され、７６．５ＫＢである。

【0004】

分野
本開示は、一般に、ＩＬ－１２及びＩＬ－２３によって媒介されるシグナル伝達を調節するための組成物及び方法に関する。特に、本開示は、ＩＬ－１２Ｒβ１に対して低下した結合親和性を有する新規ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドバリアントを提供する。そのようなＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドバリアントを産生するために有用な組成物及び方法、並びにＩＬ－１２ｐ４０媒介シグナル伝達を調節するための、及び／又はＩＬ－１２ｐ４０によって媒介されるシグナル伝達の混乱に関連する状態の治療のための方法も提供される。

【背景技術】

【0005】

背景
健康状態及び疾患の治療のための治療用タンパク質を含有するバイオ医薬品又は医薬製剤の使用は、多くの製薬会社及びバイオテクノロジー会社にとって中心的な戦略である。例えばサイトカインファミリーのいくつかのメンバーは、癌の治療に有効であることが報告されており、癌免疫療法の開発に大きな役割を果たしている。従って、サイトカインファミリーは、その投与と生体同化を改善するための多くの臨床研究と努力の焦点となっている。

【0006】

ＩＬ－１２ファミリーのサイトカインであるインターロイキン１２（ＩＬ－１２）とインターロイキン２３（ＩＬ－２３）は、それぞれ癌免疫療法と自己免疫疾患の最も有望な標的の１つになっている。ＩＬ－１２及びＩＬ－２３複合体は、ＩＬ－１２ｐ４０サイトカインサブユニットと細胞表面受容体ＩＬ－１２受容体ベータ１（ＩＬ－１２Ｒβ１）を共有するが、異なる下流のシグナル伝達を誘発する。特に、ＩＬ－１２はＩＬ－１２Ｒβ１とＩＬ－１２Ｒβ２の受容体複合体を介してシグナルを伝達して、ＮＫ細胞と活性化Ｔ細胞の両方でＳＴＡＴ４のリン酸化を誘導する。ＳＴＡＴ４シグナル伝達は、インターフェロン－ガンマ（ＩＦＮγ）の発現と、腫瘍細胞の殺傷の強化につながる。対照的に、ＩＬ－２３は、ＩＬ－１２Ｒβ１とＩＬ－２３Ｒで構成される受容体複合体を介してシグナルを伝達して、ＳＴＡＴ３のリン酸化とＩＬ－１７の発現を促進する。ＩＬ－２３は細胞外病原体に対する免疫において重要な役割を果たすが、異常なＩＬ－２３シグナル伝達は、複数の自己免疫疾患の発症に関連付けられている。

【0007】

サイトカインを含む既存の治療アプローチの臨床的成功は、オフターゲット毒性と多面発現のために限られており、これは主に、サイトカインが望ましい応答細胞と望ましくない応答細胞の両方に受容体を持っており、これらが、互いに相殺して望ましくない副作用につながるという事実による。例えば、ＩＬ－１２の場合、ＩＬ－１２の全身性投与は、ＮＫ細胞媒介性のＩＦＮγ産生による毒性をもたらす。

【0008】

近年、サイトカイン改変は、望ましい活性と低毒性を備えた組換えサイトカインを調製するための有望な戦略として浮上している。従って、治療薬として使用するために、ＩＬ－１２及びＩＬ－２３の特性を改善するための追加のアプローチが必要である。特にこれは、特定の下流の機能及び作用を他のものよりも選択的に活性化でき、例えばＩＬ－１２及びＩＬ－２３の多くの有益な特性を保持するが、これらの既知の毒性副作用は無く、抗腫瘍薬又は免疫調節薬としての改良された用途をもたらす、ＩＬ－１２及びＩＬ－２３のバリアントが必要とされている。

【発明の概要】

【0009】

概要
本開示は、一般に免疫学の分野に関し、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）及び／又はインターロイキン２３（ＩＬ－２３）によって媒介されるシグナル伝達経路を調節するための組成物及び方法を含む。より詳しくは、いくつかの実施形態において、本開示は、その天然の受容体であるインターロイキン１２受容体サブユニットベータ１（ＩＬ－１２Ｒβ１）に対する結合親和性が変化した、様々な組換えインターロイキン１２サブユニットｐ４０（ＩＬ－１２ｐ４０）ポリペプチドを提供する。以下により詳細に記載するように、ＩＬ－１２ｐ４０を調節して、異なるレベルのＳＴＡＴ３媒介シグナル伝達及び／又はＳＴＡＴ４媒介シグナル伝達を達成することができる。本開示のいくつかの実施形態は、細胞型に偏ったＩＬ－１２ｐ４０シグナル伝達をもたらすことができるＩＬ－１２ｐ４０部分アゴニストを提供する。いくつかの実施形態は、細胞型に偏ったＩＬ－１２シグナル伝達を付与、例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞中の低下したＩＬ－１２シグナル伝達を付与することができるが、ＣＤ８＋Ｔ細胞中のＩＬ－１２シグナル伝達は実質的に保持することができるＩＬ－１２ｐ４０部分アゴニストを提供する。また、そのようなＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドバリアントを産生するのに有用な組成物及び方法、対象におけるＩＬ－１２ｐ４０媒介シグナル伝達を調節する方法、並びにＩＬ－１２ｐ４０の下流のシグナル伝達、例えばＩＬ－１２シグナル伝達及び／又はＩＬ－２３シグナル伝達などの混乱に関連する状態の治療方法も提供される。

【0010】

１つの態様において、以下を含む組換えポリペプチドが本明細書に提供される：（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を有するＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドと少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列；及びさらに、配列番号１のＸ３７、Ｘ３９、Ｘ４０、Ｘ４１、Ｘ８０、Ｘ８１、Ｘ８２、Ｘ１０６、Ｘ１０８、Ｘ１１５、Ｘ２１６、Ｘ２１７、Ｘ２１８、及びＸ２１９からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置に１つ又は複数のアミノ酸置換。

【0011】

開示された組換えポリペプチドの非限定的な例示的実施形態は、以下の特徴の１つ又は複数を含むことができる。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のアミノ酸置換は、配列番号１のＸ３９、Ｘ４０、Ｘ８１、Ｘ８２、Ｘ１０６、Ｘ２１７、及びＸ２１９からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置にある。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のアミノ酸置換は、アラニン（Ａ）置換、アルギニン（Ｒ）置換、アスパラギン（Ｎ）置換、アスパラギン酸（Ｄ）置換、ロイシン（Ｌ）置換、リジン（Ｋ）置換、フェニルアラニン（Ｆ）置換、リジン置換、グルタミン（Ｑ）置換、グルタミン酸（Ｅ）置換、セリン（Ｓ）置換、及びスレオニン（Ｔ）置換、並びにこれらの任意の組み合わせからなる群から独立して選択される。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のアミノ酸置換は、配列番号１のＷ３７、Ｐ３９、Ｄ４０、Ａ４１、Ｋ８０、Ｅ８１、Ｆ８２、Ｋ１０６、Ｅ１０８、Ｄ１１５、Ｈ２１６、Ｋ２１７、Ｌ２１８、及びＫ２１９からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置にある。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のアミノ酸置換は、配列番号１のＷ３７、Ｐ３９、Ｄ４０、Ｅ８１、Ｆ８２、Ｋ１０６、Ｋ２１７、及びＫ２１９からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置にある。

【0012】

いくつかの実施形態において、本開示の組換えポリペプチドは、配列番号１と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び以下のアミノ酸置換に対応するアミノ酸置換をさらに含む：（ａ）Ｗ３７Ａ；（ｂ）Ｐ３９Ａ、（ｃ）Ｄ４０Ａ、（ｄ）Ｅ８１Ａ、（ｅ）Ｆ８２Ａ、（ｆ）Ｋ１０６Ａ、（ｇ）Ｄ１０９Ａ、（ｈ）Ｋ２１７Ａ、（ｉ）Ｋ２１９Ａ、（ｊ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ、（ｋ）Ｗ３７Ａ／Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ、（ｌ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ａ、（ｍ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ａ／Ｋ２１９Ａ、（ｎ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ａ／Ｋ２１７Ａ、（ｏ）８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ａ／Ｅ１０８Ａ／Ｄ１１５Ａ、（ｐ）Ｅ８１Ｆ／Ｆ８２Ａ、（ｑ）Ｅ８１Ｋ／Ｆ８２Ａ、（ｒ）Ｅ８１Ｌ／Ｆ８２Ａ、（ｓ）Ｅ８１Ｈ／Ｆ８２Ａ、（ｔ）Ｅ８１Ｓ／Ｆ８２Ａ、（ｕ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ｎ、（ｖ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ｑ、（ｗ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ｔ、（ｘ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ｒ、又は（ｙ）Ｐ３９Ａ／Ｄ４０Ａ／Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ。いくつかの実施形態において、本開示の組換えポリペプチドは、配列番号３～８及び１３～１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0013】

１つの態様において、本開示のいくつかの実施形態は以下を含むポリペプチドに関する：（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有するＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドと少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列；（ｂ）及びさらに、配列番号２のＸ３７、Ｘ３９、Ｘ４０、Ｘ４１、Ｘ８０、Ｘ８１、Ｘ８２、Ｘ１０６、Ｘ１０８、Ｘ１１５、Ｘ２１６、Ｘ２１７、Ｘ２１８、及びＸ２１９からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置に１つ又は複数のアミノ酸置換。

【0014】

いくつかの実施形態において、１つ又は複数のアミノ酸置換は、配列番号２のＸ３７、Ｘ３９、Ｘ４０、Ｘ８１、Ｘ８２、Ｘ１０６、Ｘ２１７、及びＸ２１９からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置にある。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のアミノ酸置換は、アラニン（Ａ）置換、アルギニン（Ｒ）置換、アスパラギン（Ｎ）置換、アスパラギン酸（Ｄ）置換、ロイシン（Ｌ）置換、リジン（Ｋ）置換、フェニルアラニン（Ｆ）置換、リジン置換、グルタミン（Ｑ）置換、グルタミン酸（Ｅ）置換、セリン（Ｓ）置換、及びスレオニン（Ｔ）置換からなる群から独立して選択される。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のアミノ酸置換は、配列番号２のＷ３７、Ｐ３９、Ｄ４０、Ａ４１、Ｋ８０、Ｅ８１、Ｆ８２、Ｋ１０６、Ｅ１０８、Ｄ１１５、Ｈ２１６、Ｋ２１７、Ｌ２１８、及びＥ２１９からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置にある。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のアミノ酸置換は、配列番号２のＷ３７、Ｐ３９、Ｄ４０、Ｅ８１、Ｆ８２、Ｋ１０６、Ｋ２１７、及びＥ２１９からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置にある。

【0015】

いくつかの実施形態において、本開示の組換えポリペプチドは、配列番号２と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び以下のアミノ酸置換に対応するアミノ酸置換をさらに含む：（ａ）Ｗ３７Ａ；（ｂ）Ｐ３９Ａ、（ｃ）Ｄ４０Ａ、（ｄ）Ｅ８１Ａ、（ｅ）Ｆ８２Ａ、（ｆ）Ｋ１０６Ａ、（ｇ）Ｄ１０９Ａ、（ｈ）Ｋ２１７Ａ、（ｉ）Ｅ２１９Ａ、（ｊ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ、（ｋ）Ｗ３７Ａ／Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ、（ｌ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ａ、（ｍ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ａ／Ｋ２１７Ａ、（ｎ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ、（ｏ）Ｅ８１Ｋ／Ｆ８２Ａ、（ｐ）Ｅ８１Ｌ／Ｆ８２Ａ、（ｑ）Ｅ８１Ｈ／Ｆ８２Ａ、（ｒ）Ｅ８１Ｓ／Ｆ８２Ａ、（ｓ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ｎ、（ｔ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ｑ、（ｕ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ｔ、（ｖ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ｒ、又は（ｗ）Ｐ３９Ａ／Ｄ４０Ａ／Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、配列番号９～１１及び１７～２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0016】

いくつかの実施形態において、本開示の組換えポリペプチドは、１つ又は複数のアミノ酸置換を欠く参照ポリペプチドの結合親和性と比較して、インターロイキン－１２受容体ベータ１（ＩＬ－１２Ｒβ１）に対して改変された結合親和性を有する。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、１つ又は複数のアミノ酸置換を欠く参照ポリペプチドの結合親和性と比較して、ＩＬ－１２Ｒβ１に対して低下した結合親和性を有する。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定すると、１つ又は複数のアミノ酸置換を欠く参照ポリペプチドの結合親和性と比較して、ＩＬ－１２Ｒβ１に対する結合親和性が約１０％～約１００％低下している。いくつかの実施形態において、本開示の組換えポリペプチドは、インターロイキン１２サブユニットｐ３５（ＩＬ－１２ｐ３５）ポリペプチドと組み合わせると、１つ又は複数のアミノ酸置換を欠く参照ポリペプチドと比較して、ＳＴＡＴ４シグナル伝達を刺激する能力が低下している。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、インターロイキン２３サブユニットｐ１９（ＩＬ－２３ｐ１９）ポリペプチドと組み合わせると、１つ又は複数のアミノ酸置換を欠く参照ポリペプチドと比較して、ＳＴＡＴ３シグナル伝達を刺激する能力が低下している。いくつかの実施形態において、ＳＴＡＴ３シグナル伝達及び／又はＳＴＡＴ４シグナル伝達は、遺伝子発現アッセイ、ホスホフローシグナル伝達アッセイ、及び酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）からなる群から選択されるアッセイによって決定される。

【0017】

いくつかの実施形態において、開示された組換えポリペプチドにおける１つ以上のアミノ酸置換は、１つ又は複数のアミノ酸置換を欠く参照ポリペプチドと比較して、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）及び／又はインターロイキン－２３（ＩＬ－２３）に媒介される下流のシグナル伝達の細胞型に偏ったシグナル伝達をもたらす。いくつかの実施形態において、細胞型に偏ったシグナル伝達は、ＮＫ細胞においてＩＬ－１２媒介シグナル伝達を刺激する組換えポリペプチドの能力の低下を含む。いくつかの実施形態において、細胞型に偏ったシグナル伝達は、ＣＤ８＋Ｔ細胞においてＩＬ－１２シグナル伝達を刺激する組換えポリペプチドの実質的に改変されていない能力を含む。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のアミノ酸置換は、ＮＫ細胞においてＩＬ－１２シグナル伝達を刺激する組換えポリペプチドの能力の低下をもたらすが、ＣＤ８＋Ｔ細胞においてＩＬ－１２シグナル伝達を刺激するその能力は実質的に保持する。

【0018】

別の態様において、組換え核酸が本明細書で提供され、ここで核酸は、本開示のポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含む。

【0019】

開示された核酸分子の非限定的な例示的実施形態は、以下の特徴の１つ又は複数を含むことができる。いくつかの実施形態において、核酸配列は、異種核酸配列に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、核酸分子は、発現カセット又は発現ベクターとしてさらに定義される。

【0020】

１つの態様において、本開示のいくつかの実施形態は組換え細胞に関し、ここで組換え細胞は、（ａ）本開示の組換えポリペプチド；及び（ｂ）本開示の組換え核酸のうちの１つ又は複数を含む。いくつかの実施形態において、組換え細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態において、真核細胞は哺乳動物細胞である。関連する態様において、本開示のいくつかの実施形態は、本開示の少なくとも１つの組換え細胞及び培地を含む細胞培養物に関する。

【0021】

別の態様において、本開示のいくつかの実施形態は、ポリペプチドを産生するための方法に関し、ここで、この方法は、（ａ）本開示の１つ又は複数の組換え細胞を提供すること、及び（ｂ）細胞が組換え核酸分子によってコードされるポリペプチドを産生するように、培地中で１つ又は複数の組換え細胞を培養すること、を含む。

【0022】

いくつかの実施形態において、本開示のポリペプチドを産生する方法は、産生されたポリペプチドを単離及び／又は精製することをさらに含む。いくつかの実施形態において、本開示のポリペプチドを産生する方法は、産生されたポリペプチドを構造的に修飾して、半減期を延長させることをさらに含む。いくつかの実施形態において、修飾は、ヒトＦｃ抗体断片への融合、アルブミンへの融合、及びＰＥＧ化からなる群から選択される１つ又は複数の改変を含む。従って、関連する態様において、本開示の方法によって産生される組換えポリペプチドも本明細書に提供される。

【0023】

１つの態様において、本開示のいくつかの実施形態は医薬組成物に関し、ここで医薬組成物は以下のうちの１つ又は複数を含む：（ａ）本開示の組換えポリペプチド；（ｂ）本開示の組換え核酸；（ｃ）本開示の組換え細胞；及び（ｄ）医薬的に許容し得る担体。

【0024】

開示された医薬組成物の非限定的な例示的実施形態は、以下の特徴の１つ又は複数を含むことができる。いくつかの実施形態において、組成物は、本開示の組換えポリペプチドと医薬的に許容し得る担体とを含む。いくつかの実施形態において、組成物は、本開示の組換え細胞と医薬的に許容し得る担体とを含む。いくつかの実施形態において、組換え細胞は、本開示の組換えポリペプチドを発現する。治療用ポリペプチドを発現し分泌するように遺伝子修飾された組換え細胞の例は、既に、例えば、Ｓｔｅｉｄｌｅｒ Ｌ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ２１， Ｎｏ． ７， Ｊｕｌｙ ２００３ ａｎｄ Ｏｈ Ｊ．Ｈ ｅｔ ａｌ．， ｍＳｐｈｅｒｅ， Ｖｏｌ． ５， Ｉｓｓｕｅ ３， Ｍａｙ／Ｊｕｎｅ ２０２０ に記載されている。いくつかの実施形態において、組成物は、本開示の組換え核酸と医薬的に許容し得る担体とをＩＣ。いくつかの実施形態において、組成物は、本開示の組換え細胞と医薬的に許容し得る担体とを含む。

【0025】

１つの態様において、本開示のいくつかの実施形態は、対象におけるＩＬ－１２ｐ４０媒介シグナル伝達を調節するための方法に関し、この方法は、対象に以下のうちの１つ又は複数を含む組成物を投与することを含む：（ａ）本開示の組換えＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチド；（ｂ）本開示の組換え核酸；（ｃ）本開示の組換え細胞；及び（ｄ）本開示の医薬組成物。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２ｐ４０媒介シグナル伝達は、ＩＬ－１２媒介シグナル伝達を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２ｐ４０シグナル伝達は、ＩＬ－２３媒介シグナル伝達を含む。

【0026】

従って、本開示のいくつかの実施形態は、対象におけるＩＬ－１２媒介シグナル伝達を調節するための方法に関し、ここで、この方法は、対象に以下の１つ又は複数を含む組成物を投与することを含む：（ａ）本開示の組換えＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチド；（ｂ）本開示の組換え核酸；（ｃ）本開示の組換え細胞；及び（ｄ）本開示の医薬組成物。いくつかの実施形態において、この方法は、対象に、ＩＬ－１２ｐ３５ポリペプチド、又はＩＬ－１２ｐ３５ポリペプチドをコードする核酸を投与することをさらに含む。

【0027】

いくつかの実施形態において、対象におけるＩＬ－２３媒介シグナル伝達を調節するための方法が提供され、ここで、この方法は、対象に以下の１つ又は複数を含む組成物を投与することを含む：（ａ）本開示の組換えＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチド；（ｂ）本開示の組換え核酸；（ｃ）本開示の組換え細胞；及び（ｄ）本開示の医薬組成物。いくつかの実施形態において、この方法は、対象に、ＩＬ－２３ｐ１９（ｐ１９）ポリペプチド、又はＩＬ－２３ｐ１９ポリペプチドをコードする核酸を投与することをさらに含む。

【0028】

別の態様において、対象における状態の治療のための様々な方法が本明細書で提供され、この方法は、対象に以下の１つ又は複数を含む組成物を投与することを含む：（ａ）本開示の組換えＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチド；（ｂ）本開示の組換え核酸；（ｃ）本開示の組換え細胞；及び（ｄ）本開示の医薬組成物。いくつかの実施形態において、この方法は、対象に以下の１つ又は複数を含む組成物を投与することをさらに含む：（ａ）ＩＬ－１２ｐ３５（ｐ３５）ポリペプチド；（ｂ）ＩＬ－２３ｐ１９ポリペプチド；及び、（ｃ）（ａ）又は（ｂ）をコードする核酸。

【0029】

対象におけるＩＬ－１２ｐ４０媒介シグナル伝達を調節するための、及び／又はそれを必要とする対象における状態の治療のための、開示された方法の非限定的な例示的実施形態は、以下の特徴の１つ又は複数を含み得る。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、１つ又は複数のアミノ酸置換を欠く参照ポリペプチドの結合親和性と比較して、インターロイキン－１２受容体サブユニットベータ１（ＩＬ－１２Ｒβ１）に対して改変された結合親和性を有する。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、１つ又は複数のアミノ酸置換を欠く参照ポリペプチドの結合親和性と比較して、ＩＬ－１２Ｒβ１に対して低下した結合親和性を有する。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により決定すると、１つ又は複数のアミノ酸置換を欠く参照ポリペプチドの結合親和性と比較して、ＩＬ－１２Ｒβ１に対して約１０％～約１００％低下した結合親和性を有する。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２Ｒβ１受容体に対する組換えポリペプチドの低下した結合親和性は、１つ又は複数のアミノ酸置換を欠く参照ポリペプチドと比較して、ＳＴＡＴ４媒介シグナル伝達の低下をもたらす。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２Ｒβ１受容体に対する組換えポリペプチドの低下した結合親和性は、１つ又は複数のアミノ酸置換を欠く参照ポリペプチドと比較して、ＳＴＡＴ３媒介シグナル伝達の低下をもたらす。いくつかの実施形態において、ＳＴＡＴ３シグナル伝達及び／又はＳＴＡＴ４シグナル伝達は、遺伝子発現アッセイ、ホスホフローシグナル伝達アッセイ、及び酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）からなる群から選択されるアッセイによって決定される。

【0030】

いくつかの実施形態において、投与された組成物は、１つ又は複数のアミノ酸置換を欠く参照ポリペプチドと比較して、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）及び／又はインターロイキン－２３（ＩＬ－２３）により媒介される下流のシグナル伝達の、細胞型に偏ったシグナル伝達をもたらす。いくつかの実施形態において、細胞型に偏ったシグナル伝達は、ＮＫ細胞においてＩＬ－１２媒介シグナル伝達を刺激する組換えポリペプチドの能力の低下を含む。いくつかの実施形態において、細胞型に偏ったシグナル伝達は、ＣＤ８＋Ｔ細胞においてＩＬ－１２シグナル伝達を刺激する組換えポリペプチドの実質的に改変されていない能力を含む。いくつかの実施形態において、投与された組成物は、ＮＫ細胞においてＩＬ－１２媒介シグナル伝達を刺激する組換えポリペプチドの能力の低下をもたらすが、ＣＤ８＋Ｔ細胞においてＩＬ－１２シグナル伝達を刺激するその能力は実質的に保持する。いくつかの実施形態において、投与された組成物は、ＣＤ８＋Ｔ細胞においてＩＮＦγの発現を刺激する組換えポリペプチドの能力を実質的に保持する。いくつかの実施形態において、投与された組成物は、腫瘍微小環境において抗腫瘍免疫を増強する。

【0031】

いくつかの実施形態において、対象は哺乳動物である。いくつかの実施形態において、哺乳動物はヒトである。いくつかの実施形態において、対象は、ＩＬ－１２ｐ４０媒介シグナル伝達に関連する状態を有するか、又は有する疑いがある。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２ｐ４０媒介シグナル伝達は、ＩＬ－１２媒介シグナル伝達又はＩＬ－２３媒介シグナル伝達である。いくつかの実施形態において、状態は癌、免疫疾患、又は慢性感染症である。いくつかの実施形態において、免疫疾患は自己免疫疾患である。いくつかの実施形態において、自己免疫疾患は、関節リウマチ、インスリン依存性糖尿病、溶血性貧血、リウマチ熱、甲状腺炎、クローン病、重症筋無力症、糸球体腎炎、自己免疫性肝炎、多発性硬化症、円形脱毛症、乾癬、白斑、異栄養性表皮水疱症、全身性エリテマトーデス、中度から重度の尋常性乾癬、乾癬性関節炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、及び移植片対宿主病からなる群から選択される。

【0032】

いくつかの実施形態において、それを必要とする対象における状態の治療のための様々な方法が本明細書で提供され、ここで、状態は、急性骨髄腫性白血病、未分化リンパ腫、星細胞腫、Ｂ細胞癌、乳癌、結腸癌、上衣腫、食道癌、神経膠芽腫、神経膠腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、肝臓癌、肺 癌、マントル細胞リンパ腫、メラノーマ、神経芽細胞腫、非小細胞肺癌、乏突起膠腫、卵巣癌、膵臓癌、末梢性T細胞リンパ腫、腎癌、肉腫、胃癌、癌腫、中皮腫、及び肉腫からなる群から選択される癌である。

【0033】

いくつかの実施形態において、組成物は、第１の治療として個別に、又は第２の治療と組み合わせて対象に投与される。いくつかの実施形態において、第２の治療は、化学療法、放射線療法、免疫療法、ホルモン療法、毒素療法、又は手術からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、第１の治療と第２の治療は付随して施される。いくつかの実施形態において、第１の治療は第２の治療と同時に施される。いくつかの実施形態において、第１の治療と第２の治療は連続して施される。いくつかの実施形態において、第１の治療は第２の治療の前に施される。いくつかの実施形態において、第１の治療は第２の治療の後に施される。いくつかの実施形態において、第１の治療は第２の治療の前及び／又は後に施される。いくつかの実施形態において、第１の治療と第２の治療は交代で施される。いくつかの実施形態において、第１の治療と第２の治療は、単一の製剤で一緒に施される。

【0034】

別の態様において、本開示のいくつかの実施形態は、本明細書に開示された方法を実施するためのキットに関する。いくつかの実施形態は、対象におけるＩＬ－１２ｐ４０媒介シグナル伝達を調節する方法のためのキットに関し、ここでキットは、本開示の組換えポリペプチド；本開示の組換え核酸；本開示の組換え細胞；及び本開示の医薬組成物、並びに本明細書に開示された方法を実施するための説明書のうちの１つ又は複数を含む。いくつかの実施形態は、それを必要とする対象における状態の治療方法のためのキットに関し、ここで、キットは、本開示の組換えポリペプチド；本開示の組換え核酸；本開示の組換え細胞；及び本開示の医薬組成物、並びに本明細書に開示された方法を実施するための説明書のうちの１つ又は複数を含む。

【0035】

本開示のさらに別の態様は、ＩＬ－１２ｐ４０媒介シグナル伝達の混乱に関連する状態を有するか又は有することが疑われる個体を治療するための、本開示の核酸分子、本開示の組換え細胞、又は本開示の医薬組成物のうちの１つ又は複数の使用である。

【0036】

前述の概要は、例示のみを目的としており、決して限定することを意図していない。本明細書に記載の例示的な実施形態及び特徴に加えて、本開示のさらなる態様、実施形態、目的、及び特徴は、図面、詳細な説明、及び特許請求の範囲から完全に明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0037】

【図1A】図１Ａ～１Ｅは、４成分ＩＬ－２３複合体の構造を示す。図１Ａ：ＩＬ－１２ファミリーのサイトカイン組成と受容体の使用の概略。

【図1B】図１Ａ～１Ｂ：ＩＬ－２３受容体複合体の側面図。

【図1C-1E】図１Ｃ～１Ｅ：ＩＬ－２３と受容体サブユニット間の３つの相互作用部位間の相互作用を強調する拡大図。

【0038】

【図2A】図２Ａ～２Ｈは、ＩＬ－１２ｐ４０がＩＬ－１２及びＩＬ－２３シグナル伝達において保存された役割を果たすことを証明するために実施された実験からの結果を概略的に要約する。図２Ａ：ＩＬ－１２ｐ４０はＩＬ－１２Ｒβ１に直接結合する。固定化ＩＬ－１２ｐ４０へのＩＬ－１２Ｒβ１の結合を示す表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーグラム。解離定数（Ｋ_D）は定常状態の親和性モデルを使用して決定された。

【図2B-2C】図２Ｂ～２Ｃ：ＩＬ－１２及びＩＬ－２３は、ＣＤ４＋Ｔ細胞における異なるパターンのＳＴＡＴリン酸化を誘発する。ＣＤ４＋Ｔ細胞を２．５μｇのαＣＤ３、５μｇαＣＤ２８、及び１００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ－２で２日間活性化し、一晩休ませ、ＩＬ－１２又はＩＬ－２３で２０分間刺激した後、固定、透過処理をして、フローサイトメトリーによりＳＴＡＴリン酸化の評価を行った。（Ｄ～Ｆ）ＩＬ－１２ｐ４０の共有界面は、ＩＬ－１２及びＩＬ－２３シグナル伝達を調節する。

【図2D】図２Ｄ：ＩＬ－１２ｐ４０とＩＬ－１２Ｒβ１の間の相互作用を示すリボン図。挿入図は、突然変異誘発の標的となるアミノ酸の位置を示す。

【図2E-2F】図２Ｅ：ＩＬ－１２ｐ４０変異体は、ＣＤ４＋Ｔ細胞において変化したＩＬ－１２ｐＳＴＡＴ４シグナル伝達を誘発する。ＩＬ－１２ｐ４０バリアントをＩＬ－１２ｐ３５と共発現させ、ＣＤ４＋Ｔ細胞芽球においてＳＴＡＴ４シグナル伝達を刺激する能力を試験した。図２Ｆ：ＩＬ－１２ｐ４０変異体は、ＣＤ４＋Ｔ細胞において変化したＩＬ－２３ｐＳＴＡＴ３シグナル伝達を誘発する。ＩＬ－１２ｐ４０バリアントをＩＬ－２３ｐ１９と共発現させ、ＣＤ４＋Ｔ細胞芽球においてＳＴＡＴ３シグナル伝達を刺激する能力を試験した。

【図2G】図２Ｇ：ＩＬ－１２Ｒβ１界面のアミノ酸を示す挿入図を含むＩＬ－１２ｐ４０のリボン図。

【図2H】図２Ｈ：ＩＬ－１２ｐ４０バリアントのＳＴＡＴ４シグナル伝達。ＩＬ－１２ｐ４０バリアントをＩＬ－１２ｐ３５と共発現させ、ＣＤ４＋Ｔ細胞芽球においてＳＴＡＴ４シグナル伝達を刺激する能力を試験した。

【0039】

【図3A】図３Ａ～３Ｄは、ＩＬ－１２ｐ４０がマウスＩＬ－１２のＳＴＡＴ４シグナル伝達を調節することを証明する実験を要約する。図３Ａ：ＩＬ－１２Ｒβ１の細胞型及び活性化状態に依存した発現。マウスＮＫ細胞（ＣＤ３－ＮＫ１．１＋）又はＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ８＋）のマウスＩＬ－１２ｐ４０四量体染色によって測定されたＩＬ－１２Ｒβ１発現レベルを示すフローサイトメトリープロット。赤線は２００ｎＭの四量体染色を示し、灰色の集団はストレプトアビジン染色のみを表す。Ｃ５７／ＢＬ６マウスの脾臓及びリンパ節の単一細胞懸濁液を、ＩＬ－１２ｐ４０四量体で直接（エクスビボ）、又は２．５μｇ／ｍＬのαＣＤ３、５μｇ／ｍＬのαＣＤ２８、及び１００ＩＵ／ｍＬのｒｍＩＬ－２（芽球）で２日間刺激した後に染色した。

【図3B】図３Ｂは、ヒトＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチド（配列番号１）及びマウスＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチド（配列番号２）の配列アラインメントを示す。アラインメントでは、保存された位置は灰色の影で示され、突然変異誘発の標的となる位置は星印で示される。

【図3C-3D】図３Ｃ～３Ｄ：ＩＬ－１２ｐ４０変異は、ＣＤ８＋Ｔ細胞芽球におけるＩＬ－１２シグナル伝達を調節する。示されたＩＬ－１２バリアント（２×Ａｌａ：Ｅ８１ＡＦ８２Ａ、３×Ａｌａ：Ｅ８１ＡＦ８２ＡＫ１０６Ａ、４×Ａｌａ：Ｅ８１ＡＦ８２ＡＫ１０６ＡＫ２１７Ａ）で２０分間刺激後のホスホ－ＳＴＡＴ４染色の用量応答（図３Ｃ）及び最高濃度での代表的なヒストグラム（図３Ｄ）。用量応答は、生物学的二重測定の平均値と標準誤差を示し、２つ以上の独立した実験を表す。

【0040】

【図4A-4B】図４Ａ～４Ｃは、本開示のいくつかの非限定的な実施形態による３つの例示的なＩＬ－１２部分アゴニストが、示差的なＩＬ－１２Ｒβ１発現に基づいて細胞型特異的応答を誘発することを証明するために実施された実験からの結果を概略的に要約する。図４Ａ：ＩＬ－１２部分アゴニストは、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮγ産生を促進する。ＯＴ－ＩＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ８＋）における細胞内ＩＦＮγの代表的なヒストグラム（左）と定量（右）。ＯＴ－Ｉ脾細胞を、１μｇ／ｍＬのＯＶＡペプチド、１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、及び１μＭのＩＬ－１２バリアントで４８時間刺激した。最後の４時間に、さらなるサイトカインの分泌を防ぐためにＧｏｌｇｉＳｔｏｐを加えた。図４Ｂ：ＩＬ－１２部分アゴニストは、ＮＫ細胞におけるＩＦＮγ誘導の減弱を示す。精製したＮＫ細胞を、１μＭのＩＬ－１２バリアントを含む５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１８で４８時間刺激した。最後の４時間に、さらなるサイトカインの分泌を防ぐためにＧｏｌｇｉＳｔｏｐを加えた。

【図4C】図４Ｃ：ＩＬ－１２部分アゴニストは、細胞型に偏った活性を示す。ＩＬ－１２及び部分アゴニストについて、野生型ＩＬ－１２に対して標準化されたＴ細胞／ＮＫ細胞におけるαＩＦＮγ ＡＦ６４７ ＭＦＩの比率が示されている。棒グラフは、生物学的二重測定の平均値と標準誤差を示し、２つ以上の独立した実験を表す。ＭＦＩ、平均蛍光強度。

【0041】

【図4D】図４Ｄ～４Ｇは、本開示のいくつかの非限定的な実施形態によるさらなる例示的なＩＬ－１２部分アゴニストが、示差的なＩＬ－１２Ｒβ１発現に基づいて細胞型特異的応答を誘発することを証明するために実施された実験からの結果を概略的に要約する。図４Ｄ：ＩＬ－１２ｐ４０変異は、ＣＤ８＋Ｔ細胞芽球におけるＩＬ－１２シグナル伝達を調節する。示されているＩＬ－１２バリアントにより２０分間の刺激後の、ホスホＳＴＡＴ４染色の用量応答。用量応答は、生物学的二重測定の平均値と標準誤差を示す。

【図4E-4F】図４Ｅ：ＩＬ－１２部分アゴニストは、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮγ産生を促進する。ＯＴ－ＩＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ８＋）における細胞内ＩＦＮγの定量。ＯＴ－Ｉ脾細胞を、１μｇ／ｍＬのＯＶＡペプチド、１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、及び１μＭのＩＬ－１２バリアントで４８時間刺激した。最後の４時間に、さらなるサイトカインの分泌を防ぐためにＧｏｌｇｉＳｔｏｐを加えた。図４Ｆ：ＩＬ－１２部分アゴニストは、ＮＫ細胞においてＩＦＮγ誘導の減弱を示す。精製したＮＫ細胞を、１μＭのＩＬ－１２バリアントを含む５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１８で４８時間刺激した。最後の４時間に、さらなるサイトカインの分泌を防ぐためにＧｏｌｇｉＳｔｏｐを加えた。

【図4G】図４Ｇ：ＩＬ－１２部分アゴニストは、細胞型に偏った活性を示す。ＩＬ－１２及び部分アゴニストについて、野生型ＩＬ－１２に対して標準化されたＴ細胞／ＮＫ細胞におけるαＩＦＮγ ＡＦ６４７ ＭＦＩの比率が示されている。棒グラフは、生物学的二重測定の平均値と標準誤差を示し、２つ以上の独立した実験を表す。ＭＦＩ、平均蛍光強度。

【0042】

【図5A-5B】図５Ａ～５Ｃは、上記図４Ａ～４Ｃに記載の例示的なＩＬ－１２部分アゴニストが、抗原特異的な腫瘍細胞死滅を促進することを証明するために実施された実験からの結果を概略的に要約する。図５Ａ～５Ｂ：ＩＬ－１２部分アゴニストの存在下で生成されたＯＴ－Ｉエフェクターからの上清は、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞に対するＭＨＣ－Ｉアップレギュレーションを増強する。ＯＴ－Ｉエフェクター上清で一晩インキュベーション後のＨ２－Ｋ^b表面発現の用量応答（図５Ａ）と代表的なヒストグラム（図５Ｂ）。矢印は、代表的なヒストグラムに示されている上清の希釈を示す。ＯＴ－Ｉエフェクターは、脾細胞を１μｇ／ｍＬのＯＶＡペプチド、１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、及び１μＭのＩＬ－１２バリアントと７２時間共培養することによって生成された。図５Ｃ－５Ｄ：ＩＬ－１２部分アゴニストは、抗原特異的な腫瘍細胞死滅の効力を増強する。

【図5C-5D】図５Ｃ：特異的死滅アッセイの概略。野生型細胞とＯＶＡ－ＧＦＰ発現Ｂ１６Ｆ１０細胞の１：１混合物を、さまざまな比率のＯＴ－Ｉエフェクターと共にインキュベートし、ＯＶＡ－ＧＦＰ＋細胞の頻度を使用して抗原特異的死滅を測定した。（図５Ｄ）ＩＬ－１２の非存在下又は示されたＩＬ－１２バリアントの存在下で生成されたＯＴ－１エフェクターの特異的な死滅を示す用量応答曲線。データは、生物学的二重測定の平均及び標準誤差として表され、２つ以上の独立した実験を表す。

【0043】

【図6A-6B】図６Ａ～６Ｉは、ＮＫ細胞上のマウスＩＬ－１２シグナル伝達を特性解析するために行った実験からの結果を概略的に要約する。図６Ａ：ＩＬ－１２部分アゴニストは、ＮＫ細胞におけるｐＳＴＡＴ４シグナル伝達の低下を誘発する。ＭＡＣＳで精製したＮＫ細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔをロードした担体細胞と混合し、ＩＬ－１２アゴニストで２０分間刺激した。図６Ｂ：ＩＬ－１８は、ＮＫ細胞におけるＩＬ－１２を介したＩＦＮγの誘導に必要である。ＭＡＣＳ精製ＮＫ細胞は、示されているように５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１８及び１ｎＭのＩＬ－１２で刺激された。

【図6C-6D】図６Ｃ：ＩＬ－１２はＮＫ細胞において、用量依存的なＩＦＮγ産生を誘導する。ＮＫ細胞を、用量設定したＩＬ－１２を用いて図４Ｂのように刺激し、細胞内サイトカイン染色により４８時間目のＩＦＮγ誘導について分析した。図６Ｄ：ＩＬ－１２アゴニストは、図４Ｂに関連した、ＮＫ細胞における用量依存的なＩＦＮγ発現を誘発する。

【図6E-6G】図６Ｅ：３×Ａｌａ及び４×Ａｌａ ＩＬ－１２部分アゴニストは、ＩＬ－１２と比較して、ＮＫ細胞によるＩＦＮγの分泌を低下させた。図４Ｂに関連した、ＥＬＩＳＡによるＮＫ細胞培養物の上清中のＩＦＮγの分析。図６Ｆ～６Ｇ：５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１８及び１μＭのＩＬ－１２で８時間刺激したＮＫ細胞からの、ｌｆｎｇ（図６Ｆ）及びＴｉｇｉｔ（図６Ｇ）の定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）。Ｃｔ値はＧａｐｄｈに対して標準化され、刺激されていない対照に対する誘導倍率として表された。棒グラフは、技術的な三重測定の平均±標準偏差を示す。

【図6H-6I】図６Ｈ：ＩＬ－２の予備活性化は、ＮＫ細胞上のＩＬ－１２Ｒβ１をアップレギュレートする。ＭＡＣＳ精製ＮＫ細胞を１０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２で４８時間刺激し、図３Ａのように２００ｎＭのｐ４０四量体（赤）又はストレプトアビジン対照（灰色）で染色して、ＩＬ－１２Ｒβ１発現レベルを特定した。図６Ｉ：ＩＬ－２はＮＫ細胞におけるＩＦＮγ誘導を増強するが、ＩＬ－１２部分アゴニストとの相乗効果はない。ＭＡＣＳ精製ＮＫ細胞を、１０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１８、及び１μＭのＩＬ－１２アゴニストで４８時間活性化した。破線は、ＩＬ－１８のみで刺激されたＮＫ細胞におけるＩＦＮγ染色を示す。特に明記しない限り、データは生物学的二重測定の平均±標準偏差として示され、２つ以上の実験を表す。

【0044】

【図7A】図７Ａ～７Ｆは、本開示の様々な例示的ヒトＩＬ－１２部分アゴニストを特性解析するために実施された実験からの結果を概略的に要約する。図７Ａ：ヒトＰＢＭＣにおけるＩＬ－１２Ｒβ１の細胞型依存性及び活性化状態依存性発現。ヒトＮＫ細胞（ＣＤ３－ＣＤ５６⁺）又はＣＤ８⁺Ｔ細胞（ＣＤ３⁺ＣＤ８⁺）のｐ４０四量体染色によって測定されたＩＬ－１２Ｒβ１発現レベルを示すフローサイトメトリープロット。赤線は２００ｎＭの四量体染色を示し、灰色の集団はストレプトアビジン染色のみを表す。Ｔ細胞芽球の場合、ＰＢＭＣは、２．５μｇ／ｍＬのαＣＤ３、５μｇ／ｍＬのαＣＤ２８、及び１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２で２日間刺激された。

【図7B】図７Ｂ：ＮＫ細胞及びＴ細胞ゲーティングスキーム。

【図7C-7D】図７Ｃ～７Ｄ：ＩＬ－１２部分アゴニストで２０分間刺激したＣＤ８⁺Ｔ細胞芽球のホスホフローサイトメトリー。図７Ｃ：ヒトＣＤ８⁺Ｔ細胞芽球におけるｐＳＴＡＴ４シグナル伝達の用量応答曲線。図７Ｄ：ヒストグラムは、８ｎＭ（ＩＬ－１２）又は１μＭ（２×Ａｌａ：Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ、３×Ａｌａ：Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ａ）でのｐＳＴＡＴ４染色を示す。

【図7E-7F】図７Ｅ：ＩＬ－１２部分アゴニストは、ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮγ分泌を支持する。ＭＡＣＳ分離ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＩＬ－１２アゴニスト有り又は無しで、２μｇ／ｍＬのαＣＤ３、０．５μｇ／ｍＬのαＣＤ２８、及び５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２で刺激した。４８時間後、上清をＩＦＮγ ＥＬＩＳＡについて分析した。破線は、ＩＬ－１２の非存在下でのＩＦＮγレベルを示す。図７Ｆ：ＩＬ－１２部分アゴニストは、ＮＫ細胞によるＩＦＮγ産生の減弱を示す。ＭＡＣＳ分離ＮＫ細胞を、ＩＬ－１２アゴニスト有り又は無しで、１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１８で４８時間刺激し、上清をＩＦＮγについてＥＬＩＳＡでアッセイした。バックグラウンドを超えるＩＦＮγが検出されなかった条件は、「測定されなかった」の「ｎ．ｄ．」としてリストされている。データは、生物学的二重測定の平均±標準偏差として表され、２つの独立した実験を表す。

【0045】

【図7G-7I】図７Ｇ～７Ｉは、ヒトＩＬ－１２部分アゴニストであるＷ３７ＡＥ８１ＡＦ８２ＡのＴ細胞への偏りを証明するために行った実験からの結果を概略的に要約する。図７Ｇ：ＩＬ－１２部分アゴニストで２０分間刺激したＣＤ８⁺Ｔ細胞芽球のホスホフローサイトメトリー。図７Ｈ：ＩＬ－１２部分アゴニストは、ＣＤ８⁺Ｔ細胞によるＩＦＮγ分泌を支持する。ＭＡＣＳ分離ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＩＬ－１２アゴニスト有り又は無しで、２μｇ／ｍＬのαＣＤ３、０．５μｇ／ｍＬのαＣＤ２８、及び５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２で刺激した。４８時間後、上清をＩＦＮγについてＥＬＩＳＡで分析した。破線は、ＩＬ－１２の非存在下でのＩＦＮγレベルを示す。図７Ｉ：ＩＬ－１２部分アゴニストは、ＮＫ細胞によるＩＦＮγ産生の減弱を示す。ＭＡＣＳ分離ＮＫ細胞を、ＩＬ－１２アゴニスト有り又は無しで、１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１８で４８時間刺激し、上清のＩＦＮγについてＥＬＩＳＡでアッセイした。データは、生物学的二重測定の平均±標準偏差として表され、２つの独立した実験を表す。

【0046】

【図8A-8D】図８Ａ～８Ｅは、哺乳動物細胞からのマウスＩＬ－１２アゴニストの発現を検証するために行った実験の結果を概略的に要約する。図８Ａ：Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞からのＩＬ－１２の精製。（Ａ）Ｎｉ－ＮＴＡ精製マウスＩＬ－１２の代表的なＳ２００サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）。ｍＡＵ：ミリ吸光度単位。図８Ｂ：Ｎｉ－ＮＴＡ親和性精製並びに還元（Ｒ）及び非還元（ＮＲ）条件下でのＳＥＣ後のＩＬ－１２のＳＤＳ－ＰＡＧＥ。図８Ｃ～８Ｆ：哺乳動物で発現されたマウスＩＬ－１２バリアントの特性解析。図８Ｃ～図８Ｄ：サイトカインで２０分間刺激後のＣＤ８＋Ｔ細胞芽球のｐＳＴＡＴ４染色。ヒストグラムは、ＩＬ－１２については８ｎＭ、部分アゴニストについては１μＭでのｐＳＴＡＴ４染色を示す。

【図8E-8F】図８Ｅ：哺乳動物で発現されたＩＬ－１２部分アゴニストは、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮγ産生を促進する。１μｇ／ｍＬのＯＶＡペプチド（２５７～２６４）、０．５μｇ／ｍＬのαＣＤ２８、１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、及び１μＭのＩＬ－１２バリアントで４８時間刺激した後の、ＯＴ－ＩＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ８＋）における細胞内ＩＦＮγの代表的なヒストグラム（左）及び定量（右）。図８Ｆ：哺乳動物で発現されたＩＬ－１２部分アゴニストは、ＮＫ細胞におけるＩＦＮγ誘導の減弱を示す。精製されたＮＫ細胞を、１μＭのＩＬ－１２バリアントを含む５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１８で４８時間刺激した。

【0047】

【図9A-9C】図９Ａ～９Ｊは、ＩＬ－１２部分アゴニストがインビボで細胞型特異的応答を誘発することを示すために行った実験の結果を概略的に要約する。図９Ａ：実験計画の概略。ＯＴ－Ｉ ＴＣＲトランスジェニックマウス（Ｔｈｙ１．２）からのＣＤ８＋Ｔ細胞を、０日目にコンジェニック受容者マウス（Ｔｈｙ１．１）に移植した。翌日、マウスをフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）中の５０μｇのＯＶＡ（２５７～２６４）で皮下免疫し、３０μｇのサイトカインの毎日の腹腔内注射を開始した。５日間のサイトカイン処理後、マウスを安楽死させて、ＥＬＩＳＡによる血清ＩＦＮγの分析と、フローサイトメトリーによる流出リンパ節の細胞型プロファイリングを行った。図９Ｂ：ＩＬ－１２は体重減少をもたらすが、部分アゴニストはそうではない。マウスの体重を毎日監視し、１日目の体重に対して標準化した後、サイトカイン処理を開始した。図９Ｃ：６日目に血清ＥＬＩＳＡによって測定されるように、ＩＬ－１２は全身性ＩＦＮγを上昇させるが、部分アゴニストはそうではない。破線は、このパネル及びその後のパネルにおける免疫化されていないマウスの測定値を表す。

【図9D-9G】図９Ｄ～９Ｅ：免疫化は、サイトカイン処理とは無関係に、ＰＤ－１＋ＯＴ－Ｉ Ｔ細胞の頻度を上昇させる。図９Ｄ：ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔｈｙ１．２＋として同定されたＯＴ－Ｉ＋Ｔ細胞におけるＰＤ－１発現を示す代表的なＦＡＣＳプロット。図９Ｅ：ＯＴ－Ｉ＋Ｔ細胞の頻度としてのＰＤ－１＋細胞の定量。図９Ｆ：ＩＬ－１２はＯＴ－Ｉ Ｔ細胞を拡張するが、部分アゴニストはそうではない。ＯＴ－Ｔ細胞はＴｈｙ１．２＋として同定され、総ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度として表された。データは、ダン（Ｄｕｎｎ）の多重比較を使用するクラスカル－ウォリス（Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ）検定によって分析した。図９Ｇ：ＩＬ－１２は、ＬＡＧ－３＋ＮＫ細胞の頻度を増加させるが、部分アゴニストはそうではない。データは、ダンの多重比較を使用するクラスカル－ウォリス検定によって分析した。９Ｈ～Ｊ：ＩＬ－１２部分アゴニストは、ＩＬ－１２と比較して、ＮＫ細胞に対する活性が低下したＣＤ２５＋発現ＯＴ－Ｉ Ｔ細胞の頻度を優先的に上昇させる。

【図9H-9J】図９Ｈ：ＯＴ－Ｉ Ｔ細胞（上）及びＮＫ細胞（下）におけるＣＤ２５発現を示す代表的なＦＡＣＳプロット。図９Ｉ：ＣＤ２５＋ＯＴ－Ｉ Ｔ細胞の定量。図９Ｊ：ＣＤ２５＋ＮＫ細胞の定量。データは、テューキーの多重比較を使用する一元配置分散分析によって分析された。データは、ｎ＝５マウス／群の平均±標準偏差として表され、２つの独立した実験を表す。

【0048】

【図10A-10B】図１０Ａ～１０Ｇは、ＩＬ－１２部分アゴニストが、ＩＬ－１２関連毒性を誘発することなく、ＭＣ－３８抗腫瘍応答を支持することを示すために実施した実験の結果を、概略的に要約する。図１０Ａ：実験計画の概略。０日目にマトリゲル中の５×１０⁵個のＭＣ－３８細胞をマウスに移植した。示されているように、７日目から毎日、マウスにＰＢＳ（ｎ＝１０）、１μｇのＩＬ－１２（ｎ＝１０）、３０μｇのＩＬ－１２（ｎ＝９）、３０μｇの２×Ａｌａ（ｎ＝９）、又は３０μｇの３×Ａｌａ（ｎ＝１０）を注射した。図１０Ｂ：ＩＬ－１２は、担癌マウスの体重低下を誘発するが、部分アゴニストはそうではない。体重は、サイトカイン処理の７日前に対して標準化された。３０μｇ用量のＩＬ－１２を投与されたマウスは、１３日～１５日の間にサイトカイン毒性で死亡した。

【図10C-10D】図１０Ｃ：ＩＬ－１２は全身性ＩＦＮγを増強するが、部分アゴニストはそうではない。１０日目の血清ＩＦＮγ ＥＬＩＳＡ、ｎ＝５マウス／群。図１０Ｄ：ＩＬ－１２は運動能力を低下させるが、部分アゴニストはそうではない。サイトカイン処理後のＭＣ－３８担持マウスの累積変位。１６日目にキャプチャされた３０秒間のビデオの定量。累積変位は、経時的なΔＸとΔＹの合計として計算された。データは、ｎ＝５匹のマウス／群の平均±標準偏差として示されている。

【図10E-10F】図１０Ｅ：ＩＬ－１２及び部分アゴニストは、ＭＣ－３８腫瘍増殖を弱める。腫瘍体積は、２０日目にダンの多重比較を使用するクラスカル－ウォリス検定によって比較された。図１０Ｆ：ＩＬ－１２及び部分アゴニストは、ＭＣ－３８担持マウスの生存を延長する。ＰＢＳ又はＩＬ－１２バリアントで処理したマウスのカプラン・マイヤー（Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ）曲線。対数順位検定のＰ値は、ホルム－シダック（Ｈｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ）法を使用する多重比較について補正された。

【図10G】図１０Ｇ：ＭＣ－３８担持マウスの個々の腫瘍増殖曲線。カラーで示したサイトカイン処理マウスと比較するために、ＰＢＳ処理マウスの増殖曲線は灰色で示されている。データは平均±標準偏差として表され、２つの独立した実験を表す。

【発明を実施するための形態】

【0049】

開示の詳細な説明
本開示は一般に、特に、対象においてインターロイキン１２（ＩＬ－１２）及びインターロイキン２３（ＩＬ－２３）によって媒介されるシグナル伝達経路を選択的に調節するための組成物及び方法に関する。特に、本開示は、ＩＬ－１２ｐ４０がその同族受容体ＩＬ－１２Ｒβ１と相互作用する方法についての新しい知見に基づく、新規ＩＬ－１２ｐ４０組成物を提供する。以下でより詳細に説明されるように、ＩＬ－１２ｐ４０媒介シグナル伝達は、ＳＴＡＴ３媒介性のシグナル伝達及び／又はＳＴＡＴ４媒介性のシグナル伝達の調整により調節することができる。より具体的には、いくつかの実施形態において本開示は、インターロイキン１２受容体ベータ１サブユニット（ＩＬ－１２Ｒβ１）に対する調節された結合親和性を有する新しい一連のＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドバリアントを提供する。本開示はまた、そのようなＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドを産生するのに有用な組成物及び方法、対象におけるＩＬ－１２ｐ４０媒介シグナル伝達を調節する方法、並びにＩＬ－１２ｐ４０受容体の下流のシグナル伝達の混乱に関連する状態の治療方法も提供する。

【0050】

インターロイキンＩＬ－１２及びＩＬ－２３は、ＩＬ－１２ｐ４０サイトカインサブユニット及びＩＬ－１２Ｒβ１細胞表面受容体を共有するヘテロ二量体サイトカインである。以下の実施例に記載されているように、完全なＩＬ－２３受容体複合体のＸ線結晶構造を決定するために実験が計画され、実施されて、ＩＬ－１２とＩＬ－２３により共有されるＩＬ－１２ｐ４０とＩＬ－１２Ｒβ１の間の共通のモジュラー相互作用が明らかになった。この新しい構造的理解に基づいて、ＩＬ－１２Ｒβ１との界面に変異を有するいくつかのＬ－１２ｐ４０バリアントが生成され、ＳＴＡＴ３及びＳＴＡＴ４シグナル伝達を誘発するそれらの能力について試験された。このアプローチにより、一連のＩＬ－１２ｐ４０バリアントが、ＩＬ－１２の関連で段階的なＳＴＡＴ４シグナル伝達を生成し、ＩＬ－２３の関連で段階的なＳＴＡＴ３シグナル伝達を生成できることが特定された。ＩＬ－１２の場合、本明細書に記載の多数の組換えＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドが同定され、細胞型に偏ったＩＬ－１２ｐ４０シグナル伝達、例えば、ＮＫ細胞内でＩＬ－１２媒介シグナル伝達を刺激する組換えポリペプチドの能力の低下を付与することが確認された。いくつかの他の実施形態において、細胞型ベースのＩＬ－１２ｐ４０シグナル伝達は、ＮＫ細胞におけるＩＬ－１２シグナル伝達を刺激する組換えポリペプチドの能力の低下を伴うが、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＩＬ－１２シグナル伝達を刺激するその能力は実質的に保持する。これらの新しいサイトカインアゴニストは、ＮＫ細胞の活性化に伴う毒性を軽減しながら、細胞傷害性Ｔ細胞の抗腫瘍効果を維持することにより、治療上の有用性を有する可能性がある。

【0051】

定義
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語、表記法、及び他の科学用語又は専門用語は、本開示が関係する当業者によって一般的に理解される意味を有することを意図している。場合によっては、一般的に理解されている意味を持つ用語が、明確にするため及び／又は参照しやすいように本明細書で定義されており、本明細書でのそのような定義の包含は、必ずしも、当技術分野で一般的に理解されているものとの実質的な違いを表すと解釈するべきではない。本明細書に記載又は参照される技術及び方法の多くは、当業者によって充分理解されており、従来の方法論を使用して一般的に使用されている。

【0052】

単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別の指示をしない限り、複数の参照を含む。例えば「細胞」という用語は、１つ又は複数の細胞を含み、それらの混合物を含む。「Ａ及び／又はＢ」は、本明細書では、「Ａ」、「Ｂ」、「Ａ又はＢ」、及び「Ａ及びＢ」のすべての選択肢を含むために使用される。

【0053】

用語「約」は、本明細書で使用される場合、その通常の意味は、およそである。およその程度が文脈から明確でない場合、「約」は、提供された値の±１０％以内、又は提供された値を含むすべての場合において、最も近い有効数字に丸められたことを意味する。範囲が指定されている場合、それらには境界値が含まれる。

【0054】

本明細書で使用される「投与」及び「投与する」という用語は、特に限定されるものではないが、経口、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、筋肉内、及び局所投与、又はこれらの組み合わせを含む投与経路による、生物活性組成物又は製剤の送達を指す。この用語には、特に限定されるものではないが、医療専門家による投与及び自己投与が含まれる。

【0055】

「細胞」、「細胞培養物」、及び「細胞株」という用語は、特定の対象細胞、細胞培養物、又は細胞株だけでなく、培養中の転移又は継代の数に関係なく、そのような細胞、細胞培養物、又は細胞株の子孫若しくは潜在的な子孫も指す。すべての子孫が親細胞と完全に同一というわけではないことを理解すべきである。これは、突然変異（例えば意図的又は偶然の突然変異）又は環境の影響（例えばメチル化やその他のエピジェネティックな修飾）のいずれかにより、次の世代で特定の修飾が発生する可能性があり、従って、子孫が実際には親細胞と同一ではない可能性があるためであるが、子孫が、元の細胞、細胞培養物、又は細胞株と同じ機能を保持する限り、依然として本明細書で使用される用語の範囲内に含まれる。

【0056】

本開示の対象の組換えポリペプチドの「有効量」、「治療有効量」、又は「医薬的有効量」という用語は、一般に、組成物が存在しない場合と比較して、組成物が記載された目的を達成する（例えばそれが投与される効果を達成する、疾患を治療する、シグナル伝達経路を減少させる、又は疾患若しくは健康状態の１つ又は複数の症状を減少させる）のに十分な量を指す。「有効量」の例は、疾患の症状の治療、予防、又は軽減に寄与するのに十分な量であり、「治療有効量」とも呼ばれる。症状の「軽減」とは、症状の重症度又は頻度の低下、又は症状の排除を意味する。「治療有効量」を含む組成物の正確な量は、治療の目的に依存し、既知の技術を使用して当業者によって確認可能である（例えばＬｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ （ｖｏｌｓ． １－３， １９９２）； Ｌｌｏｙｄ， Ｔｈｅ Ａｒｔ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ （１９９９）； Ｐｉｃｋａｒ， Ｄｏｓａｇｅ Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ （１９９９）； 及び Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， ２０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ２００３， Ｇｅｎｎａｒｏ， Ｅｄ．， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓを参照）。

【0057】

本明細書で使用される「ＩＬ－１２ｐ４０」という用語は、天然であるか又は組換えであるかに拘わらず、野生型ＩＬ－１２ｐ４０を意味する。従って、ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドは任意のＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドを指し、特に限定されるものではないが、組換え産生ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチド、合成的産生ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチド、細胞又は組織から抽出されたＩＬ－１２ｐ４０を含む。野生型ヒトＩＬ－１２ｐ４０前駆体のアミノ酸配列は、配列番号１に示され、これは、３２８のアミノ酸残基のタンパク質であり、Ｎ末端に２２アミノ酸のシグナルペプチドを有し、これは除去されて３０６アミノ酸の成熟したタンパク質を生成することができる。成熟ヒトＩＬ－１２ｐ４０のアミノ酸配列を配列番号２６に示す。野生型マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＩＬ－１２ｐ４０前駆体のアミノ酸配列を配列番号２に示す。これは、３３５のアミノ酸残基のタンパク質であり、Ｎ末端に２２アミノ酸のシグナルペプチドを有し、これは除去されて３１３アミノ酸の成熟したタンパク質を生成することができる。成熟マウスＩＬ－１２ｐ４０のアミノ酸配列は配列番号２７に提供される。本開示の目的のために、すべてのアミノ酸の番号付けは、配列番号１（ヒトＩＬ－１２ｐ４０）又は配列番号２（マウスＩＬ－１２ｐ４０）に示されるＩＬ－１２ｐ４０タンパク質の前駆体ポリペプチド（又はプレタンパク質）配列に基づく。しかしながら、当業者は、組換えポリペプチド構築物を作製するために成熟タンパク質がしばしば使用されることを理解するであろう。

【0058】

本明細書で使用されるＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドの「バリアント」という用語は、参照ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチド、例えば野生型ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドのアミノ酸配列と比較して、１つ又は複数のアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入が存在するポリペプチドを指す。従って用語「ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドバリアント」には、ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドの天然に存在する対立遺伝子バリアント又は代替的スプライスバリアントが含まれる。例えばポリペプチドバリアントは、親ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドのアミノ酸配列中の１つ又は複数のアミノ酸の、類似又は相同アミノ酸又は非類似アミノ酸による置換を含む。どのアミノ酸が類似又は相同であると判定するには多くの基準が存在する（Ｇｕｎｎａｒ ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ， Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｐ． １２３－３９ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ １９８７．） 。

【0059】

本明細書で使用される「作動可能に連結された」という用語は、２つ又はそれ以上の要素、例えばポリペプチド配列又はポリヌクレオチド配列間の物理的又は機能的連結を意味し、それらが意図した様式で作動することを可能にする。例えば目的のポリヌクレオチドと調節配列（例えばプロモーター）との間の作動可能な連結は、目的のポリヌクレオチドの発現を可能にする機能的連結である。この意味で、「作動可能に連結された」という用語は、調節領域が目的のコード配列の転写又は翻訳を調節するのに有効であるように、調節領域及びコード配列が転写される配置を指す。すなわち、プロモーターが核酸配列の転写を媒介できる場合、それは核酸配列と作動可能に連結されている。作動可能に連結された要素は、連続的又は非連続的であり得ることが理解されるべきである。ポリペプチドの文脈において「作動可能に連結された」とは、記載されたポリペプチド活性を提供するためのアミノ酸配列（例えば異なるセグメント、モジュール、又はドメイン）間の物理的連結（例えば直接又は間接的に連結）を指す。本開示において、本開示の組換えポリペプチドの様々なセグメント、領域、又はドメインは、細胞内の組換えポリペプチドの適切な折り畳み、プロセシング、ターゲティング、発現、結合、及び他の機能特性を保持するために作動可能に連結され得る。特に他に明記しない限り、本開示の組換えポリペプチドの様々なモジュール、ドメイン、及びセグメントは互いに作動可能に連結されている。本開示の組換えポリペプチドの作動可能に連結されたモジュール、ドメイン、及びセグメントは、連続的又は非連続的であり得る（例えばリンカーを介して互いに連結されている）。

【0060】

本明細書で使用される用語「パーセント同一性」は、２つ又はそれ以上の核酸又はタンパク質に関連して本明細書で使用される場合、ＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２．０配列比較アルゴリズムを使用して、以下に説明するデフォルトパラメータを使用して測定した場合、又は手動アライメント及び視覚的検査で測定した場合、同一であるか、又は同一のヌクレオチド又はアミノ酸の特定のパーセント（例えば比較ウィンドウ又は指定された領域にわたって、約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性）を有する２つ又はそれ以上の配列又は部分配列を指す。例えばＮＣＢＩのウェブサイト、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴを参照されたい。そのような配列は、「実質的に同一」であると言われる。この定義は、配列の相補体にも言及するか、又は適用することができる。この定義にはまた、欠失及び／又は付加を有する配列、並びに置換を有する配列も含まれる。配列同一性は、公開された技術及び広く利用可能なコンピュータプログラム、例えばＧＣＳプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２：３８７， １９８４）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３， １９９０）を使用して計算することができる。配列同一性は、ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ ａｔ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ （１７１０ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｖｅｎｕｅ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓ． ５３７０５） のＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ などの配列解析ソフトウェアをデフォルトパラメーターで使用して測定することができる。

【0061】

本明細書で使用される「医薬的に許容し得る賦形剤」という用語は、目的の化合物を対象に投与するための、医薬的に許容し得る担体、添加剤、又は希釈剤を提供する任意の適切な物質を指す。従って「医薬的に許容し得る賦形剤」は、医薬的に許容し得る希釈剤、医薬的に許容し得る添加剤、及び医薬的に許容し得る担体と呼ばれる物質を包含することができる。本明細書で使用される「医薬的に許容し得る担体」という用語には、特に限定されるものではないが、医薬投与に適合する、生理食塩水、溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤、及び吸収遅延剤などが含まれる。補助的活性化合物（例えば抗生物質及び追加の治療薬）も組成物に取り込むことができる。

【0062】

本明細書で使用される「組換え」又は「改変」核酸分子という用語は、ヒトの介入によって改変された核酸分子を指す。非限定的な例として、ｃＤＮＡは組換えＤＮＡ分子であり、これはインビトロのポリメラーゼ反応によって生成されたか、又はリンカーが結合されたか、又はクローニングベクターや発現ベクターなどのベクターに取り込まれた任意の核酸分子である。非限定的な例として、組換え核酸分子は、１）例えば化学的又は酵素的技術（例えば化学的核酸合成の使用により、又は核酸分子の複製、重合、エキソヌクレアーゼ消化、エンドヌクレアーゼ消化、連結、逆転写、転写、塩基改変（例えばメチル化を含む）、又は組換え（相同組換え及び部位特異的組換えを含む）を使用して、インビトロで合成又は修飾された；２）本来結合していない結合ヌクレオチド配列を含む；３）天然に存在する核酸分子配列に対して、１つ又は複数のヌクレオチドを欠くように、分子クローニング技術を使用して改変；及び／又は４）天然に存在する核酸配列に対して、１つ又は複数の配列変化又は再編成を有するように、分子クローニング技術を使用して操作されたもの、であり得る。非限定的な例として、ｃＤＮＡは組換えＤＮＡ分子であり、これは、インビトロポリメラーゼ反応によって生成されたか、又はリンカーが結合されたか、又はクローニングベクターや発現ベクターなどのベクターに組み込まれた任意の核酸分子である。組換え核酸及び組換えタンパク質の別の非限定的な例は、本明細書に開示されるＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドバリアントである。

【0063】

本明細書で使用される「個体」又は「対象」には、ヒト（例えばヒト個体）及び非ヒト動物などの動物が含まれる。いくつかの実施形態において、「個体」又は「対象」は、医師の管理下にある患者である。従って、対象は、関心のある疾患（例えば癌）及び／又は疾患の１つ又は複数の症状を有するか、又は有するリスクがある、又は有する疑いのあるヒト患者又は個体であり得る。対象はまた、診断時又はその後に関心のある状態のリスクがあると診断された個体であり得る。「非ヒト動物」という用語は、すべての脊椎動物、例えば哺乳動物、例えばげっ歯類、例えばマウス、非ヒト霊長類、及び他の哺乳動物、例えばヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、及び非哺乳動物、例えば両生類、爬虫類などを含む。

【0064】

当業者によって理解されるように、書面による説明を提供することなどの、ありとあらゆる目的のために、本明細書に開示されるすべての範囲はまた、全ての可能な部分範囲及びその部分範囲の組み合わせを包含する。記載された範囲は、同じ範囲を少なくとも等しい半分、３分の１、４分の１、５分の１、１０分の１などに分解することを充分に記載し、可能にするものとして容易に認識できる。非限定例として、本明細書で議論される各範囲は、下３分の１、中間の３分の１、及び上３分の１などに容易に分解することができる。また、当業者には理解されるように、「最大」、「少なくとも」、「より大きい」、「未満」などの全ての表現は、列挙された数を含み、これらは、上記で議論された下位範囲に分解され得る。最後に、当業者には理解されるように、範囲には個々のメンバーが含まれる。従って例えば１～３個の物品を有する群は、１、２、又は３個の物品を有する群を指す。同様に、物品数が１～５の群とは、物品数が１、２、３、４、又は５などの物品を有する群を指す。

【0065】

「ベクター」という用語は、本明細書では、別の核酸分子を移入又は輸送することができる核酸分子又は配列を指すために使用される。移入される核酸分子は、一般にベクター核酸分子に連結、例えば挿入される。一般にベクターは、適切な制御要素と結合した場合に複製可能である。「ベクター」という用語には、クローニングベクター及び発現ベクター、並びにウイルスベクター及び組み込みベクターが含まれる。「発現ベクター」は、調節領域を含むベクターであり、従ってインビトロ及び／又はインビボでＤＮＡ配列及び断片を発現することができる。ベクターは、細胞内での自律複製を指令する配列を含んでもよく、又は宿主細胞ＤＮＡへの組み込みを可能にするのに十分な配列を含んでもよい。有用なベクターには、例えばプラスミド（例えばＤＮＡプラスミド又はＲＮＡプラスミド）、トランスポゾン、コスミド、細菌人工染色体、及びウイルスベクターが含まれる。有用なウイルスベクターには、例えば複製欠損レトロウイルス及びレンチウイルスが含まれる。いくつかの実施形態において、ベクターは遺伝子送達ベクターである。いくつかの実施形態において、遺伝子を細胞に移入するための遺伝子送達ビヒクルとしてベクターが使用される。

【0066】

本明細書に記載される開示の態様及び実施形態は、態様及び実施形態「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」、及び「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」を含むことが理解される。本明細書で使用される「含む」は、「含む」、「含有する」、又は「によって特徴付けられる」と同義であり、包括的又は無制限であり、追加の列挙されていない要素又は方法工程を排除しない。本明細書で使用される「からなる」は、特許請求される組成物又は方法で指定されていない要素、工程、又は成分を排除する。本明細書で使用される「から本質的になる」は、特許請求される組成物又は方法の基本的及び新規な特徴に実質的に影響を及ぼさない材料又は工程を排除しない。特に組成物の成分の説明又は方法の工程の説明における「含む」という用語の本明細書におけるいかなる記載も、記載された成分又は工程から本質的になる及びそれらからなる組成物及び方法を包含すると理解される。

【0067】

例えば（ａ）、（ｂ）、（ｉ）などの見出しは、単に明細書及び特許請求の範囲を読みやすくするために提示されている。明細書又は特許請求の範囲における見出しの使用は、工程又は要素がアルファベット順又は番号順、又はそれらが提示された順序で実行されることを要求するものではない。

【0068】

値の範囲が提供される場合、文脈が明確に別段の指示をしない限り、下限の単位の１０分の１までの各介在値は、その範囲の上限と下限の間、及びその他の記載された値又はその記載された範囲内の介在する値は、本開示内に含まれる。これらのより小さな範囲の上限及び下限は、独立してより小さな範囲に含まれてもよく、記載された範囲で特に除外された限界に従って、開示内に包含される。記載された範囲が限界の一方又は両方を含む場合、それらの含まれる限界のいずれか又は両方を除外する範囲も本開示に含まれる。

【0069】

いくつかの範囲は、「約」という用語が前に付いた数値で本明細書に提示される。「約」という用語は、本明細書では、それが先行する正確な数、並びにその用語が先行する数に近いか又は近似の数に対する文字通りの支持を提供するために使用される。ある数字が具体的に記載された数字に近いか、又は近似の数字であるかどうかを判断する際に、近いか又は近似の未記載の数字は、それが提示される文脈において、具体的に記載された数字と実質的に同等のものを提供する数字であり得る。

【0070】

明確にするために、別個の実施形態に関連して説明される本開示のいくつかの特徴は、単一の実施形態において組み合わせて提供され得ることが理解される。逆に、簡潔にするために、単一の実施形態に関連して説明されている本開示の様々な特徴は、別個に又は任意の適切な部分組合わせで提供され得る。本開示に関連する実施形態のすべての組み合わせは、本開示によって具体的に包含され、あらゆる組み合わせが個々に明示的に開示されたかのように、本明細書に開示される。さらに、様々な実施形態及びその要素のすべての部分組合わせもまた、本開示によって具体的に包含され、あたかもそのような部分組合わせのすべてが個別かつ明示的に本明細書に開示されたかのように、本明細書に開示される。

【0071】

インターロイキン１２サブユニットｐ４０（ＩＬ－１２ｐ４０）
サイトカインは、細胞表面受容体の多量体化及びＪＡＫ－ＳＴＡＴシグナル伝達経路の誘導を通じて生理学の多様な側面を調節する分泌因子である。インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）及びインターロイキン－２３（ＩＬ－２３）は、病原体関連分子パターンに応答して抗原提示細胞によって産生されるヘテロ二量体サイトカインであり、複数のリンパ球集団の活性化と分化を調節する。共通のＩＬ－１２ｐ４０サブユニットとＩＬ－１２受容体ベータ１（ＩＬ－１２Ｒβ１）を使用しているにもかかわらず、ＩＬ－１２とＩＬ－２３は免疫系において重複しない役割を果たしている。

【0072】

ＩＬ－１２は、ＮＫ細胞及びＴ細胞上に発現されるＩＬ－１２Ｒβ１及びＩＬ－１２Ｒβ２の受容体複合体を介してシグナル伝達する（図１Ａ）。ＩＬ－１２受容体の二量体化は、受容体関連ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）分子の活性化を誘導し、これらの分子は、互いにリン酸化し、並びにＳＨ２含有シグナルトランスデューサー及び活性化因子４（ＳＴＡＴ４）のドッキング部位として機能するＩＬ－１２Ｒβ２の細胞内ドメイン上の残基上をリン酸化する。次に、受容体関連ＳＴＡＴ４タンパク質は、リン酸化された後、核に移行し、そこで、ＩＦＮγの発現とＣＤ４＋Ｔ細胞のＴヘルパー１（Ｔｈ１）表現型への極性化を促進する。細胞内病原体に対する免疫と癌の類似性を考えると、Ｔｈ１応答を刺激する治療アプローチが、ワクチンアジュバントとエピトープの選択を通じて間接的に、又はＩＬ－１２の投与を通じて直接、癌免疫療法の関連で調査されてきた。前臨床モデルでの有望性にもかかわらず、ＮＫ細胞を介したＩＦＮγの産生に関連する毒性のために、ＩＬ－１２投与の治療効果は制限されている。

【0073】

図１に模式的に示されるように、１Ａ、ＩＬ－１２はそのＩＬ－１２ｐ４０サブユニットをＩＬ－２３と共有し、これは、ＩＬ－１２Ｒβ１とＩＬ－２３受容体（ＩＬ－２３Ｒ）によって形成される受容体複合体を介してシグナル伝達をする。ＩＬ－１２とＩＬ－２３の共有受容体として、ＩＬ－１２Ｒβ１はＴ細胞、ＮＫ細胞、及び単球に現されるが、ＩＬ－２３Ｒの発現はγδＴ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞に限定される。ＩＬ－１２Ｒβ１の共有にもかかわらず、ＩＬ－１２とＩＬ－２３は、異なる表現型作用を有する。ＣＤ４＋Ｔ細胞では、ＩＬ－２３シグナル伝達は、ＳＴＡＴ３のリン酸化とＩＬ－１７産生Ｔｈ１７系統の安定化を促進する。Ｔｈ１７細胞とＩＬ－２３シグナル伝達は、細胞外病原体に対する免疫応答において重要な役割を果たすが、異常なＴｈ１７活性は複数の自己免疫疾患と関連している。実際、ＩＬ－２３ｐ１９又はＩＬ－１２ｐ４０のいずれかの遺伝的欠損は、マウスを実験的自己免疫性脳脊髄炎及び大腸炎から保護する。臨床的には、ＩＬ－２３を標的とするアンタゴニスト抗体は、中等度から重度の尋常性乾癬、乾癬性関節炎、クローン病、及び潰瘍性大腸炎の治療に承認されているが、これらの抗体の多くはＩＬ－１２とＩＬ－２３シグナル伝達の両方をブロックし、感染リスクの上昇などの合併症を引き起こす。

【0074】

ＩＬ－１２及びＩＬ－２３シグナル伝達の臨床的重要性を考えると、この重要なサイトカイン軸を特異的に調節するための新しい戦略が必要である。しかし、ＩＬ－１２とＩＬ－２３がどのように受容体に結合し、下流のシグナル伝達を開始させるかについての構造的情報が不足しているため、新しいサイトカインバリアントを改変する能力が制限されてきた。これに対処するために、完全なＩＬ－２３受容体複合体（ＩＬ－２３ｐ１９／ＩＬ－１２ｐ４０／ＩＬ－２３Ｒ／ＩＬ－１２Ｒβ１）の結晶構造を解明する実験が行われ、ＩＬ－１２ｐ４０がＩＬ－１２Ｒβ１に直接係合することが明らかになった。ＩＬ－１２Ｒβ１とＩＬ－１２ｐ４０の両方がＩＬ－１２とＩＬ－２３の間で共有されているため、この界面は、ＩＬ－１２とＩＬ－２３の両方のシグナル伝達を開始させる複合体組み立ての重要な機能を表している。次に、結晶構造から得られた新しい知見を使用して、ＳＴＡＴシグナル伝達を調節するＩＬ－１２及びＩＬ－２３部分アゴニストのパネルが設計された。以下に示すように、多くのＩＬ－１２アゴニストが、ＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＦＮγ誘導と腫瘍細胞の死滅を維持できるが、ＮＫ細胞からのＩＦＮγ産生の低下を誘発することが確認された。従って、ＩＬ－１２の活性を抗原特異的Ｔ細胞に限定することにより、ＩＬ－１２部分アゴニストは、ＮＫ細胞のＩＦＮγ産生に関連する毒性を低減することにより、治療上の有用性を有する可能性がある。

【0075】

以下により詳細に記載するように、ＩＬ－１２ｐ４０が共有受容体ＩＬ－１２Ｒβ１に係合することを明らかにする４元ＩＬ－２３受容体複合体の３．４Å分解能の結晶構造を決定するために実験を行った。受容体組み立てのこのメカニズムは、サイトカインスーパーファミリーに固有であり、ＩＬ－１２及びＩＬ－２３受容体組み立てにおけるＩＬ－１２ｐ４０の共有された役割を示している。この新たに確立された構造からの知見を使用して追加の実験が行い、ＩＬ－１２部分アゴニストのパネルを設計及び試験した。このパネルは、細胞型全体のＩＬ－１２Ｒβ１発現の差異を利用して、ＮＫ細胞に対する活性が低下した抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を支持する。本開示は、ＩＬ－１２ｐ４０媒介シグナル伝達を調節するのに有用な新しい分子、及び細胞型選択的サイトカインアゴニストを改変するための新しいアプローチを提供する。

【0076】

開示の構成
Ａ．組換えＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチド
上で概説したように、本開示のいくつかの実施形態は、ＩＬ－１２Ｒβ１に対する結合親和性が変化し、及びインターロイキン－１２（ＩＬ－１２）及び／又はインターロイキン－２３（ＩＬ－２３）を介して組織特異的に媒介される下流シグナル伝達の部分アゴニズムの特性を有する、新しい一連のＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドバリアントに関する。例えば、本開示のいくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドバリアントは、ＮＫ細胞におけるＩＬ－１２媒介シグナル伝達を刺激する能力の低下を付与する。いくつかの他の実施形態において、本明細書に開示されるＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドバリアントは、ＮＫ細胞におけるＩＬ－１２シグナル伝達を刺激する能力の低下を付与するが、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＩＬ－１２シグナル伝達を刺激する能力は実質的に保持する。

【0077】

１つの態様において、本開示のいくつかの実施形態は、以下を含む組換えポリペプチドに関する：（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を有するＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドと少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、及びさらに（ｂ）配列番号１の配列中の１つ又は複数のアミノ酸置換。

【0078】

本明細書に開示される組換えポリペプチドの非限定的な例示的実施形態は、以下の特徴の１つ又は複数を含み得る。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、配列番号１の配列と、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、配列番号１の配列と１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0079】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組換えポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１のＸ３７、Ｘ３９、Ｘ４０、Ｘ４１、Ｘ８０、Ｘ８１、Ｘ８２、Ｘ１０６、Ｘ１０８、Ｘ１１５、Ｘ２１６、Ｘ２１７、Ｘ２１８、及びＸ２１９からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置に、１つ又は複数のアミノ酸置換をさらに含む。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１のＸ３７、Ｘ３９、Ｘ４０、Ｘ４１、Ｘ８０、Ｘ８１、Ｘ８２、Ｘ１０６、Ｘ１０８、Ｘ１１５、Ｘ２１６、Ｘ２１７、Ｘ２１８、及びＸ２１９からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置に、約１～約１４のアミノ酸置換をさらに含む。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１のＸ３７、Ｘ３９、Ｘ４０、Ｘ４１、Ｘ８０、Ｘ８１、Ｘ８２、Ｘ１０６、Ｘ１０８、Ｘ１１５、Ｘ２１６、Ｘ２１７、Ｘ２１８、及びＸ２１９からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置に、約１～約５、約２～約８、約３～約１０、約４～約１２、約５～約１５、約３～約５、約７～約５、又は約３個～約１２個のアミノ酸置換をさらに含む。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１のＸ３７、Ｘ３９、Ｘ４０、Ｘ４１、Ｘ８０、Ｘ８１、Ｘ８２、Ｘ１０６、Ｘ１０８、Ｘ１１５、Ｘ２１６、Ｘ２１７、Ｘ２１８、及びＸ２１９からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置に、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、又は少なくとも１５個のアミノ酸置換をさらに含む。

【0080】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組換えポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１のＸ３７、Ｘ３９、Ｘ４０、Ｘ８１、Ｘ８２、Ｘ１０６、Ｘ２１７、及びＸ２１９からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置に１つ又は複数のアミノ酸置換をさらに含む。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１のＸ３７、Ｘ３９、Ｘ４０、Ｘ８１、Ｘ８２、Ｘ１０６、Ｘ２１７、及びＸ２１９からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置に、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、又は少なくとも７個のアミノ酸配列をさらに含む。本開示の例示的ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドバリアントは、配列番号１の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上のアミノ酸の置換を含むことができる。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１のＸ３７、Ｘ３９、Ｘ４０、Ｘ８１、Ｘ８２、Ｘ１０６、Ｘ２１７、及びＸ２１９からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置に、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸置換を含むことができる。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組換えポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１のＸ８１、Ｘ８２、Ｘ１０６、Ｘ２１７、及びＸ２１９からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置に、１つ又は複数のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組換えポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸残基Ｘ３９、Ｘ４０、Ｘ８１、Ｘ８２に対応する位置に、アミノ酸置換の組合わせを含む。

【0081】

本開示の本態様及び他の態様に従って、ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドにおけるそのようなアミノ酸置換は、そのような置換を欠く親ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドの結合親和性と比較して、ＩＬ－１２Ｒβ１に対する結合親和性が改変されたＩＬ－１２ｐ４０バリアントをもたらす。例えば本明細書に開示されるＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドバリアントは、ＩＬ－１２Ｒβ１に対する上昇した親和性又は低下した親和性を有することができるか、又は野生型ＩＬ－１２ｐ４０と同一又は同様であるＩＬ－１２Ｒβ１に対する親和性を有することができる。本明細書に開示されるＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドバリアントはまた、ＩＬ－１２ｐ４０の別の位置に保存的修飾及び置換（例えばＩＬ－１２ｐ４０バリアントの二次又は三次構造に最小限の影響を有するもの）を含むことができる。そのような保存的置換には、ＤａｙｈｏｆｆによってＴｈｅ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５ （１９７８）に、及び Ａｒｇｏｓ によってＥＭＢＯ Ｊ， ８：７７９－７８５ （１９８９）記載されたものが含まれる。例えば次の群の１つに属するアミノ酸は保存的変化を表す：群Ｉ：Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；群ＩＩ：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ；群ＩＩＩ：Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｐｈｅ；群ＩＶ：Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；群Ｖ：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ；及び群ＶＩ：Ａｓｐ、Ｇｌｕ。

【0082】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組換えＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドのアミノ酸配列におけるアミノ酸置換は、アラニン（Ａ）置換、アルギニン（Ｒ）置換、アスパラギン（Ｎ）置換、アスパラギン酸（Ｄ）置換、ロイシン（Ｌ）置換、リジン（Ｋ）置換、フェニルアラニン（Ｆ）置換、リジン置換、グルタミン（Ｑ）置換、グルタミン酸（Ｅ）置換、セリン（Ｓ）置換、及びスレオニン（Ｔ）置換、並びにこれらの任意の組み合わせからなる群から独立して選択される。本明細書に開示される組換えＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドにおけるアミノ酸置換の非限定的な例が以下の表１に提供される。

【表1】

【0083】

いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、配列番号１の配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び配列番号１のＷ３７、Ｐ３９、Ｄ４０、Ａ４１、Ｋ８０、Ｅ８１、Ｆ８２、Ｋ１０６、Ｅ１０８、Ｄ１１５、Ｈ２１６、Ｋ２１７、Ｌ２１８、及びＫ２１９からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応するアミノ酸置換をさらに含む。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、配列番号１の配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び：配列番号１のＷ３７、Ｐ３９、Ｄ４０、Ａ４１、Ｋ８０、Ｅ８１、Ｆ８２、Ｋ１０６、Ｅ１０８、Ｄ１１５、Ｈ２１６、Ｋ２１７、Ｌ２１８、及びＫ２１９からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応するアミノ酸置換をさらに含む。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１のＷ３７、Ｐ３９、Ｄ４０、Ａ４１、Ｋ８０、Ｅ８１、Ｆ８２、Ｋ１０６、Ｅ１０８、Ｄ１１５、Ｈ２１６、Ｋ２１７、Ｌ２１８、及びＫ２１９からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置に、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、又は少なくとも７個のアミノ酸置換をさらに含む。

【0084】

いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、配列番号１のＷ３７、Ｐ３９、Ｄ４０、Ａ４１、Ｋ８０、Ｅ８１、Ｆ８２、Ｋ１０６、Ｅ１０８、Ｄ１１５、Ｈ２１６、Ｋ２１７、Ｌ２１８、及びＫ２１９からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置にある。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、配列番号１のＷ３７、Ｐ３９、Ｄ４０、Ｅ８１、Ｆ８２、Ｋ１０６、Ｋ２１７、及びＫ２１９からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置にある。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組換えポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１のＥ８１、Ｆ８２、Ｋ１０６、Ｋ２１７、及びＫ２１９からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置に、１つ又は複数のアミノ酸置換をさらに含む。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組換えポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸残基Ｗ３７、Ｐ３９、Ｄ４０、Ｅ８１、Ｆ８２に対応する位置のアミノ酸置換の組み合わせをさらに含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸残基Ｅ８１、Ｆ８２、Ｋ１０６、Ｋ２１７、及びＫ２１９に対応するアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、本開示のポリペプチドは、配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を有し、以下のアミノ酸置換に対応するアミノ酸置換をさらに含む：（ａ）Ｗ３７Ａ；（ｂ）Ｐ３９Ａ、（ｃ）Ｄ４０Ａ、（ｄ）Ｅ８１Ａ、（ｅ）Ｆ８２Ａ、（ｆ）Ｋ１０６Ａ、（ｇ）Ｄ１０９Ａ、（ｈ）Ｋ２１７Ａ、（ｉ）Ｋ２１９Ａ、（ｊ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ、（ｋ）Ｗ３７Ａ／Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ、（ｌ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ａ、（ｍ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ａ／Ｋ２１９Ａ、（ｎ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ａ／Ｋ２１７Ａ、（ｏ）８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ａ／Ｅ１０８Ａ／Ｄ１１５Ａ、（ｐ）Ｅ８１Ｆ／Ｆ８２Ａ、（ｑ）Ｅ８１Ｋ／Ｆ８２Ａ、（ｒ）Ｅ８１Ｌ／Ｆ８２Ａ、（ｓ）Ｅ８１Ｈ／Ｆ８２Ａ、（ｔ）Ｅ８１Ｓ／Ｆ８２Ａ、（ｕ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ｎ、（ｖ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ｑ、（ｗ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ｔ、（ｘ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ｒ、又は（ｙ）Ｐ３９Ａ／Ｄ４０Ａ／Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ。いくつかの実施形態において、本開示のポリペプチドは、配列番号１と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有し、以下のアミノ酸置換に対応するアミノ酸置換をさらに含む：（ａ）Ｗ３７Ａ；（ｂ）Ｐ３９Ａ、（ｃ）Ｄ４０Ａ、（ｄ）Ｅ８１Ａ、（ｅ）Ｆ８２Ａ、（ｆ）Ｋ１０６Ａ、（ｇ）Ｄ１０９Ａ、（ｈ）Ｋ２１７Ａ、（ｉ）Ｋ２１９Ａ、（ｊ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ、（ｋ）Ｗ３７Ａ／Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ、（ｌ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ａ、（ｍ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ａ／Ｋ２１９Ａ、（ｎ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ａ／Ｋ２１７Ａ、（ｏ）８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ａ／Ｅ１０８Ａ／Ｄ１１５Ａ、（ｐ）Ｅ８１Ｆ／Ｆ８２Ａ、（ｑ）Ｅ８１Ｋ／Ｆ８２Ａ、（ｒ）Ｅ８１Ｌ／Ｆ８２Ａ、（ｓ）Ｅ８１Ｈ／Ｆ８２Ａ、（ｔ）Ｅ８１Ｓ／Ｆ８２Ａ、（ｕ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ｎ、（ｖ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ｑ、（ｗ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ｔ、（ｘ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ｒ、又は（ｙ）Ｐ３９Ａ／Ｄ４０Ａ／Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ。いくつかの実施形態において、本開示のポリペプチドは、配列番号１と１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、以下のアミノ酸置換に対応するアミノ酸置換をさらに含む：（ａ）Ｗ３７Ａ；（ｂ）Ｐ３９Ａ、（ｃ）Ｄ４０Ａ、（ｄ）Ｅ８１Ａ、（ｅ）Ｆ８２Ａ、（ｆ）Ｋ１０６Ａ、（ｇ）Ｄ１０９Ａ、（ｈ）Ｋ２１７Ａ、（ｉ）Ｋ２１９Ａ、（ｊ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ、（ｋ）Ｗ３７Ａ／Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ、（ｌ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ａ、（ｍ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ａ／Ｋ２１９Ａ、（ｎ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ａ／Ｋ２１７Ａ、（ｏ）８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ａ／Ｅ１０８Ａ／Ｄ１１５Ａ、（ｐ）Ｅ８１Ｆ／Ｆ８２Ａ、（ｑ）Ｅ８１Ｋ／Ｆ８２Ａ、（ｒ）Ｅ８１Ｌ／Ｆ８２Ａ、（ｓ）Ｅ８１Ｈ／Ｆ８２Ａ、（ｔ）Ｅ８１Ｓ／Ｆ８２Ａ、（ｕ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ｎ、（ｖ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ｑ、（ｗ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ｔ、（ｘ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ｒ、又は（ｙ）Ｐ３９Ａ／Ｄ４０Ａ／Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ。いくつかの実施形態において、本開示の組換えポリペプチドは、配列番号３～８及び１３～１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドと、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0085】

別の態様において、本開示のいくつかの実施形態は、以下を含む組換えポリペプチドに関する：（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有するＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドと少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、及びさらに(b)配列番号２の配列中に１つ又は複数アミノ酸置換。この態様の組換えポリペプチドの非限定的な例示的実施形態は、１つ又は複数の以下の特徴を含むことができる。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、配列番号２の配列と、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、配列番号２の配列と１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0086】

いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２のＸ３７、Ｘ３９、Ｘ４０、Ｘ４１、Ｘ８０、Ｘ８１、Ｘ８２、Ｘ１０６、Ｘ１０８、Ｘ１１５、Ｘ２１６、Ｘ２１７、Ｘ２１８、及びＸ２１９からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置に１つ又は複数のアミノ酸置換に１つ又は複数のアミノ酸置換をさらに含む。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２のＸ３７、Ｘ３９、Ｘ４０、Ｘ４１、Ｘ８０、Ｘ８１、Ｘ８２、Ｘ１０６、Ｘ１０８、Ｘ１１５、Ｘ２１６、Ｘ２１７、Ｘ２１８、及びＸ２１９からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置に、約１～約１４のアミノ酸置換をさらに含む。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２のＸ３７、Ｘ３９、Ｘ４０、Ｘ４１、Ｘ８０、Ｘ８１、Ｘ８２、Ｘ１０６、Ｘ１０８、Ｘ１１５、Ｘ２１６、Ｘ２１７、Ｘ２１８、及びＸ２１９からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置に、約１～約５、約２～約８、約３～約１０、約４～約１２、約５～約１５、約３～約５、約７～約５、又は約３個～約１２個のアミノ酸置換をさらに含む。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２のＸ３７、Ｘ３９、Ｘ４０、Ｘ４１、Ｘ８０、Ｘ８１、Ｘ８２、Ｘ１０６、Ｘ１０８、Ｘ１１５、Ｘ２１６、Ｘ２１７、Ｘ２１８、及びＸ２１９からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置に、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、又は少なくとも１５個のアミノ酸配列をさらに含む。

【0087】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組換えポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２のＸ３９、Ｘ４０、Ｘ８１、Ｘ８２、Ｘ１０６、Ｘ２１７、及びＸ２１９からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置に１つ又は複数のアミノ酸置換に１つ又は複数のアミノ酸置換をさらに含む。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２のＸ３９、Ｘ４０、Ｘ８１、Ｘ８２、Ｘ１０６、Ｘ２１７、及びＸ２１９からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置に、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、又は少なくとも７個のアミノ酸置換をさらに含む。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２のＸ３９、Ｘ４０、Ｘ８１、Ｘ８２、Ｘ１０６、Ｘ２１７、及びＸ２１９からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置に、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、又は少なくとも５個のアミノ酸置換をさらに含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、配列番号２のＸ８１、Ｘ８２、Ｘ１０６、及びＸ２１７からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置にある。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸残基Ｘ８１、Ｘ８２、及びＸ１０６に対応する位置に、アミノ酸置換の組合わせを含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸残基Ｘ８１、Ｘ８２、Ｘ１０６、及びＸ２１７に対応する位置に、アミノ酸置換の組合わせを含む。

【0088】

本開示のこの本態様及び他の態様に従って、ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドにおけるそのようなアミノ酸置換は、そのような置換を欠く親ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドの結合親和性と比較して、ＩＬ－１２Ｒβ１に対する結合親和性が改変されたＩＬ－１２ｐ４０バリアントをもたらす。例えば本明細書に開示されるＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドバリアントは、ＩＬ－１２Ｒβ１に対する上昇した親和性又は低下した親和性を有することができるか、又は野生型ＩＬ－１２ｐ４０と同一又は同様であるＩＬ－１２Ｒβ１に対する親和性を有することができる。本明細書に開示されるＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドバリアントはまた、ＩＬ－１２ｐ４０の別の位置に保存的修飾及び置換（例えばＩＬ－１２ｐ４０バリアントの二次又は三次構造に最小限の影響を有するもの）を含むことができる。そのような保存的置換には、Ｄａｙｈｏｆｆ １９７８（前述）及び Ａｒｇｏｓ １９８９（前述）に記載されたものが含まれる。例えば次の群の１つに属するアミノ酸は保存的変化を表す：群Ｉ：Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；群ＩＩ：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ；群ＩＩＩ：Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｐｈｅ；群ＩＶ：Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；群Ｖ：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ；及び群ＶＩ：Ａｓｐ、Ｇｌｕ。

【0089】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組換えＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドのアミノ酸配列におけるアミノ酸置換は、アラニン（Ａ）置換、アルギニン（Ｒ）置換、アスパラギン（Ｎ）置換、アスパラギン酸（Ｄ）置換、ロイシン（Ｌ）置換、リジン（Ｋ）置換、フェニルアラニン（Ｆ）置換、リジン置換、グルタミン（Ｑ）置換、グルタミン酸（Ｅ）置換、セリン（Ｓ）置換、及びスレオニン（Ｔ）置換、並びにこれらの任意の組み合わせからなる群から独立して選択される。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組換えＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドのアミノ酸配列におけるアミノ酸置換はアラニン置換を含む。本明細書に開示される組換えＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドにおけるアミノ酸置換の非限定例は、以下の表２に提供される。

【表2】

【0090】

いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、配列番号２の配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び配列番号１のＷ３７、Ｐ３９、Ｄ４０、Ａ４１、Ｋ８０、Ｅ８１、Ｆ８２、Ｋ１０６、Ｅ１０８、Ｄ１１５、Ｈ２１６、Ｋ２１７、Ｌ２１８、及びＥ２１９からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応するアミノ酸置換をさらに含む。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、配列番号２の配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び：配列番号２のＷ３７、Ｐ３９、Ｄ４０、Ａ４１、Ｋ８０、Ｅ８１、Ｆ８２、Ｋ１０６、Ｅ１０８、Ｄ１１５、Ｈ２１６、Ｋ２１７、Ｌ２１８、及びＥ２１９からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応するアミノ酸置換をさらに含む。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２のＷ３７、Ｐ３９、Ｄ４０、Ａ４１、Ｋ８０、Ｅ８１、Ｆ８２、Ｋ１０６、Ｅ１０８、Ｄ１１５、Ｈ２１６、Ｋ２１７、Ｌ２１８、及びＥ２１９からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置に、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、または少なくとも７個のアミノ酸置換をさらに含む。

【0091】

いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、配列番号２のＷ３７、Ｐ３９、Ｄ４０、Ａ４１、Ｋ８０、Ｅ８１、Ｆ８２、Ｋ１０６、Ｅ１０８、Ｄ１１５、Ｈ２１６、Ｋ２１７、Ｌ２１８、およびＥ２１９からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置にある。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、配列番号２のＷ３７、Ｐ３９、Ｄ４０、Ｅ８１、Ｆ８２、Ｋ１０６、Ｋ２１７、及びＥ２１９からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置にある。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、配列番号２のＥ８１、Ｆ８２、Ｋ１０６、及びＫ２１７からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置にある。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸残基Ｅ８１、Ｆ８２、及びＫ１０６に対応する位置のアミノ酸置換の組合わせを含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸残基Ｅ８１、Ｆ８２、Ｋ１０６、及びＫ２１７に対応する位置のアミノ酸置換の組合わせを含む。いくつかの実施形態において、本開示のポリペプチドは、配列番号２と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び以下のアミノ酸置換に対応するアミノ酸置換をさらに含む：（ａ）Ｗ３７Ａ；（ｂ）Ｐ３９Ａ、（ｃ）Ｄ４０Ａ、（ｄ）Ｅ８１Ａ、（ｅ）Ｆ８２Ａ、（ｆ）Ｋ１０６Ａ、（ｇ）Ｄ１０９Ａ、（ｈ）Ｋ２１７Ａ、（ｉ）Ｅ２１９Ａ、（ｊ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ、（ｋ）Ｗ３７Ａ／Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ、（ｌ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ａ、（ｍ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ａ／Ｋ２１７Ａ、（ｎ）Ｅ８１Ｆ／Ｆ８２Ａ、（ｏ）Ｅ８１Ｋ／Ｆ８２Ａ、（ｐ）Ｅ８１Ｌ／Ｆ８２Ａ、（ｑ）Ｅ８１Ｈ／Ｆ８２Ａ、（ｒ）Ｅ８１Ｓ／Ｆ８２Ａ、（ｓ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ｎ、（ｔ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ｑ、（ｕ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ｔ、（ｖ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ｒ、又は（ｗ）Ｐ３９Ａ／Ｄ４０Ａ／Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ。

【0092】

いくつかの実施形態において、本開示のポリペプチドは、配列番号２と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有し、及び以下のアミノ酸置換に対応するアミノ酸置換をさらに含む：（ａ）Ｗ３７Ａ；（ｂ）Ｐ３９Ａ、（ｃ）Ｄ４０Ａ、（ｄ）Ｅ８１Ａ、（ｅ）Ｆ８２Ａ、（ｆ）Ｋ１０６Ａ、（ｇ）Ｄ１０９Ａ、（ｈ）Ｋ２１７Ａ、（ｉ）Ｅ２１９Ａ、（ｊ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ、（ｋ）Ｗ３７Ａ／Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ、（ｌ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ａ、（ｍ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ａ／Ｋ２１７Ａ、（ｎ）Ｅ８１Ｆ／Ｆ８２Ａ、（ｏ）Ｅ８１Ｋ／Ｆ８２Ａ、（ｐ）Ｅ８１Ｌ／Ｆ８２Ａ、（ｑ）Ｅ８１Ｈ／Ｆ８２Ａ、（ｒ）Ｅ８１Ｓ／Ｆ８２Ａ、（ｓ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ｎ、（ｔ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ｑ、（ｕ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ｔ、（ｖ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ｒ、又は（ｗ）Ｐ３９Ａ／Ｄ４０Ａ／Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ。いくつかの実施形態において、本開示のポリペプチドは、配列番号２と１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、以下のアミノ酸置換に対応するアミノ酸置換をさらに含む：（ａ）Ｗ３７Ａ；（ｂ）Ｐ３９Ａ、（ｃ）Ｄ４０Ａ、（ｄ）Ｅ８１Ａ、（ｅ）Ｆ８２Ａ、（ｆ）Ｋ１０６Ａ、（ｇ）Ｄ１０９Ａ、（ｈ）Ｋ２１７Ａ、（ｉ）Ｅ２１９Ａ、（ｊ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ、（ｋ）Ｗ３７Ａ／Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ、（ｌ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ａ、（ｍ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ａ／Ｋ２１７Ａ、（ｎ）Ｅ８１Ｆ／Ｆ８２Ａ、（ｏ）Ｅ８１Ｋ／Ｆ８２Ａ、（ｐ）Ｅ８１Ｌ／Ｆ８２Ａ、（ｑ）Ｅ８１Ｈ／Ｆ８２Ａ、（ｒ）Ｅ８１Ｓ／Ｆ８２Ａ、（ｓ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ｎ、（ｔ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ｑ、（ｕ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ｔ、（ｖ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ｒ、又は（ｗ）Ｐ３９Ａ／Ｄ４０Ａ／Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ。いくつかの実施形態において、本開示の組換えポリペプチドは、配列番号９～１１及び１７～２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドと、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0093】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組換えＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドの配列におけるアミノ酸置換は、ＩＬ－１２Ｒβ１に対する組換えＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドの改変された親和性をもたらし、及びＩＬ－１２Ｒβ１に対するＩＬ－１２ｐ４０の結合を調節する。ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドの結合活性に関して「調節する」という用語は、ＩＬ－１２Ｒβ１に対するポリペプチドの結合親和性の変化を指す。調節には、ポリペプチドの増加（例えば誘導、刺激）及び減少（例えば低下、阻害）の両方、又はポリペプチドの結合親和性に影響を与えるその他が含まれる。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、アミノ酸置換を欠く参照ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドと比較して、組換えＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドのＩＬ－１２Ｒβ１結合親和性を上昇させる。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、アミノ酸置換を欠く参照ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドと比較して、組換えＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドのＩＬ－１２Ｒβ１結合親和性を低下させる。

【0094】

本明細書に記載のＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドバリアントを含む本開示の組換えポリペプチドの結合活性は、当技術分野で公知の任意の適切な方法によって測定することができる。例えば本明細書に開示されるＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドバリアント及びその同族リガンド（例えばＩＬ－１２Ｒβ１、ＩＬ－ｐ３５、及びＩＬ－２２ｐ１９）の結合活性は、スキャッチャード分析（Ｍｕｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ． Ａｎａｌｙｔ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １０７：２２０－２３９， １９８０）によって決定することができる。特異的結合はまた、特に限定されるものではないが、競合ＥＬＩＳＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）アッセイ及び／又はＫｉｎＥｘＡ（登録商標）アッセイを含む当該技術分野で公知の技術を使用して評価することができる。標的リガンドに優先的に結合又は特異的に結合するポリペプチドは、当技術分野でよく理解されている概念であり、そのような特異的又は優先的結合を決定する方法も当技術分野で公知である。

【0095】

目的のリガンド（例えばＩＬ－１２Ｒβ１、ＩＬ－ｐ３５、及び／又はＩＬ－２２ｐ１９）に結合する組換えＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドを選択するために、様々なアッセイ形式を使用することができる。例えば固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイ、免疫沈降法、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）、ＫｉｎＥｘＡ、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）、Ｏｃｔｅｔ（商標）（ＦｏｒｔｅＢｉｏ， Ｉｎｃ．， Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ， ＣＡ）、及びウエスタンブロット分析は、受容体又はそのリガンド結合部分と特異的に反応するか、同族リガンド又は結合パートナーと特異的に結合するポリペプチドを同定するために使用され得る多くのアッセイの一部である。一般に、特異的又は選択的な結合反応は、バックグラウンドシグナル又はノイズの少なくとも２倍、より一般的にはバックグラウンドの１０倍超、バックグラウンドの２０倍超、さらにより一般的にはバックグラウンドの５０倍超、バックグラウンドの７５倍超、バックグラウンドの１００倍超、より典型的にはバックグラウンドの５００倍超、さらにより典型的にはバックグラウンドの１０００倍超、及びさらにより典型的にはバックグラウンドの１０，０００倍超である。

【0096】

当業者は、結合親和性がまた、２つの結合パートナー、例えばＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドとＩＬ－１２Ｒβ１ポリペプチドの間の非共有相互作用の強度の尺度として使用され得ることを理解するであろう。場合によっては、結合親和性は、一価の相互作用（固有の活性）を記述するために使用される。２つの分子間の結合親和性は、解離定数（Ｋ_D）の測定によって定量することができる。次にＫ_Dは、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法（Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用して、複合体形成及び解離の動態を測定することによって決定することができる。一価複合体の会合及び解離に対応する速度定数は、それぞれ会合速度定数ｋ_a（又はｋ_on）及び解離速度定数ｋ_d（又はｋ_off）と呼ばれる。Ｋ_Dは、式Ｋ_D＝ｋ_d／ｋ_aによってｋ_a及びｋ_dに関連付けられる。解離定数の値は、周知されている方法によって直接決定することができ、例えばＣａｃｅｃｉ ｅｔ ａｌ． （Ｂｙｔｅ ９： ３４０－３６２， １９８４） に示される方法により、複雑な混合物についても計算することができる。例えばＫ_Dは、Ｗｏｎｇ ＆ Ｌｏｈｍａｎ （１９９３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０： ５４２８－ ５４３２） によって開示されたような二重フィルターニトロセルロースフィルター結合アッセイを使用して確立することができる。標的受容体に対する本開示のＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドバリアントの結合能力を評価するための他の標準的なアッセイは当技術分野で公知であり、例えばＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、ＲＩＡ、及びフローサイトメトリー分析、並びに実施例に示される他のアッセイが含まれる。ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドバリアントの結合動態及び結合親和性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）などの当技術分野で公知の標準アッセイ、例えばＢｉａｃｏｒｅ（商標）システム又はＫｉｎＥｘＡを使用して評価することができる。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２Ｒβ１、ＩＬ－ｐ３５、及び／又はＩＬ－２３ｐ１９に対する本開示のＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドバリアントの結合親和性は、固相受容体結合アッセイ（Ｍａｔｒｏｓｏｖｉｃｈ ＭＮ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ８６５：７１－９４， ２０１２）によって決定される。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２Ｒβ１、ＩＬ－ｐ３５、及び／又はＩＬ－２３ｐ１９に対する本開示のＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドバリアントの結合親和性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイによって決定される。

【0097】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組換えＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドの配列中のアミノ酸置換は、アミノ酸置換を欠く参照ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドと比較して、組換えＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドのＩＬ－１２Ｒβ１結合親和性を、約１０％～約１００％低下させる。いくつかの実施形態において、組換えＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドは、アミノ酸置換を欠く参照ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドと比較して、少なくとも１０％、例えば少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも約９５％低下したＩＬ－１２Ｒβ１に対する結合親和性を有する。いくつかの実施形態において、組換えＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドは、アミノ酸置換を欠く参照ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドと比較して、約１０％～約５０％、例えば約２０％～約７０％、約３０％～約８０％、約４０％～約９０％、約５０％～約１００％、約２０％～約５０％、約４０％～約７０％、約３０％～約６０％、約４０％～約１００％、約２０％～約８０％、又は約１０％～約９０％低下したＩＬ－１２Ｒβ１に対する結合親和性を有する。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２Ｒβ１、ＩＬ－ｐ３５、及び／又はＩＬ－２３ｐ１９に対する本開示のＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドバリアントの結合親和性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイによって決定される。

【0098】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組換えＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドは、ＩＬ－１２ｐ３５ポリペプチドと組合わせると、アミノ酸置換を欠く参照ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドと比較して、ＳＴＡＴ４シグナル伝達を刺激する能力が低下している。いくつかの実施形態において、ＳＴＡＴ４シグナル伝達を刺激するＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドバリアントの能力は、アミノ酸置換を欠く参照ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドと比較して、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、又は少なくとも約９５％低下している。いくつかの実施形態において、ＳＴＡＴ４シグナル伝達を刺激するＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドバリアントの能力は、アミノ酸置換を欠く参照ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドと比較して、約１０％～約１００％低下している。いくつかの実施形態において、ＳＴＡＴ４シグナル伝達を刺激するＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドバリアントの能力は、アミノ酸置換を欠く参照ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドと比較して、約１０％～約５０％、約２０％～約７０％、約３０％～約８０％、約４０％～約９０％、約５０％～約１００％、約２０％～約５０％、約４０％～約７０％、約３０％～約６０％、約４０％～約１００％、約２０％～約８０％、又は約１０％～約９０％低下している。

【0099】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組換えＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドは、ＩＬ－１２ｐ３５ポリペプチドと組合わせると、アミノ酸置換を欠く参照ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドと比較して、ＳＴＡＴ３シグナル伝達を刺激する能力が低下している。いくつかの実施形態において、ＳＴＡＴ３シグナル伝達を刺激する組換えＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドバリアントの能力は、アミノ酸置換を欠く参照ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドと比較して、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、又は少なくとも約９５％低下している。いくつかの実施形態において、ＳＴＡＴ３シグナル伝達を刺激する組換えＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドバリアントの能力は、アミノ酸置換を欠く参照ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドと比較して、約１０％～約１００％低下している。いくつかの実施形態において、ＳＴＡＴ４シグナル伝達を刺激するＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドバリアントの能力は、アミノ酸置換を欠く参照ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドと比較して、約１０％～約５０％、約２０％～約７０％、約３０％～約８０％、約４０％～約９０％、約５０％～約１００％、約２０％～約５０％、約４０％～約７０％、約３０％～約６０％、約４０％～約１００％、約２０％～約８０％、又は約１０％～約９０％低下している。

【0100】

原則として、ＳＴＡＴ３シグナル伝達及び／又はＳＴＡＴ４シグナル伝達を決定するために使用できるアッセイ及び方法に関して特定の制限はない。本明細書に開示される組成物及び方法に適した例示的な方法論には、特に限定されるものではないが、ホスホフローシグナル伝達アッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、及び下流遺伝子の発現をアッセイするための当技術分野で知られている任意の技術が含まれる。いくつかの実施形態において、ＳＴＡＴ３シグナル伝達及び／又はＳＴＡＴ４シグナル伝達の調節は、実施例４及び５に記載のホスホフローサイトメトリーアッセイなどのホスホフローシグナル伝達アッセイによって決定することができる。

【0101】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組換えＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドバリアントは、アミノ酸置換を欠く参照ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドと比較して、ＩＬ－１２ｐ４０を介して媒介される下流シグナル伝達の細胞型に偏ったシグナル伝達を与える。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組換えＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドバリアントは、ＩＬ－１２を介して媒介される下流シグナル伝達の細胞型に偏ったシグナル伝達を与える。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組換えＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドバリアントは、ＩＬ－２３を介して媒介される下流シグナル伝達の細胞型に偏ったシグナル伝達を与える。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組換えＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドバリアントは、ＩＬ－１２及びＩＬ－２３を介して媒介される下流シグナル伝達の細胞型に偏ったシグナル伝達を与える。

【0102】

ＩＬ－１２の場合、以下により詳細に記載されるように、本開示の特定の部分アゴニストＩＬ－１２ｐ４０バリアントは、Ｔ細胞対ＮＫ細胞に対する選択性を示し、従って、天然ＩＬ－１２より毒性が低いと予測され、これは多くの企業により癌について臨床開発が行われており、それを制限するものはその毒性である。理論に拘束されものではないが、これらのＩＬ－１２部分アゴニストは、サイトカイン多面発現性に関連する毒性を切り離すことにより、癌免疫療法において治療的有用性を有すると考えられる。以下の実施例４に示されるように、本明細書に開示される特定のＩＬ－１２部分アゴニストは、ＩＬ－１２Ｒβ１に対する親和性の低下を示し、これは抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する活性を保持するが、ＮＫ細胞の刺激の低下（例えば、障害）を示す。ＮＫ細胞媒介ＩＦＮγはＩＬ－１２毒性の原因であると考えられているため、これらの新しいアゴニストは、低い毒性でＩＬ－１２刺激の抗腫瘍効果を維持すると予測される。ＩＬ－２３の場合、本開示の部分アゴニストＩＬ－１２ｐ４０バリアントは、ＩＬ－２３シグナル伝達の段階的制御を可能にすることにより、自己免疫疾患の治療において治療的有用性を有すると考えられる。

【0103】

ＩＬ－１２及びＩＬ－２３シグナル伝達を阻害するＩＬ－１２ｐ４０の抗体遮断に依存する現在の治療アプローチを補完する、本開示の部分アゴニストＩＬ－１２ｐ４０バリアントは、ＩＬ－１２Ｒβ１に対するＩＬ－２３の親和性を調節することによって、ＩＬ－２３部分アゴニストは、ＩＬ－１２に影響を与えることなく、ＩＬ－２３シグナル伝達を特異的に調節するために使用することができる。

【0104】

従って、本開示のいくつかの実施形態は、アミノ酸置換を欠く参照ＩＬ－１２ポリペプチドと比較して、ＩＬ－１２を介して媒介される下流シグナル伝達の細胞型に偏ったシグナル伝達を付与する組換えＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドを提供し、ここで、細胞型に偏ったシグナル伝達には、ＮＫ細胞においてＩＬ－１２媒介シグナル伝達を刺激する組換えポリペプチドの能力の低下が含まれる。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組換えＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドバリアントがＮＫ細胞においてＩＬ－１２媒介シグナル伝達を刺激する能力は、アミノ酸置換を欠く参照ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドと比較して、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、又は少なくとも約９５％低下している。いくつかの実施形態において、細胞型に偏ったシグナル伝達は、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＩＬ－１２シグナル伝達を刺激する組換えポリペプチドの実質的に改変されていない能力を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ８＋Ｔ細胞においてＩＬ－１２媒介シグナル伝達を刺激する本明細書に開示される組換えＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドバリアントの能力は変化しておらず、例えば、アミノ酸を欠く参照ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドと比較して同じ又は実質的に同じである。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組換えＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドバリアントは、ＮＫ細胞においてＩＬ－１２シグナル伝達を刺激するＴ細胞ポリペプチドの能力の低下を付与するが、ＣＤ８＋Ｔ細胞においてＩＬ－１２シグナル伝達を刺激する能力は実質的に保持し、以下の実施例５に記載されるように、標的細胞の抗原特異的死滅を促進する。

【0105】

Ｂ．核酸
１つの態様において、発現カセット及び発現ベクターを含む、本開示の組換えＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む様々な核酸分子が本明細書で提供され、発現ベクターは、例えば宿主細胞又はエクスビボの無細胞発現系における組換えＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドのインビボ発現を可能にする調節配列などの、異種核酸配列に作動可能に連結されたこれらの核酸分子を含む。

【0106】

「核酸分子」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、及び核酸類似体を含むＤＮＡ又はＲＮＡ分子を含む核酸分子を含む、ＲＮＡ分子とＤＮＡ分子の両方を指す。核酸分子は、二本鎖又は一本鎖（例えばセンス鎖又はアンチセンス鎖）であり得る。核酸分子は、従来方ではないか又は修飾されたヌクレオチドを含むことができる。本明細書で使用される「ポリヌクレオチド配列」及び「核酸配列」という用語は、交換可能にポリヌクレオチド分子の配列を指す。本明細書に開示されるポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列は、参照によりＷＩＰＯ基準ＳＴ．２５（１９９８）、付録２、表１～６を取り込む３７ＣＦＲ§１．８２中に、ヌクレオチド塩基及びアミノ酸の標準的な文字略語を使用して示される。

【0107】

本開示の核酸分子は、一般に約０．５Ｋｂ～約２０Ｋｂ、例えば約０．５Ｋｂ～約２０Ｋｂ、約１Ｋｂ～約１５Ｋｂ、約２Ｋｂ～約１０Ｋｂ、又は約５Ｋｂ～約２５Ｋｂ、例えば約１０Ｋｂ～約１５Ｋｂ、約１５Ｋｂ～約２０Ｋｂ、約５Ｋｂ～約２０Ｋｂ、約５Ｋｂ～約１０Ｋｂ、又は約１０Ｋｂ～約２５Ｋｂである核酸分子を含む、任意の長さの核酸分子であり得る。

【0108】

本明細書に開示されるいくつかの実施形態において、本開示の核酸分子は、本明細書に開示される組換えポリペプチドのアミノ酸配列と、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本開示の核酸分子は、以下を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む：（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を有するＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドと、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列；及びさらに（ｂ）配列番号１のＸ３７、Ｘ３９、Ｘ４０、Ｘ４１、Ｘ８０、Ｘ８１、Ｘ８２、Ｘ１０６、Ｘ１０８、Ｘ１１５、Ｘ２１６、Ｘ２１７、Ｘ２１８、及びＸ２１９からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置に１つ又は複数のアミノ酸置換。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、配列番号１のＸ３９、Ｘ４０、Ｘ８１、Ｘ８２、Ｘ１０６、Ｘ２１７、及びＸ２１９からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置にある。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸残基Ｘ８１、Ｘ８２、Ｘ１０６、Ｘ２１７、及びＸ２１９に対応するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸残基Ｘ３９、Ｘ４０、Ｘ８１、Ｘ８２に対応する位置のアミノ酸置換の組合わせを含む。いくつかの実施形態において、本開示の核酸分子は、配列番号１と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、及び配列番号１のＷ３７、Ｐ３９、Ｄ４０、Ａ４１、Ｋ８０、Ｅ８１、Ｆ８２、Ｋ１０６、Ｅ１０８、Ｄ１１５、Ｈ２１６、Ｋ２１７、Ｌ２１８、及びＫ２１９からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応するアミノ酸置換をさらに含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、配列番号１のＷ３７、Ｐ３９、Ｄ４０、Ｅ８１、Ｆ８２、Ｋ１０６、Ｋ２１７、及びＫ２１９からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置にある。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸残基Ｅ８１、Ｅ８２、Ｋ１０６、Ｋ２１７、及びＫ２１９に対応するアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸残基Ｐ３９、Ｄ４０、Ｅ８１、Ｆ８２に対応する位置にアミノ酸置換の組合わせを含む。いくつかの実施形態において、本開示の核酸分子は、配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び以下のアミノ酸置換に対応するアミノ酸置換をさらに含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む：（ａ）Ｗ３７Ａ、（ｂ）Ｐ３９Ａ、（ｃ）Ｄ４０Ａ、（ｄ）Ｅ８１Ａ、（ｅ）Ｆ８２Ａ、（ｆ）Ｋ１０６Ａ、（ｇ）Ｄ１０９Ａ、（ｈ）Ｋ２１７Ａ、（ｉ）Ｋ２１９Ａ、（ｊ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ、（ｋ）Ｗ３７Ａ／Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ、（ｌ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ａ、（ｍ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ａ／Ｋ２１９Ａ、（ｎ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ａ／Ｋ２１７Ａ、（ｏ）８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ａ／Ｅ１０８Ａ／Ｄ１１５Ａ、（ｐ）Ｅ８１Ｆ／Ｆ８２Ａ、（ｑ）Ｅ８１Ｋ／Ｆ８２Ａ、（ｒ）Ｅ８１Ｌ／Ｆ８２Ａ、（ｓ）Ｅ８１Ｈ／Ｆ８２Ａ、（ｔ）Ｅ８１Ｓ／Ｆ８２Ａ、（ｕ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ｎ、（ｖ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ｑ、（ｗ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ｔ、（ｘ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ｒ、又は（ｙ）Ｐ３９Ａ／Ｄ４０Ａ／Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ。いくつかの実施形態において、本開示の核酸分子は、配列番号３～８及び１３～１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドと、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。

【0109】

いくつかの実施形態において、本開示の核酸分子は、以下を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む：（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有するＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドと、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列；及びさらに（ｂ）配列番号２のＸ３７、Ｘ３９、Ｘ４０、Ｘ４１、Ｘ８０、Ｘ８１、Ｘ８２、Ｘ１０６、Ｘ１０８、Ｘ１１５、Ｘ２１６、Ｘ２１７、Ｘ２１８、及びＸ２１９からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置に１つ又は複数のアミノ酸置換。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号２のＸ３９、Ｘ４０、Ｘ８１、Ｘ８２、Ｘ１０６、Ｘ２１７、及びＸ２１９からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置に追加のアミノ酸置換をさらに含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、配列番号２のＸ８１、Ｘ８２、Ｘ１０６、及びＸ２１７からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置にある。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸残基Ｘ８１、Ｘ８２、及びＸ１０６に対応する位置のアミノ酸置換の組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸残基Ｘ８１、Ｘ８２、Ｘ１０６、及びＸ２１７に対応する位置のアミノ酸置換の組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、本開示の核酸分子は、配列番号２と、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及びさらに配列番号２のＷ３７、Ｐ３９、Ｄ４０、Ａ４１、Ｋ８０、Ｅ８１、Ｆ８２、Ｋ１０６、Ｅ１０８、Ｄ１１５、Ｈ２１６、Ｋ２１７、Ｌ２１８、及びＥ２１９からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応するアミノ酸置換をさらに含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、配列番号２のＷ３７、Ｐ３９、Ｄ４０、Ｅ８１、Ｆ８２、Ｋ１０６、Ｋ２１７、及びＥ２１９からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置に追加のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、配列番号２のＥ８１、Ｆ８２、Ｋ１０６、及びＫ２１７からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置にある。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸残基Ｅ８１、Ｆ８２、及びＫ１０６に対応する位置のアミノ酸置換の組合わせを含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、配列番号２のＥ８１、Ｆ８２、Ｋ１０６、及びＫ２１７に対応する位置のアミノ酸置換の組合わせを含む。

【0110】

いくつかの実施形態において、本開示の核酸分子は、配列番号２と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び以下のアミノ酸置換に対応するアミノ酸置換をさらに含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む：（ａ）Ｗ３７Ａ；（ｂ）Ｐ３９Ａ、（ｃ）Ｄ４０Ａ、（ｄ）Ｅ８１Ａ、（ｅ）Ｆ８２Ａ、（ｆ）Ｋ１０６Ａ、（ｇ）Ｄ１０９Ａ、（ｈ）Ｋ２１７Ａ、（ｉ）Ｋ２１９Ａ、（ｊ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ、（ｋ）Ｗ３７Ａ／Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ、（ｌ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ａ、（ｍ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ａ／Ｋ２１７Ａ、（ｎ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ、（ｏ）８１Ｋ／Ｆ８２Ａ、（ｐ）Ｅ８１Ｌ／Ｆ８２Ａ、（ｑ）Ｅ８１Ｈ／Ｆ８２Ａ、（ｒ）Ｅ８１ｓ／Ｆ８２Ａ、（ｓ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ｎ、（ｔ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ｑ、（ｕ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ｔ、（ｖ）Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ／Ｋ１０６Ｒ、又は（ｗ）Ｐ３９Ａ／Ｄ４０Ａ／Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ。いくつかの実施形態において、本開示の核酸分子は、配列番号９～１１及び１７～２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドと、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。

【0111】

いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列は、発現カセット又は発現ベクターに取り込まれる。発現カセットは、一般に、コード配列と、インビボ及び／又はエクスビボで、レシピエント細胞においてコード配列の正しい転写及び／又は翻訳を指令するための十分な調節情報とを含む遺伝物質の構築物を含むことが理解される。一般に、発現カセットは、所望の宿主細胞及び／又は個体をターゲティングするために、ベクターに挿入され得る。従って、いくつかの実施形態において、本開示の発現カセットは、本明細書に開示される組換えポリペプチドのコード配列を含み、これは、プロモーターなどの発現制御要素、及び任意選択的に、コード配列の転写又は翻訳に影響を与える他の核酸配列のいずれか又は組み合わせに作動可能に連結される。

【0112】

いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列は発現ベクターに取り込まれる。「ベクター」という用語は、一般に、宿主細胞間の転移のために設計された組換えポリヌクレオチド構築物を指し、形質転換の目的、例えば宿主細胞内への異種ＤＮＡの導入のために使用され得ることを、当業者は理解するであろう。従って、いくつかの実施形態において、ベクターは、プラスミド、ファージ、又はコスミドなどのレプリコンであり得、挿入されたセグメントの複製をもたらすように、そこに別のＤＮＡセグメントが挿入され得る。いくつかの実施形態において、発現ベクターは組込みベクターであり得る。

【0113】

いくつかの実施形態において、発現ベクターはウイルスベクターであり得る。当業者には理解されるように、「ウイルスベクター」という用語は、典型的には、核酸分子の移動又は細胞のゲノムへの組み込みを促進するウイルス由来の核酸要素を含む核酸分子（例えばトランスファープラスミド）を、又は核酸の移動を媒介するウイルス粒子を指すために、広く使用されている。ウイルス粒子は、典型的には、核酸に加えて様々なウイルス成分を含み、時には宿主細胞成分も含む。ウイルスベクターという用語は、核酸を細胞に移動させることができるウイルス又はウイルス粒子、又は移動された核酸自体のいずれかを指し得る。ウイルスベクターとトランスファープラスミドには、主にウイルスに由来する構造的及び／又は機能的な遺伝要素が含まれている。いくつかの実施形態においてウイルスベクターは、バキュロウイルスベクター、レトロウイルスベクター、又はレンチウイルスベクターである。「レトロウイルスベクター」という用語は、主にレトロウイルスに由来する、構造的及び機能的遺伝要素又はその一部を含むウイルスベクター又はプラスミドを指す。「レンチウイルスベクター」という用語は、レトロウイルス属であるレンチウイルスに主に由来するＬＴＲを含む、構造的及び機能的遺伝要素又はその一部を含むウイルスベクター又はプラスミドを指す。

【0114】

従って、本明細書に開示される任意の組換えポリペプチド又はＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドバリアントをコードする核酸分子の１つ又は複数を含むベクター、プラスミド、又はウイルスも本明細書に提供される。核酸分子は、例えばベクターで形質転換／形質導入された細胞においてそれらの発現を指示すことができるベクター内に含まれ得る。真核細胞及び原核細胞での使用に適したベクターは、当技術分野で公知であり、市販されているか、又は当業者によって容易に調製される。

【0115】

ＤＮＡベクターは、従来の形質転換又はトランスフェクション技術を介して真核細胞に導入することができる。細胞を形質転換又はトランスフェクトするための適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （２０１２， 前述）及び他の標準的な分子生物学実験マニュアルに見いだすことができ、例えばリン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、トランスフェクション、微量注入法、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、電気穿孔法、形質導入、スクレイプローディング、弾道導入(ballistic introduction,)、ヌクレオポレーション、流体力学的ショック、及び感染がある。

【0116】

本開示で使用できるウイルスベクターには、例えばバキュロウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、及びアデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、及びウシパピローマウイルスベクターが含まれる（例えばＧｌｕｚｍａｎ （Ｅｄ．）， Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ， ＣＳＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ． を参照されたい）。例えば本明細書に開示されるキメラ受容体は、真核細胞、例えば哺乳動物細胞（例えばＣＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、又はヒーラ細胞）などにおいて産生され得る。これらの細胞は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ）を含む多くの供給源から入手できる。発現系を選択する際には、成分が互いに適合するように注意する必要がある。当業者は、そのような決定を下すことができる。さらに、発現系を選択する際にガイダンスが必要な場合、当業者は、Ｐ． Ｊｏｎｅｓ， “Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ２００９） を参照することができる。

【0117】

提供される核酸分子は、天然に存在する配列、又は天然に存在する配列とは異なるが、遺伝子コードの縮重のために同じポリペプチド、例えば抗体をコードする配列を含み得る。これらの核酸分子は、ＲＮＡ又はＤＮＡ（例えばゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又は合成ＤＮＡ、例えばホスホアミダイトベースの合成によって生成されるもの）、又はこれらのタイプの核酸内のヌクレオチドの組み合わせ又は修飾から構成され得る。さらに、核酸分子は、二本鎖又は一本鎖（例えばセンス鎖又はアンチセンス鎖のいずれか）であり得る。

【0118】

核酸分子は、ポリペプチド（例えば抗体）をコードする配列に限定されず、コード配列（例えばキメラ受容体のコード配列）の上流又は下流に位置する非コード配列の一部又は全部を含めることもできる。分子生物学の当業者は、核酸分子を単離するための日常的な操作に精通している。それらは、例えばゲノムＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで処理することによって、又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の実施によって生成することができる。核酸分子がリボ核酸（ＲＮＡ）である場合、分子は、例えばインビトロ転写によって産生され得る。

【0119】

別の態様において、本明細書に開示される少なくとも１つの組換え細胞を含む細胞培養物、及び培地が本明細書に提供される。一般に、培地は、本明細書に記載の細胞を培養するための任意の適切な培地であり得る。多種多様な上述の細胞及び種を形質転換するための技術は、当技術分野で公知であり、技術文献及び科学文献に記載されている。従って、本明細書に開示される少なくとも１つの組換え細胞を含む細胞培養物もまた、本出願の範囲内である。細胞培養物を生成及び維持するのに適した方法及びシステムは、当技術分野で公知である。

【0120】

Ｃ．組換え細胞と細胞培養物
本開示の組換え核酸は、ヒトＴリンパ球などの細胞に導入して、核酸分子を含む組換え細胞を産生することができる。本開示の核酸分子の細胞への導入は、当業者に公知の方法、例えばウイルス感染、トランスフェクション、接合、プロトプラスト融合、リポフェクション、電気穿孔、ヌクレオフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、粒子銃技術、リン酸カルシウム沈殿、直接微量注入、ナノ粒子媒介核酸送達などの方法によって達成することができる。

【0121】

従って、いくつかの実施形態において、核酸分子は、当技術分野で公知のウイルス又は非ウイルス送達ビヒクルによって送達することができる。例えば核酸分子は、組換え細胞のゲノムに安定に取り込まれるか、エピソーム的に複製するか、又は一過性発現のためのミニサークル発現ベクターとして組換え細胞に存在することができる。従って、いくつかの実施形態において、核酸分子は、組換え宿主細胞内でエピソーム単位として維持及び複製される。いくつかの実施形態において、核酸分子は、組換え細胞のゲノムに安定して組み込まれる。安定した組み込みは、古典的なランダムゲノム組換え技術、又はより正確な技術、例えばガイドＲＮＡ指向のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集、ＮｇＡｇｏ（Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｒｅｇｏｒｙｉ Ａｒｇｏｎａｕｔｅ）を用いるＤＮＡ誘導エンドヌクレアーゼゲノム編集、又はタレン（ＴＡＬＥＮ）ゲノム編集（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｕｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ）などを使用して達成することができる。いくつかの実施形態において、核酸分子は、一過性発現のためのミニサークル発現ベクターとして組換え細胞に存在する。

【0122】

核酸分子は、ウイルスカプシド又は脂質ナノ粒子に封入するか、又は電気穿孔法などの当技術分野で公知のウイルス又は非ウイルス送達手段及び方法によって送達することができる。例えば細胞への核酸の導入は、ウイルス形質導入によって達成され得る。非限定的な例では、バキュロウイルス又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を改変して、ウイルス形質導入を介して標的細胞に核酸を送達することができる。いくつかのＡＡＶ血清型が記載されており、既知の血清型はすべて、複数の多様な組織型の細胞に感染する可能性がある。ＡＡＶは、毒性の証拠なしに、インビボで広範囲の種及び組織に形質導入することができ、比較的軽度の自然免疫応答及び適応免疫応答を生成する。

【0123】

レンチウイルス由来ベクター系は、ウイルス形質導入を介する核酸送達及び遺伝子治療にも有用である。レンチウイルスベクターは、遺伝子送達媒体として次のようないくつかの魅力的な特性を提供する：（ｉ）宿主ゲノムへの安定したベクターの組み込みによる持続的な遺伝子送達；（ｉｉ）分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染する能力；（ｉｉｉ）重要な遺伝子療法及び細胞療法の標的細胞タイプを含む広範な組織親和性；（ｉｖ）ベクター形質導入後にウイルスタンパク質の発現がない；（ｖ）ポリシストロン配列又はイントロン含有配列などの複雑な遺伝要素を送達する能力；（ｖｉ）潜在的により安全な組み込み部位プロフィール；及び（ｖｉｉ）ベクトルの操作と産生のための比較的簡単なシステム。

【0124】

いくつかの実施形態において、例えば宿主細胞のゲノムの一部に相同的な核酸配列を含むか、又は目的のポリペプチドの発現のための発現ベクターであり得る相同組換え用のウイルスベクター又はベクターであり得る、本願のベクター構築物を用いて、宿主細胞を改変（例えば形質導入又は形質転換又はトランスフェクト）することができる。宿主細胞は、非形質転換細胞であるか、又は少なくとも１つの核酸分子ですでにトランスフェクトされた細胞のいずれかであり得る。

【0125】

いくつかの実施形態において、組換え細胞は原核細胞又は真核細胞である。いくつかの実施形態において、細胞はインビボである。いくつかの実施形態において、細胞はエクスビボである。いくつかの実施形態において、細胞はインビトロである。いくつかの実施形態において、組換え細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態において、組換え細胞は動物細胞である。いくつかの実施形態において、動物細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、動物細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は非ヒト霊長類細胞である。いくつかの実施形態において、組換え細胞は、免疫系細胞、例えばリンパ球（例えばＴ細胞又はＮＫ細胞）、又は樹状細胞である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、Ｂ細胞、単球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好塩基球、好酸球、好中球、樹状細胞、マクロファージ、制御性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞（Ｔ_H）、細胞傷害性Ｔ細胞（Ｔ_CTL）、又は他のＴ細胞である。いくつかの実施形態において、免疫系細胞はＴリンパ球である。いくつかの実施形態において、細胞は、対象から得られた試料に対して行われる白血球除去によって得ることができる。いくつかの実施形態において、対象はヒト対象である。いくつかの実施形態において、ヒト対象は患者である。

【0126】

適切な細胞株の非限定的な例には、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ細胞、Ｓｐｏｄｏｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ 昆虫細胞、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞、Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（ＧｎＴＩ）欠損ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ－２９３Ｔ（ＡＴＣＣ ＃ＣＲＬ－３２１６）、ＨＴ－２９（ＡＴＣＣ ＃ＨＴＢ－３８）、Ｐａｎｃ－１（ＡＴＣＣ ＃ＣＲＬ－１４６９）、ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ ＃ＨＢ－８０６５）、及びＥＣ４細胞が含まれる。

【0127】

別の態様において、本明細書に開示される少なくとも１つの組換え細胞を含む細胞培養物、及び培地が本明細書に提供される。一般に培地は、本明細書に記載の細胞を培養するための任意の適切な培地であり得る。多種多様な上述の細胞及び種を形質転換するための技術は、当技術分野で公知であり、技術文献及び科学文献に記載されている。従って、本明細書に開示される少なくとも１つの組換え細胞を含む細胞培養物もまた、本出願の範囲内である。細胞培養物を生成及び維持するのに適した方法及びシステムは、当技術分野で公知である。

【0128】

Ｄ．ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドの産生方法
別の態様において、本開示のいくつかの実施形態は、本開示の組換えポリペプチドを産生するための様々な方法に関し、この方法は以下を含む：（ａ）本開示の１つ又は複数の組換え細胞を提供すること；及び組換え細胞を培地中で培養して、組換え核酸分子によってコードされるポリペプチドを細胞が産生するようにすること。従って、本明細書に開示される方法によって産生される組換えポリペプチドもまた、本開示の範囲内である。

【0129】

組換えポリペプチドを産生するための開示された方法の非限定的な例示的実施形態は、以下の１つ又は複数の特徴を含み得る。いくつかの実施形態において、本方法は、産生されたポリペプチドを単離及び／又は精製することをさらに含む。いくつかの実施形態において、本開示の組換えポリペプチドを産生する方法は、産生されたポリペプチドを単離及び／又は精製することをさらに含む。いくつかの実施形態において、本開示のポリペプチドを産生する方法は、産生されたポリペプチドの構造を修飾して半減期を延長させることをさらに含む。

【0130】

いくつかの実施形態において、修飾は、ヒトＦｃ抗体断片への融合、アルブミンへの融合、及びＰＥＧ化からなる群から選択される１つ又は複数の改変を含む。例えば本明細書に開示される組換えポリペプチドのいずれも、組換えポリペプチド及び異種ポリペプチド（例えばＩＬ－１２ｐ４０でもそのバリアントでもないポリペプチド）を含む融合体又はキメラポリペプチドとして調製することができる。例示的な異種ポリペプチドは、インビボでキメラポリペプチドの循環半減期を延長させることができ、従って、本開示の組換えポリペプチドの特性をさらに増強することができる。様々な実施形態において、循環半減期を延長させる異種ポリペプチドは、ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミン、又はＩｇＧ重鎖可変領域を欠く抗体のＩｇＧサブクラスのＦｃ領域であり得る。例示的なＦｃ領域は、補体結合及びＦｃ受容体結合を阻害する突然変異を含むことができるか、又はそれは溶解性であり得、例えば補体に結合し得るか、又は抗体依存性補体溶解（ＡＤＣＣ）などの別の機構を介して細胞を溶解することができる。

【0131】

いくつかの実施形態において、「Ｆｃ領域」は、パパインによるＩｇＧの消化によって産生されるＩｇＧのＣ末端ドメインに相同的な天然又は合成ポリペプチドであり得る。ＩｇＧ Ｆｃの分子量は約５０ｋＤａである。本開示の組換え融合ポリペプチドは、Ｆｃ領域全体、又はそれが一部であるキメラポリペプチドの循環半減期を延長する能力を保持するそのより小さな部分を含むことができる。さらに、全長又は断片化されたＦｃ領域は、野生型分子のバリアントであり得る。すなわちそれらは、ポリペプチドの機能に影響するかも又は影響しないかもしれない突然変異を含み得る。以下でさらに説明するように、天然の活性が、必ずしもすべての場合に必要又は望ましいわけではない。いくつかの実施形態において、組換え融合タンパク質（例えば本明細書に記載のＩＬ－１２ｐ４０部分アゴニスト又はアンタゴニスト）は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４ Ｆｃ領域を含む。

【0132】

Ｆｃ領域は、「溶解性」又は「非溶解性」であり得るが、典型的には非溶解性である。非溶解性Ｆｃ領域は、典型的には、高親和性Ｆｃ受容体結合部位及びＣ’１ｑ結合部位を欠いている。マウスＩｇＧ Ｆｃの高親和性Ｆｃ受容体結合部位は、ＩｇＧ Ｆｃの２３５位にＬｅｕ残基を含む。従って、Ｆｃ受容体結合部位は、Ｌｅｕ２３５を変異又は欠失させることによって破壊することができる。例えばＬｅｕ２３５をＧｌｕで置換すると、Ｆｃ領域が高親和性Ｆｃ受容体に結合する能力が阻害される。マウスのＣ’１ｑ結合部位は、ＩｇＧのＧｌｕ３１８、Ｌｙｓ３２０、及びＬｙｓ３２２残基を変異又は欠失させることによって機能的に破壊することができる。例えばＧｌｕ３１８、Ｌｙｓ３２０、及びＬｙｓ３２２をＡｌａ残基で置換すると、ＩｇＧ１ Ｆｃは抗体依存性補体溶解を指令できなくなる。対照的に、溶解性ＩｇＧ Ｆｃ領域は、高親和性Ｆｃ受容体結合部位及びＣ’１ｑ結合部位を有する。高親和性Ｆｃ受容体結合部位は、ＩｇＧ Ｆｃの２３５位にＬｅｕ残基を含み、Ｃ’１ｑ結合部位は、ＩｇＧ１のＧｌｕ３１８、Ｌｙｓ３２０、及びＬｙｓ３２２残基を含む。溶解性ＩｇＧ Ｆｃは、これらの部位に野生型残基又は保存的アミノ酸置換を有する。溶解性ＩｇＧ Ｆｃは、抗体依存性細胞傷害又は補体指令細胞溶解（ＣＤＣ）のための細胞を標的にすることができる。ヒトＩｇＧの適切な変異も公知である（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ ２：１１９－１２４， １９９４； ａｎｄ Ｂｒｅｋｋｅ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ ２： １２５， １９９４を参照）。

【0133】

他の実施形態において、組換え融合ポリペプチドは、本開示の組換えＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチド、及びＦＬＡＧ配列などの抗原タグとして機能するポリペプチドを含むことができる。ＦＬＡＧ配列は、ビオチン化された特異性の高い抗ＦＬＡＧ抗体によって認識される。いくつかの実施形態において、組換え融合ポリペプチドはＣ末端ｃ－ｍｙｃエピトープタグをさらに含む。

【0134】

他の実施形態において、組換え融合ポリペプチドは、本開示の組換えＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドと、Ａｇａ２ｐ凝集素サブユニットなどのＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドの発現を増強するか又は細胞局在化を指令するように機能する異種ポリペプチドとを含む。

【0135】

他の実施形態において、本開示の組換えＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチド及び抗体又はその抗原結合部分を含む融合ポリペプチドを生成することができる。キメラタンパク質の抗体又は抗原結合成分は、標的化部分として働くことができる。例えばこれは、キメラタンパク質を細胞又は標的分子の特定のサブセットに局在化するために使用することができる。サイトカイン－抗体キメラポリペプチドを生成する方法は、当技術分野で公知である。

【0136】

いくつかの実施形態において、本開示の組換えＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドは１つ又は複数のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子で修飾して、その半減期を延長させることができる。本明細書で使用される「ＰＥＧ」という用語は、ポリエチレングリコール分子を意味する。典型的な形態では、ＰＥＧは末端ヒドロキシル基を有する線状ポリマーであり、式ＨＯ－ＣＨ₂ＣＨ₂－（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_n－ＣＨ₂ＣＨ₂－ＯＨを有し、ここで、ｎは約８～約４０００である。

【0137】

一般に、「ｎ」は離散値ではなく、平均値の周りにほぼガウス分布を有する範囲を構成する。末端水素は、アルキル基又はアルカノール基などのキャッピング基で置換されていてもよい。ＰＥＧは、少なくとも１つのヒドロキシ基を有することができ、より好ましくはこれは末端ヒドロキシ基である。このヒドロキシ基は、ペプチドと反応して共有結合を形成することができるリンカー部分に結合することができる。ＰＥＧの多数の誘導体が当技術分野に存在する。本開示の組換えＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドに共有結合したＰＥＧ分子は、約１０，０００、２０，０００、３０，０００、又は４０，０００ダルトンの平均分子量であり得る。ＰＥＧ化試薬は、直鎖状又は分枝状の分子でもよく、単独又はタンデムで存在することができる。本開示のＰＥＧ化ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドは、ペプチドのＣ末端及び／又はＮ末端に結合したタンデムＰＥＧ分子を有することができる。本明細書で使用される「ＰＥＧ化」という用語は、上述したように、本開示のＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドなどの分子への、１つ又は複数のＰＥＧ分子の共有結合を意味する。いくつかの実施形態において、本開示の組換えポリペプチド、例えばＩＬ－１２ｐ４０（ｐ４０）バリアントポリペプチドは、配列番号１又は配列番号２のＷ３７、Ｐ３９、Ｄ４０、Ｋ８０、Ｋ１０６、Ｅ１０８、Ｄ１１５、Ｈ２１６、及びＫ２１７に対応する位置の１つ又は複数でＰＥＧ化され得る。

【0138】

Ｅ．医薬組成物
本開示の組換えポリペプチド、核酸、組換え細胞、及び／又は細胞培養物は、医薬組成物を含む組成物に取り込むことができる。そのような組成物は、一般に、本明細書に提供及び記載された組換えポリペプチド、核酸、組換え細胞、及び／又は細胞培養物、並びに医薬的に許容し得る賦形剤、例えば担体の１つ又は複数を含む。いくつかの実施形態において、本開示の医薬組成物は、癌などの疾患を治療、予防、改善するため、又は疾患の発症を軽減又は遅延させるために、製剤化される

【0139】

従って、本開示の１つの態様は、以下のうちの１つ又は複数を含む医薬組成物に関する：（ａ）本開示の組換えポリペプチド；（ｂ）本開示の組換え核酸；（ｃ）本開示の組換え細胞；及び（ｄ）医薬的に許容し得る担体。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、（ａ）本開示の組換えポリペプチド、及び（ｂ）医薬的に許容し得る担体を含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、（ａ）本開示の組換え細胞、及び（ｂ）医薬的に許容し得る担体を含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、（ａ）本開示の組換え核酸、及び（ｂ）医薬的に許容し得る担体を含む。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、ウイルスキャプシド又は脂質ナノ粒子中に封入される

【0140】

注射用途に適した医薬組成物には、無菌水溶液（水溶性の場合）又は分散液、及び無菌注射溶液又は分散液の即時調製用の無菌粉末が含まれる。静脈内投与の場合、適切な担体には、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ， Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ， Ｎ．Ｊ．）、又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。すべての場合において、組成物は無菌でなければならず、容易に注射できる程度に流動的であるべきである。これは、製造及び保管条件下で安定していなければならず、バクテリアや菌類などの微生物による汚染作用から防御して保存しなければならない。担体は、溶媒又は分散媒体でもよく、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの適切な混合物が含まれる。適切な流動性は、例えばレシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合は必要な粒子サイズの維持、及びドデシル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば糖類、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、及び／又は塩化ナトリウムを含めるのが一般的であろう。注射用組成物の持続的な吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物に含めることに行われる。

【0141】

無菌注射溶液は、必要に応じて、上に列挙した成分の１つ又は組み合わせを含む適切な溶媒中に必要量の活性化合物を取り込み、続いて濾過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散液は、活性化合物を無菌ビヒクルに取り込むことによって調製され、このビヒクルは、基本的な分散媒体と、上に列挙したものからの必要な他の成分を含む。無菌注射溶液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥及び凍結乾燥であり、これは、有効成分の粉末に加えて、事前に無菌濾過されたその溶液からの任意の追加の所望の成分を与える。

【0142】

いくつかの実施形態において、本開示の対象の組換えポリペプチドは、体内からの急速な排出から組換えポリペプチドを防御する担体、例えばインプラント及びマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤を用いて調製される。生分解性、生体適合性ポリマー、例えばエチレンビニルアセテート、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸を使用することができる。このような製剤は、標準的な技術を使用して調製することができる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を用いて感染細胞を標的とするリポソームを含む）も、医薬的に許容し得る担体として使用することができる。これらは、当業者に公知の方法に従って調製することができる。

【0143】

以下により詳細に記載されるように、本開示の組換えポリペプチドはまた、ＰＥＧ化、アシル化、Ｆｃ融合、アルブミンなどの分子への結合などによって、延長された作用持続時間を達成するように修飾され得る。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、インビボ及び／又はエクスビボでの半減期を延長するためにさらに修飾することができる。本開示の組換えポリペプチドを修飾するのに適した既知の戦略及び方法論の非限定的な例には、（１）組換えポリペプチドがプロテアーゼと接触するのを防ぐポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）などの高溶解性高分子による、本明細書に記載の組換えポリペプチドの化学修飾、（２）本明細書に記載の組換えポリペプチドに、例えばアルブミンなどの安定なタンパク質を共有的に連結又は結合させること、を含む。従って、いくつかの実施形態において、本開示の組換えポリペプチドは、アルブミンなどの安定なタンパク質に融合することができる。例えばヒトアルブミンは、そこに融合したポリペプチドの安定性を高める最も効果的なタンパク質の１つとして知られており、そのような多くの融合タンパク質が報告されている。

【0144】

アシル化
いくつかの実施形態において、本開示のＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドバリアントポリペプチドを含む二量体ＩＬ－１２又はＩＬ－２３ポリペプチドの成分の一方又は両方は、Ｒｅｓｈ （２０１６） Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６３：１２０－１３１に記載されている脂肪酸分子に結合することによりアシル化することができる。結合できる脂肪酸の例には、ミリステート、パルミテート、及びパルミトレイン酸が含まれる。ミリストイル酸は通常、Ｎ末端グリシンに結合しているが、リジンもミリストイル化されている場合がある。パルミトイル化は通常、ＤＨＨＣタンパク質がＳ－パルミトイル化を触媒するように、遊離システイン－ＳＨ基の酵素修飾によって達成される。セリン及びスレオニン残基のパルミトイル化は、通常、ＰＯＲＣＮ酵素を使用して酵素的に達成される。

【0145】

アセチル化
いくつかの実施形態において、本開示のＩＬ－１２ｐ４０バリアントポリペプチドを含むＩＬ－１２又はＩＬ－２３は、二量体ＩＬ－１２又はＩＬ－２３分子のいずれか又は両方のＮ末端で、Ｎ末端アセチルトランスフェラーゼ、及び例えばアセチルＣｏＡとの酵素反応によってアセチル化される。あるいは、又はＮ末端アセチル化に加えて、本開示のＩＬ－１２（ｐ３５／ｐ４０）バリアント又はＩＬ－２３（ｐ１９／ｐ４０）バリアントポリペプチドのサブユニットが、１つ又は複数のリジン残基で、例えばリジンアセチルトランスフェラーゼによる酵素反応によりアセチル化される。例えば、Ｃｈｏｕｄｈａｒｙ ｅｔ ａｌ． （２００９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２５ （５９４２）：８３４Ｌ２ ｏｒｔｈｏ８４０を参照されたい。

【0146】

Ｆｃ融合
いくつかの実施形態において、二量体ＩＬ－１２（ｐ３５／ｐ４０）バリアント又はＩＬ－２３（ｐ１９／ｐ４０）バリアントポリペプチドがＦｃ融合体の形式で提供され得る場合、二量体分子の各成分は二量体Ｆｃ分子の個々のサブユニット上に提供される。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２ｐ４０融合タンパク質は、ＩｇＧ重鎖可変領域を欠く抗体のＩｇＧサブクラスに由来するＦｃ領域を取り込んでもよい。「Ｆｃ領域」は、パパインによるＩｇＧの消化によって産生されるＩｇＧのＣ末端ドメインに相同な天然ポリペプチド又は合成ポリペプチドであり得る。ＩｇＧ Ｆｃの分子量は約５０ｋＤａである。変異体コンジュゲートポリペプチドは、Ｆｃ領域全体、又はキメラポリペプチドの循環半減期を延長する能力を保持するより小さい部分（これは、キメラポリペプチドの一部である）を含み得る。さらに、全長又は断片化Ｆｃ領域は、野生型分子のバリアントであり得る。すなわち、これらは、ポリペプチドの機能に影響するか又は影響しないかもしれない突然変異を含むことができる；以下でさらに説明されるように、本来の活性がすべての場合に必要又は望ましいわけではない。特定の実施形態において、Ｆｃ融合タンパク質（例えば、ＩＬ－１２ｐ３５又はＩＬ－２３ｐ１９、及びＩＬ－１２ｐ４０バリアント）は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４Ｆｃ領域を含む。例示的なＦｃ領域は、補体結合及びＦｃ受容体結合を阻害する突然変異を含むことができるか、あるいはこれは溶解性、すなわち補体に結合できるか、又は抗体依存性補体溶解（ＡＤＣＣ）などの別のメカニズムを介して細胞を溶解することができる。

【0147】

いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２ｐ３５又はＩＬ－２３ｐ１９とｐ４０バリアント融合タンパク質は、Ｆｃ融合キメラポリペプチド分子の機能的ドメインを含む。Ｆｃ融合コンジュゲートは、バイオ医薬品の全身の半減期を延長することが示されているため、バイオ医薬品の投与頻度を減らすことができる。Ｆｃは、血管の内側を覆う内皮細胞の新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合し、結合すると、Ｆｃ融合分子は分解から保護され、循環中に再放出され、分子をより長く循環中に維持する。このＦｃ結合は、内因性ＩｇＧがその長い血漿半減期を保持するメカニズムであると考えられる。より最近のＦｃ融合技術は、バイオ医薬品の単一コピーを抗体のＦｃ領域に連結して、従来のＦｃ融合コンジュゲートと比較して、バイオ医薬品の薬物動態学的及び薬力学的特性を最適化する。Ｆｃ融合体の調製に有用な「Ｆｃ領域」は、パパインによるＩｇＧの消化によって産生されるＩｇＧのＣ末端ドメインに相同な天然ポリペプチド又は合成ポリペプチドであり得る。ＩｇＧＦｃの分子量は約５０ｋＤａである。ＩＬ－１２ｐ４０バリアントは、Ｆｃ領域全体、又はキメラポリペプチドの循環半減期を延長する能力を保持するより小さい部分（キメラポリペプチドの一部である）を含み得る。さらに、全長又は断片化されたＦｃ領域は、野生型分子のバリアントであり得る。通常の実施において、二量体Ｆｃの各単量体は、二量体ＩＬ－１２（ｐ３５／ｐ４０）バリアント又はＩＬ－２３（ｐ１９／ｐ４０）バリアントポリペプチドの成分を保有する。

【0148】

Ｋｎｏｂ／ＨｏｌｅＦｃコンジュゲート
いくつかの実施形態において、二量体ＩＬ－１２（ｐ３５／ｐ４０）バリアント又はＩＬ－２３（ｐ１９／ｐ４０）バリアントポリペプチドをＦｃ融合体の形式で提供することができ、ここで二量体分子の各成分は二量体Ｆｃ分子の個々のサブユニット上に提供され、二量体Ｆｃ分子サブユニットが「ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ修飾」を有するように改変されると、ＩＬ－１２（すなわち、ｐ３５及びｐ４０バリアント）又はＩＬ－２３（ｐ１９及びｐ４０バリアント）の各サブユニットが融合タンパク質（任意選択的に、ｐ３５又はｐ１９配列とＦｃサブユニット配列の間に介在性リンカー配列を含む）として、「ｋｎｏｂ」又は「ｈｏｌｅ」Ｆｃサブユニット上で発現され、ｐ４０バリアントポリペプチドは、相補的な「ｋｎｏｂ」又は「ｈｏｌｅ」Ｆｃサブユニット上に発現される。ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ修飾については、Ｒｉｄｇｗａｙ， ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ９（７）：６１７－６２１ 及び米国特許第５，７３１，１６８号に詳しく説明されている。一般に、ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ修飾は、ＣＨ３ドメインにおける２つの免疫グロブリン重鎖間の界面における修飾を指し、ここで、ｉ）第１の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）を有するアミノ酸残基で置換されて、表面からの突起（「ｋｎｏｂ」）を形成し、及びｉｉ）第２の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より小さな側鎖（例えば、アラニン又はスレオニン）を有するアミノ酸残基で置換されて、第２のＣＨ３ドメインの界面で空洞（「ｈｏｌｅ」）を生成し、その中で、第１のＣＨ３ドメインの突出側鎖（「ｋｎｏｂ」）が第２のＣＨ３ドメインの空洞によって受容される。１つの実施形態において、「ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ修飾」は、抗体重鎖の一方にアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗ及び任意選択的にアミノ酸置換Ｓ３５４Ｃを含み、抗体重鎖の他方にアミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、及び任意選択的にＹ３４９Ｃを含む。さらに、Ｆｃドメインは、位置Ｓ３５４及びＹ３４９にシステイン残基の導入によって修飾することができ、その結果、Ｆｃ領域の２つの抗体重鎖間に安定したジスルフィド架橋が生じる（ＣＡＲＴｅｒ， ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８， ７－１５）。ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ形式は、「ｋｎｏｂ」修飾を有する第１のＦｃモノマー上の第１のポリペプチド（例えば、本開示のｐ４０バリアント）と「ｈｏｌｅ」修飾を有する第２のＦｃモノマー上の第２のポリペプチド（ｐ１９又はｐ３５）の発現を促進するために使用されるか、又はその逆もあり、ヘテロダイマーＩＬ－１２（ｐ３５／ｐ４０）バリアント又はＩＬ－２３（ｐ１９／ｐ４０）バリアントポリペプチドＦｃ融合構築物の発現及び表面提示を促進する。

【0149】

ＰＥＧ化
いくつかの実施形態において、本開示の医薬組成物は、１つ又は複数のＰＥＧ化試薬を含む。本明細書で使用される「ＰＥＧ化」という用語は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をタンパク質に共有結合させることによってタンパク質を修飾することを指し、「ＰＥＧ化された」とはＰＥＧが結合したタンパク質を指す。約１０，０００ダルトン～約４０，０００ダルトンまでの任意の範囲のサイズを有する一連のＰＥＧ又はＰＥＧ誘導体を、様々な化学を使用して本開示の組換えポリペプチドに結合することができる。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ又はＰＥＧ誘導体の平均分子量は、約１ｋＤ～約２００ｋＤ、例えば約１０ｋＤ～約１５０ｋＤ、約５０ｋＤ～約１００ｋＤ、約５ｋＤ～約１００ｋＤ、約２０ｋＤ～約８０ｋＤ、約３０ｋＤ～約７０ｋＤ、約４０ｋＤ～約６０ｋＤ、約５０ｋＤ～約１００ｋＤ、約１００ｋＤ～約２００ｋＤ、又は約１５０ｋＤ～約２００ｋＤである。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ又はＰＥＧ誘導体の平均分子量は、約５ｋＤ、約１０ｋＤ、約２０ｋＤ、約３０ｋＤ、約４０ｋＤ、約５０ｋＤ、約６０ｋＤ、約７０ｋＤ、又は約８０ｋＤである。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ又はＰＥＧ誘導体の平均分子量は、約４０ｋＤである。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化試薬は、メトキシポリエチレングリコール－プロピオン酸スクシンイミジル（ｍＰＥＧ－ＳＰＡ）、ｍＰＥＧ－酪酸スクシンイミジル（ｍＰＥＧ－ＳＢＡ）、ｍＰＥＧ－コハク酸スクシンイミジル（ｍＰＥＧ－ＳＳ）、ｍＰＥＧ－炭酸スクシンイミジル（ｍＰＥＧ－ＳＣ）、ｍＰＥＧ－グルタル酸スクシンイミジル（ｍＰＥＧ－ＳＧ）、ｍＰＥＧ－Ｎ－ヒドロキシル－スクシンイミド（ｍＰＥＧ－ＮＨＳ）、ｍＰＥＧ－トレシレート、及びｍＰＥＧ－アルデヒドから選択される。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化試薬はポリエチレングリコールである。例えばＰＥＧ化試薬は、本開示の組換えポリペプチドのＮ末端メチオニン残基に共有結合した平均分子量２０，０００ダルトンのポリエチレングリコールである。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化試薬は、本開示の組換えポリペプチドのＮ末端メチオニン残基に共有結合した、平均分子量が約５ｋＤ、約１０ｋＤ、約２０ｋＤ、約３０ｋＤ、約４０ｋＤ、約５０ｋＤ、約６０ｋＤ、約７０ｋＤ、又は約８０ｋＤのポリエチレングリコールである。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化試薬は、本開示の組換えポリペプチドのＮ末端メチオニン残基に共有結合した平均分子量が約４０ｋＤのポリエチレングリコールである。

【0150】

従って、いつかの実施形態において、本開示の組換えポリペプチドは、１つ又は複数のポリエチレングリコール部分で化学的に修飾、例えばＰＥＧ化されているか、又は同様の修飾、例えばＰＡＳ化されている．いくつかの実施形態において、ＰＥＧ分子又はＰＡＳ分子は、開示された組換えポリペプチドの１つ又は複数のアミノ酸側鎖に結合される。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化又はＰＡＳ化されたポリペプチドは、１つのみのアミノ酸上のＰＥＧ又はＰＡＳ部分を含む。他の実施形態において、ＰＥＧ化又はＰＡＳ化ポリペプチドは、２つ又はそれ以上のアミノ酸上の、例えば２以上、５以上、１０以上、１５以上、又は２０以上の異なるアミノ酸残基に結合したＰＥＧ又はＰＡＳ部分を含む。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ又はＰＡＳ鎖は、２０００、２０００超、５０００、５，０００超、１０，０００、１０，０００超、１０，０００超、２０，０００、２０，０００超、及び３０，０００Ｄａである。ＰＡＳ化ポリペプチドは、アミノ基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基、又はカルボキシル基を介してＰＥＧ又はＰＡＳに（例えば連結基なしで）直接結合され得る。いくつかの実施形態において、本開示の組換えポリペプチドは、平均分子量が約１ｋＤ～約２００ｋＤ、例えば約１０ｋＤ～約１５０ｋＤ、約５０ｋＤ～約１００ｋＤ、約５ｋＤ～約１００ｋＤ、約２０ｋＤ～約８０ｋＤ、約３０ｋＤ～約７０ｋＤ、約４０ｋＤ～約６０ｋＤ、約５０ｋＤ～約１００ｋＤ、約１００ｋＤ～約２００ｋＤ、又は約１５０ｋＤ～約２００ｋＤの範囲のポリエチレングリコールに共有結合される。いくつかの実施形態において、本開示の組換えポリペプチドは、平均分子量が約５ｋＤ、約１０ｋＤ、約２０ｋＤ、約３０ｋＤ、約４０ｋＤ、約５０ｋＤ、約６０ｋＤ、約７０ｋＤ、又は約８０ｋＤの平均分子量であるポリエチレングリコールに共有結合される。いくつかの実施形態において、本開示の組換えポリペプチドは、平均分子量が約４０ｋＤのポリエチレングリコールに共有結合される。

【0151】

部位特異的ＰＥＧ化部位の取り込み
いくつかの実施形態において、本開示の組換えポリペプチド（例えばＩＬ－１２ｐ４０バリアント）は、例えば米国特許第７，０４５，３３７号；７，９１５，０２５号；Ｄｉｅｔｅｒｓ， ｅｔ ａｌ． （２００４） Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ １４（２３）：５７４３－５７４５；Ｂｅｓｔ， Ｍ （２００９） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４８（２８）： ６５７１－６５８４ に記載されているように、部位特異的結合（例えばＰＥＧ化）を促進する非天然のアミノ酸側鎖を有する非天然のアミノ酸の取り込みによって修飾され得る。いくつかの実施形態において、例えば Ｄｏｚｉｅｒ ａｎｄ Ｄｉｓｔｅｆａｎｏ （２０１５） Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ １６（１０）： ２５８３１－２５８６４ に記載されているように、本開示の組換えポリペプチド内の種々の位置にシステイン残基を取り込んで、システイン側鎖を介して部位特異的ＰＥＧ化を促進することができる。

【0152】

特定の実施形態において、本開示は、本開示の部位特異的ＰＥＧ化を可能にする１つ又は複数のアミノ酸（例えばシステイン又は非天然アミノ酸）の取り込みを含むＩＬ－１２ｐ４０バリアントポリペプチドを提供し、ここで、部位特異的ＰＥＧ化部位のためのアミノ酸置換は、ｐ４０／ｐ３５（ＩＬ－１２）又はｐ４０／ｐ１９（ＩＬ－２３）界面との間の界面にはない。

【0153】

いくつかの実施形態において、部位特異的アミノ酸修飾の取り込みは、配列番号１のアミノ酸残基Ｗ３７、Ｐ３９、Ｄ４０、Ａ４１、Ｋ８０、Ｅ８１、Ｆ８２、Ｋ１０６、Ｅ１０８、Ｄ１１５、Ｈ２１６、Ｋ２１７、Ｌ２１８、及びＫ２１９以外のＩＬ－１２ｐ４０アミノ酸位置（すなわち、シグナルペプチドを欠く成熟ＩＬ－１２ｐ４０タンパク質に従って番号付けされた場合、残基Ｗ１５、Ｐ１７、Ｄ１８、Ａ１９、Ｋ５８、Ｅ５９、Ｆ６０、Ｋ８４、Ｅ８６、Ｄ９３、Ｈ１９４、Ｋ１９５、Ｌ１９６、及びＫ１９７）で行われる。いくつかの実施形態において、本開示は、配列番号１に従って番号付けされたアミノ酸位置Ｗ３７、Ｐ３９、Ｄ４０、Ａ４１、Ｋ８０、Ｅ８１、Ｆ８２、Ｋ１０６、Ｅ１０８、Ｄ１１５、Ｈ２１６、Ｋ２１７、Ｌ２１８、及びＫ２１９で部位特異的結合（例えばＰＥＧ化）を可能にする部位特異的アミノ酸置換を含むヒトｐ４０バリアントを含む組成物を提供する。

【0154】

いくつかの実施形態において、部位特異的アミノ酸修飾の取り込みは、配列番号２のアミノ酸残基Ｗ３７、Ｐ３９、Ｄ４０、Ａ４１、Ｋ８０、Ｅ８１、Ｆ８２、Ｋ１０６、Ｅ１０８、Ｄ１１５、Ｈ２１６、Ｋ２１７、Ｌ２１８、及びＫ２１９以外のＩＬ－１２ｐ４０アミノ酸位置（すなわち、シグナルペプチドを欠く成熟ＩＬ－１２ｐ４０タンパク質に従って番号付けされた場合、残基Ｗ１５、Ｐ１７、Ｄ１８、Ａ１９、Ｋ５８、Ｅ５９、Ｆ６０、Ｋ８４、Ｅ８６、Ｄ９３、Ｈ１９４、Ｋ１９５、Ｌ１９６、及びＫ１９７）で行われる。いくつかの実施形態において、本開示は、配列番号２に従って番号付けされたアミノ酸位置Ｗ３７、Ｐ３９、Ｄ４０、Ａ４１、Ｋ８０、Ｅ８１、Ｆ８２、Ｋ１０６、Ｅ１０８、Ｄ１１５、Ｈ２１６、Ｋ２１７、Ｌ２１８、及びＫ２１９で部位特異的結合（例えばＰＥＧ化）を可能にする部位特異的アミノ酸置換を含むヒトｐ４０バリアントを含む組成物を提供する。

【0155】

界面での部位特異的ＰＥＧ化部位を介するＩＬ－１２及びＩＬ－２３部分アゴニスト
いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２ｐ４０タンパク質とｐ３５又はｐ１９タンパク質との相互作用は、ＩＬ－１２ｐ４０界面の本明細書に記載のアミノ酸位置に部位特異的ＰＥＧ化を取り込むことによって調節することができる。配列番号１又は配列番号２の残基３７、Ｐ３９、Ｄ４０、Ａ４１、Ｋ８０、Ｅ８１、Ｆ８２、Ｋ１０６、Ｅ１０８、Ｄ１１５、Ｈ２１６、Ｋ２１７、Ｌ２１８、及びＫ２１９（すなわち、シグナルペプチドを欠く成熟ＩＬ－１２ｐ４０タンパク質、すなわち配列番号２６又は配列番号２７の配列に従って番号付けした場合、残基Ｗ１５、Ｐ１７、Ｄ１８、Ａ１９、Ｋ５８、Ｅ５９、Ｆ６０、Ｋ８４、Ｅ８６、Ｄ９３、Ｈ１９４、Ｋ１９５、Ｌ１９６、及びＫ１９７）に対応する１つ又は複数の位置における、部位特異的ＰＥＧ化を促進する非天然アミノ酸（又はシステイン残基）の取り込みは、ｐ１９及び／又はｐ３５サブユニットへの調節された結合を有するＩＬ－１２ｐ４０バリアントポリペプチドを提供し、こうして部分的アゴニスト活性を有するバリアントＩＬ－１２ｐ４０（ｐ３５／ｐ４０）バリアント又はＩＬ－２３（ｐ１９／ｐ４０）バリアント分子をもたらす。ＰＥＧ分子が界面で取り込まれるような場合、ＩＬ－１２ｐ４０バリアントとｐ１９又はｐ３５タンパク質との結合が完全に破壊されないように、従って活性が除去されないように、ＰＥＧは、典型的には、約１ｋＤａ、あるいは約２ｋＤａ、あるいは約３ｋＤａ、あるいは約４ｋＤａ、あるいは約５ｋＤａ、あるいは約６ｋＤａ、あるいは約７ｋＤａ、あるいは約８ｋＤａ、あるいは約９ｋＤａ、あるいは約１０ｋＤａから、あるいは約１２ｋＤａ、あるいは約１５ｋＤａ、又はあるいは約２０ｋＤａの低分子量ＰＥＧ種である。

【0156】

開示の方法
本明細書に記載の治療用組成物、例えば組換えポリペプチド（例えば、ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドバリアント）、核酸、組換え細胞、及び医薬組成物のいずれか１つを投与して、癌、免疫疾患、及び慢性感染症のような関連疾患の治療において対象を治療することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組換えポリペプチド、ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドバリアント、核酸、組換え細胞、及び医薬組成物は、ＩＬ－１２ｐ４０シグナル伝達における混乱に関連する１つ又は複数の自己免疫疾患又は状態に、罹患しているか、罹患している疑いがあるか、又は状態を発症するリスクが高い可能性がある個体を、治療する方法で使用するための治療薬に取り込むことができる。例示的な自己免疫疾患又は状態には、特に限定されるものではないが、癌、免疫疾患、及び慢性感染症が含まれる。いくつかの実施形態において、個体は医師の管理下にある患者である。

【0157】

従って、１つの態様において、本開示のいくつかの実施形態は、対象におけるＩＬ－１２ｐ４０媒介シグナル伝達を調節するための方法に関し、この方法は以下の１つ又は複数を含む組成物を対象に投与することを含む：（ａ）本開示のポリペプチド；（ｂ）本開示の組換え核酸；（ｃ）本開示の組換え細胞；及び（ｄ）本開示の医薬組成物。いくつかの実施形態において、組成物は、本開示の組換えＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドの治療有効量を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、本開示の組換え核酸の治療有効量を含む。上記のように、ＩＬ－１２ｐ４０はインターロイキン１２とインターロイキン２３の共有サブユニットである。従って、いくつかの実施形態において、対象においてＩＬ－１２によって媒介されるシグナル伝達を調節するための方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＩＬ－１２シグナル伝達を調節する方法は、対象にＩＬ－１２複合体のＩＬ－１２ｐ３５ポリペプチドを投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、方法は、ＩＬ－１２複合体のＩＬ－１２ｐ３５サブユニットをコードする核酸分子を対象に投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２ｐ３５ポリペプチドをコードする核酸は、異なる核酸分子（例えばベクター）によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチド及びＩＬ－１２ｐ３５ポリペプチドは、単一の発現カセット（例えば、多シストロン性発現カセット）内で互いに作動可能に連結された核酸配列によってコードされる。

【0158】

いくつかの他の実施形態において、本開示は、対象においてＩＬ－２３によって媒介されるシグナル伝達を調節するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＩＬ－２３シグナル伝達を調節する方法は、対象にＩＬ－２３複合体のＩＬ－２３ｐ１９サブユニットを投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、方法は、ＩＬ－１２複合体のＩＬ－１２ｐ３５ポリペプチドをコードする核酸を対象に投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２ｐ３５ポリペプチドをコードする核酸分子は、異なる核酸分子（例えば、ベクター）によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチド及びＩＬ－２３ｐ１９ポリペプチドは、単一の発現カセット（例えば、多シストロン性発現カセット）内で互いに作動可能に連結された核酸配列によってコードされる。

【0159】

別の態様において、本開示のいくつかの実施形態は、それを必要とする対象における状態の治療のための方法に関し、この方法は、以下の１つ又は複数を含む組成物を対象に投与することを含む：（ａ）本開示のＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチド；（ｂ）本開示の組換え核酸；（ｃ）本開示の組換え細胞；（ｄ）本開示の医薬組成物。いくつかの実施形態において、組成物は、本開示の組換えＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドの治療有効量を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、本開示の組換え核酸の治療的有効量を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される治療方法は、ＩＬ－１２複合体のＩＬ－１２ｐ３５サブユニットの投与をさらに含む。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される治療方法は、ＩＬ－２３複合体のＩＬ－２３ｐ１９サブユニットの投与をさらに含む。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される治療方法は、ＩＬ－１２複合体のＩＬ－１２ｐ３５サブユニットをコードする核酸分子及び／又はＩＬ－２３複合体のＩＬ－２３ｐ１９サブユニットをコードする核酸分子を、対象に投与することをさらに含む。

【0160】

いくつかの実施形態において、開示された医薬組成物は、その意図された投与経路に適合するように製剤化される。本開示の組換えポリペプチドは、経口又は吸入により投与され得るが、非経口経路により投与される可能性が高い。非経口投与経路の例には、例えば静脈内、皮内、皮下、経皮（局所）、経粘膜、及び直腸投与が含まれる。非経口投与に使用される溶液又は懸濁液には、次の成分が含まれ得る：無菌希釈剤、例えば注射用水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、又はその他の合成溶媒；抗菌剤、例えばベンジルアルコール又はメチルパラベン；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸又は重亜硫酸ナトリウム；キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）；緩衝液、例えば酢酸塩、クエン酸塩、又はリン酸塩、及び張性を調整するための物質、例えば塩化ナトリウム又はデキストロース。ｐＨは、酸又は塩基、例えば一塩基性及び／又は二塩基性リン酸ナトリウム、塩酸、又は水酸化ナトリウムを用いて（例えば約７．２～７．８、例えば７．５のｐＨに）調整することができる。非経口製剤は、ガラス製又はプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器、又は複数回投与バイアルに封入することができる。

【0161】

本開示のそのような対象組換えポリペプチドの投与量、毒性、及び治療効果は、細胞培養物又は実験動物における標準的な薬学的操作によって、例えばＬＤ₅₀（集団の５０％に対する致死量）及びＥＤ₅₀（集団の５０％で治療効果のある用量）について、決定することができる。毒性作用と治療効果の用量比は治療指数であり、ＬＤ₅₀／ＥＤ₅₀比として表すことができる。高い治療指数を示す化合物が一般的に適している。毒性の副作用を示す化合物が使用されることがあるが、そのような化合物を患部組織の部位に標的化する送達系を設計するように注意して、感染していない細胞への潜在的な損傷を最小限に抑え、従って副作用を軽減する必要がある。

【0162】

細胞培養アッセイ及び動物試験から得られたデータは、ヒトで使用するための用量範囲を調製する際に使用することができる。そのような化合物の用量は、好ましくは、毒性がほとんど又は全くないＥＤ₅₀を含む循環濃度の範囲内にある。用量は、使用される投与形態及び使用される投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。本開示の方法で使用される任意の化合物について、治療有効用量は、最初に細胞培養アッセイから推定することができる。用量は、動物モデルにおいて、細胞培養で決定されるＩＣ₅₀（例えば症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように調製され得る。このような情報を使用して、ヒトでの有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。

【0163】

本開示の対象組換えポリペプチドの治療有効量（例えば有効用量）は、選択されるポリペプチドに依存する。例えば約０．００１～０．１ｍｇ／ｋｇ患者体重の範囲の単回用量を投与することができる。いくつかの実施形態において、約０．００５、０．０１、０．０５ｍｇ／ｋｇを投与することができる。いくつかの実施形態において、６００，０００ＩＵ／ｋｇが投与される（ＩＵは、リンパ球増殖バイオアッセイによって決定することができ、国際単位（ＩＵ）で表される）。組成物は、１日１回以～週１回以上まで（１日おきに１回を含む）投与することができる。当業者は、特に限定されるものではないが、疾患の重症度、以前の治療、一般的な健康状態及び／又は対象の年齢、及び他の存在する疾患を含む、対象を効果的に治療するのに必要な用量及びタイミングに影響を与える特定の要因を理解するであろう。さらに、本開示の対象組換えポリペプチドの治療有効量による対象の治療は、一回の治療又は一連の治療を含むことができる。いくつかの実施形態において、組成物は、８時間ごとに５日間投与、続いて２～１４日間、例えば９日間の休止期間、続いて８時間ごとに５日間投与される。

【0164】

対象におけるＩＬ－１２ｐ４０媒介シグナル伝達を調節するための、及び／又はそれを必要とする対象における状態の治療のための、開示された方法の非限定的な例示的実施形態は、以下の特徴の１つ又は複数を含み得る。

【0165】

いくつかの実施形態において、投与された組成物は、アミノ酸置換を欠く参照ポリペプチドの結合親和性と比較して、ＩＬ－１２Ｒβ１に対する組換えＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドの結合親和性の改変をもたらす。いくつかの実施形態において、投与された組成物は、アミノ酸置換を欠く参照ポリペプチドの結合親和性と比較して、ＩＬ－１２Ｒβ１に対する組換えＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドの結合親和性の低下をもたらす。いくつかの実施形態において、組換えＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドは、アミノ酸置換を欠く参照ポリペプチドの結合親和性と比較して、約１０％～約１００％低下したＩＬ－１２Ｒβ１に対する結合親和性を有する。いくつかの実施形態において、組換えＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドは、アミノ酸置換を欠く参照ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドと比較して、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、又は少なくとも約９５％低下したＩＬ－１２Ｒβ１に対する結合親和性を有する。いくつかの実施形態において、組換えＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドは、アミノ酸置換を欠く参照ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドのＩＬ－１２Ｒβ１結合親和性と比較して、約１０％～約５０％、約２０％～約７０％、約３０％～約８０％、約４０％～約９０％、約５０％～約１００％、約２０％～約５０％、約４０％～約７０％、約３０％～約６０％、約４０％～約１００％、約２０％～約８０％、又は約１０％～約９０％低下したＩＬ－１２Ｒβ１に対する結合親和性を有する。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２Ｒβ１に対する本開示のＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチド変異体の結合親和性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイによって決定される。

【0166】

いくつかの実施形態において、投与された組成物は、アミノ酸置換を欠く参照ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドと比較して、ＳＴＡＴ４シグナル伝達の低下をもたらす。いくつかの実施形態において、対象におけるＳＴＡＴ４シグナル伝達は、アミノ酸置換を欠く参照ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドの投与と比較して、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、又は少なくとも約９５％低下している。いくつかの実施形態において、対象におけるＳＴＡＴ４シグナル伝達は、アミノ酸置換を欠く参照ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドの投与と比較して、約１０％～約１００％低下している。いくつかの実施形態において、対象におけるＳＴＡＴ４シグナル伝達は、アミノ酸置換を欠く参照ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドの投与と比較して、約１０％～約５０％、約２０％～約７０％、約３０％～約８０％、約４０％～約９０％、約５０％～約１００％、約２０％～約５０％、約４０％～約７０％、約３０％～約６０％、約４０％～約１００％、約２０％～約８０％、又は約１０％～約９０％低下している。

【0167】

いくつかの実施形態において、投与された組成物は、アミノ酸置換を欠く参照ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドの投与と比較して、ＳＴＡＴ３シグナル伝達の低下をもたらす。いくつかの実施形態において、対象におけるＳＴＡＴ３シグナル伝達は、アミノ酸置換を欠く参照ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドの投与と比較して、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、又は少なくとも約９５％低下している。いくつかの実施形態において、対象におけるＳＴＡＴ３シグナル伝達は、アミノ酸置換を欠く参照ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドの投与と比較して、約１０％～約１００％低下している。いくつかの実施形態において、対象におけるＳＴＡＴ４シグナル伝達は、アミノ酸置換を欠く参照ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドの投与と比較して、約１０％～約５０％、約２０％～約７０％、約３０％～約８０％、約４０％～約９０％、約５０％～約１００％、約２０％～約５０％、約４０％～約７０％、約３０％～約６０％、約４０％～約１００％、約２０％～約８０％、又は約１０％～約９０％低下している。

【0168】

いくつかの実施形態において、投与された組成物は、アミノ酸置換を欠く参照ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドを含む組成物と比較して、ＩＬ－１２ｐ４０を介して媒介される下流シグナル伝達の細胞型に偏ったシグナル伝達をもたらす。いくつかの実施形態において、投与された組成物は、アミノ酸置換を欠く参照ポリペプチドを含む組成物と比較して、ＩＬ－１２を介して媒介される下流シグナル伝達の細胞型に偏ったシグナル伝達をもたらす。いくつかの実施形態において、投与された組成物は、アミノ酸置換を欠く参照ポリペプチドを含む組成物と比較して、ＩＬ－２３を介して媒介される下流シグナル伝達の細胞型に偏ったシグナル伝達をもたらす。いくつかの実施形態において、投与された組成物は、アミノ酸置換を欠く参照ポリペプチドを含む組成物と比較して、ＩＬ－１２及びＩＬ－２３を介して媒介される下流シグナル伝達の細胞型に偏ったシグナル伝達をもたらす。

【0169】

いくつかの実施形態において、投与された組成物は、アミノ酸置換を欠く参照ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドを含む組成物と比較して、細胞型に偏ったＩＬ－１２シグナル伝達をもたらし、ここで、細胞型に偏ったシグナル伝達は、ＮＫ細胞におけるＩＬ－１２媒介シグナル伝達の低下をもたらす。いくつかの実施形態において、ＮＫ細胞におけるＩＬ－１２媒介シグナル伝達は、アミノ酸置換を欠く参照ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドを含む組成物と比較して、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、又は少なくとも約９５％している。いくつかの実施形態において、細胞型に偏ったシグナル伝達には、ＣＤ８＋Ｔ細胞における実質的に改変されていないＩＬ－１２シグナル伝達が含まれる。いくつかの実施形態において、投与された組成物は、アミノ酸置換を欠く参照ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドを含む組成物と比較して、ＣＤ８＋Ｔ細胞において改変されていないＩＬ－１２媒介シグナル伝達、例えば、同じ又は実質的に同じＩＬ－１２媒介シグナル伝達をもたらす。いくつかの実施形態において、投与された組成物は、ＮＫ細胞におけるＩＬ－１２シグナル伝達の低下をもたらすが、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＩＬ－１２シグナル伝達は実質的に保持する。いくつかの実施形態において、投与された組成物は、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＩＮＦγの発現を刺激する組換えポリペプチドの能力を実質的に保持する。いくつかの実施形態において、投与された組成物は、腫瘍微小環境における抗腫瘍免疫を増強する。

【0170】

いくつかの実施形態において、対象は哺乳動物である。いくつかの実施形態において、哺乳動物はヒトである。いくつかの実施形態において、対象は、ＩＬ－１２ｐ４０媒介シグナル伝達に関連する状態を有するか、又は有する疑いがある。いくつかの実施形態において、対象は、ＩＬ－１２媒介シグナル伝達に関連する状態を有するか、又は有する疑いがある。いくつかの実施形態において、対象は、ＩＬ－２３媒介シグナル伝達に関連する状態を有するか、又は有する疑いがある。いくつかの実施形態において、状態は、癌、免疫疾患、又は慢性感染症である。

【0171】

癌という用語は、一般に、癌を引き起こす細胞に典型的な特徴、例えば制御されない増殖、不死性、転移能、急速な増殖と増殖速度、並びに特定の特徴的な形態学的特徴を有する細胞の存在を指す。癌細胞は腫瘍に凝集して観察されることが多いが、そのような細胞は動物対象内に単独で存在する場合もあれば、白血病細胞などの非腫瘍原性癌細胞である場合もある。従って、「癌」という用語は、固形腫瘍、軟部組織腫瘍、又は転移病変への言及を包含することができる。本明細書で使用される「癌」という用語は、前悪性癌及び悪性癌を含む。いくつかの実施形態において、癌は、固形腫瘍、軟部組織腫瘍、又は転移性病変である。

【0172】

いくつかの実施形態において、本明細書では、それを必要とする対象における状態を治療するための様々な方法が提供され、ここで、状態は、急性骨髄腫性白血病、未分化リンパ腫、星状細胞腫、Ｂ細胞癌、乳癌、結腸癌、上衣腫、食道癌、神経膠芽腫、神経膠腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、肝臓癌、肺癌、マントル細胞リンパ腫、メラノーマ、神経芽腫、非小細胞肺癌、乏突起神経膠腫、卵巣癌、膵臓癌、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、腎癌、肉腫、胃癌、癌腫、中皮腫、及び肉腫からなる群から選択される癌である。

【0173】

いくつかの実施形態において、免疫疾患は自己免疫疾患である。いくつかの実施形態において、自己免疫疾患は、関節リウマチ、インスリン依存性糖尿病、溶血性貧血、リウマチ熱、甲状腺炎、クローン病、重症筋無力症、糸球体腎炎、自己免疫性肝炎、多発性硬化症、円形脱毛症、乾癬、白斑、異栄養性表皮水疱症、全身性エリテマトーデス、中度から重度の尋常性乾癬、乾癬性関節炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、及び移植片対宿主病からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、対象は哺乳動物である。いくつかの実施形態において、哺乳動物はヒトである。いくつかの実施形態において、対象は、ＩＬ－１２ｐ４０媒介シグナル伝達の混乱に関連する状態を有するか、又は有する疑いがある。いくつかの実施形態において、対象は、ＩＬ－１２媒介シグナル伝達の混乱に関連する状態を有するか、又は有する疑いがある。いくつかの実施形態において、対象は、ＩＬ－２３媒介シグナル伝達の混乱に関連する状態を有するか、又は有する疑いがある。

【0174】

追加療法
上述のように、本明細書に記載の組換えポリペプチド、核酸、組換え細胞、細胞培養物、及び／又は医薬組成物のいずれか１つを、例えば化学療法剤、又は抗癌剤、又は抗癌療法などの１つ又は複数の追加の（例えば、補助的）治療薬と組み合わせて投与することができる。１つ又は複数の追加の治療薬と「組み合わせた」投与には、同時（同時）投与及び任意の順序での連続投与が含まれる。いくつかの実施形態において、１つ又は複数の追加の治療薬、化学療法剤、抗癌剤、又は抗癌療法は、化学療法、放射線療法、免疫療法、ホルモン療法、毒素療法、及び手術からなる群から選択される。「化学療法」及び「抗癌剤」は、本明細書において交換可能に使用される。様々な種類の抗癌剤を使用することができる。非限定的な例には、アルキル化剤、代謝拮抗剤、アントラサイクリン、植物アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、ポドフィロトキシン、抗体（例えば、モノクローナル又はポリクローナル）、チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、メシル酸イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標）又はＧｌｉｖｅｃ（登録商標）））、ホルモン治療、可溶性受容体、及びその他の抗新生物薬が含まれる。

【0175】

トポイソメラーゼ阻害剤も、本明細書で使用できる別のクラスの抗癌剤である。トポイソメラーゼは、ＤＮＡのトポロジーを維持する必須酵素である。Ｉ型又はＩＩ型トポイソメラーゼの阻害は、適切なＤＮＡスーパーコイルを攪乱させることによりＤＮＡの転写と複製の両方を妨害する。いくつかのＩ型トポイソメラーゼ阻害剤には、カンプトテシン、イリノテカン及びトポテカンが含まれる。ＩＩ型阻害剤の例には、アムサクリン、エトポシド、リン酸エトポシド、及びテニポシドが含まれる。これらは、アメリカンメイアップル（ポドフィルム：Ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｕｍ ｐｅｌｔａｔｕｍ）の根に天然に存在するアルカロイドであるエピポドフィロトキシンの半合成誘導体である。

【0176】

抗腫瘍薬には、免疫抑制剤ダクチノマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ブレオマイシン、メクロレタミン、シクロホスファミド、クロラムブシル、イホスファミドが含まれる。抗腫瘍化合物は一般に、細胞のＤＮＡを化学的に修飾することによって機能する。

【0177】

アルキル化剤は、細胞中に存在する条件下で多くの求核性官能基をアルキル化することができる。シスプラチンとカルボプラチン、及びオキサリプラチンはアルキル化剤である。これらは、生物学的に重要な分子のアミノ、カルボキシル、スルフヒドリル、及びリン酸基と共有結合を形成することにより、細胞機能を損う。

【0178】

ビンカアルカロイドは、チューブリン上の特定の部位に結合し、チューブリンの微小管への集合を阻害する（細胞周期のＭ期）。ビンカアルカロイドには、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、及びビンデシンが含まれる。

【0179】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の治療方法は、１つ又は複数の免疫チェックポイント分子を阻害する化合物の投与をさらに含む。いくつかの実施形態において、１つ又は複数の免疫チェックポイント分子は、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、Ａ２ＡＲ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＴＩＭ３、及びこれらの任意の組み合わせのうちの１つ又は複数を含む。いくつかの実施形態において、１つ又は複数の免疫チェックポイント分子を阻害する化合物には、拮抗抗体が含まれる。いくつかの実施形態において、拮抗抗体は、イピリムマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、デュルバルマブ、アテゾリズマブ、トレメリムマブ、又はアベルマブである。

【0180】

代謝拮抗物質は、プリン（アザチオプリン、メルカプトプリン）、又はピリミジンに似ており、これらの物質が、細胞周期の「Ｓ」期にＤＮＡに取り込まれるのを防ぎ、正常な発生及び分裂を停止させる。代謝拮抗物質もＲＮＡ合成に影響を与える。

【0181】

植物アルカロイド及びテルペノイドは、植物から得られ、微小管機能を妨げることによって細胞分裂を遮断する。微小管は細胞分裂に欠かせないもので、これがないと細胞分裂が起きない。主な例は、ビンカアルカロイドとタキサンである。ポドフィロトキシンは植物由来の化合物であり、これは、消化を助けることが報告されており、並びに他の２つの細胞増殖抑制薬であるエトポシドとテニポシドの生成にも使用されている。これらは、細胞がＧ１期（ＤＮＡ複製の開始）及びＤＮＡの複製（Ｓ期）に入るのを防ぐ。

【0182】

群としてのタキサンには、パクリタキセル及びドセタキセルが含まれる。パクリタキセルは、もともとタキソールとして知られていた天然物で、最初、太平洋イチイ（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｙｅｗ ｔｒｅｅ）の木の樹皮から得られた。ドセタキセルは、パクリタキセルの半合成類似体である。タキサンは微小管の安定性を高め、後期における染色体の分離を防ぐ。

【0183】

いくつかの実施形態において、抗癌剤は、レミケード、ドセタキセル、セレコキシブ、メルファラン、デキサメタゾン（Ｄｅｃａｄｒｏｎ（登録商標））、ステロイド、ゲムシタビン、シスプラチン、テモゾロミド、エトポシド、シクロホスファミド、テモダール、カルボプラチン、プロカルバジン、グリアデル、タモキシフェン、トポテカン、メトトレキサート、ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ（登録商標））、タキソール、タキソテール、フルオロウラシル、ロイコボリン、イリノテカン、ゼローダ、ＣＰＴ－１１、インターフェロンアルファ、ＰＥＧ化インターフェロンアルファ（例えば、ＰＥＧ ＩＮＴＲＯＮ－Ａ）、カペシタビン、シスプラチン、チオテパ、フルダラビン、カルボプラチン、リポソームダウノルビシン、シタラビン、ドキセタキソール、パクリタキセル、ビンブラスチン、ＩＬ－２、ＧＭ－ＣＳＦ、ダカルバジン、ビノレルビン、ゾレドロン酸、パルミトロネート、ビアキシン、ブスルファン、プレドニゾン、ボルテゾミブ（Ｖｅｌｃａｄｅ（登録商標））、ビスフォスフォネート、三酸化ヒ素、ビンクリスチン、ドキソルビシン（Ｄｏｘｉｌ（登録商標））、パクリタキセル、ガンシクロビル、アドリアマイシン、エストレヌスチンリン酸ナトリウム（Ｅｍｃｙｔ（登録商標））、スリンダク、エトポシド、及びこれらの任意の組み合わせから選択することができる。

【0184】

他の実施形態において、抗癌剤は、ボルテゾミブ、シクロホスファミド、デキサメタゾン、ドキソルビシン、インターフェロンアルファ、レナリドマイド、メルファラン、ＰＥＧ化インターフェロンアルファ、プレドニゾン、サリドマイド、又はビンクリスチンから選択することができる。

【0185】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の治療方法は、免疫療法をさらに含む。いくつかの実施形態において、免疫療法は、１つ又は複数のチェックポイント阻害剤の投与を含む。従って、本明細書に記載の治療方法のいくつかの実施形態は、１つ又は複数の免疫チェックポイント分子を阻害する化合物のさらなる投与を含む。いくつかの実施形態において、１つ又は複数の免疫チェックポイント分子を阻害する化合物には、拮抗抗体が含まれる。いくつかの実施形態において、拮抗抗体は、イピリムマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、デュルバルマブ、アテゾリズマブ、トレメリムマブ、又はアベルマブである。

【0186】

いくつかの態様において、１つ又は複数の抗癌療法には放射線療法が含まれる。いくつかの実施形態において、放射線療法は、癌細胞を死滅させるための放射線の投与を含むことができる。放射線は、ＤＮＡなどの細胞内の分子と相互作用して、細胞死を誘発する。放射線は、細胞膜や核膜、その他のオルガネラにも損傷を与える可能性がある。放射線の種類によって、ＤＮＡ損傷のメカニズムは、相対的な生物学的効果と同様に異なる場合がある。例えば、重粒子（すなわち、陽子、中性子）はＤＮＡを直接損傷し、相対的な生物学的効果が大きくなる。電磁放射線は、主に細胞水のイオン化によって生成される短寿命のヒドロキシルフリーラジカルを介して作用する間接的なイオン化をもたらす。放射線の臨床応用には、外部ビーム放射線（外部線源から）と小線源治療（患者に移植又は挿入された放射線源を使用）がある。外部ビーム放射線はＸ線及び／又はガンマ線で構成されるが、小線源治療では、崩壊してアルファ粒子又はベータ粒子をガンマ線とともに放出する放射性核種を使用する。本明細書で企図される放射線には、例えば、癌細胞への放射性同位体の指向性送達も含まれる。本明細書では、マイクロ波及びＵＶ照射などの他の形態のＤＮＡ損傷因子も企図される。

【0187】

放射線は、一回の線量で、又は線量分割スケジュールで一連の少量の線量で与えることができる。本明細書で企図される放射線の量は、約１～約１００Ｇｙの範囲であり、例えば、約５～約８０、約１０～約５０Ｇｙ、又は約１０Ｇｙを含む。総線量は、分割方法で適用することができる。例えば、方法は、２Ｇｙの分割された個別線量を含み得る。放射性同位体の線量範囲は大きく異なり、同位体の半減期と放出される放射線の強度と種類によって異なる。放射線が放射性同位体の使用を含む場合、同位体は、放射性ヌクレオチドを標的組織（例えば、腫瘍組織）に運ぶ治療用抗体などの標的化物質に結合され得る。

【0188】

本明細書に記載の手術は、癌組織の全部又は一部が物理的に除去、摘出、及び／又は破壊される切除を含む。腫瘍切除とは、腫瘍の少なくとも一部を物理的に除去することを指す。腫瘍切除に加えて、手術による治療には、レーザー手術、凍結手術、電気手術、顕微鏡制御手術（モース手術）などがある。前癌組織又は正常組織の除去も本明細書で企図される。

【0189】

従っていくつかの実施形態において、組成物は、第１の治療として個別に、又は第２の治療と組み合わせて対象に投与される。いくつかの実施形態において、第２の治療は、化学療法、放射線療法、免疫療法、ホルモン療法、毒素療法、又は手術からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、第１の治療は第２の治療と同時に施される。いくつかの実施形態において、第１の治療と第２の治療は連続して施される。いくつかの実施形態において、第１の治療は第２の治療の前に施される。いくつかの実施形態において、第１の治療は第２の治療の後に施される。いくつかの実施形態において、第１の治療は第２の治療の前及び／又は後に施される。いくつかの実施形態において、第１の治療と第２の治療は交代で施される。いくつかの実施形態において、第１の治療と第２の治療は、単一の製剤で一緒に施される。

【0190】

ＩＬ－１２ｐ４０バリアントを含むＩＬ－１２／ＩＬ－２３と補助治療薬の組合わせ
本開示は、１つ又は複数の追加の活性物質（「補助物質」）と組み合わせて対象に投与され得る、本明細書に記載のバリアントＩＬ－１２ｐ４０サブユニットを含むＩＬ－１２又はＩＬ－２３の使用を提供する。そのようなさらなる組み合わせは、「補助的な組み合わせ」又は「補助的な併用療法」と交換可能に呼ばれ、本開示のバリアントＩＬ－１２ｐ４０サブユニットを含むＩＬ－１２又はＩＬ－２３と組み合わせて使用される治療薬は、「補助薬剤」と呼ばれる。本明細書で使用される「補助薬剤」という用語は、別々に投与又は導入することができる薬剤、例えば、別の投与（例えば、キットで提供され得る）のために別に製剤化される物質、及び／又は本開示のＩＬ－１２ｐ４０バリアントとの組み合わせて投与又は導入することができる治療法を含む。

【0191】

本明細書で使用される用語「と組み合わせて」は、対象への複数の薬剤の投与に関して使用される場合、第１の薬剤と少なくとも１つの追加（すなわち、第２、第３、第４、第５など）の薬剤との対象への投与を指す。本発明の目的のために、第１の薬剤の投与に起因する生物学的効果が、第２の薬剤の投与時に対象において持続されて、第１の薬剤と第２の薬剤の治療効果が重複するなら、１つの薬剤（例えば、バリアントＩＬ－１２ｐ４０サブユニットを含むＩＬ－１２又はＩＬ－２３）は、第２の薬剤（例えば、免疫チェックポイント経路のモジュレーター）と組合わせて投与されると考えられる。例えば、ＰＤ１免疫チェックポイント阻害剤（例えば、ニボルマブやペムブロリズマブ）は、通常、静脈内注入によって２週間ごとに、又は３週間ごとに投与され、一方、本開示のバリアントｐ４０サブユニットを含むＩＬ－１２又はＩＬ－２３種は、より頻繁に、例えば、毎日、１日２回、又は毎週投与され得る。しかしながら、第１の薬剤（例えば、ペムブロリズマブ）の投与が長期間にわたる治療効果を提供し、第１の薬剤がその効果を継続しているときに、第２の薬剤（例えば、ＩＬ－１２（ｐ３５／ｐ４０）バリアント又はＩＬ－２３（ｐ１９／ｐ４０）バリアント）の投与が治療効果を提供する場合、第一の薬剤が第２の薬剤の投与からかなり離れた時点（例えば、数日又は数週間）で投与された可能性がある場合でも、第２の薬剤は第１の薬剤と組合わせて投与されたと考えられる。１つの実施形態において、第１及び第２の薬剤が同時に（互いに３０分以内に）、同時に、又は連続して投与される場合、第１の薬剤は第２の薬剤と組み合わせて投与されると考えられる。いくつかの実施形態において、第１及び第２の薬剤が互いに約２４時間以内、好ましくは互いに約１２時間以内、好ましくは互いに約６時間以内、好ましくは互いに約２時間以内、又は好ましくは互いに約３０分以内に投与される場合、第１の薬剤は第２の薬剤と「同時に」投与されたと見なされる。「と組み合わせて」という用語はまた、第１の薬剤と第２の薬剤が単一の医薬的に許容し得る製剤で共製剤化され、共製剤が対象に投与される状況に適用されると理解されるものとする。特定の実施形態において、ＩＬ－１２（ｐ３５／ｐ４０）バリアント又はＩＬ－２３（ｐ１９／ｐ４０）バリアントポリペプチド及び補助薬剤は、連続して投与又は適用され、例えば、１つの薬剤が１つ又は複数の薬剤の前に投与される。他の実施形態において、ＩＬ－１２（ｐ３５／ｐ４０）バリアント又はＩＬ－２３（ｐ１９／ｐ４０）バリアントポリペプチド及び補助薬剤は同時に投与され、例えば、２つ以上の薬剤が同時に又はほぼ同時に投与される；２つ以上の薬剤が、２つ以上の別個の製剤中に存在するか、又は単一の製剤に組み合わされてもよい（すなわち、共製剤）。薬剤が連続して投与されるか、又は同時に投与されるかに関係なく、これらは本開示の目的のために組み合わせて投与されたと見なされる。

【0192】

さらなる実施形態は、組合せ中の薬剤の最適量を決定するための方法又はモデルを含む。最適量は、例えば、対象又は対象集団において最適な効果を達成する量、又は１つ又は複数の薬剤に関連する副作用を最小化又は排除しながら治療効果を達成する量であり得る。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２（ｐ３５／ｐ４０）バリアント又はＩＬ－２３（ｐ１９／ｐ４０）バリアントポリペプチドと、対象（例えば、ヒト）又は対象集団において、本明細書に記載の疾患、障害、又は状態（例えば、癌状態）を治療又は予防するのに有効であることが知られているか又は有効であることが決定されている補助薬剤との組み合わせとを伴う方法において、一方の薬剤の量が、他方の薬剤の量を一定に保ちながら、力価測定される。このように薬剤の量を操作することにより、臨床医は、例えば、特定の疾患、障害、又は状態を治療するため、又は状況下で許容される有害作用を排除するため又は有害作用を軽減するために最も有効な薬剤の比率を決定することができる。

【0193】

追加の薬剤又は補助薬剤
いくつかの実施形態において、１つ又は複数の追加の（例えば、補助的な）治療薬には、化学療法剤が含まれる。いくつかの実施形態において、補助薬剤は、複数の化学療法剤の「カクテル」である。いくつかの実施形態において、化学療法剤又はカクテルは、１つ又は複数の物理的方法（例えば、放射線療法）と組み合わせて投与される。「化学療法剤」という用語には、特に限定されるものではないが、アルキル化剤、例えばチオテパ及びシクロホスファミド；アルキルスルホン酸塩、例えばブスルファン、インプロスルファン、ピポスルファン；アジリジン、例えばベンゾドーパ、カルボコン、メトレドーパ、及びウレドーパ；エチレンイミン及びメチルアメラミン、例えばアルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド、及びトリメチロールメラミン；ナイトロジェンマスタード、例えばチオラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロ尿素、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン；抗生物質、例えばアクラシノマイシン、アクチノマイシン、オートラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、例えばブレオマイシンＡ２、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、及び誘導体、例えばデメトキシ－ダウノマイシン、１１－デオキシダウノルビシン、１３－デオキシダウノルビシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、例えばマイトマイシンＣ、Ｎ－メチルマイトマイシンＣ；ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗剤、例えばメトトレキサート及び５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）；葉酸類似体、例えばデノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート、ジデアザテトラヒドロ葉酸、及びフォリン酸；プリン類似体、例えばフルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類似体、例えばアンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５－ＦＵ；アンドロゲン、例えばカルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎剤、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補給剤、例えばフロリン酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビスアントレン；エダトラキサート；デフォアミン；デメコルシン；ジアジコン；エルホルミチン；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’’－トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（Ａｒａ－Ｃ）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル、ナブパクリタキセル、及びドキセタキセル；クロラムブシル；ゲムシタビン；６－チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金及び白金配位錯体、例えばシスプラチン、オキサプラチン、カルボプラチン；ビンブラスチン；エトポシド（ＶＰ－１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルバイン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ１１；トポイソメラーゼ阻害剤；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラマイシン；カペシタビン；タキサン、例えばパクリタキセル、ドセタキセル、カバジタキセル；カルミノマイシン、アドリアマイシン、例えば４’－エピアドリアマイシン、４－アドリアマイシン－１４－ベンゾエート、アドリアマイシン－１４－オクタノエート、アドリアマイシン－１４－ナフタレンアセテート；コルヒチン及び上記のいずれかの医薬的に許容し得る塩、酸、又は上記の任意の誘導体が含まれる。

【0194】

「化学療法剤」という用語はまた、腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように作用する抗ホルモン剤を含み、例えば抗エストロゲン、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害４（５）－イミダゾール、４－ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、オナプリストン、及びトレミフェン；及び抗アンドロゲン、例えばフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、ゴセレリン；及び上記のいずれかの医薬的に許容し得る塩、酸、又は誘導体が含まれる。

【0195】

いくつかの実施形態において、補助薬剤は、腫瘍性疾患の治療に有用であると当技術分野で同定された１つ又は複数の化学薬剤又は生物学的薬剤であり、特に限定されるものではないが、サイトカイン又はサイトカインアンタゴニスト、例えばＩＬ－２、ＩＮＦγ、又は抗上皮増殖因子受容体、イリノテカン；テトラヒドロ葉酸代謝拮抗剤、例えばペメトレキセド；腫瘍抗原に対する抗体、モノクローナル抗体と毒素の複合体、Ｔ細胞アジュバント、骨髄移植、又は抗原提示細胞（例えば、樹状細胞療法）、抗腫瘍ワクチン、複製コンピテントウイルス、シグナル伝達阻害剤（例えば、Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標）又はＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））、又は腫瘍増殖の相加的若しくは相乗的抑制を達成するための免疫調節剤、非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、シクロオキシゲナーゼ－２（ＣＯＸ－２）阻害剤、ステロイド、ＴＮＦ拮抗薬（例えば、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）及びＥｎｂｒｅｌ（登録商標））、インターフェロン－β１ａ（Ａｖｏｎｅｘ（登録商標））、及びインターフェロン－β１ｂ（Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ（登録商標））、並びに既知の化学療法治療レジメンで実施される上記の１つ又は複数の組み合わせ、例えば、特に限定されるものではないが、ＴＡＣ、ＦＯＬＦＯＸ、ＴＰＣ、ＦＥＣ、ＡＤＥ、ＦＯＬＦＯＸ－６、ＥＰＯＣＨ、ＣＨＯＰ、ＣＭＦ、ＣＶＰ、ＢＥＰ、ＯＦＦ、ＦＬＯＸ、ＣＶＤ、ＴＣ、ＦＯＬＦＩＲＩ、ＰＣＶ、ＦＯＬＦＯＸＩＲＩ、ＩＣＥ－Ｖ、ＸＥＬＯＸ、及び当業者により容易に認識される他のものなどを含む。

【0196】

いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２（ｐ３５／ｐ４０）バリアント又は（ＩＬ－２３）ｐ１９／ｐ４０バリアントは、ＢＲＡＦ／ＭＥＫ阻害剤、キナーゼ阻害剤、例えばスニチニブ、ＰＡＲＰ阻害剤、例えばオラパリブ、ＥＧＦＲ阻害剤、例えばオシメルチニブ（Ａｈｎ， ｅｔ ａｌ． （２０１６） Ｊ Ｔｈｏｒａｃ Ｏｎｃｏｌ １１：Ｓ１１５）、ＩＤＯ阻害剤、例えばエパカドスタット、及び腫瘍溶解性ウイルス、例えばタリモジーン・ラハーパレプベック（ｔａｌｉｍｏｇｅｎｅｌ ａｈｅｒｐａｒｅｐｖｅｃ；Ｔ－ＶＥＣ）と組み合わせて投与される。

【0197】

治療用抗体との組み合わせ
いくつかの実施形態において、「補助薬剤」は、治療用抗体である（特に限定されるものではないが、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢＩＴＥ）、二重親和性リターゲティング（ＤＡＲＴ）構築物、及び三重特異性キラーエンゲージャー（ＴｒｉＫＥ）構築物を含む１つ又は複数の腫瘍関連抗原に結合する二重特異性及び三重特異性抗体を含む）。

【0198】

いくつかの実施形態において、治療用抗体は、ＨＥＲ２（例えば、トラスツズマブ、ペルツズマブ、アドトラスツズマブエムタンシン）、ネクチン－４（例えば、エンフォルツマブ）、ＣＤ７９（例えば、ポラツズマブベドチン）、ＣＴＬＡ４（例えば、イピルムマブ）、ＣＤ２２（例えば、モキセツモマブパスドトックス）、ＣＣＲ４（例えば、マガムイズマブ）、ＩＬ２３ｐ１９（例えば、チルドラキズマブ）、ＰＤＬ１（例えば、デュルバルマブ、アベルマブ、アテゾリズマブ）、ＩＬ１７ａ（例えば、イクセキズマブ）、ＣＤ３８（例えば、ダラツズマブ）、ＳＬＡＭＦ７（例えば、エロツズマブ）、ＣＤ２０（例えば、リツキシマブ、トシツモマブ、イブリツモマブ、及びオファツムマブ）、ＣＤ３０（例えば、ブレンツキシマブベドチン）、ＣＤ３３（例えば、ゲムツズマブオゾガマイシン）、ＣＤ５２（例えば、アレムツズマブ）、ＥｐＣａｍ、ＣＥＡ、ｆｐＡ３３、ＴＡＧ－７２、ＣＡＩＸ、ＰＳＭＡ、ＰＳＡ、葉酸結合タンパク質、ＧＤ２（例えば、ジヌンツキシマブ）、ＧＤ３、ＩＬ６（例えば、シルツキシマブ）、ＧＭ２、Ｌｅ^Y、ＶＥＧＦ（例えば、ベバシズマブ）、ＶＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ２（例えば、ラムシルマブ）、ＰＤＧＦＲα（例えば、オラーツムマブ）、ＥＧＦＲ（例えば、セツキシマブ、パニツムマブ、及びネシツムマブ）、ＥＲＢＢ２（例えば、トラスツズマブ）、ＥＲＢＢ３、ＭＥＴ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥＰＨＡ３、ＭＵＣ－１、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＲＡＮＫＬＲＡＰ、テナスイシン、インテグリンαＶβ３、及びインテグリンα４β１、からなる群から選択される少なくとも１つの腫瘍抗原に結合する抗体である

【0199】

いくつかの実施形態において、抗体は、ＨＥＲ２及びＨＥＲ３などの第１及び第２の腫瘍抗原（略してＨＥＲ２×ＨＥＲ３）を標的とする二重特異性抗体、ＦＡＰ×ＤＲ－５二重特異性抗体、ＣＥＡ×ＣＤ３二重特異性抗体、ＣＤ２０×ＣＤ３二重特異性抗体、ＥＧＦＲ－ＥＤＶ－ｍｉＲ１６三重特異性抗体、ｇｐ１００×ＣＤ３二重特異性抗体、Ｎｙ－ｅｓｏ×ＣＤ３二重特異性抗体、ＥＧＦＲ×ＣＭｅｔ二重特異性抗体、ＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体、ＥＧＦＲ－ＥＤＶ二重特異性抗体、ＣＬＥＣ１２Ａ×ＣＤ３二重特異性抗体、ＨＥＲ２×ＨＥＲ３二重特異性抗体、Ｌｇｒ５×ＥＧＦＲ二重特異性抗体、ＰＤ１×ＣＴＬＡ－４二重特異性抗体、ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性抗体、ｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性抗体、Ｂ７－Ｈ３×ＣＤ３二重特異性抗体、ＬＡＧ－３×ＰＤ１二重特異性抗体、ＤＬＬ４×ＶＥＧＦ二重特異性抗体、カドヘリン－Ｐ×ＣＤ３二重特異性抗体、ＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体、ＤＬＬ４×ＶＥＧＦ二重特異性抗体、ＣＤ２０×ＣＤ３二重特異性抗体、Ａｎｇ－２×ＶＥＧＦ－Ａ二重特異性抗体、ＣＤ２０×ＣＤ３二重特異性抗体、ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性抗体、ＳＳＴＲ２×ＣＤ３二重特異性抗体、ＰＤ１×ＣＴＬＡ－４二重特異性抗体、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗体、ＧＰＣ３×ＣＤ３二重特異性抗体、ＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体、ＬＡＧ－３×ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体、ＣＤ３８×ＣＤ３二重特異性抗体、ＨＥＲ２×ＣＤ３二重特異性抗体、ＧＤ２×ＣＤ３二重特異性抗体、及びＣＤ３３×ＣＤ３二重特異性抗体である。このような治療用抗体は、直接又はリンカー、特に酸、塩基を介して、又は酵素的に不安定なリンカーを介して、１つ又は複数の化学療法剤（例えば、抗体薬物コンジュゲート又はＡＤＣ）にさらにコンジュゲートされ得る。

【0200】

物理的方法との組み合わせ
いくつかの実施形態において、補助薬剤は、１つ又は複数の非薬理学的治療法（例えば、局所放射線療法又は全身放射線療法又は手術）である。例として、本開示は、ＩＬ－１２（ｐ３５／ｐ４０）バリアント又はＩＬ２３（ｐ１９／ｐ４０）バリアント及び１つ又は複数の補助薬剤を含む治療方法を用いる治療の前又は後に放射線段階が行われる治療方法を企図する。いくつかの実施形態において、本開示は、ＩＬ１２ｐ３５／ｐ４０バリアント又はＩＬ２３ｐ１９／ｐ４０バリアントを手術（例えば腫瘍切除）と組み合わせて使用することをさらに企図する。いくつかの実施形態において、本開示は、骨髄移植、末梢血幹細胞移植、又は他のタイプの移植療法と組み合わせたＩＬ－１２ｐ４０バリアントの使用をさらに企図する。

【0201】

免疫チェックポイントモジュレーターとの組合わせ
いくつかの実施形態において、補助薬剤は、対象における新生物疾患、並びに新生物疾患に関連する疾患、障害、又は状態を治療及び／又は予防するための免疫チェックポイントモジュレーターである。当業者は、用語「免疫チェックポイント経路」を、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上で発現される第１の分子（例えば、ＰＤ１などのタンパク質）の、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）上で発現される第２の分子への結合によって引き起こされる生物学的応答であり、これが、免疫応答の刺激（例えば、Ｔ細胞活性のアップレギュレーション）又は阻害（例えば、Ｔ細胞活性のダウンレギュレーション）を介して免疫応答を調節しているとして理解するであろう。免疫応答を調節する結合パートナーの形成に関与する分子は、「免疫チェックポイント」と呼ばれる。このような免疫チェックポイント経路によって調節される生物学的応答は、例えば細胞活性化、サイトカイン産生、細胞移動、細胞傷害性因子分泌、及び抗体産生などの下流の免疫有効経路につながる細胞内シグナル伝達経路によって媒介される。免疫チェックポイント経路は、一般に、免疫チェックポイント経路に関連する第２細胞表面分子への、第１細胞表面発現分子の結合（例えば、ＰＤ１のＰＤＬ１への結合、ＣＴＬＡ４のＣＤ２８への結合など）によって引き起こされる。免疫チェックポイント経路の活性化は、免疫応答の刺激又は阻害につながる可能性がある。

【0202】

その活性化が免疫応答の阻害又はダウンレギュレーションをもたらす免疫チェックポイントは、本明細書では「負の免疫チェックポイント経路モジュレーター」と呼ばれる。負の免疫チェックポイントモジュレーターの活性化から生じる免疫応答の阻害は、腫瘍関連抗原などの外来抗原を認識する宿主免疫系の能力を低下させる。負の免疫チェックポイント経路という用語には、特に限定されるものではないが、ＰＤ１のＰＤＬ１への結合、ＰＤ１のＰＤＬ２への結合、及びＣＴＬＡ４のＣＤＣＤ８０／８６への結合によって調節される生物学的経路が含まれる。このような負の免疫チェックポイントアンタゴニストの例には、特に限定されるものではないが、ＰＤ１（ＣＤ２７９とも呼ばれる）、ＴＩＭ３（Ｔ細胞膜タンパク質３；ＨＡＶｃｒ２としても知られている）、ＢＴＬＡ（Ｂ及びＴリンパ球アテニュエーター；ＣＤ２７２としても知られている）、ＶＩＳＴＡ（Ｂ７－Ｈ５）受容体、ＬＡＧ３（リンパ球活性化遺伝子３；ＣＤ２３３としても知られている）、及びＣＴＬＡ４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４）；ＣＤ１５２としても知られている）を含むＴ細胞阻害受容体に結合するアンタゴニスト（例えば、アンタゴニスト抗体）が含まれる。

【0203】

１つの実施形態において、その活性化が免疫応答の刺激をもたらす免疫チェックポイント経路は、本明細書において「正の免疫チェックポイント経路モジュレーター」と呼ばれる。従って、正の免疫チェックポイント経路モジュレーターという用語には、特に限定されるものではないが、ＩＣＯＳＬのＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）への、Ｂ７－Ｈ６のＮＫｐ３０への、ＣＤ１５５のＣＤ９６への、ＯＸ４０ＬのＯＸ４０への、ＣＤ７０のＣＤ２７への、ＣＤ４０のＣＤ４０Ｌへの、ＧＩＴＲＬのＧＩＴＲへの結合によって調節される生物学的経路が含まれる。正の免疫チェックポイント（例えば、免疫応答を刺激する結合対の成分に対する天然又は合成リガンド）を刺激する分子は、免疫応答をアップレギュレートするのに有用である。そのような正の免疫チェックポイントアゴニストの例には、特に限定されるものではないが、ＩＣＯＳ（例えば、ＪＴＸ－２０１１、Ｊｏｕｎｃｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＯＸ４０（例えば、ＭＥＤＩ６３８３、Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ）、ＣＤ２７（例えば、バルリルマブ、Ｃｅｌｌｄｅｘ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＣＤ４０（例えば、ダセツズマブＣＰ－８７０，８９３、Ｒｏｃｈｅ、Ｃｈｉ Ｌｏｂ７／４）、ＨＶＥＭ、ＣＤ２８、ＣＤ１３７ ４－１ＢＢ、ＣＤ２２６、及びＧＩＴＲ（例えば、ＭＥＤＩ１８７３、Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ、ＩＮＣＡＧＮ１８７６、Ａｇｅｎｕｓ）などのＴ細胞活性化受容体に結合するアゴニスト抗体が含まれる。

【0204】

当業者は、「免疫チェックポイント経路モジュレーター」という用語を、免疫適格性哺乳動物を含む生物系における免疫チェックポイント経路の活性を阻害又は刺激する分子として理解するであろう。免疫チェックポイント経路モジュレーターは、免疫チェックポイントタンパク質（例えば、癌細胞及び／又は免疫Ｔエフェクター細胞などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に発現される免疫チェックポイントタンパク質）に結合することによってその効果を発揮することができるか、又は免疫チェックポイント経路の上流及び／又は下流の反応に影響を及ぼす。例えば、免疫チェックポイント経路モジュレーターは、ＰＤ－１及びＣＴＬＡ－４シグナル伝達に関与するチロシンホスファターゼであるＳＨＰ２の活性を調節する可能性がある。当業者は、「免疫チェックポイント経路モジュレーター」という用語が、阻害性免疫チェックポイント（本明細書では「免疫チェックポイント経路阻害剤」又は「免疫チェックポイント経路アンタゴニスト」と呼ばれる）の機能を少なくとも部分的にダウンレギュレートすることができる免疫チェックポイント経路モジュレーター、及び刺激性免疫チェックポイント（本明細書では「免疫チェックポイント経路エフェクター」又は「免疫チェックポイント経路アゴニスト」と呼ばれる）の機能を少なくとも部分的にアップレギュレートできる免疫チェックポイント経路モジュレーターの両方を包含するものとして理解するであろう。

【0205】

免疫チェックポイント経路によって媒介される免疫応答は、Ｔ細胞媒介免疫応答に限定されない。例えば、ＮＫ細胞のＫＩＲ受容体は、ＮＫ細胞によって媒介される腫瘍細胞に対する免疫応答を調節する。腫瘍細胞はＨＬＡ－Ｃと呼ばれる分子を発現し、この分子は、ＮＫ細胞のＫＩＲ受容体を阻害して、縮小又は抗腫瘍免疫応答を引き起こす。ＨＬＡ－Ｃの抗ＫＩＲ３ｍａｂ（例えば、リリルマブ、ＢＭＳ）などのＫＩＲ受容体への結合に拮抗する薬剤の投与は、ＨＬＡ－ＣがＮＫ細胞阻害受容体（ＫＩＲ）に結合する能力を阻害し、それによって、ＮＫ細胞が癌細胞を検出し攻撃するためのその能力を回復させる。従って、ＨＬＡ－ＣのＫＩＲ受容体への結合によって媒介される免疫応答は、その阻害が非Ｔ細胞媒介性免疫応答の活性化をもたらす負の免疫チェックポイント経路の一例である。

【0206】

１つの実施形態において、免疫チェックポイント経路モジュレーターは、負の免疫チェックポイント経路阻害剤／アンタゴニストである。別の実施形態において、ＩＬ１２ｐ３５／ｐ４０バリアント又はＩＬ２３ｐ１９／ｐ４０バリアントと組み合わせて使用される免疫チェックポイント経路モジュレーターは、正の免疫チェックポイント経路アゴニストである。別の実施形態において、ＩＬ１２ｐ３５／ｐ４０バリアント又はＩＬ２３ｐ１９／ｐ４０バリアントと組み合わせて使用される免疫チェックポイント経路モジュレーターは、免疫チェックポイント経路アンタゴニストである。

【0207】

当業者は、「負の免疫チェックポイント経路阻害剤」という用語を、免疫応答のアップレギュレーション又は増強をもたらす負の免疫チェックポイント経路の活性化を妨害する免疫チェックポイント経路モジュレーターとして理解するであろう。例示的な負の免疫チェックポイント経路阻害剤には、特に限定されるものではないが、プログラム死－１（ＰＤ１）経路阻害剤、プログラム死リガンド－１（ＰＤＬ１）経路阻害剤、ＴＩＭ３経路阻害剤、及び抗細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ４）経路阻害剤が含まれる．

【0208】

１つの実施形態において、免疫チェックポイント経路モジュレーターは、ＰＤ１のＰＤＬ１及び／又はＰＤＬ２への結合を阻害する負の免疫チェックポイント経路のアンタゴニスト（「ＰＤ１経路阻害剤」）である。ＰＤ１経路阻害剤は、Ｔ細胞枯渇の逆転、サイトカイン産生の回復、抗原依存性Ｔ細胞の拡張などのさまざまな好ましい免疫応答の刺激をもたらす。ＰＤ１経路阻害剤は、さまざまな癌に有効であるとして認識されており、メラノーマ、肺癌、腎臓癌、ホジキンリンパ腫、頭頸部癌、膀胱癌、尿路上皮癌などのさまざまな癌の治療についてＵＳＦＤＡから承認を受けている。

【0209】

いくつかの実施形態において、ＰＤ１経路阻害剤には、ＰＤ１のＰＤＬ１及び／又はＰＤＬ２への結合を妨害するモノクローナル抗体が含まれる。抗体ＰＤ１経路阻害剤は、当技術分野で周知されている。ＰＤ１のＰＤＬ１及び／又はＰＤＬ２への結合を妨害するモノクローナル抗体である市販のＰＤ１経路阻害剤の例には、ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標）、ＢＭＳ－９３６５５８、ＭＤＸ１１０６、ＢｒｉｓｔｏｌＭｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ， Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ ＮＪから市販されている）、ペムブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標）ＭＫ－３４７５、ランブロリズマブ、Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ ＮＪから市販されている）、及びアテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ， Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ＣＡ）が含まれる。追加の抗体ＰＤ１経路阻害剤抗体が臨床開発中であり、特に限定されるものではないが、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６、Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ／ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ピディリズマブ（ＣＴ－０１１、ＣｕｒｅＴｅｃｈ）、ＰＤＲ００１（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＢＭＳ－９３６５５９（ＭＤＸ１１０５、Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、及びアベルマブ（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ、Ｍｅｒｃｋ Ｓｅｒｏｎｏ／Ｐｆｉｚｅｒ）、及びＳＨＲ－１２１０（Ｉｎｃｙｔｅ）が含まれる。追加の抗体であるＰＤ１経路阻害剤は、米国特許第８，２１７，１４９号、８，１６８，７５７号、８，００８，４４９号、及び７，９４３，７４３号に記載されている。

【0210】

ＰＤ１経路阻害剤は、アンタゴニスト抗体に限定されない。非抗体の生物学的ＰＤ１経路阻害剤も臨床開発中であり、ＰＤ－Ｌ２ＩｇＧ２ａ融合タンパク質であるＡＭＰ－２２４や、ＰＤＬ２融合タンパク質であるＡＭＰ－５１４が、ＡｍｐｌｉｍｍｕｎｅとＧｌａｘｏ ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅによって臨床開発中である。アプタマー化合物もまた、ＰＤ１経路阻害剤として有用であることが文献に記載されている（Ｗａｎｇ， ｅｔ ａｌ． （２０１８） １４５：１２５－１３０）。

【0211】

いくつかの実施形態において、ＰＤ１経路阻害剤には、Ｓａｓｉｋｕｍａｒらの米国特許第９，４２２，３３９号；及びＳａｓｉｋｕｍａｒらの米国特許第８，９０７，０５３号に記載されているようなペプチジルＰＤ１経路阻害剤が含まれる。ＣＡ－１７０（ＡＵＰＭ－１７０、Ａｕｒｉｇｅｎｅ／Ｃｕｒｉｓ）は、免疫チェックポイントＰＤＬ１及びＶＩＳＴＡを標的とする、経口で生物学的に利用可能な低分子であると報告されている。Ｐｏｔｔａｙｉｌ Ｓａｓｉｋｕｍａｒ， ｅｔ ａｌ． Ｏｒａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＰＤ－Ｌ１／ＶＩＳＴＡ ｏｒ ＰＤ－Ｌ１／Ｔｉｍ３ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ． ［抄録］。Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ １０７ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ； ２０１６ Ａｐｒ １６－２０； Ｎｅｗ Ｏｒｌｅａｎｓ， ＬＡ． Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ （ＰＡ）： ＡＡＣＲ； Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０１６；７６（１４ Ｓｕｐｐｌ）： 抄録 Ｎｏ． ４８６１。ＣＡ－３２７（ＡＵＰＭ－３２７、Ａｕｒｉｇｅｎｅ／Ｃｕｒｉｓ）は、免疫チェックポイントであるプログラム死リガンド－１（ＰＤＬ１）及びＴ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有タンパク質３（ＴＩＭ３）を阻害する、経口で生物学的に利用可能な低分子であると報告されている。

【0212】

いくつかの実施形態において、ＰＤ１経路阻害剤には、小分子ＰＤ１経路阻害剤が含まれる。本発明の実施において有用な小分子ＰＤ１経路阻害剤の例は、Ｓａｓｉｋｕｍａｒ， ｅｔ ａｌ．， １，２，４－ｏｘａｄｉａｚｏｌｅ ａｎｄ ｔｈｉａｄｉａｚｏｌｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ａｓ ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ（ＰＣＴ／ＩＢ２０１６／０５１２６６、ＷＯ２０１６１４２８３３Ａ１として公開）、及びＳａｓｉｋｕｍａｒ， ｅｔ ａｌ． ３－ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ－１，２，４－ｏｘａｄｉａｚｏｌｅ ａｎｄ ｔｈｉａｄｉａｚｏｌｅ（ＰＣＴ／ＩＢ２０１６／０５１３４３、ＷＯ２０１６１４２８８６Ａ２として公開）、ＢＭＳ－１１６６、Ｃｈｕｐａｋ ＬＳ ａｎｄ Ｚｈｅｎｇ Ｘ． Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｕｓｅｆｕｌ ａｓ ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ． Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏ． （２０１５） 、ＷＯ２０１５／０３４８２０Ａ１、ＥＰ３０４１８２２Ｂ１；ＷＯ２０１５／０３４８２０Ａ１；及び Ｃｈｕｐａｋ， ｅｔ ａｌ． Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｕｓｅｆｕｌ ａｓ ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ． Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏ． （２０１５）、ＷＯ２０１５／１６０６４１Ａ２、ＷＯ２０１５／１６０６４１Ａ２， Ｃｈｕｐａｋ， ｅｔ ａｌ． Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｕｓｅｆｕｌ ａｓ ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ． Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏ． Ｓｈａｒｐｅ， ｅｔ ａｌ．を含み、当技術分野で記載されている。免疫阻害受容体ＰＤ－１のモジュレーター及びその使用方法は、ＷＯ２０１１０８２４００Ａ２； 及び米国特許第７，４８８，８０２号に記載されている。

【0213】

いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２ｐ３５／ｐ４０バリアント又はＩＬ－２３ｐ１９／ｐ４０バリアントと１つ又は複数のＰＤ１免疫チェックポイントモジュレーターとの組み合わせは、ＰＤ１経路阻害剤がヒトにおいて臨床効果を証明した新生物状態の治療に有用であり、これは、疾患の治療に対するＦＤＡの承認、又は特に限定されるものではないが、メラノーマ、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、頭頸部癌、腎細胞癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮内膜癌，子宮頸癌，子宮肉腫，胃癌，食道癌，ＤＮＡミスマッチ修復欠損大腸癌，ＤＮＡミスマッチ修復欠損子宮内膜癌，肝細胞癌，乳癌，メルケル細胞癌，甲状腺癌，ホジキンリンパ腫，濾胞性癌リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、真菌症、末梢Ｔ細胞リンパ腫を含む臨床試験での臨床効果の証明によるものである。いくつかの実施形態において、ＩＬ１２ｐ３５／ｐ４０バリアント又はＩＬ２３ｐ１９／ｐ４０バリアントとＰＤ１免疫チェックポイントモジュレーターとの組み合わせは、ＰＤＬ１の高レベルの発現を特徴とする腫瘍の治療において有用であり、ここで、腫瘍は腫瘍変異負荷を有し、腫瘍における高レベルのＣＤ８＋Ｔ細胞、ＩＦＮγに関連する免疫活性化サイン、及び転移性疾患、特に肝転移の欠如が存在する。

【0214】

いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２ｐ３５／ｐ４０バリアント又はＩＬ－２３ｐ１９／ｐ４０バリアントは、ＣＴＬＡ４のＣＤ２８への結合を阻害する負の免疫チェックポイント経路のアンタゴニスト（「ＣＴＬＡ４経路阻害剤」）と組み合わせて投与される。ＣＴＬＡ４経路阻害剤の例は、当技術分野で公知である（例えば、米国特許第６，６８２，７３６号、６，９８４，７２０号、及び７，６０５，２３８号を参照）。

【0215】

いくつかの実施形態において、ＩＬ１２ｐ３５／ｐ４０バリアント又はＩＬ２３ｐ１９／ｐ４０バリアントは、ＢＴＬＡのＨＶＥＭへの結合を阻害する負の免疫チェックポイント経路のアンタゴニスト（「ＢＴＬＡ経路阻害剤」）と組み合わせて投与される。抗ＢＴＬＡ抗体及び拮抗的ＨＶＥＭ－Ｉｇを使用してＢＴＬＡ／ＨＶＥＭ経路を標的とする多くのアプローチが評価されており、そのようなアプローチは、移植、感染、腫瘍、及び自己免疫疾患を含む多くの疾患、障害、及び状態における有望な有用性を示唆している（例えば、Ｗｕ， ｅｔ ａｌ．， （２０１２） Ｉｎｔ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｓｃｉ． ８：１４２０－３０を参照）。

【0216】

いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２ｐ３５／ｐ４０バリアント又はＩＬ－２３ｐ１９／ｐ４０バリアントは、ＴＩＭ３がＴＩＭ３活性化リガンドに結合する能力を阻害する負の免疫チェックポイント経路のアンタゴニスト（「ＴＩＭ３経路阻害剤」）と組み合わせて投与される。ＴＩＭ３経路阻害剤の例は、当技術分野で知られており、代表的な非限定的な例は、２０１６年９月１５日に公開された米国特許公開ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０２１００５号；Ｌｉｆｋｅ、 ｅｔ ａｌ． ２０１６年９月８日に公開された米国特許公開ＵＳ２０１６／０２５７７４９Ａ１号（Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎ－ＬａＲｏｃｈｅ）、Ｋａｒｕｎｓｋｙ、米国特許第９，６３１，０２６号；Ｋａｒｕｎｓｋｙ， Ｓａｂａｔｏｓ－Ｐｅｙｔｏｎ， ｅｔ ａｌ．、米国特許第８，８４１，４１８号；米国特許第９，６０５，０７０号；Ｔａｋａｙａｎａｇｉ， ｅｔ ａｌ．， 米国特許第８，５５２，１５６号に記載されている。

【0217】

いくつかの実施形態において、バリアントｐ４０サブユニットを含むＩＬ－１２又はＩＬ－２３は、ＬＡＧ３及びＰＤ１の両方の阻害剤と組み合わせて投与され、これは、ＬＡＧ３及びＰＤ１の遮断が、慢性感染症における腫瘍特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞とウイルス特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞間のアネルギーを相乗的に逆転させることが示唆されているためである。ＩＭＰ３２１（ＩｍｍｕＦａｃｔ）は、メラノーマ、乳癌、及び腎細胞癌で評価されている。一般に、Ｗｏｏ ｅｔ ａｌ．， （２０１２） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７２：９１７－２７； Ｇｏｌｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， （２０１１） Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３４４：２６９－７８； Ｐａｒｄｏｌｌ （２０１２） Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ． Ｃａｎｃｅｒ １２：２５２－６４； Ｇｒｏｓｓｏ ｅｔ ａｌ．， （２００７） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １１７：３３８３－３９２を参照されたい。

【0218】

いくつかの実施形態において、バリアントｐ４０サブユニットを含むＩＬ－１２又はＩＬ－２３は、Ａ２ａＲ阻害剤と組み合わせて投与される。Ａ２ａＲは、ＣＤ４＋Ｔ細胞を刺激してＴ_Reg細胞に成長させることにより、Ｔ細胞応答を阻害する。Ａ２ａＲは腫瘍免疫において特に重要であり、これは、細胞のターンオーバーによる腫瘍の細胞死率が高く、死にかけている細胞がＡ２ａＲのリガンドであるアデノシンを放出するためである。さらに、Ａ２ａＲの欠失は、感染に対する強化された、時には病的な炎症反応と関連付けられている。Ａ２ａＲの阻害は、アデノシン結合をブロックする抗体などの分子の投与によって、又はアデノシン類似体によって行うことができる。このような薬剤は、癌及びパーキンソン病などの障害の治療に使用するために、ＩＬ１２ｐ３５／ｐ４０バリアント及びＩＬ２３ｐ１９／ｐ４０バリアントと組み合わせて使用することができる。

【0219】

いくつかの実施形態において、バリアントｐ４０サブユニットを含むＩＬ－１２又はＩＬ－２３は、ＩＤＯ（インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ）の阻害剤と組み合わせて投与される。ＩＤＯは、トリプトファンの酸化によって媒介される免疫応答をダウンレギュレートし、Ｔ細胞活性化の阻害とＴ細胞アポトーシスの誘導をもたらし、腫瘍特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球が機能的に不活性になるか、もはや機能しなくなるか又は被験者の癌細胞を攻撃できなくする環境を作り出す。インドキシモド（ＮｅｗＬｉｎｋ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）は、転移性乳癌で評価されているＩＤＯ阻害剤である。

【0220】

前述のように、本発明は、ＩＬ１２ｐ３５／ｐ４０バリアント又はＩＬ２３ｐ１９／ｐ４０バリアントを、２、３、又はそれ以上の免疫チェックポイント経路を調節する免疫チェックポイント経路モジュレーターを含む少なくとも１つの免疫チェックポイント経路を調節する薬剤と組合わせて、投与することにより、哺乳動物対象の新生物疾患（例えば、癌）を治療する方法を提供する。

【0221】

いくつかの実施形態において、ＩＬ１２ｐ３５／ｐ４０バリアント又はＩＬ２３ｐ１９／ｐ４０バリアントは、複数の免疫チェックポイント経路を調節することができる免疫チェックポイントモジュレーターと組み合わせて投与される。複数の免疫チェックポイント経路は、複数の免疫チェックポイント経路のモジュレーターとして作用することができる多機能分子の投与によって調節され得る。そのような複数の免疫チェックポイント経路モジュレーターの例には、特に限定されるものではないが、二重特異性又は多特異性抗体が含まれる。モジュレーター又は複数の免疫チェックポイント経路として作用することができる多重特異性抗体の例は、当技術分野で公知である。例えば、米国特許公開２０１３／０１５６７７４号は、ＰＤ１及びＴＩＭ３を共発現する細胞を標的とするための、二重特異性及び多重特異性薬剤（例えば、抗体）、及びこれらの使用方法を記載している。さらに、ＢＴＬＡとＰＤ１の二重遮断は、抗腫瘍免疫を強化することが示されている（Ｐａｒｄｏｌｌ， （Ａｐｒｉｌ ２０１２） Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ． Ｃａｎｃｅｒ １２：２５２－ ６４）。本開示は、特に限定されるものではないが、ＰＤ１及びＬＡＧ３の両方に結合する二重特異性抗体を含む複数の免疫チェックポイント経路を標的とする免疫チェックポイント経路モジュレーターと組み合わせた、ＩＬ１２ｐ３５／ｐ４０バリアント及び／又はＩＬ２３ｐ１９／ｐ４０バリアントの使用を企図する。従って、抗腫瘍免疫を複数のレベルで強化することができ、さまざまなメカニズムを考慮して組み合わせ戦略を作成することができる。

【0222】

いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２ｐ３５／ｐ４０バリアント又はＩＬ－２３ｐ１９／ｐ４０バリアントは、２、３、４、又はそれ以上のチェックポイント経路モジュレーターと組み合わせて投与され得る。このような組み合わせは、免疫チェックポイント経路が異なる作用機序を有し、これが複数の異なる治療角度から基礎疾患、障害、又は状態を攻撃する機会を提供するという点で有利である可能性がある。

【0223】

免疫チェックポイント経路阻害剤に対する治療応答は、チロシンキナーゼ阻害剤などの従来の化学療法に対する応答よりもかなり遅れて現れることが多いことに注意すべきである。場合によっては、免疫チェックポイント経路阻害剤による治療開始後、治療反応の客観的な指標が観察されるまでに６ヶ月以上かかる場合がある。従って、本開示のＩＬ－１２ｐ３５／ｐ４０バリアント又はＩＬ－２３ｐ１９／ｐ４０バリアントと組み合わせた免疫チェックポイント経路阻害剤による治療を行う必要があるかどうかは、多くの場合、従来の化学療法よりも長くなる腫瘍増殖停止時間を考慮して決定しなされなければならない。望ましい応答は、状況下で好ましいと思われる結果であれば何でもかまわない。いくつかの実施形態において、所望の応答は、疾患、障害、又は状態の進行の予防であるが、他の実施形態において、所望の応答は、疾患、障害、又は状態の１つ又は複数の特徴の退行又は安定化（例えば、腫瘍サイズの低下）である。さらに他の実施形態において、所望の応答は、組み合わせの１つ又は複数の薬剤に関連する１つ又は複数の有害作用の軽減又は排除である。

【0224】

補助薬剤としての細胞治療薬と方法
いくつかの実施形態において、本開示の方法は、ＩＬ－１２（ｐ３５／ｐ４０）バリアント又はＩＬ－２３（ｐ１９／ｐ４０）バリアントの投与と、新生物疾患、自己免疫疾患、又は炎症性疾患の治療のための細胞療法の形態の補助薬剤との組み合わせを含み得る。本開示の方法と組み合わせて使用するのに適した細胞療法の例には、特に限定されるものではないが、１つ又は複数の活性化ＣＡＲ－Ｔ細胞、改変ＴＣＲ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、改変Ｔｒｅｇ細胞を含む改変Ｔ細胞産物が含まれる。改変Ｔ細胞産物は一般に、対象への投与前にエクスビボで活性化され、従ってＣＤ２５のアップレギュレートされたレベルを提供するため、そのような活性化された改変Ｔ細胞型を含む細胞産物は、本明細書に記載のＩＬ－１２ｐ４０バリアントの投与を介してさらに支持するのに適している。

【0225】

ＣＡＲ－Ｔ細胞
本開示の方法のいくつかの実施形態において、補助薬剤は「キメラ抗原受容体Ｔ細胞」（ＣＡＲ－Ｔ細胞）であり、これは一般に、キメラ抗原受容体を発現するように組換え修飾されたＴ細胞を指す。当業者は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が、一般に（ａ）抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、（ｂ）膜貫通ドメイン（ＴＤ）；及び（ｃ）１つ又は複数の細胞質シグナル伝達ドメイン（ＣＳＤ）の順に、アミノ末端からカルボキシ末端まで配置された複数の機能性ドメインを含むキメラポリペプチドを指し、ここで、前述のドメインは、１つ又は複数のスペーサードメインによって任意に連結することができる。ＣＡＲはまた、ＣＡＲをコードする核酸配列を含む発現ベクターで形質転換された細胞の細胞表面上の、ＣＡＲの翻訳後プロセシング及び提示の間に従来通り除去されるシグナルペプチド配列をさらに含み得る。本発明の実施に有用なＣＡＲは、当技術分野で周知されている原理に従って調製される。例えば、Ｅｓｈｈａａｒ ｅｔ ａｌ． 米国特許第７，７４１，４６５Ｂ１号； Ｓａｄｅｌａｉｎ， ｅｔ ａｌ （２０１３） Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ３（４）：３８８－３９８； Ｊｅｎｓｅｎ ａｎｄ Ｒｉｄｄｅｌｌ （２０１５） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３３：９－１５； Ｇｒｏｓｓ， ｅｔ ａｌ． （１９８９） ＰＮＡＳ ＵＳＡ） ８６（２４）：１００２４－１００２８； Ｃｕｒｒａｎ， ｅｔ ａｌ． （２０１２） Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ １４（６）：４０５－１５を参照されたい。本発明の直交受容体を取り込むために修飾され得る市販のＣＡＲ－Ｔ細胞産物の例には、アキシカブタゲンシロルユーセル（ａｘｉｃａｂｔａｇｅｎｅｃｉｌｏｌｅｕｃｅｌ）（Ｇｉｌｅａｄ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓからＹｅｓＣＡＲＴａ（登録商標）として市販されている）及びチサゲンレクロイセル（ｔｉｓａｇｅｎｌｅｃｌｅｕｃｅｌ）（ＮｏｖａｒｔｉｓからＫｙｍｒｉａｈ（登録商標）として市販されている）が含まれる。

【0226】

当業者は、抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）という用語が、標的細胞の表面に発現される抗原に特異的に結合するポリペプチドを指すことを理解するであろう。ＡＢＤは、標的細胞の表面に発現される１つ又は複数の細胞表面分子（例えば、腫瘍抗原）に特異的に結合する任意のポリペプチドであり得る。いくつかの実施形態において、ＡＢＤは、ＧＤ２、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ７０、ＧＤ２、ＩＬ３Ｒα２、ＣＤ１９、メソセリン、Ｈｅｒ２、ＥｐＣａｍ、Ｍｕｃ１、ＲＯＲ１、ＣＤ１３３、ＣＥＡ、ＥＧＲＦＲＶＩＩＩ、ＰＳＣＡ、ＧＰＣ３、Ｐａｎ－ＥｒｂＢ、及びＦＡＰからなる群から選択される腫瘍細胞に関連する細胞表面分子に特異的に結合するポリペプチドである。いくつかの実施形態において、ＡＢＤは、腫瘍細胞に関連する少なくとも１つの細胞表面分子（すなわち、少なくとも１つの腫瘍抗原）に特異的に結合する抗体（ここで上述したように、１つ又は複数ＶＨＨ、ｓｃＦｖなどの分子を含む）であり、ここで、腫瘍細胞に関連する細胞表面分子は、ＧＤ２、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ７０、ＧＤ２、ＩＬ３Ｒα２、ＣＤ１９、メソセリン、Ｈｅｒ２、ＥｐＣａｍ、Ｍｕｃ１、ＲＯＲ１、ＣＤ１３３、ＣＥＡ、ＥＧＲＦＲＶＩＩＩ、ＰＳＣＡ、ＧＰＣ３、Ｐａｎ－ＥｒｂＢ、及びＦＡＰからなる群から選択される。本開示の方法の実施において補助薬剤として有用なＣＡＲ－Ｔ細胞の例には、特に限定されるものではないが、抗ＧＤ２抗体、抗ＢＣＭＡ抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ３８抗体、抗ＣＤ７０抗体、抗ＧＤ２抗体及びＩＬ３Ｒα２抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗メソテリン抗体、抗Ｈｅｒ２抗体、抗ＥｐＣａｍ抗体、抗Ｍｕｃ１抗体、抗ＲＯＲ１抗体、抗ＣＤ１３３抗体、抗ＣＥＡ抗体、抗ＰＳＭＡ抗体、抗ＥＧＲＦＲＶＩＩＩ抗体、抗ＰＳＣＡ抗体、抗ＧＰＣ３抗体、抗Ｐａｎ－ＥｒｂＢ抗体、抗－ＦＡＰ抗体のうちの少なくとも１つをさらに含むＡＢＤを含むＣＡＲを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞が含まれる。

【0227】

ＣＡＲポリペプチドの細胞質ドメインは、１つ又は複数の細胞内シグナルドメインを含む。１つの実施形態において、細胞内シグナルドメインは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と、抗原受容体の係合後にシグナル伝達を開始する共受容体と、これらの機能的誘導体及びサブ断片との細胞質配列を含む。Ｔ細胞受容体ゼータ鎖に由来するものなどの細胞質シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲの一部として使用されて、キメラ受容体と標的抗原の係合後に、Ｔリンパ球増殖及びエフェクター機能の刺激シグナルを生成する。細胞質シグナル伝達ドメインの例には、特に限定されるものではないが、ＣＤ２７の細胞質ドメイン、ＣＤ２８の細胞質ドメインＳ、ＣＤ１３７の細胞質ドメイン（４－１ＢＢ及びＴＮＦＲＳＦ９とも呼ばれる）、ＣＤ２７８の細胞質ドメイン（ＩＣＯＳとも呼ばれる）、ＰＩ３キナーゼのｐ１１０α、β、又はδ触媒サブユニット、ヒトＣＤ３ζ鎖、ＣＤ１３４の細胞質ドメイン（ＯＸ４０及びＴＮＦＲＳＦ４とも呼ばれる）、ＦｃεＲ１γ及びβ鎖、ＭＢ１（Ｉｇα）鎖、Ｂ２９（Ｉｇβ）鎖など、ＣＤ３ポリペプチド（δ、Δ、ε）、ｓｙｋファミリーチロシンキナーゼ（Ｓｙｋ、ＺＡＰ７０など）、ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ（Ｌｃｋ、Ｆｙｎ、Ｌｙｎなど）、及びＴ細胞への形質導入に関与するその他の分子（例えば、ＣＤ２、ＣＤ５、ＣＤ２８）が含まれる。

【0228】

ＩＬ－１２（ｐ３５／ｐ４０）バリアント又はＩＬ－２３（ｐ１９／ｐ４０）バリアントは、第１、第２、第３、又は第４世代のＣＡＲ－Ｔ細胞と組み合わせて投与され得る。第１世代ＣＡＲ－Ｔ細胞という用語は、ＣＡＲを発現するように改変細胞を指し、ここで、細胞質ドメインは、抗原結合からのシグナルを、単一のシグナル伝達ドメイン、例えばＩｇＥ ＦｃεＲ１又はＣＤ３ζ鎖の高親和性受容体に由来するシグナル伝達ドメインのみを介して伝達する。このドメインは、抗原依存性Ｔ細胞活性化のための１つ又は３つの免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ［ＩＴＡＭ（ｓ）］を含む。ＩＴＡＭベースの活性化シグナルは、Ｔ細胞に標的腫瘍細胞を溶解し、抗原結合に応答してサイトカインを分泌する能力を与える。第２世代ＣＡＲ－Ｔ細胞とは、ＣＤ３ζシグナルに加えて共刺激シグナルを含むＣＡＲを発現するように改変細胞を指す。共刺激シグナルの同時送達は、ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞によって誘導されるサイトカイン分泌及び抗腫瘍活性を増強する。共刺激ドメインは通常、ＣＤ３ζドメインに対して膜近位にある。第３世代ＣＡＲ－Ｔ細胞は、例えばＣＤ２８、ＣＤ３ζ、ＯＸ４０、又は４－１ＢＢシグナル伝達領域を含む三者シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを発現するように改変細胞を指す。第４世代又は「装甲車」ＣＡＲＴ細胞は、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－７、及び／又はＩＬ－１０；４－１ＢＢリガンド、ＣＤ－４０リガンドの発現などの免疫活性を高める分子及び／又は受容体を発現又は遮断するように、さらに修飾されている。本発明のＣＡＲに取り込むことができる細胞内シグナル伝達ドメインの例には、（アミノからカルボキシに）：ＣＤ３ζ；ＣＤ２８－４１ＢＢ－ＣＤ３ζ；ＣＤ２８－ＯＸ４０－ＣＤ３ζ；ＣＤ２８－４１ＢＢ－ＣＤ３ζ；４１ＢＢ－ＣＤ－２８－ＣＤ３ζ、及び４１ＢＢ－ＣＤ３ζが含まれる。

【0229】

この用語は、特に限定されるものではないが、スプリットＣＡＲ、ＯＮスイッチＣＡＲ、二重特異性又はタンデムＣＡＲ、阻害性ＣＡＲ（ｉＣＡＲ）、及び人工多能性幹（ｉＰＳ）ＣＡＲＴ細胞を含むＣＡＲバリアントを含む。「スプリットＣＡＲ」という用語は、ＣＡＲの細胞外部分、ＡＢＤ、及び細胞質シグナル伝達ドメインが２つの別個の分子上に存在するＣＡＲを指す。ＣＡＲバリアントはまた、例えば、スプリットＣＡＲの２つの部分の条件付きヘテロ二量体化が薬理学的に制御される分割ＣＡＲを含む、条件付きで活性化可能なＣＡＲであるＯＮスイッチＣＡＲを含む。ＣＡＲ分子及びその誘導体（すなわち、ＣＡＲバリアント）は、例えば、ＰＣＴ出願番号ＵＳ２０１４／０１６５２７、ＵＳ１９９６／０１７０６０、ＵＳ２０１３／０６３０８３；及びＦｅｄｏｒｏｖ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ （２０１３） ；５（２１５）：２１５ｒａ１７２； Ｇｌｉｅｎｋｅ ｅｔ ａｌ． Ｆｒｏｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ （２０１５） ６：２１； Ｋａｋａｒｌａ ＆ Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ ５２ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ （２０１４） ２０（２）：１５１－５； Ｒｉｄｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｊ （２０１４） ２０（２）：１４１－４； Ｐｅｇｒａｍ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｊ （２０１４） ２０（２）：１２７－３３； Ｃｈｅａｄｌｅ ｅｔ ａｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ （２０１４） ２５７（１）：９１－１０６； Ｂａｒｒｅｔｔ ｅｔ ａｌ． Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｍｅｄ （２０１４） ６５：３３３－４７； Ｓａｄｅｌａｉｎ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ （２０１３） ３（４）：３８８－９８； ＣＡＲＴｅｌｌｉｅｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ （２０１０） ９５６３０４に記載されており、これらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。「二重特異性又はタンデムＣＡＲ」という用語は、一次ＣＡＲの活性を増幅又は阻害することができる二次ＣＡＲ結合ドメインを含むＣＡＲを指す。「阻害性キメラ抗原受容体」又は「ｉＣＡＲ」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、結合ｉＣＡＲが二重抗原ターゲティングを使用して、二次ＣＡＲ結合ドメインの阻害性シグナル伝達ドメインを備えた二次抑制性受容体の係合を通じて活性ＣＡＲの活性化をシャットダウンすることにより、一次ＣＡＲ活性化の阻害をもたらすＣＡＲを指す。抑制性ＣＡＲ（ｉＣＡＲ）は、抑制性受容体シグナル伝達モジュールの活性化を通じてＣＡＲＴ細胞の活性を調節するように設計されている。このアプローチは、２つのＣＡＲの活性を組み合わせており、そのうちの１つは、活性化受容体によって活性化されたＣＡＲＴ細胞の応答を制限するドミナントネガティブシグナルを生成する。ｉＣＡＲは、正常組織でのみ発現される特定の抗原に結合すると、対抗する活性化因子ＣＡＲの応答をオフにすることができる。このようにして、ｉＣＡＲ－Ｔ細胞は癌細胞と健康な細胞を区別し、抗原選択的に形質導入されたＴ細胞の機能を可逆的にブロックすることができる。ｉＣＡＲのＣＴＬＡ－４又はＰＤ－１細胞内ドメインは、Ｔリンパ球に対する阻害シグナルを引き起こし、サイトカイン産生の低下、標的細胞の溶解効率の低下、及びリンパ球の運動性の変化を引き起こす。「タンデムＣＡＲ」又は「ＴａｎＣＡＲ」という用語は、２つの異なる腫瘍関連抗原の独立した係合に応答して、刺激又は共刺激シグナルを送達するように設計された２つのキメラ受容体の結合を通じて、Ｔ細胞の二重特異性活性化を媒介するＣＡＲを指す。

【0230】

一般に、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）は、実質的に上記の教示に従って、ＣＡＲをコードする発現ベクターで形質導入することによって組換え修飾されたＴ細胞である。

【0231】

いくつかの実施形態において、改変Ｔ細胞は、治療される個体に関して同種異系である。Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ． （２０１８） Ｃｅｌｌ ７（１０） Ｅ１５５。いくつかの実施形態において、同種異系の改変Ｔ細胞は、ＨＬＡが完全に一致している。しかし、すべての患者が完全に一致するドナーを持っているわけではなく、ＨＬＡ型に関係なくすべての患者に適した細胞産物が代替手段となる。

【0232】

本開示の方法の実施において使用されるＴ細胞が同種異系Ｔ細胞である場合、そのような細胞は、移植片対宿主病を軽減するために修飾され得る。例えば、本発明の改変細胞は、遺伝子編集技術によって達成されたＴＣＲαβ受容体ノックアウトであり得る。ＴＣＲαβはヘテロ二量体であり、これが発現するためにはアルファ鎖とベータ鎖の両方が存在する必要がある。アルファ鎖をコードする遺伝子（ＴＲＡＣ）は１つであるが、ベータ鎖をコードする遺伝子は２つあるため、ＴＲＡＣ遺伝子座ＫＯはこの目的のために欠失されている。この欠失を達成するために、さまざまなアプローチが使用されており、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９；メガヌクレアーゼ；改変Ｉ－ＣｒｅＩホーミングエンドヌクレアーゼなどがある。例えば、Ｅｙｑｕｅｍ ｅｔ ａｌ． （２０１７） Ｎａｔｕｒｅ ５４３：１１３－１１７（ここでは、ＴＲＡＣコード配列がＣＡＲコード配列に置き換えられている）；及びＧｅｏｒｇｉａｄｉｓ ｅｔ ａｌ． （２０１８） Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ． ２６：１２１５－１２２７（これは、ＣＡＲをＴＲＡＣ遺伝子座に直接組み込むことなく、クラスター化された定期的に間隔をあけた短い回文反復（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ９によって、ＣＡＲ発現とＴＲＡＣ破壊を連結した）を参照されたい。ＧＶＨＤを予防するための別の戦略は、Ｔ細胞を修飾して、例えば末端切断型ＣＤ３ζをＴＣＲ阻害分子として使用して、ＴＣＲαβシグナル伝達の阻害剤を発現させる。

【0233】

いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２（ｐ３５／ｐ４０）バリアント又はＩＬ－２３（ｐ１９／ｐ４０）バリアントは、特に限定されるものではないが、ＩＬ２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１８（これらのそれぞれの類似体及びバリアントを含む）を含む追加のサイトカインと組み合わせて投与される。

【0234】

いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２（ｐ３５／ｐ４０）バリアント又はＩＬ－２３（ｐ１９／ｐ４０）バリアントは、活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）を阻害する１つ又は複数の補助薬剤と組み合わせて投与される。ＡＩＣＤは、Ｆａｓ受容体（例えば、Ｆａｓ、ＣＤ９５）とＦａｓリガンド（例えば、ＦａｓＬ、ＣＤ９５リガンド）の相互作用から生じるプログラム細胞死の一種であり、末梢免疫寛容の維持に役立つ。ＡＩＣＤエフェクター細胞はＦａｓＬを発現し、Ｆａｓ受容体を発現する細胞ではアポトーシスが誘導される。活性化誘導性の細胞死は、Ｔ細胞受容体の刺激が繰り返されることにより生じる、活性化したＴリンパ球の負の調節因子となる。本明細書に記載のＩＬ－１２（ｐ３５／ｐ４０）バリアント及びＩＬ－２３（ｐ１９／ｐ４０）バリアントと組み合わせて使用することができるＡＩＣＤを阻害する薬剤の例には、特に限定されるものではないが、シクロスポリンＡ（Ｓｈｉｈ， ｅｔ ａｌ．， （１９８９） Ｎａｔｕｒｅ ３３９：６２５－６２６）、ＩＬ－１６及び類似体（ｒｈＩＬ－１６を含む， Ｉｄｚｉｏｒｅｋ， ｅｔ ａｌ．， （１９９８） Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １１２：８４－９１）、ＴＧＦｂ１ （Ｇｅｎｅｓｔｅｉｒ， ｅｔ ａｌ．， （１９９９） Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ１８９（２）： ２３１－２３９）、及びビタミンＥ（Ｌｉ－Ｗｅｂｅｒ， ｅｔ ａｌ．， （２００２） Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ １１０（５）：６８１－６９０）が含まれる。

【0235】

いくつかの実施形態において、補助薬剤は、特に限定されるものではないが、放射線療法、凍結療法、温熱療法、手術、レーザーアブレーション、及び陽子線療法を含む抗新生物物理的方法である。

【0236】

キット
本明細書に記載の方法を実施するための様々なキットも本明細書に提供される。特に、本開示のいくつかの実施形態は、対象におけるＩＬ－１２ｐ４０媒介シグナル伝達を調節する方法のためのキットに関する。いくつかの他の実施形態は、それを必要とする対象における状態を治療する方法のためのキットに関する。いくつかの実施形態において、キットは、本明細書に提供及び記載される組換えＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチド、組換え核酸、組換え細胞、又は医薬組成物のうちの１つ又は複数、及びその使用説明書を含み得る。例えば、本明細書では、いくつかの実施形態において、本開示の組換えポリペプチド、本開示のＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドバリアント、本開示の組換え核酸、本開示の組換え細胞、又は本開示の医薬組成物のうちの１つ又は複数；及びその使用説明書を含むキットが提供される。いくつかの実施形態において、本開示のキットは、ＩＬ－１２ｐ３５ポリペプチド、又はＩＬ－１２ｐ３５ポリペプチドをコードする核酸をさらに含むことができる。いくつかの実施形態において、本開示のキットは、ＩＬ－２３ｐ１９ポリペプチド、又はＩＬ－２３ｐ１９ポリペプチドをコードする核酸をさらに含むことができる。

【0237】

いくつかの実施形態において、本開示のキットは、提供された組換えポリペプチド、組換え核酸、組換え細胞、又は医薬組成物のうちの任意の１つを個体に投与するために使用される１つ又は複数の注射器（プレフィルドシリンジを含む）及び／又はカテーテル（プレフィルドシリンジを含む）をさらに含む。いくつかの実施形態において、キットは、１つ又は複数の追加の治療薬を有することができ、治療薬は、所望の目的のために、例えば細胞の活性を調節するために、標的癌細胞を阻害するために、又はそれを必要とする個体の疾患を治療するために、他のキット成分と同時に又は連続して投与することができる。

【0238】

上述のキットのいずれも、１つ又は複数の追加の試薬をさらに含むことができ、そのような追加の試薬は以下から選択することができる：希釈緩衝液、復元溶液、洗浄緩衝液、対照試薬、対照発現ベクター、陰性対照ポリペプチド、陽性対照ポリペプチド、組換えポリペプチドのインビトロ産生のための試薬。

【0239】

いくつかの実施形態において、キットの成分は別々の容器に入れることができる。いくつかの他の実施形態において、キットの成分は単一の容器で一緒にすることができる。例えば本開示のいくつかの実施形態において、キットは、１つの容器（例えば無菌ガラス又はプラスチックバイアル）内に、本明細書に記載の組換えＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチド、組換え核酸、組換え細胞、又は医薬組成物の１つ又は複数、及び別の容器（例えば滅菌ガラス又はプラスチックバイアル）中にさらなる治療薬を含む。

【0240】

いくつかの実施形態において、キットは、本明細書に記載の方法を実施するために、キットの成分の使用説明書をさらに含むことができる。例えばキットは、キット中の医薬組成物及び剤形に関する情報を含む添付文書を含むことができる。一般に、そのような情報は、患者及び医師が、同封の医薬組成物及び剤形を効果的かつ安全に使用するのに役立つ。例えば本開示の組み合わせに関する以下の情報を添付文書に提供することができる：薬物動態、薬力学、臨床試験、有効性パラメーター、適応症及び使用法、禁忌、警告、注意事項、有害反応、過剰投与、適切な用量及び投与方法、供給方法、適切な保管条件、参考文献、製造業者／販売業者の情報、及び知的所有権情報。

【0241】

いくつかの実施形態において、キットは、本明細書に開示の方法を実施するためにキットの成分を使用するための説明書をさらに含むことができる。方法を実施するための説明書は、一般に適切な記録媒体に記録される。例えば使用説明書は、紙やプラスチックなどの基材に印刷することができる。使用説明書は、添付文書としてキット内に、キット又はその成分の容器のラベル（例えばパッケージ又は部分パッケージに関連している）などに存在し得る。説明書は、適切なコンピューター可読記憶媒体、例えばＣＤ－ＲＯＭ、ディスク、フラッシュドライブなどに存在する電子記憶データファイルとして存在し得る。場合によっては、実際の説明書はキットに含まれていないが、リモートソースから（インターネット経由などで）説明書を取得する手段が提供され得る。この実施形態の例はウェブアドレスを含むキットであり、ここでは、説明書を見ることができ、及び／又はそこから説明書をダウンロードすることができる。説明書と同様に、説明書を取得するためのこの手段は、適切な基板に記録することができる。

【0242】

本開示で言及されたすべての刊行物及び特許出願は、あたかも個々の刊行物又は特許出願が、参照により取り込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同程度に、参照により本明細書に取り込まれる。

【0243】

本明細書に参考文献が引用されていることは、先行技術を構成することを認めるものではない。参考文献の議論は、その著者が主張していることを述べているのであり、本出願人は、引用された文書の正確性と妥当性に異議を唱える権利を留保する。本明細書では、科学雑誌の記事、特許文書、及び教科書を含む多くの情報源が言及されているが、この参照は、これらの文書のいずれかが当技術分野における共通の一般知識の一部を構成することを認めるものではない。

【0244】

本明細書における一般的な方法の議論は、例示のみを目的とするものである。他の代替方法及び代替物は、本開示を検討すれば当業者には明らかであり、それらは本出願の精神及び範囲内に含まれるものである。

【実施例】

【0245】

本発明の実施は、特に他に明記しない限り、当業者に周知されている分子生物学、微生物学、細胞生物学、生化学、核酸化学、及び免疫学の従来の技術を使用する。このような手法は、以下の文献に詳細に説明されている：Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， ＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ， Ｄ． Ｗ． （２０１２）． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （４ｔｈ ｅｄ．）． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、及び Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， ＆ Ｒｕｓｓｅｌ， Ｄ． Ｗ． （２００１）． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （３ｒｄ ｅｄ．）． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （一緒に“Ｓａｍｂｒｏｏｋ”と呼ぶ）； Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ． Ｍ． （１９８７）． Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ： Ｗｉｌｅｙ （２０１４年までの増刊を含む）； Ｂｏｌｌａｇ， Ｄ． Ｍ． ｅｔ ａｌ． （１９９６）． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ： Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ； Ｈｕａｎｇ， Ｌ． ｅｔ ａｌ． （２００５）． Ｎｏｎｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ． Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ： Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ； Ｋａｐｌｉｔｔ， Ｍ． Ｇ． ｅｔ ａｌ． （１９９５）． Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ： Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ； Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ， Ｉ． （１９９７）． Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ： Ｔｈｅ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｓｏｕｒｃｅｂｏｏｋ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ． Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ： Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ； Ｄｏｙｌｅ， Ａ． ｅｔ ａｌ． （１９９８）． Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ： Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ： Ｗｉｌｅｙ； Ｍｕｌｌｉｓ， Ｋ． Ｂ．， Ｆｅｒｒｅｅ， Ｆ． ＆ Ｇｉｂｂｓ， Ｒ． （１９９４）． ＰＣＲ： Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ． Ｂｏｓｔｏｎ： Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ； Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ， Ｅ． Ａ． （２０１４）． Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （２ｎｄ ｅｄ．）． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ； Ｂｅａｕｃａｇｅ， Ｓ． Ｌ． ｅｔ ａｌ． （２０００）． Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ： Ｗｉｌｅｙ， （２０１４年までの増刊を含む）；及び Ｍａｋｒｉｄｅｓ， Ｓ． Ｃ． （２００３）． Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ． Ａｍｓｔｅｒｄａｍ， ＮＬ： Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｂ．Ｖ．（これらの開示内容は参照により本明細書に取り込まれる）。

【0246】

追加の実施形態は、以下の実施例においてさらに詳細に開示されるが、これらは例示として提供され、決して本開示又は特許請求の範囲を限定することを意図するものではない。

【0247】

実施例１
一般的実験操作
ヒトＴ細胞シグナル伝達
組換えヒトＩＬ－１２及びＩＬ－２３の産生のために、ＩＬ－１２ｐ４０（２３～３２８）を、Ｎ末端ＨＡシグナルペプチドとＣ末端ＡｖｉＴａｇ（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ、配列番号１２）と６ｘＨｉｓとを有するｐＤ６４９ベクターにクローニングした。ヒトＩＬ－１２ｐ３５（２３～２１９）及びＩＬ－２３ｐ１９（２８～１８９）を、Ｎ末端ＨＡシグナルペプチド、Ｆｌａｇタグ、及びＴＥＶプロテアーゼ部位を有するｐＤ６４９にクローニングした。ＩＬ－１２（ＩＬ－１２ｐ３５及びＩＬ－１２ｐ４０）、ＩＬ－２３（ＩＬ－２３ｐ１９及びＩＬ－１２ｐ４０）、及びＩＬ－１２ｐ４０単独を、製造業者のプロトコールに従って、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃Ａ１４５２７）の一過性トランスフェクションによって発現した。上清をＮｉ－ＮＴＡ精製及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）にかけた。

【0248】

ヒトＴ細胞シグナル伝達のために、ＩＬ－１２及びＩＬ－２３バリアントを、上記のようにＥｘｐｉ２９３細胞で産生した。ＩＬ－１２ｐ３５及びＩＬ－２３ｐ１９をＩＬ－１２ｐ４０バリアント（野生型、Ｅ８１Ａ、Ｆ８２Ａ、又はＰ３９Ａ Ｄ４０Ａ Ｅ８１Ａ Ｆ８２Ａ）と同時トランスフェクトし、Ｎｉ－ＮＴＡとそれに続くＳＥＣで精製した。ヒト末梢単核細胞（ＰＢＭＣ）を、スタンフォード血液銀行の試料から、ＳｅｐＭａｔｅ－５０カラム（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃８５４５０）とＦｉｃｏｌｌ－ＰａｑｕｅＰＬＵＳ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＧＥ１７－１４４０－０２）を使用して分離した。細胞を、２％胎児牛血清（ＦＢＳ）を含む無菌ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、＃２００１２－０５０）で希釈し、予め１５ｍｌのＦｉｃｏｌｌをロードしたＳｅｐＭａｔｅ－５０カラムに添加した。赤血球をＡＣＫ溶解緩衝液（Ｇｉｂｃｏ、＃Ａ１０４９２－０１）を使用して５分間溶解し、２％ＦＢＳを含むＰＢＳでクエンチし、９０％ＦＢＳ及び１０％ＤＭＳＯを含む凍結培地に５０ｘ１０⁶／ｍＬで再懸濁した。細胞を、Ｍｒ．Ｆｒｏｓｔｙ凍結容器（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃５１００－０００１）中で－８０℃で一晩凍結し、長期保存のために－８０℃の保存ボックスに移した。ヒトＰＢＭＣを、１０％ＦＢＳ、非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ、＃１１１４００５０）、ピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１３６０－０７０）、１５ｍＭヘペス（Ｇｉｂｃｏ、＃１５６３０－０８０）、及び５μｇ／ｍＬのαＣＤ２８（ＣＤ２８．２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃３０２９４３）と１００ＩＵ／ｍＬ組換えヒトＩＬ－２を補足したペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１５１４０１６３）を有する、ＲＰＭＩ１６４０－ｇｌｕｔａＭａｘ（Ｇｉｂｃｏ、＃６１８７０－１２７）中の２．５μｇ／ｍｌのαＣＤ３（ＯＫＴ－３、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃３１７３２６）でコーティングした。細胞を５％ＣＯ₂を用いて、３７℃で４８時間培養し、細胞を１回洗浄し、完全ＲＰＭＩで一晩休ませた。細胞をαＣＤ４ ＰａｃＢｌｕｅ（ＲＰＡ－Ｔ４、ＢＤ、＃５５８１１６）で染色し、ＩＬ－１２及びＩＬ－２３バリアントで３７℃で２０分間刺激した後、１．６％パラホルムアルデヒドで室温で１０分間固定し、－２０℃のメタノールで透過処理をした。細胞を、２％ＦＢＳ及び２ｍＭＥＤＴＡを含むＰＢＳで洗浄し、ＳＴＡＴ４ｐＹ６９３ＡＦ４８８（３８／ｐ－Ｓｔａｔ４、ＢＤ、＃５５８１３６）及びＳＴＡＴ３ｐＹ７０５ＡＦ６４７（４／Ｐ－ＳＴＡＴ３、ＢＤ、＃５５７８１５）に対する抗体を用いて室温で１時間染色した。ＣｙｔｏＦｌｅｘフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて蛍光強度を分析した。

【0249】

ヒトＰＢＭＣにおけるＩＬ－１２Ｒβ１の分析のために、細胞を直接（エクスビボ）染色したか、又は上記のように活性化してＴ細胞芽球を生成した。Ｔ細胞とＮＫ細胞を特定するために、Ｆｃ受容体をＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）でブロックし、細胞を、αＣＤ３ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（ＵＣＨＴ１，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、αＣＤ４ ＦＩＴＣ（ＯＫＴ４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、αＣＤ８ ＡＦ７５０（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）、及びαＣＤ５６ＢＶ６０５（ＨＣＤ５６、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）表現型判定パネルを用いて染色した。２００ｎＭストレプトアビジン－ＡＦ６４７を、表面プラズモン共鳴セクションで説明したように発現された４倍モル過剰のビオチン化ｐ４０と混合することによって、ヒトｐ４０四量体を調製した。細胞を４℃で２時間染色した後、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して生細胞を検出した。ＣｙｔｏＦｌｅｘフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して試料を分析した後、ＦｌｏｗＪｏ（ＢＤ）で分析した。ＣＤ８⁺Ｔ細胞を生きたＣＤ３＋ＣＤ８＋として定義し、ＮＫ細胞は生きたＣＤ３－ＣＤ５６＋として定義した。ゲーティングについては図７Ｂを参照されたい。

【0250】

ヒトＣＤ８⁺Ｔ細胞ＩＦＮγ誘導アッセイのために、ＣＤ８⁺Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙ）及びＬＳ磁気カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して、ＭＡＣＳによってＣＤ８⁺Ｔ細胞をＰＢＭＣから単離した。精製されたＣＤ８⁺Ｔ細胞を、０．５μｇ／ｍＬのαＣＤ２８（ＣＤ２８．２，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）と５ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－２の存在下で２μｇ／ｍＬのαＣＤ３（ＯＫＴ３，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）でコーティングされた９６ウェル丸底プレート中で、８０，０００細胞／ウェルで刺激した。４８時間後、細胞をペレット化し、Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ ＥＬＩＳＡプレート（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を用いてヒトＩＦＮγ ＥＬＩＳＡ ＭＡＸ Ｄｅｌｕｘｅ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用して上清を分析した。ヒトＮＫ細胞ＩＦＮγ誘導アッセイのために、ＥａｓｙＳｅｐマグネット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ）を備えたＥａｓｙＳｅｐヒトＮＫ細胞分離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ）を使用して、ＭＡＣＳによってＰＢＭＣからＮＫ細胞を分離した。精製ＮＫ細胞を、１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１８（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ）の存在下で、９６ウェル丸底プレート中で４０，０００細胞／ウェルで刺激した。４８時間後、上清を回収し、ＣＤ８⁺Ｔ細胞ＩＦＮγ誘導アッセイについて説明したように処理した。

【0251】

ＩＬ－１２ｐ４０表面染色
ｍＩＬ－１２ｐ４０表面染色のために、マウスＩＬ－１２ｐ４０（２３～３３５）を、Ｎ末端ＧＰ６４シグナルペプチド及びＣ末端ＡｖｉＴａｇ及び６×Ｈｉｓタグを有するｐＡｃＧＰ６７ａにクローニングした。マウスＩＬ－１２ｐ４０はジスルフィド結合したホモ二量体として分泌されるため、単量体ＩＬ－１２ｐ４０を得るために、Ｎｉ－ＮＴＡ精製タンパク質を２０ｍＭシステインで還元し、ヘペス緩衝生理食塩水（ＨＢＳ）ｐＨ８．２中の４０ｍＭヨードアセトアミドでアルキル化し、その後ＳＥＣを行った。単量体ＩＬ－１２ｐ４０を組換えＢｉｒＡでビオチン化し、２回目のＳＥＣで精製した。

【0252】

Ｃ５７／ＢＬ６マウスから脾臓及びリンパ節を単離し、単細胞懸濁液を生成した。５μｇ／ｍＬのαＣＤ２８（３７．５１、Ｂｉｏ ＸＣｅｌｌ、カタログ番号ＢＥ００１５－１）及び１００ＩＵ／ｍＬ組換えマウスＩＬ－２を含む完全ＲＭＰＩ中の２．５μｇ／ｍＬのαＣＤ３（１４５－２ｃ１１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号１００３４０）を用いて、３７℃で４８時間コーティングされたプレート上で、Ｔ細胞芽細胞を活性化した。細胞染色のために、エクスビボ細胞とＴ細胞芽球をＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸ（９３、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、１０１３２０）でインキュベートし、αＣＤ３ ＦＩＴＣ（１７Ａ２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、＃１１－００３２－８２）、αＣＤ４ ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（ＧＫ１．５、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃１００４３３）、αＣＤ８ ＢＶ７８５（５３－６．７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃１００７４９）、及びαＮＫ１．１ｅ４５０（ＰＫ１３６、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、＃４８－５９４１－８２）の表現型パネルで染色した。ＩＬ－１２ｐ４０四量体を、２００ｎＭのストレプトアビジン－ＡＦ６４７を４倍モル過剰のビオチン化ＩＬ－１２ｐ４０と混合して調製し、細胞を４℃で２時間染色した後、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＃Ｐ３５６６）で生細胞染色を行った。ＣｙｔｏＦｌｅｘフローサイトメーターを使用して試料を分析した後、ＦｌｏｗＪｏで分析した。ＣＤ８＋Ｔ細胞を生きたＣＤ３＋ＣＤ８＋として定義し、ＮＫ細胞を生きたＣＤ３－ＮＫ１．１＋として定義した。

【0253】

マウスＩＬ－１２シグナル伝達
ＩＬ－１２シグナル伝達及び機能アッセイのために、マウスＩＬ－１２は、既に記載されたアプローチ（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９７）と同様に、単鎖として発現された。マウスＩＬ－１２ｐ４０（２３～３３５）に続く３×ＧＧＧＳリンカー、３Ｃプロテアーゼ部位、及びマウスＩＬ－１２ｐ３５（２３～２１５）を、Ｎ末端ＧＰ６４シグナルペプチドとＣ末端６×Ｈｉｓタグを有するｐＡｃＧＰ６７ａにクローニングした。マウスＩＬ－１２バリアントをＴ．ｎｉ細胞で発現させ、Ｎｉ－ＮＴＡとＳＥＣで精製した。細胞シグナル伝達のために、マウスＴ細胞芽球を上記のように調製し、完全ＲＰＭＩで一晩休ませ、αＣＤ８ ＢＶ７８５（５３－６．７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃１００７４９）で染色し、ＩＬ－１２バリアントを用いて３７℃で２０分間刺激した後、固定、透過処理し、及びヒトＴ細胞シグナル伝達について説明したようにｐＳＴＡＴ４について染色した。

【0254】

ＮＫ細胞ＩＮＦγ誘導
ＮＫ細胞ＩＦＮγ誘導アッセイのために、マウスＮＫ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、＃１３０－１１５－８１８）及びＬＳ磁気カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、＃１３０－０４２－４０１）を使用して、Ｃ５７／ＢＬ６マウスの脾臓及びリンパ節からＮＫ細胞を単離した。ＮＫ細胞を、５０ｎｇ／ｍＬ組換えマウスＩＬ－１８（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ、＃９１３９－ＩＬ－０１０）及び１μＭのＩＬ－１２バリアントを有する９６ウェル丸底プレート中で２５，０００細胞／ウェルで、３７℃で４８時間刺激した。培養の最後の４時間に、ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ（ＢＤ＃５５４７２４）を添加して、それ以上のサイトカイン分泌を防いだ。Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍキット（ＢＤ、＃５５４７１４）を使用して細胞を固定及び透過処理し、αＩＦＮγ ＡＦ６４７（ＸＭＧ１．２、ＢＤ、＃５５７７３５）で染色した。ＣｙｔｏＦｌｅｘフローサイトメーターを使用して蛍光強度を記録し、ＦｌｏｗＪｏで分析した。

【0255】

ＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＦＮγ誘導
ＣＤ８＋Ｔ細胞エフェクターアッセイのために、ＯＴ－Ｉ ＴＣＲトランスジェニックマウス（Ｃ５７ＢＬ／６－Ｔｇ（ＴｃｒａＴｃｒｂ）１１００Ｍｊｂ／ｊ）（Ｈｏｇｑｕｉｓｔ ｅｔ ａｌ．， １９９４）をＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓから入手し、スタンフォード大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されたプロトコールに従ってスタンフォード動物施設で維持した。ＯＴ－Ｉ脾細胞を、１μｇ／ｍＬオボアルブミン（ａａ２５７～２６４、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、＃ＲＰ１０６１１）、１００ＩＵ／ｍＬのｒｍＩＬ－２、及び１μＭのＩＬ－１２バリアントを含む培地で刺激した。ＩＦＮγ誘導アッセイのために、細胞を９６ウェル丸底プレートで８０，０００細胞／ウェルで４８時間刺激した。最後の４時間に、さらなるサイトカイン分泌を防ぐためにＧｏｌｇｉＳｔｏｐを添加した。細胞をαＣＤ３ ｅ４５０（１７Ａ２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、４８－００３２－８２）及びαＣＤ８ ＢＶ７８５（５３－６．７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃１００７４９）で染色した後、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍキットを使用して固定／透過処理し、αＩＦＮγ ＡＦ６４７で染色した。試料をＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞でゲートし、αＩＦＮγ ＡＦ６４７染色をＣｙｔｏＦｌｅｘフローサイトメーターを使用して評価し、続いてＦｌｏｗＪｏで分析した。

【0256】

ＭＨＣ－Ｉアップレギュレーション
ＭＨＣ－Ｉアップレギュレーションのために、２５，０００個のＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞（ＡＴＣＣ、＃ＣＲＬ－６４７５）を９６ウェルの平底プレートに３７℃で４時間播種した。上記のようにＩＬ－１２バリアントを有り又は無しで生成されたＯＴ－１エフェクターからの上清を培地で希釈し、Ｂ１６Ｆ１０細胞に３７℃で１６時間添加した。一晩インキュベーション後、培地を除去し、ＴｒｙｐＬＥ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃１２６０４０１３）を使用してＢ１６Ｆ１０細胞を分離した。細胞をαＨ－２Ｋ^b ＡＰＣ（ＡＦ６－８８．５．５．３、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃１１６５１２）及びＰＩを用いて染色して生細胞を特定した。ＣｙｔｏＦｌｅｘフローサイトメーターでデータを収集し、ＦｌｏｗＪｏで分析した。

【0257】

抗原特異的腫瘍細胞死滅
抗原特異的な腫瘍細胞死滅のために、Ｂ１６Ｆ１０細胞にｐＣＤＨ－ＥＦ１－ｃＯＶＡ－Ｔ２Ａ－ｃｏｐＧＦＰを形質導入し（Ｔｓｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）、選別してＯＶＡ－ＧＦＰ発現細胞の純粋な集団を得た。Ｂ１６Ｆ１０野生型とＯＶＡ－ＧＦＰを１：１の比率で混合し、２５，０００個の細胞を９６ウェル平底プレートに播種した。３７℃で４時間後、培地を除去し、上記のようにＩＬ－１２バリアントを有り又は無しで生成されたＯＴ－Ｉエフェクターを、完全ＲＰＭＩに３７℃で３６時間添加した。培地を除去し、ＴｒｙｐＬｅを使用してＢ１６Ｆ１０を分離し、ＰＩ及びαＣＤ４５．２ＡＰＣ（１０４、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、＃１７－０４５４－８２）を用いて染色した後、試料をＣｙｔｏＦｌｅｘにかけた。Ｂ１６Ｆ１０は生きたＣＤ４５．２－として特定され、％ＧＦＰ＋は、エフェクターなしの条件と比較して定量された。

【0258】

実施例２
ＩＬ－１２Ｒβ１と四元ＩＬ－２３受容体複合体の結晶構造
この実施例は、ＩＬ－１２Ｒβ１及び四元ＩＬ－２３受容体複合体の結晶構造を決定するために行った実験の結果を記載しており、これは、ヘテロマー受容体複合体のサイトカイン－受容体相互作用のそれぞれを駆動する化学を解明するのに役立つ。

【0259】

上述のように、ＩＬ－２３（ＩＬ－２３ｐ１９／ＩＬ－１２ｐ４０）は、ＩＬ－２３ＲとＩＬ－１２Ｒβ１から構成される受容体複合体を介してシグナル伝達する（図１Ａ）。ＩＬ－１２Ｒβ１のＥＣＤは５つのフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮＩＩＩ）ドメインで構成され、そのＮ末端Ｄ１－Ｄ２ドメインはＩＬ－２３への結合を仲介する。ＩＬ－２３及びＩＬ－２３Ｒ外部ドメインを有するＩＬ－１２Ｒβ１ Ｄ１－Ｄ２の複合体を結晶化するためように、実験を計画し実施した。以下の表３は、３．４Åの分解能で回折された四元複合体の結晶学的データと詳細な統計量を要約する。

【0260】

複合体の一部の構造を、既に公開されたＩＬ－２３Ｒ三元（ＩＬ－２３ｐ１９／ＩＬ－１２ｐ４０／ＩＬ－２３Ｒ）複合体を使用する分子置換によって決定した。しかし、まだＩＬ－１２Ｒβ１の構造が必要であった。従って、異常散乱を伴う単一同形置換（ＳＩＲＡＳ）を使用して、ヒトＩＬ－１２Ｒβ １Ｄ１－Ｄ２ドメインの構造を２．０Åの分解能で決定するために、追加の実験を実施した。続いて、この新たに確立された構造を、ＩＬ－１２Ｒβ１ Ｄ１ドメインを四元複合体の電子密度に配置することを可能にする検索モデルとして使用した。Ｄ２ドメインは見えなかったが、これは結晶格子の柔軟性によるものと思われる。

【0261】

四元ＩＬ－２３受容体複合体は、ＩＬ－２３がＩＬ－２３ＲとＩＬ－１２Ｒβ１を合体させるための橋として機能し、細胞内でＪＡＫ１／Ｔｙｋ２トランスリン酸化を開始させるモジュラー構造を示すことが観察された（図１Ｂ～１Ｅ）。ＩＬ－１２ｐ４０とＩＬ－１２Ｒβ１の接触部の概要を以下の表３に示す。

【表3】

【0262】

共有受容体であるＩＬ－１２Ｒβ１は、ＩＬ－１２ｐ４０のＤ１のＮ末端ＩｇドメインとＤ２のフィブロネクチンドメインとの間の交点で、ＩＬ－１２ｐ４０の「後部」で結合する（図１Ｄ）。ＩＬ－１２ｐ４０のＤ１ドメインは、Ｄ２ドメインに対して前方に傾いており、Ｄ１の底部とＤ２の上部の間の裂け目を露出させて、ＩＬ－１２Ｒβ１のドッキング部位を形成する。ＩＬ－１２Ｒβ１のＤ１ドメインは、相互作用するタンパク質間の高度な電荷相補性を特徴とする単一の１４２５Ų界面でＩＬ－１２ｐ４０に結合する。界面の底部は、Ｇｌｕ２８、Ａｓｐ５８、及びＡｓｐ１０１で構成されるＩＬ－１２Ｒβ１の負に帯電したパッチと相互作用するＩＬ－１２ｐ４０の連続した正に帯電したループ（Ｈｉｓ２１６、Ｌｙｓ２１７、及びＬｙｓ２１９）によって形成される。これらの電荷－電荷相互作用部の上に、ＩＬ－１２ｐ４０の側鎖と主鎖原子との水素結合相互作用部を形成するＩＬ－１２Ｒβ１の極性残基（Ｇｌｕ１０２、Ｓｅｒ１０６、Ｔｙｒ１０９、Ｇｌｎ１３２、及びＴｙｒ１３４）によって囲まれた芳香族残基（Ｔｒｙｐ３７及びＰｈｅ８２）によって形成されたＩＬ－１２ｐ４０上の疎水性ストリップがある。

【0263】

実施例３
ＩＬ－１２ｐ４０はＩＬ－１２及びＩＬ－２３シグナル伝達の共通の調節物質として機能する
この実施例は、ＩＬ－１２ｐ４０がＩＬ－１２及びＩＬ－２３シグナル伝達の共通の調節物質として作用することを証明するために行った実験を記載する。

【0264】

上記の実施例２に記載されたＩＬ－２３受容体複合体の結晶構造は、ＩＬ－１２ｐ４０がＩＬ－１２Ｒβ１に直接係合することを明らかにし、ＩＬ－１２ｐ４０がＩＬ－１２及びＩＬ－２３シグナル伝達において保存された役割を果たし得ることを示している。これは、ＩＬ－１２Ｒβ１が１．７μＭの親和性でＩＬ－１２ｐ４０に結合することを示す表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）結合測定によって確認された（図２Ａ）。ＩＬ－１２シグナル伝達とＩＬ－２３シグナル伝達の違いを調べるために、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞をＩＬ－１２又はＩＬ－２３で刺激し、並びにホスホフローサイトメトリーによってＳＴＡＴ３及びＳＴＡＴ４のリン酸化を測定する、いくつかの実験を計画し及び実施した。ＩＬ－１２刺激は優先的にＳＴＡＴ４のリン酸化をもたらし、一方、ＩＬ－２３はＳＴＡＴ３リン酸化をより強力に促進することが観察された（図２Ｂ～２Ｃ）。

【0265】

上記で論じたように、ＩＬ－１２及びＩＬ－２３受容体複合体の両方におけるＩＬ－１２ｐ４０／ＩＬ－１２Ｒβ１相互作用の共有された役割に基づいて、この界面を標的にして、ＩＬ－１２Ｒβ１動員の効率を「調整」することにより、ＩＬ－１２に関連したＳＴＡＴ４シグナル伝達のレベル、及びＩＬ－２３に関連したＳＴＡＴ３シグナル伝達のレベルを調節する追加の実験を計画し及び実施した。特に、ＩＬ－１２Ｒβ１との相互作用を媒介するＩＬ－１２ｐ４０Ｄ１の２つのループにアラニン置換を導入することにより、ＩＬ－１２及びＩＬ－２３部分アゴニストのパネルを作成した（図２Ｄ）。これらの実験では、ｐＳＴＡＴ４及びｐＳＴＡＴ３の用量反応曲線における右へのシフトによって示されるように、個々のアラニン変異（Ｅ８１Ａ及びＦ８２Ａ）がＩＬ－１２及びＩＬ－２３の効力を低下させることが見出された（図２Ｅ～２Ｆ）。これらの実験では、複数のアラニン変異（４×Ａｌａ：Ｐ３９Ａ／Ｄ３０Ａ／Ｅ８１Ａ／Ｆ８２Ａ）を組み合わせることにより、サイトカインＥＣ₅₀のより大幅な上昇と最大ＳＴＡＴリン酸化の低下が得られた。

【0266】

ＩＬ－１２Ｒβ１に係合するＩＬ－１２ｐ４０アミノ酸位置の完全なリストを図２Ｇに示し、追加のアラニン変異のＩＬ－１２シグナル伝達を図２Ｈに示す。

【0267】

実施例４
ＩＬ－１２部分アゴニストは、示差的ＩＬ－１２Ｒβ１発現に基づいて細胞型特異的活性を誘発する
この実施例は、ＩＬ－１２部分アゴニストが示差的ＩＬ－１２Ｒβ１発現に基づいて細胞型特異的活性を誘発することを証明するために、マウスＩＬ－１２で行った実験の結果を記載する。

【0268】

上述したように、ＩＬ－１２の全身投与は、ＮＫ細胞媒介性ＩＦＮγ産生による毒性をもたらすことが多い。従って、ＩＬ－１２シグナルを偏らせてＴ細胞を優先的に活性化するが、ＮＫ細胞のＩＦＮγ誘導が低下すると、毒性が低下する可能性がある。Ｔ細胞とＮＫ細胞間のＩＬ－１２シグナル伝達における重要な違いは、Ｔ細胞受容体を介する抗原刺激が、その受容体サブユニットのアップレギュレーションを通じてＩＬ－１２感受性を増強することである。ＩＬ－１２Ｒβ１表面発現を評価するためのＦＡＣＳ染色試薬としてＩＬ－１２ｐ４０を使用すると、マウスＣＤ８＋Ｔ細胞芽球が、ＮＫ細胞又はエクスビボのＣＤ８＋Ｔ細胞よりも高いＩＬ－１２Ｒβ１発現を有することがわかった（図３Ａ）。

【0269】

構造が示すように、ＩＬ－１２ｐ４０はＩＬ－１２Ｒβ１の動員を媒介する。従って、いかなる特定の理論にも拘束されるものではないが、ＩＬ－１２Ｒβ１に対するＩＬ－１２ｐ４０の親和性を低下させると、抗原を経験したＴ細胞と比較してＩＬ－１２Ｒβ１の発現レベルが低下したＮＫ細胞でのシグナル伝達がより深刻に損なわれる可能性があるという仮説が立てられた。ヒトＩＬ－１２ｐ４０との配列相同性に基づいて、ＩＬ－１２Ｒβ１への結合を破壊すると予測されるマウスＩＬ－１２ｐ４０における一連の部分アゴニストアラニン変異を設計するために、追加の実験を計画し及び実施した（図３Ｂ）。マウスＩＬ－１２バリアントを特性解析するために、ＣＤ８＋Ｔ細胞芽球のシグナル伝達を試験する実験が行われた。予測どおり、ＩＬ－１２Ｒβ１結合界面でのＩＬ－１２ｐ４０の変異は、ＥＣ５０を上昇させ、（３ｘアラニン）及び（４ｘアラニン）変異体による最大ＳＴＡＴ４リン酸化を低下させ、この急性シグナル伝達アッセイにおいて測定可能なＳＴＡＴ４リン酸化を誘導しないことがわかった。

【0270】

Ｔ細胞とＮＫ細胞の両方におけるＩＬ－１２シグナル伝達の十分に立証された収穫は、ＩＦＮγの誘導である。抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＩＦＮγ産生を促進するＩＬ－１２部分アゴニストの能力を決定するために、オボアルブミン特異的ＯＴ－Ｉ Ｔ細胞（Ｈｏｇｑｕｉｓｔ ｅｔ ａｌ．， １９９４）を、ＯＶＡペプチド及びＩＬ－１２バリアントで４８時間刺激する追加の実験を実施した後、細胞内サイトカイン染色によりＩＦＮγ産生を評価した。３×Ａｌａ及び４×Ａｌａ変異体は急性刺激時に測定可能なＳＴＡＴ４リン酸化を生じないという事実にもかかわらず、ＩＬ－１２は２×、３×、及び４×アラニンバリアントと共にＩＦＮγのアップレギュレーションをもたらした（図４Ａ）。この不一致は、感度の違い、又はアッセイ間のシグナル統合の時間が長いことが原因かも知れない。

【0271】

ＮＫ細胞におけるＩＦＮγ産生を刺激するＩＬ－１２バリアントの能力を評価するために、ＩＬ－１８の存在下で、ＩＬ－１２バリアントで細胞を４８時間刺激する追加の実験を行った後、細胞内サイトカイン染色によりＩＦＮγ誘導を分析した。ＩＬ－１２及びＩＬ－１８刺激は強固なＩＦＮγ発現を誘導し、この応答は、細胞内サイトカイン染色及び上清ＥＬＩＳＡによって測定すると、（２×Ａｌａ）変異体において減弱され、３×Ａｌａ及び４×Ａｌａバリアントにおいて抑止された（例えば、図４Ｂを参照されたい）。従ってＩＬ－１２は、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞の両方において強固なＩＦＮγ発現を誘導するが、（３×Ａｌａ）及び（４×Ａｌａ）部分アゴニストは、抗原経験ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＩＦＮγ誘導を優先的に支持し、ＮＫ細胞に対する活性は低下した（図４Ｃ及び６Ａ）。これらの結果は、ＩＬ－１２Ｒβ１表面発現の上昇により、活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞がＩＬ－１２ｐ４０の変異に対してより耐性があり、これが、ＩＬ－１２シグナル伝達の細胞型特異性を変化させてＮＫ細胞媒介毒性を低減する、新しいメカニズムを表している可能性があることを示唆している。ＩＬ－１２に応答するためにＴＣＲを介した刺激を必要とするＴ細胞とは異なり、ＮＫ細胞は、ＩＬ－１ファミリーのサイトカインＩＬ－１８と組み合わせるとＩＬ－１２に応答してＩＦＮγを産生する（図６Ｂ）。ＩＬ－１２及びＩＬ－１８刺激は強固なＩＦＮγ発現を誘導し、この応答は、細胞内サイトカイン染色（図４Ｂ、６Ｃ、及び６Ｄ）及び上清ＥＬＩＳＡ（図６Ｅ）によって測定すると、３×Ａｌａ及び４×Ａｌａバリアントによって減弱された。これらの結果は、ＩＬ－１２部分アゴニストのより大きなパネルによって確認され拡張された（図４Ｄ～４Ｇ）。

【0272】

ＩＬ－１２及びＩＬ－１８はまた、８時間刺激後に転写物レベルでｌｆｎｇのアップレギュレーションを促進し、この効果は３×Ａｌａ／ＩＬ－１８刺激で低下した（図６Ｆ）。しかしながら、これらの条件下では、ＩＬ－１２によるＴｉｇｉｔの誘導は観察されなかった（図６Ｇ）。既に、γｃファミリーのサイトカインＩＬ－２及びＩＬ－１５が、ＮＫ細胞の活性を調節し、ＩＬ－１２受容体成分のアップレギュレーションを引き起こすことが示されている。これらの報告と一致して、ＩＬ－２によるＮＫ細胞の事前活性化がＩＬ－１２Ｒβ１のわずかなアップレギュレーションをもたらすことを証明するために追加の実験を行った（図６Ｈ）。ＮＫ細胞培養物にＩＬ－２を添加すると、ＩＬ－１８単独よりもＩＦＮγ産生が上昇した。しかし、ＩＬ－２は３×Ａｌａ及び４×Ａｌａと相乗作用して、ＩＬ－２／ＩＬ－１８を超えるＩＦＮγ誘導を増強することはないことが観察された（図６Ｉ）。

【0273】

追加の実験を行って、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＩＬ－１２Ｒβ１発現及びＩＦＮγ産生を評価し、これが、ヒトＩＬ－１２部分アゴニストが細胞型特異的応答を誘発できるかどうかを決定するのに役立った。図７Ａ～７Ｄに要約されているように、マウスにおける知見と同様に、ＴＣＲ刺激は、非活性化Ｔ細胞及びＮＫ細胞よりも、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＩＬ－１２Ｒβ１発現を増強することが観察された（図７Ａ及び７Ｂ）。これらの実験では、類似のＩＬ－１２ムテインを作成し、ＣＤ８＋Ｔ細胞芽球におけるｐＳＴＡＴ４シグナル伝達について試験した（図７Ｃ～７Ｄ及び７Ｅ）。ヒトＩＬ－１２部分アゴニストは、ＮＫ細胞と比較して、ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮγの誘導を優先的に支持することが観察された（図７Ｃ～７Ｄ、７Ｆ～７Ｇ）。これらの知見は、ＩＬ－１２Ｒβ１のアップレギュレーションが、Ｔ細胞がＩＬ－１２シグナル伝達に対する感受性を高めるために使用する保存されたメカニズムであること、及びＩＬ－１２部分アゴニストが、ヒトとマウスの両方で、シグナル伝達をＴ細胞に偏らせることができることを示している。

【0274】

実施例５
ＩＬ－１２部分アゴニストは抗原特異的な腫瘍死滅を促進する
この実施例は、ＩＬ－１２部分アゴニストが抗原特異的腫瘍死滅を促進することを証明するために行った実験の結果を記載する。

【0275】

ＣＤ８＋Ｔ細胞において、ＩＬ－１２は、腫瘍及びウイルス感染細胞の抗原特異的死滅を増強するように作用する（Ｓｃｈｕｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）。ＩＬ－１２の効果は、グランザイムＢなどの細胞障害性因子のアップレギュレーション、及びＩＦＮγを含む炎症性サイトカインの分泌によって媒介される（Ａｓｔｅ－Ａｍｅｚａｇａ ｅｔ ａｌ．， １９９４）。腫瘍細胞の死滅におけるＩＦＮγの充分に説明された役割は、ＭＨＣ－Ｉのアップレギュレーションであり、これは、形質転換細胞をＴ細胞監視に対して感受性することができる（Ｚｈｏｕ，２００９）。ＩＬ－１２に誘導されるＩＦＮγが腫瘍細胞株でＭＨＣ－Ｉのアップレギュレーションを引き起こすかどうかを決定するために、ＩＬ－１２部分アゴニスト有り又は無しで生成されたＯＴ－Ｉエフェクターからの上清を採取し、Ｂ１６Ｆ１０マウスメラノーマ細胞株に添加し、一晩インキュベーション後の抗体染色によるＭＨＣ－Ｉ表面発現を評価した。細胞内サイトカイン染色によって測定されたＩＦＮγレベルの上昇と一致して、ＩＬ－１２及び部分アゴニスト培養物からの上清は、ＩＬ－１２の非存在下で生成された上清よりも強力にＭＨＣ－Ｉ発現を誘導した（図５Ａ）。

【0276】

ＩＬ－１２部分アゴニストがＩＦＮγ産生を促進し、その後の腫瘍細胞株におけるＭＨＣ－１のアップレギュレーションを促進するという本明細書に記載の知見は、ＩＬ－１２部分アゴニストが腫瘍細胞死滅を増強する能力のさらなる試験につながった。抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の死滅を測定するために、Ｂ１６Ｆ１０細胞に、ＧＦＰマーカーと共にオボアルブミンを含むプラスミドを導入し（ＯＶＡ－ＧＦＰ）、野生型Ｂ１６Ｆ１０細胞と混合した。この混合物をＯＴ－Ｉエフェクターと共にインキュベートし、ＯＶＡ－ＧＦＰ発現細胞の頻度を用いて抗原特異的腫瘍細胞死滅を測定した（図５Ｂ）。ＩＬ－１２又は部分アゴニストの存在下で生成されたＯＴ－Ｉエフェクターは、より低いエフェクター細胞対標的細胞比でＯＶＡ発現腫瘍細胞を死滅させることができ、抗腫瘍応答の効力の上昇を示した（図５Ｃ）。まとめると、これらのデータは、ＩＬ－１２Ｒβ１に対する親和性が低下したＩＬ－１２部分アゴニストが、ＮＫ細胞に対する活性が低下した抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮγ産生及び腫瘍細胞死滅を促進することを示している。

【0277】

実施例６
ＩＬ－１２部分アゴニストは、インビボのＮＫ細胞活性化が低下した抗原特異的Ｔ細胞応答を支持する
ＩＬ－１２部分アゴニストがインビボで細胞型特異的応答を誘発するかどうかを試験するために、ＯＴ－１ ＣＤ８＋Ｔ細胞をＴｈｙ１．１コンジェニックレシピエントに養子移入し、不完全フロイトアジュバント中のＯＶＡ（２５７～２６４）で免疫した（ＯＶＡ－ＩＦＡ）後、サイトカインを５日間毎日投与した（図９Ａ）。インビボ試験では、ＩＬ－１２と部分アゴニストは哺乳動物細胞（Ｅｘｐｉ２９３Ｆ）で発現された。次いで、以前に使用されたバキュロウイルス発現物質について見られたように、哺乳動物発現ＩＬ－１２部分アゴニストが、インビトロで細胞型への偏りを保持することが確認された（図８Ａ～８Ｅ）。

【0278】

２×Ａｌａ及び３×Ａｌａではなく、ＩＬ－１２による処理が、体重減少と血清中のＩＦＮｇレベルの上昇を誘導することが観察された（図９Ｂ～９Ｃ）。Ｔ細胞の活性化に対する免疫化の影響を評価するために、ＯＴ－Ｉ Ｔ細胞上の阻害性受容体であるＰＤ－１の発現を追跡した。免疫化は、サイトカイン処理とは無関係にＰＤ－１＋ＯＴ－Ｉ Ｔ細胞の頻度を上昇させ、養子移入細胞の活性化を示した（図９Ｄ～９Ｅ）。免疫化の効果は、流入領域リンパ節におけるＯＴ－Ｉ Ｔ細胞の頻度を上昇させるＩＬ－１２によって増強され、この効果は部分アゴニストでは見られなかった（図９Ｆ）。ＮＫ細胞内では、阻害性受容体ＬＡＧ－３の発現によって測定すると、部分アゴニストではなくＩＬ－１２が活性化ＮＫ細胞の集団を増加させた（図９Ｇ）。

【0279】

既に、ＩＬ－２Ｒα鎖であるＣＤ２５は、活性化Ｔ細胞及びＮＫ細胞のマーカーとして記載されている。ＩＬ－１２は、ＯＴ－Ｉ Ｔ細胞及びＮＫ細胞の両方でＣＤ２５発現を強力にアップレギュレートしたが、２×Ａｌａ及び３×Ａｌａ部分アゴニストは、ＮＫ細胞での発現を上昇させることなく、ＯＴ－Ｉ Ｔ細胞上のＣＤ２５の中間的アップレギュレーションをもたらした（図９Ｈ～９Ｊ）。興味深いことに、２×Ａｌａバリアントは、インビトロで３×Ａｌａバリアントほど顕著なＴ／ＮＫ細胞バイアスを示さなかったが（図８Ｅ～８Ｆ）、これは、インビボで３×Ａｌａに対して同等に強いＴ／ＮＫ細胞バイアスを示すことが観察され、インビトロ対インビボで治療ウィンドウが量的に異なる可能性があることを強調している。これらの結果は、ＩＬ－１２部分アゴニストが中間レベルのＴ細胞活性化を支持しており、インビボのＮＫ細胞刺激及び毒性は低下していることを示す。

【0280】

実施例７
ＩＬ－１２部分アゴニストは、ＩＬ－１２に比べて低い毒性で抗腫瘍免疫を支持する
インビトロの特性解析及びインビボの細胞プロファイリングに基づいて、ＩＬ－１２部分アゴニストは、ＩＬ－１２の活性を抗原特異的Ｔ細胞に偏らせ、ＮＫ細胞から遠ざけることによって、全身毒性なしに、抗腫瘍Ｔ細胞免疫を支持することができると結論付けられた。ＩＬ－１２部分アゴニストがインビボで治療効果をもたらす能力を判定するために、ＩＬ－１２に応答することが示されている結腸腺癌ＭＣ－３８を使用して、腫瘍に対して追加の実験を行った。これらの実験では、マウスにＭＣ－３８を１週間移植した後、７日間毎日のサイトカイン治療を開始した（図１０Ａ）。１μｇ又は３０μｇでＩＬ－１２を毎日投与すると、体重減少（図１０Ｂ）、血清ＩＦＮγの上昇（図１０Ｃ）、及び行動能力の低下（図１０Ｄ）によって測定されように、深刻な毒性が生じた。３０μｇのＩＬ－１２を投与されたすべてのマウスが、１３日目～１５日目の間に致死毒性で死亡したことが観察された。その結果、１６日目のこれらのマウスの行動能力は測定されなかった。対照的に、２×Ａｌａ及び３×Ａｌａ部分アゴニストは忍容性が高く、担癌マウスに毒性を誘発しなかった。

【0281】

ＩＬ－１２と部分アゴニストの両方が、ＰＢＳでの処置と比較して、腫瘍増殖を減弱させ、生存を延長することがさらに観察された（図１０Ｅ～１０Ｈ）。しかし、２×Ａｌａ及び３×Ａｌａ部分アゴニストは、ＩＬ－１２投与で観察された全身毒性を誘発することなく上記が観察された。これらの結果は、ＩＬ－１２Ｒβ１共有界面の構造に基づいて設計された偏ったアゴニストが、Ｔ細胞をＮＫ細胞の活性化から分離する能力を持ち、ＩＬ－１２の多面発現性を大幅に低下させるという仮説に対する、追加のインビボの支持を提供している。

【0282】

本開示の具体的な代替物が開示されているが、様々な修飾及び組み合わせが可能であり、それらは、添付の特許請求の範囲の真の精神及び範囲内であると企図されることが理解されるべきである。従って、本明細書に提示された正確な要約及び開示を限定する意図はない。

【0283】

参考文献
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Ｄｏｚｉｅｒ ａｎｄ Ｄｉｓｔｅｆａｎｏ． Ｓｉｔｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ １６（１０）： ２５８３１-２５８６４， ２０１５．
Ｅｍｓｌｅｙ， Ｐ．， Ｌｏｈｋａｍｐ， Ｂ．， Ｓｃｏｔｔ， Ｗ．Ｇ．， ａｎｄ Ｃｏｗｔａｎ， Ｋ． （２０１０）． Ｆｅａｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｏｏｔ． Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ６６， ４８６－５０１．
Ｆｅｗｅｌｌ， Ｊ．Ｇ．， Ｍａｔａｒ， Ｍ．Ｍ．， Ｒｉｃｅ， Ｊ．Ｓ．， Ｂｒｕｎｈｏｅｂｅｒ， Ｅ．， Ｓｌｏｂｏｄｋｉｎ， Ｇ．， Ｐｅｎｃｅ， Ｃ．， Ｗｏｒｋｅｒ， Ｍ．， Ｌｅｗｉｓ， Ｄ．Ｈ．， ａｎｄ Ａｎｗｅｒ， Ｋ． （２００９）． Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ ｕｓｉｎｇ ｎｏｎｖｉｒａｌ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１２ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｌｙ． Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ １１， ７１８－７２８．
Ｈｏｇｑｕｉｓｔ， Ｋ．Ａ．， Ｊａｍｅｓｏｎ， Ｓ．Ｃ．， Ｈｅａｔｈ， Ｗ．Ｒ．， Ｈｏｗａｒｄ， Ｊ．Ｌ．， Ｂｅｖａｎ， Ｍ．Ｊ．， ａｎｄ Ｃａｒｂｏｎｅ， Ｆ．Ｒ． （１９９４）． Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎｄｕｃｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ． Ｃｅｌｌ ７６， １７－２７．
Ｈｏｌｓｃｈｅｒ， Ｃ．， Ａｔｋｉｎｓｏｎ， Ｒ．Ａ．， Ａｒｅｎｄｓｅ， Ｂ．， Ｂｒｏｗｎ， Ｎ．， Ｍｙｂｕｒｇｈ， Ｅ．， Ａｌｂｅｒ， Ｇ．， ａｎｄ Ｂｒｏｍｂａｃｈｅｒ， Ｆ． （２００１）． Ａ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｎｄ ａｇｏｎｉｓｔｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ＩＬ－１２ｐ４０ ｉｎ ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６７， ６９５７－６９６６．
Ｈｕｙｔｏｎ， Ｔ．， Ｚｈａｎｇ， Ｊ．Ｇ．， Ｌｕｏ， Ｃ．Ｓ．， Ｌｏｕ， Ｍ．Ｚ．， Ｈｉｌｔｏｎ， Ｄ．Ｊ．， Ｎｉｃｏｌａ， Ｎ．Ａ．， ａｎｄ Ｇａｒｒｅｔｔ， Ｔ．Ｐ． （２００７）． Ａｎ ｕｎｕｓｕａｌ ｃｙｔｏｋｉｎｅ：Ｉｇ－ｄｏｍａｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ （ＬＩＦ） ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＬＩＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０４， １２７３７－１２７４２．
Ｋａｂｓｃｈ， Ｗ． （２０１０）． Ｘｄｓ． Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ６６， １２５－１３２．
Ｋｏｂａｙａｓｈｉ， Ｍ．， Ｆｉｔｚ， Ｌ．， Ｒｙａｎ， Ｍ．， Ｈｅｗｉｃｋ， Ｒ．Ｍ．， Ｃｌａｒｋ， Ｓ．Ｃ．， Ｃｈａｎ， Ｓ．， Ｌｏｕｄｏｎ， Ｒ．， Ｓｈｅｒｍａｎ， Ｆ．， Ｐｅｒｕｓｓｉａ， Ｂ．， ａｎｄ Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ， Ｇ． （１９８９）． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ （ＮＫＳＦ）， ａ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｗｉｔｈ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｈｕｍａｎ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ． Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １７０， ８２７－８４５．
Ｋｏｐｐ， Ｔ．， Ｒｉｅｄｌ， Ｅ．， Ｂａｎｇｅｒｔ， Ｃ．， Ｂｏｗｍａｎ， Ｅ．Ｐ．， Ｇｒｅｉｓｅｎｅｇｇｅｒ， Ｅ．， Ｈｏｒｏｗｉｔｚ， Ａ．， Ｋｉｔｔｌｅｒ， Ｈ．， Ｂｌｕｍｅｎｓｃｈｅｉｎ， Ｗ．Ｍ．， ＭｃＣｌａｎａｈａｎ， Ｔ．Ｋ．， Ｍａｒｂｕｒｙ， Ｔ．， ｅｔ ａｌ． （２０１５）． Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｉｎ ｐｓｏｒｉａｓｉｓ ｗｉｔｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２３． Ｎａｔｕｒｅ ５２１， ２２２－２２６．
Ｋｏｕｔｒｕｂａ， Ｎ．， Ｅｍｅｒ， Ｊ．， ａｎｄ Ｌｅｂｗｏｈｌ， Ｍ． （２０１０）． Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｕｓｔｅｋｉｎｕｍａｂ， ａｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１２ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２３ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｐｌａｑｕｅ ｐｓｏｒｉａｓｉｓ． Ｔｈｅｒ Ｃｌｉｎ Ｒｉｓｋ Ｍａｎａｇ ６， １２３－１４１．
Ｌａｓｅｋ， Ｗ．， Ｚａｇｏｚｄｚｏｎ， Ｒ．， ａｎｄ Ｊａｋｏｂｉｓｉａｋ， Ｍ． （２０１４）． Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １２： ｓｔｉｌｌ ａ ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｆｏｒ ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ？ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ６３， ４１９－４３５．
Ｌｅａｈｙ， Ｄ．Ｊ．， Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ， Ｗ．Ａ．， Ａｕｋｈｉｌ， Ｉ．， ａｎｄ Ｅｒｉｃｋｓｏｎ， Ｈ．Ｐ． （１９９２）． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｄｏｍａｉｎ ｆｒｏｍ ｔｅｎａｓｃｉｎ ｐｈａｓｅｄ ｂｙ ＭＡＤ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｌｅｎｏｍｅｔｈｉｏｎｙｌ ｐｒｏｔｅｉｎ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５８， ９８７－９９１．
Ｌｉａｎｇ， Ｄ．， Ｚｕｏ， Ａ．， Ｓｈａｏ， Ｈ．， Ｂｏｒｎ， Ｗ．Ｋ．， Ｏ’Ｂｒｉｅｎ， Ｒ．Ｌ．， Ｋａｐｌａｎ， Ｈ．Ｊ．， ａｎｄ Ｓｕｎ， Ｄ． （２０１３）． ＩＬ－２３ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｎ ｇａｍｍａｄｅｌｔａ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅｉｒ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ａｕｔｏｒｅａｃｔｉｖｅ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｕｖｅｉｔｉｓ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９１， １１１８－１１２５．
Ｌｉｅｂｓｃｈｎｅｒ， Ｄ．， Ａｆｏｎｉｎｅ， Ｐ．Ｖ．， Ｂａｋｅｒ， Ｍ．Ｌ．， Ｂｕｎｋｏｃｚｉ， Ｇ．， Ｃｈｅｎ， Ｖ．Ｂ．， Ｃｒｏｌｌ， Ｔ．Ｉ．， Ｈｉｎｔｚｅ， Ｂ．， Ｈｕｎｇ， Ｌ．Ｗ．， Ｊａｉｎ， Ｓ．， ＭｃＣｏｙ， Ａ．Ｊ．， ｅｔ ａｌ． （２０１９）． Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ Ｘ－ｒａｙｓ， ｎｅｕｔｒｏｎｓ ａｎｄ ｅｌｅｃｔｒｏｎｓ： ｒｅｃｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｐｈｅｎｉｘ． Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ ７５， ８６１－８７７．
Ｌｉｔｔｍａｎ， Ｄ．Ｒ．， ａｎｄ Ｒｕｄｅｎｓｋｙ， Ａ．Ｙ． （２０１０）． Ｔｈ１７ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｍｅｄｉａｔｉｎｇ ａｎｄ ｒｅｓｔｒａｉｎｉｎｇ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ． Ｃｅｌｌ １４０， ８４５－８５８．
Ｌｏｔｈａｒ Ｓｔｅｉｄｌｅｒ， Ｓａｂｉｎｅ Ｎｅｉｒｙｎｃｋ， Ｎａｔｈａｌｉｅ Ｈｕｙｇｈｅｂａｅｒｔ，Ｖｅｅｒｌｅ Ｓｎｏｅｃｋ， Ａｎ Ｖｅｒｍｅｉｒｅ， Ｂｒｕｎｏ Ｇｏｄｄｅｅｒｉｓ， Ｅｒｉｃ Ｃｏｘ， Ｊｅａｎ Ｐａｕｌ Ｒｅｍｏｎ ａｎｄ Ｅｒｉｋ Ｒｅｍａｕｔ． （２００３）． Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｎｔａｉｎｍｅｎｔ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｆｏｒ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １０． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ２１， Ｎｏ． ７， Ｊｕｌｙ ２００３．
Ｌｕｏ， Ｊ．， Ｗｕ， Ｓ．Ｊ．， Ｌａｃｙ， Ｅ．Ｒ．， Ｏｒｌｏｖｓｋｙ， Ｙ．， Ｂａｋｅｒ， Ａ．， Ｔｅｐｌｙａｋｏｖ， Ａ．， Ｏｂｍｏｌｏｖａ， Ｇ．， Ｈｅａｖｎｅｒ， Ｇ．Ａ．， Ｒｉｃｈｔｅｒ， Ｈ．Ｔ．， ａｎｄ Ｂｅｎｓｏｎ， Ｊ． （２０１０）． Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｕａｌ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ＩＬ－１２ ａｎｄ ＩＬ－２３ ｂｙ ｕｓｔｅｋｉｎｕｍａｂ． Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４０２， ７９７－８１２．
Ｌｕｐａｒｄｕｓ， Ｐ．Ｊ．， ａｎｄ Ｇａｒｃｉａ， Ｋ．Ｃ． （２００８）． Ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２３ ｒｅｖｅａｌｓ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｐ４０ ｓｕｂｕｎｉｔ ｓｈａｒｉｎｇ ｗｉｔｈ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１２． Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３８２， ９３１－９４１．
Ｍａｔｔｎｅｒ， Ｆ．， Ｍａｇｒａｍ， Ｊ．， Ｆｅｒｒａｎｔｅ， Ｊ．， Ｌａｕｎｏｉｓ， Ｐ．， Ｄｉ Ｐａｄｏｖａ， Ｋ．， Ｂｅｈｉｎ， Ｒ．， Ｇａｔｅｌｙ， Ｍ．Ｋ．， Ｌｏｕｉｓ， Ｊ．Ａ．， ａｎｄ Ａｌｂｅｒ， Ｇ． （１９９６）． Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｍｉｃｅ ｌａｃｋｉｎｇ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１２ ａｒｅ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｔｏ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ ａｎｄ ｍｏｕｎｔ ａ ｐｏｌａｒｉｚｅｄ Ｔｈ２ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ． Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２６， １５５３－１５５９．
Ｍｏｒｉｎ， Ａ．， Ｅｉｓｅｎｂｒａｕｎ， Ｂ．， Ｋｅｙ， Ｊ．， Ｓａｎｓｃｈａｇｒｉｎ， Ｐ．Ｃ．， Ｔｉｍｏｎｙ， Ｍ．Ａ．， Ｏｔｔａｖｉａｎｏ， Ｍ．， ａｎｄ Ｓｌｉｚ， Ｐ． （２０１３）． Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｏｎ ｇｅｔｓ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｏｕｔ ｏｆ ｓｏｆｔｗａｒｅ． Ｅｌｉｆｅ ２， ｅ０１４５６．
Ｍｕｒｒａｙ， Ｐ．Ｊ． （２００７）． Ｔｈｅ ＪＡＫ－ＳＴＡＴ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ： ｉｎｐｕｔ ａｎｄ ｏｕｔｐｕｔ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７８， ２６２３－２６２９．
Ｏｈ Ｊｅｅ－Ｈｗａｎ， Ｓｃｈｕｅｌｅｒ Ｌ． Ｋａｔｈｒｙｎ， Ｄｏｎｎｉｅ Ｓ． Ｓｔａｐｌｅｔｏｎ， Ｌａｕｒａ Ｍ． Ａｌｅｘａｎｄｅｒ， Ｃｈｉ－Ｌｉａｎｇ Ｅｒｉｃ Ｙｅｎ， Ｍａｒｋ Ｐ． Ｋｅｌｌｅｒ， Ａｌａｎ Ｄ． Ａｔｔｉｅ， Ｊａｎ－Ｐｅｔｅｒ ｖａｎ Ｐｉｊｋｅｒｅｎ． （２０２０）． Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２２ ｂｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ Ｒｅｄｕｃｅｓ Ｆａｔｔｙ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ａ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｄｉｅｔ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｏｂｅｓｉｔｙ． ｍＳｐｈｅｒｅ， Ｖｏｌ． ５， Ｉｓｓｕｅ ３， Ｍａｙ／Ｊｕｎｅ ２０２０．
Ｏｐｐｍａｎｎ， Ｂ．， Ｌｅｓｌｅｙ， Ｒ．， Ｂｌｏｍ， Ｂ．， Ｔｉｍａｎｓ， Ｊ．Ｃ．， Ｘｕ， Ｙ．， Ｈｕｎｔｅ， Ｂ．， Ｖｅｇａ， Ｆ．， Ｙｕ， Ｎ．， Ｗａｎｇ， Ｊ．， Ｓｉｎｇｈ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ． （２０００）． Ｎｏｖｅｌ ｐ１９ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇａｇｅｓ ＩＬ－１２ｐ４０ ｔｏ ｆｏｒｍ ａ ｃｙｔｏｋｉｎｅ， ＩＬ－２３， ｗｉｔｈ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｓｉｍｉｌａｒ ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｆｒｏｍ ＩＬ－１２． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １３， ７１５－７２５．
Ｐａｒｈａｍ， Ｃ．， Ｃｈｉｒｉｃａ， Ｍ．， Ｔｉｍａｎｓ， Ｊ．， Ｖａｉｓｂｅｒｇ， Ｅ．， Ｔｒａｖｉｓ， Ｍ．， Ｃｈｅｕｎｇ， Ｊ．， Ｐｆｌａｎｚ， Ｓ．， Ｚｈａｎｇ， Ｒ．， Ｓｉｎｇｈ， Ｋ．Ｐ．， Ｖｅｇａ， Ｆ．， ｅｔ ａｌ． （２００２）． Ａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ＩＬ－２３ ｉｓ ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｆ ＩＬ－１２Ｒｂｅｔａ１ ａｎｄ ａ ｎｏｖｅｌ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｂｕｎｉｔ， ＩＬ－２３Ｒ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６８， ５６９９－５７０８．
Ｐａｓｃｈｅ， Ｎ．， Ｗｕｌｈｆａｒｄ， Ｓ．， Ｐｒｅｔｔｏ， Ｆ．， Ｃａｒｕｇａｔｉ， Ｅ．， ａｎｄ Ｎｅｒｉ， Ｄ． （２０１２）． Ｔｈｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｂａｓｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１２ ｔｏ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ ｅｒａｄｉｃａｔｅｓ ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ． Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １８， ４０９２－４１０３．
Ｐｅｇｒａｍ， Ｈ．Ｊ．， Ｌｅｅ， Ｊ．Ｃ．， Ｈａｙｍａｎ， Ｅ．Ｇ．， Ｉｍｐｅｒａｔｏ， Ｇ．Ｈ．， Ｔｅｄｄｅｒ， Ｔ．Ｆ．， Ｓａｄｅｌａｉｎ， Ｍ．， ａｎｄ Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ， Ｒ．Ｊ． （２０１２）． Ｔｕｍｏｒ－ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｔｏ ｓｅｃｒｅｔｅ ＩＬ－１２ ｅｒａｄｉｃａｔｅ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｔｕｍｏｒｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ｎｅｅｄ ｆｏｒ ｐｒｉｏｒ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ． Ｂｌｏｏｄ １１９， ４１３３－４１４１．
Ｐｆｌａｎｚ， Ｓ．， Ｔｉｍａｎｓ， Ｊ．Ｃ．， Ｃｈｅｕｎｇ， Ｊ．， Ｒｏｓａｌｅｓ， Ｒ．， Ｋａｎｚｌｅｒ， Ｈ．， Ｇｉｌｂｅｒｔ， Ｊ．， Ｈｉｂｂｅｒｔ， Ｌ．， Ｃｈｕｒａｋｏｖａ， Ｔ．， Ｔｒａｖｉｓ， Ｍ．， Ｖａｉｓｂｅｒｇ， Ｅ．， ｅｔ ａｌ． （２００２）． ＩＬ－２７， ａ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｆ ＥＢＩ３ ａｎｄ ｐ２８ ｐｒｏｔｅｉｎ， ｉｎｄｕｃｅｓ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｎａｉｖｅ ＣＤ４＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １６， ７７９－７９０．
Ｐｒｅｓｋｙ， Ｄ．Ｈ．， Ｙａｎｇ， Ｈ．， Ｍｉｎｅｔｔｉ， Ｌ．Ｊ．， Ｃｈｕａ， Ａ．Ｏ．， Ｎａｂａｖｉ， Ｎ．， Ｗｕ， Ｃ．Ｙ．， Ｇａｔｅｌｙ， Ｍ．Ｋ．， ａｎｄ Ｇｕｂｌｅｒ， Ｕ． （１９９６）． Ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｏｍｐｌｅｘ ｉｓ ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｆ ｔｗｏ ｂｅｔａ－ｔｙｐｅ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｂｕｎｉｔｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９３， １４００２－１４００７．
Ｒｉｅｔｈｍｕｅｌｌｅｒ， Ｓ．， Ｓｏｍａｓｕｎｄａｒａｍ， Ｐ．， Ｅｈｌｅｒｓ， Ｊ．Ｃ．， Ｈｕｎｇ， Ｃ．Ｗ．， Ｆｌｙｎｎ， Ｃ．Ｍ．， Ｌｏｋａｕ， Ｊ．， Ａｇｔｈｅ， Ｍ．， Ｄｕｓｔｅｒｈｏｆｔ， Ｓ．， Ｚｈｕ， Ｙ．， Ｇｒｏｔｚｉｎｇｅｒ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ． （２０１７）． Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ Ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｈｕｍａｎ ＩＬ－６Ｒ Ｉｎ Ｖｉｖｏ ａｎｄ ａ Ｄｅｃｉｓｉｖｅ Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｎ－Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ． ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ １５， ｅ２００００８０．
Ｒｏｓｓｊｏｈｎ， Ｊ．， Ｇｒａｓ， Ｓ．， Ｍｉｌｅｓ， Ｊ．Ｊ．， Ｔｕｒｎｅｒ， Ｓ．Ｊ．， Ｇｏｄｆｒｅｙ， Ｄ．Ｉ．， ａｎｄ ＭｃＣｌｕｓｋｅｙ， Ｊ． （２０１５）． Ｔ ｃｅｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ－ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ． Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３３， １６９－２００．
Ｓｃｈｒｏｄｅｒ， Ｊ．， Ｍｏｌｌ， Ｊ．Ｍ．， Ｂａｒａｎ， Ｐ．， Ｇｒｏｔｚｉｎｇｅｒ， Ｊ．， Ｓｃｈｅｌｌｅｒ， Ｊ．， ａｎｄ Ｆｌｏｓｓ， Ｄ．Ｍ． （２０１５）． Ｎｏｎ－ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２３ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｏｍｐｌｅｘ ａｓｓｅｍｂｌｙ： ｐ４０ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｒｕｉｔｓ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｅｔａ１ ｖｉａ ｓｉｔｅ ＩＩ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅｓ ｐ１９／ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２３ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｖｉａ ｓｉｔｅ ＩＩＩ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２９０， ３５９－３７０．
Ｓｃｈｕｒｉｃｈ， Ａ．， Ｐａｌｌｅｔｔ， Ｌ．Ｊ．， Ｌｕｂｏｗｉｅｃｋｉ， Ｍ．， Ｓｉｎｇｈ， Ｈ．Ｄ．， Ｇｉｌｌ， Ｕ．Ｓ．， Ｋｅｎｎｅｄｙ， Ｐ．Ｔ．， Ｎａｓｔｏｕｌｉ， Ｅ．， Ｔａｎｗａｒ， Ｓ．， Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ， Ｗ．， ａｎｄ Ｍａｉｎｉ， Ｍ．Ｋ． （２０１３）． Ｔｈｅ ｔｈｉｒｄ ｓｉｇｎａｌ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ＩＬ－１２ ｒｅｓｃｕｅｓ ｔｈｅ ａｎｔｉ－ｖｉｒａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｈａｕｓｔｅｄ ＨＢＶ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ８ Ｔ ｃｅｌｌｓ． ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ ９， ｅ１００３２０８．
Ｓｋｉｎｉｏｔｉｓ， Ｇ．， Ｌｕｐａｒｄｕｓ， Ｐ．Ｊ．， Ｍａｒｔｉｃｋ， Ｍ．， Ｗａｌｚ， Ｔ．， ａｎｄ Ｇａｒｃｉａ， Ｋ．Ｃ． （２００８）． Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ｇｐ１３０／ＬＩＦ－Ｒ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｏｍｐｌｅｘ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ３１， ７３７－７４８．
Ｓｚａｂｏ， Ｓ．Ｊ．， Ｄｉｇｈｅ， Ａ．Ｓ．， Ｇｕｂｌｅｒ， Ｕ．， ａｎｄ Ｍｕｒｐｈｙ， Ｋ．Ｍ． （１９９７）． Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ （ＩＬ）－１２Ｒ ｂｅｔａ ２ ｓｕｂｕｎｉｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ Ｔ ｈｅｌｐｅｒ １ （Ｔｈ１） ａｎｄ Ｔｈ２ ｃｅｌｌｓ． Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８５， ８１７－８２４．
Ｔａｉｔ Ｗｏｊｎｏ， Ｅ．Ｄ．， Ｈｕｎｔｅｒ， Ｃ．Ａ．， ａｎｄ Ｓｔｕｍｈｏｆｅｒ， Ｊ．Ｓ． （２０１９）． Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１２ Ｆａｍｉｌｙ： Ｒｏｏｍ ｆｏｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ５０， ８５１－８７０．
Ｔａｋｅｓｈｉｔａ， Ｔ．， Ａｓａｏ， Ｈ．， Ｏｈｔａｎｉ， Ｋ．， Ｉｓｈｉｉ， Ｎ．， Ｋｕｍａｋｉ， Ｓ．， Ｔａｎａｋａ， Ｎ．， Ｍｕｎａｋａｔａ， Ｈ．， Ｎａｋａｍｕｒａ， Ｍ．， ａｎｄ Ｓｕｇａｍｕｒａ， Ｋ． （１９９２）． Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｇａｍｍａ ｃｈａｉｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ＩＬ－２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７， ３７９－３８２．
Ｔａｍｕｒａ， Ｔ．， Ｎｉｓｈｉ， Ｔ．， Ｇｏｔｏ， Ｔ．， Ｔａｋｅｓｈｉｍａ， Ｈ．， Ｄｅｖ， Ｓ．Ｂ．， Ｕｓｈｉｏ， Ｙ．， ａｎｄ Ｓａｋａｔａ， Ｔ． （２００１）． Ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １２ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｗｉｔｈ ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｉｓ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｆｏｒ ｃｏｌｏｎ ａｎｄ ｒｅｎａｌ ｃａｎｃｅｒ． Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １２， １２６５－１２７６．
Ｔｈｕｌ， Ｐ．Ｊ．， Ａｋｅｓｓｏｎ， Ｌ．， Ｗｉｋｉｎｇ， Ｍ．， Ｍａｈｄｅｓｓｉａｎ， Ｄ．， Ｇｅｌａｄａｋｉ， Ａ．， Ａｉｔ Ｂｌａｌ， Ｈ．， Ａｌｍ， Ｔ．， Ａｓｐｌｕｎｄ， Ａ．， Ｂｊｏｒｋ， Ｌ．， Ｂｒｅｃｋｅｌｓ， Ｌ．Ｍ．， ｅｔ ａｌ． （２０１７）． Ａ ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｐ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｔｅｏｍｅ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５６．
Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ， Ｇ． （２００３）． Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１２ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｎａｔｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｎｄ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３， １３３－１４６．
Ｔｓｅｎｇ， Ｄ．， Ｖｏｌｋｍｅｒ， Ｊ．Ｐ．， Ｗｉｌｌｉｎｇｈａｍ， Ｓ．Ｂ．， Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ－Ｔｒｕｊｉｌｌｏ， Ｈ．， Ｆａｔｈｍａｎ， Ｊ．Ｗ．， Ｆｅｒｎｈｏｆｆ， Ｎ．Ｂ．， Ｓｅｉｔａ， Ｊ．， Ｉｎｌａｙ， Ｍ．Ａ．， Ｗｅｉｓｋｏｐｆ， Ｋ．， Ｍｉｙａｎｉｓｈｉ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ． （２０１３）． Ａｎｔｉ－ＣＤ４７ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｂｙ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｐｒｉｍｅｓ ａｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１０， １１１０３－１１１０８．
Ｖａｎｃｅ， Ｒ．Ｅ．， Ｅｉｃｈｂｅｒｇ， Ｍ．Ｊ．， Ｐｏｒｔｎｏｙ， Ｄ．Ａ．， ａｎｄ Ｒａｕｌｅｔ， Ｄ．Ｈ． （２０１７）． Ｌｉｓｔｅｎｉｎｇ ｔｏ ｅａｃｈ ｏｔｈｅｒ： Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ． Ｓｃｉ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２．
Ｖｉｇｎａｌｉ， Ｄ．Ａ．， ａｎｄ Ｋｕｃｈｒｏｏ， Ｖ．Ｋ． （２０１２）． ＩＬ－１２ ｆａｍｉｌｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ： ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｌａｙｍａｋｅｒｓ． Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３， ７２２－７２８．
Ｖｉｌｌａｒｉｎｏ， Ａ．Ｖ．， Ｋａｎｎｏ， Ｙ．， Ｆｅｒｄｉｎａｎｄ， Ｊ．Ｒ．， ａｎｄ Ｏ’Ｓｈｅａ， Ｊ．Ｊ． （２０１５）． Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｊａｋ／ＳＴＡＴ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９４， ２１－２７．
Ｖｏｎｒｈｅｉｎ， Ｃ．， Ｂｌａｎｃ， Ｅ．， Ｒｏｖｅｒｓｉ， Ｐ．， ａｎｄ Ｂｒｉｃｏｇｎｅ， Ｇ． （２００７）． Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｕｔｏＳＨＡＲＰ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３６４， ２１５－２３０．
Ｗａｎｇ， Ｘ．， Ｌｕｐａｒｄｕｓ， Ｐ．， Ｌａｐｏｒｔｅ， Ｓ．Ｌ．， ａｎｄ Ｇａｒｃｉａ， Ｋ．Ｃ． （２００９）． Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｓｈａｒｅｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ． Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７， ２９－６０．
Ｗａｎｇ， Ｘ．， Ｗｅｉ， Ｙ．， Ｘｉａｏ， Ｈ．， Ｌｉｕ， Ｘ．， Ｚｈａｎｇ， Ｙ．， Ｈａｎ， Ｇ．， Ｃｈｅｎ， Ｇ．， Ｈｏｕ， Ｃ．， Ｍａ， Ｎ．， Ｓｈｅｎ， Ｂ．， ｅｔ ａｌ． （２０１６）． Ａ ｎｏｖｅｌ ＩＬ－２３ｐ１９／Ｅｂｉ３ （ＩＬ－３９） ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｉｎ Ｌｕｐｕｓ－ｌｉｋｅ ｍｉｃｅ． Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４６， １３４３－１３５０．
Ｗａｔｆｏｒｄ， Ｗ．Ｔ．， Ｈｉｓｓｏｎｇ， Ｂ．Ｄ．， Ｂｒｅａｍ， Ｊ．Ｈ．， Ｋａｎｎｏ， Ｙ．， Ｍｕｕｌ， Ｌ．， ａｎｄ Ｏ’Ｓｈｅａ， Ｊ．Ｊ． （２００４）． Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｂｙ ＩＬ－１２ ａｎｄ ＩＬ－２３ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｒｏｌｅｓ ｏｆ ＳＴＡＴ４． Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ ２０２， １３９－１５６．
Ｙｅｎ， Ｄ．， Ｃｈｅｕｎｇ， Ｊ．， Ｓｃｈｅｅｒｅｎｓ， Ｈ．， Ｐｏｕｌｅｔ， Ｆ．， ＭｃＣｌａｎａｈａｎ， Ｔ．， ＭｃＫｅｎｚｉｅ， Ｂ．， Ｋｌｅｉｎｓｃｈｅｋ， Ｍ．Ａ．， Ｏｗｙａｎｇ， Ａ．， Ｍａｔｔｓｏｎ， Ｊ．， Ｂｌｕｍｅｎｓｃｈｅｉｎ， Ｗ．， ｅｔ ａｌ． （２００６）． ＩＬ－２３ ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ Ｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｏｌｉｔｉｓ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｖｉａ ＩＬ－１７ ａｎｄ ＩＬ－６． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １１６， １３１０－１３１６．
Ｙｅｓｔｅ， Ａ．， Ｍａｓｃａｎｆｒｏｎｉ， Ｉ．Ｄ．， Ｎａｄｅａｕ， Ｍ．， Ｂｕｒｎｓ， Ｅ．Ｊ．， Ｔｕｋｐａｈ， Ａ．Ｍ．， Ｓａｎｔｉａｇｏ， Ａ．， Ｗｕ， Ｃ．， Ｐａｔｅｌ， Ｂ．， Ｋｕｍａｒ， Ｄ．， ａｎｄ Ｑｕｉｎｔａｎａ， Ｆ．Ｊ． （２０１４）． ＩＬ－２１ ｉｎｄｕｃｅｓ ＩＬ－２２ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ＣＤ４＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ． Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ５， ３７５３．
Ｙｏｄｏｉ， Ｊ．， Ｔｅｓｈｉｇａｗａｒａ， Ｋ．， Ｎｉｋａｉｄｏ， Ｔ．， Ｆｕｋｕｉ， Ｋ．， Ｎｏｍａ， Ｔ．， Ｈｏｎｊｏ， Ｔ．， Ｔａｋｉｇａｗａ， Ｍ．， Ｓａｓａｋｉ， Ｍ．， Ｍｉｎａｔｏ， Ｎ．， Ｔｓｕｄｏ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ． （１９８５）． ＴＣＧＦ （ＩＬ ２）－ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ（ｓ）． Ｉ． Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＩＬ ２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｏｎ ａ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ－ｌｉｋｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ （ＹＴ ｃｅｌｌｓ）． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３４， １６２３－１６３０．
Ｙｏｏｎ， Ｃ．， Ｊｏｈｎｓｔｏｎ， Ｓ．Ｃ．， Ｔａｎｇ， Ｊ．， Ｓｔａｈｌ， Ｍ．， Ｔｏｂｉｎ， Ｊ．Ｆ．， ａｎｄ Ｓｏｍｅｒｓ， Ｗ．Ｓ． （２０００）． Ｃｈａｒｇｅｄ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｄｏｍｉｎａｔｅ ａ ｕｎｉｑｕｅ ｉｎｔｅｒｌｏｃｋｉｎｇ ｔｏｐｏｇｒａｐｈｙ ｉｎ ｔｈｅ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１２． ＥＭＢＯ Ｊ １９， ３５３０－３５４１．
Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ， Ｔ．， Ｔａｋｅｄａ， Ｋ．， Ｔａｎａｋａ， Ｔ．， Ｏｈｋｕｓｕ， Ｋ．， Ｋａｓｈｉｗａｍｕｒａ， Ｓ．， Ｏｋａｍｕｒａ， Ｈ．， Ａｋｉｒａ， Ｓ．， ａｎｄ Ｎａｋａｎｉｓｈｉ， Ｋ． （１９９８）． ＩＬ－１２ ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ＩＬ－１８ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ， Ｔｈ１ ｃｅｌｌｓ， ａｎｄ Ｂ ｃｅｌｌｓ： ｓｙｎｅｒｇｉｓｍ ｗｉｔｈ ＩＬ－１８ ｆｏｒ ＩＦＮ－ｇａｍｍａ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６１， ３４００－３４０７．
Ｚｈｏｕ， Ｆ． （２００９）． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ＩＦＮ－ｇａｍｍａ ｔｏ ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ． Ｉｎｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２８， ２３９－２６０．
Ｚｈｏｕ， Ｌ．， Ｉｖａｎｏｖ， ＩＩ， Ｓｐｏｌｓｋｉ， Ｒ．， Ｍｉｎ， Ｒ．， Ｓｈｅｎｄｅｒｏｖ， Ｋ．， Ｅｇａｗａ， Ｔ．， Ｌｅｖｙ， Ｄ．Ｅ．， Ｌｅｏｎａｒｄ， Ｗ．Ｊ．， ａｎｄ Ｌｉｔｔｍａｎ， Ｄ．Ｒ． （２００７）． ＩＬ－６ ｐｒｏｇｒａｍｓ Ｔ（Ｈ）－１７ ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｂｙ ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ＩＬ－２１ ａｎｄ ＩＬ－２３ ｐａｔｈｗａｙｓ． Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ８， ９６７－９７４．
Ｚｈｕ， Ｊ．， Ｙａｍａｎｅ， Ｈ．， ａｎｄ Ｐａｕｌ， Ｗ．Ｅ． （２０１０）． Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ＣＤ４ Ｔ ｃｅｌｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ （＊）． Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２８， ４４５－４８９．
Ｚｉｔｖｏｇｅｌ， Ｌ．， Ｔａｈａｒａ， Ｈ．， Ｒｏｂｂｉｎｓ， Ｐ．Ｄ．， Ｓｔｏｒｋｕｓ， Ｗ．Ｊ．， Ｃｌａｒｋｅ， Ｍ．Ｒ．， Ｎａｌｅｓｎｉｋ， Ｍ．Ａ．， ａｎｄ Ｌｏｔｚｅ， Ｍ．Ｔ． （１９９５）． Ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｔｕｍｏｒｓ ｗｉｔｈ ＩＬ－１２． Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｂｙ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５５， １３９３－１４０３．

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図2A】

【図2B-2C】

【図2D】

【図2E】

【図2F】

【図2G】

【図2H】

【図3A】

【図3B】

【図3C-3D】

【図4A-4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E-4F】

【図4G】

【図5A-5B】

【図5C-5D】

【図6A-6B】

【図6C-6D】

【図6E-6G】

【図6H-6I】

【図7A】

【図7B】

【図7C-7D】

【図7E-7F】

【図7G-7I】

【図8A-8D】

【図8E-8F】

【図9A-9C】

【図9D-9G】

【図9H-9J】

【図10A-10B】

【図10C-10D】

【図10E-10F】

【図10G】

【配列表】

2023521870000001.app

【国際調査報告】